KR102511416B1

KR102511416B1 - Grp78에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102511416B1
Application number: KR1020200120449A
Authority: KR
Inventors: 나희준; 이윤숙; 이인용; 민승제; 이지영
Original assignee: 주식회사 하울바이오
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2023-03-17
Also published as: KR20220037684A

Abstract

본 발명은 GRP78에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-GRP78 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-GRP78 항체는 GRP78에 대한 특이성 및 친화도가 매우 높고, 대장암 세포주에 대한 성장 억제 효과, 침윤 억제 효과 및 혈관 신생을 억제하는 효과가 매우 뛰어난 바, 대장암의 치료 및 전이 억제와, 혈관 신생 억제용 조성물로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

GRP78에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{GRP78 specific antibody and use thereof}

본 발명은 GRP78에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 대한 것이다.

78-kDa 글루코스-조절 단백질(78-kDa glucose-regulated protein; GRP78)은 HSP 70 패밀리 샤페론(chaperone) 단백질로 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 루멘(lumen) 내 존재한다. 이는 ER 내로의 단백질 수송/전달에 관한 중요한 인자이며 세포 내 칼슘 항상성 유지에 핵심이 되는 기능성 단백질이다. 이 단백질은 두 개의 도메인으로 연결되어 있는데, 하나는 ER 내 뉴클레오타이드, 더욱 자세하게는 ATP를 결합하여 분해하는 도메인이며(Nuecleotide binding domain, NBD), 다른 하나는 ATPase 등의 대사효소 및 대사관련 단백질 및 대사기질 (예: ADP)과 결합하는 기질 결합기능성 도메인(Substrate binding domain, SBD) 이다. 이들은 세포 내의 칼슘 농도 및 세포 내 ATP 농도에 따라 대사가 진행될 때 ATP를 분해하면서 ER 내외의 에너지 대사 및 칼슘 대사를 조절한다.

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있다. 대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관 및 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자, 직장암은 남자에서 다소 높게 나타난다. 대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술시점을 놓친 경우에는 사망률이 높은 것으로 알려져있다.

최근, Imclone Systems Inc.는 EGFR(epidermal growth factor receptor)을 표적화하는 재조합 마우스/인간 키메라 단일클론 항체인 세툭시맙(Cetuximab)을 처음으로 개발하였는데, 세툭시맙은 임상 현장에서 대장암 치료제로 널리 사용되고 있지만, 단일 제제로는 효과적이지 않아 FOLFIRI 또는 FOLFOX 요법으로 병용 투여되는 것이 권고된다. 또한, 세툭시맙을 이용한 암 치료법에 있어 또 하나의 미충족 의료수요는 대장암 환자의 일부에만 효과가 있다는 점이다. 세툭시맙은 대장암 환자의 약 10~20%에만 효과가 있고, 나머지 환자들은 KRAS, PI3KCA (phosphoinositide-3-kinase catalytic subunit alpha), PTEN (phosphatase and tensin homolog), 및 BRAF를 포함한, EGFR 다운스트림 유전자 변이로 인해 세툭시맙 저항성을 나타낸다. 따라서, 대장암에 있어 새로운 치료적 타겟을 발굴하고 직결장암 치료의 임상적 결과를 개선하기 위하여 새로운 치료요법을 개발하는 것은 매우 중요하다.

한국공개특허 10-2016-0043927 (2016.04.22 공개)

본 발명의 목적은 GRP78에 특이적으로 결합하는 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 GRP78 항원 검출용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 GRP78 타겟 질환 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 고형암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 세툭시맙을 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 고형암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, GRP78에 특이적으로 결합하는 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 GRP78 항원 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 GRP78 타겟 질환 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 세툭시맙을 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 고형암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 세툭시맙을 유효성분으로 포함하는 고형암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 항-GRP78 scFv 항체 선별을 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 항-GRP78 scFv 항체의 민감도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 항-GRP78 scFv 항체의 HUVEC 세포를 이용한 인 비트로 관 형성 억제 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 항-GRP78 scFv 항체의 인 비트로 세포 이동 억제 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 항-GRP78 scFv 항체의 세포 상처 치유 이동 억제 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 항-GRP78 scFv 항체의 대장암 세포 사멸 증가 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, GRP78에 특이적으로 결합하는 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

한편, 서열번호 1 내지 서열번호 6로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR들은 표 1에 기재하였다.

본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.

본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 GRP78에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.

본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.

또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 GRP78 항원 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "GRP78 항원"은 78-kDa 글루코스-조절 단백질(78-kDa glucose-regulated protein; GRP78)를 의미하는 것으로, GRP78은 ER 내로의 단백질 수송/전달에 관한 중요한 인자이며 세포 내 칼슘 항상성 유지에 핵심이 되는 기능성 단백질이다.

바람직하게는, 상기 GRP78 타겟 질환은 방광암, 뇌암, 유방암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 백혈병, 간암, 폐암, 비소세포성 폐암, 흑색종, 다발성 골수종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 뇌종양으로 이루어진 군에서 선택된 고형암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 고형암은 방광암, 뇌암, 유방암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 백혈병, 간암, 폐암, 비소세포성 폐암, 흑색종, 다발성 골수종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암 또는 뇌종양일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 항- GRP78 scFv 항체 선별

1. bio-panning 시행

7.6 × 10⁹의 다양성을 가지는 OPAL library를 이용하여 bio-panning을 수행하였다. Epoxy magnetic bead에 10 μg의 GRP78 항원을 고정시키고 input phage를 반응시켰다. 항원과 반응한 phage를 용출(elution)하여 output titer를 측정하였다. 매 횟수마다 input과 output titer를 측정하여 bio-panning의 정보를 획득하고 정상적으로 시행되고 있는지를 확인하였다. 매 횟수마다 input phage는 1 × 10¹²cfu/mL ≥의 phage를 사용하였다. output은 1차 - 4.14 × 10⁷, 2차 - 5.32 × 10⁷cfu/mL으로 bio-panning이 진행될수록 증폭되는 것을 알 수 있었다. 따라서 bio-panning이 정상적으로 진행되었다는 것을 확인할 수 있었다.

2. ELISA 분석

고민감도, 고특이성 항체의 선별을 위해 ELISA 분석법을 수행하였다. 획득한 phage를 대장균에 감염시켜 항생제가 첨가된 LB plate에 도말하였다. 16 시간 동안 30℃ 배양기에서 배양한 후 생성된 콜로니(colony)를 랜덤하게 채집하였다. 각 콜로니를 LB 배지에 접종하여 배양한 후 IPTG를 처리하여 scFv를 발현시키고 대장균을 용해(lysis)하여 수용성 분획(soluble fraction)을 취하여 ELISA를 수행하였다. 먼저, 25 ng의 GRP78 항원을 96-well ELISA plate에 고정시키고, 3% BSA가 함유된 PBS로 블락킹(blocking) 하였다. 1 시간 후, 위에서 얻은 세포 용해물(cell lysate)을 처리하여 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 3회 씻어준 후 블락킹 용액(blocking solution)에 HRP-conjugated anti-HA 항체를 1:1000으로 희석하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween20가 함유된 PBS로 plate를 5회 씻어준 후 TMB substrate로 발색시켜 ELISA reader로 항원에 결합된 scFv 항체를 측정하였다. 96개의 항체를 분석하였고 OD 0.2를 양성 가이드라인(positive guideline), 0.1을 음성 가이드라인(negative guideline)으로 임의로 정하여 9종을 선별하였다(도 1).

< 실시예 2> 항- GRP78 scFv 항체 서열 분석

ELISA 분석을 통하여 선별된 GRP78 scFv 9종의 양성 클론(positive clone)에 대하여 서열분석(sequencing)을 통해 개별적 클론(clone)을 선별하였다. 앞서 선별한 양성 클론 중에 중복되는 클론이 존재할 가능성이 있기 때문에 서열분석이 필요하였다. 서열 분석 결과, 9 종의 양성 클론 중 8종이 개별적인 클론임을 확인하였다.

< 실시예 3> 선별된 항- GRP78 scFv 항체 정제 및 민감도 분석

1. 항- GRP78 scFv 항체 정제

앞서 선별된 8종 중 항원 결합력이 가장 높은 항-GRP78 scFv 항체(표 1)를 정제하였다. 항-GRP78 scFv 클론이 형질전환(transformation) 되어 있는 ER2738 E.coli cell을 500 mL의 SB media에 배양시킨 후 1 × TES buffer를 이용하여 세포를 용해(lysis) 시켰다. 세포 용해물(cell lysate)을 0.5 mL Ni bead에 반응시키고 이미다졸(imidazole)을 이용하여 용출(elution) 하였다.

Target	Clone	Light chain CDR sequence			Heavy chain CDR sequence
Target	Clone	CDR1	CDR2	CDR3	CDR1	CDR2	CDR3
GRP78	D11	TGSSSNIGSNYVS	SDSN	GAWDDSLSA	SYYMS	GISPGGGSK	KHRPTFDY

2. 정제된 항- GRP78 scFv 항체의 민감도 분석

정제된 항-GRP78 scFv 항체의 민감도 분석을 시행하였다. 민감도 분석은 ELISA 분석법을 이용하였다. 우선 여러 농도의 GRP78 항원을 ELISA plate에 고정시킨 후 10 μg/mL의 항-GRP78 scFv 항체를 처리하였다. 분석은 1:1000으로 희석한 HRP-conjugated anti-HA 항체를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 항-GRP78 scFv 항체의 EC50은 459 ng/mL로 분석되었다(도 2).

< 실시예 4> 선별된 항- GRP78 scFv 항체의 인 비트로 관 형성 분석

항-GRP78 scFv 항체가 관형성(tube formation)에 미치는 영향을 조사하기 위하여, EGM-2에서 배양한 1 × 10⁴HUVEC 세포를 마트리겔이 코팅된 플레이트에 분주한 후, 항-GRP78 scFv 항체와 양성대조구로 세툭시맙 1 μg 처리하여 배양하였다. 현미경을 이용하여 이미지를 얻었고, 관의 가지 개수를 계수하여 관형성을 정량화하였다. 그 결과, 항-GRP78 scFv 항체는 관 형성을 억제하는 효과가 우수하였다(도 3).

< 실시예 5> 선별된 항- GRP78 scFv 항체의 인 비트로 세포 이동 분석

1. Migration assay

항-GRP78 scFv 항체가 세포 이동(migration)에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상단 챔버에 대장암 세포(HT29)를 well 당 1 × 10⁵개 무혈청 배지에서 배양하고, 하단 챔버에는 10% FBS를 포함하는 배지를 첨가하였다. 48 시간 후, 세포의 이동을 측정하기 위해 상단 챔버를 PBS에 적신 면봉으로 닦아내고, 4% 파라포름알데하이드 1 ml 첨가하여 실온에서 30분간 고정하였다. 1% 크리스탈 바이올렛 500 μl 첨가하여 30분간 염색하고 물로 세척한후 현미경으로 세포수를 정량화하였다. 그 결과, 항-GRP78 scFv 항체는 세포 침윤 억제 효과가 우수하였다(도 4).

2. Wound-healing assay

항-GRP78 scFv 항체가 세포 상처 치유(wound healing)에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 대장암 세포(HT29)를 well 당 1 × 10⁵개로 분주한 후 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다. 24 시간 후, 스크래치를 낸 뒤, 항-GRP78 scFv를 농도별로 처리한 다음 배양하였다. 48 시간 후, 세포의 상처 치유 이동을 측정하기 위해서 4% 파라포름알데하이드 1 ml 첨가하여 실온에서 30분간 고정하였다. 1% 크리스탈 바이올렛 500 μl 첨가하여 30분간 염색하고 물로 세척한후 현미경으로 상처 치유 이동을 측정하였다. 그 결과, 항-GRP78 scFv 항체 농도 의존적으로 세포 상처 치유 이동 억제 효과가 우수하였다(도 5).

< 실시예 6> 선별된 항- GRP78 scFv 항체의 대장암 세포 사멸효과 분석

1. MTT assay

항-GRP78 scFv 항체가 대장암 세포(HT29)의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 대장암 세포를 96-well 플레이트에 well 당 1 × 10⁴개로 분주한 후 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다. 24 시간 후, 항-GRP78 scFv를 농도별로 처리한 다음 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양이 끝난 후 MTT{3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide} 용액을 넣고 3 시간 동안 반응시킨 다음 배양액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100 μL씩 넣어주었다. 15 분간 흔들어 준 다음 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 항-GRP78 scFv 항체 농도 의존적으로 세포 사멸이 증가하였다(도 6).

2. LDH assay

항-GRP78 scFv 항체가 대장암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 대장암 세포를 96-well 플레이트에 well 당 1 × 10⁴개로 분주한 후 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다. 24 시간 후, 항-GRP78 scFv를 농도별로 처리한 다음 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 96-well 플레이트에 50 μl 옮기고, LDH 시약 50 μl 용액을 넣고 실온에서 30분 반응하였다. Stop 용액 50 μl 용액을 넣고 ELISA reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 항-GRP78 scFv를 농도 의존적으로 세포 사멸이 증가하였다.

	Cetuximab		GRP78 D11 scFv Ab
농도 (ug)	%	오차	%	오차
0	50.21	0.21276	50.21	0.21276
0.001	51.025	0.862263	51.765	2.06087
0.01	57.745	8.404424	67.21222	0.506392
0.1	72.09222	1.642774	77.44111	0.935236
0.5	77.75333	0.739189	77.83667	1.654727
1	78.47333	1.853321	80.31722	1.381353

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> HAUUL BIO <120> GRP78 specific antibody and use thereof <130> DP-2020-0284 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <400> 1 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 <400> 2 Ser Asp Ser Asn 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 <400> 3 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <400> 4 Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 <400> 5 Gly Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Lys 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 <400> 6 Lys His Arg Pro Thr Phe Asp Tyr 1 5

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 78-kDa 글루코스-조절 단백질(78-kDa glucose-regulated protein; GRP78)에 특이적으로 결합하는 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항의 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
제2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제3항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
제1항의 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 GRP78 항원 검출용 조성물.
제1항의 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 조성물.
삭제
제1항의 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 세툭시맙을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물.
제1항의 항-GRP78 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 세툭시맙을 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학 조성물.
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