JP2010534469A - Ｋｄｒ指向性標的化結合物質およびその使用 - Google Patents

Ｋｄｒ指向性標的化結合物質およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＫＤＲに対する標的化結合物質ならびにそのような結合物質の使用に関する。さらに具体的には、本発明は、ＫＤＲ指向性完全ヒトモノクローナル抗体に関する。記載される標的化結合物質は、ＫＤＲの活性および／または過剰産生と関連した疾患の治療に有用である。

Description

本発明は、ＫＤＲに対する標的化結合物質ならびにこのような結合物質の使用に関する。さらに具体的には、本発明は、ＫＤＲ指向性完全ヒトモノクローナル抗体に関する。記載される標的化結合物質は、ＫＤＲの活性および／または過剰産生と関連した疾患の治療に、および診断法として有用である。
血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）は、血管増殖を誘導し、発生中にリモデリングするのに、そして多数の病理学的状態、例えば固形腫瘍増殖を支援するのに必要とされる血管新生において、重要な役割を果たす。ＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達は、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２;ＫＤＲ／ｆｌｋ−１）の活性化により主に媒介され、それは、内皮細胞増殖、移動、血管透過性および新生血管生残を刺激することができる（Olsson et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7: 359-71で再検討されている）。チロシンキナーゼ受容体のより広範なＶＥＧＦＲファミリーは、３つの成員、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３（それぞれＦｌｔ−１、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ４としても知られている）からなる。既知のＶＥＧＦＲリガンドは、各ＶＥＧＦＲに関する示差的な、明確に定義された選択性を示す。例えば、ＶＥＧＦＲ−ＡはＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方に結合し、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰ１ＧＦは主にＶＥＧＦＲ１に結合し、そしてＶＥＧＦ−ＣおよびＤはＶＥＧＦＲ３の特異的活性剤である。ＶＥＧＦＲも活性化する多数の非生理学的ＶＥＧＦも存在し、例えばＶＥＧＦ−ＥはＶＥＧＦＲ２を特異的に活性化するが、一方、ＶＥＧＦ−ＦはＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２を活性化する。
ＶＥＧＦＲの二量体化は、複雑な一連のシグナル伝達事象を推進して、多数の一般的増殖因子シグナル伝達経路の活性化をもたらす（Olsson et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7: 359-71）。分子レベルでは、リガンド発現、受容体二量体化および活性化と異なる細胞型における下流結果との間には複雑な関係が存在する。ＶＥＧＦＲシグナル伝達は、内皮細胞に対して主な重要性を有するが、しかし、当該受容体は、他の細胞の機能の調節に関連付けられている。例えばＦｌｔ−１は単球遊走を媒介するに際してある役割を果たし、そして発現されると、腫瘍細胞移動を促し得る。
ホモ−およびヘテロ二量体の両方からの３つの受容体はすべて（ＶＥＧＦＲ１／３へテロ二量体を除く）、種々のＶＥＧＦリガンドからのシグナルを組込ませる。ＫＤＲは、血管およびリンパ管で発現される通常のＶＥＧＦＲなので、これらのシグナル伝達事象の多くで中心的役割を果たす受容体のように思われる。ＫＤＲは、低ＶＥＧＦＲ−１シグナル伝達活性も相殺し得る。ＶＥＧＦＲ１はそれ自体、低い固有のキナーゼ活性を有し、ＶＥＧＦＲ１キナーゼドメインを取り去っても正常発生に影響を及ぼさない。ＶＥＧＦＲ１はＫＤＲと相乗作用を示し、ＫＤＲシグナル伝達の完全活性化を促し得る、ということを実験は示している（Carmeliet et al, Nat Med 2001, 7, 575；Auterio et al, 2003 Nat Med, 9, 936）。これはヘテロ二量体化により達成され、このことはＫＤＲ二量体化の阻害剤により妨げられる、という可能性がある。ＶＥＧＦＲ３は、ＫＤＲとヘテロ二量体を形成することも示されている（Alam et al, BBRC, 2004,324,909）。しかしながら、ＶＥＧＦＲ１、ＫＤＲおよびＶＥＧＦＲ３の種々のホモ−およびヘテロ二量体が相互作用して生理学的作用を促進するメカニズムは明らかでない。ＶＥＧＦＲ／ＶＥＧＦシグナル伝達の抑制は、異なる疾患状態に影響を及ぼし得る（Baka et al Expert Opin Ther Targets 2006, 10, 867で再検討）。
ＶＥＧＦＲは、７つの免疫グロブリン様細胞外ドメインからなる。ＶＥＧＦＲを特異的に結合するリガンド（例えば、ＶＥＧＦＡおよびＰ１ＧＦ）は、免疫グロブリン様ドメイン２および３を有し、ドメイン２は主要接触を作り、ドメイン３は結合の特異性を決定する（Christinger et al JBC, 2004, 279, 10382；Fuh et al JBC 1998, 273,11197）。これに対比して、ドメイン４〜６は、受容体複合体の二量体化に関与する。受容体複合体を安定化するリガンド結合は、二量体化を延長して、生産的シグナル伝達を進行させ得る。受容体活性化は結合および二量体化の両方の一機能であるので、受容体活性化はリガンド−受容体結合を抑制することにより、または二量体化を遮断することにより抑制され得る。リガンドの受容体との結合を遮断する抗体、例えばＩＭＣ１１２１ｂおよびそのねずみ等価物ＤＣ１０１は以前に記載されており（両方ともにＶＥＧＦ−ＡのＫＤＲとの結合を遮断し、それによりＫＤＲによるＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達を遮断する）、抗腫瘍作用をもたらすことが知られている（Prewett et al Cancer Res 1999, 59, 5209；Lu et al, JBC 2003, 278, 43496）。ＫＤＲシグナル伝達の抑制の直接的結果として、循環ＶＥＧＦ−Ａレベルの反跳増大が認められる、ということが、前臨床的にならびに臨床的に報告されている。ＫＤＲに対するＶＥＧＦ−Ａの結合を遮断するＩＭＣ１１２１のような抗体は、ＶＥＧＦ−Ａ濃度が増大する条件下で有効性がより低いと予測され、この場合、ＫＤＲとの結合に関する競合は、抗体というよりむしろＶＥＧＦ−Ａが制し得る。
したがって、ＫＤＲシグナル伝達を抑制する新規の手段を見出す必要がある。
本発明は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＫＤＲの生物学的活性を抑制する標的化結合物質に関する。本発明の実施形態は、ＫＤＲと特異的に結合し、受容体二量体化を抑制する標的化結合物質に関する。本発明の実施形態は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を抑制する標的化結合物質にも関する。本発明の実施形態は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を抑制する完全ヒト単離標的化結合物質に関する。受容体二量体化の抑制によるＫＤＲシグナル伝達の抑制は、ＫＤＲと結合するＶＥＧＦ−Ａの抑制を上回る利点を有する、と予測される。ここに記載される受容体二量体化を抑制する標的化結合物質は、ＫＤＲ：ＫＤＲホモ二量体およびＫＤＲ:Ｆｌｔ−１へテロ二量体形成を遮断し、それゆえ、ＫＤＲおよびＦｌｔ−１の両方によるＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰ１ＧＦシグナル伝達を遮断することによりＫＤＲシグナル伝達軸を最大に抑制し得ると予測される。さらに、ＶＥＧＦ−Ａレベルを増大することにより、受容体二量体化を抑制する結合物質の効力に直接的影響を及ぼすことはないはずである。
本発明の実施形態は、ＫＤＲと特異的に結合し、受容体二量体化を抑制する標的化結合物質に関する。一実施形態において、標的化結合物質は、受容体二量体化ならびにＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を抑制する。本発明の一実施形態では、標的化結合物質は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＫＤＲホモ二量体形成を抑制する。本発明の一実施形態では、標的化結合物質は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＫＤＲへテロ二量体形成を抑制する。一実施形態では、標的化結合物質は、標的化結合物質の非存在下で起こるＫＤＲ受容体二量体化の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を抑制する。
本発明の一実施形態では、標的化結合物質はＫＤＲと特異的に結合し、ＶＥＧＦの結合を抑制する。本発明の一実施形態では、標的化結合物質は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａの結合を抑制する。本発明の一実施形態では、標的化結合物質は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＰＬＧＦの結合を抑制する。本発明の一実施形態では、標的化結合物質はＫＤＲと特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄおよび／またはＶＥＧＦ−Ｅの結合を抑制する。
一実施形態では、標的化結合物質は、標的化結合物質の非存在下で起こるＫＤＲと結合するＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｃの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を抑制する。
本発明の一実施形態では、標的化結合物質はＫＤＲと特異的に結合し、ＶＥＧＦ媒介によるプロスタグランジン放出を抑制する。一実施形態では、標的化結合物質は、標的化結合物質の非存在下で起こるＶＥＧＦ媒介によるプロスタグランジン放出の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を抑制する。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、１３３ｎＭで、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中において、２ｎＭのＶＥＧＦ−１６５により誘導されるＶＥＧＦ−１６５媒介によるチロシンリン酸化の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、１３３ｎＭで、ＨＵＶＥＣが先ずＦＣＳ補足培地（これは次に無補足培地に一晩取り替えられる）中でインキュベートされ、次に標的化結合物質が付加され、標的化結合物質を用いた予備インキュベーション期間後、ＶＥＧＦ−１６５の付加により細胞が刺激されるアッセイにおいて測定した場合、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中の２ｎＭのＶＥＧＦ−１６５により誘導されるＶＥＧＦ−１６５媒介によるチロシンリン酸化の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、本明細書中の実施例１１に記載されるアッセイで測定した場合、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中のＶＥＧＦ−１６５媒介によるチロシンリン酸化の５０％より多くを抑制する。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、ハイブリドーマ上清の１／２０希釈では、ＨＵＶＥＣ中の２ｎＭのＶＥＧＦ−Ｅにより誘導されるＶＥＧＦ−Ｅ媒介によるチロシンリン酸化の４０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、ハイブリドーマ上清の１／２０希釈では、ＨＵＶＥＣが先ずＦＣＳ＋増殖補足物培地（これは次に無補足培地に一晩取り替えられる）中でインキュベートされ、その後、標的化結合物質が付加され、最後にＶＥＧＦ−Ｅに取り替えられるアッセイにおいて測定した場合、ＨＵＶＥＣ中の２ｎＭのＶＥＧＦ−Ｅにより誘導されるＶＥＧＦ−Ｅ媒介によるチロシンリン酸化の４０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、本明細書中の実施例８に記載されるアッセイで測定した場合、ＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦ−Ｅ媒介によるチロシンリン酸化の４０％より多くを抑制する。
いくつかの実施形態では、標的化結合物質は、ハイブリドーマ上清の１／２０希釈では、ＨＵＶＥＣ中の１ｎＭのＶＥＧＦ−Ｅにより誘導されるＶＥＧＦ−Ｅ媒介による細胞生残の５５％より多くを抑制する。いくつかの実施形態では、標的化結合物質は、ハイブリドーマ上清の１／２０希釈では、ＨＵＶＥＣが先ずＦＣＳ＋増殖補足物培地中でインキュベートされ、その後、標的化結合物質が付加され、予備インキュベーション期間後、ＶＥＧＦ−Ｅが付加されるアッセイにおいて測定した場合、ＨＵＶＥＣ中の１ｎＭのＶＥＧＦ−Ｅにより誘導されるＶＥＧＦ−Ｅ媒介による細胞生残の５５％より多くを抑制する。いくつかの実施形態では、標的化結合物質は、本明細書中の実施例８に記載されるアッセイで測定した場合、ＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦ−Ｅ媒介による細胞生残の５５％より多くを抑制する。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、２０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬまたは０．３１２５μｇ／ｍＬで、対照抗体と比較して、内皮細胞管形成の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、２０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬまたは０．３１２５μｇ／ｍＬで、ＴＣＳ最適化培地、または２％ウシ胎仔血清、１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足されたＭＣＤＢ１３１培地中に保持されるＨＵＶＥＣおよびヒト二倍体繊維芽細胞の共培養に標的化結合物質が導入されるアッセイで測定した場合、内皮細胞管形成の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、２０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬまたは０．３１２５μｇ／ｍＬで、実施例２３に記載されるアッセイで測定した場合、内皮細胞管形成の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、２０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬまたは０．３１２５μｇ／ｍＬで、内皮細胞管形成の６０％、７０％、８０％または９０％より多くを抑制する。
本発明のいくつかの実施形態では、１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで週２回投与される標的化結合物質は、in vivoでの血管新生の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで週２回投与される標的化結合物質は、球状体ベースのin vivo血管新生アッセイにおいてin vivoでの血管新生の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、ＨＵＶＥＣ球状体がマトリゲル／フィブリン溶液中で単独ＨＵＶＥＣと混合されて、球状体として１００，０００ＥＣおよび２００，０００単独ＥＣ／注入プラグという最終数に達し、ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦが１０００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で付加され、５００μｌの細胞／マトリックス懸濁液が試験動物に注入され、標的化結合物質を用いた治療が翌日に開始され、２１日目に終了するアッセイで測定した場合に、in vivoでの血管新生の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、実施例２４に記載されるアッセイで測定した場合、in vivoでの血管新生の５０％より多くを抑制する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、in vivoでの血管新生の６０％、７０％、８０％または９０％より多くを抑制する。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、５ナノモル（ｎＭ）未満の結合親和性（Ｋｄ）でＫＤＲを結合する。他の実施形態では、標的化結合物質は、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭまたは１ｎＭ未満のＫｄで結合する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、９５０ピコモル（ｐＭ）未満のＫｄでＫＤＲを結合する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、９００ｐＭ未満のＫｄでＫＤＲを結合する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、８００ｐＭ、７００ｐＭまたは６００ｐＭ未満のＫｄでＫＤＲを結合する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、５００ｐＭ未満のＫｄでＫＤＲを結合する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、４００ｐＭ未満のＫｄで結合する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、３００ｐＭ未満のＫｄで結合する。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、２００ｐＭ未満のＫｄで結合する。Ｋｄは、本明細書中に記載される方法または当業者に既知の方法（例えばＢＩＡコアアッセイ、ＥＬＩＳＡ）（Biacore International AB, Uppsala, Sweden）を用いて評価され得る。
本発明の標的化結合物質または抗体の結合特性は、解離または会合速度（それぞれｋoffおよびｋon）を基準にすることによっても測定され得る。
本発明の一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１のｋon速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）kｏｎ→Ａｂ−Ａｇ）を有し得る。
本発明の別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、５×１０−１ｓ−１未満、１０−１ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満または１０−１０ｓ−１未満のｋoff速度（（Ａｂ−Ａｇ）kｏff→抗体（Ａｂ）−抗原（Ａｇ））を有し得る。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、哺乳動物における腫瘍の増殖および／または転移を抑制する。他の実施形態では、標的化結合物質は、哺乳動物における炎症性障害に関連した症候を改善する。一実施形態では、標的化結合物質は、哺乳動物における関節リウマチまたは乾癬から選択される炎症性障害に関連した症候を改善する。改善され得る症候としては、血管新生および滑膜炎が挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態では、標的化結合物質は、哺乳動物における心臓血管性疾患に関連した症候を改善する。さらに他の実施形態では、標的化結合物質は、哺乳動物における心臓血管性疾患、例えばアテローム硬化症に関連した症候を改善する。改善され得る症候としては、炎症および血管新生が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの他の実施形態では、標的化結合物質は、哺乳動物における敗血症に関連した症候を改善する。改善され得る症候としては、制御されない血管透過性、血管漏出および血管新生が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの他の実施形態では、標的化結合物質は、眼疾患に関連した症候を改善する。いくつかの他の実施形態では、標的化結合物質は、眼疾患、例えば虚血性網膜症または加齢性黄斑変性症に関連した症候を改善する。改善され得る症候としては制御されない血管透過性および血管漏出が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は抗体である。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質はモノクローナル抗体である。本発明の一実施形態では、標的化結合物質は完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態では、標的化結合物質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態では、標的化結合物質は、ＩｇＧ２アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。このアイソタイプは、他のアイソタイプと比較してエフェクター機能を引き出す能力の低減を示し、これが毒性低減をもたらし得る。本発明の別の実施形態では、標的化結合物質は、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプと比較してＡＤＣＣを引き出す能力の増大を示し、これが効力改善をもたらし得る。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプ、例えばＩｇＧ４と比較して安定性改善を示し、これが生物学的利用能改善あるいは製造し易さの改善またはより長い半減期をもたらし得る。一実施形態では、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体は、ｚ、ｚａまたはｆアロタイプのものである。
さらなる一実施形態は、ＫＤＲと特異的に結合し、表２０に示した相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のうちの１つを含む配列を含む標的化結合物質または抗体である。本発明の実施形態は、表２０に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含む標的化結合物質または抗体を包含する。さらなる一実施形態は、ＫＤＲと特異的に結合し、表２０に示したＣＤＲ配列のうちの２つを含む配列を含む標的化結合物質または抗体である。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２１に示したＣＤＲ配列のうちの１つを含む配列を含む。本発明の実施形態は、表２１に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含む標的化結合物質または抗体を包含する。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２１に示したＣＤＲ配列のうちの２つを含む配列を含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２１に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表２１に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化結合物質は抗体である。ある実施形態では、標的化結合物質は完全ヒトモノクローナル抗体である。他のある実施形態では、標的化結合物質は完全ヒトモノクローナル抗体の結合性断片である。
不確かでなくするために、「表２０」という用語は、本明細書中で用いる場合、表２０ａおよび表２０ｂを包含する。
不確かでなくするために、「表２１」という用語は、本明細書中で用いる場合、表２１ａおよび表２１ｂを包含する。
当業者はＣＤＲ決定を容易に成し遂げ得る、ということが注目される。例えば、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3を参照されたい。Kabatは、多数の種の抗体アイソタイプからの免疫グロブリン鎖の多重配列アラインメントを提供する。整列された配列は、単一ナンバリング系であるKabatナンバリング系に従って番号付けされる。Kabat配列は、１９９１年の発表以来更新されてきており、電子配列データベースとして利用可能である（最新ダウンロード可能バージョン １９９７）。任意の免疫グロブリン配列は、Kabat参照配列を用いてアラインメントを実施することにより、Kabatにより番号付けされ得る。したがって、Kabatナンバリング系は、免疫グロブリン鎖を番号付けするための一貫したシステムを提供する。
一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、抗体３３Ｄ５、２９Ｈ３、２９Ｆ７、３３Ｃ３、３１Ｅ１１、２１Ａ１、２１Ｈ６、２４Ｃ９、３２Ｇ７、２４Ｂ３、３３Ｂ１、２９Ａ１１、３０Ｈ１０、３２Ｂ２、３２Ｃ１１、３０Ｅ３、１Ｇ６、３０Ｆ６、３０Ｄ７、２１Ｈ９、２９Ａ３、３３Ｅ１、２２Ｂ８、２７Ａ３、２７Ｄ１０、３０Ａ１、３２Ｆ４または２９Ｄ４の重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。軽鎖の無差別性は当該技術分野で十分に確立されており、したがって、抗体３３Ｄ５、２９Ｈ３、２９Ｆ７、３３Ｃ３、３１Ｅ１１、２１Ａ１、２１Ｈ６、２４Ｃ９、３２Ｇ７、２４Ｂ３、３３Ｂ１、２９Ａ１１、３０Ｈ１０、３２Ｂ２、３２Ｃ１１、３０Ｅ３、１Ｇ６、３０Ｆ６、３０Ｄ７、２１Ｈ９、２９Ａ３、３３Ｅ１、２２Ｂ８、２７Ａ３、２７Ｄ１０、３０Ａ１、３２Ｆ４または２９Ｄ４の重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む標的化結合物質または抗体、あるいは本明細書中に開示される別の抗体はさらに、表２１に示した軽鎖配列あるいは抗体３３Ｄ５、２９Ｈ３、２９Ｆ７、３３Ｃ３、３１Ｅ１１、２１Ａ１、２１Ｈ６、２４Ｃ９、３２Ｇ７、２４Ｂ３、３３Ｂ１、２９Ａ１１、３０Ｈ１０、３２Ｂ２、３２Ｃ１１、３０Ｅ３、１Ｇ６、３０Ｆ６、３０Ｄ７、２１Ｈ９、２９Ａ３、３３Ｅ１、２２Ｂ８、２７Ａ３、２７Ｄ１０、３０Ａ１、３２Ｆ４または２９Ｄ４あるいは本明細書中に開示される別の抗体の軽鎖配列のうちのいずれか１つを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２１に示した軽鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、抗体３３Ｄ５、２９Ｈ３、２９Ｆ７、３３Ｃ３、３１Ｅ１１、２１Ａ１、２１Ｈ６、２４Ｃ９、３２Ｇ７、２４Ｂ３、３３Ｂ１、２９Ａ１１、３０Ｈ１０、３２Ｂ２、３２Ｃ１１、３０Ｅ３、１Ｇ６、３０Ｆ６、３０Ｄ７、２１Ｈ９、２９Ａ３、３３Ｅ１、２２Ｂ８、２７Ａ３、２７Ｄ１０、３０Ａ１、３２Ｆ４または２９Ｄ４の軽鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、標的化結合物質は、２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３からなる群から選択されるモノクローナル抗体である。一実施形態では、標的化結合物質は、完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のうちの1つまたは複数を含む。ある実施形態では、標的化結合物質は、モノクローナル抗体２４Ｂ３である。他のある実施形態では、標的化結合物質はモノクローナル抗体２７Ｄ１０である。さらに他の実施形態では、標的化結合物質はモノクローナル抗体３３Ｃ３である。さらなる実施形態では、標的化結合物質は前記のモノクローナル抗体のうちのいずれかから得られる。
一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した配列のうちのいずれか１つから選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２１に示した配列のうちのいずれか１つから選択される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、抗体３３Ｄ５、２９Ｈ３、２９Ｆ７、３３Ｃ３、３１Ｅ１１、２１Ａ１、２１Ｈ６、２４Ｃ９、３２Ｇ７、２４Ｂ３、３３Ｂ１、２９Ａ１１、３０Ｈ１０、３２Ｂ２、３２Ｃ１１、３０Ｅ３、１Ｇ６、３０Ｆ６、３０Ｄ７、２１Ｈ９、２９Ａ３、３３Ｅ１、２２Ｂ８、２７Ａ３、２７Ｄ１０、３０Ａ１、３２Ｆ４または２９Ｄ４のＣＤＲのうちのいずれか１つから選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、抗体３３Ｄ５、２９Ｈ３、２９Ｆ７、３３Ｃ３、３１Ｅ１１、２１Ａ１、２１Ｈ６、２４Ｃ９、３２Ｇ７、２４Ｂ３、３３Ｂ１、２９Ａ１１、３０Ｈ１０、３２Ｂ２、３２Ｃ１１、３０Ｅ３、１Ｇ６、３０Ｆ６、３０Ｄ７、２１Ｈ９、２９Ａ３、３３Ｅ１、２２Ｂ８、２７Ａ３、２７Ｄ１０、３０Ａ１、３２Ｆ４または２９Ｄ４のＣＤＲのうちのいずれか１つから選択される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。
別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含み得る。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２１に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含み得る。一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２１に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３、ならびに表２１に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列を含む配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表２１に示した完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した完全ヒトモノクローナル抗体２７Ｄ１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表２１に示した完全ヒトモノクローナル抗体２７Ｄ１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０に示した完全ヒトモノクローナル抗体３３Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表２１に示した完全ヒトモノクローナル抗体３３Ｃ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
本発明のさらなる実施形態は、表２０または表２１に示した配列のうちのいずれか１つのフレームワーク領域ならびにＣＤＲ（特にＦＲ１〜ＦＲ４、またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ連続配列を含む配列を含む標的化結合物質または抗体である。一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、表２０または表２１に示したモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３の配列のうちのいずれか１つのフレームワーク領域ならびにＣＤＲ（特にＦＲ１〜ＦＲ４、またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ連続配列を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
一実施形態は、標的化結合物質または抗体あるいはその抗原結合部分を提供するが、この場合、標的化結合物質または抗体あるいはその抗原結合部分は、配列番号４２の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。一実施形態では、標的化結合物質または抗体あるいはその抗原結合部分は、さらに、配列番号４４の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
別の実施形態では、標的化結合物質または抗体あるいはその抗原結合部分は、配列番号１４の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。一実施形態では、標的化結合物質または抗体あるいはその抗原結合部分は、さらに、配列番号１６の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
別の実施形態では、標的化結合物質または抗体あるいはその抗原結合部分は、配列番号７４の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体あるいはその抗原結合部分は、さらに、配列番号７６の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、開示されるＣＤＲまたは重鎖または軽鎖配列内に、２０、１６、１０、９またはそれ以下、例えば１、２、３、４または５つという数のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または挿入を含む。このような修飾は、潜在的に、ＣＤＲ内の任意の残基でなされ得る。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
一実施形態では、標的化結合物質または抗体は、本明細書中に開示されるＣＤＲの変異体または誘導体、フレームワーク領域およびＣＤＲ（特にＦＲ１〜ＦＲ４、またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ連続配列、本明細書中に開示される軽鎖または重鎖配列、あるいは本明細書中に開示される抗体を含む。変異体としては、表２０または表２１に示したＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかにおいて２０、１６、１０、９またはそれ以下、例えば１、２、３、４、５または６つという数のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または挿入を有する配列、表２０または表２１に示すフレームワーク領域およびＣＤＲ（特にＦＲ１〜ＦＲ４、またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ連続配列、本明細書中に開示される軽鎖または重鎖配列、あるいは本明細書中に開示されるモノクローナル抗体を含む標的化結合物質または抗体が挙げられる。変異体としては、表２０または表２１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３、表２０または表２１に示すフレームワーク領域およびＣＤＲ（特にＦＲ１〜ＦＲ４、またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ連続配列、本明細書中に開示される軽鎖または重鎖配列、あるいは本明細書中に開示されるモノクローナル抗体のいずれかと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む標的化結合物質または抗体が挙げられる。２つのアミノ酸配列の同一性％は、当業者に既知の任意の方法により、例えばペアワイズ・アラインメント（これに限定されない）により確定され得る。一実施形態では、変異体は、天然のものであるか、もしくは組換えＤＮＡ技術または突然変異誘発技術を用いてネイティブ配列のin vitro工学処理により導入される本明細書中に開示されるＣＤＲ配列あるいは軽鎖または重鎖ポリペプチドにおける変化を含む。天然変異体としては、外来抗原に対する抗体の生成中に対応する生殖系列ヌクレオチド配列中でin vivoに生成されるものが挙げられる。一実施形態では、誘導体は、ヘテロ抗体、すなわち２またはそれより多くの抗体が一緒に連結される抗体であり得る。誘導体は、化学的に修飾された抗体を包含する。例としては、1つまたは複数のポリマー、例えば水溶性ポリマーの共有結合、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物、糖、リン酸塩および／またはその他のこのような分子が挙げられる。誘導体は、結合される分子の型または位置が天然または出発抗体とは異なるやり方で修飾される。誘導体はさらに、抗体上に自然に存在する1つまたは複数の化学基の欠失を包含する。
一実施形態では、標的化結合物質は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに関する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体の製造方法は、当該技術分野で既知である（例えばMillstein et al., Nature, 305:537-539 (1983);Traunecker etal., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991);Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986);Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992);Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993);Gruber et al.,J. Immunol., 152:5368 (1994);米国特許第４，４７４，８９３号;同第４，７１４，６８１号;同第４，９２５，６４８号;同第５，５７３，９２０号;同第５，６０１，８１号;同第９５，７３１，１６８号;同第４，６７６，９８０号;および同第４，６７６，９８０号;ＷＯ９４／０４６９０;ＷＯ９１／００３６０;ＷＯ９２／２００３７３;ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；およびＥＰ０３０８９を参照）。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質または抗体は、配列番号４２を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号４２は、表１７の各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の組合せのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、配列番号４２は、表１７で示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、いずれか６つ、いずれか７つ、いずれか８つまたは９つすべてを含む。ある実施形態では、配列番号４２は、表１７ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。他の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、ＶＨ３−２１、Ｄ３−１０およびＪＨ４Ｂドメインを有する生殖系列配列に由来し、この場合、1つまたは複数の残基はその位置で対応する生殖系列残基を生じるよう突然変異化されている。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質または抗体は、配列番号４４を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号４４は、表１６の各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、配列番号４４は、表１６で示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたはいずれか３つを含む。ある実施形態では、配列番号４４は、表１６ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。他の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、Ａ３０およびＪＫ１ドメインを有する生殖系列配列に由来し、この場合、1つまたは複数の残基はその位置で対応する生殖系列残基を生じるよう突然変異化されている。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質または抗体は、配列番号１４を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号１４は、表１５の各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１４は、表１５で示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つまたは６つすべてを含む。ある実施形態では、配列番号１４は、表１５ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。他の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、ＶＨ４−３９、Ｄ６−６およびＪＨ４Ｂドメインを有する生殖系列配列に由来し、この場合、1つまたは複数の残基はその位置で対応する生殖系列残基を生じるよう突然変異化されている。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質または抗体は、配列番号１６を含む配列を含む。ある実施形態では、標的化結合物質または抗体はＡ２７およびＪＫ４ドメインを有する生殖系列配列に由来し、この場合、1つまたは複数の残基はその位置で対応する生殖系列残基を生じるよう突然変異化されている。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質または抗体は、配列番号７４を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号７４は、表１９の各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、配列番号７４は、表１９で示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、いずれか６つ、いずれか７つまたは８つすべてを含む。ある実施形態では、配列番号７４は、表１９ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。他の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、ＶＨ３−１１、Ｄ３−３およびＪＨ５Ｂドメインを有する生殖系列配列に由来し、この場合、1つまたは複数の残基はその位置で対応する生殖系列残基を生じるよう突然変異化されている。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質または抗体は、配列番号７６を含む配列を含む。ある実施形態では、配列番号７６は、表１８の各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、配列番号７６は、表１８で示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、いずれか６つ、いずれか７つ、いずれか８つまたは９つすべてを含む。ある実施形態では、配列番号７６は、表１８ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む。他の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、Ｏ２およびＪＫ４ドメインを有する生殖系列配列に由来し、この場合、1つまたは複数の残基はその位置で対応する生殖系列残基を生じるよう突然変異化されている。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲとの結合に関して本発明の標的化結合物質または抗体と競合する標的化結合物質または抗体である。本発明の別の実施形態では、ＫＤＲとの結合に関して本発明の標的化結合物質または抗体と競合する抗体が存在する。別の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、ＫＤＲとの結合に関して完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０または３３Ｃ３のうちのいずれか１つと競合する。「競合する」は、標的化結合物質または抗体が、ＫＤＲとの結合に関して、完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３のうちのいずれか１つと競合する、ということを示し、すなわち、競合は一方向性である。
本発明の実施形態は、ＫＤＲとの結合に関して完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３のうちのいずれか１つと交差競合する標的化結合物質または抗体を包含する。「交差競合する」は、標的化結合物質または抗体が、ＫＤＲとの結合に関して、完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３のうちのいずれか１つと競合し、その逆もある、ということを示し、すなわち、競合は二方向性である。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲの二量体化ドメインとの結合に関して競合する標的化結合物質または抗体である。本発明の別の実施形態では、ＫＤＲの二量体化ドメインとの結合に関して本発明の標的化結合物質または抗体と交差競合する標的化結合物質または抗体が存在する。
本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的化結合物質または抗体と同一のＫＤＲ上エピトープと結合する標的化結合物質または抗体である。本発明の実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３のいずれか１つと同一のＫＤＲ上エピトープと結合する標的化結合物質または抗体も包含する。
本発明の他の実施形態は、本明細書中に記載される標的化結合物質または抗体のいずれかをコードする単離核酸分子、本明細書中に記載される標的化結合物質または抗体をコードする単離核酸分子を有するベクター、あるいはこのような核酸分子のいずれかで形質転換される宿主細胞を包含する。本発明の実施形態は、ＫＤＲと特異的に結合し、ＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を抑制する完全ヒト単離標的化結合物質をコードする核酸分子を包含する。本発明は、本明細書中で定義されるストリンジェントなまたはより低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書中に記載される標的化結合物質または抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。本発明の実施形態は、結合物質をコードする核酸分子を含むベクターも包含する。さらなる実施形態は、核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を包含する。
当該技術分野で知られているように、抗体は、例えばポリクローナル、オリゴクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化および／または完全ヒト抗体であるのが有益であり得る。
本発明の実施形態は、任意の特定形態の抗体、あるいは生成または産生方法に限定されない、と理解される。本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、完全ヒトモノクローナル抗体の結合性断片である。例えば、標的化結合物質は、全長抗体（例えば、無傷ヒトＦｃ領域を有する）または抗体結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、ＦＶまたはｄＡｂ）であり得る。さらに、抗体は、ｄＡｂ断片のようなＫＤＲと結合するラクダまたはヒト単一ＶＨまたはＶＬドメインのような単一ドメイン抗体であり得る。
本明細書中に記載される本発明の実施形態は、これらの抗体を産生するための細胞も提供する。細胞の例としては、ＫＤＲに対する抗体を産生する、ハイブリドーマ、あるいは組換え的に作製される細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞の変異体（例えばＤＧ４４）およびＮＳ０細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞の変異体についてのさらなる情報は、Andersen and Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15, 456-462（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に見出され得る。抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、あるいは抗体をコードする単数または複数の遺伝子で形質転換されているかまたはトランスフェクトされている組換え工学処理細胞から作り出され得る。
さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子が発現されて抗体を産生する条件下で宿主細胞を培養して、その後、抗体を回収することにより、本発明の抗体を産生する方法である。本発明の実施形態は、抗体産生のために宿主細胞中にトランスフェクトされる場合、抗体またはその断片の終了を増大するために最適化される核酸配列を含めて、本発明の抗体またはその断片をコードする任意の核酸分子も包含する、と理解されるべきである。
本明細書中のさらなる実施形態は、ヒトＫＤＲ、ヒトＫＤＲを含有する単離細胞膜、精製ヒトＫＤＲまたはその断片および／またはその断片の1つまたは複数のオルソログ配列を発現する細胞で哺乳動物を免疫感作することによる、ＫＤＲと特異的に結合し、ＫＤＲの生物学的活性を抑制する抗体の産生方法を包含する。
他の実施形態では、本発明は、本発明の標的化結合物質または抗体あるいはその結合性断片、ならびに製薬上許容可能な担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患に罹患している動物を効果的に治療する方法であって、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することによる方法を包含する。ある実施形態では、当該方法はさらに、増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患のための治療を必要とする動物を選択し、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、新生物性疾患に罹患している動物を効果的に治療する方法であって、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することによる方法を包含する。ある実施形態では、当該方法はさらに、新生物性疾患のための治療を必要とする動物を選択し、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、非新生物性疾患に罹患している動物を効果的に治療する方法であって、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することによる方法を包含する。ある実施形態では、当該方法はさらに、非新生物性疾患のための治療を必要とする動物を選択し、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、悪性腫瘍に罹患している動物を効果的に治療する方法であって、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することによる方法を包含する。ある実施形態では、当該方法はさらに、悪性腫瘍のための治療を必要とする動物を選択し、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲ発現に関連した疾患または症状に罹患している動物を効果的に治療する方法であって、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することによる方法を包含する。ある実施形態では、当該方法はさらに、ＫＤＲ発現に関連した疾患または症状のための治療を必要とする動物を選択し、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲ誘導性疾患関連ＶＥＧＦ活性化に罹患している動物を効果的に治療する方法であって、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することによる方法を包含する。ある実施形態では、当該方法はさらに、ＫＤＲ誘導性疾患関連ＶＥＧＦ活性化のための治療を必要とする動物を選択し、ＫＤＲと特異的に結合する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。
悪性腫瘍は、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性疾患および類表皮癌からなる群から選択され得る。
治療可能な増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患としては、新生物性疾患、例えば黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、胆嚢癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性疾患、類表皮癌および白血病、例えば慢性骨髄性白血病が挙げられる。
一実施形態では、新生物性疾患は、黒色腫、結腸癌または慢性骨髄性白血病である。
非新生物性疾患としては、炎症性障害、例えば関節リウマチまたは乾癬、心臓血管性疾患、例えばアテローム硬化症、敗血症、眼疾患、例えば虚血性網膜症または加齢性黄斑変性症が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、ＫＤＲに、単独でまたは一部は、左右される腫瘍を有する患者において、ＫＤＲの抑制に用いるのに適している。
本発明のさらなる実施形態は、増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患に罹患している動物の治療のための薬剤の調製における本発明の標的化結合物質または抗体の使用を包含する。ある実施形態では、使用はさらに、増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患のための治療を必要とする動物を選択することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、新生物性疾患に罹患している動物の治療のための薬剤の調製における本発明の標的化結合物質または抗体の使用を包含する。ある実施形態では、使用はさらに、新生物性疾患のための治療を必要とする動物を選択することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、非新生物性疾患に罹患している動物の治療のための薬剤の調製における本発明の標的化結合物質または抗体の使用を包含する。ある実施形態では、使用はさらに、非新生物性疾患のための治療を必要とする動物を選択することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、悪性腫瘍に罹患している動物の治療のための薬剤の調製における本発明の標的化結合物質または抗体の使用を包含する。ある実施形態では、使用はさらに、悪性腫瘍のための治療を必要とする動物を選択することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲ発現に関連した疾患または症状に罹患している動物の治療のための薬剤の調製における本発明の標的化結合物質または抗体の使用を包含する。ある実施形態では、使用はさらに、ＫＤＲ発現に関連した疾患または症状のための治療を必要とする動物を選択することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲ誘導性疾患関連ＶＥＧＦ活性化に罹患している動物の治療のための薬剤の調製における本発明の標的化結合物質または抗体の使用を包含する。ある実施形態では、使用はさらに、ＫＤＲ誘導性疾患関連ＶＥＧＦ活性化のための治療を必要とする動物を選択することを包含する。
本発明のさらなる実施形態は、増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患に罹患している動物の治療のための薬剤としての使用のための本発明の標的化結合物質または抗体を包含する。
本発明のさらなる実施形態は、新生物性疾患に罹患している動物の治療のための薬剤としての使用のための本発明の標的化結合物質または抗体を包含する。
本発明のさらなる実施形態は、非新生物性疾患に罹患している動物の治療のための薬剤としての使用のための本発明の標的化結合物質または抗体を包含する。
本発明のさらなる実施形態は、悪性腫瘍に罹患している動物の治療のための薬剤としての使用のための本発明の標的化結合物質または抗体を包含する。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲ発現に関連した疾患または症状に罹患している動物の治療のための薬剤としての使用のための本発明の標的化結合物質または抗体を包含する。
本発明のさらなる実施形態は、ＫＤＲ誘導性疾患関連ＶＥＧＦ活性化に罹患している動物の治療のための薬剤としての使用のための本発明の標的化結合物質または抗体を包含する。
一実施形態では、
増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患、
新生物性疾患、
非新生物性疾患、
悪性腫瘍、
ＫＤＲ発現に関連した疾患または症状、あるいは
ＫＤＲ誘導性疾患関連ＶＥＧＦ活性化
の治療が、前記の疾患または症状のいずれかを管理し、改善し、防止することを包含する。
一実施形態では、新生物性疾患の治療は、腫瘍増殖の抑制、腫瘍増殖遅延、腫瘍の退行、腫瘍の縮小、治療停止時の腫瘍の再増殖までの時間延長、腫瘍再発までの時間延長、疾患進行の遅延を包含する。
本発明のいくつかの実施形態では、治療されるべき動物はヒトである。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は完全ヒトモノクローナル抗体である。
本発明のいくつかの実施形態では、標的化結合物質は、完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３からなる群から選択される。
本発明の実施形態は、本明細書中に記載される標的化結合物質、ならびに治療薬を含む共役体を包含する。本発明のいくつかの実施形態では、治療薬は毒素である。他の実施形態では、治療薬は放射性同位体である。さらに他の実施形態では、治療薬は製剤組成物である。
別の態様において、患者における癌性細胞を選択的に死滅させる方法が提供される。当該方法は、完全ヒト抗体共役体を患者に投与することを包含する。完全ヒト抗体共役体は、ＫＤＲと結合し得る抗体および作用物質を含む。作用物質は、毒素、放射性同位体、または癌細胞を死滅させる別の物質である。それにより、抗体共役体は、癌細胞を選択的に死滅させる。
一態様では、ＫＤＲと特異的に結合する共役完全ヒト抗体が提供される。抗体に結合されるのは作用物質であり、抗体の細胞との結合は、細胞への作用物質の送達を生じる。一実施形態では、上記の共役完全ヒト抗体は、ＫＤＲの細胞外ドメインと結合する。別の実施形態では、抗体および共役毒素は、ＫＤＲを発現する細胞によりインターナライズされる。別の実施形態では、作用物質は細胞傷害剤である。別の実施形態では、作用物質は、例えばサポリンまたはアウリスタチン、シュードモナス外毒素、ゲロニン、リシン、カリケアマイシンまたはマイタンシンベースの免疫共役体等である。さらに別の実施形態では、作用物質は放射性同位体である。
本発明の標的化結合物質または抗体は単独で投与され得るか、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて投与され得る。例えば、細胞接着、浸潤、血管新生または増殖を遮断するＫＤＲ抗体のモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナル混合物は、腫瘍細胞増殖を抑制することが示されている薬剤と組合せて投与され得る。
本発明の別の実施形態は、疾患または症状の診断方法であって、本明細書中に開示される抗体が患者または患者試料中のＫＤＲのレベルを検出するために利用される方法を包含する。一実施形態では、患者試料は、血液または血清または尿である。さらなる実施形態では、危険因子の同定、疾患の診断、疾患の段階付けのための方法であって、抗ＫＤＲ抗体を用いるＫＤＲの発現および／または過剰発現の同定を包含する方法が提示される。いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞上のＫＤＲと選択的に結合する完全ヒト抗体共役体を患者に投与することを包含する。抗体共役体は、ＫＤＲと特異的に結合する抗体、ならびに標識を含む。当該方法はさらに、患者における標識の存在を観察することを包含する。相対的に高量の標識は相対的に高い疾患危険度を示し、そして相対的に低量の標識は相対的に低い疾患危険度を示す。一実施形態では、標識は緑色蛍光タンパク質である。
本発明はさらに、患者試料中のＫＤＲのレベルのアッセイ方法であって、本明細書中に開示される抗体を患者からの生物学的試料と接触させること、そして上記抗体と上記試料中のＫＤＲとの間の結合のレベルを検出することを包含する方法を提供する。さらなる具体的な実施形態では、生物学的試料は血液、血漿または血清である。
本発明の別の実施形態は、細胞中のＫＤＲの発現に関連した症状の診断方法であって、血清または細胞を本明細書中に開示される抗体と接触させること、その後、ＫＤＲの存在を検出することからなる方法を包含する。一実施形態では、当該症状は、増殖性、血管新生性、細胞接着または浸潤関連疾患、例えば新生物性疾患（これに限定されない）であり得る。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の組織、細胞または体液中のＫＤＲを検出して、ＫＤＲ関連疾患をスクリーニングするためのアッセイキットを包含する。キットは、本明細書中に開示される抗体、ならびに、存在する場合、抗体とＫＤＲとの反応を示すための手段を包含する。一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、ＫＤＲを結合する抗体は、標識される。別の実施形態では、抗体は非標識の一次抗体であり、キットはさらに、一次抗体を検出するための手段を包含する。一実施形態では、検出するための手段は、抗免疫グロブリンである標識化二次抗体を包含する。抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群から選択されるマーカーで標識され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体は、補体を固定し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を増強するよう修飾され得る。他の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を増強するよう修飾され得る。さらに他の実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を増強し、そして補体を固定し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を増強するよう修飾され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体は、補体を固定し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低減するよう修飾され得る。他の実施形態では、標的化結合物質または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低減するよう修飾され得る。さらに他の実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低減し、そして補体を固定し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低減するよう修飾され得る。
ある実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体の、ならびに本発明の組成物の半減期は、少なくとも約４〜７日である。ある実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体の、ならびに本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約２〜５日、３〜６日、４〜７日、５〜８日、６〜９日、７〜１０日、８〜１１日、８〜１２日、９〜１３日、１０〜１４日、１１〜１５日、１２〜１６日、１３〜１７日、１４〜１８日、１５〜１９日、または１６〜２０日である。他の実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体の、ならびに本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約１７〜２１日、１８〜２２日、１９〜２３日、２０〜２４日、２１〜２５日、２２〜２６日、２３〜２７日、２４〜２８日、２５〜２９日、または２６〜３０日である。さらなる実施形態では、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体の、ならびに本発明の組成物の半減期は、約５０日までであり得る。ある実施形態では、本発明の抗体の、ならびに組成物の半減期は、当該技術分野で既知の方法により延長され得る。このような延長は、次いで、抗体組成物の投与の量および／または頻度を低減し得る。改善されたin vivo半減期を有する抗体、ならびにそれらの調製方法は、米国特許第６，２７７，３７５号;ならびに国際公開番号ＷＯ９８／２３２８９およびＷＯ９７／３４６１に開示されている。
別の実施形態では、本発明は、容器を含めた製品を提供する。容器は、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体を含有する組成物、ならびに細胞接着、浸潤、血管新生および／または増殖関連疾患、例えばＫＤＲの発現または過剰発現により特性化される疾患（これらに限定されない）を治療するために組成物が用いられ得ることを示す包装挿入物またはラベルを包含する。
他の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体を含有する組成物、ならびに治療を必要とする被験者に組成物を投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
本発明は、変異体Ｆｃ領域、すなわち、非天然Ｆｃ領域、例えば1つまたは複数の非天然アミノ酸残基を含むＦｃ領域を含むタンパク質の処方物を提供する。アミノ酸の欠失、付加および／または修飾を含むＦｃ領域も、本発明の変異体Ｆｃ領域により包含される。
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃ領域の結合親和性を増大することにより増大され得る。一実施形態では、Ｆｃ変異体タンパク質は、匹敵する分子に対比して増強された血清半減期を有する。
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域が少なくとも１つの非天然アミノ酸を、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３９、３３０および３３２からなる群から選択される1つまたは複数の位置に含むＦｃ変異体を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体を提供する。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２、２５４および２５６からなる群から選択される1つまたは複数の位置に追加の非天然アミノ酸を含み得る。特定の一実施形態では、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸、ならびにKabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅからなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域が少なくとも１つの非天然アミノ酸を、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４、２３５および３３１からなる群から選択される1つまたは複数の位置に含むＦｃ変異体を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体を提供する。さらに特定の一実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４Ｆ、２３５Ｆおよび３３１Ｓ非天然アミノ酸残基を含む。別の特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓ非天然アミノ酸残基を含む。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２、２５４および２５６からなる群から選択される1つまたは複数の位置に追加の非天然アミノ酸を含み得る。特定の一実施形態では、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸、ならびにKabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅからなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域が少なくとも１つの非天然アミノ酸を、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３９、３３０および３３２からなる群から選択される1つまたは複数の位置に含むＦｃ変異体タンパク質処方物を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体タンパク質処方物を提供する。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２、２５４および２５６からなる群から選択される1つまたは複数の位置に追加の非天然アミノ酸を含み得る。特定の一実施形態では、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸、ならびにKabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅからなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体タンパク質処方物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｆｃ領域が少なくとも１つの非天然アミノ酸を、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４、２３５および３３１からなる群から選択される1つまたは複数の位置に含むＦｃ変異体タンパク質処方物を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体タンパク質処方物を提供する。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２、２５４および２５６からなる群から選択される1つまたは複数の位置に追加の非天然アミノ酸を含み得る。特定の一実施形態では、本発明は、Kabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸、ならびにKabatで設定されるＥＵインデックスにより番号付けした場合、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅからなる群から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸をＦｃ領域が含むＦｃ変異体タンパク質処方物を提供する。
非天然Ｆｃ領域の生成方法は、当該技術分野で知られている。例えば、アミノ酸置換および／または欠失は、突然変異誘発方法、例えば、部位特異的突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985)）、ＰＣＲ突然変異誘発（Higuchi, in “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Academic Press, San Diego, pp.177-183 (1990)）、およびカセット突然変異誘発（Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985)）（これらに限定されない）により生成され得る。好ましくは、部位特異的突然変異誘発は、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法により実施される（Higuchi, in ”PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification”, Stockton Press, New York, pp.61-70 (1989)）。オーバーラップ伸長ＰＣＲ（Higuchi、同上）の手法は、標的配列（出発ＤＮＡ）中に任意の所望の突然変異（単数または複数）を導入するためにも用いられ得る。例えば、オーバーラップ伸長法における第１回のＰＣＲは、外部プライマー（プライマー１）および内部突然変異誘発プライマー（プライマー３）で、そして別個に、第二の外部プライマー（プライマー４）および内部プライマー（プライマー２）で、標的配列を増幅して、２つのＰＣＲセグメント（セグメントＡおよびＢ）を得ることを包含する。内部突然変異誘発プライマー（プライマー３）は、標的配列に対するミスマッチを含有して所望の突然変異（単数または複数）を特定するよう意図される。第２回のＰＣＲでは、第１回のＰＣＲの産物（セグメントＡおよびＢ）は、２つの外部プライマー（プライマー１および４）を用いてＰＣＲにより増幅される。その結果生じる全長ＰＣＲセグメント（セグメントＣ）は制限酵素で消化され、その結果生じる制限断片は適切なベクター中でクローン化される。突然変異誘発の第１ステップとして、出発ＤＮＡ（例えばＦｃ融合タンパク質、抗体または単にＦｃ領域をコードする）は、突然変異誘発ベクター中で機能的にクローン化される。プライマーは、所望のアミノ酸置換を反映するよう意図される。変異体Ｆｃ領域の生成に有用な他の方法は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号;第５，８８５，５７３号;第５，６７７，４２５号；第６，１６５，７４５号;第６，２７７，３７５号;第５，８６９，０４６号；第６，１２１，０２２号;第５，６２４，８２１号;第５，６４８，２６０号；第６，５２８，６２４号;第６，１９４，５５１号;第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号;第６，２７７，３７５号；米国特許公開番号２００４／０００２５８７およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９３５１；ＷＯ９９／５８５７２；ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０２／０６０９１９；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１を参照）。
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書中で提供される抗体のグリコシル化パターンは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を増強するよう修飾される（Shields RL et al., (2002) JBC. 277: 26733;Shinkawa T et al., (2003) JBC. 278: 3466およびOkazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239を参照）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ変異体タンパク質は、1つまたは複数の改変糖型、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子と共有的に結合される炭水化物組成物を含む。改変糖型は、種々の目的に、例えば、エフェクター機能を増強するかまたは低減する（これらに限定されない）のに有用であり得る。改変糖型は、当業者に既知の任意の方法により、例えば、改変または変異体発現菌株を用いることにより、1つまたは複数の酵素、例えばＤＩ Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）による共発現により、種々の生物体または種々の生物体からの細胞株においてＦｃ領域を含む分子を発現することにより、あるいはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物（単数または複数）を修飾することにより、生成され得る。改変糖型の生成方法は当該技術分野で知られており、例としては、Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180;Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74: 288-294;Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740;Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473;米国特許第６，６０２，６８４号;米国特許番号１０／２７７，３７０;米国特許番号１０／１３３，９２９;ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１; ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１; ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１; ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１に記載されたもの;Potillegent（登録商標）技法(Biowa, Inc. Princeton, N.J.)；GlycoMAb（登録商標）グリコシル化工学処理技法（GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland）が挙げられるが、これらに限定されない（例えばＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２０１２５；ＵＳ２００３０１１５６１４；Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49を参照）。
Ｆｃ領域のグリコシル化は、エフェクター機能を増大するかまたは低減するために修飾され得る、ということも当該技術分野で知られている（例えば、Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180;Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74: 288-294;Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740;Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473;米国特許第６，６０２，６８４号;米国特許番号１０／２７７，３７０;米国特許番号１０／１３３，９２９;ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１; ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１; ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１; ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１に記載されたもの;Potillegent（登録商標）技法(Biowa, Inc. Princeton, N.J.)；GlycoMAb（登録商標）グリコシル化改変技法（GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland）を参照）。したがって、一実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基の変更されたグリコシル化を含む。別の実施形態では、アミノ酸残基の変更グリコシル化は、エフェクター機能低下を生じる。別の実施形態では、アミノ酸残基の変更グリコシル化は、エフェクター機能増大を生じる。具体的な一実施形態では、Ｆｃ領域はフコシル化低減を示す。別の実施形態ではＦｃ領域は無フコシル化される（例えば米国特許出願公開番号２００５／０２２６８６７を参照）。
血管長内皮管形成アッセイにおける内皮細胞管形成に及ぼす抑制性ＫＤＲ抗体の作用を示す棒グラフである。抗体はＸ軸上で示され、棒の各群の左から右への濃度は、２０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬおよび０．３１２５μｇ／ｍＬである。 in vivoでの血管新生に及ぼす抑制性ＫＤＲ抗体の作用を示す棒グラフである。Ｘ軸に沿って、１＝ビヒクルを週２回、２＝２４Ｂ３を１０ｍｇ／ｋｇで週２回、３＝２４Ｂ３を１ｍｇ／ｋｇで週２回、４＝３３Ｃ３を１０ｍｇ／ｋｇで週２回、５＝３３Ｃ３を１ｍｇ／ｋｇで週２回である。Ｙ軸は、血管数を示す。
本発明の実施形態は、新規組のＶＥＧＦＲ遮断分子、例えば、リガンドとその受容体との結合を遮断することなくＶＥＧＦＲシグナル伝達を抑制する抗体に関する。このような分子は、単一作用物質として、代替的にはＶＥＧＦ−Ａ結合抗体／作用物質、受容体−リガンド結合を抑制する抗体、ならびにＶＥＧＦＲの小分子阻害剤と組合せて、用いられ得る。それらは、任意の標準または新規の抗癌剤と組合せても用いられ得る。
本発明の実施形態は、ＫＤＲと結合する標的化結合物質に関する。いくつかの実施形態では、標的化結合物質はＫＤＲと結合し、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のタンパク質生成物のＫＤＲとの結合を抑制する。いくつかの実施形態では、標的化結合物質はＫＤＲと結合し、受容体二量体化を抑制する。いくつかの実施形態では、標的化結合物質はＫＤＲと結合し、受容体二量体化およびＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を抑制する。一実施形態では、標的化結合物質はモノクローナル抗体またはその結合性断片である。このようなモノクローナル抗体は、本明細書中では抗ＫＤＲ抗体と呼ばれ得る。
本発明の他の実施形態は、完全ヒト抗ＫＤＲ抗体、ならびに治療的に有用である抗体調製物を包含する。一実施形態では、本発明の抗ＫＤＲ抗体の調製物は、望ましい治療的特性、例えばＫＤＲに関する強い結合親和性、in vitroでＫＤＲチロシンリン酸化を抑制する能力、ならびにin vitroおよびin vivoでＫＤＲ誘導性細胞活性を抑制する能力を有する。
さらに、本発明の実施形態は、疾患を治療するためのこれらの抗体の使用方法を包含する。本発明の抗ＫＤＲ抗体は、健常組織のＫＤＲ媒介による腫瘍発生および腫瘍浸潤を防止するために有用である。さらに、ＫＤＲ抗体は、血管新生に関連した疾患、例えば眼疾患、例えばＡＭＤ、炎症性障害、例えば関節リウマチ、そして心臓血管性疾患および敗血症、ならびに新生物性疾患を治療するために有用であり得る。如何なる特定の理論にも限定されることなく考えると、この抑制の作用機序は、ＫＤＲとの結合からの、および／または受容体の二量体化を抑制し、それにより増殖性シグナルの生産的シグナル伝達および活性化を防止することによる、ＶＥＧＦの抑制を包含し得る。この抑制機序により治療可能である疾患としては新生物性疾患が挙げられるが、これに限定されない。任意の型の悪性腫瘍、例えば転移性癌、リンパ性腫瘍および血管癌により特性化される任意の疾患も、この抑制機序により治療され得る。ヒトにおける癌の例としては、膀胱腫瘍、乳癌、前立腺癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳およびＣＮＳ癌（例えば神経膠腫）、子宮頸癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌；子宮内膜癌、食道癌;眼癌；頭頚部癌;胃癌；上皮内新生物;腎臓癌;喉頭癌；白血病;肝臓癌;肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；リンパ腫、例えばホジキンおよび非ホジキンリンパ腫；黒色腫;骨髄腫；神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、口唇、舌、口および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌；胃癌、精巣癌、甲状腺癌；子宮癌、泌尿器系の癌、ならびにその他の癌腫および肉腫が挙げられる。イヌ、ネコおよびその他のペットにおいて一般的に診断される悪性障害としては、リンパ肉腫、骨肉腫、乳房腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮癌、肺カルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支腺癌、繊維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小神経膠細胞腫、神経芽細胞腫、破骨細胞腫、口腔新生物、繊維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫、生殖扁平上皮細胞癌、伝染性性病腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（例えば、顆粒球肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平上皮細胞癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副腎癌、口腔乳頭腫症、血管内皮腫および嚢胞腺腫、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、繊維肉腫および肺扁平上皮細胞癌が挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類、例えばフェレットでは、癌の例としては、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃腺癌が挙げられる。農場家畜に影響を及ぼす新生物形成としては、白血病、血管周囲細胞腫およびウシ眼新生物（畜牛）；包皮繊維肉腫、潰瘍性扁平上皮細胞癌、包皮癌、結合組織新生物および肥満細胞腫（ウマ）；肝細胞癌（ブタ）；リンパ腫および肺腺腫症（ヒツジ）；肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、細網内皮症、繊維肉腫、腎芽細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫およびリンパ性白血病（鳥類）；網膜芽細胞腫、肝臓新生物形成、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞様白血病および浮袋肉腫（魚）；乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）：慢性、感染性、細菌のコリネバクテリウム・シュードツベルクロシスにより引き起こされるヒツジおよびヤギの接触伝染性疾患ならびにヤーグジークテにより引き起こされるヒツジの接触伝染性肺腫瘍が挙げられる。
本発明の他の実施形態は、生物学的試料中のＫＤＲの量を特定的に確定するための診断アッセイを包含する。アッセイキットは、本明細書中に開示される標的化結合物質または抗体を、このような抗体を検出するために必要な標識とともに包含する。これらの診断アッセイは、細胞接着、浸潤、血管新生または増殖関連疾患、例えば新生物性疾患（これらに限定されない）に関してスクリーニングするのに有用である。
本発明の別の態様は、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストであって、この場合、アンタゴニストはＫＤＲと結合する。一実施形態では、アンタゴニストは標的化結合物質、例えば抗体である。アンタゴニストは、
ｉ)ＫＤＲ、または
ｉｉ）ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体
またはこれらの組合せと結合し得る。一実施形態では、アンタゴニストは、in vitroおよびin vivoでＫＤＲの生物学的活性と拮抗し得る。アンタゴニストは、本明細書中に記載される抗体、例えば抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３または３３Ｃ３から選択され得る。
一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、ＫＤＲと結合し、それによりＫＤＲ受容体チロシンキナーゼ活性を抑制するかまたは抑圧し、それにより細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を抑制し得る。この抑制の作用機序は、アンタゴニストのＫＤＲとの結合、ならびに自然のＫＤＲ特異的リガンド、例えばＶＥＧＦのＫＤＲとの結合の抑制を包含し得る。この抑制の作用機序は、アンタゴニストのＫＤＲとの結合、ならびにＫＤＲの二量体化の抑制を包含し得る。如何なる特定の理論にも縛られることなく考えると、ＫＤＲの生物学的活性の拮抗作用が達成され得る機序としては、ＶＥＧＦのＫＤＲとの結合の抑制、および／または受容体二量体の抑制またはＫＤＲ−ＶＥＧＦ媒介によるシグナル伝達活性の抑制が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３または３３Ｃ３と同一の単数または複数のエピトープと結合する標的化結合物質である。
一実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３または３３Ｃ３と同一の単数または複数のエピトープと結合する抗体である。
一実施形態は、本明細書中に上記の標的化結合物質を産生するハイブリドーマである。一実施形態は、本明細書中に上記の抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマである。一実施形態では、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。別の実施形態では、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３または３３Ｃ３の軽鎖および／または重鎖を産生する。代替的には、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３または３３Ｃ３と同一の単数または複数エピトープと結合する抗体を産生する。
別の実施形態は、本明細書中に上記の標的化結合物質をコードする核酸分子である。一実施形態は、本明細書中で上記の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。一実施形態では、核酸分子は、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする。さらに別の実施形態は、抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３または３３Ｃ３から選択される完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。
本発明の別の実施形態は、本明細書中で上記の単数または複数の核酸分子を含むベクターであって、この場合、ベクターは本明細書中に上記の標的化結合物質をコードする。本発明の一実施形態は、本明細書中で上記の単数または複数の核酸分子を含むベクターであって、この場合、ベクターは本明細書中に上記の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする。
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で上記のベクターを含む宿主細胞である。代替的には、宿主細胞は、１つより多くのベクターを含み得る。
さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子が発現されて標的化結合物質を産生する条件下で宿主細胞を培養して、その後、標的化結合物質を回収することによる本発明の標的化結合物質の産生方法である。本発明の一実施形態は、核酸分子が発現されて抗体を産生する条件化で宿主細胞を培養して、その後、抗体を回収することによる本発明の抗体の産生方法である。
一実施形態では、本発明は、本明細書中で上記の標的化結合物質をコードする少なくとも１つの核酸分子で少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクトし、宿主細胞中で核酸分子を発現して、標的化結合物質を単離することによる標的化結合物質の製造方法を包含する。一実施形態では、本発明は、本明細書中で上記の抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクトし、宿主細胞中で核酸分子を発現して、抗体を単離することによる抗体の製造方法を包含する。
別の態様によれば、本発明は、本明細書中に記載されるアンタゴニストを投与することによるＫＤＲの生物学的活性の拮抗方法を包含する。当該方法は、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびに治療上有効量のＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストを動物に投与することを包含する。
本発明の別の態様は、本明細書で上記の標的化結合物質を投与することによるＫＤＲの生物学的活性の拮抗方法を包含する。当該方法は、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。
本発明の別の態様は、本明細書で上記の抗体を投与することによるＫＤＲの生物学的活性の拮抗方法を包含する。当該方法は、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を動物に投与することを包含する。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性の治療上有効量のアンタゴニストを投与することによる、動物における疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療方法が提供される。当該方法は、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性の治療上有効量のアンタゴニストを動物に投与することを包含する。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の標的化結合物質を投与することによる、動物における疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療方法が提供される。当該方法は、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。標的化結合物質は、単独で投与され得るか、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて投与され得る。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を投与することによる、動物における疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療方法が提供される。当該方法は、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を動物に投与することを包含する。抗体は、単独で投与され得るか、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて投与され得る。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性の治療上有効量のアンタゴニストを投与することによる、動物における癌の治療方法が提供される。当該方法は、癌のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量のアンタゴニストを動物に投与することを包含する。アンタゴニストは、単独で、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて、投与され得る。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の標的化結合物質を投与することによる、動物における癌の治療方法が提供される。当該方法は、癌のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の標的化結合物質を動物に投与することを包含する。標的化結合物質は、単独で、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて、投与され得る。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を投与することによる、動物における癌の治療方法が提供される。当該方法は、癌のための治療を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を動物に投与することを包含する。抗体は、単独で、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて、投与され得る。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を投与することによる、動物における腫瘍細胞増殖、接着、浸潤および／または血管新生を低減するかまたは抑制する方法が提供される。当該方法は、増殖、細胞接着、浸潤および／または血管新生の低減または抑制を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を動物に投与することを包含し得る。抗体は、単独で、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて、投与され得る。
別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を投与することによる、動物における腫瘍増殖および／または転移を低減する方法が提供される。当該方法は、腫瘍増殖および／または転移の低減を必要とする動物を選択すること、ならびにＫＤＲの生物学的活性と拮抗する治療上有効量の抗体を動物に投与することを包含し得る。抗体は、単独で、あるいは付加的抗体または化学療法薬または放射線療法と組合せて、投与され得る。
本発明の別の態様によれば、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストの使用が提供される。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的化結合物質である。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
本発明の別の態様によれば、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストが提供される。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的化結合物質である。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
本発明の別の態様によれば、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質または抗体の使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質または抗体が提供される。
本発明の別の態様によれば、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質または抗体の使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する抗体が提供される。
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌の治療のための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストの使用が提供される。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的化結合物質である。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌の治療のための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストが提供される。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の標的化結合物質である。一実施形態では、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌の治療のための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質の使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌の治療のための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質が提供される。
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌の治療のための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する抗体の使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌の治療のための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する抗体が提供される。
本発明の別の態様によれば、動物における増殖、細胞接着、浸潤および／または血管新生の低減または抑制のための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質または抗体の使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、動物における増殖、細胞接着、浸潤および／または血管新生の低減または抑制のための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質または抗体が提供される。
別の態様によれば、動物における腫瘍増殖および／または転移を低減するための薬剤の製造のためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質または抗体の使用が提供される。
別の態様によれば、動物における腫瘍増殖および／または転移を低減するための薬剤として用いるためのＫＤＲの生物学的活性と拮抗する標的化結合物質または抗体が提供される。
一実施形態では、本発明は、単独でまたは一部が、ＫＤＲ受容体チロシンキナーゼに左右される腫瘍を有する患者においてＫＤＲと拮抗する場合に用いるのに特に適している。
本発明の別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニスト、および製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物が提供される。一実施形態では、アンタゴニストは抗体を含む。本発明の別の態様によれば、ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニスト、および製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物が提供される。一実施形態では、アンタゴニストは抗体を含む。
いくつかの実施形態では、ＫＤＲと特異的に結合する抗体の投与後、清掃剤が投与されて、血液から過剰量の循環抗体を除去する。
抗ＫＤＲ抗体は、患者試料中のＫＤＲの検出に有用であり、したがって、本明細書中に記載されるような疾患状態に関する診断として有用である。さらに、ＫＤＲ媒介によるシグナル伝達活性を有意に抑制するそれらの能力に基づいて（以下の実施例で実証されるように）、抗ＫＤＲ抗体は、ＫＤＲ発現に起因する症候および症状の治療に際して治療効果を有する。具体的な実施形態では、本明細書中の抗体および方法は、ＫＤＲ誘導性細胞接着、浸潤、血管新生、増殖および／または細胞内シグナル伝達に起因する症候の治療に関する。さらなる実施形態は、細胞接着、浸潤、血管新生および／または増殖関連疾患、例えば新生物性疾患、例えば黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌および膵臓癌を治療するために本明細中に記載される抗体および方法を用いることを包含する。抗体は、関節炎、アテローム硬化症、および血管新生を伴う疾患における細胞接着および／または浸潤を治療するのにも有用であり得る。
本発明の別の実施形態は、哺乳動物の組織、細胞または体液中のＫＤＲを検出して、細胞接着−、浸潤−、血管新生−または増殖関連疾患に関してスクリーニングするためのアッセイキットを包含する。キットは、ＫＤＲと結合する標的化結合物質、ならびに、標的化結合物質とＫＤＲとの反応（存在する場合）を示すための手段を包含する。一実施形態では、ＫＤＲを結合する標的化結合物質は標識される。別の実施形態では、標的化結合物質は非標識化物であり、キットはさらに、標的化結合物質を検出するための手段を包含する。好ましくは、標的化結合物質は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。
本発明の別の実施形態は、哺乳動物の組織、細胞または体液中のＫＤＲを検出して、細胞接着−、浸潤−、血管新生−または増殖関連疾患に関してスクリーニングするためのアッセイキットを包含する。キットは、ＫＤＲと結合する抗体、ならびに、抗体とＫＤＲとの反応（存在する場合）を示すための手段を包含する。抗体は、モノクローナル抗体であり得る。一実施形態では、ＫＤＲを結合する抗体は、標識される。別の実施形態では、抗体は非標識化一次抗体であり、キットはさらに、一次抗体を検出するための手段を包含する。一実施形態では、当該手段は、抗免疫グロブリンである標識化二次抗体を包含する。好ましくは、抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群から選択されるマーカーで標識され得る。
本明細書中に開示されるような抗体に関するさらなる実施形態、特徴等を、以下でさらに詳細に提供する。
配列表
本発明の実施形態は、以下の表１に列挙される特定の抗体を包含する。この表は、各抗ＫＤＲ抗体の識別番号を、それぞれ対応する重鎖および軽鎖遺伝子およびポリペプチドの可変ドメインの配列番号とともに報告する。各抗体は、一つの識別番号を与えられている。
Figure 2010534469
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定義
別記しない限り、本明細書中で用いられる科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、状況により必要とされない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数用語は単数を包含する。一般的に、本明細書中に記載される細胞および組織培養、分子生物学ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションと結びつけて用いられる用語法、ならびにその技術は、当該技術分野でよく知られたものであり、一般的に用いられる。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のために、標準技法が用いられる。メーカーの使用説明書に従って、あるいは当該技術分野で一般に成し遂げられるように、または本明細書中に記載されるように、酵素反応および生成技法が実施される。前記の技法および手順は、一般的に、当該技術分野でよく知られた、そして本明細書全体を通して引用され、考察される、種々の一般的な且つより具体的な参考文献に記載されているような従来の方法に従って実施される（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y. (2001))を参照）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学化学と結びつけて用いられる用語法、ならびにその実験室手順および技法は、当該技術分野で周知のそして一般に用いられるものである。化学合成、化学分析、製剤調製、処方および送達ならびに患者の治療に関して、標準技法が用いられる。
本発明の開示に従って用いられる場合、以下の用語は、別記しない限り、以下の意味を有すると理解される。
アンタゴニストまたは阻害剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体またはその断片、あるいはその共役体または融合タンパク質であり得る。ＲＮＡｉの再検討に関しては、Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. 2003 Dec; 55(4): 629-48. Review)を、ならびにアンチセンス（Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 2003 Oct 28; 2003(206); pe47）を参照されたい。
疾患関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖は、任意の異常な、望ましくないまたは病理学的な細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖、例えば腫瘍関連細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖であり得る。細胞接着−および／または浸潤および／または血管新生−および／または増殖−関連疾患としては、非固形腫瘍、例えば白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫、ならびに固形腫瘍、例えば黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽細胞腫、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、胃癌、脳／ＣＮＳの癌、頭頚部癌、肝臓系の癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、子宮頚部癌、肺癌、筋肉の癌、神経の癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、外陰部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胸膜／腹膜の癌、唾液腺癌および類表皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。
化合物は、約２０００ダルトン未満の分子量を有する任意の小分子量化合物を指す。
「ＫＤＲ」という用語は、ＫＤＲタンパク質（ＶＥＧＦＲ２としても知られている）およびＫＤＲ受容体様チロシンキナーゼである分子を指す。
「中和する」または「抑制する」という用語は、標的化結合物質、例えば抗体に言及する場合、標的抗原の活性を排除し、低減し、または有意に低減する抗体の能力に関する。したがって、本発明の「中和」抗ＫＤＲ抗体は、ＫＤＲの活性を排除するかまたは有意に低減し得る。中和ＫＤＲ抗体は、例えば、ネイティブＫＤＲ特異的リガンド、例えばＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を遮断することにより作用し得る。この結合を遮断することにより、ＫＤＲシグナル媒介による活性は、有意にまたは完全に、排除される。理想的には、ＫＤＲに対する中和抗体は、細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を抑制する。
「ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニスト」は、ＫＤＲの活性を排除し、低減しまたは有意に低減し得る。「ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニスト」は、ＫＤＲシグナル伝達を排除し、低減しまたは有意に低減し得る。「ＫＤＲの生物学的活性のアンタゴニスト」は、細胞接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を排除するかまたは有意に低減し得る。
「ＫＤＲシグナル伝達を低減すること」は、本発明の標的化結合物質、抗体またはアンタゴニストの非存在下でのシグナル伝達のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、ＫＤＲシグナル伝達を抑制する。
「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド配列のネイティブタンパク質、断片、または類似体を指す総称的用語として本明細書中で用いられる。それゆえ、ネイティブタンパク質、断片および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明による好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子を軽鎖免疫グロブリン分子、例えばκまたはλ軽鎖免疫グロブリン分子とともに含む組合せ（ならびにその逆）により形成される抗体分子、ならびにその断片および類似体を含む。本発明による好ましいポリペプチドは、単に、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはその断片も含み得る。
「ネイティブ」または「天然」という用語は、一対象に適用される場合に本明細書中で用いる場合、一対象が自然に見出され得る、という事実を指す。例えば、生物体（例えばウイルス）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然の供給源から単離され得、研究室でヒトにより意図的に修飾されていないか、そうでなければ天然のものである。
「機能的に連結される」という用語は、本明細書中で用いる場合、それらの意図された方法でそれらを機能させる関係で存在するそのように記載される構成成分の位置を指す。例えば、コード配列と「機能的に連結される」対照配列は、コード配列の発現が対照配列と比較可能な条件下で達成されるような方法で連結される。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で言及される場合、少なくとも１０塩基長の高分子形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはでオキシヌクレオチド）、あるいは修飾形態のいずれかの型のヌクレオチド、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡへテロ二重鎖を意味する。当該用語は、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを包含する。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で言及される場合、天然ヌクレオチド、ならびに天然および非天然連結により一緒に連結される修飾ヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、一般的に２００塩基またはそれ以下の長さからなるポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常は、一本鎖、例えばプローブである。しかし、例えば遺伝子突然変異体の構築に用いるために、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
本明細書中で言及される「天然ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。本明細書中で言及される「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換糖基等を有するヌクレオチドを包含する。本明細書中で言及される「オリゴヌクレオチド連結」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデート等のようなオリゴヌクレオチド連結を包含する。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986);Stee et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984);Stein etal. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988);Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991);Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991));Stec et al. U.S. Patent No. 5, 151, 510;Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990)（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、所望により、検出のための標識を含み得る。
本明細書中で言及される「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能的に且つ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびその断片は、容易に感知可能な量の非特異的核酸との検出可能な結合を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。当該技術分野で知られている且つ本明細書中で考察されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために、高ストリンジェントな条件が用いられ得る。一般的に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは抗体断片および当該核酸配列間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、さらに典型的には、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％および１００％相同である。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）（０．９ＭのＮａＣｌ／９０ｍＭのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）中でのフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、その後の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での５０〜６５℃での1つまたは複数回の洗浄、約４５℃で、６×ＳＳＣ中でのフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、その後の０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での６０℃での1つまたは複数回の洗浄のような高ストリンジェントな条件、あるいは当業者に既知の任意のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。２つのアミノ酸配列は、それらの配列間で部分的なまたは完全な同一性が存在する場合、「相同」である。例えば、８５％相同は、２つの配列が最大整合するようにアライメントされる場合、８５％のアミノ酸が同一である、ということを意味する。ギャップ（整合されている２つの配列のいずれかにおける）は、整合性を最大にする場合に認められる。５またはそれより小さいギャップ長が好ましく、２またはそれより小さいのがさらに好ましい。代替的には且つ好ましくは、２つのタンパク質配列（または少なくとも約３０アミノ酸長のそれらに由来するポリペプチド配列）は、６より大きい突然変異で得たマトリックスおよびギャップペナルティーでプログラムＡＬＩＧＮを用いて、それらが５より大きいアラインメントスコア（標準偏差単位）を有するならば、この用語が本明細書中で用いられる場合、相同である（Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp.101-110 (Volume 5,Natonal Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10を参照）。２つの配列またはその部分は、さらに好ましくは、ＩＬＩＧＮプログラムを用いて最適にアライメントされる場合、それらのアミノ酸が５０％以上同一であるならば、相同である。２つのオーソログ配列内に相同の異なる領域が存在し得る、と理解されるべきである。例えばマウスおよびヒトオーソログの機能部位は、非機能部位より高度の相同性を有し得る。
「〜に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同である（すなわち、同一であるが、厳密には進化的に関連しない）ということを、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であるということを意味するために、本明細書中で用いられる。
対照的に、「〜と相補的」という用語は、本明細書中で用いる場合、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味する。実例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
「配列同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較ウインドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド単位または残基単位で）、ということを意味する。「配列同一性パーセンテージ」という用語は、比較ウインドウにわたって２つの最適整列配列を比較して、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）またはアミノ酸残基が両方の配列で存在する位置の数を確定して、整合位置の数を得て、整合位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り（すなわち、ウインドウサイズ）、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算定される。「実質的同一性」という用語は、本明細書中で用いる場合、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウインドウにわたって、しばしば、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置のウインドウにわたって、参照配列と比較して、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特質を意味し、この場合、配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウ全体で参照配列の２０％またはそれ未満になる欠失または付加を含み得る配列と参照配列を比較することにより算定される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。
本明細書中で用いる場合、２０の従来アミノ酸およびそれらの略号は慣用的用法に従う（Immunology-A Synthesis (2nd Edition,E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))を参照）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。２０の従来アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−、α-二置換アミノ酸、Ｎ-アルキルアミノ酸、乳酸およびその他の非従来アミノ酸も、本発明のポリペプチドに適した構成成分であり得る。非従来アミノ酸の例としては、以下のものが挙げられる：４-ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，エヌハイフトリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニンおよびその他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４-ヒドロキシプロリン）。本明細書中で用いられるポリペプチド表記法では、標準用法および慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、別記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’−３’付加の方向は転写方向と呼ばれ、ＲＮＡと同一配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’−５’末端であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれる。ＲＮＡと同一配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’−３’末端であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いて、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する、ということを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の相互可換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の一群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり、イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の一群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、ならびにアスパラギン−グルタミンである。
本明細書中で考察される場合、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列中の小変異は、本発明により包含されるものとして意図されるが、但し、アミノ酸配列中の変異は、本明細書中に記載される抗体または免疫グロブリン分子との、少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を保持する。特に、保存的アミノ酸置換が意図される。保存的置換は、関連側鎖を有するアミノ酸の一ファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に、以下のファミリーに分けられる。（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ならびに（４）非荷電性極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。さらに好ましいファミリーは、以下のものである。セリンおよびトレオニンは脂肪族−ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族ファミリーであり、そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンに代わるイソロイシンまたはバリン、あるパルテートに代わるグルタメート、トレオニンに代わるセリンという単離置換、および、あるアミノ酸に代わる構造的に関連したアミノ酸という同様の置換は、特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わないならば、その結果生じる分子の結合機能または特性に重要な影響を及ぼさない、と予測するのは理にかなっている。アミノ酸変化が機能的ペプチドを生じるか否かは、ポリペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることにより容易に確定され得る。アッセイは、本明細書中に詳細に記載されている。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者により容易に調製され得る。断片または類似体の好ましいアミノ−およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近くで起こる。構造および機能ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公有または私有配列データベースと比較することにより同定され得る。好ましくは、既知の構造および／または機能を有する他のタンパク質において生じる配列モチーフまたは予測タンパク質配座ドメインを同定するために、コンピューター比較法が用いられる。既知の三次元構造に折りたたまるタンパク質配列を同定するための方法が知られている（Bowie et al. Science 253: 164 (1991)）。したがって、前記の例は、本明細書中に記載される抗体に従って構造および機能ドメインを限定するために用いられ得る配列モチーフおよび構造的配座を当業者は認識し得る、ということを実証する。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲内である。
概して、タンパク質中のシステイン残基は、システイン−システイン・ジスルフィド結合に関与するか、あるいはそれらが折りたたまれたタンパク質領域の一部である場合、ジスルフィド結合形成から立体的に保護される。タンパク質中のジスルフィド結合形成は複雑な工程であり、これは、環境および特殊化チオール−ジスルフィド交換酵素の酸化還元電位により確定される（Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984;Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44, 2002）。システイン残基がタンパク質構造中に対を有さず、そしてフォールディングにより立体的に保護されない場合、それは、ジスルフィド・シャッフリングとして知られている工程において溶液からの遊離システインでジスルフィド結合を形成し得る。ジスルフィド・スクランブリングとして知られている別の工程では、遊離システインはまた、天然ジスルフィド結合（例えば、抗体構造中に存在するもの）を妨げ、低結合、低生物学的活性および／または低安定性をもたらし得る。
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更し、（４）結合親和性を変更し、ならびに（４）このような類似体の物理化学的または機能的特性を付与するかまたは修飾するものである。類似体は、天然ペプチド配列以外の配列の種々の突然変異を含み得る。例えば、単一のまたは多数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が、天然配列中（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）の外側のポリペプチドの部分で）でなされ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特質を実質的に変えるべきでない（例えば置換アミノ酸は親配列中に生じるらせんを壊すかまたは親配列を特性化する二次構造の他の型を崩壊する傾向があってはならない）。当該技術分野で認められたポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));およびThornton et al., Nature 354: 105 (1991)（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
さらに、このような方法は、鎖内ジスルフィド結合に関与する1つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作って、1つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成するために用いられ得る。
「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗体に抗原結合特異性を付与する抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を示すよう意図される。ＣＤＲは、Kabat系（Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington）ならびにその後の版に従って定義され得る。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。ＣＤＲ（単数または複数）という用語は、場合によって、抗原またはそれを認識するエピトープに対する抗体の親和性により結合に関与するアミノ酸残基の大多数を含有するこれらの領域のうちの１つ、これらの領域のまたはいくつか、または全部でさえある領域を示すためにここで用いられる。
重鎖の第三のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きなサイズ可変性（本質的には、それを生じる遺伝子の整列機序のためのより大きな多様性）を有する。それは２アミノ酸という短さであり得るが、しかし知られている最長サイズは２６である。ＣＤＲ長は、特定の基本的フレームワークにより収容され得る長さによっても変わり得る。機能的には、ＨＣＤＲ３は、一部は、抗体の特異性の確定においてある役割を果たす（Segal et al., PNAS, 71: 4298-4302,1974、Amit et al., Science, 233: 747-753, 1986、Chothia etal., J. Mol. Biol., 196: 901-917, 1987、Chothia et al., Nature, 342: 877-883, 1989、Caton et al., J. Immunol., 144: 1965-1968, 1990、Sharon et al., PNAS, 87: 4814-4817, 1990、Sharon et al., J. Immunol., 144: 4863-4869, 1990、Kabat et al., J. Immunol., 147: 1709-1719, 1991）。
「ＣＤＲの組」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲの組は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲの組はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指す。
本発明のＶＨおよびＶＬドメインおよびＣＤＲの変異体は、アミノ酸配列が本明細書中で意図され、ＫＤＲに対する作用物質および抗体をターゲッティングするのに用いられ得るものを含めて、所望の特質による抗原ターゲッティングのための配列変更または突然変異およびスクリーニングの方法により得られる。所望の特質の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：抗原に特異的である既知の抗体に比して抗原に対する増大された結合親和性；活性が知られている場合、抗原に特異的である既知の抗体に比して抗原活性の増大された中和；特定モル比での抗原に対する既知の抗体またはリガンドとの特殊化競合能力;リガンド−受容体複合体得尾免疫沈降する能力;特定エピトープと結合する能力;ペプチド結合スキャンを用いて、例えば線状および／または束縛立体配座でスクリーニングされるペプチドを用いて同定される線状エピトープ、例えばペプチド配列；非連続残基により形成される配座エピトープ；ＫＤＲまたは下流分子の新規の生物学的活性を調整する能力;ＫＤＲ、および／または任意のその他の所望の特性を結合するかおよび／または中和する能力。
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメインおよび抗原結合部位のアミノ酸配列内に置換を作製するために必要とされる技術は、当該技術分野で利用可能である。本明細書中に開示される抗体分子の変異体は、本発明において産生され、使用され得る。多変数データ分析技法を構造／特性−活性関係に適用するに際して計算化学の先例に従って（Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984）、抗体の定量的活性−特性関係が、周知の数学的技法、例えば統計学的回帰、パターン認識および分類を用いて得られる（Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998);Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Ressoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995);Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22(Paper)). Oxford University Press; (December 2000);Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999);Denison David G.T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F.M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002);Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery）。ある場合には、抗体の特性は、抗体配列、機能的および三次元構造の経験的および理論的モデル（例えば、見込みのある接触残基または算定物理化学的特性の分析）から得られ、これらの特性は、単一に、ならびに組合せて考察され得る。
ＶＨドメインおよびＶＬドメインからなる抗体の抗原結合部位は、典型的には、ポリペプチドの６つのループ（すなわち、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から３つおよび重鎖可変ドメイン（ＶＨ）から３つ）により形成される。既知の原子構造を有する抗体の分析は、抗体結合部位の配列および三次元構造間の関係を解明した。これらの関係は、ＶＨドメインの第三領域（ループ）を除いて、結合部位ループは少数の主要鎖立体配座すなわち正準構造のうちの１つを有する、ということを暗示する。特定のループに形成される正準構造は、ループおよびフレームワーク内領域の両方の重要部位でのある残基のそのサイズおよび存在により確定されることが示されている。
配列−構造関係についてのこの研究は、既知の配列の抗体中のその残基の予測のために用いられ得るが、しかし未知の三次元構造を有するものには用いられず、これは、そのＣＤＲループの三次元構造を保持するに際して重要であり、それゆえ、結合特異性を保持するのに重要である。これらの予測は、先例の最適化実験からの結果に対して予測を比較することにより、支持され得る。構造的アプローチでは、任意の自由に利用可能なまたは市販のパッケージ、例えばＷＡＭを用いて、抗体のモデルが作製され得る。タンパク質可視化および分析ソフトウェアパッケージ、例えばInsightＩＩ（Accelrys, Inc.）またはDeep Viewが次に用いられて、ＣＤＲ中の各位置での考え得る置換を評価し得る。この情報は次に、活性に最小のまたは有益な作用を及ぼすか、あるいは他の望ましい特性を付与すると思われる置換を作製するために用いられ得る。
「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書中で用いる場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、しかし残りのアミノ酸配列は、例えば全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常は少なくとも５０アミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。「類似体」という用語は、本明細書中で用いる場合、推定アミノ酸配列の一部と実質的同一性を有し、以下の特性：（１）適切な結合条件下でのＫＤＲとの特異的結合、（２）適切なＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合を遮断する能力、または（３）ＫＤＲ受容体チロシンキナーゼ活性を抑制する能力：のうちの少なくとも１つを有する、少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長であるかまたはそれより長く、そしてしばしば、全長天然ポリペプチドと同じ長さであり得る。
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドと類似の特性を有する非ペプチド薬として、製薬産業で一般に用いられる。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」または「ペプチドミメティクス」と呼ばれる（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986);Veber and Freidinger TINS p.392 (1985);およびEvans etal. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。このような化合物は、しばしば、コンピューター分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物は、等価の治療的または予防的作用を生じるために用いられ得る。一般的に、ペプチド模倣物は、範例ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体と構造的に類似するが、しかし、当該技術分野で周知の方法により、以下の:--ＣＨ２ＮＨ--、--ＣＨ２Ｓ--、--ＣＨ２-ＣＨ２--、--ＣＨ＝ＣＨ--（シスおよびトランス）、--ＣＯＣＨ２--、--ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ--、および−ＣＨ２ＳＯ--からなる群から選択される連結により任意に取り替えられる1つまたは複数のペプチド結合を有する。同一型のＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の1つまたは複数のアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）は、より安定したペプチドを生成するために用いられ得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む束縛ペプチドは、当該技術分野で既知の方法（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することにより、生成され得る。
抗体は、単独で、または既知の技法により提供される他のアミノ酸配列と組合せて、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、多重特異性抗体、二特異性抗体、触媒的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびに可溶性または結合形態で標識され得る抗体、ならびにその断片、変異体または誘導体であり得る。抗体は、任意の種からであり得る。
本明細書中で用いる場合、「抗体（単数）」および「抗体（複数）」（免疫グロブリン）という用語は、モノクローナル抗体（例えば全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体およびキメラ抗体を包含する。本明細書中で用いる場合、「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、抗原鎖の抗原性決定の特徴と相補的な内表面形状および荷電分布を伴う三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインからなるポリペプチドまたはポリペプチドの群を指す。ネイティブ抗体は、通常は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖と連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。各重鎖および軽鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、少なくとも一端に、可変ドメイン（ＶＨ）を、その後の多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そして他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと一列に並べられ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一列に並べられる。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、λ鎖またはκ鎖として分類される。κ軽鎖の可変ドメインは、本明細書中ではＶＫとしても示される。「可変領域」という用語は、重鎖または軽鎖の可変ドメインを記述するためにも用いられ得る。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。このような抗体は、任意の哺乳動物、例えばヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等（これらに限定されない）に由来し得る。
「抗体（単数）」および「抗体（複数）」という用語は、本発明の抗体の結合性断片を包含し、断片の例としては、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を示す抗体断片、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内発現抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、ならびに上記のいずれかの抗体断片およびエピトープ結合性断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を包含する。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
酵素パパインによる抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても知られる、２つの同一の抗原結合性断片、および抗原結合活性を有さないが、結晶化する能力を有する、「Ｆｃ」断片を生じる。酵素ペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の２つの腕が連結されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を生じる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を交差結合する能力を有する。
「Ｆｖ」は、本明細書中で用いる場合、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。この領域は、密接な非共有的または共有的会合での１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体配置で、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を限定する。集合的に、６つのＣＤＲは抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つだけ含むＦｖの半分）でさえ、完全結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
「Ｆａｂ」は、本明細書中で用いる場合、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の断片を指す。
「ｄＡｂ」は、本明細書中で用いる場合、ヒト抗体の最小機能性結合単位である抗体の断片を指す。「ｄＡｂ」は単一ドメイン抗体であり、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含む。各ｄＡｂは、６つの天然ＣＤＲのうちの３つを含有する（Ward et al., Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989)；Holt, et al., Domain antibodies: protein for therapy, Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)）。１１〜１５ｋＤａの範囲の分子量で、それらは、断片抗原結合（Ｆａｂ）２の４分の１、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子のサイズの半分である。
「ラクダ抗体」は、本明細書中で用いる場合、軽鎖を欠いているが、それにもかかわらず広範な抗原結合レパートリーを有する重鎖二量体からなる抗体分子を指す（Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363: 446-448）。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、この断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインはもう１つの鎖の相補的ドメインとの対合を強いられて、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１;ならびにHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)にさらに詳細に記載されている。
全抗体の断片は結合抗原の機能を実行し得る、ということが示されている。結合性断片の例は、（Ward, E.S. et al., (1989) Nature 341, 544-546）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片;（McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片;（Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片;（ｉｖ）ｄＡｂ断片（Ward, E.S. et al., (1989) Nature 341, 544-546、McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554、Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490）、これはＶＨまたはＶＬドメインからなる;（ｖ）単離ＣＤＲ領域;（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結Ｆａｂ断片を含む二価断片;（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、この場合、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーにより連結される（Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426、Huston et al, (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883）；（ｖｉｉｉ）二特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）;ならびに（ｉｘ）「ダイアボディ」、多価または多重特異性断片（遺伝子融合により構築される）（ＷＯ９４／１３８０４；Holliger P. (1993) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組入れにより安定化され得る（Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245,1996）。ＣＨ３ドメインと接合されたｓｃＦｖを含むミニ抗体も作製される（Hu, S. et al, (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061）。結合性断片の他の例はＦａｂ’（これは、抗体ヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端で２〜３の残基が付加されるという点でＦａｂと異なる）、ならびにＦａｂ’−ＳＨ（これは、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’断片である）である。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間の配列中で広範に異なり、その特定の抗原に対する各特定抗体の結合親和性に寄与する、という事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体を通して均一に分布されるわけではない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方で、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるセグメントに集中される。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、βシート構造の一部を連結し、いくつかの場合にはその一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲにより連結されるβシート形状を大部分は取る４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域にごく近接して、他の鎖からのＣＤＲと一緒に保持されて、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照）。定常ドメインは、一般的に、抗原結合に直接的に関与しないが、しかし抗原結合親和性に影響を及ぼし、種々のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはアポトーシスにおける抗体の関与を示し得る。
「超可変領域」という用語は、本明細書中で用いる場合、抗原とのその結合で関連する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）：Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）、および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）：Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)）を包含する。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、ＣＤＲの側面に位置する可変ドメイン残基である。ＦＲ残基は、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、vaccibodies、線状抗体および二重特異性抗体中に存在する。
本明細書中で用いる場合、標的化結合物質、標的化結合タンパク質、特異的結合タンパク質等の用語は、標的部位と優先的に結合する抗体またはその結合性断片を指す。一実施形態では、標的化結合物質は、１つの標的部位に対してのみ特異的である。他の実施形態では、標的化結合物質は、１つより多くの標的部位に対して特異的である。一実施形態では、標的化結合物質はモノクローナル抗体であり、標的部位はエピトープであり得る。
抗体の「結合性断片」は、組み換えＤＮＡ技術により、あるいは無傷交代の酵素的または化学的切断により産生される。結合性断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂおよび単鎖抗体が挙げられる。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、それぞれ同一の結合部位を有すると理解される。過剰量の抗体が、少なくとも約２０％、４０％、６０％または８０％、さらに通常は約８５％より多く（in vitro競合的結合アッセイで測定した場合）対抗受容体に結合される受容体の量を低減する場合、抗体は、対抗受容体への受容体の接着を実質的に抑制する。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合し得る任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は、通常は、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的活性表面配置からなるが、特異的三次元構造特質、ならびに特異的電荷特質を常に有するというわけではない。抗体は、解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合するといわれる。
「作用物質」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子物質または生物学的物質からの抽出物を意味するために本明細書中で用いられる。
「活性な」または「活性」は、ＫＤＲポリペプチドに関しては、ネイティブＫＤＲポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するＫＤＲポリペプチドの一部を指す。「生物学的」とは、本明細書中で用いる場合、ネイティブＫＤＲポリペプチドの活性に起因する生物学的機能を指す。好ましいＫＤＲ生物学的活性としては、例えばＫＤＲ誘導性細胞接着および浸潤および／または血管新生および／または増殖が挙げられる。
「哺乳動物」は、本明細書中で用いる場合、哺乳動物と考えられる任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「動物」は、本明細書中で用いる場合、哺乳動物と考えられる動物を包含する。好ましくは、動物はヒトである。
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を指す。
「リポソーム」は、本明細書中で用いる場合、本発明のＫＤＲポリペプチドまたはこのようなＫＤＲポリペプチドに対する抗体を含み得る薬剤の哺乳動物への送達のために有用であり得る小胞を指す。
「標識」または「標識される」は、本明細書中で用いる場合、ポリペプチドへの検出可能部分、例えば放射性標識、蛍光標識、酵素的標識、化学発光標識化またはビオチニル基の付加を指す。放射性同位体または放射性核種としては３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられ、蛍光標識としては、ローダミン、ランタニド・リンまたはＦＩＴＣが挙げられ、そして酵素的標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼが挙げられる。
付加的標識としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：酵素、例えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボン酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ライソザイム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼ;染料;付加的蛍光標識または蛍光発光体としては、例えばフルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質」に関してはＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒドおよびフルオレサミン；蛍光化合物、例えばランタニド・クリプターゼおよびキレート化合物、例えばユーロピウム等（Perkin Elmer and Cis Biointernational）；化学発光標識または化学発光化合物、例えばイソルミノール、ルミノールおよびジオキセタン；感作物質；補酵素；酵素基質；粒子、例えばラテックスまたは炭素粒子;金属ゾル；微結晶；リポソーム;細胞等（染料、触媒またはその他の検出可能基でさらに標識され得る）；分子、例えばビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジン；毒素部分、例えばシュードモナス外毒素（ＰＥあるいはその細胞傷害性断片または突然変異体）、ジフテリア毒素あるいはその細胞傷害性断片または突然変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシンまたはその細胞傷害性断片、例えばリシンＡ、アブリンまたはその細胞傷害性断片、サポリンまたはその細胞傷害性断片、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性断片、ならびにブリオジン１またはその細胞傷害性断片の群から選択される毒素部分。
「医薬品または薬剤」という用語は、本明細書中で用いる場合、患者に適正に投与された場合に所望の治療効果を誘導し得る化学化合物または組成物を指す。本明細書中の他の化学用語は、McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に例示されているような、当該技術分野での従来の用法に従って用いられる。
本明細書中で用いる場合、「実質的に純粋な」とは、対象種が、存在する優勢種であり（すなわち、モルを基礎にして、それは組成物中の任意の他の個々の種より豊富に存在する）、好ましくは、実質的に純粋化された分画は、対象種が存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モルを基礎にして）を含む、ということを意味する。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約８０％より多くを、さらに好ましくは約８５％、９０％、９５％および９９％より多くを含む。最も好ましくは、対象種は、本質的に均質になるように（夾雑物種は、従来の検出方法により組成物中に検出され得ない）精製され、この場合、組成物は、本質的に単一高分子種からなる。
「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学的被験者を含む。
「抗体依存性細胞媒介による細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」は、ＩｇＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、好中球およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介による反応を指す。ＡＤＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。当該分子のＡＤＣＣ活性を査定するために、in vitroＡＤＣＣ（例えば米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載）が実施され得る。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的にまたは付加的には、当該分子のＡＤＣＣ活性は、in vivoで、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1988)に開示されているような動物モデルで査定され得る。「補体依存性細胞傷害性」および「ＣＤＣ」は、抗体がそれらの細胞殺傷機能を実行する機序を指す。それは、抗原と複合体を形成するＩｇｓ、ＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃドメインとのＣ１ｑ（補体の第一構成成分の構成要素）の結合により開始される（Hughs-Jones, N.C., and B. Gardner. 1979. Mol. Immunol. 16: 697）。Ｃ１ｑは、７０μｇ／ｍｌの濃度でヒト血清中に存在する約４１０ｋＤａの大型の構造的に複雑な糖タンパク質である（Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37: 151）。２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと共に、Ｃ１ｑは、補体の第一構成成分である複合体Ｃ１を形成する。Ｃ１ｑのＮ末端球形頭のうちの少なくとも２つがＣ１活性化のために、それゆえ、補体カスケードの開始のために、ＩｇのＦｃに結合されなければならない（Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37: 151）。
「抗体半減期」という用語は、本明細書中で用いる場合、それらの投与後の抗体分子の平均生存時間の測定値である抗体の薬理学的特性を意味する。抗体半減期は、例えば、血清または血漿中（すなわち、循環半減期）で、または他の組織で測定する場合の、患者の身体またはその特定の区画からの既知量の免疫グロブリンの５０％を排除するのに必要とされる時間として表され得る。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラス間で変わり得る。概して、抗体半減期の増大は、投与された抗体に関する循環中の平均保持時間（ＭＲＴ）の増大を生じる。
「アイソタイプ」という用語は、抗体の重鎖または軽鎖定常領域の分類を指す。抗体の定常ドメインは抗原との結合に関与しないが、しかし種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、所定のヒト抗体または免疫グロブリンは、免疫グロブリンの５つの主要クラスのうちの１つに割り当てられ得る：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。これらのクラスのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）およびＩｇＧ４（γ４）、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンの構造および三次元立体配置は、よく知られている。種々のヒト免疫グロブリン・クラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのみが、補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいて媒介することが知られている。ヒト軽鎖定常領域は、２つの主なクラス、すなわちκおよびλに分類され得る。
所望により、ＫＤＲを特異的に結合する抗体のアイソタイプは、例えば異なるアイソタイプの生物学的特性を利用するよう切り替えられ得る。例えば、いくつかの状況では、ＫＤＲに対する治療用抗体としての抗体の生成に関連して、抗体が補体を固定し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与し得るのが望ましい。同じことができる抗体の多数のアイソタイプが存在し、例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ネズミＩｇＭ、ネズミＩｇＧ２ａ、ネズミＩｇＧ２ｂ、ネズミＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３。他の実施形態では、ＫＤＲに対する治療用抗体としての抗体の生成に関連して、抗体がエフェクター細胞上のＦｃ受容体を結合し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与し得るのが望ましい。同じことができる抗体の多数のアイソタイプが存在し、例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ネズミＩｇＧ２ａ、ネズミＩｇＧ２ｂ、ネズミＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３。生成される抗体はこのようなアイソタイプを最初は保有する必要はなく、しかしむしろ、生成されるような抗体は任意のアイソタイプを保有し得るし、そして当該技術分野でよく知られている従来の技法を用いて、抗体はその後アイソタイプ切り替えされ得る、と理解される。このような技法としては、直接組換え技法（例えば米国特許第４，８１６，３９７号を参照）、細胞−細胞融合技法（例えば米国特許第５，９１６，７７１号および同第６，２０７，４１８号を参照）等の使用が挙げられる。
例として、本明細書中で考察される抗ＫＤＲ抗体は、完全ヒト抗体である。抗体がＫＤＲとの所望の結合を保有する場合、それは、同一可変領域（抗体の特異性ならびにその親和性のいくつかを限定する）を依然として保有しながら、容易にアイソタイプ切り替えされて、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３アイソタイプを生成し得る。このような分子は、次に、補体を固定し、ＣＤＣに関与し得るし、および／またはエフェクター細胞上のＦｃ受容体と結合し、ＡＤＣＣに関与し得る。
「全血アッセイ」は、天然エフェクターの供給源として非分別血を使用する。血液は、ＦｃＲ発現細胞エフェクター、例えば多形核細胞（ＰＭＮ）および単核球（ＭＮＣ）と一緒に、血漿中に補体を含有する。したがって、全血アッセイは、in vitroでのＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機序の両方の相乗作用の同時評価を可能にする。
「治療上有効な」量は、本明細書中で用いる場合、被験者に何らかの改善または利益を提供する量である。言い換えれば、「治療上有効」量は、少なくとも１つの臨床症候において、何らかの軽減、緩和および／または低減を提供する量である。本発明の方法により治療され得る障害に関連した臨床的症候は、当業者によく知られている。さらに、何らかの利益が被験者に提供される限り、治療効果は完全であるかまたは治癒的である必要はない、と当業者は理解する。
「および／または」という用語は、本明細書中で用いる場合、他のものとともにまたは伴わずに、２つの特定の特徴または構成成分の各々の特定の開示と解釈されるべきである。例えば「Ａ」および／または「Ｂ」は、各々がまさに本明細書中で独立して提示されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示と解釈されるべきである。
抗体構造
基本的抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から成り、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により接合され、重鎖は約１０またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))（この記載内容はすべての目的のために参照により本明細書中で援用される）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
したがって、無傷抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体の場合を除いて２つの結合部位は同一である。
鎖はすべて、ＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により接合される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により一列に並べられて、特異的エピトープとの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖および重鎖はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)）、またはChothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)）;Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989)の定義に従っている。
二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、種々の方法により、例えばハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結により産生され得る（例えば、Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)、Kostelny et al. J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)を参照）。二重特異性抗体は、単一結合部位を有する断片の形態で存在しない（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦｖ）。
典型的には、ＶＨドメインはＶＬドメインと対合されて、抗体抗原結合部位を提供するが、しかしＶＨまたはＶＬドメイン単独は、抗原を結合するために用いられ得る。ＶＨドメイン（表１２を参照）は、ＶＬドメイン（表１３を参照）と対合され、抗体抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬドメインの両方を含むように形成される。
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、ネズミまたはラット可変および／または定常領域を保有する抗体に関連した問題のいくつかを回避する。このようなネズミまたはラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速なクリアランスをもたらし得、あるいは患者による抗体に対する免疫応答の発生をもたらし得る。ネズミまたはラット由来の抗体の利用を回避するために、齧歯類、その他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するよう、齧歯類、他の哺乳動物または動物中への機能性ヒト抗体遺伝子座の導入することにより、完全ヒト抗体が生成され得る。
完全ヒト抗体を生成するための一方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の１０００ｋｂまで、しかしそれ未満のサイズの生殖系列改造断片を含有するよう操作されたマウスのXenoMouse（登録商標）系統の使用による（Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997)およびGreen and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)を参照）。XenoMouse（登録商標）系統は、Amgen, Inc. (Fremont, California, U.S.A)から入手可能である。
このようなマウスは、次に、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生し得、ネズミ免疫グロブリン分子および抗体の産生を欠く。このことを達成するために利用される技法は、米国特許出願第０８／７５９，６２０号（１９９６年１２月３日出願）ならびに国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）およびＷＯ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されている。Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997)も参照されたい（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
マウスのXenoMouse（登録商標）系統の産生は、米国特許出願第０７／４６６，００８号（１９９０年１月１２日出願）、同第０７／６１０，５１５号（１９９０年１１月８日出願）、同第０７／９１９，２９７号（１９９２年７月２４日出願）、同第０７／９２２，６４９号（１９９２年７月３０日出願）、同第０８／０３１，８０１号（１９９３年３月１５日出願）、同第０８／１１２，８４８号（１９９３年８月２７日出願）、同第０８／２３４，１４５号（１９９４年４月２８日出願）、同第０８／３７６，２７９号（１９９５年１月２０日出願）、同第０８／４３０，９３８号（１９９５年４月２７日出願）、同第０８／４６４，５８４号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４６４，５８２号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４６３，１９１号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４６２，８３７号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４８６，８５３号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４８６，８５７号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４８６，８５９号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／４６２，５１３号（１９９５年６月５日出願）、同第０８／７２４，７５２号（１９９６年１０月２日出願）、同第０８／７５９，６２０号（１９９６年１２月３日出願）、米国特許公報２００３／００９３８２０（２００１年１１月３０日出願）、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号および同第５，９３９，５９８号、ならびに日本国特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２号、同第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号および第３ ０６８ ５０７ Ｂ２号にさらに考察され、概説されている。欧州特許ＥＰ ０ ４６３ １５１ Ｂ１（１９９６年６月１２日公開）、国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、国際特許出願ＷＯ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）、ＷＯ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）、ＷＯ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）も参照されたい（上記特許、出願および参考文献の記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
代替的アプローチでは、他（例えばGenPharm International, Inc.）は、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用している。ミニ遺伝子座アプローチでは、外因性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座からの要素（個々の遺伝子）を含入することにより模倣される。したがって、1つまたは複数のＶＨ遺伝子、1つまたは複数のＤＨ遺伝子、1つまたは複数のＪＨ遺伝子、μ定常領域、ならびに通常は第二の定常領域（好ましくは、γ定常領域）が、動物に挿入するための構築物に形成される。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号（Surani等）、および米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号および第６，２５５，４５８号（各々、LongergおよびKay）、米国特許第５，５９１，６６９号および第６，０２３，０１０号（KrimpenfortおよびBerns）、米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号および第５，７８９，２１５号（Berns等）、ならびに米国特許第５，６４３，７６３号（ChoiおよびDunn）、ならびにGenPharm Internationalの米国特許出願第０７／５７４，７４８号（１９９０年８月２９日出願）、同第０７／５７５，９６２号（１９９０年８月３１日出願）、同第０７／８１０，２７９号（１９９１年１２月１７日出願）、同第０７／８５３，４０８号（１９９２年３月１８日出願）、同第０７／９０４，０６８号（１９９２年６月２３日出願）、同第０７／９９０，８６０号（１９９２年１２月１６日出願）、同第０８／０５３，１３１号（１９９３年４月２６日出願）、同第０８／０９６，７６２号（１９９３年７月２２日出願）、同第０８／１５５，３０１号（１９９３年１１月１８日出願）、同第０８／１６１，７３９号（１９９３年１２月３日出願）、同第０８／１６５，６９９号（１９９３年１２月１０日出願）、同第０８／２０９７４１号（１９９４年３月９日出願）に記載されている（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。欧州特許第０５４６０７３号、国際特許出願ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９２／２２６４５号、ＷＯ９２／２２６４７号、ＷＯ９２／２２６７０号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／００５６９号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９６／１４４３６号、ＷＯ９７／１３８５２号およびＷＯ９８／２４８８４号、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたい（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。さらに、Taylor等、1992、Chen等、1993、Tuaillon等、1993、Choi等、1993、Lonberg等、(1994)、Taylor等、(1994)およびTuaillon等、(1995)、Fishwild等、(1996)も参照されたい（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
Kirinは、マイクロセル融合により、染色体の大きい要素または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成も実証している。欧州特許出願第７７３２８８号および第８４３９６１号を参照（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。さらに、Medarexのミニ遺伝子座（Humab）マウスとのKirinのＴｃマウスの交雑育種の結果であるＫＭ（登録商標）マウスが作製されている。これらのマウスは、KirinマウスのヒトＩｇＨ導入染色体およびGenpharmマウスのκ鎖導入遺伝子を保有する（Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4: 91-102）。
ヒト抗体は、in vitro法によっても得られる。適切な例としては、ファージディスプレイ（Medimmune、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(旧Proliferon)、Affimed）、リボソームディスプレイ（Medimmune）、酵母ディスプレイ等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体の調製
本明細書中に記載されるように、抗体は、以下に記載するXenoMouse（登録商標）技法を用いることにより調製された。このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生し得、且つ、ネズミ免疫グロブリン分子および抗体の産生を欠く。これを達成するために利用される技法は、本明細書中の背景の節に開示された特許、出願および参考文献に開示されている。しかしながら、特に、マウスのトランスジェニック産生およびそこからの抗体の好ましい実施形態は、米国特許出願第０８／７５９，６２０号（１９９６年１２月３日出願）、ならびに国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３号（１９９８年６月１１日公開）、およびＷＯ００／７６３１０号（２０００年１２月２１日公開）に開示される（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997)も参照されたい（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
このような技術を用いることにより、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生されている。本質的には、マウスのXenoMouse(登録商標)系統は当該抗原（例えばＫＤＲ）で免疫され、高度免疫化マウスからリンパ細胞(例えばB細胞)が回収され、回収細胞は骨髄系細胞株と融合されて、不死のハイブリドーマ細胞株が調製される。このようなハイブリドーマ細胞株はスクリーニングされて、選択され、当該抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。ＫＤＲに特異的な抗体を産生する多ハイブリドーマ細胞株の産生方法が、本明細書中で提供される。さらに、このような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含めて、このような細胞株により産生される抗体の特性化が、本明細書中で提供される。
あるいは、骨髄腫細胞に融合されてハイブリドーマを作製する代わりに、Ｂ細胞は直接アッセイされ得る。例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞が高度免疫化XenoMouse(登録商標)マウスから単離され、増殖されて、抗体分泌形質細胞に分化し得る。細胞上清からの抗体は、次に、ＫＤＲ免疫原に対する反応性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングされる。上清は、ＫＤＲ上の当該機能性ドメインとの結合に関して異なる抗体をさらにマッピングするために、ＫＤＲの断片に対する免疫反応に関してもスクリーニングされ得る。抗体は、その他の関連ヒトエンドグリコシダーゼに関しても、そしてラット、マウスおよび非ヒト霊長類、例えばカニクイザルに、またＫＤＲのオーソログに対してスクリーニングされ、最後は種交差反応性を確定する。当該抗体を含有するウエルからのＢ細胞は、個体からまたはプールされたウエルからハイブリドーマを作製するための融合を含めた種々の方法により、あるいはＥＢＶに感染させるかまたは既知の不死化遺伝子によりトランスフェクトして、次に適切な倍地中でプレート化することにより、不死化され得る。あるいは、所望の特異性を有する抗体を分泌する単一形質細胞は、次に、ＫＤＲ特異的溶血性プラークアッセイを用いて単離される（例えば、Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48(1996)を参照)。溶解の標的とする細胞は、好ましくは、ＫＤＲ抗原で被覆されたヒツジ赤血球(ＳＲＢＣ)である。
当該免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するＢ細胞培養の存在下で、プラークの形成は、当該形質細胞周囲のヒツジ赤血球の特異的ＫＤＲ媒介による溶解を示す。プラークの中央の単一抗原特異的形質細胞は単離され得、抗体の特異性をコードする遺伝情報は、単一形質細胞から単離される。逆転写とその後のＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、抗体の重鎖および軽鎖可変領域がクローン化され得る。このようなクローン化ＤＮＡは、次に、適切な発現ベクター、好ましくはベクターカセット、例えばｐｃＤＮＡ、さらに好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含有するｐｃＤＮＡベクター中にさらに挿入され得る。生成されたベクターは、次に、宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ、そして転写を誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養され得る。
理解されるように、ＫＤＲを特異的に結合する抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために用いられ得る。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス内(またはウイルスベクター内)にパッケージングすること、および宿主細胞をウイルス(またはベクター)で形質導入することを含めた、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入する任意の既知の方法により、あるいは当該技術分野で知られたトランスフェクション手法（米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）により例示されている）により実行され得る。用いられる形質転換手法は、形質転換されるべき宿主によっている。哺乳動物細胞中に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例としては、デキストラン媒介によるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介によるトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、アメリカ培養細胞コレクション(ＡＴＣＣ)から入手可能な多くの不死化細胞株を包含し、例としては、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎(ＢＨＫ)細胞、サル腎細胞(ＣＯＳ)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばＨｅｐ Ｇ２)、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および多数のその他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい細胞株は、細胞株が高発現レベルを有するか、そして構成性ＫＤＲ結合特性を有する抗体を産生するかを確定することにより選択される。
細胞−細胞融合技法において、任意の所望のアイソタイプを有する重鎖を保有する骨髄腫、ＣＨＯ細胞またはその他の細胞株が調製され、且つ、軽鎖を保有する別の骨髄腫、ＣＨＯ細胞またはその他の細胞株が調製される。このような細胞は、その後、融合され、無傷抗体を発現する細胞株が単離され得る。
したがって、上記のような所望の「構造的」属性を満たす抗体候補が作製される場合、それらは一般的に、アイソタイプ切り替えにより所望の「機能的」属性の少なくともいくつかを提供され得る。
治療用投与および処方物
本発明の実施形態は、疾患のための治療として有用である抗ＫＤＲ抗体の滅菌製剤処方物を包含する。このような処方物は、ネイティブＫＤＲ特異的リガンド、例えばＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を抑制し、それにより、例えば血清または組織ＫＤＲ発現が異常に上昇される病理的症状を有効に治療する。抗ＫＤＲ抗体は、好ましくは、例えばＶＥＧＦのようなネイティブＫＤＲ特異的リガンドを強力に抑制するための十分な親和性を保有し、好ましくは、ヒトにおける稀な用量投与を可能にするのに十分な作用継続時間を有する。作用継続時間延長は、皮下または静脈内注射のような代替的非経口経路による低頻度で且つより便利な投与計画を可能にする。
滅菌処方物は、例えば、抗体の凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、作製され得る。抗体は、通常は、凍結乾燥形態でまたは溶液で貯蔵される。治療用抗体組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内注射用溶液バッグ、または処方物の取り出しを可能にするアダプタを有するバイアル、例えば皮下注射針により刺すことができる栓を有するバイアル中に入れられる。
抗体の投与経路は既知の方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、くも膜下腔内、吸入または病変内経路による注射または注入、腫瘍部位への直接注射によるか、あるいは以下に記載するような徐放系に従う。抗体は、好ましくは、注入またはボーラス注入により連続的に投与される。
治療的に用いられるべき抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態によって決まる。したがって、治療専門家が、最適な治療効果を得るために必要とされるような投与量を滴定し、投与経路を変更することが好ましい。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで抗体を投与する。この治療の経過は、従来のアッセイまたは本明細書に記載のアッセイにより、容易にモニタリングされる。
抗体は、本明細書に記載されるように、製薬上許容可能な担体との混合物で調製され得る。この治療用組成物は、静脈内もしくは鼻または肺を通して、好ましくは液体または粉末エーロゾル(凍結乾燥)として投与され得る。組成物は、所望により、非経口的または皮下的にも投与され得る。全身投与する場合、治療用組成物は、滅菌、発熱物質無含有であって、ｐＨ、等張性および安定性に当然払うべき注意を払った非経口的に許容可能な溶液であるべきである。これらの条件は、当業者に知られている。要するに、本明細書中に記載される化合物の用量処方物（dosage formulation）は、所望の純度を有する化合物と製薬上許容可能な担体、賦形剤、または安定剤とを混合することにより、貯蔵または投与用に調製される。このような物質は、用いられる投与量および濃度で受容者にとって非毒性であり、例としては、緩衝剤、例えば、トリス-ＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩およびその他の有機酸塩;酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ペプチド、例えば、ポリアルギニン；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリジノン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン;単糖、二糖およびその他の炭水化物、例えば、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール;対イオン、例えば、ナトリウムおよび/または非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン、プルロニックまたはポリエチレングリコールが挙げられる。
注射用の滅菌組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003))に記載されるような従来の製薬業務に従って処方され得る。例えば、水または天然植物油、例えばゴマ油、ピーナッツ油または綿実油、あるいは合成脂肪ビヒクル、例えばオレイン酸エチル等のような製薬上許容可能な担体中の活性化合物の溶解または懸濁が所望され得る。緩衝剤、保存剤、酸化防止剤等は、許容可能な製薬業務に従って組み入れられ得る。
徐放性調製物の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが包含され、このマトリックスは成型物、皮膜またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15: 167-277およびLanger, Chem. Tech., (1982) 12: 98-105に記載されたようなポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号)、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー(Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556)、非分解性エチレン−ビニルアセテート(Langer et al.、上記)、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON Depot(登録商標)(乳酸−グリコール酸コポリマーとロイプロリドアセテートとで構成される注射可能なミクロスフェア)、およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第１３３，９８８号)が挙げられる。
エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは100日以上に亘って分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。封入タンパク質が体内に長期間残存する場合、それらは３７℃で湿気に曝露された結果として変性または凝集して、生物学的活性の損失および免疫原性の潜在的変化を生じ得る。合理的戦略は、関与する機序によってタンパク質安定化のために意図され得る。例えば、凝集機序がジスルフィド交換を介しての分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると見出された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水量を制御し、適切な添加剤を使用し、そして特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成され得る。
徐放性組成物は、結晶を懸濁液中に保持し得る適切な処方物中に懸濁された抗体の結晶の調製物も包含する。これらの調製物は、皮下または腹腔内に投与されると、徐放性効果を生じ得る。その他の組成は、リポソームに封入された抗体も含む。このような抗体を含有するリポソームは、それ自体知られた方法により調製される：米国特許第ＤＥ３，２１８，１２１号;Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692;Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4030-4034;欧州特許第５２,３２２号;欧州特許第３６,６７６号;欧州特許第８８,０４６号;欧州特許第１４３,９４９号;欧州特許第１４２,６４１号;日本国特許出願第８３−１１８００８号;米国特許第４,４８５,０４５号および同第４,５４４,５４５号;ならびに欧州特許第１０２,３２４号。
所定の患者に関する抗体処方物の投与量は、疾患の重篤度および種類、体重、性別、食餌、投与期間および経路、その他の医薬品ならびにその他の関連する臨床上の因子を含めて、薬剤の作用を変更することが知られる種々の因子を考慮に入れて、主治医により決定される。治療的有効投与量は、in vitroまたはin vivo方法のいずれかにより確定され得る。
治療に用いられるべき、本明細書中に記載される抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。したがって、治療専門家が、最適な治療効果を得るために必要とされるような投与量を滴定し、投与経路を変更することが好ましい。典型的な一日投与量は、上記の因子に応じて、約０．０００１ｍｇ／患者の体重１ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１００００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれより多くであり得る。投与量は、上記の因子に応じて、０．０００１〜２０ｍｇ／患者の体重１ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇであり得る。典型的には、臨床医が所望の効果を達成する投与量に達するまで治療用抗体を投与する。この治療の経過は、従来のアッセイにより、または本明細書中に記載されるように、容易にモニタリングされる。
本発明の抗体の用量投与は反復され得るし、投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月または少なくとも６ヶ月、間隔を置かれ得る。
本明細書に記載の組成物および方法に従う治療用物質の投与は、処方物に組み込まれて移動、送達、耐容性などを改善する、適切な担体、賦形剤、ならびにその他の作用物質とともに投与される、と理解される。これらの処方物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、蝋、油、脂質、脂質(陽イオン性または陰イオン性)含有小胞(例えばLipofectin(登録商標))、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス(carbowax)(種々の分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。上記のいずれの混合物も、処方物中の活性成分が処方物により不活性化されず、且つ処方物が投与経路に生理学的に適合性で、耐容性であるならば、本発明に従う治療および療法に適切であり得る。Baldrick P.、”Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol. Pharmacol. 32 (2): 210-8 (2000)、Wang. W., “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000)、Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci. 89(8): 967-78 (2000)、Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、ならびに薬剤師によく知られた処方物、賦形剤および担体に関するさらなる情報について、その中に引用された文献も参照されたい。
他の治療薬の設計および生成
本発明に従い、かつＫＤＲに関して本明細書で生成し特徴付けした抗体の活性に基づき、抗体部分を超えた他の治療様式の設計が容易になる。このような様式としては、二重特異性抗体、免疫毒素、および放射線標識治療薬のような高度な抗体治療薬、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｄＡｂなどの抗体断片、ペプチド治療薬の生成、新規足場中のＫＤＲ結合ドメイン、遺伝子療法、特に細胞内発現抗体、アンチセンス治療薬、および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロムＢなどのような非抗体タンパク質足場上のＣＤＲの配置によって（HaanおよびMaggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koideら(1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygrenら(1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469）、あるいはタンパク質足場内のループのアミノ酸残基を無作為化または変異させて所望の標的に対する結合特異性を与えることによって提供され得る。タンパク質内で新しい結合部位を工学処理するための足場は、Nygrenらによって詳細に再検討されている（Nygrenら (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469）。抗体模倣物用のタンパク質足場はＷＯ第００３４７８４号に開示されており、参照によりその全体が本明細書中で援用されるが、その中でその発明者らは、少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンIII型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣物）を記載している。１つ以上のＣＤＲ、例えば１組のＨＣＤＲをグラフトするのに適した足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいずれのドメイン成員によっても提供され得る。足場は、ヒトまたはヒト以外のタンパク質であってよい。非抗体タンパク質足場の利点は、少なくともいくつかの抗体分子より小さくおよび／または製造しやすい足場分子内に抗原結合部位を備え得ることである。小サイズの結合成員は、細胞に入る能力、組織内に深く浸透する能力、または他の構造内の標的に達する能力、あるいは標的抗原のタンパク質キャビティ内部に結合する能力など、有用な生理学的特性を与え得る。非抗体タンパク質足場内の抗原結合部位の使用は、Wess、2004で再検討されている（Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004）。典型的には、安定した足場と１つ以上の可変ループとを有するタンパク質であり、このループのアミノ酸配列を特異的または無作為に変異させて、標的抗原と結合する抗原結合部位を作製する。このようなタンパク質として、S. aureus由来のＡタンパク質のＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、第１０フィブロネクチンIII型ドメイン)、リポカリン、ならびにγクリスタリンおよび他のAffilin（商標）足場（Scilタンパク質）などが挙げられる。他のアプローチの例として、分子内ジスルフィド結合を有する小型タンパク質であるシクロチドを主成分とする合成「ミクロボディ」、マイクロタンパク質（Versabodies（商標）, Amunix）、およびアンキリンリピートタンパク質（DARPins, Molecular Partners）が挙げられる。
本発明の標的化結合物質は、抗体配列および/または抗原結合部位に加えて、他のアミノ酸、例えば、折り畳みドメインのようなペプチドまたはポリペプチドを形成するアミノ酸、あるいは抗原と結合する能力に加えてその分子に別の機能特性を与えるアミノ酸を含み得る。本発明の標的化結合物質は、検出可能な標識を有してもよく、あるいは、(例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して)毒素、標的部分または酵素と結合させてもよい。例えば、標的化結合物質は、抗原結合部位に加えて(例えば、酵素ドメイン内に)触媒部位を含んでいてもよく、その場合、抗原結合部位が抗原に結合して、それにより触媒部位を抗原に向けさせる。触媒部位は、例えば切断によって、抗原の生物学的機能を阻害し得る。
高度な抗体治療薬の生成に関して、補体固定が望ましい性状である場合、例えば二重特異性抗体、免疫毒素、または放射性標識の使用を通して、細胞を死滅させるための補体への依存を回避することが可能であろう。
例えば、（ｉ）２つの抗体、すなわちその一方が、ＫＤＲに対する特異性を有し、他方が、一緒に結合された第２の分子に対して特異性を有する抗体、（ii）ＫＤＲに特異的な1つの鎖、および第２の分子に特異的なもう１つの鎖を有する単一抗体、または（iii）ＫＤＲおよびその他の分子に対して特異性を有する単鎖抗体を含む、二重特異性抗体を生成することができる。周知の技術を使用してこのような二重特異性抗体を生成することができ、例えば、（ｉ）および（ii）に関しては、Fangerら、Immunol Methods 4:72-81 (1994)、ならびにWrightおよびHarris、前掲などを、また（iii）に関しては、Trauneckerら、Int. J. Cancer (補遺) 7:51-52 (1992)などを参照されたい。それぞれの場合において、重鎖活性化受容体に第２の特異性を持たせることができる。重鎖活性化受容体には、ＣＤ１６またはＣＤ６４（例えば、Deoら、Immunol. Today 18:127 (1997)を参照されたい）、あるいはＣＤ８９（例えば、Valeriusら、Blood 90:4485-4492 (1997)を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
当技術分野で周知の技術を利用して抗体を修飾し、免疫毒素として働くようにすることもできる。例えば、Vitetta、Immunol Today 14:252 (1993)を参照されたい。また、米国特許第５１９４５９４号も参照されたい。放射線標識抗体の調製法に関しては、このような修飾抗体も、当技術分野で周知の技術を利用して容易に調製することができる。例えば、Junghansら、Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 （第２版、ChafnerおよびLongo編、Lippincott Raven (1996)）を参照されたい。米国特許第４６８１５８１号、同第４７３５２１０号、同第５１０１８２７号、同第５１０２９９０号（再３５５００）、同第５６４８４７１号、および第５６９７９０２号も参照されたい。免疫毒素および放射線標識分子はどちらも、所望の多量体酵素サブユニットオリゴマー形成ドメインを発現している細胞を死滅させる可能性が高いであろう。
抗体を作用物質（例えば、放射性同位体、医薬組成物、または毒素）と結合させる場合には、その作用物質が、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、ＣＯＸ−２剤、および抗生物質、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される医薬特性を有することが意図される。薬剤を、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗剤、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位化合物、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、オキサリプラチン、ドキソルビシンおよびこれらの類似体、ならびにこれらの組合せからなる群から選択することができる。
毒素の例には、さらに、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス内毒素、カリケアマイシンおよびエスペラミシンのようなエンジインファミリーの成員の分子、ならびにこれらの誘導体、組合せ、および修飾物が含まれる。化学毒素を、デュオカルマイシン（例えば、米国特許第５７０３０８０号および米国特許第４９２３９９０号を参照されたい）、メトトレキセート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチナム、エトポシド、ブレオマイシン、および５−フルオロウラシルからなる群から選択することもできる。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、シトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４６７５１８７号を参照されたい）、メルファラン、および他の関連するナイトロジェンマスタードなども挙げられる。適切な毒素および化学療法剤は、RemingtonのPharmaceutical Sciences、第１９版(Mack Publishing社 1995)、ならびにGoodmanおよびGilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics、第７版(MacMillan Publishing社 1985)に記載されている。他の適切な毒素および／または化学療法剤は当業者に知られている。
放射性同位体の例には、局在化および／または療法に用いることのできるγ線放射体、陽電子放射体、およびＸ線放射体、ならびに療法に用いることのできるβ線放射体およびα線放射体が含まれる。診断、予後診断、および病期分類に有用であることが以前に記載されている放射性同位体も療法に有用である。
抗癌剤および抗白血病剤の非限定的な例には、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、およびモルホリノなどのアントラサイクリン、ならびにこれらの置換誘導体、組合せ、および修飾物が含まれる。例示的な薬剤には、シスプラチナム、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド、およびブレオマイシン、ならびにこれらの誘導体、組合せ、および修飾物が含まれる。抗癌剤または抗白血病剤が、ドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、またはモルホリノダウノルビシンであることが好ましい。
本発明の抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける半減期（例えば血清半減期）が、未修飾の抗体の半減期より長い抗体を包含する。前記抗体半減期は、約１５日間より長く、約２０日間より長く、約２５日間より長く、約３０日間より長く、約３５日間より長く、約４０日間より長く、約４５日間より長く、約２ヶ月間より長く、約３ヶ月間より長く、約４ヶ月間より長く、または約５ヶ月間より長くあり得る。本発明の抗体またはそれらの断片の、哺乳動物、好ましくはヒトにおける半減期の増加により、哺乳動物内の前記抗体または前記抗体断片の血清力価がより高くなり、そのため、前記抗体または前記抗体断片の投与回数を減少させ、および／または投与する前記抗体または前記抗体断片の濃度を低下させることになる。当業者に知られている技術によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が増加する抗体またはそれらの断片を生成することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が増加する抗体またはそれらの断片は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するとして同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失、または挿入）することによって生成することができる（例えば、国際公開ＷＯ第９７／３４６３１号およびＷＯ第０２／０６０９１９号を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が増加する抗体またはそれらの断片は、前記抗体または前記抗体断片に高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー分子を結合させることによって生成することもできる。ＰＥＧは、前記抗体または前記抗体断片のＮ末端またはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合によって、もしくはリジン残基に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーを用いて、または用いず、前記抗体または前記抗体断片に結合させることができる。生物活性の損失が最小となる、直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化を用いることになる。確実にＰＥＧ分子を抗体に適切に結合させるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法によって結合の程度を厳密に観察することになる。未反応のＰＥＧを、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧ結合体から分離することができる。
当業者に理解されるように、上記実施形態では、親和性の値が重要となり得る一方で、抗体の特定の機能により、他の要因も同様またはそれ以上に重要となり得る。例えば、免疫毒素（抗体と結合された毒素）では、標的への抗体の結合作用が有用となり得るが、いくつかの実施形態では、最終結果として毒素が細胞に内在化することが望まれる。したがって、これらの場合には、内在化率の高い抗体が望ましいであろう。したがって、一実施形態では、高効率で内在化する抗体が意図される。高効率の内在化を、内在化抗体率として測定することができ、低い値から１００％までであり得る。例えば、種々の実施形態では、０．１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９９％、および９９〜１００％が高効率であり得る。当業者に理解されるように、所望の効率は種々の実施形態によって、例えば、結合する薬剤、一部位に投与できる抗体量、抗体−薬剤複合体の副作用、処置すべき問題の型（例えば癌型）および重症度に依存して、異なり得る。
他の実施形態では、本明細書に開示の抗体は、ＫＤＲの発現の変化を伴う疾患または障害をスクリーニングするために哺乳動物の組織内または細胞内におけるＫＤＲの発現を検出するアッセイキットを提供する。キットには、ＫＤＲを結合する抗体、および抗体と抗原との反応が存在する場合にそれを示す方法が含まれる。
組合せ
本明細書に定義する標的化結合物質または抗体を単独療法として適用してもよく、あるいは本発明の化合物に加えて従来の外科手術もしくは放射線療法または化学療法を組合せてもよい。そのような化学療法としては、以下の抗腫瘍剤のカテゴリーの１つ以上を挙げることができる。
（ｉ）内科腫瘍学において用いられているような他の抗増殖/抗新生物薬およびそれらの組合せ、例えば、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド、およびニトロソ尿素）；代謝拮抗物質（例えば、ゲムシタビン、ならびに５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素などの抗葉酸剤）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、タキソールおよびタキソテールのようなタキソイド、ならびにポロキナーゼ阻害剤）; ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、およびカンプトテシン）など；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン、およびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害薬（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール、およびエキセメスタンなど）ならびにフィナステリドのような５α−レダクターゼの阻害剤など；
（ｉｉｉ）抗浸潤剤（例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際特許出願ＷＯ第０１／９４３４１号）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５；J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661）のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤、ならびにマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能の阻害剤、あるいはカテプシンの阻害剤、マトリプターゼ、ヘプシン、ウロキナーゼなどのセリンプロテアーゼの阻害剤、ヘパラナーゼの阻害剤など）；
（ｉｖ）細胞傷害性剤、例えば、フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン、クロラムブシル、またはドキソルビシンなどおよびそれらの組合せ、例えば、フルダラビン＋シクロホスファミド、ＣＶＰ：シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＡＣＶＢＰ：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンデシン＋ブレオマイシン＋プレドニゾン、ＣＨＯＰ：シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＣＮＯＰ：シクロホスファミド＋ミトキサントロン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ｍ−ＢＡＣＯＤ：メトトレキセート＋ブレオマイシン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン＋ロイコボリン、ＭＡＣＯＰ−Ｂ：メトトレキセート＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋一定用量のプレドニゾン＋ブレオマイシン＋ロイコボリン、またはＰｒｏＭＡＣＥ ＣｙｔａＢＯＭ：プレドニゾン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋エトポシド＋シタラビン＋ブレオマイシン＋ビンクリスチン＋メトトレキセート＋ロイコボリンなど。
（ｖ）増殖因子機能の阻害剤、例えば、そのような阻害剤として、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［Herceptin（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［Erbitux、C225］、およびSternら、Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29に開示される任意の増殖因子抗体または増殖因子受容体抗体など）が挙げられる；また、そのような阻害剤として、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリー阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）などのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）、ラパチニブなどのｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリー阻害剤、イマチニブなどの血小板由来増殖因子ファミリー阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤などのＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、例えばソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６））、ＭＥＫキナーゼおよび／またはＡＫＴキナーゼを介した細胞シグナル伝達の阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリー阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体（インスリン様増殖因子）キナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８、およびＡＸ３９４５９）、ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ならびにＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬなどの生存シグナル伝達タンパク質の阻害剤、例えばＡＢＴ−７３７なども挙げられる；
（ｖｉ）抗血管新生剤、例えば、血管内皮増殖因子の作用を阻害するもの［例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ（Avastin（商標））ならびに４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４；ＷＯ第０１／３２６５１号の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；ＷＯ第００／４７２１２号の実施例２４０）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７；ＷＯ第９８／３５９８５号）、およびＳＵ１１２４８（スニチニブ；ＷＯ第０１／６０８１４号）などのＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、国際特許出願ＷＯ第９７／２２５９６号、ＷＯ第９７／３００３５号、ＷＯ第９７／３２８５６号、ＷＯ第９８／１３３５４号、ＷＯ第００／４７２１２号、およびＷＯ第０１／３２６５１号に開示されるような化合物、ならびに他の機序で作用する化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、およびアンジオスタチン）］、あるいはコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）またはＣＳＦ１受容体など；
（ｖｉｉ）血管傷害剤、例えば、コンブレタスタチンＡ４ならびに国際特許出願ＷＯ第９９／０２１６６号、ＷＯ第００／４０５２９号、ＷＯ第００／４１６６９号、ＷＯ第０１／９２２２４号、ＷＯ第０２／０４４３４号、およびＷＯ第０２／０８２１３号に開示される化合物など；
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法、例えば、抗ｂｃｌ２アンチセンスであるＧ−３１３９（ゲナセンス）のような、上記の標的に指向されるものなど；
（ｉｘ）遺伝子療法アプローチ、例えば、異常なｐ５３あるいは異常なＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、または細菌のニトロレダクターゼ酵素を使用するようなＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子治療のような、化学療法または放射線療法に対する患者の耐性を高めるアプローチなど；ならびに
（ｘ）免疫療法アプローチ、例えば、ＣＤ５２に指向されるモノクローナル抗体であるアレムツズマブ（campath-1H（商標））を用いた治療またはＣＤ２２に指向される抗体を用いた治療、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのアプローチ、インターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインを用いたトランスフェクション、ＣＴＬＡ−４の機能を阻害するモノクローナル抗体を用いた治療などのＴ細胞アネルギーを低下させるアプローチ、サイトカイントランスフェクト樹状細胞などのトランスフェクトした免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞株を使用するアプローチ、ならびに抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチなどが挙げられる。
（ｘｉ）タンパク質分解阻害剤、例えば、ベルケイド（ボルテゾミブ）などのプロテアソーム阻害剤。
（ｘｉｉ）バイオ治療的療法アプローチ、例えば、受容体のリガンドを隔絶するか、受容体に結合するリガンドを阻止するか、あるいは受容体のシグナル伝達を低下させるか（例えば、受容体の分解を促進する、あるいは発現レベルを低下させるなど）のいずれかの、ペプチドまたはタンパク質（抗体または可溶性外部受容体ドメイン構築物など）を使用するもの。
一実施形態では、本明細書に定義する抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、内科腫瘍学において用いられているような、他の抗増殖/抗新生物薬およびそれらの組合せ、例えば、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド、およびニトロソ尿素）；代謝拮抗物質（例えば、ゲムシタビン、ならびに５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素などの抗葉酸剤）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、タキソールおよびタキソテールのようなタキソイド、ならびにポロキナーゼ阻害剤）; ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、およびカンプトテシン）など、による治療と併用することもできる。
一実施形態では、本明細書に定義する抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、ゲムシタビンによる治療と併用することもできる。
このような併用治療は、それぞれの治療成分を同時に、連続して、あるいは別々に投与する方法によって行うことができる。このような組合せ製品には、本発明の化合物または医薬的に許容されるそれらの塩を上記の用量範囲内で、かつ他の医薬活性剤をその承認用量範囲内で用いる。
以下の実施例は、行った実験および得られた結果を含めて、例示のためにのみ提供するものであって、本明細書の教示に限定されると解釈されるべきではない。
実施例１
免疫化および力価測定
免疫化
可溶性ＫＤＲ（ＶＥＧＦ受容体２Ｄ１−７、カタログ番号676490, Calbiochem）を使用して免疫化を行った。この作戦には、XenoMouse（商標）における免疫化のために、最初の追加免疫で１０μｇ／マウス、その後、次の追加免疫で５μｇ／マウスの可溶性タンパク質を投与した。この免疫化は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９６２０号、ならびに１９９８年６月１１日に発行された国際特許出願ＷＯ第９８／２４８９３号および２０００年１２月２１日に発行された国際特許出願ＷＯ第００／７６３１０号に開示される方法に従って行われ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。この免疫化計画を表２にまとめてある。
力価による回収用動物の選択
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いたネイティブ抗原結合に対するＦＡＣＳ染色によって、あるいは固定化した可溶性ＫＤＲへの結合に対するＥＬＩＳＡアッセイによって、ヒトＫＤＲに対する抗体の力価を試験した。免疫化計画の終了後、マウス骨髄腫細胞ならびに免疫マウスの脾臓およびリンパ節から単離したリンパ球を使用して、実施例２に記載のように、電気穿孔による融合を行った。
Figure 2010534469
実施例２
リンパ球の回収、Ｂ細胞の単離、融合、およびハイブリドーマの作製
免疫マウスを頚椎脱臼で屠殺して、各コホートから流入領域リンパ節を回収してプールした。この計画のために、２種類の回収を行った。回収１には、ＩＤ番号１５７１６６、１５７１６８、１５７５９７、１５７５９９、１５７６００、１５７６０２の６匹のマウスを使用した。回収２には、ＩＤ番号１５７６６２、１５７６６３、１５７６６５、１５７６７２、１５７６９４の５匹のマウスを使用した。
ＤＭＥＭ中ですりつぶして組織から細胞を遊離させることによってリンパ系細胞を分離して、細胞をＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞を計数し、リンパ球１億個あたり０．９ｍＬのＤＭＥＭを細胞の沈殿物に添加して、穏やかに、しかし、完全に細胞を再懸濁した。細胞１億個あたり１００μＬのＣＤ９０＋磁気ビーズを使用して、細胞を磁気ビーズと共に４℃で１５分間インキュベートすることによって細胞を標識した。１０８個までの陽性細胞（または、合計２×１０９細胞まで）を含む、この磁気標識した細胞の懸濁液をＬＳ＋カラム上にロードして、カラムをＤＭＥＭで洗浄した。この全流出液をＣＤ９０陰性分画として回収した（これらの細胞の大部分がＢ細胞であると予想された）。
洗浄して濃縮した６日目のＢ細胞を、ＡＴＣＣから購入した非分泌性骨髄腫細胞P3X63Ag8.653、カタログ番号CRL1580（Kearneyら、J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550）と１：４の比率で混合することによって融合を行った。この細胞混合物を４００×ｇで４分間遠心することによって穏やかに沈殿させた。上清を注ぎ移した後に、１ｍＬピペットを使用して細胞を穏やかに混合した。予熱したＰＥＧ（Ｂ細胞１０６個あたり１ｍＬ）を穏やかに撹拌しながら１分以上かけてゆっくりと添加した後に、１分間混合した。次いで、予熱したＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１０６個あたり２ｍＬ）を穏やかに撹拌しながら２分以上かけて添加した。最後に、予熱したＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１０６個あたり８ｍＬ）を３分以上かけて添加した。
この融合細胞を４００×ｇで６分間遠心して沈殿させ、Ｂ細胞１０６個あたり２０ｍＬの選択培地（ＤＭＥＭ（Invitrogen）、１５％ＦＢＳ（Hyclone）に、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール（すべてInvitrogenより）、ＨＡ−アザセリン・ヒポキサンチンおよびＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン）（どちらもSigmaより）、ならびにＩＬ−６（Boehringer Mannheim）を添加）中に再懸濁した。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、次いで、２００ｍＬの選択培地中に再懸濁して、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養した。
融合後３日目に、細胞を回収し、４００×ｇで８分間遠心して、融合Ｂ細胞１０６個あたり１０ｍＬの選択培地中に再懸濁した。ハイブリドーマ集団のＦＡＣＳ解析を行い、その後、細胞を凍結した。
ハイブリドーマは、選択培地中、通常の操作手順で増殖させた。抗ヒトＫＤＲ抗体を産生する可能性のあるハイブリドーマから残らず回収した上清について、後のスクリーニングアッセイを行った。
実施例３
抗体力価測定：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のネイティブ抗原結合
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてＦＡＣＳ解析を行い、実施例１および２に記載のように作製した、ヒトＫＤＲに対する抗体の力価を測定した。ＨＵＶＥＣを６０，０００細胞／ウェルで播種して、２μＬの試料（１：５０希釈）と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、このウェルを洗浄し、５μｇ／ｍＬのＣｙ５結合ヤギ抗ヒト抗体および５μｇ／ｍＬの７−アミノアクチノマイシン（７ＡＡＤ）と共に４℃で１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ解析を用いて、結合したＫＤＲを検出した。陽性対照はヤギ抗ＫＤＲ抗体（R&D Systems社）であり、陰性対照は未感作ＸＭＧ２血清および未感作ＸＭＧ４（ＸＭ３Ｃ−１）血清であった。後のハイブリドーマ作製のために、ＦＡＣＳ幾何平均蛍光が最も強い動物を選択した。表３に、ＨＵＶＥＣの解析から得られたＦＡＣＳデータの一覧を示す。
Figure 2010534469
実施例４
抗体力価測定：固定化可溶性ＫＤＲとの結合
固定化可溶性ＫＤＲとの結合のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、実施例１および２に記載のように作製した抗体の力価を測定した。
抗体の力価を測定するために、プレートを１μｇ／ｍＬのＫＤＲ（Calbiochem）で４℃で一晩コーティングした。次いで、抗体を含む血清を、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ／１％ミルク）中に１：１００から始めて１：３で２段階に希釈した。血清を入れたプレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄して、次いで、二次抗体（ヤギ抗ヒトIgG Fc POD−Jackson Laboratories）と共に室温で１時間インキュベートした。陽性対照はヤギ抗ＫＤＲ（カタログ番号AF357、R&D Systems社）であり、陰性対照は未感作ＸＭＧ２血清および未感作ＸＭＧ４（ＸＭ３Ｃ−１）血清であった。表４に、結合した抗体の解析から得られたＥＬＩＳＡの測定値のまとめを示す。
Figure 2010534469
実施例５
結合アッセイによるハイブリドーマ上清スクリーニング
実施例１および２に記載のように作製した、抗体を含むハイブリドーマ上清を、固定化可溶性ヒトＫＤＲおよびＫＤＲのＩｇ４−７ドメインの両方に対する結合を測定するアッセイによってスクリーニングした。
固定化可溶性ＫＤＲとの結合によりスクリーニングするために、プレートを２５０ｎｇ／ｍＬのＫＤＲ（Calbiochem）で４℃で一晩コーティングした。コーティングしたプレートをブロッキングして洗浄した後に、候補となるハイブリドーマ上清（１：５希釈）をプレートに移して室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを洗浄して、二次抗体（１：４０００希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。表５に、スクリーニングのための結合した抗体の解析から得られたＥＬＩＳＡ測定値のまとめを示す。
Figure 2010534469
この実験のために、ＫＤＲ抗体の細胞外ドメイン４−７をpSecTagのＤＮＡ発現構築物にクローニングすることによって、Ｉｇ４−７ドメインを含むＫＤＲ抗体（b-KDRIg4-7-myc-his）を得た。この構築物を、一過的にトランスフェクトして２９３Ｔ細胞中で発現させ、発現したＨｉｓタグタンパク質をニッケル（Ｎｉ）カラムクロマトグラフィーで精製した。
ＫＤＲのＩｇ４−７ドメインとの結合によりスクリーニングするために、プレートをまず４μｇ／ｍＬのニュートラアビジン（Pierce）でコーティングして４℃で一晩インキュベートした。次いで、このプレートをブロッキングし、続いて、１μｇ／ｍＬのb-KDRIg4-7-myc-hisと共に室温で１時間インキュベートした。候補となるハイブリドーマ上清（１：５希釈）をプレートに移して室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを洗浄して、ヤギ抗ヒトIgG Fc POD（１：４０００希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。表６に、スクリーニングのための結合した抗体の解析から得られたＥＬＩＳＡ測定値のまとめを示す。
Figure 2010534469
実施例６
ヒトＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）およびマウスＫＤＲ（Ｆｌｋ−１）に対する交叉反応性
該ハイブリドーマ上清中の抗体の交叉反応性を、ＫＤＲマウスオーソログ（マウスＶＥＧＦＲ２、またはＦｌｋ−１）およびヒトＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に対して試験した。ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて交叉反応性を測定した。ＫＤＲマウスオーソログ（Ｆｌｋ−１）に対する交叉反応性が望まれた。しかし、Ｆｌｔ−１で選択した抗体をさらなる解析用に選択した。
プレートを５００ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）／Ｆｃ（Flt-1, カタログ番号321-FL/CF, R&D Systems社）またはマウスＫＤＲ（Ｆｌｋ−１）／Ｆｃ（Flk-1, カタログ番号443-KD/CF, R&D Systems社）でコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。これらのプレートを洗浄してブロッキングした後、コーティングしたこれらのウェルの中に、抗体を含む上清を（１：５希釈で）添加して、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをマウス抗ヒトＩｇＧ２、３、および４と共にインキュベートし、続いて、ヤギ抗マウスIgG Fc PODと共にインキュベートして、結合した抗体の検出および測定を行った。表７に、各基質に対するＥＬＩＳＡ交叉反応性アッセイの結果を示す。
Figure 2010534469
実施例７
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とのネイティブ結合
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてＦＡＣＳ解析を行い、実施例１および２に記載のように作製したハイブリドーマ上清中の抗体のネイティブ結合を確認した。ＨＵＶＥＣを１５，０００細胞／ウェルで播種して、１００μＬの試料上清（１：５０希釈）と共に４℃で１時間インキュベートした。陽性対照はヤギ抗ＫＤＲ抗体（R&D Systems社）であり、陰性対照は同じ希釈率の関連性のないハイブリドーマ上清であった。次いで、細胞を洗浄し、５μｇ／ｍＬのＣｙ５結合ヤギ抗ヒト抗体および５μｇ／ｍＬの７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）と共に４℃で１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ解析を用いて、結合したＫＤＲを検出した。表８に、ＨＵＶＥＣの解析から得られたＦＡＣＳデータの一覧を示す。ＨＵＶＥＣ細胞に強く結合する抗体は、より高い相対結合活性を有すると考えられた。
Figure 2010534469
実施例８
抗体を含む上清の相対力価の測定
内因的にＫＤＲを発現している正常細胞株（ＨＵＶＥＣ）において、抗体がＫＤＲリン酸化をどのくらいよく阻害したかを測定することによって、抗体を含む種々の該上清の相対力価を比較した。１：２０希釈の上清を使用して、ＶＥＧＦ１６５を介したＫＤＲチロシンリン酸化およびＶＥＧＦ−Ｅを介したＫＤＲチロシンリン酸化の両方の阻害試験などのアッセイを行った。ＶＥＧＦ１６５は、ＫＤＲ：ＫＤＲホモ二量体およびＫＤＲ：ＶＥＧＦ受容体−１ヘテロ二量体の両方に結合する。ＶＥＧＦ−Ｅは、ＶＥＧＦ１６５のオルフウイルスホモログであるが、ＶＥＧＦ１６５とは異なり、ＶＥＧＦ−ＥはＫＤＲに特異的に結合するため、ＫＤＲ二量体化の選択的な解析を可能にする（Endocrine Reviews, August 2004, 25(4): 581-611）。
抗体を含む種々の該上清の相対力価も試験して、ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ−Ｅの両方に仲介されるような血清欠乏ＨＵＶＥＣ細胞の生存を阻害できるかどうかを調べた。これらのアッセイも上清の希釈率１：２０で行った。ＨＵＶＥＣ細胞を用いたすべてのインキュベートは、３７℃、５％ＣＯ２で行った。
ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲ活性の阻害を測定するアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を２５，０００細胞／ウェルで播種して、内皮細胞基本培地−２（EBM-2, Clonetics EGM-2 BulletKit, カタログ番号CC-3162）＋２％ＦＣＳ＋増殖補助剤（ヒドロコルチゾン、ｈＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ヘパリン、ＦＢＳ、ｈＥＧＦ、およびＧＡ−１０００）中で一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、補助剤のない培地中で一晩インキュベートした。３日目に、抗体を含む種々の該上清をＨＵＶＥＣ細胞に添加して、２時間インキュベートした。次いで、上清を除去して、最終濃度２ｎＭとなるように５０μＬのＶＥＧＦ１６５で置換した。ＶＥＧＦ１６５と共に７分間インキュベートした後に、細胞を溶解し、細胞の溶解産物をＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲ活性の阻害について測定した。表９に、ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲチロシンリン酸化の阻害レベルを示す、ＥＬＩＳＡ測定値の平均（ｎ＝３）の一覧を示す。
Figure 2010534469
ＶＥＧＦ−Ｅ媒介によるＫＤＲ活性の阻害を測定するアッセイ
上記のように、ＨＵＶＥＣ細胞を播種して、抗体を含む上清と共にインキュベートした。次いで、上清を除去して、最終濃度２ｎＭとなるように５０μＬのＶＥＧＦ−Ｅで置換した。ＶＥＧＦ−Ｅと共に７分間インキュベートした後に、細胞を溶解し、細胞の溶解産物をＶＥＧＦ−Ｅ媒介によるＫＤＲ活性の阻害について測定した。表１０に、ＶＥＧＦ−Ｅ媒介によるＫＤＲチロシンリン酸化の阻害レベルを示すＥＬＩＳＡ測定値の一覧を示す。
Figure 2010534469
ＶＥＧＦ１６５に仲介される血清欠乏ＨＵＶＥＣ細胞の生存を阻害する抗体の能力を測定するアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種して、ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ＋ＶＥＧＦ以外のすべての補助剤（上記を参照されたい）中で一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、抗体を含む種々の該上清（５０μＬのＥＢＭ−２基本培地中で１：１０または１：２０のいずれかに希釈）をＨＵＶＥＣ細胞に添加して、２時間インキュベートした。５０μＬのＶＥＧＦ１６５（最終濃度１ｎＭ）をクロロキン（最終濃度２５ｎＭ、Sigma-Aldrich）および０．０１％ＦＣＳ（最終濃度）と共にこの細胞に添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。次いで、製造業者のプロトコルによって発光基質（Cell Titer Glo, Promega）を添加することにより細胞の生存を測定し、ルミノメーターを用いて検出した。ＨＵＶＥＣの生存の抗体阻害は、相対発光単位（ＲＬＵ）の値が低下することによって示される。表１１に、ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲ活性によるＨＵＶＥＣの生存を示す、ルミノメーター測定値（ｎ＝２）の一覧を示す。
Figure 2010534469
ＶＥＧＦ−Ｅに仲介される血清欠乏ＨＵＶＥＣ細胞の生存を阻害する抗体の能力を測定するアッセイ
上記のように、ＨＵＶＥＣ細胞を播種して、抗体を含む上清と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、抗体を含む種々の該上清（ＥＢＭ−２基本培地中に１：１０希釈）をＨＵＶＥＣ細胞に添加して、２時間インキュベートした。ＶＥＧＦ−Ｅ（Cederlane）を１ｎＭの最終濃度となるように細胞に添加して、細胞を４日間インキュベートした。次いで、発光基質の添加およびルミノメーターアッセイによって上記のように細胞の生存を測定した。表１２に、ＶＥＧＦ−Ｅ最大活性の割合（％）としてみられる阻害の程度の一覧を示す。１００％付近の値は、ＶＥＧＦ−Ｅ活性の完全な阻害に相当する。
Figure 2010534469
実施例９
動態アッセイ
実施例２に記載のように得られたハイブリドーマ上清中の高親和性／高力価の抗体を特定するために、これらの実験を行った。可溶性ＫＤＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Calbiochem）を使用して実験を行った。
多抗原（ＨＡ）定量（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートを、下記に記載の限定抗原定量アッセイと比較してより大量のＫＤＲ（５００ｎｇ／ｍＬ）でコーティングした。このＫＤＲコーティング済みＥＬＩＳＡプレート上に、抗体（Ａｂ）を含む試料を段階希釈し、４℃で一晩インキュベートして、Ａｂ結合を平衡に近づけた。試料中のＡｂの段階希釈は、１：２５〜１：１８，２２５の範囲に及んだ。既知濃度のＫＤＲ特異的抗体の標準曲線を用いて、アッセイの線形範囲を定めた。線形範囲内のデータを用いて、各段階希釈試料中のＫＤＲ特異的Ａｂの相対濃度を導いた。高いＫＤＲ濃度および一晩のインキュベートによってＡｂ親和性の効果が制限され、各試料中に存在するＫＤＲ特異的Ａｂの相対量を定量できた。
限定抗原（ＬＡ）定量（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートを、上記の多抗原定量アッセイと比較してより少量のＫＤＲ（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎｇ／ｍＬ）でコーティングした。一定濃度の抗体（Ａｂ）を含む試料（１：２５希釈）を一晩インキュベートして、Ａｂ結合を平衡に近づけた。低い抗原濃度によって抗体濃度の効果が制限され、抗体をその相対親和性に基づいて順位付けすることができた。
表１３および１４に、所望の中和活性および好ましい結合動態を有したハイブリドーマ株の結果をまとめる。
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実施例１０
ＫＤＲ抗体の構造解析
抗体の可変重鎖および可変軽鎖を配列決定して、これらのＤＮＡ配列を決定した。抗ＫＤＲ抗体の全配列情報を、γ鎖およびκ鎖の各組合せに対するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列で配列表に示す。可変重鎖配列を解析して、ＶＨファミリー、Ｄ領域配列、およびＪ領域配列を決定した。次いで、これらの配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、生殖系列のＶＨ領域、Ｄ領域、およびＪ領域の配列と比較して、体細胞過剰変異を評価した。
表２０は、抗体重鎖領域をこれらと同起源の生殖系列重鎖領域と比較している表である。表２１は、抗体κ軽鎖領域をこれらと同起源の生殖系列軽鎖領域と比較している表である。各ハイブリドーマから回収される姉妹クローン間のアミノ酸配列は同一であることを理解されたい。一例として、３０Ｅ３．３の重鎖および軽鎖の配列は、３０Ｅ３．１および３０Ｅ３．２の配列と同一であろう。表２０および２１を見やすくするために、姉妹クローンを一緒にまとめて、それらに共通の鎖名で識別する。例えば、３０Ｅ３．１、３０Ｅ３．２、および３０Ｅ３．３の配列を、鎖名「３０Ｅ３」のもとでの共通配列として一覧に示す。
免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は複数の生殖系列ＤＮＡセグメントによってコードされ、これらはＢ細胞個体発生の間に、機能的な可変領域（ＶＨＤＪＨまたはＶＫＪＫ）となるように連結される。ＫＤＲに対する抗体反応の分子多様性および遺伝的多様性を詳細に研究した。これらのアッセイは、抗ＫＤＲ抗体に特有ないくつかの点を明らかにした。モノクローナル抗体２９Ａ１１、３２Ｂ２、３０Ｅ３、３０Ｈ１０、および３２Ｃ１１が、Ｄ１−１４を逆相補方向で用いるようであることに注目されたい。
ある抗体がその生殖系列配列とアミノ酸レベルで異なる場合、抗体配列を変異させて生殖系列配列に戻し得ることも理解されたい。このような補正変異は、標準的な分子生物学的技法を用いて、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の部位に、あるいは任意の組合せの変異部位に生じ得る。非限定的な例として、表１６は、モノクローナル抗体２４Ｂ３（配列番号４４）の軽鎖配列が、ＣＤＲ１領域中のＳｅｒからＡｓｎへの変異（変異１）、ＣＤＲ２領域中のＴｈｒからＡｌａへの変異（変異２）、ＣＤＲ３領域中のＡｒｇからＳｅｒへの変異（変異３）によって、対応する生殖系列配列（配列番号１２４）と異なることを示す。したがって、モノクローナル抗体２４Ｂ３の軽鎖をコードしているアミノ酸またはヌクレオチドの配列を修飾して、変異１を変化させ、変異１の部位を生殖系列配列にすることができる。さらに、モノクローナル抗体２４Ｂ３の軽鎖をコードしているアミノ酸またはヌクレオチドの配列を修飾して、変異２または変異３を変化させ、変異２または変異３の部位を生殖系列配列にすることができる。またさらに、モノクローナル抗体２４Ｂ３の軽鎖をコードしているアミノ酸またはヌクレオチドの配列を修飾して、変異１および変異２の両方、あるいは他のあらゆる組合せの２つまたはそれ以上の変異を変化させ、それらの特定部位を生殖系列配列にすることができる。下記の表１５〜１９に、モノクローナル抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３、および３３Ｃ３に対する生殖系列からのこのような変異の部位を例示する。表１５ａ〜１９ａに、モノクローナル抗体２７Ｄ１０、２４Ｂ３、および３３Ｃ３に対する生殖系列からのそのような変異の部位を例示する。それぞれの列は、太字で表示した部位における生殖系列および非生殖系列の残基の固有の組合せを表す。
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当業者は、ＣＤＲ境界を定義する代替法があることに気づくであろう。表２０ａにあるＶＨ ＣＤＲ１の開始残基は、Scaviner D, Barbie V, Ruiz M, Lefranc M-P．Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy, Kappa and Lambda Variable and Joining Regions．Exp Clin Immunogenet 1999, 16:234-240に記載される方法に従って定義されている。表２０ａおよび表２１ａにある残りのＣＤＲ境界は、カバットの定義に従って定義される。
表２０ｂおよび表２１ｂにあるすべてのＣＤＲ境界は、カバットの定義に従って定義される。
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実施例１１
ＫＤＲ抗体の力価測定
ＨＵＶＥＣ細胞においてＶＥＧＦ１６５に誘導されるＫＤＲチロシンリン酸化を阻害する能力に基づいて候補抗体を区別するために、ＫＤＲ候補抗体の力価を測定した。２種類の異なる条件、すなわち、一方は抗体をＨＵＶＥＣ細胞と４℃で１時間プレインキュベートする条件、他方は抗体をＨＵＶＥＣ細胞と３７℃で２４時間プレインキュベートする条件でこのアッセイを行った。
ＨＵＶＥＣ細胞を補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ）中に２５，０００細胞／ウェルで播種して、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を、補助剤のない培地中で、３７℃で一晩インキュベートした。３日目に、５０μＬ／ウェルの候補抗体の段階希釈液または無血清培地（対照用）をＨＵＶＥＣ細胞に添加した。細胞を候補抗体と共に４℃で１時間または３７℃で２４時間のいずれかでプレインキュベートした。プレインキュベーション後、細胞を、５０μＬの２ｎＭ ＶＥＧＦ１６５（Calbiochem）で刺激し、次いで、溶解した。次いで、細胞溶解産物をＥＬＩＳＡによってアッセイした。
表２２に、１時間のプレインキュベーション後の候補抗体のアッセイ結果を示す。表２３に、２４時間のプレインキュベーション後の候補抗体のアッセイ結果を示す。
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実施例１２
アゴニストシグナルを伝達するためのＫＤＲ抗体の特徴付け
次のアッセイは、アゴニストシグナルを伝達できる抗ＫＤＲ抗体の能力を特徴付けするために行った。
ＨＵＶＥＣ細胞を補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ）中に２５，０００細胞／ウェルで播種して、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、培地を補助剤のない培地（ＥＭＢ−２）で置換して、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。３日目に、補助剤のない培地を５０μＬ／ウェルの候補抗体の段階希釈液または無血清培地（対照用）で置換して、細胞を候補抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。プレインキュベーション後、細胞を、２ｎＭのＶＥＧＦ１６５（Calbiochem）で刺激し、次いで、溶解した。次いで、細胞溶解産物をＥＬＩＳＡによってアッセイした。
表２４に、候補抗体のアッセイ結果を、ＶＥＧＦ−１６５によって誘導されるリン酸化活性と比較したリン酸化活性の割合として示す。
Figure 2010534469
実施例１３
精製抗体の相対力価の測定：ＶＥＧＦ１６５媒介による生存の阻害
候補精製抗体の相対力価を試験して、ＶＥＧＦ１６５に仲介される血清欠乏ＨＵＶＥＣ細胞の生存を阻害する能力を調べた。これらのアッセイも１３３ｎＭの抗体濃度で行った。ＨＵＶＥＣ細胞を用いたすべてのインキュベートは、３７℃、５％ＣＯ２で行った。
ＨＵＶＥＣ細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種して、補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ＋ＶＥＧＦ以外のすべての補助剤、実施例８を参照されたい）中で一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、候補抗体をＨＵＶＥＣ細胞に添加し、２時間インキュベートした。ＶＥＧＦ１６５を１ｎＭの最終濃度となるように細胞に添加して、細胞を４日間インキュベートした。次いで、発光基質の添加およびルミノメーターアッセイによって細胞の生存を測定した。表２５に、ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲ活性のＨＵＶＥＣ生存阻害の割合を示す、ルミノメーター測定値（ｎ＝２）の一覧を示す。
Figure 2010534469
実施例１４
精製抗体の相対力価の測定：ＶＥＧＦ媒介によるプロスタグランジン放出の阻害
候補精製抗体の相対力価を試験して、ＶＥＧＦ１６５に仲介されるＨＵＶＥＣ細胞からの６−ケトプロスタグランジンＦ１αの放出を阻害できるかどうかも調べた。これらのアッセイも１３３ｎＭの抗体濃度で行った。ＨＵＶＥＣ細胞を用いたすべてのインキュベートは、３７℃、５％ＣＯ２で行った。
ＨＵＶＥＣ細胞を２０，０００細胞／ウェルで播種して、補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ＋ＶＥＧＦ以外のすべての補助剤、実施例８を参照されたい）中で３日間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、候補抗体をＨＵＶＥＣ細胞に添加し、４℃で２時間インキュベートした。ＶＥＧＦ１６５を１ｎＭの最終濃度となるように細胞に添加して、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いで、それぞれのウェルからの上清試料について、ＶＥＧＦ１６５媒介による６−ケトプロスタグランジンＦ１αの放出を測定した。表２６に、この結果をプロスタグランジン放出の阻害率（％）として示す。
Figure 2010534469
この実施例および実施例１１〜１３（表２２〜２６）に記載のような活性比較実験で得られたデータに基づいて、１４の抗体候補をさらなる解析に進めた。表２７に、さらなる試験用に選択した候補抗体のまとめを示す。
Figure 2010534469
実施例１５
ヒトＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）およびマウスＫＤＲ（Ｆｌｋ−１）に対する、精製ＫＤＲ抗体の交叉反応性
精製抗体の交叉反応性を、ＫＤＲマウスオーソログ（マウスＶＥＧＦＲ２、またはＦｌｋ−１）およびヒトＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に対して試験した。可溶性ＫＤＲ Ｉｇ４−７ドメインおよび全ＫＤＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する抗体の能力も測定した。
実施例６に記載のＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて、交叉反応性実験を行い測定した。簡単に説明すると、精製抗体の段階希釈液（３データポイントにわたる１：１０の連続希釈、開始濃度＝１μｇ／ｍＬ）を、５μｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦＲ１（Flt-1、カタログ番号321-FL/CF、R&D Systems社）、５μｇ／ｍＬのマウスＫＤＲ（Flk-1、カタログ番号443-KD/CF、R&D Systems社））、可溶性ＫＤＲ Ｉｇ４−７（上清、１：１希釈）、または５μｇ／ｍＬの全ＫＤＲ−ＥＣＤ（カタログ番号 676490、Calbiochem）をコーティングしたウェル中に添加した。抗体の対照は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４（Sigma-Aldrich、それぞれカタログ番号15154および#14639）であった。表２８に、各基質に対するＥＬＩＳＡ交叉反応性アッセイの結果を示す。
Figure 2010534469
実施例１６
精製ＫＤＲ抗体の力価比較：ＶＥＧＦ誘導性ＫＤＲチロシンリン酸化の阻害
内因的にＫＤＲを発現している正常細胞株（ＨＵＶＥＣ）において、抗体がＫＤＲリン酸化をどのくらいよく阻止したかを測定することによって、精製抗体の相対力価を比較した。このアッセイには、複数の抗体濃度を使用して行い、ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲチロシンリン酸化を阻止する能力、ＶＥＧＦ１６５媒介による血清欠乏ＨＵＶＥＣの生存を阻止する能力、およびＨＵＶＥＣ細胞からのＶＥＧＦ１６５媒介による６−ケトプロスタグランジンＦ１α放出の阻害についての抗体の試験が含まれた。特記しない限り、ＨＵＶＥＣ細胞を用いたすべてのインキュベーションは、３７℃、５％ＣＯ２で行った。
ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲ活性の阻害を測定するアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を２５，０００細胞／ウェルで播種して、補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ＋ＶＥＧＦ以外のすべての補助剤）中で一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、補助剤のない培地中で一晩インキュベートした。３日目に、種々の精製抗体（開始濃度１００ｎＭで最終濃度６ｐＭまで連続的に１：５希釈）をＨＵＶＥＣ細胞に添加して、４℃で１時間インキュベートした。次いで、培養液を、最終濃度２ｎＭになるように５０μＬのＶＥＧＦ１６５で置換した。ＶＥＧＦ１６５で１０分間刺激した後に、細胞を溶解し、細胞の溶解産物をＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲ活性の阻害について測定した。表２９に、ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲチロシンリン酸化の阻害のレベルをＥＣ５０値および阻害率（％）値として示す。
Figure 2010534469
ＶＥＧＦ１６５媒介による血清欠乏ＨＵＶＥＣ細胞の生存を阻止する抗体の能力を測定するアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種して、補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ＋ＶＥＧＦ以外のすべての補助剤）中で一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、種々の精製抗体をＨＵＶＥＣ細胞に（開始濃度２００ｎＭで最終濃度１３ｐＭまで連続的に１：４希釈で）添加して、４℃で２時間インキュベートした。ＶＥＧＦ１６５を１ｎＭの最終濃度となるように細胞に添加して、細胞を３日間インキュベートした。次いで、発光基質の添加およびルミノメーターアッセイによって細胞の生存を測定した。表３０に、ＶＥＧＦ１６５媒介によるＫＤＲ活性によるＨＵＶＥＣの生存をＥＣ５０値および生存の阻害率（％）として示す。
Figure 2010534469
ＨＵＶＥＣ細胞からのＶＥＧＦ１６５媒介による６−ケトプロスタグランジンＦ １α の放出を阻害する抗体の能力を測定するアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を２０，０００細胞／ウェルで播種して、補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ＋ＶＥＧＦ以外のすべての補助剤）中で３日間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、候補抗体をＨＵＶＥＣ細胞に（開始濃度３３３ｎＭで最終濃度４ｐＭまで連続的に１：５希釈で）添加して、４℃で２時間インキュベートした。ＶＥＧＦ１６５を１ｎＭの最終濃度となるように細胞に添加して、細胞を一晩インキュベートした。次いで、それぞれのウェルからの上清試料について、ＶＥＧＦ１６５媒介による６−ケトプロスタグランジンＦ１αの放出を測定した。表３１に、この結果をＥＣ５０値およびプロスタグランジン放出の阻害率（％）として示す。
Figure 2010534469
実施例１７
精製抗体の結合親和性の測定
ＨＵＶＥＣ細胞中で内因的に発現したＫＤＲに対する精製抗体の結合親和性を測定した。ＨＵＶＥＣ細胞を１５０，０００細胞／ウェルで播種し、精製抗体の段階希釈液と共に４℃で４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−Ｃｙ５および５μｇ／ｍＬの７−アミノアクチノマイシン（７ＡＡＤ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ解析を用いて、結合したＫＤＲを検出した。表３２に、精製抗体を用いたＨＵＶＥＣ細胞の解析から得られたＦＡＣＳデータの一覧を示す。
Figure 2010534469
この実施例および実施例１６（表２９〜３２）に記載の力価の実験およびデータで得られたデータに基づいて、１１の抗体候補をさらなる解析に進めた。表３３に、さらなる試験用に選択した候補抗体のまとめを示す。
Figure 2010534469
実施例１８
ヒト以外の霊長類に対する精製ＫＤＲ抗体の交叉反応性
カニクイザル由来のＫＤＲをクローニングし、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の表面上に発現させた。このアッセイでは、細胞に結合したカニクイザルＫＤＲに対する精製抗体の結合を（親細胞を陰性対照として）ＦＡＣＳ解析によって試験した。
カニクイザルＫＤＲを３断片でクローニングした。１断片はカニクイザルの肺のｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、残りの２断片はカニクイザルの腎臓のｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。この３種類のＰＣＲ産物を、pCR3.1 Bidベクターに挿入した。次いで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をカニクイザルＫＤＲ発現ベクターまたは空のpCR3.1 Bidベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種し、５μｇ／ｍＬの候補抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、二次抗体（Ｃｙ５結合ヤギ抗ヒト抗体またはＣｙ５結合ウサギ抗ヤギ抗体に７−アミノアクチノマイシン（７ＡＡＤ）を添加）と共に４℃で１５分間インキュベートした。カニクイザルＫＤＲと精製抗体との間の結合をＦＡＣＳ解析によって検出した。表３４に、このアッセイの結果のまとめを示す。
Figure 2010534469
実施例１９
精製抗体の相対力価の測定：ＫＤＲに対するＶＥＧＦの結合を阻止する能力
抗体が、ＫＤＲに対するヒトＶＥＧＦの結合をどのくらいよく阻止したかによって、種々の抗体の相対力価をアッセイした。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をヒトＫＤＲ（Amgen Fremont, Fremont CAの提供）または空のpCR3.1 Bidベクターでトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞を５０，０００細胞／ウェルで播種し、５μｇ／ｍＬの候補抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。その後、抗体を除去して、細胞を５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ１６５（カタログ番号 293-VE、R&D Systems社）と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、ヤギ抗ＶＥＧＦと共に４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞をＣｙ５結合ウサギ抗ヤギ抗体および７ＡＡＤと共に４℃で１５分間インキュベートした。ＫＤＲに対するＶＥＧＦの結合の阻害をＦＡＣＳ解析によって検出した。表３５に、このアッセイの結果のまとめを示す。
Figure 2010534469
上記の結果より、これらの抗体はＩＭＣ１１２１ｂ（Luら、JBC 2003, 278, 43496）と比較して分化した作用様式を有することが示される。
実施例２０
精製抗体の相対力価の測定：ＶＥＧＦ−Ｃ媒介によるＫＤＲ活性を阻止する能力
抗ＫＤＲ候補抗体を、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＶＥＧＦ−Ｃ媒介によるＫＤＲチロシンリン酸化を阻害するそれらの能力についてアッセイした。ＨＵＶＥＣ細胞を２５，０００細胞／ウェルで播種して、補助剤入り培地（ＥＢＭ−２＋２％ＦＣＳ＋ＶＥＧＦ以外のすべての補助剤）中で一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、補助剤のない培地中で一晩インキュベートした。３日目に、種々の精製抗体をＨＵＶＥＣ細胞に（３データポイントにわたる１：１０の連続希釈、開始濃度＝１００ｎＭで）添加して、４℃で２時間インキュベートした。次いで、上清を除去して、最終濃度５０ｎＭとなるように５０μＬのＶＥＧＦ−Ｃで３７℃で１０分間置換した。ＶＥＧＦ−Ｃを刺激した後に、細胞を溶解し、ＶＥＧＦ−Ｃ媒介によるＫＤＲ活性の阻害について細胞の溶解産物をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。表３６に、ＶＥＧＦ−Ｃ媒介によるＫＤＲチロシンリン酸化の阻害レベルを示すアッセイの結果を示す。
Figure 2010534469
実施例２１
BIACOREによる精製抗体の結合親和性の測定
標準的なアミンカップリング法を用いて、各精製抗ＫＤＲ抗体をBiacore 2000内のセンサーチップＣＭ４上に固定した。固定化レベルを、２５０ＲＵと３５０ＲＵとの間に保った。ＫＤＲの濃度をＵＶ−ＶＩＳ分光法によって決定した。このとき、２８０ｎｍで１１０，４４０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いたが、これは、Paceらによって開発された方法（G.R. GrimsleyおよびC. N. Pace (2003) in Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), 3.1.1-3.1.9）を使用してタンパク質の配列から算出した。抗原ＫＤＲを５２ｎＭの開始濃度に希釈して、３倍の希釈系列３つで試験した。ＨＢＳ−Ｐと０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むランニング緩衝液および結合レスポンスを２３℃で回収した。結合複合体は、１４６ｍＭのリン酸の１２秒のパルスで再生成された。レスポンスデータを単純な１：１の相互作用モデルで全般的にフィッティングした。これらの結合定数を下記の表に示す。括弧内に示す数は、最後の有効数字の標準誤差である。
Figure 2010534469
実施例２２
精製抗ＫＤＲ抗体による、ＫＤＲに対する交差競合の測定
細胞接着アッセイを用いて各精製抗ＫＤＲ抗体を試験して、ヒトＫＤＲに対する他の抗ＫＤＲ抗体の結合を阻止するそれらの能力について調べた。
９６ウェルプレートのウェルを、１０μｇ／ｍＬ ＰＢＳの濃度の３３Ｃ３、２４Ｂ３、または２７Ｄ１０を用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、このウェルを、ＰＢＳ／３％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した。精製抗ＫＤＲ抗体の段階希釈液を、最高濃度の２５μｇ／ｍＬを使用して、ＫＤＲに対する交差競合について、コーティングしたそれぞれの抗体に対して試験した。アイソタイプ対照ＩｇＧ１およびＩｇＧ２（Sigma-Aldrich、それぞれカタログ番号I5154およびI5404）が含まれた。抗体の希釈液を無血清のHams F12培地中に最終的なアッセイ濃度の１０倍で調製して、１０μＬを３種類の試験用ウェルに添加した。ヒトＫＤＲでトランスフェクトしたブタ大動脈内皮細胞を、９０μＬの無血清Hams F12培地中に１ウェルあたり１００，０００細胞の濃度で添加した。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。非接着細胞をプレートから落とし、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。接着細胞を、１００％エタノールを用いて室温で３０分間固定し、次いで、１．５％メタノール中の０．１％クリスタルバイオレットを用いて室温で１５分間染色した。余分な色素を水で洗い落とし、二重蒸留水中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を1ウェルあたり１００μＬ用いて細胞内の色素を回転プラットフォーム上で２時間可溶化した。５７０ｎｍにおけるＯＤを測定して、各抗体による結合の阻害率（％）を算出した。
表に、２５μｇ／ｍＬの阻害抗体による、コーティング抗体に対する細胞の結合の阻害率（％）として、ヒトＫＤＲに対する各抗体間の交差競合を示す。
Figure 2010534469
実施例２３
ＫＤＲ阻害抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの管形成を減少させる
ＫＤＲ阻害抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養解析（TCS Cell Works カタログ番号ZHA-1000）において内皮細胞管形成を減少させる能力について試験した。１日目に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト二倍体線維芽細胞を２４ウェルプレート中の共培養物として得た。ＫＤＲ阻止抗体を以下の濃度で１日目に、かつ一定の間隔で１１日間にわたって培養物に導入した：２０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、および０．３１２５μｇ／ｍＬ。４日目、７日目、および９日目に培養液を補充した。この共培養モデルを、ＴＣＳ最適化培地（共培養解析と共に供給される）中、あるいは２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＭＣＤＢ１３１培地（以下、２％ＦＳ ＭＣＤＢ１３１培地と記載する）中のいずれかで維持した。共培養モデルを、湿気を与えた５％ＣＯ２／９５％大気の空気環境中、３７°Ｃで維持した。
１１日目に、製造業者の使用説明書に従って細管染色キット（TCS Cell Works カタログ番号ZHA-1225）を使用して、細管のＣＤ３１を固定し染色した後に細管形成を検査した。簡単に説明すると、細胞を、氷冷した７０％エタノールを用いて室温で３０分間固定した。細胞をブロッキングした後に、抗ヒトＣＤ３１を用いて室温で６０分間処理した。プレートを洗浄して、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を結合したヤギ抗マウスＩｇＧを用いて室温で６０分間処理した。ＡＰ結合二次抗体と共にインキュベートした後に、プレートを洗浄して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質を約１０分間添加した。１０分以内の黒紫色の発色は、細管形成を表した。その後、プレートを洗浄し、空気乾燥させるために放置した。
Zeiss KS400 3.0イメージアナライザーを使用して、ウェル全体の画像分析法によって細管増殖の定量化を行った。この定量化方法で測定した形態学的パラメータは細管全長であった。端収縮のアーチファクトを避けるために深さ１００μｍの端を除いて、２４ウェルの各ウェル内のすべての細管形成を測定した。
図１に示すように、抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏでの内皮細胞管形成の阻害に有効であることが認められた。このデータは、脈管形成過程をモデル化する機能アッセイにおいてこれらの抗体が作用することを示す。
実施例２４
ｉｎ ｖｉｖｏでの精製抗体の効力の測定：スフェロイドに基づくｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生アッセイにおける血管新生阻害効力の評価
以前に記載されているように（KorffおよびAugustin: J Cell Biol 143: 1341-52, 1998）、プラスチックシャーレ上の懸滴中で１００個の内皮細胞（ＥＣ）をピペッティングし、一晩スフェロイド形成させることによって、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）スフェロイドを調製した。その翌日、以前に記載されている方法（Alajatiら：Nature Methods 5:439-445, 2008）を用いて、ＥＣスフェロイドを回収して、最終数がスフェロイドとして１００，０００ＥＣ、かつ注入するプラグあたり２００，０００の単一ＥＣとなるようにマトリゲル／フィブリン溶液中で単一のＨＵＶＥＣと混合した。ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦ−２を１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。雄のＳＣＩＤマウス（５〜８週齢）に、５００μＬの細胞／マトリックス懸濁液を皮下注入した。その翌日（１日目）、処理を開始した。２１日目に、試験を終了した。マトリックスプラグを除去して、４％ＰＦＡ中で固定した。すべてのマトリックスプラグをパラフィン包埋して、組織学的検査用に８〜１０μｍの厚さに切断した。ヒトＣＤ３４および平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を染色することによって血管を可視化して、血管密度および周皮細胞の被度を測定した。
図２に示したように、これらの抗体はｉｎ ｖｉｖｏでの血管形成の阻害に有効である。このデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生のアッセイにおいてこれらの抗体が作用することを示す。
実施例２５
ヒトの患者における腫瘍細胞増殖の抑制
膵臓癌と診断された一群のヒト癌患者を無作為化して治療群に入れる。本明細書に記載の、ＫＤＲに対する完全なヒトモノクローナル抗体を週１回静脈内注射することによって各患者群を治療する。各患者には、５ｍｇ／ｋｇ／週から１５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ有効量の抗体を４〜８ヶ月間投与する。対照群には、標準的な化学療法のみを行う。
治療レジメンの最中および後に周期的に、腫瘍量を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価する。週１回の抗体治療を受けている患者が、抗体治療を受けていない患者と比較して、腫瘍サイズの有意な縮小、進行時間の遅延、あるいは生存の延長を示すであろうことが期待できる。一部の治療患者においては、腫瘍がもはや検出不能となることが期待できる。対照的に、対照群では、腫瘍サイズが増加するか、あるいはほぼ同じままであることが予想される。
実施例２６
ヒトの患者における大腸癌の抑制
大腸癌と診断された一群のヒト癌患者を無作為化して治療群に入れる。本明細書に記載のような、ＫＤＲに対する完全なヒトモノクローナル抗体を静脈内注射することによって各患者群を３週間に１回治療する。各患者には、５ｍｇ／ｋｇ／週から１５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ有効量の抗体を４〜８ヶ月間投与する。対照群には、標準的な化学療法のみを行う。治療レジメンの最中および後に周期的に、腫瘍量を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価する。３週間に１回の抗体治療を受けている患者が、抗体治療を受けていない患者と比較して、腫瘍サイズの有意な縮小、進行時間の遅延、あるいは生存の延長を示すことが期待できる。一部の治療患者においては、腫瘍がもはや検出不能となることが期待できる。対照的に、対照群では、腫瘍サイズが増加する、あるいはほぼ同じままであることが予想される。
実施例２７
ヒトの患者における黒色腫の抑制
黒色腫と診断された一群のヒト癌患者を無作為化して治療群に入れる。本明細書に記載のような、ＫＤＲに対する完全なヒトモノクローナル抗体を静脈内注射することによって各患者群を３週間に１回治療する。各患者には、５ｍｇ／ｋｇ／週から１５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ有効量の抗体を４〜８ヶ月間投与する。対照群には、標準的な化学療法のみを行う。治療レジメンの最中および後に周期的に、腫瘍量を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価する。ＫＤＲに対する抗体で３週間に１回の抗体治療を受けている患者が、抗体治療を受けていない患者と比較して、黒色腫の有意な縮小、進行時間の遅延、あるいは生存の延長を示すことが期待できる。一部の治療患者においては、黒色腫の病変がもはや検出不能となることが期待できる。対照的に、対照群では、黒色腫が増大するか、あるいはほぼ同じままであることが予想される。
実施例２８
ヒトの患者における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の抑制
ＣＭＬと診断された一群のヒト癌患者を無作為化して治療群に入れる。本明細書に記載のような、ＫＤＲに対する完全なヒトモノクローナル抗体を静脈内注射することによって各患者群を３週間に１回治療する。各患者には、５ｍｇ／ｋｇ／週から１５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲に及ぶ有効量の抗体を４〜８ヶ月間投与する。対照群には、標準的な化学療法のみを行う。治療レジメンの最中および後に周期的に、腫瘍量を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価する。３週間に１回の抗体治療を受けている患者が、抗体治療を受けていない患者と比較して、ＣＭＬの有意な軽減、進行時間の遅延、あるいは生存の延長を示すことが期待できる。一部の治療患者においては、ＣＭＬがもはや検出不能となることが期待できる。対照的に、対照群では、ＣＭＬが悪化するか、あるいはほぼ同じままであることが予想される。
実施例２９
ヒトの患者における腫瘍細胞増殖の抑制
悪性腫瘍と診断されたヒト患者を、本明細書に記載のような、ＫＤＲに対する完全なヒトモノクローナル抗体を週１回静脈内注射することによって８週間治療する。治療レジメンの最中および後に周期的に、腫瘍量を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって評価する。腫瘍サイズに有意な縮小が認められることが期待できる。
参照による援用
特許、特許出願、論文、教本、およびこれらの類似物、ならびにそれらの引用文献を含む、本明細書中のすべての引用文献は、すでに援用されていない限り、参照によりその全体が本明細書で援用される。
等価物
上記の明細書は、当業者が本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。上記の説明および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らによって意図される最良の形態を記載している。しかし、上記が文中でいかに詳細であるように見えようとも、本発明を多様な方法で実施することが可能であり、本発明が添付の特許請求の範囲およびそのあらゆる等価物に基づいて解釈されるべきであることを理解されたい。

Claims (41)

  1. ＫＤＲと特異的に結合し、受容体二量体化を抑制する標的化結合物質。
  2. ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で２ｎＭのＶＥＧＦ−１６５により誘導されるＶＥＧＦ−１６５媒介チロシンリン酸化の５０％より多くを１３３ｎＭで抑制する、請求項１に記載の標的化結合物質。
  3. ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で２ｎＭのＶＥＧＦ−Ｅにより誘導されるＶＥＧＦ−Ｅ媒介チロシンリン酸化の４０％より多くをハイブリドーマ上清の１／２０希釈で抑制する、請求項１に記載の標的化結合物質。
  4. 哺乳動物における腫瘍増殖および／または転移を抑制する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  5. 哺乳動物において、
    炎症性障害、または
    心臓血管性疾患、または
    敗血症
    に関連した症状を改善する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  6. ５ナノモル濃度（ｎＭ）未満のＫｄでＫＤＲと結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  7. モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  8. 表１に示されるモノクローナル抗体のいずれか１つである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  9. モノクローナル抗体２４Ｂ３である、請求項８に記載の標的化結合物質。
  10. モノクローナル抗体２７Ｄ１０である、請求項８に記載の標的化結合物質。
  11. モノクローナル抗体３３Ｃ３である、請求項８に記載の標的化結合物質。
  12. 請求項９〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体から誘導され得る標的化結合物質。
  13. 完全ヒトモノクローナル抗体の結合性断片である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  14. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｄＡｂ断片からなる群から選択される、請求項１３に記載の標的化結合物質。
  15. 配列番号４２を含む配列を含む請求項１〜９または１２〜１４のいずれか１項に記載の標的化結合物質であって、配列番号４２が表１７ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む、上記標的化結合物質。
  16. 配列番号４２を含む配列を含む、請求項１５に記載の標的化結合物質。
  17. 配列番号４４を含む配列を含む請求項１〜９または１２〜１４のいずれか１項に記載の標的化結合物質であって、配列番号４４が表１６ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む、上記標的化結合物質。
  18. 配列番号４４を含む配列を含む、請求項１７に記載の標的化結合物質。
  19. 配列番号１４を含む配列を含む請求項１〜８または１２〜１４のいずれか１項に記載の標的化結合物質であって、配列番号１４が表１５ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む、上記標的化結合物質。
  20. 配列番号１４を含む配列を含む、請求項１９に記載の標的化結合物質。
  21. 配列番号１６を含む配列を含む、請求項１〜８、１０または１２〜１４のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  22. 配列番号７４を含む配列を含む請求項１〜８、１１〜１４のいずれか１項に記載の標的化結合物質であって、配列番号７４が表１９ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む、上記標的化結合物質。
  23. 配列番号７４を含む配列を含む、請求項２２に記載の標的化結合物質。
  24. 配列番号７６を含む配列を含む請求項１〜８、１１〜１４のいずれか１項に記載の標的化結合物質であって、配列番号７６が表１８ａの各横列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組合せのうちのいずれか１つを含む、上記標的化結合物質。
  25. 配列番号７６を含む配列を含む、請求項２４に記載の標的化結合物質。
  26. ＫＤＲとの結合について完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３と競合する標的化結合物質。
  27. 完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３のいずれか１つと同じＫＤＲ上のエピトープと結合する標的化結合物質。
  28. （ａ）表２０または２１に示されるＣＤＲ３、
    （ｂ）表２０または表２１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つ；
    （ｃ）表２０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
    （ｄ）表２１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、あるいは
    （ｅ）表２０に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに表２１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
    を含むアミノ酸配列を含む、標的化結合物質。
  29. 抗体、または
    完全ヒトモノクローナル抗体、または
    完全ヒトモノクローナル抗体の結合性断片
    である、請求項１２〜２８のいずれか１項に記載の標的化結合物質。
  30. 請求項１〜２９のいずれか１項に記載の標的化結合物質をコードする核酸分子。
  31. 請求項３０に記載の核酸分子を含むベクター。
  32. 請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
  33. 悪性腫瘍の治療を必要とする動物を選択するステップ、および治療上有効量の請求項１〜２９のいずれか１項に記載の標的化結合物質を該動物に投与するステップを含む、動物における悪性腫瘍の治療方法。
  34. 前記動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記標的化結合物質が完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記悪性腫瘍が、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性疾患および類表皮癌からなる群から選択される、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 非新生物性疾患の治療を必要とする動物を選択するステップ、および治療上有効量の請求項１〜２９のいずれか１項に記載の標的化結合物質を該動物に投与するステップを含む、非新生物性疾患の治療方法。
  38. 前記動物がヒトである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記標的化結合物質が完全ヒトモノクローナル抗体２４Ｂ３、２７Ｄ１０および３３Ｃ３からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 非新生物性疾患が眼疾患、炎症性疾患、心臓血管性疾患および敗血症からなる群から選択される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. Ｆｃ領域が、２３４、２３５および３３１からなる群から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項１１に記載の標的化結合物質。
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