JP5374360B2 - 抗grp78抗体を有効成分として含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
GRP78は、分子量78kDaのGRPタンパク質であり、別名BiP(immunoglobulin binding protein)としてもよく知られている。GRP78の過剰発現実験、あるいはアンチセンスによるノックダウン実験から、GRP78はERストレスによって引き起こされる細胞死に対して、その防御反応に関わっていることが明らかにされている(非特許文献1)。
癌化した細胞、あるいは癌化によって変化した生体内環境は、低栄養、低酸素、低pHなど、つねにERストレスにさらされ続けているという状態だと考えられている。そしてそのことを支持するように、複数の癌細胞株や臨床癌検体においてGRP78タンパク質の発現上昇が確認されている(非特許文献2〜5)。さらに、トポイソメラーゼ阻害活性や血管新生阻害活性を機序として有する抗癌剤に対する抵抗性の獲得に、GRP78タンパク質の発現上昇とその抗アポトーシス活性が深く関わっていることが、実験的に示されている(非特許文献6、7)。臨床においても、GRP78の発現が亢進している乳癌患者グループは、GRP78の発現が低い群に比べて、アドリアマイシンによる化学療法の効果が低いことが示されている(非特許文献8)。
これらの報告から、癌細胞の生存・悪性化・抗癌剤耐性のメカニズムにGRP78の発現亢進がその一旦を担っていると推測されている(非特許文献1)。
上述のとおりGRP78は、ERに局在する分子シャペロンであることが知られているが、その一方で、一部の癌細胞ではGRP78タンパク質が細胞表面に局在することが報告されている。さらに、この細胞表面に局在が変化したGRP78を標的とした抗腫瘍剤への応用の可能性が幾つかの全く異なる手法で示されている。
Rabdomiosarcoma細胞株TE671/RDをthapsigargin(Tg)で処理するとわずかに細胞膜が抗GRP78抗体で染色されることがFACS解析により確認され、GRP78が細胞膜に局在することが示された。(非特許文献9)。
ただし、この報告は、Tg処理による細胞死誘導時の一過性の現象をみたものであり、癌細胞における恒常的なGRP78の局在変化を示したデータではない。また、用いた抗体が市販のヤギ由来ポリクローナル抗体であることから、そのエピトープも不明である。
その後、別のグループから、ファージ結合アッセイにより、2種類のGRP78結合ペプチド(WIFPWIQL、WDLAWMFRLPVG)を取得し、これらがプレート上に固定したGRP78タンパク質に結合するのみならず、前立腺癌細胞株DU145の細胞表面にも吸着し、インターナライズすることが報告されている(非特許文献10)。この実験より、GRP78が癌細胞の細胞膜上に局在している可能性が示された。
さらに、このGRP78結合ペプチドを利用した抗腫瘍剤としての可能性が確認されている。すなわち、このGRP78結合ペプチドにアポトーシス誘導ペプチド配列(KLAKLAK)2(非特許文献11)を付加したペプチド合成し、このペプチドがDU145細胞に対してin vitroで細胞死誘導を引き起こすばかりでなく、マウス移植モデルを用いたin vivo試験においても抗腫瘍効果を示すことが報告されている(非特許文献10)。
その一方で別のグループは、血管新生を阻害することが知られているプラスミノーゲンのKringle 5(K5)と呼ばれるドメインが認識する標的分子を探索し、その結果、K5の標的が血管内皮細胞に発現するGRP78タンパク質であることを明らかにしている(非特許文献16)。さらにリコンビナントK5が、GRP78を介して、血管新生阻害反応のみならず、低酸素下で培養した各種癌細胞株に対して細胞死を誘導することを示している(非特許文献16)。
このように、これら一連の実験から、癌細胞や血管内皮細胞の細胞表面に発現するGRP78に結合するペプチドが、抗腫瘍剤として有用であることが示されている。しかしながら、これらのペプチドが、細胞表面に発現していると思われるGRP78のどの部分を認識しているのかまでは明らかにされておらず、このペプチドを利用した医薬品開発への応用は難しいと考えられる。
また、これらの知見とは別に、まったく異なる2つのグループが、それぞれ違ったアプローチにより、GRP78が細胞膜に局在することを報告している。
あるグループは、受容体認識型α2マクログロブリン(α2M*)が、前立腺癌細胞株(1−LN)に対して増殖因子として機能することを示し(非特許文献12)、その後、同一のグループがその受容体がGRP78であることを明らかした(非特許文献13)。この発見により、長い間ERタンパク質であると考えられていたGRP78タンパク質が、その一方で細胞膜上で増殖因子の受容体としても機能しているという新たな知見が加えられた。
さらに別のグループは、前立腺癌の患者由来血清中に、“CNVSDKSC”というペプチド配列を認識する抗体(抗CNVSDKSC抗体)が存在することを突き止め、この抗体が認識する抗原タンパク質を解析した結果、これがGRP78タンパク質であることを明らかにしている(非特許文献14)。しかしながら、実際“CNVSDKSC”という配列、あるいはそれに類似の配列はGRP78の内部には存在せず、この患者由来の抗体が、GRP78のどの部分を認識しているのかはこの時点では不明であった。
その後、別のグループが、この“CNSVDKSC”というペプチドの三次元構造を解析し、GRP78の構造中に同様の三次元構造を有する領域がないか検索を行った。その結果、GRP78のLeu98−Leu115に位置する“LIGRTWNDPSVQQDIKFL”という配列が、この配列に相当することを発見した。そこでこの配列に対するウサギポリクローナル抗体を作製した結果、この抗体が前立腺癌株1−LN、DU145、メラノーマ細胞株DM413といった癌細胞の細胞表面を染色することが確認された。さらに、この抗体は前立腺癌細胞株に対して、α2M*添加時に見られるような、細胞内カルシウム濃度の上昇、細胞増殖の誘導、そしてTNFαに対する抗アポトーシス作用を示すことが確認された(非特許文献15)。このように、GRP78のLeu98−Leu115に対する抗体がα2M*のリガンド活性をミミックしたことから、GRP78中のこの領域がα2M*結合配列であることが明らかになった(非特許文献15)。
この報告によって、GRP78が前立腺癌などでは細胞表面に局在することが確実となり、さらにGRP78のLeu98−Leu115(LIGRTWNDPSVQQDIKFL)が、α2M*結合部位として細胞外に露呈していることも明らかにされた。
さらに、別のアプローチから、GRP78の98−115の領域に対する抗体が、癌細胞の細胞表面を染色することが報告されており、この領域がGRP78の細胞外エピトープとなりうることが明らかにされている。
このようにGRP78タンパク質が多くの癌種で発現上昇していること、さらに、それが細胞膜上へと局在が変化していることが明らかにされているが、これらの知見をもとにしてGRP78を標的にした新たな抗体治療薬の作製をするのは困難であった。なぜなら、第一に、上述のGRP78結合ペプチドはGRP78タンパク質のどの領域に結合しているのか不明であることから、ペプチドと同様の効果を期待できる抗体の作製が不可能であった。実際、そのようなペプチドの作用を代替できるようなモノクローナル抗体も実在しない。第二に、GRP78の98−115の領域に結合する抗体は、癌細胞の細胞膜上に結合できるが、α2M*の増殖促進作用をミミックしてしまうことから、この抗体の抗腫瘍活性は期待できない。
従って、GRP78に結合する抗体を用いて腫瘍活性を阻害することは困難であると考えられていた。
Lee AS.Trends Biochem Sci.2001,26,504−10 Patierno,et al.1998,Cancer Res.47,6220−24 Bini et al.1997,Electrophoresis.18,2832−41 Gazit et al.1999,Breast Cancer Res.Treat.54,135−46 Fernandez et al.2000,Breast Cancer Res.Treat.59,15−26 Reddy et al,J.Bio.Chem.2003,278,20915−24 Dong et al,2005,Cancer Res.65,5785−5791 Lee et al.2006,Cancer Res.66,7849−7853 Delpino et al.1998,Molecular Membrane Biology,15,21−26 Arap et al.2004,CANCER CELL.6,275−284 Javadpour et al.1996,J.Med.Chem.39,3107−3113 Asplin et al.2000,Archives of Biochemistry and Biophysics.383,135−141 Misra et al.2002,J.Biol.Chem.277,42082−42087 Mintz et al.2003,Nat Biotech.21,57−63 Gonzalez−Gronow et al.2006,Cancer Res.66,11424−11431 Davidoson et al.,2005,Cancer Res.65,4663−4672
以上の知見に基づいて、本発明の発明者らは、上記の課題を解決することができることを明らかにした。
具体的には、以下の(1)〜(28)に記載する態様を提供する。
(1) グルコース制御タンパク質78(glucose−regulated protein 78;GRP78)に結合する抗体を含む、医薬組成物。
(2) 抗癌剤である、(1)記載の組成物。
(3) 抗体がモノクローナル抗体である、(1)または(2)に記載の組成物。
(4) 抗体が細胞表面に局在したGRP78に結合する抗体である、(1)〜(3)いずれかに記載の組成物。
(5) 抗体がGRP78を発現する細胞にインターナライズされる抗体である、(1)〜(4)のいずれかに記載の組成物。
(6) 抗体がSEQ ID NO:3に記載のエピトープに結合する抗体である、(1)〜(5)のいずれかに記載の組成物。
(7) 抗体が細胞障害性物質が結合した抗体である、(1)〜(6)のいずれかに記載の組成物。
(8) GRP78に結合する、モノクローナル抗体。
(9) 細胞表面に発現したGRP78に結合することを特徴とする、(8)に記載の抗体。
(10) GRP78を発現する細胞にインターナライズされることを特徴とする、(8)または(9)に記載の抗体。
(11) SEQ ID NO:3に記載のエピトープに結合することを特徴とする、(8)〜(10)のいずれかに記載の抗体。
(12) 以下の(a)〜(r)のいずれかの抗体:
(a) CDR1としてSEQ ID NO:8に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:9に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO:11に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:12に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:13に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(b) CDR1としてSEQ ID NO:18に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:19に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:20に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO:21に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:22に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:23に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(c) CDR1としてSEQ ID NO:61に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:62に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:63に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO:64に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:65に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:66に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(d) CDR1としてSEQ ID NO:71に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:72に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:73に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO:74に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:75に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:76に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(e) CDR1としてSEQ ID NO:81に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:82に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:83に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO:84に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:85に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:86に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(f) CDR1としてSEQ ID NO:91に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:92に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としでSEQ ID NO:93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO:94に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO:95に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO:96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
が認識するエピトープと同じエピトープを認識することを特徴とする、(8)〜(10)いずれかに記載の抗体。
(13) GRP78を発現する細胞に対して細胞障害活性を有することを特徴とする、(8)〜(12)いずれかに記載の抗体。
(14) 細胞障害性物質が結合していることを特徴とする、(13)に記載の抗体。
(15) 抗GRP78抗体を用いて細胞障害性物質を細胞内に送達する方法。
(16) 抗GRP78抗体に結合した細胞障害性物質により細胞の増殖を抑制する方法。
(17) 細胞が癌細胞である、(15)または(16)に記載の方法。
(18) 細胞障害性物質を細胞内へ送達する為の抗GRP78抗体の使用。
(19) 細胞の増殖を抑制する為の、インターナライズ活性を有する抗GRP78抗体の使用。
(20) 細胞が癌細胞である、(18)または(19)に記載の使用。
(21) 抗GRP78抗体に細胞障害性物質が結合していることを特徴とする、(18)〜(20)ののいずれかに記載の使用。
(22) 以下の工程:
(a) GRP78抗体を提供する工程、
(b) (a)の抗体がインターナライズ活性を有するか否か確認する工程、
(c) インターナライズ活性を有する工程を選択する工程、
(d) (c)で選択された抗体に細胞障害性物質を結合する工程。
を含む医薬組成物の製造方法。
(23) 医薬組成物が抗癌剤である、(22)に記載の製造方法。
(24) 抗GRP78抗体を用いた癌の診断方法。
(25) 標識物質が結合した抗GRP78抗体を用いることを特徴とする、(24)記載の診断方法。
(26) 細胞内に取り込まれた抗GRP78抗体を検出することを特徴とする、(24)または(25)に記載の診断方法。
(27) 標識物質が結合した抗GRP78抗体。
(28) SEQ ID NO:3のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその断片。
本発明で用いられる抗GRP78抗体は特異的にGRP78に結合することが好ましい。又、本発明で用いられる抗GRP78抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
GRP78は癌細胞などにおいて細胞膜上に局在することが知られている。本発明で用いられる抗GRP78抗体の好ましい態様の一つとして、GRP78が細胞膜上に局在した際に細胞外に露呈される領域を認識する抗体を挙げることができる。
そのような抗体は、例えば、GRP78タンパク質(SEQ ID NO:2)を免疫原として抗体を作製し、作製された抗体の中からGRP78を細胞膜上に発現する癌細胞(例えば、前立腺癌細胞株DU145など)に結合可能な抗体を選択すること等により取得することが可能である。より具体的には実施例に記載の方法などにより、GRP78が細胞膜上に局在した際に細胞外に露呈される領域を認識する抗体を取得することが可能である。
本発明においてGRP78が細胞膜上に局在した際に細胞外に露呈する領域は、抗体がその領域に結合した際にα2マクログロブリンの増殖促進作用がミミックされない領域であることが好ましく、特にGRP78の98位から115位の領域以外の領域が好ましい。
GRP78が細胞膜上に局在した際に細胞外に露呈される領域の好ましい例として、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列において376位から415位までの領域(SEQ ID NO:3)を挙げることができる。従って、GRP78が細胞膜上に局在した際に細胞外に露呈される領域を認識する抗体の好ましい例としては、GRP78の376位から415位までの領域を認識する抗体を挙げることができる。GPR78タンパク質のアミノ酸376位から415位までの領域を認識する抗体の例として、特に限定されないが、アミノ酸384位から391位(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸9〜16)を認識する抗体、アミノ酸392位から407位(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸17〜32)を認識する抗体、アミノ酸400位から415位(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸25〜40)を認識する抗体、などを挙げることができる。抗体が目的のエピトープを認識するか否かは当業者に公知の方法により確認することが可能であり、例えば、実施例に記載の方法により確認することが可能である。
本発明で用いられる抗体の好ましい他の態様としてインターナライズ活性を有する抗体を挙げることができる。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、細胞表面上に局在したGRP78に結合した際に細胞内(細胞質内、小胞内、他の小器官内など)に輸送される抗体を意味する。
抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗GRP78抗体をGRP78を発現する細胞(例えば、前立腺癌細胞株DU145など)に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞障害性物質を結合した抗GRP78抗体をGRP78を発現する細胞に接触させ該GRP78発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。より具体的には実施例に記載の方法などにより抗体がインターナライズ活性を有するか否かを確認することが可能である。
本発明において、特に好ましい抗体として、GRP78が細胞膜上に局在した際に細胞外に露呈される領域を認識し、かつインターナライズ活性を有する抗体を挙げることができる。そのような抗体は、まずGRP78が細胞膜上に局在した際に細胞外に露呈される領域を認識する抗体を上述の方法により選択し、その後、選択された抗体の中からインターナライズ活性を有する抗体をさらに選択することにより取得することが可能である。
本発明に用いられる好ましい抗体の例として、例えば、以下(a)から(s)の抗体を挙げることができる。
(a) CDR1としてSEQ ID NO:8のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:9のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
(b) CDR1としてSEQ ID NO:11のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:12のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
(c) (a)の重鎖可変領域と(b)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(d) CDR1としてSEQ ID NO:18のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:19のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
(e) CDR1としてSEQ ID NO:21のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:22のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
(f) (d)の重鎖可変領域と(e)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(g) CDR1としてSEQ ID NO:61のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:62のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:63のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
(h) CDR1としてSEQ ID NO:64のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:65のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:66のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
(i) (g)の重鎖可変領域と(h)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(j) CDR1としてSEQ ID NO:71のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:72のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:73のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
(k) CDR1としてSEQ ID NO:74のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:75のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:76のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
(l) (j)の重鎖可変領域と(k)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(m) CDR1としてSEQ ID NO:81のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:82のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
(n) CDR1としてSEQ ID NO:84のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:85のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:86のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
(o) (m)の重鎖可変領域と(n)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(p) CDR1としてSEQ ID NO:91のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:92のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:93のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
(q) CDR1としてSEQ ID NO:94のアミノ酸配列、CDR2としてSEQ ID NO:95のアミノ酸配列、CDR3としてSEQ ID NO:96のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
(r) (p)の重鎖可変領域と(q)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(s) (a)から(r)のいずれかの抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体。
ある抗体と同じエピトープを認識する抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。
被検抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたGRP78タンパク質を、候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗GRP78抗体が添加される。ウェル中のGRP78タンパク質に結合した本発明の抗GRP78抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体(被検抗体)の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被検抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗GRP78抗体のGRP78タンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、被検抗体のGRP78タンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。
ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。
更に被検抗体が本発明の抗GRP78抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合した抗体の量を、その抗体の定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体の量を測定することができる。
候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20%、好ましくは少なくとも20−50%、さらに好ましくは少なくとも50%、抗GRP78抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗GRP78抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。
本発明で用いられる抗体の好ましい他の態様の一つとして、細胞障害性物質が結合した抗体を挙げることができる。細胞障害性物質が結合した抗体が細胞内に取り込まれた場合、細胞障害性物質によって該抗体を取り込んだ細胞に殺傷作用や細胞死を誘導することが可能である。従って、細胞障害性物質が結合した抗体は、さらにインターナライズ活性を有することが好ましい。
本発明の細胞障害性物質が結合した抗GRP78抗体の好ましい態様として、例えば、GRP78を発現する癌細胞(DU145、22Rv1、MCF7、など)に対して、傷害活性を有する又は細胞死を誘導する抗体を挙げることができる。
本発明で用いられる細胞障害性物質は細胞に殺傷作用や細胞死を誘導できるものであれば如何なる物質でもよく、例えば、トキシン、放射性物質、化学療法剤などを挙げることができる。これらの本発明における細胞障害性物質は、生体内で活性な細胞障害性物質に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。
本発明においてトキシンとは、微生物、動物又は植物由来の細胞毒性を示す種々のタンパク質やポリペプチド等を意味する。本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンA鎖(Diphtheria toxin A Chain)(Langone J.J.,et al.,Methods in Enzymology,93,307−308,1983)、シュードモナスエンドトキシン(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine,2,350−353,1996)、リシン鎖(Ricin A Chain)(Fulton R.J.,et al.,J.Biol.Chem.,261,5314−5319,1986;Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169−3173,1987;Cumber A.J.et al.,J.Immunol.Methods,135,15−24,1990;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519−7562,1990;Gheeite V.,et al.,J.Immunol.Methods,142,223−230,1991);無糖鎖リシンA鎖(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924−5931,1987);アブリンA鎖(Abrin A Chain)(Wawrzynczak E.J.,et al.,Br.J.Cancer,66,361−366,1992;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519−7562,1990;Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169−3173,1987;Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924−5931,1987);ゲロニン(Gelonin)(Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169−3173,1987;Cumber A.J.et al.,J.Immunol.Methods,135,15−24,1990;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519−7562,1990;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992);ポークウイード抗ウィルスタンパク質(PAP−s;Pokeweed anti−viral protein fromseeds)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992);ブリオジン(Briodin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992);サポリン(Saporin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992);モモルジン(Momordin)(Cumber A.J.,et al.,J.Immunol.Methods,135,15−24,1990;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519−7562,1990;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992);モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992);ジアンシン32(Dianthin 32)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992);ジアンシン30(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1−8,1986);モデッシン(Modeccin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1−8,1986);ビスカミン(Viscumin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1−8,1986);ボルケシン(Volkesin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1−8,1986);ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1−8,1986);トリチン(Tritin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1−8,1986);ルフィン(Luffin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1−8,1986);トリコキリン(Trichokirin)(Casellas P.,et al.,Eur.J.Biochem.176,581−588,1988;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341−346,1992)。
本発明において放射性物質とは、放射性同位体を含む物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reなどを用いることが可能である。
本発明において化学療法剤とは、上記のトキシン、放射性物質以外の細胞障害活性を有する物質を意味し、サイトカイン、抗腫瘍剤、酵素などが含まれる。本発明で用いられる化学療法剤は特に限定されないが、低分子量の化学療法剤が好ましい。分子量が小さい場合、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低いと考えられる。本発明において、低分子量の化学療法剤とは、通常100〜2000、好ましくは200〜1000の分子量を有する。本発明においては特に限定されないが、例えば、以下の化学療法剤を用いることができる。メルファラン(Melphalan)(Rowland G.F.,et al.,Nature 255,487−488,1975);シスプラチン(Cis−platinum)(Hurwitz E.and Haimovich J.,Method In Enzymology 178,369−375,1986;Schechter B.,et al.,Int.J.Cancer 48,167−172,1991);カルボプラチン(Carboplatin)(Ota,Y.,et al.,Asia−Oceania J.Obstet.Gynaecol.19,449−457,1993);マイトマイシンC(Mitomycin C)(Noguchi,A.,et al.,Bioconjugate Chem.3,132−137,1992);アドリアマイシン(Adriamycin(Doxorubicin))(Shih,L.B.,et al.,Cancer Res.51 4192−4198,1991;Zhu,Z.,et al.,Cancer Immunol.Immumother 40,257−267,1995;Trail,P.A.,et al.,Science 261,212−215,1993;Zhu,Z.,et al.,Cancer Immunol.Immumother 40,257−267,1995;Kondo,Y.,et al.,Jpn.J.Cancer Res.86 1072−1079,1995;Zhu,Z.,et al.,Cancer Immunol.Immumother 40,257−267,1995;Zhu,Z.,et al.,Cancer Immunol.Immumother 40,257−267,1995);ダウノルビシン(Daunorubicin)(Dillman,R.O.,et al.,Cancer Res.48,6097−6102,1988;Hudecz,F.,et al.,Bioconjugate Chem.1,197−204,1990;Tukada Y.et al.,J.Natl.Cancer Inst.75,721−729,1984);ブレオマイシン(Bleomycin)(Manabe,Y.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.115,1009−1014,1983);ネオカルチノスタチン(Neocarzinostatin)(Kitamura K.,et al.,Cancer Immunol.Immumother 36,177−184,1993;Yamaguchi T.,et al.,Jpn.J.Cancer Res.85,167−171,1994);メトトレキセート(Methotrexate)(Kralovec,J.,et al.,Cancer Immunol.Immumother 29,293−302,1989;Kulkarni,P.N.,et al.,Cancer Res.41,2700−2706,1981;Shin,L.B.,et al.,Int.J.Cancer 41,832−839,1988;Gamett M.C.,et al.,Int.J.Cancer 31,661−670,1983);5−フルオロウリジン(5−Fluorouridine)(Shin,L.B.,Int.J.Cancer 46,1101−1106,1990);5−フルオロ−2′−デオキシウリジン(5−Fluoro−2’−deoxyuridine)(Goerlach A.,et al.,Bioconjugate Chem.2,96−101,1991);シトシンアラビノシド(Cytosine arabinoside)(Hurwitz E.,et al.,J.Med.Chem.28,137−140,1985);アミノプテリン(Aminopterin)(Kanellos J.,et al.,Immunol.Cell.Biol.65,483−493,1987);ビンクリスチン(Vincristine)(Johnson J.R.,et al.,Br.J.Cancer 42,17,1980);ビンデシン(Vindesine)(Johnson J.R.,et al.,Br.J.Cancer 44,472−475,1981);インターロイキン2(IL−2)、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、インターフェロン(INF)、カルボキシペプチダーゼ(Carboxypeptidase)、アルカリフォスファターゼ(Alkaline Phosphatase)、ベータラクタマーゼ(β−lactamase)、シチジンデアミナーゼ(Cytidine deaminase)。
本発明において用いられる細胞障害性物質は一種類でもよいし、二種以上の細胞障害性物質が組み合わせられて用いられてもよい。
抗GRP78抗体と上記の細胞障害性物質との結合は共有結合または非共有結合等により行なうことができる。これら細胞障害性物質を結合した抗体の作製方法は公知である。
抗GRP78抗体と細胞障害性物質は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや中間支持体などの他の物質を介して間接的に結合されてもよい。抗GRP78抗体と細胞障害性物質が直接結合される場合の連結基は、例えばSH基を用いたジスルフィド結合が挙げられる。具体的には抗体のFc領域の分子内ジスルフィド結合を還元剤、例えばジチオトレイトール等にて還元し、細胞障害性物質内のジスルフィド結合を同様に還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。結合前に活性化促進剤、例えばエルマン試薬(Ellman’s reagent)にて抗体か細胞障害性物質のいずれか一方を活性化させ両者のジスルフィド結合形成を促進してもよい。抗GRP78抗体と細胞障害性物質を直接結合するその他の方法としては、例えば、シッフ塩基を用いた方法、カルボジイミド法、活性エステル法(N−hydroxysucccinimide法)、Mixed anhydrideを用いた方法、ジアゾ反応を用いた方法などを挙げることができる。
抗GRP78抗体と細胞障害性物質の結合は、他の物質を介して間接的に結合することも可能である。間接的に結合する為の他の物質は特に限定されず、例えば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基等をいずれか1種類または2種類以上の組み合わせで2個以上有する化合物、ペプチドリンカー、抗GRP78抗体への結合能を有する化合物などを挙げることができる。アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基等をいずれか1種類または2種類以上の組み合わせで2個以上有する化合物の例としては、例えば、N−スクシニミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP:N−Succinimidyl 3−(2−pyridylditio)propinate)(Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519−7562,1990;Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924−5931,1987);スクシニミジル 6−3−〔2−ピリジルジチオ〕プロピオンアミド)ヘキサノエート(LC−SPDP:Succinimidyl 6−3−〔2−pyridylditio〕propinamide)hexanoate)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,230−232,1996);スルホスクシニミジル 6−3−〔2−ピリジルジチオ〕プロピオンアミド)ヘキサノエート(Sulfo−LC−SPDP:Sulfosuccinimidyl 6−3−〔2−pyridylditio〕propinamide)hexanoate)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,230−232,1996);N−スクシニミジル 3−(2−ピリジルジチオ)ブチレート(SPDB:N−Succinimidyl 3−(2−pyridylditio)butyrate)(Wawrzynczak E.J.,et al.,Br.J.Cancer,66,361−366,1992);スクシニミジロキシカルボニル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT:Succinimidyloxycarbonyl−α−(2−pyridylditio)toruene)(Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924−5931,1987);スクシニミジル 6−(α−メチル)−〔2−ピリジルジチオ〕トルアミド)ヘキサノエート(LC−SMPT:Succinimidyl 6−(α−methyl−〔2−pyridylditio〕toruamide)hexanoate)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,232−235,1996);スルホスクシニミジロル 6−(α−メチル−〔2−ピリジルジチオ〕トルアミド)ヘキサノエート(Sulfo−LC−SMPT:Sulfosuccinimidyl 6−(α−methyl−〔2−pyridylditio〕toruamide)hexanoate)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,232−235,1996);スクシニミジル−4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB:Succinimidyl−4−(p−maleimidophenyl)butyrate)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,242−243,1996);スルホ−スクシニミジル 4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(Sulfo−SMPB:Sulfo−Succinimidyl−4−(p−maleimidophenyl)butyrate)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,242−243,1996);m−マレイミドベンゾイル−N−ハイドロキシスクシニミドエステル(MBS:m−Maleimidobenzoyl−N−hydroxysuccinimide ester)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,237−238,1996);m−マレイミドベンゾイル−N−ハイドロキシスルホスクシニミドエステル(Sulfo−MBS:m−Maleimidobenzoyl−N−hydroxysulfosuccinimide ester)(Hermanson G.T.,BIOCONJUGATE Techniques,237−238,1996);S−アセチルメルカプトスクシニックアンヒドライド(SAMSA:S−Acetyl mercaptosuccinic anhydride)(Casellas P.,et al.,Eur.J.Biochem,176,581−588,1988);ジメチル 3,3−ジチオビスプロリオニミデート(DTBP:Dimethyl 3,3’−ditiobisprorionimidate)(Casellas P.,et al.,Eur.J.Biochem,176,581−588,1988);2−イミノチオレーン(2−Iminotiolane)(Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924−5931,1987)などを挙げることができる。
抗GRP78抗体と細胞障害性物質との結合に用いられるその他の物質として、例えば、ペプチド、抗体、ポリL−グルタミン酸(PGA)、カルボキシメチルデキストラン、デキストラン、アミノデキストラン、アビジン・ビオチン、シス・アコニット酸、グルタミン酸ジヒドラジド、ヒト血清アルブミン(HSA)等を挙げることができる。
更に、タンパク質性の細胞障害性物質は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することも可能である。具体的には、たとえば上記細胞障害性ペプチドをコードするDNAと抗GRP78抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗GRP78抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素を配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。
本発明の抗GRP78モノクローナル抗体は、公知の手段を用いて取得できる。本発明の抗GRP78抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは公知技術を使用して、例えば、以下のようにして作製できる。まず、GRP78タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させて、ハイブリドーマを得る。更に、このハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗GRP78抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。
具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、GRP78遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるGRP78タンパク質(SEQ ID NO:2)が取得できる。ヒトGRP78遺伝子の塩基配列は既に公知である(SEQ ID NO:1)。すなわち、GRP78をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトGRP78タンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のGRP78タンパク質も同様に使用できる。生成は通常のイオンクロマトグラフィやアフィニティクロマトグラフィなどの複数のクロマトグラフィを単数回又は複数回、組み合わせて又は単独で使用することにより生成することができる。また、本発明で用いられるように、GRP78タンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば抗体のFc断片やペプチドタグ等を利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を前記の様に発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47−9.58,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載されている。
このようにして精製されたGRP78タンパク質を哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。GRP78の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる:
ヒトGRP78のアミノ酸配列より化学合成によって取得されたペプチド;
ヒトGRP78遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド;
ヒトGRP78タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。
部分ペプチドとして用いるGRP78の領域および大きさは限定されるものではない。好ましい領域はGRP78の376位から415位までの領域(SEQ ID NO:3)から選択することができる。感作抗原とするペプチドを構成するアミノの数は、少なくとも3以上、たとえば、5以上、あるいは6以上であることが好ましい。より具体的には、8〜50、好ましくは10〜30残基のペプチドを感作抗原とすることができる。
該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS(Phosphate−Buffered Saline)や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。更に、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる(あるいはできない)形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損(以下HGPRT欠損と省略する)、あるいはチミジンキナーゼ欠損(以下TK欠損と省略する)などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性(以下HAT感受性と省略する)を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン(以下8AGと省略する)、あるいは5’ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2−デオキシストレプタミン系抗生物質(ゲンタマイシン類似体)に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123,1548−1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1−7)、NS−1(Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511−519)、MPC−11(Margulies.D.H.et al.,Cell(1976)8,405−415)、SP2/0(Shulman,M.et al.,Nature(1978)276,269−270)、F0(de St.Groth,S.F.etal.,J.Immunol.Methods(1980)35,1−21)、S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313−323)、R210(Galfre,G.et al.,Nature(1979)277,131−133)等のようなミエローマ細胞を利用することができる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法(Kohler.G.andMilstein,C.、Methods Enzymol.(1981)73,3−46)等に準じて行なうことが可能である。
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、センダイウイルス(HVJ)等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を培養液に添加することができる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞(ハイブリドーマ)が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60%(w/v)の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、GRP78を認識する抗体を国際公開WO03/104453に記載された方法によって作成することもできる。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウエルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実施的に同質なGRP78タンパク質が好適に使用できる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をGRP78タンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる(特公平1−59878号公報参照)。この方法によって得られる抗GRP78抗体は、GRP78タンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。
さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるGRP78タンパク質を投与することによって、抗GRP78ヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞からGRP78タンパク質に対するヒト抗体を単離することによってもできる(国際公開WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602参照)。更に不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトGRP78を異物と認識する。したがって、ヒトGRP78に対するヒト抗体を容易に得ることができる。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている(例えば、Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767−775参照)。
たとえば、抗GRP78抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗GRP78抗体の可変領域(V領域)をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.et al.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)などを用いることができる。
抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス製)等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス製)などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First−strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社製)等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、5’−Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)およびPCRを用いた5’−RACE法(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998−9002、Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919−2932)を利用することができる。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認できる。
可変領域をコードする遺伝子を得るために、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使ったPCR法を利用することもできる。まず抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。
得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文(J.Mol.Biol.(1991)222,581−597)などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法を行う。
具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ1〜γ5、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3’側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5’側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。
重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、GRP78に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。
本発明の抗体のGRP78への結合は、特異的であることがさらに好ましい。GRP78に結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングすることができる。
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をGRP78に接触させる工程、
(2)GRP78と抗体との結合を検出する工程、および
(3)GRP78に結合する抗体を選択する工程。
抗体とGRP78との結合を検出する方法は公知である。具体的には、担体に固定したGRP78に対して被験抗体を反応させ、次に抗体を認識する標識抗体を反応させる。洗浄後に担体上の標識抗体が検出されれば、当該被験抗体のGRP78への結合を証明できる。標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性タンパク質、あるいはFITC等の蛍光物質を利用することができる。抗体の結合活性を評価するためにGRP78を発現する細胞の固定標本を利用することもできる。
結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv(scFv)とすることができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、scFvを表面に発現するファージを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するscFvを濃縮することができる。
本発明において抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の全長をコードしていてもよいし、あるいは抗体の一部をコードしていてもよい。抗体の一部とは、抗体分子の任意の部分を言う。以下、抗体の一部を示す用語として、抗体断片を用いる場合がある。本発明における好ましい抗体断片は、抗体の相補鎖決定領域(complementarity determinationregion;CDR)を含む。更に好ましくは、本発明の抗体断片は、可変領域を構成する3つのCDRの全てを含む。
目的とする抗GRP78抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化する。更に1コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素が好ましい。上記のように消化された抗GRP78抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターを得ることができる。このとき、抗体定常領域(C領域)をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させることによって、キメラ抗体を得ることができる。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来の生物が異なることを言う。したがって、マウス−ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト−ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入して、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。
具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列を配置しておくことができる。両者を同じ組み合わせの制限酵素で消化し、インフレームで融合させることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。
本発明の抗GRP78抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗GRP78抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖(H鎖)および軽鎖(L鎖)をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。H鎖とL鎖を組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換(co−transfect)することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい(国際公開WO 94/11523参照)。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、例えば、哺乳類細胞(CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Veroなど)、両生類細胞(アフリカツメガエル卵母細胞など)、昆虫細胞(sf9、sf21、Tn5など)などを用いることが可能である。
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)などのニコティアナ(Nicotiana)属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
更に真菌細胞としては、酵母(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces)属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属)、糸状菌(アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属)などを用いることができる。
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌(E.coli)、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させた発現ベクターを構築することができる。例えばプロモーター/エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター/エンハンサー(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)を挙げることができる。
また、その他に本発明の抗体の発現に使用できるプロモーター/エンハンサーとして、ウイルスプロモーター/エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α(HEF1α)などの哺乳類細胞由来のプロモーター/エンハンサー等が挙げられる。プロモーター/エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40(SV40)等を示すことができる。
SV40プロモーター/エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法(Nature(1979)277,108)を利用することができる。また、HEF1αプロモーター/エンハンサーはMizushimaらの方法(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法(Nature(1989)341,544−546;FASEBJ.(1992)6,2422−2427)を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法(Science(1988)240,1041−1043)により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列(Lei,S.P.et al.,J.Bacteriol.(1987)169,4379)を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素のグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される(refolded)。
発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス(BPV)等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカー挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等の選択マーカーを利用することができる。
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
また、組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ(またはその子孫)が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699−702)。本発明の組み換え抗体のC領域として、動物抗体由来のC領域を使用できる。例えばマウス抗体のH鎖C領域としては、Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεが、L鎖C領域としてはCκ、Cλが使用できる。また、マウス抗体以外の動物抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物抗体が使用できる。これらの配列は公知である。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、C領域を修飾することができる。本発明において、抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト化(Humanized)抗体などを含む。
これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体を言う。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体をを発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。例えばH鎖においては、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、およびCεをC領域として利用することができる。またL鎖においてはCκ、およびCλをC領域として使用できる。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾することができる。
一般にキメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成される。これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR;framework region)およびヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
抗体の可変領域は、通常、4つのフレーム(FR)にはさまれた3つの相補性決定領域(complementarity−determining region;CDR)で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。
ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは4つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において遊離であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
最終的に3つのCDRと4つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5’末端と3’末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される(欧州特許公開EP 239400、国際公開WO 96/02576参照)。
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる(Sato,K.et al.,Cancer Res,1993,53,851−856)。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作する。次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞融合させることによって、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体が取得できる(特公平1−59878参照)。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。
また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することにより所望のヒト抗体が取得できる(国際公開WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735参照)。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製できる。該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより該ヒト抗体が取得できる。これらの方法は既に公知である(国際公開WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388)。
本発明の抗体には、GRP78タンパク質に結合する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、GRP78タンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。
低分子化抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含む。GRP78抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び/又は挿入を含むことができる。さらにGRP78抗原への結合能を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(single chain Fv)、ディアボディー(Diabody)、sc(Fv)2(single chain(Fv)2)などを挙げることができる。これら抗体の多量体(例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー)も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる(例えば、Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968−2976、Better,M.& Horwitz,A.H.Methods in Enzymology(1989)178,476−496、Plueckthun,A.& Skerra,A.Methods in Enzymology(1989)178,476−496、Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652−663、Rousseaux,J.et al.,Methods in Enzymology(1989)121,663−669、Bird,R.E.et al.,TIBTECH(1991)9,132−137参照)。
消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる:
パパイン消化:F(ab)2またはFab;
ペプシン消化:F(ab’)2またはFab’;
プラスミン消化:Facb。
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,1988,85,5879−5883.)。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば3から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。 V領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および前記抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列の全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5’側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、[H鎖V領域DNA]−[ペプチドリンカーDNA]−[L鎖V領域DNA]の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。アセンブリーPCR用のプライマーは、[H鎖V領域DNA]の5’側にアニールするプライマーと、[L鎖V領域DNA]の3’側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方[ペプチドリンカーDNA]には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である(Hudson et al、J Immunol.Methods 1999;231:177−189)。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
また2つのVH及び2つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL([VH]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VL])の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー(例えば、Protein Engineering,9(3),299−305,1996参照)に開示されるリンカー等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、更に好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸(例えば、15アミノ酸)である。
ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。
あるいは、合成化学物リンカー(化学架橋剤)を利用してV領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えばN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ−EGS)、ジスクシンイミジル酒石酸塩(DST)、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩(スルホ−DST)、ビス[2−(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、ビス[2−(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ−BSOCOES)などを用いることが可能である。
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明において好ましい低分子化抗体はDiabody又はsc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい(例えば、Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968−2976;Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.(1989)178,476−496;Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497−515;Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986)121,652−663;Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.(1986)121,663−669;Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132−137参照)。
さらに、本発明の抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合させた抗体修飾物として使用することもできる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体(bispecific antibody)であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。すなわち本発明において、二重特異性抗体はGRP78分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することもできる。又、一方の認識部位がGRP78を認識し、他方の認識部位が細胞障害性物質を認識する二重特性抗体とすることも可能である。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
また本発明においては、GRP78以外の抗原を認識する二重特異性抗体を組み合わせることもできる。たとえば、GRP78と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、GRP78とは異なる抗原を認識するような二重特異性抗体を組み合わせることができる。
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる2種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する1/2分子であっても良いし、H鎖のみからなる1/4分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
抗体の結合活性
抗体の抗原結合活性の測定には公知の手段を使用することができる(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。更に、細胞に発現する抗原に対する抗体の結合活性を測定する手法としては、例えば、前記Antibodies A Laboratory Manual中の359‐420ページに記載されている方法が挙げられる。
また、緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原と当該抗原に対する抗体との結合を測定する方法として、特にフローサイトメーターを使用した方法を好適に用いることが出来る。使用するフローサイトメーターとしては例えば、FACSCantoTMII、FACSAriaTM、FACSArrayTM、FACSVantageTMSE、FACSCaliburTM(以上、BD Biosciences社)や、EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC 500、EPICS XL−MCL ADC EPICS XL ADC、Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(以上、Beckman Coulter社)などを挙げることができる。
被検GRP78抗体の抗原に対する結合活性の好適な測定方法の一例として、GRP78を発現する細胞と反応させた被検抗体を認識するFITC標識した二次抗体で染色後、FACSCalibur(BD社)により測定を行い、その蛍光強度をCELL QUEST Software(BD社)を用いて解析する方法を挙げることができる。
増殖抑制活性
抗GRP78抗体に基づく細胞増殖抑制効果を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、培地中に添加した[3H]ラベルしたチミジンの生細胞による取り込みをDNA複製能力の指標として測定する方法が用いられる。より簡便な方法としてトリパンブルー等の色素を細胞外に排除する能力を顕微鏡下で計測する色素排除法や、MTT法が用いられる。後者は、生細胞がテトラゾリウム塩であるMTT(3−(4,5−dimethylthiazol−2−yl)−2,5−diphenyl tetrazolium bromide)を青色のホルマザン産物へ転換する能力を有することを利用している。より具体的には、被検細胞の培養液にリガンドと共に被検抗体を添加して一定時間を経過した後に、MTT溶液を培養液に加えて一定時間静置することによりMTTを細胞に取り込ませる。その結果、黄色の化合物であるMTTが細胞内のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により青色の化合物に変換される。この青色生成物を溶解し呈色させた後にその吸光度を測定することにより生細胞数の指標とするものである。MTT以外に、MTS、XTT、WST−1、WST−8等の試薬も市販されており(nacalai tesqueなど)好適に使用することができる。活性の測定に際しては、対照抗体を用いることも可能である。
また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、腫瘍担持マウスモデルを用いることができる。例えば、GRP78を発現する癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被検抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞増殖抑制活性を評価することができる。試験管内での評価と同様に対照抗体を投与し、抗GRP78抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことにより細胞増殖抑制活性を判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのTリンパ球の機能を欠失したヌード(nu/nu)マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞増殖抑制活性の評価・測定に当たって被検動物中のTリンパ球の関与を除くことができる。
細胞の増殖を抑制する方法
本発明は、GRP78を発現する細胞と本発明の抗体とを接触させることにより当該細胞の増殖を抑制する方法を提供する。本発明の抗体は、本発明の細胞増殖抑制剤に含有されるGRP78タンパク質に結合する抗体として上述したとおりである。抗GRP78抗体と接触させる細胞はGRP78が発現している細胞であれば特に限定されないが、GRP78が細胞膜上に局在する細胞であることが好ましく、又、疾患に関連した細胞であることが好ましい。疾患に関連した細胞の好ましい例として癌細胞を挙げることができる。また、悪性腫瘍内に存在する血管内皮細胞(腫瘍血管)もこれに含まれる。対象となる癌種は特に限定されず、例えば前立腺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍を挙げることができる。
抗GRP78抗体を用いた送達方法
本発明は抗GRP78抗体を用いて細胞障害性物質を細胞内に伝達する方法に関する。本方法に用いられる抗体は上述の細胞障害性物質が結合した抗GRP78抗体である。その場合、インターナライズ活性を有する抗体であることが好ましい。細胞障害性物質の送達は細胞障害性物質が結合した抗GRP78抗体とGRP78を発現する細胞を接触させることにより行なうことができる。本発明において細胞障害性物質が送達される細胞は特に限定されないが、好ましくはGRP78が細胞膜上に局在する細胞であり、又、好ましくは疾患に関連した細胞である。疾患に関連した細胞の例としては癌細胞を挙げることができる。また、悪性腫瘍内に存在する血管内皮細胞(腫瘍血管)もこれに含まれる。対象となる癌種は特に限定されず、例えば前立腺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍を挙げることができる。
本発明において接触は、in vitroで行われてもよいし、in vivoで行われてもよい。この場合において、添加される抗体の形状としては、溶液又は凍結乾燥等により得られる固体等の形状が適宜使用できる。水溶液として添加される場合にあっては、純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。添加する濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは1pg/mlから1g/mlの範囲であり、より好ましくは1ng/mlから1mg/mlであり、更に好ましくは1μg/mlから1mg/mlが好適に使用されうる。
また本発明においてin vivoでの「接触」はGRP78発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や、内在的にGRP78を発現する癌細胞を有するヒトを含む動物に投与することによっても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物細胞増殖阻害剤および抗癌剤が全身または局部的に投与できる。また、被験動物の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の抗体投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。
医薬組成物
別の観点においては、本発明は、GRP78タンパク質に結合する抗体を含有する医薬組成物を特徴とする。又、本発明はGRP78タンパク質に結合する抗体を含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤を特徴とする。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
本発明において、GRP78タンパク質に結合する抗体を含有する細胞増殖抑制剤は、GRP78タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む細胞増殖を抑制する方法、または、細胞増殖抑制剤の製造におけるGRP78タンパク質に結合する抗体の使用と表現することもできる。
また、本発明において、GRP78タンパク質に結合する抗体を含有する抗癌剤は、GRP78タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法、または、抗癌剤の製造におけるGRP78タンパク質に結合する抗体の使用と表現することもできる。
本発明の医薬組成物(例えば、細胞増殖抑制剤、抗癌剤。)に含有される抗体はGRP78タンパク質と結合する限り特に制限はなく、本明細書中に例示されたいずれの抗体も用いることができる。
本発明の医薬組成物の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ(例えば、Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
医薬品の製造方法
本発明はさらに、以下の工程を含む医薬品、特に抗癌剤の製造方法を提供する。
以下の工程を含む医薬組成物の製造方法
(a) 抗GRP78抗体を提供する工程、
(b) (a)の抗体がインターナライズ活性を有するか否か確認する工程、
(c) インターナライズ活性を有する工程を選択する工程、
(d) (c)で選択された抗体に細胞障害性物質を結合する工程。
インターナライズ活性を有するか否かは上述の方法により確認することが可能である。又、抗GRP78抗体、細胞障害性物質についても上述の抗GRP78抗体、細胞障害性物質を用いることができる。
癌の診断
本発明は抗GRP78抗体を用いた疾患の診断方法、特に癌の診断方法を提供する。
本発明の診断方法は細胞内に取り込まれた抗GRP78抗体を検出することにより行なうことが可能である。本発明で用いられる抗GRP78抗体はインターナライズ活性を有していることが好ましく、又、標識物質で標識されていることが好ましい。
従って、本発明の診断方法の好ましい態様として、標識物質で標識され、かつインターナライズ活性を有する抗GRP78抗体を用いた診断方法を挙げることができる。標識物質を結合する抗GRP78抗体は上述の抗GRP78抗体を用いることができる。
抗GRP78抗体に結合する標識物質は特に限定されず、例えば、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗GRP78抗体との結合のためには、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法が使用できる。
抗体への標識物質の結合は当業者に公知の方法により行なうことができる。
本発明の方法によって診断される疾患が癌の場合、対象となる癌種は特に限定されず、例えば前立腺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍を挙げることができる。
本発明における診断はin vivoで行われてもよく、又、in vitroで行われてもよい。
診断がin vitroで行なわれる場合、例えば、以下の工程を含む方法により行なうことができる。
(a) 被検者から採取された試料を提供する工程、
(b) (a)の試料と標識物質が結合した抗GRP78抗体を接触させる工程、
(c) 細胞内に取り込まれた抗体を検出する工程。
採取される試料は特に限定されないが、例えば、被験者から採取された細胞、組織などが例示できる。又、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる二次的な試料も本発明の試料に含まれる。
診断がin vivoで行なわれる場合、例えば、以下の工程を含む方法により行なうことができる。
(a) 標識物質が結合した抗GRP78抗体を被験者に投与する工程、
(b) 癌細胞内に取り込まれた抗体を検出する工程。
抗GRP78抗体の投与量は標識物質の種類、診断される疾患の種類などにより当業者が適宜決定することができる。標識された抗GRP78抗体は上述の方法により製剤化してもよい。
本発明はさらに、以下の工程を含む診断薬、特に癌の診断薬の製造方法を提供する。
(a) 抗GRP78抗体を提供する工程、
(b) (a)の抗体がインターナライズ活性を有するか否か確認する工程、
(c) インターナライズ活性を有する工程を選択する工程、
(d) (c)で選択された抗体に標識物質を結合する工程。
インターナライズ活性を有するか否かは上述の方法により確認することが可能である。又、抗GRP78抗体、標識物質についても上述の抗GRP78抗体、標識物質を用いることができる。
GRP78部分ペプチド
本発明はSEQ ID NO:3(GRP78の376位から415位)のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその断片を提供する。SEQ ID NO:3(GRP78の376位から415位)のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその断片は、本発明の抗体を作製する際の免疫原や作製された抗体の結合活性の評価に有用である。本発明において断片は、少なくとも5アミノ酸以上であり、好ましくは10アミノ酸以上、さらに好ましくは15アミノ酸以上の断片である。SEQ IN NO:3のアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片の例としては、特に限定されないが、GRP78の384位から391位のアミノ酸配列からなる断片(SEQ ID NO:3の9〜16のアミノ酸配列からなる断片)、GRP78の392位から407位のアミノ酸配列からなる断片(SEQ ID NO:3の17〜32のアミノ酸配列からなる断片)、GRP78の400位から415位のアミノ酸配列からなる断片(SEQ ID NO:3の25〜40のアミノ酸配列からなる断片)などを挙げることができる。
1−1.免疫原の調製
1−1−1.GRP78大腸菌発現ベクターの作成
GRP78大腸菌発現ベクターを構築するため、まずGRP78遺伝子のクローニングを以下のとおり行った。まずヒトColon adenocarcinoma cDNA(MTC Multiple Tissue cDNA panel,クロンテック)を鋳型にしてPyrobest Taqポリメラーゼ(タカラ)を用いて以下の条件でRT−PCRを行い、全長GRP78遺伝子をクローニングした。
(94℃30秒、58℃30秒、72℃120秒:27サイクル)
次に、得られたPCR産物を鋳型にして、以下の条件で再度PCRを行い、SEQ ID NO:1の塩基配列のうち、塩基番号55〜1965のGRP78遺伝子断片に5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78 cDNA断片を得た。
(94℃30秒、64℃30秒、72℃120秒:25サイクル)
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1,アマシャムファルマシア)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78−full)を構築した。
1−1−2.GST融合GRP78タンパク質の発現誘導と精製
次に、GRP78結合抗体を取得するための免疫原として、GRP78タンパク質の調製を行った。
まず、pGEX−GRP78−fullで大腸菌(BL21)を形質転換した。これをLB培地(300ML)で培養し、OD610が0.5以上になったところで、IPTGを0.5mMになるように加え、タンパク質の発現誘導を行った。5時間培養後、大腸菌を遠心により集菌した。
集菌した大腸菌を30mlのB−BER(ピアス社)に懸濁し可溶化を行った。次に、この可溶化した大腸菌溶解物をPBSで10倍に希釈し、これにPBSで平衡化したグルタチオンセファロース4B(アマシャムファルマシア)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、PBSで数回洗浄して未吸着タンパク質を除去し、プロテアーゼ反応液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、pH7.5)中で、PreScissuionプロテアーゼ(アマシャムファルマシア)を4℃で一晩反応させた。この操作により、GRP78−GST融合タンパク質のGSTタンパク質とGRP78タンパク質(アミノ酸19〜654)とを分離切断した。続いて、プロテアーゼ消化によって溶出されたGRP78タンパク質を、Superdex200HR 10 30カラム(アマシャムファルマシア)を用いて、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離し、目的のGRP78タンパク質(アミノ酸19〜654)を回収した。
1−2.免疫
初回免疫ではCOMPLETE ADJUBANT(DIFCO:DF263810)で、二回目以降はIMCOMPLETE ADJUBANT(DIFCO:DF263910)によりGRP78タンパク質のエマルジョンを作成し、これを50μg/mouseで各マウス[(MRL/lpr、オス、4週齢)(Balb/c、メス、6週齢):いずれも日本チャールスリバーより購入]3匹ずつに皮下注射により免疫した(テルモシリンジ1mL、針26G)。初回免疫から2週間後に2回目の免疫を実施し、以降1週間おきに計4〜5回免疫を行った。最終免疫では、GRP78(50μg)を100μlのPBSに懸濁し、尾静脈注射により免疫を行い、その3日後に細胞融合を実施した。
1−3.ハイブリドーマの作成
細胞融合は以下のように行った。マウスより脾臓を無菌的に摘出し、medium 1(RPMI1640+PS)中ですりつぶして単一細胞懸濁液にした。これを70μmのナイロンメッシュ(Falcon)に通して脂肪組織等を取り除き、細胞数をカウントした。得られたB細胞をマウスミエローマ細胞(P3U1細胞)と、およそ2:1の細胞数比になるように混合し、1mLの50%PEG(Roche、cat #:783 641)を加えて、細胞融合を行った。融合した細胞をmedium2[RPMI1640+PS、10%FCS、HAT(Sigma、H0262)、5%BM condimed H1(Roche:#1088947)]に懸濁し、適当枚数(10枚)の96ウエルプレートに200μL/ウェルで分注し、37℃で培養した。1週間後に培養上清を用いて、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
実施例2:細胞膜上に局在するGRP78を認識する抗GRP78抗体のスクリーニング
2−1.GRP78結合抗体のELISAによるスクリーニング(一次スクリーニング)
細胞表面に局在する抗GRP78抗体を取得するため、まずはGRP78に結合する抗体のスクリーニングを行った。結合抗体のスクリーニングにはELISAを用いた。
大腸菌より精製したGRP78タンパク質を1μg/mlでコーティングしたELISA用プレート(NUNC)に、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、1時間インキュベートした。その後、アルカリフォスファターゼ(AP)標識抗マウスIgG(ZYMED:#62−6622)で1時間反応後、1mg/mlの基質(SIGMA:S0942−50TAB)を加え発色させた。プレートリーダー(BioRad社)によりOD405を測定し、ELISA陽性ウエルを選抜した。
2−2.細胞表面に局在する抗GRP78抗体のFACSによるスクリーニング(二次スクリーニング)
一次スクリーニングで、陽性だったウェルの培養上清を用いて、前立腺癌細胞株(DU145)に対する反応性を、FACSにより解析した。
DU145(ATCCより入手)は10%FCS、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM NEAAを含むEMEM(invitrogen)で培養・継代を行った。1mM EDTA/PBSでDU145をはがし、これにハイブリドーマの培養上清を反応させ、4℃で1時間インキュベートした。その後FITC標識抗マウスIgG抗体(BECKMAN COULTER:PN IM0819)を加え、4℃で30分インキュベートした。その後、各ハイブリドーマ培養上清のDU145細胞表面に対する結合活性をFACS(ベクトンディッキンソン)にて解析した。
2−3.限界希釈(Limiting dilution)
FACS解析によりDU145細胞への結合活性がわずかでも認められたウェルを選抜し、これらについて限界希釈(limiting dilution;LD)を行い、ウェル中のハイブリドーマの単一クローン化を行った。すなわち、各ウェルの細胞数を測定し、3cells/wellとなるように96wellプレートに播種した。約10日間培養し、コロニーが出現したウェルの培養上清について、再びELISAを行い、結合活性を指標にして抗体産生単一クローンのスクリーニングを行った。これら一連の作業により、GRP78結合抗体を6クローン得た(GA−19抗体、GA−20抗体、GA−21抗体、GA−23抗体、GA−28抗体、GA−31抗体)。
2−4.サブタイプの決定
抗体のサブタイプ決定はIsoStrip(Roche #1 493 027)を用いて行った。サブタイプ決定にはPBS(−)で10倍希釈したハイブリドーマの培養上清を用いた。
精製した各抗体のサブタイプは以下に示すとおりである。
得られた単一クローンのハイブリドーマの培養上清50mLからGA−19抗体、GA−23抗体、GA−28抗体、GA−31抗体は、Hi Trap Protein G HP 1mLカラム(Amersham Biosciences #17−0404−01)を用いて、また、IgMおよびIgG3であるGA−20抗体、GA−21抗体は、Protein L−agarose(SIGMA)1mlをオープンカラムに充填し、抗体の精製を行った。ハイブリドーマ上清を流速1mL/minで吸着させ、20mLの20mMリン酸バッファー(pH7.0)で洗浄した後、3.5mLの0.1M Glycine−HCl(pH2.7)で溶出した。溶出分画は、あらかじめ1M Tris−HCl(pH9.0)を50μLずつ加えたエッペンドルフチューブに0.5mlずつ回収した。OD280nmを測定し、抗体が含まれている分画をまとめ、PBS(−)を加えて全量2.5mLとした後、PD−10カラム(Amersham Biosciences #17−0851−01)を用いてPBS(−)にバッファー置換した。精製した抗体は0.22μmフィルター(MILLIPORE #SLGV033RS)を通し、以下詳細に各精製抗体の性質について検討を行った。
実施例3:GRP78抗体の解析
3−1.ウエスタンブロット解析
得られた抗体が、大腸菌より精製したGRP78(GST−GRP78)、さらに、DU145細胞内で発現するGRP78に特異的に結合することを確認するため、ウエスタンブロットを行った。
レーン1に、DU145細胞(1×106cells)を300μlのNP40溶解バッファー(0.5%NP40、10mM Tris−HCl、150mM NaCl、5mM EDTA、pH7.5)で可溶化した細胞可溶化サンプルを、レーン2に大腸菌より精製したGST融合GRP78タンパク質(0.1ug)をアプライし、定法に従ってPVDF膜にブロットした。これを各抗体(2μg/ml)で反応させ、二次抗体(HRP標識抗マウスIgG)で反応後、ECLウエスタンブロット検出試薬(GEヘルスケア)でタンパク質の検出を行った。その結果、得られた各抗体ともに、大腸菌で発現させたGST融合GRP78タンパク質ばかりでなく細胞内で内在性に発現するGRP78タンパク質も特異的に認識することが確認された(図1)。
3−2.FACS解析
3−2−1.前立腺癌株(DU145)の細胞表面結合活性
精製した各抗GRP78抗体が、癌細胞の細胞表面を染色するかをFACSにより解析した。
1mM EDTAではがしたDU145細胞に、FACSバッファー中で各抗体(10μg/ml)と4℃で1時間インキュベートした。その後FITC標識抗マウスIgG抗体(BECKMAN COULTER:PN IM0819)を加え、4℃で30分インキュベートした。その後、DU145細胞表面のGRP78への結合活性をFACS(ベクトンディッキンソン)にて解析した。
その結果、得られた抗GRP78抗体6クローンのうち、2クローン(GA−20抗体、GA−21抗体)がDU145細胞を染色した(図2)。
このことから、GA−20抗体、GA−21抗体は、癌細胞で発現するGRP78分子の細胞外エピトープを認識していることが確認された。
GA−20抗体の重鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:4に、重鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:5に、軽鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:6に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:7に、それぞれ記載する。又、GA−20抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:8に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:9に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:10に、軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:11に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:12に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:13に、それぞれ記載する。
GA−21抗体の重鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:14に、重鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:15に、軽鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:16に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:17に、それぞれ記載する。又、GA−21抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:18に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:19に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:20に、軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:21に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:22に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:23に、それぞれ記載する。
3−2−2.他の癌種に対するFACS結合活性の評価
次に、細胞表面に局在するGRP78認識抗体GA−20抗体を用いて、他の癌種に対するFACS反応性を調べた。卵巣癌細胞株(ES−2、SKOV3)、乳癌細胞株(MCF7)、大腸癌細胞株(LoVo)、前立腺癌細胞株(DU145、LNcap、22Rv1、PC3)は、ATCCより購入し、ATCC推奨の培養条件で培養を行った。これらの細胞に対してGA−20抗体(10μg/ml)を用いて前述のとおり染色し、FACS解析を行った。その結果、GA−20抗体はDU145だけでなくLoVo、LNcap、22Rv1など複数の癌細胞も染色することが確認された(図3)。
3−2−3.癌以外の細胞に対するFACS結合活性の評価
次に、癌細胞以外の細胞株に対するFACS結合活性を解析した。サル腎細胞(COS7)、ヒト正常繊維芽細胞(MRC5)、マウスプロB細胞(Ba/F3)、マウス繊維芽細胞(NIH3T3)、ハムスター卵巣細胞(DG44)は、ATCCより購入し、ATCC指定の培地で培養を行った。これらの細胞を、GA−20抗体(10μg/ml)で染色し、FACS解析を行った。同時に、NP40溶解バッファーで細胞を可溶化し、GA−20抗体(2μg/ml)でウエスタンブロットを行った。その結果、これらの細胞はすべてGRP78を発現しているのにも関わらず(図4B)、FACSで染色されなかった(図4A)。このことから、細胞はGRP78を発現していても、癌細胞などある特定の細胞でしか、細胞表面へと局在しないことが推測された。
3−3.インターナライズ活性の解析
3−3−1.FACSによる解析
細胞表面を染色する抗GRP78認識抗体(GA−20抗体、GA−21抗体)にインターナライズ活性があるかを調べるため、以下の実験を行った。
DU145細胞を1mM EDTAではがし、一方は、FACSバッファー(2%FCS、0.05%NaN3を含むPBS)中で各抗体(10μg/ml)と0℃で2時間作用させ、もう一方は、培養液中(10%FCSを含むRPMI1640)で各抗体(10μg/ml)と37℃で2時間インキュベートした。その後FITC標識マウスIgGで細胞表面に残存する抗体の検出をFACS解析により行った。
その結果、いずれの抗体とも37℃で二時間反応させることにより細胞表面より抗体が消失することが確認された(図5)。
3−3−2.細胞免疫染色による解析
次にこの現象が、抗体の細胞外への放出ではないことを確認するため、以下の実験を行った。ディッシュ中で培養しているDU145細胞に、GA−20抗体、あるいは、ネガティブコントロールとして細胞表面には結合しないGA−31抗体をそれぞれ20μg/mlずつ添加し、37℃で3時間培養した。これをPBSで洗浄後、グリシンバッファー(0.1M Glycin、pH2.7)で細胞を2回洗浄し、細胞表面に結合する抗体を除去した。その後、4%パラホルムアルデヒドを室温で10分間作用させ細胞を固定し、続いて0.1%Triton X100を5分間室温で作用させた。これをFITC標識マウスIgGで染色し、細胞内に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡(キーエンス)で観察した。
その結果、細胞表面に結合する活性を有するGA−20抗体においては、抗体が細胞内に検出されたが、細胞表面に結合しないGA−31抗体では細胞内に抗体が検出されなかった(図6)。この結果から、37℃で3時間培養することにより、細胞表面に結合したGA−20抗体が細胞内に取り込まれていることが確認された。
実施例4:EPITOPE解析
4−1.エピトープマップ用GST融合タンパク質の調製
4−1−1.エピトープマップ用GST融合タンパク質発現ベクターの作成
各抗体のエピトープを同定することを目的として、まずGRP78タンパク質をさまざまな領域ごとに分けたGST融合タンパク質の大腸菌発現ベクターの構築を行った。
4−1−1−1.GST−GRP78−N(19−350)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−1(SEQ ID NO:28)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−3(SEQ ID NO:30)を用いて94℃ 30秒、64℃ 30秒、72℃ 120秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸19−350をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78−N(19−350))を構築した。
4−1−1−2.GST−GRP78−C(289−654)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−4(SEQ ID NO:31)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−2(SEQ ID NO:29)を用いて94℃ 30秒、64℃ 30秒、72℃ 120秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸289−654をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78−C(289−654))を構築した。
4−1−1−3.GST−GRP78−C(289−350)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−4(SEQ ID NO:31)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−3(SEQ ID NO:30)を用いて94℃ 30秒、72℃ 30秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸289−350をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78−C(289−350))を構築した。
4−1−1−4.GST−GRP78−C(289−445)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−4(SEQ ID NO:31)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−5(SEQ ID NO:32)を用いて94℃ 30秒、72℃ 30秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸289−445をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78−C(289−445))を構築した。
4−1−1−5.GST−GRP78−C(289−538)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−4(SEQ ID NO:31)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−6(SEQ ID NO:33)を用いて94℃ 30秒、72℃ 30秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸289−538をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78−C(289−538))を構築した。
4−1−1−6.GST−GRP78(345−385)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−7(SEQ ID NO:34)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−8(SEQ ID NO:35)を用いて94℃ 30秒、64℃ 30秒、72℃ 30秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸345−385をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78(345−385))を構築した。
4−1−1−7.GST−GRP78(376−415)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−9(SEQ ID NO:36)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−10(SEQ ID NO:37)を用いて94℃ 30秒、64℃ 30秒、72℃ 30秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸376−415をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78(376−415))を構築した。
4−1−1−8.GST−GRP78(406−445)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−11(SEQ ID NO:38)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−5(SEQ ID NO:32)を用いて94℃ 30秒、64℃ 30秒、72℃ 30秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸406−445をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78(406−445))を構築した。
4−1−1−9.GST−GRP78(345−445)発現ベクターの構築
pGEX−GRP78−fullを鋳型にして、センスプライマーにGRP−GST−7(SEQ ID NO:34)を、アンチセンスプライマーGRP−GST−5(SEQ ID NO:32)を用いて94℃ 30秒、64℃ 30秒、72℃ 30秒×25サイクルでPCRを行い、5’端、3’端にそれぞれBamHI、XhoI切断配列が付加されたGRP78(アミノ酸345−445をコード)するcDNA断片を得た。
これをBamHI、XhoIで切断し、同じくBamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、GRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(pGEX−GRP78(345−445))を構築した。
以下に使用したプライマーの配列を示す。
4−1−2.各GST融合GRP78タンパク質の発現誘導
これら構築した各大腸菌発現ベクターを用いて、それぞれ大腸菌BL21株にトランスフォームした。これら大腸菌をLB培地(各1ml)で培養し、対数増殖期にIPTG(最終1mM)を添加し、タンパク質発現を誘導した。4〜5時間後に大腸菌を回収し、SDSサンプルバッファー(0.5ml)に溶解して溶解物とし、このうち5μlを定法に従ってSDS−PAGE、続いてPVDF膜にブロットし、ウエスタンブロットに用いた。
4−2.各抗体のエピトープマップ
上記で調製した、GRP78タンパク質の各領域GST融合タンパク質を用いて、ウエスタンブロットを行い、得られた各抗GRP78抗体が、GRP78タンパク質のどの領域を認識するか調べた。
最初のウエスタンブロットの結果(図7)より、FACSで細胞を染色しないGA−19抗体はN端半分(19−350)を、GA−23抗体、GA−28抗体、GA−31抗体は、C端の538−654の領域を認識していた。
一方、FACSで細胞を染色するGA−20抗体、GA−21抗体は、ウエスタンブロットの染色パターンから、350−445の約100アミノ酸にまたがる領域を認識していることが明らかになった。
次に、この350−445の領域を3つの領域に分割したGST融合タンパク質を作成し、上記と同様にウエスタンブロットを行いGA−20抗体、GA−21抗体の結合領域の同定を行った。その結果、GA−20抗体、GA−21抗体のエピトープは、GRP78タンパク質内アミノ酸番号376−415の40アミノ酸であることが分かった(図8)。
実施例5:細胞外領域認識抗GRP78抗体(GA−20抗体)を利用した細胞死誘導剤の作製
5−1.GA−20抗体の可変領域のクローニングとアミノ酸配列の解析
ハイブリドーマ約5×106個からTrizol(#15596−018,Life technologies)を用いてtotal RNAを精製した。得られたtotal RNA 1μgよりSMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH #PT3269−1)を用い、添付のマニュアルにしたがって全長cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型にして、Advantage 2 PCR Enzyme System(CLONTECH #PT3281−1)を用い、以下の条件でPCRを行ってGA−20抗体の重鎖(VH)、および軽鎖(VL)の可変領域をコードする遺伝子を増幅した。
軽鎖可変領域のクローニング用プライマー
ユニバーサルプライマーミックス(UPM)〜k(VL−k)
UPM:Kitに添付
重鎖可変領域のクローニング用プライマー
UPM〜VH−M
UPM:Kitに添付
94℃ 5秒、72℃ 2分、5サイクル
94℃ 5秒、70℃ 10秒、72℃ 2分、5サイクル
94℃ 5秒、68℃ 10秒、72℃ 2分、27サイクル
上記操作により増幅した遺伝子断片をpCRII−TOPO(Invitrogen TOPO TA−cloning kit,#45−0640)にTA−クローニングし、その後それぞれのインサートについてABI3730シークエンサーにより塩基配列を確認した。
5−2.トキシン標識GA−20_一本鎖Fv抗体(GA20_PE40)の作製
5−2−1.GA20_PE40発現ベクターの作製
5−2−1−1.pET22b_His_PE40の作製
細胞表面に局在するGRP78を特異的に認識する抗体GA−20抗体をベースにして、イムノトキシン(PE40)を標識した細胞死誘導抗体の作製を試みた。
まずGA−20抗体の一本鎖Fv(scFv)にトキシン(PE40)を付加したトキシン標識抗体(GA20_PE40)をコードする発現ベクターの構築を行った。イムノトキシンであるPE40遺伝子は、ATCCより購入したプラスミドDNA(pJH8)を鋳型とし、以下の条件でPCR増幅を行った。
5’端にEcoRI認識配列、続いて18アミノ酸からなるリンカー配列を付加したセンスプライマー(PE−1)、及び5’端にNotI認識配列、続いて終止コドン、ER移行シグナル配列(KDEL)、FLAGタグ配列を付加したアンチセンスプライマー(PE−2)を用い、10×KOD−Plusバッファー、2mM dNTPs、25mM MgSO4、KOD−Plus(タカラ社製)中で、 98℃ 10秒、72℃ 5秒、68℃ 4分、5サイクル
98℃ 10秒、70℃ 5秒、68℃ 4分,5サイクル
98℃ 10秒、68℃ 4分、25サイクル
でPCR増幅を行った。プライマー配列は以下に示すとおりである。
このPCR反応による増幅産物をpGEM−T Easy Vector System I(Promega社製)を用いてpGEM−T easyに挿入した。配列はABI3730シークエンサーにより確認した。
次に、大腸菌発現ベクターpET22bベクター(Novagen社製)のPelBシグナル配列下にHisタグ配列、HindIII認識配列、EcoRI認識配列、NotI認識配列を挿入し、pET22b_Hisの作製を行った。
そして、PCR増幅によりpGEM−T easyにクローニングしたPE40遺伝子をEcoRI、NotIにより消化してアガロースゲルより切り出し、この遺伝子断片をpET22b_HisのEcoRI−NotI間へ挿入し、pET22b_His_PE40を作製した。
5−2−1−2.pET22b_His_GA20scFv−PE40の構築
GA20抗体の一本鎖Fv、すなわち15アミノ酸からなるリンカー配列((GlyGlyGlyGlySer)3)(SEQ ID NO:43)で連結したGA−20抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片を以下の条件でPCRを行い増幅した。
まずpCRII−TOPOにTA−クローニングしたGA−20抗体重鎖可変領域を鋳型にして、重鎖可変領域はセンスプライマー(GA20−1;SEQ ID NO:44)、アンチセンスプライマー(GA20−2;SEQ ID NO:45)を用い、一方、軽鎖可変領域はセンスプライマー(GA20−3;SEQ ID NO:46)、アンチセンスプライマー(GA20−4;SEQ ID NO:47)を用い、pyrobest DNAポリメラーゼ(TAKARA#R005)により94℃ 1分反応後、94℃ 30分、72℃ 30分、25サイクルでPCR増幅を行った。
次に、ここで得られた重鎖、および、軽鎖可変領域のPCR産物をS−300HRカラム(Amersham Biosciences #27−5130−01)で精製して、各々1μLずつを同一チューブに混合しpyrobest DNAポリメラーゼを用いて94℃ 1分反応後、94℃ 30分、72℃ 30分、5サイクルでアニール反応を行った。
アニール後の反応液1μLをプライマーGA20−1(SEQ ID NO:44)、GA20−4(SEQ ID NO:47)を用いて以下の条件でpyrobest DNAポリメラーゼにより94℃ 1分反応後、94℃ 30分、72℃ 1分、25サイクルでPCR増幅を行った。
増幅した断片をS−400HRカラム(Amersham Biosciences #27−5140−01)で精製して、EcoRI−HindIIIで切断し、アガロースゲルより切り出した。これを5−2−1−1で作製したpET22b_His_PE40のHindIII、EcoR間に挿入して、塩基配列を確認し、pET22b_His_GA20scFv−PE40を作製した。
用いたプライマーの配列を以下に示す。
得られたGA20_PE40の塩基配列をSEQ ID NO:24に、その塩基配列が規定するアミノ酸配列をSEQ ID NO:25にそれぞれ示す。
5−2−2.トキシン標識GA−20_一本鎖Fv抗体(GA20_PE40)の精製
pET22b_His_GA20scFv−PE40でトランスフォームした大腸菌BL21株を50μg/mlのアンピシリンを含むLB Agar plateに撒いた。生育したシングルコロニーをピックアップし、50μg/mlのcarbenicillin(コスモバイオ)を含むLB培地(3ml)で培養した。4時間培養後、生育した菌を200mlのcarbenicillin(50μg/ml)を含むLB培地に拡大し、培養を続けた。対数増殖期になったところで、培養液を新しいLB培地(carbenicillin入り、200ml)に置換し、IPTG(final 1mM)を添加して、タンパク質発現の誘導を行った。5時間培養後、菌を遠心により回収した。
プロテアーゼインヒビターコンプリートEDTAフリー(ロッシュ)存在下で20mlB−BER(ピアス社)に懸濁して菌を可溶化し、続いて不溶性タンパク質を遠心により除去して、cell lystaeを調製した。この細胞可溶化サンプルをHisTrapカラム(HiTrap chelating HP 1ml,アマシャムファルマシア)にアプライし、添付のプロトコールに従ってGA20_PE40の精製を行った。すなわち、カラムに吸着したタンパク質を、結合バッファー(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、10mMイミダゾール、pH7.4)で洗浄し、溶出バッファー(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、500mMイミダゾール、pH7.4)で500μlずつ計7フラクション分取することにより溶出を行った。
溶出した各フラクションについて、目的のトキシン標識GA20抗体がどのフラクションに溶出されているかを確認するため、GRP78に対する結合活性を指標にしたELISAアッセイを行い、溶出フラクション結合活性を調べた。ELISAは以下のとおり実施した。大腸菌より精製したGST−GRP78、あるいはネガティブコントロールとしてHB−EGFタンパク質(R&D社)を1μg/mlでコートしたプレート(NUNC)に、Diluentバッファー(1%BSA、50mM Tris、1mM MgCl2、150mM NaCl、0.05% Tween20)で40倍に希釈した各フラクションを添加した。室温で1時間反応後、TBS−T(TBS−0.05% Tween20)で3回プレートを洗浄し、抗Flag抗体(M2抗体、シグマ)を1μg/ml加え、室温で1時間インキュベートした。再びTBS−Tで3回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(ZYMED)で1時間反応後、1mg/ml基質(シグマ)で発色を行った。
その結果、溶出フラクション2、3(Elute2、3)でGRP78に特異的な結合活性が認められ、このことよりElute2、3にGA20−PE40タンパク質が濃縮されていることが確認された(図9下)。
そこでElute2、3、4を、PD−10カラム(GEヘルスケア)を用いて、添付の説明文書に従ってPBSへのバッファー置換を行った。これらは、0.22μmのフィルター(ミリポア)を通しろ過滅菌を行い、細胞障害活性の検討に用いた。
5−3.トキシン標識抗GRP78抗体(GA20−PE40)の抗腫瘍活性の解析
得られたGA20−PE40について、細胞死誘導活性を解析した。
ハムスター卵巣細胞DG44は、1×103/wellで、前立腺癌細胞株DU145、22Rv1は6×103/wellで90μl/wellずつ96well plateに撒いた。翌日、GA20−PE40分画(Elute2、3、4)およびPBSを10μl/wellずつ添加し、37℃で培養した。5日後に、WST−8(同仁化学)試薬により生細胞数を測定し、コントロール(PBS添加群)と比較した生細胞の割合を数値化し、グラフにした。
その結果、DG44では細胞生育におけるGA20−PE40の影響はまったく認められなかった(図10C)のに対し、2種類の前立腺癌細胞株(DU145、22Rv1)では、GRP78結合活性が認められたElute2、3で、細胞障害活性が認められた(DU145について図10A、22Rv1について図10B)。
この結果から、GRP78の細胞外エピトープ(350−445)に対する抗体が、抗腫瘍剤として有用であることが明らかになった。
実施例6:再免疫による抗GRP78抗体の取得
6−1.免疫原GST−GRP78(376−415)タンパク質の調製
実施例4に記載したこれまでの解析から、GRP78タンパク質のアミノ酸376位〜415位からなる領域がGRP78の細胞外領域であることが推測された。そこで次に、この領域を再免疫し、GRP78の細胞外領域を認識するアフィニティの強い抗体の樹立を試みた。
まず実施例4に記載したGST−GRP78(376−415)発現ベクター(pGEX−GRP78(376−415))で形質転換した大腸菌(BL21)をLB培地(250ml)で培養し、OD610が0.5以上になったところでIPTG(1mM)によるタンパク質の発現誘導を行った。5時間培養の後大腸菌を集菌し、25mlのB−PER(ピアス社)で可溶化した。次に、この可溶化した大腸菌溶解物をPBSで10倍に希釈し、これにPBSで平衡化したグルタチオンセファロース4B(アマシャムファルマシア)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、グルタチオンセファロース4BをPBSで数回洗浄して未吸着タンパク質を除去し、目的タンパク質を20mMグルタチオンで溶出した。
溶出フラクションをSDS−PAGE後、CBBにより染色し、目的のタンパク質を含むフラクションをまとめた。このサンプルをさらにゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex200 16/60、GEヘルスケア)を用いてPBS中で不純タンパク質と分離を行い、目的タンパク質だけを高純度に精製した。この精製タンパク質を免疫原として以下の実験に使用した。
6−2.GST−GRP78(376−415)タンパク質の免疫
実施例6−1で精製したGST−GRP78(376−415)を、実施例1−2と同様の手法によりマウス[(MRL/lpr、オス、4週齢)(Balb/c、メス、6週齢):いずれも日本チャールスリバーより購入]に免疫した。ハイブリドーマの作製は、実施例1−3に記載のとおり行った。
6−3.抗GRP78抗体のスクリーニング
6−3−1.MBP−GRP78(376−415)タンパク質の精製
GRP78(アミノ酸376位〜415位)とマルトース結合タンパク質(MBP)の融合タンパク質(MBP−GRP78(376−415))の調製は以下のとおり行った。
実施例4で作成したpGEX−GRP78(376−415)をBamHI−SalIで切断し、GRP78(376−415)をコードする遺伝子断片を切り出した。これを、pMAL−c2X(New England BioLabs)のBamHI−SalI間に挿入し、MBP−GRP78(376−415)発現ベクターpMAL−c2X−GRP78(376−415)を構築した。
次に、このベクターで形質転換した大腸菌BL21株をLB培地(250ml)で培養し、OD610が0.5以上になったところでIPTG(1mM)によるタンパク質の発現誘導を行った。5時間培養の後大腸菌を遠心により集菌し、25mlのB−PER(ピアス社)で可溶化した。次に、この可溶化した大腸菌溶解物をカラムバッファー(20mM Tris、pH7.5、200mM NaCl、1mM EDTA)で5倍に希釈し、これにカラムバッファーで平衡化したアミロースレジン(New England BioLabs)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、カラムバッファーでアミロースレジンを数回洗浄して未吸着タンパク質を除去し、目的タンパク質を溶出バッファー(10mMマルトースを含むカラムバッファー)で溶出した。溶出フラクションをSDS−PAGE後、CBB染色により目的のタンパク質を含むフラクションを同定し、これらを1つにまとめ、PD10カラムによりPBSにバッファー置換した。ここで精製したMBP−GRP78(376−415)は、結合抗体のELISAスクリーニング用として以下の実験に使用した。
6−3−2.GRP78結合抗体のELISAによるスクリーニング(一次スクリーニング)
実施例6−3−1で精製したMBP−GRP78(376−415)を1μg/mlでコートしたELISA用プレートを用いて、GRP78タンパク質のアミノ酸376位〜415位の領域に結合する抗体のスクリーニングを行った。
方法は実施例2−1に記載のとおりである。MBP−GRP78(376−415)タンパク質への結合活性を指標にした一次スクリーニングで絞られたGRP78結合抗体を、引き続いて以下に記載する二次スリーニングにかけた。
6−3−3.細胞表面に局在する抗GRP78抗体のFACSによるスクリーニング(二次スクリーニング)
一次スクリーニングで得られたGRP78結合抗体について、次に前立腺癌細胞株(DU145および22Rv1(ATCC CRL−2505))に対する結合活性を指標に二次スクリーニングを行った。方法は実施例2−2に記載のとおりである。
その結果、前立腺癌細胞株をFACSで染色する抗体として、あらたにGC−18抗体、GC−20抗体、GD−4抗体、GD−17抗体の4抗体が見出された。
これら抗体について、実施例2−3に記載の方法で限界希釈し、モノクローン化した。これら抗体のサブタイプは、実施例2−4に記載の方法にて決定した。各抗体のサブタイプは以下に示すとおりである。
6−4.再免疫により新たに得られた抗体の解析
6−4−1.FACS解析
精製した4種類の抗体が癌細胞の細胞表面を染色することを確認するため、前立腺癌細胞株(22Rv1)を用いて、FACS解析を行った。各抗体(10μg/ml)で細胞を染色し、以下実施例3−2−1に記載の方法によりFACS解析を行った。
その結果、これらの抗体はいずれも、22Rv1細胞の細胞表面に結合することが確認された(図11)。
6−4−2.エピトープマッピング
ここで得られた4種類の抗体は、GST−GRP78(376−415)タンパク質を免疫して樹立していることから、GRP78のアミノ酸376位〜415位の部分領域を認識している抗体である。そこで次に、さらにこの領域を図12Aに示すとおり4つの領域(アミノ酸376位〜391位(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸1〜16)、アミノ酸384位〜399位(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸9〜24)、アミノ酸392位〜407位(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸17〜32)、アミノ酸400位〜415位(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸25〜40))に分割し、4種類の抗体がそれぞれGRP78のアミノ酸376位〜415位中のどの配列を認識しているかを調べた。
6−4−2−1.エピトープマップ用GST融合タンパク質の調製
6−4−2−1−1.エピトープマップ用GST融合タンパク質発現ベクターの作成
まずGRP78タンパク質のアミノ酸376位〜391位、アミノ酸384位〜399位、アミノ酸392位〜407位、そしてアミノ酸400位〜415位からなる領域をそれぞれコードするDNA断片を以下のとおり作成した。
GRP78(376−391)(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸1〜16)をコードするDNA断片はオリゴマー(GEP1/GEP2;それぞれSEQ ID NO:48および49)を、GRP78(384−399)(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸9〜24)をコードするDNA断片はオリゴマー(GEP3/GEP4;それぞれSEQ ID NO:50および51)を、GRP78(392−407)(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸17〜32)をコードするDNA断片はオリゴマー(GEP5/GEP6;それぞれSEQ ID NO:52および53)を、GRP78(400−415)(すなわち、SEQ ID NO:3のアミノ酸25〜40)をコードするDNA断片はオリゴマー(GEP7/GEP8;それぞれSEQ ID NO:54および55)をそれぞれアニールさせることにより作製した。
以下にここで使用したオリゴマーの配列を示す。
ここで作製したDNA断片を、BamHI、XhoIで切断した大腸菌GST融合発現ベクター(pGEX−6P−1)のGSTコード領域の下流に挿入し、各領域をコードするGRP78−GST融合タンパク質発現ベクター(それぞれpGEX−GRP78(376−391)、pGEX−GRP78(384−399)、pGEX−GRP78(392−407)、pGEX−GRP78(400−415))を構築した。
6−4−2−1−2.各GST融合GRP78タンパク質の発現誘導
これら構築した大腸菌発現ベクターは、大腸菌BL21株にトランスフォームし、実施例4−1−2に記載の方法によりタンパク質の発現誘導を行った。その結果、図12Bに示すとおり、目的のタンパク質が大腸菌で発現していることが確認された。そこでこのタンパク質を用いて、以下エピトープマップに用いた。
6−4−2−2.各抗体のエピトープマップ
上記のとおり調製したGST融合タンパク質を用いてウエスタンブロットを行い、得られた各抗GRP78抗体が、GRP78タンパク質のどの領域を認識するか調べた。
ウエスタンブロットの染色パターン(図13)から、GD−17抗体はGRP78のアミノ酸384位〜391位にまたがる領域を、GC−18抗体とGC−20抗体はアミノ酸392位〜407位にまたがる領域を、またGD−4抗体はアミノ酸400位〜415位の領域を認識していることが分った。また、初期に得られたGA−20抗体もGD−4抗体と同じ領域を認識していることが分かった(図13)。
6−4−3.可変領域のクローニングとアミノ酸配列の決定
新たに得られた抗体(GC−18抗体、GC−20抗体、GD−4抗体、GD−17抗体)の可変領域のクローニングとアミノ酸配列の解析を実施例5−1に記載の方法により行った。ただし、これら抗体はすべてIgG1であったため、重鎖可変領域は、以下のVH−G1プライマー(SEQ ID NO:56):
を用いてクローニングを実施した。
増幅した軽鎖および重鎖遺伝子断片をpCRII−TOPO(Invitrogen TOPO TA−cloning kit、#45−0640)にTA−クローニングし、その後それぞれのインサートについて塩基配列を確認した。
GRP78のアミノ酸392位〜407位にまたがる領域に結合するGC−18抗体の重鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:57に、重鎖可変領域の塩基配列アミノ酸配列をSEQ ID NO:58に、軽鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:59に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:60に、それぞれ記載する。また、GC−18抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:61に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:62に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:63に、軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:64に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:65に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:66に、それぞれ記載する。
GRP78のアミノ酸392位〜407位にまたがる領域に結合するGC−20抗体の重鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:67に、重鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:68に、軽鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:69に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:70に、それぞれ記載する。また、GC−20抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:71に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:72に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:73に、軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:74に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:75に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:76に、それぞれ記載する。
GRP78のアミノ酸400位〜415位の領域に結合するGD−4抗体の重鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:77に、重鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:78に、軽鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:79に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:80に、それぞれ記載する。また、GD−4抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:81に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:82に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:83に、軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:84に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:85に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:86に、それぞれ記載する。
GRP78のアミノ酸384位〜391位にまたがる領域に結合するGD−17抗体の重鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:87に、重鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:88に、軽鎖可変領域の塩基配列をSEQ ID NO:89に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をSEQ ID NO:90に、それぞれ記載する。また、GD−17抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:91に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:92に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:93に、軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列をSEQ ID NO:94に、CDR2のアミノ酸配列をSEQ ID NO:95に、CDR3のアミノ酸配列をSEQ ID NO:96に、それぞれ記載する。
実施例7:トキシン標識GD17一本鎖抗体(GD17_scFv−PE40)による薬効解析
7−1.GD17_scFv−PE40発現ベクターの作製
GD−17抗体の一本鎖Fv、すなわち15アミノ酸からなるリンカー配列((GlyGlyGlyGlySer)3)(SEQ ID NO:43)で連結したGD−17抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片を以下の条件でPCRを行い増幅した。
まずpCRII−TOPOにTA−クローニングしたGD−17抗体重鎖可変領域を鋳型にして、重鎖可変領域はセンスプライマー(GD17−1、SEQ ID NO:97)、アンチセンスプライマー(GD17−2、SEQ ID NO:98)を用い、一方、軽鎖可変領域はセンスプライマー(GD17−3、SEQ ID NO:99)、アンチセンスプライマー(GD17−4、SEQ ID NO:100)を用い、pyrobest DNAポリメラーゼ(TAKARA#R005)により94℃ 1分反応後、94℃ 30分、72℃ 30分、25サイクルでPCR増幅を行った。
次に、ここで得られた重鎖、および、軽鎖可変領域のPCR産物をS−300HRカラム(Amersham Biosciences #27−5130−01)で精製して、各々1μLずつを同一チューブに混合しpyrobest DNAポリメラーゼを用いて94℃ 1分反応後、94℃ 30分、72℃ 30分、5サイクルでアニール反応を行った。
アニール後の反応液1μLをプライマーGD17−1(SEQ ID NO:97)、GD17−4(SEQ ID NO:100)を用いて以下の条件でpyrobest DNAポリメラーゼにより94℃ 1分反応後、94℃ 30分、72℃ 1分、25サイクルでPCR増幅を行った。
増幅した断片をS−400 HRカラム(Amersham Biosciences #27−5140−01)で精製して、EcoRI−HindIIIで切断し、アガロースゲルより切り出した。これを実施例5−2−1−1で作製したpET22b_His_PE40のHindIII、EcoRI間に挿入して、塩基配列を確認し、pET22b_His_GD17scFv−PE40を作製した。
用いたプライマーの配列を以下に示す。
得られたGD17scFv_PE40の塩基配列をSEQ ID NO:101に、その塩基配列が規定するアミノ酸配列をSEQ ID NO:102にそれぞれ示す。
7−2.トキシン標識一本鎖抗体の大量精製
pET22b_His_GD17scFv−PE40で形質転換した大腸菌BL21株をcarbenicillin(50μg/ml)を含むLB培地で培養した。対数増殖期になったところでIPTG(最終用量1mM)を添加し、室温(24℃)で一晩培養してタンパク質誘導を行った。遠心にて回収した大腸菌は、結合バッファー(20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)中に懸濁し、ソニケーションにより破砕し、可溶性画分をHisTrap FF crudeカラム(GEヘルスケア)にかけた。その後目的タンパク質を溶出バッファー(20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、500mMイミダゾール、pH7.4)で溶出し、TBSバッファーで10倍程度希釈した後、これをM2アガロース(シグマ)を充填して作製したアフィニティゲルにかけた。AKTAエクスプローラ(GEヘルスケア)を用いて目的タンパク質をM2溶出バッファー(0.1Mグリシン−HCl、pH.3.5)で溶出し、これを速やかにPD10カラム(GEヘルスケア)を用いてPBSにバッファー置換し最終標品とした。
精製したGD17scFv−PE40は、SDS−PAGE後CBB染色を行い、100%の純度で精製されていることを確認した(図14)。
7−3.GRP78タンパク質に対する結合活性の解析
次に、精製GD17scFv−PE40タンパク質のGRP78結合活性を解析した。4℃保存、37℃で一晩置いたもの、および、凍結融解を行った標品で、それぞれ固相化GRP78に対する結合活性をELISAで測定・比較した。
各標品を希釈用バッファー(1%BSA、50mM Tris、1mM MgCl2、150mM NaCl、0.05%Tween20)で希釈し、これを大腸菌より精製したGST−GRP78(1μg/ml)でコートしたプレート(NUNC)に添加した。室温で1時間反応後、TBS−T(TBS−0.05%Tween20)で3回プレートを洗浄し、抗Flag抗体(M2抗体、シグマ)をlμg/ml加え、室温で1時間インキュベートした。再びTBS−Tで3回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(ZYMED)で1時間反応後、1mg/ml基質(シグマ)で発色を行った。
その結果、GD17scFv−PE40タンパク質のGRP78タンパク質に対する結合活性は、4℃保存、37℃で一晩置いたもの、および、凍結融解を行った標品でいずれもEC50=1.3nM前後であることが分かり、本精製標品は比較的安定なタンパク質であることが示された(図15)。
7−4.in vitro細胞死誘導活性の解析
次に、精製したGD17scFv−PE40の細胞死誘導活性について、癌細胞株(22Rv1、LNcap、MCF7、BxPC3、PANC1、SKOV3)あるいは、ヒト由来正常細胞株(HUVEC、MRC5)、マウス由来正常細胞株(CHO、NIH3T3、BaF3)を用いて解析した。
実験に用いた細胞株は、HUVECはCAMBREX社より、その他の細胞株はATCCより購入し、それぞれ入手もとの指南書に従って培養を行った。
各細胞を96wellプレートに撒き、翌日、GD17scFv−PE40を10%FCSを含むRPMI1640培地(インビトロジェン)で各濃度に希釈し、細胞に添加した。5日間培養後、生細胞の数をWST−8(ナカライ)にて測定した。
その結果、癌細胞に対しては、細胞ごとに感受性に差があるものの、最大活性の50%の活性を示す濃度(EC50値)が、2〜20nM程度と強い細胞死誘導活性を有することが確認された(図16A)。特に、MCF7や22Rv1細胞に対してはEC50値が2〜4nM程度であり強力な細胞障害活性が確認された。一方、ヒトおよびマウス正常細胞に対しては、まったく活性がないか、高濃度での添加でわずかに細胞障害活性が確認される程度であった(図16B)。
この感受性の差が、実験に用いた細胞間におけるGRP78タンパク質の発現の有無によるものでないことを確認するため、GD−17抗体を用いてウエスタンブロットを行った。細胞より定法に従って細胞溶解物を調製し、SDS−PAGE後、GD−17抗体(2μg/ml)を用いてウエスタンブロットを行った。図17の結果より、GD17scFv−PE40による細胞障害活性が認められなかった細胞株においてもGD−17抗体に特異的に染まるバンドが検出され、このことから、GD17scFv−PE40による癌細胞特異的な細胞障害活性は、癌細胞と正常細胞でのGRP78タンパク質の発現の有無によるのではなく、両細胞間におけるGRP78タンパク質の局在の違いに起因するものと考えられた。
7−5.in vivo抗腫瘍活性の解析
ヒト前立腺癌細胞株22Rv1細胞(ATCC CRL−2505)を、0.05%トリプシン添加0.02%EDTA溶液で回収後、細胞数1×107細胞/0.2mL HBSS(SIGMA Cat.No.H9269)でヌードマウス(オス、7週齢(CAnN.Cg−Foxn1<nu>/CrlCrlj(BALB−nu/nu)):日本チャールス・リバー株式会社)の腹部皮下に移植した。腫瘍の生着を確認し、移植16日目(day16)に腫瘍体積と体重で7群(対照群1群、薬剤投与群6群)に群分けを行った。
群分けの翌日(day17)、day21、day23、day26、day29の各日に対照群に生理食塩液、薬剤投与群に0.5mg/kgの用量のGD17scFv−PE40を、10mL/kgの投与量で静脈内に瞬時投与した。経時的に腫瘍体積を測定し、最終投与2日後(day31)を最終測定とした。
図18にその結果を示す。最終測定時の腫瘍増殖抑制率は47%であり、腫瘍体積のデータをノンパラメトリック型Dunnett多重比較により解析した結果、0.5mg/kg投与群で有意な腫瘍増殖抑制効果が見出された。この結果より、GRP78を標的としたGD17scFv−PE40の有効性がin vivoにおいても示され、GRP78を標的とする抗体が癌治療抗体として有用であることが証明された。
[配列表]
Claims (12)
- グルコース制御タンパク質78(glucose-regulated protein 78;GRP78)のSEQ ID NO: 3に記載のエピトープに結合し、GRP78を発現する細胞にインターナライズされる抗体を含む、医薬組成物。
- 抗癌剤である、請求項1記載の医薬組成物。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 抗体が細胞表面に局在したGRP78に結合する抗体である、請求項1から3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 抗体が細胞障害性物質が結合した抗体である、請求項1から4のいずれかに記載の医薬組成物。
- GRP78のSEQ ID NO: 3に記載のエピトープに結合し、GRP78を発現する細胞にインターナライズされる、モノクローナル抗体。
- 細胞表面に発現したGRP78に結合することを特徴とする、請求項6に記載の抗体。
- 以下の(a)〜(f)のいずれかの抗体:
(a) CDR1としてSEQ ID NO: 8に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 9に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 11に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 12に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 13に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(b) CDR1としてSEQ ID NO: 18に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 19に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 20に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 21に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 22に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 23に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(c) CDR1としてSEQ ID NO: 61に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 62に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 63に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 64に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 65に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 66に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(d) CDR1としてSEQ ID NO: 71に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 72に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 73に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 74に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 75に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 76に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(e) CDR1としてSEQ ID NO: 81に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 82に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 83に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 84に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 85に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 86に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(f) CDR1としてSEQ ID NO: 91に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 92に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 94に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 95に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
が認識するエピトープと同じエピトープを認識することを特徴とする、請求項6または7に記載の抗体。 - グルコース制御タンパク質78(glucose-regulated protein 78;GRP78)のSEQ ID NO: 3に記載のエピトープに結合し、GRP78を発現する細胞にインターナライズされる抗体であって、以下の(a)〜(f)のいずれかの抗体:
(a) CDR1としてSEQ ID NO: 8に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 9に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 11に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 12に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 13に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(b) CDR1としてSEQ ID NO: 18に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 19に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 20に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 21に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 22に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 23に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(c) CDR1としてSEQ ID NO: 61に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 62に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 63に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 64に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 65に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 66に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(d) CDR1としてSEQ ID NO: 71に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 72に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 73に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 74に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 75に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 76に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(e) CDR1としてSEQ ID NO: 81に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 82に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 83に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 84に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 85に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 86に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体;
(f) CDR1としてSEQ ID NO: 91に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 92に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、CDR1としてSEQ ID NO: 94に記載のアミノ酸配列を有し、CDR2としてSEQ ID NO: 95に記載のアミノ酸配列を有し、CDR3としてSEQ ID NO: 96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体。 - GRP78を発現する細胞に対して細胞障害活性を有することを特徴とする、請求項6〜9のいずれかに記載の抗体。
- 細胞障害性物質が結合していることを特徴とする、請求項10に記載の抗体。
- SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列又は請求項9に記載の抗体を作製する際の免疫源として用いられるSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド。
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