MX2015001749A

MX2015001749A - Proteinas de fusion de interleuquina-2 y usos de las mismas.

Info

Publication number: MX2015001749A
Application number: MX2015001749A
Authority: MX
Inventors: Christian Klein; Ekkehard Moessner; Pablo Umana; Ralf Hosse; Laurence Bernard Peterson; Linda Wicker
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2012-08-10
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2015-06-05
Also published as: EP2882458B1; EP2882458A1; TW201420607A; AU2013301562A1; US20180009868A1; AR092089A1; JP2015530984A; CN111635460A; US11365232B2; PH12014502767A1; US20160090407A1; PE20150752A1; EA201500206A1; CA2873291A1; CO7121348A2; CL2014003322A1; CN104507504A; US20200172591A1; HK1208827A1; SG11201407579QA

Abstract

La presente invención se refiere de manera general a proteínas de fusión de inmunoglobulinas e interleuquina-2 (IL-2). Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos codificantes de dichas proteínas de fusión, y a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a métodos para producir las proteínas de fusión de la invención, y a métodos de utilización de los mismos en el tratamiento de enfermedades.

Description

“PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE INTERLEUOUINA-2 Y USOS DE LAS MISMAS” Campo de la invención La presente invención se refiere de manera general a proteínas de fusión de inmunoglobulinas e interleuquina-2 (IL-2). Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos codificantes de dichas proteínas de fusión, y a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a métodos para producir las proteínas de fusión de la invención, y a métodos de utilización de los mismos en el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes Las células T reguladoras (Treg) representan subgrupos específicos de linfocitos T que resultan cruciales para el mantenimiento de la autotolerancia. Estas células CD4+CD25hl con función supresora pueden distinguirse de las células T efectoras por la expresión intracelular del factor de transcripción FOXP3, así como de otros marcadores celulares, tales como CD12710, CTLA-4+, LAP, CD39+, PD-1+, GARP, etc. FOXP3 resulta crítico para la diferenciación y función de las Treg, y la deficiencia génica y las mutaciones de FOXP3, tanto en ratones scurfy como en pacientes con desregulación inmunológica-poliendocrinopatía, enteropatía y síndrome ligado al cromosoma X (IPEX), resultan en la degradación de la autotolerancia y en el desarrollo de enfermedades autoinmunológicas debidas a la deficiencia o falta de función de Treg.

Las respuestas autoinmunológicas en la diabetes de tipo 1, el lupus eritematoso sistémico (SLE), la esclerosis múltiple y muchas otras se correlacionan con una deficiencia en las Treg. Los datos de modelos animales apoyan la hipótesis de que las respuestas autoinmunológicas resultan facilitadas por un fracaso de las Treg para controlar la respuesta autoinmunológica destructiva. La diabetes de tipo 1 es una enfermedad autoinmunológica que se produce tras la destrucción de la mayoría de las células b productoras de insulina en el páncreas. La frecuencia de la diabetes de tipo 1 es de -0,3% de la población de USA y su incidencia continúa incrementándose en USA, Europa y, en particular, en Escandinavia (prácticamente el 1%) y se espera que se duplique dentro de los próximos veinte años.

La citoquina IL-2 desempeña un papel importante en la activación y función de ambas Treg, así como de las células T efectoras (Teff). Una deficiencia en la producción de IL-2 ó una falta de respuesta resulta preferentemente en una pérdida de la función de Treg y un incremento de la probabilidad de autoinmunidad. Debido a que las Treg expresan constitutivamente el receptor de IL-2 de alta afinidad a niveles más altos que Teff, las dosis bajas de IL-2 preferentemente apoyan el mantenimiento de Treg frente a las células Teff. Con el efecto preferente de IL-2 de activación de Treg in vitro e in vivo, el potencial de terapia duradera a dosis baja de IL-2 aparentemente presentaría una probabilidad elevada de éxito en las enfermedades autoinmunológicas. Se ha planificado para finales de 2013 el inicio de un ensayo clínico de la diabetes de tipo 1, controlado con placebo, de doble ciego, de 200 pacientes con IL-2 (Proleukin®). En ensayos clínicos recientes con una dosis baja diaria de Proleukin® se ha demostrado una mejora de algunos de los signos y síntomas de la enfermedad crónica del injerto contra el huésped (GVHD) y la vasculitis inducida por el virus de la hepatitis C (Koreth et al., New Engl. J. Med. 365:2055-2066, 2011; Saadoun et al., New Engl. J. Med. 365:2067-2077, 2011). En ambos estudios, una dosis baja de Proleukin® indujo las Treg e incrementó la proporción Treg:Teff. Sin embargo, las pobres propiedades farmacocinéticas de Proleukin® lo convierten en subóptimo para mantener niveles consistentemente bajos de IL-2 en el ser humano. Otros métodos analizados en ensayo clínico son la expansión personalizada de Treg ex vivo seguido de reiníusión, aunque este enfoque no es ideal e implica un conjunto complicado de cuestiones relacionadas con el control de la calidad.

De esta manera, un nuevo enfoque terapéutico que reestableciese la tolerancia inmunológica dominante natural mediada por las células T reguladoras (Treg) mejoraría en gran medida la capacidad de tratar pacientes con enfermedades autoinmunológicas tales como la diabetes de tipo 1, la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico, la enfermedad de Crohn, así como otras enfermedades autoinmunológicas y enfermedades proinflamatorias de tipo inmunológico, tales como la enfermedad crónica del injerto contra el huésped, el asma, la fibrosis pulmonar, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedades cardiovasculares tales como la ateroesclerosis y el rechazo del trasplante, tanto de órganos sólidos como de médula ósea.

Las proteínas de fusión de IL-2 de la presente invención preferentemente activan Treg, inclinando el equilibrio hacia una proporción Treg:Teff más elevada y reduciendo la respuesta autoinmunológica. Son duraderas, permitiendo regímenes de dosificación cómodos, y no presentan funciones efectoras, reduciendo potenciales efectos secundarios y alteraciones de la eficacia.

Descripción resumida de la invención En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende: (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación, e (ii) dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2).

En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina de clase IgG, particularmente una molécula de inmunoglobulina de la subclase IgG]. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina humana. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es capaz de unión específica a un antígeno. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina no es capaz de unión específica a un antígeno. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena pesada basada en la secuencia de línea germinal Vh3-23 humana. En una realización específica, dicha molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEC ID n° 9. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena ligera basada en la secuencia de línea germinal Vk3-20 humana. En una realización específica, dicha molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de región variable de cadena ligera SEC ID n° 11. En una realización todavía más específica, dicha molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEC ID n° 9 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 11. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina no es capaz de unión específica a un antígeno, y comprende una secuencia de región variable de cadena pesada basada en la secuencia de línea germinal Vh3-23 humana y una secuencia de región variable de cadena ligera basada en la secuencia de línea germinal Vk3-20 humana.

En una realización, dicho receptor de Fe es un receptor de Fcy, particularmente un receptor de Fcy humano. En una realización, dicho receptor de Fe es un receptor de Fe activador. En una realización, dicho receptor de Fe se selecciona de entre el grupo de FcyRIIIa (CDlóa), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32) y FcaRI (CD89). En una realización específica, dicho receptor de Fe es FcyRIIIa, particularmente FcyRIIIa humano. En una realización, dicha modificación reduce la función efectora de la molécula de inmunoglobulina. En una realización específica, dicha función efectora es la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). En una realización, dicha modificación se encuentra en la región Fe, particularmente en la región CH2, de dicha molécula de inmunoglobulina. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una sustitución de aminoácido en la posición 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización específica, dicha sustitución de aminoácido es P329G. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 234 y 235 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización específica, dichas sustituciones de aminoácidos son L234A y L235A (LALA). En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235 y 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización particular, dicha molécula de inmunoglobulina comprende sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.

En una realización, dichas moléculas de IL-2 son moléculas de IL-2 de tipo salvaje. En una realización, dichas moléculas de IL-2 comprenden una mutación de aminoácido que no altera la afinidad de unión de dichas moléculas de IL-2 para un receptor de IL-2 en comparación con la IL-2 nativa natural. En una realización, dichas moléculas de IL-2 comprenden una mutación de aminoácido en una posición correspondiente al residuo 125 de la IL-2 humana. En una realización más específica, dicha mutación de aminoácido es la sustitución de aminoácido C125A. En una realización, dichas moléculas de IL-2 son moléculas de IL-2 humanas. En una realización específica, dichas moléculas de IL-2 comprenden la secuencia SEC ID n° 1 ó de SEC ID n° 3, particularmente la secuencia SEC ID n° 3. En una realización, dichas moléculas de IL-2 comprenden la secuencia SEC ID n° 1 ó de SEC ID n° 3, particularmente la secuencia SEC ID n° 3. En una realización, cada una de dichas moléculas de IL-2 se fusiona en su aminoácido N-terminal con el aminoácido C-terminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina de dicha molécula de inmunoglobulina, opcionalmente mediante un péptido conector.

En una realización específica, dichas proteína de fusión comprende las secuencias polipéptidicas SEC ID n° 17 y SEC ID n° 19. En una realización específica, dicha proteína de fusión comprende una cadena ligera de inmunoglobulina SEC ID n° 19 y un polipéptido de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina-IL-2 de SEC ID n° 17. En una realización, dicha proteína de fusión consiste esencialmente de una molécula de inmunoglobulina que comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación, dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2) y opcionalmente uno o más péptidos conectores. En una realización, dicha proteína de fusión consiste esencialmente de dos cadenas ligeras de inmunoglobulina de SEC ID n° 19 y dos polipéptidos de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina-IL-2 de SEC ID n° 17.

La invención proporciona además un polinucleótido codificante de la proteína de fusión de la invención. Se proporciona además un vector, particularmente un vector de expresión, que comprende el polinucleótido de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende el polinucleótido o el vector de la invención. La invención proporciona además un método para producir una proteína de fusión de la invención, que comprende las etapas de: (i) cultivar la célula huésped de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión, e (ii) recuperar la proteína de fusión. Se proporciona además una proteína de fusión que comprende: (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación, e (ii) dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2), producidas mediante dicho método.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Se proporciona además la proteína de fusión o la composición farmacéutica de la invención para la utilización a modo de medicamento, y para la utilización en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad autoinmunológica, concretamente la diabetes de tipo 1, la esclerosis múltiple (EM), el lupus eritematoso sistémico (LSE) o la enfermedad de Crohn, más concretamente la diabetes de tipo 1, o la enfermedad del injerto contra el huésped o el rechazo del trasplante. Se proporciona además la utilización de una proteína de fusión de la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita del mismo, así como un método de tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar en dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende la proteína de fusión de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable. En una realización, dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunológica. En una realización más específica, dicha enfermedad autoinmunológica es la diabetes de tipo 1, la esclerosis múltiple (EM), el lupus eritematoso sistémico (LSE) o la enfermedad de Crohn. En una realización todavía más específica, dicha enfermedad autoinmunológica es la diabetes de tipo 1. En otra realización, dicha enfermedad es el rechazo del trasplante o la enfermedad del injerto contra el huésped. En una realización, dicho individuo es un mamífero, particularmente un ser humano.

Se proporciona además la proteína de fusión de la invención para la utilización en la activación selectiva de las células T reguladoras in vitro o in vivo. En una realización, dicha activación comprende la inducción de la proliferación de las células T reguladoras y/O la inducción de la señalización del receptor de IL-2, particularmente la fosforilación de STAT5, en las células T reguladoras. En una realización, dicha utilización es in vitro y dicha proteína de fusión se utiliza a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml o menos, particularmente de aproximadamente 0,1 ng/ml o menos. En otra realización, dicha utilización es in vivo y dicha proteína de fusión se utiliza a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal o menos, particularmente de aproximadamente 12 pg/kg de peso corporal o menos, más particularmente de aproximadamente 6 pg/kg de peso corporal o menos.

La invención proporciona además un método para la activación selectiva de las células T reguladoras irt vitro o in vivo, que comprende poner en contacto dichas células T reguladoras con la proteína de fusión de la invención. En una realización, dicha activación comprende la inducción de la proliferación de las células T reguladoras y/O la inducción de la señalización del receptor de IL-2, particularmente la fosforilación de STAT5, en las células T reguladoras. En una realización, dicho método es in vitro y dicha proteína de fusión se utiliza a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml o menos, particularmente de aproximadamente 0,1 ng/ml o menos. En otra realización, dicho método es in vivo y dicha proteína de fusión se utiliza a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal o menos, particularmente de aproximadamente 12 pg/kg de peso corporal o menos, más particularmente de aproximadamente 6 pg/kg de peso corporal o menos.

Breve descripción de los dibujos Figura 1A-1D. Purificación de la proteína de fusión IgG DP47GS-IL-2 (ver SEC ID n° 13, 15 y 19). (fig.lA) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de proteína A. (fig.lB) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. Rendimiento: 4 mg/1. (fig.lC) Electroforesis capilar analítica en SDS (Caliper) del producto final. Se observó la banda siguiente: no reducido - 7,5% de área a llí kDa, 92,5% de área a 174 kDa; reducido - 23,6% de área a 29 kDa, 23,5% de área a 67 kDa, 52,9% de área a 82 kDa. El producto contiene aproximadamente 7,5% “medias IgG”. (fig.lD) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna TSKgel G3000 SW XL (contenido de monómero de 91%).

Figura 2A-2D. Purificación de proteína de fusión IgG DP47GS-(IL-2)2 (ver SEC ID n° 17, 19). (fig.2A) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de afinidad de proteína A. (fig.2B) Perfil de elución de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. Rendimiento: 13 mg/1. (fig.2C) Electroforesis capilar analítica en SDS (Caliper) del producto final. Se observó la banda siguiente: no reducido - 2,3% de área a 172,5 kDa, 97,7% de área a 185 kDa; reducido - 18,3% de área a 27,3 kDa, 0,6% de área a 29,2 kDa, 81,1% de área a 78,3 kDa. (fig.2D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto final en una columna Superdex 2000 (contenido de monómero: 100%).

Figura 3A-3D. Expresión de CD25 (IL-2RA) y CD122 (IL-2RB) en subgrupos de Treg CD4+, subgrupos de células NK y células NKT. Se utilizaron marcadores de superficie celular para definir los subgrupos de Treg CD4+, células NKT y células NK. Con el fin de optimizar la tinción para CD25 y CD122, no se llevó a cabo tinción intracelular de FOXP3. (fig.2A, 2B) Tres poblaciones de células T CD4+ reguladoras (Treg): no sensibilizadas (CD45RA+, CD25+; línea de puntos), de memoria (CD45RA, CD25+; línea continua) y activadas (CD45RA, CD25hl; línea discontinua). (fig.2C, 2D) Células NKT (línea de puntos), células NK CD56brillante (línea discontinua), células NK CD56,mermcd,° (línea continua). Gris: control de isotipo.

Figura 4A-4D. Expresión de CD25 (IL-2RA) y CD122 (IL-2RB) en subgrupos de células T convencionales CD4+ y CD8+. Se utilizaron marcadores de superficie celular para definir células T CD4+ convencionales no sensibilizadas (CD45RA+, línea de puntos) y de memoria (CD45RA, línea continua) (fig.4A, 4B), células T CD8+ convencionales de memoria (CD45RA , línea sólida) y células T CD8 CD45RA+ (una combinación de los subgrupos no expuesto y TEMRA); TEMRA se refiere a células de memoria efectoras que han revertido a expresar CD45RA, línea de puntos) (fig.4C, 4D). Gris: control de isotipo. Figura 5. Inducción de pSTAT5a en subgrupos de células sanguíneas periféricas humanas en respuesta a IgG DP47GS-IL-2. Se evaluaron tres donantes humanos diferentes (C4 a C6) en tiempos separados para los efectos de diversas dosis de IgG DP47GS-IL-2 sobre la inducción de la fosforilación de STAT5a. Se muestran los resultados para los subconjuntos de Treg CD4+: Treg activadas, de memoria y no sensibilizadas; células T efectoras CD4+ convencionales de memoria, células NK CD56brillante, células T efectoras CD8+ de memoria, células T efectoras CD4+ no sensibilizadas, células NKT y células T efectoras CD8+ no sensibilizadas + células CD45RA+ de memoria.

Figura 6. Inducción de pSTAT5a en subgrupos de células sanguíneas periféricas humanas en respuesta a IgG DP47GS-(IL-2)2. Se evaluaron cinco donantes humanos diferentes (NI, N2, C4 a C6) en tiempos separados para los efectos de diversas dosis de inmunoconjugado IgG DP47GS-(IL-2)2 sobre la inducción de la fosforilación de STAT5a. Se muestran los resultados para los subconjuntos de Treg CD4+: Treg activadas, de memoria y no sensibilizadas; células T efectoras CD4+ convencionales de memoria, células NK CD56bnllante, células T efectoras CD8+ de memoria, células T efectoras CD4+ no sensibilizadas, células NKT y células T efectoras CD8+ no sensibilizadas + células CD45RA+ de memoria.

Figura 7A-7B. Inducción de pSTAT5a en subgrupos de células sanguíneas periféricas humanas: comparación entre IgG DP47GS-IL-2 y IgG DP47GS-(IL-2)2. Los resultados de cada subgrupo de células se normalizaron respecto al efecto máximo observado de cada subgrupo y se presenta la ECso aproximada para Treg en la Tabla 2. (fíg.7A) resultados normalizados para IgG DP47GS-IL-2, (fig.7B) resultados normalizados para IgG DP47GS-(IL-2)2.

Figura 8A-8D. Examen detallado de la sensibilidad de subgrupos de Treg en tres donantes comparando IgG DP47GS-IL-2 y IgG DP47GS-(IL-2)2. Los gráficos representan medias ± SD de la IFM de pSTAT5a para los tres donantes. (fig.8A) Treg CD3+, CD4+, FoxP3+ totales. (fig.8B) Treg activadas. (fíg.8C) Treg de memoria. (fíg.8D) Treg no sensibilizadas. Figura 9A-9B. IgG DP47GS-IL-2 presenta un efecto dependiente de la dosis en monos Cynomolgus de incremento de las células T reguladoras. Los cambios en las células T reguladoras (Treg) CD4+ CD25+ FOXP3+ de sangre completa el día 7 después del tratamiento se muestran como (fig.9A) el número absoluto de células Treg por mm3 de sangre completa y (fig.B) el factor de cambio de las Treg. Todos los datos se representan como medias + SD. Columnas blancas: IgG DP47GS-IL-2 (n=6); columnas grises: vehículo (n=3).

Figura 10A-10B. Efectos temporales y de dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 sobre las Treg en monos Cynomolgus. (fig.lOA) Cambios dependientes del tiempo en factor de incremento de Treg tras la dosificación con 2 ó 6 mg/kg de IgG DP47GS-IL-2 (n=4 y 6, respectivamente). (fig.lOB) Cambios dependientes del tiempo en el recuento absoluto de Treg en sangre tras la dosificación con 2 ó 6 pg/kg de IgG DP47GS-IL-2 (n=4 y 6, respectivamente). Todos los datos se representan como medias ± SD.

Figura 11 A-l IB. Una dosis única de Proleukin® estimula una respuesta de Treg transitoria dependiente de la dosis en monos Cynomolgus. (fig.llA) Cambios en el número de Treg de sangre periférica tras el tratamiento de una única dosis de 3x104 a 3x105 IU/kg de Proleukin®. (fig.llB) Cambios en el número de pSTAT5a de Treg tras el tratamiento de una única dosis de 3x104 a 3x105 IU/kg de Proleukin®. Los datos se representan como medias ± SD.

Figura 12A-12C. Una dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 resulta más efectiva que una dosis alta de Proleukin® en la inducción de Treg en monos Cynomolgus. Se trataron monos Cynomolgus sanos normales (grupos de n=5) con una dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 ó una dosis alta de Proleukin® y se sometió a ensayo el cambio en las células T reguladoras el día 10. Los días 0 y 7, se administró s.c. IgG DP47GS-IL-2 a una dosis de 16.800 IU/kg (12 mg/kg). Se administró s.c. el tratamiento de Proleukin® (200.000 IU/kg) tres veces por semana (MWF) durante un total de 5 dosis. Se muestran los resultados como medias ± SD para (fig.l2A) el cambio de Treg totales por mm3 de sangre, (fíg.l2B) el factor de incremento de Treg, y (fig.l2C) el cambio en la proporción de Treg a células CD4+ FOXP3 convencionales. Las columnas blancas ilustran el tratamiento de IL-2 y las columnas grsises, el control de vehículo.

Figura 13A-13C. STAT5 fosforilado de sangre completa ex vivo como marcador biológico sensible para la activación in vivo de Treg IgG DP47GS-IL-2. Un día y 3 días después de la administración in vivo de una única dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 (12 pg/kg) en monos Cynomolgus sanos (n=5), se recogió sangre completa y se sometió a ensayo inmediatamente sin estimulación para STAT5 fosforilado (pSTAT5a). Se sangró cada mono el día 0 antes del tratamiento y se midió la cantidad de pSTAT5a (columnas grises) y se utilizó individualmente para evaluar el factor de cambio posterior al tratamiento (columnas blancas). Se muestra (fig.l3A) factor de cambio de pSTAT5a de Treg los días 1 y 3, (fig.l3B) factor de cambio en pSTAT5a en células T CD4+ CD45 convencionales de memoria, y fig.l3C) factor de cambio de pSTAT5a de células T no sensibilizadas. Los datos se representan como medias ± SD.

Figura 14A-14B. pSTAT5 fosforilado de sangre completa ex vivo como marcador biológico sensible para la activación in vivo de Treg a dosis baja de IgG DP47GS-IL-2. Tras uno a siete días de la administración in vivo de una única dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 en monos Cynomolgus sanos, se recogió sangre completa y se sometió a ensayo inmediatamente sin estimulación para pSTAT5. Se sangró cada mono el día 0 antes del tratamiento para niveles no estimulados de pSTAT5a y se comparó con cambios en pSTAT5a después del tratamiento. (fig.l4A) pSTAT5a de Treg antes y después del tratamiento con 2 mg/kg de IgG DP47GS-IL-2 (n=4). (fig.l4B) pSTAT5a de Treg antes y después del tratamiento con 6 pg/kg de IgG DP47GS-IL-2 (n=6). Los datos se representan como medias ± SD.

Figura 15A-15C. Ki-67 de sangre completa de Cynomolgus ex vivo sirve como marcador para la proliferación in vivo de células T inducida por IgG DP47GS-IL-2. También se realizó un seguimiento ex vivo de los monos Cynomolgus tratados con 2 y 6 pg/kg de IgG DP47GS-IL-2 tal como se describe en la figura 14A-14B, para cambios en el marcador intracelular Ki-67 con el fin de evaluar el grado de proliferación in vivo. Se cuantificó el porcentaje estable normal de células en el ciclo celular (Ki-67*) el día 0 antes del tratamiento y después se realizó un seguimiento diario durante los 7 a 11 días siguientes. Se muestra (fig.l5A) % de Ki-67+ para las Treg, (fig.l5B) % de Ki-67+ para las células T CD4+CD45 de memoria/efectoras convencionales, y (fig.l5C) % de Ki-67* para células T CD4*CD45RA* no sensibilizadas. Los datos se representan como medias ± SD.

Figura 16A-16D. Efectos temporales y de dosis baja de IgG DP47GS-(IL-2)2 sobre las Treg en monos Cynomolgus sanos no expuestos. (fig.lóA) Cambios dependientes del tiempo del número absoluto de Treg tras 6 mg/kg de IgG DP47-(IL-2)2. (fíg.lóB) Cambios dependientes del tiempo de pSTAT5a de Treg tras el tratamiento. (fíg.lóC) Cambios dependientes del tiempo en el factor de incremento de Treg, y (fig.lóD) comparación entre el factor de cambio de las Treg de monos tratados con IgG DP47GS-IL-2 (columnas blancas, 2 a 36 pg/kg) frente a los tratados con IgG DP47GS-(IL-2)2 (columnas grises, 6 pg/kg). Todos los datos se representan como medias + SD (n=4 a 6).

Figura 17A-17C. Efectos dependientes del tiempo y la dosis de una dosis muy baja de IgG DP47GS-(IL-2)2 sobre las Treg en monos Cynomolgus sanos no expuestos. (fig.l7A) Cambios dependientes del tiempo en factores de incremento de Treg tras la administración de 0,7 y 2 pg/kg de IgG DP47GS-(IL-2)2. (fig 17B) Cambios dependientes del tiempo en pSTAT5a de Treg medidos el día 0 antes del tratamiento y los días 1 a 4 después del tratamiento, (fíg.l7C) cambios dependientes del tiempo en pSTAT5a de células Teff/de memoria. Todos los datos se muestran como medias ± SD (n=3 a 0,7 pg/kg y n=8 a 2 úg/kg).

Figura 18. Comparación dependiente de la dosis entre IgG DP47GS-IL-2 y IgG DP47GS-(IL-2)2 y su capacidad de incrementar las Treg de sangre completa en Cynomolgus. Todos los datos se presentan como medias ± SD (n=3 a 6).

Figura 19A-19B. Una dosis alta de IL-2 induce eosinofilia en monos Cynomolgus. Se realizó un seguimiento de los cambios en el recuento de eosinófilos sanguíneos en todos los ensayos con Proleukin® o los inmunoconjugados de IL-2. Se detectó eosinofilia 7 a 14 días después del tratamiento con una dosis alta de Proleukin® (2x105 IU/kg 3 veces por semana durante 2 semanas) o las dosis más altas de IgG DP47GS-IL-2. Los recuentos de línea base de eosinófilos es la columna gris a la izquierda y los observados tras IgG DP47GS-(IL-2)2 a 6 mg/kg son la columna gris a la derecha. (fig 19A) Recuento de eosinófilos de cada animal en cada grupo de dosis y (fig.l9B) recuentos de eosinófilos únicamente de los animales cuyos eosinófilos se habían incrementado tras el tratamiento. Los datos se representan como medias ± SD.

Figura 20A-20B. IgG DP47GS-IL-2 presenta propiedades farmacocinéticas incrementadas en comparación Proleukin®. Se inyectaron las dosis indicadas de IgG DP47GS-IL-2 ó de Proleukin® intraperitonealmente (i.p.) (panel izquierdo) o subcutáneamente (s.c.) (panel derecho) en ratones NOD. Se evaluó IL-2 humana en muestras de suero en los tiempos indicados mediante un ensayo de captura basado en mAb y se muestra el límite de detección de cada ensayo como una línea horizontal a través de cada gráfico.

Figura 21A-21B. Tanto CD25 como FOXP3 se incrementaron en Treg murinas tras el tratamiento con Proleukin®, IgG DP47GS-IL-2 e IgG DP47GS-(IL-2)2. Se trataron ratones BALB/c con Proleukin® (20.000 y 100.000 IU/ratón, n=3), IgG DP47GS-IL-2 ó IgG DP47GS-(IL-2)2 (60, 300 ó 1.500 IU/ratón, n=3); los ratones tratados con vehículo se incluyeron a modo de controles no estimulados (n=4). Veinticuatro horas después del tratamiento se evaluaron las Treg esplénicas para los niveles de CD25 y FOXP3. Se observaron para las tres moléculas de IL-2: (fig.21A) los cambios dependientes de la dosis en CD25 de superficie celular y (fig.21B) los cambios dependientes de la dosis de FOXP3 intracelular. La IFM media para los ratones con vehículo fue de 4.900 para CD25 y de 1.566 para FOXP3. Todos los datos se representan como medias ± SD (n=3).

Figura 22A-22B. Tratamiento in vivo con IgG DP47GS-IL-2 suprime la hipersensiblidad de tipo retardado (HTR) de los glóbulos rojos murinos de oveja. Todos los datos se muestran para ratones individuales tratados con vehículo (respuesta de 100%), IgG-IL-2 (4.000 IU/ratón) o CTLA-4-Ig de ratón a modo de control positivo (200 mg/ratón). (fíg.22A) Resultados de ratones NOD y (fig.22B) ratones C57BL/6. Se muestra la magnitud de las respuestas de DTH del día cuatro como cambio en el peso de pata en comparación con ratones no inmunizados (D de peso de pata). Los datos se representan como medias ± SD. Figura 23A-23B. El tratamiento in vivo con IgG DP47GS-IL-2 (4.000 IU/ratón) suprime las respuestas murinas de anticuerpos IgG frente a KLH en (fíg.23A) ratones C57BL/621 días después de la inmunización y (fig.23B) ratones NOD siete días después de la inmunización. Los datos se representan como medias + SD.

Descripción detallada de la invención Definiciones Los términos se utilizan en la presente memoria tal como se utilizan generalmente en la téenica, a menos que se indique lo contrario.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “proteína de fusión” se refiere a una molécula de polipéptido de fusión que comprende una molécula de inmunoglobulina y una molécula de IL-2, en la que los componentes de la proteína de fusión se encuentran unidos entre sí mediante enlaces peptídicos, directamente o mediante péptidos conectores. Por claridad, las cadenas peptídicas individuales del componente inmunoglobulina de la proteína de fusión pueden unirse no covalentemente, por ejemplo mediante enlaces disulfuro.

El término “fusionado” se refiere a componentes que se encuentran unidos mediante enlace peptídicos, directamente o mediante uno o más péptidos conectores.

La expresión “unión específica” se refiere a que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de las interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un anticuerpo de unirse a un antígeno específico puede medirse mediante un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) u otra téenica que resulte familiar para el experto en la materia, por ejemplo la técnica de resonancia del plasmón superficial (SPR) (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J. 17:323-329, 2000) y los ensayos de unión tradicionales (Heelcy, Endocr. Res. 28:217-229, 2002). En una realización, el grado de unión de una inmunoglobulina a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente 10% de la unión de la inmunoglobulina al antígeno, según medición mediante, por ejemplo, SPR. En determinadas realizaciones, una inmunoglobulina que se une al antígeno presenta una constante de disociación (KD) de < 1 mM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo 108M o inferior, por ejemplo de entre 108 M y 1013 M, por ejemplo de entre 10 q M y 1013 M). El término “afinidad” o “afinidad de unión” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su pareja Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (KD, que es la proporción entre las constantes de tasa de disociación y de asociación (kofr y kon, respectivamente). De esta manera, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de tasa, con la condición de que la proporción entre las constantes de tasa no varíe. La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos de la téenica, incluyendo los indicados en la presente memoria. Un método particular para medir la afinidad es la resonancia del plasmón superficial (SPR).

La expresión “unión reducida”, por ejemplo unión reducida a un receptor de Fe, se refiere a una reducción de la afinidad para la interacción respectiva, medida mediante, por ejemplo, SPR. En aras de la claridad, la expresión incluye además la reducción de la afinidad a cero (o a un nivel inferior al límite de detección del método analítico), es decir, la anulación completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada” se refiere a un incremento de la afinidad de unión para la interacción respectiva.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “determinante antigénico” es sinónima de “antígeno” y se refiere a un sitio (por ejemplo un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida de diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un anticuerpo, formando un complejo de anticuerpo-antígeno. Pueden encontrarse determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, sobre las superficies de células, libres en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "de cadena sencilla" se refiere a una molécula que comprende monómeros aminoácidos conectados linealmente mediante enlaces peptídicos.

El término “anticuerpo” en la presente memoria se utiliza en el sentido más amplio y comprende diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífícos (por ejemplo anticuerpos biespecífícos) y fragmentos de anticuerpo, con la condición de que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.

Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo scFv) y anticuerpos de un solo dominio.

La expresión “molécula de inmunoglobulina” se refiere a una proteína que presenta la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se encuentran unidas mediante disulfuros. De extremo N-terminal a C-terminal, cada cadena pesada de inmunoglobulina presenta una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también denominados región constante de cadena pesada. De manera similar, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, cada cadena ligera de inmunoglobulina presenta una región variable (VL), también denominada dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL), también denominado región constante de cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina puede asignarse a uno de cinco tipos, denominados a (IgA), d (IgD), e (IgE), g (IgG) o m (IgM), algunos de los cuales puede dividirse adicionalmente en subtipos, por ejemplo gi (IgGi), g2 (IgG ), g3 (IgG3), g4 (IgG4), a¡ (IgAi) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (K) y lambda (l), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente de dos fragmentos Fab y un dominio Fe, unidos mediante la región bisagra de inmunoglobulina.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “fragmento Fab” se refiere a un fragmento de inmunoglobulina que comprende un dominio VL y un dominio constnate de una cadena ligera (CL) y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. La “clase” de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante que presenta su cadena pesada. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgGj, lgG2, lgG3 e IgG4, IgA] e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a , <5 , e , g y , respectivamente.

La expresión “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una inmunoglobulina o de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa generalmente en la unión de la inmunoglobulina o anticuerpo al antígeno. Sin embargo, la inmunoglobulina comprendida en la proteína de fusión de la presente invención puede comprender regiones variables que no proporcionan especificidad de unión a antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de una inmunoglobulina o anticuerpo nativo generalmente presentan estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR) Ver, por ejemplo, Kindt et al, Kuby Immunology, 6a edición, W.H.

Freeman y Co., página 91, 2007. Puede resultar suficiente un único dominio VH o VL para proporcionar especificidad de unión de antígeno.

La expresión “región hipervariable” o “HVR”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cada una de las regiones de una inmunoglobulina o dominio variable de anticuerpo, que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables”). Generalmente, los anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis HVRs, tres en la VH (Hl, H2 y H3) y tres en la VL (Ll, L2 y L3). Las HVRs generalmente comprenden residuos aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR), presentando éstas últimas la variabilidad de secuencia más alta y/o participando en el reconocimiento de antígeno. Se encuentran bucles hipervariables ejemplares en los residuos aminoácidos 26 a 32 (Ll), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (Hl), 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Se encuentran CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) en los residuos aminoácidos 24 a 34 de Ll, 50 a 56 de L2, 89 a 97 de L3, 31 a 35B de Hl, 50 a 65 de H2 y 95 a 102 de H3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Con la excepción de la CDR1 en VH, las CDRs generalmente comprenden los residuos aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDR comprenden además “residuos determinantes de especificidad”, o “SDR”, que son residuos que contactan con el antígeno. Las SDRs se encuentran contenidas dentro de las regiones de las CDRs denominadas CDRs abreviadas, o CDR-a. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se encuentran en los residuos aminoácidos 31 a 34 de Ll, 50 a 55 de L2, 89 a 96 de L3, 31 a 35B de Hl, 50 a 58 de H2 y 95 a 102 de H3 (ver Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008). A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo los residuos de FR) se numeran en la presente memoria según Kabat et al., supra (denominada "numeración Kabat”).

El término “marco” o "FR” se refiere a residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. De acuerdo con lo anterior, las secuencias de HVR y de FR generalmente aparecen en la secuencia siguiente en VH (o en VL): FR1 -H 1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Una "inmunoglobulina humana" es una que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de una inmunoglobulina producida por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza los repertorios de inmunoglobulinas humanas u otras secuencias codificantes de inmunoglobulinas humanas. Esta definición de inmunoglobulina humana excluye específicamente una inmunoglobulina humanizada que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo que contienen mutaciones naturales o que aparecen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, encontrándose presentes generalmente dichas variantes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), estando dirigido cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales contra un único determinante de un antígeno. De esta manera, el modificador "monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse según la presente invención pueden prepararse mediante una diversidad de téenicas, incluyendo, aunque sin limitación, el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de expresión fágica y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina humanos, estando descritos en la presente memoria dichos métodos y otros métodos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

La expresión "dominio Fe” o “región Fe” en la presente memoria se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. La expresión incluye las regiones de Fe de secuencia nativa y las regiones de Fe variantes. Una región Fe de IgG comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG. El “dominio CH2” de una región Fe de IgG humana habitualmente se extiende entre un residuo aminoácido en aproximadamente la posición 231 y un residuo aminoácido en aproximadamente la posición 340. En una realización, se encuentra unida una cadena de carbohidrato al dominio CH2. El dominio CH2 en la presente memoria puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o un dominio CH2 variante. El “dominio CH3” comprende el tramo de residuos C-terminal respecto a un dominio CH2 en una región Fe (es decir, entre un residuo aminoácido en aproximadamente la posición 341 y un residuo aminoácido en aproximadamente la posición 447 de una IgG).

La región CH3 en la presente memoria puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o un dominio CH3 variante (por ejemplo un dominio CH3 con una “protuberancia” (“botón”) introducida en una cadena del mismo y una correspondiente “cavidad” (“ojal”) introducido en la otra cadena del mismo; ver la patente US n° 5.821.333, incorporada expresamente en la presente memoria como referencia). Dichos dominios CH3 variantes pueden utilizarse para estimular la heterodimerización de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina no idénticas tal como se indica en la presente memoria. En una realización, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la Iisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede encontrarse presente o no. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, la numeración de los residuos aminoácidos en la región Fe o en la región constante se lleva a cabo según el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. La expresión “funciones efectoras” se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de una inmunoglobulina, las cuales varían según el isotipo de inmunoglobulina. Entre los ejemplos de funciones efectoras de inmunoglobulina se incluyen: unión de Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión de receptor de Fe, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citoquinas, incorporación de antígenos por células presentadoras de antígenos mediada por complejo inmunológico, regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptores de células B) y activación de las células B.

Un "receptor de Fe activador" es un receptor de Fe que tras la unión a un dominio Fe de un anticuerpo induce sucesos de señalización que inducen a que la célula portadora de receptores lleve a cabo funciones efectoras. Entre los receptores de Fe activadores humanos se incluyen FcyRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32) y FcaRI (CD89) Un receptor de Fe activador particular es el FcyRIIIa humano (ver UniProt n° de acceso P08637 (versión 141)).

El término “interleuquina-2” o “IL-2” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier IL-2 nativa de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo seres humanos) y roedores (por ejemplo ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. El término comprende IL-2 no procesada, así como cualquier forma de IL-2 que resulte del procesamiento en la célula. El término también comprende variantes naturales de IL-2, por ejemplo variantes de procesamiento o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IL-2 humana ejemplar se muestra en SEC ID n° 1. La IL-2 humana no procesada comprende además un péptido de señal N-terminal de 20 aminoácidos, que se encuentra ausente en la molécula de IL-2 madura.

La expresión “IL-2 nativa”, también denominada “IL-2 de tipo salvaje”, se refiere a IL-2 natural. La secuencia de una molécula de IL-2 humana nativa se muestra en SEC ID n° 1. Para el propósito de la presente invención, la expresión tipo salvaje también comprende formas de IL-2 que comprenden una o más mutaciones de aminoácidos que no alteran la unión a receptores de IL-2 en comparación con la IL-2 nativa natural, tal como, por ejemplo, una sustitución de cisterna en una posición correspondiente al residuo 125 de la IL-2 humana por alanina. En algunas realizaciones, la IL-2 de tipo salvaje para el propósito de la presente invención comprende la sustitución de aminoácidos C125A (ver SEC ID n° 3).

El término “CD25” o “receptor a de IL-2” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier CD25 nativa de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo seres humanos) y roedores (por ejemplo ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. El término comprende “longitud completa", CD25 no procesada, así como cualquier forma de CD25 que resulte del procesamiento en la célula. La expresión también comprende variantes naturales de CD25, por ejemplo variantes de procesamiento o variantes alélicas. En determinadas realizaciones, CD25 es CD25 humana. La secuencia de aminoácidos de una CD25 humana ejemplar (con secuencia de señal, etiqueta Avi y etiqueta His) se muestra en SEC ID n° 25.

La expresión “receptor de IL-2 de alta afinidad” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la forma heterotrimérica del receptor de IL-2, que consiste de la subunidad g del receptor (también conocida como subunidad g del receptor de citoquina común, yc, o CD132), la subunidad b del receptor (también conocida como CD122 ó p70) y la subunidad a del receptor (también conocida como CD25 ó p55). La expresión “receptor de IL-2 de afinidad intermedia” o “receptor bg de IL-2” en contraste se refiere al receptor de IL-2 que incluye únicamente la subunidad g y la subunidad b, sin la subunidad a (para una revisión ver, por ejemplo, Olejniczak y Kasprzak, Med. Sci. Monit. 14, RA179-189, 2008). Las secuencias de aminoácidos de los CD122 y CD132 humanos ejemplares (fusionados con una región Fe con una etiqueta His) se muestran en SEC ID n° 21 y n° 23, respectivamente. La expresión “célula T reguladora” o “célula Treg” se refiere a un tipo especializado de célula T CD4+ que puede suprimir las respuestas de otras células T. Las células Treg se caracterizan por la expresión de CD4, la subunidad a del receptor de IL-2 (CD25) y el factor de transcripción forkhead box P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu. Rev. Immunol. 22:531-62, 2004) y desempeñan un papel crítico en la inducción y mantenimiento de la autotolerancia periférica a los antígenos, incluyendo los expresados por tumores.

La expresión “activación selectiva de células Treg” se refiere a la activación de las células Treg esencialmente sin activación concomitante de otros subgrupos de células T (tales como las células T CD4+ ayudantes, las células T CD8+ citotóxicas y las células T NK) o células naturales asesinas (NK). Los métodos para identificar y distinguir dichos tipos celulares se describen en los Ejemplos. La activación puede incluir la inducción de la señalización de receptores de IL-2 (medida mediante, por ejemplo, la detección de STAT5a fosforilado), la inducción de la proliferación (medida mediante, por ejemplo, la detección de Ki-67) y/o la regulación positiva de la expresión de marcadores de activación (tales como, por ejemplo, CD25).

La expresión “péptido conector” se refiere a un péptido que comprende uno o más aminoácidos, típicamente entre 2 y 20 aminoácidos aproximadamente. Los péptidos conectores son conocidos de la téenica o se describen en la presente memoria. Entre los péptidos conectores no inmunogénicos adecuados se incluyen, por ejemplo, los péptidos conectores (G4S)n, (SG4)„ o G4(SG4)„. “n” es generalmente un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4.

El término “modificación” se refiere a cualquier manipulación del esqueleto peptídico (por ejemplo una secuencia de aminoácidos) o las modificaciones post-traduccionales (por ejemplo la glucosilación) de un polipéptido.

Una “modificación de botón-en-ojal” se refiere a una modificación en la interfaz entre dos cadenas pesadas de inmunoglobulina en el dominio CH3, en las que i) en el dominio CH3 de una cadena pesada, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido que presenta un volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia (“botón”) dentro de la interfaz en el dominio CH3 de una cadena pesada que es posicionable en una cavidad (“ojal”) dentro de la interfaz en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, e ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un residuo aminoácido se sustituye por un residuo aminoácido que presenta un volumen de cadena lateral menor, generando de esta manera una cavidad (“ojal”) dentro de la interfaz en el segundo dominio CH3 dentro del que puede situarse una protuberancia (“botón”) en el primer dominio CH3. En una realización, la “modificación de botón-en-ojal” comprende la sustitución de aminoácido T366W y opcionalmente la sustitución de aminoácido S354C en una de las cadenas pesadas de anticuerpo, y las sustituciones de aminoácidos T366S, L368A, Y407V y opcionalmente Y349C en la otra de las cadenas pesadas de anticuerpo. La teenología de botón-en-ojal se describe en, por ejemplo, las patentes US n° 5.731.168, n° 7.695.936; Ridgway et al., Prot. Eng. 9:617-621, 1996, y Cárter, J. Immunol. Meth. 248:7-15, 2001. Generalmente, el método implica introducir una protuberancia (“botón”) en la interfaz de un primer polipéptido y una cavidad correspondiente (“ojal”) en la interfaz de un segundo polipéptido, de manera que la protuberancia puede posicionarse en la cavidad de manera que estimule la formación de heterodímero y dificulte la formación de homodímero. Las protuberancias se construyen mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfaz del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo de tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensatorias de tamaño idéntico o similar al de las protuberancias en la interfaz del segundo polipéptido mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácido grandes por cadenas más pequeñas (por ejemplo de alanina o treonina). La introducción de dos residuos de cisterna en las posiciones S354 e Y349, respectivamente, resulta en la formación de un puente disulfuro entre las cadenas pesadas de anticuerpo en la región Fe, estabilizando adicionalmente el dímero (Cárter, J. Immunol. Methods 248:7-15, 2001).

Una “sustitución” de aminoácido se refiere a que se sustituye en un polipéptido un aminoácido por otro aminoácido. En una realización, se sustituye un aminoácido por otro aminoácido que presenta propiedades estructurales y/o químicas similares, por ejemplo sustituciones conservadoras de aminoácidos. Pueden realizarse sustituciones “conservadoras” de aminoácidos basándose en la similitud de polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; entre los aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoácidos cargados positivamente (básicos) se incluyen arginina, Usina e histidina, y entre los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones no conservadoras implican intercambiar un miembro de una de dichas clases por uno de otra clase. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos también pueden resultar en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que presenta propiedades estructurales y/o químicas diferentes, por ejemplo la sustitución de un aminoácido de un grupo (por ejemplo polar) por otro aminoácido de un grupo diferente (por ejemplo básico). Pueden generarse sustituciones de aminoácidos utilizando métodos genéticos o químicos bien conocidos de la téenica. Entre los métodos genéticos pueden incluirse la mutagénesis sitio-dirigida, la PCR, la síntesis génica y similares. Se contempla que también puedan resultar útiles métodos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido mediante métodos diferentes de la manipulación genética, tales como la modificación química. En la presente memoria pueden utilizarse diferentes denominaciones para indicar la misma sustitución de aminoácidos. Por ejemplo, una sustitución de prolina en la posición 329 de la cadena pesada de inmunoglobulina por glicina puede indicarse como 329G, G329, G32 , P329G o Pro329Gly.

“La expresión “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. La alineación con fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede realizarse de diversas maneras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El experto en la materia podrá determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines de la presente memoria, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos generados utilizando el programa informático de comparación de secuencias llamado ALIGN-2. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado con la documentación para usuario en el U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde se encuentra registrado con el n° TXU510087 del U.S. Copyright Office. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente de Genentech Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían. En la situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula del modo siguiente: 100 veces la fracción X/Y en la que X es el número de residuos aminoácidos puntuados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de este programa de A y B, y en la que Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se aprecia que, en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A frente a B no es igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B frente a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente memoria se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.

"Polinucleótido” o “ácido nucleico” tal como se utilizan intercambiablemente en la presente memoria, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por una ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Una secuencia de nucleótidos puede interrumpirse con componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede comprender una o más modificaciones realizadas después de la síntesis, tales como la conjugación con un mareaje. Un ácido nucleico o polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos por lo menos, por ejemplo, idéntica al 95% a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se refiere a que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleótida puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que presente una secuencia de nucleótidos idéntica por lo menos al 95% a uan secuencia de nucleótidos de referencia, puede delecionarse o sustituirse hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia por otro nucleótido, o pueden insertarse varios nucleótidos del total de nucleótidos en la secuencia de referencia en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuenci de referencia pueden producirse en las posiciones 5 '-terminales o 3'- terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier posición entre dichas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En la práctica, puede determinarse si cualquier secuencia polinucleótida particular es identica por lo menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos, tales como los comentados anteriormente para los polipéptidos (por ejemplo ALIGN-2).

El término “vector”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácidos nucleicos capaz de propagar otro ácido nucleico al que se encuentra unido. El término incluye el vector en forma de estructura de ácidos nucleicos autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que ha sido introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se encuentran ligados operablemente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión".

Las expresiones "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo de células huésped" se utilizan intercambiablemente y se refieren a células en las que se ha introducido un ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de dichas células. Entre las células huésped se incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma con independencia del número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en su contenido de ácidos nucleicos a una célula parental, pero puede contener mutaciones. La progenie mutante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado o selección de entre las células originalmente transformadas se encuentra incluida en la presente memoria. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que puede utilizarse para generar las proteínas de fusión de la presente invención. Entre las células huésped se incluyen los cultivos de células, por ejemplo los cultivos de células de mamífero, tales como las células CHO, las células BHK, las células NSO, las células SP2/0, las células de mieloma YO, las células de mieloma de ratón P3X63, las células PER, las células PER.C6 ó las células de hibridoma, las células de levadura, las células de insecto y las células vegetales, entre otras, aunque también las células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o cultivo de tejido de planta o animal.

Una “cantidad efectiva” de un agente se refiere a la cantidad que resulta necesaria para dar lugar a un cambio fisiológico en la célula o tejido en el que se administra.

Una “cantidad terapéuticamnte efectiva” de un agente, por ejemplo de una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad que resulta efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente elimina, reduce, retrasa, minimiza o evita, por ejemplo, los efectos adversos de una enfermedad.

Un “individuo” o “sujeto” es un mamífero. Entre los mamíferos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, animales domesticados (por ejemplo vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo ratones y ratas). En particular el individuo o sujeto es un ser humano.

La expresión “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma resulte efectiva, y que no contiene componentes adicionales que resulten inaceptablemente tóxicos para un sujeto en el que se administre la formulación.

Un “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, aparte de un ingrediente activo, que no resulta tóxico para el sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, aunque sin limitación, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” (y las variaciones gramaticales del mismo tales como “tratar” o “tratando”) se refiere a la intervención clínica en un intento para alterar el curso natural de una enfermedad en el individuo bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la prevención de la aparición o de la recurrencia de una enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la reducción de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de enfermedad, y la remisión o mejora del pronóstico. En algunas realizaciones, se utilizan anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para enlentecer el avance de la misma.

La expresión “enfermedad autoinmunológica” se refiere a una enfermedad o trastorno no maligno que aparece en los propios tejidos de un individuo y está dirigido contra los mismos. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunológicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, respuestas inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias de la piel, incluyendo soriasis y dermatitis (por ejemplo la dermatitis atópica); respuestas asociadas a la enfermedad intestinal inflamatoria (tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa); dermatitis; condiciones alérgicas, tales como el eccema y el asma; la artritis reumatoide; el lupus eritematoso sistémico (LSE) (incluyendo, aunque sin limitación, la nefritis del lupus y el lupus cutáneo); la diabetes mellitus (por ejemplo la diabetes mellitus de tipo 1 ó la diabetes mellitus dependiente de insulina); la esclerosis múltiple y la diabetes de aparición juvenil.

Proteína de fusión de la invención La invención proporciona nuevas proteínas de fusión de inmunoglobulina-IL-2 con propiedades particularmente ventajosas para la utilización en métodos terapéuticos tal como los descritos en la presente memoria.

En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende: (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación, e (ii) dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2).

En una realización, dicha proteína de fusión consiste esencialmente de una molécula de inmunoglobulina que comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación, dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2) y opcionalmente uno o más péptidos conectores.

Tal como se muestra en los Ejemplos, una proteína de fusión que comprende dos moléculas de IL-2 inesperadamente proporciona una eficacia y selectividad mucho mejores en la activación de las células T reguladoras, en comparación con una proteína de fusión correspondiente que comprenda una sola molécula de IL-2.

En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina de clase IgG, particularmente una molécula de inmunoglobulina de la subclase IgGj. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina humana, es decir, comprende regiones variables y constantes totalmente humanas. La secuencia de una región constante de IgG humana ejemplar se muestra en SEC ID n° 8. Una molécula de inmunoglobulina de clase IgG comprende: (i) dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, comprendiendo cada una, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL), e (ii) dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, comprendiendo cada una, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3. Los últimos dos dominios forman parte de la región Fe de la molécula de inmunoglobulina. Las dos cadenas pesadas dimerizan en la región Fe.

En una realización de la proteína de fusión según la invención, cada una de dichas dos moléculas de IL-2 se fusiona en su aminoácido N-terminal con el aminoácido C-terminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina de dicha molécula de inmunoglobulina, opcionalmente mediante un péptido conector. La fusión de dos molécula de IL-2 (idénticas) con las cadenas pesadas de inmunoglobulina permite una producción simple de la proteína de fusión, evitando la formación de productos secundarios no deseados y evitando la necesidad de modificaciones que estimulan la heterodimerización de cadenas pesadas no idénticas, tal como una modificación de botón-en-ojal.

La fusión de las moléculas de IL-2 con una molécula de inmunoglobulina proporciona propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una vida media en suero prolongada (debido al recielado mediante unión a FcRn, y siendo el tamaño molecular muy superior al umbral para la filtración renal), en comparación con IL-2 libre (no fusionado). Además, la presencia de una molécula de inmunoglobulina también permite la purificación simple de proteínas de fusión mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína A. Sin embargo, simultáneamente, la presencia de una molécula de inmunoglobulina, concretamente la región Fe de una molécula de inmunoglobulina, puede conducir al reconocimiento no deseable de la proteína de fusión por células que expresan receptores de Fe y no por las células preferentes portadoras de receptores de IL-2. Además, el acoplamiento de los receptores de Fe puede conducir a la liberación de citoquinas (proinflamatorias) y a la activación no deseada de diversas células inmunológicas diferentes de las células T reguladoras. Por lo tanto, dicha molécula de inmunoglobulina comprendida en la proteína de fusión de la invención comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe, en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación. En una realización específica, dicho receptor de Fe es un receptor de Fcy, particularmente un receptor de Fcy humano. La afinidad de unión para los receptores de Fe puede determinarse fácilmente mediante, por ejemplo, ELISA, o mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando instrumentación estándar, tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y receptores de Fe tales como los que pueden obtenerse mediante expresión recombinante. A continuación se describen realizaciones ilustrativas y ejemplares específicas para la medición de la afinidad de unión. Según una realización, la afinidad de unión para un receptor de Fe se mide mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un aparato BIACORE® TI 00 (GE Healthcare) a 25°C con ligando (receptor de Fe) inmovilizado sobre chips CM5. Brevemente, se activaron chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con hidrocloruro de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se diluyó ligando recombinante con acetato sódico 10 mM, pH 5,5, a una concentración de entre 0,5 y 30 mg/ml, antes de inyectar a un caudal de 10 ml/minuto para conseguir aproximadamente entre 100 y 5.000 unidades de respuesta (UR) de protema acoplada. Tras la inyección del ligando, se inyectó etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de tres a cinco veces de anticuerpo (intervalo de ~0,01 nM a 300 nM) en HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,05%, pH 7,4) a 25°C a un caudal de aproximadamente 30 a 50 ml/min. Se calcularon las tasas de asociación (kon) y de disociación (koñ) utilizando un modelo de unión de Langmuir simple uno a uno (software de evaluación de BIACORE® versión 1.1.1) mediante ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante del equilibrio de disociación (KD) como la proporción koff/kon. Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881, 1999. Alternativamente, puede evaluarse la afinidad de unión de anticuerpos para receptores de Fe puede evaluarse utilizando líneas celulares que es conocido que expresan receptores de Fe particulares, tales como células NK que expresan receptor FcylIIa.

En una realización, la modificación comprende una o más mutaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de unión de la inmunoglobulina para un receptor de Fe. En una realización, la mutación de aminoácido es una sustitución de aminoácido. Típicamente, se encuentra presente en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina la misma o mismas mutaciones de aminoácidos. En una realización, dicha mutación de aminoácidos reduce la afinidad de unión de la inmunoglobulina para el receptor de Fe por lo menos en 2 veces, por lo menos en 5 veces o por lo menos en 10 veces. En realizaciones en las que hay más de una mutación de aminoácido que reduce la afinidad de unión de la inmunoglobulina para el receptor de Fe, la combinación de dichas mutaciones de aminoácidos puede reducir la afinidad de unión de la inmunoglobulina para el receptor de Fe en por lo menos 10 veces, en por lo menos 20 veces o incluso en por lo menos 50 veces. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina muestra menos de 20%, particularmente menos de 10%, más particularmente menos de 5% de la afinidad de unión para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación.

En una realización, dicho receptor de Fe es un receptor de Fe activador. En una realización específica, dicho receptor de Fe se selecciona de entre el grupo de FcyRIIIa (CDlóa), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32) y FccxRI (CD89). En una realización específica, el receptor de Fe es un receptor de Fcy, más concretamente un receptor FcyRIIIa, FcyRI ó FcRIIa. Preferentemente, la afinidad de unión a cada uno de dichos receptores se encuentra reducida. En una realización todavía más específica, dicho receptor de Fe es FcylIIa, particularmente FcylIIa humano. En algunas realizaciones, la afinidad de unión a un componente complemento, específicamente afinidad de unión para Clq, también se encuentra reducida. En una realización, la afinidad de unión al receptor neonatal de Fe (FcRn) no se encuentra reducida. Un nivel de unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para dicho receptor, se consigue en el caso de que la molécula de inmunoglobulina muestre una afinidad de unión superior a aproximadamente 70% de una forma no modificada de la molécula de inmunoglobulina para FcRn. Las moléculas de inmunoglobulina comprendidas en las proteínas de fusión de la invención pueden mostrar más de aproximadamente 80% e incluso más de aproximadamente 90% de dicha afinidad.

En una realización, dicha modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe se encuentra en la región Fe, particularmente la región CH2 de la molécula de inmunoglobulina. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una sustitución de aminoácido en la posición 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización más específica, dicha sustitución de aminoácido es P329A o P329G, particularmente P329G. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 234 y 235 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización específica, dichas sustituciones de aminoácidos son L234A y L235A (LALA). En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una sustitución de aminoácido en la posición 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de anticuerpo y una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada de entre las posiciones 228, 233, 234, 235, 297 y 331 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización más específica, la sustitución de aminoácido adicional es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En una realización particular, dicha molécula de inmunoglobulina comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones P329, L234 y L235 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización más particular, dicha molécula de inmunoglobulina comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (LALA P329G) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. Esta combinación de sustituciones de aminoácidos anula de manera particularmente eficiente la unión de receptores de Fcy de una inmunoglobulina de clase IgG humana, tal como se indica en la publicación PCT n° W02012/130831, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad. La publicación PCT n° WO2012/130831 tambien describe métodos para preparar dicha inmunoglobulina modificada y métodos para determinar sus propiedades, tales como la unión de receptores de Fe o las funciones efectoras.

Pueden prepararse inmunoglobulinas que comprenden modificaciones en las cadenas pesadas de inmunoglobulina mediante la deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos utilizando métodos genéticos o químicos bien conocidos de la téenica. Entre los métodos genéticos pueden incluirse la mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, la PCR, la síntesis génica y similares. La corrección de los cambios de nucleótidos puede verificarse mediante, por ejemplo, secuenciación.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos que comprenden modificaciones que reducen la unión de receptores de Fe generalmente presentan funciones efectoras reducidas, particularmente una ADCC reducida, en comparación con las inmunoglobulinas o anticuerpos no modificados correspondientes. Por lo tanto, en una realización, dicha modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina a un receptor de Fe reduce la función efectora de la molécula de inmunoglobulina. En una realización específica, dicha función efectora es la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). En una realización, se reduce la ADCC a menos de 20% de la ADCC inducida por una molécula de inmunoglobulina correspondiente sin dicha modificación. La función efectora de una inmunoglobulina o anticuerpo puede medirse mediante métodos conocidos de la técnica. Se describen ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en la patente US n° 5.500.362; Hellstrom et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986, y Hellstrom et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; patente US n° 5.821.337; Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987. Alternativamente, pueden utilizarse métodos de ensayo no radioactivos (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA), y un ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Entre las células efectoras útiles para dichos ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, puede evaluarse la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el dado a conocer en Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998. En algunas realizaciones, también se reduce la unión de la molécula de inmunoglobulina a un componente del complemento, específicamente a Clq. De acuerdo con lo anterior, también puede reducirse la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Pueden llevarse a cabo ensayos de unión de Clq para determinar si la inmunoglobulina es capaz de unirse a Clq y si, por lo tanto, presenta actividad de CDC. Ver, por ejemplo, los ELISA de unión de Clq y C3c en en los documentos n° W02006/029879 y n° W02005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163, 1996; Cragg et al, Blood 101:1045-1052, 2003, y Cragg y Glennie, Blood 103:2738-2743, 2004).

Además de las moléculas de inmunoglobulina indicadas anteriormente en la presente memoria y en la publicación PCT n° WO2012/130831, las inmunoglobulinas con unión a receptor de Fe y/o función efectora reducidas, también se incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fe n° 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente US n° 6.737.056). Entre dichos Fe mutantes se incluyen los Fe mutantes con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoácidas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo la Fe muíante denominada “DANA”, con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente US n° 7.332.581).

Las inmunoglobulinas de subclase IgG4 muestran una afinidad de unión reducida para los receptores de Fe y funciones efectoras reducidas en comparación con las inmunoglobulinas IgG . Por lo tanto, en algunas realizaciones, dicha molécula de inmunoglobulina comprendida en la proteína de fusión de la invención es una inmunoglobulina de subclase IgG4, particularmente una inmunoglobulina de subclase IgG4 humana. En una realización, dicha inmunoglobulina de subclase IgG4 comprende sustituciones de aminoácidos en la región Fe, en la posición S228, concretamente la sustitución de aminoácidos S228P. Para reducir adiconalmente su afinidad de unión a un receptor de Fe y/o su función efectora, en una realización, dicha inmunoglobulina de subclase IgG4 comprende una sustitución de aminoácido en la posición L235, concretamente la sustitución de aminoácidos L235E. En otra realización, dicha inmunoglobulina de subclase IgG4 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición P329, concretamente la sustitución de aminoácidos P329G. En una realización particular, dicha inmunoglobulina de subclase IgG4 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones S228, L235 y P329, concretamente las sustituciones de aminoácidos S228P, L235E y P329G. Dichas inmunoglobulinas de subclase IgG4 modificadas y sus propiedades de unión de receptor de Fcy se describen en la publicación PCT n° WO2012/ 130831, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad.

En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es capaz de unión específica a un antígeno. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina no es capaz de unión específica a un antígeno, particularmente no es capaz de unión específica a un antígeno humano. La ausencia de unión específica de dicha molécula de inmunoglobulina a un antígeno (es decir, la ausencia de cualquier unión que pueda discriminarse de la interacción no específica) puede determinarse mediante, por ejemplo, ELIS o resonancia de plasmón superficial tal como se indica en la presente memoria. Dicha molécula de inmunoglobulina resulta particularmente útil, por ejemplo para incrementar la vida media en suero de la proteína de fusión, en la que no se desea el reconocimiento de un tejido particular.

En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena pesada basada en la secuencia de línea germinal Vh3-23 humana. En una realización específica, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es idéntica por lo menos al 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 9. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena ligera basada en la secuencia de línea germinal Vk3-20 humana. En una realización específica, dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es idéntica por lo menos al 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% a la secuencia SEC ID n° 11. En una realización todavía más específica, dicha molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEC ID n° 9 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 11. Las moléculas de inmunoglobulina que comprenden dichas secuencias de región variable no son capaces de unión específica a un antígeno, particularmente a un antígeno humano. No se unen a tejidos normales, así como a PBMC, no presentan polirreactividad y no muestran acumulación no específica in vivo según las imágenes (datos no mostrados). Las secuencias de región variable se basan enteramente en secuencias de línea germinal humana, con la excepción de la CDR3 de cadena pesada, en la que se ha introducido una secuencia GSG para generar una inmunoglobulina no ligante.

En una realización, dichas moléculas de IL-2 son moléculas de IL-2 de tipo salvaje. En una realización, dichas moléculas de IL-2 son moléculas de IL-2 humanas. En una realización específica, dichas moléculas de IL-2 comprenden la secuencia SEC ID n° 1 (IL-2 humana nativa).

En una realización, dicha molécula de IL-2 comprende una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente al residuo 125 de la IL-2 humana. En una realización, dicha sustitución de aminoácidos es C125A. En una realización específica, dicha molécula de IL-2 comprende la secuencia SEC ID n° 3 (IL-2 humana con la sustitución de aminoácidos C125A). Alternativamente, la cisteína en la posición 125 puede sustituirse por otro aminoácido neutro, tal como serina, treonina o valina, rindiendo IL-2 C125S, IL-2 C125T ó IL-2 C125V, respectivamente, tal como se indica en la patente US n° 4.518.584. Tal como se indica en esta patente, también puede delecionarse el residuo N-terminal alanina de IL-2, rindiendo mutantes tales como des-Al C125S ó des-Al C125A. Alternativamente, o conjuntamente, la molécula de IL-2 puede incluir una mutación en la que la metionina, normalmente presente en la posición 104 de la IL-2 humana de tipo salvaje se sustituye por un aminoácido neutro, tal como alanina (ver la patente US n° 5.206.344). Dichas modificaciones en la IL-2 humana pueden proporcionar ventajas adicionales, tales como una expresión o una estabilidad incrementadas.

Las moléculas de IL-2 comprendidas en la proteína de fusión de la invención también pueden ser moléculas de IL-2 no glucosiladas. Por ejemplo, la eliminación del sitio de O-glucosilación de la molécula de IL-2 resulta en un producto más homogéneo al expresarse la proteína de fusión en células de mamífero tales como las células CHO o HEK. De esta manera, en determinadas realizaciones, la molécula de IL-2 comprende una modificación que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 correspondiente al residuo 3 de la IL-2 humana. En una realización, dicha modificación que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de la IL-2 humana es una sustitución de aminoácidos. Entre las sustituciones ejemplares de aminoácidos se incluyen T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K y T3P. En una realización específica, dicha modificación es la sustitución de aminoácidos T3A.

En una realización, la proteína de fusión es capaz de unirse a receptores de I?-2bg con una constante de afinidad (KD) inferior a 10 nM, particularmente inferior a 3 nM, medida mediante SPR a 25°C. En una realización específica, dicho receptor de I?-2bg es un receptor de I?-2bg humano. En una realización, la proteína de fusión es capaz de unirse a receptores de IL-2a con una constante de afinidad (KD) inferior a 100 nM, particularmente inferior a 20 nM, medida mediante SPR a 25°C. En una realización específica, dicho receptor de IL-2a es un receptor de IL-2a humano. En la presente memoria se describe un método para medir mediante SPR la afinidad de unión para IL-2fiy o para el receptor de IL-2a. Según una realización, la afinidad de unión (KD) se mide mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un aparato BIACORE® TI 00 (GE Healthcare) a 25°C con receptores de Fe inmovilizados sobre chips CM5. Brevemente, se activaron chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con hidrocloruro de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se diluyó receptor de IL-2 recombinante con acetato sódico 10 mM, pH 5,5, a una concentración de entre 0,5 y 30 mg/ml, antes de inyectar a un caudal de 10 ml/minuto para conseguir aproximadamente entre 200 y 1.000 (para IL-2Ra) ó 500 a 3.000 (para el heterodímero IL-2RPy) unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección del receptor de IL-2, se inyectó etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de tres veces de proteína de fusión (intervalo de ~3 nM a 300 nM) en HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,05%, pH 7,4) a 25°C a un caudal de aproximadamente 30 ml/min. Se calcularon las tasas de asociación (kon) y de disociación (k0ff) utilizando un modelo de unión de Langmuir simple uno a uno (software de evaluación de BIACORE® versión 1.1.1) mediante ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante del equilibrio de disociación (¾) como la proporción l kon· Ver, por ejemplo, Chen et al, J. Mol. Biol.293:865-881, 1999.

En un aspecto particular, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende: (i) una molécula de inmunoglobulina de subclase IgGl que comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (numeración EU) en las cadenas pesadas de inmunoglobulina, e (ii) dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2), cada una fusionada con su aminoácido N-terminal con el aminoácido C-terminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina mediante un péptido conector. En una realización, dicha molécula de inmunoglobulina y dichas moléculas de IL-2 son humanas. En una realización específica, dicha molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEC ID n° 9 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 11. En una realización específica adicional, cada una de dichas moléculas de IL-2 comprende la secuencia SEC ID n° 3. En una realización todavía más específica, dicha proteína de fusión comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 17, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 19.

Tal como se muestra en los Ejemplos, la proteína de fusión de la invención puede utilizarse para activar selectivamente las células T reguladoras (es decir, esencialmente sin activación concomitante de otros subgrupos de células T y/o células NK). De esta manera, la invención proporciona particularmente la proteína de fusión para la utilización en la activación selectiva de las células T reguladoras in vitro o in vivo. En una realización, dicha utilización comprende poner en contacto células T reguladoras con dicha proteína de fusión in vitro o in vivo. En una realización, dicha utilización comprende además poner en contacto otras células T (no reguladoras) con dicha proteína de fusión. En una realización, dicha utilización es in vitro y dicha proteína de fusión se utiliza a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml o menos, particularmente de aproximadamente 0,1 ng/ml o menos. En otra realización, dicha utilización es in vivo y dicha proteína de fusión se utiliza a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal o menos, particularmente de aproximadamente 12 pg/kg de peso corporal o menos, más particularmente de aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal o menos (en el que “peso corporal” se refiere al peso corporal del individuo en el que se administra la proteína de fusión).

La invención proporciona además un método para la activación selectiva de las células T reguladoras in vitro o in vivo, que comprende poner en contacto dichas células T reguladoras con la proteína de fusión de la invención. En una realización, dicho método comprende además poner en contacto otras células T (no reguladoras) con dicha proteína de fusión. En una realización, dicha activación comprende la inducción de la proliferación y/o inducción de la señalización de receptores de IL-2. En una realización, dicho método es in vitro y dicha proteína de fusión se utiliza a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml o menos, particularmente de aproximadamente 0,1 ng/ml o menos. En otra realización, dicho método es in vivo y dicha proteína de fusión se utiliza a una dosis de aproximadamente 20 pg/kg de peso corporal o menos, particularmente de aproximadamente 12 pg/kg de peso corporal o menos, más particularmente de aproximadamente 6 pg/kg de peso corporal o menos (en el que “peso corporal” se refiere al peso corporal del individuo en el que se administra la proteína de fusión).

Según determinadas realizaciones de la utilización o método descrito en los párrafos anteriores, dicha activación comprende la inducción de la proliferación de células T reguladoras y/o la inducción de la señalización de receptores de IL-2 en las células T reguladoras. La inducción de la proliferación puede medirse mediante, por ejemplo, la detección del marcador de proliferación intracelular Ki-67, tal como se describe en los Ejemplos. En una realización, la proliferación de las células T reguladoras activadas por la proteína de fusión de la invención se incrementa en por lo menos aproximadamente 1,5 veces, en por lo menos aproximadamente 2 veces o en por lo menos aproximadamente 3 veces, en comparación con la proliferación de células T reguladoras no activadas. En una realización, la proliferación de otras células T (no reguladoras) y/o células NK se pone en contacto con la proteína de fusión de la invención se incrementa en menos de aproximadamente 1,5 veces, en menos de aproximadamente 1,2 veces o en menos de aproximadamente 1,1 veces, en comparación con la proliferación de células correspondientes no puestas en contacto con dicha proteína de fusión. La inducción de la señalización de receptores de IL-2 puede medirse mediante, por ejemplo, la detección de STAT5 fosforilado, tal como se describe en los Ejemplos. En una realización, la señalización de receptores de IL-2 en las células T reguladoras activadas por la proteína de fusión de la invención se incrementa en por lo menos aproximadamente 1,5 veces, en por lo menos aproximadamente 2 veces o en por lo menos aproximadamente 3 veces o en por lo menos aproximadamente 5 veces, en comparación con la señalización de receptores de IL-2 en células T reguladoras no activadas. En una realización, la señalización de receptores de IL-2 en otras células T (no reguladoras) y/o células NK se pone en contacto con la proteína de fusión de la invención se incrementa en menos de aproximadamente 1,5 veces, o en menos de aproximadamente 1,2 veces o en menos de aproximadamente 1,1 veces, en comparación con la señalización de receptores de IL-2 en células correspondientes no puestas en contacto con dicha proteína de fusión.

Polinucleótidos La invención proporciona además polinucleótidos codificantes de una fusión tal como se indica en la presente memoria o un fragmento de la misma.

Entre los polinucléotidos de la invención se incluyen aquellos que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticos a las secuencias indicadas en SEC ID n° 2, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 18 y 20, incluyendo fragmentos funcionales o variantes de los mismos.

Los polinucleótidos codificantes de las proteínas de fusión de la invención pueden expresarse en forma de un único polinucleótido que codifica la proteína de fusión entera o como múltiples (por ejemplo dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por los polinucleótidos que se coexpresan pueden asociarse mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios, formando una proteína de fusión funcional. Por ejemplo, la parte de cadena ligera de una inmunoglobulina puede encontrarse codificada en un polinucleótido separado de la parte de cadena pesada de la inmunoglobulina. Al coexpresarse, los polipéptidos de cadena pesada se asocian con los polipéptidos de cadena ligera, formando la inmunoglobulina.

En una realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido codificante de una proteína de fusión de una molécula de inmunoglobulina y dos moléculas de IL-2, o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia d eregión variable tal como se muestra en SEC ID n° 9 ó 11. En otra realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido codificante de una proteína de fusión de una molécula de inmunoglobulina y dos moléculas de IL-2, o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica tal como se muestra en SEC ID n° 17 ó 19. En otra realización, la invención se refiere además a un polinucleótido codificante de una proteína de fusión de una molécula de inmunoglobulina y dos moléculas de IL-2, o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de ácidos nuclecios mostrada como SEC ID n° 2, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 18 ó 20. En otra realización, la invención se refiere a un polinucleótido codificante de una proteína de fusión de una molécula de inmunoglobulina y dos moléculas de IL-2, o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 9 ó 11. En otra realización, la invención se refiere a un polinucleótido codificante de una proteína de fusión de una molécula de inmunoglobulina y dos moléculas de IL-2, o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótid ocomprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 17 ó 19. La invención comprende un polinucleótido codificante de una proteína de fusión de una molécula de inmunoglobulina y dos moléculas de IL-2, o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica las secuencias de región variable de SEC ID n° 9 ó 11 con sustituciones conservadoras de aminoácidos. La invención comprende además un polinucleótido codificante de una proteína de fusión de una molécula de inmunoglobulina y dos moléculas de IL-2, o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica las secuencias polipeptídicas SEC ID n° 17 ó 19 con sustituciones conservadoras de aminoácidos.

En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otras realizaciones, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser de cadena sencilla o de doble cadena.

Metodos recombinantes Las proteínas de fusión de la invención pueden obtenerse mediante, por ejemplo, síntesis peptídica en estado sólido (por ejemplo la síntesis en fase sólida de Merrifíeld) o mediante producción recombinante. Para la producción recombinante se aísla uno o más polinucleótidos codificantes de la proteína de fusión (fragmento), por ejemplo tal como se ha descrito anteriormente, y se aísla y se inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Dicho polinucleótido puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales. En una realización, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. Pueden utilizarse métodos bien conocidos por el experto en la materia, para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una proteína de fusión (fragmento), conjuntamente con señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Entre estos métodos se incluyen las téenicas de ADN recombinante, las técnicas sintéticas y la recombinación in v/vo/recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wilcy Interscience, N.Y., 1989. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido o virus o puede ser un fragmento de ácidos nucleicos. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que se clona el polinucleótido codificante de la proteína de fusión (fragmento) (es decir, la región codificante) en asociación operable con un promotor y/o otros elementos de control de la transcripción o traducción. Tal como se utiliza en la presente memoria, una “región codificante” es una porción de ácidos nucleicos que consiste de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un “codón de parada” (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, en caso de encontrarse presente, aunque cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión ribosómica, terminadores de transcripción, intrones, regiones 5’ y 3’ no traducidas, y similares, no son parte de una región codificante. Pueden encontrarse presentes dos o más regiones codificantes en un único constructo polinucleótido, por ejemplo en un único vector, o en constructos polinucleótidos separados, por ejemplo en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener un única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo un vector de la presente invención puede codificar uno o más polinucleótidos que se separan post-traduccional o co-traduccionalmente formando proteínas finales mediante corte proteolítico. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas con un polinucleótido codificante de la proteína de fusión (fragmento) de la invención, o una variante o derivado de la misma. Entre las regiones codificantes heterólogas se incluyen, aunque sin limitarse a los mismos, elementos o motivos especializados, tales como un péptido de señal secretoria o un dominio funcional heterólogo. Una asociación operable existe en el caso de que una región codificante de un producto génico, por ejemplo un polipéptido, se encuentre asociada a una o más secuencias reguladoras de manera que la expresión del producto génico se encuentra bajo la influencia o control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a la misma) se encuentran “operablemente asociados” en el caso de que la inducción de la función promotora resulte en la transcripción de ARNm codificante del producto génico deseado y en el caso de que la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiera con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico o con la capacidad del ADN molde de ser transcrito. De esta manera, una región promotora se encontrará operablemente asociada a un ácido nucleico codificante de un polipéptido en el caso de que el promotor pueda llevar a cabo la transcripción de dicho ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de un tipo celular, que dirige la transcripción sustancial del ADN únicamente en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, aparte de un promotor, por ejemplo intensificadores, operadores, represores y señales de terminación de transcripción, pueden asociarse operablemente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de un tipo celular. Se dan a conocer en la presente memoria promotores y otras regiones de control transcripcional adecuados. El experto en la materia conocerá una diversidad de regiones de control de la transcripción. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en las células de vertebrado, tales como, aunque sin limitación, segmentos promotores e intensificadores de citomegalovirus (por ejemplo el promotor temprano inmediato, conjuntamente con el intrón A), el virus 40 del simio (por ejemplo el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Entre otras regiones de control de la transcripción se incluyen aquéllas derivadas de genes de vertebrado, tales como la actina, la proteína de choque térmico, la hormona de crecimiento bovino y la a-globina, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en las células eucarióticas. Entre las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales se incluyen promotores e intensifícadores específicos de tejido, así como promotores inducibles (por ejemplo promotores inducibles por tetracielinas). De manera similar, el experto ordinario en la materia conocerá una diversidad de elementos de control de la traducción. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, sitios de unión ribosómica, codones de inicio y terminación de traducción y elementos derivados de sistemas víricos (particularmente un sitio interno de entrada ribosómica, o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros elementos, tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica, tales como repeticiones terminales largas (LTR) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (ITR) asociadas a adenovirus (AAV).

Las regiones polinucleótidas y de ácidos nucleicos de la presente invención pueden encontrarse asociadas a regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretorios o de señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, en el caso de que se desee la secreción de la fusión, puede introducirse ADN codificante de una secuencia de señal cadena arriba del ácido nucleico codificante de una proteína de fusión de la invención o de un fragmento de la misma. Según la hipótesis de la señal, las proeínas secretadas por las células de mamífero presentan una secuencia de péptido de señal o de líder secretorio que se corta a partir de la proteína madura tras iniciar la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplasmático rugoso. El experto ordinario en la materia conocerá que los polipéptido secretados por las células de vertebrado generalmente presentan un péptido de señal fusionado con el extremo N-terminal del polipéptido, que se corta a partir del polipéptido traducido, produciendo una forma secretada o “madura” del polipéptido. En determinadas realizaciones, se utiliza el péptido de señal nativo, por ejemplo un péptido de señal de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de dicha secuencia que conserve la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que se encuentra operablemente asociado al mismo. Alternativamente, puede utilizarse un péptido de señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede sustituirse por la secuencia líder del activador del plasminógeno tisular humano (TPA) o la b-glucuronidasa de ratón. Se proporcionan secuencias ejemplares de aminoácidos y polinucleótidas de péptidos de señal secretoria en SEC ID n° 39 a n° 47.

El ADN codificante de una secuencia de proteína corta que podría utilizarse para facilitar la purificación posterior (por ejemplo una etiqueta de histidinas) o asistir en el mareaje de la proteína de fusión puede incluirse en el interior o en los extremos del polinucleótido codificante de la proteína de fusión (fragmento).

En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinadas realizaciones, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, indicadas en la presente memoria en relación a polinucleótidos y vectores, respectivamente. En una de dichas realizaciones, una célula huésped comprende (por ejemplo ha sido transformada o transfectada con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) una proteína de fusión de la invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que puede manipularse para generar las proteínas de fusión de la invención o fragmentos de las mismas. Las células huésped adecuadas para replicar y dar soporte a la expresión de proteínas de fusión son bien conocidas de la téenica. Dichas células pueden transfectarse o transducirse como resulte apropiado con el vector de expresión particular y cultivarse grandes cantidades de células que contienen vector para la siembra de fermentadores a gran escala con el fin de obtener cantidades suficientes de la proteína de fusión para aplicaciones clínicas. Entre las células huésped adecuadas se incluyen microorganismos procarióticos, tales como E. coli, o diversas células eucarióticas, tales como células ováricas de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, pueden producirse polipéptidos en bacterias en particular en el caso de que la glucosilación no resulte necesaria. Tras la expresión, el polipéptido puede aislarse a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucarióticos, tales como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes de polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación han sido “humanizadas”, resultando en la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Ver Gemgross, Nat. Biotech. 22:1409-1414, 2004, y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215, 2006. También se derivan células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) a partir de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden utilizarse conjuntamente con células de insecto, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como huéspedes. Ver, por ejemplo, las patentes US n° 5.959.177, n° 6.040.498, n° 6.420.548, n° 7.125.978 y n° 6.417.429 (que describe la teenología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También pueden utilizarse células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden resultar útiles líneas celulares de mamífero adaptadas para el crecimiento en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles la línea CV1 renal de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293T, tal como se describe en, por ejemplo, Graham et al, J. Gen. Virol. 36:59, 1977), las células renales de hámster neonato (BHK), las células de sertoli de ratón (células TM4, tal como se describe en, por ejemplo, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), las células renales de mono (CV1), las células renales de mono verde africano (VERO-76), las células de carcinoma cervical humano (HELA), las células renales caninas (MDCK), las células hepáticas de rata búfalo (BRL 3 A), las células pulmonares humanas (W138), las células hepáticas humanas (Hep G2), las células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), las células TRI (tal como se describe en, por ejemplo, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982), las células MRC 5 y las células FS4. Entre otras líneas de células huésped de mamífero útiles se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células CHO dhff (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), y las líneas celulares de mieloma, tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas; ver, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, editor, Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003). 255-268 (2003). Entre las células huésped se incluyen las células en cultivo, por ejemplo las células en cultivo de mamífero, las células de levadura, las células de insecto, las células bacterianas y las células vegetales, entre otras, aunque también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en cultivo. En una realización, la célula huésped es una célula eucariótica, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula renal embrionaria humana (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo una célula YO, NSO ó Sp20).

Son conocidas de la téenica tecnología estándares para expresar genes foráneos en dichos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o ligera de una inmunoglobulina, pueden manipularse de manera que expresen además la otra de las cadenas de anticuerpo, de manera que el producto expresado es una inmunoglobulina que presenta tanto una cadena pesada como una cadena ligera.

En una realización, se proporciona un método para producir una proteína de fusión según la invención, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido codificante de la proteína de fusión, tal como se proporciona en la presente memoria, bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión, y recuperar la proteína de fusión a partir de la célula huésped (o del medio de cultivo de la célula huésped).

En las proteínas de fusión de la invención, los componentes (molécula de inmunoglobulina y molécula de IL-2) se fusionan genéticamente entre sí. Las proteínas de fusión pueden diseñarse de manera que sus componentes se encuentren fusionados directamente entre sí o indirectamente mediante una secuencia conectora. La composición y longitud del conector puede determinarse según métodos bien conocidos de la técnica y pueden someterse a ensayo para comprobar su eficacia. También pueden incluirse secuencias adicionales para incorporar un sitio de corte para separar los componentes individuales de la proteína de fusión si se desea, por ejemplo una secuencia de reconocimiento de endopeptidasa.

En determinadas realizaciones, las proteínas de fusión de la invención comprenden por lo menos una región variable de inmunoglobulina capaz de unirse a antígenos. Las regiones variables pueden formar parte y derivarse de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los métodos para producir anticuerpo policlonales y monoclonales son bien conocidos de la téenica (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, “Antibodies, a laboratory manual”, Coid Spring Harbor Laboratory, 1988). Pueden construirse anticuerpos no naturales utilizando la síntesis peptídica en fase sólida, pueden producirse recombinantemente (por ejemplo tal como se describe en la patente US n° 4.186.567) o pueden obtenerse, por ejemplo, mediante cribado de bibliotecas combinatoriales que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.969.108, de McCafferty).

Puede utilizarse en la invención cualquier especie animal de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas no limitativas que resultan útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, de primate o humano. En el caso de que la proteína de fusión esté destinado al uso humano, puede utilizarse una forma quimérica de inmunoglobulina en la que las regiones constantes de la inmunoglobulina son de origen humano. También puede prepararse una forma humanizada o totalmente humana de la inmunoglobulina, siguiendo métodos bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.565.332, de Winter). La humanización puede llevarse a cabo mediante diversos métodos, incluyendo, aunque sin limitación, (a) la injertación de los CDR no humanos (por ejemplo de anticuerpo donante) en regiones de marco y constantes humanas (por ejemplo de anticuerpo receptor) con o sin retención de los residuos de marco críticos (por ejemplo aquellos que resultan importantes para conservan una buena afinidad de unión o funciones de anticuerpo), (b) la injertación de únicamente las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDR o a-CDR, los residuos críticos para la interacción de anticuerpo-antígeno) en las regiones de marco y constantes humanas, o (c) el trasplante de los dominios variables no humanos completos, aunque "enmascarándolos" con una sección de tipo humano mediante sustitución de los residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y métodos de preparación de los mismos se revisan en, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front Biosci 13:1619-1633, 2008, y se describen adicionalmente en, por ejemplo, Riechmann et al, Nature 332:323-329, 1988; Queen et al., Proc Nati Acad Sci USA 86:10029-10033, 1989; patente US n° 5.821.337, n° 7.527.791, n° 6.982.321 y n° 7.087.409; Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Morrison et al., Proc Nati Acad Sci 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv Immunol 44:65-92, 1988; Verhocyen et al., Science 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec Immun 31(3): 169-217, 1994; Kashmiri et al., Methods 36:25-34, 2005 (que describen la injertación de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28:489-498, 1991 (que describen la “resuperficialización”); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60, 2005 (que describen la “reorganización de las FR”); y Osboum et al., Methods 36:61-68, 2005, y Klimka et al, Br J Cáncer 83:252-260, 2000 (que describen la “selección guiada” a la reorganización de las FR). Las inmunoglobulinas particulares según la invención son inmunoglobulinas humanas. Pueden producirse anticuerpos humanos y regiones variables humanas utilizando diversas téenicas conocidas. Se describen de manera general anticuerpos humanos en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.5:368-74, 2001, y en Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459, 2008. Las regiones variables humanas pueden formar parte y derivarse a partir de anticuerpos monoclonales humanos preparados mediante el método del hibridoma (ver, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). Los anticuerpos humanos y las regiones variables humanas también pueden prepararse mediante la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al reto antigénico (ver, por ejemplo, Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125, 2005). Los anticuerpos humanos y las regiones variables humanas también pueden generarse mediante aislamiento de las secuencias de región variable de clon de Fv seleccionadas de entre bibliotecas de expresión fágica de origen humano (ver, por ejemplo, Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al, editor, Human Press, Totowa, NJ, 2001), y McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991). Los fagos típicamente expresan fragmentos de anticuerpos, en forma de fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o de fragmentos Fab.

En determinadas realizaciones, las inmunoglobulinas comprendidas en las proteínas de fusión de la presente invención se manipulan para que presenten una afinidad de unión mejorada siguiendo, por ejemplo, los métodos dados a conocer en la publicación PCT n° WO20 12/020006 (ver los Ejemplos referentes a la maduración de la afinidad) o la solicitud de patente US publicada n° 2004/0132066, el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria. La capacidad de las proteínas de fusión de la invención de unirse a un determinante antigénico específico puede medirse mediante un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) u otras téenicas que resultarán familiares para el experto en la materia, por ejemplo la técnica de resonancia del plasmón superficial (Liljeblad et al, Glyco J. 17:323-329, 2000) y ensayos de unión tradicionales (Heelcy, Endocr. Res. 28:217-229, 2002). Pueden utilizarse ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compita con un anticuerpo de referencia para la unión a un antígeno particular. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo un epítopo lineal o conformacional) que se une al anticuerpo de referencia. Se proporcionan métodos ejemplares detallados para el mapeado de un epítopo al que se une un anticuerpo, en Morris, “Epitope Mapping Protocols”, Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ), 1996. En un ensayo de competición ejemplar, el antígeno inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a ensayo para su capacidad de competir con el primer anticuerpo para la unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede encontrarse presente en un sobrenadante de hibridoma. A modo de control, se incubó antígeno inmovilizado en una solución que comprendía el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Tras la incubación bajo condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se eliminó el exceso de anticuerpo no unido y se midió la cantidad de mareaje asociado al antígeno inmovilizado. El hecho de que la cantidad de mareaje asociado al antígeno inmovilizado se encuentre sustancialmente reducida en la muestra de ensayo respecto a la muestra de control indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo para la unión al antígeno. Ver Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual capítulo 14 (Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY), 1988.

Pueden purificarse proteínas de fusión tal como se describe en la presente memoria, mediante téenicas conocidas, tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento, la cromatografía de intercambio iónico, la electroforesis en gel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de exclusión por tamaño, y similares. Las condiciones reales utilizadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofílicidad, etc., y resultarán evidentes para el experto en la materia. Para la purificación mediante cromatografía de afinidad, puede utilizarse un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une la proteína de fusión. Por ejemplo, para la purificación mediante cromatografía de afinidad de proteínas de fusión de la invención, puede utilizarse una matriz con proteína A o con proteína G. Pueden utilizarse la cromatografía secuencial de afinidad de proteína A o G y la cromatografía de exclusión por tamaño para aislar una proteína de fusión esencialmente tal como se describe en los Ejemplos. La pureza de la proteína de fusión puede determinarse mediante cualquiera de entre una diversidad de métodos analíticos bien conocidos, incluyendo la electroforesis en gel, la cromatografía líquida de alta presión y similares. Por ejemplo, se ha demostrado que las proteínas de fusión expresadas tal como se describe en los Ejemplos se encuentran intactas y correctamente ensambladas, tal como demuestra la SDS-PAGE reductora y no reductora (ver, por ejemplo, la figura 2A-2D).

Composiciones, formulaciones y vías de administración En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las proteínas de fusión proporcionadas en la presente memoria, por ejemplo para la utilización en cualquiera de los métodos terapéuticos, posteriormente. En una realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las proteínas de fusión proporcionadas en la presente memoria y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las proteínas de fusión proporcionadas en la presente memoria y por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente.

Se proporciona además un método para producir una proteína de fusión de la invención en una forma adecuada para la administración in vivo, comprendiendo el método: (a) obtener una proteína de fusión según la invención, y (b) formular la proteína de fusión con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable, de manera que se formula una proteína de fusión para la administración in vivo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más proteínas de fusión disueltas o dispersadas en un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéutica o farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que generalmente resultan no tóxicas para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, es decir, no provocan una reacción adversa, alérgica u otra reacción no deseada al administrarse en un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según corresponda. La preparación de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una proteína de fusión y opcionalmente un ingrediente activo adicional resultará conocida para el experto en la materia a la luz de la presente exposición, tal como ejemplifica Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, incorporada como referencia en la presente memoria. Además, para la administración animal (por ejemplo humana), se entenderá que las preparaciones deben satisfacer los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la oficina de estándares biológicos de la FDA o autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por ejemplo agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizadores de fármacos, polímeros, geles, ligantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, pigmentos, y materiales similares y combinaciones de los mismos, tal como conocerá el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, páginas 1289 a 1329, incorporada en la presente memoria como referencia). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se encuentra contemplada su utilización en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas La composición puede comprender diferentes tipos de portador, dependiendo de si debe administrarse en forma sólida, líquida o de aerosol, y de si debe ser estéril para vías de administración tales como la inyección. Las proteínas de fusión de la presente invención (y cualquier agente terapéutico adicional) pueden administrarse por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, mediante inhalación (por ejemplo inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada que baña las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones de lípidos (por ejemplo liposomas), o mediante cualquier método o cualquier combinación de los anteriormente indicados tal como conocerá el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, incorporada en la presente memoria como referencia). La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, es la más comúnmente utilizada para administrar moléculas de polipéptido, tales como las proteínas de fusión de la invención.

Entre las composiciones parenterales se incluyen aquéllas diseñadas para la administración mediante inyección, por ejemplo la inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para la inyección, las proteínas de fusión de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, las proteínas de fusión pueden encontrarse en forma de polvos para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril sin pirógenos, antes de la utilización. Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de las proteínas de fusión de la invención en la cantidad requerida en el solvente apropiado con otros diversos ingredientes indicados posteriormente, según resulte necesario. La esterilidad puede alcanzarse fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estéril. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los demás ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsión inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacío o las téenicas de secado por congelación, que rinden unos polvos del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado a esterilidad del mismo. El medio líquido convenientemente debe tamponarse en caso necesario y el diluyente líquido en primer lugar se convierte en isotónico previamente a la inyección con suficiente solución salina o glucosa. La composición debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse como mínimo a un nivel seguro, por ejemplo menos de 0,5 ng/mg de proteína. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitación, tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamónico, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes tales como metilparabén o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, taes como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetilcelulosa sódica, el sorbitol, el dextrano o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Además, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones para inyección aceitosas apropiadas. Entre los solventes o vehículos lipofílicos adecuados se incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintéticos, tales como “cleats” de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Los ingredientes activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas mediante, por ejemplo, téenicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración coloidal de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences (18a edición, MackPrinting Company, 1990). Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, encontrándose dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. En realizaciones particulares, puede inducirse la absorción prolongada de una composición inyectable mediante la utilización en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

Además de las composiciones indicadas anteriormente, las proteínas de fusión también pueden formularse en forma de preparación de depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, las proteínas de fusión pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo como una sal moderadamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención pueden prepararse mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, emulsificación, encapsulado, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que faciliten el procesamiento de las proteínas en preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación correcta depende de la vía de administración seleccionada.

Las proteínas de fusión pueden formularse en una composición en un ácido o base libre, o en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Entre ellas se incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo aquéllas formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos hidroclórico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como el ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en solventes acuosos y otros solventes próticos que las formas de base libre correspondientes.

Métodos y composiciones terapéuticos Puede utilizarse cualquiera de las proteínas de fusión proporcionadas en la presente memoria en métodos terapéuticos.

Para la utilización en métodos terapéuticos, las proteínas de fusión de la invención pueden formularse, dosificarse y administrarse de un modo consistente con las buenas prácticas médicas. Entre los factores a considerar en el presente contexto se incluyen el trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular bajo tratamiento, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por el profesional médico.

En un aspecto, se proporcionan proteínas de fusión de la invención para la utilización como medicamento. En aspectos adicionales, se proporcionan proteínas de fusión de la invención para la utilización en el tratamiento de enfermedades. En determinadas realizaciones, se proporcionan proteínas de fusión de la invención para la utilización en un método de tratamiento. En una realización, la invención proporciona una proteínas de fusión tal como se describe en la presente memoria para la utilización en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita del mismo. En determinadas realizaciones, la invención proporciona una proteínas de fusión para la utilización en un método de tratamiento de un individuo que presenta una enfermedad, que comprende administrar en el individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión. En determinadas realizaciones, la enfermedad que debe tratarse es una enfermedad autoinmunológica. Entre las enfermedades autoinmunológicas ejemplares se incluyen la diabetes de tipo 1, la soriasis, el asma, la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, el lupus eritematoso sistémico (LSE) y la esclerosis múltiple. En una realización, la enfermedad es el rechazo del trasplante o la enfermedad del injerto contra el huésped. En una realización particular, la enfermedad se selecciona de entre el grupo de la diabetes de tipo 1, la enfermedad de Crohn, LSE y esclerosis múltiple. En una realización más particular, la enfermedad es la diabetes de tipo 1. En otra realización particular, la enfermedad es la esclerosis múltiple. En realizaciones adicionales, la enfermedad es el asma, la fibrosis pulmonar o la enfermedad obstructiva pulmonar. En todavía otras realizaciones, la enfermedad es una enfermedad cardiovascular, particularmente la ateroesclerosis. En determinadas realizaciones, el método comprende además administrar en el individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo un agente inmunosupresor en el caso de que la enfermedad que debe tratarse sea una enfermedad autoinmunológica. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona para la utilización de una proteína de fusión de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita del mismo. En una realización, el medicamento está destinado a la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad, que comprende administrar en un individuo que presenta la enfermedad una cantidad terapéuticamente efectiva del medicamento. En determinadas realizaciones, la enfermedad que debe tratarse es una enfermedad autoinmunológica. En una realización, la enfermedad es el rechazo del trasplante o la enfermedad del injerto contra el huésped. En una realización particular, la enfermedad se selecciona de entre el grupo de la diabetes de tipo 1, la enfermedad de Crohn, LSE y esclerosis múltiple. En una realización más particular, la enfermedad es la diabetes de tipo 1. En otra realización particular, la enfermedad es la esclerosis múltiple. En realizaciones adicionales, la enfermedad es el asma, la fíbrosis pulmonar o la enfermedad obstructiva pulmonar. En todavía otras realizaciones, la enfermedad es una enfermedad cardiovascular, particularmente la ateroesclerosis. En una realización, el método comprende además administrar en el individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo un agente inmunosupresor en el caso de que la enfermedad que debe tratarse sea una enfermedad autoinmunológica. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad en un individuo, comprendiendo la administración en dicho individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la invención. En una realización, se administra una composición en dicho individuo, que comprende una proteína de fusión de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, la enfermedad que debe tratarse es una enfermedad autoinmunológica. En una realización, la enfermedad es el rechazo del trasplante o la enfermedad del injerto contra el huésped. En una realización particular, la enfermedad se selecciona de entre el grupo de la diabetes de tipo 1, la enfermedad de Crohn, LSE y esclerosis múltiple. En una realización más particular, la enfermedad es la diabetes de tipo 1. En otra realización particular, la enfermedad es la esclerosis múltiple. En realizaciones adicionales, la enfermedad es el asma, la fibrosis pulmonar o la enfermedad obstructiva pulmonar. En todavía otras realizaciones, la enfermedad es una enfermedad cardiovascular, particularmente la ateroesclerosis. En determinadas realizaciones, el método comprende además administrar en el individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo un agente inmunosupresor en el caso de que la enfermedad que debe tratarse sea una enfermedad autoinmunológica. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En algunas realizaciones, se administra en una célula una cantidad efectiva de una proteína de fusión de la invención. En otras realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la invención se administra en un individuo para el tratamiento de enfermedades.

Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosis apropiada de una proteína de fusión de la invención (utilizada sola o en combinación con otro u otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, de la vía de administración, del peso corporal del paciente, del tipo de proteína de fusión, de la severidad y curso de la enfermedad, de si la proteína de fusión se administra con fines preventivos o terapéuticos, de las intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, de la historia clínica del paciente, de la respuesta a la proteína de fusión y del criterio del médico responsable. El médico responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del ingrediente o ingredientes activos en una composición y la dosis o dosis apropiadas para el sujeto individual. Se encuentran contempladas dentro de la presente memoria diversos programas de dosificación, aunque sin limitación, las administraciones individuales o múltiples en diversos puntos del tiempo, la administración de bolo y la infusión de pulsos.

La proteína de fusión se administra convenientemente en el paciente de una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, entre aproximadamente 1 mg/kg y 15 mg/kg (por ejemplo entre 0,1 mg/kg y 10 mg/kg) de proteína de fusión puede ser una dosis candidata inicial para la administración en el paciente, mediante, por ejemplo, una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se mantendría hasta producirse una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar de la proteína de fusión se encontraría comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,005 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitativos, una dosis también puede comprender entre aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, y aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal, o más en cada administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos no limitativos de un intervalo derivable a partir de los números indicados en la presente memoria, puede administrarse un intervalo de entre aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, etc., basándose en los números indicados anteriormente. De esta manera, pueden administrarse en el paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ó 10 mg/kg (o cualquier combinación de los mismos). Dichas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo de manera que el paciente reciba entre aproximadamente dos y aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis de la proteína de fusión). Puede administrarse una dosis de carga más alta inicial, seguido de una o más dosis inferiores. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. Se realiza fácilmente un seguimiento del avance de dicha terapia utilizando téenicas y ensayos convencionales.

Las proteína de fusión de la invención generalmente se utilizan en una cantidad efectiva para alcanzar el propósito pretendido. Para la utilización en el tratamiento o prevención de una condición de enfermedad, las proteínas de fusión de la invención, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente efectiva. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva se encuentra perfectamente dentro de las capacidades del experto en la materia, especialmente a la luz de la exposición detallada que se proporciona en la presente memoria.

Para la administración sistémica, puede estimarse inicialmente una dosis terapéuticamente efectiva a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones circulantes que incluya la IC5o determinada en cultivo celular. Dicha información puede utilizarse para determinar más exactamente las dosis útiles en el ser humano.

Las dosis iniciales también pueden estimarse a partir de datos in vivo, por ejemplo modelos animales, utilizando téenicas que son bien conocidas de la técnica. El experto ordinario en la materia podrá optimizar fácilmente la administración en seres humanos basándose en datos animales.

La cantidad e intervalo de dosis pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de las proteínas de fusión que resulten suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosis habituales por paciente para la administración mediante inyección se encuentran comprendidas en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 50 mg/kg/día, típicamente de entre aproximadamente 0,5 y 1 mg/kg/día. Los niveles plasmáticos terapéuticamente efectivos pueden alcanzarse mediante la administración de múltiples dosis cada día. Los niveles plasmáticos pueden medirse mediante, por ejemplo, HPLC.

En casos de administración local o incorporación selectiva, la concentración local efectiva de la proteína de fusión puede no estar relacionada con la concentración plasmática. El experto en la materia podrá optimizar las dosis locales terapéuticamente efectivas sin necesidad de experimentación indebida.

Una dosis terapéuticamente efectiva de las proteínas de íúsión indicadas en la presente memoria generalmente proporcionará un beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y eficacia terapéutica de una proteína de fusión pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivo celular o con animales experimentales. Los ensayos de cultivo celular y los estudios animales pueden utilizarse para determinar la LDs0 (la dosis letal para el 50% de una población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico, que puede expresarse como la proporción LD5o/ED5o· Resultan preferentes las proteínas de fusión que muestran índices terapéuticos elevados. En una realización, la proteína de fusión según la presente invención muestra un elevado índice terapéutico. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y de los estudios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosis adecuado para la utilización en el ser humano. La dosis se encuentra comprendida dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de dicho intervalo, dependiendo de una diversidad de factores, por ejemplo la forma de dosificación utilizada, la vía de administración utilizada, el estado del sujeto, y similares. La formulación exacta, la vía de administración y la dosis pueden ser seleccionadas por el médico individual en vista del estado del paciente (ver, por ejemplo, Fingí et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, página 1, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad). El médico responsable de los pacientes tratados con proteínas de fusión de la invención conocerá cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similar. A la inversa, el médico responsable también conocerá cómo ajustar el tratamiento a niveles más altos en el caso de que la respuesta clínica no sea adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el control del trastorno de interés variará según la severidad de la condición bajo tratamiento, la vía de administración y similares. La severidad de la condición puede evaluarse, por ejemplo, en parte, mediante métodos de evaluación pronostica estándares. Además, la dosis y quizá la frecuencia de las dosis también variarán según la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos Las proteínas de fusión de la invención pueden administrarse en combinación con otro u otros agentes en terapia. Por ejemplo, una proteína de fusión de la invención puede coadministrarse con por lo menos un agente terapéutico adicional. La expresión “agente terapéutico” comprende cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualesquiera ingredientes activos adecuados para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un agente inmunosupresor.

Dichos otros agentes convenientemente se encuentran presentes en combinación en cantidades que resultan efectivas para el propósito pretendido. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de proteína de fusión utilizada, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores comentados anteriormente. Las proteínas de fusión se utilizan generalmente a las mismas dosis y por las rutas de administración indicadas en la presente memoria, o entre aproximadamente 1% y 99% de las dosis indicadas en la presente memoria, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que resulta apropiada.

Dichas terapias de combinación indicadas anteriormente comprenden la administración combinada (en la que se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso, la administración de la proteína de fusión de la invención puede realizarse antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante.

Artículos fabricados En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo fabricado que contiene materiales que resultan útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos indicados anteriormente. El artículo fabricado comprende un recipiente y una etiqueta o impreso en el paquete o asociado al recipiente. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta, por sí misma o en combinación contra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y que puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presenta un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es una proteína de fusión de la invención. La etiqueta o impreso en el paquete indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección. Además, el artículo fabricado puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una proteína de fusión de la invención, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente terapéutico adicional. El artículo fabricado en la presente realización de la invención puede comprender además un impreso en el paquete que indique que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo fabricado puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Ejemplos A continuación se proporcionan ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica diversas otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Téenicas de ADN recombinante Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Se proporciona información general sobre las secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, N1H publicación n° 91-3242, 1991.

Secuenciación de ADN Se determinaron secuencias de ADN mediante secuenciación de doble cadena.

Síntesis génica Los segmentos génicos deseados en donde se requerían se generaron mediante PCR utilizando moldes apropiados o fueron sintetizados por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automática. En los casos en los que no se disponía de la secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleótidos basándose en secuencias de los homólogos más similares y los genes se aislaron mediante RT-PCR a partir de ARN originado a partir del tejido apropiado. Los segmentos génicos flanqueados por sitios de corte de endonucleasa de restricción individuales se clonaron en vectores de clonación/secuenciación estándares. El plásmido de ADN se purificó a partir de bacterias transformadas y la concentración se determinó mediante espectroscopia de UV. La secuencia del ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmó mediante secuenciación de ADN. Los segmentos génicos se diseñaron con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los vectores de expresión respectivos. Todos los constructos se diseñaron con una secuencia 5’-terminal de ADN codificante de un péptido líder que presenta como diana proteínas para la secreción en células eucarióticas. Las SEC ID n° 39 a n° 47 proporcionan péptidos líder ejemplares y secuencias polinucleótidas codificantes de los mismos.

Preparación de fusiones de subunidad bg de IL-2R-Fc y fusión de subunidad a de IL-2R-Fc Con el fin de estudiar la afinidad de unión de receptores de IL-2, se generó una herramienta que permitía la expresión de un receptor de IL-2 heterodimérico. La subunidad b del receptor de IL-2 se fusionó con una molécula de Fe que se manipuló para heterodimerizar (Fc(ojal)) (ver SEC ID n° 21 y n° 22 (humanas), SEC ID n° 27 y n° 28 (de ratón) y SEC ID n° 33 y n° 34 (de Cynomolgus)) utilizando la teenología de "botones-en-ojales" (Merchant et al, Nat. Biotech. 16, 677-681 (1998)). La subunidad g del receptor de IL-2 seguidamente se fusionó con la variante Fc(botón) (ver SEC ID n° 23 y n° 24 (humanas), SEC ID n° 29 y n° 30 (de ratón) y SEC ID n° 35 y n° 36 (de Cynomolgus)), que se heterodimerizaron con Fc(ojal). Dicha proteína de fusión de Fe heterodimérica seguidamente se utilizó como sustrato para analizar la interacción IL-2/receptor de IL-2. Se expresó la subunidad a de IL-2R como cadena monomérica con un sitio de corte AcTev y una etiqueta Avi His (SEC ID n° 25 y n° 26 (humanas), SEC ID n° 31 y n° 32 (de ratón) y SEC ID n° 37 y n° 38 (de Cynomolgus)). Las subunidades de IL-2R respectivas se expresaron transitoriamente en células HEK EBNA 293 con suero para el constructo de subunidad bg de IL-2R y sin suero para el constructo de subunidad a. El constructo de subunidad bg de IL-2R se purificó en proteína A (GE Healthcare), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Superdex 200). La subunidad a de IL-2R se purificó mediante etiquetas His en una columna NiNTA (Qiagen) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Superdex 75). Los aminoácidos y secuencias de nucleótidos correspondientes de diversos constructos de receptores se proporcionan en SEC ID n° 21 a 38.

Preparación de proteínas de fusión Las secuencias de ADN se generaron mediante síntesis génica y/o téenicas clásicas de biología molecular y se subclonaron en vectores de expresión de mamífero bajo el control de un promotor de MPSV y cadena arriba de un sitio poliA sintético, portando cada vector una secuencia OriP de EBV. Las proteínas de fusión aplicadas en los ejemplos, posteriormente, se produjeron mediante cotransfección de células HEK293-EBNA en crecimiento exponencial con los vectores de expresión de mamífero utilizando la transfección con fosfato de calcio. Alternativamente, se transfectaron células HEK293 en cultivo en suspensión mediante polietilenimina (PEI) con los vectores de expresión respectivos. Alternativamente, se utilizaron grupos de células CHO transfectadas establemente o clones de células CHO, para la producción en medios sin suero. A continuación, las proteínas de fusión se purificaron a partir del sobrenadante. Brevemente, se purificaron proteínas de fusión mediante una etapa de afinidad con proteína A (HiTrap ProtA, GE Healthcare) equilibrada en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Tras la carga del sobrenadante, la columna en primer lugar se lavó con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5 y posteriormente se lavó con fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. La proteína de fusión se eluyó con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM, glicina 100 mM, pH 3. Las fracciones se neutralizaron y se agruparon y se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare) en el ta pón de formulación final: histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. La concentración de proteínas de las muestras de proteínas purificadas se determinó mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos. Se analizaron mediante SDS-PAGE la pureza y el peso molecular de las proteínas de fusión en presencia y en ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y se tiñeron con azul de Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen). Se utilizó el sistema de gel premoldeado NuPAGE® (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante (geles de Tris-glicina al 4-20% o Bis-Tris al 3-12%). Alternativamente, la pureza y el peso molecular de las moléculas se analizaron mediante análisis CE-SDS en presencia y en ausencia de un agente reductor, utilizando el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizó el contenido de agregrados de las muestras de proteína de fusión utilizando una columna de cromatografía analítica de exclusión por tamaño Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare) en tampón de migración MOPS 2 mM, NaCl 150 mM, NaN3 al 0,02% (p/v), pH 7,3, a 25°C. Alternativamente, se analizó el contenido de agregados de las muestras de anticuerpos utilizando una columna analítica de exclusión por tamaño de TSKgel G3000 SW XL en tampón de migración de K2HP0425 mM, NaCl 125 mM, monohidrocloruro de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02% (p/v), pH 6,7, a 25°C.

Los resultados de la purificación y caracterización de los constructos IgG DP47GS-IL-2 y IgG DP47GS-(IL-2)2 se muestran en las figuras 1A - 2D.

Afinidad para receptores de IL-2 La afinidad de las proteínas de fusión se determinó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) para el heterodímero de IL-2R bg humano, murino y de Cynomolgus, utilizando heterodímero IL-2R bg bajo las condiciones siguientes: ligando: heterodímero IL-2R botón b ojal g humano, murino y de Cynomolgus inmovilizado sobre un chip CM5, analito: IgG DP47GS-IL-2 (ver SEC ID n° 13, 15 y 19) o IgG DP47GS-(IL-2)2 (ver SEC ID n° 17 y 19), temperatura: 25°C, tampón: HBS-EP, concentración de analito: 300 nM bajando hasta 3,7 nM (diluciones 1:3), caudal: 30 ml/min, asociación: 180 s, disociación: 300 s, regeneración: 60 s MgCl2 3 M, ajuste: unión 1:1, RI¹0, Rmax=global. La afinidad de las proteínas de fusión también se determinó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) para la subunidad a de IL-2R humano, murino y de Cynomolgus, utilizando subunidad a de IL-2R monomérico recombinante bajo las condiciones siguientes: ligando: subunidad a de IL-2R humano, murino y de Cynomolgus inmovilizado sobre un chip CM5, analito: IgG DP47GS-IL-2 ó IgG DP47GS-(IL-2)2, temperatura: 25°C, tampón: HBS-EP, concentración de analito 100 nM bajando hasta 3,1 nM (diluciones 1:3), caudal: 30 ml/min, asociación: 60 s, disociación: 180 s, regeneración: ninguna, ajuste: unión 1:1, RI=0, Rmax=global.

Los resultados del análisis cinético con el heterodímero IL-2R bg o la subunidad a de IL-2R se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1. Unión de proteínas de fusión a IL-2R bg e IL-2R a La afinidad de la IL-2 humana para el heterodímero IL 2R bg humano se describe que es de aproximadamente 1 nM, mientras que ambas proteínas de fusión presentan una afinidad ligeramente inferior, de entre 2 y 3 nM. La afinidad para el IL-2R murino es varias veces más débil que para el IL-2R humano y de Cynomolgus.

Expresión de receptores de IL-2 sobre las células inmunológicas El receptor trimérico de IL-2 de alta afinidad está compuesto de las cadenas a (1L-2RA, CD25), b (IL-2RB, CD122) y g (IL-2RG, CD132) y presenta una KD de ~10 pM CD25 solo presenta únicamente una afinidad baja (KD ~10 nM) para IL-2. El dímero IL-2RB/IL-2RG, que se expresa sobre algunos tipos celulares en ausencia de IL-2RA, se une también a IL-2 pero con una afinidad intermedia (KD ~1 nM) La señalización mediante el receptor de IL-2 está mediada por las cadenas IL-2RB e IL-2RG. De los análisis de estructura cristalina, IL-2RA aparentemente no entra en contacto con IL-2RB ó IL-2RG. Se ha propuesto que la base de la cooperatividad del receptor trimérico es una reducción de la entropía cuando CD25 captura IL-2 en la superficie celular para la presentación a IL-2RB e IL-2RG, o alternativamente se produce una alteración inducida por CD25 de la conformación de IL-2, estabilizando de esta manera el complejo. En las células T CD4+ reguladoras FOXP3+ existe un gran exceso estequiométrico de IL-2RA en comparación con las cadenas b y g del receptor, apoyando la hipótesis de que los dímeros, o incluso complejos de mayor tamaño, de la cadena a ayudan a la unión de IL-2. También existe evidencia de que CD25 sobre una célula puede presentar IL-2 a los dímeros IL-2RB/IL-2RG presentes sobre otra célula, en una interacción intercelular de alta afinidad que enfatiza la relación única entre las tres cadenas que componen el receptor de IL-2 de alta afinidad.

La expresión de CD25 (IL-2RA) y CD122 (IL-2RB) sobre subgrupos de células Treg CD4+, subgrupos de células NK y células NKT, así como sobre subgrupos de células T CD4+ y CD8+ convencionales se determinó mediante FACS (figuras 3A-4D). Se utilizaron marcadores de superficie celular para definir los subgrupos de Treg CD4+, las células NKT y las células NK (figura 3A-3D). Con el fin de optimizar la tinción para CD25 y CD122, no se llevó a cabo tinción intracelular de FoxP3. Brevemente, utilizando 150 ml de sangre donada por un voluntario sano, se incubaron anticuerpos fluorescentes durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (agitadas con vertex al inicio y después de 20 minutos). Se lisaron glóbulos rojos con tampón de lisis BD (solución de lisado BD FACS, 349202) durante 9 minutos y las células restantes se lavaron (2 mi de PBS + BSA al 0,1%) y se fijaron (PFA al 1%). Las células se analizaron en un analizador celular LSRFortessa (Becton Dickinson) y los datos se analizaron utilizando software FloJo (TreeStar). Se identificaron subgrupos de Treg utilizando anticuerpos específicos para TCRaP-FITC (IP26, BioLegend), CD4-Alexa Fluor 700 (RPA-T4, BioLegend), CD127-PE/CY7 (ebioRDR5, Ebioscience), CD45RA-Pacific Blue (HI100, BioLegend), CD25-APC (2A3, M-A251, BD Biosciences) and CD122-PE (TU27, BioLegend). Se tiñeron células NK y NKT en un tubo separado con anticuerpos específicos para TCRap-FITC, CD4-Alexa Fluor 700, CD8-PE/CY7 (HTT8a, BioLegend), CD56-Pacific Blue (HCD56, BioLegend), CD25-APC y CD122-PE Tras la separación de los linfocitos basándose en FSC/SSC y la exclusión de los dobletes, se identificaron las Treg no sensibilizadas como TCRaP+, CD4+, CD127 , CD25+y CD45RA+; las Treg de memoria se identificaron como TCRaP+, CD4+, CD127 , CD25+ y CD45RA y las Treg activadas se identificaron como TCRaP+, CD4+, CD127 , CD25aIt0 y CD45RA . Las células NK se identificaron como TCRap , CD56+ y células NK activadas identificadas como TCRaP , CD56bnllante. Las células NKT se identificaron como TCRap+, CD56+. Los controles de isotipo conjugados con APC y PE se utilizaron para estimar la fluorescencia de fondo para CD25 y CD122, respectivamente. De manera similar, se utilizaron marcadores de superficie celular para definir células T CD4+ convencionales no sensibilizadas y de memoria (figuras 4A y 4B), células T CD8+ convencionales de memoria y célula T CD8 CD45RA+ (una combinación de los subgrupos no sensibilizadas y TEMRA; TEMRA se refiere a las células de memoria efectoras que han revertido a expresar CD45RA) (figuras 4C y 4D). La tinción y el análisis se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente. Utilizando el mismo tubo indicado anteriormente para caracterizar las Treg CD4+, las células T CD4+ no sensibilizadas convencionales se identificaron TCRap+, CD4+, CD127+, CD25 /+, CD45RA+ y las células T CD4+ convencionales de memoria se identificaron como TCRaP+, CD4+, CD127+, CD25/+ y CD45RA . Las células T CD8 se definieron utilizando TCRaP-FITC, CD8-Alexa Fluor 700 (HTT8a, BioLegend), CD28-PE/CY7 (CD28.2, BioLegend), CD45RA-Pacific Blue, CD25-APC y CD122-PE Las células T CD8+ de memoria se identificaron como TCRap+, CD8+ y CD45RA . Las células CD8+ no sensibilizadas y TEMRA (TEMRA se refiere a células de memoria efectoras que han revertido a células T CD45RA expresantes) como TCRap+, CD8+ y CD45RA+. CD28 no se utilizó para distinguir las células T CD8+ no sensibilizadas de las células T TEMRA CD8+ ya que no se incluyó el marcador CD28 en el análisis de pSTAT5 indicado posteriormente (ver la figura 5).

En las figuras 3A -4D, la expresión específica de tipo celular de IL-2RA e IL-2RB se muestra para subgrupos de células T, células NK y células NK T en sangre periférica humana (IL-2RG presenta una expresión esencialmente ubicua en las células hematopoyéticas ya que se empareja con un gran número de receptores de citoquina). El nivel más alto de IL-2RA se encuentra presente sobre las tres poblaciones de células T CD4+ reguladoras (Treg): no sensibilizadas (CD45RA+, CD25+), de memoria (CD45RA , CD25+) y activadas (CD45RA , CD25hl) (figura 3A). De promedio, las células T CD4+ convencionales de memoria expresan aproximadamente 10 veces menos CD25 que las Treg (figura 4A). La expresión de CD25 sobre las células T CD4+ no sensibilizadas varía significativamente entre donantes pero en todos los casos es inferior a la observada sobre las células T CD4+ de memoria (figura 4A). La expresión de CD25 sobre las células NK, NKT y T CD8 es muy baja o no detectable excepto para las células NK CD56brillante (figuras 3C y 4C). Las células NK CD56bnllante y NK CD56+ expresan el nivel más alto de IL-2RB (figura 3D), aproximadamente 10 veces más que cualquiera de los subgrupos de células T, incluyendo las células NKT (figuras 3B, 3D, 4B, 4D).

Inducción de pSTAT5a en subgrupos de células sanguíneas periféricas humanas Tras la oligomerización inducida por IL-2 del IL-2R trimérico, se activan las proteína tirosina quinasas citoplasmáticas JAK1 y JAK3, las cuales se encuentran asociadas a los dominios intracelulares de IL-2RB e IL-2RG, respectivamente. Tres quinasas fosforilan determinados residuos de tirosina de IL-2RB que actúan como sitios de anclaje para STAT5a y STAT5b, los cuales resultan, a su vez, fosforilados. La activación inducida por IL-2 de varias rutas de señalización finalmente resulta en la transcripción de genes diana que contribuyen a las diversas funciones asociadas a la ruta IL-2/IL-2R. Debido a que diversos tipos celulares expresan niveles diferentes de las moléculas de receptores de IL-2, IL-2RA e IL-2RB (figuras 3A-4D), con el fin de entender la respuesta de señalización integrada a IL-2 mediada por diversas combinaciones de los receptores de afinidad alta e intermedia, los presentes inventores midieron los niveles de pSTAT5a dentro de células individuales mediante citometría de flujo policromática.

Los efectos de diversas dosis de IgG DP47GS-IL-2 ó IgG DP47GS-(IL-2)2 sobre la inducción de la fosforilación de STAT5a se evaluaron en subgrupos de células Treg CD4+ humanas, células T CD4+ no sensibilizadas y convencionales de memoria, células T CD8+ convencionales de memoria, células T CD8 CD45RA+, células NKT y células NK (figuras 5 y 6). Todos los subgrupos se caracterizaron en un único tubo para cada dosis. Brevemente, se introdujo sangre de un voluntario sano en tubos heparinizados. Se añadieron diversas concentraciones de IgG DP47GS-IL-2 ó de IgG DP47GS-(IL-2)2 a 500 ml de sangre y se incubaron a 37°C. Tras 30 minutos, se lisó la sangre y se fijó utilizando tampón de lisis/fijación precalentado (Becton Dickinson n° 558049) durante 10 minutos a 37°C, se lavaron 2x con PBS que contenía BSA al 0,2%, seguido de la permeabilización con metanol preenfriado a -20°C (Sigma, Biotech grado n° 494437) durante 20 minutos sobre hielo. A continuación, las células se lavaron extensivamente 4x con PBS que contenía BSA al 0,2% antes de llevar a cabo la tinción de FACS utilizando un panel de anticuerpos fluorescentes para distinguir diferentes subpoblaciones de linfocitos y células NK y el estatus de pSTAT5a. Los anticuerpos utilizados fueron anti-CD4-Alexa Fluor 700 (clon RPA-T4), CD3-PerCP/Cy5.5 (UCHT1), CD45RA-PE/Cy7 (HI100), CD8-violeta brillante 605 (RPA-T8), CD56-violeta brillante 421 (HCD56), FOXP3-PE (259D) (todos de BioLegend), CD25-APC (clones M-A251 y 2A3) y pSTAT5a-Alexa Fluor 488 (pY694) (Becton Dickinson). Las muestras se obtuvieron utilizando un analizador celular LSRFortessa (Becton Dickinson) y los datos se analizaron utilizando software FloJo (TreeStar). Tras la separación de los linfocitos y la exclusión de los dobletes, se definieron las Treg como CD3+, CD4+ y FOXP3+ y se subdividieron como CD45 FOXP3hl (Treg activadas), CD3+, CD4+, CD45RA y FOXP3+(Treg de memoria) y CD3+, CD4+, CD45+ y FOXP3+ (Treg no sensibilizadas). Las célula T CD4+ convencionales se definieron como CD3+, CD4+ y CD45RA+ (no sensibilizadas) y CD3+, CD4+ y CD45RA (de memoria) Las células T CD8 se definieron como CD3+, CD8+ y CD45RA (de memoria) y CD3+, CD8+ y CD45RA+. Las células NKT se definieron como células CD3+ y CD56+ y las células NK se definieron como CD3 , CD56bnllante (células NK activadas) o CD3 y CD56+ (células NK) Los niveles intracelulares de pSTAT5a se cuantificaron en todos los subgrupos celulares a todas las dosis.

La figura 5 muestra la respuesta a dosis del inmunoconjugado IgG DP47GS-IL-2 sobre las células T, las células NK y las célula NK T en sangre periférica humana procedente de tres donantes individuales, cada uno de los cuales se había analizado en días diferentes. La jerarquía de la respuesta a IgG DP47GS-IL-2 fue la misma en los tres donantes y la misma que la observada al utilizar IL-2 humano recombinante (Proleukin®) (datos no mostrados). Las tres poblaciones de Treg, activadas (CD45RA , CD25hl), de memoria (CD45RA, CD25+), y no sensibilizadas (CD45RA+, CD25 ) incrementaron los niveles de pSTAT5a a la concentración de 0,1 ng/ml de IgG DP47GS-IL-2, mientras que otras poblaciones celulares requirieron más de 1 ng/ml (células NK CD56bnllante y células T CD4+ de memoria) ó 10-100 ng/ml (células T CD8+ de memoria, células NK CD56+, células T CD4+ no sensibilizadas, células NKT y células T CD8 CD45RA+) de IgG DP47-IL-2 para producir incrementos detectables de pSTAT5a. Ver también la figura 8A-8D para respuestas a dosis más detalladas por parte de las poblaciones de Treg que muestran su elevada sensibilidad para IgG DP47GS-IL-2. Es notable que la expresión elevada de IL-2RB sobre las células NK con niveles intermedios de CD56 (figura 3D) en comparación con la expresión de IL-2RB sobre los subgrupos de células T no resulta suficiente para permitir una sensibilidad de IL-2 de tipo Treg. Globalmente, los subgrupos de Treg activadas, de memoria y no sensibilizadas mostraron la mayor sensibilidad para IgG DP47GS-IL-2, mientras que las células NK CD56brillante y las células T CD4+ efectoras convencionales de memoria fueron 20 a 50 veces menos sensibles. Entre los otros subgrupos celulares analizados para incrementos de pSTAT5a, las células T CD8+ efectoras de memoria, las células T CD4+ efectoras no sensibilizadas, las células NKT, las células NK “en reposo" (positivas, sin tinción brillante para CD56) y las células T CD8+ efectoras no sensibilizadas + células CD45RA+ de memoria fueron relativamente insensibles al inmunoconjugado IgG-IL-2.

La figura 6 muestra la respuesta a dosis de IgG DP47GS-(IL-2)2 sobre las células T, las células NK y las célula NK T en sangre periférica humana procedente de cinco donantes individuales, cada uno de los cuales se había analizado en días diferentes. Tal como se observa para IgG DP47GS-IL-2 (figura 5), los tres subgrupos de Treg fueron las células más sensibles a pSTAT5a inducido por IgG DP47GS-(IL-2)2 (figuras 6-8D) y se encontraron respuestas a dosis jerárquicas similares para los demás subgrupos celulares en los cinco donantes.

Para comparar más fácilmente IgG DP47GS-IL-2 e IgG DP47GS-(IL-2)2, se normalizaron los valores de pSTAT5a (figura 7A-7B). Para normalizar los valores de IFM, se restaron los valores de IFM de pSTAT5a no estimulado específicos para cada subgrupo separado, de todos los valores de IFM estimulados para ese subgrupo celular. Los valores resultantes se dividieron por el valor de IFM de pSTAT5a más alto obtneido por el subgrupo en la respuesta a dosis. Se estimaron los EC50 basándose en la cantidad de proteína de fusión de IL-2 requerida para alcanzar 50% del IFM de pSTAT5a máximo observado para ese subgrupo. Tal como se muestra en la figura 7A-7B, el inmunoconjugado IgG DP47GS-(IL-2)2 produjo una inducción más potente de pSTAT5a en las células que expresaban constitutivamente CD25, potencialmente como consecuencia de la mayor avidez del inmunoconjugado para el receptor de IL-2 de alta afinidad. Se observó que la EC50 para la activación de pSTAT5a era 5 a 9 veces más baja en Treg al comparar directamente IgG DP47GS-(IL-2)2 con IgG DP47GS-IL-2. La Tabla 2 resume los valores de EC50 representativos y los factores de diferencia para la activación de pSTAT5a por parte de IgG DP47GS-IL-2 vs. IgG DP47GS-(IL-2)2 en los diferentes subgrupos celulares.

Tabla 2. Valores de EC50 y factores de diferencia para la activación de pSTATóa por parte de IgG DP47GS-IL-2 vs. IgG-DP47GS-(IL-2)2 en diferentes subgrupos celulares.

Incluso a concentraciones extremadamente limitantes, IgG DP47GS-(IL-2)2 produjo niveles más altos de pSTAT5a comparado con IgG DP47GS-IL-2 (figura 8A-8D). Para este experimento, se sometió a ensayo sangre de tres voluntarios sanos individualmente el mismo día para las respuestas a una titulación de 2 veces de IgG DP47-IL-2 e IgG DP47-(IL-2)2 a concentraciones limitantes de IL-2. Los gráficos en la figura 8A-8D representa medias ± SD de IFM de pSTAT5a para los tres donantes Además de los tres subgrupos de Treg examinados individualmente (figura 8B-8D), se aplicó una separación para evaluar pSTAT5a en las Treg CD3+, CD4+, FoxP3+ totales (figura 8A). Los resultados indican claramente un incremento de 5 a 10 veces de potencia para la activación de IgG DP47GS-(IL-2)2 de Treg a pesar de sólo un incremento de 2 veces de IL-2 por cada molécula de IgG. Se llevó a cabo citometría de flujo policromática tal como se ha indicado anteriormente (ver la figura 5).

Las células T CD4+ convencionales de memoria también respondieron a concentraciones inferiores (7 veces) de IgG DP47GS-(IL-2)2 en comparación con IgG DP47GS-IL-2. Aunque los valores de ECD50 fueron inferiores para las células NK CD56bnllante y para las células NK CD56+ en la comparación entre IgG DP47GS-(IL-2)2 e IgG DP47-IL-2, la reducción tan sólo fue de 3 y 4 veces, respectivamente. Lo anterior probablemente se debe a que estas células se basan en el receptor de IL-2 de afinidad intermedia para la señalización mediada por IL-2. Este desplazamiento diferencial de la ED50 para las células Treg frente a las NK incrementa la preferencia para la activación de las Treg en varias veces.

Inducción de pSTAT5a en subgrupos de células sanguíneas periféricas de Cynomolgus Tal como se observa en sangre periférica humana, se produce una inducción de pSTAT5a dependiente de dosis preferente y similar en subgrupos de Treg en sangre periférica de Cynomolgus estimulados con IL-2 (Proleukin®) (datos no mostrados). En una comparación directa de la capacidad de IgG DP47GS-(IL-2)2 e IgG DP47GS-IL-2 de inducir pSTAT5a en los tres subgrupos de Treg, se requirieron 2 a 8 veces menos IgG DP47GS-(IL-2)2 para alcanzar 50% del nivel máximo de pSTAT5a. La Tabla 3 resume los valores de EC50 para la activación de pSTAT5a por IgG DP47GS-IL-2 versus IgG DP47GS-(IL-2)2 en los diferentes subgrupos de Treg de Cynomolgus; resultados que son extremadamente similares a los observados en sangre periférica humana (Tabla 2). De manera similar a la sangre completa humana, se utilizaron marcadores de superficie celular e intracelulares para * identificar subgrupos de células T reguladoras y células T convencionales en sangre completa procedente de monos Cynomolgus sanos normales. Se recogieron muestras de sangre el mismo día de tres monos Cynomolgus sanos en tubos con heparina sódica y se añadieron diversas concentraciones de IgG DP47GS-IL-2 ó de IgG DP47GS-(IL-2)2 a 500 ml de sangre y se incubaron a 37°C. Tras 10 minutos a 37°C, se Usaron las muestras y se fijaron con tampón de lisado/fijación de BD precalentado (BD Biosciences). Tras el lavado, las células se permeabilizaron con 1 mi de metanol durante 30 minutos sobre hielo. Las muestras se lavaron 3 veces y se tiñeron con un panel de FOXP3-Alexa Fluor® 647 (clon: 259D, BioLegend), CD4-V500 (clon: L200, BD Biosciences), CD45RA-V450 (clon: 5H9, BD Biosciences), CD25-PE (clon: 4E3, eBioscience), pSTAT5a- Alexa Fluor® 488 (clon: 47, BD Biosciences) y Ki-67-PerCP-Cy5.5 (clon: B56, BD Biosciences) durante 1 hora a 4°C. Todas las muestras se extrajeron con un analizador celular LSRFortessa (Becton Dickinson) y después se analizaron con el software FlowJo (Tree star, Inc., Ashland, USA). Tabla 3. Inducción de pSTAT5a en subgrupos de Treg de sangre periférica de Cynomolgus en respuesta a IgG DP47GS-IL-2 e IgG DP47GS-(IL-2)2.

Inducción del número de Treg en monos Cynomolgus Los animales Cynomolgus tratados in vivo con IgG DP47GS-IL-2 presentaron incrementos dependientes de la dosis del número absoluto de Treg, así como un factor de incremento respecto a la línea de base 7 días después de la dosificación (figuras 9A y 9B, respectivamente). Se utilizaron monos Cynomolgus sanos normales de ambos sexos con edades comprendidas entre 3 y 6 años en todos los ensayos y no se utilizó ningún animal más de una vez. Bajo anestesia, se inyectaron s.c. en el dorso lateral diversas dosis de IgG DP47GS-IL-2 (n=4 a 6) o vehículo (n=3). Las dosis individuales de IgG DP47GS-IL-2 se basaron en el peso corporal y se formularon para la inyección en un vehículo de PBS estéril, pH 7,2, que contenía suero de Cynomolgus normal estéril al 0,5%. Se recogieron muestras de sangre en diversos tiempos después del tratamiento y se sometieron a ensayo para cambios hematológicos (CBC y diferencial) con un analizador hematológico automático Advia, así como los marcadores de superficie celular e intracelulares detallados anteriormente (procedimientos experimentales para la Tabla 3). Los cambios en células T reguladoras CD4+, CD25+, FOXP3 de sangre completa el día 7 después del tratamiento se muestran en la figura 9A-9B como el número celular absoluto por mm3 de sangre completa (figura 9A) y factor de cambio de Treg (figura 9B); todos los datos se representan como medias ± SD. A las dosis más altas de 25 mg/kg y 36 pg/kg de IgG DP47GS-IL-2, se observaron incrementos medios de Treg de prácticamente 3 veces (intervalo de 111% a 255%, n=6) y de 4 veces (intervalo de 110% a 470%, n=6), respectivamente. Una reducción adicional de la dosis s.c. de IgG DP47GS-IL-2 (12, 6 y 2 mg/kg) continuó produciendo cambios correspondientemente reducidos del número de Treg y del factor de cambio. Sin restringirse a ninguna teoría en particular, el incremento de ~2 veces de las Treg (comprendido entre 67% y 133%, n=6) con la dosis de 12 pg/kg de IgG DP47GS-IL2 representa aproximadamente el incremento deseable de Treg. Existe un amplio abanico de números de Treg en el ser humano (20 a 90 Treg por mm3 de sangre; 4 a 10% de células T CD4+) y resulta razonable suponer que un incremento de las Treg inducido por IL-2 en un individuo resultará en un incremento global de la supresión funcional. Sin embargo, podría resultar deseable no incrementar el número de Treg por encima del intervalo normal para esta población celular durante un periodo sostenido de tiempo, sino principalmente incrementar la función de estas células.

Al evaluar dosis más bajas de IgG DP47GS-IL-2 (2 a 6 pg/kg), se recogieron muestras de sangre más frecuentes para identificar los tiempos óptimos para la detección de cambios de las Treg posteriores a la administración de IgG DP47GS-IL-2 (figura 10A-10B). Aunque se observaron cambios de las Treg a los 7 días, la estimulación máxima se produjo el día 4, antes de los medido con las dosis más altas de IgG DP47GS-IL-2 (día 7, figura 9A-9B). Proleukin® e IgG DP47GS-IL-2 son comparables in vitro en ensayos de sangre completa humana y de Cynomolgus al compararlos directamente con las unidades de actividad de IL-2 utilizados para estimular pSTAT5a en las Treg y en otras células sensibles a IL-2 (datos no mostrados). Con la vida media corta conocida de Proleukin® en el ser humano, se llevó a cabo un estudio de una única dosis en monos Cynomolgus para evaluar la inducción y la activación de Treg in vivo. Proleukin® produjo un cambio dependiente de la dosis y del tiempo de las Treg medido por un factor de cambio de números absolutos, así como por una activación de pSTAT5a. Aunque el incremento del número de Treg fue nominal (figura 11 A: 10% a 40%), el incremento inducido por Proleukin de pSTAT5a de Treg fue sustancial y dependiente de la dosis un día después del tratamiento (figura 1 IB).

Se muestra en la figura 12A-12C una comparación de la capacidad de IgG DP47GS-IL-2 de inducir un incremento de las Treg in vivo en monos Cynomolgus con la de Proleukin®. Se trataron monos Cynomolgus sanos normales (grupos de n=5) con dosis bajas de IgG DP47GS-IL-2 ó con dosis altas de Proleukin® y el cambio en las células T reguladoras se sometió a ensayo el día 10. Los días 0 y 7, se administró s.c. IgG DP47-IL-2 a una dosis de 16.800 IU/kg (la dosis de 12 mg/kg mostrada en la figura 9A-9B). Basándose en la literatura publicada en la que se había proporcionado Proleukin® a pacientes con diabetes de tipo 1 (4,5x106 IU/persona, 3 veces/semana) y se había demostrado que incrementaba las Treg, y los datos de dosis únicas en la figura 11 A- 1 IB, se proporcionó Proleukin® s.c. 3 veces a la semana (M, W, F) un total de 5 dosis a razón de 200.000 IU/kg (el equivalente en Cynomolgus de 4,5x106 IU/persona). Se muestran los resultados en la figura 12A-12C como medias ± SD para el cambio de Treg totales por mm3 de sangre (figura 12A), el factor de incremento de Treg (figura 12B), y el cambio en la proporción de Treg a células CD4+ FOXP3 convencionales (figura 12C).

Aunque se administró prácticamente 30 veces menos actividad de IgG DP47GS-IL-2 durante el periodo de 10 días, IgG DP47GS-IL-2 indujo un mayor incremento del número de Treg que Proleukin® (figura 12A, p=0,06). El factor de incremento del número de Treg por encima de la línea base (figura 12B) y el incremento de las Treg respecto a las células T CD4 convencionales (figura 12C) también fue mayor (p=0,0011 y p=0,016, respectivamente) en monos que habían recibido dosis de IgG DP47GS-IL-2 en comparación con Proleukin®. En el ser humano, la proporción entre células T CD4 reguladoras (habitualmente definidas como FoxP3+ o por una combinación de marcadores de superficie) y células T CD4 no reguladoras (denominadas células convencionales o efectoras) con frecuencia se utiliza para definir los niveles funcionales de Treg en pacientes con el tiempo.

Respuesta in vivo de subgrupos de células sanguíneas periféricas de Cynomolgus al tratamiento de dosis bajas de IgG DP47GS-IL-2 La especificidad celular in vivo del tratamiento de dosis baja de IL-2 es un parámetro crítico. Los presentes inventores han determinado que la activación celular in vivo inducida por IgG DP47GS-IL-2 ó Proleukin® puede seguirse con precisión midiendo los niveles de pSTAT5a ex vivo en sangre extraída en diversos tiempos tras la dosificación de monos Cynomolgus o ratones. La respuesta in vivo de todas las poblaciones celulares que pueden seguirse in vitro (figuras 5 a 7B) también puede examinarse ex vivo.

Un día y 3 días después de la administración in vivo de una única dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 (12 mg//kg) en monos Cynomolgus sanos (n=5), se recogió sangre completa y se sometió a ensayo para la fosforilación de STAT5a tal como se ha indicado anteriormente (procedimientos experimentales para la Tabla 3). Se sangró cada mono el día 0 antes del tratamiento y se midió la cantidad de fosforilación de STAT5a y se utilizó individualmente para evaluar el factor de cambio posterior al tratamiento. El factor de cambio de pSTAT5a de Treg los días 1 y 3 se muestra en la figura 13A; el factor de cambio de pSTAT5a de células T CD4+ CD45RA convencionales de memoria, en la figura 13B, y el factor de cambio de pSTAT5a de las células T CD4+ CD45RA+ no sensibilizadas, en la figura 13C. Los resultados demuestran claramente que la sangre de Cynomolgus obtenida un día y tres días después de una dosis única (12 mg/kg) de IgG DP47GS-IL-2 mostraba incrementos preferentes de pSTAT5a de las células Treg en comparación con las células T CD4+ de memoria y no sensibilizadas (figura 13A-C). Una única dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 resultó claramente superior a una única dosis alta de Proleukin® (figura 1 IB) en la producción de un estado de activación in vivo sostenido de Treg.

Los estudios iniciales utilizando la fosforilación de STAT5a como biomarcador in vivo de la activación de Treg mostraron un pSTATóa máxima incluso 1 día después de una dosis única de Proleukin® (figura 1 IB) y 1 y 3 días con una dosis baja (12 pg/kg) de IgG DP47GS-IL-2 (figura 13A). La titulación adicional de IgG DP47GS-IL-2 en combinación con tiempos de muestreo adicionales demostraron que podían mantenerse señales in vivo de pSTATóa durante 4 días antes de caer nuevamente a niveles normales a los 7 días (figuras 14A, 14B). La IFM (intensidad de fluorescencia media) de las señales de pSTATóa para las dosis tanto de 2 pg/kg (14A, n=4) como de 6 pg/kg (14B, n=6) sugiere que se había producido una señalización de pSTAT5a inferior a la máxima. Incluso estas dosis muy bajas de IgG DP47GS-IL-2 proporcionaron una señalización in vivo sostenida de las Treg y fueron superiores a Proleukin® (figura 1 IB). Estos resultados apoyan la hipótesis de los presentes inventores de que los niveles muy bajos de IL-2 de vida prolongada, es decir IgG DP47GS-IL-2 pero no Proleukin®, pueden estimular las Treg durante periodos de tiempo prolongados in vivo, reduciendo de esta manera la frecuencia de tratamiento necesaria para reestablecer una autotolerancia dominante y mejorando los resultados de enfermedad. El incremento de las células Treg en la sangre periférica tras el tratamiento de dosis baja de IL-2 podría reflejar un cambio en la distribución de las células en el cuerpo y no un incremento real de las células. Para confirmar que los incrementos de Treg in vivo se debían por lo menos en parte a la inducción de la división celular por el tratamiento de IL-2, se evaluó el marcador intracelular de proliferación Ki-67. Ki-67 es una proteína que puede detectarse en el núcleo durante G , S, G2 y la mitosis pero que se encuentra ausente de las células en reposo que se encuentran en la etapa G0 del ciclo celular. También se realizó un seguimiento ex vivo de los monos Cynomolgus tratados con 2 y 6 pgbkg de IgG DP47GS-IL-2 tal como se ha indicado anteriormene (figura 14A-14B), para cambios ex vivo en el marcador intracelular Ki-67 tal como se ha indicado (procedimientos experimentales para la Tabla 3) con el fin de evaluar el grado de proliferación in vivo. El porcentaje de las células que se encontraban en ciclo celular (Ki-674) el día 0 se comparó con el porcentaje de células Ki-674 los días 1 a 11 posteriores al tratamiento. Se muestran Treg Ki-674 en la figura 15 A; las células T CD44 CDRA45 convencionales de memoria, en la figura 15B, y las células T CD44 CD45RA4 no sensibilizadas convencionales, en la figura 15C. Las células sanguíneas de Cynomolgus obtenidas uno a siete días después de una única dosis baja de IgG DP47GS-IL-2 (6 mg/kg) mostraron incrementos preferentes de Ki-67 en las Treg en comparación con las células T CD44 no sensibilizadas convencionales (figura 15A vs. 15C). Al contrario que las células T no sensibilizadas, IgG DP47GS-IL-2 (6 pg/kg) fue capaz de estimular la proliferación de las células T CD44 convencionales de memoria (figura 15B). A la dosis más baja de IgG DP47GS-IL-2 (2 pg/kg), se produjo una activación mínima del ciclo celular y de la proliferación en comparación con la dosis de 6 Pg/kg.

En ensayos de sangre completa humana y de Cynomolgus, la actividad in vitro de IgG DP47GS-(IL-2)2 agregada era aproximadamente 6 veces más potente sobre las Treg que IgG DP47GS-IL-2 (Tablas 1 y 3). Por lo tanto, la primera dosis en monos Cynomolgus fue 6 veces inferior a la dosis más alta de IgG DP47GS-IL-2 sometida a ensayo (36 mg/kg). IgG DP47GS-(IL-2)2 administrada a razón de 6 pg/kg (n=4) produjo grandes incrementos de las Treg circulantes (figura 16A), una pSTAT5a significativa y prolongada en las Treg que volvió a niveles normales tras 1 semana (figura 16B) y un incremento de prácticamente 3 veces del número de Treg (figura 16C). Se compararon los factores de cambio inducidos por IgG DP47GS-IL-2 (de la figura 9A-9B, columnas blancas) con la dosis de 6 pg/kg de IgG DP47GS-(IL-2)2 (columnas grises) (figura 16D). De manera similar a los ensayos de sangre completa humana y de Cynomolgus, IgG DP47GS-(IL-2)2 mostró una potencia in vivo incrementada más allá de su incremento de 2 veces de IL-2 por cada molécula de IgG. Se administraron dosis adicionales de IgG DP47GS-(IL-2)2 a monos Cynomolgus para evaluar sus efectos in vivo a dosis muy bajas (2 y 0,7 pg/kg) (figura 17A-17C). Aunque 2 pg/kg produjo factores de cambio moderados (media de 46%, de entre 20% y 70%, n=8), la dosis de 0,7 pg/kg presentó poco efecto sobre el número de células T (incremento medio de 16%, n=3) (figura 17A). Ambas dosis bajas estimularon incrementos de pSTAT5a de Treg (figura 17B, n=3 cada uno), presentando poco efecto sobre pSTAT5a de Teff/células de memoria (figura 17A-17C, n=3 cada uno).

Los efectos globales de la terapia de IL-2 y su capacidad de incrementar las Treg en monos Cynomolgus se presentan en la figura 18. Ambas formas de IgG-IL-2 de vida prolongada son potentes inductores de las Treg que pueden seguirse in vivo con pSTAT5a como marcador biológico de activación y en esta figura como factor de incremento del número de Treg circulantes. IgG DP47GS-(IL-2)2, con su potencia incrementada conseguida mediante la duplicación de las moléculas de IL-2 en el extremo C-terminal de la IgG presentó una superioridad dependiente de la dosis respecto a IgG DP47GS-IL-2.

Proleukin® en el ser humano estimula una eosinofilia al administrarla diariamente a dosis de 1x10 6 a 4,5x106 IU/persona. En monos Cynomolgus se observaron incrementos similares de eosinófilos tras el tratamiento repetido con Proleukin® o con dosis únicas de IgG DP47GS-IL-2 (figura 19A-19B). Los resultados en la figura 19A representan cada animal sometido a ensayo (n=5 a 6) con independencia de que el número de eosinófilos fuese normal o elevado. Los datos en la figura 19B representan únicamente los monos que desarrollaron niveles sanguíneos elevados de eosinófilos relacionados con el tratamiento. Los datos se representan como medias ± SD. Las columnas blancas son del tratamiento con IgG DP47GS-IL-2 y las columnas grises a la derecha son de monos tratados con 6 mg/kg de IgG DP47GS-(IL-2)2 de la figura 16A-16D. Se muestra un resumen de los resultados en la Tabla 4, posteriormente. A pesar de la equivalencia de 25 pg/kg de IgG DP47GS-IL-2 y 6 pg/kg de IgG DP47GS-(IL-2)2 sobre las Treg, sus efectos sobre los eosinófilos fueron marcadamente diferentes, 50% de respondedores frente a 0% de respondedores, respectivamente.

Tabla 4. Inducción farmacológica de eosinófilos en monos Cynomolgus con IL-2.

Propiedades farmacocineticas de IgG DP47GS-IL-2 en ratones Antes de iniciar los estudios funcionales en ratones, se compararon las propiedades farmacocinéticas (PK) de IgG DP47GS-IL-2 con las de Proleukin® (figura 20A-20B).

Se inyectaron en ratones NOD i.p. (figura 20A) o s.c. (figura 20B) las dosis indicadas de IgG DP47GS-IL-2 ó Proleukin® en PBS que contenía suero de ratón al 0,5% y se sangraron en diversos tiempos después de las inyecciones. Se resumen las dosis de IgG DP47GS-IL-2 en la Tabla 4. Se evaluó la IL-2 humana en muestras de suero utilizando mAb de ratón anti-IL-2 humana, BD Pharmingen, n° de cat. 555051, clon 5344.111 para recubrir placas de 96 pocilios para capturar la IL-2. Se detectó la IL-2 utilizando mAb de ratón anti-IL-2 humana biotinilado, BD Pharmingen, n° de cat.555040, clon B33-2. Se visualizó la unión utilizando estreptavidina conjugada con europio.

Tal como se ha indicado anteriormente, Proleukin® fue eliminado rápidamente. En contraste, IgG DP47GS-IL-2 fue eliminado mucho más lentamente. Los resultados de la comparación de la PK de IgG DP47GS-IL-2 en ratones normales y en ratones NOD-scid CD25KO apoya la hipótsis de que un componente importante que contra la eliminación in vivo de IgG DP47GS-IL-2 es el receptor de I— 2 de alta afinidad (datos no mostrados). Tabla 4. Dosis de IgG DP47GS-IL-2 para el estudio PK mostrado en la figura 20A-20B.

La IFM de FOXP3 y CD25 se incrementa en Treg tras el tratamiento con IgG-IL-2 Con el fin de comparar las capacidades de los inmunoconjugados IgG DP47GS-IL-2 e IgG DP47GS-(IL-2)2 y la IL-2 humana recombinante (Proleukin®) de estimular las células Treg FoxP3+ in vivo, los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de Proleukin®, IgG DP47GS-IL-2 ó IgG DP47GS-(IL-2)2 y se realizó un seguimiento de las Treg para cambios en la expresión de CD25 y FOXP3 en un tiempo óptimo determinado previamente de 24 horas (figura 21 A-21 B).

Se inyectó en ratones BALB/c sanos jóvenes (n=3/grupo de tratamiento, n=4/cohortes de control de vehículo) subcutáneamente Proleukin® (20.000 ó 100.000 IU), IgG DP47GS-IL-2 (60, 300 ó 1.500 IU) o IgG DP47GS-(IL-2)2 (60, 30 ó 1.500 IU). Las dosis se administraron en 100 ml de PBS estéril, pH 7,2, que contenía suero de ratón filtrado a esterilidad al 0,5%. Tras 24 horas, los ratones fueron eutanizados y se extrajeron los bazos. Se generó una suspensión de células individuales de esplenocitos en 1 mi de medio L-15 y se almacenaron sobre hielo hasta el procesamiento posterior. Una alícuota filtrada de la suspensión de células individuales, 40 ml, se transfirió a tubos de FACS y se lavó con 2 mi de tampón FACS (600xg, 5 minutos). A continuación, se incubaron muestras con anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra antígenos de superficie celular: CD4 (clon RM4-5, fluorocromo A700), CD25 (eBio7D4, Af488), CD44 (IM7, e605), CD62L (MEL-14, PE), ICOS (C398.4A, PE/Cy7), CD103 (2E7, APC). Se llevó a cabo la tinción durante 30 minutos, a 4°C en 100 m? de tampón FACS (PBS, pH 7,2 + BSA al 0,2%). Tras la tinción de la superficie celular, se lavaron muestras con 4 mi de tampón FACS (600xg, 5 minutos) antes de la tinción intracelular (según el protocolo de tinción intracelular eBioscience). Brevemente, las muestras se resuspendieron en 200 m de tampón de fijación/permeabilización (eBioscience n° 00-5521) y se incubaron durante 1 hora, 4°C. Se añadió 1 mi de lx tampón de permeabilización (eBioscience n° 00-8333) a muestras antes de 3 mi de tampón FACS y el lavado (600xg, 5 minutos). Se tiñeron los antígenos intracelulares Ki-67 (B56, PerCP Cy5.5) y FOXP3 (FJK-16S, e450) en 100 m? de lx tampón de permeabilización durante 1 hora, 4°C. Las muestras se lavaron con 4 mi de tampón FACS (600xg, 5 minutos - dos veces) y los datos se adquirieron en un analizador BD Fortessa y se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc.). Se definieron * las Treg como CD4+, FOXP3+ de células individuales dentro del grupo de linfocitos; a partir de esta población se calculó para todas las muestras la intensidad de fluorescencia media (IFM) de CD25 y FOXP3.

Tal como se muestra en la figura 21A-21B, en comparación con 100.000 IU de Proleukin®, 300 IU de IgG DP47GS-IL-2 ó de IgG DP47GS-(IL-2)2 indujeron una regulación positiva similar de CD25, mientras que 1.500 IU resultaron todavía más potentes (figura 21 A). La capacidad de estimular FOXP3 intracelular mostró una capacidad incrementada similar a Proleukin® de los dos inmunoconjugados de IL-2. En todos los grupos de tratamiento se muestran los datos como medias ± SD. Algunos estudios anteriores han demostrado que los niveles de FOXP3 y de CD25 volvieron a la línea base 72 horas después del tratamiento de IL-2.

El tratamiento in vivo con IgG DP47GS-IL-2 suprime las respuestas inmunológicas en ratones En estudios preliminares anteriores a los mostrados en la figura 21A-21B los presentes inventores habían observado que una dosis de 4.000 IU de IgG DP47GS-IL-2 activaba las células T FOXP3+ reguladoras de ratón activadas in vivo; esta dosis seguidamente se utilizó para evaluar su capacidad de suprimir las respuestas inmunológicas dependientes de células T clásicas en ratones, es decir, la hipersensibilidad de tipo retardado (figura 22A-22B) y una respuesta de IgG anti-KLH (figura 23 A).

Se inmunizaron ratones NOD y C57BL/6 (n=7) i.v. con glóbulos rojos de oveja (srbc) y se retaron 3 días después con un bolo de srbc en una única pata trasera con el fin de inducir una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). Un día después del reto los ratones fueron eutanizados con CO2 y se extirparon las patas y se pesaron. Se muestra la magnitud de las respuestas de DTH como el cambio en el peso de pata en comparación con ratones no inmunizados (D de peso de pata). Se administró s.c. IgG DP47GS-IL-2 a razón de 4.000 IU por ratón 3 días antes y el día de la inmunización con srbc y el vehículo era PBS estéril, pH 7,2. Se obtuvo la significación estadística a partir del ensayo de Mann-Whitncy en GraphPad Prism.

La dosificación con IgG DP47GS-IL-2 tres días antes y el día de la inmunización con glóbulos rojos de oveja suprimió la posterior respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado a un reto con células sanguíneas de oveja en 51% de los ratones NOD (figura 22A, p=0,0023) y en 38% de los ratones C57BL/6 (figura 22B, p=0,002). La Ig de CTLA-4 como inmunosupresor de control positivo inhibió la respuesta de DTH a un nivel similar al de IgG DP47GS-IL-2.

IgG DP47GS-IL-2 también pudo suprimir las respuestas de IgG específicas de KLH en ratones C57BL/6 (inhibición de 78%, p=0,0007, figura 23A) y NOD (inhibición de 67%, p=0,004, figura 23B). Para este experimento, se inmunizaron ratones C57BL/6 jóvenes sanos (n=7 a 10) y ratones NOD (n=13 a 14) i.p. con 100 mg de KLH de grado vacunal humano sin adyuvante según recomendaciones del fabricante (Stellar). El tratamiento de IgG DP47GS-IL-2 consistía de 1 (NOD) ó 2 (C57BL/6) tratamientos semanales con 4.000 IU por ratón s.c. inicados el día de la inmunización. Siete días (NOD) y 21 días (C57BL/6) después de la inmunización se recogió sangre y se midieron mediante ELISA las respuestas de IgG sérico específico de KLH.

La capacidad de IgG DP47GS-IL-2 de suprimir las respuestas inmunológicas in vivo apoya la hipótesis de que la activación de las células T reguladoras inducida por una dosi sbaja de IL-2 produce células T reguladoras funcionales que median en una reducción de la respuesta inmunológica.

* * * Aunque la invención anteriormente proporcionada ha sido descrita en detalle a título ilustrativo y ejemplar con fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativas del alcance de la invención. Las exposiciones de toda la literatura de patentes y científica citada en la presente memoria se incorporan expresamente en su totalidad como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proteína de fusión que comprende: (i) una molecula de inmunoglobulina que comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación, e (ii) dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2).

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina de clase IgG, particularmente una molécula de inmunoglobulina de la subclase IgGi.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha molécula de inmunoglobulina es una molécula de inmunoglobulina humana.

4. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina no es capaz de unión específica a un antígeno.

5. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena pesada basada en la secuencia de línea germinal humana Vh3-23.

6. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEC ID n° 9.

7. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina comprende una secuencia de región variable de cadena ligera basada en la secuencia de línea germinal humana Vk3-20.

8. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina comprende la secuencia de región variable de cadena ligera SEC ID n° 11.

9. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho receptor de Fe es un receptor de Fcy, particularmente un receptor de Fcy humano.

10. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho receptor de Fe es un receptor de Fe activador.

11. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho receptor de Fe se selecciona de entre el grupo de FcyRIIIa (CDlóa), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

12. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho receptor de Fe es FcyRIIIa, particularmente FcyRIIIa humano.

13. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina comprende una sustitución de aminoácido en la posición 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.

14. Proteína de fusión según la reivindicación 13, en la que dicha sustitución de aminoácido es P329G.

15. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 234 y 235 (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.

16. Proteína de fusión según la reivindicación 15, en la que dichas sustituciones de aminoácidos son L234A y L235A (LALA).

17. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha molécula de inmunoglobulina comprende sustituciones de aminoácidos en la posición L234A, L235A y P329G (numeración EU) de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.

18. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas moléculas de IL-2 son moléculas de IL-2 de tipo salvaje.

19. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas moléculas de IL-2 son moléculas de IL-2 humanas.

20. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas moléculas de IL-2 comprenden la secuencia SEC ID n° 1 ó de SEC ID n° 3, particularmente la secuencia SEC ID n° 3.

21. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada una de dichas moléculas se fusionan en su aminoácido N-terminal con el aminoácido C-terminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina de dicha molécula de inmunoglobulina, opcionalmente mediante un péptido conector.

22. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de fusión comprende las secuencias polipeptídicas SEC ID n° 17 y SEC ID n° 19.

23. Polinucleótido codificante de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

24. Vector, particularmente un vector de expresión, que comprende el polinucleótido según la reivindicación 23.

25. Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 23 ó el vector según la reivindicación 24.

26. Método para producir la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que comprende las etapas de (i) cultivar la célula huésped según la reivindicación 25 bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión, e (ii) recuperar la proteína de fusión.

27. Proteína de fusión que comprende: (i) una molécula de inmunoglobulina que comprende una modificación que reduce la afinidad de unión de la molécula de inmunoglobulina para un receptor de Fe en comparación con una molécula de inmunoglobulina correspondiente que no presenta dicha modificación, e (ii) dos moléculas de interleuquina-2 (IL-2), producida mediante el método según la reivindicación 38.

28. Composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y un portador farmacéuticamente aceptable.

29. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó 27, o la composición farmacéutica según la reivindicación 28, para la utilización a modo de medicamento.

30. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó 27, o la composición farmacéutica según la reivindicación 28, para la utilización en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad autoinmunológica.

31. Proteína de fusión o composición farmacéutica según la reivindicación 30, en la que la enfermedad autoinmunológica se selecciona de entre el grupo de diabetes de tipo 1, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y esclerosis múltiple.

32. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó 27, o la composición farmacéutica según la reivindicación 28, para la utilización en el tratamiento o profilaxis del rechazo del trasplante o la enfermedad del injerto contra el huésped.

33. Utilización de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó 27, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita del mismo.

34. Utilización según la reivindicación 33, en la que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunológica.

35. Utilización según la reivindicación 34, en la que la enfermedad autoinmunológica se selecciona de entre el grupo de diabetes de tipo 1, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y esclerosis múltiple.

36. Utilización según la reivindicación 33, en la que dicha enfermedad es el rechazo del trasplante o la enfermedad del injerto contra el huésped.

37. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en la que dicho individuo es un mamífero, particularmente un ser humano.

38. Método de tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar en dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó 27 en una forma farmacéuticamente aceptable.

39. Método según la reivindicación 38, en la que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunológica.

40. Método según la reivindicación 39, en la que la enfermedad autoinmunológica se selecciona de entre el grupo de diabetes de tipo 1, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y esclerosis múltiple.

41. Método según la reivindicación 38, en la que dicha enfermedad es el rechazo del trasplante o la enfermedad del injerto contra el huésped.

42. Método según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 41, en la que dicho individuo es un mamífero, particularmente un ser humano.

43. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó 27 para la utilización en la activación selectiva de células T reguladoras in vitro o in vivo.

44. Proteína de fusión según la reivindicación 43, en la que dicha activación comprende la inducción de la proliferación de las células T reguladoras y/o la inducción de la señalización de receptores de IL-2 en las células T reguladoras.

45. Proteína de fusión según la reivindicación 43 ó 44, en la que dicha utilización es in vitro y dicha proteína de fusión se utiliza a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml o menos, particularmente de aproximadamente 0,1 ng/ml o menos.

46. Proteína de fusión según la reivindicación 43 ó 44, en la que dicha utilización es in vivo y dicha proteína de fusión se utiliza a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal o menos, particularmente de aproximadamente 12 pg/kg de peso corporal o menos, más particularmente de aproximadamente 6 pg/kg de peso corporal o menos.

47. Método para la activación selectiva de las células T reguladoras in vitro o in vivo, que comprende poner en contacto dichas células T reguladoras con la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 ó 27.

48. Método según la reivindicación 47, en la que dicha activación comprende la inducción de la proliferación de las células T reguladoras y/o la inducción de la señalización de receptores de IL-2 en las células T reguladoras.

49. Método según la reivindicación 47 ó 48, en la que dicho método es in vitro y dicha proteína de fusión se utiliza a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml o menos, particularmente de aproximadamente 0,1 ng/ml o menos.

50. Método según la reivindicación 47 ó 48, en la que dicha utilización es in vivo y dicha proteína de fusión se utiliza a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal o menos, particularmente de aproximadamente 12 pg/kg de peso corporal o menos, más particularmente de aproximadamente 6 pg/kg de peso corporal o menos.

51. Invención según se ha descrito anteriormente en la presente memoria.