CN115135341A - 抗cd73抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了抗CD73抗体。还公开了相关的核酸、载体、细胞和药物组合物。还公开了用所述抗CD73抗体治疗癌症的方法。

Description

抗CD73抗体及其用途
相关申请
本申请要求2020年1月3日提交的美国临时申请第62/956,847号的权益，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且以引用的方式整体并入本文。所述ASCII复本创建于2020年12月23日，命名为20443-0644WO1_SL.txt，大小为89,020字节。
背景技术
分化簇73(CD73)是糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接型膜蛋白，它催化细胞外单磷酸腺苷(AMP)转化为腺苷。它以同二聚体形式发挥功能，可以脱落，并且在循环中为活性可溶性蛋白质。除了它的酶功能以外，CD73还是细胞粘附分子，并且在白细胞运输调控中起作用。已知CD73水平由于组织损伤或缺氧条件而被上调，而且许多实体肿瘤都存在CD73水平升高。肿瘤内的CD73上调促成了富腺苷肿瘤微环境，所述富腺苷肿瘤微环境有多种促肿瘤和免疫抑制作用。因此，需要靶向癌症中的CD73的治疗剂。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种结合至人CD73的抗体，其中所述抗体包含可变重(VH)域，所述可变重域包含VH互补性决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列GYTFTSYG(SEQ ID NO:1)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列IYPGSGNT(SEQ ID NO:2)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ARYDYLGSSYGFDY(SEQ ID NO:3)；并且
其中所述抗体包含可变轻(VL)域，所述可变轻域包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列QDVSTA(SEQ ID NO:4)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列SAS(SEQ ID NO:5)；
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQHYNTPYT(SEQ ID NO:6)。
在第一方面的一些实施方案中，所述VH域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体包含重链，并且其中所述重链包含SEQID NO:24所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述VL域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体包含轻链，并且其中所述轻链包含SEQID NO:25所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述VH域与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列至少80％同一，并且所述VL域与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列至少80％同一。
在第一方面的一些实施方案中，所述VH域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，并且所述VL域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQID NO:24所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在第二方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体结合至人CD73，其中所述抗体在SEQ ID NO:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人CD73。
在第三方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体结合至人CD73，并且与具有包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人CD73。
在第一方面、第二方面和第三方面的一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。
在第一方面、第二方面和第三方面的一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fsc片段、Fv片段、scFv、sc(Fv)2或双功能抗体。
在第四方面，本公开提供了一种或多种核酸，所述核酸编码如第一方面至第三方面中任一个所述的抗体。
在第五方面，本公开提供了一种或多种表达载体，所述表达载体包含如第四方面所述的前述一种或多种核酸。
在第六方面，本公开提供了一种分离的细胞，所述细胞包含如第四方面所述的一种或多种核酸或者如第五方面所述的一种或多种表达载体。
在第七方面，本公开提供了一种分离的细胞，所述细胞包含：第一表达载体，所述第一表达载体包含编码第一多肽并且可操作地连接至启动子的第一核酸，所述第一多肽包含如第一方面至第三方面中任一个所述的抗体的VH域；以及第二表达载体，所述第二表达载体包含编码第二多肽并且可操作地连接至启动子的第二核酸，所述第二多肽包含如第一方面至第三方面中任一个所述的抗体的VL域。
在第八方面，本公开提供了一种分离的细胞，所述细胞产生了如第一方面至第三方面中任一个所述的抗体。
在第九方面，本公开提供了一种制造如第一方面至第三方面中任一个所述的抗体的方法，所述方法包括培养如第六方面或第七方面所述的细胞以及分离所述抗体。
在第十方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面至第三方面中任一个所述的抗体和药学上可接受的载体。
在第十一方面，本公开提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用有效量的如第一方面至第三方面中任一个所述的抗体。
在第十一方面的一些实施方案中，所述癌症具有高腺苷特征。
在第十一方面的一些实施方案中，所述癌症是头颈癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌或肾细胞癌。
在第十二方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体结合至人CD73，其中所述抗体包含可变重(VH)域，所述可变重域包含VH互补性决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSSYD(SEQ ID NO:34)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列MSYDGSNK(SEQ ID NO:35)或MSYEGSNK(SEQ ID NO:40)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ATEIAAKGDY(SEQ ID NO:36)；并且
其中所述抗体包含可变轻(VL)域，所述可变轻域包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列QGISNY(SEQ ID NO:37)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:38)；
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSYSTPH(SEQ ID NO:39)。
在第十二方面的一些实施方案中，
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSSYD(SEQ ID NO:34)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列MSYDGSNK(SEQ ID NO:35)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ATEIAAKGDY(SEQ ID NO:36)；
所述VL CDR1包含氨基酸序列QGISNY(SEQ ID NO:37)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:38)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSYSTPH(SEQ ID NO:39)。在一些实施方案中，所述VH域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含重链，并且其中所述重链包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL域包含SEQID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链，并且其中所述轻链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH域与SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列至少80％同一，并且所述VL域与SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列至少80％同一。在一些实施方案中，所述VH域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，并且所述VL域包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在第十二方面的一些实施方案中，
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSSYD(SEQ ID NO:34)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列MSYEGSNK(SEQ ID NO:40)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ATEIAAKGDY(SEQ ID NO:36)；
所述VL CDR1包含氨基酸序列QGISNY(SEQ ID NO:37)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:38)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSYSTPH(SEQ ID NO:39)。在一些实施方案中，所述VH域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含重链，并且其中所述重链包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL域包含SEQID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链，并且其中所述轻链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH域与SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列至少80％同一，并且所述VL域与SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列至少80％同一。在一些实施方案中，所述VH域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，并且所述VL域包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在第十三方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体结合至人CD73，其中所述抗体在SEQ ID NO:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人CD73。
在第十四方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体结合至人CD73，并且与具有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人CD73。
在第十五方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体结合至人CD73，并且与具有包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人CD73。
在第十二方面至第十五方面的一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。
在第十二方面至第十五方面的一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fsc片段、Fv片段、scFv、sc(Fv)2或双功能抗体。
在第十六方面，本公开提供了一种或多种核酸，所述核酸编码如第十二方面至第十五方面中任一个所述的其抗体。
在第十七方面，本公开提供了一种或多种表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至启动子的如第十六方面所述的一种或多种核酸。
在第十八方面，本公开提供了一种分离的细胞，所述细胞包含如第十六方面所述的一种或多种核酸或者如第十七方面所述的一种或多种表达载体。
在第十九方面，本公开提供了一种分离的细胞，所述细胞包含：第一表达载体，所述第一表达载体包含编码第一多肽并且可操作地连接至启动子的第一核酸，所述第一多肽包含如第十二方面至第十五方面中任一个所述的抗体的VH域；以及第二表达载体，所述第二表达载体包含编码第二多肽并且可操作地连接至启动子的第二核酸，所述第二多肽包含如第十二方面至第十五方面中任一个所述的抗体的VL域。
在第二十方面，本公开提供了一种分离的细胞，所述细胞产生了如第十二方面至第十五方面中任一个所述的抗体。
在第二十一方面，本公开提供了一种制造如第十二方面至第十五方面中任一个所述的抗体的方法，所述方法包括培养如第十八方面或第十九方面所述的细胞以及分离所述抗体。
在第二十二方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如第十二方面至第十五方面中任一个所述的抗体和药学上可接受的载体。
在第二十三方面，本公开提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用有效量的如第十二方面至第十五方面中任一个所述的抗体。
在第二十三方面的一些实施方案中，所述癌症具有高腺苷特征。在第二十三方面的一些实施方案中，所述癌症是头颈癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌或肾细胞癌。
附图说明
图1A示出了人源化CL25抗体CL_hu10-4、HzCL25、CL25_hu_10-6和CL25_hu_11-4的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)氨基酸序列。
图1B示出了人源化CL25抗体CL25_hu_11-5、CL25_hu_11-6、CL25_hu_8-4和CL25_hu_8-5的VH和VL氨基酸序列。
图1C示出了人源化CL25抗体CL25_hu_8-6、CL25_hu_9-4、CL25_hu_9-5和CL25_hu_9-6的VH和VL氨基酸序列。
图1D示出了CL25和人源化CL25抗体的VH的比对。根据IMGT定义的CDR加了下划线。
图1E示出了CL25和人源化CL25抗体的VL的比对。根据IMGT定义的CDR加了下划线。
图2A是描绘所指出的抗体在所指出的浓度下对MDA-MB-231细胞的细胞结合(通过几何平均荧光强度[GMFI]来测量)的图。
图2B是描绘CL25或同型对照(iso ctrl)在所指出的浓度下对A375细胞的细胞结合(通过GMFI来测量)的图。
图3A是描绘对用所指出的抗体或同型对照(iso ctrl)以所指出的浓度处理的A375细胞的细胞CD73抑制的图。
图3B是描绘对用所指出的抗体或同型对照(iso ctrl)以所指出的浓度处理的MDA-MB-231细胞的细胞CD73抑制的图。
图3C是描绘对用所指出的抗体或同型对照(iso ctrl)以所指出的浓度处理的MDA-MB-231细胞的细胞CD73抑制的图。
图4是描绘对用所指出的抗体或同型对照(iso ctrl)以所指出的浓度处理的重组CD73的抑制的图。
图5A至图5N是描绘用所指出的抗体或同型对照以不同浓度处理的供体细胞中的CD4+T细胞增殖百分比的各个图。
图6是人CD73的晶体结构(4H2F.pdb)的图，其中以深灰色(用箭头)指出了CL25抗体表位。
图7是描绘与所指出的抗体或同型对照(iso ctrl)一起进行24小时孵育之后或未处理(NT)时的表面CD73水平(如用直接结合的非竞争性抗体所测量)的图。
图8是描绘施用了同型对照(IgG对照)或者1mg/kg或10mg/kg HzCL25的小鼠在所指出的肿瘤接种后天数的平均肿瘤体积的图。
图9是描绘从施用了同型对照(IgG对照)或者1mg/kg或10mg/kg HzCL25处理的小鼠收集的肿瘤中的CD73抑制百分比的图。
图10A是描绘仅来自用所指出的抗体以所指出的剂量处理的小鼠的肿瘤细胞的单细胞悬浮液的总表面CD73水平(如通过非竞争性抗体的平均荧光强度(MFI)所测定)的图。
图10B是描绘仅来自用所指出的抗体以所指出的剂量处理的小鼠的肿瘤细胞的单细胞悬浮液的受体占用率(如通过竞争性抗体的MFI所测定)的图。
图11A是描绘用10mg/kg同型对照(cx00376-001)或HzCL25接种后在所指出的天数的平均肿瘤体积的图。x轴上的三角形指出了药物施用的天数。
图11B是描绘图11A的用同型对照(左)或HzCL25(右)处理的小鼠截至第33天的个别肿瘤体积的图。
图12是描绘用所指出的抗体或IgG同型对照处理的小鼠的血清中的总可溶性hCD73和游离可溶性hCD73的浓度的图。用非竞争性抗体(抗体X，下图)检测总可溶性hCD73，用竞争性抗体(HzCL25，上图)检测游离可溶性hCD73。
图13A是描绘抗体3-F03在所指出的浓度下对MDA-MB-231细胞的细胞结合(GMFI)的图。
图13B是描绘3-F03或同型对照(Iso ctrl)在所指出的浓度下对A375细胞的细胞结合(通过GMFI测量)的图。
图14A是描绘对用3-F03或同型对照(Iso ctrl)以所指出的浓度处理的A375细胞的细胞CD73抑制的图。
图14B是描绘对用3-F03或同型对照(Iso ctrl)以所指出的浓度处理的MDA-MB-231细胞的细胞CD73抑制的图。
图15是描绘对用3-F03或同型对照(Iso control)以所指出的浓度处理的重组CD73的抑制的图。
图16A至图16D是描绘用3-F03抗体或同型对照以不同浓度处理的供体细胞中的CD4+T细胞增殖百分比的各个图。
图17是人CD73的晶体结构(4H2F.pdb)的图，其中以深灰色(用箭头)指出了3-F03抗体表位。
图18是描绘与3-F03、同型对照(iso ctrl)一起进行24小时孵育之后或未处理(NT)时的CD73表面水平(如用直接结合的非竞争性抗体CL43-Dy650所测量)的图。
图19A是描绘用10mg/kg同型对照(cx00376-001)或3-F03接种后在所指出的天数的平均肿瘤体积的图。x轴上的三角形指出了药物施用的天数。
图19B是描绘图19A的用同型对照(左)或3-F03(右)处理的小鼠截至第33天的个别肿瘤体积的图。
图20是描绘用3-F03或IgG同型对照处理的小鼠的血清中的总可溶性hCD73和游离可溶性hCD73的浓度的图。用非竞争性抗体(抗体X，上图)检测总可溶性hCD73，用竞争性抗体(3-F03，下图)检测游离可溶性hCD73。
图21A至图21J示出了3-F03和示例性3-F03变体的VH和VL氨基酸序列。
图22是描绘所指出的抗体在所指出的浓度下对MDA-MB-231细胞的细胞结合(GMFI)的图。
图23是描绘对用所指出的抗体或同型对照以所指出的浓度处理的MDA-MB-231细胞的细胞CD73抑制的图。
图24示出了具有N297A突变的人IgG1重链CH1-铰链-CH2-CH3(SEQ ID NO:73)、具有N297A突变与C末端赖氨酸的人IgG1重链CH1-铰链-CH2-CH3(SEQ ID NO:75)和人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:74)的示例性氨基酸序列。
图25A示出了编码HzCL25重链和轻链的DNA序列。
图25B示出了编码3-F03_411重链的DNA序列。
图25C示出了编码3-F03_411和3-F03_413轻链和3-F03_413重链的DNA序列。
图26是描绘用同型对照抗体、HzCL25或3-F03处理的肿瘤中的腺苷浓度的图。
图27是描绘在所指出的浓度的HzCL25抗体(Ab)和AMP下的腺苷抑制的图。
图28是描绘在所指出的浓度的3-F03抗体(Ab)和AMP下的腺苷抑制的图。
图29是描绘在所指出的浓度的HzCL25抗体(Ab)和AMP下的腺苷抑制的图。
具体实施方式
本文提供了抗CD73抗体和相关的核酸、表达载体、细胞和药物组合物。本文所述的抗CD73抗体可用于治疗或预防诸多病症，如癌症(例如头颈癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌或肾细胞癌)。
CD73
CD73(又称为“5'-核苷酸酶”和“胞外-5'-核苷酸酶”)是二聚酶(EC:3.1.3.5)，它呈通过GPI键联结合至细胞膜的外面的同二聚体形式发挥功能。CD73可以脱落，并且在循环中为活性可溶性蛋白质。CD73催化细胞外AMP转化为腺苷。CD73酶活性需要在开放CD73构象下进行底物结合。底物结合之后，CD73经历了从开放构象到封闭构象的构象大变化，从而将AMP转化为腺苷(参见例如Knapp等人,2012,Structure,20(12):2161-73)。CD73还以细胞粘附分子形式发挥功能，并且在调控白细胞运输方面起作用。
CD73酶活性在癌症激发和转移中起作用(参见例如Stagg和Smyth,2010,Oncogene,29:5346-5358；Salmi和Jalkanen,2012,OncoImmunology,1:247-248,2012；Stagg,2012,OncoImmunology,1:217-218；Zhang,2012,OncoImmunology,167-70)。癌细胞中的CD73过度表达削弱了适应性抗肿瘤免疫应答，从而增强了肿瘤生长和转移(参见例如
Figure BDA0003797931500000132
等人,2004,J.Immunol.,172:1646-1653；Sadej等人,2006,NucleosidesNucleotides Nucleic Acids,25:1119-1123；Braganhol等人,2007,Biochim.Biophys.Acta.,1770:1352-1359；Zhang,2010,Cancer Res.,70:6407-6411；Zhang,2012,OncoImmunology,1:67-70)。
成熟人CD73蛋白(GenBank登录号NP_002517的氨基酸27-549)的示例性氨基酸序列为：
Figure BDA0003797931500000131
成熟鼠CD73蛋白(GenBank登录号NP_035981的氨基酸29-551)的示例性氨基酸序列为：
Figure BDA0003797931500000141
成熟食蟹猴CD73蛋白的示例性氨基酸序列为：
Figure BDA0003797931500000142
抗CD73抗体
本公开提供了可用于治疗癌症的抗CD73抗体。这些抗体可以结合人CD73。
在一些情况下，这些抗体结合人CD73和食蟹猴CD73。在一些情况下，这些抗体结合人CD73和食蟹猴CD73而不结合鼠CD73。此类抗CD73抗体包括抗CD73单克隆抗体CL25和其人源化形式HzCL25的序列，所述其人源化形式以高亲和力结合至人和食蟹猴CD73(例如，在开放构象下对人和食蟹猴CD73低于约0.5nM)，并且对小鼠CD73具有不可检测的结合。
在一些情况下，这些抗体结合人CD73、食蟹猴CD73和鼠CD73。此类抗CD73抗体包括人抗CD73单克隆抗体3-F03的序列，所述抗体以高亲和力结合至人、食蟹猴和鼠CD73中每一者的开放构象(例如，对人CD73为约0.37nM，对食蟹猴CD73为约0.734nM，对鼠CD73为约1.66nM)。此类抗CD73抗体在存在过量不可切割CD73配体APCP的情况下对人、食蟹猴和鼠CD73中每一者的封闭构象都具有不可检测的结合。
抗体HzCL25
抗体HzCL25是在重链恒定区的位置天冬酰胺-297(N297，根据EU编号)具有丙氨酸以降低效应功能的人源化IgG1/κ单克隆抗体。它以高亲和力(KD≤0.5nM)特异性结合人和食蟹猴CD73，并且具有低效应功能性。
HzCL25是由CL25抗体的嵌合形式构建而成。CL25鼠重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)是获自用包含HIS标签的重组人CD73(SEQ ID NO:70)免疫过的小鼠。测定B细胞的抗体序列，并且将鼠重链可变域(VH)(SEQ ID NO:26)和轻链可变域(VL)(SEQ ID NO:27)表达为与人IgG1 Fc(包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的κ轻链恒定区)的嵌合体。以下表1示出了根据IMGT、Chothia、AbM、Kabat和Contact编号的CL25互补性决定区(CDR)的氨基酸序列。以下表1还示出了CL25成熟VH和VL的氨基酸序列。
表1.CL25 CDR、VH和VL
Figure BDA0003797931500000151
Figure BDA0003797931500000161
为了构建HzCL25，将CL25 VH和VL序列与人VH和VK基因数据库相比对。将来自鼠CL25抗体的CDR(表1)移植到人VH和VK基因中。
以下表2示出了根据IMGT、Chothia、AbM、Kabat和Contact编号的HzCL25 CDR的氨基酸序列。以下表2还示出了HzCL25成熟VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列。
表2.HzCL25 CDR、VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列
Figure BDA0003797931500000162
Figure BDA0003797931500000171
抗CD73抗体可以涵盖HzCL25或CL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH(参见表2)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL(参见表2)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH(参见表2)以及含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL(参见表2)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有CL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH(参见表1)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有CL25的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的VL(参见表1)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有CL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH(参见表1)以及含有CL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL(参见表1)。在一些情况下，所述抗CD73抗体可以在HzCL25或CL25的六个CDR中的一个或多个(即，1、2、3、4、5或6个)内具有例如1、2或3个取代。在一些情况下，所述抗体(i)抑制了细胞CD73(例如，在细胞CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例3中所述的测定法所测定)；和/或(ii)抑制了可溶性CD73(例如，在可溶性CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例4中所述的测定法所测定)；和/或(iii)以高亲和力结合呈开放构象的人或食蟹猴CD73(例如，KD≤0.5nM)，但不显著结合来自小鼠的呈开放构象的CD73(例如，如通过实施例6中所述的结合测定法所测定)；和/或(iv)以高亲和力结合呈封闭构象的人或食蟹猴CD73(例如，KD≤0.5nM)，但不显著结合来自小鼠的呈封闭构象的CD73；和/或(v)结合至SEQID NO:70的氨基酸40-53内(即，TKVQQIRRAEPNVL(SEQ ID NO:76)内)的表位(例如，如通过实施例6中所述的结合测定法所测定)；和/或(vi)降低了AMP介导的T细胞增殖抑制(例如，在T细胞增殖方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例5中所述的测定法所测定)；和/或(vii)降低了细胞表面CD73的水平(例如癌细胞上，例如黑色素瘤癌细胞上，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例8中所述的测定法所测定)；和/或(viii)降低了肿瘤生长(例如黑色素瘤肿瘤，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例9中所述的测定法所测定)；和/或(ix)减少了细胞上的游离表面CD73(例如癌细胞，例如黑色素瘤癌，例如与同型对照相比减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例11中所述的测定法所测定)。
根据IMGT定义或替代CDR定义，诸如但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM CDR定义或contact定义，所述抗CD73抗体可以包含HzCL25或CL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。这些抗CD73抗体可以在HzCL25或CL25的VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3中包括零、一、二或三个取代。在一些实施方案中，根据IMGT定义或替代CDR定义，诸如但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM CDR定义或contact定义，所述抗CD73抗体另外包含HzCL25或CL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。这些抗CD73抗体可以在HzCL25或CL25的VL CDR1和/或VLCDR2和/或VL CDR3中包括零、一、二或三个取代。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:1、2和3所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ IDNO:4、5和6所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:7、8和9所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQID NO:10、11和6所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:12、13和9所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:10、11和6所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:14、15和9所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:10、11和6所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:16、17和18所示的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:19、20和21所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID SEQ ID NO:7、8和9所示的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:10、29和6所示的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:12、13和9所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:10、29和6所示的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:14、15和9所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:10、29和6所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQID NO:16、28和18所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:19、20和21所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，这些抗体(i)抑制了细胞CD73(例如，在细胞CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例3中所述的测定法所测定)；和/或(ii)抑制了可溶性CD73(例如，在可溶性CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例4中所述的测定法所测定)；和/或(iii)以高亲和力结合呈开放构象的人或食蟹猴CD73(例如，KD≤0.5nM)，但不显著结合来自小鼠的呈开放构象的CD73(例如，如通过实施例6中所述的结合测定法所测定)；和/或(iv)以高亲和力结合呈封闭构象的人或食蟹猴CD73(例如，KD≤0.5nM)，但不显著结合来自小鼠的呈封闭构象的CD73；和/或(v)结合至SEQ ID NO:70的氨基酸40-53内(即，TKVQQIRRAEPNVL(SEQ ID NO:76)内)的表位(例如，如通过实施例6中所述的结合测定法所测定)；和/或(vi)降低了AMP介导的T细胞增殖抑制(例如，在T细胞增殖方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例5中所述的测定法所测定)；和/或(vii)降低了细胞表面CD73的水平(例如癌细胞上，例如黑色素瘤癌细胞上，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例8中所述的测定法所测定)；和/或(viii)降低了肿瘤生长(例如黑色素瘤肿瘤，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例9中所述的测定法所测定)；和/或(ix)减少了细胞上的游离表面CD73(例如癌细胞，例如黑色素瘤癌，例如与同型对照相比减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例11中所述的测定法所测定)。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含相对于SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的重链，其中所述重链包含相对于SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含相对于SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的轻链，其中所述轻链包含相对于SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)相对于SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含相对于SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含相对于SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)相对于SEQID NO:24所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的重链，其中所述重链包含相对于SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的轻链，其中所述轻链包含相对于SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO:23、27、80和81所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与HzCL25的VH(即，SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与HzCL25的VH(即，SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与HzCL25的重链(即，SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含重链，所述重链包含含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与HzCL25的VH(即，SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述重链包含与HzCL25的重链(即，SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与HzCL25的VL(即，SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有HzCL25的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与HzCL25的VL(即，SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与HzCL25的轻链(即，SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含轻链，所述轻链包含含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与HzCL25的VL(即，SEQID NO:23所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述轻链包含与HzCL25的轻链(即，SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)与HzCL25的VH(即，SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)与HzCL25的VL(即，SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与HzCL25的VH(即，SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与HzCL25的VL(即，SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的VH以及(ii)含有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)与HzCL25的重链(即，SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；以及(ii)与HzCL25的轻链(即，SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)重链，所述重链包含含有HzCL25的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列)的VH，其中所述重链包含与HzCL25的重链(即，SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)轻链，所述轻链包含含有HzCL25的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表1，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列)的VL，其中所述轻链包含与HzCL25的轻链(即，SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链，以及(ii)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的轻链。
HzCL25的CD73结合表位在氨基酸序列TKVQQIRRAEPNVL(SEQ ID NO:76)(即，SEQID NO:70所示的氨基酸序列的氨基酸40-53)内。本公开的特征在于在序列TKVQQIRRAEPNVL(SEQ ID NO:76)内结合至CD73的抗体。本公开的特征在于与HzCL25结合至相同表位的抗体。本公开的特征还在于竞争性抑制HzCL25与人CD73的结合的抗体。
在一些实施方案中，HzCL25的VH连接至包含CH1域和铰链区的重链恒定区。在一些实施方案中，HzCL25的VH连接至包含CH3域的重链恒定区。在一些实施方案中，所述CH3域缺乏C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述CH3域含有C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在某些实施方案中，HzCL25的VH连接至包含来自人IgG1的CH1域、铰链区、CH2域和CH3域的重链恒定区。在一些实施方案中，来自人IgG1的CH3域缺乏C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在一些实施方案中，来自人IgG1的CH3域含有C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在某些实施方案中，此类抗体在重链恒定区中含有一个或多个增加抗体稳定性的其他突变。在某些实施方案中，所述重链恒定区包括改变抗体性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合)的取代。在某些实施方案中，所述重链恒定区在重链恒定区的位置天冬酰胺-297(N297，根据EU编号)处包括丙氨酸以降低效应功能。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG4抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是IgG2抗体。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于野生型重链恒定区缺乏一个或多个赖氨酸(K)氨基酸残基的重链恒定区。举例来说，在某些实施方案中，所述抗体包含缺乏重链恒定区CH3域C末端赖氨酸(K)氨基酸残基的重链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的重链恒定区和具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列的重链恒定区和具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的轻链恒定区。
抗体3-F03
抗体3-F03是在重链恒定区的位置天冬酰胺-297(N297，根据EU编号)处具有丙氨酸以降低效应功能的人IgG1/κ单克隆抗体。3-F03以高亲和力(KD≤2nM)特异性结合人、食蟹猴和鼠CD73，并且具有低效应功能性。
3-F03是从通过对单个供体库进行多轮选择而获得的序列工程改造而来。随后将这个库的scFv卡匣重组至酵母呈现载体库中，用鼠CD73(SEQ ID NO:71)进行FAC选择。酵母3-F03 scFv卡匣的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:77和65中：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:77)；和
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIK(SEQ ID NO:65)。
为了构建3-F03抗体，如下对酵母3-F03 VH和VL进行修饰并克隆至人IgG1/κ支架中。对于VH，将酵母3-F03 VH(SEQ ID NO:77)的N末端谷氨酸(E)去除，并且将SEQ ID NO:77的Kabat位置H77(即，SEQ ID NO:77的位置78)上的苏氨酸(T)取代为丙氨酸(A)。对于VL，将SEQ ID NO:65的N末端丙氨酸(A)去除。所得全长人3-F03抗体含有分别如SEQ ID NO:60和61的氨基酸序列所示的VH和VL。所得全长人3-F03抗体在本文称为“3-F03”。以下表3示出了根据IMGT、Chothia、AbM、Kabat和Contact编号的3-F03 CDR的氨基酸序列。以下表3还示出了3-F03成熟VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列。
表3. 3-F03 CDR、VH和VL的氨基酸序列
Figure BDA0003797931500000311
Figure BDA0003797931500000321
本文还描述了3-F03的变体。3-F03_411与3-F03同一，但3-F03_411重链(i)含有3-F03中缺乏的N末端谷氨酸(E)，并且(ii)不包括3-F03中所存在的C末端赖氨酸。以下表4示出了3-F03_411成熟VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列。3-F03_413与3-F03_411同一，但它在VH Kabat位置H53(SEQ ID NO:60的位置54)处含有谷氨酸(E)而非天冬氨酸(D)。以下表5示出了根据IMGT、Chothia、AbM、Kabat和Contact编号的3-F03_413CDR的氨基酸序列。以下表5还示出了3-F03_413成熟VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列。以下实施例描述了其他变体(参见图21A至图21J)。
表4. 3-F03_411HC和LC的氨基酸序列
Figure BDA0003797931500000322
Figure BDA0003797931500000331
表5. 3-F03_413CDR、VH、VL、HC、LC的氨基酸序列
Figure BDA0003797931500000332
Figure BDA0003797931500000341
所述抗CD73抗体可以涵盖3-F03或3-F03_413的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有3-F03的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的VH(参见表3)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有3-F03的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL(参见表3)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有3-F03的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH(参见表3)以及含有3-F03的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL(参见表3)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有3-F03_413的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3的VH(参见表5)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有3-F03_413的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL(参见表5)。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有3-F03_413的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH(参见表5)以及含有3-F03_413的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL(参见表5)。在一些情况下，所述抗CD73抗体可以在3-F03或3-F03_413的六个CDR中的一个或多个(即，1、2、3、4、5或6个)内具有例如1、2或3个取代。在一些情况下，这些抗体(i)抑制了细胞CD73(例如，在细胞CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例15中所述的测定法所测定)；和/或(ii)抑制了可溶性CD73(例如，在可溶性CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例16中所述的测定法所测定)；和/或(iii)以高亲和力(例如KD≤2nM)结合呈开放构象的人、食蟹猴或鼠CD73(例如，如通过实施例18中所述的结合测定法所测定)；和/或(iv)不结合呈封闭构象的人、食蟹猴或鼠CD73；和/或(v)结合至SEQ ID NO:70的氨基酸386-399内(即，AAVLPFGGTFDLVQ(SEQ ID NO:78)内)、SEQ ID NO:70的氨基酸470-489内(即，ILPNFLANGGDGFQMIKDEL(SEQ ID NO:79)内)的表位(例如，如通过实施例6中所述的结合测定法所测定)；和/或(vi)降低了AMP介导的T细胞增殖抑制(例如，在T细胞增殖方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例17中所述的测定法所测定)；和/或(vii)降低了细胞表面CD73的水平(例如癌细胞上，例如黑色素瘤癌细胞上，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例20中所述的测定法所测定)；和/或(viii)降低了肿瘤生长(例如黑色素瘤肿瘤，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例21中所述的测定法所测定)。
根据IMGT定义或替代CDR定义，诸如但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM CDR定义或contact定义，所述抗CD73抗体可以包含3-F03或3-F03_413的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。这些抗CD73抗体可以在3-F03或3-F03_413的VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3中包括零、一、二或三个取代。在一些实施方案中，根据IMGT定义或替代CDR定义，诸如但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM CDR定义或contact定义，所述抗CD73抗体另外包含3-F03或3-F03_413的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。这些抗CD73抗体可以在3-F03或3-F03_413的VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3中包括零、一、二或三个取代。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:34、35和36所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:37、38和39所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:41、42和52所示的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:44、45和39所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:46、47和52所示的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:44、45和39所示的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:49、50和52所示的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:44、45和39所示的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:53、54和56所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:57、58和59所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ IDNO:34、40和36所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:37、38和39所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:41、43和52所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQID NO:44、45和39所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:46、48和52所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:44、45和39所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:49、51和52所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:44、45和39所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，所述抗CD73抗体包含含有分别如SEQ ID NO:53、55和56所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH，以及含有分别如SEQ ID NO:57、58和59所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL。在一些情况下，这些抗体(i)抑制了细胞CD73(例如，在细胞CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例15中所述的测定法所测定)；和/或(ii)抑制了可溶性CD73(例如，在可溶性CD73活性方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例16中所述的测定法所测定)；和/或(iii)以高亲和力(例如KD≤2nM)结合呈开放构象的人、食蟹猴或鼠CD73(例如，如通过实施例18中所述的结合测定法所测定)；和/或(iv)不结合呈封闭构象的人、食蟹猴或鼠CD73；和/或(v)结合至SEQ ID NO:70的氨基酸386-399内(即，AAVLPFGGTFDLVQ(SEQ ID NO:78)内)、SEQ ID NO:70的氨基酸470-489内(即，ILPNFLANGGDGFQMIKDEL(SEQ ID NO:79)内)的表位(例如，如通过实施例6中所述的结合测定法所测定)；和/或(vi)降低了AMP介导的T细胞增殖抑制(例如，在T细胞增殖方面与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例17中所述的测定法所测定)；和/或(vii)降低了细胞表面CD73的水平(例如癌细胞上，例如黑色素瘤癌细胞上，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例20中所述的测定法所测定)；和/或(viii)降低了肿瘤生长(例如黑色素瘤肿瘤，例如与同型对照相比降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％，如通过例如实施例21中所述的测定法所测定)。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:34-36或分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含相对于SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ IDNO:30、33和66所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:34-36或分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的重链，其中所述重链包含相对于SEQ ID NO:30、33和66所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含相对于SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的轻链，其中所述轻链包含相对于SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)相对于SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:34-36或分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含相对于SEQID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含相对于SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)相对于SEQ ID NO:30、33和66所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)相对于SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:34-36或分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的重链，其中所述重链包含相对于SEQ ID NO:30、33和66所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的轻链，其中所述轻链包含相对于SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:34-36或分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO:61、64和65所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:34-36或分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的VH具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)含有3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表3和表5，例如根据IMGT定义，例如分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的VL具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与3-F03_411或3-F03_413的VH(即，分别如SEQ ID NO:62或63所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03_411的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表3，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34-36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与3-F03_411的VH(即，SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03_413的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表5，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与3-F03_411的VH(即，SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与3-F03_411或3-F03_F13的重链(即，分别如SEQ ID NO:30或33所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含重链，所述重链包含含有3-F03_411的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表3，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34-36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述重链包含与3-F03_411的重链(即，SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含重链，所述重链包含含有3-F03_413的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表5，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述重链包含与3-F03_413的重链(即，SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与3-F03_411或3-F03_413的VL(即，SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有3-F03_411或3-F03_413的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表3，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与3-F03_411或3-F03_413的VL(即，SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与3-F03_411或3-F03_413的轻链(即，SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含轻链，所述轻链包含含有3-F03_411或3-F03_413的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表5，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述轻链包含与3-F03_411或3-F03_413的轻链(即，SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含含有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与3-F03_411或3-F03_413的VH(即，分别如SEQ ID NO:62或63所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列以及与3-F03_411或3-F03_413的VL(即，如SEQ IDNO:61所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有3-F03_411的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表3，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34-36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与3-F03的VH(即，SEQ IDNO:62所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)含有3-F03_411的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3(参见表3，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与3-F03的VL(即，SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)含有3-F03_413的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3(参见表5，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述VH包含与3-F03_413的VH(即，SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)含有3-F03_413的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表5，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述VL包含与3-F03_413的VL(即，SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)VH，其包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；以及(ii)VL，其包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)VH，其包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列；以及(ii)VL，其包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含与3-F03_411或3-F03_413的重链(即，分别如SEQ ID NO:30或33所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列以及与3-F03_411或3-F03_413的轻链(即，如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)重链，所述重链包含含有3-F03_411的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3(参见表3，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34-36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述重链包含与3-F03_411的重链(即，SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)轻链，所述轻链包含含有3-F03_411的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表3，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述轻链包含与3-F03的轻链(即，SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)重链，所述重链包含含有3-F03_413的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见表5，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:34、40和36所示的氨基酸序列)的VH，其中所述重链包含与3-F03的重链(即，SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)轻链，所述轻链包含含有3-F03_413的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见表5，例如根据IMGT定义，即，分别如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列)的VL，其中所述轻链包含与3-F03_413的轻链(即，SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列)具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)重链，其包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；以及(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CD73抗体包含：(i)重链，其包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；以及(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
3-F03(及其变体，例如3-F03_411和3-F03_413)的CD73结合表位含有AAVLPFGGTFDLVQ(SEQ ID NO:78)(即，SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的氨基酸386-399)和ILPNFLANGGDGFQMIKDEL(SEQ ID NO:79)(即，SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的氨基酸470-489)。本公开的特征在于在AAVLPFGGTFDLVQ(SEQ ID NO:78)和ILPNFLANGGDGFQMIKDEL(SEQ ID NO:79)内的表位处结合至CD73的抗体。本公开的特征在于结合至与3-F03(或其变体，例如3-F03_411或3-F03_413)相同的表位的抗体。本公开的特征还在于竞争性抑制3-F03(或其变体，例如3-F03_411或3-F03_413)与人CD73的结合的抗体。
在一些实施方案中，3-F03(或其变体，例如3-F03_411或3-F03_413)的VH连接至包含CH1域和铰链区的重链恒定区。在一些实施方案中，3-F03(或其变体，例如3-F03_411或3-F03_413)的VH连接至包含CH3域的重链恒定区。在一些实施方案中，所述CH3域缺乏C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述CH3域含有C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在某些实施方案中，3-F03(或其变体，例如3-F03_411或3-F03_413)的VH连接至包含来自人IgG1的CH1域、铰链区、CH2域和CH3域的重链恒定区。在一些实施方案中，来自人IgG1的CH3域缺乏C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在一些实施方案中，来自人IgG1的CH3域含有C末端赖氨酸(K)氨基酸残基。在某些实施方案中，此类抗体在重链恒定区中含有一个或多个增加抗体稳定性的其他突变。在某些实施方案中，重链恒定区包括改变抗体性质(例如，减少Fc受体结合、增加或减少抗体糖基化、减少与C1q的结合)的取代。在某些实施方案中，重链恒定区在所述重链恒定区的位置天冬酰胺-297(N297，根据EU编号)处包括丙氨酸(A)以降低效应功能。
在某些实施方案中，所述抗CD73抗体是IgG抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG4抗体。在另一实施方案中，所述抗体是IgG2抗体。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含相对于野生型重链恒定区缺乏一个或多个赖氨酸(K)氨基酸残基的重链恒定区。举例来说，在某些实施方案中，所述抗体包含缺乏重链恒定区CH3域C末端赖氨酸(K)氨基酸残基的重链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的重链恒定区和具有SEQ IDNO:74所示的氨基酸序列的轻链恒定区。在某些实施方案中，所述抗CD73抗体包含具有SEQID NO:75所示的氨基酸序列的重链恒定区和具有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的轻链恒定区。
抗体片段
在一些情况下，所述抗CD73抗体是抗体片段。本文所述的抗体的片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Facb和Fv)可以通过对完整抗体进行蛋白水解消化来制备。举例来说，可以通过用诸如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶的酶处理完整抗体来获得抗体片段。完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生了F(ab)2或Fab片段；完整抗体的胃蛋白酶消化产生了F(ab')2或Fab'；完整抗体的纤溶酶消化产生了Facb片段。
替代地，可以重组产生抗体片段。举例来说，可以构建编码目标抗体片段的核酸，引入到表达载体中，并且在合适的宿主细胞中表达。参见例如Co,M.S.等人,J.Immunol.,152:2968-2976(1994)；Better,M.和Horwitz,A.H.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Plueckthun,A.和Skerra,A.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology,121:652-663(1989)；Rousseaux,J.等人,Methods inEnzymology,(1989)121:663-669(1989)；和Bird,R.E.等人,TIBTECH,9:132-137(1991)。抗体片段可以表达于大肠杆菌中并且从中分泌，因此允许轻易产生大量这些片段。还可以从抗体噬菌体库中分离抗体片段。替代地，可以从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab)2片段(Carter等人,Bio/Technology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab')2片段。具有增加的体内半衰期并且包含补救受体结合表位残基的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利第5,869,046号中。
微抗体
在一些情况下，所述抗CD73抗体是微抗体。抗CD73抗体的微抗体包括双功能抗体、单链(scFv)和单链(Fv)2(sc(Fv)2)。
“双功能抗体”是通过基因融合构建的二价微抗体(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6444-6448(1993)；EP 404,097；WO 93/11161)。双功能抗体是由两个多肽链构成的二聚体。双功能抗体的各个多肽链的VL和VH域通过接头结合。构成接头的氨基酸残基的数目可以在2至12个残基之间(例如3至10个残基或者五或约五个残基)。双功能抗体中的多肽的接头通常太短而不允许VL和VH与彼此结合。因此，相同多肽链中编码的VL和VH不能形成单链可变区片段，而是与不同的单链可变区片段形成二聚体。因此，双功能抗体具有两个抗原结合位点。
scFv是通过用接头连接VH和VL而获得的单链多肽抗体(参见例如Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)；和Plickthun,“The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies”,第113卷,Resenburg和Moore编,Springer Verlag,New York,第269-315页,(1994))。VH和VL的连接顺序不受特别限制，它们可以按任何顺序排列。排列的实例包括：[VH]接头[VL]；或[VL]接头[VH]。scFv中的重链可变域和轻链可变域可以来源于本文所述的任何抗CD73抗体。
sc(Fv)2是其中两个VH和两个VL通过接头连接从而形成单链的微抗体(Hudson等人,J.Immunol.Methods,(1999)231:177-189(1999))。可以例如通过用接头连接scFv来制备sc(Fv)2。本发明的sc(Fv)2包括优选其中两个VH和两个VL按以下顺序排列的抗体：VH、VL、VH和VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])，从单链多肽的N末端开始；然而，两个VH和两个VL的顺序不限于以上排列，而且它们可以按任何顺序排列。
双特异性抗体
在一些情况下，所述抗CD73抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两个不同的表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合至CD73蛋白的两个不同的表位。其他这些抗体可以组合CD73结合位点与针对另一蛋白的结合位点。可以制备呈全长抗体或其低分子量形式的双特异性抗体(例如F(ab')2双特异性抗体、sc(Fv)2双特异性抗体、双功能抗体双特异性抗体)。
全长双特异性抗体的传统产生是基于共表达两对免疫球蛋白重链-轻链，其中所述两个链具有不同的特异性(Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。在一种不同的方法中，使具有所需结合特异性的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。将编码免疫球蛋白重链融合物和(需要时)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。这在调节三个多肽片段的比例方面提供了更大的灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等比率表达导致高产率时，可以将两个或所有三个多肽链的编码序列插入到单个表达载体中。
根据美国专利第5,731,168号中所述的另一种方法，可以对一对抗体分子之间的界面进行工程改造以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选界面包含CH3域的至少一部分。在这种方法中，将来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。通过将大氨基酸侧链替换为较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)在第二抗体分子的界面上产生与大侧链具有相同或类似大小的互补“凹穴”。这提供了使异二聚体产率相对于其他不需要的终产物(诸如同二聚体)有所增高的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。举例来说，异源缀合物中的抗体中一个可以与亲和素偶联，另一个与生物素偶联。可以使用任何方便的交联方法来制造异源缀合物抗体。
“双功能抗体”技术提供了用于制造双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过因太短而不允许同一链上的两个域之间配对的接头连接至VL的VH。因此，使一个片段的VH和VL域与另一个片段的互补VL和VH域配对，从而形成两个抗原结合位点。
多价抗体
在一些情况下，所述抗CD73抗体是多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快地被表达所述抗体所结合的抗原的细胞内在化(和/或异化)。本文所述的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)，它们可以通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸而容易地产生。多价抗体可以包含二聚域和三个或更多个抗原结合位点。示例性二聚域包含Fc区或铰链区(或由其组成)。多价抗体可以包含三至约八(例如四)个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体任选地包含至少一个多肽链(例如至少两个多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变域。举例来说，所述多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的多肽链，X1和X2表示氨基酸或肽间隔基，n为0或1。
缀合的抗体
在一些情况下，所述抗CD73抗体是缀合的抗体。本文公开的抗体可以是缀合的抗体，它们结合至不同的分子，包括大分子物质，诸如聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、PEG修饰的聚乙烯亚胺(PEI)(PEI-PEG)、聚谷氨酸(PGA)(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物)、透明质酸、放射性物质(例如90Y、131I)、荧光物质、发光物质、半抗原、酶、金属螯合物、药物和毒素(例如卡奇霉素(calcheamicin)、假单胞菌外毒素A、蓖麻毒素(例如去糖基化蓖麻毒素A链))。
在一个实施方案中，为了改进抗CD73抗体的细胞毒性作用并且因此改进它们的治疗效果，使抗体与高毒性物质(包括放射性同位素和细胞毒性剂)缀合。这些缀合物可以选择性地递送毒性负载至靶位点(即，表达抗体所识别的抗原的细胞)，而抗体不识别的细胞得以幸免。为了使毒性降至最低，一般基于具有短血清半衰期的分子(因此，使用鼠序列和IgG3或IgG4同型)对缀合物进行工程改造。
在某些实施方案中，抗CD73抗体被使其稳定性和/或循环中，例如血液、血清或其他组织中滞留时间提高例如至少1.5、2、5、10或50倍的部分修饰。举例来说，所述抗CD73抗体可以与聚合物，例如基本上无抗原性聚合物，诸如聚环氧烷或聚环氧乙烷缔合(例如缀合)。合适的聚合物按重量计变化很大。可以使用数均分子量在约200至约35,000道尔顿(或约1,000至约15,000和2,000至约12,500)范围内的聚合物。举例来说，所述抗CD73抗体可以与水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮缀合。此类聚合物的实例包括聚环氧烷均聚物，诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是维持嵌段共聚物的水溶性。其他可用聚合物包括聚氧烯烃，诸如聚氧乙烯、聚氧丙烯，和聚氧乙烯与聚氧丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomer)；以及分支或无分支多糖。
可以通过分别对抗体或本文所述的其较低分子量形式进行化学修饰来制备上述缀合抗体。修饰抗体的方法在本领域中是众所周知的(例如，US 5,057,313和US 5,156,840)。
产生抗体的方法
可以在细菌或真核细胞中产生抗体。可以在细菌细胞，例如大肠杆菌细胞中产生一些抗体，例如Fab。还可以在诸如转化细胞系(例如CHO、293E、COS)的真核细胞中产生抗体。另外，抗体(例如scFv)可以表达在诸如毕赤氏酵母(Pichia)(参见例如Powers等人,JImmunol Methods.251:123-35(2001))、汉逊酵母(Hanseula)或酵母菌属(Saccharomyces)等酵母细胞中。为了产生目标抗体，构建了编码抗体的多核苷酸，引入到表达载体中，随后在合适的宿主细胞中表达。使用标准分子生物学技术制备了重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及回收抗体。
如果在细菌细胞(例如大肠杆菌)中表达抗体，则表达载体应当具有允许载体在细菌细胞中扩增的特征。另外，当使用诸如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue等大肠杆菌作为宿主时，载体必须具有可以允许在大肠杆菌中有效表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人,341:544-546(1989))、araB启动子(Better等人,Science,240:1041-1043(1988))或T7启动子。此类载体的实例包括例如M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用这种表达载体时，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)。表达载体可以含有抗体分泌的信号序列。为了产生到大肠杆菌的周质中，可以使用pelB信号序列(Lei等人,J.Bacteriol.,169:4379(1987))作为抗体分泌的信号序列。对于细菌表达，可以使用氯化钙方法或电穿孔方法将表达载体引入到细菌细胞中。
如果在诸如CHO、COS和NIH3T3细胞等动物细胞中表达抗体，则表达载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人,Nature,277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))或CMV启动子。除了编码免疫球蛋白或其域的核酸序列以外，重组表达载体还可以携带其他序列，诸如在宿主细胞中调控载体复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择已经引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。举例来说，可选择标记基因通常赋予已经引入载体的宿主细胞以对诸如G418、潮霉素(hygromycin)或甲氨喋呤(methotrexate)等药物的抗性。具有可选择标记物的载体的实例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中产生抗体。用于表达抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR可选择标记物一起使用，例如，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述)、人胚肾293细胞(例如293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞细胞系(例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞)和来自转基因动物，例如转基因哺乳动物的细胞。举例来说，细胞是乳房上皮细胞。
在示例性抗体表达系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗CD73抗体(例如CL25、HzCL25、3-F03、3-F03_411或3-F03_413)的抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至增强子/启动子调控元件(例如，来源于SV40、CMV、腺病毒等等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，它允许使用甲氨喋呤选择/扩增来选择已经用载体转染过的CHO细胞。培养所选择的转化宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链，并且从培养基中回收抗体。
还可以通过转基因动物产生抗体。举例来说，美国专利第5,849,992号描述了一种在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建了包括乳汁特异性启动子和编码目标抗体的核酸以及分泌信号序列的转基因。由此类转基因哺乳动物中的雌性产生的乳汁包括于其中分泌的目标抗体。可以从乳汁中提纯抗体，或者对于一些应用，直接使用。还提供了包含一种或多种本文所述的核酸的动物。
可以从宿主细胞内部或外部(诸如培养基)分离本公开的抗体，并提纯为基本上纯而且均质的抗体。常用于抗体提纯的分离和提纯方法可以用于对抗体进行分离和提纯，并且不限于任何具体的方法。可以通过适当地选择和组合例如柱色谱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析和再结晶来分离并提纯抗体。色谱包括例如亲和色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤、逆相色谱和吸附色谱(Strategies for Protein Purification and Characterization:ALaboratory Course Manual.Daniel R.Marshak等人编,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1996)。可以使用诸如HPLC和FPLC等液相色谱进行色谱。用于亲和色谱的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(GEHealthcare Biosciences)。本公开还包括使用这些提纯方法高度提纯的抗体。
多核苷酸、表达载体和细胞
本公开还提供了编码本文所述的抗CD73抗体或其部分(例如，VH、VL、HC或LC)的多核苷酸和载体。本公开的多核苷酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。在一些情况下，所述多核苷酸是DNA。在一些情况下，所述多核苷酸是互补DNA(cDNA)。在一些情况下，所述多核苷酸是RNA。
在一些情况下，所述多核苷酸编码包含本文所述的任何抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VH。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含本文所述的任何抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VL。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含含有本文所述的任何抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VH的重链。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含含有本文所述的任何抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VL的轻链。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中所述第一多肽包含含有本文所述的任何抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VH；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述第二多肽包含含有本文所述的任何抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VL。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中所述第一多肽包含重链，所述重链包含含有本文所述的任何抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VH；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述第二多肽包含轻链，所述轻链包含含有本文所述的任何抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(参见例如表1、表2、表3和表5)的VL。在一些情况下，所述第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且所述第二核酸可操作地连接至第二启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的VH。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的VL。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的VH；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的VL。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中所述第一多肽包含相对于SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述第二多肽包含相对于SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一核酸编码SEQ ID NO:22、26和82-84中的任一者所示的氨基酸序列，并且所述第二核酸编码SEQ ID NO:23、27、80和81中的任一者所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一核酸编码SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，并且所述第二核酸编码SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且所述第二核酸可操作地连接至第二启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的重链。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:89所示的序列。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的轻链。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:90所示的序列。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的重链和CL25或其变体(例如其人源化形式，例如HzCL25)的轻链。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含相对于SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含相对于SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)包含SEQ ID NO:89所示的序列的第一核酸，以及(ii)包含SEQ ID NO:90所示的序列的第二核酸。在一些情况下，所述第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且所述第二核酸可操作地连接至第二启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VH。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ IDNO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO:61所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VH；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的VL。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸序列，其中所述第一多肽包含相对于SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列；以及(ii)编码第二多肽的第二核酸序列，其中所述第二多肽包含相对于SEQ ID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一核酸编码SEQ ID NO:32、60、62、63、67-69、77和85-88中的任一者所示的氨基酸序列，并且所述第二核酸编码SEQID NO:61、64和65中的任一者所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一核酸编码SEQ IDNO:62所示的氨基酸序列，并且所述第二核酸编码SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一核酸编码SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，并且所述第二核酸编码SEQID NO:61所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且所述第二核酸可操作地连接至第二启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的重链。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:30、33和66中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ ID NO:30、33和66中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:30、33和66中的任一者所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:91所示的序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:93所示的序列。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的轻链。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含相对于SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:92所示的序列。在一些情况下，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些情况下，所述多核苷酸编码3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的重链和3-F03或其变体(例如3-F03_411或3-F03_413)的轻链。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO:30、33和66中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含相对于SEQ ID NO:30、33和66中的任一者所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含相对于SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:30、33和66中的任一者所示的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)编码第一多肽的第一核酸，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，以及(ii)编码第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)包含SEQ ID NO:91所示的序列的第一核酸，以及(ii)包含SEQ ID NO:92所示的序列的第二核酸。在一些情况下，所述多核苷酸包含：(i)包含SEQ ID NO:93所示的序列的第一核酸，以及(ii)包含SEQ ID NO:92所示的序列的第二核酸。在一些情况下，所述第一核酸可操作地连接至第一启动子，并且所述第二核酸可操作地连接至第二启动子。
在一些实施方案中，分离了本文所述的多核苷酸。
本文还提供了编码本文所述的抗CD73抗体或其部分(例如，VH、VL、HC和/或LC)的表达载体。本文还提供了包含一种或多种本文所述的多核苷酸的表达载体。各种类型的表达载体在本领域中是已知的并且描述于本文中(例如，参见以上“产生抗体的方法”部分)。
本文还提供了包含本文所述的抗CD73抗体的细胞。本文还提供了包含一种或多种本文所述的多核苷酸的细胞。本文还提供了包含一种或多种本文所述的表达载体的细胞。各种类型的细胞在本领域中是已知的并且描述于本文中(例如，参见以上“产生抗体的方法”部分)。
具有改变的糖基化的抗CD73抗体
不同的糖型会深刻地影响治疗剂的性质，包括药代动力学、药效学、受体相互作用和组织特异性靶向(Graddis等人,2002,Curr Pharm Biotechnol.3:285-297)。具体来说，对于抗体，寡糖结构会影响与蛋白酶抗性有关的性质、由FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、吞噬作用和抗体反馈，以及抗体的效应功能(例如与诱导CDC的补体复合物C1的结合，以及与负责调节ADCC途径的FcγR受体的结合)(Nose和Wigzell,1983；Leatherbarrow和Dwek,1983；Leatherbarrow等人,1985；Walker等人,1989；Carter等人,1992,PNAS,89:4285-4289)。
因此，调节抗体的效应功能的另一种手段包括改变抗体恒定区的糖基化。改变的糖基化包括例如糖基化残基的数目减少或增加、糖基化残基的模式或位置变化以及糖结构的变化。在人IgG上发现的寡糖影响其效应功能的程度(Raju,T.S.BioProcessInternational 2003年4月.44-53)；人IgG寡糖的微异质性会影响生物功能，诸如CDC和ADCC、与各种Fc受体的结合和与Clq蛋白的结合(Wright A.和Morrison SL.TIBTECH 1997,15 26-32；Shields等人,J Biol Chem.2001276(9):6591-604；Shields等人,J BiolChem.2002；277(30):26733-40；Shinkawa等人,J Biol Chem.2003 278(5):3466-73；Umana等人,Nat Biotechnol.1999年2月；17(2):176-80)。举例来说，IgG结合C1q并活化补体级联的能力可能取决于位于两个CH2域之间的碳水化合物部分(通常锚定在Asn297处)的存在、不存在或修饰(Ward和Ghetie,Therapeutic Immunology 2:77-94(1995))。因此，在一些情况下，抗CD73抗体相对于野生型恒定区含有Asn297Ala取代。
可以通过标准技术鉴定含Fc的多肽(例如抗体，诸如IgG抗体)中的糖基化位点。糖基化位点的鉴定可以是实验性的，或者基于序列分析或模型数据。已经描述了共有基序，即，被各种糖基转移酶识别的氨基酸序列。举例来说，N连接糖基化基序的共有基序通常是NXT或NXS，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。还描述了用于定位潜在糖基化基序的若干算法。因此，为了鉴定抗体或含Fc的片段内的潜在糖基化位点，例如通过使用公开可用数据库(诸如生物序列分析中心提供的网站)来检查抗体的序列(参见用于预测N连接糖基化位点的NetNGlyc服务和用于预测O连接糖基化位点的NetOGlyc服务)。
体内研究已经证实了无糖基抗体的效应功能减少。举例来说，无糖基抗CD8抗体不能耗竭小鼠中携带CD8的细胞(Isaacs,1992J.Immunol.148:3062)，而且无糖基抗CD3抗体不诱导小鼠或人的细胞因子释放综合征(Boyd,1995同上；Friend,1999Transplantation68:1632)。无糖基化形式的抗CD73抗体还具有减少的效应功能。
重要的是，尽管去除CH2域中的聚糖似乎对效应功能有显著影响，但抗体的其他功能和物理性质保持不变。具体来说，已经证明去除聚糖对血清半衰期和与抗原的结合几乎没有、甚至没有影响(Nose,1983同上；Tao,1989同上；Dorai,1991同上；Hand,1992同上；Hobbs,1992Mol.Immunol.29:949)。
可以修饰或改变本发明的抗CD73抗体以增加或降低效应功能(与另一种CD73特异性抗体相比)。用于改变抗体的糖基化位点的方法描述于例如以下文献中：US 6,350,861和US 5,714,350、WO 05/18572和WO 05/03175；这些方法可用于产生具有改变、减少或没有糖基化的本发明抗CD73抗体。
适应症
本公开的抗CD73抗体可以调节CD73的活性。因此，本文所述的化合物、盐或立体异构体可以用于通过使CD73与本文所述的抗体或组合物中的任一种或多种接触来抑制CD73的方法中。在一些实施方案中，所述抗体可以用于在需要抑制的个体/患者中通过施用有效量的本文所述的抗体来抑制CD73活性的方法中。在一些实施方案中，调节是抑制。在一些实施方案中，接触在体内进行。在一些实施方案中，接触离体或在体外进行。
本公开的另一方面涉及通过向需要治疗的个体施用治疗有效量或剂量的一种或多种本公开抗体或其药物组合物来治疗个体(例如患者)的CD73相关疾病或病症的方法。CD73相关疾病或病症可以包括与CD73的表达或活性(包括过度表达和/或异常活性水平)直接或间接相关的任何疾病、病症或疾患。
本公开的另一方面涉及通过向需要治疗的个体施用治疗有效量或剂量的一种或多种本公开抗体或其药物组合物来治疗个体(例如患者)的疾病或病症(例如癌症)的方法，其中所述疾病或病症具有高腺苷特征。确定疾病或病症具有高腺苷特征的方法在本领域中是已知的。举例来说，可以使用一组限定腺苷应答性基因对肿瘤组织进行基因表达分析。
本公开的化合物可用于治疗与CD73活性有关的疾病，包括例如癌症、炎性疾病、心血管疾病、神经退化性疾病、免疫调节性病症、中枢神经系统疾病和糖尿病。
基于CD73在多种免疫抑制机制中的强制作用，开发抑制剂可以增强免疫系统以抑制肿瘤进展。抗CD73抗体可以单独或与其他疗法组合用于治疗膀胱癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、肺转移)、黑色素瘤(例如转移性黑色素瘤)、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、食道癌、前列腺癌、肾脏癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、子宫癌、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)和肾细胞癌。在一些实施方案中，前列腺癌是转移性阉割抗性前列腺癌(mCRPC)。在一些实施方案中，结直肠癌是结直肠癌瘤(CRC)。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫癌、肾癌、胃癌或肉瘤。在一些实施方案中，所述肉瘤是阿斯金氏肿瘤(Askin's tumor)、葡萄样肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、肺泡软部肉瘤、血管肉瘤、叶状囊性肉瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤(MPNST)、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或未分化多形肉瘤。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、结直肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌(例如肝细胞癌)或肾细胞癌。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是间皮瘤或腺癌。在一些实施方案中，所述疾病或病症是间皮瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症是腺癌。
MDSC(骨髓源性抑制细胞)是来自骨髓谱系(源自于骨髓干细胞的细胞家族)的异源免疫细胞群。由于造血作用改变，MDSC在诸如慢性感染和癌症等病理情形下强烈扩增。MDSC与其他骨髓细胞类型的区别在于它们具有强免疫抑制活性而非免疫刺激性质。与其他骨髓细胞类似，MDSC与其他免疫细胞类型，包括T细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞相互作用，以调控其功能。在一些实施方案中，本文所述的化合物等可以用于与存在MDSC高度浸润的癌组织(例如肿瘤)相关的方法中，包括具有高基础水平的巨噬细胞和/或MDSC浸润的实体瘤。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以用于治疗肺部炎症，包括博来霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化和与腺苷脱氨酶缺乏有关的损伤。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以用作诸如过敏反应(例如CD73依赖性过敏反应)和其他CD73免疫反应等炎性疾病的疗法。可以通过本公开的抗体治疗的其他炎性疾病包括呼吸系统病症、败血症、再灌注损伤和血栓形成。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以用作诸如冠状动脉疾病(心肌梗死、心绞痛、心力衰竭)、脑血管疾病(中风、短暂性缺血性发作)、外周动脉疾病以及主动脉动脉粥样硬化和动脉瘤等心血管疾病的疗法。动脉粥样硬化是许多种类型的心血管疾病的基础病因。动脉粥样硬化以脂纹始于青春期，在成年后进展为斑块，最终导致血栓形成事件，从而导致血管堵塞，由此导致临床意义的发病和死亡。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以用作运动活动障碍、由纹状体黑质多巴胺系统退化引起的缺乏症和帕金森氏病(Parkinson’s disease)、抑郁症的一些动机症状的疗法。
在一些实施方案中，本公开的化合物可以用作糖尿病和相关病症(诸如胰岛素抗性)的疗法。糖尿病影响腺苷的产生以及刺激IL-6和CRP产生的A2B腺苷受体(A2BR)的表达、胰岛素抗性以及A2BR基因单核苷酸多态现象(ADORA2B SNP)与炎性标记物之间的关联。糖尿病中增加的A2BR信号传导可以部分通过升高促炎性介质来增加胰岛素抗性。选择性抗CD73抗体可用于治疗胰岛素抗性。
可互换使用的术语“个体(individual)”或“患者”或“受试者(subject)”是指任何动物，包括哺乳动物，优选为小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，最优选为人(即，人受试者)。
短语“治疗有效量”是指在组织、系统、动物、个体或人中引发研究人员、兽医、医学医生或其他临床医师正寻求的生物学或医学应答的活性抗体或药剂的量。
如本文所用，术语“治疗”是指以下一项或多项：(1)抑制了疾病，例如，在正经历或呈现疾病、疾患或病症的病变或症状的个体中抑制所述疾病、疾患或病症(即，阻遏病变和/或症状的进一步发展)；以及(2)改善了疾病，例如在正经历或呈现疾病、疾患或病症的病变或症状的个体中改善所述疾病、疾患或病症(即，逆转了病变和/或症状)，诸如降低了疾病的严重程度。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以用于预防本文所提到的任何疾病或降低罹患本文所提到的任何疾病的风险；例如，在可能易患疾病、疾患或病症但尚未经历或呈现疾病的病变或症状的个体中预防所述疾病、疾患或病症或降低罹患所述疾病、疾患或病症的风险。
药物组合物
本文所述的抗CD73抗体可以配制为药物组合物以便施用于受试者，例如以治疗本文所述的病症。通常，药物组合物包含药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等。所述组合物可以包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见例如Berge,S.M.等人,(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。
医药配制是既有的技术，并且另外描述于例如以下文献中：Gennaro(编),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,第7版,Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；以及Kibbe(编),Handbook of Pharmaceutical Excipients AmericanPharmaceutical Association,第3版,(2000)(ISBN:091733096X)。
药物组合物可以呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如可注射溶液和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式可以取决于预定的施用模式和治疗应用。通常，本文所述的剂的组合物呈可注射或可输注溶液形式。
组合物可以配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或适用于在高浓度下稳定储存的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过视需要将本文所述的剂以所需量与以上列举的成分之一或组合一起并入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备。一般来说，通过将本文所述的剂并入含有基础分散介质和来自以上列举的那些成分的其他所需成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而由其先前的无菌过滤溶液产生本文所述的剂加任何其他所需成分的粉末。可以例如通过使用诸如卵磷脂等包覆剂、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可以通过在组合物中包含吸收延迟剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
在某些实施方案中，抗CD73抗体可以用将会防止化合物快速释放的载体制备，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解型生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备此类制剂的方法已取得专利或众所周知。参见例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
施用
可以通过多种方法将抗CD73抗体施用于受试者，例如有需要的受试者，例如人受试者。对于许多应用，施用途径为以下之一：静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜内(IP)或肌内注射。还可以使用关节内递送。还可以使用其他肠胃外施用模式。此类模式的实例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及硬膜外和胸骨内注射。在一些情况下，施用可以是口服。
还可以针对个别情况定制抗体的施用途径和/或模式，例如，通过监测受试者，例如使用断层扫描成像例如来观察肿瘤。
抗体可以作为固定剂量或以mg/kg患者体重剂量形式施用。还可以选择剂量以减少或避免产生针对抗CD73抗体的抗体。调整剂量方案以提供所需应答，例如治疗应答或组合治疗效果。一般来说，可以使用多剂量的抗CD73抗体(和任选的第二剂)以便向受试者提供生物可利用量的剂。
如本文所用的剂量单位形式或“固定剂量”或“均一剂量(flat dose)”是指适合作为单一剂量用于欲治疗的受试者的物理离散单元；各个单元含有经过计算能与所需药物载体联合并且任选地与其他剂联合以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。可以给与单个或多个剂量。替代地或另外地，抗体可以经由连续输注施用。
以下是实施本发明的实施例。它们不应当被视为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
以下实施例是为了更好地说明所要求的发明而提供，而不应当被理解为限制本发明的范围。就提到的具体材料来说，仅出于说明目的而不希望限制本发明。本领域技术人员可以在不行使本发明的能力并且不背离本发明的范围的情况下开发等效的手段或反应物。
实施例1：抗人CD73单克隆抗体的产生
为了产生抗人CD73单克隆抗体，用包含C末端HIS标签的重组人CD73(SEQ ID NO:70)蛋白使小鼠免疫，并且从小鼠脾脏和淋巴结分离B细胞。使用10x Genomics VH/VL配对B细胞测序来确定B细胞的抗体序列。将鼠VH/VL配对表达为与huIgG1 Fc(SEQ ID NO:73和74)的嵌合体，并测试了结合和功能性。通过这种方法产生了称为CL25的抗体。以上表1示出了根据IMGT、Chothia、AbM、Kabat和Contact编号的CL25 CDR以及成熟VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列。
对嵌合抗体CL25(包含SEQ ID NO:26的鼠VH和SEQ ID NO:27的鼠VL)进行人源化以便在维持特异活性的同时最小化抗体构架的免疫原性。通过比对所述VH和VL序列与人VH和VK基因数据库来进行人源化。将来自鼠CL25抗体的CDR(表1)移植到若干顶部人VH和VK基因中。示例性人源化CL25抗体的VH和VL序列描绘于图1A至图1C中。图1D和图1E中分别描绘了CL25和示例性人源化CL25抗体的VH和VL的比对。还测试了鼠CL25中存在的若干构架突变以及鼠CDR(图1A至图1E)。选择具有SEQ ID NO:22的VH和SEQ ID NO:23的VL的CL25人源化形式，本文称为“HzCL25”，用于进一步研究。以上表2示出了根据IMGT、Chothia、AbM、Kabat和Contact编号的HzCL25 CDR以及成熟VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列。
实施例2：抗人CD73单克隆抗体与细胞表面CD73的结合
为了测试人源化和非人源化CL25克隆与细胞表面CD73的结合，洗涤MDA-MB-231或A375细胞，并且以5×104个细胞/孔加入96孔板。在冰上用所指出浓度的抗体将细胞染色30分钟(图2A和图2B)。接下来，洗涤细胞并且在冰上使用与藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗小鼠二抗染色30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术加以分析。对CD73染色的几何平均荧光强度(GMFI)进行绘图(图2A和图2B)。CL25与HzCL25都显示与具有高水平表面CD73(MDA-MB-231细胞)和中等水平表面CD73(如在A375细胞中所测试)的细胞的高效结合。
实施例3：抗人CD73单克隆抗体介导的细胞CD73抑制
为了测量抗CD73抗体抑制细胞上的CD73活性的能力，用无血清RPMI培养基(ThermoFisher)洗涤A375和MDA-MB-231细胞，并且以8×104个细胞/孔(用于A375)或1×104个细胞/孔(用于MDA-MB-231)的浓度接种在96孔板中。在37℃、5％CO2下将细胞与所指出浓度的抗体或APCP一起孵育30分钟(图3A、图3B和图3C)。接下来，加入单磷酸腺苷(AMP)直至最终浓度为100μM，并且在37℃、5％CO2下将细胞再孵育3小时。在300g下将板离心1至2分钟，并且将25μL上清液转移到新的96孔板中。根据制造商的说明书(Promega)使用AMP-Glo测定法。在这种测定法中，相对发光单位(RLU)与AMP浓度直接相关。结果描绘于图3A、图3B和图3C中。
在两种测试细胞类型中，CL25与HzCL25都具有良好的抑制细胞CD73的能力(图3A、图3B和图3C)。HzCL25具有与CL25类似的抑制细胞CD73的能力(图3A、图3B和图3C)。
实施例4：抗人CD73单克隆抗体介导的可溶性CD73抑制
为了测量CD73抗体抑制重组蛋白的CD73活性的能力，将重组人CD73(rhuCD73)(SEQ ID NO:70)以0.008μg/mL的最终浓度、与所指出浓度的抗体(图4)或5’-[α,β-亚甲基]二磷酸腺苷(APCP)一起加入96孔板，并且在37℃、5％CO2下孵育30分钟。30分钟孵育之后，加入AMP直至最终浓度为100μM，并且在37℃、5％CO2下将反应物再孵育3小时。将25μL上清液转移到新的96孔板中。根据制造商的说明书使用AMP-Glo测定法。在这种测定法中，RLU与AMP浓度直接相关。结果描绘于图4中。CL25与HzCL25都示出了高功效而且无钩状效应(hook-effect)(图4)。HzCL25具有与CL25类似的抑制细胞CD73的能力(图4)。
实施例5：AMP介导的T细胞增殖抑制的抗人CD73单克隆抗体介导的逆转
为了测量CD73抗体逆转AMP介导的T细胞增殖抑制的能力，使用人CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从外周血单核细胞(PBMC)提纯初代人CD4+T细胞。根据制造商的方案，用1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(BD Biosciences)标记分离的CD4+T细胞。使CFSE标记的细胞再悬浮在含有10％胎牛血清和60IU/ml重组人IL-2的RPMI中。在圆底96孔板中加入约50,000个细胞/孔。将Dynabeads人T活化子CD3/CD28珠粒以珠粒:细胞比1:1加入细胞悬浮液，并且在37℃下孵育1小时。将抗体的连续稀释液加入指定孔中，并且在37℃下孵育30分钟。最后以1000μM的最终浓度加入AMP，并且在孵育器中在37℃下将整个培养物孵育5天。5天之后，使用LSRFORTESSA X-20分析仪(BD Biosciences)，通过基于CFSE的流式细胞术分析测定CD4+T细胞增殖。
抗CD73抗体在多种不同的人供体中以浓度依赖性方式逆转AMP介导的CD4+T细胞增殖抑制(图5A至图5N)。
实施例6：结合亲和力
CD73酶活性需要开放构象下的底物结合。底物结合之后，CD73必须经历从开放构象到封闭构象的构象大变化，以便将AMP转化为腺苷。抑制或调节这种构象变化的抗体结合将可能降低AMP向腺苷转化的速率。
为了评价HzCL25的结合亲和力，在25℃下使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)进行表面等离子体共振(SPR)。由10X HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)制备SPR运作缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂P20，pH 7.4)。经由胺偶联将抗人Fc抗体(GE Healthcare)固定在S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)的所有十六个流动池上。对于所有流动池，固定水平都是约9000RU。可以通过使适当浓度的抗CD73抗体流经各个通道的活性流动池来实现所需抗CD73抗体俘获水平。非可切割ADP类似物APCP(腺苷-5’-(α,β-亚甲基)二磷酸)在存在Zn2+的情况下可用于使CD73构象平衡从开放变为封闭。因此，在100μM APCP和10μM ZnCl2(封闭SPR运作缓冲液)存在下将重组CD73与SPR运作缓冲液一起孵育，以研究抗CD73抗体与呈封闭构象的CD73的结合。为此，使用了Biacore 8K中的ABA注入特征。对于开放构象，ABA注入顺序以60秒注入运作缓冲液开始。然后，注入由CD73储备液(BPS Bioscience)和运作缓冲液制备的CD73 3倍连续稀释浓度系列，持续180秒，然后立即注入运作缓冲液，持续240秒。对于封闭构象，将正常SPR运作缓冲液替换为封闭SPR运作缓冲液。利用30秒注入3M MgCl2使表面再生。结合动力学和亲和力参数是从对1:1结合模型进行全域数据拟合而获得。以下表6示出了对呈开放或封闭构象的人、食蟹猴和小鼠CD73的结合亲和力以及动力学缔合和解离速率常数。表6中的结果确保了食蟹猴药代动力学数据将反映人药代动力学数据。
表6：所指出的抗体(Ab)与呈开放或封闭构象的人(SEQ ID NO:70)、食蟹猴(SEQID NO:72)和小鼠(SEQ ID NO:71)CD73的结合亲和力以及动力学缔合和解离速率常数。
Figure BDA0003797931500000761
实施例7：表位绘制
为了绘制CL25的表位，进行氢-氘交换质谱(HDX)。将CD73单独或者以与CL25 Fab的复合物的形式在氧化氘中孵育。氘交换在20℃下进行0秒、60秒、600秒或3600秒。通过低pH淬灭交换反应，并且用胃蛋白酶/蛋白酶VIII消化蛋白质。根据LC-MS上的质量变化来监测已鉴定的肽的氘水平。对交换时间范围内所有肽的氘累积曲线对比时间进行绘图。将结合至Fab后氘摄取显著降低的肽指定为各个抗体的表位。将通过HDX-MS确定的CL25的表位绘至人CD73的晶体结构(4H2F.pdb)上(图6)，它是TKVQQIRRAEPNVL(SEQ ID NO:76)(即，SEQID NO:70的氨基酸40-53)。
实施例8：CD73细胞表面水平
为了测量抗体处理之后细胞表面上CD73的量，将MDA-MB-231细胞再悬浮于培养基(10％FBS RPMI-1640)中，并且以1×105个细胞/孔接种在96孔板中。加入所指出的抗体，最终浓度是10μg/mL，在37℃、5％CO2下将板孵育24小时。使用Versene回收细胞并转移至新的96孔板。洗涤细胞并且在冰上用10μg/mL直接与Dy650缀合的非竞争性抗体染色30分钟。洗涤细胞并通过流式细胞术加以分析。使用Quantum Simply Cellular珠粒，通过抗体结合能力(ABC)测定CD73细胞表面受体密度。用CL25处理细胞24小时降低了细胞表面CD73的水平(图7)。
实施例9：抗CD73抗体对肿瘤生长的影响
测试CL25抗体的体内功效。使HzCL25悬浮在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)(LifeTechnologies)中以便经腹膜内给与hu-CD34 NSG小鼠(Jackson实验室)。这个研究中包括1×PBS和悬浮在1×PBS中的Fc失能人IgG1作为对照。具有人源化免疫系统的小鼠购自Jackson Labs(Bar Harbor，Maine)。简而言之，3周龄雌性NSG/NOD SCID小鼠接受对免疫细胞前体有毒的单剂量照射，然后通过注射人脐带血CD34+选择的细胞加以“拯救”。12周(以允许恢复并植入人免疫细胞)之后，在Incyte研究所将小鼠安置在AALAS认证的饲养箱。小鼠包含三种不同的人免疫供体的受体，以更好地表示免疫应答的个体变异。
在接种悬浮于基质胶(Corning Life Sciences，Tewksbury，Mass)中的人黑色素瘤细胞系A375(ATCC，Manassas Virginia)的5×106个细胞前一天，将小鼠左胁剃光。在第11天，通过游标卡尺测量肿瘤尺寸，并通过公式体积＝[L(长尺寸)×W2(短尺寸)]/2来估算体积。将小鼠随机分为具有近似平均体积(约200mm3)和供体代表性的3个组，每组5或6只小鼠。在研究期间每2至4天测量肿瘤。
在施用当天早晨，在PBS中将HzCL25稀释至1mg/ml和0.1mg/ml的浓度，并且将匹配同型对照(cx00376-001)稀释至1mg/ml。从第11天起，每六天通过以10ml/kg经腹膜内注射向小鼠给与抗体，从而实现1mg/kg和10mg/kg体重的有效剂量。总计给与三个剂量。
在第三剂量和最终剂量之后四十八小时，通过CO2窒息对小鼠施以安乐死。切下肿瘤，放到含有蛋白酶的培养基中，置于冰上，然后通过使用GentleMacs组织破坏器(Miltenyi，Auburn CA)破坏为单细胞悬浮液。将细胞保留在冰上，同时加以处理以进行流式细胞术和酶测定法。
施用HzCL25的小鼠在两种剂量下都表现出了肿瘤生长抑制；低剂量显著(p＝0.026，双尾t检验)减缓了生长56％(图8)。
实施例10：离体酶活性测定
为了评估施用HzCL25的带瘤小鼠中的CD73酶活性，使用死细胞去除微珠(DeadCell Removal MicroBeads，Miltenyi Biotec)针对活细胞对来自图8的实验的肿瘤匀浆的单细胞悬浮液进行分选。在细胞选择后，每孔接种10,000个活细胞与100μM AMP。作为阳性对照，使用经250μM APCP处理过的细胞。处理后，根据制造商的指导方针，使用AMP-glo试剂盒(Promega；目录号V5011)检测CD73的酶活性。使用发光作为AMP水平检测的量度，并且将各个动物的读数相对于APCP处理的培养物读数进行归一化，其中APCP处理的培养物被视为对CD73活性显示最大抑制(图9)。如图9所示，HzCL25对肿瘤细胞显示了对CD73酶活性的剂量依赖性抑制。
实施例11：抗CD73处理的肿瘤的游离表面CD73
为了评估处理后的受体覆盖率，将来自图8的实验的肿瘤匀浆的单细胞悬浮液用针对活力染料(Biolegend，目录号423110)、人CD45(Biolegend，目录号304036)、小鼠CD45(BD Biosciences，目录号563410)、小鼠CD90.2(BD Biosciences，目录号565257)的荧光染料缀合抗体和竞争性抗体(AF488缀合的CL25抗体)或非竞争性抗体(PE缀合的抗体X)进行染色。分别使用BD FACSymphony流式细胞术分析仪和FlowJo软件包对细胞进行运作和分析。通过对活细胞群体进行闸选，然后进行小鼠细胞和人免疫细胞排除，从而聚焦于肿瘤细胞群体来进行分析。使用荧光团标记的非竞争性CD73抗体检测肿瘤细胞上的总CD73水平。以剂量依赖性方式，HzCL25降低了肿瘤细胞上的总CD73水平(图10A)。在如图10A所测量的表达CD73的细胞中，使用荧光团标记的竞争性(CL25)抗体测量游离表面CD73(图10B)。HzCL25处理证明了游离表面CD73的剂量依赖性减少(图10B)。此外，与IgG处理的肿瘤相比，游离表面CD73水平的这种减少在两种剂量下都显著较低(图10B)。
实施例12：抗CD73抗体的药代动力学和药效学体内研究
为了评价HzCL25的体内功效，将雌性人CD34+重构小鼠(21周龄；The JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)经皮下接种5×106个A375人黑色素瘤细胞(ATCC编号CRL-1619)。在接种后7天，当肿瘤体积达到约330mm3时开始对带瘤小鼠进行处理。每5天向植入A375的人源化NSG小鼠经腹膜内给与10mg/kg HzCL25。研究动物接受总计6个剂量的抗体，其中最终剂量在第32天。在第26天和第29天从肿瘤大于其体重10％的小鼠收集肿瘤，并且在第33天从所有其余动物收集肿瘤。在第26天从所有动物收集血清，在第29天再次从肿瘤大于其体重10％的小鼠收集血清，并且在第33天从所有其余动物收集血清。至26天时(此时对照IgG组已经达到其平均功效终点)，HzCL25提供适度但不显著的肿瘤生长抑制14％(图11A)。然而，延长给药至32天示出了HzCL25处理的动物与接受IgG对照的其余小鼠之间在肿瘤生长速率和存活率方面存在显著差异(图11B)。
在第22天开始进行单独药效学(PD)研究，每3天以10mg/kg HzCL25进行，总计2个剂量的抗体。在第27天，即第二抗体剂量后48小时收集PD动物的肿瘤。为了测量抗体处理后小鼠血清中的可溶性人CD73(hCD73)，将MSD板包被1μg/mL非竞争性俘获IgG抗体，并在4℃下孵育过夜。洗涤诸板并加入1:5稀释的小鼠血清样品。使用重组人CD73(rhuCD73)产生标准曲线。在室温下伴随以600rpm振荡将板孵育2小时。洗涤诸板，并且向板加入1μg/mL与磺基标签直接缀合的竞争性抗体(HzCL25)或非竞争性抗体(抗体X)，在室温下伴随以600rpm振荡孵育1小时。洗涤诸板，加入150μL读数缓冲液并使用MSD板读数器加以分析。由标准曲线计算小鼠血清的可溶性hCD73水平。尽管用HzCL25处理稍微稳定了小鼠的可溶性人CD73，但可溶性人CD73的水平仍远低于小鼠的抗体水平(图12)。
实施例13：抗人CD73单克隆抗体3-F03的产生
为了产生其他抗人CD73单克隆抗体，对单一供体库进行了多轮选择。在三轮淘选中使用200nM生物素化人CD73(SEQ ID NO:70)富集了约1.5E12个噬菌体颗粒的库。然后将来自这个库的scFv卡匣重组至酵母呈现载体中，产生了约5.4E7的库。使用100nM生物素化鼠CD73(SEQ ID NO:71)，通过FACS对这个库进行了三轮选择。通过对酵母菌落进行Sanger测序从最终分选输出获得了单一序列。从这个库鉴定了酵母3-F03 scFv序列，它含有SEQID NO:77所示的氨基酸序列的VH和SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列的VL。
为了构建全长人3-F03抗体，对酵母3-F03 scFv序列进行了修饰，然后克隆到包含SEQ ID NO:73所示的人IgG1恒定区和SEQ ID NO:74所示的人κ轻链恒定区的人IgG1支架中。对于VH，去除了SEQ ID NO:77的N末端谷氨酸(E)，将SEQ ID NO:77的Kabat位置H77(即，SEQ ID NO:77的位置78)上的苏氨酸(T)取代为丙氨酸(A)。对于VL，去除了SEQ ID NO:65的N末端丙氨酸(A)。所得全长人3-F03抗体含有分别如SEQ ID NO:60和61的氨基酸序列所示的VH和VL。所得全长人3-F03抗体含有分别如SEQ ID NO:66和31的氨基酸序列所示的重链和轻链。这个抗体在本文称为“3-F03”。以上表3示出了根据IMGT、Chothia、AbM、Kabat和Contact编号的3-F03 CDR以及成熟VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列。
实施例14：3-F03与细胞表面CD73的结合
如以上实施例2所述进行3-F03与细胞表面CD73的结合。3-F03对具有高水平表面CD73(MDA-MB-231)和中等水平CD73(A375细胞)的细胞示出了高效力结合(图13A和图13B)。
实施例15：3-F03介导的细胞CD73抑制
如以上实施例3所述来评估3-F03抑制细胞上CD73活性的能力。结果描绘于图14A和图14B中。
与CD73的小分子抑制剂APCP相比，克隆3-F03在两种测试细胞类型中都对细胞CD73示出了最大程度的抑制(图14A和图14B)。
实施例16：3-F03介导的可溶性CD73抑制
如以上实施例4所述来评估3-F03抑制重组蛋白的CD73活性的能力，但使用了0.025ug/mL rhuCD73。结果描绘于图15中。抗体3-F03具有良好的效力(图15)。抗体3-F03未表现出任何钩状效应。
实施例17：AMP介导的T细胞增殖抑制的抗人CD73单克隆抗体介导的逆转
如以上实施例5所述来评估3-F03逆转AMP介导的T细胞增殖抑制的能力。3-F03在多种不同的人供体中以浓度依赖性方式逆转了AMP介导的CD4+T细胞增殖抑制(图16A至图16D)。
实施例18：抗CD73抗体的结合亲和力
如以上实施例6所述来评估3-F03的结合亲和力。以下表7示出了对呈开放或封闭构象的人、食蟹猴和小鼠CD73的结合亲和力以及动力学缔合和解离速率常数。
表7：对呈开放或封闭构象的人、食蟹猴和小鼠CD73的结合亲和力以及动力学缔合和解离速率常数。
Figure BDA0003797931500000821
实施例19：3-F03的表位绘制
如以上实施例7所述来绘制3-F03的表位。将通过HDX-MS确定的3-F03的表位绘至人CD73的晶体结构(4H2F.pdb)上(图17)，它们是AAVLPFGGTFDLVQ(SEQ ID NO:78)(即，SEQID NO:70的氨基酸386-399)和ILPNFLANGGDGFQMIKDEL(SEQ ID NO:79)(即，SEQ ID NO:70的氨基酸470-489)。
实施例20：3-F03对CD73细胞表面水平的影响
如以上实施例8所述来评估用3-F03处理之后细胞表面上CD73的量。与同型对照抗体或未处理的细胞相比，3-F03显著降低了细胞表面上可检测CD73的水平(图18)。
实施例21：体内研究
如以上实施例12所述来评估3-F03的体内功效。至26天时(此时对照IgG组已经达到其平均功效终点)，3-F03提供了适度但统计上不显著的肿瘤生长抑制8％(图19A)。然而，延长给药至32天示出了3-F03处理的动物与接受IgG对照的其余小鼠之间在肿瘤生长速率和存活率方面存在显著差异(图19B)。
另外如以上实施例12所述来评估3-F03的PD性质。用3-F03处理并未稳定小鼠中的可溶性人CD73，因为用3-F03处理后，总或游离可溶性人CD73不存在可检测的增加(图20)。
实施例22：3-F03变体
使用3-F03轻链(LC，SEQ ID NO:66)和重链(HC，SEQ ID NO:31)的序列来构建同源性模型。图21A至图21J提供了示例性3-F03变体的VH和VL的氨基酸序列。包含这些VH和VL序列的抗体含有SEQ ID NO:73所示的重链恒定区和SEQ ID NO:74所示的轻链恒定区。表8提供了示例性3-F03变体的结合亲和力和动力学。依据Biacore，测试突变中没有一个显著影响与CD73的结合。所有测试突变的亲和力都在3-F03抗体的十倍以内，大部分在3-F03抗体的两倍以内。
表8：3-F03变体的Biacore结合亲和力和动力学。-＝不存在。
Figure BDA0003797931500000831
Figure BDA0003797931500000841
为了测试工程化3-F03变体与细胞表面CD73的结合，洗涤MDA-MB-231细胞，并且以5×104个细胞/孔加入到96孔板。在冰上用所指出浓度的抗体将细胞染色1小时。然后洗涤细胞，并且在冰上用与PE缀合的山羊抗小鼠二抗染色30分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术加以分析。绘制CD73染色的GMFI(图22)。各个3-F03变体具有相似的结合概况，但显示稍高Ymax的3-F03_417除外(图22)。这些数据证实了Biacore研究(表8)：这些突变不显著改变人CD73与这些变异克隆的结合。
为了测试3-F03变体抑制细胞上CD73活性的能力，用无血清RPMI培养基洗涤MDA-MB-231细胞，并且以1×104个细胞/孔接种在96孔板中。在37℃、5％CO2下将细胞与所指出浓度的抗体或APCP一起孵育30分钟。接下来，加入AMP至最终浓度为100μM，并且在37℃、5％CO2下将细胞再孵育3小时。在300g下将板离心1至2分钟，并且将25μL上清液转移至新的96孔板中。根据制造商的说明书使用AMP-Glo测定法。在这种测定法中，RLU与AMP浓度直接相关。在3-F03变体中，3-F03示出了最大程度的抑制(图23)。与3-F03相比，变体3-F03_417、3-F03_411和3-F03_413示出了稍低效力(图23)。变体3-F03_412不抑制MDA-MB-231细胞上的膜结合CD73(图23)。
实施例23：抗CD73抗体处理的肿瘤的肿瘤腺苷水平
在体内评价了HzCL25和3-F03调节肿瘤内腺苷的能力。将雌性人CD34+重构小鼠(29周龄；The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)在其左胁经皮下接种悬浮于基质胶(Corning Life Sciences)中的3×106个MDA-MB-231细胞(ATCC编号HTB-26)，每个处理组有三只小鼠。接种后10天当肿瘤体积达到约240mm3时开始对带瘤小鼠进行处理。将HzCL25、3-F03或IgG同型对照在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至1mg/ml，在第12天以10mg/kg的剂量通过腹膜内注射施用于小鼠，并且在5天后，在第17天再次施用。在第18天，对小鼠处以安乐死，切下肿瘤，放到冷冻管中并且在液氮中快速冷冻。
为了测定肿瘤中的腺苷浓度，将冷冻组织样品切片，并且在80μm空间分辨率下一式三份进行定量MALDI质谱成像(MSI)。基于从组织切片以及点样至对照切片上的标准物稀释系列获取的MSI数据集，用多重成像软件获得了对所选组织切片中的腺苷的定量。在校准曲线与所获得的信号之间建立相关性，以确定各个目标区域中的分析物浓度。通过对连续切片进行H&E染色来鉴定含有肿瘤的目标区域。
如图26所示，用HzCL25或3-F03处理分别引起肿瘤内腺苷浓度降低35％和42％。
实施例24：由抗CD73抗体所致的CD73酶抑制
使用酶测定法研究了3-F03和HzCL25抑制的分子机制，其中使用重组全长CD73，并且通过LCMS测量腺苷产生。使用混合抑制模型分析数据，并且将关于3-F03和HzCL25二者的发现汇总在表9中。
简而言之，在酶测定法中使用腺苷13C10,15N5 5’-单磷酸钠盐溶液(650676，Sigma)作为底物并通过LC-MS检测产物腺苷来测量剂的抑制效力。将抗体剂连续稀释于缓冲液中，并且将5μL体积转移至96孔板。向板加入20μL含0.5pM重组CD73的测定缓冲液(25mM Tris、5mM MgCl2、0.005％Brij35 pH 7.5)，并且在25℃下预孵育2小时。通过加入25μL含有不同浓度的AMP的溶液来引发测定。反应在25℃下进行0.5小时，然后用50μL甲醇淬灭。
结果表明HzCL25是非竞争性抑制剂，其中Ki值为0.3±0.2nM并且α值接近于一(图27)。3-F03是混合抑制剂，其中Ki为1.5±0.7nM并且α为19±12，表明3-F03对游离酶的亲和力高于酶底物，并表现出了竞争性(图28)。
另外，HzCL25表现出了“钩状”效应，其中在高剂浓度下观测到抑制丧失(图29)。这表明HzCL25和CD73分子相互作用的化学计量随它们的浓度比变化而变化，由此将分子群体从受抑制物质变为非受抑制物质。
表9.HzCL25和3-F03的动力学参数的汇总。
剂 作用机制 K<sub>i</sub>(nM) α K<sub>m</sub>(uM)
3-F03 IgG 混合抑制 1.5±0.7 19±12 1.4±0.5
HzCL25IgG 非竞争性抑制 0.3±0.2 2.1±1.7 0.9±0.3
其他实施方案
尽管已经结合本发明的详细描述而描述了本发明，但上述描述意在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围来限定。其他方面、优点和修改在权利要求书的范围内。

Claims (54)

1.一种抗体，所述抗体结合至人CD73，其中所述抗体包含可变重(VH)域，所述可变重域包含VH互补性决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列GYTFTSYG(SEQ ID NO:1)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列IYPGSGNT(SEQ ID NO:2)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ARYDYLGSSYGFDY(SEQ ID NO:3)；并且
其中所述抗体包含可变轻(VL)域，所述可变轻域包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列QDVSTA(SEQ ID NO:4)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列SAS(SEQ ID NO:5)；
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQHYNTPYT(SEQ ID NO:6)。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述VH域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链，并且其中所述重链包含SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述VL域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含轻链，并且其中所述轻链包含SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的抗体，其中所述VH域与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列至少80％同一，并且所述VL域与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列至少80％同一。
7.如权利要求1所述的抗体，其中所述VH域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，并且所述VL域包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
9.一种抗体，所述抗体结合至人CD73，其中所述抗体在SEQ ID NO:70的氨基酸40-53内的表位处结合至人CD73。
10.一种抗体，所述抗体结合至人CD73，并且与具有包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人CD73。
11.如权利要求1、9或10所述的抗体，所述抗体是人源化抗体。
12.如权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fsc片段、Fv片段、scFv、sc(Fv)2或双功能抗体。
13.一种或多种核酸，所述核酸编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体。
14.一种或多种表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至启动子的如权利要求13所述的一种或多种核酸。
15.一种分离的细胞，所述细胞包含如权利要求13所述的一种或多种核酸或者如权利要求14所述的一种或多种表达载体。
16.一种分离的细胞，所述细胞包含：第一表达载体，所述第一表达载体包含编码第一多肽并且可操作地连接至启动子的第一核酸，所述第一多肽包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体的VH域；以及第二表达载体，所述第二表达载体包含编码第二多肽并且可操作地连接至启动子的第二核酸，所述第二多肽包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体的VL域。
17.一种分离的细胞，所述细胞产生了如权利要求1至12中任一项所述的抗体。
18.一种制造如权利要求1至12中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括培养如权利要求15或16所述的细胞以及分离所述抗体。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
20.一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用有效量的如权利要求1至12中任一项所述的抗体。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症具有高腺苷特征。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述癌症是头颈癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌或肾细胞癌。
23.一种抗体，所述抗体结合至人CD73，其中所述抗体包含可变重(VH)域，所述可变重域包含VH互补性决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSSYD(SEQ ID NO:34)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列MSYDGSNK(SEQ ID NO:35)或MSYEGSNK(SEQ ID NO:40)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ATEIAAKGDY(SEQ ID NO:36)；并且
其中所述抗体包含可变轻(VL)域，所述可变轻域包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列QGISNY(SEQ ID NO:37)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:38)；
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSYSTPH(SEQ ID NO:39)。
24.如权利要求23所述的抗体，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSSYD(SEQ ID NO:34)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列MSYDGSNK(SEQ ID NO:35)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ATEIAAKGDY(SEQ ID NO:36)；
所述VL CDR1包含氨基酸序列QGISNY(SEQ ID NO:37)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:38)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSYSTPH(SEQ ID NO:39)。
25.如权利要求24所述的抗体，其中所述VH域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
26.如权利要求24所述的抗体，其中所述抗体包含重链，并且其中所述重链包含SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列。
27.如权利要求24所述的抗体，其中所述VL域包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
28.如权利要求24所述的抗体，其中所述抗体包含轻链，并且其中所述轻链包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列。
29.如权利要求24所述的抗体，其中所述VH域与SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列至少80％同一，并且所述VL域与SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列至少80％同一。
30.如权利要求24所述的抗体，其中所述VH域包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，并且所述VL域包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
31.如权利要求24所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQID NO:30所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
32.如权利要求23所述的抗体，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列GFTFSSYD(SEQ ID NO:34)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列MSYEGSNK(SEQ ID NO:40)；
所述VH CDR3包含氨基酸序列ATEIAAKGDY(SEQ ID NO:36)；
所述VL CDR1包含氨基酸序列QGISNY(SEQ ID NO:37)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:38)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSYSTPH(SEQ ID NO:39)。
33.如权利要求32所述的抗体，其中所述VH域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
34.如权利要求32所述的抗体，其中所述抗体包含重链，并且其中所述重链包含SEQ IDNO:33所示的氨基酸序列。
35.如权利要求32所述的抗体，其中所述VL域包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
36.如权利要求32所述的抗体，其中所述抗体包含轻链，并且其中所述轻链包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列。
37.如权利要求32所述的抗体，其中所述VH域与SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列至少80％同一，并且所述VL域与SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列至少80％同一。
38.如权利要求32所述的抗体，其中所述VH域包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，并且所述VL域包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
39.如权利要求32所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQID NO:33所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
40.一种抗体，所述抗体结合至人CD73，其中所述抗体在SEQ ID NO:70的氨基酸386-399和470-489内的表位处结合至人CD73。
41.一种抗体，所述抗体结合至人CD73，并且与具有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人CD73。
42.一种抗体，所述抗体结合至人CD73，并且与具有包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链的抗体竞争结合至人CD73。
43.如权利要求23、32、40、41或42所述的抗体，所述抗体是人源化抗体。
44.如权利要求23至42中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fsc片段、Fv片段、scFv、sc(Fv)2或双功能抗体。
45.一种或多种核酸，所述核酸编码如权利要求23至44中任一项所述的抗体。
46.一种或多种表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至启动子的如权利要求45所述的一种或多种核酸。
47.一种分离的细胞，所述细胞包含如权利要求45所述的一种或多种核酸或者如权利要求46所述的一种或多种表达载体。
48.一种分离的细胞，所述细胞包含：第一表达载体，所述第一表达载体包含编码第一多肽并且可操作地连接至启动子的第一核酸，所述第一多肽包含如权利要求23至44中任一项所述的抗体的VH域；以及第二表达载体，所述第二表达载体包含编码第二多肽并且可操作地连接至启动子的第二核酸，所述第二多肽包含如权利要求23至44中任一项所述的抗体的VL域。
49.一种分离的细胞，所述细胞产生了如权利要求23至44中任一项所述的抗体。
50.一种制造如权利要求23至44中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括培养如权利要求47或48所述的细胞以及分离所述抗体。
51.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求23至44中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
52.一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用有效量的如权利要求23至44中任一项所述的抗体。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述癌症具有高腺苷特征。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述癌症是头颈癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌或肾细胞癌。
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