JP6526561B2 - インターロイキン−２融合タンパク質及びそれらの使用 - Google Patents

インターロイキン−２融合タンパク質及びそれらの使用 Download PDF

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Description

本発明は、一般に、免疫グロブリンとインターロイキン−２（ＩＬ−２）の融合タンパク質に関する。更に、本発明は、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質を生成するため方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、自己寛容の維持に重要であるＴリンパ球の特定のサブセットを表す。抑制機能を有するこれらのＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞は、転写因子ＦＯＸＰ３並びにＣＤ１２７ｌｏ、ＣＴＬＡ−４＋、ＬＡＰ、ＣＤ３９＋、ＰＤ−１＋、ＧＡＲＰなどの他の細胞マーカーの細胞内発現により、エフェクターＴ細胞から区別することができる。ＦＯＸＰ３は、Ｔｒｅｇの分化及び機能のために重要であり、ＦＯＸＰ３遺伝子の欠損及び変異は、Ｘ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）に罹患したｓｃｕｒｆｙマウスと患者の双方において、Ｔｒｅｇの欠乏又は機能の欠如に起因して、自己免疫寛容の破壊および自己免疫疾患の発症をもたらす。
１型糖尿病における自己免疫反応、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、及び他の多くが、Ｔｒｅｇの欠乏と相関している。動物モデルからのデータは、自己免疫応答は、Ｔｒｅｇの、自己に対する破壊的な免疫応答の制御の不全によって促進されるという仮説を支持している。１型糖尿病は、膵臓のインスリン産生β細胞の大部分の破壊後に起こる自己免疫疾患である。１型糖尿病の頻度は、米国の人口の〜０．３％であり、その発生率は、米国、欧州、特に北欧（ほぼ１％）で増加し続け、次の２０年以内に倍増すると予想される。
サイトカインＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ並びにエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の両方の活性化と機能において主要な役割を果たしている。ＩＬ−２の産生の欠乏又は応答性の欠如は、優先的にＴｒｅｇ機能の喪失及び自己免疫の可能性の増大をもたらす。ＴｒｅｇはＴｅｆｆより高レベルで高親和性ＩＬ−２受容体を発現するので、Ｔｅｆｆ細胞と比較して、低用量のＩＬ−２は、優先的にＴｒｅｇの維持を支援する。
インビトロ及びインビボでＴｒｅｇを活性化するＩＬ−２の選択的な効果により、低用量で長寿命のＩＬ−２療法の可能性は、自己免疫疾患における成功について大きな見込みを持っているように思われる。ＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））による、２００人の患者の、二重盲検、プラセボ対照、１型糖尿病の臨床試験は、２０１３年後半に開始するように設定されている。毎日、低用量のプロロイキン（登録商標）を用いる、最近の臨床試験では、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及びＣ型肝炎ウイルスによって誘発される血管炎の徴候と症状の一部を改善した（Koreth et al., New Engl J Med 365, 2055-2066 (2011), Saadoun et al., New Engl J Med 365, 2067-2077 (2011)）。両試験において、低用量のプロロイキン（登録商標）は、Ｔｒｅｇを誘導し、Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆの比を増加させた。しかし、プロロイキン（登録商標）の悪いＰＫ特性は、男性において、ＩＬ−２の低く、一貫したレベルを維持するためにそれを準最適にする。臨床試験で試験されている他の方法は、生体外でのＴｒｅｇの個別化増殖と続く再注入であるが、しかし、このアプローチは理想的とは言えず、品質管理上の問題の困難な組を表している。
このため、天然の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介型優性免疫寛容を再確立する新たな治療アプローチは、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、並びに他の自己免疫疾患及び免疫系の炎症誘発性疾患、例えば、慢性の移植片対宿主病、喘息、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患など、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患、及び実質臓器や骨髄共に移植拒絶反応などの自己免疫疾患に罹患した患者を治療する能力を大きく増強するであろう。
本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、Ｔｒｅｇを優先的に活性化し、Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆの高比率へとバランスを傾けて、自己免疫応答を減らす。それらは、長寿命であり、好都合な投与スケジュールを可能とし、かつエフェクター機能を欠き、潜在的な副作用及び有効性の低下を減少させる。
一態様において、本発明は、（ｉ）Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び（ｉｉ）２つのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子を含む融合タンパク質を提供する。
一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、特に、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持つ。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持たない。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｈ３−２３生殖細胞系配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｋ３−２０生殖細胞系配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。更により具体的な実施形態において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列、及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持たず、ヒトＶｈ３−２３生殖細胞系配列に基づく重鎖可変領域配列、及び、ヒトＶｋ３−２０生殖細胞系配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様において、前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である。一実施態様において、前記Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。一実施態様において、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される。特定の実施態様において、前記Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、前記修飾は、免疫グロブリン分子のエフェクター機能を低下させる。特定の実施態様において、前記エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施態様において、前記修飾は、前記免疫グロブリン分子のＦｃ領域にあり、特に、ＣＨ２領域にある。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置３２９に（ＥＵ番号付け）、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、前記アミノ酸置換はＰ３２９Ｇである。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置２３４と２３５に（ＥＵ番号付け）、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置２３４、２３５と３２９に（ＥＵ番号付け）、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む。
一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、野生型ＩＬ−２分子である。一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、天然に生じる天然型ＩＬ−２に比較して、前記ＩＬ−２分子のＩＬ−２受容体への結合親和性を変えないアミノ酸置換を含む。一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置にアミノ酸変異を含む。より特定の実施態様において、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２分子である。特定の実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、配列番号１又は配列番号３の配列、特に配列番号３の配列を含む。一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、配列番号１又は配列番号３の配列、特に配列番号３の配列を有する。一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は各々、それらのＮ末端のアミノ酸で、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖の一方のＣ末端アミノ酸へ、任意でリンカーペプチドを介して融合している。
特定の実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号１７及び配列番号１９のポリペプチド配列を含む。特定の実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号１９の免疫グロブリン軽鎖と、配列番号１７の免疫グロブリン重鎖ＩＬ−２融合ポリペプチドを含む。一実施態様において、前記融合タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子と、２個のインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子と、及び任意で一以上のペプチドリンカーとから本質的になる。一実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号１９の２つの免疫グロブリン軽鎖と、配列番号１７の２つの免疫グロブリン重鎖ＩＬ−２融合ポリペプチドとから本質的になる。
本発明は更に、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。更に、本発明のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクターが提供される。別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、（ｉ）本発明の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適した条件下で培養し、（ｉ）融合タンパク質を回収する工程を含む、本発明の融合タンパク質を生成する方法を提供する。また、（ｉ）Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び（ｉｉ）前記方法により生成された、２つのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子を含む融合タンパク質が提供される。
一態様において、本発明は、本発明のコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。また、本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物は、医薬としての使用のため、及び自己免疫疾患、具体的には１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はクローン病、最も具体的には、１型糖尿病、又は移植片対宿主病又は移植拒絶反応の治療若しくは予防における使用のために提供される。更に、それを必要とする個体において疾患を治療するための医薬の製造のための本発明の融合タンパク質の使用、及び薬学的に許容される形態で本発明の融合タンパク質を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体において疾患を治療する方法が提供される。一実施態様において、前記疾患は自己免疫疾患である。より特定の実施態様において、前記疾患は自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はクローン病である。更により特定の実施態様において、前記自己免疫疾患は、１型糖尿病である。別の実施態様において、前記疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。一実施態様において、前記個体は哺乳動物、特にヒトである。
更に提供されるのは、インビトロ又はインビボで調節性Ｔ細胞の選択的活性化に使用するための本発明の融合タンパク質である。一実施態様において、前記活性化は、調節性Ｔ細胞の増殖の誘導、及び／又は、調節性Ｔ細胞における、ＩＬ−２受容体シグナル伝達、特にＳＴＡＴ５のリン酸化の誘導を含む。一実施態様において、前記使用はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約１ｎｇ／ｍＬ以下、具体的には約０．１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記使用はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約２０μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、具体的には約１２μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、より具体的には約６μｇ／ｋｇ体重以下の用量で使用される。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質と前記調節性Ｔ細胞を接触させることを含む、インビトロ又はインビボでの調節性Ｔ細胞の選択的活性化のための方法を提供する。一実施態様において、前記活性化は、調節性Ｔ細胞の増殖の誘導、及び／又は、調節性Ｔ細胞における、ＩＬ−２受容体シグナル伝達、特にＳＴＡＴ５のリン酸化の誘導を含む。一実施態様において、前記方法はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約１ｎｇ／ｍＬ以下、具体的には約０．１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記方法はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約２０μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、具体的には約１２μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、より具体的には約６μｇ／ｋｇ体重以下の用量で使用される。
ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２融合タンパク質（配列番号１３、１５、１９を参照）の精製。（Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収率４ｍｇ／Ｌ。（Ｃ）最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（キャリパー）。以下のバンドが観察された：非還元 − １１１ｋＤａで７．５％の面積、１７４ｋＤａで９２．５％の面積；還元 − ２９ｋＤａで２３．６％の面積、６７ｋＤａで２３．５％の面積、８２ｋＤａで５２．９％の面積。生成物は、約７．５％の「半分のＩｇＧ」を含んでいる。（Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９１％単量体含有量）。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２融合タンパク質（配列番号１７、１９を参照）の精製。（Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収率１３ｍｇ／Ｌ。（Ｃ）最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（キャリパー）。以下のバンドが観察された：非還元 − １７２．５ｋＤａで２．３％の面積、１８５ｋＤａで９７．７％の面積；還元 − ２７．３ｋＤａで１８．３％の面積、２９．２ｋＤａで０．６％の面積、７８．３ｋＤａで８１．１％の面積。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫ細胞サブセット及びＮＫＴ細胞上でのＣＤ２５（ＩＬ−２ＲＡ）及びＣＤ１２２（ＩＬ−２ＲＢ）の発現。細胞表面マーカーが、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫＴ細胞及びＮＫ細胞を定義するために用いられた。ＣＤ２５及びＣＤ１２２の染色を最適化するために、細胞内ＦＯＸＰ３染色は実施されなかった。（Ａ、Ｂ）３つの調節性ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団：ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２５＋；点線）、記憶（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５＋；実線）及び活性化（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５ｈｉ；点線）。（Ｃ、Ｄ）ＮＫＴ（点線）、ＣＤ５６明るい ＮＫ細胞（破線）、ＣＤ５６中間 ＮＫ細胞（実線）。灰色：アイソタイプコントロール。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の通常型Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５（ＩＬ−２ＲＡ）及びＣＤ１２２（ＩＬ−２ＲＢ）の発現。細胞表面マーカーが、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋；点線）及び記憶（ＣＤ４５ＲＡ−；実線）通常型ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）、通常型記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−；実線）及びＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞（ナイーブ及びＴＥＭＲＡサブセットの組合せ；ＴＥＭＲＡは、ＣＤ４５ＲＡの発現に戻ったエフェクター記憶細胞を意味する；点線）（Ｃ、Ｄ）を定義するために使用された。灰色：アイソタイプコントロール。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２に応答した、ヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。３つの異なるヒトドナー（Ｃ４からＣ６）が、ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の様々な用量の効果について、別々の時間に評価された。結果は、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇサブセット：記憶及びナイーブＴｒｅｇ；通常型ＣＤ４＋記憶Ｔエフェクター細胞；ＣＤ５６明るい ＮＫ細胞；ＣＤ８＋記憶Ｔエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ナイーブＴエフェクター＋ＣＤ４５ＲＡ＋記憶細胞について示されている。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２に応答した、ヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導。５つの異なるヒトドナー（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ４−Ｃ６）が、ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導に対するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の様々な用量の効果について、別々の時間に評価された。結果は、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇサブセット：記憶及びナイーブＴｒｅｇ；通常型ＣＤ４＋記憶Ｔエフェクター細胞；ＣＤ５６明るい ＮＫ細胞；ＣＤ８＋記憶Ｔエフェクター細胞；ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；及びＣＤ８＋ナイーブＴエフェクター＋ＣＤ４５ＲＡ＋記憶細胞について示されている。 ヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導：ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の比較各細胞サブセットについての結果を、各サブセットからの観察された最大効果に対して正規化し、ＴｒｅｇについてのおよそのＥＣ５０は表２に示す。（Ａ）ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２についての正規化した結果、（Ｂ）ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２についての正規化した結果。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２とＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２を比較する、３つのドナーにおけるＴｒｅｇサブセット感受性の詳細な検討。グラフは、３つのドナーについて、ｐＳＴＡＴ５ａ ＭＦＩの平均値±ＳＤを表す。（Ａ）ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇの全て。（Ｂ）活性化Ｔｒｅｇ。（Ｃ）記憶Ｔｒｅｇｓ。（Ｄ）ナイーブＴｒｅｇ。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２は、カニクイザルにおいて、調節性Ｔ細胞を増大させる用量依存性効果を有する。治療後７日目における全血ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の変化が、（Ａ）全血のｍｍ３あたりのＴｒｅｇの絶対細胞数として、及び（Ｂ）Ｔｒｅｇの倍率変化として示される。全データは、平均値±ＳＤとして表される。空の棒：ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２（ｎ＝６）；影付きの棒：ビヒクル（ｎ＝３）。 カニクイザルにおいてＴｒｅｇに対するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の時間と低用量の効果。（Ａ）２又は６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２による投与後のＴｒｅｇの倍率増加の時間依存性変化（それぞれｎ＝４及び６）。（Ｂ）２又は６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２による投与後のＴｒｅｇの絶対数における時間依存性変化（それぞれｎ＝４及び６）。全データは、平均値±ＳＤとして示される。 単一投与のプロロイキン（登録商標）は、カニクイザルにおける一過性の用量依存性Ｔｒｅｇ応答を刺激する。（Ａ）３ｘ１０４から３ｘ１０５ＩＵ／ｋｇのプロロイキン（登録商標）の単一投与後の末梢血のＴｒｅｇ数の変化。（Ｂ）３ｘ１０４から３ｘ１０５ＩＵ／ｋｇのプロロイキン（登録商標）の単一投与後のＴｒｅｇのｐＳＴＡＴ５ａの変化。データは、平均値±ＳＤとして示される。 カニクイザルにおけるＴｒｅｇの誘導において、低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、高用量のプロロイキン（登録商標）よりも有効である。正常な健常カニクイザル（ｎ＝５の群）は、低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又は高用量のプロロイキン（登録商標）で処置され、調節性Ｔ細胞の変化が１０日目に試験された。０日目と７日目に、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は１６８００ＩＵ／ｋｇ（１２μｇ／ｋｇ）の用量でＳＣ投与された。プロロイキン（登録商標）の処置（２０００００ＩＵ／ｋｇ）は、合計５回用量に対して週当たり３回、皮下投与された。結果は、（Ａ）血液ｍｍ３あたりの全Ｔｒｅｇの変化、（Ｂ）Ｔｒｅｇの倍率増加、及び（Ｃ）通常型ＣＤ４＋ ＦＯＸＰ３−細胞に対するＴｒｅｇの比率の変化について平均値±ＳＤとして示される。空の棒：は、ＩＬ−２処置を示し、影付きの棒はビヒクル対照を示す。 インビボでのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２ Ｔｒｅｇ活性化に対する感受性バイオマーカーとしての、エキソビボでの全血リン酸化ＳＴＡＴ５。健常なカニクイザル（ｎ＝５）へのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の単一低用量（１２μｇ／ｋｇ）のインビボ投与後１日目及び３日目に、全血が採取され、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５ａ）について刺激をせずに直ちに試験された。各々のサルは、処置前０日目に出血させ、ｐＳＴＡＴ５ａの量を測定し（影付きの棒）、処置後に倍率変化を評価するために個々に使用した（空の棒）。（Ａ）１日目及び３日目のＴｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａの倍率変化、（Ｂ）通常型ＣＤ４＋ ＣＤ４５−サルのＴ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ａの倍率変化、及び（Ｃ）ナイーブＴ細胞ｐＳＴＡＴ５ａの倍率変化が示される。データは、平均値±ＳＤとして示される。 インビボでの低用量ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２活性化に対する感受性バイオマーカーとしての、エキソビボでの全血ｐＳＴＡＴ５ａ。健常なカニクイザルへのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の単一低用量のインビボ投与後１日目から７日目に、全血が採取され、ｐＳＴＡＴ５ａについて刺激をせずに直ちに試験された。各々のサルは、ｐＳＴＡＴ５ａの非刺激レベルのために、処置前０日目に出血させ、処置後のｐＳＴＡＴ５ａの変化と比較した。（Ａ）２μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２による処置の前後のＴｒｅｇのｐＳＴＡＴ５ａ（ｎ＝４）。（Ｂ）６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２による処置の前後のＴｒｅｇのｐＳＴＡＴ５ａ（ｎ＝６）。データは、平均値±ＳＤとして示される。 エキソビボのカニクイザルの全血Ｋｉ−６７は、インビボでのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２誘導Ｔ細胞増殖に対するマーカーとして機能を果たす。図１４に記載される、２及び６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２で処置されたカニクイザルは、インビボでの増殖の程度を評価するために、細胞内マーカーＫｉ−６７の変化についてエキソビボでモニターされた。細胞周期における細胞（Ｋｉ−６７＋）の正常な定常状態の割合は、治療前の０日目に定量化し、その後、次の７日目から１１日目まで毎日モニターされた。（Ａ）ＴｒｅｇのＫｉ−６７＋の％、（Ｂ）通常型ＣＤ４＋ＣＤ４５−サル／エフェクターＴ細胞のＫｉ−６７＋の％、及び（Ｃ）ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞のＫｉ−６７＋の％が示される。データは、平均値±ＳＤとして示される。 ナイーブ健常カニクイザルにおいてＴｒｅｇに対するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の時間と低用量の効果。（Ａ）６ｍｇ／ｋｇのＤＰ４７ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２後のＴｒｅｇの絶対数における時間依存性変化。（Ｂ）処置後のＴｒｅｇのｐＳＴＡＴ５ａの時間依存性変化、（Ｃ）Ｔｒｅｇの倍率変化の時間依存性変化、及び（Ｄ）ＤＰ４７Ｇｓ ＩｇＧ−ＩＬ−２で処置されたサルからのＴｒｅｇからのＴｒｅｇの倍率変化（空の棒、２から３６μｇ／ｋｇ）に対するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２で処置されたもの（影付き棒）の比較。全データは、平均値±ＳＤとして示される（ｎ＝４から６）。 ナイーブ健常カニクイザルにおいてＴｒｅｇに対する極低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の時間と低用量の効果。（Ａ）０．７及び２μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の投与後のＴｒｅｇの倍率増加の時間依存性変化（それぞれｎ＝２及び６）。（Ｂ）処置前の０日目及び処置後１日から４日目に測定されたＴｒｅｇのｐＳＴＡＴ５ａの時間依存性変化、（Ｃ）Ｔｅｆｆ／ｍｅｎ細胞のｐＳＴＡＴ５ａの時間依存性変化。全データは、平均値±ＳＤとして示される（０．７ｍｇ／ｋｇでｎ＝３及び２ｍｇ／ｋｇでｎ＝８）。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２対ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の、カニクイザルの全血Ｔｒｅｇを増加させるそれらの能力についての用量依存性比較。全データは、平均値±ＳＤとして示される（ｎ＝３から６）。 高用量のＩＬ−２は、カニクイザルおいて好酸球増加症を誘導する。血中好酸球数の変化は、プロロイキン（登録商標）又はＩＬ−２のイムノコンジュゲートによる全ての試験でモニターした。好酸球増加は、高用量プロロイキン（登録商標）による処置（２ｘ１０５ＩＵ／ｋｇを２週間、週に３回）後、又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２のより高用量での処置後、７日目〜１４日目で検出された。ベースラインの好酸球数は、左側の影付きの棒であり、と６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の後のものは右側の影付き棒である。（Ａ）各用量群内の各動物からの好酸球数及び（Ｂ）処置後に好酸球が増加したものからのみの好酸球数。データは、平均値±ＳＤとして示される。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、プロロイキン（登録商標）と比較してＰＫ特性を強化している。ＮＯＤマウスは、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はプロロイキン（登録商標）の示された用量を、腹腔内（ＩＰ）（左パネル）又は皮下に（ＳＣ）（右パネル）注射された。ヒトＩＬ−２は、ｍＡｂベースの捕捉アッセイにより、示された時間での血清サンプルにおいて評価され、各アッセイの検出限界は、各グラフを横切る水平線として示される。 ＣＤ２５とＦＯＸＰ３共に、プロロイキン（登録商標）、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２、及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２で処理した後に、マウスのＴｒｅｇを増加させる。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、プロロイキン（登録商標）（２０，０００及び１０００００ＩＵ／マウス、ｎ＝３）、又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２（６０、３００、または１５００ＩＵ／マウス、ｎ＝３）で処置し、ビヒクル処置マウスを非刺激対照として含めた（ｎ＝４）。処置の２４時間後に、脾臓のＴｒｅｇは、ＣＤ２５及びＦＯＸＰ３のレベルについて評価された。（Ａ）細胞表面のＣＤ２５の用量依存性の変化、及び（Ｂ）は、細胞内ＦＯＸＰ３の用量依存性の変化を３つ全てのＩＬ２の分子に対して観察した。ビヒクルマウスのＭＦＩの平均は、ＣＤ２５において４９００、ＦＯＸＰ３において１５６６であった。データは、平均値±ＳＤとして示される（ｎ＝３）。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２によるインビボでの処置は、マウス、ヒツジの赤血球遅延型過敏症（ＤＴＨ）を抑制する。全データは、ビヒクル（１００％応答）、ＩｇＧ−ＩＬ−２（４０００ＩＵ／マウス）又は陽性対照としてマウスＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（２００μｇ／マウス）で処置した個々のマウスについて示されている。（Ａ）ＮＯＤマウスからの結果と（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス。一日の４つのＤＴＨ応答の大きさが、非免疫マウスと比較して足の重量の変化（Δ足の重量）として示されている。データは、平均値±ＳＤとして示される。 ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２（４０００ＩＵ／マウス）によるインビボ処置は、（Ａ）免疫化後２１日目のＣ５７ＢＬ／６マウス、及び（Ｂ）免疫化後７日目のＮＯＤマウスにおいて、ＫＬＨに対するマウスＩｇＧ抗体応答を抑制する。データは、平均値±ＳＤとして示される。
定義
本明細書において、用語は、以下に定義されていない限り、当技術分野で一般的に使用されるように使用される。
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は、免疫グロブリン分子及びＩＬ−２分子を含む融合ポリペプチド分子を指し、融合タンパク質の成分は、ペプチド結合により、直接又はペプチドリンカーを介して互いに連結されている。明確にするため、融合タンパク質の免疫グロブリン成分の個々のペプチド鎖は、非共有結合で、例えば、ジスルフィド結合によって連結されていても良い。
「融合された」とは、直接又は一以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。特定の抗原に結合する免疫グロブリンの能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）および伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への免疫グロブリンの結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定される場合、抗原に対する免疫グロブリンの結合の約１０％未満である。ある実施態様において、抗原へ結合する免疫グロブリンは、解離定数（ＫＤ）≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。
「親和性」又は「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離の比率である解離定数（ＫＤ）および会合速度定数（ぞれぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）で表すことができる。従って、同等の親和性は、速度定数の比が同じままである限り、別の速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特別な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合の減少」とは、例えばＦｃ受容体に対する結合の減少であり、例えばＳＰＲにより測定される場合、それぞれの相互作用の親和性の減少を指す。明確にするために、この用語はまた、親和性がゼロへの低下（又は分析法の検出限界以下）、即ち、相互作用の完全な撤廃をも含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用されるように、用語「抗原決定基」は「抗原」と同義語であり、抗体が結合し、抗体−抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子の部位（例えば、非隣接アミノ酸の種々の領域を形成する、アミノ酸又は立体構造的配置の隣接伸長）を意味する。有用な抗原決定基は、例えば、細胞の表面上に、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見いだすことができる。
本明細書で使用される場合、「単鎖」なる用語は、ペプチド結合により直線的に結合したアミノ酸モノマーを含有する分子を意味する。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体を含む。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）がある。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのクラスの１つに割り当てることができ、そのうち幾つかは更にγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブクラスに分割され得る。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子およびＦｃドメインから本質的になる。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）、及び重鎖のＶＨドメイン及び第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む免疫グロブリン断片を指す。
抗体又はイムノコンジュゲートの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、免疫グロブリン又は抗体の抗原への結合に一般的に関与する、免疫グロブリン又は抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。しかしながら、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンは、抗原結合特異性を付与しない可変領域を含み得る。免疫グロブリン又は抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似した構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Kindt et al.Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原−結合特異性を付与するのに十分であり得る。
本明細書で使用される用語「高頻度可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループ（「高頻度可変ループ」）を形成する免疫グロブリン又は抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、天然の四鎖抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。ＨＶＲは、一般に高頻度可変ループ及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を有し、後者は、抗原認識に関与し、及び／又は最も高い配列可変性をしている。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０−５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９−９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１−３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０−６５、及びＨ３のアミノ酸残基９５−１０２に生じる（Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991））。ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般に高頻度可変ループからのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、省略された（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔら（「Ｋａｂａｔの番号付け」と称す）に従い、本明細書において番号が付けられる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、高頻度可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲとＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４の配列のようになるであろう。
「ヒト免疫グロブリン」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト免疫グロブリンのレパートリー又は他のヒト免疫グロブリンをコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する免疫グロブリンのそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト免疫グロブリンのこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化免疫グロブリンを特異的に除外する。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧのＣＨ２及びＩｇＧのＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常は約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。一実施態様において、糖鎖は、ＣＨ２ドメインに結合している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、天然型配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインである。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端残基の伸長（即ち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然型配列のＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に導入された「突起」（ノブ）を、及びその他方の鎖に導入された「空洞」（ホール）を有するＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明確に援用される、米国特許第５，８２１，３３３号を参照）であってよい。
このような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載される同一でない２つの免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用され得る。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「エフェクター機能」なる用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に起因し、抗体アイソタイプによって異なる、生物学的活性を指す。免疫グロブリンのエフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体−依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原の取込み、細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化が含まれる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、免疫グロブリンのＦｃ領域による結合後に、エフェクター機能を遂行させるために受容体を持つ細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発させるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔの受託番号Ｐ０８６３７（バージョン１４１）を参照）。
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「インターロイキン−２」又は「ＩＬ−２」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＩＬ−２を指す。その用語は、未処理のＩＬ−２、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＩＬ−２を含む。その用語はまた、天然に存在するＩＬ−２の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトＩＬ−２のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。未処理のヒトＩＬ−２は、成熟したＩＬ−２分子に欠損している、Ｎ末端の２０アミノ酸シグナルペプチドを付加的に含む。
「天然型ＩＬ−２」は「野生型ＩＬ−２」とも称され、天然に生じるＩＬ−２を意味する。天然型ヒトＩＬ−２の配列は、配列番号１に示される。本発明の目的のため、野生型なる用語はまた、天然に生じる、天然型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２受容体への結合を変えない一以上のアミノ酸変異、例えば、ヒトＩＬ−２の１２５位に相当する位置においてシステインのアラニンへの置換などを含むＩＬ−２の形態を包含する。幾つかの実施態様において、本発明の目的のための野生型ＩＬ−２は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む（配列番号３を参照）。
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＣＤ２５」又は「ＩＬ−２受容体」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＣＤ２５を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＣＤ２５、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ２５を含む。その用語はまた、ＣＤ２５の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。特定の実施態様において、ＣＤ２５はヒトＣＤ２５である。典型的なヒトＣＤ２５のアミノ酸配列（シグナル配列のＡｖｉ−タグ及びＨｉｓタグを有するもの）は配列番号２５に示される。
「高親和性ＩＬ−２受容体」なる用語は、本明細書で使用される場合、受容体γ−サブユニット（共通サイトカイン受容体γ−サブユニット、γｃ、又はＣＤ１３２としても知られる）、受容体β−サブユニット（ＣＤ１２２又はｐ７０としても知られる）及び受容体α−サブユニット（ＣＤ２５又はｐ５５としても知られる）から成るＩＬ−２受容体のヘテロ三量体形態を指す。一方、「中間親和性ＩＬ−２受容体」なる用語は、γ−サブユニット及びβ−サブユニットのみを含みα−サブユニットを持たないＩＬ−２受容体を指す（総説については、例えばOlejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)を参照）。典型的なヒトＣＤ１２２及びＣＤ１３２のアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを有するＦｃ領域に融合される）は、配列番号２１及び２３にそれぞれ示される。
「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞」は、他のＴ細胞を抑制することができるＣＤ４＋ Ｔ細胞の特定のタイプを意味する。Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４、ＩＬ−２受容体のαサブユニット（ＣＤ２５）、及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現により特徴づけられ（Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)、腫瘍によって発現されるものを含む、抗原に対する末梢自己免疫寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たしている。
「Ｔｒｅｇ細胞の選択的活性化」は、他のＴ細胞サブセット（例えば、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ Ｔ細胞）又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の同時活性化を本質的に含まないＴｒｅｇ細胞の活性化を意味する。
これらの細胞型を同定し、区別するための方法は、実施例に記載される。活性化は、（例えば、リン酸化ＳＴＡＴ５ａの検出により測定されるように）ＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導、（例えば、Ｋｉ−６７を検出することによって測定されるように）増殖の誘導、及び／又は活性化マーカー（例えば、例えば、ＣＤ２５など）の発現の上方制御が含まれる場合がある。
用語「ペプチドリンカー」は、一以上のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られ、又は本明細書に記載されている。適切な、非免疫原性ペプチドペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎは、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は一般には１と１０の間、典型的には２から４の間の数である。
用語「修飾」は、ペプチド主鎖（例えばアミノ酸配列）の任意の操作又はポリペプチドの翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を意味する。
一実施態様において、「ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）修飾」は、ＣＨ３ドメインの２つの免疫グロブリン重鎖の間の界面の修飾を指し、ここで、ｉ）一重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、他の重鎖のＣＨ３ドメイン内の界面の中のキャビティ（「ホール」）に配置可能である、一重鎖のＣＨ３ドメイン内の界面の中に突起（「ノブ」）を生成し、及び、ｉｉ）他の重鎖のＣＨ３ドメイン内で、アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、その中に、第一のＣＨ３ドメイン内の界面の中の突起（「ノブ」）を配置可能である、第二のＣＨ３ドメイン内の界面の中にキャビティ（「ホール」）を生成する。一実施態様において、「ノブ・イントゥ・ホール修飾」は、抗体重鎖の一方に、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗと、任意でアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、かつ、抗体重鎖の他方に、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、任意でアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「穴」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。位置Ｓ３５４とＹ３４９のぞれぞれにおける２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つの抗体重鎖間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
アミノ酸「置換」は、ポリペプチドにおける、一アミノ酸の別のアミノ酸による置換を意味する。一実施態様において、アミノ酸は、同様の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸により置換される、例えば、保存的アミノ酸置換である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は、両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み；極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含み；正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。例えば、アミノ酸置換はまた、異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で一つのアミノ酸を置換すること、例えば、一群（例えば、極性）由来のアミノ酸を異なる群（例えば、塩基性）由来の別のアミノ酸で置換することをもたらすことができる。アミノ酸置換は、当分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基の改変方法がまた有用でありうることが意図される。本明細書において同一のアミノ酸置換を示すために様々な命名が使用されてもよい。例えば、免疫グロブリン重鎖の位置３２９におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁、Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用されるの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書では同義的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより、又は合成反応により、ポリマー中に組み込むことができる任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に、標識へのコンジュゲーションなどの修飾（複数）を含んでもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最大で５つの点変異を含みうることを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されたり、又は別のヌクレオチド置換され得、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までの多数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置又はそれらの位置の間のどこでも起こり得、参照配列中の残基中に個別に散在するか又は参照配列内における一以上の隣接グループ中に散在している。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、従来法により、上記のものような既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と、核酸含有物において完全に同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞において、スクリーニング又は選択された場合に、同様の機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。宿主細胞は、本発明の融合タンパク質を生成するために使用することができる任意のタイプの細胞システムである。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、わずかな例を挙げると、しかしまた、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織の中に含まれる細胞も含む。
「有効な量」の薬剤とは、投与される細胞又は組織において生理学的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的に有効な量の薬剤は例えば、疾患の有害作用を除去、低下、遅延、最小化又は防止させる。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特に、個体又は被検体はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（treat）」または「治療している（treating）」など文法上の変形）は、治療されている個体における疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
「自己免疫疾患」は、個々の自身の組織から生じ及びそれに向けられた非悪性疾患又は障害を意味する。自己免疫疾患又は障害の例は、限定されないが、乾癬及び皮膚炎を含む炎症性皮膚疾患などの炎症性応答（例えば、アトピー性皮膚炎）；炎症性腸疾患に関連する応答（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎など）；皮膚炎；湿疹や喘息などのアレルギー症状；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎、皮膚エリテマトーデスを含むがこれらに限定されない）；糖尿病（例えば、１型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症及び若年発症糖尿病を含む。
本発明の融合タンパク質
本発明は、本明細書に記載される治療方法における使用のために特に有利な特性を有する新規の免疫グロブリン−ＩＬ−２融合タンパク質を提供する。
第一の態様において、本発明は、（ｉ）Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び（ｉｉ）２つのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子を含む融合タンパク質を提供する。
一実施態様において、前記融合タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子と、２個のインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子と、及び任意で一以上のペプチドリンカーとから本質的になる。
実施例に示されるように、２つのＩＬ−２分子を含む融合タンパク質は、驚くべきことに、単一のＩＬ−２分子を含む対応する融合タンパク質と比較した場合、調節性Ｔ細胞において大きく改善された有効性と選択性を提供する。
一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、特に、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子であり、即ち、それは完全なヒト可変領域及び定常領域を含む。典型的なヒトＩｇＧ１定常領域の配列は、配列番号１に示される。ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子は、（ｉ）各々がＮ末端からＣ末端に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、２つの免疫グロブリン軽鎖、及び（ｉｉ）各々がＮ末端からＣ末端に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つの免疫グロブリン重鎖を含む。後者の２つのドメインは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域の部分を形成する。二つの重鎖は、Ｆｃ領域内で二量体化する。
本発明による融合タンパク質の一実施態様において、前記２つのＩＬ−２分子は各々、それらのＮ末端のアミノ酸で、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖の一方のＣ末端アミノ酸へ、任意でリンカーペプチドを介して融合している。免疫グロブリン重鎖への２つの（同一な）ＩＬ−２分子の融合は、望ましくない副生成物の形成を回避し、非同一の重鎖のヘテロダイマー化、例えばノブ・イントゥ・ホール修飾などを促進する修飾の必要性を不要にする、融合タンパク質の簡単な生成を可能にする。
免疫グロブリン分子のＩＬ−２分子への融合は、遊離の（非融合）ＩＬ−２と比較して、（ＦｃＲｎへの結合を介したリサイクリング、及び腎濾過のための閾値を十分超えている分子の大きさに起因する）長い血清半減期を含む望ましい薬物動態学的特性を提供する。更に、免疫グロブリン分子の存在は、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる、融合タンパク質の簡単な精製を可能にする。しかしながら、同時に、免疫グロブリン分子、具体的には、免疫グロブリン分子のＦｃ領域の存在は、好ましいＩＬ−２受容体を有する細胞に対してよりむしろ、Ｆｃ受容体を発現する細胞への融合タンパク質の望ましくない標的化をもたらし得る。更に、Ｆｃ受容体の係合は、（炎症促進性）サイトカインの放出及び調節性Ｔ細胞以外の種々の免疫細胞の望ましくない活性化をもたらし得る。従って、本発明の融合タンパク質に含まれる前記免疫グロブリン分子は、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含む。特定の実施態様において、前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である。Ｆｃ受容体への結合親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（GE Healthcare）など標準的な計測機器を使用してＥＬＩＳＡによって又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、そのようなＦｃ受容体は、組換え発現によって得ることができる。結合親和性を測定するための特定の事例的及び具体的な実施態様を以下に記載する。一実施態様によれば、Ｆｃ受容体への結合親和性は、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（GE Healthcare）を使用して、ＣＭ５チップに固定化したリガンド（Ｆｃ受容体）を用いて表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥヘルスケア）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。組換えリガンドを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で、０．５−３０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１００−５０００になるように１０μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、抗体の３から５倍の段階希釈（〜０．０１ｎＭから３００ｎＭの間の範囲）が、ＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、２５℃、ｐＨ７．４）中で約３０〜５０μｌ／分の流量で注入される。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００エバリュエーションソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。代わりに、Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などを使用して評価することができる。
一実施態様において、修飾は、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリンの結合親和性を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。典型的には、同一の一以上のアミノ酸置換が２つの免疫グロブリン重鎖の各々に存在する。一実施態様において、前記アミノ酸変異は、Ｆｃレセプターに対する免疫グロブリンの結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍減少させる。Ｆｃ受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を減少させる一以上のアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリンの結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は更に少なくとも５０倍減少させ得る。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Ｆｃ受容体に対し、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満の結合親和性を呈する。
一実施態様において、前記Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体であり、より具体的にはＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合親和性が減少する。更により特定の実施態様において、前記Ｆｃ受容体はＦｃγＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＩＩＩａである。幾つかの実施態様において、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性もまた減少する。一実施態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体への免疫グロブリン分子の結合親和性の保存は、免疫グロブリン分子が、ＦｃＲｎに対し、非修飾形態の免疫グロブリン分子の約７０％より大の結合親和性を呈する場合に達成される。本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリン分子は、約８０％より大、更には約９０％より大のこのような親和性を呈しうる。
一実施態様では、Ｆｃ受容体への免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる前記修飾は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域において、特にＣＨ２ドメインにおいてである。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置３２９に（ＥＵ番号付け）、アミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置２３４と２３５に（ＥＵ番号付け）、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗体重鎖の位置３２９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含み、そして免疫グロブリン重鎖の位置２２８、２３３、２３４、２３５、２９７及び３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖にアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。その全体が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されるように、アミノ酸置換のこの組み合わせは、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンのＦｃγ受容体結合を特に効率的に消失させる。ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１はまた、このような修飾免疫グロブリンを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などその特性を決定するための方法を記載する。
免疫グロブリン重鎖に修飾を含む免疫グロブリンは、当該技術でよく知られている遺伝的又は化学的方法を使用し、アミノ酸を欠失、置換、挿入又は修飾することにより調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
Ｆｃ受容体結合を減少させる修飾を含む免疫グロブリン又は抗体は、一般に、対応する非修飾免疫グロブリン又は抗体と比較して、低下したエフェクター機能、特に低下したＡＤＣＣを有する。それゆえ、一実施態様では、Ｆｃ受容体への免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる前記修飾は、免疫グロブリン分子のエフェクター機能を低下させる。特定の実施態様において、前記エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施態様において、ＡＤＣＣは、前記修飾を持たない対応する免疫グロブリン分子により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満まで低下する。免疫グロブリン又は抗体のエフェクター機能は、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５５００３６２号：Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。幾つかの実施態様において、補体成分に対する、具体的にはＣ１ｑに対する免疫グロブリン分子の結合もまた低下する。従って、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）もまた低下され得る。免疫グロブリンがＣ１ｑに結合することができそれ故にＣＤＣ活性を有するかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。
本明細書に上述され及びＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載される免疫グロブリンに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の減少を伴う免疫グロブリンはまた、一以上のＦｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の置換を持つものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、ＩｇＧ１免疫グロブリンと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を示す。従って、幾つかの実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリン分子はＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン、特にヒトＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。一実施態様において、前記ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、位置Ｓ２２８でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様において、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、位置Ｌ２３５でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。その他の実施態様において、前記ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、位置Ｐ２３９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様において、前記ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このような修飾ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンとそのＦｃγ受容体結合特性はＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持つ。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持たず、具体的にはヒト抗原への特異的結合能力を持たない。このような免疫グロブリン分子の抗原への特異的結合の欠如は（即ち、非特異的相互作用から区別することができる任意の結合が存在しない場合）、例えば、本明細書に記載されるようにＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴によって測定することができる。このような免疫グロブリン分子は、例えば、特定の組織への標的化が所望されない、融合タンパク質の血清半減期を向上させるために、特に有用である。
一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｈ３−２３生殖細胞系配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトＶｋ３−２０生殖細胞系配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。更により具体的な実施形態において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列、及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。これらの可変領域配列を含む免疫グロブリン分子は、抗原、特にヒト抗原への特異的結合能力を持たない。それらは、正常組織並びにＰＢＭＣへの結合を欠き、多反応性を有さず、イメージングによるインビボでの非特異的な蓄積を示さなかった（データ非表示）。可変領域配列は、ＧＳＧ配列が非結合免疫グロブリンを生成するために導入されている、重鎖のＣＤＲ３を除いて、完全にヒト生殖細胞系配列に基づいている。
一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、野生型ＩＬ−２分子である。一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２分子である。特定の実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、配列番号１（天然型ヒトＩＬ−２）の配列を含む。
一実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置にアミノ酸置換を含む。一実施態様において、前記アミノ酸置換はＣ１２５Ａである。特定の実施態様において、前記ＩＬ−２分子は、配列番号３（アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含むヒトＩＬ−２）の配列を含む。あるいは、米国特許第４，５１８，５８４号に記載されるように、位置１２５でのシステインは、別の天然アミノ酸、例えばセリン、スレオニン又はバリンなどで置換されても良く、それぞれＣ１２５Ｓ ＩＬ−２、Ｃ１２５Ｔ ＩＬ−２又はＣ１２５Ｖ ＩＬ−２を生じる。そこに記載されるように、ＩＬ−２のＮ−末端アラニン残基が欠失されｄｅｓ−Ａ１ Ｃ１２５Ｓ又はｄｅｓ−Ａ１ Ｃ１２５Ａ等の変異体を生じうる。あるいは又は併せて、ＩＬ−２変異体は、野生型ヒトＩＬ−２の位置１０４に通常生じるメチオニンがアラニン等の中性アミノ酸で置換される変異を含みうる（米国特許第５，２０６，３４４号を参照）。ヒトＩＬ−２におけるそのような修飾は、増加した発現又は安定性などの付加的な利点を与え得る。
本発明の融合タンパク質に含まれるＩＬ−２分子は、非グリコシル化ＩＬ−２分子であっても良い。例えば、融合タンパク質がＣＨＯ又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞で発現されるとき、ＩＬ−２分子のＯ−グリコシル化部位の除去によって、より均質な生成物を生じる。従って、ある実施態様において、ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置でＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を除去する修飾を含む。一実施態様では、ヒトＩＬ−２の残基３に対応する位置でＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を除去する前記修飾はアミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、及びＴ３Ｐを含む。特定の実施態様において、前記修飾はアミノ酸置換Ｔ３Ａである。
一実施態様において、融合タンパク質は、２５℃でＳＰＲにより測定される場合、親和性定数（ＫＤ）が１０ｎＭ未満、特に３ｎＭ未満で、ＩＬ−２βγ受容体へ結合することができる。特定の実施態様において、前記ＩＬ−２βγ受容体はヒトＩＬ−２βγ受容体である。一実施態様において、融合タンパク質は、２５℃でＳＰＲにより測定される場合、親和性定数（ＫＤ）が１００ｎＭ未満、特に２０ｎＭ未満で、ＩＬ−２βγ受容体へ結合することができる。特定の実施態様において、前記ＩＬ−２α受容体はヒトＩＬ−２α受容体である。ＳＰＲによる、ＩＬ−２βγ又はＩＬ−２α受容体への結合親和性を測定するたｊめの方法が本明細書に記載される。一実施態様によれば、結合親和性（ＫＤ）は、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（GE Healthcare）を使用して、ＣＭ５チップに固定化したＩＬ−２受容体を用いて表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥヘルスケア）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。組換えＩＬ−２受容体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で、０．５−３０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ２００−１０００（ＩＬ−２Ｒαに対して）又は５００−３０００（ＩＬ−２Ｒβγに対して）になるように１０μｌ／分の流速で注入する。ＩＬ−２受容体の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、融合タンパク質の３倍の段階希釈（〜３ｎＭから３００ｎＭの間の範囲）が、ＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、２５℃、ｐＨ７．４）中で約３０μｌ／分の流速で注入される。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００エバリュエーションソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。
特定の態様において、本発明は、（ｉ）免疫グロブリン重鎖に、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）各々がそのＮ末端アミノ酸で、ペプチドリンカーを介して免疫グロブリン重鎖の一方のＣ末端アミノ酸に融合した、２つのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子とを含む融合タンパク質を提供する。
一実施態様において、前記免疫グロブリン分子と前記ＩＬ−２分子はヒトである。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、配列番号９の重鎖可変領域配列、及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。更なる特定の実施態様において、前記ＩＬ−２分子の各々は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。より特定の実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号１７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号１９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
実施例に示されるように、本発明の融合タンパク質は、調節性Ｔ細胞を選択的に活性化するために用いることができる（即ち、他のＴ細胞サブセット及び／又はＮＫ細胞の同時活性化を本質的に含まない）。従って、本発明は、インビトロ又はインビボで調節性Ｔ細胞の選択的活性化に使用するための融合タンパク質を提供する。一実施態様において、前記使用は、調節性Ｔ細胞をインビボ又はインビトロで前記融合タンパク質と接触させることを含む。一実施態様において、前記使用は、他の（非調節性）Ｔ細胞を前記融合タンパク質と接触させることを更に含む。一実施態様において、前記使用はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約１ｎｇ／ｍＬ以下、具体的には約０．１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記使用はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約２０μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、具体的には約１２μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、より具体的には約６μｇ／ｋｇ体重以下の用量で使用される（「体重」は、融合タンパク質が投与される個体の体重を指す）。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質と前記調節性Ｔ細胞を接触させることを含む、インビトロ又はインビボでの調節性Ｔ細胞の選択的活性化のための方法を提供する。一実施態様において、前記方法は、他の（非調節性）Ｔ細胞を、前記融合タンパク質と接触させることを更に含む。一実施態様において、前記活性化は、増殖の誘導及び／又はＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む。一実施態様において、前記方法はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約１ｎｇ／ｍＬ以下、具体的には約０．１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記方法はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約２０μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、具体的には約１２μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、より具体的には約６μｇ／ｋｇ体重以下の用量で使用される（「体重」は、融合タンパク質が投与される個体の体重を指す）。
前のパラグラフに記載される使用又は方法の所定の実施態様によれば、前記活性化は、調節性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は調節性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む。増殖の誘導は、実施例に記載されるように、例えば細胞内増殖マーカーＫｉ−６７の検出によって測定することができる。一実施態様において、本発明の融合タンパク質により活性化される調節性Ｔ細胞の増殖は、非活性化調節性Ｔ細胞の増殖に比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍増加する。一実施態様において、本発明の融合タンパク質と接触された他の（非調節性）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、前記融合タンパク質と接触されない対応する細胞の増殖と比較して、約１．５倍未満、約１．２倍未満、又は約１．１倍未満増加する。ＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導は、実施例に記載されるように、例えば、リン酸化ＳＴＡＴ５の検出によって測定することができる。一実施態様において、本発明の融合タンパク質により活性化される調節性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達は、非活性化調節性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約５倍増加する。一実施態様において、本発明の融合タンパク質と接触された他の（非調節性）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達は、前記融合タンパク質と接触されない対応する細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達と比較して、約１．５倍未満、又は約１．２倍未満、又は約１．１倍未満増加する。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載される融合体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、５、６、７、１０、１２、１８及び２０に記載された配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％同一であるものを、その機能性断片又は変異体を含み、含む。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能性融合タンパク質を形成する。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分からの別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。
一実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号９又は１１に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１７又は１９に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、５、６、７、１０、１２、１８又は２０に示される核酸配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、５、６、７、１０、１２、１８又は２０に示される核酸配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号９又は１１のアミノ酸配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号１７又は１９のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明は、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片を包含し、ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を含む、配列番号９又は１１の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた、免疫グロブリン分子と２つのＩＬ−２分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片を包含し、ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を含む、配列番号１７又は１９のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
ある実施態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の融合タンパク質は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、融合タンパク質（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明の一以上のポリヌクレオチドを含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、融合タンパク質（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片でありうる。発現ベクターは、融合タンパク質（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコーディング領域）が、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳調節要素と作動可能に結合してクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合には、コード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の融合タンパク質（断片）、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合され又は融合されない異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、例えばポリペプチドなど遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下に遺伝子産物の発現を配置するように、一以上の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコーディング領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと結合することができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと併せて最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及び（例えばラウス肉腫ウイルスなど）レトロウイルスを含む。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギα−グロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を調節することができる他の配列に由来するものを含む。更なる好適な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、様々な転写制御エレメントが当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びウィルス系由来の要素（特に、内部リボソーム進入部位、又はＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列としても知られる）を含む。発現カセットはまた、他の特性、例えば複製起源、及び／又は染色体組込み要素、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）を含みうる。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコーディング領域を伴い得る。例えば、融合体の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが本発明の融合タンパク質又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。ある実施態様において、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸及びヌクレオチド配列を、配列番号３９〜４７に示す。
後の精製を容易にし（例えば、ヒスチジンタグ）又は融合タンパク質の標識化における補助のために使用されうる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする融合タンパク質（断片）の中又は末端に含まれうる。
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。更なる実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれ関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独または組み合わせて組み込むことができる。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、本発明の融合タンパク質（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。融合タンパク質の複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は、適切である場合、特定の発現ベクターを用いて形質移入又は形質導入されてよく、多量のベクター含有細胞は、例えば臨床用途に、十分な量の融合タンパク質を得るために、大規模発酵槽に播種して増殖させることができる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要ない場合には、ポリペプチドは細菌で産生することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、グリコシル化経路が、「ヒト化」されている菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞の他の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）系（例えば、Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)）に記載されているような２９３又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適したある種の哺乳動物宿主細胞の概説について、例えばYazaki 及び Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように操作されうる。
一実施態様において、本発明による融合タンパク質を生産する方法が提供され、その方法は、本明細書に与えられるように、融合タンパク質の発現に適した条件下で、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から融合タンパク質を回収することを含む。
本発明の融合タンパク質において、その構成要素（免疫グロブリン分子及びＩＬ−２分子）は相互に遺伝子融合している。融合タンパク質は、その成分が、お互いに直接的に又はリンカー配列を介して互いに間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成物と長さは、当該技術分野において周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。また、付加的な配列が、所望であれば、融合タンパク質の個々の成分を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むために含まれていてもよい。
ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、少なくとも、抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、及びそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。非天然に生じる抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか（例えば米国特許第４，１８６，５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）によって得られうる。
任意の動物種の免疫グロブリンが、本発明で使用することができる。本発明において有用である、非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を意図する場合、免疫グロブリンの定常領域はヒトに由来するキメラ形態の免疫グロブリンが使用され得る。また、ヒト化又は完全ヒト形態の免疫グロブリンが、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定されなが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体の機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わない、ヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみを移植ヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分（section）で「覆い隠す」ことを含む。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、それに由来することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体、又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成され得る（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは典型的には、抗体断片を短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてディスプレイする。
ある実施態様において、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンは、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０２０００６（親和性成熟に関する実施例を参照）又は米国特許出願公開番号２００４／０１３２０６６（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明において有用な抗体の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体を同定するために使用され得る。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原は、抗原に結合する第一の標識された抗体、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された未標識の第二の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合において、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
本明細書で記載のように調製される免疫グロブリンは、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、融合タンパク質が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に本質的に記載されるように融合タンパク質を単離するために使用されうる。融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される融合タンパク質は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証されるように、インタクトであって、正しく会合していると示された（例えば図２を参照）。
組成物、製剤、及び投与の経路
更なる態様においは、本発明は、例えば下記の治療方法の何れかにおける使用のための、本明細書に提供される融合タンパク質の何れかを含んでなる薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される融合タンパク質の何れか、及び薬学的に許容される担体を含む。他の実施態様において、薬学的組成物は、例えば以下に記載するような、少なくとも一の付加的な治療剤と、ここで提供される融合タンパク質を含有する。
更に提供されるのは、インビボでの投与に適した形態における本発明の融合タンパク質を生産する方法であって、（ａ）本発明による融合タンパク質のを得ること、及び（ｂ）少なくとも一の薬学的に許容可能な担体を含む融合タンパク質の製剤化を含み、それによって融合タンパク質の調製物がインビボでの投与のために製剤化される方法である。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶解又は分散された、治療的に有効な量の一又は複数の融合タンパク質を含む。「薬学的に又は薬理学的許容可能な」なる語句は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに一般的に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に適宜投与された時に、有害な、アレルギー性の又は他の望まない応答をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一の融合タンパク質及び場合によっては更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明記によってここに援用する。更に、動物（例えばヒト）投与では、調製物が、ＦＤＡの生物学的標準品部（Office of Biological Standards）又は他の国において対応する当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度標準を満たすべきであることが理解されるだろう。好ましい組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られている、ありとあらゆる溶剤、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様な物質及びその組合せを含む（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照（出典明記によってここに援用する））。何れかの一般的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が意図される。
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるか、またそれが注射などの投与経路のために無菌である必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含みうる。本発明の融合タンパク質（及び何れかの追加の治療剤）は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼球内に、経口で、局所的に、局在的に、吸入によって（例えば、エアロゾル吸入）、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を浸す限局灌流によって直接、カテーテルによって、洗浄（lavage）によって、クリームにおいて、液体組成物（例えばリポソーム）において、又は他の方法によって、又は前述の何れかの組合せによって投与されうる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照（出典明記によってここに援用する））。非経口投与、特に静脈内注射が、発明の融合タンパク質などのポリペプチド分子の投与に最も一般的に使用される。
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射では、本発明の融合タンパク質は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合したバッファー、例えばＨａｎｋｓ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、又は生理学的緩衝生理食塩水中に製剤化されうる。溶液は、懸濁、安定及び／又は分散剤などのフォーミュラトリー剤を含みうる。あるいは、融合タンパク質は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水の構成用に粉末形態でありうる。滅菌注射溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて下に挙げる様々な他の成分を伴う適切な溶媒中に必要量で組み入れることによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を介して濾過することにより、容易に達成される。一般的に分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎分散培地及び他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液又はエマルションの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望成分の粉末を、先に滅菌−濾過されたその液体培地から得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体培地は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は注射の前に十分な生理食塩水又はグルコースでまず等張にされるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならなく、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。内毒素汚染は安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇ未満のタンパク質で最小限に保たれるべきであることが理解されるだろう。適な薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないが；リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有しうる。場合によっては、懸濁液は、高濃縮液の調製を可能にするために、適切な安定剤又は化合物の溶解度を増加させる薬剤をまた含有しうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリート（ethyl cleats）又はトリグリセリド、又はリポソームを含む。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ−粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。これらの技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences 18th editionに開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せの組成物における使用によってもたらされうる。
前述の組成物に加えて、融合タンパク質はまた、デポー調製物として製剤化されうる。そのように長く作用する製剤は、インプラント術（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与されうる。従って、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化されうる。
本発明の融合タンパク質を含んでなる薬学的組成物は、慣習的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥プロセスによって製造されうる。薬学的組成物は、薬剤的使用可能な調製物へのタンパク質の加工を容易にする一又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して、一般的な方法において製剤化されうる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
融合タンパク質は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保った塩である。これらは酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得ることができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒中において溶けやすい傾向がある。
治療方法及び組成物
本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかを、治療方法で使用することができる。
治療的方法において使用のために、本発明の融合タンパク質は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
一態様では、医薬として使用するために本発明の融合タンパク質が提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用のために本発明の融合タンパク質が提供される。ある実施態様において、治療の方法における使用のために本発明の融合タンパク質が提供される。一実施態様において、本発明は、それを必要としている個体において、疾患の治療に使用のために、本明細書に記載される融合タンパク質を提供する。ある実施態様において、本発明は、個体に融合タンパク質の治療的有効量を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用のための融合タンパク質を提供する。ある実施態様において、治療すべき疾患は、自己免疫疾患である。典型的な自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症を含む。一実施態様において、疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。特定の実施態様において、疾患は、１型糖尿病、クローン病、ＳＬＥ、及び多発性硬化症の群から選択される。より特定の実施態様において、疾患は、１型糖尿病である。別の実施態様において、疾患は多発性硬化症である。更なる実施態様において、疾患は、喘息、肺線維症又は閉塞性肺疾患である。更に別の実施態様では、疾患は、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が自己免疫疾患である場合には免疫抑制剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
更なる態様では、本発明は、必要している個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の融合タンパク質の使用を提供する一実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。ある実施態様において、治療すべき疾患は、自己免疫疾患である。一実施態様において、疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。特定の実施態様において、疾患は、１型糖尿病、クローン病、ＳＬＥ、及び多発性硬化症の群から選択される。より特定の実施態様において、疾患は、１型糖尿病である。別の実施態様において、疾患は多発性硬化症である。更なる実施態様において、疾患は、喘息、肺線維症又は閉塞性肺疾患である。更に別の実施態様では、疾患は、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症である。一実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が自己免疫疾患である場合には免疫抑制剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。
更なる態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体において疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様において、本発明の融合タンパク質を薬学的に許容される形態で含む組成物が前記個体に投与される。ある実施態様において、治療すべき疾患は、自己免疫疾患である。一実施態様において、疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。特定の実施態様において、疾患は、１型糖尿病、クローン病、ＳＬＥ、及び多発性硬化症の群から選択される。より特定の実施態様において、疾患は、１型糖尿病である。別の実施態様において、疾患は多発性硬化症である。更なる実施態様において、疾患は、喘息、肺線維症又は閉塞性肺疾患である。更に別の実施態様では、疾患は、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が自己免疫疾患である場合には免疫抑制剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。
幾つかの実施態様では、有効量の本発明の融合タンパク質が、細胞に投与される。他の実施態様では、治療的に有効な量の本発明の融合タンパク質が、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のためには、本発明の融合タンパク質の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は、治療すべき疾患の種類、投与の経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、事前の或いは併用による治療介入、融合タンパク質に対する患者の臨床的履歴及び応答性、及び担当医の判断に依存する。何れの場合も、投与に責任のある実践者が、個々の被験体に対し、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するだろう。限定するものではないが、単一又は様々な時間点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、ここで考えられる。
融合タンパク質は、患者に対して、単一、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、融合タンパク質の約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の所望される抑制が起こるまで持続するであろう。融合タンパク質の１つの例示される用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約１μｇ／ｋｇ／体重から、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで又はそれ以上、及びその中で導きだされる任意の範囲を含む。ここで挙げた数値から導きだされる範囲の非限定的な例は、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数値に基づき投与されうる。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数（又はその何れかの組合せ）の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与されうる（例えば、患者は約２〜約２０、又は例えば約６用量の融合タンパク質を受ける）。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
本発明の融合タンパク質は一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるだろう。疾患状態を治療又は防止するための使用では、発明の融合タンパク質又はその薬学的組成物は、治療的に有効な量において投与又は適用される。治療的に有効な量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の考慮のもと、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身性投与では、治療的に有効な用量は最初に、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定されうる。次いで用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を得るために、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。
最初の投与量はまた、当分野においてよく知られている技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定されうる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できるだろう。
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な融合タンパク質の血漿レベルを提供するために、個々に調整されうる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日の複数回投与によって達成されうる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定されうる。
局所投与又は選択的取込みの場合、融合タンパク質の有効な局所濃度は血漿濃度と関連しない場合がある。当業者は、過度な実験をすることなく、治療的に有効な局所投与量を最適化できるだろう。
治療的に有効な用量の融合タンパク質は一般的に、実質的な毒性をもたらすことなく治療効果を提供するだろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準的な手順によって決定できる。細胞培養アッセイ及び動物研究は、ＬＤ５０（集団の５０％に致死性である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するために使用できる。毒性及び治療効果間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表される治療指数である。大きい治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。一実施態様では、本発明による融合タンパク質は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に好適な投与量の範囲の策定に使用されうる。投与量は好ましくは、ほとんどあるいは全く毒性の無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、様々な要因、例えば採用される剤形、利用される投与経路、被験体の状態などに応じて、この範囲内において変わりうる。正確な処方、投与の経路及び投与量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師によって選択されうる。（例えばFingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1（出典明記によってその全体をここに援用する）を参照）。
本発明の融合タンパク質で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに対し、どのように及びいつ投与を終了、中断、調整するかを知っているだろう。逆に、主治医はまた、臨床反応が十分でない場合、治療を高レベルに調整することを知っているだろう（毒性を除く）。目的の障害の管理における投与量の程度は、治療される状態の重症度、投与の経路などによって様々だろう。状態の重症度は、例えば標準的な予後評価方法によって一部には評価されうる。さらに、用量及びおそらくは投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重及び反応によって様々だろう。
他の薬剤及び治療
本発明による融合タンパク質は、治療において一又は複数の他の薬剤との組合せで投与されうる。例えば、本発明の融合タンパク質が少なくとも一の付加的な治療剤と同時投与することができる。「治療剤」なる用語は、治療を必要としている個体における症状又は疾患を治療するために投与される何れかの薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療されている特定の徴候に好適な何れかの活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含みうる。ある実施態様において、付加的治療剤は、免疫抑制剤である。
このような他の薬剤は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。融合タンパク質は一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量で及び任意の経路により使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の組成物に含まれている）、及び、本発明の融合タンパク質の投与が、付加的治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。
製造品
本発明の他の態様では、上述の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の融合タンパク質である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の融合タンパク質を含有する組成物を中に収容する第一の容器と、（ｂ）更なる治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については次に与えられる：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242.
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定した。
遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子を、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって生成するか、又は自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Regensburg, Germany）によって合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準のクローニング／シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中にサブクローニングできるように適切な制限部位を伴って設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。配列番号３９−４７は、典型的なリーダーペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチド配列を与える。
ＩＬ−２Ｒ βγサブユニット−Ｆｃ融合体及びＩＬ−２Ｒ αサブユニットＦｃ融合体の調製
ＩＬ−２受容体結合親和性を研究するために、ヘテロ二量体ＩＬ−２受容体の発現を可能にするツールが作成された。「ノブ・イントゥー・ホール」技術Merchant et al., Nat Biotech. 16, 677-681 (1998)を使用してヘテロ二量体化するよう操作されたＦｃ分子（Ｆｃ（ホール））（配列番号２１及び２２（ヒト）、配列番号２７及び２８（マウス）及び配列番号３３及び３４（カニクイザル）を参照）にＩＬ−２受容体のβ−サブユニットを融合させた。次いで、ＩＬ−２受容体のγ−サブユニットをＦｃ（ノブ）変異体（配列番号２３及び２４（ヒト）、配列番号２９及び３０（マウス）及び配列番号３５及び３６（カニクイザル）を参照）に融合させ、これをＦｃ（ホール）とヘテロ二量体化させた。次いでこのヘテロ二量体化Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体相互作用を解析するために基質として使用された。ＩＬ−２Ｒα−サブユニットをＡｃＴｅｖ切断部位及びＡｖｉ Ｈｉｓタグ（配列番号２５及び２６（ヒト）、配列番号３１及び３２（マウス）及び配列番号３７及び３８（カニクイザル））を伴う単量体鎖として発現させた。それぞれのＩＬ−２Ｒサブユニットを、ＩＬ−２Ｒβγサブユニットコンストラクトについては血清を含み、α−サブユニットコンストラクトについては血清を含まずに、一過性にＨＥＫ ＥＢＮＡ２９３細胞で発現させた。ＩＬ−２ＲβγサブユニットコンストラクトはプロテインＡで精製され（GE Healthcare）、続いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製した（GE Healthcare, Superdex 200）。ＩＬ−２Ｒαサブユニットは、ＮｉＮＴＡカラム（Qiagen）上でＨｉｓタグを介して精製され、続いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製した（GE Healthcare, Superdex 75）。様々な受容体コンストラクトのヌクレオチド配列に対応するアミノ酸が配列番号２１〜３８に与えられる。
融合タンパク質の調製
ＤＮＡ配列は、遺伝子合成及び／又は古典的な分子生物学の技術によって生成され、各ベクターがＥＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を保有する、哺乳動物発現ベクター中に、ＭＰＳＶプロモーターの制御下で、合成ポリＡ部位の上流に、サブクローニングされた。下記の実施例に適用される融合タンパク質は、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて、指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターとともに共トランスフェクトすることにより産生された。あるいは、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３細胞を、それぞれの発現ベクターを用いてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりトランスフェクトした。あるいは、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プール又はＣＨＯ細胞クローンを無血清培地での生産のために使用した。続いて、融合タンパク質を上清から精製した。簡単に述べると、融合タンパク質は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ７．５中で平衡化されたプロテインＡ（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔＡ, GE Healthcare）による一親和性工程で精製した。上清をロードした後、カラムを最初に２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄し、続いて１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５で洗浄した。融合タンパク質は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシンｐＨ３で溶出した。画分を中和し、プールし、最終製剤緩衝液：２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中にサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ スーパーデックス２００、GE Healthcare）によって精製した。精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。融合タンパク質の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、クマシーブルー（ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Invitrogen）により染色される。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Invitrogen）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−２０％のトリスグリシン・ゲル又は３−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ）。あるいは、分子の純度と分子量は、製造業者の指示に従ってＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Caliper Lifescience）を用いて還元剤の存在下および非存在下でＣＥ−ＳＤＳ分析によって分析した。タンパク質サンプルの凝集体含有量は、スーパーデックス２００ １０／３００ＧＬ分析用サイズ排除クロマトグラフィーカラム（GE Healthcare）を用いて、２５℃で、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３のランニング緩衝液中で分析した。あるいは、抗体のサンプルの凝集体含有量は、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（東ソー）を用いて、２５℃で、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５のＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニング緩衝液中で分析した。
ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２コンストラクトの精製及び特性評価の結果は図１と２に示される。
ＩＬ−２受容体への親和性
融合タンパク質の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体について、組換えＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体を使用して以下の条件で測定した：リガンド：ＣＭ５チップ上に固定化された、ヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ−２Ｒβノブγホールヘテロ二量体、分析物：ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２（配列番号１３、１５及び１９を参照）、又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２（配列番号１７及び１９を参照）、温度：２５℃、緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ、分析物濃度：３００ｎＭから３．７ｎＭまで（１：３希釈物）、フロー：３０μｌ／分、会合：１８０秒、解離：３００秒、再生：３ＭのＭｇＣｌ２で６０秒、フィッティング：１：１結合、ＲＩ≠（not equal）０、Ｒｍａｘ＝グローバル。また、融合タンパク質の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ−２Ｒ αサブユニットについて、組換え単量体ＩＬ−２Ｒ αサブユニットを使用して以下の条件で測定した：リガンド：ＣＭ５チップ上に固定化された、ヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ−２Ｒ αサブユニット、分析物：ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２、温度：２５℃、緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ、分析物濃度：１００ｎＭから３．１ｎＭまで（１：３希釈物）、フロー：３０μｌ／分、会合：６０秒、解離：１８０秒、再生：無し、フィッティング：１：１結合、ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝グローバル。
ＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体又ははＩＬ−２Ｒのαサブユニットによる動力学的分析の結果を表１に示す。
ヒトＩＬ２Ｒβγヘテロ二量体に対するヒトＩＬ−２の親和性は、約１ｎＭであることが記載されており、一方、融合タンパク質は共には、２から３ｎＭの間に僅かに低い親和性を有する。マウスＩＬ−２Ｒに対する親和性は、ヒト及びカニクイザルＩＬ−２Ｒよりも数倍弱い。
免疫細胞におけるＩＬ−２受容体の発現
高親和性の三量体ＩＬ−２受容体は、α（ＩＬ−２ＲＡ、ＣＤ２５）鎖、β（ＩＬ−２ＲＢ、ＣＤ１２２）鎖及びγ（ＩＬ−２ＲＧ、ＣＤ１３２）鎖からなり、ＫＤは〜１０ｐＭである。ＣＤ２５のみが、ＩＬ−２に対して低い親和性（ＫＤ〜１０ｎＭ）を有する。ＩＬ−２ＲＡの非存在下で幾つかの細胞型において発現されるＩＬ−２ＲＢ／ＩＬ−２ＲＧ二量体もまた、ＩＬ−２に結合するが、中等度の親和性（ＫＤ〜１ｎＭ）である。ＩＬ−２受容体を介したシグナル伝達は、ＩＬ−２ＲＢ鎖及びＩＬ−２ＲＧ鎖によって媒介される。結晶構造解析から、ＩＬ−２ＲＡは、ＩＬ−２ＲＢ又はＩＬ−２ＲＧの何れにも接触しているようには見えない。三量体受容体の協同性の根拠は、ＣＤ２５が、ＩＬ−２ＲＢ及びＩＬ−２ＲＧへの提示のために細胞表面でＩＬ−２を捕獲する時、あるいはは、ＣＤ２５誘導性のＩＬ−２のコンフォメーションの変化が生じ、これにより複合体を安定化する時のエントロピーの減少であることが提案されている。ＦＯＸＰ３＋調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞において、受容体のβ鎖とγ鎖に比較して、化学量論的に大過剰のＩＬ−２Ａが存在し、α鎖の、二量体、又はさらに大きな複合体はＩＬ−２の結合を補助するという仮説を支持している。一細胞上のＣＤ２５は、高親和性の細胞間相互作用で、別の細胞のＩＬ−２ＲＢ／ＩＬ−２ＲＧ二量体へＩＬ−２を提示することができるとする証拠もあり、高親和性ＩＬ−２受容体を構成する三つの鎖の中での独特の関係を強調している。
ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫ細胞サブセット及びＮＫＴ細胞、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋の通常型Ｔ細胞サブセットにおける、ＣＤ２５（ＩＬ−２ＲＡ）及びＣＤ１２２（ＩＬ−２ＲＢ）の発現は、ＦＡＣＳにより測定された（図３及び４）。細胞表面マーカーが、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇサブセット、ＮＫＴ細胞及びＮＫ細胞を定義するために用いられた（図３）。ＣＤ２５及びＣＤ１２２の染色を最適化するために、細胞内ＦｏｘＰ３染色は実施されなかった。簡潔には、健常人ボランティアから寄贈された１５０μｌの血液を使用して、蛍光抗体は、暗所で室温で４５分間インキュベートした（開始時と２０分後にボルテックスした）。赤血球はＢＤ溶解緩衝液（ＢＤ ＦＡＣＳ溶解溶液、３４９２０２）で９分間溶解し、残りの細胞を洗浄し（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを２ｍｌ）、固定した（１％ＰＦＡ）。細胞はＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａの細胞分析装置（Becton Dickinson）で分析し、データをＦｌｏＪｏソフトウェア（TreeStar）を用いて分析した。Ｔｒｅｇサブセットは、ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ（ＩＰ２６、Biolegend）、ＣＤ４−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００（ＲＰＡ−Ｔ４、Biolegend）、ＣＤ１２７−ＰＥ／ＣＹ７（ｅｂｉｏＲＤＲ５、Ebioscience）、ＣＤ４５ＲＡ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＨＩ１００、Biolegend）、ＣＤ２５−ＡＰＣ（２Ａ３、Ｍ−Ａ２５１、BD Biosciences）及びＣＤ１２２−ＰＥ（ＴＵ２７、Biolegend）に特異的な抗体を用いて同定した。ＮＫ及びＮＫＴ細胞は、ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＣＤ８−ＰＥ／ＣＹ７（ＨＴＴ８ａ、BioLegend）、ＣＤ５６−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＨＣＤ５６、BioLegend）、ＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１２２−ＰＥに特異的な抗体により、別個のチューブ中で染色された。ＦＳＣ／ＳＳＣに基づいたリンパ球のゲーティング、及びダブレットを除外した後、ナイーブＴｒｅｇは、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２７−、ＣＤ２５＋、ＣＤ４５ＲＡ＋として同定され、記憶ＴｒｅｇはＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２７−、ＣＤ２５＋、ＣＤ４５ＲＡ−として同定され、活性化ＴｒｅｇはＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２７−、ＣＤ２５高い、ＣＤ４５ＲＡ−として同定された。ＮＫ細胞は、ＴＣＲαβ−、ＣＤ５６＋として同定され、活性化ＮＫ細胞はＴＣＲαβ−、ＣＤ５６明るいとして同定された。ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ５６＋として同定された。ＡＰＣとＰＥにコンジュゲートしたアイソタイプコントロールは、それぞれ、ＣＤ２５及びＣＤ１２２のためのバックグラウンドの蛍光を推定するために使用された。
同様に、細胞表面マーカーは、ナイーブ及び通常型記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞（図４Ａ及び４Ｂ）、通常型記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞（ナイーブ及びＴＥＭＲＡサブセットの組み合わせ；ＴＥＭＲＡはＣＤ４５ＲＡの発現に戻ったエフェクター記憶細胞を意味する）（図４Ｃ及び４Ｄ）を定義するために使用された。染色と分析は上述のように実施した。ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇｓを特性評価するために上述される同じチューブを使用して、ＣＤ４＋通常型ナイーブＴ細胞は、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２５−／＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４＋通常型記憶Ｔ細胞は、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２５−／＋、ＣＤ４５ＲＡ−として同定された。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（ＨＴＴ８ａ、BioLegend）、ＣＤ２８−ＰＥ／ＣＹ７（ＣＤ２８．２、BioLegend）、ＣＤ４５ＲＡ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１２２−ＰＥを用いて定義された。．ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞は、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ−として同定された。ＣＤ８＋ナイーブ及びＴＥＭＲＡ（ＴＥＭＲＡはＣＤ４５ＲＡ Ｔ細胞の発現に戻ったエフェクター記憶細胞を意味する）は、ＴＣＲαβ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋として同定された。ＣＤ２８マーカーは、以下に説明されるｐＳＴＡＴ５ａ分析に含まれなかったので、ＣＤ２８は、ＣＤ８＋ ＴＥＭＲＡ Ｔ細胞からＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を識別するためには使用されなかった（図５参照）。
図３及び４において、ＩＬ−２ＲＡ及びＩＬ−２ＲＢの細胞特異的発現は、ヒト末梢血中のＴ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫ Ｔ細胞のサブセットに対して示されている（ＩＬ−２ＲＧは、多くのサイトカイン受容体と組になるので、造血細胞における本質的に遍在的な発現を有する）。最高レベルのＩＬ−２ＲＡが、調節性ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の３つの集団：ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２５＋）、記憶（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５＋）及び活性化（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５ｈｉ）に存在する（図３Ａ）。平均して、通常型記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇよりもおよそ１０倍少ないＣＤ２５を発現する（図４Ａ）。ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現は、ドナーの間で有意に変化するが、記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞において観察されるものよりも常に低い（図４Ａ）。ＮＫ、ＮＫＴ及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現は非常に低いか又はＣＤ５６明るい ＮＫ細胞を除いては検出できない（図３Ｃ及び図４Ｃ）。ＣＤ５６明るい ＮＫ及びＣＤ５６＋ ＮＫ細胞は、最高レベルのＩＬ−２ＲＢを発現し（図３Ｄ）、ＮＫＴ細胞を含む、Ｔ細胞サブセットのどれよりもおよそ１０倍多い（図３Ｂ、３Ｄ、４Ｂ、４Ｄ）。
ヒト末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導
三量体ＩＬ−２ＲのＩＬ−２誘導性オリゴマー化後、ＩＬ−２ＲＢ及びＩＬ−２ＲＧの細胞内ドメインとそれぞれ結合するＪＡＫ１及びＪＡＫ３細胞質タンパク質チロシンキナーゼは活性化される。これらのキナーゼは、順にリン酸化されるＳＴＡＴ５ａとＳＴＡＴ５ｂのドッキング部位として働く特定のＩＬ−２ＲＢのチロシン残基をリン酸化する。幾つかのシグナル伝達経路のＩＬ−２誘導性活性化は、最終的には、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ経路に関連する様々な機能に寄与する標的遺伝子の転写をもたらす。種々の細胞型が、異なるレベルのＩＬ−２受容体ＩＬ−２ＲＡ及びＩＬ−２ＲＢ分子を発現するので（図３及び図４）、高及び中等度の親和性受容体の種々の組合せにより媒介されるＩＬ−２に対する統合されたシグナル伝達応答を理解するために、我々は多色フローサイトメトリーにより、個々の細胞内のｐＳＴＡＴ５ａレベルを測定した。
ＳＴＡＴ５ａリン酸化の誘導におけるＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の種々の用量の効果が、ヒトＣＤ４＋ Ｔｒｅｇのサブセット、ナイーブ及び通常型記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、通常型記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞において評価された（図５及び６）。全てのサブセットが、各用量において単一チューブ内で特性評価された。簡単に言えば、健康なボランティアからの血液をヘパリン処理したチューブに採取した。様々な濃度のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２が血液５００μｌに添加され、３７℃でインキュベートした。３０分後、血液は、予め加温した溶解／固定緩衝液（Becton Dickinson #558049）を用いて３７℃で１０分間、溶解し固定され、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、続いて、−２０℃の予め冷却したメタノール（Sigma, Biotech grade #494437）を用いて氷上で２０分間、透過処理した。次いで、細胞を０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで４回洗浄し、異なるリンパ球及びＮＫ細胞の亜集団とｐＳＴＡＴ５ａの状態を識別するために、ＦＡＣＳ染色が蛍光抗体のパネルを用いて行われた。利用された抗体は、抗ＣＤ４−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、ＣＤ８−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ５６−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（ＨＣＤ５６）、ＦＯＸＰ３−ＰＥ（２５９Ｄ）（全てはBioLegendから）、ＣＤ２５−ＡＰＣ（クローンＭ−Ａ２５１＆２Ａ３）及びｐＳＴＡＴ５ａ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ｐＹ６９４）（Becton Dickinson）であった。サンプルはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａの細胞分析装置（Becton Dickinson）で分析し、データをＦｌｏＪｏソフトウェア（TreeStar）を用いて得た。リンパ球においてゲーティングしダブレットを除いた後、ＴｒｅｇはＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋として定義され、ＣＤ４５− ＦＯＸＰ３ｈｉ（活性化Ｔｒｅｇ）、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＦＯＸＰ３＋ （記憶Ｔｒｅｇ）及びＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５＋、ＦＯＸＰ３＋ （ナイーブＴｒｅｇ）として細分された。通常型ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ）及び ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）として定義された。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）及びＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋として定義された。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋として定義され、ＮＫ細胞は、ＣＤ３−、ＣＤ５６明るい（活性化ＮＫ細胞）又はＣＤ３−、ＣＤ５６＋（ＮＫ細胞）として定義された。細胞内ｐＳＴＡＴ５ａのレベルは、全ての用量で全ての細胞サブセットで定量した。
図５は、それぞれが異なる日に試験された、３人の個々のドナーからのヒト末梢血中における、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞におけるＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートの用量応答を示す。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２への応答性の階層は、ＩｇＧ−ＩＬ−２は、すべての３人のドナーで同じであり、組換えヒトＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））が使用されたときに観察されたものと同じであった（データ非表示）。３つ全てのＴｒｅｇ集団、活性化（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５ｈｉ）、記憶（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２５＋）、及びナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２５＋）は、ｐＳＴＡＴ５ａのレベルを、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の濃度が０．１ｎｇ／ｍｌで上昇させたが、他の細胞集団は、検出可能なｐＳＴＡＴ５ａの増加を生じるために、ＤＰ４７ ＩｇＧ−ＩＬ−２の１ｎｇ／ｍｌ（ＣＤ５６明るい ＮＫ及び記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞）以上又は１０−１００ｎｇ／ｍｌ（記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞）を超える濃度を要求した。また、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２に対するそれらの高い感受性を示すＴｒｅｇ集団によるより詳細な用量反応については図８を参照のこと。Ｔ細胞サブセットにおけるＩＬ−２ＲＢの発現と比較して、中等度レベルのＣＤ５６を持つＮＫ細胞におけるＩＬ−２ＲＢの高発現（図３Ｄ）は、Ｔｒｅｇ様のＩＬ−２感受性を可能にするのに十分ではないことは特記するべきである。全体的に、活性化、記憶及びナイーブＴｒｅｇサブセットは、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２に対する最大感受性を示したが、ＣＤ５６明るい ＮＫ細胞及びＣＤ４＋、通常型記憶Ｔエフェクター細胞は、２０〜５０倍感受性が小さかった。ｐＳＴＡＴ５ａの増加について分析された他の細胞サブセットの中で、ＣＤ８＋ 記憶Ｔエフェクター細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴエフェクター細胞、ＮＫＴ細胞、「休止」ＮＫ細胞（ＣＤ５６に対して陽性で、明るくない染色）、及びＣＤ８＋ナイーブＴエフェクター＋ＣＤ４５ＲＡ＋ 記憶細胞は、ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートに対して比較的非感受性であった。
図６は、それぞれが異なる日に試験された、５人の個々のドナーからのヒト末梢血中における、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞におけるＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の用量応答を示す。ＤＰ４７ＧＳのＩｇＧ−ＩＬ−２に対して観察されたように（図５）、３つのＴｒｅｇサブセットはＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２誘導性ｐＳＴＡＴ５ａに対して最も感受性であって（図６及び８）、同様の階層の用量応答は、５人全てのドナーにおける他の細胞サブセットについて見出された。
より容易にＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２とＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２を比較するために、ｐＳＴＡＴ５ａの値を正規化した（図７）。ＭＦＩ値を正規化するために、ゲートされた各サブセットに特異的な非刺激ｐＳＴＡＴ５ａ ＭＦＩ値は、その細胞サブセットに対するすべての刺激性ＭＦＩ値から差し引かれた。得られた値は、用量応答においてそのサブセットによって得られる最高のｐＳＴＡＴ５ａ ＭＦＩ値で除算した。ＥＣ５０は、そのサブセットに対して観察されるｐＳＴＡＴ５ａの最大のＭＦＩの５０％に達するのに必要なＩＬ−２融合タンパク質の量に基づいて推定した。図７に示すように、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ２）２イムノコンジュゲートは、潜在的に高親和性ＩＬ−２受容体に対するイムノコンジュゲートの結合活性の増加の結果として、恒常的にＣＤ２５を発現している細胞内のｐＳＴＡＴ５ａのより強力な誘導を生じた。ｐＳＴＡＴ５ａ活性化に対するＥＣ５０は、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２に対してＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２を直接比較した場合、Ｔｒｅｇで５〜９倍低いことが観察された。表２は、異なる細胞サブセットにおいて、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２とＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２によるｐＳＴＡＴ５ａ活性化についての代表的なＥＣ５０値及び倍率の違いを要約する。
非常に限定された濃度においてさえも、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２は、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２と比べて、より高いレベルのｐＳＴＡＴ５ａを生成した（図８）。この実験のために、３人の健康なボランティアからの血液が、ＩＬ−２の限定された濃度で、ＤＰ４７ ＩｇＧ−ＩＬ−２及びＤＰ４７ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の２倍滴定に対する応答について同じ日に個別に試験された。図８のグラフは、３人のドナーについて、ｐＳＴＡＴ５ａ ＭＦＩの平均値±ＳＤを表す。個別に検討された３つのＴｒｅｇサブセットに加えて（図８Ｂ−Ｄ）、ゲートは、全てのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋ ＴｒｅｇにおいてｐＳＴＡＴ５ａを評価するために適用された（図８Ａ）。結果は、ＩｇＧの１分子あたりＩＬ−２のほんの２倍の増加にもかかわらず、ＴｒｅｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２活性化についての効力の５〜１０倍の増加を明らかに示している。上述したように、多色フローサイトメトリーを行った（図５参照）。
ＣＤ４＋通常型記憶Ｔ細胞はまた、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２に比べて、より低濃度（７倍）のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２に対して応答した。ＥＣ５０値は、ＤＰ４７ ＩｇＧ−ＩＬ−２に対してＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２を比較すると、ＣＤ５６明るい ＮＫ細胞及びＣＤ５６＋ ＮＫ細胞について低かったが、その低下は、それぞれほんの３倍及び４倍であった。これは、これらの細胞の、ＩＬ−２媒介性シグナル伝達のための中等度親和性ＩＬ−２受容体への依存に起因する可能性が高い。ＮＫ細胞に対するＴｒｅｇのＥＤ５０のこの差分シフトは、Ｔｒｅｇ活性化の優先度を数倍増加させる。
カニクイザル末梢血細胞サブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの誘導
ヒト末梢血で観察されるように、ＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））で刺激したカニクイザル末梢血中のＴｒｅｇサブセットにおけるｐＳＴＡＴ５ａの優先的な同様の用量依存的誘導がある（データ非表示）。３つのＴｒｅｇサブセットにおいてｐＳＴＡＴ５ａを誘導するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の能力の直接比較において、２〜８倍少ないＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２がｐＳＴＡＴ５ａの最大レベルの５０％に到達するのに必要であった。表３は、異なるカニクイザルのＴｒｅｇサブセットにおけるＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２に対するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２によるｐＳＴＡＴ５ａ活性化のＥＣ５０値、ヒト末梢血で見られるもの（表２）と著しく類似している結果を要約する。
ヒト全血と同様に、細胞表面及び細胞内マーカーが、正常な健康なカニクイザルの全血における調節性Ｔ細胞サブセット及び通常型Ｔ細胞を同定するために使用された。血液サンプルは、ヘパリンナトリウムチューブ中に３匹の健康なカニクイザルから同じ日に採取し、種々の濃度のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２が血液５００μｌに添加され、３７℃でインキュベートされた。３７℃で１０分後、サンプルを溶解し、予め温めたＢＤ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液（BD Biosciences）を用いて固定した。洗浄後、細胞を氷上で３０分間、１ｍＬのメタノールで透過処理した。サンプルは３回洗浄され、４℃で１時間、ＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（クローン：２５９Ｄ、BioLegend）、ＣＤ４−Ｖ５００（クローン：Ｌ２００、BD Biosciences）、ＣＤ４５ＲＡ−Ｖ４５０（クローン：５Ｈ９、BD Biosciences）、ＣＤ２５−ＰＥ（クローン：４Ｅ３, eBioscience）、ｐＳＴＡＴ５ａ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（クローン：４７、BD Biosciences）、及びＫｉ−６７−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローン：Ｂ５６、BD Biosciences）のパネルを用いて染色された。全てのサンプルはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａの細胞分析装置（Becton Dickinson）により取得した後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree star, Inc., Ashland, USA）を用いて分析した。
カニクイザルにおけるＴｒｅｇの数の誘導
ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２によりインビボで処置された動物のカニクイザルは、Ｔｒｅｇの絶対数において用量依存性の増加を、並びに投与後７日でベースラインを超える倍率増加を有していた（それぞれ図９Ａ及び９Ｂ）。全ての試験において、３歳から６歳までの範囲の年齢のオスメス両方の正常で健康なカニクイザルを用い、複数回使用された動物は無かった。麻酔下で、様々な用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２（ｎ＝４−６）又はビヒクル（ｎ＝３）を背の側面に皮下注射した。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の個々の用量は体重に基づき、０．５％の無菌正常カニクイザル血清を含有する無菌のＰＢＳ ｐＨ７．２のビヒクルで注射のために処方された。血液サンプルを処置後の種々の時点で採取し、Ａｄｖｉａ自動血液学的アナライザー並びに上記に詳述される（表３の実験手順）細胞表面及び細胞内マーカーを用いて血液学的変化（ＣＢＣ及びＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）を試験した。処置後７日での全血ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋、調節性Ｔ細胞における変化が、全血ｍｍ３あたりの絶対細胞数（図９Ａ）及びＴｒｅｇの倍率変化（図９Ｂ）として図９に示される；全データは平均値±ＳＤとして表される。より高用量の２５μｇ／ｋｇ及び３６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２で、それぞれ、平均してほぼ３倍（１１１−２５５％の範囲、ｎ＝６）及び４倍（１１０ー４７０％、ｎ＝６）のＴｒｅｇの増加が観察された。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の皮下注射用量の更なる減少（１２、６、及び２μｇ／ｋｇ）により、Ｔｒｅｇ数の変化と倍率変化の対応する減少を生じ続けた。理論に縛られることを望まないが、１２μｇ／ｋｇの用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２によるＴｒｅｇの〜２倍の増加（６７−１３３％の範囲、ｎ＝６）は、Ｔｒｅｇの所望される増加について表している。ヒトにおいてＴｒｅｇの数には大きな範囲があり（血液ｍｍ３あたり２０−９０ Ｔｒｅｇｓ；ＣＤ４＋ Ｔ細胞の４から１０％）、個体内でＩＬ−２によって誘導されるＴｒｅｇの増加は、機能抑制の全体的な増加をもたらすであろうと仮定することは妥当である。しかしながら、持続した期間、この細胞集団において正常な範囲を超えてＴｒｅｇ数を増加させずに、主にこれらの細胞の機能を高めることが所望されるかも知れない。
より低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２が評価される場合（２−６μｇ／ｋｇ）、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の投与後のＴｒｅｇの変化を検出するための最適な時間を同定するために、より頻繁に血液サンプルが採取された。Ｔｒｅｇの変化は７日目に存在したが、最大刺激は、より高用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２により測定されるよりも早い４日目に起きた（７日目、図９）。
プロロイキン（登録商標）及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ及びその他のＩＬ−２応答性細胞においてｐＳＴＡＴ５ａを刺激するために使用されるＩＬ−２活性のユニットにより直接比較される場合、ヒト及びカニクイザルにおいてインビトロで匹敵する（データ非表示）。ヒトにおけるプロロイキン（登録商標）の既知の短い半減期により、単一投与試験が、インビトロでのＴｒｅｇ誘導及び活性化を評価するために、カニクイザルで行われた。プロロイキン（登録商標）は、絶対数での倍率変化並びにｐＳＴＡＴ５ａ活性化により測定されるＴｒｅｇにおける用量及び時間依存性の変化を生じた。Ｔｒｅｇ数の増加はわずかであったが（図１１Ａ：１０−４０％）、Ｔｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５ａにおけるプロロイキン誘導性の増加は、処置後１日目には相当であって用量依存性であった（図１１Ｂ）。
カニクイザルにおいてインビボでＴｒｅｇの増加を誘導するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の能力とプロロイキン（登録商標）のそれとの比較が図１２に示される。正常な健常カニクイザル（ｎ＝５の群）は、低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又は高用量のプロロイキン（登録商標）で処置され、調節性Ｔ細胞の変化が１０日目に試験された。０日目と７日目に、ＤＰ４７ ＩｇＧ−ＩＬ−２は１６８００ＩＵ／ｋｇの用量（図９に示される１２μｇ／ｋｇの用量）で皮下投与された。プロロイキン（登録商標）が１型糖尿病患者に与えられ（４．５ｘ１０６ＩＵ／ヒト、３回／週）、図１１でＴｒｅｇを増加させること及びその単一用量データが示される公開研究に基づいて、プロロイキン（登録商標）は、各々２０００００ＩＵ／ｋｇ（カニクイザルは４．５ｘ１０６ＩＵ／ヒトに相当）で合計５回用量を週に３回（Ｍ，Ｗ，Ｆ）皮下投与された。結果は、図１２に、血液ｍｍ３あたりの全Ｔｒｅｇの変化（図１２Ａ）、Ｔｒｅｇの倍率増加（図１２Ｂ）、及び通常型ＣＤ４＋ ＦＯＸＰ３− 細胞に対するＴｒｅｇの比率の変化（図１２Ｃ）について平均値±ＳＤとして示される。
ほぼ３０倍少ないＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２活性が１０日間にわたって投与されたが、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２はプロロイキン（登録商標）よりもＴｒｅｇの数におけるより大きな増加を誘導した（図１２Ａ、ｐ＝０．０６）。また、ベースラインを超えたＴｒｅｇ数の倍率増加（図１２Ｂ）及び通常型ＣＤ４ Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの増加（図１２Ｃ）は、プロロイキン（登録商標）と比べてＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２を投与されたサルで、より大きかった（ぞれぞれ、ｐ＝０．００１１及びｐ＝０．０１６）。ヒトにおいて、調節性ＣＤ４ Ｔ細胞（通常、ＦｏｘＰ３＋として、又は表面マーカーの組合せにより定義される）の非調節性ＣＤ４ Ｔ細胞（通常型又はエフェクター細胞と称される）の比率は、多くの場合、時系列で患者におけるＴｒｅｇの機能レベルを定義するために使用されている。
低用量ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２処置に対するカニクイザル末梢血細胞サブセットのインビボ応答。
低用量のＩＬ−２処置のインビボでの細胞特異性は、重要なパラメーターである。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２ 又はプロロイキン（登録商標）により誘導されたインビボでの細胞活性化は、カニクイザル又はマウスに投薬後様々な時点で採取された血液中でエキソビボでのｐＳＴＡＴ５ａのレベルを測定することにより感度良く監視することができる。インビトロで監視することができる全ての細胞集団のインビボでの応答は（図５−７）も、エキソビボで試験することができる。
健常なカニクイザル（ｎ＝５）へのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の単一低用量（１２μｇ／ｋｇ）のインビボ投与後１日目及び３日目に、全血が採取され、上述のようにＳＴＡＴ５ａのリン酸化について試験された（表３に実験手順）。各々のサルは、処置前０日目に出血させ、ｐＳＴＡＴ５ａのリン酸化の量を測定し、処置後に倍率変化を評価するために個々に使用した。１日目と３日目におけるＴｒｅｇのｐＳＴＡＴ５ａの倍率変化は図１３Ａに示され、通常型ＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡ−記憶Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ａの倍率変化は図１３Ｂに、通常型ＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞における倍率変化は図１３Ｃに示される。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の単一低用量（１２μｇ／ｋｇ）後１日目及び３日目に得られたカニクイザル血液は、記憶及びナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞と比較した場合Ｔｒｅｇ細胞においてｐＳＴＡＴ５ａの優先的な増加を示した（図１３Ａ−Ｃ）。単一低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、持続性インビボＴｒｅｇ活性化状態を生み出す点において、単一高用量のプロロイキン（登録商標）に対して明らかに優れている（図１１Ｂ）。
Ｔｒｅｇ活性化のインビボバイオマーカーとしてＳＴＡＴ５ａのリン酸化を使用する初期の研究では、単一用量のプロロイキン（登録商標）では１日目のみに（図１１Ｂ）、及び低用量（１２μｇ／ｋｇ）のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２では１日目と３日目に（図１３Ａ）、最大のｐＳＴＡＴ５ａを見いだした。付加的なサンプリング時機と組み合わせたＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の更なる滴定は、インビボでのｐＳＴＡＴ５ａシグナルは、７日目に正常に戻る前に４日間維持され得ることを示した（図１４Ａ、１４Ｂ）。２μｇ／ｋｇ（１４Ａ、ｎ＝４）及び６μｇ／ｋｇ（１４Ｂ、ｎ＝６）の両方の用量についてｐＳＴＡＴ５ａのシグナルのＭＦＩ（平均蛍光強度）は、最大未満のｐＳＴＡＴ５ａシグナル伝達が生じることを示唆していた（図１６Ｂ）。これらの非常に低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２でさえも、Ｔｒｅｇの持続性インビボシグナル伝達を与え、プロロイキン（登録商標）よりも優れていた（図１１Ｂ）。これらの結果は、非常に低レベルの長寿命のＩＬ−２、即ちプロロイキン（登録商標）でなくＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、インビボで長時間Ｔｒｅｇを刺激することができ、これにより、優勢な自己免疫寛容を再確立するために必要な治療の頻度を減らし、疾患の転帰を改善することができるとする我々の仮説を支持している。低用量のＩＬ−２処置後の末梢血中のＴｒｅｇ細胞の増加は、細胞の実際の増加よりも身体における細胞の分布の変化を反映している可能性がある。インビボで増加するＴｒｅｇはＩＬ−２処置による細胞分裂の誘導に少なくとも一部は起因することを実証するために、増殖Ｋｉ−６７の細胞内マーカーを評価した。Ｋｉ−６７は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２及び有糸分裂の間、核内で検出することができるが細胞周期のＧ０期にある休止細胞には存在しないタンパク質である。上述される２及び６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２で処置されたカニクイザルは（図１４）、インビボでの増殖の程度を評価するために、細胞内マーカーＫｉ−６７のエキソビボでの変化についてモニターされた（表３に実験手順）。細胞周期の０日目の細胞（Ｋｉ−６７＋）の割合は、処置後１日から１１日目における細胞Ｋｉ−６７＋の割合と比較された。Ｋｉ−６７＋Ｔｒｅｇは図１５Ａに示され、通常型ＣＤ４＋ ＣＤＲＡ４５−記憶Ｔ細胞は図１５Ｂに、及び通常型ナイーブＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は図１５Ｃに示される。単一低用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２（６μｇ／ｋｇ）後１日から７日目に得られたカニクイザル血液細胞は、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇにおける優先的なＫｉ−６７の増加を示した（図１５Ａ対１５Ｃ）。ナイーブＴ細胞と違い、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２（６μｇ／ｋｇ）は通常型記憶ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を刺激することができた（図１５Ｂ）。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の最低用量で（２μｇ／ｋｇ）、６μｇ／ｋｇ用量と比べて、細胞周期及び増殖への最小の活性化が認められた。
ヒト及びカニクイザルの全血液アッセイにおいて、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２のインビトロ活性は、概して、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２よりも、Ｔｒｅｇに対しておよそ６倍強力であった（表１及び３）。それゆえ、カニクイザルへの初回用量は、試験されたＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の最高用量（３６μｇ／ｋｇ）よりも６倍少なかった。６μｇ／ｋｇ（ｎ＝４）で投与されたＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２は、循環するＴｒｅｇの大きな増加（図１６Ａ）、１週間で正常に戻る、Ｔｒｅｇにおける著しくかつ長期のｐＳＴＡＴ５ａ（図１６Ｂ）、及びＴｒｅｇの数のほぼ３倍の増加（図１６Ｃ）を生じた。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２により誘導される倍率変化（図９の空の棒から）が、６μｇ／ｋｇ用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２（影付きの棒）と比較された（図１６Ｄ）。ヒトおよびカニクイザルの全血アッセイと同様に、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２は、ＩｇＧの分子当たり、ＩＬ−２の２倍の増加を超えたインビボでの効力増強を示した。
ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の付加的用量が、非常に低用量（２及び０．７μｇ／ｋｇ）でのそのインビボ有効性を評価するために、カニクイザルへ与えられた（図１７）。２μｇ／ｋｇでは中等度の倍率変化（２０から７０％の範囲で、平均が４６％、ｎ＝８）を生み出すのに対し、０．７μｇ／ｋｇの用量はＴ細胞数にほとんど影響を与えなかった（平均増加は１６％、ｎ＝３）（図１７Ａ）。低用量の双方共ＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５ａの増加を刺激したが（図１７Ｂ、各々ｎ＝３）、Ｔｅｆｆ／ｍｅｍ細胞のｐＳＴＡＴ５ａにはほとんど影響を与えなかった（図１７Ｃ、各々ｎ＝３）。
カニクイザルにおけるＩＬ−２療法の包括的効果及びＴｒｅｇを増加させるその能力を図１８に示す。長寿命のＩｇＧ−ＩＬ−２の両方の形態は、活性化のバイオマーカーとして、及びこの図では循環するＴｒｅｇの数の倍率増加としてのｐＳＴＡＴ５ａにより追跡できるＴｒｅｇの強力な誘導因子である。ＩｇＧのＣ末端にＩＬ−２分子を倍にすることによって達成される、その増強された効力を有するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２は、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２に対して用量依存的な優位性を有している。
ヒトにおいてプロロイキン（登録商標）は、１ｘ１０６から４．５ｘ１０６ＩＵ／ヒトの用量で毎日与えられる場合、好酸球増加を刺激する。カニクイザルにおいては、同様の好酸球増加が、プロロイキン（登録商標）又は単一用量のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２による反復処置後に見られた（図１９）。図１９Ａの結果は、好酸球数が正常であるか又は上昇したかによらず、試験された全ての動物（ｎ＝５−６）を表している。図１９Ｂのデータは、治療に関連した血中好酸球の上昇を発症したサルを表している。データは、平均値±ＳＤとして示される。空の棒はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２で処置されたもの、右の影付きの棒は図１６からの６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２で処置されたサルからのものである。結果の概要を以下の表４に示す。Ｔｒｅｇにおける２５μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２と６μｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の等価性にも関わらず、それぞれ５０％の応答者対０％の応答者であって、好酸球への影響は著しく異なっていた。
マウスにおけるＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の薬物動態学的特性
マウスにおいて機能的研究を開始する前に、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の薬物動態（ＰＫ）特性がプロロイキン（登録商標）のものと比較された（図２０）。
ＮＯＤマウスは、０．５％マウス血清を含有するＰＢＳ中のＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はプロロイキン（登録商標）の示された用量で腹腔内（図２０Ａ）又は皮下注射され（図２０Ｂ）、注射後の様々な時点で採血された。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の用量は表４に要約される。ヒトＩＬ−２は、ＩＬ−２を捕獲するために９６ウェルプレートを被覆したマウス抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ、BD Pharmingen、カタログ＃５５５０５１、クローン５３４４．１１１を用いて血清サンプル中で評価された。ＩＬ−２はビオチン化マウス抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ、BD Pharmingen、カタログ＃５５５０４０、クローンＢ３３−２を用いて検出された。結合は、ユーロピウム結合ストレプトアビジンを用いて可視化した。
前述のように、プロロイキン（登録商標）は、急速に除去された。対照的に、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、はるかにゆっくりと除去された。正常なマウスとＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＣＤ２５ＫＯマウスにおけるＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２のＰＫの比較からの結果は、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２のインビボでのクリアランスを駆動する主要な成分は、高親和性ＩＬ−２受容体であるという仮説を支持している（データ非表示）。
ＩｇＧ−ＩＬ−２による処置後のＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３及びＣＤ２５ ＭＦＩの増加
インビボでＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ細胞を刺激するイムノコンジュゲートＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２、及び組換えヒトＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））の能力を比較するために、マウスに、プロロイキン（登録商標）、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２の何れかを皮下注射し、Ｔｒｅｇは、２４時間のうち前もって決められた最適な時点でＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の発現の変化についてモニターされた（図２１）。
若い健常なＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３／処置群、ｎ＝４／ビヒクル対照コホート）に、プロロイキン（登録商標）（２００００又は１０００００ＩＵ）、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２（６０３００、又は１５００ＩＵ）、又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２（６０、３００、又は１５００ＩＵ）の何れかを皮下注射した。用量は０．５％滅菌濾過したマウス血清を含有する１００μｌの滅菌ＰＢＳ ｐＨ７．２で送達した。２４時間後、マウスを安楽死させ、脾臓を切除した。脾細胞の単一細胞懸濁液が１ｍｌのＬ−１５培地中で生成され、更に処理するまで、氷上で保存した。単一細胞懸濁液の濾過されたアリコート、４０μＬをＦＡＣＳチューブへ移し、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した（６００×ｇ、５分間）。次いで、サンプルを、細胞表面抗原：ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、蛍光色素Ａ７００）、ＣＤ２５（ｅＢｉｏ７Ｄ４、Ａｆ４８８）、ＣＤ４４（ＩＭ７、ｅ６０５）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４、ＰＥ）、ＩＣＯＳ（Ｃ３９８．４Ａ、ＰＥ／Ｃｙ７）、ＣＤ１０３（２Ｅ７、ＡＰＣ）に対する蛍光色素結合抗体と共にインキュベートした。染色は、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２＋０．２％ＢＳＡ）中で４℃で３０分間行った。細胞表面染色に続いて、サンプルは、（eBioscienceの細胞内染色プロトコルに従って）、細胞内染色の前に４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を用いて洗浄した（６００×ｇ、５分）。簡単に述べると、サンプルを２００μｌの固定化／透過処理緩衝液（eBioscience ＃００−５５２１）中に再懸濁し、１時間、４℃でインキュベートした。１ｍｌの１×透過処理緩衝液（eBioscience ＃００−８３３３）が、３ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液及び洗浄（６００×ｇ、５分）前にサンプルに添加された。細胞内抗原、Ｋｉ−６７（Ｂ５６、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５）及びＦＯＸＰ３（ＦＪＫ−１６Ｓ、ｅ４５０）は、１００μｌの１×透過処理緩衝液中で４℃で１時間染色された。サンプルは４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し（６００×ｇ、５分−２回）、データはＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａアナライザーで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Tree Star Inc.）を用いて分析した。Ｔｒｅｇは、リンパ球ゲート内のシングレットからＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋として定義され；この集団から、ＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が全サンプルに対して計算された。
図２１に示すように、１０００００ＩＵのプロロイキン（登録商標）と比較して、３００ＩＵのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−（ＩＬ−２）２はＣＤ２５の類似の上方制御を誘導したが、１５００ＩＵでは更により強力であった（図２１Ａ）。細胞内ＦＯＸＰ３を刺激する能力は、プロロイキン（登録商標）に比べて、２つのＩＬ−２イムノコンジュゲートについて類似の増強された能力を示した。全処置群において、データは平均値±ＳＤとして示される。先の研究は、ＦＯＸＰ３及びＣＤ２５のレベルはＩＬ−２処置後７２時間でベースラインへと戻ったことを示していた。
マウスにおいてＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２によるインビボ処置は免疫応答を抑制する
図２１に示される研究の前の予備的研究において、我々は４０００ＩＵのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の用量は、インビボでマウスのＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞を活性化することを観察しており；次いでこの用量は、マウスにおいて古典的なＴ依存性免疫応答、即ち、遅延型過敏症（図２２）及びＩｇＧ抗ＫＬＨ応答（図２３）を抑制する能力を評価するために使用された。
ＮＯＤマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７）をヒツジ赤血球（ｓｒｂｃ）による静脈内注射で免疫し、３日後に、片方の後足にｓｒｂｃのボーラスにより曝露し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を誘導した。曝露後１日目に、マウスはＣＯ２で安楽死させ、足を切除し、計量した。ＤＴＨ応答の大きさは、非免疫マウスと比較して足の重量の変化（Δ足の重量）として示されている。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、ｓｒｂｃによる免疫化の３日前とその当日にマウスあたり４０００ＩＵが皮下注射され、そのビヒクルは無菌のＰＢＳ、ｐＨ７．２であった。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでマンホイットニー検定から得られた。
ヒツジ赤血球免疫化の３日前とその当日日にＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２を投与すると、ヒツジ血液細胞曝露に対するその後の遅延型過敏反応を、ＮＯＤマウスで５１％（図２２Ａ；ｐ＝０．００２３）及びＣ５７ＢＬ／６マウスで３８％（図２２Ｂ；ｐ＝０．００２）抑制した。陽性対照免疫抑制剤としてのマウスのＣＴＬＡ−４−Ｉｇは、ＤＴＨ応答を、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２と類似したレベルまで阻害した。
ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２は、ＫＬＨ特異的ＩｇＧ応答を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７８％阻害、ｐ＝０．０００７、図２３Ａ）及びＮＯＤマウス（６７％阻害、ｐ＝０．００４、図２３Ｂ）において抑制することができた。この実験のため、健常な若いＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７−１０）及びＮＯＤマウス（ｎ＝１３−１４）が、製造業者（Stellar）が推奨するように、アジュバントを含まずに１００μｇのヒトワクチン等級のＫＬＨによって腹腔内にて免疫化された。ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２処置は、免疫化の当日に皮下注射で開始されたマウスあたり、４０００ＩＵによる毎週１回（ＮＯＤ）又は２回（Ｃ５７ＢＬ／６）の処置からなる。免疫化の７日後（ＮＯＤ）及び２１日後（Ｃ５７ＢＬ／６）に血液が採取され、血清ＫＬＨ特異的ＩｇＧ応答がＥＬＩＳＡにより測定された。
インビボで免疫応答を抑制するＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２の能力は、低用量のＩＬ−２により誘導される調節性Ｔ細胞の活性化が、免疫応答の減少を媒介する機能的な調節性Ｔ細胞を生成するという仮説を支持している。
前述の発明は、明瞭な理解のために説明及び例として幾らか詳細に記載したが、説明及び実施例は、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用した全ての特許及び科学文献の開示は、出典明記によってその全体を明瞭に引用する。

Claims (42)

  1. （ｉ）修飾を含むヒト免疫グロブリン分子であって、前記修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含む免疫グロブリン分子、及び（ｉｉ）２つのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子を含む、融合タンパク質であって、前記免疫グロブリン分子が、配列番号９の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含み、且つ免疫グロブリン重鎖に、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含み、前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である、融合タンパク質。
  2. 前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリン分子である、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記免疫グロブリン分子は抗原への特異的結合能力を持たない、請求項１から３の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記Ｆｃγ受容体はヒトＦｃγ受容体である、請求項１から４の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である、請求項１から５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、及びＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）の群から選択される、請求項１から６の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１から７の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記ＦｃγＲＩＩＩａはヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ＩＬ−２分子は、野生型ＩＬ−２分子である、請求項１から９の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 前記ＩＬ−２分子は、ヒトＩＬ−２分子である、請求項１から１０の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  12. 前記ＩＬ−２分子は、配列番号１又は配列番号３の配列を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  13. 前記ＩＬ−２分子は、配列番号３の配列を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 前記ＩＬ−２分子は各々、それらのＮ末端のアミノ酸で、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖の一方のＣ末端アミノ酸へ、任意でリンカーペプチドを介して融合している、請求項１から１３の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  15. 融合タンパク質は、配列番号１７及び配列番号１９のポリペプチド配列を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  16. （ｉ）請求項１から１５の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、若しくは前記ポリヌクレオチドを含むベクター、を含む宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程と、（ｉｉ）融合タンパク質を回収する工程とを含む、請求項１から１５の何れか一項に記載の融合タンパク質を生成するための方法。
  17. （ｉ）修飾を含むヒト免疫グロブリン分子であって、前記修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含む免疫グロブリン分子、及び（ｉｉ）２つのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子を含む、融合タンパク質であって、請求項１６に記載の方法により生成され、前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である、融合タンパク質。
  18. 請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
  19. 医薬としての使用のための、請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１８に記載の薬学的組成物。
  20. 自己免疫疾患の治療又は予防における使用のための、請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１８に記載の薬学的組成物。
  21. 前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、及び多発性硬化症の群から選択される、請求項２０に記載の融合タンパク質又は薬学的組成物。
  22. 移植拒絶反応又は移植片対宿主病の治療又は予防における使用のための、請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１８に記載の薬学的組成物。
  23. それを必要している個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質の使用。
  24. 前記疾患が自己免疫疾患である、請求項２３に記載の使用。
  25. 前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、及び多発性硬化症の群から選択される、請求項２４に記載の使用。
  26. 前記疾患が移植拒絶反応又は移植片対宿主病である、請求項２３に記載の使用。
  27. 前記個体は哺乳動物である、請求項２３から２６の何れか一項に記載の使用。
  28. 前記哺乳動物はヒトである、請求項２７に記載の使用。
  29. 個体における疾患を治療するための医薬であって、請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的に有効な量を含む、医薬。
  30. 前記疾患が自己免疫疾患である、請求項２９に記載の医薬。
  31. 前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、及び多発性硬化症の群から選択される、請求項３０に記載の医薬。
  32. 前記疾患が移植拒絶反応又は移植片対宿主病である、請求項２９に記載の医薬。
  33. 前記個体は哺乳動物である、請求項２９から３２の何れか一項に記載の医薬。
  34. 前記哺乳動物はヒトである、請求項３３に記載の医薬。
  35. インビトロ又はインビボで調節性Ｔ細胞の選択的活性化において使用のための、請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質。
  36. 前記活性化は、調節性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は調節性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。
  37. 前記使用はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、１ｎｇ／ｍＬ以下、又は０．１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で使用される、請求項３５又は３６に記載の融合タンパク質。
  38. 前記使用はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、２０μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、１２μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、又は６μｇ／ｋｇ体重以下の用量で使用される、請求項３５又は３６に記載の融合タンパク質。
  39. インビトロ又はインビボでの調節性Ｔ細胞の選択的活性化のためのキットであって、請求項１から１５及び１７の何れか一項に記載の融合タンパク質を含み、前記調節性Ｔ細胞が前記融合タンパク質と接触させられる、キット。
  40. 前記活性化は、調節性Ｔ細胞の増殖の誘導及び／又は調節性Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体シグナル伝達の誘導を含む、請求項３９に記載のキット。
  41. 前記キットはインビトロにおけるためであり、前記融合タンパク質は、１ｎｇ／ｍＬ以下、又は０．１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で使用される、請求項３９又は４０に記載のキット。
  42. 前記キットはインビボにおけるためであり、前記融合タンパク質は、２０μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、１２μｇ／ｋｇ体重以下の用量で、又は６μｇ／ｋｇ体重以下の用量で使用される、請求項３９又は４０に記載のキット。
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