JP2022548078A - 志賀毒素ａサブユニット足場を含むｐｄ－ｌ１結合分子 - Google Patents

志賀毒素ａサブユニット足場を含むｐｄ－ｌ１結合分子 Download PDF

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Abstract

本明細書では、毒素、例えば、志賀毒素Ａサブユニット由来ポリペプチドを含むか、又はそれとコンジュゲートされているＰＤ－Ｌ１結合分子が提示される。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は細胞毒性である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをＰＤ－Ｌ１陽性細胞の内部のＭＨＣクラス分子へと送達することが可能である。本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、特異的細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞及び／又は免疫細胞）を選択的に殺滅するために；カーゴを、特異的細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞又は免疫細胞）へと選択的に送達するために、並びにＰＤ－Ｌ１発現細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞又は免疫細胞）を伴うがん及び腫瘍を含む様々な状態を治療及び診断するための治療用分子及び／又は診断用分子として、使用される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，２８８号明細書、２０２０年２月５日に出願された同第６２／９７０，６１０号明細書、２０１９年１１月８日に出願された同第６２／９３３，１９７号明細書、及び２０１９年９月１８日に出願された同第６２／９０２，２４３号明細書の優先権を主張し、これらの各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に付随する配列表は、紙の写しに代わりテキストフォーマットで提示され、それにより、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、MTEM_016_04WO_SeqList_ST25.txtである。本ファイルは約４９０ｋｂであり、２０２０年９月１８日に作成されたものであり、電子的に提出されている。
本出願は、毒素、例えば、触媒活性タンパク質毒素又はその断片などを含むＰＤ－Ｌ１結合分子に関する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１ターゲティング分子は、毒素構成要素の触媒活性のために、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を殺滅することができる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをＰＤ－Ｌ１発現細胞のＭＨＣクラスＩ系に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１ターゲティング分子は、天然に存在する志賀毒素のＡサブユニットに由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１ターゲティング分子は、野生型志賀毒素と比べた、複数のアミノ酸置換変異を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、（１）他の細胞の中で、特異的なＰＤ－Ｌ１発現細胞型（複数可）を選択的に殺滅するために有用であり、（２）がん及び腫瘍を含む、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を伴う、様々な疾患、障害、及び状態を治療するための治療分子として有用である。
以下は、本明細書で記載される発明（複数可）を理解する上で有用でありうる情報を含む。本明細書で提示される情報のいずれかが、先行技術であるか、又は現在記載された、若しくは請求された発明（複数可）に関連する、或いは本明細書において具体的又は暗黙的に参照される刊行物又は文書が先行技術であるという承認ではない。
ＰＤ－Ｌ１、プログラム細胞死リガンド１（また、ＣＤ２７４としても公知である）は、様々な悪性腫瘍からの腫瘍の細胞表面上で発現される。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体ＰＤ－１に結合することができ、Ｔ細胞活性化シグナルを阻害し、腫瘍細胞、腫瘍、及び／又は腫瘍微小環境中の他の細胞による免疫サーベイランスからの逃避、すなわち、Ｔ細胞抑制及び／又はＴ細胞アネルギーをもたらす。
治療用抗体によるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達軸の遮断は、ある特定の多岐にわたる適応症に対して臨床的有効性を有する可能性があり、正常な生理的状態を超えた抗腫瘍Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化を可能としうる。ＰＤ－Ｌ１にターゲティングされた薬剤から利益を得る場合がある腫瘍学的適応症は、肺がん、黒色腫、膀胱がん、ホジキンリンパ腫、乳がん（トリプルネガティブ乳がん、すなわち、ＨＥＲ２、エストロゲン受容体、及びプロゲステロン受容体が陰性である乳がんを含むがこれらに限定されない）のほか、例えば、高い変異量及び／又はインデルの頻度を伴う腫瘍細胞などの、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を伴う他の新生物を含むがこれらに限定されない。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、ある特定の疾患、障害、及び状態の緩和及び治療のための免疫毒素を含む抗新生物剤の送達のための標的である。
ＰＤ－Ｌ１はまた、ある特定の免疫細胞型の表面上にも発現される。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、ある特定の疾患、障害、及び状態、例えば、ある特定の免疫障害などの予防、緩和、及び治療のための、このような免疫細胞への免疫調節剤（免疫毒素、免疫原、及びワクチンを含む）の送達のための推定上の標的である。
ＰＤ－Ｌ１の発現は、細胞型、組織、疾患、障害、又は状態の特徴付けのための診断マーカーの役に立ちうる。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ある特定の療法若しくは治療手法に応答する可能性が最も高い患者の選択若しくは層別化のための、又は治療レジメン若しくは他の介入を受けている間若しくはその後の患者における変更をモニタリングするための、診断マーカーの役に立ちうる。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、診断的検出及び特徴付けのための、例えば、その進行及び治療効果を含む、ある特定の疾患、障害、及び状態の状況に関する情報収集のための、免疫毒素が連結された診断剤を内部化することが可能な細胞を検出又は特徴付けるためなどの、標的である。
当技術分野において、治療又は診断を目的として、毒素をＰＤ－Ｌ１発現細胞に送達するＰＤ－Ｌ１ターゲティング分子の創出のために、ＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫グロブリン結合ドメインと毒素構成要素とを含む分子を開発することが必要とされている。例えば、ＰＤ－Ｌ１担持新生物を殺滅することを目指す、今日の療法を補充する、新たな療法が緊急に必要とされている。
したがって、例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞の選択的殺滅、又は有益な薬剤の、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞への選択的送達により治療されうる、がん及び腫瘍など、様々な疾患を治療及び診断する、治療用及び／又は診断用分子としての使用のための、ＰＤ－Ｌ１に結合する細胞毒性分子を有することが所望されるであろう。特に、低免疫原性、低オフターゲット毒性、及び強力なオンターゲット細胞毒性を呈する毒素を含む、ＰＤ－Ｌ１結合性の、細胞毒性である結合分子を有することが所望されるであろう。さらに、低免疫原性、低オフターゲット毒性、高安定性、並びに／又はペプチドエピトープカーゴを、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系による提示のために送達する能力を呈するＰＤ－Ｌ１ターゲティング療法用分子及び／又は診断用分子を有することが所望されるであろう。例えば、１）望ましくない抗原性及び／若しくは免疫原性の可能性を低減し、２）非特異的毒性の可能性を低減し、並びに／又は３）ペプチドエピトープカーゴを、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系による提示のために送達する能力を有しながら、強力な細胞毒性を維持する、志賀毒素Ａサブユニット由来の構成要素を含むＰＤ－Ｌ１結合分子であって、また、標的細胞に強力な志賀毒素Ａサブユニットベースの細胞毒性も呈するＰＤ－Ｌ１結合分子を有することが所望されるであろう。ヒトＰＤ－Ｌ１をターゲティングするある特定のＰＤ－Ｌ１結合分子は、既に承認された抗ＰＤ－Ｌ１治療剤（複数可）及び／又は診断剤（複数可）と結合を競合しない場合に、さらなる利点をもたらしうる。毒素（例えば免疫毒素）を含むＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＰＤ－Ｌ１とのそれらの結合が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達軸をモジュレートするように機能する場合に、独自の作用機構を呈しうる。
ＰＤ－Ｌ１結合分子、及びその組成物の多様な実施形態が、本明細書で提示される。例えば、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に特異的に結合することが可能な結合領域とを含み、この場合、結合領域は、（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＹＴＭＨ（配列番号２７）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＧＩＮＰＮＮＧＧＴＷＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＰＹＹＹＧＳＲＥＤＹＦＤＹ（配列番号３２）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ；heavy chain variable region）と；（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２６）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ；light chain variable region）とを含む。
本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物もまた、本明細書で提示される。
本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするポリヌクレオチド、又はその相補体、及びこれらを含む発現ベクター又は宿主細胞もまた、本明細書で提示される。
本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子を製造するための方法であって、ＰＤ－Ｌ１結合分子を発現させるステップ、及びＰＤ－Ｌ１結合分子を回収するステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。
本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子を、ＰＤ－Ｌ１結合分子と、少なくとも１つの他の生体分子とを含む発現系組成物から精製するための方法であって、（ｉ）発現系組成物を細菌プロテインＬと接触させて、ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を創出するステップ、及び（ii）ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を回収するステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。
ＰＤ－Ｌ１発現細胞を殺滅するための方法であって、細胞を、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子又は医薬組成物と接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。
対象における疾患、障害、又は状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書で記載される、治療有効量のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は医薬組成物を投与するステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。
免疫療法を使用して、患者におけるがんを治療する方法であって、各々が、それを必要とする患者に、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子及び／又は医薬組成物を投与するステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。
がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書で記載される有効量のＰＤ－Ｌ１結合分子又は医薬組成物を投与するステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態では、がんは、以下：膀胱がん（例えば、尿路上皮癌）、乳がん（例えば、ＨＥＲ２陽性乳がん、トリプルネガティブ乳がん）、結腸がん（例えば、結腸直腸がん、例えば高頻度マイクロサテライト不安定性を有する転移性結腸直腸がん又はミスマッチ修復欠損結腸直腸がんなど）、子宮内膜がん、食道がん、卵管がん、消化器がん（例えば、胃がん、胆道新生物、食道胃接合部がん）、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、肝がん（例えば、肝細胞癌）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん）、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫）、メルケル細胞癌、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、鼻咽頭新生物、卵巣がん、膵臓がん、腹膜新生物、前立腺がん、皮膚がん（例えば、皮膚扁平上皮がん、黒色腫、移行上皮癌、又は尿路上皮がんのうちのいずれか１つである。
これらの、本発明の特色、態様、及び利点、並びに他の、本発明の特色、態様、及び利点は、以下の記載、添付の特許請求の範囲、及び添付の図に照らして、よく理解されるであろう。本発明の前述の要素は、本発明の他の実施形態を行うために、本明細書の以下で、そのような複合又は除去に反対する言明がなされない限りにおいて、個別に組み合わされる場合もあり、自由に除去される場合もある。
～ １つ又は２つ以上の毒素又は毒素サブユニット、例えば志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、１つ又は２つ以上のＰＤ－Ｌ１結合領域とを含む、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子を描示する図である。１つの例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖは、近傍のｓｃＦｖとの、分子間可変ドメイン交換に参与することが示される（左下）。図１における例示的な分子の描示は、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態の構造的特色の、ある特定の、一般的配置の例示を目的とする。これらの例示的な分子は、本明細書で記載される分子の、任意の構造的特色及び／又は構成要素の配置に関して、完全に規定的であることを意図するものでも、そのように見なされるべきでもないことが理解されるものとする。図１の概略図に示された、特色の相対的サイズ、位置、又は数は、簡略化されている。図１における概略図は、本明細書で記載される、任意の実施形態における分子構造の相対的サイズに関する、任意の情報を、正確に描写することを意図しない。 異なる哺乳動物種に由来する組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質を使用した、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子のＰＤ－Ｌ１結合特徴を、グラフにより示す図である。例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）を、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ；enzyme-linked immuno assay）フォーマットにおいて使用して、ヒト、カニクイザル（cynomolgus macaque）、又はマウスを起源とする組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合について試験した。ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質（１１４９６４）（ヒト由来、マカク由来、及びマウス由来のＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することが既に示されている、アテゾリズマブに存在する免疫グロブリン結合ドメインを含む）からなる対照ＰＤ－Ｌ１結合分子を、ＰＤ－Ｌ１への結合の陽性対照として使用した。プレートリーダーを使用して４５０ナノメートル（ｎｍ；nanometer）における吸光度値として検出し、バックグラウンドを減算したＥＬＩＳＡシグナルを、Ｙ軸に示している。図２～３において、「ｂｋｇ ｓｕｂ」という用語は、測定値を緩衝液だけの対照と比べて調整するために使用される「バックグラウンド減算（background subtraction）」を指す。このアッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）はいずれも、ヒトＰＤ－Ｌ１及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合したが、マウスＰＤ－Ｌ１には結合しなかった。 ヒト由来又はカニクイザル由来の組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質を使用した、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子のＰＤ－Ｌ１結合特徴を、グラフにより示す図である。例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１５７４９（配列番号１１３）、１１６１８８（配列番号１２６）、及び１１６２９７（配列番号１２８）を、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて使用して、組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合について試験した。一連のＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度にわたり試験した、１１５７４９（配列番号１１３）、１１６１８８（配列番号１２６）、及び１１６２９７（配列番号１２８）の、４５０ｎｍにおける吸光度で測定し、バックグラウンドを減算したＥＬＩＳＡシグナルを、Ｘ軸上のｎｇ／ｍＬ単位のＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度の底を１０とする対数と対比させて、Ｙ軸上にグラフ表示した。ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）、１１６１８８（配列番号１２６）、及び１１６２９７（配列番号１２８）は、各々、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質とカニクイザルＰＤ－Ｌ１タンパク質の両方に、同様の結合特徴で結合した。図３～５及び１０Ａ～１０Ｂ、１１、及び１２において使用される「結合分子」という用語は、下掲の実施例に、志賀毒素Ａサブユニット構成要素と、ＰＤ－Ｌ１ターゲティングのための抗体免疫グロブリンドメインとを含む、ＰＤ－Ｌ１結合分子として記載されている、ＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素の種類を指す。 フローサイトメトリー法を使用して決定した、ＰＤ－Ｌ１陽性ＨＣＣ１９５４細胞に対する、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）のＰＤ－Ｌ１結合特徴を、グラフにより示す図である。平均蛍光強度（ＭＦＩ；mean fluorescent intensity）として測定されるＦＩＴＣの蛍光シグナルを、マイクログラム毎ミリリットル（μｇ／ｍＬ；microgram per milliliter）単位で試験し、対数スケールでグラフ表示した、ＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度に対してプロットした。このアッセイにおいて、１１５７４９（配列番号１１３）は、ＰＤ－Ｌ１発現ＨＣＣ１９５４細胞への用量依存的結合を呈した。 ある濃度範囲にわたる例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子の、インビトロでのタンパク質合成阻害活性を、グラフにより示す図である。各試料分子について、相対発光単位（ＲＬＵ；relative luminescent unit×ｅ３）の、アッセイ時に発現される、ルシフェラーゼの発光強度を、ナノグラム毎ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ；nanogram per milliliter）単位で試験した、ＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度についての、底を１０とする対数に対してプロットした。これらの、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５９６１（配列番号１２３）は、いかなるターゲティング剤又は結合領域ともカップリングされていない、陽性「対照」分子である、志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＤＩ－ＳＬＴＡ）単独（すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）と同等な、リボソーム阻害活性を呈したが、ただし、１１５９６１（配列番号１２３）は、やや少ないタンパク質合成阻害を呈した。図５、９、及び１１において使用される「ＤＩ－ＳＬＴＡ」という用語は、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子における志賀毒素の構成要素であって、脱免疫化された志賀毒素の構成要素を指す（本明細書の実施例では、上記のように「ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１」とも称される）。「結合分子なしの陽性対照」とは、いかなるＰＤ－Ｌ１結合分子（すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）も欠いた被験試料を指す。「陰性対照（Neg. control）」という用語は、ルシフェラーゼを添加しなかったが、それでも発光シグナルが測定された試料を指す。 ヒト由来、カニクイザル由来、又はマウス由来のいずれかの、異なるＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）（図６Ａ）及び１１５７５０（配列番号１１４）（図６Ｂ）の細胞毒性活性について検討する、細胞殺滅アッセイの結果をグラフにより示す図である。各細胞型について、細胞の生存率パーセントを、それぞれの細胞に投与される、ＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度についての、底を１０とする対数に対してプロットした。このアッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）は、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１標的を発現する細胞を殺滅したが、マウスＰＤ－Ｌ１を発現する細胞は殺滅しなかった。 ～ ＰＤ－Ｌ１陽性及び／又はＰＤ－Ｌ１陰性の細胞型に対する例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子の活性について検討する、細胞殺滅アッセイの結果をグラフにより示す図である。各細胞型について、細胞の生存率パーセントを、それぞれの細胞試料に投与される、ＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度についての、底を１０とする対数に対してプロットした。ある特定の実験では、細胞ターゲティングの特異性が、ＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現について陰性である細胞株を用いる同じアッセイを使用することによって示された。ある特定の実験では、非ターゲティング型の触媒的に活性のＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１断片（１１４９５１）を、対照（実施例では「ＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ単独」とも称される）として使用した。 ～ １１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）が、４つの異なるＰＤ－Ｌ１発現細胞型、すなわち、ＨＣＣ－１９５４、ＨＣＣ－８２７、ＪＩＭＴ－１、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対しては細胞毒性を呈したが、対照細胞株である、細胞表面上でＰＤ－Ｌ１を発現しないＭＤＡ－ＭＢ－４８６に対しては細胞毒性を呈さなかったことを示す図である。非ターゲティング型のＤＩ ＳＬＴ－１Ａ単独（「１１４９５１」）は、被験濃度において比較的低い細胞毒性を呈し、高濃度においてのみ細胞毒性であった。ＰＤ－Ｌ１陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８を１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）と接触させたときに観察された細胞毒性は、非ターゲティング型の細胞毒性と符合する（図９、下掲、非ターゲティング型のＤＩ ＳＬＴ－１Ａ単独（「ＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ単独」）を参照されたい）。 １１５７４４（配列番号１０８）、１１５７４５（配列番号１０９）、１１５７４７（配列番号１１１）、１１５７４８（配列番号１１２）、１１５７４９（配列番号１１３）、１１５７５０（配列番号１１４）、１１５７５１（配列番号１１５）、１１５７５２（配列番号１１６）、１１５７５３（配列番号１１７）、１１５７５４（配列番号１１８）、１１５７５５（配列番号１１９）、１１５７５６（配列番号１２０）、及び１１５７５７（配列番号１２１）が、２つの異なるＰＤ－Ｌ１発現細胞型、すなわち、ＨＣＣ－１９５４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒトＰＤ－Ｌ１を発現させるようトランスフェクトした）に対して細胞毒性を呈したことを示す図である。 ～ １１６２９７及び１１６２９９が、４つの異なるＰＤ－Ｌ１発現細胞型、すなわち、ＨＣＣ １９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ ８２７、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対して細胞毒性を呈したことを示す図である。非ターゲティング型のＤＩ ＳＬＴ－１Ａ単独（「ＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ単独」）は、被験濃度において比較的低い細胞毒性を呈した（ＤＩ ＳＬＴ－１Ａは、高濃度においてのみ、かつ、ある特定の細胞株に対してのみ、細胞毒性であった）。ＰＤ－Ｌ１陰性細胞であるＳＫＢＲ３及びＭＣＦ－７を、１１６２９７（配列番号１２８）及び１１６２９９（配列番号１２９）のいずれかと、被験濃度で接触させたとき、測定可能な細胞毒性は観察されなかった。 例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子によるウイルス性抗原カーゴ送達に対するＴ細胞応答の細胞間エンゲージメントについて検討する実験の結果を示す図である。図１０Ａは、サイトカイン分泌の増大を結果としてもたらす、Ｔ細胞エンゲージメントと関連する結果を示す。例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子ペアを試験した。このペアにおける唯一の差異は、一方がカルボキシ末端のウイルス性抗原カーゴを含み、他方はこれを含まなかったことである。図１０Ｂは、腫瘍細胞殺滅を結果としてもたらす、細胞毒性Ｔ細胞エンゲージメントと関連する結果（ＣＤ５０）を示す。 図１０Ａは、共培養物から取られた上清のＥＬＩＳＡによって測定されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ；interferon gamma）の分泌という形態で、免疫応答の誘導をグラフにより示す。例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子ペア（１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５９６１（配列番号１２３））又は（１１５７５０（配列番号１１４）及び１１５９６２（配列番号１２４））を、一連のＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度を使用して、ＩＦＮ－γの誘導について試験した。結果としてもたらされる、４５０ｎｍにおける吸光度で測定したＩＦＮ－γレベルを、対数スケールを使用し、Ｘ軸上のｎｇ／ｍＬ単位のＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度と対比させて、Ｙ軸上にグラフ表示した。「無抗原」という語句は、被験ＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素分子が、いかなるカルボキシ末端のウイルス性ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープカーゴも含まなかった被験試料を指す（下掲の実施例では、「無抗原対照」、「対照ＰＤ－Ｌ１結合分子」、又は「マッチペア」内の対照とも称される）。「ＡＳＴ可能」なＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）は、ＣＭＶ抗原を認識するヒト細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＭＶ－ＣＴＬ）を刺激してＩＦＮ－γ分泌を駆動することができたが、「無抗原対照」タンパク質である１１５９６１（配列番号１２３）及び１１５９６２（配列番号１２４）は、著明量のＩＦＮ－γ分泌を誘導しなかった。抗原カーゴを保有するＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）又は１１５７５０（配列番号１１４）を、ＰＤ－Ｌ１発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に投与すると、ＣＭＶ－ＣＴＬの標的細胞に対する比が１：１の細胞の共培養物において、ＣＭＶ－ＣＴＬ細胞を刺激して、サイトカインＩＦＮ－γ分泌を増大させることができた。 図１０Ｂは、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５９６２（配列番号１２４）が、ＣＭＶ－ＣＴＬ細胞との共培養下の、ＰＤ－Ｌ１発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（「ＮＲ」は、細胞に核赤色染料をトランスフェクトしたことを指し示す）細胞に対して細胞毒性を呈したことをグラフにより示す。８０時間時点での細胞の対照に対する生存率パーセントを、対数スケールでグラフ表示された、投与されたＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度に対してプロットした。この共培養細胞殺滅アッセイでは、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子ペア（１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５９６１（配列番号１２３））又は（１１５７５０（配列番号１１４）及び１１５９６２（配列番号１２４））を、細胞毒性（ＣＤ５０）について試験した。「無抗原」という語句は、被験ＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素分子が、いかなるカルボキシ末端のウイルス性ＣＤ８＋ Ｔ細胞カーゴも含まなかった被験試料を指す。「ＡＳＴ可能」なＰＤ－Ｌ１結合分子は、カルボキシ末端のＣＭＶ抗原を含み、かつ、ＰＤ－Ｌ１陽性／ＨＬＡ：Ａ２陽性細胞に抗原を送達することによってヒト細胞毒性Ｔリンパ球を刺激することができるものである。 ＰＤ－Ｌ１発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＲ）細胞とＣＭＶ－ＣＴＬの１：１の比における共培養物から取られた上清のＥＬＩＳＡによって測定した、ＩＦＮ－γ分泌の形態における免疫応答の誘導を、グラフにより示す図である。例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）、１１６２９７（配列番号１２８）、１１６２９９（配列番号１２９）、１１５９６１（配列番号１２３）、及び１１６１８７（配列番号１２５）を、一連のＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度を使用して、ＩＦＮ－γの誘導について試験した。結果としてもたらされる、４５０ｎｍにおける吸光度で測定したＩＦＮ－γレベルを、対数スケールを使用し、Ｘ軸上のｎｇ／ｍＬ単位のＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度と対比させて、Ｙ軸上にグラフ表示した。「無Ａｇ対照」という語句は、被験ＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素分子が、いかなるカルボキシ末端のウイルス性抗原カーゴも含まなかった被験試料を指す（下掲の実施例では、「無抗原対照」、「無抗原」、「対照結合分子」、又は「マッチペア」内の対照とも称される）。このアッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）、１１６２９７（配列番号１２８）、及び１１６２９９（配列番号１２９）は、ＣＭＶ－ＣＴＬ細胞を刺激してＩＦＮ－γを分泌させることができたが、同じタンパク質濃度で投与された「無Ａｇ対照」タンパク質である１１５９６１（配列番号１２３）及び１１６１８７（配列番号１２５）並びに「ＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ単独」は、著明量のＩＦＮ－γ分泌を誘導しなかった。 Promega社製のPD-1/PD-L1 Blockage Bioassay実験の結果をグラフにより示す図である。ＲＬＵで測定したＴ細胞活性化を、対数スケールでグラフ表示したナノモル（ｎＭ；nanomolar）単位のＰＤ－Ｌ１結合分子又は抗体の濃度と対比させて、Ｙ軸上にプロットした。このアッセイでは、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）、１１５７５０（配列番号１１４）、及び１１５９６２（配列番号１２４）は全て、いくつかの濃度において、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用を遮断する能力を示したが、活性は、陽性対照の抗ｈＰＤ－Ｌ１－ｈＩｇＧ１モノクローナル抗体を投与した試料中よりも低かった。 ＰＤ－Ｌ１結合分子に関連する、その機能及び活性／力価（例えば、ｎｇ／ｍＬ単位のＩＣ５０、ＣＤ５０、及びＫＤ）を示す表である。 ある濃度範囲にわたる例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子の、インビトロでのタンパク質合成阻害活性を、グラフにより示す図である。各試料分子について、相対発光単位（ＲＬＵ×ｅ３）の、アッセイ時に発現される、ルシフェラーゼの発光強度を、ナノグラム毎ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）単位で試験した、ＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度についての、底を１０とする対数に対してプロットした。これらの、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１６２９７（配列番号１２８）及び１１５７４９（配列番号１１３）は、いかなるターゲティング剤又は結合領域ともカップリングされていない、陽性「対照」分子である志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＤＩ－ＳＬＴＡ）単独（すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）と同等な、リボソーム阻害活性を呈した。 結合分子の濃度と比べた、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１の結合（４５０ｎｍにおける吸光度）を示すグラフである。 ＰＤ－Ｌ１＋細胞株における、結合分子の濃度（ｎｇ／ｍＬ）と比べた、細胞生存率パーセントを示すグラフである。図１６は、１１６２９７（配列番号１２８）が１１５７４９（配列番号１１３）より大きな細胞毒性を呈しうることを示す。 図１７Ａは、トランスジェニックＣＨＯ－Ｋ１細胞によって発現されたヒト（Ｈｕ；human）及びカニクイザル（Ｃｙｎｏ；cynomolgus）のＰＤ－Ｌ１に対する１１６２９７（配列番号１２８）の結合を試験する結合アッセイの結果を示す。結合アッセイでは、対照の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体（「ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ」）であるアテゾリズマブを使用した。図１７Ｂは、細胞生存率アッセイの結果を示す。細胞生存率パーセントは、結合分子の濃度と比べてプロットされている。 臨床的に対象となる様々な腫瘍細胞株についての、細胞表面ＰＤ－Ｌ１発現レベル及び１１６２９７（配列番号１２８）のＣＤ５０値を報告する図である。 ＩＦＮ－γの存在下又は非存在下で培養された単球及びリンパ球を含んだヒトドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；peripheral blood mononuclear cell）試料を使用した、フローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。単球は、インターフェロンガンマ処置により、ＰＤ－Ｌ１の発現を高めるよう誘導された。 エクスビボでの、多様な濃度の１１６２９７（配列番号１２８）による処置後、かつＩＦＮ－γによる任意の処置後の、ＣＤ１４陽性単球（上パネル）及びリンパ球（下パネル）を含む、ＰＤ－Ｌ１陽性ヒト免疫細胞の生存率パーセントを示す図である。 図２１Ａは、未処置のままにしたか、又はＩＦＮ－γで処置した、単球又はリンパ球の集団における、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を使用して決定されたＰＤ－Ｌ１発現を示す。図２１Ｂは、未処置のままにしたか、又はＩＦＮ－γで処置した、単球又はリンパ球の集団における、力価（ＩＣ５０－ｎｇ／ｍＬ）と比べたＰＤ－Ｌ１発現を示す。 １１６２９７（配列番号１２８）又は１１６２９６（配列番号１２７）と共に既にインキュベートされたＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞（ＨＬＡ：Ａ０２陽性）を、抗原特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；cytotoxic T-lymphocyte、共培養）と接触させた、細胞毒性アッセイの結果を示す図である。 多様な細胞株における１１６２９７による、細胞毒性力価、及びインターフェロン－ガンマ分泌の誘導倍率を示すチャートである。 図２４Ａは、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の存在下又は非存在下での生存率研究の結果を示し、生存細胞（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）のパーセントが、１１６２９７の濃度（ｎｇ／ｍＬ）と比べてプロットされている。図２４Ｂは、１１６２９７の多様な濃度（ｎｇ／ｍＬ）におけるインターフェロンガンマの分泌を示す。 複数の細胞型における、表面標的であるＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ：Ａ＊０２の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して測定された発現を示す図である。 ＨＬＡ：Ａ＊０２及びＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞を、多様な濃度の１１６２９７（配列番号１２８）による処置後、抗原特異的ＣＴＬ（「ＣＭＶ－ＣＴＬ」）と共培養したモデルにおける、ＩＦＮ－γの分泌を示す図である。 多様な濃度の１１６２９７（配列番号１２８）の投与後の、抗原特異的ＣＴＬ（「ＣＭＶ－ＣＴＬ」）との共培養下における、ＨＬＡ：Ａ＊０２陽性腫瘍細胞の生存率を示す図である。 図２８Ａは、ヒト患者由来腫瘍を使用した異種移植（ＰＤＸ）動物モデルの実験プロトコールを示す概略図である。マウスに腫瘍細胞を注射する。腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３に達した後、０日目に、マウスに６ｍｇ／ｋｇの１１５７４９又は１１６２９７のいずれかを投与する。２、４、７、９、１１、２１、２３、及び２７日目に２ｍｇ／ｋｇの後続用量をマウスに与える。腫瘍体積を定期的に測定し、最終的な腫瘍の測定を２７日目に行う。図２８Ｂは、時間経過にわたる腫瘍体積を示すグラフである。図２８Ｃは、カプラン－マイヤー生存曲線である。 図２９Ａは、ヒト患者由来腫瘍を使用した異種移植（ＰＤＸ）動物モデルの実験プロトコールを示す概略図である。マウスに腫瘍細胞を注射する。腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３に達した後、０日目に、マウスに６ｍｇ／ｋｇの１１５７４９又は１１６２９７のいずれかを投与する。２、４、７、９、１１、１６、１８、２１、及び３３日目に２ｍｇ／ｋｇの後続用量、並びに１４日目に６ｍｇ／ｋｇの用量をマウスに与える。腫瘍体積を定期的に測定し、最終的な腫瘍の測定を６０日目に行う。図２９Ｂは、時間経過にわたる腫瘍体積を示すグラフである。図２９Ｃは、カプラン－マイヤー生存曲線である。 媒体対照又は１１６２９７で処置したマウスにおける、多様な接種後日数での腫瘍体積を示すグラフである。 多様な用量の１１６２９７（配列番号１２８）の投与後、１５日目及び２３日目の霊長動物における、血清中のＩ型サイトカインのレベル（インターロイキン－２（ＩＬ－２；interleukin-2）、ＩＦＮ－γ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α；tumor necrosis factor-alpha））を示すグラフである。 例えば、１１６２９７（配列番号１２８）などの、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子の潜在的な作用機構を示す概略図である。 例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）のリボソーム阻害アッセイの結果を示す図である。 例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）のＰＤ－Ｌ１標的結合アッセイの結果を示す図である。 ＰＤ－Ｌ１結合分子による処置（複数可）が、例えば、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞及びＰＤ－Ｌ１陽性免疫細胞を直接的に殺滅し、腫瘍免疫表現型の変化を結果としてもたらすことなどにより、抗腫瘍効果をいかに誘導しうるかを示す概略図である。 ＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞（ＴＣ；Tumor cell）及び免疫細胞（ＩＣ；Immune cell）の枯渇のために設計された細胞毒性融合タンパク質である、１１６２９７の構造及び活性を示す概略図である。１１６２９７は、脱免疫化志賀様毒素Ａと、ＣＭＶ拘束性ペプチド抗原とを細胞に送達する。１１６２９７は、Ｔ細胞及び免疫細胞の表面上のＰＤ－Ｌ１に対する特異的ターゲティングドメインを含む。１１６２９７は、細胞内のリボソームに経路決定され、ＤＩ ＳＬＴＡにより媒介される、その酵素的かつ不可逆的な不活化を介して、細胞殺滅を媒介する。非自己抗原性ペプチドを送達することにより、１１６２９７は、腫瘍に対するＣＭＶ反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を動員することができる。１１６２９７は、現在のモノクローナル抗体療法では達成できない独自の二重作用機構を有し、Ｔ細胞と免疫細胞の両方を直接枯渇させる。ＰＤ－Ｌ１＋ ＴＣとは、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞を指し、ＰＤ－Ｌ１＋ ＩＣとは、ＰＤ－Ｌ１発現免疫細胞を指す。 １１６２９７が、顕著に異なる作用方式を介して、ＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞（ＴＣ）をターゲティングして枯渇させることを示す図である。図３７Ａは、１１６２９７について測定された、あるＰＤ－Ｌ１発現レベル範囲にわたる、肺、皮膚、乳房、及び卵巣の腫瘍細胞株に対する、細胞毒性力価（ＣＤ５０）の範囲を示すグラフである。図３７Ｂは、免疫組織化学（２２Ｃ３）を使用して決定し、ＴＣ０～３（下パネル）として強度を評定した、表面ＰＤ－Ｌ１発現を示す。図３７Ｃは、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と共培養され、１１６２９７又は対照結合分子で処置された、ＰＤ－Ｌ１又はＨＬＡ：Ａ０２のいずれかを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の、細胞生存率パーセントを示す。「無Ａｇ結合分子対照」という語句は、被験ＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素分子が、いかなるカルボキシ末端のウイルス性抗原カーゴも含まなかった被験試料を指す。「不活性結合分子対照」とは、酵素的に不活性の志賀毒素サブユニットＡエフェクターを含むＰＤ－Ｌ１結合分子を指す。「ＣＴＬなし」とは、細胞毒性Ｔリンパ球が添加されなかった試料を指し、「ＣＴＬ」とは、細胞毒性Ｔリンパ球が添加された試料を指す。図３７Ｄは、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と共培養された、ＰＤ－Ｌ１又はＨＬＡ：Ａ０２のいずれかを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における、インターフェロンガンマの分泌を示す。 １１６２９７がインビボでＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍を制御することを示す図である。１１６２９７による処置後の、トリプルネガティブ乳がん株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図３８Ａ）及びＰＤＸ２（図３８Ｂ）を含む、多様なヒト腫瘍細胞株を移植した免疫不全マウスにおける、腫瘍体積の増加が示されている。図３８Ａ～３８Ｂにおいて、アステリスクは、統計学的有意性を指し示す。図３８Ｃは、非小細胞肺がん細胞（ＰＤＸ２ｂ）を移植し、１１６２９７で処置した免疫不全マウスにおける、腫瘍体積（０日目に対するパーセントとして）を示すグラフである。「触媒的に不活性のＳＬＴＡ不活性バリアントを含む結合分子」とは、酵素的に不活性の志賀毒素サブユニットＡエフェクターを含むＰＤ－Ｌ１結合分子を指す。図３８Ｄは、多様な細胞型のモデル及び有効性エンドポイントをまとめた表である。 図３９Ａは、代表的なＰＤ－Ｌ１高（ＨＣＣ１９５４）腫瘍、ＰＤ－Ｌ１中／高（mid/hi）（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）腫瘍、及びＰＤ－Ｌ１陰性（neg）（ＭＣＦ７）腫瘍、並びに、未処置か、又はＰＤ－Ｌ１発現を誘導するようＩＦＮ－γで処置された、単離されたヒトＣＤ１４陽性単球における、多様な用量の１１６２９７での処置後の細胞生存率を例示するグラフである。図３９Ｂは、力価（ＣＤ５０、ｎｇ／ｍＬ）と、代表的なＰＤ－Ｌ１高（ＨＣＣ１９５４）腫瘍細胞、ＰＤ－Ｌ１中／高（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）腫瘍細胞、及びＰＤ－Ｌ１陰性（ＭＣＦ７）腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１表面分子との相関を示すグラフである。 図４０Ａは、１１６２９７の薬物動態及び血清半減期を示す。図４０Ｂは、１１６２９７のインビトロでの力価及び受容体占有をＣＭＡＸと対比させて示すグラフである。 図４１Ａは、非ヒト霊長動物研究での投与レジメンを示す概略図である。図４１Ｂは、非ヒト霊長動物における末梢単球レベルを、ベースラインに対するパーセントとして示す。単球の枯渇は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び好酸球の拡大に先行し、これらは、１５日目に末梢性拡大し、研究のエンドポイントまで持続した。「不活性バリアント」とは、酵素的に不活性の志賀毒素サブユニットＡエフェクターを含むＰＤ－Ｌ１結合分子を指す。図４１Ｃは、非ヒト霊長動物における末梢Ｔリンパ球レベルを、ベースラインに対するパーセントとして示す。図４１Ｄは、非ヒト霊長動物における２つの独立した研究での血清サイトカイン応答の分析である。データは、研究１（非ヒト霊長動物（ＮＨＰ；non-human primate）のｎ＝２）及び研究２（１１６２９７群ではＮＨＰのｎ＝８、不活性バリアント群ではｎ＝５）についての、レスポンダーのパーセントとして表示されている。データは、研究中の３回目の投与後のあらゆる時点におけるサイトカインの誘導を反映している。 図４２Ａは、ＮＨＰにおける、１１６２９７を用いた、ＰＤ－Ｌ１発現細胞の直接的な細胞殺滅と、ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の物理的阻害（「遮断」）とをプロファイリングする、概略図である。図４２Ｂは、ＮＨＰ研究において観察された免疫効果及び薬力学応答をまとめるチャートである。 ＨＣＣ １９５４細胞（図４３Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図４３Ｂ）における、異なるＰＤ－Ｌ１結合分子（１１６２９７、１１５７４９、１１５７６５、及び１１４９８５）の比較のためのインビトロデータを示す図である。 異なるＰＤ－Ｌ１結合分子（１６２９７、１１６５５５、１１５７４９、１１５７６５、及び１１５６９５）の比較のためのインビボデータを示す図である。 標的細胞をＰＤ－Ｌ１結合分子で４時間（短期）又は２４時間（長期）にわたって処置した実験の結果を示す図である。ＰＤ－Ｌ１結合分子をウォッシュアウトした後、細胞をＣＴＬと接触させ、ＩＦＮ－γ産生（図４５Ａ）及び細胞毒性（図４５Ｂ）を測定した。 ドナー患者から単離された単球（ＩＣ）、又は腫瘍細胞（ＨＣＣ１９５４）を、２０μｇ／ｍＬ（図４６Ａ）又は２μｇ／ｍＬ（図４６Ｂ）のいずれかの多様なＰＤ－Ｌ１ターゲティング分子で処置した実験の結果を示す図である。細胞殺滅は、標準的なCell Titer Gloアッセイを使用して測定した。
本明細書の以下では、例示的で、非限定的な実施形態、及び添付の図の参照を使用して、本発明について、より完全に記載される。しかし、本発明は、多くの異なる形態で実施される可能性があり、下記に明示される、実施形態のセットに限定されると見なされるべきではない。そうではなくて、これらの実施形態は、本開示が、完全なものであり、本発明の範囲を、当業者に伝達するように提示される。
本発明が、より容易に理解されうるために、特定の用語を以下に定義する。さらなる定義は、本発明の詳細な説明の中で見出されうる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、「ある（a）」、「ある（an）」、及び「その」という用語は、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、２つの分子種である、Ａ及びＢに言及する場合に使用される、「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢのうちの少なくとも１つを意味する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、Ａ、Ｂ、及びＣなど、３つ以上の種に言及する場合に使用される、「及び／又は」という用語は、Ａ、Ｂ、若しくはＣのうちの少なくとも１つ、又はＡ、Ｂ、若しくはＣの任意の組合せのうちの少なくとも１つ（各分子種は、単数又は複数である可能性がある）を意味する。
「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに組み込まれたアミノ酸への言及を含む。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸又はアミノ酸残基の、任意のポリマーを含む。「ポリペプチド配列」という用語は、ポリペプチドを、物理的に構成する、一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。「タンパク質」とは、１つ又は２つ以上の、ポリペプチド又はポリペプチド「鎖」を含む高分子である。「ペプチド」とは、合計約１５～２０アミノ酸残基未満のサイズの、小型のポリペプチドである。「アミノ酸配列」という用語は、長さに応じて、ペプチド又はポリペプチドを、物理的に構成する、一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で開示されるポリペプチド配列及びタンパク質配列は、左から右へと書かれ、それらの、アミノ末端からカルボキシ末端への順序を表す。
「アミノ酸」、「アミノ酸残基」、「アミノ酸配列」、又はポリペプチド配列という用語は、天然に存在するアミノ酸（Ｌ立体異性体及びＤ立体異性体を含む）を含み、そうでないことが指し示されない限りにおいて、また、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ガンマ－カルボキシグルタミン酸、ヒドロキシプロリンヒプシン、ピログルタミン酸、及びセレノメチオニンなど、天然に存在するアミノ酸と同様に機能しうる、天然アミノ酸の、公知のアナログも含む。本明細書で言及されるアミノ酸は、以下の表１の略記法により記載される。
Figure 2022548078000001
ペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子のアミノ酸残基に関する、「保存的置換」という語句は、ペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子の、アミノ酸組成の変更であって、ペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子全体の機能及び構造を、実質的に変化させない変更（Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (2nd ed., 1992))を参照されたい）を指す。
ポリペプチド又はポリペプチド領域に言及する場合の、「～に由来する」という語句は、ポリペプチド又はポリペプチド領域が、「親」タンパク質内に元来見出されるアミノ酸配列と、「親」分子の、ある特定の機能（複数可）及び構造（複数可）が、実質的に保存される限りにおいて、元のポリペプチド又はポリペプチド領域と比べた、ある特定のアミノ酸残基の付加、欠失、切断、再配列、又は他の変化を、今後において含みうるアミノ酸配列とを含むことを意味する。当業者は、当技術分野で公知の技法、例えば、タンパク質配列アライメントソフトウェアを使用して、ポリペプチド又はポリペプチド領域が由来した親分子を同定することが可能であろう。
本明細書で使用される、「同等である」という用語は、類似を意味する。「同等である」が、特定の値（例えば、結合アフィニティー）を指す場合、この用語は、互いの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、若しくは約２５％、又は約２５％以上である値以内を包含しうる。
本明細書で使用される、「抗体」という用語は、免疫グロブリンタンパク質を指し、それらが所望の抗原結合活性を呈する限りにおいて、抗原結合能を有する最も広い抗体フォーマット、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、又は抗原結合性抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ断片）を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む多様なタンパク質構造などを包含する。
本明細書で使用される、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する分子を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むがこれらに限定されない。抗体断片は、本明細書で記載される、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化のほか、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（E. coli）又はファージ）による作製を含むがこれらに限定されない、多様な技法によって製造することができる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗体又は抗体断片は、単一ドメイン抗体断片、単鎖可変断片（single-chain variable fragment）、抗体可変断片、Ｆｄ断片、抗原結合性断片（Ｆａｂ；antigen-binding fragment）、自律性ＶＨドメイン、単一ドメイン免疫グロブリン由来領域ＶＨＨ、ラクダ科動物ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片に由来する重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ；immunoglobulin new antigen receptor）、ＶＮＡＲ断片、ジスルフィド安定化抗体可変（Ｆｖ；antibody variable）断片、アルマジロリピートポリペプチド、フィブロネクチン由来１０型フィブロネクチンIIIドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａ－ドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ－Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、Ｃ型レクチン様ドメイン足場等である。
一部の実施形態では、抗体又は抗体断片は、多価抗体である。例えば、抗体又は抗体断片は、多量体化ｓｃＦｖ断片、例えばダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、二特異性タンデムｓｃＦｖ断片、二特異性タンデムＶＨＨ断片、二特異性ミニボディー、又は二価ミニボディーでありうる。
本明細書で使用される、「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する一方で、重鎖及び／又は軽鎖の残りが、異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
本明細書で使用される、「ヒト化抗体」は、非ヒト供給源に由来する、抗原結合性（例えばＣＤＲ）に関与するアミノ酸配列及び／又は残基を持つものであり、この場合、１つ又は２つ以上の他のアミノ酸配列は、ヒト供給源（例えば、フレームワーク配列）に由来する。
本明細書で使用される、「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により作製される、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合性残基（例えばＣＤＲ）を含むヒト化抗体を具体的に排除する。ヒト単一ドメイン抗体は、ヒト重鎖又はヒト軽鎖のみを含むものであるが、ＣＤＲ配列は、天然に存在する場合も、合成の場合もある（例えば、米国特許第６，２４８，５１６号明細書を参照されたい）。
本明細書で使用される、「ラクダ化抗体」は、非ラクダ科動物供給源に由来するアミノ酸配列を持ち、２つの重鎖を含み、軽鎖を含まず、ラクダ科動物供給源又は種に由来するヒンジ領域を含むものである。
本明細書で使用される、「毒素」、「毒素剤」、「毒素構成要素」、又は「細胞毒素」という用語は、細胞機能を阻害若しくは防止し、及び／又は組織損傷を含む細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。結合分子又は抗体毒素コンジュゲートの毒素構成要素は、前述のいずれかに由来する天然毒素、生物毒素、タンパク質性毒素、毒液、細胞毒素、低分子毒素、及び合成毒物、例えばＡＢｘ毒素、リボソーム不活性化タンパク質毒素、アブリン、炭疽毒素、Ａｓｐｆ１、ボウガニン（bouganin）、ブリオディン（bryodin）、コリックス毒素、クローディン、ジフテリア毒素、ゲロニン、熱不安定性エンテロトキシン、ミトギリン、百日咳毒素、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、プルケリン（pulchellin）、シュードモナス外毒素Ａ、レストリクトシン、リシン（ricin）、サポリン、サルシン、志賀毒素、及びスブチラーゼ細胞毒素など；並びに本明細書で記載される、又は当業者に公知の多様な毒素剤を含みうるがこれらに限定されない。
本開示の目的では、かつ、志賀毒素ポリペプチド配列又は志賀毒素由来ポリペプチドに関して、「野生型」という用語は、一般に、例えば、病原性細菌など、生存種において見出される、天然に存在する志賀毒素タンパク質配列（複数可）を指し、この場合、この志賀毒素タンパク質配列（複数可）は、最も高頻度で生じるバリアントのうちの１つである。これは、少なくとも１つの志賀毒素タンパク質バリアントを含む種の、統計学的検出力のある数の天然に存在する生物個体をサンプリングする場合に、なおも天然に存在するものの所与の種の生物個体のうちの１パーセント未満において見出される低頻度で存在する志賀毒素タンパク質配列と対照的である。その天然環境の外部における、天然単離物のクローン拡大（単離物が、生物であるのか、生物学的配列情報を含む分子であるのかに関わらない）は、クローン拡大が、この種の天然に存在する集団内に存在しない、新たな配列の変動を導入しない、及び／又は互いに対する、配列バリアントの相対的比率を変更しない限りにおいて、天然存在要件を変化させない。
「会合した」、「～を会合させること」、「連結された」、又は「～を連結すること」という用語は、分子の、２つ又は３つ以上構成要素が、つながれるか、接合されるか、接続されるか、若しくは他の形でカップリングされて、単一の分子を形成する状態、又は２つ分子の間の、会合、連結、接合、及び／若しくは他の任意の接続を創出することにより、２つ分子を、互いと会合させて、単一の分子を形成する作用を指す。例えば、「連結された」という用語は、単一の分子が、形成されるように、１つ又は２つ以上の原子間相互作用により会合した２つ又は３つ以上構成要素を指す場合があり、この場合、原子間相互作用は、共有結合的でありうる、及び／又は非共有結合的でありうる。２つの構成要素の間の共有結合的会合の非限定例は、ペプチド結合及びシステイン間のジスルフィド結合を含む。２つの分子構成要素の間の非共有結合的会合の非限定例は、イオン結合を含む。
「連結された」という用語は、単一の分子が形成されるように、１つ又は２つ以上の原子間相互作用により会合させた２つ又は３つ以上の分子構成要素を指し、この場合、原子間相互作用は、少なくとも１つの共有結合を含む。「～を連結すること」という用語は、上記で記載した通り、連結された分子を創出する作用を指す。
本明細書における「リンカー」によって、ｓｃＦｖ並びに／又は他のタンパク質及びタンパク質融合構造において使用されるものなど、２つのタンパク質ドメインを一体につなぐドメインリンカーが意味される。例えば、「結合領域リンカー」は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを結合領域と連結するのに使用される場合があり、「ｓｃＦｖリンカー」は、ｓｃＦｖ内のＶＨとＶＬとを連結するのに使用されうる。「切断性スペーサー」は、１つ又は２つ以上のプロテアーゼについての切断部位を含有するリンカーの種類である。一般に、各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さ及び可撓性を伴う、２つのドメインの組換え接合を可能とする組換え技法により産生される、従来のペプチド結合を含む、使用できる多数の適切なリンカーがある。一部の実施形態では、リンカーペプチドは、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒを主に含みうる。リンカーペプチドは、２つの分子が互いに対して正しいコンフォメーションをとり、それにより、これらが所望の活性を保持するような形で、これらを連結するのに十分な長さを有するべきである。一部の実施形態では、リンカーは、約１～約５０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約１～約３０アミノ酸長である。一実施形態では、１～２０アミノ酸長のリンカーを使用することができ、一部の実施形態では、約５～約１０アミノ酸が用いられる。有用なリンカーは、例えば（ＧＳ）ｎ（配列番号２０１）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０３）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０４）［ここで、ｎは、少なくとも１（一般に３～４）である整数である］を含むグリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、並びに他の可動性リンカーを含む。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない、様々な非タンパク質性ポリマーをリンカーとして用いることができる。他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基ではなく、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの任意の配列、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５～１２アミノ酸残基を含みうる。リンカーはまた、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣκ又はＣλに由来しうる。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む、任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来しうる。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、及び他のタンパク質からの他の天然配列など、他のタンパク質に由来しうる。任意の適切なリンカーを使用することができるものの、一部の実施形態は、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号２０１）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０３）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０４）［ここで、ｎは、少なくとも１（一般に２～３から、４～５）である整数である］を含む、グリシン－セリンポリマーを利用する。「ｓｃＦｖリンカー」は、一般に、これらのグリシン－セリンポリマーを含む。
「融合された」という用語は、ペプチド結合が、カルボン酸基の炭素原子の参与を伴うのか、例えば、α炭素、β炭素、γ炭素、σ炭素など、別の炭素原子を伴うのかに関わらず、ペプチド結合である、少なくとも１つの共有結合により会合した２つ又は３つ以上のタンパク質性構成要素を指す。一体に融合された、２つのタンパク質性構成要素の非限定例は、例えば、結果として得られる分子が、単一の、連続ポリペプチドであるように、ペプチド結合を介して、ポリペプチドに融合したアミノ酸、ペプチド、又はポリペプチドを含む。「～を融合させること」という用語は、例えば、翻訳されると、単一のタンパク質性分子を産生する、遺伝子領域の組換え融合から作出される融合タンパク質など、上記で記載した融合分子を創出する作用を指す。
「：：」という記号は、その前後のポリペプチド領域が、連続ポリペプチドを形成するように、物理的に、一体に連結されていることを意味する。
本明細書で使用される、「発現された」、「～を発現すること」、又は「～を発現する」という用語、及びこれらの文法的変化形は、ポリヌクレオチド又は核酸の、タンパク質への翻訳を指す。発現されたタンパク質は、細胞内にとどまる場合もあり、細胞表面膜の構成要素となる場合もあり、細胞外腔に分泌される場合もある。
本明細書で使用された、少なくとも１つの細胞表面において、著明量の細胞外標的生体分子を発現する細胞は、「標的陽性細胞」、「標的＋細胞」、又は「陽性細胞」であり、指定の細胞外標的生体分子と、物理的にカップリングされた細胞である。
本明細書で使用される、「α」という記号は、記号に後続する生体分子に結合することが可能な、免疫グロブリン型結合領域の略記である。「α」という記号は、記号に後続する生体分子に、１０－５以下の解離定数（ＫＤ；dissociation constant）により記載される結合アフィニティーで結合するその能力に基づく、免疫グロブリン型結合領域の機能的特徴を指すように使用される。
本明細書で使用される、「重鎖可変（ＶＨ）ドメイン」又は「軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン」という用語は、それぞれ、対応する天然抗体の、少なくとも定性的抗原結合能を保持する、任意の抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメイン（例えば、ヒトＶＨドメイン又はヒトＶＬドメイン）のほか、これらの任意の派生物（例えば、天然のマウスＶＨドメイン又はマウスＶＬドメインに由来するヒト化ＶＨドメイン又はヒト化ＶＬドメイン）を指す。ＶＨドメイン又はＶＬドメインは、３つのＣＤＲ又は抗原結合領域（ＡＢＲ；antigen-binding region）により中断された、「フレームワーク」領域からなる。本明細書で使用される、「フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、超可変領域（ＨＶＲ；hypervariable region）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中に以下の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４として出現する。フレームワーク領域は、抗原のエピトープに特異的に結合するように、ＣＤＲ又はＡＢＲを位置合せするのに用いられる。アミノ末端からカルボキシ末端の順に、ＶＨ及びＶＬドメインのいずれも、以下のフレームワーク（ＦＲ；framework）と、ＣＤＲ領域又はＡＢＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４；又は、同様に、ＦＲ１、ＡＢＲ１、ＦＲ２、ＡＢＲ２、ＦＲ３、ＡＢＲ３、及びＦＲ４を含む。本明細書で使用される、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、又は「ＨＣＤＲ３」という用語は、それぞれ、ＶＨドメイン内の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３を指すのに使用され、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、それぞれ、ＶＬドメイン内の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３を指すように使用される。本明細書で使用される、「ＨＡＢＲ１」、「ＨＡＢＲ２」、又は「ＨＡＢＲ３」という用語は、それぞれ、ＶＨドメイン内の、ＡＢＲ１、ＡＢＲ２、又はＡＢＲ３を指すのに使用され、「ＬＡＢＲ１」、「ＬＡＢＲ２」、又は「ＬＡＢＲ３」という用語は、それぞれ、ＶＬドメイン内の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３を指すように使用される。ラクダ科動物のＶＨＨ断片、軟骨魚類のＩｇＮＡＲである、ＶＮＡＲ断片、ある特定の単一ドメイン抗体、及びこれらの派生物については、同じ基本配置：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む、単一の重鎖可変ドメインが存在する。本明細書で使用される、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、又は「ＨＣＤＲ３」という用語は、単一の重鎖可変ドメイン内の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のそれぞれを指すのに使用されうる。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。
「エフェクター」という用語は、アロステリック効果（複数可）、及び／又は１つ若しくは２つ以上の因子の動員を結果としてもたらす、細胞毒性、生物学的シグナル伝達、酵素的触媒、細胞内経路決定、及び／又は分子間結合などの生物学的活性をもたらすことを意味する。
「志賀毒素エフェクターポリペプチド」、「志賀毒素エフェクターポリペプチド領域」、及び「志賀毒素エフェクター領域」という語句は、少なくとも１つの志賀毒素ファミリーのメンバーの志賀毒素Ａサブユニットに由来する、ポリペプチド又はポリペプチド領域を指し、この場合、ポリペプチド又はポリペプチド領域は、少なくとも１つの志賀毒素機能を呈することが可能である。例えば、配列番号４０～６８は、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａに由来する。
本明細書で記載される、志賀毒素のエフェクター機能は、志賀毒素Ａサブユニットに由来するポリペプチド領域により付与される生物学的活性である。志賀毒素エフェクター機能の非限定例は、細胞への侵入の促進；脂質膜の変形；細胞への内部化の促進；クラスリン媒介性エンドサイトーシスの刺激；細胞内経路決定を、例えば、ゴルジ体、小胞体、及び細胞質ゾルなど、多様な細胞内区画へ方向付けること；細胞内経路決定を、カーゴにより方向付けること；リボソーム機能（複数可）の阻害；例えば、Ｎ－グリコシダーゼ活性などの触媒活性、及びリボソームの触媒性阻害；タンパク質合成の低減、カスパーゼ活性の誘導、エフェクターであるカスパーゼの活性化、細胞増殖抑制性効果の招来、及び細胞毒性を含む。志賀毒素触媒活性は、例えば、リボソームの不活化、タンパク質合成の阻害、Ｎ－グリコシダーゼ活性、ポリヌクレオチド：アデノシングリコシダーゼ活性、ＲＮアーゼ活性、及びＤＮアーゼ活性を含む。志賀毒素は、リボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）である。ＲＩＰは、核酸、ポリヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ｒＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｍＲＮＡ（及びポリＡ）、及びウイルス性核酸を脱プリン化させうる（例えば、Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997); Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999); Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9 (2000); Brigotti M et al., Toxicon 39: 341-8 (2001); Brigotti M et al., FASEB J 16: 365-72 (2002); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Picard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005)を参照されたい）。一部のＲＩＰは、抗ウイルス活性及びスーパーオキシドジスムターゼ活性を示す（Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)）。志賀毒素触媒活性は、インビトロ及びインビボのいずれにおいても観察されている。志賀毒素エフェクター活性についてのアッセイの非限定例は、例えば、タンパク質合成の阻害活性、脱プリン化活性、細胞増殖の阻害、細胞毒性、スーパーコイルドＤＮＡに対する弛緩活性、及びヌクレアーゼ活性など、多様な活性を測定する。
「ＩＣ５０」又は「ＩＣ５０」という用語は、本明細書において、インビトロリボソーム機能アッセイを使用して測定される場合の５０％阻害濃度を指すために使用される。「ＣＤ５０」又は「ＣＤ５０」という用語は、本明細書において、インビトロ細胞殺滅及び／又は生存アッセイにおける５０％細胞毒性濃度を指すために使用される。「ＥＣ５０」又は「ＥＣ５０」という用語は、本明細書において、５０％応答（例えば、シグナル伝達の阻害）を与える濃度を指すために使用される。文書化された場合、当業者は、これらの用語の各々の意味をたやすく理解するであろう。ＩＣ５０、ＣＤ５０、及びＥＣ５０の各々は、異なる分子濃度又は濃度系列を使用して、複数のデータ点を産生することにより測定されうる。一部の試料について、正確な曲線の当てはめに要求されるデータ点を収集できないために、ＩＣ５０又はＣＤ５０についての正確な値は、得られない場合がある。例えば、理論的に、所与の試料についての濃度系列中で、それぞれ、５０％を超えるリボソームの阻害又は細胞死が生じない場合、ＩＣ５０もＣＤ５０も決定されえない。曲線を正確に当てはめるのに不十分なデータは、実際の分子活性を表すものとして考えられるべきではない。
本明細書で使用される、志賀毒素エフェクター機能の保持とは、適切な定量的アッセイにより、再現可能に測定される通り、同じ条件下で、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド対照（例えば、志賀毒素Ａ１断片）、又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、志賀毒素Ａ１断片）を含むＰＤ－Ｌ１結合分子と同等なレベルの志賀毒素機能活性を呈することが可能であることを指す。志賀毒素の、リボソーム不活化又はリボソーム阻害のエフェクター機能について、志賀毒素エフェクター機能の保持とは、例えば、当業者に公知のアッセイ、及び／又は本明細書で記載されているアッセイを使用することなどにより、インビトロ状況において、１０，０００ｐＭ以下のＩＣ５０を呈することである。標的陽性細胞殺滅アッセイにおける、志賀毒素の、細胞毒性のエフェクター機能について、志賀毒素エフェクター機能の保持とは、例えば、当業者に公知のアッセイ、及び／又は本明細書で記載されているアッセイを使用することにより示される通り、細胞型、及びそれによる、適切な細胞外標的生体分子の発現に応じて、１，０００ｎＭ以下のＣＤ５０を呈することである。
本明細書で使用される、リボソームの阻害に関する「同等な」という用語は、実験により測定される、リボソーム阻害活性のレベルであって、適切な定量的アッセイにより、再現可能性を伴って測定され、同じ条件下で、参照分子（例えば、第２のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は第３のＰＤ－Ｌ１結合分子など）の活性から、再現可能に、１０％以内にあるレベルを意味する。
本明細書で使用される、細胞毒性に関する「同等な」という用語は、実験により測定される、細胞毒性のレベルであって、適切な定量的アッセイにより、再現可能性を伴って測定され、同じ条件下で、参照分子（例えば、第２のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は第３の結合分子）の活性から、再現可能に、１０％以内にあるレベルを意味する。
細胞毒性に関して、本明細書で使用される、「弱毒化された」という用語は、分子が、同じ条件下で、参照分子により呈されるＣＤ５０の、１０倍～１００倍の間のＣＤ５０を呈するか、又は呈したことを意味する。
志賀毒素のエフェクター機能活性のレベルを決定する場合、不正確なＩＣ５０及びＣＤ５０値が考えられるべきではない。一部の試料について、正確な曲線の当てはめに要求されるデータ点を収集できないために、ＩＣ５０又はＣＤ５０についての正確な値は、得られない場合がある。例えば、理論的に、所与の試料についての濃度系列中で、それぞれ、５０％を超えるリボソームの阻害又は細胞死が生じない場合、ＩＣ５０もＣＤ５０も決定されえない。例えば、下記の実施例において記載されるアッセイなど、例示的な志賀毒素のエフェクター機能アッセイからのデータについての解析において記載される通り、曲線を正確に当てはめるのに不十分なデータは、実際の志賀毒素のエフェクター機能を表すものとして考えられるべきではない。
志賀毒素のエフェクター機能の活性が検出できないことは、細胞への侵入、細胞内経路決定、及び／又は酵素活性の欠如ではなく、発現、ポリペプチドフォールディング、及び／又はタンパク質安定性の不適正のためでありうる。志賀毒素エフェクター機能についてのアッセイは、著明量の志賀毒素のエフェクター機能活性を測定するのに、多量の、ポリペプチドを要求しない場合がある。低エフェクター機能又はエフェクター機能の消失の根底をなす原因が、実験により、タンパク質の発現又は安定性と関連することが決定される程度において、当業者は、志賀毒素の機能的エフェクター活性が、回復され、測定されうるように、当技術分野で公知のタンパク質化学法及び分子改変法を使用して、このような因子を補償することが可能でありうる。例として述べると、細胞ベースの、不適正な発現は、異なる発現制御配列を使用することにより補償される場合があり；ポリペプチドフォールディング及び／又は安定性の不適正は、末端の配列の安定化、又は分子の三次元構造を安定化させる、非エフェクター領域内の補償変異から利益を得る場合がある。
ある特定の志賀毒素エフェクター機能、例えば、細胞内経路決定機能は、容易に測定可能ではない。例えば、細胞内経路決定の不適正のために、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、細胞毒性でない、及び／又は異種エピトープを送達しないのかどうかを識別する、規定の定量的アッセイは存在しないが、試験が利用可能な場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、適切な野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較した、任意の著明レベルの細胞内経路決定について解析されうる。しかし、結合分子の、志賀毒素エフェクターポリペプチドの構成要素が、野生型志賀毒素Ａサブユニットコンストラクトと同等（comparable又はequivalent）細胞毒性を呈する場合、細胞内経路決定活性レベルは、少なくとも、被験条件下では、野生型志賀毒素Ａサブユニットコンストラクトの細胞内経路決定活性レベルと、それぞれ、同等（comparable又はequivalent）であると推定される。
個々の志賀毒素機能のための、新たなアッセイが利用可能な場合、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び／又は志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む結合分子は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドの活性の、１０００倍若しくは１００倍以内にあるか、又は機能的ノックアウト志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して、３倍～３０倍、若しくは３０倍以上の活性を呈する志賀毒素エフェクター機能など、これらの志賀毒素エフェクター機能の任意のレベルについて解析されうる。
十分な細胞内経路決定も、例えば、Ｔ細胞エピトープの提示に基づく細胞毒性アッセイ、又は細胞質ゾル及び／若しくは小胞体に局在化する標的基質を伴う毒素エフェクター機能に基づく細胞毒性アッセイなどの細胞毒性アッセイにおいて、分子の細胞毒性活性レベルを観察することにより推定されうるにとどまる。
本明細書で使用される、「著明」な志賀毒素エフェクター機能の保持とは、適切な定量的アッセイにより、再現可能に測定される通り、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド対照（例えば、志賀毒素Ａ１断片）と同等なレベルの志賀毒素機能活性を指す。インビトロにおけるリボソームの阻害について、著明な志賀毒素のエフェクター機能は、アッセイにおいて使用されるリボソームの供給源（例えば、細菌供給源、古細菌供給源、又は真核生物（藻類、真菌、植物、又は動物）供給源）に応じて、３００ｐＭ以下のＩＣ５０を呈することである。これは、触媒的に破壊された、ＳＬＴ－１Ａ １～２５１二重変異体（Ｙ７７Ｓ／Ｅ１６７Ｄ）についての、約１００，０００ｐＭのＩＣ５０と比較して、著明に大きな阻害である。実験室の細胞培養物中の、標的陽性細胞殺滅アッセイにおける細胞毒性について、著明な志賀毒素のエフェクター機能は、結合領域の標的生体分子（複数可）及び細胞型、特に、この細胞型による、査定される分子によりターゲティングされる、適切な細胞外標的生体分子（複数可）及び／又は細胞外エピトープ（複数可）の発現及び／又は細胞表面表示に応じて、１００、５０、３０ｎＭ、又は３０ｎＭ以下のＣＤ５０を呈することである。これは、細胞株に応じて、１００～１０，０００ｎＭのＣＤ５０を有する、細胞をターゲティングする結合領域を伴わない、志賀毒素Ａサブユニット単独（又は野生型志賀毒素Ａ１断片）と比較して、適切な標的陽性細胞集団に対する、著明に大きな細胞毒性である。
本開示の目的では、かつ、本明細書で記載される分子の志賀毒素エフェクター機能に関して、「妥当な活性」という用語は、天然に存在する志賀毒素を含む分子に関して、本明細書で規定される、少なくとも中程度のレベル（例えば、１１倍～１，０００倍以内）の志賀毒素エフェクター活性を呈することを指し、この場合、志賀毒素エフェクター活性は、内部化の効率、細胞質ゾルへの細胞内経路決定の効率、標的細胞（複数可）による、送達されたエピトープの提示、リボソームの阻害、及び細胞毒性からなる群から選択される。細胞毒性について、志賀毒素エフェクター活性の妥当なレベルは、例えば、野生型志賀毒素コンストラクトが、０．５ｎＭ（例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む結合分子）のＣＤ５０を呈する場合に、５００ｎＭ以下のＣＤ５０を呈することなど、野生型の志賀毒素コンストラクトの１，０００倍以内であることを含む。
本開示の目的では、かつ、本明細書で記載される分子の細胞毒性に関して、「最適の」という用語は、野生型志賀毒素Ａ１断片（例えば、志賀毒素Ａサブユニット、又はある特定の、切断された、そのバリアント）及び／又は天然に存在する志賀毒素を含む分子の細胞毒性の、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍以内のレベルの、志賀毒素触媒性ドメインに媒介された細胞毒性を指す。
志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性が、野生型志賀毒素Ａサブユニット又はその断片と比べて、低減される場合であってもなお、効力が最高度であるバリアントは、細胞毒性力価低減バリアントにおいて最小化又は低減される、所望されない効果を呈しうるため、実際は、弱毒化志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用する適用も、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドの使用と同等以上に有効でありうることに注意されたい。野生型志賀毒素は、極めて強力であり、わずか１つの毒素分子が、中毒細胞の細胞質ゾルに達した後、又は、おそらく、わずか４０個の毒素分子が、中毒細胞に内部化された後に、中毒細胞を殺滅することが可能である。例えば、細胞内経路決定又は細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能が、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して、大幅に低減された志賀毒素エフェクターポリペプチドであってもなお、例えば、ターゲティング型細胞殺滅、異種エピトープの送達、並びに／又は特異的細胞及びそれらの細胞内区画の検出を伴う適用など、実際の適用に十分に、やはり強力でありうる。加えて、ある特定の活性低減型志賀毒素エフェクターポリペプチドは、カーゴ（例えば、さらなる外因性素材又はＴ細胞エピトープ）を、標的細胞の、ある特定の細胞内位置又は細胞内区画へ送達するために、特に有用でありうる。
本明細書で使用される、「抗体エフェクター機能」という語句は、抗体アイソタイプに応じて変動する、抗体のＦｃ領域又はその派生物に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑへの結合及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ；complement dependent cytotoxicity）；Ｆｃ受容体への結合（新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ；neonatal Fc receptor）又はブラムベル（Brambell）受容体を含む）、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ；antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）；食作用；細胞表面受容体（例えば、ＰＤ－Ｌ１）のダウンレギュレーション；Ｔ細胞活性化、及びＢ細胞活性化を含む。
分子の細胞毒性活性に関する、「選択的細胞毒性」という用語は、生体分子標的について陽性の細胞集団（例えば、標的細胞型）と、非標的バイスタンダー細胞集団（例えば、生体分子標的について陰性の細胞型）との間の、細胞毒性の相対レベルであって、細胞毒性選択性の計量、又は非標的細胞との対比での、標的細胞を殺滅する優先性の指標をもたらすように、標的細胞型についての５０％細胞毒性濃度（ＣＤ５０）の、非標的細胞型についてのＣＤ５０に対する比として表されうる細胞毒性の相対レベルを指す。
所与の細胞外標的生体分子（又は所与の標的生体分子の細胞外エピトープ）の細胞表面表示及び／又は細胞表面密度は、ある特定の、結合分子が、最も適切に使用されうる適用に影響を及ぼしうる。所与の標的生体分子の細胞表面表示及び／又は細胞表面密度の、細胞間の差違は、所与の、結合分子の、細胞への内部化の効率及び／又は細胞毒性力価を、定量的かつ定性的に変化させうる。所与の標的生体分子の細胞表面表示及び／又は細胞表面密度は、標的生体分子について陽性の細胞の間で大幅に変動する場合もあり、なお又は同じ細胞上でも、細胞サイクル又は細胞分化の異なる地点で、大幅に変動する場合もある。特定の細胞又は細胞集団における、所与の標的生体分子、及び／又は所与の標的生体分子の、ある特定の細胞外エピトープについての全細胞表面表示は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ；fluorescence-activated cell sorting）によるフローサイトメトリーを伴う方法など、当業者に公知の方法を使用して決定されうる。
ポリペプチド領域又はポリペプチド内の特色に関して、本明細書で使用される、「破壊された」、「破壊」、又は「～を破壊すること」という用語、及びこれらの文法的変化形は、領域内の、又は破壊された特色を構成する、少なくとも１つのアミノ酸の変化を指す。アミノ酸変化は、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる、例えば、欠失、逆位、挿入、又は置換など、多様な変異を含む。アミノ酸変化はまた、例えば、アミノ酸官能基内の、１つ若しくは２つ以上の原子の変化、又は１つ若しくは２つ以上の原子の、アミノ酸官能基への付加などの化学的変化も含む。
本明細書で使用される、「脱免疫化された」とは、脊索動物への投与の後で、例えば、野生型のペプチド領域、ポリペプチド領域、又はポリペプチドなどの参照分子と比較した、潜在的抗原性及び／又は潜在的免疫原性の低減を意味する。これは、１つ又は２つ以上の、デノボにおける、抗原性エピトープ及び／又は免疫原性エピトープの導入に関わらない、参照分子と比較した、全体的な潜在的抗原性及び／又は潜在的免疫原性の低減を含む。一部の実施形態では、「脱免疫化された」は、分子が、それが由来した「親」分子、例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片又は前述を含む結合分子などと比較して、哺乳動物への投与後に、低減された抗原性及び／又は免疫原性を呈したことを意味する。一部の実施形態では、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、参照「親」分子と比較した、相対的抗原性であって、同じ条件下で、例えば、定量的なＥＬＩＳＡ解析又はウェスタンブロット解析のような、当業者に公知のアッセイ及び／又は本明細書で記載されるアッセイなど、同じアッセイにより測定された参照分子の抗原性より、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９０％以上低減される、相対的抗原性を呈することが可能である。一部の実施形態では、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、参照「親」分子と比較した、相対的免疫抗原性であって、同じ条件下で、例えば、所与の時点において分子の非経口投与を受けた後の哺乳動物（複数可）において産生される抗分子抗体の定量的測定のような、当業者に公知のアッセイ及び／又は本明細書で記載されるアッセイなど、同じアッセイにより測定された参照分子の免疫抗原性より、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は９９％以上低減される、相対的免疫抗原性を呈することが可能である。
例示的な結合分子の相対的免疫原性は、時間経過にわたる、反復非経口投与の後における、結合分子に対する、インビボにおける抗体応答についてのアッセイを使用して決定された。
「Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞が脱免疫化された」という語句は、分子が、哺乳動物への投与の後で、Ｂ細胞の抗原性若しくは免疫原性、及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞の抗原性若しくは免疫原性に関して、潜在的抗原性及び／又は潜在的免疫原性を低減したことを意味する。一部の実施形態では、「Ｂ細胞が脱免疫化された」とは、分子が、哺乳動物への投与の後で、例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片など、それが由来した「親」分子と比較した、Ｂ細胞の抗原性及び／又は免疫原性の低減を呈したことを意味する。一部の実施形態では、「ＣＤ４＋ Ｔ細胞が脱免疫化された」とは、分子が、哺乳動物への投与の後で、例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片など、それが由来した「親」分子と比較した、ＣＤ４ Ｔ細胞の抗原性及び／又は免疫原性の低減を呈したことを意味する。
志賀毒素エフェクターポリペプチド内の、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ領域、又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域に関する、「内因性」という用語は、野生型志賀毒素Ａサブユニット内に存在するエピトープを指す。
「ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された」という語句は、分子が、生存する脊索動物内の、有核脊索動物細胞の内部に存在する場合、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の抗原性又は免疫原性に関して、潜在的抗原性及び／又は潜在的免疫原性を増大させていることを意味する。一般に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫化分子は、固有の特色（複数可）のために、又は結合分子の構成要素として、有核脊索動物細胞の早期エンドソーム区画への細胞内部化が可能である。
「異種」という用語は、供給源が、天然に存在する志賀毒素のＡサブユニットと異なることを意味し、例えば、異種ポリペプチドは、天然の志賀毒素の、任意のＡサブユニットの一部として、天然では見出されない。結合分子の、Ｔ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープペプチドの構成要素に関する、「異種」という用語は、修飾されるポリペプチド構成要素内で、初期に生じたものではなく、本明細書で記載される、埋込み、融合、挿入、及び／又はアミノ酸置換の方法を介して添加されるのであれ、他の任意の改変手段により添加されるのであれ、ポリペプチドに付加された、エピトープ又はペプチド配列を指す。結果は、元の非修飾ポリペプチドに対して、外来のＴ細胞エピトープを含む、修飾ポリペプチドである、すなわち、Ｔ細胞エピトープは、元のポリペプチド内に存在しなかった。
結合分子の、Ｔ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープペプチドの構成要素に関する、「埋め込まれた」という用語及びその文法的変化形は、出発ポリペプチド領域と、同じ総数のアミノ酸残基を共有する、新たなポリペプチド配列を作出するための、ポリペプチド領域内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸の、異なるアミノ酸による、内部における置きかえを指す。したがって、「埋め込まれた」という用語は、さらなるアミノ酸、ペプチド、又はポリペプチド構成要素の、出発ポリペプチドへの、外部、末端における融合も、さらなるアミノ酸残基の、内部における、さらなる挿入も含まず、存在するアミノ酸に対する置換だけを含む。内部における置きかえは、アミノ酸残基置換だけにより達せられる場合もあり、一連の置換、欠失、挿入、及び／又は逆位により達せられる場合もある。１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入が使用される場合、挿入に隣接して、同等数の近位アミノ酸が、欠失される結果として、埋め込まれたＴ細胞エピトープをもたらさなければならない。これは、結合分子のポリペプチド構成要素内に含有されるＴ細胞エピトープに関して、出発ポリペプチドと比較して、アミノ酸残基数を増大させた、新たなポリペプチドを結果としてもたらす、ポリペプチド内の内部における１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を指す、「挿入された」という用語の使用と対照的である。
結合分子のポリペプチド構成要素内に含有されるＴ細胞エピトープに関する、「挿入された」という用語及びその文法的変化形は、出発ポリペプチドと比較して、アミノ酸残基数を増大させた、新たなポリペプチド配列を結果としてもたらす、ポリペプチド内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を指す。Ｔ細胞エピトープペプチドの「純粋な」挿入とは、結果として得られるポリペプチド長さが、挿入されたＴ細胞エピトープペプチドの全体におけるアミノ酸残基の数と同等な、アミノ酸残基の数だけ増大した場合である。結合分子の構成要素のポリペプチド内に含有されるＴ細胞エピトープに関する、「部分的に挿入された」、「埋め込まれ、挿入された」という語句及びその文法的変化形は、結果として得られるポリペプチド長さが増大したが、挿入されたＴ細胞エピトープペプチドの全体の長さと同等な、アミノ酸残基の数未満だけ増大した場合を指す。挿入は、ポリペプチド内の挿入部位に対して近位でない、ポリペプチドの他の領域が、欠失され、この結果として、最終的なポリペプチドの全長の減少もたらす場合であってもなお、最終的なポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープペプチドポリペプチド領域内の内部における、１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を含むため、「純粋」であれ、「部分的」であれ、既に記載された挿入のうちのいずれかを含む。
分子の機能活性について記載する場合に、本明細書で使用される、「Ｔ細胞エピトープを送達すること」という用語は、分子が、細胞内の、細胞内区画に局在化させる生物学的活性であって、Ｔ細胞エピトープペプチドを含む、分子のタンパク質性部分の、プロテアソームによる切断を結果としてもたらすのにコンピテントである、生物学的活性をもたらすことを意味する。分子の「Ｔ細胞エピトープ送達」機能は、分子を外因的に投与された細胞の細胞表面上における、ＭＨＣによる、分子のＴ細胞エピトープペプチドカーゴの提示を観察することによりアッセイされる場合もあり、アッセイが、そのエンドソーム区画のうちの、１つ又は２つ以上において、分子を含有する細胞により開始された場合に、アッセイされる場合もある。一般に、分子が、Ｔ細胞エピトープを、プロテアソームへ送達する能力は、「Ｔ細胞エピトープ送達」分子の初期の位置が、細胞の早期エンドソーム区画であり、次いで、分子が、エピトープペプチドを、細胞のプロテアソームへ送達することが実験により示される場合に決定されうる。しかし、「Ｔ細胞エピトープ送達」能はまた、分子が、細胞外位置で出発し、エピトープを、細胞及び細胞のプロテアソームへ送達することが、実験により、直接的に、又は間接的に示される場合にも決定されうる。例えば、ある特定の「Ｔ細胞エピトープ送達」分子は、例えば、エンドサイトーシスによる、この細胞への侵入の後などに、細胞のエンドソーム区画を通過する。代替的に、「Ｔ細胞エピトープ送達」活性は、細胞外位置において出発する分子についても観察されうるが、この場合、分子は、細胞のエンドソーム区画に侵入しない（代わりに、「Ｔ細胞エピトープ送達」分子は、細胞に侵入し、おそらく、「Ｔ細胞エピトープ送達」分子が、その固有の経路決定を、そのＴ細胞エピトープペプチドの構成要素の、プロテアソームによる切断を結果としてもたらすのにコンピテントである細胞内区画へ方向付けたために、Ｔ細胞エピトープペプチドを、細胞のプロテアソームへ送達する）。
結合分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の位置に言及する、「アミノ末端に対して近位の」という語句は、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の、少なくとも１つのアミノ酸残基が、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素のエフェクター機能活性（例えば、ある特定のレベルの細胞毒性力価）を呈することが可能である限りにおいて、結合分子のアミノ末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３以上、例えば、最大で、１８～２０アミノ酸残基以内にある場合の距離を指す。したがって、一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドに対して、アミノ末端側に融合させたアミノ酸残基（複数可）は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの機能活性が、本明細書で要求される、適切な活性レベルを下回って低減されるように、志賀毒素のエフェクター機能を低減（例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端領域の近傍の構造（複数可）の立体障害となることにより）しない。
結合分子内の、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の、別の構成要素（例えば、細胞をターゲティングする結合領域、分子部分、及び／又はさらなる外因性素材）と比較した位置に言及する、「アミノ末端に対して、より近位の」という語句は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の、少なくとも１つのアミノ酸残基が、結合分子の、直鎖状のポリペプチド構成要素のアミノ末端に対して、他の参照構成要素と比較して近接する場合の位置を指す。
「志賀毒素ファミリーのメンバーの、１つのＡサブユニットに由来する、活性の酵素ドメイン」という語句は、触媒性リボソーム不活化機構を介して、タンパク質合成を阻害する能力を有することを指す。天然に存在する志賀毒素の酵素活性は、例えば、生細胞の非存在下におけるＲＮＡ翻訳を伴う、インビトロアッセイ、又は生細胞内のＲＮＡ翻訳を伴う、インビボアッセイなど、当業者に公知のアッセイを使用する、タンパク質の翻訳を阻害する能力により規定されうる。当業者に公知のアッセイ、及び／又は本明細書で記載されているアッセイを使用して、志賀毒素の酵素活性の効力は、例えば、リボソームニッキングアッセイなど、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対する、Ｎ－グリコシダーゼ活性を観察することにより、直接的に評価される場合もあり、並びに／又はリボソーム機能及び／若しくはタンパク質合成の阻害を観察することにより、間接的に評価される場合もある。
「志賀毒素Ａ１断片領域」という用語は、志賀毒素Ａ１断片から本質的になるポリペプチド領域、及び／又は志賀毒素の志賀毒素Ａ１断片に由来するポリペプチド領域を指す。
結合分子に関する、「末端」、「アミノ末端」、又は「カルボキシ末端」という用語は、一般に、結合分子のポリペプチド鎖（例えば、単一の、連続ポリペプチド鎖）の、最後のアミノ酸残基を指す。結合分子は、２つ以上のポリペプチド又はタンパク質を含むことが可能であり、したがって、結合分子は、複数のアミノ末端及びカルボキシ末端を含みうる。例えば、結合分子の「アミノ末端」は、出発アミノ酸残基の一級アミノ基を伴うか、又はＮ－アルキル化された、アルファアミノ酸残基のクラスのメンバーである、出発アミノ酸残基の場合の、等価の窒素を伴うアミノ酸残基とのペプチド結合を有さない、出発アミノ酸残基により、一般に特徴付けられる、ポリペプチドのアミノ末端を表す、ポリペプチド鎖の第１のアミノ酸残基により規定されうる。同様に、結合分子の「カルボキシ末端」は、ポリペプチドのカルボキシル末端を表す、ポリペプチド鎖の最後のアミノ酸残基により規定されていてもよく、これは一般的に、第一カルボキシル基のアルファ炭素にペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を有しない最後のアミノ酸残基によって特徴づけられる。
ポリペプチド領域に関する、「末端」、「アミノ末端」、又は「カルボキシ末端」という用語は、さらなるアミノ酸残基が、この領域の外部において、ペプチド結合により連結されるのかどうかに関わらず、この領域の、領域境界を指す。言い換えれば、この領域が、他のペプチド又はポリペプチドと融合されているのかどうかに関わらず、ポリペプチド領域の末端を指す。例えば、２つのタンパク質性領域を含む融合タンパク質、例えば、ペプチド又はポリペプチドと、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む結合領域は、別のタンパク質性領域、例えば、結合領域の起始を表す、残基２５１～２５２位におけるアミノ酸残基を伴うペプチド結合にも関わらず、カルボキシ末端が、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ酸残基２５１を終端とする、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を有しうる。この例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端領域とは、融合タンパク質の末端ではなく、領域境界の内部を表す、残基２５１を指す。したがって、ポリペプチド領域について、「末端」、「アミノ末端」、及び「カルボキシ末端」という用語は、境界が、物理的に、末端にあるのであれ、大型のポリペプチド鎖内に埋め込まれた、内部の位置にあるのであれ、ポリペプチド領域の境界を指すように使用される。
「志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端領域」という語句は、天然に存在する志賀毒素Ａ１断片に由来するポリペプチド領域であって、疎水性残基（例えば、ＳｔｘＡ－Ａ１及びＳＬＴ－１Ａ１のＶ２３６、並びにＳＬＴ－２Ａ１のＶ２３５）で起始し、これに、疎水性残基と、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチド間で保存される、フーリン切断部位を終端とする領域とが後続し、天然の志賀毒素Ａサブユニット内の、Ａ１断片とＡ２断片との接合部を終端とする領域を指す。志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端領域は、例えば、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端を含むか、又はこれから本質的になるペプチド領域など、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端ポリペプチドに由来するペプチド領域を含む。志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端に由来するペプチド領域の非限定例は、天然位置の、Ｓｔｘ１Ａ（配列番号２）内又はＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）内の、２３６位～２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、又は２５１位；及びＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）内の、２３５位～２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、又は２５０位におけるアミノ酸残基配列を含む。
連結された分子部分及び／又は結合領域に関する、「Ａ１断片のカルボキシ末端ポリペプチドに対して近位の」という語句は、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチドの最後の残基を規定することアミノ酸残基から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２アミノ酸残基以内にあることを指す。
「Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端を、立体的に遮蔽する」という語句は、例えば、天然位置の、Ｓｔｘ１Ａ（配列番号２）内若しくはＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）内の２３６～２５１位、又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）内の２３５～２５０位のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸残基に由来するアミノ酸残基など、Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端におけるアミノ酸残基と連結した、及び／又は融合した、４．５ｋＤａ又は４．５ｋＤａ以上のサイズの、任意の分子部分（例えば、免疫グロブリン型結合領域）を含む。「Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端を、立体的に遮蔽する」という語句はまた、例えば、Ａ１断片由来領域及び／又は志賀毒素エフェクターポリペプチドの最後のアミノ酸に対して、カルボキシ末端側のアミノ酸残基など、Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端におけるアミノ酸残基と連結した、及び／又は融合した、４．５ｋＤａ又は４．５ｋＤａ以上のサイズの、任意の分子部分（例えば、免疫グロブリン型結合領域）も含む。「Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端を、立体的に遮蔽する」という語句はまた、例えば、真核細胞のＥＲＡＤ（小胞体関連分解；endoplasmic reticulum-associated degradation）機構による認識など、細胞による、Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端の認識を物理的に防止する、４．５ｋＤａ又は４．５ｋＤａ以上のサイズの、任意の分子部分（例えば、免疫グロブリン型結合領域）も含む。
少なくとも４０アミノ酸を含み、Ａ１断片由来領域を含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端領域と連結した（例えば、融合した）ポリペプチドを含む、例えば、免疫グロブリン型結合領域などの結合領域は、「Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端を立体的に遮蔽する」分子部分である。
少なくとも４０アミノ酸を含み、Ａ１断片由来領域を含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端領域と連結された（例えば、融合された）ポリペプチドを含む、例えば、免疫グロブリン型結合領域などの結合領域は、「Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端を損なう」分子部分である。
「志賀毒素ファミリーのメンバーのＡ１断片」という用語は、志賀毒素Ａサブユニットの中に保存され、野生型志賀毒素Ａサブユニット内の、Ａ１断片とＡ２断片との間に位置する、フーリン切断部位における、フーリンによるタンパク質分解の後で残存する、アミノ末端の志賀毒素Ａサブユニットの断片を指す。
「Ａ１断片領域のカルボキシ末端におけるフーリン切断モチーフ」という語句は、志賀毒素Ａサブユニットの中に保存され、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニット内の、Ａ１断片とＡ２断片との接合部を架橋する、特異的なフーリン切断モチーフを指す。
「Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して近位のフーリン切断部位」という語句は、例えば、Ａ１断片由来領域の、例えば、結合分子の分子部分など、分子の別の構成要素への連結部に対して近位の位置など、Ａ１断片領域又はＡ１断片由来の領域のカルボキシ末端に位置する、フーリン切断モチーフを含む、Ａ１断片領域内又はＡ１断片由来の領域内の、最後のアミノ酸残基を規定するアミノ酸残基から、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つ以上のアミノ酸残基未満の距離内に、アミノ酸残基を有する、任意の、同定可能なフーリン切断部位を指す。
「破壊されたフーリン切断モチーフ」という語句は、（ｉ）本明細書のＩ－Ｂ節で記載された、特異的フーリン切断モチーフを指し、（ii）これは、分子に、フーリンによる切断の、参照分子と比較した低減であって、例えば、同じ条件下で、同じアッセイにおいて観察される、参照分子の、フーリンによる切断より、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以下（切断なしに相当する１００％を含む）であることが、再現可能に観察される、フーリンによる切断の低減などの低減を付与しうる、変異及び／又は切断を含む。参照分子と比較した、フーリンによる切断の百分率は、参照分子の切断される素材：切断されない素材の比で除された、所望の分子の切断される素材：切断されない素材の比（例えば、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット；国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレットを参照されたい）として表されうる。適切な参照分子の非限定例は、本明細書で記載される、野生型志賀毒素のフーリン切断モチーフ及び／若しくはフーリン切断部位を含む、ある特定の分子を含む。
「フーリンによる切断に抵抗性の」という語句は、分子又はその特異的ポリペプチド領域が、当業者に利用可能な、任意の手段であって、本明細書で記載される方法の使用を含む手段によりアッセイされる通り、（ｉ）野生型志賀毒素Ａサブユニット内の、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端、又は（ii）天然位置の、Ａ１断片と、Ａ２断片との接合部における、天然に存在するフーリン切断部位が破壊されないコンストラクトの、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端より、再現性よく少ないフーリンによる切断を示すことを意味する。
「志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する、活性の酵素ドメイン」という語句は、志賀毒素の酵素活性に基づく、リボソームの触媒性不活化を介して、タンパク質合成を阻害する能力を有するポリペプチド構造を指す。分子的構造が、タンパク質合成に対する阻害活性、及び／又はリボソームの触媒性不活化を呈する能力は、例えば、生細胞の非存在下におけるＲＮＡ翻訳アッセイを伴う、インビトロアッセイ、又は生細胞内のリボソームを伴う、インビボアッセイなど、当業者に公知の、多様なアッセイを使用して観察されうる。例えば、当業者に公知のアッセイを使用して、志賀毒素の酵素活性に基づく、分子の酵素活性は、例えば、リボソームニッキングアッセイなど、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対する、Ｎ－グリコシダーゼ活性を観察することにより、直接的に評価される場合もあり、並びに／又はリボソーム機能、ＲＮＡ翻訳、及び／若しくはタンパク質合成の阻害を観察することにより、間接的に評価される場合もある。
志賀毒素エフェクターポリペプチドに関して、本明細書で使用される、「組合せ」とは、２つ又は３つ以上の亜領域を含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドについて記載し、この場合、各亜領域は、以下：（１）内因性のエピトープ内又はエピトープ領域内の破壊；（２）埋め込まれた異種Ｔ細胞エピトープ－ペプチド；（３）挿入された異種Ｔ細胞エピトープ－ペプチド；及び（４）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフのうちの少なくとも１つを含む。
本明細書で使用される、「結合分子」は、「ＰＤ－Ｌ１結合分子」と互換的に使用され、「ＰＤ－Ｌ１結合分子」は、「ＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ融合タンパク質」及び「ＳＬＴ－１Ａ融合タンパク質」を包含する。前述の分子型の全ては、多様な「ＰＤ－Ｌ１結合性タンパク質」を含む。
ＰＤ－Ｌ１結合分子
ＰＤ－Ｌ１に結合し、毒素構成要素を含む、多様な結合分子（本明細書において「ＰＤ－Ｌ１結合分子」と称され、前述の分子型の全てが、多様な「ＰＤ－Ｌ１－結合性タンパク質」を含む）が、本明細書で提示される。ＰＤ－Ｌ１結合分子は、例えば、（１）ＰＤ－Ｌ１発現細胞を殺滅するための細胞毒性分子として、（２）他の細胞の中で特異的ＰＤ－Ｌ１陽性細胞型（複数可）を選択的に殺滅するため、（３）ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを、ＰＤ－Ｌ１発現細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へ送達するための送達媒体として、（４）原子又は分子をＰＤ－Ｌ１発現細胞の内部へ送達するための非毒性送達媒体として、（５）ＰＤ－Ｌ１発現細胞が関わる疾患及び状態の診断、予後予測、又は特徴付けのための診断用分子として、並びに（６）多様ながん及び腫瘍などの、ＰＤ－Ｌ１発現細胞が関わる様々な疾患、障害、及び状態を治療するための治療用分子として、有用である。
一部の実施形態では、結合分子は、ＰＤ－Ｌ１結合性免疫グロブリンドメインと、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドとを含む。志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドは、新規な結合分子を改変するためのロバストかつ強力な足場をもたらす（例えば、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、国際公開第２０１７／０１９６２３号パンフレット、国際公開第２０１８／１０６８９５号パンフレット、及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットを参照されたい）。細胞ターゲティング部分としてのＰＤ－Ｌ１結合性免疫グロブリン由来断片の、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドとの会合は、ＰＤ－Ｌ１をターゲティングする治療用分子及び診断用分子の改変を可能とする。
Ｉ． ＰＤ－Ｌ１結合分子の一般的構造
本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、各々が、（１）細胞ターゲティングのためのＰＤ－Ｌ１結合領域と、（２）毒素とを含む。
一部の実施形態では、結合分子は、（１）細胞表面と会合するＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に特異的に結合することが可能な結合領域と、（２）毒素エフェクターポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、（１）細胞表面と会合するＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に特異的に結合することが可能な結合領域と、（２）志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド（本明細書において「志賀毒素エフェクターポリペプチド」と称する）を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド領域とを含む。一部の実施形態では、結合分子は、同じものであれ、異なるものであれ、２つ又は３つ以上のＰＤ－Ｌ１結合領域と、同じものであれ、異なるものであれ、２つ又は３つ以上の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域とを含む。結合分子の非限定的な一例は、単鎖可変断片を含む免疫グロブリン型結合領域に融合された志賀毒素エフェクターポリペプチド、又は前述のホモ若しくはヘテロ二量体である。本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、標的細胞の内部への送達、及びその後における細胞表面提示のためのＴ細胞エピトープを含んでもよい場合がある。
一部の実施形態では、結合分子は、ホモ二量体又はヘテロ二量体である。一部の実施形態では、結合分子は、２つの単量体を含むホモ二量体であり、この場合、各々の単量体は、ＰＤ－Ｌ１結合領域と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、二量体性結合分子は、同一な結合領域及び毒素領域を含む単量体性バリアントの特性よりも好都合な特性を呈する。例えば、一部の実施形態では、二量体形の結合分子は、単量体形の類似分子よりも、抗原性エピトープ（すなわち、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ）を、標的細胞へより効率的に送達しうる。
一部の実施形態では、結合分子の志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドは、構造的エレメントを組み合わせる結果として、例えば、１）特定の構造的エレメント（複数可）を欠く分子バリアントと比較した、抗原性及び／若しくは免疫原性の低減を呈する、２）特定の構造的エレメント（複数可）を欠く分子バリアントと比較した、プロテアーゼによる切断の低減を呈する、３）特定のエレメント（複数可）を欠く分子バリアントと比較した、ある特定の投与量における、多細胞生物に対する非特異的毒性の低減を呈する、４）細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ系に、埋め込まれるか、若しくは挿入されたＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを送達する、及び／又は５）強力な細胞毒性を呈する能力など、単一の分子内に、２つ又は３つ以上の特性をもたらす。
Ａ． ＰＤ－Ｌ１結合領域
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ヒトＰＤ－Ｌ１、及び／又は例えば、ＰＤ－Ｌ１発現細胞若しくはＰＤ－Ｌ１陽性細胞などの細胞の細胞表面に存在するＰＤ－Ｌ１への、特異的で、高アフィニティーな結合を呈することが可能な免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。
一部の実施形態では、結合分子の結合領域は、細胞表面でのＰＤ－Ｌ１標的生体分子の細胞外部分（すなわち、細胞外標的生体分子）に高アフィニティーで特異的に結合することが可能な、細胞ターゲティング構成要素、例えば、ドメイン、分子部分、又は薬剤などである。本明細書で使用される、「ＰＤ－Ｌ１結合領域」という用語は、ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分に、例えば、ＰＤ－Ｌ１に対する、１リットル当たり１０－５～１０－１２モル濃度の解離定数を有するなど、高アフィニティーで、特異的に結合することが可能な分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は薬剤を指す。本明細書で使用される、ＰＤ－Ｌ１結合性とは、ヒトＰＤ－Ｌ１のアイソフォーム又はバリアントを含む、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に結合する能力を指す。
標的生体分子の細胞外部分とは、例えば、標的生体分子が、細胞表面において、細胞により発現される場合など、分子が、細胞と、物理的にカップリングされている場合に、細胞外環境に露出された、その構造の一部を指す。この文脈では、「細胞外環境に露出された」とは、標的生体分子の一部が、例えば、抗体、又は単一ドメイン型抗体ドメイン、ナノボディー（登録商標）、ラクダ科動物若しくは軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、単鎖可変断片、又は任意の数の、免疫グロブリンに対して改変された、代替的足場など、抗体より小型の、少なくとも結合性部分により、アクセス可能であることを意味する（下記を参照されたい）。細胞と物理的にカップリングした標的生体分子の部分の、細胞外環境への露出、又はこの部分へのアクセシビリティーは、当技術分野で周知の方法を使用する当業者の実験により決定されうる。
一部の実施形態では、結合分子は、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に、選択的で特異的に結合することが可能な、１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む結合領域を含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリン型ＰＤ－Ｌ１結合領域は、免疫グロブリン、ＰＤ－Ｌ１結合領域、例えば、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に結合することが可能な抗体パラトープなどに由来する。この改変ポリペプチドは、本明細書で記載される免疫グロブリンからの相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか、又はこれから本質的になる、ポリペプチド足場を含んでもよい場合がある。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、各々が、配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ；heavy chain variable region）を含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）各々が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ；light chain variable region）をさらに含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。一部の実施形態では、結合領域は、配列番号２５、配列番号２０、及び配列番号２１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号２５、配列番号２０、及び配列番号２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、各々が、配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）を含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）各々が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）と；（ｂ）各々が、配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）とを含む。一部の実施形態では、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、若しくはこれから本質的になるか、若しくはこれからなるＨＣＤＲ１；（ii）配列番号２９若しくは３０のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、若しくはこれからなるＨＣＤＲ２；及び（iii）配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、若しくはこれからなるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）；並びに／又はｂ）（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、若しくはこれからなるＬＣＤＲ１；（ii）配列番号２０のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、若しくはこれからなるＬＣＤＲ２；及び（iii）配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、若しくはこれからなるＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）を含む。一部の実施形態では、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１；（ii）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２；及び（iii）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）と、ｂ）（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１；（ii）配列番号２０のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２；及び（iii）配列番号２６のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）とを含む。一部の実施形態では、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１；（ii）配列番号２９のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２；及び（iii）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）と；ｂ）（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１；（ii）配列番号２０のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２；及び（iii）配列番号２６のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）とを含む。
一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号３３、３５～３６、及び３８のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、若しくは配列番号３３、３５～３６、及び３８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になる軽鎖領域；並びに／又は（ｂ）配列番号３４、３７、及び３９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、若しくは配列番号３４、３７、及び３９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になる重鎖領域を含む。一部の実施形態では、結合領域は、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又は配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つに示されるポリペプチドから本質的になるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、結合領域は、例えば、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つのポリペプチドからなるか、これを含むか、又はこれから本質的になるなどの、単鎖可変断片である。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）各々が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、若しくはこれからなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）；並びに（ｂ）各々が、配列番号３４、配列番号３７、及び配列番号３９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、若しくはこれからなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）を含む。
一部の実施形態では、結合分子の結合領域は、例えば、モノクローナル抗体又は改変抗体派生物でありうる。一部の実施形態では、結合領域は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、Ｆａｂ’－ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態では、結合領域は、全長抗体、例えば、本明細書で規定される及び／又は当業者に公知の、インタクトなＩｇＧ１抗体又は他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。抗体の「クラス」は、重鎖内に存在する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けられうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
一部の実施形態では、結合領域は、合成改変抗体派生物、例えば、自律性ＶＨドメイン（例えば、ラクダ科動物、マウス、又はヒト供給源からのものなど）、単一ドメイン型抗体ドメイン（ｓｄＡｂ；single-domain antibody domain）、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片）、ラクダ科動物ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片に由来する重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、単鎖可変（ｓｃＦｖ；single-chain variable）断片、ナノボディー、ＶＨドメインを含む「ラクダ化」足場、重鎖及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、単鎖Ｆｖ－ＣＨ３ミニボディー、Ｆｃ抗原結合ドメイン（Ｆｃａｂ；Fc antigen binding domain）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、多量体化ｓｃＦｖ断片（ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー）、ジスルフィド安定化抗体可変（Ｆｖ）断片（ｄｓＦｖ；disulfide-stabilized antibody variable fragment）、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるジスルフィド安定化抗原結合性（Ｆａｂ）断片、ジスルフィド安定化重鎖及び軽鎖を含む単鎖可変領域断片（ｓｃ－ｄｓＦｖ；single-chain variable-region fragment comprising a disulfide-stabilized heavy and light chain）、二価ナノボディー、二価ミニボディー、二価Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｆａｂ二量体）、二特異性タンデムＶＨＨ断片、二特異性タンデムｓｃＦｖ断片、二特異性ナノボディー、二特異性ミニボディー、Ｆａｂ－ＦＣａｂ（ｍＡｂ２のもの）、並びにそのパラトープ及び結合機能性を保持する、前出の任意の遺伝子改変対応物などであり、例えば、この場合、重鎖及び軽鎖の相対的な配向性又は順序は、逆転又は「反転される（flipped）」などである。
１つの、具体的であるが、非限定な態様に従い、結合領域は、免疫グロブリン型結合領域を含みうる。本明細書で使用される、「免疫グロブリン型結合領域」という用語は、抗原又はエピトープなど、１つ又は２つ以上の標的生体分子に結合することが可能なポリペプチド領域を指す。結合領域は、標的分子に結合する、それらの能力により、機能的に規定されうる。免疫グロブリン型結合領域は一般に、抗体又は抗体様構造に由来する。
免疫グロブリン（Ｉｇ；immunoglobulin）タンパク質は、Ｉｇドメインとして公知の構造ドメインを有する。Ｉｇドメインは、約７０～１１０アミノ酸残基の長さの範囲にあり、典型的に、７～９本の逆平行ベータ鎖が、２枚のベータシートへ配置され、これが、サンドイッチ様構造を形成する、特徴的なＩｇフォールディングを持つ。Ｉｇフォールディングは、サンドイッチの内部表面上の、疎水性アミノ酸相互作用により安定化させられ、鎖内のシステイン残基間のジスルフィド結合により、高度に保存される。Ｉｇドメインは、可変（ＩｇＶ又はＶセット；variable）ドメイン、定常（ＩｇＣ又はＣセット；constant）ドメイン又は中間（ＩｇＩ又はＩセット；intermediate）ドメインでありうる。一部のＩｇドメインには、「相補性（complementary）決定領域」ともまた呼ばれ、抗体の、それらのエピトープへの結合の特異性に重要である、相補性決定領域（ＣＤＲ；complementarity determining region）が付随していることがある。非免疫グロブリンタンパク質でもまた、Ｉｇ様ドメインが見出され、これに基づき、タンパク質のＩｇスーパーファミリーのメンバーとして分類される。ＨＵＧＯヒトゲノム命名法委員会（ＨＧＮＣ；HUGO Gene Nomenclature Committee）は、Ｉｇ様ドメイン含有ファミリーのメンバーのリストを提供している。
免疫グロブリン型結合領域は、抗体又はその抗原結合性断片のポリペプチド配列であることが可能であり、この場合、アミノ酸配列は、例えば、ライブラリースクリーニングを介する分子改変又は分子選択により、天然抗体又は非免疫グロブリンタンパク質のＩｇ様ドメインのアミノ酸配列から変動させられている。免疫グロブリン型結合領域の作出において、組換えＤＮＡ法及びインビトロライブラリースクリーニングが適切であるので、抗体は、小型のサイズ、細胞への侵入、又はインビボ適用及び／若しくは治療適用のための他の改善など、所望の特徴を得るように、再設計されうる。可能な変動は、多く、わずかに１つのアミノ酸の変更から、例えば、可変領域の、完全な再設計までの範囲にわたりうる。典型的に、抗原結合性特徴を改善するか、可変領域の安定性を改善するか、又は免疫原性応答の可能性を低減するために、可変領域内の変化がなされるであろう。
本明細書で記載される分子の構成要素であるとして想定される、多数の免疫グロブリン型結合領域が存在する。一部の実施形態では、免疫グロブリン型結合領域は、ＰＤ―Ｌ１の細胞外部分に結合することが可能な抗体パラトープなど、免疫グロブリンの結合領域に由来する。ある特定の、他の実施形態では、免疫グロブリン型結合領域は、免疫グロブリンドメインに由来しないが、ＰＤ―Ｌ１の細胞外部分への、高アフィニティーの結合をもたらすことにより、免疫グロブリンの結合領域と同様に機能する、改変ポリペプチドを含む。この改変ポリペプチドは、本明細書で記載される、免疫グロブリンに由来する相補性決定領域を含むか、又はこれらから本質的になるポリペプチド足場を含んでもよい。
それらの高アフィニティーの結合特徴を介して、ポリペプチドを、特異的細胞型へターゲティングするために有用な多数の結合領域はまた、先行技術にも存在する。一部の実施形態では、結合分子の結合領域は、自律性ＶＨドメイン、単一ドメイン型抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片）、ラクダ科動物のＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片に由来する重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、単鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、ナノボディー、重鎖とＣＨ１ドメインとからなるＦｄ断片、単鎖Ｆｖ－ＣＨ３ミニボディー、二量体ＣＨ２ドメイン断片（ＣＨ２Ｄ；dimeric CH2 domain fragment）、Ｆｃ抗原結合ドメイン（Ｆｃａｂ）、単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３；complementary determining region 3）断片、拘束型フレームワーク領域３、ＣＤＲ３、フレームワーク領域４（ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４）ポリペプチド、小型モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ；small modular immunopharmaceutical）ドメイン、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、多量体化ｓｃＦｖ断片（ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー）、ジスルフィド安定化抗体可変（Ｆｖ）断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる、ジスルフィド安定化抗原結合性（Ｆａｂ）断片、二価ナノボディー、二価ミニボディー、二価Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｆａｂ二量体）、二特異性タンデムＶＨＨ断片、二特異性タンデムｓｃＦｖ断片、二特異性ナノボディー、二特異性ミニボディー、並びにそのパラトープ及び結合機能性を保持する、前出の任意の遺伝子改変対応物（例えば、重鎖及び軽鎖の相対的な配向又は順序が逆転又は反転されたものなど）を含む群から選択される（Ward E et al., Nature 341: 544-6 (1989); Davies J, Riechmann L, Biotechnology (NY) 13: 475-9 (1995); Reiter Y et al., Mol Biol 290: 685-98 (1999); Riechmann L, Muyldermans S, J Immunol Methods 231: 25-38 (1999); Tanha J et al., J Immunol Methods 263: 97-109 (2002); Vranken W et al., Biochemistry 41: 8570-9 (2002); Jespers L et al., J Mol Biol 337: 893-903 (2004); Jespers L et al., Nat Biotechnol 22: 1161-5 (2004); To R et al., J Biol Chem 280: 41395-403 (2005); Saerens D et al., Curr Opin Pharmacol 8: 600-8 (2008); Dimitrov D, MAbs 1: 26-8 (2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012)参照）。
例えば、改変二量体Ｆｃドメイン、単量体Ｆｃ（ｍＦｃ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ＶＨＨ－Ｆｃ、ＣＨ２ドメイン、単量体ＣＨ３ドメイン（ｍＣＨ３）、合成再プログラム化免疫グロブリンドメイン、及び／又は免疫グロブリンドメインの、リガンドとのハイブリッド融合体（Hofer T et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. 105: 12451-6 (2008); Xiao J et al., J Am Chem Soc 131: 13616-13618 (2009); Xiao X et al., Biochem Biophys Res Commun 387: 387-92 (2009); Wozniak-Knopp G et al., Protein Eng Des Sel 23 289-97 (2010); Gong R et al., PLoS ONE 7: e42288 (2012); Wozniak-Knopp G et al., PLoS ONE 7: e30083 (2012); Ying T et al., J Biol Chem 287: 19399-408 (2012); Ying T et al., J Biol Chem 288: 25154-64 (2013); Chiang M et al., J Am Chem Soc 136: 3370-3 (2014); Rader C, Trends Biotechnol 32: 186-97 (2014); Ying T et al., Biochimica Biophys Acta 1844: 1977-82 (2014)）など、免疫グロブリンの定常領域に由来するポリペプチドを含む、様々な結合領域が存在する。
一部の実施形態では、結合分子の結合領域は、インタクトな抗体である、及び／又はＦｃ領域を含む。「Ｆｃ領域」という用語は、結晶化可能領域断片、すなわち、定常領域の少なくとも一部を含有する、天然免疫グロブリンのある特定の重鎖のＣ末端近位領域、例えば、少なくとも第２及び第３定常（ＣＨ）ドメイン並びにグリコシル化部位などの部分を指す。しかし、本明細書で使用される、「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアント若しくは変異Ｆｃ領域又はこれらの断片を含む。本明細書でそうでないことが指定されない限りにおいて、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991)に記載されている通りに、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
ある特定の、他の実施形態に従い、結合領域は、改変された、免疫グロブリンドメインに対する代替的足場を含む。当技術分野では、標的生体分子に対する、高アフィニティーかつ特異的な結合など、免疫グロブリン由来構造と、同様の機能的な特徴を呈する、改変された代替的足場が公知であり、例えば、安定性の増大又は免疫原性の低減など、改善された特徴を、ある特定の免疫グロブリンドメインにもたらしうる。一般に、免疫グロブリンドメインに対する代替的足場は、２０キロドルトン未満であり、単一のポリペプチド鎖からなり、システイン残基を欠き、比較的高度な熱力学的安定性を呈する。
前述のＰＤ－Ｌ１結合分子のいずれも、ＰＤ－Ｌ１結合領域としての使用に適切な場合があり、結合分子における使用のための、１つ若しくは２つ以上のＰＤ－Ｌ１結合領域を創出するように修飾される場合もある。上記の結合領域のうちのいずれも、結合領域の構成要素が、ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分に対して、１リットル当たり１０－５～１０－１２モル濃度、好ましくは２００ナノモル濃度（ｎＭ；nanomolar）未満の解離定数を有する限りにおいて、分子の構成要素として使用されうる。
Ｂ． 志賀毒素エフェクターポリペプチド
結合分子は、少なくとも１つの毒素構成要素を含む。一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａサブユニットに由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドである毒素構成要素を含む。志賀毒素エフェクターポリペプチドは、１つ又は２つ以上の志賀毒素機能を呈することが可能な、志賀毒素ファミリーの、志賀毒素Ａサブユニットメンバーに由来するポリペプチドである（例えば、Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28（2010)；国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、国際公開第２０１７／０１９６２３号パンフレット、国際公開第２０１８／１０６８９５号パンフレット、及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットを参照されたい）。志賀毒素機能は、例えば、細胞への内部化の増大、エンドソーム区画から細胞質ゾルへの細胞内経路決定の方向付け、細胞内分解の回避、リボソームの触媒性不活化、並びに細胞増殖抑制効果及び／又は細胞毒性効果の招来を含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つのバリアントを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を伴う配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は１０の変異などの、１つ又は２つ以上の変異を伴う、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターは、１～５つ、５～１０、１１～５つ、１５～２０、１０～２５、２５～３０、又は３１以上の変異を伴う、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つのバリアントを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、この場合、バリアントは、Ｓ４５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドを触媒的に不活性にする。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドの触媒活性に影響しない。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドの触媒活性を増大させる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドの触媒活性を減少させる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチド、配列番号４１を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、配列番号４１のバリアントである志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、配列番号４１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を伴う配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は１０の変異などの、１つ又は２つ以上の変異を伴う、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターは、１～５つ、５～１０、１１～５つ、１５～２０、１０～２５、２５～３０、又は３１以上の変異を伴う配列番号４１を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドを触媒的に不活性にする。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドの触媒活性に影響しない。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドの触媒活性を増大させる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の変異は、ポリペプチドの触媒活性を減少させる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターは、配列番号４１に加えて、Ｅ１６７Ｄ変異、Ｒ１７０Ｓ変異、又はＥ１６７ＤとＲ１７０Ｓ変異との両方を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターは、配列番号１６７、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つを含む。
毒素タンパク質の志賀毒素ファミリーは、構造的かつ機能的に類縁である、多様な天然に存在する毒素、例えば、志賀毒素、志賀様毒素１、及び志賀様毒素２から構成される（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。志賀毒素ファミリーのホロトキシンメンバーは、一部の宿主細胞の表面上に存在する、特異的なグリコスフィンゴ脂質に優先的に結合するターゲティングドメインと、細胞の内部に入ると、リボソームを、恒久的に不活化させることが可能な酵素的ドメインとを含有する（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。志賀毒素ファミリーのメンバーは、同じ全体構造及び作用機構を共有する（Engedal N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)）。例えば、Ｓｔｘ、ＳＬＴ－１と、ＳＬＴ－２とは、無細胞系において、識別不能な酵素活性を提示する（Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21 (1991); Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402 (1993); Brigotti M et al., Toxicon 35:1431-1437 (1997)）。
志賀毒素ファミリーは、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）血清型１から単離された、真性志賀毒素（Ｓｔｘ；true Shiga toxin）、腸管出血性大腸菌（E. coli）の血清型から単離された、志賀様毒素１（ＳＬＴ１又はＳｔｘ１又はＳＬＴ－１又はＳｌｔ－Ｉ；Shiga-like toxin 1）のバリアント、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離された、志賀様毒素２（ＳＬＴ２又はＳｔｘ２又はＳＬＴ－２；Shiga-like toxin 2）バリアントを包含する。ＳＬＴ１は、Ｓｔｘと、１アミノ酸残基だけ異なり、いずれも、ベロ細胞毒素又はベロ毒素（ＶＴ；verocytotoxin又はverotoxin）と称されている（O’Brien A, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)）。ＳＬＴ１バリアントと、ＳＬＴ２バリアントとは、一次アミノ酸配列レベルでは、互いと、約５３～６０％類似するに過ぎないが、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通する、酵素活性及び細胞毒性の機構を共有する（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。規定された亜型である、Ｓｔｘ１ａ、Ｓｔｘ１ｃ、Ｓｔｘ１ｄ、及びＳｔｘ２ａ～Ｓｔｘ２ｇなど、３９を超える、異なる志賀毒素について記載されている（Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)）。志賀毒素コード遺伝子が、遺伝子水平伝播を介して、細菌種間に拡散しうるため、志賀毒素ファミリーのメンバーは、天然では、いかなる細菌種にも限定されない（Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Bielaszewska M et al., Appl Environ Micrbiol 73: 3144-50 (2007); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6 (2011)）。種間伝播の例として述べると、志賀毒素は、患者から単離されたＡ．ヘモリティクス（A. haemolyticus）の株において発見された（Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)）。志賀毒素をコードするポリヌクレオチドが、新たな亜種又は種に侵入すると、志賀毒素のアミノ酸配列は、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通の細胞毒性機構を、やはり維持しながら、遺伝的浮動及び／又は選択圧のために、わずかな配列の変動を発生させることが可能であると推測される（Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)を参照されたい）。
本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド構成要素は、以下の志賀毒素エフェクターポリペプチド亜領域：（１）脱免疫化された亜領域、（２）志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端近くの、プロテアーゼによる切断に抵抗性の亜領域、及び（３）Ｔ細胞エピトープ－ペプチドが埋め込まれるか、又は挿入された亜領域のうちの、２つ又は３つ以上の組合せを含む。
１． 脱免疫化された、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド
一部の実施形態では、結合分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、野生型志賀毒素、野生型志賀毒素ポリペプチド、及び／又は野生型ポリペプチド配列だけを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドなどと比較して脱免疫化される。志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドは、天然に存在するのであれ、そうでないのであれ、本明細書で記載される方法、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットにおいて記載されている方法、並びに／又は当業者に公知の方法により脱免疫化される場合があり、この場合、結果として得られる分子は、１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能を保持する。脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ポリペプチドを、脊索動物に投与した後で、志賀毒素エフェクターポリペプチドの潜在的抗原性及び／又は潜在的免疫原性を低減するために、少なくとも１つの、推定の、内因性エピトープ領域の破壊を含む。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、Ｂ細胞エピトープ及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープなど、内因性のエピトープ又はエピトープ領域の破壊を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書で記載される少なくとも１つの内因性のエピトープ領域の破壊を含み、この場合、破壊は、ポリペプチドを、脊索動物に投与した後で、志賀毒素エフェクターポリペプチドの潜在的抗原性及び／又は潜在的免疫原性を低減し、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、著明レベルの志賀毒素細胞毒性など、１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能を呈することが可能である。
エピトープ領域に関して、本明細書で使用される、「破壊された」又は「破壊」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の、エピトープ領域内の欠失、少なくとも１つの反転されたアミノ酸残基が、エピトープ領域内に存在する、２つ又は３つ以上のアミノ酸残基の逆位、少なくとも１つのアミノ酸の、エピトープ領域への挿入、及び少なくとも１つのアミノ酸残基の、エピトープ領域内の置換を指す。変異によるエピトープ領域の破壊は、非標準的アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸によるアミノ酸置換を含む。エピトープ領域は、エピトープ領域内の、少なくとも１つのアミノ酸をマスキングする、共有結合的に連結された化学的構造の付加による、アミノ酸の修飾を含む変異によっても、代替的に破壊されうる。例えば、ＰＥＧ化（Zhang C et al., BioDrugs 26: 209-15 (2012)を参照されたい）、低分子アジュバント（Flower D, Expert Opin Drug Discov 7: 807-17 (2012)）、及び部位特異的アルブミン化（Lim S et al., J Control Release 207-93 (2015)）を参照されたい。
本明細書では、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットが、成熟志賀毒素Ａサブユニットを産生するために除去され、当業者に認識可能な、それらのアミノ末端における、約２２アミノ酸のシグナル配列を含有する、前駆体形態を含みうることに注目して、配列表に提示される、天然の志賀毒素Ａサブユニットの、特異的アミノ酸位置に言及することにより、ある特定のエピトープ領域及び破壊が指し示される。さらに、本明細書では、天然で、天然の志賀毒素Ａサブユニット内の特異的位置（例えば、アミノ末端から３３位におけるセリン残基に、Ｓ３３）に存在する特異的アミノ酸（例えば、セリン残基に、Ｓ）に続き、論じられる特定の変異において、この残基が置換されたアミノ酸（例えば、Ｓ３３Ｉは、アミノ末端からのアミノ酸残基３３における、イソロイシンによる、セリンのアミノ酸置換を表す）に言及することにより、変異を含む、ある特定のエピトープ領域の破壊が指し示される。
一部の実施形態では、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、本明細書で提示されるエピトープ領域の破壊を含む。一部の実施形態では、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット又は国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットにおいて記載されたエピトープ領域の破壊を含む。
一部の実施形態では、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１～１５；配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１又は配列番号２の２７～３７；配列番号１又は配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３～６６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４～１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２１０～２１８；配列番号３の２４０～２５８；配列番号１又は配列番号２の２４３～２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４～２６８；配列番号３の２６２～２７８；配列番号３の２８１～２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５～２９３、並びに志賀毒素Ａサブユニットポリペプチド内、保存された志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域内、及び／又は非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列内の同等な位置からなる天然位置のアミノ酸の群から選択されるアミノ酸配列の、少なくとも１つの破壊を含む、全長志賀毒素Ａサブユニット（例えば、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３））を含むか、又は、これから本質的になる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１６９の配列を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１７０の配列を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１７３の配列を含む。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれから本質的になる。志賀毒素Ａサブユニットの切断は、志賀毒素のエフェクター機能（複数可）に影響を及ぼさずに、全エピトープ領域（複数可）の欠失を結果としてもたらしうるであろう。著明な酵素活性を呈することが示された、最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、ＳｔｘＡの残基７５～２４７から構成されるポリペプチドであった（Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)）。ＳＬＴ－１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ－２Ａのカルボキシ末端の、アミノ酸１～２５１への切断は、２つの、予測されるＢ細胞エピトープ領域、２つの、予測されるＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞エピトープ、及び予測される不連続Ｂ細胞エピトープを除去する。ＳＬＴ－１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ－２Ａのアミノ末端の、７５～２９３への切断は、少なくとも３つの、予測されるＢ細胞エピトープ領域、及び３つの、予測されるＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを除去する。ＳＬＴ－１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ－２Ａのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方の、７５～２５１への切断は、少なくとも５つの、予測されるＢ細胞エピトープ領域；４つの、推定ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ；及び１つの、予測される、不連続Ｂ細胞エピトープを欠失させる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、提示されるエピトープ領域内の、少なくとも１つの変異、例えば、欠失、挿入、逆位、又は置換を伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、エピトープ領域内の、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む破壊を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、エピトープ領域内の、少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む破壊を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの反転されたアミノ酸が、エピトープ領域内に存在する、アミノ酸の逆位を含む破壊を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、非標準アミノ酸又は側鎖が化学修飾されたアミノ酸へのアミノ酸置換などの変異を含む破壊を含む。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然配列と比較して、１つ又は２つ以上の変異を伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットであって、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、及びＫからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然配列と比較して、単一の変異を伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれらから本質的になり、この場合、置換は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＧからＡ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＧ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、及びＹからＭからなる群から選択される。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然のアミノ酸残基配列と比較して、１つ又は２つ以上の変異を伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットであって、免疫原性残基の、少なくとも１つのアミノ酸置換、及び／又はエピトープ領域内の、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれから本質的になり、この場合、少なくとも１つの置換は、配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５４；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１又は配列番号２の５６；配列番号１又は配列番号２の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１又は配列番号２の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１又は配列番号２の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１又は配列番号２の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１又は配列番号２の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２４１；配列番号１又は配列番号２の２４２；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６からなる群から選択される天然位置のアミノ酸群において生じる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、免疫原性残基の、少なくとも１つの置換、及び／又はエピトープ領域内の、少なくとも１つの置換を伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれから本質的になり、この場合、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の天然の位置：配列番号１若しくは配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１１；配列番号１若しくは配列番号２の３３；配列番号１若しくは配列番号２の４３；配列番号１若しくは配列番号２の４４；配列番号１若しくは配列番号２の４５；配列番号１若しくは配列番号２の４６；配列番号１若しくは配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４８；配列番号１若しくは配列番号２の４９；配列番号１若しくは配列番号２の５０；配列番号１若しくは配列番号２の５１；配列番号１若しくは配列番号２の５３；配列番号１若しくは配列番号２の５４；配列番号１若しくは配列番号２の５５；配列番号１若しくは配列番号２の５６；配列番号１若しくは配列番号２の５７；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５９；配列番号１若しくは配列番号２の６０；配列番号１若しくは配列番号２の６１；配列番号１若しくは配列番号２の６２；配列番号１若しくは配列番号２の８４；配列番号１若しくは配列番号２の８８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９６；配列番号１若しくは配列番号２の１０４；配列番号１若しくは配列番号２の１０５；配列番号１若しくは配列番号２の１０７；配列番号１若しくは配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１０９；配列番号１若しくは配列番号２の１１０；配列番号１若しくは配列番号２の１１１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１１２；配列番号１若しくは配列番号２の１４１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１４７；配列番号１若しくは配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１７９；配列番号１若しくは配列番号２の１８０；配列番号１若しくは配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８４；配列番号１若しくは配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８６；配列番号１若しくは配列番号２の１８７；配列番号１若しくは配列番号２の１８８；配列番号１若しくは配列番号２の１８９；配列番号１若しくは配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；配列番号３の２４１；配列番号１若しくは配列番号２の２４２；配列番号１若しくは配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１若しくは配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１若しくは配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の２６４；配列番号１若しくは配列番号２の２６５；及び配列番号１若しくは配列番号２の２８６のうちの１つに位置する、天然に存在するアミノ酸と比べた、非保存的アミノ酸（例えば、下掲の表４を参照されたい）である。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ及びＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、及びＭ；Ｌ４９からＡ又はＧ；Ｆ５０；Ａ５１からＶ；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｌ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｄ９４；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｌ１０８からＡ、Ｇ、及びＭ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｃ２４２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｃ２６２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれから本質的になる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、以下のアミノ酸置換Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、若しくはＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／又はＴ２８６Ｉのうちの少なくとも１つを伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれから本質的になる。これらのエピトープを破壊する置換は、エピトープ領域１つ当たり複数の置換、及び／又は破壊されているが、なおも、志賀毒素のエフェクター機能を保持する、複数のエピトープ領域を伴う、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドを形成するように組み合わされうる。例えば、天然位置の残基における置換である、Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、若しくはＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／又はＴ２８６Ｉは、可能な場合、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドを創出するように、天然位置の残基における置換である、Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、若しくはＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／又はＴ２８６Ｉと組み合わされうる。
本明細書で記載される、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域、及び／又はエピトープを破壊する変異は、単独で使用される場合もあり、本明細書で記載される方法を含む、本明細書で記載される各個別の実施形態と組み合わせて使用される場合もある。
２．プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド
一部の実施形態では、結合分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域と、（２）志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフとを含む。志賀毒素構成要素と、他の結合分子の構成要素、例えば、細胞をターゲティングする結合領域との接続の安定性の改善は、例えば、タンパク質分解の結果としての、接続の断絶及び細胞ターゲティングの喪失などにより引き起こされる、非特異的毒性を低減することにより、生物への投与の後における、それらの毒性プロファイルを改善しうる。
志賀毒素ファミリーのメンバーの志賀毒素Ａサブユニットは、志賀毒素機能に重要な、それらのＡ１断片領域のカルボキシ末端において、保存された、フーリン切断部位を含む。フーリン切断部位モチーフ及びフーリン切断部位は、標準的技法を使用する当業者により、及び／又は本明細書における情報を使用することにより同定されうる。
志賀毒素Ａサブユニット内及び志賀毒素エフェクターポリペプチド内の、フーリン切断モチーフ及びフーリン切断部位は、標準的方法を使用する当業者により、及び／又は本明細書における情報を使用することにより同定されうる。フーリンは、最小限のコンセンサスモチーフである、Ｒ－ｘ－ｘ－Ｒを切断する（Schalken J et al., J Clin Invest 80: 1545-9 (1987); Bresnahan P et al., J Cell Biol 111: 2851-9 (1990); Hatsuzawa K et al., J Biol Chem 265: 22075-8 (1990); Wise R et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 9378-82 (1990); Molloy S et al., J Biol Chem 267: 16396-402 (1992)）。多くのフーリン阻害剤が、Ｒ－ｘ－ｘ－Ｒというモチーフを含むペプチドを含むことは、これと符合する。フーリンの合成阻害剤の例は、ペプチドであるR-V-K-Rを含む分子（Henrich S et al., Nat Struct Biol 10: 520-6 (2003)）である。一般に、２つのアミノ酸残基により隔てられた、２つの、正に帯電したアミノ酸を伴う、表面においてアクセス可能な、二塩基性アミノ酸モチーフを含むペプチド又はタンパク質は、モチーフ内の最後の塩基性アミノ酸のカルボキシ結合において生じる切断を伴う、フーリンによる切断に対して感受性であることが予測されうる。
フーリンにより切断される、基質内のコンセンサスモチーフは、ある程度の特異性を伴って、同定されている。Schechter I, Berger, A, Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902 (1968)において記載されている命名法を使用して、Ｐ１４～Ｐ６’と表示されうる、２０の連続アミノ酸残基の領域を含む、フーリン切断部位モチーフについて記載されている（Tian S et al., Int J Mol Sci 12: 1060-5 (2011)）。この命名法に従うと、フーリン切断部位は、Ｐ１と名指されたアミノ酸残基のカルボキシ結合にあり、フーリン切断モチーフのアミノ酸残基は、この参照Ｐ１残基から、アミノ末端へ向かう方向に、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４などと番号付けされる。Ｐ１参照残基から、カルボキシ末端へ向かう、モチーフのアミノ酸残基は、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’などのプライム表記を伴って番号付けされる。この命名法を使用すると、Ｐ６～Ｐ２’領域は、フーリンの酵素ドメインが結合するフーリン切断モチーフのコア基質を画定する。２つのフランキング領域である、Ｐ１４～Ｐ７及びＰ３’～Ｐ６’は、それらの間に位置する、フーリン切断部位のコアへのアクセシビリティーを増大させる、極性のアミノ酸残基に富むことが多い。
天然の志賀毒素Ａサブユニット内の、志賀毒素のＡ１断片とＡ２断片との接合部において見出される、２０アミノ酸残基の、フーリン切断モチーフ及びフーリン切断部位は、ある特定の志賀毒素内で、十分に特徴付けられている。例えば、ＳｔｘＡ（配列番号２）及びＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）では、このフーリン切断モチーフは、天然位置の、Ｌ２３８～Ｆ２５７に存在し、ＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）では、このフーリン切断モチーフは、天然位置の、Ｖ２３７～Ｑ２５６に存在する。本明細書で記載される、アミノ酸相同性実験及び／又はフーリン切断アッセイに基づき、当業者は、他の天然の志賀毒素Ａサブユニット内又は志賀毒素エフェクターポリペプチド内でも、フーリン切断モチーフを同定することが可能であり、この場合、モチーフは、実際のフーリン切断モチーフであるか、又は真核細胞内の、これらの分子の、フーリンによる切断の後で、Ａ１断片及びＡ２断片の産生を結果としてもたらすことが予測される。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来ポリペプチドと、（２）志賀毒素Ａ１断片由来ポリペプチドのカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフとを含む。志賀毒素Ａ１断片由来ポリペプチドのカルボキシ末端は、例えば、タンパク質配列アライメントソフトウェアを使用して、（ｉ）天然に存在する志賀毒素により保存されたフーリン切断モチーフ、（ii）天然に存在する志賀毒素により保存された、表面に露出され、伸展したループ、及び／又は（iii）ＥＲＡＤ系により認識されうる、主に疎水性である、アミノ酸残基の連なり（すなわち、疎水性「パッチ」）を同定することによるなど、当技術分野で公知の技法を使用することにより、当業者により同定されうる。
結合分子の、プロテアーゼによる切断に抵抗性である志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端における、任意のフーリン切断モチーフを、完全に欠く場合がある、並びに／又は（２）、その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフ、及び／若しくは志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端に由来する領域を含む。フーリン切断モチーフの破壊は、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基に対する、多様な変化であって、例えば、翻訳後修飾（複数可）、アミノ酸官能基内の、１つ又は２つ以上の原子の変化、１つ又は２つ以上原子の、アミノ酸官能基への付加、非タンパク質性部分（複数可）との会合、及び／又は分枝状タンパク質性構造を結果としてもたらす、アミノ酸残基、ペプチド、ポリペプチドなどへの連結などの変化を含む。
プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書で記載される、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットにおいて記載されている、及び／又は当業者に公知である方法を使用して、天然に存在するのであれ、そうでないのであれ、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドから創出されうるが、この場合、結果として得られる分子は、１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能をやはり保持する。
フーリン切断部位又はフーリン切断モチーフに関する、「破壊」又は「破壊された」という用語は、天然に存在するフーリン切断部位及び／又はフーリン切断モチーフからの変化であって、例えば、志賀毒素Ａ１断片領域、又はそれに由来する同定可能な領域のカルボキシ末端に対して近位の、フーリンによる切断の、野生型志賀毒素Ａサブユニット、又は野生型ポリペプチド配列だけを含む、野生型志賀毒素Ａサブユニットに由来するポリペプチドの、フーリンによる切断と比較した低減を結果としてもたらす変異などの変化を指す。フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基に対する変化は、例えば、フーリン切断モチーフのカルボキシ末端の、欠失、挿入、逆位、置換、及び／又は切断など、フーリン切断モチーフ内の変異のほか、例えば、分子を、アミノ酸残基の官能基とコンジュゲートさせるか、又はこれと連結することを伴う、グリコシル化、アルブミン化などの結果としての翻訳後修飾などを含む。フーリン切断モチーフは、約２０のアミノ酸残基から構成されるため、理論的に、これらの２０の位置のうちのいずれか１つの、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が関わる変化、修飾、変異、欠失、挿入、及び／又は切断は、フーリンによる切断に対する感受性の低減を結果としてもたらしうるであろう（Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)）。フーリン切断部位及び／又はフーリン切断モチーフの破壊は、例えば、トリプシン、及び哺乳動物の血管系において一般的な細胞外プロテアーゼなど、他のプロテアーゼによる切断に対する抵抗性を増大させる場合もあり、そうでない場合もある。所与のプロテアーゼによる切断への感受性に対する、所与の破壊の効果は、当技術分野で公知の技法を使用して、当業者により調べられうる。
「破壊されたフーリン切断モチーフ」とは、天然の志賀毒素Ａサブユニット内の、志賀毒素のＡ１断片とＡ２断片との接合部領域において見出される、保存された、フーリン切断モチーフを表す、２０アミノ酸残基の領域に由来し、フーリンによる、志賀毒素Ａサブユニットの切断が、Ａ１断片及びＡ２断片の産生を結果としてもたらすように、位置させた、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の変化を含む、フーリン切断モチーフであり；この場合、破壊されたフーリン切断モチーフは、当業者に公知である、及び／又は本明細書で記載されている、適切なアッセイを使用して、実験により再現可能な形で、フーリンによる切断をモニタリングするのに、十分に大きなサイズの、カルボキシ末端のポリペプチドと融合された、野生型の志賀毒素Ａ１断片領域を含む参照分子と比較した、フーリンによる切断の低減を呈する。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来ポリペプチドと、（２）志賀毒素Ａ１断片ポリペプチド領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフとを含み；この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチド（及びそれを含む、任意の結合分子）は、フーリンによる切断に対して、例えば、Ａ１断片のカルボキシ末端、及び／又はＡ１断片と、Ａ２断片との間で保存された、フーリン切断モチーフを含む、野生型志賀毒素ポリペプチドなどの参照分子と比較して、より抵抗性である。例えば、１つの分子に対する、フーリンによる切断の、参照分子と比較した低減は、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットにおいて記載され、同じ条件を使用して行われる、インビトロにおけるフーリン切断アッセイを使用し、次いで、切断から得られる、任意の断片のバンド密度の定量を実施して、フーリンによる切断の変化を、定量的に測定することにより決定されうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、インビトロ及び／又はインビボにおいて、フーリンによる切断に対して、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較して、より抵抗性である。
一般に、結合分子の、プロテアーゼによる切断への感受性は、それを、その、フーリンによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドを、志賀毒素Ａ１断片を含む、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドで置きかえた、同じ分子と比較することにより調べられる。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフを含むＰＤ－Ｌ１結合分子は、インビトロでのフーリンによる切断において、そのカルボキシ末端において、ペプチド又はポリペプチドと融合した野生型志賀毒素Ａ１断片を含む参照分子と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上の低減を呈する。
複数のフーリン切断モチーフの破壊について記載されている。例えば、最小限のＲ－ｘ－ｘ－Ｒモチーフ内の、２つの保存されたアルギニンを、アラニンに変異させることは、フーリン及び／又はフーリン様プロテアーゼによるプロセシングを完全に遮断した（例えば、Duda A et al., J Virology 78: 13865-70 (2004)を参照されたい）。フーリン切断部位モチーフは、約２０のアミノ酸残基から構成されるため、理論的に、これらの２０のアミノ酸残基位置のうちのいずれか１つの、１つ又は２つ以上が関わる、ある特定の変異は、フーリンによる切断を失効化させうるか、又はフーリンによる切断効率を低減しうるであろう（例えば、Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)を参照されたい）。
一部の実施形態では、本明細書で記載されている分子は、少なくとも１つの志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａサブユニットの、保存された、高度にアクセス可能な、プロテアーゼによる切断に感受性のループに由来する、１つ又は２つ以上のアミノ酸の破壊を含む。例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａでは、この、高度にアクセス可能な、プロテアーゼ感受性ループは、天然位置のアミノ酸残基２４２～２６１にあり、ＳＬＴ－２Ａでは、この、保存されたループは、天然位置のアミノ酸残基２４１～２６０にある。ポリペプチド配列の相同性に基づき、当業者は、この、保存された、高度にアクセス可能なループ構造を、他の志賀毒素Ａサブユニット内でも同定しうる。このループ内のアミノ酸残基に対する、ある特定の変異は、ループ内の、ある特定のアミノ酸残基の、タンパク質分解性切断へのアクセシビリティーを低減することが可能であり、これは、フーリン切断感受性を低減しうるであろう。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、志賀毒素Ａサブユニット間で保存された、表面露出型プロテアーゼ感受性ループ内に変異を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、志賀毒素Ａサブユニットの、このプロテアーゼ感受性ループ内の変異であって、フーリン切断感受性が低減されるように、ループ内の、ある特定のアミノ酸残基に対する表面アクセシビリティーを低減する変異を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドの、破壊されたフーリン切断モチーフは、例えば、最小限のフーリン切断モチーフである、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒの、１及び４位におけるアミノ酸残基など、コンセンサスアミノ酸残基である、Ｐ１及びＰ４の一方又は両方の、存在、位置、又は官能基に照らした破壊を含む。例えば、最小限のフーリンコンセンサス部位である、Ｒ－ｘ－ｘ－Ｒ内の、２つのアルギニン残基の一方又は両方の、アラニンへの変異は、フーリン切断モチーフを破壊し、この部位における、フーリンによる切断を防止するであろう。同様に、最小限のフーリン切断モチーフである、Ｒ－ｘ－ｘ－Ｒ内のアルギニン残基の一方又は両方の、当業者に公知の、任意の非保存的アミノ酸残基へのアミノ酸残基置換は、モチーフのフーリン切断感受性を低減するであろう。特に、アルギニンの、例えば、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、及びＹなど、陽性電荷を欠く、任意の非塩基性アミノ酸残基へのアミノ酸残基置換は、破壊されたフーリン切断モチーフを結果としてもたらすであろう。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドの、破壊されたフーリン切断モチーフは、介在するアミノ酸残基の数が、２以外であることに関して、コンセンサスアミノ酸残基である、Ｐ４とＰ１との間隔の破壊を含み、したがって、Ｐ４及び／又はＰ１を、異なる位置に変更し、Ｐ４及び／又はＰ１の指定を廃する。例えば、最小限のフーリン切断部位のフーリン切断モチーフ内、又はコアのフーリン切断モチーフ内の欠失は、フーリン切断モチーフのフーリン切断感受性を低減するであろう。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換であって、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基であるＲ２４８、及び／又は任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換されたＲ２５１；並びにＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基であるＹ２４７、及び／又は任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換されたＲ２５０などのアミノ酸残基置換を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、破壊されていない、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒを含むが、代わりに、例えば、天然位置の、例えば、２４１～２４７及び／又は２５２～２５９における、フーリン切断モチーフのフランキング領域内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基におけるアミノ酸残基置換など、破壊されたフランキング領域を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの、Ｐ１～Ｐ６領域内に位置するアミノ酸残基のうちの、１つ又は２つ以上の置換；Ｐ１’の、例えば、Ｒ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、及びＨなどのバルクアミノ酸への変異誘発；及びＰ２’の、極性かつ親水性のアミノ酸残基への変異誘発；並びに、フーリン切断モチーフの、Ｐ１’～Ｐ６’領域内に位置するアミノ酸残基のうちの、１つ又は２つ以上の、１つ又は２つ以上の、バルクかつ疎水性のアミノ酸残基による置換を含む。
一部の実施形態では、フーリン切断モチーフの破壊は、フーリン切断モチーフ内の、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、逆位、及び／又は変異を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性である志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然位置の、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）、若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４９～２５１；又は志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７～２５０、或いは保存された志賀毒素エフェクターポリペプチド内、及び／又は非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列内の、同等な位置における、アミノ酸配列の破壊を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、フーリン切断モチーフ内の、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む破壊を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、プロテアーゼ切断モチーフ領域内の、少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む破壊を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの反転されたアミノ酸が、プロテアーゼモチーフ領域内にある、アミノ酸の逆位を含む破壊を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、非標準アミノ酸又は側鎖が化学修飾されたアミノ酸へのアミノ酸置換などの変異を含む破壊を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフ内の、カルボキシ末端のアミノ酸残基のうちの、９つ、１０、１１、又は１２以上の欠失を含む。これらの実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断部位又は最小限のフーリン切断モチーフを含まなくなる。言い換えれば、ある特定の実施形態は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端における、フーリン切断部位を欠く。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、アミノ酸残基の欠失、及びアミノ酸残基置換の両方を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失及び置換であって、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基であるＲ２４８、及び／又は任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換されたＲ２５１；並びにＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基であるＹ２４７、及び／又は任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換されたＲ２５０などのアミノ酸残基の欠失及び置換を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、アミノ酸残基の欠失、及びアミノ酸残基置換、並びにカルボキシ末端の切断を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失及び置換であって、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基であるＲ２４８、及び／又は任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換されたＲ２５１；並びにＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基であるＹ２４７、及び／又は任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換されたＲ２５０などのアミノ酸残基の欠失及び置換を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較した、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内のアミノ酸置換、及びカルボキシ末端の切断の両方を含む、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２位以降のアミノ酸位置を終端とする切断などを含み、適切な場合、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基である、Ｒ２４８及び／又はＲ２５１を含み；ＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２位以降のアミノ酸位置を終端とする切断などを含み、適切な場合、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基である、Ｙ２４７及び／又はＲ２５０を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、挿入されたアミノ残基（複数可）が、デノボで、フーリン切断部位を創出しない限りにおいて、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の挿入を含む。一部の実施形態では、例えば、２４９若しくは２５０における、したがって、Ｒ２４８とＲ２５１との間における、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸残基の挿入を含む、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来ポリペプチド；又は２４８若しくは２４９における、したがって、Ｙ２４７とＲ２５０との間における、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸残基の挿入を含む、ＳＬＴ－２Ａ由来ポリペプチドなど、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の挿入は、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内の、アルギニン残基の間の、天然の間隔を破壊する。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、アミノ酸残基の挿入、及びカルボキシ末端の切断の両方を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、アミノ酸残基の挿入、及びアミノ酸残基置換の両方を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、アミノ酸残基の挿入、及びアミノ酸残基の欠失の両方を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、及びアミノ酸残基置換を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換、及びカルボキシ末端の切断を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ペプチド結合により、アミノ酸、ペプチド、及び／又はポリペプチドを含む分子部分と、直接融合されており、この場合、融合構造は、単一の、連続ポリペプチドを伴う。これらの融合についての実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフに後続するアミノ酸配列は、融合体接合部において、デノボで、フーリン切断部位を創出しないものとする。
任意の、上記のプロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域及び／又は破壊されたフーリン切断モチーフは、単独で使用される場合もあり、本明細書で記載される方法を含む、本明細書で記載される各個別の実施形態と組み合わせて使用される場合もある。
３．Ｔ細胞が高度免疫化された、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド
一部の実施形態では、結合分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープペプチドを含む。一部の実施形態では、エピトープペプチドは、例えば、志賀毒素Ａサブユニットに対して異種であると考えられるエピトープなどの、異種Ｔ細胞エピトープペプチドである。一部の実施形態では、エピトープペプチドは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープである。一部の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドは、１０－４モル濃度以下の解離定数（ＫＤ）により特徴付けられる、ＭＨＣクラスＩ分子に対する結合アフィニティーを有する、及び／又は結果として得られる、ＭＨＣクラスＩ－エピトープペプチド複合体は、１０－４モル濃度以下の解離定数（ＫＤ）により特徴付けられる、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ；t-cell receptor）に対する結合アフィニティーを有する。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープなど、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、異種Ｔ細胞エピトープは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが由来する、天然に存在する志賀毒素ポリペプチド内、又は親である志賀毒素エフェクターポリペプチド内で同定可能な、内因性のエピトープ又はエピトープ領域（例えば、Ｂ細胞エピトープ及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ）を破壊するように埋め込まれるか、又は挿入される。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド（及びそれを含む、任意の結合分子）は、例えば、野生型志賀毒素ポリペプチドなどと比較して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化されている。各々のＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、埋め込まれるか、又は挿入されたＴ細胞エピトープペプチドを含む。高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書で記載される、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットにおいて記載されている、及び／又は当業者に公知の方法を使用して、天然に存在するのであれ、そうでないのであれ、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドから創出される場合があり、この場合、結果として得られる分子は、１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能をやはり保持する。
Ｔ細胞エピトープは、抗原ペプチドに含まれ、直鎖状のアミノ酸配列により表されうる分子構造である。一般に、Ｔ細胞エピトープは、８～１１アミノ酸残基のサイズのペプチドである（Townsend A, Bodmer H, Annu Rev Immunol 7: 601-24 (1989)）が、ある特定のＴ細胞エピトープペプチドは、長さが、８アミノ酸長より短いか、又は１１アミノ酸長より長い（例えば、Livingstone A, Fathman C, Annu Rev Immunol 5: 477-501 (1987); Green K et al., Eur J Immunol 34: 2510-9 (2004)を参照されたい）。一部の実施形態では、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープは、少なくとも７アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープには、Stone J et al., Immunology 126: 165-76 (2009)における式を使用して計算される、１０ｍＭ未満（例えば、１～１００μＭ）のＫＤにより特徴付けられる結合アフィニティーで、ＴＣＲが結合する。しかし、ＭＨＣペプチド－ＴＣＲ複合体の安定性、ＭＨＣペプチドの密度、及びＣＤ８などのＴＣＲ補因子のＭＨＣ非依存性機能のような因子（Baker B et al., Immunity 13: 475-84 (2000); Hornell T et al., J Immunol 170: 4506-14 (2003); Woolridge L et al., J Immunol 171: 6650-60 (2003)）などのために、ＭＨＣエピトープと、ＴＣＲとの、所与の範囲内の結合アフィニティーは、抗原性及び／又は免疫原性と相関しない場合があることに注意されたい（例えば、Al-Ramadi B et al., J Immunol 155: 662-73 (1995)を参照されたい）。
一部の実施形態では、分子は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部のさらなる実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、ヒト免疫系に関するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープである。一部の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、少なくとも７つ、８つ、９つ、又は１０のアミノ酸残基を有するペプチドである。一部の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、９つのアミノ酸残基を含むか、又はこれからなる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープには、例えば、当業者に公知のインビトロアッセイを使用して決定される、１０ｍＭ未満（例えば、１～１００μＭ）のＫＤにより特徴付けられる結合アフィニティーで、ヒトＴＣＲが結合しうる。
一部の実施形態では、分子は、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号７８）の配列を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、分子は、配列ＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号７９）を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、分子は、配列ＳＩＩＮＦＥＫＹＬ（配列番号８０）を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、分子は、配列ＧＬＤＲＮＳＧＮＹ（配列番号８１）を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、分子は、配列ＧＶＭＴＲＧＲＬＫ（配列番号８２）を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、分子は、配列ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号８３）を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、分子は、配列ＩＬＲＧＳＶＡＨＫ（配列番号８４）を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号７８～８４のうちのいずれか１つの配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号７８～８４のうちのいずれか１つの配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号７８の配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号７９の配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号８０の配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号８１の配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号８２の配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号８３の配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号４１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号８４の配列を含むＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む。
異種Ｔ細胞エピトープとは、本明細書で記載される、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットにおいて記載されている、及び／又は当業者に公知の方法による修飾のために、供給源ポリペプチドとして使用される、野生型志賀毒素Ａサブユニット内；天然に存在する志賀毒素Ａサブユニット内；及び／又は親の志賀毒素エフェクターポリペプチド内に、未だ存在していないエピトープである。
異種Ｔ細胞エピトープペプチドは、例えば、供給源ポリペプチド内に、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を創出する方法、１つ又は２つ以上のアミノ酸を、供給源ポリペプチドと融合させる方法、１つ又は２つ以上のアミノ酸を、供給源ポリペプチドへ挿入する方法、ペプチドを、供給源ポリペプチドと連結する方法、及び／又は前述の方法の組合せを含む、当業者に公知の多数の方法を介して、供給源ポリペプチドに組み込まれうる。このような方法の結果は、１つ又は２つ以上の、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープペプチドを含む、供給源ポリペプチドの、修飾されたバリアントの創出である。
Ｔ細胞エピトープは、本明細書で記載される使用のための、多数の供給源分子から選び出されうるか、又はこれらに由来しうる。Ｔ細胞エピトープは、多様な、天然に存在するタンパク質から創出されうるか、又はこれらに由来しうる。Ｔ細胞エピトープは、多様な、例えば、微生物のタンパク質など、哺乳動物に対して外来である、天然に存在するタンパク質から創出されうるか、又はこれらに由来しうる。Ｔ細胞エピトープは、変異ヒトタンパク質及び／又は悪性ヒト細胞により、異常に発現される、ヒトタンパク質から創出されうるか、又はこれらに由来しうる。Ｔ細胞エピトープは、合成的に創出されうるか、又は合成分子に由来しうる（例えば、Carbone F et al., J Exp Med 167: 1767-9 (1988); Del Val M et al., J Virol 65: 3641-6 (1991); Appella E et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1: 177-84 (1995); Perez S et al., Cancer 116: 2071-80 (2010)を参照されたい）。
いかなるＴ細胞エピトープペプチドも、異種Ｔ細胞エピトープとして使用されるものとして想定されうるが、ある特定のエピトープが、所望の特性に基づき、選択されうる。本明細書で記載される１つの目的は、脊椎動物への投与のための、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを創出することであり、異種Ｔ細胞エピトープが、高度に免疫原性であり、インビボにおいて、細胞の表面上で、ＭＨＣクラスＩ分子と、複合体化されて提示されると、ロバストな免疫応答を誘発しうることを意味する。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープである、１つ又は２つ以上の、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む。異種ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドであると考えられる。
Ｔ細胞エピトープの構成要素は、脊椎動物の免疫応答を誘発することが可能であることが既知である、多数の供給源分子から選び出されうるか、又はこれらに由来しうる。Ｔ細胞エピトープは、例えば、病原性微生物のタンパク質、及び非自己であるがん抗原など、脊椎動物に対して外来である、多様な、天然に存在するタンパク質に由来しうる。特に、感染性微生物は、公知の抗原特性及び／又は免疫原性特性を伴う、多数のタンパク質を含有しうる。さらに、感染性微生物は、公知の抗原性及び／又は免疫原性の亜領域又はエピトープを伴う、多数のタンパク質を含有しうる。
例えば、哺乳動物宿主を伴う、細胞内病原体のタンパク質は、Ｔ細胞エピトープの供給源である。十分に研究された抗原タンパク質又は抗原ペプチドを伴う、ウイルス、細菌、真菌、及び単細胞真核生物など、多数の細胞内病原体が存在する。Ｔ細胞エピトープは、例えば、マイコバクテリアのような細菌、トキソプラズマのような真菌、及びトリパノソーマのような原生生物などの、ヒトウイルス又は他の細胞内病原体から選択又は同定されうる。
例えば、ヒトに対して感染性であるウイルスに由来するウイルス性タンパク質の、多くの、免疫原性である、ウイルス性ペプチド構成要素が存在する。多数のヒトＴ細胞エピトープが、タンパク質であるＨＡの糖タンパク質である、ＦＥ１７、Ｓ１３９／１、ＣＨ６５、Ｃ０５、ヘマグルチニン１（ＨＡ１；hemagglutinin 1）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２；hemagglutinin 2）、非構造的タンパク質１及び２（ＮＳ１及びＮＳ２；nonstructural protein 1及び2）、マトリックスタンパク質１及び２（Ｍ１及びＭ２；matrix protein 1及び2）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ；nucleoprotein）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ；neuraminidase）におけるペプチドなど、Ａ型インフルエンザウイルスに由来するタンパク質内のペプチドとマッピングされており、これらのペプチドの多くは、エクスビボアッセイを使用することなどにより、ヒト免疫応答を誘発することが示されている。同様に、多数のヒトＴ細胞エピトープが、タンパク質ｐｐ６５（ＵＬ８３）、ＵＬ１２８～１３１、即初期１（ＩＥ－１；ＵＬ１２３；immediate-early 1）、糖タンパク質Ｂ、テグメントタンパク質におけるペプチドなど、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ；human cytomegalovirus）に由来するタンパク質のペプチド構成要素とマッピングされており、これらのペプチドの多くは、エクスビボアッセイを使用することなどにより、ヒト免疫応答を誘発することが示されている。
別の例は、ヒトには、免疫原性のがん抗原が多く存在するということである。がん細胞抗原及び／又は腫瘍細胞抗原のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、例えば、示差的ゲノミクス、示差的プロテオミクス、イムノプロテオミクス、予測に次ぐ検証、及び逆遺伝学トランスフェクションなどの遺伝学法（例えば、Admon A et al., Mol Cell Proteomics 2: 388-98 (2003); Purcell A, Gorman J, Mol Cell Proteomics 3: 193-208 (2004); Comber J, Philip R, Ther Adv Vaccines 2: 77-89 (2014))を参照されたい）など、当技術分野で公知の技法を使用して、当業者により同定されうる。ヒトのがん細胞内及び／又は腫瘍細胞内で生じることが、既に同定されるか、又は予測されている、抗原性のＴ細胞エピトープ及び／又は免疫原性のＴ細胞エピトープが多く存在する。例えば、Ｔ細胞エピトープは、例えば、ＡＬＫ、ＣＥＡ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ－Ｖ）、ＨＣＡ５８７、ＰＤ－Ｌ１／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＭＵＣ－１、ｐ５３、及びＴＲＡＧ－３など、一般に、新生物性細胞内で、変異又は過剰発現されるものとしてヒトタンパク質中において予測されている（例えば、van der Bruggen P et al., Science 254: 1643-7 (1991); Kawakami Y et al., J Exp Med 180: 347-52 (1994); Fisk B et al., J Exp Med 181: 2109-17 (1995); Guilloux Y et al., J Exp Med 183: 1173 (1996); Skipper J et al., J Exp Med 183: 527 (1996); Brossart P et al., 93: 4309-17 (1999); Kawashima I et al., Cancer Res 59: 431-5 (1999); Papadopoulos K et al., Clin Cancer Res 5: 2089-93 (1999); Zhu B et al., Clin Cancer Res 9: 1850-7 (2003); Li B et al., Clin Exp Immunol 140: 310-9 (2005); Ait-Tahar K et al., Int J Cancer 118: 688-95 (2006); Akiyama Y et al., Cancer Immunol Immunother 61: 2311-9 (2012)を参照されたい）。加えて、ヒトがん細胞に由来するＴ細胞エピトープの合成バリアントも創出されている（例えば、Lazoura E, Apostolopoulos V, Curr Med Chem 12: 629-39 (2005); Douat-Casassus C et al., J Med Chem 50: 1598-609 (2007)を参照されたい）。
加えて、ＭＨＣクラスＩによる提示のための、複数の、免疫原性の、Ｔ細胞エピトープは、例えば、複数のＴ細胞エピトープの、同時の、ターゲティングされた送達における使用などのために、同じ、志賀毒素エフェクターポリペプチド内に埋め込まれうる。
本明細書で記載される、プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域、及び／又は破壊されたフーリン切断モチーフのうちのいずれかは、単独で使用される場合もあり、本明細書で記載される方法を含む、本明細書で記載される、各個別の実施形態と組み合わせて使用される場合もある。
Ｃ．さらなる外因性素材
一部の実施形態では、結合分子は、さらなる外因性素材を含む。本明細書で使用される、「さらなる外因性素材」とは、結合分子により細胞の内部に輸送できる、１つ又は２つ以上の原子又は分子を指す。一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、それが、典型的に天然標的細胞内又は天然志賀毒素内に存在するのであれ、存在しないのであれ、結合分子により細胞の内部へ輸送される任意の素材である。一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、一般に、志賀毒素及び／又は天然標的細胞内に存在しない素材である。１つの意味では、結合分子全体が、細胞に侵入する外因性素材であり；したがって、「さらなる」外因性素材は、コアの結合分子自体と連結されているが、これ以外の異種素材である。さらなる外因性素材の非限定例は、放射性核種、ペプチド、検出促進剤、タンパク質、低分子化学療法剤、及びポリヌクレオチドである。
結合分子についての、一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、６０Ｃ、及び／又はルテチウムの放射性同位体など、１つ又は２つ以上放射性核種である。
一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、アポトーシス促進性ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、など、例えば、ＢＣＬ－２、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３又はカスパーゼ６の断片）、チトクローム、グランザイムＢ、アポトーシス誘導性因子（ＡＩＦ）、ＢＡＸ、ｔＢｉｄ（切断型Ｂｉｄ）、及びアポトーシス促進性断片、又はこれらの派生物（例えば、Ellerby H et al., Nat Med 5: 1032-8 (1999); Mai J et al., Cancer Res 61: 7709-12 (2001); Jia L et al., Cancer Res 63: 3257-62 (2003); Liu Y et al., Mol Cancer Ther 2: 1341-50 (2003); Perea S et al., Cancer Res 64: 7127-9 (2004); Xu Y et al., J Immunol 173: 61-7 (2004); Dalken B et al., Cell Death Differ 13: 576-85 (2006); Wang T et al., Cancer Res 67: 11830-9 (2007); Kwon M et al., Mol Cancer Ther 7: 1514-22 (2008); Qiu X et al., Mol Cancer Ther 7: 1890-9 (2008); Shan L et al., Cancer Biol Ther 11: 1717-22 (2008); Wang F et al., Clin Cancer Res 16: 2284-94 (2010); Kim J et al., J Virol 85: 1507-16 (2011)を参照されたい）などを含む。
一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、酵素を含む、タンパク質又はポリペプチドを含む。ある特定の、他の実施形態では、さらなる外因性素材は、例えば、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として機能するリボ核酸などの核酸である。一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、病原体、細菌性タンパク質、ウイルス性タンパク質、がんにおいて変異したタンパク質、がんにおける発現が異常なタンパク質、又はＴ細胞相補性決定領域に由来する抗原などの抗原である。例えば、外因性素材は、細菌に感染した抗原提示細胞に特徴的な抗原、及び外因性抗原として機能することが可能な、Ｔ細胞相補性決定領域などの抗原を含む。ポリペプチド又はタンパク質を含む外因性素材は、当業者に公知であれ、未知であれ、１つ又は２つ以上の抗原を含んでもよい。
結合分子についての、一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合させる全ての異種抗原及び／又は異種エピトープは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、アミノ末端側の、結合分子内に配置する。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合させる、全ての異種抗原及び／又は異種エピトープは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、アミノ末端側の位置において、志賀毒素エフェクターポリペプチドと、直接的に、又は間接的に会合させる。一部の実施形態では、抗原である、全てのさらなる外因性素材（複数可）は、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端と、直接的に、又は間接的に融合するなど、志賀毒素エフェクターポリペプチドに対して、アミノ末端側に配置する。
結合分子についての、一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、例えば、低分子化学療法剤、抗新生物剤、細胞毒性抗生剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び／又はチューブリン阻害剤などの細胞毒性剤である。本明細書で記載される使用に適切な細胞毒性剤の非限定例は、アジリジン、シスプラチン、テトラジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ビンカアルカロイド、タキサン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、アクラルビシン、アントラサイクリン、アクチノマイシン、アマンチン、アマトキシン、ブレオマイシン、センタナマイシン（インドールカルボキサミド）、プリカマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ドラスタチン、メイタンシン、メイタンシノイド、ヅラマイシン、ドセタキセル、デュオカルマイシン、アドリアマイシン、カリケアミシン、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ；pyrrolobenzodiazepine dimer）、カルボプラチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ；5-fluorouracil）、カペシタビン、マイトマイシンＣ、パクリタキセル、１，３－ビス（２－クロロエチル）－１－ニトロソウレア（ＢＣＮＵ；1,3-Bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea）、リファンピシン、シスプラチン、メトトレキサート、ゲムシタビン、アセグラトン、アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）、アクラシノマイシン、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１、アルドホスファミドグリコシド、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン）、アルキル化剤（例えば、チオテパ及びシクロホスファミド）、アミノレブリン酸、アミノプテリン、アムサクリン、アンシタビン、アントラマイシン、アラビノシド、アザシチジン、アザセリン、アジリジン（例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ）、アザウリジン、ベストラブシル、ビサントレン、ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カクチノマイシン、カリスタチン、カラビシン、カルミノマイシン、カルモフール、カルムスチン、カルジノフィリン、ＣＣ－１０６５、クロラムブシル、クロランブシル、クロルナファジン、クロロゾトシン、クロモマイシン、クロモプロテイン系エンジイン抗生剤であるクロモフォア、ＣＰＴ－１１、クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、デフォファミン、デメコルシン、デトルビシン、ジアジコン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ジデオキシウリジン、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ；difluoromethylornithine）、ドキシフルリジン、ドキソルビシン（例えば、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン）、ジネミシン、エダトラキセート、エダトレキサート、エレウテロビン、エルホルミチン、酢酸エリプチニウム、エンジイン抗生剤（例えば、カリケアミシン）、エニルウラシル、エノシタビン、エピルビシン、エポチロン、エソルビシン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチレンイミン、２－エチルヒドラジド、エトグルシド、フルダラビン、葉酸アナログ（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、及びトリメトレキサート）、葉酸補充在（例えば、フロリン酸）、ホテムスチン、フルベストラント、ガシトシン、硝酸ガリウム、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イバンドロネート、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、エルロチニブ、フルベストラント、レトロゾール、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（Novartis社、Ｂａｓｅｌ、ＣＨ）、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパマイシン、ラパチニブ、ロナファルニブ、ソラフェニブ、メチラメラミン（例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロメラミン）、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンジスタチン、窒素マスタード（例えば、クロランブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン）、ジネミシン、ネオカルチノスタチン・クロモフォア、アントラマイシン、デトルビシン、エピルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ウベニメクス、ジノステチン、ゾルビシン、プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニン）、ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジン）、アセグラトン、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド（例えば、メイタンシン及びアンサマイトシン）、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、リゾキシン、シゾフラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２’’トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（例えば、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）、ウレタン、ビンデシン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、アラビノシド、シクロホスファミド、トキソイド（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、白金、白金アナログ（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）、エトポシド（ＶＰ－１６）、ミトキサントロン、ビノレルビン、ノバントロン、ダウノマイシン、ゼローダ、トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ２０００、レチノイド（例えば、レチノイン酸）、カペシタビン、ロムスチン、ロソキサントロン、メルカプトプリン、ニムスチン、ニトラエリン、ラパマイシン、ラゾキサン、ロリジンＡ、スポンジスタチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スーテント、Ｔ－２毒素、チアミプリン、チオテパ、トキソイド（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ツベルシジン、ベラクリンＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、並びに前述のうちのいずれかの構造的アナログ（例えば、合成アナログ）、及び／又は前述のうちのいずれかの派生物（例えば、Lindell T et al., Science 170: 447-9 (1970); Remillard S et al., Science 189: 1002-5 (1975); Ravry M et al., Am J Clin Oncol 8: 148-50 (1985); Ravry M et al., Cancer Treat Rep 69: 1457-8 (1985); Sternberg C et al., Cancer 64: 2448-58 (1989); Bai R et al., Biochem Pharmacol 39: 1941-9 (1990); Boger D, Johnson D, Proc Natl Acad Sci USA 92: 3642-9 (1995); Beck J et al., Leuk Lymphoma 41: 117-24 (2001); Cassady J et al., Chem Pharm Bull (Tokyo) 52: 1-26 (2004); Sapra P et al., Clin Cancer Res 11: 5257-64 (2005); Okeley N et al., Clinc Cancer Res 16: 888-97 (2010); Oroudjev E et al., Mol Cancer Ther 9: 2700-13 (2010); Ellestad G, Chirality 23: 660-71 (2011); Kantarjian H et al., Lancet Oncol 13: 403-11 (2012); Moldenhauer G et al., J Natl Cancer Inst 104: 622-34 (2012); Meulendijks D et al., Invest New Drugs 34: 119-28 (2016)を参照されたい）を含む。
下記の表２に、例示的なカルボキシ末端外因性素材の非限定的なリストを提示する。これらのカルボキシ末端外因性素材は、例えば、結合分子により標的細胞内に送達されうる。
Figure 2022548078000002
一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと、配列番号１７４～１８７のうちのいずれか１つの配列を含むカルボキシ末端部分など、カルボキシ末端部分とを含む。一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと、カルボキシ末端部分とを含み、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１～１８、４０～６８、１６９、１７０、又は１７３のうちのいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと、カルボキシ末端部分とを含み、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号４１の配列を含む。一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと、カルボキシ末端部分とを含み、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号４１の配列を含み、カルボキシ末端部分は、配列番号１７４～１７８のうちのいずれか１つの配列を含む。
II． 構成要素及び／又はそれらの亜構成要素を繋ぐ連結
本明細書で記載される結合分子の個別のＰＤ－Ｌ１結合領域、毒素構成要素、及び／又は他の構成要素は、互いと、適切に連結されうる、例えば、互いと直接的に融合されうる、又は当技術分野で周知である、及び／若しくは本明細書で記載される、１つ若しくは２つ以上のリンカーを介して、互いと、間接的に連結されうる。結合領域の個別のポリペプチド亜構成要素、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤＲ領域、及び／又はＡＢＲ領域は、化学コンジュゲーションを介するものを含む、当技術分野で周知である、及び／又は本明細書で記載される、１つ又は２つ以上のリンカー（例えば、ｓｃＦｖリンカー）を介して、互いと、適切に連結されうる。タンパク質性構成要素、例えば、多重鎖結合領域は、ペプチド結合を介して直接的に、及び／又は当技術分野で周知である１つ若しくは２つ以上のリンカーを介して間接的に、互いと又は他のポリペプチド構成要素と適切に連結されうる。ペプチド構成要素、例えば、ＫＤＥＬファミリー小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）は、ペプチド結合を介して直接的に、又は当技術分野で周知である、タンパク質性リンカーなど、１つ若しくは２つ以上のリンカーを介して、間接的に、別の構成要素と適切に連結されうる。例えば、結合分子の一部の実施形態では、個々のＰＤ－Ｌ１結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチド（並びに／又は結合分子のさらなる構成要素、例えば、Ｔ細胞エピトープ、さらなる外因性素材、及び／若しくはＫＤＥＬモチーフなど）は、当技術分野で周知である、及び／又は本明細書で記載される、１つ又は２つ以上の結合領域リンカーを介して、互いと適切に連結されている、及び／又はコンジュゲートされている。
適切なリンカーは、一般に、各ポリペプチド構成要素が、リンカー又は他の構成要素を伴わずに、個別に作製されたポリペプチド構成要素と、極めて類似の三次元構造でフォールディングすることを可能とするリンカーである。適切なリンカーは、分枝状であれ、環状であれ、多様な非タンパク質性炭素鎖など、前述のうちのいずれかを欠く、単一のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及びリンカーを含む。
適切なリンカーは、タンパク質性であることが可能であり、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸、ペプチド、及び／又はポリペプチドを含む。タンパク質性リンカーは、組換え融合タンパク質及び化学的に連結されたコンジュゲートのいずれにも適切である。タンパク質性リンカーは、典型的に、例えば、約５～約３０又は約６～約２５アミノ酸残基など、約２～約５０アミノ酸残基を有する。選択されるリンカーの長さは、例えば、所望の特性又はリンカーが選択される特性など、様々な因子に依存するであろう。一部の実施形態では、リンカーは、タンパク質性であり、典型的に、末端から、約２０アミノ酸以内の、タンパク質構成要素の末端近傍と連結される。
適切なリンカーは、例えば、化学リンカーなど、非タンパク質性リンカーでありうる。当技術分野で公知の、多様な非タンパク質性リンカーは、免疫グロブリンポリペプチドを、異種ポリペプチドとコンジュゲートさせるのに、一般に使用されるリンカーなど、細胞をターゲティングする結合領域を、結合分子の、志賀毒素エフェクターポリペプチドの構成要素と連結するのに使用されうる。例えば、ポリペプチド領域は、例えば、カルボキシ、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、カルボニル、ヒドロキシル、及び／又は環状基など、それらのアミノ酸残基及び炭水化物部分の官能側鎖を使用して連結されうる。例えば、ジスルフィド結合及びチオエーテル結合は、２つ又は３つ以上のポリペプチドを連結するのに使用されうる。加えて、非天然アミノ酸残基が、ケトン基など、他の官能側鎖と共に使用されうる（例えば、Axup J et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109: 16101-6 (2012); Sun S et al., Chembiochem Jul 18 (2014); Tian F et al., Proc Natl Acad Sci USA 111: 1766-71 (2014)を参照されたい）。加えて、非天然アミノ酸残基は、ケトン基、アルキン基、又はアジドなど、他の官能側鎖と共に使用されうる（例えば、カーゴへのコンジュゲーションのための、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン又はｐ－アジドメチル－Ｎ－フェニルアラニン残基を含むように改変された抗体の使用、U.S. Patent Application Publication No. 14/786,402 US 2017/0362334）を参照されたい）。非タンパク質性化学リンカーの例は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；N-hydroxysuccinimide）エステル、例えば、スルホ－ＮＨＳエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カルボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、及びフルオロフェニルエステルを含むがこれらに限定されない。非タンパク質性化学リンカーのさらなる例は、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）－アミノベンゾエート、Ｓ－（Ｎ－スクシンイミジル）チオアセテート（ＳＡＴＡ；S-(N-succinimidyl) thioacetate）、Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－ｃｕ－メチル－ａ－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ；N-succinimidyl-oxycarbonyl-cu-methyl-a-(2-pyridyldithio) toluene）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）－ペンタノエート（ＳＰＰ；N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-pentanoate）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ又はＭＣＣ；succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane carboxylate）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）－アミノベンゾエート、４－スクシンイミジル－オキシカルボニル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン、スルホスクシンイミジル－６－（α－メチル－α－（ピリジルジチオール）－トルアミド）ヘキサノエート、Ｎ－スクシンイミジル－３－（－２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ；N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-proprionate）、スクシンイミジル６（３（－（－２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル６（３（－（－２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド）ヘキサノエート、マレイミドカプロイル（ＭＣ；maleimidocaproyl）、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ；maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl）、３－マレイミドベンゾエートＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ；3-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester）、アルファ－アルキル誘導体、スルホＮＨＳ－ＡＴＭＢＡ（スルホスクシンイミジルＮ－［３－（アセチルチオ）－３－メチルブチリル－ベータ－アラニン］）、スルホジクロロフェノール、２－イミノチオラン、３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、及びＳ－（２－チオピリジル）－Ｌ－システインを含むがこれらに限定されない。
タンパク質性であれ、非タンパク質性であれ、適切なリンカーは、例えば、プロテアーゼ感受性リンカー、環境内酸化還元電位感受性リンカー、ｐＨ感受性リンカー、酸切断性リンカー、光切断性リンカー、及び／又は熱感受性リンカーを含みうる。
タンパク質性リンカーは、組換え融合結合分子への組込みのために選び出されうる。組換え融合細胞ターゲティングタンパク質のために、リンカーは、典型的に、約２～５０アミノ酸残基、好ましくは、約５～３０アミノ酸残基を含む。一般に、タンパク質性リンカーは、例えば、トレオニン、プロリン、グルタミン、グリシン、及びアラニンなど、極性残基、非帯電残基、及び／又は帯電残基を伴うアミノ酸残基の大部分を含む。タンパク質性リンカーの非限定例は、アラニン－セリン－グリシン－グリシン－プロリン－グルタミン酸（ASGGPE）、バリン－メチオニン（VM）、アラニン－メチオニン（AM）、AM(G2-4S)xAM［ここで、Ｇは、グリシンであり、Ｓは、セリンであり、ｘは、１～１０の整数である］を含む。
タンパク質性リンカーは、所望の特性に基づき選択されうる。タンパク質性リンカーは、融合体の分子フォールディング、安定性、発現、可溶性、薬物動態特性、薬力学特性、及び／又は融合コンストラクトの文脈における、同じドメイン自体の活性と比較した、融合ドメインの活性のうちの、１つ又は２つ以上を最適化するなど、特異的特色を念頭に置く当業者により選び出されうる。例えば、タンパク質性リンカーは、可撓性、非可撓性、及び／又は切断性に基づき選択されうる。当業者は、リンカーを選び出す場合に、データベースと、リンカーデザイン用のソフトウェアツールとを使用しうる。ある特定のリンカーは、発現を最適化するように選び出されうる。ある特定のリンカーは、同一なポリペプチド若しくはタンパク質の間の分子間相互作用を促進して、ホモ多量体を形成するか、又は異なるポリペプチド若しくはタンパク質の間の分子間相互作用を促進して、ヘテロ多量体を形成するように選び出されうる。例えば、例えば、二量体及び他の高次多量体の形成と関連する相互作用など、結合分子のポリペプチド構成要素の間の、所望される非共有結合的相互作用を可能とする、タンパク質性リンカーが選択されうる。
可撓性のタンパク質性リンカーは、１２アミノ酸残基長より大型であり、例えば、グリシン、セリン、及びトレオニンなど、小型で非極性のアミノ酸残基、極性のアミノ酸残基、及び／又は親水性のアミノ酸残基に富むことが多い。可撓性のタンパク質性リンカーは、構成要素間の空間的分離を増大させる、及び／又は構成要素間の分子内相互作用を可能とするように選び出されうる。例えば、当業者には、多様な「ＧＳ」リンカーが、公知であり、例えば、(GxS)n、(SxG)n、(GGGGS)n、及び(G)n［ここで、ｘは、１～６であり、ｎは、１～３０である］（配列番号２６２～２６４、２６６）など、場合によって、反復単位である、複数のグリシン、及び／又は１つ若しくは２つ以上のセリンから構成される。可撓性のタンパク質性リンカーの非限定例は、GKSSGSGSESKS（配列番号１８８）、EGKSSGSGSESKEF（配列番号１８９）、GSTSGSGKSSEGKG（配列番号１９０）、GSTSGSGKSSEGSGSTKG（配列番号１９１）、GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号１９２）、SRSSG（配列番号１９３）、及びSGSSC（配列番号１９４）を含む。
非可撓性のタンパク質性リンカーは、剛直なアルファ－螺旋構造であり、プロリン残基、及び／又は１つ若しくは２つ以上の、戦略的に位置させたプロリンに富むことが多い。非可撓性リンカーは、連結された構成要素間の、分子内相互作用を防止するように選び出されうる。
適切なリンカーは、例えば、切断及び／又は環境特異的不安定性などのために、インビボにおける、構成要素の分離を可能とするように選び出されうる。インビボにおいて切断性のタンパク質性リンカーは、しばしば、生物内又はある特定の細胞型の内部の、特異的部位において、タンパク質分解性プロセシング、及び／又は還元的環境により、連結を解除することが可能である。インビボにおいて切断性のタンパク質性リンカーは、しばしば、プロテアーゼ感受性モチーフ、及び／又は１つ若しくは２つ以上のシステイン対により形成されるジスルフィド結合を含む。インビボにおいて切断性のタンパク質性リンカーは、生物内のある特定の位置、細胞内のある特定の区画だけに存在するプロテアーゼに感受性である、及び／又はある特定の生理学的状態又は病理学的状態（例えば、異常に高レベルを示すプロテアーゼ、ある特定の疾患部位において過剰発現されるプロテアーゼ、及び病原性微生物により特異的に発現されるプロテアーゼを伴う生理学的状態又は病理学的状態など）下だけで活性となるようにデザインされうる。例えば、例えば、Ｒ－ｘ－ｘ－Ｒモチーフ、及びAMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM（配列番号１９５）など、細胞内だけに存在するプロテアーゼ、特異的細胞型だけに存在するプロテアーゼ、及びがん又は炎症のような病理学的状態下だけに存在するプロテアーゼにより切断される、当技術分野で公知のタンパク質性リンカーが存在する。
結合分子についての、一部の実施形態では、標的細胞内に存在するプロテアーゼによる切断をもたらすように、１つ又は２つ以上のプロテアーゼ感受性部位を含むリンカーが使用されうる。一部の実施形態では、脊椎動物への投与の後における、望ましくない毒性を低減するように、切断性ではないリンカーが使用されうる。
適切なリンカーは、タンパク質性であれ、非タンパク質性であれ、例えば、プロテアーゼ感受性リンカー、環境内酸化還元電位感受性リンカー、ｐＨ感受性リンカー、酸切断性リンカー、光切断性リンカー、及び／又は熱感受性リンカーを含みうる（例えば、Doronina S et al., Bioconjug Chem 17: 114-24 (2003); Saito G et al., Adv Drug Deliv Rev 55: 199-215 (2003); Jeffrey S et al., J Med Chem 48: 1344-58 (2005); Sanderson R et al., Clin Cancer Res 11: 843-52 (2005); Erickson H et al., Cancer Res 66: 4426-33 (2006); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい）。適切な切断性リンカーは、当技術分野で公知の切断性基を含むリンカーを含みうる。
適切なリンカーは、ｐＨ感受性リンカーを含みうる。例えば、ある特定の適切なリンカーは、標的細胞の細胞内区画の内部における解離をもたらすように、低ｐＨ環境における、それらの不安定性について選び出されうる（例えば、van Der Velden V et al., Blood 97: 3197-204 (2001); Ulbrich K, Subr V, Adv Drug Deliv Rev 56: 1023-50 (2004)を参照されたい）。例えば、１つ又は２つ以上の、トリチル基、誘導体化トリチル基、ビスマレイミドエトキシプロパン基、アジピン酸ジヒドラジド基、及び／又は酸不安定性トランスフェリン基を含むリンカーは、特異的ｐＨ範囲を伴う環境において、結合分子の構成要素、例えば、ポリペプチド構成要素の放出をもたらしうる。例えば、腫瘍組織内のｐＨは、健常組織内より低値であるなど、組織間の生理学的ｐＨ差に対応するｐＨ範囲内で切断される、ある特定のリンカーが選び出されうる。
光切断性リンカーとは、可視範囲内の光など、ある特定の波長範囲の電磁放射線に曝露されると切断されるリンカーである。光切断性リンカーは、ある特定の波長の光への曝露時に、結合分子の構成要素、例えば、ポリペプチド構成要素を放出するのに使用されうる。光切断性リンカーの非限定例は、システインのための光切断性保護基としてのニトロベンジル基、ニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋リンカー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマー、及びメチルローダミンコポリマーを含む。光切断性リンカーは、光ファイバーを使用して、光に曝露されうる、疾患、障害、及び状態を治療するためにデザインされる、結合分子を形成するように、構成要素を連結する場合に、特に使用される。
結合分子についての、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、共有結合的連結及び非共有結合的連結の両方を含む、当業者に公知の、任意の数の手段を使用して、志賀毒素エフェクターポリペプチドと連結される。
結合分子についての、一部の実施形態では、分子は、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを接続するリンカー（すなわち、ｓｃＦｖリンカー）を伴うｓｃＦｖである、結合領域を含む。例えば、１５残基の（Gly4Ser）３ペプチドなど、この目的に適切な、当技術分野で公知のリンカーが、多数存在する。非共有結合的多価構造の形成に使用されうる、適切なｓｃＦｖリンカーは、GGS、GGGS（配列番号１９６）、GGGGS（配列番号７２）、GGGGSGGG（配列番号１９７）、GGSGGGG（配列番号１９８）、GSTSGGGSGGGSGGGGSS（配列番号１９９）、及びGSTSGSGKPGSSEGSTKG（配列番号２００）を含む。
結合分子の構成要素を連結するために適切な方法は、接合が、細胞をターゲティングする結合領域の結合能、志賀毒素エフェクターポリペプチドの構成要素の、細胞への内部化、及び／又は、該当する場合、本明細書で記載されるアッセイを含む、適切なアッセイにより測定される、所望の志賀毒素のエフェクター機能（複数可）を、実質的に損なわない限りにおいて、このような連結を達するための、現在、当技術分野で公知である、任意の方法による方法でありうる。
結合分子の構成要素、例えば、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド及び／又は免疫グロブリン型ＰＤ－Ｌ１－結合領域は、結合領域リンカーを介して連結されうる。一部の実施形態では、構成要素は、さらなる構成要素、例えば、さらなる外因性素材を連結するために適切な接合部分をもたらすように改変されうる（国際公開第２０１８／１０６８９５号パンフレットを参照されたい）。
結合分子の目的では、具体的な順序又は配向性は、具体的に言及されない限りにおいて、構成要素：志賀毒素エフェクターポリペプチド（複数可）、結合領域（複数可）、及び互い又は全結合分子との関係で、任意であってもよいリンカー（複数可）について固定されない（例えば、図１を参照されたい）。結合分子の構成要素は、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドの所望の活性（複数可）が、消失しないという条件で、いかなる順序でも配置されうる。
III．結合分子の構造的変動の例
一部の実施形態では、結合分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、切断型志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はこれらから本質的になりうる。志賀毒素Ａサブユニットの切断は、例えば、触媒活性及び細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能に影響を及ぼさずに、全エピトープ（複数可）及び／若しくは全エピトープ領域（複数可）、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ、並びに／又はフーリン切断部位の欠失を結果としてもたらしうるであろう。完全な酵素活性を呈することが示された、最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、Ｓｌｔ１Ａの残基１～２３９から構成されるポリペプチドであった（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。著明な酵素活性を呈することが示された、最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、ＳｔｘＡの残基７５～２４７から構成されるポリペプチドであった（Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)）。
志賀毒素エフェクターポリペプチドは一般に、全長志賀毒素Ａサブユニットより小型であるが、結合分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、アミノ酸７７～２３９位のポリペプチド領域（ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、又はＳｔｘＡ（配列番号２））、又は志賀毒素ファミリーのメンバーの他のＡサブユニット内の同等なポリペプチド領域（例えば、（配列番号３）の７７～２３８）を維持することが好ましい。例えば、一部の実施形態では、ＳＬＴ－１Ａに由来する、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７５～２５１、配列番号１の１～２４１、配列番号１の１～２５１、若しくは配列番号１のアミノ酸１～２６１を含みうるか、又はこれらから本質的になることが可能であり、この場合、内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、少なくとも１つのアミノ酸残基が変異されるか、若しくは欠失される、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域が存在する。同様に、ＳｔｘＡに由来する志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、配列番号２のアミノ酸７５～２５１、配列番号２の１～２４１、配列番号２の１～２５１、又は配列番号２のアミノ酸１～２６１を含みうるか、又はこれから本質的になりえ、この場合、内因性のエピトープ領域及び／若しくはエピトープ領域において、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、少なくとも１つのアミノ酸残基が、変異されるか、若しくは欠失されている、並びに／又は、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域が存在する。加えて、ＳＬＴ－２に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、配列番号３のアミノ酸７５～２５１、配列番号３の１～２４１、配列番号３の１～２５１、又は配列番号３のアミノ酸１～２６１を含みうるか、又はこれから本質的になり、この場合、内因性のエピトープ領域及び／若しくはエピトープ領域において、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、少なくとも１つのアミノ酸残基が、変異されるか、若しくは欠失されている、並びに／又は、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域が存在する。
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子のバリアントもまた、本明細書で提示され、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０若しくは４１以上だけのアミノ酸残基、又は最大でこの数のアミノ酸残基（しかし、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を保持するアミノ酸残基数以下）異なる。したがって、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する分子は、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又は９９％以上のアミノ酸配列同一性が維持される限りにおいて、元の配列に対する付加、欠失、切断、又は他の変化を含むことが可能であり、この場合、内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、少なくとも１つのアミノ酸残基が、変異されるか、若しくは欠失される、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域が存在する。
したがって、一部の実施形態では、本明細書で記載される分子の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）、など、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対する、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．７％の全配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になり、この場合、内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、少なくとも１つのアミノ酸残基が、変異されるか、若しくは欠失される、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域が存在する。
志賀毒素Ａサブユニットの全長形又は切断形は、分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含んでもよく、この場合、志賀毒素由来ポリペプチドは、天然に存在する志賀毒素と比較した、１つ又は２つ以上の変異（例えば、置換、欠失、挿入、又は逆位）を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、宿主細胞の形質転換、トランスフェクション、感染、若しくは導入の周知の方法により、又は志賀毒素エフェクターポリペプチドと連結された、細胞をターゲティングする結合領域により媒介される内部化により、細胞への侵入の後に、細胞毒性を保持するのに十分な、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対する配列同一性を有することが好ましい。志賀毒素Ａサブユニット内の酵素活性及び／又は細胞毒性に最も重要な残基は、他の残基位置の中でも、以下の残基位置：アスパラギン７５、チロシン７７、グルタミン酸１６７、アルギニン１７０、及びアルギニン１７６とマッピングされている（Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)）。本明細書で記載される実施形態のうちのいずれか１つでは、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、必ずしもそうではないが、好ましくは、ＳｔｘＡ内、ＳＬＴ－１Ａ内の、７７、１６７、１７０、及び１７６位において見出される位置、又は細胞毒性活性に典型的に要求される、他の志賀毒素ファミリーのメンバー内の、同等な、保存された位置などの位置における、１つ又は２つ以上の保存されたアミノ酸を維持しうる。細胞毒性分子が、細胞死を引き起こす能力、例えば、その細胞毒性は、当技術分野で周知の多数のアッセイのうちの、任意の１つ又は２つ以上を使用して測定されうる。
Ａ．脱免疫化された、志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
一部の実施形態では、結合分子の、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、２つ又は３つ以上の変異を有する、切断型志賀毒素Ａサブユニットから本質的になりうる。志賀毒素Ａサブユニットの切断は、例えば、触媒活性及び細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能に影響を及ぼさずに、全エピトープ（複数可）及び／若しくは全エピトープ領域（複数可）、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ、並びに／又はフーリン切断部位の欠失を結果としてもたらしうるであろう。ＳＬＴ－１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ－２Ａのカルボキシ末端の、アミノ酸 １～２５１への切断は、２つの、予測されるＢ細胞エピトープ領域、２つの、予測されるＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞エピトープ、及び予測される、不連続Ｂ細胞エピトープを除去する。ＳＬＴ－１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ－２Ａのアミノ末端の、７５～２９３への切断は、少なくとも３つの、予測されるＢ細胞エピトープ領域、及び３つの、予測されるＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを除去する。ＳＬＴ－１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ－２Ａのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方の、７５～２５１への切断は、少なくとも５つの、予測されるＢ細胞エピトープ領域、４つの、推定ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ、及び１つの、予測される、不連続Ｂ細胞エピトープを欠失させる。
一部の実施形態では、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、提示された、内因性のＢ細胞エピトープ領域内、及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内の、少なくとも１つの変異（野生型志賀毒素ポリペプチドと比べた）、例えば、欠失、挿入、逆位、又は置換を伴う、全長又は切断型の志賀毒素Ａサブユニットを含みうるか、又はこれらから本質的になりうる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内の、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む、変異（野生型志賀毒素ポリペプチドと比べた）を含む破壊を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内の、少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を含む破壊を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの反転されたアミノ酸残基が、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内に存在する、アミノ酸残基の逆位を含む破壊を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、非標準アミノ酸、及び／又は側鎖が化学修飾されたアミノ酸残基へのアミノ酸置換などの変異（野生型志賀毒素ポリペプチドと比べた）を含む破壊を含む。本明細書で記載される使用に適切な、脱免疫化された、志賀毒素エフェクター亜領域の非限定例については、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットにおいて記載されている。
他の実施形態では、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、全長志賀毒素Ａサブユニットより短い、切断型志賀毒素Ａサブユニットを含み、この場合、少なくとも１つのアミノ酸残基は、天然位置の、Ｂ細胞エピトープ領域内、及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊される。
脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドを創出するために、提示されるエピトープ領域内の、任意のアミノ酸残基を、多様な手段により修飾することは、例えば、野生型志賀毒素ポリペプチドと比べた、側鎖の、欠失、挿入、逆位、再配列、置換、及び化学修飾を表す修飾など、原理的に、エピトープの破壊を結果としてもたらしうる。しかし、ある特定のアミノ酸残基の修飾、及びある特定のアミノ酸修飾の使用は、ある特定のレベルの志賀毒素のエフェクター機能（複数可）を維持しながら、抗原性及び／又は免疫原性を低減することに成功する可能性が高い。例えば、末端の切断及び内部のアミノ酸置換は、これらの種類の修飾が、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の、アミノ酸残基の全体的な間隔を維持するために好ましく、したがって、志賀毒素エフェクターポリペプチドの構造及び機能を維持する可能性が高い。
一部の実施形態では、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）のアミノ酸７５～２５１を含むか、又はこれらから本質的になる、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドがあり、この場合、少なくとも１つのアミノ酸残基は、天然位置のエピトープ領域において破壊される。ある特定の、他の実施形態の中には、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１～２４１を含むか、又はこれらから本質的になる、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドがあり、この場合、少なくとも１つのアミノ酸残基は、天然位置のエピトープ領域において破壊される。さらなる実施形態は、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１～２５１を含むか、又はこれらから本質的になる、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドであり、この場合、少なくとも１つのアミノ酸残基は、提示された天然位置のエピトープ領域において破壊される。さらなる実施形態は、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１～２６１を含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドであり、この場合、少なくとも１つのアミノ酸残基は、天然位置のエピトープ領域において破壊される。
脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドを創出するのに使用されうる、多数の、多岐にわたる、内部のアミノ酸置換が存在する。エピトープ領域内で使用することが可能な置換アミノ酸のうちで、以下の置換アミノ酸残基：Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、及びＨは、エピトープの抗原性及び／又は免疫原性を低減する可能性が最も高いことが予測される。グリシンを除き、これらのアミノ酸残基は全て、極性残基及び／又は帯電残基として分類されうる。置換することが可能なアミノ酸のうちで、以下のアミノ酸Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、及びＫは、置換されるアミノ酸に応じて、著明レベルの志賀毒素のエフェクター機能（複数可）の保持をもたらしながら、抗原性及び／又は免疫原性を低減する可能性が最も高いことが予測される。一般に、置換は、極性アミノ酸残基及び／又は帯電アミノ酸残基を、非極性かつ非帯電の残基へ変化させるべきである（例えば、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。加えて、アミノ酸残基のＲ基官能側鎖の全体のサイズ及び／又は全長を低減することも、エピトープ破壊に有益でありうる（例えば、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。しかし、エピトープ破壊を付与する可能性が最も高い置換についての、これらの一般的検討事項にも関わらず、目的は、著明な志賀毒素のエフェクター機能（複数可）を保存することであるため、置換アミノ酸は、例えば、極性残基及び／又は帯電残基を置換する、類似するサイズの、非極性及び／又は非帯電残基など、置換されるアミノ酸に相似する場合に、志賀毒素のエフェクター機能（複数可）を保存する可能性が高くなりうるであろう。
国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット及び国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレットは、多様な志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び結合分子の、志賀毒素のエフェクター機能に対する効果（複数可）について、多くの異なる変異及び変異の組合せを実験的に調べることからの結果を報告した。表３は、単独の、又は１つ若しくは２つ以上の他の置換と組み合わせたアミノ酸置換が、強力なレベルの志賀毒素のエフェクター機能（複数可）の呈示を妨げなかった、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット及び国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレットにおいて記載されている結果についてまとめる。表３は、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレットにおいて記載されている、エピトープ領域の番号付けスキームを使用する。
Figure 2022548078000003
Figure 2022548078000004
Figure 2022548078000005
国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット及び国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレットにおける、実験による証拠に基づき、志賀毒素のＡサブユニット内の、ある特定のアミノ酸位置は、著明な志賀毒素エフェクター機能を、なおも保持しながら、エピトープの破壊を許容することが予測される。例えば、以下の天然に存在する位置：配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５４；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１又は配列番号２の５６；配列番号１又は配列番号２の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１又は配列番号２の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１又は配列番号２の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１又は配列番号２の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１又は配列番号２の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２４１；配列番号１又は配列番号２の２４２；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６は、細胞毒性など、志賀毒素のエフェクター機能（複数可）を保持しながら、単独のアミノ酸置換、又は組合せにおけるアミノ酸置換を許容する。
国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット及び国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレットにおける実験データは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、例えば、前述の切断及び置換を許容する位置の新たな組合せのほか、類縁の志賀毒素Ａサブユニット内の、同一の位置又は保存された位置における新たな置換など、著明な志賀毒素のエフェクター機能を呈する能力を保持しながら、志賀毒素エフェクターポリペプチドの抗原性及び／又は免疫原性を低減しうる、他の、エピトープを破壊する置換、及びエピトープを破壊する置換の組合せを指示する。
本明細書における被験置換のうちの、保存的官能基を有するアミノ酸残基への、他のアミノ酸置換も、著明な志賀毒素のエフェクター機能を温存しながら、抗原性及び／又は免疫原性を低減しうることが予測可能である。例えば、Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、若しくはＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／又はＴ２８６Ｉのうちのいずれかと類似することが当業者に公知である、他の置換は、少なくとも１つの、志賀毒素のエフェクター機能を維持しながら、内因性エピトープを破壊しうる。特に、Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、Ｄ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及びＴ２８６Ｉと類似する、保存的アミノ酸残基へのアミノ酸置換は、同じ効果又は同様の効果を及ぼしうる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、Ｋ１からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ４７からＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｌ、及びＭ；Ｌ４９からＧ；Ｙ４９からＡ；Ｄ５３からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ５５からＧ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ５８からＧ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＧ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、及びＭ；Ｅ６１からＧ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｒ８４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＧ；Ｉ８８からＧ；Ｄ９４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ１５４からＧ；Ｒ１７９からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、及びＱ；Ｓ１８６からＧ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及びＭ；Ｒ１８８からＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＧ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳなど、実験による被験アミノ酸への、類似する保存的アミノ酸置換を含みうる。
同様に、電荷、極性を除去するアミノ酸置換、及び／又は側鎖長を短縮するアミノ酸置換は、少なくとも１つの、志賀毒素のエフェクター機能を維持しながら、エピトープを破壊しうる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、以下の群：Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、又はＫから選択される、適切なアミノ酸で、位置：配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１又は配列番号２の６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１２；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５４；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１又は配列番号２の５６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１又は配列番号２の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１又は配列番号２の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号３の１９７；配列番号１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２４１；配列番号１又は配列番号２の２４２；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６におけるアミノ酸残基を置換することなど、側鎖電荷が除去されるような置換、極性が除去されるような置換、及び／又は側鎖長さが短縮されるような置換により破壊される、１つ又は２つ以上のエピトープを含みうる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ、及びＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ、及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、及びＭ；Ｌ４９からＡ又はＧ；Ｆ５０；Ａ５１からＶ；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ、及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｌ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ、及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｄ９４；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｌ１０８からＡ、Ｇ、及びＭ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ、及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｃ２４２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｃ２６２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳのうちの、１つ又は２つ以上を含みうる。
加えて、著明な志賀毒素のエフェクター機能を保持しながら、エピトープを破壊する、志賀毒素エフェクターポリペプチドの、１つのエピトープ領域内の、任意のアミノ酸置換が、著明レベルの志賀毒素のエフェクター機能を保持しながら、複数のエピトープ領域が破壊された、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドを形成するように、著明な志賀毒素のエフェクター機能を保持しながら、エピトープを破壊する、同じであるか、又は異なるエピトープ領域内の、任意の他のアミノ酸置換と組合せ可能である。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、前述の置換のうちの、２つ若しくは３つ以上の組合せ、並びに／又は国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット及び／若しくは国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットにおいて記載されている置換の組合せを含みうる。
国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットに記載された、実験に基づき、志賀毒素のＡサブユニット内の、ある特定のアミノ酸領域は、著明な志賀毒素エフェクター機能を、なおも保持しながら、エピトープの破壊を許容することが予測される。例えば、天然位置の、１～１５、３９～４８、５３～６６、５５～６６、９４～１１５、１８０～１９０、１７９～１９０、及び２４３～２５７におけるエピトープ領域は、志賀毒素の酵素活性及び細胞毒性を損なわずに、複数のアミノ酸置換の組合せを、同時に許容した。
Ｂ．フーリンによる切断に抵抗性である、志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端における、破壊された、フーリン切断モチーフ及び／又はフーリン切断部位を含みうる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端に対して近位において、フーリンによる切断をもたらしうる、公知の補償構造を含まない。破壊された、フーリン切断モチーフ及びフーリン切断部位の非限定例については、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットにおいて記載されている。
本明細書では、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットが、成熟志賀毒素Ａサブユニットを産生するために除去され、当業者に認識可能な、それらのアミノ末端における、約２２アミノ酸のシグナル配列を含有する、前駆体形態を含むことに注目して、配列表に提示される、天然の志賀毒素Ａサブユニットの、特異的アミノ酸位置に言及することにより、ある特定のフーリン切断モチーフの破壊が指し示される。さらに、本明細書では、天然で、天然の志賀毒素Ａサブユニット内の特異的位置（例えば、アミノ末端から２５１位におけるアルギニン残基に、Ｒ２５１）に存在する特異的アミノ酸（例えば、アルギニン残基に、Ｒ）に続き、論じられる特定の変異において、この残基が置換されたアミノ酸（例えば、Ｒ２５１Ａは、アミノ末端からのアミノ酸残基２５１における、アラニンによる、アルギニンのアミノ酸置換を表す）に言及することにより、変異を含む、ある特定のフーリン切断モチーフの破壊が指し示される。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフを含み、本明細書では、このような実施形態は、野生型の志賀毒素Ａサブユニット及び／又は野生型の志賀毒素Ａ１断片融合タンパク質と比べた、それらの特性（複数可）について記載するのに、「フーリンによる切断に抵抗性」又は「プロテアーゼによる切断に抵抗性」の志賀毒素エフェクターポリペプチドと称される。
一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性である志賀毒素エフェクターポリペプチドは、２つ又は３つ以上の変異を有する、切断型志賀毒素Ａサブユニットから本質的になる。
一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性である志賀毒素エフェクターポリペプチドは、最小限のフーリン切断部位コンセンサスモチーフ内のアルギニン残基の一方又は両方の、Ａ、Ｇ、又はＨによるアミノ酸残基置換（野生型志賀毒素ポリペプチドと比べた）を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性である志賀毒素エフェクターポリペプチドは、フーリン切断モチーフ領域内のアミノ酸置換を含む破壊を含み、この場合、置換は、配列番号３の２４７、配列番号１又は配列番号２の２４８、配列番号３の２５０、配列番号１又は配列番号２の２５１、並びに、保存された志賀毒素エフェクターポリペプチド内、及び／又は非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列内の同等な位置からなる群から選択される天然位置のアミノ酸において生じる。一部の実施形態では、置換は、任意の、非保存的アミノ酸への置換であり、置換は、天然位置のアミノ酸残基位置において生じる。一部の実施形態では、変異は、Ｒ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、並びに保存された志賀毒素エフェクターポリペプチド内、及び／又は非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列内の同等な位置からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性である志賀毒素エフェクターポリペプチドは、欠失である変異を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、ＳｔｘＡ（配列番号２）内、及びＳＬＴ－１Ａ（配列番号３）内、天然位置の、２４７～２５２における領域、又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）内、天然位置の、２４６～２５１における領域の欠失；ＳｔｘＡ（配列番号２）内、及びＳＬＴ－１Ａ（配列番号３）内、天然位置の、２４４～２４６における領域、又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）内、天然位置の、２４３～２４５における領域の欠失；又はＳｔｘＡ（配列番号２）内及びＳＬＴ－１Ａ（配列番号３）内、天然位置の、２５３～２５９における領域、若しくはＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）内、天然位置の、２５２～２５８における領域の欠失である変異を含む。
一部の実施形態では、プロテアーゼによる切断に抵抗性の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較して、カルボキシ末端切断である変異を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含み、この切断は、フーリン切断モチーフ内の１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失を結果としてもたらす。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限の切断部位である、Ｙ／Ｒ－ｘ－ｘ－Ｒ内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を欠失させる、カルボキシ末端の切断であって、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２５０、２４９、２４８、２４７、２４６、２４５、２４４、２４３、２４２、２４１、２４０、又は２３９位以前のアミノ酸残基を終端とする切断；及びＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２４９、２４８、２４７、２４６、２４５、２４４、２４３、２４２、２４１、又は２４０位以前のアミノ酸残基を終端とする切断などの切断を含む。一部の実施形態は、可能な場合、前述の変異のうちのいずれかの組合せを含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフのカルボキシ末端の、部分的な切断である変異（複数可）を含むが、本明細書で記載されるの、一部の分子は、全２０アミノ酸残基である、フーリン切断モチーフのカルボキシ末端の、完全な切断である、破壊されたフーリン切断モチーフを含まない。例えば、ある特定の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳｔｘＡ（配列番号２）内、又はＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）内、の、天然の２４０位までの志賀毒素Ａ１断片領域の、部分的な、カルボキシ末端の切断を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含むが、２３９位以前における、カルボキシ末端の切断は含まない。同様に、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）内の、天然の２３９位までの、志賀毒素Ａ１断片領域の、部分的な、カルボキシ末端の切断を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含むが、２３８位以前における、カルボキシ末端の切断は含まない。変異が、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、フーリンによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドの、最大のカルボキシ末端の切断においても、フーリン切断モチーフのＰ１４及びＰ１３位は、依然として存在する。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基置換、及びカルボキシ末端の切断の両方を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内のアミノ酸残基置換、及びカルボキシ末端の切断の両方を含む、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２位以降のアミノ酸残基を終端とする切断などを含み、適切な場合、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基である、Ｒ２４８及び／又はＲ２５１を含み；ＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２位以降のアミノ酸残基を終端とする切断などを含み、適切な場合、任意の、正に帯電していないアミノ酸残基で置換された、天然位置のアミノ酸残基である、Ｙ２４７及び／又はＲ２５０を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、切断型志賀毒素エフェクターポリペプチドはまた、最適の細胞毒性を維持するために、Ｐ９、Ｐ８、及び／又はＰ７位におけるアミノ酸残基である、フーリン切断モチーフも含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、１つ又は２つ以上の、内部のアミノ酸残基の欠失である変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内の、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失を有する変異（複数可）を含む。例えば、例えば、２４９、２５０、２４７、２５２など、周囲の残基の欠失と組み合わされうる、天然位置のアミノ酸残基である、Ｒ２４８及び／又はＲ２５１の内部欠失を含むＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチド；並びに、例えば、２４８、２４９、２４６、２５１など、周囲の残基の欠失と組み合わされうる、天然位置のアミノ酸残基である、Ｙ２４７及び／又はＲ２５０の内部欠失を含むＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドである。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒを欠失させる、４つの連続アミノ酸残基の欠失である変異、例えば、Ｒ２４８～Ｒ２５１を欠くＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチド、及びＹ２４７～Ｒ２５０を欠くＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドなどを含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、コアであるフーリン切断モチーフを挟むアミノ酸残基における、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失であって、例えば、ＳＬＴ－１Ａ、又はＳｔｘＡ、における、２４４～２４７及び／又は２５２～２５５の欠失などの欠失を有する変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、表面に露出された、プロテアーゼによる切断に感受性のループの全体の内部欠失である変異であって、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然位置のアミノ酸残基２４１～２６２の欠失；及びＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然位置のアミノ酸残基２４０～２６１の欠失などの変異を含む。
一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、フーリン切断モチーフ内の、アミノ酸残基の内部欠失である変異、及びカルボキシ末端の切断である変異の両方を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ内のアミノ酸残基の欠失である変異、及びカルボキシ末端の切断である変異の両方を含む。例えば、プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ酸残基である、２４７及び／又は２５２をなおも有する、切断型のＳｔｘＡポリペプチド又はＳＬＴ－１Ａポリペプチドにおける、天然位置のアミノ酸残基である、２４８～２４９及び／若しくは２５０～２５１、又はアミノ酸残基である、２４６及び／若しくは２５１をなおも有する、切断型のＳＬＴ－２Ａにおける、アミノ酸残基である、２４７～２４８及び／又は２４９～２５０の欠失である変異（複数可）を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含みうる。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型の志賀毒素Ａサブユニットと比較した、最小限のフーリン切断部位である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒを欠失させる、４つの連続アミノ酸残基の欠失、及びカルボキシ末端の切断を有する変異を含む、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ－１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２位以降のアミノ酸残基を終端とする切断などを有し、Ｒ２４８～Ｒ２５１を欠き；ＳＬＴ－２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドでは、天然の、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２位以降のアミノ酸残基を終端とする切断などを有し、Ｙ２４７～Ｒ２５０を欠く。
Ｃ．エピトープを埋め込んだ、志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、脱免疫化及び／又は標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への送達を目的とする、１つ又は２つ以上の、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含みうる。一部の実施形態、及び／又はある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域では、例えば、埋込み型の修飾が、志賀毒素エフェクターポリペプチドの、多岐にわたる亜領域内で成功する可能性が高いのに対し、挿入の成功は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域の、小さいサブセットへ、より限定されるため、Ｔ細胞エピトープの埋込み又は部分的な埋込みは、Ｔ細胞エピトープの挿入より好ましい場合がある。本明細書では、「成功する」という用語は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに対する修飾（例えば、異種Ｔ細胞エピトープの導入）が、単独で、又は結合分子の構成要素として、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能を、必須の活性レベルで保持する、修飾された志賀毒素エフェクターポリペプチドを結果としてもたらすことを意味するように使用される。
国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットにおいて記載されている、志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域のうちのいずれも適切でありうる。一部の実施形態において、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットにおいて記載されている、志賀毒素エフェクターポリペプチドのうちのいずれも、例えば、脱免疫化（本明細書で記載されるものなど）及び／又はフーリン切断モチーフの破壊（本明細書で記載されるものなど）のための、１つ又は２つ以上の、新たなエピトープ領域の破壊の付加により、結合分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドに修飾されうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、１つ又は２つ以上の他の変異とを含む、切断型志賀毒素Ａサブユニットから本質的になる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、例えば、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）若しくはＳｔｘＡ（配列番号２）のアミノ酸７７～２３９、又は他の志賀毒素のＡサブユニットファミリーのメンバーにおける同等物（例えば、ＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）のアミノ酸７７～２３８）により表されるポリペプチドからなるなど、全長の志賀毒素Ａサブユニットより小型である。例えば、一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７５～２５１、配列番号１の１～２４１、配列番号１の１～２５１、又は配列番号１のアミノ酸１～２６１に由来し、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、少なくとも１つのアミノ酸は、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊され、破壊されたアミノ酸は、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープと重複しない。同様に、他の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７５～２５１、配列番号２の１～２４１、配列番号２の１～２５１、又は配列番号２のアミノ酸１～２６１に由来し、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、埋め込まれるか、又は挿入された、異種Ｔ細胞エピトープを含み、少なくとも１つのアミノ酸は、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊され、破壊されたアミノ酸は、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープと重複しない。加えて、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸７５～２５１、配列番号３の１～２４１、配列番号３の１～２５１、又は配列番号３のアミノ酸１～２６１に由来する場合があり、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、少なくとも１つのアミノ酸は、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊され、破壊されたアミノ酸は、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープと重複しない。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフとを含む。例えば、一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７５～２５１、配列番号１の１～２４１、配列番号１の１～２５１、又は配列番号１のアミノ酸１～２６１に由来し、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフとを含む。同様に、他の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７５～２５１、配列番号２の１～２４１、配列番号２の１～２５１、又は配列番号２のアミノ酸１～２６１に由来し、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフとを含む。加えて、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸７５～２５１、配列番号３の１～２４１、配列番号３の１～２５１、又は配列番号３のアミノ酸１～２６１に由来する場合があり、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフとを含む。
Ｄ． 組合せ志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
組合せ志賀毒素エフェクターポリペプチドは、２つ又は３つ以上の亜領域（すなわち、重複しない亜領域）を含み、この場合、各亜領域は、以下：（１）内因性のエピトープ内又はエピトープ領域内の破壊；（２）埋め込まれた異種Ｔ細胞エピトープ－ペプチド；（３）挿入された異種Ｔ細胞エピトープ－ペプチド；及び（４）Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフのうちの少なくとも１つを含む。
組合せ志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態は、（１）内因性のエピトープ内又はエピトープ領域内の破壊、及び（２）Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフとの両方を含む。国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットに記載されている、個々の、脱免疫化された、志賀毒素エフェクター亜領域（例えば、表３、前出を参照されたい）のうちのいずれもが、一般に、結合分子の構成要素としての使用のための志賀毒素エフェクターポリペプチドを創出するために、本明細書で記載される、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載されている、及び／又は当技術分野で公知の、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、任意の志賀毒素エフェクター亜領域と組み合わされうることが予測される。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、埋め込まれるか、又は挿入された異種ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと重複しない、少なくとも１つの、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含み；この場合、破壊は、野生型志賀毒素と比べて、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換を含む。一部の実施形態では、置換は、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＲ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、及びＫ；Ｓ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＣ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ又はＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｍ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、及びＦ；Ｌ４９からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｙ４９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＴ；Ｆ５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＴ；Ａ５１；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、Ｉ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＭ；Ｌ５７からＡ、Ｖ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＮ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｌ１０８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＴ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＣ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数の内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ領域の複数の破壊が存在し、この場合、各々の破壊は、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＲ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、及びＫ；Ｓ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＣ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ又はＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｍ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｍ及びＦ；Ｌ４９からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｙ４９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＴ；Ｆ５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＴ；Ａ５１；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、Ｉ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＭ；Ｌ５７からＡ、Ｖ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＮ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｌ１０８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＴ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＣ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を伴う。
ある特定の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープペプチド、及び（２）Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフの両方を含む。国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットにおいて記載される、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域のうちのいずれかは、一般に、結合分子の構成要素として、プロテアーゼによる切断に抵抗性であり、かつ、異種Ｔ細胞エピトープを、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することが可能な、組合せの志賀毒素エフェクターポリペプチドを創出するために、任意の、プロテアーゼによる切断に抵抗性の、志賀毒素エフェクターポリペプチドの亜領域（例えば、本明細書で記載される、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットにおいて記載される、及び／又は当技術分野で公知の、修飾された、志賀毒素Ａサブユニット亜領域）と組み合わされうる。この種類の、組合せ志賀毒素エフェクターポリペプチドの非限定例は、配列番号１９～２１に示される。
組合せ志賀毒素エフェクターポリペプチドの、ある特定の実施形態は、（１）内因性のエピトープ内又はエピトープ領域内の破壊、及び（２）埋め込まれた異種Ｔ細胞エピトープペプチドの両方を含む。しかし、本明細書又は国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットにおいて記載されている、挿入されるか、又は埋め込まれた異種Ｔ細胞エピトープを含む志賀毒素エフェクター亜領域は一般に、結果として得られる組合せ分子が、十分なレベルの志賀毒素のエフェクター機能（複数可）を保持するような組合せに成功することが、実験により示された場合を除き、あらゆる本明細書で記載される、脱免疫化志賀毒素エフェクター亜領域と、組合せ可能なわけではない。本明細書における開示は、このような実施形態が、どのようにして作製され、成功を、実験により裏付けるように調べられるのかを示す。
本明細書では、「成功する」という用語は、志賀毒素エフェクターポリペプチド内の、２つ又は３つ以上のアミノ酸残基置換が、修飾された志賀毒素エフェクターポリペプチドが、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能を保持する一方で、例えば、脱免疫化、フーリンによる切断の低減、及び／又は埋め込まれるか、若しくは挿入されたエピトープを送達する能力などの機能的特色を結果としてもたらすことを意味するように使用される。本明細書で記載される手法及びアッセイは、組合せによる、志賀毒素エフェクターポリペプチド及びこれを含む結合分子を表す、本明細書で記載される実施形態を、どのようにして設計し、作製し、これらについて実験により調べるのかを示す。
組合せによる、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、フーリン切断モチーフ破壊、個別のエピトープ破壊、及び／又は異種Ｔ細胞エピトープのカーゴなど、それらのそれぞれの亜領域の特色を組み合わせる場合があり、これらの組合せは、場合によって、それらの部分的に脱免疫化された亜領域の総和と比較して、免疫原性を、相乗的に低減した志賀毒素エフェクターポリペプチドを結果としてもたらす。
ある特定の濃度で、無細胞毒性又は低減細胞毒性を呈する、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチド、例えば、Ｒ１７９Ａを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、外因性素材を、細胞に送達するための、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドとして、やはり有用でありうる。同様に、ある特定の濃度で、無細胞毒性又は低減細胞毒性を呈する、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド、例えば、その触媒性ドメインに埋め込まれたエピトープを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、実施例１－Ｆを参照されたい）も、Ｔ細胞エピトープ（複数可）を、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の、所望の細胞内区画に送達するために、又はＴ細胞エピトープ（複数可）の、標的細胞への送達のための、結合分子の構成要素として、やはり有用でありうる。
Ｅ． 結合分子の例
以下の実施形態は、細胞表面において、ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞、例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞及び／又はＰＤ－Ｌ１陽性細胞をターゲティングする、例示的な結合分子のある特定の構造について、より詳細に記載する。
ＰＤ－Ｌ１結合分子、及びその組成物の多様な実施形態が、本明細書で提示され、この場合、各々のＰＤ－Ｌ１結合分子は、（１）少なくとも１つの毒素構成要素と、（２）ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分に特異的に結合することが可能な、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合領域とを含む。本明細書で記載される各々のＰＤ－Ｌ１結合分子では、少なくとも１つの結合領域は、毒素エフェクターポリペプチドが由来する毒素に対して異種であり、例えば、毒素と関係しない免疫グロブリンドメインを含むＰＤ－Ｌ１結合領域などである。一部の実施形態では、少なくとも１つの毒素構成要素は、毒素エフェクターポリペプチドを含む。一部の実施形態では、毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素のＡサブユニットに由来する志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドである。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、（１）志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーのＡサブユニットに由来する、少なくとも１つの志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、（２）ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分に特異的に結合することが可能な、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合領域とを含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、各々が、配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）を含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）各々が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。ある特定の他のさらなる実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号２５、配列番号２０、及び配列番号２１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号２５、配列番号２０、及び配列番号２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。ある特定の他のさらなる実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。
一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）各々が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）；並びに（ｂ）各々が、配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）を含む。
一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号３３、３５～３６、及び３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又は配列番号３３、３５～３６、及び３８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になる、軽鎖領域；並びに／或いは（ｂ）配列番号３４、３７、及び３９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又は配列番号３４、３７、及び３９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になる、重鎖領域を含む。一部の実施形態では、結合領域は、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又は配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つに示されるポリペプチドから本質的になる、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、結合領域は、単鎖可変断片であり、例えば、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つのポリペプチドからなるか、これを含むか、又はこれから本質的になるなどである。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分と特異的に結合することが可能な結合領域とを含み；この場合、結合領域は、（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＹＴＭＨ（配列番号２７）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＧＩＮＰＮＮＧＧＴＷＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＰＹＹＹＧＳＲＥＤＹＦＤＹ（配列番号３２）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２６）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分と特異的に結合することが可能な結合領域とを含み；この場合、結合領域は、（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＹＴＭＨ（配列番号２７）からなるＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＧＩＮＰＮＮＧＧＴＷＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２９）からなるＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＰＹＹＹＧＳＲＥＤＹＦＤＹ（配列番号３２）からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）からなるＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２０）からなるＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２６）からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分と特異的に結合することが可能な結合領域とを含み；この場合、結合領域は、（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＹＴＭＨ（配列番号２７）を有するＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＧＩＮＰＮＮＧＧＴＷＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２９）を有するＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＰＹＹＹＧＳＲＥＤＹＦＤＹ（配列番号３２）を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）を有するＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２０）を有するＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２６）を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一部の実施形態では、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドは、配列番号４１の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３４の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号３５の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３４の配列を含み、ＶＬは、配列番号３５の配列を含む。
一部の実施形態では、結合領域は、ＶＨとＶＬとを連結するｓｃＦｖリンカーを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、３～１２アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、３～約１２アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、約３～約１２アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、約１０～２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、２０アミノ酸長よりも大きい。一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは可動性リンカーである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、配列番号７２の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。一部の実施形態では、結合領域は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、結合領域は、配列番号１０６の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。
本明細書で使用される、「結合ドメインリンカー」という用語は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合領域（例えば、ｓｃＦｖ）とを連結するリンカーを指す。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、結合ドメインリンカーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインリンカーは、配列番号７３の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。一部の実施形態では、結合ドメインリンカーは、配列番号７４～７７のうちのいずれか１つの配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。
一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａサブユニットに対して異種であるＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号７８）、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、切断性スペーサーを介して結合領域に連結されている。一部の実施形態では、結合分子は、配列ＨＨＡＡ（配列番号２６５）を有するスペーサーを有する。
一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、及び結合領域を含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、ＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、ＶＨ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＬを含む。
一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、結合領域、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、ＶＨ、ｓｃＦｖリンカー、ＶＬ、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、結合領域、切断性スペーサー及びＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む。
一部の実施形態では、結合分子は、単一の連続ポリペプチドである。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号１２８の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号１０８～１５５、１５８～１５９、若しくは１６０～１６８のうちのいずれか１つの配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む。
一部の実施形態では、結合分子は、２つ又は３つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つ）のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、各ポリペプチドは、配列番号１２８の配列を含む。一部の実施形態では、２つのポリペプチドは、例えば結合領域を介して、互いと非共有結合的に連結されている。
一部の実施形態では、結合分子は細胞毒性である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は非細胞毒性である。例えば、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、志賀毒素サブユニットエフェクターポリペプチドが、切断されるか、又はその細胞毒性活性を消失させる１つ若しくは２つ以上の変異を含む場合に、非細胞毒性でありうる。
ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子の、ＰＤ－Ｌ１発現細胞への投与は、（ｉ）細胞によるＰＤ－Ｌ１結合分子の内部化、及び（ii）細胞死を結果としてもたらす。ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子のＰＤ－Ｌ１発現細胞への投与は、（ｉ）細胞によるＰＤ－Ｌ１結合分子の内部化、及び（ii）触媒的に活性の、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドのために、細胞死を結果としてもたらす。ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子のＰＤ－Ｌ１発現細胞への投与は、（ｉ）細胞によるＰＤ－Ｌ１結合分子の内部化、及び（ii）Ｔ細胞エピトープカーゴの送達及び提示のために、細胞死を結果としてもたらす。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、細胞に導入されると、３００ｎＭ以下の５０％阻害濃度（ＣＤ５０；half-maximal inhibitory concentration）値による細胞毒性を呈すること、及び／又は著明レベルの志賀毒素細胞毒性を呈することが可能である。
ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドは、１０，０００、５，０００、１，０００、５００、又は２００ピコモル濃度未満の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値によるリボソーム阻害活性を呈することが可能である。
ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、少なくとも１つの志賀毒素Ａサブユニット由来ポリペプチドは、特色の組合せ（例えば、脱免疫化された亜領域（複数可）、亜領域（複数可）を含む異種エピトープ、プロテアーゼによる切断に抵抗性の亜領域、及び／又はカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフ）を含む。本明細書で記載される、ある特定のＰＤ－Ｌ１結合分子は、単一の分子内に、例えば、効率的な細胞への内部化、強力な細胞ターゲティング型細胞毒性、選択的細胞毒性、脱免疫化、高投与量時における、少ない非特異的毒性、高度の安定性、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の高度免疫化、及び／又は標的細胞のＭＨＣ Ｉクラス経路に異種Ｔ細胞エピトープ（複数可）を送達する能力など、複数の特性の組合せをもたらす。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、例えば、特異的ＭＨＣクラスＩエピトープ複合体を提示している標的細胞型による、脊索動物のＣＤ８＋ Ｔ細胞（複数可）の細胞間エンゲージメントを刺激することなどを介して、（１）投与された分子から得られるある特定の免疫応答（複数可）を低減するか、若しくは消失させること、（２）投与された分子から得られる非特異的毒性を低減するか、若しくは消失させること、（３）ＰＤ－Ｌ１発現標的細胞（複数可）をインビボで特異的に殺滅すること、並びに／又は（４）有益な免疫応答（複数可）を、標的細胞型、標的細胞型を含む腫瘍塊、及び／若しくはこのような標的細胞型を含む組織箇所にターゲティングすることが、所望である場合など、脊索動物への投与に有用である。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つに示されるポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になり、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、アミノ末端メチオニン残基を含んでいてもよい。
本明細書で使用される、「Ｃｍａｘ」という用語は、結合分子が対象に投与された後にこれが達成する、ピーク血清濃度を指す。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、約１０００～約５０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲のＣｍａｘを有する。例えば、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、約１～約１，０００ｎｇ／ｍＬ、約１，０００～約３，０００ｎｇ／ｍＬ、約２，０００～約５，０００ｎｇ／ｍＬ、約５０００～約１０，０００ｎｇ／ｍＬ、約１０，０００ｎｇ／ｍＬ～約１５，０００ｎｇ／ｍＬ、約１５，０００ｎｇ／ｍＬ～約２０，０００ｎｇ／ｍＬ、約２０，０００ｎｇ／ｍＬ～約２５，０００ｎｇ／ｍＬ、約２５，０００ｎｇ／ｍＬ～約３０，０００ｎｇ／ｍＬ、又は約３０，０００ｎｇ／ｍＬ～約３５，０００ｎｇ／ｍＬ、又は約３５，０００ｎｇ／ｍＬ～約５０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲のＣｍａｘを有しうる。一部の実施形態では、Ｃｍａｘは、約１，０００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，００、約７，０００、約８，０００、約９，０００、又は約１０，０００ｎｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、Ｃｍａｘは、約２１，０００、約２２，０００、約２３，０００、約２４，０００、約２５，０００、約２６，０００、約２７，０００、約２８，０００、約２９，０００、又は約３０，０００ｎｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、Ｃｍａｘは、２，０９６、２７，０６３、又は２２，３７５ｎｇ／ｍＬである。
本明細書で使用される、「半減期」又は「Ｔ１／２」という用語は、投与されたＰＤ－Ｌ１結合分子の初回用量の半分が身体から消失するためにかかる時間を指す。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１分子の半減期は、約１分～約１時間、約１時間～約３時間、約３時間～約５時間、又は約５時間～約１０時間である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子の半減期は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、又は約６０分である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子の半減期は、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約９．６時間、又は約１０時間である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子の半減期は、約２．８時間、約３．７時間、又は約５．６時間である。
ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子のＰＤ－Ｌ１発現細胞への投与は、（ｉ）細胞によるＰＤ－Ｌ１結合分子の内部化、及び（ii）ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化されたＰＤ－Ｌ１結合分子により送達される異種ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ－ペプチドカーゴを細胞表面に提示している細胞を結果としてもたらす。
他の構造的変動
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１標的生体分子の任意の細胞外部分への機能的な結合性部位を含有し、なおより好ましくは、標的生体分子に高アフィニティーで（例えば、ＫＤにより示される通り）結合することが可能な、結合分子の断片、バリアント、及び／又は派生物が使用される。例えば、標的生体分子の細胞外部分に、１０－５～１０－１２モル／リットル、好ましくは２００ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する任意の結合領域は、本明細書で記載される結合分子及び方法を製造することにおける使用のために、置換されうる。
当業者は、例えば、１）潜在的抗原性及び／若しくは潜在的免疫原性を低減する、内因性エピトープの破壊、２）タンパク質分解性切断を低減する、フーリン切断モチーフの破壊、並びに／或いは３）潜在的抗原性及び／若しくは潜在的免疫原性を低減するか、又は細胞表面上における提示のために、ＭＨＣ Ｉ分子に送達されることが可能な、埋め込まれるか、若しくは挿入されたエピトープのうちの、１つ又は２つ以上などと共に、志賀毒素エフェクターポリペプチドの、全体的な構造及び機能を維持することにより、それらの生物学的活性を減少させずに、志賀毒素エフェクターポリペプチド、抗体、及び結合分子、並びに前者のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドに変動が施されうることを認識するであろう。例えば、一部の修飾は、発現を容易としうる、精製を容易としうる、薬物動態特性を改善しうる、及び／又は免疫原性を改善しうる。このような修飾は、当業者に周知であり、例えば、アミノ末端において付加され、起始部位をもたらす、メチオニン、いずれかの末端に配置され、好都合に位置した制限部位又は終結コドンを創出する、さらなるアミノ酸、並びにいずれかの末端に融合されて、簡便な検出及び／又は精製をもたらす、生化学的アフィニティータグを含む。非脊索動物系（例えば、原核細胞）を使用して作製されるポリペプチドの免疫原性を改善する、一般的な修飾は、例えば、Ｎ－ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ；N-formylmethionine）の存在は、脊索動物において、所望されない免疫応答を誘導しうるため、ポリペプチドを作製した後で、例えば、細菌宿主系などにおける作製時にホルミル化されうる、起始部のメチオニン残基を除去することである。
本明細書ではまた、結合分子、又は結合分子のタンパク質性構成要素のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端における、エピトープタグ又は他の部分の配列など、さらなるアミノ酸残基の組入れも想定される。さらなるアミノ酸残基は、例えば、クローニングを容易とする目的、発現を容易とする目的、翻訳後修飾目的、合成を容易とする目的、精製目的、検出を容易とする目的、及び投与を含む、多様な目的で使用されうる。エピトープタグ及び部分の非限定例は、キチン結合性タンパク質ドメイン、エンテロペプチダーゼ切断部位、因子Ｘａ切断部位、ＦＩＡｓＨタグ、ＦＬＡＧタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；green fluorescent protein）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ部分、ＨＡタグ、マルトース結合性タンパク質ドメイン、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、ＲｅＡｓＨタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳｔｒｅｐタグII、ＴＥＶプロテアーゼ部位、チオレドキシンドメイン、トロンビン切断部位、及びＶ５エピトープタグである。
上記の実施形態のうちの、ある特定の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合分子のポリペプチド配列は、全ての、要求される構造的特色が依然として存在し、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、単独で、又は結合分子の構成要素として、任意の要求される機能（複数可）を呈することが可能である限りにおいて、ポリペプチド領域（複数可）に導入される、１つ又は２つ以上の保存的アミノ酸置換により変動させられる。本明細書で使用される、「保存的置換」という用語は、１つ又は２つ以上のアミノ酸が、別の、生物学的に類似するアミノ酸残基により置きかえられることを表示する。例は、類似する特徴を伴うアミノ酸残基、例えば、小型アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸による置換（例えば、表４を参照されたい）を含む。内因性の、哺乳動物ペプチド及び哺乳動物タンパク質において、通例見出されない残基による、保存的置換の例は、アルギニン残基又はリシン残基の、例えば、オルニチン、カナバニン、アミノエチルシステイン、又は別の塩基性アミノ酸による保存的置換である。ペプチド及びタンパク質における、表現型的なサイレント置換に関する、さらなる情報については、例えば、Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)を参照されたい。
Figure 2022548078000006
表４の保存的置換スキームでは、例示的な、アミノ酸の保存的置換は、物理化学的特性により群分けされる：Ｉ：中性で親水性；II：酸及びアミド；III：塩基性；IV：疎水性；Ｖ：芳香族、バルクアミノ酸、VI：親水性で非帯電、VII：脂肪族で非帯電、VIII：非極性で非帯電、IX：シクロアルケニル会合型、Ｘ：疎水性、XI：極性、XII：小型、XIII：回転許容性、及びXIV：可撓性。例えば、保存的アミノ酸置換は、以下を含む：１）Ｓは、Ｃで置換されうる；２）Ｍ又はＬは、Ｆで置換されうる；３）Ｙは、Ｍで置換されうる；４）Ｑ又はＥは、Ｋで置換されうる；５）Ｎ又はＱは、Ｈで置換されうる；及び６）Ｈは、Ｎで置換されうる。
さらなる、保存的アミノ酸置換は、以下を含む：１）Ｓは、Ｃで置換されうる；２）Ｍ又はＬは、Ｆで置換されうる；３）Ｙは、Ｍで置換されうる；４）Ｑ又はＥは、Ｋで置換されうる；５）Ｎ又はＱは、Ｈで置換されうる；及び６）Ｈは、Ｎで置換されうる。
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子のバリアントは、細胞毒性の変更、細胞増殖抑制効果の変更、免疫原性の変更、及び／又は血清半減期の変更など、所望の特性を達成するために、結合領域内又は志賀毒素エフェクターポリペプチド領域内などで、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸残基を変化させるか、又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸残基を欠失させるか、若しくは挿入することにより、本明細書で記載されるポリペプチドを変更することにより、調製されうる。志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、さらに、シグナル配列を伴う場合も、これを伴わない場合もある。一部の実施形態では、結合分子は、本明細書において列挙されたポリペプチド配列と比較して、最大で、２０、１５、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する、本明細書で記載されるポリペプチド領域の機能的断片又はバリアントを含みうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、それが、（１）少なくとも１つの、埋め込まれるか、若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／若しくはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊された少なくとも１つのアミノ酸とを含み、破壊されたアミノ酸が、埋め込まれるか、若しくは挿入されたエピトープと重複するしないか；（２）少なくとも１つの、埋め込まれるか、若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフとを含むか；又は（３）志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／若しくはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊された少なくとも１つのアミノ酸を含み、破壊されたアミノ酸が、破壊されたフーリン切断モチーフと重複しない限りにおいて、本明細書において列挙されたポリペプチド配列と比較して、最大で、２０、１５、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する、本明細書で記載されるポリペプチド領域の機能的断片又はバリアントを含みうる。
したがって、一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニット又はその断片、例えば、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ－２Ａ（配列番号３）などの、志賀毒素Ａサブユニットなどに対して、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の全配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になり、この場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）少なくとも１つの、埋め込まれるか、若しくは挿入された、異種Ｔ細胞エピトープと、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊された少なくとも１つのアミノ酸とを含み、この場合、破壊されたアミノ酸は、埋め込まれるか、若しくは挿入されたエピトープと重複しないか；（２）少なくとも１つの、埋め込まれるか、若しくは挿入された、異種Ｔ細胞エピトープと、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフとを含むか；又は（３）志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、内因性のＢ細胞エピトープ領域内及び／若しくはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域内で破壊された少なくとも１つのアミノ酸を含み、この場合、破壊されたアミノ酸は、破壊されたフーリン切断モチーフと重複しない。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を増大させるために、変異されうるか、挿入されうるか、又は欠失されうる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性及び／又は細胞毒性活性を低減するか、又は消失させるために、変異されうるか、又は欠失されうる。例えば、志賀毒素のＡサブユニットファミリーのメンバーの触媒活性及び／又は細胞毒性活性は、変異又は切断により、減少させうるか、又は消失させうる。
志賀毒素のＡサブユニットファミリーのメンバーの細胞毒性は、変異及び／又は切断により、変化しうるか、低減しうるか、又は消失しうる。位置を表示されたチロシン７７、グルタミン酸１６７、アルギニン１７０、チロシン１１４、及びトリプトファン２０３は、Ｓｔｘ、Ｓｔｘ１、及びＳｔｘ２の触媒活性に重要であることが示されている（Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)）。グルタミン酸１６７及びアルギニン１７０の両方の変異誘発は、無細胞リボソーム不活化アッセイにおいて、Ｓｌｔ－Ｉ Ａ１の酵素活性を消失させた（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。小胞体内の、Ｓｌｔ－Ｉ Ａ１のデノボ発現を使用する、別の手法では、グルタミン酸１６７及びアルギニン１７０の両方の変異誘発は、この発現レベルにおける、Ｓｌｔ－Ｉ Ａ１断片の細胞毒性を消失させた（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。切断解析は、残基７５～２６８のＳｔｘＡの断片が、インビトロにおいて、著明な酵素活性を依然として保持することを裏付けた（Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)）。残基１～２３９を含有する、Ｓｌｔ－Ｉ Ａ１の切断断片は、インビトロにおける、著明な酵素活性、及び細胞質ゾル内のデノボ発現による細胞毒性を提示した（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。残基１～２３９に切断された、Ｓｌｔ－Ｉ Ａ１断片の、小胞体内の発現は、細胞質ゾルに逆行移動できなかったため、細胞毒性ではなかった（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
志賀毒素Ａサブユニット内の酵素活性及び／又は細胞毒性に最も重要な残基は、他の残基位置の中でも、以下の残基位置：アスパラギン７５、チロシン７７、チロシン１１４、グルタミン酸１６７、アルギニン１７０、アルギニン１７６、及びトリプトファン２０３にマッピングされた（Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)）。特に、グルタミン酸Ｅ１６７からリシンへの変異、及びアルギニン１７６からリシンへの変異を含有する、Ｓｔｘ２Ａの二重変異体コンストラクトが、完全に不活化される一方、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２における、多くの単一の変異は、細胞毒性の、１０倍の低減を示した。さらに、Ｓｔｘ１Ａの、１～２３９又は１～２４０への切断は、その細胞毒性を低減し、同様に、Ｓｔｘ２Ａの、保存された疎水性残基への切断は、その細胞毒性を低減した。志賀毒素Ａサブユニット内の、真核生物リボソームへの結合及び／又は真核生物リボソームの阻害に最も重要な残基は、他の残基位置の中でも、以下の残基位置：アルギニン１７２、アルギニン１７６、アルギニン１７９、アルギニン１８８、チロシン１８９、バリン１９１、及びロイシン２３３にマッピングされている（McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012)）。しかし、ある特定の修飾は、志賀毒素エフェクターポリペプチドにより呈される、志賀毒素機能活性を増大させうる。例えば、Ｓｔｘ１Ａ内の残基位置アラニン２３１を、グルタミン酸に変異させることは、インビトロにおいて、Ｓｔｘ１Ａの酵素活性を増大させる（Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)）。
一部の実施形態では、ＳＬＴ－１Ａ（配列番号１）又はＳｔｘＡ（配列番号２）に由来する、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、変異される、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基は、７５位におけるアスパラギン、７７位におけるチロシン、１１４位におけるチロシン、１６７位におけるグルタミン酸、１７０位におけるアルギニン、１７６位におけるアルギニンの置換、及び／又は２０３位におけるトリプトファンの置換を含む。７５位におけるアスパラギンの、アラニンへの置換、７７位におけるチロシンの、セリンへの置換、１１４位におけるチロシンの、セリンへの置換、１６７位におけるグルタミン酸の、グルタミン酸への置換、１７０位におけるアルギニンの、アラニンへの置換、１７６位におけるアルギニンの、リシンへの置換、２０３位におけるトリプトファンの、アラニンへの置換、及び／又は２３１位におけるアラニンの、グルタミン酸による置換など、このような置換の例は、先行技術に基づき、当業者に公知であろう。志賀毒素の酵素活性及び／又は細胞毒性を増強又は低減する、他の変異は、本開示の範囲内にあり、本明細書で開示される周知の技法及びアッセイを使用して決定されうる。
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、本明細書で記載される、そのような薬剤を含む、当技術分野で公知の、治療剤、診断剤、及び／又は他のさらなる外因性素材を含みうる、１つ又は２つ以上のさらなる薬剤とコンジュゲートされてもよい。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合分子は、例えば、脱免疫化をもたらす、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端における、伸展したループ及び／又はフーリン切断モチーフをマスキングすることにより、フーリンによる切断を破壊する、薬物動態特性を改善する、及び／又は免疫原性を改善するなどのために、ＰＥＧ化又はアルブミン化される（例えば、Wang Q et al., Cancer Res 53: 4588-94 (1993); Tsutsumi Y et al., Proc Natl Acad Sci USA 97: 8548-53 (2000); Buse J, El-Aneed A, Nanomed 5: 1237-60 (2010); Lim S et al., J Control Release 207-93 (2015)を参照されたい）。
１． 抗体構成要素バリアント
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子（例えば、抗体－毒素コンジュゲート）の抗体構成要素のアミノ酸配列バリアントが、想定される。例えば、抗体－毒素コンジュゲートの結合アフィニティー及び／又は他の生物学的特性を改善することが、所望でありうる。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体構成要素をコードするヌクレオチド配列内に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により、調製されうる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、及び／又はこれへの挿入、及び／又はこれ内の残基の置換を含む。最終コンストラクトが、所望の特徴、例えば、抗原結合性及び／又は毒素送達を持つという条件で、最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行うことができる。
ａ）置換、挿入、及び欠失バリアント
一部の実施形態では、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが、もたらされる。置換変異誘発に所望の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。アミノ酸置換は、所望の抗体内に導入される場合があり、抗体－毒素コンジュゲート産物は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングされる場合がある。
置換バリアントの１種類は、（例えば、ヒト化抗体を創出するために）親抗体の１つ又は２つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択された、結果として得られるバリアント（複数可）は、親抗体と比べた、ある特定の生物学的特性に、改変（例えば、改善）を有し（例えば、増大したアフィニティー又は低減された免疫原性）、及び／又は親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換バリアントは、アフィニティー成熟した抗体であり、これは、従来的に、例えば、ファージディスプレイベースのアフィニティー成熟技法を使用して、産生されうる。簡潔には、１つ又は２つ以上のＨＶＲ残基が変異され、バリアント抗体が提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングされる（例えば、国際公開第２０１５／１２００５８号パンフレットを参照されたい）。
例えば、当業者に公知の方法を使用して抗体アフィニティーを改善するために、ＨＶＲ内に変化（例えば、置換）が加えられうる。例えば、変化は、ＨＶＲの「ホットスポット」、若しくは体細胞成熟過程の間に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされる残基（Chowdhury P, Methods Mol Biol 207: 179-196（2008)）、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）に加えられる場合があり、結果として得られる、バリアント重鎖及び／又は軽鎖が、結合アフィニティーについて試験される。一部の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、抗体が抗原に結合する能力を、このような変化が実質的に低減しない限りにおいて、１つ又は２つ以上のＨＶＲ内に生じうる。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的変化が、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外部を含む、ＨＶＲ内に行われうる。上記にもたらされた、バリアントＶＨ配列及びバリアントＶＬ配列の一部の実施形態では、各々のＨＶＲは、変化しないか、又は１つ、２つ、若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から、１００又は１０１以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合体のほか、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、アミノ末端にメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入バリアントは、抗体のアミノ末端及び／若しくはカルボキシル末端の、酵素（例えば、抗体により導かれる酵素プロドラッグ療法のため）、又は抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドへの融合体を含む。
ｂ）脱免疫化されたバリアント及び／又はキメラバリアント
一部の実施形態では、結合分子の抗体構成要素（例えば、抗体－毒素コンジュゲート）は、キメラである。例えば、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体は、この抗体の派生元の親抗体からクラス又はアイソタイプが変更された、「クラススイッチ」抗体である。一部の実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合性断片を含む。
一部の実施形態では、結合分子（例えば、抗体－毒素コンジュゲート）の抗体構成要素は、ヒト化されている。典型的に、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及びアフィニティーを保持しながら、ヒトにおける免疫原性を低減するようにヒト化される。典型的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はこれらの部分）が、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はこれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ又は２つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、ヒト抗体からの定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。一部の実施形態では、例えば、抗体特異性及び／又はアフィニティーを回復又は改善するために、ヒト化抗体内の一部のＦＲ残基が、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されている。
ｃ）Ｆｃ領域バリアント
一部の実施形態では、結合分子（例えば、抗体－毒素コンジュゲート）の抗体構成要素は、Ｆｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域バリアントは、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からのＦｃ領域）を含む場合があり、１つ又は２つ以上のアミノ酸変化（例えば、１つ又は２つ以上のアミノ酸位置での置換）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、抗体構成要素は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を有するＦｃ領域を含む。このような抗体は、標的発現細胞の殺滅を媒介するために特に有用である。Ｆｃエフェクター機能が改善された抗体は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ、又はＦｃγＲIIIとＦｃＲｎ）との相互作用に関与するアミノ酸残基における変更を通じて、産生することができ、これは、細胞毒性の増大及び／又は血清半減期の増大など、薬物動態の変化をもたらしうる。ＦｃＲへの結合が改善又は減少された、ある特定の抗体バリアントは、当業者に公知である、及び／又はShields R et al., J Biol Chem 9: 6591-6604 (2001)に記載されている。
一部の実施形態では、抗体構成要素は、１つ又は２つ以上のエフェクター機能を欠く（例えば、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を欠く）、Ｆｃ領域を含む。エフェクター機能を欠くか、又は実質的に低減されたエフェクター機能を有するＦｃ領域は、Ｆｃ領域が、細胞溶解性Ｆｃ受容体（例えば、ＤＡＮＡ変異体）及び／又はＣ１ｑ補体タンパク質に結合しないか、又は実質的に低減された結合を有するように、例えば、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を天然Ｆｃ領域配列内に導入することにより、得られうる（例えば、Wilson N et al., Cancer Cell 19: 101-113 (2011); Idusogie E et al. J Immunol 164: 4178-4184 (2000)を参照されたい）。一部の実施形態では、抗体構成要素は、全てではなく一部の抗体エフェクター機能を持つ点で様々であり、これにより、抗体構成要素は、結合分子のインビボ半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば、ＣＤＣ又はＡＤＣＣ）が所望されないか、又は有害である適用にとって、所望される候補になる。
一部の実施形態では、抗体構成要素は、ＡＤＣＣを改善する１つ又は２つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を伴うＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗体構成要素は、変更されたＣ１ｑ結合及び／又はＣＤＣエフェクター機能（例えば、改善若しくは減少）を結果としてもたらす、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を伴うＦｃ領域を含む（例えば、国際公開第１９９９／０５１６４２号パンフレット；米国特許第６，１９４，５５１号明細書を参照されたい）。
ｄ）グリコシル化バリアント
一部の実施形態では、抗体がグリコシル化される程度を増大又は減少させるために、結合分子（例えば、抗体－毒素コンジュゲート）の抗体構成要素が、変化する。１つ又は２つ以上のグリコシル化部位が、創出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることにより、抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失が、好都合に達成されうる。例えば、抗体構成要素と接合された炭水化物が変化するように、グリコシル化Ｆｃ領域を含む抗体構成要素が、変化しうる。別の例では、抗体構成要素と接合された炭水化物は、当業者に公知の方法を使用して変化しうる。
ｅ）システイン改変抗体バリアント
一部の実施形態では、結合分子（例えば、抗体－毒素コンジュゲート）の抗体構成要素は、１つ又は２つ以上の改変システイン残基を持つ。抗体の一部の実施形態では、例えば、抗体の１つ又は２つ以上の残基がシステイン残基で置換されたもの（例えば、ＴｈｉｏＦａｂ）など、システイン改変抗体を創出するために所望されうる。一部の実施形態では、置換された残基は、コンジュゲーションのためにたやすく利用可能である抗体の部位に生じる（例えば、Junutula J et al., Nature Biotech 26: 925-32 (2008); Dornan D et al, Blood 114: 2721-29 (2009)を参照されたい）。それらの残基をシステインで置換し、これにより、反応性チオール基が、抗体のアクセス可能な部位に位置させ、本明細書にさらに記載される通り、免疫コンジュゲートを創出するために、抗体を、薬物部分又はリンカー－薬物部分など、他の部分とコンジュゲートするために使用されうる。抗体の一部の実施形態では、抗体フォールディング及びアセンブリーを著明には撹乱させず、抗原結合及び／又は抗体エフェクター機能も著明には変化させない、１つ又は２つ以上のシステイン残基置換を介して、システイン改変抗体を創出することが、所望でありうる。
２． 免疫コンジュゲート
ＰＤ－Ｌ１結合分子の多様な実施形態もまた、本明細書で提示され、この場合、各々のＰＤ－Ｌ１結合分子は、１つ又は２つ以上の毒素構成要素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、又はこれらの断片）とコンジュゲートされた抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む免疫コンジュゲートを含む、（１）少なくとも１つの毒素構成要素と、（２）ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分と特異的に結合することが可能な、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合領域とを含む。「免疫コンジュゲート」は、細胞毒性剤を含むがこれらに限定されない、１つ又は２つ以上の異種分子（複数可）とコンジュゲートされた抗体（抗原結合性抗体断片を含む）である。
結合分子の一部の実施形態では、免疫コンジュゲートは、例えば、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（P. aeruginosa）由来）、リシン（ricin）Ａ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（例えば、ＰＡＰＩ、ＰＡＰII、又はＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、志賀毒素Ａサブユニット、及びトリコテセンなど、毒素とコンジュゲートされた抗体である、抗体－毒素コンジュゲートである。ＰＤ－Ｌ１結合領域（例えば、抗体又は抗体断片）と連結されている毒素（例えば、志賀毒素Ａサブユニット断片）を含む生物学的免疫コンジュゲートは、治療用又は診断用生物学的分子として有用である。加えて、このような治療用分子又は診断用分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドを、例えば、可溶性変化剤、薬物動態変化剤、免疫原性変化剤、及び／又は薬力学変化剤など、さらなる薬剤とコンジュゲートさせることにより、改善されうる（例えば、国際公開第２０１８／１０６８９５号パンフレットを参照されたい）。典型的に、生物薬剤的免疫コンジュゲートは、生物学的分子の官能基（複数可）、並びに薬剤若しくはカーゴの官能基、又は代替的に、生物学的分子と、薬剤若しくはカーゴとの間で架橋するように設計されたリンカーの官能基が関わる化学反応を使用して、抗体を他の薬剤又はカーゴとコンジュゲートすることにより、創出される（II節、構成要素及び／又はそれらの亜構成要素を繋ぐ連結、前出を参照されたい）。
一部の実施形態では、結合分子は、ＰＤ－Ｌ１結合領域内へのシステイン改変を利用する免疫コンジュゲートであり、例えば、この場合、結合分子は、システイン改変抗体を含むなどである。一部の実施形態では、結合分子は、コンジュゲーションのために免疫グロブリン可変領域のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１）内へのシステイン改変を利用する、免疫コンジュゲートである（例えば、国際公開第２０１１／００００５４号パンフレットを参照されたい）。
一部の実施形態では、結合分子は、Ｆｃ領域と接合された炭水化物部分を利用する免疫コンジュゲートであり、例えば、この場合、結合分子は、グリコシル化抗体又は抗体断片を含むなどである。
一部の実施形態では、結合分子は、抗体又は抗体断片と、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドとを含む免疫コンジュゲートである。
本明細書で記載される、結合分子又は抗体毒素コンジュゲートの毒素構成要素は、例えば、アコニチン、アドリアマイシン、アマニチン、アマトキシン、アントラサイクリン、アロイン（aroin）、アピトキシン、アトロピン、ブホトキシン、強心配糖体、カリケアマイシン、セランジン（celandine）、シクトキシン、コルヒチン、コニイン、コンバラトキシン、クロタミン、クラーレ、クルシン、ダウリシン（dauricine）、ジギタリス、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エボモノシド（evomonoside）、グラヤノトキシン、ゲルセミン、ゲルセミニン（gelseminine）、ヘレブリン、ヘレボリン、ヒヨスチアミン、リガトキシン（ligatoxin）、リグストリン、メイタンシン、マイトマイシンＣ、ムスカリン、ファロトキシン、フォラトキシン（phoratoxin）、フィトトキシン、ピクロトキシン、クラゲ毒素、タキシンアルカロイド、チオニン、ビンカアルカロイド、ビスコトキシン、及び本明細書で記載される多様な毒素剤など、前述のいずれかに由来する、天然毒素、生物毒素、タンパク質性毒素、毒液、細胞毒素、低分子毒素、及び合成毒物を含みうるが、これらに限定されない。毒素構成要素としての使用に適切な、薬学的に活性な細胞毒素はまた、ＡＢｘ毒素、リボソーム不活性化タンパク質毒素、炭疽毒素、コリックス毒素、クローディン、ジフテリア毒素、熱不安定性エンテロトキシン、百日咳毒素、シュードモナス外毒素Ａ、リシン、志賀毒素、及びスブチラーゼ細胞毒素；アルキル化剤（例えば、ベンダムスチン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、エトラムスチン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ムスチン、チオテパ、及びトレオスルファンなど）、抗生剤（例えば、アントラサイクリンなど）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチンのようなビンカアルカロイド、並びにパクリタキセル及びドセタキセルのようなエトポシド、又はトキソイドなど）、インターカレート剤（例えば、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、及びストレプトゾトシンなど）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ピリミジンアンタゴニスト、及びプリンアンタゴニストなど）、増殖阻害剤（トポイソメラーゼ阻害剤及び紡錘体毒様カンプトテシン、コルヒチン、ダウノルビシン、フィセチン、ゲニステイン、イリノテカン、ラメラリン、ミリセチン、パクリタキセル、タスピン（thaspine）、トリシトリノール（tricitrinol）Ｂ、トポテカン、ビンカアルカロイドなど）；アスパラギナーゼ及びある特定のＲＮアーゼのような核酸分解酵素などの、酵素及びこれらの断片、例えば、細菌ＲＮアーゼ、真菌リボトキシン、アルゴノートポリペプチド、ビナーゼ（binase）、両生類ＲＮアーゼ、ランピルナーゼ、Onconase（登録商標）、及び哺乳動物ＲＮアーゼなど、例えば、ウシ精液ＲＮアーゼ及びヒトＲＮアーゼなど；細菌、真菌、植物若しくは動物起源の低分子毒素若しくは酵素的に活性な毒素、これらの断片及び／又はバリアントを含む、毒素など、例えば、アブリン、アグロスチン（agrostin）、アマランジン（amarandin）、アマランチン、ヒユ抗ウイルス／ＲＩＰ、アンジオゲニン、Ａ．パテンス種（A. patens）ＲＩＰ、アーティクラチン（Articulatin）Ｄ、アスパリン（asparin）、アスペルギリン、Ａｓｐｆ１、バルサミン、トウガン（B. hispida）ＲＩＰ、ボウガニン（bouganin）、ブーゲンビレア・ブッティアナ種（Bougainvillea x buttiana）抗ウイルスタンパク質１、ベニンカシン（benincasin）、ボウガニン、ツルムラサキ（B. rubra）RIP、ブリオディン（bryodin）（例えばブリオディン１、ブリオディン２）、Ｂ．スペクタビリス種（B. spectabilis）ＲＩＰ、Ｂ．ブルガリス種（B. vulgaris）ＲＩＰ、シロザ（C. album）ＲＩＰ、カンホリン（camphorin）、ヨルガオ（C. aculeatum）全身抵抗性誘導タンパク質、ケイトウ（C. cristata）ＲＩＰ、Ｃ．フィガレイ（C. figarei）ＲＩＰ、チャランチン、カリブジン、シンナモミン、クラビン、ニホンカボチャ（C. moschata）ＲＩＰ、コチニン（cochinin）Ｂ、コロシン（colocin）、クロチン、ククルモシン、クルシン、ナデシコ属種（Dianthus spp.）ＲＩＰ、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp.）ジフテリア毒素（Ｃ．ウルセランス種（C. ulcerans）内、Ｃ．オメガ種（C. omega）内、Ｃ．シュードツベルクローシス種（C. pseudotuberculosis）内のジフテリア毒素）、ドデカンドリン（dodecandrin）、エブリン（ebulin）、エブリチン（ebulitin）、オオバナキバナセツブンソウ（E. hyemalis）ＲＩＰ、ユーセルラチン（euserratin）、ユーチルカリン（eutirucallin）、フラミン（flammin）、フラムリン、フェチジシミン（foetidissimin）、ゲロニン、ギガンチン、ジプソフィリン（gypsophilin）、スナバコノキ（H. crepitans）ＲＩＰ、ヘテロテパリン（Heterotepalin）、ヒスピン（hispin）、ヒルステリン（hirsutellin）Ａ、Ｈ．オリエンタリス種（H. orientalis）ＲＩＰ、オオムギ（H. vulgare）ＲＩＰ、ヒプシン（hypsin）、インスラリン（insularin）、ダッチアイリス（I. hollandica）ＲＩＰ、ラゲニン（lagenin）、ラムジャピン（lamjapin）、ランセオリン（lanceolin）、ヘチマ（L. cylindrical）ＲＩＰ、ルファシリン（luffacylin）、ルファクリン（luffaculin）、ルファグリン（luffagulin）、ルフィン（luffin）、アマ（L. usitatissimum）ＲＩＰ、リクニン（lychnin）、リオフィリン、マヌチン（manutin）、マルモリン（marmorin）、マパルミン（mapalmin）、ツルレイシ（M. charantia）レクチン、アイスプラント（M. crystallinum）ＲＩＰ、メロニン（melonin）、メキシン（mexin）、オシロイバナ属種（Mirabilis spp.）ＲＩＰ、ミトギリン、モデッシン、ＭＯＲ、ツルレイシ属種（Mormordica spp.）ＲＩＰ、モモルスグロビン（momorsgrovin）、モスカチン（moschatin）、ムサルミン（musarmin）、タバコ（N. tabacum）ＲＩＰ、ニグリン、ニグリチン（nigritin）、オシモイジン（ocymoidin）、パキエロシン（pachyerosin）、Ｐ．カリフォルニカム種（P. californicum）レクチン、ペポシン（pepocin）、ペトログラウシン（petroglaucin）、ペトログランジン（petrograndin）、ヤマゴボウ属種（Phytolacca spp.）ＲＩＰ、ピサビン（pisavin）、プレウツレギン（pleuturegin）、プルツレギン（Pluturegin）、シロイヌナズナ（A. thaliana）ペクチンメチルトランスフェラーゼ（ＰＭＥ）、Ｐ．ムルチフォルム種（P. multiforum）ＲＩＰ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ポルレクチン（porrectin）、アエロモナス属種（Aeromonas spp.）シュードモナス毒素（Ａ．ハイドロフィラ種（A. hydrophila）シュードモナス様毒素）、プルケリン（pulchellin）、キンケギンシン（quinqueginsin）、ヒマ（R. communis）アグルチニン、レストリクトシン、リシン、リプロキシミン（riproximin）、サポリン、サルシン、サチビン（sativin）、ライムギ（S. cereale）ＲＩＰ、セキウミン（sechiumin）、志賀毒素、志賀様毒素、シーボルジン（sieboldin）ｂ、セイヨウニワトコ（S. nigra）ＲＩＰ（例えば、セイヨウニワトコ（S. nigra）アグルチニンＩ～Ｖ）、Ｓ．オシモイデス種（S. ocymoides）ＲＩＰ、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）タンパク質、ステラリン（stellarin）、ステノダクチリン（stenodactylin）、テキサニン（texanin）、トリコリン（tricholin）、カラスウリ属種（Trichosanthes spp.）ＲＩＰ（例えば、カラスリン（karasurin）、キリロウィン（kirilowin）、トリコアングイン（trichoanguin）、トリコキリン（trichokirin）、トリコサンチン、ＴＹカイ）、コムギ属種（Triticum spp.）ＲＩＰ、Ｖ．アルブム種（V. album）ＲＩＰ、ベリン（velin）、ベルチン（velutin）、ベロ毒素、ドウカンソウ（V. hispanica）ＲＩＰ、ビルクミン（vircumin）、ボルケンシン（volkensin）、フクロタケ（V. volvacea）ＲＩＰ、ボルバリン（Volvarin）、ユッカ葉タンパク質、Ｚ．ジプロペレンニス（Z. diploperennis）ＲＩＰ、トウモロコシ（Z. mays）ＲＩＰ、及び前出のうちのいずれかによる任意のリボ毒性断片；並びに本明細書で記載される多様な抗腫瘍剤又は抗がん剤を含むが、これらに限定されない。
本明細書で記載される、毒素構成要素としての使用に適切な、多数のタンパク質性毒素が存在する。例えば、真菌リボトキシン及びアルゴノート配列から構成されるアルゴノート酵素ドメイン又はハイブリッド酵素ドメインは、リボソーム不活性化のために改変されうる（Pichinuk E, Wreschner D, Protein Sci 19: 1272-8（2010)を参照されたい）。リボ毒性領域として有用な酵素ドメインを伴うＲＮアーゼの例は、細菌ＲＮアーゼ、例えば、ビナーゼ、両生類ＲＮアーゼなど、例えば、ランピルナーゼ及びOnconase（登録商標）、及び哺乳動物ＲＮアーゼなど、例えば、ウシ精液ＲＮアーゼ及びヒトＲＮアーゼ：ＲＮアーゼ２、ＲＮアーゼ３、及びＲＮアーゼ５などを含む（Newton D et al., J Biol Chem 269: 739-45 (1994); Netwon D et al., J Immunol Meth 231: 159-67 (1999); Yoon J et al., Life Sci 64: 1435-45 (1999); Hugh M et al., Cancer Res 61: 8737-42 (2001); Makarov A, Ilinskaya N, FEBS Lett 540: 15-20 (2003)）。
Figure 2022548078000007
Figure 2022548078000008
IV. 結合分子の一般的機能
結合分子は、例えば、細胞の殺滅；細胞増殖の阻害；細胞内へのカーゴの送達；生物学的情報の収集；免疫応答の刺激、及び／又は健康状態の回復を伴う、多岐にわたる適用において有用である。結合分子は、例えば、がん、免疫障害、及び微生物感染を含む、様々な疾患の、診断又は治療のための、特異的細胞型に対するインビボターゲティングを伴う適用における、例えば、細胞をターゲティングする、細胞毒性の治療用分子；細胞をターゲティングする、非毒性の送達媒体；及び／又は細胞をターゲティングする診断用分子などとしての、治療用分子及び／又は診断用分子として有用である。
一部の実施形態では、結合分子は、特定の細胞型の細胞表面と会合するＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分に結合し、それらの細胞に侵入することが可能である。標的細胞型内に内部化されると、結合分子のある特定の実施形態は、毒素構成要素の作用（複数可）を介して、細胞を殺滅することが可能である。例えば、標的細胞型内に内部化されると、結合分子のある特定の実施形態は、酵素的に活性の、細胞毒性である志賀毒素エフェクターポリペプチド断片を、標的細胞の細胞質ゾルに経路決定し、最終的に、細胞を殺滅することが可能である。別の例では、標的細胞型内に内部化されると、結合分子のある特定の実施形態は、毒素構成要素の作用のため、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路にＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープカーゴを送達することが可能であり、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化された、そのエピトープの細胞表面提示をもたらし、最終的に、細胞死を結果としてもたらす。別の例では、標的細胞型内に内部化されると、結合分子のある特定の実施形態は、毒素構成要素の作用のため、標的細胞に細胞毒性カーゴを送達することが可能であり、これにより、細胞死をもたらす。
代替的に、結合分子の非毒性バリアント又は低減された毒性のバリアントが、標的細胞内に、エピトープ、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び検出促進剤などの、さらなる外因性素材を送達するために使用されうる。このシステムは、任意の数の多岐にわたる毒素構成要素が、例えば、脊索動物への結合分子の投与が関わる適用のための、脱免疫化された毒素エフェクター、特にインビボで安定性を改善するための、低減された、プロテアーゼによる切断に感受性の毒素エフェクター、及び免疫療法適用のためのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む毒素エフェクターなど、異なる機能的特徴を伴う、結合分子のバリアントを作製するためにＰＤ－Ｌ１結合領域（複数可）と会合しうる点で、モジュラーである。
Ａ． 毒素構成要素の細胞毒性を介する細胞殺滅
結合分子の一部の実施形態は、細胞毒性である。結合分子の一部の実施形態は、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクターポリペプチドの構成要素の存在だけのために、細胞毒性である。志賀毒素のＡサブユニットファミリーのメンバーは、各々、細胞の細胞質ゾルに入ると、真核細胞を殺滅することが可能な、酵素的に活性のポリペプチド領域を含む。志賀毒素ファミリーのメンバーは、真核細胞を殺滅するように適応させられているため、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態を含むＰＤ－Ｌ１結合分子など、志賀毒素に由来する分子についての、強力な細胞殺滅活性を呈しうる。
一部の実施形態では、結合分子の結合領域により結合されたＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞）に接触すると、結合分子は、細胞の殺滅を引き起こすことが可能である。一部の実施形態では、結合分子のＣＤ５０値は、５、２．５、１、０．５、又は０．２５ｎＭ未満であり、これは、非ターゲティング型の、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、配列番号１～１８）より、はるかに強力である。
細胞の殺滅は、例えば、エクスビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織内の標的細胞、又は多細胞生物内のような、インビボ状況にある標的細胞など、標的細胞についての、様々な条件下で、本明細書で記載される分子を使用して達せられうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、（１）脱免疫化された、志賀毒素エフェクター亜領域、（２）志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端の近傍における、プロテアーゼによる切断に抵抗性の領域、（３）カルボキシ末端の、小胞体保持／回収シグナルモチーフ；及び／又は（４）異種Ｔ細胞エピトープが、埋め込まれるか、若しくは挿入された領域を含むが、一部の実施形態では、これらの構造的修飾は、志賀毒素の細胞毒性力価を、例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片などの、野生型志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドを含む参照分子と比較して、著明に変化させない。したがって、脱免疫化されている、プロテアーゼによる切断に抵抗性である、及び／又は埋め込まれるか、若しくは挿入された異種エピトープを保有する、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、１つ又は２つ以上の、他の多様な機能性又は特性をもたらしながら、強力な細胞毒性を維持しうる。
志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、既に細胞毒性である結合分子は、より細胞毒性である、及び／又は完全に異なる機構を介して作動する、冗長的な、バックアップの細胞毒性を有するように、本明細書で提示される情報及び方法を使用する当業者により改変されうる。これらの、複数の細胞毒性機構は、それらの、多岐にわたる機能により、互いを補完しうる（直接的及び間接的な、２つの細胞殺滅機構を介して、強力な殺滅をもたらすことによるほか、局所領域に対する、免疫刺激の機構などにより）、互いを、冗長的にバックアップしうる（他の機構の非存在下で、１つの細胞殺滅機構をもたらすことなどにより（標的細胞が、既に活性の機構のサブセットに対して、耐性であるか、又はこれに対する、何らかの免疫を獲得する場合のように））、及び／又は発生した耐性に対して保護しうる（悪性細胞又は感染細胞が、複数の、異なる細胞殺滅機構を、同時に遮断する、起こりにくい状況へと、耐性を制限することにより）。
Ｅ．細胞表面における、ＭＨＣクラスＩによる提示のための、Ｔ細胞エピトープの送達
一部の実施形態では、結合分子は、送達、及び有核脊索動物細胞による細胞表面提示のための、エピトープペプチドカーゴの、事実上、非限定的な選出しを伴う、「Ｔ細胞エピトープ送達」分子の改変を可能とする、Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｔ細胞エピトープを含む毒素エフェクターを含む。一部の実施形態では、結合分子は、それらの毒素構成要素を介して、細胞のプロテアソームに、１つ又は２つ以上のＴ細胞エピトープを送達することが可能である。次いで、送達されたＴ細胞エピトープは、タンパク質分解性プロセシングにかけられ、ＭＨＣクラスＩ経路により、細胞の表面上に提示される。ＭＨＣクラスＩエピトープを、結合分子に改変することにより、脊索動物免疫系の、有益な機能（複数可）を利用し、方向付けるための、免疫刺激性抗原の、ターゲティングされた送達及び提示が達せられうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合分子は、細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ分子に、Ｔ細胞エピトープを送達することが可能である。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合分子は、さらなる外因性素材としてであれ、志賀毒素エフェクターポリペプチド内に埋め込まれるか、又は挿入されるのであれ、異種Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合分子は、細胞表面提示のために、埋め込まれるか、又は挿入されたＴ細胞エピトープを、ＭＨＣクラスＩ分子に送達することが可能である。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子による、細胞の表面における、Ｔ細胞エピトープの提示のために、志賀毒素エフェクターポリペプチド内に埋め込まれるか、又は挿入されたＴ細胞エピトープを、その中に志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の、ＭＨＣクラスＩ分子に送達することが可能である。一部の実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、異種Ｔ細胞エピトープである。一部の実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、既知のものであれ、当業者に規定の方法を使用して、将来同定されるものであれ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとして機能する。
一部の実施形態では、結合分子は、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子によるＴ細胞エピトープの提示のために、結合分子と会合するＴ細胞エピトープを、細胞のＭＨＣクラスＩ分子に送達することが可能である。一部の実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、志賀毒素エフェクターポリペプチド内に埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープである。一部の実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、既知のものであれ、当業者に規定の方法を使用して、将来同定されるものであれ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとして機能する。
一部の実施形態では、細胞を、結合分子と接触させると、結合分子は、ＭＨＣクラスＩ分子による、細胞の表面における、Ｔ細胞エピトープペプチドの提示のために、結合分子と会合したＴ細胞エピトープペプチドを、細胞のＭＨＣクラスＩ分子に送達することが可能である。一部の実施形態では、Ｔ細胞エピトープペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチド内に埋め込まれるか、又は挿入された異種エピトープである。一部の実施形態では、Ｔ細胞エピトープペプチドは、既知のものであれ、当業者に規定の方法を使用して、将来同定されるものであれ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとして機能する。
異種エピトープの、結合分子への付加、又は異種エピトープの、結合分子内の存在は、さらなる外因性素材としてであれ、志賀毒素エフェクターポリペプチド内に埋め込まれるか、又は挿入されるのであれ、このような結合分子を、脊索動物内の、有核の標的細胞による、細胞表面提示のために選び出されたエピトープの、細胞ターゲティング型送達のために使用する方法を可能とする。
ある特定の、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子の１つの機能は、細胞による、ＭＨＣクラスＩ提示のための、１つ又は２つ以上のＴ細胞エピトープペプチドの、ＭＨＣクラスＩ分子への送達である。外因性のＴ細胞エピトープペプチドの、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系への送達は、細胞表面上に、ＭＨＣクラスＩ分子と会合したＴ細胞エピトープペプチドを提示するように、標的細胞を誘導し、これが、その後、標的細胞を攻撃するように、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の活性化をもたらすのに使用されうる。
当業者は、当技術分野で公知の技法を使用して、ある特定の、志賀毒素エフェクターポリペプチドを、他の多様な、ＰＤ－Ｌ１をターゲティングする結合領域と会合させて、カップリングさせて、及び／又は連結して、細胞と物理的にカップリングされた、特異的な細胞外標的生体分子をターゲティングする、結合分子を創出し、これらの結合分子の、標的細胞内部化を促進しうる。全ての有核脊椎動物細胞は、ＭＨＣクラスＩ系を使用して、細胞内エピトープを提示することが可能であると考えられる。したがって、結合分子の細胞外標的生体分子は、原理的に、このような細胞の、ＭＨＣクラスＩ提示経路への、Ｔ細胞エピトープの送達のために、任意の有核脊椎動物細胞をターゲティングしうる。
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子のエピトープ送達機能は、当技術分野で、当業者に公知である、及び／又は本明細書で記載される、様々な標準的方法により検出及びモニタリングされうる。例えば、結合分子が、Ｔ細胞エピトープペプチドを送達し、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系による、エピトープペプチドの提示を駆動する能力は、例えば、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の、直接的な検出／視覚化、異種Ｔ細胞エピトープペプチドの、ＭＨＣクラスＩ分子に対する結合アフィニティーの測定、及び／又は細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；cytotoxic T-lymphocyte）応答をモニタリングすることによる、ＭＨＣクラスＩ－ペプチド複合体の、標的細胞上の提示の、機能的な帰結の測定（例えば、下掲の実施例を参照されたい）を含む、多様なインビトロアッセイ及びインビボアッセイを使用して検討されうる。
ポリペプチド及び分子の、この機能をモニタリングする、ある特定のアッセイは、インビトロ又はエクスビボにおける、特異的なＭＨＣクラスＩ／ペプチド抗原複合体の、直接的な検出を伴う。ペプチド－ＭＨＣクラスＩ複合体の、直接的な視覚化及び定量のための、一般的な方法は、当業者に公知の、多様な免疫検出試薬を伴う。例えば、特定のＭＨＣクラスＩ／ペプチド抗原複合体を認識するための、特異的モノクローナル抗体が開発されうる。同様に、TCR-STAR試薬（Altor Bioscience Corp.社、Mirmar、FL、U.S.A.）など、可溶性の多量体であるＴ細胞受容体も、特異的なＭＨＣ Ｉ／抗原複合体を、直接視覚化又は定量するのに使用されうる（Zhu X et al., J Immunol 176: 3223-32 (2006)）。これらの、特異的な、ｍＡｂ又は可溶性の多量体であるＴ細胞受容体は、例えば、免疫組織化学、フローサイトメトリー、及び酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ；enzyme-linked immuno assay）を含む、多様な検出法により使用されうる。
ＭＨＣ Ｉ／ペプチド複合体の直接的な同定及び定量のための代替法は、例えば、ペプチド－ＭＣＨクラスＩ複合体が、細胞の表面から抽出され、次いで、ペプチドが、シーケンシング用質量分析により精製及び同定される、ProPresent Antigen Presentation Assay（ProImmune, Inc.社、Sarasota、FL、U.S.A.）（Falk K et al., Nature 351: 290-6 (1991)）などの質量分析を伴う。
本明細書で記載されるポリペプチド及び分子の、Ｔ細胞エピトープ送達及びＭＨＣクラスＩ提示の機能をモニタリングする、ある特定のアッセイは、ＭＨＣクラスＩとペプチドとの結合及び安定性をモニタリングする、コンピュータ法及び／又は実験法を伴う。例えば、ＩＥＤＢ（Immune Epitope Database and Analysis Resource）による、MHC-I binding prediction Consensus tool（Kim Y et al., Nucleic Acid Res 40: W525-30 (2012)）など、ペプチドの、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対する結合応答を予測するための、当業者による使用に、複数のソフトウェアプログラムが利用可能である。例えば、結合動態を定量及び／又は比較するのに、細胞表面結合アッセイ及び／又は表面プラズモン共鳴アッセイなど、複数の実験アッセイが、規定的に適用されている（Miles K et al., Mol Immunol 48: 728-32 (2011)）。加えて、所与のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対して、ペプチドが、三次ＭＨＣペプチド複合体を安定化させる能力についての、公知の対照と比較した尺度に基づく、他のＭＨＣペプチド結合アッセイも、開発されている（例えば、ProImmmune, Inc.社製のＭＨＣペプチド結合アッセイ）。
代替的に、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド抗原複合体の、細胞表面における提示の帰結についての測定は、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ；cytotoxic T-cell）の、特異的複合体に対する応答をモニタリングすることによっても実施されうる。これらの測定は、ＣＴＬの、ＭＨＣクラスＩ四量体試薬又はＭＨＣクラスＩ五量体試薬による、直接的な標識付けを含む。四量体又は五量体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ；Major Histocompatibility Complex）対立遺伝子とペプチドとの複合体により決定される、特定の特異性を有するＴ細胞受容体に直接結合する。加えて、特異的ＣＴＬ応答を同定するのに、インターフェロンガンマ又はインターロイキンなど、放出されたサイトカインの、ＥＬＩＳＡ又は酵素免疫スポット（ＥＬＩｓｐｏｔ；enzyme-linked immunospot）による定量も、一般にアッセイされる。ＣＴＬの細胞毒性能は、古典的なクロム５１（Ｃｒ；51 Chromium）放出アッセイ、又は代替的な非放射性細胞毒性アッセイ（例えば、Promega Corp.社、Madison、WI、U.S.A.から市販されているCytoTox 96（登録商標）非放射性キット及びCellTox（商標）CellTiter-GLO（登録商標）キット）、グランザイムＢ ＥＬＩＳｐｏｔ、カスパーゼ活性アッセイ、又はＬＡＭＰ－１移動フローサイトメトリーアッセイを含む、多数のアッセイを使用して測定されうる。標的細胞の殺滅を、特異的にモニタリングするために、エピトープ特異的なＣＳＦＥ標識付け標的細胞の殺滅をモニタリングする、インビトロ又はインビボにおける検討に所望の細胞集団を、容易かつ迅速に標識付けするように、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）が使用されうる（Durward M et al., J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)）。
ＭＨＣクラスＩ提示に対するインビボ応答に続く、ＭＨＣクラスＩ／抗原促進剤（例えば、ペプチド、タンパク質、又は不活化／弱毒化ウイルスワクチン）の投与に続き、活性薬剤（例えば、ウイルス）で感作し、この薬剤に対する応答を、典型的に、非ワクチン接種対照と比較してモニタリングする。既に記載されている方法と類似の方法（例えば、ＣＴＬ細胞毒性アッセイ及びサイトカイン放出の定量）により、ＣＴＬ活性について、エクスビボ試料がモニタリングされうる。
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／又はＨＬＡ－Ｃ分子は、免疫アフィニティーを使用する溶解の後で、中毒細胞から単離され（例えば、抗ＭＨＣ抗体による「プルダウン」精製）、会合したペプチド（すなわち、単離ＭＨＣ分子により提示されるペプチド）は、精製された複合体から回収される。回収されたペプチドは、シーケンシング用質量分析により解析される。質量分析データは、ヒトについての、外因性（非自己）ペプチド（Ｔ細胞エピトープＸ）の配列、及びＩＰＩ（International Protein Index）からなる、タンパク質データベースライブラリー（「自己」又は非免疫原性のペプチドを表す）に対して比較される。ペプチドは、確率データベースに従う有意性によりランク付けされる。検出された、全ての抗原（非自己）ペプチド配列が一覧される。偽ヒットを低減するために、データは、スクランブルデコイデータベースに照らして検索することにより検証される（例えば、Ma B, Johnson R, Mol Cell Proteomics 11: O111.014902 (2012)を参照されたい）。結果は、Ｔ細胞エピトープＸに由来するペプチドが、中毒標的細胞の表面上において、ＭＨＣ複合体内に提示されることを裏付けるであろう。
提示されるペプチド抗原－ＭＨＣ複合体のセットは、発現される、抗原特異的ＨＬＡ分子のために、細胞間で変動しうる。次いで、Ｔ細胞は、異なる抗原特異性を伴う、異なるＴＣＲ分子を使用して、細胞表面上に提示される、特異的ペプチド抗原－ＭＨＣ複合体を認識しうる。
例えば、２つ又は３つ以上の、異なるＴ細胞エピトープを、エフェクターポリペプチドを送達する、単一のプロテアソーム内に埋め込むことなどにより、複数のＴ細胞エピトープが、結合分子により、送達されうるため、単一の結合分子は、例えば、異なるＨＬＡ対立遺伝子を伴うヒトなど、異なるＭＨＣクラスバリアントを伴う、同じ種の脊索動物において有効でありうる。これは、ＭＨＣ複合体タンパク質の多様性及び多型に基づき、異なる対象の亜集団における、異なる有効性を伴う、異なるＴ細胞エピトープを、単一の分子内に組み合わせることを可能としうる。例えば、ヒトＭＨＣ複合体タンパク質である、ＨＬＡタンパク質は、遺伝子祖型、例えば、アフリカ系（サハラ以南系）、アメリカ先住民系、コーカソイド系、モンゴロイド系、ニューギニア系及びオーストラリア系、又は太平洋島嶼系に基づき、ヒトの間で変動する。
Ｔ細胞エピトープを送達するポリペプチド及び分子を伴う適用は、広範である。哺乳動物における、あらゆる有核細胞は、それらの細胞の外部表面において、ＭＨＣクラスＩ分子に複合化させられた、免疫原性のＴ細胞エピトープペプチドの、ＭＨＣクラスＩ経路による提示が可能でありうる。加えて、Ｔ細胞エピトープ認識の感受性は、極めて精緻であるため、免疫応答を結果としてもたらすのに、少数のＭＨＣ－Ｉペプチド複合体の提示が要求されるに過ぎず、例えば、単一の複合体の提示であってもなお、エフェクターＴ細胞による認識に十分でありうる（Sykulev Y et al., Immunity 4: 565-71 (1996)）。
Ｔ細胞応答の活性化は、患者の固有の免疫系を、標的細胞に向けて刺激する、ある特定の抗がん性生物学的薬物、抗新生物性生物学的薬物、抗腫瘍性生物学的薬物、及び／又は抗微生物性生物学的薬物の、所望の特徴である。ロバストかつ強力なＴ細胞応答の活性化はまた、多くのワクチンの所望の特徴でもある。生物内の標的細胞による、Ｔ細胞エピトープの提示は、生物内の標的細胞及び／又はその全体領域に対する、ロバストな免疫応答の活性化をもたらしうる。したがって、提示のためのＴ細胞エピトープの送達のターゲティングは、治療レジメにおいて、Ｔ細胞応答を活性化させるための機構として利用されうる。
ＭＨＣクラスＩ系による、免疫原性の、Ｔ細胞エピトープペプチドの提示は、ＣＴＬ媒介性溶解による殺滅のために、提示細胞をターゲティングし、また、局所微小環境内で、免疫刺激も誘発する。標的細胞内部化型治療用分子の、志賀毒素エフェクターポリペプチドの構成要素内の、免疫原性のエピトープ配列を改変することにより、免疫刺激性抗原の、ターゲティングされた送達及び提示が達せられうる。例えば、標的細胞による、高免疫原性を伴う、公知のウイルス性抗原などの、免疫刺激性非自己抗原の提示は、標的細胞を破壊するほか、より多くの免疫細胞を、領域に動員するように、他の免疫細胞にシグナル伝達する。
ＭＨＣクラスＩ複合体による、免疫原性の、Ｔ細胞エピトープペプチドの提示は、ＣＴＬ媒介性細胞溶解による殺滅のために、提示細胞をターゲティングする。ターゲティングされた細胞による、例えば、高免疫原性を伴う、公知のウイルス性エピトープペプチドなどの、免疫刺激性非自己抗原の提示は、標的細胞を破壊し、より多くの免疫細胞を、脊索動物内の標的細胞部位に動員するように、他の免疫細胞にシグナル伝達しうる。
したがって、本明細書で記載される方法を使用して、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、治療用分子又は潜在的な治療用分子など、既に細胞毒性である分子が、より細胞毒性の大きな分子に改変されうる、及び／又はＴ細胞エピトープの送達、提示、及びエフェクターＴ細胞の刺激を介して作動する、さらなる細胞毒性機構を有するように改変されうる。これらの、複数の細胞毒性機構は、互いを補完しうる（直接的な標的細胞の殺滅及び間接的な（ＣＴＬ媒介性の）細胞殺滅の両方をもたらすことなどにより）、互いを、冗長的にバックアップしうる（他の機構の非存在下で、１つの細胞殺滅機構をもたらすことなどにより）、及び／又は治療耐性の発生に対して保護しうる（耐性を、悪性細胞又は感染細胞が、２つの、異なる細胞殺滅機構を、同時に遮断するように進化する、起こりにくい状況へと制限することにより）。
加えて、触媒性ベースの細胞毒性を呈する、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む細胞毒性分子は、規定の方法を使用する当業者により、酵素的に不活性のバリアントに改変されうる。例えば、細胞毒性分子の、細胞毒性である志賀毒素エフェクターポリペプチドの構成要素は、結果として得られる分子が、Ｔ細胞エピトープを、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系に送達するその能力、及び後続する、標的細胞の表面への提示を介して、なおも細胞毒性でありうるように、１つ又は２つ以上の変異及び／又は切断の導入により、活性の低減を付与されうる、及び／又は不活性とされうる。別の例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、エピトープの付加により不活化されるように、Ｔ細胞エピトープが、志賀毒素エフェクターポリペプチドに、挿入されるか、又は埋め込まれうる（例えば、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット：実施例１－Ｆを参照されたい）。この手法は、１つの細胞毒性機構を除去する一方で、別の細胞毒性機構を保持又は付加し、また、Ｔ細胞エピトープ提示の送達又は「抗原播種」を介して、生物内の、標的細胞（複数可）の局所領域に対する免疫刺激を呈することが可能な分子ももたらしうる。さらに、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む、結合分子の、非細胞毒性バリアントは、脊索動物内の免疫刺激、及び／又は脊索動物内の標的細胞の、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるエピトープによる標識付けを伴う適用において有用でありうる。
ある特定の、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子が、Ｔ細胞エピトープを送達する能力は、様々な条件下、及び、例えば、エクスビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又は多細胞生物内のような、インビボ状況にある標的細胞など、非標的バイスタンダー細胞の存在下で達せられうる。
Ｃ．ターゲティングされた細胞毒性及び／又は細胞毒性Ｔ細胞のエンゲージメントを介する細胞殺滅
一部の実施形態では、結合分子は、１）標的細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のための、Ｔ細胞エピトープの送達、及び／又は２）強力な細胞毒性をもたらしうる。結合分子についての、一部の実施形態では、細胞をターゲティングする結合領域により結合された細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞に接触すると、結合分子は、細胞の死滅を引き起こすことが可能である。細胞殺滅の機構は、例えば、毒素エフェクターポリペプチド領域の酵素活性を介して、直接的な場合もあり、ＣＴＬ媒介性細胞溶解を介して、間接的な場合もある。
１．Ｔ細胞エピトープの送達及びＭＨＣクラスＩによる提示を介する、間接的な細胞殺滅
結合分子についての、一部の実施形態は、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達され、標的細胞の細胞表面に提示されることが可能な、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含むために、細胞毒性である。例えば、Ｔ細胞エピトープを送達する、内因性エピトープの脱免疫化を伴うか、又はこれを伴わない、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、間接的な細胞殺滅を伴う適用のための、結合分子の構成要素として使用されうる。
結合分子についての、ある特定の実施形態では、細胞をターゲティングする結合領域により結合された細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞に接触すると、結合分子は、例えば、標的細胞による、１つ又は２つ以上のＴ細胞エピトープの提示、及びその後における、標的細胞を殺滅するＣＴＬの動員などを介して、細胞の死滅を、間接的に引き起こすことが可能である。一部の実施形態では、動員は、結合分子の抗原カーゴに特異的な内因性のＣＴＬを伴う。
ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化された抗原ペプチドの、細胞による提示は、アポトーシス、溶解、及び／又は壊死の導入を介する、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による、ターゲティングされた殺滅へ、提示細胞を感作する。加えて、標的細胞を認識するＣＴＬは、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ；interferon gamma）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；tumor necrosis factor）アルファ、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ－１ｂｅｔａ；macrophage inflammatory protein-1 beta）、並びにＩＬ－１７、ＩＬ－４、及びＩＬ－２２などのインターロイキンなどの、免疫刺激性サイトカインを放出しうる。さらに、提示されたエピトープの認識による、ＣＴＬの活性化は、提示細胞に対して近位である、他の細胞も、これらの近位の細胞により提示される、ペプチド－ＭＨＣクラスＩ複合体レパートリーに関わらず、無差別的に殺滅する（Wiedemann A et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 10985-90 (2006)）。
ＭＨＣ対立遺伝子の、異なる種内の多様性のために、単一のエピトープだけを含む、結合分子は、同じ種の、異なる患者又は対象に対して、有効性の変動を呈しうる。しかし、結合分子についての、ある特定の実施形態は、各々、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系に、同時に送達されることが可能な、複数のＴ細胞エピトープを含みうる。したがって、結合分子についての、一部の実施形態では、結合分子は、それらのＭＨＣ分子のエピトープペプチドに対する結合アフィニティーの差違が、大幅である（すなわち、それらのＭＨＣ対立遺伝子及び／又はＭＨＣ遺伝子型の差違が、大幅である）、異なる対象を治療するのに使用される。加えて、結合分子についての、ある特定の実施形態は、複数の細胞殺滅機構を、同時に使用することにより（例えば、複数の、異なるＴ細胞エピトープを介して、直接的な殺滅及び間接的な殺滅を、同時に使用することにより）、殺滅を回避する、標的細胞の適応（例えば、治療有効性を回避する、標的がん細胞の変異、又は「変異体逃避」）を低減又は防止する。
一部の実施形態では、結合分子は、協同的に機能して、ある特定のＭＨＣクラスＩエピトープに特異的な拘束性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在下でより多くの標的細胞死を誘導しうる、少なくとも２つの異なる作用機構、すなわち、志賀毒素Ａサブユニットのエフェクター活性、及び免疫活性化を促進するための抗原性ペプチド送達を介して、標的細胞の殺滅を誘導する。２つの異なる作用機構、すなわち志賀毒素Ａサブユニットエフェクター活性、及び免疫活性化を促進するための抗原性ペプチド送達を介して、標的細胞の殺滅を誘導する結合分子の一部の実施形態では、結果としてもたらされる標的細胞殺滅は、孤立したいずれかの殺滅機構と比較して、相加的又は相乗的である。
２．細胞ターゲティング型の志賀毒素細胞毒性を介する、直接的な細胞殺滅
結合分子のある特定の実施形態は、触媒的に活性の、毒素構成要素を含むために、細胞毒性であり、分子内の、免疫原性の、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの存在に関わらない。例えば、内因性エピトープの脱免疫化を伴うか、又はこれを伴わない、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド又はジフテリア毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドの、リボ毒性である酵素活性、又は非触媒性機構（複数可）に起因する、リボソームへの結合及びリボソームの機能に対する干渉などを介する、直接的な細胞殺滅を伴う適用のための、結合分子の構成要素として使用されうる（例えば、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットを参照されたい）。ある特定の結合分子は、標的細胞内のリボソームを恒久的に不活性化させることができる。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高度に免疫化された結合分子の一部の実施形態では、細胞ターゲティング結合領域により結合された細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞に接触すると、結合分子は、例えば、非ターゲティング型の細胞毒性Ｔ細胞の関与などを伴わずに、細胞死を直接的に引き起こすことが可能である（前出のＶ－Ｄ節を参照されたい）。
一部の実施形態では、結合分子は、ＰＤ－Ｌ１陽性末梢血単核細胞と接触すると、例えば、インビボなどで、ＰＤ－Ｌ１陽性末梢血単核細胞の死滅を引き起こすことが可能である。
Ｃ．細胞型の間の選択的細胞毒性
ある特定の、結合分子は、非標的バイスタンダー細胞の存在下における、特異的標的細胞の、選択的殺滅において使用される。細胞をターゲティングする結合領域（複数可）を介して、毒素構成要素の、特異的細胞への送達をターゲティングすることにより、結合分子は、非標的細胞の存在下で、選択された細胞型の、排他的殺滅又は優先的殺滅を結果としてもたらす、細胞型特異的な、制限的細胞殺滅活性を呈しうる。同様に、免疫原性のＴ細胞エピトープの、標的細胞のＭＨＣクラスＩ経路への送達をターゲティングすることにより、結合分子により誘導される、後続のＴ細胞エピトープの提示、及び標的細胞の、ＣＴＬ媒介性細胞溶解は、非標的細胞の存在下で、選択された細胞型の、排他的殺滅又は優先的殺滅に制限されうる。加えて、潜在的に細胞毒性である、両方の構成要素の送達が、非標的細胞の存在下で、標的細胞に、排他的に、又は優先的に制限されるように、細胞毒性の毒素構成要素、及び免疫原性のＴ細胞エピトープの両方の、細胞ターゲティング型送達も、単一の結合分子により達せられうる。
一部の実施形態では、結合分子は、ある特定の濃度で細胞毒性である。一部の実施形態では、結合分子を、細胞型の混合物に投与すると、細胞毒性結合分子は、細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングしていない細胞型と比較して、結合領域により結合される細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞を選択的に殺滅することが可能である。一部の実施形態では、細胞毒性結合分子は、２つ又は３つ以上の異なる細胞型の混合物内で、特異的細胞型の死滅を選択的に、又は優先的に引き起こすことが可能である。これは、細胞毒性活性を、特異的細胞型に、標的生体分子を発現しない「バイスタンダー」細胞型に対して、３倍の細胞毒性効果など、高度の優先性でターゲティングすることを可能とする。代替的に、標的生体分子が、十分に低量で発現する、及び／又は低量で、ターゲティングされない細胞型と、物理的にカップリングする場合、結合領域の標的生体分子の発現は、排他的に１つの細胞型への発現ではない場合がある。これは、著明量の標的生体分子を発現しないか、又は著明量の標的生体分子と物理的にカップリングされていない、「バイスタンダー」細胞型に対して、３倍の細胞毒性効果など、高度の優先性による、特異的細胞型に対する、ターゲティングされた細胞殺滅を可能とする。
一部の実施形態では、細胞毒性である結合分子を、２つの異なる細胞型の集団に投与すると、細胞毒性である結合分子は、そのメンバーが、細胞毒性である結合分子の結合領域の、細胞外標的生体分子を発現しない細胞の集団に対する、細胞毒性である、同じ結合分子のＣＤ５０用量の、少なくとも３分の１の用量で、そのメンバーが、細胞毒性である結合分子の結合領域の、細胞外標的生体分子を発現する、標的細胞の集団上において、５０％細胞毒性濃度（ＣＤ５０）により規定される細胞死を引き起こすことが可能である。
一部の実施形態では、結合領域により結合される細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞型の集団に対する結合分子の細胞毒性活性は、結合領域により結合された細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされていない細胞型の集団に対する細胞毒性活性の、少なくとも３倍である。本明細書で記載される、選択的な細胞毒性は、（ａ）結合領域により結合される細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた特異的細胞型の細胞集団に対する細胞毒性の、（ｂ）結合領域により結合された細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされていない細胞型の細胞集団に対する細胞毒性に対する比（ａ／ｂ）との関係で定量されうる。一部の実施形態では、細胞毒性比は、結合領域の標的生体分子と物理的にカップリングされていない、細胞又は細胞型の集団と比較した、結合領域の標的生体分子と物理的にカップリングされた、細胞又は細胞型の集団について、少なくとも３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、又は１０００倍である、選択的細胞毒性を指し示す。
一部の実施形態では、結合分子の、優先的細胞殺滅機能又は選択的細胞毒性は、志賀毒素エフェクターポリペプチド内に存在する、さらなる外因性素材（例えば、細胞毒性素材）及び／又は異種Ｔ細胞エピトープのためであり、必ずしも、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の触媒活性の結果ではない。
この優先的細胞殺滅機能は、様々な条件下、及びエクスビボで操作された細胞型の混合物、インビトロで培養された、細胞型の混合物を伴う組織、又はインビボにおける、複数の細胞型の存在下（例えば、多細胞生物内の、インサイチュー又は天然の位置における）など、非標的バイスタンダー細胞の存在下における、ターゲティングされた細胞の、ある特定の、細胞毒性である、結合分子による殺滅を可能とする。
ＰＤ－Ｌ１発現細胞は、選択的にターゲティングされうるものの、ある特定の結合分子は、ＰＤ－Ｌ１を発現している末梢血単核細胞型の存在下で、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞を選択的に殺滅しうる。
Ｄ． ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達の干渉
細胞毒性、細胞増殖抑制、及び免疫刺激の適用に加えて、結合分子は、例えば、免疫チェックポイントの阻害及び抗がん免疫療法が関わる適用などで、ＰＤ－１シグナル伝達を阻害するために使用されてもよい。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、細胞に外因的に投与された場合、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断しうる。結合分子の一部の実施形態は、所与の標的細胞型について、それらの細胞毒性ＣＤ５０（例えば、０．１～５０ｎＭ）よりも、ずっと強力でないＰＤ－Ｌ１シグナル伝達阻害についての５０％阻害濃度（ＥＣ５０）（例えば、５００ｎＭ又は１μＭよりも大きい）を呈するものの、これは、常に当てはまるわけではない。結合分子の一部の実施形態は、それらのＣＤ５０値と同等なＥＣ５０値を呈する場合があり、強力なレベルのＰＤ－１シグナル伝達阻害及び細胞毒性の両方が、同時に生じうることが、指し示される。一部の実施形態では、例えば、１１６２９６（配列番号１２７）などの、不活性な又は活性が低減された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、ＰＤ－Ｌ１結合分子のような不活性化毒素を含む結合分子などの、結合分子は、それらの細胞毒性ＣＤ５０値よりも大きな（例えば、１，０００又は１０，０００ｎＭよりも大きな）、ＥＣ５０値（例えば、１～２００ｎＭ）を呈する。それらの細胞毒性ＣＤ５０値よりも大きなＥＣ５０値を呈する、ある特定の結合分子は、いかなる著明な細胞毒性活性も存在しない場合に、ＰＤ－１シグナル伝達阻害を実現するためのある特定の濃度で使用されうる。
Ｅ． 標的細胞の内部へのさらなる外因性素材の送達
細胞毒性、細胞増殖抑制、免疫刺激、及び抗がん免疫療法の適用に加えて、結合分子は、例えば、情報収集及び診断機能が関わる適用などの、標的細胞内送達機能のために使用されてもよい。
その細胞毒性低減形態及び／又は非毒性形態を含む、結合分子は、結合分子の結合領域により認識される、細胞外ＰＤ－Ｌ１分子と物理的にカップリングされた細胞に侵入することが可能であるため、結合分子についての、ある特定の実施形態は、さらなる外因性素材を、標的細胞型の内部へ送達するのに使用されうる。例えば、細胞毒性である、結合分子の非毒性バリアント、又は細胞毒性であってもよいバリアントは、さらなる外因性素材を、結合分子の結合領域により結合される細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞に送達する、及び／又はこれらの内部を標識付けするのに使用されうる。標的生体分子を、少なくとも１つの細胞表面に発現する、多様な種類の細胞及び／又は細胞集団は、外因性素材を受け取るために、結合分子によりターゲティングされうる。多様な毒素構成要素、さらなる外因性素材、及び結合領域を、例えば、腫瘍細胞についての非侵襲性のインビボイメージングなど、カーゴ送達を伴う、多岐にわたる適用に適切な結合分子をもたらすように、互いと会合させうるという点で、機能的構成要素はモジュラーである。
ある特定の、結合分子による、外因性素材機能の、この送達は、様々な条件下、及び、例えば、エクスビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又は多細胞生物内のような、インビボ状況にある標的細胞など、非標的バイスタンダー細胞の存在下で達せられうる。さらに、ある特定の、結合分子による、外因性素材の、ある特定の細胞への選択的送達は、様々な条件下、及びエクスビボで操作された細胞型の混合物、インビトロで培養された、細胞型の混合物を伴う組織、又はインビボにおける、複数の細胞型の存在下（例えば、多細胞生物内の、インサイチュー又は天然の位置における）など、非標的バイスタンダー細胞の存在下で達せられうる。
ある特定の濃度範囲など、標的細胞を殺滅すること、及び／又は標的細胞のＭＨＣ分子による細胞表面提示のために、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープを送達することが可能でない、毒素エフェクターポリペプチド、及び結合分子も、例えば、検出促進剤などの外因性素材を、細胞に送達するために、なおも有用でありうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターは、低細胞毒性～無細胞毒性を呈し、したがって、本明細書では、「非細胞毒性及び／又は低減細胞毒性」と称される。一部の実施形態では、結合分子は、低細胞毒性～無細胞毒性を呈し、「非細胞毒性バリアント」及び／又は「低減細胞毒性バリアント」と称されうる。例えば、一部の分子は、著明レベルの、志賀毒素ベースの細胞毒性を呈さず、この場合、例えば、当業者に公知のアッセイ及び／又は本明細書で記載されるアッセイなどにより測定される通り、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ未満の用量で、適切な参照分子と比較して、著明量の細胞死が見られない。一部の実施形態では、分子は、哺乳動物レシピエント１ｋｇ当たりの投与量１～１００μｇで、毒性を呈さない。細胞毒性低減バリアントは、ある特定の濃度又は投与量において、なおも細胞毒性でありうるが、例えば、ある特定の状況において、著明レベルの志賀毒素細胞毒性を呈することが可能でないなど、細胞毒性の低減を呈する。
これを含む、ある特定の結合分子は、例えば、毒素エフェクターポリペプチドを不活化させることが当業者に公知である、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換の付加であって、本明細書で記載される、例示的な置換を含む付加などを介して、非細胞毒性とされうる。結合分子の非細胞毒性バリアント及び低減細胞毒性バリアントは、ある特定の状況では、さらなる外因性素材の送達に、細胞毒性の大きなバリアントより適切でありうる。
診断機能
一部の実施形態では、結合分子は、インビトロ及び／又はインビボにおける、特異的細胞、細胞型、及び／又は細胞集団のほか、前述のうちのいずれかの、特異的細胞内区画の検出において使用される。検出促進剤とコンジュゲートされた、細胞毒性である、結合分子の、細胞毒性低減形態及び／又は非毒性形態は、例えば、同じ標的生体分子、重複エピトープ、及び／又は同じエピトープに、高アフィニティーで結合する結合領域など、同じ結合領域又は同様の結合領域を含む治療レジメンと共に使用される、コンパニオン診断剤など、診断機能のために使用されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、診断及び治療の両方に、又は診断単独に使用される。同じ、細胞毒性である結合分子が、診断及び治療の両方に使用される場合、一部の実施形態では、診断のための検出促進剤を組み込む、結合分子のバリアントは、本明細書で記載される、例示的な置換を含む、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を介する、その志賀毒素エフェクターポリペプチド領域（複数可）の触媒性不活化により、その細胞毒性を低減される場合もあり、非毒性とされる場合もある。例えば、結合分子の、ある特定の非毒性バリアントは、用量１ｍｇ／ｋｇ未満の投与の後において、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の標的細胞の死滅を呈する。細胞毒性低減バリアントは、ある特定の濃度又は投与量において、なおも細胞毒性でありうるが、例えば、本明細書で記載される、著明レベルの志賀毒素細胞毒性を呈することが可能でないなど、細胞毒性の低減を呈する。
当技術分野で公知の検出促進剤を、多様な、結合分子とコンジュゲートさせる能力は、例えば、がん細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、及び／又は感染細胞など、ある特定の細胞の検出に有用な組成物をもたらす。結合分子についての、これらの診断的実施形態は、当技術分野で公知の、多様なイメージング法及びイメージングアッセイを介する情報収集に使用されうる。例えば、結合分子についての、診断的実施形態は、患者又は生検試料における、個別のがん細胞、免疫細胞、及び／又は感染細胞の細胞内小器官（例えば、エンドサイトーシス区画、ゴルジ区画、小胞体区画、及び細胞質ゾル区画）に対するイメージングを介する情報収集に使用されうる。
診断的使用のためであれ、他の使用のためであれ、結合分子についての、診断的実施形態を使用して、多様な種類の情報が収集されうる。この情報は、例えば、新生物性細胞型の診断、患者の疾患の治療感受性の決定、時間経過にわたる、抗新生物療法の進行についてのアッセイ、時間経過にわたる、免疫調節療法の進行についてのアッセイ、時間経過にわたる、抗微生物療法の進行についてのアッセイ、移植素材中の、感染細胞の存在についての査定、移植素材中の、望ましくない細胞型の存在についての査定、及び／又は腫瘍塊の、手術による切除の後における、遺残腫瘍細胞の存在についての査定において、有用でありうる。
例えば、結合分子の診断用バリアントを使用して収集される情報を使用して、患者の亜集団が確認される場合があり、次いで、これらの診断用実施形態を使用して明らかにされる、それらの独自の特徴（複数可）に基づき、個々の患者が、亜集団に、さらに類別されうるであろう。例えば、具体的な医薬又は療法の有効性は、患者亜集団を規定するのに使用される基準でありうるであろう。例えば、特定の、細胞毒性である、結合分子の、非毒性の診断用バリアントは、この、結合分子の細胞毒性バリアントに対して、肯定的に応答することが予測される、患者のクラス又は亜集団に、どの患者が入るのかを識別するのに使用されうる。したがって、細胞毒性である、結合分子の、非毒性のバリアントを含む、結合分子を使用する、患者の同定、患者の層別化、及び診断のための、関連する方法もまた、本明細書で提示される。
例えば、直接的な細胞殺滅、間接的な細胞殺滅、Ｔ細胞エピトープのような外因性素材の送達、及び／又は情報の収集のためなど、結合分子による細胞ターゲティングのために、細胞による標的生体分子の発現が天然である必要はない。標的生体分子の、細胞表面における発現は、感染、病原体の存在、及び／又は細胞内の微生物病原体の存在の結果でありうるであろう。標的生体分子の発現は、例えば、ウイルス性発現ベクターによる感染の後において、強制又は誘導される発現など、人工的な場合もあり、例えば、アデノウイルス系、アデノ随伴ウイルス系、及びレトロウイルス系を参照されたい。ＰＤ－Ｌ１の発現は、細胞を、イオン化放射線に曝露することにより誘導されうる（Wattenberg M et al., Br J Cancer 110: 1472-80 (2014)）。
免疫抑制免疫細胞のターゲティング
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、免疫抑制免疫細胞（ＩＩＣ）など、細胞の表面でＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することが可能である。細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合すると、結合分子は、内部化される場合があり、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドの活性は、細胞を有効に、及び特異的に殺滅する。一部の実施形態では、この直接的な細胞殺滅活性は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ；tumor microenvironment）内でＴｒｅｇなど、免疫抑制免疫細胞を枯渇させる。ＴＭＥ内の免疫抑制が高まると、非抑制免疫細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）が腫瘍を攻撃することができる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、ＩＩＣ上及び腫瘍細胞上であるＰＤ－Ｌ１に結合する。したがって、一部の実施形態では、ＴＭＥ内の免疫抑制免疫細胞を枯渇させることに加えて、結合分子はまた、腫瘍細胞に結合し、これを直接的に殺滅する。この二重の作用機構は、がん療法における開示された結合分子の有効性を増強することができる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、免疫細胞など、１つ又は２つ以上の細胞型の拡大を引き起こす。例えば、一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は好酸球の拡大を引き起こす。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープなど、抗原性エピトープを含む。一部の実施形態では、結合分子がＰＤ－Ｌ１に結合し、細胞内に内部化された後、抗原性エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ系に送達され、細胞を免疫媒介破壊のためにターゲティングする。したがって、ＴＭＥ内で免疫抑制免疫細胞を枯渇させること、及び一部の実施形態では、腫瘍細胞を直接的に殺滅することに加えて、結合分子はまた、免疫系による腫瘍の認識を増強する。
一部の実施形態では、結合分子は、結合分子の結合領域が結合するＰＤ－Ｌ１の発現をモジュレートする。一部の実施形態では、結合分子は、ＰＤ－Ｌ１の発現を低減するか、又はこれをダウンレギュレーションする。一部の実施形態では、結合分子は、ＰＤ－Ｌ１の細胞表面密度を低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の発現のモジュレーションは、免疫抑制を低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の発現のモジュレーションは、細胞死をもたらす。
したがって、開示された結合分子は、（１）他の細胞の中でＰＤ－１を発現している細胞型（複数可）を選択的に殺滅するために、並びに（２）がんを含む、様々な疾患、障害、及び状態を治療するための治療用分子として、有用である。図３５は、例示的な結合分子が対象において抗腫瘍効果を誘導しうる作用機構を、さらに例示している。
本明細書で記載される結合分子は、細胞、例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞の表面で、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することが可能な結合領域を含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞は、免疫抑制Ｔ細胞、免疫抑制Ｂ細胞、免疫抑制形質細胞、又は免疫抑制骨髄系細胞など、免疫抑制免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫抑制免疫細胞は、Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、又はＴＡＭである。一部の実施形態では、免疫抑制免疫細胞は、ＴＡＮ又はＣＡＦである。一部の実施形態では、結合領域は、常在メモリーＴ細胞、腫瘍排除樹状細胞、及び／又はＣＤ１４＋単球に特異的に結合しない。
本明細書で使用される、「直接的に殺滅しない」又は「間接的に殺滅する」という用語は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合領域とを含む結合分子が、標的細胞（例えば、ＩＣＣ）に結合し、これが、下流での、第２の細胞（例えば、がん細胞）の殺滅をもたらす方法を指す。例えば、結合分子は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の免疫抑制免疫細胞に結合し、これを殺滅することにより、腫瘍細胞を間接的に殺滅することができる。ＴＭＥ内で免疫抑制が高まると、がん細胞は、非抑制免疫細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞など）により殺滅されうる。
一部の実施形態では、それを必要とする対象における、免疫細胞の免疫抑制活性を低減するための方法は、有効量の、（ｉ）結合分子、（ii）結合分子をコードする核酸（例えば、発現ベクター）、又は（iii）結合分子若しくはこれをコードする核酸を含む組成物を、対象に投与するステップを含む。
一部の実施形態では、結合分子は、対象内の免疫抑制免疫細胞の表面に存在するが、対象のがん細胞の表面には存在しないＰＤ－Ｌ１に結合する。一部の実施形態では、結合分子は、免疫抑制免疫細胞を直接的に殺滅するが、対象のがん細胞を直接的には殺滅しない。
一部の実施形態では、結合分子は、対象内の免疫抑制細胞、及び対象のがん細胞の表面に存在するＰＤ－Ｌ１に結合する。一部の実施形態では、結合分子は、免疫抑制免疫細胞及び対象のがん細胞を直接的に殺滅する。
一部の実施形態では、対象は、がんを有する。一部の実施形態では、がんは、例えば、腫瘍微小環境内の、少なくとも１つの免疫抑制細胞の存在により特徴付けられる。一部の実施形態では、がんは、高い変異量（ＴＭＢ）及び／又は高いインデル頻度により特徴付けられる。変異量は、ハイブリッドベースの次世代シーケンシングを含む、多様な方法により分析することができ、分析された腫瘍ゲノム領域当たりの配列バリアント又は変異（例えば、１メガ塩基当たりの変異）の総数として報告される。がんは、１メガ塩基当たり２０個以上の変異を有する場合に、「高い」変異量を有すると分類されうる。高い変異量は、タバコ煙及び多環芳香族炭化水素など（例えば、肺がん及び膀胱がんにおける）、強力な発がん物質への曝露のほか、変異原への曝露（例えば、黒色腫におけるＵＶ光）の帰結として発生したがんに典型的である。インデル（挿入及び欠失）は、がん細胞において一般に見られる、一種の変異である。フレームシフト変異を作製するインデルは、高度に免疫原性の腫瘍ネオ抗原を産生しうる。したがって、高いインデル頻度の存在は、本明細書で記載される治療手法へのよりよい応答をもたらしうる。がんは、１メガ塩基当たり０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のインデルを有する場合に、「高い」インデル頻度を有すると分類される。一部の実施形態では、がんは、１メガ塩基当たり０．１～１、１～１０、１０～５０、５０～１００、又は１０１以上のインデルを有する場合に、高いインデル頻度を有すると分類される。
V．志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び結合分子の、作製、製造、及び精製
志賀毒素エフェクターポリペプチド、及びある特定の結合分子は、当業者に周知の技法を使用して作製されうる。例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、標準的合成法により製造される場合もあり、組換え発現系の使用により製造される場合もあり、他の任意の適切な方法により製造される場合もある。したがって、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、例えば、（１）標準的な固相法又は液相法を使用して、段階的に、又は断片アセンブリーにより、結合分子のポリペプチド若しくはポリペプチド構成要素を合成し、最終的なポリペプチド化合生成物を単離及び精製する方法；（２）結合分子のタンパク質若しくはタンパク質構成要素をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞内で発現させ、発現産物を、宿主細胞若しくは宿主細胞培養物から回収する方法；又は（３）結合分子のポリペプチド若しくはポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチドの、無細胞のインビトロ発現法、及び発現産物を回収する方法を含む、多数の方式で合成される場合もあり、（１）、（２）、又は（３）の方法の任意の組合せを行って、タンパク質構成要素の断片を得、その後、ペプチド又はポリペプチド断片を接続して（例えば、ライゲーションして）、ポリペプチド構成要素を得、ポリペプチド構成要素を回収することにより合成される場合もある。
結合分子、又は結合分子のタンパク質構成要素を、固相又は液相のペプチド合成により合成することが好ましい場合がある。ポリペプチド及び結合分子は、標準的な合成法により、適切に製造されうる。したがって、ペプチドは、例えば、ペプチドを、標準的な固相法又は液相法を介して、段階的に、又は断片のアセンブリーにより合成するステップと、最終的なペプチド生成物を、単離及び精製するステップとを含む方法により合成されうる。この文脈では、国際公開第１９９８／０１１１２５号パンフレット、又は、とりわけ、Fields G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis (Synthetic Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002)、及びこの中の合成例が参照されうる。
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子は、当技術分野で周知の組換え法を使用して調製（作製及び精製）されうる。一般に、コードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されるか、又はこれをトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、タンパク質を、細胞培養物から精製又は回収することにより、タンパク質を調製するための方法については、例えば、Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989); Dieffenbach C et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)において記載されている。任意の適切な宿主細胞は、ポリペプチド及び／又は細胞ターゲティングタンパク質を作製するのに使用されうる。宿主細胞は、ポリペプチドの発現を駆動する、１つ又は２つ以上発現ベクターを、安定的に、又は一過性にトランスフェクトされるか、これらにより形質転換されるか、これらを形質導入するか、又はこれらを感染させられる細胞でありうる。加えて、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合分子は、細胞毒性の変更、細胞増殖抑制効果の変更、及び／又は血清半減期の変更など、所望の特性を達成するために、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸の変化、又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸の欠失若しくは挿入を結果としてもたらす、ポリペプチド又は細胞ターゲティングタンパク質をコードするポリヌクレオチドの修飾により作製されうる。
本明細書で記載されるポリペプチド又は細胞ターゲティングタンパク質を作製するのに選び出されうる、多種多様な発現系が存在する。例えば、細胞ターゲティングタンパク質を発現させるための宿主生物は、大腸菌及び枯草菌（B. subtilis）などの原核生物、酵母及び糸状菌（出芽酵母（S. cerevisiae）、メタノール資化酵母（P. pastoris）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、及びＫ．ラクティス（K. lactis）のような）、藻類（コナミドリムシ（C. reinhardtii）のような）、昆虫細胞株、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞のような）、植物細胞株などの真核生物、及びトランスジェニック植物（シロイヌナズナ（A. thaliana）及びベンサミアナタバコ（N. benthamiana）のような）などの真核生物を含む。
したがって、上記で列挙された方法に従い、ポリペプチド、若しくは細胞ターゲティングタンパク質のタンパク質構成要素の一部若しくは全部をコードするポリヌクレオチド、宿主細胞に導入されると、ポリペプチド若しくは細胞ターゲティングタンパク質の一部若しくは全部をコードすることが可能な、少なくとも１つの、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又はポリヌクレオチド若しくは発現ベクターを含む宿主細胞を使用して、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合分子を作製するための方法もまた、提供される。
宿主細胞系又は無細胞系において、組換え法を使用して、タンパク質が発現される場合、高純度であるか、又は実質的に均質である調製物を得るために、所望のタンパク質を、宿主細胞因子など、他の構成要素から分離（又は精製）することが有利である。精製は、遠心分離法、抽出法、クロマトグラフィー／分画法（例えば、ゲル濾過によるサイズ分離、イオン交換カラムによる電荷分離、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカ上又はＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上におけるクロマトグラフィー、等電点電気泳動、及び夾雑物を除去する、Protein A Sepharoseクロマトグラフィー）、及び沈殿法（例えば、エタノール沈殿又は硫酸アンモニウム沈殿）など、当技術分野で周知の方法により達せられうる。ポリペプチド及び／又は結合分子の純度を増大させるのに、任意の数の生化学的精製法が使用されうる。一部の実施形態では、ポリペプチド及び結合分子は、ホモ多量体形態（例えば、２つ又は３つ以上のポリペプチド又は結合分子を含む分子複合体）中で精製されてもよい。
抗体は、組換え方法及び組成物を使用して作製されうる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書で記載される抗体又は抗体断片をコードする、単離された核酸が、提供される。このような核酸は、抗体の、ＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。本明細書で記載される抗体を製造する方法は、上記に提示される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適切な条件下で培養するステップを含み、宿主細胞（又は宿主細胞の培養培地）から抗体を回収するステップを含んでもよい。抗体の組換え作製のために、例えば、上記で記載した、抗体をコードする核酸が、宿主細胞内へのさらなるクローニング及び／又は発現のために、単離され、１つ又は２つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、当業者に公知の規定の方法を使用して、たやすく単離され、シーケンシングされうる。
抗体コードベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書で記載される及び／又は当業者に公知の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及び／又はＦｃエフェクター機能が要求されない場合、抗体は、細菌において作製されうる（例えば、米国特許第５，６４８，２３７号明細書、米国特許第５，７８９，１９９号明細書、及び米国特許第５，８４０，５２３号明細書を参照されたい）。発現後、抗体は、細菌細胞ペーストから可溶性画分内に単離される場合があり、これをさらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母など、真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌及び酵母株を含む、抗体コードベクターに適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを伴う抗体の作製を結果としてもたらす（例えば、Gerngross T, Nat Biotech 22: 1409-14 (2004); Li H et al., Nat Biotech 24: 210-15 (2006)を参照されたい）。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。植物細胞は、宿主として利用されうる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号明細書、米国特許第６，０４０，４９８号明細書、米国特許第６，４２０，５４８号明細書、米国特許第７，１２５，９７８号明細書、及び米国特許第６，４１７，４２９号明細書を参照されたい）。昆虫細胞と共に、特にヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、使用されうる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。脊椎動物細胞は、宿主として使用されうる。例えば、懸濁状態で増殖するように適応させられた哺乳動物細胞株が、有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚腎臓株２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である（Graham F et al.，J Gen Virol 36: 59-74 (1977); Mather J et al.，Biol Reprod 23: 243-52 (1980); Mather J et al.，Ann NY Acad Sci 383: 44-68 (1992)）。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０細胞など、骨髄腫細胞株を含む（例えば、Urlaub G et al.，Proc Natl Acad Sci U.S.A. 77: 4216-20 (1980)を参照されたい）。抗体作製に適切な、ある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press，Totowa，N.J.), pp. 255-268 (2003)を参照されたい。
本明細書で提示される抗体は、当技術分野で公知の多様なアッセイにより、それらの物理／化学特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
免疫コンジュゲーションの方法は、反応性チオール、アルデヒドタグ付きの、ソルターゼに媒介されるコンジュゲーション、ＭＴＧアーゼに媒介されるコンジュゲーション、トランスグルタミナーゼコンジュゲーション、ｂｉｓ－連結、及びスペーサー又は多機能性リンカーを使用することを含むがこれらに限定されない（例えば、国際公開第２００９／０５２２４９号パンフレット、国際公開第２０１２／０９７３３３号パンフレット、国際公開第２０１３／１７３３９１号パンフレット、国際公開第２０１４／１４０３１７号パンフレット、国際公開第２０１４／１５９８３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１５５７５３号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１８８３号パンフレット、国際公開第２０１６／１０２６３２号パンフレット、国際公開第２０１８／１８５５２６号パンフレットを参照されたい）。
抗体－毒素コンジュゲート又は免疫コンジュゲートは、リンカーと抗体との間に共有結合を形成するための、抗体の求核基と、二価リンカー試薬との反応に続く、毒素構成要素との反応；及びリンカーと毒素との間に共有結合を形成するための、毒素構成要素の求核基と、二価リンカー試薬との反応に続く、抗体の求核基との反応を含む、当業者に公知の有機化学反応、条件、及び試薬を利用する複数の経路により調製されうる。
抗体上の求核基は、（ｉ）アミノ末端アミン基、（ii）側鎖アミン基、例えば、リシン（lysine）残基のもの、（iii）側鎖チオール基、例えば、システイン残基のもの、及び（iv）抗体がグリコシル化されている場合の炭水化物部分の糖ヒドロキシル基又はアミノ基を含むがこれらに限定されない。アミン基、ヒドロキシル基、及びチオール基は、求核性であり、反応して、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物など、活性エステル；（ii）ハロアセトアミドなど、ハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル；並びに（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成することが可能である。ある特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、例えば、システインジスルフィド架橋を有する。抗体が、完全に又は部分的に還元されるように、ジチオトレイトール（ＤＴＴ；dithiothreitol）又はトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ；tricarbonylethylphosphine）などの還元剤を用いる処理により、抗体は、リンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性にされうる（例えば、国際公開第２０１３／１７３３９１号パンフレット、国際公開第２０１３／１７３３９２号パンフレット、国際公開第２０１３／１７３３９３号パンフレット、国際公開第２０１３／１９０２７２号パンフレット、国際公開第２０１４／０６４４２４号パンフレット、国際公開第２０１４／１１４２０７号パンフレット、国際公開第２０１５／１５５７５３号パンフレット、国際公開第２０１８／１８５５２６号パンフレットを参照されたい）。さらなる求核基は、リシン残基の改変を通じて、例えば、リシン残基を２－イミノチオラン（トラウト試薬）と反応させることにより、抗体に導入され、アミンのチオールへの転換を、結果としてもたらすことができる。反応性チオール基はまた、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のシステイン残基を導入することにより、（例えば、１つ又は２つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含むバリアント抗体を調製することにより）、抗体内に導入されうる。
抗体－毒素コンジュゲート又は免疫コンジュゲートはまた、アルデヒド又はケトンカルボニル基など、抗体上の求電子基と、リンカー試薬又は毒素構成要素上の求核基との反応により、作製されうる。リンカー試薬上の有用な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドを含むがこれらに限定されない。一実施形態では、抗体は、リンカー試薬又は毒素構成要素上の求核置換基と反応することが可能な求電子部分を導入するように修飾される。別の実施形態では、グリコシル化抗体の糖は、リンカー試薬又は毒素構成要素のアミン基と反応しうる、アルデヒド基又はケトン基を形成するように、例えば、過ヨウ素酸塩酸化試薬を用いて、酸化されうる。結果として得られるイミンシッフ塩基基は、安定な連結を形成する場合もあり、例えば、水素化ホウ素試薬により、還元されて安定なアミン連結を形成する場合もある。一実施形態では、グリコシル化抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムとの反応は、毒素構成要素上の適切な基と反応することができる、抗体内のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基をもたらしうる。別の実施形態では、アミノ末端セリン残基又はトレオニン残基を含有する抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、最初のアミノ酸の代わりに、アルデヒドの作製を結果としてもたらすことができる（例えば、米国特許第５，３６２，８５２号明細書を参照されたい）。このようなアルデヒドは、毒素構成要素又はリンカー求核試薬と反応しうる。
抗体のＦｃ領域上の炭水化物（複数可）は、化合物を接合のための天然部位である。一般に、炭水化物は、過ヨウ素酸塩酸化により修飾して、反応性アルデヒドを産生し、次いで、これを使用して、シッフ塩基形成により、反応性アミン含有化合物を接合することができる。アルデヒドは、アミン基と反応することができるので、反応は、抗体内のリシン残基又は抗原結合ドメインがプロトン化され、非反応性であるように、低ｐＨで実行される。ヒドラジド基は、低ｐＨで反応性であり、ヒドラゾン連結を形成するので、産生されるアルデヒドへの接合に最も適切である。次いで、この連結は、ヒドラジン連結を形成するためのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元により、さらに安定化されうる。
毒素構成要素上の例示的な求核基は、反応して、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物など、活性エステル；（ii）ハロアセトアミドなど、ハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル；（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成することが可能な、アミン基、チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカルバゾン基、ヒドラジンカルボキシレート基、及びアリールヒドラジド基を含むがこれらに限定されない。
コンジュゲートのローディングは、抗体１つ当たりのコンジュゲート部分の平均数（ｘ）として表現されうる。コンジュゲートのローディングは、抗体１つ当たり１～２０のコンジュゲート部分の範囲でありうる。コンジュゲーション反応からの抗体－毒素コンジュゲート又は免疫コンジュゲートの調製物中の抗体１つ当たりのコンジュゲート部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；high-performance liquid chromatography）など、従来の手段により特徴付けられうる。ｘに関して、免疫コンジュゲートの量的分布もまた、例えば、均質な免疫コンジュゲートの分離、精製、及び特徴付けなどにより決定される場合があり、この場合、ｐは、免疫コンジュゲートからのある特定の値であり、他のコンジュゲートローディングが、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段により、達成されうる。
下記の実施例は、例示的な、結合分子を作製するための方法の非限定例のほか、作製法についての、具体的であるが、非限定的な態様についての記載である。
VI．結合分子を含む、医薬組成物及び診断用組成物
下記に、さらに詳細に記載される状態、疾患、障害、又は症状（例えば、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染）の治療又は予防のための、単独の、又は医薬組成物中に、１つ又は２つ以上の、さらなる治療剤と組み合わせた使用のための、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び結合分子もまた提供する。結合分子、又はこの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体と一体に含む医薬組成物もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態では、医薬組成物は、結合分子のホモ多量体性及び／又はヘテロ多量体性形態を含みうる。医薬組成物は、下記にさらに詳細に記載される疾患、状態、障害、又は症状を治療、改善、又は予防する方法に有用である。このような、各疾患、各状態、各障害、又は各症状は、本明細書で記載されるものに従う医薬組成物の使用に関する、別個の実施形態であると想定される。下記により詳細に記載されるものに従う、少なくとも１つの治療方法における使用のための医薬組成物もまた、提供される。
本明細書で使用される、「患者」及び「対象」という用語は、任意の生物、一般に、少なくとも１つの疾患、障害、又は状態の症状、徴候（sign及び／又はindication）を提示する、ヒト及び動物などの脊椎動物を指すように、互換的に使用される。これらの用語は、霊長動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラットなど）の非限定例などの哺乳動物を含む。
本明細書で使用される、「～を治療する」、「～を治療すること」、又は「治療」、及びこれらの文法的変化形は、有益であるか、又は所望の臨床結果を得る手法を指す。用語は、状態、障害、若しくは疾患の発生若しくは発症速度を緩徐化すること、これと関連する症状を低減若しくは緩和すること、状態の完全な退縮若しくは部分的な退縮をもたらすこと、又は上記のいずれかによる、何らかの組合せを指す場合がある。一部の実施形態では、有益であるか、又は所望の臨床結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、症状の低減又は緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（例えば、非増悪）、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は抑制、及び寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定されない。「～を治療する」、「～を治療すること」、又は「治療」はまた、治療を施されない場合に予測される生存時間と比べた、生存の延長も意味しうる。したがって、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）は、既に、問題の疾患又は障害に罹患している対象でありうる。「～を治療する」、「～を治療すること」、又は「治療」という用語は、病理学的状態又は症状の重症度の増大の、治療の非存在と比べた阻害又は軽減を含むが、対象とする疾患、障害、又は状態の、完全な根絶を含意することは、必ずしも意図されない。腫瘍及び／又はがんに関して、治療は、全体的な腫瘍負荷及び／又は個々の腫瘍サイズの低減を含む。
本明細書で使用される、「～を予防する」、「～を予防すること」、「予防」という用語、及びこれらの文法的変化形は、状態、疾患、又は障害の発症を予防するか、又はこれらの病理を変化させる手法を指す。したがって、「予防」とは、予防的（prophylactic又はpreventive）手段を指す場合がある。一部の実施形態では、有益であるか、又は所望の臨床結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、疾患の症状、進行、又は発生の予防又は緩徐化を含むがこれらに限定されない。したがって、予防を必要とする対象（例えば、ヒト）は、未だ、問題の疾患又は障害に罹患していない対象でありうる。「予防」という用語は、疾患の発生の、治療の非存在と比べた緩徐化を含むが、対象とする疾患、障害、又は状態の、恒久的な予防を含意することは、必ずしも意図されない。したがって、ある特定の文脈における、状態「を予防すること」又は状態の「予防」とは、状態を発症する危険性を低減するか、又は状態と関連する症状の発症を予防するか、若しくは遅延させることを指しうる。
本明細書で使用される、「有効量」又は「治療有効量」とは、標的状態を、予防若しくは治療すること、又は状態と関連する症状を、有益に緩和することなど、対象において、少なくとも１つの、所望の治療効果をもたらす、組成物（例えば、治療用組成物、治療用化合物、又は治療剤）の量又は用量である。最も所望される治療有効量とは、それを必要とする、所与の対象のために、当業者により選択される、特定の治療の、所望の有効性をもたらす量である。この量は、治療用組成物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティーを含む）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類、病期、全般的健康状態、所与の投与量に対する応答性、及び医薬の種類を含む）、製剤中の、薬学的に許容される、１つ又は２つ以上の担体の性質、及び投与経路を含むがこれらに限定されない、当業者により理解される、様々な因子に応じて変動するであろう。臨床技術分野及び薬理学技術分野における当業者は、規定の実験を介して、すなわち、組成物の投与に対する、対象の応答をモニタリングし、これに応じて、投与量を調整することにより、治療有効量を決定することが可能であろう（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)を参照されたい）。
有効量の薬剤、例えば、結合分子の医薬製剤は、所望の治療的結果又は予防的結果を達成するための投与量及び必要な期間で有効な量を指す。がんを治療するための薬物の有効量は、がん細胞の数を低減しうる；腫瘍サイズを低減しうる；がん細胞の末梢臓器への浸潤を阻害しうる（例えば、ある程度緩徐化し、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害しうる（例えば、ある程度緩徐化し、好ましくは停止させる）；腫瘍の増殖をある程度阻害しうる；及び／又はがんと関連する症状のうちの１つ又は２つ以上をある程度軽減しうる。薬物が、増殖を予防しうる、及び／又は既存のがん細胞を殺滅しうる程度に、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞毒性でありうる。有効量は、無増悪生存期間を延長する場合があり（例えば、固形がんの応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ；Response Evaluation Criteria for Solid Tumors）、若しくはＣＡ－１２５の変更によって測定された場合）、奏効（部分奏功（ＰＲ；partial response）、若しくは完全奏功（ＣＲ；complete response）を含む）を結果としてもたらす場合があり、全生存期間を増大させる場合があり、及び／又はがんの１つ若しくは２つ以上の症状を改善しうる（例えば、ＦＯＳＩにより評価される場合）。
診断用組成物は、結合分子と、１つ又は２つ以上の検出促進剤とを含む。診断用組成物を、作製又は製造する場合、結合分子は、１つ又は２つ以上の検出促進剤に、直接的に、又は間接的に連結されうる。多様な検出促進剤を、タンパク質又は分子のタンパク質性構成要素、とりわけ、免疫グロブリン及び免疫グロブリン由来ドメインに組み込む、固定する、及び／又はコンジュゲートするための、当業者に公知の標準的技法が、多数存在する。
生物の疾患、障害、又は状態に対する、診断適用及び／又は予後診断適用などのための情報収集法のために、ポリペプチド又は結合分子に作動可能に連結されうる、同位体、染料、比色薬剤、造影剤、蛍光剤、生物発光剤、及び磁性剤など、当業者に公知の検出促進剤が多数存在する（例えば、Cai W et al., J Nucl Med 48: 304-10 (2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem 20: 825-41 (2009); Paudyal P et al., Oncol Rep 22: 115-9 (2009); Qiao J et al., PLoS ONE 6: e18103 (2011); Sano K et al., Breast Cancer Res 14: R61 (2012)を参照されたい。）。これらの薬剤は、任意の適切な位置において、ポリペプチド又は結合分子と会合させうる、これと連結させうる、及び／又はこの中に組み込みうる。例えば、検出促進剤の連結又は組込みは、分子のアミノ酸残基（複数可）を介する場合もあり、当技術分野で公知の、ある種類の連結であって、リンカー及び／又はキレート剤を含む連結を介する場合もある。薬剤の組込みは、スクリーン手順、アッセイ手順、診断手順、及び／又はイメージング法における、診断用組成物の存在の検出を可能とするような形の組込みである。
同様に、一般に、医療分野で使用される、非侵襲性のインビボイメージング法、例えば、コンピュータ断層撮影イメージング（ＣＴスキャン；computed tomography imaging）、光学イメージング（直接的な蛍光イメージング及び生物発光イメージングを含む）、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ；magnetic resonance imaging）、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ；positron emission tomography）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ；single-photon emission computed tomography）、超音波コンピュータ断層撮影イメージング、及びｘ線コンピュータ断層撮影イメージングなど、当業者に公知である、多数のイメージング法が存在する。
VII．結合分子を含む医薬組成物及び／又は診断用組成物の作製又は製造
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子のうちのいずれかの、薬学的に許容される塩又は溶媒和物もまた、本明細書で提示される。
「溶媒和物」という用語は、溶質（この場合、タンパク質性化合物又は薬学的に許容されるその塩）と溶媒との間で形成される、化学量論比が規定された複合体を指す。この関連における溶媒は、例えば、水、エタノール、又は別の、薬学的に許容され、典型的に、低分子量である、酢酸又は乳酸などであるがこれらに限定されない有機分子種でありうる。問題の溶媒が水である場合、このような溶媒和物は、通常、水和物と称される。
ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらの塩は、保管又は投与のために調製された医薬組成物であって、典型的に、薬学的に許容される担体中に、治療有効量の、分子、又はその塩を含む医薬組成物として製剤化されうる。「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的医薬担体のうちのいずれかを含む。薬学技術分野では、治療用分子への使用のための薬学的に許容される担体が周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985)において記載されている。本明細書で使用される、「薬学的に許容される担体」は、任意で全ての、生理学的に許容される、すなわち、適合性である、溶媒、分散媒、コーティング、抗微生物剤、等張剤、及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体又は希釈剤は、経口投与、直腸内投与、経鼻投与、又は非経口投与（皮下投与、筋内投与、静脈内投与、皮内投与、及び経皮投与を含む）に適切な製剤中で使用される担体又は希釈剤を含む。例示的な、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は滅菌分散液の即席調製物のための滅菌粉末を含む。医薬組成物において利用されうる、適切な水性担体及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング素材を使用することにより維持される場合もあり、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより維持される場合もあり、界面活性剤を使用することにより維持される場合もある。一部の実施形態では、担体は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄内投与、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適切である。選択された、投与の経路に応じて、タンパク質又は他の医薬成分は、化合物を、特定の投与経路により患者に投与される場合に、活性タンパク質が遭遇しうる、低ｐＨ及び他の天然の不活化状態の作用から保護することを意図される素材によりコーティングされうる。
医薬組成物の製剤は、単位剤形で提示されうると好都合であり、薬学技術分野で周知の方法のうちのいずれかにより調製されうる。このような形態では、組成物は、適切な量の活性成分を含有する、単位用量に分割される。単位剤形は、パッケージが、個別の量の調製物を含有する、パッケージングされた調製物、例えば、バイアル内又はアンプル内に封入された、錠剤、カプセル、及び粉末でありうる。単位剤形はまた、カプセル自体、カシェ自体、又は錠剤自体の場合もあり、適切な数の、これらのパッケージング形態のうちのいずれかの場合もある。単位剤形は、単回投与用量の注射用形態、例えば、ペン形態で提供されうる。組成物は、任意の適切な投与経路及び投与手段のために製剤化されうる。本明細書で記載される治療用タンパク質には、皮下投与方式又は経皮投与方式が、特に、適切でありうる。
医薬組成物はまた、保存剤、保湿剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の存在の防止は、滅菌手順、並びに多様な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの組入れの両方により確保されうる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤の、組成物への組入れもまた、所望されうる。加えて、注射用医薬形態の吸収の延長も、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤の組入れによりもたらされうる。
医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。例示的な、薬学的に許容される抗酸化剤は、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニゾール（ＢＨＡ；butylated hydroxyanisole）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；butylated hydroxytoluene）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなどの、油溶性抗酸化剤；及びクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ethylenediamine tetraacetic acid）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤である。
異なる結合分子、又は前出のうちのいずれかのエステル、塩、若しくはアミドのうちの１つ、或いはこれと、少なくとも１つの、薬学的に許容される担体との組合せを含む医薬組成物もまた、本明細書で提示される。
治療用組成物は、典型的に、滅菌であり、製造条件下及び保管条件下で安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適切な、他の秩序構造として製剤化されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）などのアルコール、又は任意の適切な混合物を含有する、溶媒又は分散媒でありうる。溶液の適正な流動性は、当技術分野で周知の製剤化学に従い、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持される場合もあり、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより維持される場合もあり、界面活性剤を使用することにより維持される場合もある。一部の実施形態では、組成物中では、等張剤、例えば、糖、及びマンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、又は塩化ナトリウムが、所望でありうる。注射用組成物の吸収の延長は、モノステアリン酸塩及びゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤の、組成物への組入れによりもたらされうる。
皮内適用又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、典型的に、注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性調整剤のうちの１つ又は２つ以上を含む。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム、又はクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩などの緩衝剤などの酸又は塩基で調整されうる。このような調製物は、アンプル内、使い捨て型のシリンジ内、又はガラス製若しくはプラスチック製の複数回投与用バイアル内に封入されうる。
滅菌注射溶液は、ポリペプチド又は結合分子を、適切な溶媒中に、要求される量で、要求に応じて、上記で記載された成分のうちの１又は組合せと共に組み込んだ後で、滅菌精密濾過することにより調製されうる。分散液は、活性化合物を、分散媒、及び上記で記載された成分など、他の成分を含有する、滅菌媒体に組み込むことにより調製されうる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製法は、有効成分に、滅菌濾過されたその溶液に由来する、任意のさらなる所望の成分を加えた粉末をもたらす、真空乾燥法及び凍結乾燥法（freeze-drying（lyophilization））である。
治療有効量の、ポリペプチド及び／又は結合分子が、例えば、静脈内注射、皮内注射、又は皮下注射により投与されるように設計される場合、結合剤は、発熱物質非含有で、非経口的に許容可能な水溶液形態であろう。適切なｐＨ、等張性、安定性などを考慮に入れて、非経口的に許容可能なタンパク質溶液を調製するための方法は、当技術分野の技術の範囲内にある。静脈内注射、皮内注射、又は皮下注射に好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース／塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンゲル注射液、又は当技術分野で公知の他の媒体などの等張性媒体を含有するであろう。医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、又は当業者に周知の他の添加剤も含有しうる。
本明細書の別の箇所で記載される通り、ポリペプチド及び／又は結合分子は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、活性の治療剤を、急速な放出に対して保護する担体と共に、調製されうる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生体分解性の、生体適合性ポリマーが使用されうる。このような製剤を調製するための、多くの方法が、特許を付与されるか、又は一般に、当業者に公知である（例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Robinson J, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)を参照されたい）。
一部の実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物及び／又は診断用組成物）は、結合分子の所望のインビボ分布を確保するように製剤化されうる。例えば、血液脳関門は、多くの大型化合物及び／又は親水性化合物を排除する。治療用分子又は組成物を、特定のインビボ位置にターゲティングするために、それらは、例えば、特異的な細胞又は臓器に、選択的に輸送され、これにより、ターゲティング型薬物送達を増強する、１つ又は２つ以上の部分を含みうるリポソーム内に製剤化されうる。例示的なターゲティング部分は、葉酸又はビオチン；マンノシド；抗体；界面活性剤である、プロテインＡ受容体；ｐ１２０カテニンなどを含む。
医薬組成物は、インプラント系又は微粒子系として使用されるように設計された非経口製剤を含む。インプラントの例は、ポリマー又はエマルジョンなどの疎水性成分、イオン交換樹脂、及び可溶性塩溶液などから構成されるデポ製剤である。微粒子系の例は、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、及びナノ粒子である（例えば、Honda M et al., Int J Nanomedicine 8: 495-503 (2013); Sharma A et al., Biomed Res Int 2013: 960821 (2013); Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3: 1429-45 (2012)を参照されたい）。制御放出製剤は、例えば、リポソーム、ポロキサマー４０７、及びヒドロキシアパタイトなど、イオンに対して感受性のポリマーを使用して調製されうる。
VIII．ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び宿主細胞
ポリペプチド及び結合分子のほかに、ポリペプチド構成要素及び結合分子をコードするポリヌクレオチド、又はこれらの機能的な部分もまた、本明細書で提示される。「ポリヌクレオチド」という用語は、それらの各々が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ；deoxyribonucleic acid）のポリマー、リボ核酸（ＲＮＡ；ribonucleic acid）のポリマー、ヌクレオチドアナログを使用して作出される、これらのＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、並びにこれらの派生物、断片、及びホモログのうちの、１つ又は２つ以上を含む、「核酸」という用語と同等である。ポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、三本鎖の場合もある。このようなポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡコドンの第３の位置において許容されることが公知であるが、異なるＲＮＡコドンと同じアミノ酸をコードする揺らぎを考慮に入れると、例示的なタンパク質をコードすることが可能な、全てのポリヌクレオチドを含むことが、具体的に開示される（Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)を参照されたい）。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／若しくは結合分子、又はこれらの断片若しくは派生物をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提示される。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリペプチド又は結合分子のアミノ酸配列のうちの１つを含むポリペプチドと、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は９９％以上同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含みうる。厳密な条件下で、志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素及び／若しくは結合分子、又はこれらの断片若しくは派生物をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列、或いは任意のこのような配列のアンチセンス又は相補体を含むポリヌクレオチドもまた、本明細書で提示される。
本明細書で記載される分子（例えば、ＰＤ－Ｌ１結合分子）の派生物又はアナログは、とりわけ、同じサイズのポリヌクレオチド（又はポリペプチド）配列にわたり、又はアライメントが、当技術分野で公知の、コンピュータ相同性プログラムによりなされる、アライメントされた配列と比較した場合に、ポリヌクレオチド（又は結合分子）に対して、例えば、少なくとも約４５％、５０％、７０％、８０％、９５％、９８％、なお又は９９％の同一性（好ましい同一性は、８０～９９％である）により、実質的に相同な領域を有するポリヌクレオチド（又はポリペプチド）分子を含む。例示的なプログラムは、Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math 2: 482-9 (1981)によるアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を使用する、ＧＡＰプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for UNIX、Genetics Computer Group社, University Research Park、Madison、WI、U.S.）である。また、細胞ターゲティングタンパク質をコードする配列の相補体と、厳密な条件（例えば、Ausubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S, 1993)を参照されたい）、及びこれを下回る条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドも含まれる。当業者には、厳密な条件が公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, U.S, Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989))において見出すことができる。
本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターもまた、本明細書で提示される。志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素及び／又は結合分子をコードすることが可能なポリヌクレオチドは、発現ベクターを作製するために、当技術分野で周知である素材及び方法を使用して、細菌プラスミド、ウイルスベクター及びファージベクターを含む、公知のベクター内に挿入されうる。このような発現ベクターは、任意の、選ばれた宿主細胞又は無細胞発現系（例えば、pTxb1及びpIVEX2.3）内で想定される、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合分子の作製を支援するのに必要なポリヌクレオチドを含むであろう。当業者には、特異的種類の宿主細胞又は無細胞発現系を伴う使用のための発現ベクターを含む特異的ポリヌクレオチドが周知であり、規定の実験を使用して決定されうる、及び／又は購入されうる。
本明細書で使用される、「発現ベクター」という用語は、１つ又は２つ以上の発現単位を含む、直鎖状又は環状のポリヌクレオチドを指す。「発現単位」という用語は、所望のポリペプチドをコードし、宿主細胞内で、核酸セグメントの発現をもたらすことが可能な、ポリヌクレオチドセグメントを表す。発現単位は、典型的に、全てが、作動可能に構成された、転写プロモーター、所望のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写ターミネーターを含む。発現ベクターは、１つ又は２つ以上の発現単位を含有する。したがって、一部の実施形態では、単一のポリペプチド鎖を含む、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合分子をコードする発現ベクターが、単一のポリペプチド鎖のための、少なくとも１つの発現単位を含むのに対し、例えば、２つ又は３つ以上ポリペプチド鎖（例えば、１つの鎖が、ＶＬドメインを含み、第２の鎖が、毒素エフェクターポリペプチドと連結された、ＶＨドメインを含む）を含むタンパク質は、タンパク質の２つのポリペプチド鎖の各々について１つずつの、少なくとも２つの発現単位を含む。多重鎖細胞ターゲティングタンパク質を発現させるために、各ポリペプチド鎖の発現単位はまた、異なる発現ベクター上に、個別に含有される場合もある（例えば、発現は、各ポリペプチド鎖のための発現ベクターが導入された、単一の宿主細胞により達成されうる）。
当技術分野では、ポリペプチド及びタンパク質の、一過性発現又は安定的発現を方向付けることが可能な発現ベクターが周知である。発現ベクターは、一般に、それらの各々が、当技術分野で周知である、以下：異種シグナル配列又は異種シグナルペプチド、複製起点、１つ又は２つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの、１つ又は２つ以上を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、利用されうる、任意の調節的制御配列、組込み配列、及び有用なマーカーが公知である。
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターの複製又は発現を支援しうる細胞を指す。宿主細胞は、大腸菌など、原核細胞の場合もあり、真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞、又は哺乳動物細胞）の場合もある。ポリヌクレオチドを含むか、又はポリペプチド及び／若しくは結合分子を産生することが可能な、宿主細胞株の創出及び単離は、当技術分野で公知の、標準的技法を使用して達せられうる。
本明細書で記載される志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素エフェクタータンパク質は、それを、宿主細胞による、より最適の発現など、所望の特性を達成するのに、より適切としうる、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸を変化させるか、又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸を欠失させるか、若しくは挿入することを介して、結合分子のポリペプチド構成要素及び／又はタンパク質性構成要素をコードするポリヌクレオチドを修飾することにより作製される、本明細書で記載されるポリペプチド及び分子の、バリアント又は派生物でありうる。
IＸ．固体基質上に固定化された、ＰＤ－Ｌ１結合分子
一部の実施形態では、本明細書で記載される分子（例えば、結合分子、融合タンパク質、又はポリヌクレオチド）、又はこれらの任意のエフェクター断片は、固体基質上に固定化される。本明細書で想定される固体基質は、当技術分野で公知の、マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、マトリックス材料、マイクロアレイ、マイクロ滴定プレート、又は任意の固体表面（例えば、米国特許第７，７７１，９５５号明細書を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。これらの実施形態に従い、分子は、当業者に公知の技法（例えば、Jung Y et al., Analyst 133: 697-701 (2008)を参照されたい）を使用して、例えば、ビーズ、粒子、又はプレートなどの固体基質に、共有結合的に、又は非共有結合的に連結されうる。固定化された分子は、当技術分野で公知の技法を使用する、スクリーニング適用のために使用されうる（例えば、Bradbury A et al., Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011); Sutton C, Br J Pharmacol 166: 457-75 (2012); Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013); Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014)を参照されたい）。
分子が固定化されうる固体基質の非限定例は、マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、ナノポリマー、ナノチューブ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、ストレプトアビジンコーティングビーズ、逆相磁気ビーズ、カルボキシ終端ビーズ、ヒドラジン終端ビーズ、シリカ（ナトリウムシリカ）ビーズ及びイミノ二酢酸（ＩＤＡ；iminodiacetic acid）修飾ビーズ、アルデヒド修飾ビーズ、エポキシ活性化ビーズ、ジアミノジプロピルアミン（ＤＡＤＰＡ；diaminodipropylamine）修飾ビーズ（一級アミン表面基を伴うビーズ）、生体分解性ポリマービーズ、ポリスチレン基質、アミノポリスチレン粒子、カルボキシルポリスチレン粒子、エポキシポリスチレン粒子、ジメチルアミノポリスチレン粒子、ヒドロキシポリスチレン粒子、着色粒子、フローサイトメトリー粒子、スルホン酸ポリスチレン粒子、ニトロセルロース表面、強化ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラス表面、活性化ガラス表面、活性化石英表面、ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ；polyvinylidene difluoride）膜、ポリアクリルアミドベースの基質、ポリ（塩化ビニル）基質、ポリ（メタクリル酸メチル）基質、ポリ（ジメチルシロキサン）基質、及び共有結合的連結を形成することが可能な、光反応性分子種（ニトレンラジカル、カルベンラジカル、及びケチルラジカルなど）を含有する、光ポリマーを含む。分子が固定化されうる固体基質の、他の例は、一般に、例えば、細胞表面、ファージ、及びウイルス粒子などの分子ディスプレイシステムにおいて使用される。
Ｘ．送達デバイス及びキット
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象への送達のための、医薬組成物又は診断用組成物など、１つ又は２つ以上の、物の組成物を含むデバイスに関する。したがって、１つ又は２つ以上の、組成物を含む送達デバイスは、静脈内注射、皮下注射、筋内注射、若しくは腹腔内注射；経口投与；経皮投与；肺内投与若しくは経粘膜投与；植込み、浸透圧ポンプ、カートリッジ、若しくはマイクロポンプによる投与を含む、多様な送達方法により；又は当業者により認知される他の手段により、患者に物の組成物を投与するのに使用されうる。
本明細書で記載される少なくとも１つの、組成物を含むキットも本明細書で提供され、パッケージング及び使用説明書もまた、本明細書で提供されてもよい。キットは、薬物投与及び／又は診断情報の収集に有用でありうる。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬（例えば、標準物質、マーカーなど）を含んでもよい。キットは、典型的に、キットの内容物の、対象となる使用を指し示す表示を含む。キットは、試料中又は対象において、細胞型（例えば、腫瘍細胞）を検出するか、又は患者が、化合物、組成物、若しくは、例えば、本明細書で記載される方法など、関連する方法を使用する治療戦略に応答する群に属するのかどうかを診断するための試薬及び他のツールをさらに含みうる。
XI．結合分子及び／又はその医薬組成物及び／又は診断用組成物を使用するための方法
一般に、本明細書で言及される、ある特定のがん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又はさらなる病理学的状態などの、疾患、障害、及び状態の、予防及び／又は治療において使用されうる、薬理学的な活性薬剤のほか、これを含む組成物を提供することが、本開示の目的である。したがって、ポリペプチド、結合分子、及び医薬組成物を、細胞の、ターゲティングされた殺滅、ターゲティングされた細胞への、さらなる外因性素材の送達、診断情報を収集するための、ターゲティングされた細胞の内部の標識付け、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への、Ｔ細胞エピトープの送達、並びに本明細書で記載される疾患、障害、及び状態の治療のために使用する方法が本明細書で提示される。例えば、本明細書で記載される方法は、がん、がんの始原、腫瘍の始原、転移、及び／又は疾患の再発を予防又は治療するのに使用されうる。
特に、当技術分野で公知の薬剤、組成物、及び／又は方法と比較して、ある特定の利点を有する、このような薬理学的活性薬剤、組成物、及び／又は方法を提供することが、本開示の目的である。したがって、本開示は、指定されたタンパク質配列を伴う、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子、並びにそれらの医薬組成物を使用する方法を提供する。例えば、本明細書で記載されるアミノ酸配列のいずれも、以下の方法、又は例えば、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、米国特許出願第２０１５０２５９４２８号明細書、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、国際公開第２０１７／０１９６２３号パンフレット、国際公開第２０１８／１０６８９５号パンフレット、及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットにおいて記載されている、多様な方法など、当業者に公知の、結合分子を使用するための任意の方法において使用される、結合分子の構成要素として、具体的に利用されうる。
細胞を殺滅する方法であって、細胞を、インビトロ又はインビボにおいて、志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、又は本明細書で記載される医薬組成物と接触させるステップを含む方法が本明細書で提示される。本明細書で記載される、志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、及び医薬組成物は、１つ又は２つ以上の細胞を、特許請求される、物の組成物のうちの１つと接触させて、特異的細胞型を殺滅するのに使用されうる。一部の実施形態では、結合分子又は医薬組成物は、がん細胞、感染細胞、及び／又は血液細胞を含む混合物など、異なる細胞型の混合物中の、特異的細胞型を殺滅するのに使用されうる。一部の実施形態では、結合分子又は医薬組成物は、異なる細胞型の混合物中のがん細胞を殺滅するのに使用されうる。一部の実施形態では、細胞毒性志賀結合分子又は医薬組成物は、移植前組織など、異なる細胞型の混合物中の、特異的細胞型を殺滅するのに使用されうる。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、又は医薬組成物は、治療を目的とする投与前組織素材など、細胞型の混合物中の、特異的細胞型を殺滅するのに使用されうる。一部の実施形態では、結合分子又は医薬組成物は、ウイルス若しくは微生物に感染した細胞を選択的に殺滅するか、又は細胞表面生体分子など、特定の細胞外標的生体分子を発現する細胞を、他の形で選択的に殺滅するのに使用されうる。志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、及び医薬組成物は、例えば、インビトロ又はインビボにおいて、望ましくない細胞型を組織から枯渇させることにおける使用、移植片対宿主病を治療するために免疫応答をモジュレートすることにおける使用、抗ウイルス薬としての使用、抗寄生虫剤としての使用、及び移植組織から、望ましくない細胞型を取り除く使用を含む、様々な適用がなされる。
一部の実施形態では、単独の、又は他の化合物若しくは医薬組成物と組み合わせた、ある特定の、志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、及び医薬組成物は、インビトロにおいて、又は治療を必要とする患者などの対象のインビボにおいて、細胞の集団に投与されると、強力な細胞殺滅活性を示しうる。特異的細胞型に対する、高アフィニティーの結合領域を使用すること、酵素的に活性の志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド及び／又はＴ細胞エピトープの送達をターゲティングすることにより、細胞殺滅活性は、ある特定のがん細胞、新生物性細胞、悪性細胞、非悪性腫瘍細胞、及び／又は感染細胞など、生物内の、ある特定の細胞型を、特異的かつ選択的に殺滅することに制限されうる。
一部の実施形態では、それを必要とする患者における、細胞を殺滅する方法は、患者に、少なくとも１つの、結合分子、又はその医薬組成物を投与するステップを含む。
一部の実施形態では、結合分子又はそれらの医薬組成物は、がん細胞又は腫瘍細胞と、物理的にカップリングされて見出される細胞外ＰＤ－Ｌ１をターゲティングすることにより、患者におけるがん細胞を殺滅するのに使用されうる。「がん細胞」又は「がん性細胞」という用語は、異常に加速化された形で、及び／又は調節不能な形で、増殖及び分裂する、多様な新生物性細胞を指すが、当業者には明らかであろう。「腫瘍細胞」という用語は、悪性細胞及び非悪性細胞の両方を含む。一般に、がん及び／又は腫瘍は、治療及び／又は予防に適する、疾患、障害、又は状態と規定されうる。方法及び組成物から利益を得うる、がん細胞及び／又は腫瘍細胞から構成される、がん及び腫瘍（悪性又は非悪性）は、当業者に明らかであろう。新生物性細胞は、以下のうちの、１つ又は２つ以上：調節不能の増殖、分化の欠如、局所的組織浸潤、血管新生、及び転移と関連することが多い。ある特定のがん細胞及び／又は腫瘍細胞をターゲティングするための、本明細書で記載される方法及び組成物から利益を得る場合がある、がん及び／又は腫瘍（悪性又は非悪性）に起因する疾患、障害、及び状態は、当業者に明らかであろう。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子及び組成物は、一般に、分裂が緩徐であり、化学療法及び放射線のようながん療法に対して耐性である、がん幹細胞、腫瘍幹細胞、前悪性のがん始原細胞、及び腫瘍始原細胞を殺滅するために使用されうる。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ；acute myeloid leukemia）は、ＡＭＬ幹細胞及び／又は休止期ＡＭＬ前駆細胞を殺滅することにより、治療されうる（例えば、Shlush L et al., Blood 120: 603-12 (2012)を参照されたい）。
志賀毒素Ａサブユニットベースの作用機構のために、本明細書で記載される、物の組成物は、それらの、例えば、化学療法、免疫療法、放射線、幹細胞移植、及び免疫チェックポイント阻害剤など、他の療法との組合せを伴う方法において、若しくはこれらと相補的な形で、より有効に使用されうる、並びに／又は化学療法耐性細胞／放射線耐性細胞、及び／若しくは休眠腫瘍細胞／腫瘍始原細胞／幹細胞に対して有効でありうる。同様に、物の組成物は、同じ疾患、障害、又は状態のための、非重複標的上又は異なる標的上の、同じエピトープ以外のエピトープをターゲティングする、他の細胞ターゲティング療法との組合せを伴う方法においても、より有効に使用されうる。
結合分子、又はその医薬組成物についての、ある特定の実施形態は、免疫細胞と、物理的にカップリングされていることが見出される細胞外ＰＤ－Ｌ１をターゲティングすることにより、患者における免疫細胞（健常であれ、悪性であれ）を殺滅するのに使用されうる。
悪性、新生物性、又は他の形で望ましくないＴ細胞及び／又はＢ細胞の患者細胞集団（例えば、骨髄）を取り除き、次いで、患者にＴ細胞及び／又はＢ細胞枯渇素材を再点滴するために、結合分子又はこの医薬組成物を利用することは、本開示の範囲内である（例えば、van Heeckeren W et al., Br J Haematol 132: 42-55 (2006)を参照されたい）；（例えば、Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)を参照されたい）。
患者から取り出された、単離された細胞集団からのＴ細胞及び／又はＢ細胞のエクスビボ枯渇のために、結合分子又はこの医薬組成物を利用することは、本開示の範囲内である。非限定的な一例では、結合分子は、臓器及び／又は組織移植拒絶反応の予防のための方法において使用することができ、この場合、ドナーＴ細胞及び／又はＢ細胞を臓器から取り除くために、ドナー臓器又は組織は、細胞毒性の結合分子又はこの医薬組成物を移植する前に、灌流される（例えば、Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)を参照されたい）。
移植片対宿主病に対する予防として、ドナー細胞集団からＴ細胞及び／又はＢ細胞を枯渇させるために、並びに骨髄移植及び／又は幹細胞移植を受けるために患者における寛容を誘導するために、結合分子又はこの医薬組成物を利用することも、本開示の範囲内である（例えば、van Heeckeren W et al., Br J Haematol 132: 42-55 (2006)を参照されたい；例えば、Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)を参照されたい）。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド若しくは結合分子、又はこれらの医薬組成物は、感染細胞と物理的にカップリングされていることが見出された細胞外ＰＤ－Ｌ１をターゲティングすることにより、患者における感染細胞を殺滅するために使用することができる。
結合分子、又はそれらの医薬組成物についての、一部の実施形態は、脊索動物内に、免疫系を活性化させて、ある箇所の監視を増強するために、非自己であるＴ細胞エピトープペプチドの提示細胞により、その箇所「に播種する」のに使用されうる。この、「播種する」方法についての、一部の実施形態では、その箇所は、腫瘍塊又は感染組織部位である。この、「播種する」方法についての、好ましい実施形態では、非自己であるＴ細胞エピトープペプチドは、結合分子の標的細胞により、未だ提示されたことがないペプチド、標的細胞により発現されるタンパク質内に存在しないペプチド、標的細胞のプロテオーム内又はトランスクリプトーム内に存在しないペプチド、播種される部位の細胞外微小環境に存在しないペプチド、及びターゲティングされる腫瘍塊又は感染組織部位に存在しないペプチドからなる群から選択される。
この「播種する」方法は、エフェクターＴ細胞による認識、及び下流における免疫応答の活性化のために、脊索動物内の、１つ又は２つ以上の標的細胞を、１つ又は２つ以上の、ＭＨＣクラスＩにより提示されたＴ細胞エピトープで標識付けるように機能する。結合分子の、細胞内部化機能、細胞内経路決定機能、及びＴ細胞エピトープ送達機能を利用することにより、送達されたＴ細胞エピトープを提示する標的細胞は、宿主Ｔ細胞による、提示する標的細胞の認識、及びＣＴＬによる標的細胞の殺滅を含む、さらなる免疫応答の導入を誘導するのに用いられる。結合分子を使用する、この「播種する」方法は、結合分子により送達されたＴ細胞エピトープ（複数可）を提示するのであれ、提示しないのであれ、例えば、腫瘍塊又は感染組織部位などの、播種された微小環境内の細胞を攻撃するように、獲得免疫応答を誘導することにより、一時的なワクチン接種効果をもたらしうる。この「播種する」方法はまた、脊索動物内の、標的細胞集団、腫瘍塊、及び／又は感染組織部位に対する、免疫寛容の破壊も誘導しうる。
一部の実施形態では、脊索動物内の、１つ又は２つ以上の抗原性エピトープ及び／又は免疫原性エピトープによる、ある箇所への播種を伴う、方法は、例えば、本明細書で記載される組成物の、サイトカイン、細菌生成物、又は植物サポニンのような、１つ又は２つ以上の免疫アジュバントとの共投与など、ある特定の抗原に対する免疫応答を刺激するように、局所投与されるのであれ、全身投与されるのであれ、免疫アジュバントの投与と組み合わされうる。本明細書で記載される方法における使用に適切でありうる、免疫アジュバントの他の例は、例えば、アラム、水酸化アルミニウム、鉱物油、スクアレン、パラフィン油、ラッカセイ油、及びチメロサールなどの、アルミニウム塩及び油を含む。
加えて、患者における疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、結合分子、又はこの医薬組成物のうちの少なくとも１つを投与するステップを含む方法が、本明細書で提示される。一部の実施形態では、疾患、障害、又は状態は、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を伴う。この方法を使用して治療されうる、想定される疾患、障害、及び状態は、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染を含む。「治療有効投与量」の、本明細書で記載される組成物の投与は、疾患症状の重症度の低下、無疾患症状時間の頻度及び持続時間の増大、又は疾患の罹患に起因する、機能障害若しくは身体障害の防止を結果としてもたらしうる。
組成物の治療有効量は、投与経路、治療される生物の種類、及び検討下にある、具体的患者の身体特徴に依存するであろう。医療技術分野の当業者には、これらの因子、及びこの量の決定との、それらの関係が周知である。この量及び投与法は、最適の有効性を達成するように微調整される場合があり、体重、食餌、併用医薬、及び医療技術分野の当業者に周知である、他の因子のような因子に依存しうる。ヒトにおける使用に最も適切な、投与量のサイズ及び投与レジメンは、本明細書により得られる結果により導かれる場合があり、適正にデザインされた臨床試験により確認されうる。有効な投与量及び治療プロトコールは、実験動物において、低用量で始め、次いで、効果をモニタリングしながら、投与量を増大させ、また、投与レジメンも、体系的に変動させる、従来の手段により決定されうる。所与の対象に最適の投与量を決定する場合、臨床医により、多数の因子が検討されうる。このような検討事項は、当業者に公知である。
許容可能な投与経路とは、エアゾール、腸内経路、経鼻経路、眼内経路、経口経路、非経口経路、直腸内経路、膣内経路、又は経皮経路（例えば、クリーム、ゲル、若しくは軟膏の局所投与、又は経皮パッチによる）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知である、任意の投与経路を指す場合がある。「非経口投与」は、典型的に、対象となる作用部位における注射、又はこれと連絡する注射であって、眼窩下注入による投与、点滴投与、動脈内投与、嚢内投与、心内投与、皮内投与、筋内投与、腹腔内投与、肺内投与、髄腔内投与、胸骨内投与、髄腔内投与、子宮内投与、静脈内投与、くも膜下投与、被膜下投与、皮下投与、経粘膜投与、又は経気管投与を含む注射と関連する。
医薬組成物の投与のために、投与量範囲は一般に、１キログラム当たり、約０．００１～１０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）であり、より通例では、対象の体重１ｋｇ当たり０．００１～０．５ｍｇである。例示的な投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０７ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０９ｍｇ、若しくは体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ、又は０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。例示的な治療レジメは、毎日１回若しくは２回の投与、又は毎週１回若しくは２回の投与、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１カ月間ごとに１回、２若しくは３カ月間ごとに１回、又は３～６カ月間ごとに１回である。投与量は、医療ケア分野の当業者により、特定の患者のための治療利益を最大化するのに要求される通りに、選択及び再調整されうる。
医薬組成物は、典型的に、同じ患者に、複数の機会において投与されるであろう。投与の間の間隔は、例えば、２～５日間、毎週、毎月、２又は３カ月間ごと、６カ月間ごと、又は毎年でありうる。投与間隔はまた、対象又は患者において、血液レベル又は他のマーカーの調節に基づき、不規則でもありうる。組成物のための投与レジメンは、例えば、２～４週間ごと、６回の投与にわたり投与される組成物による、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり０．０３ｍｇの静脈内投与、次いで、体重１ｋｇ当たり０．０３ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇで、３カ月間ごとの静脈内投与を含む。
医薬組成物は、当技術分野で公知である、様々な方法のうちの、１つ又は２つ以上を使用して、１つ又は２つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者により理解される通り、投与経路及び／又は投与方式は、所望される結果に応じて変動するであろう。結合分子及び医薬組成物のための投与経路は、例えば、注射又は注入による、例えば、静脈内経路、筋内経路、皮内経路、腹腔内経路、皮下経路、脊髄内投与、又は他の非経口経路を含む。他の実施形態では、結合分子又は医薬組成物は、局所投与経路、表皮投与経路、又は経粘膜投与経路など、非経口経路以外の経路により投与される場合があり、例えば、鼻腔内投与、経口投与、膣内投与、直腸内投与、舌下投与、又は局所投与されうる。
治療用結合分子又は治療用医薬組成物は、当技術分野で公知である、様々な医療デバイスのうちの、１つ又は２つ以上により投与されうる。例えば、一実施形態では、医薬組成物は、無針皮下注射デバイスにより投与されうる。有用な、周知のインプラント及びモジュールの例は当技術分野で公知であり、例えば、制御速度送達のための、植込み式マイクロ注入ポンプ；皮膚を通して投与するためのデバイス；正確な注入速度における送達のための注入ポンプ；連続的な薬物送達のための、流量可変型植込み式注入デバイス；及び浸透圧式薬物送達システムを含む。これらのインプラント、送達システム、及びモジュール、並びに他のこのようなものは、当業者に公知である。
結合分子又は医薬組成物は、単独で投与される場合もあり、１つ又は２つ以上の、他の治療剤又は診断剤と組み合わせて投与される場合もある。組合せ療法は、治療される、特定の患者、疾患、又は状態に基づき選択される、少なくとも１つの、他の治療剤と組み合わされた、結合分子、又はその医薬組成物を含みうる。他のこのような薬剤の例は、とりわけ、細胞毒性剤、抗がん剤、若しくは化学療法剤、抗炎症剤若しくは抗増殖剤、抗微生物剤若しくは抗ウイルス剤、増殖因子、サイトカイン、鎮痛剤、治療的に活性の低分子若しくはポリペプチド、単鎖抗体、古典的抗体若しくはその断片、又は１つ若しくは２つ以上のシグナル伝達経路をモジュレートする核酸分子、及び治療レジメン若しくは予防処置レジメンにおいて、補完的な場合もあり、他の形で有益奈場な合もある、同様のモジュレート型治療用分子を含む。
結合分子又は医薬組成物による患者の治療は、一部の実施形態では、ターゲティングされた細胞の細胞死及び／又はターゲティングされた細胞の増殖阻害をもたらしうる。このように、細胞毒性である、結合分子、及びそれらを含む医薬組成物は、とりわけ、がん細胞、腫瘍細胞、他の増殖異常細胞、免疫障害細胞、及び感染細胞などの標的細胞を殺滅するか、又はこれらを枯渇させることが、有益でありうる、様々病理学的障害を治療する方法において、有用であろう。細胞増殖を抑制し、新生物、過剰活性Ｂ細胞、及び過剰活性Ｔ細胞を含む細胞障害を治療するための方法もまた、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される結合分子及び医薬組成物は、がん、腫瘍（悪性及び非悪性）、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染を治療又は予防するために使用することができる。一部の実施形態では、骨髄移植のレシピエントにおける拒絶を治療又は予防する方法をもたらすため、及び免疫寛容を達成するために、上述のエクスビボ方法を、上述のインビボ方法と組み合わされうる。
一部の実施形態では、ヒトなど、哺乳動物対象における、悪性腫瘍又は新生物、及び他の血液細胞関連がんを治療するための方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の、細胞毒性である、結合分子又は医薬組成物を投与するステップを含む。
結合分子及び医薬組成物は、例えば、望ましくないＴ細胞を除去することにおける使用、移植片対宿主病を治療するために免疫応答をモジュレートすることにおける使用、抗ウイルス薬としての使用、抗微生物薬剤としての使用、及び移植組織から、望ましくない細胞型を取り除く使用を含む、様々な適用を有する。本明細書で記載される結合分子及び医薬組成物は、一般に、抗新生物剤であり、それらが、がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を阻害すること、及び／又はこれらの死滅を引き起こすことにより、新生物性細胞又は悪性細胞の、発生、成熟、又は拡散を治療及び／又は予防することが可能であることを意味する。
一部の実施形態では、結合分子又は医薬組成物は、例えば、白血病、リンパ腫（例えば、縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫、リウマチ性疾患、脊椎炎、ヒト免疫不全ウイルス関連疾患、アミロイドーシス、溶血性尿毒症症候群、多発動脈炎、敗血症性ショック、クローン病、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、乾癬、喘息、シェーグレン症候群、移植片対宿主病、移植片拒絶、糖尿病、血管炎、強皮症、及び全身性紅斑性狼瘡など、Ｂ細胞、形質細胞、又は抗体により媒介される疾患又は障害を治療するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、結合分子及び医薬組成物のある特定の実施形態は、抗微生物薬剤であり、それらが、ウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は原生動物により引き起こされるなどの、微生物病原性感染の獲得、発生、又は帰結を治療及び／又は予防することが可能であることを意味する。
患者におけるＴ細胞又はＢ細胞を殺滅するために、本明細書で記載される結合分子、又はこの医薬組成物を、患者に投与することによる、Ｔ細胞又はＢ細胞により媒介される疾患又は状態のための、予防又は治療をもたらすことは、本開示の範囲内である。この使用は、移植された素材の供給源、例えば、ヒト又は非ヒト供給源に関わらず、骨髄移植、幹細胞移植、組織移植、又は臓器移植のために患者を準備又は条件付けすることと適合性である。
本明細書で記載される細胞毒性結合分子又は医薬組成物を使用して、宿主Ｔ細胞の標的細胞殺滅を介して、宿主対移植片病の予防（prophylaxis）又は治療のための骨髄レシピエントを提供することは、本開示の範囲内である。
一部の実施形態では、がんを治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量のＰＤＬ－１結合分子又はこれを含む医薬組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、がんを治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量の、ＰＤ－Ｌ１結合分子をコードする核酸（例えば、発現ベクター）を投与するステップを含む。一部の実施形態では、がんは、以下：膀胱がん（例えば、尿路上皮癌）、乳がん（例えば、ＨＥＲ２陽性乳がん、トリプルネガティブ乳がん）、結腸がん（例えば、高頻度マイクロサテライト不安定性を有する転移性結腸直腸がん又はミスマッチ修復欠損結腸直腸がんなどの結腸直腸がん）、子宮内膜がん、食道がん、卵管がん、消化器がん（例えば、胃がん、胆道新生物、食道胃接合部がん）、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、肝がん（例えば、肝細胞癌）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん）、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫）、メルケル細胞癌、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、鼻咽頭新生物、卵巣がん、膵臓がん、腹膜新生物、前立腺がん、皮膚がん（例えば、皮膚扁平上皮がん、黒色腫、移行上皮癌、又は尿路上皮がんのうちのいずれか１つである。
結合分子及び医薬組成物の一部の実施形態は、それを必要とする患者に、治療有効量の結合分子及び／又は医薬組成物を投与するステップを含むがんを治療する方法に、利用することができる。一部の実施形態では、治療されるがんは、骨がん（多発性骨髄腫又はユーイング肉腫など）、乳がん（ＨＥＲ２陽性乳がん又はトリプルネガティブ乳がんなど）、中枢／末梢神経系がん（脳がん、神経線維腫症、又は神経膠芽腫など）、消化器がん（胃がん又は結腸直腸がんなど）、胚細胞がん（卵巣がん及び精巣がんなど）、腺がん（膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がんなど）、頭頸部がん（鼻咽頭がん、口腔がん、又は喉頭がんなど）、血液がん（白血病、リンパ腫、又は骨髄腫など）、腎尿路がん（腎臓がん及び膀胱がんなど）、肝がん（肝細胞癌など）、肺／胸膜がん（中皮腫、小細胞肺がん、又は非小細胞肺がんなど）、前立腺がん、肉腫（血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫など）、皮膚がん（基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫など）、尿路上皮がん、胃がん、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、子宮頸がん、メルケル細胞癌、子宮内膜がん、及び子宮がんからなる群から選択される。
本明細書で記載されるがんを治療する方法の一部の実施形態では、対象は、結合分子の投与前に、少なくとも１つの種類又はレジメンの前治療を受けていた。一部の実施形態では、対象は、がんを有し、がんは、チェックポイント阻害剤療法など、少なくとも１つの前治療から再発している、又はこれに不応性である。一部の実施形態では、がんは、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ、又はセミプリマブから再発している、又はこれに不応性である。一部の実施形態では、がんは、下の表６に一覧されるがんのうちの１つであり、表中に「Ｘ」とマーキングした、少なくとも１つの前治療から再発している、又はこれに不応性である。
Figure 2022548078000009
一部の実施形態では、がんを治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量の、ＰＤＬ－１結合分子又はこれを含む医薬組成物を投与するステップを含み、この場合、がんは、転移性である。
結合分子及び医薬組成物の一部の実施形態は、免疫障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の結合分子及び／又は医薬組成物を投与するステップを含む方法に利用することができる。一部の実施形態では、免疫障害は、リウマチ性疾患、脊椎炎、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される疾患と関連する炎症と関係する。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合分子は、がん、腫瘍、他の増殖異常、免疫障害、及び／又は微生物感染の治療又は予防のための医薬組成物又は医薬の構成要素として使用される。例えば、患者の皮膚に現れている免疫障害は、炎症を低減する取組みにおいて、このような医薬により治療されうる。別の例では、皮膚腫瘍は、腫瘍サイズを低減するか、又は腫瘍を完全に消失させようとする取組みにおいて、このような医薬により治療されうる。
ある特定の細胞毒性結合分子、及びこれらの組成物は、免疫損傷（immunolesioning）及びニューロントレーシングなど、分子脳神経外科（molecular neurosurgery）の適用において使用されうる（総説については、Wiley R, Lappi D, Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54 (2003)を参照されたい）。例えば、ターゲティングドメインは、ニューロン回路に特異的なＧタンパク質共役受容体など、ニューロンの表面受容体に結合することにより、特異的なニューロン細胞型をターゲティングする神経伝達物質及び神経ペプチドなど、多様なリガンドから選択される場合も、これに由来する場合もある。同様に、ターゲティングドメインは、ニューロン表面受容体に結合する抗体から選択される場合も、これに由来する場合もある。ある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ロバストにそれら自体の逆行性軸索輸送を指示することから、ある特定の結合分子は、細胞外標的を発現するニューロン（複数可）を、その細胞体から遠位の細胞毒性タンパク質の注射部位で殺滅するのに使用されうる（Llewellyn-Smith I et al., J Neurosci Methods 103: 83-90 (2000)を参照されたい）。ニューロン細胞型を特異的にターゲティングする、これらのターゲティングされた細胞毒性分子は、感覚の機構を解明するため（例えば、Mishra S, Hoon M, Science 340: 968-71 (2013)を参照されたい）、並びにパーキンソン病及びアルツハイマー病など、神経変性疾患のモデル系を創出するため（例えば、Hamlin A et al., PLoS One e53472 (2013)を参照されたい）などの、神経科学調査に使用される。
一部の実施形態では、新生物性細胞及び／又は免疫細胞型の内部を標識又は検出するために、本明細書で記載される、志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物を使用する方法が、提供される。この方法は、ある特定の、結合分子が、特異的細胞型に侵入し、逆行性細胞内輸送を介して、細胞内で、検出のために標識付けされた、特異的細胞型の内部区画に経路決定する能力に基づきうる。これは、インサイチューにおける患者内の細胞において、又は生物、例えば、生検素材から取り出された細胞及び組織において実施されうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物を使用して、疾患、状態、及び／又は障害に関する情報収集の目的で、細胞型の存在を検出する方法が提供される。方法は、アッセイ法又は診断法により、分子を検出するために、細胞を、診断に有効な量の、結合分子と接触させるステップを含む。「診断に有効な」という語句は、利用される、特定のアッセイ法又は診断法による情報収集を目的として、十分な検出及び正確な測定をもたらす量を指す。一般に、全生物のインビボにおける診断使用のための、診断に有効な量は、対象１ｋｇ当たりの、検出促進剤を連結した、結合分子の非累積用量０．００１～１０ミリグラムの間であろう。典型的には、これらの情報収集方法において使用される志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合分子の量は、それが、依然として、診断に有効な量であることを条件として、可能な限りの低量であろう。例えば、生物のインビボにおける検出のために、対象に投与される、志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、又は医薬組成物の量は、実施可能な限りの低量であろう。
検出促進剤と組み合わされた、結合分子による、細胞型特異的ターゲティングは、分子の結合領域により結合された細胞外ＰＤ－Ｌ１と物理的にカップリングされた細胞を検出及びイメージングする方途をもたらす。結合分子を使用する、細胞のイメージングは、任意の、適切な、当技術分野で公知の技法により、インビトロ又はインビボにおいて実施されうる。診断情報は、生物に対する全身イメージングを含む、当技術分野で公知の、多様な方法を使用して収集される場合もあり、生物から採取されたエクスビボ試料を使用して収集される場合もある。本明細書で使用される、「試料」という用語、任意の数のものを指し、血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門分泌物、膣分泌物、及び精液などの体液、並びに生検手順により得られる組織に限定されない。例えば、多様な検出促進剤が、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学法（直接的な蛍光イメージング及び生物発光イメージングなど）、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、超音波コンピュータ断層撮影、ｘ線コンピュータ断層撮影、及び前述の組合せなどの技法による、非侵襲性のインビボ腫瘍イメージングに利用されうる（総説については、Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111 (2012)を参照されたい）。
志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合分子、又は医薬組成物を、診断用組成物中で使用して、血液細胞、がん細胞、腫瘍細胞、感染細胞、及び／又は免疫細胞の内部を、標識付けするか、又は検出する方法（例えば、Koyama Y et al., Clin Cancer Res 13: 2936-45 (2007); Ogawa M et al., Cancer Res 69: 1268-72 (2009); Yang L et al., Small 5: 235-43 (2009)を参照されたい）もまた、提供される。ある特定の、結合分子が、特異的細胞型に侵入し、逆行性細胞内輸送を介して、細胞内で経路決定する能力に基づき、特異的細胞型の内部区画が、検出のために標識付けされる。これは、インサイチューにおける患者内の細胞において、又は生物、例えば、生検素材から取り出された細胞及び組織において実施されうる。
診断用組成物は、疾患、障害、又は状態を、類縁の、医薬組成物により、潜在的に治療可能であると特徴付けるのに使用されうる。一部の、本明細書で記載される物の組成物は、患者が、本明細書で記載される、化合物、組成物、又は類縁の方法の使用をもたらす治療戦略に応答する群に属するのかどうか、又は本明細書で記載される送達デバイスの使用に、十分に適切であるのかどうかを決定するのに使用されうる。
診断用組成物は、疾患、例えば、がんの後で使用され、遠隔転移、異種性、及びがん進行の病期をモニタリングするなど、それをより良く特徴付けるために検出されうる。疾患、障害、又は感染についての表現型の評価は、治療についての決定を下す際の、予後診断及び予測の一助となりうる。疾患の再発時に、ある特定の、方法は、局所問題であるのか、全身問題であるのかを決定するのに使用されうる。
診断用組成物は、治療の種類、例えば、低分子薬、生物学的薬物、又は細胞ベースの治療に関わらず、治療に対する応答を評価するのに使用されうる。例えば、診断剤についての、ある特定の実施形態は、腫瘍サイズの変化、数及び分布を含む抗原陽性細胞集団の変化を測定するか、又は患者に、既に投与されている治療によりターゲティングされる抗原と異なるマーカーをモニタリングするのに使用されうる（Smith-Jones P et al., Nat. Biotechnol 22: 701-6 (2004); Evans M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 9578-82 (2011)を参照されたい）。
細胞型の存在を検出するのに使用される方法についての一部の実施形態では、例えば、骨がん（多発性骨髄腫又はユーイング肉腫など）、乳がん、中枢／末梢神経系がん（脳がん、神経線維腫症、又は神経膠芽腫など）、消化器がん（胃がん又は結腸直腸がんなど）、胚細胞がん（卵巣がん及び精巣がんなど）、腺がん（膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がんなど）、頭頸部がん（鼻咽頭がん、口腔がん、又は喉頭がんなど）、血液がん（白血病、リンパ腫、又は骨髄腫など）、腎尿路がん（腎臓がん及び膀胱がんなど）、肝がん、肺／胸膜がん（中皮腫、小型細胞肺癌腫、又は非小細胞肺癌など）、前立腺がん、肉腫（血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫など）、皮膚がん（基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫など）、子宮がん、ＡＩＤＳ、リウマチ性疾患、脊椎炎、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、自閉症、リウマチ性心疾患、クローン病、糖尿病、エリテマトーデス、胃炎、移植片拒絶、移植片対宿主病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、紅斑性狼瘡、リンパ増殖性障害（移植後リンパ増殖性障害を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、血管炎、細胞増殖、炎症、白血球活性化、白血球接着、白血球走化性、白血球成熟、白血球遊走、神経細胞分化、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ；acute lymphoblastic leukemia）、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病／リンパ腫（ＡＬＬ；T-cell acute lymphocytic leukemia/lymphoma）、急性骨髄性（myelogenous）白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ；acute myeloid leukemia）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ；B cell chronic lymphocytic leukemia）、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ；Burkitt’s lymphoma）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；chronic lymphocytic leukemia）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ－ＢＰ；chronic myelogenous leukemia）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ；chronic myeloid leukemia）、びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病（ＨＣＬ；hairy cell leukemia）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ；Hodgkin's Lymphoma）、血管内大細胞性Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ形質細胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ；multiple myeloma）、ナチュラルキラー細胞白血病、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ；Non-Hodgkin's lymphoma）、形質細胞白血病、形質細胞腫、原発性滲出性リンパ腫、前リンパ球性白血病、前骨髄球性白血病、小型リンパ球性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ；T-cell lymphoma）、重鎖病、単クローン性免疫グロブリン血症、単クローン性免疫グロブリン沈着症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ；myelodysplastic syndrome）、くすぶり型多発性骨髄腫、及びワルデンシュトロームマクログロブリン血症などの疾患、障害、及び状態に関する情報を収集するのに使用されうる。
一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合分子、又はこれらの医薬組成物は、診断及び治療の両方に、又は診断単独に使用される。一部の状況では、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合分子を、治療（複数可）における使用のために選択する前に、例えば、治療を必要とする患者などの対象及び／又は対象に由来する罹患組織において発現されるＨＬＡバリアント（複数可）及び／又はＨＬＡ対立遺伝子を決定又は検証することが所望であろう。
結合分子（例えば、「発明の概要」における、実施形態セット１～１３のうちのいずれか１つの実施形態）のうちの、いかなる実施形態も、本明細書で記載される方法の、各個別の実施形態と共に使用されうる。
本発明は、以下の番号付き実施形態、及びＰＤ－Ｌ１を特異的にターゲティングすることが可能であり、１つ又は２つ以上のタンパク質性毒素構成要素を含む、結合分子の非限定例により、さらに例示される。
番号付きの実施形態
ＰＤ－Ｌ１結合分子の異なる実施形態が、実施形態番号１～３のセットを参照して、下に記載される。
実施形態セット１：埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、重複しない脱免疫化亜領域とを含む、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、ＰＤ－Ｌ１結合分子
（ｉ）細胞外標的生体分子（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合することが可能な結合領域と、（ii）脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む結合分子が、本明細書で提示される。例えば、実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することが可能な結合領域、及び（ii）少なくとも１つの、挿入されるか、又は埋め込まれた異種エピトープ（ａ）と、少なくとも１つの、破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域（ｂ）とを含む、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、この場合、異種エピトープは、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと重複しない。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、細胞内経路決定を、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又は細胞質ゾルに方向付けること、リボソームの機能を阻害すること、リボソームを、酵素的に不活化させること、細胞増殖抑制を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなど、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を呈することが可能である。一部の実施形態では、異種Ｔ細胞エピトープは、例えば、ヒト免疫系に関するものなどの、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープである。一部の実施形態では、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子により提示されることが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、以下：細胞に侵入すること、リボソームの機能を阻害すること、細胞増殖抑制を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び／又は細胞表面での提示のために、埋め込まれるか、若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達することのうちの１つ又は２つ以上が可能である。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素の全て（複数可）が、各々、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む点を除き、結合分子からなる第２の結合分子などの参照分子と同等以上の細胞毒性を呈することが可能である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、カルボキシ末端側に位置する分子部分を含む。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、脊索動物に導入されると、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素の全て（複数可）が、各々、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端において、野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含む点を除き、結合分子からなる、第２の結合分子などの参照分子と比較した、インビボにおける忍容性及び／又は安定性の改善を呈することが可能である。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞毒性ではなく、分子部分は、細胞毒性である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合領域と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、直接的に、又は間接的に、一体に連結されている。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合領域は、免疫グロブリン型結合領域を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、結合領域は、自律性ＶＨドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、ナノボディー、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体可変断片（Ｆｖ）、相補性決定領域３断片（ＣＤＲ３）、拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ポリペプチド（ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４）、Ｆｄ断片、小型モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）ドメイン、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、アルマジロリピートポリペプチド（ＡｒｍＲＰ；Armadillo repeat polypeptide）、フィブロネクチン由来１０型フィブロネクチンIIIドメイン（１０Ｆｎ３；fibronectin-derived 10thfibronectin type III domain）、テネイシンIII型ドメイン（ＴＮｆｎ３；tenascin type III domain）、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａ－ドメイン（ＬＤＬＲ－Ａ；low-density-lipoprotein-receptor-derived A-domain）、リポカリン（アンチカリン）、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ－Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（アフィチン）、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣体、及び結合機能性を保持する、前出のうちのいずれかの、任意の遺伝子改変対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、（ｉ）野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同等の触媒活性レベル、（ii）１０，０００ピコモル以下の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値による、リボソーム阻害活性、及び／又は（iii）著明レベルの志賀毒素触媒活性を呈することが可能である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子及び／又はその志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａ１断片若しくは野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む参照結合分子と同等な細胞内経路決定効率を呈することが可能である、並びに／又は細胞の、エンドソーム内の出発位置から、小胞体及び／若しくは細胞質ゾルへの、著明レベルの細胞内経路決定活性を呈することが可能である。
結合分子が、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされた細胞に投与される、実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、細胞死を引き起こすことが可能である。結合分子が、細胞外標的生体分子の存在又はレベルに関して異なる、２つの、異なる細胞型集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子は、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされていない細胞型に対するＣＤ５０の、少なくとも３分の１以下のＣＤ５０で、細胞毒性である結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされた細胞型に対する細胞死を引き起こすことが可能である。結合分子が、そのメンバーが、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされた、第１の細胞集団、及びそのメンバーが、結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされていない、第２の細胞集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子の、前記第２の細胞集団のメンバーと比べた、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果は、少なくとも３倍である。結合分子が、そのメンバーが、著明量の、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされた、第１の細胞集団、及びそのメンバーが、著明量の、結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされていない、第２の細胞集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子の、前記第２の細胞集団のメンバーと比べた、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果は、少なくとも３倍である。結合分子が、標的生体分子陽性細胞の第１の集団、及びそのメンバーが、著明量の、結合分子の結合領域の標的生体分子を、細胞表面において発現しない、第２の細胞集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子の、第２の細胞集団のメンバーと比べた、第１の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果は、少なくとも３倍である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、３００ｎＭ以下の５０％阻害濃度（ＣＤ５０；half-maximal inhibitory concentration）値による細胞毒性を呈することが可能である、及び／又は著明レベルの志賀毒素志賀毒素を呈することが可能である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、埋め込まれるか、又は挿入された異種ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを、ＭＨＣクラスＩ分子が結合したエピトープを、細胞表面に提示するための、細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することが可能である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した分子部分を含む。一部の実施形態では、分子部分は、結合領域を含むか、又はこれからなる。一部の実施形態では、分子部分は、少なくとも１つのアミノ酸を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、分子部分の、少なくとも１つのアミノ酸残基に連結されている。一部の実施形態では、分子部分と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、融合され、連続ポリペプチドを形成する。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した細胞毒性分子部分をさらに含む。一部の実施形態では、細胞毒性分子部分は、例えば、当業者に公知の低分子化学療法剤、抗新生物剤、細胞毒性抗生剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び／若しくはチューブリン阻害剤などの細胞毒性剤、並びに／又は本明細書で記載される細胞毒性剤である。一部の実施形態では、細胞毒性分子部分は、１０，０００、５，０００、１，０００、５００、又は２００ｐＭ未満の濃度で、細胞毒性である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合領域は、ジスルフィド結合ではない、少なくとも１つの共有結合により、志賀毒素エフェクターポリペプチドに、直接的に、又は間接的に連結されている。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端に、直接的に、又は間接的に融合されて、単一の、連続ポリペプチドを形成する。一部の実施形態では、結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位内の、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位の、少なくとも１つのアミノ酸残基の一部又は全部と重複する配列の、アミノ末端の切断ではない。一部の実施形態では、最小限のフーリン切断部位内の変異は、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒフーリン切断モチーフ内の少なくとも１つの、アミノ酸残基の、アミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換である。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、少なくとも１つの変異を含み、変異は、天然位置の、１）志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８～２５１、又は２）志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７～２５０、或いは任意の志賀毒素Ａサブユニット内の、同等なアミノ酸配列位置における領域内の、少なくとも１つのアミノ酸残基を変化させる。一部の実施形態では、変異は、アルギニン残基の、正に帯電していないアミノ酸残基によるアミノ酸残基置換である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素（複数可）の全てが、各々、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む点を除き、結合分子からなる、第２の結合分子などの参照分子の細胞毒性と同等な細胞毒性を呈することが可能である。
一部の実施形態では、結合領域は、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になる。
一部の実施形態では、結合領域は、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９８．５％、又は９９％同一なポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）各々が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又はこれからから本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）；及び（ｂ）配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）を含む。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、配列番号１０８～１５５のうちのいずれか１つに示されるポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になる。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット１の一部の実施形態では、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。一部の実施形態では、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、カルボキシ末端側に位置する結合領域及び／又は分子部分を含む。一部の実施形態では、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内経路決定）を保持する限りにおいて、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である結合領域を含む。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合領域は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性を保持する限りにおいて、例えば、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である分子部分などを含む、比較的大型の分子部分内に含まれる。
実施形態セット１の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、結合分子のポリペプチド構成要素のアミノ末端及び／又はその近傍にある。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、結合分子のアミノ末端の近傍に位置しない。一部の実施形態では、結合領域と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近傍に位置しないように、結合分子内に物理的に配置されるか又は配向させられる。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近傍の、結合分子内に位置する。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、アミノ末端を有し、結合領域と、第３の結合分子のアミノ末端又はその近傍に位置しない、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第３の結合分子の細胞毒性より大きな細胞毒性を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、第３の結合分子の細胞毒性と比較して、例えば、４倍、５倍、６倍、９倍、又は１０倍以上の細胞毒性など、細胞毒性力価がよりよく最適化された細胞毒性を呈する。一部の実施形態では、結合分子の、標的陽性細胞の集団に対する細胞毒性は、ＣＤ５０値によりアッセイされる通り、第３の結合分子の、標的陽性細胞の第２の集団に対する細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又は１１倍以上である。一部の実施形態では、第３の結合分子は、カルボキシ末端の、ＫＤＥＬファミリーの小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）を含まない。
実施形態セット１の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、結合分子のポリペプチド構成要素のアミノ末端及び／又はその近傍にある。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、結合分子のアミノ末端の近位に位置しない。一部の実施形態では、結合領域と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近傍に位置しないように、結合分子内に物理的に配置されるか、又は配向させられる。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近傍の、結合分子内に位置する。一部の実施形態では、結合分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入されると、アミノ末端を有し、結合領域と、第３の結合分子のアミノ末端又はその近傍に位置しない、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第３の結合分子の細胞毒性と比較して、細胞外腔から、小胞体及び／又は細胞質ゾルの細胞内区画への、より大きな細胞内経路決定効率を呈することが可能である。一部の実施形態では、第３の結合分子は、カルボキシ末端の、ＫＤＥＬファミリーの小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）を含まない。
実施形態セット１の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、結合分子のポリペプチド構成要素のアミノ末端及び／又はその近傍にある。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、結合分子のアミノ末端の近傍に位置しない。一部の実施形態では、結合領域と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近傍に位置しないように、結合分子内に物理的に配置されるか、又は配向させられる。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近傍の、結合分子内に位置する。一部の実施形態では、結合分子は、低細胞毒性力価（すなわち、ある特定の陽性標的細胞型に導入されると、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、又は５０ｎＭの結合分子濃度で、細胞集団の、１％細胞死超の細胞毒性を呈することが可能ではない）を呈し、細胞に導入されると、アミノ末端を有し、結合領域と、第３の結合分子のアミノ末端又はその近傍に位置しない、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第３の結合分子の細胞毒性と比較した、細胞外腔から、小胞体及び／又は細胞質ゾルの細胞内区画への、より大きな細胞内経路決定効率を呈することが可能である。一部の実施形態では、第３の結合分子は、カルボキシ末端の、ＫＤＥＬファミリーの小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）を含まない。
実施形態セット１の一部の実施形態では、結合分子、又はそのポリペプチド構成要素は、カルボキシ末端の、ＫＤＥＬファミリーのメンバーの小胞体保持／回収シグナルモチーフを含む。一部の実施形態では、カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ（配列番号２０５）、ＨＤＥＦ（配列番号２０６）、ＨＤＥＬ（配列番号２０７）、ＲＤＥＦ（配列番号２０８）、ＲＤＥＬ（配列番号２０９）、ＷＤＥＬ（配列番号２１０）、ＹＤＥＬ（配列番号２１１）、ＨＥＥＦ（配列番号２１２）、ＨＥＥＬ（配列番号２１３）、ＫＥＥＬ（配列番号２１４）、ＲＥＥＬ（配列番号２１５）、ＫＡＥＬ（配列番号２１６）、ＫＣＥＬ（配列番号２１７）、ＫＦＥＬ（配列番号２１８）、ＫＧＥＬ（配列番号２１９）、ＫＨＥＬ（配列番号２２０）、ＫＬＥＬ（配列番号２２１）、ＫＮＥＬ（配列番号２２２）、ＫＱＥＬ（配列番号２２３）、ＫＲＥＬ（配列番号２２４）、ＫＳＥＬ（配列番号２２５）、ＫＶＥＬ（配列番号２２６）、ＫＷＥＬ（配列番号２２７）、ＫＹＥＬ（配列番号２２８）、ＫＥＤＬ（配列番号２２９）、ＫＩＥＬ（配列番号２３０）、ＤＫＥＬ（配列番号２３１）、ＦＤＥＬ（配列番号２３２）、ＫＤＥＦ（配列番号２３３）、ＫＫＥＬ（配列番号２３４）、ＨＡＤＬ（配列番号２３５）、ＨＡＥＬ（配列番号２３６）、ＨＩＥＬ（配列番号２３７）、ＨＮＥＬ（配列番号２３８）、ＨＴＥＬ（配列番号２３９）、ＫＴＥＬ（配列番号２４０）、ＨＶＥＬ（配列番号２４１）、ＮＤＥＬ（配列番号２４２）、ＱＤＥＬ（配列番号２４３）、ＲＥＤＬ（配列番号２４４）、ＲＮＥＬ（配列番号２４５）、ＲＴＤＬ（配列番号２４６）、ＲＴＥＬ（配列番号２４７）、ＳＤＥＬ（配列番号２４８）、ＴＤＥＬ（配列番号２４９）、ＳＫＥＬ（配列番号２５０）、ＳＴＥＬ（配列番号２５１）、及びＥＤＥＬ（配列番号２５２）からなる群から選択される。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、ＫＤＥＬファミリーのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）を含まない点を除き、結合分子からなる、第４の結合分子の細胞毒性より大きな細胞毒性を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、参照分子、例えば、第４の結合分子などと比較して、例えば、４倍、５倍、６倍、９倍、又は１０倍以上の細胞毒性など、細胞毒性力価がよりよく最適化された細胞毒性を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子の、標的陽性細胞の集団に対する細胞毒性は、ＣＤ５０値によりアッセイされる通り、第４の結合分子の、標的陽性細胞の第２の集団に対する細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又は１１倍以上である。
実施形態セット２：（ｉ）埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープと、（ii）破壊されたフーリン切断モチーフとを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、結合分子
（ｉ）細胞外標的生体分子（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合することが可能な結合領域と、（ii）挿入されるか、又は埋め込まれた異種エピトープを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドと；（iii）破壊されたフーリン切断モチーフとを含む、結合分子もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態では、細胞結合分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することが可能な結合領域と；（ii）（ａ）挿入されるか、又は埋め込まれた異種エピトープ；（ｂ）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来領域、及び（ｃ）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、細胞内経路決定を、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又は細胞質ゾルに方向付けること、リボソームの機能を阻害すること、リボソームを、酵素的に不活性化させること、細胞増殖抑制を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなど、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を呈することが可能である。一部の実施形態では、異種Ｔ細胞エピトープは、例えば、ヒト免疫系に関するものなど、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープである。一部の実施形態では、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子により提示されることが可能である。一部の実施形態では、細胞結合分子は、以下：細胞に侵入すること、リボソームの機能を阻害すること、細胞増殖抑制を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び／又は細胞表面での提示のために、埋め込まれるか、若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達することのうちの１つ又は２つ以上が可能である。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素の全てが、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端において、野生型志賀毒素フーリン切断部位を含む点を除き、結合分子からなる第２の結合分子などの参照分子と同等以上の細胞毒性を呈することが可能である。
実施形態セット２の一部の実施形態では、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２の１～１５；配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１若しくは配列番号２の２７～３７；配列番号１若しくは配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；及び配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５３～６６、又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域；（ii）配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４～１１５；配列番号１若しくは配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１若しくは配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０～２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０～２６０；配列番号１若しくは配列番号２の２４３～２５７；配列番号１若しくは配列番号２の２５４～２６８；配列番号３の２６２～２７８；配列番号３の２８１～２９７；及び配列番号１若しくは配列番号２の２８５～２９３、又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域からなる、天然位置の、志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域を破壊する。
実施形態セット２の一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、天然位置の、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）、若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８～２５１、又は志賀様毒素のＡサブユニット（配列番号３）の２４７～２５０；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域内の、少なくとも１つのアミノ酸残基を変化させる。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、フーリン切断モチーフの最小限のフーリン切断部位において、１つ又は２つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、最小限のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ及び／又はＲ－ｘ－ｘ－Ｒにより表される。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対してカルボキシ末端側に位置する分子部分を含む。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット２の一部の実施形態では、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。一部の実施形態では、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対してカルボキシ末端側に位置する結合領域及び／又は分子部分を含む。一部の実施形態では、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合分子は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内経路決定）を保持する限りにおいて、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である、結合領域を含む。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合領域は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性を保持する限りにおいて、例えば、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である分子部分などを含む、比較的大型の分子部分内に含まれる。
実施形態セット２の一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基置換を含む。一部の実施形態では、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基の置換は、アルギニン残基の、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される、正に帯電していないアミノ酸残基による置換である。一部の実施形態では、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基の置換は、アルギニン残基の、ヒスチジンによる置換である。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、その志賀毒素エフェクターポリペプチドの構成要素の全て（複数可）が、各々、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端において、野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含む点を除き、結合分子からなる、第２の結合分子の細胞毒性と同等な細胞毒性を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、第２の結合分子により呈される細胞毒性の、０．１倍、０．５倍、又は０．７５倍～１．２倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍の範囲にある細胞毒性を呈することが可能である。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合分子は、脊索動物に導入されると、第２の結合分子の、インビボにおける忍容性と比較した、インビボにおける忍容性の改善を呈することが可能である。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合分子は、埋め込まれるか、又は挿入された異種エピトープのために、脱免疫化される。一部の実施形態では、結合分子は、例えば、それが、細胞結合分子内に存在する、１つ又は２つ以上の、埋め込まれるか、又は挿入されたエピトープを欠く点を除き、結合分子からなる、第３の細胞結合分子などの参照分子と比較してより少ない相対的抗原性及び／又は相対的免疫原性を呈することが可能である。
実施形態セット２の一部の実施形態では、結合分子は、フーリン切断モチーフの破壊のために、脱免疫化される。一部の実施形態では、結合分子は、フーリン切断モチーフが、野生型である場合、及び／又は全ての志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素が、野生型志賀毒素Ａ１断片からなる点を除き、結合分子からなる、第４の細胞結合分子と比較してより少ない相対的抗原性及び／又は相対的免疫原性を呈することが可能である。
実施形態セット３：破壊されたフーリン切断モチーフを含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、結合分子
各々が、（ｉ）細胞外標的生体分子（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合することが可能な結合領域と、（ii）脱免疫化された、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、結合分子もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態では、結合分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することが可能な結合領域と、（ii）（ａ）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来領域、（ｂ）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における、破壊されたフーリン切断モチーフ、並びに（ｃ）少なくとも１つの、破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ及び／若しくはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ、並びに／又はこれらのエピトープ領域を含む、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、細胞内経路決定を、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又は細胞質ゾルに方向付けること、リボソームの機能を阻害すること、リボソームを、酵素的に不活化させること、細胞増殖抑制を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなど、少なくとも１つの、志賀毒素のエフェクター機能を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、以下：細胞に侵入すること、リボソームの機能を阻害すること、細胞増殖抑制を引き起こすこと、及び／又は細胞死を引き起こすことのうちの、１つ又は２つ以上が可能である。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素の全てが、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端において、野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含む点を除き、結合分子からなる第２の結合分子などの参照分子と同等以上の細胞毒性を呈することが可能である。
実施形態セット３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号２の１～１５；配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１若しくは配列番号２の２７～３７；配列番号１若しくは配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５３～６６；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４～１１５；配列番号１若しくは配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１若しくは配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５、及び配列番号３の２１０～２１８；配列番号３の２４０～２６０；配列番号１若しくは配列番号２の２４３～２５７；配列番号１若しくは配列番号２の２５４～２６８；配列番号３の２６２～２７８；配列番号３の２８１～２９７；配列番号１若しくは配列番号２の２８５～２９３；配列番号１若しくは配列番号２の４～３３；配列番号１若しくは配列番号２の３４～７８；配列番号１若しくは配列番号２の７７～１０３；配列番号１若しくは配列番号２の１２８～１６８；配列番号１若しくは配列番号２の１６０～１８３；配列番号１若しくは配列番号２の２３６～２５８；及び配列番号１若しくは配列番号２の２７４～２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域からなる、天然位置の、志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される、Ｂ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域内の野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの、破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ及び／若しくはＴ細胞エピトープ、並びに／又はこれらのエピトープ領域の一部又は全部と重複するアミノ酸残基の、カルボキシ末端の切断である破壊は存在しない。
実施形態セット３の一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、天然位置の、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）、若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８～２５１、又は志賀様毒素のＡサブユニット（配列番号３）の２４７～２５０；或いは志賀毒素Ａサブユニット内、又はその派生物内の同等な領域内の、少なくとも１つのアミノ酸残基を変化させる。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小限のフーリン切断部位において、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、１つ又は２つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、最小限のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列である、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒ及び／又はＲ－ｘ－ｘ－Ｒにより表される。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、カルボキシ末端側に位置する分子部分を含む。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット３の一部の実施形態では、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。一部の実施形態では、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、カルボキシ末端側に位置する結合領域及び／又は分子部分を含む。一部の実施形態では、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合分子は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内経路決定）を保持する限りにおいて、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である結合領域を含む。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合領域は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性を保持する限りにおいて、例えば、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である分子部分などを含む、比較的大型の分子部分内に含まれる。
実施形態セット３の一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基置換を含む。一部の実施形態では、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基の置換は、アルギニン残基の、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される、正に帯電していないアミノ酸残基による置換である。一部の実施形態では、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基の置換は、アルギニン残基の、ヒスチジンによる置換である。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素（複数可）の全てが、各々、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端において、野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素フーリン切断部位を含む点を除き、結合分子からなる第５の結合分子などの参照分子の細胞毒性と同等な細胞毒性を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、第５の結合分子により呈される細胞毒性の０．１倍、０．５倍、又は０．７５倍～１．２倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍の範囲にある細胞毒性を呈することが可能である。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合分子は、脊索動物に導入されると、第５の結合分子のインビボにおける忍容性と比較した、インビボにおける忍容性の改善を呈することが可能である。
実施形態セット３の一部の実施形態では、結合分子は、フーリン切断モチーフの破壊のために、脱免疫化される。一部の実施形態では、結合分子は、フーリン切断モチーフが、野生型である場合、及び／又は全ての志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素が、野生型志賀毒素Ａ１断片からなる点を除き、結合分子からなる、例えば、第５の結合分子などの、参照結合分子と比較してより少ない相対的抗原性及び／又は相対的免疫原性を呈することが可能である。
実施形態セット１～３のさらなる実施形態
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域に、直接的に、又は例えば、当業者に公知のリンカーを介するなど、間接的に融合される。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、カルボキシ末端側に位置する分子部分を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来領域を有し、Ａ１断片領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフをさらに含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子、又はそのポリペプチド構成要素は、ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフを含む。一部の実施形態では、カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ（配列番号２０５）、ＨＤＥＦ（配列番号２０６）、ＨＤＥＬ（配列番号２０７）、ＲＤＥＦ（配列番号２０８）、ＲＤＥＬ（配列番号２０９）、ＷＤＥＬ（配列番号２１０）、ＹＤＥＬ（配列番号２１１）、ＨＥＥＦ（配列番号２１２）、ＨＥＥＬ（配列番号２１３）、ＫＥＥＬ（配列番号２１４）、ＲＥＥＬ（配列番号２１５）、ＫＡＥＬ（配列番号２１６）、ＫＣＥＬ（配列番号２１７）、ＫＦＥＬ（配列番号２１８）、ＫＧＥＬ（配列番号２１９）、ＫＨＥＬ（配列番号２２０）、ＫＬＥＬ（配列番号２２１）、ＫＮＥＬ（配列番号２２２）、ＫＱＥＬ（配列番号２２３）、ＫＲＥＬ（配列番号２２４）、ＫＳＥＬ（配列番号２２５）、ＫＶＥＬ（配列番号２２６）、ＫＷＥＬ（配列番号２２７）、ＫＹＥＬ（配列番号２２８）、ＫＥＤＬ（配列番号２２９）、ＫＩＥＬ（配列番号２３０）、ＤＫＥＬ（配列番号２３１）、ＦＤＥＬ（配列番号２３２）、ＫＤＥＦ（配列番号２３３）、ＫＫＥＬ（配列番号２３４）、ＨＡＤＬ（配列番号２３５）、ＨＡＥＬ（配列番号２３６）、ＨＩＥＬ（配列番号２３７）、ＨＮＥＬ（配列番号２３８）、ＨＴＥＬ（配列番号２３９）、ＫＴＥＬ（配列番号２４０）、ＨＶＥＬ（配列番号２４１）、ＮＤＥＬ（配列番号２４２）、ＱＤＥＬ（配列番号２４３）、ＲＥＤＬ（配列番号２４４）、ＲＮＥＬ（配列番号２４５）、ＲＴＤＬ（配列番号２４６）、ＲＴＥＬ（配列番号２４７）、ＳＤＥＬ（配列番号２４８）、ＴＤＥＬ（配列番号２４９）、ＳＫＥＬ（配列番号２５０）、ＳＴＥＬ（配列番号２５１）、及びＥＤＥＬ（配列番号２５２）からなる群から選択される。一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、例えば、それが、ＫＤＥＬファミリーのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）を含まない点を除き、結合分子からなる、第６の結合分子などの参照分子の細部毒性より大きな細胞毒性を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、参照分子、例えば、第６の結合分子などと比較して、例えば、４倍、５倍、６倍、９倍、又は１０倍以上の細胞毒性など、細胞毒性力価がよりよく最適化された細胞毒性を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子の、標的陽性細胞の集団に対する細胞毒性は、ＣＤ５０値によりアッセイされる通り、第６の結合分子の、標的陽性細胞の第２の集団に対する細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又は１１倍以上である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、挿入される、又は埋め込まれた異種エピトープをさらに含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、２つ、又は３つの破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域をさらに含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つ、２つ、又は３つの内因性のＢ細胞エピトープ及び／若しくはＴ細胞エピトープ、並びに／又はこれらのエピトープ領域の破壊を含む。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの、挿入される、又は埋め込まれた異種エピトープと重複しない、少なくとも１つの、破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域をさらに含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、結合分子のポリペプチド構成要素のアミノ末端及び／又はその近傍にある。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、結合分子のアミノ末端の近傍に位置しない。一部の実施形態では、結合領域と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近傍に位置しないように、結合分子内に物理的に配置されるか又は配向させられる。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近傍の、結合分子内に位置する。一部の実施形態では、結合分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入されると、参照分子、例えば、アミノ末端を有し、結合領域と、アミノ末端又はその近傍に位置しない、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第７の結合分子などの細胞毒性と比較して、細胞外腔から、小胞体及び／又は細胞質ゾルの細胞内区画への、より大きな細胞内経路決定効率を呈することが可能である。一部の実施形態では、結合分子は、第７の結合分子の細胞毒性と比較して、例えば、４倍、５倍、６倍、９倍、又は１０倍以上の細胞毒性など、細胞毒性力価がよりよく最適化された細胞毒性を呈する。一部の実施形態では、結合分子の、標的陽性細胞の集団に対する細胞毒性は、ＣＤ５０値によりアッセイされる通り、第７の結合分子の、標的陽性細胞の第２の集団に対する細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又は１１倍以上である。一部の実施形態では、第７の細胞結合分子は、カルボキシ末端の、ＫＤＥＬファミリーの小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）を含まない。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号２の１～１５；配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１若しくは配列番号２の２７～３７；配列番号１若しくは配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５３～６６；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４～１１５；配列番号１若しくは配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１若しくは配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５、及び配列番号３の２１０～２１８；配列番号３の２４０～２６０；配列番号１若しくは配列番号２の２４３～２５７；配列番号１若しくは配列番号２の２５４～２６８；配列番号３の２６２～２７８；配列番号３の２８１～２９７；配列番号１若しくは配列番号２の２８５～２９３；配列番号１若しくは配列番号２の４～３３；配列番号１若しくは配列番号２の３４～７８；配列番号１若しくは配列番号２の７７～１０３；配列番号１若しくは配列番号２の１２８～１６８；配列番号１若しくは配列番号２の１６０～１８３；配列番号１若しくは配列番号２の２３６～２５８；及び配列番号１若しくは配列番号２の２７４～２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域からなる、天然位置の志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される、Ｂ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域内の破壊をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの、破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ及び／若しくはＴ細胞エピトープ、並びに／又はこれらのエピトープ領域の一部又は全部と重複するアミノ酸残基の、カルボキシ末端切断である破壊は存在しない。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、天然位置の志賀毒素Ａサブユニットアミノ酸残基：Ｌ４９、Ｄ１９７、Ｄ１９８、Ｒ２０４、及びＲ２０５の群から選択される、Ｂ細胞免疫原性アミノ酸残基における変異をさらに含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２の１～１５；配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１若しくは配列番号２の２７～３７；配列番号１若しくは配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；及び配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５３～６６；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域（この場合、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全部と重複する配列の、アミノ末端切断である破壊は存在しない）；（ii）配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４～１１５；配列番号１若しくは配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１若しくは配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０～２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０～２６０；配列番号１若しくは配列番号２の２４３～２５７；配列番号１若しくは配列番号２の２５４～２６８；配列番号３の２６２～２７８；配列番号３の２８１～２９７；及び配列番号１若しくは配列番号２の２８５～２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域からなる、天然位置の志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域を破壊する。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２の１～１５；配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１若しくは配列番号２の２７～３７；配列番号１若しくは配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；及び配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５３～６６；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域（この場合、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全部と重複する配列の、アミノ末端切断である破壊は存在しない）；（ii）配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４～１１５；配列番号１若しくは配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１若しくは配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０～２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０～２６０；配列番号１若しくは配列番号２の２４３～２５７；配列番号１若しくは配列番号２の２５４～２６８；配列番号３の２６２～２７８；配列番号３の２８１～２９７；及び配列番号１若しくは配列番号２の２８５～２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域（この場合、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全部と重複する配列の、アミノ末端切断である破壊は存在しない）からなる、天然位置の志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域内に、変異を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４～１１５；配列番号１若しくは配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１若しくは配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；又は配列番号３の２１０～２１８からなる、天然位置の志賀毒素Ａサブユニットの群から選択される、少なくとも１つの内因性のエピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上の内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、１つ又は２つ以上の破壊は、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、アミノ酸残基置換を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、１つ又は２つ以上の内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域は、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、複数のアミノ酸残基置換を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの破壊は、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域内に、複数のアミノ酸残基置換を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、少なくとも１つの破壊は、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上のアミノ酸残基置換を含み、この場合、少なくとも１つの置換が、配列番号１若しくは配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の６；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１２；配列番号１若しくは配列番号２の３３；配列番号１若しくは配列番号２の４３；配列番号１若しくは配列番号２の４４；配列番号１若しくは配列番号２の４５；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４６；配列番号１若しくは配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４９；配列番号１若しくは配列番号２の５０；配列番号１若しくは配列番号２の５１；配列番号１若しくは配列番号２の５３；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５４；配列番号１若しくは配列番号２の５５；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５６；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５７；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５９；配列番号１若しくは配列番号２の６０；配列番号１若しくは配列番号２の６１；配列番号１若しくは配列番号２の６２；配列番号１若しくは配列番号２の８４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の８８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９６；配列番号１若しくは配列番号２の１０４；配列番号１若しくは配列番号２の１０５；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１０７；配列番号１若しくは配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１０９；配列番号１若しくは配列番号２の１１０；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１１１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１１２；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１４１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１４７；配列番号１若しくは配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１７９；配列番号１若しくは配列番号２の１８０；配列番号１若しくは配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８４；配列番号１若しくは配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８６；配列番号１若しくは配列番号２の１８７；配列番号１若しくは配列番号２の１８８；配列番号１若しくは配列番号２の１８９；配列番号３の１９７；配列番号１若しくは配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；配列番号１若しくは配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１若しくは配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１若しくは配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の２６４；配列番号１若しくは配列番号２の２６５；及び配列番号１若しくは配列番号２の２８６；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等なアミノ酸残基からなる群から選択される、天然位置の志賀毒素Ａサブユニットアミノ酸残基において生じてもよい。一部の実施形態では、少なくとも２つの破壊は、各々、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、配列番号１若しくは配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１１；配列番号１若しくは配列番号２の３３；配列番号１若しくは配列番号２の４３；配列番号１若しくは配列番号２の４５；配列番号１若しくは配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の４８；配列番号１若しくは配列番号２の４９；配列番号１若しくは配列番号２の５３；配列番号１若しくは配列番号２の５５；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５９；配列番号１若しくは配列番号２の６０；配列番号１若しくは配列番号２の６１；配列番号１若しくは配列番号２の６２；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９６；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１０９；配列番号１若しくは配列番号２の１１０；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１１２；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１４７；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１７９；配列番号１若しくは配列番号２の１８０；配列番号１若しくは配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８４；配列番号１若しくは配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の１８６；配列番号１若しくは配列番号２の１８７；配列番号１若しくは配列番号２の１８８；配列番号１若しくは配列番号２の１８９；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；配列番号１若しくは配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号３の２５０；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の２６４；配列番号１若しくは配列番号２の２６５；及び配列番号１若しくは配列番号２の２８６；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等なアミノ酸残基からなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２の１～１５；配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１若しくは配列番号２の２７～３７；配列番号１若しくは配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；及び配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５３～６６、又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域（この場合、少なくとも１つの破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域の一部又は全部と重複するアミノ酸残基の、アミノ末端切断である破壊は存在しない）；（ii）配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の９４～１１５；配列番号１若しくは配列番号２の１４１～１５３；配列番号３の１４０～１５６；配列番号１若しくは配列番号２の１７９～１９０；配列番号３の１７９～１９１；配列番号３の２０４；配列番号１若しくは配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０～２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０～２６０；配列番号１若しくは配列番号２の２４３～２５７；配列番号１若しくは配列番号２の２５４～２６８；配列番号３の２６２～２７８；配列番号３の２８１～２９７；及び配列番号１若しくは配列番号２の２８５～２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域（この場合、少なくとも１つの破壊された、内因性のＢ細胞エピトープ及び／若しくはＴ細胞エピトープ、並びに／又はこれらのエピトープ領域の一部又は全部と重複するアミノ酸残基の、カルボキシ末端切断である破壊は存在しない）からなる群から選択される、少なくとも３つの、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも２つの、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含み、この場合、各々の破壊は、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換を含み、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＴ細胞エピトープ領域は、配列番号３の３～１４；配列番号３の２６～３７；配列番号１若しくは配列番号２の２７～３７；配列番号１若しくは配列番号２の３９～４８；配列番号３の４２～４８；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の５３～６６；又は志賀毒素Ａサブユニット内、若しくはその派生物内の同等な領域からなる、天然位置の、志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、埋め込まれるか、又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、本明細書で記載される、内因性のＢ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ領域を破壊しない。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、少なくとも１つの破壊は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＤからＭ、ＤからＲ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＦからＡ、ＦからＧ、ＦからＶ、ＦからＬ、ＦからＩ、ＧからＡ、ＧからＰ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＩからＡ、ＩからＶ、ＩからＧ、ＩからＣ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＶ、ＬからＧ、ＬからＣ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＶからＡ、ＶからＧ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、ＹからＭ、及びＹからＴからなる群から選択される野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換を含む。一部の実施形態では、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＧからＡ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＧ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、及びＹからＭからなる群から選択される。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、破壊（複数可）のうちの少なくとも１つは、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＲ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、及びＫ；Ｓ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＣ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ又はＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｍ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、及びＦ；Ｌ４９からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｙ４９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＴ；Ｆ５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＴ；Ａ５１；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、Ｉ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＭ；Ｌ５７からＡ、Ｖ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＮ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｌ１０８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＴ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、Ｖ及びＣ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、脊索動物に導入されると、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素（複数可）の全てが、各々、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端において、野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素フーリン切断部位を含む点を除き、結合分子からなる第２４の結合分子などの参照分子と比較した、インビボにおける忍容性及び／又は安定性の改善を呈することが可能である。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞毒性ではなく、分子部分は、細胞毒性である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合領域と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、直接的に、又は間接的に、一体に連結されている。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合領域は、少なくとも１つのペプチド及び／又はポリペプチドを含む。一部の実施形態では、結合領域は、免疫グロブリン型結合領域であるか、又はこれを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドを含む結合領域は、自律性ＶＨドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、ナノボディー、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体可変断片（Ｆｖ）、相補性決定領域３断片（ＣＤＲ３）、拘束型ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ポリペプチド（ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４）、Ｆｄ断片、小型モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）ドメイン、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、アルマジロリピートポリペプチド（ＡｒｍＲＰ）、フィブロネクチン由来１０型フィブロネクチンIIIドメイン（１０Ｆｎ３）、テネイシンIII型ドメイン（ＴＮｆｎ３）、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａ－ドメイン（ＬＤＬＲ－Ａ）、リポカリン（アンチカリン）、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ－Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（アフィチン）、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣体、及び結合機能性を保持する、前出のうちのいずれかの任意の遺伝子改変対応物からなる群から選択される。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、（ｉ）野生型志賀毒素Ａ１断片若しくは野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同等の触媒活性レベル、（ii）１０，０００ピコモル以下の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値による、リボソーム阻害活性、及び／又は（iii）著明レベルの志賀毒素触媒活性を呈することが可能である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子及び／若しくはその志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む参照結合分子と同等な細胞内経路決定効率を呈することが可能である、並びに／又は細胞の、エンドソーム内の出発位置から、小胞体及び／若しくは細胞質ゾルへの、著明レベルの細胞内経路決定活性を呈することが可能である。
結合分子が、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされた細胞に投与される、実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、細胞死を引き起こすことが可能である。結合分子が、細胞外標的生体分子の存在又はレベルに関して異なる、２つの、異なる細胞型集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子は、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされていない細胞型に対するＣＤ５０の、少なくとも３分の１以下のＣＤ５０で、細胞毒性である結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされた細胞型に対する細胞死を引き起こすことが可能である。結合分子が、そのメンバーが、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされた、第１の細胞集団、及びそのメンバーが、結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされていない、第２の細胞集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子の、前記第２の細胞集団のメンバーと比べた、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果は、少なくとも３倍である。結合分子が、そのメンバーが、著明量の、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされた、第１の細胞集団、及びそのメンバーが、著明量の、結合領域の細胞外標的生体分子に、物理的にカップリングされていない、第２の細胞集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子の、前記第２の細胞集団のメンバーと比べた、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果は、少なくとも３倍である。結合分子が、標的生体分子陽性細胞の第１の集団、及びそのメンバーが、著明量の、結合分子の結合領域の標的生体分子を細胞表面で発現しない、第２の細胞集団に投与される、一部の実施形態では、結合分子の、第２の細胞集団のメンバーと比べた、第１の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果は、少なくとも３倍である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、３００ｎＭ以下の５０％阻害濃度（ＣＤ５０）値による細胞毒性を呈すること、及び／又は著明レベルの志賀毒素細胞毒性を呈することが可能である。
実施形態セット２～１１の一部の実施形態では、結合分子は、埋め込まれるか、又は挿入された異種ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを、ＭＨＣクラスＩ分子が結合したエピトープを、細胞表面に提示するための、細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することが可能である。
実施形態セット２～１１の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した分子部分を含む。一部の実施形態では、分子部分は、結合領域を含むか、又はこれからなる。一部の実施形態では、分子部分は、少なくとも１つのアミノ酸を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、分子部分の少なくとも１つのアミノ酸残基に連結されている。一部の実施形態では、分子部分と、志賀毒素エフェクターポリペプチドとは、融合され、連続ポリペプチドを形成する。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した細胞毒性分子部分をさらに含む。一部の実施形態では、細胞毒性分子部分は、例えば、当業者に公知の低分子化学療法剤、抗新生物剤、細胞毒性抗生剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び／若しくはチューブリン阻害剤などの細胞毒性剤、並びに／又は本明細書で記載される細胞毒性剤である。一部の実施形態では、細胞毒性分子部分は、１０，０００、５，０００、１，０００、５００、又は２００ｐＭ未満の濃度で、細胞毒性である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合領域は、ジスルフィド結合ではない、少なくとも１つの共有結合により、志賀毒素エフェクターポリペプチドと、直接的に、又は間接的に連結されている。一部の実施形態では、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端に、直接的に、又は間接的に融合されて、単一の、連続ポリペプチドを形成する。一部の実施形態では、結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位内の、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小限のフーリン切断部位の、少なくとも１つのアミノ酸残基の一部又は全部と重複する配列の、アミノ末端の切断ではない。一部の実施形態では、最小限のフーリン切断部位内の変異は、Ｒ／Ｙ－ｘ－ｘ－Ｒフーリン切断モチーフ内の、少なくとも１つのアミノ酸残基の、アミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換である。一部の実施形態では、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、少なくとも１つの変異を含み、変異は、天然位置の、１）志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８～２５１、又は２）志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７～２５０、或いは任意の志賀毒素Ａサブユニット内の、同等なアミノ酸配列位置における領域内の、少なくとも１つのアミノ酸残基を変化させる。一部の実施形態では、変異は、アルギニン残基の、正に帯電していないアミノ酸残基によるアミノ酸残基置換である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、細胞に導入されると、その志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素（複数可）の全てが、各々、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む点を除き、結合分子からなる、例えば、第８の結合分子などの参照分子の細胞毒性と同等な細胞毒性を呈することが可能である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合領域は、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つにより表されるポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になる。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。一部の実施形態では、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に対して、カルボキシ末端側に位置する結合領域及び／又は分子部分を含む。一部の実施形態では、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内経路決定）を保持する限りにおいて、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である結合領域を含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合領域は、結合分子が、適切なレベルの、本明細書で言及される、志賀毒素の生物学的活性を保持する限りにおいて、例えば、質量が、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、又は１００ｋＤａ以上である分子部分などを含む、比較的大型の分子部分内に含まれる。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、低細胞毒性力価（すなわち、ある特定の陽性標的細胞型に導入されると、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、又は５０ｎＭの結合分子濃度で、細胞集団の、１％細胞死超の細胞毒性を呈することが可能ではない）を呈し、細胞に導入されると、例えば、アミノ末端を有し、結合領域と、アミノ末端又はその近傍に位置しない、志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第９の結合分子などの参照分子の細胞毒性と比較した、細胞外腔から、小胞体及び／又は細胞質ゾルの細胞内区画への、より大きな細胞内経路決定効率を呈することが可能である。一部の実施形態では、第９の細胞結合分子は、カルボキシ末端の、ＫＤＥＬファミリーの小胞体保持／回収シグナルモチーフ（配列番号２０５～２５２を参照されたい）を含まない。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、分子部分は、天然に存在する志賀毒素の志賀毒素Ａ２断片に由来するペプチド及び／又はポリペプチドを含む。
本明細書で記載される実施形態は、任意の、天然に存在する志賀ホロ毒素又は志賀毒素Ａサブユニットをカバーすることを意図しない。実施形態セット１～３の一部の実施形態では、結合分子は、天然に存在する志賀毒素Ｂサブユニットを含まない。一部の実施形態では、結合分子は、天然志賀毒素Ｂサブユニットの機能的結合ドメインを含むか、又はこれから本質的になるポリペプチドを含まない。そうではなくて、結合分子の一部の実施形態では、志賀毒素Ａサブユニット由来の領域は、細胞ターゲティングを招来するように、異種結合領域と、機能的に会合させる。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも２つの、埋め込まれるか、又は挿入された異種エピトープを含む。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べた、以下のセット：（１）Ｒ２４８Ｈ及びＲ２５１Ｈ；（２）Ｒ２４８Ｇ及びＲ２５１Ｇ；（３）Ａ２４６Ｇ、Ｓ２４７Ａ、Ａ２５３Ｇ、及びＳ２５４Ａ；並びに（４）Ａ２４６Ｇ、Ｓ２４７Ａ、Ｒ２４８Ｇ、Ｒ２５１Ｇ、Ａ２５３Ｇ、及びＳ２５４Ａから選択されるアミノ酸残基置換のセットを含まない。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然位置の、野生型志賀毒素Ａサブユニット内の、２４７～２５２における領域の欠失を含まない。実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然位置の、野生型志賀毒素Ａサブユニット内の、２４５～２４７及び２５３～２５５における領域の欠失を含まない。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変更する、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットと比べた、１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される。一部の実施形態では、天然に存在するＡサブユニットと比べた変異は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性活性を低減するか、又は消失させるが、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、細胞への内部化を促進すること、及び／又は細胞内経路決定を、ある特定の細胞内区画（複数可）に方向付けることなど、少なくとも１つの、他の志賀毒素エフェクター機能を保持する。一部の実施形態では、天然に存在するＡサブユニットと比べた変異は、例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３における、Ａ２３１Ｅ、Ｒ７５Ａ、Ｙ７７Ｓ、Ｙ１１４Ｓ、Ｅ１６７Ｄ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７６Ｋ、及び／又はＷ２０３Ａなどの、少なくとも１つのアミノ酸残基置換から選択される。
実施形態セット１～３の一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の細胞内区画であって、以下：細胞質ゾル、小胞体、及びリソソームから選択される細胞内区画への経路決定；（ii）志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の、早期エンドソーム区画から、プロテアソームへの、エピトープの細胞内送達；及び／又は（iii）志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の、早期エンドソーム区画から、ＭＨＣクラスＩ分子への、エピトープの細胞内送達が可能である。一部の実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の表面における、ＭＨＣクラスＩ分子による提示のための、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの細胞内送達が可能である。
実施形態セット４：抗体－毒素コンジュゲートを含む結合分子
ＰＤ－Ｌ１結合分子の多様な実施形態もまた、本明細書で提示され、この場合、各ＰＤ－Ｌ１結合分子は、（１）少なくとも１つの毒素構成要素と、（２）ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分と特異的に結合することが可能な、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合領域とを含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、薬学的に活性な毒素を含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、薬学的に活性な毒素とコンジュゲートされて、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）を形成する。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、（１）毒素と、（２）抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むＰＤ－Ｌ１結合領域とを含む。一部の実施形態では、毒素は、薬学的に活性な細胞毒素である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）であり、この場合、抗体と、毒素構成要素とは、本明細書で記載されるように連結されている。本明細書で使用される、「抗体」という用語は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ラクダ化抗体、ヒト化抗体、又は抗原結合性抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ断片）などの、免疫グロブリンタンパク質、すなわち、特異的抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、又はこれらの抗原結合性断片を指す。本明細書で使用される、「コンジュゲート」という用語は、広く使用され、会合の方法に関わらず、任意の毒素剤と抗体との共有結合的又は非共有結合的会合を意味する。ＡＤＣの毒素剤構成要素は、前述のいずれかに由来する、天然毒素、生物毒素、タンパク質性毒素、毒液、細胞毒素、低分子毒素、及び合成毒物を含むが、これらに限定されない。ＡＤＣは、治療目的及び診断目的のために使用されうる。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、各々が、配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）を含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）各々が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。ある特定の他のさらなる実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号２５、配列番号２０、及び配列番号２１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号２５、配列番号２０、及び配列番号２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。ある特定の他のさらなる実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか；又は配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）をさらに含む。
一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）各々が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び配列番号２６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはこれから本質的になる、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｌ）；並びに（ｂ）各々が、配列番号２２～２４及び２７～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはこれから本質的になる、３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＨＶＲ－Ｈ）を含む。
一部の実施形態では、結合領域は、（ａ）配列番号３３、３５～３６、及び３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又は配列番号３３、３５～３６、及び３８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になる、軽鎖領域；並びに／或いは（ｂ）配列番号３４、３７、及び３９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又は配列番号３４、３７、及び３９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になる、重鎖領域を含む。一部の実施形態では、結合領域は、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、又は配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つに示されるポリペプチドから本質的になる、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、結合領域は、例えば、配列番号８５～１０７及び１５６～１５７のうちのいずれか１つのポリペプチドからなるか、これを含むか、又はこれから本質的になるなどの、単鎖可変断片である。
ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子の、ＰＤ－Ｌ１発現細胞への投与は、（ｉ）細胞によるＰＤ－Ｌ１結合分子の毒素構成要素の内部化、及び（ii）細胞死を結果としてもたらす。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子のＰＤ－Ｌ１発現細胞への投与は、（ｉ）細胞によるＰＤ－Ｌ１結合分子の内部化、及び（ii）触媒的に活性の毒素構成要素のための細胞死を結果としてもたらす。一部の実施形態では、実施形態セット４のＰＤ－Ｌ１結合分子は、細胞に導入されると、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、又は１ｎＭ以下の５０％阻害濃度（ＣＤ５０）値による細胞毒性を呈することが可能である。
ＰＤ－Ｌ１結合分子の一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物又は軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン断片）、サロボディー（surrobody）（代替軽鎖コンストラクトを含む）、ラクダ化抗体、ヒト化抗体などを含むがこれらに限定されない、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する全長抗体、二特異性抗体、二重可変ドメイン抗体、複数鎖若しくは単鎖抗体、及び／又は抗体断片（複数可）の形である。ＰＤ－Ｌ１結合領域は、例えば、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、又はｓＩｇＡ）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、又はＩｇＭを含む、任意の抗体アイソタイプの場合も、又はこれに由来する場合もある。ＰＤ－Ｌ１結合領域は、哺乳動物起源の種（例えば、サル、齧歯動物、ヤギ、及びウサギ）を含むがこれらに限定されない、任意の種の任意の抗体の場合も、又はこれに由来する場合もある。ＰＤ－Ｌ１結合領域は、当技術分野で公知の通り、半減期を延長するＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＰＤ－Ｌ１拮抗作用、ＰＤ－Ｌ１アゴニスト活性などを増大させるか、又はこれを減少させる改変及び／又は変異など、抗体及び／又は抗原結合性断片の特性を変化させる改変及び／又は変異を含みうる。
一部の実施形態では、結合分子は、標的細胞への送達のために存在しうる、さらなる外因性素材をさらに含む。一部の実施形態では、さらなる外因性素材は、結合分子に、直接的に、又は間接的に、会合している、連結されている、及び／又はカップリングされている。
一部の実施形態では、結合分子は、検出促進剤をさらに含む。一部の実施形態では、検出促進剤は、結合分子に、直接的に、又は間接的に、会合している、連結されている、及び／又はカップリングされている。
一部の実施形態では、結合領域は、多重特異性でも二特異性でもなく、すなわち、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、単一特異性である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分と特異的に結合することが可能であるが、任意の他の細胞表面標的への高アフィニティーで特異的な結合を欠き、すなわち、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ１分子の細胞外部分内の単一のエピトープに、単一特異性の結合を呈することが可能である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、細胞の細胞表面に存在するＰＤ－Ｌ１への、特異的で高アフィニティーの結合を呈することが可能な免疫グロブリン型結合領域を１つだけ含む、すなわち、単一特異性の結合特徴をもたらす、１分子当たり単一の抗原結合部位を含む。実施形態セット１～４の一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、細胞の細胞表面に存在するＰＤ－Ｌ１への、特異的で高アフィニティーの結合を呈することが可能な免疫グロブリン型結合領域を１種だけ含む、すなわち、単一の抗原結合部位の２つ又は３つ以上の同一なコピーを含み、例えば、この場合、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＰＤ－Ｌ１への結合に、多価のＰＤ－Ｌ１結合特徴を呈するが、単一特異性だけを呈する。
上述の結合分子のうちのいずれか１つと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物もまた、本明細書で提示される。
上述の結合分子のうちのいずれか１つと、検出促進剤とを含む診断用組成物もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態は、結合分子であり、この場合、検出促進剤は、異種エピトープであり、結合分子は、異種エピトープを含む。
結合分子、及びこれらの組成物のほかに、結合分子をコードすることが可能なポリヌクレオチドのほか、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター並びに任意のポリヌクレオチド及び／又は発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本明細書で提示される。発現ベクターを含む宿主細胞は、例えば、本明細書で記載される分子又はそのポリペプチド構成要素若しくは断片を組換え発現により作製するための方法に使用されうる。
細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１発現細胞）を殺滅する方法であって、細胞を、本明細書で記載される上記の結合分子又は上記の医薬組成物のうちのいずれかと接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態では、細胞（複数可）を接触させるステップは、インビトロにおいて生じる。ある特定の他の実施形態では、細胞（複数可）を接触させるステップは、インビボにおいて生じる。細胞殺滅法の一部の実施形態では、方法は、結合分子の結合領域の細胞外標的生体分子の、細胞外における存在及び／又は発現レベルに関して異なる、細胞の混合物を接触させる場合に、細胞（複数可）及び／又は細胞型を、他の細胞（複数可）及び／又は細胞型に優先して、選択的に殺滅することが可能である。
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１相互作用及び／又は下流のシグナル伝達を阻害する方法であって、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を、本明細書で記載される上記の結合分子又は上記の医薬組成物のうちのいずれかと接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態では、細胞（複数可）を接触させるステップは、インビトロにおいて生じる。ある特定の他の実施形態では、細胞（複数可）を接触させるステップは、インビボにおいて生じる。
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１相互作用の阻害と、ＰＤ－Ｌ１発現細胞の死滅誘導とを同時に行う方法であって、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を、上記の結合分子又は上記の医薬組成物のうちのいずれかと接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。一部の実施形態では、細胞（複数可）を接触させるステップは、インビトロにおいて生じる。ある特定の他の実施形態では、細胞（複数可）を接触させるステップは、インビボにおいて生じる。
一部の実施形態では、疾患、障害、又は状態を治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量の、ＰＤＬ－１結合分子又はこれを含む医薬組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、がんは、以下：膀胱がん（例えば、尿路上皮癌）、乳がん（例えば、ＨＥＲ２陽性乳がん、トリプルネガティブ乳がん）、結腸がん（例えば、高頻度マイクロサテライト不安定性を有する転移性結腸直腸がん又はミスマッチ修復欠損結腸直腸がんなどの結腸直腸がん）、子宮内膜がん、食道がん、卵管がん、消化器がん（例えば、胃がん、胆道新生物、食道胃接合部がん）、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、肝がん（例えば、肝細胞癌）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん）、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫）、メルケル細胞癌、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、鼻咽頭新生物、卵巣がん、膵臓がん、腹膜新生物、前立腺がん、皮膚がん（例えば、皮膚扁平上皮がん、黒色腫、移行上皮癌、又は尿路上皮がんのうちのいずれか１つである。
一部の実施形態では、患者における疾患、障害、及び／又は状態を治療する方法は、それを必要とする患者に、治療有効量の結合分子及び／又は医薬組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法を使用して治療される疾患、障害、又は状態は、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染から選択される。これらの方法の一部の実施形態では、治療されるがんは、肺がん、黒色腫、膀胱がん、ホジキンリンパ腫、及び乳がんからなる群から選択される。これらの方法の一部の実施形態では、治療される免疫障害は、リウマチ性疾患、脊椎炎、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、結節性多発動脈炎、多発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される疾患と関連する免疫障害である。
結合分子のある特定の実施形態は、結合分子の細胞外標的生体分子と、物理的にカップリングされた細胞内への、さらなる外因性素材の送達のために利用されうる。加えて、本開示は、細胞（複数可）の内部に、外因性素材を送達するための方法であって、細胞（複数可）を、インビトロ又はインビボのいずれかで、結合分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物と接触させるステップを含む方法をもたらす。患者における細胞（複数可）の内部に、外因性素材を送達するための方法であって、患者に、結合分子（細胞毒性活性を伴うか、又はこれを伴わない）を投与するステップを含む方法もまた、提供され、この場合、標的細胞（複数可）は、結合分子の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている。
細胞のＭＨＣクラスＩ分子により提示されることが可能なＴ細胞エピトープを細胞内に送達する方法であって、細胞を、異種Ｔ細胞エピトープと会合した結合分子、及び／又はこの組成物（例えば、本明細書で記載される、医薬組成物若しくは診断用組成物）と接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提示される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子を製造する方法は、ＰＤ－Ｌ１結合分子を発現させるステップ、及びＰＤ－Ｌ１結合分子を回収するステップを含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子を発現させるステップは、この場合、ＰＤ－Ｌ１結合分子が発現される条件下で、ＰＤ－Ｌ１結合分子をコードする核酸（例えば、発現ベクター）を含む宿主細胞を培養することを含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子と、少なくとも１つの他の生体分子とを含む発現系組成物から、本明細書で記載されるＰＤ－Ｌ１結合分子を精製するための方法は、（ｉ）発現系組成物を細菌プロテインＬと接触させて、ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を創出するステップ、及び（ii）ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を回収するステップを含む。一部の実施形態では、発現系組成物は、細胞溶解物である。一部の実施形態では、プロテインＬは、Ｆ．マグナ種から単離されているか、又はこれに由来する。一部の実施形態では、プロテインＬは、樹脂にコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、本明細書で記載される分子を作製する方法は、例えば、Ｐ．マグナス種（P. magnus）由来のプロテインＬ、若しくはこの派生物及び結合ドメイン断片、又は黄色ブドウ球菌（S. areus）由来のプロテインＡ若しくはこの派生物及び結合ドメイン断片などの、細菌細胞－壁タンパク質ドメイン相互作用を使用して分子、又はこのポリペプチド構成要素を精製するステップを含む。一部の実施形態では、方法の、精製するステップは、配列番号１～１８及び４０～６８に示されるポリペプチドのうちのいずれか１つを含むか、又はこれらから本質的になる志賀毒素エフェクターポリペプチドを伴う。一部の実施形態では、方法の、精製するステップは、配列番号１０８～１５５に示されるポリペプチドのうちのいずれか１つを含むか、又はこれらから本質的になる結合分子を伴う。
実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子を製造する方法は、ＰＤ－Ｌ１結合分子が発現される条件下で、宿主細胞を培養するステップ、及びタンパク質を回収するステップを含む。一部の実施形態では、結合分子は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して結合分子を精製可能にするエピトープを含む。一部の実施形態では、結合分子は、細菌Ｉｇ結合ドメイン、又はこの断片若しくは機能的バリアントなどの、Ｉｇ結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される精製法において使用されるＩｇ結合ドメインは、プロテインＬ、又はこの派生物若しくは結合ドメイン断片である。フィネゴルディア・マグナ種（Finegoldia magna）（以前のペプトストレプトコッカス・マグナス種（Peptostreptococcus magnus））から最初に単離されたプロテインＬは、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、又は他の結合性タンパク質の抗原結合性部位と干渉せずに、カッパ軽鎖相互作用を通して結合する独自の能力を有する免疫グロブリン結合性タンパク質である。プロテインＬは、天然カッパ軽鎖亜型Ｉ、III及びIVに結合する。プロテインＬは、天然カッパ軽鎖亜型II又は天然ラムダ軽鎖に結合しない。プロテインＬは、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤに結合する。一部の実施形態では、プロテインＬは、Ｆ．マグナから単離されているか、又はこれに由来する。プロテインＬは、例えば、大腸菌において、組換え作製することができる。一部の実施形態では、プロテインＬは、配列番号２７９の配列、又はこれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一な配列を含む。
一部の実施形態では、Ｉｇ結合ドメインは、Ｃ及びＧ群連鎖球菌に由来するプロテインＧ、若しくは黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、又は前出のうちのいずれかの派生物及び結合ドメイン断片である。
一部の実施形態では、精製法は、Ｉｇ結合ドメインエピトープを含む結合分子を、Ｉｇ結合ドメイン（例えば、プロテインＬ又はその断片若しくは派生物）と接触させるステップを含む。
一部の実施形態では、方法は、３つのステップ：結合させるステップ、洗浄するステップ、及び溶出するステップを含む。結合させるステップでは、キメラ免疫グロブリン結合ドメインを含むタンパク質が、マトリックス上に固定化されたプロテインＬと接触される。マトリックスは、ビーズ、樹脂など、任意の固体支持体でありうる。一部の実施形態では、マトリックスは、カラム内又はカートリッジ内に充填することができる。
洗浄するステップでは、マトリックスは、不純物を除去するために洗浄される。洗浄するステップは、実質的に全ての不純物が除去されるまで、例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回反復することができる。一部の実施形態では、洗浄するステップは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の不純物が除去されるまで、反復される。
溶出するステップでは、キメラ免疫グロブリン結合ドメインを含むタンパク質は、プロテインＬマトリックスから溶出される。タンパク質は、例えば、高塩洗浄溶液（例えば、１Ｍ ＮａＣｌ）又はｐＨ変更を使用して、溶出することができる。溶出後、タンパク質を収集し、必要に応じて、標準的方法に従ってさらに精製及び／又は脱塩することができる。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子と、少なくとも１つの他の生体分子とを含む発現系組成物から、ＰＤ－Ｌ１結合分子を精製するための方法は、（ｉ）発現系組成物を、細菌プロテインＬと接触させて、ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を創出するステップ、及び（ii）ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を回収するステップを含む。一部の実施形態では、発現系組成物は、細胞溶解物である。一部の実施形態では、プロテインＬは、Ｆ．マグナ種から単離されているか、又はこれに由来する。一部の実施形態では、プロテインＬは、樹脂にコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、結合分子を製造する方法は、宿主細胞を、結合分子が発現される条件下で培養するステップ、及びタンパク質を回収するステップを含む。一部の実施形態では、結合分子を精製する方法は、結合分子を細菌プロテインＬと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、プロテインＬは、Ｆ．マグナ種から単離されているか、又はこれに由来する。一部の実施形態では、プロテインＬは、樹脂にコンジュゲートされている。
本明細書で記載される物の組成物を含み、使用説明書、さらなる試薬（複数可）、及び／又は医薬送達デバイス（複数可）を含んでいてもよい、キットもまた、本明細書で提示される。キットは、試料中又は対象において、細胞型（例えば、腫瘍細胞）を検出するための試薬及び他のツールをさらに含みうる。
さらなる番号付けされた実施形態
１． 志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に特異的に結合することが可能な結合領域とを含むＰＤ－Ｌ１結合分子であって；結合領域が、（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＹＴＭＨ（配列番号２７）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＧＩＮＰＮＮＧＧＴＷＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＰＹＹＹＧＳＲＥＤＹＦＤＹ（配列番号３２）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２６）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＰＤ－Ｌ１結合分子。
２． 志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドが、配列番号４１の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態１に記載のＰＤｌ－Ｌ１結合分子。
３． ＶＨが、配列番号３４の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
４． ＶＬが、配列番号３５の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
５． ＶＨが、配列番号３４の配列を含み、ＶＬが、配列番号３５の配列を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
６． 結合領域が、ＶＨとＶＬとを連結するｓｃＦｖリンカーを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７． ｓｃＦｖリンカーが、約３～約１２アミノ酸長である、実施形態６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８． ｓｃＦｖリンカーが可動性リンカーである、実施形態６～７のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
９． ｓｃＦｖリンカーが、配列番号７２の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１０． 結合領域が単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１１． 結合領域が、配列番号１０６の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１２． 志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合領域とを連結する結合ドメインリンカーを含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１３． 結合ドメインリンカーが、配列番号７３の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態１２に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１４． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、結合領域とを含む、実施形態１２～１３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１５． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ＶＨと、ＶＬとを含む、実施形態１２～１３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１６． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ＶＨと、ｓｃＦｖリンカーと、ＶＬとを含む、実施形態１２～１３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１７． 志賀毒素Ａサブユニットに対して異種であるＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１８． ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが、配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号７８）、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態１７に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
１９． ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが、切断性スペーサーを介して結合領域と連結されている、実施形態１７～１８のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２０． 切断性スペーサーが、配列ＨＨＡＡ（配列番号２６５）を有する、実施形態１９に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２１． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、結合領域と、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２２． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ＶＨと、ｓｃＦｖリンカーと、ＶＬと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２３． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、結合領域と、切断性スペーサーと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む、実施形態１９～２０のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２４． 配列番号１２８の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２５． 単一の連続ポリペプチドである、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２６． ２つのポリペプチドを含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２７． ２つのポリペプチドの各々が、配列番号１２８の配列を含む、実施形態２６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２８． ２つのポリペプチドが、互いと非共有結合的に連結されている、実施形態２６～２７のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
２９． ２つのポリペプチドが、結合領域を介して、互いと非共有結合的に連結されている、実施形態２６～２７のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
３０． 結合分子が細胞毒性である、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
３１． 結合分子が非細胞毒性である、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
３２． 実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
３３． 実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするポリヌクレオチド、又はその相補体。
３４． 実施形態３３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
３５． 実施形態３３に記載のポリヌクレオチド又は実施形態３４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
３６． 実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を製造するための方法であって、（ａ）実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を発現させるステップ、及び（ｂ）ＰＤ－Ｌ１結合分子を回収するステップを含む方法。
３７． ＰＤ－Ｌ１結合分子を発現させるステップが、実施形態３５に記載の宿主細胞を、ＰＤ－Ｌ１結合分子が発現される条件下で培養することを含む、実施形態３６に記載の方法。
３８． ＰＤ－Ｌ１結合分子と、少なくとも１つの他の生体分子とを含む発現系組成物から、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を精製するための方法であって、（ｉ）発現系組成物を細菌プロテインＬと接触させて、ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を創出するステップ、及び（ii）ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を回収するステップを含む方法。
３９． 発現系組成物が細胞溶解物である、実施形態３８に記載の方法。
４０． プロテインＬが、Ｆ．マグナ種から単離されているか、又はそれに由来する、実施形態３８～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１． プロテインＬが、樹脂にコンジュゲートされている、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２． ＰＤ－Ｌ１発現細胞を殺滅する方法であって、細胞を、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は実施形態３２に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
４３． 対象における疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は実施形態３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
４４． 疾患、障害、又は状態が、免疫障害又は微生物感染である、実施形態４３に記載の方法。
４５． がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は実施形態３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
４６． がんが、高い変異量及び／又は高いインデル頻度により特徴付けられる、実施形態４５に記載の方法。
４７． がんが固形腫瘍である、実施形態４５～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８． がんが、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、卵管がん、消化器がん、神経膠腫、頭頸部がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、メルケル細胞癌、中皮腫、骨髄腫、鼻咽頭新生物、卵巣がん、膵臓がん、腹膜新生物、前立腺がん、皮膚がん、移行上皮癌、又は尿路上皮がんである、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９． がんが膀胱がんであり、膀胱がんが尿路上皮癌である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５０． がんが乳がんであり、乳がんが、ＨＥＲ２陽性乳がん又はトリプルネガティブ乳がんである、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５１． がんが結腸がんであり、結腸がんが結腸直腸がんである、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５２． がんが消化器がんであり、消化器がんが、胃がん、胆道新生物、又は食道胃接合部がんである、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５３． がんが神経膠腫であり、神経膠腫が神経膠芽腫である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５４． がんが頭頸部がんであり、頭頸部がんが頭頸部扁平上皮癌である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５５． がんが腎臓がんであり、腎臓がんが腎細胞癌である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５６． がんが肝がんであり、肝がんが肝細胞癌である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５７． がんが肺がんであり、肺がんが、非小細胞肺がん又は小細胞肺がんである、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５８． がんがリンパ腫であり、リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、又はびまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
５９． がんが中皮腫であり、中皮癌が胸膜中皮腫である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
６０． がんが骨髄腫であり、骨髄腫が多発性骨髄腫である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
６１． がんが皮膚がんであり、皮膚がんが、皮膚扁平上皮がん又は黒色腫である、実施形態４５～４７のいずれか１つに記載の方法。
６２． がんが、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ及びセミプリマブのうちの少なくとも１つを伴う治療から再発した、又はそれに不応性である、実施形態４５～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３． がんが転移性である、実施形態４５～６２のいずれか１つに記載の方法。
６４． 配列番号４１と少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含む志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと；ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分と特異的に結合することが可能な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって；（ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＹＴＭＨ（配列番号２７）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＧＩＮＰＮＮＧＧＴＷＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＰＹＹＹＧＳＲＥＤＹＦＤＹ（配列番号３２）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ１、（ii）アミノ酸配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ２、及び（iii）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２６）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と；３～１２アミノ酸長である、ＶＨとＶＬとの間のｓｃＦｖリンカーを含むｓｃＦｖと；ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む細胞毒性ＰＤ－Ｌ１結合分子。
６５． ＶＨが、配列番号３４の配列、又はこれと少なくとも９０％同一な配列を含む、実施形態６４に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
６６． ＶＬが、配列番号３５の配列、又はこれと少なくとも９０％同一な配列を含む、実施形態６４又は６５に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
６７． ＶＨが、配列番号３４の配列を含み、ＶＬが、配列番号３５の配列を含む、実施形態６４に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
６８． ｓｃＦｖリンカーが、配列番号７２の配列、又はこれと少なくとも９０％同一な配列を含む、実施形態６４～６７のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
６９． ｓｃＦｖが、配列番号１０６の配列、又はこれと少なくとも９０％同一な配列を含む、実施形態６４～６８のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７０． 志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ｓｃＦｖとを連結する結合ドメインリンカーを含む、実施形態６４～６９のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７１． 結合ドメインリンカーが、配列番号７３の配列、又はこれと少なくとも９０％同一な配列を含む、実施形態７０に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７２． ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが、配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号７８）を含む、実施形態６４～７１のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７３． ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが、スペーサーを介してｓｃＦｖと連結されている、実施形態６４～７２のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７４． スペーサーが、配列ＨＨＡＡ（配列番号２６５）を有する、実施形態７３に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７５． 配列番号１２８の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、実施形態６４～７４のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７６． 単一の連続ポリペプチドである、実施形態６４～７５のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７７． Ｎ末端から、Ｃ末端への順序で、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ｓｃＦｖと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む単一の連続ポリペプチドである、実施形態７６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７８． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ｓｃＦｖと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む単一の連続ポリペプチドである、実施形態７６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
７９． Ｎ末端から、Ｃ末端の順序で、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ＶＨと、ｓｃＦｖリンカーと、ＶＬと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む単一の連続ポリペプチドである、実施形態７６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８０． Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ｓｃＦｖと、スペーサーと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む単一の連続ポリペプチドである、実施形態７６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８１． ２つのポリペプチドを含む、実施形態６４～７５のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８２． ２つのポリペプチドが、互いと非共有結合的に連結されている、実施形態８１に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８３． ２つのポリペプチドが、結合領域を介して互いと非共有結合的に連結されている、実施形態８１又は８２に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８４． ２つのポリペプチドの各々が、Ｎ末端から、Ｃ末端への順序で、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ｓｃＦｖと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む、実施形態８１～８３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８５． ２つのポリペプチドの各々が、Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ｓｃＦｖと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む、実施形態８１～８３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８６． ２つのポリペプチドの各々が、Ｎ末端から、Ｃ末端への順序で、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ＶＨと、ｓｃＦｖリンカーと、ＶＬと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む、実施形態８１～８３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８７． ２つのポリペプチドの各々が、Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合ドメインリンカーと、ｓｃＦｖと、スペーサーと、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとを含む、実施形態８１～８３のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８８． ２つのポリペプチドの各々が、配列番号１２８の配列を含む、実施形態８１～８７のいずれか１つに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
８９． 配列番号１２８の配列を含むタンパク質。
９０． 配列番号１２８の配列からなるタンパク質。
［実施例］
以下の例は、本発明のある特定の実施形態を裏付ける。しかし、これらの例は、例示だけを目的とするものであり、本発明の条件及び範囲について、完全に規定的であることを意図するものでも、そのように見なされるべきでもないことが理解されるものとする。以下の例における実験は、そうでないことが記載される場合を除き、当業者に周知であり、規定である、標準的技法を使用して実行された。
以下の例は、複数の例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子について記載する。下記の例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子は各々、細胞をターゲティングするＰＤ－Ｌ１結合領域と、直接的に、又は間接的に連結された、少なくとも１つの毒素を含む（例えば、図１を参照されたい）。下記で記載される、例示的な、細胞毒性である、結合分子は、ターゲティングされる、腫瘍細胞型により発現された、細胞表面の、ＰＤ－Ｌ１分子に結合し、これらの標的細胞に侵入した。実施例において示される、内在化したＰＤ－Ｌ１結合分子のうちのいくつかは、標的細胞の細胞質コンパートメントに効果的に移行した毒素構成要素を有しており、そこで、毒素は、リボソームを不活化させ、その後、標的細胞のアポトーシス性死滅を引き起こした。いくつかの例示的な結合分子は、免疫原性のＴ細胞エピトープペプチドを、腫瘍標的細胞の細胞内ＭＨＣクラスＩ経路に効果的に送達し、細胞表面提示、細胞間Ｔ細胞エンゲージメント、並びにサイトカイン分泌及び／又は標的細胞殺滅を含む免疫応答を結果としてもたらすことができた。
実施例における例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子に使用したタンパク質毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書で「不活化」と指し示されない限り、触媒活性及び／又は細胞毒性活性を保持しながら脱免疫化された。いくつかの例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子は、（１）脱免疫化される；（２）結合分子のポリペプチド構成要素のアミノ末端上若しくはその近位に位置する；（３）本明細書で記載されるように、フーリンによる切断に抵抗性である；及び／又は（４）埋め込まれるか、若しくは挿入されたＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む、少なくとも１つの志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素を含む。
［実施例１］
ＰＤ－Ｌ１結合ドメインの発見
ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、Abeome Corporation社（Bogart、Georgia、U.S.A.）によって同定されたか、又はAbeome Corporation社によって同定されたＰＤ－Ｌ１結合性タンパク質に由来した（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２２９７１号を参照されたい）。ＰＤ－Ｌ１結合性タンパク質は、アフィニティー成熟した抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を発現するトランスジェニックマウスＢ細胞をＰＤ－Ｌ１結合アフィニティーについてスクリーニングするAbeome Corporation社の方法に関する文献に記載されている方法を使用して同定された。ある特定の抗ＰＤ－Ｌ１抗体候補は、任意で、マウス／ヒトキメラ配列を作製する組換え法を使用してヒト化し、結果としてもたらされたキメラ抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を、ＰＤ－Ｌ１結合アフィニティーとＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合の阻害の両方についてスクリーニングした。ある特定の分子については、推定の翻訳後修飾部位と同定される、及び／又は製造時に不都合となりうるアミノ酸残基、例えば非標準又は不対のシステイン残基及びＮ－グリコシル化部位を、変化させたか、又は除去した。より大きなＰＤ－Ｌ１結合アフィニティーが所望された場合には、Abeome Corporation社の独占権下にある方法を使用して、相補性決定領域（ＣＤＲ）の突然変異誘発を行った。
組換えＰＤ－Ｌ１細胞外ドメイン（ヒトＰＤ－Ｌ１の最初の２３９アミノ酸を含む）を免疫原として使用したプライム／ブーストスケジュールでの皮下投与により免疫化されたトランスジェニックAbeoMice（商標）から、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を発現するトランスジェニックマウスＢ細胞を得た。リンパ系組織試料及び骨髄を採取してプールし、細胞表面上でモノクローナル抗体（ｍＡｂ；monoclonal antibody）を発現するＢ細胞を分取し、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合についてスクリーニングした。ある特定のＢ細胞クローンのモノクローナル抗体の可変領域を同定し、キメラｍＡｂとしてクローニングした。候補ｍＡｂを、ＰＤ－Ｌ１結合、並びにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用及び／又はＰＤ－１シグナル伝達軸を破壊する能力について特徴付けた。
［実施例２］
志賀毒素Ａサブユニット構成要素を含むＰＤ－Ｌ１結合分子
Ｉ．ＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素の構築及び試験
志賀毒素構成要素と、実施例１の候補ｍＡｂ免疫グロブリンドメインとを含むＰＤ－Ｌ１結合分子を、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットに既に記載されているように、設計し、発現させ、精製した。これらの実施例に記載されるＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素の毒素構成要素には、志賀毒素Ａ１断片への多様な変異を利用した。例えば、実施例２の例示的なＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素において使用した志賀毒素Ａ１断片は全て、脱免疫化した（本明細書では「ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１」と称される）。例示的なＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素は、実施例１で同定されたＰＤ－Ｌ１結合ドメインの可変領域に由来する例示的な抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖと、「ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１」の１つ又は２つ以上のバリアントとを各々が含む、融合タンパク質として構築した。これらのＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素は、本明細書では「ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質」と称される。１１６２９７のタンパク質調製物は、単量体（すなわち、配列番号１２８を含むタンパク質の単量体）、ホモ二量体（すなわち、配列番号１２８の配列を各々が含む２つのタンパク質の二量体）、及び二量体よりもサイズの大きいホモ多量体（すなわち、配列番号１２８の配列を各々が含む３つ又は４つ以上のタンパク質の多量体）の混合物を含み、ホモ二量体が大部分を占める。１１５７４９の調製物は、主に単量体（すなわち、配列番号１１３を含むタンパク質の単量体）を含む。
例示的な抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含むＰＤ－Ｌ１ターゲティング免疫毒素（ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質）を、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットにおいて、ＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質への結合について試験した。簡潔に述べると、Nunc Maxisorp（登録商標）プレートを、ヒト又はカニクイザルの組換えＰＤ－Ｌ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ；extracellular domain）タンパク質でコーティングし、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキングして、非特異的なバックグラウンドノイズを低減させた。ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質をＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質と共にインキュベートし、試料を洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；horseradish peroxidase）とコンジュゲートさせた抗ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１ ｍＡｂを使用して、ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質レベルを検出した。TMB-Ultra（３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）とのインキュベーション、及びその後の塩酸による中和の後、ＥＬＩＳＡシグナルを検出した。プレートリーダーを使用して４５０ナノメートル（ｎｍ）における吸光度値（Ａｂｓ；absorbance）を読み取り、緩衝液だけの対照からのバックグラウンドＥＬＩＳＡシグナルを減算した。非線形曲線回帰分析（Prism（GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.A.、Prismソフトウェア関数である、sigmoidal 4PL）を使用して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、ｌｏｇ変換されたＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質濃度の関数としてプロットして、Ｂｍａｘ及びＫＤを決定した。これらの結合実験のいくつかの結果を、表７、並びに図２、３、１５、及び３４に示す。表７は、ナノグラム毎ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）単位で測定された解離定数（ＫＤ）、及びＭＦＩ単位で測定されたＢｍａｘを示す。
ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）を、異なる種のＰＤ－Ｌ１への結合について試験したところ、図２に示されるように、ヒト及びカニクイザルのＰＤ－Ｌ１には結合するが、マウスのＰＤ－Ｌ１には結合しないことが決定された。ヒト、マカク、及びマウスのＰＤ－Ｌ１に結合することが知られているアテゾリズマブに存在する免疫グロブリン結合ドメインを含む、ＰＤ－Ｌ１をターゲティングする、対照ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質（１１４９６４）を、陽性対照として使用した。
このアッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）はいずれも、ヒトＰＤ－Ｌ１及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合したが、マウスＰＤ－Ｌ１には結合しなかった（図２；表７）。
軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの間のｓｃＦｖドメイン間リンカーだけが異なる、近縁のＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質を、同様のアッセイで試験して、それらのＰＤ－Ｌ１への結合アフィニティーを特徴付けた。この実験では、ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質の系列希釈液を、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質への結合について試験した。これらの結合実験のいくつかの結果を、表７、並びに図３、１５、及び３４に示す。
ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１６２９７（配列番号１２８）はいずれも、組換えのヒトＰＤ－Ｌ１及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合した（表７；図３、１５、及び３４）。
Figure 2022548078000010
ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）、１１６１８８（配列番号１２６）、及び１１６２９７（配列番号１２８）は、各々、ヒトとカニクイザルの両方のＰＤ－Ｌ１タンパク質に、同様の結合特徴で結合した（図３、１３、１５、１７Ａ～１７Ｂ、及び３４）。表７並びに図３及び１５に示される結果は、１１５７４９（配列番号１１３）と１１６２９７（配列番号１２８）の両方が、ヒト及びカニクイザルのＰＤ－Ｌ１に、同様のアフィニティー及びＢｍａｘ値で結合することを裏付ける。加えて、図３の結果は、１１６２９７（配列番号１２８）の関連するバリアントである１１６１８８（配列番号１２６）が、ＰＤ－Ｌ１への同様の結合特徴を裏付けたことを示す。同じアッセイを使用した別の実験において、ＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に対する１１５７４９（配列番号１１３）のアフィニティーは、同じＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に対する１１５９６１（配列番号１２３）のアフィニティーと同等であることが示された。
例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）は、ヒト及びカニクイザルの組換えタンパク質に同様のアフィニティーで結合した（図３、１３、１５、１７Ａ～１７Ｂ、及び３４）；しかし、１１６２９７（配列番号１２８）は、齧歯動物ＰＤ－Ｌ１には結合しなかった（図１７Ａ～１７Ｂ）。
ＰＤ－Ｌ１発現ＨＣＣ１９５４細胞への１１５７４９（配列番号１１３）の結合を、フローサイトメトリーによって測定した。以下のように結合アッセイを実施する前に、細胞をＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）で１日間処置した。融合タンパク質１１５７４９（配列番号１１３）を細胞に添加し、試料を氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣとコンジュゲートさせた抗ＤＩ ＳＬＴ－Ａ１ ｍＡｂを使用して、ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質を検出した。図４は、このアッセイの結果を示す。ＰＤ－Ｌ１結合分子１１５７４９（配列番号１１３）は、ＰＤ－Ｌ１発現ＨＣＣ１９５４細胞への用量依存的結合を呈した（図４）。
とりわけ、ＰＤ－Ｌ１発現細胞結合アッセイにおいて、１１６２９７、１１５７４９、１１５６９５、及び１１６５５５の結合アフィニティーは同等である（例えば、図１５を参照されたい）。ＰＤ－Ｌ１陽性細胞殺滅アッセイにおいて、１１６２９７及び１１５７６５のＣＤ５０値は同等である（例えば、図１４を参照されたい）。
II．毒素の酵素活性及び免疫毒素の細胞毒性の決定
例示的なＰＤ－Ｌ１結合領域を含むＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質は、ＤＩ ＳＬＴ－Ａ１志賀毒素エフェクターポリペプチド単独と同様のリボソーム不活化活性を有することが裏付けられた。リボソーム阻害アッセイは、TNT（登録商標）Quick Coupled Transcription/Translationキット（L1170、Promega社、Madison、WI、U.S.A.）を使用する、無細胞の、インビトロにおける、タンパク質翻訳アッセイを使用した。キットは、Luciferase T7 Control DNA（L4821、Promega社、Madison、WI、U.S.A.）及びTNT（登録商標）Quick Master Mixを含む。リボソーム活性反応物を、製造元の使用説明書に従い調製した。希釈液の系列（典型的に、１０倍）を、適切な緩衝液中で調製し、各希釈液にわたり、同一のTNT反応混合物成分の系列を創出した。タンパク質試料を、Luciferase T7 Control DNAと共に、TNT反応混合物の各々と組み合わせた。被検試料を、３０℃で、１．５時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、Luciferase Assay Reagent（E1483、Promega社、Madison、WI、U.S.A.）を、全ての被検試料に添加し、ルシフェラーゼタンパク質の翻訳量を、製造元の使用説明書に従い、発光により測定した。翻訳の阻害レベルは、ｌｏｇ変換された全タンパク質濃度、対、相対発光単位の非線形回帰分析により決定した。統計学的ソフトウェア（GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.A.）を使用して、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値は、「用量－応答－阻害（dose-response-inhibition）」という標題下の、応答（３パラメータ）対ｌｏｇ（阻害剤）についての、Prismソフトウェアの関数[Y=最低値+((最高値-最低値)/(1+10^(X-LogIC50)))]を使用して、各試料について計算した。このリボソーム阻害アッセイのいくつかの結果を、表８、図５、図１３～１４、及び図３３に示す。
Figure 2022548078000011
例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５９６１（配列番号１２３）は、いかなるターゲティング剤又は結合領域ともカップリングされていない、陽性「対照」分子である、志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＤＩ－ＳＬＴＡ）単独（すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）と同等な、リボソーム阻害活性を呈したが、ただし、１１５９６１（配列番号１２３）は、力価がわずかに低かった（図５；表８）。１１５７４９（配列番号１１３）は、例えば、ＤＩ－ＳＬＴＡ単独（すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）のレベルにおけるような、強力にタンパク質合成を阻害する志賀毒素の機能を保持した（表８；図５）。
図１３、１４、及び３３はまた、１１６２９７（配列番号１２８）のリボソーム阻害アッセイの結果を報告する。例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）は、１１５７４９（配列番号１１３）のリボソーム阻害活性レベル（ＩＣ５０ ０．２５ｎｇ／ｍＬ）と同等の、リボソーム阻害活性レベル（ＩＣ５０ ０．３６ｎｇ／ｍＬ）を呈した（表８を参照されたい）。１１６２９７（配列番号１２８）は、１１５７４９（配列番号１１３）、及び、いかなるターゲティング剤又は結合領域ともカップリングされていない、陽性「対照」分子である、志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＤＩ－ＳＬＴＡ）単独（すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）と同等な、リボソーム阻害活性を呈した（図１４及び３３）。
例示的なｓｃＦｖ及び他のＰＤ－Ｌ１ターゲティング型結合ドメインを含むＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質を、細胞表面上でＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に対する特異的な細胞毒性について試験した。簡潔に述べると、細胞を播種し、次いで、ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質の系列希釈液と共にインキュベートし、３～５日間インキュベートし、次いで、CellTiter-Gloを用いて生存率のリードアウトを得た。相対発光値（ＲＬＵ）を測定し、細胞のみの対照ウェルに照らして正規化した。GraphPad Prismにおいて、生存率を、ｌｏｇ変換された濃度の関数としてプロットし、ＣＤ５０を、非線形回帰（応答（３パラメータ）対ｌｏｇ（阻害剤））によって計算した。最も高い被験試料濃度で細胞の５０％を殺滅しなかった試料について、ＣＤ５０値が、被験濃度にわたる曲線の形状に基づいて計算できなかった場合には、最大ＣＤ５０値は、最大被験値を超える、例えば、２０，０００ｎｇ／ｍＬより大きい（「２０，０００ｎｇ／ｍＬを超える」）ものとした。ヒト、カニクイザル、又はマウスのＰＤ－Ｌ１を発現させるようトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞株を、細胞生存率の読み取り（Cell Titer Glo、Promega社、Madison、WI、U.S.A.）の前に、１１５７４９（配列番号１１３）又は１１５７５０（配列番号１１４）（系列希釈液中）と共に４日間インキュベートした。この細胞毒性実験のいくつかの結果を、表９及び図６Ａ～６Ｂに示す。
Figure 2022548078000012
図６Ａは、ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７４９（配列番号１１３）を示し、図６Ｂは、ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７５０（配列番号１１４）が、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を殺滅したが、マウスＰＤ－Ｌ１を発現する細胞は殺滅しなかったことを示す。表９及び図６Ａ～６Ｂに示される結果は、１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）の細胞毒性の特異性が、ヒト由来及びカニクイザル由来のＰＤ－Ｌ１の存在と相関するが、マウス由来のＰＤ－Ｌ１の存在とは相関しないことを裏付けた。
上記で記載したインビトロ細胞生存率アッセイを使用したところ、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）は、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を殺滅したが、マウスＰＤ－Ｌ１を発現する細胞は殺滅しなかった（図１７Ａ～１７Ｂ）。
上記で記載したアッセイを使用した細胞生存率の読み取り（Cell Titer Glo、Promega社、Madison、WI、U.S.A.）の前に、ヒト不死化がん細胞を、１１５７４９（配列番号１１３）若しくは１１５７５０（配列番号１１４）又はＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ志賀毒素エフェクターポリペプチド（系列希釈液中）と共に５日間インキュベートした（この期間中、全ての試料で培地を１回換えた）。別個のフローサイトメトリー実験において、これらの細胞株を、細胞表面上のＰＤ－Ｌ１発現についてプロファイリングした。これらの細胞株を伴う実験は、互いの１週間以内に行った。この細胞毒性実験のいくつかの結果を、表１０及び図７に示す。
Figure 2022548078000013
表１０及び図７に示される結果は、１１５７４９（配列番号１１３）が、ＰＤ－Ｌ１を発現するヒトがん細胞株に対し、ある濃度範囲にわたって細胞毒性である一方で、非ターゲティング型のＤＩ ＳＬＴ－１Ａ単独（「ＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ単独」、すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）は、被験濃度において比較的低い細胞毒性を呈した（ＤＩ ＳＬＴ－１Ａは、高濃度においてのみ、かつ、ある特定の細胞株に対してのみ、細胞毒性であった）ことを裏付ける。図１６は、１１６２９７（配列番号１２８）が、１１５７４９（配列番号１１３）より大きな細胞毒性を呈しうることを示す。
関連するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質について、本質的に上記で記載したように、さらなる細胞生存率実験を行った。代表的なＰＤ－Ｌ１陽性細胞株である、ＨＣＣ－１９５４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１についての、これらの実験のいくつかの結果を、表１１及び図８に示す。これらの細胞毒性実験において試験したＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質は、それらの免疫グロブリン型結合ドメインの可変領域において同じ又は同様のＣＤＲ配列を有する。
Figure 2022548078000014
ＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１５７４４（配列番号１０８）、１１５７４５（配列番号１０９）、１１５７４７（配列番号１１１）、１１５７４８（配列番号１１２）、１１５７４９（配列番号１１３）、１１５７５０（配列番号１１４）、１１５７５１（配列番号１１５）、１１５７５２（配列番号１１６）、１１５７５３（配列番号１１７）、１１５７５４（配列番号１１８）、１１５７５５（配列番号１１９）、１１５７５６（配列番号１２０）、及び１１５７５７（配列番号１２１）は、２つの異なるＰＤ－Ｌ１発現細胞型、すなわち、ＨＣＣ－１９５４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対して細胞毒性を呈した（表１１；図８）。
関連するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質について、同様のフォーマットで、さらなる細胞生存率実験を行った。これらの実験において試験したＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質は、それらの免疫グロブリン型結合ドメインの可変領域において同じ又は同様のＣＤＲ配列を有する。代表的なＰＤ－Ｌ１陽性細胞株である、ＨＣＣ－１９５４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１についての、これらの実験のいくつかの結果を、表１２及び図９に示す。表１２において使用される、「ＤＩ－ＳＬＴＡ－１Ａ単独」とは、配列番号４１を含むポリペプチドを指す。
Figure 2022548078000015
ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）及び１１６２９９（配列番号１２９）は、４つの異なるＰＤ－Ｌ１発現細胞型、すなわち、ＨＣＣ １９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ ８２７、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対して細胞毒性を呈した（図９；表１２）。表１０～１２及び図７～９で特徴付けられたＰＤ－Ｌ１結合分子は、細胞毒性Ｔ細胞の非存在下で、約１～４８０ｎｇ／ｍＬのＣＤ５０値を呈した。理論に束縛されるものではないが、これらの結果は、ある特定のＰＤ－Ｌ１結合分子が、インビボで、「非炎症型（cold）」腫瘍細胞、又は「非炎症性（non-inflamed）」と特徴付けられる腫瘍、若しくは免疫監視から除外される腫瘍、例えば「免疫除外性腫瘍」における腫瘍細胞に対して、細胞毒性であることを示唆する。例えば、いくつかのＰＤ－Ｌ１結合分子は、インビボにおいて、腫瘍浸潤リンパ球の非存在下で、かつ腫瘍微小環境の免疫モジュレートのステータスに関わらず、腫瘍細胞に対して細胞毒性でありうる。理論に束縛されるものではないが、いくつかのＰＤ－Ｌ１結合分子は、腫瘍細胞の変異的負荷に関わらず、インビボで腫瘍細胞に対して細胞毒性でありうる。したがって、ターゲティング型細胞殺滅の作用機構（複数可）は、腫瘍の免疫ステータス（例えば、免疫除外性、非炎症性、及び／又は「非炎症型」）に関わらず、インビボで、ターゲティング型の腫瘍細胞の殺滅を可能にする。
上記で記載したアッセイを使用した細胞生存率の読み取り（Cell Titer Glo、Promega社、Madison、WI、U.S.A.）の前に、ヒト不死化がん細胞を、１１６２９７（配列番号１２８）、１１５７４９（配列番号１１３）、１１５７６５（配列番号１６１）、又は１１４８９５（配列番号１６３）と共に５日間インキュベートした（この期間中、全ての試料で培地を１回換えた）。この細胞毒性実験の結果を、図４３Ａ～４３Ｂに示す。これらの結果は、１１６２９７（配列番号１２８）が、ＰＤ－Ｌ１を発現するヒトがん細胞株（ＨＣＣ１９５４（図４３Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図４３Ｂ））に対して、ある濃度範囲にわたって細胞毒性であり、かつ、１１５７４９（配列番号１１３）、１１５７６５（配列番号１６１）、及び１１４８９５（配列番号１６３）よりも大きな細胞毒性を呈しうることを裏付ける。
図１８は、臨床的に対象となる様々な腫瘍細胞株についての、細胞表面ＰＤ－Ｌ１発現レベル（図１８Ａ）及び１１６２９７（配列番号１２８）のＣＤ５０値（図１８Ｂ）を報告する。ＰＤ－Ｌ１は、ヒトの肺がん由来、皮膚がん由来、及び乳がん由来の細胞株の細胞を含む、多様なヒト腫瘍細胞の細胞表面上で発現される。１１６２９７（配列番号１２８）は、広い抗腫瘍細胞毒性を呈した。１１６２９７（配列番号１２８）は、ＰＤ－Ｌ１を発現する標的細胞を特異的かつ強力に殺滅する。
図１９、２０Ａ～２０Ｂ、及び２１Ａ～２１Ｂは、ＰＢＭＣ試料の免疫細胞のサブセットにおけるＰＤ－Ｌ１発現レベルが、１１６２９７（配列番号１２８）による処置の細胞毒性力価と関連することを示す。図１９は、ヒトドナーＰＢＭＣ試料が、単球及びリンパ球を含み、単球は、インターフェロンガンマ処置により、ＰＤ－Ｌ１の発現を高めるよう誘導されうることを裏付ける。図２０Ａは、１１６２９７（配列番号１２８）のＰＢＭＣに対する細胞毒性が、より高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現する、ＩＦＮ－γ処置された単球に限定されることを裏付ける。図２０Ａ～２０Ｂ、及び図２１Ａ～２１Ｂは、１１６２９７（配列番号１２８）が、ＰＤ－Ｌ１陰性リンパ球に対する細胞毒性を伴わず、「ＰＤ－Ｌ１高発現」単球に対する選択的な細胞毒性を呈しうることを示す。図２１Ｂは、被験条件下の１１６２９７（配列番号１２８）のＣＤ５０値と対比させた、ＰＤ－Ｌ１発現レベルのプロットを示す。図２１Ａ～２１Ｂは、より高いＰＤ－Ｌ１発現と、１１６２９７（配列番号１２８）の、より大きな細胞毒性力価（すなわち、より低いＣＤ５０値）との間に、一般的相関があることを裏付ける。単球におけるＰＤ－Ｌ１発現は、炎症性サイトカインＩＦＮ－γによって増強される。図２０Ａ～２０Ｂは、１１６２９７（配列番号１２８）が、ＰＤ－Ｌ１陽性ヒト免疫細胞に対して、エクスビボで細胞毒性を呈することを示す。１１６２９７（配列番号１２８）による免疫細胞の直接的な殺滅は、ＰＤ－Ｌ１発現を要求する。１１６２９７（配列番号１２８）は、ＩＦＮ－γの存在下又は非存在下で、ＰＤ－Ｌ１を発現しない、塊状リンパ球集団をターゲティングしない。１１６２９７（配列番号１２８）は、腫瘍環境においてＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞（ＴＣ）と免疫細胞（ＩＣ）の両方を枯渇させるよう設計される。エクスビボにおける、単球によるＰＤ－Ｌ１発現のＩＦＮ－γ誘導は、腫瘍におけるＩＣ上の適応性ＰＤ－Ｌ１発現と符合する（例えば、Kowanetz M et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. 115: E10119-E10126 (2018)を参照されたい）。他のＰＤ－Ｌ１にターゲティングされた薬剤は、腫瘍細胞又は免疫細胞においてＰＤ－Ｌ１陽性の患者における活性を示している（Kowanetz M et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. 115: E10119-E10126 (2018); Tang F, Zheng P, Cell Biosci 8: 34 (2018)）。
III．ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ送達及び免疫応答誘導の試験
標的細胞の表面における抗原の機能的提示について、例示的な分子を試験した。この実施例では、ヒトにおいて免疫原性であることが知られているウイルス性ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドを選択して、ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質と融合させた。この実施例で使用した、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドのNLVPMVATV（配列番号７８）は、このペプチドの、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合し、したがってヒトのＣＴＬ媒介性免疫応答（複数可）を誘起する能力に基づいて選び出した。このウイルス性エピトープペプチドを、小胞体を介した逆行性輸送を介して、細胞質ゾルに細胞内経路決定する能力を内在する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むＰＤ－Ｌ１ターゲティングタンパク質（例えば、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットを参照されたい）に融合させた。
免疫原性ウイルス性エピトープペプチドの機能的提示を試験するために、コインキュベーションアッセイを利用した。標的がん細胞株のＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＲ）（ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ａ０２を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に、蛍光定量のためのIncuCyte（登録商標）NucLight Red Lentivirus試薬（Essen Bioscience社、Ann Arbor、MI、U.S.A.）をトランスフェクトしたもの）を、例示的なＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質か、又は免疫原性ウイルス性ペプチドを有しない関連する対照ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質で処置し、次いで、NLVPMVATV（配列番号７８）のペプチドに特異的なＣＴＬについて強化された（標準的条件で培養した、ＨＬＡ－Ａ０２陽性、ＣＭＶ血清陽性のドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から強化された）リンパ球に曝露した。NLVPMVATV（配列番号７８）のペプチドに特異的なＣＴＬについて強化されたリンパ球は、これ以降、ＣＭＶ－ＣＴＬと称される。
ＣＭＶ－ＣＴＬシグナル伝達の刺激を、上清中のＩＦＮ－γレベル（ＥＬＩＳＡ）によって測定し、エンゲージされたＣＭＶ－ＣＴＬによって方向付けられた特異的な標的細胞の溶解を、標的細胞生存率によって（IncuCyte（登録商標）S3 Live-Cell Analysis System（Essen Bioscience社、Ann Arbor、MI、U.S.A.）での読み取りにおける蛍光によって動態学的に、かつ、エンドポイントのCell Titer-Gloアッセイを用いて）測定した。簡潔に述べると、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＲ）を、２４時間まで、リン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ；phosphate buffered saline）単独（「緩衝液だけ」）又はＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質のいずれかと共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＭＶ－ＣＴＬを含有する培地を、標的細胞と共にコインキュベートした。２４～４８時間後、上清を採取し、ＩＦＮ－γ濃度を、サイトカイン特異的なIFN-γ ELISA Kit（Biolegend, Inc.社、San Diego、CA、U.S.A.)により、製造元の使用説明書に従って測定した。いくつかの実験では、上清の採取後に、接着性標的細胞を洗浄してＰＢＭＣを除去し、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（G7573、Promega Corp.社、Madison、WI、U.S.A.）により、製造元の使用説明書に従って、細胞生存率を評価し、ＲＬＵで測定した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＲ）標的細胞（ウェル１つ当たり３０，０００個の細胞を、ＩＦＮ－γの存在下で、アッセイの２４時間前に播種した）を、２４時間にわたり、（１）異種ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープカーゴ（「抗原送達性」）を有する（例えば１１５７４９（配列番号１１３））か、又は（２）ウイルス性抗原カーゴを欠いている（本明細書では「無抗原」又は「対照結合分子」と称される）（例えば、１１５７４９（配列番号１１３）と近縁である、１１５９６１（配列番号１２３））かのいずれかの、ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質のマッチするペアと共にインキュベートした。ウイルス性抗原カーゴを有する１１５７４９（配列番号１１３）と、ウイルス性抗原カーゴを有しない関連する１１５９６１（配列番号１２３）とのマッチするペアに加えて、試験した別のマッチするペアは、ウイルス性抗原カーゴを有するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質１１５７５０（配列番号１１４）と、いかなるウイルス性抗原カーゴも欠いている、関連するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質１１５９６２（配列番号１２４）とであった。結果を図１０Ａに示す。
細胞を洗浄し、次いで、ＣＭＶ－ＣＴＬの標的細胞に対する比を１：１として、ＣＭＶ－ＣＴＬを添加した。４８時間で、ＩＦＮ－γ分泌のために上清を除去し、培地を置きかえた。未処置の対照と比較した処置細胞の生存率を時間経過にわたってモニタリングし、８０時間後の生存率を示した。この免疫原性実験のいくつかの結果を、表１３、図１０Ａ及び１０Ｂ、並びに図２４Ｂに示す。
Figure 2022548078000016
表１３並びに図１０Ａ及び１０Ｂに示されるデータは、抗原カーゴを保有するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質である１１５７４９（配列番号１１３）及び１１５７５０（配列番号１１４）が、ＣＭＶ－ＣＴＬ細胞を刺激して、サイトカイン（ＩＦＮ－γ）の分泌及び標的細胞の殺滅を駆動することができたこと、そしてこの特性が、いずれも、いかなるウイルス性抗原カーゴも含まない対照のＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質である、１１５９６１（配列番号１２３）及び１１５９６２（配列番号１２４）には存在しなかったことを裏付ける。
同様の免疫原性アッセイを使用して、一方が融合ウイルス性抗原を含み、他方が、いかなるウイルス性抗原カーゴも欠いている対照ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質を含む、さらなるＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質ペアを投与した後、ＩＦＮ－γ分泌の誘導を測定した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＮＲ）標的細胞（ウェル１つ当たり１０，０００個の細胞を、ＩＦＮ－γの存在下で、アッセイの２４時間前に播種した）を、２４時間にわたり、抗原送達能力を有するものと有しないものとのＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質のマッチするペア、例えば、ウイルス性抗原を有しない、関連するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質１１５９６１（配列番号１２３）とペアになった、抗原送達性１１５７４９（配列番号１１３）；及び、抗原カーゴを有しない、関連するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質１１６１８７（配列番号１２５）とペアになった、抗原送達性１１６２９７（配列番号１２８）又は１１６２９９（配列番号１２９）と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、ＣＭＶ－ＣＴＬの標的細胞に対する比を１：１として、ＣＭＶ－ＣＴＬを添加した。４０時間で、ＩＦＮ－γ分泌のために上清の３５％を除去し、培地を置きかえた。未処置の対照と比較した処置細胞の生存率を時間経過にわたってモニタリングした。この免疫原性実験のいくつかの結果を、表１４及び図１１に示す。
Figure 2022548078000017
表１４及び図１１のデータは、ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質である１１５７４９（配列番号１１３）、１１６２９７（配列番号１２８）及び１１６２９９（配列番号１２９）が、ＣＭＶ－ＣＴＬ細胞を刺激して、サイトカイン（ＩＦＮ－γ）の分泌を駆動することができたこと、そしてこの機能が、ウイルス性抗原を含まない対照のＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質である、１１５９６１（配列番号１２３）及び１１６１８７（配列番号１２５）には存在しないことを裏付ける。表１４において使用される、「ＤＩ－ＳＬＴ－１Ａ単独」という用語は、配列番号４１を含むポリペプチドを指す。
共培養実験において、ＰＤ－Ｌ１結合分子に曝露したＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞の存在下のＣＭＶ血清陽性ドナーＰＢＭＣは、自然感染時に生じる、及び／又は内因性記憶Ｔ細胞に相似するようになされる、ＣＴＬの記憶拡大のように、ＣＴＬ集団を拡大することができる。
ＣＴＬベースの細胞毒性アッセイを使用して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ提示の帰結を評価した。このアッセイは、標的細胞及びＴ細胞の組織培養を伴う。３７℃及び５％二酸化炭素の雰囲気を含む標準的条件で細胞をインキュベートして（典型的には４時間、又は１６時間若しくは１７時間以上）、ＰＤ－Ｌ１ターゲティングによる中毒を可能にすることにより、標的細胞を例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子で中毒させた。インキュベーション後、標的細胞を洗浄した。次に、処置した標的細胞にＣＴＬを添加し、インキュベートして、ＣＴＬが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体（ｐＭＨＣ Ｉ）を提示する任意の標的細胞を認識して結合するようにした。次いで、ＣＴＬ媒介性細胞溶解によるエピトープ提示標的細胞の殺滅、及びＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－γ又はインターロイキンなどのサイトカインの放出を含む、当業者に知られる標準的方法を使用して、ｐＭＨＣ Ｉ認識の、ある特定の機能的な帰結について検討した。
共培養細胞殺滅アッセイ：ＰＤ－Ｌ１陽性細胞を、ウェル１つ当たり細胞１０，０００～２０，０００個で９６ウェルプレートに播種し、５，０００ｎｇ／ｍＬの濃度の例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子と共にインキュベートした。２４時間後、ＰＤ－Ｌ１結合分子を洗い流し、次いで、Ｔ細胞又は細胞培養培地だけと共に、細胞を共培養した。蛍光タグを発現するＰＤ－Ｌ１陽性／ＨＬＡ：Ａ２陽性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、IncuCyte（登録商標）アッセイ（Essen BioScience社、Ann Arbor、MI、U.S.A.）における標的として使用した。IncuCyte-S3-Liveセルイメージャー（Essen BioScience社、Ann Arbor、MI、U.S.A.）を使用して、時間経過にわたる細胞生存率を測定し、細胞試料の位相及び蛍光画像を４～６時間ごとに捕捉した。生存率パーセントは、IncuCyte（登録商標）S3ソフトウェアパッケージ（Essen BioScience社、Ann Arbor、MI、U.S.A）による蛍光細胞数によって測定した。生存率データを全蛍光細胞数としてプロットし、０時間に照らして正規化した。
図２２、２３、及び２４Ａ～２４Ｂは、１１６２９７（配列番号１２８）が、ターゲティング型細胞殺滅の少なくとも２つの機構、すなわち、直接的な細胞殺滅、及び抗原特異的ＣＴＬ依存性細胞殺滅を呈することを示す。図２２は、１１６２９７（配列番号１２８）が、抗原特異的ＣＴＬ（共培養）の存在下で、より大きな標的細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＬＡ：Ａ０２陽性））細胞毒性を呈するが、１１６２９６（配列番号１２７）はこれを呈さないことを裏付ける。抗原特異的ＣＴＬの存在下での１１６２９７（配列番号１２８）の細胞毒性効果は、ＣＴＬの非存在下よりも大きい。ＣＴＬの非存在下（赤、白抜きの円）での１１６２９７（配列番号１２８）の細胞毒性効果は、ＣＴＬの存在下（緑色の四角）又は非存在下（緑色、白抜きの円）での１１６２９６（配列番号１２７）の細胞毒性効果と同等である。ＨＬＡ＊Ａ０２＋／ＰＤ－Ｌ１＋標的細胞に対する１１６２９７（配列番号１２８）の細胞毒性効果は、ウイルス性抗原特異的な細胞毒性Ｔ細胞（ＣＭＶ－ＣＴＬ）が存在したときに増大した。対照として、いかなるウイルス性抗原カーゴも欠いている対照ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＣＭＶ－ＣＴＬの存在下で細胞毒性の増大を呈さなかった。図２４は、１１６２９７（配列番号１２８）と腫瘍細胞のインキュベーションが、ＣＴＬの存在下において、用量依存的細胞毒性及びインターフェロンガンマ分泌の誘導を結果としてもたらすことを裏付ける。図２２及び２４Ａ～２４Ｂは、抗原カーゴ送達が、内部化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを介した、直接的な細胞毒性に加えて、第２の細胞毒性作用機構として存在することを示す。
図２３、２５～２７は、腫瘍標的細胞によるＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ：Ａ＊０２の発現が、抗原播種のために要求されるが、十分ではないこと、すなわち、１１６２９７（配列番号１２８）により誘導される、より大きな細胞毒性が、ＣＴＬの存在下で観察されることを裏付ける。これらの結果は、これらの共培養実験において、１１６２９７（配列番号１２８）によって誘導されるＣＴＬ活性化及びＣＴＬ媒介性細胞毒性が、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ：Ａ＊０２の標的細胞発現、並びにＣＴＬ抗原特異性を要求することを示唆する。図２５は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＰＤ－Ｌ１陽性、ＨＬＡ：Ａ＊０２陽性）細胞；Ｌ１２３６（（ＰＤ－Ｌ１陽性、ＨＬＡ：Ａ＊０２陽性）細胞；又はＭＣＦ－７（ＰＤ－Ｌ１陰性、ＨＬＡ：Ａ＊０２陽性）細胞における、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ：Ａ＊０２の表面分子発現を示す。図２６は、抗原特異的ＣＴＬ（「ＣＭＶ－ＣＴＬ」）との共培養下のＨＬＡ：Ａ＊０２及びＰＤ－Ｌ１＋腫瘍細胞への１１６２９７（配列番号１２８）の投与が、インターフェロンガンマ分泌を誘導することを示す。図２７は、抗原特異的ＣＴＬ（「ＣＭＶ－ＣＴＬ」）との共培養下のＨＬＡ：Ａ＊０２及びＰＤ－Ｌ１＋腫瘍細胞への１１６２９７（配列番号１２８）の投与が、ＣＴＬなしの試料中よりも高い細胞毒性を誘導することを示す。図２７は、ＰＤ－Ｌ１陽性標的細胞に対する１１６２９７（配列番号１２８）の細胞毒性力価が、ＣＴＬの存在下で増大することを示す。
これらの実験の結果は、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９６（配列番号１２７）及び１１６２９７（配列番号１２８）が、ヒトドナー細胞毒性Ｔ細胞の非存在下と存在下の両方で、ＰＤ－Ｌ１陽性／ＨＬＡ：Ａ０２陽性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対して細胞毒性であったことを示した（例えば、図９、図１１、図２４Ａを参照されたい）。ドナーＣＴＬの存在下では、１１６２９６（配列番号１２７）の投与と比して、１１６２９７（配列番号１２８）を先に投与したことの結果として、著明に多くのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が殺滅された。
IV．ＰＤ－Ｌ１結合分子によるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達干渉の試験
いかなる理論にも束縛されるものではないが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するＰＤ－Ｌ１ターゲティングＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質の能力は、志賀毒素Ａサブユニット構成要素による細胞への内部化及びリボソーム阻害をおそらく要求する、ＰＤ－Ｌ１発現標的細胞の殺滅において、例示的なＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質のいずれの細胞毒性作用機構にも要求されない。しかし、ある特定の抗体では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達軸を遮断する能力は、それらの治療利益のために重要であると考えられる（Ribas A, Wolchok J, Science 359: 1350-55 (2018)を参照されたい）。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を撹乱するＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質の能力を試験するため、市販の細胞ベースのＰＤ－１シグナル伝達バイオアッセイ（Promega PD-1/PD-L1 Blockage Bioassay、Promega Corp.社、Madison、WI、U.S.A.）を、製造元の使用説明書に従って使用した。このアッセイは、ＰＤ－１阻害の解除によって活性化されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター系に基づく。ＰＤ－Ｌ１を発現する標的細胞（ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞）を、被験タンパク質（例えば、抗体又はＰＤ－Ｌ１結合分子）と共に３０分間インキュベートし、次いで、６時間３７℃で、ＴＣＲの制御下でＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーターを発現する、ＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＰＤ－１エフェクター細胞）と共に共培養した。BioGlo試薬（ルシフェリン）をプレートのウェルに添加し、ルミノメーターを標準的なプロトコールに従って使用して、プレートの発光を読み取った。シグナル（ＲＬＵで測定）の増大は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の妨害を指し示す。この相互作用を遮断することが知られているＰＤ－Ｌ１ターゲティング型モノクローナル抗体である、抗ｈＰＤ－Ｌ１－ｈＩｇＧ１抗体（Ｎ２９８Ａ）（カタログ番号ｈｐｄｌ１－ｍａｂ１２、InvivoGen社、San Diego、CA、U.S.A.）を、対照として試験した。これらのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用実験の結果を、図１２に示す。
ＰＤ－Ｌ１ターゲティング型ＤＩ－ＳＬＴ－Ａ１融合タンパク質である、１１５７４９（配列番号１１３）、１１５７５０（配列番号１１４）、及び１１５９６２（配列番号１２４）は全て、図１２に示されるように、いくつかの濃度において、この相互作用を遮断する能力を示したが、活性は、抗ｈＰＤ－Ｌ１－ｈＩｇＧ１抗体対照よりもはるかに低かった。１１５７４９（配列番号１１３）、１１５７５０（配列番号１１４）、及び１１５９６２（配列番号１２４）の、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の５０％阻害濃度（ＥＣ５０）は、このアッセイでは、２００ｎＭより高かった（図１２を参照されたい）。ある特定の他の実施形態のＰＤ－Ｌ１結合分子は、１～５０ｎＭ以下の５０％阻害濃度でＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する能力を示した。
Ｖ．結合分子及び免疫応答の誘導をインビボで試験するための動物モデル
動物モデルを使用して、新生物性細胞及び／又は免疫系に対する例示的な細胞ターゲティング融合タンパク質のインビボ効果を決定した。
Ａ．マウス研究
細胞表面上にＰＤ－Ｌ１を発現するヒト新生物性細胞であるＣＴＧ－１４４４又はＣＴＧ－０１９２（患者に由来し、マウスでインビボ継代した非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；non-small cell lung cancer）腫瘍細胞）を注射したマウスに投与した後の、細胞ターゲティング融合タンパク質の異種移植腫瘍に対する効果を試験するために、多様なマウス株を使用した。この実験で試験したＮＳＣＬＣ腫瘍細胞は、ＨＬＡ：Ａ０２０１陽性であった。
免疫障害（ヌード）又は免疫不全（ＮＯＧ）のマウス株を異種移植モデルとして使用した。マウスには、まず、ヒトＴ細胞系の養子移入モデルとして、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを認識することが可能なＣＤ８＋ヒト細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を投与した。ヒト腫瘍細胞を免疫不全マウスに投与して、皮下腫瘍又は播種性腫瘍のいずれかを、ヒトＮＳＣＬＣの患者由来の異種移植モデルとして創出した。
１１６２９７（配列番号１２８）の静脈内投与は、２つの異なるマウスモデルにおいて、ヒト患者由来の非小細胞肺がん異種移植に対するインビボ有効性を示した（図２８Ａ～２８Ｃ及び２９Ａ～２９Ｃを参照されたい）。第１の異種移植モデルでは、免疫障害ＮＯＧマウスにおいて、１１６２９７（配列番号１２８）の投与により、腫瘍増殖が低減し、侵襲性の高い形態のＮＳＣＬＣ異種移植に対するエンドポイントの生存期間が延長した（図２８Ｂ）。１１６２９７（配列番号１２８）の投与スケジュールは、研究１日目に６ｍｇ／ｋｇ、並びに研究３日目、５日目、８日目、１０日目、１２日目、２２日目、２４日目、及び２８日目に２ｍｇ／ｋｇであった。１１５７４９（配列番号１１３）と１１６２９７（配列番号１２８）の両方の投与が、生存の利益を結果としてもたらした（図２８Ｃ）。１１６２９７（配列番号１２８）の投与は、媒体対照群の６７％の腫瘍体積を結果としてもたらし、１１５７４９（配列番号１１３）の投与は、媒体対照群の８５％の腫瘍体積を結果としてもたらした（図２８Ｃ）。免疫障害ＮＯＧマウスを使用した第２の異種移植モデルにおいて、１１６２９７（配列番号１２８）の投与は、比較的低いレベルの細胞表面ＰＤ－Ｌ１を発現するＮＳＣＬＣ細胞に由来するＮＳＣＬＣ異種移植に対して、腫瘍退縮を促進し、エンドポイントの生存期間を増大させた（図２９Ａ～２９Ｃ及び３０）。１１６２９７（配列番号１２８）の投与スケジュールは、研究１日目及び１５日目に６ｍｇ／ｋｇ、並びに研究３日目、５日目、８日目、１０日目、１２日目、１７日目、１９日目、２２日目、及び２４日目に２ｍｇ／ｋｇであった。１１６２９７（配列番号１２８）の投与は、媒体対照群の２１％の腫瘍体積を結果としてもたらしたのに対し、１１５７４９（配列番号１１３）の投与は、腫瘍増殖を低減させなかった（図２９Ａ～Ｃ及び図３０）。６０日間の研究の間、１１６２９７（配列番号１２８）の投与は、媒体対照と比較して生存期間を増大させた（図２９Ａ～２９Ｃ及び３０）。
図３０は、異種移植（ＰＤＸ）動物モデルにおいて、１１６２９７（配列番号１２８）が、インビボで、ヒト患者由来腫瘍に対する活性を呈したことを示す。１１６２９７（配列番号１２８）の投与は、ＰＤ－Ｌ１陽性の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者由来異種移植に対する、強力かつ長期の応答を結果としてもたらした。１１６２９７（配列番号１２８）による処置は、このＮＳＣＬＣ ＰＤＸマウスモデル（ＮＯＧマウス）において、全身的退縮及び腫瘍増殖の遅延を結果としてもたらした。
Ｂ．非ヒト霊長動物研究
例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）をカニクイザルに投与し、ある特定の薬力学的効果を観察した。１１６２９７（配列番号１２８）は、ヒトとカニクイザルの両方のＰＤ－Ｌ１をターゲティングし、カニクイザルＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を殺滅するので（図１３、１５、１７Ａ～１７Ｂ、及び３４を参照されたい）、カニクイザルは、忍容性研究及び薬力学的研究のための対象モデルと考えられた。カニクイザルＰＤ－Ｌ１は、ヒトＰＤ－Ｌ１と約９３％の配列相同性を共有する。
１１６２９７（配列番号１２８）の、毎週１回、４週間の静脈内投与は、２匹中１匹の被験動物において、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）（すなわち、Ｉ型サイトカイン）の増大を結果としてもたらした（図３１を参照されたい）。Ｉ型サイトカインレベルの上昇は、１１６２９７（配列番号１２８）の投与の結果としてのＴ細胞活性化の指標である。
図１７Ａは、１１６２９７（配列番号１２８）が、トランスジェニックＣＨＯ－Ｋ１細胞によって発現される、ヒト（Ｈｕ）及びカニクイザル（Ｃｙｎｏ）の両方のＰＤ－Ｌ１に結合することを報告する。１１６２９７（配列番号１２８）は、これらの条件下で、トランスジェニックＣＨＯ－Ｋ１細胞によって発現されるマウスＰＤ－Ｌ１には結合しなかった。結合アッセイでは、対照の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体（「ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ」）であるアテゾリズマブを使用した。同様に、図１７Ｂは、１１６２９７（配列番号１２８）が、ヒト（Ｈｕ）又はカニクイザル（Ｃｙｎｏ）のいずれかのＰＤ－Ｌ１を発現するトランスジェニックＣＨＯ－１細胞に対しては細胞毒性であるが、マウスＰＤ－Ｌ１を発現するものに対しては細胞毒性でないことを示す。
図３１は、１１６２９７（配列番号１２８）の投与が、非ヒト霊長動物の血清中のＩ型サイトカインの増大を結果としてもたらしたことを示す。カニクイザルにおける探査的研究（用量レベルコホート１つ当たりｎ＝２）で、１１６２９７（配列番号１２８）の毎週の静脈内反復投与を、５０μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、及び４５０μｇ／ｋｇの用量で４週間（１日目、８日目、１５日目、及び２２日目の投与）にわたって試験した。この研究は、１１６２９７（配列番号１２８）の投与が、最も高い用量の２つのコホート（１５０μｇ／ｋｇ及び４５０μｇ／ｋｇ）における、２匹中１匹のカニクイザルにおいて、１５日目及び２３日目の血清中のＩ型サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２のレベルを上昇させたことを示した。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１にターゲティングされた薬剤によって駆動される免疫関連事象は、患者の利益に関連している（例えば、Das S, Johnson D, J Immunother Cancer 7: 306 (2019)を参照されたい）。図３１において、μｇは、対象の体重１キログラム当たりに投与されるマイクログラム（μｇ）を指し、ｐｇ／ｍｌは、ピコグラム毎ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ；picograms per milliliter）を指す。
図３２は、例えば、１１６２９７（配列番号１２８）などの、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子の潜在的な作用機構を示す概略図である。１１６２９７（配列番号１２８）は、ＰＤ－Ｌ１陽性の腫瘍細胞及び免疫細胞を枯渇させるよう設計されている。ＰＤ－Ｌ１結合分子は、脱免疫化志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド（ＤＩ ＳＬＴＡ）、抗ＰＤ－Ｌ１単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドカーゴ（例えば、ヒトＣＭＶ－ｐｐ６５由来ペプチド）を含む、連続ポリペプチドを含みうる（図３２を参照されたい）。この潜在的な作用機構は、２つの顕著に異なる作用機構：ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞及び免疫細胞の強力な殺滅、並びに腫瘍免疫表現型の変化を含むという点で、独自である。簡潔に述べると、第１の作用機構は、ＰＤ－Ｌ１発現標的細胞に対して、強力な細胞毒性をターゲティングすることを伴う。まず、ＰＤ－Ｌ１結合分子のｓｃＦｖ断片領域が、細胞表面ＰＤ－Ｌ１に結合する；次いで、志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素が、細胞内への内部化と、ゴルジを介して小胞体へ、そして最終的に細胞質ゾルへの細胞内経路決定とを誘導する；細胞質ゾルに入ったら、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、酵素的かつ不可逆的なリボソーム破壊により、標的細胞を強力に殺滅する。ＰＤ－Ｌ１結合分子が小胞体又は細胞質ゾルに入ったら、抗原性ペプチドカーゴが、ＰＤ－Ｌ１結合分子の残部から切断され、小胞体の内腔への抗原性ペプチドの輸送及び／又はＭＨＣクラスＩ分子による抗原性ペプチドの結合が可能になりうる。これにより、ローディングされていないＭＨＣクラスＩ分子に、抗原性ペプチドカーゴをローディングして、例えば、「エピトープペプチドがローディングされたＭＨＣ－Ｉ」を形成することが可能になる。抗原がローディングされたＭＨＣクラスＩ分子は、次いで、小胞体からゴルジを通って細胞表面に輸送されて、適応免疫系によって認識されるＣＤ＊＋ Ｔ細胞エピトープを提示することができる。細胞表面上に至ると、エピトープがローディングされたＭＨＣクラスＩ分子複合体は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって認識され、例えば、細胞毒性Ｔ細胞エンゲージメント及び抗原提示標的細胞の殺滅をもたらしうる。送達された抗原の腫瘍細胞による提示は、本明細書で記載されるように、「免疫表現型の変化」を結果としてもたらし、抗原播種を結果としてもたらしうる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの送達及び提示を介した、腫瘍標的細胞への内因性細胞毒性Ｔ細胞の再方向付けは、治療対象における腫瘍又は特定の箇所の免疫表現型の変化を表しうる。例えば、クラスＩのＣＭＶのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの送達及び提示は、内因性ＣＭＶ特異的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を腫瘍細胞に再方向付けしうる。図３２において、「ＣＴＬ」とは、ＭＨＣクラスＩによって提示されるＣＭＶウイルス性エピトープペプチド複合体を認識するＴＣＲを発現するＣＭＶ特異的Ｔ細胞を指す。図３２において、「免疫表現型の変化」又は「腫瘍免疫表現型の変化」という語句は、内因性ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を腫瘍に再方向付けするための、ウイルス性ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ（抗原）の送達、すなわち、「抗原播種技術（Antigen seeding technology）」又は単に「ＡＳＴ」の結果を指す。ウイルス性エピトープペプチドカーゴが除去されたＰＤ－Ｌ１結合分子は、標的細胞殺滅をもたらすタンパク質合成の阻害を伴う主要作用機構（ＭＯＡ；mechanism of action）を有し、細胞質ゾルにおいて活性でありうる。この主要作用機構は、対象の免疫機能のステータスから独立している。
この潜在的な作用機構は、腫瘍部位（複数可）又はある特定の腫瘍微小環境における、抑制性及び／又はアネルギー性の細胞の除去を介した、抗腫瘍免疫監視の好ましい改善をもたらす、抑制性免疫細胞を含む、ＰＤ－Ｌ１発現免疫細胞の殺滅も伴いうる。１１６２９７（配列番号１２８）は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍、及びＰＤ－Ｌ１陽性の抑制性（すなわち、免疫抑制性）免疫細胞を枯渇させるよう設計されている。腫瘍細胞（ＴＣ）及び免疫細胞（ＩＣ）のＰＤ－Ｌ１陽性は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）と診断された患者による、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法薬）への持続的な臨床応答と、独立して相関している（Kowanetz M et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. 115: E10119-E10126 (2018)）。１１６２９７（配列番号１２８）の細胞毒性能は、（１）患者の腫瘍負荷を低減させるための、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞の直接的なターゲティング、及び（２）患者の腫瘍微小環境に対する所望されない効果を低減させるための、阻害性免疫細胞のターゲティングの両方のために、治療的に活用されうるであろう。例えば、１１６２９７（配列番号１２８）の細胞毒性能は、腫瘍負荷を低減させるためのＰＤ Ｌ１＋ＴＣの直接的なターゲティング、並びに、腫瘍におけるＰＤ Ｌ１＋ＩＣの枯渇による、阻害性細胞及びそれらがＴＭＥに及ぼす関連する効果の低減の両方のために、活用されうるであろう。
図３３は、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）のリボソーム阻害アッセイの結果を示す。ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）は、いかなるターゲティング剤又は細胞結合領域若しくはドメインともカップリングされていない、陽性「対照」分子である志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＤＩ－ＳＬＴＡ）単独（すなわち、配列番号４１を含むポリペプチド）のものと同等な、リボソーム阻害活性レベルを呈した。したがって、１１６２９７（配列番号１２８）は、その脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素における、ＤＩ－ＳＬＴＡ単独のコンストラクトの触媒ドメインに存在する、タンパク質合成阻害の強力な酵素活性を保持すると考えられる。
図３４は、例示的なＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）のＰＤ－Ｌ１標的結合アッセイの結果を示す。図３４は、このアッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６２９７（配列番号１２８）が、組換えヒトＰＤ－Ｌ１及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１には結合したが、組換えマウスＰＤ－Ｌ１には高アフィニティーの結合を呈さなかったことを示す。
図３５は、ＰＤ－Ｌ１結合分子による処置（複数可）が、例えば、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞及びＰＤ－Ｌ１陽性免疫細胞を直接的に殺滅し、腫瘍免疫表現型の変化を結果としてもたらすことなどにより、抗腫瘍効果をいかに誘導しうるかを示す。１１６２９７（配列番号１２８）は、腫瘍及び抑制性免疫細胞を枯渇させるよう設計された独自の薬剤である。１１６２９７（配列番号１２８）は、ＰＤ－Ｌ１＋標的細胞を特異的かつ直接的に殺滅し、これは、インビトロでは腫瘍細胞について、エクスビボでは免疫細胞について裏付けられた。１１６２９７（配列番号１２８）は、ウイルス性抗原カーゴを送達して、ＭＨＣクラスＩ分子と複合させて、ＨＬＡ＊Ａ０２＋／ＰＤ－Ｌ１＋標的細胞の表面上に提示させることができ、これは、組織部位、腫瘍、及び／又は腫瘍微小環境の免疫表現型の変化をもたらし、これにより、エフェクターＴ細胞による有益な抗腫瘍監視を可能にしうる。１１６２９７（配列番号１２８）は、薬力学的に関連する霊長動物モデルにおいて、ヒトがん患者で予測される力価に関連する用量で忍容される。図３５において、「Ｔｅｆｆ」は、エフェクターＴ細胞を指し、「ウイルス性ＣＴＬ」は、ウイルス性抗原特異的ＣＴＬを指し、「ＳＬＴＡ」は、ＰＤ－Ｌ１結合分子の志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド構成要素を指す。
［実施例４］
１１６２９７は、顕著に異なる作用方式を介して、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞（ＴＣ）をターゲティングして枯渇させる
この例では、１１６２９７を、ＰＤ－Ｌ１発現のレベルが異なる腫瘍細胞に対する細胞毒性について、かつ異なる作用機構を介して試験した。最初に、２９個の代表的な肺、皮膚、乳房、及び卵巣の腫瘍細胞株（ＴＣ）を、免疫組織化学により、表面ＰＤ－Ｌ１発現について査定し、強度を評定した（ＴＣ１＝低発現、ＴＣ２＝中発現、ＴＣ３＝高発現）。代表的な結果を図３７Ｂに示す。
次いで、２９個の細胞株を、フローサイトメトリーによるＰＤ－Ｌ１発現、及び１１６２９７に対する細胞毒性感受性について、インビトロで査定した。ＨＣＣ１９５４（乳がん）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（トリプルネガティブ乳がん）、ＨＣＣ８２７（肺がん）、ＮＣＩ－Ｈ２２５（肺がん）、Ａ５４９（肺がん）、及びＭＣＦ７（乳がん）を含む、多様な例示的細胞株からの結果を、図３７Ａに示す。これらのデータは、１１６２９７が、あるＰＤ－Ｌ１発現レベル範囲にわたる腫瘍細胞株に対して細胞毒性であることを示す。
リボソーム阻害ベースの細胞毒性及びＣＴＬ媒介性細胞毒性を、１１６２９７について検討した。この実験におけるＣＴＬ媒介性細胞毒性は、送達されたＣＭＶ ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドカーゴを細胞表面上で提示する、抗原播種されたＰＤ－Ｌ１／ＨＬＡ＊Ａ０２陽性標的細胞に基づく。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＰＤ－Ｌ１結合分子１１６２９７か、「無Ａｇ」ＰＤ－Ｌ１結合分子対照（１１６２９７に関連しているが、抗原性ペプチドドメインを欠いている分子）か、又はＣＭＶエピトープペプチドを保有する「不活性」ＰＤ－Ｌ１結合分子対照である１１６５５５で処置し、次いで、ＣＭＶ－ＨＬＡ：Ａ０２拘束性Ｔ細胞の存在下又は非存在下で５日間培養して、細胞生存率、及びＩＦＮ－ガンマ分泌を介するＴ細胞活性化を試験した。図３７Ｃに示されるように、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、多様な作用機構、すなわち、リボソーム阻害（「無Ａｇ」ＰＤ－Ｌ１結合分子対照）及び抗原性ペプチド送達（「不活性」ＰＤ－Ｌ１結合分子対照）に従って、細胞を殺滅した。１１６２９７は、両方の作用機構に従って細胞を殺滅した。図３７Ｄに示されるように、１１６２９７は、ＰＤ－Ｌ１／ＨＬＡ＊Ａ０２標的細胞が、ＭＨＣクラスＩ系を介して、送達されたＣＭＶ ＣＤ８＋ Ｔ細胞ペプチドを提示するのに応答して、ＩＦＮ－ガンマを分泌するように、ＣＭＶ特異的ＣＴＬを刺激した。
［実施例５］
１１６２９７は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍をインビボで制御する
この例では、ヒト腫瘍を移植した免疫不全マウスのＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍を制御する能力について、１１６２９７を査定した。１１６２９７による処置は、限定された毒性で、マウスの腫瘍の著明な制御を結果としてもたらした（図３８Ａ～３８Ｂ）。１１６２９７の投与は、ＰＤ－Ｌ１陽性のヒトのトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ；triple negative breast cancer、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図３８Ａ））、又はＰＤ－Ｌ１陽性のヒトの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者由来細胞（図３８Ｂ）を移植したマウスにおいて、腫瘍の増殖を抑制した。加えて、これらのマウス異種移植モデルにおける１１６２９７の活性を、ウイルス性抗原を欠いている（無ＣＭＶペプチド）か、又は志賀毒素触媒活性を欠いている（１１６２９７の触媒的に不活性のバリアントである１１６５５５）かのいずれかの関連分子での処置と比較して、１１６９２７のインビボでの作用機構（複数可）を裏付けた（図３８Ｃ）。モデル及び有効性エンドポイントは、図３８Ｄにまとめてある。これらのデータは、１１６２９７が、関連する腫瘍モデルにおいて、インビボで腫瘍増殖を制御し、活性は、触媒的に活性の志賀毒素構成要素に依存することを指し示す。
［実施例６］
１１６２９７は、エクスビボでプロファイリングされた同様の力価で、腫瘍細胞及び免疫細胞に結合し、ターゲティングする
この例では、Cell Titer-Glo（登録商標）（Promega社）のアッセイ、高ＰＤ－Ｌ１発現（ＨＣＣ１９５４）、中／高ＰＤ－Ｌ１発現（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、及びＰＤ－Ｌ１陰性（ＭＣＦ７）の代表的な細胞を使用して、ＰＤ－Ｌ１発現が異なる腫瘍細胞に対する１１６２９７の細胞毒性を査定した。腫瘍細胞及び免疫細胞サブセットについて、ＰＤ－Ｌ１の細胞表面密度をフローサイトメトリーによって決定して、標的発現、１１６２９７の細胞結合、及び細胞毒性力価の間の関係を査定した。図３９Ｂは、ＣＤ５０値によって表される１１６２９７の細胞毒性力価に対してプロットした、細胞１個当たりの細胞表面ＰＤ－Ｌ１分子の数（円）、又は細胞１個当たりの結合した１１６９２７分子の数（四角）を示す。未処置か、又はＰＤ－Ｌ１発現を誘導するためにＩＦＮ－ガンマで処置したかのいずれかであった、単離されたヒトＣＤ１４陽性単球において、１１６２９７の細胞毒性（ＣＤ５０）も測定した。１６２９７の力価（ＣＤ５０）は、ＰＤ－Ｌ１表面発現、並びにＰＤ－Ｌ１陽性の腫瘍細胞及び免疫細胞への結合と相関した。図３９Ａに示すように、１１６２９７は、ＰＤ－Ｌ１発現レベル依存的な形で、ヒト腫瘍細胞及び免疫細胞サブセットを強力に枯渇させた。
［実施例７］
１１６２９７は、非ヒト霊長動物において、ヒトＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞をターゲティングして枯渇させる
非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）研究を使用して、１１６２９７の薬物動態（ＰＫ；pharmacokinetics）をインビボで決定し、腫瘍細胞及び免疫細胞サブセットについて、最大の細胞殺滅及び受容体占有を推定した。１１６２９７、又はＳＬＴＡ触媒不活性の対照結合分子である１１６５５５（配列番号１６０）を、毎週４用量、５０μｇ／ｋｇ（１１６２９７）又は４５０μｇ／ｋｇ（１１６２９７及び１１６５５５）でＮＨＰに静脈内投与した。
研究の１日目に、１１６２９７又は１１６５５５の投与後２４時間にわたり定期的に血液試料を取った。薬物動態曲線を計算し、図４０Ａに示した。１１６２９７の半減期は、５０μｇ／ｋｇで投与した場合は約２．８時間であり、４５０μｇ／ｋｇで投与した場合は約３．７時間であった。１１６５５５は、４５０μｇ／ｋｇの投与後に約５．６時間の半減期を有することが観察された。
次いで、上記で記載した研究のＮＨＰのＰＫデータから、ヒトにおける血清曝露をシミュレートし、インビトロのＣＤ５０値及びＰＤ－Ｌ１結合データと相関付けて、ＴＣ及びＩＣサブセットについて最大の細胞殺滅及び受容体占有を予測した。結果を図４０Ｂに示す。
［実施例８］
１１６２９７は、非ヒト霊長動物において、顕著に異なるプロファイルの免疫関連有害事象を誘発する
非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）研究をまた使用して、インビボでの免疫関連有害作用（ｉｒＡＥ；immune related adverse effect）を観察し測定した。１１６２９７又は１１６５５５（ＳＬＴＡ触媒不活性の対照結合分子）を、毎週４用量、５０μｇ／ｋｇ（１１６２９７）又は４５０μｇ／ｋｇ（１１６２９７及び１１６５５）でＮＨＰに投与した。この投与レジメンは、図４１Ａに例示されている。
循環中の、末梢単球（図４１Ｂ）及び末梢Ｔリンパ球（図４１Ｃ）を含む免疫細胞サブセットのレベルを、フローサイトメトリーによって査定した。単球試料を８日目に得て、リンパ球試料を１５日目に得た。図４１Ｂに示されるように、１１６２９７による処置は、ＮＨＰにおいて、分子の２回の投与後、ＣＤ１４陽性単球の枯渇を結果としてもたらした。１１６２９７での処置によるＣＤ１４陽性単球の殺滅は、用量依存的であり、かつ、１１６５５５での処置が単球枯渇を結果としてもたらさなかったことから、触媒的に活性の志賀毒素構成要素を要求した。図４１Ｃに示されるように、１１６２９７は、ＮＨＰにおいて、分子の２回の投与後、Ｔリンパ球及びＢリンパ球を拡大させた。これに対し、１１６５５５の投与は、ＮＨＰにおける免疫細胞の枯渇を結果としてもたらさなかった。このＮＨＰ研究は、単球に対する１１６２９７の効果が用量依存的であり、免疫細胞枯渇の効果が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用の遮断によって引き起こされたのではなく、志賀毒素Ａサブユニット構成要素の触媒活性を要求したことを示す。
２つの独立したＮＨＰ研究間で、血清サイトカイン応答を査定した。図４１Ｄでは、これらの研究からの結果が、研究１（ＮＨＰのｎ＝２）及び研究２（ＮＨＰのｎ＝８（１１６２９７）及びｎ＝５（１１６５５５））についての、レスポンダーのパーセントとして表示されている。データは、研究中の３回目の投与後のサイトカインの誘導を反映している。１１６２９７による免疫細胞の枯渇及びリンパ球の活性化は、免疫チェックポイント阻害剤の炎症性サインと関連していた。とりわけ、１１６２９７での処置は、臨床において免疫チェックポイント阻害剤で観察されるＴ細胞の活性化及び応答と関連する、ＮＨＰにおけるサイトカインプロファイルを誘発した。１１６２９７の投与はまた、皮膚炎（皮膚剥落）及び心筋炎を含むｉｒＡＥの発生と関連する免疫活性化プロファイルを結果としてもたらした。
ＮＨＰ研究をまた使用して、インビボでの免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ；immune related adverse event）を観察し測定した。全て合計４用量の毎週投与で、１１６２９７をＮＨＰに５０μｇ／ｋｇ又は４５０μｇ／ｋｇで投与し、４５０μｇ／ｋｇの１１６５５５（触媒的に不活性の対照）の投与と比較した。さらなる研究では、１１５７４９をＮＨＰに１５０、４５０、又は７５０μｇ／ｋｇで投与し、１１５７６５をＮＨＰに２５、１５０、又は４５０μｇ／ｋｇで投与し、１１５６９５をＮＨＰに５０、１５０、又は４５０μｇ／ｋｇで投与し、全ての投与は３日ごとに２週間にわたって行った。
循環中の、末梢単球（図４１Ｂ）及び末梢Ｔリンパ球（図４１Ｃ）を含む免疫細胞サブセットのレベルを、フローサイトメトリーによって査定した。図４１Ｂに示されるように、１１６２９は、ＮＨＰにおいて、分子の２回の投与後に観察されたように、ＣＤ１４＋単球を枯渇させた。細胞殺滅は、用量依存的であり、触媒的に不活化されたバリアントである１１６５５５はこの応答を誘発できなかったことから、触媒的に活性の志賀毒素構成要素を要求した。図４１Ｃに示されるように、１１６２９７の投与は、ＮＨＰにおいて、分子の２回の投与後に観察されたように、Ｔリンパ球集団及びＢリンパ球集団の増大を結果としてもたらしたが、このようなリンパ球集団の増大は、触媒的に不活性の対照ＰＤ－Ｌ１結合分子である１１６５５５をＮＨＰに投与した後には観察されなかった。これらの応答は、１１５７４９、１１５７６５、又は１１５６９５でＮＨＰを処置した場合には観察されなかった（図４４を参照されたい）。
独立したＮＨＰ研究間で、血清サイトカイン応答をまた査定した。図４１Ｄにおいて、データは、研究１（動物２匹の標本サイズ）及び研究２（１１６２９７で試験した動物８匹、及び１１６５５５で試験した動物５匹）についての、レスポンダーのパーセントとして表示されている。データは、研究中の１１６２９７の３回目の投与後の時点におけるサイトカインの誘導を反映している。１１６２９７による免疫細胞の枯渇及びリンパ球の活性化は、免疫チェックポイント阻害剤の炎症性サインと関連していた。とりわけ、１１６２９７での処置は、臨床において免疫チェックポイント阻害剤で観察されるＴ細胞の活性化及び応答と関連する、ＮＨＰにおけるサイトカインプロファイルを誘発した。１１５７４９、１１５７６５、又は１１５６９５のいずれによる処置も、いかなる被験用量においても、ＮＨＰにおけるｉｒＡＥと関連するサイトカイン応答を誘発しなかった（図４４）。
患者における免疫細胞のターゲティングは、臨床利益を示している。例えば、単一の薬剤の投与、又は組合せの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ；immune checkpoint inhibitor）による処置は、好ましい応答と相関する免疫活性化及び免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）をもたらしうる。しかし、このＮＨＰ研究では、ｉｒＡＥ応答は、高用量における組合せのＩＣＩ ｍＡｂによる処置後にのみ観察されたが、単一の薬剤のＩＣＩ ｍＡｂによる処置後には観察されなかった。このデータは、ＮＨＰモデルが、より高い応答閾値を有することを示唆する。
図４２Ａに示されるように、１１６２９７による処置は、免疫活性化を刺激し、かつ、ヒトにおいて承認されたＩＣＩ組合せ療法（又はＮＨＰにおける高用量のＩＣＩ組合せ処置）と符号するが、単一の薬剤のＩＣＩによるＮＨＰ研究とは符合しない薬力学的プロファイル及びｉｒＡＥプロファイルを結果としてもたらした。１１６２９７による処置の免疫関連応答は、用量依存的であり、志賀毒素の触媒活性によって媒介される。被験用量（複数可）での１１６５５５による処置は、免疫活性化又はＰＤ応答をインビボで誘発しなかったので、これらの応答は、ただ単にＰＤ－Ｌ１シグナル伝達阻害及び／又は抗原送達によって媒介されるのではないと思われる。
１１６２９７ベースの療法は、図４２Ｂに示されるデータが示唆するように、単一の薬剤による療法として、ヒトにおいて強力に応答する可能性のある独自の治療手法を表しうるであろう。とりわけ、心筋炎及び皮膚炎は、臨床の場において、組合せの免疫チェックポイント阻害剤で観察された、一般的な免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）であり、有益な治療応答と関連している。心筋炎又は皮膚炎の形態におけるｉｒＡＥは、１１６２９７による処置でも、用量依存的な形で観察され、投与の休止と共に解消した。１１６９２７に関連した有害事象は、分子の比較的短い半減期（およその時間）から利益を得うるであろう（図４０Ａを参照されたい）。１１６２９７により誘導されたｉｒＡＥはＴリンパ球の心臓組織への浸潤と関連し、これは、志賀毒素の触媒活性の非存在下では観察されなかった。１１６５５５による処置は、心筋炎、皮膚炎、又はＴリンパ球の心臓組織への浸潤を誘発しなかったからである。加えて、他のＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１５７６５（配列番号１６１）又は１１５６９５（配列番号１６２）は、これらの応答を誘発しなかった。１１６２９７と同じＩｇの重鎖及び軽鎖の可変ドメイン領域を含むが、異なるｓｃＦｖリンカーを含む、１１５７４９の投与は、心筋炎を誘発することはなかったが、皮膚炎を結果としてもたらした（図４４を参照されたい）。
まとめると、これらのデータは、１１６２９７が、被験ＰＤ－Ｌ１結合分子の中でも独自の特性を持つことを指し示す。１１６２９７は、多様なＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞に対して、最も強力なインビトロ細胞毒性を呈し、１１６２９７による処置は、ＮＳＣＬＣ ＰＤＸインビボモデルにおいて、腫瘍増殖の遅延及び生存の利益を結果としてもたらした（例えば、図２９Ａ～２９Ｃを参照されたい）。１１６２９７は、ＰＤ－Ｌ１陽性免疫細胞を直接的に殺滅した。１１６２９７による処置は、ＮＨＰにおいて、免疫チェックポイント阻害剤で治療された患者における臨床利益と関連するｉｒＡＥプロファイルと同様の、免疫媒介性ｉｒＡＥプロファイルを誘発する。１１６２９７で細胞をターゲティングして枯渇させることは、図４２Ａに示されるように、立体的遮断のみによって活性を媒介する抗体遮断では観察されない、独自の臨床利益をもたらしうる。１１６２９７は、ＮＨＰにおいて、免疫活性化、並びに、チェックポイント阻害剤の組合せとは符合するが単一の薬剤とは符合しない、薬力学的プロファイル及びｉｒＡＥプロファイルを刺激する。
単剤療法のｍＡｂチェックポイント阻害剤を用いるＮＨＰモデルではｉｒＡＥが見られなかったので、１１６２９７での処置によって誘導されたｉｒＡＥ応答は、独自のＰＤ－Ｌ１ターゲティング型単剤療法として患者に利益を与える可能性を示唆する。１１６２９７は、複数の作用機構を用いてＰＤ－Ｌ１をターゲティングするので、承認された投与量で投与される、政府の規制で承認されたＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体で観察されているものよりも、改善された応答をもたらしうるであろう。
［実施例９］
ＰＤ－Ｌ１結合分子の活性の比較
この研究の目的は、１１６２９７及び他のＰＤ－Ｌ１結合分子が標的細胞において抗原特異的Ｔリンパ球（ＡＳＴ；antigen-specific T-lymphocyte）の応答を誘導する能力を、標的細胞が分子に曝露される時間の関数として比較することであった。
共培養細胞生存率アッセイにおいて、顕著に異なる結合ドメインを含むＰＤ－Ｌ１結合分子を互いと比較した。簡潔に述べると、ＰＤ－Ｌ１結合分子を、高密度のＰＤ－Ｌ１陽性及びＨＬＡ：Ａ＊０２陽性の標的細胞と共に、４時間又は２４時間のいずれかにわたってインキュベートした（表１５を参照されたい）。次いで、結合分子を洗い落とした。被験ＰＤ－Ｌ１結合分子は各々、標的細胞に送達するためのペプチド抗原（NLVPMVATV、配列番号７８）を含んだ。その後、結合分子によって送達されるペプチド抗原に拘束された細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、エフェクター細胞の標的細胞に対する比を１：１として、前処置された標的細胞と共培養した。４８時間の共培養後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡによるＣＴＬ活性化のリードアウトとしてのＩＦＮ－γの検出のために使用した。また、IncuCtye S3（Sartorius社）のシステムを使用して、生存率を６０～７２時間で測定し、単層の集密度によって決定した。短期インキュベーション及びウォッシュアウト（４時間）又は標的との長期インキュベーション（２４時間）の後に、直接的な細胞殺滅を促進する、又はＴ細胞活性化（すなわち、ＩＦＮ－γ分泌）を媒介する能力について、ＰＤ－Ｌ１結合分子を比較した。
Figure 2022548078000018
結果を図４５Ａ、４５Ｂに示し、下記の表１６にまとめる。被験ＰＤ－Ｌ１結合分子は、Ｔ細胞依存的な活性化及び細胞殺滅を示した。ＣＴＬの存在下で誘発されるＩＦＮ－γ分泌及び細胞殺滅応答によって測定された、Ｔ細胞活性化の力価は、２４時間の「長期」インキュベーション実験では、４時間の「短期」ＰＤ－Ｌ１結合分子インキュベーション実験と比較して、全体的に増大した（図４５Ａ）。
注目すべきことに、１１６２９７及び１１６５５５（分子の酵素活性を低減させる２つの点変異を志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素内に含有する）は、「短期」刺激の後に、他の被験ＰＤ－Ｌ１結合分子と比較して増大した、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌（約２０ｐｇ／ｍＬ）を誘発し、このＩＦＮ－γ分泌は、「長期」のＰＤ－Ｌ１結合分子への曝露後には、約４０～８０ｐｇ／ｍＬまでさらに増大した。このことは、無関係の結合ドメインから構成された、２つの他のＰＤ－Ｌ１結合分子（１１５７６５及び１１４８９５）では観察されず、これらは、長期曝露後に約２０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌を誘発するに留まり、これは短期曝露後には認められなかった（図４５Ａ）。
さらに、１１６２９７は、４時間のインキュベーション及びウォッシュアウト後に、ＰＤ－Ｌ１発現細胞集団の約４０％のＣＴＬ媒介性細胞殺滅を誘発する能力を示した。この４０％の細胞殺滅レベルは、異なる結合ドメインを含む他の被験ＰＤ－Ｌ１結合分子では観察されなかった。他の被験ＰＤ－Ｌ１結合分子（１１５７６５及び１１５７４９）は、標的細胞集団の少なくとも４０％のＣＴＬ媒介性殺滅を誘導するのに、２４時間の長期曝露を要求した（図４５Ｂ）。
上記で記載したデータは、１１６２９７が、異なるｓｃＦｖ結合ドメイン又はｓｃＦｖリンカーを含む他のＰＤ－Ｌ１結合分子と比較して、より急速かつ強力なＴ細胞活性化を呈することを指し示す。１１６２９７の触媒的に不活性化されたバリアントである１１６５５５について上記で記載したデータは、被験ＰＤ－Ｌ１結合分子が呈する所望の特性が、１１６２９７及び１１６５５５の結合ドメイン構造と相関することを支持する証拠を提供する。１１５７４９（１１６２９７の結合ドメインと同じ重鎖及び軽鎖の可変領域を保持するが、ｓｃＦｖリンカーが異なり、ホモ二量体分子ではなく単量体分子を結果としてもたらす）を使用した実験における、この活性の非存在は、１１６２９７の活性及び力価が、その結合ドメインの構造／機能と、その全体的なホモ二量体構造との組合せに起因しうることを示唆する。
Figure 2022548078000019
１１６２９７及び他の独自のＰＤ－Ｌ１結合分子が免疫細胞を特異的に枯渇させる能力についても試験した。これらの研究の目標は、１１６２９７が、他のＰＤ－Ｌ１結合分子では観察されなかった、非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）における単球枯渇及び免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の発生と相関する活性を呈するかどうかを決定することであった。
ＰＤ－Ｌ１結合分子を、（ｉ）ＰＤ－Ｌ１発現を誘導するためにＩＦＮ－γ（１００ＩＵ／ｍＬ）で処置された初代ヒト単球（ＩＣ）、（ii）高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現するＨＣＣ１９５４腫瘍細胞、又は（iii）ＰＤ－Ｌ１を発現しないＭＣＦ７腫瘍細胞のいずれかと共にインキュベートした（表１７を参照されたい）。最終的なＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度を０．６３１～２０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲（６倍又は８倍の希釈）とした用量系列を使用して、ＰＤ－Ｌ１結合分子を細胞に添加し、研究期間全体にわたって培養下においた。アッセイの５日目に、上記で記載したように、標準的なCell Titer Gloアッセイを使用して、細胞の生存率を査定した。
Figure 2022548078000020
結果を図４６Ａ、４６Ｂに示し、表１８にまとめる。１１６２９７は、４名の個々のドナーに由来する細胞において、生存率を２０μｇ／ｍＬで約６０％、２μｇ／ｍＬで４０％低減させることにより、初代単球の代表的なＩＣ集団の用量依存的枯渇を誘発した。Ｃ末端のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドカーゴを欠くＰＤ－Ｌ１結合分子である、１１４９６３（配列番号２６０）、１１４９６４（配列番号２６１）、及び１１５６９５（配列番号１６２）で、同様の応答が観察された。注目すべきことに、１１６２９７の単量体バリアントであり、１１６２９７と同じ結合ドメイン及び抗原性ペプチドカーゴを含有する１１５７４９を含む、さらなるＰＤ－Ｌ１結合分子だけでなく、異なる結合ドメインを含み、同じペプチド抗原カーゴを含む、さらなるＰＤ－Ｌ１結合分子である１１５７６５及び１１４８９５も、１１６２９７と比較して低減した、単球に対する力価を呈した。
Ｃ末端のペプチド抗原カーゴを欠く１１４９６２（配列番号２５９）は、ＳＬＴＡ－Ｉの酵素力価を大きく弱毒化させる点変異（Ｙ７７Ｓ、Ｅ１６７Ｄ）を有する１１６２９７のアナログである１１６５５５と同様に、細胞枯渇のために単球をターゲティングできなかった。陰性対照のＤＩ－ＳＬＴＡ単独は、アッセイで試験した単球に対する直接的な活性を示さなかった。
異なるＰＤ－Ｌ１結合分子の単球に対する示差的活性とは対照的に、ＰＤ－Ｌ１結合性分子は、ＰＤ－Ｌ１標的を発現するＴＣ株のＨＣＣ１９５４に対して同様の力価、及びＰＤ－Ｌ１陰性対照株ＭＣＦ７に対して同様の活性の欠如を示した。
Figure 2022548078000021
全ての被験ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＴＣ対照株の強力な細胞殺滅（９０％を超える最大応答）を誘発し、１１４９６２、１１５７４９、及び１１４８９５（３５ｎｇ／ｍＬを超える）を例外として、１０ｎｇ／ｍＬ未満の力価を呈した。１１６２９７、１１５６９５、１１４９６４、及び１１５９６３は各々、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞に対して同等の選択的細胞毒性を示した。１１５７６５、１１５７４９、及び１１４８９５は、２０μｇ／ｍＬでは、１１６２９７と比較して低減した活性を示し、より低い２μｇ／ｍＬの濃度では、単球を枯渇させることができなかった（触媒的に不活性の１１６５５５と同様の応答）。
まとめると、これらのデータは、ＰＤ－Ｌ１結合分子が、インビトロにおいて、ＴＣに対しては同様の力価範囲を示すものの、単球などのＩＣサブセットに対する力価は、これらの分子のサブセットにのみ存在することを裏付ける。この分子のサブセットは、１１６２９７、１１５６９５、１１４９６４、及び１１５９６３を含む。注目すべきことに、このサブセット内の１１６２９７のみが、ＳＬＴＡ酵素活性を介した直接的な細胞毒性と、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドの送達及びＣＴＬエンゲージメントを介した間接的な細胞毒性とを送達する能力があるＰＤ－Ｌ１結合分子を表す。さらに、１１６２９７のこうしたインビトロ活性は、ＮＨＰにおける１１６２９７による単球のインビボの枯渇の観察と相関するが、こうした枯渇は、他の被験分子では観察されず、例えば、インビボＮＨＰ研究において、１１５６９５、１１５７４９、又は１１５７６５による処置は、ＩＣ枯渇、免疫関連有害事象の生成、又は免疫刺激活性を結果としてもたらさなかった。
［実施例１０］
ＰＤ－Ｌ１に結合し、志賀毒素Ａサブユニット足場を含むＰＤ－Ｌ１結合分子
この例では、各々が配列番号２７、２９、３０、及び／又は３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか又はこれらから本質的になる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、及び／又は配列番号２６に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む、ＰＤ－Ｌ１標的生体分子の細胞外部分に結合する結合領域を、毒素又はその断片若しくは派生物に融合させる。一部の実施形態では、結合領域を、志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、配列番号１～１８及び４０～６８のうちのいずれか１つなど）に融合させる。志賀毒素エフェクター領域は、任意で、１）脱免疫化、２）プロテアーゼによる切断に対する抵抗性、及び／又は３）埋め込まれるか、若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープのうちの２つ又は３つ以上をもたらすよう、本明細書で記載される亜領域の組合せを含むような、志賀毒素又は志賀様毒素のＡサブユニット（例えば、配列番号１～１８のうちのいずれか１つ）に由来する（例えば、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、国際公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、国際公開第２０１７／０１９６２３号パンフレット、国際公開第２０１８／１０６８９５、及び国際公開第２０１８／１４０４２７号パンフレットのうちのいずれか１つに記載されている志賀毒素エフェクターポリペプチドなど）。
結果としてもたらされる融合タンパク質は、任意に多価であり（例えば、２つ又は３つ以上のＰＤ－Ｌ１結合領域を含む）、単鎖ポリペプチド又は多量体として産生及び精製される。この例の例示的なタンパク質は、当技術分野で公知の技法を使用して、カルボキシ末端のＫＤＥＬ型シグナルモチーフを用いて任意に創出され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープペプチドカーゴ及び／又は検出促進剤（複数可）などの、さらなる外因性素材に任意に連結される。この例の例示的なタンパク質は、適切なＰＤ－Ｌ１分子を発現する細胞を使用して、先の例に記載したように試験される。この例の例示的なＰＤ－Ｌ１ターゲティング融合タンパク質を使用すると、例えば、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を殺滅すること、標的細胞の細胞内区画を標識すること、並びに例えば多様ながん及び腫瘍などの疾患、状態、及び／又は障害を診断し治療することができる。
総括
１１６９２７は、インビトロでのＰＤ－Ｌ１発現細胞に対するその細胞毒性力価に基づいて、複数の被験ＰＤ－Ｌ１結合分子から選択され、加えて、非ヒト霊長動物モデルにおける予測外の活性を示した。ＰＤ－Ｌ１発現細胞への１１６２９７の投与は、異なる免疫グロブリン結合ドメイン（例えば１１５７６５又は１１４８９５）又は異なるｓｃＦｖリンカー（１１５７４９）を有する他のＰＤ－Ｌ１ターゲティング型分子と比較すると、２つのＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍株であるＰＤ－Ｌ１高発現株（＋＋＋）及びＰＤ－Ｌ１中発現株（＋＋）に対して、最も強力な志賀毒素Ａサブユニット触媒活性媒介性細胞毒性力価を結果としてもたらした（図４３Ａ、４３Ｂを参照されたい）。ＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現レベルが低下した際、他のＰＤ－Ｌ１ターゲティング型分子に対して大きい、１１６２９７の相対細胞毒性力価が維持され、１１６２９７が、他のＰＤ－Ｌ１結合分子と比較して、より大きな治療域を有しうること、及び／又は、より中程度のＰＤ－Ｌ１発現で、ＰＤ－Ｌ１発現細胞をより強力に殺滅することができうることが示唆された（図４３Ａ、４３Ｂを参照されたい）。さらに、１１６２９７（配列番号１２８）は、インビボにおいて、腫瘍浸潤リンパ球の非存在下で、かつ腫瘍微小環境の免疫モジュレートのステータスに関わらず、例えば、腫瘍が「炎症型（hot）」又は「非炎症型」、非炎症性、又は免疫除外性の腫瘍と特徴付けられるかに関わらず、腫瘍細胞に対して細胞毒性でありうる。
１１６２９７（配列番号１２８）は、ヒト患者由来の異種移植マウスモデルにおいて、生存の利益及び抗腫瘍活性を呈することが可能であった。４５０μｇ／ｋｇの１１６２９７（配列番号１２８）の４週間にわたる静脈内投与は、非ヒト霊長動物によって忍容された。１１６２９７（配列番号１２８）は、臨床的に対象となる腫瘍細胞１１６２９７（配列番号１２８）に対して、ＰＤ－Ｌ１発現レベルといくらか関係する強力な細胞毒性活性を呈する。１１６２９７（配列番号１２８）は、３つの顕著に異なる作用機構、すなわち、＃１）細胞への内部化及び触媒活性を介する、ＰＤ－Ｌ１発現細胞の直接的な細胞殺滅；＃２）抗原送達、提示、及びＣＴＬ認識を介する、ＰＤ－Ｌ１発現細胞の間接的な細胞殺滅；並びに＃３）ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を呈することが可能である。１１６２９７（配列番号１２８）は、ＰＤ－Ｌ１を発現する健常な末梢免疫細胞を殺滅しうるが、これは、ＰＤ－Ｌ１発現が高まっている単球のサブセットに限定される可能性があり、ＰＤ－Ｌ１レベルが高まったこれらの免疫細胞が、腫瘍細胞への免疫応答を阻害している場合、腫瘍部位における利益をもたらしうる。
ＰＤ－Ｌ１をターゲティングするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫チェックポイント阻害剤として作用し、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用を物理的に阻害することによって作動して、免疫チェックポイント活性化を阻止し、腫瘍細胞に対するＴ細胞の機能性を回復する。
ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＣＴＬＡ－４をターゲティングするｍＡｂを含む、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）として作用するｍＡｂは、良好な臨床利益をもたらすと報告されている。ＩＣＩを受ける患者の大部分は免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）を経験しないが、ＩＣＩ治療の臨床利益は、ｉｒＡＥなどの免疫関連応答と相関付けられている（Das S et al. J Immunother Cancer 7: 306 (2019)を参照されたい）。非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）研究において、承認されたＩＣＩの単一の薬剤による治療は、いかなる用量でも、いかなるｉｒＡＥも結果としてもたらさない。しかし、ＮＨＰモデルにおいて、単一の薬剤のＩＣＩ ｍＡｂ投与は、２つ又は３つ以上のＩＣＩ ｍＡｂの組合せで、かつ予測される臨床用量を大きく超える用量で与えられる場合、ｉｒＡＥを結果としてもたらしうる（Changhua J et al., Clin Cancer Res 25: 4735-48 (2019)）。本明細書の実施例に記載したように、ＮＨＰへの単一の薬剤としての１１６２９７の投与は、著明な割合の動物においてｉｒＡＥを結果としてもたらしたことが、予測外に観察された。
実施例に記載したように、ＮＨＰへの１１６２９７の投与は、ＩＣＩで治療された患者における有益な応答と相関するものと同様の、免疫活性化及びｉｒＡＥの提示を結果としてもたらしうる（図４２Ｂ；Nakamura Y, Front Med (Lausanne) 6: 119 (2019)を参照されたい）。１１６２９７は、単一の薬剤としてこれらの効果をもたらすので、１１６２９７の活性は、ＩＣＩ ｍＡｂから識別される。さらに、これらの応答は、ＰＤ－Ｌ１発現依存的な形で枯渇されることが示されている単球の枯渇と関連し、したがって、免疫活性化及びｉｒＡＥを誘導する１１６２９７の能力を、ＰＤ－Ｌ１ターゲティングに関連する薬力学的効果と関係付ける。
ＮＨＰの１１６２９７による処置は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、及び好酸球を含む免疫サブセットの用量依存的な末梢性拡大を結果としてもたらした。免疫拡大は、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、及びＩＬ－２を含むサイトカインの分泌と関連していた（図４２Ｂを参照されたい）。観察された機能的免疫活性は、臨床の場においてＩＣＩ治療後に観察されているｉｒＡＥ（Nakamura et al. 2019）と同様の、心臓組織への免疫浸潤（心筋炎）及び皮膚炎のｉｒＡＥの発生とさらに関連していた。ＰＤ－Ｌ１結合分子によって誘導されたこれらのｉｒＡＥは、１１６２９７の短い半減期と合致して、投与休止と共に解消した。
実施例において示したように、志賀毒素構成要素の触媒活性を不活化した点変異を有するＰＤ－Ｌ１結合分子バリアントである１１６５５５の投与は、ＮＨＰにおいて、免疫活性化、細胞枯渇、又はｉｒＡＥの提示のいずれも示さなかったため、１１６２９７の特性は、志賀毒素Ａサブユニットの細胞殺滅触媒性機構に依存する（図４１Ｂ、４１Ｃ、及び４１Ｄを参照されたい）。
加えて、異なる可変ドメインを有する分子（１１５７６５及び１１５６９５）は、１１６２９７と比較して、同等の用量及び高い頻度でＮＨＰに投与されたにも関わらず、霊長動物モデルにおいて同じ効果を有しなかったため（図４４）、１１６２９７の特性は、ｓｃＦｖ ＣＤＲ、重鎖及び軽鎖、及び／又はｓｃＦｖリンカーと相関付けられた。１１５７６５及び１１５６９５は、ＮＨＰ研究において、ｉｒＡＥの発生を促進する、免疫サブセットの直接的なクリアランス、免疫サブセットの拡大、又は組織浸潤の徴候を示さなかった。
単量体かつ一価のＰＤ－Ｌ１結合分子であり、１１６２９７と同じ結合ドメインを含有するがｓｃＦｖリンカーの長さが異なる１１５７４９は、免疫の枯渇又は活性化を示さなかったが、ｉｒＡＥ発生（皮膚炎）のいくつかの徴候を示したので、１１６２９７と１１５７４９との間で共有されるＩｇドメインの特異的な結合特性への依存性が示唆され、ＮＨＰにおける完全な免疫活性化及びｉｒＡＥの発生が、重鎖及び軽鎖を超える、１１６２９７に独自のさらなる構造／機能に起因しうることが裏付けられた。
本発明の一部の実施形態について、例示を目的として記載してきたが、本発明が、本発明の精神から逸脱しない限りにおいて、多くの修飾、変動、及び適応を伴い、当業者の技術の範囲内にある、多数の均等物又は代替的解決法の使用を伴って実施されうることが明らかであろう。
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、又は特許出願が、参照によりその全体において組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度において、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。国際特許出願公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際特許出願公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際特許出願公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際特許出願公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際特許出願公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際特許出願公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際特許出願公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、国際特許出願公開第２０１６／１９６３４４号パンフレット、国際特許出願公開第２０１７／０１９６２３号パンフレット、国際特許出願公開第２０１８／１０６８９５号パンフレット、国際特許出願公開第２０１８／１４０４２７号パンフレット、国際特許出願公開第２０１９／１８３０９３号パンフレット、及び国際特許出願公開第２０２０／１５４４７５号パンフレット、は、各々、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。米国特許出願第２０１５／２５９４２８号明細書、同第２０１６／１７７８４号明細書、同第２０１７／１４３８１４号明細書、及び同第６２／６４４，８３２号明細書の開示は、各々、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列についての、GenBank（National Center for Biotechnology Information、U.S.A.）による、全ての電子的に利用可能な生物学的配列情報の完全な開示は、各々、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。

Claims (64)

  1. 志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、ＰＤ－Ｌ１の細胞外部分に特異的に結合することが可能な結合領域とを含むＰＤ－Ｌ１結合分子であって、
    前記結合領域が、
    （ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＹＴＭＨ（配列番号２７）を含むＣＤＲ１、
    （ii）アミノ酸配列ＧＩＮＰＮＮＧＧＴＷＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２９）を含むＣＤＲ２、及び
    （iii）アミノ酸配列ＰＹＹＹＧＳＲＥＤＹＦＤＹ（配列番号３２）を含むＣＤＲ３
    を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と；
    （ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ１、
    （ii）アミノ酸配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２０）を含むＣＤＲ２、及び
    （iii）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２６）を含むＣＤＲ３
    を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
    を含む、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子。
  2. 志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドが、配列番号４１の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項１に記載のＰＤｌ－Ｌ１結合分子。
  3. ＶＨが、配列番号３４の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項１又は２に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  4. ＶＬが、配列番号３５の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  5. ＶＨが、配列番号３４の配列を含み、ＶＬが、配列番号３５の配列を含む、請求項１又は２に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  6. 結合領域が、ＶＨとＶＬとを連結するｓｃＦｖリンカーを含む、請求項１～５のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  7. ｓｃＦｖリンカーが、約３～約１２アミノ酸残基長である、請求項６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  8. ｓｃＦｖリンカーが可動性リンカーである、請求項６又は７に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  9. ｓｃＦｖリンカーが、配列番号７２の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  10. 結合領域が単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１～９のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  11. 結合領域が、配列番号１０６の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項１～９のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  12. 志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドと、結合領域とを連結する結合ドメインリンカーを含む、請求項１～１１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  13. 結合ドメインリンカーが、配列番号７３の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項１２に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  14. Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、及び結合領域を含む、請求項１２又は１３に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  15. Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、ＶＨ、及びＶＬを含む、請求項１２又は１３に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  16. Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、ＶＨ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＬを含む、請求項１２又は１３に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  17. 志賀毒素Ａサブユニットに対して異種であるＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む、請求項１～１６のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  18. ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが、配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号７８）を含む、請求項１７に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  19. ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが、スペーサーを介して結合領域と連結されている、請求項１７又は１８に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  20. スペーサーが、配列ＨＨＡＡ（配列番号２６５）を有する、請求項１９に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  21. Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、結合領域、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む、請求項１７～２０のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  22. Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、ＶＨ、ｓｃＦｖリンカー、ＶＬ、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む、請求項１７～２０のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  23. Ｎ末端からＣ末端の順に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、結合ドメインリンカー、結合領域、スペーサー、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む、請求項１９又は２０に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  24. 配列番号１２８の配列、又はこれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項１～２３のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  25. 単一の連続ポリペプチドである、請求項１～２４のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  26. ２つのポリペプチドを含む、請求項１～２４のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  27. ２つのポリペプチドの各々が、配列番号１２８の配列を含む、請求項２６に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  28. ２つのポリペプチドが、互いに非共有結合的に連結されている、請求項２６又は２７に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  29. ２つのポリペプチドが、結合領域を介して、互いに非共有結合的に連結されている、請求項２６又は２７に記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  30. 細胞毒性である、請求項１～２９のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  31. 非細胞毒性である、請求項１～２９のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子。
  32. 請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
  33. 請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子をコードするポリヌクレオチド、又はその相補体。
  34. 請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  35. 請求項３３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  36. 請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を製造するための方法であって、（ａ）請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を発現させるステップ、及び（ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合分子を回収するステップを含む、前記方法。
  37. ＰＤ－Ｌ１結合分子を発現させるステップが、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子が発現される条件下で、請求項３５に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子を、前記ＰＤ－Ｌ１結合分子を含む発現系組成物から精製するための方法であって、（ｉ）前記発現系組成物を細菌プロテインＬと接触させて、ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を創出するステップ、及び（ii）前記ＰＤ－Ｌ１結合分子－プロテインＬ複合体を回収するステップを含む、前記方法。
  39. 発現系組成物が細胞溶解物である、請求項３８に記載の方法。
  40. プロテインＬが、Ｆ．マグナ種（F. magna）から単離されているか、又はそれに由来する、請求項３８又は３９に記載の方法。
  41. プロテインＬが、樹脂にコンジュゲートされている、請求項３８～４０のいずれかに記載の方法。
  42. ＰＤ－Ｌ１発現細胞を殺滅する方法であって、前記細胞を、請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は請求項３２に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、前記方法。
  43. 対象における疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は請求項３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
  44. 疾患、障害、又は状態が、免疫障害又は微生物感染である、請求項４３に記載の方法。
  45. がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は請求項３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
  46. がんが、高い変異量及び／又は高いインデル頻度により特徴付けられる、請求項４５に記載の方法。
  47. がんが固形腫瘍である、請求項４５又は４６に記載の方法。
  48. がんが、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、卵管がん、消化器がん、神経膠腫、頭頸部がん、腎臓がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、メルケル細胞癌、中皮腫、骨髄腫、鼻咽頭新生物、卵巣がん、膵臓がん、腹膜新生物、前立腺がん、皮膚がん、移行上皮癌、又は尿路上皮がんである、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  49. がんが膀胱がんであり、前記膀胱がんが尿路上皮癌である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  50. がんが乳がんであり、前記乳がんが、ＨＥＲ２陽性乳がん又はトリプルネガティブ乳がんである、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  51. がんが結腸がんであり、前記結腸がんが結腸直腸がんである、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  52. がんが消化器がんであり、前記消化器がんが、胃がん、胆道新生物、又は食道胃接合部がんである、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  53. がんが神経膠腫であり、前記神経膠腫が神経膠芽腫である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  54. がんが頭頸部がんであり、前記頭頸部がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  55. がんが腎臓がんであり、前記腎臓がんが腎細胞癌である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  56. がんが肝がんであり、前記肝がんが肝細胞癌である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  57. がんが肺がんであり、前記肺がんが、非小細胞肺がん又は小細胞肺がんである、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  58. がんがリンパ腫であり、前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、又はびまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  59. がんが中皮腫であり、中皮癌が胸膜中皮腫である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  60. がんが骨髄腫であり、前記骨髄腫が多発性骨髄腫である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  61. がんが皮膚がんであり、前記皮膚がんが、皮膚扁平上皮がん又は黒色腫である、請求項４５～４７のいずれかに記載の方法。
  62. がんが再発している、又はイピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ及びセミプリマブのうちの少なくとも１つを伴う治療に不応性である、請求項４５～６１のいずれかに記載の方法。
  63. がんが転移性である、請求項４５～６２のいずれかに記載の方法。
  64. 免疫療法を使用してがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、請求項１～３１のいずれかに記載のＰＤ－Ｌ１結合分子、又は請求項３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2749862T3 (es) 2014-01-27 2020-03-24 Molecular Templates Inc Polipéptidos efectores desinmunizados de subunidad A de toxina Shiga para aplicaciones en mamíferos
WO2016196344A1 (en) 2015-05-30 2016-12-08 Molecular Templates, Inc. De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
EP3551645A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
JP7082424B2 (ja) * 2017-01-25 2022-06-08 モレキュラー テンプレーツ，インク． 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニットエフェクター及びｃｄ８＋ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子
US11918649B2 (en) 2019-09-18 2024-03-05 Molecular Templates, Inc. PD-L1-binding molecules comprising Shiga toxin a subunit scaffolds
EP4262858A1 (en) * 2020-12-16 2023-10-25 Molecular Templates, Inc. Clinical methods for use of a pd-l1-binding molecule comprising a shiga toxin effector
EP4308242A1 (en) * 2021-03-17 2024-01-24 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994029347A1 (en) 1993-06-03 1994-12-22 Therapeutic Antibodies Inc. Antibody fragments in therapy
AU784062B2 (en) 1999-08-23 2006-01-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Novel B7-4 molecules and uses therefor
WO2001039722A2 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1, a novel immunoregulatory molecule
US6979564B2 (en) 2000-10-20 2005-12-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 80090, human fucosyltransferase nucleic acid molecules and uses thereof
CA2485373A1 (en) 2002-05-10 2003-11-20 Medimmune, Inc. Epha2 monoclonal antibodies and methods of use thereof
EP1727827B1 (en) 2004-03-26 2010-05-12 Molecular Templates, Inc. Library of toxin mutants, and methods of using same
AU2005295038B2 (en) 2004-10-06 2012-05-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1 and methods of diagnosis, prognosis, and treatment of cancer
HUE026039T2 (en) 2005-07-01 2016-05-30 Squibb & Sons Llc Human monoclonal antibodies programmed for death ligand 1 (PD-L1)
US20090156417A1 (en) 2005-09-26 2009-06-18 Jean Gariepy Library From Toxin Mutants, And Methods Of Using Same
CN101679508B (zh) 2007-02-02 2014-11-05 贝勒研究院 基于靶向抗原至抗原呈递细胞上表达的dcir的疫苗
JP5374360B2 (ja) 2007-02-27 2013-12-25 中外製薬株式会社 抗ｇｒｐ７８抗体を有効成分として含む医薬組成物
US7887801B2 (en) 2007-07-13 2011-02-15 Topotarget Germany Ag Optimized DNA and protein sequence of an antibody to improve quality and yield of bacterially expressed antibody fusion proteins
KR101924874B1 (ko) 2008-09-26 2018-12-04 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 인간 항-ｐｄ-１, ｐｄ-ｌ１, 및 ｐｄ-ｌ2 항체 및 그의 용도
EP2376535B9 (en) 2008-12-09 2017-09-13 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
JP2012531212A (ja) 2009-07-03 2012-12-10 アビペップ ピーティーワイ リミテッド イムノコンジュゲート及びその作製方法
WO2011019396A2 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Unifrax I Llc Mounting mat for exhaust gas treatment device
HUE049647T2 (hu) 2009-11-24 2020-09-28 Medimmune Ltd Targetált kötõdõ ágensek B7-H1 ellen
BR112014012819B1 (pt) 2011-11-28 2022-08-16 Merck Patent Gmbh Anticorpo anti-pd-l1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e composição
US20160068577A1 (en) 2013-03-12 2016-03-10 Molecular Templates, Inc. Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types
ES2749862T3 (es) 2014-01-27 2020-03-24 Molecular Templates Inc Polipéptidos efectores desinmunizados de subunidad A de toxina Shiga para aplicaciones en mamíferos
US20160177284A1 (en) * 2014-01-27 2016-06-23 Molecular Templates, Inc. Cell-targeted molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal shiga toxin a subunit effector regions
US20210138076A2 (en) * 2014-01-27 2021-05-13 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
US20160376328A1 (en) * 2014-03-11 2016-12-29 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions
WO2015138435A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising binding regions, shiga toxin a subunit effector regions, and carboxy-terminal, endoplasmic reticulum localization signal motifs
EP3514168B1 (en) * 2014-06-11 2021-09-01 Molecular Templates, Inc. Protease-cleavage resistant cytotoxic cell-targeting molecules
US9535074B2 (en) 2014-09-08 2017-01-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Immunoassay for soluble PD-L1
WO2016126950A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Molecular Templates, Inc. Multivalent cd20-binding molecules comprising shiga toxin a subunit effector regions and enriched compositions thereof
WO2016196344A1 (en) * 2015-05-30 2016-12-08 Molecular Templates, Inc. De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
JP6884133B2 (ja) 2015-07-26 2021-06-09 モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. 志賀毒素ａサブユニットエフェクター及びｃｄ８＋ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子
EP3423089A4 (en) 2016-03-04 2019-10-23 JN Biosciences, LLC ANTI-Tigit ANTIBODY
ES2883297T3 (es) 2016-03-29 2021-12-07 Stcube Inc Anticuerpos de función doble específicos para PD-L1 glucosilado y métodos de uso de los mismos
EP3532100A4 (en) 2016-10-30 2020-11-25 Shanghai Henlius Biotech, Inc. ANTI-PD-L1 ANTIBODIES AND VARIANTS
EP3551645A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
JP7082424B2 (ja) 2017-01-25 2022-06-08 モレキュラー テンプレーツ，インク． 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニットエフェクター及びｃｄ８＋ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子
CN110573524B (zh) 2017-03-09 2023-07-18 健玛保 针对pd-l1的抗体
WO2019059400A1 (ja) 2017-09-25 2019-03-28 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
KR20210003099A (ko) 2018-03-19 2021-01-11 아베오미 코포레이션 세포예정사 리간드 1 (pd-l1)에 대한 고 친화도 중화 단일클론 항체 및 이의 용도
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
WO2020154475A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains
US11918649B2 (en) 2019-09-18 2024-03-05 Molecular Templates, Inc. PD-L1-binding molecules comprising Shiga toxin a subunit scaffolds

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