JP2022542670A - 抗ｅｇｆｒ／抗４－１ｂｂ二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体、及び薬学的組成物、並びにこれを使用して、がんを治療及び／又は防止するための方法が提供される。【選択図】図１１ａ

Description

抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体、及び薬学的組成物、並びにこれを使用して、がんを治療及び／又は防止するための方法が提供される。

４－１ＢＢタンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、自然免疫細胞及び獲得免疫細胞の両方の免疫細胞の活性化の後において発現される共刺激分子である。４－１ＢＢは、多様な免疫細胞の活性をモジュレートする上で、重要な役割を果たす。４－１ＢＢアゴニストは、免疫細胞の増殖及び生存、サイトカインの分泌、並びにＣＤ８Ｔ細胞の細胞溶解活性を増強する。他の多くの研究は、マウスにおいて、４－１ＢＢの活性化が、免疫応答を増強して、腫瘍を消失させることを示した。したがって、これは、４－１ＢＢが、がん免疫学における有望な標的分子であることを示唆する。それらの抗腫瘍効果にもかかわらず、抗４－１ＢＢ抗体は、臨床適用において、重度の肝毒性を誘導した。

ＥＧＦＲタンパク質は、細胞外タンパク質リガンドの、上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーに対する受容体である膜貫通タンパク質であり、腫瘍に関連する多様な機構に関与する。ＥＧＦＲは、細胞の表面に存在し、これにより、がん細胞の増殖及び浸潤、血管新生などを誘導する典型的な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。

一方、２つ又はこれを超える抗原をターゲティングする多重特異性抗体が、多様な種類及び形態で開発され、モノクローナル抗体と比較して優れた治療効果を有する新たな薬物抗体として期待されている。

したがって、より効果的ながん治療のために、一方が、がん細胞上に存在し、他方が、免疫細胞など、他の細胞上に存在する、２つの異なる抗原を認識することが可能な多重特異性抗体を開発することが必要とされている。

技術的課題
一実施形態は、
（１）ＥＧＦＲタンパク質を特異的に認識し、かつ／又はこれに特異的に結合することが可能な、ＥＧＦＲターゲティング部分としての抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片；及び
（２）４－１ＢＢタンパク質を特異的に認識し、かつ／又はこれに特異的に結合することが可能な、４－１ＢＢターゲティング部分としての抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片
を含む抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体を提供する。

別の実施形態は、二重特異性抗体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。薬学的組成物は、がんを治療及び／若しくは防止し、かつ／又は免疫応答を増強するために使用されうる。

別の実施形態は、がんを治療及び／若しくは防止し、かつ／又は免疫応答を増強するための薬学的組成物であって、二重特異性抗体を含む組成物を提供する。

別の実施形態は、それを必要とする対象におけるがんを治療及び／又は防止するための方法であって、対象へと、薬学的有効量の二重特異性抗体又は薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。方法は、投与する工程の前に、がんの治療及び／又は防止を必要とする対象を同定する工程をさらに含みうる。

別の実施形態は、それを必要とする対象における免疫応答を増強する方法であって、対象へと、薬学的有効量の二重特異性抗体又は薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。方法は、投与する工程の前に、免疫応答の増強を必要とする対象を同定する工程をさらに含みうる。

別の実施形態は、がんの治療及び／又は防止における、二重特異性抗体又は薬学的組成物の使用を提供する。別の実施形態は、がんを治療及び／又は防止するための医薬の調製における二重特異性抗体の使用を提供する。

別の実施形態は、免疫応答の増強における二重特異性抗体又は薬学的組成物の使用を提供する。別の実施形態は、免疫応答を増強するための医薬の調製における二重特異性抗体の使用を提供する。

ある実施形態は、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

ある実施形態は、ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。組換えベクターは、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドの発現ベクターとして使用されうる。

別の実施形態は、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。細胞は、ポリヌクレオチドを含む組換えベクターをトランスフェクトされた組換え細胞でありうる。

別の実施形態は、二重特異性抗体を調製する方法であって、細胞内でポリヌクレオチドを発現させることを含む方法を提供する。ポリヌクレオチドを発現させる工程は、ポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、組換えベクター内の）を、ポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下で培養することにより行われうる。

技術的解決
本開示は、それらの各々が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ；ＥＧＦＲ）に特異的な抗体と、４－１ＢＢに特異的な抗体とを含む、二重特異性抗体、及びこれらの使用に関する。これらの二重特異性抗体は、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化させ、ＥＧＦＲ発現細胞の存在下に限り、強力な免疫細胞をブーストする。特異的なＥＧＦＲ媒介免疫応答のために、二重特異性抗体を使用することにより、肝毒性を、４－１ＢＢモノクローナル抗体と比較して、はるかに弱めることが期待される。

本開示では、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体、及びその使用が提示され、この場合、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、
（１）ＥＧＦＲタンパク質を特異的に認識し、かつ／又はこれに特異的に結合することが可能な、ＥＧＦＲターゲティング部分としての抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片、及び
（２）４－１ＢＢタンパク質を特異的に認識し、かつ／又はこれに特異的に結合することが可能な、４－１ＢＢターゲティング部分としての抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片
を含みうる。

本明細書の以下では、本発明について、より詳細に記載される。

定義
本明細書で使用される、「配列からなること」、「配列から本質的になること」、又は「配列を含むこと」とは、この配列を含む任意の場合を指す場合があるが、この配列以外のさらなる配列を含む場合を除外することが意図されない場合もある。

本明細書で使用される、「配列番号により同定されるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるタンパク質又はポリペプチド」及び「配列番号により同定される核酸配列を含むか、又はこれからなる遺伝子又はポリヌクレオチド」という用語は、その固有の活性及び／又は機能を維持するアミノ酸配列又は核酸配列との、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列又は核酸配列から本質的になるタンパク質（又はポリペプチド）又は遺伝子（又はポリヌクレオチド）を指す場合がある。

本明細書で使用された、「抗体」という用語は、生化学的に識別されうる、ポリペプチドの、多様な、広範にわたるクラスを包含しうる。当業者は、重鎖は、それらの間に一部のサブクラス（例えば、γ１～γ４）を伴う、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、軽鎖は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）として分類される。抗体の「クラス」を、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＧ、又はＩｇＥと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特徴づけられており、機能的な特化を付与することが公知である。

インタクトな抗体は、各軽鎖が、ジスルフィド結合により、重鎖へと連結される、２つの完全長軽鎖と、２つの完全長重鎖とを含む。抗体は、重鎖定常領域と、軽鎖定常領域とを有する。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）型、ミュー（μ）型、アルファ（α）型、デルタ（δ）型、又はイプシロン（ε）型の重鎖定常領域であり、これらは、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、又はアルファ２（α２）としてさらに類別されうる。軽鎖定常領域は、カッパ（κ）型又はラムダ（λ）型の軽鎖定常領域である。

「重鎖」という用語は、抗原に対する特異性をもたらすのに十分なアミノ酸配列を含む可変領域のＶ_Ｈと、３つの定常領域である、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３と、ヒンジとを含む、完全長重鎖又はその断片を指す。「軽鎖」という用語は、抗原に対する特異性をもたらすのに十分なアミノ酸配列を含む可変領域のＶ_Ｌと、定常領域であるＣ_Ｌとを含む、完全長軽鎖又はその断片を指す。

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の超可変領域内に見出されるアミノ酸配列を指す。重鎖及び軽鎖は、それぞれ、３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）を含みうる。ＣＤＲは、抗原又はエピトープへの抗体の結合において、重要な役割を果たす残基をもたらしうる。当業者には、「～に特異的に結合すること」又は「特異的に認識された」という用語が周知であり、互いと特異的に相互作用して、免疫学的活性をもたらす、抗体と抗原とを指し示す。

本開示では、抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体；及び／又はヒト抗体、ヒト化抗体、動物（例えば、マウス、ウサギなど）由来抗体、若しくはキメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）を含みうるがこれらに限定されない。

所望の抗原で動物を免疫化することにより産生される動物由来抗体は、一般に、治療目的で、ヒトへと投与されると、免疫拒否反応を誘発する場合があり、このような免疫拒否反応を抑制するように、キメラ抗体が開発されている。キメラ抗体は、遺伝子操作法を使用して、抗アイソタイプ反応の原因である、動物由来抗体の定常領域を、ヒト抗体の定常領域で置きかえることにより形成される。キメラ抗体は、抗アイソタイプ反応を、動物由来抗体と比較して、大幅に改善したが、動物由来アミノ酸は、その可変領域内に、依然として存在するので、抗イデオタイプ反応から生じる潜在的副作用を、依然として含有する。こうして、このような副作用を改善するように開発されたのが、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、キメラ抗体の可変領域のうちで、抗原への結合において重要な役割を果たすＣＤＲ（相補性決定領域）を、ヒト抗体フレームワークへとグラフトすることにより製造される。

本明細書で使用される、「抗原結合断片」という用語は、完全免疫グロブリン構造に由来する断片であって、ＣＤＲなど、抗原に結合することが可能な部分を含む断片を指す。例えば、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）_２でありうるがこれらに限定されない。本開示では、抗原結合断片は、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される、少なくとも１つの相補性決定領域を含む抗体に由来する断片でありうる。

抗原結合断片のうちで、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の第１の定常領域（Ｃ_Ｈ１）を有する構造であり、１つの抗原結合部位を有する。

Ｆａｂ’は、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ末端において、１つ又は複数のシステイン残基を含むヒンジ領域を有するという点で、Ｆａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域において、システイン残基のジスルフィド結合を介して形成される。

Ｆｖとは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有する、最小限の抗体片であり、関連技術分野では、Ｆｖ断片を作製するための組換え法が周知である。二鎖型Ｆｖは、重鎖可変領域が、非共有結合的結合により、軽鎖可変領域へと連結された構造を有する場合があり、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般に、重鎖の可変領域と、軽鎖の可変領域とが、ペプチドリンカーを介して共有結合的に連結されるか、又はそのＣ末端において、互いへと直接連結された、二鎖型Ｆｖにおける通り、ダイマー構造を有しうる。

抗原結合断片は、プロテアーゼを使用して得られる場合があり（例えば、全抗体は、Ｆａｂ断片を得るように、パパインにより消化され、Ｆ（ａｂ’）_２断片を得るように、ペプシンにより消化される）、遺伝子組換え法により調製されうる。

本開示の免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）又は抗体分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹなど）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）、又はサブクラスの免疫グロブリン分子でありうる。

抗体内又は抗体断片内で、ＣＤＲ又は可変領域を除く部分（例えば、定常領域）は、ヒト抗体に由来する場合があり、特に、ＣＤＲ又は可変領域を除く部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＹ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来しうる。

抗体又は抗原結合断片は、化学的に、又は組換えにより合成される（天然に存在しない）場合がある。

４－１ＢＢターゲティング部分
抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片を、４－１ＢＢターゲティング部分として含みうる。

ＣＤ１３７又はＴＮＦＲＳＦ９（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９）とも呼ばれる、「４－１ＢＢ」という用語は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、自然免疫細胞及び獲得免疫細胞の両方の免疫細胞の活性化の後において発現される共刺激分子である。４－１ＢＢは、多様な免疫細胞の活性をモジュレートする上で、重要な役割を果たす。本明細書で使用される、４－１ＢＢは、哺乳動物、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ＿００１５５２．２）に由来しうる。例えば、ヒト４－１ＢＢタンパク質（ＮＰ＿００１５５２．２）は、アミノ酸配列（配列番号８９）により、以下：
１ ｍｇｎｓｃｙｎｉｖａ ｔｌｌｌｖｌｎｆｅｒ ｔｒｓｌｑｄｐｃｓｎ ｃｐａｇｔｆｃｄｎｎ ｒｎｑｉｃｓｐｃｐｐ ｎｓｆｓｓａｇｇｑｒ
６１ ｔｃｄｉｃｒｑｃｋｇ ｖｆｒｔｒｋｅｃｓｓ ｔｓｎａｅｃｄｃｔｐ ｇｆｈｃｌｇａｇｃｓ ｍｃｅｑｄｃｋｑｇｑ ｅｌｔｋｋｇｃｋｄｃ
１２１ ｃｆｇｔｆｎｄｑｋｒ ｇｉｃｒｐｗｔｎｃｓ ｌｄｇｋｓｖｌｖｎｇ ｔｋｅｒｄｖｖｃｇｐ ｓｐａｄｌｓｐｇａｓ ｓｖｔｐｐａｐａｒｅ
１８１ ｐｇｈｓｐｑｉｉｓｆ ｆｌａｌｔｓｔａｌｌ ｆｌｌｆｆｌｔｌｒｆ ｓｖｖｋｒｇｒｋｋｌ ｌｙｉｆｋｑｐｆｍｒ ｐｖｑｔｔｑｅｅｄｇ
２４１ ｃｓｃｒｆｐｅｅｅｅ ｇｇｃｅｌ
の通りに表されうる。

ある実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ（相補性決定領域）－Ｈ１（Ｈ－ＣＤＲ１）；
配列番号４、５、又は６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；
配列番号７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；
配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；
配列番号１４又は１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；及び
配列番号１６又は１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３
を含みうる。

抗４－１ＢＢ抗体又は抗原結合断片のＣＤＲのアミノ酸配列は、表１に例示される。

例えば、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号２のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３；又は
配列番号３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３
を含みうる。

別の実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４、５、又は６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６又は１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含みうる。

別の実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号３０、３１、３２、３３、３４、又は８８のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖可変領域を含みうる。

抗４－１ＢＢ抗体又は抗原結合断片の可変領域のアミノ酸配列は、表２に例示される。

例えば、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含みうる。

抗４－１ＢＢ抗体又は抗原結合断片の可変領域のフレームワークのアミノ酸配列は、表３に例示される。

別の実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、又は６１のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖；及び配列番号６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖を含みうる。

例えば、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号５６、５７、５８、５９、６０、又は６１のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖；及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖；
配列番号５６、５７、５８、５９、６０、又は６１のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖；及び配列番号６３のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖；又は
配列番号５６、５７、５８、５９、６０、又は６１のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖；及び配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖
を含みうる。

別の実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４、５、又は６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６又は１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含み、
重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とが、互いへと、任意の順序で、直接（すなわち、リンカーを伴わずに）、又はペプチドリンカーを介して連結されうる、
ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）でありうる。

例えば、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、
配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
配列番号３０、３１、３２、３３、３４、又は８８のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖可変領域
を含むことが可能であり、
この場合、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とは、互いへと、任意の順序で、直接、又はペプチドリンカーを介して連結されうる。

例えば、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、
配列番号２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖可変領域；及び配列番号３３を含むか、又はこれから本質的になる軽鎖可変領域；
配列番号２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖可変領域；及び配列番号３４を含むか、又はこれから本質的になる軽鎖可変領域；又は
配列番号２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むことが可能であり、
この場合、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とは、互いへと、任意の順序で、直接、又はペプチドリンカーを介して連結されうる。

本開示では、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを、任意の順序で含む。例えば、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域と、重鎖可変領域とを、Ｎ末端からＣ末端への方向で含みうる。代替的に、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを、Ｎ末端からＣ末端への方向で含みうる。

ＥＧＦＲターゲティング部分
抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を、ＥＧＦＲターゲティング部分として含みうる。

「ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体；また、ＥｒｂＢ－１、又はヒトにおいて、ＨＥＲ１とも呼ばれる）」とは、細胞外タンパク質リガンドの、上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーに対する受容体である、膜貫通タンパク質である。上皮増殖因子受容体は、受容体のＥｒｂＢファミリーの、４つの近縁の受容体チロシンキナーゼのサブファミリーのメンバー：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ－１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ－２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ－３）、及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ－４）である。多くのがん型において、ＥＧＦＲの発現又は活性に影響を及ぼしうる突然変異は、がんを結果としてもたらしうるであろう。例えば、ＥＧＦＲタンパク質は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＭ＿００１３４６８９７．２、ＮＭ＿００１３４６８９８．２などの下に寄託されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされる、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿００１３３３８２６．１、ＮＰ＿００１３３３８２７．１などの下に寄託されたポリペプチドでありうる。

一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブでありうる。ＥＧＦＲを抗原として認識する、抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合領域は、抗ＥＧＦＲ抗体である、セツキシマブのｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）_２でありうる。

抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、抗ＥＧＦＲ抗体、又はセツキシマブの６つのＣＤＲを含むその抗原結合断片でありうる。

ある実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体、又は抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）_２）は、セツキシマブ若しくはその抗原結合断片、又はこれらの変異体でありうる。

例えば、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；
配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；
配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；
配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；
配列番号６９のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；及び
配列番号７０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３
を含みうる。

抗ＥＧＦＲ抗体又は抗原結合断片のＣＤＲのアミノ酸配列は、表４に例示される。

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含みうる。

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７１のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖可変領域、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖可変領域を含みうる。

抗ＥＧＦＲ抗体又は抗原結合断片の可変領域のアミノ酸配列は、表５に例示される。

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７３又は７４のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖；及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖を含みうる。

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含み、
重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とが、互いへと、任意の順序で、直接（すなわち、リンカーを伴わずに）、又はペプチドリンカーを介して連結されうる、
ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）でありうる。

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号７１のアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる重鎖可変領域；及び
配列番号７２のアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる軽鎖可変領域
を含み、
重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とが、互いへと、任意の順序で、直接、又はペプチドリンカーを介して連結されうる、
ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）でありうる。

本開示では、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを、任意の順序で含む。例えば、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域と、重鎖可変領域とを、Ｎ末端からＣ末端への方向で含みうる。代替的に、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを、Ｎ末端からＣ末端への方向で含みうる。

二重特異性抗体
本開示は、
（１）ＥＧＦＲタンパク質を特異的に認識し、かつ／又はこれに特異的に結合することが可能な、ＥＧＦＲターゲティング部分としての抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片、及び
（２）４－１ＢＢタンパク質を特異的に認識し、かつ／又はこれに特異的に結合することが可能な、４－１ＢＢターゲティング部分としての抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片
を含む抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体を提示する。

抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞により架橋された場合に限り、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化させうる。加えて、二重特異性抗体内に含有される抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内に限り局在化及び／若しくは活性化し、かつ／又は肝毒性を、既存の抗４－１ＢＢ抗体と比較して、大幅に低減し、免疫応答増強及び／若しくは腫瘍治療の効能を維持することにより特徴づけられうる。

ある実施形態では、二重特異性抗体は、完全長抗ＥＧＦＲ抗体と、抗４－１ＢＢ抗体の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）とを含むことが可能であり、この場合、抗４－１ＢＢ抗体の抗原結合断片は、完全長抗ＥＧＦＲ抗体のＮ末端、Ｃ末端、又はこれらの両方へと、直接、又はペプチドリンカーを介して連結されうる。別の実施形態では、二重特異性抗体は、完全長抗４－１ＢＢ抗体と、抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）とを含むことが可能であり、この場合、抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、完全長抗４－１ＢＢ抗体のＮ末端、Ｃ末端、又はこれらの両方へと、直接、又はペプチドリンカーを介して連結されうる。

ある実施形態では、二重特異性抗体内に含有されるｓｃＦｖは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを、任意の順序で含みうる。例えば、二重特異性抗体内に含有されるｓｃＦｖは、軽鎖可変領域と、重鎖可変領域とを、Ｎ末端からＣ末端への方向で含み、任意選択で、これらの間に、ペプチドリンカーを含む場合もあり、代替的に、二重特異性抗体内に含有されるｓｃＦｖは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを、Ｎ末端からＣ末端への方向で含み、任意選択で、これらの間に、ペプチドリンカーを含む場合もある。

二重特異性抗体が、完全長抗ＥＧＦＲ抗体と、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖとを含む場合、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチド
を含むことが可能であり、
この場合、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域
を含みうる。

代替的に、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチド
を含むことが可能であり、
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域
を含みうる。

代替的に、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチド
を含むことが可能であり、
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域
を含みうる。

代替的に、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチド
を含むことが可能であり、
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域
を含みうる。

二重特異性抗体が、完全長抗４－１ＢＢ抗体と、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖとを含む場合、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含むことが可能であり、
この場合、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域
を含みうる。

代替的に、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含むことが可能であり、
この場合、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域
を含みうる。

代替的に、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含むことが可能であり、この場合、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域
を含みうる。

代替的に、二重特異性抗体は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、
任意選択で、ペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖
を含む、第１のポリペプチド；並びに
（ｉｉ）抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含むことが可能であり、この場合、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域、
任意選択で、ペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）、及び
抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域
を含みうる。

第１のペプチドリンカーと、第２のペプチドリンカーとは、独立して、二重特異性抗体内に、存在する場合もあり、存在しない場合もあり、互いと同じ場合もあり、異なる場合もある。

別の実施形態では、二重特異性抗体内に含有される、ＥＧＦＲターゲティング部分及び４－１ＢＢターゲティング部分の両方は、互いと、直接、又はペプチドリンカーを介して連結された、重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、又はこれらの組合せを含む、完全長抗体又は抗原結合断片でありうる。

抗体の各々が、４－１ＢＢ（ヒト４－１ＢＢなど）及びＥＧＦＲ（ヒトＥＧＦＲなど）の両方に結合しうることを踏まえると、本明細書で開示される、ＣＤＲ配列、又はＶ_Ｈ（重鎖可変領域）配列と、Ｖ_Ｌ（軽鎖可変領域）配列とは、他の抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ結合性二重特異性分子を創出するように、「混合され、マッチさせられ」うる。

ペプチドリンカー
高純度の抗体のために、二重特異性抗体は、第１のポリペプチド内の、重鎖と、ｓｃＦｖとの間におけるペプチドリンカー（第１のペプチドリンカー）、及び／又はｓｃＦｖ内の、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との間におけるペプチドリンカー（第２のペプチドリンカー）を含みうる。

本明細書で使用される、「ペプチドリンカー」という用語は、それらの各々が、任意の制限を伴わない、任意の種類のアミノ酸でありうる、１～１００アミノ酸、特に、２～５０アミノ酸を含むオリゴペプチドを指す場合がある。任意の常套的なペプチドリンカーは、具体的な目的に適合する、適切な修飾を伴って使用される場合もあり、これらを伴わずに使用される場合もある。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及び／又はＳｅｒ残基を含む場合もあり、かつ／又はＴｈｒ及び／又はＡｌａなどの中性アミノ酸を含む場合もある。ペプチドリンカーに適するアミノ酸配列は、関連する技術分野において公知でありうる。ペプチドリンカーの長さは、ポリペプチド及び／又はｓｃＦｖの機能が影響を受けないように、このような限界内で適正に決定されうる。例えば、ペプチドリンカーは、それらの各々が、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＡｌａからなる群から独立して選択される、合計約１～約１００アミノ酸、約２～約５０アミノ酸、又は約５～約２５（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）アミノ酸を含むことにより形成されうる。一実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇ_ｍＳ_ｌ）_ｎ（ｍ、ｌ、及びｎは、それぞれ、「Ｇ」、「Ｓ」、及び「（Ｇ_ｍＳ_ｌ）」の数であり、独立して、約１～約１０、特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の整数から選択される）として表されうる。一実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、又は（ＧＳ）９のアミノ酸でありうるがこれらに限定されない。

医学的使用
免疫応答を増強し、かつ／又はがんを治療及び／若しくは防止するための、二重特異性抗体の医学的使用が提供される。

より具体的に述べると、実施形態は、二重特異性抗体を、有効成分として含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。薬学的組成物は、免疫応答を増強し、かつ／又はがんを治療及び／若しくは防止するために使用されうる。

別の実施形態は、がんを治療及び／又は防止するための薬学的組成物であって、二重特異性抗体を、有効成分として含む組成物を提供する。

別の実施形態は、それを必要とする対象におけるがんを治療及び／又は防止するための方法であって、対象へと、薬学的有効量の二重特異性抗体又は薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。方法は、投与する工程の前に、がんの治療及び／又は防止を必要とする対象を同定する工程をさらに含みうる。

別の実施形態は、がんの治療及び／又は防止における、二重特異性抗体又は薬学的組成物の使用を提供する。別の実施形態は、がんを治療及び／又は防止するための医薬の調製における二重特異性抗体の使用を提供する。

一部の実施形態では、がんは、ＥＧＦＲの発現又はＥＧＦＲの過剰発現（正常と比較した）により特徴づけられうる。

別の実施形態は、免疫応答を増強するための薬学的組成物であって、二重特異性抗体を、有効成分として含む組成物を提供する。

別の実施形態は、それを必要とする対象における免疫応答を増強する方法であって、対象へと、薬学的有効量の二重特異性抗体又は薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。方法は、投与する工程の前に、免疫応答の増強を必要とする対象を同定する工程をさらに含みうる。

別の実施形態は、免疫応答の増強における二重特異性抗体又は薬学的組成物の使用を提供する。別の実施形態は、免疫応答を増強するための医薬の調製における二重特異性抗体の使用を提供する。

一部の実施形態では、二重特異性抗体又は薬学的組成物は、ＥＧＦＲの存在を条件として、免疫応答を増強しうる。例えば、免疫応答を増強する方法において、対象は、ＥＧＦＲ発現細胞又はＥＧＦＲ過剰発現細胞（例えば、ＥＧＦＲ発現がん細胞又はＥＧＦＲ過剰発現がん細胞）を有しうる。

二重特異性抗体又は薬学的組成物により防止及び／又は治療されるがんは、４－１ＢＢ及び／又はＥＧＦＲ、とりわけ、ＥＧＦＲ発現又はＥＧＦＲ過剰発現がんと関連しうる。がんは、固形がん及び血液がんから選択されうる。がんは、乳がん、結腸がん、胃がん、肺がん（例えば、肺扁平上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌）、腹腔癌、皮膚がん、扁平上皮癌、皮膚又は眼球におけるメラノーマ、直腸がん、肛門周囲がん、食道がん、小腸腫瘍、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、慢性白血病又は急性白血病、リンパ球性リンパ腫、肝がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腺腫、大腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺腫瘍、腎臓がん、子宮頸がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、頭頸部がん、脳がん、胆管がん、胆嚢がんなどからなる群から選択される、１つ又は複数のがんでありうるがこれらに限定されない。がんは、原発がんの場合もあり、転移性がんの場合もある。

本明細書で使用される、「がんの防止及び／又は治療」という用語は、がん細胞死、がん細胞増殖の阻害、がんと関連する症状の緩和、がんの転移の阻害などを指す場合がある。

本明細書で使用される、「免疫応答の増強」という用語は、４－１ＢＢシグナルの活性化、４－１ＢＢに誘導されるシグナルの活性化など、４－１ＢＢと関連する任意の免疫応答の増強（例えば、４－１ＢＢに誘導されるＮＦ－ｋＢシグナルの活性化、サイトカインの放出の増大、Ｔ細胞などの免疫細胞による標的細胞の殺滅などであるがこれらに限定されないを指す場合がある。一部の実施形態では、本開示により提示される二重特異性抗体による免疫応答の増強は、ＥＧＦＲの存在下で生じうる。

薬学的組成物は、有効成分としての二重特異性抗体に加えて、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は添加物をさらに含みうる。薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は添加物は、抗体の製剤化のために一般に使用される、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は添加物から選択される、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は添加物でありうる。例えば、薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ剤、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油からなる群から選択される、１つ又は複数の薬学的に許容される担体でありうるがこれらに限定されない。

薬学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、芳香増強剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤などからなる群から選択される１つ又は複数の薬剤をさらに含みうる。

二重特異性抗体又は薬学的組成物は、対象へと、経口投与される場合もあり、非経口投与される場合もある。非経口投与は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、又は直腸投与でありうる。経口投与は、タンパク質又はペプチドの消化をもたらすので、経口投与のための組成物中の有効成分は、胃内の消化を防止するように、コーティング又は製剤化されなければならない。加えて、組成物は、有効成分が、標的細胞（例えば、がん細胞）へと送達されることを可能とする、任意選択のデバイスを使用して投与されうる。

本明細書で使用される、「薬学的有効量」という用語は、有効成分である、二重特異性抗体が、がんの防止又は治療において、薬学的に有意味な効果を及ぼしうる量を指す場合がある。二重特異性抗体の薬学的有効量、又は二重特異性抗体の量により指し示される、薬学的組成物の適切な投与量は、患者の年齢、体重、性別、病態、食餌、排出速度、及び／又は反応感受性、製剤の種類、投与回数、投与経路、投与方式など、多様な因子に応じて、様々な形で処方されうる。例えば、二重特異性抗体の薬学的有効量、又は薬学的組成物の適切な投与量は、成人について、１日当たりｋｇ（体重）当たり約０．００１～約１０００ｍｇ（二重特異性抗体の量）、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ、又は０．１～５０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。

二重特異性抗体又は薬学的組成物が投与される対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ、ｃｏｗｓ）などから選択される対象、又はこれらから得られる細胞若しくは組織でありうるがこれらに限定されず、がんを患う対象でありうる。

薬学的組成物は、当業者により容易に実施される方法により、薬学的に許容される担体及び／又は添加物と共に、単位剤形又は複数回投与剤形へと製剤化されうる。剤形は、油性媒体中又は水性媒体中の溶液、懸濁液、シロップ剤、乳化溶液、抽出物、粉末、顆粒、錠剤、又はカプセル剤であることが可能であり、分散剤又は安定化剤をさらに含みうる。

ポリヌクレオチド、組換えベクター、及び抗体の調製物
ある実施形態は、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、直接、又はペプチドリンカーを介して連結された、本明細書で記載される、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖と、本明細書で記載される、抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖとをコードする、第１のポリヌクレオチド；並びに抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを含みうる。代替的に、ポリペプチドは、直接、又はペプチドリンカーを介して連結された、本明細書で記載される、抗４－１ＢＢ抗体の重鎖と、本明細書で記載される、抗ＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖとをコードする、第１のポリヌクレオチド；並びに抗４－１ＢＢ抗体の軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを含みうる。

別の実施形態は、ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。例えば、組換えベクターは、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドとを、１つのベクターの中に、併せて含む場合もあり、２つのベクターの中に、別個に含む場合もある。別の実施形態は、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドとを含む組換え細胞を提供する。例えば、組換え細胞は、組換えベクターをトランスフェクトされた細胞でありうる。

別の実施形態は、二重特異性抗体を調製する方法であって、ポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドとを、細胞内で発現させることを含む方法を提供する。ポリヌクレオチドを発現させる工程は、ポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、組換えベクター内の）を、ポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下で培養することにより行われうる。方法は、発現させる工程又は培養する工程の後で、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片を、細胞培養物から単離及び／又は精製することをさらに含みうる。

「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、並びにバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターにより例示される通り、宿主細胞内で標的遺伝子を発現させるための手段を指す。組換えベクターは、当技術分野で頻繁に使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、及びｐＵＣ１９）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、及びＭ１３）から構築される場合もあり、ウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作することにより構築される場合もある。

組換えベクター内で、ポリヌクレオチドは、プロモーターへと、作動的に連結されうる。「作動的に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列と、発現調節配列（例えば、プロモーター配列）との間の機能的連結に関することが意図される。「作動的に連結」すると、調節エレメントは、目的のヌクレオチドの転写及び／又は翻訳を制御しうる。

組換えベクターは、典型的に、クローニングベクター又は発現ベクターとして構築されうる。組換え発現ベクターのために、植物、動物、又は微生物細胞における外来タンパク質の発現について、関連する技術分野で一般に利用可能なベクターが用いられうる。組換えベクターの構築のために、当技術分野で周知の多様な方法が使用されうる。

原核細胞又は真核細胞などの宿主における使用のために、組換えベクターは、宿主に応じて構築されうる。例えば、ベクターが、原核生物宿主における使用のための発現ベクターとして構築される場合、ベクターは、典型的に、転写のための強力なプロモーター（例えば、ｐＬκλプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、翻訳を開始するためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳終止配列を含む。他方、真核生物宿主における使用のための発現ベクターは、ｆ１複製開始点、ＳＶ４０複製開始点、ｐＭＢ１複製開始点、アデノ複製開始点、ＡＡＶ複製開始点、及びＢＢＶ複製開始点など、真核細胞内で作動可能な複製開始点を含むがこれらに限定されない。加えて、発現ベクターは、典型的に、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、及びＨＳＶのｔｋプロモーター）、及び転写終結配列としてのポリアデニル化配列を含む。

組換え細胞は、組換えベクターを、適切な宿主細胞へと導入することにより調製されうる。本開示では、組換えベクターの逐次的なクローニング及び発現を、安定的な形で可能とする限りにおいて、当技術分野で公知である、任意の宿主細胞が用いられうる。本開示のために利用可能な原核宿主細胞の例は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、並びにネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）などの腸内細菌科株、及び多様なシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種から選択されうる。形質転換のために使用されうる真核生物宿主細胞は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、並びにＳｐ２／０、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、及びＭＤＣＫなどの動物細胞から選択されうるがこれらに限定されない。

ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを保有する組換えベクターは、関連する技術分野において周知の方法を使用して、宿主細胞へと導入（トランスフェクト）されうる。例えば、このトランスフェクションは、宿主細胞が原核細胞である場合に、ＣａＣｌ２法又はエレクトロポレーション法を使用して実施されうる。真核生物宿主細胞のために、遺伝子導入は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、又はパーティクルボンバードメントであるがこれらに限定されない方法を使用して達成されうる。

形質転換宿主細胞を選択するために、当技術分野で周知の方法に従い、選択用マーカーと関連する表現型が利用されうる。例えば、選択用マーカーが、ある特定の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子である場合、宿主細胞は、目的の形質転換体を選択するように、媒体中の抗生物質の存在下で増殖させられうる。

別の実施形態は、二重特異性抗体を作製するための方法であって、ポリヌクレオチド又は組換えベクターを、宿主細胞内で発現させる工程を含む方法を提供する。一実施形態では、作製方法は、そこにポリヌクレオチド又は組換えベクターを保有する組換え細胞を培養することと、任意選択で、抗体を、培地から単離及び／又は精製することとを含みうる。

有益な効果
本開示は、それらの各々が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ；ＥＧＦＲ）に特異的な抗体と、４－１ＢＢに特異的な抗体とを含む、二重特異性抗体、及びこれらの使用に関する。これらの二重特異性抗体は、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化させ、ＥＧＦＲ発現細胞の存在下に限り、強力な免疫細胞をブーストする。特異的なＥＧＦＲ媒介免疫応答のために、二重特異性抗体を使用することにより、肝毒性を、４－１ＢＢモノクローナル抗体と比較して、はるかに弱めることが期待される。

ＥＬＩＳＡにより測定される、抗４－１ＢＢ抗体の抗原（ヒト４－１ＢＢ）結合活性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより測定される、抗４－１ＢＢ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより測定される、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗原（ヒトＥＧＦＲ）結合活性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより測定される、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗原（ヒトＥＧＦＲ）結合活性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより測定される、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗原（ヒト４－１ＢＢ）結合活性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより測定される、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗原（ヒト４－１ＢＢ）結合活性を示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株（ＥＧＦＲ高発現細胞）内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＢＴ－４７４細胞株（ＥＧＦＲネガティブ細胞）内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現ＨＣＣ１９５４細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現Ｃａｌｕ－３細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現ＤＬＤ－１細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現ＳＫ－ＢＲ－３細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現ＮＣＩ－Ｎ８７細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ発現Ｐａｎｃ－１細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ非発現ＣＨＯ－ｋ１細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ非発現ＳＷ６２０細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ非発現ＭＣ３８細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ＥＧＦＲ非発現Ｊｕｒｋａｔ細胞株内の４－１ＢＢシグナル活性化レベルを示すグラフである。 多様な細胞株内の、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体（７ａ、７ｂ）による、ＥＧＦＲ ｓＡＢＣと、４－１ＢＢ誘導性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達との相関を示すグラフである。 多様な細胞株内の、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体（７ａ、７ｂ）による、ＥＧＦＲ ｓＡＢＣと、４－１ＢＢ誘導性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達との相関を示すグラフである。 多様な細胞株内の、コントロール抗体（７ｃ）による、ＥＧＦＲ ｓＡＢＣと、４－１ＢＢ誘導性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達との相関を示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体で治療されたＥＧＦＲ発現ＤＬＤ－１細胞から放出されるＩＦＮ－ガンマレベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体で治療されたＥＧＦＲ発現ＤＬＤ－１細胞から放出されるＩＦＮ－ガンマレベルを示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体で治療されたＥＧＦＲ発現ＤＬＤ－１細胞の生存％を示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体で治療されたＥＧＦＲ発現ＤＬＤ－１細胞の生存％を示すグラフである。 ＤＬＤ－１を保有するｈＰＢＭＣ生着マウスにおける、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。 ヒトＥＧＦＲ／ＭＣ３８腫瘍を保有する４－１ＢＢノックインマウスにおける、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体により治癒され、ヒトＥＧＦＲ／ＭＣ３８腫瘍細胞及びＢ１６ Ｆ１０腫瘍細胞により再抗原投与されたマウスにおける、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体についてのＦｃγＲＩＩｂ依存性４－１ＢＢバイオアッセイの結果を示すグラフである。 抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体についてのＦｃγＲＩＩｂ非依存性４－１ＢＢバイオアッセイの結果を示すグラフである。

発明の方式
本明細書の以下では、本発明について、例により、詳細に記載される。

以下の例は、本発明を例示することだけが意図され、本発明を限定するとは見なされない。

実施例１
抗４－１ＢＢ抗体
１．１． ４－１ＢＢに対する完全ヒトモノクローナル抗体の調製
完全長ＩｇＧ形態の、完全ヒトモノクローナル抗４－１ＢＢ抗体を、４－１ＢＢに対する、ファージライブラリー（ＫＢｉｏ Ｈｅａｌｔｈから得た）イムノチューブパニングによりスクリーニングした。標的分子に対するファージライブラリーのパニングのために、４－１ＢＢ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ＿００１５５２．２）でコーティングされたイムノチューブを使用して、合計４ラウンドのパニングを実施した。

３ラウンドにわたるパニングアウトプットに由来する細菌コロニーを、９６深底ウェルプレート内、ＳＢ－カルベニシリン（Ｂｉｏｍａｔｉｋ型番：Ａ２３１１－５ｇ）中で、混濁するまで増殖させ、この時点で、１０^１１ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｋ－Ｂｉｏ Ｈｅａｌｔｈ）を、各ウェルへと添加した。感染の１時間後、３７℃で、静かに振盪（８０ｒｐｍ）しながら、７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加し、細胞を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で、一晩にわたり培養した。

翌日、プレートを遠心分離し、ファージを含有する上清を、ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０を伴うリン酸緩衝生理食塩水）中に３％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックされた、４－１ＢＢ抗原コーティングＥＬＩＳＡプレートへと添加した。室温で、１時間にわたるインキュベーションの後、プレートを、ＰＢＳＴで、３回にわたり洗浄し、抗Ｍ１３抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ型番：１１９７３－ＭＭ０５）を添加した。プレートを、１時間にわたりインキュベートし、ＰＢＳＴで、３回にわたり洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して、結合活性を測定した。

４－１ＢＢ特異的結合剤を、プラスミドＤＮＡを配列決定するために増幅した。表６～１３に示される通りに、固有の配列を同定し、配列多様性を決定するように（下線：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の順序）、軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列（ＶＬ配列及びＶＨ配列）を解析した。以下の実施例では、ＢＭＵＲ（ＢＭＳ製のウレルマブ、米国特許第７，２８８，６３８号）として表示の抗４－１ＢＢ抗体を、アゴニスト活性を比較するために使用する。

１．２． ４－１ＢＢに対するｓｃＦｖ抗体の調製
重鎖可変領域の４４位におけるアミノ酸残基「Ｇ」を、「Ｃ」で置換し、軽鎖可変領域の１０３位におけるアミノ酸残基「Ｇ」を、「Ｃ」で置換した、実施例１．１の表６～１３に示された、４－１ＢＢに対する完全ヒトモノクローナル抗体の可変領域を使用して、（Ｎ’）－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－（Ｃ’）の構造を伴う抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体を調製した。ｓｃＦｖ内の、このような「Ｇ」から「Ｃ」へのアミノ酸置換は、ｓｃＦｖを、１つの標的特異的部分として含む、二重特異性抗体の安定性の増大に寄与しうる。調製された抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を、以下の表１４～１９に例示するが、当業者は、以下の実施形態において、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、又は（ＧＳ）９など、多様な種類のペプチドリンカーの適用を含む、アミノ酸配列の変化又は修飾を適用して、具体的な目的を満たすことができる。

１．３． 抗４－１ＢＢ抗体（完全長ＩｇＧ形態）の、ヒト４－１ＢＢへの抗原結合能
（１）ＥＬＩＳＡにより測定される抗原結合活性
抗原結合活性について査定するために、実施例１．１において調製された抗体候補物質を、ＥＬＩＳＡ試験にかけた。略述すると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中に０．１μｇ／ｍｌのヒト４－１ＢＢ－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ウェル１つ当たり１００μｌにより、４℃で、一晩にわたりコーティングし、次いで、５％（ｖ／ｖ）のＢＳＡ、ウェル１つ当たり１００μｌによりブロックした。１０μｇ／ｍｌから始める、ヒト化抗体（１Ａ１０、１Ａ１２、及びＡＢ４１）の５倍希釈液を、各ウェルへと添加し、室温（ＲＴ）で、１～２時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体コンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ）と共に、ＲＴで、１時間にわたりインキュベートした。洗浄の後、プレートを、ＴＭＢ基質で現像し、ＯＤを４５０～６５０ｎｍとする分光光度計により解析した。

得られた結果を、図１ａに示す。図１ａに示される通り、全ての被験抗４－１ＢＢ抗体は、４－１ＢＢ結合能を示す。

（２）ＦＡＣＳにより測定される細胞結合活性
細胞結合活性について査定するために、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により、抗体候補物質を、哺乳動物により発現された４－１ＢＢへのその結合について解析した。略述すると、それらの表面上において、４－１ＢＢを発現するＪｕｒｋａｔ細胞であるＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ；細胞３×１０^５個）を、抗体（１Ａ１０及び１Ａ１２；各々、１０ｕｇ／ｍＬずつ）と共にインキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中に１％（ｖ／ｖ）のＢＳＡ）による洗浄の後で、ＦＩＴＣ－抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ９５１２、濃度：２．０ｍｇ／ｍｌ）を、各ウェルへと添加し、４℃で、１時間にわたりインキュベートした。ＦＩＴＣの平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により査定した。

得られた結果を、図１ｂに示す。図１ｂに示される通り、全ての被験抗４－１ＢＢ抗体は、細胞表面上で発現された４－１ＢＢへの結合能を示し、哺乳動物細胞上で発現された４－１ＢＢに効率的に結合しうる。

実施例２
抗ＥＧＦＲ抗体の調製
抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のための、ＥＧＦＲターゲティング部分としては、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）：ＢＭＳ”、ＤｒｕｇＢａｎｋ寄託番号：ＤＢ００００２；ヒトＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体）、又はｓｃＦｖなど、その抗原結合断片を用いた。

セツキシマブの配列を、以下の通りにまとめる：
重鎖：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９０）
軽鎖：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号７５）

二重特異性抗体内に含有される抗ＥＧＦＲ抗体の定常領域は、１つを超える突然変異又は変化を、ヒトＩｇＧ１へと導入することにより修飾することができ、例示的な一実施形態（本明細書の以下では、「ＥＴ（ＷＴ）」と指し示される）を、表２０に例示する。

二重特異性抗体内に含有される抗ＥＧＦＲ抗体の定常領域は、１つを超える突然変異又は変化を、ヒトＩｇＧ１へと導入することにより修飾することができ、例示的な一実施形態であるＥＧＦＲ（ＮＡ又はＮ２９７Ａ）を、下記の表２１に提示する。

実施例３
抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の調製
多様な抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体候補物質を、完全長ＩｇＧ（抗ＥＧＦＲ抗体）－ｓｃＦｖ（抗４－１ＢＢ抗体）フォーマット、又は完全長ＩｇＧ（抗４－１ＢＢ抗体）－ｓｃＦｖ（抗ＥＧＦＲ抗体）フォーマットで調製した。本実施例では、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体を、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合形態（１つの抗原のｓｃＦｖ抗体断片を、別の抗原のＩｇＧのＣ末端へと融合させた）で調製するのに、それぞれ、実施例２及び実施例１．２で調製された、抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ及び４－１ＢＢ ｓｃＦｖクローンを、例示的に選択した。ＥＧＦＲを、完全ＩｇＧ部分に配置する場合は、ＡＤＣＣを低減した突然変異体骨格（Ｎ２９７Ａ突然変異；Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、１９巻、１号、１０１～１１３頁など）を伴うＩｇＧ１を使用し、４－１ＢＢを、完全ＩｇＧ部分に配置する場合は、ＩｇＧ４を使用した。

抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＩｇＧ抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメント１を、ｐｃＤＮＡ ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７；プラスミド１）へと挿入し、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体のＩｇＧ抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメント２を、ｐｃＤＮＡ ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７；プラスミド２）へと挿入した。二重特異性抗体の発現のためのベクターを構築するのに、（ＧＧＧＧＳ）３からなる、１５アミノ酸長を有するリンカーペプチドをコードするＤＮＡセグメント４を使用するか、又は（ＧＳ）９からなる、１８アミノ酸長を有するリンカーペプチドをコードするＤＮＡセグメント５を使用して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡセグメント３を、プラスミド１へと挿入された、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＣ末端に対応するＤＮＡセグメント１の部分において融合させた。さらに、実施例１．２で記載された通り、ｓｃＦｖを安定化させるために、ＶＬ１０３－ＶＨ４４（ＶＬ１０３：１０３位において、Ｇ→Ｃ突然変異を有するＶＬ；ＶＨ４４：４４位において、Ｇ→Ｃ突然変異を有するＶＨ）を、軽鎖のＣ末端及び重鎖のＣ末端のそれぞれへと融合させる、さらなる修飾を適用して、ジスルフィド架橋を作出した。

調製される二重特異性抗体の中で、一部のいくつかの例示的二重特異性抗体の調製において使用される、重鎖、軽鎖、ｓｃＦｖ、及びＤＮＡセグメントの配列を、表２２～３０に例示する。下記に提示される抗体では、安定性及び力価の改善、免疫原性の低下などの目的で、アミノ酸配列内に、１つ以上の点突然変異を適用することができる。

実施例４
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の結合親和性についての試験
４．１． ヒトＥＧＦＲへの結合
二重特異性抗体の、ＥＧＦＲへの結合親和性は、実施例１．３（１）を参照しながら、ＥＬＩＳＡにより行った。

略述すると、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ）を、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌのヒトＥＧＦＲ－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０００１－Ｈ０８Ｂ）、ウェル１つ当たり１００μｌにより、４℃で、一晩にわたりコーティングし、次いで、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ、３００６３５７２））、ウェル１つ当たり２００μｌ）により、３７℃で、２時間にわたりブロックした。０．１μＭから始める、実施例３で調製された抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の６倍希釈液を、各ウェルへと添加し、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲートＦａｂマルチクローナル抗体試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、３１４１４）と共に、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。洗浄の後、プレートを、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）基質で現像し、ＯＤを４５０～６５０ｎｍとする分光光度計により解析した。

得られた結果を、図２ａ及び２ｂに示す。図２ａ及び２ｂに示す通り、全ての被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、コントロール抗ＥＧＦＲ抗体の親和性と同様の高親和性で、ヒトＥＧＦＲタンパク質に結合しうる。

４．２． ヒト４－１ＢＢへの結合
二重特異性抗体の、４－１ＢＢへの結合親和性は、実施例１．３（１）を参照しながら、ＥＬＩＳＡにより行った。

略述すると、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ）を、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌのヒト４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１００４１－Ｈ０８Ｈ）、ウェル１つ当たり１００μｌにより、４℃で、一晩にわたりコーティングし、次いで、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ、３００６３５７２））、ウェル１つ当たり１００μｌにより、３７℃で、２時間にわたりブロックした。０．１μＭから始める、実施例３で調製された抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の６倍希釈液を、各ウェルへと添加し、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲートＦａｂマルチクローナル抗体試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、３１４１４）と共に、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。洗浄の後、プレートを、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）基質で現像し、ＯＤを４５０～６５０ｎｍとする分光光度計により解析した。

得られた結果を、図３ａ及び３ｂに示す。図３ａ及び３ｂに示す通り、全ての被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体が、ヒト４－１ＢＢタンパク質に、高親和性で結合しうるのに対し、抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に結合しない。

図２ａ、２ｂ、３ａ、及び３ｂの結果を定量し、以下の表３１にまとめる。

表３１に示される通り、全ての被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ヒトＥＧＦＲタンパク質及びヒト４－１ＢＢタンパク質の両方に、高親和性で結合しうる。

４．３． 多様な細胞表面発現ヒトＥＧＦＲへの結合
それらの表面において、ＥＧＦＲを発現させる、多様な細胞に対する、二重特異性抗体の結合親和性は、実施例１．３（２）を参照しながら、ＦＡＣＳ解析により行った。

ＥＧＦＲは、多様ながん細胞内で発現され、皮膚がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、胃がん、膵臓がん、頭頸部がんなど、多様な固形がん内で、過剰発現されることが報告されている。

この実験のために、以下：Ａ４３１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５５５（商標）、類表皮癌）、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２０（商標）、乳管癌）、ＨＣＣ１９５４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２３３８（商標）、ＴＮＭ病期ＩＩＡ、悪性度３、乳管癌）、Ｊｉｍｔ－１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５８９、乳癌）、Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標）、頸部腺癌）、ＤＬＤ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２１（商標）、デュークスＣ型、結腸直腸腺癌）、Ｋａｔｏ ＩＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１０３（商標）、胃癌）、ＮＣＩ－Ｎ８７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８２２（商標）、ヒト胃癌）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２６（商標）、ヒト乳がん）、ＣＦＰＡＣ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１９１８（商標）、膵管腺癌）、Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４６９（商標）、膵類表皮癌）、Ａ２５３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－４１（商標）、顎下腺類表皮癌）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１３８（商標）、咽頭癌、ＦａＤｕ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－４３（商標）、咽頭扁平上皮癌）、ＳＣＣ９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６２９（商標）、舌扁平上皮癌）、ＳＣＣ１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６２３（商標）、舌扁平上皮癌）、ＳＣＣ２５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６２８（商標）、舌扁平上皮癌）の通りの、多様な種類のがん細胞株を使用した。細胞株について、ＥＧＦＲへの結合を、本発明の抗体を使用することを介して、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により解析した。

具体的に述べると、各細胞株を解離させ、ＰＢＳ中で洗浄した後で、細胞数を計数し、ＦＡＣＳバッファー２００μｌ当たりの細胞２×１０^５個として設定し、次いで、抗ＥＧＦＲ×４－１ＢＢ抗体を、１０μｇ／ｍＬで治療し、４℃で、１時間にわたり反応させた。反応の後、細胞を、ＦＡＣＳバッファー中で洗浄し、次いで、ＦＩＴＣ標識付け定常領域（Ｆｃ）特異的抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＩＴＣコンジュゲートＦｃ特異的抗体、Ｓｉｇｍａ、Ｆ９５１２、濃度：２．０ｍｇ／ｍｌ）を、ＦＡＣＳバッファー２００μｌ当たりの細胞を１×１０^５個とする２μｌ中で懸濁させ、４℃で１時間にわたり反応させた。反応の後、細胞を、ＦＡＣＳバッファー中で洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒデバイスを使用して解析した。ネガティブコントロール群は、ＦＩＴＣ標識付け定常領域（Ｆｃ）特異的抗体だけで治療した。がん細胞株の間における、ＥＧＦＲの発現度を比較するために、被験群内のピークシフトについての結果についての値を、ネガティブコントロール群内のピークシフトについての結果についての値で除した（平均蛍光発光強度比であるＭＦＩ比：被験抗体についてのＭＦＩ／第２についての抗体のＭＦＩ）。

得られた結果を、以下の表３２に示す。

表３２に示される通り、全ての被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、細胞表面発現ヒトＥＧＦＲタンパク質に結合しうる。

実施例５
ＢｓＡｂの、４－１ＢＢに対する結合親和性（ＳＰＲ）
ＳＰＲ実験では、抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８９５８３２５）を、アミンカップリングにより固定化させた、Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００５３０）上のフローセル１を、参照として保持しながら、フローセル２、３、及び４において、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体を、個別に捕捉した。組換えヒト４－１ＢＢタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４１Ｂ－Ｈ５２２７）を、チップにわたって、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、及び０．７８ｎＭの濃度、３０μｌ／分で、３００秒間流し、４００秒間の解離相がこれに続いた。再生は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００３５５）により実施した。

得られた結果を、以下の表３３に示す。

表３３に示される通り、被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、高度な４－１ＢＢ結合親和性を示す。

実施例６
４－１ＢＢシグナルの活性化
６．１． ＢｓＡｂ対単一特異性抗体
本実施例では、４－１ＢＢシグナルの活性化を測定するために、応答エレメントの下流において、ヒト４－１ＢＢ及びルシフェラーゼを安定的に発現するように遺伝子改変されたＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、エフェクター細胞として使用し、ＥＧＦＲを発現するか、又は発現しないがん細胞を、標的細胞として使用した。略述すると、標的細胞として、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＥＧＦＲを発現する；細胞２．５×１０^４個）又はＢＴ－４７４（ＥＧＦＲを発現しない；細胞２．５×１０^４個）を、９６ウェルアッセイプレート内に播種し、一晩にわたり培養した。アッセイ当日に、被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体（実施例３；１００ｎＭ又は４ｎＭ、５倍希釈液）と、エフェクターＪｕｒｋａｔ細胞（細胞２．５×１０^４個）とを、プレートへと添加した。インキュベーションの６時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、マイクロプレートリーダーを使用して、発光を測定した。

得られた結果を、以下の図４ａ（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株）及び４ｂ（ＢＴ－４７４細胞株）に示す。図４ａ及び４ｂでは、ＢＭＵＲ（ＢＭＳ製のウレルマブ、米国特許第７，２８８，６３８号）は、アゴニスト活性を比較するために使用される抗４－１ＢＢ抗体を指し示す。図４ａ及び４ｂに示す通り、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ高発現細胞と共に共培養された場合に限り、４－１ＢＢシグナルの強力な活性化をもたらす。Ｆｃ架橋抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、最小限の活性を示した。

６．２． 多様なＥＧＦＲ発現細胞内の、４－１ＢＢの活性化
本実施例では、４－１ＢＢシグナルの活性化を測定するために、応答エレメントの下流において、ヒト４－１ＢＢ及びルシフェラーゼを安定的に発現するように遺伝子改変されたＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、エフェクター細胞として使用し、ＥＧＦＲを発現するか、又は発現しないがん細胞を、標的細胞として使用した。略述すると、ＥＧＦＲ発現（Ａ－４３１、ＨＣＣ１９５４、Ｃａｌｕ－３、ＤＬＤ－１、ＳＫ－ＢＲ－３、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｐａｎｃ－１）又はＥＧＦＲ非発現（ＣＨＯ－ｋ１、ＳＷ６２０、ＭＣ３８、Ｊｕｒｋａｔ）がん細胞（ウェル１つ当たりの細胞２．５×１０^４個ずつ）を、９６ウェルアッセイプレート内に播種し、一晩にわたり培養した。アッセイ当日に、被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体（実施例３；１００ｎＭ又は２ｎＭ、５倍希釈液）と、エフェクターＪｕｒｋａｔ細胞とを、プレートへと添加した。インキュベーションの６時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、マイクロプレートリーダーを使用して、発光を測定した。

得られた結果を、図５ａ～５ｈ（ＥＧＦＲ発現細胞）及び図６ａ～６ｄ（ＥＧＦＲ非発現細胞）に示す。図５ａ～５ｈ及び６ａ～６ｄにおいて示される通り、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ発現細胞と共に共培養された場合に限り、４－１ＢＢシグナルの強力な活性化をもたらす。

６．３． ＥＧＦＲの定量
ＥＧＦＲの細胞表面発現レベルを、製造元の推奨に従い、ＱＩＦＩＫＩＴ定量キット（Ｄａｋｏ）を使用して、多様ながん細胞株上において定量した。略述すると、細胞を、飽和濃度の非標識抗ＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）、又は精製マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール（Ａｂｃａｍ）で染色した。洗浄の後、染色された細胞と、キットによる較正ビーズとを、キットによる、同じＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体で、同時に標識付けした。標識付けされた細胞と、較正ビーズとを、フローサイトメーター上で解析した。較正ビーズによるＭＦＩ値を使用して、線形回帰を実施した。この回帰直線から、ＡＢＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂｉｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）を外挿し、抗ＥＧＦＲ抗体のＡＢＣから、アイソタイプコントロール抗体のＡＢＣを減算することにより、ｓＡＢＣ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＢＣ）を決定した。

得られた結果を、表３４に示す。

表３４に示される通り、９つのがん細胞株のｓＡＢＣを決定した。

６．４． ＥＧＦＲ ｓＡＢＣと、４－１ＢＢ誘導性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達との相関
実施例６．３で測定されたＥＧＦＲレベルを、ＭＤＡ－ＭＢ２３１により発現されるＥＧＦＲレベルに照らして標準化した。二重特異性抗体による４－１ＢＢ活性化のレベルは、実施例６．２の４－１ＢＢ ＮＦ－ｋＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるコントロールと比較した倍率変化の最高レベルとして決定した。共通領域は、線形当てはめのための信頼区間を指し示す。

得られた結果を、図７ａ～７ｃに示す。図７ａ～７ｃに示される通り、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体による４－１ＢＢ活性化は、ＥＧＦＲの細胞表面発現との、ＢＭＵＲと比較して、強力な相関を示した（図７ｃ）。

実施例７
Ｔ細胞による免疫応答
７．１． サイトカインの放出に対する効果
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の応答を刺激する、二重特異性抗体の能力について調べるために、ＩＦＮ－ガンマの上清中濃度を測定した。ヒト抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、５ｕｇ／ｍＬ）で刺激されたヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用した。ＥＧＦＲを発現するＤＬＤ－１細胞を、標的細胞として使用した。この系では、ＰＢＭＣを、ヒト抗ＣＤ３抗体の存在下で、ＤＬＤ－１と共に共培養した。二重特異性抗体（実施例３）（２０ｎＭ（＝４ｕｇ／ｍＬ）から始めて、１０回の投与にわたり希釈した）、及びそれらの対応物である単一特異性抗体（２６．６７ｎＭ（＝４ｕｇ／ｍＬ）から始めて、１０回の投与にわたり希釈した）を、混合培養物へと添加した。５％ＣＯ_２を伴い、３７℃で、７２時間にわたる、加湿チャンバー内の培養の後、ＩＦＮ－ガンマの上清中濃度を、ヒトＩＦＮ－ガンマＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＩＦ５０）により測定した。

得られた結果を、図８ａ及び８ｂに示す。図８ａ及び８ｂに示す通り、全ての被験二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ高発現細胞の存在下において、各モノクローナル抗体の組合せを超えるサイトカイン放出を誘導した。

７．２． 標的細胞の増殖に対する効果
ヒトＰＢＭＣの応答を刺激する、二重特異性抗体の能力について調べるために、標的細胞溶解アッセイを使用した。ヒト抗ＣＤ３抗体で刺激されたヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用した。ＥＧＦＲを発現するＤＬＤ－１細胞を、標的細胞として使用した。この系では、ＰＢＭＣを、ヒト抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、５ｕｇ／ｍＬ）の存在下で、ＤＬＤ－１と共に共培養した。二重特異性抗体（２０ｎＭ（＝４ｕｇ／ｍＬ）から始めて、１０回の投与にわたり希釈した）、及びそれらの対応物である単一特異性抗体（２６．６７ｎＭ（＝４ｕｇ／ｍＬ）から始めて、１０回の投与にわたり希釈した）を、混合培養物へと添加した。培養の後、ＤＬＤ－１の生存率を、細胞カウンティングキット－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＣＫ０４－２０）により測定した。

得られた結果を、図９ａ～９ｄに示す。図９ａ～９ｄに示される通り、全ての被験二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ高発現細胞の存在下において、各単一特異性抗体の組合せと比較して、優れたがん細胞死活性を示した。

実施例８
ＤＬＤ－１を保有するｈＰＢＭＣ生着マウスにおける、ｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍効果
抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果について調べるために、ＰＢＭＣヒト化ＮＰＧマウスを使用した。６～８週齢のＮＰＧマウスに、ヒトＰＢＭＣ １×１０^７個を静脈内注入し、ＤＬＤ－１がん細胞５×１０^６個を、ＰＢＭＣ注射の５日後に、マウスの右脇腹へと接種した。ＤＬＤ－１を保有するヒト化マウスを、腫瘍植込みの６日後に、腫瘍体積に基づき、各試験群（群１つ当たりのｎ＝８）へと無作為化したところ、各群の平均腫瘍体積は、約８５ｍｍ^３であった。ヒトＩｇＧ１コントロール抗体であるセツキシマブ、ウレルマブ、及び抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体ＥＴ（ＮＡ）×１Ａ１０を、毎週２回、１０又は６０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。実験期間中、腫瘍サイズは、デジタルノギスで測定し、腫瘍体積が、３０００ｍｍ^３に到達するか、又は初回の治療からの、２０％を超える体重の減少が生じた場合は、動物を安楽死させた。

生存結果を、図１０に示す。図１０に示される通り、ウレルマブは、体重減少のほか、わずかな抗腫瘍効果を含む有害作用を誘導した。一方、用量を６０ｍｇ／ｋｇとするＥＴ（ＮＡ）×１Ａ１０で治療されたマウスは、他の治療を適用されたマウスより優れた生存率を示した。

実施例９
４－１ＢＢノックインマウスにおける、ｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍効果
９．１． 抗腫瘍活性
抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を、ヒトＥＧＦＲ／ＭＣ３８腫瘍を保有する４－１ＢＢノックインマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）において査定した。ヒトＥＧＦＲ／ＭＣ３８細胞株は、ＳＩＲＩＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨにより、ＭＣ３８－ＷＴに基づき作出され、ＥＧＦＲの発現が確認された。ＥＧＦＲ／ＭＣ３８細胞５×１０^５個を、マウスの右脇腹へと接種した。マウスを、腫瘍接種の８日後に、腫瘍体積（約８０ｍｍ^３）に基づき、各試験群（群１つ当たりのｎ＝５）へと無作為化した。ヒトＩｇＧ１抗体であるセツキシマブ、及び抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体（ＥＴ（ＷＴ）×１Ａ１０ Ｍ１２、ＥＴ（ＮＡ）×１Ａ１０ Ｍ１２）を、毎週２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、マウスへと、４週間にわたり腹腔内投与した。腫瘍サイズを、デジタルノギスで測定した。

得られた結果を、図１１に示す。図１１に示される通り、抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ヒトＥＧＦＲ／ＭＣ３８腫瘍において、セツキシマブと比較して、優れた抗腫瘍効果を示した。ＥＴ（ＷＴ）×１Ａ１０ Ｍ１２及びＥＴ（ＥＴ）×１Ａ１０ Ｍ１２で治療された大半のマウスは、治癒した。

９．２． 腫瘍特異的メモリーＴ細胞の効果についての査定
ＥＴ（ＷＴ）×１Ａ１０ Ｍ１２及びＥＴ（ＮＡ）×１Ａ１０ Ｍ１２により治癒されたマウスに、腫瘍注入の１００日後において、両側の脇腹に、ヒトＥＧＦＲ／ＭＣ３８腫瘍細胞（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）及びＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）を再抗原投与した。マウスには、再抗原投与研究期間中に、薬物を投与しなかった。腫瘍サイズを、デジタルノギスで測定した。

得られた結果を、図１２に示す。図１２に示される通り、ヒトＥＧＦＲ／ＭＣ３８腫瘍の発症は、観察されなかった。加えて、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の増殖も、ＥＧＦＲ（ＷＴ）×１Ａ１０ Ｍ１２治療及びＥＧＦＲ（ＷＴ）×１Ａ１０ Ｍ１２治療により抑制された。

実施例１０
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性（ＮＡ骨格対ＷＴ）
１０．１． ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ
本実施例では、ヒト末梢血由来ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を、エフェクター細胞として使用し、ＥＧＦＲを発現するＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）標識付けＤＬＤ－１細胞（ＡＴＣＣ）を、標的細胞として使用した。細胞を、エフェクター：標的比を５：１として、５０ｎＭの抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体（実施例３）と共に、３７℃で共培養した。４時間後に、細胞を、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｌｉｔｙ色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））で染色し、次いで、標的死細胞の比を、フローサイトメトリーにより解析した。

得られた結果を、以下の図１３に示す。図１３に示される通り、ＩｇＧ１型（ＷＴ）の抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＮＫ細胞により媒介される、顕著なＡＤＣＣ効果を示した。

１０．２． ＦｃγＲＩＩｂのエンゲージメントに依存する、４－１ＢＢシグナルの活性化
本実施例では、ＦｃγＲＩＩｂを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、９６ウェルアッセイプレート内に播種し、一晩にわたり培養した。アッセイ当日に、Ｊｕｒｋａｔ／４－１ＢＢ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、９６ウェルプレートに播種した。細胞を、ＦｃγＲＩＩｂを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下（ＦｃγＲＩＩｂ依存性）又は非存在下（ＦｃγＲＩＩｂ非依存性）における、滴定量の抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体と共にインキュベートした。誘導の６時間後に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、発光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して決定した。４パラメータロジスティック曲線解析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアにより実施した。

得られた結果を、以下の表３５（ＦｃγＲＩＩｂ依存性４－１ＢＢバイオアッセイ）及び３６（ＦｃγＲＩＩｂ非依存性４－１ＢＢバイオアッセイ）、並びに図１４ａ（ＦｃγＲＩＩｂ依存性４－１ＢＢバイオアッセイ）及び１４ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ非依存性４－１ＢＢバイオアッセイ）に示す。

表３５及び３６、並びに図１４ａ及び１４ｂにおいて示される通り、ウレルマブ治療群は、ＦｃγＲＩＩｂ ＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在により、最大ＲＬＵの１４．２倍の差違、及びＥＣ_５０の２．３倍の差違を示した。４つの抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体は、ＦｃγＲＩＩｂ ＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在又は非存在に関わらず、ウレルマブと比較して、極めて低度のＲＬＵを示した。これらのデータは、全ての被験抗ＥＧＦＲ／抗４－１ＢＢ二重特異性抗体が、臨床研究（ＮＣＴ００３０９０２３、ＮＣＴ００６１２６６４、ＮＣＴ０１４７１２２１０）において、重度の毒性を及ぼしたウレルマブと比較して、潜在的利益をもたらすことを示した。

本明細書で引用される、刊行物、特許出願、及び特許を含む、全ての参考文献は、各参考文献が、参照により組み込まれることが、個別に、かつ、具体的に指し示され、本明細書で、その全体において明示された場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。

本明細書で別途指示がない限り、又は文脈により反対のことが明確に指示されない限り、本発明についての記載の文脈における（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈における）、「ある（ａ）」指示対象及び「ある（ａｎ）」指示対象及び「その」指示対象、並びに「少なくとも１つの」指示対象及び「１つ又は複数の」指示対象、並びに同様の指示対象という用語の使用は、単数の指示対象及び複数の指示対象の両方を対象とすると理解されるものとする。本明細書で別途指示がない限り、又は文脈により反対のことが明確に指示されない限り、リストの１つ又は複数の項目に続く、「少なくとも１つの」（又は「１つ又は複数の」）という用語（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）の使用は、列挙された項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）、又は列挙された項目のうちの２つ又はこれを超える任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると理解されるものとする。「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を有すること」、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「～を含有すること」という用語は、別途注記されない限り、オープンエンドの（すなわち、「～を含むがこれらに限定されない」を意味する）用語であると理解されるものとする。本明細書で別途指示がない限り、本明細書における、値の範囲の列挙は、範囲内に収まる各個別の値に、個別に言及する縮約法として用いられることだけが意図され、各個別の値は、本明細書で個別に列挙された場合と同様に、本明細書へと組み込まれる。本明細書で別途指示がない限り、又は文脈により反対のことが別途明確に指示されない限り、本明細書で記載されたる全ての方法は、任意の適切な順序で実施されうる。本明細書で提示される、任意の例及び全ての例、又は例示的表現（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく例示することだけが意図されるものであり、別途特許請求されない限り、本発明の範囲に対する限定を提起するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、特許請求されていない任意の要素を、本発明の実施に不可欠なものとして指し示すものとして理解されるべきではない。

本明細書では、本発明を実施するために、本発明者らに既知である、最良の方式を含む、本発明の好ましい実施形態が記載される。これらの好ましい実施形態の変動は、前出の記載を読めば、当業者に明らかとなりうる。本発明者らは、当業者が、適宜、このような変動を用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書で、具体的に記載された形とは別の形で実施されることを意図する。したがって、本発明は、該当する法規により許容される限りにおいて、本明細書に付属の特許請求の範囲で列挙される対象物の、全ての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書で別途指示がない限り、又は文脈により反対のことが別途明確に指示されない限り、上記で記載された要素の、その全ての可能な変動における、任意の組合せも、本発明により包含される。

Claims (21)

1. （ａ）抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片、及び
   （ｂ）抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片
   を含み、抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；
   配列番号４、５、又は６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；
   配列番号７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；
   配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；
   配列番号１４又は１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；及び
   配列番号１６又は１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３
   を含む、抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
2. 抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
   配列番号３０、３１、３２、３３、３４、又は８８のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖可変領域
   を含む、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
3. 抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号５６、５７、５８、５９、６０、又は６１のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる重鎖；及び
   配列番号６２、６３、又は６４のアミノ酸配列を含むか、又はこれらから本質的になる軽鎖
   を含む、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
4. 抗４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合断片が、抗４－１ＢＢ抗体の抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
5. 抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖが：
   配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号４、５、又は６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに
   配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号１６又は１７のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
   を含む、請求項４に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
6. 抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖが、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との間に、ペプチドリンカーを更に含む、請求項５に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
7. 抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブである、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
8. 抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片が：
   配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；
   配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；
   配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；
   配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；
   配列番号６９のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；及び
   配列番号７０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３
   を含む、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
9. 抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片が：
   配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
   配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
   を含む、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
10. 抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片が：
    配列番号７３又は７４のアミノ酸配列を含む重鎖；及び
    配列番号７５のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
11. 抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片が、抗ＥＧＦＲ抗体の抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
12. 抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖが：
    配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに
    配列番号６８のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
13. 抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖが、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との間に、ペプチドリンカーを更に含む、請求項１２に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
14. 抗ＥＧＦＲ抗体の完全長形態、及び
    抗４－１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ
    を含む、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
15. 抗４－１ＢＢ抗体の完全長形態、及び
    抗ＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖ
    を含む、請求項１に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療又は防止のための薬学的組成物。
17. がんが、ＥＧＦＲの発現により特徴づけられる、請求項１６に記載の薬学的組成物。
18. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを投与することを含む、免疫応答を増強するための薬学的組成物。
19. がんの治療又は防止における使用のための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
20. がんが、ＥＧＦＲの発現により特徴づけられる、請求項１９に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体の使用。
21. 免疫応答の増強における使用のための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗４－１ＢＢ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体。
    

Images