JP2022513434A - アゴニスト性腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーポリペプチド - Google Patents
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Abstract
抗体およびその抗原結合断片などのアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、ならびに制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）および／または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の増殖を刺激するため、またＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞などのＴエフェクター細胞の機能を阻害し、増殖を減少させ、かつ／または直接殺傷するための、これらのポリペプチドの使用が記載される。本開示の抗体およびその抗原結合断片などのポリペプチドは、例えば、自己免疫および炎症を抑制するため、ならびに多種多様な組織および臓器、例えば、ＴＮＦＲ２＋細胞を含む組織および臓器の保護、治癒、保存、および／または再生を促進するために使用することができる。【選択図】なし
Description
技術分野
本発明は、アゴニスト性腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーポリペプチドに関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１１月１５日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、００７８６－５８２ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１．１５．１９＿ＳＴ２５という名称であり、２８，７２２バイトのサイズである。
本発明は、アゴニスト性腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーポリペプチドに関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１１月１５日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、００７８６－５８２ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１．１５．１９＿ＳＴ２５という名称であり、２８，７２２バイトのサイズである。
細胞性免疫応答および体液性免疫応答の制御を維持することは、健康な免疫系活動の重要な側面である。Ｔ細胞およびＢ細胞によって引き起こされる免疫反応の異常な調節は、様々な自己および外来抗原に対する免疫応答の不適切な上昇が、自己免疫疾患、喘息、アレルギー反応、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、およびその他の様々な免疫疾患などの病態において原因となる役割を果たす。これらの疾患は、自己抗原およびアレルゲンまたは移植同種移植片などの非脅威源に由来する抗原に対する反応性を示すＴリンパ球およびＢリンパ球によって媒介される。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、「自己」主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質および他の良性抗原と交差反応する免疫細胞の活性を阻害するよう進化してきた。Ｔｒｅｇ細胞は、ユニークな表面タンパク質の提示に基づいて区別できるＴ細胞の異種クラスを表す。最もよく理解されているＴｒｅｇ細胞の集団には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞、およびＣＤ１７＋Ｔｒｅｇ細胞が含まれる。これらの細胞が自己反応性Ｔ細胞の抑制を媒介する正確なメカニズムは、進行中の研究の対象であるが、特定のクラスのＴｒｅｇ細胞は、標的Ｔ細胞における増殖誘導サイトカインＩＬ－２の産生を阻害し、追加的にＩＬ－２に対するＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のサブドメイン）の親和性によって、自己反応性細胞からＩＬ－２を隔離する可能性があることが示されている（Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．，３０：５３１－５６４（２０１２））。さらに、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋のＴｒｅｇ細胞もＢ細胞が豊富な領域に存在し、ＴＨ２細胞の活性を弱めるそれらの能力と独立して、免疫グロブリンの生成を直接抑制することができることが示されている（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５：４１８０－４１８３（２００５））。
現在、とりわけ、自己免疫疾患、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、アレルギー反応、喘息、および炎症などの疾患を標的とした治療に使用するために、Ｔｒｅｇ細胞の生存および増殖を増強できる改善された治療法が必要とされている。
本明細書に記載されるのは、アゴニスト性腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトである。例えば、特徴とされるのは、アゴニスト性腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）結合ポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトである。ヒトＴＮＦＲ２は、以下の４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含む。ＣＲＤ１（配列番号１のアミノ酸残基４８～７６）、ＣＲＤ２（配列番号１のアミノ酸残基７８～１２０）、ＣＲＤ３（配列番号１のアミノ酸残基１２１～１６２）、およびＣＲＤ４（配列番号１のアミノ酸残基１６２～２０２）。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ１、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上のエピトープに結合するもの、例えば、ＣＲＤ４内でＴＮＦＲ２に結合することなく、排他的にＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２内でＴＮＦＲ２の１つ以上のエピトープに結合するものが含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、１つ以上の上記のエピトープにおいてＴＮＦＲ２に特異的に結合するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体およびその抗原結合断片が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、Ｃ１２７Ｓ変異（Ｋａｂａｔ付番による）を有する変異型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含むＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）などのＣＨ１ドメインアミノ酸配列の１２７位のシステイン残基を欠いている、変異型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２重鎖定常１（ＣＨ１）ドメインを含む。本開示は、抗体およびその抗原結合断片が、これらの分子がＩｇＧ２－Ｂアイソタイプの形態である場合に、他の抗体アイソタイプと比較して、著しく優れたＴＮＦＲ２アゴニスト特性を示すという驚くべき発見に部分的に基づいている。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、少なくとも２つの部位でＴＮＦＲ２に結合するポリペプチドも含まれる（例えば、ポリペプチドは、ＴＮＦＲ２が「抗原」である２つ以上の抗原結合部位を有する）。これらの結合部位は、約１３３Å未満で互いに空間的に隔てられてもよい。有利なことに、１３３Å未満の間隔で隔てられる抗原結合部位を有するアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、上記の１つ以上のエピトープでＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、約１３３Åを超えて互いに隔てられるＴＮＦＲ２結合部位を含むポリペプチドよりも、高い効力でＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化する。例えば、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、約１１７Åによって互いに隔てられるＴＮＦＲ２結合部位を含むＩｇＧ１抗体およびその抗原結合断片、ならびに約１２５Åによって互いに隔てられるＴＮＦＲ２結合部位を含む、ＩｇＧ３抗体およびその抗原結合断片が含まれる。
単一のジスルフィド結合アイソフォームを採用するアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、およびそれを含む医薬組成物も特徴とする。例えば、本開示の医薬組成物は、アゴニストＴＮＦＲ２結合ポリペプチドを含むものを含み、例えば、医薬組成物中の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、またはそれ以上のポリペプチドが、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。ヒトＩｇＧ２－Ｂアイソフォームを採用するアゴニスト性ＴＮＦＲ２結合ポリペプチドは、ＩｇＧ２－Ａ、ＩｇＧ２－Ａ／Ｂ１、およびＩｇＧ２－Ａ／Ｂ２などの他のヒトＩｇＧ２アイソフォームを採用するＴＮＦＲ２結合ポリペプチドと比較して、実質的に優れたＴＮＦＲ２アゴニスト効果を示す。したがって、単一のジスルフィド結合アイソフォームを採用するＴＮＦＲ２ポリペプチドを医薬組成物として調製し、本明細書に記載の治療方法で投与して、強力なＴＮＦＲ２アゴニスト効果を促進することができる。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）および／または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の増殖および安定化を促進する能力など、１つ以上の有益な生物学的特性を示す。追加的に、または代替的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与して、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞の相互収縮を促進し、および／または直接殺傷することができる。これは、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の増殖および活性の間接的な拡大、またはＴエフェクター細胞の直接的な殺傷によって起こり得る。したがって、アゴニストとしてのＴＮＦＲ２ポリペプチドの指定は、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＭＤＳＣの増殖および活性を促進する能力を指し、明確にするために、望ましくないＴエフェクター細胞応答の活性化を示す。本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、とりわけ、自己免疫疾患、炎症性疾患などを含む様々な病状の治療に使用でき、ニューロンおよび脳関連組織などのＴＮＦＲ２を発現する組織の増殖、治癒、保護、および／または再生を促進し、本開示のポリペプチドを、例えば、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病、およびその他の神経変性疾患などの神経疾患の治療に有用にする。
第一の態様では、本発明は、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）１（ＣＲＤ１）、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合し、ＣＲＤ４内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合しない、ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトを特徴とする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、
（ａ）システイン残基１２７において欠失または置換を有するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含み、
（ｂ）約１３３Å未満の距離で、互いに隔てられる抗原結合部位を含み、
（ｃ）
（ｉ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ー重鎖１（ＣＤＲ－Ｈ１）を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４は、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンであり、かつ／あるいは
（ｄ）ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、もしくはＦであり、各々のＸ２は、独立して、ＭもしくはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥもしくはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳもしくはＲである。
（ａ）システイン残基１２７において欠失または置換を有するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含み、
（ｂ）約１３３Å未満の距離で、互いに隔てられる抗原結合部位を含み、
（ｃ）
（ｉ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有する相補性決定領域ー重鎖１（ＣＤＲ－Ｈ１）を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４は、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンであり、かつ／あるいは
（ｄ）ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、もしくはＦであり、各々のＸ２は、独立して、ＭもしくはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥもしくはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳもしくはＲである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位（Ｋａｂａｔ付番スキームによる）においてシステイン残基を欠くヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ１ドメインを含む。例えば、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位において、セリン残基などのシステイン以外のアミノ酸を有するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ１ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶ
（配列番号６）のアミノ酸配列に対し、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％同一またはそれ以上同一）である、アミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有してもよいが、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、Ｃ１２７Ｓ置換によってのみ配列番号６とは異なるアミノ酸配列を有する（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。これらの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶ
（配列番号７）のアミノ酸配列を有する。
（配列番号６）のアミノ酸配列に対し、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％同一またはそれ以上同一）である、アミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有してもよいが、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、Ｃ１２７Ｓ置換によってのみ配列番号６とは異なるアミノ酸配列を有する（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。これらの実施形態では、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインは、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶ
（配列番号７）のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶ
（配列番号８）のアミノ酸配列に対し、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である、アミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、例えば、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有してもよいが、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、Ｃ１２７Ｓ置換によってのみ配列番号８とは異なるアミノ酸配列を有する（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。これらの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶ
（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶ
（配列番号８）のアミノ酸配列に対し、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である、アミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、例えば、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有してもよいが、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するが、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位にセリン残基を含むという条件である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、Ｃ１２７Ｓ置換によってのみ配列番号８とは異なるアミノ酸配列を有する（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番による）。これらの実施形態では、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶ
（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。
ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、１３３Å未満の距離（例えば、約９０Å～約１３２Åの距離、例えば、約９０Å、９１Å、９２Å、９３Å、９４Å、９５Å、９６Å、９７Å、９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、１３０Å、１３１Å、または１３２Åの距離）で互いに隔てられる、抗原結合部位（例えば、２つ以上の抗原結合部位、例えば、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２、または３の抗原結合部位）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約９５Å～約１３０Åの距離、例えば、約９５Å、９６Å、９７Å、９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、または１３０Åの距離で、互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約９８Å～約１２８Åの距離、例えば、約９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、または１２８Åの距離で、互いに隔てられる。
例えば、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、約１０５Å～約１２７Åの距離、例えば、約１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、または１２７Åの距離で互いに隔てられる、抗原結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１１０Å～約１２２Åの距離で、例えば、約１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、または１２２Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１１５Å～約１１９Åの距離で、例えば、約１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、または１１９Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、１１７Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、上述のような抗原結合アームの間隔を有し、ＩｇＧ１アイソタイプを有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、約１１５Å～約１３２Åの距離、例えば、約１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、１３０Å、１３１Å、または１３２Åの距離で互いに隔てられる抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１２０Å～約１２９Åの距離で、例えば、約１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、または１２９Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１２３Å～約１２７Åの距離で、例えば、約１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、または１２７Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、１２５Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、上述のような抗原結合アームの間隔を有し、ＩｇＧ３アイソタイプを有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである。
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＣＲＤ１内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいて、例えば、配列番号１内のアミノ酸残基５６～６０（ＫＣＳＰＧ）の１つ以上によって定義されるエピトープにおいて、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＲＤ２内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいて、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、ＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいて、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳ、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲのうちの１つ以上または全てをさらに含む。
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳ、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲのうちの１つ以上または全てをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲのうちの１つ以上または全てを含む。
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲのうちの１つ以上または全てを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを含む。
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを含む。
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ヒトの定常領域などの非天然定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠いているか、天然Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠いているか、またはＦｃドメインを全て欠いている。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列または配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、またはＦであり、各々のＸ２は、独立して、ＭまたはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥまたはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳまたはＲである。例えば、ポリペプチドは、
（ａ）ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳ（配列番号１６）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳ（配列番号１７）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号１８）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳ（配列番号１９）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｅ）ＴＦＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２０）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｆ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＴＳ（配列番号２１）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｇ）ＴＲＤＴＳＴＮＴＶＹＭＥＬＴＳＬＲＳ（配列番号２２）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、および
（ｈ）ＴＡＤＴＳＴＤＲＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み得る。
（ａ）ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳ（配列番号１６）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳ（配列番号１７）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号１８）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳ（配列番号１９）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｅ）ＴＦＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２０）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｆ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＴＳ（配列番号２１）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｇ）ＴＲＤＴＳＴＮＴＶＹＭＥＬＴＳＬＲＳ（配列番号２２）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、および
（ｈ）ＴＡＤＴＳＴＤＲＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、フレームワーク領域は、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）内のＣＤＲ－Ｈ２に隣接して位置する。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域は、ポリペプチド内のＣＤＲ－Ｈ３に隣接して位置する。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域は、ＣＤＲ－Ｈ２とＣＤＲ－Ｈ３の間に位置する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）のうちの１つ以上のアミノ酸残基に対応するＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合する。
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）のうちの１つ以上のアミノ酸残基に対応するＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、約１０ｎＭ未満のＫＤ、例えば、約１ｎＭ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）に特異的に結合する。例えば、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、約１ｐＭ～約１０ｎＭのＫＤで、例えば、他の値の間でとりわけ、約１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、１５ｐＭ、２０ｐＭ、２５ｐＭ、３０ｐＭ、３５ｐＭ、４０ｐＭ、４５ｐＭ、５０ｐＭ、５５ｐＭ、６０ｐＭ、６５ｐＭ、７０ｐＭ、７５ｐＭ、８０ｐＭ、８５ｐＭ、９０ｐＭ、９５ｐＭ、１００ｐＭ、１０５ｐＭ、１１０ｐＭ、１１５ｐＭ、１２０ｐＭ、１２５ｐＭ、１３０ｐＭ、１３５ｐＭ、１４０ｐＭ、１４５ｐＭ、１５０ｐＭ、１５５ｐＭ、１６０ｐＭ、１６５ｐＭ、１７０ｐＭ、１７５ｐＭ、１８０ｐＭ、１８５ｐＭ、１９０ｐＭ、１９５ｐＭ、２００ｐＭ、２０５ｐＭ、２１０ｐＭ、２１５ｐＭ、２２０ｐＭ、２２５ｐＭ、２３０ｐＭ、２３５ｐＭ、２４０ｐＭ、２４５ｐＭ、２５０ｐＭ、２５５ｐＭ、２６０ｐＭ、２６５ｐＭ、２７０ｐＭ、２７５ｐＭ、２８０ｐＭ、２８５ｐＭ、２９０ｐＭ、２９５ｐＭ、３００ｐＭ、３０５ｐＭ、３１０ｐＭ、３１５ｐＭ、３２０ｐＭ、３２５ｐＭ、３３０ｐＭ、３３５ｐＭ、３４０ｐＭ、３４５ｐＭ、３５０ｐＭ、３５５ｐＭ、３６０ｐＭ、３６５ｐＭ、３７０ｐＭ、３７５ｐＭ、３８０ｐＭ、３８５ｐＭ、３９０ｐＭ、３９５ｐＭ、４００ｐＭ、４０５ｐＭ、４１０ｐＭ、４１５ｐＭ、４２０ｐＭ、４２５ｐＭ、４３０ｐＭ、４３５ｐＭ、４４０ｐＭ、４４５ｐＭ、４５０ｐＭ、４５５ｐＭ、４６０ｐＭ、４６５ｐＭ、４７０ｐＭ、４７５ｐＭ、４８０ｐＭ、４８５ｐＭ、４９０ｐＭ、４９５ｐＭ、５００ｐＭ、５０５ｐＭ、５１０ｐＭ、５１５ｐＭ、５２０ｐＭ、５２５ｐＭ、５３０ｐＭ、５３５ｐＭ、５４０ｐＭ、５４５ｐＭ、５５０ｐＭ、５５５ｐＭ、５６０ｐＭ、５６５ｐＭ、５７０ｐＭ、５７５ｐＭ、５８０ｐＭ、５８５ｐＭ、５９０ｐＭ、５９５ｐＭ、６００ｐＭ、６０５ｐＭ、６１０ｐＭ、６１５ｐＭ、６２０ｐＭ、６２５ｐＭ、６３０ｐＭ、６３５ｐＭ、６４０ｐＭ、６４５ｐＭ、６５０ｐＭ、６５５ｐＭ、６６０ｐＭ、６６５ｐＭ、６７０ｐＭ、６７５ｐＭ、６８０ｐＭ、６８５ｐＭ、６９０ｐＭ、６９５ｐＭ、７００ｐＭ、７０５ｐＭ、７１０ｐＭ、７１５ｐＭ、７２０ｐＭ、７２５ｐＭ、７３０ｐＭ、７３５ｐＭ、７４０ｐＭ、７４５ｐＭ、７５０ｐＭ、７５５ｐＭ、７６０ｐＭ、７６５ｐＭ、７７０ｐＭ、７７５ｐＭ、７８０ｐＭ、７８５ｐＭ、７９０ｐＭ、７９５ｐＭ、８００ｐＭ、８０５ｐＭ、８１０ｐＭ、８１５ｐＭ、８２０ｐＭ、８２５ｐＭ、８３０ｐＭ、８３５ｐＭ、８４０ｐＭ、８４５ｐＭ、８５０ｐＭ、８５５ｐＭ、８６０ｐＭ、８６５ｐＭ、８７０ｐＭ、８７５ｐＭ、８８０ｐＭ、８８５ｐＭ、８９０ｐＭ、８９５ｐＭ、９００ｐＭ、９０５ｐＭ、９１０ｐＭ、９１５ｐＭ、９２０ｐＭ、９２５ｐＭ、９３０ｐＭ、９３５ｐＭ、９４０ｐＭ、９４５ｐＭ、９５０ｐＭ、９５５ｐＭ、９６０ｐＭ、９６５ｐＭ、９７０ｐＭ、９７５ｐＭ、９８０ｐＭ、９８５ｐＭ、９９０ｐＭ、９９５ｐＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、または１０ｎＭのＫＤで、ＴＮＦＲ２に特異的に結合し得る。
ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、少なくとも約１０４Ｍ－１ｓ－１、または１０５Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで、例えば、約１×１０４Ｍ－１ｓ－１～約１×１０８Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで、ＴＮＦＲ２に特異的に結合して、抗体抗原複合体を形成し得る。例えば、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、約１×１０４Ｍ－１ｓ－１、２×１０４Ｍ－１ｓ－１、３×１０４Ｍ－１ｓ－１、４×１０４Ｍ－１ｓ－１、５×１０４Ｍ－１ｓ－１、６×１０４Ｍ－１ｓ－１、７×１０４Ｍ－１ｓ－１、８×１０４Ｍ－１ｓ－１、９×１０４Ｍ－１ｓ－１、１×１０５Ｍ－１ｓ－１、２×１０５Ｍ－１ｓ－１、３×１０５Ｍ－１ｓ－１、４×１０５Ｍ－１ｓ－１、５×１０５Ｍ－１ｓ－１、６×１０５Ｍ－１ｓ－１、７×１０５Ｍ－１ｓ－１、８×１０５Ｍ－１ｓ－１、９×１０５Ｍ－１ｓ－１、１×１０６Ｍ－１ｓ－１、２×１０６Ｍ－１ｓ－１、３×１０６Ｍ－１ｓ－１、４×１０６Ｍ－１ｓ－１、５×１０６Ｍ－１ｓ－１、６×１０６Ｍ－１ｓ－１、７×１０６Ｍ－１ｓ－１、８×１０６Ｍ－１ｓ－１、９×１０６Ｍ－１ｓ－１、１×１０７Ｍ－１ｓ－１、２×１０７Ｍ－１ｓ－１、３×１０７Ｍ－１ｓ－１、４×１０７Ｍ－１ｓ－１、５×１０７Ｍ－１ｓ－１、６×１０７Ｍ－１ｓ－１、７×１０７Ｍ－１ｓ－１、８×１０７Ｍ－１ｓ－１、９×１０７Ｍ－１ｓ－１、または１×１０８Ｍ－１ｓ－１ｋｏｎで、ＴＮＦＲ２に特異的に結合して、抗体抗原複合体を形成し得る。
ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合して、例えば、約１０－３ｓ－１または１０－４ｓ－１のｋｏｆｆ、例えば、約１０－６ｓ－１～約１０－３ｓ－１のｋｏｆｆ（例えば、約１×１０－６ｓ－１、２×１０－６ｓ－１、３×１０－６ｓ－１、４×１０－６ｓ－１、５×１０－６ｓ－１、６×１０－６ｓ－１、７×１０－６ｓ－１、８×１０－６ｓ－１、９×１０－６ｓ－１、１×１０－５ｓ－１、２×１０－５ｓ－１、３×１０－５ｓ－１、４×１０－５ｓ－１、５×１０－５ｓ－１、６×１０－５ｓ－１、７×１０－５ｓ－１、８×１０－５ｓ－１、９×１０－５ｓ－１、１×１０－４ｓ－１、２×１０－４ｓ－１、３×１０－４ｓ－１、４×１０－４ｓ－１、５×１０－４ｓ－１、６×１０－４ｓ－１、７×１０－４ｓ－１、８×１０－４ｓ－１、９×１０－４ｓ－１、または１×１０－３ｓ－１のｋｏｆｆ）で解離する抗体抗原複合体を形成し得る。
本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、ＴＮＦＲ２を発現する細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ２５Ｈｉを発現するＴｒｅｇ細胞）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、および／またはＴＮＦＲ２＋組織、例えば、ニューロンまたは他の中枢神経系の細胞において、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を刺激し得、それによって細胞の、治癒、再生、増殖、および／または保護を促進する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、後述の遺伝子の１つ以上の発現における増加を観察することによって、または遺伝子活性化を評価する当該技術分野で既知の他の方法によって評価されるとき、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンα、リンホトキシンβ、ＴＮＦＳＦ１８、ＩＬ２ＲＡ、ＩＫＺＦ２／４、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦ－ベータ、ＣＨＵＫ、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＦＫＢＩＡ、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＴＲＡＦ３、ｒｅｌＢ、ＴＮＦ、ＣＸＣＲ３、ＰＤＬ１（ＣＤ２７４）、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ７Ｒ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＮＦＫＢＩＢ、ＴＡＮＫ、ＴＢＫ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＡＦ２、ｒｅｌＢ、ＬＴＡ、ＥＰ３００、およびＣＲＥＢＢＰからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を増加させる。例えば、アゴニストＴＮＦＲ２単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋細胞の活性化に関与する１つ以上のタンパク質の発現、または翻訳後修飾（例えば、リン酸化）を促進し得る。ポリペプチドは、例えば、ＩＬ４の発現を低下させ得る。
例えば、本開示のポリペプチドは、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ａ ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンαリンホトキシンβ、ＴＮＦＳＦ１８、ＩＬ２ＲＡ、ＩＫＺＦ２／４、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦ－ベータ、ＣＨＵＫ、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＦＫＢＩＡ、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＴＲＡＦ３、ｒｅｌＢ、ＴＮＦ、ＣＸＣＲ３、ＰＤＬ１（ＣＤ２７４）、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ７Ｒ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＮＦＫＢＩＢ、ＴＡＮＫ、ＴＢＫ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＡＦ２、ｒｅｌＢ、ＬＴＡ、ＥＰ３００、およびＣＲＥＢＢＰからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現または翻訳後修飾（例えば、リン酸化）を、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクトによって処理されていない試料から単離したこれらのタンパク質の１つ以上の発現または翻訳後修飾（例えば、リン酸化）と比較して、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％増加させ得る。発現レベルおよびリン酸化状態を決定するために使用できる例示的なアッセイは、当該技術分野で知られており、例えば、タンパク質含有量を決定するウェスタンブロットアッセイおよびｍＲＮＡ含有量を決定する定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）実験を含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は優勢なＴＮＦＲ２アゴニストであり、それらのアゴニスト性活性は、ＴＮＦα、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）などの天然のＴＮＦＲ２リガンド、および／またはＩＬ－２などの増殖促進剤物質と組み合わせて使用される場合、さらに増強され得る。
単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトなどのアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドは、末梢リンパ球（例えば、ヒト末梢リンパ球）において解糖からグルタミノ分解および脂肪酸酸化への代謝シフトを刺激することができ、これは、Ｔｒｅｇ細胞の増殖の増加の証拠である。
本明細書に記載のアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、イタコン酸産生における増加（そのアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドで処理されていない細胞（例えば、末梢リンパ球）と比較して、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１，０００％、またはそれ以上）を、誘導し得る。
本明細書に記載のアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、以下の特性のうちの１つ以上、または全てを示し得る。
（ａ）例えば、Ｔｒｅｇ細胞表面のＴＮＦＲ２に結合して活性化することによって、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を促進するか、または安定性および持続を増加させる（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、細胞の集団におけるＴｒｅｇ細胞の質または量を増加させる）、
（ｂ）例えば、ＭＤＳＣ表面のＴＮＦＲ２に結合して活性化することによって、ＭＤＳＣの増殖を促進するか、または安定性を増加させる（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、細胞の集団におけるＭＤＳＣの質または量を増加させる）、
（ｃ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞を殺傷するか、またはその拡大を阻害する（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、細胞の集団におけるＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の量を減少させる）、および／または
（ｄ）ＴＮＦＲ２発現実質細胞、例えば、中枢神経系および末梢神経系ならびにそれらの関連する構造の細胞の増殖を促進するか、および／または直接拡大する（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上）。
（ａ）例えば、Ｔｒｅｇ細胞表面のＴＮＦＲ２に結合して活性化することによって、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を促進するか、または安定性および持続を増加させる（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、細胞の集団におけるＴｒｅｇ細胞の質または量を増加させる）、
（ｂ）例えば、ＭＤＳＣ表面のＴＮＦＲ２に結合して活性化することによって、ＭＤＳＣの増殖を促進するか、または安定性を増加させる（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、細胞の集団におけるＭＤＳＣの質または量を増加させる）、
（ｃ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞を殺傷するか、またはその拡大を阻害する（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、細胞の集団におけるＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の量を減少させる）、および／または
（ｄ）ＴＮＦＲ２発現実質細胞、例えば、中枢神経系および末梢神経系ならびにそれらの関連する構造の細胞の増殖を促進するか、および／または直接拡大する（例えば、それによって、ポリペプチドに暴露していない細胞の集団と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上）。
例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトを使用して、患者（ヒト患者など）または試料内（例えば、本明細書に記載の疾患の治療を受けているヒト患者などの患者から単離された試料）のＴｒｅｇ、ＭＤＳＣ、および／または実質細胞の総量を、それぞれポリペプチドで治療されていない患者または試料と比較して、増加させることができる。例えば、実質細胞は、リンパ球またはニューロンなどの中枢神経系関連細胞の様々なサブセットのうちの１つであってよい。
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ２５Ｈｉを発現する活性化Ｔｒｅｇ細胞）、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２を発現する実質細胞の増殖または拡大を増加させ、および／または直接増強することができる。例えば、実質細胞は、リンパ球またはニューロンなどの中枢神経系関連細胞の様々なサブセットのうちの１つであってよい。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、ＭＤＳＣ（例えば、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＣＲ２、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｄ１、ＣＤ２、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ４３、ＣＤ４４、補体成分Ｃ５ａ Ｒ１、Ｆ４／８０（ＥＭＲ１）、Ｆｃγ ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、Ｆｃγ ＲＩＩ（ＣＤ３２）、Ｆｃγ ＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、Ｆｃγ ＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）、Ｆｃγ ＲＩＩＢ／Ｃ（ＣＤ３２ｂ／ｃ）、Ｆｃγ ＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）、Ｆｃγ ＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）、Ｆｃγ ＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、ガレクチン－３、ＧＰ１３０、Ｇｒ－１（Ｌｙ－６Ｇ）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－６Ｒα、インテグリンα４（ＣＤ４９ｄ）、インテグリンαＬ（ＣＤ１１ａ）、インテグリンαＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｍ－ＣＳＦＲ、ＭＧＬ１（ＣＤ３０１ａ）、ＭＧＬ１／２（ＣＤ３０１ａ／ｂ）、ＭＧＬ２（ＣＤ３０１ｂ）、一酸化窒素、ＰＳＧＬ－１（ＣＤ１６２）、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、シグレック－３（ＣＤ３３）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ－１）、およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲまたはＦｌｋ－１）からなる群から選択されるタンパク質および小分子の全てまたはサブセットを発現する細胞）の表面上のＴＮＦＲ２に結合し得る。特に、ＭＤＳＣは、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ２１、ＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＳｃａ－１（Ｌｙ６）からなる群から選択されるタンパク質を発現しない。ＭＤＳＣへのＴＮＦＲ２の結合は、ＭＤＳＣの増殖または安定性を増加させ得、および／またはＭＤＳＣのアポトーシスを防止することなどにより、ＭＤＳＣを直接拡大し得る。本明細書に記載のポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、Ｔｒｅｇ細胞、実質細胞（例えば、ＴＮＦＲ２発現細胞）、および／またはＭＤＳＣの増殖を促進するのにＴＮＦαを必要としないものであり得るが、場合によっては、ＴＮＦαまたはアゴニスト性ＴＮＦαムテイン（例えば、参照によりその開示の全てが本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０２９０４３に記載のアゴニスト性ＴＮＦαムテイン）は、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド組み合わせることができ、それによって、増殖効果をさらに増強する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、自己免疫疾患に罹患した患者において、自己免疫を有しない対象と比較して、より大きな効力で、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を増強し、および／または直接安定化もしくは増殖させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、自己免疫のない部位と比較して、自己免疫の微小環境においてより大きな効力で、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を増強し、および／または直接拡大する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患した患者において、ＧＶＨＤを有しない対象と比較して、より優れた効力で、ＭＤＳＣの蔵書工を増強または安定化し、および／または直接殺傷する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、ＧＶＨＤのない部位と比較して、ＧＶＨＤの微小環境においてより大きな効力で、ＭＤＳＣの増殖を増加させ、および／または直接拡大する。
例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、自己免疫またはＧＶＨＤに罹患した患者の細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＴＮＦＲ２に結合し得、ＭＤＳＣの増殖を増加させ得、および／またはＣＴＬの死を促進し得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、自己免疫またはＧＶＨＤの微小環境において、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＭＤＳＣの増殖を拡大するために、疾患とは異なる部位におけるＴｒｅｇ細胞および／またはＭＤＳＣの増殖を拡大するポリペプチドのＩＣ５０より小さいＩＣ５０を示し得、ＩＣ５０は、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上減少している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、自己免疫またはＧＶＨＤに罹患している患者において、それらの疾患のない対象よりも、より大きな効力で、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞を殺傷または排除する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、自己免疫またはＧＶＨＤのない部位と比較して、自己免疫反応またはＧＶＨＤの微小環境においてより大きな効力で、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞を収縮させる。
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトは、自己免疫のない対象におけるＴエフェクター細胞の殺傷におけるポリペプチドのＥＣ５０よりも、例えば、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上低い、自己免疫の患者におけるＥＣ５０で、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞を直接殺傷する。
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、本開示の方法によって同定および／または生成されるものである。ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを同定および／または生成するための開示の方法には、
（ａ）抗体またはその断片の混合物を、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２内の５つ以上の連続または不連続のアミノ酸残基を含む少なくとも１つのペプチドと接触させることと、
（ｂ）ペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片を混合物から分離し、それにより、少なくとも１つのＴＮＦＲ２アゴニスト抗体または抗原結合断片を含む濃縮された抗体混合物を生成することと、
（ｃ）濃縮された抗体混合物を、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ３および／またはＣＲＤ４内の５つ以上の連続または不連続のアミノ酸残基を含む少なくとも１つのペプチドに暴露し、ペプチドに特異的に結合しない抗体またはその断片を残し、それにより、少なくとも１つのＴＮＦＲ２アゴニスト抗体またはその抗原結合断片を含む抗体混合物を生成することと、が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、本開示の方法によって同定および／または生成されるものである。ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを同定および／または生成するための開示の方法には、
（ａ）抗体またはその断片の混合物を、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２内の５つ以上の連続または不連続のアミノ酸残基を含む少なくとも１つのペプチドと接触させることと、
（ｂ）ペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片を混合物から分離し、それにより、少なくとも１つのＴＮＦＲ２アゴニスト抗体または抗原結合断片を含む濃縮された抗体混合物を生成することと、
（ｃ）濃縮された抗体混合物を、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ３および／またはＣＲＤ４内の５つ以上の連続または不連続のアミノ酸残基を含む少なくとも１つのペプチドに暴露し、ペプチドに特異的に結合しない抗体またはその断片を残し、それにより、少なくとも１つのＴＮＦＲ２アゴニスト抗体またはその抗原結合断片を含む抗体混合物を生成することと、が含まれる。
いくつかの実施形態では、方法は、濃縮された抗体混合物中の抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上のアミノ酸配列を決定することを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）および／または（ｃ）のペプチドが表面に結合している。抗体またはその抗原結合断片は、ファージ、細菌細胞、または酵母細胞の表面に発現することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、リボソームに非共有結合しているか、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡに共有結合している、１つ以上のポリペプチド鎖として発現する。いくつかの実施形態では、（ａ）および／または（ｃ）のペプチドは、蛍光分子（例えば、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ヘキスト、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、テトラメチルロアドミン、もしくはシアニン）、またはエピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、ビオチン、もしくはストレプトアビジン）などの検出可能な標識とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）および（ｂ）は、１回以上（例えば、１回～１０回、２回～９回、３回～８回、または４回～７回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回、またはそれ以上）、逐次的に繰り返される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、ポリクローナル抗体またはその抗原結合断片、ヒト抗体またはその抗原結合断片、ヒト化抗体またはその抗原結合断片、霊長類化抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体またはその抗原結合断片、多重特異性抗体またはその抗原結合断片、二重可変免疫グロブリンドメイン、一価抗体またはその抗原結合断片、キメラ抗体またはその抗原結合断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ディアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質足場、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２分子、およびタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）からなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒト抗体もしくはその抗原結合断片、ヒト化抗体もしくはその抗原結合断片、またはキメラ抗体もしくはその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単鎖ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、二重特異性モノクローナル抗体などの二重特異性抗体であり、抗体の一方のアームがＴＮＦＲ２に特異的に結合し、他方のアームは、本明細書に記載のうちとりわけ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する。ＴＮＦＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、例えば、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるヒトＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合できるが、ＣＲＤ４内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるヒトＴＮＦＲ２のエピトープには結合しない。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）のうちの１つ以上に対応するヒトＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合する。
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）のうちの１つ以上に対応するヒトＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、上記のヒトＴＮＦＲ２のエピトープなどのＴＮＦＲ２に特異的に結合する１つのアームと、ＰＤ－１に特異的に結合する免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する１つのアームを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、ＰＤ－１活性のアゴニストである。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、上記のヒトＴＮＦＲ２のエピトープなどのＴＮＦＲ２に特異的に結合する１つのアームと、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する１つのアームを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、ＰＤ－Ｌ１活性のアゴニストである。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、上記のヒトＴＮＦＲ２のエピトープなどのＴＮＦＲ２に特異的に結合する１つのアームと、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する１つのアームを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、ＣＴＬＡ－４活性のアゴニストである。
第２の態様は、第１のポリペプチドドメインおよび第２のポリペプチドドメインを含むコンストラクトを特徴とする。第１のポリペプチドドメインおよび第２のポリペプチドドメインは、それぞれ独立して、第１の態様またはその実施形態のいずれかの抗原結合断片である。第１のポリペプチドドメインおよび第２のポリペプチドドメインは、例えば、アミド結合またはジスルフィド結合を含む（例えば、それらである）リンカーなどの共有リンカーによって互いに結合され得る。
第３の態様は、第１の態様のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）、および／または第２の態様のコンストラクト、またはその実施形態のいずれかをコードするポリヌクレオチドを特徴とする。
第４の態様は、第３の態様のポリヌクレオチドをコードするベクターを特徴とする。ベクターは、真核生物発現ベクターなどの発現ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターはアデノウイルス（例えば、血清型２、５、１１、１２、２４、２６、３４、３５、４０、４８、４９、５０、５２、またはＰａｎ９アデノウイルスなどの血清型１－５７アデノウイルス）、レトロウイルス（例えば、γ－レトロウイルスまたはレンチウイルス）、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルス（例えば、改変されたワクシニアアンカラウイルス）などのウイルスベクターである。
第５の態様は、第３の態様のポリヌクレオチドおよび／または第４の態様のベクターを含む単離された宿主細胞を特徴とする。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＥＫ細胞）であり得る。宿主細胞は、例えば、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９１：１８０－１８９，２００５に記載されているものであり得る。
第６の態様は、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合し、結合時にＴＮＦＲ２活性に対するアゴニスト効果を示すポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）を含む医薬組成物を特徴とする。ポリペプチドは、例えば、第１の態様またはその実施形態のいずれかの抗体または抗原結合断片であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１０％が、ＩｇＧ２－ＢまたはＩｇＧ２－Ａジスルフィド結合アイソフォームなどの単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の約１０％～約９９．９９９％が、例えば、抗体またはその抗原結合断片の約１１％～約９９．９％、約１２％～約９９．９％、約１３％～約９９．９％、約１４％～約９９．９％、約１５％～約９９％、約１６％～約９９．９％、約１７％～約９９．９％、約１８％～約９９．９％、約１９％～約９９．９％、約２０％～約９９．９％、約２１％～約９９．９％、約２２％～約９９．９％、約２３％～約９９．９％、約２４％～約９９．９％、約２５％～約９９．９％、約２６％～約９９．９％、約２７％～約９９．９％、約２８％～約９９．９％、約２９％～約９９．９％、約３０％～約９９．９％、約３１％～約９９．９％、約３２％～約９９．９％、約３３％～約９９．９％、約３４％～約９９．９％、約３５％～約９９．９％、約３６％～約９９．９％、約３７％～約９９．９％、約３８％～約９９．９％、約３９％～約９９．９％、約４０％～約９９．９％、約４１％～約９９．９％、約４２％～約９９．９％、約４３％～約９９．９％、約４４％～約９９．９％、約４５％～約９９．９％、約４６％～約９９．９％、約４７％～約９９．９％、約４８％～約９９．９％、約４９％～約９９．９％、約５０％～約９９．９％、約５１％～約９９．９％、約５２％～約９９．９％、約５３％～約９９．９％、約５４％～約９９．９％、約５５％～約９９．９％、約５６％～約９９．９％、約５７％～約９９．９％、約５８％～約９９．９％、約５９％～約９９．９％、約６０％～約９９．９％、約６１％～約９９．９％、約６２％～約９９．９％、約６３％～約９９．９％、約６４％～約９９．９％、約６５％～約９９．９％、約６６％～約９９．９％、約６７％～約９９．９％、約６８％～約９９．９％、約６９％～約９９．９％、約７０％～約９９．９％、約７１％～約９９．９％、約７２％～約９９．９％、約７３％～約９９．９％、約７４％～約９９．９％、約７５％～約９９．９％、約７６％～約９９．９％、約７７％～約９９．９％、約７８％～約９９．９％、約７９％～約９９．９％、約８０％～約９９．９％、約８１％～約９９．９％、約８２％～約９９．９％、約８３％～約９９．９％、約８４％～約９９．９％、約８５％～約９９．９％、約８６％～約９９．９％、約８７％～約９９．９％、約８８％～約９９．９％、約８９％～約９９．９％、約９０％～約９９．９％、約９１％～約９９．９％、約９２％～約９９．９％、約９３％～約９９．９％、約９４％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９６％～約９９．９％、約９７％～約９９．９％、約９８％～約９９．９％、または約９９％～約９９．９９％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約１０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約１５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約２０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約２５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約３０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約３５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約４０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約４５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約５０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約６０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約６５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約７０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約７５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約８０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約８５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約９０％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約９５％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約９６％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約９７％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約９８％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約９９％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも約９９．９％が、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、非還元条件下で実施されるゲル電気泳動分析で単一の検出可能なバンドのみをもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように、抗体または抗原結合断片の単一のジスルフィド結合アイソフォームはＩｇＧ２－Ｂである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように、抗体または抗原結合断片の単一のジスルフィド結合アイソフォームはＩｇＧ２－Ａである。
追加的に、または代替的に、医薬組成物は、第２の態様またはその任意の実施形態のコンストラクト、第３の態様またはその任意の実施形態のポリヌクレオチド、第４の態様またはその任意の実施形態のベクター、および／または第５の態様またはその任意の実施形態の宿主細胞を含んでもよい。医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、医薬組成物中に、約０．００１ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの量、例えば、０．０１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
医薬組成物は、免疫療法剤などの追加の治療薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＣＤ３０剤、アゴニスト性抗ＣＤ４０剤、アゴニスト性抗４－１ＢＢ剤、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ剤、アゴニスト性抗ＯＸ４０剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ剤、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質剤、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ剤、アゴニスト性抗ＭＥＫ剤、アゴニスト性抗ＣＤ３３剤、アゴニスト性抗ＣＤ２０剤、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ剤、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ剤、アゴニスト性抗ＣＤ５２剤、アゴニスト性抗Ａ３３剤、アゴニスト性抗ＧＤ３剤、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ剤、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １剤、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９剤、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ剤、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ剤、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４剤、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ１５５剤、アゴニスト性抗ＣＤ８０剤、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１６０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２８剤、アゴニスト性抗ＣＤ２２６剤、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１剤、アゴニスト性抗ＴＩＭ３剤、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９６剤、アゴニスト性抗ＣＤ７０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１３７剤、アゴニスト性抗ＤＲ４剤、アゴニスト性抗ＣＲ５剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１剤、アゴニスト性抗ＦＡＳ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９５剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ剤、アゴニスト性抗ＤＲ６剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ剤、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ剤、アゴニスト性抗ＯＰＧ剤、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ剤、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体剤、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ剤、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ剤、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ剤、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ剤からなる群から選択される。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤であってよい。
いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＭＥＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ａ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＤ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１５５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１６０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２２６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１抗
体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合性断片、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。
体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合性断片、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、例えば、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７８、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１２１、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１８７、ＣＤ１８８、ＣＤ１８９、ＣＤ１９０、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤ１９８、ＣＤ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２、ＣＤ２０３、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤ２１１、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５、ＣＤ２３６、ＣＤ２３７、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５０、ＣＤ２５１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５５、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２５９、ＣＤ２６０、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８５、ＣＤ２８６、ＣＤ２８７、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９１、ＣＤ２９２、ＣＤ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１０、ＣＤ３１１、ＣＤ３１２、ＣＤ３１３、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、および／またはＣＤ３２０のうちの１つ以上に結合して活性を促進する抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、ケモカインまたはリンフォカインに結合する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。例えば、免疫療法剤は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ５のうちの１つ以上、または全てに結合して活性化する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、およびＣＣＬ２２のうちの１つ以上、または全てに結合して活性化する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、抗体の一方のアームがＴＮＦＲ２に特異的に結合し、他方のアームは、本明細書に記載のうちとりわけ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する二重特異性モノクローナル抗体などの二重特異性抗体を含む。ＴＮＦＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、例えば、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるヒトＴＮＦＲ２のエピトープに特異的に結合できるが、ＣＲＤ４内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープには結合しない。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、上記のヒトＴＮＦＲ２のエピトープなどのＴＮＦＲ２に特異的に結合する１つのアームと、ＰＤ－１に特異的に結合する免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する１つのアームを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、ＰＤ－１活性のアゴニストである。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、上記のヒトＴＮＦＲ２のエピトープなどのＴＮＦＲ２に特異的に結合する１つのアームと、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する１つのアームを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、ＰＤ－Ｌ１活性のアゴニストである。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、上記のヒトＴＮＦＲ２のエピトープなどのＴＮＦＲ２に特異的に結合する１つのアームと、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する１つのアームを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する二重特異性抗体のアームは、ＣＴＬＡ－４活性のアゴニストである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の追加の治療薬は、ＴＮＦα、アゴニスト性ＴＮＦαムテイン（例えば、その開示が全て参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２９０４３に記載の意アゴニスト性ＴＮＦαムテイン）、またはＢＣＧである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、抗ＴＮＦα抗体またはその抗原結合断片などの抗ＴＮＦα剤を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、インフリキシマブ、エタネルセプト、セルトリズマブ、ゴリムマブ、またはアダリムマブを含まない。
第７の態様は、第１の態様のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）、および／または第２の態様のコンストラクト、またはその実施形態のいずれかを生成する方法を特徴とする。この方法は、ポリペプチドまたはコンストラクトをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞（例えば、本明細書に記載の宿主細胞）中で発現させることと、宿主細胞培地からポリペプチドを回収することと、を含み得る。
第８の態様は、第１の態様もしくはその任意の実施形態のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）、第２の態様もしくはその任意の実施形態のコンストラクト、第３の態様もしくはその任意の実施形態のポリヌクレオチド、第４の態様もしくはその任意の実施形態のベクター、第５の態様もしくはその任意の実施形態の宿主細胞、および／または第６の態様もしくはその任意の実施形態の医薬組成物を対象に投与することによって、哺乳動物対象においてＢ細胞またはＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞）によって媒介される免疫応答などの免疫応答を阻害する方法を特徴とする。
第９の態様は、第１の態様もしくはその任意の実施形態のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）、第２の態様もしくはその任意の実施形態のコンストラクト、第３の態様もしくはその任意の実施形態のポリヌクレオチド、第４の態様もしくはその任意の実施形態のベクター、第５の態様もしくはその任意の実施形態の宿主細胞、および／または第６の態様もしくはその任意の実施形態の医薬組成物を対象に投与することによって、哺乳動物対象において免疫学的疾患を治療する方法を特徴とする。
いくつかの実施形態では、対象は組織または臓器の再生を必要としている。この組織または臓器は、例えば、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、頭の構造、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、または精巣であってよい。
いくつかの実施形態では、この免疫学的疾患は、自己免疫疾患、神経疾患、アレルギー、喘息、黄斑変性症、筋肉萎縮、流産に関連する疾患、アテローム性動脈硬化症、骨喪失、筋骨格疾患、肥満、ＧＶＨＤ、または同種移植片拒絶反応である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、本態性混合型クリオグロブリン、線維筋痛－線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、またはウェゲナー肉芽腫症である。
いくつかの実施形態では、神経学的状態は、脳腫瘍、脳転移、脊髄損傷、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、または発作である。
いくつかの実施形態では、アレルギーは、食物アレルギー、季節性アレルギー、ペットアレルギー、じんましん、花粉症、アレルギー性結膜炎、毒ツタアレルギー、オークアレルギー、カビアレルギー、薬物アレルギー、粉塵アレルギー、化粧品アレルギー、または化学物質アレルギーである。
いくつかの実施形態では、同種移植片拒絶反応は、皮膚移植片拒絶反応、骨移植片拒絶反応、血管組織移植片拒絶反応、靭帯移植片拒絶反応、または臓器移植片拒絶反応である。
いくつかの実施形態では、靭帯移植片拒絶は、輪状甲状腺靭帯移植片拒絶、歯周靭帯移植片拒絶、水晶体の提靱帯移植片拒絶、掌側橈骨手根靭帯移植片拒絶、背側橈骨手根靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、乳房提靭帯移植片拒絶、前仙腸靭帯移植片拒絶、後仙腸靭帯移植片拒絶、仙骨結節靭帯移植片拒絶、仙棘靭帯移植片拒絶、下恥骨靱帯移植片拒絶、上恥骨靭帯移植片拒絶、前十字靱帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、後十字靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、頭蓋十字靭帯移植片拒絶、尾側十字靭帯移植片拒絶、または膝蓋靭帯移植片拒絶である。
いくつかの実施形態では、臓器移植片拒絶は、心臓移植片拒絶反応、肺移植片拒絶反応、腎臓移植片拒絶反応、肝臓移植片拒絶反応、膵臓移植片拒絶反応、腸移植片拒絶反応、または胸腺移植片拒絶反応である。
いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤは、骨髄移植、または造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、巨核球、単球、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞からなる群から選択される１つ以上の血液細胞から生じる。
第１０の態様は、第１の態様もしくはその任意の実施形態のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）、第２の態様もしくはその任意の実施形態のコンストラクト、第３の態様もしくはその任意の実施形態のポリヌクレオチド、第４の態様もしくはその任意の実施形態のベクター、第５の態様もしくはその任意の実施形態の宿主細胞、および／または第６の態様もしくはその任意の実施形態の医薬組成物を対象に投与することによって、哺乳動物対象において炎症性疾患を治療する方法を特徴とする。
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は急性または慢性の炎症である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、変形性関節症、線維性肺疾患、および心臓の炎症からなる群から選択される。
第１１の態様は、第１の態様もしくはその任意の実施形態のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）、第２の態様もしくはその任意の実施形態のコンストラクト、第３の態様もしくはその任意の実施形態のポリヌクレオチド、第４の態様もしくはその任意の実施形態のベクター、第５の態様もしくはその任意の実施形態の宿主細胞、および／または第６の態様もしくはその任意の実施形態の医薬組成物を対象に投与することによって、哺乳動物対象においてＴＮＦＲ２＋組織を治癒、保護、増殖、および／または再生する方法を特徴とする。
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２＋組織は、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、胃腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、または精巣の組織からなる群から選択される。
第８、第９、第１０、および／または第１１の態様のいくつかの実施形態において、方法は、免疫療法剤をヒトに投与することをさらに含む。免疫療法剤は、例えば、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＣＤ３０剤、アゴニスト性抗ＣＤ４０剤、アゴニスト性抗４－１ＢＢ剤、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ剤、アゴニスト性抗ＯＸ４０剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ剤、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質剤、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ剤、アゴニスト性抗ＭＥＫ剤、アゴニスト性抗ＣＤ３３剤、アゴニスト性抗ＣＤ２０剤、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ剤、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ剤、アゴニスト性抗ＣＤ５２剤、アゴニスト性抗Ａ３３剤、アゴニスト性抗ＧＤ３剤、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ剤、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １剤、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９剤、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ剤、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ剤、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４剤、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ１５５剤、アゴニスト性抗ＣＤ８０剤、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１６０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２８剤、アゴニスト性抗ＣＤ２２６剤、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１剤、アゴニスト性抗ＴＩＭ３剤、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９６剤、アゴニスト性抗ＣＤ７０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１３７剤、アゴニスト性抗ＤＲ４剤、アゴニスト性抗ＣＲ５剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１剤、アゴニスト性抗ＦＡＳ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９５剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ剤、アゴニスト性抗ＤＲ６剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ剤、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ剤、アゴニスト性抗ＯＰＧ剤、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ剤、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体剤、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ剤、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ剤、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ剤、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ剤からなる群から選択できる。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤であってよい。
ヒトに投与される免疫療法剤は、例えば、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＭＥＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ａ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＤ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１５５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１６０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２２６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１抗
体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択できる。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合性断片、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。
体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択できる。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合性断片、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。
第８、第９、第１０、および／または第１１の態様のいくつかの実施形態では、方法は、抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、例えば、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７８、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１２１、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１８７、ＣＤ１８８、ＣＤ１８９、ＣＤ１９０、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤ１９８、ＣＤ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２、ＣＤ２０３、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤ２１１、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５、ＣＤ２３６、ＣＤ２３７、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５０、ＣＤ２５１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５５、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２５９、ＣＤ２６０、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８５、ＣＤ２８６、ＣＤ２８７、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９１、ＣＤ２９２、ＣＤ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１０、ＣＤ３１１、ＣＤ３１２、ＣＤ３１３、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、および／またはＣＤ３２０のうちの１つ以上に結合して活性化する抗体またはその抗原結合断片を、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含む。
第８、第９、第１０、および／または第１１の態様のいくつかの実施形態では、方法は、ケモカインまたはリンフォカインに結合して活性化する薬剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）を哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含む。例えば、免疫療法剤は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ５のうちの１つ以上、または全てに結合してその活性を活性化する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、およびＣＣＬ２２のうちの１つ以上、または全てに結合して活性化する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。
第８、第９、第１０、および／または第１１の態様のいくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）は、抗ＴＮＦα抗体またはその抗原結合断片などの抗ＴＮＦα剤を投与されない。第８、第９、第１０、および／または第１１の態様のいくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）は、インフリキシマブ、エタネルセプト、セルトリズマブ、ゴリムマブ、またはアダリムマブを投与されない。
第８、第９、第１０、および／または第１１の態様のいくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する、ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの量、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの量で哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される。
第１２の態様は、第１の態様もしくはその任意の実施形態のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）、第２の態様もしくはその任意の実施形態のコンストラクト、第３の態様もしくはその任意の実施形態のポリヌクレオチド、第４の態様もしくはその任意の実施形態のベクター、第５の態様もしくはその任意の実施形態の宿主細胞、および／または第６の態様もしくはその任意の実施形態の医薬組成物を含む、キットを特徴とする。
いくつかの実施形態では、キットにはベクターを宿主細胞にトランスフェクトするための使用説明書が含まれる。追加的にまたは代替的に、キットは、宿主細胞においてポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）を発現するための使用説明書を含んでもよい。キットは、宿主細胞内でポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）を発現するために使用できる試薬を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の細胞増殖障害および／または感染症に罹患しているヒト患者などの哺乳動物（例えば、ヒト）に薬剤を投与するための使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットには薬剤を作製する方法または使用方法の使用説明書を含む。
定義
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、記載されている値よりも１０％以上上または下にある値を指す。例えば、「約５ｎＭ」という用語は、４．５ｎＭ～５．５ｎＭの範囲を示す。
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、記載されている値よりも１０％以上上または下にある値を指す。例えば、「約５ｎＭ」という用語は、４．５ｎＭ～５．５ｎＭの範囲を示す。
本明細書で使用されるとき、「アゴニストＴＮＦＲ２抗体」および「アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体」という用語は、ＴＮＦＲ２の活性化を促進または増加させ、および／またはＴＮＦＲ２によって媒介される１つ以上のシグナル伝達経路を増強できるＴＮＦＲ２抗体を指す。例えば、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の集団の増殖を促進または増大させることができる。本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２に結合することにより、例えば、受容体を生物学的に活性にする立体構造変化を誘導することにより、ＴＮＦＲ２活性化を促進または増加させ得る。例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２とその同族リガンドであるＴＮＦαとの間の相互作用と同様の方法でＴＮＦＲ２の三量体化の核となり、したがって、ＴＮＦＲ２媒介性シグナル伝達を誘導することができる。本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導することができる。本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体はまた、例えば、免疫調節Ｔｒｅｇ細胞の活性化を通じて、または免疫エフェクター細胞（自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞など）の表面上のＴＮＦＲ２に直接結合してアポトーシスを誘導することにより、Ｂリンパ球および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の増殖を抑制することができる。特に明記しない限り、「アゴニストＴＮＦＲ２抗体」および「アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体」という用語は、ＴＮＦＲ２に結合してＴＮＦＲ２シグナル伝達を増強する能力を保持する抗体断片、例えば以下に記載されるものも含む。
本明細書で使用されるとき、「抗体」（Ａｂ）という用語は、特定の抗原に特異的に結合するか、免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作、およびその他の修飾された形態の抗体を含み、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重、三重、および四重特異的抗体、ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ）、ならびに例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、組換えＩｇＧ（ｒｌｇＧ）断片、およびｓｃＦｖ断片を含む抗体の抗原結合断片を含むがこれらに限定されない。さらに、特に明記しない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、標的タンパク質に特異的に結合できる、インタクトな分子、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片など）の両方を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片はインタクトな抗体のＦｃ断片を欠いており、動物の循環からより迅速に除去され、インタクトな抗体よりも非特異的組織結合が少なくなり得る（参照により本明細書に組み込まれるＷａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６，１９８３を参照されたい）。
「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用されるとき、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行できる。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、ディアボディ、トリアボディ、アフィボディ、ナノボディ、アプタマー、またはドメイン抗体であり得る。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨおよびＶＬドメインを含むｄＡｂ、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）、（ｖｉｉ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ、（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｉｘ）合成リンカーによって任意選択で結合され得る、２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬとＶＨ領域が対となって一価の分子を形成する、単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にするリンカーによって、組換え法を使用して結合することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として知られる、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照されたい）。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同一の方法で有用性についてスクリーニングできる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的切断、または当該技術分野で既知の化学ペプチド合成手順によって生成することができる。
本明細書で使用されるとき、「抗腫瘍壊死因子受容体２抗体」、「ＴＮＦＲ２抗体」、「抗ＴＮＦＲ２抗体部分」、「抗ＴＮＦＲ２抗体断片」等の用語には、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、例えば重鎖または軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖の可変領域、重鎖または軽鎖の定常領域、フレームワーク領域またはＴＮＦＲ２に特異的に結合することができるその任意の部分を含むタンパク質またはペプチド含有分子が含まれる。ＴＮＦＲ２抗体には、抗体のＣＤＲに対して構造および溶媒の接近性が類似したＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの構造ループを含む、第１０フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（１０Ｆｎ３）などの抗体様タンパク質骨格も含まれる。１０Ｆｎ３ドメインの三次構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の三次構造に類似し、当業者は、例えば、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの残基を、ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲＨ－１、ＣＤＲＨ－２、またはＣＤＲＨ－３領域からの残基と置換することにより、ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲをフィブロネクチン足場に移植することができる。エピトープ移植のための足場としての１０Ｆｎ３ドメインの使用は、例えば、ＷＯ２０００／０３４７８４に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。「抗腫瘍壊死因子受容体２抗体」、「ＴＮＦＲ２抗体」という用語により包含される追加の足場タンパク質には、ペプチド－Ｆｃ融合タンパク質が含まれる（例えば、ＷＯ２０１２／１２２３７８、ならびにＵＳ８，６３３，２９７に記載され、それぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書で使用されるとき、「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、多くの場合ヒトまたはヒト化抗体を指す。本発明の二重特異性ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２および任意の他の抗原、例えば細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、または組織特異的抗原に対する結合特異性を有し得る。二重特異性抗体はまた、２つの別個の抗原結合ドメイン（例えば、リンカーによって連結された２つのｓｃＦｖ）を含む抗体またはその抗原結合断片であってもよい。ｓｃＦｖは、同一の抗原または異なる抗原に結合することができる。
本明細書で使用されるとき、「キメラ」抗体という用語は、ラットまたはマウスなどの１つの供給源生物の免疫グロブリンに由来する可変ドメイン配列（例えば、ＣＤＲ配列）と、異なる生物（例えば、とりわけヒト、別の霊長類、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科のメンバー（とりわけ、ウシ、バイソン、バッファロー、ヘラジカ、ヤクなど）、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはバイソン）の免疫グロブリンに由来する定常領域とを有する抗体を指す。キメラ抗体生成する方法は当該技術分野で知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第４，８１６，３９７号を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方に見られる超可変領域を指す。可変ドメインのより高度の保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。当該技術分野で理解されるように、抗体の超可変領域を描写するアミノ酸の位置は、文脈および当該技術分野で既知の様々な定義に応じて変化し得る。可変領域内のいくつかの位置は、これらの位置が１つの基準セットの下では超可変領域内にあるとみなされる一方で、異なる基準セットの下では超可変領域外にあるとみなされるハイブリッド超可変位置とみなされる場合がある。これらの位置の１つ以上は、拡大超可変領域でも見つけることができる。本発明は、これらのハイブリッド超可変位置に改変を含む抗体を含む。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、主としてβ－シート構造を採用し、β－シート構造を連結するループを形成し、場合によりβ－シート構造の一部を形成する３つのＣＤＲによって連結される４つのフレームワーク領域を含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によってごく近接してＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で一緒に保持され、他の抗体鎖からのＣＤＲとともに、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７を参照されたい）。本明細書で使用されるとき、免疫グロブリンアミノ酸残基の付番は、特に断りのない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基付番システムに従って行う。
本明細書で使用されるとき、「保存的変異」、「保存的置換」、または「保存的アミノ酸置換」という用語は、１つ以上のアミノ酸の、極性、静電荷、および／または立体体積などの類似の物理化学的性質を示す１つ以上の異なるアミノ酸への置換を指す。これらの特性は、下の表１中に、２０の天然アミノ酸のそれぞれについて要約されている。
この表から、保存的アミノ酸ファミリーには、例えば、（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、およびＭ、（ｉｉ）ＤおよびＥ、（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ、およびＴ、（ｉｖ）Ｈ、Ｋ、およびＲ、（ｖ）ＮおよびＱ、ならびに（ｖｉ）Ｆ，Ｙ、およびＷが含まれることが理解される。したがって、保存的変異または置換は、１つのアミノ酸を、同じアミノ酸ファミリーのメンバーへと置換することである（例えば、ＳｅｒをＴｈｒへと、またはＬｙｓをＡｒｇへと）。
本明細書で使用されるとき、「コンジュゲート」という用語は、ある分子の反応性官能基と別の分子の適切な反応性官能基との化学結合によって形成される化合物を指す。コンジュゲートは、例えば、両方のポリペプチドを互いにインフレームでコードする単一のＲＮＡ転写産物の翻訳によって合成される単一のポリペプチド鎖の一部として互いに共有結合した２つのポリペプチドドメインとして追加的に生成され得る。
ＴＮＦＲ２アゴニストに関して本明細書で使用されるとき、「コンストラクト」という用語は、第２のポリペプチドドメインに結合した第１のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質を指す。ポリペプチドドメインは、それぞれ独立して、例えば、本明細書に記載のアゴニストＴＮＦＲ２単鎖ポリペプチドであり得る。第１のポリペプチドドメインは、例えば、とりわけペプチドリンカーまたはジスルフィド架橋などのリンカーを介して、第２のポリペプチドドメインに共有結合され得る。アゴニスト性ＴＮＦＲ２コンストラクトのポリペプチドドメインを結合するために使用され得る例示的なリンカーには、非限定的に、参照により本明細書にその開示の全てが組み込まれる、Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０：５７１－５８２（２０１２）に記載のものが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「誘導体化抗体」という用語は、化学反応によって修飾されて、残基を切断するか、単離された抗体に固有ではない化学的部分を追加する抗体を指す。誘導体化抗体は、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の化学的保護／ブロッキング基の付加による誘導体化、タンパク質分解的切断、および／または細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合によって得ることができる。確立された手順を使用して、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって、様々な化学修飾のいずれも実施することができる。追加的に、誘導体は、例えば、琥珀抑制技術を使用して、１つ以上の非天然アミノ酸を含むことができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９６４，８５９号を参照されたい）。
本明細書で使用されるとき、「ディアボディ」という用語は、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体を指し、各ポリペプチド鎖は、同じペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメインの分子内会合を可能にするために短すぎるリンカー（例えば、５アミノ酸からなるリンカー）によって結合されたＶＨおよびＶＬドメインを含む。この構成により、各ドメインは別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対になり、ホモ二量体構造を形成する。したがって、「トリアボディ」という用語は、３つのペプチド鎖を含む３価の抗体を指し、その各々が非常に短いリンカー（例えば、１～２アミノ酸で構成されるリンカー）によって結合された１つのＶＨドメインと１つのＶＬドメインを含み、同じペプチド鎖内のＶＨドメインとＶＬドメインの分子内会合を可能にする。本来の構造に折りたたむために、このように構成されたペプチドは、典型的には、隣接するペプチド鎖のＶＨおよびＶＬドメインを互いに空間的に近接して配置し、適切な折りたたみを可能にするように三量体化する（参照により本明細書に組み込まれるＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８，１９９３を参照されたい）。
本明細書で使用されるとき、抗体またはその抗原結合断片の「ジスルフィド結合アイソフォーム」は、特定の内部ジスルフィド結合パターンを有する抗体またはその抗原結合断片の形態である。ジスルフィド結合アイソフォームは、所定の抗体またはその抗原結合断片の構造異性体であり、アミノ酸配列は互いに異ならないが、異なるジスルフィド結合連結を示す。例えば、ヒトＩｇＧ２抗体またはそのバリアントの文脈において、抗体は、本明細書においてアイソフォームＩｇＧ２－Ａ、ＩｇＧ２－Ｂ、ＩｇＧ２－Ａ／Ｂ１、およびＩｇＧ２－Ａ／Ｂ２として表される４つの可能なジスルフィド結合アイソフォームの１つで存在し得る。これらの各アイソフォーム内のジスルフィド結合連結は、図５Ａ～５Ｄに図示される。
ＴＮＦＲ２の「ドミナントアゴニスト」は、ＴＮＦαなどの天然のＴＮＦＲ２リガンドの非存在下でもＴＮＦＲ２活性化を促進することができるアゴニスト（例えば、アゴニスト性ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）である。例えば、アゴニストのＥＣ５０が、ＴＮＦαなどの天然のＴＮＦＲ２リガンドの非存在下で、２００％未満（例えば、２００％、１００％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％未満、またはそれ以下）増加する場合、ＴＮＦＲ２アゴニストはドミナントアゴニストである。ＴＮＦＲ２の活性化は、例えば、とりわけ、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、実質細胞、および中枢神経系の細胞などのＴＮＦＲ２＋細胞の増殖を測定することによって、ならびにＮＦκＢシグナル伝達の活性化を測定することによって評価することができる（例えば、遺伝子発現アッセイにおいて、ＣＨＵＫ、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＦＫＢＩＡ、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ｒｅｌＢ、およびｃＩＡＰ２／ＢＩＲＣ３からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現をモニタリングすることによる）。
本明細書で使用されるとき、「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（「ＤＶＤ－Ｉｇ」）は、リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合可変ドメインを結合して、四価の二重標的化の単一の剤を作製する抗体を指す。（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５０２：２５－４１，２０１２）。本明細書に記載のＤＶＤの軽鎖における使用に適したリンカーは、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．の３０ページの表２．１において識別される以下のものを含む短いＫ鎖リンカーＡＤＡＡＰ（配列番号２４）（マウス）、およびＴＶＡＡＰ（配列番号２５）（ヒト）；長いκ鎖リンカーＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰ（配列番号２６）（マウス）、およびＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２７）（ヒト）、短いλ鎖リンカーＱＰＫＡＡＰ（配列番号２８）（ヒト）長いλ鎖リンカーＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号２９）（ヒト）、ＧＳ－短いリンカーＧＧＳＧＧ（配列番号３０）、ＧＳ－中間リンカーＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号３１）、ＧＳ－長いリンカーＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３２）（全てのＧＳリンカーはマウスおよびヒトである）。ＤＶＤの重鎖における使用に適したリンカーは、参照により本明細書に組み込まれるＧｕ ＆ Ｇｈａｙｕｒ，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０２：２５－４１の３０ページの表２．１で識別される以下のものを含む：短いリンカーＡＫＴＴＡＰ（配列番号３３）（マウス）、およびＡＳＴＫＧＰ（配列番号３４）（ヒト）、長いリンカーＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号３５）（マウス）、およびＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号３６）（ヒト）、ＧＳ－短いリンカーＧＧＧＧＳＧ（配列番号３７）、ＧＳ－中間リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＳ－長いリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３９）（全てのＧＳリンカーはマウスおよびヒトである）。
本明細書で使用されるとき、「内因性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）または生物の体内の特定の位置（例えば、臓器、組織、またはヒト細胞などの細胞）に自然に見られる分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を指す。
本明細書で使用されるとき、「エピトープ」という用語は、本明細書に記載の抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクトなどのポリペプチドによって認識および結合される抗原の一部を指す。タンパク質抗原（ＴＮＦＲ２、例えば、配列番号１によって指定されるヒトＴＮＦＲ２、または本明細書に記載の非ヒト哺乳動物などの非ヒト哺乳動物のＴＮＦＲ２）の文脈において、エピトープは、ペプチド結合によって互いに共有結合された１つ以上のアミノ酸の単一の途切れのないセグメントである連続エピトープであってよく、エピトープの構成アミノ酸がポリペプチド（例えば、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）によって結合されている。抗原内の特定のアミノ酸へのアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの結合を決定するための例示的なアッセイは、以下の実施例１に記載されている。連続エピトープは、例えば、本明細書に記載のＴＮＦＲ２タンパク質（例えば、配列番号１で示されるヒトＴＮＦＲ２）などの抗原内の１、５、１０、１５、２０、またはそれ以上のアミノ酸から構成され得る。例えば、連続エピトープは、抗原内の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれ以上のアミノ酸によって構成され得る。本明細書に記載のアゴニスト性ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）が結合するＴＮＦＲ２上の連続エピトープの例には、ＫＣＳＰＧモチーフ（配列番号４０）、および非ヒト哺乳動物（例えば、バイソン、ウシ、および本明細書に記載の他のもの）のＴＮＦＲ２タンパク質の対応する領域の１つ以上または全てが含まれる。いくつかの実施形態では、エピトープは、１つ以上の介在アミノ酸残基によって抗原のアミノ酸配列内で互いに分離された２つ以上のアミノ酸セグメントを含む不連続なエピトープであってもよい。不連続なエピトープは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸残基のそのようなセグメント、例えば、（ｉ）ヒトＴＮＦＲ２のアミノＫＣＳＰＧモチーフ内の酸（配列番号４０）、または非ヒト
ＴＮＦＲ２の同等の領域のうちの１つ以上、および（ｉｉ）ヒトＴＮＦＲ２のシステインシステインリッチドメイン１（ＣＲＤ１残基４８～７６）または非ヒトＴＮＦＲ２の同等の領域のうちの１つ以上から構成され得る。
ＴＮＦＲ２の同等の領域のうちの１つ以上、および（ｉｉ）ヒトＴＮＦＲ２のシステインシステインリッチドメイン１（ＣＲＤ１残基４８～７６）または非ヒトＴＮＦＲ２の同等の領域のうちの１つ以上から構成され得る。
本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）または生物の体内の特定の位置（例えば、臓器、組織、またはヒト細胞などの細胞）に自然に見られない分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を指す。外因性物質には、生物またはそこから抽出された培養物に外部供給源から提供される物質が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「フレームワーク領域」または「ＦＷ領域」という用語は、ＣＤＲに隣接するアミノ酸残基を含む。ＦＷ領域残基は、例えば、とりわけヒト抗体、げっ歯類由来抗体（例えば、ネズミ抗体）、ヒト化抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）、単鎖抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ断片）、抗体ドメイン、二重特異性抗体などに存在し得る。
本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」という用語は、共有結合を介して別の分子に結合しているタンパク質を指す。融合タンパク質は、例えば、あるタンパク質のＮ末端と別のタンパク質のＣ末端との間のアミド結合形成反応によって化学合成することができる。代替的に、別のタンパク質に共有結合した１つのタンパク質を含む融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現によって、例えば、ベクターまたは細胞のゲノムから、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）内で組換え発現させることができる。融合タンパク質は、リンカーに共有結合している１つのタンパク質を含む場合があり、転じてリンカーは別の分子に共有結合する。融合タンパク質の形成に使用できるリンカーの例には、天然または非天然アミノ酸を含むものなどのペプチド含有リンカーが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｄ－アミノ酸をリンカーに含めることが望ましい場合がる。これらの残基は天然に存在するタンパク質には存在せず、したがって内因性プロテアーゼによる分解に対してより耐性があるためある。リンカーは、当該技術分野で既知の様々な戦略を使用して調製でき、リンカーの反応性成分に応じて、酵素加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、塩基性条件下での加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核開裂、または有機金属開裂によって切断することができる（Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０：５７１－５８２，２０１２）。
本明細書で使用されるとき、「異種特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗体を指す。伝統的に、異種特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を持つ２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７，１９８３）。同様の手順は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９３／０８８２９、米国特許第６，２１０，６６８号、同第６，１９３，９６７号、同第６，１３２，９９２号、同第６，１０６，８３３号、同第６，０６０，２８５号、同第６，０３７，４５３号、同第６，０１０，９０２号、同第５，９８９，５３０号、同第５，９５９，０８４号、同第５，９５９，０８３号、同第５，９３２，４４８号、同第５，８３３，９８５号、同第５，８２１，３３３号、同第５，８０７，７０６号、同第５，６４３，７５９号、同第５，６０１，８１９号、同第５，５８２，９９６号、同第５，４９６，５４９号、同第４，６７６，９８０号、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、ＥＰ０３０８９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）に開示される。参照により本明細書に組み込まれるＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，ｍＡｂｓ ４（６）：６５３－６６３，２０１２に記載されているように、異種特異的抗体には、多重特異的抗体における正しい鎖結合を強制するＦｃ変異が含まれていてもよい。
本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的に全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ（ＶＬ、ＶＨ））は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、わずかな配列の変化または変化のみを伴う。ヒト抗体は、ヒト細胞（例えば、組換え発現によって）、または機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することのできる非ヒト動物または原核細胞もしくは真核細胞によって生成できる。また、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、天然型ヒト抗体には見られないリンカーペプチドを含んでもよい。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続する、２～約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含んでもよい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で既知の様々な方法によって作製することができる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号、ならびにＰＣＴ公開、ＷＯ１９９８／４６６４５、ＷＯ１９９８／５０４３３、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９８／１６６５４、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、およびＷＯ１９９１／１０７４１を参照されたい。ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して生成することもできる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９１６，７７１号、および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「ヒト化」抗体という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の標的結合サブドメインなど）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応する。ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものであってもよい。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれを含み得る。抗体ヒト化の方法は、当該技術分野において既知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－７，１９８８、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、およびＱｕｅｅｎらへの同第６，１８０，３７０号、ＥＰ２３９４００、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５，２２５，５３９号、ＥＰ５９２１０６、およびＥＰ５１９５９６を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「疎水性側鎖」という用語は、例えば、側鎖内に存在する化学的部分の立体的または電子的性質などに比べて、水への溶解度が低いアミノ酸側鎖を指す。疎水性側鎖を含むアミノ酸の例には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、およびメチオニンなどの不飽和脂肪族炭化水素を含むアミノ酸、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンなどの生理学的ｐＨで静電気的に中性である芳香環系を含むアミノ酸が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「免疫療法剤」という用語は、免疫チェックポイントタンパク質（例えば、免疫チェックポイント受容体またはリガンド）に特異的に結合して受容体またはリガンドに対してアゴニスト効果を発揮し、それによって受容体またはリガンドのシグナル伝達を促進し、例えば免疫応答を下方制御する、本明細書に記載の抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクトなどの化合物を指す。免疫療法剤には、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）などの造血細胞の表面に発現する受容体に特異的に結合し、例えば、内因性（「自己」）抗原に対する寛容をもたらす受容体またはリガンドによって誘導されたシグナル伝達を活性化できる、抗体、抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、およびコンストラクトなどの化合物が含まれる。免疫療法剤は、免疫療法剤の非存在下で示される受容体またはリガンドによって誘導されるシグナル伝達と比較して、受容体またはリガンドによって誘導されるシグナル伝達を、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上増強できる。受容体またはリガンドのシグナル伝達の程度を測定するために使用できる例示的なアッセイには、例えば、特定のシグナル伝達経路に関連するタンパク質発現変化を測定するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術、ならびに逆転写ＰＣＲ、および特定のシグナル伝達経路に関連する遺伝子発現の変化を決定するのに役立つ、定量的ＰＣＲ、およびリアルタイムＰＣＲ実験などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術が含まれる。免疫療法剤の例には、例えば、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｓｉｎｇｌｅｃｓ、ＩＣＯＳ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＴＭＩＧＤ２、ＢＴＮＬ２、ＣＤ４８、ＫＩＲ、ＬＩＲ、ＬＩＲ抗体、ＩＬＴ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ２４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＤＯ、ＴＧＦβ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ４７、ＶＥＧＦ、およびニューロピリンのうちの１つ以上に特異的に結合して活性化する抗体またはその抗原結合断片が含まれる。本明細書に記載の組成物および方法と併せて使用することができる免疫療法剤の特定の例には、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片、ならびにアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片、ならびにアゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体およびその抗原結合断片が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物、原核生物、またはファージのクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、その製造方法を指さない。
本明細書で使用されるとき、「多重特異性抗体」という用語は、１つを超える標的抗原に対して親和性を示す抗体を指す。多重特異性抗体は、完全な免疫グロブリン分子に類似した構造を有することができ、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ Ｆｃ領域を含むことができる。そのような構造には、ＩｇＧ－Ｆｖ、ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）２、ＤＶＤ－Ｉｇ、（ｓｃＦｖ）２－（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ、および（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ－（ｓｃＦｖ）２が含まれ得るが、これらに限定されない。ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）２の場合、ｓｃＦｖは、重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合できる。Ｆｃ領域を含み、ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を組み込むことができる例示的な多重特異性分子は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２，ｍＡｂｓ ４（２）：１８２－１９７，Ｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２６（３）：１８７－ １９３，ａｎｄ Ｇｒｏｔｅ ｅｔ ａｌ，２０１２，ｉｎ Ｐｒｏｅｔｚｅｌ ＆ Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．９０１，ｃｈａｐｔｅｒ １６：２４７－２６３で総説される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＩｇＧの断片またはＤＶＤもしくはｓｃＦｖに基づいて、Ｆｃ領域を持たない多重特異性分子の構成要素であり得る。Ｆｃ領域を欠き、抗体または抗体断片を組み込むことができる例示的な多重特異性分子には、ｓｃＦｖ二量体（ディアボディ）、三量体（三量体）および四量体（四量体）、Ｆａｂ二量体（接着性ポリペプチドまたはタンパク質ドメインによるコンジュゲート）、およびＦａｂ三量体（化学的に結合された）が含まれ、参照により本明細書に組み込まれるＨｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：１２９－１３４に記載される。
本明細書で使用されるとき、「骨髄由来サプレッサー細胞」または「ＭＤＳＣ」という用語は、とりわけ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、およびマクロファージなど、様々なエフェクター細胞および抗原提示細胞の活性を調節する免疫系の細胞を指す。骨髄由来サプレッサー細胞は、それらの遺伝子発現プロファイルによって区別され、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＣＲ２、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｄ１、ＣＤ２、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ４３、ＣＤ４４、補体成分Ｃ５ａ Ｒ１、Ｆ４／８０（ＥＭＲ１）、Ｆｃγ ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、Ｆｃγ ＲＩＩ（ＣＤ３２）、Ｆｃγ ＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、Ｆｃγ ＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）、Ｆｃγ ＲＩＩＢ／Ｃ（ＣＤ３２ｂ／ｃ）、Ｆｃγ ＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）、Ｆｃγ ＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）、Ｆｃγ ＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、ガレクチン－３、ＧＰ１３０、Ｇｒ－１（Ｌｙ－６Ｇ）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－６Ｒα、インテグリンα４（ＣＤ４９ｄ）、インテグリンαＬ（ＣＤ１１ａ）、インテグリンαＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｍ－ＣＳＦＲ、ＭＧＬ１（ＣＤ３０１ａ）、ＭＧＬ１／２（ＣＤ３０１ａ／ｂ）、ＭＧＬ２（ＣＤ３０１ｂ）、一酸化窒素、ＰＳＧＬ－１（ＣＤ１６２）、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、シグレック－３（ＣＤ３３）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ－１）、およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲまたはＦｌｋ－１）からなる群から選択されるタンパク質および小分子の全てまたはサブセットを発現する。特に、ＭＤＳＣは、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ２１、ＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＳｃａ－１（Ｌｙ６）からなる群から選択されるタンパク質を発現しない。
本明細書で使用されるとき、「非天然定常領域」とは、抗体可変領域とは異なる起源に由来する抗体定常領域、または抗体の定常領域の配列とは異なるアミノ基配列を有するヒト生成合成ポリペプチドである抗体定常領域を指す。例えば、非天然定常領域を含む抗体は、非ヒト供給源（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）に由来する可変領域と、ヒト供給源（例えば、ヒト抗体定常領域）、または別の霊長類、とりわけ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科のメンバー（ウシ、バイソン、バッファロー、ヘラジカ、ヤクなど）、ウシ、ヒツジ、ウマ、バイソンに由来する定常領域と、を有し得る。
本明細書で使用される場合、「パーセント（％）配列同一性」という用語は、最大パーセントの配列同一性を達成するために配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後、候補配列のアミノ酸（または核酸）残基が、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である割合を指す（例えば、最適なアライメントのために候補配列および参照配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。例えば、候補配列との比較のために整列された参照配列は、候補配列が候補配列の全長または候補配列の連続したアミノ酸（または核酸）残基の選択された部分にわたって、５０％～１００％の配列同一性を示すことを示し得る。比較のために整列された候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）であり得る。候補配列の位置が、参照配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基で占められている場合、分子はその位置で同一である。
本明細書で使用されるとき、「霊長類化抗体」という用語は、霊長類由来の抗体由来のフレームワーク領域と、非霊長類供給源の抗体由来のＣＤＲおよび／または定常領域などの他の領域とを含む抗体を指す。霊長類化抗体生成する方法は当該技術分野で知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６８１，７２２号、および同第５，６９３，７８０号を参照されたい。例えば、本明細書に記載の霊長類化抗体またはその抗原結合断片は、非霊長類抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲを、霊長類の１つ以上のフレームワーク領域を含む抗体またはその抗原結合断片に挿入することによって生成することができる。
本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチド断片の文脈における「作動可能に連結された」という用語は、２つのポリヌクレオチド断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのポリヌクレオチド断片が結合していることを意味することを意図している。
本明細書で使用されるとき、「薬物動態プロファイル」という用語は、治療薬（例えば、本開示のポリペプチド、例えばアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）の、患者への薬物投与後の経時的な吸収、分布、代謝、およびクリアランスを指す。
本明細書で使用されるとき、「制御配列」という用語には、例えば抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、および他の発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。そのような調節配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）に記載される。
本明細書で使用されるとき、「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが結合して１つの鎖を形成している単鎖Ｆｖ抗体を指す。ｓｃＦｖ断片には、リンカーによって隔てられた、抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、および／またはＣＤＲ－Ｌ３）と抗体重鎖（ＶＨ）の可変領域（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、および／またはＣＤＲ－Ｈ３）を含む単一のポリペプチド鎖が含まれる。ｓｃＦｖ断片のＶＬおよびＶＨ領域を連結するリンカーは、タンパク質構成アミノ酸から構成されるペプチドリンカーであり得る。ｓｃＦｖ断片のタンパク質分解に対する耐性を増加するために（例えば、Ｄアミノ酸を含むリンカー）、ｓｃＦｖ断片の溶解性を高めるために（例えば、ポリエチレングリコール含有リンカーまたは繰り返しグリシンおよびセリン残基を含むポリペプチドなどの親水性リンカー）、分子の生物物理学的安定性を改善するために（例えば、分子内または分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むリンカー）、またはｓｃＦｖ断片の免疫原性を弱めるために（例えば、グリコシル化部位含有リンカー）、代替リンカーを使用することができる。ｓｃＦｖ分子は、当該技術分野で知られ、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ｆｌｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ７７：５１，１９８９）、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３，１９８８）、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０１１７，１９９１）、Ｍｉｌｅｎｉｃ ｅｔ ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：６３６３，１９９１）、およびＴａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：８３７，１９９１）に記載される。ｓｃＦｖ分子のＶＬおよびＶＨドメインは、１つ以上の抗体分子に由来し得る。本明細書に記載のｓｃＦｖ分子の可変領域は、それらが由来する抗体分子とはアミノ酸配列が異なるように改変できることも当業者には理解されるであろう。例えば、一実施形態では、アミノ酸残基における保存的置換または変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸置換を行うことができる（例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基において）。代替的に、または追加的に、当該技術分野で認められた技法を使用して抗原結合を最適化するために、ＣＤＲアミノ酸残基に変異が作製される。ｓｃＦｖ断片が、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０８４７１４に記載される。
本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」という語句は、例えば抗体またはその抗原結合断片によって特に認識されるタンパク質および他の生体分子の不均一な集団における抗原の存在を決定する結合反応を指す。抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、１００ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する。例えば、抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、最大１００ｎＭ（例えば、１ｐＭ～１００ｎＭ）のＫＤで抗原に結合する。特定の抗原またはそのエピトープへの特異的結合を示さない抗体またはその抗原結合断片は、その特定の抗原またはそのエピトープに対して、１００ｎＭを超える（例えば、５００ｎｍ、１μＭ、１００μＭ、５００μＭ、または１ｍＭを超える）ＫＤを示す。特定のタンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、様々なイムノアッセイ形式を使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される。特定の免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイのフォーマットと条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「対象」および「患者」という用語は、免疫学的障害（例えば、自己免疫疾患）などの特定の疾患または状態に対して、治療（例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば本明細書に記載の抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクトの投与による）を受ける生物を指す。対象および患者の例には、とりわけ、免疫疾患または状態、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病、同種移植片拒絶反応、アレルギー反応、および喘息に対する治療を受けている、ヒト、霊長類、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科のメンバー（ウシ、バイソン、バッファロー、ヤクなど）ヒツジ、およびウシなどの哺乳動物が含まれる。本明細書に記載の組成物および方法を使用して治療することができる患者は、確立された疾患（例えば、自己免疫疾患などの確立された免疫疾患）を有している可能性があり、その場合、患者はその疾患を有すると診断され、長期間にわたる（例えば、数日、数週間、数ヶ月、または数年にわたる）疾患の症状を示している。代替的に、患者は、本明細書に記載の免疫障害などの特定の疾患の症候を示している可能性があるが、医師による疾患の診断はまだされていない。本明細書に記載の組成物および方法を使用して治療することができる他の患者には、免疫学的障害を有すると診断された患者が含まれ、現時点では疾患の症状を示している場合と示していない場合がある。例えば、本明細書に記載の組成物および方法による治療に適格な患者は、患者が多発性硬化症の症状（例えば、平衡感覚の欠如、認知能力の低下、視界のぼやけ、協調運動の低下など）をまだ示していない場合でも、自己反応性Ｔ細胞の活動により患者の１つ以上のニューロンの周りでミエリンが枯渇していることの検出により、患者が多発性硬化症などの免疫学的障害の診断を受けた場合、診断されているが無症候性であると記載され得る。免疫学的状態と診断されているが無症候性である患者の別の例には、患者が、とりわけ、関節痛、関節の硬直、筋肉の範囲や動きの減少など、この疾患に関連する症状をまだ示していない場合でも、患者から分離されたリンパ試料中の自己反応性Ｔ細胞の検出などにより、関節リウマチと診断された患者が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどのいずれかを指す。
本明細書で使用されるとき、「治療する」または「治療」という用語は、免疫学的障害（例えば、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病、対宿主病、または同種移植片拒絶）などの望ましくない生理学的変化または障害を抑制または減速（軽減）することが目的である、治療的処置を指す。治療の有益なまたは望ましい臨床結果には、非限定的に病状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延または緩徐化、病態の寛解または好転、および検出可能か検出不能かにかかわらず緩解（部分的または全体的）が含まれる。治療の必要のあるものは、状態もしくは障害をすでに有するもの、および状態もしくは障害を有する傾向にあるもの、または状態もしくは障害を阻害すべきものを含む。
本明細書で使用されるとき、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」、「ＴＮＦＲ」、または「ＴＮＦＲＳ」という用語は、カルボキシ末端細胞内ドメインおよび共通のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）によって特徴付けられるアミノ末端細胞外ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質のグループを指す。ＴＮＦＲスーパーファミリーには、ＴＮＦスーパーファミリーの１つ以上のリガンドへの結合の結果として細胞シグナル伝達を媒介する受容体が含まれる。ＴＮＦＲスーパーファミリーは、細胞内デスドメインを含む受容体と、このドメインを持たない受容体の２つのサブグループに分けることができる。デスドメインは８０アミノ酸のモチーフであり、受容体の活性化に続いてアポトーシスのシグナル伝達カスケードを伝播する。細胞内デスドメインを含む例示的なＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーにはＴＮＦＲ１が含まれるが、ＴＮＦＲ２はこのドメインを含まないＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質を代表する。ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーには、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＲＡＮＫ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴ－βＲ）、ＯＸ４０、Ｆａｓ受容体、デコイ受容体３（ＤＣＲ３）、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、デス受容体４（ＤＲ４）、デス受容体５（ＤＲ５）、デコイ受容体１（ＤＣＲ１）、デコイ受容体２（ＤＣＲ２）、オステオプロテグリン、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ヘルペスウイルス侵入メディエーター、神経成長因子受容体、Ｂ細胞成熟抗原、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦＲ関連、ＴＲＯＹ、デス受容体６（ＤＲ６）、デス受容体３（ＤＲ３）、およびエクトディスプラスシンＡ２受容体が含まれる。
本明細書で使用される「可変領域ＣＤＲ」という用語は、配列または構造に基づく方法を使用して同定されるＣＤＲまたは相補性決定領域内のアミノ酸を含む。本明細書で使用されるとき、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見られる非連続抗原結合部位を指す。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６，１９７７ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１ －３２４２，１９９１、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５，１９９６）に記載されており、定義は、互いに比較したときにアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。特定の実施形態において、「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づいてＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲである。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、核酸ベクター、例えば、プラスミドなどのＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスまたは他の好適なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）を含む。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するために、様々なベクターが開発されている。そのような発現ベクターの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９９４／１１０２６に開示される。本明細書に記載の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、ならびにタンパク質の発現および／または哺乳動物細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチド配列の組み込みに使用される追加の配列要素などを含む。本明細書に記載の抗体および抗体断片の発現に使用できる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーターおよびエンハンサー領域などの調節配列を含むプラスミドが含まれる。抗体および抗体断片の発現のための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強するか、遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性または核輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列要素には、例えば、５’および３’非翻訳領域、内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）、および発現ベクターで運搬される遺伝子の効率的な転写を指示するためのポリアデニル化シグナルサイトが含まれる。本明細書に記載の発現ベクターは、そのようなベクターを含む細胞の選択のためのマーカーをコードするポリヌクレオチドも含み得る。好適なマーカーの例には、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはヌールセオスリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「ＶＨ」という用語は、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂの重鎖を含む。「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同一の構造的特性を有する糖タンパク質である。抗体が特定の標的に対し結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは、抗体と標的特異性を欠いた他の抗体様分子との両方を含む。天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。天然抗体の各々の重鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが後に続く。天然抗体の各軽鎖は、アミノ末端（ＶＬ）に可変ドメインを、カルボキシ末端に定常ドメインを有する。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、抗原その結合断片、およびそのコンストラクトは、ＴＮＦＲ２発現細胞の増殖、保護、治癒、および／または再生を促進し得る。これは、例えば、ＴＮＦＲ２（例えば、とりわけ、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、またはＴＮＦＲ２＋体細胞（例えば、中枢神経系の細胞（例えば、ニューロン）などの実質細胞の表面上の）への結合、および受容体の三量体化の誘導によって、果たされる。ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドの活性は、膜結合三量体ＴＮＦαなどの天然リガンドであるＴＮＦαによって増強され得る。メカニズムに制限されることなく、この三量体化イベントは、個々のＴＮＦＲ２タンパク質を互いに近接させることによってＴＮＦＲ２の活性化に寄与し、ＭＡＰＫ／ＮＦκＢ／ＴＲＡＦ２／３経路を介して細胞増殖を促進することができる。ＴＮＦＲ２シグナル伝達はまた、三量体状態での可溶性ＴＮＦＲ２（ｓＴＮＦＲ２）の分泌、およびそれによって細胞の安定性と維持が強化される、Ｆｏｘｐ３転写部位に結合する２つの細胞内タンパク質であるｐ３００とＣＢＰの二重活性化によって特徴付けられる。重要なことに、ＴＮＦＲ２シグナル伝達の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞に抑制効果を及ぼす。これらの細胞では、ＴＮＦＲ２アゴニズムが細胞死を引き起こす。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを使用して、多種多様なＴＮＦＲ２＋組織におけるこの三量体化イベントを促進することができる。したがって、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＭＤＳＣ活性を上昇させ、Ｔエフェクター細胞の活性を低下させ、それによって、とりわけ本明細書に記載の自己免疫性、対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症、および移植片拒絶反応を抑制するために使用できるため、本明細書に記載の組成物および方法は、重要な生理学的利益を提供する。本開示の組成物および方法を使用して、内因性（「自己」）抗原と反応するものを含む、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞を直接殺傷することもできる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＴＮＦＲ２＋組織および器官の再生を刺激し、組織変性および器官不全を特徴とする多種多様な疾患を治療するために使用することができるという有益な特徴を追加的に提供する。
本明細書に記載のＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、およびコンストラクト）は、ＴＮＦＲ２内のエピトープに特異的に結合して、受容体活性化および上述の様々な有利な生物活性を促進する。ヒトＴＮＦＲ２は、以下の４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含む。ＣＲＤ１（配列番号１のアミノ酸残基４８～７６）、ＣＲＤ２（配列番号１のアミノ酸残基７８～１２０）、ＣＲＤ３（配列番号１のアミノ酸残基１２１～１６２）、およびＣＲＤ４（配列番号１のアミノ酸残基１６２～２０２）。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上のエピトープにおいてＴＮＦＲ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＣＲＤ４内のエピトープに結合しない。例えば、本開示のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、以下の残基のうちの１つ以上に対応するエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に結合できる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）、
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）、
あるいは、本明細書に記載の非ヒト哺乳動物などの非ヒト哺乳動物のＴＮＦＲ２内の同等のエピトープ。
本開示は、部分的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、およびコンストラクト）が、これらの分子がＩｇＧ２－Ｂアイソタイプの形態である場合、実質的に改善されたＴＮＦＲ２活性化効果を示すという発見に基づく。以下の実施例に記載されているように、このクラスのＴＮＦＲ２ポリペプチドは、他のアイソタイプのＴＮＦＲ２ポリペプチドと比較して、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化し、Ｔｒｅｇ細胞およびＭＤＳＣ増殖を促進し、ＴＮＦＲ２を発現する組織および臓器を治癒、保護、および再生する驚くほど優れた能力を示すことが現在発見された。
本開示の根底にある別の発見は、互いに空間的に約１３３Å未満隔てられる抗原結合部位を含むアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが、上述１つ以上のエピトープにおいてＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、約１３３Å以上隔てられる抗原結合部位を含むポリペプチドと比較して予想外に優れたＴＮＦＲ２活性化効果を示すという発見である。そのようなポリペプチドの例には、互いに約９０Å～約１３３Å隔てられる抗原結合部位を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体およびその抗原結合断片が含まれ、互いに約１１７Å隔てられる抗原結合部位を含むＩｇＧ１抗体およびその抗原結合断片、ならびに互いに約１２５Å隔てられる抗原結合部位を含むＩｇＧ３抗体およびその抗原結合断片が特に含まれる。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、医薬組成物に製剤化することができる。好ましくは、医薬組成物中に存在するポリペプチドは、単一のジスルフィド結合アイソフォームを採用する。例えば、本開示の医薬組成物は、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むものを含み、例えば、医薬組成物中の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、またはそれ以上のポリペプチドが、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＩｇＧ２－Ａ、ＩｇＧ２－Ａ／Ｂ１、およびＩｇＧ２－Ａ／Ｂ２アイソフォームなどの他のＩｇＧ２ジスルフィド結合アイソフォームと比較して実質的により強いレベルのＴＮＦＲ２活性化を促進することが驚くべきことに発見されたＩｇＧ２－Ｂジスルフィド結合アイソフォームを有利に採用し得る。これらのアイソフォームは、図５Ａ～５Ｄに図示される。本開示のポリペプチドは、例えば、他のジスルフィド結合アイソフォームの形成を禁止する変異をＩｇＧ２重鎖定常１（ＣＨ１）ドメインに導入することにより、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームを主に採用するように操作され得る。上述の残りのアイソフォームを除外してＩｇＧ２－Ｂアイソフォームの形成を促進する、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列における例示的な変異には、配列番号８に記載されるヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１２７位のシステイン残基の欠失および／または置換が含まれる（本明細書に記載のＫａｂａｔ付番スキームによる）。例えば、ＩｇＧ２抗体またはその抗原結合断片を操作して、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームを主に採用するために、配列番号８のシステイン残基１２７に保存的アミノ酸置換を導入することができる。ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームに主に存在する例示的なＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、配列番号９を有し、これは配列番号８に対してＣ１２７Ｓ置換が含まれている。
以下の生物活性は、（ｉ）１３３Åを超えて互いに隔てられる抗原結合部位を含む、および／または（ｉｉ）単一のジスルフィド結合アイソフォーム（例えば、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォーム）で主に存在しない、ＴＮＦＲ２結合ポリペプチドと比較して本開示のポリペプチドによってより強い度合でもたらされるアゴニスト性ＴＮＦＲ２表現型の例である：
（ａ）例えば、Ｔｒｅｇ細胞表面上でのＴＮＦＲ２の結合および活性化による、Ｔｒｅｇ細胞の増殖および／または直接的な拡大の増強。
（ｂ）例えば、ＭＤＳＣ表面上でのＴＮＦＲ２の結合および活性化による、ＭＤＳＣの増殖および／または直接的な拡大の増強。
（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞）などのＴエフェクター細胞の枯渇。および／または
（ｄ）ＴＮＦＲ２発現実質細胞の増殖および／または直接的な拡大の増強。
（ａ）例えば、Ｔｒｅｇ細胞表面上でのＴＮＦＲ２の結合および活性化による、Ｔｒｅｇ細胞の増殖および／または直接的な拡大の増強。
（ｂ）例えば、ＭＤＳＣ表面上でのＴＮＦＲ２の結合および活性化による、ＭＤＳＣの増殖および／または直接的な拡大の増強。
（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞）などのＴエフェクター細胞の枯渇。および／または
（ｄ）ＴＮＦＲ２発現実質細胞の増殖および／または直接的な拡大の増強。
以下のセクションは、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクトの典型的な特徴、ならびに治療法におけるそれらの使用の説明を提供する。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド
ＩｇＧアイソタイプ抗体は、優れたＴＮＦＲ２アゴニスト作用を促進する
上述および本明細書に記載されるように、強力なＴＮＦＲ２活性化は、本明細書に記載のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチド（例えば、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、およびコンストラクト）によって達成される。そのようなポリペプチドは、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上もしくは全てを有し得、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％の配列同一性）を有する１つ以上のＣＤＲは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。ＩｇＧ２－Ｂジスルフィド結合アイソフォームに有利なＣＨ１ドメインを含むもののような、改変されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプを有するポリペプチドが特に有利である。ヒトＩｇＧ２抗体の様々なアイソフォームのジスルフィド結合パターンを図５Ａ～５Ｄに示す。図５Ｂに示すように、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームは、他のＩｇＧ２アイソフォームと比較してより狭く、より立体構造的に拘束された構造を生成するジスルフィド結合パターンを示す。この構造は、細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、またはＴＮＦＲ２を発現する実質細胞）の表面でＴＮＦＲ２を結合し、受容体の三量体化、したがって受容体活性化を促進するために受容体のモノマーを互いに近接させるのに理想的である。
ＩｇＧアイソタイプ抗体は、優れたＴＮＦＲ２アゴニスト作用を促進する
上述および本明細書に記載されるように、強力なＴＮＦＲ２活性化は、本明細書に記載のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチド（例えば、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、およびコンストラクト）によって達成される。そのようなポリペプチドは、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上もしくは全てを有し得、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％の配列同一性）を有する１つ以上のＣＤＲは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。ＩｇＧ２－Ｂジスルフィド結合アイソフォームに有利なＣＨ１ドメインを含むもののような、改変されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプを有するポリペプチドが特に有利である。ヒトＩｇＧ２抗体の様々なアイソフォームのジスルフィド結合パターンを図５Ａ～５Ｄに示す。図５Ｂに示すように、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームは、他のＩｇＧ２アイソフォームと比較してより狭く、より立体構造的に拘束された構造を生成するジスルフィド結合パターンを示す。この構造は、細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、またはＴＮＦＲ２を発現する実質細胞）の表面でＴＮＦＲ２を結合し、受容体の三量体化、したがって受容体活性化を促進するために受容体のモノマーを互いに近接させるのに理想的である。
ＩｇＧ２－Ｂジスルフィド結合アイソフォームを安定化するために、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインに変異を導入して、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームに非結合チオールとして存在するシステイン残基間のジスルフィド結合の発生を防止または低減することができる。患者（例えば、ヒトなどの哺乳動物患者）に抗体を投与した後、インビボでのシステインの酸化および還元プロセスによって引き起こされる可能性のある、４つ全てのアイソフォームバリアントの形成を防ぐために、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインに変異を導入することもできる。そのような突然変異の例は、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインの残基Ｃ１２７でのアミノ酸置換または欠失である。この残基を削除し、および／またはアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）によってこの部位を改変することにより、ＩｇＧ２アイソフォームの集団におけるジスルフィド結合パターンをＩｇＧ２－Ｂアイソフォームにバイアスすることができる。ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームを選好するために使用できるＣＨ１ドメインの特に有利な変異は、Ｃ１２７Ｓ変異である。
抗原結合部位間の間隔
本明細書に記載のアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体における抗原結合アーム間で観察される間隔である１３３Åより短い距離で互いに隔てられた抗原結合部位（すなわち、抗原結合アーム）を含み得る。以下の実施例に記載されているように、この間隔により、最適なＴＮＦＲ２アゴニスト特性を有する抗体が生じることが発見された。本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、例えば、約１３３Å未満の距離、例えば、９０Å、９１Å、９２Å、９３Å、９４Å、９５Å、９６Å、９７Å、９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、１３０Å、１３１Å、または１３２Åの距離で、互いに隔てられる、抗原結合アームを含むものを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約９５Å～約１３０Åの距離、例えば、約９５Å、９６Å、９７Å、９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、または１３０Åの距離で、互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約９８Å～約１２８Åの距離、例えば、約９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、または１２８Åの距離で、互いに隔てられる。
本明細書に記載のアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体における抗原結合アーム間で観察される間隔である１３３Åより短い距離で互いに隔てられた抗原結合部位（すなわち、抗原結合アーム）を含み得る。以下の実施例に記載されているように、この間隔により、最適なＴＮＦＲ２アゴニスト特性を有する抗体が生じることが発見された。本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、例えば、約１３３Å未満の距離、例えば、９０Å、９１Å、９２Å、９３Å、９４Å、９５Å、９６Å、９７Å、９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、１３０Å、１３１Å、または１３２Åの距離で、互いに隔てられる、抗原結合アームを含むものを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約９５Å～約１３０Åの距離、例えば、約９５Å、９６Å、９７Å、９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、または１３０Åの距離で、互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約９８Å～約１２８Åの距離、例えば、約９８Å、９９Å、１００Å、１０１Å、１０２Å、１０３Å、１０４Å、１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、または１２８Åの距離で、互いに隔てられる。
例えば、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、約１０５Å～約１２７Åの距離、例えば、約１０５Å、１０６Å、１０７Å、１０８Å、１０９Å、１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、または１２７Åの距離で互いに隔てられる、抗原結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１１０Å～約１２２Åの距離で、例えば、約１１０Å、１１１Å、１１２Å、１１３Å、１１４Å、１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、または１２２Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１１５Å～約１１９Åの距離で、例えば、約１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、または１１９Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、１１７Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、上述のような抗原結合アームの間隔を有し、ＩｇＧ１アイソタイプを有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、約１１５Å～約１３２Åの距離、例えば、約１１５Å、１１６Å、１１７Å、１１８Å、１１９Å、１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、１２９Å、１３０Å、１３１Å、または１３２Åの距離で互いに隔てられる抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１２０Å～約１２９Åの距離で、例えば、約１２０Å、１２１Å、１２２Å、１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、１２７Å、１２８Å、または１２９Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、約１２３Å～約１２７Åの距離で、例えば、約１２３Å、１２４Å、１２５Å、１２６Å、または１２７Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、１２５Åの距離で互いに隔てられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、上述のような抗原結合アームの間隔を有し、ＩｇＧ３アイソタイプを有する。
本明細書に記載のＴＮＦＲ２アゴニスト性ポリペプチドは、例えば、上で指定された距離だけ隔てられた２、３、４、５、またはそれ以上の抗原結合アームを有し得る。２つ以上の抗原結合アームを有する抗体断片の例には、とりわけ、ディアボディ、トリアボディ、Ｆ（ａｂ’）２分子、およびタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）分子が含まれるが、これらに限定されない。これらの抗体断片を生成する方法には、本明細書に記載され当該技術分野で既知のペプチド合成および組換えタンパク質発現技術が含まれる。
抗体または抗体断片の抗原結合アーム間の距離を測定するための様々な方法が存在する。例えば、抗体の抗原結合アーム間の距離は、抗体または抗体断片の三次元構造を、ＰＹＭＯＬ（登録商標）および他の分子イメージングソフトウェアの使用などのコンピューターソフトウェアを使用して分析することによって作成することができる。抗体および抗体断片などのポリペプチドの三次元構造は、当該技術分野で既知のＸ線結晶学実験および核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術から得られたデータを使用して計算することができる。三次元ポリペプチド構造を得るために使用できるＸ線結晶学およびＮＭＲ法の例は、例えば、それぞれの開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２２９：９６９－９９５，１９９３、およびＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１９３０－１９３４，２００７に記載されている。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの可変領域および定常領域の構造的特徴
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）の分子的特徴の中で、相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ－Ｈ１）は、分子のＴＮＦＲ２結合特性を決定付けることができる。特に、後述するＣＤＲ－Ｈ１を有するＴＮＦＲ２ポリペプチドは、アゴニスト活性を付与するものとして本明細書に記載されるエピトープの１つ以上においてＴＮＦＲ２に結合する。例えば、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）の分子的特徴の中で、相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ－Ｈ１）は、分子のＴＮＦＲ２結合特性を決定付けることができる。特に、後述するＣＤＲ－Ｈ１を有するＴＮＦＲ２ポリペプチドは、アゴニスト活性を付与するものとして本明細書に記載されるエピトープの１つ以上においてＴＮＦＲ２に結合する。例えば、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである。
上述のＣＤＲ－Ｈ１の存在は、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）に、は、ＣＲＤ１内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいて、例えば、配列番号１内のアミノ酸残基５６～６０（ＫＣＳＰＧ）の１つ以上によって定義されるエピトープにおいて、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する能力を与える。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤＲ－Ｈ１の存在において、ＣＲＤ２内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいて、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、ＣＤＲ－Ｈ１の存在において、ＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいて、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳ、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上、または全てをさらに含み得る。
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳ、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）、もしくはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上、または全てをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、上述のＣＤＲ－Ｈ１を、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲのうちの１つ以上、または全てと組み合わせて含む。
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲのうちの１つ以上、または全てと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを有し得る。
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを含む。
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％同一（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ヒトの定常領域などの非天然定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠いているか、天然Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠いているか、またはＦｃドメインを全て欠いている。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのフレームワーク領域
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み得、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、またはＦであり、各々のＸ２は、独立して、ＭまたはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥまたはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳまたはＲである。例えば、ポリペプチドは、
（ａ）ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳ（配列番号１６）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳ（配列番号１７）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号１８）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳ（配列番号１９）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｅ）ＴＦＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２０）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｆ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＴＳ（配列番号２１）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｇ）ＴＲＤＴＳＴＮＴＶＹＭＥＬＴＳＬＲＳ（配列番号２２）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、および
（ｈ）ＴＡＤＴＳＴＤＲＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み得る。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み得、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、またはＦであり、各々のＸ２は、独立して、ＭまたはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥまたはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳまたはＲである。例えば、ポリペプチドは、
（ａ）ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳ（配列番号１６）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳ（配列番号１７）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号１８）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳ（配列番号１９）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｅ）ＴＦＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２０）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｆ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＴＳ（配列番号２１）、またはその配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｇ）ＴＲＤＴＳＴＮＴＶＹＭＥＬＴＳＬＲＳ（配列番号２２）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、および
（ｈ）ＴＡＤＴＳＴＤＲＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み得る。
前述のアミノ酸配列は、とりわけヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＲおよびＤＱを含むＭＨＣクラスＩＩタンパク質を認識し、それらに結合する。典型的には、ＭＨＣタンパク質に結合するアミノ酸配列を含むことがわかっている抗体は、そのようなモチーフを除去するように操作されている。これは、ＭＨＣタンパク質に結合する抗体は、患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物患者に投与されると、分解されやすく、免疫系の抗原提示細胞の外部に位置し、それによって投与された抗体に対する不適切な免疫応答を引き起こすためである。特定のアミノ酸配列がＭＨＣ分子に結合する傾向があるかどうかを決定する方法は当該技術分野で知られており、例えば、それぞれの開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １１：５６８，２０１０、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：２３８，２００７、Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｇａｌａｒｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：Ｄ９１３－Ｄ９１９，２０１１、およびＧｒｅｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６３：３２５，２０１１に記載される。
上述のフレームワーク領域は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する傾向があるにもかかわらず、免疫原性ペプチドではない。むしろ、これらのアミノ酸配列は、高親和性のＴＮＦＲ２結合を付与する。前述のフレームワーク領域配列のいずれかを含む本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ポリペプチドを患者（例えば、ヒトなどの哺乳動物患者）に投与するとき、ポリペプチドに対する免疫応答を誘導することなく、高いＴＮＦＲ２親和性という予期せぬ有利な特性を示す。
ＴＮＦＲ２アゴニスト性ポリペプチドの集団の均一性
本明細書に記載のＴＮＦＲ２アゴニスト性ポリペプチド（例えば、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）が単一のジスルフィド結合アイソフォームとして存在する医薬組成物を生成することができる。例えば、医薬組成物中のポリペプチドの少なくとも１０％以上が、単一のジスルフィド結合アイソフォーム（例えば、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォーム）として存在し得る。これは、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのシステイン残基１２７でのアミノ酸置換または欠失によって達成でき、それにより、例えば、ＩｇＧ２－Ｂ以外のアイソフォームを発生できるジスルフィド結合の発生を予防または低減する（例えば、図５Ａ～５Ｄを参照されたい）。本開示の医薬組成物には、例えば、医薬組成物中のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの約１０％～約９９．９９９％が、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームなどの単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在するものが含まれる。例えば、本開示の医薬組成物は、アゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むものを含み、例えば、医薬組成物中の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、またはそれ以上のポリペプチドが、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。
本明細書に記載のＴＮＦＲ２アゴニスト性ポリペプチド（例えば、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）が単一のジスルフィド結合アイソフォームとして存在する医薬組成物を生成することができる。例えば、医薬組成物中のポリペプチドの少なくとも１０％以上が、単一のジスルフィド結合アイソフォーム（例えば、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォーム）として存在し得る。これは、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのシステイン残基１２７でのアミノ酸置換または欠失によって達成でき、それにより、例えば、ＩｇＧ２－Ｂ以外のアイソフォームを発生できるジスルフィド結合の発生を予防または低減する（例えば、図５Ａ～５Ｄを参照されたい）。本開示の医薬組成物には、例えば、医薬組成物中のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの約１０％～約９９．９９９％が、ＩｇＧ２－Ｂアイソフォームなどの単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在するものが含まれる。例えば、本開示の医薬組成物は、アゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むものを含み、例えば、医薬組成物中の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、またはそれ以上のポリペプチドが、単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。
アゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドの試料中に存在する様々なジスルフィド結合アイソフォームの相対量を測定するための技法には、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている液体クロマトグラフィー技法、例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１６１９４－１６２０５，２００８に例示されるものが含まれる。
シグナル伝達カスケードに対するＴＮＦＲ２の影響
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）は、ＴＮＦＲ２と相互作用し、ＴＮＦＲ２の活性を増強することができる。本開示のＴＮＦＲ２ポリペプチドは、隣接するＴＮＦＲ２モノマーを互いに近接させることにより、ＴＮＦＲ２三量体の形成を選好する１つ以上の特定のエピトープにおいてＴＮＦＲ２に結合することができる。ＴＮＦＲ２の三量体化は、ＴＮＦＲ２モノマーをＴＮＦα結合部位が立体的に利用可能な立体構造に配置するため、受容体活性化に特に有益である。この三量体化事象は、ＴＮＦＲ２による細胞内シグナル伝達を活性化し、転じて、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞などのＴＮＦＲ２発現細胞の増殖を促進できる。ＴＮＦＲ２の活性化は、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＰＤＣＤ１ＬＧ２（ＰＤＬ２）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、およびＩＫＺＦ２の発現レベルの上昇をももたらし得る。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）は、ＴＮＦＲ２と相互作用し、ＴＮＦＲ２の活性を増強することができる。本開示のＴＮＦＲ２ポリペプチドは、隣接するＴＮＦＲ２モノマーを互いに近接させることにより、ＴＮＦＲ２三量体の形成を選好する１つ以上の特定のエピトープにおいてＴＮＦＲ２に結合することができる。ＴＮＦＲ２の三量体化は、ＴＮＦＲ２モノマーをＴＮＦα結合部位が立体的に利用可能な立体構造に配置するため、受容体活性化に特に有益である。この三量体化事象は、ＴＮＦＲ２による細胞内シグナル伝達を活性化し、転じて、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞などのＴＮＦＲ２発現細胞の増殖を促進できる。ＴＮＦＲ２の活性化は、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＰＤＣＤ１ＬＧ２（ＰＤＬ２）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、およびＩＫＺＦ２の発現レベルの上昇をももたらし得る。
ＴＮＦＲ２活性化は、重要な治療効果を発揮し得る様々な遺伝子の発現を引き起こすが、本明細書に記載のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、特に治療上重要ないくつかのタンパク質の発現を促進し得る。メカニズムに限定されないが、本明細書に記載のＴＮＦＲ２ポリペプチドは、Ｆｏｘｐ３転写を促進する２つのヒストンアセチルトランスフェラーゼであるＥＰ３００およびＣＲＥＢの発現を刺激することにより、ＴＮＦＲ２媒介細胞の治癒、保護、増殖、および／または再生を誘導し得る。この生物活性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞の死を引き起こしながら、ＴＮＦＲ２＋細胞の細胞周期を通じて流動を促進できるため、特に重要である。ＴＮＦＲ２＋細胞の選択的拡大およびＴエフェクター細胞の阻害は、自己免疫、ＧＶＨＤ、炎症、および本明細書に記載の他の適応症を治療するアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの能力の根底にある表現型の一部である。
例えば、転写がＮＦκＢによって媒介される遺伝子の発現など、ＭＡＰＫおよびＴＲＡＦ２／３シグナルカスケードに関連する遺伝子の発現を測定することによって、ＴＮＦＲ２の活性化をモニターできる。（その開示が参照により本明細書に組み込まれるＦａｕｓｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．，９：４８２－４９３，２０１０）。
ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドの二重増殖および細胞殺傷効果
本明細書に開示されるアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原その結合断片、およびそのコンストラクトは、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞の増殖を促進するだけでなく、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞などのＴエフェクター細胞（例えば、ヒト患者などの患者内）の死を誘導できる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、アゴニストＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片で処理されていない試料と比較して、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上、アゴニストＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片で処理された試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、アレルギー、慢性炎症性疾患、喘息、または本明細書に記載の別の障害の治療を受けているヒト患者から単離された試料）中のＴｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞の総量を増加させることができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、および抗原結合断片）がＴｒｅｇ、ＭＤＳＣ、および／または実質細胞増殖を増強する能力は、部分的には、これらのポリペプチドが試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、アレルギー、慢性炎症性疾患、喘息、または本明細書に記載の別の障害の治療を受けているヒト患者から単離された試料）内の可溶性ＴＮＦＲ２の量を増加させるためであり得る。
本明細書に開示されるアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原その結合断片、およびそのコンストラクトは、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞の増殖を促進するだけでなく、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞などのＴエフェクター細胞（例えば、ヒト患者などの患者内）の死を誘導できる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、アゴニストＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片で処理されていない試料と比較して、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上、アゴニストＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片で処理された試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、アレルギー、慢性炎症性疾患、喘息、または本明細書に記載の別の障害の治療を受けているヒト患者から単離された試料）中のＴｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞の総量を増加させることができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、および抗原結合断片）がＴｒｅｇ、ＭＤＳＣ、および／または実質細胞増殖を増強する能力は、部分的には、これらのポリペプチドが試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、アレルギー、慢性炎症性疾患、喘息、または本明細書に記載の別の障害の治療を受けているヒト患者から単離された試料）内の可溶性ＴＮＦＲ２の量を増加させるためであり得る。
ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣの増殖の刺激は、重要な治療上の利点を生み出す。これらの細胞が自己組織に対する不適切な免疫応答を開始する自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴエフェクター細胞の活性を抑制するからである。同様に、自己免疫、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、アレルギー、慢性炎症性疾患、喘息、または本明細書に記載の別の障害に苦しんでいる患者の自己反応性Ｔ細胞の量を減らすためにＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを使用できるため、Ｔエフェクター細胞の直接的な殺傷は治療活性をもたらす。
これらのメカニズムの一方または両方を通じて、本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを使用して、哺乳動物患者（例えば、ヒト患者）などの患者における免疫学的状態を抑制することができる。
これらのメカニズムの一方または両方を通じて、本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを使用して、哺乳動物患者（例えば、ヒト患者）などの患者における免疫学的状態を抑制することができる。
追加的に、本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドがＴＮＦＲ２＋実質細胞の増殖を刺激する能力は、組織および臓器の再生を誘導する有益な効果を提供する。本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを使用して増殖を誘導できる例示的なＴＮＦＲ２＋細胞には、非限定的に、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、頭の構造、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、および精巣の細胞が含まれる。したがって、本明細書に記載のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを使用して、これらの細胞型の１つ以上の再生、保護、および／または治癒が望まれる障害を治療することができる。本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドを使用して治療できる例示的な疾患は、本明細書に記載されている。
活性のある（ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗ）Ｔｒｅｇ細胞の選択的改変
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、アレルギー、慢性炎症性疾患、喘息、または本明細書に記載の別の障害の治療を受けているヒト患者から単離された試料）内でのＴｒｅｇ細胞の増殖または総量の増加を増強でき、活発に分裂している状態のＴｒｅｇ細胞に選択的に作用できる。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗを発現するＴｒｅｇ細胞の増殖を、例えば、ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗタンパク質を発現しないＴｒｅｇ細胞、例えば、ＣＤ２５ＭｅｄおよびＣＤ４５ＲＡＨｉタンパク質を発現するＴｒｅｇ細胞、またはＴｒｅｇ細胞ではないＴ細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上、増加させる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、アレルギー、慢性炎症性疾患、喘息、または本明細書に記載の別の障害の治療を受けているヒト患者から単離された試料）内でのＴｒｅｇ細胞の増殖または総量の増加を増強でき、活発に分裂している状態のＴｒｅｇ細胞に選択的に作用できる。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗを発現するＴｒｅｇ細胞の増殖を、例えば、ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗタンパク質を発現しないＴｒｅｇ細胞、例えば、ＣＤ２５ＭｅｄおよびＣＤ４５ＲＡＨｉタンパク質を発現するＴｒｅｇ細胞、またはＴｒｅｇ細胞ではないＴ細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上、増加させる。
ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、活性のために追加のＴＮＦＲ２結合剤に依存しない
重要なことに、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片は、天然のＴＮＦＲ２リガンドであるＴＮＦαを必要とせずに、ＴＮＦＲ２に結合し、ＴＮＦＲ２媒介シグナル伝達を増強することができる。そのようなアゴニストは、本明細書ではドミナントＴＮＦＲ２アゴニストと呼ばれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、およびコンストラクトは、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞を増殖させるためにＴＮＦαを必要としない。メカニズムに制限されることなく、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、結合すると受容体およびその隣接するモノマーの三量体立体構造を安定化する特定のエピトープにおいてＴＮＦＲ２に結合するこれらの分子の能力により、この特性を示し得る。この構造的構成は、ＮＦκＢシグナル伝達を強化し、Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、およびＴＮＦＲ２＋実質細胞の活性化に関連する基本的なシグナル伝達カスケードの一部を増強する。
重要なことに、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片は、天然のＴＮＦＲ２リガンドであるＴＮＦαを必要とせずに、ＴＮＦＲ２に結合し、ＴＮＦＲ２媒介シグナル伝達を増強することができる。そのようなアゴニストは、本明細書ではドミナントＴＮＦＲ２アゴニストと呼ばれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、およびコンストラクトは、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞を増殖させるためにＴＮＦαを必要としない。メカニズムに制限されることなく、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、結合すると受容体およびその隣接するモノマーの三量体立体構造を安定化する特定のエピトープにおいてＴＮＦＲ２に結合するこれらの分子の能力により、この特性を示し得る。この構造的構成は、ＮＦκＢシグナル伝達を強化し、Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、およびＴＮＦＲ２＋実質細胞の活性化に関連する基本的なシグナル伝達カスケードの一部を増強する。
例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、抗原その結合断片、およびそのコンストラクトは、ＴＮＦαの存在下または非存在下において、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／またはＴＮＦＲ２＋実質細胞などのＴＮＦＲ２＋細胞の表面上のＴＮＦＲ２に結合し、そのような細胞の増殖を増強する。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、そのような細胞の増殖を、例えば、ＴＮＦＲ２ポリペプチドで処理されないそのような細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上、増加させる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）は、細胞増殖アッセイにおいて、ＴＮＦαの存在または非存在によってほとんど変化しないＥＣ５０値を示す（例えば、ＴＮＦαの存在下でのＥＣ５０が、ＴＮＦαの非存在下での同じ細胞増殖アッセイにおけるアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）のＥＣ５０値と比較して、５０％、４５％、４０％、３５％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満の変化である）。ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト性効果を測定するために使用できるＴｒｅｇアッセイの例は、本明細書、例えば以下の実施例２に記載されている。同様に、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合、断片、およびそのコンストラクトは、Ｆｏｘｐ３、ＴＮＦＳＦＳＦ１８、ＩＬ２ＲＡ、ＩＫＺＦ２／４、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦ－ベータ、ＣＨＵＫ、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＦＫＢＩＡ、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ｒｅｌＢ、ＴＮＦ、ＣＸＣＲ３、ＰＤＬ１（ＣＤ２７４）、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ７Ｒ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ、ＭＡＰ３Ｋ４、ＮＦＫＢＩＢ、ＴＡＮＫ、ＴＢＫ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＡＦ２、ｒｅｌＢ、ＬＴＡ、ＥＰ３００、ＣＲＥＢＢ
Ｐ、ＮＦｋＢシグナル伝達タンパク質からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することによって評価されるとき、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を、例えば、ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドで処理されていないそのような細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上増強できる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）は、遺伝子発現アッセイにおいて、ＴＮＦαの存在または非存在によってほとんど変化しないかまたは増強されないＥＣ５０値を示す（例えば、ＴＮＦαの存在下でのＥＣ５０が、ＴＮＦαの非存在下での同じ遺伝子発現アッセイにおけるアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）のＥＣ５０値と比較して、５０％、４５％、４０％、３５％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満の変化である）。
Ｐ、ＮＦｋＢシグナル伝達タンパク質からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することによって評価されるとき、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を、例えば、ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドで処理されていないそのような細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上増強できる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）は、遺伝子発現アッセイにおいて、ＴＮＦαの存在または非存在によってほとんど変化しないかまたは増強されないＥＣ５０値を示す（例えば、ＴＮＦαの存在下でのＥＣ５０が、ＴＮＦαの非存在下での同じ遺伝子発現アッセイにおけるアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）のＥＣ５０値と比較して、５０％、４５％、４０％、３５％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満の変化である）。
全長ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の抗原結合断片の活性
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／または実質細胞の増殖を増強し、および／またはＴエフェクター細胞死を促進し、そのような抗体の抗原結合断片によって示されるのと同様の効力を有する。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＦｃ領域の除去は、分子が、試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、アレルギー、移植拒絶反応、または本明細書に記載の別の状態の治療を受けているヒト患者から単離された試料）内の、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／または実質細胞の増殖を促進する能力、および／またはＴエフェクター細胞（例えば、ＣＤ８＋自己反応性Ｔ細胞）を直接殺傷する能力を変化させなくてもよい。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその抗原結合断片は、例えば、細胞死を誘導するためにエフェクタータンパク質を動員するためにＦｃ領域が必要とされる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）とは異なる経路によって機能し得る。追加的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、とりわけ、単鎖ポリペプチド（例えば、互いに、例えば、アミド結合、チオエーテル結合、炭素間結合、またはジスルフィド架橋によって互いに共有結合された１つ以上のＣＤＲを含む単鎖ポリペプチド）、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、ポリクローナル抗体またはその抗原結合断片、ヒト化抗体またはその抗原結合断片、霊長類化抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体またはその抗原結合断片、多重特異性抗体またはその抗原結合断片、二重可変免疫グロブリンドメイン、一価抗体またはその抗原結合断片、キメラ抗体またはその抗原結合断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ディアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質足場、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２分子、およびタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）などの様々な形態で治療活性を示し得る。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／または実質細胞の増殖を増強し、および／またはＴエフェクター細胞死を促進し、そのような抗体の抗原結合断片によって示されるのと同様の効力を有する。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＦｃ領域の除去は、分子が、試料（例えば、自己免疫、ＧＶＨＤ、アレルギー、移植拒絶反応、または本明細書に記載の別の状態の治療を受けているヒト患者から単離された試料）内の、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、および／または実質細胞の増殖を促進する能力、および／またはＴエフェクター細胞（例えば、ＣＤ８＋自己反応性Ｔ細胞）を直接殺傷する能力を変化させなくてもよい。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその抗原結合断片は、例えば、細胞死を誘導するためにエフェクタータンパク質を動員するためにＦｃ領域が必要とされる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）とは異なる経路によって機能し得る。追加的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、とりわけ、単鎖ポリペプチド（例えば、互いに、例えば、アミド結合、チオエーテル結合、炭素間結合、またはジスルフィド架橋によって互いに共有結合された１つ以上のＣＤＲを含む単鎖ポリペプチド）、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、ポリクローナル抗体またはその抗原結合断片、ヒト化抗体またはその抗原結合断片、霊長類化抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体またはその抗原結合断片、多重特異性抗体またはその抗原結合断片、二重可変免疫グロブリンドメイン、一価抗体またはその抗原結合断片、キメラ抗体またはその抗原結合断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ディアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質足場、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２分子、およびタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）などの様々な形態で治療活性を示し得る。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの特異的結合特性
本明細書に記載のポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、または抗体断片のヒトＴＮＦＲ２への特異的結合は、様々な確立された方法のいずれかによって決定することができる。親和性は、インビトロまたはインビボでのＴＮＦＲ２受容体の最大半量の活性化（ＥＣ５０）および抗体－ＴＮＦＲ２複合体解離の平衡定数（ＫＤ）を達成するために必要な抗体の濃度など、様々な測定値によって定量的に表すことができる。ＴＮＦＲ２と本明細書に記載の抗体との相互作用を表す平衡定数ＫＤは、ＴＮＦＲ２－抗体複合体の、互いに相互作用しない溶媒分離されたＴＮＦＲ２と抗体分子への解離反応の化学平衡定数である。
本明細書に記載のポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、または抗体断片のヒトＴＮＦＲ２への特異的結合は、様々な確立された方法のいずれかによって決定することができる。親和性は、インビトロまたはインビボでのＴＮＦＲ２受容体の最大半量の活性化（ＥＣ５０）および抗体－ＴＮＦＲ２複合体解離の平衡定数（ＫＤ）を達成するために必要な抗体の濃度など、様々な測定値によって定量的に表すことができる。ＴＮＦＲ２と本明細書に記載の抗体との相互作用を表す平衡定数ＫＤは、ＴＮＦＲ２－抗体複合体の、互いに相互作用しない溶媒分離されたＴＮＦＲ２と抗体分子への解離反応の化学平衡定数である。
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、および抗原結合断片）には、１００ｎＭ未満（例えば、９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、または１ｎＭ）のＫＤ値でＴＮＦＲ２に特異的に結合するものが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそれらのコンストラクト）は、１ｎＭ未満（例えば（例えば、９９０ｐＭ、９８０ｐＭ、９７０ｐＭ、９６０ｐＭ、９５０ｐＭ、９４０ｐＭ、９３０ｐＭ、９２０ｐＭ、９１０ｐＭ、９００ｐＭ、８９０ｐＭ、８８０ｐＭ、８７０ｐＭ、８６０ｐＭ、８５０ｐＭ、８４０ｐＭ、８３０ｐＭ、８２０ｐＭ、８１０ｐＭ、８００ｐＭ、７９０ｐＭ、７８０ｐＭ、７７０ｐＭ、７６０ｐＭ、７５０ｐＭ、７４０ｐＭ、７３０ｐＭ、７２０ｐＭ、７１０ｐＭ、７００ｐＭ、６９０ｐＭ、６８０ｐＭ、６７０ｐＭ、６６０ｐＭ、６５０ｐＭ、６４０ｐＭ、６３０ｐＭ、６２０ｐＭ、６１０ｐＭ、６００ｐＭ、５９０ｐＭ、５８０ｐＭ、５７０ｐＭ、５６０ｐＭ、５５０ｐＭ、５４０ｐＭ、５３０ｐＭ、５２０ｐＭ、５１０ｐＭ、５００ｐＭ、４９０ｐＭ、４８０ｐＭ、４７０ｐＭ、４６０ｐＭ、４５０ｐＭ、４４０ｐＭ、４３０ｐＭ、４２０ｐＭ、４１０ｐＭ、４００ｐＭ、３９０ｐＭ、３８０ｐＭ、３７０ｐＭ、３６０ｐＭ、３５０ｐＭ、３４０ｐＭ、３３０ｐＭ、３２０ｐＭ、３１０ｐＭ、３００ｐＭ、２９０ｐＭ、２８０ｐＭ、２７０ｐＭ、２６０ｐＭ、２５０ｐＭ、２４０ｐＭ、２３０ｐＭ、２２０ｐＭ、２１０ｐＭ、２００ｐＭ、１９０ｐＭ、１８０ｐＭ、１７０ｐＭ、１６０ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭ、１３０ｐＭ、１２０ｐＭ、１１０ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、または１ｐＭ）のＫＤ値でＴＮＦＲ２に特異的に結合する。
本明細書に記載のポリペプチドは、様々なインビトロ結合アッセイによって特徴付けることもできる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのＫＤまたはＥＣ５０を決定するために使用できる実験の例には、とりわけ、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定、蛍光異方性、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、遺伝子発現アッセイ、およびタンパク質発現アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡは、抗体の活性を分析するための特に有用な方法であり、そのようなアッセイは、通常、抗体の最小濃度を必要とする。典型的なＥＬＩＳＡアッセイで分析される一般的なシグナルは発光であり、これは通常、一次抗体（例えば、本明細書に記載のＴＮＦＲ２抗体）に特異的に結合する二次抗体にコンジュゲートしたペルオキシダーゼの活性の結果である。本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、および抗原結合断片）は、ヒトＴＮＦＲ２のＣＲＤ１、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上の連続または不連続残基を含むエピトープなど、ＴＮＦＲ２およびその中のエピトープに結合することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ポリペプチドは、天然タンパク質における上述のエピトープの立体構造をシミュレートする方法で、様々な残基を構造的に事前に組織化する、ＴＮＦＲ２に由来する単離されたペプチドに追加的に結合することができる。直接ＥＬＩＳＡ実験では、この結合は、例えば、ＨＲＰ基質（例えば、２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート）とＨＲＰコンジュゲート二次抗体に結合した抗原抗体複合体とのインキュベーション時に発生する発光を分析することによって定量できる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの速度論的特性
ＴＮＦＲ２－ポリペプチド相互作用の熱力学的パラメーターに加えて、本明細書に記載のポリペプチドとＴＮＦＲ２との動的結合および解離を定量的に特徴付けることも可能である。これは、例えば、確立された手順に従って、ポリペプチド－抗原（例えば、抗体－抗原）複合体形成の速度をモニタリングすることによって行うことができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、抗体－ＴＮＦＲ２複合体の形成（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）の速度定数を決定することができる。これらのデータは、抗体－ＴＮＦＲ２複合体解離の平衡定数（ＫＤ）の計算も可能にする。これは、この単分子解離の平衡定数がｋｏｆｆ値とｋｏｎ値の比として表すことができるためである。ＳＰＲは、受容体と抗体の相互作用の速度論的および熱力学的なパラメーターを決定するのに特に有利な手法である。この実験では、１つのコンポーネントを化学標識の付着によってを変更する必要がないためである。むしろ、受容体は通常、抗体の濃度が増加する溶液でパルス処理される固体金属表面に固定化される。抗体と受容体の結合は、金属表面での入射光の反射角の歪みを引き起こし、抗体がシステムに導入されるときの時間の経過に伴うこの屈折率の変化は、抗体受容体相互作用の会合および解離速度の定数を計算するために、確立された回帰モデルに適合させることができる。
ＴＮＦＲ２－ポリペプチド相互作用の熱力学的パラメーターに加えて、本明細書に記載のポリペプチドとＴＮＦＲ２との動的結合および解離を定量的に特徴付けることも可能である。これは、例えば、確立された手順に従って、ポリペプチド－抗原（例えば、抗体－抗原）複合体形成の速度をモニタリングすることによって行うことができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、抗体－ＴＮＦＲ２複合体の形成（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）の速度定数を決定することができる。これらのデータは、抗体－ＴＮＦＲ２複合体解離の平衡定数（ＫＤ）の計算も可能にする。これは、この単分子解離の平衡定数がｋｏｆｆ値とｋｏｎ値の比として表すことができるためである。ＳＰＲは、受容体と抗体の相互作用の速度論的および熱力学的なパラメーターを決定するのに特に有利な手法である。この実験では、１つのコンポーネントを化学標識の付着によってを変更する必要がないためである。むしろ、受容体は通常、抗体の濃度が増加する溶液でパルス処理される固体金属表面に固定化される。抗体と受容体の結合は、金属表面での入射光の反射角の歪みを引き起こし、抗体がシステムに導入されるときの時間の経過に伴うこの屈折率の変化は、抗体受容体相互作用の会合および解離速度の定数を計算するために、確立された回帰モデルに適合させることができる。
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、高親和性受容体結合と一致して、ＴＮＦＲ２との相互作用時に高いｋｏｎおよび低いｋｏｆｆ値を示し得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチドは、ＴＮＦＲ２の存在下で、１０４Ｍ－１ｓ－１を超える（例えば、１．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、１．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、２．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、２．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、３．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、３．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、４．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、４．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、５．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、５．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、６．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、６．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、７．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、７．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、８．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、８．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、９．０×１０４Ｍ－１ｓ－１、９．５×１０４Ｍ－１ｓ－１、１．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、１．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、２．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、２．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、３．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、３．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、４．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、４．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、５．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、５．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、６．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、６．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、７．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、７．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、８．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、８．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、９．０×１０５Ｍ－１ｓ－１、９．５×１０５Ｍ－１ｓ－１、または１．０×１０６Ｍ－１ｓ－１）ｋｏｎ値を示し得る。本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、これらのポリペプチドが高い親和性で異なるＴＮＦＲ２エピトープと相互作用できるため、ＴＮＦＲ２に結合すると低いｋｏｆｆ値を示し得る。これらのエピトープ内の残基は、ＴＦＮＲ２との強い分子間接触を形成することができ、抗体－ＴＮＦＲ２複合体の解離を遅らせることができる。この高い受容体親和性は、低いｋｏｆｆ値として現れ得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチドは、ＴＮＦＲ２と複合体形成する場合、１０－３ｓ－１未満（例えば、１．０×１０－３ｓ－１、９．５×１０－４ｓ－１、９．０×１０－４ｓ－１、８．５×１０－４ｓ－１、８．０×１０－４ｓ－１、７．５×１０－４ｓ－１、７．０×１０－４ｓ－１、６．５×１０－４ｓ－１、６．０×１０－４ｓ－１、５．５×１０－４ｓ－１、５．０×１０－４ｓ－１、４．５×１０－４ｓ－１、４．０×１０－４ｓ－１、３．５×１０－４ｓ－１、３．０×１０－４ｓ－１、２．５×１０－４ｓ－１、２．０×１０－４ｓ－１、１．５×１０－４ｓ－１、１．０×１０－４ｓ－１、９．５×１０－５ｓ－１、９．０×１０－５ｓ－１、８．５×１０－５ｓ－１、８．０×１０－５ｓ－１、７．５×１０－５ｓ－１、７．０×１０－５ｓ－１、６．５×１０－５ｓ－１、６．０×１０－５ｓ－１、５．５×１０－５ｓ－１、５．０×１０－５ｓ－１、４．５×１０－５ｓ－１、４．０×１０－５ｓ－１、３．５×１０－５ｓ－１、３．０×１０－５ｓ－１、２．５×１０－５ｓ－１、２．０×１０－５ｓ－１、１．５×１０－５ｓ－１、または１．０×１０－５ｓ－１）のｋｏｆｆ値を示し得る。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが結合するＴＮＦＲ２内のエピトープ
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、ドミナントアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、
（ａ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、
（ｈ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）、のＴＮＦＲ２の残基、および／または
（ｉ）非ヒト哺乳動物、例えば、本明細書に記載の非ヒト哺乳動物のＴＮＦＲ２内の同等のエピトープ、上述のエピトープのいずれかに対し、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すエピトープ、および／または上述のエピトープのいずれかに対して１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むエピトープ、のうちの１つ以上に特異的に結合できる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、ドミナントアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、
（ａ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、
（ｈ）ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）、のＴＮＦＲ２の残基、および／または
（ｉ）非ヒト哺乳動物、例えば、本明細書に記載の非ヒト哺乳動物のＴＮＦＲ２内の同等のエピトープ、上述のエピトープのいずれかに対し、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すエピトープ、および／または上述のエピトープのいずれかに対して１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むエピトープ、のうちの１つ以上に特異的に結合できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のドミナントアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドなどのアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、ヒトＴＮＦＲ２内の配列番号１の１４２～１４６の残基（ＫＣＲＰＧ、配列番号４１）のうちの１つ以上または全てを含むエピトープに結合しない。
本明細書に記載のＴＮＦＲ２ポリペプチドの増殖、再生、治癒、または保護活性を予測するために使用できる１つの例示的な手順は、ＫＣＳＰＧモチーフ（配列番号４０）、例えば、このモチーフを含む直線状または環状ペプチドを含むペプチドに対する抗体または抗体断片の親和性を決定することである。ペプチドは、例えば、ＫＣＳＰＧモチーフ（配列番号４０）の３次元配向をシミュレートする方法で、１つ以上の立体構造的拘束（例えば、骨格または側鎖から側鎖への環化）によって構造的に事前に組織化されていてもよい。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＫＣＳＰＧモチーフ（配列番号４０）を含むペプチドに、ＫＣＲＰＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むペプチドに対するアゴニスト性ポリペプチドの親和性よりも、例えば、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、または１０００倍以上高い親和性で結合する。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１
本明細書に記載の例示的なアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクトには、エピトープにおいてＴＮＦＲ２に特異的に結合し、ＴＮＦＲ２のシグナル伝達を促進し、したがってＴｒｅｇ細胞およびＭＤＳＣの増殖、ＴＮＦＲ２＋実質細胞の再生、治癒、および保護、ならびにＴエフェクター細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞）の死を促進するモノクローナル抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲの１つ以上、または全てが含まれ得る。例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、および／またはＣＤＲ－Ｌ３、およびこれらのＣＤＲのバリアント（例えば、これらのＣＤＲ配列に対して、保存的アミノ酸置換を示すバリアント）を使用して、本開示の追加のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）を、例えば、本明細書に記載されているか、当該技術分野で既知の抗体ヒト化法によって、生成することができる。
本明細書に記載の例示的なアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、およびそのコンストラクトには、エピトープにおいてＴＮＦＲ２に特異的に結合し、ＴＮＦＲ２のシグナル伝達を促進し、したがってＴｒｅｇ細胞およびＭＤＳＣの増殖、ＴＮＦＲ２＋実質細胞の再生、治癒、および保護、ならびにＴエフェクター細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞）の死を促進するモノクローナル抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲの１つ以上、または全てが含まれ得る。例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、および／またはＣＤＲ－Ｌ３、およびこれらのＣＤＲのバリアント（例えば、これらのＣＤＲ配列に対して、保存的アミノ酸置換を示すバリアント）を使用して、本開示の追加のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）を、例えば、本明細書に記載されているか、当該技術分野で既知の抗体ヒト化法によって、生成することができる。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、および抗原結合断片）は、ＴＮＦＲＡＧ１のものと同じまたは類似の結合特性を示し得る。特に、ＴＮＦＲＡＧ１は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）のうちの１つ以上において、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）のうちの１つ以上において、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する。
ＴＮＦＲＡＧ１は、以下の配列番号１４および１５に記載の重鎖可変領域の一方または両方を含み得る。これらの領域の各々のＣＤＲは太字で示される。
[配列表１]
[配列表２]
[配列表１]
追加的に、ＴＮＦＲＡＧ１は、以下の配列番号４２に記載の軽鎖可変領域を含む。この領域のＣＤＲは太字で示される。
[配列表３]
[配列表３]
以下のセクションでは、例えば、ＴＮＦＲＡＧ１の分子的特徴に基づいて、ヒト、ヒト化、霊長類化、キメラ、および他のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）を調製するために使用できる方法の詳細な説明を提供する。
完全ヒト、ヒト化、霊長類化、およびキメラ抗体
本明細書に記載の抗体には、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ配列の１つ以上、または全てを含む完全ヒト、ヒト化、霊長類化、およびキメラ抗体が含まれる。追加的に、本明細書に記載の抗体には、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３の１つ以上、または全てを含む完全ヒト、ヒト化、霊長類化、およびキメラ抗体が含まれ、ＣＤＲ配列の１つ以上または全ては、ＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示す。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体には、さらに、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲーＬ３の１つ以上または全てを含む完全ヒト、ヒト化、霊長類化、およびキメラ抗体が含まれ、ここで、ＣＤＲ配列の１つ以上、または全ては、対応するＣＤＲ配列または重要なヒト重鎖配列にもバージョンが見られる共有重鎖フレームワーク配列対して１つ以上（例えば、３つまで）のアミノ酸置換（例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換）を含む。
本明細書に記載の抗体には、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ配列の１つ以上、または全てを含む完全ヒト、ヒト化、霊長類化、およびキメラ抗体が含まれる。追加的に、本明細書に記載の抗体には、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３の１つ以上、または全てを含む完全ヒト、ヒト化、霊長類化、およびキメラ抗体が含まれ、ＣＤＲ配列の１つ以上または全ては、ＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示す。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体には、さらに、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲーＬ３の１つ以上または全てを含む完全ヒト、ヒト化、霊長類化、およびキメラ抗体が含まれ、ここで、ＣＤＲ配列の１つ以上、または全ては、対応するＣＤＲ配列または重要なヒト重鎖配列にもバージョンが見られる共有重鎖フレームワーク配列対して１つ以上（例えば、３つまで）のアミノ酸置換（例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換）を含む。
一例として、本明細書に記載のヒト化抗体を設計するために使用できる１つの戦略は、ＴＮＦＲＡＧ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を、コンセンサスヒト抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と整列させることである。コンセンサスヒト抗体の重鎖および軽鎖配列は、当該技術分野で知られている（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖系列配列データベースを参照されたい。Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１ －３２４２，１９９１；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－９８，１９９２、およびＣｏｘ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６，１９９４も参照されたい。この開示は参照により本明細書に組み込まれる）。このようにして、可変ドメインフレームワークの残基およびＣＤＲは、配列アラインメントによって識別できる（前出のＫａｂａｔを参照されたい）。ヒト化ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体を生成するために、例えば、コンセンサスヒト抗体の１つ以上のＣＤＲをＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）で置換することができる。コンセンサスヒト抗体の例示的な可変ドメインには、重鎖可変ドメイン：
[配列表４]
および軽鎖可変ドメイン：
[配列表５]
が含まれ、
参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５４，２９７号にて同定される（ＣＤＲｓは、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１－９１７，１９８７の方法に従って決定され、太字で示される）。これらのアミノ酸置換は、例えば、当該技術分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて、宿主細胞におけるヒト化抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドの組換え発現によって行うことができる。
[配列表４]
[配列表５]
参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５４，２９７号にて同定される（ＣＤＲｓは、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１－９１７，１９８７の方法に従って決定され、太字で示される）。これらのアミノ酸置換は、例えば、当該技術分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて、宿主細胞におけるヒト化抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドの組換え発現によって行うことができる。
同様に、この戦略は、霊長類化アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体を生成するためにも使用できる。例えば、霊長類抗体コンセンサス配列の１つ以上または全てのＣＤＲを、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲの１つ以上または全てと置換することができる。コンセンサス霊長類抗体配列は当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６８１，７２２号、および同第５，６９３，７８０号を参照されたい。それぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＡＧ１などのアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体からのＣＤＲ配列に加えて、特定のフレームワーク残基をヒト抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメインにインポートすることが望ましい場合がある。例えば、米国特許第６，０５４，２９７号は、結果として生じるヒト化抗体において特定の抗体重鎖または軽鎖可変領域から特定のフレームワーク残基を保持することが有利であり得るいくつかの例を特定している。いくつかの実施形態では、フレームワーク残基が抗原と非共有結合相互作用によって係合し、標的抗原に対する抗体の親和性に寄与し得る。いくつかの実施形態では、個々のフレームワーク残基がＣＤＲの立体構造を調節し、抗体と抗原との相互作用に間接的に影響を与え得る。特定のフレームワーク残基は、ＶＨドメインとＶＬドメイン間のインターフェースを形成する可能性があり、したがって、グローバルな抗体構造に寄与し得る。場合によっては、フレームワーク残基が機能的グリコシル化部位（例えば、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を構成する場合があり、これが炭水化物部分への結合時に抗体構造および抗原親和性を決定づけ得る。上述のような場合、様々なフレームワーク残基が抗体またはその抗原結合断片の高いエピトープ親和性および改善された生化学的活性を促進する可能性があるため、例えばヒト化または霊長類化アゴニスト抗体またはその抗原結合断片中に、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体（例えば、ＴＮＦＲＡＧ１）の特定のフレームワーク残基を保持することが有益であり得る。
本明細書に記載の抗体には、（ｉ）ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲの１つ以上または全てを含む、および／または（ｉｉ）そのＣＤＲが、ＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すＣＤＲ配列の１つ以上または全てを含むＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上または全てを含む、抗体断片、Ｆａｂドメイン、Ｆ（ａｂ’）分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ断片、ディアボディ、トリアボディ、二重可変ドメイン免疫グロブリン、多重特異性抗体、二重特異性抗体、および異種特異的抗体も含まれる。これらの分子は、例えば、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の技術を使用して真核生物または原核生物の細胞にトランスフェクションすることにより組換え発現することができ、または、例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の固相ペプチド合成方法により化学的に合成することができる。
本明細書に記載のポリペプチドには、追加的に、例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲの１つ以上または全てを含むか、あるいはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上または全てがＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示す、および／またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列と比較して、１つ以上（例えば、３つまで）のアミノ酸置換（例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換）を含む、抗体様足場が含まれる。抗体様足場の例には、標準抗体に類似したＢＣ、ＤＥ、およびＦＧ構造ループを含む第１０フィブロネクチンＩＩＩドメイン（１０Ｆｎ３）を含むタンパク質が含まれる。１０Ｆｎ３ドメインの三次構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の三次構造に似ており、当業者は、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの残基をＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列の残基で置き換えることにより、例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ配列のうちの１つ以上もしくは全て、またはこれらのＣＤＲ配列の任意の１つ以上に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する配列または、これらのＣＤＲ配列の１つ以上に対してアミノ酸置換、例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換（例えば３つまでのアミノ酸置換）を含む配列を、フィブロネクチン足場に移植することができる。これは、原核細胞または真核細胞における改変１０Ｆｎ３ドメインの組換え発現によって達成することができる（例えば、本明細書に記載のベクターおよび技術を使用して）。抗体からのＣＤＲをＢＣ、ＤＥ、およびＦＧ構造ループに移植するための抗体様骨格として１０Ｆｎ３ドメインを使用する例は、ＷＯ２０００／０３４７８４、ＷＯ２００９／１４２７７３、ＷＯ２０１２／０８８００６、および米国特許第８，２７８，４１９号に報告され、それぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＴＮＦＲ２親和性およびアゴニスト作用の分子決定因子
本開示のポリペプチドは、ＴＮＦＲ２アゴニスト表現型（例えば、ドミナントＴＮＦＲ２アゴニスト表現型）を生じさせる一連の共有された構造的特徴を示し得る。例えば、ＴＮＲＡＧ１のそれぞれのＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列と２つの追加のアゴニスト性ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体、ＴＮＦＲＡＧ２およびＴＮＦＲＡＧ３のアライメントは、これらの抗体が以下に示すように、保存されたコンセンサスＣＤＲ－Ｈ１配列を特徴とすることを実証する：
Ｇ Ｙ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ Ｎ （Ｉ／Ｌ） （ＴＮＦＲＡＧ１ ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４５）
Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ Ｄ （ＴＮＦＲＡＧ２ ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４６）
Ｇ Ｙ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ － Ｉ （ＴＮＦＲＡＧ３ ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４７）
Ｇ（Ｙ／Ｆ）Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ （Ｎ／Ｄ）－ （コンセンサス配列、配列番号４８）
本開示のポリペプチドは、ＴＮＦＲ２アゴニスト表現型（例えば、ドミナントＴＮＦＲ２アゴニスト表現型）を生じさせる一連の共有された構造的特徴を示し得る。例えば、ＴＮＲＡＧ１のそれぞれのＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列と２つの追加のアゴニスト性ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体、ＴＮＦＲＡＧ２およびＴＮＦＲＡＧ３のアライメントは、これらの抗体が以下に示すように、保存されたコンセンサスＣＤＲ－Ｈ１配列を特徴とすることを実証する：
Ｇ Ｙ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ Ｎ （Ｉ／Ｌ） （ＴＮＦＲＡＧ１ ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４５）
Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ Ｄ （ＴＮＦＲＡＧ２ ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４６）
Ｇ Ｙ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ － Ｉ （ＴＮＦＲＡＧ３ ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４７）
Ｇ（Ｙ／Ｆ）Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ （Ｎ／Ｄ）－ （コンセンサス配列、配列番号４８）
配列のアラインメントにより、ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）に記載されるモチーフなどの共有されたＣＤＲ－Ｈ１モチーフが明らかとなり、各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、各々のＺ４が独立してロイシンまたはイソロイシンである。本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、上述の配列番号４５～４７のいずれか１つに記載されるＣＤＲ－Ｈ１配列、および／または配列番号２の保存されたモチーフによって表されるＣＤＲ－Ｈ１を有し得る。
核酸および発現系
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、確立された様々な技術のいずれかによって調製することができる。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。抗体を組換えで発現させるために、抗体の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を単時する１つ以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、軽鎖および重鎖が宿主細胞で発現され、任意選択で宿主細胞が培養されている培地に分泌することができ、そこから抗体を回収することができる。その各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９８９）、および米国特許第４，８１６，３９７号に記載されるように、標準的な組換えＤＮＡ手法を使用して、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を取得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、そのベクターを宿主細胞に導入する。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、確立された様々な技術のいずれかによって調製することができる。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。抗体を組換えで発現させるために、抗体の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を単時する１つ以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、軽鎖および重鎖が宿主細胞で発現され、任意選択で宿主細胞が培養されている培地に分泌することができ、そこから抗体を回収することができる。その各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９８９）、および米国特許第４，８１６，３９７号に記載されるように、標準的な組換えＤＮＡ手法を使用して、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を取得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、そのベクターを宿主細胞に導入する。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの発現のためのベクター
ウイルスゲノムは、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）のゲノムに外因性遺伝子を効率的に送達するために使用できる豊富なベクターソースを提供する。ウイルスゲノムは、遺伝子送達に特に有用なベクターである。そのようなゲノムに含まれるポリヌクレオチドが、一般的に、一般化または特殊化された形質導入によって標的細胞のゲノムに組み込まれるからである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として発生し、遺伝子組み込みを誘導するために追加のタンパク質や試薬を必要としない。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、およびＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミキソウイルスなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および小水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、およびアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型）を含む二本鎖ＤＮＡウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ファウルポックスおよびカナリアポックス）が挙げられる。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを送達するために有用な他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物のＣ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプマウイルスが含まれる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。その他の例としては、ネズ
ミ白血病ウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、鳥白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ギボン類人猿白血病ウイルス、メイソン・ファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、ＭｃＶｅｙ ｅｔ ａｌ．，（米国特許第５，８０１，０３０号）に記載され、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスゲノムは、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）のゲノムに外因性遺伝子を効率的に送達するために使用できる豊富なベクターソースを提供する。ウイルスゲノムは、遺伝子送達に特に有用なベクターである。そのようなゲノムに含まれるポリヌクレオチドが、一般的に、一般化または特殊化された形質導入によって標的細胞のゲノムに組み込まれるからである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として発生し、遺伝子組み込みを誘導するために追加のタンパク質や試薬を必要としない。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、およびＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミキソウイルスなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および小水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、およびアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型）を含む二本鎖ＤＮＡウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ファウルポックスおよびカナリアポックス）が挙げられる。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを送達するために有用な他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物のＣ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプマウイルスが含まれる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。その他の例としては、ネズ
ミ白血病ウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、鳥白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ギボン類人猿白血病ウイルス、メイソン・ファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、ＭｃＶｅｙ ｅｔ ａｌ．，（米国特許第５，８０１，０３０号）に記載され、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
プラスミドなどの非ウイルスベクターも当該技術分野で既知であり、原核生物および真核生物のベクター（例えば、酵母および細菌に基づくプラスミド）、ならびに哺乳動物細胞における発現のためのプラスミドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターを宿主細胞に導入し、発現したタンパク質を単離および精製する方法も当該技術分野で既知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９））。
ゲノム編集技術
ウイルスベクターに加えて、とりわけ、抗体の軽鎖および重鎖、単鎖ポリペプチド、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、Ｆａｂドメイン、Ｆ（ａｂ’）２ドメイン、ディアボディ、およびトリアボディをコードする遺伝子の標的細胞のゲノムへの組み込みのために、様々な追加の方法が開発されている。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に組み込むために使用できるそのような方法の１つは、トランスポゾンの使用を含む。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドであり、５’および３’位置の切除部位が隣接する目的のポリヌクレオチド配列または遺伝子を含む。トランスポゾンが細胞に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が始まり、トランスポゾンから目的の遺伝子を切断する活性酵素が生じる。この活性は、トランスポザーゼによるトランスポゾン切除部位の部位特異的認識によって媒介される。いくつかの実施形態では、これらの切除部位は、末端反復または逆方向末端反復であり得る。トランスポゾンから切り出されると、目的の遺伝子を、細胞の核ゲノム内に存在する同様の切り出し部位のトランスポザーゼ触媒による切断によって、原核細胞または真核細胞のゲノムに組み込むことができる。これにより、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをコードする遺伝子を、切断された核ＤＮＡの切除部位に挿入し、続いて目的の遺伝子を原核細胞または真核細胞ゲノムのＤＮＡに結合するホスホジエステル結合のライゲーションにより、取り込みプロセスが完了する。いくつかの実施形態では、トランスポゾンはレトロトランスポゾンであり、ポリペプチドをコードする遺伝子が最初にＲＮＡ産物に転写され、次にＤＮＡに逆転写されてから原核細胞または真核細胞のゲノムに組み込まれる。例示的なトランスポゾン系には、ピギーバックトランスポゾン（ＷＯ２０１０／０８５６９９に詳細に記載）およびスリーピングビューティートランスポゾン（ＵＳ２００５／０１１２７６４に詳細に記載）が含まれ、それぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスベクターに加えて、とりわけ、抗体の軽鎖および重鎖、単鎖ポリペプチド、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、Ｆａｂドメイン、Ｆ（ａｂ’）２ドメイン、ディアボディ、およびトリアボディをコードする遺伝子の標的細胞のゲノムへの組み込みのために、様々な追加の方法が開発されている。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に組み込むために使用できるそのような方法の１つは、トランスポゾンの使用を含む。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドであり、５’および３’位置の切除部位が隣接する目的のポリヌクレオチド配列または遺伝子を含む。トランスポゾンが細胞に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が始まり、トランスポゾンから目的の遺伝子を切断する活性酵素が生じる。この活性は、トランスポザーゼによるトランスポゾン切除部位の部位特異的認識によって媒介される。いくつかの実施形態では、これらの切除部位は、末端反復または逆方向末端反復であり得る。トランスポゾンから切り出されると、目的の遺伝子を、細胞の核ゲノム内に存在する同様の切り出し部位のトランスポザーゼ触媒による切断によって、原核細胞または真核細胞のゲノムに組み込むことができる。これにより、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをコードする遺伝子を、切断された核ＤＮＡの切除部位に挿入し、続いて目的の遺伝子を原核細胞または真核細胞ゲノムのＤＮＡに結合するホスホジエステル結合のライゲーションにより、取り込みプロセスが完了する。いくつかの実施形態では、トランスポゾンはレトロトランスポゾンであり、ポリペプチドをコードする遺伝子が最初にＲＮＡ産物に転写され、次にＤＮＡに逆転写されてから原核細胞または真核細胞のゲノムに組み込まれる。例示的なトランスポゾン系には、ピギーバックトランスポゾン（ＷＯ２０１０／０８５６９９に詳細に記載）およびスリーピングビューティートランスポゾン（ＵＳ２００５／０１１２７６４に詳細に記載）が含まれ、それぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）をコードする核酸分子を原核細胞または真核細胞のゲノムに組み込むための別の有用な方法は、もともとはウイルスの感染に対する細菌や古細菌の適応防御メカニズムとして進化したクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、プラスミドＤＮＡ内のパリンドロームリピート配列と、関連するＣａｓ９ヌクレアーゼで構成される。このＤＮＡとタンパク質の集合体は、最初に外来ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むことにより、標的配列の部位特異的ＤＮＡ切断を指示する。これらの外来配列とＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピートスペーサー要素を含むポリヌクレオチドは、転じて宿主細胞で転写されてガイドＲＮＡを作成し、続いてこれは、標的配列にアニールし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをこの部位に局在化させることができる。このようにして、標的ＤＮＡ分子の近接内にｃａｓ９をもたらす相互作用はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションによって支配されるため、外来ポリヌクレオチドで高度に部位特異的なｃａｓ９媒介ＤＮＡ切断を引き起こすことができる。その結果、目的の標的ＤＮＡ分子を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを理論的に設計することができる。この技術は、真核生物のゲノムを編集するために利用されており（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３１：２２７－２２９，２０１３）、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）をコードするポリヌクレオチドを組み込む前に、ＤＮＡを切断するために、真核生物または原核生物のゲノムを部位特異的に編集する効率的な手段として使用できる。遺伝子発現を調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用は、米国特許第８，６９７，３５９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のＴＮＦＲ２抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを組み込む前にゲノムＤＮＡを部位特異的に切断する代替的な方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とは異なり、これらの酵素には、特定の標的配列に局在するためのガイドポリヌクレオチドが含まれていない。代わりに、標的特異性は、これらの酵素内のＤＮＡ結合ドメインによって制御される。ゲノム編集用途で使用するためのジンクフィンガーヌクレアーゼとＴＡＬＥＮ は、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：６３６－６４６，２０１０）、およびＪｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４：４９－５５，２０１３）に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞のゲノムに組み込むために使用できる追加のゲノム編集技術には、ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断するように合理的に設計できるＡＲＣＵＳ（商標）メガヌクレアーゼの使用が含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞のゲノムに組み込むためのこれらの酵素の使用は、そのような酵素のために確立された構造活性関係の点で特に有利である。したがって、単鎖メガヌクレアーゼを特定のアミノ酸位置で改変して、所望の位置でＤＮＡを選択的に切断するヌクレアーゼを作成することができる。これらの単鎖ヌクレアーゼは、例えば米国特許第８，０２１，８６７号および同第８，４４５，２５１号に詳細に記載され、各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチド配列要素
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）を発現するために、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲ配列の１つ以上または全てをコードするポリヌクレオチドを、その遺伝子を転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の確立された技術を使用して、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの軽鎖遺伝子および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに挿入することができ、または、任意選択で、両方のポリヌクレオチドを同じ発現ベクターに組み込むことができる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）を発現するために、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲ配列の１つ以上または全てをコードするポリヌクレオチドを、その遺伝子を転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の確立された技術を使用して、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの軽鎖遺伝子および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに挿入することができ、または、任意選択で、両方のポリヌクレオチドを同じ発現ベクターに組み込むことができる。
抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド（または単鎖ポリペプチド、ｓｃＦｖ分子などの抗体断片、または本明細書に記載のコンストラクトをコードするポリヌクレオチド）に加えて、本明細書に記載の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持することができる。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、または所望のタンパク質の発現レベルの因子に依存し得る。例えば、哺乳類宿主細胞発現の好適な制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスのエレメントが含まれる。ウイルス調節エレメントおよびその配列は、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，５１０，２４５号、および米国特許第４，９６８，６１５号に詳細に記載されており、それぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本明細書に記載の組換え発現ベクターは、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子などの追加の配列を担持してもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ブラスチシジン、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの細胞毒性薬に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に付与する。好適な選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うＤＨＦＲ”宿主細胞で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。ＴＮＦＲ２抗体またはＴＮＦＲ２抗体断片の軽鎖および重鎖を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（複数可）を、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
改変されたアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本開示の組成物および方法を使用して、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、所与のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドから１つ以上のＣＤＲを生殖細胞系抗体配列、例えばヒトまたはヒト化抗体を発生させる場合のヒト生殖細胞系抗体配列に導入することにより、産生され得る。例として、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ（配列番号２～４および１０～１３に記載される）の１つ以上または全て、あるいはＣＤＲの１つ以上または全てがＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列と比較して、１つ以上（例えば、３つまで）のアミノ酸置換（例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換）を含む、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上または全てを含み得る。任意選択で、ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、ＣＤＲ－Ｈ１とＣＤＲ－Ｈ２との間に位置するフレームワーク領域など、ＴＮＦＲＡＧ１のものと比較して１つ以上のフレームワーク領域における相違を特徴とすることができる。例えば、ＴＮＦＲＡＧ１の１つ以上のフレームワーク領域は、ヒト抗体のフレームワーク領域で置換され得る。例示的なフレームワーク領域には、例えば、ＵＳ７，８２９，０８６に記載されているヒトフレームワーク領域、およびＥＰ１９４５６６８に記載されている霊長類フレームワーク領域が含まれ、各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。このようなＴＮＦＲ２抗体をコードする核酸を生成するために、例えば、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の少なくとも一方または両方をコードするＤＮＡ断片を化学合成（例えば、固相ポリヌクレオチド合成技術）によって、インビトロ遺伝子増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応技術による）、または宿主生物におけるポリヌクレオチドの複製によって、生成することができる。
本開示の組成物および方法を使用して、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、所与のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドから１つ以上のＣＤＲを生殖細胞系抗体配列、例えばヒトまたはヒト化抗体を発生させる場合のヒト生殖細胞系抗体配列に導入することにより、産生され得る。例として、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ（配列番号２～４および１０～１３に記載される）の１つ以上または全て、あるいはＣＤＲの１つ以上または全てがＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列と比較して、１つ以上（例えば、３つまで）のアミノ酸置換（例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換）を含む、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上または全てを含み得る。任意選択で、ＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチドは、ＣＤＲ－Ｈ１とＣＤＲ－Ｈ２との間に位置するフレームワーク領域など、ＴＮＦＲＡＧ１のものと比較して１つ以上のフレームワーク領域における相違を特徴とすることができる。例えば、ＴＮＦＲＡＧ１の１つ以上のフレームワーク領域は、ヒト抗体のフレームワーク領域で置換され得る。例示的なフレームワーク領域には、例えば、ＵＳ７，８２９，０８６に記載されているヒトフレームワーク領域、およびＥＰ１９４５６６８に記載されている霊長類フレームワーク領域が含まれ、各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。このようなＴＮＦＲ２抗体をコードする核酸を生成するために、例えば、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の少なくとも一方または両方をコードするＤＮＡ断片を化学合成（例えば、固相ポリヌクレオチド合成技術）によって、インビトロ遺伝子増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応技術による）、または宿主生物におけるポリヌクレオチドの複製によって、生成することができる。
いくつかの実施形態では、ヒト化アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＣＤＲ配列の１つ以上または全てが、ＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ配列と比較して、１つ以上（例えば、３つまで）のアミノ酸置換（例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換）を含む、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上または全てを含み得る。これは、例えば、生殖細胞系ＤＮＡまたはｃＤＮＡの部位特異的変異導入を行い、確立された手順に従ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、得られたポリヌクレオチドを増幅することによって達成することができる。ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、当該技術分野で知られている（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖系列配列データベースを参照されたい。Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８，１９９２、およびＣｏｘ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６，１９９４も参照でき、参照により本明細書に組み込まれる）。ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲまたは上述の類似配列の１つ以上、または全てを含むヒト重鎖および軽鎖可変領域をコードするキメラ核酸コンストラクトは、例えば、当該技術分野で既知の確立されたクローニング技術を使用して生成することができる。追加的に、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲまたは上述の同様の配列の１つ以上を含む重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを合成し、変異導入のテンプレートとして使用して、通常の変異導入技術を使用して本明細書に記載のバリアントを生成することができる。代替的に、バリアントをコードするＤＮＡ断片を直接合成することができる（例えば、確立された固相核酸化学合成手順によって）。
ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列の１つ以上、または全てを含むＶＨセグメントをコードするＤＮＡ断片を、標準の組換えＤＮＡ技術によってさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長の抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、例えば、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および任意選択でＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより、全長重鎖遺伝子（およびＦａｂ重鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得、特定の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１ドメインのみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１）を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、例えば、原核細胞または真核細胞におけるこれらの領域をコードするポリヌクレオチドの増幅、ＰＣＲ増幅、または化学的ポリヌクレオチド合成によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）定常領域であり得るが、特定の実施形態では、カッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作成するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、柔軟なリンカーをコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３などの柔軟な親水性アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結して、ＶＨおよびＶＬ配列が、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカーによって結合された連続した単鎖タンパク質として発現できるようにされる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３，１９８８、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４，１９９０を参照されたい）。
組換えＤＮＡ技術を使用して、ＴＮＦＲ２への結合に必要のない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部または全てを除去することもできる。このような短縮されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本明細書に記載の抗体に包含される。加えて、一方の重鎖が、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲまたは上述の同様のＣＤＲ配列の１つ以上または全てを含み、他方の重鎖および／または軽鎖がＴＮＦＲ２以外の特定の抗原に特異的である二機能性抗体を生成することができる。そのような抗体は、例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲまたは上述の同様のＣＤＲ配列の１つ以上、または全てを含む重鎖および軽鎖を、例えば、標準的な化学架橋法を使用して（例えば、ジスルフィド結合形成によって）異なる抗原に特異的である二次抗体の重鎖および軽鎖に架橋することによって生成することができる。二機能性抗体は、二機能性抗体をコードするように操作された核酸分子を原核細胞または真核細胞で発現させることによっても作製することができる。
二重特異性抗体、すなわち、同じ結合部位を使用してＴＮＦＲ２と異なる抗原とに結合する抗体は、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲのアミノ酸残基を変異させることによって生成できる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位の周辺にあるアミノ酸残基を変異させることにより、ＴＮＦＲ２と第２の細胞表面受容体などの２つの抗原に結合する二重特異性抗体を生成することができる（Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０－１６１４，２００９）。二重特異性抗体をコードするように操作されたポリヌクレオチドを発現させることにより、二重機能性抗体を作製することができる。
本明細書に記載の改変アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体および抗体断片は、化学合成によっても生成することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４ Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１に記載されている方法によって）。無細胞合成プラットフォームを使用してバリアント抗体を生成することもできる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ Ｎｏ．２，２００１（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を参照されたい）。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの発現のための宿主細胞
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原その結合断片、およびそのコンストラクト）を、原核生物または真核生物の宿主細胞で発現することが可能である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）の発現は、適切にフォールディングされた免疫学的に活性な抗体の最適な分泌のために、哺乳動物宿主細胞などの真核細胞で行われる。本明細書に記載の組換え抗体またはその抗原結合断片を発現するための例示的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載される、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１）に記載のＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＳＰ２／０細胞が含まれる。抗体およびその断片の発現に有用である可能性のある追加の細胞型には、確立されたプロトコールに従って外来ＤＮＡを含むベクターで形質転換できるＢＬ－２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの細菌細胞が含まれる。抗体の発現に有用である可能性のある追加の真核細胞には、酵母細胞、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの栄養要求性株が含まれ、これは当該技術分野で既知の確立された手順に従って不完全培地で形質転換および選択的に増殖させることができる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類の宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞での抗体の発現またはそれらが増殖する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原その結合断片、およびそのコンストラクト）を、原核生物または真核生物の宿主細胞で発現することが可能である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片）の発現は、適切にフォールディングされた免疫学的に活性な抗体の最適な分泌のために、哺乳動物宿主細胞などの真核細胞で行われる。本明細書に記載の組換え抗体またはその抗原結合断片を発現するための例示的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載される、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１）に記載のＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＳＰ２／０細胞が含まれる。抗体およびその断片の発現に有用である可能性のある追加の細胞型には、確立されたプロトコールに従って外来ＤＮＡを含むベクターで形質転換できるＢＬ－２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの細菌細胞が含まれる。抗体の発現に有用である可能性のある追加の真核細胞には、酵母細胞、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの栄養要求性株が含まれ、これは当該技術分野で既知の確立された手順に従って不完全培地で形質転換および選択的に増殖させることができる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類の宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞での抗体の発現またはそれらが増殖する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。
ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収できる。宿主細胞を使用して、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子などのインタクトな抗体の一部を生成することもできる。また、本明細書には、当該技術分野で既知の確立されたプロトコールに従って上記手順が変更される方法が含まれる。例えば、抗体の抗原結合断片を生成するために、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（しかし両方ではない）をコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましい場合がある。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）が組換え発現によって生成されたら、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡまたはプロテインＧ選択後のＴＮＦＲ２に対するアフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはその他の標準的なタンパク質の精製のための技術のような当該技術分野で既知の任意の方法によって精製することができる。さらに、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはその断片は、精製を促進するために、または治療用コンジュゲートを生成するために、本明細書に記載の、または当該技術分野で既知の異種ポリペプチド配列に融合することができる。
単離された後、アゴニスト性ＴＮＦＲ２単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトは、必要に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィー（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０）；ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を参照されたい、またはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などでのゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを生成および親和性成熟させるためのプラットフォーム
受容体アゴニズム作用を促進するＴＮＦＲ２のエピトープのマッピング
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）は、受容体阻害よりもむしろ受容体アゴニズムを選択的に促進するＴＮＦＲ２内のエピトープに結合できる機能分子について、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）のライブラリーをスクリーニングすることによって生成することができる。そのようなエピトープは、抗体またはその抗原結合断片を、ＴＮＦＲ２内の所望のエピトープに対応する残基を含む一連の直線状または環状ペプチドに対してスクリーニングすることによってモデル化することができる。
受容体アゴニズム作用を促進するＴＮＦＲ２のエピトープのマッピング
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）は、受容体阻害よりもむしろ受容体アゴニズムを選択的に促進するＴＮＦＲ２内のエピトープに結合できる機能分子について、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）のライブラリーをスクリーニングすることによって生成することができる。そのようなエピトープは、抗体またはその抗原結合断片を、ＴＮＦＲ２内の所望のエピトープに対応する残基を含む一連の直線状または環状ペプチドに対してスクリーニングすることによってモデル化することができる。
例として、受容体アゴニズムを促進するＴＮＦＲ２から単離された個々の断片を含むペプチドは、本明細書に記載されているか、または当該技術分野で既知のペプチド合成技術によって合成することができる。これらのペプチドを固体表面に固定し、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）に結合する分子を例えば、確立された手順を使用したＥＬＩＳＡベースのスクリーニングプラットフォームを使用してスクリーニングできる。このアッセイを使用すると、例えば、高親和性でＴＮＦＲＡＧ１に特異的に結合するペプチドは、したがって、これらの抗体に優先的に結合するＴＮＦＲ２のエピトープ内の残基を含む。この方法で同定されたペプチドは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを同定するために、ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド断片、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）のライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。さらに、これらのペプチドは受容体アゴニズムを促進するＴＮＦＲ２内のエピトープの代理として機能するため、このスクリーニング技術を使用して生成されたポリペプチドは、ＴＮＦＲ２の対応するエピトープに結合する可能性があり、受容体活性のアゴニスト性が期待される。
アゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドのライブラリーのスクリーニング
ＴＮＦＲ２内のエピトープ（例えば、配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２）に結合できる分子のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗体断片、またはそのコンストラクト）のライブラリーのハイスループットスクリーニングには、非限定的に、１）ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびｃＤＮＡディスプレイを含む。生物学的に関連する分子に結合するリガンドを単離するためのファージディスプレイの使用は、例えば、Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．１：１４９－１８３，１９９５）、Ｋａｔｚ（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７－４５，１９９７）、およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１－２０，１９９８）で総説されている。いくつかのランダム化されたコンビナトリアルペプチドライブラリーが構築され、細胞表面受容体やＤＮＡなどの異なる標的に結合するポリペプチドを選択する（Ｋａｙ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｄｅｓ．２，２５１－２６８，１９９５）、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．１：１３９－１４０，１９９６によって総説される）。タンパク質および多量体タンパク質は、機能分子としてファージディスプレイに成功している（ＥＰ０３４９５７８Ａ、ＥＰ４５２７８３９Ａ、ＥＰ０５８９８７７Ａ、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，８０－８４ １９９２）を参照されたい）。加えて、機能的な抗体断片（例えば、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖ［ｓｃＦｖ］が発現されている（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－ ５５４，１９９０）、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８－７９８２，１９９１）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８，１９９１））。これらの参照文献は参照によりその全体が本明細書によって組み込まれる。
ＴＮＦＲ２内のエピトープ（例えば、配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２）に結合できる分子のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗体断片、またはそのコンストラクト）のライブラリーのハイスループットスクリーニングには、非限定的に、１）ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびｃＤＮＡディスプレイを含む。生物学的に関連する分子に結合するリガンドを単離するためのファージディスプレイの使用は、例えば、Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．１：１４９－１８３，１９９５）、Ｋａｔｚ（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７－４５，１９９７）、およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１－２０，１９９８）で総説されている。いくつかのランダム化されたコンビナトリアルペプチドライブラリーが構築され、細胞表面受容体やＤＮＡなどの異なる標的に結合するポリペプチドを選択する（Ｋａｙ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｄｅｓ．２，２５１－２６８，１９９５）、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．１：１３９－１４０，１９９６によって総説される）。タンパク質および多量体タンパク質は、機能分子としてファージディスプレイに成功している（ＥＰ０３４９５７８Ａ、ＥＰ４５２７８３９Ａ、ＥＰ０５８９８７７Ａ、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，８０－８４ １９９２）を参照されたい）。加えて、機能的な抗体断片（例えば、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖ［ｓｃＦｖ］が発現されている（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－ ５５４，１９９０）、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８－７９８２，１９９１）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８，１９９１））。これらの参照文献は参照によりその全体が本明細書によって組み込まれる。
（ｉ）ファージディスプレイ技術
例として、受容体の活性化を促進するＴＮＦＲ２内のエピトープを含む環状または多環状ペプチドに結合できる機能分子について、ポリペプチドのライブラリー（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）をスクリーニングするために、ファージディスプレイ技術を使用できる（例えば、配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２）。例えば、ｓｃＦｖ断片などの単鎖抗体断片をコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、確立された手順（例えば、固相ポリヌクレオチド合成またはエラーが発生しやすいＰＣＲ技法、参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣｕｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６３４：１０３－１０９，２０１０）を参照されたい）を使用して得ることができる。これらのランダム化ポリヌクレオチドは、これらの遺伝子によってコードされるランダム化抗体鎖が、例えば、抗体鎖とコートタンパク質（例えば、Ｍ１３ファージの表面上のｐＩＩＩコートタンパク質）との間の共有結合によって、繊維状ファージの表面に発現するように、ウイルスゲノムに組み込むことができる。これにより、抗体鎖の遺伝子型と表現型の間に物理的なつながりをもたらす。このようにして、超可変領域にランダム変異を含む多様な抗体鎖を提示するファージのライブラリーを、外部抗体鎖が確立された手順を使用して表面に固定化されたＴＮＦＲ２エピトープ（例えば、配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２）に結合する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、そのようなペプチドは、ペプチドとエピトープタグ（例えば、ビオチン）との間で共有結合を形成し、事前にペプチドに付着したタグに高い親和性で結合する相補的タグ（例えば、アビジン）によってコートされたマイクロタイタープレートのウェル内でペプチドをインキュベートすることにより、マイクロタイタープレートの表面に物理的に結合させることができる。好適なエピトープタグには、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、ビオチン、ストレプトアビジンが含まれるが、これらに限定されない。これらの分子によって提示されるエピ
トープを含むペプチドは、それぞれ、マルトース、グルタチオン、ニッケル含有複合体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体、ストレプトアビジン、またはビオチンなどの相補的分子を含む表面上に固定化することができる。このように、ファージは、固定化されたＴＮＦＲ２由来ペプチドを含む表面と、拘束されたペプチドへの抗体の結合を可能にするのに適した時間、適切な緩衝液系（例えば、生理的塩濃度、イオン強度を含み、および緩衝剤によって生理学的ｐＨに維持されるもの）の存在下でインキュベートすることができる。次に、表面を洗浄して（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で）、特定の閾値を超える親和性でＴＮＦＲ２由来ペプチドと相互作用する抗体鎖を提示しないファージを除去する。
例として、受容体の活性化を促進するＴＮＦＲ２内のエピトープを含む環状または多環状ペプチドに結合できる機能分子について、ポリペプチドのライブラリー（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびコンストラクト）をスクリーニングするために、ファージディスプレイ技術を使用できる（例えば、配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２）。例えば、ｓｃＦｖ断片などの単鎖抗体断片をコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、確立された手順（例えば、固相ポリヌクレオチド合成またはエラーが発生しやすいＰＣＲ技法、参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣｕｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６３４：１０３－１０９，２０１０）を参照されたい）を使用して得ることができる。これらのランダム化ポリヌクレオチドは、これらの遺伝子によってコードされるランダム化抗体鎖が、例えば、抗体鎖とコートタンパク質（例えば、Ｍ１３ファージの表面上のｐＩＩＩコートタンパク質）との間の共有結合によって、繊維状ファージの表面に発現するように、ウイルスゲノムに組み込むことができる。これにより、抗体鎖の遺伝子型と表現型の間に物理的なつながりをもたらす。このようにして、超可変領域にランダム変異を含む多様な抗体鎖を提示するファージのライブラリーを、外部抗体鎖が確立された手順を使用して表面に固定化されたＴＮＦＲ２エピトープ（例えば、配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２）に結合する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、そのようなペプチドは、ペプチドとエピトープタグ（例えば、ビオチン）との間で共有結合を形成し、事前にペプチドに付着したタグに高い親和性で結合する相補的タグ（例えば、アビジン）によってコートされたマイクロタイタープレートのウェル内でペプチドをインキュベートすることにより、マイクロタイタープレートの表面に物理的に結合させることができる。好適なエピトープタグには、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、ビオチン、ストレプトアビジンが含まれるが、これらに限定されない。これらの分子によって提示されるエピ
トープを含むペプチドは、それぞれ、マルトース、グルタチオン、ニッケル含有複合体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体、ストレプトアビジン、またはビオチンなどの相補的分子を含む表面上に固定化することができる。このように、ファージは、固定化されたＴＮＦＲ２由来ペプチドを含む表面と、拘束されたペプチドへの抗体の結合を可能にするのに適した時間、適切な緩衝液系（例えば、生理的塩濃度、イオン強度を含み、および緩衝剤によって生理学的ｐＨに維持されるもの）の存在下でインキュベートすることができる。次に、表面を洗浄して（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液で）、特定の閾値を超える親和性でＴＮＦＲ２由来ペプチドと相互作用する抗体鎖を提示しないファージを除去する。
この最初のパニング（つまり、スクリーニング）ステップの後に残るポリペプチドの親和性は、洗浄ステップの条件を調整することによって（例えば、弱酸性または塩基性成分を含めることによって、または抗原結合部位について固定化ペプチドと競合するために他のＴＮＦＲ２由来ペプチドを低濃度で含めることによって）調整することができる。このようにして、洗浄ステップ後にマイクロタイタープレートの表面に結合したままのファージの集団は、受容体の活性化を促進するＴＮＦＲ２由来のペプチドエピトープに結合するファージが濃縮されている。残りのファージは、タンパク質間相互作用の強度を低下させてこれらのペプチドを含む表面からファージを溶出することによって（例えば、周囲のｐＨ、イオン強度、または温度を変更することによって）増幅することができる。次いで、単離されたファージを、例えば細菌細胞に感染させることによって増幅することができ、得られたファージは、より高親和性のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを保有するファージの集団をさらに濃縮するために、スクリーニングの追加の反復によるパニングに任意選択で供することができる。これらのパニング段階に続いて、高親和性抗体またはその抗原結合断片を表示するファージを単離し、コードされた抗体のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するために、これらのファージのゲノムを配列決定することができる。このようなファージディスプレイ技術は、例えば、ＴＮＦＲ２のアゴニストとして使用できる本明細書に記載のｓｃＦｖ断片、タンデムｓｃＦｖ断片、および他の抗原結合断片などの抗体鎖を生成するために使用することができる。特定の抗原に高い親和性で結合する抗体鎖およびその抗原結合断片を同定するための例示的なファージディスプレイプロトコールは十分に確立されており、例えば、米国特許第７，８４６，８９２号、ＷＯ１９９７／００２３４２、米国特許第８，８４６，８６７号、およびＷＯ２００７／１３２９１７に記載され、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。同様のファージディスプレイ技術を使用して、受容体活性化を促進するＴＮＦＲ２内のエピトープ（例えば、配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２）に結合する、本明細書に記載の抗体様足場（例えば、１０Ｆｎ３ドメイン）を生成す
ることができる。抗体様足場タンパク質の同定のための例示的なファージディスプレイプロトコールは、例えば、ＷＯ２００９／０８６１１６に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
ることができる。抗体様足場タンパク質の同定のための例示的なファージディスプレイプロトコールは、例えば、ＷＯ２００９／０８６１１６に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
（ｉｉ）細胞ベースのディスプレイ技術
溶媒にさらされたポリペプチドの遺伝子型と表現型の間の連鎖を利用する他のインビトロディスプレイ技術には、酵母および細菌ディスプレイが含まれる。酵母ディスプレイ技術は当該技術分野で確立されており、個々の酵母細胞の表面に大量の抗体（多くの場合３０，０００個まで）を提示できるという点で利点がある（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．１５：５５３，１９９７）を参照されたい）。フローサイトメトリーを使用して酵母のライブラリーを分析および選別できるため、繊維状ファージよりも大きなサイズの酵母細胞により、追加のスクリーニング戦略が可能になる。例えば、確立された手順を使用して、ランダム化された超可変領域を含むポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）を発現する細菌細胞または酵母細胞のライブラリーを生成することができる（例えば、各々の教示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４９，５０１およびＵＳ２０１３／００８５０７２を参照されたい）。例えば、ナイーブなｓｃＦｖ断片をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母細胞の大きなライブラリーは、確立された手順を使用して作成することができる（参照により本明細書に組み込まれるｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：３９７，１９９９）。これらのポリヌクレオチドを発現する酵母細胞は、パニングステップ中に２つの異なる蛍光分子とインキュベートできます。１つは抗体内の保存された残基に結合し、表示される抗体の量を反映し、別の色素は異なる波長で蛍光を発し、抗原に結合し、したがって、結合した抗原の量を示す。例えば、当業者は、任意選択で、ペプチドのＮ末端またはＣ末端、または抗体－抗原結合を妨害すると予想されない残基で、エピトープタグ（例えば、ビオチン）に結合された配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２を含むＴＮＦＲ２由来ペプチドを使用することができる。これにより、相補的なタグ（例えば、アビジン）で標識された蛍光色素が抗体－抗原複合体に局在化できる。これにより、選択の進行状況に関する優れた柔軟性と即時のフィードバックが得られる。ファージディスプレイとは対照的に、抗体ディスプレイレベルに正規化することにより、より高い発現レベルではなく、より高い親和性を持つ抗体を簡単に選択できる。実際、アフィニティーが２倍のみ異なる抗体を区別して分類することが可能である（ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １６：３１，２０００））。
溶媒にさらされたポリペプチドの遺伝子型と表現型の間の連鎖を利用する他のインビトロディスプレイ技術には、酵母および細菌ディスプレイが含まれる。酵母ディスプレイ技術は当該技術分野で確立されており、個々の酵母細胞の表面に大量の抗体（多くの場合３０，０００個まで）を提示できるという点で利点がある（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．１５：５５３，１９９７）を参照されたい）。フローサイトメトリーを使用して酵母のライブラリーを分析および選別できるため、繊維状ファージよりも大きなサイズの酵母細胞により、追加のスクリーニング戦略が可能になる。例えば、確立された手順を使用して、ランダム化された超可変領域を含むポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）を発現する細菌細胞または酵母細胞のライブラリーを生成することができる（例えば、各々の教示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４９，５０１およびＵＳ２０１３／００８５０７２を参照されたい）。例えば、ナイーブなｓｃＦｖ断片をコードするポリヌクレオチドを発現する酵母細胞の大きなライブラリーは、確立された手順を使用して作成することができる（参照により本明細書に組み込まれるｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：３９７，１９９９）。これらのポリヌクレオチドを発現する酵母細胞は、パニングステップ中に２つの異なる蛍光分子とインキュベートできます。１つは抗体内の保存された残基に結合し、表示される抗体の量を反映し、別の色素は異なる波長で蛍光を発し、抗原に結合し、したがって、結合した抗原の量を示す。例えば、当業者は、任意選択で、ペプチドのＮ末端またはＣ末端、または抗体－抗原結合を妨害すると予想されない残基で、エピトープタグ（例えば、ビオチン）に結合された配列番号１のアミノ酸５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２を含むＴＮＦＲ２由来ペプチドを使用することができる。これにより、相補的なタグ（例えば、アビジン）で標識された蛍光色素が抗体－抗原複合体に局在化できる。これにより、選択の進行状況に関する優れた柔軟性と即時のフィードバックが得られる。ファージディスプレイとは対照的に、抗体ディスプレイレベルに正規化することにより、より高い発現レベルではなく、より高い親和性を持つ抗体を簡単に選択できる。実際、アフィニティーが２倍のみ異なる抗体を区別して分類することが可能である（ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １６：３１，２０００））。
（ｉｉｉ）ヌクレオチドディスプレイ技術
ランダム化ポリヌクレオチドライブラリーのインビトロ翻訳を利用するディスプレイ技術も、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを生成する強力なアプローチを提供する。例えば、指定された超可変領域内に変異を含むポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）をコードするランダム化ＤＮＡライブラリーは、例えば、本明細書に記載の確立されたＰＣＲベースの変異導入技術を使用して得ることができる。これらのライブラリーのポリヌクレオチドは、プロモーターや転写終結配列などの転写調節配列を含むことができ、追加的に結果として生じるｍＲＮＡコンストラクトの翻訳速度を高める配列（例えば、ＩＲＥＳ配列、５’および３’ＵＴＲ、ポリ－アデニル化ｔｒａｃｔなど）をコードすることがでる。これらのポリヌクレオチドライブラリーは、ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む適切な緩衝液中でインキュベートすることで、ＤＮＡ配列をコンピテントなｍＲＮＡ分子に転写し、その後、溶液中に存在するリボソーム大サブユニット、およびリボソーム小サブユニット、アミノアシルｔＲＮＡ分子、ならびに翻訳開始因子および伸長因子によって翻訳することができる（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）インビトロタンパク質合成キット、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ（登録商標）を使用）。設計されたｍＲＮＡ改変により、抗体生成物はピューロマイシンへの化学結合によりｍＲＮＡテンプレートに共有結合したままになる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｅｆｅ（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４，Ｕｎｉｔ ２４．５，２００１）を参照されたい）。したがって、この遺伝子型－表現型連結は、ｍＲＮＡ：抗体融合コンストラクトを表面に固定化されたペプチドとインキュベートし、ファージディスプレイ技術と同様の方法でパニングすることにより、ＴＮＦＲ２由来ペプチドに結合する抗体を選択するために使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０７２７７３を参照されたい）。
ランダム化ポリヌクレオチドライブラリーのインビトロ翻訳を利用するディスプレイ技術も、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを生成する強力なアプローチを提供する。例えば、指定された超可変領域内に変異を含むポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）をコードするランダム化ＤＮＡライブラリーは、例えば、本明細書に記載の確立されたＰＣＲベースの変異導入技術を使用して得ることができる。これらのライブラリーのポリヌクレオチドは、プロモーターや転写終結配列などの転写調節配列を含むことができ、追加的に結果として生じるｍＲＮＡコンストラクトの翻訳速度を高める配列（例えば、ＩＲＥＳ配列、５’および３’ＵＴＲ、ポリ－アデニル化ｔｒａｃｔなど）をコードすることがでる。これらのポリヌクレオチドライブラリーは、ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む適切な緩衝液中でインキュベートすることで、ＤＮＡ配列をコンピテントなｍＲＮＡ分子に転写し、その後、溶液中に存在するリボソーム大サブユニット、およびリボソーム小サブユニット、アミノアシルｔＲＮＡ分子、ならびに翻訳開始因子および伸長因子によって翻訳することができる（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）インビトロタンパク質合成キット、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ（登録商標）を使用）。設計されたｍＲＮＡ改変により、抗体生成物はピューロマイシンへの化学結合によりｍＲＮＡテンプレートに共有結合したままになる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｅｆｅ（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４，Ｕｎｉｔ ２４．５，２００１）を参照されたい）。したがって、この遺伝子型－表現型連結は、ｍＲＮＡ：抗体融合コンストラクトを表面に固定化されたペプチドとインキュベートし、ファージディスプレイ技術と同様の方法でパニングすることにより、ＴＮＦＲ２由来ペプチドに結合する抗体を選択するために使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０７２７７３を参照されたい）。
任意選択で、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）は、抗体生成物がピューロマイシンリンカーを介して共有結合するのではなく、リボソーム－ｍＲＮＡ複合体に非共有結合できることを除いて、同様の手法を使用して生成することができる。リボソームディスプレイとして知られるこのプラットフォームは、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５５７号に記載される。代替的に、ｍＲＮＡではなくｃＤＮＡがピューロマイシンリンカーを介して抗体生成物に共有結合することを除いて、ｍＲＮＡディスプレイに類似した技術であるｃＤＮＡディスプレイを使用して抗体を生成することができる。ｃＤＮＡディスプレイ技術は、特にＴＮＦＲ２由来ペプチドに対する高い親和性を有する抗体をスクリーニングするために環境の塩濃度、イオン強度、ｐＨ、および／または温度が調整された条件など、増加する厳しい条件下でパニングステップを実行できるという利点を提供できる。これは、一本鎖ｍＲＮＡよりも二本鎖ｃＤＮＡの方が自然な安定性が高いためである。ｃＤＮＡディスプレイスクリーニング技術は、例えば参照により本明細書に組み込まれる、Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８０５：１１３－１３５，２０１２）に記載される。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）の生成に加えて、インビトロディスプレイ技術（例えば、本明細書に記載のものおよび当該技術分野で既知のもの）も本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの親和性の改善方法を提供する。例えば、完全にランダム化された超可変領域を含む抗体およびその断片のライブラリーをスクリーニングするのではなく、超可変領域内の特定の部位での標的化された変異を特徴とする抗体およびその抗原結合断片のより狭いライブラリーをスクリーニングすることができる。これは、例えば、超可変領域内の特定の部位でのみランダム変異をコードする抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを組み立てることによって達成することができる。これらのポリヌクレオチドは、次いで、結合親和性が改善されたＴＮＦＲ２エピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングするために、例えば、繊維状ファージ、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞で、またはインビトロで、例えば、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、またはｃＤＮＡディスプレイ技術を使用して発現させることができる。例えば、酵母ディスプレイは親和性成熟によく適していて、以前は単鎖抗体の親和性を４８ｆＭのＫＤまで改善するために使用されてきた（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１０７０１，２０００））。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）の生成および親和性成熟に使用できる追加のインビトロ技術には、ＴＮＦＲ２由来ペプチドに特異的に結合できる機能性分子のための、抗体またはその抗原結合断片のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングが含まれる。コンビナトリアル抗体ライブラリーは、例えば、真核細胞または原核細胞における抗体またはその抗原結合断片のランダム化超可変領域をコードするポリヌクレオチドの発現によって得ることができる。これは、例えば、本明細書に記載されているか、または当該技術分野で既知の遺伝子発現技術を使用して達成することができる。抗体の不均質混合物は、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ選択、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、および／またはタンパク質精製のためのその他の標準技術によって精製できる。このようにして得られたコンビナトリアルライブラリーのライブラリーは、例えば、これらの抗体の不均質混合物を、抗体と抗原の結合を可能にするのに十分な時間、表面に固定化されたＴＮＦＲ２に由来するペプチドとインキュベートすることによってスクリーニングできる。非結合抗体またはその断片は、適切な緩衝液（例えば、生理学的ｐＨ（約７．４）で緩衝され、生理学的塩濃度およびイオン強度を含み、任意選択でＴＷＥＥＮ－２０などの界面活性剤を含む溶液）で表面を洗浄することによって除去できる。結合したままの抗体は、その後、例えばＥＬＩＳＡベースの検出プロトコールを使用して検出することができる（例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６６１，４４５号を参照されたい）。
ＴＮＦＲ２由来ペプチドに特異的に結合するポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、抗原その結合断片、およびそのコンストラクト）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための追加の手法には、抗体断片の１ビーズ１化合物ライブラリーのスクリーニングが含まれる。抗体断片は、各ビーズが単一の抗体断片を提示するように、親水性で水膨潤性の材料で構成された固体ビーズ上で化学的に合成できる（例えば、確立されたスプリットアンドプール固相ペプチド合成プロトコールを使用）。次に、不均質なビーズ混合物を、検出可能な部分（例えば、蛍光色素）で任意選択で標識されているか、または後で相補的なタグ（例えば、それぞれアビジン、ビオチン、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＨＡ抗体）で処理することによって検出できるエピトープタグ（例えば、ビオチン、アビジン、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ）にコンジュゲートされているＴＮＦＲ２由来ペプチドとインキュベートすることができる。ＴＮＦＲ２由来ペプチドに特異的に結合する抗体断片を含むビーズは、蛍光標識抗原または相補的タグとのインキュベーション後のビーズの蛍光特性を分析することによって識別できる（例えば、共焦点蛍光顕微鏡法または蛍光活性化ビーズソーティングによって、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１６５００－１６５０５，１９９６）を参照されたい）。したがって、ＴＮＦＲ２由来ペプチドに特異的に結合する抗体断片を含むビーズは、高親和性抗体断片を含まないビーズから分離することができる。ＴＮＦＲ２由来ペプチドに特異的に結合する抗体断片の配列は、例えばエドマン分解、タンデム質量分析、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および２Ｄゲル電気泳動を含む、当該技術分野で既知の技術によって決定できる（例えば、その各々の開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０６２５５３を参照されたい）。
ポリペプチドのネガティブスクリーニング
受容体の活性化を促進するヒトＴＮＦＲ２に由来するエピトープに特異的に結合する単鎖ポリペプチド、抗体、または抗体断片をスクリーニングするための上述の方法に加えて、ＫＣＲＰＧ配列などの受容体アンタゴニスト作用を促進するエピトープにも結合する可能性のある抗体または抗体断片を排除するためにネガティブスクリーニングを追加的に実行することができる。これは、上述の方法またはその変形のいずれかを使用して、例えば、スクリーニングされる抗体または抗体断片がアゴニスト性ＴＮＦＲ２活性を有すると以前に同定されたものであるようにして、達成することができる。ネガティブスクリーニングに有用な技術の例としては、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ｃＤＮＡディスプレイ、または表面ベースのコンビナトリアルライブラリースクリーニニング（例えば、ＥＬＩＳＡフォーマット）が挙げられる。このスクリーニング技術は、ＫＣＲＰＧ配列を含むＴＮＦＲ２エピトープに結合できる抗体または抗体断片として、アゴニスト活性を欠くか、または著しく低下させるため、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体または抗体断片を同定するための有用な戦略を表す。
受容体の活性化を促進するヒトＴＮＦＲ２に由来するエピトープに特異的に結合する単鎖ポリペプチド、抗体、または抗体断片をスクリーニングするための上述の方法に加えて、ＫＣＲＰＧ配列などの受容体アンタゴニスト作用を促進するエピトープにも結合する可能性のある抗体または抗体断片を排除するためにネガティブスクリーニングを追加的に実行することができる。これは、上述の方法またはその変形のいずれかを使用して、例えば、スクリーニングされる抗体または抗体断片がアゴニスト性ＴＮＦＲ２活性を有すると以前に同定されたものであるようにして、達成することができる。ネガティブスクリーニングに有用な技術の例としては、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ｃＤＮＡディスプレイ、または表面ベースのコンビナトリアルライブラリースクリーニニング（例えば、ＥＬＩＳＡフォーマット）が挙げられる。このスクリーニング技術は、ＫＣＲＰＧ配列を含むＴＮＦＲ２エピトープに結合できる抗体または抗体断片として、アゴニスト活性を欠くか、または著しく低下させるため、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体または抗体断片を同定するための有用な戦略を表す。
非ヒト哺乳動物の免疫化
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその抗原結合断片を生成するために使用できる別の戦略には、非ヒト哺乳動物を免疫化することが含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその断片を産生するために免疫化することができる非ヒト哺乳動物の例には、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、およびヒツジ、ならびに非ヒト霊長類が含まれる。例えば、霊長類を免疫化する確立された手順は当該技術分野で知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９８６／６００４７８２を参照されたい）。免疫は、Ｂリンパ球の抗原特異性を利用してモノクローナル抗体を生成する堅牢な方法である。例えば、モノクローナル抗体は、ケーラー・ミルシュタイン法（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ０１１０７１６に記載されている）によって調製することができ、ここで、ペプチドで免疫化された非ヒト動物（例えば、霊長類）からの脾臓細胞が、受容体の活性化を促進するＴＮＦＲ２由来の抗原を提示する。免疫化によって産生されたクローン拡大されたＢリンパ球は、動物の血清から単離され、続いてハイブリドーマを形成するために骨髄腫細胞と融合することができる。ハイブリドーマは、これらの不死化細胞が抗原特異的抗体の持続的な供給を提供できるため、抗体産生に特に有用な主体である。そのようなハイブリドーマからの抗体は、その後、当該技術分野で既知の技術を使用して、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧなどの試薬を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養培地から抗体を精製することによって単離することができる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその抗原結合断片を生成するために使用できる別の戦略には、非ヒト哺乳動物を免疫化することが含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその断片を産生するために免疫化することができる非ヒト哺乳動物の例には、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、およびヒツジ、ならびに非ヒト霊長類が含まれる。例えば、霊長類を免疫化する確立された手順は当該技術分野で知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９８６／６００４７８２を参照されたい）。免疫は、Ｂリンパ球の抗原特異性を利用してモノクローナル抗体を生成する堅牢な方法である。例えば、モノクローナル抗体は、ケーラー・ミルシュタイン法（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ０１１０７１６に記載されている）によって調製することができ、ここで、ペプチドで免疫化された非ヒト動物（例えば、霊長類）からの脾臓細胞が、受容体の活性化を促進するＴＮＦＲ２由来の抗原を提示する。免疫化によって産生されたクローン拡大されたＢリンパ球は、動物の血清から単離され、続いてハイブリドーマを形成するために骨髄腫細胞と融合することができる。ハイブリドーマは、これらの不死化細胞が抗原特異的抗体の持続的な供給を提供できるため、抗体産生に特に有用な主体である。そのようなハイブリドーマからの抗体は、その後、当該技術分野で既知の技術を使用して、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧなどの試薬を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養培地から抗体を精製することによって単離することができる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドコンジュゲート
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）を哺乳動物対象（例えば、ヒト）に投与する前に、例えば、インビボでの抗体の活性を調節するために、抗体またはその断片を第二の分子にコンジュゲートするのが望ましい場合がある。アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその断片は、当該技術分野で周知の様々な確立されたコンジュゲーション戦略のいずれかを使用して、抗体の軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端のいずれかで他の分子にコンジュゲートすることができる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を別の分子に共有結合するために使用できる反応性官能基のペアの例には、チオールペア、カルボン酸およびアミノ基、ケトンおよびアミノ基、アルデヒドおよびアミノ基、チオールおよびα，β－不飽和部分（マレイミドまたはデヒドロアラニンなど）、チオールおよびα－ハロアミド、カルボン酸およびヒドラジド、アルデヒドおよびヒドラジド、ならびにケトンおよびヒドラジドが含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）を哺乳動物対象（例えば、ヒト）に投与する前に、例えば、インビボでの抗体の活性を調節するために、抗体またはその断片を第二の分子にコンジュゲートするのが望ましい場合がある。アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその断片は、当該技術分野で周知の様々な確立されたコンジュゲーション戦略のいずれかを使用して、抗体の軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端のいずれかで他の分子にコンジュゲートすることができる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を別の分子に共有結合するために使用できる反応性官能基のペアの例には、チオールペア、カルボン酸およびアミノ基、ケトンおよびアミノ基、アルデヒドおよびアミノ基、チオールおよびα，β－不飽和部分（マレイミドまたはデヒドロアラニンなど）、チオールおよびα－ハロアミド、カルボン酸およびヒドラジド、アルデヒドおよびヒドラジド、ならびにケトンおよびヒドラジドが含まれる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、記載されているように、化学結合によって別の分子に直接共有結合することができる。代替的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその断片を含む融合タンパク質は、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）から組換えにより発現され得る。これは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞の核ゲノムに組み込むことによって達成することができる（例えば、本明細書に記載されるまたは当該技術分野で既知の技法を使用して）。任意選択で、抗体とリンカーとの間に共有結合を形成することにより、本明細書に記載の抗体およびその断片を第２の分子に結合させることができる。次いで、このリンカーを別の分子にコンジュゲートするか、またはリンカーを別の分子にコンジュゲートしてから、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片に連結することができる。コンジュゲートの形成に使用できるリンカーの例には、天然または非天然アミノ酸を含むものなどのポリペプチドリンカーが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｄ－アミノ酸をリンカーに含めることが望ましい場合がる。これらの残基は天然に存在するタンパク質には存在せず、したがって内因性プロテアーゼによる分解に対してより耐性があるためある。ポリペプチドリンカーを含む融合タンパク質は、本明細書に記載されているような化学合成技術を使用して、または細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）における融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの組換え発現を通じて作成することができる。リンカーは、当該技術分野で周知の様々な戦略を使用して調製でき、リンカーの反応性成分に応じて、酵素加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、塩基性条件下での加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核開裂、または有機金属開裂によって切断することができる（Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０：５７１－５８２，２０１２）。
薬物－ポリペプチドコンジュゲート
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）は追加的に、自己免疫および／または炎症を治療するために使用される薬剤などの治療薬とコンジュゲートして、混合して、または別個に投与することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドに結合、混合、または別個に投与できる例示的な薬剤には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）が含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドにコンジュゲート、混合、または別個に投与することができる追加の薬剤には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば（ｉ）アセチルサリチル酸（アスピリン）を含むサリチル酸誘導体、ジフルニサル、およびスルファサラジン、（ｉｉ）アセトアミノフェンを含むパラアミノフェノール誘導体、（ｉｉｉ）メフェナム酸、メクロフェナム酸、およびフルフェナム酸を含むフェナメート、（ｉｖ）イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、およびオキサプロジンを含むプロピオン酸誘導体、ならびに（ｖ）ピロキシカムおよびテノキシカムを含むエノール酸（オキシカム）誘導体が含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドに結合、混合、または別個に投与できるさらなる薬剤には、グルココルチコイドが含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、追加的または代替的に、メトトレキサート、レフルノミド、金化合物、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、抗リウマチ薬、Ｄ－ペニシラミン、シクロスポリンなどの疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）とコンジュゲート、混合、または別個に投与することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとコンジュゲート、混合、または別個に投与できる追加の薬剤には、とりわけ、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、およびセルトリズマブペゴルが含まれる。本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドにコンジュゲート、混合、または別個に投与され得るさらなる薬剤は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８：４６０，２０１７に記載され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）は追加的に、自己免疫および／または炎症を治療するために使用される薬剤などの治療薬とコンジュゲートして、混合して、または別個に投与することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドに結合、混合、または別個に投与できる例示的な薬剤には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）が含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドにコンジュゲート、混合、または別個に投与することができる追加の薬剤には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば（ｉ）アセチルサリチル酸（アスピリン）を含むサリチル酸誘導体、ジフルニサル、およびスルファサラジン、（ｉｉ）アセトアミノフェンを含むパラアミノフェノール誘導体、（ｉｉｉ）メフェナム酸、メクロフェナム酸、およびフルフェナム酸を含むフェナメート、（ｉｖ）イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、およびオキサプロジンを含むプロピオン酸誘導体、ならびに（ｖ）ピロキシカムおよびテノキシカムを含むエノール酸（オキシカム）誘導体が含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドに結合、混合、または別個に投与できるさらなる薬剤には、グルココルチコイドが含まれる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、追加的または代替的に、メトトレキサート、レフルノミド、金化合物、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、抗リウマチ薬、Ｄ－ペニシラミン、シクロスポリンなどの疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）とコンジュゲート、混合、または別個に投与することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとコンジュゲート、混合、または別個に投与できる追加の薬剤には、とりわけ、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、およびセルトリズマブペゴルが含まれる。本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドにコンジュゲート、混合、または別個に投与され得るさらなる薬剤は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８：４６０，２０１７に記載され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＣＤ３０剤、アゴニスト性抗ＣＤ４０剤、アゴニスト性抗４－１ＢＢ剤、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ剤、アゴニスト性抗ＯＸ４０剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ剤、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質剤、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ剤、アゴニスト性抗ＭＥＫ剤、アゴニスト性抗ＣＤ３３剤、アゴニスト性抗ＣＤ２０剤、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ剤、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ剤、アゴニスト性抗ＣＤ５２剤、アゴニスト性抗Ａ３３剤、アゴニスト性抗ＧＤ３剤、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ剤、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １剤、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９剤、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ剤、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ剤、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４剤、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ１５５剤、アゴニスト性抗ＣＤ８０剤、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１６０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２８剤、アゴニスト性抗ＣＤ２２６剤、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１剤、アゴニスト性抗ＴＩＭ３剤、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９６剤、アゴニスト性抗ＣＤ７０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１３７剤、アゴニスト性抗ＤＲ４剤、アゴニスト性抗ＣＲ５剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１剤、アゴニスト性抗ＦＡＳ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９５剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ剤、アゴニスト性抗ＤＲ６剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ剤、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ剤、アゴニスト性抗ＯＰＧ剤、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ剤、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体剤、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ剤、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ剤、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ剤、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ剤などの免疫療法剤とコンジュゲートするか、混合するか、または別個に投与される。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ
－１剤、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤であってよい。
－１剤、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤であってよい。
いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＭＥＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ａ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＤ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１５５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１６０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２２６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１抗
体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合性断片、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。
体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。例えば、免疫療法剤は、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合性断片、またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。
いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、例えば、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７８、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０、ＣＤ１２１、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１８７、ＣＤ１８８、ＣＤ１８９、ＣＤ１９０、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤ１９８、ＣＤ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２、ＣＤ２０３、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０、ＣＤ２１１、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５、ＣＤ２３６、ＣＤ２３７、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５０、ＣＤ２５１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５５、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２５９、ＣＤ２６０、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８５、ＣＤ２８６、ＣＤ２８７、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９１、ＣＤ２９２、ＣＤ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０８、ＣＤ３０９、ＣＤ３１０、ＣＤ３１１、ＣＤ３１２、ＣＤ３１３、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、および／またはＣＤ３２０のうちの１つ以上に結合して活性を促進する抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、ケモカインまたはリンフォカインに結合する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。例えば、免疫療法剤は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ５のうちの１つ以上、または全てに結合して活性化する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、およびＣＣＬ２２のうちの１つ以上、または全てに結合して活性化する剤（例えば、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはそのコンストラクト）である。
標識されたＴＮＦＲ２ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトは、精製または検出の目的で別の分子（例えば、エピトープタグ）にコンジュゲートされる。タンパク質精製に有用なそのような分子の例には、第２の分子によって認識可能な構造的エピトープを提示する分子が含まれる。これは、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製で使用される一般的な戦略であり、分子が固体支持体に固定され、固定化された化合物に結合できる分子にコンジュゲートした標的タンパク質を含む不均質混合物にさらされる。分子認識の目的でアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドにコンジュゲートできるエピトープタグ分子の例には、非限定的に、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、ビオチン、ストレプトアビジンが含まれる。これらの分子によって提示されるエピトープを含むコンジュゲートは、それぞれ、マルトース、グルタチオン、ニッケル含有複合体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体、ストレプトアビジン、またはビオチンなどの相補的分子によって認識することができる。例えば、他のタンパク質および生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、リン脂質など）の複雑な混合物から、その混合物を、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片のエピトープタグを選択的に認識して結合できる相補的分子を含む固相樹脂によって処理することによって、エピトープタグにコンジュゲートした本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を精製できる。固相樹脂の例には、水溶液中での精製に適合するアガロースビーズが含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトは、精製または検出の目的で別の分子（例えば、エピトープタグ）にコンジュゲートされる。タンパク質精製に有用なそのような分子の例には、第２の分子によって認識可能な構造的エピトープを提示する分子が含まれる。これは、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製で使用される一般的な戦略であり、分子が固体支持体に固定され、固定化された化合物に結合できる分子にコンジュゲートした標的タンパク質を含む不均質混合物にさらされる。分子認識の目的でアゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドにコンジュゲートできるエピトープタグ分子の例には、非限定的に、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、ビオチン、ストレプトアビジンが含まれる。これらの分子によって提示されるエピトープを含むコンジュゲートは、それぞれ、マルトース、グルタチオン、ニッケル含有複合体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体、ストレプトアビジン、またはビオチンなどの相補的分子によって認識することができる。例えば、他のタンパク質および生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、リン脂質など）の複雑な混合物から、その混合物を、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片のエピトープタグを選択的に認識して結合できる相補的分子を含む固相樹脂によって処理することによって、エピトープタグにコンジュゲートした本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を精製できる。固相樹脂の例には、水溶液中での精製に適合するアガロースビーズが含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを蛍光分子に共有結合させて、例えば、蛍光光度測定および／または蛍光顕微鏡を用いた直接可視化により抗体またはその抗原結合断片を検出することもできる。本明細書に記載の抗体とコンジュゲートできる例示的な蛍光分子には、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ヘキスト、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、テトラメチルロアドミン、およびシアニンが含まれる。本明細書に記載の抗体へのコンジュゲーションに適した蛍光分子の追加の例は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第７，４１７，１３１号および７，４１３，８７４号に詳細に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
蛍光分子を含むアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、本明細書に記載の抗体およびその断片の細胞表面局在特性をモニタリングするために特に有用である。例えば、培養された哺乳動物細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）を、蛍光分子に共有結合した本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドに曝露し、続いて当該技術分野で既知の従来の蛍光顕微鏡法を用いてこれらの細胞を分析することができる。共焦点蛍光顕微鏡は、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの細胞表面局在を決定するための特に強力な方法である。細胞の個々の平面を分析して、例えば受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞の内部に取り込まれた抗体またはその断片を、細胞膜の外面に結合している抗体またはその断片から区別することができるためである。追加的に、細胞は、特定の波長の可視光を発する蛍光分子（例えば、約５３５ｎｍで蛍光を発するフルオレセイン）およびＴｒｅｇ細胞表面の特定の部位に局在することが知られている異なる波長で蛍光を発する追加の蛍光分子（例えば、ＣＤ２５に局在し、約５９９ｎｍで蛍光を発する分子）にコンジュゲートしたアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体で処理できる。結果として得られる発光パターンは、共焦点蛍光顕微鏡によって視覚化することができ、他の受容体に対するＴｒｅｇ細胞表面上のアゴニストＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片の位置に関する情報を明らかにするために、これらの２つの波長からの画像をマージすることができる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、またはその断片の検出および視覚化の目的で、生物発光タンパク質を融合タンパク質に組み込むこともできる。ルシフェラーゼおよびエクオリンなどの生物発光タンパク質は、基質（例えば、ルシフェリンやセレンテラジン）との化学反応の一部として発光する。診断配列としての使用に適した生物発光タンパク質の例およびそれらの使用方法は、例えば、米国特許第５，２９２，６５８号、同第５，６７０，３５６号、同第６，１７１，８０９号、および同第７，１８３，０９２号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。生物発光タンパク質で標識されたアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片は、インビトロアッセイ後の本明細書に記載の抗体の検出に有用なツールである。例えば、生物発光タンパク質にコンジュゲートしたアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の存在は、当該技術分野で知られているゲル電気泳動法（例えば、ネイティブゲル分析）を使用して混合物の成分を分離し、その後、ウェスタンブロットを行うために、分離したタンパク質を膜に転写することにより、追加のタンパク質の複雑な混合物の間で検出できる。他のタンパク質の混合物中のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの検出は、膜を適切なルシフェラーゼ基質で処理し、続いて確立されたプロトコールを使用してフィルム上のタンパク質の混合物を視覚化することによって達成できる。
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）はまた、放射性核を含む分子にコンジュゲートすることができ、本明細書に記載の抗体またはその断片を核の放射能放出パターンを分析することによって検出することができる。代替的に、タンパク質の調製中に抗体内に放射性核を組み込むことにより、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を直接修飾することができる。メチオニン（３５Ｓ）、窒素（１５Ｎ）、または炭素（１３Ｃ）の放射性同位体は、例えば、これらの同位体を含む栄養素を補充した培地で細菌を培養することにより、本明細書に記載の抗体またはその断片に組み込むことができる。任意選択で、放射性ハロゲンを含むチロシン誘導体は、例えば、放射性標識チロシンを補充した培地中で細菌細胞を培養することにより、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドに組み込むことができる。フェノール系のＣ２位で放射性ハロゲンで官能化されたチロシンは、インビボで内因性翻訳酵素を使用して伸長するポリペプチド鎖に迅速に組み込まれることが示されている（米国特許第４，９２５，６５１号、参照により本明細書に組み込まれる）。ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アスタチンが含まれる。追加的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、細胞培養物からの単離および精製後に、本明細書に記載のポリペプチドを放射性同位体で官能化することにより修飾することができる。ハロゲンは、チロシンまたはトリプトファンでの芳香族置換によって、例えば、これらの残基の１つ以上と求電子性ハロゲン種との反応によって、精製されたタンパク質に容易に組み込むことができる同位体のクラスを表す。放射性ハロゲン同位体の例には、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２２Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ、または２１１Ａｔが含まれる。
放射性同位元素の取り込みのための別の代替戦略は、キレート基を、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その断片、またはコンストラクトに共有結合させることである。キレート基は、チオール、アミノ基、アルコール、またはカルボン酸などの反応性官能基に結合することにより、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片に共有結合することができる。次に、キレート基を修飾して、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１６９Ｙｂ、１８６Ｒｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、７７Ａｓ、７２Ａｓ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、または２２５Ａｃなどの放射性核種を含むがこれらに限定されない、様々な金属放射性同位体のいずれかを含むようにすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その断片、またはそのコンストラクト）を、Ｇｄ３＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ３＋、またはＣｒ２＋などの重元素からの金属イオンまたは希土類元素イオンを結合できるキレート基と共有結合させることが望ましい場合がある。このような常磁性金属に配位するキレート基を含むコンジュゲートは、ＭＲＩイメージング用途の場合と同様に有用である。常磁性金属には、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ディスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、およびイッテルビウム（ＩＩＩ）が含まれるが、これらに限定されない。このようにして、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをＭＲＩ分光法により検出することができる。例えば、常磁性イオンに結合したキレート基にコンジュゲートしたアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を、投与後の抗体の分布をモニターするために、哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）に投与することができる。これは、静脈内などの本明細書に記載の投与経路のいずれかによって患者に抗体を投与し、続いて確立されたプロトコールに従って患者のＭＲＩを記録することにより投与された抗体の位置を分析することによって達成することができる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、水溶液中でのタンパク質の溶解性と安定性を改善する目的で、追加的に他の分子にコンジュゲートさせることができる。そのような分子の例には、とりわけ、ＰＥＧ、ＰＳＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれる。例えば、治療を受けている患者の免疫系による抗体またはその断片の検出を回避するために、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを炭水化物部分にコンジュゲートさせることができる。この過グリコシル化のプロセスは、循環中のＢ細胞受容体とタンパク質の相互作用を立体的に阻害することにより、治療用タンパク質の免疫原性を低下させる。代替的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を、ヒト血清からのクリアランスを防止し、本明細書に記載の抗体の薬物動態プロファイルを改善する分子にコンジュゲートすることができる。クリアランスを弱め、これらの抗体および断片の薬物動態プロファイルを改善するために、本明細書に記載のＴＮＦＲ２抗体またはその断片にコンジュゲートまたは挿入できる例示的な分子には、サルベージ受容体結合エピトープが含まれる。これらのエピトープは、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域内に見られ、Ｆｃ受容体に結合し、ヒト血清中の抗体半減期を延長することが示されている。サルベージ受容体結合エピトープのＴＮＦＲ２抗体またはその断片への挿入は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように達成することができる。
改変されたアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド
他の治療薬および識別または視覚化のための標識への結合に加えて、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）を改変して、薬物動態プロファイル、生物物理学的安定性、またはアゴニスト能力を改善することもできる。例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与しないシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、アイソステリックまたは等電アミノ酸（例えば、セリン）で置換され得る。逆に、シスチン結合（複数可）を抗体またはその断片に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体が抗体断片、例えばＦｖ断片である場合）。これは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド、または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを変更して、抗体の三次構造を強化するために、酸化条件下でジスルフィド結合を形成できるシステイン残基の１つ以上の追加のペアをコードすることによって達成できる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２２，８９９号を参照されたい）。
他の治療薬および識別または視覚化のための標識への結合に加えて、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）を改変して、薬物動態プロファイル、生物物理学的安定性、またはアゴニスト能力を改善することもできる。例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与しないシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、アイソステリックまたは等電アミノ酸（例えば、セリン）で置換され得る。逆に、シスチン結合（複数可）を抗体またはその断片に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体が抗体断片、例えばＦｖ断片である場合）。これは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド、または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを変更して、抗体の三次構造を強化するために、酸化条件下でジスルフィド結合を形成できるシステイン残基の１つ以上の追加のペアをコードすることによって達成できる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２２，８９９号を参照されたい）。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド断片、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）に行うことができる別の有用な改変には、これらの抗体およびその断片のグリコシル化プロファイルの変更が含まれる。これは、例えば、グリコシル化部位を挿入または除去するために、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体においてアミノ酸を置換、挿入、または欠失させることにより達成することができる。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ－結合型またはＯ－結合型で起こる。Ｎ－結合型グリコシル化は、炭水化物部分の抗体への結合がアスパラギン残基の側鎖で起こるプロセスである。Ｎ－結合型グリコシル化のコンセンサスアミノ酸配列には、トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリン（ＮＸＳ）およびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ＮＸＴ）が含まれ、ここで、ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。これらのトリペプチド配列のいずれかをポリペプチド（例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体）に挿入すると、潜在的なグリコシル化部位が作成される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに結合することを指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンもグリコシド形成の適格性のある基質である。したがって、ＴＮＦＲ２抗体へのグリコシル化部位の付加は、抗体のアミノ酸配列を変更することによって（例えば、本明細書に記載の組換え発現技術を使用して）、Ｎ－結合型を促進する上記のトリペプチド配列の１つ以上を含むようにすることで、または元の抗体の配列に対する１つ以上のセリンまたはスレオニン残基が、Ｏ結合型グリコシル化を引き起こすことによって、達成することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２２，８９９号を参照されたい）。
別のケースでは、エフェクター機能に関して本明細書に記載の抗体またはその断片を改変することが望ましい場合があり、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強する。これは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成できる。例えば、システイン残基をＴＮＦＲ２抗体またはその断片のＦｃ領域に導入して（例えば、本明細書に記載の組換え発現技術により）、この領域におけるさらなる鎖間ジスルフィド結合形成を促進することができる。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力を改善し、および／または補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加させることを促進し得る、増加した立体構造の拘束を有し得る。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，５３：２５６０－２５６５，１９９３）に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。代替的に、二重のＦｃ領域を有し、それにより補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強することができる抗体を改変することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，３：２１９－２３０，１９８９）を参照されたい）。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）の血清半減期は、いくつかの実施形態において、例えば、ＦａｂドメインのＣＨ１またはＣＬ領域を、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループにみられるサルベージ受容体モチーフを導入するように変更することなどによって、もう１つのアミノ酸修飾を組み込むことによって、いくつかの実施形態において改善することができる。そのような変更は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８６９，０４６号および米国特許第６，１２１，０２２号に記載される。例えば参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００３／０１５３０４３に記載されているように、抗体またはその断片の免疫原性を低減するか、またはそこに存在するＴ細胞エピトープを低減または除去するために、追加のフレームワーク改変を行うこともできる。
治療方法
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示し、かつ／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なる１つ以上のＣＤＲを有する抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト、ならびに／あるいは本明細書に記載の他のアゴニストＴＮＦＲ２抗体）は、幅広い免疫学的障害の治療に役立つ治療法である。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、他の適応症の中でもとりわけ、自己免疫疾患、神経疾患、代謝疾患（例えば、糖尿病）、黄斑疾患（例えば、黄斑変性症）、筋萎縮症、流産に関連する疾患、血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、骨損失に関連する疾患（例えば、閉経や骨粗しょう症による骨損失）、アレルギー、喘息、血液疾患（例えば、血友病）、筋骨格障害、増殖受容体の発現または活性に関連する疾患、肥満、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または同種移植片拒絶などの状態を治療するために、対象、例えば、ヒトなどの哺乳類対象に投与することができる。本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドはまた、例えば、損傷した組織または臓器内の細胞の増殖を誘導することにより、臓器の修復または再生を必要とする患者を治療するために使用することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをヒトなどの哺乳動物対象に投与して、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞）および／またはＭＤＳＣの増殖を刺激することができる。この応答は、免疫学的障害を引き起こす可能性のある不適切な免疫応答の開始に関連することの多い、細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団を減少させる効果がある。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、追加または代替として、上述のように、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞などのＴエフェクター細胞を直接殺傷し、ＴＮＦＲ２発現実質細胞の増殖、再生、治癒、および／または保護を促進し得る。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示し、かつ／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なる１つ以上のＣＤＲを有する抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト、ならびに／あるいは本明細書に記載の他のアゴニストＴＮＦＲ２抗体）は、幅広い免疫学的障害の治療に役立つ治療法である。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、他の適応症の中でもとりわけ、自己免疫疾患、神経疾患、代謝疾患（例えば、糖尿病）、黄斑疾患（例えば、黄斑変性症）、筋萎縮症、流産に関連する疾患、血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、骨損失に関連する疾患（例えば、閉経や骨粗しょう症による骨損失）、アレルギー、喘息、血液疾患（例えば、血友病）、筋骨格障害、増殖受容体の発現または活性に関連する疾患、肥満、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または同種移植片拒絶などの状態を治療するために、対象、例えば、ヒトなどの哺乳類対象に投与することができる。本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドはまた、例えば、損傷した組織または臓器内の細胞の増殖を誘導することにより、臓器の修復または再生を必要とする患者を治療するために使用することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをヒトなどの哺乳動物対象に投与して、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞）および／またはＭＤＳＣの増殖を刺激することができる。この応答は、免疫学的障害を引き起こす可能性のある不適切な免疫応答の開始に関連することの多い、細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の集団を減少させる効果がある。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、追加または代替として、上述のように、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞などのＴエフェクター細胞を直接殺傷し、ＴＮＦＲ２発現実質細胞の増殖、再生、治癒、および／または保護を促進し得る。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）は、移植片拒絶を有する対象、例えばヒトなどの哺乳動物対象に対して投与することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、移植片の表面に提示された抗原に結合する自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴＮＦＲ２受容体に結合し、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞にアポトーシスを誘導することにより、または後に自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を排除し得るＴｒｅｇ細胞および／またはＭＤＳＣの拡大を誘導することにより、移植片拒絶を治療することができる。本明細書に記載のポリペプチドの投与により治療できる移植の例には、非限定的に、皮膚移植拒絶、骨移植拒絶、血管移植拒絶、靭帯移植片拒絶、（例えば、輪状甲状腺靭帯移植片拒絶、歯周靭帯移植片拒絶、水晶体の提靱帯移植片拒絶、掌側橈骨手根靭帯移植片拒絶、背側橈骨手根靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、乳房提靭帯移植片拒絶、前仙腸靭帯移植片拒絶、後仙腸靭帯移植片拒絶、仙骨結節靭帯移植片拒絶、仙棘靭帯移植片拒絶、下恥骨靱帯移植片拒絶、上恥骨靭帯移植片拒絶、前十字靱帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、後十字靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、頭蓋十字靭帯移植片拒絶、尾側十字靭帯移植片拒絶、膝蓋靭帯移植片拒絶）、および臓器移植拒絶（例えば、とりわけ、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、および胸腺の移植拒絶）が含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）は、追加的にまたは代替的に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物対象に対して投与することができる。本発明の組成物および方法を用いて治療することができる典型的な移植片対宿主疾患には、骨髄移植、ならびに造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ球共通前駆細胞、巨核球、単球、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および／または樹状細胞などの血液細胞の移植から生じる疾患が含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）はまた、例えば、患者において、自己反応性Ｔ細胞の表面にあるＴＮＦＲ２受容体に結合してアポトーシスを誘導するため、および／またはＴｒｅｇ細胞増殖を促進して、不適切に反応する細胞傷害性Ｔリンパ球およびＢリンパ球の活性を抑制するために、対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物対象に対して投与することができる。本発明の抗体は、例えば、本明細書に記載の投与経路のいずれかを介して、対象に投与することができる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）の投与によって治療することのできる免疫学的疾患には、食物アレルギー、季節性アレルギー、ペットアレルギー、じんましん、花粉症、アレルギー性結膜炎、ツタアレルギー、オークアレルギー、カビアレルギー、薬物アレルギー、ほこりアレルギー、化粧品アレルギー、化学アレルギーなどのアレルギーが含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）の投与によって治療することのできる疾患には、自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、限局性強皮症（ＣＲＥＳＴ症候群）、寒冷凝集素症、クローン病、本態性混合型クリオグロブリン、線維筋痛－線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、炎症性腸疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、特発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、またはウェゲナー肉芽腫症が含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）は、追加的に、臓器修復または再生を必要とする患者を治療するのに使用できる。例えば、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、例えば、損傷した組織内の細胞の表面にＴＮＦＲ２を結合させて、ＴＲＡＦ２／３および／またはＮＦκＢ媒介細胞増殖を誘導することにより、臓器の修復または再生を刺激するために使用され得る。本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片の対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物対象）への投与によって再生するように誘導され得る組織および臓器の例には、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、頭の構造、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、および精巣が含まれる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）は、脳腫瘍、脳転移、脊髄損傷、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中などの神経疾患または状態を治療するために、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物対象）に投与することができる。
当業者は、それを必要とする哺乳動物対象（例えば、ヒト）に投与するための、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの有効量を容易に決定することができる。例えば、医師は、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの投与量を、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで処方し始め、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増やすことができる。代替的に、医師は、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを高用量で投与することにより治療計画を開始し、その後、治療効果（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増殖の減少またはＩＦＮγの末梢分泌における減少）が達成されるまで、漸進的により低い用量で投与できる。一般に、本発明の抗体またはその抗原結合断片の好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である抗体の量である。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、注射によって、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射によって、任意選択で標的組織の部位に近接して投与され得る。本発明の抗体またはその抗原結合断片の治療用組成物の１日用量は、単回投与または２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の投与を、１日、１週間、１ヶ月、または１年を通して適切な間隔で、必要に応じて単位剤形で別々に投与することができる。本発明の抗体またはその断片を単独で投与することは可能であるが、賦形剤、担体、および任意で追加の治療薬と組み合わせて、医薬製剤として投与することもできる。
本開示のポリペプチドは、当該技術分野で既知の様々な方法のいずれかによって、自己免疫疾患などの免疫疾患の進行を弱める能力についてモニターすることができる。例えば、医師は、特定の患者内のＣＤ８＋Ｔ細胞によって分泌されるＩＦＮγの量を分析することにより、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドによる治療に対する哺乳動物対象（例えば、ヒト）の応答をモニターすることができる。例えば、本発明の抗体は、ＩＦＮγ分泌を１％～１００％（例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％）減少させることができる。代替的に、医師は、特定の対象のリンパにおけるＴｒｅｇ細胞集団を分析することにより、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片による治療に対する対象（例えば、ヒト）の応答性をモニターすることができる。例えば、医師は、哺乳類の対象（例えば、ヒト）から血液の試料を採取し、蛍光標識細胞分取などの確立された手順を使用して、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞、またはＣＤ１７＋Ｔｒｅｇ細胞）の集団の量または密度を決定することができる。これらの場合、高いＴｒｅｇ細胞数は有効な治療を示すが、低いＴｒｅｇ細胞数は、理想的なＴｒｅｇ細胞数が達成されるまで、本発明のＴＮＦＲ２抗体を高用量で患者に処方または投与する必要があることを示し得る。加えて、当業者は、本明細書に記載の自己免疫疾患などの免疫学的障害に罹患している患者に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を投与することによる治療の効果を、患者から単離されたリンパ球試料の自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を分析することによってモニタリングすることができる。本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびその抗原結合断片は、例えば、自己反応性Ｔ細胞の表面でＴＮＦＲ２に結合してアポトーシスを誘導することにより、および／またはその後、自己反応性Ｔリンパ球を排除するＴｒｅｇ細胞の拡大を刺激することにより、自己反応性Ｔ細胞の増殖を減衰させ得る。アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片による治療は、治療を受けている患者から単離されたリンパの自己反応性Ｔ細胞量の減少をもたらす可能性があり、そのような患者から単離されたリンパ試料の自己反応性Ｔ細胞の急
速な減少は、効果的な治療を示す。患者から単離されたリンパ試料が、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体療法に反応して減少していない自己反応性Ｔ細胞数を示す場合、医師は患者により高い用量の抗体またはその抗原結合断片を処方するか、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片をより高い頻度で、例えば、１日、１週間、または１ヶ月ごとに複数回で投与することができる。
速な減少は、効果的な治療を示す。患者から単離されたリンパ試料が、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体療法に反応して減少していない自己反応性Ｔ細胞数を示す場合、医師は患者により高い用量の抗体またはその抗原結合断片を処方するか、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片をより高い頻度で、例えば、１日、１週間、または１ヶ月ごとに複数回で投与することができる。
医薬組成物
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトを含む医薬組成物は、当該技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。本開示の医薬組成物に組み込むことができる例示的なアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、結合部位が互いに空間的に約１３３Å未満で隔てられる少なくとも２つのＴＮＦＲ２結合部位を有するもの、ならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ（例えば、ＣＨ１ドメインにＣ１２７Ｓ変異を有し、それにより、例えば、ヒトＩｇＧ２－Ｂアイソタイプを生成する）、ＩｇＧ３アイソタイプ、またはＩｇＧ４アイソタイプを有するものが含まれる。ＴＮＦＲ２アゴニストは、例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクトであり得る。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトを含む医薬組成物は、当該技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。本開示の医薬組成物に組み込むことができる例示的なアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、結合部位が互いに空間的に約１３３Å未満で隔てられる少なくとも２つのＴＮＦＲ２結合部位を有するもの、ならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ（例えば、ＣＨ１ドメインにＣ１２７Ｓ変異を有し、それにより、例えば、ヒトＩｇＧ２－Ｂアイソタイプを生成する）、ＩｇＧ３アイソタイプ、またはＩｇＧ４アイソタイプを有するものが含まれる。ＴＮＦＲ２アゴニストは、例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクトであり得る。
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含み得る。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、例えば生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を使用して（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）参照により本明細書に組み込まれる）、所望の形態、例えば、凍結乾燥された製剤、または水溶液の形態で調製することができる。組成物は、活性剤（例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片）を所望の濃度で含むように調製することもできる。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、重量（ｗ／ｗ）で少なくとも１０％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％）の活性剤を含むことができる。
追加的に、医薬製剤に組み込むことができる活性剤（例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば本明細書に記載のドミナントアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド）は、それ自体が所望の純度レベルを有することができる。例えば、本明細書に記載のポリペプチド、例えば単鎖ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片は、細胞培養培地から抗体を単離した後、または化学合成、例えば確立された固相ペプチド合成法または本明細書に記載のネイティブケミカルライゲーションによる単鎖抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）の化学合成、特定の純度によって特徴付けることができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、抗体を医薬組成物に組み込む前に少なくとも１０％純粋であり得る（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、または１００％純粋）。
追加的に、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）は、ポリペプチドの多くが単一ジスルフィド結合アイソフォームで存在するように、医薬組成物に混合することができる。例えば、本開示の医薬組成物は、アゴニストＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むものを含み、例えば、医薬組成物中の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、またはそれ以上のポリペプチドが、単一のジスルフィド結合アイソフォーム、例えば、本明細書に記載のＩｇＧ２－Ｂアイソフォームで存在する。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を当該技術分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤、例えば緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗剤、酸化防止剤、およびその他の雑多な添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液として貯蔵のために調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい（Ｏｓｏｌ，ｅｄ．１９８０、参照により本明細書に組み込まれる）。このような添加剤は、使用する投与量と濃度でレシピエントに無毒であるべきである。
緩衝剤
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲でｐＨを維持するのに役立つ。それらは、約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）とともに使用するための好適な緩衝剤には、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸－コハク酸一ナトリウム混合液、コハク酸－水酸化ナトリウム混合液、コハク酸－コハク酸二ナトリウム混合液など）、酒石酸塩緩衝液（例えば、酒石酸－酒石酸ナトリウム混合液、酒石酸－酒石酸カリウム混合液、酒石酸－水酸化ナトリウム混合液など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸－フマル酸一ナトリウム混合液、フマル酸－フマル酸二ナトリウム混合液、フマル酸一ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸－グルコン酸ナトリウム混合液、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合液、グルコン酸－グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸－乳酸ナトリウム混合液、乳酸酸－水酸化ナトリウム混合液、乳酸－乳酸カリウム混合液など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸－酢酸ナトリウム混合液、酢酸－水酸化ナトリウム混合液など）などの有機酸と無機酸の両方およびそれらの塩が含まれる。追加的に、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を使用することができる。
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲でｐＨを維持するのに役立つ。それらは、約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合断片）とともに使用するための好適な緩衝剤には、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸－コハク酸一ナトリウム混合液、コハク酸－水酸化ナトリウム混合液、コハク酸－コハク酸二ナトリウム混合液など）、酒石酸塩緩衝液（例えば、酒石酸－酒石酸ナトリウム混合液、酒石酸－酒石酸カリウム混合液、酒石酸－水酸化ナトリウム混合液など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸－フマル酸一ナトリウム混合液、フマル酸－フマル酸二ナトリウム混合液、フマル酸一ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸－グルコン酸ナトリウム混合液、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合液、グルコン酸－グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸－乳酸ナトリウム混合液、乳酸酸－水酸化ナトリウム混合液、乳酸－乳酸カリウム混合液など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸－酢酸ナトリウム混合液、酢酸－水酸化ナトリウム混合液など）などの有機酸と無機酸の両方およびそれらの塩が含まれる。追加的に、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を使用することができる。
保存剤
保存剤は、微生物の増殖を遅らせるために、本明細書に記載の組成物に添加することができ、０．２％～１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合および、そのコンストラクト）とともに使用するための好適な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物など）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および３－ペンタノールが含まれる。「安定剤」として知られる等張化剤を添加して、本明細書に記載の液体組成物の等張性を確保することができ、多価糖アルコール、例えば、グリセリン、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールが挙げられる。安定剤とは、増量剤から、治療薬を可溶化するか、または変性もしくは容器壁への付着を防止するのに役立つ添加剤など、機能の範囲が広くあり得る賦形剤の広いカテゴリーを指す。典型的な安定剤は多価糖アルコール（上に列挙）、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸、イノシトールなどのシクリトールを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコール、ポリエチレングリコール、アミノ酸ポリマー、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、ａ－モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤、低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどのポリビニルピロリドン単糖などの親水性ポリマー、ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類、ラフィノースなどの三糖類、デキストラ
ンなどの多糖類であってよい。安定剤は、活性タンパク質の重量部あたり０．１～１０，０００重量の範囲で存在することができる。
保存剤は、微生物の増殖を遅らせるために、本明細書に記載の組成物に添加することができ、０．２％～１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合および、そのコンストラクト）とともに使用するための好適な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物など）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および３－ペンタノールが含まれる。「安定剤」として知られる等張化剤を添加して、本明細書に記載の液体組成物の等張性を確保することができ、多価糖アルコール、例えば、グリセリン、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールが挙げられる。安定剤とは、増量剤から、治療薬を可溶化するか、または変性もしくは容器壁への付着を防止するのに役立つ添加剤など、機能の範囲が広くあり得る賦形剤の広いカテゴリーを指す。典型的な安定剤は多価糖アルコール（上に列挙）、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸、イノシトールなどのシクリトールを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコール、ポリエチレングリコール、アミノ酸ポリマー、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、ａ－モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤、低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどのポリビニルピロリドン単糖などの親水性ポリマー、ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類、ラフィノースなどの三糖類、デキストラ
ンなどの多糖類であってよい。安定剤は、活性タンパク質の重量部あたり０．１～１０，０００重量の範囲で存在することができる。
界面活性剤
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られている）を添加して、治療薬の可溶化を促進するとともに、治療用タンパク質を攪拌によって誘発される凝集から保護し、これにより、タンパク質の変性を引き起こすことなく、製剤を剪断表面応力にさらすことができる。好適な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．０７ｍｇ／ｍＬ～約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在することができる。
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られている）を添加して、治療薬の可溶化を促進するとともに、治療用タンパク質を攪拌によって誘発される凝集から保護し、これにより、タンパク質の変性を引き起こすことなく、製剤を剪断表面応力にさらすことができる。好適な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．０７ｍｇ／ｍＬ～約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在することができる。
追加のその他の賦形剤には、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が含まれる。
他の薬学的担体
本明細書に記載の医薬組成物に組み込むことができる代替の薬学的に許容される担体には、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、リン酸カリウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カリウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油が含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体を含む組成物は、潤滑剤、保湿剤、甘味料、香味料、乳化剤、懸濁化剤、および保存剤をさらに含み得る。好適な薬学的に許容される担体および製剤の詳細は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に見出すことができる。
本明細書に記載の医薬組成物に組み込むことができる代替の薬学的に許容される担体には、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、リン酸カリウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カリウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油が含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体を含む組成物は、潤滑剤、保湿剤、甘味料、香味料、乳化剤、懸濁化剤、および保存剤をさらに含み得る。好適な薬学的に許容される担体および製剤の詳細は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に見出すことができる。
免疫療法剤
本明細書に記載の方法を用いて、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、免疫療法剤と共投与（例えば、混合）または別個に投与することができる。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトなど）を、炎症を患うヒト患者などの患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクト）を、免疫療法剤または他の薬剤の投与前に患者に投与して、患者の炎症や疼痛を減少させる。代替的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクト）は、免疫療法剤の後に患者に投与され得る。例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクト）は、免疫療法剤治療の失敗後に患者に投与され得る。
本明細書に記載の方法を用いて、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはそのコンストラクト）は、免疫療法剤と共投与（例えば、混合）または別個に投与することができる。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトなど）を、炎症を患うヒト患者などの患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクト）を、免疫療法剤または他の薬剤の投与前に患者に投与して、患者の炎症や疼痛を減少させる。代替的に、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクト）は、免疫療法剤の後に患者に投与され得る。例えば、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクト）は、免疫療法剤治療の失敗後に患者に投与され得る。
血液脳関門の浸透
特定の実施形態では、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、親水性の高い多くの化合物を排除する。本明細書に記載の治療用組成物が（必要に応じて）ＢＢＢを通過することを確実にするために、それらは、例えば、リポソーム中に製剤化することができる。リポソームの製造方法は、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号に記載される。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１つ以上の部分を含むことができ、それによって標的化された薬物送達を増強する（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５，１９８９）を参照されたい）。例示的な標的化部分には、例えば、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８，１９８８））、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０，１９９５）；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０，１９９５））；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４，１９９５））が含まれ、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、親水性の高い多くの化合物を排除する。本明細書に記載の治療用組成物が（必要に応じて）ＢＢＢを通過することを確実にするために、それらは、例えば、リポソーム中に製剤化することができる。リポソームの製造方法は、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号に記載される。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１つ以上の部分を含むことができ、それによって標的化された薬物送達を増強する（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５，１９８９）を参照されたい）。例示的な標的化部分には、例えば、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８，１９８８））、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０，１９９５）；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０，１９９５））；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４，１９９５））が含まれ、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
投与経路および投与
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、腫瘍内、非経口、局所、髄腔内、および脳室内などの様々な経路によって哺乳動物対象（例えば、ヒト）に投与することができる。いかなる場合においても、投与に最も適した経路は、投与される特定のポリペプチド、患者、製剤方法、投与方法（例えば、投与時間および投与経路）、患者の年齢、体重、性別、治療される疾患の重症度、患者の食事、患者の排泄率に依存する。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、腫瘍内、非経口、局所、髄腔内、および脳室内などの様々な経路によって哺乳動物対象（例えば、ヒト）に投与することができる。いかなる場合においても、投与に最も適した経路は、投与される特定のポリペプチド、患者、製剤方法、投与方法（例えば、投与時間および投与経路）、患者の年齢、体重、性別、治療される疾患の重症度、患者の食事、患者の排泄率に依存する。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの有効量は、例えば、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与または連続投与（例えば、持続注入）あたり、体重１ｋｇあたり約０．０００１～約１００ｍｇの範囲、または、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与または連続投与（例えば、持続注入）あたりの血清濃度ｍＬあたり０．０００１～５０００μｇの血清濃度を達成する範囲、または、治療中の状態、投与経路、対象の年齢、体重、および状態に応じて、その中の任意の有効範囲または値であり得る。特定の実施形態では、各用量は、体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ～約５００ｍｇの範囲であり得る。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の一日量で投与され得る。用量は、それを必要とする哺乳動物対象（例えば、ヒト）に、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回以上（例えば、２～１０回）投与され得る。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、持続静脈内注入または単回ボーラス投与により患者に投与することができる。本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、患者に、例えば、１０μＬから１０ｍＬの体積中、例えば、０．０１μｇ～約５ｇの量で投与され得る。アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、数分から数時間かけて患者に投与され得る。例えば、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、５分～５時間の期間にわたって、例えば５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、８０分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、１１５分、１２０分、１２５分、１３０分、１３５分、１４０分、１４５分、１５０分、１５５分、１６０分、１６５分、１７０分、１７５分、１８０分、１８５分、１９０分、１９５分、２００分、２０５分、２１０分、２１５分、２２０分、２２５分、２３０分、２３５分、２４０分、２４５分、２５０分、２５５分、２６０分、２６５分、２７０分、２７５分、２８０分、２８５分、２９０分、２９５分、もしくは３００分、またはそれ以上の期間にわたって、患者に投与され得る。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片、およびそのコンストラクト）は、抗体またはその抗原結合断片などのＰＤ－１のアゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アゴニスト抗体またはその抗原結合断片、および／またはアゴニスト性ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片などの免疫療法剤と組み合わせて投与することができる。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むキット
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド断片、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）を含むキットも本明細書に含まれる。本明細書に提供されるキットは、上述のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのいずれか、ならびにこれらのポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、または本明細書に記載の抗体を発現および分泌するように操作された細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）を含み得る。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド断片、抗体、その抗原結合、およびそのコンストラクト）を含むキットも本明細書に含まれる。本明細書に提供されるキットは、上述のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのいずれか、ならびにこれらのポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、または本明細書に記載の抗体を発現および分泌するように操作された細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）を含み得る。
本明細書に記載のキットに組み込むことができる本開示の例示的な組成物は、結合部位が互いに空間的に約１３３Å以下隔てられる少なくとも２つのＴＮＦＲ２結合部位を有するもの、ならびにヒトＩｇＧ２アイソタイプ、例えばヒトＩｇＧ２－Ｂアイソタイプを有するものなどのアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが含まれる。本明細書に記載のキットに組み込むことができる本開示の組成物には、単一のジスルフィド結合アイソフォームを採用するアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含む医薬組成物も含まれ、例えば、医薬組成物中の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、またはそれ以上のポリペプチドが単一のジスルフィド結合アイソフォームで存在する。
本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の組成物を生成するために使用できる試薬（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、コンストラクト、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むコンジュゲート、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含むベクターなどの、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド）を含み得る。任意選択で、本明細書に記載のキットは、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンなどの細胞（例えば、哺乳動物細胞）内でアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの発現を誘導できる試薬を含み得る。他の場合において、本明細書に記載のキットは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体およびエピトープタグを含む融合タンパク質に結合および検出することができる化合物を含み得る。例えば、そのような場合、本明細書に記載のキットは、マルトース、グルタチオン、ニッケル含有複合体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体、ビオチン、またはストレプトアビジンを含み得る。
本明細書に記載のキットは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その断片、またはそのコンストラクト）を直接検出できる試薬も含み得る。そのような試薬の例には、本明細書に記載のＴＮＦＲ２抗体のＦｃ領域内の特定の構造的特徴を選択的に認識して結合する二次抗体が含まれる。本明細書に記載のキットは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＦｃ領域を認識し、蛍光分子にコンジュゲートされた二次抗体を含み得る。これらの抗体－蛍光体コンジュゲートは、確立された免疫蛍光技術を使用して、特定の組織または培養哺乳類細胞などにおけるアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の局在を分析するためのツールを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキットには、既知の細胞内局在パターンを示す追加の蛍光化合物が含まれていてもよい。これらの試薬は、他の細胞表面タンパク質に対するＴＮＦＲ２抗体の局在を分析するために、別の抗体－フルオロフォア複合体、例えば、細胞表面上の異なる受容体を特異的に認識するものと組み合わせて使用できる。
本明細書に記載のキットは、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、単鎖ポリペプチド、抗体、その抗原結合ペプチド断片、およびそのコンストラクト）の投与による治療に対する患者の応答の分析に使用できる試薬も含み得る。例えば、本明細書に記載のキットは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体および本明細書に記載の抗体による治療を受けている対象（例えば、ヒト）から採取された血液試料中のＴｒｅｇ細胞の量を決定するために使用できる１つ以上の試薬を含み得る。そのようなキットは、例えば、ＣＤ４およびＣＤ２５などのＴｒｅｇ細胞によって提示される細胞表面抗原に選択的に結合する抗体を含み得る。任意選択で、これらの抗体をフルオレセインまたはテトラメチルローダミンなどの蛍光色素で標識して、当該技術分野で既知の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）法によってＴｒｅｇ細胞の分析を促進することができる。本明細書に記載のキットは、腫瘍浸潤リンパ球増殖の回復における本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの有効性を判定するために、腫瘍反応性Ｔリンパ球を定量化するために使用できる１つ以上の試薬を任意選択で含み得る。例えば、本明細書に記載のキットは、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上の細胞表面マーカー、例えばＣＤ８またはＣＤ３に選択的に結合する抗体を含み得る。任意選択で、これらの抗体を蛍光分子で標識して、ＦＡＣＳ分析による定量を可能にできる。
本明細書に記載のキットは、ＴＮＦＲ２に由来する１つ以上のペプチドに対する本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの親和性および選択性を判定するために有用な１つ以上の試薬も含み得る。例えば、キットは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、および天然タンパク質におけるエピトープの立体構造と類似の立体構造においてＴＮＦＲ２エピトープを提示する１つ以上のペプチドに対する、本明細書に記載の抗体のＤを決定するためにＥＬＩＳＡアッセイで使用できる１つ以上の試薬を含み得る。キットは、例えば、事前にアビジンにコンジュゲートされたウェルを含むマイクロタイタープレートを含み、それぞれがビオチン部分にコンジュゲートされたＴＮＦＲ２由来ペプチドのライブラリーを含み得る。そのようなキットは、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＦｃ領域に特異的に結合する二次抗体を任意に含み得、二次抗体は、ルミネッセンス光の放出をもたらす化学反応を触媒する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合され得る。
本明細書に記載のキットはまた、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、および以前に記載されたもの（例えば、細胞傷害剤、蛍光分子、生物発光分子、放射性同位元素を含む分子、常磁性イオンなどに結合したキレート基を含む分子）を含む、そのような抗体にコンジュゲートすることのできる試薬を含み得る。これらのキットは、追加的に、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体と、上述のような第２の分子とのコンジュゲートをどのように達成できるかについての使用説明書に含み得る。
本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の任意のベクターなど、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも含み得る。代替的に、キットは、細胞の核ゲノムからアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片を発現および分泌するように遺伝子改変された哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含み得る。そのようなキットは、ポリヌクレオチドからのアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片の発現をどのように誘導できるかを説明する使用説明書も含み、追加的に、これらのポリヌクレオチドの転写を促進するために使用できる試薬（例えば、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンなど）を含み得る。そのようなキットは、本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片の製造に有用であり得る。
本明細書に記載の他のキットは、細胞の核ゲノムから本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを発現および分泌するように、原核細胞または真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を操作するためのツールを含み得る。例えば、キットは、適切な培地に保存され、当該技術分野で既知の方法に従って任意選択で凍結されたＣＨＯ細胞を含み得る。キットはまた、ヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＡＲＣＵＳ（商標）ヌクレアーゼなど）をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに細胞内でヌクレアーゼを発現するための試薬を提供し得る。このキットは、追加的に、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを改変して、目的の特定の標的ＤＮＡ配列の切断を指示するためにヌクレアーゼのＤＮＡ配列を変更できるようにするためのツールを提供することができる。そのようなツールの例には、目的のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの増幅および部位特異的変異導入のためのプライマーが含まれる。キットはまた、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをベクターから選択的に切り出し、続いてユーザーが遺伝子を改変した後、改変されたポリヌクレオチドをベクターに再導入するために使用できる制限酵素を含んでもよい。そのようなキットは、改変ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと標的ベクターとの間の共有ホスホジエステル結合の形成を触媒するために使用できるＤＮＡリガーゼも含み得る。本明細書に記載のキットは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに、細胞のゲノム内の特定のＤＮＡ配列を選択的に切断し、アゴニスト性ＴＮＦＲ２をコードするポリヌクレオチドをこの部位でゲノムに組み込むために使用できる方法を説明する添付文書も提供することができる。任意選択で、キットは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体またはその断片と、例えば本明細書に記載のものなどの追加のポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することができる。
以下の実施例は、本明細書で特許請求される組成物および方法がどのように実施、作製、および評価されるかを当業者に説明するために記載されており、本明細書に記載されている純粋に例示的なものであり、発明者が自分の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。
実施例１．アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが結合するＴＮＦＲ２内の個別のエピトープのマッピング
ヒトＴＮＦＲ２に由来する線状、環状、および二環式ペプチドのライブラリーを、モノクローナルＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１に対して高い親和性を示すタンパク質内の異なる配列についてスクリーニングした。ＴＦＮＲ２内の立体構造エピトープをスクリーニングするために、一次タンパク質配列の異なる領域からのペプチドを互いにコンジュゲートさせて、キメラペプチドを形成した。これらのペプチドには、一次配列内の戦略的な位置にシステイン残基が含まれていた。これにより、個々のペプチドを幅広い３次元立体構造のうちの１つに拘束するために使用される分子内架橋戦略が促進された。システイン残基の保護されていないチオールは、２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジンおよび１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼンなどの二価および三価の求電子試薬との求核置換反応を介して架橋され、立体構造的に拘束された環状および二環式ペプチドをそれぞれ形成した。このようにして、ＴＮＦＲ２一次配列の異なる領域からのアミノ酸のユニークな組み合わせを含むペプチドは、天然のＴＮＦＲ２三次構造に提示されたものに似ている可能性のあるエピトープを構造的に事前に編成するように拘束された。これらのペプチドを含むライブラリーは、ペプチドを固体表面の異なる領域に固定し、表面をアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした二次抗体、および過酸化水素の存在下でＨＲＰ基質（２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート）で処理することによってスクリーニングされた。固体表面を連続試薬で処理する間に洗浄して、過剰または非特異的に結合した物質を除去した。続いて、各表面の各領域の発光を、電荷結合素子（ＣＣＤ）－カメラおよび画像処理システムを使用して分析した。
ヒトＴＮＦＲ２に由来する線状、環状、および二環式ペプチドのライブラリーを、モノクローナルＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１に対して高い親和性を示すタンパク質内の異なる配列についてスクリーニングした。ＴＦＮＲ２内の立体構造エピトープをスクリーニングするために、一次タンパク質配列の異なる領域からのペプチドを互いにコンジュゲートさせて、キメラペプチドを形成した。これらのペプチドには、一次配列内の戦略的な位置にシステイン残基が含まれていた。これにより、個々のペプチドを幅広い３次元立体構造のうちの１つに拘束するために使用される分子内架橋戦略が促進された。システイン残基の保護されていないチオールは、２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジンおよび１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼンなどの二価および三価の求電子試薬との求核置換反応を介して架橋され、立体構造的に拘束された環状および二環式ペプチドをそれぞれ形成した。このようにして、ＴＮＦＲ２一次配列の異なる領域からのアミノ酸のユニークな組み合わせを含むペプチドは、天然のＴＮＦＲ２三次構造に提示されたものに似ている可能性のあるエピトープを構造的に事前に編成するように拘束された。これらのペプチドを含むライブラリーは、ペプチドを固体表面の異なる領域に固定し、表面をアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした二次抗体、および過酸化水素の存在下でＨＲＰ基質（２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート）で処理することによってスクリーニングされた。固体表面を連続試薬で処理する間に洗浄して、過剰または非特異的に結合した物質を除去した。続いて、各表面の各領域の発光を、電荷結合素子（ＣＣＤ）－カメラおよび画像処理システムを使用して分析した。
「表面上のペプチドの拘束ライブラリー」（ＣＬＩＰＳ）プラットフォームは、コンビナトリアルマトリックスデザインを使用して、標的タンパク質、例えばＴＮＦＲ２を最大１０，０００までの重複するペプチドコンストラクトのライブラリーに変換することによって開始する（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，２０：２８３－２９，２００７）。固体担体上で、直線状ペプチドのマトリックスが合成され、その後、空間的に定義されたＣＬＩＰＳコンストラクトへと形作られる。正しい立体構造の不連続なエピトープの複数の部分を表すコンストラクトは、高い親和性で抗体に結合し、検出および定量化される。不完全なエピトープを提示するコンストラクトは、より低い親和性で抗体に結合するが、エピトープを含まないコンストラクトはまったく結合しない。親和性情報は、反復スクリーニングで使用され、エピトープの配列と立体構造を詳細に定義する。これらのＥＬＩＳＡ実験から得られた生の発光データは、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体に結合するＴＮＦＲ２の表面に存在するエピトープの分析に情報を提供した。
ペプチド合成
標的分子のエピトープを再構築するために、ペプチドのライブラリーを合成した。アミノ官能化ポリプロピレン支持体は、独自の親水性ポリマー配合物をグラフトした後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とＮ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を使用してｔ－ブチルオキシカルボニル－ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＢｏｃ基を切断した。標準のＦｍｏｃペプチド合成を使用して、特注のＪＡＮＵＳ（登録商標）リキッドハンドリングステーション（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によりアミノ官能化固体支持体上にペプチドを合成した。ＣＬＩＰＳテクノロジーにより、ペプチドを単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート状の折り畳み、ヘリックス様の折り畳み、およびそれらの組み合わせに構造化できる。ＣＬＩＰＳテンプレートはシステイン残基に結合している。ペプチドの複数のシステインの側鎖は、１つまたは２つのＣＬＩＰＳテンプレートに結合している。例えば、ＣＬＩＰＳテンプレート（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン）の０．５ｍＭ溶液を炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）／アセトニトリル（１：３（ｖ／ｖ））に溶解する。この溶液は、表面結合ペプチドアレイに添加される。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチドアレイ（３μｌウェルを有する４５５ウェルプレート）の固相結合ペプチドに存在する２つのシステインの側鎖と反応する。ペプチドアレイは、溶液中で完全に覆われた状態で３０～６０分間、溶液中で穏やかに振とうされる。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１％ＳＤＳ／０．１％ベータメルカプトエタノールを含む破砕緩衝液により７０℃で３０分間超音波処理した後、さらに４５分間Ｈ２Ｏ中で超音波処理する。
標的分子のエピトープを再構築するために、ペプチドのライブラリーを合成した。アミノ官能化ポリプロピレン支持体は、独自の親水性ポリマー配合物をグラフトした後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とＮ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を使用してｔ－ブチルオキシカルボニル－ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＢｏｃ基を切断した。標準のＦｍｏｃペプチド合成を使用して、特注のＪＡＮＵＳ（登録商標）リキッドハンドリングステーション（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によりアミノ官能化固体支持体上にペプチドを合成した。ＣＬＩＰＳテクノロジーにより、ペプチドを単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート状の折り畳み、ヘリックス様の折り畳み、およびそれらの組み合わせに構造化できる。ＣＬＩＰＳテンプレートはシステイン残基に結合している。ペプチドの複数のシステインの側鎖は、１つまたは２つのＣＬＩＰＳテンプレートに結合している。例えば、ＣＬＩＰＳテンプレート（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン）の０．５ｍＭ溶液を炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）／アセトニトリル（１：３（ｖ／ｖ））に溶解する。この溶液は、表面結合ペプチドアレイに添加される。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチドアレイ（３μｌウェルを有する４５５ウェルプレート）の固相結合ペプチドに存在する２つのシステインの側鎖と反応する。ペプチドアレイは、溶液中で完全に覆われた状態で３０～６０分間、溶液中で穏やかに振とうされる。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１％ＳＤＳ／０．１％ベータメルカプトエタノールを含む破砕緩衝液により７０℃で３０分間超音波処理した後、さらに４５分間Ｈ２Ｏ中で超音波処理する。
表面プラズモン共鳴によるアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の結合親和性の分析
組換えヒトＴＮＦＲ２に対するアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を使用して測定された。簡潔に述べると、ＰＢＳ中のビオチン－ＬＣ－ＬＣ－ＮＯＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、５：１の化学量論比で抗体をビオチン化した。過剰なビオチン化試薬を遠心分離クロマトグラフィーで除去し、ビオチン化抗体を３０００ＲＵのストレプトアビジン表面に１００ＲＵのレベルまで捕捉した。そのレベルの抗体捕捉によるＴＮＦＲ２のシグナルの理論上の最大値は２６ＲＵであり、そのシグナルは、ランニング緩衝液中５００ｎＭのＴＮＦＲ２を使用した予備実験で達した。抗原結合の速度論の分析は、２分間の注入で６０μＬ／分の流速で実施された。抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で注入し、最終的に１００ＲＵを捕捉した。使用した機器は、ＢｉｏＣａｐチップを搭載したＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。分析には二重参照法を使用した。参照チャネルには、同じレベルのストレプトアビジンが含まれていた。
組換えヒトＴＮＦＲ２に対するアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を使用して測定された。簡潔に述べると、ＰＢＳ中のビオチン－ＬＣ－ＬＣ－ＮＯＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、５：１の化学量論比で抗体をビオチン化した。過剰なビオチン化試薬を遠心分離クロマトグラフィーで除去し、ビオチン化抗体を３０００ＲＵのストレプトアビジン表面に１００ＲＵのレベルまで捕捉した。そのレベルの抗体捕捉によるＴＮＦＲ２のシグナルの理論上の最大値は２６ＲＵであり、そのシグナルは、ランニング緩衝液中５００ｎＭのＴＮＦＲ２を使用した予備実験で達した。抗原結合の速度論の分析は、２分間の注入で６０μＬ／分の流速で実施された。抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で注入し、最終的に１００ＲＵを捕捉した。使用した機器は、ＢｉｏＣａｐチップを搭載したＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。分析には二重参照法を使用した。参照チャネルには、同じレベルのストレプトアビジンが含まれていた。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
合成されたペプチドのそれぞれに対する抗体の結合は、ＥＬＩＳＡフォーマットで試験された。表面固定されたペプチドアレイを一次抗体溶液とともにインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ）の１／１０００希釈液とともに２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２０μｌ／ｍｌの３パーセントＨ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色が測定された。発色は、電荷結合素子（ＣＣＤ）－カメラと画像処理システムで定量化された。ＣＣＤカメラから得られる値は、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に、０～３０００ｍＡＵの範囲である。
合成されたペプチドのそれぞれに対する抗体の結合は、ＥＬＩＳＡフォーマットで試験された。表面固定されたペプチドアレイを一次抗体溶液とともにインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ）の１／１０００希釈液とともに２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２０μｌ／ｍｌの３パーセントＨ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色が測定された。発色は、電荷結合素子（ＣＣＤ）－カメラと画像処理システムで定量化された。ＣＣＤカメラから得られる値は、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に、０～３０００ｍＡＵの範囲である。
ＥＬＩＳＡによって評価された、ヒトＴＮＦＲ２の一連のペプチド断片のＴＮＦＲＡＧ１に対する親和性は、以下の表２に要約されている。親和性は、カテゴリカル４ポイントスケールを使用して定性的に報告され、親和性スコア「０」は親和性が最も低く、親和性スコア「４」は親和性が最も高いことを示す。
合成されたペプチドの品質を検証するために、陽性対照ペプチドと陰性対照ペプチドの別個のセットが並行して合成された。これらは、ＴＮＦＲ２に特異的に結合しない陰性対照である抗体５７．９でスクリーニングされた（Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６４：３３０４－３３０９，１９９０））。
エピトープマッピング
ＥＬＩＳＡは、ＴＮＦＲ２の細胞外表面に存在する直線状エピトープを決定するためにも使用された。ＴＮＦＲ２一次配列内の様々な領域に対応する直線状ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入し、コーティング緩衝液で希釈し、Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸ平底マイクロたいたープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１μｇ／ウェルの濃度で配置した。一次ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体（０．１μｇ／ウェル）を基質とともにインキュベートした。げっ歯類ＩｇＧに対する二次抗体を使用して、一次抗体を検出した。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）１９０ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ を使用して吸光度を測定し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。
ＥＬＩＳＡは、ＴＮＦＲ２の細胞外表面に存在する直線状エピトープを決定するためにも使用された。ＴＮＦＲ２一次配列内の様々な領域に対応する直線状ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入し、コーティング緩衝液で希釈し、Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸ平底マイクロたいたープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１μｇ／ウェルの濃度で配置した。一次ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体（０．１μｇ／ウェル）を基質とともにインキュベートした。げっ歯類ＩｇＧに対する二次抗体を使用して、一次抗体を検出した。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）１９０ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ を使用して吸光度を測定し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。
エピトープマッピング分析の結果を図１に示し、ヒトＴＮＦＲ２の一次構造を示し、ＴＮＦＲＡＧ１などの本開示の例示的なアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体が結合する領域を強調している。エピトープマッピング研究の追加の結果を図１３Ａおよび１３Ｂに示す。まとめると、これらのデータは、配列番号１のアミノ酸残基７８～１２０に対応する、ヒトＴＮＦＲ２の相補性決定領域２（ＣＲＤ２）内のエピトープにおいてＴＮＦＲＡＧ１がＴＮＦＲ２に特異的に結合することを示す。ＴＮＦＲ２のＣＲＤ２に結合したアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の構造モデルを図１４に示す。
実施例２．アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、内因性ＴＮＦＲ２リガンドによって促進され、抗ＴＮＦα抗体によって阻害される方法でＴｒｅｇ細胞を拡大する。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１がＴｒｅｇ細胞の増殖を促進する能力を調査するために、Ｔｒｅｇ細胞の集団を様々な濃度のＴＮＦＲＡＧ１とともにインビトロで４８～７２時間インキュベートした一連の実験を実施した。インキュベーション期間の終わりに、フローサイトメトリー法を使用して、各集団におけるＴｒｅｇ細胞の割合を評価した。図２に示すように、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１は、Ｔｒｅｇ細胞に対して用量依存的な増殖効果を発揮することが判明した。図２に示すデータは、３５回の個別の実験の平均を表す。これらの結果は、ＴＮＦＲＡＧ１に類似した分子特性を有するアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、（ｉ）Ｃ１２７Ｓ変異などの残基Ｃｙｓ１２７に欠失または置換を有するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ１ドメインを含むもの、（ｉｉ）約１３３Å未満の距離で互いに隔てられる抗原結合部位を含むもの、（ｉｉｉ）配列番号２～４、または配列番号２～４のいずれか１つから保存的アミノ酸置換によって異なるアミノ酸配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含むもの、（ｉｖ）配列番号５、および１６～２３、または配列番号５、および１６～２３のいずれか１つから保存的アミノ酸置換によって異なるアミノ酸配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含むもの、および／または配列番号１の残基５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２内のヒトＴＮＦＲ２のエピトープに結合するもの）が、Ｔｒｅｇ細胞の拡大に影響を及ぼし得ることを実証する。
アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１がＴｒｅｇ細胞の増殖を促進する能力を調査するために、Ｔｒｅｇ細胞の集団を様々な濃度のＴＮＦＲＡＧ１とともにインビトロで４８～７２時間インキュベートした一連の実験を実施した。インキュベーション期間の終わりに、フローサイトメトリー法を使用して、各集団におけるＴｒｅｇ細胞の割合を評価した。図２に示すように、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１は、Ｔｒｅｇ細胞に対して用量依存的な増殖効果を発揮することが判明した。図２に示すデータは、３５回の個別の実験の平均を表す。これらの結果は、ＴＮＦＲＡＧ１に類似した分子特性を有するアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、（ｉ）Ｃ１２７Ｓ変異などの残基Ｃｙｓ１２７に欠失または置換を有するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ１ドメインを含むもの、（ｉｉ）約１３３Å未満の距離で互いに隔てられる抗原結合部位を含むもの、（ｉｉｉ）配列番号２～４、または配列番号２～４のいずれか１つから保存的アミノ酸置換によって異なるアミノ酸配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含むもの、（ｉｖ）配列番号５、および１６～２３、または配列番号５、および１６～２３のいずれか１つから保存的アミノ酸置換によって異なるアミノ酸配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含むもの、および／または配列番号１の残基５６～６０、１０１～１０７、および／または１１５～１４２内のヒトＴＮＦＲ２のエピトープに結合するもの）が、Ｔｒｅｇ細胞の拡大に影響を及ぼし得ることを実証する。
Ｔｒｅｇ細胞に対するＴＮＦＲＡＧ１の増殖効果を決定した後、ＴＮＦαなどのアゴニスト性ＴＮＦＲ２リガンドのＴＮＦＲＡＧ１のＴｒｅｇ拡大能力への影響を研究するために、一連の実験を行った。Ｔｒｅｇ細胞の集団を、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαとともに、インビトロで、単独で、または様々な濃度のＴＮＦＲＡＧ１と組み合わせてインキュベートした。図３に示すように、ＴＮＦαの存在により、ＴＮＦＲＡＧ１がＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激する能力がさらに高まることが判明した。メカニズムによって制限されることなく、これらのデータは、ＴＮＦＲＡＧ１がＴＮＦＲ２モノマーに結合し、これらの個々の分子を三量体構造を形成するのに十分な距離に近づけるＴＮＦＲＡＧ１－ＴＮＦＲ２結合モデルを裏付ける。この結合事象により、ＴＮＦαなどの別のＴＮＦＲ２リガンドが結合する可能性のあるＴＮＦＲ２表面上の部位が立体的に露出し、それによってＴＮＦＲ２活性化がさらに促進される。これらの結果は、本開示のＴＮＦＲ２アゴニストポリペプチド、例えばＴＮＦＲＡＧ１と同様の分子特性を有するものは、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、またはＴＮＦＲ２＋体細胞などのＴＮＦＲ２発現細胞の拡大をさらに増強するために、ＴＮＦαまたは本明細書に記載の別のアゴニスト性ＴＮＦＲ２リガンドと組み合わせることができることを示している。
上述のＴＮＦＲＡＧ１－ＴＮＦＲ２結合のモデルをさらに試験するために、Ｔｒｅｇ細胞を、２．５μｇ／ｍｌのＴＮＦＲＡＧ１および様々な濃度の抗ＴＮＦα抗体とともにインビトロでインキュベートした。Ｔｒｅｇ増殖に対するこの組み合わせの効果を図４に示す。これは、抗ＴＮＦα抗体が、ＴＮＦＲＡＧ１などの本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドによって誘導されるＴｒｅｇ拡大を抑制する能力を有することを示す。
まとめると、これらのデータは、ＴＮＦＲＡＧ１などの本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、およびＴＮＦＲＡＧ１と同様のＴＮＦＲ２結合特性を有するポリペプチドが、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣ、およびＴＮＦＲ＋体細胞などのＴＮＦＲ２発現細胞（例えば、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、頭の構造、眼、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、および精巣の細胞）の増殖を促進する能力を有することを実証する。これらの結果は、本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドによるＴＮＦＲ２発現細胞の拡大が、ＴＮＦαまたはアゴニスト性ＴＮＦαムテインなどのＴＮＦＲ２活性化リガンドによってさらに強化され得ることをさらに示している。
実施例３．ファージディスプレイによるアゴニストＴＮＦＲ２抗体の生成
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のインビトロタンパク質進化の例示的な方法は、当該技術分野で既知の技術であるファージディスプレイである。ファージディスプレイライブラリーは、抗体のＣＤＲまたは抗体様骨格の類似領域（例えば、１０Ｆｎ３ドメインのＢＣ、ＣＤ、およびＤＥループ）のコード配列内に設計された一連の変異またはバリエーションを作成することによって作成できる。これらの変異を導入できるテンプレート抗体コード配列は、例えば、本明細書に記載のナイーブなヒト生殖系列配列であり得る。これらの変異は、本明細書に記載されている、または当該技術分野で既知の標準的な変異導入技術を使用して行うことができる。したがって、各変異体配列は、テンプレートの配列内に１つ以上のアミノ酸変異を有することを除いて、全体的な構造がテンプレートに対応する抗体をコードする。レトロウイルスおよびファージディスプレイベクターは、本明細書に記載または当該技術分野で既知の標準的なベクター構築技術を使用して操作することができる。当該技術分野で既知のように、適合するタンパク質発現ベクターとともにＰ３ファージディスプレイベクターを使用して、本明細書に記載の抗体多様化のためのファージディスプレイベクターを生成することができる。
本明細書に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のインビトロタンパク質進化の例示的な方法は、当該技術分野で既知の技術であるファージディスプレイである。ファージディスプレイライブラリーは、抗体のＣＤＲまたは抗体様骨格の類似領域（例えば、１０Ｆｎ３ドメインのＢＣ、ＣＤ、およびＤＥループ）のコード配列内に設計された一連の変異またはバリエーションを作成することによって作成できる。これらの変異を導入できるテンプレート抗体コード配列は、例えば、本明細書に記載のナイーブなヒト生殖系列配列であり得る。これらの変異は、本明細書に記載されている、または当該技術分野で既知の標準的な変異導入技術を使用して行うことができる。したがって、各変異体配列は、テンプレートの配列内に１つ以上のアミノ酸変異を有することを除いて、全体的な構造がテンプレートに対応する抗体をコードする。レトロウイルスおよびファージディスプレイベクターは、本明細書に記載または当該技術分野で既知の標準的なベクター構築技術を使用して操作することができる。当該技術分野で既知のように、適合するタンパク質発現ベクターとともにＰ３ファージディスプレイベクターを使用して、本明細書に記載の抗体多様化のためのファージディスプレイベクターを生成することができる。
変異したＤＮＡは配列の多様性を提供し、各形質転換体のファージは、ＤＮＡによってコードされた最初のテンプレートアミノ酸配列の１つのバリアントを提示し、多数の、異なるが、しかし構造的に関連したアミノ酸配列を提示するファージ集団（ライブラリー）をもたらす。抗体超可変領域の構造が明確に定義されているため、ファージディスプレイスクリーンに導入されたアミノ酸変異は、その構造を大幅に変更することなく、結合ペプチドまたはドメインの結合特性を変更すると予想される。
典型的なスクリーニングでは、ファージライブラリーをＴＮＦＲ２由来ペプチドまたはその特定のサブコンポーネントと接触させ、結合させる。結合剤と非結合剤の分離を容易にするために、標的を固体支持体に固定することが有益である。ＴＮＦＲ２結合部分を持つファージは、固体支持体上の標的と複合体を形成することができるが、非結合ファージは溶液中に残り、過剰な緩衝液で洗い流すことができる。次いで、緩衝液を極端なｐＨ（ｐＨ２またはｐＨ１０）に変更することによって、緩衝液のイオン強度を変更することによって、変性剤を追加することによって、またはその他の既知の手段によって、結合したファージを標的から解放できる。結合ファージを単離するために、タンパク質溶出を行うことができる。
回収されたファージは、細菌細胞の感染によって増幅され、スクリーニングプロセスは、非結合抗体が枯渇し、標的ペプチドに結合する抗体が濃縮された新しいプールで繰り返すことができる。少数の結合ファージの回収でさえ、その後のスクリーニングの反復のためにファージを増幅するのに十分である。数ラウンドの選択の後、結合プール内の選択されたファージクローンに由来する抗体またはその抗原結合断片をコードする遺伝子配列が従来の方法によって決定され、標的に対するファージの結合親和性を与えるペプチド配列が明らかにされる。パニングプロセスの間、集団の配列多様性は、望ましいペプチド結合抗体が残るまで、選択の各ラウンドで減少する。配列は、少数の関連抗体またはその抗原結合断片、典型的には、各ライブラリーからの約１０９～１０１０の元の候補のうちの１０～５０に収束し得る。選択の各ラウンドで回収されたファージの数の増加は、ライブラリーの収束がスクリーニングで発生したことを示す良い指標である。結合ポリペプチドのセットが同定された後、配列情報を使用して、追加の所望の特性を有するメンバーにバイアスをかけた他の二次ファージライブラリーを設計することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１５２６６０を参照されたい）。
実施例４．ヒト化アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体の作製
本明細書に記載のヒト化ＴＮＦＲ２抗体を生成する１つの方法は、非ヒトアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＣＤＲの１つ以上、または全てをヒト抗体コンセンサス配列にインポートすることである。コンセンサスヒト抗体重鎖および軽鎖の配列は当該技術分野で知られている（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖系列配列データベース；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１）、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８，１９９２）、およびＣｏｘ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６，１９９４）を参照されたい、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）。確立された手順を使用して、コンセンサス抗体配列の可変ドメインのフレームワーク残基およびＣＤＲを識別することができる（例えば、配列アラインメントによって（前出のＫａｂａｔを参照されたい））。例えば、コンセンサス抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上、または全てを、本明細書に記載の非ヒトアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）と、本明細書に記載のヒト化アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体を生成するために、置換することができる。上述のＣＤＲ配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で知られている技術
を使用して、合成または組換えにより生成することができる。
本明細書に記載のヒト化ＴＮＦＲ２抗体を生成する１つの方法は、非ヒトアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のＣＤＲの１つ以上、または全てをヒト抗体コンセンサス配列にインポートすることである。コンセンサスヒト抗体重鎖および軽鎖の配列は当該技術分野で知られている（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖系列配列データベース；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１）、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８，１９９２）、およびＣｏｘ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６，１９９４）を参照されたい、その各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）。確立された手順を使用して、コンセンサス抗体配列の可変ドメインのフレームワーク残基およびＣＤＲを識別することができる（例えば、配列アラインメントによって（前出のＫａｂａｔを参照されたい））。例えば、コンセンサス抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上、または全てを、本明細書に記載の非ヒトアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）と、本明細書に記載のヒト化アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体を生成するために、置換することができる。上述のＣＤＲ配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で知られている技術
を使用して、合成または組換えにより生成することができる。
コンセンサスヒト抗体の可変ドメインの一例には、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５４，２９７号で同定される、重鎖可変ドメイン
[配列表６]
および軽鎖可変ドメイン
[配列表７]
が含まれる（ＣＤＲを太字で示す）。本開示のヒト化アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体を生成するために、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列の１つ以上、または全てが、本明細書に記載の非ヒトアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）と置き換えられた、上述のコンセンサス配列の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを組換え的に発現することができる。
[配列表６]
[配列表７]
互いに作動可能に連結された上述の重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で既知の原核細胞または真核細胞におけるタンパク質発現のために最適化された発現ベクター）に組み込むことができる。ヒト化抗体は、宿主細胞で発現させ、続いて、本明細書に記載のサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーなどの確立された技術を使用して、宿主細胞培地または宿主細胞から精製することができる。
実施例５．アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの投与によるヒト患者におけるＩ型糖尿病の治療
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、Ｉ型糖尿病を治療するためにヒト患者に投与することができる。例えば、Ｉ型糖尿病に罹患しているヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＢＣＧなどのＩ型糖尿病の治療に有効な別の治療薬と同時投与、混合、または別個に投与することができる。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、Ｉ型糖尿病を治療するためにヒト患者に投与することができる。例えば、Ｉ型糖尿病に罹患しているヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＢＣＧなどのＩ型糖尿病の治療に有効な別の治療薬と同時投与、混合、または別個に投与することができる。
本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体で治療されるＩ型糖尿病の進行は、いくつかの確立された方法のいずれか１つ以上によってモニターすることができる。医師は、患者が示した症状が治療に応答してどのように変化したかを評価するために、直接観察することで患者をモニターできる。さらに、患者から単離された尿試料は、ＴＮＦＲ２抗体療法の有効性を示すことができる、試料中のグルコースの含有量を決定するために分析され得る。例えば、尿試料中のグルコース含有量が高い場合、最小尿グルコース濃度が維持されるまで、患者に本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体をより高用量投与することを示し得る。
実施例６．アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの投与によるヒト患者における同種移植拒絶の治療
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、同種移植拒絶を治療するためにヒト患者に投与することができる。これらの抗体の投与は、Ｔｒｅｇ細胞の集団の増殖を誘導し、移植後の組織移植片の拒絶に関連する自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞によって開始される免疫応答を弱める。例えば、同種移植片拒絶を示すヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、ＴＮＦＲ２のＫＣＳＰＧ配列（例えば、配列番号１の残基５６～６０）の１つ以上の残基を含むエピトープに特異的に結合するＴＮＦＲ２抗体）、例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、または、コンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、免疫認識を回避し、および／または抗体の薬物動態プロファイルを改善するために、例えば、高グリコシル化またはＰＥＧとの結合によって修飾することができる。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、同種移植拒絶を治療するためにヒト患者に投与することができる。これらの抗体の投与は、Ｔｒｅｇ細胞の集団の増殖を誘導し、移植後の組織移植片の拒絶に関連する自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞によって開始される免疫応答を弱める。例えば、同種移植片拒絶を示すヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、ＴＮＦＲ２のＫＣＳＰＧ配列（例えば、配列番号１の残基５６～６０）の１つ以上の残基を含むエピトープに特異的に結合するＴＮＦＲ２抗体）、例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、または、コンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、免疫認識を回避し、および／または抗体の薬物動態プロファイルを改善するために、例えば、高グリコシル化またはＰＥＧとの結合によって修飾することができる。
本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体で治療される同種移植拒絶の進行は、いくつかの確立された方法のいずれか１つ以上によってモニターすることができる。医師は、患者が示した症状が治療に応答してどのように変化したかを評価するために、直接観察することで患者をモニターできる。本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体による治療に応答して細胞の量が変化した（例えば、減少した）かどうかを判断するために、１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞数を分析するために、患者から血液試料を採取することもできる。医師はまた、ＴＮＦＲ２抗体療法の経過中に患者内の同種移植片の体積の変動をモニターすることができる。これらの分析の結果に基づいて、医師は、同種移植片を保存するために、その後の治療ラウンドでアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のより高い／より低い投与量、またはより多く／より少ない頻度の投与を処方することができる。
実施例７．アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの投与によるヒト患者の関節リウマチの治療
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、関節リウマチを治療するためにヒト患者に投与することができる。例えば、関節リウマチに罹患しているヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＢＣＧなどの関節リウマチの治療に有効な別の治療薬と同時投与、混合、または別個に投与することができる。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、関節リウマチを治療するためにヒト患者に投与することができる。例えば、関節リウマチに罹患しているヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＢＣＧなどの関節リウマチの治療に有効な別の治療薬と同時投与、混合、または別個に投与することができる。
本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体で治療される関節リウマチの進行は、いくつかの確立された方法のいずれか１つ以上によってモニターすることができる。医師は、患者が示した症状が治療に応答してどのように変化したかを評価するために、直接観察することで患者をモニターできる。例えば、当業者は、ＴＮＦＲ２抗体療法に応答して患者が示す関節痛、関節硬直、または筋肉範囲のレベルをモニターすることができる。追加的に、患者から単離されたリンパ試料は、ＴＮＦＲ２抗体療法の有効性を示すことができる、試料中の自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を決定するために、例えば、ＦＡＣＳ分析によって分析され得る。例えば、リンパ試料中の自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が多い場合、患者に本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のより高い投与量を、患者内の自己反応性Ｔ細胞集団が排除されるまで、投与することを示すことができる。
実施例８．アゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの投与によるヒト患者の多発性硬化症の治療
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、多発性硬化症を治療するためにヒト患者に投与することができる。例えば、多発性硬化症に罹患しているヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＢＣＧなどの多発性硬化症の治療に有効な別の治療薬と同時投与、混合、または別個に投与することができる。
本開示のアゴニスト性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、多発性硬化症を治療するためにヒト患者に投与することができる。例えば、多発性硬化症に罹患しているヒト患者は、本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体（例えば、配列番号２～４および１０～１３に記載のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲのうちの１つ以上を有するか、またはＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を示すか、および／または、保存的アミノ酸置換によってＴＮＦＲＡＧ１の対応するＣＤＲ（複数可）から異なるＣＤＲの１つ以上を有する、抗体、その抗原結合断片、単鎖ポリペプチド、またはコンストラクト）を、適切な経路（例えば、静脈内）で、特定の投与量（例えば、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日）で、数日、数週間、数か月、または数年の治療単位にわたって、投与することによって治療することができる。必要に応じて、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体は、ＢＣＧなどの多発性硬化症の治療に有効な別の治療薬と同時投与、混合、または別個に投与することができる。
本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体で治療される多発性硬化症の進行は、いくつかの確立された方法のいずれか１つ以上によってモニターすることができる。医師は、患者が示した症状が治療に応答してどのように変化したかを評価するために、直接観察することで患者をモニターできる。例えば、当業者は患者をモニターして、患者がＴＮＦＲ２抗体療法に応答して視力および／または協調の改善、反射の高速化、運動活動の増加、および／または認知能力の改善を示しているかどうかを判断することができる。これらの特性の改善が観察されない場合、医師は患者にアゴニスト性ＴＮＦＲ抗体またはその抗原結合断片のより高い用量またはより頻繁な投与を処方することができる。追加的に、患者から単離されたリンパ試料は、ＴＮＦＲ２抗体療法の有効性を示すことができる、試料中の自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を決定するために、例えば、ＦＡＣＳ分析によって分析され得る。例えば、ミエリン鞘生成細胞を認識するリンパ試料中の自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が多い場合、これは、患者に本発明のアゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体のより高い投与量を、患者内の自己反応性Ｔ細胞集団が排除されるまで、投与することを示すことができる。
実施例９．ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体は、末梢ヒトＣＤ４＋細胞とのインキュベーション時にＴｒｅｇ増殖を選択的に上方制御する
ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体は、自己免疫応答を特徴とする疾患の治療に有益な属性であるＴｒｅｇ細胞活性を上方制御するために使用できる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１は、末梢ヒトＣＤ４＋細胞とのインキュベーション時にＴｒｅｇ細胞を選択的に誘導する。これは、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体とのインキュベーション後の、単離された末梢ヒトＣＤ４＋細胞の遺伝子発現および代謝特性を評価することによって確認された。Ｔｒｅｇ細胞を選択的に誘導するＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の能力は、異常なまたは過剰な免疫応答に関連する病態を治療するためのそのような抗体の有用性をさらに証明する。
ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体は、自己免疫応答を特徴とする疾患の治療に有益な属性であるＴｒｅｇ細胞活性を上方制御するために使用できる。アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体であるＴＮＦＲＡＧ１は、末梢ヒトＣＤ４＋細胞とのインキュベーション時にＴｒｅｇ細胞を選択的に誘導する。これは、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体とのインキュベーション後の、単離された末梢ヒトＣＤ４＋細胞の遺伝子発現および代謝特性を評価することによって確認された。Ｔｒｅｇ細胞を選択的に誘導するＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の能力は、異常なまたは過剰な免疫応答に関連する病態を治療するためのそのような抗体の有用性をさらに証明する。
材料および方法
調査研究参加者
採血を伴うヒト試験は、マサチューセッツ総合病院およびパートナーヘルスケアによって承認された（研究番号２００７Ｐ００１３４７、２０１２Ｐ００２２４３、および２０１３Ｐ００２６３３）。インフォームドコンセントは全ての対象から得られ、実験は世界医師会ヘルシンキ宣言および保健社会福祉省ベルモント・レポートに記載された原則に準拠した。研究参加者からＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に全血を採取し、瀉血から２時間以内に処理した。
調査研究参加者
採血を伴うヒト試験は、マサチューセッツ総合病院およびパートナーヘルスケアによって承認された（研究番号２００７Ｐ００１３４７、２０１２Ｐ００２２４３、および２０１３Ｐ００２６３３）。インフォームドコンセントは全ての対象から得られ、実験は世界医師会ヘルシンキ宣言および保健社会福祉省ベルモント・レポートに記載された原則に準拠した。研究参加者からＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に全血を採取し、瀉血から２時間以内に処理した。
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
新鮮なヒト全血を１×ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋２％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、磁気ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）ダイレクトヒト単球単離キットまたはＥＡＳＹＳＥＰ（商標）ダイレクトヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の使用説明書に従って単離した。簡潔に述べると、１，２００μＬのＩｓｏｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌおよび１，２００μＬのＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳ（商標）を５０ｍＬ遠心管内で２４ｍＬの全血と混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳを２４ｍＬ加え、チューブをＥａｓｙ ５０ ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）マグネット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入れた。これにより、不要な細胞がチューブの側面に固定された。１０分後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が濃縮された懸濁液を新しいチューブに移し、磁気分離プロセスを新しいＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳ（商標）で５分間繰り返した。得られた高度に濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞懸濁液を新しいチューブに移し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マグネットを使用して３回目の精製を行った。最終的なＣＤ４＋Ｔ細胞調製物の純度は＞９５％であった。単離されたＣＤ４＋細胞を、ＲＰＭＩ ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を９６ウェル丸底プレートに０．２～１×１０６細胞／ウェルの濃度で播種し、様々な試薬で処理し、３７℃、５％ＣＯ２で最大７２時間インキュベートした。全てのインビトロ細胞培養実験には、培地中に低レベルのＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）が含まれていた。
新鮮なヒト全血を１×ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋２％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、磁気ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）ダイレクトヒト単球単離キットまたはＥＡＳＹＳＥＰ（商標）ダイレクトヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の使用説明書に従って単離した。簡潔に述べると、１，２００μＬのＩｓｏｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌおよび１，２００μＬのＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳ（商標）を５０ｍＬ遠心管内で２４ｍＬの全血と混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳを２４ｍＬ加え、チューブをＥａｓｙ ５０ ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）マグネット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入れた。これにより、不要な細胞がチューブの側面に固定された。１０分後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が濃縮された懸濁液を新しいチューブに移し、磁気分離プロセスを新しいＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳ（商標）で５分間繰り返した。得られた高度に濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞懸濁液を新しいチューブに移し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マグネットを使用して３回目の精製を行った。最終的なＣＤ４＋Ｔ細胞調製物の純度は＞９５％であった。単離されたＣＤ４＋細胞を、ＲＰＭＩ ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を９６ウェル丸底プレートに０．２～１×１０６細胞／ウェルの濃度で播種し、様々な試薬で処理し、３７℃、５％ＣＯ２で最大７２時間インキュベートした。全てのインビトロ細胞培養実験には、培地中に低レベルのＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）が含まれていた。
試薬およびフローサイトメトリー
試薬、ならびにヒトＴＮＦＲ２および分泌ＴＮＦＲ２（ｓＴＮＦＲ２）に対するフローサイトメトリーｍＡｂは、社内で製造されるか、外部の商用ベンダーから入手された。組換えヒトＴＮＦαおよびＩＬ－２は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｍＡｂのＦ（ａｂ’）２断片は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆ（ａｂ’）２調製キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して調製された。抗体ＭＡＢ２２６１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴＮＦＲ２細胞表面発現の測定に使用された。げっ歯類ＩｇＧに対する架橋抗体（ａｂ９１６５）は、Ａｂｃａｍから購入した。製造元の使用説明書に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してフローサイトメトリー用に細胞を調製した。蛍光染色した細胞を１×ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＴｒｅｇのＦＡＣＳ分析に使用した抗体には、ＦｏｘＰ３の細胞内染色用のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＦｏｘＰ３（クローン２５９Ｄ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ２５の細胞表面染色用のフィコエリトリン抗ヒトＣＤ２５（クローンＢＣ９６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）が含まれた。Ｔｒｅｇ集団は、ＦＬ２（赤）対ＦＬ１（緑）を使用してＦＡＣＳによって評価され、ＣＤ２５ｈｉおよびＦｏｘＰ３＋として定義され、一方、Ｔｅｆｆ集団はＣＤ２５ｈｉおよびＦｏｘＰ３＋として定義された。細胞抑制アッセイでは、レスポンダーをカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ８－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（クローンＳＫ１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＦＬ４（極赤）対ＦＬ１（緑）を用いたＦＡＣＳによって分析した（図３）。ＴＮＦＲ２に対するモノクローナル抗体は、この文書で以前に説明したように、社内で製造するか、商用ベンダーから購入した。ＦＡＣＳデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．０．８）を使用して処理され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で分析された。
試薬、ならびにヒトＴＮＦＲ２および分泌ＴＮＦＲ２（ｓＴＮＦＲ２）に対するフローサイトメトリーｍＡｂは、社内で製造されるか、外部の商用ベンダーから入手された。組換えヒトＴＮＦαおよびＩＬ－２は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｍＡｂのＦ（ａｂ’）２断片は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆ（ａｂ’）２調製キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して調製された。抗体ＭＡＢ２２６１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴＮＦＲ２細胞表面発現の測定に使用された。げっ歯類ＩｇＧに対する架橋抗体（ａｂ９１６５）は、Ａｂｃａｍから購入した。製造元の使用説明書に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してフローサイトメトリー用に細胞を調製した。蛍光染色した細胞を１×ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＴｒｅｇのＦＡＣＳ分析に使用した抗体には、ＦｏｘＰ３の細胞内染色用のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＦｏｘＰ３（クローン２５９Ｄ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ２５の細胞表面染色用のフィコエリトリン抗ヒトＣＤ２５（クローンＢＣ９６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）が含まれた。Ｔｒｅｇ集団は、ＦＬ２（赤）対ＦＬ１（緑）を使用してＦＡＣＳによって評価され、ＣＤ２５ｈｉおよびＦｏｘＰ３＋として定義され、一方、Ｔｅｆｆ集団はＣＤ２５ｈｉおよびＦｏｘＰ３＋として定義された。細胞抑制アッセイでは、レスポンダーをカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ８－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（クローンＳＫ１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＦＬ４（極赤）対ＦＬ１（緑）を用いたＦＡＣＳによって分析した（図３）。ＴＮＦＲ２に対するモノクローナル抗体は、この文書で以前に説明したように、社内で製造するか、商用ベンダーから購入した。ＦＡＣＳデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．０．８）を使用して処理され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で分析された。
分泌されたＴＮＦＲ２の測定
分泌されたＴＮＦＲ２（ｓＴＮＦＲ２）は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をいくつかの変更を加えて使用して、細胞培養上清から測定された。簡潔に述べると、ＣＤ４＋細胞をＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）単独、またはＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＴＮＦＲ２ｍＡｂ（１２．５ｍｇ／ｍｌ）と一緒に、２４～４２時間インキュベートした後、上清を収集し、ウェルあたり２ｍｇのＴＮＦＲ２指向性抗体でコーティングされた市販のプレートまたはカスタムプレートのいずれかの上でインキュベートされた。ＥＬＩＳＡは、製造者の使用説明書に従って実施した。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（商標）１９０ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ を使用して吸光度を測定し、ＳＯＦＴＭＡＸ ＰＲＯ（商標）６．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。ＲＮＡ単離および遺伝子発現分析のために、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）、およびＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦＲ２アンタゴニストｍＡｂ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で３時間インキュベートした。
分泌されたＴＮＦＲ２（ｓＴＮＦＲ２）は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をいくつかの変更を加えて使用して、細胞培養上清から測定された。簡潔に述べると、ＣＤ４＋細胞をＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）単独、またはＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＴＮＦＲ２ｍＡｂ（１２．５ｍｇ／ｍｌ）と一緒に、２４～４２時間インキュベートした後、上清を収集し、ウェルあたり２ｍｇのＴＮＦＲ２指向性抗体でコーティングされた市販のプレートまたはカスタムプレートのいずれかの上でインキュベートされた。ＥＬＩＳＡは、製造者の使用説明書に従って実施した。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（商標）１９０ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ を使用して吸光度を測定し、ＳＯＦＴＭＡＸ ＰＲＯ（商標）６．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。ＲＮＡ単離および遺伝子発現分析のために、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）、およびＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦＲ２アンタゴニストｍＡｂ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で３時間インキュベートした。
細胞増殖および抑制アッセイ
末梢血白血球（ＰＢＬ）の増殖実験では、ＰＢＬを１μＭのＣＦＳＥで染色した。抗ＣＤ３ｍＡｂ（５μｇｍｌ－１）（ＯＫＴ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でプレコートした９６ウェルプレートに、ウェルあたり２×１０５細胞の密度で細胞を播種した。４日後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。増殖率は、分裂している細胞のパーセンテージによって計算された。Ｔｒｅｇ抑制アッセイでは、応答細胞として自家ＰＢＭＣを使用した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用した密度勾配分離によって静脈穿刺の日に収集され、－８０℃で凍結保存され、前日に解凍され、Ｔｒｅｇと混合され、１％ＦＢＳ、および１０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で一晩静置した。翌日、レスポンダー細胞をＣＦＳＥ（１μＭ）で染色した。レスポンダー細胞（５×１０４細胞）と増殖したＴｒｅｇを培養液中で０：１、１：１、２：１、および４：１の比率で混合し、抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＩＬ－２（５０Ｕｍｌ－１）で刺激した。４日後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。抑制指数は、分裂したレスポンダー細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージによって計算された。抑制指数は、次の式を使用して計算された。（ＴｒｅｇなしのＴｒｅｇ増殖－ＴｒｅｇありのＴｒｅｓｐ増殖）／ＴｒｅｇなしのＴｒｅｓｐ増殖。
末梢血白血球（ＰＢＬ）の増殖実験では、ＰＢＬを１μＭのＣＦＳＥで染色した。抗ＣＤ３ｍＡｂ（５μｇｍｌ－１）（ＯＫＴ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でプレコートした９６ウェルプレートに、ウェルあたり２×１０５細胞の密度で細胞を播種した。４日後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。増殖率は、分裂している細胞のパーセンテージによって計算された。Ｔｒｅｇ抑制アッセイでは、応答細胞として自家ＰＢＭＣを使用した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用した密度勾配分離によって静脈穿刺の日に収集され、－８０℃で凍結保存され、前日に解凍され、Ｔｒｅｇと混合され、１％ＦＢＳ、および１０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で一晩静置した。翌日、レスポンダー細胞をＣＦＳＥ（１μＭ）で染色した。レスポンダー細胞（５×１０４細胞）と増殖したＴｒｅｇを培養液中で０：１、１：１、２：１、および４：１の比率で混合し、抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＩＬ－２（５０Ｕｍｌ－１）で刺激した。４日後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。抑制指数は、分裂したレスポンダー細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージによって計算された。抑制指数は、次の式を使用して計算された。（ＴｒｅｇなしのＴｒｅｇ増殖－ＴｒｅｇありのＴｒｅｓｐ増殖）／ＴｒｅｇなしのＴｒｅｓｐ増殖。
細胞抑制アッセイ
抑制アッセイでは、レスポンダーとして末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配を使用して静脈穿刺の日に分離され、－８０℃で凍結保存された。細胞をＴｒｅｇと混合する前日に解凍し、ＲＰＭＩ１６４０およびＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）中で一晩静置した。翌日、レスポンダー細胞を１ｍＭ ＣＦＳＥで染色した。次いで、レスポンダー細胞（５×１０４細胞）を、１４～１７日間拡大したＴｒｅｇと様々な比率（０：１、４：１、２：１、１：１）で混合した。混合物を、抗ＣＤ３ｍＡｂ、ヒトＣＤ３タンパク質に対する抗体（ＨＩＴ３ａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、または２：１の比率（細胞／ビーズ）でのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）のいずれか、およびＩＬ－２（５０～２００Ｕ／ｍｌ）で刺激した。４～６日後に細胞を収集し、ＣＤ８－ＡＰＣ（クローンＳＫ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＣＤ８＋Ｔ細胞数対ＣＦＳＥのＦＡＣＳ分析によって細胞分裂の抑制を評価した。
抑制アッセイでは、レスポンダーとして末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配を使用して静脈穿刺の日に分離され、－８０℃で凍結保存された。細胞をＴｒｅｇと混合する前日に解凍し、ＲＰＭＩ１６４０およびＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）中で一晩静置した。翌日、レスポンダー細胞を１ｍＭ ＣＦＳＥで染色した。次いで、レスポンダー細胞（５×１０４細胞）を、１４～１７日間拡大したＴｒｅｇと様々な比率（０：１、４：１、２：１、１：１）で混合した。混合物を、抗ＣＤ３ｍＡｂ、ヒトＣＤ３タンパク質に対する抗体（ＨＩＴ３ａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、または２：１の比率（細胞／ビーズ）でのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）のいずれか、およびＩＬ－２（５０～２００Ｕ／ｍｌ）で刺激した。４～６日後に細胞を収集し、ＣＤ８－ＡＰＣ（クローンＳＫ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＣＤ８＋Ｔ細胞数対ＣＦＳＥのＦＡＣＳ分析によって細胞分裂の抑制を評価した。
転写プロファイリング分析（ＲＮＡｓｅｑ）
ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して正常ドナーの末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞から全ＲＮＡを単離し、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ）のＣＣＣＢ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって処理した。ｍＲＮＡは、２．５ｕｇ／ｍｌの濃度で６時間、ＴＮＦＲ２抗体の存在下または非存在下で培養された、単離された新鮮なＣＤ４＋Ｔ細胞から調製された。ＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを使用して判定した。ＲＩＮ値が６より大きく、ＤＮＡ混入が１０％未満のＲＮＡをライブラリー調製に使用した。１００ｎｇの全ＲＮＡを投入し、ＮＥＢＮＥＸＴＴＮＰｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを使用してポリＡの選択を実施した。得られたｍＲＮＡは、ＮＥＢＮＥＸＴ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）を使用したライブラリー調製に使用された。ＲＮＡｓｅｑライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーの高感度ＤＮＡチップで実施され、ライブラリーの機能濃度は、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用したｑＰＣＲによって決定された。配列決定するライブラリーを２ｎＭの濃度でプールし、次いで変性し、最終濃度２ｐＭに希釈して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００にロードした。参照ゲノムＨＧ１９に対するリードのアラインメントは、ＴｏｐＨａｔを使用して実施され、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを使用して分析された。結果のデータは、Ｒ－Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ パッケージＡｎｄｅｒｓ，Ｈｕｂｅｒ ＲＥＦ）の一部であるＤＥＳｅｑを使用して正規化された。正規化されたデータは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｒ統計プログラミング言語（Ｒｅｆ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して分析された。
ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して正常ドナーの末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞から全ＲＮＡを単離し、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ）のＣＣＣＢ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって処理した。ｍＲＮＡは、２．５ｕｇ／ｍｌの濃度で６時間、ＴＮＦＲ２抗体の存在下または非存在下で培養された、単離された新鮮なＣＤ４＋Ｔ細胞から調製された。ＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを使用して判定した。ＲＩＮ値が６より大きく、ＤＮＡ混入が１０％未満のＲＮＡをライブラリー調製に使用した。１００ｎｇの全ＲＮＡを投入し、ＮＥＢＮＥＸＴＴＮＰｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを使用してポリＡの選択を実施した。得られたｍＲＮＡは、ＮＥＢＮＥＸＴ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）を使用したライブラリー調製に使用された。ＲＮＡｓｅｑライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーの高感度ＤＮＡチップで実施され、ライブラリーの機能濃度は、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用したｑＰＣＲによって決定された。配列決定するライブラリーを２ｎＭの濃度でプールし、次いで変性し、最終濃度２ｐＭに希釈して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００にロードした。参照ゲノムＨＧ１９に対するリードのアラインメントは、ＴｏｐＨａｔを使用して実施され、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを使用して分析された。結果のデータは、Ｒ－Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ パッケージＡｎｄｅｒｓ，Ｈｕｂｅｒ ＲＥＦ）の一部であるＤＥＳｅｑを使用して正規化された。正規化されたデータは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｒ統計プログラミング言語（Ｒｅｆ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して分析された。
統計学的方法
統計的有意性は、ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙまたはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、およびＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ－５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して外れ値を削除するＧｒｕｂｂ検定を使用して決定された。計算は、ＳＡＳバージョン９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）、Ｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｌａｎｇｕａｇｅ、または Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して実施された。信頼度は０．０５に設定された。
統計的有意性は、ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙまたはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、およびＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ－５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して外れ値を削除するＧｒｕｂｂ検定を使用して決定された。計算は、ＳＡＳバージョン９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）、Ｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｌａｎｇｕａｇｅ、または Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して実施された。信頼度は０．０５に設定された。
結果
ＴＮＦＲ２発現とＴＮＦＲ２アゴニスト作用
ヒトＴ細胞集団におけるＴＮＦＲ２発現の評価は、ヒト対象のコホート間で有意差があることを実証する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して、がんの対象は、健常な対象または１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のＴｒｅｇ上で有意に高いレベルのＴＮＦＲ２を発現する（図６Ａ）。対照的に、Ｔ１Ｄ対象は、がん患者のいずれかの正常な対象よりもＴｅｆｆ上で有意に高いレベルのＴＮＦＲ２を発現する（図６Ｂ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＮＦＲ２アゴニスト抗体で処理すると、Ｔｒｅｇ細胞が用量依存的に増殖する（図６Ｃ）。天然のリガンドであるＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でも、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の濃度が上昇しても有意差はない（対応ｔ検定、ｐ＞０．５）（図６Ｄ）。これは、ＴＮＦα自体がＴｒｅｇ増殖に有効であるにもかかわらず、ＴＮＦαがＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の有効性を増強しないことを実証する。したがって、アゴニスト抗体ＴＮＦＲＡＧ１はＴＮＦαに依存せずに機能する。
ＴＮＦＲ２発現とＴＮＦＲ２アゴニスト作用
ヒトＴ細胞集団におけるＴＮＦＲ２発現の評価は、ヒト対象のコホート間で有意差があることを実証する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して、がんの対象は、健常な対象または１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のＴｒｅｇ上で有意に高いレベルのＴＮＦＲ２を発現する（図６Ａ）。対照的に、Ｔ１Ｄ対象は、がん患者のいずれかの正常な対象よりもＴｅｆｆ上で有意に高いレベルのＴＮＦＲ２を発現する（図６Ｂ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＮＦＲ２アゴニスト抗体で処理すると、Ｔｒｅｇ細胞が用量依存的に増殖する（図６Ｃ）。天然のリガンドであるＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でも、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の濃度が上昇しても有意差はない（対応ｔ検定、ｐ＞０．５）（図６Ｄ）。これは、ＴＮＦα自体がＴｒｅｇ増殖に有効であるにもかかわらず、ＴＮＦαがＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の有効性を増強しないことを実証する。したがって、アゴニスト抗体ＴＮＦＲＡＧ１はＴＮＦαに依存せずに機能する。
Ｔｒｅｇの拡大と可溶性ＴＮＦＲ２の評価
ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体のＦ（ａｂ’）２断片の評価は、Ｔｒｅｇ増殖に対するＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の活性がＦｃ領域に依存しないことを実証する（図７Ａ）。げっ歯類抗ＩｇＧ抗体とＴＮＦＲ２アゴニストとの共培養は、用量依存的にＴｒｅｇ増殖を阻害しないという観察からも明らかなように、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の機能活性も受容体架橋とは独立する（図７Ｂ）。これらのデータは、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の作用機序が、架橋またはＦｃ結合の効果を無効にする活性化経路によるものであることを示唆する。一貫して、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体によって媒介される活性化と比較した場合、天然リガンドであるＴＮＦαの濃度が上昇に伴うＴｒｅｇの比率について、同様の用量依存的な増加が観察される（図７Ｃ）。追加的に、ＣＤ４＋細胞をＴＮＦαで処理すると、ＴＮＦＲ２アゴニストの存在下で培養液中の可溶性ＴＮＦＲ２が増加する傾向をもたらす（図７Ｄ）。
ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体のＦ（ａｂ’）２断片の評価は、Ｔｒｅｇ増殖に対するＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の活性がＦｃ領域に依存しないことを実証する（図７Ａ）。げっ歯類抗ＩｇＧ抗体とＴＮＦＲ２アゴニストとの共培養は、用量依存的にＴｒｅｇ増殖を阻害しないという観察からも明らかなように、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の機能活性も受容体架橋とは独立する（図７Ｂ）。これらのデータは、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体の作用機序が、架橋またはＦｃ結合の効果を無効にする活性化経路によるものであることを示唆する。一貫して、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体によって媒介される活性化と比較した場合、天然リガンドであるＴＮＦαの濃度が上昇に伴うＴｒｅｇの比率について、同様の用量依存的な増加が観察される（図７Ｃ）。追加的に、ＣＤ４＋細胞をＴＮＦαで処理すると、ＴＮＦＲ２アゴニストの存在下で培養液中の可溶性ＴＮＦＲ２が増加する傾向をもたらす（図７Ｄ）。
拡大したＴｒｅｇ細胞の機能評価
ＴＮＦＲ２アゴニストを使用してインビトロで拡大したＴｒｅｇ細胞の機能的能力を決定するために、１型糖尿病患者からの自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するそれらの能力を試験した。共培養では、レスポンダー、ＣＤ８＋Ｔ細胞（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色）の増殖能力が、レスポンダーと比較して、Ｔｒｅｇの多い割合の存在によって阻害されることが判明した（図８Ｃ－８Ｅ、左）。追加的に、レスポンダーであるＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＦＳＥで染色）の増殖能力は、（ｉ）ＴＮＦα（図８Ｃ～８Ｅ、中央）またはＴＮＦＲ２アゴニスト抗体およびラパマイシン（図８Ｃ～８Ｅ、右）の存在下で拡大したＴｒｅｇ細胞によって阻害された。試験した条件のうち、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の最大の抑制は、レスポンダー細胞をＴｒｅｇ細胞と最低比率のＴｒｅｇ：レスポンダー（１：１）でインキュベートした場合、およびレスポンダー細胞を、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体で拡大されたＴｒｅｇ細胞とインキュベートした場合に観察された。
ＴＮＦＲ２アゴニストを使用してインビトロで拡大したＴｒｅｇ細胞の機能的能力を決定するために、１型糖尿病患者からの自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するそれらの能力を試験した。共培養では、レスポンダー、ＣＤ８＋Ｔ細胞（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色）の増殖能力が、レスポンダーと比較して、Ｔｒｅｇの多い割合の存在によって阻害されることが判明した（図８Ｃ－８Ｅ、左）。追加的に、レスポンダーであるＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＦＳＥで染色）の増殖能力は、（ｉ）ＴＮＦα（図８Ｃ～８Ｅ、中央）またはＴＮＦＲ２アゴニスト抗体およびラパマイシン（図８Ｃ～８Ｅ、右）の存在下で拡大したＴｒｅｇ細胞によって阻害された。試験した条件のうち、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の最大の抑制は、レスポンダー細胞をＴｒｅｇ細胞と最低比率のＴｒｅｇ：レスポンダー（１：１）でインキュベートした場合、およびレスポンダー細胞を、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体で拡大されたＴｒｅｇ細胞とインキュベートした場合に観察された。
まとめると、これらの実験は、ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体ＴＮＦＲＡＧ１、ならびにＴＮＦＲＡＧ１と同様の構造特性（例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲの１つ以上または全てを有する抗体）および／またはＴＮＦＲ２結合特性を有する抗体の、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を実証する。ＴＮＦＲＡＧ１および類似の抗体が、自己組織に対する不適切な免疫応答を開始し、自己免疫疾患または他の状態を引き起こすＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制することができるので、この表現型は、特に自己免疫疾患、および自己組織に対する異常な免疫応答によって引き起こされる本明細書に記載されているような他の状態の治療に重要な治療上の利点を提供する。
代謝活性の評価によるＴｒｅｇ拡大の評価
ＴＮＦＲＡＧ１によるＴｒｅｇ細胞の拡大に関する追加の証拠は、アゴニスト抗体が単離された末梢ＣＤ４＋細胞で代謝シフトを誘導するという観察によって提供される。特に、そのような細胞とＴＮＦＲＡＧ１をインキュベートすると、細胞が解糖の低下（図１０Ｂ）、グルタミノリシスの上昇（図１０Ｃ）、および脂肪酸代謝の上昇（図１２Ａ～１２Ｄ）を示すことが観察された。この代謝シフトは、ＴＮＦＲＡＧ１などのＴＮＦＲ２アゴニスト抗体が、単離されたリンパ球間のＴｒｅｇ細胞増殖を選択的に上方制御したことを実証する。追加的に、ＴＮＦＲＡＧ１は、クレブス回路に関与する初期遺伝子の発現を増加させ、クレブス回路後半に関与する遺伝子の発現を低下させることが判明した（図１１Ａ～１１Ｃ）。この観察は、Ｔｒｅｇ拡大のさらなる証拠であるだけでなく、クレブス回路の初期段階から生じる代謝物の１つであるイタコン酸が自己免疫の強力な抑制剤であるため、重要である。まとめると、これらのデータは、ＴＮＦＲＡＧ１、および類似の構造特性（例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ、またはＴＮＦＲＡＧ１内の対応するＣＤＲに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するＣＤＲの１つ以上、または全てを有する抗体）、および／またはエピトープ結合特性を有する抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を選択的に誘導し、抗炎症代謝産物を上方制御することにより、自己免疫を抑制できる。
ＴＮＦＲＡＧ１によるＴｒｅｇ細胞の拡大に関する追加の証拠は、アゴニスト抗体が単離された末梢ＣＤ４＋細胞で代謝シフトを誘導するという観察によって提供される。特に、そのような細胞とＴＮＦＲＡＧ１をインキュベートすると、細胞が解糖の低下（図１０Ｂ）、グルタミノリシスの上昇（図１０Ｃ）、および脂肪酸代謝の上昇（図１２Ａ～１２Ｄ）を示すことが観察された。この代謝シフトは、ＴＮＦＲＡＧ１などのＴＮＦＲ２アゴニスト抗体が、単離されたリンパ球間のＴｒｅｇ細胞増殖を選択的に上方制御したことを実証する。追加的に、ＴＮＦＲＡＧ１は、クレブス回路に関与する初期遺伝子の発現を増加させ、クレブス回路後半に関与する遺伝子の発現を低下させることが判明した（図１１Ａ～１１Ｃ）。この観察は、Ｔｒｅｇ拡大のさらなる証拠であるだけでなく、クレブス回路の初期段階から生じる代謝物の１つであるイタコン酸が自己免疫の強力な抑制剤であるため、重要である。まとめると、これらのデータは、ＴＮＦＲＡＧ１、および類似の構造特性（例えば、ＴＮＦＲＡＧ１のＣＤＲ、またはＴＮＦＲＡＧ１内の対応するＣＤＲに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するＣＤＲの１つ以上、または全てを有する抗体）、および／またはエピトープ結合特性を有する抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を選択的に誘導し、抗炎症代謝産物を上方制御することにより、自己免疫を抑制できる。
結論
これらの実験の結果は、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１、および同様の構造および／またはエピトープ結合特性を有する抗体を使用して、（ｉ）Ｔｒｅｇ細胞および（ｉｉ）重要な抗炎症代謝産物を選択的に上方制御できることを実証する。メカニズムによって制限されることなく、これらの特徴は、本開示のＴＮＦＲ２アゴニスト抗体を使用して、自己抗原に対する異常な免疫応答に関連する疾患を治療することができる２つ可能性のあるモダリティを表す。
これらの実験の結果は、アゴニスト性ＴＮＦＲ２抗体ＴＮＦＲＡＧ１、および同様の構造および／またはエピトープ結合特性を有する抗体を使用して、（ｉ）Ｔｒｅｇ細胞および（ｉｉ）重要な抗炎症代謝産物を選択的に上方制御できることを実証する。メカニズムによって制限されることなく、これらの特徴は、本開示のＴＮＦＲ２アゴニスト抗体を使用して、自己抗原に対する異常な免疫応答に関連する疾患を治療することができる２つ可能性のあるモダリティを表す。
他の実施形態
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々独立して刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々独立して刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、その具体的な実施形態と関連して説明されてきたが、本発明はさらなる修正が可能であり、この出願は、一般に本明細書に記載の原理に従い、既知または慣行に含まれ、本発明が関係する技術の範囲内であり、前述の本質的な特徴に適用することができ、特許請求の範囲の範囲に従う本発明からのそのような逸脱を含む、本明細書に記載のあらゆる変形、使用、または適応をカバーすることを意図していることを理解されたい。
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
Claims (373)
- システインリッチドメイン（ＣＲＤ）１（ＣＲＤ１）、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒト腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）に特異的に結合し、ＣＲＤ４内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合しない、抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）システイン残基１２７において欠失もしくは置換を含むヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２重鎖定常１（ＣＨ１）ドメインを含み、
（ｂ）約１３３Å未満の距離で、互いに隔てられる抗原結合部位を含み、
（ｃ）
（ｉ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲ－Ｈ１）を含み、
各々のＺ１は、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２は、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３は、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４は、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンであり、かつ／あるいは
（ｄ）ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、もしくはＦであり、各々のＸ２は、独立して、ＭもしくはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥもしくはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳもしくはＲである、抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、システイン残基１２７において欠失または置換を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ１ドメインを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＣＨ１ドメインがＣ１２７Ｓ変異を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１３３Å未満の距離で隔てられる少なくとも２つの抗原結合部位を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約９０Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約９５Å～約１３０Åの距離で隔てられる、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約９８Å～約１２８Åの距離で隔てられる、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１０５Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１０Å～約１２２Åの距離で隔てられる、請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１１９Åの距離で隔てられる、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１７Åの距離で隔てられる、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１２０Å～約１２９Åの距離で隔てられる、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１２３Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項２３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１２５Åの距離で隔てられる、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ３アイソタイプを有する、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ１内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸残基５６～６０（ＫＣＳＰＧ）のうちの１つ以上によって定義される、請求項２８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ２内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳ、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上または全てをさらに含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上または全てを含む、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１がアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有する、請求項３４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲを含む、請求項３５に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２７～３６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項３７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項３８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項３９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１がアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有する、請求項４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲを含む、請求項４２に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２７～３３および４１～４３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項４４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項４５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項４６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、非天然の定常領域を含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記非天然の定常領域が、ヒトの定常領域である、請求項４８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠き、天然Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠き、またはＦｃドメインを欠く、請求項１～４９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、もしくはＦであり、各々のＸ２は、独立してＭもしくはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥもしくはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳもしくはＲである、請求項１～５０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳ（配列番号１６）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳ（配列番号１７）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号１８）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳ（配列番号１９）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｅ）ＴＦＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２０）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｆ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＴＳ（配列番号２１）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｇ）ＴＲＤＴＳＴＮＴＶＹＭＥＬＴＳＬＲＳ（配列番号２２）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、および
（ｈ）ＴＡＤＴＳＴＤＲＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記フレームワーク領域が、前記抗体またはその抗原結合断片内のＣＤＲ－Ｈ２に隣接している、請求項１～５２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記フレームワーク領域が、前記抗体またはその抗原結合断片内のＣＤＲ－Ｈ３に隣接している、請求項１～５３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記フレームワーク領域が、前記ＣＤＲ－Ｈ２とＣＤＲ－Ｈ３との間に位置する、請求項５４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）内のエピトープにおいて前記ＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項１～５５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化する、請求項１～５６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１０ｎＭを超えないＫＤでＴＮＦＲ２に結合する、請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１ｎＭを超えないＫＤでＴＮＦＲ２に結合する、請求項５８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２に結合して、少なくとも約１０４Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで抗体抗原複合体を形成する、請求項１～５９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２に結合して、少なくとも約１０５Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで抗体抗原複合体を形成する、請求項６０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２に結合して、抗体抗原複合体を形成し、前記複合体が約１０－３ｓ－１を超えないｋｏｆｆで解離する、請求項１～６１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１０－４ｓ－１を超えないｋｏｆｆでＴＮＦＲ２から解離する、請求項６２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖を促進する、請求項１～６３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記Ｔｒｅｇ細胞が、ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗを発現する、請求項６４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を直接殺傷するか、またはその死を促進する、請求項１～６５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンα、およびリンホトキシンβからなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子のレベルの増加を促進する、請求項１～６６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンα、およびリンホトキシンβからなる群から選択される１つ以上のタンパク質のレベルの増加を促進する、請求項１～６７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、対象への投与時にイタコン酸のレベルの増加を促進し、任意選択で前記対象がヒト対象である、請求項１～６８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体またはその抗原結合断片を同定する方法であって、
（ａ）抗体またはその断片の混合物を、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２内の５つ以上の連続または不連続のアミノ酸残基を含む少なくとも１つのペプチドと接触させることと、
（ｂ）前記ペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片を前記混合物から分離し、それにより、少なくとも１つの前記ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体または抗原結合断片を含む濃縮された抗体混合物を生成することと、
（ｃ）前記濃縮された抗体混合物を、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ３および／またはＣＲＤ４内の５つ以上の連続または不連続のアミノ酸残基を含む少なくとも１つのペプチドに暴露し、前記ペプチドに特異的に結合しない抗体またはその断片を残し、それにより、少なくとも１つのＴＮＦＲ２アゴニスト抗体またはその抗原結合断片を含む抗体混合物を生成することと、を含む、方法。 - 前記方法が、前記濃縮された抗体混合物中の前記抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上のアミノ酸配列を決定することを含む、請求項７０に記載の方法。
- 前記（ａ）および／または（ｃ）のペプチドが、表面に結合している、請求項７０または７１に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ファージ、細菌細胞、または酵母細胞の表面上で発現する、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、リボソームに非共有結合しているか、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡに共有結合している、１つ以上のポリペプチド鎖として発現する、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記（ａ）および／または（ｃ）のペプチドが検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項７０～７４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、蛍光分子およびエピトープタグからなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
- 前記蛍光分子が、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ヘキスト、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、テトラメチルロアドミン、およびシアニンからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
- 前記エピトープタグが、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、ビオチン、およびストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
- ステップ（ａ）および（ｂ）が１回以上逐次的に繰り返される、請求項７０～７８のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項７０～７９のいずれか１項に記載の方法によって産生される抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、ポリクローナル抗体またはその抗原結合断片、ヒト抗体またはその抗原結合断片、ヒト化抗体またはその抗原結合断片、霊長類化抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体またはその抗原結合断片、多重特異性抗体またはその抗原結合断片、二重可変免疫グロブリンドメイン、一価抗体またはその抗原結合断片、キメラ抗体またはその抗原結合断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ディアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質足場、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２分子、およびタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）からなる群から選択され、任意選択で前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体もしくはその抗原結合断片、ヒト化抗体もしくはその抗原結合断片、またはキメラ抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項１～６９および８０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、単鎖ポリペプチドである、請求項１～６９、８０、および８１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項８２に記載の単鎖ポリペプチドに対するヒトＴＮＦＲ２の結合を競合的に阻害する、単鎖ポリペプチド。
- 第１のポリペプチドドメインおよび第２のポリペプチドドメインを含むコンストラクトであって、前記第１のポリペプチドドメインおよび前記第２のポリペプチドドメインが、各々独立して、請求項８２または８３に記載の単鎖ポリペプチドを含む、コンストラクト。
- 前記コンストラクトがヒトＦｃドメインを含む、請求項８４に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトがマウスＦｃドメインを欠く、請求項８４または８５に記載のコンストラクト。
- 前記第１のポリペプチドドメインおよび前記第２のポリペプチドドメインが共有結合リンカーによって結合されている、請求項８４～８６のいずれか１項に記載のコンストラクト。
- 前記共有結合リンカーが、アミド結合またはジスルフィド結合を含む、請求項８７に記載のコンストラクト。
- 請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項８２または８３に記載の単鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクトをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項９２に記載のベクター。
- 前記発現ベクターが真核生物発現ベクターである、請求項９３に記載のベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項９２に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス（Ａｄ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項９５に記載のベクター。
- 前記アデノウイルスが血清型２、５、１１、１２、２４、２６、３４、３５、４０、４８、４９、５０、５２、もしくはＰａｎ９アデノウイルス、またはヒト、チンパンジー、もしくはアカゲザルのアデノウイルスである、請求項９６に記載のベクター。
- 前記レトロウイルスがγ－レトロウイルスまたはレンチウイルスである、請求項９６に記載のベクター。
- 前記ワクシニアウイルスが、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項９６に記載のベクター。
- 請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１００に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１００に記載の宿主細胞。
- 前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０２に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項１０３に記載の宿主細胞。
- ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、および／またはＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合し、ＣＲＤ４内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合しない抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも５０％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームとして存在する、医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、システイン残基１２７において欠失または置換を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ１ドメインを含む、請求項１０５に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＨ１ドメインがＣ１２７Ｓ変異を含む、請求項１０５または１０６に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０８に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０９に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１０５または１０６に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０５または１０６に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１１２に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１１３に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１０５または１０６に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項１０５に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１３３Å未満の距離で隔てられる少なくとも２つの抗原結合部位を含む、請求項１０５～１１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約９０Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項１１７に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約９５Å～約１３０Åの距離で隔てられる、請求項１１８に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約９８Å～約１２８Åの距離で隔てられる、請求項１１９に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１０５Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項１１７に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１０Å～約１２２Åの距離で隔てられる、請求項１２１に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１１９Åの距離で隔てられる、請求項１２２に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１７Åの距離で隔てられる、請求項１２３に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項１２４に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項１１７に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１２０Å～約１２９Åの距離で隔てられる、請求項１２６に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１２３Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項１２７に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１２５Åの距離で隔てられる、請求項１２８に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ３アイソタイプを有する、請求項１２９に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである、請求項１１７～１３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ１内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項１３１に記載の医薬組成物。
- 前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸残基５６～６０（ＫＣＳＰＧ）のうちの１つ以上によって定義される、請求項１３２に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ２内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項１３１～１３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項１３１～１３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳ、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上または全てをさらに含む、請求項１３１～１３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上または全てをさらに含む、請求項１３６に記載の医薬組成物。 - 前記ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する、請求項１３１～１３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１がアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有する、請求項１３８に記載の医薬組成物。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲを含む、請求項１３９に記載の医薬組成物。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１３１～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１４１に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１４２に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１４３に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する、請求項１３１～１３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有する、請求項１４５に記載の医薬組成物。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲを含む、請求項１４６に記載の医薬組成物。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１３１～１３７および１４４～１４６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１４８に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１４９に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１５０に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、非天然の定常領域を含む、請求項１０５～１５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記非天然の定常領域が、ヒトの定常領域である、請求項１５２に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠き、天然Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠き、またはＦｃドメインを欠く、請求項１０５～１５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、もしくはＦであり、各々のＸ２は、独立してＭもしくはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥもしくはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳもしくはＲである、請求項１０５～１５４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳ（配列番号１６）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳ（配列番号１７）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号１８）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳ（配列番号１９）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｅ）ＴＦＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２０）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｆ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＴＳ（配列番号２１）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｇ）ＴＲＤＴＳＴＮＴＶＹＭＥＬＴＳＬＲＳ（配列番号２２）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、および
（ｈ）ＴＡＤＴＳＴＤＲＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む、請求項１０５～１５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 前記フレームワーク領域が、前記抗体またはその抗原結合断片内のＣＤＲ－Ｈ２に隣接している、請求項１０５～１５６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記フレームワーク領域が、前記抗体またはその抗原結合断片内のＣＤＲ－Ｈ３に隣接している、請求項１０５～１５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記フレームワーク領域が、前記ＣＤＲ－Ｈ２とＣＤＲ－Ｈ３との間に位置する、請求項１５８に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）内のエピトープにおいて前記ＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項１０５～１５９のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化する、請求項１０５～１６０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１０ｎＭを超えないＫＤでＴＮＦＲ２に結合する、請求項１０５～１６１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１ｎＭを超えないＫＤでＴＮＦＲ２に結合する、請求項１６２に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２に結合して、少なくとも約１０４Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで抗体抗原複合体を形成する、請求項１０５～１６３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２に結合して、少なくとも約１０５Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで抗体抗原複合体を形成する、請求項１６４に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２に結合して、抗体抗原複合体を形成し、前記複合体が約１０－３ｓ－１を超えないｋｏｆｆで解離する、請求項１０５～１６５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１０－４ｓ－１を超えないｋｏｆｆでＴＮＦＲ２から解離する、請求項１６６に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖を促進する、請求項１０５～１６７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記Ｔｒｅｇ細胞が、ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗを発現する、請求項１６８に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を直接殺傷するか、またはその死を促進する、請求項１０５～１６９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンα、およびリンホトキシンβからなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子のレベルの増加を促進する、請求項１０５～１７０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンα、およびリンホトキシンβからなる群から選択される１つ以上のタンパク質のレベルの増加を促進する、請求項１０５～１７１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも７５％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１０５～１７２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも８０％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１７３に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも８５％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１７４に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも９０％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１７５に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも９５％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１７６に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約７５％～約９９．９％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１０５～１７７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約８０％～約９９．９％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１７８に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約８５％～約９９．９％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１７９に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約９０％～約９９．９％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１８０に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物中の前記抗体またはその抗原結合断片の約９５％～約９９．９％が単一のジスルフィド結合のアイソフォームで存在する、請求項１８１に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、日還元条件下で実施されたゲル電気泳動解析の際に単一の検出可能なバンドをもたらす、請求項１０５～１８２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記単一のジスルフィド結合のアイソフォームがＩｇＧ２－Ｂである、請求項１０５～１８３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項８３に記載の単鎖ポリペプチド、請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１００および１０２～１０４のいずれか１項に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、前記医薬組成物中に約０．００１ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１０５～１８５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、追加の治療薬をさらに含む、請求項１０５～１８６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記追加の治療薬が免疫療法剤である、請求項１８７に記載の医薬組成物。
- 前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＣＤ３０剤、アゴニスト性抗ＣＤ４０剤、アゴニスト性抗４－１ＢＢ剤、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ剤、アゴニスト性抗ＯＸ４０剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ剤、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質剤、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ剤、アゴニスト性抗ＭＥＫ剤、アゴニスト性抗ＣＤ３３剤、アゴニスト性抗ＣＤ２０剤、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ剤、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ剤、アゴニスト性抗ＣＤ５２剤、アゴニスト性抗Ａ３３剤、アゴニスト性抗ＧＤ３剤、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ剤、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １剤、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９剤、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ剤、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ剤、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４剤、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ１５５剤、アゴニスト性抗ＣＤ８０剤、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１６０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２８剤、アゴニスト性抗ＣＤ２２６剤、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１剤、アゴニスト性抗ＴＩＭ３剤、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９６剤、アゴニスト性抗ＣＤ７０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１３７剤、アゴニスト性抗ＤＲ４剤、アゴニスト性抗ＣＲ５剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１剤、アゴニスト性抗ＦＡＳ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９５剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ剤、アゴニスト性抗ＤＲ６剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ剤、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ剤、アゴニスト性抗ＯＰＧ剤、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ剤、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体剤、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ剤、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ剤、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ剤、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ剤からなる群から選択され、任意選択で前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１８８に記載の医薬組成物。
- 前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＭＥＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ａ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＤ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１５５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１６０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２２６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはその抗原結合
断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１８９に記載の医薬組成物。 - 前記免疫療法剤がアゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤またはアゴニスト性抗ＰＤ－１剤である、請求項１８９に記載の医薬組成物。
- 前記免疫療法剤がアゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片またはアゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項１９１に記載の医薬組成物。
- 請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、前記方法が、前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させることと、宿主細胞培地から前記抗体またはその抗原結合断片を回収すること、を含む、方法。
- 請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクトを産生する方法であって、前記方法が、前記コンストラクトをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させることと、宿主細胞培地から前記コンストラクトを回収することと、を含む、方法。
- ヒト対象においてＢ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される免疫応答を阻害する方法であって、前記方法が、請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項８３に記載の単鎖ポリペプチド、請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクター、請求項１００および１０２～１０４のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項１０５～１９２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
- ヒト対象において、免疫学的疾患を治療する方法であって、前記方法が、請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項８３に記載の単鎖ポリペプチド、請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクター、請求項１００および１０２～１０４のいずれか１項に記載の宿主細胞と、または請求項１０５～１９２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、組織または臓器の再生を必要としている、請求項１９６に記載の方法。
- 前記組織または臓器が、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、頭の構造、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、および精巣からなる群から選択される、請求項１９７に記載の方法。
- 前記免疫学的疾患が、自己免疫疾患、神経学的状態、アレルギー、喘息、黄斑変性症、筋萎縮症、流産に関連する疾患、アテローム性動脈硬化症、骨量減少、筋骨格系疾患、肥満、移植片対宿主病、および同種移植片拒絶からなる群から選択される、請求項１９６～１９８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、本態性混合型クリオグロブリン、線維筋痛－線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項１９９に記載の方法。
- 前記神経学的状態が、脳腫瘍、脳転移、脊髄損傷、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および発作からなる群から選択される、請求項１９９に記載の方法。
- 前記アレルギーが、食物アレルギー、季節性アレルギー、ペットアレルギー、じんましん、花粉症、アレルギー性結膜炎、毒ツタアレルギー オークアレルギー、カビアレルギー、薬物アレルギー、粉塵アレルギー、化粧品アレルギー、および化学物質アレルギーからなる群から選択される、請求項１９９に記載の方法。
- 前記同種移植片拒絶が、皮膚移植片拒絶、骨移植片拒絶、血管組織移植片拒絶、靭帯移植片拒絶、および臓器移植片拒絶からなる群から選択される、請求項１９９に記載の方法。
- 前記靭帯移植片拒絶が、輪状甲状腺靭帯移植片拒絶、歯周靭帯移植片拒絶、水晶体の提靱帯移植片拒絶、掌側橈骨手根靭帯移植片拒絶、背側橈骨手根靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、乳房提靭帯移植片拒絶、前仙腸靭帯移植片拒絶、後仙腸靭帯移植片拒絶、仙骨結節靭帯移植片拒絶、仙棘靭帯移植片拒絶、下恥骨靱帯移植片拒絶、上恥骨靭帯移植片拒絶、前十字靱帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、後十字靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、頭蓋十字靭帯移植片拒絶、尾側十字靭帯移植片拒絶、および膝蓋靭帯移植片拒絶からなる群から選択される、請求項２０３に記載の方法。
- 前記臓器移植片拒絶が、心臓移植片拒絶、肺移植片拒絶、腎臓移植片拒絶、肝臓移植片拒絶、膵臓移植片拒絶、腸移植片拒絶、および胸腺移植片拒絶からなる群から選択される、請求項２０３に記載の方法。
- 前記移植片対宿主疾患が、骨髄移植、または造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、巨核球、単球、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞からなる群から選択される１つ以上の血液細胞から生じる、請求項１９９に記載の方法。
- ヒト対象において、炎症性疾患を治療する方法であって、前記方法が、請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項８３に記載の単鎖ポリペプチド、請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクター、請求項１００および１０２～１０４のいずれか１項に記載の宿主細胞と、または請求項１０５～１９２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記炎症性疾患が、急性または慢性の炎症である、請求項２０７に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、変形性関節症、線維性肺疾患、および心臓の炎症からなる群から選択される、請求項２０７に記載の方法。
- ヒト対象において、ＴＮＦＲ２＋組織を再生する方法であって、前記方法が、請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項８３に記載の単鎖ポリペプチド、請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクター、請求項１００および１０２～１０４のいずれか１項に記載の宿主細胞と、または請求項１０５～１９２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記ＴＮＦＲ２＋組織が、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、胃腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、および精巣の組織からなる群から選択される、請求項２１０に記載の方法。
- 前記方法が、免疫療法剤を前記ヒトに投与することを含む、請求項１９５～２１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＣＤ３０剤、アゴニスト性抗ＣＤ４０剤、アゴニスト性抗４－１ＢＢ剤、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ剤、アゴニスト性抗ＯＸ４０剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ剤、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質剤、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ剤、アゴニスト性抗ＭＥＫ剤、アゴニスト性抗ＣＤ３３剤、アゴニスト性抗ＣＤ２０剤、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ剤、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ剤、アゴニスト性抗ＣＤ５２剤、アゴニスト性抗Ａ３３剤、アゴニスト性抗ＧＤ３剤、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ剤、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １剤、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９剤、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ剤、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ剤、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４剤、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ１５５剤、アゴニスト性抗ＣＤ８０剤、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１６０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２８剤、アゴニスト性抗ＣＤ２２６剤、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１剤、アゴニスト性抗ＴＩＭ３剤、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９６剤、アゴニスト性抗ＣＤ７０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１３７剤、アゴニスト性抗ＤＲ４剤、アゴニスト性抗ＣＲ５剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１剤、アゴニスト性抗ＦＡＳ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９５剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ剤、アゴニスト性抗ＤＲ６剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ剤、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ剤、アゴニスト性抗ＯＰＧ剤、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ剤、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体剤、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ剤、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ剤、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ剤、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ剤からなる群から選択され、任意選択で前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項２１２に記載の方法。
- 前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＭＥＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ａ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＤ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１５５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１６０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２２６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはその抗原結合
断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項２１３に記載の方法。 - 前記免疫療法剤がアゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤またはアゴニスト性抗ＰＤ－１剤である、請求項２１３に記載の方法。
- 前記免疫療法剤がアゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片またはアゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項２１５に記載の方法。
- 前記方法が、ＴＮＦα、アゴニスト性ＴＮＦαムテイン、および Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）からなる群から選択される追加の薬剤を前記ヒトに投与することを含む、請求項１９５～２１６のいずれか１項に記載の方法。
- ＴＮＦＲ２に特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの量で前記ヒトに投与される、請求項１９５～２１７のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項８３に記載の単鎖ポリペプチド、請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクター、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の宿主細胞、ならびに請求項１０５～１９２のいずれか１項に記載の医薬組成物からなる群から選択される薬剤を含むキット。
- 前記キットが、請求項１～６９および８０～８２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記キットが、請求項８３に記載の単鎖ポリペプチドを含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記キットが、請求項８４～８８のいずれか１項に記載のコンストラクトを含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記キットが、請求項８９～９１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記キットが、請求項９２～９９のいずれか１項に記載のベクターを含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記キットが、前記ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするための使用説明書をさらに含む、請求項２２４に記載のキット。
- 前記キットが、前記宿主細胞において前記抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトを発現させるための使用説明書をさらに含む、請求項２２５に記載のキット。
- 前記キットが、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記キットが、前記宿主細胞において前記抗体、その抗原結合断片、またはコンストラクトを発現するために使用できる試薬をさらに含む、請求項２２７に記載のキット。
- 前記キットが、請求項１０５～１９２のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記薬剤をヒト患者に投与するための使用説明書をさらに含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記薬剤を作製または使用するための使用説明書をさらに含む、請求項２１９に記載のキット。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１３３Å未満の距離で隔てられる少なくとも２つの抗原結合部位を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約９０Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項２４０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約９５Å～約１３０Åの距離で隔てられる、請求項２４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約９８Å～約１２８Åの距離で隔てられる、請求項２４２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１０５Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項２４３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１０Å～約１２２Åの距離で隔てられる、請求項２４４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１１９Åの距離で隔てられる、請求項２４５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１７Åの距離で隔てられる、請求項２４６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項２４８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１２０Å～約１２９Åの距離で隔てられる、請求項２４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１２３Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項２５０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合部位が、約１２５Åの距離で隔てられる、請求項２５１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ３アイソタイプを有する、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ１内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項２５４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸残基５６～６０（ＫＣＳＰＧ）のうちの１つ以上によって定義される、請求項２５５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ２内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ３内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳ、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上または全てをさらに含む、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｂ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｄ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｅ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲのうちの１つ以上または全てを含む、請求項２５９に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記ＣＤＲ－Ｈ１がアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１がアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有する、請求項２６１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲを含む、請求項２６２に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２６４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２６５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２６６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１がアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記ＣＤＲ－Ｈ１がアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有する、請求項２６８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）を有するＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＩＮＰＮＹＤＳＴ（配列番号１０）を有するＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）アミノ酸配列ＣＡＲＧＮＳＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有するＣＤＲ－Ｈ３、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＳＶＲＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）アミノ酸配列ＬＴＳを有するＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）アミノ酸配列ＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１３）を有するＣＤＲ－Ｌ３、のＣＤＲを含む、請求項２６９に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２７１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２７２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２７３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、非天然の定常領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記非天然の定常領域が、ヒトの定常領域である、請求項２７５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠き、天然Ｆｃドメインの全てもしくは一部を欠き、またはＦｃドメインを欠く、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＪＤＪＳＪＪＪＸ１ＹＸ２Ｘ３ＬＪＸ４ＬＪＳ（配列番号５）のアミノ酸配列もしくは配列番号５の残基のうちの１０個以上を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含み、各々のＪは、独立して、天然に存在するアミノ酸であり、各々のＸ１は、独立して、Ａ、Ｖ、もしくはＦであり、各々のＸ２は、独立して、ＭもしくはＩであり、各々のＸ３は、独立してＥもしくはＱであり、各々のＸ４は、独立してＳもしくはＲである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳ（配列番号１６）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＩＱＬＳＳＬＴＳ（配列番号１７）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号１８）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳ（配列番号１９）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｅ）ＴＦＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２０）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｆ）ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＴＳ（配列番号２１）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
（ｇ）ＴＲＤＴＳＴＮＴＶＹＭＥＬＴＳＬＲＳ（配列番号２２）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、および
（ｈ）ＴＡＤＴＳＴＤＲＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳ（配列番号２３）、または前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、アミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記フレームワーク領域が、前記抗体またはその抗原結合断片内のＣＤＲ－Ｈ２に隣接している、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記フレームワーク領域が、前記抗体またはその抗原結合断片内のＣＤＲ－Ｈ３に隣接している、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記フレームワーク領域が、前記ＣＤＲ－Ｈ２とＣＤＲ－Ｈ３との間に位置する、請求項２８１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸５６～６０（ＫＣＳＰＧ）、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１０１～１０７（ＣＳＳＤＱＶＥＴ）、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１１５～１４２（ＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫ）、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２６～４５（ＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣ）、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸９０～１０９（ＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱ）、
（ｆ）配列番号１のアミノ酸９８～１１７（ＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰ）、
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１０６～１２５（ＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦ）、および／または
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１０８～１２７（ＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶ）内のエピトープにおいて前記ＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１０ｎＭを超えないＫＤでＴＮＦＲ２に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１ｎＭを超えないＫＤでＴＮＦＲ２に結合する、請求項２８５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がＴＮＦＲ２に結合して、少なくとも約１０４Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで抗体抗原複合体を形成する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がＴＮＦＲ２に結合して、少なくとも約１０５Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎで抗体抗原複合体を形成する、請求項２８７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がＴＮＦＲ２に結合して抗体抗原複合体を形成し、前記複合体が約１０－３ｓ－１を超えないｋｏｆｆで解離する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１０－４ｓ－１を超えないｋｏｆｆでＴＮＦＲ２から解離する、請求項２８９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖を促進する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記Ｔｒｅｇ細胞が、ＣＤ２５ＨｉおよびＣＤ４５ＲＡＬｏｗを発現する、請求項２９１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を直接殺傷するか、またはその死を促進する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンα、およびリンホトキシンβからなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子のレベルの増加を促進する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ｃＩＡＰ２、ＴＲＡＦ２、Ｅｔｋ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、血管新生経路に関与するタンパク質、ＩＫＫ複合体、ＲＩＰ、ＮＩＫ、ＭＡＰ３Ｋ、ＮＦｋＢ経路に関与するタンパク質、ＮＩＫ、ＪＮＫ、ＡＰ－１、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ７）、ＭＫＫ３、ＮＥＭＯ、ＩＬ２Ｒ、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ２、ＴＮＦ、リンホトキシン、リンホトキシンα、およびリンホトキシンβからなる群から選択される１つ以上のタンパク質のレベルの増加を促進する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、対象への投与時にイタコン酸のレベルの増加を促進し、任意選択で前記対象がヒト対象である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項７０に記載の方法によって産生される抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、ポリクローナル抗体またはその抗原結合断片、ヒト抗体またはその抗原結合断片、ヒト化抗体またはその抗原結合断片、霊長類化抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体またはその抗原結合断片、多重特異性抗体またはその抗原結合断片、二重可変免疫グロブリンドメイン、一価抗体またはその抗原結合断片、キメラ抗体またはその抗原結合断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ディアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質足場、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２分子、およびタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）からなる群から選択され、前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体もしくはその抗原結合断片、ヒト化抗体もしくはその抗原結合断片、またはキメラ抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、単鎖ポリペプチドである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項２９９に記載の単鎖ポリペプチドに対するヒトＴＮＦＲ２の結合を競合的に阻害する、単鎖ポリペプチド。
- 第１のポリペプチドドメインおよび第２のポリペプチドドメインを含むコンストラクトであって、第１のポリペプチドドメインおよび第２のポリペプチドドメインが、各々独立して、請求項３００に記載の単鎖ポリペプチドを含む、コンストラクト。
- 前記コンストラクトがヒトＦｃドメインを含む、請求項３０１に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトがマウスＦｃドメインを欠く、請求項３０１に記載のコンストラクト。
- 前記第１のポリペプチドドメインおよび前記第２のポリペプチドドメインが共有結合リンカーによって結合されている、請求項３０１に記載のコンストラクト。
- 前記共有結合リンカーが、アミド結合またはジスルフィド結合を含む、請求項３０４に記載のコンストラクト。
- 請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項２９９に記載の単鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項３０１に記載のコンストラクトをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項３０６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項３０９に記載のベクター。
- 前記発現ベクターが真核生物発現ベクターである、請求項３１０に記載のベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３０９に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス（Ａｄ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項３１２に記載のベクター。
- 前記アデノウイルスが血清型２、５、１１、１２、２４、２６、３４、３５、４０、４８、４９、５０、５２、もしくはＰａｎ９アデノウイルス、またはヒト、チンパンジー、もしくはアカゲザルのアデノウイルスである、請求項３１３に記載のベクター。
- 前記レトロウイルスがγ－レトロウイルスまたはレンチウイルスである、請求項３１３に記載のベクター。
- 前記ワクシニアウイルスが、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項３１３に記載のベクター。
- 請求項３０９に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項３１７に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項３１７に記載の宿主細胞。
- 前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項３１９に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項３２０に記載の宿主細胞。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０５に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３２２に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３２３に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１０５に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０５に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３２６に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３２７に記載の医薬組成物。
- 前記ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインが、配列番号８または配列番号９アミノ酸配列を有する、請求項１０５に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、約１３３Å未満の距離で隔てられる少なくとも２つの抗原結合部位を含む、請求項１０５に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約９０Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項３３０に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約９５Å～約１３０Åの距離で隔てられる、請求項３３１に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約９８Å～約１２８Åの距離で隔てられる、請求項３３２に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１０５Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項３３０に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１０Å～約１２２Åの距離で隔てられる、請求項３３４に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１１９Åの距離で隔てられる、請求項３３５に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１７Åの距離で隔てられる、請求項３３６に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項３３７に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１１５Å～約１３２Åの距離で隔てられる、請求項３３０に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１２０Å～約１２９Åの距離で隔てられる、請求項３３９に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１２３Å～約１２７Åの距離で隔てられる、請求項３４０に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合部位が、約１２５Åの距離で隔てられる、請求項３４１に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ３アイソタイプを有する、請求項３４２に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）ＧＺ１ＴＦＺ３Ｚ２ＹＺ３Ｚ４（配列番号２）、
（ｂ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＩ（配列番号３）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）ＧＹＴＦＴＤＹＮＬ（配列番号４）、もしくは前記配列に対して２個までの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１を含み、
各々のＺ１が、独立して、芳香族置換基を含む側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ２が、独立して、生理学的ｐＨにおいてアニオン性側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ３が、独立して、生理学的ｐＨにおいて極性の非荷電側鎖を含む天然に存在するアミノ酸であり、
各々のＺ４が、独立して、ロイシンもしくはイソロイシンである、請求項３３０に記載の医薬組成物。 - 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ１内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項３４４に記載の医薬組成物。
- 前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸残基５６～６０（ＫＣＳＰＧ）のうちの１つ以上によって定義される、請求項３４５に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ＣＲＤ２内の１つ以上のアミノ酸によって定義されるエピトープにおいてヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合する、請求項３４４に記載の医薬組成物。
- 請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、前記方法が、前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させることと、宿主細胞培地から前記抗体またはその抗原結合断片を回収すること、を含む、方法。
- 請求項８４に記載のコンストラクトを産生する方法であって、前記方法が、前記コンストラクトをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させることと、宿主細胞培地から前記コンストラクトを回収することと、を含む、方法。
- ヒト対象においてＢ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される免疫応答を阻害する方法であって、前記方法が、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することを含む、方法。
- ヒト対象において免疫学的疾患を治療する方法であって、前記方法が、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、組織または臓器の再生を必要としている、請求項３５１に記載の方法。
- 前記組織または臓器が、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、頭の構造、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、および精巣からなる群から選択される、請求項３５２に記載の方法。
- 前記免疫学的疾患が、自己免疫疾患、神経学的状態、アレルギー、喘息、黄斑変性症、筋萎縮症、流産に関連する疾患、アテローム性動脈硬化症、骨量減少、筋骨格系疾患、肥満、移植片対宿主病、および同種移植片拒絶からなる群から選択される、請求項３５１に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、本態性混合型クリオグロブリン、線維筋痛－線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項３５４に記載の方法。
- 前記神経学的状態が、脳腫瘍、脳転移、脊髄損傷、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および発作からなる群から選択される、請求項３５４に記載の方法。
- 前記アレルギーが、食物アレルギー、季節性アレルギー、ペットアレルギー、じんましん、花粉症、アレルギー性結膜炎、毒ツタアレルギー、オークアレルギー、カビアレルギー、薬物アレルギー、粉塵アレルギー、化粧品アレルギー、および化学物質アレルギーからなる群から選択される、請求項３５４に記載の方法。
- 前記同種移植片拒絶が、皮膚移植片拒絶、骨移植片拒絶、血管組織移植片拒絶、靭帯移植片拒絶、および臓器移植片拒絶からなる群から選択される、請求項３５４に記載の方法。
- 前記靭帯移植片拒絶が、輪状甲状腺靭帯移植片拒絶、歯周靭帯移植片拒絶、水晶体の提靱帯移植片拒絶、掌側橈骨手根靭帯移植片拒絶、背側橈骨手根靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、乳房提靭帯移植片拒絶、前仙腸靭帯移植片拒絶、後仙腸靭帯移植片拒絶、仙骨結節靭帯移植片拒絶、仙棘靭帯移植片拒絶、下恥骨靱帯移植片拒絶、上恥骨靭帯移植片拒絶、前十字靱帯移植片拒絶、外側側副靭帯移植片拒絶、後十字靭帯移植片拒絶、内側側副靭帯移植片拒絶、頭蓋十字靭帯移植片拒絶、尾側十字靭帯移植片拒絶、および膝蓋靭帯移植片拒絶からなる群から選択される、請求項３５８に記載の方法。
- 前記臓器移植片拒絶が、心臓移植片拒絶、肺移植片拒絶、腎臓移植片拒絶、肝臓移植片拒絶、膵臓移植片拒絶、腸移植片拒絶、および胸腺移植片拒絶からなる群から選択される、請求項３５８に記載の方法。
- 前記移植片対宿主疾患が、骨髄移植、または造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、巨核球、単球、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞からなる群から選択される１つ以上の血液細胞から生じる、請求項３５４に記載の方法。
- ヒト対象において炎症性疾患を治療する方法であって、前記方法が、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記炎症性疾患が、急性または慢性の炎症である、請求項３６２に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、変形性関節症、線維性肺疾患、および心臓の炎症からなる群から選択される、請求項３６３に記載の方法。
- ヒト対象においてＴＮＦＲ２＋組織を再生する方法であって、前記方法が、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記ＴＮＦＲ２＋組織が、膵臓、唾液腺、下垂体、腎臓、心臓、肺、造血系、脳神経、心臓、大動脈、嗅覚腺、耳、神経、目、胸腺、舌、骨、肝臓、小腸、大腸、胃腸、肺、脳、皮膚、末梢神経系、中枢神経系、脊髄、乳房、胚構造、胚、および精巣の組織からなる群から選択される、請求項３６５に記載の方法。
- 前記方法が、免疫療法剤を前記ヒトに投与することを含む、請求項３５１に記載の方法。
- 前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤、アゴニスト性抗ＰＤ－１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１剤、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＣＤ３０剤、アゴニスト性抗ＣＤ４０剤、アゴニスト性抗４－１ＢＢ剤、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ剤、アゴニスト性抗ＯＸ４０剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ剤、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ剤、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質剤、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ剤、アゴニスト性抗ＭＥＫ剤、アゴニスト性抗ＣＤ３３剤、アゴニスト性抗ＣＤ２０剤、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ剤、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ剤、アゴニスト性抗ＣＤ５２剤、アゴニスト性抗Ａ３３剤、アゴニスト性抗ＧＤ３剤、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ剤、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １剤、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９剤、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ剤、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ剤、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４剤、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２剤、アゴニスト性抗ＣＤ１５５剤、アゴニスト性抗ＣＤ８０剤、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１６０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２８剤、アゴニスト性抗ＣＤ２２６剤、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１剤、アゴニスト性抗ＴＩＭ３剤、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９６剤、アゴニスト性抗ＣＤ７０剤、アゴニスト性抗ＣＤ２７剤、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ剤、アゴニスト性抗ＣＤ１３７剤、アゴニスト性抗ＤＲ４剤、アゴニスト性抗ＣＲ５剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ剤、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１剤、アゴニスト性抗ＦＡＳ剤、アゴニスト性抗ＣＤ９５剤、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ剤、アゴニスト性抗ＤＲ６剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ剤、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ剤、アゴニスト性抗ＯＰＧ剤、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ剤、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体剤、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ剤、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ剤、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ剤、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２剤、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ剤、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ剤からなる群から選択され、任意選択で前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはアゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項３６７に記載の方法。
- 前記免疫療法剤が、アゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＤ－Ｌ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＷＥＡＫＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗細胞表面リンパ球タンパク質抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＲＡＦ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＭＥＫ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＬＡクラスＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ａ３３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＧＤ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｃｅａｃａｎ １抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｇａｌｅｄｉｎ ９抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＶＥＭ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＶＩＳＴＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗Ｂ７ Ｈ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＨＨＬＡ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１５５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ８０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１６０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２２６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体またはその抗原結合
断片、アゴニスト性抗ＴＩＭ３抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＩＧＨＴ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＲ５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＮＦＲ１抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＦＡＳ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＤＲ６抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＮＧＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＯＰＧ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＲＡＮＫＬ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＬＴβ受容体抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＡＣＩ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＢＡＦＦＲ抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＥＤＡＲ２抗体またはその抗原結合断片、アゴニスト性抗ＴＲＯＹ抗体またはその抗原結合断片、およびアゴニスト性抗ＲＥＬＴ抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項３６８に記載の方法。 - 前記免疫療法剤がアゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４剤またはアゴニスト性抗ＰＤ－１剤である、請求項３６８に記載の方法。
- 前記免疫療法剤がアゴニスト性抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片またはアゴニスト性抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項３７０に記載の方法。
- 前記方法が、ＴＮＦα、アゴニスト性ＴＮＦαムテイン、およびＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）からなる群から選択される追加の薬剤をヒトに投与することを含む、請求項３５１のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキット。
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