ES2687520T3 - Anticuerpos específicos para polipéptido amiloide de islote humano (HIAPP) y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos específicos para polipéptido amiloide de islote humano (HIAPP) y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Anticuerpo contra polipéptido amiloide de islote (IAPP) monoclonal humano o un fragmento de unión a IAPP y/o proIAPP del mismo, caracterizado por que el anticuerpo reconoce preferiblemente agregados de IAPP y/o proIAPP humanos que comprenden oligómeros y/o fibrillas de IAPP y/o proIAPP sobre IAPP y/o proIAPP fisiológicos, y no reconoce sustancialmente péptido b-amiloide patológico (Ab1-42) en cerebro humano de la enfermedad de Alzheimer, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de IAPP que comprende la secuencia de aminoácidos SSNNFGA establecida en la SEQ ID NO: 4, CNTATCA establecida en la SEQ ID NO: 5 o QRLANFLVHS establecida en la SEQ ID NO: 71; (b) un anticuerpo que es capaz de unirse a un epítopo de IAPP humano, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a IAPP del mismo comprende en su región variable las siguientes seis regiones determinantes de complementariedad (CDR): (i) VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 12, VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 12, VHCDR3: posiciones 99-110 de la SEQ ID NO: 12, VKCDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 14, VKCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 14, y VKCDR3: posiciones 89-96 de la SEQ ID NO: 14, o 20 en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos; (ii) VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 16, VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 16, VHCDR3: posiciones 99-111 de la SEQ ID NO: 16, VKCDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 18, VKCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 18, y VKCDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 18, o en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos; (iii) VHCDR1: posiciones 26-37 de la SEQ ID NO: 20, VHCDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 20, VHCDR3: posiciones 100-110 de la SEQ ID NO: 20, VKCDR1: posiciones 24-38 de la SEQ ID NO: 22, VKCDR2: posiciones 54-60 de la SEQ ID NO: 22, y VKCDR3: posiciones 93-101 de la SEQ ID NO: 22, o en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos; (iv) VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 24, VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 24, VHCDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 24, VKCDR1: posiciones 24-39 de la SEQ ID NO: 26, VKCDR2: posiciones 55-61 de la SEQ ID NO: 26, y VKCDR3: posiciones 94-102 de la SEQ ID NO: 26, o en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos; (v) VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 28, VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 28, VHCDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 28, VLCDR1: posiciones 23-34 de la SEQ ID NO: 30, VLCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 30, y VLCDR3: posiciones 93-101 de la SEQ ID NO: 30, o en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos; (vi) VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 64, VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 64, VHCDR3: posiciones 99-116 de la SEQ ID NO: 64, VKCDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 66, VKCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 66, y VKCDR3: posiciones 89-96 de la SEQ ID NO: 66, o en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos; (vii) VHCDR1: posiciones 25-35 de la SEQ ID NO: 68, VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 68, VHCDR3: posiciones 99-112 de la SEQ ID NO: 68, VLCDR1: posiciones 23-35 de la SEQ ID NO: 70, VLCDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 70, y VLCDR3: posiciones 90-100 de la SEQ ID NO: 70, o en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos; y (c) un anticuerpo que es capaz de unirse a un epítopo de IAPP y proIAPP humano, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a IAPP y/o proIAPP del mismo comprende en su región variable las siguientes seis CDR: (viii) VHCDR1: posiciones 26-37 de la SEQ ID NO: 20, VHCDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 20, VHCDR3: posiciones 100-110 de la SEQ ID NO: 20, VKCDR1: posiciones 24-38 de la SEQ ID NO: 22, VKCDR2: posiciones 54-60 de la SEQ ID NO: 22, y VKCDR3: posiciones 93-101 de la SEQ ID NO: 22, o en las que una o más de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoácidos.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos especificos para polipeptido amiloide de islote humano (HIAPP) y usos de los mismos Campo de la Invencion
La presente invencion se refiere de manera general a moleculas novedosas que enlazan especlficamente a polipeptido amiloide de islote humano (hlAPP) tambien conocido como amilina y/o su polipeptido amiloide de proislote precursor (prolAPP), particularmente anticuerpos humanos, as! como a fragmentos, derivados y variantes de los mismos, que reconocen las protelnas IAPP, prolAPP, formas agregadas de IAPP, formas agregadas de prolAPP, y/o fibrillas de IAPp. Ademas, la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas y de diagnostico que comprenden las moleculas de union, anticuerpos y mimeticos de los mismos valiosos tanto como una herramienta de diagnostico para identificar IAPP, proIAPP, IAPP agregado, especies proIAPP y/o fibrillas de IAPP en plasma, como tambien en estrategias de vacunacion pasiva para tratar trastornos relacionados con IAPP agregado, proIAPP agregado, y fibrillas de IAPP tal como diabetes mellitus tipo 2 (T2D) y rechazo de islote seguido de trasplante cllnico de islote pancreatica en individuos con diabetes mellitus tipo 1 (T1D).
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La acumulacion, modificaciones y agregacion de protelna son aspectos patologicos de numerosas enfermedades metabolicas incluyendo enfermedades neurodegenerativas bien conocidas como enfermedades de Huntington, Alzheimer (AD) y Parkinson (PD) (Taylor et al, Science 296 (2005), 1991-1995). La agregacion de protelna patologica tambien esta implicada en enfermedades metabolicas tal como diabetes mellitus tipo 2 (T2D) y en rechazo de islote despues de trasplante cllnico de islote pancreatica en individuos con diabetes mellitus tipo 1 (T1D). El mal pliegue y la agregacion de protelnas conduce al desarrollo de depositos amiloides y parece estar directamente relacionados con toxicidad celular en estas enfermedades. El polipeptido amiloide islote (IAPP o amilina), un peptido fisiologico segregado junto con insulina mediante celulas p en el pancreas, forma agregados fibrilares en islotes pancreaticas (tambien llamados islotes de Langerhans) de pacientes T2D y se ha sugerido que desempena un papel importante en el desarrollo de la enfermedad (Westermark et al. (2011), Physiol. Rev. 91(3): 795-826). Ademas, tal como se menciono anteriormente, los agregados de IAPP se ha descubierto en islotes pancreaticos al momento del trasplante de islotes aislados en pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (T1D).
IAPP humano (hIAPP) es una hormona de peptido que consiste en 37 aminoacidos, con un puente de disulfuro entre los residuos de cistelna 2 y 7 y un C termino amidado. Los islotes pancreaticos estan compuestos del 65 al 80% de celulas p, las cuales producen y segregan insulina y IAPP esencial para regulacion de niveles de glucosa en la sangre y metabolismo celular. IApP se procesa a partir de la preprohormona preproIAPP, un precursor de 89 aminoacidos producidos en celulas-p pancreaticas.
PreproIAPP se disocia rapidamente de la traduccion en polipeptido amiloide de proislote, un peptido de 67 aminoacidos, que pasa por proteolisis y modificaciones post-traduccion adicionales para generar hIAPP. La expresion de hIAPP es regulada junto con la insulina, ya que una produccion incrementada de insulina conduce a niveles hIAPP incrementados. hIAPP se libera de las celulas-p pancreaticas en la circulacion sangulnea y esta implicado en la regulacion glicemica a traves del vaciado gastrico y control de saciedad en sinergia con la insulina.
Aunque hIAPP actua como un regulador del metabolismo celular bajo condiciones fisiologicas, hIAPP puede agregarse y formar fibrillas amiloides (amiloidosis IAPP) asociadas con deficiencia de celula-p y muerte de celula-p incrementada y masa de celula-p reducida. Las diversas evidencias senalan hacia una amiloidosis de hIAPP como un disparador importante para la patogenesis de T2D. En primer lugar, la deposicion de las fibrillas de IAPP se encuentra en mas del 90% de los pacientes con diabetes tipo-2 (Zraika et al. (2010), Diabetologia 53(6): 1046-1056). En segundo lugar, la agregacion de hIAPP es toxica para celulas p y se correlaciona con la reduccion en las celulas-p que producen insulina (Butler et al. (2003), Diabetes 52(9): 2304-2314; Ritzel et al. (2007), Diabetes 56(1): 65-71; Jurgens et al. (2011), Am. J. Pathol. 178(6): 2632-2640). En tercer lugar, los modelos transgenicos de murido que expresan hIAPP muestran depositos amiloides de islote pancreatico y desarrollan en forma espontanea T2D (Janson et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(14): 7283-7288; Hoppener et al. (1999), Diabetologia 42(4): 427-434; Hull et al. (2003), Diabetes 52(2): 372379; Butler et al. (2004), Diabetes 53(6): 1509-1516; Matveyenko et al. (2006), ILAR J. 47(3): 225-233; Hoppener et al. (2008), Exp. Diabetes Res. 697035). Recapitulan la enfermedad humana con disfuncion de celula-p, deficiencia de la masa de celula-p y perdida de celula-p, en comparacion con lo que se observa en los tejidos de pacientes T2D. La expresion de hIAPP y la formacion amiloide se correlaciona directamente con la apoptosis de celula-p y el desarrollo de diabetes en estos modelos, proporcionando de esta forma evidencia para la contribucion de IAPP humana en el
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desarrollo de la enfermedad. Ademas, el tratamiento que interfiere con la agregacion de hlAPP disminuyo el fenotipo diabetico e incremento la duracion de vida del animal (Aitken et al. (2009), Diabetes 59(1): 161-171). La agregacion y la amiloidosis de hlAPP es un prerrequisito para toxicidad. El roedor no amiloidogenico IAPP (rIAPP), que no tiene la capacidad de formar fibrillas como un resultado de la sustitucion de seis aminoacidos, es no toxico para celulas-p. En el desarrollo de la enfermedad, la agregacion hlAPP patologica encontrada en islotes pancreaticos humanos puede originar disfuncion de celula-p y muerte asociada con dano por secrecion de insulina. Ademas, el incremento compensador en masa de celula-p e insulina y la secrecion de amilina para mantener niveles de glucosa en sangre normales puede favorecer la formacion de hlAPP oligomeros y la deposicion de fibrillas de IAPP. Aunque los oligomeros hlAPP iniciales se consideran como la principal especie citotoxica, el producto final de la fibrila hlAPP tambien puede desempenar un papel importante en la perdida de celula-p (Meier et al. (2006), Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291(6): E1317-1324; Haataja et al. (2008), Endocr. Rev. 29(3): 303-316; Engel et al. (2008), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16): 6033-6038). Las fibrillas de lAPP tambien se han observado en los lotes pancreaticos de donadores y se han asociado con perdida de celula p despues de trasplante de islotes pancreaticos cllnicos en individuos con diabetes tipo-1 (Andersson et al. (2008), Exp. Diabetes Res. 562985; Udayasankar et al. (2009), Diabetologia 52(1): 145-153; Bohman et al. (2012), Amyloid 19(2): 87-93). El mecanismo exacto que conduce a la agregacion de hlAPP y a la amiloidosis en T2D es desconocido. La resistencia a insulina en T2D incrementa la demanda de secrecion a insulina junto con el contenido de celula prolAPP y la liberacion de hlAPP, lo cual puede provocar amiloidosis ya que la formacion de la fibrila hlAPP depende de la concentracion. Otro mecanismo propuesto es la acumulacion y agregacion de prolAPP no procesado N- terminal originado por deficiencia en proteolisis en el establecimiento de la resistencia a insulina, ya que se encuentran formas de prolAPP parcialmente procesadas en depositos amiloides, en particular el prolAPP1-48 intermedio de 48 residuos (Marzban et al. (2006), Diabetes 55(8): 2192-2201). Dentro de este contexto, el procesamiento normal de prolAPP puede actuar como una semilla para amiloidosis hlAPP e incrementar la formacion amiloide (Paulsson et al. (2005), Diabetes 54(7): 2117-2125; Paulsson et al. (2006), Diabetologia 49(6): 1237-1246; Marzban et al. (2006), Diabetes 55(8): 2192-2201). Por consiguiente ProlAPP tambien se considera como un objeto terapeutico adecuado.
Las caracterlsticas cllnicas de T2D son altos niveles de glucosa en la sangre y resistencia y/o deficiencia de insulina. La diabetes mellitus es un grupo de enfermedades metabolicas que incluyen T1D, T2D, y diabetes gestacional. T2D, tambien nombrada como diabetes de generacion en adultos, diabetes relacionada con la obesidad y diabetes mellitus no dependiente de insulina (NlDDM) es la forma de diabetes mas comun que abarca aproximadamente el 90% de todos los casos (Gerich et al. (1998), Endocr. Rev. 19(4): 491-503). T2D esta caracterizada por una disminucion en el numero de celulas p que producen insulina funcional. Mientras progresa la patologla, esto puede conducir a complicaciones a largo plazo tal como enfermedad cardiovascular, retinopatla diabetica, que conduce a ceguera, deficiencia de rinon, infecciones frecuentes y amputaciones originadas por una circulacion deficiente. Como consecuencia, T2D esta asociada con una expectativa de vida mas corta. La enfermedad afecta mas de 300 millones de personas a nivel mundial dando como resultado mas de un millon de muertes anualmente. Tanto los determinantes geneticos como los factores ambientales conducen al desarrollo de la enfermedad, con obesidad, inactividad flsica y envejecimiento considerada como la causa primaria (Kahn et al. (2006), Nature 444(7121): 840-846).
Los tratamientos actuales para T2D incluyen manejo del estilo de vida (dieta y ejercicio) e intervencion farmacologica tal como suministro de metformina e insulina para disminuir los niveles de glucosa en la sangre, ya sea estimulando al pancreas a liberar insulina o incrementando la respuesta de insulina. Esos tratamientos estan basados en una mejorla sintomatica de la diabetes, con la consecuencia de una carencia de durabilidad. De hecho, ninguno de los tratamientos disponibles ha mostrado contrarrestar la agregacion de hlAPP y la perdida de celulas-p pancreatica. Las nuevas estrategias de tratamiento que implican analogos del peptido 1 de glucagon (GLP-1) (Butler et al. (2009), Diabetologia 53(1): 1-6) e inhibidores de la peptidasa 4 de dipeptidilo de enzima de desactivacion de GLP-1 (DDP4) estan basados en los efectos insulinotropico potente de GLP-1 y sus efectos para incrementar la proliferacion de celula-p. De manera importante, la liberacion de insulina incrementada tambien esta acoplada a la liberacion de amilina incrementada. En forma experimental, la secrecion de insulina estimulada mostrada para promover el desarrollo de amiloidosis de islote en modelos animales y se pueden esperar efectos similares en humanos (Aston-Mourney et al. (2011), Diabetologia 54(7): 1756-1765). Estos tratamientos por consiguiente pueden agraviar potencialmente la amiloidosis de islote. Las estrategias mas recientes y prometedoras implican el desarrollo de farmacos antiinflamatorios o anticuerpos que dirigen la trayectoria lL-ip (Donath et al. (2008), Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 4(5): 240-241; Ehes et al. (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 106(33): 13998-14003; Owyang et al. (2010), Endocrinology 151(6): 2515-2527; Dinarello et al. (2010), Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17(4): 314-321; Boni-Schnetzler et al. (2011), J. Clin. Endocrinol. Metab. 93(10): 4065-4074; Boni-Schnetzler et al. (2012), Br. J. Clin. Pharmacol.; Cavelti-Weder et al. (2012), Diabetes Care). Es importante observar, que los estudios recientes muestran que hlAPP induce especlficamente la inflamasoma - sistema lL-1 p que conduce a la activacion del sistema inmune innato (Masters et al. (2010), Nat. lmmunol. 11(10): 897904; Mandrup-Poulsen et al. (2010), Nat. lmmunol. 11(10): 881-883), soportando de esta forma una estrategia terapeutica que se dirige a la agregacion de hlAPP. Ademas, se ha sugerido la utilizacion de anticuerpos monoclonales
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que reaccionan con hlAPP agregado/fibrilar y/o con hlAPP oligomerico para el tratamiento de T2D (WO2003/092619 y WO 2011/151833).
Estos descubrimientos senalan el beneficio potencial asociado con los metodos de immunoterapia active o pasiva que dirigen hlAPP y/o prolAPP.
Resumiendo lo anterior, se necesitan urgentemente estrategias terapeuticas novedosas que atiendan la hlAPP agregada, protelnas prolAPP y/o oligomeros hlAPP y/o fibrillas con una terapia eficaz y segura.
La inmunizacion pasiva con anticuerpos humanos que son optimizados en forma de evolucion y la afinidad madurada por el sistema inmune humano pueden proporcionar una nueva avenida terapeutica con una alta probabilidad de excelente eficacia y seguridad.
BREVE DESCRlPClON DE LA lNVENClON
La presente invencion se refiere a realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y hace uso de la respuesta inmune especlfica de hlAPP de sujetos humanos saludables para el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos especlficos de anti-hlAPP naturales. En particular, los experimentos llevados a cabo segun la presente invencion fueron exitosos en el aislamiento de anticuerpos monoclonales especlficos de hlAPP y/o prolAPP de un conjunto de sujetos humanos saludables o de un conjunto de pacientes obesos y otros grupos de pacientes con riesgo incrementado de desarrollar T2D, los cuales al momento del aislamiento del anticuerpo no mostraron signos de T2D.
La presente invencion se dirige por lo tanto a anticuerpos humanos, fragmentos de union a antlgeno y moleculas de union a antlgeno similares, tal como se caracteriza en las reivindicaciones, que tienen la capacidad de reconocer especlficamente lAPP y/o prolAPP. Si no se indica de otra manera, por el termino “que reconoce en forma especlfica lAPP y/o prolAPP”, “anticuerpo especlfico de/para lAPP y/o prolAPP” y “anticuerpo anti-lAPP y/o anti-prolAPP” se entiende especlficamente, de manera general y colectiva anticuerpos para la forma monomerica nativa de lAPP; anticuerpos para la forma de precursora prolAPP de lAPP; anticuerpos de union especlfico a otras formas, lAPP y prolAPP; anticuerpos que enlazan a especies lAPP y/o prolAPP, agregadas, oligomericas, fibrilares y/o no fibrilares. En la presente invencion se proporciona a anticuerpos humanos selectivos para formas de longitud total y/o agregadas, tal como formas agregadas oligomericas, fibrilares y no fibrilares de lAPP y/o prolAPP.
En una realizacion particularmente preferida de la presente invencion, el anticuerpo humano o fragmento de union a antlgeno del mismo muestra las caracterlsticas de union inmunologicas de un anticuerpo caracterizado por las regiones variables Vh y/o Vl tal como se establece en la figura 1A-E, H y l.
El fragmento de union a antlgeno del anticuerpo puede ser un fragmento Fv de cadena simple, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab), y un fragmento F(ab')2, o cualquier otro fragmento de union a antlgeno. En una realizacion especlfica, infra, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo de isotipo lgG humano. Alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo de roedor humano quimerico o roedorizado, tal como murido o murinizado, anticuerpo de rata o ratinizado, siendo las versiones de roedor particularmente utiles para metodos de diagnostico y estudios en animales.
Ademas, la presente invencion se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo de la presente invencion o fragmentos activos del mismo y a metodos inmunoterapeuticos o inmunodiagnostico que utilizan dichas composiciones en la prevencion, diagnostico o tratamiento de trastornos relacionados con lAPP, tal como T2D, en donde se administra a un paciente que necesita del mismo una cantidad efectiva de la composicion.
La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos que codifican al menos una region variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la presente invencion. Dicha region variable comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la region variable Vh y Vl tal como se establece en la figura 1A-E, H e l.
Por consiguiente, la presente invencion tambien comprende vectores que comprenden los polinucleotidos y celulas huesped transformadas a partir de los mismos, as! como a su uso para la produccion de un anticuerpo y moleculas de union equivalentes que son especlficas para lAPP y/o prolAPP. Los medios y metodos para la produccion recombinante de anticuerpos y mimeticos de los mismos, as! como a metodos para clasificar las moleculas de union de competicion, que pueden o no ser anticuerpos, son conocidos en la tecnica. Sin embargo, tal como aqul se describe, en particular con respecto a las aplicaciones terapeuticas en humanos, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo humano en el sentido de que la aplicacion de dicho anticuerpo esta sustancialmente libre de una respuesta inmune dirigida contra el anticuerpo, observada de otra forma para anticuerpos quimericos e incluso humanizados.
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Ademas, en el presente documento se describen composiciones y metodos que se pueden utilizar para identificar IAPP y/o proIAPP en muestras y/o in vivo. Los anticuerpos anti-IAPP y/o proIAPP o los fragmentos de union de IAPP y/o prolAPP de los mismos descritos, se pueden utilizar para clasificar sangre, plasma, suero, saliva, fluido peritoneal, fluido cerebroespinal (“CSF”), y orina humana para la presencia de IAPP y/o proIAPP en las muestras, por ejemplo, utilizando un ensayo adaptado por superficie o a base de ELISA. En una realizacion de la presente invencion que se refiere a un metodo para el diagnostico o control del progreso de una enfermedad relacionada con IAPP y/o proIAPP en un sujeto, el metodo comprende determinar la presencia de oligomeros, agregados o fibrillas de IAPP y/o proIAPP en una muestra del sujeto que sera diagnosticado con al menos un anticuerpo de la presente invencion, en el que la presencia de los oligomeros, agregados o fibrillas de IAPP y/o proIAPP, es indicativa del trastorno.
Ademas, en una realizacion de la presente invencion se proporcionan los anticuerpos anti-IAPP y/o proIAPP o fragmentos de union a IAPP y/o proIAPP de los mismos para el uso en la deteccion in vivo (tambien llamada generacion de imagen in vivo) de o la direccion de un agente terapeutico y/o de diagnostico a IAPP y/o proIAPP en el cuerpo humano o de animal. Los metodos y composiciones aqul descritos pueden ayudar a trastornos relacionados con IAPP y caracterizados, por ejemplo, mediante el surgimiento de formas agregadas oligomericas, fibrilares y no fibrilares de, IAPP y/o proIAPP tal como diagnostico de T2D y pueden utilizarse para monitorear el progreso de la enfermedad y eficacia terapeutica de la terapia proporcionada al sujeto, por ejemplo, en metodos de diagnostico relacionados con generacion de imagen in vivo. Por consiguiente, en una realizacion se proporciona la molecula de union a IAPP y/o proIAPP de la presente invencion, en donde la deteccion in vivo (generacion de imagen) comprende tomografla de emision de positrones (PET), tomografla de emision de foton simple (SPECT), generacion de imagen optica casi infrarroja (NIR) o imagenes de resonancia magnetica (MRI).
Por lo tanto, la presente solicitud tambien describe metodos para tratar, diagnosticar o prevenir una enfermedad relacionada con IAPP y/o proIAPP oligomerico y/o agregado fibrilar y/o no fibrilar, tal como Diabetes Tipo 2 (T2D). Los metodos comprenden administrar una concentracion efectiva de un anticuerpo o de activado de anticuerpo humano al sujeto, en donde el anticuerpo se dirige a IAPP y/o proIAPP.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un peptido, tal como se carcteriza en las reivindicaciones, que tiene un epltopo de IAPP y/o proIAPP reconocido en forma especlfica por un anticuerpo de la presente invencion. El peptido comprende o consiste de una secuencia de aminoacidos tal como se indica mas adelante en la descripcion detallada y en los ejemplos. Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para diagnosticar T2D o el riesgo de desarrollar T2D en un sujeto, en donde el metodo comprende determinar la presencia del paso de un anticuerpo que enlaza al peptido en una muestra biologica del sujeto.
Las realizaciones adicionales de la presente invencion podran ser apreciadas a partir de la descripcion y Ejemplos que se encuentran mas adelante.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1: Secuencias de aminoacido y nucleotido de la region variable, es decir, cadena pesada y cadena ligera kappa/lambda de anticuerpos IAPP humanos NI-203.9A2 (A), NI-203.19H8 (B), NI-203.26C11 (C), NI-203.8E3 (D), NI- 203.11B12 (E), NI-203.205F8 (F), NI-203.9B3 (G), NI-203.19F2 (H), y NI-203.15C7 (I). Las regiones de estructura (FR) y de determinacion de complementariedad (CDRs) estan indicadas con las CDRs que estan subrayadas. La region de union de cadena pesada (JH) y la region de union de cadena ligera (JK) estan indicadas tambien. Debido a la estrategia de clonacion, la secuencia de aminoacidos en el N-termino de la cadena pesada y la cadena ligera pueden contener potencialmente alteraciones inducidas por cebador en FR1, lo cual sin embargo, no afecta sustancialmente la actividad biologica del anticuerpo. Con el objeto de proporcionar un anticuerpo humano de consenso, las secuencias de nucleotido y aminoacidos del clon original fueron alineadas con y afinadas segun las secuencias de region variable de llnea germinal humana pertinente en la base de datos. Ver por ejemplo, Vbase (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) albergado por el MRC Centre for Protein Engineering (Centro MRC de Diseno de Protelnas)(Cambridge, UK). La secuencia de aminoacido de los anticuerpos humanos se indica cuando se considera que los aminoacidos de N-termino se desvlan potencialmente de la secuencia de la llnea germinal del consenso debido al cebador PCR y por lo tanto han sido reemplazados por la correccion de mutacion inducida por cebador (PIMC). Los aminoacidos modificados por PIMC estan indicados por letras negritas en las secuencias.
Figura 2: Las secuencias de aminoacido y nucleotido de la region variable, es decir, cadena pesada y cadena ligera kappa/lambda de los anticuerpos proIAPP humanos NI-203. ID 10 (A), NI-203.2A11 (B), NI-203.10C4 (C), NI-203.20H9 (D), NI-203.26D2 (E) y NI-203.60H3 (F). Las regiones de estructura (FR) y de determinacion de complementariedad
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(CDRs) estan indicadas con las CDRs subrayadas. La region de union de cadena pesada (JH) y region de union de cadena ligera (JK) tambien estan indicadas. Debido a la estrategia de clonacion la secuencia de aminoacidos del N- termino de la cadena pesada y cadena ligera puede contener potencialmente alteraciones inducidas por cebadores en FR1, lo cual, sin embargo, no afecta sustancialmente la actividad biologica del anticuerpo. Con el objeto de proporcionar un anticuerpo humano de consenso, las secuencias de nucleotido y aminoacidos del clon original fueron alineadas con y afinadas segun las secuencias de region variable de llnea germinal humana pertinentes en la base de datos; ver por ejemplo, Vbase (
http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) albergada por MRC Centre for Protein Engineering (Centro MRC de Diseno de Protelnas) (Cambridge, UK). La secuencia de aminoacido de los anticuerpos humanos se indica cuando se considera que los aminoacidos de N-termino se desvlan potencialmente de la secuencia de llnea germinal de consenso debido al cebador PCR y por lo tanto han sido reemplazados por la correccion de mutacion inducida por el cebador (PIMC). Los aminoacidos modificados por PIMC estan indicados en letras negritas en las secuencias.
Figura 3: Especificidad de union a IAPP de anticuerpos recombinantes humanos evaluados mediante ELISA directo. (A) Imagen de microscopio de electron de la solucion IAPP (2 mg/ml) utilizada para el recubrimiento de la placa ELISA. La barra de escala representa 1 pm. (B) NI-203.9A2, NI- 203.19H8, NI-203.26C 11 y NI-203.8E3 recombinante mostraron una union especlfica IAPP (10 pg/ml) humano. Se utiliza BSA (10 pg/ml) como un control para determinar una union no especlfica. Los datos se expresan como valores OD en 450 nm.
Figura 4: Determinacion EC50 de los anticuerpos anti-IAPP derivados de humanos recombinantes para IAPP y proIAPP. (A) Imagenes de microscopio de electrones de las soluciones IAPP y proIAPP (2 mg/ml) utilizadas para recubrimiento de placa ELISA. La barra de escala representa 1 pm. (B) Las placas se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpos derivados de humanos recombinantes NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C 1 1 o NI-203.8E3. Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C1 1 y NI-203.8E3 enlazados con alta afinidad a IAPP humano (■, 10 pg/ml) con una EC50 de 9 nM, 22 nM, 6 nM y 4 nM, respectivamente. NI-203.26C 11 tambien enlaza proIAPP (□, 10 pg/ml) con una EC50 de 260 nM. Las medidas se elaboraron por duplicado y la senal de fondo en BSA se resto. Los datos se expresan como valores OD promedio en 450 nm.
Figura 5: Los anticuerpos anti-IAPP derivados de humanos son especlficos de fibrillas de IAPP. (A) Imagenes de microscopio de electrones de soluciones IAPP (2 mg/ml) y no fibrilar IAPP (500 pg/ml) utilizadas para el recubrimiento de placas ELISA. Aunque la solucion IAPP contiene fibrillas, las fibrillas de IAPp no aparecen en la solucion no fibrilar IAPP. La barra de escala representa 1 pm. (B) Las placas fueron incubadas con las concentraciones indicadas en los anticuerpos derivados de humanos recombinantes NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 o NI-203.8E3. Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 y NI-203.8E3 enlazan con alta afinidad a las fibrillas de IAPP (solucion IAPP,^, 10 pg/ml) y con afinidad muy baja para IAPP no fibrilar (A, 10 pg/ml), lo que sugiere especificidad hacia las fibrillas de IAPP. Las medidas se elaboraron por duplicado y se resto la senal de fondo en BSA. Los datos se expresan como valores promedio OD en 450 nm.
Figura 6: Epltopos de union a IAPP de anticuerpos recombinantes humanos valuados por analisis de pepscan. (A) Imagenes Pepscan de anticuerpos derivados de humano NI-203.19H8 y NI-203.26C11 (1 pg/ml). La union NI-203.1 9h8 ocurrio en los peptidos 6 y 7 (fila A) que cubre los aminoacidos 19-25 (peptido 6: 16-lVhSsNNFGA-25 SEQ ID NO: 6, peptido 7: 19-SsNNFGAiLs-28 SeQ Id NO: 8, secuencia de union de consenso: 19-SSNNFGA-25 SEQ ID NO: 4). La union NI-203.26C11 ocurrio en el peptido 1 (fila A) que cubre los aminoacidos 1-10 (peptido 1: 1-KCNTATCATQ- 10 SEQ ID NO: 9) pero no en el peptido 2 que cubre los aminoacidos 4-13 (peptido 2: 4-tAtCaTQRLA-13 SEQ ID NO: 10). La sustitucion o reemplazo de alanina en los residuos 2 a 8 en los peptidos 33 a 39 y 41 (fila C) danaron la union de NI- 203.26C11 (33 mutacion de peptido: C2A, mutacion de peptido 34: N3A, mutacion de peptido 35: T4A, mutacion de peptido 36: A5G, mutacion de peptido 37: A5P, mutacion de peptido 38: T6A, mutacion de peptido 39: C7A, mutacion de peptido 41: A8P). Se utilizo como control unicamente IgG Fcy anti-humano de burro conjugado con HRP secundario (1:20000; Ilary Ab). (B) Los epltopos de union identificados de los anticuerpos especlficos de IAPP derivados de diferentes humanos dentro del aminoacidos indicados de la secuencia de protelna IAPP humana. Panel superior: secuencia de aminoacidos del IAPP humano de longitud total (aminoacidos 1-37). NI: epltopo de union no identificado.
Figura 7: Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 reconocieron en forma especlfica el amiloide IAPP patologico en el pancreas de pacientes diagnosticados con diabetes mellitus tipo 2 (T2D). Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y Nl-203.26C11 muestran manchado en islotes pancreaticos T2D de cargados con fibrillas de IAPP (amiloide) (A, B) pero no en islotes pancreaticos T2D que carecen de fibrillas de IAPP (C, D). (A) Manchado con tioflavina S (ThioS, panel izquierdo) y rojo Congo (CR, panel derecho) de amiloide en islotes pancreaticos de un paciente T2D. (B) Deteccio de fibrillas de IAPp en islotes pancreaticos T2D de positivos amiloides con anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 (cafe-CR) en 50 nM (panel grande e inserto izquierdo inferior) y 5 nM (inserto derecho inferior). (C) Ausencia de amiloide islotes pancreaticos de un paciente T2D, tal como se muestra mediante manchado
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negativo de tioflavina S (ThioS, panel izquierdo) y rojo Congo (CR, panel derecho). (D) Ausencia de manchado en islotes pancreaticos T2D negativos amiloides con anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.1 9h8 y NI-203.26C11 en 50 nM. Se utilizo como un control unicamente anticuerpos antihumano de burro secundario (Ilary Ab). Insertos inferiores: imagenes de alta magnificacion de islotes pancreaticos humanos individuales. Se mancharon los islotes pancreaticos humanos con anticuerpo de anti-insulina (azul en original (i.o.), aqul manchado fuerte) y se llevo a cabo un contramanchado para visualizar el nucleo celular (azul palido, i.o., aqul manchado palido).
Figura 8: Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 no reconocen IAPP fisiologico en pancreas de control humano. Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 (50 nM) mostraron manchado debil en islotes de control humanos cuando se compararon con el anticuerpo de control IAPP (1: 100; Ab de control). Se utilizo unicamente anticuerpo anti-humano de burro secundario (Ilary Ab) como un control. Se mancharon islotes pancreaticos humanos con anticuerpo de anti-insulina (azul en original (i.o.), aqul manchado fuerte) y se llevo a cabo el contramanchado para visualizar el nucleo celular (azul palido i.o., aqul manchado palido).
Figura 9: Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 reconocen las fibrillas de IAPP patologicas en un pancreas de gato diabetico. Deteccion de fibrillas de IAPP en islotes pancreaticos de un gato T2D con anticuerpos NI- 203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 (50 nM, cafe-CR). Se mancharon fibrillas de IAPP (amiloide) con rojo Congo (CR). Se utilizo como un control unicamente anticuerpos anti-humano de burro secundario (Ilary Ab). Insertos inferiores: imagenes de alta magnificacion de islotes pancreaticos de gato individuales. Se mancharon los islotes pancreaticos de gato con un anticuerpo anti-insulina (azul en original (i.o.), aqul manchado fuerte) y se llevo a cabo el contramanchado para visualizar los nucleos celulares (azul palido i.o., aqul manchado palido).
Figura 10: Los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 no reconocen los depositos Ap patologicos en un cerebro humano con la enfermedad de Alzheimer. La ausencia de manchado con anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 (50 nM), en oposicion al anticuerpo especlfico de Ap 6E10 (1:2000; Ab el control). Se utilizo como un control unicamente el anticuerpo anti-humano de burro secundario (Ilary Ab). El contramanchado se llevo a cabo para visualizar los nucleos celulares (azul palido i.o., aqul manchado palido).
Figura 11: Los anticuerpos quimericos humanos y de raton recombinantes NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 se enlazan con igual afinidad a IAPP humano. (A) Determinacion EC50 de los anticuerpos anti-IAPP quimericos de raton y humano recombinantes para IAPP (■, 10 pg/l) y BSA (◊, 10 pg/ml). Las placas se incubaron con las concentraciones de anticuerpos identicas. Las medidas se llevaron a cabo por duplicado. Los datos se expresan como valores promedio OD en 450 nm. (B, C) Valores EC50 de anticuerpos quimericos de humano y raton.
Figura 12: El anticuerpo quimerico de raton recombinante NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 reconoce las fibrillas de IAPP patologicas en el pancreas de pacientes diagnosticados con diabetes mellitus tipo 2 (T2D). Deteccion de fibrillas de IAPP en islotes pancreaticos de dos pacientes T2D humanos (1 y 2) con anticuerpos NI-203.9A2, NI- 203.19H8 y NI-203.26C11 quimericos en 50 nM (cafe i.o., aqul manchado fuerte de oscuro a color negro. Se mancharon islotes pancreaticos humanos con anticuerpo anti-insulina (azul i.o., aqul manchado fuerte) y se llevo a cabo el contramanchado para visualizar los nucleos celulares (azul palido, i.o., aqul manchado palido).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
En diabetes tipo-2 (T2D) las determinantes geneticas y los factores ambientales conducen al desarrollo de resistencia a insulina seguido de un incremento compensador en la masa de celula beta y en la secrecion de insulina y amilina (hIAPP) para mantener niveles de glucosa en sangre normales. Las altas concentraciones de amilina resultantes favorecen la formacion de oligomeros de polipeptido de amiloide de islote humano toxicos (hIAPP) y la deposicion de fibrillas de IAPP que se encuentran mas del 90% de los pacientes con diabetes tipo-2. La deposicion de hIAPP se correlaciona con la reduccion en celulas beta que producen insulina y tambien se propone que desempenan un papel importante para la perdida de las celulas-p en islotes pancreaticos transplantados en individuos con diabetes tipo-1. Los diversos anticuerpos derivados de humano de conjuntos de donadores saludables y obesos con alto riesgo de diabetes tipo-2 pero la ausencia de enfermedad, han sido identificados y caracterizados in vitro, clonados y producidos en forma recombinante mediante tecnologla Neurimmune's RTM™ tal como se describe con detalle en la Solicitud Internacional W02008/081008 y se proporcionan en la presente invencion. Los candidatos principales son validados en ratones transgenicos que expresan hIAPP y se exponen a una dieta con alto contenido de grasa. La eficacia terapeutica se evaluo determinando la masa de celula beta y la carga amiloide hIAPP en el pancreas, as! como los niveles en plasma hIAPP, y pruebas funcionales del metabolismo de glucosa y secrecion de insulina.
La forma de diabetes mas comun, que abarca hasta aproximadamente el 90% de todos los casos. La enfermedad afecta
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a mas de 200 millones de personas a nivel mundial, dando como resultado en mas de un millon de muertes anualmente por diabetes. Mas de 300,000 pacientes son afectados en Suiza. La prevalencia de la diabetes incrementa dramaticamente tanto en palses desarrollados como en desarrollo debido al crecimiento, envejecimiento de la poblacion, organizacion y prevalencia cada vez mayor de la obesidad y la inactividad flsica. El mercado global de diabetes tipo 2 es 25 billones de dolares americanos se preve que alcance 35 billones de dolares americanos en 2016 con un rango de crecimiento anual del 6.4% entre el 2009 y el 2016. Los tratamientos actuales incluyen manejo de dieta e intervencion farmacologica que actuan en diferentes trayectorias para disminuir los niveles de glucosa en la sangre, ya sea mejorando la sensibilidad a insulina o estimulando al pancreas para liberar insulina. Ninguno de los tratamientos disponibles sin embargo, pueden contrarrestrar la agresion de hlAPP y la perdida de celulas beta pancreaticas. Las nuevas estrategias de tratamiento para la diabetes tipo 2 implican analogos del peptido 1 de glucagon (GLP-1) e inhibidores de la peptidasa-4 de dipeptidilo (DPP 4), cuya enzima inactiva el GLP-1 endogeno. Estas estrategias estan basadas en el efecto insulinotropico potente de GLP-1 y su efecto para incrementar la proliferacion de celula beta. De manera importante, la liberacion de insulina incrementada tambien se acopla a la liberacion de amilina incrementada. Experimentalmente, la secrecion de insulina estimulada ha mostrado promover el desarrollo de amiloidosis de islote en modelos animales y, se pueden esperar efectos similares en humanos. Ademas del uso particular de moleculas de union a IAPP de la presente invencion, por consiguiente un metodo terapeutico propuesto adicional es una terapia de combinacion atractiva de las moleculas y los tratamientos novedosos antes indicados.
1. Definiciones
A menos que se manifieste lo contrario, un termino tal como aqul se utiliza se proporciona como la definicion segun Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Diccionario de Bioqulmica y Biologla Molecular de Oxford), Oxford University Press, 1997, revisado el 2000 y reimpreso el 2003, ISBN 0 19 850673 2.
Si no se especifica claramente lo contrario, el termino “IAPP”, se utiliza de manera intercambiable para referirse especlficamente a la forma monomerica, oligomerica, no fibrilar y fibrilar nativa del peptido de amiloide de islote (IAPP). El termino “IAPP” tambien se utiliza para identificar generalmente otros conformadores de IAPP, por ejemplo, oligomeros y/o agregados de IAPP, tal como IAPP-fibrillas.
El termino “IAPP” tambien se utiliza para referirse colectivamente a todos los tipos y formas de IAPP. El termino proIAPP se utiliza de manera intercambiable para referirse especlficamente a la forma nativa monomerica, oligomerica, fibrilar y/o agregada del peptido precursor del polipeptido amiloide de islote (proIAPP). Las letras agregadas en la parte frontal de los terminos IAPP o proIAPP se utilizan para indicar el organismo del ortologo particular que se esta originando de, por ejemplo, hIAPP para IAPP humano o mlAPP para origen de murido.
La secuencia de aminoacido de 37 aa para IAPP humanos es:
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO: 1) con un puente de disulfuro entre los residuos de cistelna 2 y 7 y el C-termino amidado.
IAPP se procesa a partir de la preprohormona preproIAPP, un precursor de 89 aminoacidos producidos en celulas p pancreaticas. La secuencia de protelna para preproIAPP humano es: MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNF
GAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL (SEQ ID NO: 2), cuya secuencia puede encontrarse tambien en las bases de datos pertinentes, por ejemplo, en la base de datos: UniProtID: P10997 (IAPP_HUMAN).
PreproIAPP se disocia rapidamente despues de la transicion en el polipeptido amiloide de proislote. La secuencia de protelna para proIAPP humano es:
TPIESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEV LKREPLNYLPL (SEQ ID NO: 3), la cual pasa por proteolisis y modificaciones post traduccion adicionales para generar hIAPP.
Las secuencias de aminoacido de IAPP, proIAPP y preproIAPP “tipo silvestre” o humanas recombinantes estan representadas por las secuencias antes mencionadas segun las SEQ ID NOs: 1-3.
Los anticuerpos anti-IAPP y anti-proIAPP humanos aqul descritos se enlazan especlficamente a IAPP y/o proIAPP y a los epltopos de los mismos y a varias conformaciones de IAPP y/o proIAPP y epltopos de los mismos. Por ejemplo, en la presente invencion se describen anticuerpos que enlazan especlficamente a las formas IAPP y/o proIAPP patologicamente agregadas, tal como oligomeros no fibrilares y/o oligomeros fibrilares/fibrillas y/o agregados que consisten en las formas mezcladas de los mismos. El termino agregado (patologicamente)/agregados de IAPP y/o proIAPP se utiliza de manera intercambiable para referirse especlficamente a las formas antes mencionadas. El termino
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“formas agregadas” (patologicas) o “agregados” tal como se utiliza en la presente invencion, describe los productos de una acumulacion o formacion de grupos debido a una interaccion erronea/patologica de IAPP y/o proIAPP entre si. Estos agregados, acumulaciones o formas de grupo pueden ser, consistir sustancialmente o consistir tanto de IAPP y/o proIAPP como de oligomeros no fibrilares y/o oligomeros fibrilares y fibrillas de los mismos. Tal como se utiliza en la presente invencion, la referencia a un anticuerpo que “se enlaza especlficamente”, “se enlaza selectivamente”, o “se enlaza preferentemente” a IAPP y/o proIAPP se refiere a un anticuerpo que no enlaza otras protelnas no relacionadas. En un ejemplo, el anticuerpo IAPP y/o proIAPP descrito en la presente invencion puede enlazar IAPP y/o proIAPP o un epltopo de los mismos, y no muestra la union anterior aproximadamente 2 veces antes para otras protelnas. Un anticuerpo que “se enlaza especlficamente” o “se enlaza selectivamente” a un conformador IAPP y/o proIAPP se refiere a un anticuerpo que no enlaza a todas las conformaciones de IAPP y/o proIAPP, es decir, no enlaza al menos a otro conformador IAPP y/o proIAPP. Por ejemplo, en la presente invencion se describen anticuerpos que enlazan preferentemente formas a agregadas de IAPP y/o proIAPP tanto in vitro como en tejidos obtenidos de pacientes con T2D evidente o con riesgo a desarrollar T2D. Ya que los anticuerpos IAPP y/o proIAPP humanos de la presente invencion han sido aislados de un conjunto de sujetos humanos saludables o de un conjunto de pacientes obesos y otros grupos de pacientes con riesgo incrementado a desarrollar T2D, los cuales en el tiempo del aislamiento de anticuerpo no mostraron signos de T2D, exhibiendo una respuesta inmune especlfica de IAPP y/o proIAPP, los anticuerpos IAPP y/o proIAPP de la presente invencion tambien pueden ser llamados “autoanticuerpos humanos” con el objeto de enfatizar que dichos anticuerpos de hecho fueron expresados por los sujetos y no han sido aislados de, por ejemplo, una inmunoglobulina humana que expresa biblioteca de fago, que hasta la fecha represento un metodo comun para tratar de proporcionar anticuerpos tipo humano.
El termino “peptido” se entiende que incluye los terminos “polipeptido” y “protelna” (los cuales, en ocasiones, pueden ser utilizados intercambiablemente en la presente invencion) dentro de su significado. Similarmente, los fragmentos de protelnas y polipeptidos tambien estan contemplados y pueden ser referidos en la presente invencion como “peptidos”. Sin embargo, el termino “peptido” indica preferentemente un pollmero de aminoacido que incluye al menos 5 aminoacidos contiguos, preferentemente al menos 10 aminoacidos contiguos, mas preferentemente al menos 15 aminoacidos contiguos, aun mas preferentemente al menos 20 aminoacidos contiguos, y particularmente preferidos al menos 25 aminoacidos contiguos. Ademas, el peptido segun la presente invencion normalmente no tiene mas de 100 aminoacidos contiguos, preferentemente menos de 80 aminoacidos contiguos y mas preferentemente menos de 50 aminoacidos contiguos.
Polinucleotidos:
El termino “polinucleotido” pretende comprender un acido nucleico singular, as! como acidos nucleicos plurales, y se refiere a una molecula o construccion de acido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (mARN) o ADN de plasmido (pADN). Un polinucleotido puede comprender una union de fosfodiester convencional o una union no convencional (por ejemplo, una union de amida, tal como el que se encuentra en los acidos nucleicos de peptido (PNA)). El termino “acido nucleico” se refiere a cualquiera de uno o mas segmentos de acido nucleico, es decir, fragmentos de ADN o ARN, presentes en el polinucleotido. Por el termino acido nucleico o polinucleotido “aislado” se entiende una molecula de acido nucleico, aDn o ARN que ha sido eliminada de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleotido recombinante que codifica un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado para los propositos de la presente invencion. Los ejemplos adicionales de un polinucleotido aislado incluyen polinucleotidos recombinantes mantenidos en celulas huesped heterologas o polinucleotidos purificados (parcial o sustancialmente) en solucion. Las moleculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de polinucleotidos de la presente invencion. Los polinucleotidos o acidos nucleicos aislados segun la presente invencion, incluyen ademas las moleculas producidas en forma sintetica. Ademas, el polinucleotido o acido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de union de ribosoma o un terminador de transcripcion.
Tal como se utiliza en la presente invencion, una “region de codificacion” es una parte de un acido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoacidos. Aunque un “codon de detencion” (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoacido, puede considerarse como parte de una region de codificacion, aunque cualesquiera secuencias de flanqueo, por ejemplo, promotores, sitios de union de ribosoma, terminadores de transcripcion, intrones y similares no son parte de la region de codificacion. Dos o mas regiones de codificacion de la presente invencion pueden estar presentes en una sola construccion de polinucleotido, por ejemplo, o un solo vector, o en construcciones de polinucleotido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Ademas, cualquier vector puede contener una sola region de codificacion, o puede comprender dos o mas regiones de codificacion, por ejemplo, un solo vector puede codificar por separado una region variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Ademas, un vector, polinucleotido, o un acido nucleico de la presente invencion puede codificar regiones de codificacion heterologas, ya sea fusionadas o no fusionadas a un acido nucleico que codifica una
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molecula de union, un anticuerpo, un fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones de codificacion heterologa incluyen sin limitacion elementos o motivos especializados, tal como un peptido de senal de secrecion o un dominio funcional heterologo.
En ciertas realizaciones, el polinucleotido o acido nucleico es ADN. En el caso de ADN un polinucleotido que comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido normalmente puede incluir un promotor y/o otros elementos de control de transcripcion o traduccion que pueden operar asociados con una o mas regiones de codificacion. Una asociacion operable es cuando una region de codificacion de un producto de gen, por ejemplo, un polipeptido, esta asociada con una o mas secuencias reguladoras en tal forma que se pone la expresion del producto de gen bajo la influencia o control de la secuencia(s) reguladora. Dos fragmentos de ADN (tal como una region de codificacion de polipeptido y un promotor asociado con la misma) estan “asociados en forma operable” o “enlazados en forma operable” si la induccion de la funcion del promotor da como resultado la transcripcion del mARN que codifica el producto de gen deseado y si la naturaleza de la ligadura entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresion de dirigir la expresion de un producto de gen o interferir con la capacidad que tiene la plantilla de ADN de ser transcrita. Por lo tanto, una region promotora puede asociarse en forma operable con un acido nucleico que codifica un polipeptido, si el promotor tuvo la capacidad de efectuar la transcripcion de dicho acido nucleico. El promotor puede ser un promotor especlfico de celula que dirige la transcripcion sustancial del ADN unicamente en celulas predeterminadas. Otros elementos de control de transcripcion, ademas de un promotor, por ejemplo, aumentadores, operadores, represores y senales de terminacion de transcripcion, pueden ser operables en forma asociada con el polinucleotido para dirigir la transcripcion especlfica de la celula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de transcripcion se describen en la presente invencion.
Una “molecula de union”, tal como se utiliza dentro del contexto de la presente invencion se refiere principalmente a anticuerpos, y fragmentos de los mismos.
Anticuemos:
Los terminos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se utilizan de manera intercambiable en la presente invencion. Un anticuerpo o inmunoglobulina es una molecula de union a IAPP y/o prolAPP que comprende al menos el dominio variable de la cadena pesada, y comprende normalmente al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunoglobulina basicas en sistemas de vertebrado estan relativamente bien entendidas; ver por ejemplo la Publicacion de Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2° edicion 1988).
Tal como se describe con mayor detalle mas adelante, el termino “inmunoglobulina” comprende varias y amplias clases de polipeptidos que pueden ser distinguidos en forma bioqulmica. Los expertos en la tecnica apreciaran que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, (g, g, a, 6, e) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, g1-g4). Es la naturaleza de esta cadena lo que determina la “clase” del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. estan bien caracterizados y son bien conocidos por conferir especializacion funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son facilmente discernibles por los expertos en la tecnica en virtud de la presente descripcion, y por consiguiente, estan dentro del alcance de la misma. Todas las clases de inmunoglobulina estan claramente dentro del alcance de la presente invencion, por lo que la descripcion que se encuentra mas adelante estara dirigida de manera general a la clase IgG de las moleculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molecula de inmunoglobulina estandar comprende dos polipeptidos de cadena ligera identicos de un peso molecular de aproximadamente 23,000 Daltons, y dos polipeptidos de cadena pesada identicos con un peso molecular de 53,000-70,000. Las cuatro cadenas normalmente se unen mediante unions de disulfuro en una configuracion “Y”, en donde la cadena pesada soporta el inicio de la cadena ligera en la boca de “Y” y continua a traves de la region variable.
Las cadenas ligeras se clasifican ya sea, kappa o lambda (k, l). Cada clase de cadena pesada puede enlazarse ya sea con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre si, y las partes de “cola” de las dos cadenas pesadas se enlazan entre si mediante ligaduras de disulfuro covalentes o ligaduras no covalentes, cuando las inmunoglobulinas se generan ya sea mediante hibridomas, celulas B o celulas huesped geneticamente disenadas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoacido de un N-termino en los extremos bifurcados de la configuracion Y al C-termino en la parte inferior de cada cadena.
Tanto las cadenas ligeras como pesadas se dividen en regiones de homologla estructural y funcional. Los terminos “constante” y “variable” se utilizan de manera funcional. En este respecto, se podra apreciar que los dominios variables
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de las partes de cadena tanto ligera (Vl) como pesada (Vh) determinan el reconocimiento y especificidad del antlgeno. De manera inversa, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biologicas importantes tal como secrecion, movilidad transplacenta, union de receptor Fc, union de complemento y similares. Por convenio la numeracion de los dominios de region constante incrementa conforme se vuelven mas distantes del sitio de union a antlgeno o termino amino del anticuerpo. La parte N-terminal es una region variable y la parte C-terminal es una region constante; los dominios CH3 y CL realmente comprenden el termino carboxi de la cadena pesada y ligera, respectivamente.
Tal como se indico anteriormente, la region variable permite que el anticuerpo reconozca en forma selectiva y union en forma especlfica epltopos en antlgenos. Esto es, el dominio Vl y dominio Vh, o subconjunto de las regiones de determinacion de complementariedad (CDRs), de un anticuerpo se combinan para formar la region variable que define un sitio de union a antlgeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de union a antlgeno presente al final de cada brazo de la Y. Mas especlficamente, el sitio de union a antlgeno se define a traves de las tres CDRs en cada una de las cadenas Vh y Vl. Un anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contiene suficiente estructura para enlazar especlficamente a IAPP y/o prolAPP, se indica en la presente invencion de manera intercambiable como un “fragmento de union” o “un fragmento inmunoespeclfico”.
El anticuerpo de origen natural, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables, algunas veces llamadas “regiones de determinacion de complementariedad” o “CDRs” presentes en cada dominio de union a antlgeno, las cuales son secuencias cortas, no contiguas de los aminoacidos que se colocan en forma especlfica para formar el dominio de union a antlgeno dominio de union a antlgeno, ya que el anticuerpo asume su configuracion tridimensional en un ambiente acuoso. Las “CDRs” estan flanqueadas por cuatro regiones de “estructura” relativamente conservadas o “FRs”, que muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones de estructura adoptan en gran parte una conformacion de hoja-P y las CDRs forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja-p. Por lo tanto, las regiones de estructura actuan para formar un andamio que proporciona la colocacion de las CDRs en una orientacion correcta mediante interacciones no covalentes, intercadena. El dominio de union a antlgeno formado por las CDRs colocadas define una superficie complementaria para el epltopo en el antlgeno inmunorreactivo. Esta superficie de complementariedad promueve la union no covalente del anticuerpo a su epltopo cognato. Los aminoacidos que comprenden las CDRs y las regiones de estructura, respectivamente, pueden ser identificadas facilmente a traves de cualquier region variable de cadena pesada o ligera por un experto en la tecnica, ya que han sido definidas en forma precisa; ver las Publicaciones de “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (Secuencias de protelnas de Interes Inmunologico), Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196 (1987), 901-917.
En caso en donde existen dos o mas definiciones de un termino que se utiliza y/o acepta en la tecnica, la definicion del termino tal como aqul se utiliza, esta proyectada para incluir todos de dichos significados a menos que se manifieste expllcitamente lo contrario. Un ejemplo especlfico es el uso del termino “region determinante de complementariedad (“CdRS”) para describir el antlgeno no contiguo que combina sitios encontrados dentro de la region variable en polipeptidos tanto de cadena pesada como ligera. Esta region particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (Secuencias de Protelnas de Interes Inmunologico” (1983) y por Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196 (1987), 901-917, y las definiciones incluyen el traslape o subconjuntos de residuos de aminoacido cuando se comparan entre si. Sin embargo, la aplicacion de cualquier definicion para referirse a una CDR de un anticuerpo o variante del mismo esta proyectada para estar dentro del alcance del termino, tal como se define y utiliza en la presente invencion. Los residuos de aminoacido adecuados que comprenden las CDRs tal como se define a traves de cada una de las referencias mencionadas anteriormente se establecen a continuacion en la tabla I como una comparacion. Los numeros de residuos exactos que comprenden una CDR particular variaran dependiendo de la secuencia y tamano de la CDR. Los expertos en la tecnica pueden determinar en forma rutinaria que residuos comprenden una region hipervariable particular o CDR del subtipo IgG humano del anticuerpo proporcionado a la secuencia de aminoacido de region variable del anticuerpo.
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Tabla 1. Definiciones CDR1
Kabat Chothia
VH CDR1
31-35 26-32
VHCDR2
50-65 52-58
VH CDR3
95-102 95-102
VL CDR1
24-34 26-32
VL CDR2
50-56 50-52
VL CDR3
89-97 91-96
La numeracion de todas las definiciones CDR en la tabla I esta segun los convenios de numeracion establecidos por Kabat et al. (ver mas adelante).
Kabat et al. tambien definio un sistema de numeracion para secuencias de dominio variable que puede aplicar a cualquier anticuerpo. Un experto en la tecnica puede asignar sin ambiguedad este sistema de “numeracion de Kabat” a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de cualquier dato experimental mas alla de la propia secuencia. Tal como se utiliza en la presente invencion, la “numeracion de Kabat” se refiere al sistema de numeracion establecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (Secuencia de Protelnas de Interes Inmunologico” (1983). A menos que se especifique de otra manera, las referencias a la numeracion de posiciones de residuo de aminoacido especlficas en un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno, variante o derivado del mismo de la presente invencion son segun el sistema de numeracion de Kabat, lo cual sin embargo es teorico, y puede no aplicar de manera igual a cada anticuerpo de la presente invencion. Por ejemplo, dependiendo de la posicion de la primera CDR, las siguientes CDRs deben ser cambiadas en cualquier direccion.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antlgeno, fragmentos inmunoespeclficos, variantes o derivados de los mismos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespeclficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados o quimericos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos de union de epltopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden cualquiera de un dominio Vl o Vh, fragmentos producidos por una biblioteca de expresion Fab, y anticuerpos anti-idiotipo (anti-Id) (incluyendo por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos aqul descritos). Las moleculas ScFv son conocidas en la tecnica y se describen por ejemplo en la Patente de Estados Unidos No. 5,892,019. Las moleculas de inmunoglobulina o de anticuerpo de la presente invencion pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA y IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase de una molecula de inmunoglobulina.
En una realizacion, el anticuerpo de la presente invencion no es IgM o un derivado del mismo con una estructura pentavalente. Los IgMs particulares, en aplicaciones especlficas de la presente invencion, especialmente uso terapeutico, son menos utiles que IgG y otros anticuerpos bivalentes o moleculas de union correspondientes, ya que IgMs debido a su estructura pentavalente y carencia de maduracion de afinidad, con frecuencia muestran reactividades cruzadas no especlficas y afinidad muy baja.
El anticuerpo de la presente invencion no es un anticuerpo policlonal, es decir, consiste sustancialmente de una especie de anticuerpo particular en lugar de ser una mezcla obtenida de una muestra de inmunoglobulina en plasma.
Los fragmentos de anticuerpo, incluyendo anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la region(s) variable sola o en combinacion con la totalidad o una parte de lo siguiente: region de articulacion, dominios CH1, CH2 y CH3. Tambien se incluyen en la presente invencion fragmentos de union a IAPP y/o proIAPP que comprenden cualquier combinacion de la region(s) variable con la region de articulacion, dominios CH1, CH2 y CH3.
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En un aspecto, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo monoclonal humano aislado de un humano. Opcionalmente, la region de estructura del anticuerpo humano se alinea y adopta segun las secuencias de region variables de llnea germinal humana pertinentes en la base de datos; ver por ejemplo la Vbase (
http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) alojada por el MRC Centre for Protein Engineering (Centro para Ingenierla de Protelna MRC) (Cambridge, UK). Por ejemplo, los aminoacidos considerados para desviarse potencialmente de la secuencia de llnea germinal real pueden deberse a las secuencias cebadoras PCR incorporadas durante el proceso de clonacion. En comparacion con anticuerpos tipo humano generados en forma artificial, tal como fragmentos de anticuerpo de cadena simple (scFvs) de una biblioteca de anticuerpo de despliegue de fago o raton xenogeneico, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invencion esta caracterizado por (i) obtenerse utilizando la respuesta inmune humana en lugar de los sustitutos animales, es decir, el anticuerpo ha sido generado en respuesta a IAPP o prolAPP natural en su conformacion relevante en el cuerpo humano, (ii) teniendo protegido al individuo o es al menos significativo para la presencia de IAPP y/o prolAPP, y (iii) ya que el anticuerpo es de origen humano, se minimizan los riesgos de reactividad cruzada contra autoantlgenos. Por lo tanto, segun la presente invencion, los terminos “anticuerpo monoclonal humano”, “autoanticuerpo monoclonal humano”, “anticuerpo humano” y similares se utilizan para indicar una molecula de union a IAPP y/o prolAPP que es de origen humano, es decir, que ha sido aislada de una celula humana tal como una celula B o hibridoma del mismo o el cADN del cual ha sido clonado directamente a partir de mARN de una celula humana, por ejemplo, una celula B de memoria humana. Un anticuerpo humano es aun “humano”, incluso si las sustituciones de aminoacido se elaboran en un anticuerpo (por ejemplo, para mejorar las caracterlsticas de union).
Los anticuerpos derivados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgenicos para una o mas inmunoglobulinas humanas, y que no expresan inmunoglobulinas endogenas, tal como se describe infra, y por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,939,598 de Kucherlapati et al., estan indicadas como anticuerpos tipo humano con el objeto de distinguirlos de los anticuerpos realmente humanos de la presente invencion.
Por ejemplo, el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos tipo humano, tal como anticuerpos sinteticos y semisinteticos normalmente aislados de un despliegue de fago, no reflejan necesariamente el emparejamiento original tal como ocurre en la celula B humana original. Por consiguiente, los fragmentos Fab y scFV obtenidos de bibliotecas de expresion recombinante como comunmente utilizadas en la tecnica anterior, pueden considerarse como siendo artificiales con todos los posibles efectos asociados en la inmunogenicidad y estabilidad.
En cambio, la presente invencion proporciona anticuerpos madurados por afinidad aislados de sujetos humanos seleccionados, que estan caracterizados por su utilidad terapeutica y su tolerancia en hombres.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “anticuerpo roedorizado” o “inmunoglobulina roedorizada” se refieren a un anticuerpo que comprende una o mas CDRs de un anticuerpo humano de la presente invencion; y una region de estructura humana que contiene sustituciones y/o eliminaciones y/o inserciones de aminoacido que estan basadas en una secuencia de anticuerpo de roedor. Cuando se refiere a roedores, preferentemente las secuencias que se originan en ratones y ratas son las utilizadas, en donde los anticuerpos que comprenden dicha secuencias son referidos como “murinizados” o “ratinizados”, respectivamente. La inmunoglobulina humana que proporciona las CDRs se llama “de origen” o “aceptadora”, y el anticuerpo de roedor que proporciona los cambios de estructura se llama “el donador”. Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo estan, normalmente son sustancialmente identicas a las regiones constantes de anticuerpo de roedor, es decir, al menos aproximadamente del 85 al 90%, preferentemente aproximadamente 95% o mas identicas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la inmunoglobulina de cadena pesada o ligera murinizada de longitud total contiene una region constante de raton, las CDRs humanas y una estructura sustancialmente humana que tiene un numero de sustituciones de aminoacido de “murinizacion”. Normalmente, un “anticuerpo murinizado” es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada y/o cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado puede no comprender un anticuerpo quimerico tlpico, por ejemplo, debido a que toda la region variable de un anticuerpo quimerico no es de raton. Un anticuerpo modificado que ha sido “murinizado” a traves del proceso de “murinizacion” enlaza al mismo antlgeno que el anticuerpo de origen que proporciona las CDRs, y normalmente es menos inmunogenico en ratones, tal como se compara con el anticuerpo de origen. Las explicaciones anteriores con respecto a los anticuerpos “murinizados” se aplican en forma analoga para ordenar anticuerpos “roedorizados”, tal como “anticuerpos ratinizados”, en donde se utilizan secuencias de rata en lugar de murido.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “parte de cadena pesada” incluye secuencias de aminoacido derivadas de cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipeptido que comprende una parte de cadena pesada comprende al menos una de: un dominio CH1, un dominio de articulacion (por ejemplo, region de articulacion superior, medio y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, un polipeptido de union para utilizarse en la presente invencion puede comprender una cadena de polipeptido que comprende un
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dominio CH1; una cadena de polipeptido que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio de articulacion, y un dominio CH2; una cadena de polipeptido que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena de polipeptido que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio de articulacion, y un dominio CH3, o una cadena de polipeptido que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio de articulacion, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realizacion, un polipeptido de la presente invencion comprende una cadena de polipeptido que comprende un dominio CH3. Ademas, un polipeptido de union para utilizarse en la presente invencion puede carecer de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, toda o parte de un dominio CH2). Tal como se establecio anteriormente, quedara entendido por un experto en la tecnica que estos dominios (por ejemplo, las partes de cadena pesada) pueden modificarse de modo que varlen en la secuencia de aminoacido de la molecula de inmunoglobulina de origen natural.
En ciertos anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variantes o derivados de los mismos aqul descritos, las partes de cadena pesada de una cadena de polipeptido de un multlmero, son identicas a una segunda cadena de polipeptido del multlmero. Alternativamente, los monomeros que contienen una parte de cadena pesada de la presente invencion no son identicos. Por ejemplo, cada monomero puede comprender un diferente sitio de union objetivo, formando, por ejemplo, un anticuerpo o diacuerpo biespeclfico.
En otra realizacion, los anticuerpos o fragmentos de union a antlgeno, variantes o derivados de los mismos aqul descritos estan compuestos de una cadena de polipeptido simple, tal como scFvs y seran expresados en forma intracelular (intracuerpos) para aplicaciones terapeuticas y de diagnostico potenciales in vivo.
Las partes de cadena pesada del polipeptido de union para utilizarse en los metodos de diagnostico y tratamiento aqul descritos, pueden derivarse de moleculas de inmunoglobulina diferentes. Por ejemplo, la parte de cadena pesada de un polipeptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molecula IgG1, y una region de articulacion derivada de una molecula IgG3. En otro ejemplo, una parte de cadena pesada puede comprender una region de articulacion derivada, en parte, de una molecula IgG1, y en parte, de una molecula IgG3. En otro ejemplo, la parte de cadena pesada puede comprender una articulacion quimerica derivada, en parte, de una molecula IgG1, y en parte de una molecula IgG4.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “parte de cadena ligera” incluye secuencias de aminoacido derivadas de una cadena ligera de nmunoglobulina. Preferentemente, la parte de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio VL o CL.
El tamano mlnimo de un epltopo de peptido o polipeptido para un anticuerpo se considera como de aproximadamente cuatro a cinco aminoacidos. Los epltopos de peptido y polipeptido contienen preferentemente al menos siete, mas preferentemente al menos nueve y lo mas preferentemente entre al menos aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 aminoacidos. Ya que una CDR puede reconocer un peptido o polipeptido antigenico en su forma terciaria, los aminoacidos que comprenden un epltopo no necesitan ser contiguos, y en algunos casos, incluso pueden no estar en la misma cadena de peptido. En la presente invencion, un epltopo de peptido o polipeptido reconocido por anticuerpos de la presente invencion contiene una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, mas preferentemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 aminoacidos contiguos o no contiguos de IAPP o proIAPP.
Por el termino “union en forma especlfica” o “reconocimiento especlfico” utilizado de manera intercambiable en la presente invencion, generalmente se entiende que una molecula de union, por ejemplo, un anticuerpo que enlaza a un epltopo a traves de su dominio de union a antlgeno, y que la union comprende cierta complementariedad entre el dominio de union a antlgeno y el epltopo. Segun esta definicion, se dice que un anticuerpo “enlaza especlficamente” a un epltopo cuando enlaza a dicho epltopo a traves de su dominio de union a antlgeno mas facilmente que lo que podrla enlazar a un epltopo no relacionado, aleatorio. El termino “especificidad” se utiliza en la presente invencion para calificar la afinidad relativa a traves de la cual un cierto anticuerpo enlaza a un cierto epltopo. Por ejemplo, el anticuerpo “A” puede considerarse que tiene una mayor especificidad para un epltopo determinado que el anticuerpo “B”, o el anticuerpo “A” se puede decir que enlaza al epltopo “C” con una mayor especificidad que para el epltopo relacionado “D”.
En donde esta presente, el termino “caracterlsticas de union de inmunoglobulina” u otras caracterlsticas de union de un anticuerpo con un antlgeno, y en todas sus formas gramaticas, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras caracterlsticas de union de un anticuerpo.
Por el termino “enlaza preferentemente” se entiende que la molecula de union, por ejemplo, anticuerpo que enlaza
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especlficamente a un epltopo mas facilmente que lo que podrla enlazar a un epltopo relacionado similar homologo o analogo. Por lo tanto, un anticuerpo que “enlaza preferentemente” a un epltopo determinado puede ser mas probable que union a dicho epltopo que el epltopo relacionado, incluso aunque dicho anticuerpo pueda reaccionar en forma cruzada con el epltopo relacionado.
A manera de ejemplo no limitante, la molecula de union, por ejemplo, un anticuerpo puede considerarse que enlaza a un primer epltopo preferentemente si enlaza al primer epltopo con una constante de disociacion (Kd) que es menor a la Kd del anticuerpo para el segundo epltopo. En otro ejemplo no limitante, un anticuerpo puede ser considerado que enlaza a un primer antlgeno preferentemente si enlaza al primer epltopo con una afinidad que es al menos de un orden de magnitud menor a la Kd del anticuerpo para el segundo epltopo. En otro ejemplo no limitante, se considera que un anticuerpo puede enlazar a un primer epltopo preferentemente si enlaza al primer epltopo con una afinidad que es al menos de dos ordenes de magnitud menor que la Kd del anticuerpo para el segundo epltopo.
En otro ejemplo no limitante, una molecula de union, por ejemplo, un anticuerpo puede considerarse que enlaza a un primer epltopo preferentemente si enlaza al primer epltopo con un fuera de rango (k(fuera)) que es menor que la k(fuera) del anticuerpo para el segundo epltopo. En otro ejemplo no limitante, un anticuerpo puede considerarse que enlaza a un primer epltopo preferentemente si enlaza al primer epltopo con una afinidad que es al menos de un orden de magnitud menor que la k(fuera) del anticuerpo para el segundo epltopo. En otro ejemplo no limitante, un anticuerpo puede considerarse que enlaza a un primer epltopo preferentemente si enlaza al primer epltopo con una afinidad que es al menos de dos ordenes de magnitud menor a la k(fuera) del anticuerpo para el segundo epltopo.
Una molecula de union, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno, variante o derivado aqul descrito puede decirse que enlaza a IAPP y/o prolAPP o un fragmento, variante o conformacion especlfica del mismo con un fuera de rango (k(fuera)) menor o igual a 5 x 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5 x 10-3 seg-1 o 10-3 seg-1. Mas preferentemente, un anticuerpo de la presente invencion se puede decir que enlaza a IAPP y/o prolAPP o un fragmento, variante o conformacion especlfica del mismo con un fuera de rango (k(fuera)) menor o igual a 5 x 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 x 10-5 seg-1 o 10-5 seg-1 5 x 10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 x 10-7 seg-1 o 10-7 seg-1.
Una molecula de union, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno, variante, o derivado aqul descrito puede decirse que enlaza a lAPP y/o prolAPP o un fragmento, variante o conformacion especlfica del mismo con un en rango (k(en)) mayor o igual a 103 M-1 seg-1, 5 x 103 M-1 seg-1, 104 M-1 seg-1 o 5 x 104 M-1 seg-1. Mas especlficamente, un anticuerpo de la presente invencion se puede decir que enlaza a IAPP y/o prolAPP o un fragmento, variante o conformacion especlfica del mismo con un en rango (k(en)) mayor o igual a 105 M-1 seg-1, 5 x 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, o 5 x 106 M-1 seg-1 o 107 M-1 seg-1.
Una molecula de union, por ejemplo, un anticuerpo se dice que inhibe en forma competitiva la union de un anticuerpo de referencia a un epltopo determinado, si enlaza preferentemente a dicho epltopo hasta un grado en que bloquee, hasta cierto grado, la union del anticuerpo de referencia al epltopo. La inhibicion competitiva puede ser determinada a traves de cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competicion. Un anticuerpo se puede decir que inhibe competitivamente la union del anticuerpo de referencia a un epltopo determinado en al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50%.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “afinidad” se refiere a una medida de la resistencia dla union de un epltopo individual con la CDR de una molecula de union, por ejemplo, una molecula de inmunoglobulina; ver por ejemplo la Publicacion de Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2° edicion (1988) en las paginas 27-28. Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “avidez” se refiere a la estabilidad general del complejo entre una poblacion de inmunoglobulinas y un antlgeno, esto es, la fuerza de combinacion funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antlgeno; ver por ejemplo la Publicacion de Harlow en las paginas 29 a 34. La avidez se relaciona tanto con la afinidad de las moleculas de inmunoglobulina individuales en la poblacion con los epltopos especlficos, como tambien con las valencias de las inmunoglobulinas y el antlgeno. Por ejemplo, la interaccion entre el anticuerpo monoclonal bivalente y un antlgeno con una estructura de epltopo de alta repeticion, tal como un pollmero, puede ser uno de alta avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo para un antlgeno puede determinarse en forma experimental utilizando cualquier metodo de acuerdo; ver por ejemplo la Publicacion de Berzofsky et al., “Interacciones de Anticuerp-Antlgeno” En Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman y Company New York, N Y (1992), y los metodos ahl descritos. Las tecnicas generales para medir la afinidad de un anticuerpo a un antlgeno incluyen ELISA, RIA, y resonancia de plasmon de superficie. La afinidad medida de una interaccion de anticuerpo- antlgeno particular puede variar si se mide bajo diferentes condiciones, es decir, concentracion de sal, pH. Por lo tanto, las medidas de afinidad y otros parametros de union a antlgeno, por ejemplo, Kd, IC50, se elaboran preferentemente con
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soluciones estandarizadas de anticuerpo y antlgeno, y un amortiguador estandarizado.
Las moleculas de union, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de union a antlgeno, variantes o derivados de los mismos de la presente invencion, tambien se describen o especifican en terminos de su reactividad cruzada.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “reactividad cruzada” se refiere a la capacidad de un anticuerpo, especlfico para un antlgeno, para reaccionar con un segundo antlgeno; una medida de la relacion entre dos diferentes sustancias antigenicas. Por lo tanto, un anticuerpo es reactivo en forma cruzada si enlaza a un epltopo ademas de uno que indujo su formacion. El epltopo de reactivo cruzado generalmente contiene muchas de las mismas caracterlsticas estructurales complementarias, tal como epltopo de induccion, y en algunos casos, puede realmente ajustar mejor que el original.
Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen cierto grado de reactividad cruzada, ya que enlazan epltopos relacionados pero no identicos, por ejemplo epltopos con al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, y al menos 50% de identidad (tal como se calcula utilizando metodos conocidos en la tecnica y aqul descritos) con un epltopo de referencia. Un anticuerpo se puede decir que tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no enlaza epltopos con menos del 95%, menos del 90%, menos del 85%, menos del 80%, menos del 75%, menos del 70%), menos del 65%, menos del 60%, menos del 55% y menos del 50% de identidad (tal como se calcula utilizando metodos conocidos en la tecnica y aqul descritos) con un epltopo de referencia. Un anticuerpo puede considerarse “altamente especlfico” para un cierto epltopo, si no enlaza cualquier otro analogo, ortologo u homologo de dicho epltopo.
Las moleculas de union, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de union a antlgeno, variantes o derivados de los mismos de la presente invencion tambien pueden describirse o especificarse en terminos de su afinidad de union para IAPP y/o prolAPP. Las afinidad de union preferidas incluyen las que tienen una constante de disociacion o Kd menor a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M o 10-15 M.
Tal como se indico anteriormente, las estructuras de subunidad y la configuracion tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulina son bien conocidas. Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “dominio Vh” incluye el dominio variable terminal amino de una cadena pesada de inmunoglobulina, y el termino “dominio CH1” incluye el primer dominio de region constante (en su mayorla terminal amino) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 esta adyacente al dominio Vh y es terminal amino para la region de articulacion de una molecula de cadena pesada de inmunoglobulina.
Tal como se utiliza en la presente invencion el termino “dominio CH2” incluye una parte de la molecula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo que utiliza esquemas de numeracion convencional (residuos 244 a 360, sistema de numeracion de Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeracion EU; ver la Publicacion de Kabat EA et al. op. cit). El dominio CH2 es unico ya que no se empareja cercanamente con otro dominio. Mas bien, dos cadenas de carbohidrato de ramificacion enlazadas-N estan interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molecula IgG nativa intacta. Tambien esta bien documentado que el dominio CH3 se extiende en el dominio CH2 hasta el C-terminal de la molecula IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “region de articulacion” incluye la parte de una molecula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta region de articulacion comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo de esta forma que las regiones de union a antlgeno N-terminal se muevan en forma independiente. Las regiones de articulacion pueden ser subdivididas en tres dominios distintos: dominios de articulacion superior, media e inferior; ver la Publicacion de Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083-4090.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “union de disulfuro” incluye la union covalente formada entre dos atomos de azufre. La cistelna de aminoacido comprende un grupo tiol que puede formar una union de disulfuro o puente con un segundo grupo tiol. En la mayorla de las moleculas IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL estan enlazadas por una union de disulfuro, y las dos cadenas pesadas estan enlazadas por dos unions de disulfuro en las posiciones que corresponden a 239 y 242 utilizando el sistema de numeracion de Kabat (posicion 226 o 229, sistema de numeracion USA).
Tal como se utiliza en la presente invencion, los terminos “enlazado”, “fusionado” o “fusion” se utilizan en forma
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intercambiable. Los terminos se refieren a la union de dos o mas elementos o componentes, mediante lo cual se entiende que incluyen medios de conjugacion qulmica o recombinantes. Una “fusion intraestructura” se refiere a la union de dos o mas cuadros de lectura abierta de polinucleotidos (ORFs) para formar un ORF mas largo continuo, en una forma que mantiene el marco de lectura de traduccion correcta de los ORFs originales. Por lo tanto, una protelna de fusion recombinante es una protelna simple que contiene dos o mas segmentos que corresponden a polipeptidos codificados por los ORFs originales (cuyos segmentos normalmente no se unen naturalmente). Aunque el marco de lectura se hace de esta forma continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden ser separados flsica o espacialmente, por ejemplo, mediante la secuencia enlazadora en estructura. Por ejemplo, los polinucleotidos que codifican las CDRs de una region variable de inmunoglobulina pueden ser fusionados, en-estructura, aunque separados por un polinucleotido que codifica al menos una region de estructura de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDRs “fusionadas” se traduzcan juntas como una parte de un polipeptido continuo.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “muestra” se refiere a cualquier material biologico obtenido de un sujeto o paciente. En un aspecto, una muestra puede comprender sangre, fluido peritoneal, CSF, saliva u orina. En otros aspectos, una muestra puede comprender sangre completa, plasma en sangre, suero en sangre, celulas B enriquecidas de muestras en sangre y celulas cultivadas (por ejemplo, las celulas B de un sujeto). Una muestra puede incluir tambien una biopsia o muestra de tejido que incluye tejido neural. Aun en otros aspectos, una muestra puede comprender celulas completas y/o un lisado de celulas. Las muestras de sangre pueden recolectarse a traves de metodos conocidos en la tecnica. En un aspecto, el pelet puede ser resuspendido vortizando a una temperatura de 4°C en 200 pl de amortiguador (20 mM Tris, pH. 7.5, 0.5% Nonidet, 1 mM EdTa, 1 mM PMSF, 0.1M NaCl, inhibidor de proteasa 1X e inhibidores de fosfatasa Sigma 1X 1 y 2). La suspension puede mantenerse en hielo durante 20 minutos con vortizado intermitente. Despues de girar en 15,000 x g durante 5 minutos a una temperatura de aproximadamente 4°C, las allcuotas del sobrenadante se pueden almacenar en aproximadamente -70°C.
Enfermedades:
A menos que se manifieste lo contrario, los terminos “trastorno” y “enfermedad” se utilizan de manera intercambiable en la presente invencion y comprenden cualquier cambio fisiologico indeseado en un sujeto, un animal, un organo, tejido o celula/cultivo celular aislado.
En determinantes geneticas T2D y factores ambientales conducen al desarrollo de resistencia a insulina seguido de un incremento compensador en la masa de celula beta y secrecion de insulina y amilina (IAPP) para mantener niveles de glucosa en sangre normales. Las altas concentraciones resultantes de amilina favorecen la formacion de oligomeros hlAPP toxicos y la deposicion de fibrillas hlAPP que se encuentran en mas del 90% e pacientes T2D. La deposicion de hlAPP se correlaciona con la reduccion en las celulas beta que producen insulina y tambien se ha propuesto que desempena un papel importante para la perdida de celulas-P en islotes pancreaticos transplantados en individuos con T1D. La presente solicitud proporciona varios anticuerpos derivados de humano de conjuntos de donadores saludables o donadores obesos con alto riesgo de T2D pero en ausencia de la enfermedad, los cuales fueron clonados y producidos en forma recombinante tal como se describe en la presente invencion mas adelante con mayor detalle.
Sin embargo, en una realizacion de la presente invencion, los anticuerpos de la presente invencio, los polinucleotidos, los vectores o las celulas de la presente invencion se utilizan para la preparacion de una composicion farmaceutica o de diagnostico para el tratamiento profilactico y terapeutico, control del progreso o una respuesta al tratamiento y/o diagnostico de enfermedades del grupo de enfermedades Diabetes mellitus, que comprende diabetes tipo 1 (T1D), diabetes gestacional, pre-diabetes, diabetes autoinmune latente de adultos (LADA; diabetes tipo 1,5) y/o diabetes tipo 2 (T2D).
En una realizacion preferida los anticuerpos de la presente invencion, los polinucleotidos, los vectores o las celulas de la presente invencion se utilizan para la preparacion de una composicion farmaceutica o de diagnostico para el tratamiento profilactico y terapeutico, control del progreso o una respuesta al tratamiento y/o diagnostico de un grupo de trastornos generalmente caracterizados por slntomas tal como cambios metabolicos que anteceden, originan y/o estan conectados/asociados o enlazados a T2D, comprende enfermedades que originan dano al pancreas y por consiguiente pueden conducir a diabetes, que comprende pancreatitis cronica, fibrosis qulstica, cancer pancreatico, en enfermedades que incrementan el riesgo de T2D que comprende enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington; y/o en enfermedades cardiovasculares enlazadas o no con obesidad y T2D. En una realizacion preferida, los slntomas que generalmente caracterizan las enfermedades antes mencionadas, comprenden sensibilidad a insulina perturbada y secrecion incrementada de insulina y/o hlAPP en un sujeto.
En una realizacion, el grupo de trastornos asociados con slntomas especlficos antes mencionados asociados
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comprenden diabetes gestacional, prediabetes (cuando la glicemia de alto nivel en la sangre no alcanza el valor de umbral de T2D o resistencia a insulina); sindrome metabolico en general como un factor de riesgo para desarrollar diabetes o como una condicion que puede existir antes de la diabetes; amiloidosis de Islote en general como un factor de riesgo para desarrollar diabetes o como una condicion que puede existir antes de la diabetes; obesidad en general como un factor de riesgo para desarrollar diabetes o como una condicion que puede existir antes de la diabetes y/o deficiencia de celula beta despues de trasplante clinico de islote pancreatico.
Ademas, los anticuerpos de la presente invencion, los polinucleotidos, los vectores o celulas de la presente invencion, se utilizan para la preparacion de una composicion para la deteccion de una secrecion de amilina cambiada, es decir incrementada o disminuida, en comparacion con una secrecion de amilina en un sujeto saludable en un diagnostico diferencial de diabetes tipo 1, diabetes autoinmune latente de adultos (LAD A, diabetes Tipo 1,5) en comparacion con formas T2D o en trastornos que anteceden una T2D evidente, tal como diabetes gestacional o prediabetes; en enfermedades que originan danos al pancreas y por consiguiente pueden conducir a diabetes tal como pancreatitis cronica, fibrosis quistica, cancer pancreatico; en enfermedades que incrementan el riesgo de T2D tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington; y/o en enfermedades cardiovasculares enlazadas o no con obesidad y T2D.
Los trastornos tales como obesidad y resistencia a insulina/hiperinsulinemia se observan con frecuencia como una predisposicion y/o como un sintoma de T2D que puede conducir a niveles elevados en la circulacion del polipeptido amiloide de islote (IAPP) ya como una forma evidente de T2D. Se ha descubierto que los oligomeros, fibrillas y placas de amilina (hlAPP) se acumulan no unicamente dentro del pancreas y rinones, sino tambien dentro del corazon en pacientes con obesidad y resistencia a insulina. Esta acumulacion ha sido observada en relacion con una homeostasis Ca2+ celular alterada que a su vez, puede contribuir a disfuncion cardiaca en dichos pacientes.
Por consiguiente, en una realizacion, los anticuerpos de la presente invencion, los polinucleotidos, los vectores o las celulas de la presente invencion se utilizan para la preparacion de una composicion farmaceutica o de diagnostico para el tratamiento profilactico y terapeutico, disminucion, control del progreso o una respuesta al tratamiento y/o para el diagnostico de un grupo de trastornos que siguen a T2D, o que resultan de cambios metabolicos que preceden y/o originan T2D, es decir, cambios metabolicos que ocurren en un estado prediabetico, en donde el grupo de trastornos comprende enfermedad cardiaca, ataques, retinopatia diabetica, deficiencia de rinon, deficiencia renal, cetoacidosis y, hiperosmolar no cetotico.
Mas de 20 trastornos neurodegenerativos (ver tabla 1 en la pagina 511 en la Publicacion de M. Ristow, J. Mol. Med 82 (2004), 510-529) son conocidos por estar asociados con diabetes mellitus, resistencia a insulina y obesidad incrementada, sensibilidad de insulina perturbada y secrecion de insulina excesiva o danada. Por consiguiente, en una realizacion de la presente invencion, los anticuerpos de la presente invencion, los polinucleotidos, los vectores o las celulas de la presente invencion se utilizan para la preparacion de una composicion farmaceutica o de diagnostico para tratamiento profilactico y terapeutico, control del progreso o una respuesta al tratamiento y/o diagnostico de trastornos neurodegenerativos que comprenden enfermedad de Alzheimer (AD), ataxia-telangiectasia (AT), sindrome de Bardet- Biedl (BBS), ataxia de Friedreich (FRDA), enfermedad de Huntington, distrofia miotonica, narcolepsia, enfermedad de Parkinson, sindrome de Prader-Willi y sindrome de Werner.
La tolerancia a la glucosa danada induce pocas complicaciones que son caracteristicas de diabetes mellitus, pero tiene un mayor riesgo de la generacion de diabetes mellitus que el tipo normal, lo cual puede ser una causa de enfermedades macrovasculares. La “resistencia a insulina” significa condiciones de sensibilidad reducida a insulina. La insulina ha sido conocida por exhibir un mayor rango de efectos tal como, ademas de un efecto en el metabolismo de glucosa, un efecto en el metabolismo de lipidos o efectos en los vasos sanguineos y rinon. Una vez que se reduce la sensibilidad a insulina, no unicamente se puede inducir anormalidad metabolica de glucosa, sino tambien la anormalidad metabolica de Kpidos, tal como hipertriglicemia, nivel de HDL en plasma disminuido o hipertension como una anormalidad de efectos de insulina en el vaso sanguineo o el rinon.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “diabetico” en un humano significa de manera general y actual una concentracion de glucosa en plasma o sangre aleatoria de 2200 mg/dL (211.1 mmol/L) o glucosa en plasma en ayuno de 2126 mg/dL (27.0 mmol/L) o glucosa postcarga de 2 horas 2200 mg/dL (2:11.1 mmol/L) durante una prueba de tolerancia de glucosa oral. Ademas o en forma alternativa, el termino “diabetico” se utiliza para sujetos que muestran uno o mas de los sintomas clinicos de diabetes que incluyen sed incrementada (polidipsia), orina frecuente (poliuria), hambre extrema, perdida de peso no explicada, fatiga y vision borrosa, vulnerabilidad a llagas de curacion lenta e infeccion frecuente, incluyendo la de la vejiga, vagina y gomas y/o areas de piel oscurecida (acanthosis nigricans).
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “no diabetico” en un humano significa de manera general y actual
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un nivel de glucosa en plasma en ayuno de <100 mg/dL (5.6 mmol/dL) o un nivel de glucosa postcarga de 2 horas <140 mg/dL (<7.8 mmol/dL) durante una prueba de tolerancia de glucosa oral.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “prediabetico” en humano significa de manera general y actual un nivel de glucosa en plasma en ayuno de 100 a 125 mg/dL (5.6 a 6.9 mmol/L) o un nivel de glucosa postcarga de 2 horas de 140 a 199 mg/L (7.8 a 11.1 mmol/L) durante una prueba de tolerancia a glucosa oral. A menos que se manifieste lo contrario, los terminos “prediabetico”, “prodromico” y “presintomatico” se utilizan de manera intercambiable en la presente invencion y describen la fase precllnica de T2D.
Ademas o en forma alternativa, los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c) pueden utilizarse en el diagnostico de diabetes en un sujeto. En niveles de HbA1c elevados en o mas alla del valor de umbral de 6.5%, se realiza un diagnostico de diabetes, es decir, el termino “diabetico” se utiliza de manera general y actual en un humano, aunque los niveles de 5.7% a 6.4% senalan un alto riesgo de desarrollo tanto de diabetes como de enfermedad cardiovascular, y son un marcador de “prediabetes,” o un estado “prediabetico/presintomatico” en un humano. El termino “no diabetico” en un humano significa de manera general y actual niveles HbA1c debajo del valor umbral de 5.7%.
Modelos de Roedor de Diabetes Mellitus Tipo II en Descubrimiento de Farmacos
Los ejemplos de animales modelo reportados convencionalmente que desarrollan espontaneamente diabetes Tipo II incluyen ratones KK-Ay (Nishimura M., Exp. Anim. 18, 147-157, 1969), ratones NSY (Ueda H., et al., Diabetologia 38, 503-508, 1995), ratones db/db (Hummel K. P., et al., Science 153, 1127-1128, 1966), ratones ob/ob (Herberg L. & Kley H K, Horm. Metab. Res. 7, 410-5, 1975), y ratones AKITA (Yoshioka M., et al., Diabetes 46, 887-894, 1997).
De estos animales, los ratones KK-Ay y ratones NSY son modelos con obesidad y los ratones db/db y ratones ob/ob son modelos con obesidad debido a una anormalidad en receptores de leptina o en la produccion de leptina. Por otra parte, los ratones AKITA son un modelo para diabetes originada por una anormalidad en las celulas p pancreaticas.
Como un modelo animal de diabetes Tipo II no obeso, por ejemplo, un modelo de raton se reporta en la Solicitud de Patente Japonesa No. 2004-65181. Este raton exhibe una secrecion anormal de insulina.
Sin embargo, los anticuerpos de la presente invencion se prueba preferentemente y caracterizan en animales transgenicos, por ejemplo, roedores que expresan hIAPP tal como ratas transgenicas para amilina humana en celulas p pancreaticas (ratas HIP) tal como se describe en la Publicacion de Butler et al., Diabetes 53 (2004), 1509-1516 y Matveyenko and Butler, Diabetes 55 (2006), 2106-2114. Mas preferentemente, los modelos de raton de diabetes tipo 2 que sobreexpresan IAPP, se utilizan tal como se describe en la Publicacion de Matveyenko and Butler (2006), ILAR J. 47(3): 225-233, y se resume en la tabla 2 en la pagina 228 de dicho documento. Debido a la sobreexpresion de hIAPP de dichos modelos de animal, se muestra en forma valida slntomas de T2D tal como un estado hiperglicemico. En general, el termino “hiperglicemia” o “estado hiperglicemico” se refiere a niveles de glucosa en plasma en ayuno significativamente incrementados en dos medidas consecutivas tomadas en diferentes intervalos de tiempo, y cuando se compara con crlas de control no transgenicas. Los valores absolutos medidos en animales hiperglicemicos deben depender del modelo animal en particular utilizado, por ejemplo, en h-IAPP (ratones hemicigoticos)/ob/+, s-15-20 mM glucosa; en ratones h-IAPP (homicigoticos)/FVB/N s~11mM glucosa.
Los metodos para estudiar diabetes incluyen medida de cambios fisiologicos y analisis de sangre o plasma de animales diabeticos en comparacion con animales no diabeticos, saludables. Estas medidas incluyen pero no se limitan a, dinamicas de crecimiento, Indice de masa corporal (BMI), Indice de masa magra (LMI), ingesta de alimentos y agua, diferencias de sexo, glucosa en sangre en ayuno y aleatoria, trigliceridos (TG), lipoprotelnas, colesterol, peso de hlgado y llpidos de hlgado, tamano de funcion de rinon, prueba de tolerancia a glucosa (GTT), prueba de tolerancia a insulina (itT), concentracion de insulina en sangre, morfologla de celula de islote pancreatico, dietas con alto contenido de grasa y restriccion calorica.
Tal como se utiliza en la presente invencion, los terminos “aleatorio” y “sin ayuno” significan generalmente en cualquier tiempo durante el dla o la noche sin importar que tiempo ha transcurrido desde el ultimo alimento.
Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “ayuno” significa generalmente ninguna ingesta calorica durante al menos 12 horas.
Se podra apreciar que estas definiciones son las directrices generalmente aceptadas por medicos que generalmente estan segun la American Diabetes Association (Asociacion Americana de Diabetes) (ADA) y German Diabetes
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Association (Asociacion Alemana de Diabetes) (GDA). Las directrices pueden cambiar con el tiempo y variar por region o pals y dependen del grupo o institucion (por ejemplo, ADA, Organizacion Mundial de la Salud, NIDDK/NIH, CDC, GDA etc.) que proporciona las directrices conocidas para los expertos en la tecnica. Los medicos tambien pueden utilizar su experiencia cllnica, el historial medico del paciente y/o otra informacion cuando se decide un diagnostico y tratamiento. Estas definiciones por consiguiente pueden cambiar con el tiempo segun los avances en ciencia y medicina.
Tratamiento:
Tal como se utiliza en la presente invencion, los terminos “tratar” o “tratamiento” se refieren tanto a un tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o disminuir (alentar) un cambio o trastorno fisiologico no deseado, tal como el desarrollo de diabetes. Los resultados cllnicos beneficos o deseados incluyen pero no se limitan a, alivio de slntomas, disminucion de grado de enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeora), retraso o disminucion del progreso de la enfermedad, disminucion o alivio del estado de enfermedad, y remision (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. El termino “tratamiento” tambien puede significar prolongar la supervivencia en comparacion con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen la condicion o trastorno, as! como los que son propensos a tener la condicion o trastorno, o aquellos en donde se evitara la manifestacion de la condicion o trastorno.
Si no se indica de otra manera, el termino “farmaco”, “medicina”, o “medicamento” se utilizan de manera intercambiable en la presente invencion y deben incluir pero no limitarse a todos (A) artlculos, medicinas y preparaciones para uso interno o externo, y cualquier sustancia o mezcla de sustancias proyectada para ser utilizada para el diagnostico, curacion, mitigacion, tratamiento o prevencion de la enfermedad ya sea de un hombre u otros animales; y (B) artlculos, medicinas y preparaciones (ademas de alimento) proyectados para afectar la estructura o cualquier funcion del cuerpo de un hombre u otros animales; y (C) artlculos proyectados para utilizarse como un componente de cualquier artlculo especificado en clausulas (A) y (B). El termino “farmaco”, “medicina” o “medicamento” deben incluir la formula completo de la preparacion proyectada para utilizarse en cualquier hombre u otros animales que, en donde la formula contiene uno o mas “agentes”, “compuestos”, “sustancias” o “composiciones (qulmicas)”, y en algun otro contexto tambien otros excipientes farmaceuticamente inactivos como rellenadores, desintegrantes, lubricantes, deslizadores, enlazadores o que aseguren un facil transporte, desintegracion, disgregacion, disolucion y disponibilidad biologica del “farmaco”, “medicina” o “medicamento” en una ubicacion objetivo proyectada dentro del cuerpo del hombre u otros mamlferos, por ejemplo, en la piel, en el estomago o el intestino. Los terminos “agente”, “compuesto” o “sustancia” se utilizan de manera intercambiable en la presente invencion y deben incluir, en un contexto mas particular, pero no se limitan a todos los agentes farmacologicamente activos, es decir, agentes que inducen un efecto biologico o farmacologico deseado o se investigan o prueba para la capacidad de inducir dicho efecto farmacologico posible a traves de los metodos de la presente invencion.
Por el termino “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamlfero”, se entiende cualquier sujeto, particularmente sujeto humano, por ejemplo, un paciente humano, para el cual se desea diagnostico, pronostico, prevencion o terapia.
Portadores farmaceuticos:
Los portadores y las rutas de administracion farmaceuticamente aceptables pueden tomarse de la literatura correspondiente conocida por los expertos en la tecnica. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden formularse segun metodos conocidos en la tecnica; ver por ejemplo la Publicacion de Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Ciencia y Practica de Farmacia) (2000) de la Universidad de Ciencias de Filadelfia, ISBN 0683-306472, Protocolos de Vacuna 2° Edicion de Robinson et al., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, USA, 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems (Peptidos y Protelnas Terapeuticos: Formulacion, Procesamiento y Sistema de Suministro) 2° Edicion de Taylor and Francis (2006), ISBN: 08493-1630-8. Los ejemplos de portadores farmaceuticos adecuados son bien conocidos en la tecnica e incluyen soluciones salinas amortiguadas por fosfato, agua, emulsiones, tal como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones esteriles etc. Las composiciones que comprenden dichos portadores pueden formularse a traves de metodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmaceuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. La administracion de composiciones adecuadas puede llevarse a cabo por diferentes formas. Los ejemplos incluyen administrar una composicion que contiene un portador farmaceuticamente aceptable via oral, intranasal, rectal, topica, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutanea, subdermica, transdermica, intratecal, y metodos intracraneales. Las formulaciones en aerosol tal como formulaciones de roclo nasal incluyen soluciones acuosas purificadas, u otras soluciones del agente activo con agentes conservadores y agentes isotonicos. Dichas formulaciones se ajustan preferentemente a un pH y estado isotonico compatible con las membranas mucosas nasales. Las composiciones farmaceuticas para administracion oral, tal como moleculas de anticuerpo de
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dominio simple (por ejemplo, “nanocuerpos™”) etc., tambien estan consideradas en la presente invencion. Dichas formulaciones orales pueden estar en forma de tableta, capsula, polvo, liquido o semisolido. Una tableta puede comprender un portador solido tal como gelatina o un adyuvante. Las formulaciones para administracion rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio con un portador adecuado, ver tambien la Publicacion de O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735. La guia adicional con respecto a formulaciones que son adecuadas para diversos tipos de administracion se pueden encontrar en las Ciencias Farmaceuticas de Remington, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17° edicion (1985) y actualizaciones correspondientes. Para una revision breve de los metodos para suministro de farmaco consultar la Publicacion de Langer, Science 249 (1990), 1527-1533.
II. Anticuerpos de la presente invencion
La presente invencion se refiere generalmente a anticuerpos anti-IAPP humanos y a fragmentos de union a antigeno de los mismos, tal como se caracteriza en las reivindicaciones, que demuestran preferentemente las caracteristicas de union inmunologicas y/o propiedades biologicas tal como se describe para los anticuerpos, cuyas secuencias se representan en las figuras 1A-E, H e I y se ilustran en los Ejemplos. Segun la presente invencion, los anticuerpos monoclonales humanos especificos para IAPP y/o prolAPP fueron clonados a partir de un conjunto de sujetos humanos saludables.
En el curso de los experimentos llevados a cabo segun la presente invencion, los anticuerpos en un medio acondicionado de cultivos de celula B de memoria humana fueron clasificados en paralelo para union a proteina r IAPP y/o proIAPP oligomerica, fibrilar y/o no fibrilar agregada-albumina de suero de bovino (BSA). Unicamente los cultivos de celula B positivos para proteina IAPP y/o proIAPP agregada pero no para BSA, fueron sometidos a clonacion de anticuerpo.
Debido a esta medida, se pueden aislar varios anticuerpos. Los anticuerpos seleccionados fueron analizados en forma adicional para la determinacion de clase y subclase de cadena ligera. Los mensajes de anticuerpos relevantes seleccionados de cultivos de celula B de memoria posteriormente son transcritos por RT-PCR, clonados y combinados en vectores de expresion para produccion recombinante; ver los ejemplos adjuntos. La expresion recombinante de los anticuerpos humanos en celulas HEK293 o CHO y la caracterizacion subsecuente de sus especificidades de union hacia la proteina IAPP y/o proIAPP humana (figuras 3 y 4; Ejemplo 1), y su union distintivo a formas patologicamente agregados de los mismos (figura 5, ejemplo 2) confirmaron que por primera vez los anticuerpos humanos han sido clonados de modo que son altamente especificos para proteina IAPP y/o proIAPP y reconocen en forma distinta las formas patologicamente agregadas de proteina IAPP y/o proIAPP, tal como fibrillas de IAPP. Una segunda vuelta de experimentos confirmo los descubrimientos anteriores tal como se muestra en las figuras 7 a 9 y en el Ejemplo 4. Ademas, los anticuerpos quimericos de raton generados segun la presente invencion y que comprende dominios CDR de los anticuerpos humanos de la presente invencion, han mostrado una afinidad de union igual a IAPP humano como los anticuerpos humanos tal como se muestra en las figuras 11 y 12 y en el Ejemplo 6.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere de manera general a un anticuerpo de polipeptido amiloide anti-islote monoclonal humano de origen natural, aislado y fragmentos de union, derivados y variantes del mismo, tal como se caracteriza en las reivindicaciones. En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo tiene la capacidad de enlazar IAPP y/o proIAPP.
En una realizacion, la presente invencion se dirige a un anticuerpo anti-IAPP y/o anti-proIAPP o un fragmento de union a antigeno, variantes o derivados del mismo, en donde el anticuerpo enlaza especificamente al mismo epitopo de IAPP como un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI- 203.8E3, NI-203.11B12, NI-203.19F2 y NI-203.15C7. El mapeo de epitopo identifico una secuencia dentro del iApP humano que incluye aa 19-SSNNFGA-25 (SEQ ID NO: 4) como el epitopo lineal unico reconocido por el anticuerpo Nl- 203.19H8 de la presente invencion, una secuencia dentro del IAPP humano que incluye una aa 2-CNTATCA-8 (SEQ ID NO: 5) como el epitopo lineal unico reconocido por el anticuerpo NI-203.26C11 de la presente invencion, y una secuencia dentro del iApP humano que incluye una aa 10-QRLANFLVHS-19 (SEQ ID NO: 71) el epitopo lineal unico reconocido por el anticuerpo NI-203.15C7 de la presente invencion (ver figuras 5 A y 5B y el Ejemplo 3). Por consiguiente, en una realizacion se proporciona el anticuerpo de la presente invencion, en donde el anticuerpo enlaza especificamente un epitopo IAPP que comprende la secuencia de aminoacido SSNNFGA (SEQ ID NO: 4), CNTATCA (SEQ ID NO: 5) o QrLaNFLVHS (SEQ ID NO: 71). Tal como se describe con detalle en el Ejemplo 3, los epitopos de los anticuerpos IApP recombinantes, anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.8E3 y NI-203.19F2 puede no ser identificado, lo que indica que estos anticuerpos probablemente enlazan epitopos no lineales.
Ademas, en una realizacion, la presente invencion se dirige a un anticuerpo anti-IAPP y/o anti-proIAPP, un fragmento de
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union a antlgeno, variante o derivados del mismo, en donde el anticuerpo enlaza especlficamente al mismo epltopo de proIAPP como el anticuerpo de referencia NI-203.26C11.
Ademas, sin pretender limitarse por las observaciones experimentales iniciales tal como se muestra en el Ejemplo 4 y se muestra en la figura 7, los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 y NI-203.8E3 anti-IAPP monoclonales humanos de la presente invencion estan caracterizados preferentemente en una union especlfico a los agregados IAPP patologicos (fibrillas en este Ejemplo), y no reconocen sustancialmente IAPP en la forma fisiologica en el pancreas. Lo mismo se espera que aplique para los anticuerpos NI-203.19F2 y NI-203.15C7 anti-IAla prPP monoclonales humanos. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un conjunto de anticuerpos anti-IAPP y/o anti-proIAPP humanos con especificidades de union, que por lo tanto son particularmente utiles para propositos de diagnostico y terapeuticos. Por lo tanto, en una realizacion la presente invencion proporciona anticuerpos, que tiene la capacidad de enlazar especlficamente a formas patologicamente agregadas de IAPP y/o proIAPP (ver figura 5 y figuras 7 a 9, y los Ejemplos 2 y 4). Para detalles adicionales y una revision resumida con respecto a las especificidades de union de la presente invencion ver tambien las figuras 7 y 8 y la descripcion que se encuentra mas adelante.
El anticuerpo de la presente invencion exhibe las propiedades de union de los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI- 203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2 y NI-203.1 5c7 de ejemplo tal como se describe en los Ejemplos. Ademas o en forma alternativa, el anticuerpo anti-IAPP y/o anti-proIAPP de la presente invencion reconoce preferentemente anti-IAPP y/o anti-proIAPP patologicamente agregado, tal como fibrillas de IAPP en lugar de monomeros IAPP y/o proIAPP fisiologicos, en particular cuando se analizan segun los Ejemplos 2 a 4. En una realizacion, por lo tanto, el anticuerpo de la presente invencion no reconoce sustancialmente IAPP fisiologico. El termino “no reconoce sustancialmente” cuando se utiliza en la presente solicitud, describe una afinidad de union de una molecula de un grupo que comprende un anticuerpo, un fragmento del mismo o una molecula de union para una molecula objetivo, antlgeno y/o conformacion especlfica de la molecula objetivo y/o antlgeno, significa que la molecula del grupo antes mencionado enlaza a la molecula, antlgeno y/o conformacion con una afinidad de union que es de al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces o 9 veces menor que la constante de disociacion (KD) de la molecula del grupo antes mencionado para enlazar a otra molecula, antlgeno y/o conformacion. Preferentemente el termino “no reconoce sustancialmente” cuando se utiliza en la presente solicitud significa que la molecula del grupo antes mencionado enlaza la molecula, antlgeno y/o conformacion con una afinidad de union que es de al menos o de 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 1000 veces o 10000 veces menor que la constante de disociacion (KD) de la molecula del grupo antes mencionado para enlazar a otra molecula, antlgeno y/o conformacion. Ademas, o en forma alternativa, el anticuerpo anti- IAPP y/o anti-proIAPP de la presente invencion enlaza a la enfermedad originando formas agregadas de anti-IAPP y/o anti-proIAPP humano, en particular las descritas en el Ejemplo 4. En este contexto, las especificidades de union pueden estar en el rango tal como se muestra en los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11 y NI-203.8E3 de ejemplo en la figura 4, respectivamente figura 5, es decir, teniendo la mitad de las concentraciones efectivas maximas (EC50) de aproximadamente 1 pM a 500 nM, preferentemente una EC50 de aproximadamente 10 pM a 100 nM, mas preferentemente una EC50 de aproximadamente 100 pM a 50 nM para IAPP humano tal como se muestra para NI- 203.19H8 o una EC50 de aproximadamente 100 pM a 10 nM para IAPP humano tal como se muestra para NI-203.9A2, NI-203.26C11 y NI-203.8E3. En este contexto, los resultados experimentales tal como se proporcionan en el Ejemplo 4 y se muestran en la figura 4, la figura 5 respectiva, tambien indica que ademas o en forma alternativa, algunos de los anticuerpos anti-IAPP de la presente invencion no reconocen sustancialmente proIAPP tal como se muestra para los anticuerpos de ejemplo NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.8E3. Por lo tanto, en una realizacion, el anticuerpo de la presente invencion no reconoce sustancialmente proIAPP.
Ademas, o en forma alternativa, el anticuerpo anti-IAPP de la presente invencion enlaza especlficamente ademas para madurar IAPP para la forma precursora de IAPP, es decir proIAPP tambien en particular como se describe en el Ejemplo 1. En este contexto, las especificidades de union pueden estar dentro del rango tal como se muestra en el anticuerpo NI- 203.26C11 de ejemplo en la figura 3, la figura 4 respectiva, es decir, que tiene la mitad de las concentraciones efectivas maximas (EC50) de aproximadamente 1 pM a 500 nM, preferentemente una EC50 de aproximadamente 10 pM a 400nM, mas preferentemente una EC50 de aproximadamente 100 pM a 400nM o una EC50 de aproximadamente 100 pM a 300 nM, mas preferentemente una EC50 de aproximadamente 1nM a 300nM para el pro-IAPP agregado tal como muestra para NI-203.26C11.
Ademas o en forma alternativa, el anticuerpo anti-IAPP de la presente invencion enlaza especlficamente a IAPP madura y no enlaza sustancialmente la forma precursora de IAPP, es decir proIAPP, en particular tal como se describe en el Ejemplo 1. En este contexto, las especificidades de union pueden estar dentro del rango tal como se muestra en los anticuerpos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.8E3 de ejemplo en la figura 4, la figura 5 respectiva tal como se indico anteriormente.
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Algunos anticuerpos purificados se enlazan a una amplia formacion de biomoleculas, por ejemplo, protelnas. Tal como lo apreciaran los expertos en la tecnica, el termino especlfico se utiliza en la presente invencion para indicar que otras biomoleculas ademas de las protelnas IAPP y/o prolAPP o fragmentos de las mismas, no enlazan significativamente a la molecula de union a antlgeno, por ejemplo, uno de los anticuerpos de la presente invencion. Preferentemente, el nivel de union a una biomolecula ademas de IAPP y/o prolAPP, da como resultado una afinidad de union que es cuando mucho unicamente el 20% o menos, 10% o menos, unicamente 5% o menos, unicamente 2% o menos o unicamente 1%> o menos (es decir al menos 5, 10, 20, 50 o 100 veces menor) de la afinidad a IAPP y/o prolAPP, respectivamente; ver por Ejemplo 1 y figura 3. Ademas, los anticuerpos anti-IAPP y/o anti-prolAPP de la presente invencion enlazan especlficamente a los agregados IAPP y/o proIAPP tal como se valida mediante los experimentos que muestran que los anticuerpos de la presente invencion no reconocen el amiloide Ap patologico en enfermedad Alzheimer de cerebro humano y tiene unicamente calidades de union de reaccion cruzada mlnimas para diversos candidatos de protelna con una propension de mal pliegue/agregacion, tal como se muestra con los anticuerpos de ejemplo NI-203.9A2, NI- 203.19H8 y NI-203.26C11 en las secciones de cerebro incrustadas con parafina de un paciente diagnosticado con enfermedad de Alzheimer y mediante experimentos de ELISA directo; ver el Ejemplo 5 y figura 10.
Por consiguiente, en una realizacion se proporciona el anticuerpo de la presente invencion, el cual no reconoce sustancialmente el amiloide-p peptido (AP1-42).
El anticuerpo anti-IAPP y/o anti-proIAPP de la presente invencion se enlaza preferentemente a las formas agregadas de IAPP y/o proIAPP, las fibrillas y/o oligomeros IAPP y/o proIAPP; ver los resultados experimentales mediante ELISA directa en el Ejemplo 2 y en pancreas de pacientes diagnosticados con T2D y en pancreas de gato diabetico mediante manchado inmunohistoqulmico descrito en el Ejemplo 4 y tal como se muestra en las figuras 7 y 9 respectivamente. En una realizacion, el anticuerpo de la presente invencion enlaza preferentemente las formas agregadas de IAPP y/o proIAPP, en donde los agregados comprenden, consisten esencialmente o consisten de formas fibrilares y/o oligomeros fibrilares de IAPP. En otra realizacion, el anticuerpo de la presente invencion enlaza preferentemente a las formas agregadas de IAPP y/o proIAPP, en donde los agregados comprenden, consisten esencialmente o consisten en formas no fibrilares y/o oligomeros no fibrilares de IAPP. Aun en otra realizacion, el anticuerpo de la presente invencion enlaza preferentemente a las formas agregadas de IAPP y/o proIAPP, en donde los agregados comprenden, consisten esencialmente en, o consisten ya sea de formas fibrilares o no fibrilares de IAPP y/o proIAPP y/o oligomeros fibrilares y no fibrilares de IAPP y/o proIAPP. Aun en otra realizacion, el anticuerpo anti-IAPP y/o anti-proIAPP de la presente invencion enlaza preferentemente tanto a IAPP y/o proIAPP nativo y a las formas patologicamente agregadas de IAPP y/o proIAPP; ver los resultados experimentales tal como se ejemplifica en el Ejemplo 2 y Ejemplo 3 mediante ELISA directo.
Tal como se menciono anteriormente, los agregados que comprenden IAPP y/o proIAPP tambien se pueden encontrar asociados con depositos amiloides en islotes pancreaticos de pacientes T2D. Por consiguiente, en una realizacion, el anticuerpo de la presente invencion puede ser util en el tratamiento de T2D.
La presente invencion tambien se muestra como un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante o derivados del mismo, en donde el anticuerpo comprende un dominio de union a antlgeno identico al de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.11B12, NI-203.19F2, NI- 203.15C7.
La presente invencion ejemplifica ademas varias de dichas moleculas de union, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de union del mismo, que pueden caracterizarse por comprender en su region variable, es decir, el dominio de union las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la region variable Vh y Vl que comprende cualquiera de las secuencias de aminoacido ilustradas en la figura 1A-E, H e I. Las secuencias de nucleotido correspondientes que codifican las regiones variables antes identificadas tal como se establecen en la tabla II mas adelante. Los conjuntos de CDRs de ejemplo de las secuencias de aminoacido anteriores de la region Vh y Vl se ilustran en la figura 1A-E, H e I. Sin embargo, tal como se describe a continuacion, los expertos en la tecnica estan atentos del hecho de que en forma adicional o alternativa se pueden utilizar las CDRs, las cuales difieren en la secuencia de aminoacido de las establecidas en la figura 1A-E, H e I por uno, dos, tres, o incluso mas aminoacidos en caso de CDR2 y CDR3. Por consiguiente, en una realizacion, se proporciona el anticuerpo de la presente invencion o un fragmento de union a IAPP y/o proIAPP del mismo, que comprende en su region variable las regiones determinantes de complementariedad (CDR) tal como se ilustra en la figura 1A-E, H e I y/o una o mas CDRs de la misma, que comprenden una o dos sustituciones de aminoacido.
En una realizacion, el anticuerpo de la presente invencion es cualquiera de los anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoacido de la region Vh y Vl tal como se ilustra en la figura 1A-E, H e I. Preferentemente, el anticuerpo
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de la presente invencion se caracteriza por la conservacion del emparejamiento cognato de la cadena pesada y ligera, tal como estuvo presente en la celula B humana.
Alternativamente, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno, derivado o variante del mismo, que compite para enlazar a IAPP y/o prolAPP con al menos uno de los anticuerpos que tienen la region Vh y/o Vl tal como se ilustra en la figura 1A-E, H e I.
Los resultados experimentales proporcionados en el Ejemplo 4 sugieren que algunos de los anticuerpos anti-IAPP y/o anti-prolAPP de la presente invencion se enlazan preferentemente a la enfermedad originando formas agregadas de anti-IAPP y/o anti-prolAPP humano con respecto a las formas fisiologicas de las protelnas. Por lo tanto, el anticuerpo de la presente invencion, reconoce preferentemente los agregados IAPP y/o proIAPP con respecto a IAPP y/o proIAPP fisiologico. Ademas, el anticuerpo de la presente invencion reconoce preferentemente los agregados IAPP que comprenden oligomeros IAPP y/o fibrillas con respecto a IAPP fisiologicos. En otra realizacion, el anticuerpo de la presente invencion reconoce preferentemente los agregados IAPP que comprenden oligomeros IAPP no fibrilares y/o IAPP no fibrilares con respecto a IAPP fisiologico.
Tal como ya se indico anteriormente, algunos de los anticuerpos de la presente invencion han mostrado tener la capacidad de enlazar tanto a IAPP como a su forma precursora proIAPP. Ademas, algunos de los anticuerpos de la presente invencion han sido aislados de pacientes humanos debido a su capacidad de enlazar a proIAPP. Por consiguiente, en una realizacion, el anticuerpo de la presente invencion tiene la capacidad de enlazar proIAPP.
El anticuerpo de la presente invencion puede ser humano, en particular, para aplicaciones terapeuticas. En forma alternativa, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo de roedor, anticuerpo roedorizado o de roedor- humano quimerico, preferentemente, un anticuerpo de murido, murinizado o de murido-humano quimerico o un anticuerpo de rata, ratinizado o de rata-humano quimerico que es particularmente util para metodos de diagnostico y estudios en animales. En una realizacion, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo de roedor-humano quimerico o roedorizado.
Ademas, en una realizacion, el anticuerpo quimerico de la presente invencion, exhibe las propiedades de union de los anticuerpos quimericos de murido NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 de ejemplo tal como se describe en los Ejemplos. Ademas, los anticuerpos quimericos de raton de la presente invencion enlazan con alta afinidad a las fibrillas de IAPP humanas, tal como se describe en el Ejemplo 6. Preferentemente, la afinidad de union de los anticuerpos quimericos es similar a la de las contrapartes humanas. En este contexto, las especificidades de union pueden estar dentro del rango tal como se muestra para los anticuerpos quimericos de murido NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI- 203.26C11 de ejemplo con una EC50 de 18.6 nM, 23.9 nM y 11.5 nM, respectivamente, tal como se describe en el Ejemplo 6 y como se muestra en la figura 11 y en la tabla C que se encuentra mas adelante. No se observo union en BSA.
En una realizacion, se proporciona el anticuerpo de la presente invencion mediante cultivos de celulas B simples u oligoclonales que son cultivadas y el sobrenadante del cultivo, que contiene anticuerpos producidos por dichas celulas B, se clasifica para la presencia y afinidad de anticuerpos anti-IAPP y/o proIAPP en el mismo. El proceso de clasificacion comprende clasificar para la union a agregados monomericos, fibrilares o no fibrilares nativos tipo oligomeros de hIAPP derivados de un peptido hIAPP de longitud total sintetico de la secuencia de aminoacido representada por la SEQ ID NO: 1; y/o la clasificacion separada e independiente para la union a un peptido sintetico derivado del proIAPP humano (fragmento N-terminal) de la secuencia de aminoacido TPIESHQVEKRCnTaTCATQR representada por SEQ ID NO: 7.
En forma adicional o alternativa el proceso de clasificacion para la presencia de afinidad de anticuerpos anti-IAPP y/o proIAPP comprende los pasos de ensayo de inmunorreactividad de placa amiloide de tejido sensible (TAPIR), tal como se describe en la solicitud internacional WO2004/095031, se lleva a cabo en la presente invencion en analogla para depositos amiloides en islotes pancreaticos. Ademas o en forma alternativa, se pueden llevar a cabo clasificaciones en secciones de pancreas para union a anti-IAPP y/o proIAPP, tal como se describe en analogla a la Solicitud Internacional W02008/081008 para secciones de cerebro y/o de medula espinal.
Tal como se menciono anteriormente, debido a su generacion al momento de la respuesta inmune humana, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invencion reconocera epltopos que son de relevancia patologica particular y que no deben ser accesibles o menos inmunogenicos en caso de procesos de inmunizacion para la generacion, por ejemplo, de anticuerpos monoclonales de raton y la clasificacion in vitro de bibliotecas de despliegue de fago, respectivamente. Por consiguiente, es prudente estipular que el epltopo del anticuerpo anti-IAPP y/o proIAPP humano de la presente invencion es unico y que no hay otro anticuerpo que tienen la capacidad de enlazar al epltopo reconocido por el anticuerpo
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monoclonal humano de la presente invencion; ver tambien la figura 5A y la cual muestra el epltopo unico del anticuerpo NI-203.19H8, el anticuerpo NI-203.26C11 respectivo de la presente invencion. Una indicacion adicional para la exclusividad de los anticuerpos de la presente invencion es el hecho de que, tal como se indica en el Ejemplo 3, los anticuerpos NI-203.9A2 y NI-203.8E3 de la presente invencion enlazan a epltopos conformacionales asumibles de agregados IAPP, lo cual es tal como se indico anteriormente, es de una relevancia patologica particular y tampoco debe ser obtenible mediante procesos usuales para generacion de anticuerpo, tal como inmunizacion o clasificacion de biblioteca in vitro.
Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion tambien se extiende generalmente a los anticuerpos anti- IAPP y a las moleculas de union a IAPP, que compiten con el anticuerpo monoclonal humano de la presente invencion para la union especlfico a IAPP. La presente invencion se dirige en forma mas especlfica a un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante o derivados del mismo, en donde el anticuerpo enlaza especlficamente al mismo epltopo de IAPP como un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI- 203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2 y NI-203.15C7.
Ademas, en una realizacion la presente invencion tambien se extiende generalmente a anticuerpos anti-IAPP y/o anti- proIAPP y a moleculas de union a IAPP y/o anti-proIAPP que compiten con el anticuerpo monoclonal humano de la presente invencion para la union especlfico a proIAPP. La presente invencion, por consiguiente, se dirige tambien en forma mas especlfica a un anticuerpo, o a un fragmento de union a antlgeno, variante o derivados del mismo, en donde el anticuerpo enlaza especlficamente al mismo epltopo de proIAPP, como el anticuerpo de referencia NI-203.26C11.
En forma adicional o alternativa, la presente invencion tambien se extiende generalmente a anticuerpos anti-IAPP y/o anti-proIAPP y a moleculas de union a IAPP y/o anti-proIAPP que compiten con el anticuerpo monoclonal humano de la presente invencion para la union especlfico tanto a IAPP como a proIAPP. La presente invencion por consiguiente, tambien se dirige en forma mas especlfica a un anticuerpo, fragmento de union a antlgeno, variante o derivados del mismo, en donde el anticuerpo enlaza especlficamente al mismo epltopo de IAPP y proIAPP como el anticuerpo NI- 203.26C11 de ejemplo. En virtud de lo anterior, en una realizacion la presente invencion tambien se relaciona con un anticuerpo o molecula de union a antlgeno que compite con un anticuerpo de la presente invencion para la union especlfico a IAPP y/o proIAPP.
La competicion entre anticuerpos se determina a traves de un ensayo en el cual la inmunoglobulina bajo prueba inhibe la union especlfico de un anticuerpo de referencia a un antlgeno comun, tal como IAPP y/o proIAPP. Se conocen numerosos tipos de ensayos de union competitivo, por ejemplo: inmunoensayo directo o indirecto de fase solida (RIA), inmunoensayo de enzimas directo o indirecto de fase solida (EIA), ensayo de competicion de intercalado; ver las Publicacion de Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA biotina-avidina directa de fase solida; ver las Publicaciones de Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 y Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; ensayo etiquetado directo de fase solida, ensayo de intercalado de etiquetado directo de fase solida; ver la Publicacion de Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de etiqueta directa de fase solida utilizando etiqueta I125; ver las Publicaciones de Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 and Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Normalmente, dicho ensayo implica el uso de agregados IAPP y/o proIAPP purificados, tal como oligomeros y/o fibrillas de los mismos enlazados a una superficie solida o celulas que contienen cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no etiquetada y una inmunoglobulina de referencia etiquetada, es decir, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invencion. La inhibicion competitiva se mide determinando la cantidad de etiqueta enlazada a la superficie solida o celulas en la presencia de la inmunoglobulina de prueba. Normalmente la inmunoglobulina de prueba esta presente en exceso. Preferentemente, el ensayo de union competitivo se lleva a cabo bajo condiciones tal como se describe para el ensayo ELISA en los Ejemplos adjuntos. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competicion (anticuerpos de competicion) incluyen anticuerpos que enlazan al mismo epltopo que el anticuerpo de referencia, y los anticuerpos que enlazan a un epltopo adyacente en forma lo suficientemente proxima al epltopo enlazado al anticuerpo de referencia para que ocurra el impedimento esterico. Normalmente, cuando esta presente en exceso un anticuerpo de competicion, inhibira la union especlfica de un anticuerpo de referencia a un antlgeno comun en al menos 50% o 75%. De ahl, la presente invencion creado en forma adicional para un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante o derivado del mismo, en donde el anticuerpo inhibe que un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en NI-203.9A2, NI-203.19H8, NI-203.26C11, NI-203.8E3, NI-203.19F2 y NI-203.15C7 union a IAPP.
Ademas, la presente invencion se crea en forma adicional para un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante o derivado del mismo, en donde el anticuerpo inhibe competitivamente que el anticuerpo de referencia NI-203.26C11 se una a proIAPP.
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Ademas en forma adicional o alternativa, la presente invencion es creada en forma adicional para un anticuerpo biespeclfico, un fragmento de union a antlgeno, variante o derivado del mismo, en donde el anticuerpo inhibe en forma competitiva que un anticuerpo de referencia, tal como el anticuerpo NI-203.26C11 de ejemplo union ya sea a IAPP y prolAPP.
Una inmunoglobulina o su cADN de codificacion pueden ser modificadas en forma adicional. Por lo tanto, el metodo descrito en la presente solicitud comprende cualquiera del paso(s) para producir un anticuerpo quimerico, anticuerpo murinizado, anticuerpo de cadena simple, fragmento de Fab, anticuerpo biespeclfico, anticuerpo de fusion, anticuerpo etiquetado o un analogo de cualquiera de estos. Los metodos correspondientes son conocidos para los expertos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en la Publicacion de Harlow and Lane “Antibodies, A Laboratory Manual” (Anticuerpos, Manual de Laboratorio), CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Cuando los derivados de dichos anticuerpos se obtienen mediante la tecnica de despliegue de fago, se puede utilizar la resonancia de plasmon de superficie tal como se emplea en el sistema BIAcore para incrementar la eficiencia de los anticuerpos de fago que enlazan al mismo epltopo como el de cualquiera de los anticuerpos aqul descritos (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). La produccion de anticuerpos quimericos se describe, por ejemplo, en la Solicitud Internacional WO89/09622. Los metodos para la produccion de anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en la Solicitud Europea EP-A1 0 239 400, y en la Solicitud Internacional WO90/07861. Las fuentes adicionales de anticuerpos que seran utilizadas segun la presente invencion son los llamados anticuerpos xenogeneicos. El principio general para la produccion de anticuerpos xenogeneicos, tal como anticuerpos tipo humano en ratones se describe, por ejemplo, en las solicitudes internacionales WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 y WO96/33735. Tal como se describio anteriormente, el anticuerpo de la presente invencion puede existir en una variedad de formas ademas de anticuerpos completos, incluyendo por ejemplo Fv, Fab y F(ab)2, as! como en cadenas simples; ver por ejemplo la Solicitud Internacional WO88/09344. En una realizacion, por consiguiente se proporciona el anticuerpo de la presente invencion, el cual es seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena simple (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2.
Los anticuerpos de la presente invencion o su cadena(s) de inmunoglobulina correspondiente pueden ser modificados en forma adicional utilizando tecnicas convencionales conocidas en el arte, por ejemplo, utilizando eliminacion(s), insercion(s), sustitucion(s), adicion(s) y/o recombinacion(s) y/o otra modificacion(s) de aminoacido conocida en la tecnica, ya sea solas o en combinacion. Los metodos para introducir dichas modificaciones en la secuencia de ADN que pasan por la secuencia de aminoacido de una cadena de inmunoglobulina son bien conocidos para los expertos en la tecnica, ver por ejemplo la Publicacion de Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual (Clonacion Molecular, Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y en la de Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biologla Molecular), Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la presente invencion incluyen derivaciones qulmicas y/o enzimaticas en uno o mas aminoacidos constituyentes, incluyendo las modificaciones de cadena natural, modificaciones de esqueleto, y modificaciones de N- y C-terminal que incluyen acilacion, hidroxilacion, metilacion, amidacion, y la adhesion de porciones de carbohidrato o llpido, cofactores y similares. Ademas, la presente invencion comprende la produccion de protelnas quimericas que comprenden el anticuerpo descrito o algun fragmento del mismo en el termino amino fusionado a la molecula heterologa, tal como el ligando inmunoestimulador en el termino carboxilo; ver por ejemplo la Solicitud Internacional WO00/30680 para los detalles tecnicos correspondientes.
Los resultados preliminares de los experimentos subsecuentes llevados a cabo segun la presente invencion revelaron que el anticuerpo anti-IAPP y/o anti-proIAPP humano de la presente invencion, en particular los anticuerpos NI-203.9A2, Ni-203.1 9H8, NI-203.26C11 y NI-203.8E3 tuvieron la capacidad de enlazar en forma diferencial a las fibrillas de IAPP en pruebas ELlSA. Ademas, los anticuerpos 203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 de la presente invencion han mostrado enlazar preferentemente a patologlas en humanos, tal como depositos amiloides grandes en islotes pancreaticos que corresponden a las fibrillas de IAPP patologicas, tal como se visualiza mediante manchado ThioS y de rojo Congo (ver figura 7A). Se espera que apliquen las mismas propiedades a los anticuerpos NI-203.19F2 y NI-203.15C7.
Los anticuerpos humanos NI-203.9A2, NI-203.19H8 y NI-203.26C11 mostraron un manchado de islote pancreatico prominente y secreciones positivas de amiloide, pero no mostraron algun manchado en los islotes pancreaticos de un paciente T2D que carece de depositos amiloides y de un paciente de control no diagnosticado con t2d (ver Ejemplo 4 y figura 7). Los anticuerpos de la presente invencion tambien proporcionaron resultados positivos en pancreas de gato diabetico mostrando depositos amiloides de isleto; ver la figura 9. Esta especificidad de union hacia las formas patologicas de IAPP y/o prolAPP en tejido humano y de animal, se enfatiza ya que los experimentos bioqulmicos aqul mostrados (ver Ejemplos 2 y figura 5) mostraron la capacidad de uso de los anticuerpos de la presente invencion en el tratamiento y diagnostico de enfermedades asociadas con el surgimiento de IAPP y/o prolAPP agregado en el pancreas.
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Como una alternativa para obtener inmunoglobulinas directamente del cultivo de celulas B o celulas de memoria B, las celulas se pueden utilizar como una fuente de sitios de cadena pesada y cadena ligera reajustados para la expresion y/o manipulacion genetica subsecuente. Los gentes de anticuerpo reajustados pueden ser transcritos en forma inversa a partir de mARNs adecuados para producir cADN. Si se desea, la region constante de cadena pesada puede ser intercambiada por la de un isotipo diferente o eliminado en conjunto. Las regiones variables pueden ser enlazadas para codificar las regiones Fv de cadena simple. Las multiples regiones Fv pueden enlazarse para conferir capacidad de union a mas de un objetivo o se pueden emplear combinaciones de cadena pesada y ligera objetivo o quimerica. Una vez que esta disponible el material genetico, es sencillo el diseno de analogos como se describio anteriormente, los cuales retienen su capacidad de enlazar al objetivo deseado. Los metodos para clonar regiones variantes de anticuerpo y la generacion de anticuerpos recombinantes son conocidos por los expertos en la tecnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 17871792.
Una vez que se obtiene el material genetico adecuado, y si se desea, se modifica para codificar un analogo, las secuencias de codificacion, incluyendo las que codifican, como un mlnimo, las regiones variables de la cadena pesada y ligera, pueden ser insertadas en sistemas de expresion contenidos en vectores que pueden ser transfectados en celulas huesped recombinantes estandar. Se puede utilizar una variedad de dichas celulas huesped; sin embargo, para un procesamiento eficiente, se prefieren celulas de mamlfero. Las llneas celulares de mamlfero tlpicas para este proposito incluyen pero no se limitan a celulas CHO, celulas HEK 293 o celulas NSO.
La produccion del anticuerpo o analogo posteriormente se lleva a cabo cultivando el huesped recombinante modificado bajo condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de celulas huesped y la expresion de secuencias de codificacion. Los anticuerpos posteriormente se recuperan aislandolos del cultivo. Los sistemas de expresion estan disenados preferentemente para incluir peptidos de senal de modo que los anticuerpos resultantes sean secretados en el medio; sin embargo, tambien es posible la produccion intracelular.
Segun lo anterior, la presente invencion tambien se refiere a un polinucleotido que codifica el anticuerpo o una molecula de union equivalente de la presente invencion, en el caso del anticuerpo, preferentemente al menos una region variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo descrito anteriormente. Normalmente, la region variable codificada por el polinucleotido comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del VH y VL de la region variable del anticuerpo.
Los expertos en la tecnica apreciaran facilmente que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable antes descrito puede ser utilizado para la construccion de otros polipeptidos o anticuerpos de especificidad y funcion biologica deseada. Los expertos en la tecnica conocen que la afinidad de union puede ser incrementada elaborando sustituciones de aminoacido dentro de las CDRs o dentro de los bucles hipervariables (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que traslapan parcialmente con las CDRs tal como lo define Kabat; ver la Publicacion de Riechmann, et al., Nature 332 (1988), 323-327. Por lo tanto la presente invencion tambien se refiere a anticuerpos en donde una o mas de las CDRs mencionadas comprenden una o mas, preferentemente no mas de dos sustituciones de aminoacido. Preferentemente, el anticuerpo de la presente invencion comprende en una o ambas de sus cadenas de inmunoglobulina las tres CDRs de las regiones variables tal como se establece en la figura 1A-E, H e I.
Las moleculas de union, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variantes, o derivados de los mismos de la presente invencion, tal como lo sabran los expertos en la tecnica, pueden comprender una region constante que transmite una o mas funciones efectoras. Por ejemplo, la union del componente CI del complemento para una region constante de anticuerpo puede activar el sistema de complemento. La activacion del complemento es importante en la opsonizacion y lisis de los patogenos celulares. La activacion de complemento tambien estimula la respuesta inflamatoria y puede estar implicada en hipersensibilidad autoinmune. Ademas, los anticuerpos enlazan a receptores en diversas celulas a traves de la region Fc, con un sitio de union de receptor Fc en la region Fv de anticuerpo que enlaza a un receptor Fc (FcR) en la celula. Existe un numero de receptores Fc que son especlficos para diferentes clases de anticuerpo, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores epsilon), IgA (receptores alfa) y IgM (receptores mu). La union del anticuerpo a los receptores Fc en las superficies celulares activa un numero de respuestas biologicas diversas importantes que incluyen hundimiento y destruccion de las partlculas recubiertas con anticuerpo, despeje de complejos inmune, lisis de las celulas objetivo recubiertas con anticuerpo mediante celulas exterminadas (llamado citotoxicidad transmitida por celula dependiente de anticuerpo, o ADCC), liberacion de transmisores inflamatorios, transferencia de placenta y control de produccion de inmunoglobulina.
Por consiguiente, ciertas realizaciones de la presente invencion incluyen un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante o derivado del mismo, en donde al menos una fraccion del uno o mas dominios de region constante han sido
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eliminados o alterados de otra forma para proporcionar caracterlsticas bioquimicas deseadas, tal como funciones efectoras reducidas, la capacidad de dimerizacion en forma no covalente, una capacidad incrementada de posicionamiento en el sitio de agregacion IAPP y/o prolAPP y deposicion, vida media en suero reducida o vida media en suero incrementada cuando se compara con un anticuerpo no alterado, completo, de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertos anticuerpos para utilizarse en los metodos de diagnostico y tratamiento aqul descritos son anticuerpos eliminados por dominio que comprenden una cadena de polipeptido similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen al menos de una parte de uno o mas dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, todo un dominio de la region constante del anticuerpo modificado sera eliminada, por ejemplo, todo o parte del dominio CH2 sera eliminado. En otras realizaciones, ciertos anticuerpos para utilizarse en los metodos de diagnostico y tratamiento aqul descritos tienen una region constante, por ejemplo, una region constante de cadena pesada IgG, que se altera para eliminar la glicosilacion, referida en cualquier parte como anticuerpos aglicosilados o “agli”. Dichos anticuerpos “agli” pueden ser preparados en forma enzimatica tambien, mediante el diseno de sitios de glicosilacion de consenso en la region constante. Sin pretender limitarse a la teorla, se considera que los anticuerpos “agli” pueden tener un perfil de seguridad y estabilidad mejorado in vivo. Los metodos para producir anticuerpos aglicosilados, que tienen una funcion efectora deseada se encuentran por ejemplo en la Solicitud Internacional WO2005/018572.
En ciertos anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado del mismo aqul descritos, la parte Fc puede ser mutada para disminuir la funcion efectora utilizando tecnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, la eliminacion o inactivacion (a traves de las mutaciones de punta u otros medios) de un dominio de region constante pueden reducir la union de receptor Fc del anticuerpo modificado en la circulacion, incrementando de esta forma el posicionamiento de IAPP y/o prolAPP. En otros casos, puede ser que las modificaciones de region constante consistentes con la presente invencion, moderen la union de complemento y por lo tanto reduzcan la vida media en suero y la asociacion no especlfica de una citotoxina conjugada. Aun otras modificaciones de la region constante puede ser utilizadas para modificar las ligaduras de disulfuro o porciones de oligosacarido que permiten el posicionamiento incrementado debido a la especificidad de antlgeno o flexibilidad de anticuerpo incrementado. El perfil fisiologico, biodisponibilidad y otros efectos bioqulmicos resultantes de las modificaciones, tal como el posicionamiento IAPP y/o proIAPP, biodistribucion y vida media en suero, pueden ser medidos y cuantificados facilmente utilizando tecnicas inmunologicas bien conocidas sin experimentacion indebida.
En ciertos anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado del mismo aqul descritos, la parte Fc puede ser mutada o intercambiada por secuencias de protelna alternativa para incrementar la captacion celular de los anticuerpos, a manera de ejemplo, incrementando la endocitosis transmitida por receptor de los anticuerpos mediante receptores Fg, LRP o receptores Thy1 o mediante “Tecnologla de SuperAnticuerpo”, la cual se dice que habilita a los anticuerpos a que sean revueltos en celulas vivas sin danarlos (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Por ejemplo, la generacion de protelnas de fusion de la region de union de protelna y los ligandos de anticuerpo de cognato de los receptores de superficie celular o anticuerpos bi o multiespeclficos con una secuencia especlfica que enlaza IAPP y/o proIAPP, as! como un receptor de superficie celular, pueden disenarse utilizando tecnicas conocidas en la tecnica.
En ciertos anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado del mismo, aqul descritos, la parte Fc puede ser mutada o intercambiada por secuencias de protelna alternativas o el anticuerpo puede ser modificado en forma qulmica para incrementar su penetracion de la barrera de sangre-cerebro.
Las formas modificadas de anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado del mismo de la presente invencion pueden elaborarse de anticuerpos precursores o de origen completos utilizando tecnicas conocidas en el arte. Las tecnicas de ejemplo se describen con mayor detalle en la presente invencion. Los anticuerpos o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado de los mismos de la presente invencion pueden elaborarse o fabricarse utilizando tecnicas que son conocidas en el arte. En ciertas realizaciones, las moleculas de anticuerpo o fragmentos de los mismos se “producido en forma recombinante”, es decir, se producen utilizando tecnologla de aDn recombinante. Las tecnicas de ejemplo para elaborar moleculas o fragmentos de anticuerpo de las mismas se describen con mayor detalle en otras partes de presente documento.
Los anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado del mismo de la presente invencion tambien incluyen derivados que seran modificados, es decir, mediante adhesion covalente de cualquier tipo de molecula al anticuerpo, de modo que la adhesion covalente no evite que el anticuerpo union en forma especlfica a su epltopo cognato. Por ejemplo, pero no a manera de limitacion, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, mediante glucosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivacion mediante grupos de proteccion/bloqueo conocidos, disociacion proteolltica, ligadura a un ligando celular u otra protelna, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera modificaciones qulmicas a traves de tecnicas conocidas, incluyendo pero sin limitarse a
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disociacion qulmica especlfica, acetilacion, formilacion, slntesis metabolica de tunicamicina, etc. Ademas, el derivado puede contener uno o mas aminoacidos no clasicos.
En realizaciones preferidas particulares, los anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado del mismo de la presente invencion no generaran una respuesta inmune perjudicial en el animal que sera tratado, es decir, en un humano. En ciertas realizaciones, las moleculas de union, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno del mismo de la presente invencion se derivan de un paciente, por ejemplo, un paciente humano, y se utilizan subsecuentemente en la misma especie de la cual se derivaron, por ejemplo, un humano, aliviando o minimizando el surgimiento de respuestas inmune perjudiciales.
La desinmunizacion tambien se puede utilizar para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “desinmunizacion” incluye la alteracion de un anticuerpo para modificar epltopos de celula T; ver por ejemplo las Solicitudes Internacionales Nos. W098/52976 y WO00/34317. Por ejemplo, las secuencias Vh y Vl del anticuerpo de partida son analizadas y el “mapa” de epltopo de celula T humana de cada region V que muestra el posicionamiento de epltopos en relacion con las regiones de determinacion de complementariedad (CDRs) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epltopos de T individuales del mapa de epltopo de celula T, se analizan con el objeto de identificar sustituciones de aminoacido alternativas con bajo riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se disena un rango de secuencias Vh y Vl alternativas, que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoacido y estas secuencias se incorporan subsecuentemente en un rango de polipeptidos de union, por ejemplo, anticuerpos especlficos de IAPP y/o prolAPP o fragmentos inmunoespeclficos de los mismos para utilizarse en metodos de diagnostico y tratamiento aqul descritos, que posteriormente se prueban para funcion. Normalmente, se generan y pruebas entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Los genes de cadena pesada y ligera completos que comprenden regiones V modificadas y C humanas posteriormente se clonan en vectores de expresion y los plasmidos subsecuentes se introducen en las llneas celulares para la produccion de un anticuerpo completo. Los anticuerpos posteriormente se comparan en ensayos bioqulmicos y biologicos adecuados, y se identifica la variante optima.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando una amplia variedad de tecnicas conocidas en el arte que incluyen el uso de hibridoma, recombinante y tecnologlas de despliegue de fago, o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos utilizando tecnicas de hibridoma que incluyen las conocidas en la tecnica y que ensenan, por ejemplo, en la Publicacion de Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2° edicion (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Anticuerpos Monoclonales e Hibridomas de Celula T) Elsevier, N.Y., 563681 (1981). El termino “anticuerpo monoclonal” tal como se utiliza en la presente invencion, no se limita a anticuerpos producidos a traves de tecnologla de hibridoma. El termino “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariotico, procariotico o de fago, y no el metodo por el cual se produce. Por lo tanto, el termino “anticuerpo monoclonal” no se limita a anticuerpos producidos a traves de tecnologla de hibridoma. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente invencion se derivan de celulas B humanas que han sido inmortalizadas mediante transformacion con virus Epstein-Barr, tal como se describe en la presente invencion.
En el proceso de hibridoma bien conocido (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495), los linfocitos de vida relativamente corta, o mortales de un mamlfero, por ejemplo celulas B derivadas de un sujeto humano tal como se describe en la presente invencion, se fusionan con una llnea de celula de tumor inmortal (por ejemplo, una llnea de celula de mieloma), produciendo de esta forma celulas hlbridas o “hibridomas” que son tanto inmortales como con la capacidad de producir el anticuerpo geneticamente modificado de la celula B. Los hlbridos resultantes se segregan en las cepas geneticas simples mediante seleccion, dilucion y recrecimiento con cada cepa individual comprendiendo genes especlficos para la formacion de un anticuerpo simple. Producen anticuerpos, que son homogeneos contra un antlgeno deseado, y en referencia a su parentesco genetico puro, se denominan “monoclonal”.
Las celulas de hibridoma preparadas de esta forma se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las celulas de mieloma de origen, no fusionadas. Los expertos en la tecnica apreciaran que los reactivos, llneas celulares y medios para la formacion, seleccion y crecimiento de hibridomas estan comercialmente disponibles en cualquier numero de fuentes y estan bien establecidos los protocolos estandarizados. Generalmente, el medio de cultivo en donde las celulas de hibridoma estan creciendo se ensaya para la produccion de anticuerpos monoclonales contra el antlgeno deseado. La especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producida mediante celulas de hibridoma se determina mediante ensayos in vitro, tal como inmunoprecipitacion, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA) tal como aqul se describe. Despues de que las celulas de hibridomas son identificadas por producir anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilucion limitante y crecidos mediante metodos estandar; ver por ejemplo la Publicacion de Goding, Monoclonal Antibodies:
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Principles and Practice (Anticuerpos Monoclonales: Principios y Practica), Academic Press, pp. 59-103 (1986). Se puede apreciar en forma adicional que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser separados del medio de cultivo, fluido de ascitos o suero mediante procedimientos de purificacion convencional tal como por ejemplo, protelna-A, cromatografla de hidroxilapatita, electroforesis de gel, dialisis o cromatografla por afinidad.
En otra realizacion, los linfocitos pueden ser seleccionados mediante micromanipulacion y los genes aislados variables. Por ejemplo, se pueden aislar celulas mononucleares de sangre periferica de un mamlfero inmunizado o naturalmente inmune, por ejemplo, un humano, y cultivarse durante aproximadamente 7 dlas in vitro. Los cultivos pueden ser clasificados para IgGs especlficos que cumplen con los criterios de clasificacion. Las celulas de depositos positivos pueden ser aisladas. Las celulas Ig que producen B individuales pueden ser aisladas mediante FACS o identificandolos en un ensayo de placa hemolltica transmitido por complemento. Las celulas B que producen Ig pueden ser micromanipuladas en un tubo, y los genes Vh y Vl pueden ser amplificados utilizando por ejemplo, RT-PCR. Los genes Vh y Vl pueden ser clonados en un vector de expresion de anticuerpo y transfectados en celulas (por ejemplo, celulas eucarioticas o procarioticas) para expresion.
Alternativamente, las llneas celulares que producen anticuerpo pueden ser seleccionadas y cultivadas utilizando tecnicas bien conocidas por los expertos en el arte. Dichas tecnicas se describen en una variedad de manuales de laboratorio y publicaciones primarias. A este respecto, las tecnicas adecuadas para utilizarse en la presente invencion tal como se describe mas adelante, se describen en la Publicacion de Current Protocols in Immunology (Protocolos Actuales en Inmunologla), Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, Nueva York (1991).
Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epltopos especlficos pueden ser generados mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden ser producidos en forma recombinante o mediante disociacion proteolltica de moleculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tal como papalna (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la region variable, la region constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Dichos fragmentos son suficientes para uso, por ejemplo, en procedimientos de inmunodiagnostico que implican acoplamiento de las partes inmunoespeclficas de inmunoglobulinas para detectar reactivos, tales como radioisotopos.
Los anticuerpos humanos, tal como aqul se describe, son particularmente deseables para uso terapeutico en pacientes humanos. Los anticuerpos humanos de la presente invencion se alslan, por ejemplo, de sujetos humanos saludables quienes debido a su sobrepeso u obesidad se puede sospechar que esten en riesgo de desarrollar un trastorno metabolico, por ejemplo, T2D, o un paciente con el trastorno pero con una enfermedad inusualmente estable en curso o una forma inusualmente leve de la enfermedad. Sin embargo, el sujeto humano saludable que se sospecha esta en riesgo de desarrollar un trastorno metabolico, por ejemplo, T2D, del cual los anticuerpos, tal como aqul se describe, pueden ser aislados, puede ser seleccionado sobre las bases de la presencia de otros riesgos conocidos por incrementar la oportunidad de que una persona desarrolle un trastorno metabolico, por ejemplo, T2D. Dichos riesgos pueden ser deducidos de la revision de una persona con respecto a factores de riesgo asociados con el desarrollo de un trastorno metabolico, por ejemplo, T2D, tal como una edad de 45 o mas; sobrepeso u obesidad; familiares cercanos con diabetes; antecedentes familiares de Afro Americano, Nativo de Alaska, Indio Americano, Asiatico Americano, Hispano/Latino, Americano de Islas del Paclfico, Asiatico o Arabe; historial de diabetes gestacional; tener un parto de un bebe que pesa mas de 4,5 kg, presion sangulnea de 140/90 o mas; niveles de colesterol mas elevados que lo normal, por ejemplo, con un nivel de lipoprotelna de Alta densidad (HDL) debajo de 40 mg/dL (equivalente a 1 mmol/L), o nivel de trigliceridos arriba de 200-499 mg/dL (equivalente arriba de 2,3 a 5,6 mmol/L); estilo de vida sedentario; diagnostico de slndrome de ovario poliqulstico (PCOS); diagnostico de prediabetes en pruebas previas - un nivel de A1C (tambien llamada HbA1c o glucohemoglobina) de 5,7 a 6,4%, glucosa en ayuno danada (IFG), o tolerancia a glucosa danada (IGT); diagnostico de otras funciones cllnicas asociadas con resistencia a insulina, tal como acantosis nigricans; historia de enfermedad cardiovascular.
En caso de obesidad o sobrepeso de una persona, se utiliza como un indicador para que una persona desarrolle un trastorno metabolico, por ejemplo, T2D, aunque es prudente esperar que los sujetos obesos saludables y libres de slntomas, respectivamente, desarrollaran en forma mas regular anticuerpos anti-IAPP y/o anti-proIAPP protectores que los sujetos que estan diagnosticados con menor riesgo, por ejemplo, ya que no estan clasificados como obesos sino sobrepeso, e incluso como personas con un peso normal, sujetos que pertenecen a las ultimas dos clasificaciones pueden ser utilizados tambien como una fuente para obtener un anticuerpo humano de la presente invencion.
Un sujeto puede ser clasificado como teniendo peso normal, teniendo sobrepeso o siendo obeso con base en las medidas de la altura y peso del sujeto, y calculando el Indice de Masa Corporal de los sujetos a traves de los siguientes
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calculos: BMI=peso [kg]/(altura[m])2. Con base en el resultado, los sujetos se clasifican como de peso normal (BMI 18.5 a 24,9 kg/m2), sobrepeso (25,0 a 29,9 kg/m2), u obesos (s30 kg/m2) con base en el criterio actual de la Organizacion Mundial de la Salud (World Health Organization (2000) “Obesidad; prevencion y manejo de epidemia global. Reporte de una consulta de WHO”. World Health Organ Tech Rep Ser 894: 1.253). Alternativamente o en forma adicional, se puede medir la circunferencia de la cintura (WC) de un sujeto, y utilizarse con base en los cortes especlficos del sexo para definir la WC como normal (<94 cm [<34.6 pulgadas] en hombres y <80 cm [31.5 pulgadas] en mujeres), tijera moderadamente incrementada (94 a 102 cm [34,6 a 40 pulgadas] en hombres y 80 a 88 cm [31,5 a 35 pulgadas] en mujeres), o grande (>102 cm [>40 pulgadas] en hombres y >88 cm [>35 pulgadas] en mujeres) tal como se describe en InterAct Consortium, Langenberg et al., PLoS Med. 2012 Jun;9(6): e1001230, en donde el sujeto saludable con una circunferencia en la cintura grande (WC grande) desarrollara mas regularmente anticuerpos anti-IAPP y/o anti-prolAPP protectores en comparacion con la clasificacion como obeso con el mayor riesgo de desarrollar T2D, y se pueden utilizar preferentemente para el aislamiento de estos anticuerpos, aunque las personas con una WC moderadamente incrementada o normal se pueden utilizar para el aislamiento de anticuerpos anti-IAPP y/o anti-proIAPP tambien.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser producidos a traves de cualquier metodo conocido en la tecnica para la slntesis de anticuerpos, en particular, mediante slntesis qulmica o preferentemente mediante tecnicas de expresion recombinante tal como aqul se describe.
En una realizacion, un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante, o derivado del mismo de la presente invencion, comprende una region constante sintetica en donde uno o mas dominios estan parcial o totalmente eliminados (“anticuerpos eliminados por dominio”). En ciertas realizaciones, los anticuerpos modificados compatibles comprenderan construcciones eliminadas por dominio o variantes, en donde todo el dominio CH2 ha sido eliminado (construcciones DCH2). Para otras realizaciones, se puede utilizar un peptido de conexion corta para el dominio eliminado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento de la region variable. Los expertos en la tecnica apreciaran que dichas construcciones son particularmente preferidas debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 en el rango catabolico del anticuerpo. Las construcciones eliminadas por dominio pueden ser derivadas utilizando un vector que codifica un dominio constante humano IgG1, ver por ejemplo las Solicitudes Internacionales WO02/060955 y WO02/096948A2. Este vector esta disenado para eliminar el dominio CH2 y proporcionar un vector sintetico que expresa una region constante IgG1 de dominio eliminada.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de union a antlgeno, variante o derivado del mismo de la presente invencion son minicuerpos. Los minicuerpos pueden elaborarse utilizando metodos descritos en la tecnica, ver por ejemplo la Patente de Estados Unidos No. 5,837,821 o la Solicitud Internacional No. WO94/09817.
En una realizacion, un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante, o derivado del mismo, de la presente invencion comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene una eliminacion o sustitucion de pocos o incluso un solo aminoacido, siempre que permita la asociacion entre las subunidades monomericas. Por ejemplo, la mutacion de un solo aminoacido en areas seleccionadas del dominio CH2, puede ser suficiente para reducir sustancialmente la union de Fc y de esta forma incrementar el posicionamiento de IAPP y/o proIAPP. Similarmente, puede ser deseable simplemente eliminar dicha parte de uno o mas dominios de region constante que controlan la funcion efectora (por ejemplo, union de complemento) para ser modulada. Dichas eliminaciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las caracterlsticas seleccionadas del anticuerpo (vida media en suero) dejando aun intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de region constante del sujeto. Ademas, tal como se menciono anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sinteticas a traves de mutacion o sustitucion de uno o mas aminoacidos que aumentan el perfil de la construccion resultante. A este respecto, puede ser posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de union conservado (por ejemplo, union Fc), mientras se mantiene sustancialmente la configuracion y perfil inmunogenetico del anticuerpo modificado. Aun otras realizaciones comprenden la adicion de uno o mas aminoacidos a la region constante para incrementar las caracterlsticas deseables, tal como una funcion efectora o proporcionar mas adhesion de citotoxina o carbohidrato. En dichas realizaciones, puede ser deseable insertar o replicar secuencias especlficas derivadas de dominios de region constante seleccionados.
La presente solicitud tambien describe anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en variantes (incluyendo derivados) de moleculas de anticuerpo (por ejemplo, las regiones Vh y/o Vl) aqul descritas, en donde los anticuerpos o fragmentos de los mismos, enlazan en forma inmunoespeclfica a IAPP y/o proIAPP. Las tecnicas estandar conocidas para los expertos en el arte pueden ser utilizadas para introducir mutaciones en la secuencia de nucleotido que codifica un anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a, mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis transmitida por PCR, que da como resultado sustituciones de aminoacido. Preferentemente, las variantes (que incluyen derivados) codifican sustituciones menores a 50 aminoacidos, sustituciones menores a 40 aminoacidos, sustituciones menores a 30 aminoacidos, sustituciones menores a 25 aminoacidos, sustituciones menores a 20
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Por ejemplo, es posible introducir mutaciones unicamente en las regiones de estructura y unicamente en las regiones CDR de una molecula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser silentes o mutaciones de desacoplamiento neutral, por ejemplo, no tener, o tener poco efecto en la capacidad que tiene el anticuerpo de enlazar al antlgeno, de hecho, algunas de dichas mutaciones no alteran en forma alguna la secuencia de aminoacido. Estos tipos de mutaciones pueden ser utiles para optimizar el uso de codon, o mejorar una produccion de anticuerpo de hibridoma. Las regiones de codificacion optimizadas por codon que codifican anticuerpos de la presente invencion se describen en cualquier parte en la presente invencion. Alternativamente, las mutaciones de desacoplamiento no neutral pueden alterar la capacidad que tiene un anticuerpo de enlazar un antlgeno. El posicionamiento de la mayor parte de las mutaciones de desacoplamiento silentes y neutrales es probable que este en las regiones de estructura, en tanto que el posicionamiento de la mayor parte de las mutaciones de desacoplamiento no neutrales es probable que este en CDR, aunque esto no es un requerimiento absoluto. Un experto en la tecnica puede tener la capacidad de disenar y probar moleculas mutantes con propiedades deseadas, tal como no alteracion en la actividad de union a antlgeno o alteracion en la actividad de union (por ejemplo, mejorlas en la actividad de union a antlgeno o cambio en la especificidad de anticuerpo). Despues de la mutagenesis, la protelna modificada puede ser expresada en forma rutinaria y la actividad funcional/biologica de la protelna codificada (por ejemplo, la capacidad de enlazar en forma inmunoespeclfica al menos a un epltopo de IAPP y/o prolAPP) puede determinarse utilizando tecnicas aqul descritas o mediante tecnicas de modificacion rutinaria conocida en la tecnica.
III. Polinucleotidos que Codifican Anticuerpos
Un polinucleotido que codifica un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante, o derivado del mismo puede estar compuesto de cualquier polirribonucleotido o polidesoxirribonucleotido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o aDn modificado. Por ejemplo, un polinucleotido que codifica un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante, o derivado del mismo puede estar compuesto de ADN de hebra simple o doble, ADN que es una mezcla de regiones de hebra simple o doble, ARN de hebra simple o doble, y ARN que es una mezcla de regiones de hebra simple o doble, moleculas hlbridas que comprenden ADN y ArN que pueden ser de hebra simple, o mas tlpicamente, de hebra doble o una mezcla de regiones de hebra simple y hebra doble. Ademas, un polinucleotido que codifica un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante, o derivado del mismo puede estar compuesto de regiones de hebra triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Un polinucleotido que codifica un anticuerpo, o fragmento de union a antlgeno, variante, o derivado del mismo tambien puede contener una o mas bases modificadas o esqueletos de ADN o ARN modificados para estabilidad o por otras razones. Las bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales, tales como inosina. Una variedad de modificaciones pueden ser elaboradas para el ADN y ARN; por lo tanto, el termino “polinucleotido” abarca formas qulmica, enzimatica o metabolicamente modificadas.
Un polinucleotido aislado que codifica una variante no natural de un polipeptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una parte de cadena pesada o parte de cadena ligera de inmunoglobulina) puede crearse introduciendo una o mas sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleotido en la secuencia de nucleotido de la inmunoglobulina, de modo que una o mas sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoacido sean introducidas sean introducidas en la protelna codificada. Las mutaciones pueden ser introducidas mediante tecnicas estandar, tal como mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis transmitida por PCR. Preferentemente, las sustituciones de aminoacido conservadoras se elaboran en uno o mas residuos de aminoacido no esenciales.
Tal como se sabe, el ARN puede ser aislado de las celulas B originales, celulas de hibridoma o de otras celulas transformadas a traves de tecnicas estandar, tal como extraccion o precipitacion de isotiocianato de guanidino seguido
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de centrifugacion o cromatografla. Cuando es deseable, el mARN puede ser aislado de un ARN total mediante tecnicas estandar tal como cromatografla en la oligocelulosa dT. Las tecnicas adecuadas son familiares en la tecnica. En una realizacion, los cADNs que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo pueden ser elaboradas, ya sea en forma simultanea o separada, utilizando transcriptasa inversa y polimerasa de ADN segun metodos bien conocidos. PCR se puede iniciar mediante cebadores de region constante de consenso o mediante cebadores mas especlficos con base en el ADN de cadena pesada y ligera publicado, con base en las secuencias de aminoacido y ADN de cadena pesada y ligera publicada. Tal como se describio anteriormente, PCR tambien se puede utilizar para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas pueden ser clasificadas mediante cebadores de consenso o sondas homologas mas grandes, tal como sondas de region constante humana.
El ADN, normalmente ADN de plasmido, puede ser aislado de celulas utilizando tecnicas conocidas en el arte, restriccion mapeada y secuenciada segun el estandar, tecnicas bien conocidas establecidas con detalle, por ejemplo, las referencias anteriores que se relacionan con tecnicas de ADN recombinante. Por supuesto, el ADN puede ser sintetico segun la presente invencion, en cualquier punto durante el proceso de aislamiento o analisis subsecuente.
Dentro de este contexto, la presente invencion tambien se refiere a un polinucleotido que codifica al menos un dominio de union o region variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la presente invencion. En una realizacion, la presente invencion proporciona un polinucleotido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un acido nucleico que codifica una region variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH).
En otra realizacion, la presente invencion proporciona un polinucleotido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un acido nucleico que codifica una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL).
En otra realizacion, la presente invencion proporciona un polinucleotido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un acido nucleico que codifica una region variable de cadena pesada de inmunoglobulina (Vh) en donde las regiones Vh-CDR1, Vh-CDR2 y Vh-CDR3 tienen secuencias de polipeptido que son identicas a los grupos Vh-CDR1, Vh-CDR2 y Vh-CDR3 mostrados en la figura 1A-E, H e I.
En una realizacion preferida de la presente invencion, el polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un acido nucleico que codifica una secuencia de polinucleotido de la region Vh o Vl de un anticuerpo anti- IAPP y/o anti-prolAPP tal como se ilustra en la tabla II o en la tabla III. A este respecto, el experto en la tecnica apreciara facilmente que los polinucleotidos que codifican al menos un dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar el dominio variable de ambas cadenas de inmunoglobulina, o unicamente una. Por consiguiente, en una realizacion, el polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un acido nucleico que tiene una secuencia de polinucleotido de la region Vh y Vl del anticuerpo anti-IAPP y/o anti-proIAPP tal como se ilustra en la tabla II.
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45
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55
Secuencias de nucleotido de la region Vh y Vl de anticuerpos IAPP
Anticuerpo
Secuencias de nucleotido de cadenas pesada variable (VH) y ligera variable (VL/VK)
NI-203.9A2-Vn
GAGGT GCAGCTGGTGGAGT C T GGGGGAGGCT T GGTACAGCC T GGGGGG TCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACGTTTAGCACCTTT GCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTGCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCAACTATTAGTGGTAGTGGTGATAATACATACTATGCAGACTCCCTG AAGGGCCGGTGCACCAGCXCCAGAGACAATXCCAAGAACACACTATAT CTGCAAGTSAACAGCCTGAGACCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGT GCGAAAAGTCCCTCGTCACTTCTGGCCACCTACTTTGACTACTGGGGC cagggaacgGtgcStcaccGtctcctcg seq I Id NO : 11
NI-203.9A2 -VK
GAAATTG7GT XGACACAGXCXCCXXCCACCCTGXCXGCAXCX GXAGGA GAC AGAG X CAC CAXCACX X GCCGGCCCAGXGAGAGXAXXAAXAGCXGG XXGGCCXGGXAXCAGCAGAAACCAGGGAAAGGCCCXAAGCX'CCXGAXC XAXAAGGCGXCXAGXXXACAAAGXGGGGXCGCAXCAAGGXXGAGCGGC AG X GGAX C X GGGACAGAAX X CAC XCTCACCAXCAGCAGCC XGCACCCX GAXGAXXTTGCAACXXAXXACXGCCAACAGCACAAXAGXXAXXGGACG XXCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAXCAAA SEQ XJ3 NO: 13
NI-203.1 9H8-Vh
GAGGXGCAGCXGGXGGAGXCXGGGGGAGGCGXGGXCCAGCCXGGGACG XCCCXGAGACXCXCCXGXGCAGCGXCXGGGXXCACCXXCAGCAGXXAX ggcaxgcacxgggxccgccaggcxccaggcaagggccxggagxgggxg GCAAXXAXAXGGXAXGAXGGAAGXAAGGAAXAXXAXGCAGACXCCCXG AAGGGCCGAGX CACCAXC X CCAGAGACAAXX CCGAGAACAC XCXC XAX C X GCAAC XG CACAC CCX GAGACTCGAGGACACGGC X GXGXAXXXCXGX GCGAGGACAAXCGCAXCGGCCACCQXGGACCACGGXAXGGACGXCTGG GGCCAAGGCACCCXGGXCACCGXCXCCXCG SEQ ID NO: 15
NI-203.1 9H8-Vk
GaxgxxgxGaxgacxcagxcxQQxxcgxccgxgxcxgcaxcxgxagga gacagagxcaccaxcacxxgxcgggcgagxcacgaxaxxagcaccxgg xxagccxggxaxcagcagagaocagggaaagccccxaaccxccxgaxc X X X G GAGCAX C GAGGX XBCAAAGXGGGGXCXCACCAAGGXXCAGCGGC AGXGGAXCXGGGACAGAXXTCACXCXCACCAXCAGCAGCCXGCAGCCX GAAGAXX X X GCAAC X XAC XAX X GX CAACAGAC XAACAAX X XCCC XCCC AC C X X C G G CCAAG G GAC ACGACfGGAGAXXAAA SEQ Itt NO: 17
NI-203.26C11-Vh
CaGgxgcagCxgcaggagxcgggcccaggaxxggxgaagsscxxcxcag acccxgxcgGxcaccxgcacxgxcxcxggxggcxccaxcaGcagxggx aaxxacxacxggaccxggaxccggcagccggccgggaagggacxggaG: XGGAX X GGGCAXAXCXAXXCCAGXGGGACCACCAAXXACAACCCCXCC CXCGAGAGX CGAGX CACCATX X CAGXAGACACGX CCAACAACCACX X C XOCCXGAGCCXGAACXCXGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTTXAXXAC XGXGCGAGACCACTGGCXACAGX XCCGGAXGCXXX XAAXAXCXGGGGC CAAGGGACAAXGGXCACCGXCXCXXCG SEQ ID N G: 19
NI-203.26C11-Vk
gaaaxxgxgatgacxcagxcxccagacxcccxggcxqxgxcxcxgggc GAgagggccaccaxcaagxgcaagxccagccagagxqctxtaxacagc
A ATAAGAAC T T C T TAGC T T GGTACCAGCAGAAA C C AGG ACAGCC TC C T
AAATTACTCATTTACTGGGCATCTACTCGGGAATCCGGGGTCCCTGAC CGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGGCTGAAGATG_GGCAGT"TT ATT ACGGTCAGCAGTATTA- AGTAATCCTAACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA SEQ ID NO: 21
NI-203.8E3-Vh
CAGG T GCAGC T GG T GCAGT C T GGGGC TGAAGT GAAGAAACC T GGGT C C TCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGTAGTCAC ACTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGGCAAGGGCTTGAGTGGATG GGAGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTT CAGGACAGAGTCACGGTTACCGCGGACAAATCCACGAATACAGCCTAC ATGGAGTTGAGTAGCCTCAGACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT GCGAAGGGGGAACTGGAACCACGAATCCTCTACTACTACGGTATGGAC GTCTGGGGCCGAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG SEQ TO NO: 23

Claims (29)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    1. Anticuerpo contra polipeptido amiloide de islote (IAPP) monoclonal humano o un fragmento de union a IAPP y/o proIAPP del mismo, caracterizado por que el anticuerpo reconoce preferiblemente agregados de IAPP y/o prolAPP humanos que comprenden oligomeros y/o fibrillas de IAPP y/o proIAPP sobre IAPP y/o proIAPP fisiologicos, y no reconoce sustancialmente peptido b-amiloide patologico (AP1-42) en cerebro humano de la enfermedad de Alzheimer, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
    (a) un anticuerpo que se une especlficamente a un epltopo de IAPP que comprende la secuencia de aminoacidos SSNNFGA establecida en la SEQ ID NO: 4, CNTATCA establecida en la SEQ ID NO: 5 o QRLANFLVHS establecida en la SEQ ID NO: 71;
    (b) un anticuerpo que es capaz de unirse a un epltopo de IAPP humano, en el que el anticuerpo o el fragmento de union a IAPP del mismo comprende en su region variable las siguientes seis regiones determinantes de complementariedad (CDR):
    (i)
    VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 12,
    VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 12,
    VHCDR3: posiciones 99-110 de la SEQ ID NO: 12,
    VKCDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 14,
    VKCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 14, y VKCDR3: posiciones 89-96 de la SEQ ID NO: 14, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos;
    (ii)
    VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 16,
    VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 16,
    VHCDR3: posiciones 99-111 de la SEQ ID NO: 16,
    VKCDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 18,
    VKCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 18, y VKCDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 18, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos;
    (iii)
    VHCDR1: posiciones 26-37 de la SEQ ID NO: 20,
    VHCDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 20,
    VHCDR3: posiciones 100-110 de la SEQ ID NO: 20,
    VKCDR1: posiciones 24-38 de la SEQ ID NO: 22,
    VKCDR2: posiciones 54-60 de la SEQ ID NO: 22, y VKCDR3: posiciones 93-101 de la SEQ ID NO: 22, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos;
    (iv)
    VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 24,
    VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 24,
    VHCDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 24,
    VKCDR1: posiciones 24-39 de la SEQ ID NO: 26,
    VKCDR2: posiciones 55-61 de la SEQ ID NO: 26, y VKCDR3: posiciones 94-102 de la SEQ ID NO: 26, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos;
    (v)
    VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 28,
    VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 28,
    VHCDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 28,
    VLCDR1: posiciones 23-34 de la SEQ ID NO: 30,
    VLCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 30, y VLCDR3: posiciones 93-101 de la SEQ ID NO: 30, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos;
    (vi)
    VHCDR1: posiciones 26-35 de la SEQ ID NO: 64,
    VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 64,
    VHCDR3: posiciones 99-116 de la SEQ ID NO: 64,
    VKCDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 66,
    VKCDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 66, y
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    VKCDR3: posiciones 89-96 de la SEQ ID NO: 66, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos;
    (vii)
    VHCDR1: posiciones 25-35 de la SEQ ID NO: 68,
    VHCDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 68,
    VHCDR3: posiciones 99-112 de la SEQ ID NO: 68,
    VLCDR1: posiciones 23-35 de la SEQ ID NO: 70,
    VLCDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 70, y VLCDR3: posiciones 90-100 de la SEQ ID NO: 70, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos; y
    (c) un anticuerpo que es capaz de unirse a un epltopo de IAPP y proIAPP humano, en el que el anticuerpo o el
    fragmento de union a IAPP y/o proIAPP del mismo comprende en su region variable las siguientes seis CDR:
    (viii)
    VHCDR1: posiciones 26-37 de la SEQ ID NO: 20,
    VHCDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 20,
    VHCDR3: posiciones 100-110 de la SEQ ID NO: 20,
    VKCDR1: posiciones 24-38 de la SEQ ID NO: 22,
    VKCDR2: posiciones 54-60 de la SEQ ID NO: 22, y VKCDR3: posiciones 93-101 de la SEQ ID NO: 22, o
    en las que una o mas de las CDR pueden comprenden una o dos sustituciones de aminoacidos.
  2. 2. Anticuerpo o fragmento de union a IAPP/proIAPP del mismo, segun la reivindicacion 1, que comprende en su region variable
    (a) una secuencia de aminoacidos de la region Vh y Vl seleccionada entre
    (i) SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14
    (ii) SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18
    (iii) SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22
    (iv) SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26
    (v) SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 30
    (vi) SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 66
    (vii) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 70; o
    (b) una secuencia de aminoacidos de la region Vh y Vl establecida en (viiii) SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22.
  3. 3. Anticuerpo, segun la reivindicacion 1 o 2, que es un anticuerpo quimerico roedor-humano o un anticuerpo roedorizado.
  4. 4. Anticuerpo o molecula de union a antlgeno que compite con un anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la union especlfica a IAPP y/o proIAPP caracterizado por que el anticuerpo reconoce preferiblemente agregados de IAPP y/o proIAPP humanos que comprenden oligomeros y/o fibrillas de IAPP y/o proIAPP sobre IAPP y/o proIAPP fisiologicos, y no reconoce sustancialmente el peptido b-amiloide patologico (AP1-42) en cerebro humano de la enfermedad de Alzheimer.
  5. 5. Anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena simple (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2.
  6. 6. Polinucleotido que codifica al menos el dominio de union o region variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5.
  7. 7. Vector que comprende el polinucleotido, segun la reivindicacion 6, opcionalmente en combinacion con un polinucleotido, segun la reivindicacion 6, que codifica la region variable de la otra cadena de inmunoglobulina de dicha molecula de union.
  8. 8. Celula huesped que comprende el polinucleotido, segun la reivindicacion 6, o el vector, segun la reivindicacion 7.
  9. 9. Anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o codificado por el polinucleotido, segun la reivindicacion 6, que esta
    (i) marcado de forma detectable; y/o
    (ii) unido a un farmaco.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
  10. 10. Anticuerpo, segun la reivindicacion 9, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisotopo, un fluoroforo y un metal pesado.
  11. 11. Composicion, que comprende el anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9 o 10, el polinucleotido, segun la reivindicacion 6, el vector, segun la reivindicacion 7 o la celula, segun la reivindicacion 8, en la que la composicion es
    (i) una composicion farmaceutica y que comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable;
    (ii) una vacuna; o
    (iii) una composicion de diagnostico.
  12. 12. Composicion, segun la reivindicacion 11, en la que la composicion farmaceutica y/o la vacuna comprenden ademas un agente adicional util para el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2 (T2D) y/o para utilizar en el tratamiento o prevencion del rechazo de islotes despues del trasplante cllnico de islotes pancreaticos, o en la que la composicion de diagnostico comprende ademas reactivos utilizados convencionalmente en metodos de diagnostico de base inmunologica o basados en acidos nucleicos.
  13. 13. Anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9 o 10, el polinucleotido, segun la reivindicacion 6, el vector, segun la reivindicacion 7 o la celula, segun la reivindicacion 8, o una composicion farmaceutica o de diagnostico que comprende cualquiera de los mismos para utilizar en el tratamiento profilactico, tratamiento terapeutico y/o control de la progresion o una respuesta al tratamiento de un trastorno relacionado con IAPP y/o prolAPP.
  14. 14. Metodo de diagnostico o control de la progresion de amiloidosis de islotes en un sujeto, comprendiendo el metodo determinar la presencia de oligomeros, agregados o fibrillas de IAPP y/o prolAPP en una muestra del sujeto que sera diagnosticado con al menos un anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5, 9 o 10, en el que la presencia de oligomeros, agregados o fibrillas de IAPP y/o prolAPP, es indicativa de diabetes mellitus tipo 2 (T2D) presintomatica, prodromica o cllnica y/o de la deficiencia de celulas beta despues del trasplante cllnico de islotes pancreaticos y un incremento del nivel de oligomeros, agregados o fibrillas de IAPp y/o prolAPP en comparacion con el nivel del IAPP fisiologico o en comparacion con una muestra de referencia derivada de un sujeto de control sano o una muestra de control del mismo sujeto, es indicativa del progreso de diabetes mellitus tipo 2 (T2D) presintomatica, prodromica o establecida y/o de deficiencia de islotes despues del trasplante cllnico de islotes pancreaticos en dicho sujeto.
  15. 15. Anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5, 9, 10 o 13, para utilizar en la detecion in vivo de o el reconocimiento de un agente terapeutico y/o de diagnostico para IAPP y/o prolAPP en el cuerpo humano o de un animal.
  16. 16. Anticuerpo para utilizar, segun la reivindicacion 15, en el que dicha deteccion in vivo comprende tomografla por emision de positrones (PET), tomografla por emision monofotonica (SPECT), obtencion de imagenes opticas del infrarrojo cercano (NIR) u obtencion de imagenes de resonancia magnetica (MRI) y/o en el que el anticuerpo se disena para utilizar en el metodo, segun la reivindicacion 14.
  17. 17. Peptido que tiene un epltopo de IAPP reconocido especlficamente por un anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el peptido consiste en 10 aminoacidos contiguos y comprende la secuencia de aminoacidos SSNNFgA establecida en la SEQ ID NO: 4, CNTATCA establecida en la SEQ IS NO: 5 o QRLANFLVHS establecida en la SEQ ID NO: 71.
  18. 18. Metodo de diagnostico de amiloidosis de islotes indicativa de diabetes mellitus tipo 2 presintomatica o cllnica y/o de la deficiencia de celulas beta despues del trasplante cllnico de islotes pancreaticos en un sujeto, que comprende una etapa de determinar la presencia de un anticuerpo que se une a un peptido, segun la reivindicacion 17, en una muestra biologica de dicho sujeto.
  19. 19. Equipo util en el diagnostico o control de la progresion de amiloidosis de islotes, comprendiendo dicho equipo al menos un anticuerpo, segun cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5, 9, 10 o 13, el polinucleotido, segun la reivindicacion 6, el vector, segun la reivindicacion 7 o la celula, segun la reivindicacion 8 y/o el peptido, segun la reivindicacion 17, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para su utilizacion.
    A NI-203.9A2-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1------------------------CDRl------FR2------------CDR2--------------
    FVQT.VFiSGjGT iVQPGGS T.RLSC AASGFTF STF AKSWVRQAPGKGT.FWVST T ggsgpk^yyaps tag
    FR3--------------------------------CDR3---------JH----------
    RFTIS RUN S KK T L Y L Q V N S LRPED T A V Y Y C AKSPSSLLAIYFUYW G Q G TL V T V S S
    NI-203.9A2-VH (secuencia de cadena pesada variable VH despues de PIMC)
    FRY------------------------CDR1------FR2------------CDR2--------------
    FVQT,LFGGGGT iVQPGGS T.RLSC AAS GFTF STF AKS2JVRQAPGKGT.FWVST T GGSGPN^YYAPS LAG
    FR3--------------------------------CDR3---------JH----------
    RFT 13 RUN S KK T L Y L Q V N S LRPED T A V Y Y C AKSPSSLLAIYFUYW G Q G TL V T V S S
    NI-203.9A2-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1----------------------CDRl-------FR2-------------CDR2---FR3---------
    ETVLTQSPSTLS A S VG DRVTTT CRASESINSWLAWY Q Q KPGKGPKT.T.T YKASSLQSGVP SRFS G S G S
    -----------------------CDR3----JK---------
    GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQHKSYWTT ’ GQ GTKVEIK
    NI-203.9A2-VK (secuencia de cadena ligera variable VK despues de PIMC)
    FR1----------------------CDRl-------FR2-------------CDR2---FR3---------
    DIQMTQ S P S TL SASVGDRVTIT CRASESINSWLAWYQQKPGKGPKLLIYKASSLQSGVPS RF S GS G S
    ------------------------------------------------CDR3---------jk------------------
    GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQHNSYWT1GQGTKVEIK
    B NI-203.19H8-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1------------------------CDRl------FR2------------CDR2--------------
    EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYGKIIWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGSKEYYAFSLKG
    FR3--------------------------------CDR3----------JH----------
    RVTISRDNSENTLYLQLHTLRVEDTAVYFC ART IASATVDHGNFVWGQC-TLVTVS 3
    NI-203.19H8-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1----------------------CDRl-------FR2-------------CDR2---FR3---------
    DVVMTQSPSSVSA S VGDRVTIT CRASHDISTWLAWYQQRP GKAFNL LIF GASRLQSGVSPRFSGSGS
    ------------------------------------------------CDR3-----------jk------------------
    GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNNFPPTFGQGTRLEIK
    Figura 1
    C NI-203.26C11-VH {secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1-------------------------CDR1---------FR2------------C DR2--------------
    Q'VQLQZSGPSLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGNYYWTWIRQFASKGlEWISHIYSSGTrNYNPSLES
    FR3-------------------------------CDR3-------JH---------
    RVT“SVDTSKNQFSI, S LNSVTAAD TAVYYCARPLATVPDAFNIWGQGTMVTVSS
    NI-203.26C11-VK {secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1----------------------CDR1------------FR2-------------C DR2---FR3----
    F 1 VITG'QSPIIS LAVSLGERAIlKCKSSQSyJ-'YSNKN FLAW YQQKPCQPPKIiIjIY WAS IRES GvPlYRFS
    ----------------------------CDR3-----JK---------
    GSGSGTDFTLTISSI iQAEDVAVYYCQQYYSNPNTFGQGTKVET K
    D NI-203.8E3-VH {secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1-------------------------CDR1------FR2------------GCR2---------------
    QVQ_i VQ SOAR VRKPGSSVK VS CRR SGC PI’S SH'11 SWyRQARGQG_iFWMGG__LP_FGIAKYAQKFQl_)
    FR3---------------------------------CDR3------------JH----------
    RVTVTADKSTNTAYMEL S SLRPEDTAVYYCAKGELEPRILYYYGMDVWGRGTTVTVSS
    NI-203.8E3-VK {secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1----------------------CDR1-------------FR2-------------CDR2---FR3---
    DVVMG'QSPLlSLPVTLGQRASI SCRSSQS1A/YSDGNTYLNWFHQKFGQSPRRL1YKVSERDfiGYPURF
    --------------------------CDR3----JK--------
    SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGSNWPGTFGQGTKVE = K
    E NI-203.11B12-VH {secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1-------------------------CDR1------FR2------------CDR2---------------
    QyQVyQSGAPVKKPGASMKVSCRRSG YIFTF Y YLHVv’RQAPGQGIjPVMCV 1NPSAGSISYAQKFQO
    FR3--------------------------------CDR3-----------JH---------
    RVT MTRDTSTST VYME L S SLKSEDTAVYYCARDSAC-IQIWFRDAFDIWGQGTMVTVS S
    NI-203.11B12-VL {secuencia de cadena ligera variable VL)
    FR1---------------------CDR1---------FR2-------------GCR2---FR3---------
    QPVETQPPRASASLGSSVKLTCTLNSGJISSYTIAWIIQaGPGKAPRYEMKVEHKGNYNRGSGLPRRFS
    —CDR3----JK—
    G S S S GADRYLAISNLQ S E DE ADYYCETWDT STRVF GG GT I< L T VL
    F NI-203.205F8-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1--------------------------CDRl-------FR2----------------CDR2-------------
    QVQ" j Q ESGP G LVKPSETLSLT C T V SGDSVSSGSYYW 5 WIRQPP G K GI, E W “ GY ~ VY G G S ~YTYNP S T. X S
    FR3----------------------------------CDR3----------------JH----------
    RVT1SVCTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYSCARVPYC-YGYRGYDGRWYFDYWGQGTLVTVSS
    NI-203.205F8-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1-----------------------CDR1--------FR2--------------CDR2---FR3---------
    F T VT.TQSPATTiS T.SPGFR ATT. SCR AS QSVS SYT. AWYQQKPGQ APRIF. T YDASKRA.TGTPARFSGSGS
    ---------------------------------------------CDR3---------jk-----------------
    GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQP.SNP.RTF GPGTKVDTK
    G NI-203.9B3-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FRT--------------------------CDR1-------FR2-------------CDR2---------------
    EVQLVESGGGVVQPGGS LRLS C AA SGFTFSSYGMHWVRQ APGKGT.F.WAVTWYCGFKRYYAPSVKG
    FR3----------------------------------CDR3-------JH----------
    RE1T T S RDN S KN T S LQMN S L RAG D S A V Y Y C ARGFSSSWEFGFWGQ G T L V T V S S
    NI-203.9B3-VL (secuencia de cadena ligera variable VL)
    FR1----------------------CDRl------------FR2--------------CDR2---FR3-----
    QSALTQPPSAS GSPGQS VT IS C T GT SGYIY GYNYVSWYCQEPGKAPKVMIYEVTKRPS GVPDRF S G
    ----------------------------------------------------CDR3-------------jk-----------------
    SKS GN T AS L T V S GLQAE DE AV Y Y CAS YAGSNNVVF GGGT KLT V
    H NI-203.19F2-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1--------------------------CDRl-------FR2-------------CDR2---------------
    EVQLVQSGAEVRKPGSSVKVSCKASGGNFLSYSISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTPNYAQKFQG
    FR3--------------------------------CDR3------------------JH —
    RVT:TADKSTRTAYMEL S S LRF DDTAVYYCADATRPGTAASGFYYYGMDVWGQGTTVTVSS
    NI-203.19F2-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1-----------------------CDRl--------FR2--------------GDR2---FR3---------
    EIVMTQSPDTLSVSPGERATLSCRASQSVNNNLAWFQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGS
    ------------------------CDR3----JK---------
    GTEFTLTISSLQSEDFAVYFC QQSHNWPTF GP C-T K VDIK
    I NI-203.15C7-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1------------------------CDR1--------FR2------------CDR2---------------
    EVQLVETGGGWQPGMSLKLSCA AS GFTFSTYTMHWVFtQAPGKGT.F2JVSF T S YDGREKYYADSVKG
    FR3-----------------------------------CDR3------------JH-----------
    RETlSRUNSKNMLYliQMNSliRDEEMAVYYC/i'I’LQVWQLYDYYCMIJVWGQGTTVTVSS
    NI-203.15C7-VL (secuencia de cadena ligera variable VL)
    FR1---------------------CCR1----------FR2-------------CDR2---FR3---------
    QS VLTQPPS VS A APGQKVTIS CS TAG S SN 7 GKRYVS2JYQQ L P GT APK L LI YNSDKRPSGIPDRFS ASKS
    ------------------------CDR3--------jk---------
    GTS AT LGITGLQTGDEADY YCATWDTRLSAGVF1G GGTKLTVL
    A NI-203.1D10-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1------------------------CDR1------FR2-------------CDF; 2-------------
    EVQLVQSGAEVKKPGESI RISCKASGYSFTNSWIAWVRQMPGKGI DYVGT T YPGDSD'T’KYGPSFQG
    FR3--------------------------------CDR3-------JH----------
    HVTISADN11 ANTAYLQWS SLKAS C TA2 YYCARRAAAAINWFD S WGQGTL VTVSS
    NI-203.1D10-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1----------------------CDR2-------------FR2-------------CDR2---FR3---
    DIQLTQSPLSLS VTPGEPAS IS CRS S Q S T, T.H^NGN D'Y T,D>JYVQKPGQSPQT V T YMGSNRAAGVPDP F
    -----------------------------CDR3----JK---------
    SGSGSGTDF TLKISRVEAEDVGTYYCGGAERGYT2 ’ GQGTKVEIK
    B NI-203.2A11-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FP 1------------------------CDRl------FR2------------CDR2--------------
    QVQLVESGGGWQPGGSI RLSCVASGFT7SSYGMHWVPQAPGKGI FWVAFVPYDGSNKYYADSVT<G
    FR3--------------------------------CDR3-------JH----------
    RF' TISRDNSKNSLSLQMNS LRTEDTAVYYCAKEQEDHKEAFDYWCQCTLVTVSS
    NI-203.2A11-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FP 1----------------------CDRl------FP 2-------------CDR2---FR3---------
    EIVMTQSPATLSVSPGERATESCRASQRVE EIAWYQQKP GQAPRL LIYGA S3RAED2 PARFSGSGS
    -----------------------CDR3-----JK---------
    GT DFTLTISSLQSEDFA V Y Y C QQY2IQWPL2 F 'GGGTKLEIK
    C NI-203.10C4-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FP 1------------------------CDRl------FR2------------CDR2--------------
    evqlvesgaevrkpgasvrvscqfsgysvfdyyl;ifjvpqapgqglewmgvrnpsnghvgyfqkfqg
    FR3--------------------------------CDR3--------------JH----------
    RVTMTADTSTGTVYMVLTGLEAGCTAVYYCARGGSEPGQEVRSPHVLDLVJGQGTLVEVSS
    NI-203.10C4-VH (secuencia de cadena pesada variable VH despues de PIMC)
    FR1------------------------CDRl------FR2------------CDR2--------------
    QVQLVQSGAEVRKPGASVRVSCQESGYSVrDYYLHWVPQAPGQGLEWMGVRNPSNGNYGYPQKFQG
    FR3--------------------------------CDR3--------------JH----------
    RVTMTADlSTGIVYRVLTGLDAGCTAVYYCARGGSEPGQEVRSPHVLDLWGQgiLVDVSS
    Figura 2
    N1-203.10C4-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1--------------------CDR 1------------FR2------------CDR2---FR3---
    DVVMTQSPL SL S7TPGQPA51S CRSDESLLII5DGRTYLYWYLCKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPNRF
    ----------------------------CDR3-----jk--------
    S GS GS GT D FT LKIS RVEAEDVGVYYCMQGVHFPQTFGQGTKLEIK
    N1-203.10C4-VK (secuencia de cadena ligera variable VK despues de PIMC)
    FR1--------------------CDR 1------------FR2------------CDR2---FR3---
    DIVMTQTPLSLSVTPGQPASIS CRSDESLLIISDGRTYLYWYLQK?GC?FQLLIYEVSNRFSGVPNRF
    ----------------------------CDR3-----jk--------
    S GS GS GT D FT LKIS RVEAEDVGVYYCMQGVHFPQTFGQGTKLEIK
    D NI-203.20H9-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1----------------------CDR1------FR2-----------CDR2-------------
    QVQLVQ SGSELKKPGAS VK VS C KA S GYIFSKHGIN WVRQ AP GQGLE WI GW IH T NT GNP T YAQ DF T C-
    FR3-----------------------------CDR3--------JH ■-
    RFVF S LD T SVS TAYLEIS S LKAEDTAVYYCARE SEPIFGVIYYMDVWGKGTTVTVS S
    NI-203.20H9-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1--------------------CDR1-------FR2------------CDR2---FR3--------
    DIQMTQSPS SLSASVGDSVTIT CRASQSIS TNLNWYQKKPGQAPTVLIYAASSLQGGVPSRFRGRGS
    ---------------------CDR3----JK--------
    GTYFTLTISGLQPEDFATYYCQHNYNDLWTFGQ GTKVEIK
    E NI-203.26D2-VH (secuencia de cadena pesada variable VH)
    FR1----------------------CDR1------FR2-----------CDR 2--------------
    QVQLVE S G G G WQP G G SLRL S C AA S GF TFRT C GMHWVRQAP GKGLE WVAF VRS D>0 T T RY YAP S LMC
    FR3-----------------------------CDR3 -----JH
    RF TISRDNS KNS LYLQMNS LRPEDTALYYCAREKEDHREAFDYWGQGTLVTVS 3
    NI-203.26D2-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FR1--------------------CDR1------FR2------------CDR2---FR3--------
    El VMTQSPA'l'L S'/'SPC-ERA1L SCRAP QRVS'IVAW YQQKPGGAPRL^l YCASTRATD1 PARI'SC-SGS
    ---------------------CDR3----JK--------
    GTDFTLTISTLQSEDSAVYYCQQYNRWPLTFGGGTKVEIK
    F NI-203.60H3-VH {secuencia de cadena pesada variable VH)
    FRl-------------------------CDR1------FR2------------CDR2---------------
    F,VQT,VESGGGLARPGGSLRLSCAVAGFTFSGYEMNWVRQA2= GKGLEWT SYT SGPGDVT YYAGSVXG
    FR3-----------------------------------CDR3--------JH-----------
    RE • T1S R DN AKN S LF LQ M N 3 L RA E D T A V Y Y C T RYPPD1S Y OFF1 YW G Q G1L V1V 5 S
    NI-203.60H3-VK (secuencia de cadena ligera variable VK)
    FRl------------------------CDR1--------FR2--------------CDR2---FR3---------
    D T QMTQSPSSLSASVRDSVTTTC R A S N WYQQKPGKAPNLLIHDTDILQSGVPSRFSGTGS
    -------------------------CDR3------jk---------
    GTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQSYSTPPTE1GQ GTKLEIK
    o o es o O
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    imagen1
    33
    imagen2
    CO
    DO 450 nm
    imagen3
    Nf-203.26C11 NI-203.8E3
    imagen4
    Figura 4
    imagen5
    imagen6
    IAPP prolAPP
    123
    imagen7
    imagen8
    IAPP no fibrilar
    imagen9
    imagen10
    Mary Ab
    imagen11
    B
    IAPP humana: 1-KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY-37
    Anticuerpo
    Epitopo de union
    NI-203.9A2
    Nl
    N 1-203.19H8
    19-SSNNFGA-25
    NI-203.26C11
    N-Terminal: 2-CNTATCA-8
    NI-203.8E3
    Nl
    NI-203.19F2
    Nl
    N 1-203.15C7
    10-QRLANFLVHS-19
    Figura 6
    imagen12
    imagen13
    Figura 7 (continuacion)
    imagen14
    NI-203.9A2
    NI-203.X9H8
    NI-203.26C11
    Control Ab
    Hary Ab
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    1.5-
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    19H8 murino [pM]
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  25. 2.B-1
  26. 2.0-1
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    1.5-
    O 1.1-
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    G.5-
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    10*
    26C11 humano fnM]
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    Anticuerpos humanos
    Anticuerpos quimericos de raton
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    ECe:;, [nM]
    NI-203.9A2
    NI-203.9A2
  27. 18.6
    NI-203.19H8
  28. 22.9
    NI-203.19H8
  29. 23.9
    NI-203.26C11
    NI-203.26G11
    NI-203.9A2
    quimerico
    NI-203.19H8
    quimerico
    NI-203.26C11
    quimerico
    imagen18
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