KR20080090441A

KR20080090441A - Ｅｐｈａ２ｂｉｔｅ 분자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20080090441A
Application number: KR1020087017878A
Authority: KR
Inventors: 마이클 에스. 킨치; 섀넌 로프; 페테르 쿠페; 엘리자벳 브룩하이머; 베른트 쉴러레트; 스콧 에이. 하몬드; 랄프 루터부에세; 피터 에이. 키이너; 패트릭 바유렐; 페트라 루터부에세
Original assignee: 메디뮨 엘엘씨; 마이크로메트 에이지
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2008-10-08
Also published as: EP1981532A2; US20080044413A1; ZA200805261B; MX2008008046A; JP2009521474A; CA2633713A1; EP1981532A4; RU2008129827A; WO2007073499A3; CN101426521A; AU2006327175A1; IL192279A0; WO2007073499A2

Abstract

본 발명은 T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 EphA2 수용체에 면역특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체에 관한 것이다. 상기 이중특이적 단일 사슬 항체는 용어 "EphA2-BiTE"에 포함된다. 본 발명은 또한 EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료, 예방 및/또는 관리를 위해 설계된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 장애는 암, 비-암 과증식성 세포 장애 및 감염을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 본 발명의 EphA2-BiTE를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 이로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 EphA2-BiTE의 생산에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 앞서 언급된 EphA2-BiTE, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 중 어느 것을 단독으로 또는 하나 이상의 예방제 또는 치료제와 조합하여 포함하는, 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 상기 EphA2-BiTE에 대한 스크리닝 방법 및 상기 언급된 조성물 및 진단 시약 중 임의의 것을 포함하는 키트를 개시한다.

Description

ＥＰＨＡ２ＢＩＴＥ 분자 및 이의 용도 {EPHA２ BITE MOLECULES AND USES THEREOF}

본 출원은, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 2005년 12월 21일에 출원된 미국 가출원 제60/753,368호의 이익을 주장한다.

본 발명은 T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 EphA2 수용체에 면역특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적(bispecific) 단일 사슬 항체에 관한 것이다. 상기 이중특이적 단일 사슬 항체는 용어 "EphA2-BiTE"에 포함된다. 본 발명은 또한 EphA2의 비정상적(aberrant) 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(disorder)의 치료, 예방 및/또는 관리(management)를 위하여 설계된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 장애는, 암, 비-암 과증식성 세포 장애(non-cancer hyperproliferative cell disorders) 및 감염을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 본 발명의 EphA2-BiTE를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 이것으로 형질전환된 숙주 세포 및 이들의 상기 EphA2-BiTE 생성에의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 EphA2-BiTE, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 중 어느 하나를 단독으로 또는 하나 이상의 예방제(prophylactic agent) 또는 치료제(therapeutic agent)와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 전술한 조 성물 및 진단시약 중 임의의 것을 포함하는 키트 및 상기 EphA2-BiTE의 스크리닝 방법을 개시한다.

2.1 EphA2

EphA2는 성인 상피에서 낮은 농도로 발현되고, 세포-세포 접착(adhesion) 사이트 내에서 풍부해지는 130 kDa 수용체 타이로신 키나아제이다 (Zantek 등, 1999, Cell Growth & Differentiation 10(9):629-38; Lindberg 등, Mol. & Cell. Biol. 10:6316, 1990). 이 세포하 국소화(subcellular localization)는, EphA2와 인접 세포의 세포막에 앵커된(anchored) 이의 리간드 (Ephrin A1 내지 A5로 알려짐)의 상호작용을 통한 접촉 억제의 역할을 하는 것으로 생각된다 (Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403-04; Cheng 등, 2002, Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85). EphA2와 이의 리간드의 맞물림(engagement)은 EphA2의 자가인산화(autophosphorylation) 및 그것의 이어지는 분해를 가져온다 (Walker-Daniels 등, 2002, Mol. Cancer. Res. 1(1):79-87; Carles-Kinch 등, 2002, Cancer Res. 62(10):2840-47). 이러한 신호 캐스캐이드(signaling cascade)는 또한 세포외 매트릭스 접착 분자에의 부착을 네거티브하게 조절하고 이에 의하여 세포 성장 및 이동을 조절하는 하류 이벤트를 개시한다 (Zantek 등, 1999, Cell Growth & Differentiation 10(9):629-38; Miao 등, 2000, Nat. Cell Biol. 2(2):62-69; Zelinski 등, 2001, Cancer Res. 61(5):2301-06).

EphA2는 흑색종, 신장 세포 암종, 유방, 전립선, 결장, 식도, 자궁 경부, 폐, 난소 및 방광 암을 비롯한 다수의 상이한 종양 유형에서 과발현(overexpression)되는 것으로 보여져 왔다 (Carles-Kinch 등, 2002, Cancer Res. 62(10):2840-47). EphA2 발현의 가장 높은 수준은 가장 공격적인 세포에서 관찰되며, 이는 질병 진행에서의 EphA2에 대한 역할을 제안한다. EphA2의 높은 수준은 또한 소세포 폐암(non-small cell lung), 식도, 경부 및 난소 암에 대한 낮은 생존과도 관련된다 (Kinch 등, 2003, Clin. Cancer Res. 9(2):613-18; Miyazaki 등, 2003, Int. J. Cancer 103(5) 657-63; Wu 등, 2004, Gynecol. Oncol. 94(2):312-19; Thaker 등, 2004, Clin. Cancer Res. 10(15):5145-50). 추가로, 예비-임상적 모델에 있어서, EphA2의 외인성 발현이 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 비-발암성 세포주(cell line)를 발암성이 되도록 하기에 충분한 것으로 나타났다 (Zelinski 등, 2001, Cancer Res. 61(5):2301-06).

2.2 BiTE ^® 분자

이중특이적 T-세포 맞물림자(engager) 또는 BiTE^®는 나란히(tandemly) 배열된 단일-사슬 항체에 기초한 이중특이적 항체의 형태이다(출판된 문헌[Wolf 등, 2005, Drug Discovery Today]에서 검토됨). 이들은 약 55 kDa의 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성하고 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의하여 모노머(monomer) 및 다이머(dimer)의 혼합물로서 분비된다. 하나의 아암(arm)으로, BiTE^®는 T-세포 상의 T-세포 수용체의 신호-전달(signal-transducing) 복합체의 단백질 성분인 인간 CD3 의 엡실론(ε) 서브유닛에 결합한다. 다른 아암으로, BiTE^®는 표적 세포 상의 항원을 인식한다. T-세포 활성화는 단지 BiTE^®가 표적 세표의 표면상의 T-세포에 제시(present)되는 경우에만 보여진다.

BiTE^®는 일시적으로 T-세포 및 표적 세포를 속박한다. BiTE^®에 의한 T-세포 활성화는 CD69, CD25 및 다양한 세포 접착 분자의 상향조절(upregulation), 사이토카인 (예, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-4 및 IL-10)의 방출 및 새로운(de novo) 발현, 그랜자임(granzyme) 및 퍼포린(perforin) 발현의 상향조절 및 세포 증식을 수반한다. BiTE^®에 의하여 방향전환된(redirected) 표적 세포 용해는 T-세포 수용체 특이성, MHC 클래스 I 및 β2 마이크로글로불린의 존재 및 임의의 공-자극적인 자극(stimuli)의 존재와 독립적이다. 이러한 통상의 T-세포 신호 및 인식 분자로부터의 독립성은 통상의 세포용해 시냅스 및 최대 막 근접부(maximum membrane proximity)의 BiTE^®를 통한 유도(induction)에 의하여 설명될 수 있다. BiTE^®-유도된 시냅스로부터의 CD45와 같은 음성(negative) 조절 단백질의 이동(displacement)은 공-자극(co-stimulation)에 대한 필요를 완화시킬 수 있다.

BiTE^®는 미리 비자극된 말초 폴리클로날(peripheral polyclonal) CD8- 및 CD4-양성 T-세포를 가지고 시험관 내에서 방향전환된 용해를 나타낸다. 순수한(naive) CD8- 또는 CD4-양성 T-세포에서는 활성을 나타내지 않는다. CD4 T-세포 는 BiTE^®에 의하여 자극되었을 때 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현을 상향조절할 수 있고, 이에 의하여 CD8-매개 표적 세포 용해에 기여한다. 시험관 내에서, 방향전환된 용해는 낮은 피코몰(picomolar) 농도에서 나타나고, 이것은 매우 적은 수의 BiTE 분자가 T-세포를 유인하기 위하여 표적 세포에 결합될 필요가 있음을 제안한다. SCID 마우스 모델에서, BiTE^®의 서브 마이크로그램 용량은 종양 성장을 완전히 예방하고 (Dreier 등, 2003, J Immunol. 170:4397-4402), 200 mm³ 이하의 고상 종양을 박멸하는 것으로 나타났다 (Schlereth 등, 2005, Cancer Res. 2005 65(7):2882-89).

따라서, BiTE^®는 EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 및 감염)의 치료, 예방 및/또는 관리를 위하여 EphA2에 대한 선택적이고 효능있는 항체-기반 요법을 개발할 독특한 기회를 제공한다.

본 발명은 EphA2와 T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 이중특이적 T-세포 맞물림자(즉, EphA2-BiTE(특히, 이중특이적 단일 사슬 항체인 EphA2-BiTE)) 및 이것을 EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여 사용하는 방법을 제공한다. 상기 장애는 예컨대 암, 비-암 과증식성 세포 장애 및 감염을 포함한다. 한 양태에 있어서, 상기 EphA2-BiTE는 당기술분야에 알려진 EphA2-특이적 항체보다 EphA2를 비정상적으로 발현하는 세포를 제거하는데 더욱 효율적이다. 특정 양태에 있어서, 상기 EphA2-BiTE는 당기술분야에 알려진 EphA2 항체보다 EphA2-발현하는 암 세포(특히, EphA2-발현 악성 암 세포)를 제거하는데 더욱 효율적이다. 또 하나의 양태에 있어서, 상기 EphA2-BiTE는 당기술분야에 알려진 EphA2 항체보다 EphA2-발현하는 비-암 과증식성 세포를 제거하는데 더욱 효율적이다. 또 하나의 양태에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 당기술분야에 알려진 EphA2 항체보다 EphA2-발현 감염된 세포(특히, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus); "RSV"로 감염된 세포)를 제거하는데 더욱 효율적이다. 또 하나의 양태에 있어서, 당기술분야에 알려진 EphA2-특이적 항체보다 더 적은 투여량의 EphA2-BiTE이 EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여 필요하다.

본 발명의 EphA2-특이적 이중특이적 T-세포 맞물림자는 상기 T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다 (이하, "EphA2-BiTE", "EphA2-BiTE 분자" 또는 "EphA2 이중특이적 T-세포 맞물림자"). 한 구체예에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 CD3에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구체예에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 CD3의 임의의 서브유닛(예컨대, 감마, 델타, 제타 또는 에타 서브유닛)의 하나 이상에 면역특이적으로 결합한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 CD3의 엡실론(ε) 서브유닛에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구체예에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은, CD3의 엡실론(ε) 서브유닛이 CD3의 델타 서브유닛과 복합체를 형성할 때, 상기 CD3의 엡실론 서브유닛에 면역특이적으로 결합한다. 또 하나의 구체예에 있어서, CD3에 결합하는 결합 도메인은 탈면역화된다(deimmunized). 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 EphA2의 세포외 도메인에 면역특이적으로 결합한다. 바람직한 구체예에 있어서, 암의 치료, 예방 및/또는 관리에 사용되는 EphA2-BiTE의 제2 결합 도메인은 암 세포에서 선택적으로 노출되고/되거나 증가되고 비-암 세포에서는 노출되지 않고/않거나 증가되지 않는 EphA2 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 또 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 제2 결합 도메인은 비-암 과증식성 세포에서 선택적으로 노출되고/되거나 증가되고 비-과증식성 세포에서는 노출되지 않고/않거나 증가되지 않는 EphA2 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 또 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 제2 결합 도메인은 감염된 세포에서 선택적으로 노출되고/되거나 증가되고 비-감염된 세포에서는 노출되지 않고/않거나 증가되지 않는 EphA2 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 (1) T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 (2) EphA2 에 면역특이적으로 결합하는 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 상기 제1 결합 도메인의 VH 도메인 및 VL 도메인은 이들 도메인들이 T-세포 항원 CD3에 결합하도록 하는 방식으로 접힐 수 있기에 충분한 길이의 링커에 의하여 함께 연결된다. 이 구체예에 추가로, 상기 링커는 예컨대 서열 GEGTSTGS(G₂S)₂GGAD(서열 식별 번호: 57)를 포함할 수 있다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 상기 제2 결합 도메인의 VH 도메인 및 VL 도메인은 이들 도메인들이 EphA2에 결합하도록 하는 방식으로 접힐 수 있기에 충분한 길이의 링커에 의하여 함께 연결된다. 이 구체예에 추가로, 상기 링커는 예컨대 서열(G₄S)₃(서열 식별 번호: 59)를 포함할 수 있다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 이들 도메인들이 T-세포 항원 CD3에, 그리고 EphA2에 결합하도록 하는 방식으로 접힐 수 있기에 충분한 길이의 링커에 의하여 함께 연결된다. 이 구체예에 추가로, 상기 링커는 예컨대 서열 G₄S(서열 식별 번호: 58)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)(서열 식별 번호: 65)이다.

직전 단락의 구체예에 따르면, 상기 연결(linkage)은 공유결합성(covalent)이다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 링커는 세린 및 글리신 잔기를 포함한다. EphA2-BiTE의 링커, 예컨대 CD3에 결합하는 제1 결합 도메인의 VH 및 VL 도메인 사이의 링커, EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인의 VH 및 VL 도메인 사이의 링커, 및 CD3에 결합하는 제1 결합 도메인과 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인 사이의 링커는 상기 도메인들이 각각 CD3 및 EphA2 항원에 결합하도록 접힐 수 있기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 어떤 구체예에 있어서, 본 발명의 링커는 적어도 5 잔기, 적어도 10 잔기, 적어도 15 잔기, 적어도 20 잔기, 적어도 25 잔기, 적어도 30 잔기 또는 그 이상의 길이를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 링커는 2 내지 4 잔기, 2 내지 4 잔기, 2 내지 6 잔기, 2 내지 8 잔기, 2 내지 10 잔기, 2 내지 12 잔기, 2 내지 14 잔기, 2 내지 16 잔기, 2 내지 18 잔기, 2 내지 20 잔기, 2 내지 22 잔기, 2 내지 24 잔기, 2 내지 26 잔기, 2 내지 28 잔기 또는 2 내지 30 잔기의 길이를 포함한다. 어떤 구체예에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 상기 제2 결합 도메인에 대하여 5'이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 상기 제1 결합 도메인에 대하여 5'이다. 어떤 구체예에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 단일 사슬 항체이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 도메인은 단일 사슬 Fvs(scFvs)를 포함한다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명은 (a) 각각 CD3의 ε 사슬에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터의 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인; 및 (b) 세포 표면에 노출된 EphA2의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터의 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체로서, 상기 제1 중쇄 가변 도메인은 상기 제1 중쇄 가변 도메인 및 상기 제1 경쇄 가변 도메인이 CD3의 ε 서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인을 형성하기 위하여 접히도록 충분한 길이의 제1 링커(예, GEGTSTGS(G₂S)₂GGAD(서열 식별 번호: 57))에 의하여 상기 제1 경쇄 가변 도메인에 공유결합적으로(covalently) 연결되고, 상기 제2 중쇄 가변 도메인은 상기 제2 중쇄 가변 도메인 및 상기 제2 경쇄 가변 도메인이 상기 EphA2의 에피토프에 결합하는 제2 결합 도메인을 형성하기 위하여 접히도록 충분한 길이의 제2 링커(예, (G₄S)₃(서열 식별 번호: 59))에 의하여 상기 제2 경쇄 가변 도메인에 공유결합적으로 연결되며, 여기서 상기 제1 결합 도메인 및 상기 제2 결합 도메인은 상기 제1 결합 도메인과 상기 제2 결합 도메인이 서로 독립적으로 접히도록 하는 길이의 제3 링커(예, G₄S(서열 식별 번호: 58))에 의하여 공유결합적으로 연결되는 것인, 이중특이적 단일 사슬 항체를 제공한다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 5'에서 3' 방향으로 하기 배열 중 임의의 것을 포함한다: (1) VH_CD3-VL_CD3-VH_EPhA2-VL-_EphA2; (2) VL_CD3-VH_CD3-VH_EphA2-VL_EphA2; (3) VL_CD3-VH_CD3-VL_EphA2-VH-_EphA2; (4) VH_CD3-VL_CD3-VL_EphA2-VH_EphA2; (5) VH_EphA2-VL_EphA2-VH_CD3-VL_CD3; (6) VL_EphA2-VH_EphA2-VH_CD3-VL_CD3; (7) VL_EphA2-VH_EphA2-VL_CD3-VH_CD3; 또는 (8) VH_EphA2-VL_EphA2-VL_CD3-VH_CD3. 예컨대 본 발명의 EphA2-BiTE 구조체의 일반적인 묘사에 대한 도 14A를 참고하라.

특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 제1 결합 도메인은 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인보다 낮은 친화도(affinity)로 CD3의 ε 서브유닛에 결합한다. 한 구체예에 있어서, CD3의 ε 서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인의 해리 상수(K_D)는 0.1 x 10^-12 M 내지 0.5 x 10^-12 M, 0.1 x 10^-12 M 내지 1 x 10^-12 M, 0.1 x 10^-11 M 내지 0.5 x 10^-11 M, 0.1 x 10^-11 M 내지 1 x 10^-11 M, 0.1 x 10^-10 M 내지 0.5 x 10^-10 M, 0.1 x 10^-10 M 내지 1 x 10^-10 M, 0.1 x 10^-9 M 내지 0.5 x 10^-9 M, 0.1 x 10^-9 M 내지 1 x 10^-9 M, 0.1 x 10^-8 M 내지 0.5 x 10^-8 M, 0.1 x 10^-8 M 내지 1 x 10^-8 M, 0.1 x 10^-7 M 내지 0.5 x 10^-7 M, 0.1 x 10^-7 M 내지 1 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 2 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 3 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 4 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 5 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 6 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 7 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 8 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 9 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 10 x 10^-7 M, 0.1 x 10^-6 M 내지 0.5 x 10^-6 M, 0.1 x 10^-6 M 내지 1 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 2 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 3 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 4 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 5 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 6 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 7 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 8 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 9 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 10 x 10^-6 M, 0.1 x 10^-5 M 내지 0.5 x 10^-5 M, 0.1 x 10^-5 M 내지 1 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 2 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 3 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 4 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 5 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 6 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 7 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 8 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 9 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 10 x 10^-5 M 사이이다. 특정 구체예에 있어서, CD3의 ε 서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인의 해리 상수는 4 x 10^-7 M이다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, EphA2에 결합하는 제2 도메인의 해리 상수는 0.1 x 10^-12 M 내지 0.5 x 10^-12 M, 0.1 x 10^-12 M 내지 1 x 10^-12 M, 0.1 x 10^-11 M 내지 0.5 x 10^-11 M, 0.1 x 10^-11 M 내지 1 x 10^-11 M, 0.1 x 10^-10 M 내지 0.5 x 10^-10 M, 0.1 x 10^-10 M 내지 1 x 10^-10 M, 0.1 x 10^-9 M 내지 0.5 x 10^-9 M, 0.1 x 10^-9 M 내지 1 x 10^-9 M, 0.1 x 10^-8 M 내지 0.5 x 10^-8 M, 0.1 x 10^-8 M 내지 1 x 10^-8 M, 0.1 x 10^-7 M 내지 0.5 x 10^-7 M, 0.1 x 10^-7 M 내지 1 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 2 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 3 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 4 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 5 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 6 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 7 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 8 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 9 x 10^-7 M, 1 x 10^-7 M 내지 10 x 10^-7 M, 0.1 x 10^-6 M 내지 0.5 x 10^-6 M, 0.1 x 10^-6 M 내지 1 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 2 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 3 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 4 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 5 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 6 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 7 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 8 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 9 x 10^-6 M, 1 x 10^-6 M 내지 10 x 10^-6 M, 0.1 x 10^-5 M 내지 0.5 x 10^-5 M, 0.1 x 10^-5 M 내지 1 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 2 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 3 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 4 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 5 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 6 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 7 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 8 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 9 x 10^-5 M, 1 x 10^-5 M 내지 10 x 10^-5 M 사이이다. 특정 구체예에 있어서, EphA2에 결합하는 제2 도메인의 해리 상수는 1.13 x 10^-7 M이다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 4 x 10^-7 M의 K_D로 CD3의 ε 서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인 및 1.13 x 10^-7 M의 K_D로 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 EphA2-결합 도메인은 높은 친화도 상수 및 낮은 해리 상수를 갖는다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 EphA2-결합 도메인은 낮은 친화도 상수 및 높은 해리 상수를 갖는다. 또 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 EphA2-결합 도메인은 높은 친화도 상수 및 높은 해리 상수를 갖는다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 CD3-결합 도메인은 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인보다 낮은 친화도로 CD3의 ε 서브유닛에 결합한다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 우선 EphA2에 결합하고 그 후 CD3에 결합한다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 EphA2를 발현하는 표적 세포의 용해(lysis)를 초래하며, 이는 당기술분야에 알려지거나 이하 섹션 6.2.6 및 6.3에 기재된 표준 세포독성 어세이에 의하여 측정된다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 표적 세포(예, EphA2를 발현하는 암, 비-암 과증식성 또는 감염된 세포)의 용해를, EphA2를 발현하는 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 개체군에서의 EphA2 발현 수준에 비하여 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 또는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 7배 또는 적어도 10배까지 매개하며, 이는 하기 섹션 6.0에 기재한 플로우-사이토메트리-기반 어세이(flow-cytometry-based assay)에 의하여 측정된다. 또 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 EphA2에 결합되는 경우 EphA2를 활성화(예, 인산화)시키지 않으며, 이는 하기 섹션 6.0에 기재한 면역침전(immunoprecipitation)/웨스턴 블롯 어세이에 의하여 측정된다. 특정 구체예에 있어서, EphA2 수용체 개체군의 20% 미만, 15% 미만, 또는 5% 미만이 본 발명의 EphA2-BiTE에 결합되는 경우 활성화(예, 인산화)된다.

본 발명은 추가로 본 발명의 EphA2-BiTE를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명의 EphA2-BiTE 및 하나 이상의 약제학적 담체 또는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 임의의 본 발명의 EphA2-BiTE를 함유하는 수성 제형, 동결건조된(lyophilized) 제형, 겔, 및 외과용 이식물(implant)를 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 용기 내에 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE를 포함하는 키트 및 상기 EphA2-BiTE의 사용을 위한 설명서(instruction)를 제공한다.

본 발명은 비정상적인 EphA2 발현(예, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 암을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 EphA2-BiTE를 그것이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명은 비정상적인 EphA2 발현과 관련된 암을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 EphA2-BiTE의 예방적 또는 치료적 유효량을 그것이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

한 구체예에 있어서, 치료, 예방 및/또는 관리하고자 하는 암은 상피 세포 기원이다. 또 하나의 구체예에 있어서, 치료, 예방 및/또는 관리하고자 하는 대상의 암의 암 세포들은 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 개체군에 비하여 EphA2를 과발현한다. 바람직한 구체예에 있어서, 암 세포에 의하여 발현된 몇몇 EphA2는 감소된 세포-세포 접촉, 변경된(altered) 세포하 국소화, 또는 리간드 대비 EphA2 양의 증가의 결과로서 리간드에 결합되지 않는다. 바람직한 구체예에 있어서, 치료, 예방 및/또는 관리하고자 하는 암은 악성이다.

본 발명의 EphA2-BiTE는 하나 이상의 다른 암 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 특히, 본 발명은 암을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 치료적 또는 예방적 유효량을, 하나 이상의 다른 요법의 치료적 또는 예방적 유효량의 투여와 조합하여, 그것이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 요법의 비제한적인 예는 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법/면역 요법, 방사선(radiation) 및 수술을 포함한다.

EphA2의 증가된 발현은 어떤 세포내 병원체, 특히 RSV에 의한 감염과 관련되는 것으로 밝혀졌다 (예컨대, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 "Use of Modulators of EphA2 and EphrinA1 for the Treatment and Prevention of Infections"의 표제로 2005년 10월 27일에 출원된 미국 출원 일련 번호 11/259,266를 참조한다). 따라서, 본 발명은 또한 바이러스 감염, 세균(bacterial) 감염, 곰팡이 감염, 원생동물(protozoal) 감염을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 병원체 감염의 치료, 예방 및/또는 관리를 위하여 설계된 조성물 및 방법을 제공한다 (상기 병원체의 예들은 예컨대 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 "Use of Modulators of EphA2 and EphrinA1 for the Treatment and Prevention of Infections"의 표제로 2005년 10월 27일에 출원된 미국 출원 일련 번호 11/259,266 (특히, 단락 [006], [0046], [0047] 및 [0057])에 기재되어 있다). 특히, 본 발명은 EphA2의 발현이 감염된 세포(예, 감염된 EphA2-발현 세포)에서 상향조절된 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량 및 선택적으로 EphA2-BiTE 이외의 요법의 유효량을 그것이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리하고자 하는 병원체 감염은 세포내 병원체 감염이다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리하고자 하는 병원체 감염은 RSV 감염이다.

본 발명의 또 하나의 양태에 있어서, EphA2의 증가된 발현은 예컨대 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 "EphA2 and Hyperproliferative Cell Disorders"를 표제로 하는 미국 특허 공개 제US 2005-0059592 A1호에 기재된 것들과 같은 어떤 비-암 과증식성 세포 장애와 관련된 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 과증식성 세포 장애의 치료, 예방 및/또는 관리를 위하여 설계된 조성물 및 방법을 제공한다 (상기 장애의 비제한적인 예들은 예컨대 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 "EphA2 and Hyperproliferative Cell Disorders"를 표제로 하는 미국 특허 공개 제US 2005-0059592호 (특히, 단락 [0035])에 기재된다). 특히, 본 발명은 EphA2의 발현이 과증식성 세포 장애에 의하여 영향을 받은 세포에서 상승조절된 과증식성 세포 장애의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량 및, 선택적으로, EphA2-BiTE 이외의 요법의 유효량을 그것이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리하고자 하는 과증식성 세포 장애는 천식, COPD, 폐 섬유증(lung fibrosis), 석면증(asbestosis), IPF, DIP, UIP, 신장 섬유증(kidney fibrosis), 간 섬유증(liver fibrosis), 기타 섬유증(other fibroses), 기관지 과민반응(bronchial hyper-responsiveness), 건선(psoriasis), 지루피부염(seborrheic dermatitis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 또는 재협착(restenosis), 과증식성 혈관 질환(hyperproliferative vascular disease), 베체트증후군(Behcet's Syndrome), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 황반 변성(macular degeneration)과 같은 과증식성 내피 세포 장애(a hyperproliferative endothelial cell disorder), 또는 과증식성 섬유아세포 장애(hyperproliferative fibroblast disorder)이다.

본 발명의 방법 및 조성물은 치료되지 않은 암 환자에게 유용할 뿐만 아니라 비제한적으로 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법, 면역요법, 방사선 요법 및/또는 수술을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 현재 표준의 그리고 실험적인 암 요법에 대해 부분적으로 또는 완전히 불응성(refractory)인 암 환자의 치료 뿐만 아니라 상기 치료의 효능을 개선시키는 데에도 유용하다. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 EphA2-BiTE의 투여를 포함하는 것들 이외의 요법에 불응성 또는 비반응성인 것으로 보여지거나 불응성 또는 비반응성일 수 있는 암의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 치료법 및 예방법을 제공한다. 특정 구체예에 있어서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는 비-EphA2-BiTE-기반 요법 (즉, EphA2-BiTE 이외의 요법)에 불응성 또는 비반응성인 환자에게 투여되어, 환자를 비-불응성 또는 반응성이 되도록 한다. 어떤 구체예에 있어서, 환자가 이전에 불응성 또는 비반응성을 가졌던 요법은 그 후 치료적 효과를 가지고 시행될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 비-암 과증식성 세포 장애를 가진 치료되지 않은 환자에게 유용할 뿐만 아니라, 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법, 면역요법, 방사선 요법 및/또는 수술을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 비-암 과증식성 세포 장애를 위한 현재 표준의 그리고 실험적인 요법에 부분적으로 또는 완전히 불응성인 환자의 치료 뿐만 아니라 상기 치료의 효능을 개선시키는 데에도 유용하다. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 EphA2-BiTE의 투여를 포함하는 것들 이외의 요법에 불응성 또는 비반응성인 것으로 보여지거나 불응성 또는 비반응성일 수 있는 비-암 과증식성 세포 장애의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 치료법 및 예방법을 제공한다. 특정 구체예에 있어서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는 비-EphA2-BiTE-기반 요법 (즉, EphA2-BiTE 이외의 요법)에 불응성 또는 비반응성인 환자에게 투여되어, 환자를 비-불응성 또는 반응성이 되도록 한다. 어떤 구체예에 있어서, 환자가 이전에 불응성 또는 비반응성을 가졌던 요법은 그 후 치료적 효과를 가지고 시행될 수 있다.

또 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 방법 및 조성물은 병원체(예컨대, 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 원생동물 병원체)로 감염된 치료되지 않은 환자에게 유용할 뿐만 아니라, 항바이러스, 항균, 항곰팡이 및/또는 다른 항미생물 약제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 감염증을 위한 현재 표준의 그리고 실험적인 요법에 부분적으로 또는 완전히 불응성인 암 환자의 치료에도 유용하다. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 EphA2-BiTE의 투여를 포함하는 것들 이외의 요법에 불응성 또는 비반응성인 것으로 보여지거나 불응성 또는 비반응성일 수 있는 감염증의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 치료법 및 예방법을 제공한다. 특정 구체예에 있어서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는 비-EphA2-BiTE-기반 요법(즉, EphA2-BiTE 이외의 요법)에 불응성 또는 비반응성인 환자에게 투여되어, 환자를 비-불응성 또는 반응성이 되도록 한다. 어떤 구체예에 있어서, 환자가 이전에 불응성 또는 비반응성을 가졌던 요법은 그 후 치료적 효과를 가지고 시행될 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 EphA2-BiTE의 스크리닝 방법을 제공한다. 특히, EphA2-BiTE는 예컨대 방사선면역 어세이(radioimmunoassay; RIA), 효소결합면역흡착 어세이(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 플로우 사이토메트리 어세이 및 이하의 섹션 6에 기재된 것들과 같은 일상적인 면역학적 기법을 사용하여, EphA2, 특히 EphA2의 세포외 도메인 및 T-세포 항원 CD3에의 결합에 대하여 스크린될 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, EphA2-BiTE를 확인하기 위하여 후보자 EphA2-BiTE는 EphA2-양성 표적 세포(예컨대, EphA2를 발현하는 암 세포, 비-암 과증식성 세포 또는 감염된 세포)의 방향전환된 용해를 개시하는 능력에 대하여 스크린될 수 있다. 또 하나의 구체예에 있어서, 후보자 EphA2-BiTE는 생체 내에서 (예컨대, NOD/SCID 마우스 이종이식(xenograft) 모델 내에서) 항-종양 활성을 갖는 능력에 대하여 스크린될 수 있다.

본 발명은 또한 EphA2-특이적 BiTE를 확인하기 위하여, 본원에 기재된 방법을 이용하여, A 및 B 유형의 다른 Eph 수용체, 즉 다른 Eph 수용체-BiTE에 결합하는 이중특이적 단일 사슬 항체 구조체의 스크리닝 방법을 제공한다. 다른 Eph 수용체-특이적 BiTE 분자를 확인하기 위한 표적으로서 사용될 수 있는 Eph 수용체 패밀리 멤버의 열거를 위하여, 각각 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90(3):403-4; 및 Cheng 등, 2002, Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85를 참조한다.

또 하나의 구체예에 있어서, 비-암 세포가 아닌 암 세포, 비-암 과증식성 세포, 또는 비-감염된 세포가 아닌 감염된 세포 상에 노출된 EphA2 에피토프에 우선적으로 결합하는 EphA2-BiTE를 확인하기 위하여, EphA2-BiTE는 리간드, 예컨대 Ephrin A1에 결합되지 않고 세포-세포 접촉으로 국소화되지 않은 EphA2에 우선적으로 결합하는 능력에 대하여 스크린될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명은 에피토프 배제(exclusion) 어세이(예컨대, 이하 섹션 6.2.4, 6.3.8 및 6.7.2를 참고하라)에서 본 발명의 EphA2-BiTE를 사용하는 것을 포함하는, 비정상적 EphA2 발현 및/또는 활성과 관련된 장애에 의하여 영향받은 조직을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 이 구체예에 따르면, 본 발명의 EphA2-BiTE는 비정상적인 EphA2 발현 및/또는 활성과 관련된 장애에 의하여 영향 받은 조직의 세포(예컨대, EphA2를 발현하는 암, 비-암 세포, 과증식성 세포 또는 감염된 세포) 에서만 접근가능한 EphA2 에피토프에 결합하거나 노출되고, 동일한 조직 유형의 정상 조직의 세포에서는 그렇지 않다. 세포에서의 항체 결합/국소화를 결정하기 위한 당기술분야에 알려진 임의의 방법은 희망하는 결합 특성에 대하여 후보자 BiTE를 스크린하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 핵자기 공명(NMR) 현미경, 면역형광 현미경(immunofluorescence microscopy), 플로우 사이토메트리 또는 표면 플라즈몬 공명 어세이(surface plasmon resonance assay)와 같은 당기술분야에 알려진 표준 어세이가 특별한 EphA2-BiTE의 결합 특징을 측정하기 위하여 사용된다. 이 구체예에 있어서, 리간드에 결합되고 세포-세포 접촉에 국소화되었을 때 EphA2에는 잘 결합하지 않고 세포 상에서 자유(free) EphA2에는 잘 결합하는 EphA2-BiTE는 본 발명에 포함된다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, EphA2-BiTE는 세포-기반 또는 ELISA 어세이를 이용하여 EphA2에의 결합을 위하여 리간드 (예컨대, 세포-앵커된(anchored) 또는 정제된 리간드)와 경쟁하는 그들의 능력에 대하여 선택된다.

3.1 정의

본 명세서의 어떤 구체예에서 EphA2 발현의 문맥에서 사용된, 용어 "비정상적(aberrant)"은 세포, 예컨대 대상의 암 세포, 비-암 과증식성 세포, 또는 감염된 세포에서, 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 개체군에서의 EphA2 발현 수준에 비하여 증가된 EphA2의 발현을 말한다. 증가된 EphA2 발현은 EphA2의 비정상적 발현과 관련된 장애를 갖는 대상의 세포에서의 EphA2의 발현이, 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 개체군에서의 EphA2 발현 수준에 비하여 증가한 것을 말한다. 특정 구체예에 있어서, EphA2의 비정상적인 발현과 관련된 장애를 갖는 대상의 세포에서의 EphA2 발현의 수준은, 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 개체군에서의 EphA2 발현 수준에 비하여, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 7배 또는 적어도 10배 증가되며, 이는 당기술분야에 알려졌거나 하기 섹션 6.0에 기재된 표준 어세이 (예컨대, 플로우 사이토메트리 어세이)에 의하여 측정된다. 특정 구체예에 있어서, 암 세포, 비-암 과증식성 세포 또는 감염된 세포에서의 EphA2 발현은, 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 개체군에서의 EphA2 발현 수준에 비하여, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 7배 또는 적어도 10배 증가되며, 이는 당기술분야에 알려졌거나 하기 섹션 6.0에 기재된 표준 어세이 (예컨대, 플로우 사이토메트리 어세이)에 의하여 측정된다. 또 하나의 구체예에 있어서, EphA2 발현의 문맥에 있어서, 용어 "비정상적"은 EphA2의 어떤 에피토프가 대상으로부터의 암 세포, 비-암 과증식성 세포 또는 감염된 세포에서 선택적으로 노출되고, 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 개체군에서는 그렇지 않은 EphA2의 발현을 말한다. 또 하나의 구체예에 있어서, EphA2 발현의 문맥에 있어서, 용어 "비정상적"은 EphA2의 세포하 국소화가 세포 내에서(예컨대 세포-세포 접촉 사이트 이외의 사이트) 변경된 EphA2의 발현을 말하며, 이는 예컨대 면역형광 염색과 같은 당기술분야에 알려진 표준 방법 또는 이하의 섹션 6에 기재한 방법에 의하여 측정된다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "약제(agent)"는 희망하는 생물학적 효과를 갖는 분자를 말한다. 약제는 단백질성(proteinaceous) 분자(예컨대, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 항체 (예컨대, 이중특이적 단일 사슬 항체)), 백신, 소분자 (small molecule)(1000 달톤 미만), 무기 또는 유기 화합물 및 핵산 분자(이중-가닥의 또는 단일-가닥의 DAN 또는 이중-가닥의 또는 단일-가닥의 RNA (예컨대, 안티센스, RNAi, 등), 압타머(aptamer), 삼중 나선 핵산 분자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아님)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 약제는 임의의 공지된 유기체 (동물(예컨대, 포유류 (인간 및 비인간 포유류)), 식물, 세균, 곰팡이 및 원생생물 또는 바이러스를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아님)로부터 또는 합성 분자의 라이브러리로부터 유래되거나 얻어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 단백질성 약제 (예컨대, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체)의 문맥에서의 용어 "유사체 (analog)"는 제2 단백질성 약제와 유사하거나 동일한 기능을 갖지만, 반드시 제2 단백질성 약제와 유사하거나 동일한 아미노산 서열 또는 구조를 포함하는 것은 아닌 단백질성 약제를 말한다. 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질성 약제는 다음 중 적어도 하나를 만족하는 단백질성 약제를 말한다: (a) 제2 단백질성 약제의 아미노산 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질성 약제; (b) 적어도 20 아미노산 잔기, 적어도 30 아미노산 잔기, 적어도 40 아미노산 잔기, 적어도 50 아미노산 잔기, 적어도 60 아미노산 잔기, 적어도 70 아미노산 잔기, 적어도 80 아미노산 잔기, 적어도 90 아미노산 잔기, 적어도 100 아미노산 잔기, 적어도 125 아미노산 잔기 또는 적어도 150 아미노산 잔기의 제2 단백질성 약제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 엄격한(stringent) 조건 하에서 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 단백질성 약제; 및 (c) 제2 단백질성 약제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화되는 단백질성 약제. 제2 단백질성 약제와 유사한 구조를 갖는 단백질성 약제는 제2 단백질성 약제의 유사한 2차, 3차 또는 4차 구조를 갖는 단백질성 약제를 말한다. 단백질성 약제의 구조는 X-선 결정학(X-ray crystallography), 핵 자기 공명 및 결정학 전자 현미경을 비롯한, 그러나 이들로만 한정되는 것은 아닌, 당기술분야에 알려진 방법에 의하여 결정될 수 있다.

2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위하여, 상기 서열은 최적의 비교 목적을 위하여 배열된다(예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 배열을 위하여 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 갭(gap)이 도입될 수 있다). 그 후, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의하여 채워진 경우, 그 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 상기 서열들에 의하여 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 중복 위치의 수/위치의 총 수 x 100%). 하나의 구체예에 있어서, 2개의 서열은 동일한 길이이다.

2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 또한 수학 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위하여 이용된 수학 알고리즘의 바람직한, 비제한적인 예는 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877]에서 수정된 [Karlin 및 Altschul, 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 87: 2264-2268]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 [Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자와 상동의 뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여, 예컨대 스코어=100, 단어 길이=12에 대한, NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터 세트를 가지고 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 상동의 아미노산 서열을 얻기 위하여, 예컨대 스코어=50, 단어 길이=3에 대한, XBLAST 프로그램 파라미터 세트를 가지고 수행될 수 있다. 비교 목적을 위하여 갭이 삽입된(gapped) 배열을 얻기 위하여 [Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 갭이 삽입된 BLAST가 이용될 수 있다. 또한, 분자간 거리 관계(Id)를 검출하는 되풀이되는 검색을 수행하기 위하여 PSI-BLAST가 사용될 수 있다. BLAST, 갭이 삽입된 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 파라미터가 사용될 수 있다(예컨대, NCBI 웹사이트를 참고하라). 서열 비교를 위하여 이용된 수학 알고리즘의 또 하나의 바람직한, 비제한적인 예는 [Myers 및 Miller, 1988, CABIOS 4: 11-17]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 배열 소프트웨어 팩키지의 부분인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위하여 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4가 사용될 수 있다.

2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 전술한 것들과 유사한 기법을 이용하여, 갭을 허용하거나 허용하지 않고 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성의 계산시 일반적으로 단지 정확한 매치(match)만이 계산된다.

본 명세서에서 비-단백질성 유사체의 문맥에서 사용된 용어 "유사체(analog)"는 제1 유기 또는 무기 분자와 유사하거나 동일한 기능을 갖고, 상기 제1 유기 또는 무기 분자와 구조적으로 유사한 제2 유기 또는 무기 분자를 말한다.

본 명세서에 사용된 용어 "항체(antibody)" 또는 "항체들(antibodies)"은 항원 결합 사이트, 예컨대 항원 결합 사이트를 함유하는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 절편을 함유하는 분자를 말한다. 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 타입(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클레스(subclass)일 수 있다. 항체들은, 이에 한정되는 것은 아니나, 합성 항체, 단일클론성 항체, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 항체, 재조합으로 생성된 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라(chimeric) 항체, 인트라바디(intrabody), scFvs(예컨대, 단일특이적 및 이중특이적 등 포함), Fab 절편, F(ab') 절편, 다이설파이드-연결된 Fvs(sdFv), 항-이디오타입(anti-idiotypic)(항-Id) 항체 및 전술한 임의의 것의 에피토프-결합 절편을 포함한다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 (1) T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 (2) EphA2에 면역특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체이다. 또 하나의 특이적 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 단일 사슬 Fv(scFv)를 포함한다. EphA2-BiTE의 제1 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및/또는 가변 경쇄 도메인은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 임의의 타입의 항체로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. EphA2-BiTE의 제2 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및/또는 가변 경쇄 도메인은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 임의의 타입의 항체로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. 항체 타입의 비제한적인 예는 합성 항체, 단일클론성 항체, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 항체, 재조합으로 생성된 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 인트라바디, scFvs(예컨대, 단일특이적 및 이중특이적 등 포함), Fab 절편, F(ab') 절편, 다이설파이드-연결된 Fvs(sdFv), 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 전술한 임의의 것의 에피토프-결합 절편을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "결합 도메인(binding domain)"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 3차원 구조를 포함하는 도메인을 말한다. 따라서, 하나의 구체예에 있어서, 상기 도메인은 항체 사슬의 VH 및/또는 VL 도메인, 바람직하게는 적어도 VH 도메인을 포함할 수 있다. 또 하나의 구체예에 있어서, 상기 결합 도메인은 EphA2 및 CD3 항원을 각각 인식하는 항체 사슬의 적어도 하나의 상보적인 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 EphA2-BiTE에 존재하는 결합 도메인의 도메인이 항체로부터 유래될 뿐만 아니라, 자연적으로 발생하는 표면 수용체 또는 리간드와 같은 다른 EphA2 또는 CD3 결합 단백질로부터도 유래될 수 있다는 것이 주목된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "탈면역화된(deimmunized)", "탈면역화(deimmunization)" 또는 그것의 문법적으로 관련된 변형어는 인간에서 비면역원성이거나 적은 면역원성인 와일드 타입(wild type) 구조체를 생성함으로써 본래 와일드 타입 구조체에 대하여 제1 및/또는 제2 결합 도메인의 변형을 의미한다. 탈면역화 접근은 당기술분야에 잘 알려져 있고, 예컨대 국제 공개 번호 WO 00/34317(특히 pp. 1-14); WO 98/52976(특히, pp. 18-38의 실시예 1-6); WO 02/079415(특히 pp. 2-8 및 pp. 15-43의 실시예 1-10); 및 WO 92/10755(특히, pp. 6-9)에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다. 용어 "탈면역화된"은 또한 T-세포 에피토프를 발생시키는 경향이 감소된 구조체에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 용어 "T-세포 에피토프를 발생시키는 경향의 감소"는 특이적 T-세포 활성화를 이끄는 T-세포 에피토프의 제거에 관한 것이다. 더욱이, "T-세포 에피토프를 발생시키는 경향의 감소"는 T-세포 에피토프의 형성에 기여하는 아미노산의 치환, 즉 T-세포 에피토프의 형성을 위하여 필수적인 아미노산의 치환을 말한다. 다시 말하면, "T-세포 에피토프를 발생시키는 경향의 감소"는 면역원성의 감소 또는 항원-의존성 T-세포 증식을 유도하는 능력의 감소에 관한 것이다. 용어 T-세포 에피토프는 세포 내에서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 분해 도중 방출될 수 있고, 이어서 T 세포의 활성화를 촉진하기 위하여 주요한 조직 적합성 복합체(MHC)의 분자에 의하여 제공되는 짧은 펩타이드 서열에 관한 것이다(예컨대, 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함되는 국제 공개 번호 WO 02/066514를 참고하라). MHC 클래스 II에 의하여 제공되는 펩타이드에 대하여, 상기 T-세포의 활성화는 그 후 상기 항체를 생성하는 B 세포의 직접적인 자극에 의하여 항체 반응을 일으킬 수 있다. "T-세포 에피토프를 발생시키는 경향의 감소" 및/또는 "탈면역화"는 당기술분야에 알려진 기법에 의하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 단백질의 탈면역화는 T-세포 증식 어세이에 의하여 시험관 내에서 시험될 수 있다. 이 어세이에 있어서, 세상에서 HLA-DR 대립 유전자의 >80%를 나타내는 도너(donor)로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 와일드 타입 또는 탈면역화된 펩타이드에 반응하는 증식에 대하여 스크리닝된다. 이상적인 세포 증식은 단지 와일드 타입 펩타이드를 갖는 항원-제시 세포의 로딩(loading)시에 검출된다. 대안적으로, 탈면역화는 모든 일배체형(haplotype)을 나타내는 HLA-DR 테트라머(tetramer)를 발현함으로서 시험될 수 있다. 이들 테트라머는 증식 어세이에 있어서 항원-제시 세포 대신 펩타이드로 로딩되거나 펩타이드 결합에 대하여 테스트될 수 있다. 탈면역화된 펩타이드가 HLA-DR 일배체형에 제시되었는지 여부를 결정하기 위하여, 예컨대 PBMC 상의 형광-표지된 펩타이드의 결합이 측정될 수 있다. 더욱이, 탈면역화는 탈면역화된 분자에 대한 항체가 환자에서의 시행 후에 형성되었는지 결정함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게, 항체 유래 분자는 프레임워크 영역(framework region)에서 탈면역화되고, 대부분의 CDR 영역은 T-세포 에피토프를 유도하는 경향의 감소를 발생시키기 위하여 변형되지 않으므로, CDR 영역의 결합 친화도는 영향을 받지 않는다. 하나의 T-세포 에피토프의 제거만으로도 감소된 면역원성을 초래한다. 특정 구체예에 있어서, 흥미있는 항원(예컨대, CD3)에 결합하는 결합 도메인의 면역원성은, 비면역화된 대조군 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 이의 절편과 비교할 때, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, at elast 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 적어도 100%까지 감소되며, 이는 당기술분야에 알려지거나 전술한 표준 분석(예컨대, T-세포 증식 어세이)에 의하여 측정된다. 요컨대, 앞에서 논의된 접근은 본 명세서에 기재된 치료적 이중특이적 단일 사슬 항체(예컨대, EphA2-BiTE)가 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 및 감염)를 갖는 환자에게 시행되었을 때 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 면역원성을 감소시키는 것을 돕는다. 예컨대, CD3의 엡실론 서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인은 탈면역화된다. 바람직하게는, 이 CD3-결합 도메인의 가변 영역의 배열은 VH-VL이다.

본 명세서에 단백질성 약제(예컨대, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및 항체)의 문맥에서 사용된 용어 "유도체(derivative)"는 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가의 도입에 위하여 변경된 아미노산 서열을 포함하는 단백질성 약제를 말한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "유도체"는 또한 변형된, 즉 임의의 타입의 분자의 단백질성 약제에의 공유결합 부착에 의하여 변형된 단백질성 약제를 말한다. 예컨대, 그러나 이에 한정되지 않는, 단백질성 약제의 유도체가 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 페그화(pegylation), 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단(blocking) 기에 의한 유도화, 단백질 가수 분해성 절단, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에의 연결 등에 의하여 생성될 수 있다. 단백질성 약제의 유도체는 또한 비제한적인 예로서 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포밀화, 튜니카마이신(tunicamycin)의 대사 합성 등을 비롯한 당기술분야에 알려진 기법을 이용하는 화학적 변형에 의하여 생성될 수도 있다. 더욱이, 단백질성 약제의 유도체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다. 단백질성 약제의 유도체는 그것이 유래되었던 단백질성 약제와 동일한 기능(들)을 갖는다.

본 명세서에서 비-단백질성 유도체의 문맥에서 사용된 용어 "유도체"는 제1 유기 또는 무기 분자의 구조에 기초하여 형성된 제2 유기 또는 무기 분자를 말한다. 유기 분자 유도체는 비제한적인 예로 예컨대 히드록실, 메틸, 에틸, 카복실, 니트릴 또는 아민기의 부가 또는 결실에 의하여 변형된 분자를 포함한다. 유기 분자는 또한 예컨대 에스테르화, 알킬화 및/또는 인산화될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애 또는 이의 증상의 심각함 및/또는 기간을 감소 및/또는 경감시키고, 상기 장애의 진행을 예방하고, 상기 장애의 퇴행를 초래하고, EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 상기 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발달 또는 발병을 예방하고, 또는 또 다른 요법(예컨대 또 다른 예방제 또는 치료제)의 예방적 또는 치료적 효과를 향상 또는 개선시키기에 충분한 요법(예컨대 예방제 또는 치료제)의 양을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "나이든 인간(elderly human)", "나이든(elderly)" 또는 이의 변형어는 65세 이상의 인간, 바람직하게는 70세 이상의 인간을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "내재적(endogenous) 리간드" 또는 "자연적 리간드(natural ligand)"는 생체 내에서 특별한 수용체에 정상적으로 결합하는 분자를 말한다. 예컨대, EphrinA1은 EphA2의 내재적 리간드이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "EphA2 폴리펩타이드"는 EphA2, 유사체, 이의 유도체 또는 절편, 또는 EphA2를 포함하는 융합 단백질, 유사체, 이의 유도체 또는 절편을 말한다. EphA2 폴리펩타이드는 임의의 종(species)으로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, EphA2 폴리펩타이드는 인간이다. 어떤 구체예에 있어서, 용어 "EphA2 폴리펩타이드"는 EphA2의 성숙한 처리된 형태를 말한다. 다른 구체예에 있어서, 용어 "EphA2 폴리펩타이드"는 EphA2의 미성숙한 형태를 말한다. 이 구체예에 따르면, 본 발명의 항체는 EphA2의 성숙한 처리된 형태에 대응하는 EphA2의 미성숙한 형태의 부분에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구체예에 있어서, 용어 "EphA2 폴리펩타이드"는 EphA2의 세포외 도메인 또는 이의 절편을 말한다. 어떤 구체예에 있어서, 세포의 문맥에서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 EphA2의 세포외 도메인(즉, 세포 표면 상에 노출된 EphA2의 에피토프)에 결합한다.

EphA2 폴리펩타이드의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열은 문헌 또는 공용 데이터베이스에서 찾아질 수 있고, 또는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열은 당기술분야에 알려진 클로닝(cloning) 및 시퀀싱(squencing) 기법을 이용하여 결정될 수 있다. 예컨대, 인간 EphA2의 뉴클레오티드 서열은 GenBank 데이터베이스에서 발견할 수 있다 (예컨대, 수납 번호 BC037166, M59371 및 M36395를 참조). 인간 EphA2의 아미노산 서열은 GenBank 데이터베이스에서 발견할 수 있다 (예컨대, 수납 번호 AAH37166 및 AAA53375를 참조). EphA2의 아미노산 서열의 추가의 비제한적인 예는 하기 표에 기록된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "에피토프(epitope)"는 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간에서 항원 또는 면역원 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질의 사이트 또는 절편을 말한다. 특정 구체예에 있어서, 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간에서 항원 또는 면역원 활성을 갖는 EphA2 폴리펩타이드의 절편 또는 CD3 폴리펩타이드 절편을 말한다. 면역원 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 이끌어내는 폴리펩타이드 또는 단백질의 사이트 또는 절편이다. 특정 구체예에 있어서, 면역원 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 이끌어내는 EphA2 폴리펩티드 절편 또는 CD3 폴리펩티드 절편이다. 항원 활성을 갖는 에피토프는 항체가 면역특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 사이트 또는 절편이며, 이는 당기술분야의 숙련자에게 잘 알려진 임의의 방법, 예컨대 RIA 또는 ELISA 어세이와 같은 면역 어세이에 의하여 결정된다. 특정 구체예에 있어서, 항원 활성을 갖는 에피토프는 항체가 면역특이적으로 결합하는 EphA2 폴리펩티드 절편 또는 CD3 폴리펩티드 절편이며, 이는 당기술분야의 숙련자에게 잘 알려진 임의의 방법, 예컨대 면역 분석에 의하여 결정된다. 항원 에피토프는 필수적으로 면역원성일 것이 요구되지 않는다.

본 명세서에서 단백질성 약제의 문맥에서 사용된 용어 "절편(fragment)"은 또 하나의 폴리펩타이드 또는 단백질의 적어도 5 인접 아미노산 잔기, 적어도 10 인접 아미노산 잔기, 적어도 15 인접 아미노산 잔기, 적어도 20 인접 아미노산 잔기, 적어도 30 인접 아미노산 잔기, 적어도 40 인접 아미노산 잔기, 적어도 50 인접 아미노산 잔기, 적어도 60 인접 아미노산 잔기, 적어도 70 인접 아미노산 잔기, 적어도 80 인접 아미노산 잔기, 적어도 90 인접 아미노산 잔기, 적어도 100 인접 아미노산 잔기, 적어도 125 인접 아미노산 잔기, 적어도 150 인접 아미노산 잔기, 적어도 175 인접 아미노산 잔기, 적어도 200 인접 아미노산 잔기, 또는 적어도 250 인접 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 말한다. 특정 구체예에 있어서, 단백질성 약제의 문맥에서의 용어 "절편"은 또 하나의 폴리펩타이드 또는 단백질의 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 60, 10 내지 70, 10 내지 80, 10 내지 100, 10 내지 125, 10 내지 150, 10 내지 175, 10 내지 200, 10 내지 250, 또는 10 내지 300의 인접 아미노산 잔기 범위의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 말한다.

특정 구체예에 있어서, 절편은 EphA2의 절편 또는 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 항체이다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 절편은 CD3의 절편 또는 CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체이다. 하나의 구체예에 있어서, 단백질 또는 폴리펩타이드의 절편은 상기 단백질 또는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 기능을 보유한다. 또 하나의 구체예에 있어서, 폴리펩타이드 또는 단백질의 절편은 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 적어도 2, 3, 4 또는 5의 기능을 보유한다. 바람직한 구체예에 있어서, EphA2 폴리펩타이드 또는 이의 절편에 면역특이적으로 결합하는 항체의 절편은 EphA2 폴리펩타이드 또는 이의 절편에 면역특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 또 하나의 바람직한 구체예에 있어서, CD3 폴리펩타이드 또는 이의 절편에 면역특이적으로 결합하는 항체의 절편은 CD3 폴리펩타이드 또는 이의 절편에 면역특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "융합 단백질(fusion protein)"은 제1 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체의 아미노산 서열 및 이종 기원(heterologous)의 폴리펩타이드 또는 단백질(즉, 제1 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체와 상이한 제2 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체, 또는 제1 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 이의 절편, 유사체 또는 유도체의 정상적이지 않은 부분)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 말한다. 하나의 구체예에 있어서, 융합 단백질은 이종 기원 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 융합된 예방제 또는 치료제를 포함한다. 이 구체예에 따르면, 이종 기원의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 예방제 또는 치료제의 상이한 타입일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 예컨대, 면역 조절 활성을 갖는 2개의 상이한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 서로 융합되어 융합 단백질을 형성할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 융합 단백질은 이종 기원의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 융합되기 전의 본래의 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성에 비하여 개선된 활성을 보유하거나 갖는다. 특정 구체예에 있어서, 융합 단백질은 T-세포 항원 CD3에 결합하는 제1 결합 도메인 및 흥미있는 항원(예컨대, EphA2)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다. 이 구체예에 따르면, 융합 단백질은 EphA2-BiTE이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "인간화된 항체(humanized antibody)"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소한의 서열을 함유하는 비-인간(예컨대, 뮤린(murine)) 항체, 바람직하게는 키메라 항체의 형태를 말한다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수용자(recipient)의 과가변 영역 또는 상보적 결정(CDR) 잔기가 마우스, 래트, 토끼 또는 희망하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(도너 항체)로부터의 항체로부터의 과가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기에 의하여 대체된 인간 면역그로불린(수용자 항체)이다. 몇몇 예에 있어서, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 프레임워크 영역(Framework Region, FR) 잔기는 예컨대 인간화된 항체의 친화도를 개선하기 위하여 대응하는 비-인간 잔기 또는 구조적 모델링에 기초한 다른 잔기에 의하여 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수용자 항체에서 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 추가로 항체 성능을 개량하기 위하여 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 통상적으로는 두 개의 가변 도메인의 실질적인 전부를 포함할 것이며, 여기서 과가변 영역의 전부 또는 실질적인 전부는 비-인간 면역글로불린의 그것들에 대응하고 FR의 전부 또는 실질적인 전부는 인간 면역글로불린 서열의 그것들이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역의 절편(Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 그것을 포함할 것이다. 인간화 방법 및 프레임워크 셔플링(framework shuffling)에 관한 상세 내용을 위하여, Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60, Jones 등, 1986, Nature 321:522-525; Reichmann 등, 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596; 및 Queen 등, 미국 특허 번호 5,585,089, 및 미국 특허 공개 번호 2005-0048617 A1를 참고할 수 있고, 상기 문헌들은 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "엄격한 조건 하에서의 하이브리드화(hybridizes under stringent conditions)"는 적어도 30%(바람직하게는, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%)가 서로 동일한 뉴클레오티드 서열이 통상적으로 서로 하이브리드된 채로 있는 하이브리드화 및 세척 조건을 나타낸다. 상기 엄격한 조건은 당기술분야의 숙련자에게 알려져 있고, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]서 찾을 수 있다.

일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH의 특정 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 낮도록 선택된다. Tm은 표적과 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열과 하이브리드화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵 농도 하)이다(Tm에서 표적 서열이 과잉으로 존재하기 때문에 프로브의 50%가 평형에서 채워진다). 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 통상적으로는 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예컨대 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대하여 적어도 약 30℃, 긴 프로브(예컨대 50 뉴클레오티드 초과)에 대하여 적어도 약 60℃일 것이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화 약제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의하여 달성될 수 있다. 선택적이거나 특이적 하이브리드화를 위하여, 포지티브 신호는 적어도 2배의 백그라운드, 바람직하게는 10 배의 백그라운드 하이브리드화이다.

하나의 비제한적인 예에 있어서, 엄격한 하이브리드화 조건은 약 45℃에서 6X 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트(SSC)에서의 하이브리드화이고, 이어서 약 68℃에서 0.1X SSC, 0.2% SDS에서 한 번 이상 세척한다. 바람직한, 비제한적인 예에 있어서, 엄격한 하이브리드화 조건은 약 45℃에서 6X SSC에서의 하이브리드화이고, 이어서 50-65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 한 번 이상 세척한다(즉, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 한 번 이상 세척). 본 발명의 핵산은 이와 같은 조건하에서 단지 A 또는 T 뉴클레오티드만으로 구성된 뉴클레오티드 서열에 단독으로 하이브리드화하는 핵산 분자를 포함하지 않는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과가변 영역(hypervariable region)"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 "상보적 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "과가변 루프"로부터의 그들 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia 및 Lesk, 1987, J. Mol . Biol . 196:901-917)를 포함한다. "프레임워크 영역(Framework Region)" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 바와 같이 과가변 영역 잔기 이외의 그들의 가변 도메인 잔기이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역조정제(immunomodulatory agent)"는 대상의 면역 시스템을 조절하는 약제를 말한다. 특히, 면역조정제는 대상의 면역 시스템의 능력을 변경시켜 하나 이상의 외래 항원에 대하여 반응하도록 하는 약제이다. 특정 구체예에 있어서, 면역조정제는 대상의 면역 반응의 한 양태를 바꾸어 놓는 약제이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 면역 조정제는 대상의 면역 반응을 억제하거나 감소시키는 약제이다(즉, 면역억제 약제).

본 명세서에서 항-EphA2 항체, EphA2-BiTE 및 EphA2-BiTE의 결합 도메인의 문맥에서 사용된 용어 "EphA2에 면역특이적으로 결합한다" 및 이의 유사 용어는 EphA2 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고 비-EphA2 폴리펩타이드에는 특이적으로 결합하지 않는 항체(예컨대, 이중특이적 단일 사슬 항체인 EphA2-BiTE) 및 EphA2-BiTE의 결합 도메인(예컨대, 이중특이적 단일 사슬 항체인 EphA2-BiTE의 scFvs)을 포함하는 단백질성 약제를 말한다. 바람직하게는, EphA2 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 및 EphA2-BiTE의 결합 도메인은 다른 비관련된 항원과는 교차-반응(cross-react)하지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 항-EphA2 항체는 다른 비관련도니 항원과 거의 또는 전혀 교차 반응성을 갖지 않고 EphA2 폴리펩타이드와 결합하며, 이는 ELISA 어세이과 같은 당기술분야에 알려진 표준 어세이에 의하여 측정된다. 어떤 구체예에 있어서, EphA2 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 EphA2-BiTE의 결합 도메인은 관련된 항원(예컨대 Eph 수용체의 A 및/또는 B 패밀리로부터의 다른 종류의 Eph 수용체)와 교차-반응할 수 있다. EphA2 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 결합 도메인은 낮은 친화도로 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 결합할 수 있으며, 이는 결합 친화도를 검출하기 위하여 예컨대 당기술분야에 알려져 있는 면역 어세이 또는 다른 분석에 의하여 결정된다. EphA2 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 도메인은 관련된 항원과 교차-반응할 수 있다. 바람직하게는, EphA2 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 절편은 예컨대 면역 어세이 또는 당기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 다른 기법에 의하여 확인될 수 있다. 항체 또는 이의 절편은 그것이 임의의 교차-반응성 항원에의 친화도 보다 더 높은 친화도로 EphA2 폴리펩타이드에 결합하는 경우 EphA2 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며, 이는 방사선면역 어세이( RIA) 및 효소결합면역흡착 어세이(ELISA)과 같은 실험적 기법을 사용하여 결정된다. 항체 특이성과 관련된 논의를 위하여 [Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, 2^nd ed., Raven Press, New York at pages 332-336]를 참고하라. 또 하나의 구체예에 있어서, 융합 단백질인 EphA2 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 EphA2 폴리펩타이드인 융합 단백질의 절편에 면역특이적으로 결합한다. 바람직하게는 EphA2 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 EphA2-BiTE의 결합 도메인은 단지 EphA2 활성(들)을 조절하며, 다른 활성에는 별로 영향을 미치지 않는다. 특정 구체예에 있어서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 EphA2-BiTE의 결합 도메인은 바람직하게는 낮은 K_off 비(예컨대, K_off가 3 x 10^-2s^-1 미만)를 가질 수 있는 단일 사슬 항체(예컨대, VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 scFvs)이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "CD3에 면역특이적으로 결합한다" 및 이의 유사 용어는 CD3 또는 이의 서브 유닛에 특이적으로 결합하고 다른 항원에는 특이적으로 결합하지 않는 단백질성 약제를 말한다. 바람직하게는, CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 EphA2-BiTE의 결합 도메인은 비관련 항원과 교차-반응하지 않는다.

본 명세서에서 요법의 시행의 문맥에서 사용된 "조합하여(in combination)"는 하나의 요법 이상의 사용을 말한다. 용어 "조합하여"의 사용은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 갖는 대상에 요법이 시행되는 순서를 제한하지 않는다. 제1 요법은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 가졌거나, 가지고 있거나, 또는 가질 여지가 있는 대상에게 제2 요법을 시행하기 전(예컨대, 1 분, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 또는 12 주 이전), 부수적으로 또는 동시에, 또는 제2 요법의 시행에 이어서(예컨대, 1 분, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 또는 12 주 후)에 시행될 수 있다. 임의의 추가 요법이 다른 추가의 요법과 함께 임의의 순서로 시행될 수 있다. 어떤 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 하나 이상의 요법(예컨대 진통제, 마취제, 항생제, 항바이러스제, 항균제, 항원충제, 면역조정제와 같은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여 현재 시행되는 비-EphA2-BiTE)과 조합하여 시행될 수 있다.

본 명세서에서 EphA2 발현과 관련하여 사용된 용어 "증가된(increased)" 또는 "과발현되다(overexpress)" 또는 "과발현(overexpression)"은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 갖는 대상의 세포에서의 EphA2의 발현이, 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 군에서의 EphA2 발현의 수준에 비하여 증가된 것을 말하며, 이는 비제한적인 예로서 RIA, ELISA 어세이, 웨스턴 블롯 분석, 플로우 사이토메트리 또는 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 면역조직화학(immunohistochemistry)를 비롯한 당기술분야에 알려진 임의의 방법에 의하여 측정한다. 특정 구체예에 있어서, EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 갖는 대상의 세포에서의 EphA2의 발현 수준은 상기 대상의 정상 세포, 정상의 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의 건강한 세포들의 군에서의 EphA2 발현의 수준에 비하여 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 또는 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 2.5 배, 적어도 3 배, 적어도 3.5 배, 적어도 4 배, 적어도 4.5, 적어도 5 배, 적어도 7 배 또는 적어도 10 배까지 증가된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "인간 인펀트(human infant)" 또는 "인펀트(infant)" 또는 이의 변형어는 24개월 미만, 바람직하게는 12개월 미만, 6개월 미만, 3개월 미만, 2개월 미만 또는 1개월 미만의 인간을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "미성숙하게 태어난 인간 인펀트(human infant born prematurely)", "조산된 인펀트(preterm infant)" 또는 "미성숙 인펀트(premature infant)" 또는 이의 변형어는 임신주수 40주 미만, 바람직하게는 임신주수 35주 미만에 태어난 6개월 미만, 바람직하게는 3개월 미만, 더욱 바람직하게는 2개월 미만, 그리고 가장 바람직하게는 1개월 미만의 인간을 말한다.

본 명세서에서 단백질성 약제 또는 핵산 이외의 유기 또는 무기 분자(그것이 작은 것이든 큰 것이든)의 문맥에서 사용된 용어 "단리된(isolated)"은 상이한 유기 또는 무기 분자에 대하여 실질적으로 자유로운 유기 또는 무기 분자를 말한다. 바람직하게는, 유기 또는 무기 분자는 제2의 상이한 유기 또는 무기 분자에 대하여 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 자유롭다. 바람직한 구체예에 있어서, 유기 및/또는 무기 분자는 단리된다.

본 명세서에서 단백질성 약제(예컨대, 펩타이드, 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 항체)의 문맥에서 사용된 용어 "단리된(isolated)"은 그것이 유래된 세포 또는 조직으로부터의 오염(contaminating) 단백질 또는 세포성 물질에 대하여 실질적으로 자유f롭거나, 화학적으로 합성시 화학 전구체 또는 다른 화학물질에 대하여 실질적으로 자유로운 단백질성 약제를 말한다. 언어 "세포성 물질에 대하여 실질적으로 자유로운"은 단백질성 약제가 그것이 단리되거나 재조합적으로 생성된 세포의 세포성 성분으로부터 분리되는 단백질성 약제의 제조를 포함한다. 따라서, 세포성 물질에 대하여 실질적으로 자유로운 단백질성 약제는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만(건조량 기준)의 이종 기원 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 항체("오염 단백질"이라고도 함)를 갖는 단백질성 약제의 제조를 포함한다. 단백질성 약제가 재조합적으로 생성되는 경우, 그것은 바람직하게는 배양 배지에 실질적으로 자유롭고, 즉 배양 배지는 단백질성 약제의 제조의 용적의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만으로 나타난다. 단백질성 약제가 화학 합성에 의하여 생성되는 경우, 화학 전구체 또는 다른 화학물질에 대하여 실질적으로 자유로운 것이 바람직하며, 즉 그것은 단백질성 약제의 합성에 포함되는 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 단백질성 약제의 제조는 흥미있는 단백질성 약제 이외의 화학 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 5% 미만(건조량 기준) 갖는다. 특정 구체예에 있어서, 본 명세서에 기재된 단백질성 약제는 분리된다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE 분자는 분리된다.

본 명세서에서 핵산 분자의 문맥에서 사용된 "단리된(isolated)"은 핵산 분자의 자연적인 소스에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리되는 핵산 분자를 말한다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기법에 의하여 생성될 때 다른 세포성 물질 또는 배양 배지에 대하여 실질적으로 자유롭거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질에 대하여 실질적으로 자유로운 것이 바람직하다. 특정 구체예에 있어서, 핵산 분자는 분리된다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE를 암호화하는 핵산 분자는 분리된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "낮은 내성(tolerance)"은 환자가 요법(들)로부터 부작용을 겪어, 부작용으로부터의 해(harm) 및/또는 역효과가 치료의 이익을 넘어서기 때문에, 환자가 치료를 계속할 수 없거나 및/또는 이롭지 않은 상태를 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "관리하다(manage)", "관리하는(managing)" 및 "관리(management)"는 장애의 치유를 가져오지 않는 요법으로부터 대상이 이끌어낸 이로운 효과를 말한다. 어떤 구체예에 있어서, EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)를 "관리"하기 위하여 하나 이상의 요법이 대상에게 시행되어, 상기 장애의 진전 또는 악화를 예방한다(예컨대, 질병 진행을 막음).

본 명세서에서 사용된 용어 "병리-유발 세포 표현형질(pathology-causing cell phenotype)"은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애에 의하여 영향을 받은 세포가 상기 장애의 병리학적 상태를 유발하거나 기여하는 기능을 말한다. 병리-유발 세포 표현형질은, 세포/세포 간 상호작용의 감소, 세포외 매트릭스 증착의 증가, 이동(migration)의 증가, 세포 생존, 및/또는 암 세포, 과증식 세포 또는 감염성 병원체/약제(예컨대, 세균, 바이러스, 곰팡이 또는 원생동물)에 의하여 감염된 세포(예컨대, 상피 세포)의 증식의 증가를 포함하나, 이들로만 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 이들 병리-유발 세포 표현형질은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)를 겪는 환자의 증상을 유발하거나 기여한다.

본 명세서에서 사용된 문구 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 연방 또는 주 정부의 취체기관(regulatory agency)에 의하여 승인되거나 미국 약전(Pharmacopeia), 유럽 약전 또는 동물, 특히 인간에의 사용에 대한 다른 일반적으로 인식된 약전에 기록된 것을 의미한다.

본 명세서에서 대상에게 요법의 시행의 문맥에서 사용된 용어 "약효를 증가시키다(potentiate)"는 그것의 통상의 또는 승인된 용량에서 요법의 효능의 개선을 말한다.

본 명세서에서 대상에게 시행된 요법의 문맥에서 사용된 용어 "예방하다(prevent)", "예방하는(preventing)" 및 "예방(prevention)"은 요법의 시행(예컨대, 예방제 또는 치료제) 또는 요법들의 조합 시행(예컨대, 예방제 또는 치료제들의 조합)에 의하여 초래되는 대상에서의 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애 또는 이의 증상의 발전, 발병, 확산 또는 재발의 감소 또는 억제를 말한다. 특정 구체예에 있어서, 대상에게 시행되는 요법의 문맥에서 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 확산 및 진행의 감소 또는 재발 시간의 증가를 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방제(prophylactic agent)"는 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 증상의 발전, 재발, 확산 또는 발병을 예방할 수 있는 임의의 약제를 말한다. 어떤 구체예에 있어서, 용어 "예방제"는 EphA2-BiTE를 말한다. 어떤 다른 구체예에 있어서, 용어 "예방제"는 EphA2-BiTE 이외의 약제를 말한다. 바람직하게는, 예방제는 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 하나 이상의 증상의 발병, 발전, 재발, 진행 및/또는 확산을 예방 또는 방해하는데 유용한 것으로 알려졌거나 사용되어 왔거나 또는 현재 사용되는 약제를 말한다.

본 명세서에서 사용된 "예방적 유효량(prophylactically effective amount)"은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 증상의 발전, 재발, 확산 또는 발병의 예방을 가져오기에 충분한 요법(예컨대, 예방제)의 양을 말한다. 예방적 유효량은 예컨대, 상기 장애를 이미 겪고 있는 사람들 또는 면역저하(immunocompromised) 또는 면역억제, 또는 유전적으로 상기 장애에 걸리기 쉬운 사람들에서 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 증상의 발전, 재발, 확산 또는 발병을 예방하기에 충분한 요법(예컨대, 예방제)의 양을 말할 수 있다. 예방적 유효량은 또한 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 증상의 예방에 예방적 이익을 제공하는 요법(예컨대, 예방제)의 양을 말할 수 있다. 또한, 요법(예컨대, 본 발명의 예방제)과 관련된 예방적 유효량은 요법(예컨대, 예방제) 단독, 또는 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 예방에 예방적 이익을 제공하는 하나 이상의 다른 요법(예컨대, EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)를 예방하기 위하여 현재 시행되는 비-EphA2-BiTE 요법, 진통제, 마취제, 항생제 또는 면역조정제)과 조합의 양을 말한다. 본 발명의 EphA2-BiTE 양과 관련하여 사용되는 용어는 또 하나의 요법(예컨대, 예방제)과의 시너지(synergy) 또는 예방적 효능을 향상시키거나 전체 예방 처치를 개선하는 양을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "프로토콜(protocol)"은 투약 스케줄 및 투약 처방계획(regimen)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "불응성(refractory)"은 하나 이상의 요법(예컨대, 현재 이용가능한 요법)에 반응하지 않는 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)를 말한다. 어떤 구체예에 있어서, EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)가 요법에 대하여 불응성이라는 것은 상기 장애와 관련된 증상의 적어도 일부 상당한 부분이 그 요법에 의하여 제거되거나 줄어들지 않은 것을 의미한다. 상기 장애가 불응성인지 여부의 결정은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)를 위한 요법의 효과를 어세이하기 위하여 당기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의하여 생체 내 및/또는 시험관 내에서 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 문구 "부작용(side effects)"은 요법(예컨대, 예방제 또는 치료제)의 원하지 않는 역효과를 포함한다. 역효과는 항상 원하지 않지만, 원하지 않는 효과가 필수적으로 역효과는 아니다. 요법(예컨대, 예방제 또는 치료제)으로부터의 역효과는 해롭거나 불편하고나 위험할 수 있다. 부작용의 예로는 메스꺼움, 구토, 식욕 부진, 복부 경련, 열, 통증, 체중 감소, 탈수, 탈모, 호흡곤란, 불면증, 어지러움, 점막염, 신경 및 근육 효과, 피로, 입안 건조 및 식욕 감퇴, 투여 사이트의 발진 또는 부기, 열, 오한 및 피로와 같은 인플루엔자 유사 증상(flu-like symptom), 소화관 문제 및 알러지 반응이 있으나, 이들로만 한정되는 것은 아니다. 환자에 의하여 경험된 추가의 희망하지 않는 효과는 다수이며 당기술분야에 알려져 있다. 많은 것들이 [Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)]에 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 절편을 말하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬로 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위한 희망하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFvs의 생성 방법은 당기술분야에 잘 알려져 있다. scFvs의 생성 방법을 검토하기 위하여 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg] 및 [Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참고하라. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 scFvs로 구성된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "대상(subject)" 및 "환자(patient)"는 상호 교환가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 대상은 동물, 바람직하게는 비영장류와 같은 포유류(예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류(예컨대, 원숭이(예컨대, 붉은털(rhesus) 원숭이, 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 또는 침팬치) 및 인간), 그리고 가장 바람직하게는 인간이다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 대상은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 가진 포유류, 바람직하게는 인간이다. 상기 장애는 암, 비-암 과증식성 세포 장애 및 감염을 포함하나, 이들로만 한정되는 것은 아니다. 또 하나의 구체예에 있어서, 상기 대상은 EphA2의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 발전시킬 위험이 있는 포유류, 바람직하게는 인간이다(예컨대, 면역저하 또는 면역억제된 포유류 또는 유전적으로 걸리기 쉬운 포유류). 또 하나의 구체예에 있어서, 상기 대상은 면역저하 또는 면역억제된 포유류, 바람직하게는 인간이 아니다. 또 하나의 구체예에 있어서, 상기 대상은 림프구 수가 약 500 세포/mm³ 아래가 아닌 포유류, 바람직하게는 인간이다.

본 발명에서 사용된 용어 "시너지(synergistic)"는 임의의 2 이상의 단일 요법(예컨대, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 부가 효과보다 더 우수한 요법들(예컨대, 예방제들 또는 치료제들)의 조합을 말한다. 하나의 양태에 있어서, 요법의 조합(예컨대 예방제 또는 치료제의 조합)의 시너지 효과는 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)를 갖는 대상에게 하나 이상의 요법(예컨대, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)을 더 적은 용량으로 및/또는 상기 요법을 더 적은 시행 빈도로 사용하도록 한다. 몇몇 구체예에 있어서, 더 적은 용량의 요법(예컨대, 예방제 또는 치료제)을 이용하는 능력 및/또는 상기 요법을 더 적은 빈도로 시행하는 능력은 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)의 예방 또는 치료에 상기 요법의 효능을 감소시키지 않고 대상에게 상기 요법의 시행과 관련된 독성을 줄인다. 또 하나의 양태에 있어서, 시너지 효과는 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)의 치료, 예방 및/또는 관리에서 요법(예컨대, 예방제 또는 치료제)의 개선된 효능을 가져올 수 있다. 또 하나의 양태에 있어서, 요법(예컨대, 예방제 또는 치료제)의 조합의 시너지 효과는 임의의 단일 요법과 관련된 역효과 또는 원하지 않는 부작용을 피하거나 감소시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료제(therapeutic agent)"는 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 하나 이상의 증상의 치료 및/또는 관리에 사용될 수 있는 임의의 약제를 말한다. 어떤 구체예에 있어서, 용어 "치료제"는 본 발명의 EphA2-BiTE 분자를 말한다. 어떤 다른 구체예에 있어서, 용어 "치료제"는 본 발명의 EphA2-BiTE 분자 이외의 약제를 말한다. 바람직하게는, 치료제는 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리를 위하여 유용한 것으로 알려져 있거나, 또는 사용되었거나, 또는 현재 사용되고 있는 약제이다.

본 명세서에서 암의 문맥에서 사용된 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"는 암의 치료 및/또는 관리에 치료적 이익을 제공하는 요법 단독 또는 다른 요법과의 조합의 양을 말한다. 하나의 양태에 있어서, 치료적 유효량은 일차적, 지역 또는 전이 암 조직을 파괴, 변형, 조절 또는 제거하기에 충분한 치료량을 말한다. 또 하나의 양태에 있어서, 치료적 유효량은 암의 증상을 감소시키는데 충분한 치료량을 말한다. 또 하나의 양태에 있어서, 치료적 유효량은 암의 확산을 지연하거나 최소화하는데 충분한 치료량을 말한다. 특정 구체예에 있어서, 요법의 치료적 유효량은 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하고, 생존한 암 세포를 사멸시키고(예컨대, 암의 퇴행 유발), 및/또는 다른 조직 또는 영역으로의 암 세포 확산을 예방하기에(예컨대, 전이 예방) 충분한 치료량이다. 또 하나의 구체예에 있어서, 요법의 치료적 유효량은 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%까지 종양의 성장을 억제하는데 충분한 치료량이며, 이는 하기 섹션 6.4.1에 기재되었거나 당기술분야에 알려진 표준 방법에 의하여 측정된다. 본 발명의 EphA2-BiTE의 양과 관련하여 사용된 용어는 전체 요법을 개선하고, 원하지 않는 효과를 감소시키거나 피하고, 또는 또 다른 요법의 치료적 효능을 향상시키거나 시너지를 나타내는 양을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 요법의 유효량은 당기술분야에 알려져 있거나 본 명세서에 기재된 어세이에서 대조군(예컨대, 포스페이트 완충된 염수와 같은 음성 대조군)에 비하여 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 까지 원하지 않는 효과를 감소시키거나 피하고, 또는 또 다른 요법의 치료적 효능을 향상시키거나 시너지를 나타낸다.

본 명세서에서 비-암 과증식성 세포 장애의 문맥에서 사용된 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"는 상기 장애의 치료 및/또는 관리에 치료적 이익을 제공하는 요법 단독 또는 다른 요법과의 조합의 양을 말한다. 하나의 양태에 있어서, 치료적 유효량은 비-암 과증식성 세포 장애에 의하여 영향받은 세포를 파괴, 변형, 조절 또는 제거하기에 충분한 치료량을 말한다. 또 하나의 양태에 있어서, 치료적 유효량은 비-암 과증식성 세포 장애의 증상을 감소시키는데 충분한 치료량을 말한다. 또 하나의 양태에 있어서, 치료적 유효량은 비-암 과증식성 세포 장애의 확산을 지연하거나 최소화하는데 충분한 치료량을 말한다. 특정 구체예에 있어서, 요법의 치료적 유효량은 비-암 과증식성 세포 장애의 성장 또는 증식을 억제하고, 생존한 비-암 과증식성 세포를 사멸시키기에(예컨대, 상기 장애의 퇴행 유발) 충분한 치료량이다. 또 하나의 특정 구체예에 있어서, 요법의 치료적 유효량은 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%까지 비-암 과증식성 세포의 성장을 억제하는데 충분한 치료량이며, 이는 당기술분야에 알려진 표준 방법에 의하여 측정된다. 본 발명의 EphA2-BiTE의 양과 관련하여 사용된 용어는 전체 요법을 개선하고, 원하지 않는 효과를 감소시키거나 피하고, 또는 또 다른 요법의 치료적 효능을 향상시키거나 시너지를 나타내는 양을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 요법의 치료적 유효량은 당기술분야에 알려져 있거나 본 명세서에 기재된 어세이에서 대조군(예컨대, 포스페이트 완충된 염수와 같은 음성 대조군)에 비하여 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 까지 원하지 않는 효과를 감소시키거나 피하고, 또는 또 다른 요법의 치료적 효능을 향상시키거나 시너지를 나타낸다.

본 명세서에서 감염의 문맥에서 사용된 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"는 감염의 심각성을 감소시키고, 감염의 기간을 감소시키고, 하나 이상의 감염의 증상을 경감시키고, 감염의 진전을 예방하고, 감염의 퇴행을 유발하고, 또는 또 다른 요법의 치료적 효과(들)을 향상시키거나 개선하기에 충분한 요법(예컨대, 치료제)의 양을 말한다. 어떤 구체예에 있어서, 치료적 유효량은 병원체의 복제를 감소시키거나 억제하고, 병원체에 의한 세포의 감염을 억제하거나 감소시키고, 병원체 단백질의 생산을 억제하거나 감소시키고, 병원체의 방출을 억제하거나 감소시키고, 다른 조직 또는 대상으로의 병원체의 확산을 억제하거나 감소시키고, 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 경감시키기에 충분한 치료제의 양을 말한다. 하나의 구체예에 있어서, 치료제의 치료적 유효량은 당기술분야에 알려져 있거나 본 명세서에 기재된 어세이에서 대조군(예컨대, 포스페이트 완충된 염수와 같은 음성 대조군)에 비하여 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%까지 병원체의 복제 또는 확산을 감소시킨다. 병원체, 예컨대 바이러스의 복제를 측정하는데 사용될 수 있는 어세이는 예컨대 문헌 [H.M. Temin 및 H. Rubin. 1958. Characteristics of an assay for Rous sarcoma virus and Rous sarcoma cells in tissue culture. Virology 17: 669-688] 및 [J.W. Hartley 및 W.P. Rowe. 1966. Production of altered cell foci in tissue culture by defective Moloney sarcoma virus particles. Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 780-786]에 기재된 바와 같이 감염력 및 형질전환(transforming) 어세이를 포함하며, 이들 예로만 한정되는 것은 아니고, 상기 문헌들은 각각 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "요법(therapy)"은 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염)의 치료, 예방 및/또는 관리에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 약제를 말한다. 어떤 구체예에 있어서, 용어 "요법들" 및 "요법"은 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 또는 이의 의사와 같은 당기술분야의 숙련자에게 알려진 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 유용한 생물학적 요법, 보조적인 요법 및/또는 다른 요법을 말한다.

본 명세서에서 대상에게 요법(들)을 시행하는 문맥에서 사용된 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)" 및 "치료하는(treating)"은 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암, 비-암 과증식성 세포 장애 또는 감염) 의 진행, 심각성 및/또는 기간의 감소 또는 경감 및/또는 하나 이상의 요법의 시행(하나 이상의 예방제 또는 치료제의 시행을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아님)으로부터 얻어진 상기 장애의 하나 이상의 증상의 경감을 말한다. 특정 구체예에 있어서, 대상에게 요법(들)을 시행하는 문맥에서의 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 대조군(예컨대, 포스페이트 완충된 염수와 같은 음성 대조군)에 비하여 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%까지 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암)의 진행, 심각성 및/또는 기간을 감소 또는 경감시키는 것, 암 세포의 감소를 의미한다. 다른 구체예에 있어서, 대상에게 요법(들)을 시행하는 문맥에서의 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 EphA2의 비정상적인 발현(예컨대, 과발현) 및/또는 활성과 관련된 장애(예컨대, 암) 의 진행, 심각성 및/또는 기간을 감소 또는 경감시키는 것, 암 세포 수의 불변, 입원 기간의 감소, 사망률의 감소, 또는 암에 걸린 대상의 생존 시간의 증가를 말한다.

도 1A-1B: 항-EphA2 항체 EA2의 VL 및 VH 도메인의 서열. VL 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열 식별 번호: 각각 1 및 2)은 (A)에 나타내었다. VH 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열 식별 번호: 각각 9 및 10)은 (B)에 나타내었다. CDR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다. EA2 항체는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 공개 제US 2005-0152899 A1호에 이미 기재되어 있다.

도 2A-2B: 항-EphA2 항체 EA5의 VL 및 VH 도메인의 서열. VL 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열 식별 번호: 각각 17 및 18)은 (A)에 나타내었다. VH 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열 식별 번호: 각각 25 및 26)은 (B)에 나타나 있다. CDR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다. EA5 항체는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 공개 제US 2005-0152899 A1호에 이미 기재되어 있다.

도 3A-3B: EphA2-BiTE cDNA의 구조. 발현 벡터 pEF-DHFR로 클로닝된 인서트(insert)는 각각 증가된 변역 효율 및 분비 신호 서열을 위한 5'-말단 코작(Kozak) 사이트를 갖는 리더(leader)(뮤린 Ig 중쇄 리더)을 포함하였다. 상기 리더는 앞에 열거한 바와 같은 4개의 가변 Ig 도메인이 뒤따른다. 항-EphA2의 VL-VH 또는 VH-VL 접합(junction)에서의 링커 펩타이드는 15 아미노산 길이를 갖는다 (모티프 G4S의 3 반복). EphA2를 CD3 결합 특이성과 관련시키는 링커 펩타이드는 모티프 G4S의 1 반복을 포함한다. 4번째 도메인에 직접 인접하는 것은 검출 및 정제 목적을 위한 C-말단 헥사-히스티딘(H6) 서열이다. 표시된 제한 효소 사이트는 EphA2-BiTE 구조체를 발현 벡터로 클로닝하기 위하여 사용되었다.

도 4A-4B: CHO 세포에서 EphA2-BiTE를 발현하는 데 사용된 pEF-DHFR 벡터의 구조. pEF-DHFR 벡터는 인간 EF1α 프로모터의 제어 하에 발현되는 유전자와 함께 바이-시스트론성(bi-cistronic) 전사 유닛을 형성하는 선택 마커(selection marker)로서 뮤린 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 환원 효소를 갖는 5.8 kb 벡터이다. 진핵 발현 벡터는 발현 벡터 pMT2PC의 유도체이다.

도 5A-5B: 겔여과 컬럼(gelfiltration column)으로부터의 EphA2-BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL) 함유 단백질 분획로부터의 용리 프로필. 피크 1: 결집체(aggregate), 피크 2: 다이머, 피크 3: 모노머.

도 6A-6B: 정제된 EphA2-BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL) 분획의 SDS PAGE 및 항-His 태그 워스턴 블롯. 모노머 분획(레인 7)은 본질적으로 순수한 EphA2 BiTE를 함유하였다. EphA2-BiTE는 결집체 내에서 검출가능하지 않았다.

도 7A-7B: 사이노몰거스-반응성 항-CD3 부모 항체의 플로우 사이토메트리 결합 분석. 사이노몰거스 원숭이로부터의 PBMC는 FITC와 모두 컨쥬게이션되는 부모 항체 cCD3-1 및 cCD3-2의 CD3-결합을 검출하는데 사용되었다. FACS-Calibur(Becton Dickinson, Heidelberg) 상의 플로우 사이토메트리에 의하여 세포를 분석하였다. 여기에 나타낸 바와 같이, 2개의 항체는 모두 사이노몰거스 PBMC 의 T-세포 분획에 대하여 별개의 결합을 나타낸다.

도 8. EA2 및 EA5의 붉은털원숭이(Rhesus) EphA2과의 교차반응성(crossreactivity)을 위한 증거. EA2 및 EA5 항체는 웨스턴 블롯에서 나타낸 바와 같이 CMMT110/CL 세포에서 EphA2의 인산화를 활성화시켰다.

도 9. 짧은꼬리원숭이(macaque) CD3와 반응하는 다양한 항-EphA2 대리(surrogate) BiTE 구조체의 플로우 사이토메트리 결합 분석. 단지 짧은꼬리원숭이 CD3 항체 cCD3-1에 기초한 상기 대리 BiTE 구조체만이 CD3 및 EphA2에 대하여 강한 결합을 나타내었다. cCD3-2에 기초한 구조체만이 강한 CD3-결합을 나타내고, EphA2-결합은 거의 완전히 억제되었음이 판명되었다. 따라서, cCD3-1 기반 대리 BiTE 구조체는 생성, 정제 및 사이노몰거스 T-세포와 함께 세포독성 활성의 분석으로 진행될 것이다.

도 10. 항-EphA2 부모 항체의 플로우 사이토메트리 결합 분석. EphA2 발현 A549 세포(인간 폐 암종 세포주)(A) 및 MDA-MB-231 세포(인간 유방암)(B)이 사용되었다. 세포(200,000)는 얼음 상에서 30분간 10㎍/ml의 반응성 항체와 함께 배양되었다. 상기 세포는 이어서 PBS에서 2회 세척되었다. 일차 항체의 결합은 2% FCS를 갖는 50 ㎕ PBS 중에서 1:100으로 희석된 파이코에리트린-컨쥬게이트된(phycoerythrin-conjugated) 뮤린 Fc-감마 특이적 항체를 통하여 검출되었다(Dianova, 주문번호. 115-116-071). 음성 대조군으로서, 동일한 이소타입(isotype)을 갖는 무관계한(irrelevant) 항체가 사용되었다(얇은선). FACS-Calibur(Becton Dickinson, Heidelberg) 상에서 플로우 사이토메트리에 의하여 세 포를 분석하였다. 도에 도시된 바와 같이, mAb B322는 EA2 및 EA5이 뒤따르는 가장 강한 결합 신호를 나타내었다. 3개의 상이한 항체의 결합 능력은 막대그래프 오버레이에 나타내었다 (왼쪽으로부터 4번째 피크 = B322 항체; 왼쪽으로부터 3번째 피커 = EA2 항체 ; 왼쪽으로부터 2번째 피크 = EA5 항체; 왼쪽 끝 피크 - 대조군).

도 11. 정상 조직에의 EA2 및 EA5 결합의 면역조직화학 분석(immunohistochemical analysis). (A) 일차 항체 없음. EA5는 심장 조직의 사이 원반(intercalated discs)(B), 다수의 기관(organ)의 혈관 및 기질 평활근(stromal smooth muscle) 요소(세포질), 결장 상피(세포질), 및 자궁근층에서의 염색을 나타내었다. 인간 조직 섹션(C)은 이소타입 대조군 단일클론성 항체 1A7과 비교할 때 EA2로 염색되지 않았다.

도 12. 플로우 사이토메트리에 의하여 측정된 상이한 세포주 상의 EphA2-BiTE의 이중특이적 결합. CD3-양성 HP-BALL(인간 T-세포주) 뿐만 아니라 EphA2-양성 A549 세포(인간 폐 암종 세포주) 및 MDA-MB-231 세포(인간 유방암 세포주)가 사용되었다.

도 13A-13B. (A) MDA MB 231(유방), 및 (B) A549(폐) 세포 내의 5개의 EphA2-BiTE에 의한 방향전환된 용해의 잠재성. BiTE 구조체 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)는 일관적으로 유방 및 폐 암 세포주의 방향전환된 용해의 잠재성이 가장 높았다.

도 14A-14C. 탈면역화된 항-CD3(VH-VL) x EA2(VH-VL) EphA2-BiTE의 서열. CD3에 면역특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE 구조체의 도시는 (A)에 나타나 있다. 또한, VH_CD3-VL_CD3, VL_CD3-VH_EphA2 및 VH_EphA2-VL_EphA2 도메인 사이의 각각의 링커 서열은 5' 에서 3' 방향으로(왼쪽에서 오른쪽) 도시되어 있다. 각 링커의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 식별 번호: 27 및 28, 29 및 30, 및 31 및 32로 표시된다. 탈면역화된 항-CD3(VH-VL) x EA2(VH-VL) EphA2-BiTE의 전체 길이의 서열 뉴클레오티드 서열(서열 식별 번호: 60) 및 아미노산 서열(서열 식별 번호: 65)은 (B)에 나타나 있다. 볼드체는 각각 EcorI 및 SalI의 효소 제한 사이트를 나타낸다. 이탤릭 대문자(Italic upper case letters)는 리더 서열을 표시하고, 이중 밑줄 문자는 종결 코돈을 나타낸다. 링커 및 히스티딘-태그 서열은 밑줄 표시되어 있다.

도 15. EphA2 BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 2개의 상이한 배치의 세포독성 활성은 효과기(effector) 세포로서 자극된 D8+ T-세포 및 PBMC(CD16 양성 세포의 고갈 후)와 비교되었다. EphA2-양성 세포주 A549 및 MDA-MB231이 표적 세포 역할을 하였다. E:T 비는 10:1이었고, 배양시간은 18 시간이었다. (A) A549 세포 용해는 PBMC를 갖는 EphA2-BiTE에 의하여 매개되었고, (B) A549 세포 용해는 자극된 CD8+ T-세포를 갖는 EphA2-BiTE에 의하여 매개되었으며, (C) MDA-MB231 세포 용해는 PBMC를 갖는 EphA2-BiTE에 의하여 매개되었고, (D) MDA-MB231 세포 용해는 자극된 CD8+ T-세포에 의하여 매개되었다.

도 16A-16B. 효과기 세포 도너를 갖는 EphA2-BiTE 세포독성 활성의 변이ariation). EphA2-BiTE는 상이한 대상으로부터의 T-세포를 방향전환시켜 EphA2+ 종양 세포 사멸을 매개한다. 세포독성 분석은 49 개별 인간 도너로부터 단리된 SW480 표적 세포 및 CD3+ T-세포를 이용하였다. 대부분의 인간 도너에 있어서, EphA2-BiTE는 매우 낮은 농도로 종양 세포 사멸을 매개하였다. EphA2-BiTE에 대한 EC50은 24 ng/ml인 중간값(수평 바)에서 테스트된 모든 T-세포 도너에 대하여 1 내지 110 ng/ml이었다. 따라서, 대부분의 인간 T-세포 도너에 있어서, EphA2-BiTE는 낮은 ng/ml 범위의 농도에서 사멸 활성이 관찰되는 매우 잠재성 있는 분자이다.

도 17A-17D. 표적 세포 결합의 특이성 - 가용성 EphA2 융합 단백질은 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 결합에 대하여 경쟁한다. BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 표적 결합 특이성을 경쟁 어세이에서 테스트하였다. 도면에 나타난 바와 같이, BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)을, 중량이 10배 초과하는 가용성 EphA2 Fc 융합 단백질과 함께 공동인큐베이션(coincubation)한 경우, A549 인간 폐 암 세포에 대한 BiTE의 결합을 완전히 차단(blocked)하였다. 이것은 종양 세포에 대한 BiTE 결합이 EphA2 표적의 인식에 의하여 특이적으로 매개된다는 것을 보여준다.

도 18. EphA2-BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 표적 세포 특이성: 항원 양성 세포의 사멸. 탈면역화된 항-CD3xEA2 BiTE의 세포독성 활성은 트랜스펙트된(transfected) B16F10 표적 세포에서의 EphA2 발현에 엄격하게 의존하고, EphA2-음성 B16F10 세포는 탈면역화된 항-CD3xEA2 매개 용해에 대하여 완전히 저항성이 있다.

도 19A-19C. 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL) 시험관 내 세포독성 활성의 특이성. (A) 표적 세포 용해의 특이성. CD3+ T-세포가 풍부한(enriched) PBMC는 EphA2 양성 SW480(폐쇄된 기호) 또는 EphA2 음성 SK-MEL-28(개방된 기호) 세포와 함께, 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL)(사각형) 또는 bscCD19xCD3(삼각형)의 일련의 희석액의 존재하에, 42시간 동안 37℃에서 배양되었다. (B 및 C) CD3(DiL2K) 및 EphA2(EA2)에 대한 부모 항체는 EphA2 양성 종양 세포의 bscEphA2xCD3 용해를 억제한다. CD3+ T-세포는 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL) 단독(개방된 사각형)의 일련의 희석액의 존재하에, 또는 패널 B에서의 DiL2K 또는 패널 C에서 EA2의 10 ㎍(삼각형) 또는 100 ㎍(원)의 존재하에, SW480 세포를 갖는 배양 배지 200㎕에서 42시간 동안 37℃에서 배양되었고, 결과는 용해된 표적 세포의 백분율로 제시된다. 에러 바(error bar)는 이중 측정의 표준 편차(SD)를 표시한다. 주의: 용해의 규모는 각 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL) 커브에 대하여 100% 접근한다.

도 20. EphA2-BiTE에 의하여 매개된 신장 세포 암종 및 전립선 암 세포 사멸. 세포독성 어세이는 EC₅₀ 값이 각각 3, 30, 6, 및 0.8 ng/ml인 ACHN(A), Caki 2(B), PC3(C) 및 DU145(D) 세포의 EphA2-BiTE 매개된 종양 세포 사멸을 나타냈다. CD19에 대한 특이적 음성 대조군 BiTE는 표적 세포를 용해하기 위하여 T-세포를 방향전환시키지 않았다.

도 21A-21B. 표적 세포의 EphA2 수준에서의 EphA2-BiTE 사멸 효과. (A) 세 포독성 어세이는 EC50 값이 6 ng/ml인 SW480 세포의 EphA2-BiTE 매개 종양 세포 사멸을 나타냈다. CD19에 대하여 특이적인 음성 대조군 BiTE는 표적 세포를 용해하기 위하여 T-세포를 방향전환시키지 않았다. (B) 시험관 내 세포독성 어세이의 완료 후에, 남아있는 살아있는 SW480 표적 세포는 EphA2 또는 EphA2-BiTE의 존재에 대하여 측정되었다. 이소타입 대조군, EphA2 발현(B233 염색), 또는 EphA2-BiTE(BiTE)로 염색된 살아있는 SW480 세포의 기하학적 평균 형광 강도는 투입 BiTE 용량에 대하여 그래프가를 작성하였다. EphA2-BiTE는 T-세포를 방향전환시켜 높은 EphA2 발현 수준을 갖는 표적 세포를 우선 사멸시켰다. 흥미롭게도, EphA2-BiTE가 상기 세포에 결합되었더라도 모든 표적 세포가 용해되어 사멸된 것은 아니었다. 따라서, EphA2+ 세포의 서브세트가 저항성을 가질 수 있을지라도 EphA2-BiTE는 대부분의 EphA2+ 표적 세포의 T-세포 사멸을 매개하였다.

도 22A-22D. 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL) 시험관 내 세포독성의 특성화. (A) 방향전환된 용해의 동역학. CD3+ T-세포는 SW480 세포와 함께, 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL)의 일련의 희석액의 존재하에, 4(사각형), 18(삼각형), 24(역삼각형), 또는 42(다이아몬드) 시간 동안 37℃에서 배양되었다. 에러 바는 SD를 표시한다. EC50 값은 상기 곡선으로부터 예측되었고, 기록된다. (B) 방향전환된 용해에서의 표적에 대한 효과기 비율의 효과. CD3+ T-세포는 20:1(흑색 사각형), 10:1(흑색 삼각형), 5:1(개방된 역삼각형), 1:1(개방된 다이아몬드), 1:2(회색 원), 또는 1:5(회색 사각형)의 비로 SW480 세포와 함께, 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL)의 일련의 희석액의 존재하에, 37℃에서 42 시간 동안 배양되었다. 에러 바는 SD를 표시한다. EC50 값은 곡선으로부터 예측되었고, 기록된다. (C) 방향전환된 용해의 잠재성에서의 이용가능한 EphA2 수용체 결합 사이트의 효과. 각 종양 주(tumor line) (HeyA8, SW480, A549 인간 암종 주 및 M14 및 A375 흑색종 주)에 대한 세포 당 EphA2 분자의 예측되는 수를 4개의 별도의 실험으로부터 용해된 표적 세포의 백분율의 각 EC50 값에 대하여 그래프를 그렸다. 선형 회귀 곡선의 P 값 및 r2은 그래프에 기재된다. (D) 방향전환된 용해에 대한 EphA2 표면 밀도의 효과. CD3+ T-세포는 세포주 HeyA8(흑색 사각형; 세포 당 107,000 EphA2 수용체), M14(회색 원; 세포 당 2,400 EphA2 수용체), 및 SKMEL-28(개방된 사각형; EphA2 수용체는 검출의 한계 미만이었다)과 함께, 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH./VL)의 일련의 희석액의 존재하에, 37℃에서 18 시간동안 배양되었다. 에러 바는 SD를 표시한다. EC50 값은 곡선으로부터 예측되었고, 기록된다.

도 23. 인간 플라즈마에서의 EphA2-BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 안정성. EphA2-특이적 BiTE의 플라즈마 안정성은 상이한 배양 조건 하에서 테스트되었고, 이어서 표준 51-크롬 방출 어세이에서의 세포독성 활성의 ED50 측정이 이루어졌다.

도 24A-E. 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)에 의하여 형질전환되지 않은 세포에서의 표적 에피토프 배제. BiTE 탈면역화된 항-CD3 x EA2(VH/VL) 및 비-에피토프 베제 대조군 BiTE의 존재하에, 형질전환되지 않은 MCF10A 세포에 대한 CD8+ T-세포의 공격을 가시화하기 위하여, 비디오 현미경이 이용되었다. (A) CD8⁺ T-세포(E:T 비 1:1) 및 100 ng/ml 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)와 함께 공동-배양된(co-incubated) 형질전환되지 않은 MCF10A. (B) BiTE 없이 CD8⁺ T-세포(E:T 비 1:1)와 함께 공동-배양된 형질전환되지 않은 MCF10A. (C) CD8⁺ T-세포(E:T 비 1:1) 및 범-암종(pan-carcinoma) 비 에피토프 배제 대조군 BiTE 100 ng/ml와 함께 공동-배양된 형질전환되지 않은 MCF10A. (D) CD8⁺ T-세포(E:T 비 1:1) 및 100 ng/ml 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)와 함께 공동-배양된 폐 암종 세포주 A549. (E) (D)와 동일한 셋업(setup). 용해된 세포(밝은 회색)를 가시화하기 위한 프로피듐 요오드(propidium iodide)의 존재하에의 형광 현미경 및 광투과 현미경 사진의 오버레이.

도 25. 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의한 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 표적 친화도의 측정. BiTE/EphA2 복합체의 형성 및 해리는 Biacore 3000 시스템을 이용하는 표면 플라즈몬 공명에 의하여 모니터되었다. K_D는 45 nM로 예측된다.

도 26. SW480 모델에서의 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 생체 내 항-tum에 대한 음성 대조군 테스트 그룹. 5x10⁶ SW480 세포 단독("SW480 만" 및 "탈면역화된 항-CD3xEA2") 또는 인간 2.5 x 10⁶ CD3+ T-세포("PBS", "비관련 BiTE" 및 "추가적 T-세포 정맥 내, PBS (add. T-cell i.v., PBS)"와 함께 혼합되어 암컷 NOD/SCID 마우스의 피하에 주사되었다. 마우스의 한 그룹은 2.5 x 10⁶ CD3+ T-세포를 정맥으로 주입받았다("add. T-세포 i.v., PBS"). 마우스는 BiTE("탈면역화된 항-CD3xEA2만"), PBS("PBS", "추가적 T-세포 정맥 내") 또는 비관련 BiTE로 연속 5일간 매일 치료되었다. 6 마우스/군의 평균 종양 부피를 나타내었다.

도 27. 연속 5일 동안의 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL) 일일 치료가 CD3+ 효과기 T-세포의 존재하에 SW480 종양 중식물(outgrowing)의 용량-의존적 억제를 유도하였다. 스튜던트 T 테스트(Student's T test)에 의하여 **높은 유의성(p≤0.01); *유의성(p≤0.05)

도 28. 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 항-종양 효과에 대한 말초 T-세포의 효과 없음. 6개의 마우스/군의 평균 종양 부피가 도시된다. **높은 유의성(p≤0.01).

도 29. 항-EphA2 항체 233의 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열. VL 도메인의 아미노산 서열(서열 식별 번호: 33)은 (A)에 나타나 있다. VH 도메인의 아미노산 서열(서열 식별 번호: 37)은 (B)에 나타나 있다. CDR의 서열은 박스로 표시하였다. 233 항체는 이미, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 공개 번호 US 2004-0028685 A1에 기재되어 있다.

도 30. 항-EphA2 항체 3F2의 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열. VL 도메인의 아미노산 서열(서열 식별 번호: 41)은 (A)에 나타나 있다. VH 도메인의 아미노산 서열(서열 식별 번호: 45)은 (B)에 나타나 있다. CDR의 서열은 박스로 표시하 였다. 3F2 항체는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 2005년 8월 15일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 11/203,251에 기재되어 있다.

도 31. MD102 발현 벡터에서의 4H5 scFv 삽입 사이트의 선형 맵.

도 32A-32B. 4H5 VH-VL scFV 인간화된 클론의 서열. 뉴클레오티드 서열(서열 식별 변호: 67)는 (A)에 나타나 있다. 아미노산 서열(서열 식별 번호: 68)은 (B)에 나타나 있다. CDR는 박스로 표시하였다. 4H5 항체는 이미, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 출원 일련 번호 2005-0048617 A1에 기재되어 있다.

도 33A-33B. VH VL 2A4의 scFv의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. 뉴클레오티드 서열(서열 식별 번호: 75)은 (A)에 나타나 있다. 아미노산 서열(서열 식별 번호: 76)은 (B)에 나타나 있다. CDR는 박스로 표시하였다.

도 34A-34B. VH VL 2E7 scFv의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. (A)는 뉴클레오티드 서열(서열 식별 번호: 83)을 나타내고; (B)는 아미노산 서열(서열 식별 번호: 84)을 나타낸다.

도 35A-35B. VH VL 12E2 scFv의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. (A)는 뉴클레오티드 서열(서열 식별 번호: 91)을 나타내고; (B)는 아미노산 서열(서열 식별 번호: 92)을 나타낸다.

도 36. 고정화된 인간 EphA2 상의 조합(combinatorial) 친화도 최적화된 변이체(variant)의 scFv 상청액의 ELISA 적정.

도 37. 인간화된 4H5 scFv를 갖는 친화도 최적화된 변이체 2A2, 2E7 및 12E2의 아미노산 서열 정렬.

도 38. 이 도면은 Fab 2G6의 친화도 최적화에 사용된 조합 프라이머(L1, L2, L3, L4, L6, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, 및 H13)의 서열(서열 식별 번호: 각각 99-111)을 나타낸다.

도 39. 뮤린 B233, 인간화된 2G6 및 친화도 최적화된 3F2 mAbs의 가변 영역의 아미노산 서열 정렬이 제공된다.

도 40. 항-인간 EphA2 항체는 사이노몰거스 EphA2에 결합한다. 정제된 뮤린(EA2) 및 인간화된(3F2 및 4H5) 항-인간 항체가 SW480 결장 암종 세포 상의 인간 EphA2 및 트랜스펙션된 CHO 세포에서 발현된 사이노몰거스 EphA2에 결합하였다. 결합된 항체는 항-마우스 또는 인간 IgG(H+L) Alexafluor 488 항체를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의하여 검출되었다. 항체는 비결합 음성 대조군 항체(R347)와 비교되었다. EA2, 3F2, 및 4H5는 인간 및 사이노몰거스 EphA2에 결합하였다.

도 41. EphA2 항체의 서브세트에 의한 선택적인 종양 세포 인식.형질전환되지 않은(MCF-10A) 및 악성의(MDA-MB-231) 유방 상피 세포의 단일층이 고정되고, 표시된 항체(G5, EA5, EA2, 3F2, 또는 4H5)로 표지되었고, 이어서 면역형광 현미경을 사용하여 가시화되었다. MCF-10A 세포의 세포-세포 접촉의 사이트로부터 배제되거나(yes) 배제되지 않은(no) 항체가 표시된다. 따라서, EA5 및 EA2 에피토프는 형질전환되지 않은 상피 세포를 대표하지만,악성 형질전환 후 접근이 쉬워지는 정상 아키텍처(architecture)에 의하여 선택적으로 배제된다.

도 42. G5의 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열. VL 도메인의 아미노산 서 열(서열 식별 번호: 49)은 (A)에 나타나 있다. VH 도메인의 아미노산 서열(서열 식별 번호: 53)은 (B)에 나타나 있다. G5 항체는 이미, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 2005년 6월 24일에 출원된 미국 출원 일련 번호 11/165,023에 기재되어 있다.

도 43. 인간화된 3F2 단일클론성 항체의 2개의 상이한 생산 런(run)으로부터 제조된 4개의 EphA2-특이적 BiTE의 세포독성 잠재능 비교. 시험관 내 세포독성 어세이는 EphA2+ MDA-MB-231 세포의 방향전환된 T-세포 용해를 매개하기 위한 4개의 상이한 3F2-기반 항-EphA2 BiTE 구조체의 능력을 비교하였다. 표는 2개의 별도의 생산 런으로부터 정제된 각각의 구조체에 대한 잠재(즉, EC50) 값을 기록한다. BiTE 구조체 탈면역화된 항-CD3x3F2(VH/VL)는 일관적으로 가장 큰 잠재능을 나타내었다.

도 44. 4개의 3F2-기반 EphA2-특이적 BiTE의 독립적인 세포독성 잠재능 비교. 시험관 내 세포독성 분석은 EphA2+ SW480 세포의 방향전환된 T-세포 용해를 매개하기 위한 4개의 상이한 3F2-기반 항-EphA2 BiTE 구조체의 능력을 비교하였다. BiTE 구조체 탈면역화된 항-CD3x3F2(VL/VH)가 가장 큰 잠재능을 나타내었다.

도 45. EphA2+ 및 CD3+ 발현 세포에 대한 4H5-기반 항-EphA2 BiTE의 표적 세포 결합의 특이성. 다양한 4H5-기반 BiTE 구조체의 표적 결합 특이성은 전술한 플로우 사이토메트리-기반 어세이를 이용하여 평가되었다. EphA2+ MDA MB 231 유방암 세포 및 CD3+ HP Ball 인간 T-세포가 표적 세포로서 사용되었다. 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL) BiTE는 양성 대조군으로서 사용되었다. 도면에 나타난 바와 같이, 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체 각각은 EphA2 및 CD3를 모두 발현하는 세포에 결합하였다.

도 46. 인간화된 친화도 성숙된 4H5-기반 BiTE 구조체 12E2, 2E7 및 2A4의 표적 세포 결합의 특이성. 다양한 4H5-기반 BiTE 구조체의 표적 결합 특이성은 전술한 플로우 사이토메트리-기반 어세이를 이용하여 평가되었다. EphA2+ MDA MB 231 유방암 세포 및 CD3+ HP Ball 인간 T-세포가 표적 세포로서 사용되었다. 도면에 나타난 바와 같이, 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체 각각은 EphA2 및 CD3를 모두 발현하는 세포에 결합하였다.

도 47. 정제된 모노머의 표적 세포 결합의 특이성. 도면에 나타난 바와 같이, 친화도 성숙한 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체의 정제된 모노머는 전술한 바와 같은 플로우 사이토메트리-기반 어세이를 이용하여 5㎍/ml의 농도에서 EphA2+ MDA MB 231 유방암 세포 및 CD3+ HP Ball 인간 T-세포 표적 세포에 결합하였다.

도 48. 인간화된 4H5 단일클론성 항체의 4개의 EphA2-특이적 BiTE의 세포독성 잠재능 비교. 크롬-51 방출에 기초한 세포독성 어세이는 자극된 인간 CD8+ T-세포의 존재하에 다양한 항-EphA2 BiTE 구조체에 의해 방향전환된 표적 세포 용해를 측정하기 위하여 수행되었다. EphA2-양성 종양 세포주 MDA-MB-231은 크롬-51과 함께 로딩되어 표적 세포 역할을 하였다. 다양한 항-EphA2 BiTE 구조체는 넓은 범위의 농도에 걸쳐 적정되었다. 어세이 기간은 18 시간이었고 효과기-대-표적 비는 10:1이었다. 상이한 생성 배치를 갖는 최대의 반(half-maximal) 용해를 위하여 필요한 EphA2-BiTE 농도(즉, EC50)는 4개의 파라미터 비-직선 피트(fit) 모델을 사 용하여 예측되었다.

도 49. 이 도면은 다양한 3F2 (A) 및 (B) 4H5-기반 EphA2 구조체의 MDA-MB-231 세포의 표적 세포 용해의 잠재능의 직접적인 비교를 나타내며, 이는 크롬-51 기반 세포독성 어세이에 의하여 측정되었다.

도 50. 친화도 성숙된 4H5-기반 EphA2-BiTE 12E4, 2E7 및 2A4에 의하여 유도된 세포독성 활성. 이 도면은 다양한 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체(12E4, 2E7 및 2A4)의 표적 세포 용해의 잠재능을 나타낸다. EphA2-양성 종양 세포주 A549으로부터의 세포는 크롬-51과 함께 로딩되어 표적 세포 역할을 하였다. 자극된 인간 CD8+ T-세포는 효과기 세포 역할을 하였다. 다양한 항-EphA2 BiTE 구조체는 넓은 범위의 농도에 걸쳐 적정되었다. 어세이 기간은 18 시간이었고 효과기-대-표적 비는 10:1이었다. 최대의 반(half-maximal) 용해를 위하여 필요한 EphA2-BiTE 농도(즉, EC50)는 4개의 파라미터 비-직선 피트 모델을 사용하여 예측되었다.

도 51. 친화도 성숙된 4H5-기반 EphA2-BiTE 12E4, 2E7 및 2A4에 의하여 유도된 세포독성 활성. 이 도면은 다양한 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체(12E4, 2E7 및 2A4)의 표적 세포 용해의 잠재능을 나타낸다. EphA2-양성 종양 세포주 A549 및 SW480으로부터의 세포가 크롬-51과 함께 로딩되어 표적 세포 역할을 하였다. 자극된 인간 CD8+ T-세포는 효과기 세포 역할을 하였다. 다양한 항-EphA2 BiTE 구조체는 넓은 범위의 농도에 결쳐 적정되었다. 어세이 기간은 18 시간이었고 효과기-대-표적 비는 10:1이었다. 상이한 생성 배치(batch)를 갖는 최대의 반(half-maximal) 용해를 위하여 필요한 EphA2-BiTE 농도(즉, EC50)는 4개의 파라미터 비- 직선 피트 모델을 사용하여 예측되었다.

도 52. EphA2 인산화에 의하여 측정된 4H5-기반 EphA2-BiTE에 의한 EphA2의 비활성화. 이 도면은 2A4 또는 2E7 BiTE 구조체 어느 것도 EphA2-발현 세포 내에서의 EphA2 인산화를 유도하지 않았다는 것을 나타낸다.

도 53. 친화도 성숙된 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체의 생체 내 효능. 2A4- 및 2E7-BiTE 구조체의 생체 내 잠재능은 인간 결장 암종 이종이식편(xenograft) 모델을 가지고 면역결핍 NOD/SCID 마우스에서 평가되었다. SW480 세포는 EphA2를 발현하기 때문에, 인간 콜론 암종 세포주 SW480이 인간 이종이식편 모델의 확립(establishment)를 위하여 선택되었다. 본 연구의 결과는 본 명세서에 나타내었다.

발명의 상세한 설명

아래에서 상술하는 바와 같이, 본 발명은 T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인과 EphA2 수용체에 면역특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체들에 관한 것이다. 이러한 이중특이적 단일 사슬 항체들은 "EphA2-BiTE"라는 용어로 포함된다. 본 발명은 또한, 비정상적 발현 및/또는 활성의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 장애는 암, 비-암(비암) 과다증식성 세포장애 및 감염을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한 본 발명의 EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 이에 의해 형질전환된 숙주 세포 및 상기 EphA2-BiTE의 제조에의 용도를 포함한다. 본 발명은 또한 상술한 EphA2-BiTE, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 어느 하나를 단독으로, 또는 하나 이상의 예방적 또는 치료적 약제와 조합하여 포함하는, 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 여기에는 상기한 EphA2-BiTE을 스크린하는 방법 및 상기한 조성물 및 진단 시약 중 어느 하나를 포함하는 키트를 개시한다.

5.1 EphA2 - BiTE

본 발명은 EphA2 및 T-세포 항원 CD3 에 면역특이적으로 결합하는 이중특이적 T-세포 맞물림자(engagers) (즉, 특히, 이중특이적 단일 사슬 항체인 EphA2-BiTE)와, 이를 이용하여, EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 이러한 장애는, 예를 들어, 암, 비암(non-cancer) 과다증식성 세포 장애, 및 감염을 포함한다. 일측면에서, EphA2-BiTE은, EphA2을 비정상적으로 발현시키는 세포를 제거함에 있어서, 이 기술분야에서 알려진 EphA2-특이적 항체보다 효율적이다. 다른 측면에서, EphA2-BiTE은, EphA2-발현 암세포(특히, EphA2-발현 악성 암세포)을 제거함에 있어서, 이 기술분야에서 알려진 EphA2 항체들보다 효율적이다. 다른 측면에서, EphA2-BiTE은, EphA2-발현 비암 과증식 세포를 제거함에 있어서, 이 기술분야에서 알려진 EphA2 항체들보다 효율적이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은, EphA2-발현 감염 세포(특히, 호흡기 신시티아 바이러스(Respiratory Syncytial Virus; "RSV")에 감염된 세포)를 제거함에 있어서, 이 기술분야에서 알려진 EphA2 항체들보다 효율적이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은, EphA2의 비정상적 발현 및/ 또는 활성과 관련된 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 단위 투여량(dosages)에 있어서, 이 기술분야에서 알려진 EphA2-특이적 항체에 비하여, 보다 낮은 양이 요구된다.

본 발명의 EphA2-특이적 BiTEs은 T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인과,EphA2에 면역특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다(이하, "EphA2-BiTE" 또는 "EphA2-BiTE 분자"라 함). 일 구체예에서, 제1 결합 도메인은 CD3에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 제1 결합 도메인은, CD3의 하나 이상의 서브유닛에 면역특이적으로 결합한다(예를 들어, 감마, 델타, 제타 또는 에타 서브유닛). 바람직한 실시예에서, 상기 제1 결합 도메인은, CD3의 엡실론(ε) 서브유닛에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 제1 결합 도메인은, CD3의 엡실론(ε)서브유닛에 면역특이적으로 결합하고, 이 때, 상기 엡실론(ε)서브유닛이 CD3의 델타 서브유닛과 복합체를 형성한다. 다른 구체예에서, CD3과 결합하는 결합 도메인은 탈면역화된다. 다른 특정 구체예에서, 제2 결합 도메인은 EphA2의 세포외(extracellular) 도메인에 면역특이적으로 결합한다. 바람직한 실시예에서, EphA2-BiTE은 암의 치료, 예방 및/또는 관리에 사용되는 것으로서, 그의 제2 결합 도메인은, 암 세포에서는 선택적으로 노출 및/또는 증가하나, 비암 세포에서는 그렇지 아니한 EphA2상의 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 제2 결합 도메인은 비암 과다증식 세포 상에서는 선택적으로 노출 및/또는 증가되나, 정상세포에서 그렇지 아니한 EphA2 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시예 에서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 제2 결합 도메인은 감염 세포 상에서는 선택적으로 노출 및/또는 증가되나, 정상세포에서 그렇지 아니한 EphA2 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.

본 발명은 EphA2-BiTE을 제공하고, 이 때, EphA2-BiTE의 제1 결합 도메인은 T-세포 항원 CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체의, 가변 중(heavy) (VH) 도메인 및 가변 경(light)(VL) 도메인을 포함하고, 제2 결합 도메인은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 결합 도메인의 VH 도메인 및 VL 도메인은, T-세포 항원 CD3으로의 결합을 허용하는 방식으로 이들 도메인들을 접는 것이 가능하도록, 충분한 길이의 링커에 의해 서로 링크된다. 이 구체예에 더하여, 이러한 링커는 예를 들어, 서열 GEGTSTGS(G₂S)₂GGAD (서열 식별 번호:57)을 포함할 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VH 도메인 및 VL 도메인은, EphA2으로의 결합을 허용하는 방식으로 이들 도메인들을 접는 것이 가능하도록, 충분한 길이의 링커에 의해 서로 링크된다. 이 구체예에서 또한, 이러한 링커는 예를 들어, 서열 (G₄S)₃ (서열 식별 번호: 59)을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 T-세포 항원 CD3 및 EphA2으로의 결합을 허용하는 방식으로 이들 도메인들을 접는 것이 가능하도록, 충분한 길이의 링커에 의해 서로 링크된다. 이 구체예에서 또한, 이러한 링커는, 예를 들면, 서열 G4S(서열 식별 번호: 58)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 (서열 식별 번호: 65)의 아미노산 서열을 가진다. 특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 단일 도메인 항체를 포함한다.

상술한 상기 구체에에서, 그 링크수단(linkage)은 공유결합이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 링커들은 세린 및 글리신 잔기를 포함한다. EphA2-BiTE의 링커들, 예를 들어, CD3에 결합하는 제1 결합 도메인의 VH 및 VL 도메인 사이의 링커, EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인의 VH 및 VL 도메인 사이의 링커, 및 CD3에 결합하는 제1 결합 도메인 및 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인 사이의 링커는 각각, CD3 및 EphA2 항원으로의 결합을 허용하는 방식으로, 이들 도메인들을 접는 것이 가능하도록 하는 충분한 길이일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 링커들은 적어도 5 잔기(residues), 적어도 10 잔기, 적어도 15 잔기, 적어도 20 잔기, 적어도 25 잔기, 적어도 30 잔기 또는 그 이상의 길이를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 링커들은 2 내지 4 잔기, 2 내지 6 잔기, 2 내지 8 잔기, 2 내지 10 잔기, 2 내지 12 잔기, 2 내지 14 잔기, 2 내지 16 잔기, 2 내지 18 잔기, 2 내지 20 잔기, 2 내지 22 잔기, 2 내지 24 잔기, 2 내지 26 잔기, 2 내지 28 잔기, 또는 2 내지 30 잔기의 길이를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인에 대하여 5'이다. 다른 구체예에서, 제2 결합 도메인은 제1 결합 도메인에 대하여 5'이다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 단일 사슬 항체이다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 단일 사슬 Fvs (scFvs)을 포함한다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은, (a) 각각, CD3의 ε사슬에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터인, 제1 중쇄 가변 도메인 및 제1 경쇄 가변 도메인과, (b) 세포 표면 상에 노출된 EphA2의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터의, 제2 중쇄 가변 도메인과 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 이중특이적 단일 사슬 항체를 제공하고, 이 때, 상기 제1 중쇄 가변 도메인과 상기 제1 경쇄 가변 도메인은, 이들 도메인들이 접혀서, CD3의 ε서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인을 형성하기에 충분한 길이의 제1 링커(예를 들어,GEGTSTGS(G₂S)₂GGAD (서열 식별 번호:57))에 의해 서로 공유결합적으로 링크되고; 상기 제2 중쇄 가변 도메인과 상기 제2 경쇄 가변 도메인은, 이들 도메인들이 접혀서, EphA2의 상기 에피토프에 결합하는 제2 결합도메인을 형성하기에 충분한 길이의 제2 링커(예를 들어,(G₄S)_S (서열 식별 번호:59))에 의해 서로 공유결합적으로 링크되고; 이 때, 상기 제1 결합 도메인과 상기 제2 결합 도메인은, 이들 도메인들이 서로 독립적으로 접히도록 하는 길이의 제3 링커(예를 들어,G4S (서열 식별 번호:58))에 의해 공유결합적으로 서로 링크된다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 5'에서 3' 방향으로 하기 배열들 중 어느 것을 포함한다 : (1) VH_CD3-VL_CD3-VH_EPhA2-VL-_EPhA2; (2) VL_CD3-VH_CD3-VH_EPhA2-VL_EPhA2; (3) VL_CD3-VH_CD3-VL_EPhA2-VH-_EphA2; (4) VH_CD3-VL_CD3-VL_EPhA2-VH_EPhA2 (5) VH_EPhA2-VL_EPhA2-VH_CD3-VL_CD3; (6) VL_EPhA2-VH_EPhA2-VH_CD3-VL_CD3; (7) VL_EPhA2-VH_EPhA2-VL_CD3-VH_CD3; 또는 (8) VH_EPhA2-VL_EPhA2-VL_CD3-VH_CD3. 예를 들어, 본 발명의 EphA2-BiTE 구조체의 일반적 모식도인 도 14a를 참조한다.

알려진 바와 같이, 완전한 항원 인식 도메인 및 결합 도메인을 포함하는 항체 절편은, 특정 경우에, 비-공유결합적인, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)간의 다이머로 구성될 수 있다. 천연 항체들에서 발견되는 것에 대응하는 이러한 구조에서, 각 가변 도메인의 3개의 상보성 결정 영역들(CDRs)은 상호작용하여, VH-VL 다이머의 표면 상에, 항원 결합 사이트를 한정한다. 집합적으로, 6개의 CDRs은, 항체에 대하여 항원 결합 특이도를 부여한다. CDRs을 천연 면역글로블린을 플랭킹(flanking)하는 프레임워크(FRs)는 인간 및 마우스와 같이 다양한 종 내의 천연 면역글로블린에서 본질적으로 보존되는 3차 구조를 갖는다. 이들 FRs은 CDRs이 이들의 적합한 방향성(orientation)을 유지하도록 한다. 이 불변 도메인은 결합 기능을 위해서 필요한 것은 아니나, VH-VL 상호작용을 안정화시키는 것을 도울 수 있다. 하나의 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 오직 3개의 CDRs을 포함하는 Fv의 절반)조차도 높은 구조 안정성을 가지고 항원을 인식하고, 결합하는 능력을 가진다.(참조: 예를 들어, Dumoulin 등, 2002, Protein Science 11:500-515). 따라서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 결합 도메인의 상기 도메인은 동일 또는 상이한 면역글로블린 중 한 쌍의 VH-VL 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 사슬 내의 VH 및 VL 도메인의 순서는 본 발명에 대하여 중요하지 않다; 본 발명은 가변 도메인의 모든 가능한 배열을 포함한다. 그러나, 항원 결합 도메인이 항원을 인식하고 결합하도록, VH 및 VL 도메인이 적절히 접힐 수 있도록 배열되는 것은 중요하다. 특정 구체예에서, EphA2-결합 도메인의 도메인들은 동일 또는 상이한 면역글로블린으로부터 얻어질 수 있다.

따라서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 각 항체의 가변 중(heavy) 도메인과 가변 경(light) 도메인{예를 들어, CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체의 VH 및 VL 도메인 및 관심대상인 다른 항원(예를 들어,EphA2)에 면역특이적으로 결합하는 VH 및 VL 도메인}의 모든 배열(arrangement)을 포함하고, 각 도메인은 BiTE 분자의 N-말단 또는 C-말단 부분에 위치할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 EphA2-BiTE은 다음 표에 보인 바와 같이, 다음과 같은 배열을 포함할 수 있다:

상술한 상기 결합 도메인들은 바람직하게는 가요성 링커, 바람직하게는, 상기 도메인들 사이에 배치된 폴리펩티드 링커에 의해 접속되고, 여기서, 상기 폴리펩티드 링커는, 본 발명의 폴리펩티드가 수용액에 놓여지고, 결합되기 적합한 배위(conformation)를 보일 때, 상기한 결합 도메인들을 포함하는 상기 도메인들 중 하나의 C-말단과, 상기 결합 도메인들을 포함하는 상기 다른 도메인들의 N-말단 사이의 거리를 넓히기에 충분한 길이의, 복수의, 친수성, 펩티드-결합 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드 링커는 복수개의 글리신, 알라닌 및/또 는 세린 잔기을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 폴리펩티드 링커는 복수개의 아미노산 서열의 연속적 카피를 포함한다. 일반적으로, 폴리펩티드 링커는 1 내지 15 아미노산을 포함하나, 15 아미노산 이상의 폴리펩티드 링커도 잘 작동한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 링커들은 적어도 5 잔기, 적어도 10 잔기, 적어도 15 잔기, 적어도 20 잔기, 적어도 25 잔기, 적어도 30 잔기 또는 그 이상의 길이를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 링커들은 2 내지 4 잔기, 2 내지 4 잔기, 2 내지 6 잔기, 2 내지 8 잔기, 2 내지 10 잔기, 2 내지 12 잔기, 2 내지 14 잔기, 2 내지 16 잔기, 2 내지 18 잔기, 2 내지 20 잔기, 2 내지 22 잔기, 2 내지 24 잔기, 2 내지 26 잔기, 2 내지 28 잔기, 또는 2 내지 30 잔기의 길이를 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 링커들의 예는, 도 3 (서열 식별 번호S.:57-59)에 보여진다.

본 발명의 일 구체예에서, EphA2에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드는 BiTE 분자의 일부를 포함할 것이다. 예를 들어, EphA2에 면역특이적으로 결합하는 항체의 VH 및/또는 VL (바람직하게는 scFV)는, 상술한 분자의 그것과 같은 항-CD3 결합 부위로 융합될 수 있고, 이로써, EphA2을 타겟팅하는 이중특이적 단일 사슬 항체를 만들어낼 수 있다. 항체 EphA2의 VH 및/또는 VL 도메인에 추가하여, EphA2에 결합하는 다른 분자는 EphA2-BiTE, 예를 들어 수용체 또는 리간드 (예를 들어, Ephrin)을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 면역특이적으로 CD3와 결합하는 제1 결합 도메인과, 면역특이적으로 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하 는, 이중특이적 단일 사슬 항체이다. 특정 구체예에서, 제1 결합 도메인은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체의 탈면역화된 버전의 VH 및 VL을 포함한다. 또한, 이 구체예에 따르면, 제2 결합 도메인은 EA2의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 EphA2-BiTE의 가변 영역의 배열은 다음과 같다: CD3 결합 도메인내의 VH-VL 및 EphA2 결합 도메인 내의 VH-VL. 또한, 이 구체예에 따르면, 특정 구체예에서, 제2 결합 도메인은 다음의, EA2, EA3, EA4, EA5, 3F2, 4H5, 2A4, 2E7, 12E2, Eph099B-102.147, Eph099B-208.261, EphO99B-210.248, EphO99B-233.152, Eph1Ol.530.241, 233 또는 G5의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다.

본 발명의 EphA2-BiTE (특히, 이중특이적 단일 사슬 항체들인 EphA2-BiTE)이 유도되는 항체들을 생산하는 방법은 이 기술분야에서 잘 알려져 있고, 다음과 같은 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 미국 출원공개공보 제2004-0091486 Al호 (2004년 5월 13일), 미국 출원공개공보 제2004-0028685 Al호 (2004년 2월 12일) 및 WO 제99/5440호 (그리고, 여기에 개시된 참고자료들)이고, 이들 각각은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다. 친화도-최적화된 EphA2 작용제적 항체 변이체 2A4, 2E7 및 12E2에 관련된 정보는 또한 다음을 참고한다. U.S. Provisional Appn. No.60/751,964, filed December 21, 2005, "Affinity Optimized EphA2 Agonistic Antibodies 및 methods of Use Thereof." 이 자료는 인용에 의해 전체가 이 명세서에 삽입된다.

5.1.1 EnhA2 항체들

상술한 바와 같이, 본 발명은 EphA2 및 CD3 항원 각각에 특이적인 적어도 두개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 T-세포 맞물림자(engagers) (즉, EphA2-BiTE, 특히, 이중 특이적 단일 사슬 항체인 EphA2 -BiTEs)를 포함한다. 본 발명의 EphA2-BiTE은 T-세포 항원 CD3에 결합하는 제1 결합 도메인과, EphA2 폴리펩티드 또는 그 절편에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

특정 구체예에서, EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인 은 단일 사슬 Fv (scFv)이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 절편을 말하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬로 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위한 희망하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFvs의 생성 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. scFvs의 생성 방법을 검토하기 위하여는 다음을 참조한다. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). 일 구체예에서, EphA2에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE의 결합 도메인은, 여기에 개시된 EphA2 항체들을 포함하는, 임의의 항체로부터 생성된 scFV로부터 유도된다.

특정 구체예들에서, EphA2-BiTE의 생성에 사용되는 EphA2 항체들은 면역글로블린 분자와 면역글로블린 분자의 면역적으로 활성인 부위를 포함하고, 상기 면역글로블린 분자는, EphA2 항원, 예를 들어, 항-EphA2 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDRs)에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 분자이다. EphA2-BiTE의 EphA2 결합 도메인이 유도되는 EphA2 항체들은 면역글로블린의, 임의의 타입(예를 들어,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(class)(예를 들어,IgG_b IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgAi 및 IgA₂) 또는 서브클래스(subclass)일 수 있다.

다른 특정 구체예에서, EphA2-BiTE의 생성에 사용되는 EphA2 항체들은 본 발명에서, 다음을 포괄한다. EA2 (도 1), EA3, EA4, EA5 (도 2), 3F2 (도 30), 4H5 (도 32), 2A4 (도 33), 2E7 (도 34), 12E2 (도 35), Eph099B-102.147, Eph099B-208.261, EphO99B-210.248, Eph099B-233.152, Ephl01.530.241,233 (도 29) 및 G5 (도 42). 다음을 참조한다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제 2004-0091486 Al호 (2004년 5월 13일), 제2004-0028685 Al호 (2004년 2월 12일), 제2005-0059592 Al호(2005년 5월 17일), 제2005-0048617 Al호, 미국 가출원 일련 번호 제11/165,023호(2005년 6월 24일 제출) 및 제11/203,251호(2005호 8월 15일 제출). 이들 각각은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 삽입된다. 본 발명의 항체들 EA2 (스트레인 EA2.31) 및 EA5 (스트레인 EA5.12)을 생산하는 하이브리도마는 2002.5.22에 American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108)에 기탁되었고, 각각 PTA-4380 및 PTA-4381의 수납 번호가 부여되었다. 이들은 각각 인용에 의해 본원에 전체로서 온전히 삽입된다. Eph099B-102.147, Eph099B-208.261, 및 EphO99B-210.248은 2002년 8월 7일에 ATCC에 기탁되었고, 수납 번호는 각각 PTA-4572, PTA-4573, 및 PTA-4574이다. Eph099B-233.152은 ATCC에 2003년 5월 12일자로 기탁되어, 수납 번호 PTA-5194를 부여받았고, Eph101.530.241은 ATCC에 2002년 9월 26일에 기탁되어 수납 번호 PTA-4724를 부여받았다. 상술한 기 탁은 모두 특허출원 절차를 위해, 미생물 기탁의 국제적 인정에 대한 부다페스트 조약 규정을 따른 것이고, 각 항헤들에 대응되는 수납 번호 및 일자는 인용에 의해 본원에 전체로서 온전히 삽입된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법을 이용하여, EphA2-BiTE 을 생성하는데 사용되는 항체들은 상술한 EphA2 항체들의 인간 또는 인간화된 버젼이다. 이러한 인간화된 EphA2 항체들 및 제조방법은 다음과 같은 자료에 개시된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개번호 제2005-0048617 A1호, 및 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60. 이들 각각은 인용에 의해 본원에 전체로서 온전히 삽입된다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE을 생성하는데 사용되는 EphA2 항체는 EA2이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 EphA2-BiTE을 생성하는데 사용되는 항체들은 상술한 상체들의 인간화된 친화도 최적화된 버전이다. 이 구체예에 따르면, 본 발명의 EphA2-BiTE의 EphA2에 면역 특이적으로 결합하는 결합 도메인은 2A4, 2E7 및 12E2로부터 유도된다. 친화도 최적화된 EphA2 작용제적 항체 변이체 2A4, 2E7 및 12E2에 대한 정보는 다음을 참조한다. 미국 가출원 번호 제 60/751,964호(2005년 12월 21일 제출), 표제 "Affinity Optimized EphA2 Agonistic Antidodies 및 Methods of Use Thereo." 이 자료는 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다.

몇몇 EphA2 항체들의 서열은 도 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 또는 39, 또는 상술한 EphA2 항체들의 서열을 개시한 간행물에 개시된다. 본 발명의 EphA2-BiTE이 생성되는 EphA2 항체들을 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제2004-0091486 Al호 (2004년 5월 13일), 제2004-0028685 Al호 (2004년 2월 12일), 제2005-0059592 Al호 (2005년 3월 17일), 제2005-0048617 Al호_, 미국 출원번호 일련번호 제11/165,023호(2005년 6월 24일 제출) 및 제11/203,251호(2005년 8월 15일 제출)에 개시되며, 이들은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다.

본 발명은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도되는 EphA2-BiTE를 제공한다. 이 때, 상기 항체들은 예를 들어, 도 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 또는 39, 또는 상술한 EphA2 항체들을 개시하는 간행물에서 개시된 VH CDRs 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에서 제공하는 것은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE이고, 상기 결합 도메인은 다음, 즉, 일, 이, 삼, 사, 오 또는 그 이상의 VH CDRs로서, 도 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 또는 39, 또는 상술한 EphA2 항체들을 개시하는 간행물들에 리스트된 VH CDRs의 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 포함한다(또는, 또다른 방법으로서, 이들로 구성된다).

본 발명이 제공하는 것은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도된 EphA2-BiTE이고, 이 때, 상기 항체들은 VL CDRs 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR을 포함할 수 있고, 이들은 도 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 또는 39, 또는 상술한 EphA2 항체들을 개시하는 간행물에서 강조된 것이다. 특히, 본 발명에서 제공하는 것은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE이고, 이 때, 상기 결합 도메인은 다음을 포함한다(또는 또 다른 방법으로서, 이들로 구성된다): 일, 이, 삼, 사, 오 또는 그 이상의 VH CDRs의 어느 하나로서, 그 아미노산 서열은 예를 들어, 도 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 또는 39, 또는 상술한 EphA2 항체들을 개시하는 간행물에서 강조된 것이다.

특히, 본 발명에서 제공하는 것은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE이고, 이 때, 상기 결합 도메인은 다음을 포함한다(또는, 또 다른 방법으로서, 이들로 구성된다): VH CDRl 및 VL CDRl ; VH CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl 및 VL CDR3 ; VH CDR2 및 VL CDRl ; VH CDR2 및 VL CDR2; VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR3 및 VH CDRl; VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR3 및 VL CDR3; VHl CDRl, VH CDR2 및 VL CDRl; VH CDRl, VH CDR2 및 VL CDR2; VH CDRl , VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDRl, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDRl , VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDRl , VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDRl ; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR3; VH CDRl₅ VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR2 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR2, VL CDRl, VL CDR2, 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR3, VL CDRl, VL CDR2, 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl, VL CDR2, 및 VL CDR3; 또는 예를 들어, 도 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 또는 39, 또는 상술한 EphA2 항체들의 서열을 개시하는 간행물에 개시된 VH CDRs 및 VL CDRs 의 조합.

다른 구체예에서, 특히, 본 발명에서 제공하는 것은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE이고, 이 때, 상기 결합 도메인은 다음을 포함한다(또는 또 다른 방법으로서, 이들로 구성된다): 상기 언급된 상술한 EphA2 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL도메인으로서, 예를 들어, 도1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35 또는 37, 또는 상기 EphA2 항체들의 서열을 개시하는 간행물에 개시된 것. 특정 구체예에서, VH 및 VL은 2A4, 2E7 및 12E2 항체로부터이다. 다음을 참조한다: 도 33, 34, 35 및 37.

특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공하고, 이 결합 도메인은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도된다, 이 때, 상기 항체들이 가지는 해리 속도 상수(association rate constant) 또는 K_on 율 (항체 (Ab) + 항원 (Ag)-> Ab-Ag)는 적어도 10⁴M^-1s^-11, 적어도 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 1.5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 2 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 10⁶M^-1s^-1, 적어도 5 X10⁶M^-1s^-1, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 1O⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸ M^-1s^-1, 또는 대략 10⁵ 내지 10⁸ M^-1s^-1의 범위 이내, 대략 1.5 X 10⁵ M^-1s^-1내지 1 X 10⁷M^-1s^-1의 범위 이내, 대략 2 X 10⁵내지 1 X 1O⁶M^-1s^-1의 범위 이내, 또는 대략 4.5 X 10⁵ 내지 10⁷M^-1s^-1의 범위 이내이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 항체를 제공하고, 이 때, 상기 결합 도메인은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터 유도되며, 상기 항체는 적어도 10⁴M^-1s^-1, 적어도 2 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵M^-1s^-11, 적어도 5 X 1O⁵M^-1s^-1, 적어도 10⁶M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁶M^-1s^-1, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸M^-1s^-1 와 같은 K_on 을 가지며, 이 수치는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 결정된 것이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공하고, 이 결합 도메인은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도된다, 이 때, 상기 항체들은 다음과 같은 k_off 율 (항체(Ab) + 항원 (Ag)-> Ab-Ag)을 가진다 : 즉, lO^-3s^-1미만, 5 X lO^{- 3}s^-1미만, 10^-4s^-1, 2 X lO^-4s^-1미만, 5 X 10^-4s^-1미만, 10^-5s^-1미만, 5 X 10^-5s^-1미만, 10^-6s^-1미만, 5 X 10^-6s^-1미만, 10^-7s^-1미만, 5 X 10^-7s^-1미만, 10^-8s^-1미만, 5 X 10^-8s^-1미만, 10^-9s^-1미만, 5 X 10^-9s^-1미만, 또는 10^-10s^-1미만, 또는 대략 10^-3 내지 10^-10s^-1의 범위 이내, 대략 10^-4내지 1O^-8s^-1의 범위 이내, 또는 대략 lO^-5 내지 10^-8s^-1의 범위 이내. 특정 구체예에서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체는 k_off가 1O^-2s^-1, 5 X 10^-3s^-1미만 또는 10^-4s^-1미만이고, 이 수치는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 측정된 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공하고, 이 결합 도메인은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도되며, 여기서, 상기 항체들이 갖는 친화도 상수 또는 K_a (k_on/k_off)는 다음과 같다: 적어도 10² M^-1, 적어도 5 X 10² M^-1, 적어도 10³ M^-1, 적어도 5 X 10³ M^-1, 적어도 10⁴ M^-1, 적어도 5 X 10⁴M^-1, 적어도 10⁵M^-1, 적어도 5 X 10⁵M^-1, 적어도 10⁶M^-1, 적어도 5 X 10⁶M^-1, 적어도 10⁷M^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5 X 10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5 X 10⁹ M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5 X 10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5 X 10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1, 적어도 5 X 10¹²M^-1, 적어도 10¹³ M^-1, 적어도 5 X 10¹³ M^"1, 적어도 10¹⁴ M^"1, 적어도 5 X 10¹⁴ M^-1, 적어도 1O¹⁵ M^-1, 또는 적어도 5 X 10¹⁵ M^-1, 또는 대략 10² 내지 5 X 10⁵ M^-1의 범위이내, 대략 10⁴ 내지 1 X 10¹⁰M^-1의 범위 내, 또는 대략 10⁵ 내지 1 X 10⁸M^- ¹범위 내. 이 수치는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 측정된 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공하고, 이 결합 도메인은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도된며, 여기서, 상기 항체들이 갖는 해리 상수 또는 Kd (k_off/k_on) 는 다음과 같다: 10^-5 M 미만, 5 X lO^-5 M 미만, 10^-6 M 미만, 5 X 10^-6 M 미만, 10^-7 M 미만, 5 X 10^-7 M 미만, 10^-8 M 미만, 5 X 10^-8 M 미만, 10^-9 M 미만, 5 X 10^-9 M 미만, 10^-10 M 미만, 5 X 10^-10 M 미만, 10^-11M 미만, 5 X 10^-11M 미만, 10^-12M 미만, 5 X 10^-12 M 미만, 10^-13 M 미만, 5 X 10^-13M 미만, 10^-14M 미만, 5 X 10^-14M 미만, 10^--15M 미만, 또는 5 X 10^-15M 미만, 또는 대략 10^-2M 내지 5 X 10^-5M의 범위이내, 대략 10^-6내지 10^-15M의 범위 이내, 또는 대략 10^-8내지 10^-14M의 범위 이내. 이 수치는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 측정된 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 EphA2-BiTE은 다음과 같은 해리율 상수 또는 K_0N 율(항체(Ab) + 항원 (Ag) -> Ab-Ag)을 가지고, 그 수치는 다음과 같다: 적어도 10⁴ M^-1s^-1, 적어도 10⁵M^-1s^-1, 적어도 1.5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 2 X lO⁵M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 10⁶M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁶M^-1s^-1, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸ M^-1s^-1 또는 대략 다음의 범위 이내 10⁵ 내지 10⁸M^-1s^-1, 대략 1.5 X 10⁵ M^-1s^-1내지 1 X 10⁷M^-1s^-1의 범위 이내, 대략 2 X 10⁵ 내지 1 X 10⁶M^-1s^-1의 범위 이내, 또는 대략 4.5 X 10⁵ 내지 10⁷M^-1s^-1의 범위 이내. 특정 구체예에서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE은 다음의 K_0n 을 갖는다. 적어도 10⁴ M^-1S^-1, 적어도 2 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 10⁶M^-1s^-1, 적어도 5 X 1O⁶M^-1s^-1, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸M^-1s^-1. 이 수치는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 측정된 것이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 EphA2-BiTE 은 다음 범위의 k_off 율 (항체(Ab)+항원(Ag)-> Ab-Ag)을 갖는다: 10^-3 s^-1 미만, 5 X 10^-3s^-1 미만, 10^-4 s^-1 미만, 2 x 10^-4s^-1미만, 5 X 10^-4s^-1 미만, 10^-5s^-1미만, 5 X 10^-5s^-1미만, lO^-6s^-1미만, 5 X lO^-6s^-1 미만, lO^-7s^-1 미만, 5 X 10^-7s^-1 미만, 10^-8s^-1 미만, 5 X 10^-8s^-1미만, 10^-9s^-1미만, 5 X 10^-9s^-1 미만, 또는 10^-10s^-1 미만, 또는 대략 10^-3 내지 10^-10s^-1의 범위 이내, 대략 10^-4 내지 10^-8s^-1의 범위 이내, 또는 대략 10^-5 내지 10^-8s^-1의 범위 이내. 특정 구체예에서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE 은 k_off 을 갖는다: 10^-2s^-1미만, 5 X 10^-3 s^-1미만, 또는 10^-4s^-1. 이 수치는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 측정된다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 EphA2-BiTE은 친화도 상수 또는 K_a (k_on/k_off) 로서 다음의 수치범위를 갖는다: 적어도 10²M^"1, 적어도 5 X 10² M^-1, 적어도 10³ M^-1, 적어도 5 X 10³ M^-1, 적어도 10⁴ M^-1, 적어도 5 X 10⁴ M^-1, 적어도 10⁵ M^-1, 적어도 5 X 10⁵ M^-1, 적어도 10⁶ M^-1, 적어도 5 X 10⁶ M^-1, 적어도 10⁷ M^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5 X 10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5 X 10⁹ M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5 X 10¹⁰ M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5 X 1O¹¹ M^-1, 적어도 10¹²M^-1, 적어도 5 X 10¹² M^-1, 적어도 10¹³M^-1, 적어도 5 X 10¹³M^-1, 적어도 10¹⁴ M^-1, 적어도 5 X 10¹⁴M^-1, 적어도 10¹⁵ M^-1, 또는 적어도 5 X 10¹⁵ M^-1, 또는 대략 10² 내지 5 X 10⁵ M^-1의 범위 이내, 대략 10⁴ 내지 1 X 1O¹⁰ M^-1의 범위 이내, 또는 대략 10⁵ 내지 1 X 10⁸M^-1의 범위 이내. 이 수치는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 측정된 것이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 EphA2-BiTE 은 해리 상수 또는 K_d(k_off/k_on)로서 다음 수치범위를 갖는다. 10^-5 M 미만, 5 X 10^-5 M 미만, 10^-6 M 미만, 5 X lO^-6 M 미만, 10^-7 M 미만, 5 X 10^-7 M 미만, 10^-8 M 미만, 5 X 10^-8 M 미만, 10^-9 M 미만, 5 X 10^-9 M 미만, lO^-10 M 미만, 5 X 10^-10 M 미만, 10^-11 M 미만, 5 X 10^-11M 미만, 10^-12M 미만, 5 X 10^-12M 미만, 10^-13M 미만, 5 X 10^-13M 미만, 10^-14M 미만, 5 X 10^-14M 미만, 10^-15 M 미만, 또는5 X 10^-15 M 미만, 또는 대략 I0^-2 M 내지 5 X 10^-5 M 의 범위 이내, 대략 10^-6 내지 10^-15 M의 범위 이내, 또는 대략 10^-8 내지 10^-14 M의 범위 이내. 이 수치 범위는 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 측정된 것이다.

5.1.2 CD3 항체들

본 발명의 특정 구체예에서, EphA2-BiTE은 CD3 T-세포 항원에 면역 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 CD3 T-세포 항원은 임의의 종(예를 들어, 인간)에서나 온 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 CD3의 하나 이상의 서브 유닛에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 감마, 델타, 제타 또는 에타 서브유닛). 바람직한 실시예에서, 제1 결합 도메인은 CD3의 엡실론(ε) 서브유닛에 면역특이적으로 결합한다. 특정의 구체예에서, 상기 제1 결합 도메인은 상기 서브유닛이 CD3의 델타 서브유닛과 복합화될 때, CD3의 엡실론(ε) 서브유닛에 면역특이적으로 결합한다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 CD3 결합 도메인은 탈면역화된다. 탈면역화 수법은 이 기술분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 다음 문헌에 개시된다. 국제 특허 공보 제WO 00/34317호 (특히, pp.1-14); 제WO 98/52976호 (특히, pp. 18-38의 실시예 1-6 ); 제WO 02/079415호 (특히, pp.2-8 및 pp. 15-43의 실시예 1-10 ); 및 제WO 92/10755호 (특히, pp. 6-9). 이들 각각은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다.

특정 구체예에서, CD3에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE은 단일 사슬 Fv (scFv)이다. 여기서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv"은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 절편을 가리킨다. 이 때, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가로 VH 및 VL 도메인사이의 폴리펩티드 링커를 포함하고, 이것은 scFv가 항원 결합의 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다. scFvs을 제조하는 방 법은 이 기술분야에서 잘 알려져 있다. scFvs을 제조하기 위한 방법의 리뷰는 다음을 참조한다. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg와 Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). 일 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 하기의 EphA2 항체들 중 어느 하나로부터 제조되는 scFvs로부터 유도될 수 있다.

특정 구체예들에서, EphA2-BiTE을 생성하는데 사용되는 CD3 항체들은 면역글로블린 분자와, 면역글로블린 분자의 면역적으로 활성인 부위, 즉, CD3 항원, 예를 들어, 항 CD3 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining region) (CDRs)에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함한다. EphA2-BiTE의 CD3 결합 도메인이 유도되는 CD3 항체들은 면역글로블린의 임의의 타입 (예를 들어,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(class) (예를 들어,IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 서브클래스(subclass)로부터도 유도될 수 있다. 이러한 CD3 항체들은 임의의 종(예를 들어, 래트, 마우스, 인간, 등)으로부터일 수 있다.

특정의 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 CD3 결합 도메인은 다음 문헌에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 국제 특허 공보 제WO99/54440호(p.3 및 도 8). 이것은 인용에 의해 이 명세서에 그 전체가 온전히 삽입된다. 상기 결합 도메인이 유도되는 항-CD3 항체는 예를 들어, 다음에 기재된 내용과 같이 유도될 수 있다. 예를 들어, Kipriyanov, 1998, Int. J. Cancer 77:763-772 (p. 763-765); Dreier 등, 2002, Int. J. Cancer 100:690-697 (p. 691) 이들은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다.

본 발명은 CD3 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도되는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 항체들은, 예를 들어, 상기 인용된 CD3 항체 또는 결합 절편을 개시하는 문헌들에 의해 인용된 VH CDR의 임의의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명은 CD3 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도되는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 결합 도메인은 다음, 즉, 일, 이, 삼, 사, 오 또는 그 이상의 VH CDRs으로서, 이들은 상기에서 인용한 CD3 항체들 또는 결합 절편을 개시하는 간행물에 개시된 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다(또는 또 다른 방법으로서, 이들로 구성된다).

본 발명은 CD3 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도된 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 항체들은, 예를 들어, 상기 인용한 CD3 항체 또는 결합 절편을 개시하는 문헌들에 개시된 VL CDRs 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 상기 결합 도메인은 다음, 즉, 일, 이, 삼, 사, 오 또는 그 이상의 VL CDRs로서, 에를 들어, 상기 인용한 CD3 항체 또는 결합 절편을 개시하는 문헌에 개시된 VL CDRs의 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다(또는, 다른 방법으로서, 이들로 구성된다).

본 발명은 CD3 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 결합 도메인은 다음을 포함한다(또는 선택적으 로 이들로 구성된다): VH CDRl 및 VL CDRl; VH CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl 및 VL CDR3; VH CDR2 및 VL CDRl ; VH CDR2 및 VL CDR2; VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR3 및 VH CDRl; VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR3 및 VL CDR3; VHl CDRl, VH CDR2 및 VL CDRl ; VH CDRl , VH CDR2 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDRl, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDRl, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDRl; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR2, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR2 및 VL CDR3; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR2; VH CDRl, VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl 및 VL CDR3; VH CDRl₅ VH CDR2, VL CDRl₅ VL CDR2, 및 VL CDR3; VH CDRl₅ VH CDR3, VL CDRl, VL CDR2, 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDRl₉ VL CDR2, 및 VL CDR3; 또는 상술한 CD3 항체들의 VH CRDs 및 VL CDRs의 모든 조합.

다른 구체예에서, 본 발명은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체들로부터 유도되는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 항체들은 CD3 항체의 상술한 VH 및 VL 도메인을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 면역특이적으로 CD3 폴리펩티드에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공하고, 상기 결합 도메인은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터 유도되고, 이 때, 상기 항체들이 갖는 해리 속도 상수 또는 k_on 율(항체(Ab) + 항원 (Ag) -> Ab-Ag)은 다음과 같다. 적어도 10⁴M^-1s^-1, 적어도 10⁵M^-1s^-1, 적어도 1.5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 2 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 5 X lO⁵ M^-1s^-1, 적어도 10⁶ M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁶M^-1s^-1, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸M^-1s^-1, 또는 대략 10⁵ 내지 10⁸ M^-1s^-1의 범위 이내, 대략 1.5 X 10⁵ M^-1s^-1내지 1 X 1O⁷M^-1s^-1의 범위 이내, 대략 2 X 10⁵ 내지 1 X 10⁶ M^-1s^-1의 범위 이내, 또는 대략 4.5 X 10⁵ 내지 10⁷M^-1s^-1의 범위 이내. 특정의 구체예에서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체는 다음 수치범위의 K_on을 갖는다. 적어도 10⁴M^-1s^-1, 적어도 2 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 10⁶M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁶ M^-1s^-11, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸ M^-1s^-1. 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된 것이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메 인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 항체들은 다음과 같은 K_off 율(항체(Ab)+ 항원 (Ag) -> Ab-Ag)을 갖는다. 10^-3 s^-1미만, 5 X 10^-3s^-1미만, 1O^-4 s^-1미만, 2 x 10^-4 s^-1미만, 5 X 1O^-4s^-1미만,10^-5s^-1미만, 5 X 10^-5s^-1미만, 5 X 10^-6s^-1미만, 10^-7 s^-1미만, 5 X 10^-7s^-1미만, 10^-8s^-1미만, 5 X 10^-8 s^-1미만, 10^-9 s^-1미만, 5 X 10^-9 s^-1미만, 또는 10^-10s^-1미만, 또는 대략 10^-3내지 10^-10s^-1의 범위 이내, 대략 10^-4내지 10^-8s^-1의 범위 이내, 또는 대략 lO^-5 내지 10^-8s^-1의 범위 이내. 특정 구체예에서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체는 10^-2s^-1, 5 X 10^-3s^-1, 또는 10^-4s^-1의 k_off 를 가지며, 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 항체들은 다음과 같은 친화도 상수 또는 K_a (k_on/k_off)를 갖는다: 즉, 적어도 10² M^-1, 적어도 5 X 10²M^-1, 적어도 10³ M^-1, 적어도 5 X 10³M^-1, 적어도 10⁴M^-1, 적어도 5 X 10⁴M^-1, 적어도 10⁵ M^-1, 적어도 5 X 10⁵M^-1, 적어도 10⁶M^-1, 적어도 5 X 10⁶ M^-1, 적어도 10⁷ M^-1, 적어도 5 X 10⁷ M^-1, 적어도 10⁸ M^-1, 적어도 5 X 10⁸ M^-1, 적어도 10⁹ M^-1, 적어도 5 X 10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰ M^-1, 적어도 5 X 10¹⁰M^-1, 적어도 1O¹¹M^"1, 적어도 5 X lO¹¹ M^'1, 적어도 10¹²M^-1. 적어도 5 X 10¹²M^-1, 적어도 10¹³ M^-1, 적어도 5 X 10¹³M^-1, 적어도 10¹⁴M^-1, 적어도 5 X 10¹⁴M^-1, 적어도 10¹⁵ M^-1, 또는 적어도 5 X 10¹⁵ M^-1, 또는 대략 10² 내지 5 X 10⁵M^-1의 범위 이내, 대략 10⁴ 내지 1 X 10¹⁰ M^-1의 범위 이내, 또는 대략 10^s 내지 1 X 10⁸ M^"1의 범위 이내. 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된 것이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이때, 상기 항체들은 다음과 같은 해리 상수 또는 또는 K_d (k_off/k_on)을 갖는다. 10^-5M 미만, 5 X lO^-5M 미만, 10^-6M 미만, 5 X 10^-6M 미만, 10^-7M 미만, 5 X 10^-7M 미만, 10^-8M 미만, 5 X 10⁸M 미만, 10^-9M 미만, 5 X 10^-9M 미만, lO^-10M 미만, 5 X 10^-10M 미만, 10^- ^uM 미만, 5 X 10^-11M 미만, 10^-12M 미만, 5 X 10^-12M 미만, 10^-13M 미만, 5 X 10^-13M 미만, 10^-14M 미만, 5 X 10^-14M 미만, 10^-15M 미만, 또는 5 X 10^-15M 미만, 또는 대략 10^-2M 내지 5 X 10^-5M의 범위 이내, 대략 10^-6내지 10^-15M의 범위 이내, 또는 대략 10^-8 내지 10^-14 M의 범위 이내, 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 CD3에 면역특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, EphA2-BiTE은 다음과 같은 해리 속도 상수 또는 K_on 율 (항체(Ab) + 항원(Ag)-> Ab-Ag)을 갖는다: 적어도 10⁴ M^-1s^-1, 적어도 10⁵M^-1s^-1, 적어도 1.5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 2 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁵ M^-1s^-1, 적어도 10⁶M^-1s^-1, 적어도 5 X 1O⁶ M^-1s^-1, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸ M^-1s^-1, 또는 대략 10⁵ 내지 10⁸ M^-1s^-1의 범위 이내, 대략 1.5 X 10⁵ M^-1s^-1 내지 1 X 1O⁷M^-1s^-1의 범위 이내, 대략 2 X 10⁵ 내지 1 X 10⁶M^-1s^-1의 범위 이내, 또는 대략 4.5 X lO⁵ 내지 10⁷M^-1s^-1의 범위 이내. 특정 구체예에서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE은 다음과 같은 범위의 K_on을 갖는다: 적어도 10⁴M^-1s^-1, 적어도 2 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 2.5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁵M^-1s^-1, 적어도 10⁶M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁶ M^-1s^-1, 적어도 10⁷M^-1s^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1s^-1, 또는 적어도 10⁸M^-1s^-1 . 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된 것이다..

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 CD3 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 EphA2-BiTE은 다음과 같은 k_off 율(항체(Ab)+항원(Ag) -> Ab-Ag)을 갖는다: lO^-3s^- ¹미만, 5 X lO^-3s^- ¹미만, 10^-4s^- ¹미만, 2 x 10^-4s^- ¹미만, 5 X 10^-4s^- ¹미만, 10^-5s^- ¹미만, 5 X lO^-5s^- ¹미만, 10^-6s^- ¹미만, 5 X 10^-6s^- ¹미 만, 10^-7s^- ¹미만, 5 X 10^-7s^- ¹미만, 10^-8s^- ¹미만, 5 X 10^-8 s^- ¹미만, 10^-9s^- ¹미만, 5 X 10^-9s^-1미만, 또는 10^-10s^- ¹미만, 또는 대략 10^-3 내지 10^-10s^-1의 범위 이내, 대략 10^-4내지 10^-8s^-1의 범위 이내, 또는 대략 10^-5 내지 10^-8s^-1의 범위 이내. 특정 구체예에서, EphA2 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE은 10^-2s^- ¹미만, 5 X 10^-3s^- ¹미만, 또는 10^-4s^-1미만의 K_off을 갖는다. 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된 것이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 CD3 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 EphA2-BiTE은 다음과 같은 수치범위의 친화도 상수 또는 K_a(K_0n/K_0ff)를 갖는다. 적어도 10² M^-1, 적어도 5 X 10² M^-1, 적어도 10³ M^-1, 적어도 5 X 10³ M^-1, 적어도 10⁴ M^-1, 적어도 5 X 10⁴ M^-1, 적어도 10⁵ M^-1, 적어도 5 X 10⁵M^-1, 적어도 10⁶ M^-1, 적어도 5 X 10⁶ M^-1, 적어도 10⁷M^-1, 적어도 5 X 10⁷M^-1, 적어도 10⁸ M^-1, 적어도 5 X 10⁸ M^-1, 적어도 10⁹ M^-1, 적어도 5 X 10⁹ M^-1, 적어도 10¹⁰ M^-1, 적어도 5 X 10¹⁰ M^-1, 적어도 10¹¹M^"1, 적어도 5 X 10¹¹ M^"1, 적어도 10¹²M^"1, 적어도 5 X 10¹² M^'1, 적어도 10¹³M^-1, 적어도 5 X 10¹³M^-1, 적어도 10¹⁴M^-1, 적어도 5 X 10¹⁴M^-1, 적어도 10¹⁵ M^-1, 또는 적어도 5 X 10^l5M^-1, 또는 대략 10² 내지 5 X 10⁵M^-1의 범위 이내, 대략 10⁴ 내지 1 X 10¹⁰M^-1의 범위 이내, 또는 대략 10⁵내지 1 X 10⁸M^-1의 범위 이내. 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된 것이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명은 CD3 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 EphA2-BiTE을 제공한다. 이 때, 상기 EphA2-BiTE는 다음과 같은 수치범위의 해리 상수 또는 K_d(K_off/K_on)를 갖는다. 10^-5M 미만, 5 X 10^-5M 미만, 10^-6M 미만, 5 X 10^-6M 미만, 10^-7M 미만, 5 X 10^-7M 미만, 10^-8 M 미만, 5 X 10^-8 M 미만, 10^-9M 미만, 5 X 10^-9M 미만, 10^-10M 미만, 5 X 10^-10M 미만, 10^-11M 미만, 5 X lO^-11M 미만, 10^-12M 미만, 5 X 10^-13M 미만, 10^-14M 미만, 5 X 10^-14M 미만, 10^-15M 미만, 5 X 10^-15M 미만, 또는 대략 10^-2 M 내지 5 X 10^-5M의 범위 이내, 대략 10^-6 내지 10^-15 M의 범위 이내, 또는 대략 10^-8내지 10^-14M의 범위 이내, 이 수치는 표면 플라즈몬 어세이에 의해 측정된 것이다.

5.1.3 EphA2 - BiTE 콘쥬게이트

본 발명은 또한, 이중특이적 T-세포 맞물림자에 관한 것이다(즉, EphA2-BiTE (특히, 이중특이적 단일 사슬 항체들인 EphA2-BiTE)은 하나의 추가의 도메인을 포함하고, 상기 도메인은 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 연결된다. 추가의 도메인은 소정의 특이도 또는 기능을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명은 융합 단백질을 생성시키기 위한, 재조합 융합된 또는 화학저으로 컨쥬데이트된(공유 및 비공유 컨쥬게이션을 모두 포함하는) 이종유래 폴리펩티드(또는 그것의 절편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 아미노산의 폴리펩티드)의 용도일 수 있다. 이 융합은 반드시 직접적일 것을 요하지 않고, 링커 서열을 통해 일어날 수 있다. 예를 들어, 항체들은 그 항체들을 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체들로 융합 또는 컨쥬게이팅함으로써, 시험관 내 또는 생체 내로, 특정 세포 타입으로 이종유래 폴리펩티드을 타겟팅하는게 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음을 참조로 한다. 국제 특허 공보 제WO 93/21232호; EP 439,095; Naramura 등, 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; 미국 특허 제5,474,981호; Gillies 등, 1992, PNAS 89:1428-1432; 및 Fell 등, 1991, J. Immunol. 146:2446-2452. 이들은 인용에 의해 이 명세서에 온전히 전체로서 삽입된다.

본 발명은 또한, EphA2-BiTE 절편으로 융합 또는 컨쥬게이트되는 이종유래(heterologous) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 이 이종유래 폴리펩티즈는 Fab 절편, Fd 절편, Fv 절편, F(ab)₂ 절편 또는 이들의 절편으로 융합되거나 컨쥬게이트 될 수 있다. 폴리펩티드를 항체 절편으로 융합 또는 컨쥬게이트하는 방법은 당 기술분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 다음을 참조로 한다. 미국 특허 번호 제5,336,603호, 제5,622,929 호, 제5,359,046호, 제5,349,053호, 제5,447,851호, 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; 국제 특허 공개공 보 제WO 96/04388호 및 제WO 91/06570호; Ashkenazi 등, 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zheng 등, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 ViI 등, 1992, PNAS 89:11337- 11341. 상기 문헌들은 인용에 의해 전체로서 이 명세서에 온전히 삽입된다.

추가적인 융합 단백질, 예를 들어, 상술한 EphA2-BiTE의 어느 하나는, 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(집합적으로 "DNA 셔플링"이라 함)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체들의 활성을 바꾸는데 사용될 수 있다(예를 들어, 보다 높은 친화도 및 보다 낮은 해리 율을 가지는 항체들). 다음을 참조한다. 미국 특허 공보 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호, 및 Patten 등, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hansson, 등, 1999, J. Mol. Biol. 287:265; 및 Lorenzo 및 Blasco, 1998, BioTechniques 24:308. 이들 각 특허들은 인용에 의하여 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다. EphA2-BiTE, 또는 그 인코드된 EphA2-BiTE은 재조합 이전에, 에러가 생기기 쉬운 PCR, 랜덤 뉴클레도티드 삽입 또는 다른 방법에 의하여 무작위적 돌연변이 생성 가해짐으로써 변경될 수 있다. EphA2에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 항체 절편을 인코드하는 폴리뉴클레도티드의 하나 이상의 절편은 하나 이상의 이종유래 분자의, 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 파트, 도메인, 절편 등과 재조합될 수 있다.

또한, EphA2-BiTE 또는 그의 절편은 정제를 원활하게 하기 위한 펩티드와 같 은, 마커 서열로 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예를 들어, pQE 벡터에 제공되는 tag(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)이고, 이들 중에서, 대다수는 상업적으로 입수가능하다. Gentz 등 1989, PNAS 86:821에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 tag는, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질(Wilson 등, 1984, 세포 37:767) 과 "flag" tag에 대응되는, 헤마글루티닌 "HA" tag를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE 또는 이의 절편 또는 변이체는 진단 또는 검출 시약에 컨쥬데이트된다. 이러한 EphA2-BiTE는 특정 치료요법의 효율성을 측정하는 것과 같은, 임상 시험의 일부로서, 암의 발병 또는 진행을 모니터 또는 진단하는데 유용할 수 있다. 추가로, 이러한 항체들은 EphA2을 과다발현하는 세포와 관련된 전암성 상태의 발병 및 진행의 모니터링 또는 진단에 유용할 수 있다(예를 들어, 고-등급 전립선 상피내 종양(PIN), 유방의 섬유선종, 섬유낭포성 질환 또는 복합 모반). 일 구체예에서, 노출된 EphA2 에피토프 항체가 진단 또는 검출가능한 시약에 컨쥬데이트된다. 보다 구체적인 구체예에서, 항체는 EphA2-BiTE이다.

이러한 진단 및 검출은 그 항체를 검출가능한 물질에 커플링함으로써 달성될 수 있다. 상기 물질은 다음의 물질들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다 : 효소, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지는 않는, 호스라디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스페타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제; 보형(prosthetic) 기들, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지는 않는, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지는 않는, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이드, 로다민, 디클로로트리아지닐아민, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린; 루미네센트 물질들, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지는 않는, 루미놀; 바이오루미네센트 물질, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지는 않는, 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린(equorin); 방사성 물질, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지는 않는, 비스무스 (²¹³Bi), 카본 (¹⁴C), 크롬 (⁵¹Cr), 코발트 (⁵⁷Co), 불소 (¹⁸F), 가돌리늄 (¹⁵³Gd, ¹⁵⁹Gd), 갈륨(⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), 게르마늄 (⁶⁸Ge), 홀뮴(holmium) (¹⁶⁶Ho), 인듐(¹¹⁵In, ¹¹³In, ¹¹²In, ¹¹¹In), 요오드 (¹³¹1, ¹²⁵1, ¹²³1, ¹²¹I), 란탄 (¹⁴⁰La), 루테튬 (¹⁷⁷Lu), 망간 (⁵⁴Mn), 몰리브덴 (⁹⁹Mo), 팔라듐 (¹⁰³Pd), 인 (³²P), 프라세오디뮴(praseodymium) (¹⁴²Pr), 프로메튬(promethium) (¹⁴⁹Pm), 레늄(rhenium) (¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re)₅ 로듐 (¹⁰⁵Rh), 루테늄(⁹⁷Ru), 사마륨 (¹⁵³Sm), 스칸듐(⁴⁷Sc), 셀레늄(⁷⁵Se), 스트론튬(⁸⁵Sr)₅ 황(³⁵S), 테크네튬(⁹⁹Tc), 탈륨 (²⁰¹Ti), 주석 (¹¹³Sn, ¹¹⁷Sn), 트리튬(³H), 제논(¹³³Xe), 이테르븀(¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb), 이트륨 (⁹⁰Y), 아연 (⁶⁵Zn); 다양한 양전자 방출 단층촬영기를 사용하는 양전자(positron) 방출금속 및 비방사성 상자성 금속 이온.

일 구체예에서, EphA2-BiTE의 질환 조직(예를 들어, 종양)으로 국소화는, 조직 내에서의 EphA2-BiTE의 표지된 형태를 검출함으로써 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 표지된 EphA2-BiTE은 아래 단계로 이루어진 방법에 따라 대상에서 생체 내 검출된다: (a) 대상에 유효량의 표지된 EphA2-BiTE을 투여하는 단계, 및 (b) 대상 내의 표지된 EphA2-BiTE을 검출하고, 이어서 EphA2이 발현되는 대상 내의 사이트에서 표지된 EphA2-BiTE이 농축되도록 하기에 충분한 시간 간격을 두는 단계. 이 구체예에 따르면, 표지된 EphA2-BiTE는 이 기술분야에서의 임의의 적합한 방법으로, 예를 들어, 비경구적으로(parenterally) 또는 복강으로(intraperitoneally) 대상에 투여할 수 있다. 추가로, 이 구체예에 따르면, 표지된 EphA2-BiTE의 유효량은 대상 내에서 EphA2-BiTE의 검출을 허용하는 양이다. 이 양은 구체적인 대상, 사용된 표지 및 사용된 검출방법에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 당 기술분야에서, 대상의 크기 및 사용된 이미징 시스템이 이미징 수단을 사용하여 대상에서 EphA2-BiTE을 검출하기에 필요한 표지된 EphA2-BiTE의 양을 측정할 수 있을 것임이 이해될 수 있을 것이다. 인간 대상에 대하여 방사표지된 EphA2-BiTE의 경우에, 투여된 표지된 EphA2-BiTE의 양은 방사표지의 관점에서, 예를 들어, ⁹⁹Tc의 약 5 내지 20 밀리퀴리(millicuries)로 측정된다. EphA2이 발현되는 대상 내의 사이트에 표지된 EphA2-BiTE가 농축되기에 충분한 표지된 EphA2-BiTE을 투여한 후의 시간 간격은 여러가지 인자, 예를 들어, 사용된 표지의 타입, 투여 모드 및 이미지화되는 대사에 신체의 부분 등에 따라 변화될 것이다. 구체적인 구체예에서, 충분한 시간 간 격은 6 내지 48 시간, 6 내지 24 시간, 또는 6 내지 12 시간이다. 또 다른 구체예에서, 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.

표지된 EphA2-BiTE의 존재는 이 기술분야에서 알려진 이미징 수단을 사용하여 대상 내에서 검출될 수 있다. 일반적으로, 사용된 이미징 수단은 사용된 표지의 타입에 의존한다. 숙련된 기술자라면 특정 표지를 검출하기 위해 적합한 수단을 결정할 수 있을 것이다. 사용되는 방법과 장치는 컴퓨터 단층촬영기(CT), 포지션 방출 단층촬영기(PET)와 같은 전신 스캔, 마그네틱 공명 이미징(MRI) 및 소노그래피 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, EphA2-BiTE은 방사성동위원소로 표지되고, 방사선 반응성 외과 기구를 이용하여 환자 내에서 검출된다.(Thurston 등, 미국 특허 번호 제441,050호). 다른 구체예에서, EphA2-BiTE은 형광 화합물로 표지되고, 형광 반응성 스캐닝 기구를 사용하여 환자 내에서 검출된다. 다른 구체예에서, 이 EphA2-BiTE은 양전자 방출 금속으로 표지되고, 양전자 방출-단층촬영기를 이용하여 환자 내에서 검출된다. 또 다른 구체예에서, EphA2-BiTE은 상자성(paramagnetic) 표지로 표지되고, 마그네틱 공명 이미징(MRI)로 환자 내에서 검출된다.

본 발명은 또한, 치료요법 약제에 컨쥬게이트되는 EphA2-BiTE 또는 그의 절편의 사용을 포함한다.

본 발명의 EphA2-BiTE은 사이토톡신(cytotoxin), 예를 들어, 세포증식억제(cytotoxin) 또는 세포파괴(cytocidal) 약제, 치료요법 약제 또는 방사활성 금속 이온, 예를 들어, 알파-에미터(alpha-emitter)와 같은 비-거대분자 치료 모이어 티에 컨쥬게이트될 수 있다. 세포증식억제 또는 세포파괴 약제는 세포에 해로운 모든 시약을 포함한다. 그 예는 다음과 같다: 파클리탁셀(paclitaxel), 시토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜치신(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디히드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 안티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로케인(procaine), 테트라케인(tetracaine), 리도케인(lidocaine), 프로프라놀올(propranolol), 퓨로마이신(puromycin), 에피루비신(epirubicin), 및 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 및 이들의 유사체 또는 동족체.

치료용 약제는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 대사길항물질(antimetabolites) (예를 들어, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파클로람부실(thioepachlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine) (BCNU) 및 로무스틴(lomustine) (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 플라티늄 II 시스 플라틴 (cisdichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin), 안트라시클린(anthracyclines), (예를 들어, 다우노루비신(daunorubicin) (종전명 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(dactinomycin) (종전명 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미트라이신(mithramycin) 및 안트라마이신(anthramycin) (AMC)), 및 항-미오틱 약제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴).

또한, EphA2-BiTE은 소정 생물학적 반응을 변형시키는 치료약제 또는 약 모이어티로 컨쥬게이트 될 수 있다. 치료용 약제 또는 약 모이어티는 고전적 화학적 치료용 약제로 제한되는 것이 아니다. 예를 들어, 약 모이어티는 소망하는 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 톡신(toxin), 예를 들어, 아브린(abrin), 리신 A (ricin A), 슈도모나스 엑소톡신(pseudomonas exotoxin), 콜레라 톡신, 또는 디프테리아 톡신; 단백질, 예를 들어, 종양 괴사 인자,

-인터페론,

-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 작동자, 아폽토시스 약제, 예를 들어, TNF-

, TNF-

, AIM I (참조 : 국제 출원 공보 제WO 97/33899호), AIM II (참조: 국제 출원 공보 제WO 97/34911호), Fas 리간드 (Takahashi 등, 1994, J. Immunol., 6:1567) 및 VEGI (참조 : 국제 출원 공보 제WO 99/23105호), 혈전제(thrombotic agent) 또는 항-맥관형성제(angiogenic agent), 예를 들어, 안지오스테틴(angiostatin) 또는 엔도스테틴(endostatin); 또는, 생물학적 반응 변형자(modifier), 예를 들어, 림포카인(lymphokine) (예를 들어, 인터루킨-1 ("IL-I"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루 킨-6 ("IL-6"), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 및 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF")), 또는 성장 인자 (예를 들어, 성장 호르몬 ("GH")).

게다가, EphA2-BiTE은 치료적 모이어티, 예를 들어, 방사성금속 이온(예를 들어, 상술한 방사활성 물질을 참조)을 컨쥬게이트하기에 유용한 방사활성 물질 또는 거대고리 킬레이터(macrocyclic chelator)에 컨쥬게이트될 수 있다. 특정 구체예에서, 거대고리 킬레이터는 l,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"-테트라아세트산(DOTA)으로서, 이것은 링커 분자를 통하여 항체에 부착될 수 있는 것이다. 이러한 링커 분자는 이 기술분야에 통상적으로 알려져있고, 다음 자료들에 기술되어 있다. Denardo 등, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson 등, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; 및 Zimmerman 등, 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50. 이들 각각은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다.

특정 구체예에서, 컨쥬게이트된 EphA2-BiTE은 하나의 도메인, 바람직하게는 암세포에는 노출되고 비 암세포에는 그렇지 않은, 또는 감염된 세포에는 노출되고 비감염된 세포에는 그렇지 않은 EphA2 에피토프 및 제2 도메인, 바람직하게는 CD3에 결합한다.

치료요법 모이어티를 항체들에 컨쥬게이트하는 기술들은 잘 알려져 있다. 모이어티는 이 기술분야에서 알려진 방법들에 의해 항체들에 컨쥬게이트되는데, 이 방법은 알데히드/시프 링키지, 설피드릴(sulphydryl) 링키지, 산-불안정(acid-labile) 링키지, 시스-아코니틸 링키지, 히드라진 링키지, 효소적으로 붕괴가능한 링키지(참조 : 전체적으로 Garnett, 2002, Adv. DrugDeliv. Rev. 53:171-216)를 포 함하나, 이에 제한되지는 않는다. 모이어티를 항체들에 컨쥬게이트하는 추가적 기술들은 예를 들어, 다음 문헌들에 잘 나타나 있다: Arnon 등, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," Monoclonal Antibodies 및 Cancer Therapy, Reisfeld 등 (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 등, "Antibodies For Drug Delivery," Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson 등 (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," Monoclonal Antibodies '84: Biological 및 Clinical Applications, Pinchera 등 (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 등 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe 등, 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. 항체들을 폴리펩티드 모이어티에 융합 또는 컨쥬게이트시키는 방법은 이 기술분야에 알려져 있다. 다음을 참조한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,336,603호, 제5,622,929호, 제5,359,046호, 제5,349,053호, 제5,447,851호, 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; 국제 특허 공보 제WO 96/04388호 및 제WO 91/06570호; Ashkenazi 등, 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zheng 등, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 ViI 등, 1992, PNAS 89:11337- 11341. 항체를 모이어티에 융합하는 것은 반드시 직접적일 필요는 없고, 링커 서열을 통해 일어날 수도 있다. 이러한 링커 분자는 이 기술분야에서 잘 알려져 있고, 다음의 자료에 기술 되어 있다. Denardo 등, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson 등, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; Zimmerman 등, 1999, Nucl Med. Biol. 26:943-50; Garnett, 2002, Adv. DrugDeliv. Rev. 53:171-216. 이들 각각의 자료들은 그 전체가 인용에 의해 이 명세서에 온전히 삽입된다.

EphA2-BiTE은 또한, 고체 지지체에 부착될 수 있는데, 이것은 특히 타겟 항원의 면역어세이 또는 정제에 유용한다. 이러한 고체 지지체는, 글래스, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나이론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

5.2 본 발명의 EphA2 - BiTE 폴리뉴클레오티드

본 발명은 여기세 개시된 EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 제공한다. 특정 구체예에서, EphA2-BiTE을 인코드하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 제1 결합 도메인을 인코드하는 제1 뉴클레오티드 서열과, 제2 결합 도메인을 인코드하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 제1 및 제2 결합 도메인을 링크하는 링커 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, EphA2- BiTE 폴리뉴클레오티드 구조체의 일반적 모식도에 대한 도 3을 참조한다. 본 발명은 또한, EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이 때, 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 이 분야에서 알려진 또는 여기에 기술된 항 EphA2 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, EA2, 4H5, 2A4, 2E7 또는 12E2) 및/또는 이 기술분야에서 알려진 또는 여기에 기술된 항-CD3 항체에 하이브리다이즈한다.

일 구체예에서, 본 발명의 EphA2 -BiTEs은, 당 기술분야에서 알려진 또는 여기에 기술된 어세이에 의하여, EphA2의 발현을 조절하고/하거나, T-세포에 의한 EphA2 의 과다발현 세포의 방향전환된 용해를 유도하는 EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로부터 제조된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 EphA2-BiTE은 EphA2 -BiTEs의 절편을 인코드하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로부터 제조되는 폴리펩티드를 포함한다. 하이브리다이제이션 조건은 다음과 같은 엄격한 조건들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 : 엄격한(stringent) 하이브리다이제이션 조건, 예를 들어, 약 45℃에 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)내에서 필터-바운드 DNA로 하이브리다이제이션한 후, 약 50-65℃의 온도에서 0.2X SSC/0.1% SDS 에서 한번 이상 세척하는 방법, 고도의 엄격한 조건, 예를 들어, 45℃에서 6X SSC에서 필터-바운드 DNA로 하이브리다이제이션하고, 이어서 약 60℃에서 0.1X SSC/0.2% SDS로 한번 이상 세척하는 방법, 또는 그외 이 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 엄격한 하이브리다이제이션 조건(참조 : 예를 들어, Ausubel, F.M. 등, eds. 1989 Current Protocol in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley 및 Sons, Inc., NY, 페이지 6.3.1 to 6.3.6 및 2.10.3).

일단, 본 발명의 방법에서 사용되는 EphA2-BiTE의 뉴클레오티드 서열이 결정되면, 이 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열을 조작하는 당업계에 잘 알려진 방법들, 예를 들어, 재조합 DNA 기술, 사이트-디렉티트 돌연변이 생성법법, PCR 등 (참조 : 예를 들어, Sambrook 등, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 및 usubel 등, eds., 1998, Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 등에 기재된 기술들. 이들 문헌들은 인용에 의한 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다)을 사용하여 조작되어, 상이한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 만들기 위해, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성한다.

특정 구체예들에서, 이러한 아미노산은 적어도 1 , 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 가진다. 가능한 치환 중에는, 보존적 치환이 포함되고, 이 경우, 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산을 유사한 화학적 또는 구조적 및/또는 펩티드의 생물학적 기능을 심각하게 바꾸지 않는 특징을 가지는 상이한 아미노산으로 대체함으로써 변형된다.

본 발명의 EphA2-BiTE을 인코드하는 뉴클레오티드 서열내의 돌연변이를 도입할 수 있는 당업자에게 알려진 표준 기술은, 예를 들어, 사이트-디렉티드 돌연변이 생성 및 PCR-매개 돌연변이 생성으로서, 아미노산 치환을 가져온다. 바람직하게는, 유도체는 원래의 분자에 비하여, 25 미만의 아미노산 치환, 20 미만의 아미노산 치환, 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 2 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 유도체는 하나 이상의 예측된 비-본질적 아미노산 잔기에서 일어난 보존성 아미노산 치환을 갖는다. "보존성 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 가지는 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 전하를 가지는 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 이 기술분야에서 한정되어 있다. 이 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트리톱판), 베타-가지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 또 다른 방법으로서, 뮤테이션은, 예를 들어, 포화 돌연변이 생성에 의해, 코딩 서열의 전체 또는 부분을 따라 랜덤하게 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이는 활성을 유지하는 돌연변이를 식별하기 위한 생물학적 활성에 대하여 스크린될 수 있다. 돌연변이 생성에 이어서, 인코드된 EphA2-BiTE은 발현 백터내로 삽입되어 발현될 수 있고(예를 들어, 이종유래 숙주 세포에서), 단백질의 활성은 하기한 바와 같이 측정될 수 있다.

본 발명은 또한, 제1 및/또는 제2 결합 도메인의 프레임워크 또는 가변 영역에서, 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환)를 가지는 여기에 기술된 EphA2-BiTE의 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체들을 포함한다. 바람직하게는, 이들 돌연변이는 이들이 면역특이적으로 결합하는 EphA2 및/또는 CD3을 위한 EphA2 및/또는 CD3의 결합력(avidity) 및/또는 친화도를 유지 또는 향상시킨다. 이 기술분야에서 당업자들에에 알려진 표준 기술들(예를 들어, 면역어세이 또는 ELISA 어세이)가 폴리펩티드 EphA2-BiTE 및 그 결합 상대 사이의 결합도를 어세이하는데 사용될 수 있다.

5.3 EphA2 - BiTE 의 제조방법.

5.3.1 EphA2 - BiTE 의 재조합 발현

본 발명의 EphA2-BiTE은 이 기술분야에서 알려진 또는 여기에 기술된 모든 방법, 특히, 화학적 합성 또는, 바람직하게는, 재조합 발현 기술(참조, 예를 들어, 제WO 99/54440호, 이 문헌은 인용에 의해 이 명세서에 그 전체가 온전히 삽입된다)에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 EphA2-BiTE을 제조하기 위한 방법의 상세한 실시예에 대하여는 infra, 섹션 6을 참조한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 벡터의 일부로서, 세포에서, 예를 들어, EphA2의 비정상적인 발현 (예를 들어, 과다발현) 및/또는 활성 (예를 들어,암, 비-암 과증식 세포 장애 또는 감염)과 연관된 장애의 유전자 치료요법 또는 진단에서, 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, EphA2-BiTE)를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 관심 대상의 폴리펩티드(예를 들어, EphA2-BiTE)를 교대로 생성하는 세포 내로 도입된다. 유전자 치료요법은, 치료적 유전자를 ex-vivo 또는 in-vivo 기술로 세포 내에 도입하는 것에 기초하며, 유전자 전달의 가장 중요한 응용이다.

따라서, 본 발명의 EphA2-BiTE 은 EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터의 구조를 요하고, 그 예는 도 3과 같다. EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 이 기술분야에서 알려진 방법에 의하여 얻어지고 시퀀싱할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의한 방법에서 사용되는 EphA2- BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있고(예를 들어, Kutmeier 등, 1994, BioTechniques 17:242), 이것은, 간단히 말하면, 폴리펩티드를 인코드하는 서열의 절편을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 겹침(overlapping), 이들 올리고뉴클레티드의 어닐링 및 리게이팅의 합성을 하고, 이어서 이 리게이트된 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 단계로 포함된다.

본 발명의 EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, EphA2-BiTE 분자를 제조하기 위한 벡터는 이 기술분야에서 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다. 따라서, EphA2-BiTE 인코딩 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 여기 기술된다. 당업자에게 잘 알려진 방법은 EphA2-BiTE 코딩 서열 및 적합한 전사 및 번역 조절 시그널을 포함하는 발현 벡터를 구성하는데 사용된다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 그리고 생체 내 유전 재조합을 포함한다. 본 발명은 따라서 본 발명의 EphA2-BiTE을 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체 또는 그 절편의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 프로모터에 작동가능하게 링크되는, 중쇄 또는 경좨 CDR을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체분자의 불변 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열(참조: 예를 들어, 국제 특허 공보 제WO 86/05807호 및 제WO 89/01036호; 및 미국 특허 번호 제5,122,464호)을 포함할 수 있고, 그 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄 또는 전체 중쇄와 경쇄 모두의 발현을 위한 벡터로 클론될 수 있다.

발현 벡터는 종래 기술에 의해 숙주 세포로 전달되고, 트렌스펙트된 세포는 본 발명의 EphA2-BiTE을 제조하기 위한 종래 기술에 의해 배양된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 EphA2-BiTE을 인코드하는 폴리뉴클레오티드와 그 절편(예 : EphA2-BiTE의 제1 및/또는 제2 결합 도메인)으로서, 이종유래 프로모터에 작동가능하게 링크된 것을 함유하는 숙주 세포를 포함한다.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 발명의 EphA2-BiTE 또는 그 절편(예를 들어, EphA2-BiTE의 제1 및/또는 제2 결합 도메인)을 발현시키기 위해 활용될 수 있다. (참조 : 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,807,715호). 이러한 숙주-발현 시스템은 관심대상의 코팅 서열이 제조되고, 이어서 정제되는 비히클을 나타내나, 또한, 적당한 뉴클레오티드 코딩서열로 형질전환 또는 트렌스펙트되었을 때, 본 발명의 EphA2-BiTE을 in-situ 발현할 수 있는 세포 역시 나타낸다. 이들은 EphA2-BiTE 코딩 서열을 포함하는, 재조합 박테리오파지 DNA, 플라즈미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어,E. coli 및 B. subtilis); EphA2-BiTE 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효소(예를 들어, Saccharomyces Pichia); EphA2-BiTE 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포 시스템 (예를 들어, 바쿨로바이러스(baculovirus)) ; EphA2-BiTE 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV); 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus, TMV) 또는 벡터재조합 플라즈미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터(예를 들어, 아네노바이러스 후기 프로모터; 백신 바이러스 7.5K 프로모터)을 포함하는 재조합 발현 구조체가 번식된 포유동물 세포 시스템(예를 들어,COS, CHO, BHK, 293, NSO, 및 3T3 세포)을 포함하나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 대장균(Escherichia coli)같은 박테리아 세포, 더욱 바람직하게는, 진핵세포가 재조합 EphA2-BiTE 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 중국 햄스터 자궁세포(CHO)는, 인간 시토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터(major intermediate early gene promoter) 구성요소와 함께, 항체의 효과적인 발현 시스템이다(Foecking 등, 1986, Gene 45:101; 및 Cockett 등, 1990, BioTechnology 8:2). 특정 구체예에서, EphA2-BiTE을 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다. 대안적으로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 트랜스제닉 식물 발현 시스템에서 발현될 수 있고, 그 예는 다음의 LEX System^TM을 들 수 있다. 미국 특허 공보 제6,040,498호, 1999년 2월 18일에 공표된 국제 출원(제WO 99/07210호), 2002년 2월 7일에 공표된 국제 출원(제WO 02/10414호). 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 활용될 수 있는 다른 트랜스제닉 식물 발현 시스템은 미국 특허 번호 제5,202,422호; 제5,639,947호; 제5,959,177호; 및 제6,417,429호에 기재된 Plantibodies^TM 기술이다.

박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터가 EphA2-BiTE 분자 또는 그의 절편 이 발현되게 하기 위한 용도에 따라 바람직하게 선택될 수 있다. 예를 들어, EphA2-BiTE 분자의 약학적 조성물을 제조하기 위하여, 이러한 단백질이 다량 생산될 때, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물을 고도로 발현시키는 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 내부에서 EphA2-BiTE 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역과 프레임을 이루며 각각 벡터내로 용리되어, 융합 단백질이 제조되는 E. coli 발현 벡터 pUR278 (Ruther 등, 1983, EMBO 12:1791); pIN 벡터s (Inouye & Inouye, 1985, 핵산s Res. 13:3101-3109; Van Heeke Sc Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); 등. 또한, pGEX 벡터가 글루타티온 5 -트랜스퍼라제 (GST)을 가지는 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합단백질은 가용성이고, 흡수 및 매트릭스 글루타티온-아가로스 비스에 결합한 후, 프리 글루타티온의 존재하에 용리(elution)됨으로써, 용해 세포(lysed cell)로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 사이트를 포함하여, 클론된 타겟 유전자 생산물이 GST 모이어티로부터 배출될 수 있도록 디자인된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 또 다른 미생물 시스템은 Pfenex Expression Technology이다. 이 기술은 신규한 수도모나스 플루오레세인에 기초하고, 이는 다음에 기재된 바와 같다 : Squires 등, BioProcess Int'l p. 54 Dec 2004; 및 Squires 등, Specialty Chemicals July/August 2004.

곤충 시스템에서, AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용된다. 이 바이러스는 Spodoptera frugiperda 세포에서 자란다. EphA2-BiTE 코딩 서열은 바이러스의 비본질 영역(예를 들어, 폴리히드린 유전자)로 각각 클론되어, AcNPV 프로모터 (예를 들어 , 폴리히드린 프로모터)의 조절 하에 놓여질 수 있다.

포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기초 발현 시스템이 활용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우에, 관심대상이 되는 EphA2-BiTE 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 3자(tripartite) 리더 서열로 용해될 수 있다. 이 키메라 유전자는 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈으로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-본질적 부분(예를 들어, 영역 El 또는 E3)으로의 삽입은 감염된 세포 숙주 내에서 EphA2-BiTE 분자를 볼 수 있고 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 얻게 된다(참조 : 예를 들어, Logan & Shenk, 1984, PNAS 8 1 :355-359). 특이적 개시 시그널은 또한 삽입된 EphA2-BiTE 코딩 서열의 효율적인 번역에 필요하다. 이 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 게다가, 이 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 보장하기 위해 소망하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 상을 이루어야(in phase with) 한다. 이들 외래성(exogenous) 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 이 발현 효율은 적합한 전사 인헨서 구성요소, 전사 종결자 등을 포함시킴으로써 향상될 수 있다(참조 : 예를 들어, Bittner 등, 1987, Method in Enzymol. 153:516-544).

추가로, 숙주 세포 스트레인은 소망하는 특이적 방식으로, 삽입된 서열의 발현을 조절(modulate)하는 것, 또는 유전자 산물을 변형(modify)시키고 가 공(process)하는 것으로 선택될 수 있다. 이러한 단백질의 산물의 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단(cleavage)) 단백질 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전사 산물의 후-번역 가공 및 변형을 위한 특성 및 특이적 메카니즘을 가진다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템이 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하도록 선택될 수 있다. 이러한 목적으로, 유전자 산물의 1차 전사, 글리코실화, 및 포스포실화의 올바른 가공을 위한 세포적 장치를 가공하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O, NSl 및 T47D, NSO (어떠한 면역글로블린쇄도 내재적으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78BsT-세포.

장기적으로, 재조합 단백질의 높은 수율의 생산을 위해서는, 안정된 발현이 바람직하다. 예를 들어, EphA2-BiTE 분자를 안정하게 발현시키는 세포주가 개발될 수 있다. 복제의 바이러스 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 대신, DNA로 형질전환된 숙주 세포가 적합한 발현 조절 구성요소 및 선택가능한 마커에 의해 형질전환될 수 있다(예를 들어, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐레시션 사이트, 등). 외래 DNA의 도입에 있어서, 조작된 세포(engineered cell)는 1-2일 동안 농후 매질(enriched media)에서 성장하여, 선택적 매질로 옮겨질 수 있다. 재조합 플라즈미드 내에 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라즈미드를 그들의 염색체로 안정하게 통합화하고 foci를 형성하여, 차례 로 클론되어 세포주로 확장될 수 있게 한다. 이 방법은 EphA2-BiTE 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 바람직하게 사용된다. 이러한 조작된 세포주는 EphA2-BiTE 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용하다.

다수의 선택 시스템이 사용될 수 있고, 다음을 포함하나, 여기에 제한되지는 않는다 : 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(the herpes simplex virus thymidine kinase) (Wigler 등, 1977, 세포 11:223), 글루타민 합성효소, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase) (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202). 그리고 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Adenine phosphoribosyltransferase) (Lowy 등, 1980, 세포 22:8-17) 유전자가 각각 tk-, gs-, hgprt- 또는 aprt- 세포들에 사용될 수 있다.

또한, 대사길항제 내성이 다음의 유전자에 대한 선택 기준으로 사용될 수 있다: dhfr, 메토트렉세이트(methotrezate)에 대한 내성을 부여함(Wigler 등, 1980, PNAS 77:357; O'Hare 등, 1981, PNAS 78:1527); gpt, 미코페놀산에 내성을 부여함(Mulligan & Berg, 1981, PNAS 78:2072); neo, 아미노글리코시드(G-418)에 내성을 부여함(Wu 및 Wu, 1991, Biotherapy 3:87; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulligan, 1993, Science 260:926; 및 Morgan 및 nderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191; May, 1993, TIB TECH 11 :155-); 그리고 hygro, 하이그로마이신에 내성을 부여함(Santerre 등, 1984, Gene 30:147).

이 기술분야에서 통상적으로 알려진 재조합 DNA 기술이 소망하는 재조합 클론을 선택하는데 통상 사용될 수 있고, 이러한 방법은 예를 들어, 다음에 기술된다 : 예를 들어, Ausubel 등 (eds.), Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer 및 Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 in Chapters 12 및 13, Dracopoli 등 (eds), Current Protocol in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin 등, 1981, J. Mol. Biol. 150:1. 이들은 인용에 의해 이 명세서에 온전히 전체로서 삽입된다.

EphA2-BiTE 분자의 발현 레벨은 벡터의 증폭에 의해 증가될 수 있다(리뷰를 위해 다음을 참조 : Bebbington 및 Hentschel, The use of Vectors based on Gene Amplication for the Expression of cloned genes in Mammalian Cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). EphA2-BiTE을 발현하는 벡터 시스템 내의 마커는 증폭가능하면, 숙주 세포의 배양액 내에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 복제 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 EphA2-BiTE 유전자와 연관되어 있으므로, EphA2-BiTE의 생성 역시 증가할 것이다(Grouse 등, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

숙주 세포는 본 발명의 두개의 발현 벡터, 즉, EphA2-BiTE의 제1 결합도메인 및 항체 (예를 들어, 항-EphA2 항체 또는 항-CD3 항체)의 가변 중 도메인을 인코드하는 제1 벡터 및, EphA2-BiTE의 제2 결합도메인 및 항체 (예를 들어, 항-EphA2 항체 또는 항-CD3 항체)의 가변 경 도메인을 인코드하는 제2 벡터와 공동-트랜스펙트 될 수 있다. EphA2-BiTE의 제1 및 제2 결합 도메인은 이 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 정제될 수 있고, 이 두개의 도메인은 이 기술분야에서 알려진 방법에 의하여 화학적으로 링크될 수 있다.

숙주 세포는 본 발명의 EphA2-BiTE을 인코드하는 발현 벡터로 트랜스펙트될 수 있다. 이 벡터는 항체 (예를 들어,항-EphA2 항체 또는 항-CD3 항체)의 가변 및 경(light) 도메인, 또는 EphA2-BiTE (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; 및 Kohler, 1980, PNAS 77:2197)의 제1 및 제2 결합 도메인을 모두 인코드하고 발현시킬 수 있는 단일 벡터를 포함한다. 가변 도메인 또는 결합 도메인의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA을 포함할 수 있다.

일단, 재조합 발현에 의하여 본 발명의 EphA2-BiTE 또는 이의 결합도메인이 생성되면, 이는 면역글로블린분자의 정제에 대하여 이 기술분야에서 알려진 모든 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 이후의 특이적 항원에 대한 친화도, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도법(differential solubility), 또는 단백질의 정제를 위한 다른 표준기술에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 본 발명의 EphA2-BiTE 또는 그의 절편은 정제를 용이하게 하는 이 기술분야에 알려진 또는 여기 기술된 이종유래 폴리펩티드 서열로 융합될 수 있다.

특정 구체예에서, 재조합으로 생성된 본 발명의 EphA2-BiTE은 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인을 포함하고, 이 때, 제1 결합 도메인은 VH 도메인과 VL 도메인을 포함하고, 이들 도메인들은 CD3 T-세포 항원에 결합하는 것을 허용하는 식으 로 도메인이 접힐 수 있을 정도로 충분한 길이의 링커에 의해 서로 링크된다. 다른 특정 구체예에서, 제2 결합 도메인은 VH 도메인과 VL 도메인을 포함하고, 이들 도메인들은 EphA2에 결합하는 것을 허용하는 식으로 도메인이 접힐 수 있을 정도로 충분한 길이의 링커에 의해 서로 링크된다. 다른 특정 구체예에서, 제1 및 제2 결합 도메인은, CD3와 EphA2와 결합하는 것을 허용하도록 도메인이 접힐 수 있을 정도로 충분한 길이의 링커에 의해 서로 링크된다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 scFvs이다. 다른 구체예에서, CD3에 결합하는 결합 도메인은 탈면역화된다.

5.4 예 방적 / 치료적 방법

본 발명은 하나 이상의 EphA2-BiTE을 투여함으로써, 대상 내의 EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성(예를 들어, 암, 비암 과증식 세포장애 및 감염)과 관련된 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하도록 설계된 약학적 조성물 및 예방적 및 치료요법적 처방에 관한 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 장애(예를 들어, 암, 비암, 과증식 세포 장애 및 감염)을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여 대상에게 투여된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 하나 이상의 다른 치료 요법과 조합하여 투여된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 하나 이상의 다른 치료요법과 동시에(concurrently), 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 바람직하게는, 이러한 치료 요법은 이러한 장애의 치료에 유용하다. 용어, "동시에(concurrently)"는 치료 요법의 투여가 정확히 같은 시각에 이루어지는 것에 제한되지 않고, 그 보다는 본 발명의 EphA2-BiTE 및 다른 치료요법들이 대상에게 연속으로 그리고 시간 간격을 두고 투여되어, 그렇지 않은 경우와 비교하여, 본 발명의 항체들이 보다 유리한 효과를 제공할 수 있도록 다른 치료요법들과 서로 작용했음을 의미한다. 예를 들어, 각 치료요법은 같은 시간에 또는 상이한 시각에 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다; 그러나, 같은 시간에 투여되지 않는 경우에도 원하는 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 이들은 시간적으로 충분히 가깝게 투여되어야 한다. 각 치료요법은 별도로 투여될 수 있고, 임의의 적합한 형태로, 그리고 임의의 적당한 경로로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 외과수술 이전, 동시 또는 이후에 투여된다. 바람직하게는 외과수술은 국소화된 종양을 완전히 제거하거나, 또는 큰 종양의 사이즈를 축소한다. 외과수술은 또한, 예방적 조치 또는 고통 경감을 위해 시행될 수 있다.

다양한 구체예에서, 치료 요법은 1 시간 미만을 두고(apart), 약 1 시간 내지 약 2시간을 두고, 약 2 시간 내지 약 3 시간을 두고, 약 3 시간 내지 약 4시간을 두고, 약 4 시간 내지 약 5 시간을 두고, 약 5 시간 내지 약 6시간을 두고, 약 6 시간 내지 약 7 시간을 두고, 약 7 시간 내지 약 8시간을 두고, 약 8 시간 내지 약 9 시간을 두고, 약 9 시간 내지 약 10시간을 두고, 약 10 시간 내지 약 11 시간을 두고, 약 11 시간 내지 약 12시간을 두고, 24 시간 이상은 두지 않고, 48 시간 이상은 두지 않고, 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 2 이상의 성분이 동일 환자 내원시 투여된다.

여기서 제공되는 단위투여량(dosage)의 양 및 투여빈도는 치료적으로 효과적 및 예방적으로 효과적이라는 용어에 포함된다. 단위투여량 및 빈도는 또한, 일반적으로 투여되는 구체적 치료요법, 암의 경중 및 타입, 투여경로와 함께, 환자의 연령, 체중, 응답성 및 의료이력에 따라 각 환자에게 특이한 인자에 따라 변할 수 있다. 적당한 처방은 상기한 인자 및 다음의, 예를 들어, Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)라는 문헌에 기록된 단위투여량을 고려함으로써, 당업자가 선택할 수 있다.

5.4.1 환자 집단

5.4.1.1. 암 환자

본 발명은 본 발명의 EphA2-BiTE의 하나 이상을 치료적으로 또는 예방적으로 유효량으로 대상에 투여함으로써, 암을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 하나 이상의 다른 치료 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 대상은 동물이고, 바람직하게는 포유동물, 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 등) 및 영장류{예를 들어, 원숭이, 사이노몰거스 원숭이 및 인간)이다. 바람직한 실시예에서, 대상는 인간이다.

본 발명에 의해 포괄되는 방법에 의해 치료될 수 있는 구체적인 암의 예는 EphA2을 과다발현하는 암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 구체예에서, 암은 상피 기원이다. 이러한 암의 추가예들은 폐암, 대장암, 전립선암, 유방암 및 피부암이다. 추가적인 암은 infra 섹션 5.4.1.2의 실시예에 기술되나 이에 제한 되지는 않는다. 특히, 구체적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 1차 종양으로부터의 전이를 치료, 예방 및/또는 관리하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 암에 걸린 또는 걸릴 것으로 예측되는, 즉, 특정 타입의 암에 대하여 유전적 소질이 있거나, 발암물질에 노출되어 왔거나, 특정 암이 완화되고 있는 상태의 대상/환자에게 본 발명의 EphA2-BiTE을 하나 이상 투여하는 것을 포함한다. 여기서 사용되는 바와 같이, "암" 은 원발성(primary) 또는 전이(metastatic) 암을 가리킨다. 이러한 환자는 이전에 암을 치료받았거나, 치료받지 않았을 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 어떠한 라인의 치료요법, 예를 들어, 제1, 제2, 제3, 등의 치료요법의 라인으로서 사용될 수 있다. 본 발명에는, 또한, 다른 암치료요법을 겪는 환자의 치료가 포함되고, 본 발명의 방법 및 조성물은 다른 암 치료 요법의 임의의 부작용 또는 과민증(intolerance)이 일어나기 전에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 EphA2-BiTE을, 불응성(refractory) 환자의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여 투여하는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료요법에 불응성인 암이란 암세포의 적어도 몇몇 중요한 부분이 죽지 않거나, 또는 그들의 세포 분화가 멈춰지지 않는 것을 의미한다. 암세포가 불응성인 지 여부의 결정은 이 기술분야에서 받아들여지는 문맥상 "불응성"의 의미를 사용하여, 암세포에 대한 치료요법의 유효성을 어세이하기 위한 기술분야에서 알려진 임의의 방법을 생체 내 또는 시험관 내로 행해질 수 있다. 다양한 구체예에서, 암세포의 수가 유의적으로 감소되지 않거나 증가된 경우에, 암은 불응성이다. 본 발명은 또한 암을 가질 소질이 있는 환자에게, 암의 발명(onset) 또는 재 발(recurrence)을 예방하기 위하여 하나 이상의 EphA2-BiTE을 투여하는 것을 포함한다.

구체적인 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE, 또는 EphA2 발현을 감소시키는 다른 치료요법들이 투여됨으로써, 암세포의 특정 호르몬, 방사 및 화학치료용 약제에 대한 내성 또는 감소된 민감성을 돌려놓아서, 이들 약제 하나이상에 암세포가 다시 민감하게 함으로써, 전이 예방을 포함하여, 암을 치료 또는 관리하도록 투여될 수 있게(또는 계속적으로 투여되게) 한다.

다른 구체예에서, 본 발명은, 다른 치료에 불응성으로 판명되나 이 방법들에 더이상 진행중이지 않은 환자들에게 본 발명의 EphA2-BiTE과 하나 이상의 다른 치료요법을 조합하여 투여함으로써, 환자의 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 환자는 이미, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법, 또는 생물학 치료요법/면역치료요법에 의해 치료 중인 환자들이다. 이들 환자들 중에는, 진행중인(existing) 암치료 요법이 존재하나, 이에 불응성인 환자 및 암을 가진 사람들이 포함된다. 다른 구체예에서, 환자들은 치료되었고, 질환 활성이 없고, 본 발명의 EphA2-BiTE이 암의 재발을 예방하기 위해 투여된다.

바람직한 구체예에서, 진행중인 치료는 화학지료이다. 구체적인 구체예에서, 진행중인 치료는 다음과 같은 화학치료를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 메토트렉세이트(methotrexate), 탁솔(taxol), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 시클로 포스파미드, 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosoureas), 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 다카르바진, 프로카르바진(procarbizine), 에토포시드, 캄파테신(campathecins), 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신( daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신, 미토산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 파클리탁셀, 도세탁셀 등. 이들 환자들은 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법 및/또는 생물학 치료요법/면역치료요법을 받은 환자들이 포함된다. 이들 환자들은, 암의 치료를 위해 외과수술을 한 사람들을 포함한다.

또 다른 방법으로서, 본 발명은 또한, 방사선 치료요법은 받은 또는 받고 있는 환자의 치료방법을 포함한다. 이들 환자들은 화학치료요법, 호르몬 치료요법 및/또는 생물학 치료요법/면역치료요법으로 치료를 받고 있거나, 이전에 치료받은 환자들을 포함한다. 또한, 이들 환자들은 암의 치료를 위한 외과수술을 받은 사람을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 호르몬 치료요법 및/또는 생물학 치료요법/면역치료요법을 받고 있거나, 받은 환자들을 치료하기 위한 방법을 포함한다. 이들 환자들은 화학치료요법 및/또는 방사선 치료요법을 받고 있거나, 받은 환자들은 포함한다. 또한, 이들 환자들은 암의 치료를 위해 외과수술을 받은 환자를 포함한다.

추가로, 본 발명은 또한 그 치료요법이 유독하다는 것이 판명되거나 판명될 수 있어서, 즉, 받아들이기 어려운(unacceptable) 또는 참기 힘든(unvearable) 부작용을 가져오는, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법에 대한 대안으 로서, 암 치료방법을 제공한다. 본 발명의 방법으로 치료되는 대상는 그 치료가 받아들일 수 없거나 참을 수 없다고 알려진 치료가 무엇인지에 따라, 임의로, 이러한 외과수술, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법 또는 생물학 치료요법과 같은 다른 암치료에 의하여 치료된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 암 치료를 위한 암치료법 중 이러한 치료에 불응성이라고 판명된 암 치료법을 사용하지 않고, 본 발명의 EphA2-BiTE을 하나 이상 투여하는 것을 제공한다. 특정 구체예들에서, 다른 암치료요법에 불응성이 환자들에는 다른 암치료요법 없이, 본 발명의 EphA2-BiTE이 하나 이상 투여된다.

다른 구체예에서, EphA2을 과다발현하는 세포와 관련된 전암성 상태의 환자에게 본 발명의 EphA2-BiTE을 투여함으로써, 그 장애를 치료하고 악성 암으로 진행될 가능성을 줄인다. 특정 구체예들에서, 전암성 상태는 높은 등급의 전립선 상피 이상증식(PIN), 유방의 섬유선종, 섬유낭종성 질환, 또는 복합 모반이다.

5.4.1.2. 암

본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료, 예방 및/또는 관리될 수 있는 암 및 관련 장애는 다음과 같으나, 이에 한정되지는 않는다:백혈병(leukemias), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 급성(acute leukemia), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수구성(acute myelocytic leukemias), 예를 들어, 골수성(myeloblastic), 전골수구성(promyelocytic), 골수단구성(myelomonocytic), 단핵구성(monocytic), 및 적백혈병(Erythroleukemia leukemias)와 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome); 만성 백혈병, 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 만성 골수구성 백혈병(chronic myelocytic, (과립구성(granulocytic)) leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 모양 세포성 백혈병(hairy cell leukemia); 적혈구 증가증(polycythemia vera); 임파종(lymphomas), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 호킨스 질환 (Hodgkin's disease), 비-호킨스 질환(non-Hodgkin's disease); 다발 골수종(multiple myelomas), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 스몰더링 다발 골수종(smoldering multiple myeloma), 비분비 골수종( nonsecretory myeloma), 골경화성골수종(osteosclerotic myeloma), 플라즈마 세포 백혈병(plasma cell leukemia), 독립성 골수종(solitary plasmacytoma) 및 수질외 골수종(Extramedullary plasmacytoma); 발덴슈트롬 거대글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia); 비측정된 유의성의 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance); 양성 모노클로날 감마병증(benign monoclonal gammopathy); 중쇄(heavy chain) 질환; 뼈 및 연결 조직 육종(bone 및 connective tissue sarcomas), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 뼈 육종(bone sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 악성 거인 세포 종양, 뼈의 섬유육종(fibrosarcoma of bone), 척색종(chordoma), 골막성 육종(periosteal sarcoma), 연조직 육종(soft-tissue sarcomas), 혈관육종(angiosarcoma) (hemangiosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 평활근종(leiomyosarcoma), 지방종(liposarcoma), 림프관 육종(lymphangiosarcoma), 신경초종(neurilemmoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 활막 육종(synovial sarcoma); 뇌종양, 이에 한정되 는 것은 아니나 예를 들면, 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 뇌간교세포종(brain stem glioma), 상의세포종(ependymoma), 핍지교종(oligodendroglioma), 비신경아교종(nonglial tumor), 청신경초종(acoustic neurinoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 수모세포종(medulloblastoma), 뇌수막종(meningioma), 송과세포종(pineocytoma), 송과모세포증(pineoblastoma), 원발성 뇌 림프종(primary brain lymphoma); 유방암, 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 선암(adenocarcinoma), 소엽성 암종(lobular (small cell) carcinoma), 유관 상피내암(intraductal carcinoma), 수양암(medullary breast cancer), 점액성 유방암(mucinous breast cancer), 관형 유방암(tubular breast cancer), 유두암(papillary breast cancer), 파제트병(Paget' s disease), 및 염증성 유방암; 신장암, 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 갈색세포종(pheochromocytom) 및 부신피질 암(drenocortical carcinoma); 갑상선 암(thyroid cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 유두형(papillary) 또는 여포형(follicular) 갑상선 암, 수질암(medullary thyroid cancer) 및 갑상선 미분화 암(anaplastic thyroid cancer); 췌장암(pancreatic cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 인슐린종(insulinoma), 가스트린종(gastrinoma), 글루카곤종(glucagonoma), VIP종(vipoma), 소마토스테틴-분비 종양(somatostatin-secreting tumor), 및 유암종(carcinoid) 또는 랑게르한스섬(islet) 세포 종양; 뇌하수체 암, 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 쿠싱병(Cushing's diease), 프로락틴-분비 종양(prolactin-secreting tumor), 말단비대증(acromegaly) 및 요붕증(diabetes insipius); 안암, 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 안구 흑색종(ocular melanoma), 예를 들면, 홍채 흑색종(iris melanoma), 맥락막 흑색종 (Choroidal melanoma) 및 모양체 흑색종(cilliary body melanoma), 및 망막모세포종 (Retinoblastoma); 질암(vaginal cancer), 예를 들면, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 샘암종(adenocarcinoma) 및 흑색종; 외음암(vulvar cancer), 예를 들면, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 흑색종, 샘암종(adenocarcinoma), 기저 세포암(basal cell carcinoma), 육종(sarcoma), 및 파제트 병(Paget's disease); 자궁경부암(cervical cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 편평 상피 세포암(squamous cell carcinoma) 및 샘암종(adenocarcinoma); 자궁암(uterine cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 자궁내막암(endometrial carcinoma) 및 자궁 육종(uterine sarcoma); 난소암(ovarian cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 난소 상피 암종, 경계선 종양(borderline tumor), 생식 세포 종양(germ cell tumor), 및 기질 종양(stromal tumor); 식도암(esophageal cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 편평세포암(squamous cancer), 샘암종(adenocarcinoma), 선양낭성암종(adenoid cystic carcinoma), 악성 전막표피양암(mucoepidermoid carcinoma), 선편평 암종( adenosquamous carcinoma), 육종(sarcoma), 흑색종, 악성 형질세포종 (plasmacytoma), 우췌상 암종(verrucous carcinoma), 및 귀리 세포암(oat cell (작은 세포: small cell) carcinoma); 위암(stomach cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 샘암종(adenocarcinoma), 종괴형(fungating) (용종형(polypoid)), 궤양성(ulcerating), 표층 팽창형(superficial spreading), 미만 침윤형(diffusely spreading), 악성 림프종(lymphoma), 지방육종(liposarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 및 암육종(carcinosarcoma); 대장암(colon cancers); 직장암(rectal cancers); 간암(liver cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 간세포암(hepatocellular carcinoma) 및 간모세포종(hepatoblastoma); 당낭암(Gallbladder cancer), 예를 들면, 샘암종(adenocarcinoma); 담관상피암종(cholangiocarcinoma), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 유두형(pappillary), 결절성(nodular) 및 미만성(diffuse); 폐암(lung cancer), 예를 들면 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 편평세포암종(squamous cell carcinoma) (epidermoid carcinoma), 샘암종(adenocarcinoma), 대세포 암종(large-cell carcinoma) 및 소세포 폐암(small-cell lung cancer); 고환암(testicular cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 배세포 종양(germinal tumor), 고환종(seminoma), 미분화암(anaplastic), 원형(classic) (typical), 정모세포(spermatocyte), 비정상피종(nonseminoma), 배아암종(embryonal carcinoma), 편평상피암(teratoma carcinoma), 융모상피암(choriocarcinoma (yolk-sac 종양)), 전립선암(prostate cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 샘암종(adenocarcinoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 및 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 음경(penal cancers); 구강암(oral cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 편평세포암종(squamous cell carcinoma); 기저 세포 피부암 (basal cancers); 타액선암(salivary gland cancer), 이에 한정되는 것은 아니 나 예를 들면, 샘암종(adenocarcinoma), 점액 표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma), 및 선상낭포암 (adenoidcystic carcinoma); 인두암(Pharyngeal cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 편평세포암종(squamous cell cancer), 및 우췌상(verrucous); 피부암(skin cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 기저세포 피부암(basal cell carcinoma), 편평세포암종 및 흑색종, 표층 팽창형 흑색종, 표재 확장성 흑색종(nodular melanoma), 흑색점 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma), 악성 흑자 흑색종(acral lentiginous melanoma); 신장암(kidney cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 콩팥세포암종(renal cell carcinoma), 샘암종(adenocarcinoma), 부신종(hypernephroma), 섬유종(fibrosarcoma), 이행세포암종(transitional cell cancer) (신우(renal pelvis) 및/또는 요로(uterer); 윌름즈 종양(Wilms' tumor); 방광암(bladder cancer), 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들면, 이행세포암종(transitional cell carcinoma), 편평상피세포 암종(squamous cell cancer), 샘암종(adenocarcinoma), 암육종(carcinosarcoma).

추가로, 다음의 암을 포함한다: 월발성 심장 혼합육종(myxosarcoma), 골육종(osteogenic sarcoma), 내피육종(endotheliosarcoma), 임파절내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 중피종(mesothelioma), 윤활막종(synovioma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 상피 암종, 난소암(cystadenocarcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 땀샘 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma) 및 유두선 암(papillary adenocarcinoma).

이러한 장애의 리뷰를 위해서는 다음을 참조한다 : Fishman 등, 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia 및 Murphy 등, 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Therapy, 및 Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).

따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 또한, 이에 한정하는 것은 아니나 하기에 예를 든, 다양한 암 또는 비정상적 증식성 질환의 치료, 예방, 및/또는 관리에도 유용하다. 즉, 암종으로서, 다음의 암종을 포함 : 방광, 유방, 대장, 신장, 간, 폐, 자궁, 췌장, 위, 경부(cervix), 갑상선 및 피부; 편평 세포암종을 포함; 림프계 질환의 혈액 종양으로서, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, B-세포 림프종, T-cell 림프종, 버킷(Burkitt's) 림프종을 포함; 림프계 질환의 조혈모 세포 종양으로서 급성 및 만성 골수원성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 포함; 중간엽 기원의 종양들로서 섬유육종(fibrosarcoma) 및 횡문근육종(rhabdomyoscarcoma)을 포함; 다른 종양들로서 흑색종, 고환종(seminoma), 기형암종(tetratocarcinoma), 신경아세포종(neuroblastoma) 및 신경아교종(glioma)을 포함; 중추 및 말포 신경 시스템의 종양들로서 별아교세포종(astrocytoma), 신경아세포종( neuroblastoma), 신경아교종(glioma), 및 신경초종(schwannomas)을 포함; 중간엽 기원의 종양들로서 섬유종(fibrosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyoscarama) 및 골육종을 포함; 그리고, 흑색종, 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum), 각화 극세포증(keratoactanthoma), 고환종(seminoma), 갑상성 유두암 및 기형암종을 포함하는 다른 종양들.

비정상적 아폽토시스로 인해 유발되는 암 역시 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 암은, 이들에 한정되는 것은 아니나 예를 들면 다음과 같다 : 여포성 림프종(follicular lymphomas), p53 돌연변이를 가지는 암종, 유방, 전립성 및 난소의 호르몬 의존성 종양, 및 전암적(precancerous) 사마귀, 예를 들어, 가족성 용종증(familial adenomatous polyposis) 및 골수이형성증.

특정 구체예들에서, 악성 또는 이상증식성 (dysproliferative) 변화 (예를 들어, 변질(metaplasias) 및 형성이상(dysplasias)), 또는 과증식 세포 장애가, 피부, 폐, 대장, 유방, 전립성, 방광, 신장, 췌장, 난소 또는 요로에서 치료 또는 예방되었고, 그 외의 특정 예들, 육종, 흑색종, 또는 백혈병이 치료 또는 예방된다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의하여, 치료, 예방 및/또는 관리되는 암은 상피 기원이다. 다른 구체예에서, 그 암은 악성이고 EphA2을 과다발현한다. 특정 구체예에서, 그 암은 EphA2을 비정상적으로 발현하는 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 치료되는 장애는 EphA2를 과다발현시키는 세포와 관련된 전암성 상태이다. 특정 구체예에서, 전암성 상태(pre-cancerous condition)는 고도의 전립선 상피내 종양(PIN), 유방의 섬유샘종, 섬유낭성 질환 또는 섬유낭종성 질환 또는 복합 모반이다.

특정 구체예들에서, 특정 구체예들에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의하 여, 치료, 예방 및/또는 관리되는 암은 유방, 대장, 난소, 폐 및 전립선 암과 피부암이고, 예를 들어, 흑색종이다.

5.4.1.3. 유방암의 치료

특정 구체예들에서, 유방암을 가지는 본 발명의 환자들에게 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2 -BiTEs이 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 유방암 치료요법에 유용한 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여되고, 이 다른 약제들은, 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 다음과 같다: 독소루비신, 에피루비신, 독소루비신 및 사이클로포스파미드 (AC)의 조합, 사이클로포스파미드, 독소루비신 및 5-플루오로우라실 (CAF)의 조합, 사이클로포스파미드, 에피루비신 및 5-플루오로우라실 (CEF)의 조합, 헤르셉틴, 타목시펜, 타목시펜 및 세포 독성 화학치료요법의 조합, 탁사네스(예를 들어, 도세탁셀 및 파클리탁셀). 추가의 구체예에서, 본 발명의 EphA2 -BiTEs은 임파절-양성, 국소 유방암의 보조(adjuvant) 치료를 위한 탁사네스 플러스 표준 독소루비신 및 사이클로포스파미드로 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 유방 또는 섬유낭성 질환의 전암성(pre-cancerous) 섬유종을 가지는 환자는, 상기 장애를 치료하고, 악성 유방암으로 진행할 가능성을 줄이기 위해 본 발명의 EphA2-BiTE을 투여한다.

5.4.1.4. 대장암의 치료

특정 구체예들에서, 대장암을 가지는 환자들에게 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2 -BiTEs이 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체들은 대장암 치료요법에 유용한 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 약제들은, 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 다음과 같다: 5-FU 및 루코보린의 조합, 5-FU 및 레바미솔, 이리노테칸 (CPT-11) 또는이리노테칸, 5-FU 및 루코보린 (IFL)의 조합.

5.4.1.5. 전립선 암의 치료

특정 구체예들에서, 전립선 암을 가진 환자에게, 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE이 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 전립선 암 치료요법에 유용한 유효량의 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 이 약제들은, 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 다음과 같다: 외부-빔 방사선 치료요법, 방사성 동위원소 (즉, I¹²⁵, 팔라듐, 이리듐)의 간질내 삽입(interstitial implantation), 루프롤리드 또는 다른 LHRH 작용제, 비스테로이드성 항안드로젠제 (플루타미드, 니루타미드, 바이칼루타미드), 스테로이드성 항안드로젠제 (사이프로테론 아세테이트), 루프롤리드 및 플루타미드의 조합, 에스트로겐, 예를 들면, DES, 클로로트리아니센, 에티닐 에스트라디올, 컨쥬게이티드 에스트로겐 U.S.P., DES-디포스페이트, 방사성 동위원소, 예를 들면, 스트론튬- 89, 외부-빔 방사선 치료요법 및 스트론튬-89의 조합, 2차-라인 호르몬 치료 요법, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 하이드로코르티손, 플루타미드 위축(withdrawal), 프로게스테론, 및 케토코나졸, 저-용량 프레드니손, 또는 PSA 수준의 감소 및 증상의 객관적 개선을 가져온다고 보고된 다른 화학치료요법 처방으로서, 도세탁셀, 파 클리탁셀, 에스트라무스틴/도세탁셀, 에스트라무스틴/에토포시드, 에스트라무스틴/빈블라스틴, 및 에스트라무스틴/파클리탁셀을 포함하는 것.

특정 구체예에서, 전암성(pre-cancerous) 전립선 상피내 종양(PIN)을 갖는 환자에게, 장애 및 악성 전립성 암을 진행시킬 가능성을 줄이기 위하여, 본 발명의 EphA2-BiTE이 투여된다.

5.4.1.6. 흑색종의 치료

특정 구체예들에서, 흑색종을 가지는 환자에게 유효량의, 하나 이상의 다른 흑색종 암 치료요법에 유용한 약제들과 조합하여 본 발명의 EphA2-BiTE이 투여된다. 상기 약제는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 다카르바진 (DTIC), 니트로로우레아, 예를 들면, 카르무스틴 (BCNU) 및 로무스틴 (CCNU), 온화한 단일 약제 활성을 가지는 약제로서, 다음을 포함함 빈카 알칼로이드, 백금 화합물, 및 탁사네스, 다트무스 처방(시스플라틴, BCNU, 및 DTIC), 인터페논 알파(IFN-A), 및 인터루킨-2 (IL-2). 특정 구체예에서, 증상의 완화 및 방사선 치료요법으로 종양의 일부 축소를 얻기 위하여, 다발성 뇌전이(multiple brain metastases), 뼈 전이, 및 척수 압박 증상을 가지는 환자에게, 유효량의, 하나 이상의, 본 발명의 EphA2 -BiTEs을, 멜파란(melphalan) (L-PAM)과 함께, 고온 사지 격리 관류법(isolated hyperthermic limb perfusion) (ILP)으로, 종양 괴사 인자-alpha (TNF-alpha)의 존재 혹은 부존재하에, 투여할 수 있다.

특정 구체예에서, 장애 및 악성 흑색종으로 진행할 가능성을 줄이기 위하여, 전암성 복합 모반을 갖는 환자에게, 본 발명의 EphA2 -BiTEs이 투여된다.

5.4.1.7. 난소암의 치료

특정 구체예에서, 난소암을 가진 환자에게, 유효량의, 하나 이상의, 본 발명의 EphA2 -BiTEs이 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은, 유효량의, 난소암 치료요법에 유용한 하나 이상의 다른 약제와 함께, 투여될 수 있다. 상기 난소암 치료요법은 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 다음과 같다: 복강내(intraperitoneal) 방사선 치료요법, 예를 들면, P³² 치료요법, 전 복식(total abdominal) 및 골반(pelvic) 방사선 치료요법, 시스플라틴, 파클리탁셀 (탁솔) 또는 도세탁셀 (탁소테르) 및 시스플라틴 또는 카르보플라틴의 조합, 사이클로포스파미드 및 시스플라틴의 조합, 사이클로포스파미드 및 카르보플라틴의 조합, 5-FU 및 루코보린의 조합, 에토포시드, 리포솜 독소루비신, 겜시타빈(gemcitabine) 또는 토포테칸(topotecan). 유효량의, 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE은 백금-불응성 질환을 가지는 환자를 위해, 탁솔 투여와 조합하여 투여됨이 고려된다. 불응성 난소암을 가지는 환자의 치료에는, 다음의 투여가 포함된다: 시스플라틴-기초 조합 처방의 실패 후에, 백금-불응성이고, 헥사메틸멜라민(HMM)의 질환을 가지는 환자에게는, 샐비지 화학치료요법으로서, 이포스파미드(ifosfamide)를, 그리고, 그들의 종양에 검출가능한 수준의 세포질 에스트로겐 수용체를 가지는 환자에게는 타목시펜(tamoxifen)을 투여함.

5.4.1.8. 폐암의 치료

특정 구체예에서, 소세포폐암(small lung cell cancer)을 가진 환자에게, 유 효량의, 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE이 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은 유효량의, 폐암 치료요법에 유용한 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 상기 약제의 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 흉곽(thoracic) 방사선 치료요법, 시스플라틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 및 에토포시드을, 단독 또는 조합으로 투여함, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴/에토포시드, 및 시스플라틴 (CAV/EP)의 조합, 기관지 레이저 치료요법의 국소 보조요법, 기관지 스텐트 및/또는 근접치료요법(brachytherapy).

다른 특정 구체예에서, 소세포폐암을 가지는 환자에게, 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE가, 폐암 치료요법에 유용한, 유효량의, 하나 이상의 다른 약제들과 조합하여 투여된다. 상기 다른 약제들의 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 보조적(palliative) 방사선 치료요법, 시스플라틴, 빈블라스틴 및 미토마이신의 조합, 시스플라틴 및 비노렐빈(vinorelbine)의 조합, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 겜시타빈, 카르보플라틴 및 파클리탁셀의 조합, 기관지 병변 또는 정위 방사선외과수술(stereotactic radiosurgery)을 위한 기관지 근접(interstitial) 방사선 치료요법.

5.4.2 다른 예방적 /치료용 약제

몇몇 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE을 하나 이상 투여하는 치료요법은, 하나 이상의 다른 치료요법의 투여와 조합된다. 이 다른 치료요법의 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 화학치료 요법, 방사선 치료 요법, 호르몬 치료 요법, 및/또는 생물학적 치료 요법/면역치료 요법.

예방적(prophylactic) 또는 치료용 약제는 다음을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 단백질성 분자로서 다음을 포함하나 이에 한정되지 않음 - 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 후-번역 변형된 단백질을 포함함, 항체들 등; 또는 소분자(1000 달톤 미만), 무기 또는 유기 화합물; 또는 핵산 분자로서 다음을 포함하나 이에 한정되지 않음 - 이중가닥 또는 단일가닥 DNA, 또는 이중가닥 또는 단일가닥 RNA, 이와 더불어 삼중 헬릭스 핵산 분자.

예방적 또는 치료용 약제는 알려진 유기체로부터(다음을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다 - 동물, 식물, 박테리아, 곰팡이 및 원생생물(protista), 또는 바이러스), 또는 합성분자 라이브러리로부터 유도될 수 있다. 이러한 치료 요법은 본 발명의 EphA2-BiTE을 하나 이상 투여하기 전에, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은, 본 발명의 EphA2-BiTE와 조합하여, 키나제의 억제제인 예방적/치료용 약제를 하나 이상 투여하는 것을 포함한다. 상기 키나제 억제제의 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다: ABL, ACK, AFK, AKT (예를 들어,AKT-I, AKT-2, 및 KT-3), ALK, AMP-PK, ATM, Auroral, Aurora2, bARKl, bArk2, BLK, BMX, BTK, CAK, CaM kinase, CDC2, CDK, CK, COT, CTD, DNA-PK, EGF-R, ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4, ERK (예를 들어,ERKl, ERK2, ERK3, ERK4, ERK5, ERK6, ERK7), ERT-PK, FAK, FGR (예를 들어,FGFlR, FGF2R), FLT (예를 들어,FLT-I, FLT-2, FLT-3, FLT-4), FRK, FYN, GSK (예를 들어, GSKl, GSK2, GSK3-alpha, GSK3-beta, GSK4, GSK5), G-단백질 커플 수용체 키나제 (GRKs), HCK, HER2, HKII, JAK (예를 들어, JAKl, JAK2, JAK3, JAK4), JNK (예를 들어,JNKl, JNK2, JNK3), KDR, KIT, IGF-I 수용체, IKK-I, IKK-2, INSR (인슐린 수용체), IRAKI, IRAK2, IRK₅ ITK, LCK, LOK, LYN, MAPK, MAPKAPK-I, MAPKAPK-2, MEK, MET, MFPK, MHCK, MLCK₅ MLK3, NEU, NIK, PDGF 수용체 alpha, PDGF 수용체 beta, PHK, PI-3 kinase, PKA, PKB, PKC, PKG, PRKl, PYK2, p38 kinases, pl35tyk2, p34cdc2, p42cdc2, p42mapk, p44mpk, RAF, RET, RIP, RIP-2, RK, RON, RS kinase, SRC, SYK, S6K, TAKl, TEC, TIEl₅ TIE2, TRKA, TXK, TYK2, UL13, VEGFRl, VEGFR2, YES₅ YRK, ZAP-70, 및 이들 키나제의 서브타입 ll(참조 : Hardie 및 Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I 및 II, Academic Press, San Diego, Calif.).

바람직한 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE은, Eph 수용체 키나제의 억제제인 하나 이상의 예방적/치료적 약제(예를 들어, EphA2)의 투여를 조합하여 투여된다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 은, EphA2의 억제제인 예방적/치료적 약제를 하나 이상 조합하여 투여한다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은, 본 발명의 EphA2-BiTE와 함께, 혈관 신생 억제제인 예방적/치료용 약제를 하나 이상 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 상기 약제의 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 안지오스타틴 (플라스미노겐 절편); 항-신생혈관생성 안티트롬빈 III; 엔지오자임(Angiozyme); ABT-627; Bay 12-9566; 베네픔(Benefm); 베카시주맙(Bevacizumab); BMS-275291; 연골유도(cartilage- derived) 억제제 (CDI); CAI; CD59 보체 절편; CEP-7055; Col 3; Combretastatin A-4; 엔도스타틴(Endostatin) (콜라겐 XVIII 절편); 피브로넥틴(fibronectin) 절편; Gro-beta; 할로푸지논(Halofuginone); 헤파리나제(Heparinases); 헤파린 헥사사카라이드(Heparin hexasaccharide) 절편; HMV833; 인간 만성 고나도트로핀(Human chorionic gonadotropin) (hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도가능 단백질 (IP-10); 인터루킨-12; Kringle 5 (플라스미노겐 절편); Marimastat; 금속단백분해효소(Metalloproteinase) 억제제 (TIMPs); 2-메톡시에스트라디올; MMI 270 (CGS 27023 A); MoAb IMC-ICl 1; 네오바스타트(Neovastat); NM-3; 판잠(Panzem); PI-88; 태반 리보뉴클레아제(Placental ribonuclease) 억제제; 플라스미노겐 활성자 억제제; 혈소판 인자 -4(Platelet factor-4)(PF4); 프리노마스태트(Prinomastat); 프로락틴(Prolactin) 16kD 절편; 프로리퍼린-관련(Proliferin-related) 단백질 (PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드(Retinoids); 솔리마스타트(Solimastat); 스쿠알아민(Squalamine); SS 3304; SU 5416; SU6668; SUl 1248; Tetrahydrocortisol-S; tetrathiomolybdate; 탈리도마이드(thalidomide); 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1 (TSP-I); TNP-470; 형질전환 성장인자-베타 (TGF-

); 바스큘로스타틴(Vasculostatin); 바소스타틴(Vasostatin) (칼레티큘린 절편); ZD6126; ZD6474; 파아네실 트랜스퍼레이즈(farnesyl transferase) 억제제 (FTI); 및 비스포스포네이트.

다른 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은, 본 발명의 EphA2-BiTE와 함께, 항암제인 예방적/치료용 약제를 하나 이상 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 상기 약제의 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 아시비신(acivicin), 아 크라루비신(aclarubicin), 염화아코다졸(acodazole hydrochloride), 아크로닌(acronine), 아도젤레신(adozelesin), 알데스루킨(aldesleukin), 알트레트아민(altretamine), 암보마이신(ambomycin), 아메탄트론 아세테이트(ametantrone acetate), 아미노글루테티미드, 암사크린(amsacrine), 아나스트로졸(anastrozole),안트라마이신(anthramycin),아스파라기나제(asparaginase), 아스펄린(asperlin), 아자시티딘(azacitidine), 아제테파(azetepa), 아조토마이신(azotomycin), 베티마스태트(batimastat), 벤조데파(benzodepa), 바이칼루타미드, 염화비스안트렌(bisantrene hydrochloride), 비스나피드 디메실레이트(bisnafide dimesylate), 바이젤레신(bizelesin), 블레오마이신설페이트(bleomycin sulfate), 소듐브레키나르(brequinar sodium), 브로피리민(bropirimine), 부술판(busulfan), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼루스테론(calusterone), 카라세마이드(caracemide), 카르베타이머(carbetimer), 카르보플라틴, 카르무스틴, 염화카루비신(carubicin hydrochloride), 카르젤레신(carzelesin), 세데핀골(cedefingol), 클로암부실(chlorambucil), 시롤레마이신(cirolemycin), 시스플라틴, 클라드리빈(cladribine), 크리스나톨 메실레이트(crisnatol mesylate), 사이클로포스파미드, 시타라빈(cytarabine), 다카르바진, 닥티노마이신(dactinomycin), 염화다우노루비신(daunorubicin hydrochloride), 데카르바진(decarbazine), 데시타빈(decitabine), 덱소르마플라틴(dexormaplatin), 데자구아닌(dezaguanine), 데자구아닌 메실레이트(dezaguanine mesylate), 디아지퀴온(diaziquone), 도세탁셀, 독소루비신, 염화독소루비신, 드롤옥시펜(droloxifene), 드롤옥시펜 시트레이 트(droloxifene citrate), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 두아조마이신(duazomycin), 에다트렉스에이트(edatrexate), 염화에플로니틴(eflornithine hydrochloride), 엘사미트루신(elsamitrucin), 엔로플라틴(enloplatin), 엔프로메이트(enpromate), 에피프로피딘(epipropidine), 염화에피루비신, 에르부로졸, 염화에소루비신, 에스트라무스틴, 에스트라무스틴 포스페이트 소듐, 에타니다졸(etanidazole), 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 에토프린(etoprine), 염화파드로졸(fadrozole hydrochloride), 파자라빈(fazarabine), 펜레티나이드(fenretinide), 플록수리딘(floxuridine), 플루다라딘 포스페이트(fludarabine phosphate), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루오로시타빈(flurocitabine), 포스퀴돈(fosquidone), 포스트리에신 소듐(fostriecin sodium), 겜시타빈(gemcitabine), 염화 겜시타빈(gemcitabine hydrochloride), 히드록시우레아(hydroxyurea), 염화 이다루비신(idarubicin hydrochloride), 이포스파마이드(ifosfamide), 일모포신(ilmofosine), 인터루킨 2 (재조합 인터루킨 2을 포함), (또는 rIL2)), (인터페론 alpha-2a), (인터페론 알파-2b), (인터페론 알파-nl), (인터페론 알파-n3), (인터페론 베타-I a), (인터페론 감마-Ib), 이프로플라틴(iproplatin), 염화 이리노테칸, 란레오타이드 아세테이트(lanreotide acetate), 레트로졸(letrozole), 루프롤리드 아세테이트, 염화 리아로졸(liarozole hydrochloride), 소듐 로메트렉솔(lometrexol sodium), 로무스틴, 염화 로속산트론 (losoxantrone hydrochloride), 마소프로콜(masoprocol), 메이탄신(maytansine), 염화 메클로레타민(mechlorethamine hydrochloride), 메게스트롤 아세테이 트(megestrol acetate), 멜렌게스트롤 아세테이트(melengestrol acetate), 멜파란(melphalan), 메노가릴(menogaril), 머캅토퓨릴(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 소듐 메토트렉세이트(methotrexate sodium), 메토프린(metoprine), 메트레데파(meturedepa), 미틴도마이드(mitindomide), 미토카르신(mitocarcin), 미토크로민(mitocromin), 미토길린(mitogillin), 미토말신(mitomalcin), 미토마이신, 미토스퍼(mitosper), 미토테인(mitotane), 염화 미톡산트론(mitoxantrone hydrochloride), 미코페놀산(mycophenolic acid), 니트로소우레아(nitrosoureas), 노코다졸(nocodazole), 노갈라마이신(nogalamycin), 올마플라틴(ormaplatin), 옥시수란(oxisuran), 파클리탁셀, 페가스파르가제(pegaspargase), 펠리마이신(peliomycin), 펜타무스틴(pentamustine), 페플로마이신 설페이트(peplomycin sulfate), 퍼포스파미드(perfosfamide), 피포브로만(pipobroman), 피포술판(piposulfan), 염화 피록산트론(piroxantrone hydrochloride), 플리카마이신(plicamycin), 플로메스테인(plomestane), 포르플머 소듐(porflmer sodium), 포르피로마이신(porfiromycin), 프레드니무스틴(prednimustine), 염화 프로카르바진(procarbazine hydrochloride), 프로마이신(puromycin), 염화 프로마이신(puromycin hydrochloride), 피라조퓨린(pyrazofurin), 리보프린(riboprine), 로글레티딘(rogletimide), 사핀골(safingol), 염화사핀골(safingol hydrochloride), 세무스틴(semustine), 심트라진(simtrazene), 스파르포세이트 소듐(sparfosate sodium), 스파르소마이신(sparsomycin), 염화 스피로게르마늄(spirogermanium hydrochloride), 스피로무스틴(spiromustine), 스피로플라틴(spiroplatin), 스트렙 토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 술로페너(sulofenur), 탈리소마이신(talisomycin), 테코갈란 소듐(tecogalan sodium), 테가퍼(tegafur), 염화 텔록산트론(teloxantrone hydrochloride), 테모포르핀(temoporfin), 테니포시드(teniposide), 테록시론(teroxirone), 테스톨락톤(testolactone), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 티아조퓨린(tiazofurin), 티라파자민(tirapazamine), 토레미펜 시트레이트(toremifene citrate), 트레스톨론 아세테이트(trestolone acetate), 트리시리빈 포스페이트(triciribine phosphate), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 트리메트렉세이트 글루크로네이트(trimetrexate glucuronate), 트립토레린(triptorelin), 염화 튜불로졸(tubulozole hydrochloride), 우라실 머스타드(uracil mustard), 유레데파(uredepa), 베프레오타이드(vapreotide), 베르테포르핀(verteporfin), 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신(vindesine), 빈데신 설페이트(vindesine sulfate), 비네피딘 설페이트(vinepidine sulfate), 빈글리시네이트 설페이트(vinglycinate sulfate), 빈루로신 설페이트(vinleurosine sulfate), 비노렐빈 타르트레이트(vinorelbine tartrate), 빈로시딘 설페이트(vinrosidine sulfate), 빈졸리딘 설페이트(vinzolidine sulfate), 보로졸(vorozole), 제니플라틴(zeniplatin), 지노스태틴(zinostatin), 염화조루비신(zorubicin hydrochloride).

다른 항암약의 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 20-epi-l,25 디히드록시 비타민 D3, 5-에티닐우라실(5-ethynyluracil), 아비라테 론(abiraterone), 아클라루비신(aclarubicin), 아실풀베인(acylfulvene), 아데시페놀(adecypenol), 아도젤레신(adozelesin), 알데스루킨(aldesleukin), 모든-TK 길항제, 알트레트아민(altretamine), 암바무스틴(ambamustine), 아미독스(amidox), 아미포스틴(amifostine), 아미노루블린산(aminolevulinic acid), 암루비신(amrubicin), 암사크린(amsacrine), 아나그라이드(anagrelide), 아나트로졸(anastrozole), 안드로그라폴리드(andrographolide), 신생혈관생성억제제, 길항제 D, 길항제 G, 안타레릭스(antarelix), (항-dorsalizing morphogenetic 단백질- 1), 항안드로젠제, 항에스트로겐, 항네오플라스톤, 아피디콜린 글리시네이트(aphidicolin glycinate), 아폽토시스 유전자 조절자(apoptosis gene modulators), 아폽토시스 조절자(apoptosis regulators), 아퓨린산(apurinic acid), ara-CDP-DL-PTBA, 아르기닌 디아미나제(arginine deaminase), 아술아크린 (asulacrine), 아타메스테인(atamestane), 아트리무스틴(atrimustine), 악시나스태틴(axinastatin 1), 악시나스태틴(axinastatin 2), 악시나스태틴(axinastatin 3), 아자세트론(azasetron), 아자톡신(azatoxin), 아자티로신(azatyrosine), 베카틴(baccatin) III 유도체, 발라놀(balanol), 바티마스태트(batimastat), BCR/ABL 길항제, 벤조콜린(benzochlorins), 벤조일스타우로스포린(benzoylstaurosporine), 베타 락탐 유도체, 베타-알레틴(beta-alethine), 베타클라마이신(betaclamycin B), 베튤린산(betulinic acid), bFGF 억제제, 바이칼루타미드, 비스안트렌(bisantrene), 비스아지리디닐스페러민(bisaziridinylspermine), 비스나피드(bisnafide), 비스트라틴(bistratene A), 바이젤레신(bizelesin), 브레피에이 트(brefiate), 브로피리민(bropirimine), 부도티탄(budotitane), 부티오닌 설폭시이민(buthionine sulfoximine), 칼시포트리올(calcipotriol), 칼포스틴C₅ 캄포테신 유도체(calphostin C₅ camptothecin derivatives), 카나리폭스(canarypox IL-2), 카페시타빈(capecitabine), 카르복스아미드-아미노-트리아졸 (carboxamide-amino-triazole), 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole), CaRest M3, CARN 700, 카틸리지(cartilage) 유도 억제제, 카젤레신(carzelesin), 카세인 키나제억제제s (ICOS), 카스타노스퍼민(castanospermine), 세크로핀(cecropin B), 세트로렐릭스 (cetrorelix), 클로로퀴녹살린 설포메이드(chloroquinoxaline sulfonamide), 시카프로스트(cicaprost), cis-포르피린(porphyrin), 클라드리빈(cladribine), 클로미펜 유사체(clomifene analogues), 클로트리마졸(clotrimazole), 콜리스마이신(collismycin) A, 콜리스마이신(collismycin) B, 콤브레타스틴(combretastatin) A4, 콤브레타스틴 유사체(combretastatin analogue), 코나게닌(conagenin), 크램베시딘(crambescidin 816), 크리스나톨(crisnatol), 크립토피신(cryptophycin) 8, 크립토피신(cryptophycin) A 유도체, 쿠라신(curacin) A, 시클로펜탄트라퀸논(cyclopentanthraquinones), 시클로플라탐(cycloplatam), 시페마이신(cypemycin), 시타라빈 옥포스페이트(cytarabine ocfosfate), 세포살해 인자(cytolytic factor), 시트스태틴(cytostatin), 다클릭시맵(dacliximab), 데시타빈(decitabine), 디히드로디뎀닌 B(dehydrodidemnin B), 데슬로레린(deslorelin), 덱사메타손(dexamethasone), 덱시포스파미드(dexifosfamide), 데크라족 산(dexrazoxane), 덱스베라파밀(dexverapamil), 디아지퀴온(diaziquone), 디뎀닌 B(didemnin B), 디독스(didox), 디에틸노르스퍼민(diethylnorspermine), 디히드로-5-아자시티딘(dihydro-5-azacytidine), 디히드로탁솔(dihydrotaxol), 디옥사마이신(dioxamycin), 디페닐 스피로무스틴(diphenyl spiromustine), 도세탁셀, 도코사놀(docosanol), 돌라세트론(dolasetron), 독시플루리딘(doxifluridine), 드록시펜(droloxifene), 드로나비놀(dronabinol), 듀오카마이신 SA(duocarmycin SA), 엡셀렌(ebselen), 에코무스틴(ecomustine), 에델포신(edelfosine), 에드레코로맵(edrecolomab), 에플로미틴(eflomithine), 엘레민(elemene), 에미테퍼(emitefur), 에피루비신, 에피리스테라이드(epristeride), 에스트라무스틴 유사체, 에스트로겐 작용제, 에스트로겐 길항제, 에타니다졸(etanidazole), 에토포시드 포스페이트, 엑세메스테인(exemestane), 파드로졸(fadrozole), 파자라빈(fazarabine), 펜레티나이드(fenretinide), 필그라스팀(filgrastim), 피나스테리드(finasteride), 플라보피리돌(flavopiridol), 플레젤라스틴(flezelastine), 플루아스테론(fluasterone), 플루다라빈(fludarabine), 염화 플루오로다우노루니신 (fluorodaunorunicin hydrochloride), 포르페니멕스(forfenimex), 프로메스테인(formestane), 포스트리에신(fostriecin), 포테무스틴(fotemustine), 가도리늄 텍사피린(gadolinium texaphyrin), 갈륨 니트레이트(gallium nitrate), 갈로시타빈(galocitabine), 가니렐릭스(ganirelix), 겔라티나제 억제제, 겜시타빈(gemcitabine), 글루타티온 억제제, 헵설팜(hepsulfam), 헤레굴린(heregulin), 헥사메틸렌 비스아세트아미드(hexamethylene bisacetamide), 하이퍼리 신(hypericin), 이반드론산(ibandronic acid), 이다루비신(idarubicin), 이독시펜(idoxifene), 이드라만톤(idramantone), 일모포신(ilmofosine), 일로마스태이트(ilomastat), 이미다조아크리돈(imidazoacridones), 이미퀴모드(imiquimod), 이뮤노스티뮬런트 펩티드(immunostimulant peptides), 인슐린형 성장인자 - 1 수용체 억제제, 인터페론 작용제, 인터페론, 인터루킨, 이오벤구안, 아이오도 독소루비신, 이포메아놀(ipomeanol), 이로플락트(iroplact), 이어소글라딘(irsogladine), 이소벤가졸(isobengazole), 이소호모할리콘드린 B(isohomohalicondrin B), 이타세트론(itasetron), 자스플라키놀리드(jasplakinolide), 카할라이드 F(kahalalide F), 라멜라린-N 트리아세테이트(lamellarin-N triacetate), 란레오타이드(lanreotide), 레이나마이신(leinamycin), 레노그라스팀(lenograstim), 렌티난 설페이트(lentinan sulfate), 렙톨스태틴(leptolstatin), 레트로졸(letrozole), 백혈병 억제 인자, 백혈병 알파 인터페론, 루프롤리드+에스트로겐+프로게스테론, 루프로레린(leuprorelin), 레바미솔, 리아로졸(liarozole), 선형 폴리아민 유사체(linear polyamine analogue), 친지질성 디사카라이드 펩티드(lipophilic disaccharide peptide), 친지질성 백금 화합물, 리속클린아미드 7(lissoclinamide 7), 로바플라틴(lobaplatin), 롬브리신(lombricine), 로메트렉솔(lometrexol), 로니다민(lonidamine), 로속산트론(losoxantrone), 로바스태틴(lovastatin), 록소리빈(loxoribine), 루토테칸(lurtotecan), 루테튬 텍사피린(lutetium texaphyrin), 리소필린(lysofylline), 용균 펩티드(lytic peptides), 메이탄신(maitansine), 마노스타틴 A(mannostatin A), 마리마스태트(marimastat), 마소프로콜(masoprocol), 마스핀(maspin), 마트릴리신 억제제(matrilysin inhibitors), 금속단백분해효소 억제제(matrix metalloproteinase inhibitors), 메노가릴(menogaril), 메르바론(merbarone), 메테렐린(meterelin), 메티오나제(methioninase), 메토클로프라미드(metoclopramide), MIF 억제제, 미페프리스톤(mifepristone), 밀테포신(miltefosine), 미리모스팀(mirimostim), 미스매치 이중 가닥 RNA, 미토구아존(mitoguazone), 미토락톨(mitolactol), 미토마이신 유사체, 미토나피드(mitonafide), 미토톡신 피브로블라스트 성장인자-사포린, 미톡산트론(mitoxantrone), 모파로텐(mofarotene), 몰그라모스팀(molgramostim), 모노클로날 항체, 인간 만성 고나도트로핀, 모노포스포릴 지질 A + 미오박테리움 세포벽sk, 모피다몰(mopidamol), 다중 약내성 유전자 억제제, 다중 종양 서프레서 1- 기초 치료요법, 머스타드 항암제, 미카퍼록시드 B(mycaperoxide B), 미코박테리아 세포벽 추출물, 미리아포론(myriaporone), N-아세틸디날린, N-치환 벤즈아미드, 나파렐린(nafarelin), 나그레스팁(nagrestip), 날록손 + 펜타조신, 나파빈(napavin), 나프테르핀(naphterpin), 나르토그라스팀(nartograstim), 네다플라틴(nedaplatin), 네모루비신(nemorubicin), 네리드론산(neridronic acid), 중성 엔도펩티드(neutral endopeptidase), 니루타미드, 니사마이신(nisamycin), 니트릭옥시드 조절제(nitric oxide modulators), 니트록시드 항산화제(nitroxide antioxidant), 니트룰린(nitrullyn), O6-벤질구아닌, 옥트레오티드(octreotide), 오키세논(okicenone), (올리고뉴클레오티드), 오나프리스톤(onapristone), 온단세트론(ondansetron), (ondansetron), 오라신(oracin), 경구 사이토킨 유도제(oral cytokine inducer), 올마플라틴(ormaplatin), 오사테론(osaterone), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 옥사우노마이신(oxaunomycin), 파클리탁셀, 파클리탁셀 유사체, 파클리탁셀 유도체, 팔라우아민(palauamine), 팔미토일리족신(palmitoylrhizoxin), 파미드론산(pamidronic acid), 파낙시트리올(panaxytriol), 파노미펜(panomifene), 파라벡틴(parabactin), 파젤립틴(pazelliptine), 페가스파르가제(pegaspargase), 펠데신(peldesine), 펜도산 폴리설페이트 소듐(pentosan polysulfate sodium), 펜토스테틴(pentostatin), 펜트로졸(pentrozole), 퍼플루브론(perflubron), 퍼포스파미드(perfosfamide), 페릴리알콜(perillyl alcohol), 페나진마이신(phenazinomycin), 페닐아세테이트(phenylacetate), 포스페이트 억제제, 피키바닐(picibanil), 염화 필로카르핀(pilocarpine hydrochloride), 피라루비신(pirarubicin), 피리트렉심(piritrexim), 플라세틴 A(placetin A), 플라세틴 B(placetin B), 플라스미노겐 활성자 억제제, 백금 착체, 백금 화합물, 백금- 트리아민 착체, 포르플머 소듐, 포르피로마이신(porfiromycin), 프레드니손, 프로필 비스-아크리돈(propyl bis-acridone), 프로스태글란딘 32 (prostaglandin 32), 프로테아솜 억제제, 단백질 A-기초 면역 조절제, 단백질 키나제 C 억제제, 단백질 키나제 C 억제제, 미크로알갈(microalgal), 단백질 티로신 포스페타제 억제제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제, 푸르푸린(purpurins), 피라졸로아크리딘(pyrazoloacridine), 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트, raf 길항제, 랄티트렉스드(raltitrexed), 라모세트론(ramosetron), 라스(ras) 파네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제, ras 억제제, ras-GAP 억제제, 디메틸화 레텔립틴(retelliptine demethylated), 레늄 Re 186 데티드로네이트(rhenium Re 186 etidronate), 리족신(rhizoxin), 리보자임(ribozymes), RII 레틴아미드(retinamide), 로글레티미드(rogletimide), 로히튜카인(rohitukine), 로뮤르타이드(romurtide), 로키니멕스(roquinimex), 루비기논 B1(rubiginone Bl), 루복실(ruboxyl), 사핀골(safingol), 사인토핀(saintopin), SarCNU, 사르코피톨 A(sarcophytol A), 사르그라포스팀(sargramostim), Sdi 1 미메틱, 세무스틴(semustine), 세네센스 유도 억제제 1(senescence derived inhibitor 1), 센스 올리고뉴클레오티드, 신호 전달 억제제, 신호 전달 조절제, 단일 사슬 항원 결합 상대단백질, 시조피란(sizofiran), 소부족산(sobuzoxane), 소듐 보로캅테이트(sodium borocaptate), 소듐 페닐아세테이트(sodium phenylacetate), 솔베롤(solverol), 소마토메딘 (somatomedin) 결합 상대 단백질), 소네르민(sonermin), 스파포스산(sparfosic acid), 스피카마이신 D (spicamycin D), 스피로무스틴(spiromustine),스플레노펜틴(splenopentin), 스폰지스틴 1(spongistatin 1), 스쿠알라민(squalamine), 줄기 세포 억제제, 줄기 -세포 분화 억제제, 스티피아미드(stipiamide), 스트로멜리신(stromelysin) 억제제, 설플노신(sulflnosine), 초활성 바소활성 장관내 펩티드 길항제, 수라디스타(suradista), 수라민(suramin), 스웨인소닌(swainsonine), 합성 글리코스아미노글리칸(synthetic glycosaminoglycans), 탈리무스틴(tallimustine), 타목시펜 메트아이오드(tamoxifen methiodide), 타우로무스틴(tauromustine), 탁솔(taxol), 타자로틴(tazarotene), 테코갈란 소듐(tecogalan sodium), 테가퍼(tegafur), 텔루라피 리륨(tellurapyrylium), 텔로머라제 (telomerase) 억제제, 테모포르핀(temoporfin), 테모졸로미드(temozolomide), 테니포시드(teniposide), 테트라클로로데카옥시드(tetrachlorodecaoxide), 테트라조민(tetrazomine), 탈리블라스틴(thaliblastine), 탈리도미드(thalidomide), 티오코랄린(thiocoraline), 티오구아닌(thioguanine), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 트롬보포이에틴 미메틱(thrombopoietin mimetic), 티말파신(thymalfasin), 티모포이에틴(thymopoietin) 수용체 작용제, 티모트리난(thymotrinan), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone), 틴 에틸 에티오푸르푸리(tin ethyl etiopurpurin), 티라파자민(tirapazamine), 이염화 티타노세인(titanocene bichloride), 톱센틴(topsentin), 토레미펜(toremifene), 전능성 줄기 세포 인자, 번역 억제제, 트레티노인(tretinoin), 트리아세틸유리딘(triacetyluridine), 트리시리빈(triciribine), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 트립토렐린(triptorelin), 트로피세트론(tropisetron), 트로스테로이드(turosteride), 티로신 키나제 억제제, 티로포스틴(tyrphostins), UBC 억제제, 유베니멕스(ubenimex), 요생식동-유도 성장억제 인자(urogenital sinus-derived growth inhibitor factor), 우로키나제 수용체 길항제, 베프리오타이드(vapreotide), 베리올린 B(variolin B), 벡터 시스템, 적혈구(erythrocyte)유전자 치료 요법, 벨라레솔(velaresol), 베라르닌(verarnine), 베르딘(verdins), 베르테포르핀(verteporfin), 비노렐빈(vinorelbine), 빈칼틴(vinxaltine), VITAXIN®, 보로졸(vorozole), 자노테론(zanoterone), 제니플라틴(zeniplatin), 질라스코르브(zilascorb), 및 지노스테 틴 스티말라머(zinostatin stimalamer). 바람직한 추가 항암제는 5-플루오로우라신 및 루코보린이다.

보다 구체적인 구체예에서, 본 발명은 또한, 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE와 조합하여, 유방, 난소, 흑색종, 전립선, 대장 및 폐암의 치료를 위해, 하나 이상의 치료요법을 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료요법의 예는 표 1에 개시된 항암제와 같으나, 이에 한정되는 것이다.

표 1

치료제	투여	용량	간격
염산 독소루비신 아드리아마이신 RDF® 및 아드리아마이신 PFS®)	정맥내	1일째 60-75 ㎎/㎡	21일 간격
염산 에피루비신 (Ellence™)	정맥내	매 사이클의 1일째 100-120 ㎎/㎡ 또는 사이클의 1-8일 동안 동량으로 분할하여 준다	3-4주 사이클
플루오로우사실	정맥내	공급 방법: (250 및 500㎎ 플루오로우라실을 각각 함유하는) 5㎖ 및 10㎖ 바이알(vial)
독세탁셀 (Taxotere®)	정맥내	1시간에 걸쳐 60-100 ㎎/㎡	매 3주에 한번
파클리탁셀 (Taxol®)	정맥내	3시간에 걸쳐 175 ㎎/㎡	매 3주 4코스
타목시펜 시트레이트 (Nolvades®)	경구 (정제)	20-40 ㎎ 20 ㎎을 초과하는 투여량은 분할된 용량으로 주어야 한다 (아침 및 밤)	매일
주사용 류코보린 칼슘	정맥내주사 또는 근육내주사	공급 방법: 350 ㎎ 바이알	투여량은 텍스트.PDR 3610으로부터 명확하지 않다.
루프로라이드 아세테이트 (Lupron®)	단일 피하 주사	1 ㎎ (0.2 ㎖ 또는 20 유닛 마크)	하루 한번
플루타마이드 (Eulexin®)	경구 (캡슐)	250 ㎎ (125 ㎎ 플루타마이드를 각각 함유하는 캡슐)	하루 8시간 간격으로3번 (일일 총 용량 750 ㎎)
닐루타마이드 (Nilandron®)	경구 (정제)	300 ㎎ 또는 150 ㎎ (50 또는 150 ㎎ 닐루타마이드를 각각 함유하는 정제)	30일간은 하루 한번 300 ㎎, 이후 하루 한번 150 ㎎
바이칼루타마이드 (Casodex®)	경구 (정제)	50 ㎎ (50 ㎎ 바이칼루타마이드를 함유하는 정제)	하루 한번
프로게스테론	주사	참기름 내의 USP 50㎎/ ㎖
케토코나졸 (Nizoral®)	크림	증상에 따라 하루 한번 또는 두번 2% 크림 도포

프레드니손	경구 (정제)	치료되는 특정 질환실체에 따라 최초 투여량은 하루 5 ㎎ 내지 60 ㎎으로 다양할 수 있다.
에스트라무스틴 포스페이트 소듐 (Emcyt®)	경구 (캡슐)	체중의 14 ㎎/㎏ (즉, 체중의 10 ㎏ 또는 22lb에 대한 하나의 140 캡슐)	하루에 3 또는 4번으로 분할된 용량
에토포사이드 또는 VP-16	정맥내	20 ㎎/ ㎖ 용액의 2 ㎖ (100 ㎎)
다카르바진 (DTIC-Dome®)	정맥내	2-4.5 ㎎/㎏	10일간 하루 한번. 4주 간격으로 반복될 수 있다.
카르무스틴 삽입물을 갖는 폴리페프로산 20 (BCNU) (nitrosourea) (Gliadel®)	Resection cavity 내에 배치하는 웨이퍼	절제 공동의 크기 및 모양이 허용한다면, 7.7 ㎎의 카르무스틴을 각각 함유하는, 총 61.6 ㎎인, 8 웨이퍼
시스플라틴	주사	[PDR 861에서 n/a] 공급 방법: 50 ㎖ 및 100 ㎖ 다중 용량 바이알의 1 ㎎/ ㎖의 용액
마이토마이신	주사	(5 ㎎ 및 20 ㎎ 마이토마이신을 함유하는) 5 ㎎ 및 20 ㎎ 바이알로 공급됨
젬시타빈 HCl (Gemzar®)	정맥내	NSCLC-2 일정은 탐구되며, 최적 일정은 결정되지 않았을 경우 4주 일정- 30분에 걸쳐 1000 ㎎/㎡ 정맥내 투여 3주 일정- Gemzar는 30분에 걸쳐 1250 ㎎/㎡ 정맥내 투여된다.	4주 일정 각 28일 사이클의 1, 8 및 15일째. Gemzar의 주입 후 1일째에 100 ㎎/㎡ 정맥내 시스플라틴. 3주 일정 각 21일 사이클의 1 및 8일째. 1일째에 Gemzar의 투여 후 100 ㎎/㎡ 투여량의 시스플라틴을 정맥내 투여.
카르보플라틴 (Paraplatin®)	정맥내	단일 약제 요법: 1일째 정맥내 360 ㎎/㎡ (15분 이상 지속하는 주입) 다른 투여량 계산: 시클로포스파마이드와의 조합 요법, 용량 조정 권장, 제형 투약 등	매 4주
이포사마이드 (Ifex®)	정맥내	일일 1.2 g/㎡	연속 5일 매 3주 또는 혈액 독성으로부터 회복 후 반복
염산 포토테칸 (Hycamtin®)	정맥내	1.5 ㎎/㎡ 매일 30분에 걸쳐 정맥내 주입	21일 코스의 1일째에 시작하여 연속 5일,

본 발명은 또한 본 발명의 EphA2-BiTE 와 조합하여 X-선, 감마선 및 암세포를 죽이는 다른 방사선 원료를 포함하는 방사선 치료요법을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방사선 치료는 외부 빔 방사로서 또는 방사가 원격 근원에서 오는 원격 치료법(teletherapy)으로 투여된다. 다른 바람직한 구체예에서, 방사선 치료는 내부치료요법 또는 방사선 원료가 암세포 또는 종양덩어리의의 내부에 위치하는 근접치료로서 투여된다.

암 치료 요법 및 복용량, 투여경로 및 권장 단위복용량은 이 기술분야에 잘 알려져 있고, 아래와 같은 문헌에 기술되어 있다. Physicians ' Desk Reference (61^st ed., 2007).

5.4.2.1. 과증식 세포 장애를 가지는 환자

본 발명은 대상에게 본 발명의 EphA2-BiTE 하나 이상을 단독으로, 또는 EphA2-BiTE 이외의 요법과 조합하여 투여하여, 과다증식세포 장애 또는 그 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공한다. 대상는 동물이고, 바람직하게는 포유동물 예를 들면, 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 등) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 예를 들면, 사이노몰거스 원숭이 또는 사람)이다. 바람직한 실시예에서, 상기 대상은 사람이다.

특정 구체예에서, 과증식 세포 장애는 암이다. 본 발명의 방법에 의해 치료, 예방 및/또는 관리되는 과증식 세포 장애의 비제한적 예가 예를 들어, 다음에 개시된다. 미국 특허 공보 제2005-0059592호, 표제 "EphA2 and Hyperproliferative Cell". 이 문헌은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다. 따라서, 본 발명은 또한, 과증식 세포 장애의 치료, 예방 및/또는 관리를 위해 설계된 조성물 및 방법을 제공한다. (이러한 장애의 비제한적 예는 예를 들어, 미국 특허 공보 2005-0059592, 표제 "EphA2 and Hyperproliferative Cell"에 개시된다. 이 문헌은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다).

특히 , 본 발명은 EphA2의 발현이 이러한 장애에 감염된 세포내에서 상향조절되는, 과증식 세포장애를 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은, 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE을, 선택적으로는, 본 발명의 EphA2-BiTE 이외의 유효량의 치료법과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 과증식 세포 장애는 다음과 같다: 천식, COPD, 폐섬유증, 석면증, IPF, DIP, UIP, 신장 섬유증, 간 섬유증, 다른 섬유증, 기관지 과다-반응증(bronchial hyper-responsiveness), 건선(psoriasis), 지루성피부염(seborrheic dermatitis), 낭성섬유증(cystic fibrosis), 또는 과증식 내피 세포 장애, 예를 들면, 재협착증(restenosis), 과증식 혈관 질환, 베체트 병, 죽상동맥경화, 황반부 변성(macular degeneration), 또는 과증식 섬유아세포 장애.

5.4.2.2. 염증성 및/또는 자가면역 장애를 갖는 환자

본 발명은 대상에게 본 발명의 EphA2-BiTE 하나 이상을 단독으로, 또는 EphA2-BiTE 이외의 요법과 조합하여 투여하는 것을 포함함으로써, 염증성 또는 자가면역 장애 또는 그 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공한다. 대상는 동물이고, 바람직하게는 포유동물 예를 들면, 영장류(예를 들어, 원숭이, 예를 들면, 붉은털 원숭이, 사이노몰거스 원숭이 또는 침팬지, 또는 사람)이다. 바람직한 실시예에서, 상기 대상은 사람이다.

특히, 본 발명은 EphA2의 발현이 이러한 장애에 감염된 세포내에서 상향조절되는, 염증성 또는 자가면역 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은, 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE을, 선택적으로는, 본 발명의 EphA2-BiTE 이외의 유효량의 치료법과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 염증성 또는 자가면역 장애는 다음과 같다: 국제 출원 공보 제WO 00/78815호, 국제 출원 공보 제WO 02/070007 Al호(2002년 9월 12일), 표제 "Method of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists," 국제 출원 공보 제WO 03/075957 Al호(2003년 9월 18일), 표제 "The Prevention or Treatment of Cancer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination With Other Agents." 미국 특허 공개공보 제US 2002/0168360 Al호(2002년 11월 14일), 표제 "Method of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin α_vβ3 Antagonists in Combination With Other Prophylactic or Therapeutic Agent" 및 국제 출원 공보 제WO 03/075741 A2호(2003년 9월 18일), 표제"Method of Preventing or Treating Disorder by Administering an Integrin αvβ3 Antagonists in Combination With an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate." 이들 문헌 각각은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다.

이들 구체예에 따라, 본 발명의 EphA2-BiTE 은 유효량의 VITAXIN®과 조합하여 투여된다. (Medlmmune, Inc., 국제 출원 공보 제WO 00/78815호, 국제 출원 공보 제WO 02/070007 Al호, 2002년 9월 12일자, 표제"Method of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists," 국제 출원 공보 제WO 03/075957 Al호(2003년 9월 18일), 표제 "The Prevention or Treatment of Cancer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination With Other Agents," ㅁ미국 특허 공보 제US 2002/0168360 Al호(2002년 11월 14일), 표제 "Method of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin αv

3 Antagonists in Combination With Other Prophylactic or Therapeutic Agent" 및 국제 출원 공보 제WO 03/075741 A2호(2003년 9월 18일), 표제, "Method of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin αv

3 Antagonists in Combination With an HMG- CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate." 이들 각각은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 염증성 또는 자가면역 장애 또는 하나 이상의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE에 유효량의 시플리주맙(siplizumab)을 조합하여, 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다 (Medlmmune, Inc., 국제 출원 공보 제WO 02/069904호, 이 문헌은 인용에 의해 그 전체가 이 명세서에 온전히 삽입된다). 다른 특정 구체예에서, 본 발명은, 염증성 또는 자가면역 장애 또는 이들의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여, 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE에 조합하여, infra 섹션 5.4.2.4.에 개시된 항염증성 약제의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다.

5.4.2.3. 감염된 환자

본 발명은 감염(특히, 세포내 감염) 또는 그 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여, 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE을 단독으로 또는 EphA2-BiTE 이외의 다른 치료 요법과 조합하여, 투여하는 것을 포함한다. 대상은 동물이고, 바람직하게는 포유동물, 예를 들면, 비영장류 (예를들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 등) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 예를 들면, 사이노몰거스 원숭이, 또는 사람)이다. 바람직한 실시예에서, 대상은 사람이다.

본 발명의 방법은 감염이 있거나 있을 것으로 예측되는 환자(예를 들어, 유전적 소인(genetic predispotion)이 있는 환자 또는 이전에 감염되었던 환자)에게 본 발명의 EphA2-BiTE 하나 이상을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 환자는 비- EphA2-BiTE 치료요법으로, 이전에 치료받았거나, 현재 그 감염에 대하여 치료 중일 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 방법은 면역이 저하된 또는 면역이 억제된 환자에게, 하나 이상의 본 발명의 EphA2 -BiTEs을 투여한다. 특정 구체예에서, an EphA2-BiTE은 면역이 저하된 또는 면역이 억제된 환자에게는 투여되지 않는다. 본 발명에 따르면, EphA2-BiTE 은 어느 라인의 치료요법일 수 있고, 제1, 제2, 제 3 및 제4의 치료요법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 의하면, EphA2-BiTE은 비-EphA2-BiTE 치료 요법의 부작용 또는 불내성이 일어나기 전에 사용될 수 있다. 본 발명은 감염의 발명 또는 재발을 방지하기 위하여, 본 발명의 EphA2-BiTE을 하나 이상 투여하는 것을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 또한 현재의 치료 요법에 대한 대체수단으로서, 감염의 치료, 예방 및/또는 관리방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 현재의 치료요법 환자에게 독성인 것으로 판명되거나 판명된 것일 수 있다(즉, 받아들일 수 없는 부작용 또는 참기 힘든 부작용이 일어남). 다른 구체예에서, EphA2- BiTE은 현재 치료요법과 비교하여 부작용이 감소한다. 다른 구체예에서, 환자는 현재의 치료요법에 불응성으로 판명된다. 이러한 구체예에서, 본 발명은 다른 항-감염 치료 요법없이, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE은 감염을 치료하기 위하여, 다른 치료요법 대신에, 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명은 활성감염을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 잠복 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 다 른 구체예에서, 본 발명은 급성 감염의 재발을 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 만성 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 비-EphA2-BiTE 치료 요법에 불응성인 또는 불응성으로 된 환자의 감염 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위하여, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE을 투여하는 방법을 포함한다. 감염이 불응성인지의 여부의 결정은 감염에 걸린 세포 상에서, 특히 상피 세포상에또는 비-EphA2-BiTE 치료 요법에 대해 불응성인 또는 불응성이 된 환자에게서, 이 기술분야에서 알려진 치료의 유효성을 어세이하는 방법을 생체 내 또는 시험관 내로 시행한다.

5.4.2.3.1 바이러스 감염증

EphA2의 증가된 발현은 어떤 세포내 병원체, 특히, RSV에 의한 감염증과 관련되는 것으로 발견되어 왔다 (예를 들어, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 "Use of Modulators of EphA2 and EphrinAl for the Treatment and Prevention of Infections" 표제의 2005년 10월 27일 출원된 미국 출원 일련번호 제11/259,266호 참조). 따라서, 본 발명은 또한 예를 들어, RSB 감염과 같은 바이러스 감염을 포함하나 제한되는 것은 아닌, 병원체 감염의 치료, 예방 및/또는 관리를 위해 설계된 조성물 및 방법을 제공한다. 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE 및 상기 EphA2-BiTE를 포함하는 조성물은 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 대상에게 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 바이러스 감염은 세 포내 바이러스 감염증이다. 바이러스 감염의 치료, 예방 및/또는 관리에 유용한, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 다른 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)과 조합된, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE 및 상기 항체를 포함하는 조성물은 바이러스 감염된 대상 또는 바이러스 감염에 걸리기 쉬운 대상에게 투여될 수 있다. 상기 요법의 비제한적 예는 아래의 섹션 5.4.2.5에 기술된 약제(agent)를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량 및 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

어떤 구체예에서는, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 통용되는, 사용되어 온, 또는 유용한 것으로 알려진 하나 이상의 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합된 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 바이러스 감염에 대한 요법은 아시클로버(acyclovir), 아만타딘(amantadine), 오셀타미비르(oseltamivir), 리바비란(ribaviran), 팔리비주 맙(palivizumab), 및 아나미비르(anamivir)와 같은 항바이러스제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2 -BiTE는 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리를 위해 하나 이상의 지지 수단(supportive measures)과 조합되어 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 지지 수단의 비제한적 예는 초음파 흡입기(nebulizer)에 의한 공기의 가습(humidification), 에어로라이즈된(aerolized) 라세미(racemic) 에피네프린, 경구 덱사메타존(oral dexamethasone), 정맥내 유체, 삽관(intubation), 해열제(fever reducer) (예를 들어, 이부프로펜(ibuprofen), 아세토메타핀(acetometaphin), 및 (즉, 이차 세균 감염증을 예방 또는 치료하기 위한) 항생제 요법 또는 항곰팡이 요법을 포함한다.

바이러스 감염과 관련된 또는 이로 인해 야기되는 바이러스 감염 또는 병태의 모든 유형이 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리될 수 있고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로 또는 다른 요법 (예를 들어 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 바이러스 감염증을 야기하는 바이러스의 예는 레트로바이러스(retrovirus) (예를 들어, 인간 T-세포 림프영양성 바이러스(T-cell lymphotrophic virus; HTLV) 유형 I 및 II 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV, 예를 들어, HIV-I 및 HIV-2)), 헤르페스 바이러스(herpes virus) (예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 유형 I 및 II, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, HHV6-HHV8, 및 사이토메갈로바이러 스(cytomegalovirus)), 아레나바이러스(arenavius) (예를 들어, 랏사 열 바이러스(lassa fever virus)), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예를 들어, 모빌리바이러스(morbillivirus) 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(human respiratory syncytial virus), 이하선염(mumps), hMPV, 및 뉴모바이러스(pneumovirus)), 아데노바이러스(adenovirus), 분야바이러스(bunyavirus) (예를 들어, 한타바이러스(hantavirus)), 코르나바이러스(cornavirus), 필로바이러스(filovirus) (예를 들어, 에볼라 바이러스(Ebola virus)), 플라비바이러스(flavivirus) (예를 들어, C형 간염 바이러스(HCV), 황열 바이러스(yellow fever virus), 및 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)), 헤파드나바이러스(hepadnavirus) (예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV)), 오르토미오바이러스(orthomyovirus) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C 및 PIV), 파포바이러스(papovavirus) (예를 들어, 유두종바이러스(papillomavirus)), ㅍ피코나바이러스(cornavirus) (예를 들어, 리노바이러스(rhinovirus), 엔테로바이러스(enterovirus) 및 A형 간염 바이러스), 폭스바이러스(poxvirus), 레오바이러스(reovirus) (예를 들어, 로타바이러스(rotavirues)), 토가바이러스(togavirus) (예를 들어, 루벨라 바이러스(rubella virus)), 및 랩도바이러스(rhabdovirus) (예를 들어, 광견병 바이러스(rabies virus))를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바이러스 감염에 대한 생물학적 반응은 상승된 수치의 IgE 항체, T-세포의 증가된 증식 및/또는 침윤(infiltration), B-세포의 증가된 증식 및/또는 침윤, 표피 과증식(hyperplasia), 및 뮤신(mucin) 생성을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명은 또한 일반 감기, 바이러스성 인두염(viral pharyngitis), 바이러스성 후두염(viral laryngitis), 바이러스성 크룹(viral croup), 바이러스성 기관지염(viral bronchitis), 인플루엔자(influenza), 파라인플루엔자 바이러스 질환(parainfluenza viral diseases; "PIV") 질환 (예를 들어, 크룹, 세기관지염(bronchiolitis), 기관지염, 폐렴), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus; "RSV") 질환, 메타뉴마바이러스 질환(metapneumavirus disease), 및 아데노바이러스 질환 (예를 들어, 열성 호흡기 질환(febrile respiratory disease), 크룹, 기관지염, 폐렴)을 야기하거나 또는 이와 관련된 바이러스 감염증의 치료, 예방 및/또는 관리방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로 또는 다른 요법의 유효량과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 감염증, PIV 감염증, hMPV 감염증, 아데노바이러스 감염증, 및/또는 RSV 감염증, 또는 하나 이상의 이의 증상은 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 RSV 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로 또는 하나 이상의 아만타딘, 리만타딘(rimantadine), 오셀타미비르, 즈나미비르(znamivir), 리바비란, RSV-IVIG (예를 들어, 정맥내 면역 글로불린 주입물(infusion)) (RESPIGAM®), 및 팔리비주맙과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌 항바이러스제와 조합하여 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 항체들은 2001년 11월 28일 출원된 "Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies For Prophylaxis and Treatment" 표제의 미국 특허 출원 연속 번호 제09/966,288호 및 제09/996,265호에 개시되었다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 바이러스 감염은 RSV 감염이 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명은 PIV 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로 또는 하나 이상의, 아만타딘, 리만타딘, 오셀타미비르, 즈나미비르, 리바비란, 및 팔리비주맙과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌 항바이러스제의 유효량과 조합하여 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 hMPV 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 항체의 유효량을 단독으로 또는 하나 이상의, 아만타딘, 리만타딘, 오셀타미비르, 즈나미비르, 리바비란, 및 팔리비주맙과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌 항바이러스제의 유효량과 조합하여 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자를 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로 또는 자나미비르(zanamivir) (리렌자(RELENZA)®), 오셀타미비르 (타미플루(TAMIFLU)®), 리만타딘, 및 아만타딘 (시마딘(SYMADINE)®, 시메트렐(SYMMETREL)®)과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌 항바이러스제의 유효량과 조합하여 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 호흡기 바이러스 감염(viral respiratory infection)에 걸렸거나 또는 걸렸던 적이 있는 대상에서의 천식의 진전을 예방하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로 또는 다른 요법의 유효량과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 대상은 나이든 사람이고 (예를 들어, 65세 이상의 인간 대상), 미숙하게 태어난 인펀트, 인펀트, 또는 어린이이다. 다른 특정 구체예에서, 상기 대상은 RSV 감염에 걸렸거나 또는 걸렸던 적이 있다. 특정 구체예에서, 상기 감염은 호흡기 바이러스 감염이 아니다. 추가의 구체예에서, 상기 감염은 RSV 감염이 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의, 일차 바이러스 감염에 대한 이차 반응을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로 또는 다른 요법 (예를 들어, 다른 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일차 바이러스 감염, 상세하게는 일차 호흡기 바이러스 감염에 대한 이차 반응의 예는 점막 자극에 대한 천식-유사 반응성, 상승된 호흡기 총 내성(elevated total respiratory resistance), 이차 바이러스, 세균, 곰팡이(fungal) 및 원생동물(protozoan) 감염증에 대한 증가된 감수성(susceptibility), 및 폐렴, 크룹, 및 열성 기관지염(febrile bronchitits)과 같으나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 본 발명은 급성 바이러스 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공한다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 잠복성(latent) 바이러스 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공한다. 다른 추가의 구체예에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HBV 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 비탁신®(메디뮨 인코포레이티드, 국제 공개 제WO 00/78815호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists" 표제의 2002년 9월 12일자 국제 공개 제WO 02/070007 A1호, "The Prevention or Treatment of Cancer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination With Other Agents" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075957 A1호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin α_νβ3 Antagonists in Combination With Other Prophylactic or Therapeutic Agents" 표제의 2002년 11월 14일자 미국 특허 공개 제US 2002/0168360 A1호, 및 "Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in Combination With an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075741 A2호, 이들 각각은 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다)의 유효량과 조합한, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 시플리주맙(siplizumab)(메디뮨 인코포레이티드, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 국제 공개 제WO 02/069904호)의 유효량과 조합한 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 공개 제20050002934호 (2005년 1월 6일)에 개시된 것과 같은, 하나 이상의 항-IL-9 항체의 유효량과 조합된 하나 이상의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 비탁신®, 항-IL-9 항체 및/또는 시플리주맙 중 둘 이상의 유효량과 조합된 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량은 하나 이상의 항-IgE 항체의 유효량과 조합되어, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 대상에게 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 항체의 유효량은 항-IgE 항체 TNX901의 유효량과 조합되어, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 대상에게 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 항체의 유효량은 항-IgE 항체 rhuMAb-E25의 유효량과 조합되어, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 대상에게 투여된다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량은 항-IgE 항체 HMK-12의 유효량과 조합되 어, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 대상에게 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량은 항-IgE 항체 6HD5의 유효량과 조합되어, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 대상에게 투여된다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 항체의 유효량은 항-IgE 항체 MAb Hu-901의 유효량과 조합되어, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 대상에게 투여된다.

본 발명은 바이러스 감염에 걸릴 것으로 예상되거나 또는 상기 감염의 위험도가 증가된 환자, 예를 들어 억제된 면역 시스템을 갖는 환자 (예를 들어, 기관-이식 받은 자, AIDS 환자, 화학요법 중인 환자, 노인, 미숙하게 태어난 인펀트, 인펀트, 어린이, 폐쇄된 식도의 암종을 갖는 환자, 기관기관지 샛길(tracheobronchial fistula)을 갖는 환자, (예를 들어, 뇌졸중, 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발경화증(multiple sclerosis), 및 근육병증(myopathies)에 기인한) 신경계 질환을 갖는 환자, 및 이미 바이러스 감염에 걸린 환자)에서, 바이러스 감염의 진전을 예방하기 위한 방법을 포함한다. 상기 환자들은 이전에 바이러스 감염에 대해 치료받았거나 또는 받지 않았을 수 있다

본 발명의 EphA2-BiTE, 본 발명의 조성물 또는 조합 요법은, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한, 일차, 이차, 삼차, 사차 또는 오차 요법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 모든 차수의 요법(any line of therapy)으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 EphA2 발현에서 의 증가와 관련된 다른 질환 또는 장애에 대한 요법 중인 환자에서의 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은, 이전에 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법에 대한 모든 유해 효과(adverse effect) 또는 못견딤(intolerance)이 발생했던 환자에서의 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 불응성(refractory) 환자에게서의 바이러스 감염 또는 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서, 바이러스 감염된 환자는, 상기 감염이 유의하게 박멸되지 않았을 때 및/또는 증상이 유의하게 완화되지 않았을 때 요법에 대해 불응성이다. 환자가 불응성인지 아닌지는, 그러한 문맥의 "불응성"의 기술용인된 의미를 이용하는, 감염의 치료의 유효성을 어세이하는 것(assaying)에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생체 내(in vivo ) 또는 시험관 내(in vitro) 어느 것으로도 결정될 수 있다. 여러 구체예에서, 바이러스 감염을 갖는 환자는 바이러스 복제가 줄지 않거나 또는 증가될 때 불응성이다. 본 발명은 또한 상기 감염의 진전의 위험이 있는 환자에서, 바이러스 감염의 발병(onset) 또는 재발생(reoccurrence)의 예방 방법 포함한다. 본 발명은 또한 통상적인 요법에 대한 유해 반응에 민감한 환자에서 바이러스 감염, 또는 이의 증상의 치료, 관리 및/또는 예방 방법을 포함한다. 본 발명은 어떠한 항바이러스 요법도 가능하지 않은 바이러스 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 추가로 포함한다.

본 발명은, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법들에 대해 불응성인 것으로 입증되었으며, 더 이상 이들 요법들 중이지 않은, 환자에서의 바이러스 감염, 또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 관리되거나 치료되는 환자는 이미 항염증제, 항생제, 항바이러스제, 항곰팡이제, 또는 다른 생물학적 요법/면역요법으로 치료된 환자이다. 이들 환자 중 통상적인 요법을 받기에는 너무 어린 환자, 및 존재하는 요법으로 관리 또는 치료했음에도 불구하고 바이러스 감염이 재발생한 환자가 불응성 환자이다.

본 발명은 다른 통상적인 요법에 대한 대안으로서의, 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 관리되거나 또는 치료되는 환자는 다른 요법에 대해 불응성이거나 또는 상기 요법으로부터의 유해 반응에 민감하다. 상기 환자는 억제된 면역 시스템을 갖는 사람 (예를 들어, 수술후 환자, 화학요법 환자, 및 면역결핍질환을 갖는 환자), 신장 또는 간 기능 부전인 사람, 노인, 어린이, 인펀트, 미숙하게 태어난 인펀트, 신경정신장애를 갖는 사람 또는 정신작용 약물을 먹는 사람, 발작 병력이 있는 사람, 또는 바이러스 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용된 통상적인 약제와 부정적으로 상호작용하는 약물처치 중인 사람일 수 있다.

바이러스 감염 요법 및 이들의 용량, 투여 루트(route) 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)와 같은 문헌에 기술된 바 있다.

5.4.2.3.2 세균 감염증

본 발명은 세균 감염, 특히 세포내 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 세포내 세균에 감염된 세포는 EphA2 발현이 증가되어 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 세균 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량 및 본 발명의 EphA2-BiTE이 아닌 하나 이상의 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제(prophylactic agent) 또는 치료제)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료될, 예방될 및/또는 관리될 세균 감염은 세포내 세균 감염증이다.

세균 감염 (예를 들어, 호흡기 감염)과 관련된 또는 이로 인해 야기되는 세포내 세균 감염 또는 병태의 모든 유형이 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리될 수 있다. 감염을 야기하는 세포내 세균의 예는 마이코박테리움 튜버 큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 살모넬라 엔테리카 세로바 타이피(Salmonella enterica serovar Typhi), 브루셀라 종(Brucella sp), 레지오넬라 종(Legionella sp), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 리케 치아 리케치(Rickettsia rickettsii); 리케치아 프로와제키(Rickettsia prowazekii); 리케치아 타이피(Rickettsia tsutsugamushi); 리케치 아 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamushi); 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis); 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci); 및 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 세포내 세균 감염은 호흡기 세균 감염이 아니다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 세포내 세균 감염은 살모넬라 종 감염이 아니다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 세포내 세균 감염은 살모넬라 더블린 감염이 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명은 세포내 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 세포내 세균 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량 및 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

어떤 구체예에서, 본 발명은 세균 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 세균 감염증을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용되는, 본 발명의 EphA2-BiTE이 아닌 하나 이상의 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량의 조합을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 세균 감염증, 상세하게는 세균 감염증에 대한 요법은 항균제 (anti-bacterial agents) (예를 들어, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) (예를 들어, 겐타마이신(gentamicin), 토브라마이신(tobramycin), 아미카신(amikacin), 네틸리마이신(netilimicin)) 아즈트레오남(aztreonam), 세팔로스포린(cephalosporin) (예를 들어, 세파클러(cefaclor), 세파드록실(cefadroxil), 세팔렉신(cephalexin), 세파졸린(cephazolin)), 클린다마이신(clindamycin), 에리스로마이신(erythromycin), 페니실린 (예를 들어, 페니실린 V, 결정성 페니실린 G(crystalline penicillin G), 프로카인 페니실린 G(procaine penicillin G)), 스펙티노마이신(spectinomycin), 및 테트라사이클린 (예를 들어, 클로르테트라사이클린(chlortetracycline), 독시사이클린(doxycycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycine))) 및 보충적 및 기계적 통풍(supplemental and mechanical ventilation)과 같은 지지요법(supportive therapy)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2 -BiTE는 하나 이상의 지지 수단과 조합되어, 세균 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 지지 수단의 비제한적 예는 초음파 흡입기에 의한 공기의 가습, 에어로라이즈된 라세미 에피네프린, 경구 덱사메타존, 정맥내 유체, 삽관, 해열제 (예를 들어, 이부프로펜, 아세토메타핀, 및 보다 바람직하게는, (즉, 이차 감염증을 예방 또는 치료하기 위한) 항생제 요법 또는 항바이러스 요법을 포함한다.

본 발명은, 상승된 수치의 IgE 항체, 비만 세포(mast cell) 증식, 탈과 립(degranulation), 및/또는 침윤(infiltration), B 세포의 증가된 증식 및/또는 침윤, 및 T-세포의 증가된 증식 및/또는 침윤과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌, 세균 감염에 대한 생물학적 반응을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로, 또는 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌, 하나 이상의 요법 (예를 들어 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 폐렴(pneumonia), 재발성 흡인 폐렴(recurrent aspiration pneumonia), 레지오넬라증(legionellosis), 백일해(whooping cough), 수막염(meningitis), 또는 결핵(tuberculosis)과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌, 세균 감염과 관련된 또는 이에 기인하는 호흡기 병태를 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로, 또는 다른 요법의 유효량과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 마이코박테리아(Mycobacteria)에 기인하는 세균 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 사용되며, 상기 방법은 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 단독으로, 또는 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 다른 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)과 유효량과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의, 일차 세균 감염, 바람직하게는 일 차 세균 감염에 대한 이차 병태 또는 반응을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE를 단독으로 또는 유효량의 다른 요법(예를 들어 다른 예방제 또는 치료제)과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일차 세균 감염, 상세하게는 세균 감염에 대한 이차 병태 또는 반응의 예는 점막 자극에 대한 천식-유사 반응성, 상승된 총 내성, 이차 바이러스, 세균, 곰팡이 및 원생동물 감염증에 대한 증가된 감수성, 및 폐렴, 크룹, 및 열성 기관지염과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌 병태의 진전(development)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용되고, 상기 방법은 유효량의 비탁신®(메디뮨 인코포레이티드, 국제 공개 제WO 00/78815호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists" 표제의 2002년 9월 12일자 국제 공개 제WO 02/070007 A1호, "The Prevention or Treatment of Cancer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination With Other Agents" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075957 A1호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin α_νβ3 Antagonists in Combination With Other Prophylactic or Therapeutic Agents" 표제의 2002년 11월 14일자 미국 특허 공개 제US 2002/0168360 A1호, 및 "Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in Combination With an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075741 A2호, 이들 각각은 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다)과 조합한 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용되고, 상기 방법은 유효량의 시플리주맙(메디뮨 인코포레이티드, 국제 공개 제WO 02/069904호)와 조합한 유효량의, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE를, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용되고, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 항-Il-9 항체 (예를 들어, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 공개 제20050002934호 (2005년 1월 6일)에 기술된 항-IL-9 항체 중 하나)와 조합된 유효량의 하나 이상의 EphA2-BiTE을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 유효량의, 비탁신®, 시플리주맙, 및/또는 항-Il-9 항체 중 둘 이상과 조합된 유효량의 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 세균 감염에 걸릴 것으로 예상되거나 또는 상기 감염의 위험도가 증가된 환자, 예를 들어 억제된 면역 시스템을 갖는 환자 (예를 들어, 기관-이식 받은 자, AIDS 환자, 화학요법 중인 환자, 노인, 미숙하게 태어난 인펀트, 인펀트, 어린이, 폐쇄된 식도의 암종을 갖는 환자, 기관기관지 샛길을 갖는 환자, (예를 들어, 뇌졸중, 근육위축가쪽경화증, 다발경화증, 및 근육병증에 기인한) 신경계 질환을 갖는 환자, 및 이미 감염에 걸린 환자)에서, 세균 감염의 진전을 예방하기 위한 방법을 포함한다. 상기 환자들은 이전에 감염에 대해 치료받았거나 또는 받지 않았을 수 있다.

본 발명의 EphA2-BiTE 또는 본 발명의 조합 요법은, 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한, 일차, 이차, 삼차, 사차 또는 오차 요법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 모든 차수의 요법으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 다른 질환 또는 장애에 대한 요법 중인 환자에서의 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은, 이전에 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법에 대한 모든 유해 효과 또는 못견딤이 발생했던 환자에서의 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은 불응성 환자에게서의 세균 감염, 또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법 또한 포함한다. 어떤 구체예에서, 세균 감염에 걸린 환자는 감염이 유의하게 박멸되지 않았을 때 및/또는 증상이 유의하게 완화되지 않았을 때 요법에 대해 반응하지 않는다. 환자가 불응성인지 아닌지는, 그러한 문맥의 "불응성"의 기술용인된 의미를 이용하는, 감염의 치료의 유효성을 어세이하는 것에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생체 내 또는 시험관 내 어느 것으로도 결정될 수 있다. 여러 구체예에서, 세균 감염을 갖는 환자는 세균 복제가 줄지 않거나 또는 증가될 때 불응성이다. 본 발명은 상기 감염의 진전의 위험이 있는 환자에서, 세균 감염의 발병 또는 재발생을 예방하는 방법 또한 포함한다. 본 발명은 통상적인 요법에 대한 유해 반응에 민감한 환자에서 세균 감염, 또는 이의 증상을 치료, 관리 및/또는 예방하는 방법을 또한 포함한다. 본 발명은 어떠한 항균 요법도 가능하지 않은 세균 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 추가로 포함한다.

본 발명은 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법들에 대해 불응성인 것으로 입증되었으며, 더 이상 이들 요법들 중이지 않은, 환자에서의 세균 감염, 또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 관리되거나 치료되는 환자는 이미 항염증제, 항생제, 항바이러스제, 항곰팡이제, 항원생동물제(anti-protozoan agent), 또는 다른 생물학적 요법/면역요법으로 치료된 환자이다. 이들 환자 중 통상적인 요법을 받기에는 너무 어린 환자, 및 존재하는 요법으로 관리 또는 치료했음에도 불구하고 세균 감염이 재발생한 환자가 불응성 환자이다.

본 발명은 다른 통상적인 요법에 대한 대안으로서의, 세균 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 관리되거나 또는 치료되는 환자는 다른 요법에 대해 불응성이거나 또는 상기 요법으로부터의 유해 반응에 민감하다. 상기 환자는 억제된 면역 시스템을 갖는 사람 (예를 들어, 수술후 환자, 화학요법 환자, 및 면역결핍질환을 갖는 환자), 신장 또는 간 기능 부전인 사람, 노인, 어린이, 인펀트, 미 숙하게 태어난 인펀트, 신경정신장애를 갖는 사람 또는 정신작용 약물을 먹는 사람, 발작 병력이 있는 사람, 또는 세균 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용된 통상적인 약제와 부정적으로 상호작용하는 약물처치 중인 사람일 수 있다.

세균 감염 요법 및 이들의 용량, 투여 루트(route) 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)와 같은 문헌에 기술된 바 있다.

5.4.2.3.3 곰팡이 감염증

하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 본 발명의 방법에 따라 대상에게 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 곰팡이에 감염된 세포는 증가된 EphA2 발현을 갖는다. 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는, 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 유용한 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE가 다른 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)과 조합하여, 곰팡이 감염 및/또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 관리, 및/또는 개선하기 위해 대상에게 또한 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 곰팡이 감염은 세포내 곰팡이 감염이다.

곰팡이 감염과 관련되거나 또는 이에 기인하는 곰팡이 감염 또는 병태의 모든 유형은 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리될 수 있다. 곰팡이 감 염의 원인이 되는 곰팡이의 예는 압시디아(Absidia) 종 (예를 들어, 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera) 및 압시디아 라모사(Absidia ramosa)), 아스퍼질러스(Aspergillus) 종, (예를 들어, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스 퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 및 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)), 바시디오볼루스 라나룸(Basidiobolus ranarum), 블라스토 마이세스 더마타이티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다(Candida) 종 (예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 케르(Candida kerr), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파라실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 퀼러몬디(Candida quillermondii), 칸디다 루고사(Candida rugosa), 칸디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea), 및 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 코니디오볼루 스(Conidiobolus) 종, 크립토코커스 네오폼스(Cryptococcus neoforms), 커닝하멜라(Cunninghamella) 종, 피부사상균(dermatophytes), 히스토플라즈마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 마이크로스포룸 집세움(Microsporum gypseum), 뮤코 푸실러스(Mucor pusillus), 파라콕시디오이데스 브라실렌시스(Paracoccidioides brasiliensis), 슈달레쉐리아 보이디(Pseudallescheria boydii), 리노스포리디움 시베리(Rhinosporidium seeberi), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 라이조 푸스(Rhizopus) 종 (예를 들어, 라이조푸스 아리 주스 ( Rhizopus arrhizus ), 라이조푸 스 오리재(Rhizopus oryzae), 및 라이조푸스 마이크로스포루스(Rhizopus microsporus)), 사카로마이세스(Saccharomyces) 종, 스포로트릭스 쉔키(Sporothrix schenckii), 접합균류(zygomycetes), 및 접합균류(Zygomycetes), 자낭균류(Ascomycetes), 담자균류(Basidiomycetes), 불완전균류(Deuteromycetes), 및 난균류(Oomycetes)와 같은 강(class)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 곰팡이 감염은 호흡 곰팡이 감염이 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명은 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE유효량 및 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 요법(예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

어떤 구체예에서, 하나 이상의 항체의 유효량은, 현재 통용중인, 사용되어 온, 또는 곰팡이 감염, 바람직하게는 곰팡이 감염의 치료, 예방 및/또는 관리에 유용한 것으로 알려진, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 요법(예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합되어 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 곰팡이 감염에 대한 요법은 아졸 약물, 예를 들어, 미코나졸, 케토코나 졸 (니조랄(NIZORAL)®), 카스포펀진 아세테이트(caspofungin acetate) (칸시다스(CANCIDAS)®), 이미다졸(imidazole), 트리아졸(triazole) (예를 들어, 플루코나졸(fluconazole) (디플루칸(DIFLUCAN)®), 및 이타코나졸(itraconazole) (스포라녹스(SPORANOX)®), 폴리엔(polyene) (예를 들어, 니스타틴(nystatin), 암포테리신 B 현탁분산액(amphotericin B colloidal dispersion)("ABCD")(암포텍(AMPHOTEC)®), 리포좀 암포테리신 B (암비손(AMBISONE)®), 요오드칼륨(KI), 피리미딘(pyrimidine) (예를 들어, 플루사이토신(flucytosine) (안코본(ANCOBON)®)), 및 보리코나졸(voriconazole) (브이펜드(VFEND)®)과 같은 항곰팡이제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는 하나 이상의 지지 수단과 조합되어 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 지지 수단의 비제한적 예는 초음파 흡입기에 의한 공기의 가습, 에어로라이즈된 라세미 에피네프린, 경구 덱사메타존, 정맥내 유체, 삽관, 해열제 (예를 들어, 이부프로펜, 아세토메타핀, 및 (즉, 이차 바이러스 또는 세균 감염증을 예방 또는 치료하기 위한) 항생제 요법 또는 항바이러스 요법을 포함한다.

본 발명은 IgE 항체의 상승된 수치, 신경성장인자(NGF)의 상승된 수치, 비만 세포 증식, 탈과립, 및/또는 침윤, B 세포의 증가된 증식 및/또는 침윤, 및 T-세포의 증가된 증식 및/또는 침윤과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌, 곰팡이 감염에 대한 생물학적 반응을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 또한 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 다른 요법과 조합하거나 또는 단독인, 하나 이상의 EphA2-BiTE의 유효량의 투여를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의, 일차 곰팡이 감염, 바람직하게는 일차 곰팡이 감염에 대한 이차 병태 또는 반응을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 다른 요법 (예를 들어, 다른 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합하거나 또는 단독인, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일차 곰팡이 감염증, 상세하게는 일차 곰팡이 감염에 대한 이차 병태 또는 반응의 예는 점막 자극에 대한 천식-유사 반응성, 상승된 총 내성, 이차 바이러스, 곰팡이, 및 곰팡이 감염증에 대한 증가된 감수성, 및 폐렴, 크룹, 및 열성 기관지염과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌 병태의 진전을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명은 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 비탁신®(메디뮨 인코포레이티드, 국제 공개 제WO 00/78815호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists" 표제의 2002년 9월 12일자 국제 공개 제WO 02/070007 A1호, "The Prevention or Treatment of Cancer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination With Other Agents" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075957 A1호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin α_νβ3 Antagonists in Combination With Other Prophylactic or Therapeutic Agents" 표제의 2002년 11월 14일자 미국 특허 공개 제US 2002/0168360 A1호, 및 "Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in Combination With an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075741 A2호, 이들 각각은 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다)의 유효량과 조합한 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 시플리주마브(메디뮨 인코포레이티드, 국제 공개 제WO 02/069904호)의 유효량과 조합한 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 항-IL-9 항체(예를 들어, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 공개 제20050002934호 (2005년 1월 6일)에 기재된 하나 이상의 항-IL-9 항체)의 유효량과 조합한 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 비탁신®, 시플리주마 브 및/또는 항-IL-9 항체 중 둘 이상의 유효량과 조합한 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 곰팡이 감염에 걸릴 것으로 예상되거나 또는 상기 감염의 위험도가 증가된 환자에서 곰팡이 감염의 진전을 예방하기 위한 방법을 포함한다. 상기 대상은 억제된 면역 시스템을 갖는 환자 (예를 들어, 기관-이식 받은 자, AIDS 환자, 화학요법 중인 환자, 폐쇄된 식도의 암종을 갖는 환자, 기관기관지 샛길을 갖는 환자, (예를 들어, 뇌졸중, 근육위축가쪽경화증, 다발경화증, 및 근육병증에 기인한) 신경계 질환을 갖는 환자, 및 이미 병태, 상세하게는 감염에 걸린 환자)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 상기 환자는 기관지폐형성이상(bronchopulmonary dysplasia), 선천성 심장병, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 및/또는 후천성 또는 선천성 면역결핍증을 앓는다. 다른 특정 구체예에서, 상기 환자는 대용 수용 시설(group home), 요양원, 또는 일부 다른 유형의 기관에 있는 미숙하게 태어난 인펀트, 인펀트, 어린이, 나이든 사람, 또는 사람이다. 본 발명은 병태에 대한 통상적인 항곰팡이 요법에 대한 유해 반응에 민감한, 어떠한 요법도 가능하지 않은 환자에서의 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 또한 포함한다.

본 발명의 EphA2-BiTE 또는 본 발명의 조합 요법은 곰팡이 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한, 일차, 이차, 삼차, 사차 또는 오차 요법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 모든 차수의 요법으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 다른 질환 또는 장애에 대한 요법 중인 환자에서의 곰팡이 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은, 이전에 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법에 대한 임의의 유해 효과 또는 못견딤이 발생했던 환자에서의 곰팡이 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은 불응성 환자에게서의 곰팡이 감염, 또는 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법 또한 포함한다. 어떤 구체예에서, 곰팡이 감염에 걸린 환자는 감염이 유의하게 박멸되지 않았을 때 및/또는 증상이 유의하게 완화되지 않았을 때 요법에 대해 불응성이다. 환자가 불응성인지 아닌지는, 그러한 문맥의 "불응성"의 기술용인된 의미를 이용하는, 감염의 치료의 유효성을 어세이하는 것에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생체 내 또는 시험관 내 어느 것으로도 결정될 수 있다. 여러 구체예에서, 곰팡이 감염을 갖는 환자는 곰팡이 복제가 줄지 않거나 또는 증가될 때 불응성이다. 본 발명은 상기 감염의 진전의 위험이 있는 환자에서, 곰팡이 감염의 발병 또는 재발생의 예방 방법 또한 포함한다. 본 발명은 통상적인 요법에 대한 유해 반응에 민감한 환자에서의 곰팡이 감염, 또는 이의 증상의 치료, 관리 및/또는 예방 방법을 또한 포함한다. 본 발명은 어떠한 항곰팡이 요법도 가능하지 않은 곰팡이 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 추가로 포함한다.

본 발명은, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법들에 대해 불응성인 것으로 입증되었으며, 더 이상 이들 요법들 중이지 않은, 환자에서의 곰팡이 감염, 또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서, 이 발명의 방법에 따라 관리되거나 치료되는 환자는 이미 항생제, 항바이러스제, 항곰팡이제, 또는 다른 생물학적 요법/면역요법으로 치료된 환자이다. 이들 환자 중 통상적인 요법을 받기에는 너무 어린 환자, 및 존재하는 요법으로 관리 또는 치료했음에도 불구하고 곰팡이 감염이 재발생한 환자가 불응성 환자이다.

본 발명은 다른 통상적인 요법에 대한 대안으로서의, 곰팡이 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 관리되거나 또는 치료되는 환자는 다른 요법에 대해 불응성이거나 또는 상기 요법으로부터의 유해 반응에 민감하다. 상기 환자는 억제된 면역 시스템을 갖는 사람 (예를 들어, 수술후 환자, 화학요법 환자, 및 면역결핍질환을 갖는 환자), 신장 또는 간 기능 부전인 사람, 노인, 어린이, 인펀트, 미숙하게 태어난 인펀트, 신경정신장애를 갖는 사람 또는 정신작용 약물을 먹는 사람, 발작 병력이 있는 사람, 또는 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용된 통상적인 약제와 부정적으로 상호작용하는 약물처치 중인 사람일 수 있다.

곰팡이 감염 요법 및 이들의 용량, 투여 루트 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)와 같은 문헌에 기술된 바 있다.

5.4.2.3.4 원생동물 감염증

하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 본 발명의 방법에 따라 대상에게 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 원생동물에 감염된 세포는 EphA2 발현이 증가된다. 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE는, 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 관리, 및/또는 개선하기 위해, 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 유용한, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 다른 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)과 조합되어 대상에게 또한 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및/또는 관리되는 원생동물 감염은 세포내 원생동물 감염증이다.

모든 유형의 원생동물 감염 또는 원생동물 감염과 관련되거나 또는 이로서 야기되는 병태는 본 발명의 방법에 따라 치료, 예방 및//또는 관리될 수 있다. 감염증을 야기하는 원생동물의 예는 리슈마니아 트리파노소마(Leishmanial Trypanosoma); 지아르디아(Giardia); 트리코모나스(Trichomonas); 엔트아메바(Entamoeba); 디엔트아메바(Dientamoeba); 내 글레리 아(Naegleria) 및 아칸트아메바(Acanthamoeba); 바베시아(Babesia); 플라스모듐(Plasmodium); 이소스포라(Isospora); 사르코시스티스(Sarcocystis); 톡소플라즈마(Toxoplasma); 엔테로사이토준(Enterocytozoon); 발란티디움(Balantidium); 및 뉴모시스티스(Pneumocystis)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량 및 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법(예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

어떤 구체예에서, 하나 이상의 EphA2-BiTE의 유효량은, 원생동물 감염의 치료, 예방 및/또는 관리에 통용되는, 사용되어 온, 또는 유용한 것으로 알려진, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 하나 이상의 요법 (예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합되어 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 EphA2 -BiTE의 유효량은 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리를 위해 하나 이상의 지지 수단과 조합되어 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 지지 수단의 비제한적 예는 초음파 흡입기에 의한 공기의 가습, 에어로라이즈된 라세미 에피네프린, 경구 덱사메타존, 정맥내 유체, 삽관, 해열제 (예를 들어, 이부프로펜, 아세토메타핀), 및 (즉, 이차 바이러스 또는 세균 감염증을 예방 또는 치료하기 위한) 항바이러스 요법 또는 항생제 요법을 포함한다.

본 발명은 또한 IgE 항체의 상승된 수치, 상승된 신경성장인자(NGF) 수치, 비만 세포 증식, 탈과립, 및/또는 침윤, B 세포의 증가된 증식 및/또는 침윤, 및 T-세포의 증가된 증식 및/또는 침윤과 같으나 이에 제한되는 것은 아닌, 원생동물 감염에 대한 생물학적 반응을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 EphA2-BiTE의 유효량의 단독 투여 또는 하나 이상의 다른 요법과의 조합 투여를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의, 일차 감염, 바람직하게는 일차 원생동물 감염에 대한 이차 병태 또는 반응을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 다른 요법 (예를 들어, 다른 예방제 또는 치료제)의 유효량과 조합하거나 또는 단독인, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 비탁신®(메디뮨 인코포레이티드, 국제 공개 제WO 00/78815호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists" 표제의 2002년 9월 12일자 국제 공개 제WO 02/070007 A1호, "The Prevention or Treatment of Cancer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination With Other Agents" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075957 A1호, "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin α_νβ3 Antagonists in Combination With Other Prophylactic or Therapeutic Agents" 표제의 2002년 11월 14일자 미국 특허 공개 제US 2002/0168360 A1호, 및 "Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in Combination With an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate" 표제의 2003년 9월 18일자 국제 공개 제WO 03/075741 A2호, 이들 각각은 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된 다)의 유효량과 조합한 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 시플리주맙(메디뮨 인코포레이티드, 국제 공개 제WO 02/069904호)의 유효량과 조합한 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량를, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 원생동물 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 항-IL-9 항체 (예를 들어, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 공개 제20050002934호 (2005년 1월 6일)에 기술된 항-IL-9 항체)의 유효량와 조합된 하나 이상의 EphA2-BiTE의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 비탁신®, 시플리주맙, 및/또는 항-IL-9 항체 중 둘 이상의 유효량과 조합된 하나 이상의 EphA2-BiTE의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 원생동물 감염에 걸릴 것으로 예상되거나 또는 상기 감염의 위험도가 증가된 환자에서 원생동물 감염의 진전을 예방하기 위한 방법을 포함한다. 상기 대상은 억제된 면역 시스템을 갖는 환자 (예를 들어, 기관-이식 받은 자, AIDS 환자, 화학요법 중인 환자, 암 환자, 기관기관지 샛길을 갖는 환자, (예를 들어, 뇌졸중, 근육위축가쪽경화증, 다발경화증, 및 근육병증에 기인한) 신경계 질환 을 갖는 환자, 및 이미 병태, 상세하게는 감염에 걸린 환자)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 상기 환자는 기관지폐형성이상, 선천성 심장병, 낭포성 섬유증, 및/또는 후천성 또는 선천성 면역결핍증을 앓는다. 다른 특정 구체예에서, 상기 환자는 대용 수용 시설, 요양원, 또는 일부 다른 유형의 기관에 있는 미숙하게 태어난 인펀트, 인펀트, 어린이, 나이든 사람, 또는 사람이다. 본 발명은 또한 병태에 대한 통상적인 항원생동물 요법에 대한 유해 반응에 민감한, 어떠한 요법도 가능하지 않은 환자에서의 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다.

본 발명의 EphA2-BiTE 또는 본 발명의 조합 요법은 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한, 일차, 이차, 삼차, 사차 또는 오차 요법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 모든 차수의 요법으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 다른 질환 또는 장애에 대한 요법 중인 환자에서의 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은, 이전에 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법에 대한 임의의 유해 효과 또는 못견딤이 발생했던 환자에서의 원생동물 감염, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 포함한다. 본 발명은 불응성 환자에게서의 원생동물 감염, 또는 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법 또한 포함한다. 어떤 구체예에서, 원생동물에 감염된 환자는, 감염이 유의하게 박멸되지 않았을 때 및/또는 증상이 유의하게 완화되지 않았을 때 요법에 대해 불응성이다. 환자가 불응성인지 아닌지는, 그러한 문맥의 "불응성"의 기술용인된 의미를 이용하 는, 감염의 치료의 유효성을 어세이하는 것에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생체 내 또는 시험관 내 어느 것으로도 결정될 수 있다. 여러 구체예에서, 원생동물 감염된 환자는 원생동물 복제가 줄지 않거나 또는 증가될 때 불응성이다. 본 발명은 또한 상기 감염의 진전의 위험이 있는 환자에서, 원생동물 감염의 발병 또는 재발생의 예방 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 통상적인 요법에 대한 유해 반응에 민감한 환자에서의 원생동물 감염, 또는 이의 증상의 치료, 관리 및/또는 예방 방법을 포함한다. 본 발명은 어떠한 항원생동물 요법도 가능하지 않은 원생동물 감염을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 추가로 포함한다.

본 발명은, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법들에 대해 불응성인 것으로 입증되었으며, 더 이상 이들 요법들 중이지 않은, 환자에서의 원생동물 감염 또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서, 이 발명의 방법에 따라 관리되거나 치료되는 환자는 이미 항생제, 항바이러스제, 항곰팡이제, 또는 다른 생물학적 요법/면역요법으로 치료된 환자이다. 이들 환자 중 통상적인 요법을 받기에는 너무 어린 환자, 및 존재하는 요법으로 관리 또는 치료했음에도 불구하고 원생동물 감염이 재발생한 환자가 불응성 환자이다.

본 발명은 다른 통상적인 요법에 대한 대안으로서의, 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위한 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 관리되거나 또는 치료되는 환자는 다른 요법에 대해 불응성이거나 또는 상기 요법으로부터의 유해 반응에 민감하다. 상기 환자는 억제된 면역 시스템을 갖는 사람 (예를 들어, 수술후 환자, 화학요법 환자, 및 면 역결핍질환을 갖는 환자), 신장 또는 간 기능 부전인 사람, 노인, 어린이, 인펀트, 미숙하게 태어난 인펀트, 신경정신장애를 갖는 사람 또는 정신작용 약물을 먹는 사람, 발작 병력이 있는 사람, 또는 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 사용된 통상적인 약제와 부정적으로 상호작용하는 약물처치 중인 사람일 수 있다.

원생동물 감염 요법 및 이들의 용량, 투여 루트 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)와 같은 문헌에 기술된 바 있다.

5.4.2.4. 항염증요법

당업계에 공지된, 염증 장애에 대한 요법에 유용한 약제를 포함하는 모든 항염증제가 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 항염증제의 비제한적 예는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 스테로이드성 항염증 약물, 항콜린제 (예를 들어, 황산아트로핀, 아트로핀 메틸니트레이트, 및 이프라트로피움 브로마이드(아트로벤트(ATROVENT)™)), 베타2-작용제 (예를 들어, 아부테롤(abuterol) (벤톨린(VENTOLIN)™ 및 프로벤틸(PROVENTIL)™, 비톨테롤(bitolterol) (TORNALATE™, levalbuterol (XOPONEX™), 메타프로테레놀(metaproterenol) (ALUPENT™), 필부테롤(pirbuterol) (MAXAIR™), 테르부트레인(terbutlaine) (BRETHAIRE™ and BRETHINE™), 알부테롤(albuterol) (프로벤틸(PROVENTIL)™, REPETABS™, and VOLMAX™), 포르모테롤(formoterol) (FORADIL AEROLIZER™), 및 살메테 롤(salmeterol) (SEREVENT™ and SEREVENT DISKUS™)), 및 메틸크산틴 (예를 들어, 테오필린(theophylline) (UNIPHYL™, THEO-DUR™, SLO-BID™, 및 TEHO-42™))를 포함한다. NSAID의 예는 아스피린, 이부프로펜, 셀레콕시브(celecoxib) (CELEBREX™), 디클로페낙(diclofenac) (VOLTAREN™), 에토돌락(etodolac) (LODINE™), 페노프로펜(fenoprofen) (NALFON™), 인도메타신(indomethacin) (INDOCIN™), 케토라락(ketoralac) (TORADOL™), 옥사프로진(oxaprozin) (DAYPRO™), 나부멘톤(nabumentone) (RELAFEN™), 설린닥(sulindac) (CLINORIL™), 톨멘틴(tolmentin) (TOLECTIN™), 로페콕시브(rofecoxib) (VIOXX™), 나프록센(naproxen) (ALEVE™, NAPROSYN™), 케토프로펜(ketoprofen) (ACTRON™) 및 나부메톤(nabumetone) (RELAFEN™)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 NSAID는 시클로옥시게나제 효소 (예를 들어, COX-1 및/또는 COX-2) 를 억제함으로써 작용한다. 스테로이드성 항염증 약물의 예는 글루코코르티코이드, 덱사메타존 (DECADRON™), 코르티코스테로이드 (예를 들어, 메틸프레드니솔론 (MEDROL™)), 코르티손(cortisone), 하이드로코르티손, 프레드니손 (PREDNISONE™ 및 DELTASONE™), 프레드니솔론 (PRELONE™ 및 PEDIAPRED™), 트리암시놀론(triamcinolone), 아줄피딘(azulfidine), 및 에이코사노이드(e.g., 프로스타글란딘, 트롬복산, 및 류코트리엔 (예를 들어, 몬테루카스트(montelukast) (SINGULAIR™), 자필루카스트(zafirlukast) (ACCOLATE™), 프란루카스트(pranlukast) (ONON™), 또는 질류톤(zileuton) (ZYFLO™))의 억제제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

항염증 요법 및 이들의 용량, 투여 루트 및 추천되는 용법은 당업계에 공지 되어 있고, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)와 같은 문헌에 기술된 바 있다.

5.4.2.5. 항바이러스 요법

당업계에 공지된 모든 항바이러스제가 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 항바이러스제의 비제한적 예는, 그의 수용체에 대한 바이러스의 부착, 세포 내부로의 바이러스의 내재화(internalization), 바이러스의 증식, 또는 세포로부터의 바이러스의 방출을 억제 및/또는 감소시키는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 융합 단백질 항체, 핵산 분자, 유기분자, 무기분자, 및 소분자를 포함한다. 특히, 항바이러스제는 뉴클레오사이드 유사체 (예를 들어, 지도부딘(zidovudine), 아시클로버(acyclovir), 강사이클로버(gangcyclovir), 비다라빈(vidarabine), 이독수리딘(idoxuridine), 트리플루리딘(trifluridine), 및 리바비린), 포스카르넷(foscarnet), 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비르(saquinavir), 인디나비르(indinavir), 리토나비르(ritonavir), 알파-인터페론 및 다른 인터페론, 및 AZT를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 상기 항바이러스제는 바이러스 항원에 대해 면역특이적인 면역조정제(immunomodulatory agent)이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 항원(viral antigen)"은 면역 반응을 일으킬 수 있는 모든 바이러스 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 (예를 들어, HIV gpl20, HIV nef, RSV F 당단백(glycoprotein), RSV G 당단백, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아 제(neuraminidase), 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin), HTLV tax, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백 (예를 들어, gB, gC, gD, 및 gE) 및 B형 간염 표면 항원)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바이러스 감염의 치료를 위한 본 발명에서 유용한 항체는, 아데노바이러스과(adenovirdiae) (예를 들어, 포유류 아데노바이러스(mastadenovirus) 및 조류 아데노바이러스(aviadenovirus)), 헤르페스바이러스과(herpesviridae) (예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 1, 헤르페스 심플렉스 바이러스 2, 헤르페스 심플렉스 바이러스 5, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 6), 레비바이러스과(leviviridae) (예를 들어, 레비바이러스(levivirus), 장내세균 상(enterobacteria phase) MS2, 알로레바이러스(allolevirus)), 폭스바이러스과(poxviridae) (예를 들어, 코르도폭스바이러스 아과(chordordopoxvirinae), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus), 레프리폭스바이러스(leporiipoxvirus), 수이폭스바이러스(suipoxvirus), 몰루사이폭스바이러스(molluscipoxvirus), 및 엔토모폭스바이러스 아과(entomopoxvirinae)), 파포바바이러스과(papovaviridae) (예를 들어, 폴리오마바이러스(polyomavirus) 및 파필로마바이러스(papillomavirus)), 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae) (예를 들어, 파라믹소바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1, 모빌리바이러스(mobillivirus) (예를 들어, 홍역 바이러스(measles virus)), 루불라바이러스(rubulavirus) (예를 들어, 멈프스 바이러스(mumps virus)), 뉴모바이러스과(pneumonovirinae) (예를 들어, 뉴모바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스), 및 메타뉴모바이러 스(metapneumovirus) (예를 들어, 조류 뉴모바이러스 및 인간 메타뉴모바이러스)), 피코르나바이러스과(picornaviridae) (예를 들어, 엔테로바이러스(enterovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 헤파토바이러스(hepatovirus) (예를 들어, 인간 A형 간염 바이러스), 카르디오바이러스(cardiovirus), 및 압토바이러스(apthovirus)), 레오바이러스과(reoviridae) (예를 들어, 오르토레오바이러스(orthoreovirus), 오르비바이러스(orbivirus), 로타바이러스(rotavirus), 사이포바이러스(cypovirus), 피지바이러스(fijivirus), 파이토레오바이러스(phytoreovirus), 및 오리자바이러스(oryzavirus)), 레트로바이러스과(retroviridae) (예를 들어, 포유류 B 유형 레트로바이러스(mammalian type B retroviruses), 포유류 C 유형 레트로바이러스, 조류 C 유형 레트로바이러스, D 유형 레트로바이러스 그룹, BLV- HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스(lentivirus) (예를 들어 인간 면역결핍 바이러스 1 및 인간 면역결핍 바이러스 2), 스푸마바이러스(spumavirus)), 플라비바이러스과(flaviviridae) (예를 들어, C형 간염 바이러스), 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae) (예를 들어, B형 간염 바이러스), 토가바이러스과(togaviridae) (예를 들어, 알파바이러스(alphavirus) (예를 들어, 신드비스 바이러스(sindbis virus)) 및 루비바이러스(rubivirus) (예를 들어, 루벨라 바이러스(rubella virus))), 랩도바이러스과(rhabdoviridae) (예를 들어, 베시큘로바이러스(vesiculovirus), 리싸바이러스(lyssavirus), 에페메로바이러스(ephemerovirus), 사이토랩도바이러스(cytorhabdovirus), 및 네클레오랩도바이러스(necleorhabdovirus)), 아레나바이러스과(arenaviridae) (예를 들어, 아레나바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러 스(lymphocytic choriomeningitis virus), 이피 바이러스(Ippy virus), 및 랏사 바이러스 (lassa virus), 및 코로나바이러스과(coronaviridae) (예를 들어, 코로나바이러스 및 토로바이러스(torovirus))를 예로서 포함하고 제한하고자 하는 것이 아닌, 병원성 바이러스의 항원에 대한 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

바이러스 감염의 치료에 유용한 입수 가능한 항체의 특정 예는 HIV 감염의 치료에 유용한 CD4 융합 항체인 PRO542 (Progenies); B형 간염 바이러스의 치료에 유용한 인간 항체인 Ostavir (Protein Design Labs, Inc., CA); 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 치료에 유용한 인간화된 IgGl 항체인 Protovir (Protein Design Labs, Inc., CA); 및 RSV를 치료하는데 유용한 인간화된 항체인 팔리비주맙(SYNAGIS®; 메디뮨 인코포레이티드; 국제 공개 제WO 02/43660호)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 항바이러스제는 바이러스 감염을 억제하거나 또는 감소시키고, 감염을 야기하는 바이러스의 증식을 억제하거나 또는 감소시키고, 또한 다른 세포 또는 대상에게로의 감염을 야기하는 바이러스의 확산을 억제하거나 또는 감소시킨다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 항바이러스제는 RSV, hMPV, 또는 PIV에 의한 감염을 억제하거나 또는 감소시키고, RSV, hMPV, 또는 PIV의 증식을 억제하거나 또는 감소시키고, 또는 다른 세포 또는 대상에게로의 RSV, hMPV, 또는 PIV의 확산을 억제하거나 또는 감소시킨다. RSV, hMPV, 및/또는 PIV의 치료 방법 및 약제의 예는 지도부딘, 아시클로버, 강사이클로버, 비다라빈, 이독수리딘, 트리플루리딘, 및 리바비린과 같은 뉴클레오사이드 유사체뿐만 아니라 포스카르넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비르, 인디나비르, 리토나비르, 알파-인터페론을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, 표제 "Methods of Treating and Preventing RSV, HMPV, and PIV Using Anti-RSV, Anti-HMPV, and Anti-PIV Antibodies"의 2002년 7월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 제60/398,475호 및 2003년 2월 21일에 출원된 미국 특허 출원 제10/371,122호를 참조하라.

특정 구체예에서, 바이러스 감염은 RSV이고, 항바이러스제는 RSV 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체이다. 어떤 구체예에서, 항-RSV-항원 항체는 RSV의 그룹 A의 RSV 항원에 면역특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항-RSV-항원 항체는 RSV의 그룹 B의 RSV 항원에 면역특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 한 그룹의 RSV의 항원에 결합하고, 다른 그룹의 유사한(analogous) 항원과 교차 반응한다. 특정 구체예에서, 항-RSV-항원 항체는 RSV 핵단백질(nucleoprotein), RSV 인단백질(phosphoprotein), RSV 매트릭스 단백질, RSV 작은 소수성 단백질, RSV RNA-의존적 RNA 중합효소, RSV F 단백질, 및/또는 RSV G 단백질에 면역특이적으로 결합한다. 추가의 특정 구체예에서, 항-RSV-항원 항체는 RSV 핵단백질, RSV 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질, RSV 인단백질, RSV 매트릭스 단백질, RSV 부착 당단백질, RSV 융합 당단백질, RSV 뉴클레오캡시드 단백질, RSV 매트릭스 단백질, RSV 작은 소수성 단백질, RSV RNA-의존적 RNA 중합효소, RSV F 단백질, RSV L 단백질, RSV P 단백질, 및/또는 RSV G 단백질의 대립 변이체(allelic variant)에 결합한다.

RSV 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체가 당업계에 공지되어 있음이 인식되어야 한다. 예를 들어, 팔리비주맙 (SYNAGIS®)은 소아 환자에서 RSV 감염의 예방을 위해 현재 사용되는 인간화된 단일클론성 항체이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 팔리비주맙 또는 이의 항체-결합 절편(예를 들어, 하나 이상의 상보성 결정 부위(complementarity determining region; CDR)을 함유하는 절편, 및 바람직하게는, 팔리비주맙의 가변 도메인)이다. 팔리비주맙의 아미노산 서열은, 예를 들어, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, Johnson 등, 1997, J. Infection 176:1215-1224, 및 Young 등의 "Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment" 표제의 국제 출원 공개 제WO 02/43660호 및 미국 특허 제5,824,307호에 개시된다.

FcRn 수용체에 대해, 팔리비주맙의 Fc 도메인보다 더 높은 친화도를 갖는 Fc 도메인을 포함하는, RSV 항원에 면역특이적으로 결합하는, 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 절편도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 항체는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, 2001년 12월 12일에 출원된 미국 특허 출원 제10/020,354호에 기재된다. 또한, 하나 이상의 항-RSV-항원 항체 A4B4; P12f2 P12f4; P11d4; Ale9; A12a6; A13c4; A17d4; A4B4; 1X-493L1; FR H3-3F4; M3H9; Y10H6; DG; AFFF; AFFF(1); 6H8; L1-7E5; L2-15B10; A13a11; A1h5; A4B4(1);A4B4-F52S; 또는 A4B4L1FR-S28R가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이들 항체는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Young 등의 "Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment" 표제 의 국제 출원 공개 제WO 02/43660호, 및 2002년 7월 25일에 출원된 "Methods of Treating and Preventing RSV, HMPV, and PIV Using Anti-RSV, Anti-HMPV, and Anti-PIV Antibodies" 표제의 미국 특허 가출원 60/398,475에 개시된다.

어떤 구체예에서, 항-RSV-항원 항체는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Young 등의, 모두 "Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment" 표제인 2000년 11월 28일에 출원된 미국 출원 제09/724,531호; 2001년 11월 28일에 출원된 미국 출원 제09/996,288호; 및 2003년 5월 15일에 공개된 미국 특허 공개 제US2003/0091584 A1호의 방법으로 준비된 또는 이의 항-RSV-항원 항체이다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 안정화된 항체 제형을 위한 방법 및 조성물은 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 2002년 6월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 제60/388,921호, 및 2002년 6월 14일에 출원된 제60/388,921호에 개시된다.

항바이러스 요법 및 이들의 용량, 투여 루트 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)와 같은 문헌에 기술된 바 있다. 호흡기 바이러스 감염에 대한 추가적 정보는 Cecil Textbook of Medicine (18번째 판, 1988)에서 입수 가능하다.

5.4.2.6. 항균 요법

당업자에게 공지된, 세균 감염의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 항균제 및 요법이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 항균제의 비제한적 예는, 세 균 감염을 억제하거나 감소시키는, 세균의 증식을 억제하거나 감소시키는, 또는 다른 대상으로의 세균의 확산을 억제하거나 감소시키는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 융합 단백질, 항체, 핵산 분자, 유기분자, 무기분자, 및 소분자를 포함한다. 특히, 항균제의 예는 페니실린(penicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 이미페넴(imipenem), 악스트레오남(axtreonam), 반코마이신(vancomycin), 시클로세린(cycloserine), 바시트라신(bacitracin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 에리트로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린(tetracycline), 스트렙토마이신(streptomycin), 토브라마이신(tobramycin), 겐타마이신(gentamicin), 아미카신(amikacin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 트리메토프림(trimethoprim), 노르플록사신(norfloxacin), 리팜핀(rifampin), 폴리믹신(polymyxin), 암포테리신(amphotericin) B, 니스타틴(nystatin), 케토코나졸(ketocanazole), 이소니아지드(isoniazid), 메트로니다졸(metronidazole), 및 펜타미딘(pentamidine)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직한 구체예에서, 상기 항균제는 세균 감염을 억제하거나 또는 감소시키는, 감염을 야기하는 세균의 증식을 억제하거나 또는 감소시키는, 또는 다른 대상에게로의 감염을 야기하는 세균의 확산을 억제하거나 또는 감소시키는 약제이다. 세균 감염이 마이코플라즈마 감염 (예를 들어, 인두염, 기관기관지염(tracheobronchitis), 및 폐렴)인 경우, 상기 항균제는 바람직하게는 테트라사이클린, 에리트로마이신, 또는 스펙티노마이신이다. 세균 감염이 튜버큘로시스인 경 우, 상기 항균제는 바람직하게는 리팜피신, 이소나이지드(isonaizid), 피란지나마이드(pyranzinamide), 에탐부톨(ethambutol), 및 스트렙토마이신이다.

항균 요법 및 이들의 용량, 투여 루트 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)와 같은 문헌에 기술된 바 있다. 호흡기 감염 및 항균 요법에 대한 추가적 정보는 Cecil Textbook of Medicine (18번째 판, 1988)에서 입수 가능하다.

5.4.2.7. 항곰팡이 요법

당업자에게 공지된, 곰팡이 감염 또는 하나 이상의 이의 증상(예를 들어, 호흡기 곰팡이 감염)의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 항곰팡이제 및 요법은 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 항곰팡이제의 비제한적 예는, 곰팡이 감염을 억제 및/또는 감소시키는, 곰팡이의 증식을 억제 및/또는 감소시키는, 또는 다른 대상으로의 곰팡이의 확산을 억제 및/또는 감소시키는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 융합 단백질, 항체, 핵산 분자, 유기분자, 무기분자, 및 소분자를 포함한다. 항곰팡이제의 특정예는 아졸 약물(예를 들어, 미코나졸, 케토코나졸 (니조랄(NIZORAL)®), 카스포펀진 아세테이트 (칸시다스(CANCIDAS)®), 이미다졸, 트리아졸 (예를 들어, 플루코나졸 (디플루칸(DIFLUCAN)®), 및 이타코나졸 (스포라녹스(SPORANOX)®), 폴리엔 (예를 들어, 니스타틴, 암포테리신 B (FUNGIZONE®), 암포테리신 B 지질 복합체 ("ABLC")(ABELCET®), 암포테리신 B 현탁 분산액("ABCD")(암포텍(AMPHOTEC)®), 리포좀 암포테리신 B (암비손(AMBISONE)®), 요오 드칼륨(KI), 피리미딘 (예를 들어, 플루사이토신 (안코본(ANCOBON)®)), 및 보리코나졸(voriconazole) (브이펜드(VFEND)®)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 특정 항곰팡이제 및 이들의 권장 용량의 목차인 아래의 표 3을 참조한다.

표 3. 항곰팡이제

어떤 구체예에서, 항곰팡이제는 곰팡이 감염을 억제하거나 또는 감소시키는, 감염을 야기하는 곰팡이의 증식을 억제하거나 또는 감소시키는, 또는 다른 대상으로의 감염을 야기하는 곰팡이의 확산을 억제하거나 또는 감소시키는 약제이다. 곰팡이 감염이 블라스토마이세스 더마타이티디스인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 이트라코나졸, 암포테리신 B, 플루코나졸, 또는 케토코나졸이다. 곰팡이 감염이 폐 아스페르길루스종(pulmonary aspergilloma)인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 암포테리신 B, 리포좀성 암포테리신 B, 이트라코나졸, 또는 플루코나졸이다. 곰팡이 감염이 히스토플라즈마증(histoplasmosis)인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 암포테리신 B, 이트라코나졸, 플루코나졸, 또는 케토코나졸이다. 곰팡이 감염이 콕시디오이데스 진균증(coccidioidomycosis)인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 플루코나졸, 또는 암포테리신 B이다. 곰팡이 감염이 크립토콕쿠스증(cryptococcosis)인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 암포테리신 B, 플루코나졸, 또는 상기 두 약제의 조합이다. 곰팡이 감염이 색소진균증(chromomycosis)인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 이트라코나졸, 플루코나졸, 또는 플루사이토신이다. 곰팡이 감염이 털곰팡이증(mucormycosis)인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 암포테리신 B 또는 리포좀성 암포테리신 B이다. 폐 또는 호흡기 곰팡이 감염이 슈도알레쉐리아시스(pseudoallescheriasis)인 경우, 항곰팡이제는 바람직하게는 이트라코나졸 또는 미코나졸이다.

항곰팡이 요법 및 이들의 용량, 투여 루트, 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Dodds 등, 2000 Pharmacotherapy 20(11) 1335-1355, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007) 및 Merk Manual of Diagnosis and Therapy (17th 판, 1999)와 같은 문헌에 기술된 바 있다.

5.4.2.8. 항원생동물 요법

당업자에게 공지된, 원생동물 감염 또는 하나 이상의 이의 증상(예를 들어, 원생동물 감염과 관련된 호흡기 감염)의 치료, 예방 및/또는 관리를 위한 항원생동물제 및 요법은 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 항원생동물제의 비제한적 예는, 원생동물 감염을 억제 및/또는 감소시키는, 원생동물의 증식을 억제 및/또는 감소시키는, 또는 다른 대상으로의 원생동물의 확산을 억제 및/또는 감소시키는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 융합 단백질, 항체, 핵산 분자, 유기분자, 무기분자, 및 소분자를 포함한다. 항원생동물제의 특정 예는 클로로퀴닌 포스페이트(chloroquine phosphate) (Aralen™); 독시사이클린, 테트라사이클린, 또는 클린다마이신 중 하나를 더한 황산 퀴닌 (quinine sulfate); 아토바큐온-프로구아닐(atovaquone-proguanil) (Malarone™); 메플로퀸(Mefloquine) (Lariam™); 메트로니다졸(metronidazole) (Flagyl); 티니다졸(tinidazole) (Tindamax); 5-니트로이미다졸(5-nitroimidazole) (ornidazole), 및 미국 특허 제6,440,936호에 기재된 약제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

어떤 구체예에서, 항원생동물제는, 원생동물 감염을 억제하거나 또는 감소시키는, 감염을 야기하는 원생동물의 증식을 억제하거나 또는 감소시키는, 또는 다른 대상으로의 감염을 야기하는 원생동물의 확산을 억제하거나 또는 감소시키는 약제이다. 원생동물 감염이 트리코모나스증(Trichomoniasis)인 경우, 항원생동물제는 바람직하게는 메트로니다졸 (Flagyl), 티니다졸 (Tindamax), 또는 5-니트로이미다졸 (ornidazole)이다. 원생동물 감염이 말라리아(malaria)인 경우, 항원생동물제는 바람직하게는 클로로퀴닌 포스페이트 (Aralen™); 독시사이클린, 테트라사이클 린, 또는 클린다마이신 중 하나를 더한 황산 퀴닌; 독시사이클린, 테트라사이클린, 또는 클린다마이신 중 하나를 더한 퀴니딘 글루코네이트(quinidine gluconate); Fansidar™; Malarone™ (아토바큐온 250 mg 플러스 프로구아닐 100 mg); 또는 메플로퀸 (Larium™)이다.

항원생동물 요법 및 이들의 용량, 투여 루트, 및 추천되는 용법은 당업계에 공지되어 있고, Dodds 등, 2000 Pharmacotherapy 20(11) 1335-1355, Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007); Merk Manual of Diagnosis and Therapy (17th 판, 1999) 및 질환 제어 및 예방을 위한 센터(Centers for Disease Control and Prevention) (CDC; http://www.cdc.gov) (Atlanta, GA)에 의해 제공된 출판물와 같은 문헌에 기술된 바 있다.

5.5 EphA2 - BiTE 의 생물학적 활성

당업계에 공지되었으며, 이하의 섹션 6에서 자세하게 기술되는 다양한 시험관 내 및 생체 내 어세이는 본 발명의 방법에 의해 생산된 EphA2-BiTE의 생물학적 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 시험관 내 및 생체 내 어세이는 예를 들어, 표적 세포 특이성 및 상기 세포의 효과적인 용해(lysis)와 같은 바라는 생물학적 활성을 갖는 EphA2-BiTE을 스크리닝 및 식별하도록 한다. 특히, 본 발명은 다양한 면역어세이를 이용하여 표적 세포 특이성 (예를 들어, EphA2-BiTE가 EphA2를 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합하는 능력)을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 EphA2-BiTE의 결합 특성은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 EphA2-BiTE의 친화도 상수 (K_D, K_0n 및 K_off)를 확인하기 위해 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용하여 측정될 수 있다. 본 발명은 추가로 다양한 세포독성 어세이를 이용하여 예를 들어, 시험관 내 용해를 매개하기 위해 표적 세포 (예를 들어, EphA2를 과발현하는 종양 세포)에 결합하는 능력과 같은 특이적인 생물학적 활성을 갖는 EphA2-BiTE를 스크린하는데 사용될 수 있는 어세이를 제공한다. 상기 어세이는 본 발명의 EphA2-BiTE의 독성 및 효능을 측정하기 위해 (예를 들어, EphA2-BiTE로 처리된 세포의 개체수의 50%까지 치사시키는(lethal) 용량(LD₅₀)을 측정하기 위해) 사용될 수 있다. 또한 동물 모델을 이용하여 본 발명의 EphA2-BiTE의 생체 내 종양 세포의 치사(killing)를 매개하는 능력을 측정하기 위해 사용될 수 있는 어세이가 제공된다.

5.5.1 표적 세포 특이성을 측정하기 위한 어세이

EphA2- 및 CD3-발현 세포 (예를 들어, EphA2를 과발현하는 세포 또는 EphA2의 어떤 에피토프가 선택적으로 노출된 세포)에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 EphA2-BiTE의 능력을 측정하기 위해 당업자에게 공지된 다양한 어세이가 사용될 수 있다. 상기 어세이는 예를 들어, RIA, ELISA, 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역조직화학(immunohistochemistry), 면역형광법(immunofluorescence) 및 플로우 사이토메트리 어세이(flow cytometry assay)를 포함한다. 예를 들어, 섹션 6.2.3에 기재된 바와 같이, 플로우 사이토메트리 기반 어세이는 다양한 EphA2-BiTE 컨스트럭트(construct)의 이중특이적 세포 결합을 측정하기 위해 사용될 수 있다. A549 세포(인간 폐 암종 세포)와 같은 EphA2-양성(positive) 세포주 및 MDA-MB-231 세포 (인간 유방암 세포)는 표적 세포로서 사용될 수 있고, 또한 CD3-양성 HP-Ball 세포 (인간 T-세포주)는 효과기 세포로서 사용될 수 있다. 상기 세포는 함께 혼합되고 또한 관심있는 EphA2-BiTE와 함께 인큐베이트될 수 있다. 플로우 사이토메트리는 각 EphA2-양성 표적 세포에 대한 결합 강도를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

에피토프 배제(exclusion) 분석은 본 발명의 방법에 의해 생산된 EphA2-BiTE가 그들이 유래된 부모 항체의 에피토프 배제를 유지하는지 여부를 측정하기 위해 면역형광 염색을 이용하여 수행될 수 있다. 이하의 섹션 6.2.4를 참조한다.

5.5.2 표면 플라즈몬 공명 어세이

표면 플라즈몬 공명 어세이는 본 발명의 EphA2-BiTE의 결합 특성을 측정하기 위해 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 EphA2-BiTE의 친화도 및 해리 상수뿐만 아니라 회합율 및 해리율(k_a, kD, k_ON 및 k_off)은 이 어세이를 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 이하의 6.8.3을 참조한다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 어세이는, 카르복시메틸(CM) 덱스트란 매트릭스 및 Biacore^®3000 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 함유하는 센서 칩 CM5 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 수행될 수 있다. CD3εγ는 아민 커플링 케미스트리를 이용하여 CM 덱스트란 매트릭스에 공유결합적으로 부착된다. 참조(reference) 표면은 CD3εγ 커플링 단계를 생략시킴으로써 생성된다. EphA2-Fc는, EphA2Fc의 Fc 부분과 염소 항-인간 IgG (Fc) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) 사이의 높은 친화도 상호작용을 통해 포획된다. 염소 항-인간 IgG (Fc)는 아민 커플링 케미스트리를 이용하여 CM 덱스트란 매트릭스에 공유결합적으로 부착된다. 그 후 두개의 항-인간 IgG (Fc)-특이적 표면이 생성된다. 이들 표면 중 하나가 참조 표면으로 사용되는 동안 다른 표면이 EphA2-Fc-특이적 표면을 생성하기 위해 사용된다. 그 후 상이한 농도의 bscEphA2 x CD3가 HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)에서의 연속 희석에 의해 준비된다. EphA2-BiTE는 CD3εγ-특이적 또는 EphA2-특이적 표면 및 그의 상응하는 참조 표면을 가로지르는 연속-흐름 방식으로 주입된다. 결합된 EphA2-BiTE의 해리는 HBS-EP의 존재 하에 모니터된다. 잔류하는 결합 물질은 10 mM 사붕산이나트륨(disodium tetraborate) pH 8.5, (CD3εγ-특이적 표면에 대해) 1 M NaCl 또는 (EphA2-Fc-특이적 표면에 대해) 10 mM 글리신 pH 1.7으로 제거되었다.

5.5.3 세포독성 어세이

이하의 섹션 6.3.1에서 설명한 바와 같이, 플로우 사이토메트리-기반 방향전환된 세포 독성 어세이는 효과기 세포 도너로 EphA2-BiTE 세포독성 활성을 측정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, CD3+ T-세포가 풍부한 인간 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells; "PBMC")는 건강한 도너로부터 단리될 수 있다. 표적 세포, 예를 들어, EphA2를 발현하는 세포는 (DiOC 18(3) 또는 "DiO")와 같은 형광 막 염료로 표지된다. 상기 세포는 관심있는 EphA2-BiTE와 공동인큐베이트되고 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide; PI)의 첨가 후 플로우 사이토메트리에 의해 분석된다. 그 후 표적 세포 용해는 PL에 의해 양성으로 염색 되는 DiO 양성 세포의 백분율로서 계산된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE는 aberrant EphA2 발현 및/또는 활성과 관련된 세포 (예를 들어, 암세포, 비암 과증식 세포 또는 EphA2를 발현하는 감염된 세포)의 용해를 매개한다. 이 구체예에 따르면, 상기 세포는, 동일한 세포주 또는 대상으로부터의 정상 세포, 정상의, 건강한 대상의 세포 및/또는 정상의, 건강한 세포의 개체군의 수치에 비하여 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 9% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 또는 1.5배 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 7배 이상 또는 10배 이상 감소된다. 다른 특정 구체예에서, EphA2-BiTE는 정상 조직으로부터의 세포 또는 건강한 대상 또는 대조군의 조직으로부터의 정상 세포의 용해를 매개하지 않는다.

본 발명에 따라 사용된 요법의 생물학적 활성 (예를 들어, 항암, 항-과증식, 또는 항-감염 활성) 또한 SCID 마우스 모델 또는 마우스 EphA2가 인간 EphA2로 교체된 트랜스제닉(transgenic) 마우스, 인간 이종이식물(xenografts)을 갖는 누드 마우스, 이하의 섹션 6에 기재된 동물 모델, 또는 당업계에 공지된 및 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig 및 Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven 및 Winograd); 및 Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher)에 기재된 (햄스터, 토 끼 등을 포함하는) 모든 동물 모델과 같은 암 연구를 위한 다양한 실험 동물 모델을 이용함으로써 측정될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE의 세포독성 효과는 또한 SW480 인간 결장 암종 세포주와 같은 종양 이종이식을 이용하는 비당뇨병성/중증(non-diabetic/severe) 조합된 면역결핍 (NOD/SCID) 마우스 모델과 같은 마우스 모델로 생체 내 테스트될 수 있다. SW480 세포가 EphA2를 발현하므로, SW480 세포주는 인간 이종이식 모델의 수립을 위해 선택될 수 있다. 간단히 말하면, 동물에게 표적 (예를 들어, SW480 세포)과 효과기 (건강한 도너로부터의 인간 CD3+ T 세포) 또는 효과기 세포 없이 표적 세포 단독으로 주사할 수 있다. 종양 성장 동력학은 두 처리군 사이에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 이하의 섹션 6.4.1을 참조한다.

따라서, 본 발명의 예방적 및/또는 치료적 프로토콜의 독성 및 효능은 세포배양 또는 실험 동물에서 예를 들어, LD₅₀ (개체군의 50%까지 치사하는 용량) 및 ED₅₀ (개체군의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)를 측정하기 위한 표준의 약제학적 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고, 이는 비율 LD₅₀/ED₅₀로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 예방제 및/또는 치료제가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 예방제 및/또는 치료제가 사용되는 한, 비감염된 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하기 위해 영향받은 조직의 사이트로 상기 약제를 표적화하는 전달 시스템을 설계하기 위한 간호가 이뤄져야 한다. 본 발명의 EphA2-BiTE의 생물학적 활성을 측정하는 방법의 특정 예가 또한 이하의 실시예의 섹션 6에 제공된다.

세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서의 사용을 위한 예방제 및/또는 치료제의 투여량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 상기 약제의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 없는 ED₅₀를 포함하는 순환 농도 범위 내에 놓인다. 상기 투여량은 사용된 dosage form 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 임의의 약제에 대해, 치료적 유효량은 세포 배양 어세이로부터 최초에 평가될 수 있다. 용량은, 세포 배양에서 측정된 바와 같은 IC₅₀ (즉, 증상의 최고의 절반(half-maximal) 억제를 달성하는 테스트 화합물의 농도)를 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 상기 정보는 인간에서의 유용한 용량을 보다 정확하게 측정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수치는 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

요법에서의 사용을 위한 화합물은 인간에서 테스트하기 전에 랫트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼, 햄스터 등, 예를 들면, 상기한 동물 모델을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 적합한 동물 모델 시스템에서 테스트 될 수 있다. 그 후 상기 화합물은 적절한 임상 시험에 사용할 수 있다.

또한, 당업자에게 공지된 임의의 어세이는, EphA2의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 장애 (예를 들어, 암, 비-과증식성 세포 장애, 또는 감염)의 치료 또는 예방을 위한 본원에 개시된 조합 요법의 예방적 및/또는 치료적 유용성을 평 가하기 위해 사용될 수 있다.

5.6 조성물

본 발명은 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 또한 약제학적 조성물 (예를 들어, 순수하지 않은 또는 멸균하지 않은 조성물) 및 단위 조제 형태(unit dosage form)의 조제(preparation)에 사용될 수 있는 약제학적 조성물 (즉, 대상 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물(bulk drug composition)을 포함한다. 상기 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의, 본원에 개시된 예방제 및/또는 치료제 또는 이들 약제의 조합 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 EphA2-BiTE가 아닌 추가적 요법을 추가로 포함한다.

특정 구체예에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 동물, 및 보다 상세하게는 인간에서의 사용을 위해 연방 또는 주 정부(state government)의 취체기관(regulatory agency)에 의해 승인된 것 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 승인된 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 투여된 therapeutic을 갖는 희석제, 부형제, 또는 비히클(vehicle)을 나타낸다. 상기 약제학적 담체는 땅콩 기름, 대두유, 광물유, 참기름 등과 같은 석유, 동물, 합성 또는 식물 기원의 것을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균액일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수용성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 은 액체 담체로서, 바람직하게는 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 또한 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크(chalk), 실리카겔, 소듐 스테아레이트(sodium stearate), 글리세롤 모노스테아레이트(glycerol monostearate), 탈크, 염화나트륨, 건조된 탈지 우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원한다면, 상기 조성물은 작은 양의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은 예를 들어, 활성 약제의 양을 나타내는 앰플 또는 사쉐(sachette)와 같은 밀봉된(hermetically sealed) 용기 내의 건조 동결된 분말 또는 무수 농축물로서의 단위 조제 형태로 함께 혼합되어 또는 개별적으로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균된 약제학적 등급 물 또는 염수를 함유하는 수액병(infusion bottle)으로 분배될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균된 약제학적 등급 물 또는 염수를 함유하는 수액병(infusion bottle)으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사를 위한 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있어 성분이 투여 직전에 혼합될 수 있다.

본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같은 음이온으로 형성된 염 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2 철(ferric hydroxide), 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.

다양한 전달 시스템, 예를 들어, 미세입자, 미소캡슐, 항체 또는 항체 절편을 발현할 수 있는 재조합 세포 (예를 들어, Wu 및 Wu, 1987, J. Biol Chem . 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 벡터 또는 다른 벡터의 일부인 핵산 구조체 등이 알려져 있으며, 본 발명의 EphA2-BiTE 또는 본 발명의 EphA2-BiTE의 조합물 및 비정상적 발현 (예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하기에 유용한 예방제 또는 치료제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구적 투여 (예를 들어, 진피내(intradermal), 근육내, 복막내, 정맥내 및 피하), 경막외(epidural), 및 점막 (예를 들어, 비강내(intranasal), 흡입(inhaled), 및 경구 루트)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 근육내로, 정맥내로, 또는 피하로 투여된다. 상기 예방제 또는 치료제는 모든 편리한 루트에 의해, 예를 들어 주입 또는 거환 주사에 의해, 상피(epithelial) 또는 점막피부 내층(mucocutaneous lining) (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 소장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 또한 다른 생물학적 활성 약제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여 또는 국부 투여일 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 치료를 필요로 하는 구역에 대해 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 것이다; 이는 예로서, 또한 제한의 의 도가 아닌, 주사에 의한, 또는 삽입물(implant)을 이용하는 국소 주입에 의해 달성될 수 있으며, 상기 삽입물은 시알라스틱막(sialastic membrane)과 같은 막, 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴 재료일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 예방제 또는 치료제는 제어 방출(controlled release) 또는 서방출(sustained release) 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 제어 방출 또는 서방출을 달성하기 위해 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit . Ref . Biomed . Eng . 14:20; Buchwald 등, 1980, Surgery 88:507; Saudek 등, 1989, N. Engl . J. Med . 321 :574 참조). 다른 구체예에서, 폴리머 재료는 본 발명의 EphA2-BiTE 또는 이의 절편의 제어 방출 또는 서방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer 및 Wise (편집자), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen 및 Ball (편집자), Wiley, New York (1984); Ranger 및 Peppas, 1983, J. Macromol . Sci. Rev . Macromol . Chem . 23:61 참조; 또한 Levy 등, 1985, Science 228:190; During 등, 1989, Ann . Neurol . 25:351; Howard 등, 1989, J. Neurosurg . 71 :105); 미국 특허 제5,679,377호; 제5,916,597호; 제5,912,015호; 제5,989,463호; 제5,128,326호; 국제 공개 제WO 99/15154호 및 제WO 99/20253호 참조. 서방성 제형에 사용되는 폴리머의 예는, 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-co-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리(N- 비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-co-글리콜리드) (PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 서방성 제형에 사용되는 폴리머는 비활성의(inert), 여과가능한 불순물이 없는, 저장시 안정한, 멸균된, 및 생분해성 폴리머이다. 또 다른 구체예에서, 제어 방출 또는 서방출 시스템은 예방적 또는 치료적 표적 부근에 둘 수 있으며, 따라서 전신 용량의 분획만을 필요로한다 (예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조).

제어 방출 시스템은 Langer에 의한 리뷰에서 논의된다 (1990, Science 249:1527-1533). 당업자에게 공지된 모든 기술은 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 서방성 제형을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, 미국 특허 제4,526,938호; 국제 공개 제WO 91/05548호 및 제WO 96/20698호; Ning 등, 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song 등, 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek 등, 1997, Pro . Int'l . Symp . Control . ReI . Bioact . Mater . 24:853-854; 및 Lam 등, 1997, Proc . Int'l . Symp . Control ReI . Bioact . Mater . 24:759-760을 참조한다.

5.6.1 제형

본 발명에 따른 용도를 위한 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하는 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다.

따라서, 본 발명의 EphA2-BiTE 및 그들의 생리적으로 허용가능한 염 및 용매화합물(solvate)은 (입 또는 코를 통한) 흡입(inhalation) 또는 취입(insufflation) 또는 경구, (볼(buccal), 질(vaginal), 직장, 혀밑(sublingual)과 같은) 점막 또는 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 국부적 또는 전신적 비경구적 투여가 사용된다.

경구 투여를 위해, 상기 약제학적 조성물은, 예를 들어, 결합제 (예를 들어, 미리젤라틴화된(pregelatinised) 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충진제 (예를 들어, 락토오스, 미정질(microcrystalline) 셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트); 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탤크 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 전분 글리콜레이트 나트륨); 또는 습윤제 (예를 들어, 라우릴 황산 나트륨)와 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 갖는 통상적인 수단에 의해 조제된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 상기 정제는 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체제제는 예를 들어, 액체, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있고, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클을 갖는 구성을 위해 건조 생산물로서 존재할 수도 있다. 상기 액체 제제는 현탁제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 경화된 식용 지방(hydrogenated edible fat)); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수 비히클(non-aqueous vehicle) (예를 들어, 아몬드 오일, oily esters, 에틸 알코올 또는 fractionated 식물성 오일); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)와 같은 약 학적으로 허용가능한 첨가제를 갖는 통상적인 수단으로 조제될 수 있다. 상기 제제는 또한 완충액 염, 가향제(flavoring agent), 착색제 및 감미료를 적절하게 함유할 수 있다.

경구 투여를 위한 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 부여하기 위해 적합하게 제형화될 수 있다.

볼(buccal) 투여를 위해 상기 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태를 취할 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명의 예방제 또는 치료제는, 적합한 분사제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여, 가압팩 또는 흡입기로부터의 에어로졸 스프레이 제시(presentation)의 형태로 편리하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 투약 용량은 계량된 양의 전달을 위해 밸브를 제공함으로써 측정될 수 있다. 흡입기(inhaler) 또는 취입기(insufflator)에서의 사용을 위한, 예를 들어, 화합물의 분말 혼합물 및 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재를 함유하는 젤라틴 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다.

예방제 또는 치료제는 주사에 의한, 예를 들어 거환 주사 또는 연속적 주입에 의한 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은 첨가된 보존제를 갖는 단위 조제 형태로, 예를 들어 앰플로 또는 다용량(multi-dose) 용기로 마련될 수 있다. 상기 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 내에서 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형 화제(formulatory agent)를 함유할 수 있다. 또는, 상기 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 멸균수를 갖는 구성을 위해, 사용 전에 분말 형태일 수 있다.

예방제 또는 치료제는 또한 예를 들어 코코아버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 기재를 함유하는 좌약 또는 정체관장(retention enema)과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.

이전에 기술된 제형에 추가하여, 예방제 또는 치료제는 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 그러한 오래 활동하는 제형은 (예를 들어 피하 또는 근육내) 삽입(implantation)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 예방제 또는 치료제는 적합한 폴리머 또는 소수성 재료 (예를 들어 허용가능한 오일 내 에멀션) 또는 이온 교환 수지로 제형화될 수 있거나, 또는 난용성 유도체로, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.

본 발명은 또한 양을 나타내는 앰플 또는 사쉐와 같은 밀봉된 용기 내에 포장된 예방제 또는 치료제를 제공한다. 한 구체예에서, 예방제 또는 치료제는 밀봉된 용기 내의 건조 멸균된 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고, 대상에게로의 투여를 위한 적절한 농도로 예를 들어, 물 또는 염수와 함께 재구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 다양한 화학요법, 생물학적/면역요법적 및 호르몬 요법제의 투여 및 제형은 당업계에 공지되어 있고, 종종 Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)에 기재된다. 예를 들어, 본 발명의 어떤 특정 구체예에서, 본 발명의 치료제는 표 2에 제공된 바와 같이 제형화될 수 있고 또한 공급될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 방사성 동위원소와 같은 방사선 요법제는 캡슐 내 액체로서 또는 드링크로서 경구로 주어질 수 있다. 방사성 동위원소는 또한 정맥내 주사를 위해 제형화될 수 있다. 숙련된 종양의(oncologist)는 바람직한 제형 및 투여 루트를 결정할 수 있다.

어떤 구체예에서 본 발명의 EphA2-BiTE는, 정맥내 주사를 위해 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 및 25 mg/ml로, 또한 반복된 피하 투여 및 근육내 주사를 위해 5 mg/ml, 10 mg/ml, 및 80 mg/ml로 제형화된다

상기 조성물은, 원한다면, 하나 이상의, 활성 성분을 함유하는 단위 조제 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치 내에 존재할 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터 팩(blister pack)과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 설명서가 동봉될 수 있다.

5.6.2 투여량 및 투여 빈도

빈도 및 투여량은 또한, 투여되는 특정 요법 (예를 들어, 특정 요법 또는 예방제 또는 예방제들), 장애, 질환 또는 병태의 중증도, 투여 경로뿐만 아니라 환자의 나이, 신체, 체중, 반응, 및 과거 의료 병력에 좌우되는 각 환자에 대한 특정 요인에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 비정상적인 발현(예를 들어, 과발현) 및/ 또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 효과적일 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 조성물의 투여량은, 예를 들어, 본원에 개시된 또는 당업자에게 알려진 동물 모델과 같은 동물 모델에게 상기 조성물을 투여함으로써 결정될 수 있다. 추가로, 시험관 내 어세이는 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 사용할 수 있다. 적합한 투약 계획은 당업자에 의해 상기 요인을 고려함으로써, 및 예를 들어, 문헌에 보고된 및 Physicians' Desk Reference (61 ^st 판, 2007)에서 권장된 투여량을 준수함으로써 선택될 수 있다.

소분자의 대표적 용량은 대상 또는 샘플 중량의 킬로그램 당 소분자의 밀리그램(milligram) 또는 마이크로그램(microgram) 양을 포함한다 (예를 들어, 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 500 밀리그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 5 밀리그램, 또는 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50 마이크로그램).

본 발명에 포함된 항체, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및 융합 단백질에 있어서, 환자에게 투여되는 용량은 일반적으로 환자의 체중의 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하게는, 상기 환자에게 투여된 용량은, 환자의 체중의 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.0001 내지 0.15 mg/kg, 0.0001 내지 0.10 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.25 mg/kg 또는 0.01 내지 0.10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는, 외부 폴리펩타이드에 대한 면역 반응때문에 다른 종으로부터의 항체에 비해 인체 내에서 더욱 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 더욱 낮은 투여량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 절편의 투여 빈도 및 투여량은, 예를 들어, 지질화(lipidation)와 같은 변형(modification)에 의한 상기 항체의 섭취 및 조직 침투의 향상에 의해 감소될 수 있다.

환자에게 투여되는 본 발명의 EphA2-BiTE의 대표적 투여량은 일반적으로 0.01 ㎍ 내지 100 mg이다. 특히 바람직한 투여량은 0.1 ㎍ 내지 10 mg, 보다 바람직하게는, 1 ㎍ 내지 100 ㎍, 또한 가장 바람직하게는 3 ㎍ 내지 10 ㎍이다.

특정 구체예에서, 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애 또는 하나 이상의 이의 증상의 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 환자에게 투여된 EphA2-BiTE (예를 들어, 본 발명의 항체, 조성물 또는 조합 요법)의 투여량은, 환자의 체중의 100 mg/kg 이하, 50 mg/kg 이하, 25 mg/kg 이하, 10 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 500 ㎍/kg 이하, 400 ㎍/kg 이하, 300 ㎍/kg 이하, 200 ㎍/kg 이하, 150 ㎍/kg 이하, 바람직하게는 125 ㎍/kg 이하, 100 ㎍/kg 이하, 95 ㎍/kg 이하, 90 ㎍/kg 이하, 85 ㎍/kg 이하, 80 ㎍/kg 이하, 75 ㎍/kg 이하, 70 ㎍/kg 이하, 65 ㎍/kg 이하, 60 ㎍/kg 이하, 55 ㎍/kg 이하, 50 ㎍/kg 이하, 45 ㎍/kg 이하, 40 ㎍/kg 이하, 35 ㎍/kg 이하, 30 ㎍/kg 이하, 25 ㎍/kg 이하, 20 ㎍/kg 이하, 15 ㎍ /kg 이하, 10 ㎍/kg 이하, 5 ㎍/kg 이하, 2.5 ㎍/kg 이하, 2 ㎍/kg 이하, 1.5 ㎍/kg 이하, 1 ㎍/kg 이하, 0.5 ㎍/kg 이하, 또는 0.5 ㎍/kg 이하이다. 특정 구체예에서, 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애 또는 하나 이상의 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 관리하기 위해 환자에게 투여된 본 발명의 EphA2-BiTE 또는 조합 요법의 투여량은, 0.1 mg 내지 20 mg, 0.1 mg 내지 15 mg, 0.1 mg 내지 12 mg, 0.1 mg 내지 10 mg, 0.1 mg 내지 8 mg, 0.1 mg 내지 7 mg, 0.1 mg 내지 5 mg, 0.1 내지 2.5 mg, 0.25 mg 내지 20 mg, 0.25 내지 15 mg, 0.25 내지 12 mg, 0.25 내지 10 mg, 0.25 내지 8 mg, 0.25 mg 내지 7m g, 0.25 mg 내지 5 mg, 0.5 mg 내지 2.5 mg, 1 mg 내지 20 mg, 1 mg 내지 15 rng, 1 mg 내지 12 mg, 1 mg 내지 10 mg, 1 mg 내지 8 mg, 1 mg 내지 7 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 1 mg 내지 2.5 mg의 단위 용량이다.

다른 구체예에서, 대상은 하나 이상의, 본 발명의 하나 또는 EphA2-BiTE의 유효량의 용량을 투여받고, 여기서 상기 유효량의 용량은, 본 발명의 EphA2-BiTE의 적어도 0.1 ㎍/ml, 적어도 0.5 ㎍/ml, 적어도 1 ㎍/ml, 적어도 2 ㎍/ml, 적어도 5 ㎍/ml, 적어도 6 ㎍/ml, 적어도 10 ㎍/ml, 적어도 15 ㎍/ml, 적어도 20 ㎍/ml, 적어도 25 ㎍/ml, 적어도 50 ㎍/ml, 적어도 100 ㎍/ml, 적어도 125 ㎍/ml, 적어도 150 ㎍/ml, 적어도 175 ㎍/ml, 적어도 200 ㎍/ml, 적어도 225 ㎍/ml, 적어도 250 ㎍/ml, 적어도 275 ㎍/ml, 적어도 300 ㎍/ml, 적어도 325 ㎍/ml, 적어도 350 ㎍/ml, 적어도 375 ㎍/ml, 또는 적어도 400 ㎍/ml의 혈청 역가를 달성한다. 또 다른 구체예에서, 대상은, 항체의 적어도 0.1 ㎍/ml, 적어도 0.5 ㎍/ml, 적어도 1 ㎍/ml, 적어도, 2 ㎍/ml, 적어도 5 ㎍/ml, 적어도 6 ㎍/ml, 적어도 10 ㎍/ml, 적어도 15 ㎍/ml, 적어도 20 ㎍/ml, 적어도 25 ㎍/ml, 적어도 50 ㎍/ml, 적어도 100 ㎍/ml, 적어도 125 ㎍/ml, 적어도 150 ㎍/ml, 적어도 175 ㎍/ml, 적어도 200 ㎍/ml, 적어도 225 ㎍/ml, 적어도 250 ㎍/ml, 적어도 275 ㎍/ml, 적어도 300 ㎍/ml, 적어도 325 ㎍/ml, 적어도 350 ㎍/ml, 적어도 375 ㎍/ml, 또는 적어도 400 ㎍/ml의 혈청 역가를 달성하기 위해, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE유효량의 용량을 투여받고, 또한 적어도 0.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 적어도, 2 ㎍/ml, 적어도 5 ㎍/ml, 적어도 6 ㎍/ml, 적어도 10 ㎍/ml, 적어도 15 ㎍/ml, 적어도 20 ㎍/ml, 적어도 25 ㎍/ml, 적어도 50 ㎍/ml, 적어도 100 ㎍/ml, 적어도 125 ㎍/ml, 적어도 150 ㎍/ml, 적어도 175 ㎍/ml, 적어도 200 ㎍/ml, 적어도 225 ㎍/ml, 적어도 250 ㎍/ml, 적어도 275 ㎍/ml, 적어도 300 ㎍/ml, 적어도 325 ㎍/ml, 적어도 350 ㎍/ml, 적어도 375 ㎍/ml, 또는 적어도 400 ㎍/ml의 혈청 역가를 유지하기 위해 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량의 이후의 용량을 투여받는다. 이들 구체예에 따라, 대상은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 후속적 용량을 투여받을 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE, 조합 요법, 또는 조성물의 적어도 10 ㎍, 바람직하게는 적어도 15 ㎍, 적어도 20 ㎍, 적어도 25 ㎍, 적어도 30 ㎍, 적어도 35 ㎍, 적어도 40 ㎍, 적어도 45 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 55 ㎍, 적어도 60 ㎍, 적어도 65 ㎍, 적어도 70 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 80 ㎍, 적어도 85 ㎍, 적어도 90 ㎍, 적어도 95 ㎍, 적어도 100 ㎍, 적어도 105 ㎍, 적어도 110 ㎍, 적어도 115 ㎍, 적어도 120 ㎍, 적어도 150 ㎍, 적어도 300 ㎍, 적어도 400 ㎍, 적어도 500 ㎍, 적어도 적어도 1 mg, 적어도 5 mg, 적어도 10 mg, 적어도 25 mg, 적어도 50 mg, 또는 적어도 100 mg의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE, 조합 요법, 또는 조성물의 적어도 10 ㎍, 바람직하게는 적어도 15 ㎍, 적어도 20 ㎍, 적어도 25 ㎍, 적어도 30 ㎍, 적어도 35 ㎍, 적어도 40 ㎍, 적어도 45 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 55 ㎍, 적어도 60 ㎍, 적어도 65 ㎍, 적어도 70 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 80 ㎍, 적어도 85 ㎍, 적어도 90 ㎍, 적어도 95 ㎍, 적어도 100 ㎍, 적어도 105 ㎍, 적어도 110 ㎍, 적어도 115 ㎍, 또는 적어도 120 ㎍의 용량을 매 3일에 한번, 바람직하게는 매 4일에 한번, 매 5일에 한번, 매 6일에 한번, 매 7일에 한번, 매 8일에 한번, 매 10일에 한번, 매 2주에 한번, 매 3주에 한번, 또는 한 달에 한번, 연속적 주입으로 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE, 조성물, 또는 조합 요법의 예방적 또는 치료적 유효량의 하나 이상의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계; 및 (b) 상기 EphA2-BiTE의 용량의 일정 수의 투여 후 상기 대상에서의 상기 투여된 EphA2-BiTE의 혈장 수치/농도를 모니터하는 단계를 포함한다. 게다가, 상기 용량의 일정 수는, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE, 조성물, 또는 조합 요법의 예방적 또는 치료적 유효량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 용량이다. 다른 구체예에서, 상기 용량은 연속적 정맥내 주입으로 투여된다.

특정 구체예에서, 본 발명은 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE의 적어도 10 ㎍ (바람직하게는 적어도 15 ㎍, 적어도 20 ㎍, 적어도 25 ㎍, 적어도 30 ㎍, 적어도 35 ㎍, 적어도 40 ㎍, 적어도 45 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 55 ㎍, 적어도 60 ㎍, 적어도 65 ㎍, 적어도 70 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 80 ㎍, 적어도 85 ㎍, 적어도 90 ㎍, 적어도 95 ㎍, 또는 적어도 100 ㎍)의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계; 및 (b) 상기 대상에게 투여된 EphA2-BiTE의 혈장 수치가 0.1 ㎍/ml, 바람직하게는 0.25 ㎍/ml 미만, 0.5 ㎍/ml 미만, 0.75 ㎍/ml 미만, 또는 1 ㎍/ml 미만일 때, 상기 대상에게 하나 이상의 연속적 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예 에서, 본 발명은 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 본 발명의 항체의 적어도 10 ㎍ (바람직하게는 적어도 15 ㎍, 적어도 20 ㎍, 적어도 25 ㎍, 적어도 30 ㎍, 적어도 35 ㎍, 적어도 40 ㎍, 적어도 45 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 55 ㎍, 적어도 60 ㎍, 적어도 65 ㎍, 적어도 70 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 80 ㎍, 적어도 85 ㎍, 적어도 90 ㎍, 적어도 95 ㎍, 또는 적어도 100 ㎍)의 하나 이상의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계; (b) 용량의 일정 수의 투여 후 상기 대상에 투여된 본 발명의 EphA2-BiTE의 혈장 수치를 모니터하는 단계; 및 (c) 상기 대상에게 투여된 EphA2-BiTE의 혈장 수치가 0.1 ㎍/ml, 바람직하게는 0.25 ㎍/ml 미만, 0.5 ㎍/ml 미만, 0.75 ㎍/ml 미만, 또는 1 ㎍/ml 미만일 때, 본 발명의 EphA2-BiTE의 연속적 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 용량의 일정 수는 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE의 유효량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 용량이거나 또는 연속적 정맥내 주입으로 투여될 수 있다.

비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리를 위해, 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 사용되어 오거나 또 는 현재 사용되는, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은, 하나 이상의, 본 발명의 방법에 따른 EphA2-BiTE와 조합되어 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조합 요법에 사용된 예방제 또는 치료제의 투여량은 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리에 사용되어 오거나 또는 현재 사용되는 것들에 비해 더 낮다. 비정상적 발현(예를 들어, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어, 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애, 또는 하나 이상의 이의 증상의 치료, 예방 및/또는 관리를 위해 현재 사용되는 약제의 권장 용량은, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, Hardman 등, 편집자, 2001, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., Mc-Graw-Hill, New York; Physicians' Desk Reference (61^st 판, 2007), Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 당업계의 임의의 참조 문헌으로부터 수득될 수 있다.

여러 구체예에서, 상기 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 5분 미만 간격, 30분 미만 간격, 1시간 간격, 약 1시간 간격, 약 1 내지 약 2시간 간격, 약 2시간 내지 약 3시간 간격, 약 3시간 내지 약 4시간 간격, 약 4시간 내지 약 5시간 간격, 약 5시간 내지 약 6시간 간격, 약 6시간 내지 약 7시간 간격, 약 7시간 내지 약 8시간 간격, 약 8시간 내지 약 9시간 간격, 약 9시간 내지 약 10시간 간격, 약 10시간 내지 약 11시간 간격, 약 11시간 내지 약 12시간 간격, 약 12시간 내지 18시간 간격, 18시간 내지 24시간 간격, 24 내지 36시간 간격, 36시간 내지 48시간 간격, 48시간 내지 52시간 간격, 52시간 내지 60시간 간격, 60시간 내지 72시간 간격, 72시간 내지 84시간 간격, 84시간 내지 96시간 간격, 또는 96시간 내지 120시간 간격의 연속적 주입으로 투여된다. 바람직한 구체예에서, 둘 이상의 요법이 동일 환자 방문 내에 투여된다.

어떤 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 항체와 하나 이상의 다른 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 순환적으로 투여된다. 순환 요법(Cycling therapy)은 기간 동안 제1 요법 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여, 이어서 기간 동안 제2 요법 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 선택적으로, 이어서 기간 동안 제3 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 투여 등을 포함하고, 또한 이 순차적 투여, 즉, 상기 요법 중 하나에 대한 내성의 진전(development)을 감소시키기 위한, 상기 요법 중 하나의 부작용을 피하거나 또는 감소시키기 위한, 및/또는 상기 요법의 효능을 향상시키기 위한 사이클을 반복한다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 동일한 EphA2-BiTE의 투여는 반복될 수 있고, 상기 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2달, 75일, 3달, 또는 적어도 6달만큼 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 EphA2-BiTE가 아닌 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 투여는 반복될 수 있고, 또한 상기 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2달, 75일, 3달, 또는 적어도 6달만큼 분리될 수 있다.

5.7 키트

발명은, 하나 이상의, 본 발명의 EphA2-BiTE, 상기 EphA2-BiTE를 인코드하는(encoding) 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 발현하는 벡터로 충진된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 비정상적 발현 (즉, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제는 상기 약제학적 팩 또는 키트에 또한 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의, 본 발명의 약제학적 조성물의 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 상기 용기(들)와 관련하여, 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 통제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 고시(notice)될 수 있고, 상기 고시는 인간 투여에 대한 제조, 사용 또는 판매의 상기 기관에 의한 승인을 반영한다.

본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에, 하나 이상의 본 발명의 EphA2-BiTE 및 사용을 위한 설명서를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에, 비정상적 발현 (즉, 과발현) 및/또는 EphA2의 활성 (예를 들어 암, 비-암 과증식 세포 장애, 또는 감염)과 관련된 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 EphA2-BiTE는 탈면역화된 항-CD3xEA2 (VHTVL)이다. 어떤 구체예에서, 상기 다른 예방제 또는 치료제는 화학치료 법(chemotherapeutic)이다. 다른 구체예에서, 상기 예방제 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 치료법이다. 또 다른 구체예에서, 상기 예방제 또는 치료제는 항바이러스제, 항곰팡이제, 항원생동물제, 항균제, 또는 항-자가면역제이다.

본 발명은 앞에서 검토한 임의의 진단 조성물을 포함하는 키트를 추가로 제공한다.

6. 실시예

이하의 비제한적 실시예는 EphA2-BiTE의 생산 및 그들의 특성을 설명한다.

6.1 EphA2 - BiTE 발생

6.1.1 2개의 부모( parental ) 단일클론성 항체로부터의 8개의 EphA2 -특이적 BiTE의 구축( Construction )

2006년 10월 6일에 출원된 미국 공개 제US 2004-0091486 A1호 및 출원 연속 번호 11/544,322에 기술된 바와 같은 EA2 및 EA5로 불리는, 두개의 뮤린(murine) 항-EphA2 항체의 가변 도메인에 대한 코드 서열을 갖는 플라스미드를 EphA2-BiTE 구축을 위해 사용하였다. 도 1 및 2 각각을 또한 참조한다. diL2K로 불리는 인간 CD3ε 특이적인 뮤린 mAb L2K의 탈면역화된 유도체인 항-C3 단일-사슬 항체를 EphA2 단일-사슬 항체와 융합하기 위해 사용하였다 (인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Dreier 등, 2002, Int. J. Cancer 100:690-697 참조). 여덟개의 상이한 BiTE 구조체(construct)에 대한 cDNA는 PCR-기반 융합에 의해 생성시켰다. BiTE 구조체는 하기의 가변 (VH 및 VL) 도메인의 배열 및 항-EphA2 및 항-CD3 단일 -사슬 항체의 위치결정(positioning)을 갖는다:

BiTE 구조체 제작

BiTE cDNA의 구조는 도 3에 나타낸다. 인서트(insert)는, 증가된 번역 효능을 위한 5′-말단 코작(Kozak) 사이트를 갖는 리더(leader) 및 분비 신호 서열 (뮤린 Ig 중쇄 리더)을 각각 포함하는 발현 벡터 pEF-DHFR 내부로 클론하였다. 상기 리더는 상기에 열거한 바와 같은 4개의 가변 Ig 도메인이 뒤따른다. 항-EphA2의 VL-VH 또는 VH-VL 정션(junction)의 링커 펩타이드는 15개 아미노산의 길이를 갖는다 (모티프 G₄S의 3개의 사본(repeat); 서열 식별 번호: 59). CD3 결합 특이성을 갖는, EphA2를 연결하는 링커 펩타이드는 모티프 G₄S의 1개의 사본을 포함한다 (서열 식별 번호: 58). 검출 및 정제 목적을 위한 C-말단 헥사-히스티딘(H6) 서열 (서열 식별 번호: 66)은 4번째 도메인에 직접적으로 인접한다. 지시된 제한 효소 사이트는 BiTE 구조체를 상기 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해 사용하였다.

6.1.1.1. CHO 세포 내에서 BiTE 발현을 위한 벡터

pEF-DHFR 벡터는, 유전자가 인간 EF1α 프로모터의 제어하에 발현되도록 하 면서 이중-시스트론성(bi-cistronic) 전사 단위를 형성하는, 선택 마커로서 뮤린 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)를 갖는 5.8 kb 벡터이다. 상기 진핵 발현 벡터는 발현 벡터 pMT2PC의 유도체이다.

상기 EF1α 프로모터 이후로는 다중 클로닝 사이트(multiple cloning site), 내부 리보솜 도입 사이트 (internal ribosomal entry site; IRES), DHFR 유전자 및 폴리아데닐화 신호가 뒤따른다. 상기 벡터 내에 존재하는 추가의 제어 서열은 세균의 복제 기점 (origin of replication; ORI) 및 암피실린 저항성 유전자 (bla)이다. 이하의 표에서, cDNA 발현 벡터의 여러 구성 요소가 요약된다.

벡터의 묘사는 도 4에 나타낸다.

6.1.1.2. 숙주 CHO 세포주

중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포주 CHO/dhfr^-,CRL 9096은 American Type Culture Collection ("ATCC"; Manassas, Virginia)로부터구입하였으며, Q-One, UK로 특징화하였다. CHO/dhFr-세포주가 디하이드로폴레이트 환원효소가 없기 때문에, 성장 배지에 히포크산틴 및 티미딘이 보충제로서 첨가되 어야 한다.

6.1.1.3. CHO 세포 내에서의 BiTE 발현

EphA2 기반의 BiTE 구조체를 인코드하는 8개의 발현 벡터로 CHO/dhfr- 세포의 트랜스펙션 후, 각 세포 풀(pool)은 DHFR-양성 트랜스펙턴트(transfectant)의 선별을 위해 뉴클레오시드가 없는 HyQ PF CHO 액체 대두 배지(nucleoside-free HyQ PF CHO liquid soy medium)(4.0 mM L-글루타민 함유, 0.1% 플루로닉 F-68(Pluronic F-68) 함유; Cat.# SH30359.02; HyClone)에서 배양하였다. 그 후, 트랜스펙트된 세포의 풀은 뉴클레오시드가 없는 배지에 보충제로서 20 nM 농도의 DHFR 억제제 메토트렉세이트(methotrexate; MTX)를 사용하는 단일 유전자 증폭 단계에 가하였다.

6.1.1.4. 배양 상청액으로부터 EphA2 - BiTE 의 정제

크로마토그래피를 위해 Akta®FPLC 시스템 (Amersham) 및 Unicorn® 소프트웨어를 사용하였다. 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 ZnCl₂를 로딩한 Fractogel® 컬럼 (Merck)을 이용하는, 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(Immobilized metal affinity chromatography; "IMAC")를 수행하였다. 상기 컬럼은 완충액 A (0 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.5, 0.4 M NaCl)으로 평형화시켰으며, 상기 컬럼 (10 ml)에 상기 세포 배양 상청액 (500 ml)을 3 ml/분의 흐름 속도로 적용하였다. 결합하지 않은 샘플을 제거하기 위해 상기 컬럼을 완충액 A로 세척하였다. 결합한 단백질은 하기에 따라 2 단계의 완충액 B(20 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.5, 0.4 M NaCl, 0.5 M 이미다졸)의 구배를 이용하여 용리하였다:

단계 1: 6 컬럼 부피의 10% 완충액 B;

단계 2: 6 컬럼 부피의 100% 완충액 B.

단계 2로부터 용리된 단백질 분획물은 추가의 정제를 위해 풀(pool)하였다.

겔 여과 크로마토그래피는 PBS (Gibco)로 평형화된 세파덱스 200 HiPrep 컬럼 (Amersham) 상에서 수행하였다 (도 5). (1 ml/분의 흐름 속도에서) 용리된 단백질 샘플은 검출을 위한 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 적용하였다 (도 6). 정제 전, 분자량 결정을 위해 상기 컬럼을 조정하였다 (분자량 마커 키트, Sigma MW GF-200). 단백질 농도는 단백질 어세이 염료 (MicroBCA, Pierce) 및 기준 단백질로서 IgG (Biorad)를 이용하여 측정되었다.

6.1.2 독성 연구를 위한 짧은꼬리원숭이( Macaque ) CD3 와 반응적인 대리( Surrogate ) EphA2 BiTE

6.1.2.1. 사이노몰거스 ( Cvnomolgus )-반응성 항- CD3 부모 항체의 플로우 사이토메트리 결합 분석

사이노몰거스 원숭이에서의 독성학에 대해 테스트하기 위한 EphA2-BITE 구조체에 대한 출발점으로서, 사이노몰거스 원숭이로부터의 말초 혈액 단핵 세포 ("PBMC")를 사용하였다. 두 개의 사이노몰거스-반응성 항-CD3 부모 항체인 cCD3-l 및 cCD3-2의 CD3 결합을 검출하기 위해 둘 모두를 FITC로 컨쥬게이트하였다. 각 샘플에 대해 200,000 세포를 반응성 항체와 얼음 위에서 30분간 인큐베이트하였다. 이어서, 상기 세포를 PBS로 두 번 세척하였다. 음성 대조군으로서 무관계한(irrelevant) 항체를 사용하였다 (검은선). CD3-결합은 히스토그램 오버레 이(histogram overlay)에서 회색선으로 나타낸다. 세포는 FACS-Calibur 상에서 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다 (Becton Dickinson, Heidelberg). 두 모든 항체는 사이노몰거스 PBMC의 T-세포 분획에 대해 별개의 결합을 나타낸다. 도 7을 참조한다.

6.1.2.2. 대용 표적 특이성( substitute target specificity )을 갖는 대리 분자

항-CD3 항체 cCD3-l 및 cCD3-2의 가변 도메인은 대용 표적 특이성을 갖는 BiTE 분자를 구축하기 위해 사용하였다. 상이한 도메인 배열의 단일-사슬 항체는 PCT-기반 융합으로 생성하였다. 대용 표적 특이성을 갖는 하기의 BiTE 구조체는 이들 특이성을 조합함으로써 생성하였다:

대리 구조체의 클로닝 및 트랜스펙션은 상기와 같이 수행하였다.

6.1.2.3. mAbs EA2 및 EA5 와 붉은털원숭이 ( Rhesus ) EphA2 의 교차반응성에 대한 증거

붉은털원숭이 CMMT110/CL 주(line)로부터의 붉은털원숭이 EphA2의 시퀀싱(sequencing) (인간 EphA2에 대해 97.7% 상동성) 및 사이노몰거스 비장 세포의 일부 시퀀싱 (인간 EphA2에 대해 >99% 상동성)는 인간 EphA2-특이적 단일클론성 항 체 EA2 및 EA5가 비-인간 영장류 EphA2 분자와 교차반응할 수 있음을 제시한다. 실제로, EA2 및 EA5 항체는 CMMT110/CL 세포에서 EphA2의 인산화를 활성화하였으며 (도 8), 또한 플로우 사이토메트리에 의해 측정된 바 CMMT110/CL 세포 상의 표면 붉은털원숭이 EphA2에 약하게 결합하였다 (이소타입 대조군 대비 MFI에서 1.2-1.8배 변화).

6.1.2.4. 짧은꼬리원숭이 CD3 -반응성 EA2 및 EA5 BiTE 의 구축

항-EphA2 항체 EA2 및 EA5 및 짧은꼬리원숭이 CD3-특이적 단일-사슬 항체 cCD3-1 및 cCD3-2의 가변 사슬에 대한 코딩 서열을 갖는 플라스미드는 PCR-기반 융합에 의해 구축되었다. 하기의 12개 BiTE 분자를 제조하였다:

6.1.2.5. 짧은꼬리원숭이 CD3 과 반응하는 여러 항- EphA2 대리 BiTE 구조체의 플로우 사이토메트리 결합 분석

각 샘플에 있어 200,000 세포 (T-세포 또는 EphA2⁺ 종양 세포)는 50 ㎕의 여러 항-EphA2 대리 BiTE 구조체로 트랜스펙트된 CHO 세포의 순수 세포 배양 상청액과 얼음 위에서 30분간 인큐베이트하였다. 상기 세포는 PBS로 두번 세척하였고, 결합된 구조체는 뮤린 펜타 His 항체로 이의 C-말단 히스티딘 태그(Tag)를 통해 검출하였으며, 세척 단계가 이어졌으며, 또한 파이코에리트린(Phycoerythrin) 컨쥬게이트된 뮤린 Fc 감마 특이적 항체 (Dianova, 주문번호. 115-116-071)를 2% FCS를 갖는 50 ㎕ PBS에 1:100으로 희석하였다. 음성 대조군으로서, 트랜스펙트되지 않은 세포의 세포 배양 상청액을 사용하였다 (검은선). 세포는 FACS-Calibur 상에서 플로우 사이토메트리로 분석하였다 (Becton Dickinson, Heidelberg). 도 9에 나타난 바와 같이, 오직 짧은꼬리원숭이 CD3 항체 cCD3-l를 기반으로 한 이들 대리 BiTE 구조체만이 CD3 및 EphA2에 대한 강한 결합을 나타내었다. cCD3-2를 기반으로 한 구조체는 단지 강한 CD3-결합만을 나타내었다; EphA2-결합은 거의 완전히 억제되는 것으로 판명되었다.

6.2 EphA2 - BiTE 특성화

6.2.1 항- EnhA2 부모 항체의 플로우 사이토메트리 결합 분석

플로우 사이토메트리 분석은 항-EphA2 부모 단일클론성 항체 B233, EA2 및 EA5의 결합 강도를 평가하기 위해 수행하였다 (도 10). B233 단일클론성 항체의 VL 및 VH 도메인 서열에 대해서는 도 3을 참조한다. EphA2-발현 A549 세포 (인간 폐 암종 세포주) 및 MDA-MB-231 세포 (인간 유방암)를 사용하였다. 200,000개의 세포는 각각의 항체 10 ㎍/ml와 얼음 상에서 30분간 인큐베이트하였다. 그 후 상기 세포는 PBS에서 두 번 세척하였다. 일차 항체의 결합은 2% FCS를 갖는 50 ㎕ PBS에 1:100으로 희석된 파이코에리트린 컨쥬게이트된 뮤린 Fc-감마 특이적 항체 (Dianova, 주문번호. 115-116-071)를 통해 검출하였다. 음성 대조군으로서, 동일한 이소타입을 갖는 무관계한 항체를 사용하였다 (얇은 선). 세포는 FACS-Calibur 상에서 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다 (Becton Dickinson, Heidelberg).

mAb B233이 가장 강한 결합 신호를 나타내었으며, 그 뒤를 EA2 및 EA5가 뒤따랐다. 세개의 상이한 항체의 결합 능력은 히스토그램 오버레이에 나타내었다.

6.2.2 항- EphA2 부모 항체 EA2 및 EA5 의 조직 교차반응성( Tissue cross -reactivity; TCR )

상기 항체가 정상 조직에 특이적으로 결합하는지를 측정하기 위해, 동결된 인간 조직 섹션(section)은 면역조직화학 방법을 이용하여 인간 EphA2-반응성 단일클론성 항체 EA5 및 EA2로 염색하였다. 간단히 말하면, 일차 및 이차 항체의 전-복합체(pre-complex)는 적절한 종의 감마 글로불린으로 블로킹된, 결합되지 않은 이차 결합 사이트로 생산된다. 동결된 섹션은 10% 포르말린 내에서 슬라이드에 부착시키고, 0.01% 트윈 20을 갖는 1x 트리스-완충된 염수 (Tris-buffered saline; TBS)로 세척하였다. 내재적 퍼옥시다아제는 글루코오스 산화효소 (Sigma), β-D(+)-글루코오스 (Sigma), 및 소듐 아자이드 (Sigma)를 함유하는 용액으로 블로킹하였다. 아비딘/비오틴 벡터 키트 (Vector Labs)는 아비딘/비오틴 반응성 사이트를 블로킹한다. 그 후 상기 슬라이드는 소혈청알부민, 카제인, 및 정상 염소 혈청 으로 구성된 단백질 블로킹 용액으로 인큐베이트하였다. 조직 섹션은 전복합체화된 항체 그리고 그 후 Vectastain ABC Elite Kit (Vector Labs)로 인큐베이트한 후, 1x TBS로 세척하고, DAB (Sigma)으로 처리하고, 헤마톡실린으로 대조염색(counterstain)하였다. 조직 섹션은 탈수하고, 커버슬립(coverslip)하였으며, 영상화하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, EA5는 심장 조직 (도 11B); 다발 기관 (multiple organ)의 혈관 및 기질(stromal) 평활근 요소 (세포질), 결장 상피 (세포질), 및 자궁근층 (uterine myometrium)에서의 사이원반(intercalated disc)의 염색을 증명한다. 인간 조직 섹션 (도 11C)는 이소타입 대조군 단일클론성 항체 1A7과 비교하여 또한 이하의 표로 요약된 바와 같이 EA2로 염색되지 않았다.

6.2.3 EnhA2 - BiTE 구조체의 이중특이적 세포 결합

EphA2-양성 A549 세포 (인간 폐 암종 세포주) 및 MDA-MB-231 세포 (인간 유방암), 뿐만 아니라 CD3-양성 HP-BALL (인간 T-세포주)를 사용하였다. 200,000 세 포를 4개의 상이한 EphA2 BiTE 구조체의 정제된 BiTE 모노머 10 ㎍/ml과 얼음상에서 30분 동안 인큐베이트하였다. 이어서 세포는 PBS로 두번 세척하였고, 결합된 구조체는 뮤린 펜타-His 항체 (2% FCS를 갖는 50 ㎕ PBS 내에서 1 :20 희석됨; Qiagen; 주문번호. 34660)로 이의 C-말단 히스티딘 태그를 통해 검출하였으며, 세척 단계가 이어졌으며, 또한 파이코에리트린 컨쥬게이트된 뮤린 Fc-감마 특이적 항체 (Dianova, 주문번호. 115-116-071)를 2% FCS를 갖는 50 ㎕ PBS에 1:100으로 희석하였다. 음성 대조군으로서, 트랜스펙턴트로부터의 배양 상청액 대신 트랜스펙트되지 않은 CHO 세포로부터의 새로운 세포 배양 배지를 사용하였다 (검은선). 세포는 FACS-Calibur 상에서 플로우 사이토메트리로 분석하였다 (Becton Dickinson, Heidelberg). 도 12를 참조한다.

하기의 표는 플로우 사이토메트리에 의해 측정된 바와 같은 여덟개의 생성된 EphA2-BiTE 구조체 모두의 상대적 결합 강도를 요약한다.

여덟 개의 EA2 BiTE 구조체 모두는 그들의 항-CD3 SCA 부분으로 HP Ball 세포 상에서 발현된 CD3에 대해 대체로 강한 결합을 나타내고, 적절한 발현 및 항-CD3 부분의 폴딩(folding)을 지시한다. mAb EA2로부터 유래된 네 개의 BiTE 모두는 EphA2-양성 유방암 및 폐암 세포주에 대한 결합을 나타내고, 반면 mAb EA5로부터 유래된 하나의 BiTE에서만은 EphA2-특이적 결합 활성을 유지하였다. 따라서 단일클론성 항체 EA2는, mAb EA5에 비해 BiTE 구조체에 대해 보다 안정한 것으로 나타났다.

6.2.4 EphA2 BiTE 의 에피토프 배제( exclusion )

EphA2-양성 비-형질전환된 유방 상피주 MCF1OA 및 유방 샘암종(breast adenocarcinoma) MDA-MB-231는 (10 ㎍/ml로 사용된) EphA2 BiTE 구조체가 그들의 부모 단일클론성 항체 EA2 및 EA5와 같이 에피토프 배제를 유지하는지를 측정하기 위한 면역형광 염색 실험에 사용되었다. 상기 분석의 결과는 이하의 표에 요약하였다. BiTE EA2 (VH/VL)-탈면역화된 항-CD3는 가장 강합 에피토프 배제를 나타내었다.

6.2.5 모노머성 EphA2 - BiTE 의 생산성

다섯 개의 활성 EphA2 BiTE의 생산성은 롤러 병(roller bottle) 내에서의 소규모 생산물의 모노머 수율로부터 계산하였다. 1.1 mg/l 이하의 정제된 모노머의 생산성을 수득하였다 (이하의 표 참조).

BiTE 구조체 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)로 트랜스펙트된 증폭된 CHO 세포 (20 nM MTX)의 풀의 중간-규모 생산물 (2 x 10 L 반응기(reactor))의 생산성은 l.l mg 정제된 BiTE 모노머/L 세포 배양 상청액이었다.

6.2.6 다섯 개의 EphA2 - BiTE 구조체의 방향전환된 용해의 잠재성

인간 T-세포의 존재 하에 여러 EphA2-BiTE 구조체에 의한 방향전환된 표적 세포 용해를 측정하기 위해 크롬-51(Chromium-51) 방출을 기반으로 한 세포독성 어세이를 수행하였다. 간단히 말하면, 효과기 T-세포의 원천으로서의 PBMC는 피콜(Ficoll) 농도 구배 원심분리기로 수득하였다. T-세포 비의존적 세포 용해를 피하기 위해, NK 세포를 CD16-directed 자성 비드에 의해 PBMC로부터 고갈(deplete)시켰다. EphA2-양성 종양 세포주 MDA-MB231 및 A549는 크롬-51으로 로딩하였으며, 표적 세포로서 알맞다. 여러 EphA2-BiTE 구조체는 농도의 넓은 범위에 걸쳐 적정(titrate)하였다. 어세이 지속시간(duration)은 18시간이었으며, 또한 상기 효과기-대-표적 비율 (E:T) 10:1이었다. 도 13을 참조한다.

이하의 표는, 두 가지 독립적 실험에서 측정된 바와 같은, EphA2-양성 표적 세포주 MDA MB231 및 A549 각각의 최고의 절반의 방향전환된 세포 용해 (즉, EC50)를 위해 요구되는 BiTE 농도를 요약한다. 이하의 표는, 두 가지 독립적 실험에서 측정된 바와 같은, EphA2-양성 표적 세포주 MDA MB231 및 A549 각각의, 최고의 방향전환된 세포 용해의 절반 (즉, EC50)을 위해 요구되는 BiTE 농도를 요약한다.

상기 BiTE 구조체 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)는 유방암 및 폐암 세포주의 방향전환된 용해에 가장 높은 잠재성을 지속적으로 나타내었다.

6.2.7 추가적 특성화를 위한 BiTE 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )의 선별

탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)는 방향전환된 용해에 가장 잠재적인 EphA2-BiTE 구조체인 것으로 판명되었고(두 표적 세포주로 6 내지 25 ng/ml의 ED50 value), 이중특이적 결합 활성을 나타내는 다섯 개의 BiTE 구조체 모두 중 두번째로 좋은 모노머의 생산성을 나타내므로, 이는 추가의 특성화를 위해 선별되었다. 상기 탈면역화된 항-CD3xEA2 BiTE 구조체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해서는 도 14를 참조한다.

6.3 EphA2 - BiTE " 탈면역화된 항- CD3 x EA2 ( VH / VL )"의 추가적 특성화

6.3.1 생산 배치 및 효과기 세포 도너로의 세포독성 활성의 변화

EphA2-BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 두 개의 상이한 생산물 롯트의 세포독성 활성은 (CD 16 양성 세포의 고갈 후의) PBMC 및 효과기로서의 자극된 CD8+ T-세포를 이용하여 비교하였다. EphA2-양성 세포주 A549 및 MDA-MB231는 표적 세포로서 알맞다. E:T 비율은 10:1이었으며, 인큐베이션 시간은 18시간이었다. 도 15를 참조한다.

이하의 표는 효과기 세포로서 PBMC 또는 자극된 CD8+ T-세포를 이용하는 상이한 생산물 배치로부터의 EphA2 BiTE로의 상기 용량-반응 분석으로부터 수득된 방향전환된 표적 세포 용해에 대한 최고의 용해의 절반(즉, EC50)값을 요약한다.

방향전환된 표적 세포 용해를 위한 ED50의 variation은 EphA2-BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)에 대해 7개의 인간 PBMC 도너 (NK 세포-제거됨)로 테스트하였다.

EphA2 BiTE 탈면역화된 항-D3xEA2(VH/VL)는 NK 세포-제거된 PBMC에 비해 자극된 CD 8+ T-세포로 상당히 더 높은 세포독성을 나타낸다. 두 가지 상이한 배치 사이의 생물학적 활성의 변화량은 1.4 내지 3.2배의 범위였다. 그러나 잠재성의 변화량은 인간 PBMC 도너로 보다 현저하며, 여기서 2.9 내지 23.9 ng/ml의 ED50 값을 관찰하였다. 따라서 T-세포의 도너-특이적 효능은 BiTE 활성 변화의 주요 원인일 것이다.

효과기 세포 도너로 EphA2-BiTE 세포 독성 활성의 변화를 측정하기 위해 플로우 사이토메트리-기반의 방향전환된 세포 세포독성 어세이를 또한 수행하였다. CD3+ T-세포가 풍부한 PBMC를 효과기 세포로서 사용하였고, 또한 EphA2+ SW480 결장 암종 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 간단히 말하면, CD3+ T-세포가 풍부한 인간 PBMC (RosetteSep; StemCell Technologies)를 피콜 농도 구배 원심분리에 의해 건강한 도너로부터 단리하였다. 표적 세포는 37℃에서 3,3'-디옥타데실옥사카르보시아닌 (DiOC18(3) 또는 "DiO"; (Molecular Probes)) 녹색 형광 막 염료로 5분 간 표지하였다. 효과기 및 표적 세포 혼합물은 5:1 비율로 조합하였으며, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 옮겼다. 배지 단독 또는 각 BiTE 구조체의 연속 희석물을 적절한 웰에 첨가하고, 37℃에서 18 내지 42시간 동안 인큐베이트하였으며, 또한 1 ㎍/ml의 최종 농도로 프로피디움 요오드 (PI)의 첨가 후 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다. 표적 세포 용해는 PI에 의해 양성으로 염색되는 DiO 양성 세포의 백분율로서 계산하였다. 모든 인큐베이션은 2배수로 수행하였다. EC50 값의 계산은 4개의 파라미터 비선형 피트 모델을 이용하여 수행하였다.

도 16에 나타낸 바와 같이, EphA2-BiTE는 EphA2+ 종양 사멸을 매개하기 위해 상이한 대상으로부터의 T-세포를 redirect시킨다. 플로우 사이토메트리-기반 세포독성 어세이는 49명의 개인 도너로부터 단리된 CD3+ T-세포 및 SW480 표적 세포를 이용하였다. 인간 도너의 대다수에 있어서, EphA2-BiTE는 매우 낮은 농도에서 종양 세포 사멸을 매개한다. EphA2-BiTE에 대한 EC50는, 24 ng/ml의 중앙값(수평 바)을 갖는 테스트된 T-세포 도너 모두에 있어 1 내지 110 ng/ml이었다. 따라서, 인간 T-세포 도너의 대다수에 있어서, EphA2-BiTE는 낮은 ng/ml 범위 내 농도에서 관찰된 사멸 활성을 갖는 고도의 잠재성 분자이다.

6.3.2 표적 세포 결합의 특이성: 가용성 EphA2 융합 단백질은 탈면역화 된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )와 결합에 있어 경쟁한다

BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 표적 결합 특이성은 경쟁 어세이에서 테스트하였다. 이 때문에, 200,000 EphA2-양성 A549 세포는, 50 ㎍/ml 가용성 EphA2 Fc 융합 단백질의 존재 또는 부재(absence) 하에, EA2 기반의 BiTE 구조체 5 ㎍/ml과 얼음 위에서 30분간 인큐베이트하였다. 이어서 상기 세포는 PBS로 두번 세척하였다. 그 후 상기 구조체의 결합은 뮤린 펜타-His 항체 (2% FCS를 갖는 50 ㎕ PBS 내에서 1 :20 희석됨; Qiagen; 주문번호. 34660)를 이용하여 이의 C-말단 히스티딘 태그를 통해 검출하였으며, 세척 단계가 이어졌으며, 또한 파이코에리트린 컨쥬게이트된 뮤린 Fc-감마 특이적 항체 (Dianova, 주문번호. 115-116-071)를 2% FCS를 갖는 50 ㎕ PBS에 1:100으로 희석하였다 (회색선). 음성 대조군으로서, 이차 항체만을 사용하였다 (검은선). 세포는 FACS Calibur 장치상의 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다 (Becton Dickinson, Heidelberg).

도 17에 나타낸 바와 같이, EphA2-BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2 (VH/VL)과 10배 중량 이상의 가용성 EphA2 Fc 융합 단백질의 공동인큐베이션은 A549 인간 폐암 세포에 대한 EphA2-BiTE의 결합을 완전히 차단한다. 이는 종양 세포에 대한 EphA2-BiTE 결합은 EphA2 표적의 인식에 의해 특이적으로 매개되는 것을 나타낸다.

6.3.3 EpbA2 - BiTE 탈면역화된 항- CD3 xEA2 ( VH / VL )의 표적 세포 특이성: 항원-양성 세포의 사멸

최초 IgG로부터 BiTE 포맷으로의 전환 후의 표적 특이성의 유지를 확실하게 하기 위해, 항원 양성 및 음성 표적 세포로의 세포독성 어세이를 수행하였다. 이 목적을 위해, EphA2-트랜스펙션된, 마우스 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 트랜스펙션되지 않은 세포와 비교하였다. 효과기로서 자극된 인간 CD8 T-세포를 이용하는, 10:1의 E:T 비율 및 18시간의 어세이 지속 시간의 표준 크롬 방출 어세이를 여러 농도의 EphA2-BiTE 구초제로 수행하였다. 도 18을 참조한다.

표적 세포 용해의 특이성은 EphA2+ SW480 인간 결장 암종 세포의, 탈면역화된 항-CD3xEA2 BiTE가 매개하는 용해에 의해 추가로 지속되었으며, EphA2 음성 SK-MEL28 흑색종 세포에서는 그렇지 않았다. 도 19를 참조한다. EphA2 및 CD3 모두에 대한 부모 항체 특이성은 탈면역화된 항-CD3xEA2 BiTE 매개의 용해를 블록하였다. 따라서, 상기 탈면역화된 항-CD3xEA2 BiTE의 세포독성 활성은 표적 세포상의 EphA2의 발현에 엄격하게 의존한다; EphA2-음성 세포는 탈면역화된 항-CD3xEA2 BiTE 매개의 용해에 대해 완전히 저항한다.

6.3.4 EphA2 - BiTE 에 의해 매개된 신장 세포 암종 및 전립선암세포 사멸

효과기 세포로서 CD3+ T-세포가 풍부한 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를, 또한 표적 세포로서 EphA2+ ACHN 및 Caki 2 신장 세포 암종 주 및 PC3 및 DU145 전립선 세포주를 사용하는 플로우 사이토메트리-기반의 방향전환된 세포 세포독성 어세이를 수행하였다. 간단히 말하면, CD3+ T-세포가 풍부한 인간 PBMC (RosetteSep; StemCell Technologies)를 피콜 농도 구배 원심분리에 의해 건강한 도너로부터 단리하였다. 표적 세포는 37℃에서 3,3'-디옥타데실옥사카르보시아닌 (DiOC18(3) 또는 "DiO"; (Molecular Probes)) 녹색 형광 막 염료로 5분간 표지하였다. 효과기 및 표적 세포 혼합물은 5:1 비율로 조합하였으며, 96-웰 둥근 바닥 플 레이트에 옮겼다. 배지 단독 또는 각 BiTE 구조체의 연속 희석물을 적절한 웰에 첨가하고, 37℃에서 42시간 동안 인큐베이트하였으며, 또한 1 ㎍/ml의 최종 농도로 프로피디움 요오드 (PI)의 첨가 후 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다. 표적 세포 용해는 PI에 의해 양성으로 염색되는 DiO 양성 세포의 백분율로서 계산하였다. 모든 인큐베이션은 2배수로 수행하였다. EC50 값의 계산은 4개의 파라미터 비선형 피트 모델을 이용하여 수행하였다.

도 20에 나타낸 바와 같이, EphA2-BiTE는 신장 세포 암종 및 전립선암세포 모두의 방향전환된 T-세포 용해를 매개하였다.

6.3.5 표적 세포 상의 EphA2 수치에 대한 EphA2 - BiTE 사멸의 영향

세포독성 어세이는 상기한 바와 같이 수행하였다. 상기 세포독성 어세이를 완료한 후, 배양물을 얼음 위에 두었으며, 또한 10 ㎍/ml의 비-결합 이소타입 대조군 마우스 단일클론성 항체 1A7 또는 항-인간 EphA2 마우스 단일클론성 항체 B233으로 처리 또는 비처리하여 두었다 (인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60 참조). APC-컨쥬게이트된 항-펜타히스티딘 항체는 비처리된 세포 상에 잔류하는 EphA2-BiTE에 결합하였다. APC-컨쥬게이트된 항-마우스 IgG (H+L) 항체는 표적 세포에 결합한 이소타입 또는 B233의 양을 분석한다. EphA2-BiTE의 투입 용량 대비 이소타입 대조군, EphA2 및 EphA2-BiTE의 기하학적 평균 형광 강도를 그래프화하였다. 도 21을 참조한다.

6.3.6 시간, 표적에 대한 효과기 비율, 및 수용체 결합 사이트에 대한 세포독성 의존성

탈면역화된 항-CD3xEA2 (VH/VL)의 동력학 및 잠재성을 탐구하기 위해, 방향전환된 종양 세포 용해의 여러 파라미터를 평가하였다. 표적 세포 사멸의 시간 경과 분석은, 항-CD3xEA2 (VH/VL)의 존재하에, 18시간 후 자극되지 않은 CD3+ T-세포에 의한 제한된 용해, 또한 42시간까지 최대 사멸 (>80% 용해)이 일어남을 밝혔다 (도 22A). 대부분의 실험에서, 방향전환된 T-세포 용해의 매그니튜드(magnitude)는 표적 세포의 80%를 초과하였다. 잠재성의 추가적 측정으로서, 표적 세포에 대한 효과기의 비율을 조사하였다. 1:1 내지 20:1의 E:T 비율은 유사하게 높은 용해 활성을 부여하고, 한편 1:2 및 1:5의 E:T 비율은 비록 감소된 백분율이기는 하나 SW480 종양 세포를 redirected 용해시킨다 (도 22B). 특히, 평가된 EC50 값은 인큐베이션 시간(도 22A; 1 to 9 ng/mL) 또는 E:T 비율(도 22B; 2 to 7 ng/mL)의 변화에도 불구하고 대부분 일정하게 남았다.

항-CD3xEA2 (VH/VL)의 활성에 요구되는 표면 표적 농도의 역치가 있었는지를 측정하기 위해 표면상에 상이한 수치의 EphA2가 발현된 종양 세포 표적을 평가하였다. 세포당 겨우 2,400 분자의 EphA2를 발현하는 M14 세포를 포함하는 모든 EphA2-발현 세포주 (도 22C)에서 유효한 방향전환된 T-세포 용해가 관찰되었다 (도 22D). 항-CD3xEA2 (VH/VL)에 의해 매개되는 표적 세포에 대한 용해의 매그니튜드는 그들의 표면 표적 농도에 상관없이 유사하였다 (도 22D). 그러나, 표적 세포상의 EphA2의 표면 농도는 방향전환된 용해의 효능에 영향을 미치지 않았다. 종양 세포상의 EphA2 결합 사이트의 수가 증가할수록 항-CD3xEA2 (VH/VL)의 잠재성이 증가하는 경향이 관찰되었다 (도 22C). 동시에, 이들 발견은 항-CD3xEA2 (VH/VL)가, 심지어 종양 상에 가능한 결합 사이트가 낮은 수치로 존재할 때라도, EphA2-발현 종양 세포를 용해하기 위해 자극되지 않은 인간 T-세포를 잠재적으로 또한 특이적으로 redirect할 수 있음을 제시한다.

6.3.7 인간 혈장에서의 BiTE 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / HL )의 안정성

EphA2-특이적 BiTE의 혈장 안정성을 상이한 인큐베이션 조건 하에서 테스트하였으며, 뒤이어 표준 51-크롬 방출 어세이에서 세포독성 활성의 ED50 측정이 수행되었다. 다섯명의 건강한 도너의 혈액으로부터 유래된 인간 혈장 풀은 EDTA-코팅된 시린지(syringe)에 의해 수합되었다. 세포 성분은 원심분리에 의해 제거하였고, 상부 혈장 상(upper plasma phase)을 수합하였으며, 이어서 풀된(pooled), 탈면역화된 항-CD3xEA2 (VH/VL) BiTE를 37℃ 또는 4℃에서 혈장의 존재 또는 부재하에서 인큐베이트하였다. 대조군으로서, BiTE는 세포독성 어세이 직전에 혈장 또는 RPMI-1640 배지 각각에 희석하였다. MDA-MB231는 표적 세포로서 적합하고; NK 세포-제거된 PBMC는 효과기 세포로서 사용하였다. 효과기:표적 (E:T) 비율은 10:1이었다. 어세이 지속 시간은 18시간이었다. 도 23을 참조한다.

세포독성 활성의 대부분의 상실 없이 안정한 것으로 입증된 탈면역화된 항- CD3xEA2(VH/VL)는 37℃에서 24시간 동안 인간 혈장 내에서의 인큐베이션 후 검출될 수 있었다.

6.3.8 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )에 의한 비-형질전환된 세포 상의 표적 에피토프 배제

BiTE 탈면역화된 항-CD3 x EA2 (VH/VL) 및 비-에피토프 배제 대조군 BiTE의 존재하에 비-형질전환된 MCF1OA 세포에 대한 CD8+ T-세포의 공격(attack)을 시각화하기 위해 비디오 현미경검사(video microscopy)를 사용하였다 (도 24 참조). 비디오 녹화를 시작하기 24시간 전에 부착성 세포 성장을 위해 48-웰 플레이트 내부에 표적 세포를 seed하였다. 녹화 직전에, CD8+ T-세포 및 BiTE의 혼합물을 배양 웰에 첨가하였다. 비디오 현미경검사는 약 분당 하나의 화상으로 20시간 동안 녹화하였다. 18시간 후 웰에 프로피디움 요오드 (1 ㎍/ml)를 첨가하였다. 각각의 화상은 AVI 비디오 영화로 전환시켰으며, 빛 화상 및 형광 빛 화상을 전송하였다.

18시간의 어세이 지속 시간 동안의 비디오현미경검사 분석은 EphA2-특이적 BiTE에 의한 에피토프 배제를 예증한다. 모든-암종 (pan-carcinoma) 양성 대조군 BiTE가 완전한(intact) 세포 단일층의 전역에 걸쳐 비-형질전환된 MCF1OA 세포를 공격하는 동안 (도 24C), EphA2-특이적 BiTE는 인접하는 세포를 통한 에피토프 배제가 불가능한 합류(confluent) 세포층의 경계에서 t-세포 활성만을 나타낸다 (도 24A). 완전한 단일층의 구역에서는, T-세포가 상기 단일층의 최상부에 동일하게 분포하는 BiTE의 부재시 나타나는 바와 같이 (도 24B) 매우 적은 T-세포 활성이 주목된다 . EphA2의 에피토프 배제를 지원하지 않는 A549 암종 세포의 단일층은 탈 면역화된 항-CD3xEA2 (VH/VL)의 존재하에 T-세포에 의해 완전히 파괴되었다. 어세이의 마지막에 프로피디움 요오드의 첨가는 T-세포와의 클러스터(cluster) 내의 죽은 암종 세포를 시각화시킨다. 상기 짙게 염색된 세포 클러스터는, BiTE가 없는 대조군 웰을 제외하고 어세이의 마지막에 각 웰에 존재하였다.

6.3.9 EphA2 표적에 대한 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )의 결합 상수

BiTE/EphA2 복합체의 형성 및 해리는 Biacore 3000 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명에 의해 모니터되었다. 이 목적을 위해, EphA2 Fc 융합 단백질은 CM5 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스를 갖는 센서 칩 상에 고정화시켰다. 최적의 고정화 조건은 pH 스카우팅(scouting) (소듐 아세테이트 pH 4.0 내지 pH 5.5; disodium tetraborate pH 8.5)을 통해 확인하였다. 최적의 pH 값은 pH 4.0였다. 흐름 셀(flow cell) 2로 1000 RU, 흐름 셀 3으로 5,000 RU, 및 흐름 셀 4로 400 RU의 고정화 후, 과잉의 반응기는 에탄올아민으로 비활성화시켰다. 고정화된 EphA2에 대한 항-EphA2 BiTE의 친화도는, HBS-EP 완충액에 희석한, 상이한 농도의 분석물인 탈면역화된 항-CD3xEA2 VHVL를 주입함으로써 측정하였다. 표면을 재생하기 위해, REGEN 완충액 (50 mM NaOH; 20 mM MES; 1 mM NaCl pH 6.4)을 사용하였다. 도 25를 참조한다.

6.4 EPHA2 -특이적 BITE 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )의 생체 내 효능

탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)는 인간 CD3 및 영장류 EphA2에 특이적이고, 따라서 마우스 CD3 또는 EphA2에 결합하지 않는다. 따라서 EphA2 BiTE 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 항-tum은 인간 결장 암종 이종이식물 모델을 갖는 면역결핍 NOD/SCID 마우스에서만 연구될 수 있다.

6.4.1 NOD / SCID SW480 이종이식물 모델

인간 결장 암종 세포주 SW480는, SW480 세포가 EphA2를 발현하고, 또한 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)는 시험관 내 SW480 세포의 방향전환된 용해를 증명하였기 때문에, 인간 이종이식물 모델의 확립을 위해 선별하였다.

5x10⁶ SW480 세포는 최종 부피 0.2 ml의 PBS에서 건강한 도너로부터의 2.5xlO⁶ 인간 CD3+ T-세포와 혼합하여, 1:2 비율의 E:T가 되었다. T-세포 효과기/SW380 세포 혼합물은 각 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 내로 피하 주사하였다. 피하로 자라는 SW480 종양은 캘리퍼스(calipers)로 일주일에 3번, 두 수직 치수(perpendicular dimension)를 측정하였으며, 종양 부피는 이하의 공식에 따라 계산되었다: 종양 부피 = [(폭² * 길이)/2].

6.4.2 연구 설계

이하의 표에 따르는 CD3+ T-세포 및 SW480 종양 세포의 피하 접종 1시간 후에 시작하는 연속적인 5일 동안, 각 그룹마다 6마리의 동물은, PBS 대조군 비히클, 비-관련 대조군 BiTE 또는 탈면역화된 항-CD3xEA2(VHVL)을 정맥내로 처리되었다.

그룹 I 및 J의 동물들은 말초 T-세포의 존재를 흉내내기 위해 SW480 종양 세포 접종 5분 후 꼬리 정맥 주사를 통해 추가적으로 2.5x10⁶ CD3+ 효과기 세포를 받았다.

6.4.3 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )의 생체 내 항- Tum

6.4.3.1. SW480 모델의 특이성 및 재현성

효과기 세포 없이 SW480 세포 단독 접종 후 PBS (그룹 A) 또는 탈면역화된 항-CD3xEA2 (VH/VL) (그룹 B)의 처리는 접종 4일째에 첫번째로 촉진가능한 종양을 생성시키고, 또한 마우스는 큰 종양 덩어리 (>1 cm³)때문에 30일째 되는 날 희생시켜야 한다. PBS와 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL) 처리 그룹 사이의 종양 성장 동력학에는 어떠한 차이점이 없으며, 이는 EphA2 BiTE는 효과기 세포의 부재시 어떠한 항-종양 효과도 갖지 않는다는 것을 지시한다. 도 26을 참조한다.

SW480 종양과 인간 T-세포의 혼합물의 접종 후 PBS 대조군 비히클 (그룹 C), 또는 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)와 CD3 결합 아암(arm)을 공유하나 상이한 표적 아암을 갖는 비-관련 대조군 BiTE (그룹 D)로의 처리는 종양 성장에 영향을 미치지 않았으며, 이는 본질적으로 BiTE 항-CD3 아암뿐만 아니라 T-세포 단독으로도 어떠한 항-종양 활성을 갖지 않음을 나타낸다. 따라서, 비-관련 대조군 BiTE로의 처리는 비히클 PBS로의 처리와 동일한 효과를 나타내었다. 도 26을 참조한다.

마지막으로, 종양 세포 접종 5분 전 말초 T-세포의 존재를 모방하는 추가적 CD3+ T-세포의 정맥내 주사는 종양 성장에 영향을 미치지 않았다 (그룹 I). 도 26을 참조한다.

이하에서 테스트된 모든 대조군 조건 사이에서 종양 성장에 있어서 어떠한 유의한 차이점은 보지 못했다. 이는 또한 선택된 종양 세포 용량으로 SW480 NOD/SCID 마우스에서의 종양 성장의 높은 강건함(robustness) 및 재현성을 나타낸다. 도 26을 참조한다.

6.4.3.2. 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )에 의한 종양 성장의 용량 의존 억제

탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL) 처리는 CD3+ 효과기 T-세포의 존재하에 SW480 종양 증식물(outgrowth)의 용량-의존 억제를 유도하였다.

1 ㎍ 탈면역화된 항-CD3xEA2로의 처리가 종양 성장에 거의 어떠한 효과도 나타내지 않는 반면, 테스트된 모든 다른 용량들 (5일간 일일 5, 20 및 100 ㎍)은 종양 증식물의 유의한 억제를 유발하였다. 일일 5-㎍의 용량으로, 종양 부피는 비-관련 대조군 BiTE 그룹과 비교하여 3-9일째 유의하게 더욱 낮아졌으며, 또한 18, 20 및 27일째 유의하게 더욱 낮아졌다. 20 ㎍ 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)로 처리된 마우스의 분석된 모든 시점에서의 종양 부피는 비-관련 대조군 BiTE 처리된 마우스의 종양 부피에 비교하여 유의하게 보다 낮아졌다. 마지막으로, 5x100 ㎍ 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)로의 처리는 분석된 모든 시점에서 고도로 유의한 차이를 이끌었으며, 또한 BiTE 처리 후 2주간 종양 성장은 전혀 나타나지 않았다. 비-관련 대조군 BiTE로의 처리는 비히클 PBS로의 처리와 동일한 효과를 나타내었다. 도 27을 참조한다.

6.4.3.3. 탈면역화된 항- CD3xEA2 ( VH / VL )의 항-종양 효과에 말초 T-세포의 영향 없음

인간 T-세포가 말초에 존재하지 않는 이종이식물 모델에서의 상황에 대비하여, 탈면역화된 항-CD3xEA2의 효능은 말초에서 분자를 트랩(trap)할 수 있어 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 종양-특이적 표적화를 줄일 수 있는 T-세포를 순환시키는 것에 의해 영향받을 수 있다. 이 시나리오를 모방하기 위해, 두 그룹의 마우 스에게 말초 인간 T-세포 개체군을 제공하기 위해 인간 T-세포를 정맥 내로 추가적으로 주사하였다.

추가적 인간 T-세포의 정맥내 투여는 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)의 효능에 어떠한 영향도 갖지 않았다. 그룹 F (20 ㎍ 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)로의 처리/주사) 및 J (추가적 2.5x10⁶ T-세포의 정맥내 주사 후 20 ㎍ 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL)로의 처리/주사)에서의 SW480 종양의 성장은 거의 동일하였다. 두 그룹 모두에서, 탈면역화된 항-CD3xEA2(VH/VL) 처리는 PBS 처리된 마우스 또는 추가적으로 순환하는 T-세포를 갖는 PBS 처리된 마우스와 비교하여 매우 유의한 종양 성장 억제를 유도하였다. 도 28을 참조한다.

6.5 인간화된 항- EPHA2 - BITE 생성 및 특성화

이하의 정보는 항-EphA2 BiTE의 구축에 사용된 인간화된 항-EphA2 항체의 생성 및 특성화를 상술한다. 후보자 BiTE는 인간화된, 인간 사이토몰거스 EphA2에 결합할 수 있고, 또한 정상 인간 심장 조직에는 결합하지 않았던 항체로부터 구축하였다.

두 개의 뮤린 항-EphA2 단일클론성 항체인 B233 (도 29 참조) 및 EA2 (도 1)는 인간화되었으며, 3F2 (B233로부터 유래됨; 도 30) 및 4H5 (EA2로부터 유래됨)를 생산하였다. 친화도 최적화는 이하에, 및 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60에 상세하게 설명된 바와 같이 수행하였다.

6.5.1 EphA2 항체의 친화도 최적화

6.5.1.1. 4 H5 의 친화도 최적화

이하의 정보는 세 개의 친화도 최적화된 변이체 2A4, 2E7, 및 12E2를 생산하기 위한 인간화된 항-인간 EphA2 mAb 4H5의 친화도 최적화를 상술한다. 친화도 최적화된 변이체, 특히, 2A4, 2E7, 및 12E2의 생산에 대한 추가의 상술을 위해, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 "Affinity Optimized EphA2 Agonistic Antibodies and Methods of Use Thereof" 표제의 2005년 12월 21일에 출원된 미국 가출원 제60/751,964호를 참조하길 바란다.

6.5.1.1.1 시약

모든 화학물질은 분석 등급의 것이었다. 제한 효소 및 DNA-변형 효소, 및 T4 리가아제(ligase) 및 T7 DNA 중합효소는 New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)로부터 구입하였다. 주문제작형 올리고뉴클레오티드는 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 합성되었다. (인간 IgG1의 Fc 부분과 융합된 인간 EphA2-Fc 엑토도메인(ectodomain)으로 구성된) 인간 EphA2-Fc 융합 단백질은 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포에서 발현시켰으며, 표준 프로토콜을 이용하는 단백질 G 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 인간 EphA2-Fc 비오틴화는 EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴화 키트(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit)를 이용하여 제조사의 설명서(Pierce, Rockford, IL)에 따라 수행하였다.

6.5.1.1.2 프레임워크 셔플링 ( Framework Shuffling ) 기술에 의한 뮤린 항-인간 EphA2 항체 EA2 의 인간화

부모 뮤린 mAb EA2의 인간화는, 각각 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60, 및 미국 특허 공개 제US-2005/0048617 A1호에 상세하게 기술된 바와 같은 프레임워크 셔플링 기술을 이용하여 달성되었다.

본질적으로, EA2 VL 및 EA2 VH 영역 모두의 CDR 영역은 조합 방식으로 인간 프레임워크 생식세포라인(germline) 서열의 라이브러리 상에 이식되었으며, 이는 EphA2 결합을 유지하는 모자이크, 인간화된 변이체를 생성(create)한다. 이러한 인간화된 클론의 하나인 4H5는 키메라 Fab EA2와 비교하였을 때, 친화도의 약 20배 증가를 나타내었다. 이 클론은 친화도 성숙(affinity maturation)을 위한 주형으로 선택되었으며, 이어서 이하에 기재된 바와 같이 최적화되어, 변이체 2A4, 2E7 및 12E2를 유발하였다.

6.5.1.2. 4 H5 seFv 의 친화도 최적화

6.5.1.2.1 scFv 주형 구축

scFv 절편으로서의 인간화된 mAb 4H5의 가변 영역은 M13 발현 벡터 내부로 클론하였다 (인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60). 4H5 가변 경 영역(variable light region)은 [(Gly)4Ser]3 링커에 의해 4H5 가변 중쇄의 3' 단부에 조합되었으며, 그리고 C-말단 단부에 FLAG 태그 및 His 태그가 뒤따른다 (도 31). 구조체는, PCR 및 개별 반응에서 가변 영역을 증폭하기 위한 이하의 프라이머를 사용하여 생성하였다:

여기서 밑줄친 서열은 [(Gly)₄Ser]₃서열에 상응하고, 또한 굵은 이탤릭체는 Sfi I 제한효소 사이트를 나타낸다. 중복 PCR (Overlapping PCR)은 scFv 절편을 구축하기 위해 사용하였으며, 그 후 상기 절편은 SfiI에 의해 제한되고, 벡터 MD 102 내부로 클론되었다. 뮤린 부모 EA2 가변 영역은 scFv 대조군으로서 사용하기 위해 동일한 방식으로 클론하였다. 그 후 4H5 scFv 구조체는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Wu 및 An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234에 기술된 바와 같이 우리딘 + ssDNA를 생산하기 위해 CJ236 내에서 발현시켰다. 이 4H5 scFv U+ ssDNA는, 이후의 돌연변이유발(mutagenic) 친화도 최적화 반응을 위한 주형으로 사용되었다. 4H5 scFv의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 32에 도시하였다.

6.5.1.2.2 각 CDR 영역의 인색한 무작위화(Parsimonious Randomization)에 의한 scFv 의 친화도 최적화

모든 6개의 상보성-결정 영역 (Complementarity-Determining Regions; CDRs)의 각 아미노산은, 두 개의 분리 라이브러리를 이용하여 아미노산 당 개별적으로, 무작위적으로 돌연변이되었다 (인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, Wu 및 An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234). 모든 CDR 아미노산 위치에서의 8 아미노산 (NSS) 또는 12 아미노산 (NWS)의 인코딩을 위해, 각각의 개별적인 축퇴(degenerate) 프라이머를 단일 혼성화 돌연변이생성 반응(single hybridization mutagenesis reaction)(각각 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212, 및 Dall'Acqua 등, 2005. Methods 36:43-60)에서 사용하였으며, 상응하는 CDR 라이브러리의 생성을 위해 조합하였다. 간단히 말해서, 각 축퇴 프라이머는 인산화시켰으며, 그 후 온도가 1시간에 걸쳐 95℃에서 55℃로 낮춰진 어닐링(annealing) 반응에서 (Wu 및 An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234에 기재된 바와 같이 준비된) 우리딘화된 4H5 scFv 단일-가닥 U+ DNA 주형과 10:1 비율로 사용하였다. 상기 어닐링된 반응에 TR 리가아제 및 T7 DNA 중합효소를 첨가하고, 반응을 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이트하였다. 각 CDR의 모든 아미노산에 대한 합성 산물을 풀(pool)하였으나, NSS 및 NWS 라이브러리는 격리하여 두었으며 개별적으로 스크린하였다. 일반적으로, 풀된 CDR 라이브러리 합성된 DNA의 1 ㎕는 그 후 Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212에 기재된 바와 같이 scFv 절편의 생산 또는 XL1-블루(XL1-Blue) 세균 터(bacterial lawn) 상의 플라크 형성을 위해 XL1-블루 내부로 전기천공(electrophrate)시켰다.

6.5.1.3. 라이브러리의 스크리닝

6.5.1.3.1 일차 스크린

일차 스크린은, 본질적으로 Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212, 및 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60에 기술된 바와 같이 개별적 재조합 M13 클론으로 감염된, 96 딥-웰(deep-well) 플레이트에서 기른 1 ml- 세균 배양물로부터 준비된 가용성의, 분비된 scFv 단백질을 함유하는 상청액을 사용하여 수행된 단일점 ELISA (single point ELISA; SPE)로 구성된다. 간단하게 말하면, 이 포획 ELISA는 96 웰 Maxisorp Immunoplate의 개별 웰을 약 30ng의 마우스 항-FLAG 항체 (Sigma)로 코팅하고, 3% BSA/PBS로 37℃에서 2시간 동안 블로킹하며, 또한 샘플 (가용성, 분비된 scFv)로 실온에서 2시간 동안 인큐베이트해야한다. 그 후 150-600 ng/웰의 비오틴화된 인간 EphA2-Fc를 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 이후 뉴트라비딘(neutravidin)-서양고추냉이 페록시다아제 (HRP) 컨쥬게이트 (Pierce, IL)와 실온에서 40분동안 인큐베이션하였다. HRP 활성은 테트라메틸벤지딘(tetra methyl benzidine; TMB) 기질로 검출하였으며, 상기 반응은 0.2 M H2SO4로 퀀치하였다. 플레이트는 450 nm에서 리드하였다.

6.5.1.3.2 일차 스크린의 결과

일반적으로, 부모 4H5 scFv보다 약 2배 더 큰 OD 450nm 신호를 나타내는 클론은 15 ml 규모로 다시 키웠고, 양성 결과를 확인하기 위해 2배 웰에서 동일한 ELISA로 다시 어세이하였다. 그 후 반복된 클론은 시퀀싱하였으며, 인간 EphA2에 대한 결합의 증가 배수를 평가하기 위해 활성 ELISA (activity ELISA)(이하 참조)를 이용하여 어세이하였다.

6.5.1.3.3 이차 스크린

이전에 확인된 단일-변화, 친화도 최적화된 변이체의 추가적 특성화를 위해, 15 ml- 세균 배양물로부터 발현된, 분비된 svFc 절편을 사용하여 이차 스크린 (Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212 참조)을 수행하였다. 보다 정확하게는, 두 ELISA를 사용하였다: (i) 96-well Maxisorp Immunoplate의 개별적 웰을 ~ 0.5ug의 인간 EphA2-Fc로 코팅하고, 3%BSA/PBS로 37℃에서 2시간 동안 블록한 활성 ELISA. 그 후 2배 연속적으로 희석한 샘플을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 염소 항-인간 카파(kappa) 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP) 컨쥬게이트와의 인큐베이트가 이어졌다. HRP 활성은 TMB 기질로 검출하였으며, 반응은 0.2 M H2SO4로 퀀치하였다. 플레이트는 450 nm에서 리드하였다; (ii) Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212에 기재된 바와 같이 본질적으로 수행된 항-scFv 정량 ELISA. 간단히 말해서, 96-웰 Ni NTA 플레이트 (Qiagen)의 개별적 웰은 2배 연속적으로 희석된 샘플 또는 표준물 (50-0.78 ng/ml)로 인큐베이트하였다. 항-FLAG 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP) 컨쥬게이트와의 인큐베이션이 이어졌다. HRP 활성은 TMB 기질로 검출하였으며, 상기 반응은 0.2 M H2SO4로 퀀치하였다. 플레이트는 450 nm에서 리드하였다.

6.5.1.3.4 이차 스크린의 결과

상기에 기재된 2-부(two-part) 이차 ELISA 스크린은, scFv 4H5와 친화도 최적화된 변이체를 그들의 scFv 농도를 표준화시킴으로써 인간 EphA2에 대한 결합의 견지에서 서로 비교토록 한다. 모든 단일-변화, 친화도 최적화된 변이체 scFv 클론은 부모 scFv 4H5와 비교할 때 인간 EphA2에 대한 보다 좋은 결합을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).

6.5.1.4. CDR 친화도 최적화된 클론으로부터의 조합 변이체의 구축 및 특성화

결합에서의 추가적 향상을 갖는 조합 변이체를 조작하기(engineer) 위해, 활성/정량 ELISA에 의해 부모 4H5 scFv와 비교하였을 때 향상된 결합의 모든 단일 아미노산 변화를 작은, 집중된 조합 라이브러리를 생성하기 위해 조합하였다. 간단히 말하면, 모든 확인된 아미노산 변화뿐만 아니라 동일한 위치의 부모 아미노산을 인코딩하는 축퇴 프라이머를 설계하였다. 어닐링 반응에서 모든 프라이머가 포함되고, (상기)에 이어 합성된, 조합 라이브러리가 전술된 바와 같이 구축되고 스크린되었다.

6.5.1.4.1 EphA2 의 일차 스크리닝의 결과

일반적으로, 부모 4H5 scFv보다 더 큰 OD 450nm 신호를 나타내는 클론은 15 ml 규모로 다시 키웠고, 양성 결과를 확인하기 위해 2배 웰에서 (상기한) ELISA로 다시 어세이하였다. 그 후 16개 조합 변이체를 선택하고, 시퀀싱하여 11개의 독특한 CDR 아미노산 변화의 조합을 확인하였으며, 따라서 일차 서열 수준에서 1 내지 3개의 아미노산에 있어 서로 상이한 각 변이체를 제조하였다.

6.5.1.4.2 EphA2 의 이차 스크리닝의 결과

상기한 11개의 독특한 조합 변이체는 상기 조합 변이체의 향상된 결합 친화도를 평가하기 위해 상기한 이차 스크린에 의해 분석하였다. 모든 변이체는 4H5 scFv에 비해 인간 EphA2에 대해 유의하게 향상된 친화도를 가졌다. 세 친화도 최적화된 조합 변이체 2A4, 2E7 및 12E2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 33, 34 및 35 각각에 나타낸다. 세 친화도 최적화된 조합 변이체 2A4, 2E7, 및 12E2의 데이터는 도 36에 나타낸다. 도 37은 인간화된 4H5 scFv와 친화도 최적화된 변이 체 2A4, 2E7 및 12E2의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.

6.5.1.4.3 결합 분석

2A4, 2E7 및 12E2뿐만 아니라 부모 EA2 scFv 및 인간화된 4H5 scFv는 1L 배양 부피의 대장균에서 발현이 유도되었다. 가용성, 분비된 절편을 함유한 상청액은 세포 부스러기(debris)를 제거하기 위해 회전시켰으며, 그 후 항-FLAG 컬럼 (Sigma)를 통과시켜 정제하고 변이체 단백질을 단리하였다. 정제된 친화도 최적화된 변이체는 BIAcore 3000 기기(Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검출에 의해 분석하였다. 부모 항-EphA2 scFv EA2에 비교하였을 때, 인간화된, 친화도 최적화된 EA2의 변이체는 110-150배 친화도 향상을 나타내었다. 친화도 측정 결과에 있어서는, 아래의 섹션 6.6의 표를 참조한다.

6.5.2 뮤린 항-인간 EphA2 항체 B233의 친화도 최적화

부모 분자 mAb B233의 인간화는, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Dall' Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60에 기술된 바와 같은 프레임워크 셔플링 기술을 사용하여 달성되었다. 본질적으로, 두 B233 VL 및 B233 VH 영역의 CDR 영역 모두는, 조합 방식으로 인간 골격 생식세포라인 서열의 라이브러리 상에 이식되었으며, 이는 EphA2 결합을 유지하는 모자이크, 인간화된 변이체를 생성한다. 이러한 인간화된 클론의 하나인 2G6는 키메라 mAb B233과 비교하였을 때, 친화도의 약 10배 상실을 나타내었다. 이 클론은 친화도 성숙을 위한 주형으로 선택되었으며, 이어서 이하에 기재된 바와 같이 최적화되어, 변이체 3F2를 유발하였다.

6.5.2.1. 조합 변이체의 구축 및 특성화

인간 EphA2에 대한 향상된 결합을 갖는 조합 변이체를 조작하기(engineer) 위해, 부모 B233와 비교하여 향상된 결합의 모든 단일 아미노산 변화를 작은, 집중된 조합 라이브러리를 생성하기 위해 조합하였다. 간단히 말하면, 모든 확인된 아미노산 변화뿐만 아니라 동일한 위치의 부모 아미노산을 인코딩하는 축퇴 프라이머 (도 38 참조)를 설계하였다. 어닐링 반응은 모든 프라이머가 포함되고, 이에 따라 합성된, 본질적으로, 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36: 43-60 및 Wu, 2003. Methods Mol. Biol. 207:197- 212에 기술된 바와 같이 수행하였다. 그 후 이렇게 구축된 조합 라이브러리는 스크린하였다.

6.5.2.1.1 라이브러리의 스크리닝

6.5.2.1.1.1 일차 스크린

일차 스크린은, 본질적으로 Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36:43-60 및 Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212에 기술된 바와 같이 단일 재조합 M13 클론으로 감염된, 96 딥-웰 플레이트에서 기른 1 ml- 세균 배양물로부터 준비된 주변세포질 Fab 추출물(periplasmic Fab extracts)을 사용하여 수행된 단일점 ELISA (SPE)로 구성된다. 간단하게 말하면, 이 포획 ELISA는 96-웰 Maxisorp Immunoplate의 개별 웰을 약 20ng의 염소 항-인간 Fab 항체로 코팅하고, 3% BSA/PBS로 37℃에서 2시간 동안 블로킹하며, 또한 샘플 (주변세포질-발현된 Fabs)로 실온에서 2시간 동안 인큐베이트 해야한다. 그 후 300 ng/웰의 비오틴화된 인간 EphA2-Fc를 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 이후 뉴트라비딘-서양고추냉이 페록시다아제 (HRP) 컨쥬게이트 (Pierce, IL)와 실온에서 40분동안 인큐베이션하였 다. HRP 활성은 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질로 검출하였으며, 상기 반응은 0.2 M H2SO4로 퀀치하였다. 플레이트는 450 nm에서 리드하였다.

6.5.2.1.1.2 일차 스크린의 결과

일반적으로, 부모 2G6보다 2배 더 큰 OD 450nm 신호를 나타내는 클론은 15 ml 규모로 다시 키웠고, 양성 결과를 확인하기 위해 2배 웰에서 동일한 ELISA로 다시 어세이하였다. 그 후 반복된 클론은 시퀀싱하였으며 인간 EphA2에 대한 결합의 증가 배수를 평가하기 위해 활성 ELISA (이하 참조)를 이용하여 어세이하였다.

6.5.2.1.1.3 이차 스크린

이전에 확인된 조합 친화도 최적화된 변이체 (상기 참조)의 추가적 특성화를 위해, 15 ml- 세균 배양물로부터 발현된, 15 ml-세균 배양물로부터 준비된 주변세포질 추출물에서 발현된 Fab 절편을 사용하여 이차 스크린 (Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212 참조)을 수행하였다. 보다 정확하게는, 두 ELISA를 사용하였다: (i) 96-웰 Maxisorp Immunoplate의 개별적 웰을 ~ 1㎍의 인간 EphA2-Fc로 코팅하고, 3%BSA/PBS로 37℃에서 2시간 동안 블록한 활성 ELISA. 그 후 2배 연속적으로 희석한 샘플을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 염소 항-인간 카파 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP) 컨쥬게이트와의 인큐베이트가 이어졌다. HRP 활성은 TMB 기질로 검출하였으며, 반응은 0.2 M H2SO4로 퀀치하였다. 플레이트는 450 nm에서 리드하였다; (ii) 본질적으로 (Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212)에 기재된 바와 같이 수행된 항-인간 Fab 정량 ELISA. 간단히 말해서, 96-웰 Biocoat 플레이트 (BD Biosciences, CA)의 개별적 웰은 2배 연속적으로 희석된 샘플 또는 표준물 (인간 IgG Fab, 100-1.56 ng/ml)로 인큐베이트하였다. 항-인간 카파 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP) 컨쥬게이트와의 인큐베이션이 이어졌다. HRP 활성은 TMB 기질로 검출하였으며, 상기 반응은 0.2 M H2SO4로 퀀치하였다. 플레이트는 450 nm에서 리드하였다.

6.5.2.1.1.4 이차 스크린의 결과

상기 항에 기재된 2-부 이차 ELISA 스크린은, Fab 2G6와 친화도 최적화된 조합 변이체를 인간 EphA2에 대한 결합의 견지에서 서로 비교하였다. 이들 친화도 최적화된 조합 변이체 Fab들 중 하나를 보다 광범위한 분석을 위해 선택하였다 (그 후 변이체는 3F2로 지정됨). 뮤린 B233, 인간화된 2G5 및 친화도 최적화된 3F2 mAb의 가변 영역의 아미노산 서열을 도 39에 정렬시켰다.

6.5.2.2. 인간 IgG1 포맷의 mAb B233의 여러 인간화된, 친화도 최적화된 변 이체의 클로닝 , 발현 및 정제

인간화된, 프레임워크-셔플된 클론 2G6 및 친화도 최적화된 변이체 3F2의 가변 영역은 pfu DNA 중합효소를 이용하여 상응하는 V영역-인코딩 M13 파아지(phage) 벡터로부터 PCR-증폭하였다. 그 후 이들을 인간 사이토메갈로바이러스 주 직전 초기 (human cytomegalovirus major immediate early; hCMVie) 인핸서, 프로모터 및 5'-비번역 영역을 인코딩하는 표유류 발현 벡터 내로 개별적으로 클론하였다 (인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, Boshart 등, 1985, Cell 41:521-530). 이 시스템에서, 인간 γ1 사슬은 인간 κ 사슬과 함께 분비된다 (인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, Johnson 등, 1997, Infect. Dis. 176:1215-1224). 상이한 구조체를 HEK 293에서 일시적으로 발현시켰으며, 트랜스펙션 후 72 및 144 시간에 수합하였다. 분비된, 가용성 인간 IgG1은 제조사의 설명서에 따라 1 ml HiTrap 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 상에 올려진 조정된 배지로부터 정제하였다 (APBiotech, Inc., Piscataway, NJ). 정제된 인간 IgG1 (SDS-PAGE에 의해 판단된 바, 일반적으로 > 95% 상동성)은 인산염 완충 염수(PBS)에서 투석하고, 순간 동결하고 -7O℃에 보관하였다.

6.5.2.2.1 비아코어 분석

고정화된 EphA2-Fc와 가용성 B233, 2G6, 및 3F2 IgG의 상호작용은, 본질적으로 W.F. Dall'Acqua 등, 2005, Methods 36 (2005) 43-60에 기술된 바와 같이 Biacore^®3000 기기 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검출에 의해 모니터하였다. 이하의 섹션 6.6.2도 참조한다. 키메라 B233, 인간화된 2G6, 및 친화도-최적화된 3F2의 친화도 측정은 이하의 표로 주어진다.

6.6 EphA2 - BiTE 의 친화도 측정

이하는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 본 발명의 EphA2-BiTE의 친화도 상수를 설명한다.

6.6.1 항-인간 CD3

고정화된 가용성 CD3εγ 표면을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 측정이 제공된다. CD3εγ에 대한 BiTE 분자의 이상 회합(biphasic association)은 결합율 및 친화도 상수의 정확한 계산을 막는다.

탈면역화된 항-CD3 x EA2 VH/VL 400-500 nM (추측)

6.6.2 항-인간 EphA2

고정화된 EphA2-Fc 표면을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 측정이 제공된다:

탈면역화된 항-CD3 x EA2 VH/VL (MT) 45 nM

탈면역화된 항-CD3 x EA2 VH/VL (MedI) 113 nM

6.6.3 scFV 의 친화도 측정( K _D )

이하의 표는 항-인간 EphA2 scFv의 결합 동력학의 요약을 제공한다. EphA2에 대한 모노머성 항-인간 EphA2 scFv 결합은 표면 플라즈몬 공명 결합에 의해 측정된다. 친화도 최적화는 4H5에 비교하여 인간 EphA2에 대한 친화도 (KD)가 20-30배 증가된 세 scFv를 생산하였다.

6.7 인간화된 항-인간 EPHA2 - BITE 의 특성화

6.7.1 인간 및 사이노몰거스 EphA2 에 대한 인간화된 항- EphA2 부모 항체의 플 로우 사이토메트리 결합 분석

SW480 결장 암종의 반합류(subconfluent) 단일층 또는 사이노몰거스 EphA2 트랜스펙트된 CHO 세포를 신속하게 트립신처리하고, 세척하고, 계수하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하고, 또한 10 ㎍/ml의 음성 대조군 항체 (R347), 항-인간 EphA2 뮤린 항체인 EA2 (Coffman 2003), 또는 인간화된 항체인 3F2 및 4H5로 염색하였다. 세포를 AlexaFluor 488 항-마우스 또는 항-인간 IgG H+L (Invitrogen)에 재부유시킨 후, FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하는 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 도 40에 나타낸 바와 같이, EA2, 3F2, 및 4H5 각각은 인간 및 사이노몰거스 EphA2에 결합하였다.

6.7.2 인간화된 항- EphA 부모 항체의 에피토프 배제 특성

염색 전에 MCF-1OA 또는 MDA-MB-231의 단일층을 유리 커버슬립 상에서 37℃에서 적어도 24시간 동안 배양하였다. 세포 단일층을 일차 항체(클론 G5 (음성 대조군), EA5, EA2, 3F2, 또는 4H5)와의 인큐베이션 전에 4% 포름알데히드 (2분, 25℃)에서 30분 동안 고정하고, 그 후 AlexaFluor 488-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 또는 AlexaFluor 488-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (The Jackson Laboratory)와 염색하였다. 세포는 면역형광 현미경검사에 의한 분석을 위해 고정하였다. 도 41에 나타낸 바와 같이, 3F2 및 4H5는 비형질전환된 및 형질전환된 유방 상피 세포 모두에서 EphA2에 대해 결합하였다. 따라서, 3F2 및 4H5는, EA2의 악성 세포(malignant cell)에 접근가능 (accessible)하지만 비형질전환된 상피 세포의 정상 아키텍처(architecture)에 의해 선택적으로 배제되는, EphA2 에피토프에 결합하는 독특한 능력을 공유하지 않았다. G5 항체의 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열은 도 42에 도시되었다.

6.7.3 조직 교차 반응성 분석

인간 심장 조직에 대한 인간화된 항-EphA2 항체의 조직 교차-반응성 평가는 10 ㎍/ml 이하의 농도의 3F2 및 4H5이 정상 인간 심장 조직에 결합하지 않는 것으로 측정되었다.

합 변이체 scFvs 2A4, 12E2, 및 2E7에 대한 조직 교차-반응성이 또한 평가되었다. 50 10 ㎍/ml 이하의 농도의 조합 변이체 scFvs (2A4, 12E2, 및 2E7)의 어떤 것도 인간 심장 조직 (2 도너)을 염색하지 않았다 (데이터 제기되지 않음).

6.7.4 3F2 항- EnhA2 BiTE 구조체의 특성화

생산된 3F2-기반 BiTE 구조체는 이하의 표에 도시되었으며, 세포독성 어세이로 추가로 특성화되었다.

자극된 인간 CD8+ T-세포의 존재 하에 여러 항-EphA2 BiTE 구조체에 의한 방향전환된 표적 세포 용해를 측정하기 위해 크롬-51 방출을 기반으로 한 세포독성 어세이를 수행하였다. EphA2-양성 종양 세포주 MDA-MB-231는 Chromium-51를 로딩하였으며, 표적 세포로서 알맞다. 여러 EphA2-BiTE 구조체는 농도의 넓은 범위에 걸쳐 적정하였다. 어세이 지속시간은 18시간이었으며, 효과기-대-표적 비율은 10:1이었다. 상이한 생산 배치로의 최고-절반 용해(즉, EC₅₀)에 필요한 EphA2-BiTE 농도는 4개의 파라미터 비선형 피트 모델을 이용하여 평가되었다. 도 43을 참조한다.

플로우 사이토메트리-기반 방향전환된 세포의 세포독성 어세이는 효과기 세포로서의 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)가 풍부한 CD3+ T-세포와 EphA2+ SW480 결장 암종 세포를 사용하여 상기에 열거한 바와 같이 수행되었다. 도 44를 참조한다.

상기 네 단일-사슬 3F2-기반 항-EphA2 BiTE 구조체 (상기의 표)의 시험관 내 세포독성 측정 (도 43 및 44)은, 3F2 BiTE의 잠재성 (즉, EC₅₀)는 뮤린 EA2 BiTE에 대해 뛰어나지 않음을 제시한다. 이들 결과는 인간 항-EphA2 BiTE가 EphA2+ 종양 세포를 용해하기 위해 인간 T-세포를 redirect함을 확증하였다.

6.7.5 4 H5 Anti - EphA2 BiTE 구조체의 특성화

생산된 4H5-기반 항-EphA2 BiTE 구조체는 이하의 표에 도시되었으며, 추가로 특성화되었다.

6.7.5.1. EphA2 + 및 CD3 + 발현 세포에 대한 4 H5 -기반 항- EphA2 BiTE 의 표적 세포 결합의 특이성

여러 4H5-기반 BiTE 구조체의 표적 결합 특이성은 상기한 플로우 사이토메트리-기반 어세이를 이용하여 평가하였다. EphA2+ MDA MB 231 유방암 세포 및 CD3+ HP Ball 인간 T-세포를 표적 세포로서 사용하였다. 탈면역화된 항-CD3xEA2 (VH/VL) BiTE는 양성 대조군으로 사용하였다. 도 45에 나타낸 바와 같이, 각각의 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체는 EphA2 및 CD3 모두를 발현하는 세포에 결합하였다.

6.7.5.2. 인간화된 친화도 성숙된 4 H5 -기반 BiTE 구조체 12 E2 , 2 E7 및 2A4의 표적 세포 결합의 특이성

여러 4H5-기반 BiTE 구조체의 표적 결합 특이성은 상기한 플로우 사이토메트리-기반 어세이를 이용하여 평가하였다. EphA2+ MDA MB 231 유방암 세포 및 CD3+ HP Ball 인간 T-세포를 표적 세포로서 사용하였다. 도 46에 나타낸 바와 같이, 각각의 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체는 EphA2 및 CD3 모두를 발현하는 세포에 결합하였다.

도 47에 나타낸 바와 같이, 상기한 바와 같은 플로우사이토메트리-기반 어세이를 이용하여 5 ㎍/ml 농도의 친화도 성숙된 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체의 정제 된 모노머는 EphA2+ MDA MB 231 유방암 세포 및 CD3+ HP Ball 인간 T-세포 표적 세포에 결합하였다.

친화도 성숙된 4H5-기반 scFv의 능력을 측정하기 위해, 염색 전에 MCF-1OA 또는 MDA-MB-231 세포의 단일층을 유리 커버슬립 상에서 37℃에서 적어도 24시간 동안 배양하였다. 세포 단일층을 일차 scFv 항체(2A4, 2E7 또는 12E2)와의 인큐베이션 전에 4% 포름알데히드 (2분, 25℃)에서 30분 동안 고정하고, 그 후 AlexaFluor 488-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 또는 AlexaFluor 488-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (The Jackson Laboratory)와 염색하였다. 세포는 면역형광 현미경검사에 의한 분석을 위해 고정하였다. 2A4 및 12E2 scFv는 비형질전환된 및 형질전환된 유방 상피 세포 모두에서 EphA2에 대해 결합하였다. 그러나, 2E7 scFv는 악성 세포에 접근가능하지만 비형질전환된 상피 세포의 정상 아키텍처(architecture)에 의해 선택적으로 배제되는, EphA2 에피토프에 결합하는 EA2의 독특한 능력을 공유하였다 (데이터는 나타내지 않음).

6.7.5.3. 인간화된 4 H5 단일클론성 항체의 네 EphA2 - specific BiTE 의 세포독성 잠재성 비교

자극된 인간 CD8+ T-세포의 존재 하에 여러 항-EphA2 BiTE 구조체에 의한 방향전환된 표적 세포 용해를 측정하기 위해 크롬-51 방출을 기반으로 한 세포독성 어세이를 수행하였다. 도 48을 참조한다. EphA2-양성 종양 세포주 MDA-MB-231는 Chromium-51를 로딩하였으며, 표적 세포로서 알맞다. 여러 EphA2-BiTE 구조체는 농도의 넓은 범위에 걸쳐 적정하였다. 어세이 지속시간은 18시간이었으며, 효과기 -대-표적 비율은 10:1이었다. 상이한 생산 배치로의 최고-절반 용해(즉, EC₅₀)에 필요한 EphA2-BiTE 농도는 4개의 파라미터 비선형 피트 모델을 이용하여 평가되었다.

도 49는 여러 3F2- 및 4H5-기반 EphA2 구조체의 표적 세포 용해의 직접적 비교를 제공한다. 크롬-51-기반 세포독성 어세이는 상기한 바와 같이 수행하였다.

6.7.5.4. 친화도 성숙된 4 H5 -기반 EphA2 - BiTE 12 E4 , 2 E7 및 2A4에 의해 유도된 세포독성 활성

도 50 및 51는 여러 4H5-기반 EphA2-BiTE 구조체의 표적 세포 용해의 잠재성을 증명한다 (12E4, 2E7 및 2A4). EphA2-양성 종양 세포주 A549 및 SW480는 Chromium-51를 로딩하였으며, 표적 세포로서 사용하였다. 자극된 인간 CD8+ (도 40) 및 비자극된 인간 CD3+ (도 51) T-세포는 효과기 세포로 사용하였다. 여러 EphA2-BiTE 구조체는 농도의 넓은 범위에 걸쳐 적정하였다. 어세이 지속시간은 18시간 (도 50) 또는 42시간 (도 51)이었으며, 효과기-대-표적 비율은 10:1 (도 50) 또는 5:1 (도 41)이었다. 상이한 생산 배치로의 최고-절반 용해(즉, EC₅₀)에 필요한 EphA2-BiTE 농도는 4개의 파라미터 비선형 피트 모델을 이용하여 평가되었다.

6.7.5.5. 4 H5 -기반 EphA2 - BiTE 에 의한 EphA2 활성화 없음

도 52는 2A4뿐만 아니라 2E7 BiTE 구조체가 EphA2-발현 세포에서 EphA2 인산화를 유도하지 않음을 증명한다. EphA2+ SW480 및 A549 세포는 지시된 농도의 2A4-BiTE 또는 the 2E7-BiTE, EA5 IgG (양성 대조군), 또는 R347 (음성 대조군)로 15분간 처리되었다. 그 후 세포 추출물은 항-EphA2 단일클론성 항체 D7 (Upstate, Charlottesville, VA)를 이용하여 면역침강(immunoprecipitate)시키고, 항-포스포타이로신 항체 4G10 (Upstate)를 이용하여 입증하였다. 샘플 추출, 면역침강 및 웨스턴 블롯 분석은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는 Coffman K. 등, 2003, Cancer Res. 63:7907-12). 모든 실험을 위해, 단백질 수치는 표준 쿠마시(Coomassie) 어세이(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 측정하였으며, 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE (10%)에 의해 분석하였으며, PVDF 막으로 옮겼다 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

6.7.6 친화도 matured 4 H5 - based EphA2 - BiTE 구조체의 생체 내 효능

2A4- 및 2E7-BiTE 구조체의 생체 내 잠재성은 (상기의 섹션 6.4 및 이하의 섹션 6.8.7에서 설명된) 인간 결장 암종 이종이식물 모델과 면역결핍 NOD/SCID 마우스에서 평가하였다. 인간 결장 암종 세포주 SW480는, SW480 세포가 EphA2를 발현하는 점에서 인간 이종이식물 모델의 확립을 위해 선별되었다.

6.7.6.1. 연구 설계

5x10⁶ SW480 세포는 0.2 ml PBS의 최종 부피의, 동일한 도너로부터의 2.5xlO⁶ 인간 CD3+ T-세포와 혼합하였으며, E:T 1:2의 비율을 야기한다. T-세포 효과기/SW480 세포 혼합물은 각 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 내로 피하 주사하였다. 피하로 자라는 SW480 종양은 캘리퍼스로 일주일에 3번, 두 수직 치수를 측정하였으며, 종양 부피는 이하의 공식에 따라 계산되었다: 종양 부피 = [(폭² * 길 이)/2]. 동물은 정맥내로 1, 5, 20 및 100 ㎍/용량의 농도인 2A4-BiTE 또는 2E7-BiTE, PBS 대조군 비히클, 또는 양성 대조군으로서 100 ㎍/용량인 탈면역화된 항-CD3xEA2(VHVL)를, CD3+ T-세포 및 SW480 종양 세포를 피하 접종하고 1시간 후부터 시작하여 연속된 5일간 처리하였다. 연구의 결과는 도 53에 도시한다.

6.8 본원에서 수행된 어세이의 추가적 설명

6.8.1 세포주 및 배양

CHO dhfr-, SW480, MCF-7, PC3, M14, A549, MDA-MB-231, MCF1OA, MDA-MB-468, SK-MEL-28, ACHN 세포는 ATCC로부터 수득하였으며, 그들의 권고에 따라 배양하였다. HeyA8는 M.D. 앤더슨 암센터(M.D. Anderson Cancer Center)의 Anil Sood 박사로부터 받았다.

6.8.2 면역조직화학 및 면역형광 현미경검사

상기 항체가 정상 조직에 특이적으로 결합하는지를 측정하기 위해, 동결된 인간 조직 섹션은 인간 EphA2-반응성 단일클론성 항체인 EA2로 염색하였다. 간단히 말하면, 일차 및 이차 항체의 복합체가 생산되고, 결합하지 않은 이차 결합 사이트는 인간 감마 글로불린으로 블로킹되었다. 동결된 섹션은 10% 포르말린 내에서 슬라이드에 부착시키고, 0.01% 트윈 20을 갖는 1x 트리스-완충된 염수 (TBS)로 세척하였다. 내재적 퍼옥시다아제는 글루코오스 산화효소 (Sigma), β-D(+)-글루코오스 (Sigma), 및 소듐 아자이드 (Sigma)를 함유하는 용액으로 블로킹하였다. 아비딘/비오틴 벡터 키트 (Vector Labs)는 아비딘/비오틴 반응성 사이트를 블로킹한다. 그 후 상기 슬라이드는 소혈청알부민, 카제인, 및 정상 염소 혈청으로 구성 된 단백질 블로킹 용액으로 인큐베이트하였다. 조직 섹션은 전복합체화된 항체 그리고 그 후 Vectastain ABC Elite Kit (Vector Labs)로 인큐베이트한 후, 1x TBS로 세척하고, DAB (Sigma)으로 처리하고, 메이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 대조염색하였다. 조직 섹션은 탈수하고, 커버슬립하였으며, 영상화하였다.

6.8.3 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 분석

모든 연구는 카르복시메틸(CM) 덱스트란 매트릭스 및 Biacore^®3000 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 함유하는 센서 칩 CM5 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 수행하였다. CD3εγ는 아민 커플링 케미스트리를 이용하여 CM 덱스트란 매트릭스에 공유결합적으로 부착된다. 참조 표면은 CD3εγ 커플링 단계를 생략시킴으로써 생성된다. EphA2-Fc는, EphA2Fc의 Fc 부분과 염소 항-인간 IgG (Fc) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) 사이의 높은 친화도 상호작용을 통해 포획된다. 염소 항-인간 IgG (Fc)는 아민 커플링 케미스트리를 이용하여 CM 덱스트란 매트릭스에 공유결합적으로 부착된다. 두개의 항-인간 IgG (Fc)-특이적 표면이 생성된다. 이들 표면 중 하나가 참조 표면으로 사용되는 동안 다른 표면은 EphA2-Fc-특이적 표면을 생성하기 위해 사용된다. 상이한 농도의 bscEphA2 x CD3가 HBS-EP (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)에서의 연속 희석에 의해 준비된다. EphA2-BiTE는 CD3εγ-특이적 또는 EphA2-특이적 표면 및 그의 상응하는 참조 표면을 가로지르는 연속-흐름 방식으로 주입된다. 결합된 EphA2-BiTE의 해리는 HBS-EP의 존재 하에 모니터 된다. 잔류하는 결합 물질은 10 mM 사붕산이나트륨 pH 8.5, (CD3εγ-특이적 표면에 대해) 1 M NaCl 또는 (EphA2-Fc-특이적 표면에 대해) 10 mM 글리신 pH 1.7으로 제거되었다.

6.8.4 세포 표면 항원 밀도

세포 상의 EphA2 표면 결합 사이트의 수는 Qifikit (DakoCytomation)를 이용하여 평가하였다. 간단히 말하면, 세포의 반합류 단일층을 신속하게 트립신처리하고, 세척하고, 계수하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하고, 또한 100 ㎕의 2배 연속 희석된 항-인간 EphA2 항체인 B233 (Coffman 2003)으로 염색하였다. 세포 및 마우스 IgG-컨쥬게이트된 조정 비드(calibration bead)를 AlexaFluor 647 항-마우스 IgG H+L (Invitrogen)에 재현탁한 후, FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하는 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 표면 결합 사이트의 수는 비드 조정 곡선으로부터 비선형 회귀 분석에 의해 평가하였다.

7. 균등물

당업자들은 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물들은 이하의 청구범위에 포함될 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별적 공개물, 특허 또는 특허 출원이 인용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되도록 명확하게 또한 개별적으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 본 명세서 내에 참조로서 삽입된다.

SEQUENCE LISTING <110> MedImmune, Inc. Micromet Inc. <120> EphA2 BiTE Molecules and Methods of use thereof <130> 10271-175-228 <150> 60/753,368 <151> 2005-12-21 <160> 123 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain Nucleotide Sequence <400> 1 gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aactatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctgaaa tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain Amino Acid Sequence <400> 2 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain CDR1 Nucleotide Sequence <400> 3 aaggcgagtc aggacattaa taactattta agc 33 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 4 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain CDR2 Nucleotide Sequence <400> 5 cgtgcaaaca gattggtaga t 21 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 6 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain CDR3 Nucleotide Sequence <400> 7 ctgaaatatg atgagtttcc gtacacg 27 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Light Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 8 Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain Nucleotide Sequence <400> 9 gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtactta cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagaagct 300 atctttactt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345 <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain Amino Acid Sequence <400> 10 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain CDR1 Nucleotide Sequence <400> 11 ggattcactt tcagtagcta taccatgtct 30 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain CDR1 Amino acid Sequence <400> 12 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain CDR2 Nucleotide Sequence <400> 13 accattagta gtggtggtac ttacacctac tatccagaca gtaagggc 48 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain CDR2 Amino acid Sequence <400> 14 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain CDR3 Nucleotide Sequence <400> 15 gaagctatct ttacttac 18 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA2 Variable Heavy Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 16 Glu Ala Ile Phe Thr Tyr 1 5 <210> 17 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable Nucleotide Sequence <400> 17 gatgtkgtka tgacbcagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggttc acattttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable Amino Acid Sequence <400> 18 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable CDR1 Nucleotide Sequence <400> 19 aagtcaagtc agagcctctt atatagt 27 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable CDR1 Amino Acid Sequence <400> 20 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable CDR2 Nucleotide Sequence <400> 21 ctggtgtcta aactggactc t 21 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable CDR2 Amino Acid Sequence <400> 22 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable CDR3 Nucleotide Sequence <400> 23 gtgcaaggtt cacattttcc gtggacg 27 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Light Chain Variable CDR3 Amino Acid Sequence <400> 24 Val Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 25 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable Nucleotide Sequence <400> 25 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctagtgaaga ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggttactaca tgcactgggt caagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attagttgtt acaatggtgt tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattt actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagttca acagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagatctcat 300 gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345 <210> 26 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable Region - Amino Acid Sequence <400> 26 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable CDR1 Nucleotide Sequence <400> 27 ggttactaca tgcac 15 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable CDR1 Amino Acid Sequence <400> 28 Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 29 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable CDR2 Nucleotide Sequence <400> 29 tatattagtt gttacaatgg tgttactagc tacaaccaga agttcaaggg c 51 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable CDR2 Amino Acid Sequence <400> 30 Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable CDR3 Nucleotide Sequence <400> 31 tctcatgcta tggactac 18 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA5.12 Heavy Chain Variable CDR3 Amino Acid Sequence <400> 32 Ser His Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 33 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Light Chain Amino Acid Sequence <400> 33 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 20 25 30 Asp Ser Val Asn Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 35 40 45 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 50 55 60 Lys Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 85 90 95 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 100 105 110 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Light Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 34 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Light Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 35 Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Light Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 36 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Heavy Chain Amino Acid Sequence <400> 37 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Heavy Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 38 Asp Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 39 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Heavy Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 39 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233 Variable Heavy Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 40 Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Light Chain Amino Acid Sequence <400> 41 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Gly Phe Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Light Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 42 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Light Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 43 Tyr Gly Phe Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Light Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 44 Gln Gln Ala Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 45 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Heavy Chain Amino Acid Sequence <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Heavy Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 46 Asp Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Heavy Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 47 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2 Variable Heavy Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 48 Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Light Chain Amino Acid Sequence <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Light Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 50 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Light Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 51 Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Light Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 52 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 53 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Heavy Chain Amino Acid Sequence <400> 53 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Heavy Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 54 Asp Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Heavy Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 55 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G5 Variable Heavy Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 56 Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Linker Sequence of EphA2-BiTe construct <400> 57 Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Asp <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Linker Sequence of EphA2-BiTe construct <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Linker Sequence of EphA2-BiTe construct <400> 59 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 60 <211> 1554 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Deimmunized anti-CD3 (VH-Vl) x EA2 (VH-VL) Nucleotide Sequence <400> 60 gaattcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggtgta 60 cactccgacg tccaactggt gcagtcaggg gctgaagtga aaaaacctgg ggcctcagtg 120 aaggtgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttactaggt acacgatgca ctgggtaagg 180 caggcacctg gacagggtct ggaatggatt ggatacatta atcctagccg tggttatact 240 aattacgcag acagcgtcaa gggccgcttc acaatcacta cagacaaatc caccagcaca 300 gcctacatgg aactgagcag cctgcgttct gaggacactg caacctatta ctgtgcaaga 360 tattatgatg atcattactg ccttgactac tggggccaag gcaccacggt caccgtctcc 420 tcaggcgaag gtactagtac tggttctggt ggaagtggag gttcaggtgg agcagacgac 480 attgtactga cccagtctcc agcaactctg tctctgtctc caggggagcg tgccaccctg 540 agctgcagag ccagtcaaag tgtaagttac atgaactggt accagcagaa gccgggcaag 600 gcacccaaaa gatggattta tgacacatcc aaagtggctt ctggagtccc tgctcgcttc 660 agtggcagtg ggtctgggac cgactactct ctcacaatca acagcttgga ggctgaagat 720 gctgccactt attactgcca acagtggagt agtaacccgc tcacgttcgg tggcgggacc 780 aaggtggaga tcaaatccgg aggtggtgga tccgacgtga agctggtgga gtctggggga 840 ggcttagtga agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc 900 agtagctata ccatgtcttg ggttcgccag actccagaga agaggctgga gtgggtcgca 960 accattagta gtggtggtac ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc 1020 atctccagag acaatgccaa gaacaccctg tacctgcaaa tgagcagtct gaagtctgag 1080 gacacagcca tgtattactg tacaagagaa gctatcttta cttactgggg ccaagggact 1140 ctggtcactg tctcttcctc cggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt 1200 ggttctgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 1260 gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaataact atttaagctg gttccagcag 1320 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagattggt agatggggtc 1380 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattatt ctctcaccat cagcagcctg 1440 gagtatgaag atatgggaat ttattattgt ctgaaatatg atgagtttcc gtacacgttc 1500 ggagggggga ccaagctgga aataaaacat catcaccatc atcattaggt cgac 1554 <210> 61 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Linker Sequence of EphA2-BiTE construct <400> 61 ggcgaaggta ctagtactgg ttctggtgga agtggaggtt caggtggagc agacg 55 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Linker Sequence of EphA2-BiTE construct <400> 62 tccggaggtg gtggatccg 19 <210> 63 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Linker Sequence of EphA2-BiTe construct <400> 63 tccggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttct 48 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Linker Sequence of EphA2-BiTE construct <400> 64 catcatcacc atcatcatta g 21 <210> 65 <211> 492 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of Deimmunized anti-CD3(VH-VL) x EA2 (VH-VL) EphA2-Bite <400> 65 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Lys Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln 275 280 285 Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly 290 295 300 Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys 325 330 335 Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Ala Ile Phe Thr 340 345 350 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 355 360 365 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Met Thr 370 375 380 Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile 385 390 395 400 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln 405 410 415 Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg 420 425 430 Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln 435 440 445 Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile 450 455 460 Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 465 470 475 480 Thr Lys Leu Glu Ile Lys His His His His His His 485 490 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal hexa-histidine sequence of EphA2-BiTe cDNA <400> 66 His His His His His His 1 5 <210> 67 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4h5 VH VL scFV Nucleotide sequence <400> 67 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatacca tgtcttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag cgcttgagtg gatgggaacc attagtagtg gtggtactta cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagct 300 atctttactt actggggccg tggcaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct 360 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca aggcgagtca ggacattaat 480 aactatttaa gctggtacca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatcgt 540 gcaaacagat tggtagatgg ggtcccagac aggttcagtg gcagcgggta tggaacagat 600 tttaccctca caattaataa catagaatct gaggatgctg catattactt ctgtctgaaa 660 tatgatgtgt ttccgtacac gttcggccaa gggaccaagg tggagatcaa a 711 <210> 68 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4H5 VH VL scFv Amino Acid Sequence <400> 68 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asp Val Phe 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4H5 VH VL scFv CDR1 (VH) Amino Acid Sequence <400> 69 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4H5 VH VL scFv CDR2 (VH) Amino Acid Sequence <400> 70 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4H5 VH VL scFv CDR3 (VH) Amino Acid Sequence <400> 71 Glu Ala Ile Phe Thr Tyr 1 5 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4H5 VH VL scFv CDR1 (VL) Amino Acid Sequence <400> 72 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4H5 VH VL scFv CDR2 (VL) Amino Acid Sequence <400> 73 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4H5 VH VL scFv CDR3 (VL) Amino Acid Sequence <400> 74 Leu Lys Tyr Asp Val Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 75 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv Nucleotide Sequence <400> 75 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatacca tgtcttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag cgcttgagtg gatgggaacc attagtagtc gtggtactta cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagct 300 atctttactc actggggccg tggcaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct 360 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca aggcgagtca ggacattaat 480 aactatcaca gctggtacca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatcgt 540 gcaaacagat tggtcgatgg ggtcccagac aggttcagtg gcagcgggta tggaacagat 600 tttaccctca caattaataa catagaatct gaggatgctg catattactt ctgtctgaaa 660 tataatgtgt ttccgtacac gttcggccaa gggaccaagg tggagatcaa a 711 <210> 76 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv Amino Acid Sequence <400> 76 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 145 150 155 160 Asn Tyr His Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Val Phe 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv CDR1 (VH) Amino Acid Sequence <400> 77 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv CDR2 (VH) Amino Acid Sequence <400> 78 Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv CDR3 (VH) Amino Acid Sequence <400> 79 Glu Ala Ile Phe Thr His 1 5 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv CDR1 (VL) Amino Acid Sequence <400> 80 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr His Ser 1 5 10 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv CDR2 (VL) Amino Acid Sequence <400> 81 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A4 VH VL scFv CDR3 (VL) Amino Acid Sequence <400> 82 Leu Lys Tyr Asn Val Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 83 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv Nucleotide Sequence <400> 83 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatacca tgtcttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag cgcttgagtg gatgggaacc attagtagtc gtggtactta cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagct 300 atctttactc actggggccg tggcaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct 360 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca aggcgagtca ggacattaat 480 aactatggca gctggtacca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatcgt 540 gcaaacagat tggtcgatgg ggtcccagac aggttcagtg gcagcgggta tggaacagat 600 tttaccctca caattaataa catagaatct gaggatgctg catattactt ctgtctgaaa 660 tataatcggt ttccgtacac gttcggccaa gggaccaagg tggagatcaa a 711 <210> 84 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv Amino Acid Sequence <400> 84 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 100 105 110 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 115 120 125 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 130 135 140 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 145 150 155 160 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 165 170 175 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 180 185 190 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 195 200 205 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 225 230 235 240 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 245 250 255 Asn Tyr Gly Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 260 265 270 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 275 280 285 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 290 295 300 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Arg Phe 305 310 315 320 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 325 330 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv CDR1 (VH) Amino Acid Sequence <400> 85 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv CDR2 (VH) Amino Acid Sequence <400> 86 Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv CDR3 (VH) Amino Acid Sequence <400> 87 Glu Ala Ile Phe Thr His 1 5 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv CDR1 (VL) Amino Acid Sequence <400> 88 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Gly Ser 1 5 10 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv CDR2 (VL) Amino Acid Sequence <400> 89 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E7 VH VL scFv CDR3 (VL) Amino Acid Sequence <400> 90 Leu Lys Tyr Asn Arg Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 91 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv Nucleotide Sequence <400> 91 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatacca tgtcttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag cgcttgagtg gatgggaacc attagtagtc gtggtactta cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagct 300 atctttactt actggggccg tggcaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct 360 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca aggcgagtca ggacattaat 480 aactatttaa gctggtacca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatcgt 540 gcaaacagat tgttcgatgg ggtcccagac aggttcagtg gcagcgggta tggaacagat 600 tttaccctca caattaataa catagaatct gaggatgctg catattactt ctgtctgaaa 660 tatgatcggt ttccgtacac gttcggccaa gggaccaagg tggagatcaa a 711 <210> 92 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv Amino Acid Sequence <400> 92 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Phe Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asp Arg Phe 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv CDR1 (VH) Amino Acid Sequence <400> 93 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv CDR2 (VH) Amino Acid Sequence <400> 94 Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv CDR3 (VH) Amino Acid Sequence <400> 95 Glu Ala Ile Phe Thr Tyr 1 5 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv CDR1 (VL) Amino Acid Sequence <400> 96 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv CDR2 (VL) Amino Acid Sequence <400> 97 Arg Ala Asn Arg Leu Phe Asp 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E2 VH VL scFv CDR3 (VL) Amino Acid Sequence <400> 98 Leu Lys Tyr Asp Arg Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 99 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer L1 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 99 ccagtgtagg ttgttgctaa tactttggct ggc 33 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer L2 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 100 ccagtgtagg ttgttgtdaa tactttggct ggc 33 <210> 101 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer L3 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 101 gggaccccag agatgdactg gaagvcatac ttgatcagga gc 42 <210> 102 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer L4 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 102 gggaccccag agatgdactg gaagstatac ttgatcagga gc 42 <210> 103 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer L5 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 103 gagcggccag ctgttggmct gttgacagta atatg 35 <210> 104 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H6 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 104 gcctgtcgca cccasttcat ggagtaatcg gwaaaggtga atccag 46 <210> 105 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H7 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 105 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly 1 5 10 15 Trp Cys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Cys Gly Gly Trp 20 25 30 Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly 35 40 45 <210> 106 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H8 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 106 gcctgtcgca cccasttcat ggagtaatcg tcaaaggtga atccag 46 <210> 107 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H9 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 107 gcctgtcgca cccaggwcat ggagtaatcg tcaaaggtga atccag 46 <210> 108 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H10 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 108 Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly 1 5 10 15 Thr Thr Gly Thr Gly Thr Ala Gly Lys Cys Ala Thr Thr Ala Gly Cys 20 25 30 Thr Thr Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr 35 40 45 Cys <210> 109 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H11 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 109 gatgcactgt actctgttgt gtaggaatta gctttgtttc taataaatc 49 <210> 110 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H12 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 110 gttccttggc cccaggagtc catagcatga trcctagggt atctc 45 <210> 111 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combinatorial Primer H13 used in affinity optimization of Fab 2G6 <400> 111 gttccttggc cccacaggtc catagcatga trcctagggt atctc 45 <210> 112 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Heavy Chain Amino Acid Sequence <400> 112 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 113 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Heavy Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 113 Asp Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 114 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Heavy Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 114 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Heavy Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 115 Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5 <210> 116 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Light Chain Amino Acid Sequence <400> 116 Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu 20 25 30 His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Light Chain CDR1 Amino Acid Sequence <400> 117 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Light Chain CDR2 Amino Acid Sequence <400> 118 Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 2G6 Variable Light Chain CDR3 Amino Acid Sequence <400> 119 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 120 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Medi-VH8 5' primer used to amplify VH <400> 120 ttctatgcgg cccagccggc ccaggtgcag ctgttgsagt ctg 43 <210> 121 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Medi-JH1 3' primer used to amplify VH <400> 121 ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 54 <210> 122 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Medi-VK1 5' primer used for VL <400> 122 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagw tgacccagtc tcc 53 <210> 123 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Medi-JK4 3' primer used for VL <400> 123 tggaattcgg cccccgaggc cacgtttgat ctccaccttg gtccc 45 ?? ?? ?? ?? 1

Claims

(a) CD3에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터의 각 제1 중쇄 가변 도메인(VH domain) 및 제1 경쇄 가변 도메인(VL domain)으로서, 이 때, 상기 제1 VH 도메인은, 상기 제1 VH 도메인 및 상기 제1 VL 도메인이 접혀서 CD3에 결합하는 제1 결합 도메인을 형성하도록 하는 충분한 길이의 제1 링커에 의해, 상기 제1 VL 도메인에 공유결합적으로 링크되는 것; 및

(b) 세포 표면에 노출된 EphA2의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체로부터의 제2 VH 도메인 및 제2 VL 도메인으로서, 이 때, 상기 제2 VH 도메인은, 상기 제2 VH 도메인 및 상기 제2 VL 도메인이 접혀서 상기 EphA2의 에피토프에 결합하는 제2 결합 도메인을 형성하도록 하는 충분한 길이의 제2 링커에 의해, 상기 제2 VL 도메인에 공유결합적으로 링크되는 것;

을 포함하고,

여기서 상기 제1 결합 도메인 및 상기 제2 결합 도메인은, 상기 제1 결합 도메인 및 상기 제2 결합 도메인이 상호 독립적으로 접히도록 충분한 길이의 제3 링커에 의해 공유결합적으로 링크되는,

이중특이적 단일 사슬 항체(bispecific single chain antibody).
청구항 1에 있어서, 상기 CD3에 면역특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인은 CD3의 엡실론(ε) 서브유닛에 결합하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 CD3의 ε 서브유닛에 특이적인 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인에 비해 N-말단에 위치하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 CD3의 ε 서브유닛에 특이적인 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인에 비해 C-말단에 위치하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 제1 결합 도메인 및 상기 제2 결합 도메인은 VH_CD3-VL_CD3-VH_EphA2-VL_EphA2 순서로 배열되는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 CD3의 ε 서브유닛에 면역특이적으로 결합하는 상기 제1 결합 도메인은 탈면역화된(deimmunized), 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 제2 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인은 EA2, EA3, EA4, EA5, 3F2, 4H5, 2A4, 2E7, 12E2, Eph099B-102.147, Eph099B-208.261, Eph099B-210.248, Eph099B-233.152, Eph101.530.241,233 또는 G5의 VH 및/또는 VL 도메인인, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 링커 서열의 길이는 5 잔기 이상, 10잔기 이상, 15잔기 이상, 20잔기 이상, 25잔기 이상 또는 30잔기 이상을 포함하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 CD3의 ε 서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인의 제1 경쇄 가변 도메인 및 제1 중쇄 가변 도메인 사이의 제1 링커는 서열 식별 번호: 57의 서열을 포함하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인의 제2 경쇄 가변 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인 사이의 상기 제2 링커는 서열 식별 번호: 59의 서열을 포함하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 제1 결합 도메인과 상기 제2 결합 도메인 사이의 제3 링커는 서열 식별 번호: 58의 서열을 포함하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 제1 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인은 인간화된 항-CD3 항체로부터의 것인, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 제2 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인은 인간화된 항- EphA2 항체로부터의 것인, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 2에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은, 상기 제2 결합 도메인이 EphA2에 결합하는 것보다 더 낮은 친화도로 상기 CD3의 ε 서브유닛에 결합하는, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 14에 있어서, 상기 CD3의 ε 서브유닛에 결합하는 제1 결합 도메인의 해리 상수는 4 x 10^-7 M인, 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 14에 있어서, 상기 EphA2에 결합하는 제2 결합 도메인의 해리 상수는 1.13 x 10^-7 M 인, 이중특이적 단일 사슬 항체.
서열 식별 번호: 65의 서열을 포함하는 청구항 2의 이중특이적 단일 사슬 항체.
청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 이중특이적 단일 사슬 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
암세포가 EphA2를 발현하는, 암을 치료, 예방 또는 관리하는 것을 필요로 하는 대상에서 암을 치료, 예방 또는 관리하는 방법으로서, 상기 방법은 치료적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 이중특이적 단일 사슬 항체 및 약 제학적으로 허용가능한 담체를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체는, 세포-세포 접촉(cell-cell contact)하지 않는 세포에서 발현되는 EphA2에 결합하는, 암을 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 암은 전이성 암인, 암을 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 19에 있어서, 이중특이적 단일 사슬 항체가 아닌 추가의 항암 요법의 시행(administration)을 포함하는, 암을 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 22에 있어서, 상기 추가의 암 요법은 화학적 요법, 생물학적 요법, 면역요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 및 수술로 구성되는 군으로부터 선택되는, 암을 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
감염을 치료, 예방, 관리하는 것을 필요로 하는 대상에서 감염을 치료, 예방, 관리하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상에게 치료적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 이중특이적 단일 사슬 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 투여하는 것을 포함하는, 감염을 치료, 예방, 관리하는 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 감염은 세포내 병원체 감염인, 감염을 치료, 예방, 관리하는 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 감염은 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus; RSV) 감염인, 감염을 치료, 예방, 관리하는 방법.
청구항 24에 있어서, 추가 요법의 시행을 포함하는, 감염을 치료, 예방, 관리하는 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 추가적 요법은 항바이러스 요법, 항진균 요법, 항균 요법 또는 항원생동물(anti-protozoan) 요법인, 감염을 치료, 예방, 관리하는 방법.
치료적으로 유효한 양의 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 이중특이적 단일 사슬 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 비-암 과증식성 세포 장애를 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 29에 있어서, 상기 비-암(non-cancer) 과증식성 세포 장애는 천식, COPD, 폐 섬유증(lung fibrosis), 석면증(asbestosis), IPF, DIP, UIP, 신장 섬유증(kidney fibrosis), 간 섬유증(liver fibrosis), 기타 섬유증(other fibroses), 기관지 과민반응(bronchial hyper-responsiveness), 건선(psoriasis), 지루피부염(seborrheic dermatitis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 또는 재협착(restenosis), 과증식성 혈관 질환(hyperproliferative vascular disease), 베체트증후군(Behcet's Syndrome), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 황반 변성(macular degeneration)과 같은 과증식성 내피 세포 장애(a hyperproliferative endothelial cell disorder), 또는 과증식성 섬유모세포 장애(hyperproliferative fibroblast disorder)인, 비-암 과증식성 세포 장애를 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 29에 있어서, 추가적 요법의 시행을 포함하는, 비-암 과증식성 세포 장애를 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 31에 있어서, 상기 추가적 요법은 항-바이러스 요법 또는 면역조정제인, 비-암 과증식성 세포 장애를 치료, 예방 또는 관리하는 방법.
청구항 19, 청구항 24 또는 청구항 29에 있어서, 상기 대상은 인간인, 비-암 과증식성 세포 장애를 치료, 예방 또는 관리하는 방법.