TW202104268A

TW202104268A - Cd73阻斷抗體

Info

Publication number: TW202104268A
Application number: TW109113576A
Authority: TW
Inventors: 依凡佩洛特; 凱倫帕吐爾; 勞倫古提爾
Original assignee: 法商天賜製藥公司
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2021-02-01
Also published as: WO2020216697A1; CN113784981A; BR112021021224A2; MX2021012769A; EP3959239A1; AU2020260693A1; SG11202111106WA; US20220041744A1; IL286997A; JP2022530404A; CA3136698A1; KR20220002959A

Abstract

本發明係關於結合及抑制CD73之抗體及其片段。本發明亦關於產生此類化合物之細胞；製造此類化合物及其抗體、片段、變異體及衍生物之方法；包含彼等之醫藥組合物；使用該等化合物診斷、治療或預防疾病(例如癌症)之方法。

Description

CD73阻斷抗體

CD73 (外-5'-核苷酸酶)係一種70-kDa糖基化磷脂醯肌醇(GPI)錨定蛋白，通常表現於內皮細胞及造血細胞子集上。CD73連同CD39可調節三磷酸腺苷(ATP)代謝。CD39 (NTPDase-1)可將ATP轉化成AMP，其中僅釋放痕量的ADP，同時CD73催化AMP轉化成腺苷。

腺苷三磷酸(ATP)及其代謝物AMP及腺苷在細胞代謝、信號傳導及免疫穩態方面具有重要作用。細胞外腺苷三磷酸(ATP)響應於細胞死亡或細胞應激之釋放起活化免疫反應之作用。然而，其代謝物腺苷具有免疫抑止活性。細胞外腺苷在癌症組織中會積累且構成腫瘤免疫逃脫之重要機構。在其他影響中，腫瘤源性腺苷經由腺苷酸環化酶活化A2A受體明顯地抑制浸潤效應T細胞。

CD73表現已報導在一系列腫瘤細胞中，包括白血病、膀胱癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、食道癌及乳癌。CD73表現亦已與黑色素瘤及乳癌中之促轉移表型相關。已報導，用結合鼠類CD73之抗體進行之療法可抑制小鼠中之乳房腫瘤生長及癌轉移(Stagg等人(2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:1547-1552)。已展示A2A受體之基因缺失可誘導T細胞依賴性腫瘤排斥反應(Ohta等人，(2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:13132-13137)。使用siRNA之阻斷基因表現或CD73在腫瘤細胞上之過度表現可調節腫瘤生長及轉移(Beavis等人(2013 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14711-716; Stagg等人(2010), supra; Jin等人(2010) Cancer Res. 70: 2245-55)。CD73-/-小鼠經保護免於移植及自發性腫瘤(Stagg等人(2010) Cancer Res. 71: 2892-2900)。在人類中，已展示較高CD73表現為三陰性乳癌之陰性預後(Loi等人(2013 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 11091-11096)。然而，儘管CD73表現於腫瘤細胞上，但其亦表現於免疫系統之不同細胞，尤其CD4及CD8 T細胞以及B細胞上。另外，另一種併發因素為文獻中所述之多種抗體一般係能夠與Fcγ受體結合之鼠類同型，使得難以將任何潛在的阻斷作用與Fc介導之作用分離。

儘管CD73作為治療目標存在長期關注，但仍需要抑制CD73酶活性方面具有較高效能且適用於人類療法之抗體。

本發明人提供結合在細胞(包括腫瘤細胞)表面處表現CD73上之抗原決定基且抑制CD73酶之酶(外-5'核苷酸酶)活性的抗體。該等抗體具有人類衍生之構架區，其具有最小非人類(例如小鼠)序列含量。抗體可以二聚體內模式結合CD73且可抑制細胞表面處所表現之可溶性CD73及膜結合之CD73蛋白的酶活性。有利地，此等抗體可以用作純CD73阻斷抗體，例如其抑制在細胞表面處表現的膜結合之CD73蛋白的酶活性，而實質上不結合Fcγ受體及/或實質上不引導ADCC朝向CD73表現細胞。視情況，抗體保持Fc域且保持結合至人類FcRn。抗體可有利地具有低免疫原性風險，例如在投與人類時的較低或降低的(與鼠類親本抗體相比)誘導人類抗小鼠抗體(HAMA)反應之可能性。

抗體結合存在於在細胞(包括但不限於腫瘤細胞)表面處表現之人類CD73多肽上的抗原決定基，且抑制CD73酶之酶(外-5'核苷酸酶)活性。其具有尤其有利的抑止由CD73介導之T細胞增殖之能力，且因此可使細胞毒性CD4及/或CD8 T細胞之生物活性(包括但不限於增殖)增加，例如如在T細胞增殖分析中所觀測到。在一個實施例中，對CD73酶活性之抑制或中和係藉由評估抗體或抗體片段當在AMP (例如外源添加之AMP)存在下誘導T細胞活體外增殖(例如經由TCR共刺激)時提高該等T細胞增殖的能力來確定。

在一個實施例中，提供一種抗體或抗體片段或其抗原結合域，其包含：含胺基酸序列SEQ ID NO: 37之重鏈可變區及含選自由胺基酸序列SEQ ID NO: 33、34、35或36組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。在一個實施例中，提供抗體或抗體片段或其抗原結合域，其包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 37之重鏈可變區及含胺基酸序列SEQ ID NO: 33之輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供一種抗體或抗體片段或其抗原結合域，其包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 42之重鏈可變區及含選自由胺基酸序列SEQ ID NO: 43、44、45或46組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。在一個實施例中，提供抗體或抗體片段或其抗原結合域，其包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 42之重鏈可變區及含胺基酸序列SEQ ID NO: 43之輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供抗CD73抗體或抗體片段，其包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 38之重鏈及含胺基酸序列SEQ ID NO: 39之輕鏈。

在一個實施例中，提供抗CD73抗體或抗體片段，其包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 47之重鏈及含胺基酸序列SEQ ID NO: 48之輕鏈。

在一個實施例中，提供抗CD73抗原結合域或包含此類之蛋白質(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 2、3及4中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGHV1-3基因的構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及視情況來自人類IGHJ4基因的其他構架4 (FR4))胺基酸序列)；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 5、6及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGKV1-33基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及視情況來自人類IGKJ2基因的構架4 (FR4)胺基酸序列)。視情況，存在於重鏈可變區中Kabat位置59 (HCDR2)處之殘基為白胺酸或麩醯胺酸殘基。視情況，存在於重鏈可變區中Kabat位置60 (HCDR2)處之殘基為蘇胺酸或離胺酸殘基。視情況，存在於重鏈可變區中Kabat位置97 (HCDR3)處之殘基為甘胺酸或天冬醯胺殘基。視情況，存在於輕鏈可變區中Kabat位置30 (LCDR1)處之殘基為絲胺酸或蘇胺酸殘基。視情況，存在於輕鏈可變區中Kabat位置53 (LCDR2)處之殘基為蘇胺酸或天冬醯胺殘基。

在一個實施例中，提供抗CD73抗原結合域或包含此類之蛋白質(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 2、8及9中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGHV1-3基因的構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及視情況來自人類IGHJ4基因的其他構架4 (FR4))胺基酸序列)；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 10、11及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGKV1-33基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及視情況之來自人類IGKJ2基因的構架4 (FR4)胺基酸序列)。在一個實施例中，VH進一步包含Kabat重鏈CDR中選自由以下組成之群之Kabat重鏈位置處的胺基酸取代中之一個、兩個或三個：59 (HCDR2)、60 (HCDR2)及97 (HCDR3)。視情況，位置59處之白胺酸殘基經麩醯胺酸殘基取代。視情況，位置60處之蘇胺酸殘基經離胺酸殘基取代。視情況，位置97處之甘胺酸殘基經天冬醯胺殘基取代。在一個實施例中，VL進一步包含Kabat輕鏈CDR中Kabat輕鏈位置30 (LCDR1)及/或53 (LCDR2)處之胺基酸取代，視情況進一步其中位置30處之絲胺酸殘基經蘇胺酸殘基取代，視情況進一步其中位置53處之蘇胺酸殘基經天冬醯胺殘基取代。

在一個實施例中，提供抗CD73抗原結合域或包含此類之蛋白質(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 2、12及13中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGHV1-3基因的構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及視情況來自人類IGHJ4基因之其他構架4 (FR4))胺基酸序列)；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 14、15及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGKV1-33基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及視情況之來自人類IGKJ2基因的構架4 (FR4)胺基酸序列)。

在本文任何實施例之一個態樣中，重鏈可變區(VH)之特徵可在於在選自由2、30、48、69及73組成之群的Kabat重鏈位置處包含一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代，視情況其中存在於人類序列中特定位置處之殘基經存在於鼠類供體序列中該特定位置處之殘基置換；及輕鏈可變區(VL)之特徵可在於在Kabat輕鏈位置67處包含胺基酸取代，視情況其中存在於人類序列中特定位置處之殘基經存在於鼠類供體序列中該特定位置處之殘基置換。在一個實施例中，VL包含Kabat輕鏈位置67處之取代，且視情況包含選自由2、67及87組成之群的Kabat輕鏈位置處之其他一個、兩個或三個胺基酸取代，視情況其中存在於人類序列中特定位置處之殘基經存在於鼠類供體序列中該特定位置處之殘基置換。在一個實施例中，抗體或抗體結合域包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含胺基酸取代V2I、T30A、M48I、I69L及T73K，該輕鏈可變區包含胺基酸取代S67Y，其中編號係根據Kabat。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置2處之胺基酸為異白胺酸。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置30處之胺基酸為丙胺酸。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置48處之胺基酸為異白胺酸。

在本文中之任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置69處之胺基酸為白胺酸。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置73處之胺基酸為離胺酸。

在一個實施例中，VH包含Kabat位置2處之異白胺酸殘基、位置30處之丙胺酸、位置48處之異白胺酸、位置69處之白胺酸及位置73處之離胺酸。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat輕鏈位置67處之胺基酸為酪胺酸。

在本文之任何實施例之一個態樣中，Kabat輕鏈位置60處之胺基酸為天冬胺酸。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat輕鏈位置2處之胺基酸為異白胺酸。

在本文之任何實施例之一個態樣中，Kabat輕鏈位置87處之胺基酸為苯丙胺酸。

在一個實施例中，VL包含Kabat位置67處之酪胺酸殘基；視情況，VL在Kabat構架中不包含藉由非人類殘基之其他取代及/或具有除殘基67之取代以外的完全人類之VL Kabat構架。

在一個實施例中，VL包含Kabat位置67處之酪胺酸殘基及位置60處之天冬胺酸。

在一個實施例中，VL包含Kabat位置67處之酪胺酸殘基、位置60處之天冬胺酸及位置2處之異白胺酸。

在一個實施例中，VL包含Kabat位置67處之酪胺酸殘基、位置60處之天冬胺酸、位置2處之異白胺酸及位置87處之苯丙胺酸。

在一個實施例中，提供抗CD73抗原結合域或包含抗原結合域之蛋白質(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 37至少80%、90%、95%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO: 33、34、35或36中之任一者之胺基酸序列至少80%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一個實施例中，VH包含具有SEQ ID NO: 2、12及13中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3且VL包含具有SEQ ID NO: 14、15及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。在一個實施例中，該VH包含Kabat位置2處之異白胺酸殘基、位置30處之丙胺酸、位置48處之異白胺酸、位置69處之白胺酸及位置73處之離胺酸。在一個實施例中，VL包含Kabat位置67處之酪胺酸殘基。

在一個實施例中，提供抗CD73抗原結合域或包含抗原結合域之蛋白質(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，其包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 2、3及4中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3及人類構架(例如人源之FR1、FR2、FR3及FR4)；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含含SEQ ID NO: 5、6及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及人類構架(例如人源之FR1、FR2、FR3及FR4)，其中(VH)包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 37或42至少80%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，且輕鏈可變區(VL)包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 33-36或43-46中任一者至少80%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。視情況，存在於重鏈可變區中Kabat位置59 (HCDR2)處之殘基為白胺酸或麩醯胺酸殘基。視情況，存在於重鏈可變區中Kabat位置60 (HCDR2)處之殘基為蘇胺酸或離胺酸殘基。視情況，存在於重鏈可變區中Kabat位置97 (HCDR3)處之殘基為甘胺酸或天冬醯胺殘基。視情況，存在於輕鏈可變區中Kabat位置30 (LCDR1)處之殘基為絲胺酸或蘇胺酸殘基。視情況，存在於輕鏈可變區中Kabat位置53 (LCDR2)處之殘基為蘇胺酸或天冬醯胺殘基。在一個實施例中，該VH包含Kabat位置2處之異白胺酸殘基、位置30處之丙胺酸、位置48處之異白胺酸、位置69處之白胺酸及位置73處之離胺酸。在一個實施例中，VL包含Kabat位置67處之酪胺酸殘基。

在任何實施例中，VH可表徵為包含人類VH受體構架胺基酸序列且VL包含人類VL受體構架胺基酸序列。在一個實施例中，VH人類受體構架之VH區段來自人類IGHV1-3基因區段且J區段來自人類IGHJ4基因區段。在一個實施例中，VH人類受體構架來自人類IGHV1-3*01基因區段。在一個實施例中，VL域人類受體構架來自人類IGKV1-33基因區段，視情況VL域人類受體構架來自人類IGKV1-33*01基因區段。在一個實施例中，VL域人類受體構架包含來自人類IGKJ2基因區段之J區段。

在一個實施例中，抗體或抗體片段包含H4+ VH域及L1、L2、L3或L4 VL域。在一個實施例中，抗體為抗體H4+L1。

在一個實施例中，提供抗CD73抗原結合域或包含抗原結合域之蛋白質(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，其包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 37之重鏈可變區及含選自由胺基酸序列SEQ ID NO: 33、34、35或36組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供一種抗體或抗體片段，其結合人類CD73且中和CD73之ATP酶活性，其中抗體或抗體片段包含抗體H4+L1之重鏈可變區及輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供一種結合人類CD73多肽且中和CD73之ATP酶活性的抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 37的重鏈可變區及含胺基酸序列SEQ ID NO: 33的輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供一種結合人類CD73多肽且中和CD73之ATP酶活性的抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 38的重鏈及含胺基酸序列SEQ ID NO: 39的輕鏈。

在一個實施例中，抗體或抗體片段包含2H4+ VH域及2L1、2L2、2L3或2L4 VL域。在一個實施例中，抗體為抗體2H4+2L1。

在一個實施例中，提供抗CD73抗原結合域或包含抗原結合域之蛋白質(例如抗體或抗體片段、多特異性結合蛋白、雙特異性抗體等)，其包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 42之重鏈可變區及含選自由胺基酸序列SEQ ID NO: 43、44、45或46組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供一種抗體或抗體片段，其結合人類CD73且中和CD73之ATP酶活性，其中抗體或抗體片段包含抗體2H4+2L1之重鏈可變區及輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供一種結合人類CD73多肽且中和CD73之ATP酶活性的抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 42的重鏈可變區及含胺基酸序列SEQ ID NO: 43的輕鏈可變區。

在一個實施例中，提供一種結合人類CD73多肽且中和CD73之ATP酶活性的抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含胺基酸序列SEQ ID NO: 47的重鏈及含胺基酸序列SEQ ID NO: 48的輕鏈。

在一個實施例中，抗體為非消耗性的且中和腫瘤環境中之CD73酶活性。

在一個實施例中，抗體為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型抗體。舉例而言，抗體可為包含人類IgG4同型之Fc域的抗體，或包含任何人類IgG同型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc域的抗體，該Fc域經修飾以減少或缺乏Fc域與人類Fcγ受體(例如CD16)之間的結合，視情況經修飾以減少Fc域與複數個人類Fcγ受體(例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及CD64)之間的結合。在一個實施例中，抗體包含人類IgG亞型(例如IgG1)之Fc域，該Fc域包含使得與CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及CD64中之每一者之結合減少(與包含野生型人類IgG1 Fc域之抗體相比)或實質上完全喪失的胺基酸修飾。

在任何實施例中，抗體重鏈包含人類CH1恆定域及視情況之人類IgG1同型的經修飾之人類Fc域，視情況進一步包含胺基酸序列SEQ ID NO: 16、17、18或19中之任一者。在任何實施例中，抗體輕鏈包含人類輕鏈恆定域，視情況其中恆定域為人類κ域。

在一個態樣中，本發明之抗體不誘導或增加細胞表面表現之CD73多肽的細胞內內化，或更一般而言，下調，及/或不會視CD73抑制活性而定。與藉由致使CD73內化來抑制CD73之抗體相比，本發明抗體可以提供更大的抑制效能(實質上中和CD73酶活性之能力)。相較於藉由其他機制(例如致使CD73抗體寡聚物形成)抑制可溶性CD73的抗體，本發明抗體能夠以較高(例如10倍)過量的抗體:酶抑制CD73酶活性。此外，不同於結合重組CD73上之抗原決定基(其可在細胞表面CD73 (例如抗體7G2)上加以修飾或不存在於該表面)的抗體，或親和力過低而無法在CD73表現細胞中轉譯成功效的抗體，本發明抗體以高親和力結合至存在於細胞表面CD73上且/或在保持完好之抗原決定基，從而提供能夠有效地中和細胞CD73酶活性的抗體。本發明之抗體抑制細胞中之CD73酶活性，但可視情況亦抑制可溶性重組CD73之外-5'核苷酸酶活性(如使用可溶性二聚CD73多肽進行的非細胞檢定中所觀測到)。

在一個態樣中，本發明之抗體能夠在不結合至CD73多肽之酶活性位點的情況下抑制人類CD73多肽之活性，及/或為CD73之非競爭性抑制劑，例如其抑制人類CD73多肽之活性而不會可偵測地減少CD73多肽與其天然受質之間的結合。

在一個態樣中，本發明之抗體失去與殘基K136處具有取代之CD73突變體的結合。在一個態樣中，本發明之抗體與殘基K136處具有取代之CD73突變體(參考序列SEQ ID NO: 1)的結合減少；且與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之野生型CD73進行比較；視情況，該等抗體亦與殘基A99、E129、K133、E134及A135處具有取代之CD73突變體 (參考序列SEQ ID NO: 1)的結合減少；且與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1的野生型CD73進行比較；視情況進一步而言，該等抗體與殘基K97、E125、Q153及K330處具有取代之CD73突變體(參考序列SEQ ID NO: 1)的結合減少；且與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之野生型CD73進行比較。

在一個實施例中，抗體結合至CD73二聚體內之各CD73多肽鏈上的抗原決定基(亦即以二聚體內方式結合至CD73)，視情況進一步其中抗原決定基存在於CD73二聚體之相同面上。因此，抗體可以二價方式結合至一種CD73二聚體，尤其在抗體結合位點在空間上比在「開放」之位置更遠相隔的較為「封閉」之位置中。鑒於結合至配位體結合之CD73，本文所述之抗體當結合至AMP時可適用於結合至CD73，例如用於治療表徵為(例如已知或疑似表徵為)腫瘤環境之個體或癌症，其中上游ADP及/或AMP在治療前以顯著含量存在。抗體可適用於治療患有(例如已知或疑似患有)腫瘤環境之個體或癌症，該腫瘤環境表徵為高含量之ADP (例如由死亡細胞產生、由基質及細胞浸潤(例如TReg細胞)上之CD73吸收以產生高含量之AMP)，以及更一般而言表徵為AMP、腺苷、CD73表現或CD73表現細胞之存在或含量、CD73表現細胞之高(例如與健康組織相比)數目或頻率及/或細胞上CD73表現之高含量(例如如藉由免疫組織化學分析所評估)、高(例如與健康組織相比)可溶性CD73多肽(例如如藉由ELISA或一般任何基於抗體之偵測分析所評估)或腺苷受體表現或腺苷受體表現細胞之存在或含量。腫瘤環境中之CD73分子可呈受質結合構形，且結合及抑制除非受質結合CD73外的受質結合細胞CD73 (例如與諸如AMP之受質一起預培育的細胞表現CD73)的能力可提供更大的活體內抑制CD73的能力。視情況，可在治療前在腫瘤環境中評估可溶性CD73蛋白、CD73表現細胞之數目或頻率及/或細胞上之CD73表現量。該等抗體可具有治療個體之特定優勢，該個體具有可溶性CD73蛋白之顯著含量(例如與參考物相比，高含量)、CD73表現細胞之數目或頻率及/或腫瘤樣品中之細胞上的CD73表現量。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種人類化抗體或抗體片段，其結合細胞表面處表現之人類CD73多肽且抑制CD73多肽之酶(外-5'核苷酸酶)活性，其中該抗體能夠以二價方式結合至單一CD73多肽二聚體(可溶性CD73多肽二聚體或由細胞表現之CD73多肽二聚體)。視情況，該抗體與第一抗原結合域結合至二聚體內之第一CD73多肽且與第二抗原結合域結合至第二CD73多肽。在一個態樣中，抗體為CD73多肽之別位抑制劑。

由抗體結合之CD73上的抗原決定基存在於CD73多肽上，如藉由一系列細胞(例如癌細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、經轉染細胞)所表現，且如藉由流式細胞量測術所測定以高親和力結合。舉例而言，抗體可表徵為如藉由流式細胞量測術所測定的針對與在其表面表現CD73多肽之細胞之結合的EC₅₀ ，其不超過5 µg/ml，視情況不超過2 µg/ml、不超過1 µg/ml、不超過0.5 µg/ml、不超過0.1 µg/ml或不超過0.05 µg/ml。在一個實施例中，細胞為經製成以在其表面表現CD73的細胞。在一個實施例中，細胞為在其表面處內源性表現CD73之細胞，例如癌細胞、白血病細胞、膀胱癌細胞、神經膠質瘤細胞、神經膠母細胞瘤細胞、卵巢癌細胞、黑色素瘤細胞、前列腺癌細胞、甲狀腺癌細胞、食道癌細胞或乳癌細胞。

在一個實施例中，CD73中和抗體之特徵可在於能夠使CD73之細胞5'-外核苷酸酶活性降低至少60%、75%或80%。在一個實施例中，CD73中和抗體可表徵為針對抑制由細胞表現之CD73之5'-外核苷酸酶活性的EC₅₀ ，其不超過1 µg/ml，視情況不超過0.5 µg/ml，視情況不超過0.2 µg/ml。

視情況，對由細胞表現的CD73之5'-外核苷酸酶活性之抑制係藉由在CD73表現細胞中定量AMP水解成腺苷評估5'-外核苷酸酶活性(例如MDA-MB-231細胞)之中和來確定。

視情況，對由細胞表現之CD73之5'-外核苷酸酶活性的抑制係藉由評估抗體或抗體片段當在AMP ((例如外源添加之AMP)存在下誘導T細胞(例如來自健康人類供體)活體外增殖(例如經由TCR共刺激、CD3及CD28信號傳導刺激，例如藉由使T細胞與用CD3促效劑及CD28促效劑功能化之珠粒接觸)時提高該等T細胞增殖的能力來測定。視情況，使用本文實例中所述之分析評估T細胞增殖(參見實例5及方法)。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合存在於細胞表面表現處之可溶性CD73與CD73上的共同抗原決定子。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合CD73二聚體內之各CD73多肽鏈內的抗原決定子(以二聚體內模式)，例如其中抗原決定子存在於CD73二聚體之共同面上。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含殘基K136 (參考SEQ ID NO: 1)之CD73上的抗原決定基。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含選自由K97、E125、Q153及K330 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群之殘基中之一個、兩個、三個或四個的CD73上之抗原決定基。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含選自由A99、E129、K133、E134及A135 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群之殘基中之一個、兩個、三個、四個或五個的CD73上之抗原決定基。

在一個態樣中，抗CD73抗體至少部分結合於包含胺基酸殘基K97、A99、E125、E129、K133、E134、A135、K136、Q153及K330 (參考SEQ ID NO: 1)之人類CD73蛋白(例如CD73均二聚體蛋白)上之胺基酸殘基的結構域或區段內。在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含選自由K97、A99、E125、E129、K133、E134、A135、K136、Q153及K330 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群之殘基中之至少一個、兩個、三個、四個或五個或更多個的CD73上之抗原決定基。

在一個態樣中，與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1的野生型CD73多肽相比，抗CD73抗體與在殘基K136 (參考SEQ ID NO: 1)處具有突變之CD73多肽的結合減少；視情況，突變型CD73多肽具有突變：K136A。

在一個態樣中，與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之野生型CD73多肽相比，抗CD73抗體與在選自由K97、E125、Q153及K330 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群之殘基處具有突變之CD73多肽的結合減少；視情況，突變型CD73多肽具有以下突變：K97A、E125A、Q153A及/或K330A (例如K97A、Q125A及K330A；K97A、E125A及/或Q153A)。

在一個態樣中，與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1的野生型CD73多肽相比，抗CD73抗體與在選自由A99、E129、K133、E134及A135 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群之殘基處具有突變之CD73多肽的結合減少；視情況，突變型CD73多肽具有以下突變：A99S、E129A、K133A、E134N及A135S。

在一個實施例中，提供在治療或預防疾病，例如傳染病或癌症中使用抗體之方法。在一個態樣中，向患有癌症之個體投與足以中和腫瘤微環境中之CD73活性之量及頻率的抗體。在一個實施例中，以足以降低在腫瘤微環境中之腺苷的產生及/或濃度之量及頻率投與抗體。在一個實施例中，抗體以足以增加腫瘤微環境中之ATP產生及/或濃度之量及頻率投與。在一個實施例中，抗體以足以中和由腫瘤細胞表現之CD73之活性的量及頻率投與。在一個實施例中，抗體以足以中和由CD4 T細胞、CD8 T細胞及/或B細胞表現之CD73之活性的量及頻率投與。

抗體將適用於抑制CD73介導之AMP至腺苷之分解代謝，例如降低腫瘤微環境中腺苷之濃度。此等抗體因此將適用於逆轉CD73及/或腺苷對T細胞、B細胞及表現腺苷受體之其他細胞之免疫抑止作用，例如在治療癌症中。在一個實施例中，抗CD73抗體中和T細胞中之增殖、細胞介素產生、細胞毒性及/或腺苷介導之對NFκB活性之抑制。

由於CD73介導之AMP至腺苷之分解代謝為不可逆的，而藉由CD73的ATP至ADP及ADP至AMP的分解代解為可逆的(分別藉由NDK激酶及腺苷酸激酶)，阻斷不可逆CD73介導之分解代謝的抗體將增加AMP池，進而用於增加ADP及ATP之濃度，例如在腫瘤微環境中。抗體可適用於增加來自AMP之ADP的形成及來自ADP之ATP的形成。由於ATP具有免疫活化作用，故抗CD73抗體可適用於活化T細胞，例如適用於治療癌症。

抗體將適用於抑制腺苷至腫瘤微環境中之產生、量及/或濃度。

中和可溶性人類CD73多肽二聚體之活性的抗體可以在任何其他適合的情形下進一步中和CD73，例如在為了表現CD73而製成的報導體細胞中、在T細胞中等。

提供一種治療個體之方法，該方法包含向個體(例如患有疾病、腫瘤等之個體)投與治療活性量之本文所述之抗CD73抗原結合化合物中之任一者。在一個態樣中，提供一種治療個體之方法，該方法包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：向個體(例如患有疾病、腫瘤等之個體)投與治療活性量之本發明之抗原結合化合物。

在一個態樣中，提供一種用於減少由CD73表現細胞(例如個體中之免疫細胞及/或腫瘤細胞)產生的腺苷的方法，或一種用於中和細胞CD73酶活性的方法，該方法包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：使CD73表現細胞與本發明之抗原結合化合物(例如抗CD73抗體或抗體片段，或包含此類之組合物)接觸。在一個實施例中，使CD73表現細胞與本發明之抗原結合化合物接觸的步驟包含向個體投與治療活性量之抗原結合化合物。在一個實施例中，個體患有癌症。

在一個態樣中，提供一種降低存在於腫瘤環境(例如個體中)中之腺苷的方法，該方法包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：向個體投與治療活性量之本發明化合物(例如抗CD73抗體或抗體片段，或包含此類化合物的組合物)。在一個實施例中，個體患有癌症。視情況，個體為患有癌症或易患癌症之人類。

該等抗體視情況表徵為如藉由SPR (例如根據實例之方法)所測定的針對人類CD73多肽(例如作為CD73二聚體)之結合親和力(KD)，其小於(較佳小於) 10^-9 M，較佳小於10^-10 M，或較佳小於10^-11 M，及/或表徵為EC₅₀ 小於(較佳結合小於) 1 µg/ml的結合人類CD73多肽。視情況，結合親和力可規定為二價的。

在一個實施例中，抗體針對與細胞表面處表現人類CD73之細胞(例如腫瘤細胞、MDA-MB-231細胞)的結合具有不超過0.5 µm/ml，視情況不超過0.2 µm/ml，視情況不超過0.1 µm/ml之EC₅₀ 。

抗體視情況表徵為針對中和CD73表現細胞(例如腫瘤細胞、MDA-MB-231細胞)中CD73酶活性的EC₅₀ ，其小於(較佳小於) 1 µm/ml，視情況小於0.5 µm/ml。

在一個實施例中，抗體為單株抗體或其片段，其保持結合特異性及中和CD73酶活性之能力(例如，如藉由評估抗體或抗體片段當在AMP (例如外源添加之AMP)存在下誘導T細胞活體外增殖時提高該等T細胞增殖的能力來確定)。在一個實施例中，抗體在中和CD73酶活性方面實質上與親本抗體同樣有效或至少與其同樣有效，該親本抗體具有相應的VH及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 40及41，視情況其中該抗體具有針對中和CD73酶活性的EC₅₀ ，其在親本抗體之EC₅₀ 的1-log、0.5-log內。在一個實施例中，該抗體在中和CD73酶活性方面比具有相應的VH及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 40及41之親本抗體更有效，視情況其中該抗體具有針對中和CD73酶活性的EC₅₀ ，其小於具有相應的VH及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 40及41之親本抗體的EC₅₀ 。

在一個實施例中，抗體在中和CD73酶活性方面實質上與親本抗體同樣有效或至少與其同樣有效，該親本抗體具有相應的VH及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 27及28，視情況其中該抗體具有針對中和CD73酶活性的EC₅₀ ，其在親本抗體之EC₅₀ 的1-log或0.5-log內。在一個實施例中，該抗體在中和CD73酶活性方面比具有相應的VH及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 27及SEQ ID NO: 28之親本抗體更有效，視情況其中該抗體具有針對中和CD73酶活性的EC₅₀ ，其小於具有相應的VH及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 27及SEQ ID NO: 28之親本抗體的EC₅₀ 。

亦提供編碼本發明之抗體(或其重鏈或輕鏈)或VH及/或VL域的經分離及/或重組核酸(例如核酸集合)、包含此類核酸之載體或載體集合、包含此類載體之細胞及一種產生人類抗CD73抗體或抗體片段的方法，該方法包含在適於表現抗CD73抗體或抗體片段的條件下培養此類細胞。本發明亦關於組合物，諸如醫藥學上可接受之組合物及套組，其包含此類蛋白質、核酸、載體及/或細胞，且通常一或多種另外成分，其可為促進調配、遞送、穩定性或組合物之其他特徵的活性成分或非活性成分(例如各種載劑)。本發明進一步關於各種新的且適用的方法，其製備及諸如在調節CD73介導之生物活性中，例如在治療與其相關之疾病(尤其癌症)中，使用此類抗體、核酸、載體、細胞、生物體及/或組合物。

本發明亦提供產生或測試結合及中和CD73酶活性之抗體或抗體片段的方法。

本發明亦提供一種增強有需要之個體中之淋巴細胞(例如T細胞)活性或用於恢復淋巴細胞(例如T細胞)之活性的方法，或緩解腺苷介導之對淋巴細胞活性(例如T細胞)之抑制的方法，該方法包含向個體投與有效量之前述組合物中之任一者。在一個實施例中，個體為罹患癌症之患者。舉例而言，患者可罹患實體腫瘤，例如結腸直腸癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、乳癌或惡性黑色素瘤。替代地，患者可罹患造血癌症，例如急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、多發性骨髓瘤或非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)。

此等態樣更充分地描述於本文中所提供之實施方式中，且另外態樣、特性及優點將自本文中所提供之實施方式而顯而易見。

定義如本說明書中所用，「一(a/an)」可意謂一或多個。如申請專利範圍中所用，當與字組「包含」結合使用時，字組「一(a/an)」可意謂一個或多於一個。如本文中所用，「另一」可意謂至少第二個或更多個。

當使用「包含」時，此可視情況由「基本上由……組成」或由「由……組成」置換。

人類CD73，亦稱為外-5'-核苷酸酶及為5'-核糖核苷酸磷酸水解酶，EC 3.1.3.5，由NT5E基因編碼，呈現5'-核苷酸酶，尤其為AMP-、NAD-及NMN-核苷酶活性。CD73催化中性pH之嘌呤5'單核苷酸轉化成核苷，較佳受質為AMP。酶由2種相同的70-kD子單元之二聚體組成，該等子單元藉由糖基磷脂醯肌醇鍵結合於質膜之外表面。人類CD73前蛋白(單體)之胺基酸序列(包括胺基酸1-26處之信號序列)在Genbank中寄存編號NP_002517下展示，其全部揭示內容以引用之方式併入本文中，且如下： mcpraarapa tlllalgavl wpaagawelt ilhtndvhsr leqtsedssk cvnasrcmgg varlftkvqq irraepnvll ldagdqyqgt iwftvykgae vahfmnalry damalgnhef dngvegliep llkeakfpil sanikakgpl asqisglylp ykvlpvgdev vgivgytske tpflsnpgtn lvfedeital qpevdklktl nvnkiialgh sgfemdklia qkvrgvdvvv gghsntflyt gnppskevpa gkypfivtsd dgrkvpvvqa yafgkylgyl kiefdergnv isshgnpill nssipedpsi kadinkwrik ldnystqelg ktivyldgss qscrfrecnm gnlicdamin nnlrhtdemf wnhvsmciln gggirspide rnngtitwen laavlpfggt fdlvqlkgst lkkafehsvh rygqstgefl qvggihvvyd lsrkpgdrvv kldvlctkcr vpsydplkmd evykvilpnf langgdgfqm ikdellrhds gdqdinvvst yiskmkviyp avegrikfst gshchgsfsl iflslwavif vlyq (SEQ ID NO: 1)。

在本文之上下文中，「中和CD73酶活性」係指CD73之5'-核苷酸酶(5'-外核苷酸酶)活性受到抑制的過程。此尤其包含抑制CD73介導之腺苷產生，亦即抑制CD73介導之AMP至腺苷之分解代謝。此可例如在非細胞檢定中量測測試化合物之能力以直接或間接抑制AMP至腺苷之轉化。在一個實施例中，參考例如本文所述之分析，抗體製劑引起AMP至腺苷之轉化減少至少50%，AMP至腺苷之轉化減少至少70%，或AMP至腺苷之轉化減少至少80%。

每當在本說明書內，參考抗CD73結合劑(例如抗體)提及「治療癌症」或其類似者時，意謂：(a)治療癌症之方法，該方法包含以允許治療癌症之劑量(治療有效量)，較佳以如本文所規定之劑量(量)，向需要此類治療之個體、哺乳動物、尤其人類投與(針對至少一種治療)抗CD73結合劑(較佳為醫藥學上可接受之載劑材料)的步驟；(b)抗CD73結合劑用於治療癌症之用途，或抗CD73結合劑用於該治療(尤其在人類中)之用；(c)抗CD73結合劑用於製造用於治療癌症之醫藥製劑之用途，使用抗CD73結合劑用於製造用於治療癌症之醫藥製劑之方法，包含摻合抗CD73結合劑與醫藥學上可接受之載劑，或包含適於治療癌症之抗CD73結合劑之有效劑量的醫藥製劑；或(d)根據在本申請案所申請之國家中申請專利所允許的標的物，a)、b)及c)之任何組合。

如本文所用，術語「抗體」係指多株抗體及單株抗體。取決於重鏈中恆定域的類型，將抗體分配至以下五個主要類別中之一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。將此等中之若干者進一步分成子類或同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其類似物。例示性免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚物。各四聚體由兩對相同之多肽鏈構成，各對具有一個「輕」鏈(約25 kDa)及一個「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈之N端限定具有約100至110種或更多種主要負責抗原識別之胺基酸的可變區。術語可變輕鏈(V_L )及可變重鏈(V_H )分別指此等輕及重鏈。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為「α」、「δ」、「ε」、「γ」及「μ」。不同類別之免疫球蛋白的子單元結構及三維組態已為吾人所熟知。IgG為本文所用抗體之例示性類別，因為其為生理情況下最常見之抗體且因為其最易於在實驗室環境中製備。視情況抗體為單株抗體。抗體之特定實例為人類化、嵌合、人類或者人類適合之抗體。「抗體」亦包括本文所述之抗體中之任一者的任何片段或衍生物。

術語「特異性結合於」意謂抗體可較佳在競爭結合分析中結合於結合搭配物(例如CD73)，如使用蛋白質之重組形式、其中之抗原決定基或存在於經分離之目標細胞表面上之天然蛋白質所評估。在下文中進一步描述用於測定特異性結合之競爭性結合分析法及其他方法且其為此項技術中所熟知的。

當抗體稱為「與」特定單株抗體「競爭」時，其意謂該抗體在結合分析中使用重組CD73分子或表面表現之CD73分子來與單株抗體競爭。舉例而言，若測試抗體在結合分析中降低參考抗體與CD73多肽或CD73表現細胞的結合，則該抗體稱為分別與參考抗體「競爭」。

如本文所用，術語「親和力」意謂抗體與抗原決定基結合之強度。藉由解離常數Kd給出抗體之親和力，Kd定義為[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]為抗體-抗原複合物之莫耳濃度，[Ab]為未結合抗體之莫耳濃度，且[Ag]為未結合抗原之莫耳濃度。親和力常數K_a 由1 /Kd定義。用於測定mAb親和力之方法可見於Harlow, 等人，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan 等人，編，Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), 及Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。此項技術中熟知用於測定mAb親和力之一種標準方法為使用表面電漿子共振(SPR)篩檢(諸如藉由用BIAcore™ SPR分析裝置分析)。

在本文中之上下文內，「決定子」代表多肽上之相互作用或結合位點。

術語「抗原決定基」係指抗原決定子，且係抗原上抗體結合至之面積或區域。蛋白抗原決定基可包含直接涉及結合之胺基酸殘基以及由特定抗原結合抗體或肽實際上阻斷之胺基酸殘基，亦即在抗體之「佔據面積」內的胺基酸殘基。其為可與例如抗體或受體組合之複合抗原分子上之最簡單形式或最小結構面積。抗原決定基可為線性的或構形/結構性的。術語「直鏈抗原決定基」定義為由在直鏈胺基酸序列(一級結構)上連續之胺基酸殘基構成的抗原決定基。術語「構形或結構性抗原決定基」定義為由不全部連續之胺基酸殘基構成的抗原決定基，且該等胺基酸殘基因此表示藉由分子摺疊而接近彼此的直鏈胺基酸序列之分離部分(二級、三級及/或四級結構)。構形抗原決定基依賴於3維結構。因此，術語「構形」通常可與「結構性」互換使用。

關於CD73表現細胞，術語「消耗」或「消耗性的」意謂致使殺滅、消除、溶解或誘導此類殺滅、消除或溶解以便不利地影響存在於樣品或個體中之此類CD73表現細胞之數目的過程、方法或化合物。

術語「內化」可與「細胞內內化」互換使用，其係指與將分子自細胞外細胞表面易位至細胞內細胞表面之過程相關的分子、生物化學及細胞事件。造成分子之細胞內內化的過程為熟知的，且可涉及尤其以下之內化：細胞外分子(諸如激素、抗體及有機小分子)；膜相關分子(諸如細胞表面受體)；及結合至細胞外分子(例如結合至跨膜受體之配位體或結合至膜相關分子之抗體)之膜相關分子之複合物。因此，「誘導及/或增加內化」包含其中起始細胞內內化及/或增加細胞內內化之速率及/或程度的事件。

術語「試劑」在本文中用以表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。術語「治療劑」係指具有生物活性之試劑。

出於本文之目的，「人類化」或「人類」抗體係指一或多種人類免疫球蛋白之恆定及可變構架區與動物免疫球蛋白之結合區(例如CDR)融合的抗體。此類抗體經設計以維持結合區所衍生自之非人類抗體的結合特異性，但避免針對非人類抗體之免疫反應。此類抗體可獲自已經「工程改造」以響應於抗原攻擊而產生特異性人類抗體的轉殖基因小鼠或其他動物(參見例如Green等人(1994) Nature Genet 7:13; Lonberg等人(1994) Nature 368:856; Taylor等人(1994) Int Immun 6:579，其整個教示內容以引用之方式併入本文中)。全人類抗體亦可藉由基因或染色體轉染方法以及噬菌體呈現技術來構築，其皆為此項技術中已知的(參見例如McCafferty等人(1990) Nature 348:552-553)。人類抗體亦可由活體外活化B細胞產生(參見例如美國專利第5,567,610號及第5,229,275號，其以全文引用之方式併入本文中)。

當在本文中使用時，術語「高變區」係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區一般包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如輕鏈可變域中之殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)及重鏈可變域中之31-35 (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)；Kabat等人1991)及/或來自「高變環」之殘基(例如輕鏈可變域中之殘基26-32 (L1), 50-52 (L2)及91-96 (L3)及重鏈可變域中之26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)；Chothia及Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)，或用於確定負責抗原結合之必需胺基酸的類似系統。通常，此區域中胺基酸殘基之編號係藉由上述Kabat等人文獻中所描述之方法來執行。本文中諸如「Kabat位置」、「如Kabat中之可變域殘基編號」及「根據Kabat」之片語係指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或另外胺基酸對應於可變域之FR或CDR之縮短或插入。舉例而言，重鏈可變域可包括在CDR H2之殘基52之後的單個胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。對於給定抗體，可藉由該抗體序列同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定該等殘基之Kabat編號。

如本文所用，「構架」或「FR」殘基意謂排除定義為CDR區域之抗體可變域之區域。各抗體可變域構架可進一步再分為由CDR隔開之連續區域(FR1、FR2、FR3及FR4)。

術語「Fc域」、「Fc部分」及「Fc區」係指抗體重鏈之C端片段，例如人類γ (gamma)重鏈之約胺基酸(aa) 230至約aa 450，或在其他類型之抗體重鏈(例如人類抗體之α、δ、ε及μ)或其天然存在異型中之對應序列。除非另外說明，否則在本發明中使用免疫球蛋白之通常接受之Kabat胺基酸編號(參見Kabat等人(1991)免疫相關蛋白質之序列，第5版，United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)。

術語「分離的」、「純化的」或「生物學純的」係指物質實質上或基本上不含天然狀態中所發現通常伴隨之組分。純度及均質性通常使用分析化學技術(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析)來確定。製劑中存在之主要物種之蛋白質實質上經純化。

術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。

在用於指代例如細胞或核酸、蛋白或載體時，術語「重組」指示細胞、核酸、蛋白或載體已藉由引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白經修飾，或細胞係衍生自如此修飾之細胞。因此，舉例而言，重組細胞表現不在天然(非重組)形式之細胞內發現之基因或表現另外異常表現、不完全表現或完全不表現之原生基因。

在本文中之上下文內，術語「結合」多肽或抗原決定基之抗體表示以特異性及/或親和力結合該決定子之抗體。

當用於兩種或更多種多肽之序列之間的關係中時，術語術語「一致性」或「一致」係指多肽之間的序列相關性程度，如藉由兩種或更多種胺基酸殘基之串之間的匹配數目所確定。「一致性」用間隙比對(若存在)量測兩個或更多個序列之較小者之間的一致匹配的百分比，該等間隙比對藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「算法」)處理。相關多肽之一致性可藉由已知方法容易地計算。此類方法包括但不限於描述於以下文獻中之彼等方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. 編，Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. 編，Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., 及Griffin, H. G. 編，Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及Devereux, J. 編，M. Stockton Press, New York, 1991；及Carillo等人，SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)。

測定一致性之較佳方法係經設計以在所測試序列之間產生最大匹配。測定一致性之方法描述於可為公眾獲得之電腦程式中。用於測定兩個序列之間的一致性的較佳電腦程式方法包括GCG程式包，包括GAP (Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul等人，J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程式公開地可購自美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)及其他來源(BLAST手冊, Altschul等人NCB/NLM/NIH 貝塞斯達, 馬里蘭州20894；前述Altschul等人)。亦可使用熟知之史密斯沃特曼演算法(Smith Waterman algorithm)以確定一致性。

抗體之產生 本發明部分地基於經修飾之人類受體構架序列的發現，可向該等序列併入抗體CDR，使得所得抗CD73可變區在中和人類CD73酶活性方面具有高效能。該抗體具有在人體中具有較低的免疫原性或降低的免疫原性的優點，例如當施與人類時，引起不需要的抗CD73抗體定向的免疫應答具有較低的能力或可能性。本發明之此類抗體之實例包括包含H4+或2H4+VH域與L1、L2、L3、L4、2L1、2L2、2L3或2L4 VL域組合之抗體。本發明抗體之實例包括包含抗體H4+L1、H4+L2、H4+L3、H4+L4、2H4+L1、2H4+L2、2H4+L3或2H4+L4中之任一者之VH及VL域對的抗體。

在一個態樣中，結合人類CD73多肽之抗體或抗體片段包含來源於人類之VH及VL構架(例如FR1、FR2、FR3及FR4)。在一個態樣中，抗體或抗體片段包含：含有如SEQ ID NO: 2中所述之胺基酸序列SYNMY的HCDR1 (重鏈CDR1)；含有如SEQ ID NO: 12中所述之胺基酸序列YIDPYNGGSSYNQKFKG的HCDR2 (重鏈CDR2)，視情況進一步其中SEQ ID NO: 12之位置13處之麩醯胺酸殘基(Q)可經白胺酸殘基(L)取代，其中SEQ ID NO: 12之位置14處的離胺酸殘基(K)可視情況經蘇胺酸殘基(T)取代；包含如SEQ ID NO: 13中所述之胺基酸序列GYNNYKAWFAY的HCDR3 (重鏈CDR3)，視情況進一步其中SEQ ID NO: 13之位置3處之天冬醯胺殘基(N)可經甘胺酸殘基(G)取代；包含如SEQ ID NO: 14中所述之胺基酸序列KASQSVTNDVA之LCDR1 (輕鏈CDR1)，視情況進一步其中SEQ ID NO: 14之位置7處之蘇胺酸殘基(T)可經絲胺酸殘基(S)取代；包含如SEQ ID NO: 15中所述之胺基酸序列YASNRYT之LCDR2 (輕鏈CDR2)，視情況其中SEQ ID NO: 15之位置4處之天冬醯胺殘基(N)可經蘇胺酸殘基(T)取代；及包含如SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列QQDYSSLT之LCDR3 (輕鏈CDR3)。

在一個實施例中，HCDR2包含式I之胺基酸序列： Y - I - D - P - Y- N - G - G - S- S - Y - N - Xaa₁ - Xaa₂ - F - K - G (SEQ ID NO: 3)，或其子序列，其中Xaa₁ 為Q (Gln)或L (Leu)且其中Xaa₂ 為K (Lys)或T (Thr)。

在一個實施例中，HCDR3包含式II之胺基酸序列： G - Y - Xaa₁ - N - Y - K - A - W - F - A - Y (SEQ ID NO: 4)，或其子序列，其中Xaa₁ 為N (Asp)或G (Gly)。

在一個實施例中，LCDR1包含式III之胺基酸序列： K - A - S - Q - S - V -Xaa₁ - N - D - V- A (SEQ ID NO: 5)，或其子序列，其中Xaa₁ 為T (Thr)或S (Ser)。

在一個實施例中，LCDR2包含式IV之胺基酸序列： Y - A - S - Xaa₁ - R - Y - T (SEQ ID NO: 6)，或其子序列，其中Xaa₁ 為T (Thr)或N (Asn)。

在一個態樣中，結合人類CD73多肽之經分離之抗體包含：包含如SEQ ID NO: 2中所述之胺基酸序列SYNMY之HCDR1；包含如SEQ ID NO: 8中所述之胺基酸序列YIDPYNGGSSYNLTFKG之HCDR2；包含如SEQ ID NO: 9中所述之胺基酸序列GYGNYKAWFAY之HCDR3；包含如SEQ ID NO: 10中所述之胺基酸序列KASQSVSNDVA之LCDR1；包含如SEQ ID NO: 11中所闡述之胺基酸序列YASTRYT之LCDR2；及包含如SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列QQDYSSLT之LCDR3。

在一個態樣中，結合人類CD73多肽之經分離抗體包含：包含如SEQ ID NO: 2中所述之胺基酸序列SYNMY之HCDR1；包含如SEQ ID NO: 12中所述之胺基酸序列YIDPYNGGSSYNQKFKG之HCDR2；包含如SEQ ID NO: 13中所述之胺基酸序列GYNNYKAWFAY之HCDR3；包含如SEQ ID NO: 14中所述之胺基酸序列KASQSVTNDVA之LCDR1；包含如SEQ ID NO: 15中所述之胺基酸序列YASNRYT之LCDR2；及包含如SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列QQDYSSLT之LCDR3。

在一個實施例中，該抗體包含來自人類子群IGHV1-3 (視情況連同IGHJ4)之重鏈構架，視情況IGHV1-3為IGHV1-3*01。在一個實施例中，人類化抗體包含來自人類子群IGKV1-33 (視情況連同IGKJ2)，視情況來自IGKV1-33*01之輕鏈構架。

抗體可進一步包含人類重鏈及/或輕鏈構架中之一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代，以例如增強抗體之親和力、穩定性或其他特性。

抗CD73抗體之VH及VL胺基酸序列之實例展示於實例6 (展示H4+鏈，及關於2H4+2Lx抗體之表5)及關於L1-L4鏈之表1中。

在一個態樣中，本發明提供一種結合人類CD73多肽之抗原結合域或抗體，其包含： (a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2之CDRH1； (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3、8或12之CDRH2； (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4、9或13之CDR-H3； (d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5、10或14之CDR-L1； (e)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6、11或15之CDR-L2； (f)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 7之CDR-L3；及 (g)人類重鏈及輕鏈構架序列。

在一個實施例中，該抗體包含來自人類子群IGHV1-3以及IGHJ4之重鏈構架，視情況該等抗體包含IGHV1-3*01以及IGHJ4。在一個實施例中，人類化抗體包含來自人類子群IGKV1-33，視情況IGKV1-33*01，以及IGKJ2之輕鏈構架。

視情況，在任何實施例中，抗體可規定為除鼠類親本抗體以外之抗體，例如具有SEQ ID NO: 27及28之相應VH及VL，或具有SEQ ID NO: 40及41之相應VH及VL)。

視情況，人類構架包含一或多個突變，例如引入存在於非人類哺乳動物(例如小鼠)中之特定位置處之殘基的回復突變。

在本文之任何實施例之一個態樣中，Kabat輕鏈位置60之胺基酸為絲胺酸或天冬胺酸。

在本文之任何實施例之一個態樣中，Kabat輕鏈位置2之胺基酸為纈胺酸或異白胺酸。

在本文之任何實施例之一個態樣中，Kabat輕鏈位置87處之胺基酸為酪胺酸或苯丙胺酸。

在一個實施例中，VL包含Kabat位置67處之酪胺酸殘基、位置60處之絲胺酸、位置2處之異白胺酸及位置87處之酪胺酸。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置28處之胺基酸為蘇胺酸(T)。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置66處之胺基酸為精胺酸(R)。

在本文之任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置67處之胺基酸為纈胺酸(V)。

在本文任何實施例之一個態樣中，Kabat重鏈位置71處之胺基酸為精胺酸(R)。

本文中VH及VL域中之位置係使用Kabat編號系統描述(Kabat等人(1991)免疫相關之蛋白質之序列，第5版，United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)。

在一個態樣中，抗CD73抗體包含與SEQ ID NO: 37或42之VH域具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的VH域。

在一個態樣中，抗CD73抗體包含與SEQ ID NO: 33-36或43-46中之任一者之VL域具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的VL域。

在一個態樣中，抗CD73抗體包含與SEQ ID NO: 42之VH域具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的VH域，及與SEQ ID NO: 43-46具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%、99%一致性，或100%一致性)的VL域；

在一個態樣中，抗CD73抗體包含與H4+L1抗體之SEQ ID NO: 38的重鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的重鏈。在一個實施例中，抗體包含與H4+L1抗體之SEQ ID NO: 39之輕鏈具有至少約80%序列一致性(例如，至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的輕鏈。

在一個態樣中，抗CD73抗體包含與2H4+2L1抗體之SEQ ID NO: 47之重鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的重鏈。在一個實施例中，抗體包含與2H4+2L1抗體之SEQ ID NO: 48之輕鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性或100%一致性)的輕鏈。

可製備編碼抗體之DNA且將其置放於適當表現載體中以轉染至適當宿主中。接著，宿主用於重組產生抗體或其變異體，諸如單株抗體之人類化形式、抗體之活性片段、包含抗體之抗原識別部分之嵌合抗體或包含可偵測部分之形式。

編碼本發明之單株抗體的DNA可使用習知程序容易地分離及定序(例如，藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。在一個態樣中，提供一種核酸，其編碼本文任何實施例之抗CD73抗體的重鏈或輕鏈。DNA一經分離，則可置放於表現載體中，接著轉染至宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中(否則不產生免疫球蛋白)，以在重組宿主細胞中達成單株抗體之合成。此類DNA序列可出於許多目的中之任一者而經修飾，例如用於使抗體人類化、產生片段或衍生物，或用於例如在抗原結合位點中修飾抗體序列以使抗體之結合特異性最佳化。在一個實施例中，提供一種編碼抗體之輕鏈及/或重鏈的經分離核酸序列，以及一種包含(例如在其基因組中)此類核酸之重組宿主細胞。編碼抗體之DNA之細菌中的重組表現為此項技術中所熟知的(參見例如Skerra等人，Curr. Opinion in Immunol., 5, 第256頁 (1993)；及Pluckthun, Immunol. 130, 第151頁 (1992))。

可藉由本領域中已知的技術製備抗體之片段及衍生物(如本申請案中所用，其由術語「抗體(antibody)」或「抗體(antibodies)」涵蓋，除非另行說明或與上下文明顯矛盾)。「片段」包含完整抗體之一部分，一般抗原結合位點或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F (ab') 2及Fv片段；雙功能抗體；任何抗體片段，其為具有由以下組成之一級結構的多肽：一個連續胺基酸殘基之不間斷序列(在本文中稱為「單鏈抗體片段」或「單鏈多肽」)；及由抗體片段形成之多特異性(例如雙特異性)抗體。

通常，本文所提供之抗CD73抗體對CD73多肽(例如如本文實例中產生之CD73多肽)的親和力在約10⁴ 至約10¹¹ M-1 (例如約10⁸ 至約10¹⁰ M-1)範圍內。舉例而言，在一特定態樣中，本發明提供抗CD73抗體，其平均解離常數(K_D )相對於CD73小於1×10^-9 M，如藉由例如表面電漿子共振(SPR)篩選(諸如藉由用BIAcore™ SPR分析裝置分析)所測定。在一個更特定的例示性態樣中，本發明提供CD73的K_D 為約1×10^-8 M至約1×10^-10 M，或約1×10^-9 M至約1×10^-11 M的抗CD73抗體。

抗體之特徵可例如在於不超過約(亦即親和力好於) 100、60、10、5或1奈莫耳，較佳次奈莫耳，或視情況不超過約500、200、100或10皮莫耳之平均KD。可例如藉由將重組產生之人類CD73蛋白固定於晶片表面上，接著施加欲測試抗體之溶液來測定KD。在一個實施例中，該方法進一步包含步驟(d)，選擇能夠與對照抗體競爭結合至CD73的來自(b)之抗體。

在一個實施例中，抗CD73抗體可經製備使得其不具有與人類Fcγ受體之實質性特異性結合，人類Fcγ受體例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及/或CD64中之任何一或多者。此類抗體可包含已知缺乏或具有較低的與Fcγ受體之結合的各種重鏈之恆定區。替代地，不包含恆定區(諸如F(ab')2片段) (或不包含恆定區之一部分)之抗體片段可用於避免Fc受體結合。可根據此項技術中已知之方法評估Fc受體結合，此項技術中已知之方法包括例如在BIACORE分析法中測試抗體與Fc受體蛋白之結合。此外，通常可使用其中Fc部分經修飾(例如藉由引入1、2、3、4、5或更多個胺基酸取代)以最小化或消除與Fc受體之結合的任何抗體IgG同型(參見例如WO 03/101485，其揭示內容以引用的方式併入本文中)。用於評估Fc受體結合之諸如基於細胞的分析法之分析法為此項技術中所熟知的，且描述於例如WO 03/101485中。

在一個實施例中，抗體可在Fc區中包含一或多種特定突變，其產生與效應細胞具有最小相互作用之「Fc沉默」抗體。沉默效應功能可藉由在抗體之Fc區中的突變得到且已描述於此項技術中：N297A突變、LALA突變(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. 第20卷(6):685-691)；及D265A (Baudino等人，2008, J. Immunol. 181: 6664-69)亦參見Heusser等人，WO2012/065950，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，抗體在鉸鏈區中包含一個、兩個、三個或更多個胺基酸取代。在一個實施例中，抗體為IgG1或IgG2且在殘基233-236，視情況233-238 (EU編號)處包含一個、兩個或三個取代。在一個實施例中，抗體為IgG4且在殘基327、330及/或331 (EU編號)處包含一個、兩個或三個取代。沉默Fc lgG1抗體之實例為lgG1 Fc胺基酸序列中包含L234A及L235A突變的LALA突變體。Fc沉默突變之另一實例為在殘基D265處或在D265及P329處的突變，例如如在lgG1抗體中作為DAPA (D265A，P329A)突變(US 6,737,056)所用。另一沉默lgG1抗體包含殘基N297處之突變(例如N297A、N297S突變)，其產生去糖基化/非糖基化抗體。其他沉默突變包括：殘基L234及G237處之取代(L234A/G237A)；殘基S228、L235及R409處之取代(S228P/L235E/R409K、T、M、L)；殘基H268、V309、A330及A331處之取代(H268Q/V309L/A330S/A331S)；殘基C220、C226、C229及P238處之取代(C220S/C226S/C229S/P238S)；殘基C226、C229、E233、L234及L235處之取代(C226S/C229S/E233P/ L234V/L235A)；殘基K322、L235及L235處之取代(K322A/L234A/ L235A)；殘基L234、L235及P331處之取代(L234F/L235E/P331S)；殘基234、235及297處之取代；殘基E318、K320及K322處之取代(L235E/E318A/K320A/K322A)；殘基處之取代(V234A、G237A、P238S)；殘基243及264處之取代；殘基297及299處之取代；藉由EU編號系統定義之殘基233、234、235、237及238處之取代包含選自PAAAP、PAAAS及SAAAS之序列(參見WO2011/066501)。

在一個實施例中，抗體在Fc區中可包含一或多種特定突變。舉例而言，此類抗體可包含人類lgG1來源之Fc域，在Kabat殘基234、235、237、330及/或331處包含突變。此類Fc域之一個實例包含在Kabat殘基L234、L235及P331處之取代(例如L234A/L235E/P331S或(L234F/L235E/P331S)。此類Fc域之另一實例包含在Kabat殘基L234、L235、G237及P331處之取代(例如L234A/L235E/G237A/P331S)。此類Fc域之另一實例包含在Kabat殘基L234、L235、G237、A330及P331處之取代(例如L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)。在一個實施例中，抗體包含視情況為人類IgG1同型之Fc域，其包含：L234X₁ 取代、L235X₂ 取代及P331X₃ 取代，其中X₁ 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X₂ 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，且X₃ 為除脯胺酸以外之任何胺基酸殘基；視情況其中X₁ 為丙胺酸或苯丙胺酸或其保守性取代；視情況其中X₂ 為麩胺酸或其保守性取代；視情況其中X₃ 為絲胺酸或其保守性取代。在另一實施例中，抗體包含視情況為人類IgG1同型之Fc域，其包含：L234X₁ 取代、L235X₂ 取代、G237X₄ 取代及P331X₄ 取代，其中X₁ 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X₂ 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X₃ 為除甘胺酸以外之任何胺基酸殘基，且X₄ 為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基；視情況其中X₁ 為丙胺酸或苯丙胺酸或其保守性取代；視情況其中X₂ 為麩胺酸或其保守性取代；視情況X₃ 為丙胺酸或其保守性取代；視情況X₄ 為絲胺酸或其保守性取代。在另一實施例中，抗體包含視情況為人類IgG1同型之Fc域，其包含：L234X₁ 取代、L235X₂ 取代、G237X₄ 取代、G330X₄ 取代及P331X₅ 取代，其中X₁ 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X₂ 為除白胺酸以外之任何胺基酸殘基，X₃ 為除甘胺酸以外之任何胺基酸殘基，X₄ 為除丙胺酸以外之任何胺基酸殘基，且X₅ 為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基；視情況其中X₁ 為丙胺酸或苯丙胺酸或其保守性取代；視情況其中X₂ 為麩胺酸或其保守性取代；視情況X₃ 為丙胺酸或其保守性取代；視情況X₄ 為絲胺酸或其保守性取代；視情況X₅ 為絲胺酸或其保守性取代。

在本文所用之簡寫表示法中，格式為：野生型殘基：多肽中之位置：突變型殘基，其中殘基位置係根據Kabat根據EU編號指示。

在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235及331 (帶下劃線)處之胺基酸殘基的胺基酸序列： A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C P A P EA E G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P AS I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO: 16) 。

在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235及331 (帶下劃線)處之胺基酸殘基的胺基酸序列： A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C P A P EF E G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P AS I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO: 17) 。

在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235、237、330及331 (帶下劃線)處胺基酸殘基的胺基酸序列： A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C P A P E A E GA P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L PS S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO: 18) 。

在一個實施例中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含以下胺基酸序列，或與其至少90%、95%或99%一致但保持在Kabat位置234、235、237及331 (帶下劃線)處之胺基酸殘基的序列： A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C P A P EA E GA P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P AS I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO: 19) 。

Fc沉默抗體不產生ADCC活性或產生較低ADCC活性，意謂Fc沉默抗體呈現低於50%特異性細胞溶解之ADCC活性。較佳地，抗體實質上缺乏ADCC活性，例如Fc沉默抗體呈現低於5%或低於1%之ADCC活性(特異性細胞溶解)。Fc沉默抗體亦可引起在CD73表現細胞表面處之缺乏FcγR介導的CD73之交聯。

在一個實施例中，抗體在重鏈恆定區中在選自由以下組成之群的殘基中之任一個、兩個、三個、四個、五個或更多個處具有取代：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331及409 (在重鏈恆定區中的殘基之編號係根據Kabat根據EU編號)。在一個實施例中，抗體包含殘基234、235及322處之取代。在一個實施例中，抗體在殘基234、235及331處具有取代。在一個實施例中，抗體在殘基234、235、237及331處具有取代。在一個實施例中，抗體在殘基234、235、237、330及331處具有取代。在一個實施例中，Fc域具有人類IgG1亞型。根據Kabat根據EU編號指示胺基酸殘基。

在一個實施例中，抗體包含Fc域，該Fc域包含增加與人類FcRn多肽之結合以便增加抗體之活體內半衰期的胺基酸取代。例示性突變描述於Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. 第20卷(6):685-691中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。人類IgG1同型之抗體中所用之取代之實例為在Kabat殘基M252、S254及T256處之取代；在殘基T250及M428處之取代；在殘基N434處之取代；在殘基H433及N434處之取代；在殘基T307、E380及N434處之取代；在殘基T307、E380及N434處之取代；在殘基M252、S254、T256、H433、N434及436處之取代；在殘基I253處之取代；在殘基P257、N434、D376及N434處之取代。可評估任何所需階段之抗原結合化合物抑制CD73酶活性，尤其阻斷CD73之5'-核苷酸酶活性且減少藉由CD73表現細胞產生腺苷，且繼而恢復淋巴細胞之活性及/或緩解腺苷介導之對淋巴細胞之抑制。

可使用重組可溶性人類CD73 (作為二聚體)及AMP在非細胞檢定中測試抗體抑制CD73酶活性之能力，其中直接(例如藉由量測受質及產物，亦即AMP、腺苷及/或磷酸鹽)或間接偵測AMP至腺苷之轉化(及/或其抑制)。在一個實例中，在測試化合物與重組CD73一起培育之前及之後經由HPLC偵測AMP及/或腺苷。

抗體之CD73抑制活性亦可以多種其他方式中之任一者評估。舉例而言，在間接分析中，使用基於螢光素酶之試劑(例如購自Promega之CellTiter-Glo®系統)偵測AMP之消失。分析中之螢光素酶反應藉由AMP抑制。向反應中添加CD73酶來降解AMP且減輕抑制，產生可偵測信號。

使用可溶性CD73之分析將包括在內以在以下條件下進行測試：其中抗體以實質性莫耳濃度過量(例如10倍、20倍、50倍、100倍等)提供CD73多肽二聚體。當以與酶相比莫耳濃度過量提供時，抗CD73抗體不再能夠形成抗體之多聚複合物及CD73二聚體；可隨後選擇保持對CD73酶活性之抑制的抗體。

替代地或另外，亦可在細胞分析(使用表現CD73之細胞)中測試抗體抑制CD73之5'-外核苷酸酶酶活性之能力。有利地，抗體可首先在非細胞檢定中測試或篩選以鑑別阻斷酶活性之抗體，從而藉由引起CD73內化來降低選擇抑制CD73之抗體的可能性，且隨後在細胞分析中測試為純化抗體。細胞分析可如本文實例中所示或如PCT公開案第WO2016/055609號中所揭示進行，其揭示內容以引用之方式併入本文中。舉例而言，在抗CD73抗體存在下在平底96孔板中塗鋪CD73表現細胞(例如MDA-MB-231細胞株)且培育，如WO2016/055609中所詳述。向細胞添加AMP且在4℃下培育(以避免CD73下調)。隨後將板離心且將上清液轉移至平底96孔培養板中。接著定量藉由將AMP水解成腺苷所產生之游離磷酸鹽。在抗體存在下AMP水解成腺苷之降低表明抗體抑制細胞CD73。

在一個實施例中，抗體製劑使CD73多肽之酶活性降低至少50%，較佳CD73多肽(例如可溶性均二聚CD73多肽；CD73由細胞表現)酶活性降低至少60%、70%或80%。

抗體活性亦可在針對其調節淋巴細胞活性，例如緩解腺苷介導之對淋巴細胞活性之抑制或引起淋巴細胞活性之活化的能力的間接分析中量測。此可例如使用細胞介素釋放分析法處理。在另一實例中，可在間接分析法中評價抗體調節淋巴細胞增殖之能力。

在一個實施例中，抗體中和溶液中之均二聚人類CD73多肽之5'-外核苷酸酶活性。在一個實施例中，抗體結合且抑制可溶性人類CD73多肽之酶活性，尤其是中和CD73介導之AMP至腺苷之分解代謝的抗體。在一個實施例中，抗體以二價方式結合CD73。在一個實施例中，抗體為非消耗性抗體，例如實質上缺乏與人類Fcγ受體之結合的Fc沉默抗體。在一個實施例中，抗體在溶液中中和CD73而不依賴於CD73多肽：抗CD73抗體寡聚物之誘導。

在一個實施例中，抗體特異性結合細胞表面處之人類CD73且能夠中和可溶性人類CD73多肽之5'-外核苷酸酶活性。在一個實施例中，抗體不誘導可溶性CD73之寡聚。

在一個實施例中，抗體特異性結合細胞表面處之人類CD73且能夠中和細胞CD73 (由細胞表現之CD73)之5'-外核苷酸酶活性。在一個實施例中，抗體特異性結合且中和細胞表面處之人類CD73之5'-外核苷酸酶活性且在結合至CD73時不內化至CD73表現細胞中。抗體不會引起CD73之多聚化及後續內化。在一個實施例中，抗體結合且能夠抑制重組人類CD73多肽在溶液中的酶活性，其中該抗體不內化至CD73表現細胞中。在一個實施例中，非內化抗體以二價方式結合CD73。在一個實施例中，抗體為非消耗性抗體，例如Fc沉默抗體。此外，抗體能夠中和二聚人類CD73多肽在溶液中之5'-外核苷酸酶活性，而不依賴於CD73多肽：抗CD73抗體寡聚物之誘導。

在一個實施例中，抗體以二價方式特異性結合至人類CD73多肽且抑制細胞人類CD73 (及視情況存在之其他重組可溶性人類CD73)酶活性，其中該抗體不誘導或增加CD73表現細胞中之CD73的細胞內內化。較佳地，該抗體實質上缺乏Fcγ受體結合(例如經由其Fc域)。

在一個態樣中，抗體特異性結合與AMP一起預培育之細胞表面處的人類CD73，且能夠中和其5'-外核苷酸酶活性。視情況，中和5'-外核苷酸酶活性藉由在CD73表現細胞(例如MDA-MB-231細胞)中定量AMP水解成腺苷評估5'外核苷酸酶活性之中和來確定。

在一個態樣中，由細胞表示之CD73之5'-外核苷酸酶活性之中和藉由評估抗體當在AMP (例如外源添加之AMP)存在下誘導T細胞活體外增殖(例如經由TCR共刺激、CD3刺激及CD28信號傳導，例如藉由使T細胞與用CD3促進劑及CD28促效劑功能化之珠粒接觸)時提高該等T細胞增殖之能力來確定。在一個態樣中，使用實例中標題「方法」章節中所描述之T細胞增殖分析來評估5'-外核苷酸酶活性分析之中和。

與抗CD73抗體結合野生型CD73多肽(例如SEQ ID NO: 1)之能力相比，抗體可藉由其結合至用CD73突變體轉染之細胞的能力表徵。抗CD73抗體與突變型CD73多肽之間的結合減少意謂結合親和力減小(例如如藉由諸如表現特定突變體之細胞之FACS測試的已知方法所量測，或藉由與突變型多肽之結合的Biacore測試所量測)及/或抗CD73抗體之總結合力減小(例如，如藉由抗CD73抗體濃度相對於多肽濃度之曲線中B_max 降低所證明)。結合之顯著減少指示突變殘基直接參與與抗CD73抗體之結合，或當抗CD73抗體結合至CD73時緊密接近結合蛋白。

在一些實施例中，結合顯著減少意謂相對於抗體與野生型CD73之間的結合，抗CD73抗體與突變型CD73多肽之間的結合親和力及/或能力降低大於40%、大於50%、大於55%、大於60%、大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%或大於95%。在某些實施例中，結合降低至低於可偵測極限。在一些實施例中，當抗CD73抗體與突變型CD73多肽之結合小於50% (例如小於45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)的抗CD73抗體與野生型CD73多肽之間所觀測到的結合時，證明結合顯著減少。

在一個態樣中，抗CD73抗體與在殘基K136 (參考SEQ ID NO: 1)處具有突變的CD73多肽之結合減少；視情況，突變型CD73多肽具有突變：K136A。

在一個態樣中，抗CD73抗體與在選自由以下組成之群之殘基處具有突變的CD73多肽的結合減少：K97、E125、Q153及K330 (參考SEQ ID NO: 1)；視情況，突變CD73多肽具有突變：K97A、E125A、Q153A及/或K330A (例如K97A、E125A及K330A；K97A、E125A及/或Q153A)。

在一個態樣中，抗CD73抗體與在選自由以下組成之群之殘基處具有突變的CD73多肽的結合減少：A99、E129、K133、E134及A135 (參考SEQ ID NO: 1)；視情況，突變型CD73多肽具有突變：A99S、E129A、K133A、E134N及/或A135S。

視情況，在一個態樣中，抗CD73抗體與在選自由以下組成之群的殘基處具有突變的CD73多肽的結合減少：Q70、R73、A74、A107及R109 (參考SEQ ID NO: 1)；視情況，突變型CD73多肽具有突變：A99S、Q70S、R73A、A74E、A107I及/或R109G。

在一個態樣中，該等抗CD73抗體結合包含殘基K136 (參考SEQ ID NO: 1)之CD73上的抗原決定基。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含選自由K97、E125、Q153及K330 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群的殘基中之一個、兩個、三個或四個的CD73上之抗原決定基。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含選自由A99、E129、K133、E134及A135 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群的殘基中之一個、兩個、三個、四個或五個的CD73上之抗原決定基。

在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含選自由以下組成之群的殘基中之一個、兩個、三個、四個、五個或更多個的CD73上之抗原決定基：K97、A99、E125、E129、K133、E134、A135及K136 (參考SEQ ID NO: 1)。在一個態樣中，抗CD73抗體結合包含選自由以下組成之群的殘基中之一個、兩個、三個、四個、五個或更多個的CD73上之抗原決定基：K97、A99、E125、E129、K133、E134、A135、K136、Q153及K330 (參考SEQ ID NO: 1)。

視情況，在一個態樣中，抗CD73抗體不結合包含選自由以下組成之群的殘基中之一個、兩個、三個、四個或五個的CD73上之抗原決定基：Q70、R73、A74、A107及R109 (參考SEQ ID NO: 1)。

抗CD73抗體可以併入醫藥調配物中，該醫藥調配物包含1 mg/ml至500 mg/ml之濃度，其中該調配物具有2.0至10.0之pH。調配物可進一步包含緩衝系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑。在一個實施例中，醫藥調配物為水性調配物，亦即包含水之調配物。此類調配物通常為溶液或懸浮液。在另一實施例中，醫藥調配物為水性溶液。術語「水性調配物」定義為包含至少50% w/w水之調配物。同樣地，術語「水性溶液」定義為包含至少50% w/w水之溶液，且術語「水性懸浮液」定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。

在另一實施例中，醫藥調配物為凍乾調配物，醫師或患者在使用之前向其添加溶劑及/或稀釋劑。

在另一實施例中，醫藥調配物為無需任何預先溶解的即用型乾燥調配物(例如凍乾或噴乾)。

在另一態樣中，醫藥調配物包含該抗體之水溶液及緩衝劑，其中抗體以1 mg/ml或更高之濃度存在，且其中該調配物之pH值為約2.0至約10.0。

在另一實施例中，調配物之pH值在選自由以下組成之列表的範圍內：約2.0至約10.0、約3.0至約9.0、約4.0至約8.5、約5.0至約8.0及約5.5至約7.5。

在另一實施例中，緩衝劑選自由以下組成之群：乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及參(羥基甲基)-胺基甲烷、二甘胺酸、麥黃酮、蘋果酸、丁二酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬胺酸或其混合物。此等特定緩衝劑中之各者構成替代實施例。

在另一實施例中，調配物進一步包含醫藥學上可接受之防腐劑。在另一實施例中，調配物進一步包含等張劑。在另一實施例中，調配物亦包含螯合劑。在另一實施例中，調配物進一步包含安定劑。在另一實施例中，調配物進一步包含界面活性劑。為方便起見，參考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。

其他成分有可能可存在於肽醫藥調配物中。此類另外成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、增積劑、張力改質劑、螯合劑、金屬離子、油性媒劑、蛋白質(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質)及兩性離子(例如胺基酸，諸如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸)。當然，此類另外成分不應不利地影響醫藥調配物之整體穩定性。

可在若干位點向需要此類治療之患者投與含有抗體的醫藥組合物，例如在局部位點，例如皮膚及黏膜位點；在繞過吸收之位點，例如在動脈中、靜脈中、心臟中投與；及在涉及吸收之位點，例如在皮膚中、皮膚下、肌肉中或腹部中投與。醫藥組合物之投藥可經由若干投藥途徑，例如皮下、肌肉內、腹膜內、靜脈內、經舌、舌下、經頰、口中、經口、胃及腸中、經鼻、經肺(例如經由細支氣管及肺泡或其組合)、表皮、真皮、經皮、經陰道、經直腸、經眼(例如經由結膜)、經輸尿管及非經腸向需要此類治療之患者投與。

亦可藉由檢查用其他已發展之治療性單株抗體的經歷來測定適合抗體調配物。若干單株抗體已展示在臨床情況下有效，諸如利妥仙(Rituxan) (利妥昔單抗(Rituximab))、賀癌平(Herceptin) (曲妥珠單抗(Trastuzumab)) 夏羅爾(Xolair) (奧馬珠單抗(Omalizumab))、百克沙(Bexxar) (托西莫單抗(Tositumomab))、坎帕斯(Campath) (阿妥珠單抗(Alemtuzumab))、澤瓦林(Zevalin)、奧科立姆(Oncolym)及可與抗體一起使用之類似調配物。舉例而言，單株抗體可以10 mg/mL之濃度在100 mg (10 mL)或500 mg (50 mL)單次用小瓶中供應，其經調配以9.0 mg/mL氯化鈉、7.35 mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7 mg/mL 聚山梨醇酯80及注射用無菌水用於IV投藥。將pH調節至6.5。在另一實施例中，抗體係以包含約20 mM檸檬酸鈉、約150 mM NaCl (pH為約6.0)之調配物形式供應。

惡性疾病之診斷及治療 亦提供使用如本文所述之抗CD73抗體或抗體片段治療個體、尤其人類患者的方法。在一個實施例中，本發明提供在用於投與人類患者的醫藥組合物之製備中，如本文所描述的抗體或抗體片段之用途。通常，患者罹患癌症或感染性疾病(例如病毒或細菌感染)或處於癌症或感染性疾病之風險下。

舉例而言，在一個態樣中，提供一種恢復或增強有需要之患者的免疫細胞(例如淋巴細胞)之活性的方法，其包含向該患者投與本發明之中和抗CD73抗體的步驟。在一個實施例中，該方法係針對增加免疫細胞(例如，T細胞)在患有諸如癌症或傳染病之疾病的患者中之活性，其中增加免疫細胞活性及/或至疾病位點(例如，腫瘤環境或感染位點)之浸潤為有益的，或由免疫抑止、免疫抑止細胞或例如由CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞產生之腺苷引起或表徵。

該等方法將尤其適用於患有腫瘤之患者，其中疑似腫瘤微環境(及其中CD73介導之腺苷產生))可能有促成缺乏免疫系統之識別(免疫逃脫)。腫瘤環境可例如藉由CD73表現之免疫細胞(例如CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞及/或CD73表現之腫瘤細胞)表徵。

該等方法及抗CD73抗體可用於治療及/或預防多種癌症及其他增生性疾病。因為此等方法藉由降低抑制淋巴細胞之抗腫瘤活性之腺苷且可能另外藉由增加可提高淋巴細胞之抗腫瘤活性之ATP來起作用，所以其適用於多種癌症，尤其包括實體腫瘤，其中腫瘤微環境中之腺苷可在抑止抗腫瘤免疫反應中起較強作用。在一個實施例中，用抗CD73抗體治療之人類患者患有肝癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭部或頸部之癌症、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)、黑色素瘤、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌症、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陽莖癌、兒童固態腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸腫瘤、腦幹神經膠瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘導之癌症(包括藉由石棉誘導之癌症)；血液科惡性疾病，包括例如多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤/原發性縱隔B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴母細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病、蕈樣黴菌病、多形性大細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤及前驅體T淋巴母細胞淋巴瘤；以及該等癌症之任何組合。本發明亦適用於治療轉移性癌症。可在治療之前、治療期間或治療之後針對上述臨床特質中之一或多者測試或選擇患者。

因為該等方法及抗CD73抗體藉由降低抑制免疫細胞(例如淋巴細胞)之活性及/或浸潤的腺苷且可能另外藉由增加可提高淋巴細胞活性之ATP來起作用，所以其適用於廣泛範圍之感染性疾病，包括較佳由病毒、細菌、原蟲、黴菌或真菌感染所引起之任何感染。

在一個實施例中，抗CD73抗體以以下量投與：可有效達成及/或維持個體(例如持續1、2、3、4週及/或直至隨後投與抗原結合化合物)之至少EC₅₀ ，視情況EC₇₀ ，視情況實質上EC₁₀₀ 的血液濃度，以用於中和CD73酶活性。在一個實施例中，抗CD73抗體之活性量為以下量：可有效達成針對中和個體之血管外組織中CD73酶活性的EC₅₀ ，視情況EC₇₀ ，視情況實質上EC₁₀₀ 。在一個實施例中，抗CD73抗體之活性量為以下量：可有效達成(或維持)個體之EC₅₀ ，視情況EC₇₀ ，視情況實質上EC₁₀₀ ，以用於抑制CD73酶活性之中和。

在一個實施例中，抗CD73抗體係以以下量投與：可有效達成及/或維持(例如1、2、3、4週及/或直至隨後投與抗CD73抗體)個體之至少EC₅₀ ，視情況EC₇₀ ，視情況實質上EC₁₀₀ 的血液濃度，以用於抑制CD73介導之AMP至腺苷之分解代謝(例如藉由在MDA-MB-231細胞中定量AMP水解成腺苷評估5'外核苷酸酶活性之中和)。在一個實施例中，抗CD73抗體之量為以下量：可有效達成(或維持)用於在個體之血管外組織中抑制CD73介導之AMP至腺苷之分解代解的EC₅₀ ，視情況EC₇₀ ，視情況實質上EC₁₀₀ 。

在一個實施例中，提供一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向患有疾病之個體投與以下量之抗CD73抗體：在循環中(視情況在相關血管外組織(例如腫瘤或腫瘤環境)中)達成或維持指定時段內的濃度，該濃度高於循環中50%、70%或完全(例如90%)受體飽和CD73表現細胞所需的濃度(例如如在PBMC中所評估)。視情況，所達成之濃度比指定受體飽和所需之濃度高至少20%、50%或100%。

I在一個實施例中，提供一種治療或預防個體之癌症的方法，該方法包含向個體投與以下量之抗CD73抗體：在循環中(視情況在相關血管外組織(例如腫瘤或腫瘤環境)中)達成或維持指定時段內的濃度，該濃度高於針對結合至CD73表現細胞的EC₅₀ ，視情況EC₇₀ 或視情況EC₁₀₀ (例如如藉由滴定CD73表現細胞，例如MDA-MB-231細胞上之抗CD73抗體所評估)。視情況，所達成之濃度比針對結合至CD73表現細胞的EC₅₀ ，視情況EC₇₀ 或視情況EC₁₀₀ 高至少20%、50%或100%。

在任何實施例中，抗體可例如具有針對結合至人類PBMC中之CD73表現細胞的EC₅₀ ，視情況EC₇₀ 或視情況EC₁₀₀ ，其為0.5-100 ng/ml，視情況1-100 ng/ml，視情況30-100 ng/ml，例如約30-90 ng/ml之間(例如如藉由滴定CD73表現細胞，例如MDA-MB-231細胞上之抗CD73抗體所評估)。

針對用抗CD73抗體中和CD73酶活性的EC₅₀ 可為例如約0.01 µg/ml與1 µg/ml之間，視情況0.1 µg/ml與10 µg/ml之間，視情況0.1 µg/ml與1 µg/ml之間。舉例而言，EC₅₀ 可為約0.1 µg/ml、約0.2 µg/ml或約0.3 µg/ml。因此，舉例而言，此抗CD73抗體的量如此投與以獲得及/或維持至少0.1 µg/ml，視情況至少0.2 µg/ml，視情況至少1 µg/ml或視情況至少2 µg/ml之血液濃度。

當靶向血管結構外部之組織(腫瘤環境，例如治療實體腫瘤)時，與循環中提供相應濃度之劑量相比，通常咸信需要大致10倍的較高劑量。預期如此投與以在循環(血液)中達成(及/或維持)約1 µg/ml、2 µg/ml、10 µg/ml或20 µg/ml之濃度的抗CD73抗體之量分別達到(及/或維持)約0.1 µg/ml、0.2 µg/ml、1 µg/ml、2 µg/ml之血管外組織(例如腫瘤組織)濃度。

在一個實施例中，抗CD73抗體例如以如此量投與以達成及/或維持組織(例如腫瘤環境)濃度至少為0.1 µg/ml，視情況至少0.2 µg/ml，視情況至少1 µg/ml或視情況至少2 µg/ml。抗體可例如以達成及/或維持至少約1 µg/ml、2 µg/ml、10 µg/ml或20 µg/ml之血液濃度，例如在1-100 µg/ml、10-100 µg/ml、1-50 µg/ml、1-20 µg/ml或1-10 µg/ml之間的量投與。可調節投與量以便在投與後之指定時段(例如1、2、3、4週等)之持續時間內提供所需濃度之維持。

在一些實施例中，投與抗CD73抗體之量以獲得血液(血清)或血管外組織(例如腫瘤環境)中之濃度至少對應於中和CD73酶活性之EC₇₀ 或EC₁₀₀ 。抗體可例如以達成及/或維持至少約1 µg/ml、2 µg/ml、10 µg/ml或20 µg/ml之血液濃度或血管外組織(例如腫瘤環境)的量投與。

EC₅₀ 、EC₇₀ 或EC₁₀₀ 可例如在CD73酶活性中和之細胞分析中評估(例如在MDA-MB-231細胞中5'外核苷酸酶活性之中和係藉由定量AMP之水解成腺苷)。關於CD73酶活性之中和的「EC₅₀ 」係指抗CD73抗體對於該酶活性之中和產生50%最大反應或作用之有效濃度。關於CD73酶活性之中和的「EC₇₀ 」係指抗CD73抗體產生70%最大反應或作用之有效濃度。關於CD73酶活性之中和的「EC₁₀₀ 」係指抗CD73抗體對於該酶活性之中和產生實質上最大反應或作用之有效濃度。

在一些實施例中，尤其對於治療實體腫瘤，所達成之濃度經設計以導致組織中(在血管結構外部，例如在腫瘤或腫瘤環境中)之濃度對應於用於中和該酶活性的至少EC₅₀ ，視情況在約或至少約EC₁₀₀ 。

在一個實施例中，抗CD73抗體之量在每公斤體重1與20 mg之間。在一個實施例中，每週、每兩週、每月或每兩個月向個體投與該量。

在一個實施例中，提供一種治療人類個體的方法，其包含向該個體投與有效量之本發明抗CD73抗體至少一個投與週期(視情況至少2、3、4或更長投與週期)，其中該週期為八週或更少，其中對於至少一個週期中之每一者，投與一個、兩個、三個或四個劑量之抗CD73抗體，一個劑量為每公斤體重1-20 mg。在一個實施例中，抗CD73抗體藉由靜脈內輸注投與。

用於治療人類之適合治療方案包括例如向患者投與如本文所揭示之抗CD73抗體之量，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中投與至少一個劑量之抗CD73抗體。視情況投與至少2、3、4、5、6、7或8個劑量之抗CD73抗體。在一個實施例中，投藥週期在2週與8週之間。

可在具有或不具有預先偵測步驟之情況下用抗CD73抗體治療患有癌症之患者，該預先偵測步驟評估CD73在腫瘤微環境中之細胞(例如在腫瘤細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞上)上之表現。視情況，治療方法可包含偵測來自個體的腫瘤之生物樣品(例如癌症組織，或靠近或在癌症邊緣之組織、癌症鄰近組織、鄰近非腫瘤性組織或正常鄰近組織中)中的CD73核酸或多肽的步驟。對生物樣品包含表現CD73之細胞(例如與參考物，例如健康組織相比，以用抗CD73抗體的較高含量、較高染色強度表現CD73)之確定指示該患者患有可很大程度上得益於用抗CD73抗體治療的癌症。在一個實施例中，該方法包含測定CD73核酸或多肽在生物樣品中之表現量及將該含量與對應於健康個體之參考含量相比較。對生物樣品包含以一定含量(與參考含量(例如健康組織)相比為增加的)表現CD73核酸或多肽之細胞的確定指示該患者患有可宜用本發明之抗CD73抗體治療的癌症。視情況，偵測生物樣品中之CD73多肽包含偵測表現於惡性細胞或CD4 T細胞、CD8 T細胞或B細胞表面上的CD73多肽。

確定個體是否患有以表現CD73多肽之細胞為特徵之癌症可例如包含自包含來自癌症環境之細胞(例如腫瘤或腫瘤鄰近組織)的個體獲得之生物樣品(例如藉由執行活檢體)，使該等細胞與結合CD73多肽之抗體接觸，及偵測該等細胞是否在其表面上表現CD73。視情況，確定個體是否具有表現CD73之細胞包含進行免疫組織化學分析。

抗體組合物可有利地與一或多種其他治療劑組合使用，該一或多種其他治療劑包括通常用於投與抗體之特定治療目的之試劑。另外治療劑通常將以通常試劑在用於所治療的特定疾病或病狀的單藥療法中所用之量及治療方案投與。此類治療劑包括但不限於抗癌劑及化學治療劑。

在一個實施例中，抗CD73抗體增強中和人類PD-1之抑制活性(例如抑制PD-1與PD-L1之間的相互作用)之試劑的功效。因此，在一個實施例中，第二或另外第二治療劑為中和人類PD-1之抑制活性的抗體或其他試劑。

計劃性死亡1 (PD-1) (亦稱為「計劃性細胞死亡1」)為受體之CD28家族之抑制成員。完整人類PD-1序列可見於GenBank寄存編號U64863。抑制或中和PD-1之抑制活性可涉及使用防止PD-L1誘導之PD-1信號傳導之多肽試劑(例如抗體、與Fc域稠合之多肽、免疫黏附素等)。目前存在至少六種阻斷PD-1/PD-L1路徑之市售或在臨床評價中之試劑。一種試劑為BMS-936558 (納武單抗(Nivolumab)/ONO-4538，Bristol-Myers Squibb；先前為MDX-1106)。納武單抗(商標Opdivo®)為FDA審批通過之完全人類IgG4 抗PD-L1 mAb，其抑制PD-L1配位體與PD-1及CD80之結合，且在WO 2006/121168中描述為抗體5C4，其揭示內容以引用之方式併入本文中。對於黑色素瘤患者，在3 mg/kg之劑量下觀測到最顯著OR，而對於其他癌症類型其係在10 mg/kg下。納武單抗一般每3週以10 mg/kg給藥直至癌症發展。術語「降低人類PD-1之抑制活性」、「中和PD-1」或「中和人類PD-1之抑制活性」係指其中抑制PD-1之產生於PD-1與其結合配偶體(諸如PD-L1或PD-L2)中之一或多者的相互作用之信號轉導能力的過程。中和PD-1之抑制活性的試劑降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與其結合搭配物中之一或多者(諸如PD-L1、PD-L2)相互作用產生的信號轉導。此類藥劑可藉此減少藉由或經由T淋巴細胞上表現之細胞表面蛋白質來介導的負共刺激信號，以便增強T細胞效應功能，諸如增殖、細胞介素產生及/或細胞毒性。

MK3475 (來自Merck之人類IgG4 抗PD1 mAb)，亦稱為拉立珠單抗(lambrolizumab)或派立珠單抗(pembrolizumab) (商標Keytruda®)，已由FDA批准用於治療黑色素瘤且在其他癌症中進行測試。每2或3週以2 mg/kg或10 mg/kg測試派立珠單抗直至疾病發展。MK-3475，亦稱為Merck 3745或SCH-900475，亦描述於WO2009/114335中。

MPDL3280A/RG7446 (阿特珠單抗(atezolizumab)，商標Tecentriq^TM ，來自Roche/Genentech之抗PD-L1)為含有經改造之Fc域的人類抗PD-L1 mAb，該經改造之Fc域經設計以藉由最小化FcγR結合及隨之發生的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來最優化功效及安全性。每3週投與≤1、10、15及25 mg/kg MPDL3280A之劑量，持續至多1年。在3期試驗中，藉由靜脈內輸注每三週在NSCLC中以1200 mg投與MPDL3280A。

AMP-224 (Amplimmune及GSK)為包含與Fc域融合之PD-L2細胞外域的免疫黏附素。中和PD-1之試劑之其他實例可包括結合PD-L2 (抗PD-L2抗體)且阻斷PD-1與PD-L2之間的相互作用之抗體。

帕利珠單抗(Pidlizumab) (CT-011；CureTech) (來自CureTech/Teva之人類化IgG1抗PD1 mAb)、帕利珠單抗(CT-011；CureTech) (參見例如WO2009/101611)為另一實例；在三十名具有利妥昔單抗敏感之復發FL的患者中測試試劑，該等患者每4週用3 mg/kg靜脈內CT-011治療，持續4次輸注，組合起始於CT-011之首次輸注之後2週，每週以375 mg/m2給藥的利妥昔單抗，持續4週。

其他已知PD-1抗體及其他PD-1抑制劑包括WO 2012/145493中所述之AMP-224 (授權給GSK的B7-DC/IgG1融合蛋白)、AMP-514；WO2011/066389及US2013/034559中所述之MEDI-4736 (德瓦魯單抗(durvalumab)，商標Imfinzi™，由AstraZeneca/Medimmune研發之抗PD-L1)；WO2010/077634中所述之抗體YW243.55.S70 (抗PD-L1)；MDX-1105 (亦稱為BMS-936559)為WO2007/005874中所描述之由Bristol-Myers Squibb研發之抗PD-L1抗體；及WO2006/121168、WO2009/014708、WO2009/114335及WO2013/019906中所描述之抗體及抑制劑，其揭示內容以引用的方式併入本文中。抗PD1抗體之其他實例揭示於WO2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.)中，例如分別具有SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及/或SEQ ID NO: 8之輕鏈可變域CDR1、2及3的抗體，及分別具有SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之抗體重鏈可變域CDR1、2及3的抗體，其中SEQ ID NO引用為根據WO2015/085847之編號，其揭示內容以引用的方式併入本文中。亦可使用與此等抗體中之任一者競爭結合至PD-1或PD-L1的抗體。在一些實施例中，PD-1中和劑為抑制PD-L1與PD-1之結合的抗PD-L1抗體。在一些實施例中，PD-1中和劑為抑制PD-1與PD-L1之結合的抗PD1抗體。例示性抗PD-1抗體為派立珠單抗(由Merck & Co. 以Keytruda™出售，亦參見WO 2009/114335，其揭示內容以引用之方式併入本文中)。例示性抗PD-L1為抗體MEDI-4736 (德瓦魯單抗，商標名Imfinzi™，由AstraZeneca/Medimmune研發之抗PD-L1)。

在治療方法中，CD73結合化合物及第二治療劑可分開、一起或依序投與或在混合物中投與。在一些實施例中，在投與第二治療劑之前投與抗原結合化合物。舉例而言，CD73結合化合物可在投與第二治療劑之前大致0至30天投與。在一些實施例中，在投與第二治療劑之前約30分鐘至約2週、約30分鐘至約1週、約1小時至約2小時、約2小時至約4小時、約4小時至約6小時、約6小時至約8小時、約8小時至1天或約1至5天投與CD73結合化合物。在一些實施例中，CD73結合化合物與治療劑之投與同時進行投與。在一些實施例中，在投與第二治療劑之後投與CD73結合化合物。舉例而言，CD73結合化合物可在投與第二治療劑之後大致0至30天投與。在一些實施例中，在投與第二治療劑之後約30分鐘至約2週、約30分鐘至約1週、約1小時至約2小時、約2小時至約4小時、約4小時至約6小時、約6小時至約8小時、約8小時至1天或約1至5天投與CD73結合化合物。

實例方法重組 huCD73 之選殖、產生及純化 分子生物學 使用以下引子TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTGTCC CCGAGCCGCGCG (SEQ ID NO: 20) (正向)及CCGCCCCGACTCTA GAtcaGTGATGGTGATGATGGTGcttgatccgaccttcaactg SEQ ID NO: 21) (反向)自MIAPACA-2 cDNA選殖huCD73蛋白質。隨後使用InFusion選殖系統將經純化之PCR產物選殖至表現載體中。在蛋白質之C端部分中添加6xHis標籤用於純化步驟。

選殖 huCD73 之胺基酸序列： MCPRAARAPATLLLALGAVLWPAAGAWELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKHHHHHH(SEQ ID NO: 22) 。

huCD73 蛋白之表現及純化 在驗證選殖之序列後，細胞經核轉染且隨後次選殖產生池以獲得產生huCD73蛋白之細胞純系。收集來自生長於輥中之huCD73純系之上清液且使用Ni-NTA管柱純化且使用250 mM咪唑溶離。隨後將經純化之蛋白裝載至S200尺寸排阻層析管柱上。將對應於二聚體之純化蛋白質調配於Tris 20 mM pH 7.5，NaCl 120 mM及CaCl2 4 mM緩衝液中以用於酶活性分析，而調配物緩衝液補充有20%甘油。

評估重組 CD73 蛋白上之 Ab KD 的 SPR 分析在Biacore™ T200設備上在25℃下進行SPR量測。將蛋白質A (GE Healthcare)固定於感測器晶片CM5 (GE Healthcare)上。用EDC/NHS (N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽及N-羥基丁二醯亞胺(Biacore™, GE Healthcare)活化晶片表面。在偶合緩衝液(10 mM乙酸鹽，pH 5.6)中將蛋白質A稀釋至10 µg/mL且注射直至達到適當的固定含量(亦即2000 RU)。剩餘活化基團之失活係使用100 mM乙醇胺pH 8 (Biacore™, GE Healthcare)進行。根據製造商建議之標準捕獲動力學方案(standard Capture-Kinetic protocol) (Biacore™, GE Healthcare kinetic wizard)進行親和力研究。將在1.23至300 nM範圍內之人類重組可溶性CD73蛋白之連續稀釋液依序在所捕獲之抗CD73抗體上方注射，且使其解離10分鐘，隨後更換。使用1:1動力學結合模型擬合整個感測器圖譜集。計算二價親和力及動力學結合常數及解離速率常數。

藉由抗體評估抗 CD73 識別之流式細胞儀分析 將再懸浮於FCSB中之10⁵ MDA-MB-231細胞分佈於圓底96W微孔板中(每孔50 µL)。向板中添加一定劑量範圍之抗CD73 mAb且在+5±3℃下培育細胞1小時。細胞在FCSB中藉由在400 g下在4℃下旋轉板來洗滌3次。將在FCSB中稀釋之PE共軛山羊F(ab')2抗人類IgG (H+L)二級Ab添加至細胞中且在+5±3℃下再培育板30分鐘。細胞如上所述洗滌三次且在流式細胞儀上分析。

對螢光強度相對於mAb濃度之中值繪製曲線且使用 GraphPad Prism™程式計算EC₅₀ 。

用重組人類或獼猴 CD73 進行的活體外酶分析 簡言之，在抗CD73或同型對照mAb存在下，在白色96W平底微孔板中培育重組人類或獼猴CD73。板在+37±1℃下培育1小時。向各孔中添加ATP (12.5 µM)及AMP (125 µM)且將板在+37±1℃下再培育30分鐘。將螢光素酶/含螢光素之CellTiter-Glo™ (Promega)添加至孔中，在室溫下在暗處培育板5分鐘且使用Enspire™設備(Perkin Elmer)量測所發射之光。 • 條件： • ATP+AMP：最大螢光素酶抑制(100%) • CD73+ATP+AMP：無螢光素酶抑制(0%)

使用GraphPad Prism7™軟體將殘餘酶活性相對於抗CD73 Ab濃度繪製於圖表上。

T 細胞增殖分析 獲得來自健康供體之末梢血液且根據菲科爾梯度(Ficoll gradient)分離單核細胞。根據52% Percoll™梯度進一步富集淋巴細胞(細胞集結粒)且用2 µM CellTrace™紫色(Thermofisher)染色。5x10⁴ 將達1×10⁵ 個染色細胞分佈於96孔圓底板中，在37℃下與抗CD73 Ab培育1小時且藉由添加抗CD3/抗CD28塗佈之珠粒活化3至5天。藉由添加200 µM AMP達成T細胞增殖之抑制。藉由流式細胞量測術藉由定量增殖性T細胞之染料稀釋液來評估T細胞增殖及Ab阻斷AMP之免疫抑制作用的能力。使用GraphPad Prism™軟體將增殖T細胞相對於抗CD73 Ab濃度之百分比繪製在圖表上。對來自健康供體或癌症患者之整個PBMC進行一些實驗。方案如上文所描述，除了藉由添加0.5至1 mM ATP達成T細胞抑制之外。

為了比較供體或患者，使用下式將T細胞增殖標準化：

同種異體混合淋巴細胞反應 (MLR) 分析根據菲科爾梯度分離來自健康供體之單核細胞，且藉由使用CD14微珠(Miltenyi Biotec)之免疫磁性選擇來純化單核細胞。在GM-CSF (400 ng/ml)及IL-4 (20 ng/ml)存在下藉由5-7天培養將單核細胞分化成樹突狀細胞(MoDC)。DC回收當天，來自同種異體供體之CD4+ T細胞藉由非CD4+ T細胞(Miltenyi Biotec)之免疫磁性消耗來純化，且用Cell Trace™紫色染色。在抗huCD73 Ab及固定劑量之ATP存在下，在96W圓底微孔板中混合DC (10⁴ 個細胞/孔)及T細胞(5×10⁴ 個細胞/孔)。如針對T細胞增殖分析所述，評估T細胞增殖及Ab逆轉ATP介導之抑止的能力。

實例 1 ： 具有人類構架序列之抗 huCD73 抗體之建模及產生 在PCT公開案WO2016/055609中所描述的分別具有VH及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 27及28之親本抗體3C12藉由將重鏈構架(FR1、FR2、FR3)自人類子組及IGHV1-3*01以及IGHJ4*01 (FR4)引入至VH，且將輕鏈構架(FR1、FR2、FR3)之自人類子組IGKV1-33*01以及IGKJ2*01 (FR4)引入至VL中來修飾。

重疊基於不同人類VH及VL基因區段之三維模型且逐一仔細檢查所有胺基酸之差異。使用親代嵌合(HPLP)及人類化(H0L0)抗體之3D模型攻擊電腦模擬之分子設計。亦評估殘基之間的側鏈及重鏈連接以便鑑別及避免破壞任何重要的低能量鍵。

將各設計域之VH及VL序列選殖至含有huIgG1衍生之恆定域的載體中，該等恆定域分別具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代及huCk恆定域。將兩個所得載體共轉染至CHO細胞株中。使用所建立之細胞池在CHO培養基中產生抗體。接著使用蛋白質A純化抗體。用於建模具有人類IgG1恆定區之3C12之嵌合Fab形式的重鏈及輕鏈序列為以下序列(該恆定區包括包含L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代之Fc域(保持N297連接之糖基化))： HP Fab重鏈(可變域帶下劃線)QIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFASYNMNWVKQSHGKSLDWIGYIDPYNGGSSYNLTFKGKATLTVDKSSTTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARGYGNYKAWFAYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK(SEQ ID NO: 23) 。

LP Fab輕鏈(可變域帶下劃線)DVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASTRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSLTFGAGTKLELK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 24) 。

H0 Fab重鏈(可變域帶下劃線)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMYWVRQAPGQRLEWMGYIDPYNGGSSYNLTFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYKAWFAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK(SEQ ID NO: 25) 。

L0 Fab輕鏈(可變域帶下劃線)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASTRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 26) 。

HPLP親本抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區序列展示如下： HP VH QIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFASYNMNWVKQSHGKSLDWIGYIDPYNGGSSYNLTFKGKATLTVDKSSTTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARGYGNYKAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO: 27) 。

LP VL DVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASTRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO: 28) 。

重鏈設計為了研究殘基I2 (根據Kabat編號，亦為位置2)是否與CDR_H3-Y109形成疏水性鍵且在CDR_H3定位或可撓性中起作用，將位置2處之纈胺酸殘基經異白胺酸取代。在兩個模型中V2與I2側鏈出現不一致。V2亦與H0-Y109 (Kabat Y108)形成疏水性鍵，但Y109位置經稍微修飾且H0-Y109與LC-Y55 (Kabat Y54)形成h鍵。Y55為CDR_L2殘基。V2取代可能影響CDR_H3及CDR_L2兩者之位置。

為了研究位置28及30 (構架1，亦為根據Kabat之位置28及30)處之殘基是否影響與抗原之結合，此等位置經丙胺酸取代。與H0L0抗體之YTFT相比，親本抗體具有序列YAFA。在接近於互補位之分子表面處暴露殘基A28及A30。似乎可能在位置28處之蘇胺酸有可能不利地影響與抗原之結合。另一方面，A30似乎不太可能為關鍵的。

為了研究位置44 (亦Kabat 44)處之殘基是否在VH/VL界面中起一定作用，使此殘基回復突變，藉此保守親本抗體中所存在之絲胺酸。與H0L0抗體之GQR相比，親本抗體具有序列GKS。R44位於VH/VL界面處，極接近L45側鏈。

為了研究位置48 (亦Kabat 48)處之殘基是否重要，此殘基經回復突變，藉此保守親本抗體中所存在之殘基。與H0L0抗體之WMG相比，親本抗體具有序列WIG。I48及M48似乎佔據剛好在CDR_H2以下之關鍵位置且涉及複雜疏水性網路。

為了研究位置67 (Kabat位置66)及68 (Kabat位置67)處之殘基之重要性，此等殘基經回復突變，藉此保守親本抗體中存在之殘基。與H0L0抗體中之RVT相比，親本抗體具有序列KAT。F64 (Kabat F63)與K67/R67 (Kabat K66/R66)之間的環在兩個模型中展示極不同構形。A68 (Kabat 67)為維尼爾殘基(Vernier residue)。

為了研究殘基在Abnum位置70 (Kabat位置69)處之作用，此殘基經回復突變，藉此保守親本抗體中存在之白胺酸。與H0L0抗體之TIT相比，親本抗體具有序列TLT。L70及I70 (Kabat L69及I69)涉及複合疏水性網路。

為研究殘基在位置72 (Kabat 71)處之作用，此殘基經反突變，藉此保守親本抗體中存在之絲胺酸。與H0L0抗體之TRD相比，親本抗體具有序列TVD。V72及R72 (Kabat V71及R71)佔據剛好在CDR_H2下方之關鍵位置。殘基V72之遠端親水性側鏈在分子表面投影且與N55 (Kabat N54)形成h鍵。N55佔據兩個模型中之相同位置。然而，與R72 (Kabat R71)之h鍵可降低對應環之可撓性。因此，無法預測在H0L0中對用精胺酸置換親本纈胺酸之抗原結合的影響。

為研究位置74 (Kabat 73)處之殘基是否影響與抗原之結合，此殘基經回復突變，藉此保守親本抗體中存在的絲胺酸。與H0L0抗體中之DTS相比，親本抗體具有序列DKS。K74及T74 (Kabat K73及T73)暴露於接近互補位之分子表面處且其可參與抗原結合。

具有展示於SEQ ID NO: 29中之胺基酸序列的第一重鏈變異體(H1)具有V2I及T73K取代。具有展示於SEQ ID NO: 30中之胺基酸序列的第二重鏈(H2)變異體具有取代V2I、T28A、R71V及T73K。具有展示於SEQ ID NO: 31中之胺基酸序列的第三重鏈變異體(H3)具有取代V2I、T28A、M48I、R66K、V67A、R71V及T73K。具有展示於SEQ ID NO: 32中之胺基酸序列的第四重鏈變異體(H4)具有取代V2I、T28A、T30A、M48I、R66K、V67A、I69L、R71V及T73K。取代之編號係根據Kabat。

輕鏈設計與H0L0抗體之DIQM相比，親本抗體具有序列DVVM。殘基V2與A25形成疏水性鍵。可在互補位表面暴露殘基I2，但無法預測對互補位組織之影響。I2不與A25形成疏水性鍵，且此可略微修飾CDRL1之位置。因此，殘基2處之異白胺酸經纈胺酸取代。

與H0L0抗體中之PSR相比，親本抗體具有序列PDR。殘基R61佔據旋轉異構位置。環似乎以相同方式定向但並不重疊(對應於整個域之全域平移的側向平移)。在親本抗體中，D60與CDR-L2-R54形成鹽橋及h鍵。在H0L0抗體中，殘基S60不接觸R54。R54佔據旋轉異構位置。與D60之接觸對於將特定及適合位置施加至CDRL2殘基可為關鍵的。H0L0抗體中位置60處之天冬胺酸殘基因此經絲胺酸取代。

與H0L0抗體中之GSG相比，親本抗體具有序列GYG。為研究殘基Y67是否有助於互補位，H0L0抗體中之絲胺酸經酪胺酸置換。

與H0L0抗體中之YYC相比，親本抗體具有序列YFC。儘管Y87似乎不與相鄰殘基形成h鍵，但此殘基之作用為待研究的且H0L0中位置87之酪胺酸經苯丙胺酸取代。

具有SEQ ID NO: 33中所示之胺基酸序列的第一輕鏈變異體(L1)具有取代S67Y。具有SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的第二輕鏈(L2)變異體具有取代S60D及S67Y。具有SEQ ID NO: 35中所示之胺基酸序列的第三輕鏈變異體(L3)具有取代I2V、S60D及S67Y。具有SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的第四輕鏈變異體(L4)具有取代I2V、S60D、S67Y及Y87F。

相應重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列展示於下表1中。表1

Ab	SEQ ID NO	序列(胺基酸取代以粗體表示，Kabat CDR帶下劃線)
H1	29	QI QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMY WVRQAPGQRLEWMGYIDPYNGGSSYN LTFKG RVTITRDK SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYKAWFAY WGQGTLVTVSS
H2	30	QI QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYA FTSYNMY WVRQAPGQS LEWMGYIDPYNGGSSYN LTFKG RVTITV DK SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYKAWFAY WGQGTLVTVSS
H3	31	QI QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYA FTSYNMY WVRQAPGQS LEWI GYIDPYNGGSSYN LTFKG KA TITV DK SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYKAWFAY WGQGTLVTVSS
H4	32	QI QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYA FA SYNMY WVRQAPGQS LEWI GYIDPYNGGSSYN LTFKG KA TL TV DK SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYKAWFAY WGQGTLVTVSS
L1	33	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASTRYT GVPSR FSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLT FGQGTKLEIK
L2	34	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASTRYT GVPD R FSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLT FGQGTKLEIK
L3	35	DV QMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASTRYT GVPD R FSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLT FGQGTKLEIK
L4	36	DV QMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASTRYT GVPD R FSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYF CQQDYSSLT FGQGTKLEIK

產生具有下表2中所示之重鏈及輕鏈組合的抗體。表2

		輕鏈
		L0	L1	L2	L3	L4
重鏈	H0	H0L0	H0L1	H0L2	H0L3	H0L4
H1	H1L0	H1L1	H1L2	H1L3	H1L4
H2	H2L0	H2L1	H2L2	H2L3	H2L4
H3	H3L0	H3L1	H3L2	H3L3	H3L4
H4	H4L0	H4L1	H4L2	H4L3	H4L4

實例 2 ：藉由 SPR 結合至可溶性 CD73 蛋白針對與在Innate Pharma處選殖、產生及純化的人類可溶性二聚CD73蛋白之結合，測試實例1表2中之抗體之結合。藉由SPR分析評估人類化變異體之親和力及結合常數及解離常數。表3概述所有所經計算之常數。

具有完全人類IGHV1-3*01及IGHJ4*01重鏈構架及完全人類IGKV1-33*01及IGKJ2*01輕鏈構架之H0L0抗體產生65 nM之KD。如表3中所示，人類化變異體HxL0 (H1L0、H2L0、H3L0及H4L0)呈現等效於其他變異體之締合常數，但具有較快的解離特徵。HxL0變異體之KD因此高於所有其他變異體之所觀測到的KD (表3)。因此，在人類化變異體中引入完全人類IGKV1-33*01及IGKJ2*01輕鏈胺基酸序列似乎對人類化Ab對CD73之親和力有害。

然而，所有其他人類化變異體與嵌合親本3C12抗體(0.68 nM)對CD73具有類似親和力。值得注意的是，包括完全人類的未經修飾之IGHV1-3*01及IGHJ4*01重鏈構架的全部重鏈均提供與CD73之高親和力結合。表3

人類化變異體	KD (nM)	ka (1/Ms)	kd (1/s)
H0L0	65	1.36E+05	8.82E-03
H0L1	0.9	1.44E+05	1.27E-04
H0L2	0.7	1.68E+05	1.19E-04
H0L3	0.6	1.70E+05	9.49E-05
H0L4	0.6	1.37E+05	8.65E-05
H1L0	28.7	1.03E+05	2.96E-03
H1L1	0.8	1.00E+05	8.43E-05
H1L2	0.6	1.35E+05	8.38E-05
H1L3	0.8	9.26E+04	7.20E-05
H1L4	0.7	9.82E+04	6.77E-05
H2L0	5.6	2.38E+05	3.20E-03
H2L1	1.4	8.37E+04	1.18E-04
H2L2	1.3	1.18E+05	1.55E-04
H2L3	1	1.20E+05	1.23E-04
H2L4	0.9	1.20E+05	1.06E-04
H3L0	29.4	2.71E+05	7.97E-03
H3L1	1.8	7.89E+04	1.40E-04
H3L2	1.4	8.66E+04	1.22E-04
H3L3	1.1	9.57E+04	1.05E-04
H3L4	1	9.04E+04	8.91E-05
H4L0	7.8	1.58E+05	1.23E-03
H4L1	1.7	1.06E+05	1.79E-04
H4L2	0.9	7.75E+04	7.12E-05
H4L3	0.7	1.10E+05	7.69E-05
H4L4	1.2	6.01E+04	7.14E-05

實例 3 ： 藉由流式細胞量測術結合至表現人類 CD73 之細胞 藉由流式細胞量測術測試表2中之人類化抗體與CD73表現細胞的結合。如圖 1 中所示，所有所測試之Ab識別人類CD73蛋白。除了H0L0、H2L0及H3L0 (比親本抗體低效)以外，huCD73之結合功效在人類化變異體與嵌合形式之間類似。此等觀測結果係根據展示對HxL0變異體(H1L0、H2L0、H3L0及H4L0)之較低親和力之SPR資料。因此，包括未經修飾之完全人類IGHV1-3*01及IGHJ4*01重鏈構架的全部重鏈提供與CD73表現細胞的極佳結合，其與親本抗體相當。

實例4：用重組可溶性人類CD73蛋白進行的活體外酶分析比較人類化變異體與親本抗體在抑制重組CD73蛋白之酶活性方面之功效(圖 2 )。

如圖2 (圖A)中所示，當ATP及CTG受質混合時，量測高發光水準。當將AMP添加至反應混合物中時，CTG反應物受到抑制，導致發光減少。在使AMP水解之rhCD73蛋白存在下，恢復發光水準。人類化變異體之CD73酶活性阻斷展示於圖2中。

結果展示除與親本抗體相比活性降低的L0變異體(H0L0、H1L0、H2L0、H3L0及H4L0)以外，所有人類化變異體展示可溶性CD73蛋白酶活性之有力抑制。然而，出人意料地，對於大部分抗體，效能略低於親本抗體之效能。僅H1L4及所有H4變異體以與親本抗體類似之效能阻斷酶活性。

此等實驗展示與重鏈上之回復突變數目無關，當使用IGKV1-33*01及IGKJ2*01序列作為受體構架時，輕鏈上不存在突變使得抑制可溶性CD73蛋白活性之能力顯著降低。

CD73蛋白活性阻斷之最佳功效使用除H4L0外之H1L4及H4Lx變異體(亦即H4L1、H4L2、H4L3及H4L4)達成。

實例 5 ： T 細胞增殖分析 在兩個系列實驗中測試能夠抑制T細胞增殖之AMP的濃度，以便建立誘發較高抑制作用且准許在親本3C12抗體存在下增殖恢復之AMP的濃度。將富集淋巴細胞部分在抗CD3/抗CD28珠粒及AMP劑量範圍(50 µM至1.6 mM至50 µM)存在下培育3天。在兩個系列實驗中，觀測到CD4+及CD8+ T細胞之恢復最佳百分比，分別為0.2至0.8 mM及0.2至1 mM AMP。

在兩個系列實驗中評估人類化變異體及親本抗體之能力以比較其恢復由0.8 mM AMP抑制之T細胞增殖的能力。

如圖 3 中所示，除HxL0變異體之外，嵌合及人類化Ab能夠恢復T細胞增殖(對於CD4+及CD8+子群兩者)。儘管其能夠恢復增殖，但大部分人類化變異體之效能低於親本抗體。H0L4、H1L4及H4L4變異體表明親本抗體之效能水準類似，然而不完全實現親本抗體之全部效能。

用相同實驗條件進行第二實驗，不同之處在於L0變異體經同型對照置換。結果呈現於圖 4 中。

類似於圖3中所示，除HxL0變異體之外，嵌合及人類化Ab能夠恢復T細胞增殖(對於CD4+及CD8+子群兩者)。然而，與親本抗體相比，儘管其能夠恢復增殖，但大部分人類化變異體之效能仍略微較低。H0L4、H1L4及H4L4變異體最接近親本抗體之功效。

實例 6 ：新構架及 CDR 變異體之設計 出人意料地，前述實例展示在流式細胞量測術滴定與抑制CD73酶活性方面之效能之間不存在直接相關性。有趣的是，雖然H1、H2、H3及H4變異體基於SPR分析中與CD73重組蛋白之結合親和力及在CD73表現細胞上的流式細胞量測術基本上不可區分，但在功能性分析中，H2及H3變異體比在實例5中恢復T細胞增殖之能力方面的H4變異體強。一種可能性為引入至H2及H3構架中之對抑制CD73之效能有害(但對CD73之結合親和力不有害)之突變藉由引入至H4變異體構架中之突變得到補償。因此，設計在重鏈構架及/或CDR殘基中具有取代之新變異體。基於此等觀察結果，在H2、H3及H4鏈中進行之取代歸類為咸信對於功能至關重要之殘基、可能不影響病害功能之殘基、不利地影響功能之殘基及恢復功能之殘基。

設計具有下文展示之胺基酸序列(SEQ ID NO: 37；胺基酸取代以粗體表示，Kabat CDR帶下劃線)的新的重鏈變異體，其被稱為「H4+」，且將其與(分別為SEQ ID NO: 33、34、35及36之) L1、L2、L3及L4輕鏈組合，以產生四種新抗體H4+L1、H4+L2、H4+L3及H4+L4。

H4+VH： QI QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFA SYNMY WVRQAPGQRLEWI GYIDPYNGGSSYNLTFKG RVTL TRDK SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYKAWFAY WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 37) 。

包含具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代之人類IgG1 Fc域的完整H4+重鏈之胺基酸序列展示如下： QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFASYNMYWVRQAPGQRLEWIGYIDPYNGGSSYNLTFKGRVTLTRDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYKAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 38) 。

H4+L1抗體含有包含人類Cκ域之L1輕鏈，其完整序列展示如下： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASTRYTGVPSR FSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 39) 。

為了研究相同構架取代如何影響在其重鏈及輕鏈CDR中具有差異之抗體，產生另一系列具有共同重鏈及四個不同輕鏈中之一者的四個抗體。稱為「2H4+」之常見重鏈在HCDR2中之Kabat位置59 (Q59)處具有麩醯胺酸(亦即相較於H4+鏈，L59Q取代)，在HCDR2中之Kabat殘基60 (K60)處具有離胺酸(亦即相較於H4+鏈，T60K取代)，且在HCDR3中之Kabat位置97 (N97)處具有天冬醯胺(亦即相較於H4+鏈，G97N取代)。稱為2L1、2L2、2L3及2L4之四個輕鏈分別具有與L1、L2、L3及L4鏈相同之構架殘基，且藉由LCDR1中Kabat位置30 (T30)處存在蘇胺酸(亦即相較於L1-L4鏈，S30T取代)及LCDR2中Kabat殘基53 (N53)處存在天冬醯胺(亦即相較於L1-L4鏈，T53N取代)而在其CDR方面與L1-L4鏈不同。所得四種新抗體在下文稱為2H4+2L1、2H4+2L2、2H4+2L3及2H4+2L4 (參見表4)。在鼠構架中共享CDR之親本抗體用稱為2HP及2LP之重鏈及輕鏈可變區(以下表5中展示之胺基酸序列)產生。

如在實例1中，所有抗體以具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代之人類IgG1同型形式產生以減少Fc受體結合。表4

mAb 參考	VH	VL
2H4+L1	2H4+ (SEQ ID NO: 42)	2L1 (SEQ ID NO:43)
2H4+L2	2H4+ (SEQ ID NO: 42)	2L2 (SEQ ID NO: 44)
2H4+L3	2H4+ (SEQ ID NO: 42)	2L3 (SEQ ID NO: 45)
2H4+L4	2H4+ (SEQ ID NO: 42)	2L4 (SEQ ID NO: 46)
2HP2LP	2HP (SEQ ID NO: 40)	2LP (SEQ ID NO: 41)

表5

Ab	SEQ ID NO	可變區胺基酸序列(胺基酸取代以粗體表示，Kabat CDR帶下劃線)
2HP	40	EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFTSYNMY WVKQSHGKRLEWIGYIDPYNG GSSYNQKFKG KATLTVDKSSSTAYMHLNNLTSEDSAVYYCARGYNNYKAWFAY WGQ GTLVTVSA
2LP	41	DVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVTNDVA WYQQKPGQSPKLLIYYASNRYT GVPD RFTGSGYGTDFTFTISTMQAEDLAVYFCQQDYSSLT FGAGTKLELK
2H4+	42	QI QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFA SYNMY WVRQAPGQRLEWI GYIDPYNG GSSYNQK FKG RVTL TRDK SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYN NYKAWFAY WGQ GTLVTVSS
2L1	43	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVT NDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASN RYT GVPSRFSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLT FGQGTKLEIK
2L2	44	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVT NDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASN RYT GVPD RFSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLT FGQGTKLEIK
2L3	45	DV QMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVT NDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASN RYT GVPD RFSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLT FGQGTKLEIK
2L4	46	DV QMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVT NDVA WYQQKPGKAPKLLIYYASN RYT GVPD RFSGSGY GTDFTFTISSLQPEDIATYF CQQDYSSLT FGQGTKLEIK

包含具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代之人類IgG1 Fc域的完整2H4+重鏈之胺基酸序列展示如下： QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFASYNMYWVRQAPGQRLEWIGYIDPYNGGSSYNQKFKGRVTLTRDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYNNYKAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 47) 。

包含人類Cκ域之抗體之完整2L1輕鏈之胺基酸序列展示如下： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVTNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 48) 。

實例 7 ：用重組 CD73 蛋白進行之新變異體活體外酶分析的研究 使用實例4中所述之方法比較人類化變異體與親本抗體之功效以抑制重組CD73蛋白之酶活性。實例6中產生之所有新的人類化變異體均能夠有效抑制CD73蛋白之活性。

H4+Lx抗體與其親本對應物一樣有效。此外，與H4+Lx變異體相比，所有2H4+2Lx (2H4+L1、2H4+L2、2H4+L3及2H4+L4)變異體展示CD73抑制效能之增加。2H4+2Lx變異體以類似於親本2HP2LP抗體之功效的功效抑制CD73之活性。

用不同濃度之CD73蛋白(50、100、200、400 ng/mL)進行另一實驗。此實驗之目標為研究人類化抗體阻斷大量CD73蛋白之活性的能力。同樣，2H4+2Lx變異體與親本2HP2LP抗體一樣有效。

實例 8 ： 針對獼猴 CD73 蛋白之功效的新變異體之研究 重組rec cyCD73蛋白之實驗用2H1Lx及2H4+2Lx變異體進行。除所用的cyCD73蛋白濃度(400 ng/mL)以外，實驗條件與對人類蛋白之實驗相同。

人類化變異體阻斷cyCD73蛋白之酶活性的功效與親本(嵌合)抗體之功效相同。

實例 9 ： T 細胞增殖分析中新變異體之研究 測試不同抗體之人類化變異體恢復由AMP抑制之T細胞增殖的能力。

圖 5A 展示AMP對T細胞增殖之抑制作用。所有人類化變異體均有效阻斷AMP對T細胞增殖之抑制作用(圖 5B 及 C )。雖然大部分人類化變異體一般似乎與其在逆轉AMP介導之T細胞抑制中之嵌合親本對應物一樣有效，但2H4+2Lx變異體在所有變異體中最有效，且出人意料地，其甚至比親本2HP2LP抗體更有效以阻斷AMP之抑止效應。

實例 10 ： 兩個人類供體之 T 細胞增殖分析中之新變異體的比較研究 根據先前獲得之結果，2H4+2Lx人類化變異體進一步在一系列T細胞增殖實驗中表徵。

圖 6A 及圖 6B 分別展示使用來自兩個健康供體之細胞在T細胞增殖分析中獲得的結果。如先前所觀測，2H4+2Lx變異體各自比親本2HP2LP更有效以恢復T細胞增殖(圖6A及B，右圖)。在不同2H4+2Lx變異體中未觀測到明顯差異。因此，再者，2H4+2Lx變異體比親本2HP2LP抗體更有效，以阻斷AMP的抑制作用。

綜合而言，在T細胞增殖分析上獲得之結果表明，具有H4+及H4+鏈之構架的人類化變異體為最有效抗體變異體，且2H4+2Lx變異體在所有抗體中整體具有最大效能。

實例11：同種異體混合淋巴細胞反應(MLR)分析中新變異體之研究在同種異體MLR中測試2H4+2Lx抗體變異體，以便確認先前在T細胞增殖分析中獲得之結果。藉由添加100 µM ATP (其藉由CD39降解成ADP及AMP)來抑制T細胞增殖，在圖7中展示兩個人類供體樣品。

如圖7中所示，左圖，藉由添加ATP抑制T細胞增殖。在抗CD73抗體存在下，此抑制得到有效恢復(中間圖及右圖)。所有2H4+2Lx人類化變異體均能夠以與親本2HP2LP抗體相當或比其更好之功效恢復T細胞增殖。在此等環境中，所有2H4+2Lx變異體比親本2HP2LP更有效以恢復T細胞增殖。此等結果係根據在使用AMP作為抑制劑之T細胞增殖分析中獲得之彼等結果。

概言之，在H4+及2H4+可變區中引入之取代與引入L1及2L1鏈中之取代(及L2、L3、L4、2L2、2L3、2L4鏈)一起似乎恢復(且甚至改良)其親本鼠類抗體之重要功能特性，又具有人類構架區且因此具有較低的在人類中之免疫原性風險。2H4+2Lx抗體完全最有效。

出人意料的發現(對CD73之結合親和力與對CD73活性之功能抑制中之效能不直接相關)之一個可能解釋可能與此等抗體結合至CD73充當別位抑制劑之事實相關。抗體以二聚體內結合模式以1:1化學計量在完整全長抗體與CD73二聚體之間與CD73結合。CD73之先前結構性研究已展示，其酶活性需要延伸的N端域旋度，從而限定酶之開放(非活性)及關閉(活性，受質結合)狀態(Knapp等人，2012)。基於親本抗CD73 F(ab)與CD73之胞外域複合之晶體結構，且考慮完整抗體與CD73二聚體之間的1:1化學計量，預期位阻將使得完整抗體不大可能結合至CD73開放構象異構體。相反，完整抗體將CD73以其中AMP無法水解之中間狀態約束。因為CD73因此在能量上不穩定之構形下受抗體結合，所以在此改變抗體結構之硬度的較小變化可影響抗體適應CD73二聚體之改變之構形的能力。因此，此等變化可影響抗體抑制CD73在受質存在下之活性的能力。然而，在SPR或其他結合分析中未觀測到此等抗體結構之較小變化，此外在不存在受質之情況下進行。本文所述之重鏈及輕鏈可變區似乎能夠捕獲(且甚至改良)親本抗體之全部CD73相互作用動力學，同時併入人類構架。

本文所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利均以全文引用之方式併入本文中，且引用程度與個別且特定地指示在本文中以引用之方式併入且全文闡述(在法律允許之最大程度上)的各參考文獻相同，無論本文中其他地方作出之特定文獻的任何單獨提供之併入。

除非本文另外指示或與上下文明顯矛盾，否則術語「一(a)」及「一(an)」及「該」之用途及類似引用應理解為涵蓋單數及複數兩者。

除非另有說明，否則本文中所提供之所有準確值表示對應近似值(例如關於特定因數或量測所提供之所有準確例示性值可被視為亦提供對應近似量測，在適當時藉由「約」修飾)。

除非另外說明或明顯與上下文相矛盾，否則本文中對任何態樣或實施例之描述，本文中使用參考一或多種要素之術語，諸如「包含」、「具有」、「包括」或「含有」意欲對本文中揭示之「基本上由」該特定一或多種要素「組成」、「基本上由」該特定一或多種要素「組成」或「實質上包含」該特定一或多種要素的類似態樣或實施例提供支持(例如，除非另外說明或明顯與上下文相矛盾，否則如包含特定要素之本文所描述之組合物應理解為亦描述由該要素組成之組合物)。

除非另外主張，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)僅意欲較好地闡明本發明而不對本發明之範圍造成限制。本說明書中之語言不應理解為指示實踐本發明所必需之任何未主張要素。

圖1A-圖1B展示用具有H0、H1、H2、H3及H4重鏈可變區(各自與L0、L1、L2、L3及L4輕鏈可變區中之每一者組合)之人類化變異體及親本鼠類抗體HPLP獲得的滴定曲線，如在表現人類(圖1A)或獼猴(圖1B) CD73蛋白的經轉染細胞株上所測試。圖2展示可溶性重組CD73酶活性的阻斷。左上側圖(A)展示當ATP與CTG受質混合時量測的高發光水準。當將AMP添加至反應混合物中時，CTG反應物受到抑制，導致發光減少。在使AMP水解之rhCD73蛋白存在下，恢復發光水準。展示不同人類化變異體之CD73酶活性阻斷。圖3A-圖3C及圖4A-圖4C展示兩個系列實驗以比較人類化抗體在逆轉AMP介導之對T細胞增殖抑制中之效能。圖3A及4A展示針對各系列實驗，藉由AMP進行對T細胞增殖及其抑制的控制。圖3B及4B展示抗CD73抗體恢復CD4+之功效，且圖3C及4C展示抗CD73抗體恢復CD8+ T細胞增殖之功效。細胞增殖係藉由稀釋細胞痕量紫色標記物來確定。資料表示為重複+/-標準差之平均值。圖5A-圖5C展示藉由所有抗CD73 Abs恢復T細胞增殖。圖5A展示藉由AMP進行對T細胞子群增殖及其抑制的控制。圖5B展示H4+Lx抗體及親本抗體HPLP恢復CD4+及CD8+ T細胞增殖之功效。圖5C展示2H4+2Lx抗體(與2L1、2L2、2L3或2L4鏈組合之2H4+鏈)及親本抗體2HP2LP恢復CD4+及CD8+ T細胞增殖之功效。資料表示為重複+/-標準差之平均值。圖6A及圖6B分別展示藉由人類化變異體恢復之T細胞增殖在兩個代表性人類供體中為可複製的。展示2H4+2Lx抗CD73抗體變異體恢復CD4及CD8 T細胞增殖之功效。資料表示為重複+/-標準差之平均值。圖7展示CD4+ T細胞增殖係藉由ATP抑制且藉由2H4+2Lx抗體變異體恢復。藉由100 uM ATP控制CD4+ T細胞增殖及抑制，如針對兩個代表性供體D795 (圖7A)及D664 (圖7B)之測試所展示。資料表示為重複+/-標準差之平均值。

Claims

一種能夠特異性結合人類CD73多肽之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 42 (2H4+鏈)的重鏈可變區(VH)；及含有選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)：SEQ ID NO: 43 (2L1鏈)、44 (2L2鏈)、45 (2L3鏈)及46 (2L4鏈)。
如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 42 (2H4+鏈)之重鏈可變區(VH)，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 43 (2L1鏈)之輕鏈可變區(VL)。
如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 47之重鏈及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 48之輕鏈。
一種能夠特異性結合人類CD73多肽之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 37 (H4+鏈)的重鏈可變區(VH)；及含有選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)：SEQ ID NO: 33 (L1鏈)、34 (L2鏈)、35 (L3鏈)及36 (L4鏈)。
如請求項4之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 37 (H4+鏈)之重鏈可變區(VH)，及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 33 (L1鏈)之輕鏈可變區(VL)。
如請求項4之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 38之重鏈及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 39之輕鏈。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段能夠中和CD73多肽之5'-外核苷酸酶(5'-ectonucletidase)活性。
一種抗體或抗體片段，其能夠特異性結合細胞表面之人類CD73多肽且中和該細胞表面CD73多肽之5'-外核苷酸酶活性，其中該抗體或抗體片段包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 42至少90%、95%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO: 43組成之群的胺基酸序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
一種抗體或抗體片段，其能夠特異性結合細胞表面之人類CD73多肽且中和該細胞表面CD73多肽之5'-外核苷酸酶活性，其中該抗體或抗體片段包含重鏈，該重鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 47至少90%、95%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，及輕鏈，該輕鏈包含與選自由SEQ ID NO: 48組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
如請求項8或9之抗體或抗體片段，其中該VH包含具有SEQ ID NO: 2、3及4中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3；且該VL包含具有SEQ ID NO: 5、6及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。
如請求項8至10中任一項之抗體或抗體片段，其中該VH包含來自人類IGHV1-3基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列，且該VL包含來自人類IGKV1-33基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列。
一種特異性結合人類CD73多肽之抗體或抗體片段，其包含：重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 2、3及4中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGHV1-3基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO: 5、6及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及來自人類IGKV1-33基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列。
如請求項8至12中任一項之抗體或抗體片段，其中該VH包含具有SEQ ID NO: 2、8及9中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3；且該VL包含具有SEQ ID NO: 10、11及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。
如請求項13之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 37至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO: 33組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
如請求項13之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含重鏈，該重鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 38至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，及輕鏈，該輕鏈包含與選自由SEQ ID NO: 39組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
如請求項8至12中任一項之抗體或抗體片段，其中該VH包含具有SEQ ID NO: 2、12及13中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3；且該VL包含具有SEQ ID NO: 14、15及7中所示之相應胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。
如請求項16之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 42至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO: 43組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
如請求項16之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含重鏈，該重鏈包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 47至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，及輕鏈，該輕鏈包含與選自由SEQ ID NO: 48組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置2之胺基酸為異白胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置30之胺基酸為丙胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置48之胺基酸為異白胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置69之胺基酸為白胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置73之胺基酸為離胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該重鏈包含Kabat位置2之異白胺酸殘基、位置30之丙胺酸、位置48之異白胺酸、位置69之白胺酸及位置73之離胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat輕鏈位置67之胺基酸為酪胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat輕鏈位置60之胺基酸為絲胺酸或天冬胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat輕鏈位置2之胺基酸為纈胺酸或異白胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat輕鏈位置87之胺基酸為酪胺酸或苯丙胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該輕鏈包含Kabat位置67之酪胺酸殘基、位置60之絲胺酸、位置2之異白胺酸及位置87之酪胺酸。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置28之胺基酸為蘇胺酸(T)，Kabat重鏈位置66之胺基酸為精胺酸(R)，Kabat重鏈位置67之胺基酸為纈胺酸(V)，且Kabat重鏈位置71之胺基酸為精胺酸(R)。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段特異性結合細胞表面之人類CD73多肽且能夠中和其5'-外核苷酸酶活性，其中該抗體或抗體片段抑制該人類CD73多肽之活性而不會可偵測地減少該CD73多肽與其受質之間的結合。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中相對於該抗體或抗體片段與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之野生型CD73多肽之間的結合，該抗體或抗體片段與包含突變K136A (參考SEQ ID NO: 1)之突變型CD73多肽的結合減少。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中相對於該抗體或抗體片段與包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之野生型CD73多肽之間的結合，該抗體或抗體片段與包含突變A99S、E129A、K133A、E134N及A135S (參考SEQ ID NO: 1)之突變型CD73多肽的結合減少。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段實質上不誘導抗體-CD73複合物之細胞內內化。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含人源Fc域，該Fc域經修飾以減少該Fc域與人類Fcγ受體之間的結合。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含實質上不與人類CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及CD64多肽結合的人源Fc域。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含人類IgG1 Fc域，該IgG1 Fc域包含胺基酸取代在殘基234、235及331或包含胺基酸取代在殘基234、235及322 (根據Kabat之EU編號)。
如上述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為全長抗體。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為抗體片段。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段在中和人類CD73酶活性方面與具有重鏈可變區胺基酸序列SEQ ID NO: 27及輕鏈可變區胺基酸序列SEQ ID NO: 28的抗體相比至少同樣有效，或視情況更有效。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段在中和人類CD73酶活性方面至少與具有重鏈可變區胺基酸序列SEQ ID NO: 40及輕鏈可變區胺基酸序列SEQ ID NO: 41的抗體同樣有效，或視情況更有效。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中對CD73酶活性之中和係藉由評估抗體或抗體片段在AMP存在下誘導T細胞活體外增殖(例如經由TCR共刺激)時提高該等T細胞增殖的能力來確定。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中CD73酶活性之中和係藉由在CD73表現細胞中定量AMP水解成腺苷評估5'外核苷酸酶活性之中和來確定。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中當該抗體以大於CD73多肽二聚體之10倍莫耳濃度過量提供時，該抗體或抗體片段能夠中和可溶性人類二聚CD73多肽之5'-外核苷酸酶活性。
如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段能夠使人類細胞CD73多肽之5'-外核苷酸酶活性降低超過50%，視情況超過70%，視情況超過80%。
一種醫藥組合物，其包含如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段及醫藥學上可接受之載劑。
一種套組，其包含如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段，視情況進一步包含特異性識別如上述請求項中任一項之抗體或抗體片段的標記二級抗體。
一種核酸或核酸集合，其編碼如請求項1至45中任一項之抗體或抗體片段之重鏈及/或輕鏈。
一種重組宿主細胞，其產生如請求項1至45中任一項之抗體或抗體片段。
一種用於治療或預防有需要患者之疾病的方法，該方法包含向該患者投與有效量之如請求項1至46中任一項之抗體、抗體片段或組合物。
如請求項50之方法，其中該疾病為癌症或感染性疾病。
一種用於增加患有癌症之個體之T細胞活性的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至46中任一項之抗體、抗體片段或組合物。
一種用於患有癌症之個體緩解腺苷介導之抑制T細胞活性之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至46中任一項之抗體、抗體片段或組合物。
一種用於個體之腫瘤微環境中增加T細胞活性的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至46中任一項之抗體、抗體片段或組合物。
如請求項52至54中任一項之方法，其中T細胞活性為T細胞增殖。
如請求項50至55中任一項之方法，其中該抗CD73抗體或抗體片段係以可有效達成血液(血清)或腫瘤組織中濃度的量至少投與一次，該濃度對應於用於CD73酶活性中和的至少EC₅₀ 。
如請求項56之方法，其中CD73酶活性之中和係藉由在MDA-MB-231細胞中定量AMP水解成腺苷評估5'外核苷酸酶活性之中和來確定。
如請求項50至57中任一項之方法，其中該腫瘤或癌症為實體腫瘤。
如請求項58之方法，其中該腫瘤或癌症為白血病、膀胱癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、食道癌或乳癌。