JP7132981B2 - Ｃｄ７３遮断 - Google Patents

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Description

関連出願に対する相互参照
本願は、あらゆる図面を含め、その全体において参照により本明細書中に全て組み込まれる、２０１４年１０月１０日提出の米国仮特許出願第６２／０６２，３２３号明細書；２０１５年２月２０日提出の同第６２／１１８，５４９号明細書；２０１５年３月１６日提出の同第６２／１３３，５９７号明細書；および２０１５年７月６日提出の同第６２／１８８，８８１号明細書の優先権を主張する。
配列表に対する参照
本願は、電子方式の配列リストとともに提出されている。本配列リストは、２０１５年１０月８日作成の「ＣＤ７３－１＿ＳＴ２５」という題名のファイルとして提供されており、サイズは２４ＫＢである。本配列リストの電子方式の情報はその全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は、ＣＤ７３を阻害する抗原結合化合物（例えば抗体）に関する。本発明はまた、このような化合物を産生する細胞；このような化合物および抗体、断片、変異体およびその誘導体を作製する方法；これらを含む医薬組成物；疾患、例えば癌を診断、処置または予防するための化合物を使用する方法にも関する。
ＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）は、通常は内皮細胞および造血性細胞のサブセットにおいて発現される、７０ｋＤａグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）－アンカードタンパク質である。ＣＤ３９とともに、ＣＤ７３は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）代謝を制御する。ＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ－１）はＡＴＰをＡＭＰに変換し、微量のＡＤＰのみが放出され、一方でＣＤ７３はアデノシンへのＡＭＰの変換を触媒する。
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびその代謝物ＡＭＰおよびアデノシンは、細胞代謝、シグナル伝達および免疫ホメオスタシスにおいて重要な役割を有する。細胞死または細胞ストレスに反応した細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の放出は、免疫反応を活性化するために作用する。しかし、その代謝産物アデノシンは免疫抑制活性を有する。細胞外アデノシンは癌性組織に蓄積し、腫瘍免疫逸脱の重要な機序を構成する。効果の中でもとりわけ、腫瘍由来アデノシンは、アデニリルシクラーゼ活性化Ａ２Ａ受容体を通じて浸潤性のエフェクターＴ細胞を大きく阻害する。
ＣＤ７３発現は、白血病、膀胱癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌、食道癌および乳癌を含む一連の腫瘍細胞で報告されている。ＣＤ７３発現は、メラノーマおよび乳癌における前転移性表現型とも関連付けられている。マウスにおいて、マウスＣＤ７３に結合する抗体での治療によって、乳腺腫瘍の成長および転移が阻害され得ることが示されている（（非特許文献１））。しかし、抗体は一般に、ヒトおよびマウスＣＤ７３と交差反応せず、ＣＤ７３の抗体および生物学的機能の研究を複雑化している。Ａ２Ａ受容体の遺伝子欠失がＴ細胞依存性の腫瘍拒絶を誘導し得ることが示されている（（非特許文献２））。ｓｉＲＮＡまたは腫瘍細胞上でのＣＤ７３過剰発現を用いたノックダウンは、腫瘍成長および転移を変化させ得る（（非特許文献３）；（非特許文献１）前出；（非特許文献４））。ＣＤ７３－／－マウスでは、移植および自然発症腫瘍が妨げられる（（非特許文献５））。ヒトにおいて、高ＣＤ７３発現は、トリプルネガティブ乳癌に対するネガティブな予後兆候であることが示されている（（非特許文献６））。
治療標的としてのＣＤ７３への長年にわたる関心にもかかわらず、インビボでＣＤ７３を標的とするための薬剤の求められる活性は、完全には解明されていない。腫瘍細胞上でＣＤ７３が発現される一方で、これは、免疫系の様々な細胞、とりわけＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞ならびにＢ細胞上でも発現される。いくつかの抗体が、ヒトＣＤ７３に結合し、Ｔ細胞の活性または増殖を向上させるかまたは腫瘍細胞の遊走を変化させることが報告されている一方で、このようなＴ細胞調整および同時刺激シグナルのＣＤ７３介在性伝達はＣＤ７３のエクト－５’ヌクレオチダーゼ活性に依存することなく可能であることが報告されているので、このような抗体がどのように機能するかについては明確になっていない（（非特許文献７））。結果的に、総称的にＣＤ７３阻害剤と呼ばれる抗体は、ＣＤ７３のエクト－５’ヌクレオチダーゼ活性を調整することにより作用し得ない。ある１つの抗体、７Ｇ２（ｍＩｇＧ２アイソタイプ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＣＤ７３を阻害することが報告されているが、この抗体は、フローサイトメトリーで細胞表面ＣＤ７３に結合しないか、または結合するとしても親和性が非常に低い。ＣＤ７３に結合する別の抗体であるクローンＡＤ２（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）は、受容体クラスター形成および内部移行を引き起こすが、酵素活性には僅かな効果しかないことが報告されている。また別の薬剤である１Ｅ９（マウスＩｇＧ３アイソタイプ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）は、独立に酵素性阻害のＴ細胞シグナル伝達を促進することが報告されている。さらなるｍＡｂ、４Ｇ４（ＩｇＧ１アイソタイプ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）は、Ｔ細胞表面からのＣＤ７３脱落を誘導することが報告されている。さらなる特徴は分かっていないが、１つの薬剤のみ、組み換えＣＤ７３を用いたアッセイにおいて部分的な酵素遮断能があることが報告されており（（非特許文献８））、後に細胞内の内部移行を誘導する抗体として記載された（（非特許文献９））。さらに、あるさらなる複雑化因子は、文献に記載の抗体が一般に、Ｆｃγ受容体が結合可能であるマウスアイソタイプのものであることであり、それにより、Ｆｃ介在性効果から何らかの潜在的な遮断効果を分離することが困難となる。Ｆｃγ受容体が結合する抗ＣＤ７３抗体は、例えばＣＤ７３発現腫瘍細胞（およびおそらくＣＤ７３発現免疫抑制細胞）の（例えばＡＤＣＣによる）枯渇に介在し得、および／または、何らかの真の遮断効果ではなく、炎症促進性サイトカインの産生を誘発し得る。結果的に、抗体の作用形式は未だに理解が困難である。
したがって、ＣＤ７３を標的化することへの関心にもかかわらず、最も効果的な抗ＣＤ７３抗体の特徴は分かっていない。ＣＤ７３活性部位に結合することが報告されている抗体はない。免疫細胞および腫瘍細胞を含む様々な細胞型でのＣＤ７３発現によって、実際にＣＤ７３を遮断しないかまたは純粋な遮断因子ではないかの何れかの抗体の使用と相まって、抗体の基本的な活性の評価のための設定が複雑になる。新規アッセイおよび抗体が必要である。
Ｓｔａｇｇら（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：１５４７－１５５２ Ｏｈｔａら（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：１３１３２－１３１３７ Ｂｅａｖｉｓら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：１４７１１－７１６ Ｊｉｎら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：２２４５－５５ Ｓｔａｇｇら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：２８９２－２９００ Ｌｏｉら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：１１０９１－１１０９６ Ｇｕｔｅｎｓｏｈｎら（１９９５）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２１３－２１７ Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒら（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １７：９９３－９９８ Ｒｕｓｔら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ１２：１１
発明者らは、腫瘍細胞を含む細胞表面で発現されるＣＤ７３上に存在するエピトープに結合し、ＣＤ７３酵素の酵素的（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する抗体を発見した。本抗体は、細胞表面で発現される膜結合ＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害し得る。有利に、これらの抗体は純粋なＣＤ７３遮断抗体として使用し得、例えばこれらは、Ｆｃγ受容体への実質的な結合なく、および／または実質的にＣＤ７３発現細胞に対してＡＤＣＣを向けることなく、細胞表面で発現される膜結合ＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害する。任意選択により、本抗体は、Ｆｃドメインを保持し、ヒトＦｃＲｎへの結合を保持する。
任意選択により、（例えば受容体飽和を与えるものと同等かまたはこれよりも実質的に低い濃度で完全な有効性を提供し得る）ＣＤ７３発現腫瘍細胞を枯渇させることが可能ないくつかの抗体と対照的に、本抗体は、有利に、純粋な遮断因子として使用し得、例えば抗ＣＤ７３抗体の次の連続的投与まで１週間、２週間、１カ月、所望の期間にわたりＣＤ７３の酵素活性を中和するのに有効な量で投与され得る。
任意選択により、本抗体は、純粋な遮断因子であり、腫瘍環境におけるＣＤ７３の酵素活性を中和することを目的とする。任意選択により、本抗体は、例えば（例えば腫瘍環境においてＭＭＰなどのプロテアーゼに対して）プロテアーゼ感受性を低下させるために、および／またはヒトＦｃγ受容体（例えばＣＤ１６）への結合を減少させるための修飾Ｆｃドメインを含む。
ある態様における開示は、真のＣＤ７３機能遮断抗体を同定するために使用し得るアッセイを提供する。本明細書中で示されるように、先行する可溶性酵素遮断アッセイにおいて、二価抗体として遮断することが分かった抗体の大部分は偽陽性であり、一方で一価結合抗体は、おそらく活性部位を遮断できないかまたはＣＤ７３二量体内の各ＣＤ７３ポリペプチドに結合しない場合はアロステリック阻害剤として作用できないので、遮断活性はないかまたは僅かであり得る。先行細胞アッセイは作用機序を区別することができず、ＣＤ７３活性を低下させることが報告される抗体は、複数の作用機序、例えば受容体内部移行、受容体脱落および／またはＦｃγ受容体介在性効果の誘導を組み合わせ得る。残留ＣＤ７３酵素活性の結果、免疫抑制効果を媒介するのに十分なアデノシン生成が起こり得るので、高レベルの抗体介在性酵素遮断は、治療効果を媒介するために有利である。
ある態様における開示は、腫瘍細胞を含むが限定されない細胞表面で発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチド上に存在するエピトープに結合し、ＣＤ７３酵素の酵素的（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する抗体を提供する。
ある態様における開示は、可溶性組み換えＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害し得る抗体を提供する。
本開示の抗体は、細胞内内部移行、またはより一般的には細胞表面で発現されるＣＤ７３の下方調整を引き起こさず、および／またはそれらのＣＤ７３阻害活性についてそれに依存しない。本開示の抗体は、ＣＤ７３内部移行を引き起こすことによりＣＤ７３を阻害する抗体よりも大きい阻害能（ＣＤ７３酵素活性を実質的に中和する能力）を提供し得る。他の機序（例えばＣＤ７３－抗体オリゴマー形成を引き起こすこと）により可溶性ＣＤ７３を阻害する抗体とは対照的に、本開示の抗体は、より高い（例えば１０倍）過剰な抗体：酵素を含む全ての濃度でＣＤ７３の酵素活性を阻害することが可能である。さらに、修飾され得るかまたは細胞表面ＣＤ７３に存在しない（例えば抗体７Ｇ２）かまたは親和性が低すぎてＣＤ７３発現細胞における有効性につながらない組み換えＣＤ７３上のエピトープに結合する抗体とは異なり、本抗体は、細胞表面ＣＤ７３上に存在し、および／またはインタクトなままであるエピトープに高親和性で結合し、細胞性ＣＤ７３の酵素活性を強く中和する能力がある抗体を提供する。本抗体は、細胞においてＣＤ７３酵素活性を阻害するが、任意選択により可溶性組み換えＣＤ７３のエクト－５’ヌクレオチダーゼ活性も阻害し得る（可溶性二量体ＣＤ７３ポリペプチドを使用して細胞不含アッセイで観察する場合）。
さらに、細胞により発現されるＣＤ７３のアロステリック阻害剤として作用可能であると考えられる代表的な抗体（例えば、抗体１Ｅ１１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７を参照）が本明細書中で開示され、例えばこれらは、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性部位へ結合せずに、ヒトＣＤ７３ポリペプチドの活性を阻害し、および／またはこれらはＣＤ７３の非競合型の阻害剤であり、例えばこれらはＣＤ７３ポリペプチドとその天然基質との間の結合を検出可能に減少させることなく、ヒトＣＤ７３ポリペプチドの活性を阻害する。代表的な抗体は、残基Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５での置換を有するＣＤ７３突然変異体への結合を失う。ＣＤ７３活性部位阻害剤ＡＰＣＰの存在下および非存在下の両方でのＣＤ７３への代表的な抗体の結合を考慮すると、ＣＤ７３上でのそれらのエピトープは、基質に結合しない場合の「開いた」立体構造だけでなく、基質（例えばＡＭＰなどの天然基質またはＡＭＰ類似アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸（ＡＰＣＰ）などの活性部位に結合する、阻害剤または他の化合物）に結合した場合の「閉じた」立体構造でもＣＤ７３上に存在すると思われる。
したがって、ある態様において、本開示は、ＣＤ７３ポリペプチドのアロステリック阻害剤を提供する。ある態様において、アロステリック阻害剤は抗体である。ある態様において、腫瘍細胞を含むが限定されない、細胞表面で発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、酵素（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性ＣＤ７３ポリペプチドを阻害し、ＣＤ７３ポリペプチドのアロステリック阻害剤である抗体を提供する。
さらに、代表的な抗体は、本明細書中に記載されており、これらは、ＣＤ７３がＣＤ７３二量体として存在する場合、同じ面上に存在するＣＤ７３上のエピトープに結合し、これにより、例えば抗体が１つのＣＤ７３二量体に、とりわけ結合部位が空間的にさらに離れる「閉じた」位置で二価的に結合可能になる可能性がある。リガンド結合ＣＤ７３への結合を考慮して、本明細書中に記載の抗体は、例えば処置前に）上流ＡＤＰおよび／またはＡＭＰが顕著なレベルで存在する腫瘍環境において、ＡＭＰに結合する場合、ＣＤ７３への結合に有用であり得る。腫瘍微小環境は、高レベルのＡＭＰを得るために間質および細胞浸潤（例えばＴＲｅｇ細胞）においてＣＤ３９により取り込まれる何らかの適切なパラメーター、例えば（例えば死細胞により生成される）高レベルのＡＤＰ、ならびにより一般的にはＡＭＰ、アデノシン、ＣＤ３９発現またはＣＤ３９発現細胞の存在もしくはレベル、ＣＤ７３発現またはＣＤ７３発現細胞の存在もしくはレベル、アデノシン受容体発現またはアデノシン受容体発現細胞の存在もしくはレベルを特徴とし得る。したがって、腫瘍環境におけるＣＤ７３分子は、基質結合型の立体構造であり得、非基質結合型ＣＤ７３に加えて、基質結合型細胞性ＣＤ７３（例えばＡＭＰなどの基質と一緒に予め温置されたＣＤ７３を発現する細胞）に結合し、阻害する能力によって、インビボでのより大きなＣＤ７３阻害能がもたらされ得る。任意選択により、ＡＤＰまたはＡＭＰ（および／またはＡＴＰまたはアデノシン）のレベルを処置前に腫瘍環境において評価し得る。本抗体は、腫瘍試料中のＡＤＰ、ＡＭＰ、ＡＴＰまたはアデノシンが顕著なレベル（例えば参照と比較して高いレベル）である個体での処置に対して特別な利点を有し得る。
したがって、ある態様において、本開示は、細胞表面で発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する抗体を提供し、この抗体は、１つのＣＤ７３ポリペプチド二量体（可溶性ＣＤ７３ポリペプチド二量体または細胞により発現されるＣＤ７３ポリペプチド二量体）に二価的に結合可能である。任意選択により、本抗体は、二量体内の第一のＣＤ７３ポリペプチドに第一の抗原結合ドメインで結合し、第二のＣＤ７３ポリペプチドに第二の抗原結合ドメインで結合する。ある態様において、本抗体はＣＤ７３ポリペプチドのアロステリック阻害剤である。
したがって、別の態様において、本開示は、細胞表面で発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する抗体を提供し、この抗体は、基質結合型立体構造でＣＤ７３ポリペプチドに結合可能である。
ＣＤ７３阻害抗体についてスクリーニングするという文献中での取り組みにもかかわらず、既存の抗体は、細胞性ＣＤ７３を中和せず、または良くてもＣＤ７３下方調整を引き起こすのみである。発明者らは、本明細書中でこれらの抗体がなぜ細胞においてＣＤ７３を阻害しないかについての説明を提供する：二価方式でＣＤ７３ホモ二量体に結合可能であり、溶液中の組み換えＣＤ７３を阻害する抗体は、ＣＤ７３ポリペプチドおよび抗ＣＤ７３抗体の複合体へのオリゴマー形成（例えば２つ以上の抗体および２つ以上のＣＤ７３二量体を含有する構造）を引き起こしている可能性があり、偽陽性から真の阻害剤を区別することが困難になる。
過剰に高い抗体：酵素で行われる改良アッセイ法の設計を通じて、発明者らは、本明細書中で、オリゴマー化に依存しないＣＤ７３への二価結合を有する抗体を提供する。特に、本明細書中で提供される抗ＣＤ７３抗体は、この抗体が、オリゴマーを形成できない設定／立体構造にある場合、例えばそれらがＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰（例えば少なくとも１０倍、２０倍、１００倍など）で提供される場合、可溶性ヒト二量体ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を阻害可能である。オリゴマー化を引き起こすことにより機能する抗体は、ＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰で抗体が提供される場合、ＣＤ７３を阻害できない。本抗体は、さらに、ＣＤ７３が細胞表面で発現される場合、維持されているＣＤ７３上のエピトープに結合する。このアッセイの使用を通じて、抗体が二価的に１つのＣＤ７３二量体に結合することも確認され得；このような抗体は、ＣＤ７３発現細胞におけるインビトロおよびインビボでのＣＤ７３結合の向上およびＣＤ７３遮断活性を有し得る。次に、精製抗体を使用した細胞酵素活性アッセイにおいてこれらの方法により同定された抗体を試験し、細胞性ＣＤ７３の酵素活性を中和することが分かった。内部移行を誘導することによりＣＤ７３を阻害するかまたは細胞性ＣＤ７３に対する顕著な結合を喪失する抗体はあまり強力ではなく、酵素活性を中和できず、良くても細胞においてＣＤ７３の酵素活性を部分的に阻害するだけであった。
これらの抗体が結合するＣＤ７３上のエピトープは、一連の細胞、例えば癌細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞、遺伝子移入細胞により発現される場合、ＣＤ７３ポリペプチド上に存在し、フローサイトメトリーにより決定される場合、高親和性で結合する。例えば、抗体は、それらの表面でＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞への結合について、５μｇ／ｍＬを超えない、任意選択により２μｇ／ｍＬを超えない、１μｇ／ｍＬを超えない、０．５μｇ／ｍＬを超えない、０．１μｇ／ｍＬを超えない、または０．０５μｇ／ｍＬを超えない、フローサイトメトリーにより決定される場合のＥＣ５０を特徴とし得る。ある実施形態において、細胞は、それらの表面でＣＤ７３を発現させるために作製される細胞である。ある実施形態において、細胞は、それらの表面でＣＤ７３を内因性に発現する細胞、例えば癌細胞、白血病細胞、膀胱癌細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、卵巣癌細胞、メラノーマ細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、食道癌細胞または乳癌細胞である。
ある実施形態において、ＣＤ７３中和抗体は、ＣＤ７３の細胞の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の少なくとも６０％、７５％または８０％の低下を引き起こすことが可能であることを特徴とし得る。ある実施形態において、ＣＤ７３中和抗体は、１μｇ／ｍＬを超えない、任意選択により０．５μｇ／ｍＬを超えない、任意選択により０．２μｇ／ｍＬを超えない、細胞により発現されるＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害に対するＥＣ５０を特徴とし得る。
任意選択により、細胞により発現されるＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害は、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解を定量することによるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによって判定される（例えば実施例５を参照）。
二価方式でＣＤ７３に結合する全長抗体が使用される場合を含め、本明細書中で開示される中和抗体が結合するＣＤ７３上のエピトープにより、細胞上でのＣＤ７３発現の下方調整は起こらない（および、例えば、抗体－ＣＤ７３複合体のクラスター形成および内部移行が起こらない）。したがって、抗ＣＤ７３抗体は、細胞表面でＣＤ７３と一緒に結合したままである。ＣＤ７３の広い組織発現を考慮すると、ＣＤ７３下方調整および／または内部移行を惹起しない抗体によって、薬理学的特性が改善され、腫瘍微小環境でより多量の抗体が提供され得る。
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３（例えば配列番号１または２のアミノ酸配列を含むポリペプチド）に特異的に結合し、溶液中でホモ二量体ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する単離抗体が提供される。ある実施形態において、可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、この酵素活性を阻害する抗体、とりわけＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性異化反応を中和する抗体が提供される。ある実施形態において、本抗体は、ＣＤ７３に二価方式で結合する。ある実施形態において、本抗体は、非枯渇抗体、例えばＦｃサイレント抗体である。ある実施形態において、本抗体は、ＣＤ７３ポリペプチド：抗ＣＤ７３抗体オリゴマーの誘導に依存せずに、溶液中でＣＤ７３を中和する。
ある実施形態において、細胞表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和可能である単離抗体が提供される。ある実施形態において、本抗体は、可溶性ＣＤ７３のオリゴマー化を誘導しない。
ある実施形態において、細胞表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、細胞性ＣＤ７３（細胞により発現されるＣＤ７３）の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和可能である単離抗体が提供される。ある実施形態において、特異的に結合し、細胞表面でヒトＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和し、ＣＤ７３への結合時にＣＤ７３発現細胞に内部移行されない単離抗体が提供される。本抗体は、ＣＤ７３のマルチマー化および続いて起こる内部移行を引き起こさない。ある実施形態において、溶液中で組み換えヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、その酵素活性を阻害可能である抗体が提供され、この抗体は、ＣＤ７３発現細胞中に内部移行されない。ある実施形態において、非内部移行抗体は、ＣＤ７３に二価方式で結合する。ある実施形態において、この抗体は非枯渇抗体、例えばＦｃサイレント抗体である。この抗体は、さらにＣＤ７３ポリペプチド：抗ＣＤ７３抗体オリゴマーの誘導に依存することなく、溶液中で二量体のヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和可能である。
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに二価的に特異的に結合し、細胞ヒトＣＤ７３（および任意選択によりさらに組み換え可溶性ヒトＣＤ７３）の酵素活性を阻害する抗体が提供され、この抗体はＣＤ７３発現細胞に内部移行されない。好ましくは、この抗体は実質的に（例えばそのＦｃドメインを介した）Ｆｃγ受容体結合を欠く。
ある態様において、ＡＭＰと予め温置した細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、その５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和可能である単離抗体が提供される。任意選択により、５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することは、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解を定量することによりＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによって、判定される（例えば実施例５を参照）。
本明細書中での実施形態の何れかにおいて、本抗体は、活性部位が基質、例えばＡＭＰ、ＡＰＣＰにより占有されているヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合可能であることを特徴とし得る。本明細書中での実施形態の何れかにおいて、本抗体は、ＣＤ７３を発現する細胞をＡＭＰと予め温置した場合、このＣＤ７３を発現する細胞の５’－エクトヌクレチダーゼ（５’－ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｔｉｄａｓｅ）活性を阻害可能であることを特徴とし得る。本発明はまた、とりわけ、細胞および癌に罹患している個体においてＣＤ７３活性を中和することに対して非常に有効な標的化を可能とするヒトＣＤ７３上のエピトープの探索からの結果でもある。本抗体は、ＣＤ７３への結合について互いに対して競合し（しかし、参照可溶性ＣＤ７３遮断抗体とは競合しなかった）、このことから、特にＣＤ７３の酵素活性の阻害に適切であり、細胞表面で発現されたときにＣＤ７３ポリペプチド上に存在し続けるＣＤ７３上の領域が示唆される。有利に、このエピトープは、細胞表面で発現される場合、各ヒトおよび非ヒト霊長類ＣＤ７３上に、同様に癌細胞により発現される場合もＣＤ７３上に存在する。
ある態様において、可溶性ＣＤ７３および細胞表面上で発現されるＣＤ７３の両方に存在する共通する抗原性決定基に結合する抗ＣＤ７３抗体が提供される。
ある態様において、「開かれた」立体構造（ＣＤ７３活性部位が基質、例えばＡＭＰ、ＡＰＣＰにより占有されていない／これに結合されていない場合）、および「閉じた」立体構造のときに「閉じた」ＣＤ７３（ＣＤ７３活性部位が、例えばＡＭＰ、ＡＰＣＰにより占有される／これに結合される場合）である場合にＣＤ７３上に存在する共通する抗原性決定基に結合する抗ＣＤ７３抗体が提供される。
ある態様において、ＣＤ７３二量体内の各ＣＤ７３ポリペプチド鎖内の抗原性決定基に結合する抗ＣＤ７３抗体が提供され、例えば、この抗原性決定基はＣＤ７３二量体の共通する面上に存在する。
ある態様において、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５（配列番号１に対する）からなる群から選択される残基のうち１、２、３、４または５個を含むＣＤ７３上でエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体が提供される。
ある態様において、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５（配列番号１に対する）からなる群から選択される残基で突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少した抗ＣＤ７３抗体が提供され；任意選択により、この突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、突然変異：Ａ９９Ｓ、Ｅ１２９Ａ、Ｋ１３３Ａ、Ｅ１３４ＮおよびＡ１３５Ｓを有する。
ある態様において、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および／または６Ｅ１により結合されるＣＤ７３上のエピトープへの結合について競合する（例えば、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の何れかの重および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体と、ＣＤ７３ポリペプチド上のエピトープへの結合について競合する）抗ＣＤ７３抗体が提供される。
本明細書中の実施形態の何れかのある態様において、同じエピトープに結合し、および／またはＣＤ７３ポリペプチドへの結合についてモノクローナル抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および／または６Ｅ１と競合する（例えば１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の何れかの重および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体と、ＣＤ７３ポリペプチドへの結合について競合する）抗原結合化合物が提供される。ある実施形態において、これは、同じエピトープに結合し、および／またはＣＤ７３ポリペプチドへの結合について、
（ａ）配列番号３および４のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体（１Ｅ１１）；
（ｂ）配列番号２１および２２のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体（６Ｅ１）
（ｃ）配列番号２８および２９のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体（８Ｃ７）；および
（ｄ）配列番号３６および３７のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体（３Ｃ１２）
からなる群から選択される抗体と競合する、抗原結合化合物が提供される。
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、１Ｅ１１、６Ｅ１、３Ｃ１２または８Ｃ７により結合されるＣＤ７３上のアミノ酸残基からなる群から選択される１、２または３個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。ある実施形態において、ＣＤ７３上のアミノ酸残基は、表１で列挙される残基からなる群から選択される。
本明細書中の実施形態の何れかのある態様において、本抗体は、抗体１Ｅ１１、６Ｅ１、３Ｃ１２および８Ｃ７からなる群から選択される抗体の重および／または軽鎖それぞれの１、２または３個のＣＤＲを有する重および／または軽鎖を有し得る。
本明細書中での実施形態の何れかにおいて、抗ＣＤ７３抗体は、細胞（例えば、腫瘍細胞、実施例で示されるように、ＣＤ７３を発現するように作製される細胞、例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞株またはＣＤ７３を発現するように作製される組み換え宿主細胞）の表面上で発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチドへの結合を特徴とし得、任意選択によりさらに、本抗体は、フローサイトメトリーにより判定される場合、高親和性で結合する。例えば、抗体は、それらの表面でＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞、例えばＣＤ７３を発現する腫瘍細胞、それらの表面でＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞、ＣＤ７３を発現するリンパ球などへの結合に対して、５μｇ／ｍＬを超えない、任意選択により１μｇ／ｍＬを超えない、０．５μｇ／ｍＬを超えない、０．１μｇ／ｍＬを超えない、または０．０５μｇ／ｍＬを超えない、フローサイトメトリーにより判定される場合のＥＣ５０を特徴とし得る。任意選択により、（ｉ）それらの表面でヒトＣＤ７３（例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を発現する細胞および／または（ｉｉ）それらの表面でヒト非ヒト霊長類ＣＤ７３（例えばカニクイザルＣＤ７３）を発現する細胞への結合について、抗原結合化合物は、１μｇ／ｍＬを超えない、任意選択により０．５μｇ／ｍＬを超えない、０．１μｇ／ｍＬを超えない、または０．０５μｇ／ｍＬを超えないＥＣ５０を有する。
本明細書中の実施形態の何れかのある態様において、本抗ＣＤ７３抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む四量体抗体であり、重鎖は、ヒトアイソタイプのＦｃ領域を含み、実質的にヒトＦｃγ受容体への結合を欠く（例えばＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４）。
ある実施形態において、本抗体は、癌を有する個体に、腫瘍微小環境においてＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。ある実施形態において、本抗体は、腫瘍微小環境においてアデノシンの生成および／または濃度を減少させるのに十分な量および頻度で投与される。ある実施形態において、本抗体は、腫瘍微小環境においてＡＴＰの生成および／または濃度を増加させるのに十分な量および頻度で投与される。ある実施形態において、本抗体は、腫瘍細胞により発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。ある実施形態において、本抗体は、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞および／またはＢ細胞により発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量および頻度で投与される。
本抗体は、ＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応を阻害すること、例えば腫瘍微小環境においてアデノシン濃度を低下させることにおいて有用である。したがってこれらの抗体は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびアデノシン受容体を発現する他の細胞上でＣＤ７３および／またはアデノシンの免疫抑制効果を逆転させることにおいて、例えば癌の処置において有用である。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｔ細胞での、増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性および／またはＮＦκＢ活性のアデノシン介在性阻害を中和する。
ＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応は不可逆的なので、ＣＤ３９による（それぞれＮＤＫキナーゼおよびアデニル酸キナーゼによる）ＡＴＰからＡＤＰおよびＡＤＰからＡＭＰへの異化反応が可逆的である一方で、不可逆的なＣＤ７３介在性の異化反応を遮断する抗体は、ＡＭＰの貯蔵を増加させ、それにより例えば腫瘍微小環境においてＡＤＰおよびＡＴＰの濃度を上昇させることにおいて役立つ。本抗体は、ＡＭＰからのＡＤＰの形成およびＡＤＰからのＡＴＰの形成を増加させるために有用であり得る。ＡＴＰは免疫活性化の役割を有するので、抗ＣＤ７３抗体は、例えば癌の処置で、Ｔ細胞を活性化することにおいて有用であり得る。
本抗体は、腫瘍微小環境へのアデノシンの、生成、量および／または濃度を阻害することにおいて有用である。
可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチド二量体の活性を中和する抗体は、何らかの他の適切な関連において、例えばＴ細胞においてＣＤ７３を発現させるために作製されるレポーター細胞などにおいて、ＣＤ７３をさらに中和し得る。
個体を処置するための方法が提供され、この方法は、治療的に活性のある量の本明細書中に記載の抗ＣＤ７３抗原結合化合物の何れかを個体（例えば疾患、腫瘍などを有する個体）に投与することを含む。ある態様において、個体を処置するための方法が提供され、この方法は、次のこと：個体（例えば疾患、腫瘍などを有する個体）に治療的に活性のある量の、ＣＤ７３ポリペプチドを阻害する本開示の抗原結合化合物を投与することを含むか、基本的にこのことからなるか、またはこのことからなる。ある実施形態において、本抗体は、細胞性および任意選択によりさらに非細胞アッセイ、例えば組み換えＣＤ７３、可溶性ＣＤ７３において、ＣＤ７３ポリペプチドを阻害する。好ましくは、本化合物は非枯渇抗体（それに結合する細胞を枯渇させない抗体、例えばＦｃサイレント抗体）である。任意選択により、本化合物は、ＣＤ７３に二価方式で結合する。任意選択により、本抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。任意選択により、本抗体はＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を含む。
ある態様において、ＣＤ７３発現細胞（例えば個体中の免疫細胞および／または腫瘍細胞）により生成されるアデノシンを減少させるための方法または、細胞性ＣＤ７３の酵素活性を中和するための方法が提供され、この方法は、ＣＤ７３を阻害する本開示の抗原結合化合物とＣＤ７３発現細胞を接触させることを含むか、基本的にこのことからなるか、またはこのことからなる。ある実施形態において、本開示の抗原結合化合物とＣＤ７３発現細胞を接触させる段階は、個体に治療的に活性のある量の、ＣＤ７３を阻害する抗原結合化合物を投与することを含む。ある実施形態において、個体は癌を有する。
ある態様において、腫瘍環境において（例えば個体において）存在するアデノシンを減少させるための方法が提供され、この方法は、治療的に活性のある量の、ＣＤ７３ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物を個体に投与することを含むか、基本的にこのことからなるか、またはこのことからなる。ある実施形態において、個体は癌を有する。
ある実施形態において、ＣＤ７３ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の、活性のある量とは、個体におけるＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化作用の阻害に対して、少なくともＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００の血液濃度を達成および／または（例えば抗原結合化合物の続く投与まで）維持するのに有効な量である。ある実施形態において、ＣＤ７３ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の活性のある量とは、個体の血管外組織におけるＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応の阻害に対して、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、ＣＤ７３ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の活性のある量とは、個体におけるＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応の阻害に対して、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、ＣＤ７３ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の活性のある量は、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の間である。ある実施形態において、毎週、２週間ごと、毎月または２カ月ごとに個体に活性のある量を投与する。
任意選択により、個体は、癌を有するかまたは癌を有する疑いがあるヒトである。
本抗体は、任意選択により、１０－９Ｍ未満（より良好）、好ましくは１０－１０Ｍ未満または好ましくは１０－１１Ｍ未満のヒトＣＤ７３ポリペプチドに対する結合親和性（ＫＤ）および／または１μｇ／ｍＬより低い（より良好な結合）ＥＣ５０でのヒトＣＤ７３への結合を特徴とし、好ましくは、細胞表面でヒトＣＤ７３を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）への結合に対する本抗体のＥＣ５０は、０．５μｇ／ｍＬを超えない、任意選択により０．２μｇ／ｍＬを超えない、任意選択により０．１μｇ／ｍＬを超えない。
本抗体は、任意選択によりキメラ、ヒトまたはヒト化抗体である。
本抗体は、任意選択により、１μｇ／ｍＬ未満（より良好）、任意選択により０．５μｇ／ｍＬ未満の、ＣＤ７３発現細胞におけるＣＤ７３の酵素活性の中和に対するＥＣ５０を特徴とする。
ある実施形態において、本抗体は、結合特異性およびＣＤ７３の酵素活性を中和する能力を保持するモノクローナル抗体またはその断片である。ある実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体である。例えば、本抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体または、ＦｃドメインとＦｃγ受容体（例えばＣＤ１６）との間の結合を減少させるために修飾される何れかのヒトＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃドメインを含む抗体であり得る。好ましくは、抗原結合化合物は、抗体介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／またはＣＤＣを誘導可能であるＦｃドメインを含まず；任意選択により、この抗原結合化合物は、実質的にＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに結合可能であるＦｃドメインを含まない（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合可能ではないＦｃドメインを含み；Ｆｃドメインを欠く（例えばＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを欠き；ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む）。ある実施形態において、（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの）Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸修飾（例えば置換）を含み、この置換は、Ｆｃドメイン（またはそれを含有する抗体）がＦｃγ受容体（例えばＣＤ１６）に結合する、および／または補体に結合する能力を低下させる。任意選択により、ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインが存在する場合、このようなＦｃドメインは、ヒンジにおける突然変異、例えばＳ２４１Ｐ（Ｓ２２８Ｐ）突然変異など、半抗体の形成を減少させるための安定化突然変異を含み得る。任意選択により、抗原結合化合物は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、１本鎖抗体断片または複数の異なる抗体断片を含む多特異的抗体からなるかまたはこれらを含む。ある実施形態において、抗原結合化合物は毒性部分と連結されない。
前出の特性の何れかを有する、ヒトまたはヒト化抗体もしくは抗体断片をコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このようなベクターを含む細胞および、抗ＣＤ７３抗体の発現に適切な条件下でこのような細胞を培養することを含む、ヒト抗ＣＤ７３抗体を作製する方法も提供される。本開示はまた、このようなタンパク質、核酸、ベクター、および／または細胞および一般的には組成物の処方、送達、安定性または他の特徴を促進する、活性成分または不活性成分であり得る１つ以上のさらなる成分（例えば様々な担体）を含む、薬学的に許容可能な組成物などの組成物およびキットにも関する。本開示は、さらに、ＣＤ７３介在性の生物学的活性の調整において、例えばそれに関連する疾患、とりわけ癌の処置などにおいて、このような抗体、核酸、ベクター、細胞、生物および／または組成物を作製および使用する、様々な新規のおよび有用な方法に関する。
本開示はまた、ＣＤ７３に結合し、ＣＤ７３の酵素活性を中和する抗体を作製または試験する方法も提供し、この方法は、
（ａ）ＣＤ７３ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供し、
（ｂ）この抗体のそれぞれを（例えば細胞不含アッセイにおいて、例えばＡＭＰ存在下で）可溶性ＣＤ７３ポリペプチドと（例えば個別に、互いに）接触させ、
（ｃ）この可溶性ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を中和する抗体（例えば段階（ｂ）のもの）を選択する、
段階を含む。ある実施形態において、本抗体は、ＣＤ７３に二価方式で結合可能であり、例えば本抗体は全長ＩｇＧ抗体である。任意選択により、段階（ｂ）は、細胞不含アッセイにおいてこの抗体のそれぞれを可溶性ＣＤ７３ポリペプチドと接触させることを含み、ここで抗体は、（ＣＤ７３ポリペプチドと比較して）抗体のモル過剰量で提供される。任意選択により、ＣＤ７３ポリペプチドは可溶性ＣＤ７３二量体である。任意選択により、段階（ｃ）は、抗体がＣＤ７３二量体に対して抗体のモル過剰量（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍または１００倍モル過剰量）で提供される場合に、この可溶性ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性を中和する抗体を選択することを含む。
ある実施形態において、複数の抗体を提供する段階は、ＣＤ７３ポリペプチドを含む免疫原で非ヒト哺乳動物に免疫付与することを含む。
本開示はまた、必要とする対象においてリンパ球（例えばＴ細胞）の活性を増強する、またはリンパ球（例えばＴ細胞）の活性を回復させるための方法またはリンパ球（例えばＴ細胞）のアデノシン介在性の阻害を緩和する方法も提供し、この方法は、有効量の前述の組成物の何れかを対象に投与することを含む。ある実施形態において、対象は、癌に罹患している患者である。例えば、患者は、固形腫瘍、例えば結直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肺癌、乳癌または悪性メラノーマに罹患し得る。あるいは、患者は、造血性癌、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫または非ホジキンリンパ腫に罹患し得る。
本開示はまた、個体における疾患の処置のための方法も提供し、この処置は、ＣＤ７３の酵素活性の中和に対して、少なくともＥＣ５０（例えば０．０１～０．５μｇ／ｍＬの間のＥＣ５０）、任意選択によりＥＣ７０または任意選択によりＥＣ１００に対応する（例えば０．０５～１μｇ／ｍＬの間および０．１～１μｇ／ｍＬの間のＥＣ１００）、血液（血清）または血管外組織（例えば腫瘍環境）における濃度を達成し、および／または抗ＣＤ７３抗体の２回の連続投与の間に維持するのに有効である量で、抗ＣＤ７３抗体が少なくとも１回、任意選択により少なくとも２回投与される、少なくとも１回の投与サイクルにわたり、ＣＤ７３の酵素活性を中和する抗ＣＤ７３抗体を個体に投与することを含む。本抗体は、例えば、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬ）の、循環中または血管外組織（例えば腫瘍環境）中の濃度を達成し、および／または維持するための量で投与され得る。例えば、０．０５～１μｇ／ｍＬの間、または０．１～１μｇ／ｍＬの間の血管外組織中の濃度を達成するために、抗ＣＤ７３抗体が、０．５～１０μｇ／ｍＬの間、または１～１０μｇ／ｍＬの間の、抗ＣＤ７３抗体の循環中の濃度を達成するのに有効な量で投与される。任意選択により、抗ＣＤ７３抗体は、少なくとも２回、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間にわたり、抗ＣＤ７３抗体の２回の連続投与の間、および／または投与サイクル全体を通じて、少なくとも上述の濃度で抗ＣＤ７３抗体の濃度を維持するのに有効な量で投与される。
本開示はまた、個体における疾患の処置のための方法も提供し、この処置は、少なくとも１回、任意選択により少なくとも２回、少なくとも１μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも１０μｇ／ｍＬ、任意選択により１～１００μｇ／ｍＬの抗ＣＤ７３抗体の血液または組織濃度を達成し、および／または抗ＣＤ７３抗体の２回の連続投与の間に維持するのに有効な量で抗ＣＤ７３抗体が投与される、少なくとも１回の投与サイクルにわたり、ＣＤ７３の酵素活性を中和する抗ＣＤ７３抗体を個体に投与することを含む。任意選択により、抗ＣＤ７３抗体は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間にわたり、抗ＣＤ７３抗体の２回の連続投与の間、および／または投与サイクル全体を通じて、少なくとも２回、少なくとも１μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも１０μｇ／ｍＬ、任意選択により１～１００μｇ／ｍＬの抗ＣＤ７３抗体の連続的な血液または組織濃度を維持するのに有効な量で投与される。
これらの態様をより詳しく記載し、本明細書中で提供される説明から、さらなる態様、特性および長所が明らかとなろう。
図１は、ルシフェラーゼ活性および発光を回復させる、ＣＤ７３がＡＭＰを切断してアデノシン＋無機リン酸化物にする能力に試験ｍＡｂが影響を及ぼす能力を測定することによって評価した、抗ＣＤ７３抗体のＣＤ７３酵素活性断能を示す。結果は残存酵素活性（％）として表す。抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、６Ｅ１および３Ｃ１２（図示せず）は、酵素活性の強い低下を引き起こし、過剰な、免疫複合体に依存しない状況で提供された場合も、残留酵素活性を低下させ続ける。 図２は、可溶性組み換えヒトＣＤ７３ポリペプチドにおけるＥＬＩＳＡによる抗体の滴定の結果を示す。 図３は、ヒト、カニクイザルおよびマウスＣＤ７３発現組み換え宿主細胞株におけるフローサイトメトリーによる抗体の滴定の結果を示す。１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１はヒトおよびカニクイザル（マウスではない）ＣＤ７３を発現する組み換え宿主細胞に優れた親和性で結合するが、７Ｇ２または１Ｅ９はそうではない。 図４は、ＣＤ７３を内因性に発現するヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞におけるフローサイトメトリーによる抗体の滴定の結果を示す。１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に優れた親和性で結合するが、７Ｇ２または１Ｅ９はそうではない。 図５は、抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１が細胞性ＣＤ７３の酵素活性を中和することを示す。 図６は、様々な抗体が細胞でのＣＤ７３発現の下方調整を引き起こす能力を示す。各ＡＤ２、７Ｇ２および１Ｅ９は、ＣＤ７３の下方調整を引き起こしたが、抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１のうち、細胞表面ＣＤ７３の減少を引き起こしたものはなかった。 図７は、ヒトＣＤ７３の突然変異体を発現する細胞における、フローサイトメトリーによる抗体の滴定を示す。抗体３Ｃ１２は、野生型ＣＤ７３および突然変異体２に結合するが、突然変異体３には結合せず、一方で抗体ＡＤ２は野生型ＣＤ７３および突然変異体３に結合するが、突然変異体２には結合しない。 図８Ａは、「開いた」または「閉じた」立体構造の両方で示される（白丸）、突然変異体２において突然変異しているアミノ酸（ＡＤ２による結合喪失）があるＣＤ７３二量体の分子構造を示す。図８Ｂは、「開いた」または「閉じた」立体構造の両方で示される、突然変異体３において突然変異しているアミノ酸（１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１による結合の喪失）があるＣＤ７３二量体の分子構造を示す。活性部位はボックス（点線）により示す。
定義
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味し得る。請求項で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と組み合わせて使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」という語は、１または１を超えるものを意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第二またはそれを超えるものを意味し得る。
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、任意選択により、「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」により置き換えられ得る。
ＮＴ５Ｅ遺伝子によりコードされる、エクト－５’－ヌクレオチダーゼとして、および５－プライム－リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．３．５としても知られるヒトＣＤ７３は、５’－ヌクレオチダーゼ、特にＡＭＰ－、ＮＡＤ－およびＮＭＮ－ヌクレオシダーゼ活性を示す。ＣＤ７３は、中性ｐＨでプリン５－プライムモノヌクレオチドからヌクレオシドへの変換を触媒し、好ましい基質はＡＭＰである。この酵素は、原形質膜の外面にグリコシルホスファチジルイノシトール結合により結合される２つの同一である７０ｋＤサブユニットの二量体からなる。アミノ酸１～２６にシグナル配列を含むヒトＣＤ７３タンパク質前駆体（単量体）のアミノ酸配列は、全体的な開示が参照により本明細書中に組み込まれる、受入番号ＮＰ＿００２５１のもとＧｅｎｂａｎｋで示され、次のとおりである：
Figure 0007132981000001
本明細書中での関連において、「ＣＤ７３の酵素活性を中和する」は、ＣＤ７３の５’－ヌクレオチダーゼ（５’－エクトヌクレオチダーゼ）活性が阻害される過程を指す。これは、とりわけアデノシンのＣＤ７３介在性の産生の阻害、すなわちＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応の阻害を含む。これは、例えば、直接的または間接的に、の何れかで、試験化合物がＡＭＰからアデノシンへの変換を阻害する能力を測定する細胞不含アッセイにおいて測定し得る。ある実施形態において、抗体標品は、例えば本明細書中に記載のアッセイに関して、ＡＭＰからアデノシンへの変換の少なくとも５０％の減少、ＡＭＰからアデノシンへの変換の少なくとも７０％の減少、またはＡＭＰからアデノシンへの変換の少なくとも８０％の減少を引き起こす。
この明細書全体内で抗ＣＤ７３結合剤（例えば抗体）に関して「癌の処置」などに言及する場合は常に、（ａ）癌の処置の方法であって、このような処置を必要とする個体、哺乳動物、特にヒトに、癌の処置を可能にする用量で、（治療的有効量）、好ましくは本明細書中で指定されるような用量（量）で、（少なくとも１回の処置に対して）（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質中で）抗ＣＤ７３結合剤を投与する段階を含む方法；（ｂ）癌の処置のための抗ＣＤ７３結合剤の使用またはこの処置での使用のための抗ＣＤ７３結合剤（特にヒトにおいて）；（ｃ）癌の処置用の医薬標品の製造のための抗ＣＤ７３結合剤の使用、抗ＣＤ７３結合剤を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、癌の処置用の医薬標品の製造のための抗ＣＤ７３結合剤を使用する方法または、癌の処置に適切である有効用量の抗ＣＤ７３結合剤を含む医薬標品；または（ｄ）本願が提出される国で特許を得ることを可能とする主題に従う、ａ）、ｂ）およびｃ）の何れかの組み合わせを意味する。
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインのタイプに依存して、抗体は５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのうち１つに割り当てられる。これらのうち一部は、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分類される。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１本の「軽」（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽および重鎖をそれぞれ指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」とそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。ＩｇＧは、生理学的状況において最も共通する抗体であるので、および実験室で最も容易に作製されるので、本明細書中で使用される抗体の代表的なクラスである。任意選択により、本抗体はモノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒトまたはそうでなければヒトに適切な抗体である。「抗体」はまた、本明細書中に記載の抗体の何れかの何らかの断片または誘導体も含む。
「特異的に結合する」という語は、単離標的細胞の表面上に存在するタンパク質、その中のエピトープまたはネイティブタンパク質の何れかの組み換え形態を用いて評価した場合に、抗体が好ましくは競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばＣＤ７３に結合し得ることを意味する。競合的結合アッセイおよび特異的な結合を決定するための他の方法を以下でさらに記載するが、これらは当技術分野で周知である。
抗体が特定のモノクローナル抗体「と競合する」と言われる場合、これは、本抗体が、組み換えＣＤ７３分子または表面発現ＣＤ７３分子の何れかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいて参照抗体のＣＤ７３ポリペプチドまたはＣＤ７３発現細胞への結合を減少させる場合、本抗体は、参照抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
「親和性」という用語は、本明細書中で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定められる解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）で見出すことができ、この参考文献は、全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知のある標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析によるなど）の使用である。
本明細書の文脈内で、「決定基」はポリペプチド上の相互作用または結合の部位を指す。
「エピトープ」という用語は、抗原性決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリアまたは領域である。タンパク質エピトープは、直接結合に関与するアミノ酸残基ならびに特異的な抗原結合抗体またはペプチドにより効果的に遮断されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば抗体または受容体と組み合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態または最小構造領域である。エピトープは、直鎖状または立体構造／構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で隣接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「立体構造または構造エピトープ」という用語は、全てが隣接しておらず、したがって分子の折り畳みにより互いに対して近接するようになるアミノ酸の直鎖状配列の分離部分を表す（二次、三次および／または四次構造）アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造エピトープは三次元構造に依存する。したがって「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。
「枯渇させる（ｄｅｐｌｅｔｅ）」または「枯渇させること（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）」という用語は、ＣＤ７３発現細胞に関して、結果として、試料または対象中に存在するこのようなＣＤ７３発現細胞の数に負の影響を与えるように、死滅させる、排除する、溶解する、またはこのような死滅、排除もしくは溶解の誘導を引き起こす、過程、方法または化合物を意味する。
「内部移行」という用語は「細胞内内部移行」と交換可能に使用され、細胞外細胞表面から分子を細胞内細胞表面に移行させる過程と関連する、分子的、生化学的および細胞事象を指す。分子の細胞内内部移行に関与する過程は周知であり、とりわけ細胞外分子（ホルモン、抗体および小さい有機分子など）；膜結合性分子（細胞表面受容体など）；および細胞外分子に結合される膜結合性分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合されるリガンドまたは膜結合性分子に結合される抗体）の内部移行を含み得る。したがって、「内部移行を誘導するおよび／または増加させる」は、細胞内内部移行が開始され、および／または細胞内内部移行の速度および／または程度が上昇する事象を含む。
「薬剤」という用語は、本明細書中で、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子または生体物質から作製される抽出物を指すために使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
本明細書中での目的のために、「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合される抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するために設計される。このような抗体は、抗原負荷に反応して特異的なヒト抗体を作製させるために「操作」されている、トランスジェニックマウスまたは他の動物から入手し得る（例えば、全体的な教示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９を参照）。全て当技術分野で公知である、遺伝学的または染色体導入法ならびにファージディスプレイ技術によって、完全ヒト抗体も構築し得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３を参照）。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても作製し得る（例えば、参照によりそれらの全体において組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは改変されているクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域またはそれらの一部が、改変され、置き換えられ、または交換されているか；または（ｂ）可変領域またはそれらの一部が、改変され、置き換えられ、または異なるかもしくは改変されている抗原特異性を有する可変領域と交換されている、抗体分子である。
「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば軽鎖可変ドメイン中の、残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中の、３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら１９９１）および／または「超可変ループ」からの残基（例えば軽鎖可変ドメイン中の、残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中の、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１－９１７）または抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系からのアミノ酸残基を含む。一般的には、この領域中のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔら、前出に記載の方法により行われる。「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基付番」および「Ｋａｂａｔによる」などの句は、本明細書中で、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに対するこの付番系を指す。Ｋａｂａｔ付番系を用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応する少数のまたはさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に１個のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後に残基の挿入（例えばＫａｂａｔによる、残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列での抗体の配列の相同性の領域でのアライメントにより、ある一定の抗体に対して決定され得る。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＲとして定められる領域を除く、抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離される隣接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）にさらに分けられ得る。
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０～約ａａ４５０からの、抗体重鎖のＣ末端断片、または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、εおよびμ）におけるその対応配列またはその天然のアロタイプを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対する一般的に受容されるＫａｂａｔアミノ酸付番がこの開示を通じて使用される（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照）。
「単離」、「精製」または「生物学的に純粋」という用語は、実質的にまたは基本的に、そのネイティブ状態で見られるような通常それに付随する成分を含まない物質を指す。純度および均一性は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析学的化学技術を用いて決定される。標品中に存在する主要な種であるタンパク質は実質的に精製されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然のアミノポリマーおよび非天然のアミノポリマーに適用される。
「組み換え」という用語は、例えば細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の改変により修飾されているか、または細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞のネイティブ（非組み換え）形態内では見いだされない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないかまたは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
本明細書の文脈内で、ポリペプチドまたはエピトープに「結合」する抗体という用語は、特異性および／または親和性をもって前記の決定基に結合する抗体を指す。
「同一性」または「同一である」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、一連の２個以上のアミノ酸残基の間の一致数により決定される場合の、ポリペプチド間の配列関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により扱われるギャップアライメント（もしあれば）を用いた２つ以上の配列のうちより小さいものの間の完全な一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられるが限定されない。
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の一致が最大となるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．），ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
抗体の産生
癌の処置のために使用し得る抗ＣＤ７３剤は、ヒトＣＤ７３ポリペプチドの細胞外部分に結合し、細胞、例えば腫瘍細胞の表面上で発現されるＣＤ７３の酵素活性を中和する。ある実施形態において、本剤は、ＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を阻害する。ある実施形態において、本抗体は、ＣＤ７３介在性のアデノシン生成を阻害する。ある実施形態において、本抗体は、ＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応を阻害する。ある実施形態において、本抗体は、リンパ球活性（例えばＴ細胞）のアデノシン介在性の阻害を阻害する。ある実施形態において、本抗体は、ＣＤ７３上で酵素活性部位に結合し、および／またはこれを阻害する。ある態様において、本剤は、全長抗体、抗体断片および合成または半合成抗体由来分子から選択される抗体である。
ある態様において、本剤は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体から選択される抗体である。
ある態様において、本剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される定常ドメインを含む抗体の断片である。
ある態様において、本剤は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、重鎖Ｉｇ（ラマまたはラクダＩｇ）、ＶＨＨ断片、シングルドメインＦＶおよび１本鎖抗体断片から選択される抗体断片である。
ある態様において、本剤は、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディー、ダイアボディ、トリアボディー、カッパボディー、ＩｇＮＡＲから選択される、合成または半合成抗体由来分子；および多特異性抗体である。
したがって、本開示は、ＣＤ７３に結合する、抗体または他の抗原結合剤に関する。
ある態様において、本抗体は、少なくとも部分的に精製された形態である。
ある態様において、本抗体は、基本的に単離形態である。
本抗体は、当技術分野で公知の様々な技術により作製し得る。一般的には、これらは、ＣＤ７３ポリペプチド、好ましくはヒトＣＤ７３ポリペプチドを含む免疫原での非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫付与によって作製される。ＣＤ７３ポリペプチドは、ヒトＣＤ７３ポリペプチドの全長配列またはその断片もしくは誘導体、一般的には免疫原性断片、すなわち、ＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞の表面に露出したエピトープを含むポリペプチドの部分を含み得る。このような断片は、一般的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７連続アミノ酸、さらにより好ましくはその少なくとも約１０連続アミノ酸を含有する。断片は、一般的には、基本的に受容体の細胞外ドメイン由来である。ある実施形態において、免疫原は、脂質膜中、一般的には細胞の表面の、野生型ヒトＣＤ７３ポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、免疫原は、任意選択により処理されるかまたは溶解される、インタクトな細胞、特にインタクトなヒト細胞を含む。他の実施形態において、本ポリペプチドは組み換えＣＤ７３ポリペプチドである。
非ヒト哺乳動物に抗原で免疫付与する段階は、マウスにおいて抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の何らかの方式で行われ得る（例えば、その全体的な開示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照）。任意選択により完全または不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントとともに、免疫原を緩衝液中で懸濁するかまたは溶解させる。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための方法は、当業者にとって周知であり、何ら限定していない。これらのパラメーターは、異なる免疫原に対して異なり得るが、容易に明らかとなる。
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫付与の位置および頻度も当技術分野で周知である。典型的な免疫付与プロトコールにおいて、第１日に非ヒト動物に抗原を腹腔内注射し、約１週間後に再び注射する。この後、第２０日前後に、任意選択により不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントとともに、抗原のリコール注射を行う。リコール注射は、静脈内で行い、数日連続して反復し得る。この後、第４０日に、静脈内または腹腔内の何れかで、一般的にはアジュバントなしで、ブースター注射を行う。このプロトコールの結果、約４０日後、抗原特異的な抗体産生Ｂ細胞が生成する。結果として免疫付与で使用した抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の生成が起こる限り、他のプロトコールも使用し得る。
ポリクローナル抗体調製の場合、免疫付与非ヒト動物から血清を得て、周知の技術によりその中に存在する抗体を単離する。ＣＤ７３ポリペプチドと反応する抗体を得るために、固体支持体上に連結される上記の免疫原の何れかを使用して、血清をアフィニティー精製し得る。
代替的な実施形態において、非免疫付与非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、インビトロで増殖させ、次いで細胞培養中で免疫原に曝露する。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合段階を行う。
モノクローナル抗体の場合、次の段階は、免疫付与した非ヒト哺乳動物から脾臓細胞を単離し、続いて、抗体産生ハイブリドーマを形成させるために、不死化細胞とこれらの脾臓細胞を融合させることである。非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離は当技術分野で周知であり、一般的には、麻酔下の非ヒト哺乳動物から脾臓を摘出し、それを切って小片にし、単一の細胞懸濁液を生成させるために、細胞ストレイナーのナイロンメッシュを通じて脾膜から脾臓細胞を適切な緩衝液中に圧搾することを含む。この細胞を洗浄し、遠心し、あらゆる赤血球細胞を溶解する緩衝液中で再懸濁する。溶液を再び遠心し、ペレット中の残留リンパ球を新鮮な緩衝液中で最終的に再懸濁する。
単離し、単一細胞懸濁液中に入れたら、リンパ球を不死細胞株に融合させ得る。これは、一般的にはマウス骨髄腫細胞株であるが、ハイブリドーマを作製するのに有用な多くの他の不死細胞株が当技術分野で公知である。マウス骨髄腫株としては、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＭＯＰＣ－２１およびＭＰＣ－１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ａから入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３およびＳＰ－２細胞由来のものが挙げられるが限定されない。融合はポリエチレングリコールなどを使用して達成される。次いで、未融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する選択培地中で、得られたハイブリドーマを増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、一般的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
ハイブリドーマは、一般的にはマクロファージのフィーダー層上で増殖させる。マクロファージは、脾臓細胞を単離するために使用される、好ましくは非ヒト哺乳動物の同腹仔からのものであり、一般的にはハイブリドーマを播種する数日前に不完全フロインドアジュバントなどで刺激する。融合方法は、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）に記載されている。
コロニー形成および抗体産生のために十分な時間にわたり選択培地中で細胞を増殖させる。これは通常、約７～約１４日の間である。
次いで、ＣＤ７３ポリペプチド遺伝子産物に特異的に結合する抗体産生についてハイブリドーマコロニーをアッセイする。このアッセイは、一般的には、比色分析ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマを増殖させるウェルに適合させ得るあらゆるアッセイを使用し得る。他のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイまたは蛍光励起細胞分取が挙げられる。１つ以上の別個のコロニーが存在するか否かを決定するために、所望の抗体産生について陽性であるウェルを調べる。複数のコロニーが存在する場合、単一細胞のみが所望の抗体を産生するコロニーを生じさせていることを確実にするために、細胞を再クローン化し、増殖させ得る。一般的には、抗体はまた、ＣＤ７３ポリペプチド、例えばＣＤ７３発現細胞に結合する能力についても試験され得る。
モノクローナル抗体を産生することが確認されるハイブリドーマを、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０などの適切な培地中でより大量に増殖させ得る。あるいは、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させ得る。
所望のモノクローナル抗体を産生させるのに十分な増殖後、モノクローナル抗体を含有する増殖培地（または腹水）を細胞から分離して除き、その中に存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は一般的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡもしくはプロテインＧ－セファロースを使用したクロマトグラフィーまたはアガロースもしくはセファロースビーズなどの固体支持体に連結される抗マウスＩｇによって達成される（例えば、開示が参照により本明細書によって組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８－１０３７－４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに全て記載されている）。結合される抗体は、一般的には、抗体含有分画の即時の中和とともに低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシンまたは酢酸緩衝液）を使用することによって、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出される。これらの分画をプールし、透析し、必要に応じて濃縮する。
一般的には単一の明らかなコロニーがある陽性ウェルを再びクローン化し、再アッセイして、１つのモノクローナル抗体のみが検出され、産生されていることを保証する。
抗体は、例えば（全体的な開示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されるような免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリの選択によっても作製され得る。
ＣＤ７３、特に実質的にまたは基本的にモノクローナル抗体１Ｅ１１、８Ｃ７または６Ｅ１と同じエピトープに結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体競合が評価され得る様々な免疫学的スクリーニングアッセイの何れか１つを用いて容易に決定し得る。多くのこのようなアッセイは、日常的に実施され、当技術分野で周知である（例えば参照により本明細書中に特に組み込まれる、１９９７年８月２６日発行の米国特許第５，６６０，８２７号明細書を参照）。本明細書中に記載の抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、本明細書中に記載のモノクローナル抗体と同じまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定するのに何ら必要とされないことを理解されたい。
例えば、調べようとする試験抗体は、異なるソースの動物から得られるか、または異なるＩｇアイソタイプのものでもある場合、対照（例えば１Ｅ１１、８Ｃ７または６Ｅ１）および試験抗体を混合し（または予め吸着させ）、ＣＤ７３ポリペプチドを含有する試料に適用する、単純な競合アッセイを使用し得る。ウエスタンブロッティングおよびＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用に基づくプロトコールは、このような競合実験での使用に適切である。
ある一定の実施形態において、ＣＤ７３抗原試料に適用する前のある時間、対照抗体（例えば１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）を様々な量の試験抗体と予め混合する（例えば、約１：１０または約１：１００）。他の実施形態において、対照および様々な量の試験抗体をＣＤ７３抗原試料への曝露中に単純に混合し得る。（例えば未結合抗体を排除するための分離または洗浄技術を使用することによって）遊離抗体から結合抗体を、（例えば種特異的なまたはアイソタイプ特異的な二次抗体を使用することにより、または検出可能標識で１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１を特異的に標識することにより）試験抗体から１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１を区別し得る限り、試験抗体が１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の抗原への結合を減少させるか否かを判定し得、これは、試験抗体が１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と実質的に同じエピトープを認識することを示す。完全に無関係な抗体の非存在下での（標識化）対照抗体の結合は、対照高値となり得る。対照低値は、標識化（１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）抗体を完全に同じタイプの（１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）非標識抗体と温置することによって得られ得るが、この温置時に競合が起こり、標識抗体の結合が減少する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での標識化抗体の反応性の顕著な低下は、実質的に同じエピトープを認識する試験抗体、すなわち標識化（１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）抗体と「交差反応する」かまたは競合するエピトープを認識する試験抗体を示す。約１：１０～約１：１００の間の１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１：試験抗体の何れかの比率でＣＤ７３抗原への１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の結合を少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％またはより好ましくは少なくとも約８０％または９０％（例えば約６５～１００％）減少させる何らかの試験抗体は、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と実質的に同じエピトープまたは決定基と結合する抗体であるとみなされる。好ましくは、このような試験抗体は、少なくとも約９０％（例えば約９５％）、ＣＤ７３抗原への１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の結合を減少させる。
例えばフローサイトメトリー試験により競合を評価することもできる。このような試験において、ある種のＣＤ７３ポリペプチドを保有する細胞を最初に例えば１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と温置し、次いで蛍光色素またはビオチンで標識した試験抗体と温置し得る。本抗体は、飽和量の１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１との予備温置時に得られる結合が、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１との予備温置を行わずに抗体により得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％またはそれ以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）（蛍光手段により測定される場合）である場合、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と競合すると言われる。あるいは、抗体は、飽和量の試験抗体と予備温置された細胞上で（蛍光色素またはビオチンによる）標識化１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１抗体とともに得られる結合が、試験抗体との予備温置を行わずに得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％またはそれ以下（例えば約３０％、２０％または１０％）である場合、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と競合すると言われる。
試験抗体が予め吸着され、ＣＤ７３抗原が固定化される表面に飽和濃度で適用される単純な競合アッセイも使用し得る。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析に適切な他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）をＣＤ７３飽和濃度で表面と接触させ、ＣＤ７３および対照抗体の表面結合を測定する。対照抗体のこの結合を試験抗体の非存在下でのＣＤ７３含有面への対照抗体の結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるＣＤ７３含有面の結合の顕著な減少は、試験抗体が対照抗体と実質的に同じエピトープを認識し、試験抗体が対照抗体と「交差反応する」ようになることを示す。少なくとも約３０％またはそれ以上、好ましくは約４０％、ＣＤ７３抗原への、対照（１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１など）抗体の結合を減少させる何らかの試験抗体は、対照（例えば、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であるとみなされ得る。好ましくは、このような試験抗体は、少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、少なくとも約７０％またはそれ以上）、ＣＤ７３抗原への対照抗体（例えば、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）の結合を減少させる。当然のことながら、対照および試験抗体の順序は逆転し得：すなわち、対照抗体を最初に表面に結合させ得、試験抗体をその後に競合アッセイにおいて表面と接触させる。好ましくは、ＣＤ７３抗原に対してより高い親和性を有する抗体は、（抗体が交差反応することが推測される）第二の抗体に対して見られる結合の減少がより大きい規模であると予想されるので、最初に表面と結合させる。このようなアッセイのさらなる例は、例えば、開示が参照により本明細書中に組み込まれるＳａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：３３－４１で提供される。
本抗体は、ＣＤ７３陽性細胞の発現を特徴とする疾患を有する個体、すなわち抗ＣＤ７３抗体を用いた本明細書中に記載の方法の１つによる処置に対する候補である個体からのＣＤ７３発現細胞に結合する。したがって、細胞上でＣＤ７３を特異的に認識する抗体を得たら、任意選択によりこれをＣＤ７３陽性細胞（例えば癌細胞）へのその結合能について試験し得る。特に、治療が患者において有益である可能性を最大にするために、本抗体の１つで患者を処置する前に、任意選択により、例えば血液試料または腫瘍生検において、本抗体がその患者から採取した悪性細胞に結合する能力を試験し得る。
ある実施形態において、ＣＤ７３発現細胞、例えば悪性細胞に結合するそれらの能力を試験するために、本抗体を免疫アッセイにおいて確認する。例えば、血液試料または腫瘍生検を行い、腫瘍細胞を回収する。次いで、当業者にとって周知の標準的方法を使用して、ある種の抗体の細胞への結合能を評価する。抗体は、例えば、個体または患者のかなりのパーセンテージ（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上）からの、ＣＤ７３を発現することが知られている細胞、例えば腫瘍細胞、のかなりの割合（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上）に結合し得る。例えば患者が、抗ＣＤ７３剤での処置にまたは本明細書中に記載の治療方法での使用に適切であるか否かを評価するためのバイオマーカーとして、患者における悪性細胞の存在またはレベルを判定するための診断目的で抗体を使用し得る。細胞への抗体の結合を評価するために、抗体を直接的または間接的の何れかで標識し得る。間接的に標識される場合、標識化二次抗体が一般的に添加される。
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの判定は、当業者にとって公知のように行い得る。このようなマッピング／特徴評価方法の一例として、抗ＣＤ７３抗体に対するエピトープ領域は、ＣＤ７３タンパク質における露出アミン／カルボキシルの化学修飾を用いて、エピトープ「フットプリンティング」により決定され得る。このようなフットプリンティング技術のある具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析により検出される水素－重水素交換）の使用であり、ここで受容体およびリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合および逆交換が起こり、タンパク質結合に関与する骨格アミド基は、逆交換から保護され、したがって重水素化されたままとなる。関連領域は、この点でペプシン性のタンパク質分解、ファストマイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定され得る。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２－２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．およびＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ－２６５Ａを参照。適切なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、一般的には遊離抗原および抗体などの抗原結合ペプチドと複合体形成する抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、一般的には、１５Ｎで選択的に同位体標識され、抗原に対応するシグナルのみがＮＭＲ－スペクトルで見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが見られないようになる。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸由来の抗原シグナルは一般的に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルにおいて位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのように同定され得る。例えばＥｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９－６７；Ｈｕａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１－６７（１９９８）；およびＳａｉｔｏおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６ Ｊｕｎ；９（３）：５１６－２４を参照。
エピトープマッピング／特徴評価は質量分析方法を用いて行うこともできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００ Ａｐｒ；３５（４）：４９３－５０３およびＫｉｓｅｌａｒおよびＤｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｍａｙ １；７１（９）：１７９２－１８０１を参照。プロテアーゼ消化技術もエピトープマッピングおよび同定との関連で有用であり得る。抗原性決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化によって、例えばＣＤ７３に対して約１：５０の比率でトリプシンを使用することによって、またはｐＨ７－８でｏ／ｎ消化を使用することによって、続いてペプチド同定のために質量分析（ＭＳ）を行うことによって決定し得る。続いて、抗ＣＤ７３結合物によりトリプシン切断から保護されるペプチドは、トリプシン消化に供した試料および抗体と温置し、続いて例えばトリプシン（それにより結合物に対するフットプリントが明らかになる）による消化に供した試料の比較により同定し得る。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素も、またはあるいは同様のエピトープ特徴評価方法で使用し得る。さらに、酵素性消化によって、可能性のある抗原性決定基配列が表面に露出していない、したがっておそらく免疫原性／抗原性について関連がないと思われるＣＤ７３ポリペプチドの領域内にあるか否かを分析するための迅速な方法が提供され得る。
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープを明らかにするのに有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置き換え、結合親和性に対する結果を測定する。突然変異が結合親和性の顕著な低下につながる場合、おそらく結合に関与すると思われる。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、折り畳まれていないタンパク質に結合しない抗体）を使用して、アラニン置換がタンパク質の全体的な折り畳みに影響しないことを確認し得る。例えば、ＣｌａｃｋｓｏｎおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５；２６７：３８３－３８６；およびＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１－６を参照。
エピトープ「フットプリンティング」のために電子顕微鏡も使用し得る。例えば、Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５５：２７５－２７８は、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成およびＸ結晶学の同時適用を使用して、ネイティブササゲモザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂ断片の物理学的フットプリントを決定した。
エピトープ評価のための「標識不含」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）および反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９０；３：２０８－１４；Ｎｉｃｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９－１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８－３３１１；Ｋｒｏｅｇｅｒら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００２；１７：９３７－９４４を参照。
ある抗体と同じであるかまたは実質的に同じであるエピトープに結合する抗体が本明細書中に記載の代表的な競合アッセイのうち１つ以上で同定され得ることも注意すべきである。
脊椎動物または細胞での免疫付与および抗体産生時に、主張されるような抗体を単離するために特定の選択段階を行い得る。この点において、具体的な実施形態において、本開示はまた、このような抗体を作製する方法にも関し、この方法は、（ａ）ＣＤ７３ポリペプチドを含む免疫原で非ヒト哺乳動物に免疫付与し；（ｂ）前記の免疫付与動物から抗体を調製し；（ｃ）ＣＤ７３に結合可能な抗体を段階（ｂ）から選択することを含む。
一般的には、本明細書中で提供される抗ＣＤ７３抗体の、ＣＤ７３ポリペプチド（例えばＣＤ７３ホモ二量体として）に対する親和性は、約１０４～約１０１１Ｍ－１（例えば，約１０８～約１０１０Ｍ－１）の範囲である。例えば、特定の態様において、本開示は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によるなど）で決定した場合、ＣＤ７３に関して平均解離定数（ＫＤ）が１ｘ１０－９Ｍ未満である抗ＣＤ７３抗体を提供する。より特定の代表的な態様において、本開示は、ＣＤ７３に対してＫＤが約１ｘ１０－８Ｍ～約１ｘ１０－１０Ｍまたは約１ｘ１０－９Ｍ～約１ｘ１０－１１Ｍである抗ＣＤ７３抗体を提供する。
抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５または１ナノモル濃度を超えない（すなわちより良好な親和性）、好ましくはナノモル濃度より小さいかまたは任意選択により約５００、２００、１００または１０ピコモル濃度を超えない平均ＫＤを特徴とし得る。ＫＤは、例えば組み換え産生ヒトＣＤ７３タンパク質をチップ表面上に固定化し、続いて、溶液中の試験しようとする抗体を適用することによって決定し得る。ある実施形態において、本方法は、ＣＤ７３への結合について抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と競合可能である抗体を（ｂ）から選択する、段階（ｄ）をさらに含む。
実施形態の何れかのある態様において、本方法に従い調製される抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、本明細書中の方法に従い抗体を作製するために使用される非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギまたはヒツジなどである。
ＣＤ７３ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主への遺伝子移入のために適切な発現ベクターに入れる。次いで、抗体またはそれらの変異体、例えばそのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体または検出可能部分を含むバージョンの組み換え産生のために宿主を使用する。
本開示のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、例えば、抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１は、従来の手順を使用して、容易に単離し、配列決定し得る（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。ある態様において、本明細書中の何れかの実施形態の抗ＣＤ７３抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸が提供される。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ得、次いで、組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るために、これを、そのままでは免疫グロブリンタンパク質を産生しない、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子移入する。本明細書中の他所に記載されるように、多数の目的の何れかのために、例えば抗体をヒト化する、断片もしくは誘導体を作製するために、または例えば抗体の結合特異性を最適化するために抗原結合部位において抗体の配列を修飾するために、このようなＤＮＡ配列を修飾し得る。ある実施形態において、抗体（例えば１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１）の軽鎖および／または重鎖をコードする単離核酸配列ならびに（例えばそのゲノムにおいて）このような核酸を含む組み換え宿主細胞が提供される。抗体をコードするＤＮＡの細菌中の組み換え発現は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）を参照）。
任意選択により、本開示の抗体は、抗体７Ｇ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）、抗体４Ｇ４（Ａｂｃａｍ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｆ．ａｂ８１７２０）、抗体ＡＤ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃｏｒｐ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｆ．３４４００４）、抗体１Ｅ９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｃ－３２２９９）、米国特許出願第２０１４／０２３５８３３号明細書に記載の０６７－２１３抗体、Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒら（（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １７：９９３－９９８および／またはＲｕｓｔら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ １２：１１で言及される抗ＣＤ７３抗体またはＨｕａｎｇら（２０１５）ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ；Ａｂｓｔｒａｃｔ １５３８で言及される抗体ＭＥＤＩ９４４７（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｒｐ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）または前出のものの誘導体、例えば抗原結合領域または重および／または軽鎖ＣＤＲの全体または一部を含むものの何れか１つ以上以外の抗体であると規定され得る。他の実施形態において、上述の抗体は、抗体の性質に依存して、本開示の抗体の特徴を有するように修飾され得る。
ＣＤ７３に結合可能であり、および／または他の所望の特性を有することが可能な抗体が同定されたら、一般的には、これらの、無関係なポリペプチドを含む他のポリペプチドへの結合能について、本明細書中に記載のものを含む標準的な方法を使用してこれらも評価する。理想的には、本抗体はかなりの親和性でＣＤ７３にのみ結合し、無関係のポリペプチドまたは５’－ヌクレオチダーゼファミリーの他のポリペプチドに対して顕著なレベルで結合しない。しかし、当然のことながら、ＣＤ７３に対する親和性が他の無関係なポリペプチドに対する親和性よりも実質的に大きい限り（例えば、１０ｘ、１００ｘ、５００ｘ、１０００ｘ、１０，０００ｘまたはそれ以上）、抗体は、本方法での使用に適切である。
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、それらがヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４の何れか１つ以上、に対して実質的な特異的結合を有さないように調製し得る。このような抗体は、Ｆｃγ受容体に結合しないことが知られている様々な重鎖の定常領域を含み得る。あるこのような例は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域（ＩｇＧ４は最小のＦｃγ受容体結合を有する）である。ヒトＩｇＧ４定常領域は、Ｆａｂアーム交換を防ぐことによって、インビボでの二価結合能を保持するために、Ｓ２２８Ｐ（Ｓ２４１Ｐ）置換）を安定化することをさらに含み得る。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２断片など、定常領域を含まない（またはその一部を含む）抗体断片は、Ｆｃ受容体結合を回避するために使用し得る。Ｆｃ受容体結合は、例えばＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおいてＦｃ受容体タンパク質への抗体の結合を試験することを含む、当技術分野で公知の方法に従い評価し得る。また、一般に、Ｆｃ受容体への結合を最小化するかまたは排除するために（例えば１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換を導入することにより）Ｆｃ部分が修飾されている何れかの抗体ＩｇＧアイソタイプを使用し得る（例えば、開示が参照により本明細書中に組み込まれる、国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットを参照）。Ｆｃ受容体結合を評価するための、細胞に基づくアッセイなどのアッセイは、当技術分野で周知であり、例えば国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットに記載されている。
ある実施形態において、本抗体は、エフェクター細胞との相互作用が最小限である「Ｆｃサイレント」抗体を生じさせる、Ｆｃ領域における１個以上の特異的な突然変異を含み得る。抑制化エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域における突然変異によって得られ得、当技術分野に記載されている：Ｎ２９７Ａ突然変異、ＬＡＬＡ突然変異、（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５－６９１）；およびＤ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏら、２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：６６６４－６９）、Ｈｅｕｓｓｅｒら、国際公開第２０１２／０６５９５０号パンフレットを参照するが、これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる。ある実施形態において、抗体は、ヒンジ領域において１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２であり、残基２３３－２３６、任意選択により２３３～２３８（ＥＵ付番）で１、２または３個の置換を含む。ある実施形態において、本抗体はＩｇＧ４であり、残基３２７、３３０および／または３３１（ＥＵ付番）で１、２または３個の置換を含む。サイレントＦｃ ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列においてＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含むＬＡＬＡ突然変異体である。Ｆｃサイレント突然変異の別の例は、例えばＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）突然変異としてＩｇＧ１抗体において使用される場合の、残基Ｄ２６５での、またはＤ２６５およびＰ３２９での突然変異である（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、残基Ｎ２９７（例えばＮ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｓ突然変異）で突然変異を含み、その結果、アグリコシル化／非グリコシル化抗体が生じる。他のサイレント突然変異としては、残基Ｌ２３４およびＧ２３７での置換（Ｌ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ）；残基Ｓ２２８、Ｌ２３５およびＲ４０９での置換（Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｔ、Ｍ、Ｌ）；残基Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０およびＡ３３１での置換（Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ）；残基Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９およびＰ２３８での置換（Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ）；残基Ｃ２２６、Ｃ２２９、Ｅ２３３、Ｌ２３４およびＬ２３５（Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａでの置換；残基Ｋ３２２、Ｌ２３５およびＬ２３５での置換（Ｋ３２２Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）；残基Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３３１での置換（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）；残基２３４、２３５および２９７での置換；残基Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２での置換（Ｌ２３５Ｅ／Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａ）；残基（Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ）での置換；残基２４３および２６４での置換；残基２９７および２９９での置換；ＥＵ付番系により定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７および２３８がＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳおよびＳＡＡＡＳから選択される配列を含むような置換（国際公開第２０１１／０６６５０１号パンフレットを参照）が挙げられる。
Ｆｃサイレント抗体によりＡＤＣＣ活性がなくなるかまたは低くなり、これは、Ｆｃサイレント抗体が、５０％を下回る特異的細胞溶解であるＡＤＣＣ活性を示すことを意味する。好ましくは、抗体は、実質的にＡＤＣＣ活性を欠き、例えばＦｃサイレント抗体は、５％を下回るかまたは１％を下回るＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）を示す。Ｆｃサイレント抗体の結果また、ＣＤ７３発現面でのＣＤ７３のＦｃγＲ介在性の架橋が欠如し得る。
ある実施形態において、本抗体は、重鎖定常領域において、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０、３３１および４０９（重鎖定常領域での残基の付番はＫａｂａｔに従うＥＵ付番によるものである）からなる群から選択される、何れか１、２、３、４、５個またはそれ以上の残基で置換を有する。ある実施形態において、本抗体は、残基２３４、２３５および３２２で置換を含む。ある実施形態において、本抗体は、残基２３４、２３５および３３１で置換を有する。
ある実施形態において、Ｆｃサイレント抗体は、残基２３４、２３５および３３１でアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含み、例えば「ＴＭ」突然変異は、置換Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓを有する。ある実施形態において、本抗体は、米国特許出願第２０１５／０１２５４４４号明細書に記載の、残基２３４、２３５および３２２で、または残基２３４、２３５および３３１でアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含み、ここで残基２３４はＦ（フェニルアラニン）；残基２３５はアラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グルタミン（Ｑ）またはバリン（Ｖ）；残基３２２はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）；および残基３３１はアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）である。アミノ酸残基はＫａｂａｔに従うＥＵ付番に従い示される。
ある実施形態において、本抗体は、抗体のインビボ半減期を延長させるためにヒトＦｃＲｎポリペプチドへの結合を増加させるアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。代表的な突然変異は、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５－６９１に記載され、その開示は参照により本明細書中に組み込まれる。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体で使用される置換の例は、残基Ｍ２５２、Ｓ２５４およびＴ２５６での置換；残基Ｔ２５０およびＭ４２８での置換；残基Ｎ４３４での置換；残基Ｈ４３３およびＮ４３４での置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０およびＮ４３４での置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０およびＮ４３４での置換；残基Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４および４３６での置換；残基Ｉ２５３での置換；残基Ｐ２５７、Ｎ４３４、Ｄ３７６およびＮ４３４での置換である。
ある実施形態において、本抗体は、プロテアーゼによる切断への感受性低下をもたらすアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍発生と関連するプロテイナーゼの最も代表的なファミリーに相当する。癌細胞がＭＭＰを発現し得る一方で、細胞外ＭＭＰの大部分は、腫瘍に浸潤し、特異的な一連のプロテイナーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤をそれぞれ産生する様々なタイプの間質細胞により提供され、産生されたものは、細胞外間隙に放出され、腫瘍周囲の環境を特異的に変化させる。腫瘍微小環境に存在するＭＭＰは、ヒンジ領域内で抗体を切断し得るので、腫瘍部位内で機能するように設計されている治療用抗体の不活性化につながり得る。ある実施形態において、アミノ酸置換を含むＦｃドメインは、ＧｌｕＶ８、ＩｄｅＳ、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ－９）、マトリクスメタロプロテイナーゼ－７（ＭＭＰ－７）、ストロメリシン（ＭＭＰ－３）およびマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ－１２）からなる群から選択されるプロテアーゼの何れか１、２、３個またはそれ以上（または全て）による切断に対する感受性が低下している。ある実施形態において、切断に対する感受性が低下した抗体は、残基Ｅ２３３－Ｌ２３４および／またはＬ２３５でのアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。ある実施形態において、本抗体は、残基Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＧ２３６でアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。ある実施形態において、本抗体は、例えば、Ｅ２３３－Ｌ２３４－Ｌ２３５－Ｇ２３６配列がＰ２３３－Ｖ２３４－Ａ２３５により置換される（Ｇ２３６が欠失している）ように、１個以上の残基２３３～２３８でのアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。例えば、開示が参照により本明細書中に組み込まれる、国際公開第９９／５８５７２号パンフレットおよび同第２０１２０８７７４６号パンフレットを参照。
抗原結合化合物は、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する、とりわけＣＤ７３の５’－ヌクレオチダーゼ活性を遮断する、およびＣＤ７３発現細胞によるアデノシン産生を減少させ、次にリンパ球の活性を回復させ、および／またはリンパ球のアデノシン介在性の阻害を緩和する、その能力について何らかの所望の段階で評価し得る。
組み換え可溶性ヒトＣＤ７３（二量体として）およびＡＭＰを用いた細胞不含アッセイにおいて、抗体がＣＤ７３の酵素活性を阻害する能力を試験し得、ここでＡＭＰからアデノシンへの変換（および／またはその阻害）を直接（例えば基質および生成物、すなわちＡＭＰ、アデノシンおよび／またはリン酸の測定による）または間接的に検出する。一例において、ＡＭＰおよび／またはアデノシンは、組み換えＣＤ７３との試験化合物の温置前後にＨＰＬＣを介して検出される。組み換えＣＤ７３は、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手可能である。
抗体の阻害活性（すなわち細胞傷害性促進能）は、多くの他の方法の何れかでも評価し得る。例えば、間接的アッセイにおいて、ＡＭＰの消失を検出するために、ルシフェラーゼに基づく試薬を使用する（例えばＰｒｏｍｅｇａから入手可能なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）システム）。このアッセイにおけるルシフェラーゼ反応は、ＡＭＰにより阻害される。反応系にＣＤ７３酵素を添加することによって、ＡＭＰが分解され、阻害が緩和され、検出可能なシグナルが生じる（本明細書中の実施例２参照）。
可溶性ＣＤ７３を使用するアッセイは、ＣＤ７３ポリペプチド二量体に対してかなりのモル過剰量（例えば１０倍、２０倍、５０倍、１００倍など）で抗体が提供される条件で試験することを含む。酵素に対してモル過剰量で提供される場合、抗ＣＤ７３抗体は、抗体およびＣＤ７３二量体の多量体の複合体を形成できなくなり；ＣＤ７３の酵素活性の阻害を保持する抗体が選択され得る。
抗体がＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ酵素活性を阻害する能力は、あるいはまたはさらに、細胞アッセイ（ＣＤ７３を発現する細胞を使用）でも試験し得る。有利に、ＣＤ７３の内部移行を引き起こすことによりＣＤ７３を阻害する抗体を選択する可能性を低下させるため、酵素の活性を遮断する抗体を同定するために最初に細胞不含アッセイにおいて抗体を試験またはスクリーニングし得、次いで細胞アッセイにおいて精製抗体として試験し得る。細胞アッセイは、本明細書中の実施例で示されるように行い得る。例えば、ＣＤ７３発現細胞株（例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株）を抗ＣＤ７３抗体の存在下で平底９６ウェルプレートに播種し、温置する。ＡＭＰを細胞に添加し、４℃で温置する（ＣＤ７３下方調整を回避するため）。次いでプレートを遠心し、上清を平底９６ウェル培養プレートに移す。次に、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解により生成した遊離リン酸を定量する。抗体存在下でのＡＭＰからアデノシンへの加水分解の減少は、その抗体が細胞性ＣＤ７３を阻害することを示す。
ある実施形態において、抗体標品は、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性の少なくとも５０％の低下、好ましくは、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性の、少なくとも６０％、７０％または８０％の低下を引き起こす（例えば可溶性ホモ二量体ＣＤ７３ポリペプチド；細胞により発現されるＣＤ７３）。
抗体の活性は、リンパ球の活性を調整する、例えばリンパ球活性のアデノシン介在性阻害を緩和するかまたはリンパ球活性の活性化を引き起こす、その能力について、間接的アッセイでも測定し得る。これは、例えばサイトカイン放出アッセイを用いて対処し得る。別の例において、間接的アッセイにおいて、リンパ球の増殖を調整する能力について抗体を評価し得る。
本抗体は、ＣＤ７３を内部移行させるかまたはＣＤ７３の下方調整を誘導するその能力、例えば細胞表面からのＣＤ７３の内部移行またはＣＤ７３脱落誘導によるか否かについて試験し得る。哺乳動物細胞上でのＣＤ７３への結合時に抗ＣＤ７３抗体が内部移行するか否かまたはＣＤ７３ポリペプチドが（例えば抗体により結合されているとき）細胞内内部移行されるか否かは、本明細書中の実験例（例えば実施例７）に記載のものを含む様々なアッセイにより決定し得る。他の例において、インビボで内部移行を試験するために、試験抗体を標識し、ある一定の細胞表面上でＣＤ７３が発現されることが知られている動物に導入する。本抗体は、放射性標識し得るかまたは例えば蛍光もしくは金粒子で標識し得る。このアッセイに適切な動物としては、哺乳動物、例えばヒトＣＤ７３発現腫瘍移植片もしくは異種移植片を含有するヌードマウスまたはヒトＣＤ７３を遺伝子移入された細胞が導入されているマウスまたはヒトＣＤ７３導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスなどが挙げられる。適切な対照としては、試験抗体を与えられなかったか、または無関係の抗体を与えられた動物、および、抗原への結合時に内部移行されることが知られている、関心のある細胞上の別の抗原に対する抗体を与えられた動物が挙げられる。本抗体は、動物に、例えば静脈内注射によって投与し得る。適切な時間間隔で、公知の方法を使用して、または下記実験例に記載のように、動物の組織切片を調製し、内部移行ならびに細胞における内部移行抗体の位置について、光学顕微鏡または電子顕微鏡により分析し得る。インビトロでの内部移行について、培地に添加される関連抗体の存在下または非存在下で組織培養皿において細胞を温置し、所望の時点で顕微鏡分析のために処理し得る。細胞中の内部移行した標識化抗体の存在は、顕微鏡によって、または放射線標識抗体を使用する場合はオートラジオグラフィーによって、直接可視化し得る。任意選択により、顕微鏡において、公知のポリペプチドまたは他の細胞構成成分との共局在を評価し得；例えばエンドソーム／リソソームマーカーＬＡＭＰ－１（ＣＤ１０７ａ）との共局在は、内部移行抗体の細胞内局在に関する情報を提供し得る。あるいは、定量的生化学アッセイにおいて、ＣＤ７３発現細胞を含む細胞集団は、インビトロまたはインビボで放射性標識試験抗体と接触させ、細胞（インビボで接触させる場合、細胞は適切な時間の後に単離される）をプロテアーゼで処理するか、または細胞表面上の非内部移行抗体を除去するために酸洗浄に供する。細胞を破砕し、ホモジェネートをシンチレーションカウンターに通すことによって細胞の各バッチと会合するプロテアーゼ耐性の、放射性カウント／分（ｃｐｍ）の量を測定する。放射性標識抗体の既知の比活性に基づき、細胞あたりの内部移行抗体分子数を破砕細胞のシンチレーションカウントから推定し得る。培養皿またはフラスコ中の細胞培養液に細胞を添加し、抗体を培地とよく混合して確実に細胞を抗体に均一に曝露することなどによって、細胞をインビトロ、好ましくは溶液形態の抗体と「接触」させる。
抗体エピトープ
ある態様において、本抗体は、可溶性ＣＤ７３および細胞表面で発現されるＣＤ７３の両方の上に存在する共通の抗原性決定基と結合する。
ある態様において、本抗体は、抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１と実質的に同じエピトープと結合する。ある実施形態において、本抗体は、抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１が結合するエピトープ中の少なくとも１個の残基と少なくとも部分的に重複するかまたはこれを含むＣＤ７３のエピトープに結合する。本抗体が結合する残基は、ＣＤ７３ポリペプチドの表面上に、例えば細胞表面上で発現されるＣＤ７３ポリペプチドに存在するものとして特定され得る。本抗体が結合するＣＤ７３上のアミノ酸残基は、例えば表１で列挙される残基からなる群から選択され得る。
ＣＤ７３突然変異体が遺伝子移入された細胞への抗ＣＤ７３抗体の結合を測定し、抗ＣＤ７３抗体の、野生型ＣＤ７３ポリペプチド（例えば配列番号１または２）への結合能を比較し得る。抗ＣＤ７３抗体と突然変異体ＣＤ７３ポリペプチド（例えば表１の突然変異体ＣＤ７３）との間の結合の減少は、結合親和性の低下（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のこのようなＦＡＣＳ試験の公知の方法によって、または突然変異体ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験によって測定される場合）および／または抗ＣＤ７３抗体の総結合能の低下（例えば、抗ＣＤ７３抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットでのＢｍａｘの低下により明らかにされる場合）があることを意味する。結合の顕著な減少は、突然変異した残基が抗ＣＤ７３抗体への結合に直接関与するか、または抗ＣＤ７３抗体がＣＤ７３と結合するときに結合タンパク質に対して近接近していることを示す。
いくつかの実施形態において、結合の顕著な減少は、抗体と野生型ＣＤ７３ポリペプチドとの間の結合と比較して、抗ＣＤ７３抗体と突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドとの間の結合親和性および／または結合能が、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％または９５％超低下することを意味する。ある一定の実施形態において、結合が検出限界を下回って減少する。いくつかの実施形態において、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドへの抗ＣＤ７３抗体の結合が、抗ＣＤ７３抗体と野生型ＣＤ７３ポリペプチドとの間で観察される結合の５０％未満（例えば４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）であるとき、結合の顕著な減少が明らかになる。
いくつかの実施形態において、抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１が結合するアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸で置換される突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドに対して顕著に低い結合を示す抗ＣＤ７３抗体が提供される。ある実施形態において、野生型ＣＤ７３ポリペプチド（例えば配列番号１のポリペプチド）への結合と比較して、突然変異体は、表１の突然変異体１～１５から選択される突然変異体、例えば、突然変異体３、またはこのような突然変異体３のアミノ酸置換のうち１個以上を含む突然変異体である。
任意選択により、突然変異体１～１５のうち１つ以上の突然変異体への結合を喪失する抗体は、表１の１つ以上の他の突然変異体ＣＤ７３ポリペプチド、例えば突然変異体２、５、６または７のうち１つ以上（または全て）に対して顕著に低い結合を示さない。
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５（配列番号１に対する）からなる群から選択される残基で突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少しており；任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは突然変異：Ａ９９Ｓ、Ｅ１２９Ａ、Ｋ１３３Ａ、Ｅ１３４ＮおよびＡ１３５Ｓを有する。
任意選択により、ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｑ７０、Ｒ７３、Ａ７４、Ａ１０７およびＲ１０９（配列番号１に対する）からなる群から選択される残基で突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの結合が減少しておらず；任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、突然変異：Ａ９９Ｓ、Ｑ７０Ｓ、Ｒ７３Ａ、Ａ７４Ｅ、Ａ１０７ＩおよびＲ１０９Ｇを有する。
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５（配列番号１に対する）からなる群から選択される残基のうち１、２、３、４または５個を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
任意選択により、ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｑ７０、Ｒ７３、Ａ７４、Ａ１０７およびＲ１０９（配列番号１に対する）からなる群から選択される残基のうち１、２、３、４または５個を含むＣＤ７３上のエピトープに結合しない。
抗体ＣＤＲ配列
抗体１Ｅ１１
抗体１Ｅ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３として記載し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４として記載する。具体的な実施形態において、本開示は、モノクローナル抗体１Ｅ１１と同じエピトープまたは決定基と基本的に結合する抗体を提供し；任意選択により、本抗体は、抗体１Ｅ１１の超可変領域を含む。本明細書中での実施形態の何れかにおいて、抗体１Ｅ１１は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とし得る。ある実施形態において、本モノクローナル抗体は、１Ｅ１１のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。１Ｅ１１の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。ある実施形態によれば、本モノクローナル抗体は、１Ｅ１１の重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む。１Ｅ１１の可変軽鎖可変領域または１Ｅ１１の軽鎖可変領域のＣＤＲのうち１、２または３個をさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択により、その軽または重鎖ＣＤＲのうち何れか１つ以上は、１、２、３、４もしくは５個またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択により、抗体１Ｅ１１の抗原結合領域の一部または全てを含む軽および／または重鎖可変領域の何れかが、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域、任意選択によりヒト定常領域、任意選択によりヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプと融合され、任意選択により、エフェクター機能（ヒトＦｃγ受容体への結合）を低下させるためにアミノ酸置換をさらに含む抗体が提供される。
別の態様において、本開示は、表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む１Ｅ１１のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む１Ｅ１１のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む１Ｅ１１のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む１Ｅ１１のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む１Ｅ１１のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む１Ｅ１１のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸のうち１個以上が欠失され得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、任意選択により、全てが（またはそれぞれ、独立に）Ｋａｂａｔ付番系（各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、Ｃｈｏｔｉａ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、ＩＭＧＴ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のものまたは何らかの他の適切な付番系のものとして特定され得る。
抗体６Ｅ１
抗体６Ｅ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２１として記載し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２２として記載する。具体的な実施形態において、本開示は、モノクローナル抗体６Ｅ１と同じエピトープまたは決定基と基本的に結合する抗体を提供し；任意選択により本抗体は、抗体６Ｅ１の超可変領域を含む。本明細書中での実施形態の何れかにおいて、抗体６Ｅ１は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とし得る。ある実施形態において、本モノクローナル抗体は、６Ｅ１のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。６Ｅ１の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。ある実施形態によれば、本モノクローナル抗体は、６Ｅ１の重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む。６Ｅ１の可変軽鎖可変領域または６Ｅ１の軽鎖可変領域のＣＤＲのうち１、２または３個をさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択により、その軽または重鎖ＣＤＲの何れか１つ以上は、１、２、３、４もしくは５個またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択により、抗体６Ｅ１の抗原結合領域の一部または全てを含む軽および／または重鎖可変領域の何れかが、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域、任意選択によりヒト定常領域、任意選択によりヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプと融合され、任意選択により、エフェクター機能（ヒトＦｃγ受容体への結合）を低下させるためにアミノ酸置換をさらに含む抗体が提供される。
別の態様において、本開示は、表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む６Ｅ１のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む６Ｅ１のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む６Ｅ１のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む６Ｅ１のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む６Ｅ１のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む６Ｅ１のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が欠失され得るか、または異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は任意選択により、全てが（またはそれぞれ、独立に）Ｋａｂａｔ付番系（各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、Ｃｈｏｔｉａ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、ＩＭＧＴ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のものまたは何らかの他の適切な付番系のものとして特定され得る。
抗体３Ｃ１２
抗体３Ｃ１２の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３６として記載し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３７として記載する。具体的な実施形態において、本開示は、モノクローナル抗体３Ｃ１２と同じエピトープまたは決定基と基本的に結合する抗体を提供し；任意選択により本抗体は、抗体３Ｃ１２の超可変領域を含む。本明細書中での実施形態の何れかにおいて、抗体３Ｃ１２は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とし得る。ある実施形態において、本モノクローナル抗体は、３Ｃ１２のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。３Ｃ１２の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。ある実施形態によれば、本モノクローナル抗体は、３Ｃ１２の重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む。３Ｃ１２の可変軽鎖可変領域または３Ｃ１２の軽鎖可変領域のＣＤＲのうち１、２または３個をさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択により、その軽または重鎖ＣＤＲの何れか１つ以上は、１、２、３、４もしくは５個またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択により、抗体３Ｃ１２の抗原結合領域の一部または全てを含む軽および／または重鎖可変領域の何れかが、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域、任意選択によりヒト定常領域、任意選択によりヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプと融合され、任意選択により、エフェクター機能（ヒトＦｃγ受容体への結合）を低下させるためにアミノ酸置換をさらに含む抗体が提供される。
別の態様において、本開示は、表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む３Ｃ１２のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む３Ｃ１２のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む３Ｃ１２のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む３Ｃ１２のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む３Ｃ１２のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む３Ｃ１２のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が欠失され得るか、または異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は任意選択により、全てが（またはそれぞれ、独立に）Ｋａｂａｔ付番系（各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、Ｃｈｏｔｉａ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、ＩＭＧＴ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のものまたは何らかの他の適切な付番系のものとして特定され得る。
抗体８Ｃ７
抗体８Ｃ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２８として記載し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２９として記載する。具体的な実施形態において、本開示は、モノクローナル抗体８Ｃ７と同じエピトープまたは決定基と基本的に結合する抗体を提供し；任意選択により、本抗体は、抗体８Ｃ７の超可変領域を含む。本明細書中での実施形態の何れかにおいて、抗体８Ｃ７は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とし得る。ある実施形態において、本モノクローナル抗体は、８Ｃ７のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。８Ｃ７の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。ある実施形態によれば、本モノクローナル抗体は、８Ｃ７の重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む。８Ｃ７の可変軽鎖可変領域または８Ｃ７の軽鎖可変領域のＣＤＲのうち１、２または３個をさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択により、その軽または重鎖ＣＤＲの何れか１つ以上は、１、２、３、４もしくは５個またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択により、抗体８Ｃ７の抗原結合領域の一部または全てを含む軽および／または重鎖可変領域の何れかが、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域、任意選択によりヒト定常領域、任意選択によりヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプと融合され、任意選択により、エフェクター機能（ヒトＦｃγ受容体への結合）を低下させるためにアミノ酸置換をさらに含む抗体が提供される。
別の態様において、本開示は、表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む８Ｃ７のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む８Ｃ７のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む８Ｃ７のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む８Ｃ７のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む８Ｃ７のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａに規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を含む８Ｃ７のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択によりこれらのアミノ酸のうち１個以上欠失され得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は任意選択により、全てが（またはそれぞれ、独立に）Ｋａｂａｔ付番系（各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、Ｃｈｏｔｉａ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のもの、ＩＭＧＴ付番系各ＣＤＲに対して表Ａで示されるとおり）のものまたは何らかの他の適切な付番系のものとして特定され得る。
別の態様において、本開示は、
（ａ）配列番号３、２１、２８または３６の重鎖可変領域の超可変領域であって、任意選択により１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されるもの；および（ｂ）配列番号３、２２、２９または３７の軽鎖可変領域の超可変領域であって、任意選択により１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されるものを含む、ヒトＣＤ７３に結合する抗体を提供する。
別の態様において、本開示は、
（ａ）配列番号５～７または３０～３２のうち何れか１つで示されるような重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列であって、任意選択によりＣＤＲ中の１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換され得るもの；
（ｂ）配列番号８～１０、２３、２４または３３のうち何れか１つで示されるような重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列であって、任意選択によりＣＤＲ中の１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換され得るもの；
（ｃ）配列番号１１～１３、２５または２７のうち何れか１つで示されるような重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列であって、任意選択によりＣＤＲ中の１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換され得るもの；
（ｄ）配列番号１４、１５、１６、３４または３５のうち何れか１つで示されるような軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列であって、任意選択によりＣＤＲ中の１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換され得るもの；
（ｅ）配列番号１７または１８のうち何れか１つで示されるような軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列であって、任意選択によりＣＤＲ中の１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換され得るもの；および／または
（ｆ）配列番号１９または２０のうち何れか１つで示されるような軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列であって、任意選択によりＣＤＲ中の１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換され得るもの
を含む、ヒトＣＤ７３に結合する抗体を提供する。
本明細書中の実施形態の何れかの別の態様において、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の重および軽鎖のＣＤＲ１、２および３の何れも、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸の配列を特徴とし得、および／または対応する配列番号で列挙される特定のＣＤＲまたは一連のＣＤＲと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％配列同一性を共有するアミノ酸配列を有することを特徴とし得る。
本明細書中の実施形態の何れかのある態様において、何れの抗体も、個々の式（Ｉ）～（Ｖ）から選択される個々の式に従う、ＣＤＲ１、２および／または３配列を有する重および／または軽鎖を含み得る。本明細書中の何れかの実施形態において、特定のＨＣＤＲ１～３またはＬＣＤＲ－１～３が、個々の式（Ｉ）～（ＶＩ）の配列を有するものとして規定され得る。ある４４好ましい実施形態において、本抗体は、３個のＬＣＤＲを含む軽鎖および３個のＨＣＤＲを含む重鎖を含む。
ある実施形態において、ＨＣＤＲ１は、式（Ｉ）のアミノ酸配列：
Ｓ－Ｙ－Ｎ－Ｍ－Ｘａａ１（配列番号３８）
（式中、Ｘａａ１は、指定されるアミノ酸の何れかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、任意選択によりＸａａ１はＹ（Ｔｙｒ）またはＮ（Ａｓｎ）である）を含む。
ある実施形態において、ＨＣＤＲ２は、式（ＩＩａ）のアミノ酸配列：
Ｙ－Ｉ－Ｄ－Ｐ－Ｙ－Ｎ－Ｇ－Ｇ－Ｘａａ２－Ｓ－Ｙ－Ｎ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｆ－Ｋ－Ｇ（配列番号３９）またはその部分配列、例えば式（ＩＩｂ）のアミノ酸配列：
Ｙ－Ｉ－Ｄ－Ｐ－Ｙ－Ｎ－Ｇ－Ｇ－Ｘａａ２（配列番号４０）
（式中、Ｘａａ２は、指定されるアミノ酸の何れかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、任意選択により、Ｘａａ２はＳ（Ｓｅｒ）またはＴ（Ｔｈｒ）であり；式中、Ｘａａ３は、指定されるアミノ酸の何れかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、任意選択によりＸａａ３はＱ（Ｇｌｎ）またはＬ（Ｌｅｕ）であり；Ｘａａ４は、指定されるアミノ酸の何れかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、任意選択によりＸａａ４はＫ（Ｌｙｓ）またはＴ（Ｔｈｒ）である）を含む。
ある実施形態において、ＨＣＤＲ３は、式（ＩＩＩ）のアミノ酸配列：
Ｇ－Ｙ－Ｘａａ５－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ａ－Ｗ－Ｆ－Ａ－Ｙ（配列番号４１）
（式中、Ｘａａ５は、指定されるアミノ酸の何れかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、任意選択によりＸａａ５はＧ（Ｇｌｙ）またはＮ（Ａｓｎ）である）を含む。
ある実施形態において、ＬＣＤＲ１は、式（ＩＶ）のアミノ酸配列：
Ｋ－Ａ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｖ－Ｘａａ６－Ｎ－Ｄ－Ｖ－Ａ（配列番号４２）、
（式中、Ｘａａ６は、指定されるアミノ酸の何れかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、任意選択によりＸａａ６は、Ｔ（Ｔｈｒ）またはＳ（Ｓｅｒ）である）を含む。
ある実施形態において、ＬＣＤＲ２は、式（Ｖ）のアミノ酸配列：
Ｙ－Ａ－Ｓ－Ｘａａ７－Ｒ－Ｙ－Ｔ（配列番号４３）
（式中、Ｘａａ７は、指定されるアミノ酸の何れかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、任意選択によりＸａａ７はＴ（Ｔｈｒ）またはＮ（Ａｓｎ）である）を含む。
ある実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９または２０のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、抗体は、
ａ 配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；および／または
ｂ 配列番号３９（または４０）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；および／または
ｃ 配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む重鎖を含み得る。
ある実施形態において、抗体は、
ａ 配列番号４２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；および／または
ｂ 配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；および／または
ｃ 配列番号１９または２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む軽鎖を含み得る。
抗体、例えば、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の何れかにおいて、特定される可変領域およびＣＤＲ配列は、配列修飾、例えば置換（１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の配列修飾）を含み得る。ある実施形態において、重および軽鎖のＣＤＲ１、２および／または３は、置換される残基が、ヒト起源の配列中に存在する残基である、１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、置換は保存的修飾である。保存的配列修飾は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に顕著に影響しないかまたはこれを変化させないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾としては、アミノ酸置換、付加および欠失が挙げられる。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的技術によって、抗体に修飾を導入し得る。保存的アミノ酸置換は、一般的には、あるアミノ酸残基が、同様の物理化学的特性の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。特定される可変領域およびＣＤＲ配列は、１、２、３、４個またはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。置換が行われる場合、好ましい置換は保存的修飾である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定められている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐状側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）があるアミノ酸を含む。したがって、ある抗体のＣＤＲ領域内の１個以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体は、本明細書中に記載のアッセイを用いて、保有される機能（すなわち本明細書中に記載の特性）について試験し得る。
ＩＭＧＴ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義系に従うＣＤＲの配列を以下の表Ａでまとめた。本抗体の可変領域の配列を以下の表Ｂに挙げ（リーダー配列が存在する場合、リーダー配列の終わりのすぐ後のアミノ酸位置で開始するように何らかの抗体鎖が指定され得る）、各ＣＤＲに下線を付す。本明細書中の何れかの実施形態において、シグナルペプチドまたはその何らかの部分を含有するかまたは欠くように、ＶＬまたはＶＨ配列を指定または付番し得る。
Figure 0007132981000002
Figure 0007132981000003
抗体の断片および誘導体（別段の指定がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本願で使用される場合の「抗体」という用語に包含される）は、当技術分野で公知の技術により作製し得る。「断片」は、インタクト抗体の一部分、一般的には抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；（１）１本鎖Ｆｖ分子（２）会合する重鎖部分なく、軽鎖可変ドメインを１つのみ含有する１本鎖ポリペプチドまたは、軽鎖可変ドメインの３個のＣＤＲを含有するその断片および（３）会合する軽鎖部分なく、重鎖可変領域を１個のみ含有する１本鎖ポリペプチドまたは重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含有するその断片を含むが限定されない、連続アミノ酸残基の１つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチド（本明細書中で「１本鎖抗体断片」または「１本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）である何らかの抗体断片；および抗体断片から形成される多特異性（例えば二特異性）抗体が挙げられる。とりわけ、ナノボディ、ドメイン抗体、単ドメイン抗体または「ｄＡｂ」が挙げられる。
ある一定の実施形態において、抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、例えば相同非ヒト配列の代わりにヒト重および軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＰＮＡＳ ｐｐ．６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全てまたは一部を共有結合により連結することによって、発現ベクターに挿入する前に修飾し得る。このようにして、オリジナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。一般的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドが抗体の定常ドメインに対して置換される。
任意選択により、抗体はヒト化される。抗体の「ヒト化」型は、マウス免疫グロブリン由来の最小配列を含有する特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。殆どの部分に対して、ヒト化抗体は、オリジナル抗体の所望の特異性、親和性および能力を維持しながら、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基がオリジナル抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列の何れでも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに高め、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てがオリジナル抗体のものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、通常はヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、全体的な開示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。
ヒト化抗体を作製することにおいて使用しようとするヒト可変ドメイン、軽および重鎖両方の選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」方法に従い、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対して抗体の可変ドメインの配列をスクリーニングする。次に、マウスのものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法は、軽または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体のために同じフレームワークを使用し得る（Ｃａｒｔｅｒら、ＰＮＡＳ ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，ｐ．２６２３（１９９３））。
抗体がＣＤ７３に対する高親和性および他の有利な生物学的特性を保有してヒト化されることはさらに重要である。この目的を達成するために、ある方法に従い、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析の過程によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性が高い三次元構造を例示し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンのその抗原への結合能に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を選択し、コンセンサスおよび輸入配列から組み合わせ得、標的抗原に対する親和性向上などの所望の抗体特性が達成されるようになる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的に、および最も実質的に関与する。
「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫付与のために使用されるマウスとして、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子により置換されているマウス宿主である。したがって、このマウスにより、またはこのマウスのＢ細胞から作製されるハイブリドーマにおいて産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその全体において本明細書中に組み込まれる、米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
ヒト抗体は、免疫付与のためにヒト抗体レパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を使用することによる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）かまたはファージディスプレイ法を用いた抗体レパートリーの選択によるなど、様々な他の技術によっても作製され得る。このような技術は、当業者にとって公知であり、本願で開示されるようにモノクローナル抗体から出発して実行され得る。
抗体処方物
１ｍｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む医薬処方物中に抗ＣＤ７３抗体が組み込まれ得、この処方物のｐＨは２．０～１０．０である。本処方物は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤および界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、医薬処方物は、水性処方物、すなわち水を含む処方物である。このような処方物は一般的に溶液または懸濁液である。さらなる実施形態において、本医薬処方物は水性溶液である。「水性処方物」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む処方物として定義される。同様に「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態において、本医薬処方物は、凍結乾燥処方物であり、医師または患者が使用前にそれに溶媒および／または希釈剤を添加する。
別の実施形態において、本医薬処方物は、前もって溶解する必要がない使用準備済みの乾燥処方物（例えば凍結乾燥または噴霧乾燥）である。
さらなる態様において、本医薬処方物は、このような抗体の水溶液および緩衝液を含み、この抗体は１ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の濃度で存在し、本処方物のｐＨは約２．０～約１０．０である。
別の実施形態において、本処方物のｐＨは、約２．０～約１０．０、約３．０～約９．０、約４．０～約８．５、約５．０～約８．０および約５．５～約７．５からなる一覧から選択される範囲である。
さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはこれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な緩衝液のそれぞれ１つは、代替的な実施形態を構成する。
さらなる実施形態において、本処方物は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物はキレート剤も含む。さらなる実施形態において、本処方物は安定化剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は界面活性剤をさらに含む。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
ペプチド医薬処方物中に他の成分が存在し得ることが可能である。このようなさらなる成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）が挙げられ得る。このようなさらなる成分は、当然ではあるが本医薬処方物の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
抗体を含有する医薬組成物は、いくつかの部位、例えば局所部位、例えば皮膚および粘膜部位、吸収を迂回する部位、例えば動脈における、静脈における、心臓における投与、および吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下における、筋肉における、または腹部における投与において、このような処置を必要とする患者に投与し得る。医薬組成物の投与は、このような処置を必要とする患者への、いくつかの投与経路を通じた、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬側、口腔中、経口、胃腸中、鼻腔、肺、例えば細気管支および肺胞またはそれらの組み合わせを通じた投与、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼、例えば結膜を通じた投与、ウレタル（ｕｒｅｔａｌ）および非経口投与であり得る。
適切な抗体処方物は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体での経験を調べることによっても決定し得る。いくつかのモノクローナル抗体は、リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）ゾーレア（オマリズマブ）、ベクザー（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）など、臨床的状況で有効であることが示されており、本抗体とともに同様の処方物を使用し得る。例えば、モノクローナル抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の何れかの単回使用バイアルで、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０および注射用の滅菌水中でＩＶ投与用に処方された１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。ｐＨは６．５に調整する。別の実施形態において、本抗体は、ｐＨが約６．０の約２０ｍＭクエン酸Ｎａ、約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む処方物中で供給される。
悪性腫瘍の診断および処置
本明細書中に記載のような抗ＣＤ７３抗体を使用して、個体、とりわけヒト患者を処置する方法も提供される。ある実施形態において、本開示は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における本明細書中で記載のような抗体の使用を提供する。一般的には、患者は、癌に罹患しているか、またはそのリスクがある。
例えば、ある態様において、必要とする患者においてリンパ球の活性を回復させるかまたは増強する方法が提供され、この方法は、中和抗ＣＤ７３抗体をその患者に投与する段階を含む。本抗体は、例えばヒトまたはヒト化抗ＣＤ７３抗体であり得、この抗体は、ヒトＣＤ７３の５’－ヌクレオチダーゼ活性を低下させるかまたは妨害する。ある実施形態において、本方法は、リンパ球活性向上が有益であるか、または免疫抑制、免疫抑制細胞または例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞）によるアデノシン生成を引き起こすかまたはこれを特徴とする疾患を有する患者における、リンパ球（例えばＴ細胞）の活性の向上を対象とする。本方法は、例えば、腫瘍微小環境（およびそこでのＣＤ７３介在性のアデノシン産生）が免疫系による認識の欠如（免疫逸脱）に関与し得ることが疑われる固形腫瘍を有する患者に特に有用となろう。腫瘍は、例えば、ＣＤ７３発現免疫細胞、例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞を特徴とし得る。
より具体的に、本方法および組成物は、様々な癌および他の増殖性疾患の処置のために利用される。これらの方法は、リンパ球の抗腫瘍活性を阻害するアデノシンを減少させることにより、およびおそらくさらにリンパ球の抗腫瘍活性を向上させ得るＡＴＰを増加させることにより、効果を発揮するので、これらは、特に、腫瘍微小環境中のアデノシンが抗腫瘍免疫反応を抑制することに強い関与があり得る固形腫瘍を含め、非常に広い範囲の癌に適用可能である。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体で処置されるヒト患者は、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）、メラノーマ、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストにより誘導されるものを含む環境誘導性の癌、例えば多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫／縦隔原発性Ｂ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫を含む血液系悪性腫瘍およびこれらの癌の何れかの組み合わせを有する。本開示は転移性癌の処置にも適用可能である。患者は、処置前、処置中または処置後に、上記臨床特性のうち１つ以上に対して試験または選択され得る。
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３の酵素活性の中和に対して少なくともＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００の血液濃度を個体において（例えば１、２、３、４週間にわたり、および／または抗原結合化合物の次の投与まで）達成および／または維持するのに有効な量で投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の活性量は、個体の血管外組織で、ＣＤ７３の酵素活性の中和に対してＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の活性量は、ＣＤ７３の酵素活性の中和の阻害に対して、個体においてＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成（または維持）するのに有効な量である。
任意選択により、ある実施形態において、（例えば、受容体飽和を提供するものと同等または実質的により低い濃度で完全な有効性を提供し得る）ＡＤＣＣによるＣＤ７３発現腫瘍細胞の枯渇を対象とする一部の抗体とは対照的に、抗ＣＤ７３抗体は、純粋な遮断因子であり（実質的なＦｃγ受容体介在性の活性なし）、抗ＣＤ７３抗体の次の連続する投与まで、所望の期間にわたり、例えば１週間、２週間、１カ月、ＣＤ７３の酵素活性を中和するのに有効な量で投与される。
ある実施形態において、本抗ＣＤ７３抗体は、ＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応の阻害（例えば、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解を定量することによって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによる。実施例５参照）に対して、個体において、少なくともＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００の血液濃度を達成および／または（例えば１、２、３、４週間にわたり、および／または抗ＣＤ７３抗体の次の投与まで）維持するのに有効な量で投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の量は、個体の血管外組織でのＡＭＰからアデノシンへのＣＤ７３介在性の異化反応の阻害に対して、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成（または維持）するのに有効な量である。
ある実施形態において、個体において癌を処置または予防するための方法が提供され、この方法は、循環中、任意選択により関心のある血管外組織（例えば腫瘍または腫瘍環境）中、循環中での５０％、７０％または完全な（例えば９０％）受容体飽和ＣＤ７３発現細胞に必要とされる濃度よりも高い（例えばＰＢＭＣにおいて評価した場合）濃度を達成または指定の期間にわたり維持する量で、抗ＣＤ７３抗体を疾患がある個体に投与することを含む。任意選択により、達成される濃度は、指定される受容体飽和に必要とされる濃度よりも少なくとも２０％、５０％または１００％高い。
ある実施形態において、個体において癌を処置または予防するための方法が提供され、この方法は、循環中、任意選択により関心のある血管外組織（例えば腫瘍または腫瘍環境）中で、ＣＤ７３発現細胞への結合に対するＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、または任意選択によりＥＣ１００よりも高い濃度を達成または指定の期間にわたり維持する量で抗ＣＤ７３抗体を個体に投与することを含む（例えば、ＣＤ７３発現細胞、例えば実施例４のようにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞上で抗ＣＤ７３抗体を滴定することにより評価した場合）。任意選択により、達成される濃度は、ＣＤ７３発現細胞への結合に対するＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択によりＥＣ１００よりも、少なくとも２０％、５０％または１００％高い。
何らかの実施形態において、本抗体は、例えば、ヒトＰＢＭＣにおいて、０．５～１００ｎｇ／ｍＬ、任意選択により１～１００ｎｇ／ｍＬ、任意選択により３０～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば約３０～９０ｎｇ／ｍＬの間の、ＣＤ７３発現細胞への結合に対するＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０または任意選択によりＥＣ１００を有し得る（例えば、ＣＤ７３発現細胞、例えば実施例４のようにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞上で抗ＣＤ７３抗体を滴定することにより評価した場合）。例えば、ＥＣ５０は、約３０、３７、３９、４３、５７、５８、６１、６２、９０、９５、１４３ｎｇ／ｍＬであり得る。
抗ＣＤ７３抗体でのＣＤ７３の酵素活性の中和に対するＥＣ５０は、例えば約０．０１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、任意選択により０．１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、任意選択により０．１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの間であり得る。例えばＥＣ５０は、約０．１μｇ／ｍＬ、約０．２μｇ／ｍＬまたは約０．３μｇ／ｍＬであり得る。したがって、この抗ＣＤ７３抗体の量は、例えば少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも０．２μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも１μｇ／ｍＬまたは任意選択により少なくとも２μｇ／ｍＬの血液濃度を達成および／または維持するために投与される。
脈管構造外の組織（腫瘍環境、例えば固形腫瘍の処置中）が標的とされる場合、一般的には、循環中での対応する濃度を提供する用量と比較して、およそ１０倍高い用量が必要であると考えられる。約１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬまたは２０μｇ／ｍＬの循環（血液）中の濃度を達成（および／または維持）するために投与される抗ＣＤ７３抗体の量は、それぞれ約０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬの血管外組織（例えば腫瘍組織）濃度を達成（および／または維持）すると予想される。
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも０．２μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも１μｇ／ｍＬまたは任意選択により少なくとも２μｇ／ｍＬの組織（例えば腫瘍環境）濃度を達成および／または維持するための量で投与される。本抗体は、例えば、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬまたは２０μｇ／ｍＬ、例えば１～１００μｇ／ｍＬ、１０～１００μｇ／ｍＬ、１～５０μｇ／ｍＬ、１～２０μｇ／ｍＬまたは１～１０μｇ／ｍＬの血液濃度を達成および／または維持するための量で投与され得る。投与される量は、投与後の指定の期間（例えば１、２、３、４週間など）にわたる所望濃度の維持を提供するために調整し得る。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７３の酵素活性の中和に対する少なくともＥＣ７０またはＥＣ１００に対応する、血液（血清）または血管外組織（例えば腫瘍環境）中の濃度を得るための抗ＣＤ７３抗体の量が投与される。本抗体は、例えば、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬまたは２０μｇ／ｍＬの血液濃度または血管外組織（例えば腫瘍環境）を達成および／または維持する量で投与され得る。
ＥＣ５０、ＥＣ７０またはＥＣ１００は、本明細書中の実施例で示されるように、例えばＣＤ７３の酵素活性の中和に対する細胞アッセイにおいて評価し得る（例えば、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解を定量することによる、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞での５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和、実施例５参照）。ＣＤ７３の酵素活性の中和と関連する「ＥＣ５０」は、酵素活性の中和に関してその最大反応または効果の５０％を生じさせる抗ＣＤ７３抗体の有効濃度を指す）。ＣＤ７３の酵素活性の中和に関して「ＥＣ７０」は、その最大反応または効果の７０％を生じさせる抗ＣＤ７３抗体の有効濃度を指す。ＣＤ７３の酵素活性の中和に関する「ＥＣ１００」は、酵素活性のこのような中和に関してその実質的な最大反応または効果を生じさせる抗ＣＤ７３抗体の有効濃度を指す。
いくつかの実施形態において、特に固形腫瘍の処置に対して、達成される濃度は、組織中（脈管構造外、例えば腫瘍または腫瘍環境において）での酵素活性の中和に対する少なくともＥＣ５０、任意選択により約または少なくとも約ＥＣ１００に対応する濃度につながるように設定される。
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の量は、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重である。ある実施形態において、この量が個体に毎週、２週間ごと、毎月または２カ月ごとに投与される。
ある実施形態において、少なくとも１回の投与サイクル（任意選択により少なくとも２、３、４回またはそれ以上の投与サイクル）にわたり、有効量の本開示の抗ＣＤ７３抗体を個体に投与することを含む、癌を有するヒト個体を処置する方法が提供され、この投与サイクルは、８週間以下であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれに対して、抗ＣＤ７３抗体が１、２、３または４回、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。ある実施形態において、本抗ＣＤ７３抗体を静脈内点滴により投与する。
ヒトを処置するための適切な治療プロトコールは、例えば、本明細書中で開示されるような量の抗ＣＤ７３抗体を患者に投与することを含み、本方法は、抗ＣＤ７３抗体が少なくとも１回投与される、少なくとも１回の投与サイクルを含む。任意選択により、抗ＣＤ７３抗体が少なくとも２、３、４、５、６、７または８回投与される。ある実施形態において、投与サイクルは２週間～８週間である。
ある実施形態において、個体において疾患（例えば癌、固形腫瘍、血液腫瘍）を処置または予防するための方法が提供され、この方法は、少なくとも１回の投与サイクルにわたり、疾患（例えば癌、固形腫瘍）を有する個体にＣＤ７３の酵素活性を中和する抗ＣＤ７３抗体を投与することを含み、この投与サイクルは、抗ＣＤ７３抗体の少なくとも第１回および第２回（および任意選択により第３、第４、第５、第６、第７および／または第８回またはそれ以上）の投与を含み、この抗ＣＤ７３抗体は、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも０．２μｇ／ｍＬ、任意選択により少なくとも１μｇ／ｍＬもしくは任意選択により少なくとも２μｇ／ｍＬ（例えば血液腫瘍の処置の場合）または任意選択により少なくとも約１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬもしくは２０μｇ／ｍＬ、例えば１～１００μｇ／ｍＬ、１～５０μｇ／ｍＬ、１～２０μｇ／ｍＬまたは１～１０μｇ／ｍＬ（例えば固形腫瘍の処置の場合、血液腫瘍の処置の場合）の抗ＣＤ７３抗体の血液（血清）濃度を達成するかまたは２回の連続する投与の間に維持するのに有効な量で投与される。ある実施形態において、指定の連続血液濃度が維持され、この血液濃度は、指定の期間にわたり（例えば、抗体の２回の投与の間、数週間、１週間、２週間、３週間、４週間）、実質的に指定の血液濃度を下回って下落せず、すなわち指定の期間中に血液濃度が変動し得るものの、維持される指定の血液濃度は、最小または「トラフ値」濃度に相当する。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の治療的活性量は、抗体の投与後、少なくとも約１週間、約２週間または約１カ月にわたり、ＣＤ７３の酵素活性の中和に対して、血液および／または組織中で、（少なくとも）ＥＣ５０濃度、任意選択によりＥＣ７０濃度、任意選択によりＥＣ１００濃度を提供することが可能なこのような抗体の量である。
本開示の抗ＣＤ７３抗体での一連の処置前または処置中、患者が処置に適切であるか否かを評価するために（例えば患者が処置に反応する可能性があるか否かを予測するために）、存在またはレベルまたはＣＤ７３発現細胞、アデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰレベルを患者の腫瘍内および／またはその隣接部で評価し得る。存在またはレベルまたはＣＤ７３発現細胞、アデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰのレベルの上昇は、（基質結合ＣＤ７３を阻害する抗体を含むが限定されない）本開示の抗ＣＤ７３抗体での処置に対して個体が適切である（例えば抗ＣＤ７３が有益である可能性がある）ことを示し得る。
本開示の抗ＣＤ７３抗体での一連の処置前または処置中、患者にとって抗ＣＤ７３抗体での処置が有益であるか否かを評価するために、アデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰレベルをまた患者の腫瘍内および／またはその隣接部で評価し得る。処置（または抗体の投薬）前のレベルと比較した、投与（または抗体の投薬）後に比較されるアデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰのレベルの低下は、個体にとって、（基質結合ＣＤ７３を阻害する抗体を含むが限定されない）本開示の抗ＣＤ７３抗体での処置が有益であることを示し得る。任意選択により、患者にとって抗ＣＤ７３抗体での処置が有益である場合、方法は、抗ＣＤ７３抗体のさらなる用量を患者に投与することをさらに含み得る（例えば連続処置）。
ある実施形態において、患者の腫瘍組織試料内および／またはその隣接部でアデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰレベルを評価することは、癌患者からの組織、例えば癌組織、癌に対して近位または癌の周辺の組織、癌隣接組織、隣接する非腫瘍組織または正常な隣接組織からなる群から選択されるヒト組織の生体試料を患者から得て、組織内でアデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰレベルを検出することを含む。患者からのレベルは、例えば健康な個体に対応する参照レベルとそのレベルを比較し得る。
ある実施形態において、本開示は、癌の処置または予防を必要とする個体における癌の処置または予防のための方法を提供するが、この方法は、
ａ）ＣＤ７３発現細胞（またはアデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰ）を腫瘍環境で、任意選択により腫瘍内および／または隣接組織内で検出し、
ｂ）腫瘍環境が、任意選択により参照レベルと比較して上昇しているレベルで、ＣＤ７３発現細胞（またはアデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰ）を含むと判定されたら、抗ＣＤ７３抗体を個体に投与すること
を含む。任意選択により、腫瘍環境内でＣＤ７３発現細胞（またはアデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰ）を検出することは、癌組織および／または癌に対して近位もしくは癌の周辺の組織（例えば、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織または正常な隣接組織）を含む生体試料を個体から得て、ＣＤ７３発現細胞（またはアデノシン、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰ）のレベルを検出することを含む。ＣＤ７３発現細胞は、例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞を含み得る。
癌を有する患者は、腫瘍微小環境における細胞上（例えば腫瘍細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞上）でのＣＤ７３の発現を評価するために予め検出する段階を行うかまたは行わずに、抗ＣＤ７３抗体で処置され得る。任意選択により、処置方法は、個体からの腫瘍の生体試料中で（例えば、癌組織、癌の近位または癌の周囲の組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織または正常な隣接組織において）ＣＤ７３核酸またはポリペプチドを検出する段階を含み得る。生体試料がＣＤ７３を発現する（例えば顕著に発現する；参照と比較して、高レベルでＣＤ７３を発現、抗ＣＤ７３抗体での高強度染色）細胞を含むという判定は、ＣＤ７３を阻害する薬剤での処置が非常に有益であり得る癌を患者が有することを示す。ある実施形態において、本方法は、生体試料中のＣＤ７３核酸またはポリペプチドの発現のレベルを決定し、健康な個体に対応する参照レベルとそのレベルを比較することを含む。生体試料が、参照レベルと比較して上昇しているレベルでＣＤ７３核酸またはポリペプチドを発現する細胞を含むという判定は、患者が、本開示の抗ＣＤ７３抗体で処置され得る癌を有することを示す。任意選択により、生体試料中でＣＤ７３ポリペプチドを検出することは、悪性細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞の表面上で発現されるＣＤ７３ポリペプチドを検出することを含む。ある実施形態において、生体試料が顕著にＣＤ７３核酸またはポリペプチドを発現する細胞を含むという判定は、患者が、本開示の抗ＣＤ７３抗体で処置され得る癌を有することを示す。「顕著に発現される」とは、ＣＤ７３ポリペプチドに言及する場合、ＣＤ７３ポリペプチドが、ある一定の患者から採取されるかなりの数の細胞で発現されることを意味する。「顕著に発現される」という用語の定義が正確なパーセント値に縛られない一方で、「顕著に発現される」と言われる受容体は、患者から採取される腫瘍細胞の少なくとも１０％、２０％ ３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上において存在することである。
個体がＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞を特徴とする癌を有するか否かを判定することは、例えば、癌環境（例えば腫瘍または腫瘍隣接組織）からの細胞を含む個体から（例えば生検を行うことにより）生体試料を得て、ＣＤ７３ポリペプチドに結合する抗体とその細胞を接触させ、その細胞がそれらの表面上でＣＤ７３を発現するか否かを検出することを含み得る。任意選択により、個体がＣＤ７３を発現する細胞を有するか否かを判定することは、免疫組織化学アッセイを行うことを含む。
ある実施形態において、本開示は、癌の処置または予防を必要とする個体における癌の処置または予防のための方法を提供し、この方法は、
ａ）腫瘍環境内、任意選択により腫瘍内および／または隣接組織内で細胞のＣＤ７３ポリペプチド状況を判定し、
ｂ）腫瘍環境が、任意選択により参照レベルと比較して上昇しているレベルで、ＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞を含むという判定時に、抗ＣＤ７３抗体を個体に投与することを含む。ある実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態において、腫瘍環境、腫瘍および／または隣接組織内の細胞は非悪性免疫細胞、例えばＴ細胞である。任意選択により、腫瘍環境内のＣＤ７３ポリペプチド状況を判定することは、癌組織および／または癌に対して近位のまたは癌の周辺の組織（例えば、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織または正常隣接組織）を含む生体試料を個体から得て、ＣＤ７３ポリペプチドに結合する抗体とその細胞を接触させ、ＣＤ７３を発現する細胞を検出することを含む。
本抗体組成物は、単剤療法または、本抗体が投与されている特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む１つ以上の他の治療剤との併用処置で使用し得る。さらなる治療剤は、通常、処置している特定の疾患または状態のための単剤療法での薬剤に対して一般的に使用される量および処置計画で投与される。このような治療剤としては、抗癌剤および化学療法剤が挙げられるが、限定されない。
ある実施形態において、第二またはさらなる第二の治療剤は、例えばＮＫ細胞により発現されるＣＤ１６を介してそれが結合される細胞に対してＡＤＣＣを誘導可能である、抗体または他のＦｃドメイン含有タンパク質である。一般的には、このような抗体または他のタンパク質は、関心のある抗原に結合するドメイン、例えば腫瘍細胞上に存在する抗原（腫瘍抗原）およびＦｃドメインまたはそれらの一部を含み、抗原結合ドメインを介した抗原への、およびＦｃドメインを介したＦｃγ受容体（例えばＣＤ１６）への結合を示す。ある実施形態において、そのＡＤＣＣ活性には少なくとも部分的にＣＤ１６が介在する。ある実施形態において、さらなる治療剤は、ネイティブまたは修飾ヒトＦｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体からのＦｃドメインを有する抗体である。「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、当技術分野でよく理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上で結合される抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣに介在する非特異的な細胞傷害性細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球および好酸球が挙げられる。「ＡＤＣＣ誘導抗体」という用語は、当業者にとって公知のアッセイにより測定した場合にＡＤＣＣを示す抗体を指す。このような活性は、一般的には様々なＦｃＲとのＦｃ領域の結合を特徴とする。何らかの特定の機序により限定されるものではないが、当業者は、抗体がＡＤＣＣを示す能力が、例えば、そのサブクラス（ＩｇＧ１またはＩｇＧ３など）によるか、Ｆｃ領域に導入される突然変異によるか、または抗体のＦｃ領域での炭水化物パターンに対する修飾によるものであり得ることを認識する。
ある実施形態において、第二またはさらなる第二の治療剤は、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１系を阻害する（すなわちＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を阻害する）薬剤（例えば抗体）である。例えば下記のような、例えばこのような薬剤が単剤療法として使用される代表的な用量および／または頻度で、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を使用し得る。
ＰＤ－１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現される。Ｏｋａｚａｋｉら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔら（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。ＰＤ－１に対する２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２が同定されており、これらは、ＰＤ－１への結合時にＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒら（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１は、様々なヒト癌において豊富である（Ｄｏｎｇら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７８７－９）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の結果、腫瘍浸潤性のリンパ球が減少し、Ｔ細胞受容体介在性増殖が減少し、癌性細胞による免疫回避が起こる。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって逆転させ得、その効果は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用が同時に遮断される場合、相加的である。ＰＤ－１の遮断は、例えばその天然リガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断することによって、ＰＤ－Ｌ１誘導性のＰＤ－１シグナル伝達を妨げる抗体の使用を有利に含み得る。ある態様において、本抗体は、ＰＤ－１に結合し（抗ＰＤ－１抗体）；このような抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間のおよび／またはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を遮断し得る。別の態様において、本抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合し（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断する。
現在、市販されているかまたは臨床評価中の、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断する、少なくとも６種類の薬剤があり、これらの何れも、本開示の抗ＣＤ７３抗体との併用において有用であり得る。ある薬剤は、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ／ＯＮＯ－４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；旧名ＭＤＸ－１１０６）である。ニボルマブ（商品名オプジーボ（登録商標））は、ＰＤ－１およびＣＤ８０の両方へのＰＤ－Ｌ１リガンドの結合を阻害するＦＤＡにより承認された完全ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂであり、抗体５Ｃ４として国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに記載されており、この開示は参照により本明細書中に組み込まれる。メラノーマ患者に対して、最も顕著であるＯＲは、３ｍｇ／ｋｇの用量で観察され、一方で他の癌タイプの場合は１０ｍｇ／ｋｇであった。ニボルマブは、一般に癌の増悪まで３週間ごとに１０ｍｇ／ｋｇで投与される。
ランブロリズマブまたはペンブロリズマブ（商品名キートルーダ（登録商標））とも呼ばれるＭＫ－３４７５（ＭｅｒｃｋからのヒトＩｇＧ４抗ＰＤ１ ｍＡｂ）は、メラノーマの処置に対してＦＤＡにより承認されており、他の癌において試験されている。ペンブロリズマブは、疾患増悪まで２または３週間ごとに２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで試験された。ヒト化抗体ｈ４０９Ａｌｌの重および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡコンストラクトは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に預託されている。ｈ４０９Ａ－ｌ１の重鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは２００８年６月９日に預託され、０８１４６９＿ＳＰＤ－Ｈとされ、ｈ４０９Ａｌ１の軽鎖をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは２００８年６月９日に預託され、０８０１４７０＿ＳＰＤ－Ｌ－ｌ１とされた。
ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈからの抗ＰＤ－Ｌ１）は、ＦｃγＲ結合および結果として生じる抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を最小化することにより効率および安全性を最適化するために設計された改変Ｆｃドメインを含有するヒト抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂである。≦１、１０、１５および２５ｍｇ／ｋｇ ＭＰＤＬ３２８０Ａの用量が３週間ごとに最長１年間投与された。第３相試験において、ＭＰＤＬ３２８０Ａは、ＮＳＣＬＣにおいて３週間ごとに静脈内点滴により１２００ｍｇで投与される。
ＡＭＰ－２２４（ＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅおよびＧＳＫ）は、Ｆｃドメインに融合されたＰＤ－Ｌ２細胞外ドメインを含むイムノアドヘシンである。
ピドリズマブ（Ｐｉｄｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａからのヒト化ＩｇＧ１抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、ピドリズマブ（Ｐｉｄｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（例えば国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレット参照）。ＣＴ－０１１の最初の点滴から２週間後に開始して、４週間にわたり毎週、３７５ｍｇ／ｍ２で投与されるリツキシマブと組み合わせ、３ｍｇ／ｋｇ静脈内ＣＴ－０１１で４週間ごとに４回の点滴にわたり、リツキシマブ感受性の再発ＦＬの３０名の患者を処置した。
さらなる公知のＰＤ－１抗体および他のＰＤ－１阻害剤としては、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫにライセンスされたＢ７－ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、国際公開第２０１２／１４５４９３号パンフレットに記載のＡＭＰ－５１４、国際公開第２０１１／０６６３８９号パンフレットおよび米国特許出願第２０１３／０３４５５９号明細書に記載の抗体ＭＥＤＩ－４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発された抗ＰＤ－Ｌ１）、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載の抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ－Ｌ１）、国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載のＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂにより開発された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるＢＭＳ－９３６５５９としても知られるＭＤＸ－１１０５、および国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレット、同第２００９／０１４７０８号パンフレット、同第２００９／１１４３３５号パンフレットおよび同第２０１３／０１９９０６号パンフレットに記載の抗体および阻害剤が挙げられ、これらの開示は参照により本明細書によって組み込まれる。抗ＰＤ１抗体のさらなる例は、国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で開示されており、例えばそれぞれ配列番号６、配列番号７および／または配列番号８の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２および３およびそれぞれ配列番号３、配列番号４または配列番号５の抗体重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２および３を有する抗体であり、これらの配列番号参照番号は、開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレットに従う付番である。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１への結合に対してこれらの抗体の何れかと競合する抗体も使用し得る。
ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの他の阻害性メンバーであり、Ｔ細胞上で発現される。ＣＴＬＡ－４に結合し、これを阻害する抗体は当技術分野で公知である。一例において、本抗体は、イピリムマブ（商品名エルボイ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ヒトＩｇＧ抗体である。エルボイに対する代表的な投与計画は、３週間ごとに９０分間にわたり３ｍｇ／ｋｇを静脈投与することである。一例において、本開示の抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用する抗体は、ＣＴＬＡ－４への結合に対してイピリムマブと競合する抗体である。
処置方法において、ＣＤ７３結合化合物および第二の治療剤は、個別に、一緒にまたは連続的に、またはカクテルで投与し得る。いくつかの実施形態において、抗原結合化合物は、第二の治療剤の投与前に投与する。例えば、第二の治療剤の投与前およそ０～３０日にＣＤ７３結合化合物を投与し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物は、第二の治療剤の投与前、約３０分～約２週間、約３０分～約１週間、約１時間～約２時間、約２時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～１日または約１～５日で投与する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物を治療剤の投与と同時に投与する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物は、第二の治療剤の投与後に投与する。例えば、ＣＤ７３結合化合物は、第二の治療剤の投与後、およそ０～３０日で投与し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物は、第二の治療剤の投与後、約３０分～約２週間、約３０分～約１週間、約１時間～約２時間、約２時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～１日または約１～５日で投与する。
実施例１：新規抗ｈｕＣＤ７３抗体の作製
抗ヒトＣＤ７３抗体を得るために、組み換えヒトＣＤ７３－Ｈｉｓ細胞外ドメイン組み換えタンパク質（下記のとおりＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａでクローニングおよび作製）でＢａｌｂ／ｃマウスに免疫付与した。マウスに対して、５０μｇ ＣＤ７３タンパク質および完全フロインドアジュバントの溶液で腹腔内に１回の初回免疫付与を行い、５０μｇ ＣＤ７３タンパク質および不完全フロインドアジュバントの乳液で腹腔内に２回目の免疫付与を行い、最後に１０μｇ ＣＤ７３タンパク質で静脈内に追加免疫を行った。追加免疫から３日後に免疫脾臓細胞をＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、照射した脾臓細胞の存在下で培養した。ハイブリドーマを半固体メチルセルロース含有培地に播種し、ｃｌｏｎｅｐｉｘ２装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて増殖クローンを採取した。
一次スクリーニング：親およびｈｕＣＤ７３、ｃｙｎｏＣＤ７３またはｍｏＣＤ７３発現組み換え宿主細胞株を使用して、フローサイトメトリーによって一次スクリーニングにおいて増殖クローンの上清（ＳＮ）を試験した。０．３５μＭおよび０．０３５μＭ ＣＦＳＥをそれぞれ用いてＨｕＣＤ７３およびｃｙｎｏＣＤ７３発現組み換え宿主細胞を染色した。フローサイトメトリースクリーニングのために、全細胞を等しく混合し、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって上清中の反応抗体の存在を明らかにした。４７種類の抗体が、ヒトおよびカニクイザルＣＤ７３の両方に結合することが分かった。ｈｕＣＤ７３およびｃｙｎｏＣＤ７３に結合した抗体は全て、重鎖Ｎ２９７Ｑ（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）突然変異を有し、その結果、Ｎ－結合グリコシル化を欠き、Ｆｃγ受容体への結合を実質的に欠く、キメラヒトＩｇＧ１抗体として作製した。
二次スクリーニング：この有益なスクリーニング（実施例２参照）は、４７種類の選択抗体のＣＤ７３酵素活性遮断特性を評価するために組み換えＣＤ７３タンパク質において行った。４７種類のうち３５種類の抗体が、完全にまたは部分的にＣＤ７３活性を遮断すると思われる。
組み換えｈｕＣＤ７３のクローニング、作製および精製
分子生物学
次のプライマーを使用して、ＭＩＡＰＡＣＡ－２ ｃＤＮＡからｈｕＣＤ７３タンパク質をクローニングした：ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧ（配列番号４５）（フォワード）およびＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡｔｃａＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧｃｔｔｇａｔｃｃｇａｃｃｔｔｃａａｃｔｇ（配列番号４６）（リバース）。次に、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムを用いて発現ベクターに精製ＰＣＲ産物をクローニングした。精製段階のためにタンパク質のＣ末端部分に６ｘＨｉｓタグを付加した。
クローニングされたｈｕＣＤ７３のアミノ酸配列：
Figure 0007132981000004
ｈｕＣＤ７３タンパク質の発現および精製
クローニングされた配列の確認後、細胞に対してヌクレオフェクションを行い、次いでｈｕＣＤ７３タンパク質を産生する細胞クローンを得るために作製プールをサブクローニングした。ローラー中で増殖させたｈｕＣＤ７３クローンからの上清を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを用いて精製し、２５０ｍＭ イミダゾールを用いて溶出した。次に、精製タンパク質をＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラム上に載せた。酵素活性アッセイのためにＴｒｉｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １２０ｍＭおよびＣａＣｌ２ ４ｍＭ緩衝液中で二量体に対応する精製タンパク質を処方し、一方で処方緩衝液に２０％グリセロールを供給する。
実施例２：可溶性ＣＤ７３遮断の評価
Ｓａｃｈｓｅｎｍｅｉｅｒら（Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，２０１２）に記載のように、抗ＣＤ７３抗体がＣＤ７３の酵素活性を遮断する能力を評価した。簡潔に述べると、抗ＣＤ７３またはアイソタイプ対照Ａｂの用量範囲の存在下で白色９６Ｗ平底マイクロプレート中で５００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＣＤ７３－ｈｉｓを温置した。プレートを３７℃で１時間温置した。１２．５μＭ ＡＴＰおよび１２５μＭ ＡＭＰを各ウェルに添加し、プレートを３７℃でさらに３０分間温置する。ルシフェラーゼ／ルシフェリン含有Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、プレートを暗所にてＲＴで５分間温置し、Ｅｎｓｐｉｒｅ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、放射光を測定する。
過剰なＡＭＰは、ＡＴＰ依存性ルシフェラーゼ活性を遮断することが知られている。ＡＭＰを切断してアデノシン＋無機リン酸にするＣＤ７３の添加は、ルシフェラーゼ活性および光の放射を回復させる。したがって、ＣＤ７３の酵素活性を遮断する抗体は、光の放射を減少させる。
酵素阻害のパーセンテージを下記のように評価する：
－ 条件：
〇ＡＴＰ＋ＡＭＰ：最大ルシフェラーゼ阻害（１００％）
〇ＡＴＰ＋ＡＭＰ＋ＣＤ７３：ルシフェラーゼ阻害なし（０％）
－ 式：
Figure 0007132981000005
実施例１で得た３５種類の抗体ならびに参照抗体ｍＡｂ ７Ｇ２、４Ｇ４および１Ｅ９は全て、この実験設定を使用してＣＤ７３活性を阻害することが分かった。
参照抗体を用いて報告された種々の結果を考慮して、発明者らは、ＣＤ７３遮断が酵素性部位の真の遮断ではなく、二価抗体によるＣＤ７３二量体の架橋から生じ得るか否かを考えた。すなわち、二価的結合ｍＡｂが２つの異なるＣＤ７３ホモ二量体と結合し得、次により大きいタンパク質複合体につながるので、抗体は、ＣＤ７３二量体のオリゴマー複合体を生じさせている可能性がある。次に、発明者らは、高い比の抗体：ＣＤ７３二量体で遮断アッセイを行うことによって、この可能性を試験した。この設定において、ｍＡｂは大過剰であり、オリゴマー複合体の誘導が生じ得、真のＣＤ７３機能遮断が観察されるようになる。この設定において、実際に、参照ｍＡｂ ４Ｇ４および１Ｅ９を含む全ての抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を阻害しなかった。
抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１は、試験した全ての濃度でＣＤ７３を機能的に遮断した。ｍＡｂ １Ｅ１１、８Ｃ７および６Ｅ１について、代表的な結果を図１で示す。その後、さらなる抗体（結果は示さない）は、細胞表面上で発現されるＣＤ７３に対して親和性が低く、したがって、細胞表面ＣＤ７３への高親和性結合に適切でないエピトープを提示する可能性があることが分かった。最近の刊行物で報告されている入手可能な抗ＣＤ７３参照抗体も試験した：ＣＤ７３遮断について７Ｇ２、４Ｇ４および１Ｅ９を評価した。結果（図１参照）から、７Ｇ２はＣＤ７３を遮断し、一方で、４Ｇ４および１Ｅ９は、残存酵素活性がおよそ出発レベルまたは陰性対照まで回復したので、ＣＤ７３活性を遮断しなかったことが示された。抗体ＡＤ２も試験し、何れの濃度でもＣＤ７３活性を遮断しないことが分かった。したがって、４Ｇ４および１Ｅ９は、このアッセイにおいて、おそらく溶液中でオリゴマー化を引き起こすことによりＣＤ７３を非特異的に阻害する抗体のクラスの代表である。したがって、抗体７Ｇ２、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１は、このアッセイにおいてＣＤ７３を機能的に遮断した。
ＣＤ７３遮断に対するＥＣ５０値を以下の表で示す。
Figure 0007132981000006
実施例３：ＥＬＩＳＡによるｒｅｃＣＤ７３タンパク質におけるＡｂ滴定
可溶性組み換えヒトＣＤ７３に対する結合について、機能的に可溶性組み換えＣＤ７３を遮断した抗体の特徴をより詳細に調べた。
ＰＢＳ中で５μｇ／ｍＬの組み換えヒトＣＤ７３タンパク質（ＩＰＨ、アイソフォームＥ６）でＭａｘ－ｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩コーティングした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中でプレートを５回洗浄し、２００μＬ／ｗ ＴＢＳ出発ブロック緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｈｅｒ）を添加することによって、非特異的部位を飽和させた。用量範囲の抗ＣＤ７３抗体を３７℃で２時間温置した。洗浄緩衝液中でプレートを５回洗浄し、ＨＲＰ連結ヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片二次抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、１／５００００）をＲＴで１時間添加して、結合抗ＣＤ７３抗体を検出した。洗浄緩衝液中でプレートを５回洗浄し、ＴＭＢ（ＨＲＰ基質）を添加し、プレートをＲＴで５～１０分間、暗所で温置することによって、結合二次抗体を明らかにする。ＨＣｌ １Ｍを添加することによって、酵素反応を停止させ、４５０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定した。光学密度対抗ＣＤ７３Ａｂ濃度をグラフ上にプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＥＣ５０を計算する。
結果を図２で示す。抗体、１Ｅ１１、８Ｃ７、６Ｅ１および７Ｇ２は全て、可溶性組み換えＣＤ７３と結合した。結合に対するＥＣ５０値を以下の表で示す。
Figure 0007132981000007
実施例４：フローサイトメトリー滴定
ヒト、カニクイザルおよびマウスＣＤ７３発現組み換え宿主細胞株またはＣＤ７３を内因性に発現するヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌を使用して、抗ＣＤ７３抗体がヒトＣＤ７３に結合する能力およびカニクイザルおよび／またはマウスＣＤ７３上で交差反応する能力を評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はＡＴＣＣ（参照ＨＴＢ－２６）から入手可能である。ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ／０．０２％ＮａＮ３（「染色緩衝液」と呼ぶ）中で再懸濁した１０５個の細胞を丸底９６ｗマイクロプレートに分注する。用量範囲の抗ＣＤ７３抗体をプレートに添加し、細胞を４℃で４５分間温置する。プレートを４℃にて４００ｇで３分間、回転させることにより、染色緩衝液中で細胞を３回洗浄した。染色緩衝液中で希釈したＰＥ連結ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片二次抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を細胞に添加し、プレートを４℃にてさらに３０分間温置する。細胞を上記のように３回洗浄し、ＨＴＦＣプレートリーダーを備えるＡｃｃｕｒｙ Ｃ６フローサイトメーター上で分析した。
蛍光の中央値対抗体濃度をグラフ上にプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプログラムを使用してＥＣ５０を計算する。
新規ｍＡｂ １Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１ならびに参照ｍＡｂ ７Ｇ２および１Ｅ９について図３で結果を示す。ｍＡｂ １Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１は、優れた親和性でヒトまたはカニクイザル（マウスではない）ＣＤ７３を発現する組み換え宿主細胞に結合する。しかし、ＭＡｂ ７Ｇ２および１Ｅ９は、ヒトまたはカニクイザルＣＤ７３を発現する細胞に対して乏しい結合性を示す。
ＣＤ７３を内因性に発現するヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞を使用して、実験を繰り返した。再び、ｍＡｂ １Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１は優れた親和性で結合し、一方でｍＡｂ ７Ｇ２および１Ｅ９は乏しい結合性を示す。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞での結果を図４で示す。
７Ｇ２および１Ｅ９は、組み換えＣＤ７３および、とりわけ内因性にＣＤ７３を発現するヒト腫瘍細胞を含め、ＣＤ７３発現細胞の表面上のＣＤ７３において異なって提示されるＣＤ７３上のエピトープに結合することが可能であり、その結果、組み換えＣＤ７３によく結合する（例えば免疫付与で使用される）が、細胞表面ＣＤ７３にはよく結合しないｍＡｂが得られる。一方、１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１が結合するエピトープは細胞表面ＣＤ７３上に存在し続ける。
次いで、内因性にＣＤ７３を発現するヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞を使用して実験を繰り返した。２００μＭアデノシン５’－（α，β－メチレン）ジホスフェート（ＡＰＣＰ）存在下または非存在下で細胞を３７℃で３０分間予め温置し、次いで抗体を添加した。ＡＰＣＰは、ＡＤＰの類似体であり、ＣＤ７３の活性部位に不可逆的に結合する。ＡＰＣＰが結合するとき、ＣＤ７３は、「開いた」立体構造から「閉じた」立体構造へと立体構造を変化させる。ｍＡｂ １Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１は、ＡＰＣＰ存在下および非存在下の両方で、良好な親和性でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に結合した。ＡＰＣＰ存在下で、ＥＣ５０は、ＡＰＣＰ非存在下で観察されるものと同等であった。１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１の最大結合に対するプラトーは、ＡＰＣＰ存在下よりもＡＰＣＰ非存在下で高く、一方でＡＤ２については逆であった。ＥＣ５０の数値を以下の表で示す。
Figure 0007132981000008
実施例５：細胞性ＣＤ７３活性遮断
パートＡ：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞における遮断
抗ＣＤ７３抗体が細胞表面発現ＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ酵素活性を中和する能力を評価した。ＣＤ７３を発現するモデル腫瘍細胞株として、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞株を使用した。
以下で詳述する実験で使用する試薬は全て、ＴＢＳ ｐＨ７．５（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １５０ｍＭ）中で希釈した。ＰＢＳ－ＥＤＴＡ中でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を回収し、ＴＢＳ ｐＨ７．５中で２回洗浄した。用量範囲の抗ＣＤ７３抗体の存在下で平底９６ウェルプレート中で０．５～１ｘ１０５個の細胞を播種し、４℃で２時間温置した。４℃で３０分間の温置時間の間、細胞に２００ｍＭ ＡＭＰを添加した（ＣＤ７３下方調整を回避するため）。次いで、プレートを遠心し、５０μＬ上清を平底９６ウェル培養プレートに移す。Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ検出キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造者により提供されるＴＤＳに従い、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解により生じた遊離リン酸を定量した。リン酸濃度対抗ＣＤ７３Ａｂ濃度をグラフ上にプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＥＣ５０を計算する。
結果を図５で示す。抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１は、細胞性ＣＤ７３の酵素活性を中和し、ＥＣ５０値を以下の表で示す。
Figure 0007132981000009
各抗体が、酵素活性の７５％超または８０％超の低下を達成した。細胞性ＣＤ７３に対する結合性不良と一致する抗体７Ｇ２（実施例４参照）は細胞性ＣＤ７３の酵素活性を中和しなかった。細胞表面ＣＤ７３に結合する能力が限定的であることと一致する抗体７Ｇ２は、何れの濃度でもＣＤ７３酵素活性を中和せず、試験した最大濃度で僅かな部分的阻害しか示さなかった。
各場合において、非内部移行抗体１Ｅ１１、６Ｅ１、８Ｃ７および３Ｃ１２に対して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞での細胞性ＣＤ７３の酵素活性の中和に必要とされるＥＣ５０値は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における細胞表面ＣＤ７３への結合に必要とされるＥＣ５０値よりも数倍高かった。
パートＢ：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ２９２およびＡ３７５腫瘍細胞における遮断
並行してＣＤ７３株を発現する３種類の腫瘍細胞株を用いて複数の実験においてこの時間、上記と同じアッセイを使用して、抗ＣＤ７３抗体が細胞表面発現ＣＤ７３の５’－エクトヌクレチダーゼ（５’－ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｔｉｄａｓｅ）酵素活性活性を中和する能力を評価した：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌腫瘍細胞株、Ｈ２９２肺癌細胞株（例えば、ＡＴＣＣ参照番号ＣＲＬ－１８４８を参照）およびＡ３７５メラノーマ癌細胞株（例えば、ＡＴＣＣ参照番号ＣＲＬ－１６１９を参照）。以下の表で示される中和に必要とされる有効濃度（ＥＣ、例えばＥＣ５０、ＥＣ７０、ＥＣ１００）は、３種類の様々なＣＤ７３発現細胞型での反復実験からの平均として計算した。
Figure 0007132981000010
実施例６：フローサイトメトリー競合実験
発明者らの候補および他の市販の抗ＣＤ７３抗体との間の競合を評価するために、ヒトＣＤ７３発現組み換え宿主細胞株を使用した。染色緩衝液中で再懸濁した１０５個の細胞を丸底９６Ｗマイクロプレートに分注した。用量範囲の参照マウス抗ヒトＣＤ７３抗体の存在下または非存在下で試験抗体（１μｇ／ｍＬ）の固定用量を細胞に添加する。細胞を４℃で４５分間温置し、次いで上記のように３回洗浄した。染色緩衝液中で希釈したＰＥ連結またはヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片二次抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を細胞に添加し、プレートを４℃でさらに３０分間温置する。細胞を３回洗浄し、ＨＴＦＣプレートリーダーを備えるＡｃｃｕｒｙ Ｃ６フローサイトメーター上で分析した。
蛍光の中央値対抗体濃度をプロットした。ＣＤ７３中和抗体のエピトープを試験するために、抗体間の競合として、既知の抗体が細胞膜ＣＤ７３への新規抗体の結合を遮断する能力を評価した。新規抗体候補とともに、オリゴマー化の誘導に依存することなくＣＤ７３を中和する能力を有するが、細胞アッセイにおいてＣＤ７３に結合しないかまたはこれを中和しないことが実施例２で示される参照抗体７Ｇ２を試験した。抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２、６Ｅ１の何れも、ＣＤ７３への結合について７Ｇ２と競合せず、このことから、７Ｇ２は、新規抗体とは異なるＣＤ７３上の領域に結合することが示される。
実施例７：ＣＤ７３下方調整
抗ＣＤ７３抗体がＣＤ７３発現を下方制御する能力を評価するために、ＣＤ７３を内因性に発現するヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞株を使用した。染色緩衝液中で再懸濁した１０５個の細胞を平底９６Ｗマイクロプレートに分注した。１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ７３抗体を細胞に添加し、プレートを４℃または３７℃でタイムコースにわたり温置する。Ｔ＝１０分、３０分、１ｈ、２ｈ、３ｈおよび４ｈで、ＰＳＢ／２ｍＭ ＥＤＴＡを使用して細胞を回収し、前記のように染色緩衝液中で３回洗浄し、タイムコース終了まで４℃で温置した。１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦＬｕｏｒ ６４７連結非競合抗ＣＤ７３抗体を細胞に添加し、プレートを４℃で３０分間温置する。細胞を３回洗浄し、ＨＴＦＣプレートリーダーを備えたＡｃｃｕｒｙ Ｃ６フローサイトメーター上で分析した。
発現のパーセンテージ対温置時間をグラフ上にプロットする。
細胞においてＣＤ７３発現の下方調整を引き起こすそれらの能力について抗体を評価し、参照ｍＡｂ ＡＤ２、７Ｇ２および１Ｅ９と比較した。ＡＤ２、７Ｇ２および１Ｅ９のそれぞれは、ＣＤ７３の下方調整を引き起こし、このことから、これらのｍＡｂが、ＣＤ７３のクラスター形成および内部移行を引き起こしている可能性があることが示唆される。ＡＤ２は２０％を大幅に上回る低下を引き起こし、一方で７Ｇ２および１Ｅ９はそれぞれ、細胞表面の受容体の５０％超の低下を引き起こした。抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１の何れも、細胞表面でＣＤ７３の減少を引き起こさなかった。結果は図６で示す。
実施例８：エピトープマッピング
抗ＣＤ７３抗体のエピトープを定義するために、発明者らは、ＣＤ７３の表面にわたり分子表面で露出されるアミノ酸の置換によって規定されるＣＤ７３突然変異体を設計した。以下の表で示されるように、突然変異体をＨｅｋ－２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。以下の表１の標的化アミノ酸突然変異は、配列番号１の付番を使用して示す。
Figure 0007132981000011
突然変異体の作製
ＣＤ７３突然変異体をＰＣＲにより作製する。増幅配列をアガロースゲル上で泳動し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（参照番号７４０６０９）を用いて精製する。次いで、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて、各突然変異体に対して作製される精製ＰＣＲ産物を発現ベクターに連結する。突然変異配列を含有するベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐとして調製し、配列決定する。配列決定後、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）プラスミドＭｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、突然変異配列を含有するベクターをＭｉｄｉｐｒｅｐとして調製する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用してベクターを遺伝子移入し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間、温置し、その後、導入遺伝子発現について試験する。
ＨＥＫ２９３Ｔ遺伝子移入細胞への抗ＣＤ７３結合のフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーによって、抗ＣＤ７３抗体を、各突然変異体へのそれらの結合について試験する。ある濃度で１つまたはいくつかの突然変異体への結合を喪失する抗体を決定するために、第一の実験を行う。結合の喪失を確認するために、ＣＤ７３突然変異により結合が影響を受けると思われる抗体において抗体の滴定を行う（１～０．１～０．０１～０．００１μｇ／ｍＬ）。抗体１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１は、ＣＤ７３の突然変異体３に対する結合を喪失したが、その他の何れの突然変異体に対しても結合を喪失しなかった。突然変異体３は、残基Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４およびＡ１３５でアミノ酸置換を含有し、これは、突然変異体の残基のうち１個以上または全てがこれらの抗体のコアエピトープにとって重要であることを示す。ＣＤ７３のクラスター形成および内部移行を引き起こす抗体ＡＤ２は、突然変異体３に対する結合を喪失せず；ＡＤ２は代わりに、残基Ｑ７０、Ｒ７３、Ａ７４、Ａ１０７およびＲ１０９での置換を有する突然変異体２への結合を喪失した。抗体３Ｃ１２およびＡＤ２に対する代表的な結果を図７で示す。抗体７Ｇ２は、突然変異体５、６および７への結合を喪失した（しかし突然変異体２または３に対しては喪失しなかった）。
不可逆的にＡＤＰ類似体結合物ＡＰＣＰにより例示されるように、活性部位リガンドが結合したとき、ＣＤ７３は、「開かれた」立体構造から「閉じた」立体構造に立体構造を変化させる。実施例４で示されるように、ｍＡｂ １Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２および６Ｅ１は、ＡＰＣＰの存在下および非存在下の両方で細胞性ＣＤ７３に結合し、このことから、これらの抗体のエピトープは、活性部位が塞がっている際、ＣＤ７３上に存在したままであることが示される。図８Ａは、ＣＤ７３二量体の分子構造を示し、突然変異体２で突然変異が起こったアミノ酸（ＡＤ２による結合の喪失）を「開かれた」または「閉じた」立体構造の両方で示した（白丸）。図８Ｂは、ＣＤ７３二量体の分子構造を示し、突然変異体３で突然変異が起こったアミノ酸（１Ｅ１１、８Ｃ７、３Ｃ１２または６Ｅ１による結合の喪失）を「開かれた」または「閉じた」立体構造の両方で示した。活性部位は、囲み（点線）により示す。興味深いことに、図８Ｂから、ＣＤ７３が二量体型と仮定する場合、突然変異体３で突然変異が起こったアミノ酸はＣＤ７３二量体の共通面上、例えば平面上、またはほぼ平面上にあることが分かり得る（他の突然変異体の他のエピトープはそうではない）。最終的に、突然変異体３内のアミノ酸の比較から、これらの残基が比較的酵素活性部位とは離れていることが分かり得（図８Ｂで示される）、ＣＤ７３のアロステリック阻害を含む作用方式と一致する。
実施例９：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＣＤ７３結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００一般的手順および試薬
２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＳＰＲ測定を行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＮａＯＨ １０ｍＭをそれぞれランニング緩衝液および再生緩衝液とした。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてセンサーグラムを分析した。プロテインＡは（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａでヒト可溶性二量体ＣＤ７３タンパク質をクローニングし、作製し、精製した。
プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質をセンサーチップＣＭ５上でデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合により固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でチップ表面を活性化した。プロテインＡをカップリング緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．６）中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、適切な固定レベルに到達するまで注入した（すなわち２０００ＲＵ）。１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、残存する活性化基の脱活性化を行った。
親和性実験
製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）により推奨される標準的なキャプチャー－キネティック（Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｋｉｎｅｔｉｃ）プロトコールに従い、親和性実験を行った。捕捉抗ＣＤ７３抗体に対して、１．２３～３００ｎＭの範囲のヒト組み換え可溶性二量体のＣＤ７３タンパク質の連続希釈物を連続的に注入し、再生前に１０分間、解離させた。１：１動力学的結合モデルを用いて、センサーグラムセット全体をフィットさせた。二価親和性および動力学的結合および解離速度定数を以下の表２で示す。
Figure 0007132981000012
本明細書中で引用される、刊行物、特許出願および特許を含む全ての参照物は、本明細書中の他所でなされる特定の文書の何れかの個別に提供される組み込みにかかわらず、（法律によって許される最大の限度で）各参照物が個々におよび具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書中でその全体において記載されているかのように同定度に、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる。
「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という語および同様の言及の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈すべきである。
別段の指定がない限り、本明細書中で提供される全ての厳密値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要因に関して提供される全ての代表的厳密値または測定値は、必要に応じて、「約」により修飾される対応する近似測定値も提供するとみなされ得る）。
１つまたは複数の要素に関する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの語を使用した本明細書中の何らかの態様または実施形態の本明細書中での記述は、別段の指定がない限り、または内容に明らかに矛盾しない限り、その特定の１つまたは複数の要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」またはそれを「実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」本明細書中の同様の態様または実施形態に対する支持を提供するものとする（例えば、特定の要素を含む場合の本明細書中に記載の組成物は、別段の指定がない限り、または内容に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとしても理解されるべきである）。
本明細書中で提供されるあらゆる実施例または代表的な語（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明を単により詳しく明らかにするものとして意図され、別段の主張がない限り、本発明の範囲において限定を提起しない。本願中のいかなる語も、何らかの請求項に記載されていない要素を本発明の実施に必須であるものとして示すものと解釈すべきではない。

Claims (11)

  1. 抗ＣＤ７３抗体を含む、乳癌の処置のための組成物であって、抗体が、細胞表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、その５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和可能であり、ＣＤ７３ポリペプチド二量体に二価方式で結合する抗体であり、抗ＣＤ７３抗体が、
    （ａ）Ｋａｂａｔにしたがい、（ｉ）それぞれ配列番号５、８、１１で示されるＣＤＲ１、２、３を含む重鎖、および（ｉｉ）それぞれ配列番号１４、１７、１９で示されるＣＤＲ１、２、３を含む軽鎖、を含む抗体（１Ｅ１１）；
    （ｂ）Ｋａｂａｔにしたがい、（ｉ）それぞれ配列番号５、２３、２５で示されるＣＤＲ１、２、３を含む重鎖、および（ｉｉ）それぞれ配列番号１４、１７、１９で示されるＣＤＲ１、２、３を含む軽鎖、を含む抗体（６Ｅ１）；
    （ｃ）Ｋａｂａｔにしたがい、（ｉ）それぞれ配列番号３０、３３、１１で示されるＣＤＲ１、２、３を含む重鎖、および（ｉｉ）それぞれ配列番号４４、１７、１９で示されるＣＤＲ１、２、３を含む軽鎖、を含む抗体（８Ｃ７）；
    （ｄ）Ｋａｂａｔにしたがい、（ｉ）それぞれ配列番号３０、３３、１１で示されるＣＤＲ１、２、３を含む重鎖、および（ｉｉ）それぞれ配列番号３８、１７、１９で示されるＣＤＲ１、２、３を含む軽鎖、を含む抗体（３Ｃ１２）、
    からなる群から選択される、
    組成物。
  2. 抗体が、Ｆｃドメインを介した、ヒトＣＤ１６ポリペプチド（ＦｃγＩＩＩ受容体）への結合を実質的に欠くものである、請求項１に記載の組成物。
  3. 抗体が、全長抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 抗体が、可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和可能である、請求項１～３の何れか１項に記載の組成物。
  5. 抗体が、細胞性ＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の中和に対する、１μｇ／ｍＬを超えないＥＣ５０を特徴とし、ＣＤ７３の酵素活性の中和が、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解を定量することによりＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中の５’エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害を評価することによって判定されるものである、請求項１～４の何れか１項に記載の組成物。
  6. 抗体が、ＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して１０倍大きいモル濃度過剰で提供される場合、可溶性ヒト二量体のＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和可能である、請求項１～５の何れか１項に記載の組成物。
  7. 抗体が、抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ７３ポリペプチドとの間の結合と比較して、変異Ａ９９Ｓ、Ｅ１２９Ａ、Ｋ１３３Ａ、Ｅ１３４ＮおよびＡ１３５Ｓ（配列番号１に対する）を含む突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドへの結合が低下しているものである、請求項１～６の何れか１項に記載の組成物。
  8. 抗体が、ＩｇＧ４抗体または、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の結合を減少させるために修飾されるＦｃドメインを有する抗体である、請求項１～７の何れか１項に記載の組成物。
  9. 抗体がＩｇＧ１であり、残基２３４、２３５および３３１で、または残基２３４、２３５および３２２で（ＥＵ付番）、置換を含むものである、請求項１～７の何れか１項に記載の組成物。
  10. 処置を受ける個体が、ＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞を含む腫瘍環境を有する、請求項１～９の何れか１項に記載の組成物。
  11. 組成物が、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合する抗体をさらに含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の組成物。
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