CN108463472A - 具有修饰的j-链的结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含含有包括拮抗T‑细胞抑制性信号传导途径的结合部分的修饰的J链的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的结合分子，及其用途。

Description

具有修饰的J-链的结合分子
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年9月30日提交的美国临时专利申请系列号62/235,486的申请日优先权，其公开通过引用全文纳入本文。
发明领域
本发明涉及包含含有经修饰以包括影响T-细胞信号传导途径的结合部分的J链的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的结合分子，及其用途。
背景技术
J链是酸性15-kDa多肽，其通过二硫键与五聚体IgM和二聚体IgA结合，所述二硫键涉及IgM μ或IgA α重链的C-末端处的18个氨基酸分泌尾部片段(tp)中的倒数第二半胱氨酸残基。三个二硫桥分别在Cys 12和100，Cys 71和91，以及Cys 108和133之间形成。参见例如Frutiger等，1992，Biochemistry 31，12643-12647。Sorensen等，2000，Int.Immunol.12(1)：19-27和Yoo等，1999，J.Biol.Chem.274(47)：33771-33777分别报道了将J链纳入人IgM和IgA以及聚合免疫球蛋白装配和与J链缔合的结构要求。Redwan等，2006，HumanAntibodies 15：95-102报道了大肠杆菌中可溶性J链的重组生产。
制备杂合IgA/IgG和IgM/IgG抗体的方法是本领域已知的。因此，Chintalacharuvu等，Clin Immunol 101(1)：21-31中报道了重组产生杂合IgA2/IgG1抗体。据报道，在IgG γ重链末端添加αtp或μtp促进聚合并增强效应功能，如补体活化(Smith等，JImmunol 1995，154：2226-2236)。IgA/IgG杂合抗体同时具有IgA和IgG的特性。用于重组生产IgM抗体的方法在本领域中也是已知的。例如，Tchoudakova A等，人PER.C6细胞中功能性人IgM的高水平表达(High level expression of functional human IgMs in human PER.C6cells).mAbs.2009；1(2)：163-171。
尽管在设计抗体方面取得了进展，但仍需要具有改进的性质(例如改进的亲和性(affinity)，特异性和/或亲合力(avidity))以及与多个结合靶标结合的能力的修饰的抗体。
随着该领域的进展，抗体功能已通过如下方式而被增加：例如，蛋白质工程改造的创新性手段，以提供更高的亲和力、更长的半衰期，和/或更好的组织分布，以及用于增加通过毒性净负荷递送(例如抗体-药物偶联物)的细胞破坏的集中性小分子和大分子技术的组合。另一种提高抗体功能的方法利用了允许一个IgG分子结合两个抗原的免疫球蛋白G(IgG)结构的二价结合。事实上，在某些应用中，通过同时结合两种不同的靶抗原，不对称抗体具有发挥有用功能的良好潜力。为了满足这种需求，已经生产了多种构建体以产生可以结合两种不同抗原的单个分子，从而实现了自然界以前从未出现的功能。这种双特异性方法的一个例子是结合分别在T细胞和B细胞上的CD3和CD19受体的“博纳吐单抗(blinatumomab)”(MT103或AMG103)。将细胞毒性T细胞系连于癌性B细胞允许有效治疗B细胞白血病。
免疫检查点的阻断已经成为推进癌症治疗的一个有前途的领域。免疫检查点是指编码进入免疫系统的抑制性信号传导途径，其在维持自身耐受性以及调节免疫应答的持续时间和幅度方面发挥重要作用。参见例如，Pardoll，Drew M.″癌症免疫治疗中的免疫检查点的阻断(The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy).″NatureReviews Cancer 12.4(2012)：252-264；Postow，Michael A.等，“癌症治疗中的免疫检查点阻断(Immune CheckDoint Blockade in Cancer Therapy)，”J Clin Oncol.2015年6月10日；33(17)：1974-82.doi：10.1200/JCO.2014.59.4358。
尽管临床前模型对概念结果有肯定的证据，但研究人员已报道针对T细胞抑制性信号传导途径成分(例如，均针对CTLA4的伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)和特姆单抗(MedImmune/AstraZenica))的单克隆IgG封闭抗体在临床上仅取得了很小的疗效结果。例如，Postow等，第1-2页。此外，涉及单克隆IgG抗体的治疗已导致免疫相关的不良事件，如皮肤病，胃肠道，肝脏，内分泌和其他炎症事件。例如，同上，第4页。因此，单克隆IgG抗体在免疫检查点阻断中的应用可能受到这些分子的治疗指数的限制，因为引发所需治疗效果所需的单克隆IgG抗体的剂量也会引起免疫相关的不良事件。
因此，需要具有提高的亲合力的结合分子，其将提供增加的效力，从而可以使用较低的剂量水平，从而防止发生免疫相关的不良事件，同时仍然实现有效阻断T细胞抑制性信号传导途径。
发明内容
本发明至少部分基于如下认识：可以通过将一个或多个结合部分引入天然J链序列来修饰IgM或IgA抗体的J链，并且修饰的J链可被引入IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体中，而不影响修饰的J链与其靶标的结合或受者抗体的功能。这使得具有结合部分的修饰的J链与一组靶抗原相互作用，而IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体可与不同组靶抗原相互作用。
本发明进一步基于这样的认识，即由于其多价性质，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体可以提供抗体与靶抗原之间增加的亲和力，从而促进与低水平表达和/或低结合亲和性的抗原的结合。此外，所述结合分子的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA部分的任选多特异性允许特定数目和/或特定类型的结合靶标之间的结合，从而促进抗原靶标的特异性组合。所述结合分子的修饰的J链部分提供可靶标结合的额外机会，使得所述结合分子通过该分子的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA部分结合一个或多个靶标，同时通过J链上的结合部分结合一个或多个靶标。
本发明的方面包括包含具有修饰的J链的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体或其抗原结合片段的结合分子，其中修饰的J链包含影响T-细胞信号传导途径的结合部分。在一些实施方式中，如权利要求1所述的结合分子，其中结合部分拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。在一些实施方式中，修饰的J链上的结合部分结合选自下组的细胞表面蛋白：CTLA4、PD-1、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA和TIGIT。在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。在一些实施方式中，抗体结合选自下组的靶标：PD-1、PD-L1、TIM3和LAG3。
在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体激动T-细胞刺激性信号传导途径。在一些实施方式中，抗体结合选自下组的靶标：CD137、OX40、CD40、GITR、CD27和HVEM。在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体结合低水平表达靶标。在一些实施方式中，低水平表达靶标选自下组：EGFR、HER2、HER3、EpCAM、CEACAM、Gp100、MAGE1和PD-L1。在一些实施方式中，低水平表达靶标是上皮癌细胞上的细胞表面蛋白。
在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体结合低亲和性靶标。在一些实施方式中，低亲和性靶标选自下组：NY-ESO-1，唾液酸化Lewis X抗原和Tn抗原。在一些实施方式中，低亲和性靶标是上皮癌细胞上的细胞表面蛋白。在一些实施方式中，抗体靶标是血液癌细胞上的细胞表面蛋白。在一些实施方式中，抗体靶标选自下组：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52和CD70。
在一些实施方式中，修饰的J链包含修饰的人J链序列或其功能片段。在一些实施方式中，修饰的人J链序列包含SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，将J链结合部分通过直接或间接融合引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，所述结合部分通过肽接头的间接融合引入。在一些实施方式中，间接融合通过结合部分的C端和/或N端处或其周围的肽接头进行。在一些实施方式中，将结合部分在C端处或其周围引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，在离C末端约10个残基内将结合部分引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，将结合部分在N端处或其周围引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，在离N端约10个氨基酸残基内将结合部分引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，将结合部分在SEQ ID NO：1的半胱氨酸残基92和101之间引入天然人J链序列中。在一些实施方式中，将结合部分在糖基化位点处或附近引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，肽接头长约10至20个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头长约15至20个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头长15个氨基酸。
在一些实施方式中，通过化学或化学-酶促衍生将结合部分引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，将结合部分通过化学接头引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。在一些实施方式中，化学接头是可切割或不可切割的接头。在一些实施方式中，可切割接头是化学不稳定接头或酶不稳定接头。在一些实施方式中，接头选自N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)，亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物，活性酯，醛，双叠氮化合物，双重氮鎓衍生物，二异氰酸酯和双活性氟化合物。在一些实施方式中，修饰的J链通过插入酶识别位点以及通过肽或非肽接头在酶识别位点处翻译后附连结合部分而被修饰。
在一些实施方式中，结合部分选自：抗体，抗体的抗原结合片段，抗体-药物偶联物，抗体样分子，抗体样分子的抗原结合片段，配体和受体。在一些实施方式中，结合部分是抗原结合片段，并且选自F(ab′)2，F(ab)2，Fab′，Fab，Fv，scFv，和单结构域抗体。在一些实施方式中，抗原结合片段是scFv。
在一些实施方式中，修饰的J链是V-接头-J取向。在一些实施方式中，修饰的J链是J-接头-V取向。在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体是双特异性抗体。在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体是多特异性抗体。
本发明的各方面包括用于治疗癌症的药物组合物，其中所述药物组合物包含有效量的结合分子和药学上可接受的运载体。本发明的方面包括在制备用于治疗癌症的药物中使用结合分子。在一些实施方式中，癌症是血液癌症或上皮癌症。在一些实施方式中，血液癌症是白血病，淋巴瘤，骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。在一些实施方式中，白血病是急性骨髓性白血病，急性淋巴母细胞性白血病，慢性髓性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方式中，淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，上皮癌症是黑素瘤，非小细胞肺癌，鼻咽癌，结直肠癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，肾癌，甲状腺癌或乳腺癌。在一些实施方式中，乳腺癌是激素受体阴性或三阴性乳腺癌。
在一些实施方式中，药物还包含有效量的第二治疗剂。
附图说明
图1示出了包含J链的IgM五聚体的结构，其中链A和B在天然IgM中是相同的。
图2显示了IgA，二聚体IgA，和分泌的IgA(sIgA)的示意性结构。
图3显示成熟人J链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图4是Tn抗原结构的图示。
图5示出了包含具有与CTLA4结合的结合部分的修饰的J链的J链构建体的两种不同取向。
图6是对靶抗原具有结合特异性并包含与J链附连的结合部分的不对称IgM五聚体的示意图。
图7列出了IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体靶标和J链上结合部分的靶标。左列中列出的任何抗体靶标均可以与右列中列出的任何J链上的结合部分的靶标组合。
图8显示了对具有附连至J链的抗-CTLA4结合部分的不同抗-PD-L1IgM抗体的混合SDS PAGE和Western印迹分析。在有或没有抗-CTLA-4scFv的J链存在下五聚体PD-L1结合IgM的适当组装产生增加量的组装产物和凝胶移位。
图9，图A显示在J链上有或没有各种抗CD3结合部分的抗CD20 IgM抗体的SDS PAGE分析。图B是显示与J链上不含CD3结合部分的抗CD20 IgM抗体以及抗CD20 IgG抗体相比，比较在J链上具有CD3结合部分的抗CD20 IgM活化T细胞的能力的T细胞活化测定结果的图。
图10显示了2张图，其比较了抗-PD-L1 IgM和抗-PD-L1 IgG分子在具有高和低水平的PD-L1表达的2种不同细胞类型中的结合。
图11显示了由来自抗-PD-L1 S70抗体的VH序列制备的IgM和IgG分子对PD-1：PD-L1相互作用的抑制的图。
图12，图A显示了具有野生型或CD3-结合scFv融合J链的S70 IgM的SDS PAGE混合凝胶。图B是显示PD-1：PD-L1相互作用阻断试验的结果的图，其显示CD3-结合J链不破坏PD-L1结合和所得对活性的阻断。
图13显示了携带野生型或CD3-结合J链的S70 IgM在PD-L1表达细胞系上的T-细胞激活，有或没有额外的干扰素γ刺激以增加PD-L1表达。
图14是显示用低(HDML2)和高(SUPHD)PD-L1表达细胞的T-细胞依赖性靶细胞杀伤的图。
图15，图A显示SDS PAGE混合凝胶，证明在野生型，CD3-结合(V)或抗-CTLA-4(Y)scFv存在下S70 IgM的表达和组装。图B是证明用这些抗体分别阻断PD-1：PD-L1相互作用的图。
图16，图A显示了具有或没有野生型J链以及具有2个携带抗-CTLA-4scFv(Y)或抗-CD3 scFv(V)的修饰的J链的抗-PD-L1 IgM的混合凝胶。
图17显示了2张图，其显示了使用Forte Bio BLI读取，携带CTLA-4结合J链或亲本抗-CTLA-4结合IgG的S70 IgM的结合动力学。亲本CTLA-4结合抗体(IgG)以2nM的Kd结合，对比S70Y15J的单价结合。
图18是比较TRAIL配体、IgG和IgM抗体靶向肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员的能力的示意图。
图19是比较抗-DR5 IgM和IgG抗体的激动活性的图。
发明详述
I.定义
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所述的具体实施方式，因为它们当然可能变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、到下限单位的十分之一的各中间值，以及所述范围的任何其它标注或中间值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。
除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解一致。Singleton等，微生物学和分子生物学词典(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology)第二版，约翰威利父子出版社(J.Wiley&Sons)(纽约州纽约，1994)为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。
本文提及的所有出版物均明确通过引用纳入本文，与所引用出版物相关联来公开和描述这些方法和/或材料。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)，单链分子以及抗体片段(例如Fab，F(ab′)2，和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)与本文中的“抗体”可互换使用。基本的4链抗体单位是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异四聚体糖蛋白。除非另有说明，术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且具体包括抗体的所有同种型，亚类和形式，包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE抗体及其片段，优选抗原结合片段。本文优选的抗体包括IgM和IgA抗体及其抗原结合片段，其可以被修饰以包括来自其他同种型的序列，例如IgG以产生嵌合抗体。
在IgG的情况下，4-链单元通常约为150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键相互连接。各H链和L链也具有规则间隔的链内二硫桥键。每条H链在N端具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链各自的三个恒定结构域(CH)，以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。相信某些特定氨基酸残基会形成轻链和重链可变结构域之间的界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。
IgM是形成聚合物的糖蛋白，其中多个免疫球蛋白与二硫键共价连接在一起。IgM主要以五聚物形式存在，但也以六聚体形式存在，因此含有10或12个抗原结合位点。五聚体形式通常含有额外的多肽，称为J链，但也可以在不存在J链的情况下制备。五聚体IgM分子的分子量约为970kDa。由于其多聚性，IgM具有高亲合力，并且在补体激活中特别有效。与IgG不同，IgM单体中的重链由一个可变结构域和四个恒定结构域组成。本文中将IgM恒定结构域称为CM1或Gμ1，CM2或Cμ2，CM3或Cμ3，以及CM4或Cμ4，其中“CM”和“Cμ”名称可互换使用。图1中显示了IgM五聚体的结构。
术语“IgM”在本文中以最广泛的含义使用，具体包括单特异性和多特异性(包括双特异性)IgM分子，例如PCT申请号PCT/US2014/054079中公开的多特异性IgM结合分子，其全部公开内容明确地通过引用并入本文。
术语“IgM结合单元”或“IgM抗体结合单元”以最广泛的含义使用并且具体涵盖与结合靶标(例如，抗原)的可变结构域序列(VH)融合的包含至少CM4恒定结构域的IgM抗体重链恒定区多肽，其有或没有相关的抗体轻链可变结构域(VL)序列。
术语双特异性“IgM结合单元”或“双特异性IgM抗体结合单元”以最广泛的含义使用，并具体涵盖一对IgM抗体重链恒定区多肽，其包含至少一个CM4恒定结构域，与可变结构域序列(VH)融合，每个可变结构域序列结合不同的靶标，有或没有相关的抗体轻链可变结构域(VL)序列。在一个实施方式中，双特异性IgM抗体包含两个VHVL抗原结合区，各自能够结合一个抗原上的不同表位或两个不同抗原上的表位。双特异性IgM抗体结合单元可以是全长来自单个物种，也可以是嵌合或人源化的。本发明的双特异性IgM抗体具有包含五个或六个双特异性IgM结合单元的五或六聚环结构。
术语“多特异性IgM”在本文中以最广泛的含义用于指具有两种或更多种结合特异性的IgM抗体。因此，术语“多特异性”包括“双特异性”，例如，双特异性抗体或双特异性结合单元，包括包含至少两个单特异性亚基的IgM五聚体，每个亚基与不同抗原(AA，BB)结合，或五或六个双特异性亚基，每个亚基结合两种不同的抗原(AB，AB)。因此，双特异性和多特异性IgM五聚体可以包括五个相同的双特异性结合单元，单特异性IgM结合单元，其中至少两个具有不同的结合特异性，或其任何组合。
“全长IgM抗体重链”是这样的多肽，其以N端向C端的方向由以下组成，抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CM1或Cμ1)、抗体重链恒定结构域2(CM2或Cμ2)、抗体重链恒定结构域3(CM3或Cμ3)，和抗体重链恒定结构域4(CM4或Cμ4)。如本文所定义的双特异性全长IgM抗体包含五个或六个单体(结合单元)，每个具有两个抗原结合位点，其特异性结合两个不同的结合靶标(表位)。全长抗体的重链或轻链的C端表示位于重链或轻链的C端的最后一个氨基酸。全长抗体的重链或轻链的N端表示位于重链或轻链的N端的第一个氨基酸。
天然IgA是包含两条相同轻链(κ或λ)和两条相同重链(α)的四聚体蛋白质。在人体中，有两种IgA同种型，IgA1和IgA2。与IgG类似，IgA含有三个恒定结构域(CA1-CA3或Cα1-Cα3)，在Cα1和Cα2结构域之间具有铰链区，其中“CA”和“Cα”的名称可互换使用。所有IgA同种型都具有18个氨基酸的“尾片段”，其位于Cα3结构域的C端，这使得形成多聚Ig(参见例如Garcia-Pardo等，1981，J.Biol.Chem.256，11734-11738和Davis等，1988，Eur.J.Immunol.18，1001-1008)。血清IgA是一种单体，但也可以聚合。在其分泌形式中，IgA包含2-5个由J链连接的基本4-链单元，其可以包含尾片段，并且可以由分泌组分缔合。图2显示了与分泌组分(sIgA)缔合的尾片段，二聚体IgA和分泌型IgA的结构。IgA抗体可以进一步分为IgA1和IgA2亚类。术语“IgA”抗体在本文中用于具体包括所有亚类，即IgA1和IgA2抗体，包括具有和不具有分泌组分的二聚体和多聚体形式，以及这类抗体的片段，优选抗原结合片段。为了本发明的目的，IgA抗体优选是二聚体，其中两个尾片段通过J链连接(参见图2)。
术语“IgA”在本文中以最广泛的含义使用，具体包括单特异性和多特异性IgA分子，例如PCT申请号PCT/US2015/015268中公开的多特异性IgA结合分子，其全部公开内容明确地通过引用并入本文。
术语“多特异性IgA”在本文中以最广泛的含义用于指具有两种或更多种结合特异性的IgA抗体。因此，术语“多特异性”包括“双特异性”，例如，双特异性抗体或双特异性结合单元，包括包含两个单特异性亚基的IgA二聚体，每个亚基结合不同抗原(AA，BB)，或两个双特异性亚基，每个亚基结合两种不同的抗原(AB，AB)。
在一个实施方式中，二聚体多特异性IgA分子由两个单特异性结合单元组成，每个结合单元对不同的结合靶标(AA，BB)具有结合特异性。在另一个实施方式中，在二聚体IgA分子中，两个结合单元中的至少一个具有两种不同的结合特异性(即，是双特异性的，例如AA，A，B或AA，BC)。在另一个实施方式中，两个结合单元中的每一个具有两种特异性，这两种特异性可以是相同的(AB，AB)或不同的(例如，AC，CD或AB，AC)。
术语“双特异性IgA结合单元”以最广泛的含义使用，并具体覆盖一对IgA抗体重链恒定区多肽，其包含至少CA3恒定结构域，与可变结构域序列(VH)融合，每个可变结构域序列结合不同的靶标，有或没有相关的抗体轻链可变结构域(VL)序列。在一个实施方式中，双特异性IgA抗体包含两个VHVL抗原结合区，各自能够结合一个抗原上的不同表位或两个不同抗原上的表位。双特异性IgA抗体结合单元可以是全长来自单个物种，也可以是嵌合或人源化的。
“全长IgA抗体重链”是这样的多肽，其以N端向C端的方向由以下组成，抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CA1或Cα1)、抗体重链恒定结构域2(CA2或Cα2)，和抗体重链恒定结构域3(CA3或Cα3)。根据本发明的双特异性或多特异性全长IgA抗体包含两种单体(结合单元)，每种单体可以是单或双特异性的，有或没有分泌组分。因此，本发明的多特异性IgA抗体可包括单特异性和双特异性结合单元，条件是所得IgA抗体具有至少两种结合特异性。全长抗体的重链或轻链的C端表示位于重链或轻链的C端的最后一个氨基酸。全长抗体的重链或轻链的N端表示位于重链或轻链的N端的第一个氨基酸。
对于不同类别的抗体的结构和性质的其他细节，参见例如《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology)，第8版，DanielP.Stites，AbbaI.Terr和TristramG.Parslow(编)，Appleton&Lange出版社，康涅狄克州诺瓦克，1994，第71页和第6章。
如本文所用，术语“界面”用于指包含于第一IgM重链恒定区中的那些“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团，例如碳水化合物基团)，该恒定区与第二IgM重链恒定区中的一个或多个“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团)相互作用。
术语“不对称界面”用于指两个抗体链，诸如第一和第二IgM重链恒定区之间形成的，和/或IgM重链恒定区和其匹配轻链之间形成的界面(如上文所定义的)，其中第一链和第二链中的接触残基通过设计而不同，包含互补接触残基。可以通过结/孔相互作用和/或盐桥偶联(电荷交换)和/或本领域已知的其他技术(例如，通过用于将u重链偶联到其匹配轻链的CrossMab方法)来产生不对称界面。
“空腔”或“孔”是指从第二多肽的界面凹陷的至少一个氨基酸侧链，并因此容纳在第一多肽的相邻界面上的相应突起(“节”)。空腔(孔)可以存在于原始界面中或可以合成引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。通常，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码空腔。为了实现这一点，编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸被编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA置换，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。可以理解的是，可以存在超过一个的原始和相应输入残基。被替代的原始残基的数量的上限是第二多肽的界面中残基的总数。用于形成空腔的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选选自丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)和甘氨酸(G)。最优选的氨基酸残基是丝氨酸，丙氨酸或苏氨酸，最优选丙氨酸。在优选的实施方式中，用于形成突起的原始残基具有大的侧链体积，例如酪氨酸(Y)，精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
“原始”氨基酸残基是被“输入”残基取代的氨基酸残基，其可以具有比原始残基更小或更大的侧链体积。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。
“非天然存在的”氨基酸残基是指不由遗传密码编码的残基，但其能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的示例是正亮氨酸，鸟氨酸，正缬氨酸，高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336(1991)中描述的那些。为了产生这种非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等，Science 244：182(1989)和Ellman等，同上的方法。简言之，这涉及化学活化具有非天然存在的氨基酸残基的抑制子tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。在某些实施方式中，本发明的方法涉及替换IgM重链中的至少一个原始氨基酸残基，但可以替换超过一个原始残基。通常，不超过第一或第二多肽的界面中的总残基将包含被替换的原始氨基酸残基。替换的优选原始残基是被“埋藏的”。“埋藏”是指残基基本上不能与溶剂接触。优选的输入残基不是半胱氨酸以防止可能的二硫键的氧化或错配。
突起在空腔中是“可定位的”，这意味着分别在第一多肽和第二多肽的界面上的突起和空腔的空间位置以及突起和空腔的尺寸使得突起可以位于空腔中而不显著干扰界面处第一和第二多肽的正常缔合。由于诸如Tyr，Phe和Trp之类的突起通常不从界面的轴线垂直延伸并具有优选的构象，所以突起与对应空腔的对准依赖于基于三维结构对突起/空腔对进行建模，如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)所获得的那样。这可以使用本领域中广泛接受的技术来实现，包括分子建模技术。
“原始核酸”是指编码感兴趣多肽的核酸，其可以被“改变”(即，基因工程改造或突变)以编码突起或空腔。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含经历先前改变的核酸(例如，人源化抗体片段)。“改变”核酸是指原始核酸通过插入，缺失或取代至少一个编码感兴趣氨基酸残基的密码子而突变。通常，编码原始残基的密码子被编码输入残基的密码子取代。已经在《诱变：实践方法》(Mutagenesis：a Practical Approach)，M.J.McPherson编，(英国牛津的IRL出版社)(1991)中综述了以这种方式遗传修饰DNA的技术，包括定点诱变，盒式诱变和聚合酶链式反应(PCR)诱变。
可以通过合成手段将突起或空腔“引入”第一或第二多肽的界面，例如通过重组技术，体外肽合成，用于引入先前描述的非天然存在的氨基酸残基的那些技术，通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的一些组合。因此，“引入”的突起或空腔是“非天然存在的”或“非天然的”，这意味着它不存在于自然界或原始多肽中(例如，人源化单克隆抗体)。
优选用于形成突起的输入氨基酸残基具有较少数量的“旋转异构体”(例如约3-6)。“旋转异构体”是氨基酸侧链的能量有利的构象。在Ponders和Richards，J.Mol.Biol.193：775-791(1987)中综述了各种氨基酸残基的旋转异构体数量。
除非另有说明，术语“抗体”具体包括天然人和非人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgE，IgA，IgD和IgM抗体，包括天然存在的变体。因此，例如，人IgM序列可在GenBank登录号X14940.1下获得，而变体已被报道为GenBank CAB37838.1，CAC20458.1，AFM37312.1，X57331.1和J00260.1
针对多肽(例如，抗体或J链)的术语“天然”在本文中用于指具有天然存在的序列的多肽，而不管其制备方式如何。因此，术语“天然”和“天然序列”在本文中可互换使用，并且明确地涵盖具有在自然界中发现的序列的重组多肽。
本文所述术语“天然序列的J链”或“天然J链”指各种动物物种的天然序列的IgM或IgA抗体的J链，包括成熟人J链，其氨基酸序列示于图3(SEQ ID NO：1)。
本文所述术语“修饰的J链”指天然序列的J链多肽的变体，其含被引入天然序列的外来结合部分。该引入可以通过各种方式实现，包括外来结合部分的直接或间接融合或通过化学接头的附连。术语“修饰的人J链”具体包括但不限于通过引入结合部分修饰的SEQID NO：1的氨基酸序列的天然序列人J链。该术语具体包括但不限于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的天然序列人J链，其通过引入不干扰IgM或IgA的有效聚合(二聚化)以及这些聚合物(二聚体)与靶标的结合的外来结合部分来修饰。
本文所用术语“结合部分”以最广泛的含义包括能够特异性结合靶标，如抗原的任何化学实体。结合部分的示例包括但不限于抗体，抗体的抗原结合片段，抗体-药物偶联物，抗体样分子，抗体样分子的抗原结合片段，配体，和受体。优选的结合部分是多肽(包括肽)，优选具有生物功能。生物功能的示例是结合部分结合并活化或阻断信号传导途径的活性的能力。
术语“多肽”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括肽序列。术语“肽”通常描述含有由肽键共价连接的多达约60个，优选多达约30个氨基酸的氨基酸线性分子链。
针对“结合部分”的术语“外来”在本文中用于指代在相同位置处不存在于参考天然多肽序列中的结合部分。因此，外来多肽序列(包括肽序列)可以包含在相应的天然序列内但在不同的位置。在一个优选的实施方式中，“外来”序列在任何位置都不存在于相应的天然序列中。
本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了少数出现可能的天然产生突变外，群体包含的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有针对某一抗原性位点的高度特异性。而且，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每一单克隆抗体针对抗原的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示该抗体获自基本均质的抗体群这一特点，而不应被解释为需要通过任何特定的方法来产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等，Nature 256：495(1975)所述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。也可通过例如Clackson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文所述单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种的抗体的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与衍生自另一物种的抗体的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白最小序列的抗体。多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中接受者的高变区的残基被非人物种，如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区(供者抗体)的残基取代，具有所需特异性、亲和性和性能。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基也被相应的非人残基所替换。而且，人源化抗体可包含在受者抗体或供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，所述人源化抗体包含至少一个且通常两个可变结构域的几乎全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。其他详细内容参见，Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
本文中的“分离”抗体是重组宿主细胞中已从其天然环境的组成中鉴定并分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗应用的材料，并可以包含酶、激素、和其他蛋白质或非蛋白质的溶质、以及不需要的生产副产物。在一个优选的实施方式中，本文中的分离抗体将被纯化(1)至大于95重量％，或大于98重量％，或大于99重量％，通过SDS-PAGE或SEC-HPLC方法测定，(2)至足以通过使用氨基酸测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝或优选银染在还原性或非还原性条件下通过SDS-PAGE的均一化。通常，分离抗体的制备经历至少一个纯化步骤。
术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”是指结合部分与结合靶标的结合，例如抗体与靶抗原的结合，例如特定多肽，肽或其他靶标(例如，糖蛋白靶标)上的表位，以及与非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可能与牛血清白蛋白或酪蛋白结合)可测量地不同的手段结合。例如，可以通过测定与结合至对照分子的结合相比的结合部分或抗体或通过引入结合部分修饰的抗体与靶分子的结合来测量特异性结合。例如，可通过与靶标相似的对照分子的竞争来确定特异性结合，例如过量的未标记的靶标。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可以通过以下方式展示，例如具有针对靶标至少约200nM，或者至少约200nM，或者至少约150nM，或者至少约100nM，或者至少约60nM，或者至少约50nM，或者至少约40nM，或者至少约30nM，或者至少约50nM约20nM，或者至少约10nM，或者至少约8nM，或者至少约6nM，或者至少约4nM，或者至少约2nM，或者至少约1nM或更大的Kd的分子。在某些情况下，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的情况下的结合。
“结合亲和性”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和性”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和性。分子X对其伴侣Y的亲和性通常可以由解离常数(Kd)表示。例如，Kd可以是约200nM，150nM，100nM，60nM，50nM，40nM，30nM，20nM，10nM，8nM，6nM，4nM，2nM，1nM，或更强。亲和性可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。低亲和性抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和性抗体通常更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合。测量结合亲和性的多种方法在本领域中是已知的。
如本文所用，“Kd”或“Kd值”是指通过适用于抗体和靶配对的技术测量的解离常数，例如使用表面等离子共振测定法，例如，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(新泽西州皮斯卡特维的BIAcore公司(BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.))在25℃下进行，用约10个响应单位(RU)的固定抗原CM5芯片。
术语“偶联物”，“偶联的”和“偶联”是指任何和所有形式的共价或非共价连接，并且包括但不限于直接的遗传或化学融合，通过接头或交联剂的偶联，和非共价缔合。
术语“融合”在本文中用于指一条多肽链中不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合的组合。术语“融合”明确地包括内部融合，即，除了融合到其一个末端之外，在多肽链内插入不同来源的序列。术语“融合”在本文中用于指不同来源的氨基酸序列的组合。
如本文所用，术语“价”表示抗体中存在特定数目的结合位点。如此，术语“二价”，“四价”和“六价”分别表示存在两个结合位点，四个结合位点和六个结合位点。因此，如果在根据本发明的双特异性IgA抗体中每个结合单位是二价的，则双特异性IgA抗体将具有4价位。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何分子决定簇。在某些实施方式中，表位决定簇包括有化学活性的成组表面分子(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团)，而在某些实施方式中，表位决定簇可具有特定的三维结构特点和/或特定的荷电特点。表位是由抗体结合的抗原的区域。“结合区域”是由结合分子结合的结合靶标上的区域。
“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”指与唯一一种表位结合的能力。根据一个实施方式，双特异性IgM抗体以至少10-7M或10-8M或更好的亲和性与每个表位结合。
术语“靶标”或“结合靶标”以最广泛的含义使用，并且具体包括多肽，但不限于，核酸，碳水化合物，脂质，细胞和其它具有或不具有它们在自然界中存在的生物功能的分子。
术语“抗原”是指可以结合抗体或引发细胞免疫应答的实体或其片段。免疫原是指可以在有机体，特别是动物，更特别是包括人在内的哺乳动物中引发免疫应答的抗原。术语抗原包括如上所定义的已知为抗原决定簇或表位的区域
如本文所用，术语“免疫原性”是指引发抗体产生和/或激活针对免疫原抗原的T细胞和/或其他反应性免疫细胞的物质。
本发明抗体的“抗原结合位点”或“抗原结合区”通常含有六个互补决定区(CDR)，其对于抗原对结合位点的亲和性具有不同程度的贡献。有三个重链可变结构域CDR(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。通过与氨基酸序列的编译数据库比较来确定CDR和框架区(FR)的程度，其中根据来自抗体/抗原复合物的序列/结构信息间的差异确定了这些区域。在本发明的范围内还包括由较少的CDR组成的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由三个，四个或五个CDR确定)。少于一组完整的6个CDR可能足以结合一些结合靶标。因此，在一些情况下，单独的VH或VL结构域的CDR将是足够的。此外，某些抗体可能具有抗原的非CDR相关结合位点。这种结合位点具体包括在本定义中。
本申请中使用的术语“宿主细胞”表示可被工程改造以产生根据本发明的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方式中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用作宿主细胞。
本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的名称包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代对象细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移的数量。还应理解，由于有意或偶然的突变，所有的后代的DNA含量可能不是精确相同的。包括功能或生物活性与在初始转化细胞中筛选的功能或生物活性相同的变体子代。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能性关系中时，其是“可操作地连接”的。例如，如果前体序列或分泌前导体的DNA表达为参与多肽分泌的前体蛋白质，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并且在阅读框中。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用的术语“拮抗剂”是指与不存在分子时的相同功能或活性相比，引起功能或活性降低的分子。因此，信号传导途径的“拮抗剂”是其存在引起信号传导途径的功能或活性降低的分子。如本文所用的术语“拮抗”是指引起功能或活性的降低。
如本文所用的术语“激动剂”是指与不存在分子时的相同功能或活性相比，引起功能或活性增加的分子。因此，信号传导途径的“激动剂”是其存在引起信号传导途径的功能或活性增加的分子。如本文所用的术语“激动”是指引起功能或活性的增加。
如本文所用的术语“T细胞抑制信号传导途径”是指导致T细胞免疫应答的阻断或停止的定性或定量降低的T细胞信号传导途径。
如本文所用的术语“T细胞刺激信号传导途径”是指导致T细胞免疫应答的维持或定性或定量增加的T细胞信号传导途径。
如本文所用，术语“低水平表达靶标”是指通过免疫组织化学(IHC)组织分析确定的，靶细胞上的表达水平范围为0至1+的靶标，优选在冷冻，福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片上进行。通过IHC确定表达水平的指导由例如美国病理学家协会(CAP)提供，并且通过ASCO-CAP HER2试验指导建议(ASCO-CAP HER2 Test Guideline Recommendations)来举例说明，可在http：//www.cap.org/apps/docs/committees/immunohistochemistry/summary_of_recommendations.pdf获得。
如本文所用的术语“低亲和性靶标”是指其与抗体的结合相互作用的解离常数Kd大于或等于约10至100nM，例如约25至约75nM范围的值，如通过ELISA所测量。
具有修饰的J链的结合分子的设计和产生
IgM是由B细胞响应抗原刺激产生的第一种免疫球蛋白，并且以约1.5mg/ml在血清中以5天的半衰期存在。IgM是五聚或六聚分子。就像IgG一样，IgM单体由两条轻链和两条重链组成。然而，尽管IgG包含三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，IgM的重(μ)链另包含第四恒定结构域(CH4)，其类似于IgE中的ε重链。该额外恒定结构域位于负责抗原结合Fab结构域相对于IgG和IgA抗体的Fc结构域的旋转灵活性的IgG和IgA脯氨酸富集铰链区。
五个IgM单体与额外的小多肽链(J链)形成复合物以形成天然IgM分子。认为J链在IgM从抗体产生细胞分泌之前促进u链的聚合。虽然IgM的结晶已被证明是众所周知的挑战，但Czajkowsky和Shao(PNAS106(35)：14960-14965，2009)最近公布了基于IgE Fc结构的结构和已知二硫键配对的基于同源性的IgM结构模型。作者报道，人IgM五聚体是一种具有弯曲倾斜的蘑菇形分子。IgM重(u)链含有五个N连接的糖基化位点：Asn-171，Asn-332，Asn-395，Asn-402和Asn-563。
免疫球蛋白A(IgA)作为大多数哺乳动物粘膜分泌物中存在的主要抗体类别，是防止吸入和摄入病原体侵袭的关键第一道防线。在许多物种的血清中也发现显著浓度的IgA，其作为介导消除破坏粘膜表面的病原体的第二道防线。IgA，FcαR的Fc区特异性受体是IgA效应功能的关键介质。人IgA可能具有两个不同的IgA重恒定区(Cα)基因，这两个基因产生两个亚类IgA1和IgA2。IgA1和IgA2之间的主要区别在于位于两个Fab臂和Fc区之间的铰链区。由于插入IgA2中不存在的重复氨基酸片段，IgA1具有延伸的铰链区。IgA具有形成二聚体的能力，其中两个单体单元(每个单体单元包含两条重链和轻链)被假定为以由二硫键桥稳定的并且包含J链的端对端构型排列。在粘膜部位局部产生的二聚体IgA通过与多聚免疫球蛋白受体(pIgR)相互作用被运输穿过上皮细胞边界并进入分泌物。在此过程中，pIgR被切割，并且称为分泌组分(SC)的主要片段变得与IgA二聚体共价连接。
IgA和IgM在C末端具有被称作“尾片段”(tp)的18个氨基酸延长段。IgM(μtp)和IgA(αtp)尾片段区别于7个氨基酸位置。IgM和IgA尾片段在不同的动物物种中都是高度保守的。已经证明聚合中涉及IgM和IgA尾片段中保守的倒数第二位半胱氨酸残基。两个尾片段都包含N连接的碳水化合物添加位点，它的存在是在IgA和J链的引入中的二聚化物形成和在IgM中的五聚化物形成所需的。然而，尾片段中的N连接的碳水化合物的结构和组成并不相同，这表明聚糖对于糖基转移酶的加工的可及性方面的差异。
已经报道了人类和各种脊椎动物物种如牛，小鼠，禽类，两栖类和兔的J链的核苷酸和/或蛋白质序列。人J链含有八个半胱氨酸残基，两个(Cys13和Cys69)涉及α或μ链的二硫键桥(分别在IgA和IgM中)，六个涉及链内二硫键桥(Cys13：Cys101，Cys72：Cys92，Cys109：Cys134)。尚未报道J链的三维晶体结构。
本发明的结合分子包括J链，其包含拮抗T-细胞抑制性信号传导途径而不干扰IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与其结合靶标结合的能力的结合部分。例如，结合分子可以是IgM抗体，IgA抗体或IgG/IgM或IgG/IgA杂合抗体，其可以在IgG重链上含有IgM或IgA尾片段，并因此组合了IgG和IgA或IgA的性质，包括纳入且形成具有修饰的J链的聚合物的能力，所述修饰的J链的结合部分能拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。关于IgG/IgM和IgG/IgA杂合抗体的其他详细内容参见例如Koteswara等，Clinical Immunology 2001，101(1)：21-31。图6中描绘了根据本发明方面的示例性结合分子的图示。所描绘的结合分子包含对靶抗原具有结合特异性的IgM五聚体，并且包含连接至J链的结合部分。
T-细胞抑制性信号传导途径是本领域已知的，并且包括但不限于Pardoll，DrewM.”癌症免疫治疗中的免疫检验点阻断(The blockade of immune checkpoints incancer immunotherapy)″Nature Reviews Cancer 12.4(2012)：252-264中所述的那些，其全部内容通过引用纳入本文。下文进一步详细描述T细胞抑制性信号传导途径及其组分的非限制性示例。
细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)是免疫球蛋白超家族成员，并且已经显示向T-细胞传送抑制性信号。CTLA4的膜结合同种型以由二硫键互连的同二聚体发挥功能，而可溶同种型以单体发挥功能。例如，Pardoll，255处。
除了CTLA4以外，其它T细胞抑制信号传导途径包括，例如，涉及程序性细胞死亡-1(PD-1)及其配体，程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)的信号传导途径。PD-1是免疫球蛋白超家族的抑制性细胞表面受体蛋白，参与调节免疫和自身耐受中的T细胞功能。PD-L1与T细胞表面上的PD-1相互作用，并通过阻断细胞周期进程和细胞因子产生来抑制T细胞的增殖。同上。
T细胞抑制性信号传导途径的另一个示例是涉及T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM3)的信号传导途径。TIM3是一种在T细胞表面上表达的细胞表面糖蛋白，其功能是参与Th1细胞终止的抑制性分子。同上。
T细胞抑制性信号传导途径的另一个示例是涉及淋巴细胞激活基因3(LAG3)的信号传导途径。LAG3属于免疫球蛋白超家族，并作为T细胞的细胞增殖，活化和体内平衡的抑制剂起作用。同上。
T细胞抑制性信号传导途径的另一个示例是涉及B和T淋巴细胞衰减蛋白(BTLA)的信号传导途径。BTLA是通过与肿瘤坏死因子受体超家族成员的相互作用抑制T-细胞而发挥功能的细胞表面蛋白。已知BTLA负调节T细胞免疫应答。同上。
T细胞抑制性信号传导途径的另一个示例是涉及T细胞活化的V-结构域Ig抑制物(VISTA)的信号传导途径。VISTA是T-细胞功能的调节物，其在造血细胞和白细胞上表达，并通过抑制T-细胞活化来发挥作用。例如，Lines JL等，Cancer research.2014；74(7)：1924-1932。
T细胞抑制性信号传导途径的另一个示例是涉及具有Ig和ITIM结构域的蛋白质T细胞免疫受体(TIGIT)的信号传导途径。TIGIT在几种类型的T-细胞中表达，并且以高亲和性结合脊髓灰质炎病毒受体。TIGIT通过促进成熟免疫调节树突细胞的生成来抑制T-细胞活化。例如，YuX.等，Nat Immunol.2009年1月；10(1)：48-57。
如上所述，所述结合分子包括在J链上的结合部分，其拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。在一些实施方式中，J链上的结合部分结合T-细胞抑制性信号传导途径中的靶标，并因此阻断或消除通过该途径由T细胞接收的抑制性信号。结果，T细胞的免疫应答不被阻断，停止或减少，或至少对T细胞的免疫应答的抑制减少或消失。所述结合分子的J链上的结合部分可用于拮抗任何T细胞抑制性信号传导途径，包括但不限于涉及下表1中列出的蛋白质的抑制性信号传导途径。下表1中提供了对应于这些T细胞抑制性信号传导途径靶标的人类蛋白质序列的GenBank登录号。
表1：T-细胞抑制性信号传导途径靶标的序列信息
T-细胞抑制性信号传导途径成员： GenBank登录号
CTLA4 AAL07473.1
PD-1 AAC51773.1
TIM3 AAL65158.1
LAG3 AAH52589.1
BTLA AAI07092.1
VISTA NP_071436.1
TIGIT NP_776160.2
所述结合分子的J链上的结合部分可包括，但不限于，抗体，抗体的抗原结合片段，抗体-药物偶联物，抗体-药物欧偶联物的抗原结合片段，抗体样分子，抗体样分子的抗原结合片段，可溶和膜结合蛋白，配体和受体。需要强调的是，根据本公开内容的教导，通过适当选择添加的位置和类型(例如，直接或间接融合，化学束缚等)，可将任何类型的结合部分引入J链。
在一个优选的实施方式中，J链上的结合部分包含抗体或抗体的抗原结合片段(也称为“抗体片段”)，包括单特异性，双特异性和多特异性抗体和抗体片段，其拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。术语“抗体片段”以最广义使用，包括但不限于Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv和(scFv)2片段，互补决定区(CDR)片段，线性抗体，单链抗体分子，微抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个优选实施方式中，该抗体片段是单链Fv(scFv)。
在另一个优选的实施方式中，J链上的结合部分包括抗体样分子，例如，人结构域抗体(dAb)、双亲和性再靶向(Dual-Affinity Re-Targeting，DART)分子、双抗体、双-双抗体、双可变区结构域抗体、堆叠可变结构域抗体(Stacked Variable Domain antibody)、小模块免疫药物(SMIP)、替代抗体(Surrobody)、链交换工程改造结构域(SEED)体、或通过作为T-细胞抑制性信号传导途径的拮抗剂来起作用的TandAb。
J链上的结合部分可在任何位置引入天然J链序列，在该位置允许结合部分与其结合靶标结合，而不干扰受者IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA分子与其一个或多个结合靶标的结合。优选的位置包括C端处或C端附近，N端处或N端附近，或基于J链的三维结构可及的内部位置。在优选的实施方式中，将结合部分在距C端约10个残基外或距N端约10个氨基酸残基外引入天然序列J链内，其中天然序列J链优选为SEQ ID NO：1的人J链。在另一方面中，结合部分在SEQ ID NO：2的半胱氨酸残基92和101之间，或在另一天然序列J链的等同的位置被引入SEQ ID NO：1的天然序列人J链。在另一个实施方式中，在糖基化位点处或附近将结合部分引入天然序列J链，例如SEQ ID NO：1的J链。最优选地，在离C端约10个氨基酸残基内将结合部分引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。
可以通过采用或不采用肽接头直接或间接融合来实现引入，即，通过将J链和结合部分氨基酸序列以它们的编码氨基酸序列的框内组合的形式组合成一个多肽链实现组合。若采用肽接头(间接融合)，其可以是约1-50，或约1-40，或约1-30，或约1-20，或约1-10，或约10-20氨基酸残基，并且可存在于待引入J链序列的结合部分的一端或两端处。在一个优选的实施方式中，肽接头长度为约10-20，或10-15个氨基酸。在另一个优选的实施方式中，肽接头长15个氨基酸。
还可以使用含有两个不同官能团的异双功能蛋白交联剂通过化学键将J链结合部分附加到天然J链序列上，所述官能团具有它们自己的反应性和选择性。这些交联剂可以一步法使用，也可以用于制造活化的蛋白质，这些蛋白质通常可以在单独的步骤中保存并与第二种生物分子反应。因此，例如，可以使用异双功能交联剂来形成J链和结合部分之间的偶联物。反应性基团包括但不限于亚胺反应性基团(例如NHS或磺基-NHS)，马来酰亚胺基团等。这种可切割或不可切割的交联剂已被用于例如形成半抗原运载体蛋白和制备酶-抗体偶联物。化学上，可切割交联剂具体包括但不限于二硫化物类，腙类和肽接头。众所周知并且研究得非常多的酶不稳定接头是缬氨酸-瓜氨酸接头，但其他肽接头也是已知的并且是合适的。不可切割接头的典型代表包括硫醚，例如SMCC(N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯)。其他详细内容参见例如Ducry L和Stump B，BioconjugateChem.2010，21：5-13，其全部公开内容明确通过引用并入本文。对于其他合适接头的列表，参见例如Klein等，Protein Engineering，Design&Selection；2014，27(10)：325-330，其全部公开内容明确地通过引用并入本文。
在一些实施方式中，结合分子包括表7中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合分子包括与表7中列出的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列，例如具有至少约80％氨基酸序列相同性，或者具有约81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或约99.9％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列。
虽然修饰的J链通常含有一个外来结合部分，但也可能将超过一个结合部分引入J链。在一些实施方式中，修饰的J链包含一个外来结合部分。在一些实施方式中，修饰的J链包含超过一个外来结合部分。例如，在一些实施方式中，将一个结合部分在N端或C端引入修饰的J链中。在一些实施方式中，第一结合部分在N端引入修饰的J链中，并且第二结合部分在C端引入到相同的修饰的J链中。例如，在一些实施方式中，第一结合部分在N端引入修饰的J链中，并且第二结合部分在C端引入到相同的修饰的J链中。在J链的N端和C端都包含结合部分的结合分子在本文中称为包含“双齿(bidentate)”J链的结合分子。
经修饰的J链可由已知的重组DNA技术通过在合适的原核生物或真核宿主生物中表达编码经修饰J链的核酸产生。因此，修饰的J链可例如在大肠杆菌中表达，如Symersky等，Mol Immunol 2000，37：133-140所述的那样。
在一个实施方式中，可以通过插入酶识别位点来初始修饰J链，并且可以通过肽或非肽接头进行翻译后修饰，所述肽或非肽接头可以将任何外来的结合部分系连至J链，例如，细胞毒性小分子以制备抗体-药物偶联物(ADC)。
修饰的J链也可以与受者IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的重链和轻链共表达。尽管由于其复杂的结构，大规模生产重组IgM一直很困难，但已经报道了使用非淋巴细胞的IgM的几种重组生产系统，包括IgM重(H)和轻(L)链在C6神经胶质瘤细胞，CHO细胞和HeLa细胞中的共表达(参见例如W089/01975和Wood等，J.Immunol.145，3011-3016(1990)用于在CHO细胞中表达)。例如，在Azuma等，Clin Cancer Res 2007，13(9)：2745-2750中描述了具有或不具有J链的IgM单克隆抗体在大肠杆菌中的表达。在美国申请公开号20060063234中描述了在表达腺病毒的E1A和E1B蛋白的永生化人视网膜细胞系中产生IgM。
受者IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体可以是单特异性的，双特异性的或多特异性的。双特异性和多特异性IgM和IgA结合分子(包括抗体)在例如，PCT申请号PCT/US2014/054079和PCT/US2015/015268中描述，它们都通过引用全文纳入本文。
所述结合分子可通过IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体结合任何结合靶标，而J链结合部分拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。由此，可使用所述结合分子来将J链结合部分的官能团定位至由IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体靶向的结合靶标的位置。抗体靶标类别在下文中详细描述。
拮抗剂靶标
本发明的方面包括具有拮抗T细胞抑制性信号传导途径的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的结合分子。本领域已知T细胞抑制性信号传导途径，并且包括但不限于Pardoll等所述的那些。下文进一步详细描述T细胞抑制性信号传导途径及其组分的非限制性示例。
T细胞抑制信号传导途径的一个示例是涉及程序性细胞死亡-1(PD-1)及其配体，程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)的信号传导途径。PD-1是免疫球蛋白超家族的抑制性细胞表面受体蛋白，参与调节免疫和自身耐受中的T细胞功能。PD-L1与T细胞表面上的PD-1相互作用，并通过阻断细胞周期进程和细胞因子产生来抑制T细胞的增殖。同上。
T细胞抑制性信号传导途径的另一个示例是涉及T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM3)的信号传导途径。TIM3是一种在T细胞表面上表达的细胞表面糖蛋白，其功能是参与Th1细胞终止的抑制性分子。同上。
T细胞抑制性信号传导途径的另一个示例是涉及淋巴细胞激活基因3(LAG3)的信号传导途径。LAG3属于免疫球蛋白超家族，并作为T细胞的细胞增殖、活化和体内平衡的抑制剂起作用。同上。
如上所述，所述结合分子包括J链结合部分，其拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与参与T细胞抑制性信号传导途径的靶标结合并拮抗抑制性信号传导途径，从而阻断或减弱由T细胞通过该途径接收的抑制性信号，而J链结合部分也拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。由于它们更高的亲合力，与仅具有两个结合位点的IgG抗体相比，当针对T细胞抑制性信号传导途径靶标时，所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体更有效地作为拮抗剂起作用。结果，T细胞的免疫应答不被阻断，停止或减少，或至少对T细胞的免疫应答的抑制减少或消失。所述结合分子的抗体可用于拮抗任何T细胞抑制性信号传导途径，包括但不限于涉及下表2中列出的蛋白质的抑制性信号传导途径。下表2中提供了对应于这些T细胞抑制性信号传导途径靶标的人类蛋白质序列的GenBank登录号。
表2：T-细胞刺激性信号传导途径靶标的序列信息
T-细胞刺激性信号传导途径成员： GenBank登录号
PD-1 AAC51773.1
PD-L1 Q9NZQ7.1
TIM3 AAL65158.1
LAG3 AAH52589.1
激动剂靶标
本发明的方面包括具有激动T细胞刺激性信号传导途径的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的结合分子。本领域已知T细胞刺激性信号传导途径，并且包括但不限于Pardoll等所述的那些。下文进一步详细描述T细胞刺激性信号传导途径及其组分的非限制性示例。
CD137是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族的成员，并在T细胞表面表达。其功能是刺激T细胞增殖和细胞因子分泌。例如，Pardoll，254处。OX40是在T细胞上表达的肿瘤坏死因子受体超家族的另一成员，并且其通过向T细胞递送刺激性信号而起作用，所述刺激性信号有助于随时间维持免疫应答。同上。
另一种T细胞刺激性信号传导通路涉及CD40。CD40是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，并且在抗原呈递细胞上表达。CD40与其配体CD40L的结合产生各种T细胞刺激性信号。同上。
另一种T细胞刺激性信号通路涉及葡糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)。GITR是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，并且在T-细胞上表达。它通过增加T细胞增殖，激活和细胞因子产生而起作用。例如，Nocentini，G.等，Proc Natl Acad Sci U S A.1997年6月10日；94(12)：6216-21。
CD27是参与T细胞刺激性信号传导途径的另一种蛋白质。肿瘤坏死因子受体超家族的另一成员CD27在T细胞表面上表达，并且当其与CD70相互作用时通过向T细胞递送刺激性信号发挥功能。例如，Pardoll，254处。
另一种T细胞刺激性信号传导途径涉及疱疹病毒进入介质(HVEM)。HVEM是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，并且在抗原呈递细胞的表面上表达。当HVEM与某些配体如CD258相互作用时，它会向T细胞传递刺激性信号。同上。
如上所述，所述结合分子包括在J链上的结合部分，其拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与参与T细胞刺激性信号传导途径的靶标结合并激动该刺激性信号传导途径，从而维持或增加由T细胞通过该途径接收的刺激性信号，而J链上的结合部分拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。由于它们更高的亲合力，与仅具有两个结合位点的IgG抗体相比，当针对T细胞刺激性信号传导途径靶标时，所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体更有效地作为激动剂起作用。结果，T细胞的免疫应答得以维持或增加。所述结合分子的抗体可用于激动任何T细胞刺激性信号传导途径，包括但不限于涉及下表3中列出的蛋白质的刺激性信号传导途径。下表3中提供了对应于这些T细胞刺激性信号传导途径靶标的人类蛋白质序列的GenBank登录号。
表3：T-细胞刺激性信号传导途径靶标的序列信息
T-细胞刺激性信号传导途径成员： GenBank登录号
CD137(4-1BB) NP_001552.2
OX40 CAE11757.1
CD40 P25942.1
GITR Q9Y5U5.1
CD27 P26842.2
HVEM AAQ89238.1
T细胞刺激性信号传导途径的其他非限制性示例包括由以下介导的那些：TNFR1(DR1)(GenBank登录号P19438.1)；TNFR2(GenBank登录号P20333.3)；Fas(CD95，Apo1，DR2)(GenBank登录号AAH12479.1)；CD30(GenBank登录号AAA51947.1)；TRAILR1(DR4，Apo2)(GenBank登录号O00220.3)；DR5(TRAILR2)(GenBank登录号O14763.2)；TRAILR3(DcR1)(GenBank登录号O14798.3)；TRAILR4(DcR2)(GenBank登录号Q9UBN6.1)；OPG(OCIF)(GenBank登录号O00300.3)；TWEAKR(FN14)(GenBank登录号Q9NP84.1)；DcR3(GenBank登录号095407.1)；DR3(GenBank登录号AAQ88676.1)；EDAR(GenBank登录号Q9UNE0.1)；和XEDAR(GenBank登录号AAQ89952.1)。参见例如Aggarwal等，Blood，119：651-665，2012，其公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与这些靶标中的任何一个结合并激动T细胞刺激性信号传导途径，从而维持或增加T细胞通过该途径接收的刺激性信号，而J链上的结合部分拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。
低水平表达靶标
本发明的方面包括具有结合低水平表达靶标的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的结合分子。由于它们更高的亲合力，所述结合分子比IgG抗体更有效。如此，所述结合分子可以用于其中特定结合靶标以低水平表达的环境中，并且其中更高的亲和力有利于促进抗体与靶标之间的结合。所述结合分子的抗体可用于靶向任何低水平表达靶标。可以由所述结合分子的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体靶向的低水平表达靶标的具体示例包括但不限于EGFR，HER2，HER3，EpCAM，CEACAM，Gp100，MAGE1和PD-L1。下表4中提供了对应于这些靶标的人类蛋白质序列的GenBank登录号。
表4：低水平表达靶标的序列信息
靶标名称 GenBank登录号
EGFR AAI18666.1
HER2 P04626.1
HER3 P21860.1
EpCAM P16422.2
CEACAM P06731.3
Gp100 AAC60634.1
MAGE1 NP_004979.3
PD-L1 Q9NZQ7.1
低亲和性靶标
本发明的方面包括具有结合低亲和性靶标的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的结合分子。由于它们更高的亲合力，所述结合分子比IgG抗体更有效。如此，所述结合分子可以用于特定结合靶标具有低结合亲和性的环境中，并且其中更高的亲和力有利于促进抗体与靶标之间的结合。所述结合分子的抗体可用于靶向任何低亲和性靶标。可以由所述结合分子的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体靶向的低亲和性靶标的具体示例包括但不限于NY-ESO-1，唾液酸化Lewis X抗原和Tn抗原。下表5中提供了对应于NY-ESO-1和唾液酸化LewisX抗原的人蛋白质序列的GenBank登录号。图4中提供了Tn抗原的结构。
表5：低亲和性靶标的序列信息
血液癌症靶标
本发明的方面包括具有结合血液癌症靶标的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的结合分子。由于它们更高的亲合力，所述结合分子比IgG抗体更有效。如此，所述结合分子可用于其中特定结合靶标以低水平表达的环境中，如在某些血液癌症中的情况。所述结合分子的较高亲合力促进抗体与靶标之间的结合。所述结合分子的抗体可以用于靶向任何结合靶标，例如血液癌细胞上的低水平表达靶标。可以由所述结合分子的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体靶向的血液癌症靶标的具体示例包括但不限于CD19，CD20，CD22，CD33，CD38，CD52和CD70。下表6中提供了对应于这些靶标的人类蛋白质序列的GenBank登录号。
表6：血液癌症靶标的序列信息
靶标名称 GenBank登录号
CD19 AAA69966.1
CD20 NP_690605.1
CD22 P20273.2
CD33 P20138.2
CD38 BAA18966.1
CD52 AJC19276.1
CD70 NP_001243.1
具有修饰的J-链的结合分子的应用
包含本发明的修饰的J链的结合分子具有广泛的治疗和诊断应用，包括但不限于通过调节T-细胞免疫应答的活性等治疗各种癌症和免疫疾病。包含修饰的J-链的所述结合分子可广泛地用于治疗多种癌症中的任一种。预计任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤相关抗原都可以被所述结合分子靶向。癌症类型的示例包括但不限于急性淋巴细胞白血病，急性骨髓性白血病，胆管癌，乳腺癌，宫颈癌，慢性淋巴细胞性白血病，慢性粒细胞性白血病，结直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，胃癌，头颈癌，霍奇金淋巴瘤，肺癌，甲状腺髓样癌，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，肾癌，卵巢癌，胰腺癌，神经胶质瘤，黑素瘤，肝癌，前列腺癌和膀胱癌。然而，本领域技术人员将认识到，肿瘤相关抗原在本领域中对于几乎任何类型的癌症是已知的。
在一些实施方式中，所述结合分子的J链包括拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的结合部分，并且抗体也拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。不受理论限制，这种结合分子的目的是通过抗体和J链上的结合部分阻断或降低T-细胞抑制性信号传导。这类结合分子提供了对T-细胞抑制性信号传导的阻断或降低，由此维持或增加特定位置(例如，癌细胞表面)的T-细胞免疫应答。由于它们的亲和力增加，如上所述，当针对某些结合靶标如T细胞抑制性信号传导途径的成员时，所述IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体充当有效的拮抗剂。此类结合分子例如可用于治疗其中需要维持或激活T细胞免疫应答的疾病，例如某些癌症和免疫紊乱。此类癌症包括但不限于上皮癌症以及血液癌症。
适合用具有拮抗性抗体和J链上的拮抗剂结合部分的所述结合分子治疗的上皮癌症包括但不限于黑素瘤，非小细胞肺癌，鼻咽癌，结直肠癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，肾癌，甲状腺癌或乳腺癌，激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌。适合用具有拮抗性抗体和J链上的拮抗剂结合部分的所述结合分子治疗的血液癌症包括但不限于白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，急性骨髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性骨髓性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，所述结合分子可用于治疗任何这些病症。
在一些实施方式中，所述结合分子的J链包括拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的结合部分，并且抗体也激动T-细胞刺激性信号传导途径。不受理论限制，这种结合分子的目的是通过J链部分阻断或降低T-细胞抑制性信号传导，同时通过抗体维持或增加T-细胞刺激性信号传导。这种结合分子将T-细胞抑制性信号传导的阻断或降低(由J链上的结合部分促进)定位至与T-细胞刺激性信号传导的维持或活化(由抗体促进)的相同部位，由此在特定位置，例如，癌细胞表面维持或增加T-细胞免疫应答。由于它们的亲和力增加，如上所述，当针对某些结合靶标如T细胞刺激性信号传导途径的成员时，所述IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体充当更为有效的激动剂。此类结合分子例如可用于治疗其中需要维持或激活T细胞免疫应答的疾病，例如某些癌症和免疫紊乱。此类癌症包括但不限于上皮癌症以及血液癌症。
适合用具有拮抗性抗体和J链上的激动剂结合部分的所述结合分子治疗的上皮癌症包括但不限于黑素瘤，非小细胞肺癌，鼻咽癌，结直肠癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，肾癌，甲状腺癌或乳腺癌，激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌。适合用具有拮抗性抗体和J链上的激动剂结合部分的所述结合分子治疗的血液癌症包括但不限于白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，急性骨髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性骨髓性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，所述结合分子可用于治疗任何这些病症。
在一些实施方式中，所述结合分子的J链包括拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的结合部分，并且抗体结合低水平表达靶标。不受理论束缚，这种结合分子的目的是通过J链上的结合部分阻断或降低T-细胞抑制性信号传导，同时使用IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体的更高亲和力结合至低水平表达靶标。这种结合分子提供了将T-细胞抑制性信号传导的阻断或降低在低水平表达靶标部位的定位，并且用于治疗疾病，其中在低水平表达靶标的位置处，例如，某些癌症和免疫疾病处需要T-细胞免疫应答的维持或活化。例如，已知某些上皮癌症表达具有低表达水平的肿瘤抗原，如上所述。这些上皮癌症包括但不限于黑素瘤，非小细胞肺癌，鼻咽癌，结肠直肠癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，肾癌，甲状腺癌或乳腺癌，激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌。在一些实施方式中，所述结合分子可用于治疗任何这些病症。
在一些实施方式中，所述结合分子的J链包括拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的结合部分，并且抗体结合低亲和性靶标。不受理论束缚，这种结合分子的目的是通过J链上的结合部分阻断或降低T-细胞抑制性信号传导，同时使用IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体的更高亲和力结合至低亲和性靶标。这类结合分子提供了T-细胞抑制性信号传导的阻断或降低在低亲和性靶标部位处的定位。如上所述，由于其亲和力增加，包含修饰的J链的所述IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体在IgG抗体以低亲和性与其靶标结合的情况下尤其有利。因此，在一些实施方式中，本文所述的IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体可以包含治疗性IgG抗体的结合结构域。此类结合分子例如可用于治疗其中需要在低亲和性靶标的位置处维持或激活T细胞免疫应答的疾病，例如某些癌症和免疫紊乱。例如，已知某些上皮癌症表达具有低结合亲和性的肿瘤抗原，如上所述。这些上皮癌症包括但不限于黑素瘤，非小细胞肺癌，鼻咽癌，结肠直肠癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，肾癌，甲状腺癌或乳腺癌，激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌。在一些实施方式中，所述结合分子可用于治疗任何这些病症。
在一些实施方式中，所述结合分子的J链包括拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的结合部分，并且抗体结合血液癌细胞上的靶标。不受理论束缚，这种结合分子的目的是通过J链上的结合部分阻断或降低T-细胞抑制性信号传导，同时使用IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体的更高亲和力结合至血液癌症靶标。这类结合分子提供了在血液癌症靶标部位处，例如，在血液癌细胞的表面上的T-细胞抑制性信号传导的阻断或降低的定位。这类结合分子可用于治疗血液癌症。例如，如上所述，已知某些血液癌症以低水平表达肿瘤抗原。这样的血液癌症包括但不限于白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，急性骨髓性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，慢性骨髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，所述结合分子可用于治疗任何这些病症。
包括拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的修饰的J链的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体的示例可以包括已知的IgG抗体与肿瘤相关抗原的结合区，例如，博纳吐单抗(也称为MT103)(抗CD19)，CD19hA19(抗CD19，美国专利号7,109,304)，hPAM4(抗粘蛋白，美国专利号7,282,567)，hA20(抗CD20，美国专利号7,251,164)，(抗-AFP，美国专利号7,300,655)，hLL1(抗CD74，美国专利号7,312,318)，hLL2(抗CD22，美国专利号7,074,403)，hMu-9(抗CSAp，美国专利号7,387,773)，hL243(抗HLA-DR，美国专利号7,612,180)，hMN-14(抗CEACAM5，美国专利号6,676,924)，hMN-15(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)，hRS7(抗EGP-1，美国专利号7,238,785)，hMN-3(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)，Ab124和Ab125(抗CXCR4，美国专利号7,138,496)，其公开内容明确地通过引用并入本文。
可提供与拮抗T细胞抑制性信号传导途径的修饰的J链组合的其他抗体包括例如阿昔单抗(抗糖蛋白IIb/IIIa)，阿仑单抗(抗CD52)，贝伐单抗(抗EGFR)，吉西单抗(抗-CD33)，替伊莫单抗(抗-CD20)，帕尼单抗(抗EGFR)，托西莫单抗(抗CD20)，曲妥珠单抗(抗-ErbB2)，兰波单抗(抗-PD-1受体)，尼莫单抗(抗PD-1受体)，易普利姆玛(抗-CTLA4)，阿巴单抗(抗CA-125)，阿德木单抗(抗EpCAM)，阿利珠单抗(抗IL-贝伐珠单抗(抗CD125)，阿托珠单抗(GA101，抗CD20)，CC49(抗TAG-72)，AB-PG1-XG1-026(抗PSMA，美国专利申请系列号11/983,372，保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)，D2/B(抗-PSMA，WO 2009/130575)，托珠单抗(抗-IL-6受体)，巴利昔单抗(抗-CD25)，达利珠单抗(抗-CD25)，依法珠单抗(抗CD11a)，GA101(抗-CD20；罗氏(Glycart Roche))，阿达珠单抗(抗-α4整联蛋白)，奥马珠单抗(抗IgE)；抗TNF-α抗体，如CDP571(Ofei等，2011，Diabetes 45：881-85)，MTNFAI，M2TNFAI，M3TNFAI，M3TNFABI，M302B，M303(伊利诺州洛克福德的热科学公司(Thermo Scientific，Rockford，IL))，英夫利昔单抗(宾夕法尼亚州玛尔文)，塞妥珠单抗(UCB，布鲁塞尔，比利时)，抗CD40L(UCB，布鲁塞尔，比利时)，阿达木单抗(伊利诺州雅培园的雅培公司(Abbott，Abbott Park，IL))，BENLYSTA.RTM(人类基因组科学)；用于治疗阿尔茨海默病的抗体如Alz50(Ksiezak-Reding等，1987，J Biol Chem 263：7943-47)，甘特如单抗，索拉珠单抗和英利昔单抗；抗纤维蛋白抗体如59D8，T2G1s，MH1；诸如MOR03087(MorphoSys AG)，MOR202(塞尔基公司(Celgene))，HuMax-CD38(基麦公司(Genmab))或达拉木单抗(强生)的抗-CD38抗体；曲妥珠单抗(抗-HER2)；特姆单抗(抗CTLA4)；乌鲁单抗(抗CD137(4-1BB))；沃舍珠单抗(抗CD70)；杜立木单抗(抗HER3)；达塞珠单抗(抗CD40)；法立单抗(varlilumab)(抗CD27)；阿特珠单抗(抗PD-L1)；抗-MAGE1抗体，如MA454(伊利诺州洛克福德的热科学公司)；抗OX-40抗体如ACT35(加利福尼亚州圣迭戈的昂飞电子生物科学公司(Affymetrix eBioscience，SanDiego，CA))；抗GITR抗体如621(加利福尼亚州圣迭戈的白乐津公司(BioLegend，SanDiego，CA))；抗HVEM抗体如122(加利福尼亚州圣迭戈的白乐津公司)；抗TIM3抗体如F38-2E2(加利福尼亚州圣迭戈的白乐津公司)；抗LAG3抗体如3DS223H(加利福尼亚州圣迭戈的昂飞电子生物科学公司)；抗BTLA抗体如MIH26(加利福尼亚州圣迭戈的白乐津公司)；抗VISTA抗体如MAB71261(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems，Minneapolis，MN))；抗TIGIT抗体如MBSA43(加利福尼亚州圣迭戈的昂飞电子生物科学公司)；抗CEACAM抗体如D14HD11(马萨诸塞州剑桥的阿柏堪穆公司(abcam，Cambridge，MA))；抗-Gp100抗体如ab52058(马萨诸塞州剑桥的阿柏堪穆公司)；抗-NY-ESO-1抗体如E978(伊利诺州洛克福德的热科学公司)；抗唾液酸化Lewis X抗原抗体如MAB2096(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(EMD Millipore，Billerica，MA))；抗Tn抗原抗体如MA1-90544(伊利诺州洛克福德的热科学公司)；抗HIV抗体如P4/D10(美国专利号8,333,971)，Ab 75，Ab 76，Ab77(Paulik等，1999，Biochem Pharmacol 58：1781-90)以及在美国专利号5,910,811美国专利号5,831,034，5,911,989和Vcelar等，AIDS 2007；21(16)：2161-2170以及Joos等，Antimicrob.Agents Chemother.2006；50(5)：1773-9中所述的抗HIV抗体。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-1结合并拮抗PD-1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-1结合并拮抗PD-1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-1结合并拮抗PD-1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-1结合并拮抗PD-1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-1结合并拮抗PD-1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-1结合并拮抗PD-1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合并拮抗PD-L1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合并拮抗PD-L1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合并拮抗PD-L1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合并拮抗PD-L1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合并拮抗PD-L1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合并拮抗PD-L1介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与TIM3结合并拮抗TIM3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与TIM3结合并拮抗TIM3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与TIM3结合并拮抗TIM3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与TIM3结合并拮抗TIM3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与TIM3结合并拮抗TIM3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与TIM3结合并拮抗TIM3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与LAG3结合并拮抗LAG3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与LAG3结合并拮抗LAG3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与LAG3结合并拮抗LAG3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与LAG3结合并拮抗LAG3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与LAG3结合并拮抗LAG3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与LAG3结合并拮抗LAG3介导的T细胞抑制性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD137结合并激动CD137介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD137结合并激动CD137介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD137结合并激动CD137介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD137结合并激动CD137介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LGA3并拮抗LGA3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD137结合并激动CD137介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD137结合并激动CD137介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD137结合并激动CD137介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与OX40结合并激动OX40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与OX40结合并激动OX40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与OX40结合并激动OX40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与OX40结合并激动OX40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LGA3并拮抗LGA3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与OX40结合并激动OX40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与OX40结合并激动OX40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与OX40结合并激动OX40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD40结合并激动CD40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD40结合并激动CD40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD40结合并激动CD40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD40结合并激动CD40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LGA3并拮抗LGA3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD40结合并激动CD40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD40结合并激动CD40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD40结合并激动CD40介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GITR结合并激动GITR介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GITR结合并激动GITR介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GITR结合并激动GITR介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GITR结合并激动GITR介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LGA3并拮抗LGA3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GITR结合并激动GITR介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GITR结合并激动GITR介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GITR结合并激动GITR介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD27结合并激动CD27介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD27结合并激动CD27介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD27结合并激动CD27介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD27结合并激动CD27介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LGA3并拮抗LGA3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD27结合并激动CD27介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD27结合并激动CD27介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD27结合并激动CD27介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HVEM结合并激动HVEM介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HVEM结合并激动HVEM介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HVEM结合并激动HVEM介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HVEM结合并激动HVEM介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LGA3并拮抗LGA3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HVEM结合并激动HVEM介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HVEM结合并激动HVEM介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HVEM结合并激动HVEM介导的T细胞刺激性信号传导途径的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症和血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EGFR结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EGFR结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EGFR结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EGFR结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EGFR结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EGFR结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EGFR结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER2结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER2结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER2结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER2结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER2结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER2结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER2结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER3结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER3结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER3结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER3结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER3结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER3结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与HER3结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EPCAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EPCAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EPCAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EPCAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EPCAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EPCAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与EPCAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CEACAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CEACAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CEACAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CEACAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CEACAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CEACAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CEACAM结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GP100结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GP 100结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GP100结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GP100结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GP100结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GP100结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与GP 100结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与MAGE1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与MAGE1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与MAGE1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与MAGE1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与MAGE1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与MAGE1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与MAGE1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与PD-L1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与NY-ESO-1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与NY-ESO-1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与NY-ESO-1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与NY-ESO-1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与NY-ESO-1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与NY-ESO-1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与NY-ESO-1结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与唾液酸化Lewis X抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与唾液酸化Lewis X抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与唾液酸化Lewis X抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与唾液酸化Lewis X抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与唾液酸化Lewis X抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与唾液酸化Lewis X抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与唾液酸化Lewis X抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与Tn抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与Tn抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与Tn抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与Tn抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与Tn抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与Tn抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与Tn抗原结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于上皮癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD19结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD19结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD19结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD19结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD19结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD19结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD19结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD20结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD20结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD20结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD20结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD20结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD20结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD20结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD22结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD22结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD22结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD22结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD22结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD22结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD22结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD33结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD33结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD33结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD33结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD33结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD33结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD33结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD38结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD38结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD38结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD38结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD38结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD38结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD38结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD52结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD52结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD52结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD52结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD52结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD52结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD52结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于血液癌症。
在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD70结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合CTLA4并拮抗CTLA4介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD70结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合PD-1并拮抗PD-1介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD70结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIM3并拮抗TIM3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD70结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合LAG3并拮抗LAG3介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD70结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合BTLA并拮抗BTLA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD70结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合VISTA并拮抗VISTA介导的T-细胞抑制性信号传导途径。在一个具体实施方式中，其IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与CD70结合的结合分子在J链上具有结合部分，其结合TIGIT并拮抗TIGIT介导的T-细胞抑制性信号传导途径。这类结合分子可用于治疗癌症，包括但不限于血液癌症。
应当理解，可以将与本文所述的任何所列的肿瘤抗原结合的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与具有本文所列的结合特异性的修饰的J链组合以产生结合分子。因此，本文所列的任何抗体靶标可以与本文所列的任何修饰的J链靶标组合。
虽然本文具体提及某些优选实施方式，但应理解，对任何靶标(例如任何肿瘤抗原)具有结合特异性的IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体，其包含具有任何结合任何拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的靶标的结合部分的修饰的J链被考虑并且在本发明的范围内。图7提供了J链的结合部分的靶标和抗体靶标的列表。图7左列中列出的任何抗体靶标可以与图7右列中列出的任何J链的结合部分靶标组合。
在一个优选的实施方式中，IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体与本文列出的一种或多种肿瘤靶标结合，而J链包含拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的结合部分。
在一个优选的实施方式中，所述结合分子的J链包含结合部分，其是scFv，并且其通过结合T-细胞抑制性信号传导途径中的靶标拮抗该途径。
在一个优选的实施方式中，J链上的结合部分是scFv，其结合CTLA4(即，是抗-CTLA4scFv)并拮抗CTLA4-介导的T-细胞抑制性信号传导途径。
在一个优选的实施方式中，结合分子包括结合PD-L1的IgM抗体，并且J链上的结合部分是拮抗CTLA4-介导的T-细胞抑制性信号传导途径的抗-CTLA4scFv。
在一个优选的实施方式中，结合分子包括结合PD-1的IgM抗体，并且J链上的结合部分是拮抗CTLA4-介导的T-细胞抑制性信号传导途径的抗-CTLA4scFv。
在一个优选的实施方式中，结合分子包括结合TIM3的IgM抗体，并且J链上的结合部分是拮抗CTLA4-介导的T-细胞抑制性信号传导途径的抗-CTLA4scFv。
在一个优选的实施方式中，结合分子包括结合LAG3的IgM抗体，并且J链上的结合部分是拮抗CTLA4-介导的T-细胞抑制性信号传导途径的抗-CTLA4scFv。
在所有实施方式中，修饰的J链上的结合部分可以在J链之前或之后引入。因此，例如，具有通过结合CTLA4拮抗T-细胞抑制性信号传导途径的scFv结合部分的修饰的J链可具有抗-CTLA4scFv-J或J-抗-CTLA4scFv构象。这两种构象的示意图示于图5。
由于它们的亲合力增加，所述结合分子比双特异性IgG抗体更优。例如，其结果是，它们适用于靶向低水平表达靶标，例如以低水平CD20表达为特征的耐利妥昔单抗的伯基特淋巴瘤细胞。此外，本文中包含修饰的J链的IgM，IgA，IgG/IgM和IgG/IgA抗体相对于双特异性IgG抗体具有极大增强的效力。
具有修饰的J链的抗体的药物组合物
对于治疗用途，可将所述结合分子配制成药物组合物。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法给予。本领域熟练技术人员应当理解，给药的途径和/或方式根据靶标疾病或病症和所需结果而有所不同。为了通过某些给药途径来给予本发明的化合物，可能需要用材料包覆化合物或与化合物共同给药，以防止其失活。例如，该化合物可以在合适的运载体(例如脂质体或稀释剂)中给予对象。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药学运载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。
这些组合物还可包含辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和/或分散剂。可通过灭菌步骤和加入各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物的出现。组合物中也可能需要包含等张剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过加入能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的长期吸收。
可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，从而获得就具体患者、组合物与给药方式有效实现所需治疗应答且对患者无毒性的活性成分量。所选剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄率，治疗持续时间，与所用特定组合物联用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗病人的年龄、性别、体重、病症、整体健康状况、先前病史以及医学领域熟知的类似因素。
组合物必须是无菌的并且流体的达到组合物可以通过注射器递送的程度。除了水之外，运载体优选是等渗缓冲盐溶液。
提供以下实施例，序列表和附图以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求书中阐述。应该理解，可以在不背离本发明精神的情况下对所述程序进行修改。
通过以下非限制性实施例来说明本发明的其他细节。
实施例1：包含结合CTLA4的结合部分的修饰的J链的双特异性拉-PD-L1 IgM抗体 的制备
1.生成具有设计的突变的DNA构建体
a.DNA构建体合成。所有具有设计的突变的DNA构建体均由商业供应商(金斯瑞(Genescript))合成，两端具有相容的限制性位点，用于亚克隆到各自的表达载体中。
b.构建表达载体。合成的DNA构建体以1μg/ml重悬于Tris-EDTA缓冲液中。对DNA(1μg)进行酶消化，并通过电泳将合成的基因与载体质粒DNA分离。通过标准分子生物学技术将消化的DNA连接到预消化的质粒DNA(用于J链的pCAGGS，Gene 108(1991)193-200)。将连接的DNA转化进入感受态细菌，并铺板于含有多重选择性抗生素的LB板上。挑取若干细菌集落，并通过标准分子生物学技术制备DNA制备物。通过测序验证制备的DNA。只有DNA序列与设计的DNA序列100％匹配的细菌克隆用于质粒DNA制备，随后用于细胞转染。
i.第一构建体由与人J链的N端融合的scFv型抗-CTLA4组成(CTLA4scFv-15aa接头-J)：该构建体(Y15J)的氨基酸序列是：
ii.第二构建体由与人J链的C端融合的scFv型抗-CTLA4组成(J-15aa接头-CTLA4scFv)。该构建体(J15Y)的氨基酸序列是：
这些构建体都设计为能够将J链整合到对PD-L1具有特异性的IgM中。
IgM重链：该重链构建体具有全长μ链与来自抗-PD-L1抗体的Vh区：
该重链构建体具有约64kD的分子量，并且当与轻链共表达时，所得的IgM被设计为结合肿瘤细胞上过表达的PD-L1。
d.该双特异性IgM的轻链来自抗-PD-L1抗体：
轻链构建体具有约24kD的分子量，并且当与合适的重链(SEQ ID NO：4)共表达时设计为结合肿瘤细胞上的PD-L1。
2.蛋白质表达、纯化和表征
a.转染。将重链，轻链和修饰的J链DNA转染到CHO细胞中。表达载体的DNA通常以1∶1∶1的比例与PEI混合，然后加入到CHO-S细胞中。根据已建立的技术用CHO-S细胞进行PEI转染(参见Biotechnology and Bioengineering，第87卷，553-545页)。
b.免疫沉淀
i.捕获选择IgM(Capture Select IgM))(BAC，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))根据制造商的方案(GE生命科学公司(GE Life Sciences))，通过用CaptureSelect IgM亲和基质的免疫沉淀部分纯化来自转染的CHO细胞上清液的IgM蛋白。在室温下温育2小时后，通过离心将亲和基质与上清液分离。在小心除去PBS之前，将基质进一步用PBS洗涤3次。捕获的蛋白质通过与NuPage LDS蛋白质缓冲液(生命技术公司(LifeTechnology))一起孵育5分钟而从基质中洗脱下来。
c.凝胶电泳
i.非还原性SDS PAGE根据大小分离天然IgM及其突变体形式。由同源二聚体重链和轻链组成的五聚体IgM产生约1,000,000分子量的蛋白质条带。加载到凝胶上之前，在25℃下将NuPage LDS样品缓冲液(生命技术公司)加入到IgM蛋白质样品中30分钟。NativePage Novex 3-12％Bis-Tris凝胶(生命技术公司)与Novex Tris-乙酸盐SDS运行缓冲液(生命技术公司)一起使用。凝胶跑动直至染料前沿到达凝胶底部。(图8)
ii.还原性SDS-PAGE。将NuPage LDS样品缓冲液(生命技术公司)和NuPage还原剂二硫苏糖醇(生命技术公司)加入到IgM蛋白质样品中并在加载到NuPage Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(生命技术公司)上之前加热至80℃持续10分钟。NuPage MES SDS运行缓冲液(生命技术公司)用于凝胶电泳。凝胶跑动直至染料前沿到达凝胶底部。电泳完成后，从设备中取出凝胶并使用胶体蓝染色(生命技术公司)染色凝胶。
iii.Western印迹检测。在完成电泳后，将凝胶从XCell SureLock Mini-Cell移出。并转移到PVDF膜，转膜以30伏特持续1小时进行(参考生命技术公司手册)。在25℃下用20ml含3％BSA的PBST封闭1小时。
对于抗-J-链Western印迹，在4℃下添加以1∶500在含3％BSA的PBST中的抗-J(SP105，赛默飞世尔公司)。在室温下用PBST洗涤四次。在室温下添加以1∶5000在含3％BSA的PBST中的HRP-山羊抗兔IgG(杰克逊免疫研究公司)持续1小时。在室温下用PBST洗涤四次。在将印迹暴露于膜之前添加10ml的HRP化学发光底物(赛默飞世尔公司)持续10分钟。抗-J链抗体只与IgM反应，IgM与未经修饰的J链或经修饰的J链共表达。如图8所示，具有野生型J链或携带抗-CTLA4 scFv的修饰的J链(Y15J)的抗-PD-L1 IgM明显组装正确。
实施例2：在其J链上携带抗-CD3 scFv结合部分的抗-CD20 IgM仅在CD20阳性B细 胞在在下可活化T-细胞
该实施例显示了包含修饰的J链的IgM分子的制备和表征。具体而言，该实施例描述了以下物质的分子克隆、表达和纯化的制备：靶向B-细胞抗原(CD20)的IgM抗体和修饰的J链，其包含与CD3结合的结合部分，以证明双特异性IgM的产生并在相关系统中测量功能活性。使用实施例1中所述的方法制备了对应于以下重链、轻链和J链的DNA。
抗CD20抗体的IgM轻链序列的氨基酸序列：
抗CD20抗体的IgM重链序列的氨基酸序列：
V15J的J链序列的氨基酸序列：
J15V的J链序列的氨基酸序列：
O15J的J链序列的氨基酸序列：
J15O的J链序列的氨基酸序列：
将对应于这些重链和轻链的DNA以及对应于上述野生型(wt)J链(图3)，V15J或J15V J链序列的DNA共转染到HEK293细胞中，并且蛋白质经表达并使用如前所述的骆驼科树脂纯化。如图9，图A所示，所有四种蛋白质均表达良好。不含J链的抗CD20 IgM六聚体清楚地从具有野生型J链的IgM五聚体以及双特异性IgM(其中抗CD3 scFv与J链以任一取向连接)的含有J链的五聚体中分离出(图9，图A)。
使用市售的基于荧光素酶报告基因的试剂盒(普洛麦格公司(Promega))分析纯化的蛋白质的T细胞活化。简而言之，将纯化的蛋白质加入到含有10％FBS的40uL RPMI中的7500 Ramos和25000工程改造Jurkat细胞(Promega CS176403)中。混合物与5％CO2一起在37℃下孵育5小时。将细胞与含荧光素的裂解缓冲液混合以测量荧光素酶报道基因活性。通过EnVision读板器测量并通过Prism软件分析光输出。如图9，图B所示，在该测定中，只有在J链上携带CD3特异性scFv结合部分的抗体能够显示剂量依赖性活化，而缺乏修饰的J链的IgM抗体或IgG无法显示任何信号。
实施例3：IgM比IgG更好地结合低丰度靶标
大约30x103个细胞/孔加载到V底平板的FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中。平板经离心并吸出上清。向细胞加入50μL体积的在FACS缓冲液中连续稀释的抗体并在冰上孵育30分钟。细胞然后用150μL的FACS缓冲液洗涤并在室温下在1200rpm下离心5分钟。吸出上清并向各孔中加入50μL的1μg/mL的相关二抗。平板在冰上再孵育30分钟。细胞然后用150μL的FACS缓冲液洗涤，在室温下在1200rpm下离心5分钟，吸出上清并加入60μL的7-AAD FACS缓冲液(1∶100)。在简单孵育(5分钟)之后，获取数据，在calibur流式细胞仪上针对AAD阴性细胞门选。使用GraphPad Prism软件分析结合数据。如图10所示，抗-PD-L1 IgM和IgG与高PD-L1表达细胞(普洛麦格转染的CHO细胞系)的结合相当。在低PD-L1表达细胞系(Arent)上，发现抗-PD-L1 IgM比抗-PD-L1 IgG明显更好地结合(在摩尔基础上更佳超过10倍)。
实施例4：抗-PD-L1 IgM对T-细胞活化的功能效果比IgG好
使用报告细胞系(普洛麦格)，对抗-PD-L1 IgG和IgM抗体针对T细胞的B细胞依赖性活化进行表征。T细胞活化增加了NFAT依赖性荧光素酶表达，其经工程改造成Jurkat细胞。可使用发光读数在裂解后对增强的表达进行测量。
简而言之，将纯化的蛋白质加入到含有10％FBS的40uL RPMI中的7500 Ramos和25000工程改造Jurkat细胞(Promega CS 176403)中。混合物与5％CO2一起在37℃下孵育5小时。将细胞与含荧光素的裂解缓冲液混合以测量荧光素酶报道基因活性。通过EnVision读板器测量并通过Prism软件分析光输出。
如图11所示，具有或没有J链的抗-PD-L1 IgM可抑制PD-L1：PD-1相互作用，其导致报告细胞的活化和增加的发光。同样，很明显，在分子基础上，抗-PD-L1 IgM能够比相应的IgG更好地活化T-细胞。
实施例5：具有与J链融合的抗-CD3 scFv的双特异性抗-PD-L1 IgM可在PD-L1表达 细胞存在下活化T-细胞
该实施例显示了包含修饰的J链的IgM分子的制备和表征。具体而言，该实施例描述了以下物质的分子克隆、表达和纯化的制备：靶向PD-L1的IgM抗体和修饰的J链，其包含与CD3结合的结合部分，以证明双特异性IgM的产生并在相关系统中测量功能活性。使用实施例1中所述的方法制备了对应于以下重链、轻链和J链的DNA。
抗PD-L1抗体的IgM轻链序列的氨基酸序列：
抗PD-L1抗体的IgM重链序列的氨基酸序列：
V15J的J链序列的氨基酸序列：
将对应于这些重链和轻链的DNA以及对应于上述野生型(wt)J链(图12)，V15J序列的DNA共转染到HEK293细胞中，并且蛋白质表达并使用如前所述的骆驼科树脂纯化。如图9，图A所示，所有四种蛋白质均表达良好。不含J链的抗PD-L1六聚体清楚地从具有野生型J链的IgM五聚体以及双特异性IgM，其中抗CD3 scFv与J链连接的含有J链的五聚体中分离出(图12，图A)。
具有或没有上述J链的抗-PD-L1 IgM抗体可使用报告细胞系(普洛麦格公司)针对依赖于T细胞失活的PD-L1表达肿瘤细胞的释放表征。T细胞活化增加了NFAT依赖性荧光素酶表达，其经工程改造成Jurkat细胞。可使用发光读数在裂解后对增强的表达进行测量。
简而言之，将纯化的蛋白质加入到含有10％FBS的40uL RPMI中的7500 Ramos和25000工程改造Jurkat细胞(Promega CS 176403)中。混合物与5％CO2一起在37℃下孵育5小时。将细胞与含荧光素的裂解缓冲液混合以测量荧光素酶报道基因活性。通过EnVision读板器测量并通过Prism软件分析光输出。
如图12，图B所示，具有或没有J链的抗-PD-L1 IgM可抑制PD-L1：PD-1相互作用，其导致报告细胞的活化和增加的发光。可以清楚地看到，添加CD3结合J链融合不干扰该IgM阻断PD-1：PD-L1相互作用的能力。
实施例6：具有与J链融合的抗-CD3 scFv的双特异性抗-PD-L1 IgM可使用T-细胞 来杀伤PD-L1表达细胞
与不携带J链或携带野生型J链的IgM相比，预期通过具有修饰的J链的双特异性IgM抗体接合效应T细胞极大增强了靶标B-细胞群的杀伤。为了测试共培养中的细胞杀伤，我们进行了细胞杀伤试验。将抗体剂量与Oregon Green 488标记的PD-L1+细胞(高表达HDML2或低表达SUPHD1)孵育并纯化CD8+效应细胞。如图14所示，在其J链上携带CD3结合scFv的双特异性IgM能够对PD-L1表达细胞造成完全杀伤。在低至2 pM的浓度下观察到双特异性IgM对靶细胞的完全杀伤。
实施例7：可制备具有与J链融合的白蛋白或白蛋白结合scFv的半衰期延长的抗- PD-L1 IgM并且其仍然阻断PD-1：PD-L1相互作用
估计人血浆中IgM的半衰期约为2-3天，在小鼠中更短。这比与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的IgG的时间短得多，并且在内吞作用后被循环使用，使得有大约21天的长得多的半衰期。为了增加我们的抗-PD-L1 IgM的半衰期，我们利用了以下事实：我们可将scFv系连至J链的任一端而不显著改变IgM的效应功能，如CDC。
本领域已经描述了几种方法来实现生物制品的半衰期延长。这些包括人血清白蛋白突变体的(Andersen等，JBC VOL.289，19期，第13492-13502页，2014)，肽(Dennis等，J.Biol.Chem.2002，277：35035-35043)或可结合人血清白蛋白的scFv(Muller等，mAbs 4：6，673-685；2012)的系连(tethering)。
本文提供了修饰的J链序列。
使用实施例1中所述的IgM序列测试该ABD-J链融合物或HSA-J链融合物表达和组装到IgM中(图15，图A)。另外，我们验证了ABD或HAS与J链的融合不会扰乱在其表面上携带PD-L1的靶细胞上抗-PD-L1IgM的阻断活性，如实施例5所述。
实施例8：可制备具有抗-CTLA-4 J链(Y15J)的抗-PDL1 IgM(S70)并保留其两臂的 活性
使用实施例1中所述的IgM序列测试该抗-CTLA-4 scFv-J链融合物(Y15J)表达和组装到S70 IgM中(图16，图A)。另外，我们验证了该scFv与J链的融合不会扰乱在其表面上携带PD-L1的靶细胞上抗-PD-L1 IgM的阻断活性(图16，图B)，如实施例5所述。
为了验证J链上的CTLA-4结合scFv保持结合CTLA-4，具有与J链氨基端连接的抗CTLA4的双特异性抗PDL1 IgM在Expi293中表达并且如之前实施例所述由捕获选择IgM进行亲和纯化。纯化的人CTLA4的Fc融合蛋白使用pH 6.0的乙酸钠中的胺反应化学法固定在Fortebio传感器上。抗CTLA4 IgG(BioLegend A3.B10.G1)以2 nM的KD结合固定的CTLA4传感器。CTLA4 scFv的结合率与IgG相似。如预期的那样，单价抗CTLA4 scfv的解离率快于IgG(图17，图A和B)。
实施例9：证明抗-TNF受体超家族(DR5)抗体可以具有优于IgG的显著改善的超级 激动剂活性
IgA或IgM分子的多价性质呈现了用于其中必须同时结合多重组分以传递生物信号的特定生物系统的应用的有用的工具。例如，真核细胞表面上的许多受体蛋白需要多重单体或亚基的同时活化，以实现跨过细胞膜的生物信号的活化和将该其传递至该细胞的胞质。
在活化之前或与活化相应地需要多聚化的细胞表面蛋白质受体的一个这样的系统存在于受体蛋白的肿瘤坏死因子(TNF)超家族中。该受体蛋白的超家族中包括这样的成员，它们在活化之后，将信号传递至造成凋亡的细胞的核。该超家族的其它家族成员造成NF-κB、凋亡途径、胞外信号调节性激酶(ERK)、p38分裂素活化的蛋白质激酶(p38MAPK)和c-Jun N末端激酶(JNK)的活化。活化时调节所述细胞的凋亡的TNF超家族受体成员的非限制性示例如下：TNFR1(DR1)、TNFR2、CD40(p50)、Fas(CD95、Apo1、DR2)、CD30、4-1BB(CD137、ILA)、TRAILR1(DR4、Apo2)、DR5(TRAILR2)、TRAILR3(DcR 1)、TRAILR4(DcR2)、OPG(OCIF)、TWEAKR(FN 14)、LIGHTR(HVEM)、DcR3、DR3、EDAR和XEDAR。(参见，Aggarwal等，Blood，119：651-665，2012)。
更具体地，假设了上述的TNF超家族受体蛋白成员的活化需要，例如，通过配体，使至少三个非相互作用受体单体被交联，以形成稳定的受体三聚体，导致跨过细胞膜的信号转导。已观察到这些TNF超家族受体蛋白三聚体簇集成三聚体的“筏(raft)”，并且已假设其导致该TNF超家族受体蛋白依赖型信号转导级联的更有效活化。(参见，Valley等，J.Biol.Chem.，287(25)：21265-21278，2012)。已讨论了活化的其它模式。(参见，例如，Lewis等，Biophys.J.，106(6)：L21-L24，2014)(图12)。
抗DR5抗体的IgM重链序列的氨基酸序列：
抗DR5抗体的IgM轻链序列的氨基酸序列：
野生型J链序列的氨基酸序列：
将对应于这些重链和轻链以及对应于野生型(wt)J链序列的DNA共转染到HEK293细胞中，并且蛋白质经表达并使用如前所述的骆驼科树脂纯化。为了测试纯化的蛋白质的细胞毒性，使用COLO205细胞进行细胞活力测试。简言之，以5000个细胞/孔以25μL接种到96孔白色平板中。抗体在25μL体积的无酚红培养基中稀释，并且将稀释物加入到含有细胞的平板中。在37℃下孵育24小时后，使用Cell-Titer Glo试剂(普洛麦格公司)测量细胞活力。如图13所示，抗-DR5 IgM和IgM+wt J链抗体显示相比相应IgG显著改善的细胞毒性效应(超过1000倍)。这突出了IgM五聚体/六聚体对于TNF受体超家族靶标发挥超激动剂活性的能力。
实施例10：抗CDIM抗体(IGM-55.5)
IGM-55.5是来自非霍奇金淋巴瘤患者的脾细胞的在斯坦福大学分离的天然单克隆抗体216的重组单克隆人IgM抗体。HuMab 216之前用于B细胞急性淋巴细胞性白血病的I期试验，并且证明充分耐受并观察到外周母细胞显著降低(Liedtke等，Haematologica，2012)。IGM-55.5已经再工程改造以对作为正常人B细胞以及B-细胞淋巴瘤和B-祖淋巴母细胞上的表位的糖决定簇更有特异性，并且因此是晚期B细胞恶性肿瘤，尤其是利妥昔单抗耐药性或难治性患者中的潜在治疗剂。下面提供了IGM-55.5轻链和重链的氨基酸序列。
IGM-55.5重链。该重链构建体具有IGM-55.5的全长u链，其结合B细胞表面上的CDIM：
该重链构建体具有约64kD的分子量，并且当与轻链共表达时，所得的IgM能够结合CDIM阳性B细胞。
已知为IGM-55.5的IGM-55.5的轻链，其结合B细胞表面上的CDIM(细胞死亡诱导分子)：
轻链构建体具有约24kD的分子量，并且当与合适的重链(SEQ ID NO：14)共表达时能够结合CDIM阳性B细胞。可如本文所述制备具有修饰的J链的IGM-55.5，并且任何上述结合部分可添加至该J链。
表7：序列概述
尽管在本公开中已经提供了若干实施方式，但应该理解，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，所公开的系统和方法可以体现为许多其他特定形式。当前的实施例被认为是说明性的而不是限制性的，并且本发明的意图不限于这里给出的细节。本领域技术人员可以确定各种变化，替代和改变的例子，并且可以在不脱离本文公开的精神和范围的情况下做出变化，替代和改变。

Claims (51)

1.一种包含具有修饰的J链的IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体或其抗原结合片段的结合分子，其中修饰的J链包含影响T-细胞信号传导途径的结合部分。
2.如权利要求1所述的结合分子，其中所述结合部分拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。
3.如权利要求2所述的结合分子，其中所述修饰的J链上的结合部分结合选自下组的细胞表面蛋白：CTLA4、PD-1、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA和TIGIT。
4.如权利要求2或3所述的结合分子，其中所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体拮抗T-细胞抑制性信号传导途径。
5.如权利要求4所述的结合分子，其中所述抗体结合选自下组的靶标：PD-1、PD-L1、TIM3和LAG3。
6.如权利要求2或3所述的结合分子，其中所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体激动T-细胞刺激性信号传导途径。
7.如权利要求6所述的结合分子，其中所述抗体结合选自下组的靶标：CD137、OX40、CD40、GITR、CD27和HVEM。
8.如权利要求2或3所述的结合分子，其中所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体结合低水平表达靶标。
9.如权利要求8所述的结合分子，其中所述低水平表达靶标选自下组：EGFR、HER2、HER3、EpCAM、CEACAM、Gp100、MAGE1和PD-L1。
10.如权利要求8所述的结合分子，其中所述低水平表达靶标是上皮癌细胞上的细胞表面蛋白。
11.如权利要求2或3所述的结合分子，其中所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体结合低亲和性靶标。
12.如权利要求11所述的结合分子，其中所述低亲和性靶标选自下组：NY-ESO-1，唾液酸化Lewis X抗原和Tn抗原。
13.如权利要求11所述的结合分子，其中所述低亲和性靶标是上皮癌细胞上的细胞表面蛋白。
14.如权利要求2或3所述的结合分子，其中所述抗体靶标是血液癌细胞上的细胞表面蛋白。
15.如权利要求14所述的结合分子，其中所述抗体靶标选自下组：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52和CD70。
16.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述修饰的J链包括修饰的人J链序列，或其功能性片段。
17.如权利要求16所述的结合分子，其中所述修饰的人J链序列包括SEQ ID NO：1的天然人J链序列。
18.如权利要求17所述的结合分子，其中将所述J链结合部分通过直接或间接融合被引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。
19.如权利要求18所述的结合分子，其中所述结合部分通过经肽接头的间接融合引入。
20.如权利要求19所述的结合分子，其中所述间接融合是通过所述结合部分的C端和/或N端或其周围的肽接头。
21.如权利要求20所述的结合分子，其中将所述结合部分在C端处或其附近引入SEQ IDNO：1的天然人J链序列。
22.如权利要求21所述的结合分子，其中将所述结合部分在距离C端约10个残基内引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。
23.如权利要求20所述的结合分子，其中将所述结合部分在N端处或其附近引入SEQ IDNO：1的天然人J链序列。
24.如权利要求23所述的结合分子，其中将所述结合部分在距离N端约10个氨基酸残基内引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。
25.如权利要求19所述的结合分子，其中将所述结合部分在SEQ ID NO：1的半胱氨酸残基92和101之间引入天然人J链序列中。
26.如权利要求19所述的结合分子，其中将所述结合部分在糖基化位点处或其附近引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。
27.如权利要求19所述的结合分子，其中所述肽接头长约10至20个氨基酸。
28.如权利要求27所述的结合分子，其中所述肽接头长约15至20个氨基酸。
29.如权利要求28所述的结合分子，其中所述肽接头长15个氨基酸。
30.如权利要求17所述的结合分子，其中将所述结合部分通过化学或化学-酶促衍生引入SEQ ID NO：1的天然人J链序列。
31.如权利要求30所述的结合分子，其中将所述结合部分通过化学接头引入SEQ IDNO：1的天然人J链序列。
32.如权利要求31所述的结合分子，其中所述化学接头是可切割或不可切割接头。
33.如权利要求32所述的结合分子，其中所述可切割接头是化学不稳定接头或酶不稳定接头。
34.如权利要求32所述的结合分子，其中所述接头选自N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)，亚氨基硫杂环戊烷(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物，活性酯，醛，双叠氮化合物，双重氮鎓衍生物，二异氰酸酯和双活性氟化合物。
35.如权利要求30所述的结合分子，其中所述修饰的J链通过插入酶识别位点以及通过肽或非肽接头在酶识别位点处翻译后附连结合部分而被修饰。
36.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述结合部分选自：抗体，抗体的抗原结合片段，抗体-药物偶联物，抗体样分子，抗体样分子的抗原结合片段，配体和受体。
37.如权利要求36所述的结合分子，其中所述结合部分是抗原结合片段，并且选自F(ab′)2，F(ab)2，Fab′，Fab，Fv，scFv，和单结构域抗体。
38.如权利要求37所述的结合分子，其中所述抗原结合片段是scFv。
39.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述修饰的J链是V-接头-J取向。
40.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述修饰的J链是J-接头-V取向。
41.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体是双特异性抗体。
42.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述IgM，IgA，IgG/IgM或IgG/IgA抗体是多特异性抗体。
43.一种用于治疗癌症的药物组合物，其中所述药物组合物包括有效量的权利要求1-42中任一项所述的结合分子和药学上可接受的运载体。
44.如权利要求1-42中任一项所述的结合分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
45.如权利要求44所述的用途，其中所述癌症是血液癌症或上皮癌症。
46.如权利要求45所述的用途，其中所述血液癌症是白血病，淋巴瘤，骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。
47.如权利要求46所述的用途，其中所述白血病是急性骨髓性白血病，急性淋巴母细胞性白血病，慢性髓性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。
48.如权利要求46所述的用途，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
49.如权利要求45所述的用途，其中所述上皮癌症是黑素瘤，非小细胞肺癌，鼻咽癌，结直肠癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，肾癌，甲状腺癌或乳腺癌。
50.如权利要求49所述的用途，其中所述乳腺癌是激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
51.如权利要求44所述的用途，其中所述药物还包括有效量的第二治疗剂。
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