KR20230166120A - 새로운 tnfr2 결합 분자 - Google Patents

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KR20230166120A
KR20230166120A KR1020237037803A KR20237037803A KR20230166120A KR 20230166120 A KR20230166120 A KR 20230166120A KR 1020237037803 A KR1020237037803 A KR 1020237037803A KR 20237037803 A KR20237037803 A KR 20237037803A KR 20230166120 A KR20230166120 A KR 20230166120A
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하랄드 와잔트
안드레아스 베일하크
율리아네 메들러
팀 슈타인파트
롬페이 뤽 반
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율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크
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Abstract

본 발명은 TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공한다. 바람직하게는, 결합 분자는 FcγR-독립적인 TNFR2 작용제이고, 더 바람직하게는 TNFR2에 대한 결합가가 2 이상이다. 결합 분자는 진단 및 치료 등의 다양한 용도를 가진다. 결합 분자가 면역 반응을 조절할 수 있는 능력은, 이것이 특히 자가면역 질환 또는 염증성 병태를 치료하는데 특히 적합하다는 것을 의미한다.

Description

새로운 TNFR2 결합 분자
본 발명은 TNFR2 (종양 괴사 인자 수용체 2, TNFRSF1B 및 CD120B로도 알려져 있음)에 특이적인 결합 분자에 관한 것이다. 이 결합 분자는 전형적으로 TNFR2에 결합해, FcγR (Fc γ 수용체) 결합과는 독립적으로 TNFR2 신호전달을 촉발할 수 있다. 결합 분자를 이용해 TNFR2를 발현하는 표적 세포를 표적화 할 수 있다. 또한, 본 발명은 치료 및 진단 방법에서, 특히 염증성 장애 및 자가면역 질환과 같은 병태의 치료 방법에서 이러한 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
TNFα는 염증, 분화 및 조직 항상성에 광범위한 역할을 담당하는 사이토카인으로, 이것은 용해성 형태 및 막관통 형태로 발생한다. 이것은 염증성 병태 및 자가면역 병태에서 원치않는 면역 반응을 억제하기 위해 임상에서 TNF 차단제를 이용해 표적화하는 핵심적인 염증 매개인자이다. TNFR1 및 TNFR2는, 각각의 수용체를 통해 신호전달하여 여러가지 효과들을 야기하는, 종양 괴사 인자-α (TNFα)에 대한 별개의 수용체들이다. TNFR1을 통한 신호전달은 강력하고 다양한 염증-촉진 효과를 촉발하는데 반해, TNFR2 신호전달을 통한 신호전달은 면역 자극에서 조직 재생, 면역 반응의 억제, 조직 재생에 이르는 광범위한 작용을 가진다. 이들 수용체 2종은 표면에 발현되는 세포 측면에서 다르다. TNFR1은 어디서나 발현되는 반면 TNFR2는 보다 제한적인 세포군, 특히 면역 세포, 내피 세포 및 뉴런 하위 집단들에서 발견된다. TNFR2를 발현하는 면역 세포로는 T 조절성 세포 (Tregs), B 조절성 세포 (B regs) 및 MDSC (골수 유래 억제 세포)와 같은 면역 억제 세포 타입뿐 아니라 CD8+ T 세포와 같은 다른 세포 타입도 있다.
TNFR1 및 TNFR2는 4개의 특징적인 시스테인 풍부 도메인 (CRD)을 가진 세포외 도메인, 막관통 분절 및 세포내 도메인을 가지고 있다. TNFR2는, TNFR1과 달리, 세포질 사멸 도메인 (cytoplasmic death domain)을 가지고 있진 않지만, TRAF2 및 cIAP와 같은 세포 사멸 조절 인자를 제어함으로 세포자살에 여전히 역할을 수행할 수 있다. TNFR2 분자들은 서로 연합해, TNFα에 고 친화성으로 결합할 수 있는 TNFR2의 이량체 및 삼랑체 복합체를 형성함으로써, 세포내 신호전달을 할 수 있는 삼량체 TNF-TNFR2 복합체 올리고머를 형성한다. TNFR1 및 TNFR2 둘다 동일한 세포 타입의 표면에서 발현될 수 있지만, 서로 복합체를 형성하진 않는다. TNFR2는 용해성 TNFα 및 막 결합형 TNFα 둘다와 결합할 수 있다. 막 TNFα에 결합하면 TNFR2를 효율적으로 활성화할 수 있지만, 용해성 TNFα를 이용하여 리간드화된 TNFR2 삼량체를 육량체 또는 그 이상의 복합체로 올리고머화하는 것은 TNFR2 활성화에 부적절하며, 따라서 효과적인 TNFR2 활성화를 촉발하지 못한다. TNFα 뿐 아니라 림포톡신-α (LTα)도 TNFR2에 대한 리간드로 작용할 것으로 여겨진다.
TNFR2가 막 TNFα에 의해 활성화되면, 이 수용체의 세포내 도메인은 존재하는 세포질 TNFR2 삼량체를 동원해, E3 리가제 cIAP1 및 cIAP2를 TNFR2 복합체로 모집하는 것으로 보이며, 그래서 고전적인 NFκB 신호전달을 유도한다. TRAF2 동원은 또한 대안적인 NFκB 신호전달 경로의 활성화와 관련 있다. 막 TNFα가 TNFR2에 결합하면, PI3K/Akt 경로를 통한 신호전달을 촉발하여, 생존성 유지 및 증식 강화뿐 아니라 세포 부착 및 이동과 같은 다른 기능을 촉진하는 것으로 보인다. TNFR2 넉아웃 마우스는 염증성 질환에 보다 취약하고, Treg 세포가 있지만 반응성이 낮다. TNFR2의 자연 생성 다형성 역시 존재하며, 매우 다양한 자가면역 질환들과 연관성이 있다.
Treg 세포 상에서의 TNFR2 발현 및 기능은 이를 면역 시스템을 조절하기 위한 바람직한 표적으로 만들며, 특히 TNFR2가 TNFR1보다는 더 제한된 세포 하위집단들에서 발견된다. Treg 세포 자극 능력은 알레르기, 자가면역, 이식, 이식편대숙주 질환 (GVHD) 및 감염 질환을 비롯하여 면역 반응을 억제하는 능력이 유익할 수 있는 매우 다양한 병태들에서 원치않는 면역 반응을 제어하는 방법을 제시해준다. Treg 세포뿐 아니라 TNFR2를 발현하는 다른 세포 타입도 원하는 기능을 달성하도록 표적화할 수 있다. 그래서, TNFR2를 표적화하여 활성화하는 물질이 계속 요구되고 있다.
본 발명은 TNFR2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 결합 분자를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 결합해 수용체를 통한 신호전달을 촉발하여, 작용제로서 작용할 수 있다. 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 FcγR 결합과는 독립적인, TNFR2 작용제로서 작용할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 이의 항체 단편이다. 본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합한다는 점에서 선택적이다.
결합 분자는 진단 용도에서 치료학적 용도에 이르는 다양한 용도를 가질 수 있다. 결합 분자는 면역 시스템을 조절할 수 있는 능력을 가지고 있어, 특히 자가면역 병태 및 염증 병태를 치료하는데 특히 유용하다. 결합 분자는 Treg 세포에 대한 작용으로 인해 면역 시스템의 하향 조절에 이용할 수 있으며, 또한 특히 이식편대숙주 질환 (GvHD) 등의 이러한 병태를 치료하는데 유용하다.
이에, 일 구현예에서, 본 발명은 TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공하며, 여기서 결합 분자는 FcγR 독립적인 TNFR2 작용제이며, TNFR2에 대해 2 이상의 결합가를 가진다. 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 4 이상이다. 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 4이다. 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 6 이상이다. 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 6이다
다른 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 특이적인 VHH 결합 도메인으로서, TNFR2에 대해 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 다른 특히 바람직한 구현예에서, TNFR2에 특이적인 결합 도메인들 모두 TNFR2에 특이적인 VHH 결합 도메인이다. 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 특이적인 VHH 결합 도메인을 6개 포함하는 6가 항체이다.
또한, 본 발명은 다음을 제공한다:
ㆍ 의약제로 사용하기 위한 본 발명의 결합 분자.
ㆍ 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 본 발명의 결합 분자.
ㆍ 본 발명의 결합 분자를 장애가 있거나 또는 발병 위험이 있는 개체에 투여하는 것을 포함하는 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법.
ㆍ 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법에 이용하기 위한 의약제의 제조를 위한 본 발명의 결합 분자의 용도.
ㆍ TNFR2를 발현하는 표적 세포를 본 발명의 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 세포 증식을 자극하는 방법.
ㆍ 본 발명의 결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
ㆍ 검사 샘플을 본 발명의 결합 분자와 접촉시키고 존재할 경우 TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하는 TNFR2 검출 방법.
ㆍ 본 발명의 결합 분자를 개체에 투여하고 존재할 경우 TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하는 진단 방법.
ㆍ 본 발명의 결합 분자를 개체에 투여하고 존재할 경우 TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하는 진단 방법에 이용하기 위한 본 발명의 결합 분자.
서열목록
본 출원은 본 출원의 일부를 구성하는 서열목록을 출원과 함께 전자 형태로 포함한다.
도 1 - N-말단으로 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 예시적인 항- TNFR2 항체 변이체들의 도메인 구조 명칭 및 도표 ( Fab 또는 scFv 도메인). CI = 부모 항-TNFR2 항체의 클론 식별자, 예를 들어, 마우스 항-인간 TNFR2 항체 C4, C19, C9, C40 등; N297A는 FcγR 상호작용을 낮추는 인간 IgG1 중쇄 내 해당 돌연변이를 지칭하고; N-RGY는 N297A 돌연변이 + IgG1 헥사머 형성을 촉진하는 돌연변이를 지칭한다.
도 2 - N-말단 단방향으로 배향된 TNFR2 결합 부위를 가진 항- TNFR2 항체 C4 변이체에 대한 웨스턴 블롯 분석. 지정된 C4 구조체의 Flag-태깅된 변이체 (200 ng)를 항-인간 IgG 및 항-Flag 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
도 3 - 단방향으로 구성된 N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체를 처리한 후 HT1080- Bcl2 - TNFR2 세포에서의 TNFR2 -매개 IL8 생산. 인간 TNFR2를 안정적으로 발현하는 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 다양한 C4 구조체를 지정된 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량을 ELISA에 의해 분석하였다. 나타낸 데이터는 병행 처리한 실험으로부터 수득하였으며, 더 나은 해상도를 위해 3개의 도표로 나타낸다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)인 양성 대조군에 의해 유발된 최대 반응은 점선으로 표시한다.
도 4. 단방향으로 구성된 N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체로 처리한 후 Kym -1 세포에서의 TNFR2 -매개 세포 사멸. Kym-1 세포를 다양한 C4 구조체를 지정된 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 크리스탈 바이올렛 염색으로 세포 생존성을 확인하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)(oligo. TNF80)를 TNFR2 결합에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
도 5 - N-말단 단방향으로 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체로 처리한 후 Kym -1 세포에서의 TNFR2 -매개 p100 프로세싱. Kym-1 세포를 다양한 C4 구조체를 지정된 농도로 함유한 상층액으로 밤새 처리하였다. 처리는 TNFR2-유발성 세포 사멸을 방지하기 위해 20 μM ZVAD 존재 하에 수행하였다. 인간 및 뮤라인 TNFR2를 강하게 활성화하는, 마우스 TNF의 9량체 TNFR2-특이적인 돌연변이 (oligo. TNF80)를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 6 - N-말단 단방향으로 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 C19, C27 및 C40 변이체로 처리한 후 HT1080- Bcl2 - TNFR2 세포에서 TNFR2 -매개 IL8 생산. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를, 다양한 구조체를 지정된 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)인 양성 대조군에 의해 유발된 최대 반응은 점선으로 표시하였다. 주의: 저 친화성 항체 C27로부터 유래한 구조체도 현저한 작용제 기능을 보였다 (하단 패널).
도 7 - N-말단 및 C-말단으로 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 항- TNFR2 항체의 도메인 구조의 명칭 및 도표 ( Fab 또는 scFv 도메인). CI = 클론 식별자, 예를 들어 C4, C19 등; N297A는 FcγR 결합을 낮추는 인간 IgG1의 중쇄 내 해당 돌연변이를 나타낸다.
도 8 - N-말단 및 C-말단에 융합된 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체에 대한 웨스턴 블롯 분석. 지정된 C4 구조체의 Flag-태깅된 변이체 (200 ng)를 항-인간 IgG 및 항-Flag 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4의 중쇄는 Flag 태그를 함유하지 않음에 유념한다.
도 9 - N-말단 및 C-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 구조체로 처리한 후 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에서 TNFR2 -매개 IL8 생산. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를, 다양한 C4 구조체를 지정된 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 나타낸 데이터는 병행 처리한 실험으로부터 수득하였으며, 더 나은 해상도를 위해 3개의 도표로 나타낸다. 양성 대조군 (oligo. TNF80; TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R))에 의해 유발된 최대 반응은 점선으로 표시한다. N-말단 결합 부위만 존재하는 해당 구조체들을 비교를 위해 병행 분석하였다.
도 10 - N-말단 및 C-말단으로 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 구조체로 처리한 후 Kym -1 세포에서 TNFR2 -매개 세포 사멸. Kym-1 세포를 다양한 C4 구조체를 지정된 대략적인 농도로 함유한 HEK293 형질감염 세포로부터 유래한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 세포 생존성을 MTT 분석을 이용해 확인하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 양성 대조군으로 이용하였다
도 11 - TNFR2 -특이 항체의 결합 특성. (A) 37℃에서 세포 발현된 인간 TNFR2에 대한 지정된 항-TNFR2 항체 GpL 융합 단백질의 평형 결합. (B) HeLa-TNFR2 세포에 항-TNFR2 항체를 지정된 양으로 전처리하거나 또는 무처리한 채 두었다. 5 ng/ml GpL-TNF를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후 결합을 측정하였다. 비-형질감염 HeLa 세포에 대한 다양한 구조체의 결합을 분석하여, 비특이적인 결합 값을 구하였다.
도 12 - αTNFR2 항체의 경쟁. HeLa-TNFR2 세포에 지정된 항-TNFR2 항체를 3 - 10 ㎍/ml로 전처리하거나 또는 무처리한 채 두었다. 50 ng/ml로 다양한 αTNFR2-IgG1(N297A)-LC:GpL 변이체를 첨가하고, 1시간 후 결합을 측정하였다.
도 13 - 4가 mAb 결합성 TNFR2 분자가 통상적인 2가 mAb 변이체에 의해 결합되는 TNFR2 분자보다 IL8을 훨씬 강하게 촉발한다. (A,B) TNFR2-음성 Hela 세포 및 HeLa-TNFR2 세포를 TNFR2-특이적인 mAb C4의 2가- 및 4가 버전의 GpL 융합 단백질을 지정된 농도로 사용해 8시간 동안 쌍으로 자극하였다 (구조는 삽입도 참조). HeLa-TNFR2 세포의 상층액을 TNFR2-유발성 IL8 생산에 대해 분석하였으며 (B), 반복 세척한 세포 (HeLa, 및 HeLa-TNFR2)를 세포-관련 GpL 활성에 대해 분석하였다. (A)에 나타낸 TNFR2에 대한 특이적인 결합은 HeLa-TNFR2 세포로부터 유래한 총 결합 값으로부터 HeLa 세포로부터 수득한 비-특이 결합 값을 제하여 계산하였다. 루시퍼라제 활성은 2종의 mAb 변이체 내 TNFR2-결합 도메인 개수에 대한 GpL 리포터 도메인의 개수의 비율에 따라 표준화하였다 (1 버전 0.5). (C) mAb 변이체에 의한 IL8 생산을 이의 특이적인 결합의 함수로써 직접 도표로 작성하였다. 후자는 분석에서 세포 수 및 GpL 구조체의 측정한 특이적인 활성 (RLU/분자)을 이용해 "세포 당 점유된 수용체"로 변환하였다. A에서 입수한 구조체 2종의 최대 결합은 수직 파선으로 표시하였다. 점선은 수용체 점유에 따른 IL8 생산의 선형 회귀를 나타낸다.
도 14 - 인간, 뮤라인 및 시노몰구스 TNFR2에 대한 TNFR2 -특이적인 항체의 결합. HEK293 세포를 인간, 뮤라인 및 시노몰구스 TNFR2 또는 빈 벡터로 일시적으로 형질감염하였다. 그런 후, 지정된 항-TNFR2 항체 GpL 융합 단백질의 평형 결합을 37℃에서 결정하였다. 빈 벡터 형질감염된 세포에 대한 결합성을 확인해 비-특이적인 결합 값을 구하였다.
도 15 - TNFR2의 도메인 구조 및 항- TNFR2 항체 C4, C19, C27 및 C40 및 이로부터 유래한 4가 CI- IgG1 ( N297A )- HC:scFvCI 변이체에 의해 인지되는 세포외 TNFR2 도메인을 나타낸 도표. CI, 항-TNFR2 클론 식별자; CRD, 시스테인-풍부 도메인.
도 16 - 단일- 및 이중 특이적인 TNFR2 -특이적인 CI- IgG - HC:scFvCI 변이체 에 대한 웨스턴 블롯 분석. 지정된 항체 구조체의 Flag-태깅된 변이체 (200 ng)를 항-인간 IgG (하단 패널) 및 항-Flag 항체 (상단 패널)를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 기존 IgG 변이체를 비교 목적으로 포함하였다. 다음 사항에 유념한다: i) C4-IgG1(N297A), C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4 및 C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC19의 중쇄는 Flag 태그를 포함하지 않으며, ii) 이용한 기존 C19 변이체는 뮤라인 IgG1(D265A) 이소형 형태이다.
도 17 - 모노- (상단 패널) 및 바이파라토프 (하단 패널) TNFR2 -특이적인 CI-IgG-HC:scFvCI 변이체를 이용한 처리 후 HT1080- Bcl2 - TNFR2 세포에서 TNFR2 -매개 IL8 생산. 고 작용제로서 올리고머화된 TNFR2-특이적인 TNF 변이체 200 ng/ml에 의해 유도된 반응을 표시한다 (점선). 상단 패널에서 저 친화성 C27 항체가 4가 형태에서도 일부 작용제 활성을 여전히 제공함에 유념한다.
도 18 - 단일- (상단 패널) 및 이중 특이성 (하단 패널)의 TNFR2 -특이적인 CI-IgG-HC:scFvCI 변이체로 처리한 후 Kym -1 세포에서 TNFR2 -매개 세포 사멸. Kym-1 세포를 다양한 구조체를 지정된 대략적인 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 세포 생존성을 크리스탈 바이올렛 염색을 이용해 결정하였다. 기존 항체 (상단 패널)는 비교 목적으로 병행 분석하였다.
도 19 - 단일- (A) 및 이중 특이성 (B)의 TNFR2 -특이적인 CI- IgG - HC:scFvCI 변이체를 이용한 처리 후 Kym -1 세포에서 TNFR2 -매개 p100 생산. 세포를 밤새 다양한 구조체를 지정된 대략적인 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 처리는 20 μM ZVAD 존재 하에 수행하여, TNFR2-유발성 세포 사멸을 방지하였다.
도 20 - C4- IgG1 ( N297A )- HC:scFvC4 , C4- IgG1 ( N297A )- LC:scFvC4 및 C4-IgG1(N297A)-LC:scFvC4-HC:scFvC4의 정제 및 기능 분석. (A) 은 염색한 SDS-PAGE 겔. (B) 겔 여과 분석. (C) HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에서 IL8 유도. (D) Kym-1 세포에서 세포 사멸 유도. (E) Kym-1 세포에서 p100 프로세싱 유도. ZVAD는 세포 사멸을 방지하기 위해 첨가하였다.
도 21 - 4가 TNFR2 작용제로 처리한 후 Treg 및 Tcon 세포의 생체외 평가. PBMC를 공여체로부터 수집해, 배양, 회수한 다음 4가 항체 (단일- 또는 이중 특이성; Fab-HC-scFv 포맷)를 처리하였다. 무처리 음성 대조군 세포 역시 양성 대조군과 마찬가지로 고도로 강력한 올리고머화된 TNFR2-선택적인 TNF 변이체인 Star2 (TNC-sc(mu)TNF(143N/145R이라고도 함) TNFR2 작용제 (oligo TNF80)로 처리하였다 (Chopra et al., 2016). 최상단 패널은 Treg의 배수 변화 %를 나타내고, 하단 패널은 Tcon 세포를 나타낸다.
도 22 - 동계 FoxP3 - 루시퍼라제 형질전환 마우스에서 인간-마우스 교차 반응성 4가 TNFR2 작용제 C19- IgG1 ( N297A )- HC:scFvC19에 의한 용량-의존적인 Treg 증가. 트랜스제닉 FoxP3-Luci 마우스에 TNFR2 작용제를 8회 투여하고 (N=1), 생발광 촬상에 의해 매일 평가하였다. 4일 후, 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 분석하였다. 패널 (A)는 실험의 타임라인을 나타낸다. 패널 (B)는 비장세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 23 - 동계 FoxP3 - 루시퍼라제 형질전환 마우스에서 인간-마우스 교차 반응성 4가 TNFR2 작용제 C19- IgG1 ( N297A )- HC:scFvC19에 의한 용량-의존적인 Treg 증가. 트랜스제닉 FoxP3-루시퍼라제 마우스에 C19-IgG1(N297A)-HC;scFvC19를 여러가지 용량으로 투여한 다음 생발광 촬상에 의해 매일 평가하였다. 4일 후, 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 유세포 측정에 의해 분석하였다.
도 24 - TNFR2 -특이적인 TNF 구조체의 생산 및 분석. 패널 (A): TNF-기반한 분자의 도메인 구조. TNF80은 용해성 TNF의 TNFR2-특이적인 돌연변이를 지칭한다. 패널 (B): 뮤라인 용해성 TNF80-기반한 구조체는 모든 구조체에 함유된 Flag 태그를 이용하여 항-Flag 친화성 정제에 의해 정제하고, SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 분석하였다. 패널 (C): "B"에 나타낸 정제된 단백질에 대한 겔 여과 분석.
도 25 - 용해성 뮤라인 TNF80의 여러가지 형태들의 작용제 활성. 패널 (A): Kym-1 세포를 다양한 muTNF80 변이체의 지정된 농도로 자극하였다. 다음날, 세포 생존성을 크리스탈 바이올렛 염색을 이용해 결정하였다. 패널 (B): HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 도 24에 나타낸 다양한 TNF80 변이체를 지정된 농도로 사용해 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 나타낸 데이터는 4개의 독립 실험으로부터 유래한다.
도 26 - Fc (DANA)-TNC- muTNF80에 의한 생체내 Treg 증폭. Foxp3 프로모터의 통제 하에 루시퍼라제를 가진 마우스에 Fc(DANA)-TNC-muTNF80을 지정된 양으로 1회 i.v. 주사하고, 생발광 촬상 (BLI)에 의해 매일 분석하였다 (상단 패널). 0일 및 4일 BLI 사진을 중앙 패널에 나타낸다. 하단 패널은 4일 Treg 빈도 정량 결과에 기반한 유세포 측정 분석을 나타낸다.
도 27 - 본 발명의 결합 분자에 의한 TNFR1이 아닌 TNFR2의 선택적인 결합 검증. HEK293 세포에 (i) TNFR2 발현 플라스미드; (ii) TNFR1의 세포외 도메인을 GPI 앵커 도메인과 함께 코딩하는 발현 플라스미드; 또는 (iii) 빈 벡터 (ev)로 일시적으로 형질감염시켰다. 다음날, 지정된 GpL 태깅된 결합 분자를 지정된 농도로 세포에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 후, PBS로 2회 헹구고, 남아있는 세포 결합 GpL 활성을 결정하였다. GpL-TNF는 TN 수용체 2가지 타입에 결합하는 양성 대조군으로 이용하였다.
도 28 - WO 2020/089474로부터 유래한 005-B08의 IgG1 ( N297A )- HC:scFv , IgG1(N297A)-HC:TNC 및 IgG1 (N- RGY ) 변이체는 IL-8 방출을 이용해 측정한 바와 같 이 강력한 TNFR2 작용제이다. 양성 대조군으로서 C4-IgG1(N297A)-HC:C4를 이용해 유도한 최대 반응을 점선으로 표시하였다.
도 29 - scFv에서 중쇄와 경쇄 사이의 링커 길이 변화와 C4- IgG1 ( Durv )-scFv:C4 변이체의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 scFv는 TNFR2 작용제 활성에 영향을 미치지 않는다. (A) 구조체의 도메인 구조. "G4S"는 링커 서열 GGGGS를 나타내고, "Durv"는 항체 두르발루맙 (Durvalumab)의 불변 영역 서열을 나타낸다. (B) 정제한 C4-IgG1(Durv)-HC:scFvC4(G4S)4 및 C4-IgG1(Durv)-LC:scFvC4(G4S)4의 겔 여과. (C) IL-8 방출 분석. 양성 대조군으로서 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다.
도 30 - 서열 최적화는 C4- IgG1 ( Durv )-HC/ LC:scFvC4 변이체의 활성에 영향을 미치지 않는다. (A) 정제한 C4-IgG1(Durv)-HC/LC:scFvC4 변이체의 겔 여과 분석. (B) TNFR2 활성화의 척도로서 IL8 방출 분석. 양성 대조군으로서 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다.
도 31 - TNFR2 -특이적인 sdAb의 TNFR2 결합. 인간 TNFR2를 발현하는 세포에 대한 지정된 TNFR2-특이적인 VHH-Fc-GpL VHH 구조체의 37℃ 평형 결합. 인간 TNFR2를 발현하는 형질감염체 (전체 결합)로부터 비-특이적인 결합 값 (Hek293 세포)를 제하여 특이적인 결합을 구하였다.
도 32 - 인간 및 뮤라인 TNFR2에 대한 TNFR2 -특이적인 6가 3xVHH - Fc - GpL 구조체의 결합. 인간 TNFR2를 발현하는 세포에 대한 지정된 TNFR2-특이적인 3xVHH-Fc-GpL VHH 구조체의 37℃ 평형 결합. GpL 리포터 도메인은 Fc 도메인의 C-말단에 클로닝하였다. ○ = 비-특이적인 결합; □ = 전체 결합; ● = 특이적인 결합.
도 33 - VHH:C18 , VHH:C74 , VHH:C188 및 VHH:C238의 3xVHH - Fc (DANA) 변이체 는 TNFα가 TNFR2에 결합하는 것을 차단한다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 TNFR2-특이적인 VHH 구조체를 지정된 양으로 또는 음성 대조군으로서 CD40-특이적인 구조체 3xVHH:CD40(V12t)-Fc(DANA)으로 전처리하거나, 무처리한 채 두었다. 5 ng/ml GpL-TNF를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후 결합성을 측정하였다.
도 34 - TNFR2 -특이적인 VHH는 TNFR1과 결합하지 않는다. HEk293 세포를 TNFR1 및 TNFR2를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 다음 지정된 단백질에 대한 결합성을 분석하였다. 비-특이적인 결합에 대한 음성 대조군으로 빈 벡터 형질감염된 세포의 결합을 이용하였다. TNF-GpL은 성공적인 TNFR1 결합에 대한 양성 대조군으로 이용하였다. ● = 전체 결합; x = 비-특이적인 결합; ○ = 특이적인 결합.
도 35 VHH:C18 , VHH:C188 및 VHH:C238은 TNFR2의 CRD4에 결합하고 VHH:C74는 CRD3에 결합한다. (A) 블랙 96-웰 플레이트를 단백질 G로 코팅한 다음 지정된 TNFR2-특이적인 나노바디의 3xVHH-Fc(DANA) 버전을 로딩하였다. 비결합 단백질을 제거한 후, 우측 패널의 웨스턴 블롯에 나타낸 TNFR2(ed)의 GpL-태깅된 결손 돌연변이의 결합에 대해 고정된 항체 구조체를 분석하였다. 마지막으로, 이들 GpL 융합 단백질의 결합을 정량하였다. (B) 클론 C188 및 C4는 인간 TNFR2에 대한 결합에 대해 TNF와 경쟁한다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에 TNFR2-특이적인 VHH 구조체를 지정된 양으로 또는 음성 대조군으로 CD20-특이적인 mAb 리툭시맙을 전처리하거나 또는 무처리한 채 두었다. 5 ng/ml GpL-TNF를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후 결합을 측정하였다
도 36 - N-말단-단독에만 TNFR2 결합 부위 4개를 가진 VHH -기반의 구조체로 처리한 후 TNFR2 -매개 IL8 방출. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체를 함유한 상층액으로 자극하고, 수득한 상층액을 다음날 IL-8 방출에 대해 분석하였다. 최대 반응을 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R) (상단 패널) 또는 양성 대조군으로서 C4-IgG1(N297A)-HC:C4 (중앙 및 하단 패널)를 이용해 유도하여 점선으로 표시하였다.
도 37 - N-말단-단독에만 TNFR2 결합 부위를 6개 가진 VHH -기반의 구조체로 처리한 후 TNFR2 -매개 IL8 방출 및 Kym -1 세포 사멸. (A) HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체로 자극하고, 컨디셔닝화된 배지에서 IL-8 방출을 측정하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R) 양성 대조군을 이용하여 유도한 최대 반응을 점선으로 표시하였다. (B) Kym-1 세포를 다양한 6가 변이체로 자극하고, 다음날 세포 생존성을 MTT 분석을 이용해 확인하였다. 200 ng/ml TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)에 의해 유도된 최대 사멸을 다시 점선으로 표시하였다.
도 38 - VHH:C188 - Fc , 2xVHH:C188 - Fc - GpL 및 3xVHH:C188 - Fc의 작용제 활성의 병렬 비교. (A,B) 정제한 단백질을 SDS-PAGE (A) 및 겔 여과 (B)에 의해 분석하였다. (C) TNFR2 활성화의 지표로서 IL-8 방출 측정. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 양성 대조군으로 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다. (D) Kym-1 세포를 다양한 VHH:C188 변이체로 자극한 후 세포 생존성 분석. C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4에 의해 유도된 최대 사멸을 점선으로 표시하였다.
도 39 - C18 및 C74의 VHH - Fc - GpL , 2xVHH - Fc - GpL 및 3xVHH - Fc - GpL 변이체의 Kym-1 세포 사멸-유도 활성 및 IL8 방출에 대한 병렬 비교 . (A) IL-8 방출 분석. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 표시하였다.
도 40 - 3xVHH:C188 - IgG1 ( Durv ) 변이체의 VHH 도메인 사이 링커 길이는 TNFR2 작용제 효과에 영향을 미치지 않는다. 3xVHH:C188-IgG1(Durv) 변이체의 VHH 도메인 사이 링커 길이는 TNFR2 작용제 효과에 영향을 미치지 않는다. (A) 구조체의 도메인 구조. (B) 정제된 구조체의 SDS-PAGE 분석. (C) 겔 여과 분석. (D) HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체가 함유된 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다. 부모 분자 3xVHH:C188-Fc(DANA)가 비교를 위해 포함된다.
도 41 - VHH:C188 도메인을 4, 6 또는 9개 가진 여러가지 도메인 구조의 구조체들은 강력한 TNFR2 작용제 효과를 유도한다. (A) 구조체의 도메인 구조. TNC는 테나신-C의 삼량체화 도메인을 나타낸다. (B) IL-8 방출 분석. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다.
도 42 - 단백질 G는 항- TNFR2 mAb C4의 서열 최적화된 변이체의 작용제 활성을 강화한다. (A) 지정된 항체 변이체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양 상층물의 항-인간 IgG1 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석. (B) HT1080-TNFR2 세포를, 지정된 농도의 C4 변이체로 500 ng/ml 단백질 G (PG)의 존재 및 부재 하에 챌린지 하였다. 다음날, 세포 상층액에서 IL8 생산에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다. 단백질 G의 존재시 활성 강화는 적절한 도메인 구조를 가진 구조체의 구현에 의해 달성될 수 있는 잠재적인 작용제 활성의 존재를 시사한다.
도 43 - 3xVHH:C188 - Fc(Durv)의 서열 최적화된 변이체의 TNFR2 작용제 효과. (A) 지정된 3xVHH:C188-Fc(Durv) 변이체를 코딩하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양 상층물의 항-인간 IgG1 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석. (B) HT1080-TNFR2 세포를, 지정된 농도의 3xVHH:C188-Fc(Durv) 변이체 및 부모 3xVHH:C188-Fc(DANA) 분자로 챌린지 하였다. 다음날, 세포 상층액에서 IL8 생산에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다.
도 44 - TNFR2 -작용제는 인간 말초혈 단핵 세포 ( PBMC )에서 Foxp3 + 조절성 T 세포 ( Tregs )를 증가시킨다 - 동일한 공여체의 무처리 대조군 대비, 지정된 TNFR2-작용제로 4일 자극한 후 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 Treg 빈도의 배수 변화. 샘플을 유세포 측정으로 측정하고, Treg는 CD3+CD4+FoxP3+ T 세포로서 정의하였다. 공여자 수는 n으로 표시한다. 유의성은 가상 수치 1로 1-샘플 t 검정으로 조사하고, *P=0.05, **P=0.01, ***P=0.001, ****P<0.0001으로 나타내었다.
도 45 - C4- IgG1(N297A)Hc - scFvC4 항체에 의한 Treg 활성화. 인간 PBMC를 100 ng/ml C4-IgG1(N297A)Hc-scFvC4로 4일간 자극하고, Treg 활성과 관련한 마커 발현을 유세포 측정으로 측정하였다. 동일 공여체의 무처리 대조군 대비 발현의 배수 증가를 나타낸다. Treg는 CD3+CD4+FoxP3+ T 세포로서 정의하였다. 평균 ± SD 및 각 점은 공여체 개체를 나타낸다.
도 46 - 3xVHHC188(G4S)1 - Fc ( Durv ) 항체에 의한 Treg 활성화. 인간 PBMC를 지정된 농도의 3xVHHC188(G4S)1-Fc(Durv)로 4일간 자극하고, Treg 활성과 관련한 마커 발현을 유세포 측정으로 측정하였다. 동일 공여체의 무처리 대조군 대비 발현의 배수 증가를 나타낸다. Treg는 CD3+CD4+FoxP3+ T 세포로서 정의하였다. 평균 ± SD 및 각 점은 공여체 개체를 나타낸다.
도 47 - TNFR2 작용제는 시험관내에서 인간- TNFR2 - 발현성 CD4 T 세포를 증폭시킨다. 인간-TNFR2 넉인 마우스에서 수득한 농화된 CD4 T 세포를 여러가지 농도의 (A) C4-C4 (C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4)로 자극하거나, 또는 (B) 3xVHH:C188-Fc(DANA)는 각각의 작용제와 함께 4일간 배양한 후 Treg 빈도를 증가시킨다. 데이터는 무처리 (이소형 대조군) 샘플 대비 CD25highFoxP3high CD4 T 세포의 증가 배수 변화를 나타낸다. 데이터는 일원식 ANOVA에 의해 분석하였다.* p≤0.05, ** p≤0.005.
도 48 - Fc (DANA)-TNC- muTNF80의 혈청 체류. 75 ㎍ Fc(DANA)-TNC-muTNF80 또는 이소형 대조군 항체를 0시간에 주사한 야생형 마우스의 여러가지 혈청 희석물 (주어진 시점에 말초혈에서 분리)로 자극한, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포 배양물의 상층액을 이용한 ELISA에 의해 측정한 IL-8 농도. 도표에서 시점은 주사한 후 혈액 샘플을 수집한 시점으로서 델타 t를 의미한다. x 축은 TNFR2 작용제 활성을 결정하기 위한 시험관내 분석에서 이들 샘플의 희석을 나타낸다.
도 49 - TNFR2 작용제는 Treg를 생체내 증폭시키고, 활성화 마커를 상향 조절한다. (A) 야생형 마우스를 75 ㎍ Fc(DANA)-TNC-muTNF80로 자극한 후 4일에 분리한 비장에서의 생존 세포의 Treg 빈도. (B) 이소형 대조군 항체 샘플에 대해 표준화한 Treg의 평균 형광 강도로서 정의한 소정의 세포외 마커의 배수 변화.
도 50 - TNFR2 작용제는 생체내에서 비장 Treg를 증가시킨다. (A) 300, 1000 ㎍ 3xVHH:C188-Fc(DANA) 또는 1000 ㎍ 이소형 대조군 항체로 자극한 후 4일차에 분리한 huTNFR2-발현 마우스 비장에서 생존 세포의 Treg 빈도의 배수 변화. 배수 변화는 이소형 대조군을 기준으로 계산하였다. 처리 군과 이소형 대조군 간의 평균 비교는 비-대응 t-검정을 통해 수행하였다.* p≤0.05, ns= 유의하지 않음. (B) 40㎍, 100㎍ 또는 250 ㎍ C4-IgG1(N297A)-HC:scFv:C4로 자극한 후 4일차에 분리한 huTNFR2-발현 마우스 비장에서 CD4+CD3+ T 세포의 Treg 빈도의 배수 변화. 배수 변화는 무처리 대조군을 기준으로 계산하였다. 처리 군과 이소형 대조군 간의 평균 비교는 비-대응 t-검정을 통해 수행하였다. * p≤0.05, ns= 유의하지 않음.
도 51 - TNFR2 작용제는 동종이계 조혈 세포 이식 ( allo -HCT)에 의해 유발된 급성 이식편대숙주 질환 ( GvHD ) 이후의 생존성을 높인다. (A) 마우스 (FVB/N H-2q->C57BL/6 H-2b, MHC 주 미스매치 모델)에서 allo-HCT 유발성 실험 급성 GvHD 이후의 생존 빈도. C19-IgG1(N297A)-HC;scFvC19와 이소형 대조군 항체 간에 Log-순위 검정으로 통계 유의성을 평가하였다.* p≤0.05. (B) 면역 세포 침윤 및 장 음와 손상에 기반한 allo-HCT 이후 6일에 분리한 장 샘플에 대한 병리학적 점수. (C) 이소형 대조군 항체로 처리된 마우스의 신호에 대해 표준화한, 지정된 장기에서 동종이계 공여 T 세포에서의 상대적인 생발광 신호에 대한 6일 생체외 분석.
도 52 - C4- IgG1 ( N297A )- HC:scFvC4는 아프리카 녹색 원숭이 ( vervet ) 말초 혈 단핵 세포 ( PBMC ) 로부터 Treg를 증폭시킨다 - 지정된 C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4로 5일 자극한 후 vervet 원숭이 PBMC의 Treg 빈도의, 동일 공여체의 무처리 대조군 대비, 배수 변화 및 총 변화. 샘플을 유세포 측정으로 측정하고, Treg는 CD3+ CD4+ FoxP3+ T 세포로서 정의하였다. 증폭은 n=1 vervet 원숭이 샘플에서 검사하였다.
도 53: C188 부모 및 서열 최적화된 변이체 14에 기반한 3xVHH - Fc ( durv ) (6가) 형태의 아미노산 서열. 도면은 바람직한 6가 결합 분자의 폴리펩타이드를 나타낸다. 나타낸 CDR, CDR 3종으로 구성된 전체 세트, 가변 영역, 및 전체 폴리펩타이드는 아래에 기술된 이들의 임의 변이체와 마찬가지로 바람직한 구현예를 나타낸다.
도 54: 부모 C4에 기반한 C4- IgG1 ( Durv )- HC:scFvC4(G4S)4 (4가) 형태의 아 미노산 서열. 도면은 바람직한 4가 결합 분자의 폴리펩타이드를 나타낸다. 나타낸 CDR, 경쇄 CDR 3종으로 구성된 세트, 중쇄 CDR 3종으로 구성된 세트, CDR 6종으로 구성된 전체 세트, 가변 영역, 가변 영역들의 쌍 및 전체 폴리펩타이드는 아래에 기술된 이들의 임의 변이체와 마찬가지로 바람직한 구현예를 나타낸다.
도 55: 서열 최적화된 변이체 7 및 변이체 16 각각에 기반한 4가 C4var7 -IgG1(Durv)-HC:scFvC4var7(G4S)4 및 C4var16 - IgG1 ( Durv )- LC:scFvC4var16(G4S)4의 아미노산 서열. 도면은 바람직한 4가 결합 분자의 폴리펩타이드를 나타낸다. 나타낸 CDR, 경쇄 CDR 3종으로 구성된 세트, 중쇄 CDR 3종으로 구성된 세트, CDR 6종으로 구성된 전체 세트, 가변 영역, 가변 영역들의 쌍 및 전체 폴리펩타이드는 아래에 기술된 이들의 임의 변이체와 마찬가지로 바람직한 구현예를 나타낸다.
TNFR2 및 TNFR2 표적 세포
본 발명은 TNFR2에 결합하는 결합 분자, 특히 TNFR2의 세포외 도메인에 결합하는 결합 분자를 제공한다. TNFR2는 특징적인 세포외 도메인, 막관통 분절 및 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 영역은 반복적인 시스테인 풍부 도메인 (CRD) 4개를 포함한다. 본 발명의 결합 분자에 의해 결합되는 TNFR2는 전형적으로 포유류 TNFR2이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자에 의해 결합되는 TNFR2는 인간 TNFR2이다. 인간 TNFR2의 아미노산 서열은 서열번호 1로서 제공된다. 서열번호 1에 제공된 인간 TNFR2 아미노산 서열은 아미노산 1-22를 포함하는 신호 펩타이드; 아미노산 23-257의 세포외 도메인; 및 아미노산 258-287의 막관통 영역으로 세분된다. 본 발명의 결합 분자는 전형적으로 TNFR2의 세포외 도메인에 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 인간 TNFR2에 결합할 수 있으며, 마우스 TNFR2 및/또는 원숭이 TNFR2와 같은 다른 종의 TNFR2에도 결합한다. 일 구현예에서, 이는 인간, 마우스 및 원숭이 TNFR2에 결합한다. 일 구현예에서, 결합 분자는 인간 및 시노몰구스 원숭이 TNFR2에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 결합 분자는 인간 및 아프리카 녹색 원숭이 TNFR2에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 인간, 시노몰구스 원숭이 및 아프리카 녹색 원숭이 TNFR2에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 인간 및 마우스 TNFR2에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 인간, 마우스 및 아프리카 녹색 원숭이 TNFR2에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 TNFR2에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 인간, 마우스, 시노몰구스 원숭이 및 아프리카 녹색 원숭이 TNFR2에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 적어도 이러한 TNFR2 종들에 결합할 것이다.
본 발명의 결합 분자는 전형적으로 표적 세포, 특히 TNFR2를 발현하는 표적 세포에 결합하기 위해 이용될 것이다. 표적 세포는 TNFR2를 발현하는 모든 세포 타입일 수 있다. 일 구현예에서, 표적 세포는 면역 세포, 내피 세포, 간엽 줄기 세포 또는 뉴런이다. 특히 바람직한 구현예에서, 표적 세포는 면역 세포이다. 특히 바람직한 구현예에서, 표적 세포는 Treg 세포이다. 일 구현예에서, TNFR2를 발현하는 면역 세포는 T 조절성 세포 (Treg), B 조절성 세포 (B reg) 및 MDSC (골수 유래 억제 세포)로부터 선택된다. 일 구현예에서, 표적 세포는 Treg 세포, 즉 Foxp3+ CD25+ 조절성 T 세포일 수 있다.
결합 분자
본 발명은 TNFR2에 결합하는 결합 분자를 제공한다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 결합할 것이며, TNFR2를 통한 신호전달을 자극할 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 대한 작용제 (agonistic) 항체 또는 항체 융합 단백질 또는 항체 단편 또는 항체 단편 융합 단백질이고, 그래서 그 수용체를 자극한다. 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 특이적으로 결합하는 항체이고, 바람직하게는 이는 TNFR2에 특이적으로 결합하고 FcγR에의 결합 없이 작용제로서 작용하는 항체이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR1에 비해 TNFR2에 더 높은 수준으로 결합할 것이다. 예를 들어, TNFR1 대비 TNFR2에 대한 결합 강도는 적어도 10, 50, 100, 500, 1000 또는 그 이상의 배수로 높을 수 있다. 일 구현예에서, TNFR1 대비 TNFR2에 대한 결합 강도는 적어도 10,000 또는 적어도 100,000배 이상일 수 있다. 일 구현예에서, 결합 분자는 TNFR1에 전혀 결합하지 않는다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 이의 항체 또는 항체 단편 또는 융합 단백질은, 결합 KD가 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 이하의 값일 경우, TNFR2에 특이적으로 결합하는 것으로 지칭한다. 일 구현예에서, KD 값은 TNFR2를 발현하는 세포, 예를 들어 TNFR2를 발현하는 HeLa 형질감염체를 이용해 측정한다. 바람직한 일 구현예에서, KD 값은 Kums J, Nelke J, Ruth B, SchAfer V, Siegmund D, Wajant H. MAbs. 2017 Apr;9(3):506-520에 기술된 방법을 이용해 결정한다. 그래서, 일 구현예에서, 결합 분자와 리포터 도메인으로서 가우시아 프린셉스 (Gaussia princeps) 루시퍼라제의 융합을 이용해, 상기 Kums 등의 문헌에 언급된 바와 같이 결합 분자의 KD 값을 측정한다. 일 구현예에서, TNFR2를 발현하는 세포주, 예를 들어 표면에 TNFR2를 안정적으로 발현하는 HeLa 또는 HEK293 세포를 이러한 측정에 이용할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 결합해 TNFR2 신호전달을 촉발한다. 일 구현예에서, 제공된 결합 분자, 특히 항체는 TNFR2에 대해 작용제이지만 TNFR1에 대한 작용제인 것은 아니다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 결합하지만 임의의 다른 TNFR 슈퍼패밀리 멤버에는 결합하지 않는다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체이다. 용어 "항체"는 본원에 사용된 바와 같이 전형적으로 chapter 7 of Paul, W.E. (Ed.).: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989 또는 "Periodic 표 of Antibodies" (https://absoluteantibody.com/periodic-table-of-antibodies/)에 일반적으로 기술된 바와 같이, 대상 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는, 임의의 기능성 항체 또는 항체 융합 단백질 또는 항체 단편을 의미하며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에서 항체 언급은 구체적으로 달리 명시되지 않은 한 항체 단편을 망라한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 TNFR2에 특이적으로 결합한다. 항체 언급은 인간에서 확인되는 항체의 자연 생성되는 4개의 체인 구조를 갖지 않은 항체를 비롯하여, 본원에 논의된 다양한 항체 형태들을 모두 망라하며, 예를 들어 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 단쇄 항체이거나 또는 단쇄 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 TNFR2에 결합하는 리간드 기반의 분자와 같은 비-항체 서열을 포함할 수도 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 폴리펩타이드(들), 즉 항체 서열과 비-항체 서열의 융합체, 예를 들어 본원에 언급된 바와 같이 TNC 펩타이드 및 TNF-α 폴리펩타이드 (특히, TNFR2-특이적인 돌연변이, 예컨대 TNF80 (또는 TNF(143N/145R)의 융합체를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 특이적인 임의의 비-항체 결합 부위를 포함하지 않는 항체이다.
본원에 언급된 임의의 항체는 하나 이상의 리간드계 분자, 특히 TNFR2에 특이적인 리간드계 분자를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원은, 분자의 결합가 (valency)가 본원에 기술된 임의의 것을 비롯한 TNFR2에 대해 하나 이상의 리간드계 결합 분자를 함유함으로써 6보다 높을 수 있는, 다양한 6가 항체를 기술한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 임의 항체는 폴리펩타이드의 일부이거나, 폴리펩타이드에 연결되거나 또는 이와 접합된, TNFR2에 대해 하나 이상의 리간드계 결합 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, VHH 도메인을 포함하는 6가 결합 분자는 폴리펩타이드의 일부이거나, 폴리펩타이드에 연결되거나 또는 이와 접합된, 하나 이상의 리간드계 결합 분자를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 결합 분자는 폴리펩타이드 2개를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 일부이거나, 폴리펩타이드에 연결되거나 또는 이와 접합된 리간드 기반의 TNFR2 결합 분자와 함께, CH1 영역이 없는 중쇄 불변 영역, 즉 VHH 도메인 3개를 연속적으로 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 각 중쇄가 폴리펩타이드의 일부이거나, 폴리펩타이드에 연결되거나 또는 이와 접합된 리간드계 TNFR2 결합 분자를 가지도록 변형된다. 일 구현예에서, 결합 분자의 경쇄는 그렇게 변형될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 리간드계 분자를, 즉 폴리펩타이드의 C-말단 절반에서 폴리펩타이드의 일부이거나, 폴리펩타이드에 연결되거나 또는 이와 접합된 리간드계 TNFR2를 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 다양한 4가 결합 분자를 제공하며, 이러한 결합 분자는 "South" 또는 "C-말단" 부분에 TNFR2 결합 부위에 기반한 scFv 또는 기타 항체 대신, 결합 분자는 리간드계 분자를 가진다. 그래서, 예를 들어, 다양한 C4 및 C4 변이체 항원-결합 부위들이 본원에서 기술되며, 본 발명은 "North" 항원-결합 부위가 C4 또는 C4 변이체 항원-결합 부위이고 "South" 항원-결합 부위가 리간드계 TNFR2 항원-결합 분자인, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 항체는 또한 항체의 일부 또는 단편을 포함한다. 예를 들어, 단 본 발명의 항체는, Fc 수용체 및 Fc 영역과 연결된 리간드계 결합 분자와 결합하지 않도록, 변형된 항체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체에 존재하는 리간드계 분자는 TNFR2에 특이적인 TNF에 기반한 리간드, 예를 들어 TNF 프로모터 또는 이의 돌연변이이다. 일 구현예에서, 이는 TNF 삼량체의 단일 체인 버전이다.
결합 분자의 "결합가"는 본원에 사용된 바와 같이 결합 분자가 가진 TNFR2에 대한 결합 부위의 개수를 나타내는 TNFR2의 결합가로서, 결합 분자가 가진 결합 부위의 개수를 나타낸다. 결합 부위의 "특이성"은, 이것이 결합하는 것을 나타내며, 예를 들어, 이는 결합 분자가 결합하는 표적 분자를 나타낼 수 있을 뿐 아니라, 표적이 결합하는 곳 역시 나타내는 것일 수 있다. 항체와 관련하여, 항체의 특이성은 항체가 결합하는 표적을 나타낼 수 있으며, 이는 또한 표적 분자 상에 결합되는 에피토프의 측면에서 항체가 결합하는 항원 상의 위치를 나타내는 데에도 적용될 수도 있다. 결합 분자는 여러가지 표적 분자 (항원들) 상의 에피토프에 결합한다는 의미에서 서로 다른 특이성을 가질 수 있다. 그러나, 결합 분자는 이들이 동일한 표적 분자 (항원) 상의 서로 다른 에피토프에 결합한다는 의미에서 서로 다른 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 이중 특이성 결합 분자는 이것이 2종의 서로 다른 표적 분자에 결합할 수 있다는 의미에서 이중 특이성일 수 있으며, 대안적으로 이것이 동일한 표적 분자, 특히 TNFR2의 2종의 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다는 의미에서 이중 특이성일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자의 모든 결합 부위들이 동일한 표적과 결합할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자가 항체인 경우, 항체의 모든 항원-결합 부위들은 TNFR2의 동일한 에피토프에 결합하는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 각각 TNFR2 상의 서로 다른 표적 부위에 결합하는, 예를 들어 각각 TNFR2의 서로 다른 에피토프를 인지하는 2 이상의 서로 다른 표적 결합 부위를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2의 서로 다른 에피토프에 결합하는 2 이상의 항원-결합 부위를 포함하는 항체이다. 일 구현예에서, 분자의 결합 부위 하나 이상은 TNFR2 이외의 다른 표적에 결합할 것이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 서로 다른 세포 타입의 표적을 인지하는 서로 다른 특이성을 가진 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 특이성은 다른 세포 타입과 함께 TNFR2를 발현하는 세포를 표적으로 가져오는 호밍 엔터티 (homing entity)로서 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합 분자의 혈청 반감기를 바꾸는 표적에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있으며, 예를 들어 일 구현예에서, 이는 혈청 알부민에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 분자의 결합 부위들 중 단 하나는 TNFR2 이외의 다른 것을 표적으로 할 것이다. 일 구현예에서, 이러한 부위가 2개일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 2 이상일 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 또는 그 이상일 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합가가 2일 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 결합가는 3일 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 3중 특이성이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 4 이상의 결합가를 가질 것이다. 그래서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 4가이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합가 4를 가질 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합가 적어도 6을 가질 것이다. 바람직한 구현예에서, 이것은 결합가 6을 가질 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합가 12를 가질 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어, 적어도 2, 바람직하게는 적어도 4의 결합가를 가지므로 다중-특이성이다. 특히 바람직한 구현예는 4가 항체이다. 추가로 특히 바람직한 구현예는 6가 항체이다. 바람직한 6가 항체는 TNFR2 결합 부위가 TNFR2에 특이적인 단일한 도메인 항체 (sdAb)인 것이다. 특히 바람직한 6가 항체는 TNFR2 결합 부위가 TNFR2에 특이적인 VHH 결합 도메인인 것이다. SdAb 및 VHH는 아래에서 추가로 기술한다.
본 발명의 결합 분자의 "결합가"뿐 아니라, 추가의 포인트는 결합 분자의 결합 부위의 배향성/국지성이다. 이는 도 1 및 7에 나타낸 항체 예를 이용하여 가장 잘 고려될 수 있다. 도 1은 오직 "North" 배향성으로만 간주될 수 있는 (N-말단) 단방향으로 배향된 항원-결합 부위를 가진 항체를 도시한다. 예를 들어 일 구현예에서, 이러한 결합 분자는 기존 4쇄 항체의 중쇄 및 경쇄의 N-말단 부분으로 간주되는 위치에 TNFR2에 결합하는 항원-결합 부위를 가진 것으로 간주할 수 있으며, 이는 결합 분자의 폴리펩타이드 N-말단 부분에 위치할 수 있다. 결합 부위의 배향성은 또한 "병렬 (parallel)" 결합 부위와 동일한 배향성을 가진 결합 부위를 지칭하는 것으로 정의할 수 있으며, 예를 들어, 모든 결합 부위가 항체의 N-말단 부분에 또는 모두 항체 체인들의 C-말단 부분에 위치하는 경우, 결합 부위들은 병렬인 것으로 간주할 수 있다. 이러한 결합 부위들은 또한 단방향으로 배향된 것으로 간주할 수 있다. 본 발명의 도 7은 "North"+"South" 배향 또는 "반대" 배향으로서 간주할 수 있는 형태로 듀얼 N- 및 C-말단 항원 결합 부위들을 가진 항체를 도시한다. 일 구현예에서, 이러한 결합 부위는 하나 이상의 평면 또는 하나 이상의 방향으로 항원-결합 부위를 가진 것으로 간주할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 구조체는 항원 결합 부위가 오직 "North" 배향성으로 존재하는 것이며, 그래서 항원-결합 부위는 N-말단이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 HC 및 LC의 가변성 도메인을 대체하는 scFv를 가진 North 구조체, 예를 들어 (scFv-IgG(N297A) 및 scFv-IgG(N297A)-HC:TNC)이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 "North" 및 "South" 배향성 둘다에서 결합 부위를 가질 수 있으며, 그래서 N-말단 위치 및 C-말단 위치 둘다에서 효과적으로 항원-결합 부위를 가진다.
일 구현예에서, "North" 또는 "N-말단" 대면 (facing) 항원-결합 부위는 기존 모노머 IgG 분자의 결합 부위와 동일한 배향성 또는 평면에 있는 것으로 간주할 수 있으며, 특히 기존 IgG 분자의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 N-말단 부분으로 통상적으로 간주될 것이다. 일 구현예에서, "South" 또는 "C-말단" 대면 항원 결합 부위는 기존 모노머 IgG 분자가 항원 결합 부위를 가지지 않는 배향성 또는 평면에 있는 것으로 간주할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 배향성은 기존 모노머 IgG 분자에서 Fab 서브도메인 (VH+VL) 도메인과는 반대이며, 따라서 항원 발현 세포의 이웃 세포로 향하는 Fc 도메인 C-말단에 TNFR2 결합 도메인을 가진다. 이러한 결합 부위는 항체에서 Fab 도메인의 "정상" 배향성과는 반대로 놓인 것으로 볼 수 있다. 도 1에 도시된 6량체 IgG 분자는 6량체의 위 및 아래에 항원-결합 부위를 가지지만, "North" 및 "South" 또는 "반대" 배향된 항원-결합 부위를 가진 것으로 간주하지 않는데, 그 이유는 항원-결합 부위들 모두, 예를 들어 기존 IgG 분자의 C-말단 부분으로 간주될 위치에서 항원-결합 부위를 가지지 않는다는 의미에서, 기존 모노머 IgG 분자와 동일한 포맷으로 존재하기 때문이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체를 구성하는 폴리펩타이드의 N-말단 엔드에 항원 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체의 폴리펩타이드 체인들의 N-말단과 C-말단 양쪽에 항원 결합 부위를 가진다는 의미에서 항체일 수 있다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 대해 N-말단 ("north") 결합 부위 2개 및 C-말단 ("south") 결합 부위 2개를 가진 4가 항체이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 각 경쇄의 C 말단에 scFv를 가진 IgG이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 항체는 각 중쇄의 C 말단에 scFv를 가진 IgG이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 항체는 각 중쇄의 C-말단과 각 경쇄의 C-말단에 scFv를 가진 IgG이며, 그래서 이 항체는 6가이다.
바람직한 일 구현예에서, 이용되는 결합 분자는 개개 서브유닛들로 구성된 다량체 (multimer)이다. 예를 들어, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 2량체이다. 본 발명의 일 구현예에서, 2량체는 scFv-Fab 분자 2개로 된 형태이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 삼량체이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 6량체이다. 일 구현예에서, 이용되는 결합 분자는 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 이용되는 결합 분자는 항체, 즉 항체 융합 단백질 6량체일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 6량체를 구성하는 개개 IgG 분자의 중쇄는 RGY 펩타이드 모티프를 포함하고, 특히 이의 C-말단에 포함할 수 있다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 중쇄에, 특히 Fc 꼬리에 RGY 모티프의 돌연변이, 즉 E345R/E430G/S440Y를 포함한다. RGY 모티프는 예를 들어, Jong et al (2016) PLOSBiology |DOI:10.1371/journal.pbio.1002344에 기술되어 있으며, 또한 RGF 모티프 및 6량체 형성에서의 이의 용도와 관련하여 구체적으로 기술된 바 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.
전형적으로, 본 발명의 결합 분자가 다량체 또는 더 작은 단위들의 조립체를 포함하는 경우, 이는 여전히, 예를 들어 IgG 및 scFv와 같은 항체로 각각 간주할 수 있는 서브유닛을 수개 포함할 수 있더라도, 본 발명의 "결합 분자" 또는 "항체"로 간주될 것이다. 그래서, 예를 들어, 본 발명의 "항체"는 본 발명의 전체 "항체"의 일부분으로서 항체 단편 또는 단편을 포함할 수 있다. 아래에서 기술한 바와 같이, 이는 TNFR2에 대한 리간드, 예를 들어 TNF-α 및 구체적으로 TNF80 및 기타 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이와 같은 다른 엔터티 (entity)를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 특정 포맷들 모두 TNFR2에 대한 리간드를 추가로 포함하도록 변형될 수 있다.
항체 6량체는 본 발명의 일 구현예이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 E345 위치에 적어도 중쇄 변형, 특히 E345R을 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 E430 위치에 중쇄 변형, 특히 E430G를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 S440에 중쇄 변형, 특히 S440Y를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 E345 및 E430 위치에 중쇄 변형, 특히 E345R 및 E430G를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 E345, E439 및 S440 위치에 중쇄 변형, 특히 E345R, E439G 및 S440Y를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 이러한 변형을 포함하고, IgG 단위들로 된 6량체를 포함할 것이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 TNFR2에 결합하면 온-타겟 6량체화를 이행하게 될 것이다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 삼량체화를 유도하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예로는 콜라겐, 루신 지퍼, R4 피브리틴 및 TRAF 패밀리 구성원의 삼량체화 도메인으로부터 유래한 삼량체화 도메인을 포함한다. 본 발명의 결합 분자는 일부 구현예에서, 이러한 삼량체화 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 이러한 도메인의 존재로 인해 삼량체를 포함하거나 또는 삼량체일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 삼량체화 서열은 테나신-C (TNC)으로부터 유래한 것일 수 있다. 그러나, TNC가 삼량체화 서열을 지칭하는 본원에 기술된 임의 구현예에서, 일반적으로 예를 들어 단지 TNC가 아닌 본원에 언급된 구체적인 임의의 서열도 이용 가능하지만, 바람직한 구현예에서, TNC를 이용한다. 바람직한 일 구현예에서, 이용되는 TNC 서열은 닭 TNC로부터 유래한다. 다른 바람직한 구현예에서, 이는 포유류 TNC로부터 유래한다. 추가의 바람직한 구현예에서, TNC는 인간 TNC이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNC를 포함하지 않는다.
다른 바람직한 구현예에서, 테나신-C (TNC) 삼량체화 도메인을 이용해 개개 항체 또는 다른 서브유닛을 다량체로 조립할 수 있다. 그래서, 결합 분자, 특히 본 발명의 항체는 서열번호 2에서와 같이 TNC 삼량체화 도메인 펩타이드를 포함할 수 있다. 이는 변이체 TNC 펩타이드, 예를 들어 서열번호 2에 대해 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 서열 변형을 가지되 여전히 다량체를 형성할 수 있는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 항체 중쇄의 C-말단이 TNC 펩타이드 서열을 포함하거나 또는 이와 연결된다. 일 구현예에서, 이러한 방식을 이용해 항체, 서브유닛 항체 및/또는 리간드와 같은 개개 TNFR2 결합 모이어티들의 삼량체를 달성한다. 본원에 기술된 임의의 결합 분자는, 달리 언급되지 않은 한, 개개 단위들을 연합하는 방식으로, 구체적으로 다량체를 형성하는 방식에서와 같이, TNC 펩타이드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 FcγR 독립적인 TNFR2 작용제이다. 예를 들어, 결합 분자가 항체인 경우, 항체에는 Fc 영역이 없으며, 그래서 그 영역에 대해 FcγR 결합은 이루어지지 않는 것일 수 있다. 대안적으로, 다른 구현예에서, 항체는 Fc 영역을 가지지만, FcγR에 결합할 수 없도록 변형된 것일 수 있다. 이를 달성하기 위해 이용 가능한 다양한 Fc 변형들이 본원에서 언급된다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 항체로부터 선택되는 항체이거나, 또는 이러한 항체를 포함할 것이다. 이는 Fc γ 수용체 독립성을 부여하는 본원에 언급된 Fc 변형을 포함할 수 있다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 이는 IgG 항체이거나 이를 포함할 것이거나, 또는 이러한 항체를 포함할 것이다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 이는 IgG1 항체이거나 또는 이러한 항체를 포함할 것이다. 항체는 IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체일 수 있거나, 또는 이러한 항체를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일 도메인 항체, 예를 들어 VHH 단일 도메인 항체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 이러한 dAb, 특히 VHH를 적어도 2 이상 포함할 것이다.
바람직한 구현예에서, 제공된 결합 분자는 TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제공된 결합 분자는 FcγR 비의존적인 TNFR2 작용제이다. 결합 분자는 TNFR2 결합에 대한 결합가가 2 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자의 결합 부위는 TNFR2에 결합하는 항체, 항원-결합 부위 및 리간드로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체이거나 또는 항체의 적어도 일부를 포함한다. 본원에 정의된 바와 같이, 항체는 항원-결합 부위를 포함하는 다양한 포맷들을 포함하지만, 자연 생성 항체 포맷인 것은 아니다. 항체가 반드시 전체 (whole) 항체이어야 하는 것은 아니며, 예를 들어 본 발명의 항체는 Fab2 항체 단편과 같은 항체 단편이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 항체 단편을 포함할 수 있으며, 예를 들어 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체의 일부로서 Fab 또는 scFv 단편에 의해 제공되는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 단쇄 항체이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
항체 언급은 항체 기반의 서열로부터 자체 기원한 것이 아닌 모이어티를 포함하거나, 이와 연결되거나 또는 이와 접합된 항체 분자를 포괄한다. 그래서, 예를 들어, 본원에서 항체 언급은 TNFR2 리간드 또는 TNFR2 리간드의 변형된 버전과 연결되거나 또는 접합된 항체를 포함한다. 채택될 수 있거나 또는 채택되도록 변형될 수 있는 TNFR2 리간드에 대한 예로는 TNFα 및 LTα 뿐 아니라 이들의 변이체 등이 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 다량체 형성을 유도하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열 한가지 예는, 본 발명의 항체가 예를 들어 다량체화를 유도하는 RGY 돌연변이를 포함함으로써 다량체화를 유도하는 서열을 가진 중쇄를 포함하는 것일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 이는 6량체화를 유도하기 위한 RGY 변형을 포함하는 FC 꼬리 조각이다. 다른 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 중쇄 C-말단에 테나신-C 삼량체화 도메인 펩타이드 서열 (TNC)을 포함할 수 있다. 그래서, 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 서열번호 2로서 제공되는 테나신-C로부터 유래한 펩타이드 서열 또는 다량체화를 여전히 유도할 수 있는 변이체 TNC 펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 삼량체화를 유도하는 인간 TNC 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 본원에 언급된 구체적인 임의의 것과 같은 삼량체화 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 TNFR2 결합 분자의 결합 부위들 모두 항체 항원-결합 부위일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 결합하는, TNFR2에 대한 하나 이상의 항체 항원-결합 부위 및 하나 이상의 리간드 또는 리간드 유도체를 포함하며, 다시 말해 이는 이러한 결합 부위들의 혼합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대한 리간드계 결합 부위를 추가로 포함하는 항체를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 리간드 기반의 TNFR2 결합 부위를 포함하지 않는다. 결합 분자가 항체이거나 또는 항체를 포함하는 구현예들에서, 항원-결합 부위는 일반적으로 CDR 6개, 즉 경쇄 가변 영역 CDR 3개 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR2) 및 중쇄 CDR 3개 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)를 포함할 것이다. 그러나, 아래에서 추가로 기술한 바와 같이, 본 발명의 결합 분자는 특히 TNFR2에 대해 VHH 결합 도메인 및 기타 단일 도메인 결합 물질을 포함할 수 있다. 이러한 VHH 도메인은 CDR 3개, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다. 본 발명은 TNFR2에 대한 항원-결합 부위에서 본원에 기술된 CDR 6개 또는 3개로 된 임의의 특정 세트를 가진 결합 부위를 포함하는 결합 분자를 제공한다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 본원에 기술된 VH 및 VL 영역들의 임의 쌍을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 이는 본원에 기술된 임의의 VHH를 포함하거나 또는 이로 이루어진 결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 특이적인 서열은 본 발명의 표에 기술되어 있다. 이러한 CDR 세트는 서열번호를 들어 본원에 언급된다. 이러한 CDR 세트, VL과 VH 쌍 또는 VHH 도메인은 도면에서 도시되고 실시예에서 채택된 것을 비롯하여, 본원에 기술된 임의 구조로 사용될 수 있다. 본원에 기술된 구체적인 임의 서열에 대한 변이체 서열도 채택될 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 항체의 항원 결합 부위 및 리간드계 결합 부위는 서로 다른 배향성 (orientation)으로 놓이며, 그리고 이들 2개는 반대되는 배향성으로 놓일 수 있으며, 예를 들어 항원-결합 부위는 "North" 배향성으로, 리간드계 결합 부위는 "South" 또는 "반대" 배향성으로 놓일 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 "North" 및 "South" 배향성 양쪽으로 놓인 항체 항원-결합 부위를 가질 수 있으며, 그러나 리간드계 결합 부위는 단 한가지 배향성으로 놓일 수 있으며, 예를 들어 "South" 배향성으로만 놓일 수 있다. "North" 및 "South"는 항원 결합 부위가 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 부분에 존재하는지를 나타낸다. 그래서, 기존 항체에서는, 예를 들어 항체의 가변 영역에 의해 제공되는 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 N-말단 부분에 위치한다. 이와는 대조적으로, 본원에서 제공하는 결합 분자들 중 일부는, 항원 결합 부위가 폴리펩타이드의 C-말단 엔드에 위치하거나 또는 쪽으로 위치한, 예를 들어 scFv가 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드의 C-말단 부분이거나 또는 이와 연결된, 항체이다. 일부 결합 분자는 N-말단 및 C-말단 양쪽에 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, "North" 배향된 결합 부위만 가진 항체를 이용한다. 본 발명의 도 1은 바람직한 TNFR2 결합 분자에 대한 예시적인 예와 결합가가 1이며 그래서 그 자체로는 본 발명의 결합 분자가 아닌 Fab를 도시한다.
도면, 특히 도 1, 7, 24, 29, 40 및 41에 도시된 포맷에서, 구조들은 부모 TNFR2-특이적인 IgG 분자를 지칭하는 "CI" 또는 "클론 식별자"와 함께 표시되고, 클론 식별자는 IgG 항원-결합 부위의 CDR이 실시예에 기술된 어느 클론에서 기원한 것인지를 표시한다. 본원에 이러한 구조가 클론 식별자의 사용 없이 언급된 경우에는, 그 구조는 구체적인 클론을 지칭하는 것으로 제한되지 않으며, 즉 CDR이 실시예의 특정 클론으로부터 유래한 것으로 제한되지 않으며, 항원-결합 부위들은 임의의 적합한 TNFR2 항체로부터 유래할 수 있다. 그래서, 예를 들어, scFv-C4-IgG1(N297A)은 클론 4에 대한 클론 식별자 (CI)를 포함하지만, scFv-IgG1(N297A)는 항원-결합 부위가 특정 클론의 서열로 제한되지 않는 이러한 포맷을 가진 결합 분자를 지칭한다. 본원에 특정 클론과 관련하여 기재된 임의의 포맷의 경우, 본원에 제공된 다른 항원-결합 부위들 중 하나가 대신 채택될 수 있으며, 그 포맷은 특정 클론으로 제한되지 않는 경우에도 또한 제공된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 결합 분자에서, C4 및 C4 변이체 CDR, CDR 세포, 가변 영역 및 가변 영역들의 쌍 (표 10 참조)이 바람직한 구현예로서, 채택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 하기로부터 선택된다:
i. 양쪽 특이성이 TNFR2에 특이적인 Fab2 항체.
ii. Fc 수용체를 활성화하지 못하며, 특히 FcγR에 결합하지 않는 Fc 영역을 포함하는 IgG 항체. 이 분자의 양쪽 결합가는 TNFR2에 특이적이고, "North" 배향성인 것으로 볼 수 있다. 일 구현예에서, 항체의 Fc 영역은 본원에 언급된 임의의 특이적인 변형 등의 Fc 수용체에 결합하지 않는 것을 의미하는 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 IgG1 항체이다. 바람직한 구현예에서, 이는 도 1에 나타낸 포맷 IgG1(N297A), 비-제한적으로 특정 클론을 가진다.
iii. TNFR2에 특이적이고 모두 "North" 배향된 항원-결합 부위 4개를 포함하는, 4가 항체 분자로서, 여기서 항체는 각 중쇄 및 경쇄가 N 말단에서 이와 연결된 항원-결합 부위를 가지도록 변형된 IgG 분자의 기본 구조를 가진, 4가 항체 분자. 일 구현예에서, 각각의 항원-결합 부위는 기본 4쇄 IgG 구조의 경쇄 또는 중쇄에 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 쌍 (scFv 도메인)을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는, 항체 쇄의 각 N-말단이 이와 연결된 scFv를 가진, 기본 IgG 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 항체는 전형적으로 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 FcγR 결합을 방지하거나 또는 낮추는 본원에 언급된 임의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 도 1에 나타낸 포맷 scFv-IgG1(N297A)를 가지나, 특정 클론으로부터 기원한 서열로 한정되는 것은 아니다.
iv. IgG 항체 서브유닛 3개로 된 다량체이며, 각 IgG 서브유닛의 Fc 영역이 FcγR에 결합하지 못하는, 결합가 6의 항체. 항원-결합 부위 6개 모두 "North" 배향성인 것으로 간주될 수 있다. 일 구현예에서, Fc 영역은, 본원에 개시된 임의 변형 등의 변형을 포함하므로, Fc γ-수용체 군에 결합하지 못한다. 다른 구현예에서, Fc 영역은 N297A 변형을 포함한다. 임의의 적합한 방법을 이용해, 개개 IgG 서브유닛들로 이루어진 다량체를 형성할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 서브유닛들은 테나신-C 펩타이드 (TNC)를 이용함으로써, 특히 서열번호 2의 펩타이드 서열 등의 TNC 유래 펩타이드의 존재 하에 연합된다. 예를 들어, 일 구현예에서, IgG 서브유닛의 중쇄들은 테나신 펩타이드를 포함하거나 또는 이와 연결되고, 테나신 펩타이드의 연합은 다량체 조립으로 이어진다. 바람직한 구현예에서, 펩타이드는 서열번호 2의 서열 또는 여전히 다량체를 형성할 수 있는 변이체 서열을 가진다. 일 구현예에서, 항체는 도 1에 나타낸 포맷 IgG1(N297A)-HC:TNC를 가지지만, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
v. 서브유닛 3개로 된 다량체로서 결합가 12의 항체. 일 구현예에서, 서브유닛은, 가변 영역이 각각 TNFR2에 특이적인 scFv로 치환되고 항원 결합 부위들 모두 "North" 대면으로서 간주될 수 있는, IgG 구조를 포함하며, 예를 들어 scFv-IgG1(297A)-HC:TNC를 포함한다. 항체는 Fc 수용체에 결합하지 못하며, 일 구현예에서, 이는 Fc 영역이 결합하지 못하도록 변형되었으므로 FcγR에 결합하지 않으며, 예를 들어 본원에 언급된 임의 변형이 적용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, N297A 변형이 적용된다. 임의의 적합한 방법을 이용해 서브유닛 3개를 함께 조립할 수 있으며, 일 구현예에서, TNC 삼량체화 도메인이 이용된다. 바람직한 구현예에서, 각 중쇄의 C 말단이 서열번호 2 등의 Fab2 또는 IgG 수개를 다량체화하기 위해 TNC 삼량체화 도메인을 포함하거나 또는 이와 연결된다. 일 구현예에서, 항체는 도 1에 나타낸 포맷 scFv:IgG1(N297A)-HC:TNC를 가지지만, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
vi. 6량체 IgG 항체. 전형적으로, 항체의 항원 결합 부위들 모두 TNFR2에 특이적이며, 즉 항체 결합가가 12이다. 각 개별 IgG 서브유닛의 Fc 영역은 FcγR에 결합하는 것을 방지하는 변형을 가진다. 본원에 언급된 임의 변형이 적용될 수 있으며, 바람직한 일 구현예에서, 변형은 N297A이다. 온 표적 또는 오프 표적에서 6량체화를 달성하기 위한 임의의 적절한 방법이 채택될 수 있다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 개개 IgG 서브유닛의 각 중쇄는 6량체화를 허용하기 위해 RGY 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 도 1에 나타낸 RGY 돌연변이 + N297A 돌연변이 (IgG1(N-RGY)를 가지며, 그래서 Fc 수용체 결합을 방지하는 돌연변이와 6량체화를 달성하는 돌연변이를 둘다 가진다. 그래서, 일 구현예에서, 결합 분자는 도 1에 나타낸 포맷 IgG1(N-RGY)를 가지지만, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
바람직한 일 특정 구현예에서, 결합 분자는 상기 (iii) 내지 (vi)에 언급될 것들 중 하나이다. 다른 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 4가 결합 분자이며, 예를 들어 (iv)에 언급된 4가 결합 분자이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 결합가가 12인 것이며, 예를 들어 상기 (v) 및 (vi)에 언급된 것으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 병렬 배향된 체인들 (Fc, IgG, Fc-TNC, TNC-Fc, IgG-TNC)을 가진 항체 스캐폴드에 N-말단 및 C-말단 양쪽에 결합 부위가 배치된 항체를 이용한다. 그래서, 결합 부위들이 "반대" 방향으로 배향된 항체를 이용한다. 본 발명의 도 7은 "반대" 배향성으로 간주될 수 있는 결합 부위들을 가진 특히 바람직한 TNFR2 결합 분자에 대한 예시적인 예들을 보여준다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 아래 언급한 군으로부터 선택된다:
i. TNFR2에 대한 Fab 및 scFv의 결합 부위들의 배향성이 반대 배향성이고 따라서 scFv와 연결된 Fab 영역을 포함하고, scFv 도메인이 LC의 C-말단 또는 절단된 (truncated) HC에 연결된, 항체. 바람직한 구현예에서, scFv는 Fab의 경쇄 C-말단에 연결된다. 그래서, 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 도 7에 나타낸 포맷 Fab-LC:scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
ii. 항체, 즉 각 중쇄 C-말단에 부착된 scFv와 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 Fc 영역을 가진, IgG 분자. Fc 영역은 Fc 결합을 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형, 특히 N297A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 도 7에 나타낸 포맷 IgG1(N297A)-HC:scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
iii. 항체, 즉, 각 경쇄 C-말단에 부착된 scFv와 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 Fc 영역을 가진, IgG 분자. Fc 영역은 Fc 결합을 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형, 특히 N297A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 도 7에 나타낸 포맷 IgG1(N297A)-LC:scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
iv. 항체, 즉 각 경쇄와 중쇄의 C-말단에 부착된 scFv 및 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 Fc 영역을 가진, IgG 분자. Fc 영역은 Fc 결합을 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형, 특히 N297A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 도 7에 나타낸 포맷 IgG1(N297A)-LC:scFv-HC:scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
v. 항체, 즉 경쇄 및 중쇄 가변 영역들이 각각 TNFR2-특이적인 scFv로 치환되도록 변형되고 IgG 분자의 중쇄가 각각 이와 연결된 TNFR2-특이적인 scFv를 가진, IgG 분자. 그래서 이러한 항체는 TNFR2에 대한 결합가가 6이다. 항체의 Fc 영역은 이것이 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 것이다. Fc 영역은 Fc 결합을 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형, 특히 N297A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 도 7에 나타낸 포맷 LC:scFv-HC:scFv-IgG1(N297A)-HC:scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
vi. 항체, 즉 경쇄 및 중쇄 가변 영역들이 각각 scFv로 치환되도록 변형되고 IgG 분자의 경쇄가 각각 연결된 scFv를 가진, IgG 분자. 그래서 이러한 항체는 TNFR2에 대한 결합가가 6이다. 항체의 Fc 영역은 이것이 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 것이다. Fc 영역은 Fc 결합을 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형, 특히 N297A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 도 7에 나타낸 포맷 LC:scFv-HC:scFv-IgG1(N297A)-LC:scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
vii. 항체, 즉 경쇄 및 중쇄 가변 영역들이 각각 scFv로 치환되도록 변형되고 IgG 분자의 경쇄 및 중쇄가 각각 연결된 scFv를 가진, IgG 분자. 그래서 이러한 항체는 TNFR2에 대한 결합가가 8이다. 항체의 Fc 영역은 이것이 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 것이다. Fc 영역은 Fc 결합을 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형, 특히 N297A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 도 7에 나타낸 포맷 LC:scFv-HC:scFv- IgG1(N297A)-LC:scFv-HC:scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
viii. 중쇄 C-말단에 테나신-C (TNC) 삼량체화 펩타이드를 포함하고 각 테나신 펩타이드가 scFv와 이의 C-말단을 이용해 연결된, 개별 IgG 항체 분자 3개를 포함하는, 다량체. 항체 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 12이다. 항체의 Fc 영역은 이것이 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하지 않도록 변형된 것이다. Fc 영역은 Fc 결합을 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형, 특히 N297A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 도 7에 나타낸 포맷 IgG1(N297A)-HC:TNC-scFv의 것이나, 특정 클론으로부터 유래한 서열로 제한되는 것은 아니다.
상기에서 언급된 바와 같이, 도 1에 나타낸 상기에 언급된 포맷들이 제공되지만, 이는 특정 클론으로부터 기원한 서열로 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 또한 실시예에 제공된 특정 클론의 서열 또는 본원에 언급된 변이체 서열을 가진 특정 포맷을 제공한다. 일 구현예에서, Fc 영역을 가진 포맷들에서, 중쇄는 N297A 변형뿐 아니라 본원에 언급된 중쇄 변형, 예를 들어 본원에 언급된 DANA 변형을 포함한다.
바람직한 일 특정 구현예에서, 본원에 제공된 C4 클론 또는 C4 클론의 특이적인 변이체 하나로부터 기원한, CDR 6개로 된 세트 또는 VL 및 VH 서열이 도 1 및 7에 나타낸 포맷들 중 하나에 채택된다. 이들은 또한 도 29에 나타낸 포맷에도 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 표 5에 나타낸 CDR 6개로 된 임의 세트 또는 표 6에 나타낸 가변 영역 쌍은 본원에 언급된 임의 포맷에, 특히 도 1 및 7에 나타낸 포맷에 채택될 수 있다. CDR 세트 변이체 또는 가변 영역 쌍의 변이체 역시 본원에 추가로 기술된 바와 같이 채택될 수 있다. 채택하기 특히 바람직한 CDR들, CDR 세트 및 가변 영역은 본원에 언급된 C4 및 C4 변이체에 대해 언급된 것이다.
바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 다음과 같은 포맷들 중 하나로부터 선택되는 항체이며, 괄호 안에 포맷의 일부 장점을 언급한다:
ㆍ Fab1 - scFv (높은 조직 침투성, 짧은 수명);
ㆍ IgG - HC:scFv (다양한 항체 검사, 이중 특이성 변이체의 구축 용이성);
ㆍ scFv - IgG (이중 특이성 변이체의 구축 용이성);
ㆍ IgG -TNC (경로 식별에 잠재적으로 유용함); 및
ㆍ scFv - IgG -TNC (고 활성의, 이중 특이성 변이체의 구축 용이성).
상기에서 IgG를 언급하는 바람직한 일 특정 구현예에서, IgG1이 채택된다. 대안적으로, 다른 구현예에서, 특정 포맷에서 IgG1이 언급되는 경우, IgG가 임의의 IgG 서브타입일 수 있는 동일한 포맷 역시 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는
(a) 항체의 하나 이상의 중쇄의 N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 포함하거나; 및/또는
(b) 항체의 하나 이상의 경쇄의 N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 포함하는, 항체이다.
바람직한 일 구현예에서, 결합 분자는 결합 분자의 중쇄 C-말단 부분에 scFv를 포함하고, scFv가 TNFR2와 결합한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 분자에서 경쇄 C-말단 부분에 scFv를 포함한다.
바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, 중쇄 C-말단 부분이 TNFR2에 특이적인 리간드를 가지거나, 이와 연결되거나 또는 이와 접합된, Fc 영역을 단지 포함하는, 항체이다. 일 구현예에서, 각 중쇄는 중쇄의 C-말단 부분에 존재하는 이러한 리간드를 3개 가진다.
바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 C-말단 TNC 삼량체화에 이어 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이, 특히 TNF80을 가진 항체 또는 Fc 영역이다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드는 TNF80 단위 3개 등의 삼량체를 형성할 수 있는 TNF-α 서열을 3개 포함하는 단쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 공간적으로 유동적인 C-말단 및 N-말단에 위치한 항원-결합 부위를 가진 2가이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 TNFR2에 특이적인 Fab를 포함하는 2가 항체로서, 여기서 항체의 Fab 영역의 중쇄 또는 경쇄는 TNFR2에 특이적인 scFv를 포함한다. 이러한 소분자가 가진 한가지 이점은 높은 조직 침투성을 보일 수 있다는 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 항체는 Fab 경쇄와 연결된 scFv를 포함할 수 있으며, 예를 들어 이들 2개는 동일한 폴리펩타이드의 일부이다. 바람직한 일 구현예에서, 항체는 도 7에 도시된 바와 같은 Fab-LC:scFv 포맷을 취하지만, 본 실시예에 제공된 클론으로부터 유래한 서열로 제한되지 않으며, TNFR2에 대한 항체로부터 유래한 임의의 적정 서열일 수 있다. Fab 및 scFv 도메인은 이러한 구현예에서, 예를 들어 동일한 또는 서로 다른 TNFR2 에피토프를 인지할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 4가이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 포맷 Fab-HC-scFv로 존재하고, 여기서 항체는 Fc 수용체 결합을 제거하거나 또는 낮추는 Fc 영역 변형을 포함하고, 항체는 각 중쇄 C-말단 엔드에 scFv를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 항체는 포맷 Fab-HC-scFv로 존재하고, 여기서 항체는 TNFR2에 대해 서로 다른 2개의 특이성을 가진다는 의미에서 이중 특이적이다. 예를 들어, 바람직한 일 구현예에서, 존재하는 scFv는 IgG의 항원-결합 부위와는 다른 에피토프에 결합한다. 대안적인 구현예에서, TNFR2 결합 부위들 모두 TNFR2의 동일한 에피토프를 인지한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 포맷 scFv:IgG로 존재하며, 여기서 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단 부분에 scFc를 포함하도록 변형된 것이고, 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체에 결합하지 않도록 변형된 것이다. Fc 결합성을 낮추거나 또는 제거하는 본원에 언급된 임의의 변형이 적용될 수 있다. 이러한 항체는, 중쇄 폴리펩타이드 상에 발현되는 scFv가 TNFR2의 에피토프에 결합할 수 있으며 경쇄의 것이 TNFR2의 다른 특이성을 가진다는 의미에서 이중 특이성일 수 있다. 대안적인 구현예에서, scFv 영역들 모두 TNFR2의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 6가이다. 일 구현예에서, 항체는 포맷 IgG-LC:scFv-HC:scFv로 존재하고, 또한 Fc 수용체에 결합하지 않도록 변형된 Fc 영역, 예를 들어 Fcγ 수용체에 대한 결합성을 제거 또는 낮추는 본원에 언급된 임의의 Fc 변형을 가진다. 바람직한 구현예에서, IgG는 IgG1이다. 다른 바람직한 구현예에서, 항체는 6가이며, 여기서 각 중쇄는 C-말단 부분에 TNF-α의 삼량체 또는 이의 변이체가 연결된, 항체 Fc 영역을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 12가이다. 바람직한 일 구현예에서, 12가 결합 분자는, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들이 scFv 분자로 치환된 개개 항체 서브유닛 3개로 이루어진 다량체이다. 바람직한 구현예에서, 각 항체의 중쇄가 TNC의 삼량체화 도메인을 포함하는 테나신-C 펩타이드를 C-말단에 포함하므로, 항체 서브유닛 3개가 연합된다. 결합 분자는 Fc 수용체에 결합하지 않을 것이며, 바람직한 구현예에서, 본원에 언급된 임의의 변형을 가진 Fc 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 IgG 분자 6개를 포함하는 헥사바디일 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 IgG 항체 6개로 된 헥사바디일 수 있으며, 여기서 Fc 영역들은 RGY HexaBody 돌연변이를 포함하고, 또한 Fc 수용체에 결합하지 않는 것을 의미하는 변형, 예를 들어 본원에 언급된 임의의 특정 변형을 포함한다. 바람직한 구현예에서, IgG는 IgG1이다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 4 또는 12이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 포맷 scFv-IgG(*)-HC-TNC 및 scFv-IgG(*)로부터 선택되는 항체이고, 여기서 *는 Fc 수용체 결합성을 없애거나 또는 낮추는 Fc 영역 변형을 의미한다. 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자의 IgG 부분은 IgG1이다. HC-TNC는 IgG의 중쇄가 테나신 펩타이드, 예를 들어 서열번호 2의 펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 포맷 scFv-IgG(*)-HC-TNC, scFv-IgG(*) 및 IgG(*)-HC:RGY로부터 선택되는 항체이다. IgG(*)-HC:RGY 포맷의 경우, 재차 분자의 바람직한 IgG 부분은 IgG1 항체이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 세포의 표면 상에서 TNFR2 분자들의 6량체 포맷 또는 적어도 6량체를 달성할 수 있을 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2 수용체에 cis로 결합할 수 있으며, 즉 동일한 세포의 표면에서 TNFR2 수용체 여러 개에 결합한다. 일 구현예에서, 결합 분자는 동일한 세포의 표면에서 TNFR2의 6량체 포맷을 적어도 달성할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2 분자에 trans로 결합할 수 있으며, 즉 결합 분자는 한 세포의 표면 상의 하나 이상의 TNFR2 분자와, 그리고 다른 세포 표면 상의 하나 이상의 TNFR2 분자와 결합한다. 일 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 cis 및 trans로 결합할 수 있다. 예를 들어, 이는 그렇게 이행하는 능력을 가질 수 있으며, 다른 구현예에서, 이는 실제 그렇게 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, trans 결합이 이루어지면 양쪽 세포 상에서 TNFR2의 6량체 포맷을 형성하게 된다. 일 구현예에서, 결합 부위들의 배향성은, 항체가 TNFR2에 cis 및/또는 trans 방식으로 결합하는지에 영향을 미칠 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 서로 반대되는 배향성을 가진 2 이상의 TNFR2 결합 부위를 가진 것이고, 바람직하게는 결합 분자는 항체 항원-결합 부위인 상기한 TNFR2 결합 부위를 적어도 2개 가진다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 서로 다른 세포 상의 TNFR2에 결합하여 trans-결합을 허용할 수 있는 2 이상의 TNFR2 결합 부위를 가진 것이며, 바람직하게는 결합 분자는 항체 항원-결합 부위인 상기한 TNFR2 결합 부위를 적어도 2개 가진다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합가가 4 이상이고, 동일 세포의 표면에서 서로 다른 TNFR2 분자 여러 개에 결합할 수 있으며, 바람직하게는 결합 분자는 결합가가 6 이상이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 다이아바디일 수 있다. 다이아바디는 전형적으로 소형 2가 항원-결합성 항체 부분이고, 사용될 수 있는 다양한 다이아바디 포맷들이 있으며, 예를 들어 다이아바디는 동일한 체인에서 2개의 도메인 간의 쌍 형성을 허용하기에는 매우 짧은 펩타이드 링커에 의해 연결된, 동일 폴리펩타이드에서 경쇄 가변성 도메인과 연결된 중쇄 가변성 도메인을 포함할 수 있다. 그래서 다른 체인의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하여, TNFR2에 대한 항원 결합 부위가 2개인 이량체 분자로 조립된다.
매우 다양한 항체 포맷들이 있으며, 본 발명의 항체로서 또는 이의 일부로서 이용될 수 있으며, 예를 들어 Fab, Fv, scFv, (ScFv)2, (ScFv2), 이중 특이성 (scFv2), 트리아바디, 테트라바디, 이중 특이성 sc(Fv)2, 탠덤 다이-scFv, 탠덤 트리-scFv 및 트리바디 (tribody) 모두 본 발명에서 가능한 항체 포맷이다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 결합 분자는 결합가가 2 이상이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 2개의 공간적으로 이동가능한 잠재적인 세포-세포 연결성 TNFR2 결합 부위, 또는 적어도 6개의 "병렬" 또는 "단방향으로" 배향된 cis-작용하는 결합 부위들을 가진 결합가를 가진다. 본원에 언급된 포맷이 결합가 1인 구현예에서, 이는 전체 항체로서가 아닌 본 발명의 항체의 일부로서 상기한 포맷으로 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 언급된 TNFR2에 특이적인 결합 부위들 중 하나를 포함하는 대신, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합 부위 변이체를 포함할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, TNFR2에 대한 결합 분자 변이체는 본원에 언급된 TNFR2에 특이적인 결합 분자들 중 하나가 TNFR2에 결합하는 것을 교차 차단하는 능력에 의해 정의될 것이다. 교차 차단하는 능력은 결합 분자가 TNFR2에 결합하는 결합성을 측정하는 결합 분석을 이용해 평가할 수 있으며, 추가의 결합 분자에 대해 이러한 TNFR2에 대한 결합을 교차 차단하는 능력을 평가할 수 있다. 일 구현예에서, 교차 차단하는 능력은 TNFR2에 대한 결합 부위를 단 한 카피 포함하는 1가 분자를 이용하여 검사한다. 예를 들어, 결합 부위를 포함하는 scFv가, 본원에 언급된 특이적인 결합 분자들 중 하나로부터 유래한 TNFR2 결합 부위를 가진다는 점에서만 상이한 scFv를 교차 차단하는 능력을 검사한다. 다른 구현예에서, 실제 결합 분자가 서로 교차 차단하는 능력을, 이를 scFv 분자로 변환하지 않고, 조사한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFα가 TNFR2에 결합하는 결합성을 차단하거나 또는 낮출 수 있을 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 림포톡신-α가 TNFR2에 결합하는 결합성을 차단하거나 또는 낮출 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체에서 TNFR2에 대한 결합 도메인의 친화성은 KD 약 400 nM 이하, 200　nM 이하, 예를 들어 약 100 nM, 50　nM, 20　nM, 10　nM, 1　nM, 500　pM, 250　pM, 200　pM, 100　pM 또는 그 미만이다. 일 구현예에서, 결합 친화성은 50　pM 이하이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자에서 개별 TNFR2 결합 부위는 결합 분자에 대한 전체적인 친화성 (overall affinity)이라기 보다는 이러한 TNFR2에 대한 친화성을 나타낼 것이다. 일 구현예에서, 이러한 친화성은 TNFR2에 대한 항체의 전체 항원-항체 결합력 (overall avidity)이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자의 개개 항원-결합 부위의 친화성은 1　μM 미만, 750 nM 미만, 500 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만, 10 nM 미만, 1　nM 미만, 0.1 nM 미만, 10 pM 미만, 1　pM 미만, 또는 0.1 pM 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, Kd는 약 0.1 pM 내지 약 1 μM이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체이거나 또는 상기 항체 클래스의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG1 이소형 항체이거나 또는 이러한 항체를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 채택되는 불변 영역은 인간 IgG 불변 영역이다. 특히 바람직한 구현예에서, 인간 IgG1 불변 영역이 채택된다. 이는 본원에 언급된 임의 변형을 가질 수 있다. 구체적으로 제한하는 것은 아니지만, 용어 "항체"는 닭, 상어 및 포유류, 예를 들어 마우스, 햄스터, 토끼, 염소, 소, 라마, 인간을 제외한 영장류 및 인간을 비롯한 임의의 적절한 기원 종으로부터 유래한 항체를 망라한다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 전적으로 인간의 것이다. 인간화된 항체를 제작하는 방법에 대한 비-제한적인 예들은 당해 기술 분야에, 예를 들어 Riechmann et al. (Nature. 1988 Mar 24; 332(6162): 323-7) 또는 Jones et al. (Nature. 1986 May 29-Jun 4; 321 (6069): 522-5)에 공지되어 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 본원에 언급된 바와 같이, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 테나신-c 펩타이드와 같은 비-인간 서열을 포함할 수 있으며, 그러나, 바람직한 일 구현예에서, 항체의 항체 기본 서열들 모두 테나신 펩타이드 서열의 존재에도 불구하고 인간의 것이다. 용어 "항체"는 단량체 항체 (예, IgD, IgE, IgG) 또는 올리고머 항체 (예, IgA 또는 IgM)를 망라한다. 용어 "항체"는 또한 단리된 항체 및 변형된 항체, 예를 들어 유전자 조작된 항체, 예컨대 키메라 또는 인간화된 항체를 망라하지만, 특별히 제한되는 것은 아니다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대해 단 한가지 특이성을 가진다. 그래서, 바람직한 일 구현예에서, TNFR2에 특이적인 본 발명의 항체의 항원-결합 부위들 모두 TNFR2의 동일한 에피토프에 대해 특이적일 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대해 2 이상의 특이성을 포함할 것이다. 예를 들어, 이는 결합 분자가 항체 항원-결합 부위뿐 아니라 리간드 기반의 TNFR2 결합 부위를 둘다 포함하기 때문일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 그러나, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2의 에피토프를 2 이상 인지하는 항원-결합 부위들을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 TNFR2에 대해 이중 특이성이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자에서, TNFR2에 대한 결합 분자의 특이성 하나는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 쌍에 의해 제공되고, 다른 특이성은 전체 결합 분자의 일부로서 존재하는 scFv 단편들에 의해 제공된다. 다른 구현예에서, 결합 분자, 특히 항체의 TNFR2 결합 부위들 모두, 각각 서로 다른 특이성으로 scFv를 포함하는 2종의 서로 다른 폴리펩타이드로부터 형성된 결합 분자를 이용해, scFc들에 의해 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 관련 없는 특이성을 가진 Fc 영역 또는 항체 분자를 포함할 수 있으며, TNFR2에 결합하는 능력은 결합 분자의 다른 부분들에 의해 제공된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 중쇄들의 C-말단 부분에 TNF-α 분자, 특히 TNFR2에 선택적인 돌연변이 TNF-α 분자, 예를 들어 TNF80 돌연변이가 존재하는 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 관련 없는 특이성을 가진 면역글로불린을 포함할 수 있으며, 중쇄의 C-말단 부분에는 TNF-α 분자, 특히 돌연변이 TNF-α 분자, 예를 들어 TNF80이 있을 수 있다. 일 구현예에서, Fc 또는 관련 없는 항체의 중쇄는 동일한 폴리펩타이드의 일부로서 TNF-α, 특히 TNF80 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이는 TNF-α 폴리펩타이드 3개, 특히 TNF80 폴리펩타이드 3개를 포함하는 단쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드의 TNF-α 부분 앞에, 중쇄는 TNC 펩타이드 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 가변 영역을 갖는 대신, 단일 폴리펩타이드의 일부로서 Fc 영역의 중쇄 부분 2개를 가진, Fc 영역을 포함할 수 있다.
TNF 리간드를 포함하는 바람직한 결합 분자의 일 예는 도 24에 도시된 바와 같은 Fc(DANA)-TNC-TNF80이고, 여기서 DANA는 D265A 및 N297A 돌연변이를 포함하는 Fc 영역의 중쇄를 나타내고, TNC는 테나신 삼량체화 도메인의 펩타이드 서열을 의미한다. 그래서, 바람직한 본 발명의 결합 분자는 Fc 영역 3개를 포함하고, 여기서 각각의 중쇄는 DANA 돌연변이, D265A 및 N297A를 가진다. 추가의 바람직한 구현예에서, 이들 중쇄 폴리펩타이드 각각은 TNC 펩타이드를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 각 Fc 영역의 중쇄 폴리펩타이드는 각각 TNC 펩타이드 서열을 포함하고 그 다음으로 TNF-α 서열, 특히 TNF80 서열을 포함한다.
추가로 바람직한 본 발명의 결합 분자는 Fc(DANA)-TNF80이며, 이는 각 중쇄 폴리펩타이드가 DANA 돌연변이, D265A 및 N297A와 TNF-α, 특히 TNF80 서열을 포함하는, Fc 영역 3개를 포함한다. 또한, 본 발명은 도 24에 나타낸 Fc-TNC-TNF80 및 Fc-TNF80 포맷 분자를 결합 분자로서 제공한다.
다른 구현예에서, TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공하며, 여기서 결합 분자는 FcγR 독립적인 TNFR2 작용제이고, TNFR2에 대해 2 이상의 결합가를 가지고, TNFR1이 아닌 TNFR2에 결합하는 돌연변이 TNF-α와 폴리펩타이드를 올리고머화하는 테나신 펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 결합 분자는 항체 서열을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 분자는 각각 테나신 펩타이드, 예를 들어 본원에 개시된 임의의 테나신 폴리펩타이드와 함께 돌연변이 TNF-α 서열을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 테나신 펩타이드 서열은 이러한 폴리펩타이드의 올리고머화를 달성한다. 일 구현예에서, 돌연변이 TNF-α는 143N/145R 변형을 가지고 있어, TNFR1 대비 TNFR2에 대해 선택적으로 결합한다. 이러한 TNF 돌연변이는 또한 TNF80으로 지칭할 수도 있다.
TNFR2에 대해 2 이상의 특이성을 가진 결합 분자
바람직한 구현예에서, TNFR2에 특이적인 결합 분자의 항원-결합성 결합 분자들 모두 TNFR2에 대해 동일한 특이성을 가진다. 구체적으로, 이들은 모두 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 그래서 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 항원-결합 부위들 모두 TNFR2의 동일한 에피토프에 대해 특이성을 가진다. 다른 구현예에서, TNFR2 항원-결합 부위들 모두 다른 TNFR2 항원-결합 부위가 TNFR2에 결합하는 것을 교차 차단할 수 있다.
그러나, 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 결합하는 항원-결합 부위를 가질 수 있으나, 이들 항원-결합 부위들 중 적어도 2개는 TNFR2에 대해 다른 특이성을 가진다. 일 구현예에서, 결합 분자는 동일한 TNFR2 분자의 서로 다른 에피토프에 결합하는 TNFR2에 대해 2 이상의 항원-결합 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, 2 이상의 항원-결합 부위는 TNFR2에 결합하는데 서로 교차 차단하지 않는다. 일 구현예에서, 결합 분자는, TNFR2의 2 이상의 서로 다른 에피토프를 인지하는 항원-결합 부위를 포함한다는 점에서, TNFR2에 대해 바이파라토프이다. 다른 구현예에서, TNFR2에 대해 적어도 2, 3, 4, 5 또는 5개의 서로 다른 특이성이 항원-결합 부위에 의해 부여된다. 일 구현예에서, TNFR2에 특이적인 결합 분자의 항원-결합 부위들 모두 TNFR2에 대해 서로 다른 특이성을 가진다.
일 구현예에서, 결합 분자는, 각각의 개별 폴리펩타이드가 TNFR2에 대해 서로 다른 특이성을 가진 2 이상의 항원-결합 부위를 포함하는, 폴리펩타이드 2개를 포함하는 6가 결합 분자이다. 일 구현예에서, 각 폴리펩타이드는 이러한 특이성을 3개 포함한다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드 2개가 동일한 폴리펩타이드에 대해 서로 다른 특이성을 포함하더라도, 이 2개의 폴리펩타이드는 동일하다. 다른 구현예에서, 2개의 폴리펩타이드는 동일하지 않으며, 각 폴리펩타이드는 TNFR2에 대해 3개의 서로 다른 특이성을 가지고 TNFR2에 대해 총 6개의 서로 다른 특이성이 존재한다.
다른 구현예에서, 항체가 "North" 및 "South" 배향된 항원-결합 부위를 포함하는 경우, "North" 및 "South" 배향된 항원-결합 부위는 TNFR2에 대해 서로 상이한 특이성을 부여한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 언급된 임의의 4가 항원-결합 분자는 TNFR2에 대해 하나의 특이성을 가진 항원-결합 부위 2개와 TNFR2에 대해 다른 특이성을 가진 항원-결합 부위 2개를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 2개의 "South" 배향된 scFv들은 "North" 배향된 항원-결합 부위와는 다른 TNFR2 특이성을 가질 수 있다.
sdB , SdAb 및 VHH에 결합하는 도메인들
바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 단일한 도메인 결합제 (sdB, single domain binder)를 포함한다. 단일한 도메인 결합제로는 예를 들어 비-Ig-조작된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 다르핀 (darpin), 어피바디 (affibody), 아드넥틴 (adnectin), 안티칼린 (anticalin) 단백질 또는 펩타이드 등이 있다. 따라서 sdB, sdAb, HCAb 및 VHH가 언급된 경우, TNFR2에 결합할 수 있는 펩타이드, 안티칼린, 아드넥틴, 아피바디 또는 다르핀을 채택하는 것이 가능할 수 있으며, 용어 sdB는 채택되는 이러한 결합 엔터티를 포괄한다.
단일한 결합성 도메인 결합제 (sdB)의 예로는 특히 단일한 도메인 항체 (sdAb), 예를 들어, 중쇄 단독 항체 (HCAb), 특히 VHH 도메인 항체가 있다. VHH 항원-결합성 도메인을 채택하는 것이 특히 바람직한 구현예이다. 단일-도메인 항체 (sdAb)는 단일한 단량체 가변성 항체 도메인으로 구성된 항체 단편이다. 전체 항체와 마찬가지로, sdAb는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. sdAb는 낙타과 중쇄 항체 (VHH) 또는 연골 어류의 IgNAR (VNAR)의 단일한 단량체성 가변성 도메인으로부터 조작할 수 있거나, 또는 낙타과화된 인간 항체로부터 개발된 항체 단편일 수 있다. 임의의 이러한 sdAb들이 채택될 수 있다. 특히 바람직한 sdAb는 VHH 도메인이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 2개의 sdAb 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 결합 분자는 적어도 2개의 sdAb 도메인을 동일한 폴리펩타이드 상에 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일한 도메인 항체, 또는 결합 분자의 전체 결합가가 2 이상인 단일한 도메인 항체를 포함하는, 분자일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 전체 항체의 일부로서 함께 연결된 이러한 단일한 도메인 항체 2개를 포함할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 sdAb와 같은 VHH 결합 도메인을 포함할 수 있다. 중쇄-단독 항체를 생산하는 낙타과, 상어 및 기타 연골 어류와 같은 유기체로부터 유래한 sdAb를 채택할 수 있다. 이러한 중쇄-단독 항체의 단일한 도메인 가변성 단편은 VHH 또는 나노바디 또는 sdAb로 지칭된다. VHH는 항체와 공유되는 면역글로불린 폴드를, 초가변성 루프 3개, CDR1, CDR2 및 CDR3를 이용해 유지하여, 이의 표적에 결합한다. VHH 단편 (예를 들어, NANOBODY®)은 낙타과 중쇄 항체로부터 유래한 재조합, 항원-특이적인, 단일-도메인, 가변성 단편이다.
본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 TNFR2에 대해 2 이상의 결합가를 가지므로, 결합 분자가 VHH 단편을 포함하는 일 구현예에서, 이는 이러한 VHH 단편을 적어도 2개 포함할 것이다. 개개 VHH 단편들이 함께, 예를 들어 링커를 통해 연결될 수 있으며, 그래서, 일 구현예에서, TNFR2에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 VHH 단편을 총 2개 이상 포함하는 단일한 폴리펩타이드로 발현될 수 있다. VHH 단편은 Fc 영역을 가지지 않으며, 일 구현예에서, VHH 단편들이 본 발명의 결합 분자의 일부로서 존재하는 경우, 결합 분자는 Fc 영역이 없을 것이며 그래서 이러한 이유로 Fc 수용체에 결합하지 않을 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 특이적인 VHH 단편을 3, 4, 5, 6 또는 그 이상으로 포함하거나 또는 적어도 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 단일한 VHH 도메인 항체를 포함할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체는 sdAb를 적어도 4개 포함할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체는 sdAb를 4개 포함할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체는 sdAb를 적어도 6개 포함할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체는 sdAb를 6개 포함할 것이다. 추가의 바람직한 구현예에서, sdAb는 VHH이다. 일 구현예에서, 결합 분자는 sdBr를 소정의 개수로 포함할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 Fc 영역은 포함하되 CH1 영역은 포함하지 않을 것이며, 경쇄의 참여 없이 TNFR2에 결합할 수 있을 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 VHH를 포함할 것이고, Fc 영역을 포함하고, 경쇄의 참여 없이 TNFR2에 결합할 수 있을 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, 도 41에 나타낸 구조들 중 일부에 도시된 바와 같이, 하나 이상의 VHH를 포함할 것이고, TNC 삼량체화 도메인 또는 Fc 영역, 또는 이 둘다를 포함할 것이다.
항체 불변 영역 및 Fc 영역 기능
바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 Fc 수용체에 결합하지 않으며, 특히 FcγR 수용체에 결합하지 않는다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체이고, Fc 수용체에 결합하지 않으며, 그 이유는 Fc 영역을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 Fc 수용체에 결합하지 않도록 변형된 Fc 영역을 가지기 때문이다. 여기서 채택되는 Fc 도메인은 일반적으로 달리 명확하게 기술되지 않은 한 -(CH2CH3)2를 의미하며, 여기서 CH2는 중쇄 CH2 도메인이고, CH3는 중쇄 CH3 도메인이고, 각 중쇄로부터 하나씩, 즉 CH2CH3가 2개 존재한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 -CH2CH3 단편을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 CH2 도메인을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 CH3 도메인을 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 Fc γ 수용체에 결합하지만, 비변형된 Fc 영역을 포함하는 동일한 항체가 FcγR에 결합하는 결합에 비해 실질적으로 감소된 수준으로 결합한다 (예를 들어, 측정된 바와 같이, FcγR에 대한 결합성이, 비변형된 Fc 영역을 포함하는 동일한 항체가 FcγR에 결합하는 결합에 비해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 감소). 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 FcγR에 대한 결합성을 전혀 검출할 수 없다. 결합은, 결합 존재 또는 부재와 비롯하여, 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 기법을 이용해, 예를 들어 비-제한적으로, 평형 방법 (예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA); KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373:52-60, 2008; 또는 방사성면역분석 (RIA)), 또는 표면 플라스몬 공명 분석 또는 그외 카이네틱스-기반의 분석 기전 (예를 들어, BIACORE™ 분석 또는 Octet™ 분석 (forteBIO)) 및 기타 방법, 예를 들어 간접 결합 분석, 경쟁적인 결합 분석, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예, 겔 여과)에 의해 결정할 수 있다.
일 구현예에서, Fc 영역이 존재하는 경우, 채택되는 Fc 영역은 돌연변이되고, 특히 본원에 언급된 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 Fc 수용체, 특히 FcγR에 대한 결합성을 제거하기 위한 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 Fc 수용체에 결합하지 않도록 돌연변이된 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역을 포함할 수 있으나, 보통 자연 생성 4-쇄 항체에서 발견되는 가변 영역을 포함하는 것은 아닐 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 이러한 Fc 영역은 Fc 영역의 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드의 일부로서 다른 서열, 특히 TNC 펩타이드 및/또는 TNF-α (특히 TNF80), 바람직하게는 이 둘다를, 특히 폴리펩타이드의 C-말단 부분에 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 어글리코실 (aglycosyl) IgG를, 예를 들어 Fc 기능 감소를 달성하기 위해, 특히 거의 Fc-null 표현형을 달성하기 위해 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 N297에 변형을, 특히 N297A를 가진다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 F243 및/또는 F244에 변형을 가지며, 특히, 항체가 어글리코실 IgG를 포함하는 것을 의미하는 변형을 가진다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 F243A 및/또는 F244A 중쇄 변형을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, F241, F243, V262 및 V264 중 하나 이상이 변형될 수 있으며, 특히 당화에 영향을 미치는 아미노산으로 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 F241A, F243A, V262E 및 V264E에 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형은 Yu et al (2013) 135(26): 9723-9732에, 특히 문헌에 논의된 변형과 관련하여 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 이러한 변형은 예를 들어 Fc 수용체 결합을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 항체의 당화에 영향을 미치는 변형이 존재할 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체는 당 조작을 위한 추가적인 방식으로서 당화에 영향을 미치는 세포 타입에서 생산할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체의 푸코실화, 시알릴화, 갈락토실화 및/또는 만노실화가 서열 변형에 의해 및/또는 항체를 생산하기 위해 사용되는 세포 유형에 의해 변경될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 297 및/또는 299 위치에 변형을 가진다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 이의 중쇄에 N297A 변형을, 바람직하게는 N297Q를, 또는 299번에 Ser 또는 Thr에서 다른 잔기로의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 이는 이들 변형을 둘다 가진다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는, 중쇄들이 동일한 중쇄들과 연합하는 중쇄와 비교해 서로 다른 중쇄들을 선호적으로 연합할 수 있게 하는 변형을 포함하는, 2 이상의 서로 다른 중쇄를 포함한다. 이러한 방식은, 특히, 항체가 TNFR2에 대해 2 이상의 특이성을 가진 경우, 예를 들어 항체가 TNFR2의 서로 다른 2개의 에피토프에 결합하는 경우에, 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 2 이상의 서로 다른 중쇄들이 놉-인-홀 돌연변이 (knob-in-hole mutation)를 포함한다. 특정 측면에서, 놉-인 홀 돌연변이는 중쇄 불변 영역들 중 하나에 존재하는 T366W 돌연변이와, 다른 도메인에 존재하는 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이다. 특정 측면에서, 돌연변이는 전하-쌍 돌연변이 (charge-pair mutation)를 포함한다. 특정 측면에서, 전하-쌍 돌연변이는 중쇄 불변 영역들 중 하나에 존재하는 T366K 돌연변이와 다른 도메인에 존재하는 대응하는 L351D 돌연변이이다. 대안적인 구현예에서, 서로 다른 중쇄들의 선호적인 쌍 형성을 달성하는 돌연변이를 가지는 것 대신, 중쇄는 2개의 중쇄를 포함하는 헤테로다이머가 한가지 타입의 중쇄만을 포함하는 호모다이머로부터 선호적으로 정제될 수 있음을 의미하는 변형을 포함한다. 예를 들어, 변형은 단백질 A에 대한 친화성을 바꿀 수 있지만, 중쇄 하나는 여전히 단백질 A에 결합할 수 있지만 변형된 중쇄는 그렇지 않은데, 이는 2개의 서로 다른 중쇄로 된 헤테로다이머가 단백질 A에 대한 친화성에 기반하여 정제될 수 있음을 의미한다.
다른 구현예에서, 중쇄 및 경쇄는 이들 간의 이황화 결합의 형성 유무를 바꾸는 변형을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 변형은 경쇄와 중쇄 간에 조작된 이황화 연결을 형성하는 돌연변이를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, "조작된 이황화 연결"은 비-네이티브 이황화 결합이 도메인 2개 이상이 연합되는 경우에 형성되도록 폴리펩타이드 2 이상에 비-내인성 시스테인 아미노산을 제공하는 돌연변이이다. 조작된 이황화 연결은 Merchant et al. (Nature Biotech (1998) 16:677-681)에 더 상세히 기술되어 있으며, 이 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본원에 포함된다. 구체적인 구현예에서, 조작된 이황화 연결을 형성하는 돌연변이는 제1 또는 제2 CH3 도메인들 중 하나에 존재하는 K392C 돌연변이와 다른 CH3 도메인에 존재하는 D399C이다. 바람직한 구현예에서, 조작된 이황화 연결을 형성하는 돌연변이는 제1 또는 제2 CH3 도메인들 중 하나에 존재하는 S354C 돌연변이와 다른 CH3 도메인에 존재하는 Y349C이다. 다른 바람직한 구현예에서, 조작된 이황화 연결을 형성하는 돌연변이는, KSC 트리펩타이드 서열을 병합하는 CH3 도메인의 C-말단의 연장에 의해 제공되는, 제1 및 제2 CH3 도메인 양쪽에 존재하는 447C 돌연변이다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합 분자의 혈청 반감기를 바꾸는 변형을 포함할 수 있다. 그래서, 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체의 반감기를 변형하는 Fc 영역 돌연변이(들)를 가진다. 이러한 변형이 존재할 뿐 아니라 Fc 기능을 변경하는 변형일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체의 혈청 반감기를 변경하는 변형(들)을 가진다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 이러한 변형이 없는 항체와 비교해 항체의 혈청 반감기를 변경하는 변형(들)을 가진다. 일 구현예에서, 변형으로 혈청 반감기가 증가한다. 다른 구현예에서, 이로써 혈청 반감기가 감소한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 이러한 변형이 없는 항체와 비교해 총괄적으로 Fc 영역을 침묵시키고 항체의 혈청 반감기를 감소시키는 하나 이상의 변형을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 항체는 작동자 기능이 거의 또는 전혀 없는 불변 영역을 가지며, 예를 들어 Fc 변형 L234F/L235E/P331S를 가진 FDA-승인된 항체 두르발루맙으로부터 유래한 항체이다. 두르발루맙에서 Fc 변형은 Fc 기능 소거에 일조하며, 그래서 경쇄 및 중쇄 불변 영역 또는 두르발루맙을 사용하는 것이 Fc 기능이 바람직하게는 제거된 불변 영역을 제공하는데 특히 효과적인 방법이다. 두르발루맙은 임상 승인되었으며, 불변 영역의 사용이 특히 바람직한 구현예인 추가적인 이유이다. 그래서, 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자는 두르발루맙의 Fc 영역을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 결합 분자가 VHH 결합 도메인을 포함하는 경우, VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 두르발루맙의 CH2 및 CH2 도메인들을 추가로 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이 경우 항체는 두르발루맙의 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 임의의 구현예에서, 결합 분자가 두르발루맙으로부터 유래한 불변 영역 서열을 포함하는 경우, 이는 본원에 언급된 불변 영역 변형들 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 두르발루맙은 인간 IgG1 백본을 가진다. 그래서, 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자가 불변 영역을 포함하는 경우, 이는 인간 IgG 영역을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이는 인간 IgG1 영역을 포함할 수 있다. 이러한 영역들은 Fc 기능을 제거하도록 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 불변 영역은 CH1 영역을 제거하도록, 특히 항원-결합 도메인이 sdBr인 경우에, 변형될 수 있다.
두르발루맙의 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열은 서열번호 135 및 136으로 각각 제공된다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 이러한 경쇄 및 중쇄 가변성 서열 또는 이러한 서열의 변이체를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 변이체 서열 또는 서열들은 관련한 특정 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 다른 구현예에서, 변이체는 적어도 95%의 서열 동일성을 가진다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 서열번호 135 및 135의 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열들을 포함하며, 본원에 언급된 불변 영역 서열 변형 하나 이상과 함께 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 이러한 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 본원에 제공된 4가 결합 분자에 채택된다.
CH1 영역이 결손된 두르발루맙의 중쇄 불변 영역의 변이체는 서열번호 316으로 제공된다. 바람직한 일 구현예에서, 이러한 불변 영역이 채택되며, 이 경우 결합 분자는 sdAb에 기반한 항원 결합 부위를, 바람직하게는 VHH 항원-결합 부위와 함께 포함한다. 이러한 서열은, 본원에 언급된 다른 불변 영역 변형 하나 이상과 함께, 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 서열번호 316의 서열 또는 90% 이상의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체는 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 이러한 구현예에서, 변이체는 여전히 CH1 결손될 것이다. CH1 결손된 이러한 중쇄 불변 영역이 바람직하게는 일 구현예에서 채택되며, 여기서 하나 이상의 항원-결합 부위는 TNFR2에 특이적인 VHH 항원-결합 도메인이다.
예시적인 바람직한 높은 결합가의 TNFR2 결합 분자
바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대해 4 이상의 결합가를 가진다. 일 구현예에서, 결합 분자의 결합가는 TNFR2에 대해 4-9이다. 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 제한된 공간 안에 고 밀도로 존재하는 TNFR2 결합 부위들은 TNFR2 작용제 활성을 촉진하는데 도움이 될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은, 항체를 본원에 언급된 포맷으로, 특히 결합가 4 이상의 포맷으로 재구성함으로써 공지된 TNFR2 길항제 항체를 TNFR2 작용제로 변환하는 것이 가능함을 알게 되었다.
바람직한 일 특정 구현예에서, 제공된 결합 분자는 TNFR2에 대해 4가이다. 4가 포맷의 예가 본 발명의 실시예에서 제공된다. 본 발명은 본원에 언급된 특이적인 결합 도메인들 중 하나를 포함하는 임의의 포맷을 제공한다. 바람직한 포맷의 예로는 다음을 포함한다: scFv-IgG (도 1 참조); IgG-HC:scFv (도 7 참조); IgG-LC:scFv (도 7 참조). IgG-HC:scFv가 특히 바람직한 포맷이다. IgG-LC:scFv 역시 특히 바람직한 구현예이다. 일 구현예에서, scFv 군들은, 링커에 의해 이러한 형태로 중쇄 또는 경쇄를 연결한다. 그래서, 바람직한 일 구현예에서, scFv를 연결하는데 G4S 링커가 이용된다. 다른 구현예에서, 항체는 2 이상의 결합 도메인을 분리시키는 링커를 포함하는 것일 수 있다. 바람직한 4가 포맷의 예는 도 29에 예시된다. 도 29에 나타낸 구조체는 바람직한 결합 도메인인 C4 결합 도메인을 포함한다. 그러나, 도 29에 도시된 포맷들 역시 제공되며, 여기서 각 결합 부위의 VH 및 VL 영역은 본원에 기술된 변이체 C4 서열들 중 어느 것이다. 도 29에 나타낸 포맷은 또한 결합 분자에서 결합 부위가 본원에 언급된 CDR 6개 세트들 중 어느 것을 포함하는 경우에 채택될 수 있다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 결합 분자 포맷은 6가 결합 분자이고, 특히 특이적인 TNFR2 결합 부위 6개를 가진 것이다. 본 발명자들은, 여러가지 TNFR2 항원-결합 도메인들을 이용해 달리 동일한 6가 분자를 구축하는 경우에, 6량체 포맷의 결합 분자들이 TNFR2 작용제 활성에 낮은 변동성을 보인다는 것을 예상치 못하게도 알게 되었다.
예시적인 6가 포맷은 본 발명의 실시예 또는 도면에서 언급된 임의의 포맷을 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 6가 항체는 TNFR2에 특이적인 결합 부위 적어도 2개를 동일한 폴리펩타이드 상에 포함한다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 6가 항체는, 각 폴리펩타이드가 TNFR2에 특이적인 결합 부위 3개, 특히 VHH 3개, 특히 본원에 언급된 특정 VHH를 포함하는, 폴리펩타이드 2개를 포함한다.
일 구현예에서, 6가 결합 분자에서 VHH 항원-결합 부위들 모두 동일하다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 TNFR2에 대해 서로 다른 특이성을 가진, 예를 들어 서로 다른 에피토프에 결합하는 항원-결합 부위를 적어도 2개 가질 수 있다. 다른 구현예에서, TNFR2에 특이적인 결합 분자의 항원-결합 부위들 모두 TNFR2에 대해 서로 다른 특이성을 가질 수 있으며, 즉 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 항원-결합 부위는 이들이 TNFR2에 결합하였을 때 서로 교차 차단하지 않는다는 의미에서, 상이할 수 있다.
바람직한 6가 결합 분자 포맷에 대한 예로는 본 발명의 실시예 및 도면에 언급된 것을 포함한다. 도면 또는 실시예에서 특정한 TNFR2 결합 도메인을 가진 항체 포맷인 경우, 본 발명은 또한 본원에 언급된 다른 TNFR2 결합 도메인들 중 하나를 가지되, 동일한 포맷인 항체를 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, TNFR2 결합 도메인은 VHH 도메인이다. 바람직한 구현예에서, 채택되는 VHH 도메인은 본원에 기술된 특이적인 VHH 도메인들 중 하나 또는 이의 변이체이다. 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자는 도 40에 도시된 6가 포맷들 중 하나이다. 추가로 바람직한 포맷 및 특이적인 서열들은 도 54 및 55에 제공된다. 특히 바람직한 포맷은 폴리펩타이드 2개를 포함하며, 각각에는 VHH 도메인 3개가 존재한다. 추가로 특히 바람직한 포맷에서, 결합 분자는 포맷 3xVHH-Fc로 존재한다. 예를 들어, 특히 바람직한 포맷은 3xVHH-Fc이다. 추가로 바람직한 포맷은 3xVHH-Fc(DANA)이다. 본 발명의 결합 분자에 채택될 특히 바람직한 VHH 도메인은 C188이다. 추가로 바람직한 VHH 도메인은 본원에 언급된 C188의 특이적인 변이체들 중 하나이다. 그래서, 3xVHH:C188-Fc가 특히 바람직한 결합 분자이다. 추가로 바람직한 결합 분자는 3xVHH:C188-Fc(DANA)이다. 대안적으로, 이들 포맷에서 C188은 본원에 언급된 다른 VHH 도메인들 중 하나에서 치환될 수 있다.
6가 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 이는 항체 두르발루맙의 Fc 영역을 포함할 것이다. 대안적인 구현예에서, 결합 분자는 본원에 언급된 임의의 Fc 영역을 가지되, 두르발루맙의 Fc 영역을 포함할 것이다.
결합 분자 구축 및 스크리닝
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 표적 항원 또는 항원들, 특히 TNFR2에 대해 개선된 친화성을 제공하도록 변형된다. 이러한 변이체는 표적 항원 또는 항원, 특히 TNFR2에 대해 개선된 친화성을 제공하도록 변형된다. 이러한 변이체는 CDR 돌연변이 (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 체인 셔플링 (chain shuffling)(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), E. coli의 돌연변이 균주 이용 (Low et al J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링 (Patten et al Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이 (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 섹슈얼 PCR (sexual PCR)(Crameri et al Nature, 391, 288-291, 1998) 등의 여러가지 친화성 성숙 프로토콜에 의해 수득할 수 있다. Vaughan 등 (상기 문헌 참조)은 이러한 친화성 성숙 방법들을 기술하고 있다. 본 발명에 이용하기 위한 결합 도메인은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 통해 구축할 수 있으며, 예를 들어 CDR은 시판 이용가능한 항체 등의 비-인간 항체로부터 취해 인간 프래임워크에 이식할 수 있거나, 또는 대안적으로 키메라 항체를 비-인간 가변 영역과 인간 불변 영역 등을 이용해 제조할 수 있다. 본 발명의 항체는 자연 생성 포맷이 아닐 수 있으므로, 이러한 스크리닝을 이용해 TNFR2에 결합하기 위한 바람직한 특성을 가진 항원-결합 부위를 식별한 다음 이를 본원에 언급된 포맷들 중 하나로 재구성하는 것일 수 있다.
당업자는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법을 이용해 본 발명의 항체에 이용하기 위한 항체를 제작할 수 있다. 항체 제작에 이용하기 위한, 예를 들어 파지 디스플레이와 같은 패닝 (panning)에 이용하거나 또는 숙주 면역화에 이용하기 위한 항원 폴리펩타이드는 발현 시스템을 포함하는 유전자 조작된 숙주 세포로부터 당해 기술 분야에서 잘 알려진 공정에 의해 제조할 수 있거나, 또는 천연 생물학적 공급원으로부터 회수할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포괄한다. 이들 용어는 달리 언급되지 않은 한 상호 호환적으로 사용된다. 항원 폴리펩타이드는 일부 경우에 예를 들어 친화성 태그 또는 유사 물질에 융합된 융합 단백질과 같이 더 큰 단백질의 일부일 수 있다. 일 구현예에서, 숙주는 TNFR2로 형질감염된 세포, 예를 들어 표면에 TNFR2를 발현하는 세포로 면역화할 수 있다.
동물의 면역화가 필요한 경우, 폴리펩타이드를 동물, 바람직하게는 비-인간 동물에, 잘 알려진 통상적인 프로토콜을 이용해 투여함으로써 항원 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체를 입수할 수 있으며, 예를 들어 Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)을 참조한다. 토끼, 마우스, 랫, 양, 소, 카멜 또는 돼지와 같은 다수의 온혈 동물을 면역화할 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 랫이 일반적으로 가장 적합하다. 단일클론 항체는 하이브리도마 기법 (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법 (Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법 (Cole et al Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)과 같이 당해 기술 분야에서 공지된 임의 방법을 통해 제조할 수 있다. 항체는 또한 예를 들어 Babcook, J. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l; WO92/02551; WO2004/051268 및 WO2004/106377에 언급된 방법들에 의해, 특이적인 항체를 생산하기 위해 선택된 단일한 림프구로부터 만들어진 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하여 발현시킴으로써, 단일한 림프구 항체를 이용해 제조할 수 있다. 본 발명에 이용하기 위한 항체는 또한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용해 제조할 수 있으며, Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) 및 WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 5,969,108 및 WO20011/30305에 기술된 방법을 포함한다.
일 예로, 본 발명의 항체는 완전 인간 (fully human)이고, 특히 하나 이상의 가변성 도메인은 완전 인간이다. 완전 인간 분자는, 중쇄 및 경쇄 둘다의 가변 영역 및 (존재하는 경우) 불변 영역이 모두 인간 기원의 것이거나 또는 인간 기원 서열과 실질적으로 동일하나, 반드시 동일한 항체로부터 유래한 것은 아닌, 것이다. 완전 인간 항체의 예로는, 예를 들어, 일반적으로 EP0546073, US5,545,806, US5,569,825, US5,625,126, US5,633,425, US5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 및 EP0463151에 기술된 바와 같이, 예를 들어 전술한 파지 디스플레이 방법에 의해 생산된 항체, 및 뮤라인 면역글루불린 가변 영역 및 선택적으로 불변 영역 유전자가 이의 인간 카운터파트와 교체된 마우스에 의해 생산된 항체를 포함할 수 있으며, 상기한 문헌은 각각 원용에 의해 본원에 포함된다.
일 예로, 본 발명에 따른 항체의 항원-결합 부위, 특히 가변 영역은 인간화된다. 본원에서 채택되는 인간화된 (CDR-이식된 항체 포함)은 비-인간 종으로부터 유래한 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)과 인간 면역글로불린 분자로부터 유래한 프래임워크 영역을 가진 분자를 지칭한다 (예, US 5,585,089; WO91/09967, 원용에 의해 본원에 포함됨). 전체 CDR이 아닌 CDR의 특이성 결정 잔기들을 옮기는 것만 필요할 수 있는 것으로 이해될 것이다 (예, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). 바람직한 구현예에서, 그러나, 전체 CDR 또는 CDR들을 이식한다. 인간화된 항체는 선택적으로 CDR의 기원이 되는 비-인간 종으로부터 유래한 하나 이상의 프래임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된 항체 분자"는 중쇄 및/또는 경쇄가 수여 항체 (예, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프래임워크로 이식된 공여 항체 유래 하나 이상의 CDR (필요에 따라 하나 이상의 변형된 CDR 포함)을 포함하는, 항체 분자를 지칭한다. 검토로서 Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998을 참조한다. 일 구현예에서, 전체 CDR을 옮기는 대신, 특이성을 결정하는 잔기 하나 이상만 상기에 언급된 CDR들 중 어느 하나에서 인간 항체 프래임워크로 옮긴다 (예, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). 일 구현예에서, 오직 특이성을 결정하는 잔기만 전술한 CDR들 중 하나 이상에서 인간 항체 프래임워크로 옮긴다. 다른 구현예에서, 특이성을 결정하는 잔기만 전술한 CDR들 각각에서 인간 항체 프래임워크로 옮긴다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기를 이식하는 경우, 마우스, 영장류 및 인간 프래임워크 영역을 비롯하여, CDR이 유래하는 공여 항체의 클래스/유형을 감안해, 임의의 적절한 어셉터 가변 영역 프래임워크 서열을 이용할 수 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항체는 인간 어셉터 프래임워크 영역을 포함하는 가변성 도메인뿐 아니라 하나 이상의 본원에 제공된 CDR을 가진다. 본 발명에서 이용가능한 인간 프래임워크의 예로는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이 있다 (상기 Kabat 문헌). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 대해 이용할 수 있으며, REI는 경쇄에 대해 이용할 수 있으며, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘다에 대해 이용할 수 있다. 대안적으로, 인간 생식계열 세포를 이용할 수 있으며, 이는 http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php에서 이용가능하다.
본 발명의 인간화된 항체 분자에서, 어셉터 중쇄 및 경쇄가 반드시 동일한 항체로부터 유래하여야 하는 것은 아니며, 필요에 따라 다른 체인들로부터 유래한 프래임워크 영역을 가진 복합 체인 (composite chains)을 포함할 수 있다. 프래임워크 영역은 어셉터 항체와 실제 동일한 서열을 가져야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 드문 잔기는 어셉터 체인 클래스 또는 타입에서 출현 빈도가 더 높은 잔기로 바꿀 수 있다. 대안적으로, 어셉터 프래임워크 영역 내 선택 잔기는, 공여 항체 내 동일 위치에서 발견되는 잔기에 대응하도록 바꿀 수 있다 (Reichmann et al 1998, Nature, 332, 323-324). 이러한 변동은 공여 항체의 친화성을 회복하는데 필요한 최소한으로 유지하여야 한다. 어셉터 프래임워크 영역에서 바꿀 필요가 있을 수 있는 잔기를 선택하는 프로토콜은 WO 91/09967에 언급되어 있다. 프래임워크의 유도체는 대체 아미노산, 예를 들어 공여체 잔기로 치환된 아미노산을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 가질 수 있다. 공여체 잔기는 공여체 항체, 즉, CDR이 본래 기원한 항체로부터 유래한 잔기이며, 특히 공여체 서열에서 대응하는 위치에 있는 잔기를 이용한다. 공여체 잔기는 인간 수용체 프래임워크로부터 유래한 적절한 잔기 (어셉터 잔기)로 치환할 수도 있다.
항체 가변성 도메인 내 잔기들은 Kabat et al에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적으로 번호가 매겨진다. 이 시스템은 Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (이하 "Kabat et al. (supra)")에 언급되어 있다. 이 번호 부여 시스템은 달리 언급되지 않은 한 본원에 적용된다. Kabat 잔기 명명이 아미노산 잔기의 선형적인 번호 지정과 항상 직접 일치하는 것은 아니다. 실제 선형적인 아미노산 서열은 기본적인 가변성 도메인 구조의 프래임워크 또는 상보성 결정 영역 (CDR)과 무관하게, 엄격한 Kabat 번호 지정에서와 비교해 구조 성분의 축소 또는 구조 성분으로의 삽입에 대응하여 아미노산 서열이 더 적거나 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기들에 대한 올바른 Kabat 번호는 항체 서열을 "표준" Kabat 번호 지정된 서열과 상동성 잔기에 맞춰 정렬함으로써 소정의 항체에 대해 결정할 수 있다. 중쇄 가변성 도메인의 CDR들은 Kabat 번호 지정 시스템에 따르면 잔기 31-35 (CDR-H1), 잔기 50-65 (CDR-H2) 및 잔기 95-102 (CDR-H3)에 위치한다. 그러나, Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1과 동등한 루프가 잔기 26에서 잔기 32까지 확장된다. 따라서, 달리 언급되지 않은 한, 본원에 채택된 바와 같이 'CDR-H1'은 Kabat 번호 부여 시스템 및 Chothia의 위상 루프 정의의 조합에 의해 설명되는 바와 같이 잔기 26-35를 지칭하는 것으로 의도된다. 경쇄 가변성 도메인의 CDR들은 Kabat 번호 부여 시스템에 따라 잔기 24-34 (CDR-L1), 잔기 50-56 (CDR-L2) 및 잔기 89-97 (CDR-L3)에 위치한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 서열에까지 확장된다. 다른 예로, 이는 이러한 항체의 인간화된 버전으로까지 확장된다.
당업자는 활성이 유지되는 지를 검증하기 위해 본원에 언급된 방법 등의 임의의 적절한 분석으로 CDR의 변이체 또는 인간화된 서열을 검사할 수 있다.
일 구현예에서, 변이체 결합 분자는, 본원에 언급된 특이적인 결합 분자를 교차 차단할 수 있는 이러한 결합 분자를 식별함으로써, 식별할 수 있다. 교차-차단 항체는 당해 기술 분야에서의 임의의 적절한 방법을 이용해, 예를 들어 항원 (TNFR2)에 교차 차단 항체의 결합이 본 발명의 항체의 결합을 방지하거나 또는 그 반대로 작용하는, 경쟁 ELISA 또는 BIAcore 분석을 이용해 식별할 수 있다. 이러한 교차 차단 분석은 표적으로 TNFR2를 발현하는 세포를 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 유세포 측정을 이용해 TNFR2를 발현하는 세포에 대한 결합을 분석한다.
변이체 결합 분자가 여전히 본 발명의 결합 분자의 요망하는 특성을 유지하는 경우, 그 변이체 결합 분자를 채택할 수 있다. 그래서, 결합 분자, 특히 본원에 언급된 특정 대상에 대해 소정의 서열 동일성을 가진 항체 역시 제공한다. 서열 동일성은 폴리펩타이드의 전체 길이에 대한 것일 수 있거나, 또는 단 가변 영역 또는 CDR 서열만 같이, 특정 부분에 관한 것일 수 있다. 동일성 및 유사성 정도는 쉽게 계산할 수 있다 (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M. 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656). 또한, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩타이드 서열 및 이와 적어도 80%, 예를 들어 85% 이상, 예를 들어 90% 이상, 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상으로 유사 또는 동일한 서열에까지 확장된다. 일 구현예에서, 변이체는 적어도 80%의 서열 동일성을 가진다. 다른 구현예에서, 변이체는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 다른 구현예에서, 변이체는 적어도 95%의 서열 동일성을 가진다. 일 구현예에서, 서열은 본원에 제공된 특이적인 서열 하나 이상에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체가 본원에 언급된 모든 경우에, 이는 이러한 정도의 서열 동일성을 가질 수 있으며/ "동일성"은 본원에 사용된 바와 같이 정렬된 서열들에서 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 간에 동일한 것을 의미한다. "유사성"은 본원에 사용된 바와 같이, 정렬된 서열들에서 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 간에 유사한 유형의 것임을 의미한다. 예를 들어, 루신은 이소루신 또는 발린으로 치환될 수 있다. 흔히 다른 잔기로 서로 치환될 수 있는 아미노산은 비-제한적으로 다음을 포함한다.:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 가진 아미노산);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 가진 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌 (황-함유 측쇄를 가진 아미노산).
일 구현예에서, 변이체는, 변이체가 TNFR2에 특이적으로 여전히 결합할 수 있으며 바람직하게는 이전에 언급된 포맷일 경우 작용제로서 작용할 수 있는 한, 1-10, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 최대 이들 개수로 또는 적어도 이들 개수 또는 최대 이들 개수로 아미노산 서열 변동을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 언급된 특이적인 항체들 중 하나의 CDR과 비교해 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있으며, 예를 들어 항원-결합 부위를 구성하는 CDR 6개에 상기한 개수의 서열 변동을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 결합 분자가 VHH 도메인을 포함하는 경우, VHH 도메인은 본원에 제공된 VHH에 대한 CDR 3개로 구성된 특정 세트와 비교해 전술한 개수의 아미노산 서열 변화를 가진 CDR 3개 세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 본원에 언급된 특이적인 항체와 비교해 CDR들에 상기한 개수의 서열 변동을 가질 수 있다. 이는 최대 상기한 개수의 서열 변동을 가질 수 있다. 이는 적어도 상기한 개수의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있다. 이러한 변이체 항체 분자는 전형적으로 TNFR2에 특이적으로 결합하는 능력을 유지할 것이다. 이는 또한 본원에 언급된 그외 다른 기능을 유지할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 가변 영역들의 변이체 쌍을 이용하는 경우, 이는 본원에 언급된 특정한 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 것이다. 다른 구현예에서, 이는 적어도 90% 서열 동일성을 가질 것이다. 다른 예로, 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 것이다. 일 구현예에서, 이는 아미노산 서열 변동을 10개 이하로 가질 것이다. 다른 구현예에서, 이는 특정한 서열과 비교해 5개 이하의 아미노산 서열 변동을 가질 것이다. 일 구현예에서, 이는 특정한 서열과 비교해 1, 2 또는 3개의 서열 변동을 가질 것이다. 변이체는 TNFR2에 결합하는 능력을 유지할 것이다. 예를 들어, 변이체는 특정한 서열의 결합 활성을 적어도 50%로 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 결합 활성의 적어도 75%를 가질 것이다. 일 구현예에서, 이는 적어도 동일한 결합 활성을 가질 것이다. 일 구현예에서, 서열 변동은 프래임워크 영역에만 존재할 것이다. 다른 구현예에서, 서열 변동은 보존적인 아미노산 변동일 것이다.
구현예에서, CDR 세트가 식별되면, 변이체 세트를 이용할 수 있다. 예를 들어 최대 총 10개의 아미노산 변동을 가진 세트, 예를 들어 최대 5개의 아미노산 서열 변동을 가진 변이체를 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변동이 존재할 수 있다. 아미노산 서열 변동은 모두 보존적일 수 있다. 일 구현예에서, 변이체 CDR은 여전히 항원-결합 부위가 TNFR2에 결합하게 할 수 있을 것이다. 예를 들어, 변이체는 특정 서열의 결합 활성을 적어도 50%로 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 적어도 75%의 결합 활성을 가질 것이다. 일 구현예에서, 이는 적어도 동일한 결합 활성을 가질 것이다.
일 구현예에서, 변이체 서열은 특정한 서열을 포함하는 결합 부위의 결합을 차단하는 능력을 가질 것이다. 일 구현예에서, 변이체 서열은 결합에 대해 경쟁할 것이다. 본 발명의 예는 결합, 즉 차단/경쟁을 측정하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 분석을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면은 또한 아미노산이 본원에 전술한 바와 같이 이성질화, 탈아미드화, 당화 부위 또는 시스테인 잔기를 제거하기 위해 CDR에서 돌연변이된 것을 비롯하여, 인간화된 버전 및 변형된 버전 등의, 특이적인 결합 분자, 특히 항체의 변이체로까지 확장되는 것으로 이해될 것이다.
바람직한 구현예에서, 서열 동일성이 언급된 경우, 이는 비교 중인 서열 2종의 전장에 대한 것이다. 예를 들어, 명시된 서열 동일성 수준은 CDR의 길이 전역에 대한 것일 수 있다. 이는 가변 영역의 길이 전역에 대한 것일 수 있다. 이는 서열의 전체 길이, 예를 들어 서열 2종 중 더 짧은 전체 길이에 대한 것일 수 있다.
특정한 서열이 명시된 모든 경우에는 변이체가, 예를 들어 상기 및 하기에 정의된 변이체가 채택될 수 있다. CDR 변이체 세트일 수 있는 바와 같이 변이체 CDR들이 채택될 수 있다. 변이체 가변 영역이 이러한 가변 영역 쌍일 수 있는 바와 같이 채택될 수 있다. 변이체 힌지부가 채택될 수 있다. 변이체 불변 영역이 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 변이체는 전체 폴리펩타이드에 대한 것일 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 변이체는 특정한 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 일 구현예에서, 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 가진다. 변이체 항원-결합 부위는 여전히 TNFR2 결합 활성을 유지할 것이다. 변이체 결합 분자는 전형적으로 TNFR2 작용제 활성을 유지할 것이다. 변이체는 본원에 언급된 임의 기능을 유지할 수 있다. 바람직한 변이체는 아미노산 변동 1-10개를 가진다. 추가의 변이체는 1-5개의 아미노산 변동을 가진다. 바람직한 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산 변동을 가진다. 기타 변이체는 특정 서열과 비교해 단 하나의 아미노산 변동을 가진다. 일 구현예에서, 변이체는 본원에 언급된 바와 같이 결합 분자의 바이오시밀러일 수 있다.
추가의 예시적인 항체 및 CDR 서열
본 발명의 실시예는 본 발명 및 이의 이점을 예시하는 것을 돕기 위해 그 구조의 일부로서 TNF 리간드를 가진 분자 등의 다양한 특이적인 항체 분자를 포함한다. 본 발명은 이들 서열로 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 이들 예시적인 항체 또는 이의 변이체로부터 유래한 특이적인 서열을 포함할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 변이체, 특히 FcγR 독립적인 방식으로 TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 변이체 등의 변이체 항체도 제공된다.
본 발명의 표 3은 특정 항체를 발현하기 위해 사용된 다양한 발현 구조체 쌍들을 나타낸다. 이 표는 또한 벡터 쌍들에 의해 발현되는 폴리펩타이드를 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 폴리펩타이드들의 쌍 조합들 중 하나를 포함하는 결합 분자를 제공한다. 실시예에서 non-VHH 기반의 항체를 제작하기 위해 사용된 오리지널 항체 클론은 마우스 항체이다. 일 구현예에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 폴리펩타이드들의 쌍 조합들 중 하나를 포함하되, 마우스 CDR 서열은 유지되고 항체의 나머지 부분은 인간화된, 결합 분자를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, 마우스 서열 전체가 TNFR2에 특이적으로 결합할 수 있는 인간 항체의 서열로 교체된 것을 제외하고는, 표에 나타낸 폴리펩타이드 쌍 조합들 중 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 표 3에 나타낸 폴리펩타이드 쌍 조합들로부터 기인한 결합 분자를 교차 차단하는 결합 분자를 채택한다. 다른 구현예에서, 표 3에 나타낸 폴리펩타이드 쌍 조합들로부터 기인한 결합 분자와 교차 반응하는 결합 분자를 채택한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 본 발명의 표 3에 나타낸 중쇄 및 경쇄의 쌍 조합들의 것으로부터 기인한 CDR 6개 세트를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 표 3에 나타낸 것으로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 가변 영역들의 쌍을 포함할 것이다.
본 발명의 표 4는 본 발명의 실시예에 사용된 발현 벡터에 의해 발현되는 다양한 폴리펩타이드들의 서열번호를 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 이러한 폴리펩타이드들 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, 폴리펩타이드가 인간화되었으며, 마우스 CDR 서열은 유지되되 나머지 마우스 서열은 인간 서열로 치환된, 이러한 폴리펩타이드 등 중 하나 이상을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 결합 분자는, 이들 폴리펩타이드 2개를 포함하거나 또는 마우스 CDR을 제외한 모든 서열이 대응하는 서열로 치환된, 인간화된 버전을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 본 발명의 표 4에 나타낸 중쇄 및 경쇄 서열번호의 쌍 조합들의 것으로부터 기인한 CDR 6개 세트를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 표 4에 나타낸 서열번호의 가변 영역으로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 쌍을 포함할 것이다.
본 발명의 표 5는 본 발명에 언급된 항체 포맷에 대한 출발점으로 사용된 특정 항체로부터 유래한 CDR 서열을 기술한다. 경쇄 유래 CDR 3개는, 중쇄 유래 CDR 3개와 마찬가지로, 함께 군으로 묶이며, 경쇄 및 중쇄 유래 CDR들도 함께 군으로 묶인다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 표 5에 언급된 경쇄 CDR 3개로 된 세트를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 이는 표 6에 언급된 중쇄 CDR 3개로 된 세트를 포함할 것이며, 그래서 클론들 중 하나로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 CDR 서열 또는 이러한 서열의 기능성 변이체 둘다 포함할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 특이성 2 이상을 위한 CDR들을 포함하며, 그래서 결합 분자는 예를 들어 표 5에 나타낸 항체들 중 하나로부터 유래한 CDR 6개를 총괄적으로 포함하는 폴리펩타이드 2개를 포함할 수 있으나, 결합 분자는 예를 들어 결합 분자의 일부인 scFv로서 존재하는, 다른 항체에 대한 CDR 6개로 된 추가의 세트를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 대해 트리파라토프이며, 그래서 TNFR2에 대한 서로 다른 3가지 특이성을 가진다. 일 구현예에서, 하나 이상의 특이성은 표 5의 CDR 6개 세트에 의해 또는 이들 CDR들의 변이체에 의해 부여된다. 다른 구현예에서, 특이성 2 이상은 표에서 유래한 CDR 6개 세트들에 의해 또는 이의 변이체에 의해 부여된다. 추가의 구현예에서, 특이성 3가지 모두 표에서 유래한 CDR 6개 세트들에 의해 또는 이의 변이체에 의해 부여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, 예를 들어 표 5에 언급된 CDR 6개로 된 세트들 또는 이의 변이체에 의해 부여되는 특이성을 적어도 1, 2 또는 3개 가진, 테트라파라토프이다. 일 구현예에서, 특이성 4가지 모두 표 5에 언급된 CDR 6개로 된 세트들 또는 이의 변이체에 의해 부여될 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 C40 클론의 CDR 6개 세트를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 C19 클론의 CDR 6개 세트를 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 항체는 C40 클론의 CDR 6개 세트를 포함하는 항원-결합 부위와 또한 C19 클론의 CDR 6개 세트를 포함하는 추가의 항원-결합 부위를 둘다 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, CDR들은 C4 클론으로부터 유래한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항원-결합 부위들 모두 CDR 6개로 된 동일한 세트를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체의 서로 다른 항원-결합 부위들은 서로 다른 CDR 6개 세트를 포함한다. 일 구현예에서, C40, C19 또는 C4로부터 유래한 CDR 6개 대신, 본원에 언급된 임의의 변이체와 같이 CDR 6개 세트에 대한 변이체를 채택할 수 있다.
일 구현예에서, 항원-결합 부위의 CDR 6개가 C40의 것인, 본원에 언급된 임의의 항체 포맷이 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 C4의 것이다. 다른 구현예에서, CDR들은 여전히 TNFR2에 결합하는 능력을 가진, C40, C19 또는 C4로부터 유래한 것의 변이체이다.
또한, 본 발명은 상기한 결합 분자의 변이체 및 실시예에서 채택된 특이적인 결합 분자를 제공한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 변이체는 표 5에 언급된 CDR 6개로 된 세트와 비교해 항원-결합 부위의 CDR 서열에 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있지만, 여전히 TNFR2의 작용제로서 작용할 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 이러한 아미노산 변동을 6개 이상 가질 수 있으며, 예를 들어 이러한 변동을 6-15개, 예를 들어 이러한 변동을 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 가질 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 적어도 명시된 개수의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 언급된 개수까지 가질 수 있다. 추가의 구현예에서, 이는 언급된 개수의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 서열 변동은 보존적인 아미노산 서열 변동일 수 있다. 다른 구현예에서, 서열 변동은 비-보존적인 아미노산 변동을 포함할 수 있다. 다양한 특이적인 변동이 본원에 언급되어 있으며, 이는 이러한 변이체 분자에 존재할 수 있다. 특정한 항체 포맷이 추가의 구현예에 언급된 본원에 언급된 임의 구현예에서, 본 발명의 실시예의 포맷 항체이나, 마우스 CDR 서열을 제외한 전체가 인간 CDR 서열로 치환되도록 변형된, 결합 분자를 제공할 수 있거나 또는 채택할 수 있다.
바람직한 C4 및 C4 변이체 항원-결합 부위
바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 C4 클론의 서열 또는 이의 변이체 서열을 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 결합 분자는 C4 클론으로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 이는 C4 클론의 CDR 6개 세트를 포함할 수 있다. 변이체 C4 가변 영역 및 CDR 서열 또한 채택될 수 있으며, 본 발명에서는 이의 바람직한 예를 제시한다.
C4 클론에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 295 및 296으로 제공되며, 항원-결합 부위에 채택될 수 있다. C4 클론에서 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 서열번호 69/70/71로 제공되며, 이들 CDR 3종이 항원-결합 부위에 채택될 수 있다. C4 클론에서 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 서열번호 102/103/104로 제공되며, 이들 CDR 3종이 항원 결합 부위에 채택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항원-결합 부위는 이들 CDR 6종 모두, 즉 서열번호 69/70/71의 경쇄 CDR과 서열번호 102/103/104의 중쇄 CDR을 모두 포함한다. 변이체 C4 서열 역시 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 특정한 CDR 서열들과 비교해 아미노산 서열 변동을 최대 10개 가진, 이들 CDR 6종의 변이체 세트가 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 변이체 세트는 아미노산 서열 변동을 최대 5개 가질 것이다. 일 구현예에서, 이는 CDR 6개로 된 특정 세트의 서열과 비교해 아미노산 서열 변동을 1, 2 또는 3개 가질 수 있다.
특히 바람직한 C4 변이체 경쇄 가변 영역은 서열번호 262-265로 제공하며, 이를 채택할 수 있다. 이러한 경쇄 가변 영역으로부터 유래하는 CDR은 서열번호 266 내지 277로 제공되며, 이를 채택할 수 있다. 변이체 CDR 세트는 특정한 경쇄 가변성 CDR들의 서열과 비교해 아미노산 서열 변동을 최대 10개 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체 세트는 특정한 서열과 비교해 아미노산 서열 변동을 최대 5개 가질 수 있다. 특히 바람직한 중쇄 가변 영역은 서열번호 278 내지 281로 제공되며, 이를 채택할 수 있다. 이러한 중쇄 가변 영역으로부터 유래하는 CDR은 서열번호 282 내지 293으로 제공되며, 이를 채택할 수 있다. 중쇄 CDR에 대해 최대 10개의 아미노산 서열 변동을 가진 변이체가 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 중쇄 CDR 세트의 서열과 비교해 아미노산 서열 변동이 최대 5개인 변이체 세트가 채택될 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 서열번호 295, 262 내지 265 중 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 또는 이의 임의의 변이체 및 서열번호 306, 278 내지 281 중 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 또는 이의 임의의 변이체를 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 69, 70 및 71의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체와 서열번호 102, 103 및 104의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 가진 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 266/267/268; 269/270/271; 272/273/274; 275/276/278로부터 선택되는 CDR1/CDR2/CDR3에 대한 경쇄 CDR 3개 세트; 또는 이의 변이체를 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 282/283/284; 285/286/287; 288/289/290; 291/292/293으로부터 선택되는 CDR1/CDR2/CDR3에 대한 중쇄 CDR 3개 세트; 또는 이의 변이체를 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 결합 부위는 이러한 경쇄 및 중쇄 CDR들을 둘다 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 결합 분자는 본원에 제공된 특정한 C4 변이체들 중 어느 하나로부터 유래한 중쇄에 대한 CDR, 중쇄에 대한 CDR 또는 이 둘다를 포함한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 본원에 언급된 임의 항체 포맷에 C4 및 C4 변이체에 기반한 결합 부위가 채택될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 이러한 항원-결합 부위가 본 발명의 4가 결합 분자에 채택된다. 바람직한 일 특정 구현예에서, C4 클론 또는 본원에 제공된 C4 클론의 특정 변이체들 중 하나로부터 유래한, CDR 6개 세트, 또는 VL 및 VH 서열 쌍이, 도면에 나타낸, 특히 도 1 및 7에 나타낸 포맷들 중 하나에 채택된다. 이는 또한 도 29A에 나타낸 포맷에도 채택될 수 있다. 특이적인 서열의 변이체 역시 채택될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 서열번호 259의 서열을 가진 폴리펩타이드 및 서열번호 261의 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 결합 분자는 이러한 각각의 폴리펩타이드 2종으로 구성된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 이러한 폴리펩타이드 2종을 포함하되, 서열번호 261의 경쇄 가변 영역이 서열번호 262-265 중 하나의 가변 영역 또는 이의 변이체로 교체된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 이러한 폴리펩타이드 2종을 포함하되, 서열번호 259의 중쇄 가변 영역이 서열번호 278 내지 281 중 하나의 가변 영역 또는 이의 변이체로 교체된다. 바람직한 일 구현예에서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 이러한 방식으로 교체된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 도 54 또는 55에 표시된 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 결합 분자는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 332의 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 변이체 서열; 및
(b) 서열번호 33의 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 변이체 서열.
일 구현예에서, 결합 분자는 (a)에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 2개와 (b)에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 2개를 포함한다.
일 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 332 및 333에 존재하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가지되 결합 분자가 TNFR2 작용제로 작용할 수 있는 변이체 서열을 포함하는 것이다.
일 구현예에서, 결합 분자는 다음을 포함한다:
(c) 서열번호 334의 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 변이체 서열; 및
(d) 서열번호 335의 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 변이체 서열.
일 구현예에서, 결합 분자는 (a)에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 2개와 (b)에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 2개를 포함한다.
일 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 334 및 335에 존재하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 또는 적어도 10%의 서열 동일성을 가지되 결합 분자가 TNFR2 작용제로 작용할 수 있는 변이체 서열을 포함하는 것이다.
일 구현예에서, 결합 분자는 다음을 포함한다:
(e) 서열번호 336의 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 변이체 서열; 및
(f) 서열번호 337의 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 변이체 서열.
일 구현예에서, 결합 분자는 (a)에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 2개와 (b)에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 2개를 포함한다.
일 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 336 및 337에 존재하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 또는 적어도 10%의 서열 동일성을 가지되 결합 분자가 TNFR2 작용제로 작용할 수 있는 변이체 서열을 포함하는 것이다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자에서 TNFR2에 특이적인 항원-결합 부위들 모두 본원에 언급된 C4 또는 C4 변이체에 기반한 결합 부위들 중 하나이다.
표 10은 C4 변이체 결합성 항원-결합 부위에 대한 바람직한 경쇄 및 중쇄 쌍의 예를 제공한다. 바람직한 일 구현예에서, 표 10에 나타낸 바와 같은 서열 쌍들이 항원-결합 부위로서 채택될 수 있다. 다른 구현예에서, 서열 쌍들 중 하나에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 서열 쌍이 채택될 수 있다. 95% 서열 동일성을 가진 변이체가 채택될 수 있다.
본원에 언급된 C4 및 특정한 C4 변이체는, 이들의 CDR, 경쇄 CDR 세트, 중쇄 CDR 세트, CDR 6개 세트, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 및 가변 영역들의 쌍의 변이체일 수 있는 바와 같이, 본원에 언급된 결합 포맷들 중 임의의 것에 채택될 수 있다. 채택될 수 있는 C4 변이체들의 특정 쌍들이 표 10에 제공되며, 이들 특정 쌍에 대한 변이체 서열 역시 채택될 수 있다. 도 54 및 55는 채택될 수 있는 특히 바람직한 C4 변이체 기반의 폴리펩타이드, 특히 지정된 중쇄 및 경쇄를 나타낸다.
바람직한 VHH 서열
바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자의 TNFR2 결합 도메인은 VHH 도메인이다. 그래서, 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자에서 모든 TNFR2 결합 도메인들이 VHH 도메인이다. 본 발명의 실시예는 TNFR2에 특이적인 VHH 영역 14개의 제조를 기술하며, 이들 서열은 서열번호 140-153에 제공된다. 이들 특정한 VH 영역들은 본원에 언급된 임의의 결합 분자 포맷을 비롯한 각각 본 발명의 결합 분자에 채택하기 바람직한 VHH 도메인이다. 변이체가 TNFR2에 여전히 결합할 수 있으며 결합 분자가 TNFR2의 작용제로서 작용하는 한, 이러한 특정한 VHH 도메인의 변이체 서열 역시 채택할 수 있다.
결합 분자에 채택하기 특히 바람직한 VHH 도메인은 서열번호 140의 C188 VHH 결합 도메인 또는 이의 변이체이다. C188의 CDR 3개는 서열번호 154/155/156으로 제공된다. 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자는 CDR 3개를 포함하는 것을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, TNFR2에 특이적인 항원-결합 부위들 모두 이러한 CDR 3개를 포함한다. 아울러, 변이체 CDR은, 결합 부위가 여전히 TNFR2에 결합할 수 있는 한, 채택할 수 있다.
본 발명의 실시예에 기술된 바와 같이, C188의 특정한 변이체 서열은 C188-VHH_1 내지 C188-VHH_15로서 제작되었으며, 그 서열은 각각 서열번호 198 내지 212로 제공된다. 그래서, 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자의 TNFR2 결합 도메인은 서열번호 198 내지 212 중 하나의 VHH 도메인을 가진다. 바람직하게는, TNFR2 결합 도메인들 모두 동일한 서열을 가진다. 특히 바람직한 구현예에서, 변이체는 서열번호 198 내지 211 중 하나의 서열을 가진다. 재차, 바람직하게는, 결합 도메인들 모두 동일한 서열을 가진다. 일 구현예에서, 서열번호 198 내지 211 중 하나에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 변이체 VHH 결합 도메인이 채택될 수 있다. 다른 구현예에서, 서열 동일성 수준은 적어도 95%이다. 이러한 변이체는 TNFR2 작용제로서 여전히 작용할 수 있을 것이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 198 내지 211로 제공된 특정한 C188 VHH 변이체들 중 하나이거나 또는 이러한 서열의 변이체인 항원-결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, TNFR2 특이적인 결합 부위들 모두 이러한 VHH 변이체 결합 도메인이다. 일 구현예에서, 결합 분자는 C188 변이체 VHH 결합 도메인들 중 하나로부터 유래한 CDR 3개 세트를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 결합 분자는 213/214/215; 216/217/218; 219/220/221; 222/223/224; 225/226/227; 227/229/230; 231/232/233; 234/235/236; 237/238/239; 240/241/242; 243/244/245; 246/247/248; 249/250/251; 252/253/254; 255/256/257로부터 선택되는 CDR 3개 세트; 또는 이들의 변이체 세트를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 213/214/215; 216/217/218; 219/220/221; 222/223/224; 225/226/227; 227/229/230; 231/232/233; 234/235/236; 237/238/239; 240/241/242; 243/244/245; 246/247/248; 249/250/251; 252/253/254로부터 선택되는 CDR 3개 세트; 또는 이들의 변이체 세트를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하되, 여기서 변이체는 총 최대 10개의 아미노산 서열 변동을 가지지만 VHH는 여전히 TNFR2에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 변이체는 최대 5개의 아미노산 서열 변동을 가지지만 여전히 TNFR2에 결합할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 이러한 VHH 도메인을 채택한 결합 분자는 본원에 언급된 포맷들 중 하나와 같이, 이러한 VHH에 대해 4가 또는 6가 결합성이다. 서열번호 140-153 및 198-212의 특정한 VHH 영역들이 도 및 실시예에 나타낸 포맷 등의, 본원에 언급된 임의의 결합 분자 포맷에 채택될 수 있다. 일 구현예에서, 서열번호 140, 142-145, 149, 151 및 153의 특정한 VHH 영역이 도 및 실시예에 나타낸 포맷 등의, 본원에 언급된 임의의 결합 분자 포맷에 채택될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 198 내지 211 중 하나로부터 선택되는 가변 영역을 가진 VHH 또는 여전히 TNFR2에 결합할 수 있으며 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 실시예 및 도면에서 결합 분자 포맷들 중 하나는 이러한 항원-결합 부위를 사용하도록 변형될 수 있다.
도 40 및 41은 VHH 항체에 대해 특히 바람직한 포맷을 예시한다. 나타낸 6가 포맷이 특히 바람직하다. 본원에 언급된 임의의 VHH 도메인 또는 이러한 VHH 도메인으로부터 유래한 CDR 3개 세트가 VHH 기반의 결합 분자에, 특히 본원에 언급된 C188 또는 특정한 C188 변이체에 채택될 수 있다. 특히 바람직한 포맷은 3xVHH-Fc 포맷이며, 선택적으로 VHH 결합 도메인들 사이에 링커가 존재한다. 특히 바람직한 결합 분자는 서열번호 197의 폴리펩타이드 2개를 포함한다. 추가로 바람직한 결합 분자는, VHH 도메인이 서열번호 198 내지 212 중 어느 하나의 것인 것을 제외하고는, 서열번호 197에 상응하는 서열의 폴리펩타이드 2개를 포함한다. 추가로 특히 바람직한 결합 분자는, VHH 도메인들이 서로 다르고 서열번호 213 내지 257 중 어느 하나로부터 유래한 CDR 3개 세트를 포함하는 것을 제외하고는, 서열번호 197에 상응하는 서열의 폴리펩타이드 2개를 포함한다.
일 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 331의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 이러한 폴리펩타이드를 3개 포함한다. 일 구현예에서, 결합 분자는, 다른 힌지부를 가진, 서열번호 331의 아미노산 서열의 변이체인 폴리펩타이드를 포함하고, 변이체는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다. 다른 구현예에서, 이는 이러한 폴리펩타이드를 3개 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 331에 존재하는 가변 영역 또는 이와 적어도 90% 서열 동일성을 가지며 여전히 작용제로서 작용할 수 있는 변이체를 포함하는, 항원-결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 결합 분자는, 서열번호 331의 아미노산 서열에 존재하는 CDR 3개를 포함하는 항원-결합 부위를 포함한다.
일 구현예에서, 결합 분자는 상기에 언급된 것들 중 하나와 같이 본원에 언급된 특정한 VHH 영역의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 특정 서열들 중 하나에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가진 것일 수 있다. 이는 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 이는 적어도 98%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 이는 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 변이체는 1-10개의 아미노산 서열 변동을 가진다. 일 구현예에서, 이는 1-5개의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있다. 이는 특정 서열과 비교해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있다. 이는 특정 서열과 비교해 1, 2 또는 3개의 아미노산 서열 변동을 가질 수 있다. 주어진 서열에 대한 가능한 변이체는 본원에 도처에 기술되어 있으며, 이러한 타입의 임의 변이체가 채택될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 적어도 동일한 TNFR2 결합 활성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 변이체는 오리지널 분자의 활성의 적어도 50%를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 이는 오리지널 분자의 활성의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%의 동일한 활성을 가질 수 있다. 한가지 바람직한 결합 분자는 서열번호 197의 서열을 포함하지만, 본원에 언급된 유형의 임의 변이체와 같이 이 서열에 대한 변이체가 채택될 수도 있다. 서열번호 198 내지 212의 VHH 도메인 또한 바람직하며, 이의 변이체도 본원에 언급된 타입의 임의 변이체를 비롯해 채택될 수 있다.
일 구현예에서, 결합 분자는 sdBr 결합 도메인과 기타 non-sdBr 결합 도메인을 둘다 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 결합 분자는 양쪽 VHH 결합 도메인, 예를 들어 C188 및 C188 변이체 항원 결합 도메인을 non-VHH 항원 결합 도메인과 조합하여 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 결합 분자는 C188, C188 변이체 결합 도메인과 C4 또는 C4 변이체 항원-결합 도메인인 결합 도메인을 둘다 포함할 수 있다.
본원에 언급된 C188 및 특정한 C188 변이체는 이의 CDR, 이의 CDR 세트 또는 가변 영역의 변이체일 수 있는 바와 같이, 본원에 언급된 임의의 결합 포맷에 채택될 수 있다. 도 53은 이러한 특정 서열의 변이체일 수 있는 바와 같이, 채택될 수 있는 특히 바람직한 폴리펩타이드를 도시한다.
추가로 바람직한 결합 분자
특히 바람직한 결합 분자 포맷은 4가이다. 결합 분자에 채택하기 특히 바람직한 한가지 VH 도메인, 특히 4가 도메인은 C4 VH 도메인이다. 특히 바람직한 포맷은 IgG1-HC:scFv 또는 IgG1-HC:scFv이다. 바람직한 포맷에서, 이러한 포맷에서 VH 및 VL 도메인은 C4의 것이다. 특히 바람직한 한가지 포맷은 C4-IgG1(Durv)-HC:scFvC4(G4S)4이다. 특히 바람직한 구현예에서, 이러한 결합 분자는 폴리펩타이드 2개, 즉 서열번호 261의 경쇄 서열과 서열번호 259의 중쇄 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드를 포함하되, VH 및/또는 VL 영역이 본원에 언급된 이러한 특정 영역들 중 하나인, 결합 분자가 제공된다. 실시예에 기술된 바와 같이, 서열번호 262-265에 기재된 서열을 가진 C4 VL 서열의 변이체를 제작하고, 이러한 VL 서열들 중 임의 서열이 C4-IgG1(Durv)-HC:scFvC4(G4S)4 분자에서 이것으로 치환할 수 있다. 실시예에 기술된 바와 같이, 서열번호 278 내지 281에 기재된 서열을 가진 C4 VH 서열의 변이체를 제작하고, 이러한 VH 서열들 중 임의 서열을 C4-IgG1(Durv)-HC:scFvC4(G4S)4 분자에서 이것으로 치환할 수 있다. 일 구현예에서, VL 및 VH 영역 서열들 둘다 경쇄의 경우 서열번호 262 내지 265 및 중쇄의 경우 서열번호 278 내지 281로부터 선택되는 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 이용되는 VL 서열과 VH 서열은 각각 서열번호 295 및 296의 것이다.
분석
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자가 특정한 특성 또는 특성들, 예를 들어 본원에 언급된 임의의 특성을 가지는 지를 결정하기 위해 기능성 분석을 이용할 수 있다. 그래서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체를 평가하는데 기능성 분석을 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 실시예에 기술된 하나 이상의 분석을 이용해 특정 결합 분자를 평가할 수 있으며, 요망되는 특성 또는 특성들을 가지는 지를 확인할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 실시예 1에 기술된 분석들 중 하나를 이용할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 결합할 수 있다. TNFR2에 결합할 수 있는 본 발명의 결합 분자 또는 후보 결합 분자의 결합력을 다양한 방식으로 평가할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 결합 분자의 TNFR2 결합력은 TNFR2 단백질을 이용함으로써, 예를 들어 칩에 결합된 TNFR2 또는 이의 일부를 이용한 표면 플라스몬 공명과 같은 기법을 이용함으로써, 평가한다. 특히 바람직한 구현예에서, 결합 분자의 TNFR2 결합력은 표면에 TNFR2를 발현하는 세포를 이용해 평가할 것이다. 일 구현예에서, 후보 분자를 표지한 다음 TNFR2를 발현하는 세포에 대한 자체 결합력을 ELISA 또는 유세포 측정과 같은 기법을 이용해 스크리닝한다. 다른 구현예에서, 후보 분자를 TNFR2를 발현하는 세포와 인큐베이션한 다음 결합된 후보 분자를 후보 분자 종들에 특이적인 표지된 항체와 같은 2차 제제를 이용해 검출할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, 예를 들어 결합 분자, 특히 항체 또는 융합 단백질의 루시퍼라제-태깅된 (예, 가우시아 프린셉스 루시퍼라제 (GpL)) 변이체를 이용해, 예를 들어 Kums et al., MAbs. 2017 Apr; 9(3):506-520)에 기술된 바와 같이 표지한다. 이러한 태깅된 결합 분자는 경쟁적인 결합 분석에도 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 (a) TNFR2를 발현하는 세포의 표면에서 TNFR2를 올리고머화하여, 바람직하게는 세포 표면에서 TNFR2의 6량체 또는 TNFR2 삼량체들의 고차원의 클러스터 (higher-order cluster)를 형성할 수 있으며; (b) TNFR2 신호전달을 촉발할 수 있으며; 및/또는 (d) 백혈구, 바람직하게는 T 세포, 더 바람직하게는 Treg 세포의 증식을 자극할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 세포 표면 상에서 TNFR2 수용체들의 기존재하는 고차원 복합체에, 특히 세포 표면 상의 TNFR2의 삼량체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 동일한 세포 상에서 TNFR2 수용체의 슈퍼-클러스터 형성 또는 세포 2개간의 브릿지 형성 또는 이 둘다를 야기할 수 있다.
일 구현예에서, 후보 분자가 TNFR2를 발현하는 세포의 표면에서 개개 TNFR2 분자의 올리고머화를 달성하는 능력을 측정한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 이러한 올리고머화를 달성할 수 있을 것이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 6량체 형성 또는 TNFR2 삼량체들로 된 기타 올리고머 형성을 달성할 수 있을 것이다. 일 구현예에서, 이러한 올리고머의 형성은 고 해상도 현미경 검경으로 검출할 수 있다. 일 구현예에서, TNFR2의 올리고머 형성은 PALM, dSTQRM, 화학적 가교 또는 FRET와 같은 기법을 이용해 검출할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자가 TNFR2를 활성화하는 능력은 자체 결합을 직접 측정하기 보다는 TNFR2 활성화의 하류 효과를 측정함으로써 평가한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 결합 분자가 IL-8 생산을 유도하는지 여부는, 주어진 결합 분자가 TNFR2 신호전달을 유도할 수 있는 지를 확립하기 위한 방식으로 이용할 수 있다. TNFR2 신호전달에 따른 반응으로 NFκB 활성화는 전형적으로 IL-8의 생산으로 이어지며, 그래서 소정의 결합 분자가 TNFR2 신호전달을 활성화할 수 있는 지, 바람직한 구현예에서 본 발명의 결합 분자는 이러한 신호전달을 활성화할 수 있는 지를 평가하기 위한 한가지 방식으로 이용할 수 있다. 일 구현예에서, TNFR2 신호전달을 활성화하는 것으로 알려진 분자는 본 발명의 결합 분자와 같이 양성 대조군으로 이용할 수 있다. 결합 분자가 TNFR2에 결합하고 IL-8 생산을 자극하는 능력을 분석하기 위해 이용할 수 있는 바람직한 세포주의 일 예는 HT1080-Bcl2-TNFR2이다. 일 구현예에서, 기능성 분석은 분석 중인 결합 분자를 TNFR2를 발현하는 세포, 예를 들어 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포와 접촉시키고, 이를 밤새 인큐베이션한 다음 IL-8의 존재에 대해 상층액 샘플을 분석하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 분석에 ELISA, 예를 들어 BD OptEIA™ IL8 ELISA 키트가 활용된다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 또한 TNFR2 신호전달을 자극하는 것으로 알려진 양성 대조군을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 분석을 이용해 하나 이상의 결합 분자가 결합하여 IL-8 생산을 활성화하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있으며, 예를 들어 잠재적인 결합 분자 라이브러리를 스크리닝할 수 있으며, IL-8 생산의 활성화를 식별할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 분석을 이용해, 본 발명의 결합 분자의 변이체가 본 발명의 특정 결합 분자와 비교해 여전히 활성인지 또는 더 활성인지를 검토할 수 있다.
본 발명의 결합 분자를 평가하는데 이용할 수 있는 다른 분석은, TNFR2가 일부 세포주/세포 타입 세포 사멸을 생존 단백질 (TRAF2, cIAP1, cIAP2)의 저해 및 TNFR1을 촉발하는 내인성으로 생산된 TNF의 부수적인 상향 조절에 의해 유발할 수 있으므로, 생존성 분석이다. 바람직한 구현예에서, Kym-1 세포 (Schneider et al., 1999)가 이러한 분석에 이용된다. 예를 들어, 플레이트 또는 웰에 접종된 TNFR2를 발현하는 세포, 특히 Kym-1 세포를 검사 결합 분자와 함께 인큐베이션한 다음 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 OD 595 nm을 측정할 수 있다. 대조군 혼합물 등의 "세포 사멸"과 같이 세포 살상을 유도하는 것을 알려진 양성 대조군이 이용될 수 있다 (일 예: 200 ng/ml TNF, 200 ng/ml TRAIL, 200 ng/ml CD95L, 25 ㎍/ml CHX, 1 % (w/v) 소듐 아지드). 관찰된 수치는 무처리 세포 및 "사멸 혼합물"로 처리된 세포와 비교해 표준화할 수 있다. 재차, 이러한 방법을 이용해 원하는 특성을 가진 결합 분자를 스크리닝할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는, 예를 들어 전술한 분석에서 평가된 바와 같이 IL-8 생산을 유도할 것이며, 또한 예를 들어 전술한 분석에서 평가된 바와 같이 세포 사멸을 유도할 수 있을 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 IL-8 생산을 유도할 것이나, 예를 들어 본 발명의 실시예에 언급된 분석에서 평가된 바와 같이 세포 사멸은 유의하게 유도하지 않을 것이다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR2에 결합하고 대안적인 NFκB 경로의 활성화를 통해 신호전달을 개시할 수 있을 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 p100에서 p52로의 프로세싱에 의해 확인되는 바와 같이 대안적인 NFκB 경로를 활성화할 수 있을 것이다. 일 구현예에서, TNFR2를 발현하는 세포를 분석 중인 결합 분자와 접촉시킨 다음 세포를 회수하고, p100 및 p52 수준을 측정하기 위해 분석하는 세포의 세포용해물 (lysate)을 수득한다. 일 구현예에서, p100이 p52로 프로세싱되는 지를 조사하기 위해 p100 항체 및 p52 항체를 이용해 세포용해물에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행한다. 임의의 적절한 세포를 이용할 수 있지만, 바람직한 구현예에서, 이러한 평가에 Kym-1 세포를 이용한다. 활성인 것으로 알려진 결합 분자와 같은 양성 대조군이 이용될 수 있다. 또한, 결합 분자 없이 인큐베이션한 다음 동일한 방식으로 평가하는 세포와 같이 음성 대조군도 수행할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어 IL-8 생산에 의해 측정된 바와 같이 고전적인 NFκB 경로를 활성화할 수 있으며, 또한 p100에서 p52로의 프로세싱을 평가함으로써와 같이 대안적인 NFκB 경로를 활성화할 수 있을 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 또한 예를 들어 전술한 바와 같은 세포 생존성 분석을 이용한 분석과 같이, 세포 살상을 활성화할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 결합 분자는 FcγR에 결합하지 않는다. 바람직한 일 구현예에서, 후보 결합 분자에서 TNFR2에 결합 및 활성화하는 능력과 FcγR에 결합 및 활성화하지 않는 능력을 둘다 평가한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자가 Fc 수용체, 특히 FcγR에 결합하는 능력을 평가한다. Fc 수용체에 대한 결합 결핍을, 예를 들어 CDC 또는 ADCC 활성의 발현 유무를 결정하기 위해 평가할 수 있으며, 바람직하게는 어느 것도 본 발명의 결합 분자에 의한 것은 아닐 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자가 세포의 활성화 및 증폭을 자극하는 능력을, 예를 들어, 본 발명의 결합 분자가 전형적으로 T 세포와 같은 세포의 활성화 및/또는 증폭을 야기할 수 있을 것이므로, 그러한 방식으로 특정 면역 세포를 자극하기 위해, 평가할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자가 PBMC로부터 Treg 세포를 자극하는 능력을 평가한다. 일 구현예에서, 결합 분자가 Treg를 증폭하는 능력을 하기를 포함하는 방법에 의해 평가한다:
- PBMC를 단리하여 배양하는 단계 (예를 들어, 고 밀도로, 예컨대 천만개 세포/ml);
- 세포를 회수한 다음 PBMC에 접종하는 단계 (예를 들어, 저 밀도로, 백만개 세포/ml);
- 세포를 후보 결합 분자와 4일간 함께 인큐베이션하는 단계; 및
- 세포 수를 측정하기 위해 분석하는 단계.
바람직한 구현예에서, 세포를 후보 결합 분자와 접촉하지 않고 배양하는 음성 대조군을 수행한다. 세포는 유세포 측정을 이용해, 특히 CD4+ CD25+ FoxP3+ 세포의 염색에 대해 분석할 수 있다. 바람직한 구현예에서, CD3+ CD4+ 세포 집단에서 FoxP3+ CD25+ 세포의 수를 측정한다. 또한, 세포를 CD3 및/또는 CD8에 특이적인 항체로 염색할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 결합 분자없이 인큐베이션한 경우와 비교해 CD4+ CD25+ FoxP3+ 세포를 더 많은 수로 제공할 것이다. 다른 구현예에서, 후보 결합 분자는, 예를 들어, 변이체 결합 분자가 본 발명의 특정 결합 분자보다 동일하거나 또는 더 높은 정도로 Treg를 증폭시킬 수 있는 지를 평가하기 위해, 본 발명의 특정 결합 분자와 비교할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, FoxP3-Luci 마우스를 이용해, 마우스가 Treg 세포에 대한 마커로서 작용하는, 마우스 FoxP3 프로모터의 통제 하에 루시퍼라제를 발현하므로, Treg 세포 증폭을 조사한다. 예를 들어, 이러한 마우스에 후보 TNFR2 작용제를 주사한 다음 생발광 이미징을 이용해 Treg 세포를 촬영한다. 공지된 TNFR2 작용제를 이용한 양성 대조군도 음성 대조군과 마찬가지로 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 변이체 또는 후보 결합 분자를 본원에 언급된 공지된 TNFR2 작용제와 비교할 것이며, 바람직한 구현예에서 생발광 이미징에 의해 평가되는 바와 같이 Treg가 동등한 또는 더 높은 수준으로 달성된다면, 이 또한 본 발명의 결합 분자로 분류한다. 이러한 평가는, 예를 들어 이후 동물을 희생시키고, 세포를 단리한 다음 Treg 수를 측정함으로써, 또한 생체외 평가와 조합할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 인간-특이적인 분자를 검사하기 위해, 인간 TNFR2, 또는 특히 인간 TNFR2의 세포외 도메인을 발현하는, 예를 들어 인간 TNFR2 cDNA를 마우스 게놈에, 또는 보다 구체적으로 마우스 TNFR2 유전자 좌에 랜덤 삽입한 후 수득한, 형질전환 마우스를 이용해, Treg 수준, 특히 증폭을 조사한다. 이러한 형질전환 마우스는 생체내 Treg 증폭 촬상을 위해 FoxP3-Luci 형질전환 마우스와 교배할 수 있다. 희생시킨 후, 개개 조직을 음성 대조군 동물과 비교해 Treg의 변화 수준에 대해 촬상을 통해 가공 처리할 수 있다. Treg 증폭 및 Treg/Teff 비율 역시 유세포 측정, 비장세포 소싱 (sourcing splenocytes), 혈중 백혈구 또는 기타 조직을 이용해 정량할 수 있다. 대안적으로, 면역결핍 마우스, 예를 들어 NSG 마우스에 인간 PBMC 또는 인간 Treg를 주사하고, Treg 증폭을 유세포 측정을 통해 결정할 수 있다.
특정 결합 분자의 효능은 동물 모델과 같은 생체내 시스템에서 평가할 수 있다. 예를 들어, 다양한 이식편대숙주 질환 (GvHD) 모델을 이용할 수 있으며, 결합 분자를 이러한 동물 모델에 제공한 다음 동일한 GvHD 동물 모델이지만 결합 분자는 제공하지 않은 대조군 동물과 비교한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 동물 모델에서 GvHD를 제시하거나 또는 낮출 것이다. 다른 동물 모델, 예를 들어 건선, 염증성 장 질환 (IBD), 루푸스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 신경병 및 죽상동맥경화증과 같은 병태 모델들도 동일한 방식으로 이용할 수 있다. 또한, 생체내 실험을 이용해, 주어진 결합 분자가 생체내에서 Treg를 증폭시킬 수 있는 지를 확인할 수 있다.
접합체, 융합 단백질 및 작동자 분자
본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 작동자 분자와 접합될 수 있다. 그래서, 적합하다면, 본 발명에 사용하기 바람직한 결합 분자, 특히 항체는 하나 이상의 작동자 분자(들)와 접합될 수 있다. 작동자 분자가 단일한 작동자 분자를 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 결합 분자, 특히 항체에 부착될 수 있는 단일한 모이어티를 형성하도록 연결된, 이러한 분자 2 이상을 포함할 수 있다. 작동자 분자와 연결된 본 발명에 따른 결합 분자, 특히 항체를 수득하는 것이 요망되는 경우, 이는 결합 분자, 특히 항체를 직접 또는 커플링제를 통해 작동자 분자와 연결하는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 공정에 의해 제조할 수 있다. 이러한 작동자 분자를 항체와 접합하는 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 및 Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). 구체적인 화학적 공정으로는 예를 들어 WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03/031581에 기술된 공정 등이 있다. 대안적으로, 작동자 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 연결은 예를 들어 WO 86/01533 및 EP0392745에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 공정을 이용해 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 작동자 분자를 포함할 수 있다. 용어 작동자 분자는 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 항체 또는 이의 항체 단편, 합성 또는 자연 생성 폴리머, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사핵종, 특히 방사성 요오드, 방사성 동위원소, 킬레이트화된 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예컨대 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 스펙트로스코피에 의해 검출할 수 있는 화합물을 포함한다.
작동자 분자에 대한 예로는, 세포에 유해한 (예, 살상하는) 임의 물질을 비롯한, 세포독소 또는 세포독성 물질을 포함할 수 있다. 그 예로는 콤브레스타틴 (combrestatin), 돌라스타틴 (dolastatin), 에포틸론 (epothilone), 스타우로스포린 (staurosporin), 메이탄시노이드 (maytansinoid), 스폰기스타틴 (spongistatin), 리족신 (rhizoxin), 할리콘드린 (halichondrin), 로리딘 (roridin), 헤미아스테를린 (hemiasterlin), 탁솔 (taxol), 사이토칼라신 B (cytochalasin B), 그라미시딘 D (gramicidin D), 에티듐 브로마이드, 에메틴 (emetine), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 테노포시드 (tenoposide), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 콜히친 (colchicin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 다이하이드록시 안트라신 다이온 (dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론 (mitoxantrone), 미트라마이신 (mithramycin), 액티노마이신 (actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인 (tetracaine), 리도카인 (lidocaine), 프로프라놀롤 (propranolol) 및 푸로마이신 (puromycin) 및 이들의 유사체 또는 상동체 등이 있다. 또한, 작동자 분자는, 비-제한적으로, 항-대사산물제 (예, 메토트렉세이트 (methotrexate), 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈 (cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예, 메클로르에타민 (mechlorethamine), 티오에파 클로람부실 (thioepa chlorambucil), 멜팔란, 카르무스틴 (carmustine) (BSNU) 및 로무스틴 (Lomustine) (CCNU), 사이클로포스파미드 (cyclothosphamide), 부설판 (busulfan), 다이브로모만니톨 (dibromomannitol), 스트렙토조톡신 (streptozotocin), 미토마이신 C 및 cis-다이클로로다이아민 플라티늄 (II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예, 다우노루비신 (종래에 다우노마이신 및 독소루비신), 항생제 (예, 닥티노마이신 (종래에 액티노마이신), 블레오마이신 (bleomycin), 미트라마이신, 안트라마이신 (AMC), 칼리케아미신 (calicheamicin) 또는 두오카르마이신 (duocarmycin)) 및 항-유사분열제 (예, 빈크리스틴 (vincristine) 및 빈블라스틴 (vinblastine)) 등이 있다.
기타 작동자 분자로는 킬레이트화된 방사핵종, 예를 들어 111In 및 90Y, Lu177, 비스무스213, 칼리포늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물, 예를 들어, 비-제한적으로, 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 저해제, 탁소이드 및 수라민 (suramin) 등이 있을 수 있다. 기타 작동자 분자로는 단백질, 펩타이드 및 효소를 포함한다. 대상 효소로는 비-제한적으로 프로테오라이틱 효소 (proteolytic enzyme), 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제, 트랜스퍼라제를 포함한다. 대상 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드로는 비-제한적으로 면역글로불린, 독소, 예를 들어, 아브린 (abrin), 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예를 들어 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장인자, 혈소판 유래 성장인자 또는 조직 플라스미노겐 활성제, 또는 혈전 치료제 (thrombotic agent) 또는 항-혈관신생제, 예를 들어 안지오스타틴 (angiostatin) 또는 엔도스타틴 (endostatin), 또는 생물학적 반응 개변제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 신경 성장인자 (NGF) 또는 기타 성장인자 및 면역글로불린 등이 있다.
기타 작용자 분자는 예를 들어 진단에 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속 (양전자 방출 단층촬영술에 사용) 및 비-방사성 상자성 금속 이온 등이 있다. 일반적으로 진단제로서 이용하기 위해 항체에 접합할 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 번호 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소로는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며; 적합한 보결기로는 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴이 있으며; 적합한 형광 물질로는 움벨리페론 (umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린이 있으며; 적합한 발광 물질로는 루미놀이 있으며; 적합한 생발광 물질로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며; 적합한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc가 있다.
다른 구현예에서, 작동자 분자는 결합 분자, 특히 항체의 반감기를 생체내에서 높이거나 또는 낮추거나 및/또는 면역원성을 낮추거나 및/또는 상피 장벽을 통한 면역 시스템으로의 전달을 강화할 수 있다. 이러한 유형의 적합한 작동자 분자의 예로는 폴리머, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예를 들어 WO 05/117984에 언급된 것 등이 있다. 작동자 분자가 폴리머인 경우, 이는 일반적으로 합성 또는 자연 생성 폴리머, 예를 들어 선택적으로 치환된 직선형 또는 분지형 체인 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 폴리머 또는 분지형 또는 비-분지형 다당류, 예를 들어 호모- 또는 헤테로-다당류일 수 있다. 전술한 합성 폴리머에 존재할 수 있는 구체적인 선택적인 치환기로는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기 등이 있다. 합성 폴리머에 대한 구체적인 예로는 선택적으로 치환된 직선형 또는 분지형 체인 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이의 유도체, 특히 선택적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예를 들어 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체 등이 있다.
본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 혈청 반감기를 조절 또는 변형하는 분자와 접합될 수 있다. 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 알부민에, 예를 들어 혈청 반감기를 조절하기 위해 결합시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 알부민 결합 펩타이드인 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 알부민 결합 펩타이드에 대한 예는 WO 2015/197772 및 WO 2007/106120에 포함되며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 작동자 분자와 접합되지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 독소와 접합된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 방사성 동위원소와 접합되지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 촬상을 위한 물질과 접합되지 않는다.
본 발명의 항체 분자는, 작동자 분자와 연결하기 위해 접합을 이용할 뿐 아니라, 전체 항체의 서로 다른 부분을 연속하거나 또는 예를 들어 리간드 기반의 TNFR2 결합 부위를 본 발명의 항체 부분과 연결하기 위해 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 융합 단백질일 수 있다. 본원에 언급되는 바와 같이 "융합 단백질"은 융합 단백질을 구성하는 부분들이 공유 결합에 의해 융합되는 한 특정한 유형의 융합 단백질로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 융합 단백질의 부분들은 하나 이상의 단일한 폴리펩타이드 체인(들)으로 발현함으로써, 하나 이상의 이황화 연결에 의해, 화학적 접합에 의해 (바람직하게는, 클릭 화학을 이용한 화학적 접합에 의해) 및/또는 단백질에 적합한 링크로서 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기타 공유 연결에 의해 융합될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질의 부분들은 하나 이상의 단일한 폴리펩타이드 체인(들)으로 발현됨으로써 및/또는 하나 이상의 이황화 연결을 통해 융합된다. 예를 들어, 결합 분자, 특히 항체는 scFv에 대한 폴리펩타이드 서열에 융합된 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 테나신 펩타이드 서열, 특히 폴리펩타이드의 C-말단에서 테나신 펩타이드 서열과 융합된 중쇄 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 융합은 하나 이상의 이황화 연결에 의해, 화학적 접합에 의해 (바람직하게는, 클릭 화학을 이용한 화학적 접합에 의해) 및/또는 단백질에 적합한 링커로서 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기타 공유 연결에 의해 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 분자의 혈청 반감기에 영향을 주는 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 Fc 꼬리, 혈청 알부민, 및/또는 혈청 알부민 및 PEG의 결합제인 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 혈청 알부민에 대한 결합 부위를 포함하거나, 이와 접합되거나 또는 이를 가질 것이다. 일 구현예에서, 결합 분자는 결합 분자의 혈청 반감기를 바꾸기 위해 혈청 알부민 또는 이의 변이체와 접합된다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 혈청 알부민에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 항체이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 혈청 알부민에 결합하는 펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 링커 또는 링커들을 포함할 수 있다. 링커는 결합 분자의 부분들을 함께 연결하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 결합 부위들이 링커에 의해 분리된다. 바람직한 일 구현예에서, 결합 분자가 하나 이상의 링커를 포함하는 경우, 이는 GS 또는 G4S (GGGGS)와 같은 글리신/세린 링커를 포함하거나 또는 이러한 링커 하나 또는 이 둘다를 다수 카피로 포함할 것이다. 일 구현예에서, 단일한 G4S 링커를 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 G4S 유닛을 복수로 포함할 수 있으며, 각 링커에는 그 서열이 1-7회 반복된다. 일 구현예에서, G4S 링커 유닛 1-5개가 연속적으로 사용된다. 본 발명에서 임의의 적절한 링커가 사용될 수 있으며, 예를 들어 구체적인 G4S 링커를 이용하는 이러한 구현예에서, 링커가 G4S 링커 서열로 제한되지 않으며 임의의 적절한 링커일 수 있는 대안적인 구현예가 제공된다. 일 구현예에서, VHH 도메인 3개가 연속적으로 존재하는 경우, 동일한 폴리펩타이드 링커를 이용해 VHH 도메인들을, 예를 들어 가운데 위치한 VHH의 양쪽에서 이를 다른 VHH 도메인과 분리할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 힌지부를 포함할 수 있다. VH 및 VL을 포함하는 (4가) IgG 포맷의 경우, 이러한 힌지부는 전형적으로 CH1 도메인을 CH2 도메인과 연결한다. VHH의 경우, 이러한 힌지부는 전형적으로 가장 C-말단 sdAB/VHH를 Fc 부분에 연결한다. 일 구현예에서, 힌지는 IgG1 또는 2 또는 3 또는 4의 것일 수 있다. 이는 그러한 인간 힌지부일 수 있다. 일 구현예에서, 힌지부는 인간 IgG1 컨센서스 서열의 것이다. 일 구현예에서, 힌지부는 두르발루맙의 것이다. 일 구현예에서, 힌지부는 두르발루맙 힌지부의 변이체일 수 있다.
본원에 제시된 다수의 폴리펩타이드는 신호 또는 리더 서열을 포함한다. 이 경우, 특히 바람직한 폴리펩타이드는 신호 또는 리더 서열이 제거된 것이다.
약학적 조성물
일 구현예에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 결합 분자, 특히 항체; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 본 발명의 결합 분자, 즉 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 결합 분자뿐 아니라 담체, 안정제, 부형제, 희석제, 용해제, 계면활성제, 유화제, 보존제 및/또는 보강제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 고체 형태 또는 액체 형태이다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 분말, 정제, 용액 또는 에어로졸 형태일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 냉동된 형태로 제공된다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 멸균된 약학적 조성물로 공급될 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 보강제를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물에 이러한 보강제가 존재하지 않는다. 또한, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 특히 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 첨가하여 혼합하는 것을 포함하는 약학적 또는 의약제 조성물의 제조 공정을 제공한다.
치료학적 조성물에서 약제학적으로 허용가능한 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 담체를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 그래서 약학적 조성물은 환자에 의해 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액체, 겔, 시럽제,슬러리 및 현탁제로서 제형화된다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 본원에 사용된 바와 같이 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 제형 담체, 용액 또는 본 발명의 조성물의 원하는 특징을 강화하기 위한 첨가제를 지칭한다. 부형제는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 완충제 (예를 들어, 사이트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 바이카보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁제는 리포솜 또는 생분해성 미소구 안에 캡슐화될 수 있다. 적절한 담체는 단백질, 폴리펩타이드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머성 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 비활성 바이러스 입자와 같은 크고 느리게 대사되는 거대분자일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 조성물의 일부 특징, 예를 들어 pH, 삼투압몰농도, 점도, 투명도, 색, 등장도, 냄새, 멸균성, 안정성, 분해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 목적으로 제형화제 (formulation material)를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체에 대한 충분한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)에서 이용가능하다. 부가적인 약학적 조성물은 지속 또는 조절 전달 제형으로 본 발명의 결합 분자를 수반하는 제형을 포함한다. 다양한 지속 또는 조절 전달 수단을 제형화하는 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다. 본 발명의 결합 분자는 또한 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캅셀제, 콜로이드형 약물 전달 시스템에 또는 마크로에멀젼 안에 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 Remington's Pharmaceutical Sciences에도 개시되어 있다.
개체는 전형적으로 약학적 조성물, 즉 본 발명의 결합 분자를 치료학적 유효량으로 투여받게 될 것이다. 용어 "치료학적 유효량"은 전형적으로 표적 질환 또는 병태를 치료, 개선 또는 방지하거나, 또는 검출가능한 치료학적 또는 예방적 효과를 발휘하기 위해 필요한 치료학적 물질의 양을 지칭한다. 인간 개체에 정확한 치료학적 유효량은 질환 상태의 중증성, 개체의 전반적인 건강 상태, 개체의 나이, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내약성/반응에 따라 달라질 것이다. 이 양은 일상적인 실험을 통해 결정할 수 있으며, 이는 임상의의 판단 내이다. 일반적으로, 치료학적 유효량은 1일 당 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg일 것이다. 대안적으로, 용량은 1일 당 1 내지 500mg, 예를 들어 10 내지 100, 200, 300 또는 400 mg/일일 수 있다. 일 구현예에서, 주어진 용량의 양은 특정한 기능을 달성하기에 적어도 충분하다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 치료 중인 병태에 대한 다른 치료제와, 특히 TNF-α 차단제와 조합하여 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자와 함께 사용되는 제2 약물은 항-염증제이다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 이러한 추가의 물질과 동시에, 연속적으로 또는 분리하여 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 제2 치료학적 물질과 동일한 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 동일한 조성물로 제공되거나 또는 본 발명의 결합 분자와 함께 사용될 수 있는 약물의 예로는 TNF-α 차단제, 라파마이신, 우스테키누맙 (ustekinumab), 또는 자가면역 또는 염증 질환의 표준 관리로서 사용되는 물질 등이 있다. 본 발명의 결합 분자와 함께 이용가능한 TNF-α 차단제의 예로는 비-제한적으로 인플릭시맙 (infliximab), 아달리무맙 (adalimumab), 에타너셉트 (etanercept), 골리무맙 (golimumab) 및 세르톨리주맙 (certolizumab) 등이 있다. 일 구현예에서, 제2 약물은 TNF-α에 특이적인 항체이다. 일 구현예에서, 투여되는 제2 약물은 스테로이드일 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 치료학적 물질은, 약학적 제제에서, 단위 용량 형태로 존재할 수 있다. 적합한 용량은 환자의 체중에 따라 환자에 대해 계산될 수 있으며, 예를 들어, 적절한 용량은 0.01 내지 20mg/kg, 예를 들어 0.1 내지 20mg/kg, 예를 들어 1 내지 20mg/kg, 예를 들어 10 내지 20mg/kg 또는 예를 들어 1 내지 15mg/kg, 예를 들어 10 내지 15mg/kg 범위일 수 있다. 본 발명에서 인간 질환을 효과적으로 치료하기 위한 적절한 용량은 본 발명의 듀얼 표적화 단백질의 0.01 내지 1000 mg, 예를 들어 0.1 내지 1000 mg, 예를 들어 0.1 내지 500 mg, 예를 들어 500 mg, 예를 들어 0.1 내지 l00 mg, 또는 0.1 내지 80 mg, 또는 0.1 내지 60 mg, 또는 0.1 내지 40 mg, 또는 예를 들어 1 내지 100 mg, 또는 1 내지 50 mg 범위일 수 있으며, 이는 비경구로, 예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 이러한 용량은, 필요에 따라, 의사가 적절하게 선택한 적절한 시간 간격으로 반복적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 예를 들어, 저장하기 위해 동결건조하고, 사용하기 전 적절한 담체에서 재구성할 수 있다. 동결건조 및 재구성 기법이 적용될 수도 있다.
본 발명의 결합 분자 및 약학적 조성물은, 비-제한적으로, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수강내, 뇌실내, 진피를 통해, 피부를 통해 (예를 들어, WO 98/20734), 피하, 복막내, 비강내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로 등의 임의의 경로에 의해 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 투여하기 위해 하이포스프레이 (hypospray) 역시 이용할 수 있다. 조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복막내, 정맥내 또는 근육내에 의해 달성될 것이거나, 또는 조직의 간질 공간으로 전달될 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 투여는 정맥내 투여에 의한 것이고, 예를 들어, 바람직한 일 구현예에서, 투여는 정맥내 주사에 의한 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 투여는 피하 투여에 의한 것이며, 예를 들어 피하 주사에 의한 것이다. 조성물은 또한 대상 특정 조직으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 부위-특이적인 또는 표적화된 국소 전달 기법을 통해 투여된다. 부위-특이적인 또는 표적화된 국소 전달 기법의 예로는 결합 분자의 다양한 이식가능한 디포 소스 (implantable depot sources) 또는 국소 전달 카테터, 예를 들어, 주입 카테터, 삽입 (indwelling) 카테터 또는 바늘 카테터, 합성 그래프트, 외막 랩 (adventitial wraps), 션트 및 스텐트, 또는 기타 이식가능한 기구, 부위 특이적인 담체, 직접 주사 또는 직접 적용 등이 있다.
투여량 치료 (dosage treatment)는 1회 투여 일정 (single dose schedule) 또는 수회 투여 일정일 수 있다. 제품이 주사 또는 주입용인 경우, 이는 오일성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 용액 또는 현탁물의 형태를 취할 수 있으며 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산화제와 같은 제형제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 결합 분자, 특히 항체는 사용하기 전 적절한 멸균 액체로 재구성하기 위한 건조 형태일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물은 동결건조된 형태로 제공된다. 만일 조성물이 위장관을 이용한 경로에 의해 투여할 경우, 그 조성물은 결합 단백질을 분해로부터 보호하지만, 위장관에 흡수되면 결합 분자를 방출하는 물질을 함유하여야 할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 분무가능한 제형 (nebulisable formulation)은 예를 들어 호일 외막 안에 포장된 단일 용량 단위 (예, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이얼)로서 제공될 수 있다. 각 바이얼은 단위 용량을 소정의 체적으로, 예를 들어 2 ml을 용매/용액 완충제 중에 수용한다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여하기 위한 수단을 제공하는 용기 (receptacle) 안에 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 사전 충진된 주사기 안에 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 탑재된 주사기를 제공한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물이 탑재된 자동-주입기를 제공한다.
일 구현예에서, 제형은 흡입 등의 국소 투여용 제형으로서 제공된다. 적합한 흡입가능한 제제로는 흡입성 산제, 추진 가스를 함유한 정량식 에어로졸 또는 추진 가스가 없는 흡입성 용액 등이 있다. 활성 물질을 함유하는 본 발명에 따른 흡입성 산제는 전술한 활성 물질과 생리학적으로 허용가능한 부형제의 혼합물 또는 전술한 활성 물질 단독으로 구성될 수 있다. 이러한 흡입성 산제는 단당류 (예, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류 (예, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당 및 다당류 (예, 덱스트란), 폴리알코올 (예, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염 (예, 염화나트륨, 칼슘 카보네이트) 또는 이들 간의 혼합물을 함유할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적절하게 사용되며, 특히 락토스 또는 글루코스의 사용시, 오직 이의 수화물 형태인 것만은 아니다.
폐에 침착 (deposition)하기 위한 입자는 입자 크기가 10 미크론 미만, 예를 들어 1-9 미크론, 예를 들어 1 내지 5 μm이어야 한다. 활성 성분 (예, 항체 또는 단편)의 입자 크기가 가장 중요하다. 흡입성 에어로졸을 제조하기 위해 사용될 수 있는 추진 가스는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 적합한 추진 가스는 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄과 같은 탄화수소 및 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염소화 및/또는 불소화된 유도체와 같은 할로탄화수소 중에서 선택된다. 전술한 추진 가스는 그 자체로 또는 이들의 혼합물로 사용될 수 있다. 특히 적합한 추진 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택되는 할로겐화 알칸 유도체이다. 전술한 할로겐화 탄화수소들 중에서, TG134a (1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227 (1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이의 혼합물이 특히 적합하다. 추진-가스 함유 흡입 에어로졸은 또한 공용매, 안정제, 표면-활성제 (계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH를 적정하기 위한 수단 등의 기타 성분을 함유할 수 있다. 이들 성분들은 모두 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 추진 가스-함유 흡입 에어로졸은 활성 물질을 최대 5 중량%로 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은, 활성 성분을 예를 들어, 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%로 함유한다.
대안적으로, 국소 폐 투여는 또한 액체 용액 또는 현탁물 제형을, 예를 들어 네불라이저와 같은 장치, 예를 들어 압축기와 연결된 네불라이저 (예를 들어, Pari Master(R) 압축기가 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 네불라이저, 제조사 Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.)를 이용하여 투여함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 분무가능한 제형은, 예를 들어 호일 외막으로 포장된 1회 용량 단위 (예, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이얼)로서 제공될 수 있다. 각 바이얼은 단위 용량을 소정의 체적으로, 예를 들어 2 ml을 용매/용액 완충제 중에 수용한다. 본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자, 특히 항체를 포함하는 조성물이 탑재된 주사기를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체의 단위 용량이 탑재된 사전 충전된 주사기를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체가 탑재된 자동-주입기를 제공한다. 추가적인 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체가 탑재된 IV 백을 제공한다. 또한, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체는 바이얼 안에 동결건조된 형태로 또는 비슷한 용기 안에 동결건조된 형태로 제공된다.
또한, 본 발명의 결합 분자는 유전자 요법을 이용함으로써 투여할 수 있을 것으로 예상된다. 이를 달성하기 위해, 적절한 DNA 성분의 통제 하에, 필수 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 분자를, 항체 체인이 DNA 서열로부터 발현하여 인 시추에서 조립하도록 환자에게 도입된다.
본 발명의 조성물은 제형화되면 개체에 직접 투여할 수 있다. 치료할 대상은 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 인간 투여용으로 적합하다. 특히 바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다.
일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자가 다른 물질과 함께 투여되는 경우, 이 2가지는 동시에, 순차적으로 또는 분리하여 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 이들 2가지는 동일한 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 이식하기 전, 이식과 동시에 및/또는 이식 후 투여된다. 예를 들어, 이는 또한 본원에 언급된 임의의 것과 같은 세포, 조직 또는 장기의 이식과 동시에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 개체에 이식된 물질은 이식하기 전 생체외에서 처리되는 것일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 이식된 물질의 거부를 방지 또는 낮추기 위해 사용된다. 일 구현예에서, 이는 이식된 물질에 대한 면역 반응을 방지, 치료 또는 개선하기 위해 사용된다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 이는 이식편대숙주 질환과 관련하여 이러한 목적으로 사용된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 결합 분자를 포함하는 키트로 확장된다. 일 구현예에서, 본 발명의 임의의 결합 분자를 포함하는 키트는, 선택적으로 투여 지침과 함께 제공된다. 또 다른 구현예에서, 키트는 하나 이상의 기능 분석을 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 하나의 챔버 또는 다중 챔버형 사전 충전된 주사기를 포함하는 키트가 제공된다. 또한, 본 발명은 1회 용량 투여 단위용 키트를 제공한다.
병리학적 병태 , 의료 및 진단 용도
또한, 의약제로서 이용하기 위한 본 발명의 결합 분자의 용도를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위해 제공된다. 결합 분자를 참조하는 본원에 언급된 다양한 치료학적 용도에서, 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물이 달리 언급되지 않은 한 또한 사용될 수 있으며, 그 반대도 가능함에 유념할 수 있다. 또한, 본 발명의 결합 분자는 생체내 진단 및 시험관내 진단 등의 진단에, 예를 들어 개체의 샘플에 대해 수행되는 이러한 진단에 이용할 수 있다.
아래에 추가로 기술된 바와 같이, 본 발명의 결합 분자는 병태를 치료하기 위해 이용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘다를 지칭하며, 여기서 목적은 부적절한 생리학적 변화 또는 장애를 방지하거나 또는 서행 (약화)하는 것이다. 유익한 또는 요망하는 임상 결과로는 비-제한적으로 검출 가능하든 또는 검출 불가능하든, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화 안됨), 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 완화 또는 호전 및 (부분 또는 완전) 관해를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존과 비교해 생존 연장을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 대상은 병태 또는 장애에 이미 걸린 개체뿐 아니라 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상 또는 병태 또는 장애를 예방하여야 하는 대상을 포함한다.
바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 면역 시스템을 조절하기 위해 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 면역 시스템의 세포를 자극하거나, 예를 들어 면역 시스템의 특정 세포를 활성화하기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 세포를 증폭하도록 자극할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 결합 분자를 이용해, TNFR2를 발현하는 세포를 그 표면에서 활성화한다. 예를 들어, 대상 세포는 백혈구 세포, 특히 T 세포일 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자를 이용해 T reg 세포를 활성화한다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자를 이용해 T reg 세포를 자극할 수 있으며, 그래서 면역 반응을 억제, 감소 또는 방지할 수 있다.
본 발명이 면역 시스템을 조절하는 능력은, 이것이 예를 들어, 자가면역 장애 또는 염증성 장애를 표적으로 하기에 특히 양호한 방식임을 의미한다. 그래서, 본 발명은 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법에 이용하기 위한 본 발명의 결합 분자 또는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 하기한 이러한 방법에 사용하기 위한 결합 분자 또는 약학적 조성물을 제공한다:
(a) 장애는 이식편대숙주 질환 (GvHD)이며, 바람직하게는 여기서 방법에 사용하기 위한 결합 분자는 세포, 조직 또는 장기를 이식하기 전, 이식과 동시에 또는 이식한 후 투여되거나; 또는
(b) 장애는 백혈구, 바람직하게는 T 세포, 더 바람직하게는 Teff 세포의 기능부전 또는 원치않는 증식을 수반하는 것이고; 이러한 장애는 예를 들어 Treg의 개수 및/또는 면역억제 특성과 불균형인, Teff의 개수 또는 활성 증가로 인해, Teff 세포 대비 Treg의 불균형을 함께 나타낼 수 있으며, 일 구현예에서, 본 발명은 Treg를 촉진하고, 특히 작용자 세포와의 균형을 정상으로 또는 정상쪽으로 이동시킨다.
(c) 장애는 염증성 장 질환 (예, 궤양성 대장염, 크론 질환 및 셀리악 질환), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 피부 자가면역 질환, 예를 들어 심상성 천포창 또는 수포성 유사천포창 및 1형 당뇨병 및 죽상동맥경화증으로부터 선택된다.
본 발명은 이식편대숙주 질환 (GVHD)을 치료하는데 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 세포, 조직 또는 장기 이식하기 전 Treg 활성을 촉진하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명은 세포를 이식하기 전, 특히 줄기 세포를 이식하기 전, 바람직하게는 조혈 줄기 세포를 이식하기 전에 Treg 활성을 촉진하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 이식하기 전 수여체에서 Treg를 자극하기 보다는, 본 발명은 숙주에 이식할 세포, 조직, 또는 장기에서 Treg를 증폭하기 위해 사용된다. 추가의 구현예에서, 이는 비-악성 조혈 질환의 치료의 일환으로 이용된다.
본 발명은 이식체, 예를 들어 이식된 세포, 조직 또는 장기에 대한 면역 반응을 낮추거나, 방지하거나 또는 치료하기 위해 이용할 수 있다. 그래서, 본 발명은 이식편대숙주 질환 (GvHD)을 낮추거나, 방지하거나 또는 치료하기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 이식되는 것이 세포 집단과 같은 세포인 그러한 방식으로 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 이식되는 물질은 조혈 줄기 세포 (HSC)이거나 또는 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 이식되는 물질은 장기 또는 조직, 예를 들어, 심장, 폐, 신장, 각막 또는 기타 조직 이식일 수 있다. 다른 구현예에서, 이식되는 물질은 피부 그래프트와 같은 그래프트일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자를 투여하여 이식된 세포, 조직 또는 장기에 대한 원치않는 면역 반응을 치료, 방지 또는 개선하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 이식 수행을 실제 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 이식하기 전, 이식하는 중에 및/또는 이식한 후 개체에 제공된다. 추가의 구현예에서, 결합 분자를 개체에 투여하는 대신, 본 방법은 이식할 물질을 이식하기 전 결합 분자로 생체외 처리하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 질환 자체를 치료, 예방 또는 개선하기 보다는, 질환에 대한 치료, 즉 이식된 세포, 조직 또는 장기가 GvHD를 예방하거나 또는 심각성을 낮춤으로써 효과적이도록 보장하는 것을 돕기 위해 이용된다. 그래서, 본 발명은 질환이 세포, 조직 또는 장기의 이식에 의해 치료되는 다양한 구현예들에 적용될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 병태는 줄기 세포 이식, 예를 들어 조혈 줄기 세포 (HSC) 이식을 통해 치료되는 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 이식에 의해 치료될 대사 축적 장애 (metabolic storage disorder)가 있거나 또는 달리 영향을 받는다. 개체는 글리코겐 축적 질환, 뮤코다당증 (mucopolysaccharidoses), 고셰병 (Gaucher's Disease), 헐러스 질환 (Hurlers Disease), 스핑고지질증 (sphingolipidoses), 이염성 백질 영양장애 (metachromatic leukodystrophy) 또는 본원에 기술된 치료 및 요법이 유익할 수 있는 임의의 기타 질환 또는 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사 장애를 앓을 수 있거나 또는 달리 이에 영향을 받을 수 있으며, 예를 들어, 비-제한적으로, 중증 복합 면역결핍 (severe combined immunodeficiency), 위스콧-알드리치 (Wiscott-Aldrich) 증후군, 고 면역글로불린 M (IgM) 증후군 (hyper immunoglobulin M syndrome), 케디악-히가시 질환 (Chediak-Higashi disease), 유전성 림프조직구증 (hereditary lymphohistiocytosis), 골석화증 (osteopetrosis), 골생성 부전 (osteogenesis imperfecta), 축적 질환 (storage diseases), 주요 지중해 빈혈 (thalassemia major), 겸상 세포 질환 (sickle cell disease), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증, 소아 류마티스 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis) 및 "Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease", ASH Education Book, 1:319-338 (2000)에 기술된 이러한 질환 또는 장애를 포함하며, 조혈 줄기 세포 이식 요법의 투여에 의해 치료될 수 있는 병리학에 속하므로, 문헌의 내용은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 일 구현예에서, 본 발명이 이식에 관한 것인 경우, 전달은 동종이식 세포, 조직 또는 장기의 전달일 수 있다. 일 구현예에서, 전달되는 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 키메라 항원 수용체 T-세포 (CART) 요법이 필요한 상태이다. 예를 들어, 이러한 요법은 본 발명의 방법의 일부를 구성할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 방법은 세포 집단, 조직 또는 장기에 대한 면역 반응을 치료하거나, 낮추거나 또는 방지함으로써, 개체에서 세포 집단, 조직 또는 장기의 생착을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 결합 분자가 면역 시스템을 조절하는 능력은 또한 자가면역 질환을 표적화하하기 위한 특히 유용한 접근법일 수 있게 만든다. 그래서, 다른 구현예에서, 치료할 개체는 자가면역 장애를 가진다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 자가면역 장애는 다발성 경화증이다. 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 개체는 궤양성 대장염을 가진다. 다른 특히 바람직한 구현예에서, 병태는 경피증이다. 일 구현예에서, 치료할 병태는 루푸스이다. 자가면역 질환에 대한 추가적인 예로는 경피증, 크론 질환, 1형 당뇨병 또는 그외 본원에 언급된 자가면역 병태 등이 있다. 일 구현예에서, 치료할 자가면역 질환은 궤양성 대장염, 크론 질환, 셀리악 질환, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 루푸스, 그레이브 질환 및 1형 당뇨병으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 개체는 1형 당뇨병이 있으며, 치료된다. 일 구현예에서, 병태는 죽상동맥경화증이다.
바람직한 일 구현예에서, 치료받는 병태는 원치않는 염증을 수반하는 병태이다. 바람직한 일 구현예에서, 병태는 관절염이다. 예를 들어, 본 발명을 이용해 류마티즘 또는 골관절염을 치료할 수 있다. 치료할 수 있는 질환에 대한 비-제한적인 타입의 예로는 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염, 건선 관절염 및 소아 관절염 등이 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료할 병태는 다발성 경화증, 강직성 척추염, 크론질환 및 궤양성 대장염으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명이 Treg 세포를 자극하는 능력은 알레르기를 치료하기 위한 방법으로서 이용된다. 다른 구현예에서, Treg 세포를 자극하는 능력은 천식을 치료하기 위한 방식으로 이용될 수 있다.
검출 및 진단
본 발명의 결합 분자를 이용해 TNFR2를 검출할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 결합 분자를 검사 샘플과 접촉시키는 단계 및 결합 분자의 모든 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 결합 분자는 결합 분자의 검출을 가능하게 하는 효소로 표지되거나 또는 효소와 연결될 수 있으며, 그래서 결합 분자가 결합한다. 일 구현예에서, 이러한 검출 방법은 검사 샘플에서 세포가 표면에 TNFR2를 발현하는지 유무를 검출하기 위한 방식으로서 예를 들어, ELISA 분석 또는 유세포 측정에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 시험관내 검출에 이용될 수 있으며, 이는 또한 생체내 TNFR2 검출에 이용될 수도 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 표지된 결합 분자를 투여한 다음 개체 신체에서 항체 위치를 검출하는 것을 포함하는 생체내 TNFR2 검출 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 병태를 검출하는데, 예를 들어, TNFR2를 발현하는 세포의 감소를 식별하는데, 특히 TNFR2를 발현하는 세포의 특정 하위집단의 감소를 식별하는데 이용할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 환자를 TNFR2 수준을 토대로, 예를 들어 TNFR2를 발현하는 특정 세포 타입의 수준을 토대로 하위 분류하는 것을 포함하는 환자 층화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 결합 분자 및 선택적으로 TNFR2 검출 방법에 결합 분자를 이용하기 위한 설명서를 포함하는 TNFR2 검출 키트를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 TNFR2의 수준, 예를 들어 TNFR2를 발현하는 특정 세포 타입의 수 또는 그 위치와 같이 TNFR2의 검출에 기반하여 개체에 약물 투여 여부를 결정하기 위한, 동반 진단 (companion diagnostic)으로서 본 발명의 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 결합 분자는 촬상 (imaging)에 이용할 수도 있다. 일 구현예에서, 결합 분자는 생체내 촬상에 이용할 수 있다. 그래서, 또한, 본 발명의 표지된 결합 분자를 개체에 투여한 다음 표지물질을 검출하는 것을 포함하는 촬상 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 촬상은 TNFR2를 발현하는 세포를 생체내에서 검출가능하게 할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 이러한 세포의 국지화 (localisation) 또는 증가 (build-ups)를 식별하는데 이용할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 시험관내 촬상 방법에 이용할 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이, 본 발명은 개체를 치료하기 위해 이용할 수 있다. "개체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 진단, 예후 예측 또는 요법이 요망되는 모든 개체, 특히 포유류 개체를 의미한다. 포유류 개체는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 기니아피그, 토끼, 랫. 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다.
본 발명의 결합 분자는 또한 T 세포 증식, 특히 T reg 세포 증식을 자극하기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 시험관내 또는 생체외에서, 예를 들어 T reg 세포를 본 발명의 결합 분자와 접촉시킴으로써 수행된다. 다른 구현예에서, 본 발명은 그런 후, 예를 들어 T reg 집단을 증폭시킨 후 또는 세포가 개체에 전달된 후 증폭이 생체내에서 이루어지도록 결합 분자와 접촉시킨 후, 세포를 개체에 전달하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 구현예들
본 발명은 또한 장애를 앓고 있거나 또는 발병 위험이 있는 개체에 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 이식편대숙주 질환 (GvHD)을 치료 또는 예방하기 위한 것이며, 결합 분자를 개체에 투여하고, 세포, 조직 또는 장기를 개체에 이식하는 것을 포함하며, 결합 분자가 이식하기 전, 이식하는 중 또는 이식한 후 개체에 투여되는, 상기한 방법을 제공한다.
본 발명은 장애가 다음과 같은 상기한 방법을 추가로 제공한다:
(a) 장애는 백혈구, 바람직하게는, T 세포, 더 바람직하게는, T reg 세포의 수적 감소, 기능부전 또는 원치않는 증식을 수반하는 것이거나; 또는
(b) 장애는 Treg 수적 증가 및/또는 기능 증가가 유익할 수 있는 것이거나,
(b) 장애는 염증성 장 질환 (예, 궤양성 대장염, 크론 질환 및 셀리악 질환), 죽상동맥경화증, 루푸스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창 및 수포성 유사천포창으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법에 이용하기 위한 의약제의 제조에서 본 발명의 결합 분자의 용도를 제공한다.
본 발명은 의약제가 하기 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것인, 상기한 용도를 추가로 제공한다:
(a) 장애는 백혈구, 바람직하게는, T 세포, 더 바람직하게는, T reg 세포의 기능부전 또는 원치않는 증식을 수반하는 것이거나; 또는
(b) 장애는 염증성 장 질환 (예, 궤양성 대장염, 크론 질환 및 셀리악 질환), 루푸스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 죽상동맥경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창 및 수포성 유사천포창으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 결합 분자를 개체에 투여하고, TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 바람직하게는 결합 분자는 표지되고, TNFR2에 대한 결합 분자의 결합이 표지물질을 통해 검출되는, 진단 방법을 제공한다.
번호 매긴 구현예
이하 본 발명의 추가적인 바람직한 구현예들을 제시한다:
[1]. TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 결합 분자로서, 결합 분자가 FcγR 독립적인 TNFR2 작용제이고, TNFR2에 대한 결합가가 2 이상인, 결합 분자.
[2]. 결합 분자가
(a) TNFR2를 발현하는 세포의 표면 상에서 TNFR2를 올리고머화하여, 바람직하게는 세포 표면 상에서 TNFR2 분자 6개 이상을 군집할 수 있거나;
(b) TNFR2 신호전달을 촉발할 수 있거나; 및/또는
(c) 백혈구, 바람직하게는 T 세포, 더 바람직하게는 Treg 세포의 증식을 자극할 수 있는, [1]의 결합 분자.
[3]. (a) 결합 분자가 혈청 반감기를 변화시키는 모이어티를 포함하고, 바람직하게는 상기 모이어티가 Fc 꼬리, 혈청 알부민, 혈청 알부민의 결합제인 모이어티 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
(a) 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 2가이거나;
(b) 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 3가이거나;
(c) 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 4가이거나; 또는
(d) 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 적어도 4인, [1] 또는 [2]의 결합 분자.
[4]. (a) 결합 분자가 항체이거나;
(b) 결합 분자가 TNFR2에 대한 리간드를 포함하는 항체이거나;
(c) 결합 분자가 항체 불변 영역의 적어도 일부, 바람직하게는 Fc 영역을 포함하거나; 또는
(d) 결합 분자가 TNFR2에 대한 리간드를 포함하고, 바람직하게는 상기 리간드가 TNFα 또는 림포톡신-α로부터 유래하고,
바람직하게는, 상기 결합 분자가 하기 항체인, [1] - [3] 중 어느 하나의 결합 분자:
(a) 하나 이상의 항체 중쇄의 N-말단과 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 포함하는 항체; 또는
(b) 하나 이상의 항체 경쇄의 N-말단과 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 포함하는 항체.
[5]. (a) 항체가 2가 항체이거나;
(b) 항체가 3가 항체이거나;
(c) 항체가 4가 항체이거나;
(d) 항체가 6가 항체이거나;
(e) 항체가 중쇄 단독 항체이거나;
(f) 항체가 단일 도메인 Ab (sdAb), VHH 또는 나노바디와 같은 단일 도메인 항체이거나;
(g) 항체가 항체 2 이상의 다량체이거나;
(h) 항체가 다량체 형성 모이어티, 바람직하게는 테나신-c 펩타이드 (TNC)을 포함하거나 또는 이와 연결되고, 바람직하게는 상기 항체가 테나신-c 펩타이드 서열을 통해 연결된 항체 2 이상의 다량체이거나;
(i) 항체가 TNFR2의 리간드로부터 유래한, 바람직하게는 TNF-α 또는 림포톡신-α로부터 유래한 하나 이상의 분자와 연결된, [4]의 결합 분자.
[6]. (a) 항체에는 Fc 영역이 없거나; 또는
(b) 항체가 Fc 수용체와 결합할 수 있는 변형된 Fc 영역을 포함하는, [4] 또는 [5]의 결합 분자.
[7]. 결합 분자가 하기로부터 선택되는 항체 포맷을 가진 항체인, 전술한 항목들 중 어느 하나의 결합 분자:
- Fc 수용체 결합을 제거하는 Fc 변형을 가진 IgG;
- IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형을 가진 scFv:IgG;
- IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형을 가진 IgG-HC:TNC;
- IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형을 가진 scFv:IgG-HC:TNC; 및
- IgG 6량체;
여기서,
- HC는 IgG의 중쇄를 나타내고;
- LC는 IgG의 경쇄를 나타내고;
- scFv:IgG는 IgG 분자와 연결되거나 또는 IgG 분자의 일부를 형성하는 scFv를 나타내고; 및
- HC:TNC는 테나신-c 삼량체화 도메인 펩타이드 (TNC)를 포함하거나 또는 이와 연결된 중쇄 (HC)를 나타냄.
[8]. 결합 분자가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 포맷을 가진 항체인, [1] - [7] 중 어느 하나의 결합 분자:
- Fab-LC:scFv;
- IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형, 바람직하게는 N297A를 가진, IgG-HC:scFv;
- IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형, 바람직하게는 N297A를 가진, IgG-LC:scFv;
- IgG-LC:scFv-HC:scFv;
- LC:scFv-HC:scFv-IgG-HC:scFv;
- LC:scFv-HC:scFv-IgG-LC:scFv;
- LC:scFv-HC:scFv-IgG-LC:scFv-HC:scFv; 및
- IgG-HC-TNC-scFv;
- sdAb/VHH
여기서:
- HC는 IgG의 중쇄를 나타내고;
- LC는 IgG의 경쇄를 나타내고;
- LC:scFv는 경쇄와 연결되거나 또는 경쇄의 일부를 형성하는 scFv를 나타내고;
- HC:scFv는 중쇄와 연결되거나 또는 중쇄의 일부를 형성하는 scFv를 나타내고;
- HC:TNC는 테나신 (TNC)를 포함하거나 또는 이와 연결된 중쇄 (HC)를 나타내고;
- TNC-scFv는 scFv와 연결되거나 또는 scFv에 결합된 테나신을 나타내고;
- sdAb는 단일 도메인 항체를 나타내고;
- VHH는 낙타과 항체의 가변성 중쇄 영역을 나타내며,
바람직하게는, 결합 분자는 항체이고, 하기로부터 선택되는 항체 포맷을 가짐:
- Fab-scFv;
- IgG-HC:scFv;
- LC:scFv-HC:scFv-IgG1; 및
- LC:scFv-HC:scFv-IgG1-TNC.
[9]. TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 결합 분자로서, 결합 분자가 FcγR 독립적인 TNFR2 작용제이고, TNFR2에 대한 결합가가 2 이상이고, TNFR1이 아닌 TNFR2에 결합하는 돌연변이 TNF-α, 및 폴리펩타이드를 올리고머화하는 Fc 영역 또는 테나신 펩타이드 서열 또는 이 둘다를 포함하고,
바람직하게는, 상기 결합 분자는:
(a) 항체 서열을 포함하지 않는 것이거나;
(b) TNFR1이 아닌 TNFR2에 결합하는 돌연변이 TNF-α 및 테나신 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하거나;
(c) TNF-α 돌연변이가 TNF80이거나; 및/또는
(d) TNFR2에 대한 결합가가 3 이상, 바람직하게는 6 이상인, 결합 분자.
[10]. 의약제로서 사용하기 위한 [1] - [10] 중 어느 하나의 결합 분자.
[11]. 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법에 이용하기 위한 것이고, 바람직하게는,
(a) 상기 장애가 이식편대숙주 질환 (GvHD)이고, 바람직하게는, 상기 결합 분자가 세포, 조직 또는 장기를 이식하기 전, 이식과 동시에 또는 이식한 후 투여되는 방법에 이용하기 위한 것이거나; 또는
(b) 상기 장애가 백혈구, 바람직하게는 T 세포, 더 바람직하게는 Treg 세포의 기능부전 또는 원치않는 증식을 수반하는 장애이거나; 또는
(c) 상기 장애가 염증성 장 질환 (예, 궤양성 대장염, 크론 질환 또는 셀리악 질환), 죽상동맥경화증, 루푸스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창 및 수포성 유사천포창으로부터 선택되는, [1] - [9] 중 어느 하나의 결합 분자.
[12]. TNFR2를 발현하는 표적 세포를 [1] - [9] 중 어느 하나에 따른 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 증식을 자극하는 방법.
[13]. [1] - [9] 중 어느 하나에 따른 결합 분자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
[14]. 검사 샘플을 [1] - [9] 중 어느 하나에 따른 결합 분자와 접촉시키고, TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하고,
바람직하게는, 상기 결합 분자가 표지되고, TNFR2에의 결합 분자의 결합을 표지 물질을 통해 검출하는, TNFR2를 검출하는 방법
[15]. 진단 방법에 이용하기 위한 것이고, 상기 방법이 제1항 내지 제15항 중 어느 하나에 따른 결합 분자를 개체에 투여하고, TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하고,
바람직하게는, 상기 결합 분자가 표지되고, TNFR2에의 결합 분자의 결합을 표지 물질을 통해 검출하는, [1] - [9] 중 어느 하나에 따른 결합 분자.
본원에 언급된 모든 문헌들은 원용에 의해 통합된다. 본원에서 부정 관사 ("a" 및 "an")와 같은 용어를 사용해 하나를 언급하는 것은 명시적으로 달리 언급되지 않은 한 복수를 망라한다. 다른 구현예에서, 본원에서 어떤 것을 "포함하는"으로 언급하는 경우, 본 발명은 언급된 것으로 "본질적으로 구성"될 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 언급된 것으로 "구성"될 수 있다. 달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명에 속하는 당해 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가진다.
실시예
실시예 1 - 재료 및 방법
서론
이하 후속 실험에 언급된 실험을 수행시 사용한 재료 및 방법을 요약 기술한다.
세포주 및 세포 배양 조건
HEK293T 세포, HeLa 세포, HeLa-TNFR2 (Weiss et al., 1997) 세포, HT1080-TNFR2 (Gerspach et al., 2006, Cell Death Differ., 13(2): 273-284) 및 Kym-1 세포는 10% FCS (GIBCO, EU Approved, South America)가 첨가된 RPMI 1640 배지 (Sigma-Aldrich, Irvine, United Kingdom)에서 배양하였다. 세포는 표준 조건에서 배양하였다 (5% CO2, 37℃).
항체 클로닝 , 생산 및 정제
사내 조작한 TNFR2-특이적인 항체 (Medler et al., 2019)의 cDNA 단편을 코딩하는 중쇄 및 경쇄를 구축하고, 서열분석한 다음 pCR3 발현 벡터 (Invitrogen)에 표준 PCR 및 클로닝 기법을 이용해 클로닝하였다. 대상 아미노산 서열을 코딩하는 합성 DNA 단편과 표준 클로닝 기법을 이용해 항체 체인의 변이체 (돌연변이, 융합 단백질)를 제작하였다. TNFR2-특이적인 항체를 위한 발현 플라스미드는 전형적으로 FLAG-태그를 포함한다.
HEK293T 세포에서 형질감염 시약 PEI (폴리에틸렌이민; Polyscience Inc., Warrington, USA)를 이용해, 예를 들어 Medler and Wajant (2021)에 기술된 바와 같이, 항체 및 항체 변이체를 생산하였다. 상층액으로 분비된 단백질 양을 정량하기 위해, SDS-PAGE와, 사내 생산한 FLAG-태깅된 표준 단백질을 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다 (항-FLAG M2 항체, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).
생산된 TNFR2-특이적인 항체를 함유한 상층액을 항-FLAG 아가로스 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 항-FLAG M2 친화성 겔 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에 FLAG-태깅된 항체를 결합시킨 후, FLAG-펩타이드 (100 ㎍/ml) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 과량으로 사용해 항체를 용출시키고, 분획으로 수집하였다. TBS-완충화된 시스템으로 정제를 수행하였다. TBS를 PBS로 교체하기 위해 단백질을 밤새 +4℃에서 투석하였다.
Non-FLAG-태깅된 항체는 단백질 A 크로마토그래피와 이후 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제한 단백질/항체의 순도 및 농도를 SDS-PAGE 및 은 염색으로, 기지 분자량의 단백질이 지정된 양으로 함유된 Amersham의 "SDS 전기영동용 저 분자량 보정 키트" (GE Healthcare UK Limited, Little Chalfont, UK)를 비교로 이용해, 결정하였다. 은 염색 키트는 Thermo Scientific (Rockford, USA)에서 구입하였다.
항체 포맷
도 1은 TNFR2 결합 부위가 N-말단에 단방향으로 배향된 항체 포맷들을 제시하고, 각각의 명칭과 도메인 구조를 나타낸다. 도에서 다양한 항체 포맷에 제시된 명칭에 사용된 약어는 다음과 같다: CI = 클론 식별자, 예를 들어 C4, C19 등이고; N297A는 인간 IgG2 중쇄에서 FcγR 상호작용 저하에 해당하는 돌연변이를 나타내고; N-RGY는 IgG1 6량체화를 촉진하는 돌연변이 + N297A 돌연변이를 나타내고; TNC는 개개 항체 3개를 함께 삼량체로 조립할 수 있도록 작동하는 중쇄 C-말단에 존재하는 테나신-C 삼량체화 도메인 펩타이드를 나타낸다. 항체 포맷 및 N-말단 항원 결합 개수를 각각 아래 표에 요약 개시한다.
정보를 요약한 표들
표 1 - 도 1의 항체 및 결합가
항체 포맷 TNFR2에 대한 결합가
CI-Fab 1
CI-Fab2 2
CI-IgG1(N297A) 2
ScFv:CI-IgG1(297A) 4
CI-IgG1(N297A)-HC:TNC 6
ScFv:CI-IgG1(N297A)-HC:TNC 12
CI-IgG1(N-RGY) 12
도 7은 TNFR2 결합 부위가 N-말단과 C-말단 양쪽에 구성된 항체 포맷을 나타내고, 각각의 명칭과 도메인 구조가 표시된다. 클론 식별자, N297A 변형의 존재 및 테나신 삼량체 형성 펩타이드의 존재에 대해서도 동일한 약어가 도 1에서와 같이 사용된다.
표 2 - 도 1의 항체 및 결합가
항체 포맷 TNFR2에 대한 N-말단 및 C-말단 항원 결합 부위 개수 및 전체 결합가
CI-Fab-LC:scFvCI 2 (N-말단에 1개 및 C-말단에 1개)
CI-IgG1(N297A)-HC:scFvCI 4 (N-말단에 2개 및 C-말단에 2개)
CI-IgG1(N297A)-LC:scFvCI 4 (N-말단에 2개 및 C-말단에 2개)
CI-IgG1(N297A)-LC:scFvCI-HC:scFvCI 6 (N-말단에 2개 및 C-말단에 4개)
LC:scFvCI-HC:scFvCI-IgG1(N297A)-HC:scFvCI 6 (N-말단에 4개 및 C-말단에 2개)
LC:scFvCI-HC:scFvCI-IgG1(N297A)-LC:scFvCI 6 (N-말단에 4개 및 C-말단에 2개)
LC:scFvCI-HC:scFvCI-IgG1(N297A)-LC:scFvCI-HC:scFvCI 8 (N-말단에 4개 및 C-말단에 4개)
CI-IgG1(297A)-HC:TNC-scFvCI 12 (N-말단에 6개 및 C-말단에 6개)
하기 표 3은 각 항체의 폴리펩타이드를 발현하기 위해 사용한 발현 벡터 2종을 비롯해, 도 1-26에 언급되고 아래 실시예들에 기술된 결합 분자들을 요약한다.
표 3 - 도 1 내지 27에서 사용된 단백질: 열거된 pDualyx 발현 플라스미드에 의해 코딩된 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열
단백질 명칭 발현 플라스미드(들) 발현 폴리펩타이드
C4-IgG1(N297A) pDualyx-010pre pDualyx-011pre 서열번호 3 & 28
C4-IgG1-LC:GpL pDualyx-030pre pDualyx-029pre 서열번호 4 & 29
C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4 pDualyx-010pre pDualyx-012pre 서열번호 3 & 30
C4-IgG1(N297A)-LC:scFvC4 pDualyx-013pre pDualyx-011pre 서열번호 5 & 28
C4-IgG1(N297A)-LC:scFvC4-HC:scFvC4 pDualyx-013pre pDualyx-012pre 서열번호 5 & 30
C4-Fab1 pDualyx-010pre pDualyx-019pre 서열번호 3 & 31
C4-Fab1-LC:scFvC4 pDualyx-013pre pDualyx-019pre 서열번호 5 & 31
C4-Fab2 pDualyx-010pre pDualyx-020pre 서열번호 3 & 32
C4-Fab2-LC:scFvC4 pDualyx-013pre pDualyx-020pre 서열번호 5 & 32
C4-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-010pre pDualyx-044 서열번호 3 & 33
C4-IgG1(N297A)-HC:RGY pDualyx-010pre pDualyx-118 서열번호 3 & 34
C4-IgG1(N297A)-HC:TNC-scFvC4 pDualyx-010pre pDualyx-119 서열번호 3 & 35
C4(scFv)-IgG1(N297A) pDualyx-022 pDualyx-021 서열번호 6 & 36
C4(scFv)-IgG1(N297A)-LC:scFvC4 pDualyx-023 pDualyx-021 서열번호 7 & 36
C4(scFv)-IgG1(N297A)-HC:scFvC4 pDualyx-022 pDualyx-024 서열번호 6 & 37
C4(scFv)-IgG1(N297A)-LC:scFvC4-HC:scFvC4 pDualyx-023 pDualyx-024 서열번호 7 & 37
C4(scFv)-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-022 pDualyx-051 서열번호 6 & 38
C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC19 pDualyx-010pre pDualyx-080 서열번호 3 & 39
C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC27 pDualyx-010pre pDualyx-082 서열번호 3 & 40
C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC40 pDualyx-010pre pDualyx-063 서열번호 3 & 41
C19-muIgG1(D265A) pDualyx-005 pDualyx-006 서열번호 8 & 42
C19-IgG1-LC:GpL pDualyx-032 pDualyx-031 서열번호 9 & 43
C27-IgG1(N297A) pDualyx-092 pDualyx-091 서열번호 10 & 44
C27-IgG1(N297A)-LC:GpL pDualyx-093 pDualyx-091 서열번호 11 & 44
C40-IgG1(N297A) pDualyx-077 pDualyx-075 서열번호 12 & 45
C40-IgG1(N297A)-LC:GpL pDualyx-076 pDualyx-075 서열번호 13 & 45
C19-gG1(N297A)-HC:scFvC19 pDualyx-016pre pDualyx-017pre 서열번호 14 & 46
C27-IgG1(N297A)-HC:scFvC27 pDualyx-092 pDualyx-108 서열번호 10 & 47
C40-IgG1(N297A)-HC:scFvC40 pDualyx-077 pDualyx-111 서열번호 12 & 48
C1-IgG1-LC:GpL pDualyx-028 pDualyx-027 서열번호 15 & 49
C9-IgG1(N297A)-LC:GpL pDualyx-087 pDualyx-085 서열번호 16 & 50
C29-IgG1(N297A)-LC:GpL pDualyx-090 pDualyx-088 서열번호 17 & 51
C31-2-IgG1(N297A)-LC:GpL pDualyx-071 pDualyx-069 서열번호 18 & 52
68/69-IgG1(N297A)-LC:GpL pDualyx-040pre pDualyx-041pre 서열번호 19 & 53
C19-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-016 pDualyx-149 서열번호 14 & 54
C19(scFv)-IgG1(N297A) pDualyx-151 pDualyx-150 서열번호 25 & 55
C19(scFv)-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-151 pDualyx-152 서열번호 25 & 56
C19(scFv)-Fab2-HC:TNC pDualyx-151 pDualyx-153 서열번호 25 & 57
C40-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-077 pDualyx-159 서열번호 12 & 62
C40(scFv)-IgG1(N297A) pDualyx-161 pDualyx-160 서열번호 27 & 63
C40(scFv)-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-161 pDualyx-162 서열번호 27 & 64
C40(scFv)-Fab2-HC:TNC pDualyx-161 pDualyx-163 서열번호 27 & 65
C27-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-092 pDualyx-154 서열번호 10 & 58
C27(scFv)-IgG1(N297A) pDualyx-156 pDualyx-155 서열번호 26 & 59
C27(scFv)-IgG1(N297A)-HC:TNC pDualyx-156 pDualyx-157 서열번호 26 & 60
C27(scFv)-Fab2-HC:TNC pDualyx-156 pDualyx-158 서열번호 26 & 61
C4-IgG1(N297A)-LC:GpL-HC:scFvC4 pDualyx-030 pDualyx-012 서열번호 4 & 30
C4-Fab1-LC:scFvC9 pDualyx-112 pDualyx-019 서열번호 20 & 31
C4-Fab1-LC:scFvC27 pDualyx-113 pDualyx-019 서열번호 21 & 31
C4-Fab1-LC:scFvC29 pDualyx-114 pDualyx-019 서열번호 22 & 31
C4-Fab1-HC:scFvC40 pDualyx-116 pDualyx-019 서열번호 24 & 31
C4-Fab1-HC:scFv31.1 pDualyx-115 pDualyx-019 서열번호 23 & 31
하기 표 4는 상기 표 3에 언급된 발현 구조체에 의해 코딩된 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드의 서열번호를 나타낸다.
표 4 - 표 3에 언급된 발현 플라스미드에 의해 코팅된 단백질의 서열번호
발현 플라스미드 LC / HC 서열번호
pDualyx-010pre LC 서열번호 3
pDualyx-030pre LC 서열번호 4
pDualyx-013pre LC 서열번호 5
pDualyx-022 LC 서열번호 6
pDualyx-023 LC 서열번호 7
pDualyx-005 LC 서열번호 8
pDualyx-032 LC 서열번호 9
pDualyx-092 LC 서열번호 10
pDualyx-093 LC 서열번호 11
pDualyx-077 LC 서열번호 12
pDualyx-076 LC 서열번호 13
pDualyx-016pre LC 서열번호 14
pDualyx-028 LC 서열번호 15
pDualyx-087 LC 서열번호 16
pDualyx-090 LC 서열번호 17
pDualyx-071 LC 서열번호 18
pDualyx-040pre LC 서열번호 19
pDualyx-112 LC 서열번호 20
pDualyx-113 LC 서열번호 21
pDualyx-114 LC 서열번호 22
pDualyx-115 LC 서열번호 23
pDualyx-116 LC 서열번호 24
pDualyx-151 LC 서열번호 25
pDualyx-156 LC 서열번호 26
pDualyx-161 LC 서열번호 27
pDualyx-011pre HC 서열번호 28
pDualyx-029pre HC 서열번호 29
pDualyx-012pre HC 서열번호 30
pDualyx-019pre HC 서열번호 31
pDualyx-020pre HC 서열번호 32
pDualyx-044 HC 서열번호 33
pDualyx-118 HC 서열번호 34
pDualyx-119 HC 서열번호 35
pDualyx-021 HC 서열번호 36
pDualyx-024 HC 서열번호 37
pDualyx-051 HC 서열번호 38
pDualyx-080 HC 서열번호 39
pDualyx-082 HC 서열번호 40
pDualyx-063 HC 서열번호 41
pDualyx-006 HC 서열번호 42
pDualyx-031 HC 서열번호 43
pDualyx-091 HC 서열번호 44
pDualyx-075 HC 서열번호 45
pDualyx-017pre HC 서열번호 46
pDualyx-108 HC 서열번호 47
pDualyx-111 HC 서열번호 48
pDualyx-027 HC 서열번호 49
pDualyx-085 HC 서열번호 50
pDualyx-088 HC 서열번호 51
pDualyx-069 HC 서열번호 52
pDualyx-041pre HC 서열번호 53
pDualyx-149 HC 서열번호 54
pDualyx-150 HC 서열번호 55
pDualyx-152 HC 서열번호 56
pDualyx1-153 HC 서열번호 57
pDualyx-154 HC 서열번호 58
pDualyx-155 HC 서열번호 59
pDualyx-157 HC 서열번호 60
pDualyx-158 HC 서열번호 61
pDualyx-159 HC 서열번호 62
pDualyx-160 HC 서열번호 63
pDualyx-162 HC 서열번호 64
pDualyx-163 HC 서열번호 65
하기 표 5는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 CDR 서열들이 하기 실시예에 언급된 VHH계 항체 이외에 본 실시예에서 사용한 다양한 항체 포맷들의 항원-결합 부위에 대한 출발점으로 이용한, 구체적인 항체 클론의 CDR 서열들을 나타낸다. 음영은 단순히 동일한 클론으로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 CDR을 표시하기 위한 것이다.
표 5 - 특정 항- TNFR2 항체 클론 #의 CDR 아미노산 서열
항체 도메인 CDR1 CDR2 CDR3
C1 VL RSSTGAVTTSNYANGTNNRTP (서열번호 66) GTNNRTP (서열번호 67) ALWYSNHWV (서열번호 68)
C1 VH DDYIH (서열번호 99) WIDPENSDTEYASKFQGKAT
(서열번호 100)		 TTGLWLRTAIDY (서열번호 101)
C4 VL KASQDVDTAVA (서열번호 69) WASTRHT (서열번호 70) QQYYSVPPT (서열번호 71)
C4 VH SYDIN(서열번호 102) WIYPRDGDTKYNEKFKGKAI
(서열번호 103)		 LTGPYWYFDV
(서열번호 104)
C8 VL KASQDVDTAV (서열번호 72) WASTRHT (서열번호 73) QQYYSVPPT (서열번호 74)
C8 VH DDYIH (서열번호 105) WIDPENSDTEYASKFQGKAT (서열번호 106) GLWLRTAIDY (서열번호 107)
C9 VL SASSSVSYMH (서열번호 75) STSNLAS (서열번호 76) QQRSSYPPT (서열번호 77)
C9 VH TAGMQ (서열번호 108) WINTHSGEPKYAEDFKGRFA
(서열번호 109)		 WDGTGY (서열번호 110)
C15 VL RASENIDNYGISFMY (서열번호 78) AASNQGS (서열번호 79) QQSKEVPYT (서열번호 80)
C15 VH DYEMH(서열번호 111) VVDPGTGDTASNQKFKG (서열번호 112) RYYGSRESMDY (서열번호 113)
C16 VL KASQNVGTNVA (서열번호 81) SASFRYS (서열번호 82) QHFNSFPLT (서열번호 83)
C16 VH RYWMS (서열번호 114) ESDPDSSTINYAPSLKDKFI (서열번호 115) EGYYDNEGYFDV (서열번호 116)
C19 VL KASQNVGTNVA (서열번호 84) SASYRYS (서열번호 85) QQFDSHPLT (서열번호 86)
C19 VH IHGMS (서열번호 117)
 WINTYSGVPTYANDFKGRFA (서열번호 118) ARDEVRRGFGFAY (서열번호 119)
C25 VL KASQNVGSNVD (서열번호 87) SASYRYS (서열번호 88) QQYNSHPLT (서열번호 89)
C25 VH DLYIH (서열번호 120) WIDPETDNTIYDPKFQGKAS (서열번호 121) STGLLQWYFDV (서열번호 122)
C31-1 VL RASQSLVHSNGNTYLQ (서열번호 90) KVSNRFS (서열번호 91) SQSTHVPFT (서열번호 92)
C31 VH GYYWN (서열번호 123) YITNDGSNNYNPSLKNRIS (서열번호 124 DGGWFHYFDY (서열번호 125)
C31-2 VL RSSTGAVTTSNYAN (서열번호 93) TNNRAP (서열번호 94) ALWYSNHWV (서열번호 95)
C31 VH GYYWN (서열번호 126) YITNDGSNNYNPSLKNRIS (서열번호 127 DGGWFHYFDY (서열번호 128)
C40 VL KASQDINKFIA (서열번호 96) YTSTLQP (서열번호 97) LQYDNLYT (서열번호 98)
C40 VH GMGVG (서열번호 129) HIWWDDDKYYNPALKSRLT (서열번호 130) IAGTRYFDV (서열번호 131)
표 6: 클론의 특정 VH 및 VL 가변 영역 서열
항체 도메인 서열번호
C1 VL 294
C1 VH 305
C4 VL 295
C4 VH 306
C8 VL 296
C8 VH 307
C9 VL 297
C9 VH 308
C15 VL 298
C15 VH 309
C16 VL 299
C16 VH 310
C19 VL 300
C19 VH 311
C25 VL 301
C25 VH 312
C31-1 VL 302
C31 VH 313
C31-2 VL 303
C31 VH 314
C40 VL 304
C40 VH 315
표 7은 추가의 관련 단백질들에 대한 서열번호를 제공한다.
표 7 - TNFR2 , TNFα 변이체 , LTα 및 기타 단백질에 대한 서열번호
서열번호 단백질
서열번호 1 인간 TNFR2 - 등재 번호 NP_001057
서열번호 2 테나신 펩타이드 - 닭 테나신의 아미노산 110 - 139
서열번호 132 인간 TNF-α - 등재 번호 NP_000585
서열번호 133 인간 림포톡신-α - 등재 번호 NP_000586
서열번호 134 TNC-sc(mu)TNF(143N/145R)
서열번호 135 & 136 두르발루맙 중쇄 불변 영역 서열: 서열번호 135
두르발루맙 경쇄 불변 영역 서열: 서열번호 136
서열번호 316 CH1 영역이 없는 두르발루맙 중쇄 불변 영역 서열: 서열번호 316
서열번호 137 TNFR2(mu)-pCMV-SPORT6 (Tnfrsf1b) (Origene) cDNA 클론 IMAGE:3710793; GenBank: BC039127.1
서열번호 138 TNFR2-cyno; Macaca fascicularis; GenBank: EHH62644.1
서열번호 139 인간 테나신 펩타이드 - 인간 테나신의 아미노산 110 - 139 (NP_002151.2)
표 8 - VHH계 서열들에 대한 서열번호
서열번호 단백질
서열번호 140 내지 153 제작한 TNFR2에 특이적인 VHH 서열 14종
서열번호 198 내지 212 C188 변이체 VHH 서열:
C188- VHH _1: 서열번호 148/ C188- VHH _2: 서열번호 149 / C188-VHH_3: 서열번호 150 / C188- VHH _4: 서열번호 151 / C188- VHH _5: 서열번호 152 / C188-VHH_6: 서열번호 153 / C188- VHH _7: 서열번호 154/ C188-VHH_8: 서열번호 155/ C188- VHH _9: 서열번호 156/ C188-VHH_10: 서열번호 157/ C188- VHH _11: 서열번호 158/ C188-VHH_12: 서열번호 159/ C188- VHH _13: 서열번호 160 / C188-VHH_14: 서열번호 161 / C188-VHH_15: 서열번호 162
서열번호 197 3XVHHC188(G4S)1-Fc(Durv)
표 9 - C4에 기반한 변이체 서열
서열번호 단백질
서열번호 261 및 258 C4-IgG1(Durv)-HC:scFvC4(G4S)4 서열:
경쇄 (신호 펩타이드 + C4- VL + durvaCL ) - 서열번호 261
중쇄 (신호 펩타이드 + C4- VH + DURVA [CH1 + 힌지 + CH2 + CH3] + scFvC4(C4-Vh-링커-C4-VL): 서열번호 258
서열번호 262 내지 265 C4에 대한 경쇄 변이체 서열:
C4_ VL _1 - 서열번호 262 / C4_ VL _2 - 서열번호 263 / C4_ VL _3 - 서열번호 264 / C4_ VL _1 - 서열번호 265
서열번호 278 내지 281 C4에 대한 경쇄 변이체 서열:
C4_ VH _1 - 서열번호 278/ C4_ VH _2 - 서열번호 279/ C4_ VH _3 - 서열번호 280 / C4_ VH _4 - 서열번호 281
표 10: C4의 서열 최적화 변이체 : C4_ VH 및 C4_ VL 변이체 조합:
변이체 명칭 중쇄 경쇄
C4 C4_VH C4_VL
C4_var1 C4_VH_1 C4_VL_1
C4_var2 C4_VH_1 C4_VL_2
C4_var3 C4_VH_2 C4_VL_1
C4_var4 C4_VH_2 C4_VL_2
C4_var5 C4_VH_1 C4_VL_3
C4_var6 C4_VH_1 C4_VL_4
C4_ var7 C4_ VH _2 C4_ VL _3
C4_var8 C4_VH_2 C4_VL_4
C4_var9 C4_VH_3 C4_VL_1
C4_var10 C4_VH_3 C4_VL_2
C4_var11 C4_VH_4 C4_VL_1
C4_var12 C4_VH_4 C4_VL_2
C4_var13 C4_VH_3 C4_VL_3
C4_var14 C4_VH_3 C4_VL_4
C4_var15 C4_VH_4 C4_VL_3
C4_ var16 C4_ VH _4 C4_ VL _4
겔 여과
MabPac SEC-1 컬럼 (Thermo Fisher)에서 UltiMate 3000 HPLC 시스템 (Thermo Fisher)과 수성 SEC-1 컬럼 성능 체크 표준 (#AL0-3042, Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 이용한 겔 여과를 통해, 정제한 항체 융합 단백질 (50-200 ㎍)에서 이의 네이티브 질량과 잠재적인 단백질 응집을 분석하였다. 대안적으로, Gravitrap 또는 MAbSelect 컬럼을 이용하였다.
세포 결합 실험
인간, 시노몰구스 원숭이 및 뮤라인 TNFR2에 대한 TNFR2-표적화 항체의 친화성 (KD-값)을 세포 평형 결합 실험에 의해 평가하였다. 따라서, HEK293T 세포를 인간, 시노몰구스 또는 마우스 TNFR2를 코딩하는 발현 플라스미드 또는 빈 벡터 대조군 (EV)으로 PEI 방법을 이용해 일시적으로 형질감염하였다. HEK293T 형질감염체 분액에 지정된 GpL (가우시아 프린셉스 루시퍼라제)-태깅된 항-TNFR2 항체를 농도를 증가시키면서 처리하여 표준 세포 배양 조건 하에 1시간 동안 인큐베이션한 다음 빙랭한 PBS로 2번 헹구었다. 세포를 마지막으로 0.5% FCS 첨가된 RPMI 1640 배지 50 ㎕에 재현탁하여 96-블랙 웰 플레이트로 옮겼다. 1.5 μM 기질 코엘렌테라진 (Carl Roth, Karlsruhe, Germany)을 첨가한 후 직접 세포 관련 루시퍼라제 활성 (RLU; 상대적인 광 단위)을 LUmo 발광측정기 (anthos Mikrosysteme GmbH, Friesoythe, Germany)를 이용해 검출하였다.
TNFR2-특이적인 항체 및 항체 변이체의 친화성을 또한 HeLa 세포 및 인간 TNFR2를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 이용해 평가하였다. HeLa 및 HeLa-TNFR2 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 다음날, 세포에 GpL-표지된 TNFR2 항체를 지정된 농도로 첨가해 1시간 동안 37℃에서 챌린지하였다. 미결합 항체를 제거하기 위해 세포를 빙랭한 PBS로 10번 헹구었다. 그런 후, 세포를 긁어 배지 (RPMI, 0.5% FCS) 50 ㎕ 중에 수집한 다음 전술한 측정을 위해 블랙 96-웰 플레이트로 옮겼다. (HeLa-TNFR2으로부터 수득한) 전체 결합에서 (HeLa 세포로부터 수득한 값) 비-특이적인 결합을 제하여 여러가지 TNFR2-특이적인 항체/항체 변이체들의 특이적인 결합을 계산하였다. 수득한 값은 GraphPad Prism 5의 비-선형 회귀 분석 옵션을 이용해 피팅하였다.
IL8 유도 분석
사이토카인 유도는 TNFR2 신호전달에 따른 반응으로 NFκB 활성화에 대해 잘-확립된 판독 정보이다. 본 발명자들은 시판 입수가능한 IL8 ELISA 키트 (IL8 ELISA Set, BD OptEIA™, San Diego, USA)를 이용해 TNFR2를 자극한 후 IL8 양을 측정함으로써 NFκB 활성화 강도를 분석하였다.
TNFR2 자극에 반응하여 IL8를 강하게 유도하는 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 96-웰 플레이트 (20.000 세포/웰)에 접종하였다. 다음날, 세포를 대상 TNFR2-표적화 시약 및 올리고머화된 TNF80 (= TNC-sc(mu)TNF(143N/145R), 즉 양성 대조군으로서 TNFR2-선택적인 TNF 변이체 (Chopra et al., 2015)로 자극하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 상층액 50 ㎕을 BD OptEIA™ IL8 ELISA 키트를 제조사의 매뉴얼에 기술된 바와 같이 사용해 분석하였다.
생존성 분석
TNFR2는 생존 단백질 (TRAF2, cIAP1, cIAP2)의 저해 및 TNF 표적화 TNFR1의 동시적인 상향 조절에 의해 일부 세포주/세포 타입에서 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이러한 유형의 반응은 특히 Kym-1 세포에서 입증된 바 있다 (Schneider et al., 1999). TNFR2-표적화 구조체가 이러한 TNFR2 반응을 촉발할 수 있는 지를 검사하기 위해, Kym-1 세포를 96-웰 플레이트 (20.000 세포/웰)에 접종하고, 다음날 TNFR2를 표적화하는 대상 시약으로 자극하였다. 완전한 세포 사멸을 정의하기 위해, 세포 분액에 "세포 사멸"-대조군 혼합물 ((200 ng/ml TNF, 200 ng/ml TRAIL, 200 ng/ml CD95L, 25 ㎍/ml CHX, 1% (w/v) 소듐 아지드))을 처리하였다. 나머지 플라스틱-부착 세포는 마지막으로 크리스탈-바이올렛 용액 70 ㎕로 염색하였다. 20분 후, 플레이트를 dH20로 한번 헹군 다음 공기 중에 건조하였다. 메탄올에 용해하여 OD 595 nm를 PHOmo 광도계 (anthos Mikrosysteme GmbH, Friesoythe, Germany)로 측정해 생존성을 정량하였다. 값들은 무처리 세포 (생존성 100%) 및 세포독성 혼합물로 처리된 세포 (생존성 0%)에 대해 표준화하였다.
대안적인 NFκB 경로의 활성화
p100에서 p52로의 프로세싱은 대안적인 NFκB 경로 활성의 주된 특징이다. 항-TNFR2 항체가 p100 프로세싱을 유도하는 능력을 평가하기 위해, 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 Kym-1 세포를 1 x 106씩 접종하였다. 다음날, 세포를 TNFR2를 표적화하는 대상 시약으로 자극하였다. 표준 세포 배양 조건에서 밤새 인큐베이션한 후, 전체 세포 용해물을 준비한 다음 (PBS로 1x 세척, 세포를 긁어 PBS 1 ml에서 수집하고, 원심분리 (2분, 12000 rpm)하고, 세포 펠릿을 4x Laemmli 샘플 완충제에 용해하여 25초간 최대 진폭으로 초음파 처리 (UP100H Ultrasonic Processor, Hielscher, Germany)하고, 5분간 95℃에서 가열하고, 원심분리 (2분, 12000 rpm)를 통해 파편을 제거하였다. p100 프로세싱을 평가하기 위해 표준 기법 및 표준 장치를 이용한 웨스턴 블롯팅을 Sigma Aldrich (Darmstadt, Germany) 사의 항-p100/p52 항체를 이용해 수행하였다.
재료 및 방법에 대한 참조문헌
Chopra M, Biehl M, Steinfatt T, Brandl A, Kums J, Amich J, Vaeth M, Kuen J, Holtappels R, Podlech J, Mottok A, Kraus S, Jordan-Garrote AL, Bauerlein CA, Brede C, Ribechini E, Fick A, Seher A, Polz J, Ottmuller KJ, Baker J, Nishikii H, Ritz M, Mattenheimer K, Schwinn S, Winter T, Schafer V, Krappmann S, Einsele H, Muller TD, Reddehase MJ, Lutz MB, Mannel DN, Berberich-Siebelt F, Wajant H, Beilhack A. Exogenous TNFR2 activation protects from acute GvHD via host T reg cell expansion. J Exp Med. 2016 Aug 22;213(9):1881-900.
Medler, J., Nelke, J., Weisenberger, D. et al. TNFRSF receptor-specific antibody fusion proteins with targeting controlled FcγR-independent agonistic activity. Cell Death Dis 10, 224 (2019). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1456-x
Medler J, Wajant H. Analysis of FcγR-Dependent Agonism of Antibodies Specific for Receptors of the Tumor Necrosis Factor (TNF) Receptor Superfamily (TNFRSF). Methods Mol Biol. 2021;2248:81-90.
Schneider P, Schwenzer R, Haas E, Muhlenbeck F, Schubert G, Scheurich P et al. (1999). TWEAK can induce cell death via endogenous TNF and TNF receptor 1. Eur J Immunol 29: 1785-1792.
Weiss, T. et al. Enhancement of TNF receptor p60-mediated cytotoxicity by TNF receptorp80: requirement of the TNF receptor-associated factor-2 binding site. J. Immunol. 158, 2398-2404 (1997).
실시예 2: 병렬 구성된 (단방향으로 배향된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 항- TNFR2 항체 C4 변이체에 대한 웨스턴 블롯 분석.
단방향으로 배향된 (병렬 구성된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 항-TNFR2 항체 C4의 Flag-태깅된 변이체를 실시예 1에 기술된 바와 같이 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 분석한 항체 포맷들은 도 1에 나타낸 것이며, 사용된 특이 항체는 클론 4 TNFR2 항체로부터 유래한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 가지고 있어, 도에 표시된 "클론 식별자"는 "C4"이다. 다양한 C4 구조체들 각각의 체인 (HC, LC)을 코딩하는 플라스미드를 세포에 형질감염하였다. 항체 변이체가 함유된 상층액을 농도를 알고 있는 다양한 농도의 항체 표준물질과 함께 WB에 의해 분석하였으며, 상층액 내 항체 변이체의 농도를 표준 항체 신호로부터 결정하였다. 각 항체 변이체에 대해 200 ng을 함유한 소정의 부피의 상층액에 대해 다시 항-인간 IgG 및 항-Flag 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 수득한 결과는 세포로부터 회수한 상층액에서 성공적으로 발현 및 확인된 모든 항체 포맷과 함께 도 2에 나타낸다.
실시예 3: 단방향으로 배향된 (병렬 구성된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체로 처리한 후 TNFR2-매개 IL8 생산
단방향으로 배향된 (병렬 구성된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 항체 변이체의 능력을 TNFR2에 특이적인 오리지널 클론 4 항체로부터 유래한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 변이체를 이용해 분석하였다. 재차, 변이체의 구조는 도 1에 나타낸 것이며, 단 "클론 식별자"는 항원-결합 부위의 오리진을 표시하여 C4이다. 양성 대조군은 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 사용해 수행하였다.
평가를 수행하기 위해, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를, 도 3에 지정된 다양한 C4 구조체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 수득한 결과는 도 3에 나타낸다. 유도된 최대 반응은 양성 대조군으로 포함시킨 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이 TNF(143N/145R)의 고 활성 올리고머 형태를 이용한 경우였으며, 그 결과는 그래프에 점선으로 표시하였다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 분석에서 가장 활성이 높은 항체 변이체는 단방향으로 배향된 (병렬 구성된) 복수의 N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 것이었다. 가장 낮은 IL-8 생산 수준은 TNFR2 결합 부위가 2개 이하인 C4-Fab, C4-Fab2 및 C4-IgG1(N297A) 변이체를 이용한 경우에 관찰되었다.
실시예 4: 단방향으로 배향된 (병렬 구성된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체로 처리한 후 Kym-1 세포에서 TNFR2-매개 세포 사멸
N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 항체 포맷이 Kym-1 세포에서 세포 사멸을 촉발하는 능력을, TNFR2에 대해 특이성을 부여하기 위해 재차 클론 4 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 이용하여 분석하였다. 수득한 결과는 도 4에 나타내며, 항원-결합 부위의 오리진을 나타내기 위해 "C4"를 사용하는 것 외에도 도 1의 약어를 다시 사용하였다.
Kym-1 세포를 도 4에 나타낸 다양한 C4 구조체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 세포 생존성을 크리스탈 바이올렛 염색을 이용해 결정하였다. 수득한 결과는 도 4에 나타낸다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 재차 TNFR2 인게이지먼트 (engagement)의 양성 대조군으로 이용하였다. 세포자살 유도에 가장 효과적인 항체 변이체는 scFv:C4-IgG1(N297A) 및 scFv:C4-IgG1-(N297A)-HC:TNC 변이체였으며, 그 결과는 도 4의 중앙 패널에 나타낸다. 클론 C19, C27 및 C40로부터 유래한 결합 부위에 기반한 결합 분자들의 결과는 도 6에 나타낸다.
실시예 5: 단방향으로 배향된 (병렬 구성된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체로 처리한 후 Kym-1 세포에서 TNFR2-매개 p100 프로세싱
단방향으로 배향된 (병렬 구성된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체가 p100에서 p52으로의 프로세싱을 촉발하는 능력, 즉 TNFR2를 통한 신호 전이 촉발을 평가하였다. Kym-1 세포는 도 5에 나타낸 다양한 C4 변이체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 밤새 자극하였다. 사용된 변이체의 구조를 도 1에 나타내며, 여기서 "C4"는 "클론 식별자"를 나타낸다. 처리는 TNFR2-유발성 세포 사멸을 방지하기 위해 20 μM ZVAD의 존재 하에 수행하였다. 마우스 TNF의 9량체 TNFR2-특이적인 돌연변이 (oligo TNF80)를 양성 대조군으로 이용하였다. 지정된 단백질, p100, p52 및 대조군으로서 β-액틴에 특이적인 항체를 이용해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 수득한 결과는 도 5에 나타낸다.
실시예 6: N-말단 및 C-말단에 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체의 웨스턴 블롯 분석
단방향으로 배향된 (병렬 구성된) N-말단 TNFR2 결합 부위를 가진 항체 변이체에 대해 실시예 2에 기술된 실험을, N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 가진 도 7에 나타낸 C4 항체 변이체를 대상으로 수행하였다. 이들 변이체는 중쇄 및 경쇄에 Flag 태그를 함유하였으며, 단 C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4 변이체의 중쇄는 Flag 태그를 함유하지 않았다.
각각의 C4 구조체를 세포에 형질감염시키고, 세포 상층액으로부터 항체 변이체를 정제하였다. 각 항체 변이체 200 ng을 웨스턴 블롯팅에 이용하였다. Flag-태깅된 변이체를 함유한 상층액을 항-인간 IgG 및 항-Flag 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 수득한 결과는 세포에서 회수한 상층액에서 성공적으로 발현 및 발견된 항체 포맷들 모두 도 8에 나타낸다.
실시예 7: N-말단 및 C-말단에 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 구조체로 처리한 후 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에서 TNFR2-매개 IL8 생산
실시예 3에 기술된 실험과 동일한 실험을 도 7에 나타낸 N-말단 및 C-말단 양쪽에 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 변이체로 또한 수행하였다. 비교를 제공하기 위해, N-말단에만 TNFR2 결합 부위를 가진 여러 개의 항체 변이체를 N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 가진 것과 나란히 검사하였다.
HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 도 9에 나타낸 다양한 C4 구조체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 수득한 결과는 도 9에 나타낸다. 나타낸 데이터는 병행 수행한 실험으로부터 수득하였으며, 우수한 해상도를 위해 3개의 도표로 나타낸다. 양성 대조군 (hTNFR2-특이적인 TNF 돌연변이 TNF(143N/145R)의 고 활성 올리고머 형태)을 이용해 유도된 최대 반응은 점선으로 표시하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 가진 항체 변이체가 가장 우수한 결과를 보이는 경향이 있었으며, 결합가도 영향이 있는 것으로 보인다. 예를 들어, 중앙 패널에 나타낸 결과는 이러한 항체 포맷이 N-말단에만 TNFR2 결합 부위를 가진 C4-IgG1(N297A) 변이체보다 IL-8을 더 높은 수준으로 생산 촉발함을 보여준다.
실시예 8: N-말단 및 C-말단에 구성된 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 구조체를 처리한 후 Kym-1 세포에서 TNFR2-매개 세포 사멸
실시예 4에 기술된 실험과 동일한 실험을 N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 가진 C4 항체 변이체에 대해 또한 수행하였다. Kym-1 세포를 도 10에 나타낸 다양한 C4 구조체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 세포 생존성을 MTT 분석을 이용해 확인하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 양성 대조군으로 이용하였다. 수득한 결과는 도 10에 나타낸다.
실시예 9: 인간 TNFR2를 발현하는 HeLa 세포에 대한 TNFR2 -특이적인 항체의 결합 특성
다양한 클론들로부터 유래한 여러 개의 TNFR2-특이적인 항체의 결합 특성을 TNFR2를 발현하는 Hela 세포를 이용해 평가하였다. 37℃에서 TNFR2를 발현하는 세포에 대한 항-TNFR2 항체 GpL 융합 단백질의 평형 결합을 분석하였으며 수득한 결과는 도 11A에 나타내었다. 각 항체에 대해 특이적인 결합, 비특이적인 결합 및 전체 결합의 수준을 나타내었다. 첫번째 그래프는 TNFR2 결합에 대한 GpL-Flag-TNFwt 양성 대조군의 결과를 나타낸다.
GpL 표지된 항체 대신 GpL 표지된 TNF를 이용하여 추가로 실험을 수행하였다. HeLa-TNFR2 세포에 항-TNFR2 항체를 지정된 양으로 전처리하거나 또는 무처리한 채 두었다. 5 ng/ml GpL-TNF를 첨가하여, 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후 결합을 측정하였다. 비-형질감염 HeLa 세포에 대한 결합성을 분석해 비-특이적인 결합 수치를 구하였다. 수득한 결과는 도 11B에 나타낸다.
실시예 10: αTNFR2 항체의 경쟁
HeLa-TNFR2 세포에 도 12에 나타낸 항-TNFR2 항체 3 - 10 ㎍을 전처리하거나 또는 무처리한 채 두었다. 다양한 aTNFR2-IgG1(N297A)-LC:GpL 변이체를 50 ng/ml로 첨가하고, 실시예 1의 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 1시간 후 결합성을 측정하였다. 수득한 결과는 도 12에 나타낸다.
실시예 11: 4가 mAb로 점유된 TNFR2 분자가 기존 2가 mAb 변이체에 의해 점유된 TNFR2 분자와 비교해 훨씬 더 강한 IL8 유도를 촉발한다
TNFR2-음성 Hela 세포 및 HeLa-TNFR2 세포를, 2가 및 4가 버전의 TNFR2-특이적인 mAb C4 (구조는 삽입도 참조)로 도 13의 (A) 및 (B)에 나타낸 농도로 사용해 8시간 동안 쌍으로 자극하였다. 그런 후, HeLa-TNFR2 상층액에서 TNFR2-유발성 IL8 생산을 분석하였으며, 그 결과는 (B)에 나타낸다. 반복 헹군 세포 (HeLa 및 HeLa-TNFR2)를 세포-관련 GpL 활성에 대해 분석하였다. HeLa 세포에서 수득한 비-특이적인 결합 값을 HeLa-TNFR2 세포로부터 수득한 전체 결합 값으로부터 제하여 TNFR2에 대한 특이적인 결합을 계산하였으며, 수득한 결과는 (A)에 나타낸다. mAb 변이체 2종에서 TNFR2-결합 도메인의 개수에 대한 GpL 리포터 도메인의 개수의 비에 따라 루시퍼라제 활성을 표준화하였다 (1 대 0.5).
mAb 변이체에 의한 IL8 생산을 이의 특이적인 결합에 대해 직접 도표로 작성하였다. 특이적인 결합은 분석에서 세포 수 및 GpL 구조체의 측정한 비활성 (RLU/molecule)을 이용해 "세포 당 점유된 수용체 개수"로 변환하였다. 결과는 (C)에 나타낸다. A에서 수득한 구조체 2종의 최대 결합은 수직 파선으로 나타내었다. 점선은 수용체 점유에 따른 IL8 생산의 선형 회귀를 표시한다.
실시예 12: 인간 TNFR2를 발현하는 HEK293T 세포에 대한 TNFR2 -특이적인 항체의 결합 특성
여러가지 클론으로부터 유래한 항-TNFR2 항체의 결합 특성을 분석하였다. HEK293 세포를 인간, 뮤라인 및 시노몰구스 TNFR2 또는 빈 벡터로 일시적으로 형질감염하였다. 지정된 항-TNFR2 항체 GpL 융합 단백질의 평형 결합을 37℃에서 결정하였다. 빈 벡터가 형질감염된 세포에 대한 결합을 측정해, 비-특이적인 결합 값을 구하였다. 수득한 결과는 도 14에 나타낸다. 인간, 뮤라인 및 시노몰구스 TNFR2 3종 모두에 대해 특이적으로 결합하는 항체는 C19-IgG1-LC-GpL 항체였다. C4-IgG1-LC-GpL 항체는 인간 TNFR2에 결합하지만 원숭이 또는 뮤라인 TNFR2에는 결합하지 않았다. C40-IgG1-LC-GpL 항체는 인간 및 원숭이 TNFR2에 결합하지만 뮤라인 TNFR2에는 결합하지 않았다.
도 15는 항-TNFR2 항체 C4, C19, C27 및 C40 및 이로부터 유래한 4가 CI-IgG1(N297A)-HC:scFvCI 변이체에 의해 인지되는 세포외 TNFR2 부분을 나타낸, TNFR2의 도메인 구조를 도시한다.
아울러, 항-TNFR2 VHHs VHH:C18, VHH:C74, VHH:C188 및 VHH:C238 클론 및 이로부터 유래한 구조체에 의한 TNFR2의 세포외 부분의 인지를 도 35에 기반한 바와 같이, 개략적으로 표시하였다.
실시예 13: 단일 및 이중 특이성 TNFR2 -특이적인 CI- IgG - HC:scFvCI 변이체 의 웨스턴 블롯 분석
실시예 2 및 6에 사용된 방식과 비슷한 방식으로 여러가지 다양한 항체 변이체를 발현시켜 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 분석한 변이체 11종은 서로 다른 클론으로부터 유래한 TNFR2 결합 부위를, 서로 다른 중쇄 변형을 가지고 있었으며, 이들 다수는 또한 C-말단 TNFR2 결합 부위를 가지고 있었으며, 조사한 변이체는 도 16에 나타낸다. 변이체는 실시예 2 및 6에 언급된 방법과 유사한 방법으로 발현 및 분석하였다.
도 16의 상단 패널은 항체를 표지한 Flag 태그에 대한 항-FLAG 항체를 이용한 블롯팅 결과를 도시한다. i) C4-IgG1(N297A), C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4 및 C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC19의 중쇄는 Flag 태그를 함유하지 않으며; ii) 이용한 기존 C19 변이체는 뮤라인 IgG1(D265A) 이소형 형태임에 유념한다. 도 16의 하단 패널은 항-hIgG를 이용한 웨스턴 블롯 결과를 도시한다.
실시예 14: HT1080- Bcl2 - TNFR2 세포에서 TNFR2 -매개 IL8 생산
HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에서 항-TNFR2 항체가 IL-8 생산을 자극하는 능력을 실시예 3 및 7과 비슷한 방식으로 분석하였다. 단일 특이성 항체 변이체 여러 개와 TNFR2에 대해 서로 다른 특이성을 가진 이중 특이성 항체 여러 개를 분석하였다. 평가를 수행하기 위해, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 도 17에 나타낸 다양한 구조체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 수득한 결과는 도 17에 나타내었으며, 상단 패널은 단일 특이성 항체에 대한 결과를 나타내고, 하단 패널은 이중 특이성 항체의 결과를 나타낸다.
상단 패널은, 각 경우에, N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 가진 항체 변이체가 N-말단 TNFR2 결합 부위만 가진 대응하는 항체 변이체와 비교해 TNF를 더 높은 수준으로 생산하도록 자극함을 보여준다. C40-IgG1(N297A)-HC:scFvC40 결합 분자에 대한 결과는 상단 패널에 나타낸 결과에서 특히 긍정적이었다.
실시예 15: 단일 특이성 및 이중 특이성 TNFR2 -특이적인 CI- IgG - HC:scFvCI 변이체로 처리한 후 Kym -1 세포에서 TNFR2 -매개 세포 사멸
단일 특이성 및 이중 특이성 항체가 세포 사멸을 유도하는 능력을 실시예 4 및 8에서 이용된 방식과 비슷한 방식으로 평가하였다. Kym-1 세포를 도 18에 나타낸 다양한 C4 구조체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 세포 생존성을 크리스탈 바이올렛 염색을 이용해 결정하였다. 수득한 결과는 도 18에 나타낸다. 단일 특이성 항체에 대한 결과는 상단 패널에 나타내었으며, 하단 패널에는 바이파라토프 항체의 결과를 나타낸다.
실시예 16: 단일 특이성 및 이중 특이성 TNFR2 -특이적인 CI- IgG - HC:scFvCI 변이체로 처리한 후 Kym-1 세포에서 TNFR2-매개 p100 프로세싱
단일 특이성 및 이중 특이성 항체가 TNFR2를 통해 신호 전이를 달성하는 능력을 실시예 5 및 9와 유사한 방식으로 p100 프로세싱을 관찰함으로써 분석하였다. Kym-1 세포를 도 19에 나타낸 다양한 C4 변이체를 소정의 농도로 함유한 상층액으로 밤새 자극하였다. 처리는 TNFR2-유발성 세포 사멸을 방지하기 위해 20 μM ZVAD의 존재 하에 수행하였다. 마우스 TNF의 9량체 TNFR2-특이적인 돌연변이 (oligo. TNF80)를 양성 대조군으로 이용하였다. 지정된 단백질, p100, p52 및 대조군으로서 β-액틴에 특이적인 항체를 이용해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 수득한 결과는 도 19에 나타낸다.
실시예 17: C4- IgG1 ( N297A )- HC:scFvC4 , C4- IgG1 ( N297A )- LC:scFvC4 및 C4-IgG1(N297A)-LC:scFvC4-HC:scFvC4의 생산 및 기능 분석
도 20에 나타낸 구조체를 실시예 1에 언급되고 이전 실시예들에 채택된 방법으로 평가하였다. 수득한 결과는 도 20에 나타낸다. (A) 은 염색한 SDS-PAGE 겔. (B) 겔 여과 분석. (C) HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에서 IL8 생산. (D) Kym-1 세포에서 세포 사멸 유도. (E) Kym-1 세포에서 p100 프로세싱 유도. 세포 사멸을 방지하기 위해 ZVAD를 첨가하였다.
실시예 18: 활성
아래 표 7은 실시예 1의 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 생산한 이전 실시예들에 채택된 다양한 항체 포맷들의 활성을 요약 개시한다. 분석한 항체 포맷은 C4 클론으로부터 유래한 항원-결합 부위를 가진 것이었으며, 표에서 "Bs"는 항체의 "North" 및 "South" 항원 결합 부위의 개수를 나타낸다. 표는 IL-8 활성에서 관찰된 활성을 요약 개시한다 (활성 I - 고전적인 NFκB 경로 > IL8) 또는 활성 II (TRAF2 고갈 > 대안적인 NFκB 경로 (= p100 프로세싱) 및 Kym-1 사멸)).
표 7 - C4에 기반한 항체 포맷들의 활성 요약
번호 Ab 포맷 Bs 활성 I (IL8) ng/ml 활성 II ( tox ) ng/ml
1 Fab1 1+0 0 0
2 Fab1-scFv 1+1 10 20
3 Fab2 2+0 0 0
4 Fab2-scFv 2+2 50
5 IgG1 2 0 0
6 irrIgG1-HC:scFv 0+2 0
7 IgG1-HC:scFv 2+2 5-20 10-20
8 IgG1-LC:scFv 2+2 5-20 10-20
9 IgG1-LC:scFv-HC:scFv 2+4 5-20 10-20
10 IgG1-TNC 6+0 100 Very low
11 IgG1-RGY* 12+0 20-100 Low
12 LC:scFv-HC:scFv-IgG1 4**+0 10-20 20
13 L/H:scFv-IgG1-LC:scFv 4**+2 5-10 5-10
14 L/H:scFv-IgG1-LC:scFv 4**+2 5-10 5-10
15 L/H:scFv-IgG1-L/HC:scFv 4**+4 5-10 5-10
16 LC:scFv-HC:scFv-IgG1-TNC 12**+0 5-10 10
17 scFv-Fc-TNC 12+0 10
18 scFv-TNC-Fc 12+0 5-20 20
19 IgG1-TNC-HC:scFv 6+6 5-10 10-20
Star2 9+0 5-20 100-200
실시예 19: 생체외 Treg 증폭 평가
특정 TNFR2 결합 분자가 조절성 T 세포를 증폭시키는 능력을 평가하였다. Fab-HC-scFv 포맷의 4가 항체는, Fc 영역의 중쇄에 Fc 기능을 제거하기 위한 N297A 아미노산 돌연변이와 IgG1 Fab를 가진 기본 Fab를 가진다. 4명의 공여체로부터 PBMC를 분리하였으며, 각 공여체로부터 수득한 세포는 분리하여 분석하였다. PBMC를 2일간 107 세포/ml 밀도로 배양하였다. 그런 후, PBMC를 회수해 멀티-웰 플레이트에 106 세포/ml로, 웰 당 세포 500,000씩 접종하였다. 그 후 세포를 다음과 같이 세분하였다: (a) 무처리 대조군 세포; (b) STAR2 작용제 분자 100 ng/ml로 처리되는 세포; (c) 특이성이 단 하나인 4가 항체로 처리되는 세포 (1000 - 0.3 ng/ml); 및 (d) TNFR2에 대해 이중 특이성의 4가 항체로 처리되는 세포 (1000 - 0.3 ng/ml). 4일간 배양한 후, 세포의 생존성을 평가하였다. 세포를 CD3, CD8, CD4, CD25 및 FoxP3 특이적인 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 21은 Treg 세포 및 이의 증폭을 측정하기 위해 CD3+ CD4+ 세포들 중 Foxp3+ CD25+ 세포에 대해 수득한 결과를 상단 패널에 도시한다. 도 21의 하단 패널은 Tcon 세포를 측정하기 위해 CD3+ CD4+ 세포들 중 Foxp3- 세포 결과를 도시한다. 이 둘다 4일 인큐베이션하기 전 세포 수와 비교해 변화 %를 나타낸다.
실시예 20: 생체내 Treg 증폭
동계 FoxP3-Luci 마우스를 이용해 제공된 TNFR2 작용제가 Treg 세포를 증폭하는 능력을 또한 평가하였다. FoxP3-Luci 마우스는 FoxP3와 루시퍼라제의 융합 단백질을 발현하는 형질전환 마우스이다. 이는 Treg 세포의 생체내 부위를 촬상할 수 있다는 점에서 효과적이다. 이 마우스에 TNFR2 작용제를 제공하고 매일 생발광 사진을 촬영하였다. 4일 후, 마우스를 희생시키고, 마우스의 비장에서 분리한 세포에 대해 Foxp3, CD3 및 CD4를 평가하기 위해 이용한 유세포 측정을 이용해 생체외 분석을 수행하였다. 실험의 타임 라인을 도 22 상단 패널 (A)에 요약 표시한다. 생체외 분석 결과는 도 22에 하단 패널 (B)에 나타낸다. 실험은 도 23에 나타낸 바와 같이 치료 군 당 여러 마우스에서 반복 실시하였다.
실시예 21: TNFR2 -특이적인 TNF 구조체의 생산 및 분석
도 24 파트 (A)에 나타낸 TNF-α에 기반한 분자를 구축하였다. 이들 분자들은 모두 TNFR1 결합성을 상실하며 따라서 TNFR2에 특이적인 TNF-α의 돌연변이 형태인 TNF80 분자를 포함하였다. 파트 (A)에 좌에서 우측 방향으로 나타낸 구조들은 다음과 같다:
- Fc -TNC- TNF80 - 이것은 각 폴리펩타이드의 C-말단 영역이 테나신 펩타이드 (TNC)과 그 다음으로 단일한 TNF80 서열 (TNFR2-특이적인 돌연변이 TNF(143N/145R)에 해당하는 TNF80)을 포함하는 Fc 영역을 3개 포함한다. 테나신 펩타이드는 삼량체를 형성하는데, 이는 돌연변이 TNF-α의 삼량체 2개가 존재하는 것을 의미한다.
-Fc - TNF80 - 이는 각 폴리펩타이드가 단일한 TNF80 서열을 포함하는 Fc 영역을 3개 포함하며, 따라서 이 분자에는 돌연변이 TNF-α의 삼량체 2개가 존재한다.
-Fc (DANA)-TNC- TNF80 - 이는 중쇄 변형 D265A 및 N297A (DANA)를 가진 Fc-TNC-TNF80에 해당한다.
-TNF80 - 이는 삼량체 형태의 기본 TNF80 돌연변이에 해당한다.
- TNC- scTNF80 - 이는 TNF80 돌연변이 분자 3개를 포함하는 단쇄 분자에 해당하며, 여기서 체인은 단쇄 폴리펩타이드 3개의 삼량체화를 유발하는 RNC 펩타이드를 추가로 포함한다.
분자를 발현시키기 위해 각각에 대해 뮤라인 용해성 TNF80에 기반한 구조체를 이용하였다. 그런 후, 구조체를 모든 구조체에 함유된 Flag 태그를 이용한 항-Flag 친화성 정제에 의해 정제하였다. 그 후, SDS-PAGE 및 은 염색으로 분석하였으며, 수득한 결과는 도 24, 파트 (B)에 나타낸다. 도 24, 패널 (B)에 나타낸 정제한 단백질에 대한 겔 여과 분석을 수행하였으며, 수득한 결과는 도 24 패널 (C)에 나타내었다. 겔 여과 결과는, 발현된 결합 분자가 응집되지 않으며, 균질한 단백질 종임을 보여준다. 본 실시예에 사용된 방법은 상기 실시예 1에서의 재료 및 방법에 기술된 바와 같다.
실시예 21: 여러가지 포맷의 용해성 뮤라인 TNF80의 작용제 활성
실시예 20에서 언급한 구조체가 TNFR2의 작용제로서 작용하는 능력을 Kym-1 세포를 이용해 평가하여, 결합 분자가 세포 사멸을 유도하는 능력을 측정하였으며, HT1080-TNFR2 세포를 이용해 결합 분자가 IL-8 분비를 유도하는 능력을 측정하였다. 실시예 1의 재료 및 방법에 기술된 방법을 이용하였다. 수득한 결과는 도 25에 나타낸다.
도 25의 상단 패널은 TNFR2를 발현하는 Kym-1 세포를 다양한 muTNF80 변이체를 지정된 농도로 사용해 자극한 다음 다음날 크리스탈 바이올렛 염색으로 구조체가 세포 사멸을 유도하는 능력을 확인한 결과를 도시한다. 알 수 있는 바와 같이, TNC- sc(mu)TNF80 결합 분자는 Fc(DANA)-TNC-TNF80 결합 분자 다음으로 가장 큰 세포 생존성 감소를 나타내었다.
도 25의 하단 패널은 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에 대한 결과를 보여준다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 도 1에 나타낸 다양한 TNF80 변이체를 지정된 농도로 사용해 자극하였다. 다음날, 상층액을 회수해 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 나타낸 데이터는 독립적인 실험 4개로부터 도출하였다. 알 수 있는 바와 같이 기본 뮤라인 TNF80은 가장 낮은 수준의 IL8 유도를 나타내었으며, 다른 결합 분자들은 더 높은 수준으로 IL-8 방출을 자극하였다.
실시예 22: Fc (DANA)-TNC- muTNF80에 의한 생체내 Treg 증폭
TNF80을 포함하는 결합 분자가 TNFR2 작용제로 작용하는 능력을 확인하기 위해, 생체내 실험을 마우스에서 Fc(DANA)-TNC-muTNF80 결합 분자를 이용해 수행하였다. 수득한 결과는 도 26에 나타낸다. 루시퍼라제를 Foxp3 프로모터의 통제 하에 가진 마우스에, Fc(DANA)-TNC-muTNF80를 지정된 양으로 1회 i.v. 주사하고, 생발광 이미징 (BLI)에 의해 매일 분석하였으며, 또한 4일차에 Treg 빈도를 FAC 분석에 의해 평가하였다. BLI 분석 결과는 도 26의 상단 패널에 나타낸다. 도 16의 중앙 패널에는 0일 및 4일 BLI 사진을 도시한다. 4일에 수행한 FAC 분석 결과는 도 26의 하단 패널에 도시한다.
실시예 22: TNFR2에 대한 특이적인 결합 입증
제공된 결합 분자가 TNFR1이 아닌 TNFR2에 결합하는 능력을 설명하기 위해 실험을 수행하였다. HEK293 세포에 다음을 일시적으로 형질감염시켰다: (i) TNFR2 발현 플라스미드; (ii) TNFR1의 세포외 도메인과 GPI 앵커 도메인을 코딩하는 발현 플라스미드; 또는 (iii) 빈 벡터 (ev). 다음날, GpL 태그를 가진 다양한 결합 분자들에서 TNFR2에 결합하지만 TNFR1에는 유의하게 결합하지 않는 능력을 평가하였다. 수득한 결과는 도 27에 나타낸다. 도 27에 나타낸 단백질을 HEK293 세포에 지정된 농도로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 2회 헹군 후, 남아있는 세포 결합된 GpL 활성을 측정하였다. GpL-TNF는 TNF 수용체 양쪽 타입에 결합하는 양성 대조군으로 이용하였다.
실시예 23: 공지된 005-B08 항체의 재구성
공지된 항-TNFR2 항체를 본원에 언급된 포맷으로 이를 배치하기 위한 "재구성"으로, 공지된 항체가 항-TNFR2 길항제 항체인 경우에도, TNFR2에 유용한 작용제가 만들어짐을 설명하기 위해, 공지된 TNFR2 길항제를 제시한 4가 포맷들 중 어느 것으로 재구성하였다. WO2020/089474에 개시된 005-B08 항체를 본원에 언급된 수종의 포맷으로 재구성하였다. 그래서, 포맷 IgG1(N297A)-HC:scFv, IgG1(N297A)-HC:TNC 및 IgG1(N-RGY)의 항체를 제작하였으며, 여기서 항원-결합 부위들은 모두 005-B08 항체로부터 기원하였다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 항체를 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 작용제 활성의 척도로서 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 수득한 결과는 도 28에 그래프로 나타내었다. 양성 대조군으로서 C4-IgG1(N297A)-HC:C4를 이용해 유도된 최대 반응을 그래프에 점선으로 표시하였다. 놀랍게도 재구성된 4가 구조체들은 모두, 오리지널 005-B08 항체가 TNFR2의 길항제이더라도, 우수한 작용제 활성을 발휘하였으며, 이는 항체 포맷의 영향을 보여준다.
실시예 24: 4가 포맷에서 링커 길이 및 scFv 위치 변동
scFv 내 링커 길이와 "Southern" scFv 기가 경쇄 또는 중쇄 C-말단에 연결되는지의 여부가 미치는 잠재적인 영향을, 도 29A에 나타낸 "North" 및 "South" 항체 구조들에서 조사하였다. 여러가지 항체 변이체들은 scFv의 가변성 중쇄 및 경쇄를 연결하는 링커의 길이에 차이가 있으며, 기본 GGGS (G4S) 링커가 3번 ((G4S)3) 또는 4번 ((G4S)4) 반복하여 존재하며, 또한 항체 백본 경쇄 또는 중쇄에 scFv 기의 연결 유무에 차이가 있다.
정제한 C4-IgG1(Durv)-HC:scFvC4(G4S)4 및 C4-IgG1(Durv)-LC:scFvC4(G4S)에 대해 겔 여과를 수행하였으며, 수득한 결과는 도 29B에 나타낸다. 구조체가 TNFR2에 작용제로 작용하는 능력을 또한 작용제 활성의 척도로서 IL-8 방출을 이용해 조사하였으며, 수득한 결과는 도 29C에 나타낸다. 이러한 결과를 수득하기 위해, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체로 형질감염된 HEK293 세포로부터 수득한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 양성 대조군으로서 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다. 4가 구조체는 링커 길이 및 scFv 기가 중쇄 또는 경쇄에 연결되었는지 유무와 무관하게 잘 작동하였으며, 이는 제공된 4가 항체 포맷의 견고한 특성을 보여준다.
실시예 25: C4- IgG1 ( Durv )-HC/ LC:scFvC4 포맷에서 C4 변이체 서열 비교
C4 가변 영역의 변이체를 인 실리코로 제작하고, 서열 최적화를 추가로 보고하기 위한 목적으로, 인간화, 탈면역화 (deimmunization) 및 PTM 책임 (liability)의 제거 측면에서 서열을 최적화하였다. C4 변이체 서열은 C4-IgG1(Durv)-HC/LC:scFvC4 포맷으로 이용하였다. 단백질을 HEK293 세포를 이용해 생산하고, 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제한 변이체를 겔 여과 크로마토그래피로 분석하고 (결과는 도 30, 패널 A에 도시), IL-8 방출을 TNFR2 작용제 활성의 척도로 분석하였다 (결과는 도 30, 패널 B에 도시). IL-8 방출을 측정하기 위해, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체로 자극하였다. 부모 구조체 C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4를 비교 목적으로 포함시켰다. 다음날, 상층액에서 IL8 함량을 ELISA에 의해 분석하였다. 양성 대조군으로서 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다. 도 30에 나타낸 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, C4 변이체가 IL-8 분석에서 가장 효과적이었다.
실시예 26: VHH 항체 제작 및 분석
TNFR2 항체를 제작하는데 추가의 옵션을 제공하기 위해 VHH 발견 캠페인에 착수하였다. TNFR2 표적 단백질 2종 (인간-ECD-Fc 및 뮤라인-ECD-Flag-Fc)과 대조군 단백질을 단일 도메인 항체 (VHH) 라이브러리 (Creative Biolabs library CaVHHL-4)의 파지 디스플레이 스크리닝에 이용하였다. 대안적인 바이오패닝 (biopanning)을 이들 표적 2종에 대해 4회 라운드로 수행하였으며, 양쪽 표적에 대해 특정 VHH를 식별하였으며, 대조군 Fc 태그에 대한 음성 결합 물질을 제거하였다. 클론 153종에 대해 DNA 서열분석을 수행하였으며, 고유한 양성 서열 14종을 식별하였다.
클론 14종 중 8종은 세포 표면에 발현된 인간 TNFR2에 대해 특이적인 결합을 나타내었다. VHH 항체가 TNFR2에 결합하는 능력을 VHH-Fc-GpL 포맷의, 존재하는 특정한 VHH에 차이가 있는 단백질을 이용해 조사하였으며, 수득한 결과는 도 31에 나타내었다. GpL 리포터 도메인을 항체의 Fc 도메인 C-말단에 클로닝하였다. TNFR2-특이적인 VHH-Fc-GpL sdAb 구조체에 대한 평형 결합 분석을 인간 TNFR2를 발현하는 세포를 이용해 37℃에서 수행하였으며, 비-형질감염 대조군 세포로서 HEK293 세포를 함께 이용하였다. 수득한 결과는 도 31에 나타낸다. 인간 TNFR2를 발현하는 형질감염체에 대한 결합 값 (전체 결합 - ●)에서 비-특이적인 결합 값 (Hek293 세포 - X)을 제하여 특이적인 결합 (○)을 구하였다. GraphPad Prism5 소프트웨어의 "1-부위 특이적인 결합 곡선에 대한 비선형 회귀" 기능으로 특이적인 결합을 분석하였다. 도 31에서 알 수 있는 바와 같이, 변이체는 TNFR2에 대해 우수한 특이적인 결합을 나타내었다.
여러 종, 즉 Mus musculus (마우스), Macaca fascicularis (시노몰구스 원숭이) 및 Chlorocebus sabaeus (아프리카 녹색 원숭이)로부터 유래한 TNFR2를 이용해, 비슷한 실험을 또한 수행하여, VHH 영역이 여러 종 유래 TNFR2에 결합하는 능력을 조사하였다. 여러 종 유래 TNFR2에 교차 반응하는 능력은 인간 환자에서 평가하기에 앞서 다양한 모델들에서 항체를 연구하는데 도움이 될 수 있다. 실험들에서 수득한 결과들을 하기 표 8에 나타내며, 표에서 "n.s. b."는 특이적인 결합이 없음을 나타낸다.
표 8: 여러가지 종으로부터 유래한 TNFR2 단백질에 대한 VHH의 결합
VHH 친화성 (ng/ml)
마우스 시노몰구스 녹색 원숭이
C12 n.s.b. n.s.b. 80
C18 > 3000 50 60
C36 n.s.b. 90 80
C74 n.s.b. n.s.b. 60
C118 n.s.b. 50 100
C178 n.s.b. n.s.b. 60
C188 950 450 150
C238 1050 200 170
실시예 27: VHH 항체 도메인을 이용하는 6가 항체
항체 포맷이 결합 친화성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 다음으로 VHH 도메인 항체를 이용해 6가 항체를 제작하였으며, VHH 항체 도메인 여러 개에 대해 3xVHH-Fc-GpL 포맷 항체를 제작하였다. 소정의 6가 항체에서 모든 VHH 도메인들은 동일하였다. 이들 항체의 평형 결합을 실시예 26에서와 동일한 방식으로 조사하였다. 도 32는 37℃에서 인간 TNFR2를 발현하는 세포에 대한 지정된 TNFR2-특이적인 3xVHH-Fc-GpL sdAb 구조체의 평형 결합 결과를 도시한다. GpL 리포터 도메인을 Fc 도메인의 C-말단에 클로닝하였다. 놀랍게도, 수득한 결과는, 6가 포맷 항체가 높은 친화성 결합을 나타내고, 여러가지 VHH들 간의 Kd 편차는 일반적으로 도 31에 나타낸 2가 항체에 대한 결과와 비교해 훨씬 작았다. 6가 및 더 높은 결합가의 포맷에서 가까운 공간적인 근접성으로 복수의 결합 부위들이 배치된 결과가, 결합 친화성에 있어, 특정한 (2가) VHH보다 더 중요할 수 있으며, 이는 6가 포맷의 견고한 결합 특성을 보여주는 것으로 생각된다.
실시예 28: TNFR2에의 TNFα의 결합 차단 평가
결합 부위로서 VHH:C18, VHH:C74, VHH:C188 또는 VHH:C238 VHH 도메인을 가진 VHH-Fc(DANA) 6가 포맷 항체들을 TNFR2에의 TNFα 결합을 차단하는 능력에 대해 비교하였다. 수득한 결과는 도 33에 나타낸다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에 지정된 양의 TNFR2-특이적인 sdAb 구조체를, 또는 음성 대조군으로, 구조체가 TNFR2가 아닌 CD40에 특이적이므로, CD40-특이적인 구조체 3xVHH:CD40(V12t)-Fc(DANA)를 전처리하였다. 모든 샘플에 5 ng/ml GpL-TNF를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후 결합성을 측정하였다. 도 33에서 가장 왼쪽 막대는 양성 대조군의 결과, 즉 다른 구조체가 없는 경우의 결과를 나타내며, 즉 TNFR2에 대한 TNFα 결합성은 100%이다. 그 뒷 막대들은 음성 대조군 값에 대한 %로 활성을 나타낸 지정된 구조체들의 결과를 나타낸다. 6가 항체 포맷에서 VHH:C18, VHH:C74, VHH:C188 및 VHH:C238의 3xVHH-Fc(DANA) 변이체들 모두 TNFR2 수용체에 TNF 결합을 강하게 차단하는 능력을 나타내었다. V12t CD40-VHH는 "A Bispecific Antibody Antagonizes Prosurvival CD40 Signaling and Promotes Vg9Vd2 T cell-Mediated Antitumor Responses in Human B-cell Malignancies A. C Iris de Weerdt, Roeland Lameris, George L. Scheffer, Jana Vree, Renate de Boer, Anita G. Stam, Rieneke van de Ven, Mark-David Levin, Steven T. Pals, Rob C. Roovers, Paul W.H.I. Parren, Tanja D. de Gruijl, Arnon P. Kater, and Hans J. van der Vliet"으로부터 유래한다.
실시예 29: 6가 구조체가 TNFR2에 특이적으로 결합하지만 TNFR1에는 결합하 지 않는 능력
HEK293 세포를 TNFR1 및 TNFR2를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨 다음 다양한 6가 구조체의 결합성을 분석하였으며, 수득한 결과는 도 34에 나타낸다. 분석한 6가 구조체는 도 34에 나타낸다. 빈 벡터로 형질감염된 세포에 대한 결합은 비-특이적인 결합을 위한 음성 대조군으로 이용하였다. TNF-GpL은 성공적인 TNFR1 결합을 위한 양성 대조군으로 이용하였다. 좌측 그래프에서 TNFR1 결합에 대한 결과를 우측의 TNFR2 결합에 대한 대응하는 그래프를 비교함으로써, 6가 구조체들 모두 TNFR1과 비교해 TNFR2에 대해 특이적인 결합을 나타내어, TNFR2에 대한 선택적인 표적화가 가능함을, 알 수 있다.
실시예 30: VHH:C18 , VHH:C188 및 VHH:C238은 TNFR2의 CD4에 결합하고, VHH:C74는 CRD3에 결합한다. 블랙 96-웰 플레이트를 단백질 G로 코팅한 다음 지정된 TNFR2-특이적인 VHH의 3xVHH-Fc(DANA) 버전을 로딩하였다. 미결합 단백질을 제거한 후, 우측 패널에 웨스턴 블롯에서 나타낸 TNFR2(ed)의 GpL-태깅된 결손 돌연변이의 결합성을 고정된 항체 구조체에서 분석하였다. 마지막으로, 이들 GpL 융합 단백질의 결합성을 도 35에 나타낸 바와 같이 정량하였다. 여러가지 CRD 도메인들에 대한 VHH 클론의 결합을 도 15에 대략적으로 나타낸다.
실시예 31: 4가 N-말단-단독 VHH에 기반한 구조체는 강력한 TNFR2 작용제이 다
다음으로 4가 "north-단독" TNFR2-특이적인 sdAb 변이체가 TNFR2 작용제로 작용하는 능력을 조사하였으며, 수득한 결과는 도 36에 나타낸다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 모노- 또는 바이-파라토프 구조체를 함유한 상층액으로 자극하였다. 다음날, 상층액을 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R) (상단 패널) 또는 C4-IgG1(N297A)-HC:C4 (중간 및 하단 패널)를 이용해 유도된 최대 반응을 양성 대조군으로 이용하였으며, 점선으로 표시하였다. 4가 "north" 단독 구조체는 강력한 작용제였다.
실시예 32: 6가 N-말단-단독 TNFR2 -특이적인 sdAb 변이체는 강력한 TNFR2 작용제이다.
다음으로 6가 "north-단독" VHH 항체가 TNFR2 작용제로서 작용하는 능력을 IL-8 방출 및 세포 생존성 둘다를 마커로서 이용해 조사하였다. 수득한 결과는 도 37에 나타낸다. 패널 (A)에 나타낸 결과에서, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체로 자극하였다. 다음날, 상층액을 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 양성 대조군으로 TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 양성 대조군으로서 점선으로 표시하였다. 패널 (B)에 나타낸 결과에서, Kym-1 세포를 다양한 6가 변이체로 자극하고, 다음날 세포 생존성을 MTT 분석을 이용해 확인하였다. 200 ng/ml TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)에 의해 유발되는 최대 사멸을 점선으로 표시하였다. 이 분석은 IL-8 방출 측정에 의해 측정하는 경로와는 분리된 경로를 통해 TNFR2 활성화 및 신호전달을 측정한다. 전반적으로, 그 결과는, 6가 "north-단독" 포맷이 VHH 도메인으로 강력한 TNFR2 활성을 발휘함을, 보여준다.
실시예 33: VHH:C188 - Fc , 2xVHH:C188 - Fc - GpL 및 3xVHH:C188 - Fc의 작용제 활성의 병렬 비교
동일한 VHH 도메인을 채택한 여러가지 항체 포맷의 능력을 비교하였다. VHH:C188-Fc, 2xVHH:C188-Fc-GpL 및 3xVHH:C188-Fc 포맷을 비교하였으며, 이들 각각은 C188 VHH 도메인을 채택하며, 수득한 결과는 도 38에 나타낸다. 도 38, 패널 (A) 및 (B)는 SDS-PAGE (A) 및 겔 여과 (B)에 의한 분석한 정제된 단백질의 결과를 도시한다. 패널 (C)는 IL-8 방출 결과를 도시한다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체로 자극하였다. 다음날, 상층액을 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 양성 대조군으로서 점선으로 표시하였다. 패널 (D)는 지정된 다양한 VHH:C188 변이체로 자극한 Kym-1 세포의 세포 생존성 결과를 도시한다. 자극한 후, 다음날 세포 생존성을 MTT 분석을 이용해 확인하였다. C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4에 의해 유발된 최대 사멸을 점선으로 표시하였다. 포맷 3종 중 가장 강력한 것은 6가 3xVHH:C188-Fc 항체 포맷이었으며, 세포 생존성 감소 및 IL-8 방출 자극이 가장 높았다.
실시예 34: C18 및 C74의 VHH - Fc - GpL , 2xVHH - Fc - GpL 및 3xVHH - Fc - GpL 변이 체의 IL8- 및 세포 사멸-유도 활성의 병렬 비교
C18 및 C74의 VHH-Fc-GpL, 2xVHH-Fc-GpL 및 3xVHH-Fc-GpL 변이체에서 동일한 VHH 결합 도메인을 가진 여러가지 항체 포맷들을, 이전 실시예에서와 동일한 IL-8 및 세포 생존성 분석을 이용해 추가로 비교하였다. 수득한 결과는 도 39에 나타낸다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체로 자극하였다. 패널 (A)는 상층액에서 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석한 결과를 도시한다. 패널 (B)는 세포 생존성 분석 결과를 도시하며, 여기서 Kym-1 세포는 다양한 변이체로 자극한 다음 다음날, 세포 생존성을 MTT 분석을 이용해 확인하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 표시하였다. 흥미롭게도, 6가 포맷은 C18 변이체에 대한 이들 2가지 분석에서 가장 활성이 우수하였다. C74에 대한 6가 포맷은 IL-8 방출을 자극하는데 가장 우수한 포맷이었지만, 어떤 포맷도 세포 생존성에 현저한 감소를 촉발하지 않았다. 이는, C74 VHH 항체가 TNFR2 매개 신호전달 경로들을 촉발하지 않고, 오직 IL-8 방출을 달성하는 경로에서 신호전달을 자극함을 의미하는 것으로 생각된다.
실시예 35: 3xVHH:C188 - IgG1 ( Durv ) 변이체의 VHH 도메인 사이의 링커 길이는 TNFR2 작용제 효과에 영향을 미치지 않는다.
다음으로, 점진적으로 더 긴 링커로 VHH 도메인을 분리하는 효과를 점진적으로 더 긴 링커가 사용된 3xVHH:C188-IgG1(Durv) 항체 포맷을 이용해 조사하였다. 비교하는 서로 다른 항체는 VHH 도메인 사이에 G4S 링커 (GSSSS) 하나를, 도메인 사이에 링커 3개 (G4S)3 또는 도메인 사이에 링커 5개 (G4S)5를 가지고 있다. 수득한 결과는 도 40에 나타낸다. 패널 (A)는 구조체의 도메인 구조를 도시한다. 패널 (B)는 정제한 구조체의 SDS-PAGE 분석을 도시하고, 패널 (C)는 겔 여과 분석의 결과를 도시한다. 패널 (D)는 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체를 함유한 상층액으로 자극한, IL-8 방출 분석의 결과를 도시한다. 다음날, 상층액을 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다. 부모 분자 3xVHH:C188-Fc(DANA)는 비교 목적으로 포함시켰다. 도 40에서 알 수 있는 바와 같이, 패널 (D)는 IL-8 방출에 의해 측정된 바와 같이 전체 링커 길이 증가가 TNFR2 작용제 효과에 영향이 없음을 보여주며, 이는 6가 포맷의 견고한 특성을 추가로 보여준다.
실시예 36: VHH:C188 도메인이 2, 3, 4, 6 또는 9개인 여러가지 도메인 구조의 구조체들은 강력한 TNFR2 작용제 효과를 나타낸다.
C188 VHH 도메인을 이용해 여러가지 항체 포맷들을 추가로 비교하였다. 수득한 결과는 도 41에 나타낸다. 패널 (A)는 항체의 도메인 구조를 도시한다. TNC는 테나신-C의 삼량체화 도메인을 나타낸다. 패널 (B)는 IL-8 방출에 의해 측정된 바와 같이 TNFR2 작용제 활성에 대한 결과를 도시한다. HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체로 자극하였다. 다음날, 상층액을 IL8 함량에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다. VHH 도메인이 적어도 4개인 구조체들이, 특히 동일한 폴리펩타이드에 VHH 도메인이 적어도 2개 존재하는 항체에 대해 일반적으로 최상의 결과를 제공하였다.
실시예 37: 단백질 G는 항- TNFR2 mAb C4의 서열 최적화된 변이체의 작용제 활성을 강화한다.
도 42에 나타낸 바와 같이, 단백질 G의 존재 하에 활성 강화가 C4 변이체 Ab에서 수득되었으며, 이는 단일클론 항체의 다량체화에 의해 구현될 수 있는 잠재적인 작용제 효과의 존재를 의미한다. (A) 지정된 항체 변이체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양 상층액의 항-인간 IgG1 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석. (B) HT1080-TNFR2 세포에 C4 변이체를 지정된 농도로 사용해 500 ng/ml 단백질 G의 존재 및 부재 하에 챌린지하였다. 다음날, 세포 상층액을 ELISA에 의해 IL8 생산을 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)를 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다.
실시예 38: 3xVHH:C188 - Fc(Durv)의 서열 최적화된 변이체의 TNFR2 작용제 효과.
변이체 15종을 인 실리코로 제작하고, 인간화, 탈면역화 및 PTM 책임의 제거 측면에서 서열을 최적화하였다. 변이체 1종의 경우 (변이체 14), 서로 다른 VHH 사이에 다양한 길이의 링커를 사용해 구조체를 또한 제작하였다. 도 43, 패널 (A)에 나타낸 바와 같이, 모든 변이체 구조체가 성공적으로 생산되었다: 지정된 3xVHH:C188-Fc(Durv) 변이체를 코딩하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양 상층액의 항-인간 IgG1 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석. 3xVHH:C188-Fc(Durv) 포맷에서, 변이체들 모두, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 구조체를 함유한 상층액으로 자극한 IL-8 방출 분석의 결과를 도시한 패널 (B)에서 알 수 있는 바와 같이 생활성이었다: HT1080-TNFR2 세포는 지정된 농도의 3xVHH:C188-Fc(Durv) 변이체 및 부모3xVHH:C188-Fc(DANA) 분자를 사용해 챌린지하였다. 다음날, 세포 상층액을 ELISA에 의해 IL8 생산을 분석하였다. TNFR2-특이적인 TNF 돌연변이의 고 활성 올리고머 형태 TNF(143N/145R)을 이용해 유도된 최대 반응을 점선으로 표시하였다.
실시예 39: TNFR2 -작용제는 인간 말초혈 단핵 세포 ( PBMC )에서 Treg를 증폭시킨다.
말초혈 단핵 세포를 증폭하기 위해 특정 TNFR2 결합 분자가 서로 다른 TNFR2 결합 부위를 가진 조절성 T 세포를 증폭시키는 능력을 조사하였다. Fab-HC-scFv 포맷 (C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4, C19-IgG1(N297A)-HC:scFvC19 및 C40-IgG1(N297A)-HC:scFvC40)의 4가 항체 및 3xVHH-Fc 포맷의 6가 VHH 구조체 (3xVHH:C188-Fc(Durv)를 이용해 수득한 결과를 도 44에 도시하며, 도 21에 나타낸 데이타를 확장한 것이다. 병태 당 지정된 수의 공여체로부터 PBMC를 분리하였으며, 각 공여체의 세포는 분리하여 평가하였다. PBMC를 2일 동안 밀도 107 세포/ml로 배양하였다. 그런 후, PBMC를 회수하여, 멀티-웰 플레이트에 밀도 106 세포/ml로, 웰 당 세포 500,000개씩 접종하였다. 4일 배양한 후, 세포를 CD3, CD8, CD4, CD25 및 FoxP3 특이 항체로 유세포 분석을 위해 염색하였다. 도 44는 동일한 공여체의 무처리 대조군 대비, 지정된 TNFR2-작용제로 4일 자극한 후 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 Treg 빈도의 배수 변화를 도시한다. 샘플들은 유세포 측정으로 측정하였으며, Treg를 FoxP3+CD4+CD3+ T 세포로 정의하였다. 개개 공여체 수는 n으로 나타낸다. 유의성은 가상 수치 1로 1-샘플 t 검정으로 조사하고, *P=0.05, **P=0.01, ***P=0.001, ****P<0.0001으로 나타내었다.
실시예 40: C4- IgG1 ( N297A )- HC:scFvC4는 Treg를 활성화한다
C4 TNFR2 결합 부위를 가진 IgG1(N297A)-HC:scFv 포맷 항체가 Treg를 활성화하는 능력을 추가로 조사하였다. 수득한 결과는 도 45에 나타낸다. 인간 PBMC를 100 ng/ml C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4로 4일간 자극하고, Treg 활성과 관련한 마커의 발현을 유세포 측정으로 측정하였다. 동일한 공여체의 무처리 대조군 대비 발현의 배수 변화를 도시한다. Treg는 FoxP3+ CD4+ CD3+ T 세포로 정의하였다. 평균 ± SD 및 각 점은 개개 공여체를 나타낸다.
실시예 41: 3xVHHC188(G4S)1 - Fc(Durv)는 Treg를 활성화한다.
VHH 도메인을 포함하는 6가 항체 포맷이 Treg를 활성화하는 능력을 3xVHHC188(G4S)1-Fc(Durv) 포맷 항체를 이용해 조사하였다. 수득한 결과는 도 46에 나타낸다. 인간 PBMC를 지정된 농도의 3xVHHC188(G4S)1-Fc(Durv)로 4일간 자극하고, Treg 활성과 관련한 마커의 발현을 유세포 측정으로 측정하였다. 동일한 공여체의 무처리 대조군 대비 발현의 배수 변화를 도시한다. Treg는 FoxP3+ CD4+ CD3+ T 세포로 정의하였다. 평균 ± SD 및 각 점은 개개 공여체를 나타낸다.
실시예 42: TNFR2 작용제는 인간- TNFR2 -발현 CD4 T 세포를 시험관내에서 증폭한다.
인간-TNFR2 넉인 마우스에서 수득한 농화된 CD4 T 세포를 여러가지 농도의 (A) C4-C4 (C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4)로 자극하거나, 또는 (B) 3xVHH:C188-Fc(DANA)는 각각의 작용제와 함께 4일 배양한 후 Treg 빈도를 증가시켰다. 도 47의 데이터는 무처리 (이소형 대조군) 샘플 대비 CD25highFoxP3high CD4 T 세포의 증가 배수 변화를 나타낸다.
실시예 43: Fc (DANA)-TNC- muTNF80의 혈청 체류.
다음으로 Fc(DANA)-TNC-muTNF80의 혈청 체류를 조사하였으며, 수득한 결과는 도 48에 나타낸다. 75 ㎍ Fc(DANA)-TNC-muTNF80 또는 이소형 대조군 항체를 0시간에 주사한 야생형 마우스에서 소정의 시점에 말초혈에서 분리한 혈청으로 자극한 HT1080-Bcl2-TNFR2 세포 배양물의 상층액을 이용한 ELISA에 의해 측정한 IL-8 농도. 데이터를 도 48에 나타낸다.
실시예 44: 리간드-기반의 TNFR2 작용제는 Treg를 생체내 증폭시키고, 활성화 마커를 상향 조절한다.
다음으로 리간드-기반의 TNFR2 작용제가 생체내에서 Treg를 증폭하고 활성화 마커를 상향 조절하는 능력을 조사하였으며, 수득한 결과는 도 49에 나타낸다. (A) 야생형 마우스에서 75 ㎍ Fc(DANA)-TNC-muTNF80로 자극한 후 4일에 분리한 비장에서의 생존 세포의 Treg 빈도. (B) 이소형 대조군 항체 샘플에 대해 표준화한 Treg의 평균 형광 측정 강도로서 정의한 선택한 세포외 마커의 배수 변화. 데이터는 도 49에 나타낸다.
실시예 45: TNFR2 작용제는 생체내에서 비장 Treg를 증가시킨다.
마우스를 3xVHH:C188-Fc(DANA) 또는 이소형 대조군 항체 또는 C4-IgG1(N297A)-HC:scFv:C4로 처리한 후 4일에 분리한 huTNFR2-발현 마우스의 비장에서 Treg 빈도를 결정하였다. 동일한 실험에서 이소형 대조군 또는 무처리 대조군에 대해 배수 변화를 계산하였다. 도 50에 나타낸 바와 같이, TNFR2 작용제는 인간 TNFR2 KI 마우스의 비장에서 Treg를 생체내 증폭시킬 수 있다. 처리 군과 대조군 간의 평균 비교는 비-대응 t-검정을 통해 수행하였다.* p≤0.05, ns= 유의하지 않음.
실시예 46: TNFR2 작용제는 동종이계 조혈 세포 이식 ( allo -HCT)에 의해 유발된 급성 이식편대숙주 질환 ( GvHD ) 후 생존성을 높인다.
이식편대 숙주 질환 (GvHD) 모델에서 TNFR2 작용제의 영향을 조사하였으며, 수득한 결과는 도 51에 나타낸다. 패널 (A)는 마우스 (FVB/N H-2q->C57BL/6 H-2b, MHC 주 미스매치 모델)에서 allo-HCT 유발성 실험 급성 GvHD 이후의 생존 빈도를 도시한다. 각 TNFR2 작용제 처리 군과 이소형 대조군 항체 간의 Log-순위 검정으로 통계 유의성을 평가하였다. * p≤0.05. 패널 (B)는 면역 세포 침윤 및 장 음와 손상에 기반한 allo-HCT 이후 6일에 분리한 장 샘플에 대한 병리학적 점수를 도시한다.
실시예 47: TNFR2 작용제는 아프리카 녹색 원숭이 ( vervet ) 말초혈 단핵 세포 ( PBMC ) 로부터 Treg를 증폭한다.
아프리카 녹색 원숭이의 냉동한 말초혈 단핵 세포를 해동하고, 웰 당 세포 2x105개로 배양한 다음 무처리한 채 두거나 또는 1, 10, 100, 1000 ng/mL C4-IgG1(N297A)-HC:scFvC4로 5일간 37℃에서 처리하였다. 샘플을 유세포 측정으로 측정하고, Treg는 CD3+ CD4+ FoxP3+ T 세포로 규정하였다. 도 52에 나타낸 바와 같이, TNFR2 작용제 처리시 아프리카 녹색 원숭이 PBMC로부터 Treg가 용량 의존적으로 증폭되었다.
실시예 48: 클론 C188 및 C4는 인간 TNFR2에의 결합에 대해 TNF와 경쟁한다.
HT1080-Bcl2-TNFR2 세포를 지정된 양의 TNFR2-특이적인 VHH 구조체 또는 음성 대조군으로서 CD20-특이적인 mAb 리툭시맙으로 전처리하거나, 또는 무처리한 채 두었다. 5 ng/ml GpL-TNF를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후 결합을 측정하였다. 도 35 패널 B에 나타낸 바와 같이, HT1080-Bcl2-TNFR2 세포에 대한 TNF-GpL의 결합은 C188-VHH-IgG1(N297A) VHH-Fc 포맷으로서 클론 C188 및 C4-IgG1(N297A) 항체 포맷으로서 클론 C4의 존재에 의해 무력화되었다.
<110> JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAT WURZBURG <120> Novel TNFR2 binding molecules <130> N420734WO <150> EP21166756.3 <151> 2021-04-01 <160> 338 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro 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Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 290 295 300 Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Thr Gly Pro Tyr Trp Tyr Phe 305 310 315 320 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 325 330 335 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 340 345 350 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 355 360 365 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr 370 375 380 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 385 390 395 400 Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 405 410 415 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 420 425 430 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Val Pro 435 440 445 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 450 455 460 <210> 337 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4var16-IgG1(Durv)-LC:scFvC4var16(G4S)4 - Heavy chain ~= C4var16-VH + DURVA[CH1 + Hinge + CH2 + CH3] <400> 337 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser 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Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 565 570 575 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 580 585 590 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 595 600 605 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 610 615 620 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 625 630 635 640 Ser Pro Gly Lys

Claims (31)

  1. TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 결합 분자로서,
    상기 결합 분자가 FcγR 독립적인 TNFR2 작용제이고, TNFR2에 대한 결합가가 2 이상인, 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자가 4 이상의 결합가를 가진, 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 6이거나; 또는
    (b) 상기 결합 분자는 TNFR2에 대한 결합가가 4인, 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자의 TNFR2에 특이적인 항원-결합 도메인 하나 이상이 TNFR2에 특이적인 단일 도메인 결합제 (single domain binder, sdB), 바람직하게는 TNFR2에 특이적인 단일 도메인 항체 (single domain antibody, sdAb)인, 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 TNFR2에 특이적인 sdBr (단일 도메인 결합제) 하나 이상이 VHH인, 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자가 각각 TNFR2에 특이적인 VHH 항원-결합 도메인으로서 TNFR2 특이적인 항원-결합 부위를 6개 포함하는, 결합 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 VHH 항원-결합 도메인 6개와 Fc 영역을 포함하고, 바람직하게는 상기 결합 분자가 6가 항체이거나;
    (b) 상기 결합 분자가 TNFR2에 특이적인 VHH 결합 도메인 3개를 각각 포함하는 폴리펩타이드를 2개 포함하고, 바람직하게는 상기 결합 분자가 6가 항체이거나;
    (c) 상기 결합 분자가 폴리펩타이드 2개를 포함하고, 상기 폴리펩타이드가 각각 TNFR2에 특이적인 VHH 결합 도메인 3개를 포함하고, 각 폴리펩타이드가 CH1이 아닌 CH2-CH3를 포함하는 중쇄 불변 영역 서열을 C-말단 부분에 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 결합 분자가 6가 항체이거나; 또는
    (d) 상기 결합 분자가 폴리펩타이드 2개를 포함하고, 상기 폴리펩타이드가 각각 TNFR2에 특이적인 VHH 결합 도메인 3개를 포함하고, 각 폴리펩타이드가 C-말단 부분에 CH1이 아닌 CH2-CH3, 및 Fc 도메인의 작동자 기능 저하를 나타내는 변형을 포함하는 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 결합 분자가 6가 항체인, 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 서열번호 세트 213/214/215; 216/217/218; 219/220/221; 222/223/224; 225/226/227; 228/229/230; 231/232/233; 234/235/236; 237/238/239; 240/241/242; 243/244/245; 246/247/248; 249/250/251; 252/253/254로부터 선택되는 CDR 3개 세트; 또는 상기한 임의 세트의 변이체 CDR 세트를 포함하는, VHH 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하되, 상기 변이체는 최대 총 5개의 아미노산 서열 변동을 가지고, 변이체 항원-결합 부위는 TNFR2에 결합하는 능력을 유지하거나;
    (b) 상기 결합 분자가 서열번호 154/155/156의 CDR 3개 또는 이러한 CDR 3개에 대한 변이체 세트를 포함하는 VHH 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하되, 상기 변이체는 최대 총 5개의 아미노산 서열 변동을 가지고, 변이체 항원-결합 부위는 TNFR2에 결합하는 능력을 유지하거나;
    (c) 상기 결합 분자가 154/155/156; 160/161/162; 163/164/165; 166/167/168; 169/170/171; 181/182/183; 187/188/189; 193/194/195로부터 선택되는 CDR 3개 세트 또는 이들에 대한 변이체 세트를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하되, 상기 변이체는 최대 5개의 아미노산 서열 변동을 가지고, 변이체 항원-결합 부위는 TNFR2에 결합하는 능력을 유지하거나;
    (d) 상기 결합 분자는 VHH 항원-결합 부위 6개를 포함하는 6가이되, 항원-결합 부위들이 모두 동일하고 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 항원-결합 부위이거나;
    (e) 상기 결합 분자는 폴리펩타이드 2개를 포함하는 6가이되, 폴리펩타이드 각각 VHH 항원-결합 부위 3개를 포함하고, 항원-결합 부위 6개 모두 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 동일한 항원-결합 부위이거나;
    (f) 상기 결합 분자는 VHH 항원-결합 부위 6개를 포함하는 6가이되, VHH 항원-결합 부위들 중 2 이상이 서로 다른 TNFR2 특이성을 가지고, 이들 특이성 하나 이상은 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 VHH 항원-결합 부위에 의해 부여되거나;
    (g) 상기 결합 분자는 VHH 항원-결합 부위 6개를 포함하는 6가이되, VHH 항원-결합 부위들 중 3 이상이 서로 다른 TNFR2 특이성을 가지고, 이들 특이성 하나 이상은 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 VHH 항원-결합 부위에 의해 부여되거나;
    (h) 상기 결합 분자는 VHH 항원-결합 부위 6개를 포함하는 6가이되, VHH 항원-결합 부위 6개 모두 서로 다른 TNFR2 특이성을 가지고, 이들 특이성 하나 이상은 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 VHH 항원-결합 부위에 의해 부여되는, 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 서열번호 198 내지 211 중 하나 이상의 VHH 항원-결합 도메인 또는 여전히 TNFR2에 결합할 수 있는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하거나;
    (b) 상기 결합 분자가 서열번호 140으로부터 선택되는 하나 이상의 VHH 항원-결합 도메인 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하거나;
    (c) 상기 결합 분자가 서열번호 140, 142 내지 145, 149, 151, 153로부터 선택되는 하나 이상의 VHH 항원-결합 도메인 또는 여전히 TNFR2에 결합할 수 있는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하거나;
    (d) 상기 결합 분자가 (a), (b) 또는 (c)에 정의된 하나 이상의 VHH 항원-결합 도메인을 각각 포함하는 폴리펩타이드 2개를 포함하거나;
    (e) 상기 결합 분자가 (a), (b) 또는 (c)에 정의된 VHH 항원-결합 도메인을 3씩 각각 포함하는 폴리펩타이드 2개를 포함하거나;
    (f) 상기 결합 분자가 (a), (b) 또는 (c)에 정의된 VHH 항원-결합 도메인을 3씩 각각 포함하는 폴리펩타이드 2개를 포함하되, TNFR2에 특이적인 결합 분자의 항원-결합 도메인들 모두 동일하거나; 또는
    (g) 상기 결합 분자가 (a), (b) 또는 (c)에 정의된 VHH 항원-결합 도메인을 3씩 각각 포함하는 폴리펩타이드 2개를 포함하되, TNFR2에 특이적인 결합 분자의 VHH 항원-결합 도메인들 모두 동일하지 않은, 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 폴리펩타이드 2개를 포함하고, 상기 폴리펩타이드가 각각
    (i) 서열번호 197의 아미노산 서열을 가지되, 단 상기 서열에서 서열번호 140에 해당하는 VHH 도메인이 대신 서열번호 198 내지 211 중 하나의 서열이거나; 또는
    (ii) (i)에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 가지면 TNFR2에 여전히 결합할 수 있는 변이체 아미노산 서열
    을 가지거나;
    (b) 상기 결합 분자가 폴리펩타이드 2개를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 각각이 서열번호 197의 아미노산 서열 또는 여전히 TNFR2에 결합할 수 있는 90% 이상의 서열 동일성을 가진 변이체 아미노산 서열을 가지고, 바람직하게는 각각의 폴리펩타이드가 이러한 VHH 결합 도메인을 3개씩 포함하거나;
    (c) 상기 결합 분자가 폴리펩타이드 2개를 포함하고, 상기 폴리펩타이드가 각각
    (i) 서열번호 197의 아미노산 서열을 가지되, 상기 서열에서 서열번호 140에 해당하는 VHH 도메인이 대신 서열번호 140, 142 내지 145, 149, 151 또는 153 중 하나의 서열이거나; 또는
    (ii) (i)에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 가지면 TNFR2에 여전히 결합할 수 있는 변이체 아미노산 서열
    을 가지거나;
    (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나를 가지되, 상기 변이체 아미노산 서열이 특이적인 서열과 비교해 1-5개의 아미노산 서열 변동을 가지고, 상기 결합 분자는 TNFR2에 결합하는 능력을 유지하고, 바람직하게는 상기 변이체는 특이적인 서열과 비교해 단지 1, 2 또는 3개의 아미노산 서열 변동, 더 바람직하게는 1개의 아미노산 서열 변동을 가지거나; 또는
    (e) (a) 내지 (c) 중 어느 하나를 가지되, 상기 변이체 아미노산 서열이 서열번호 197의 아미노산 302-405 서열이 서열번호 327의 아미노산 서열로 치환된, 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 서열번호 330의 아미노산 서열 또는 여전히 TNFR2에 결합할 수 있는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 가진 폴리펩타이드를 포함하거나;
    (b) 상기 결합 분자가 서열번호 331의 아미노산 서열 또는 여전히 TNFR2에 결합할 수 있는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 가진 폴리펩타이드를 포함하거나; 또는
    (c) 상기 결합 분자가 (a)의 폴리펩타이드를 3개 또는 (b)의 폴리펩타이드를 3개를 포함하는, 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자가 "N-말단" 및 "C-말단" 양쪽에 배향된 TNFR2에 대한 결합 부위를 가진 결합가 4의 항체인, 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제3항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 CDR 6개 세트를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하되:
    (i) 경쇄 CDR이 서열번호 266/267/268; 269/270/271; 272/273/274; 275/276/277로부터 선택되는 CDR1/CDR2/CDR3 세트로부터 선택되고, 중쇄 CDR이 서열번호 282/283/284; 285/286/287; 288/289/290; 291/292/293로부터 선택되는 CDR1/CDR2/CDR3 세트로부터 선택되거나; 또는
    (ii) 상기 CDR 6개 세트가, 특이적인 CDR 6개 세트와 비교해 총 5개 이하의 아미노산 변동을 가진, (i)의 CDR 6개 세트의 변이체이고, 항원-결합 부위가 TNFR2에 결합하는 능력을 유지하거나;
    (b) 상기 결합 분자가 CDR 6개 세트를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하되:
    (i) 경쇄 CDR1/CDR2/CDR3가 서열번호 69/70/71이고, 중쇄 CDR1/CDR2/CDR3이 서열번호 102/103/104이고;
    (ii) CDR 6개 세트가, 특이적인 CDR 6개 세트와 비교해 총 5개 이하의 아미노산 변동을 가진, (i)의 CDR 6개 세트의 변이체이고, 항원-결합 부위가 TNFR2에 결합하는 능력을 유지하거나;
    (c) 상기 결합 분자가 표 5에 나타낸 것으로부터 유래한 경쇄 CDR 3개 세트 및/또는 중쇄 CDR 3개 세트를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하거나;
    (d) 상기 결합 분자가 표 5에 기재된 6개 세트로부터 유래한 CDR 6개 세트 또는 5개 이하의 아미노산 서열 변동을 가지되 TNFR2에 결합하는 능력을 유지하는 변이체 CDR 6개 세트를 포함하거나;
    (f) 상기 결합 분자가 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 항원-결합 부위 4개를 포함하되, 항원-결합 부위 4개 모두 동일하거나;
    (g) 상기 결합 분자가 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 항원-결합 부위 4개를 포함하되, 항원-결합 부위 4개 모두 동일하고, 항체가 TNFR2에 대해 4가이거나; 또는
    (h) 상기 결합 분자가 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 항원-결합 부위 4개를 포함하되, 항원-결합 부위 4개 모두 동일하고, 항체가 TNFR2에 대해 4가이고, N-말단에 배향된 항원-결합 부위 2개와 C-말단에 배향된 항원-결합 부위 2개를 가진, 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제3항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자가
    (a)
    (i) 각 경쇄 폴리펩타이드가 서열번호 261의 서열을 가진 아미노산 서열을 포함하되, 서열번호 295에 해당하는 아미노산 서열이 서열번호 262 내지 265 중 하나로부터 선택되는 서열로 치환된, 경쇄 폴리펩타이드 2개; 또는
    (ii) 각각 (i)에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 가진, 경쇄 폴리펩타이드 변이체 2개; 및
    (b)
    (iii) 각 중쇄 폴리펩타이드가 서열번호 259의 서열을 가진 아미노산 서열을 포함하되, 서열번호 296에 해당하는 아미노산 서열이 서열번호 278 내지 281 중 하나로부터 선택되는 서열로 치환된, 중쇄 폴리펩타이드 2개; 또는
    (iv) 각각 (iii)에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 가진, 중쇄 폴리펩타이드 변이체 2개
    를 포함하는 항체인, 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제3항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자가
    (a) 서열번호 261의 서열 또는 서열번호 261에 대해 아미노산 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가진 경쇄 폴리펩타이드 2개; 또는
    (b) 서열번호 259의 서열 또는 서열번호 259에 대해 아미노산 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가진 중쇄 폴리펩타이드 2개
    를 포함하는 항체인, 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제3항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자가
    (a) 서열번호 332의 경쇄 및 서열번호 333의 중쇄 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이들의 변이체를 포함하되, 결합 분자가 여전히 TNFR2 작용제로서 작용할 수 있거나;
    (b) 서열번호 334의 경쇄 및 서열번호 335의 중쇄 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이들의 변이체를 포함하되, 결합 분자가 여전히 TNFR2 작용제로서 작용할 수 있거나;
    (c) 서열번호 336의 경쇄 및 서열번호 337의 중쇄 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 이들의 변이체를 포함하되, 결합 분자가 여전히 TNFR2 작용제로서 작용할 수 있거나; 또는
    (d) (a), (b) 또는 (c)에 정의된 중쇄 2개 및 경쇄 2개를 포함하는, 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) TNFR2를 발현하는 세포 상에서 TNFR2를 올리고머화하여, 바람직하게는 세포 표면 상에서 TNFR2 분자 6개 이상을 군집시킬 수 있거나;
    (b) TNFR2 신호전달을 촉발할 수 있거나; 및/또는
    (c) 백혈구, 바람직하게는 T 세포, 더 바람직하게는 Treg 세포의 증식을 자극할 수 있는, 결합 분자.
  18. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자 혈청 반감기를 변화시키는 모이어티를 포함하고, 바람직하게는 상기 모이어티가 Fc 꼬리, 혈청 알부민, 혈청 알부민의 결합제 모이어티 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    (a) 상기 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 2가이거나;
    (b) 상기 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 3가이거나;
    (c) 상기 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 4가이거나; 또는
    (d) 상기 결합 분자가 TNFR2에 대한 결합가가 적어도 4인, 결합 분자.
  19. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 항체이거나;
    (b) 상기 결합 분자가 TNFR2에 대한 리간드를 포함하는 항체이거나;
    (c) 상기 결합 분자가 항체 불변 영역의 적어도 일부, 바람직하게는 Fc 영역을 포함하거나; 또는
    (d) 상기 결합 분자가 TNFR2에 대한 리간드를 포함하고, 바람직하게는 상기 리간드가 TNFα 또는 림포톡신-α로부터 유래하고,
    바람직하게는, 상기 결합 분자가
    (a) 하나 이상의 항체 중쇄의 N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 포함하는 항체; 또는
    (b) 하나 이상의 항체 경쇄의 N-말단 및 C-말단 양쪽에 TNFR2 결합 부위를 포함하는 항체인, 결합 분자.
  20. 제19항에 있어서,
    (a) 항체가 2가 항체이거나;
    (b) 항체가 3가 항체이거나;
    (c) 항체가 4가 항체이거나;
    (d) 항체가 6가 항체이거나;
    (e) 항체가 중쇄 단독 항체이거나;
    (f) 항체가 단일 도메인 Ab (sdAb), VHH 또는 나노바디와 같은 단일 도메인 항체이거나;
    (g) 항체가 항체 2 이상의 다량체이거나;
    (h) 항체가 다량체 형성 모이어티, 바람직하게는 테나신-c 펩타이드 (TNC)를 포함하거나 또는 이와 연결되고, 바람직하게는 상기 항체가 테나신-c 펩타이드 서열을 통해 연결된 항체 2 이상의 다량체이거나;
    (i) 항체가 TNFR2의 리간드로부터 유래한, 바람직하게는 TNF-α 또는 림포톡신-α로부터 유래한 하나 이상의 분자와 연결된, 결합 분자.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    (a) 항체에는 Fc 영역이 없거나;
    (b) 항체가 Fc 수용체와 결합할 수 없는 변형된 Fc 영역을 포함하거나; 또는
    (c) 항체가 CH1이 없는 중쇄 불변 영역을 포함하는, 결합 분자.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자가 하기로부터 선택되는 항체 포맷을 가진 항체인, 결합 분자:
    - Fc 수용체 결합을 제거하는 Fc 변형을 가진 IgG;
    - IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형을 가진 scFv:IgG;
    - IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형을 가진 IgG-HC:TNC;
    - IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형을 가진 scFv:IgG-HC:TNC; 및
    - IgG 6량체;
    -3(VHH-TNC);
    여기서,
    - HC는 IgG의 중쇄를 나타내고;
    - LC는 IgG의 경쇄를 나타내고;
    - scFv:IgG는 IgG 분자와 연결되거나 또는 IgG 분자의 일부를 형성하는 scFv를 나타내고;
    - HC:TNC는 테나신-c 삼량체화 도메인 펩타이드 (TNC)를 포함하거나 또는 이와 연결된 중쇄 (HC)를 나타내고;
    - VHH-TNC는 VHH와 연결되거나 또는 VHH에 결합된 테나신을 나타냄.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 포맷을 가진 항체인, 결합 분자:
    - Fab-LC:scFv;
    - IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형, 바람직하게는 N297A를 가진, IgG-HC:scFv;
    - IgG가 Fc 수용체 결합을 제거하는 변형, 바람직하게는 N297A를 가진, IgG-LC:scFv;
    - IgG-LC:scFv-HC:scFv;
    - LC:scFv-HC:scFv-IgG-HC:scFv;
    - LC:scFv-HC:scFv-IgG-LC:scFv;
    - LC:scFv-HC:scFv-IgG-LC:scFv-HC:scFv;
    - IgG-HC-TNC-scFv;
    - sdAb/VHH; 및
    -3(VHH-TNC),
    여기서:
    - HC는 IgG의 중쇄를 나타내고;
    - LC는 IgG의 경쇄를 나타내고;
    - LC:scFv는 경쇄와 연결되거나 또는 경쇄의 일부를 형성하는 scFv를 나타내고;
    - HC:scFv는 중쇄와 연결되거나 또는 중쇄의 일부를 형성하는 scFv를 나타내고;
    - HC:TNC는 테나신 (TNC)를 포함하거나 또는 이와 연결된 중쇄 (HC)를 나타내고;
    - TNC-scFv는 scFv와 연결되거나 또는 scFv에 결합된 테나신을 나타내고;
    - TNC-VHH는 VHH와 연결되거나 또는 VHH에 결합된 테나신을 나타내고;
    - sdAb는 단일 도메인 항체를 나타내고;
    - VHH는 낙타과 항체의 가변 영역을 나타내며,
    - VHH-TNC는 VHH와 연결되거나 또는 VHH에 결합된 테나신을 나타내고;
    바람직하게는, 상기 결합 분자는 항체이고, 하기로부터 선택되는 항체 포맷을 가짐:
    - Fab-scFv;
    - IgG-HC:scFv;
    - LC:scFv-HC:scFv-IgG1; 및
    - LC:scFv-HC:scFv-IgG1-TNC.
  24. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 결합 분자가 서로 다른 TNFR2 특이성을 가진 2 이상의 항원-결합 부위를 포함하거나;
    (b) TNFR2에 특이적인 상기 결합 분자의 항원-결합 부위들 모두 각각 서로 다른 TNFR2 특이성을 가지거나;
    (c) 상기 결합 분자가 폴리펩타이드 2개를 포함하되 각 폴리펩타이드는 TNFR2에 특이적인 VHH 항원-결합 도메인을 3개씩 포함하고, 이러한 VHH 항원-결합 도메인 3개 중 적어도 2개가 서로 다른 TNFR2 특이성을 가지거나; 또는
    (d) 상기 결합 분자가 폴리펩타이드 2개를 포함하되 각 폴리펩타이드는 TNFR2에 특이적인 VHH 항원-결합 도메인을 3개씩 포함하고, 이러한 VHH 항원-결합 도메인 3개가 서로 다른 TNFR2 특이성을 가진, 결합 분자.
  25. TNFR1이 아닌 TNFR2에 특이적으로 결합하는 결합 분자로서,
    상기 결합 분자가 FcγR 독립적인 TNFR2 작용제이고, TNFR2에 대한 결합가가 2 이상이고, TNFR1이 아닌 TNFR2에 결합하는 돌연변이 TNF-α 및 Fc 영역, 또는 폴리펩타이드를 올리고머화하는 테나신 펩타이드 서열 또는 이 둘다를 포함하고,
    바람직하게는, 상기 결합 분자는:
    (a) 항체 서열을 포함하지 않는 것이거나;
    (b) TNFR1이 아닌 TNFR2에 결합하는 돌연변이 TNF-α 및 테나신 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 것이거나;
    (c) TNF-α 돌연변이가 TNF80인 것이거나; 및/또는
    (d) TNFR2에 대한 결합가가 3 이상, 바람직하게는 6 이상인 것인, 결합 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 의약제로서 사용하기 위한 것인, 결합 분자.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 장애 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법에 이용하기 위한 것이고,
    바람직하게는,
    (a) 상기 장애가 이식편대숙주 질환 (GvHD)이고, 바람직하게는, 상기 결합 분자는 이를 세포, 조직 또는 장기를 이식하기 전, 이식과 동시에 또는 이식한 후 투여하는 방법에 이용하기 위한 것이거나; 또는
    (b) 상기 장애가 백혈구, 바람직하게는 T 세포, 더 바람직하게는 Treg 세포의 기능부전 또는 원치않는 증식을 수반하는 장애이거나; 또는
    (c) 상기 장애가 염증성 장 질환 (예, 궤양성 대장염, 크론 질환 또는 셀리악 질환), 죽상동맥경화증, 루푸스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창 및 수포성 유사천포창으로부터 선택되는, 결합 분자.
  28. 표적 TNFR2를 발현하는 세포를 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 세포 증식을 자극하는 방법.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  30. 검사 샘플을 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자와 접촉시키고, TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하고,
    바람직하게는, 상기 결합 분자를 표지하고, TNFR2에의 결합 분자의 결합을 표지 물질을 통해 검출하는, TNFR2를 검출하는 방법
  31. 진단 방법에 이용하기 위한 것이고, 상기 방법이 제1항 내지 제23항 중 어느 하나에 따른 결합 분자를 개체에 투여하고, TNFR2에 대한 결합 분자의 결합을 검출하는 것을 포함하며,
    바람직하게는, 상기 결합 분자를 표지하고, TNFR2에의 결합 분자의 결합을 표지 물질을 통해 검출하는, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자.
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