CN104812774B - 人胰岛淀粉样多肽(hiapp)特异性抗体及其用途 - Google Patents

人胰岛淀粉样多肽(hiapp)特异性抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104812774B
CN104812774B CN201380047659.6A CN201380047659A CN104812774B CN 104812774 B CN104812774 B CN 104812774B CN 201380047659 A CN201380047659 A CN 201380047659A CN 104812774 B CN104812774 B CN 104812774B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
iapp
seq
antibodies
proiapp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380047659.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104812774A (zh
Inventor
简·格瑞姆
法布里斯·海兹
陈丰
伊万娜·科姆巴鲁兹尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Holdings Co ltd
Original Assignee
Bio Holdings Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Holdings Co ltd filed Critical Bio Holdings Co ltd
Priority to CN202011111797.4A priority Critical patent/CN112225808A/zh
Publication of CN104812774A publication Critical patent/CN104812774A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104812774B publication Critical patent/CN104812774B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

提供了一种新的人胰岛淀粉样多肽，也分别称为胰淀素和IAPP和proIAPP，特异性抗体以及其片段，衍生物和变体以及与其相关的方法。还公开了与对IAPP和/或proIAPP特异性的抗体相关的测定法、试剂盒和载体。抗体、其一个或多个免疫球蛋白链、以及结合片段、衍生物和变体可以用于药物和诊断组合物中，其分别用于IAPP和/或proIAPP靶向的免疫疗法和诊断。

Description

人胰岛淀粉样多肽(HIAPP)特异性抗体及其用途
技术领域
本发明通常涉及新型分子，其特异性结合至人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)(还称为胰淀素)和/或其前体前胰淀粉样蛋白(proIAPP)，特别是人抗体以及其片段、衍生物和变体，其识别IAPP、proIAPP蛋白、IAPP的聚集形式、proIAPP的聚集形式和/或IAPP原纤维。另外，本发明涉及药物和诊断组合物，其包括这样的结合分子、抗体以及其模拟物，其作为识别血浆中的IAPP、proIAPP、聚集的IAPP、proIAPP种类和/或IAPP原纤维的诊断工具以及在用于治疗疾病的被动接种疫苗策略中都是有价值的，所述疾病与聚集的IAPP、聚集的proIAPP和IAPP原纤维相关，诸如2型糖尿病(T2D)和伴随临床胰岛(pancreatic islet)移植到患有1型糖尿病(T1D)的个体中的胰岛排斥反应。
背景技术
蛋白质积累、变化和聚集是许多代谢疾病的病理方面，这些疾病包括众所周知的神经退行性疾病，例如亨廷顿氏病、阿尔茨海默病氏病(AD)和帕金森病(PD)(Taylor等人，Science 296(2005),1991-1995)。病理蛋白质聚集也涉及代谢性疾病，诸如2型糖尿病(T2D)和伴随临床胰岛移植到患有1型糖尿病(T1D)的个体中的胰岛排斥反应。蛋白质的错误折叠和聚集导致淀粉样沉积的发展并在这些疾病中似乎是与细胞毒性直接相关。胰岛淀粉样多肽(IAPP或胰淀素)，一种与由在胰腺中的β-细胞共同分泌胰岛素的生理性肽，在T2D患者的胰岛(也称郎格罕氏岛)内形成纤维状聚集体并建议在疾病的发展中发挥作用(Westermark等人.(2011),Physiol.Rev.91(3):795-826)。此外，如前所述，在患有1型糖尿病(T1D)的患者中移植分离的岛之后，已在胰岛中发现IAPP聚集体。
人IAPP(hIAPP)是一种肽激素，其由37个氨基酸构成，具有位于半胱氨酸残基2和7之间的二硫键以及酰胺化的C-末端。胰岛由65％至80％的β细胞组成，其产生并分泌对调节血糖水平和细胞代谢必不可少的胰岛素和IAPP。IAPP由前激素原preproIAPP合成，一种在胰腺β细胞中产生的89个氨基酸前体。
preproIAPP在翻译成胰淀粉样多肽(一种67个氨基酸肽)后迅速裂解，其经历额外的蛋白水解作用和翻译后修饰从而产生hIAPP。hIAPP的表达与胰岛素共同调节，因为增加的胰岛素产生导致增加的hIAPP水平。hIAPP由胰腺β细胞释放到血液循环中并协同胰岛素通过胃排空和饱腹感控制参与血糖调节。
当hIAPP在生理条件下作为细胞代谢的调节器时，hIAPP能聚集并形成与β细胞衰竭有关的淀粉样原纤维(IAPP淀粉样变性)，增加了β细胞死亡且减少了β细胞团块。一些证据指出hIAPP淀粉样变性对于T2D发病机理是主要的致病因素。首先，hIAPP原纤维的沉积在超过90％的2型糖尿病患者中被发现(Zraika等人.(2010),Diabetologia 53(6):1046-1056)。其次，hIAPP聚集对β细胞是有毒的并与产生胰岛素的β细胞的减少有关(Butler等人.(2003),Diabetes 52(9):2304-2314；Ritzel等人.(2007),Diabetes 56(1):65-71；Jurgens等人.(2011),Am.J.Pathol.178(6):2632-2640)。最后，表达hIAPP的转基因小鼠模型显示胰岛淀粉样沉积并自发地发展成T2D(Janson等人.(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(14):7283-7288；Hoppener等人.(1999),Diabetologia 42(4):427-434；Hull等人.(2003),Diabetes 52(2):372-379；Butler等人.(2004),Diabetes53(6):1509-1516；Matveyenko等人.(2006),ILAR J.47(3):225-233；Hoppener等人.(2008),Exp.Diabetes Res.697035)。他们概括了伴有β细胞功能障碍、β细胞团块不足和β细胞损失的人类疾病，其可与在来自T2D患者的组织中所观察到的相比较。hIAPP表达和淀粉样形成与在这些模型中的β细胞凋亡和糖尿病发展直接相关，因此在疾病的发展中为人IAPP的贡献提供了证据。此外，干扰hIAPP聚集的治疗改善了糖尿病表型并增加了动物的寿命(Aitken等人.(2009),Diabetes 59(1):161-171)。hIAPP聚集和淀粉样变性是毒性的先决条件。非淀粉样原性啮齿动物IAPP(rIAPP)(其由于六个氨基酸置换而不能形成原纤维)对β细胞是非毒性的。在发展疾病的过程中，在人类胰岛中发现的病理性hIAPP聚集可能引起与胰岛素分泌的受损有关的β细胞功能障碍和死亡。另外，β细胞团块以及胰岛素和胰淀素分泌的代偿性增加(用于维持正常的血糖水平)可能有利于毒性hIAPP寡聚物的形成和hIAPP原纤维的沉积。虽然最初的hIAPP寡聚物被认为是主要的细胞毒性物质，但是hIAPP原纤维的最终产物也可能在β细胞损失中起作用(Meier等人.(2006),Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.291(6):E1317-1324；Haataja等人.(2008),Endocr.Rev.29(3):303-316；Engel等人.(2008),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(16):6033-6038)。在由供体分离的胰岛中也观察到了hIAPP原纤维并与伴随临床胰岛移植到患有1型糖尿病(T1D)的个体中的β细胞损失有关(Andersson等人.(2008),Exp.Diabetes Res.562985；Udayasankar等人.(2009),Diabetologia 52(1):145-153；Bohman等人.(2012),Amyloid 19(2):87-93)。在T2D中导致hIAPP聚集和淀粉样变性的确切机制尚不清楚。在T2D中胰岛素抗性增加了胰岛素分泌需求连同proIAPP细胞含量和hIAPP释放，可以引发作为hIAPP原纤维形成的淀粉样变性是浓度依赖性的。另一种提出的机制是未加工的proIAPP的N-末端的积累和聚集，其起因于在胰岛素抗性的设置中的蛋白水解作用的衰竭，因为在淀粉样蛋白沉积中发现proIAPP的部分加工形式，特别是48个残基中间体proIAPP1-48(Marzban等人.(2006),Diabetes 55(8):2192-2201)。在这种情况下，proIAPP的异常处理可能作为hIAPP淀粉样变性的原因并且增加淀粉样蛋白形成(Paulsson等人.(2005),Diabetes 54(7):2117-2125；Paulsson等人.(2006),Diabetologia 49(6):1237-1246；Marzban等人.(2006),Diabetes55(8):2192-2201)。因此，ProIAPP也被认为是一种适当的治疗靶标。
T2D的临床特征是高血糖水平和胰岛素抗性和/或缺乏。糖尿病是一组包括T1D、T2D和妊娠糖尿病的代谢性疾病。T2D，也称为成人发病型糖尿病、肥胖相关的糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)是糖尿病的最常见形式，占所有病例的约90％(Gerich等人.(1998),Endocr.Rev.19(4):491-503)。T2D的特点在于产生功能性胰岛素的β细胞的数目的减少。虽然病理学发展，但是可能导致长期的并发症，诸如心血管疾病、导致失明的糖尿病视网膜病、肾衰竭、频繁的感染、以及由不良的循环所引起的截肢。结果，T2D与较短的预期寿命有关。这种疾病影响了全世界超过3亿人，导致每年超过一百万人死亡。遗传因素和环境因素都导致了该疾病的发展，伴有被认为是主要原因的肥胖、缺乏体力活动以及衰老(Kahn等人.(2006),Nature 444(7121):840-846)。
用于T2D的目前治疗包括生活方式管理(饮食和运动)和药物干预，诸如通过刺激胰腺释放胰岛素或者增加胰岛素应答提供二甲双胍和胰岛素以降低血糖水平。这些治疗基于糖尿病的症状改善，伴有耐久性不足的后果。事实上，现有的治疗都不显示阻止hIAPP的聚集和胰腺β细胞的损失。涉及胰高血糖素肽1(GLP-1)的类似物(Butler等人.(2009),Diabetologia 53(1):1-6)和GLP-1失活酶的二肽基肽酶4(DDP4)的抑制剂的新的治疗策略是基于GLP-1的强效促胰岛素效应和其提高β细胞增殖的影响。重要的是，增加的胰岛素释放也与增加的胰淀素释放结合在一起。根据实验，刺激胰岛素分泌在动物模型中已显示出促进胰岛淀粉样变性的发展并且类似的影响可以在人类中预期(Aston-Mourney等人.(2011),Diabetologia 54(7):1756-1765)。因此这些治疗可能潜在地加剧胰岛淀粉样变性。更近的和有前途的策略涉及消炎药或针对IL-1β途径的抗体的开发(Donath等人.(2008),Nat.Clin.Pract.Endocrinol.Metab.4(5):240-241；Ehes等人.(2009),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(33):13998-14003；Owyang等人.(2010)、Endocrinology151(6):2515-2527；Dinarello等人.(2010),Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes.17(4):314-321；Boni-Schnetzler等人.(2011),J.Clin.Endocrinol.Metab.93(10):4065-4074；Boni-Schnetzler等人.(2012),Br.J.Clin.Pharmacol.；Cavelti-Weder等人.(2012),Diabetes Care)。重要的是注意到，最近的研究表明，hIAPP特异性诱导炎性体-IL-1β系统，其导致先天免疫系统的激活(Masters等人.(2010),Nat.Immunol.11(10):897-904；Mandrup-Poulsen等人.(2010),Nat.Immunol.11(10):881-883)，因此支持针对hIAPP聚集的治疗策略。
这些发现强调与针对hIAPP和/或proIAPP的主动或被动免疫治疗方法有关的潜在好处。
综上所述，新的治疗策略迫切需要利用有效和安全的治疗来解决聚集的hIAPP、proIAPP蛋白和/或hIAPP寡聚物和/或原纤维。
利用由人免疫系统进化优化和亲和力成熟的人抗体的被动免疫将提供一种有前途的新的治疗途径，其具有对于极好的安全效力和安全性的高概率。
发明内容
本发明利用健康人受试者的hIAPP特异性免疫应答来分离天然抗hIAPP特异性人单克隆抗体。特别是，根据本发明进行的实验成功地从健康人受试者的群或从肥胖患者的群和其他具有发展T2D的增加风险的患者群(其在抗体分离时没有T2D的迹象)中分离单克隆hIAPP和/或proIAPP特异性抗体。
因此本发明涉及人抗体、抗原结合片段和类似的抗原结合分子，其能够特异性地识别IAPP和/或proIAPP。如果没有另外说明，则“特异性地识别IAPP和/或proIAPP”、“特异于/用于IAPP和/或proIAPP的抗体”和“抗IAPP和/或抗proIAPP抗体”具体地，通常和统一是指对IAPP的天然单体形成的抗体；对IAPP的proIAPP前体形式的抗体；特异性地结合至任一种形式，IAPP和proIAPP的抗体；结合至聚集的、寡聚的、纤维状的和/或非纤维状的IAPP和/或proIAPP种类的抗体。本文提供的是这样的人抗体，其选择性地用于全长和/或聚集形式，诸如例如IAPP和/或proIAPP的寡聚、纤维状和非纤维状的聚集形式。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，人抗体或其抗原结合片段描述了抗体的免疫结合特性，其由可变区VH和/或VL表征，如图1或图2中所示。
抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab')片段、F(ab)片段、和F(ab')2片段，或任何其他抗原结合片段。在一个具体实施方式中，在下文中，抗体或其片段是人IgG同种型抗体。可替换地，该抗体是嵌合人-啮齿动物或啮齿动物化(鼠源化，rodentized)抗体例如小鼠或小鼠化的抗体，大鼠或大鼠化的(ratinized)抗体，啮齿动物模型对动物体内的诊断方法和研究是特别有用的。
此外，本发明涉及包括本发明的抗体或其活性片段的组合物，并且涉及在与IAPP相关的疾病诸如T2D的预防、诊断或治疗中使用这样的组合物的免疫治疗和免疫诊断方法，其中将有效量的所述组合物给予需要其的患者。
自然地，本发明分别延伸至永生化人B记忆淋巴细胞和B细胞，其产生具有如下定义的明显和独特的特性的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及至少编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。优选地，所述可变区包括该可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)，如图1或图2中所示。
因此，本发明还涵盖包括所述多核苷酸的载体和由其转化的宿主细胞以及它们在生产对IAPP和/或proIAPP特异性的抗体和等价结合分子中的应用。用于抗体和其模拟物的重组生产的手段和方法以及用于竞争结合分子(其可能是或可能不是抗体)的筛选的方法在本领域中是已知的。然而，如本文中所述，特别是关于在人体中的治疗应用，本发明的抗体就以下而言是人抗体，所述抗体的应用基本上没有对这样的抗体的免疫应答，其另外针对嵌合的并且甚至人源化的抗体观察到。
此外，本文公开的是可用于在样品中和/或体内识别IAPP和/或proIAPP的组合物和方法。公开的抗IAPP和/或proIAPP抗体或其IAPP和/或proIAPP结合片段可用于针对样品中IAPP和/或proIAPP的存在筛选人血液、血浆、血清、唾液、腹膜液、脑脊髓液(“CSF”)以及尿液，例如，通过利用基于ELISA的或表面适合的测定。在一个实施方式中，本发明涉及一种在受试者中诊断或监测与IAPP和/或proIAPP相关的病症的进展的方法，该方法包括利用本发明的至少一种抗体或其任何一种具有基本上相同的结合特异性的IAPP和/或proIAPP结合分子来测定来自待诊断受试者的样品中IAPP和/或proIAPP寡聚物(寡聚体)、聚集体或原纤维的存在，其中IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的存在是病症的指示。
此外，在本发明的一个实施方式中，提供了公开的抗IAPP和/或proIAPP抗体或其IAPP和/或proIAPP结合片段和/或IAPP和/或proIAPP结合分子(其包括本发明抗体的至少一个CDR)用于制备用于体内检测(也称为体内成像)治疗和/或诊断剂或在人体或动物体内将治疗和/或诊断剂靶向IAPP和/或proIAPP的组合物。本文公开的方法和组合物可以对与IAPP相关并且例如通过IAPP和/或proIAPP的寡聚的、纤维状的和非纤维状的聚集体形式的发生来表征(诸如T2D诊断)的病症提供帮助，并且可用于监测疾病的进展和提供给受试者的疗法的治疗功效，例如在体内成像有关的诊断方法中。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的IAPP和/或proIAPP结合分子，其中所述体内检测(成像)包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)光学成象或核磁共振成像(MRI)。
由此，本发明的一个特别目的是提供用于治疗、诊断或预防与纤维状的和/或非纤维状的寡聚体和/或聚集的IAPP和/或proIAPP相关的疾病(例如2型糖尿病(T2D))的方法。该方法包括将有效浓度的人抗体或抗体衍生物给予受试者，其中该抗体靶向IAPP和/或proIAPP。
在另外的方面中，本发明提供了具有IAPP和/或proIAPP表位的由本发明的抗体特异性识别的肽。所述肽包括或由如下在具体实施方式和实施例中描述的氨基酸序列或其经修改的序列(经修饰的序列)组成，在经修改的序列中，一个或多个氨基酸被取代、缺少和/或添加。此外，本发明提供了一种用于在受试者内诊断T2D或发展T2D的风险的方法，包括确定在所述受试者的生物样品中与肽结合的抗体的存在的步骤。
从随后的描述和实施例中，本发明的另外的实施方式将是显而易见的。
附图说明
图1：可变区的氨基酸和核苷酸序列，即人IAPP抗体NI-203.9A2(A)、NI-203.19H8(B)、NI-203.26C11(C)、NI-203.8E3(D)、NI-203.11B12(E)、NI-203.205F8(F)、NI-203.9B3(G)、NI-203.19F2(H)和NI-203.15C7(I)的重链和κ/λ轻链。骨架区(FR)和互补决定区(CDR)是用有下划线的CDR显示。重链连接区(JH)和轻链连接区(JK)也被显示。由于克隆策略，在重链和轻链的N-末端的氨基酸序列可能潜在地包含在FR1中的引物诱导的改变，但其基本上不影响抗体的生物活性。为了提供一致的人类抗体，原始克隆的核苷酸和氨基酸序列根据数据库中的有关人种系(生殖细胞系)的可变区序列对准和调整；例如，参见由蛋白质工程MRC中心(MRC Centre for Protein Engineering)(Cambridge,UK)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。当N-末端氨基酸被认为可能由于PCR引物偏离一致的种系序列，并且因此由引物引起的突变校正(PIMC)替换时，人类抗体的氨基酸序列被指示。PIMC修饰的氨基酸在序列上以粗体显示。
图2：可变区的氨基酸和核苷酸序列，即人proIAPP抗体NI-203.1D10(A)、NI-203.2A11(B)、NI-203.10C4(C)、NI-203.20H9(D)、NI-203.26D2(E)and NI-203.60H3(F)的重链和κ/λ轻链。骨架区(FR)和互补决定区(CDR)是用有下划线的CDR显示。重链连接区(JH)和轻链连接区(JK)也被显示。由于克隆策略，在重链和轻链的N-末端的氨基酸序列可能潜在地包含FR1中的引物引起的改变，但其基本上不影响抗体的生物活性。为了提供一致的人类抗体，原始克隆的核苷酸和氨基酸序列根据数据库中的有关人种系的可变区序列对准和调整；例如，参见由蛋白质工程MRC中心(Cambridge,UK)主办的Vbase(http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/)。当N-末端氨基酸被认为可能由于PCR引物偏离一致的种系序列，并且因此由引物引起的突变校正(PIMC)替换时，人类抗体的氨基酸序列被指示。PIMC修饰的氨基酸在序列上以粗体显示。
图3：通过直接ELISA评估的人重组抗体的IAPP结合特异性。(A)用于ELISA板包被的IAPP溶液(2mg/ml)的电子显微镜图像。比例尺表示1μm。(B)表现出与人IAPP(10μg/ml)特异性结合的重组NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11和NI-203.8E3。BSA(10μg/ml)被用作对照以用于测定非特异性结合。数据表示为450nm处的OD值。
图4：对于IAPP和proIAPP的重组人源化(衍生的)抗IAPP抗体的EC50测定。(A)用于ELISA板包被的IAPP和proIAPP溶液(2mg/ml)的电子显微镜图像。比例尺表示1μm。(B)板用指定浓度的重组人源化抗体NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11或NI-203.8E3孵育。抗体NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11和NI-203.8E3分别以9nM、22nM、6nM和4nM的EC50以高亲和力与人IAPP(■，10μg/ml)结合。NI-203.26c11以260nM的EC50也与proIAPP(□，10μg/ml)结合。一式两份进行测量并且扣除BSA上的本底信号。数据表示为450nm处的平均OD值。
图5：人源化的抗IAPP抗体对IAPP原纤维是特异性的。(A)用于ELISA板包被的IAPP(2mg/ml)和非纤维状IAPP(500μg/ml)溶液的电子显微镜图像。虽然IAPP溶液包含原纤维，但是在非纤维状IAPP溶液中缺乏IAPP原纤维。比例尺表示1μm。(B)用指定浓度的重组人源化抗体NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11或NI-203.8E3孵育板。NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11和NI-203.8E3抗体以高亲和力与IAPP原纤维(IAPP溶液，■，10μg/ml)结合并以非常低的亲和力与非纤维状IAPP(△，10μg/ml)结合，建议对IAPP原纤维具有特异性。一式两份进行测量并且扣除BSA上的本底信号。数据表示为450nm处的平均OD值。
图6：通过肽扫描分析评估的人重组抗体的结合表位。(A)重组NI-203.19H8和NI-203.26C11人源化抗体(1μg/ml)的肽扫描图像。NI-203.19H8结合发生在覆盖氨基酸19-25的肽6和7(行A)处(肽6：16-LVHSSNNFGA-25SEQ ID NO:6，肽7：19-SSNNFGAILS-28SEQ IDNO:8，一致的结合序列：19-SSNNFGA-25SEQ ID NO:4)。NI-203.26C11结合发生在覆盖氨基酸1-10的肽1(行A)(肽1：1-KCNTATCATQ-10SEQ ID NO:9)处而不是覆盖氨基酸4-13的肽2(肽2：4-TATCATQRLA-13SEQ ID NO:10)。肽33-39和41(行C)上的残基2-8处的丙氨酸置换或替代损坏了NI-203.26C11结合(肽33突变：C2A，肽34突变：N3A，肽35突变：T4A，肽36突变：A5G，肽37突变：A5P，肽38突变：T6A，肽39突变：C7A，肽41突变：A8P)。次级HRP结合的驴抗人IgG Fcγ(1:20000；IIary Ab)仅用作对照。(B)在人IAPP蛋白质序列的指定氨基酸内识别的不同人源化IAPP特异性抗体的结合表位。上图：全长人IAPP的氨基酸序列(氨基酸1-37)。NI：未识别结合表位。
图7：NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体在诊断有2型糖尿病(T2D)的患者的胰腺内特异性识别病理性IAPP淀粉样蛋白。NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体在加载有IAPP原纤维(淀粉样蛋白)的T2D胰岛内(A，B)而不是在缺乏IAPP原纤维的T2D胰岛(C，D)内显示出染色。(A)在T2D患者的胰岛内淀粉样蛋白的硫磺素S(ThioS，左图)和刚果红(CR，右图)染色。(B)用50nM(大图和左底部的插图)和5nM(右底部的插图)的NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体(棕色-CR)来检测淀粉样蛋白阳性T2D胰岛上的IAPP原纤维。(C)在T2D患者的胰岛中没有淀粉样蛋白，如通过阴性硫磺素S(硫磺素S，左图)和刚果红(CR，右图)所示出的。(D)淀粉样蛋白阴性T2D胰岛上没有用50nM的NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体进行染色。驴抗人二抗(IIary Ab)仅用作对照。底部插图：个体人胰岛的高放大倍率图像。人胰岛用抗胰岛素抗体染色(蓝色原(i.o.)，这里强烈染色)和进行复染(对比染色)以使细胞核可视化(淡蓝色i.o.，这里弱染色)。
图8：在人类控制胰腺上，NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体不识别生理性IAPP。当与IAPP对照抗体(1:100；对照Ab)相比时，在人类控制胰岛上，NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体(50nM)表现为弱染色。驴抗人二抗(IIary Ab)仅被用作对照。人胰岛用抗胰岛素抗体染色(蓝色原(i.o.)，这里强烈染色)并且进行复染以使细胞核可视化(淡蓝色i.o.，这里弱染色)。
图9：在患糖尿病的猫的胰腺上，NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体识别病理性IAPP原纤维。在具有NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体的T2D猫的胰岛上的IAPP原纤维的检测。用刚果红(CR)染色IAPP原纤维(淀粉样蛋白)。驴抗人二抗(IIary Ab)仅被用作对照。底部左插图：个体猫胰岛的高放大倍率图像。猫胰岛用抗胰岛素抗体染色(蓝色原(i.o.)，这里强烈染色)并且进行复染以使细胞核可视化(淡蓝色i.o.，这里弱染色)。
图10：在具有阿尔茨海默氏病的人脑中，NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体不识别病理性Aβ沉积。与Aβ特异性抗体6E10相反(1:2000；对照Ab)，没有用NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体(50nM)进行染色。驴抗人二抗(IIary Ab)仅被用作对照。进行复染以使细胞核可视化(淡蓝色i.o.，这里弱染色)。
图11：重组人和小鼠嵌合抗体NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11以相等的亲和力与人IAPP结合。(A)针对IAPP(■，10μg/ml)和BSA(◇，10μg/ml)，重组人和小鼠嵌合抗IAPP抗体的Ec50测定。用具有指定浓度的抗体孵育板。一式两份进行测量。数据表示为450nm处的平均OD值。(B，C)人和小鼠嵌合抗体的EC50值。
图12：重组小鼠嵌合抗体NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11在诊断有2型糖尿病(T2D)的患者的胰腺内识别病理性IAPP原纤维。用50nM的嵌合NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体在两种人T2D患者(1和2)的胰岛上检测IAPP原纤维(棕色i.o.，这里强烈的深至黑色染色)。人胰岛用抗胰岛素抗体染色(蓝色i.o.，这里强烈染色)并且进行复染以使细胞核可视化(淡蓝色i.o.，这里弱染色)。
具体实施方式
在2型糖尿病(T2D)中，遗传因素和环境因素导致胰岛素抗性的发展，其伴随在β细胞团块以及胰岛素和胰淀素(hIAPP)分泌的代偿性增加以维持正常的血糖水平。所得的高浓度的胰淀素有利于毒性人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)寡聚物的形成和hIAPP原纤维的沉积，其在超过90％的2型糖尿病患者中发现。hIAPP的沉积与产生胰岛素的β细胞的减少有关，并且还被提出在移植到具有1型糖尿病的个体内的胰岛中对β细胞的损失发挥作用。一些来自对于2型糖尿病具有高风险但没有疾病的健康或肥胖供体的人群的人源化抗体已经被识别并且通过如在国际申请WO2008/081008中详细描述且本文提供的Neurimmune的RTMTM技术在体外被表征，克隆和重组地生产。主要候选者在表达hIAPP的转基因小鼠内被证实并且被暴露于高脂肪饮食。疗效通过确定在胰腺内β细胞团块和hIAPP淀粉样蛋白负荷以及hIAPP的血浆水平，和葡萄糖代谢以及胰岛素分泌的功能性测试来评估。
2型糖尿病是糖尿病的最常见形式，占所有病例的约90％。这种疾病影响了全世界超过2亿人，其导致每年超过一百万人死于糖尿病。在瑞士有超过300,000个患者被感染。由于人口增长、衰老、城市化以及糖尿病和缺乏体力活动的日益盛行，糖尿病的流行在发达国家和发展中国家正在急剧增加。预测全球的2型糖尿病市场为250亿美元，到2016年达到350亿美元，其中在2009年和2016之间具有6.4％的复合年增长率。目前的治疗包括通过提高胰岛素敏感性或者刺激胰腺释放胰岛素而以不同的途径作用来降低血糖水平的饮食管理和药物干预。然而，没有可用的治疗方法可以抵消hIAPP的聚集以及胰腺β细胞的损失。用于2型糖尿病的新的治疗策略包括胰高血糖素肽-1(GLP-1)的类似物和二肽基肽酶4(DPP 4)的抑制剂，使内源性GLP-1失活的酶。这些策略基于GLP-1的强效促胰岛素作用和对提高β细胞增殖的作用。重要的是，增加的胰岛素释放也被耦合到增加的胰淀素释放。实验上，刺激的胰岛素分泌在动物模型中已显示出促进胰岛淀粉样变性的发展并且类似的影响在人类中是可预期的。除了本发明的IAPP结合分子的特定使用，另外提出的治疗方法因此可能是这些分子和上面指出的新型治疗的有吸引力的组合疗法。
I.定义
除非另有说明，否则如此处使用的术语给出了如在牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)，牛津大学出版社，1997年，2000年修订和2003年再版，ISBN 0198506732中提供的定义。
应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指所述实体中的一个或多个；例如，“一种抗体”被理解为表示一种或多种抗体。因此，术语“一个”(或“一种”)，“一种或多种(一个或多个)”，和“至少一种”在本文中可互换使用。
如果没有以其他方式具体指明，则术语“IAPP”可互换使用以具体地是指胰岛淀粉样多肽(IAPP)的天然单体、寡聚体、非纤维状和纤维状的形式。术语“IAPP”也用于通常识别IAPP的其他构象异构体，例如，IAPP的寡聚物和/或聚集体诸如IAPP原纤维。术语“IAPP”也用于统一指所有类型和形式的IAPP。术语proIAPP可互换使用以具体地是指胰岛淀粉样多肽(proIAPP)的前体肽的天然单体、寡聚体、纤维状和/或聚集的形式。在术语IAPP或proIAPP的前面添加的字母用于指出生物体的特定同源基因是源自例如针对人IAPP的hIAPP或针对鼠源的mIAPP。
用于人IAPP的37aa的氨基酸序列是：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(SEQ ID NO:1)，具有在半胱氨酸残基2和7之间的二硫键和酰胺化的C-末端。
IAPP由前激素原preproIAPP处理，一种在胰腺β细胞产生的89个氨基酸前体。用于人preproIAPP的蛋白质序列是：
MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL(SEQ ID NO：2)，该序列也可在相关的数据库中找到，例如，在UniProt数据库：UniProtID:P10997(IAPP_HUMAN)。
preproIAPP在翻译成前胰淀粉样多肽后被迅速裂解。对于人proIAPP的蛋白质序列是：
TPIESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL(SEQ ID NO：3)，其经历额外的蛋白水解作用以及翻译后修饰以产生hIAPP。
“野生型”或重组人IAPP、proIAPP和preproIAPP氨基酸序列根据SEQ ID NOs:1-3由上述序列表示。
本文中公开的人抗IAPP和抗proIAPP抗体特异性地结合IAPP和/或proIAPP以及其表位并且结合至IAPP和/或proIAPP以及其表位的多种结构。例如，本文中公开的是这样的抗体，其特异性结合病理上聚集的IAPP和/或proIAPP形式，如非纤维状寡聚物和/或纤维状寡聚物/原纤维和/或由其混合形式组成的聚集体。术语IAPP和/或proIAPP的(病理)聚集/聚集体可互换使用以具体地是指上述形式。如本文所用的术语(病理)“聚集形式”或“聚集体”描述了由于IAPP和/或proIAPP彼此间错误的/病理的相互作用引起的累积或簇形式的产物。这些聚集体、累积或簇形式可以基本上包括或由IAPP和/或proIAPP以及非纤维状寡聚物和/或纤维状寡聚物及其原纤维组成。如在本文中使用的，提及“特异性结合”、“选择性结合”或“优先结合”IAPP和/或proIAPP的抗体是指不与其他非相关蛋白质结合的抗体。在一个实例中，本文公开的IAPP和/或proIAPP抗体可以结合IAPP和/或proIAPP或其表位并且在对于其他蛋白质的约2倍背景值之上显示没有结合。“特异性结合”或“选择性结合”IAPP和/或proIAPP构象异构体的抗体是指这样的抗体，其不与IAPP和/或proIAPP的所有构象结合，即，不与至少一个其他IAPP和/或proIAPP构象异构体结合。例如，本文公开的是在体外和在组织内能优先与从具有公开的T2D或具有发展T2D风险的患者获得的IAPP和/或proIAPP的聚集形式结合的抗体。因为本发明的人IAPP和/或proIAPP抗体已经从健康人受试者的群体或从肥胖患者的群体及其他具有发展为T2D的提高风险的患者群体中分离，其在抗体分离时没有显示出T2D的迹象，呈现出IAPP和/或proIAPP特异性免疫应答，因此本发明的IAPP和/或proIAPP抗体也可被称作“人自身抗体”以便强调那些抗体确实通过该受试者被表达并且没有从例如人免疫球蛋白表达噬菌体文库分离，其至今代表了用于试图提供人样抗体的一种常见方法。
术语“肽”在其含义中理解为包括术语“多肽”和“蛋白质”(此时其可交换地使用)。类似地，蛋白质和多肽的片段也被考虑并且在本文中可以是指“肽”。尽管如此，术语“肽”优选表示氨基酸聚合物，其包括至少5个连续氨基酸，优选至少10个连续氨基酸，更优选至少15个连续氨基酸，还更优选至少20个连续氨基酸，并且特别优选至少25个连续氨基酸。另外，根据本发明的肽典型地具有不超过100个连续氨基酸，优选少于80个连续氨基酸以及更优选小于50个连续氨基酸。
多肽
如本文所使使用的，术语“多肽”旨在包括单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(又称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指任何链或两种或更多种氨基酸的链，并且不是指产物的特定长度。因此，用于指代一个链或两种或更多种氨基酸的链的“肽”、“二肽”、“三肽”、“低聚肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且代替任何这些术语，可以使用术语“多肽”或者可以与任何这些术语互换地使用术语“多肽”。
术语“多肽”也用于是指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化和衍生化，其通过已知的保护/阻断基团、蛋白水解裂解，或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可来源于天然的生物来源或通过重组技术来产生，但不一定由指定的核酸序列翻译。多肽可以以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明的多肽可以是约3个或更多，5个或更多，10个或更多，20个或更多，25个或更多，50个或更多，75或更多，100个或更多，200个或更多，500个或更多，1000个或更多，或2000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有限定的三维结构，虽然它们不必具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，但是不具有限定的三维结构的多肽可以采用大量的不同构象并且被称为未折叠的。如本文中所使用的，术语糖蛋白是指耦联到至少一个碳水化合物部分上的蛋白质，所述部分通过氨基酸残基(例如，丝氨酸残基或天门冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链附着于蛋白质。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在其天然环境内的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以从其天然或自然环境中除去。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是对本发明的目的而言的分离，因为是通过任何合适的技术分离的、分馏的或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽。
“重组肽、多肽或蛋白质”是指通过重组DNA技术产生(即，由细胞、微生物或哺乳动物产生)的肽、多肽或蛋白质，其通过编码包括期望的肽的融合蛋白的外源性重组DNA表达构建体转化。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽典型地不含聚糖。在酵母中表达的蛋白质或多肽可具有不同于在哺乳动物细胞中表达的糖基化模式。
包括作为本发明的多肽的是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及它们的任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有与天然肽的氨基酸序列足够相似(充分相似)的氨基酸序列的肽和多肽。术语“足够相似(充分相似)”是指相对于第二氨基酸序列含有足够或最小数目的相同的或等同的氨基酸残基的第一氨基酸序列，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包括这样的共同结构域的氨基酸序列在本文中被定义为足够相似的，即至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同的。优选地，变体将与本发明的优选肽的氨基酸序列足够相似，特别是与IAPP和/或proIAPP或它们中的任何一个的片段、变体、衍生物或类似物足够相似。这样的变体通常保留本发明的肽的功能活性。变体包括通过一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或置换分别与天然和重量的肽的氨基酸序列不同的肽。它们可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
此外，当提及本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”，“变体”，“衍生物”和“类似物”包括保留相应的天然结合分子、抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。除了本文所讨论的特定抗体片段之外，本发明的多肽的片段还包括蛋白水解片段，以及缺失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，以及具有由于氨基酸取代、缺失或插入改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或者是非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来生产。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。IAPP和/或proIAPP特异性结合分子(例如本发明的抗体和抗体多肽)的衍生物是这样的多肽，其已被改变从而显示出在天然多肽中未发现的附加功能。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可以被称为“多肽类似物”。如本文所使用的，结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有通过官能侧基的反应而化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。也包括作为“衍生物”的是那些含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
分子的相似性和/或同一性的确定：
两个肽之间的“相似性(相似度)”通过比较一个肽的氨基酸序列与第二种肽的序列来确定。如果它是相同的或保守的氨基酸取代，则一种肽的氨基酸相似于第二种肽的相应氨基酸。保守取代包括在Dayhoff、M.O.,ed.,Atlas of Protein Sequence andStructure 5,National Biomedical Research Foundation、Washington、D.C.(1978)(蛋白质序列和结构5的图集，国家生物医学研究基金会，华盛顿特区(1978))，和在Argos、EMBOJ.8(1989)、779-785中描述的那些。例如，属于下列基团之一的氨基酸代表保守改变或取代：-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；和-Asp、Glu。
两个多核苷酸之间的“相似性”通过比较一个多核苷酸的核酸序列与多核苷酸的序列来确定。一个多核苷酸的核酸相似于第二多核苷酸的相应核酸，如果其是相同的，或者如果核酸是编码序列的一部分，包含核酸的各自的三个一组(三元组)编码相同的氨基酸或保守的氨基酸取代。
两个序列之间的百分比同一性或相似性的确定优选地使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877的数学算法来实现。将这样的算法并入到可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)获得的Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中。
就特定长度和组成的序列而言，同一性百分比或相似性的确定使用BLASTn和BLASTp程序的标准参数来进行，如在NCBI网页和“BLAST程序选择指南”中所建议的。
使用BLASTn程序进行BLAST多核苷酸搜索。
对于一般的参数，“最大靶序列”框可以被设置为100，可以勾选“短查询”框，“期望阈值”框可以被设置为1000，并且“字大小”框可被设置为7，如针对NCBI网页上的短序列(小于20个碱基)所建议的。对于较长的序列，“期望阈值”框可被设定为10并且“字大小”框可以被设置为11。对于得分参数，“匹配/错配得分”可以被设置为1、-2并且“缺口成本(gapcost)”框可被设置为线性的。对于过滤和屏蔽参数，“低复杂性的区域”框可能不被勾选，“物种特异性重复”框可能不被勾选，“仅用于查找表的掩码”框可能被勾选，“DUST过滤设置”可以被勾选并且“掩码小写字母”框可能不被勾选。通常，在这方面可以使用“搜索短近精确匹配”，其提供了大部分的上述指示的设置。在这方面的进一步信息可在NCBI网页上公开的“BLAST程序选择指南”中找到。
利用BLASTp程序进行BLAST蛋白质搜索。对于一般的参数，“最大靶序列”框可以被设置为100，可以勾选“短查询”框，“期望阈值”框可被设定为10并且“字大小”框可被设置为“3”。对于得分参数，“矩阵”框可以设置为“BLOSUM62”，“缺口成本”框可以被设置为“存在：11扩展名：1”，“组成调整”框可以被设置为“有条件的组成得分矩阵调整”。对于过滤和屏蔽参数，“低复杂性区域”框可能不被勾选，“仅用于查找表的掩码”框可能不被勾选，并且“掩码小写字母”框可能不被勾选。
这两个程序的修改，例如，就搜索序列的长度，根据在NCBI网页上以HTML和PDF版本公开的“BLAST程序选择指南”进行。
多核苷酸：
术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸以及复数核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如，DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指已经从其天然环境中去除的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，编码包含在载体中的抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外的实例包括保持在溶液中的异源宿主细胞或纯化的(部分地或基本上)的多核苷酸中的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这些分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
如本文所使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子构成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但是它可以被认为是编码区的一部分，相反，任何侧翼序列，例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子等，不是编码区的一部分。本发明的两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如，存在于单个载体上，或者存在于分开的多核苷酸构建体中，例如，存在于单独的(不同的)的载体上。此外，任何载体可以包含单一的编码区，或者可以包括两个或更多个编码区，例如，单个载体可以分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸、或核酸可以编码异源编码区，其稠合至或未稠合至编码结合分子、抗体、或其片段、变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能性结构域。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括可操作性地与一个或更多个编码区相关联的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。一个可操作的关联是在用于基因产物例如多肽的编码区以这样的方式与一个或更多个调节序列相关联时使得在一个或多个调节序列的影响或控制下设置基因产物的表达。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调节序列指导基因产物的表达的能力或者不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作性相关联的”或“可操作性连接的”。因此，如果所述启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将是可操作性地与编码多肽的核酸相关联。该启动子可以是细胞特异性启动子，其用来指导DNA仅在预定细胞中的大量转录。除了启动子的其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、抑制子、和转录终止信号可以可操作性地与指导细胞特异性转录的多核苷酸相关联。本文公开了合适的启动子和其它转录控制区。
多种转录控制区对于本领域技术人员来说是已知的。它们包括，但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如，但不限于，来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(立即早期启动子，与内含子-A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)、和逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒)。其它的转录控制区那些包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-内球蛋白，以及能够控制在真核细胞中的基因表达的其它序列。额外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导的启动子(例如，可由干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
类似地，各种翻译控制元件对于本领域普通技术人员来说是已知的。它们包括，但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，和元件，其衍生自细小核糖核酸病毒，(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也被称为CITE序列)。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸为RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的附加编码区相关联，所述分泌或信号肽指示由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经启动越过粗面内质网的生长蛋白质链的输出，则其从成熟的蛋白质裂解。本领域的普通技术人员已知，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至多肽的N-末端的信号肽，所述N-末端从完整的或“全长”多肽裂解以产生分泌的或“成熟“形式的多肽。在某些实施方式中，使用了天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或保持引导多肽的分泌的能力的该序列的功能性衍生物可操作性地与其相关联。可替换地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列取代。
如在本发明的上下文中所使用的“结合分子”主要涉及抗体以及其片段，但也可以指结合至IAPP和/或proIAPP的其它非抗体分子，包括但不限于激素，受体，配体，主要组织相容性复合体(MHC)分子，分子伴侣诸如热休克蛋白(HSP)，以及细胞-细胞粘附分子如钙粘着蛋白、整合素、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为了清楚并且不限制本发明的范围，相对于抗体和代表用于治疗和诊断试剂的开发的优选结合分子的抗体样分子对大部分下面的实施方式进行了讨论。
抗体：
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白是IAPP和/或proIAPP结合分子，其至少包含重链的可变结构域，并且通常至少包含重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构被比较充分地了解；例如，参见Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版.1988)。
如将在下面更详细地讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可以在生物化学上区分的多肽的各种广泛的类。本领域技术人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，(γ、μ、α、δ、ε)，其中在它们之间具有一些亚类(例如，γ1-γ4)。这种链的性质是将所述抗体的“类”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1等被充分表征，并且已知赋予功能特化。这些类和同种型中的每一个的修饰形式是易于由本领域技术人员根据本公开内容来确定的，因此它们在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类在本发明的范围内是清楚的，下面的讨论将通常涉及IgG类免疫球蛋白分子。对于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量为约23,000道尔顿的两个相同的轻链多肽，以及分子量为53,000-70,000的两个相同的重链多肽。四个链通常由二硫键以“Y”结构来结合，其中使所述轻链括弧于“Y”型的嘴开始并通过可变区继续的重链。
轻链被分类为κ或λ(κ、λ)。每个重链类可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价结合，并且当通过杂交瘤、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生免疫球蛋白时，两个重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键而彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y形结构的叉形端部处的N末端延伸到每个链的底部的C末端。
轻链和重链都被分成结构和功能同源性的区域。根据功能来使用术语“恒定”和“可变”。在这方面，可以理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域确定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物特性，诸如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得与抗原结合位点或抗体的氨基末端更远而增加。N末端部分是可变区并且C末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上所指出的，可变区允许抗体选择性地识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，使抗体的互补性决定区(CDR)的VL结构域和VH结构域、或子集结合从而形成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成抗原结合位点，其存在于Y的每个臂的端部。更具体地，抗原结合位点由在每个VH和VL链上的三个CDR定义。含有足以特异性地结合至IAPP和/或proIAPP的结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文中可互换地被表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包含六个高变区，有时称为“互补决定区”或“CDR”，其存在于每个抗原结合结构域中，所述区是氨基酸的短的、非连续序列，其被特异性地定位以形成抗原-结合域，因为抗体在水性环境中呈现其三维结构。“CDR”由显示较少的分子间可变性的四个相对保守的“框架”或“FR”旁侧。框架区主要采取β-折叠(片，sheet)构象并且CDR形成环，其连接并且在某些情况下形成所述β-折叠结构的一部分。因此，框架区起作用以形成支架，所述支架被提供以用于通过链间的非共价相互作用而将CDR定位在正确的方向。由定位的CDR形成的抗原结合结构域限定了互补于免疫反应性抗原上的表位的表面。该互补的表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。分别包括CDR和框架区的氨基酸可以容易地由本领域的普通技术人员来确定以用于任何给定的重链或轻链可变区，因为它们已被精确定义；参见，"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat、E.,等人的U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196(1987),901-917，将其全部内容通过引用并入本文中。
在具有在本领域中使用和/或接受的术语的两个或更多个定义的情况下，除非明确相反指出，否则如这里所用的术语的定义旨在包括所有这样的含义。一个具体的实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区中发现的不连续抗原结合位点。该特定区域已经由Kabat等人，美国卫生和人类服务部，“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)(1983)和Chothia和Lesk等人，J.Mol.Biol.,196(1987),901-917描述，将其通过引用并入本文，其中，当相互进行比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，指代抗体或其变体的CDR的任一定义的应用旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。包括如由每个上述引用的参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基列于下面的表Ⅰ中作为比较。包含特定CDR的确切残基数将随着序列和CDR的大小而变化。本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含抗体的人IgG亚型的特定超变区或CDR，其给出抗体的可变区氨基酸序列。
表I:CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表I中的所有CDR定义的编号是根据由Kabat等人阐述的编号约定(参见下文)。
Kabat等人还定义了用于可应用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以将“Kabat编号”的这个系统明确地分配给任何可变域序列，而不依赖于超出所述序列本身的任何实验数据。如本文所用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人，美国卫生和人类服务部，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)(1983)阐述的编号系统。除非另有指明，否则提及本发明的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统，然而这是理论上的并且可以不等同地适用于本发明的每个抗体。例如，取决于第一CDR的位置，后面的CDR可以在任一方向移动。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体、或衍生物包括，但不限于，多克隆，单克隆，多特异性，人类，人源化，灵长类化，鼠源化或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VL或V H结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段，以及抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，抗-Id抗体到本文中公开的抗体)。scFv分子在本领域中是已知的并且描述在例如美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、和IgY)，类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
在一个实施方式中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别是，在本发明的具体应用中，特别是治疗用途，IgM比IgG和其他二价抗体或相应的结合分子是更少有用的，这是因为由于它们的五价结构和缺乏亲和力成熟的IgM经常表现出非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即，它基本上由一个特定抗体种类构成，而不是从血浆免疫球蛋白样品获得的混合物。
抗体片段(包括单链抗体)可以单独或与以下的全部或一部分组合包括一个或多个可变区：铰链区，CH1，CH2和CH3结构域。还包括在本发明中的是IAPP和/或proIAPP结合片段，其包括一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域的任何组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人，小鼠，驴，兔，山羊，豚鼠，骆驼，羊驼，马，或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区可以是海洋生物(condricthoid)起源的(例如，来自鲨鱼)。
在一个方面，本发明的抗体是从人分离的人单克隆抗体。可选地，使人抗体的框架区对齐，并且根据在数据库中的有关人种系可变区序列使用；参见，例如，MRC蛋白质工程中心(英国剑桥)(MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge,UK))主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，考虑到潜在的氨基酸与真正的种系序列偏离可能是由于在克隆过程中掺入的PCR引物序列。与来自噬菌体展示抗体文库或异种小鼠的人工生成的人样抗体如单链抗体片段(scFv)相比，本发明的人单克隆抗体的特征在于：(i)使用人体免疫应答而不是动物代替品获得，即该抗体已响应于在其相关的构象中的天然IAPP或proIAPP而在人体中产生，(ii)保护个体或者至少对于IAPP和/或proIAPP的存在是显著的，以及(iii)因为该抗体是人来源的，因此针对自身抗原的交叉反应性的风险被最小化。因此，按照本发明，术语“人单克隆抗体”，“人单克隆自身抗体”，“人抗体”等被用来表示作为人来源的IAPP和/或proIAPP结合分子，即它分离自人细胞，如B细胞或其杂交瘤，或者其cDNA已直接从人细胞例如人记忆B细胞的mRNA克隆。人抗体仍然是“人的”，即使在抗体中进行氨基酸取代，例如，以改善结合特征。
从人类免疫球蛋白文库或从转基因动物衍生的用于一个或更多个人类免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白的抗体(如在下文并且例如在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中所描述的)表示将它们与本发明的真正人类抗体进行区分的人样抗体。
例如，人样抗体诸如典型地分离自噬菌体展示的合成和半合成抗体的重链和轻链的配对不一定反映原始配对，因为它出现在原始人B细胞中。因此，由如在现有技术中常规使用的重组表达文库中获得的Fab和scFv片段可以被认为是人工的，其中具有对免疫原性和稳定性的所有可能的相关影响。
相反，本发明提供了来自选择的人类受试者的分离的亲和力成熟的抗体，其特征在于它们的治疗用途和它们在人体中的耐受性。
如本文所使用的，术语“啮齿动物化(rodentized)抗体”或“啮齿动物化免疫球蛋白”是指这样的抗体，其包含来自本发明的人抗体的一个或更多个CDR；包含基于啮齿动物抗体序列的氨基酸取代和/或缺失和/或插入的人构架区。当提到啮齿动物时，优选地，使用来源于小鼠和大鼠的序列，其中包含这样的序列的抗体分别被称为“小鼠化的(murinized)”或“大鼠化的(ratinized)”。提供CDR的人免疫球蛋白被称为“亲本”或“受体”并且提供框架变化的啮齿动物抗体被称为“供体”。不需要存在恒定区，但如果它们存在，则它们通常基本上相同于啮齿动物抗体的恒定区，即至少约85-90％，优选约95％或更多相同的(同一的)。因此，在一些实施方式中，全长小鼠化的人类重链或轻链免疫球蛋白包含小鼠恒定区，人CDR，和具有大量“小鼠化(murinizing)”氨基酸取代的基本上的人框架。通常，“小鼠化抗体”是包含小鼠化的可变轻链和/或小鼠化的可变重链的抗体。例如，小鼠化抗体不会包含典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。通过“鼠源化(murinization)”的过程已被“小鼠化的”的修饰抗体结合于与提供CDR的亲本抗体相同的抗原，并且与亲本抗体相比，在小鼠中通常免疫原性更低。关于该“小鼠化”抗体的上述说明类似地适用于“啮齿动物化”抗体，如“大鼠化抗体”，其中，代替小鼠，使用了大鼠序列。
如本文所使用的，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下中的至少一种：CH1结构域，铰链(例如，上，中，和/或下铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本发明中的结合多肽可以包括包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、以及CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、以及CH3结构域的多肽链，或者包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域、以及CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，用于本发明中的结合多肽可以至少缺少CH2结构域的一部分(例如，CH2结构域的全部或一部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解到，这些结构域(例如，重链部分)可被修饰，使得它们在来自天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列中变化。
在本文所公开的某些抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与多聚体的第二条多肽链上的那些相同。可替换地，本发明的含重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包含形成例如双特异性抗体或双抗体的不同靶结合位点。
在另一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段，变体，或衍生物由单个多肽链如scFv构成并且被细胞内(细胞内抗体)表达，用于潜在的体内治疗和诊断应用。
用于本文公开的诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包括衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用的，术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包括VL或CL结构域中的至少一种。
用于抗体的肽或多肽表位的最小尺寸被认为是约四到五个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少7个，更优选至少9个，并且最优选在至少约15个至约30个之间的氨基酸。由于CDR可以识别其三级形式的抗原性肽或多肽，因此包含表位的氨基酸不需要是连续的，并且在一些情况下，甚至可能不是在相同的肽链上。在本发明中，由本发明的抗体所识别的肽或多肽表位包含IAPP或proIAPP的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，更优选至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，或约15至约30个连续或不连续的氨基酸的序列。
“特异性地结合”或“特异性识别”，在本文中可互换使用，一般指的是结合分子(例如，抗体)通过其抗原结合结构域而结合至表位，并且该结合引起该抗原结合结构域和表位之间的一些互补。根据该定义，当其结合至表位时，抗体据说通过其抗原结合结构域以比其结合至随机的不相关的表位相比更容易的方式“特异性结合”至该表位。术语“特异性”在本文中用于限定通过其某抗体结合至某表位的相对亲和力。例如，抗体“A”可以被认为比抗体“B”具有对给定的表位更高的特异性，或者抗体“A”可以被说成是以比其对相关的表位“D”具有更高的特异性结合至表位“C”。
当存在时，术语抗体与抗原的“免疫结合特性”，或者其它结合特性(以其所有语法形式)是指抗体的特异性，亲和力，交叉反应性，以及其它结合特性。
“优先结合”是指与其结合至相关的、相似的、同源的或类似的表位相比，该结合分子例如抗体更容易地特异性结合至表位。因此，“优先结合”至给定的表位的抗体更可能结合至该表位而不是相关的表位，尽管这样的抗体可以与相关的表位交叉反应。
通过非限制性实例的方式，如果其以低于对于第二表位的抗体的KD的解离常数(KD)结合所述第一表位，则结合分子，例如抗体，可被认为是优先结合所述第一表位。在另一非限制性实例中，如果其以小于对于第二表位的抗体的KD的至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则抗体可被认为优先结合第一抗原。在另一非限制性实例，如果其以小于对于第二表位的抗体的KD的至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则抗体可被认为优先结合第一表位。
在另一个非限制性实例中，如果其以小于对于第二表位的抗体的k(off)的解离速率(k(off))结合第一表位，则结合分子，例如抗体，可被认为优先结合第一表位。在另一非限制性实例，如果其以小于对于第二表位的抗体的k(off)的至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则抗体可被认为优先结合第一表位。在另一非限制性实例，如果其以小于对于第二表位的抗体的k(off)的至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则抗体可被认为优先结合第一表位。
本文公开的结合分子，例如抗体或抗原结合片段，变体或衍生物可以被说成以小于或等于5x 10-2sec-1、10-2sec-1、5x l0-3sec-1或l0-3sec-1的解离速率(k(off))结合IAPP和/或proIAPP或其片段，变体或特定的构象。更优选地，本发明的抗体可以被说成是以小于或等于5x 10-4sec-1、10-4sec-1、5x 10-5sec-1、或10-5sec-15x 10-6sec-1、10-6sec-1、5x 10- 7sec-1或10-7sec-1的解离速率(k(off))结合IAPP和/或proIAPP或其片段，变体或特定构象。
本文所公开的结合分子，例如抗体或抗原结合片段，变体或衍生物可以被说成以大于或等于103M-1sec-1、5x 103M-1sec-1、104M-1sec-1或5x104M-1sec-1的吸收速率(吸附速率，on rate)(k(on))结合IAPP和/或proIAPP或其片段，变体或特定的构象。更优选地，本发明的抗体可以被说成以大于或等于105M-1sec-1、5x 105M-1sec-1、106M-1sec-1、或5x 106M-1sec-1或107M-1sec-1的吸收速率(吸附速率，on rate)(k(on))结合IAPP和/或proIAPP或其片段，变体或特定构象。
如果它优先结合该表位至其在一定程度上阻断参考抗体与表位结合的程度，则结合分子，例如，抗体被说成竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合。竞争性的抑制可以通过本领域已知的任何方法，例如，竞争性ELISA测定法来确定。抗体可以被说成竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，或至少50％。
如本文所用的，术语“亲和力”是指个别的表位与结合分子的CDR，例如，免疫球蛋白分子的结合强度的量度；例如，参见Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)，第27-28页。如本文所用的，术语“亲合力(avidity)”是指免疫球蛋白的群体和抗原之间的复合物的整体稳定性，也就是说，免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度；参见，例如，Harlow，第29-34页。亲合力与具有特定表位的群体中的单独的免疫球蛋白分子的亲和力，以及免疫球蛋白和抗原的价数相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复的表位结构如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力之一。抗体对于抗原的亲和力或亲合力)可以通过实验使用任何合适的方法；参见，例如，Berzofsky等人，"Antibody-Antigen Interactions"In FundamentalImmunology,Paul、W.E.，Ed.,Raven Press New York,N Y(1984)Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman和Company New York,N Y(1992)，以及本文所述的方法来确定。用于测量抗体对于抗原的亲和力的一般技术包括ELISA、RIA、和表面等离子体共振。如果在不同的条件，例如，盐浓度，pH下测量，则特定抗体-抗原相互作用的测量的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数例如KD、IC50的测量，优选利用抗体和抗原、以及标准化的缓冲液的标准化方案来进行。
本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物也可根据它们的交叉反应性来描述或指明。如本文所用的，术语“交叉反应性”是指特异于一种抗原的抗体与第二抗原反应的能力；两种不同的抗原性物质之间的相关性的量度。因此，如果它结合至不是诱导其形成的表位，则抗体是交叉反应性的。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，实际上可能比原始更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们使相关但不相同的表位，例如，具有至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，和至少50％的同一性(如使用本领域已知的和本文所描述的方法计算的)的表位结合至参考表位。如果它不使具有小于95％，小于90％，小于85％，小于80％，小于75％，小于70％，小于65％，小于60％，小于55％，和少于50％的同一性(如使用本领域中已知的和本文中所描述的方法计算的)的表位结合至参考表位，则抗体可被说成具有很少或没有交叉反应性。如果它不结合该表位的任何其它类似物，直向同源物，或同源物，则抗体可以被认为对于一定的表位是“高度特异性的”。
本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物，也可以根据其与IAPP和/或proIAPP的结合亲和力进行描述或指明。优选的结合亲和力包括具有小于5x 10- 2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10-4M、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10-10M、10-10M、5x 10-11M、10-11M、5x 10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x 10-14M、10-14M、5x 10-15M、或10-15M的解离常数或Kd的那些。
如先前所指出的，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维结构(构象)是公知的。如本文所用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的开始(大多数氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且是对于免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用的，术语“CH2结构域”包括重链分子的部分，其例如使用常规的编号方案从抗体的约残基244延伸至残基360(残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等人，同前)。CH2结构域的独特之处在于它不紧密地与另一结构域配对。相反，两个N-连接的分支的碳水化合物链在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入。也有据可查的是，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C末端，并且包含约108个残基。
如本文所用的，术语“铰链区”包括将CH1结构域结合至CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包含大约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中、和下铰链结构域；参见Roux等人，J.Immunol.161(1998)、4083-4090。
如本文所用的，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二硫醇基一起形成二硫键或桥的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两条重链通过两个二硫键在相应于239和242的位置连接，其中使用了Kabat编号系统(位置226或229，EU编号系统)。
如本文所使用的，术语“连接的”，“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指的是两个元件或部件以包括化学结合或重组手段的任何方式结合在一起。“框内融合”是指以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式使两个或更多个多核苷酸的开放阅读框(ORF)接合，以形成连续的更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或更多个区段(该区段通常本质上不接合)的单个蛋白。虽然阅读框因此在整个融合区段被制成连续的，但是这些区段可以通过例如框内连接序列被物理上或空间上分开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以被框内融合，但是由编码至少一个免疫球蛋白的框架区或附加CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR被作为连续多肽的一部分被共翻译。
如本文所用的术语“表达”是指这样的过程，通过该过程，基因产生一种生物化学物质，例如RNA或多肽。该过程包括细胞内的基因的功能性存在的任何表现，包括但不限于，基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，转移RNA(tRNA)，小发夹RNA(shRNA)，小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及将mRNA翻译成一种或多种多肽。如果最终希望的产物是生物化学物质，则表达包括产生(创建)该生物化学物质和任何前体。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用的，基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或由转录物翻译的多肽。本文所描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰，例如，多腺苷酸化的核酸，或具有翻译后修饰，例如，甲基化，糖基化，脂质的添加，与其他蛋白质亚基，蛋白水解裂解等关联的多肽。
如本文所使用的，术语“样品”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。在一个方面中，样品可以包括血液、腹膜液、CSF、唾液或尿液。在其它方面中，样品可以包括全血、血浆、血清、从血液样品富集的B细胞和培养的细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可以包括组织活检或组织样本，其包括神经组织。在还有的其它方面中，样品可以包括全细胞和/或该细胞的溶胞产物。血液样品可以通过本领域中已知的方法来收集。在一个方面中，颗粒(pellet)可以通过涡旋在4℃下重悬浮在200μl的缓冲液(20mMTris，pH 7.5，0.5％Nonidet，1mM EDTA，1mM PMSF，0.1M NaCl，IX西格玛蛋白酶抑制剂(Sigma ProteaseInhibitor)，和IX西格玛蛋白酶抑制剂1和2)中。该悬浮液可以在间歇涡旋的情况下保持在冰上20分钟。在约4℃下以15,000x g纺丝5分钟之后，上清液的等分试样可以存储在约-70℃。
疾病：
除非另有说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文可互换使用，并且包括受试者、动物、分离的器官、组织或细胞/细胞培养物中的任何不期望的生理变化。
在T2D中，遗传因素和环境因素导致胰岛素抗性的发展，其伴随β细胞团块(质量)和胰岛素和胰淀素(IAPP)的代偿性增加，以维持正常的血糖水平。所得的高浓度胰淀素有利于毒性hIAPP寡聚物的形成和hIAPP原纤维的沉积，其在多于90％的T2D患者中被发现。hIAPP的沉积与产生胰岛素的β细胞的减少相关，并且还提出了在移植入患有T1D的个体的胰岛中对于β细胞的损失起作用。本申请提供了来自健康供体或对于T2D具有高风险但没有疾病的肥胖供体的群体的多个人源化抗体，其如本文在下面更详细地描述的被克隆和重组生产。
然而，在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体，本发明的结合分子(其任何一种具有基本上相同的结合特异性)，多核苷酸，载体或细胞用于制备药物或诊断组合物，用于预防和治疗性治疗，监测来自糖尿病的组的疾病的治疗和/或诊断的进展或对治疗和/或诊断的反应，所述疾病的组包括1型糖尿病(T1D)，妊娠糖尿病，前驱糖尿病，成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA；1,5型糖尿病)和/或2型糖尿病(T2D)。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体，本发明的结合分子(其任何一种具有基本上相同的结合特异性)，多核苷酸，载体或细胞被用于制备药物或诊断组合物，用于预防性和治疗性治疗，监测一组病症的治疗和/或诊断的进展或对所述治疗和/或诊断的反应，所述病症通常由症状例如代谢变化表征，所述代谢变化先于T2D，引起T2D，和/或与T2D相关/关联或联系，包括引起对胰腺的损坏并且因此可能导致糖尿病的疾病，包括慢性胰腺炎，囊性纤维化，胰腺癌；增加T2D的风险的疾病，包括阿尔茨海默氏病，杭廷顿氏病；和/或与肥胖症和T2D相关或不相关的心血管疾病。在一个优选的实施方式中，通常表征上述疾病的症状包括干扰的胰岛素敏感性和在受试者中胰岛素和/或hIAPP的增加的分泌。
在一个实施方式中，病症的上述特定症状关联组包括妊娠糖尿病，前驱糖尿病(当高血血糖(high blood glycaemia)未达到T2D阈值或胰岛素抗性时)；通常作为发展糖尿病的风险因素或作为在糖尿病之前可能存在的病症的代谢综合征；通常作为发展糖尿病的风险因素或作为在糖尿病之前可能存在的病症的胰岛淀粉样变性；通常作为发展糖尿病的风险因素或作为在糖尿病之前可能存在的病症和/或伴随临床胰岛移植的β细胞衰竭的肥胖症。
此外，本发明的抗体，本发明的结合分子(其任何一种具有基本上相同的结合特异性)，多核苷酸，载体或细胞被用于制备组合物，其用于检测与健康受试者中的胰淀素分泌相比在以下中的胰淀素的增加或减少的分泌：1型糖尿病、与T2D形式相比成人的隐匿性自身免疫糖尿病(LADA，1,5型糖尿病)、或在先于公开的T2D的病症，如妊娠糖尿病或前驱糖尿病；造成损害胰腺并且因此可能导致糖尿病如慢性胰腺炎，囊性纤维化，胰腺癌的疾病；增加T2D的风险的疾病，诸如阿尔茨海默氏病，杭廷顿氏病；和/或与肥胖症和T2D相关或不相关的心血管疾病。
病症如肥胖症和胰岛素抗性/高胰岛素血症经常被作为T2D的倾向和/或作为其症状被观察到，其可以导致已在T2D的公开形式之前的胰岛淀粉样多肽(IAPP)的升高的循环水平。胰淀素(hIAPP)寡聚物，原纤维，和斑块已经发现不仅在胰腺和肾脏中累积而且还在具有肥胖症和胰岛素抗性的患者的心脏中累积。这种累积在改变的细胞Ca2+稳态的连接中被观察到，其又可以有助于这样的患者中的心功能不全。
因此，在一个实施方式中，本发明的抗体，本发明的结合分子(其任何一种具有基本上相同的结合特异性)，多核苷酸，载体或细胞用于制备药物或诊断组合物，用于预防性和治疗性治疗，改善，监测一组疾病的进展或对一组疾病的治疗和/或诊断的反应，所述疾病伴随T2D或由先于和/或导致T2D的代谢改变引起，即在前驱糖尿病状态中出现的代谢变化，其中该组疾病包括心脏疾病，中风，糖尿病性视网膜病，肾衰竭，肾功能衰竭，酮症酸中毒和非酮症高渗性昏迷。
超过20种神经变性疾病(参见，例如，M.Ristow,J.Mol.Med 82(2004),510–529中的第511页的表1)已知与糖尿病、增加的胰岛素抗性和肥胖症、紊乱的胰岛素敏感性、以及过度或受损的胰岛素分泌相关。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体，本发明的结合分子(其任何一种具有基本上相同的结合特异性)，多核苷酸，载体或细胞用于制备药物或诊断组合物，用于预防性和治疗性治疗，监测神经变性病症的进展或对治疗和/或诊断神经变性病症的反应，所述神经变性病症包括阿尔茨海默病(AD)，共济失调毛细血管扩张症(AT)，巴比二氏综合征(BBS)，弗里德赖希共济失调(FRDA)，亨廷顿病，肌强直性营养不良，发作性睡病，帕金森病，普-威综合征和沃纳综合征。
受损的葡萄糖耐量几乎不诱导并发症，其特征为糖尿病，但具有比正常型更高的糖尿病发作的风险，其可能是大血管疾病的起因。
“胰岛素抗性”是指对于胰岛素降低的敏感性的条件。胰岛素已知表现出更广泛的影响，例如，除了对糖代谢的影响外，还有对脂质代谢的影响或对血管和肾脏的影响。一旦对胰岛素的敏感性降低，则不仅可以引起葡萄糖代谢异常，而且还引起脂质代谢异常如三酸甘油脂过高症(hypertriglycemia)，降低的HDL血浆水平，或作为对血管或肾脏的胰岛素作用的异常的高血压。
如本文所用的，术语“糖尿病”在人体中通常和目前是指在口服葡萄糖耐量试验中，≧200mg/dL(≧11.1mmol/L)的随机血浆或血糖浓度或空腹血糖≧126mg/dL(≧7.0mmol/L)或2小时负荷后葡萄糖≧200mg/dL(≧11.1mmol/L)。此外或可替换地，术语“糖尿病”用于这样的受试者，其显示糖尿病的临床症状中的一种或多种，包括增加的口渴(烦渴)，尿频(多尿)，极度饥饿，不明原因的体重减轻，疲劳和视力模糊，对缓慢愈合疮和频繁感染的易感性，包括膀胱，阴道和牙龈和/或变黑皮肤区域(黑棘皮病)的那些。
如本文所用的，术语“非糖尿病”在人体中通常和目前是指在口服葡萄糖耐量试验中，<100mg/dL(5.6mmol/dL)的空腹血糖水平或2小时负荷后葡萄糖<140mg/dL(<7.8mmol/dL)。
如本文所用的，术语“前驱糖尿病”在人体中通常并且目前指的是在口服葡萄糖耐量试验期间，100-125mg/dL(5.6-6.9mmol/L)的空腹血糖水平或2小时负荷后葡萄糖140-199mg/L(7.8-11.1mmol/L)。除非另有说明，否则术语“前驱糖尿病”，“前驱(潜伏期，潜伏，prodromal)”和“症状前”在本文可互换使用，并且描述T2D的临床前阶段。
此外或可替换地，糖化血红蛋白(HbA1c)的水平可以用于诊断受试者中的糖尿病。在处于或超过6.5％阈值的升高的HbA1c水平，进行糖尿病的诊断，即，术语“糖尿病”通常且目前用于人体中，而从5.7％至6.4％点的水平表明发展糖尿病和心血管疾病的高风险并且是在人体中“前驱糖尿病”，或“前驱糖尿病/症状前”状态的标志。于是，在人体中术语“非糖尿病”通常且目前是指低于5.7％阈值的HbA1c水平。
在药物发现中II型糖尿病的啮齿动物模型
常规报道的自发发展II型糖尿病的模型动物的实例包括KK-A y小鼠(NishimuraM.,Exp.Anim.18,147–157,1969)，NSY小鼠(Ueda H.,等人.,Diabetologia 38,503–508,1995)，db/db小鼠(Hummel K.P.,等人.,Science153,1127–1128,1966)、ob/ob小鼠(Herberg L.&Kley H K,Horm.Metab.Res.7,410–5,1975)、和AKITA小鼠(Yoshioka M.,等人.,Diabetes 46,887–894,1997)。
在这些动物中，KK-Ay小鼠和NSY小鼠是具有肥胖症的模型，并且db/db小鼠和ob/ob小鼠是具有由于瘦素受体或瘦素生产中的异常引起的肥胖症的模型。另一方面，AKITA小鼠是用于由胰腺β细胞的异常引起的糖尿病的模型。
作为非肥胖Ⅱ型糖尿病模型动物，例如，模型小鼠迄今在日本专利申请号2004-65181中报道。这种小鼠呈现出异常的胰岛素分泌。
然而，本发明的抗体优选地在转基因动物中被测试和表征，例如，如表达hIAPP的啮齿动物如对胰腺β细胞中的人胰淀素转基因的大鼠(HIP大鼠)，如在Butler等人，Diabetes 53(2004),1509-1516以及Matveyenko和Butler,Diabetes 55(2006),2106–2114中所描述的。更优选地，使用了过表达人IAPP的2型糖尿病小鼠模型，如在Matveyenko和Butler(2006),ILAR J.47(3):225-233中所描述的，并且总结于其中的第228页的表2中。因为hIAPP过表达，因此这种动物模型有效地显示T2D-症状，如高血糖状态。通常，术语“高血糖症”或“高血糖状态”是指在不同的时间间隔取两个连续测量并且当与非转基因对照同窝相比时，显著升高的空腹血浆葡萄糖水平。在高血糖动物中测量的绝对值可能取决于使用的特定动物模型，例如，在h-IAPP(半合子)/ob/+小鼠中，≧～15-20mM的葡萄糖；在h-IAPP(纯合子)/FVB/N小鼠中≧～11mM葡萄糖。
用于研究糖尿病的方法包括与健康的非糖尿病动物相比，测量生理变化并且分析糖尿病的血液或血浆。这些测量包括，但不限于，生长动力学，身体质量指数(BMI)，瘦体质量指数(LMI)，食物和水的摄入量，性别差异，空腹和随机血糖，甘油三酯(TG)，脂蛋白，胆固醇，肝脏重量和肝脏脂质，肾的大小和功能，葡萄糖耐量试验(GTT)，胰岛素耐量试验(ITT)，血胰岛素浓度，胰岛细胞形态，高脂肪的饮食，和热量限制。
如本文所用的，术语“随机”和“非空腹”通常是指在白天或晚上期间的的任何时间，而不是从上次用餐的时间。
如本文所用的，术语“空腹”通常是指在至少12小时内没有热量摄入。
可以理解，这些定义是目前接受的从业人员根据美国糖尿病协会(AmericanDiabetes Association)(ADA)和德国糖尿病协会(German Diabetes Association)(GDA)通常遵照的准则。准则可能会随时间发生变化并且因地区或国家而变化并取决于本领域技术人员已知的提供指导的团体或机构(例如，ADA，世界卫生组织，NIDDK/NIH，CDC，GDA等)。当对诊断和治疗作出决定时，医师还可以利用临床经验，患者的既往病史，和/或其它信息。因此根据科学和医学的进步，这些定义随着时间的推移可能会发生变化。
治疗：
如本文所使用的，术语“处理(治疗)”或“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，如糖尿病的发展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，症状的减轻，疾病程度的减弱，疾病的稳定(即，不恶化)状态，疾病进展的延迟或减慢，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指与如果不接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的那些包括已经患有所述病症或障碍的那些以及易患所述病症或障碍的那些或者其中所述病症或障碍的表现形式被防止的那些。
如果没有另外说明，则术语“药物(drug)”，“药品(药剂，medicine)”或“药物(medicament)”在本文中可互换使用，并且应当包括但不限于所有的：(A)用于内部或外部使用的制品、药品和制剂，以及旨在用于诊断，治愈，缓解，治疗或预防人或其他动物的疾病的任何物质或物质的混合物；和(B)旨在影响人或其他动物的身体的结构或任何功能的制品，药品和制剂(除了食物)；以及(C)旨在用作在条目(A)和(B)中规定的任何制品的组分的制品。术语“药物”、“药品”或“药物”应当包括旨在用于人或其他动物中的制剂的完整配方，其包含一种或多种“药剂”，“化合物”，“物质”或“(化学)组合物”，如并且在一些其他情况下还包括其他药学上无活性的赋形剂作为填充剂，崩解剂，润滑剂，助流剂，粘合剂或在人或其他动物的身体内的预定目标位置，例如，在皮肤上，在胃或肠中确保“药物”，“药品”或“药物”的容易运输，崩解，解聚，溶出和生物可用性。术语“药剂”，“化合物”，或“物质”在本文可互换使用，并且在更具体的上下文中，应当包括，但不限于所有的药理学活性剂，即诱导期望的生物学或药理学效果或研究或测试用于通过本发明的方法诱导这样的可能的药理作用的能力的药剂。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人类患者，对他们来说，诊断，预后，预防或治疗是期望的。
药物载体：
药学上可接受的载体(carrier)和给药途径可以获自本领域技术人员已知的相应文献。本发明的药物组合物可以根据本领域中公知的方法来配制；例如参见Remington:费城科学大学的药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)(2000),ISBN0-683-306472,Robinson等人的疫苗协议(Vaccine Protocol)，第二版,Humana Press,Totowa,New Jersey,USA,2003；Banga,Therapeutic Peptides and Proteins(治疗性多肽和蛋白质):制剂、加工和递送系统(Formulation,Processing,and Delivery Systems).泰勒和弗朗西斯，第二版(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适的药物载体的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸缓冲盐溶液，水，乳剂，如油/水乳剂，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。包括这样的载体的组合物可以通过公知的传统方法来配制。这些药物组合物可以以合适的剂量给予受试者。合适的组合物的给药可以通过不同的方式来实现。实例包括通过口服，鼻内，直肠，局部，腹膜内，静脉内，肌内，皮下，真皮下，经皮，鞘内，颅内方法给予含有药用载体的组合物。气溶胶制剂例如鼻喷雾制剂包括具有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化的水溶液或其他溶液。这样的制剂优选调节至与鼻粘膜兼容的pH和等渗状态。用于口服给药的药物组合物，例如单域抗体分子(例如，“纳米抗体TM(nanobodiesTM)”)等也设想在本发明中。这样的口服制剂可以是片剂，胶囊，粉末，液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，如明胶或佐剂。用于直肠或阴道给药的制剂可呈现为具有合适的载体的栓剂；还参见O'Hagan等人，Nature Reviews,Drug Discovery 2(9)(2003),727-735。关于适合于各种类型的给药的制剂的进一步指导可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,MacePublishing Company,Philadelphia,PA,17th ed.(1985)和相应的更新中找到。对于用于药物递送的方法的简要回顾，参见Langer,Science 249(1990),1527-1533。
II.本发明的抗体
本发明通常涉及人抗IAPP抗体和其抗原结合片段，其优选地表明如对于在实施例中示出的抗体概述的免疫结合特性和/或生物学性质。根据本发明，对于IAPP和/或proIAPP特异性的人单克隆抗体是从健康人受试者的群体进行克隆的。
在根据本发明进行的实验的过程中，对人记忆B细胞培养物的条件培养基中的抗体进行并行筛选以与聚集的寡聚、纤维状的和/或非纤维状的IAPP和/或proIAPP蛋白质以及牛血清白蛋白(BSA)结合。只有对聚集IAPP和/或proIAPP蛋白而不是对BSA阳性的B细胞培养物经受抗体克隆。
由于该措施，可以分离到一些抗体。进一步地分析选择的抗体以用于类和轻链亚类测定。从记忆B细胞培养物中选择的相关的抗体信息，然后通过RT-PCR进行转录，克隆并结合到用于重组产品的表达载体中；参见所附的实施例。在HEK293或CHO细胞中人抗体的重组表达以及它们针对人IAPP和/或proIAPP蛋白质的结合特异性的随后表征(图3和4；实施例1)，以及它们与其病理聚集形式的独特结合(图5；实施例2)证实了人类抗体首次已经被克隆，其对于IAPP和/或proIAPP蛋白质是高度特异性的并且区别地识别IAPP和/或proIAPP蛋白质的病理聚集形式，如IAPP原纤维。第二轮实验证实了上述发现，如在图7-9和实施例4中所示出的。此外，根据本发明产生的并且包括本发明的人抗体的CDR结构域的小鼠嵌合抗体已经显示出作为人抗体与人IAPP同等的结合亲和力，如图11和12以及实施例6中所示出的。
因此，本发明通常涉及分离的天然存在的人单克隆抗胰岛淀粉样多肽(IAPP)抗体以及其结合片段、衍生物和变体。在本发明的一个实施方式中，抗体能够结合人IAPP和/或proIAPP。
在一个实施方式中，本发明涉及抗IAPP和/或抗proIAPP抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体特异性地结合于与参考抗体相同的IAPP的表位，所述参考抗体选自由以下组成的组：NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11、NI-203.8E3、NI-203.11B12、NI-203.205F8、NI-203.9B3、NI-203.19F2、和NI-203.15C7。表位作图鉴别在人IAPP内的序列(其包括aa 19-SSNNFGA-25(SEQ ID NO:4))作为由本发明的抗体NI-203.19H8识别的独特线性表位，鉴别在人IAPP内的包括aa2-CNTATCA-8(SEQ ID NO:5)的序列作为由本发明的抗体NI-203.26C11识别的独特线性表位，以及鉴别人IAPP内的包括aa 10-QRLANFLVHS-19(SEQ ID NO:71)的序列作为由本发明的抗体NI-203.15C7识别的独特线性表位(参见图5A和5B以及实施例3)。因此，在一个具体实施方式中，提供了本发明的抗体，其中抗体特异性结合包括氨基酸序列SSNNFGA(SEQ ID NO:4)、CNTATCA(SEQ ID NO:5)或QRLANFLVHS(SEQID NO:71)的IAPP表位。如在实施例3中详细描述的，重组IAPP抗体NI-203.9A2、NI-203.8E3和NI-203.19F2抗体的表位迄今为止不能被识别，这表明这些抗体可能与非线性表位结合。
此外，在一个实施方式中，本发明涉及抗IAPP和/或抗proIAPP抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体特异性地结合于与参考抗体相同的proIAPP的表位，所述参考抗体选自由以下组成的组：NI-203.1D10、NI-203.2A11、NI-203.10C4、NI-203.20H9、NI-203.26D2、NI-203.60H3和NI-203.26C11。
此外，不受最初的实验观察约束，如在实施例4中所描述的和图7中所示出的，本发明的人单克隆NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11和NI-203.8E3抗IAPP抗体的特征优选在于，特异性结合于病理IAPP聚集体(本实施例中原纤维)，并且基本上不识别胰腺中生理形式的IAPP。预期这同样适用于人单克隆NI-203.19F2和NI-203.15C7抗IAPP抗体。因此，本发明提供了一组具有结合特异性的人抗IAPP和/或抗proIAPP抗体，其因此对诊断和治疗目的特别有用。因此，在一个实施方式，本发明提供了这样的抗体，其能够特异性地结合IAPP和/或proIAPP的病理聚集形式(参见图5和图7-9，以及实施例2和4)。对于涉及本发明的结合特异性的更多细节和总结概述还参见图7和8以及以下描述。
在一个实施方式中，本发明的抗体显示出对示例性的NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11、NI-203.8E3、NI-203.19F2和NI-203.15C7抗体的结合特性，如实施例中所述的。此外，或可替换地，本发明的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体优选地识别病理聚集的抗IAPP和/或抗proIAPP(如IAPP原纤维)而不是生理性IAPP和/或proIAPP单体，特别是当根据实施例2至4进行分析时。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体基本上不识别生理性IAPP。术语“基本上不识别”当在本申请中用于描述包括抗体、其片段或针对特异性靶分子的结合分子、抗原和/或该靶分子和/或抗原的构象的组的分子的结合亲和力时是指上述组的分子以这样的结合亲和力结合所述分子、抗原和/或构象，所述结合亲和力比上述组的分子的解离常数(KD)小至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍，其用于结合另一个分子、抗原和/或构象。优选地，术语“基本上不识别”当被用于本申请时是指上述组的分子以这样的结合亲和力结合所述分子、抗原和/或构象，所述结合亲和力比上述组的所述分子的解离常数(KD)小至少10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或10000倍，其用于结合另一个分子、抗原和/或构象。此外，或可替换地，本发明的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体结合于由人抗IAPP和/或抗proIAPP的聚集形式引起的疾病，特别是在实施例4中描述的那些。在这种情况下，抗体结合特异性可以在如在图中4，相应的图5中针对示例性的NI-203.9A2、NI-203.19H8、NI-203.26C11和NI-203.8E3抗体所示的范围内，即具有约1pM至500nM的半数最大有效浓度(EC50)，优选地约10pM至100nM的EC50，针对人IAPP最优选地约100pM至50nM的EC50，如针对NI-203.19H8所示出的，或针对人IAPP约100pM至10nM的EC50，如针对NI-203.9A2,NI-203.26C11和NI-203.8E3所示出的。在这种情况下，如实施例4提供和图4(相应的图5)所示的实验结果还表明，另外或可替换地，本发明的一些抗IAPP抗体基本上不识别proIAPP，如针对示例性的抗体NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.8E3所示出的。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体基本上不识别proIAPP。
另外，或可替换地，本发明的抗IAPP抗体除了特异性结合至成熟的IAPP外还结合至IAPP的前体形式，即proIAPP，特别是如在实施例1中所描述的。这种情况下，结合特异性可以在如在图3中，相应的图4中针对示例性NI-203.26C11抗体所示出的范围内，即具有约1pM至500nM的半数最大有效浓度(EC50)，优选地约10pM至400nM的EC50，更优选地约100pM至400nM的EC50或约100pM至300nM的EC50，最优选地针对聚集的pro-IAPP约1nM至300nM的EC50，如针对NI-203.26C11所示出的。
另外，或可替换地，本发明的抗IAPP抗体特异性地结合至成熟的IAPP并且不结合于或基本上不结合于IAPP的前体形式，即proIAPP，特别是如在实施例1中所描述的。在这种情况下，抗体结合特异性可以在如针对示例性的NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.8E3抗体在图4中，相应的图5中所示出的范围内。
在一个实施方式中，本发明的抗体显示出对示例性的抗体NI-203.1D10、NI-203.2A11、NI-203.10C4、NI-203.20H9、NI-203.26D2和NI-203.60H3的结合特性，优选地结合proIAPP超过proIAPP。然而，proIAPP抗体已经通过筛选特异性结合于proIAPP的N-末端侧翼区的抗体而获得，所述N-末端侧翼区不存在于IAPP中，因为有一些证据表明在淀粉样形成和细胞死亡中是N-末端未处理的proIAPP的作用而不是全长proIAPP肽。因此，在一个实施方式中，本发明的抗proIAPP抗体，如示例性的抗体NI-203.1D10,NI-203.2A11,NI-203.10C4,NI-203.20H9,NI-203.26D2和NI-203.60H3基本上不结合或不结合IAPP。
一些纯化的抗体结合于各种各样的生物分子，例如，蛋白质。如本领域技术人员将理解的，术语特异性在本文中用来指明其他生物分子比IAPP和/或proIAPP蛋白质或其片段不显著地结合于抗原结合分子，例如，本发明的抗体之一。优选地，结合于除了IAPP和/或proIAPP的生物分子的水平导致结合亲和力，其最多分别仅为与IAPP和/或proIAPP的亲和力的20％或更少，10％或更少，仅5％或更少，仅2％或更少或仅1％或更少(即至少5、10、20、50或100倍或更低)；例如，参见实施例1和图3。此外，如通过试验证实的特异性结合于IAPP和/或proIAPP聚集体的本发明的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体表明本发明的抗体不识别在阿尔茨海默氏病人脑中的病理Aβ淀粉样蛋白，并且对于一些具有错误折叠/聚集倾向的蛋白质后选择仅具有最小的交叉反应结合特性，如在诊断有阿尔茨海默氏病的患者的石蜡包埋脑切片上利用示例性的抗体NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11以及通过直接ELISA实验所示出的；参见实施例5和图10。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体，其基本上不识别淀粉样β肽(Aβ1-42)。
在一个实施方式中，本发明的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体优选地优先结合于IAPP和/或proIAPP的聚集形式、IAPP和/或proIAPP原纤维和/或寡聚体；参见在实施例2中通过直接ELISA以及在诊断有T2D患者的胰腺中和在糖尿病猫的胰腺上通过在实施例4中描述的和分别在图7和9中所示的免疫组织化学染色的试验结果。在一实施方式中，本发明的抗体优先结合于IAPP和/或proIAPP的聚集形式，其中聚集体包括，基本上由或者由IAPP的纤维状形式和/或其纤维状寡聚体组成。在另一个实施方式中，本发明的抗体优先结合于IAPP和/或proIAPP的聚集形式，其中聚集体包括，基本上由或者由IAPP的非纤维状形式和/或其非纤维状寡聚体组成。在又一实施方式中，本发明的抗体优先结合于IAPP和/或proIAPP的聚集形式，其中聚集体包括，基本上由或者由IAPP和/或proIAPP的纤维状和非纤维状形式和/或IAPP和/或proIAPP的纤维状和非纤维状寡聚体组成。在再一具体实施方式中，本发明的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体优先结合于天然的IAPP和/或proIAPP和IAPP和/或proIAPP的病理聚集形式两者；参见如在实施例2和实施例3中举例说明的通过直接ELISA的试验结果。
如前所述，还可以发现包括IAPP和/或proIAPP的聚集体与在T2D患者的胰岛中的淀粉样沉积物有关。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体可以用于T2D的治疗中。
本发明还描述了抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体包括与选自由以下组成的组中的抗体的抗原结合结构域相同的抗原结合结构域：NI-203.9A2,NI-203.19H8,NI-203.26C11,NI-203.8E3,NI-203.11B12,NI-203.205F8,NI-203.9B3,NI-203.19F2,NI-203.15C7,NI-203.1D10,NI-203.2A11,NI-203.10C4,NI-203.20H9,NI-203.26D2和NI-203.60H3。
本发明进一步例证了几种这样的结合分子，例如，抗体及其结合片段，其特征可以在于：在它们的可变区，例如，结合结构域中包括包括图1或图2中描绘的任何一个氨基酸序列的VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)。在表II中相应的下面表III中阐述了编码上面确定的可变区的相应核苷酸序列。在图1和图2中描绘了VH和/或VL区的上述氨基酸序列的CDR的示例性组。然而，如下面所讨论的，本领域技术人员清楚知道这样的事实：另外或可替换地，可以使用CDR，其在CDR2和CDR3的情况下在它们的氨基酸序列方面与在图1相应的图2中阐述的那些相差一个、两个、三个或甚至更多个氨基酸。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其IAPP和/或proIAPP结合片段，在其可变区中包括如图1所示的至少一个互补决定区(CDR)和/或包括一个或多个氨基酸取代的其一个或多个CDR。
在一个实施方式中，本发明的抗体是包括如图1所示的VH和/或VL区的氨基酸序列或包括一个或多个氨基酸取代的其VH和/或VL区的抗体中的任何一种。优选地，本发明的抗体的特征在于：如存在于人B细胞中的重链和轻链的同源配对的保存。
可替换地，本发明的抗体是这样的抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有如图1所示的VH和/或VL区的抗体中的至少一种竞争结合于IAPP和/或proIAPP。
实施例4中提供的试验结果表明本发明的一些抗IAPP和/或抗proIAPP抗体相对于蛋白质的生理形式优先与由人抗IAPP和/或抗proIAPP的聚集形式引起的疾病结合。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体相对于生理性IAPP和/或proIAPP优先识别IAPP和/或proIAPP聚集体。此外，在一个实施方式中，相对于生理IAPP，本发明的抗体优先识别包括IAPP寡聚体和/或原纤维的IAPP聚集体。在另一实施方式中，相对于生理IAPP，本发明的抗体优先识别包括非纤维状IAPP和/或非纤维状IAPP寡聚体的IAPP聚集体。
如前面已经描述的，本发明的一些抗体已经表明能够结合IAPP和其前体形式proIAPP。此外，因为其结合proIAPP的能力，本发明的一些抗体已经从人患者中分离出来。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体能够结合proIAPP。
因此，可替换地或除上述之外，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其IAPP和/或proIAPP结合片段，在其可变区中包括如图2中所示的至少一个互补决定区(CDR)和/或包括一个或更多个氨基酸取代的其一个或更多个CDR。
在一个实施方式中，本发明的抗体是包含如图2所示的VH和/或VL区的氨基酸序列或包含一个或更多个氨基酸取代的VH和/或VL区的抗体中的任一种。优选地，本发明的抗体的特征在于：如存在于人B细胞中的重链和轻链的同源配对的保存。
可替换地，本发明的抗体是这样的抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有如图2所示的VH和/或VL区的抗体中的至少一种竞争结合于IAPP和/或proIAPP。
本发明的抗体可以是人，特别是用于治疗应用中。可替换地，本发明的抗体是啮齿动物、啮齿动物化或嵌合啮齿动物-人抗体，优选小鼠、小鼠化的或嵌合小鼠-人抗体或大鼠、大鼠化的或嵌合大鼠-人抗体，其对于动物中的诊断方法和研究是特别有用的。在一个实施方式中，本发明的抗体是嵌合啮齿动物-人或啮齿动物化抗体。
另外，在一个实施方式中，本发明的嵌合抗体显示了如在实施例中描述的示例性的NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11小鼠嵌合抗体的结合特性。此外，本发明的小鼠嵌合抗体以高亲和力结合于人IAPP原纤维，如实施例6中所描述的。优选地，嵌合抗体的结合亲和力与它们的人配对物相似。在这种情况下，结合特异性可以在如上针对分别具有18.6nM、23.9nM和11.5nM的EC50的示例性NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11小鼠嵌合抗体述所示出的范围内，如实施例6所述以及图11和其中的表C所示。在BSA上没有观察到结合。
在一个实施方式中，通过被培养的单个或单克隆B细胞的培养物和培养物的上清液(其包含由所述B细胞产生的抗体)来提供本发明的抗体，在其中筛选抗IAPP和/或proIAPP抗体的存在和亲和力。筛选方法(过程)包括筛选结合于天然单体的，纤维状的或非纤维状的聚集体如从由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的合成全长hIAPP肽衍生的hIAPP的寡聚体；和/或单独和独立地筛选结合于从由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列TPIESHQVEKRKCNTATCATQR的人proIAPP(N-末端片段)衍生的合成肽。
此外或可替换地，对于抗IAPP和/或proIAPP抗体的存在和亲和力的筛选过程可以包括以下步骤：如在国际申请WO2004/095031中描述的敏感组织淀粉样蛋白斑块免疫反应(TAPIR)测定的步骤，该申请的公开内容通过引入并入本文中，此处类似于在胰岛上针对淀粉样蛋白沉积物进行的。此外或可替换地，进行对胰腺切片的筛选以用于结合于抗IAPP和/或proIAPP，如类似于在国际申请WO2008/081008中针对脑和脊髓切片描述的。
如上所述，由于其在人免疫反应上的传代，本发明的人单克隆抗体将识别这样的表位，其是特定病理相关的并且在免疫过程的情况下分别对于例如小鼠单克隆抗体的传代和噬菌体展示文库的体外筛选可能是无法访问的或更少免疫原性的。因此，为谨慎起见，规定本发明的人抗IAPP和/或proIAPP抗体的表位是独特的，并且不存在能够结合于由本发明的人单克隆抗体识别的表位的其他抗体；还参见图5A并且其显示本发明的抗体NI-203.19H8，分别地抗体NI-203.26C11的独特表位。对于本发明的抗体的独特性的进一步指示是这样的事实：如实施例3中所描述的，本发明的抗体NI-203.9A2和NI-203.8E3结合IAPP聚集体的假定的构象表位，如上面所说明的，其是特定病理相关的并且也可能不是通过用于抗体产生的通常过程(例如免疫或体外文库筛检)获得的。
因此，在一个实施方式中，本发明通常还扩展到抗IAPP抗体和IAPP结合分子，其与本发明的人单克隆抗体竞争以特异性结合于IAPP。本发明更具体地涉及抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体特异性地结合于与参考抗体相同的IAPP的表位，所述参考抗体选自由NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11，NI-203.8E3，NI-203.19F2和NI-203.15C7组成的组。
此外，在一个实施方式中，本发明还通常扩展到抗IAPP和/或抗proIAPP抗体和IAPP和/或抗proIAPP结合分子，其与本发明的人单克隆抗体竞争以特异性结合于proIAPP。因此，本发明更具体地还涉及一种抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体特异性结合于与参考抗体相同的proIAPP的表位，所述参考抗体选自由NI-203.1D10，NI-203.2A11，NI-203.10C4，NI-203.20H9，NI-203.26D2，NI-203.60H3和NI-203.26C11组成的组。
另外，或可替换地，本发明通常还扩展到双特异性抗IAPP和/或抗proIAPP抗体和IAPP和/或抗proIAPP结合分子，其与本发明的人单克隆抗体竞争以特异性结合于IAPP和proIAPP。因此，本发明更具体地还涉及一种抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体特异性结合于与示例性的抗体NI-203.26C11相同的IAPP和proIAPP的表位。因此，考虑到上述情况，在一个实施方式中，本发明还涉及这样的抗体或抗原结合分子，其与本发明的抗体竞争以特异性结合IAPP和/或proIAPP。
抗体之间的竞争通过这样的测定法来确定，在该测定法中，试验下的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合，如IAPP和/或proIAPP。许多类型的竞争性结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定；参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9(1983)；固相直接生物素-亲和素EIA；参见Kirkland等人，J.Immunol.137(1986),3614-3619和Cheung等人，Virology 176(1990)，546-552。固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定；参见Harlow和Lane，抗体，实验手册，冷泉港出版社(1988)(Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press(1988))；采用I125标记的固相直接标记RIA；参见Morel等人，Molec.Immunol.25(1988)，7-15和Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32(1990)，77-82。典型地，这样的测定法涉及使用纯化的IAPP和/或proIAPP或聚集体，如其寡聚体和/或原纤维物，其结合至具有它们中的任一种的固体表面或细胞上，未标记的试验免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白，即本发明的人单克隆抗体。竞争抑制是在测试免疫球蛋白存在的情况下通过测定结合至固体表面或细胞的标记物的量来测量的。通常，测试免疫球蛋白是过量存在的。优选地，在如在所附的实施例针对ELISA测定法所描述的条件下进行竞争结合测定。通过竞争测定识别的抗体(竞争抗体)包括结合于与参考抗体相同的表位的抗体以及结合于足够接近由参考抗体结合的表位的相邻表位(用于发生空间位阻)的抗体。通常，当竞争抗体过量存在时，其将抑制参考抗体与共同抗原的至少50％或75％的特定结合。因此，本发明进一步描述了这样的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体竞争性地抑制选自由NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11，NI-203.8E3，NI-203.19F2和NI-203.15C7组成的组中的参考抗体结合于IAPP。
另外，本发明进一步描述了这样的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体竞争性地抑制选自由NI-203.1D10，NI-203.2A11，NI-203.10C4，NI-203.20H9，NI-203.26D2，NI-203.60H3和NI-203.26C11组成的组中的参考抗体结合于proIAPP。
而且，此外或可替换地，本发明进一步描述了这样的双特异性抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体竞争性抑制参考抗体如示例性的抗体NI-203.26C11结合于IAPP或proIAPP。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由所述免疫球蛋白重链可变区组成、或由所述免疫球蛋白重链可变区组成，其中重链可变区的VH-CDR中的至少一个或重链可变区的VH-CDR中的至少两个是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列。可替换地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文中公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。因此，根据本实施方式，本发明的重链可变区具有与分别在图1或在图2中所示的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。虽然图1和2示出了由Kabat系统定义的VH-CDR，但是其他CDR的定义，例如，由Chothia系统定义的VH-CDR，也包括在本发明中，并且可以通过本领域普通技术人员使用图1和图2中呈现的数据而容易地识别。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由所述免疫球蛋白重链可变区组成、或由所述免疫球蛋白重链可变区组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与分别在图1或图2中所示的所述VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3基团(组)相同的多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由所述免疫球蛋白重链可变区组成、或由所述免疫球蛋白重链可变区组成，其中所述VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区具有与分别在图1或图2中所示的所述VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，不同之处在于，在任何一个VH-CDR中具有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由所述免疫球蛋白轻链可变区组成、或由所述免疫球蛋白轻链可变区组成，其中轻链可变区的VL-CDR中的至少一个或轻链可变区的VL-CDR中的至少两个是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文中公开的抗体的参考轻链VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列。可替换地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文中公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区具有与分别在图1或在图2中所示的组相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。虽然图1和2示出了由Kabat系统定义的VH-CDR，但是其他CDR的定义，例如，由Chothia系统定义的VH-CDR，也包括在本发明中。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由所述免疫球蛋白轻链可变区组成、或由所述免疫球蛋白轻链可变区组成，其中所述VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有多肽序列，其与分别在图1或图2中所示的所述VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3基团相同。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白重链可变区(VL)、基本上由所述免疫球蛋白重链可变区组成、或由所述免疫球蛋白重链可变区组成，其中VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有多肽序列，其其分别在图1或图2所示的所述VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3基团相同，不同之处在于，在任何一个VL-CDR中具有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
免疫球蛋白或其编码的cDNA可被进一步修饰。因此，在另外的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤中的任一个：产生嵌合抗体、小鼠化抗体，单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或这些中的任一个的类似物。相应的方法对于本领域技术人员来说是已知的并且描述在，例如，在Harlow和Lane“Antibodies,A Laboratory Manual”，CSH出版社，Cold Spring Harbor(1988)。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得时，如在BIAcore系统中使用的表面等离子体共振可用于增加结合于与本文描述的抗体中的任一个相同的表位的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。嵌合抗体的生产描述在例如国际申请WO89/09622中。用于生产人源抗体的方法描述在例如欧洲申请EP-A1 0239400和国际申请WO90/07861中。根据本发明待使用的抗体的其他来源是所谓的异种抗体。用于生产异种抗体(例如小鼠中的人样抗体)的一般原理描述在，例如，国际申请WO91/10741，WO94/02602，WO96/34096和WO 96/33735中。如上面所讨论的，本发明的抗体可以以除了完整抗体以外的多种抗体形式存在；包括，例如Fv、Fab和F(ab)2，以及以单链存在；参见例如国际申请WO88/09344。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体，其选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段组成的组。
本发明的抗体或其相应的一个或过个免疫球蛋白链可以使用本领域中已知的常规技术来进一步修饰，例如，通过使用氨基酸的一个或多个缺失、一个或多个插入、一个或多个取代、一个或多个添加，和/或一个或多个重组和/或单独或组合的本领域已知的任何一种或多种其它修饰。用于在位于免疫球蛋白链的氨基酸序列之下的DNA序列中引入这样的修饰的方法对于本领域技术人员来说是公知的；参见，例如，Sambrook，MolecularCloning A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，Cold Spring Harbor实验室(1989)N.Y和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，格林出版协会和威利跨学科(Green Publishing Associates and Wiley Interscience)，纽约(1994)。本发明的抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸上的化学和/或酶衍生，包括侧链修饰，主链修饰以及包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和碳水化合物的附属物或脂质部分、辅因子等的N-末端和C-末端修饰。同样地，本发明包括嵌合蛋白质的产生，所述嵌合蛋白质包含所描述的抗体或其某些片段，其在氨基末端融合至异源分子，如在羧基末端的免疫刺激配体；对于相应的技术细节，参见，例如国际申请WO00/30680。
此外，本发明涵盖这样的肽，所述肽包括含有上述的结合分子，例如含有所述抗体中的任一种的可变区的CDR3区，特别是重链的CDR3的那些，因为经常观察到重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度的可变性并且在抗原-抗体反应中占优势参与的区域。根据本发明，这样的肽可以容易地由重组方法合成或产生以产生有用的结合剂。这样的方法对于本领域的普通技术人员来说是公知的。例如，肽可以使用商业上可获得的自动肽合成器来合成。该肽也可以通过重组技术通过以下来生产：将表达该肽的DNA并入到表达载体中并且用表达载体转化细胞以产生所述肽。
因此，本发明涉及任何结合分子，例如，抗体或其结合片段，其针对本发明的人抗IAPP和/或抗proIAPP抗体，并显示出所述特性，即其特异性识别IAPP和/或proIAPP。如本文所述，这些抗体和结合分子的结合特异性和亲和力可以通过ELISA和免疫组织化进行测试，参见，例如实施例。抗体和结合分子的这些特性也可通过蛋白质印迹(Western Blot)进行测试。根据本发明进行的随后实验的初步结果显示，在ELISA测试中，本发明的人抗IAPP和/或抗proIAPP抗体，特别是抗体NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3能够差异性地结合于IAPP-原纤维。此外，本发明的203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体已被证明优先结合于人体中的病状(pathologies)，例如在胰岛中对应于病理性IAPP原纤维的较大的淀粉样蛋白沉积物，如通过ThioS和刚果红染色可视化的(参见图7A)。期望相同特性适用于抗体NI-203.19F2和NI-203.15C7。
人抗体NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11在淀粉样蛋白阳性的部分上显示出突出的胰岛染色，但是在来自缺乏淀粉样蛋白沉积物的T2D患者和来自未被诊断有T2D的对照患者的胰岛上没有显示出任何染色(参见实施例4和图7)。本发明的抗体也在显示出胰岛淀粉样蛋白沉积物的糖尿病猫胰腺上给出了阳性结果；参见图9。除本文所示的生化实验(参见实施例2和图5)外，在人类和动物组织内针对IAPP和/或proIAPP的病理形式的结合特异性强调了本发明的抗体在治疗和诊断与胰腺内聚集的IAPP和/或proIAPP发生相关的疾病中的可用性。
作为用于直接从B细胞或B记忆细胞的培养物中获得免疫球蛋白的备选方案，细胞可以被用作重排重链和轻链位点的来源以用于后续的表达和/或遗传操作。重排抗体基因可由适当的mRNA进行反转录以产生cDNA。如果需要的话，重链恒定区可以用不同的同种型交换或被完全消除。可以连接可变区以编码单链Fv区。可以连接多个Fv区从而对多于一个的目标赋予结合能力，或者可以使用嵌合重链和轻链的组合。一旦遗传物质是可用的，保留它们的结合所期望的目标的能力的如上所述的类似物的设计是简单的。用于克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并且描述在，例如，Gilliland等人，Tissue Antigens47(1996)，1-20；Doenecke等人，Leukemia 11(1997)，1787-1792中。
一旦获得适当的遗传材料，并且，如果需要，修饰以编码类似物，则编码序列，包括在最低限度上编码重链和轻链的可变区的那些，可被插入到包含在载体上的表达系统中，所述载体可以被转染到标准的重组宿主细胞中。可以使用各种这样的宿主细胞；然而，为了高效处理，哺乳动物细胞是优选的。可用于该目的典型的哺乳动物细胞系包括，但不限于，CHO细胞、HEK293细胞或NSO细胞。
抗体或类似物的生产于是通过在适合于宿主细胞的生长和编码序列的表达的培养条件下培养经修饰的重组宿主来进行。然后通过从培养物中分离它们来回收抗体。表达系统优选地被设计成包括信号肽，使得产生的抗体被分泌到培养基中；然而，细胞内的生产也是可能的。
根据上述，本发明还涉及这样的多核苷酸，其编码本发明的抗体或等效结合分子，在抗体的情况下，优选地，上述抗体的免疫球蛋白链的至少一个可变区。典型地，由多核苷酸编码的所述可变区包含所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
本领域技术人员将容易理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可以用于其它多肽或所需特异性和生物功能的抗体的结构。因此，本发明还涵盖多肽和抗体(其包括上述可变结构域的至少一个CDR)，并且其有利地具有与如在所附的实施例中描述的抗体基本上相同或相似的结合特性。本领域技术人员已知，通过在CDR内或高变环内进行氨基酸取代可以增强结合亲和力(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(1987)，901-917)，其与CDR部分重叠，如Kabat所述；例如，参见Riechmann等人，Nature332(1988)，323-327。因此，本发明还涉及这样的抗体，其中所述CDR中的一个或多个包括一个或多个，优选为不超过2个氨基酸取代。优选地，本发明的抗体在其一个或两个免疫球蛋白链中包括可变区的两个或全部三个CDR，如在图1或分别在图2中所示出的。
本发明的结合分子，例如抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，如本领域的普通技术人员已知的，可以包括介导一种或更多种效应功能的恒定区。例如，补体的C1成分与抗体恒定区的结合可以激活补体系统。补体的活化在细胞病原的调理和裂解中是重要的。补体的活化还刺激炎症反应，并且也可以参与到自身免疫超敏中。此外，在各种细胞上抗体通过Fc区结合于受体，其中在结合于细胞上的Fc受体(FcR)的抗体Fc区上具有Fc受体结合位点。存在许多Fc受体，其对于不同类的抗体是特异性的，包括IgG(γ-受体)，IgE(ε受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)。在细胞表面上抗体与Fc受体的结合引发了许多重要和多样的生物反应，包括抗体包被的颗粒的吞噬和杀伤，免疫复合物的清除，通过杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
因此，本发明的某些实施方式包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中，一个或多个恒定区结构域的至少一部分已被删除(缺失)或以其他方式改变，以提供所需的生化特性，诸如，降低的效应子功能、非共价地二聚化的能力、定位于IAPP和/或proIAPP聚集和沉积的部位处的增加的能力、以及减少的血清半衰期或当与整体的大致相同的免疫原性的不变抗体相比增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法中的某些抗体是域删除抗体(域缺失抗体，domain deleted antibody)，其包括类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但其缺少一个或多个重链域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将被删除(缺失)，例如，CH2结构域的全部或部分将被删除(缺失)。在其他实施方式中，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体具有恒定区，例如，IgG重链恒定区，其被改变以消除糖基化，在本文其它地方被称为无糖基化或“阿格利河(agly)”抗体。这样的“阿格利河”抗体可通过酶促以及通过工程化恒定区中的一个或多个共识糖基化位点而被制备。虽然不被理论所束缚，但据信“阿格利河(agly)”抗体可具有改进的安全性和体内稳定性曲线。生产具有所需效应子功能的无糖基化抗体的方法被发现在例如国际申请WO2005/018572中，其整体通过引用并入本文。
在这里描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以使用本领域中已知的技术被突变，以降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它手段)可减少循环经修饰的抗体的Fc受体结合，从而增加IAPP和/或proIAPP定位。在其他情况下，它可以是恒定区修饰，与本发明温和补体结合一致，从而降低了血清半衰期和共轭细胞毒素的非特异性关联。还可以使用恒定区的其它修饰来改变二硫键或寡糖部分，其由于增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。所得的生理信息、生物利用度和该修改(修饰)的其它生化效果(诸如IAPP和/或proIAPP定位)、生物分布和血清半衰期，可以容易地使用公知的免疫学技术被测量并定量，而无需过度实验。
在这里描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以针对可替换的蛋白序列而被突变或交换以增加抗体的细胞摄取，举例方式，通过增强抗体的受体介导的内吞，其经由Fcγ受体、LRP或Thy1受体或通过‘SuperAntibody技术’，这是说，使抗体可以穿梭进入活细胞而不伤害它们(Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241)。例如，可以使用本领域已知的技术来工程化该抗体结合区的融合蛋白的产生和细胞表面受体或双-或多特异性抗体的同源蛋白质配体，具有滞留于IAPP和/或proIAPP以及细胞表面受体的特定序列。
在这里描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以针对可替换的蛋白质序列而被突变或交换，或抗体可以被化学修饰，以增加其血脑屏障渗透。
可以使用本领域已知的技术，由整个前体或亲本抗体来制备本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式。示例性的技术在本文中更详细讨论。可以使用本领域已知的技术来制备或制造本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些实施方式中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即，使用重组DNA技术产生的。用于制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其他地方更详细地讨论。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括被修饰的衍生物，例如，通过任何类型的分子与抗体的共价连接，使得共价连接不阻止抗体特异性地结合至其同源表位。例如，但非限制性地，所述抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的联接，等等。可通过已知的技术来实现多种化学修饰中的任何一种，包括但不限于，特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，该衍生物可含有一种或多种非经典的氨基酸。
在特别优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在待治疗的动物(例如，在人体)内不会引起有害的免疫应答。在某些实施方式中，本发明的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)来自患者(例如人患者)，并随后被用于从他们所源自的相同物种，例如，人，缓解或最小化有害的免疫反应的发生。
去免疫也可用于降低抗体的免疫原性。如本文所用的，术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位，参见，例如，国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如，对来自起始抗体序列的VH和VL进行分析，并且来自每个V区的人T细胞表位“地图”示出了与互补性决定区(CDR)相关的表位位置以及序列中的其他关键残基。对来自T细胞表位地图的各个T细胞表位进行分析，以便确定可替换的氨基酸取代，其中改变最终抗体的活性的风险很低。可替换的VH和VL序列的范围被设计成包括氨基酸取代的组合，并且这些序列随后被并入到结合多肽的范围内，例如，IAPP和/或proIAPP特异性抗体或其免疫特异性片段，以便用在本文公开的诊断和治疗方法中，然后测试其功能。典型地，产生并测试12至24个变体抗体。包含经修饰的V和人C区的完整重链和轻链的基因然后被克隆到表达载体及导入到细胞系中的随后质粒中，用于生产完整抗体。所述抗体于是在适当的生物化学和生物学测定中进行比较，并且识别最佳变体。
可使用本领域中已知的各种技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体、和噬菌体展示技术，或它们的组合。例如，可以使用杂交瘤技术来生产单克隆抗体，包括本领域中已知的，以及如下教导的那些技术，例如，Harlow et等人的Antibodies:A LaboratoryManual、Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)；Hammerling等人的Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier,N.Y.,563-681(1981)，所述参考文献通过引入结合于此。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指从单个克隆衍生的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是由其所产生的方法而来。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。在某些实施方式中，本发明的抗体来自于人B细胞，其已利用Epstein-Barr病毒通过转化而被永生化，如本文所描述的。
在公知的杂交瘤方法(Kohler等人，Nature 256(1975)，495)中，来自哺乳动物的相对短寿命或必死的淋巴细胞(例如，从人受试者衍生的B细胞，如本文所述)与永生肿瘤细胞系融合(例如，骨髓瘤细胞系)，由此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其均为永生的且能够产生B细胞的遗传编码的抗体。所得的杂合体通过选择、稀释和再生长被分成单个基因的菌株，其中每一菌株包括特定基因，用于单个抗体的形成。它们产生这样的抗体，其针对所需的抗原是均匀的，并且参考其纯的遗传血统，被称为“单克隆”。
由此制备的杂交瘤细胞被接种并在合适的培养基中生长，该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。本领域技术人员将理解，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可从许多来源商业获得，并且标准化协议被很好地确立。一般地，杂交瘤细胞正在其中生长的培养基被测定，用于产生抗所期望抗原的单克隆抗体。由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性通过体外测定(如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，如本文所述)来测定。在杂交瘤细胞被鉴定为生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体之后，可通过限定稀释流程而对该克隆进行亚克隆过程，并通过标准方法生长；参见例如，Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,Academic Press,pp.59-103(1986)。还应该理解的是，可以通过常规纯化方法，诸如，例如，蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，使由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。
在另一个实施方式中，淋巴细胞可通过显微操作和分离的可变基因进行选择。例如，外周血单核细胞可以与免疫的或天然免疫哺乳动物(例如，人)隔离，并且被体外培养约7天。筛选培养物的符合筛选标准的特定的IgG。来自阳性孔中的细胞可以被分离。各个产生Ig的B细胞可以通过FACS或通过在补体介导的溶血斑测定法中识别它们而被分离。产生Ig的B细胞可以被微操纵(micromanipulated)到管中，并且VH和VL基因可使用例如RT-PCR进行扩增。VH和VL基因可克隆到抗体表达载体中，并转染到细胞(例如，真核或原核细胞)中以用于表达。
可替代地，产生抗体的细胞系可使用本领域技术人员公知的技术进行选择并培养。这样的技术描述在各种实验室手册和主要出版物中。在这方面，适合于在如下所述的本发明中使用的技术被描述在Current Protocols in Immunology,Coligan等人，Eds.,Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons,NewYork(1991),其整体内容通过引用结合于此，包括补充。
可以通过已知的技术来产生识别特定表位的抗体片段。例如，Fab和F(ab')2片段可以被重组地产生，或通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生，使用酶，诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。这样的片段足以用于例如免疫诊断程序中，所述程序涉及结合免疫球蛋白的免疫特异性部分以检测试剂(例如放射性同位素)。
如本文中所描述的人抗体针对在人类患者中治疗的应用是特别理想的。本发明的人抗体分离自例如健康人受试者，因为他们的超重或肥胖可能被怀疑有发展代谢紊乱(例如，T2D)的风险，或具有病症的患者，但其具有不同寻常的稳定病程或异常温和形式的疾病。然而，被怀疑有发展代谢紊乱(例如，T2D)风险的健康人受试者(诸如本文描述的抗体可以分离自该健康人受试者)也可能基于其他风险的存在而被选择，该其他风险已知能够增加人发展代谢紊乱(例如，T2D)的可能性。所述风险可以从对人的检查推断，该检查针对与代谢紊乱(例如，T2D)发展相关的风险因素，诸如，年龄45岁或以上、超重或肥胖；患有糖尿病的近亲亲属；家庭背景是非洲裔、西班牙裔、印第安人、亚裔美国人、西班牙/拉丁美洲、太平洋岛民美国、亚洲或阿拉伯语；妊娠糖尿的病史；分娩体重超过4.5kg的至少一个婴儿；140/90或更高的血压；高于正常的胆固醇水平，其中例如，高密度脂蛋白(HDL)的水平低于40mg/dL(相当于低于1mmol/L)，或甘油三酯水平高于200-499mg/dL(相当于上述2.3-5.6mmol/L)；久坐的生活方式；多囊卵巢综合征(PCOS)的诊断；5.7～6.4％的以往测试前驱糖尿病的诊断-A1C(也称为HbA1c或糖化血红蛋白)水平、受损的空腹血糖(IFG)或受损的糖耐量(IGT)；与胰岛素抗性有关的其他临床病症，如黑棘皮病的诊断；心血管疾病史。
一旦人的肥胖症或超重被用作人发展代谢性疾病(例如，T2D)的指示，尽管谨慎的是，预期相比于被诊断为具有较少风险的受试者，那些肥胖健康和无症状受试者分别地更经常会发展保护性抗-IAPP和/或抗proIAPP抗体，例如，因为它们不被分类为肥胖但为超重，或者甚至被分类为正常体重的人，属于后两种分类的受试者也可用于获得本发明的人抗体的来源。
基于所述受试者的身高和体重的测量和所述受试者的身体质量指数的计算，受试者可以被分类为具有正常体重、超重或肥胖，身体质量指数如下计算：BMI＝体重[kg]/(高度[m])2。根据该结果，基于当前世界卫生组织标准，受试者被分类为具有正常体重(BMI18.5-24.9kg/m2)、超重(25.0-29.9kg/m2)，或肥胖(≥30kg/m2)，(世界卫生组织(2000)“肥胖：预防和控制全球疫情。WHO商讨会报告“World Health Organ Tech Rep Ser894:1.253”(World Health Organization(2000)"Obesity:preventing and managing the globalepidemic.Report of a WHO consultation."World Health Organ Tech Rep Ser 894:1.253)。可替代地或另外地，受试者的腰围(WC)可以被测量，并基于性别特异性的截断来使用，以限定WC为正常情况(<94cm[<34.6英寸](男性)和<80cm[31.5英寸](女性)，中度增加(94-102cm[34.6-40英寸](男性)和80-88cm[31.5-35英寸](女性)，或大腰围(≥102cm[≥40英寸](男性)和≥88cm[≥35英寸](女性)，如在InterAct Consortium,Langenberg等人，PLoS Med.2012Jun；9(6):e1001230中所描述的，其中，具有高腰围(大的WC)的健康受试者更经常地将发展保护性抗IAPP和/或抗proIAPP抗体，其与归类为肥胖的发展T2D风险最高的受试者相当，并且可以优选用于这些抗体的分离，但具有适度增加或正常的WC的人也可用于抗IAPP和/或抗proIAPP抗体的分离。
在一个实施方式中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。本文中描述了包含至少一个CDR的示例性抗体分子，该CDR可包含在受试者抗体中。
可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法来生产本发明的抗体，尤其是通过化学合成，或者优选通过如本文所述的重组表达技术。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括合成恒定区，其中，一个或多个结构域被部分地或完全地删除(缺失)(“结构域缺失的抗体”)。在某些实施方式中，兼容的修饰抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中，整个CH2结构域已被删除(ΔCH2构建体)。对于其他实施方式，短连接肽可以代替缺失的域，以对可变区提供活动的灵活性和自由度。本领域技术人员将理解，这样的构建体是特别优选的，由于对抗体的分解代谢速率的CH2结构域的调节特性。可以采用编码IgG1人恒定域的载体而得到域缺失的构建体，参见例如，国际申请WO02/060955和WO02/096948A2。这种载体被工程化以删除该CH2结构域并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是微型抗体。可以使用本领域中描述的方法来制备微型抗体，参见例如，美国专利5,837,821或国际申请WO94/09817。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括免疫球蛋白重链，其具有几个或甚至单一的氨基酸的缺失或取代，只要它允许单体亚基之间的关联即可。例如，CH2结构域的所选区域中的单一氨基酸的突变可足以基本上减少Fc结合，并由此增加了IAPP和/或proIAPP定位。类似地，可能期望的是，简单地删除用于控制待被调节的效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的该部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的所选特性(血清半衰期)，同时留下与受试者恒定区结构域的完整相关联的其他所需功能。此外，如上面提到的，所公开的抗体的恒定区可以是通过一个或多个氨基酸的突变或取代而合成的，其增强了所得的构建体的轮廓。在这方面，有可能破坏由保守结合位点(例如，Fc结合)提供的活性，同时基本上维持修饰的抗体的结构和免疫原性轮廓。另外的其它实施方式包括，将一个或多个氨基酸添加至恒定区，以提高期望的特性，如效应子功能，或提供更多的细胞毒素或碳水化合物附着。在这样的实施方式中，可能期望的是，插入或复制从选定的恒定区结构域衍生的特定序列。
本发明还提供了这样的抗体，该抗体包含、基本上由或由如下组成：本文所述的抗体分子的变体(包括衍生物)(例如，VH区和/或VL区)，该抗体或其片段免疫特异性地结合至IAPP和/或proIAPP。本领域技术人员已知的标准技术可以用于在编码抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于：位点定向诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸取代。优选地，相对于于参考VH区，VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3，VL区，VL-CDR1，VL-CDR2或VL-CDR3，该变体(包括衍生物)编码小于50个氨基酸的取代，少于40个氨基酸的取代，少于30个氨基酸的取代，少于25个氨基酸的取代，少于20个氨基酸的取代，少于15个氨基酸取代，少于10个氨基酸的取代，少于5个氨基酸的取代，少于4个氨基酸的取代，少于3个氨基酸的取代，或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中氨基酸残基被替换为具有侧链(具有相似电荷)的氨基酸残基。具有侧链(具有相似电荷)的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可替换地，突变可以沿着编码序列的全部或部分被随机导入，诸如通过饱和诱变，并且所得的突变体可针对生物活性而被筛选，以识别保留活性(例如，结合IAPP和/或proIAPP的能力)的突变体。
例如，可以将突变仅引入到框架区或仅抗体分子的CDR区中。引入的突变可以是沉默或中性的错义突变，例如，对于抗体的结合抗原的能力不具有或具有很小的效果，确实，一些这样的突变无论任何不改变氨基酸序列。这些类型的突变可用于优化密码子使用，或改善杂交瘤的抗体产生。编码本发明的抗体的密码子优化的编码区域在本文别处公开。可替代地，非中性错义突变可改变抗体的结合抗原的能力。大多数沉默和中性的错义突变的位置有可能位于构架区中，而大多数非中性的错义突变的位置可能位于CDR中，但这不是绝对要求。本领域技术人员将能够设计和测试具有所需性质的突变分子，诸如，抗原结合活性中没有改变，或结合活性的改变(例如，抗原结合活性的改善或抗体特异性的改变)。在诱变之后，所编码的蛋白质可以被常规地表达，并且可以使用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术来测定所编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性地结合IAPP和/或proIAPP的至少一个表位的能力)。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由以下组成：单链DNA和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链RNA和双链RNA、和作为单链区和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子，其可以是单链，或更典型地是双链或单链区和双链区的混合物。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区组成。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可含有一个或更多个修饰的碱基或因为稳定性或其他原因而被修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和稀有碱基，诸如，肌苷。可对DNA和RNA进行各种修饰，因此，“多核苷酸”包括化学地，酶地，或代谢地进行修饰的形式。
可通过向免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一个或更多个核苷酸取代、添加或缺失，来创建编码衍生自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离多核苷酸，使得一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入到所编码的蛋白质中。可以通过标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变，来引入突变。优选地，保守氨基酸取代是在一个或多个非必需的氨基酸残基上进行的。
如众所周知的，RNA可以通过标准技术与原始B细胞、杂交瘤细胞或与其它转化细胞分离，诸如，异硫氰酸胍提取和沉淀，随后通过离心或层析分离。当期望时，mRNA可通过标准技术与全部RNA分离，诸如，色谱法对寡dT纤维素。在本领域中，合适的技术是熟悉的。在一个实施方式中，使用根据公知方法的逆转录酶和DNA聚合酶，编码该抗体的轻链和重链的cDNA可同时或分别形成。可以通过共同的恒定区引物或通过更特异性的引物基于公布的重链和轻链DNA和氨基酸序列来启动PCR。如上所讨论的，PCR也可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以通过共同的引物或更大的同源探针(诸如人恒定区探针)来筛选这些文库。
可以使用本领域中已知的技术，使DNA(通常为质粒DNA)与细胞分离，根据例如在有关重组DNA技术的前述引用中更详细阐述的标准的公知技术进行限制映射和测序。当然，根据本发明，在分离过程或随后分析中的任意点，DNA可以是合成的。
在这种背景下，本发明还涉及编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的至少结合结构域或可变区的多核苷酸。在一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括、基本上由或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成，其中，所述重链可变区的至少一个CDR或者所述重链可变区的至少两个VH-CDR是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列。可替代地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3区是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。因此，根据本实施方式，本发明的重链可变区具有与图1中所示的多肽序列相关的VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列，或者分别具有与在图2所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括、基本上由或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成，其中，所述轻链可变区的至少一个VL-CDR或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR是至少80％，85％，90％或95％相同于来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列。可替代地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文所公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区具有与图1中所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列，或者分别具有与图2所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括、基本上由或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成，其中，所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有多肽序列，其与图1中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同，或者分别与图2中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同。
如本领域已知的，通过将一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二多肽或多核苷酸的序列相比较来确定两个多肽或两个多核苷酸之间“序列同一性”。当在本文中讨论时，可以使用本领域已知的方法和计算机程序/软件，来确定任何特定的多肽是否为至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％相同于另一多肽，所述计算机程序/软件为诸如但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin序列分析软件包，Version8，用于Unix，Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法，Advances inApplied Mathematics 2(1981),482-489，以发现两个序列之间的同源性最好的部分。当使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否例如是与根据本发明的参考序列95％相同时，当然，设定所述参数，使得在参考多肽序列的全长范围内计算同一性的百分比，并且允许参照序列中的全数氨基酸的可达5％的同源性间隙(缺口)。
在本发明的一个优选实施方式中，多核苷酸包含、基本上由或由以下组成：具有如表II或表Ⅲ中所示的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸。在这方面，本领域技术人员将容易理解的是，编码至少轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码两个免疫球蛋白链或仅一个的可变结构域。因此，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含、基本上由或由以下组成：具有如表II所示的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体的VH和VL区的多核苷酸序列或如表Ⅲ所示的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体的VH和VL区的序列的核酸。
表II:IAPP抗体的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0000681248500000561
Figure BDA0000681248500000571
Figure BDA0000681248500000581
Figure BDA0000681248500000591
表III:proIAPP抗体的VH和VL区的核苷酸序列
Figure BDA0000681248500000592
Figure BDA0000681248500000601
Figure BDA0000681248500000611
本发明还包括本发明的多核苷酸的片段，如其他地方描述的。另外，本发明还设想了如本文所述的编码融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸。可以通过本领域中已知的方法来生产或制造该多核苷酸。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸而组装，例如，如在Kutmeier等人的生物技术(BioTechniques)，17(1994)，242中描述的，其主要涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、这些寡核苷酸的退火和结扎以及之后的通过PCR的连接的寡核苷酸的扩增。
可替换地，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以从来自合适来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆无法获得，但抗体分子的序列是已知的，则编码抗体的核酸可被化学合成或从合适的来源(例如，抗体cDNA库或cDNA库，由表达IAPP和/或proIAPP特定抗体的任何组织或细胞获得，或相对于该任何组织或细胞孤立的核酸，优选聚A+DNA，诸如，被选定以表达抗体的杂交瘤细胞)而获得，通过PCR扩增，使用可杂交至序列的3’和5’端的合成引物，或使用用于特定基因序列的寡核苷酸探针来克隆以进行识别，例如，来自编码抗体的cDNA库的cDNA克隆。使用本领域公知的任何方法，通过PCR产生的扩增核酸可以进而被克隆到可复制的克隆载体中。
一旦该抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，或抗原结合片段、变体，或其衍生物被测定，可使用本领域公知的用于操纵核苷酸序列的方法来操纵其核苷酸序列，例如，重组DNA技术、定点突变、PCR等(参见，例如，在Sambrook等人的Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)和Ausubel等人的,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY(1998)中描述的技术，其全部内容均通过引用方式结合于此)，以便产生具有不同的氨基酸序列的抗体，例如，产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
在操纵分离的遗传物质以提供本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物之后，编码抗体的多核苷酸通常被插入到表达载体中，以便导入宿主细胞中，该宿主细胞可用于产生所需量的抗体。本文中描述了抗体或其片段、衍生物或类似物的重组表达，例如，结合于目标分子的抗体的重链或轻链。一旦已经获得本发明的编码抗体分子或抗体的重链或轻链的多核苷酸或其一部分(优选含有重链或轻链可变结构域)，则可使用本领域众所周知的技术，通过重组DNA技术来产生该载体，该载体用于产生抗体分子。因此，这里描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员公知的方法可以用来构建含有编码抗体的序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包括编码本发明的抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列的可复制载体，其可操作性地连接至启动子。这样的载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，国际申请WO86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且抗体的可变结构域可被克隆到用于整个重链或轻链表达的这样的载体中。
术语“载体(媒介，vector)”或“表达载体”在本文中用于表示根据本发明使用的载体，作为用于导入并表达宿主细胞中的所需基因的媒介物(vehicle)。如本领域技术人员所公知的，这样的载体可以容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。在一般情况下，可与本发明兼容的载体将包括选择标记、适当的限制位点，以促进所期望的基因的克隆和进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力。对于本发明的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一类载体利用DNA元件，它们从动物病毒衍生，诸如，牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV，MMTV或MoMLV)或SV40病毒。其他的涉及使用多顺反子系统，其中利用了内部核糖体结合位点。此外，可以通过引入一个或多个标记，来选择将DNA整合到其染色体中的细胞，所述标记允许选择转染的宿主细胞。该标记可以(针对原养型)向营养缺陷型宿主提供杀生物剂抗性(例如，抗生素)或抗重金属(诸如铜)性。可选择的标记基因可以被直接连接至待被表达的DNA序列，或者通过共转化而导入相同的细胞中。对于mRNA的最佳合成，还可能需要另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中，克隆的可变区基因与重和轻链恒定区基因(优选是人)一起被插入到表达载体中，如上所述。在一个实施方式中，这是使用Biogen IDEC公司(称为NEOSPLA)的专有的表达载体来完成的，并且在美国专利号6,159,730中公开。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已发现该载体导致抗体的非常高水平的表达，这是基于在可变区和恒定区基因的结合、CHO细胞中的转染、接着通过在含有培养基和甲氨蝶呤扩增的G418中的选择。当然，也可以在本发明中使用能够引发在真核细胞中表达的任何表达载体。合适的载体的实例包括，但不限于，质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His，pVAX1和pZeoSV2(可从加拿大圣地亚哥的Invitrogen获得)和质粒的pCI(可从麦迪逊，威斯康星州Promega公司(Promega,Madison,WI)获得)。在一般情况下，针对那些而筛选大量的转化细胞，其表达适当高的水平，如果免疫球蛋白重链和轻链是可以进行的常规实验，例如，通过机器人系统。在美国专利号5,736,137和5,658,570中也教导了载体系统，其每一个的全部内容通过引用并入到本文中。该系统提供了高表达水平，例如>30pg/细胞/天。其它示例性的载体系统被公开在例如美国专利号6,413,777中。
在其它优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用多顺反子构建体来表达，如在美国专利申请公开号2003-0157641A1中披露的那些，将其全部内容并入本文中。在这些表达系统中，多个感兴趣的基因产物(例如抗体的重链和轻链)可以由一个单一的多顺反子构建体产生。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对高水平的抗体。在美国专利号6,193,980中披露了兼容的IRES序列，其也并入本文中。本领域技术人员将理解，这样的表达系统可以用于有效地产生在本申请中公开的完整范围的抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸至少编码抗体的免疫球蛋白链的结合域或可变区，可选地，与编码所述结合分子的其它免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸结合。
更一般地，一旦编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列已经制备，则表达载体可被引入到适当的宿主细胞中。将质粒导入宿主细胞中可以通过本领域技术人员公知的各种技术来完成。这些包括但不限于：转染，其包括脂质转染(lipotransfection)，使用例如
Figure BDA0000681248500000631
或脂质体(lipofectamine)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、具有包膜DNA的细胞融合、显微注射及利用完整病毒的感染。通常，质粒进入宿主的导入是通过标准磷酸钙共沉淀法实现的。携带表达构建体的宿主细胞在适于生产轻链和重链的条件下生长，并被测定用于重链和/或轻链蛋白合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活的细胞分选仪分析(FACS)、免疫组化等。
将表达载体通过常规技术转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞，以产生抗体，以便用于本文描述的方法。因此，本发明包括含有多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸编码本发明的抗体或其重链或轻链或至少其免疫球蛋白的结合域或可变区，其优选可操作地连接至异源启动子。此外或可替换地，本发明还包括包含载体的宿主细胞，如上文所定义，其包含编码抗体的免疫球蛋白链的至少所述结合域或可变区的多核苷酸，可选地，与编码所述结合分子的其它免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸结合。在用于双链抗体的表达的优选实施方式中，编码重链和轻链的单个载体或多个载体可以在宿主细胞中被共表达，用于表达整个免疫球蛋白分子，如下文详述。
可以利用本发明的两种表达载体来共转染所述宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，并且第二载体编码轻链衍生的多肽。所述两种载体可含有相同的可选标记，其实现了重链和轻链多肽的同等表达。可替代地，可以使用单一的载体，其编码重链和轻链多肽。在这种情况下，轻链被有利地置于重链之前，以避免过量的有毒游离重链，参见Proudfoot，自然(Nature)322(1986)，52；Kohler，PROC.Natl.Acad,Sci.USA 77(1980)，2197。对于重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
如本文所使用的，“宿主细胞”指这样的细胞，其包含载体，使用重组DNA技术且编码至少一种异源基因来构建该载体。在用于从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，表示抗体的来源，除非它被明确地另有规定。换句话说，从“细胞”恢复多肽可意味着从旋降完整细胞恢复或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物恢复。
各种宿主表达载体系统可用于表达用于本文所述方法中的抗体分子。这种宿主表达系统代表媒介物，感兴趣的编码序列可以通过该媒介物而产生并随后纯化，而且还表示这样的细胞，其可以在通过合适的核苷酸编码序列被转化或转染时，原位表达本发明的抗体分子。这些包括但不限于，诸如细菌的微生物(例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌)，其利用含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化；酵母(如酵母属，毕赤酵母属)，其用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞系统，其用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染；植物细胞系统，其用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化；或哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞)，其携带含有从哺乳动物细胞(例如，金属硫蛋白启动子)的基因组或从哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)衍生的启动子的重组表达构建体。优选地，细菌细胞(诸如大肠杆菌)，更优选真核细胞，尤其是对于整个重组抗体分子的表达，可用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)与载体结合，是抗体的有效表达系统，所述载体例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，参见，例如，Foecking等人，Gene 45(1986)，101；Cockett等人，生物/技术(Bio/Technology)8(1990),2。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的，本领域技术人员具有优先确定特定宿主细胞系的能力，该特定宿主细胞系最适合于在其中表达的期望基因产物。示例性的宿主细胞系包括但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系、DHFR负)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3X63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人肾)。CHO和293细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可从商业服务(美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection))或者从发表的文献中获得。
此外，可以选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(例如，切割)可能对于所述蛋白质的功能来说是重要的。不同的宿主细胞具有特性和特定机制，用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可以使用真核宿主细胞，其具有细胞机器，用于基因产物的初级转录、糖基化和磷酸化的适当处理。
对于重组蛋白的长期高产率的生产，稳定的表达是优选的。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可以被工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用DNA而被转化，DNA由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选的标记所控制。在导入外源DNA后，工程化的细胞可以被允许在富集培养基中生长1-2天，然后被切换至选择性培养基。在重组质粒中的可选标记赋予对于选择的抗力并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长以形成病灶，而这又可以被克隆并扩展到细胞系。该方法可有利地用于工程细胞系，所述细胞系稳定地表达抗体分子。
可以使用多个选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11(1977)，223),次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992),202)，并且，腺嘌呤磷酸(Lowy等人，Cell 22(1980),817)基因可以被分别用在tk-，hgprt-或aprt-细胞中。此外，抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础：dbfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人,Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),357；O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 12(1993),488-505；Wu和Wu,Biotherapy3(1991),87-95；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596；Mulligan,Science 260(1993),926-932；以及Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217；TIB TECH 11(1993),155-215)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,Gene30(1984),147)。可以使用的重组DNA技术领域中常用的方法被描述在Ausubel等人的(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；and in Chapters 12and 13,Dracopoli等人.(eds),Current Protocols inHuman Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colberre-Garapin等人.,J.Mol.Biol.150:1(1981)中，将其全部内容通过引用并入本文中。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增而增加，对于综述，参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Academic Press,New York,Vol.3.(1987)。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，存在于宿主细胞的培养物中的抑制剂的水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与抗体基因相关，所以抗体的产生也将增加，参见Crouse等人,Mol.Cell.Biol.3(1983),257。体外生产允许按比例放大，以产生大量的所需多肽。用于在组织培养条件下的哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，并且包括均质悬浮培养，例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定化或包埋细胞培养，例如，在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷盒上。如果有必要和/或期望的话，多肽的溶液可以通过惯用的层析方法来纯化，例如，凝胶过滤、离子交换层析、DEAE纤维素上的层析或(免疫-)亲和层析，例如，在合成铰链区多肽的优先生物合成后或在这里所描述的HIC层析步骤之前或之后。
本发明的基因编码抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以表达在非哺乳动物细胞中，诸如，细菌或昆虫或酵母或植物细胞。容易拾取核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，诸如，大肠杆菌或沙门氏菌的菌株；芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。进一步理解的是，当在细菌中表达时，所述异源多肽典型地成为包涵体的一部分。所述异源多肽必须被分离、纯化，然后被组装成功能性分子。当期望抗体的四价形式时，该亚基将然后被自组装成四价抗体，参见，例如，国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，取决于针对被表达的抗体分子的使用，可有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量的这种蛋白时，对于抗体分子的药物组合物的生产，可以期望这样的载体，该载体指导容易被纯化的高水平融合蛋白产物的表达。这样的载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2(1983)，1791)，其中，抗体编码序列可单独被连接到载体中，在与lacZ编码区的框架中，使得融合蛋白被产生；pIN载体(Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13(1985),3101-3109；Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)；和类似物。pGEX载体也可用于表达外源多肽，作为融合蛋白，具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)。通常，这样的融合蛋白是可溶的，并且通过吸附和结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠的基质可以很容易地从裂解的细胞被纯化，并且随后在游离谷胱甘肽存在的情况下洗脱。pGEX载体被设计成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物，也可以使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母最常使用在真核微生物中，但是许多其它菌株是通常可获得的，例如，巴斯德毕赤酵母。为了在酵母属中表达，通常使用质粒YRp7，例如，(Stinchcomb等人,Nature 282(1979),39；Kingsman等人,Gene 7(1979),141；Tschemper等人.,Gene 10(1980),157)。该质粒已包含TRP1基因，其提供了用于酵母突变株的选择标记，该酵母突变株缺乏在色氨酸中生长的能力，例如ATCCNo.44076或PEP4-1(Jones,Genetics 85(1977),12)。trp1损伤的存在(作为酵母宿主细胞基因组的特征)于是提供了有效环境，用于通过在缺乏色氨酸中的生长来检测转化。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)通常被用作载体，以表达外源基因。该病毒生长在草地贪夜蛾细胞中。抗体编码序列可被单独地克隆到病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如，多角体启动子)的控制下。
一旦本发明的抗体分子被重组地表达，则本发明的全部抗体、其二聚体、个别的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，可根据本领域的标准程序被纯化，包括例如，通过色谱(例如，离子交换、亲和，特别是通过对蛋白A后的特异性抗原的亲和力，以及分级柱色谱)、离心、差异溶解度，例如，硫酸铵沉淀，或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术；参见，例如，Scopes,"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。可替代地，用于提高本发明的抗体的亲和力的优选方法披露在美国专利公开2002-0123057A1中。因此，在一个实施方式中，本发明还提供了一种用于制备抗IAPP或抗proIAPP抗体或其一个或多个免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养如上文所定义的宿主细胞，其细胞包含多核苷酸或载体，如上文所定义的；和
(b)从培养物中分离所述抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
此外，在一个实施方式中，本发明还涉及一种抗体或其一个或多个免疫球蛋白链，其由如上文所定义的多核苷酸编码，或可由用于制备抗IAPP或抗proIAPP抗体或其一个或多个免疫球蛋白链的所述方法获得。
V.融合蛋白和结合物(共轭物)
在某些实施方式中，所述抗体多肽包含氨基酸序列或者一个或多个通常不与抗体相关的部分。下面更详细地描述了示例性变型。例如，本发明的单链Fv抗体片段可以包括柔性连接体(连接子)序列，或可以被修饰以添加功能性部分(例如，PEG，药物，毒素，或标签，诸如，荧光，放射性试剂，酶，核磁共振，重金属等)。
本发明的抗体多肽可以包含、基本上由或由融合蛋白组成。融合蛋白是这样的嵌合分子，其例如包括具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白IAPP和/或proIAPP结合域，和至少一个异源的部分，即，它不本质地连接的一部分。氨基酸序列可通常存在于在融合多肽中被带到一起的单独蛋白质中或者它们通常可以存在于同一蛋白质中，但以新的布置放置在融合多肽中。融合蛋白可以，例如，通过化学合成，或通过创建和翻译多核苷酸来产生，其中，肽区域以所需的关系被编码。
如应用于多核苷酸或多肽的术语“异源的”是指，多核苷酸或多肽是衍生自一实体，该实体独立于和其相比较的实体的其余部分。例如，如本文所使用的，被稠合到抗体或其抗原结合片段、变体或类似物的“异源多肽”衍生自相同物种的非免疫球蛋白多肽，或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如在本文中其它地方更详细讨论的，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可进一步重组地融合到N-末端或C-末端的异源多肽或化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其他组合物。例如，抗体可重组融合或结合至这样的分子，该分子可用作在检测分析和效应分子，如异源多肽、药物、放射性核素、或毒素的标签，参见例如，国际申请WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995；和欧洲专利申请EP 0 396387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)接合至彼此的氨基酸组成，并且可以含有不同于20基因-编码的氨基酸的氨基酸。抗体可以通过自然过程(如翻译后加工)或通过本领域公知的化学修饰技术而被修饰。这样的修饰在基础教科书及更详细的专著以及大量研究文献中充分说明。修饰可以在抗体的任何地方发生，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或在诸如碳水化合物的部分上发生。应该理解的是，相同类型的修饰可以存在于给定抗体中的相同或不同程度的几个位点。此外，给定抗体可含有许多类型的修饰。抗体可以是分支的，例如作为泛素化的结果，并且它们可以是环状的，有或没有分支。环状的、分支的、和分支环状的抗体可通过翻译后自然过程来产生或者可以通过合成方法来制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工化、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、将氨基酸转移RNA介导添加到蛋白质(如精氨酰化)、和泛素化，参见例如，Proteins-Structure And Molecular Properties,T.E.Creighton,W.H.Freeman andCompany,New York 2nd Ed.,(1993)；Posttranslational Covalent Modification OfProteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1-12(1983)；Seifter等人.,Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等人.,Ann.NY Acad.Sci.663(1992),48-62。
本发明还提供了融合蛋白，其包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，以及异源多肽。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包括、基本上由、或由以下组成：具有本发明的抗体的任何一个或多个VH区的氨基酸序列或本发明的抗体或其片段或变体的任何一个或多个VL区的氨基酸序列以及异源性多肽序列的多肽。在另一个实施方式中，本文中公开的用于诊断和治疗方法中的融合蛋白包含、或基本上由、或由以下组成：具有抗体、或其片段、变体或衍生物的任何一个、二个、三个VH-CDR的氨基酸序列，或具有抗体或其片段、变体或衍生物的任何一个、二个、三个VL-CDR的氨基酸序列以及异源多肽序列的多肽。在一个实施方式中，融合蛋白包括这样的多肽，该多肽具有本发明抗体的VH-CDR3或其片段、衍生物或变体的氨基酸序列和异源多肽序列，其融合蛋白特定地结合至IAPP和/或proIAPP。在另一个实施方式中，融合蛋白包括这样的多肽，其具有本发明的抗体的至少一个VH区的氨基酸序列以及本发明的抗体的至少一个VL区或其片段、衍生物或变体的氨基酸序列以及异源多肽序列。优选地，所述融合蛋白的VH和VL区对应于单个源抗体(或scFv或Fab片段)，其特定地结合IAPP和/或proIAPP。在又一个实施方式中，用于本文所公开的诊断和治疗方法中的融合蛋白包括这样的多肽，该多肽具有抗体的任何一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列、和抗体的任何一个、两个、三个或更多个VL CDR或其片段或变体的氨基酸序列以及异源性多肽序列。优选地，两个，三个，四个，五个，六个或更多个所述VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单源抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体的融合物(Gascoigne等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),2936-2940；CD4(Capon等人,Nature 337(1989),525-531；Traunecker等人,Nature 339(1989),68-70；Zettmeissl等人,DNA Cell Biol.USA 9(1990),347-353；和Byrn等人,Nature 344(1990),667-670)；L-选择素(归巢受体)(Watson等人,J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等人,Nature 349(1991),164-167)；CD44(Aruffo等人,Cell 61(1990),1303-1313)；CD28和B7(Linsley等人,J.Exp.Med.173(1991),721-730)；CTLA-4(Lisley等人,J.Exp.Med.174(1991),561-569)；CD22(Stamenkovic等人,Cell 66(1991),1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),10535-10539；Lesslauer等人,Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；and Peppel等人,J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991)；和IgE受体(Ridgway and Gorman,J.Cell.Biol.115(1991),Abstract No.1448)。
如本文其他地方所讨论的，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可被融合至异源多肽，以增加多肽的体内半衰期或在使用本领域已知方法的免疫测定中使用。例如，在一个实施方式中，PEG可以结合至本发明的抗体，以增加其体内半衰期，参见例如，Leong等人的Cytokine 16(2001),106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人的Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
而且，本发明的抗体或它们的抗原结合片段、变体或衍生物可融合至标记序列(例如肽)，以方便它们的纯化或检测。在优选的实施方式中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，诸如在pQE载体中提供的标记(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)，尤其是，它们中的许多都是市售的。如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),821-824中所描述的，例如，六组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。可用于纯化的其他肽标记包括但不限于：“HA”标签，其对应于来自流感血细胞凝集素蛋白的表位(Wilson等人,Cell 37(1984),767),GST,c-mycand的“标志”标签；参见，例如Bill Brizzard,BioTechniques 44(2008)693-695，用于表位标记技术的综述，并且在第694页的表1中列出了可用于本发明的最常见的表位标记，其中，其主题通过引用明确结合于此。
可以利用本领域中公知的方法来制备融合蛋白；参见例如美国专利号5,116,964和5,225,538。可以凭经验选择形成该融合的精确位点，以优化融合蛋白的分泌或结合特征。编码融合蛋白的DNA然后被转染到宿主细胞中用于表达，其如前文所述进行。
本发明的抗体可以非结合形式使用，或可被结合至各种分子中的至少一个，例如，以提高该分子的治疗特性，以促进目标检测，或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物可以在纯化之前或之后被标记或结合。特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可被结合至治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。
作为包括常规抗体的免疫毒素的结合物(偶联物，conjugate)已经在本领域中被广泛描述。毒素可通过常规结合技术被结合到所述抗体，或可以产生含蛋白质毒素部分的免疫毒素，作为融合蛋白。本发明的抗体可以以相应的方式被使用以获得这样的免疫毒素。这种免疫毒素的示例是被描述在Byers,Seminars Cell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54中的那些。
本领域技术人员将会理解，还可以利用各种技术来组装结合物，这取决于所选择的待被结合的药剂。例如，制备具有生物素的结合物，例如，通过IAPP和/或proIAPP结合多肽与生物素的活化酯(例如，生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应。类似地，具有荧光标记物的结合物可以在偶合剂(如本文所列出的那些)存在的情况下被制备，或通过与异硫氰酸酯优选荧光素异硫氰酸酯的反应。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合物以类似方式制备。
本发明还包括被结合至诊断剂或治疗剂的本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。该抗体可以以诊断方式被使用，从而例如展示代谢疾病例如，2型糖尿病(T2D)的存在，以指示得到代谢性疾病的风险，从而监控代谢性疾病的发展或进展，代谢性疾病即为这样的疾病，该疾病表示聚集的IAPP和/或proIAP的发生或与之相关的疾病，作为临床测试步骤的一部分，从而例如确定给定治疗和/或预防方案的功效。因此，在一个实施方式中，本发明涉及可检测地标记的抗体。此外，在一个实施方式中，本发明涉及附着至药物的抗体。可以通过将抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合至可检测物质来促进检测。可检测的物质或标记一般可以是酶、重金属(优选是金)、染料(优选荧光或发光染料)或放射性标记。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子；对于金属离子参见例如美国专利号4,741,900，其可以结合至抗体，以便用作根据本发明的诊断剂。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括125I，131I，111In或99Tc。因此，在一个实施方式中，本发明提供了可检测的标记抗体，其中，可检测的标签选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可通过将其结合至化学发光化合物而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中所引起的发光的存在来确定化学发光标记抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
其中抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可被检测地标记的方法之一是，通过将其联接至酶并将联接产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller,A.,"The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)"Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersville,Md.,Diagnostic Horizons 2(1978),1-7)；Voller等人.,J.Clin.Pathol.31(1978),507-520；Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523；Maggio,E.(ed.),Enzyme Immunoassay,CRC Press,Boca Raton,Fla.,(1980)；Ishikawa,E.等人,(eds.),Enzyme Immunoassay,Kgaku Shoin,Tokyo(1981))。被结合至抗体的酶将以这样的方式与适当的底物反应，优选为显色底物，以产生可被检测的化学部分，例如，通过分光光度法、荧光或通过视觉手段。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸酶、脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶(接触酵素)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，该检测可以通过使用用于酶的生色底物的比色方法来完成。也可通过底物的酶反应程度与相似制备标准的视觉比较来完成检测。
也可以使用任何各种其它免疫测定来实现检测。例如，通过放射性标记该抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以通过使用放射免疫测定(RIA)来检测抗体(参见例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,(March,1986))，将其通过引用并入本文)。可以通过包括但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影来检测放射性同位素。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以使用荧光发射金属(如152Eu)或其它镧系而被可检测地标记。这些金属可以附着至使用这样的金属螯合基团(如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA))的抗体。
用于将各种部分结合至抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是公知的，参见例如，Arnon等人.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy",in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等人,"Antibodies For DrugDelivery",in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson等人.(eds.),MarcelDekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications,Pinchera等人.(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人.(eds.),Academic Press pp.303-16(1985),and Thorpe等人.,"The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.62(1982),119-158。
如所提到的，在某些实施方式中，增强结合分子的稳定性或功效的部分(例如结合多肽，例如，抗体或其免疫特异性片段)可被结合(轭合)。例如，在一个实施方式中，PEG可以被结合至本发明的结合分子，以增加其体内半衰期。Leong等人,Cytokine 16(2001),106；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；or Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
VI.组合物和使用方法
本发明涉及包括前述IAPP和/或proIAPP结合分子的组合物，例如本发明的抗体或其抗原结合片段或其衍生物或变体，或本发明的如上定义的多核苷酸、载体或细胞。在一个实施方式中，本发明的组合物是药物组合物并且还包含药学上可接受的载体(carrier)。此外，取决于药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物可以包含其他试剂，诸如白介素或干扰素。为了用于示出例如T2D的发生或与之相关的聚集IAPP和/或proIAPP的代谢疾病的治疗，另外的试剂可以选自由有机小分子、抗IAPP和/或proIAPP抗体以及它们的组合组成的组。因此，在一个特别优选的实施方式中，本发明涉及IAPP和/或proIAPP结合分子(例如本发明的抗体或其抗原结合片段)或其任何一种具有基本上相同结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞在用于制备药物或诊断组合物中的应用，所述药物或诊断组合物用于在受试者中预防性和治疗性治疗代谢疾病，监测代谢疾病的进展或对代谢疾病的治疗的反应或用于确定受试者发展代谢疾病的风险。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种治疗在郎格罕岛(胰岛)中以IAPP和/或proIAPP的异常积聚和/或沉积为特征的代谢紊乱的方法，该方法包括给予需其要的受试者治疗有效量的前面所描述的本发明的IAPP和/或proIAPP结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞中的任何一种。术语“代谢紊乱”包括但不限于通常以下组的以诸如T2D之前的、导致T2D的和/或与T2D有联系/关联或连接的代谢变化的症状为特征的病症，包括造成胰腺损害和可能因此导致糖尿病的疾病，包括慢性胰腺炎、囊性纤维化、胰腺癌；增加T2D风险的疾病，包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病；与或不与肥胖症和T2D关联的心血管疾病；和/或T2D本身。
本发明的治疗方法的一个特别优点在于以下事实，本发明的抗体源自没有疾病迹象的健康人受试者的B细胞或B记忆细胞，示出了与诸如T2D的聚集IAPP和/或proIAPP的发生或与之相关，并且因此，在一定概率上，能够防止与聚集IAPP和/或proIAPP相关的临床症状疾病，或降低了临床症状疾病发生的风险，或延迟了临床症状疾病的发作或进展。通常，本发明的抗体也已经成功地通过了体细胞成熟，即通过抗体的可变区的体细胞变异，相对于选择性和效力以高亲和力优化地结合至靶IAPP和/或proIAPP分子。
体内(例如人体内)的这些细胞在自动免疫或过敏性反应方面没有通过相关的或其他生理蛋白质或细胞结构被激活的知识也有很大的医学重要性，因为这意味着显著增加了成功经历临床测试阶段的机会。可以这么说，在至少一个人受试者中进行预防或治疗抗体的临床前和临床开发之前，已经证实了效力、可接受性和耐受性。因此，可以预期的是，本发明的人抗IAPP和/或抗proIAPP抗体，其作为治疗剂的靶标结构特异性效率和其副作用的降低概率显著提高了其临床成功的概率。
本发明还提供了药物和诊断包装或试剂盒，分别包括填充有一种或多种上述成分的一个或多个容器，所述成分为例如本发明的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体、其结合片段、衍生物或变体、多核苷酸、载体或细胞。与这样的一个或多个容器相关联的可以是由调节药品或生物制品的生产、使用或出售的政府机构规定的形式的通知(注意事项)，该通知反映了制造、使用或销售用于人类给药的机构的批准。另外或可替代地，所述试剂盒包含试剂和/或在适当的诊断测定中使用的说明书。本发明的组合物(例如试剂盒)当然特别适用于伴随有聚集IAPP和/或proIAPP的存在的病症的风险评估、诊断、预防和治疗，并且特别适用于通常以诸如T2D之前的、导致T2D的和/或与T2D有联系/关联或链接的代谢变化的症状为特征的病症的治疗，例如，包括造成胰腺损害和可能因此导致糖尿病的疾病，包括慢性胰腺炎、囊性纤维化、胰腺癌；增加T2D风险的疾病，包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病；与或不与肥胖症和T2D关联的心血管疾病；和/或T2D本身。
本发明的药物组合物可以根据本领域中公知的方法来配制；例如，参见Remington：费城的科学大学的The Science and Practice of Pharmacy(药剂的科学与实践)(2000)，ISBN 0-683-306472。合适的药物载体的实例是本领域所熟知的，并且包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(诸如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这样的载体的组合物可以通过公知的传统方法来配制。这些药物组合物可以以合适的剂量给予受试者。合适的组合物的给药可以通过不同的方式来实现，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、局部或皮内给药或脊髓或脑递送。诸如鼻喷雾制剂的气溶胶制剂包括纯净水或活性剂与防腐剂和等渗剂的其他溶液。这种制剂优选地被调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道给药的制剂可呈现为具有合适载体的栓剂。
剂量方案将由主治医生和临床因素来确定。如在医学领域所公知的，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的个头、体表面积、年龄、待服用的特定化合物、性别、给药时间和途径、健康状况以及同时正在服用的其他药物。典型的剂量可以例如在0.001至1000μg的范围内(或在该范围内的核酸表达或表达抑制)；然而，也可以设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。通常，剂量范围可以例如从约0.0001至100mg/kg主体重，更通常为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，等等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选为至少1mg/kg。在上述范围内的中间剂量也旨在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据经验分析所确定的任何其他安排来给予这种剂量。示例性治疗需要长时间地给予多种剂量，例如，至少六个月。另外的示例性治疗方案需要每两周给予一次或每月给予一次或每3至6个月给予一次。示例性的剂量方案包括连续数天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体同时给予，这种情况下所给予的每种抗体的剂量落在所示的范围内。进程可以通过定期评估来监测。用于肠胃外给药的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)、以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的补充剂)，等等。例如，也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含其它试剂，诸如多巴胺或精神病药物，这取决于药物组合物的预期用途。
此外，在本发明的一个优选实施方式中，药物组合物可以被配制成疫苗，例如，如果本发明的药物组合物包含用于被动免疫的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体或其结合片段、衍生物或变体。如背景技术部分中所提及的，已示出了一些证据，表明聚集的IAPP和/或proIAPP物种是T2D发病的主要触发者(Zraika等人.(2010),Diabetologia 53(6):1046-1056；Westermark等人.(2011),Physiol.Rev.91(3):795-826；Jurgens等人.(2011),Am.J.Pathol.178(6):2632-2640；Hoppener等人.(2008),Exp.Diabetes Res.697035)，并且干扰hIAPP聚集的治疗改善糖尿病表型和增加动物寿命(Aitken等人.(2009)、Diabetes59(1):161-171)。因此，为谨慎起见，期望具有本发明的人抗IAPP和/或抗proIAPP抗体以及等效IAPP和/或proIAPP结合分子的被动免疫将有助于规避主动免疫治疗概念的几个不利影响，如在背景技术部分已经讨论过的。因此，本发明的这种抗IAPP和/或抗proIAPP抗体及其等同物作为用于疾病的预防或改善的疫苗将是特别有用的，例如，这些疾病示出了聚集的IAPP和/或proIAPP的存在或由聚集的IAPP和/或proIAPP导致(诸如在T2D之前的、导致T2D的和/或与T2D有联系/关联或链接的代谢变化，包括造成胰腺损害和可能因此导致糖尿病的疾病，包括慢性胰腺炎、囊性纤维化、胰腺癌；增加T2D风险的疾病，包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病；与或不与肥胖症和T2D关联的心血管疾病；和/或T2D本身。
在一个实施方式中，可能有益的是，使用本发明的抗体的重组双特异性或多特异性构建体。对于参考，参见Fischer和Léger，Pathobiology(病理学)74(2007),3-14。这样的双特异性分子可以被设计成具有一个结合臂的靶标IAPP和在糖尿病发病时已知的具有第二臂的另一实体，例如，proIAPP(除了本发明的抗体外，它们具有抗IAPP和proIAPP的双特异性，如上面针对示例性抗体NI-203.26C11说明的)。或者这样的双特异性分子可以被设计成使在糖尿病发病时已知的其他实体与第二臂结合，诸如IL-1β和IL-6，或通过阻断钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)或CD33，其介入被认为是通过适应性调节T细胞的诱导而逆转NOD小鼠中的糖尿病(Ablamunits等人.,Diabetes 61(2012),145-154；Belghith等人.,NatMed 9(2003),1202–1208)。
在一个实施方式中，可能有益的是，使用本发明的抗体的重组Fab(rFab)和单链片段(scFvs)，这可能更容易渗透细胞膜。例如，预先在线发表的Robert等人的ProteinEng.Des.Sel.(2008)Oct 16；S1741-0134描述了单克隆抗体WO-2的嵌合重组Fab(rFab)和单链片段(scFvs)的使用，其识别Aβ的N-末端区中的表位。工程化的片段能够(i)预防淀粉样蛋白纤维化，(ii)分解预形成的Aβ1-42原纤维和(iii)体外抑制Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性，如整个IgG分子一样有效。使用缺乏效应子作用的小Fab和scFv工程化的抗体形式的感知优点包括穿过血脑屏障的更有效通道，并使引发炎症副作用的风险最小化。此外，除了scFv和单域抗体保留全长抗体的结合特异性外，它们可以被表达为哺乳动物细胞内的单基因和细胞内作为胞内抗体，具有用于改变折叠、相互作用、修饰、或其靶标的亚细胞定位的潜能；对于评论，参见，例如，Miller和Messer的Molecular Therapy 12(2005),394–401。
在一种不同的方法中，Muller等人的Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241描述了一种技术平台，所谓的“超抗体技术(SuperAntibody Technology)”，这就是说，使抗体能够穿梭进入活细胞而不伤害它们。这种穿过细胞的抗体打开新的诊断和治疗窗口。已创造了术语“TransMabs”用于这些抗体。
在进一步的实施方式中，用于治疗与聚集的IAPP和/或proIAPP的发生相关的疾病的其它抗体的共同给药或顺序给药可能是期望的。在一个实施方式中，另外的抗体被包括在本发明的药物组合物中。可用于治疗受试者的抗体的实例包括但不限于针对CD33、SGLT2、IL-6和IL-1的抗体。
在进一步的实施方式中，用于治疗与聚集的IAPP和/或proIAPP和/或与糖尿病相关的疾病的其它试剂的共同给药或顺序给药可能是期望的。在一个实施方式中，另外的试剂被包括在本发明的药物组合物中。可用于治疗受试者的试剂的实例包括但不限于：胰岛素和胰岛素类似物；胰岛素信号传导途径调节剂，诸如蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)的抑制剂、非小分子模拟化合物和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)的抑制剂、DPP-IV抑制剂、影响解除管制的肝葡萄糖生产的试剂(如葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的抑制剂)、果糖-1,6-二磷酸酶(F-1,6-BPase)的抑制剂、糖原磷酸化酶(GP)的抑制剂、胰高血糖素受体拮抗剂、磷酸烯醇丙酮酸羧(PEPCK)的抑制剂、丙酮酸脱氢酶激酶(PDHK)抑制剂、胰岛素敏感性增强剂、胰岛素分泌增强剂、α葡萄糖苷酶抑制剂、胃排空的抑制剂；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂；磺脲类药物；双胍剂，诸如二甲双胍；α-葡糖苷酶抑制剂；过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂；格列奈类药物；二肽基肽酶(DPP)IV抑制剂；PDE1、PDE5、PDE9、PDE10或PDE11(PDE＝磷酸二酯酶)抑制剂；胰淀素激动剂(例如，普兰林肽和其它胰淀素类似物)；肉桂；胰高血糖素受体拮抗剂；糖原磷酸化酶抑制剂；果糖-1,6-二磷酸酶抑制剂；大麻素(CB1)受体拮抗剂；诸如食欲抑制剂的抗肥胖药物、饱足感增加物质和能量消耗增加药物；抗炎剂或它们的任意组合。可用于治疗或预防伴随临床胰岛移植的胰岛排斥反应的试剂的实例包括但不限于包括以下的组的药剂：西罗莫司(雷帕霉素)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，他克莫司)、环孢菌素、霉酚酸酯、FTY720、环孢菌素、糖皮质激素和抗-IL2-受体的单克隆抗体(例如，达珠单抗)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂(例如，参见Noguchi等人的Noguchi等人.,Acta Med.Okayama,60(2006),and the internationalapplication WO2012088157)。因此，在一个实施方式中，提供的组合物进一步包含另外的试剂，其可用于治疗2型糖尿病(T2D)和/或可用于治疗或预防伴随临床胰岛移植的胰岛排斥反应。可以与本发明的药物组合物共同使用的其它试剂的实例在本领域中有描述；例如参见，国际申请WO2009005672、WO2010128092、WO2012088157或欧洲申请EP11158212.8。
治疗有效剂量或量是指足以改善症状或病症的活性成分的量。这样的化合物的治疗功效和毒性可以通过在细胞培养物或实验动物中进行的标准药学过程来确定，例如，ED50(对50％群体治疗有效的剂量)和LD50(对50％群体致死的剂量)。治疗效果和毒性效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。优选地，组合物中的治疗剂以足以恢复或维持正常的血糖控制和/或在代谢紊乱(诸如T2D)的情况下的胰岛素反应的量存在。
根据上述内容，很明显的是，本发明涵盖IAPP和/或proIAPP结合分子的任何应用，所述结合分子包含上述抗体的至少一个CDR，特别是用于如上所述的与聚集的IAPP和/或proIAPP有关的疾病(诸如T2D)的诊断和/或治疗。优选地，所述结合分子是本发明的抗体或其免疫球蛋白链。另外，本发明涉及上文所述的任一种所提及抗体的抗独特型抗体。这些是抗体或结合到位于抗原结合位点附近的抗体可变区的独特抗原性肽序列的其它结合分子并且例如可用于从受试者获得的样品中的抗IAPP和/或抗proIAPP抗体的检测。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种如上文和下面所定义的抗体或如本文所定义的其任一种具有基本上相同的结合特异性的IAPP和/或proIAPP结合分子、多核苷酸、载体或细胞、或者包含其任一种的药物或诊断组合物，其被用于预防性治疗、治疗性治疗与IAPP和/或proIAPP有关的病症和/或监测其进展或对与IAPP和/或proIAPP有关的病症的治疗的响应，优选地其中所述病症选自包含以下的组：所有类型的糖尿病，诸如1型糖尿病、妊娠糖尿病、前驱糖尿病(当高血糖未达到T2D阈值或胰岛素抵抗时)以及成年人的隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)；导致损害胰腺且因此可能导致糖尿病的任何疾病，诸如慢性胰腺炎、囊性纤维化和胰腺癌；增加T2D风险的任何疾病，诸如阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病或本文中已定义的与糖尿病相关的其它神经退行性疾病；一般作为发展糖尿病的危险因素或作为可能在糖尿病之前存在的病症的代谢综合症；一般作为发展糖尿病的危险因素或作为可能在糖尿病之前存在的病症的胰岛淀粉样变性；一般作为发展糖尿病的危险因素或作为可能在糖尿病之前存在的病症的肥胖症；与或不与肥胖症和T2D相关的任何心血管疾病；也可能增加发展糖尿病的风险的T2D的一切后果，例如心脏病、中风、糖尿病性视网膜病、肾功能衰竭、肾脏功能衰竭、酮症酸中毒和非酮症高渗性昏迷。上述病症的组将被称为与IAPP和/或proIAPP相关的病症的组。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种诊断组合物，其包含本发明的任一种上述的IAPP和/或proIAPP结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞，以及可选的用于检测的合适装置(means)，诸如在基于免疫或核酸的诊断方法中常规使用的试剂。例如，本发明的抗体适合用于免疫测定中，其中它们可以以液相使用或结合于固相载体。可以利用本发明的抗体的免疫测定的实例是直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。这样的免疫测定的实例是放射性免疫测定(RIA)、夹心(免疫分析测定)、流式细胞术和蛋白质印迹试验。本发明的抗原和抗体可与许多不同的载体结合并用来分离特异性结合于其上的细胞。众所周知的载体(carrier)的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。对于本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。存在本领域普通技术人员所熟知的许多不同的标记和标记方法。可在本发明中使用的标记的类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也参见上文所讨论的实施方式。
通过进一步的实施方式，IAPP和/或proIAPP结合分子，特别是本发明的抗体，通过从测试个体获得体液样品，也可以被用于诊断个体病症的方法中，所述体液样品可以是血液样品、血浆样品、血清样品、淋巴样品或任何其它体液样品，诸如唾液或尿液样品，并且在一定条件下使体液样品与本发明的抗体接触，使得能够形成抗体-抗原复合物。这种复合物的水平然后通过本领域中已知的方法确定，水平显著高于指示测试个体中的疾病的对照样品中所形成的水平。以相同的方式，也可以使用由本发明的抗体结合的特异性抗原。因此，本发明涉及一种包含所述结合分子(例如本发明的抗体或抗原结合片段)的体外免疫测定。
在本文中，本发明还涉及专门为此目的而设计的装置(means)。例如，可以使用基于抗体的阵列，其例如装载有本发明的特异性识别IAPP和/或proIAPP的抗体或等效的抗原结合分子。在Kusnezow等人的Mol.Cell Proteomics 5(2006),1681-1696中总结了微阵列免疫测定的设计。因此，本发明还涉及装载有根据本发明识别的IAPP和/或proIAPP结合分子的微阵列。
在一个实施方式中，本发明涉及一种在受试者中诊断与聚集的IAPP和/或proIAPP有关的疾病的方法，该方法包括：在来自待被诊断的受试者的样品中，利用本发明的至少一种抗体，其IAPP和/或proIAPP结合片段或者其任何一种具有基本上相同的结合特异性的IAPP和/或proIAPP结合分子来确定IAPP和/或proIAPP和/或聚集的IAPP和/或proIAPP的存在，其中病理性聚集的IAPP和/或proIAPP的存在表示代谢紊乱，诸如T2D，并且与生理性IAPP和/或proIAPP单体形式的水平相比，病理性聚集的IAPP和/或proIAPP的水平的增加表示在所述受试者中代谢紊乱的进展。
待诊断的受试者对于该疾病可能是无症状的或临床前的。优选地，对照受试者具有与聚集的IAPP和/或proIAPP有关的疾病，例如在T2D之前的、导致T2D的、和/或与T2D有联系/关联或链接的代谢变化，包括造成胰腺损害和可能因此导致糖尿病的疾病，包括慢性胰腺炎、囊性纤维化、胰腺癌；增加T2D风险的疾病，包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病；与或不与肥胖症和T2D关联的心血管疾病；和/或T2D本身，其中病理性聚集的IAPP和/或proIAPP的水平与参考标准之间的相似性表明，待诊断的受试者具有代谢性疾病或存在发展代谢性疾病的风险。可替代地，或另外地作为第二对照，对照受试者不具有代谢性疾病，其中生理性IAPP和/或proIAPP单体和/或聚集的IAPP和/或proIAPP的水平与参考标准之间的差异表示待诊断的受试者具有代谢性疾病或存在发展代谢性疾病的风险。优选地，待诊断的受试者与一个或多个对照受试者是年龄匹配的。待分析的样品可以是怀疑含有病理性聚集的IAPP和/或proIAPP的任何体液，例如血液、血浆、血清、尿液、腹膜液、唾液或脑脊髓液(CSF)。
生理性IAPP和/或proIAPP单体和/或病理性聚集的IAPP和/或proIAPP的水平可以通过本领域中已知的任何合适的方法进行评估，包括，例如，通过从以下中选择的一种或多种技术分析IAPP和/或proIAPP：蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)、二维凝胶电泳、质谱分析(MS)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间MS(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸电离飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)、多维液相色谱(LC)，接着是串联质谱法(MS/MS)，以及激光光密度。优选地，IAPP和/或proIAPP的所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。
基于抗体的方法，其用于检测IAPP和/或proIAPP和用于诊断或监测与聚集的IAPP和/或proIAPP有关的疾病(诸如T2D)的进展，以及使用根据本发明而适应的抗体和相关的装置监测这种疾病的治疗，还描述在国际申请WO2003092619中，将该申请的公开内容结合于此作为参考。这些方法可以如所描述的应用，但与本发明的IAPP和/或proIAPP特异性抗体、结合片段、生物或变体一起应用。
因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或如上文所定义的其任一种具有基本上相同的结合特异性的IAPP和/或proIAPP结合分子、多核苷酸、载体或细胞、或者包含其任一种的药物或诊断组合物，以用于预防性治疗、治疗性治疗与IAPP和/或proIAPP有关的病症和/或监测其进展后对与IAPP和/或proIAPP有关的病症的治疗的反应。因而，一般来说，本发明还涉及一种诊断或监测受试者中的与IAPP和/或proIAPP有关的病症(诸如胰岛淀粉样变性病和通常在胰岛淀粉样变性病之前的T2D)的进展的方法，该方法包括利用本发明的至少一种抗体或IAPP和/或proIAPP结合分子来测定来自待诊断的受试者的样品中IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的存在，所述结合分子中的任何一种具有基本上相同的结合特异性，其中IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的存在是病症的指示。在一个实施方式中，提供了诊断或监测受试者中的胰岛淀粉样变性的进展的所述方法，该方法包括利用本发明的至少一种抗体或IAPP和/或proIAPP结合分子来测定来自待诊断的受试者的样品中IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的存在，所述结合分子中的任何一种具有基本上相同的结合特异性，其中IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的存在是症状前、前驱或临床2型糖尿病(T2D)和/或在临床胰岛移植之后的β细胞衰竭的指示，并且IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的水平相比于生理性IAPP的水平或相比于来自健康对照受试者的参照样品或来自同一受试者的对照样品的增加表示在所述受试者中症状前、前驱或既定的2型糖尿病(T2D)和/或伴随临床胰岛移植的胰岛衰竭的进展。本领域普通技术人员将认识到，在一个实施方式中，所述方法还用于从与如上文定义的IAPP和/或proIAPP有关的一组病症中诊断或监测任何其它病症的进展。
如上面所指出的，不仅在体外而且在体内可以使用本发明的抗体、其片段和与所述抗体及其片段具有相同结合特异性的分子，其中，除了诊断外，还可以追求治疗性应用。因此，在一个实施方式中，本发明还涉及一种包含本发明的抗体的至少一个CDR的IAPP和/或proIAPP结合分子，其用于制备用于体内检测或者在人体或动物体内将治疗和/或诊断剂靶向IAPP和/或proIAPP的组合物。潜在的治疗和/或诊断剂可以选自在治疗代谢性疾病(诸如T2D)和如上所述的潜在标签时有用的非穷尽枚举的治疗剂。在体内成像方面，在一个优选的实施方式中，本发明提供了所述IAPP和/或proIAPP结合分子，其包含本发明的抗体的至少一种CDR，其中所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。在进一步的实施方式中，本发明还提供了包含本发明的抗体的至少一种CDR的所述IAPP和/或proIAPP结合分子，或用于制备用于上述体内成像方法中的组合物的所述分子，在受试者中诊断或监测与IAPP和/或proIAPP有关的病症的进展的方法中的应用，如上文所定义的。
VII.具有聚集特异性IAPP表位的肽
在进一步的方面中，本发明涉及由本发明的任何抗体特异性识别的具有IAPP和/或proIAPP的表位的肽。优选地，这样的肽包含或由如在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQID NO：71中所示的氨基酸序列，作为由抗体识别的独特的线性表位或其中一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加的其修改序列，其中所述肽由本发明的任何抗体识别，优选地由抗体NI-203.19H8，相应地由抗体NI-203.26C11或由抗体NI-203.15C7识别。
在本发明的一个实施方式中，这样的肽可用于诊断或监测与受试者体内的聚集IAPP和/或proIAPP相关的疾病，诸如T2D，包括确定在所述受试者的生物样品中结合于肽的抗体的存在的步骤，并且通过测量识别本发明的上述肽的抗体的水平，并将测量结果与在可比年龄和性别的健康受试者中所发现的水平进行比较，而被用于在所述受试者中诊断这种疾病。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种这样的方法，其用于诊断指示受试者体内症状前或临床2型糖尿病(T2D)和/或伴随临床胰岛移植的β细胞衰竭的胰岛淀粉样变性，包括确定在所述受试者的生物样品中抗体的存在的步骤，所述抗体结合于如上所定义的肽。根据该方法，对于于本发明的所述肽特异性的所测抗体的升高的水平指示用于在所述受试者体内诊断症状前或临床2型糖尿病(T2D)和/或伴随临床胰岛移植的β细胞衰竭，或者用于在所述受试者体内诊断选自如上所定义的与IAPP和/或proIAPP有关的病症的组的任何其它疾病。本发明的肽可以被分别配制成阵列、试剂盒和组合物，如前所述。在本文中，本发明还涉及一种用于诊断或监测胰岛淀粉样变性的进展的试剂盒，所述试剂盒包含分别如前所定义的本发明的至少一种抗体或其任一种具有基本上相同的结合特异性的IAPP和/或proIAPP结合分子、多核苷酸、载体或细胞和/或肽，可选地具有试剂和/或使用说明。
本发明的说明书和实施例公开并涵盖了这些和其它实施方式。使用例如电子设备，根据本发明待应用的关于材料、方法、用途和化合物中的任何一种的进一步文献可从公共图书馆和数据库中检索到。例如，可以利用公共数据库“Medline”，这是由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)和/或国家医学图书馆(National Library of Medicine)在国立卫生研究院(National Institutes of Health)主办的。进一步的数据库和网址(诸如欧洲生物信息研究所(EBI)，其是欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分)对本领域技术人员来说是已知的，并且也可以利用因特网搜索引擎获得。在Berks,TIBTECH 12(1994),352-364中给出了对追溯查询和当前意识很有用的生物技术中的专利信息的综述和专利信息的相关资源的调查。
上述公开内容总体上描述了本发明。除非另有说明，否则本文中所使用的术语给出了定义，如牛津大学出版社，1997年，2000年修订和2003再版，ISBN 0198506732的生物化学与分子生物学的牛津词典(Oxford Dictionary of Biochemistry and MolecularBiology)所提供的。几个文件通篇引用在本说明书中。完整的书目引文可以在权利要求书之前的说明书的末尾找到。所有引用的文献(包括如在本申请中通篇引用的参考文献、授权的专利、公开的专利申请，和制造商的说明书、指南等)的内容在此明确地通过引用并入本文中；然而，没有承认所引用的任何文献确实作为本发明的现有技术。
可以通过参考以下具体实例来获得更完整的理解，本文中提供这些实例仅用于说明的目的，而并非旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：人IAPP抗体的靶标和结合特异性的验证
为了验证作为分离的抗体的识别靶标的IAPP，进行直接ELISA测定。对于示例性的重组人NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3抗体，96孔微板(Costar，康宁，美国)用人IAPP溶液涂布或用BSA(Sigma-Aldrich公司，Buchs，瑞士)涂布，其被稀释到在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.42)中的10μg/ml的浓度，并且对抗体的结合效率进行测试。重要的是，用于ELISA测定的人IAPP溶液含有IAPP原纤维，如通过电子显微镜所示出的；参见图3A。示例性的NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3抗体通过ELISA特异性地结合至人IAPP原纤维。没有观察到结合于BSA；参见图3B。相同的特性似乎适用于抗体NI-203.19F2和NI-203.15C7。
对于示例性的抗体NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3的半数最大有效浓度(EC50)的确定，进行具有不同抗体浓度的另外的直接ELISA试验。96孔微板(Costar，康宁，美国)用人IAPP和人proIAPP溶液涂布，所述溶液被稀释至在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.42)中的10μg/ml的浓度，并且测试抗体的结合效率。虽然用于ELISA测定的人IAPP溶液含有IAPP原纤维，但是人proIAPP在溶液中形成大的聚集体，如通过电子显微镜所揭示的；参见图4A。结合利用结合有HRP的驴抗人IgGγ抗体(Jackson ImmunoResearch,Newmarket,UK)进行测定，接着是在标准比色测定法测定HRP活性。
EC50值通过使用GraphPad Prism(美国圣地亚哥)软件的非线性回归来估计。重组人源化抗体NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3以高亲和力分别以9nM、22nM、6nM和4nM的EC50与人IAPP原纤维结合。抗体NI-203.26C11也以在纳摩尔范围(260nM)内的EC50结合至聚集的人proIAPP；参见图4B。
实施例2：对人IAPP原纤维特异性并且不对非纤维状人IAPP特异性因此优选结合至构象表位的抗体
为了确定示例性的NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3抗体与构象表位的结合能力，利用人IAPP和非纤维状IAPP溶液进行直接ELISA实验，所述溶液在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、pH 9.42)中被稀释至10μg/ml的浓度，并且测试抗体的结合能力。虽然用于ELISA测定的人IAPP溶液包含IAPP原纤维，但是人非原纤维IAPP溶液缺乏IAPP原纤维并且仅显示出小的无定形聚集体，如由电子显微镜所揭示的；参见图5A。结合利用与HRP结合的驴抗人IgGγ抗体(Jackson immunoResearch，纽马基特，英国)进行确定，接着是在标准比色测定法测量HRP活性。
在用IAPP溶液涂布时，重组NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3抗体显示出结合于IAPP原纤维的高亲和力(图5B)，如先前所观察到的(图4)。当与IAPP原纤维相比时(图5B)，在非纤维IAPP上观察到亲和力的损失，因此表明NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11和NI-203.8E3抗体优先结合至IAPP原纤维。初步结果显示出与上面针对抗体NI-203.19F2和NI-203.15C7描述的相同的效果。
这些研究结果强烈指明NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11，NI-203.8E3，NI-203.19F2和NI-203.15C7抗体结合表位，其主要被暴露并且在IAPP原纤维形成时可获得，这与存在于生理性人IAPP蛋白构象中的线性表位相反。在T2D患者的胰岛中观察到病理性IAPP原纤维。由于NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11，NI-203.8E3，NI-203.19F2和NI-203.15C7抗体表现出与治疗相关的病理性人IAPP原纤维的明显结合，因此这些人源化抗体在T2D中具有治疗潜力。
实施例3：NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11，NI-203.8E3，NI-203.19F2，和NI-203.15C7抗体的结合表位的评估
为了确定示例性的NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11，NI-203.8E3，NI-203.19F2和NI-203.15C7抗体的结合表位，利用重叠肽(映射整个人IAPP氨基酸序列)和proIAPP的前22个氨基酸的丙氨酸取代进行肽扫描和丙氨酸扫描分析。在这些肽上对抗体的结合能力进行测试，这些肽被点样到硝酸纤维素膜上(JPT肽技术(JPT PeptideTechnologies)，柏林，德国)，并使用HRP结合的驴抗人IgGγ二抗(JacksonimmunoResearch，纽马基特，UK)，随后检测HRP的活性(图6A)。
重组NI-203.19H8，NI-203.26C11，和NI-203.15C7抗体(1μg/ml)表现出与人IAPP上的序列19-SSNNFGA-25(SEQ ID NO:4)、2-CNTATCA-8(SEQ ID NO:5)、和10-QRLANFLVHS-19(SEQ ID NO:71)结合(图6A和6B)，因此对应于这些抗体的推定的结合表位序列。重组的NI-203.9A2，NI-203.8E3，和NI-203.19F2抗体(1和10μg/ml)的表位还未被确定。
实施例4：在诊断有2型糖尿病的患者的胰腺中，但不是在对照患者中，NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体与病理性IAPP原纤维的结合
基于在胰岛中在ThioS和刚果红染色时观察到的淀粉样蛋白负荷来选择诊断有2型糖尿病(T2D)的两个患者的石蜡包埋的胰腺切片，并随后用于示例性的NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体结合表征。未被诊断有2型糖尿病的患者的石蜡包埋的胰腺切片被用作对照。在甲酸预处理之后，切片与人NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体(5和50nM)或小鼠单克隆抗IAPP抗体(1:100；Abcam，剑桥，英国)一起孵育，随后与生物素化的驴抗人二抗(1:500；Jackson ImmunoResearch，纽马基特，英国)或生物素化的山羊抗小鼠二抗(1:500；Jackson ImmunoResearch，纽马基特，英国)一起孵育。抗体信号用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，美国)扩增，并且用二氨基联苯胺底物(Thermo Fisher Scientific，USA)检测。在抗生物素蛋白/生物素阻断(抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒，Vector Laboratories，美国)之后，胰岛β细胞利用多克隆豚鼠抗胰岛素抗体(1:5；Dako，美国)进行可视化，其与生物素化的驴抗豚鼠二抗(1:500；ImmunoResearchLaboratories，美国)结合，并且抗体信号用Vectastain ABC-AP试剂盒(VectorLaboratories，美国)扩增，并用碱性磷酸酶底物(Vector Laboratories，美国)进行检测。
第一T2D患者在对应于病理性IAPP原纤维的胰岛中显示出较大的淀粉样蛋白沉积物，如通过ThioS和刚果红染色可视化(图7A)。NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11人抗体显示出对这些淀粉样蛋白阳性切片的突出的胰岛染色(图7B)。在5nM处观察到抗体染色并且在50nM处增加，其中没有观察到仅利用二抗的染色，这表明人IAPP抗体的特异性结合。这些研究结果在第二T2D患者中被证实，其显示出在胰岛中的淀粉样蛋白沉积物(数据未示出)。相反，NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11人抗体均未示出对来自缺乏淀粉样蛋白沉积物的第三T2D患者(图7C和D)和来自未被诊断为T2D的对照患者的胰岛的任何染色(图8)。市售小鼠单克隆抗IAPP抗体染色来自非糖尿病对照患者的胰岛上的生理性IAPP；参见图8。本发明的抗体也对显示胰岛淀粉样蛋白沉积物的糖尿病猫胰腺给出正面结果；参见图9。相同的结合特性似乎适用于抗体NI-203.19F2和NI-203.15C7。
这些数据表明，NI-203.9A2，NI-203.19H8，NI-203.26C11，NI-203.19F2和NI-203.15C7抗体特异性地识别病理性IAPP原纤维并符合这些抗体的生化结合特性，其显示出体外对IAPP原纤维的强结合特异性(图5)。
实施例5：NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体不与诊断有阿尔茨海默氏病的患者的脑中的病理性Aβ淀粉样蛋白交叉反应
诊断有阿尔茨海默氏病的患者的石蜡包埋的脑切片被用于评估示例性的NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体的交叉反应。在甲酸预处理之后，切片与人NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体(50nM)或小鼠单克隆抗β淀粉样蛋白抗体6E10(1:2000；Covance，Allschwill，瑞士)一起孵育，随后与生物素化的驴抗人二抗(1:500；Jackson ImmunoResearch，纽马基特，英国)或生物素化的山羊抗小鼠二抗(1:500；JacksonImmunoResearch，纽马基特，英国)一起孵育。抗体信号利用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，美国)进行扩增，并且用二氨基联苯胺底物(Thermo FisherScientific，USA)进行检测。
与抗β淀粉样蛋白的特异性抗体6E10相比，NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体不识别在阿尔茨海默氏病的人脑中的病理性Aβ淀粉样蛋白(图10)。同样似乎适用于抗体NI-203.19F2和NI-203.15C7。
这些数据表明，NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体对病理Aβ淀粉样蛋白没有交叉反应性。因此，已经证明由于错折叠/聚集倾向通过直接ELISA，NI-203.9A2、NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体与几种蛋白质候选者的交叉反应性结合也是最小的，包括最显著的形成淀粉样蛋白的蛋白，包括，但不限于，α-突触核蛋白，超氧化物歧化酶1(SOD1)，Tau和TAR结合蛋白43(TDP-43)。
实施例6：小鼠嵌合NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体的质量控制
为了验证示例性小鼠嵌合的NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体，如上所述进行直接ELISA测定。将嵌合抗体与相应的人抗体进行比较。对于示例性的重组嵌合NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体，以及它们的相应的人抗体，96孔微板(Costar，康宁，美国)用人IAPP溶液或用BSA(Sigma-Aldrich，Buchs，瑞士)涂布，其被稀释到在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、pH 9.42)中的10μg/ml的浓度，并且对嵌合和人抗体的结合效率进行测试。使用结合有HRP的驴抗人IgGγ抗体(JacksonimmunoResearch，纽马基特，英国)来确定结合，接着是在标准比色测定法测量HRP活性。重要的是，用于ELISA测定的人IAPP溶液含有IAPP原纤维，如通过电子显微镜所示出的；参见图3A。EC50值通过使用GraphPad Prism(圣地亚哥，美国)软件的非线性回归来估计。
NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11小鼠嵌合抗体分别以18.6nM、23.9nM和11.5nM的EC50以高亲和力与人IAPP原纤维结合。在BSA上没有观察到结合。嵌合抗体的结合亲和力类似于它们的人对应物，其中对于人NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体，EC 50分别为9.4nM、22.9nM和6.8nM；参见图11。
示例性的小鼠嵌合NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体进一步在两个选择的诊断有2型糖尿病(T2D)的患者的石蜡包埋的胰腺切片上验证，并且显示出胰岛淀粉样蛋白沉积物。在甲酸预处理之后，切片与嵌合的NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体(50nM)一起孵育，随后与生物素化的驴抗人二抗(1:500；JacksonImmunoResearch，纽马基特，英国)一起孵育。抗体信号利用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，美国)进行扩增，并用二氨基联苯胺底物(Thermo FisherScientific，USA)检测。在抗生物素蛋白/生物素阻断(抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒，Vector Laboratories，美国)之后，胰岛β细胞利利用多克隆豚鼠抗胰岛素抗体(1:5；Dako，美国)可视化，其与生物素化的驴抗豚鼠二抗(1:500；ImmunoResearch Laboratories，美国)结合，并且抗体信号用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，美国)进行扩增，并用碱性磷酸酶底物(Vector Laboratories，美国)进行检测。
NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11嵌合抗体在来自两个T2D患者的淀粉样蛋白阳性切片上显示出明显的胰岛染色(图12)。
这些数据表明，嵌合的NI-203.9A2，NI-203.19H8和NI-203.26C11抗体以可与它们的人对应物相比的效力特异性地识别病理性IAPP原纤维(图12)。
实施例7：在T2D动物模型中IAPP和/或proIAPP抗体的治疗效果的体内验证
铅抗体候选物在两种转基因小鼠模型和大鼠模型中验证，其表达hIAPP：1)h-IAPP(半合子)/C57BL/6/DBA小鼠，其暴露于高脂肪饮食(Hull等人，(2003)，Diabetes 52:372-379)；2)h-IAPP(半合子)/Avy/A，其暴露于标准饮食(Butler等人(2003)，Diabetes 52:2304-2314)；3)h-IAPP(纯合)/CD大鼠，其暴露于标准饮食(Butler等人.(2004),Diabetes53:1509-1516)。治疗效力通过确定胰腺中的β细胞团块和hIAPP淀粉样蛋白负荷以及hIAPP的血浆水平，以及葡萄糖代谢和胰岛素分泌的功能测试来评估。
1)生理特征
测试了II型糖尿病动物模型的下列生理特征(i)至(ⅶ)，以检查本申请的抗体的应用是否显示预防和/或治疗效果。
(i)血糖：
对T2D动物模型的血糖水平进行测试并与未处理的动物和正常(不是T2D模型)的品系动物进行比较。
“正常品系小鼠”在此没有特别限定并且可以是任何小鼠，只要它没有显示出血糖水平，尿素糖，胰岛素分泌等的异常即可。“正常品系小鼠”的优选实例包括KOR小鼠，NC小鼠和实验室小鼠，其在生产同类系小鼠(例如，C3H/He小鼠，BALB/c小鼠，和C57BL/6小鼠)中被用作轮回亲本。
“正常品系大鼠”这里没有特别限定并且可以是任何的大鼠，只要它没有显示出血糖水平，尿素糖，胰岛素分泌等的异常即可。
由于在小鼠和大鼠模型中的糖尿病优选通过hIAPP的转基因表达来诱导，因此，优选地，相同的品系被用作对照，如原始被用于转基因动物的生产的那些。
表述“与正常品系的小鼠/大鼠相比具有较高的血糖水平”是指禁食的血糖水平(血液中的葡萄糖浓度)高于禁食的正常品系小鼠/大鼠的水平。130mg/dl或更高，更优选140mg/dl或更高，进一步优选200mg/dl并且进一步更优选300mg/dl或更高的糖尿病患者的血糖水平被归类为更高的血糖。此外，如这里所使用的术语“禁食”是指在小鼠/大鼠禁食开始的约12小时之后的状态。
在本发明中，“血糖水平”可以通过本领域技术人员已知的常规方法，例如使用市售的测量装置(例如，Medisafe Reader；Terumo Co.、Ltd.)根据在下文的实施例中描述的方法进行测量。
测量血糖水平的示例性方法
使用商业测量装置(Medisafe Reader,Terumo Co.,Ltd.)对受试动物的血糖水平(血糖浓度)进行测量。这种装置的测量原理如下进行说明。测量是基于比色分析。制备测量芯片，并且将作为催化剂的葡萄糖氧化酶和过氧化物酶和作为显色剂的4-氨基安替吡啉(4-aminoantipyrine)和N-乙基-N(2-羟基-3-磺丙基)-间-甲苯胺置于该芯片上。当通过毛细管现象吸附的血液样品被置于该芯片上时，血液中的葡萄糖于是被葡萄糖氧化酶氧化。于是，芯片上的显色剂是通过此刻产生的过氧化氢和过氧化物酶进行氧化的，这将产生红紫色。血液中的葡萄糖的量通过测量该色调的程度进行计算。
这里，4μl的全血由受试动物获得作为血液样品，并且使用18秒的测量时间进行测量。
(ii)糖化血红蛋白(HbA1c)的浓度：
测试II型糖尿病动物模型的增加的血液糖化血红蛋白浓度并且与未处理的T2D模型动物和正常的非T2D模型动物进行比较。2.5％或更高，2.6％或更高，进一步2.8％或更高，并进一步3.0％或更高的浓度被分类为增加的。
如本文所用的“糖化血红蛋白浓度”是指红细胞中血红蛋白分子与附着至它们的葡萄糖的比例。糖化血红蛋白浓度可以被用作指标，以判断对糖尿病患者的治疗控制的适当性，并且已知能更好地与在比当前时间早1至2个月的血糖水平相关。
根据实施例中描述的方法，所述“糖化血红蛋白浓度”可以通过本领域技术人员已知的常规方法，例如使用市售的测量装置(例如，DCA 2000System；Bayer Medical Ltd.)进行测量。更具体地，例如，当上述的DCA 2000系统被用作测量装置时，总的血红蛋白的量由硫氰-高铁血红蛋白法测量并且糖化血红蛋白的量由胶乳凝固抑制反应进行测量。
(iii)尿糖：
这里测试了对照动物和T2D模型动物的尿糖。
如这里使用的术语“在尿糖的测试中为阳性”是指在动物排泄的尿中的葡萄糖浓度为100mg/dl或更高。尿葡萄糖的浓度可以通过常规的方法来测定，例如，通过在下文的实施例中描述的方法，使用市售的试剂盒(例如，Pretest；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)。具体地，例如，当Pretest被用作测量试剂盒时，动物的尿液样品首先被放在Pretest(预测试)的试纸上，并且在30秒后，根据该试剂盒中的用于分为从-至+4的五个等级的指定色表进行判断。从判断的结果估计的尿糖浓度为对于+1的100–250mg/dl，对于+2的250–500mg/dl，对于+3的500–2000mg/dl以及对于+4的2000mg/dl或更高。+1和更高的判断结果被评价为“在尿糖的测试中为阳性”。
测量尿糖的示例性方法
受试动物的尿葡萄糖(尿糖)通过本领域技术人员已知的方法，例如使用商业试剂盒(Pretest；Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)进行测量。首先，将动物的尿液样品印迹到上述Pretest(预测试)的试纸上，并且在30秒后，根据用于分为从-至+4的五个等级规定的色表进行判断。由判断的结果估计的尿糖浓度为对于+1的100–250mg/dl，对于+2的250–500mg/dl，对于+3的500–2000mg/dl以及对于+4的2000mg/dl或更高。+1和更高的判断结果被评价为“在尿糖的测试中为阳性”。
(iv)血液胰岛素浓度：
测试II型糖尿病动物模型的血液胰岛素浓度是否可与等于或高于未处理的和非糖尿病对照动物(正常品系动物)的水平进行比较。
血液胰岛素浓度“等于或高于正常品系动物”的表述是指禁食的血液胰岛素浓度等于或高于禁食的正常品系动物，例如90pg/ml或更高，或110pg/ml或更高。
在本发明中，“血液胰岛素浓度”可以通过常规方法，例如，使用Levis胰岛素U型测定试剂盒(Shibayagi Co.)，根据下文在实施例中描述的方法进行测量。更具体地，例如，抗胰岛素单克隆抗体(小鼠)被固定在板上，样品中的胰岛素被结合在其上，之后，使识别胰岛素的另一位点的生物素标记的抗胰岛素单克隆抗体与其反应，进一步向其中加入过氧化物酶-抗生物素蛋白结合物以结合至生物素，最后加入发色物质从而通过显色来测量胰岛素。
测量血液胰岛素浓度的示例性方法
受试小鼠的血液胰岛素浓度利用本领域技术人员已知的方法进行测量，其例如被并入到商业试剂盒(Levis胰岛素U型测定试剂盒；Shibayagi Co.)中。以下述方式来测量胰岛素浓度。抗胰岛素单克隆抗体被固定到板上，使样品中的胰岛素与其结合，之后，使识别胰岛素的另一部分的生物素标记的抗胰岛素单克隆抗体反应，进一步向其中加入过氧化物酶-抗生物素蛋白结合物以结合至生物素，最后加入发色物质从而通过显色来测量胰岛素。对于正常动物(小鼠)来说，测量的范围通常为39至2,500pg/ml。
(v)葡萄糖耐量：
测试经处理的和未经处理的T2D模型动物和正常动物的异常葡萄糖耐量。
动物的葡萄糖耐量是否正常或异常可以由葡萄糖耐量试验来确认。葡萄糖耐量试验可以根据本领域技术人员已知的常规方法，例如，通过将葡萄糖以每克体重2mg腹膜内给予禁食(至少12小时)动物并且在葡萄糖耐量试验过程中在特定的时间测量动物的血糖水平(例如，在240分钟内每15分钟)实施。当结果表明与正常小鼠相比，血糖水平没有显示出随时间减少的趋势时，葡萄糖耐量被评价为异常。当在经处理(经治疗)的动物中的结果显示出与非处理的动物相比随时间减少的倾向时，用本发明的抗体的治疗被分类为有效。
评价葡萄糖耐量的示例性方法
通过葡萄糖耐量试验来评价受试动物的葡萄糖耐量。
通过首先将葡萄糖以每克体重2mg腹膜内给予禁食动物12小时，然后测量动物的血液(外周血)中的葡萄糖水平(在240分钟内每隔15分钟)，来进行葡萄糖耐量试验。血糖水平通过上述方法进行测量。当结果表明，血糖水平表现出与正常动物相比没有随时间而减少的趋势时，葡萄糖耐量被评定为异常。与未处理的T2D模型动物相比，在处理的动物中随时间的更快减少被评估为本发明的治疗的效率的一个标志。
(vi)胰岛素敏感性：
测试经处理的和未经处理的T2D模型动物和正常动物的异常胰岛素敏感性。
动物的胰岛素敏感性是正常还是异常可以通过胰岛素敏感性试验来确认。胰岛素敏感性试验可以根据本领域技术人员已知的常规方法，例如，通过将胰岛素以每kg体重0.5-0.85U腹膜内给予禁食动物并且在胰岛素敏感性试验过程中在特定的时间测量动物的血糖水平(例如，在240分钟内每隔15分钟)来实施。当结果表明与正常小鼠相比，血糖水平没有显示出随时间减少的趋势时，胰岛素敏感性被评价为异常。当在经处理的动物中的结果显示出与非处理的动物相比随时间减少的倾向时，用本发明的抗体的治疗被分类为有效。
评价胰岛素敏感性的示例性方法
通过胰岛素敏感性试验来评价受试动物的胰岛素敏感性。
通过首先将胰岛素以每kg体重0.5-0.85U腹膜内给予禁食动物12小时，然后测量动物的血液(外周血)中的葡萄糖水平(在240分钟内每隔15分钟)，来进行胰岛素敏感性测试。血糖水平通过上述方法进行测量。当结果表明血糖水平表现出与正常动物相比没有随时间而减少的趋势时，胰岛素敏感性被评定为异常。与未处理的T2D模型动物相比，在处理的动物中随时间的更快减少被评估为本发明的治疗的效率的一个标志。
(vii)其他：
多饮和多尿的评估
在糖尿病发病后并且在本发明的抗体的治疗过程中，对II型糖尿病模型动物进行测试，以便显示出增加的饮水和增加的排尿的倾向。增加的饮水的倾向可以例如通过仔细监测置于饲养笼中的水瓶中的水体积的减少速率并且将其与用于正常品系的动物以及与非处理的动物进行比较来确认。此外，增加的排尿的倾向可以例如通过观察在饲养笼中的底板的润湿的程度并且如之前说明的将其进行比较来确认。
在小鼠中是否存在肥胖倾向的判断
对处理过的、未处理的T2D模型动物和正常动物的体重进行测量和比较。与未处理的动物相比的经处理的动物的减少的体重和/或处理的和正常动物的可比重量被评估为本发明的处理的效率的一个标志。
2)组织病理学检查
将II型糖尿病动物、未处理的T2D模型对照和正常动物的胰腺组织固定，包埋在石蜡中并按照实施例4的方法进行染色和分析，用于胰岛(郎格罕氏小岛)β细胞上的淀粉样蛋白的胰淀素沉积物。类似地，β细胞凋亡和β细胞存活通过使用适当的标记物的免疫染色(例如，用于细胞凋亡的TUNEL和裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)染色和用于β细胞区域的胰岛素染色)进行评估。与未处理的动物相比，在处理的动物中的胰岛中，淀粉样蛋白沉积物和/或β细胞凋亡的减少和/或β细胞存活的增加或在经处理的动物中和正常动物中的可比水平被评估为本发明的预防和/或治疗方法的有效性的标志。
3)动物的外壳
将II型糖尿病动物模型保持在SPF条件下并且相应地如前所述进行(Hull等人.(2003),Diabetes 52:372-379；Butler等人.(2003),Diabetes 52:2304-2314；Butler等人.(2004),Diabetes 53:1509-1516)。在6周龄时，h-IAPP(半合子)/C57BL/6/DBA小鼠被分配显示出促进胰岛淀粉样蛋白形成的高脂肪饮食(Hull等人.(2003),Diabetes 52:372-379)。
Figure IDA0000681248540000011
Figure IDA0000681248540000021
Figure IDA0000681248540000031
Figure IDA0000681248540000041
Figure IDA0000681248540000051
Figure IDA0000681248540000061
Figure IDA0000681248540000071
Figure IDA0000681248540000081
Figure IDA0000681248540000091
Figure IDA0000681248540000101
Figure IDA0000681248540000111
Figure IDA0000681248540000121
Figure IDA0000681248540000131
Figure IDA0000681248540000141
Figure IDA0000681248540000151
Figure IDA0000681248540000161
Figure IDA0000681248540000171
Figure IDA0000681248540000181
Figure IDA0000681248540000191
Figure IDA0000681248540000201
Figure IDA0000681248540000211
Figure IDA0000681248540000221
Figure IDA0000681248540000231
Figure IDA0000681248540000241
Figure IDA0000681248540000251
Figure IDA0000681248540000261
Figure IDA0000681248540000271
Figure IDA0000681248540000281
Figure IDA0000681248540000291
Figure IDA0000681248540000301
Figure IDA0000681248540000311
Figure IDA0000681248540000321
Figure IDA0000681248540000331
Figure IDA0000681248540000341
Figure IDA0000681248540000351
Figure IDA0000681248540000361
Figure IDA0000681248540000371
Figure IDA0000681248540000381
Figure IDA0000681248540000391
Figure IDA0000681248540000401
Figure IDA0000681248540000411
Figure IDA0000681248540000421

Claims (26)

1.一种人单克隆抗胰岛淀粉样多肽(IAPP)抗体，其特征在于，所述抗体
(i)相对于生理性IAPP和/或proIAPP优先识别包括IAPP和/或proIAPP寡聚物和/或原纤维的人IAPP和/或proIAPP聚集体，并且
(ii)基本上不识别在阿尔茨海默氏病的人脑中的β-淀粉样肽Aβ1-42，其中，所述抗体是
(a)能够结合人IAPP的表位的抗体，其中，所述抗体在其可变区中包括以下六个互补性决定区(CDR)：
(i)VHCDR1：SEQ ID NO:12的位置26-35，
VHCDR2：SEQ ID NO:12的位置50-66，
VHCDR3：SEQ ID NO:12的位置99-110，
VLCDR1：SEQ ID NO:14的位置24-34，
VLCDR2：SEQ ID NO:14的位置50-56，和
VLCDR3：SEQ ID NO:14的位置89-96；
(ii)VHCDR1：SEQ ID NO:16的位置26-35，
VHCDR2：SEQ ID NO:16的位置50-66，
VHCDR3：SEQ ID NO:16的位置99-111，
VLCDR1：SEQ ID NO:18的位置24-34，
VLCDR2：SEQ ID NO:18的位置50-56，和
VLCDR3：SEQ ID NO:18的位置89-97；
(iii)VHCDR1：SEQ ID NO:20的位置26-37，
VHCDR2：SEQ ID NO:20的位置52-67，
VHCDR3：SEQ ID NO:20的位置100-110，
VLCDR1：SEQ ID NO:22的位置24-38，
VLCDR2：SEQ ID NO:22的位置54-60，和
VLCDR3：SEQ ID NO:22的位置93-101；
(iv)VHCDR1：SEQ ID NO:64的位置26-35，
VHCDR2：SEQ ID NO:64的位置50-66，
VHCDR3：SEQ ID NO:64的位置99-116，
VLCDR1：SEQ ID NO:66的位置24-34，
VLCDR2：SEQ ID NO:66的位置50-56，和
VLCDR3：SEQ ID NO:66的位置89-96；或
(v)VHCDR1：SEQ ID NO:68的位置25-35，
VHCDR2：SEQ ID NO:68的位置50-66，
VHCDR3：SEQ ID NO:68的位置99-112，
VLCDR1：SEQ ID NO:70的位置23-35，
VLCDR2：SEQ ID NO:70的位置51-57，和
VLCDR3：SEQ ID NO:70的位置90-100；或
(b)能够结合人IAPP和proIAPP的表位的抗体，其中，所述抗体在其可变区中包括以下六个互补性决定区(CDR)：
VHCDR1：SEQ ID NO:20的位置26-37，
VHCDR2：SEQ ID NO:20的位置52-67，
VHCDR3：SEQ ID NO:20的位置100-110，
VLCDR1：SEQ ID NO:22的位置24-38，
VLCDR2：SEQ ID NO:22的位置54-60，和
VLCDR3：SEQ ID NO:22的位置93-101。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体特异性地结合包括氨基酸序列SSNNFGA(SEQ ID NO:4)、CNTATCA(SEQ ID NO:5)、或QRLANFLVHS(SEQ ID NO:71)的IAPP表位。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，包括：
选自以下的VH和VL区的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14
(ii)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18
(iii)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22
(iv)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66，和
(v)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:70。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体是嵌合的啮齿动物-人抗体或啮齿动物化抗体。
5.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体的IAPP和/或proIAPP结合片段选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段组成的组。
6.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体被可检测性地标记。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中，所述标记选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
8.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体附着至药物。
9.一种或多种编码根据权利要求1至5中任一项所述的抗体的多核苷酸。
10.一种或多种载体，包括根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种包括根据权利要求9所述的多核苷酸或根据权利要求10所述的载体的宿主细胞。
12.一种用于制备抗IAPP或抗proIAPP抗体的方法，所述方法包括：
(a)培养根据权利要求11所述的细胞；以及
(b)从培养物中分离所述抗体。
13.一种由根据权利要求9所述的多核苷酸编码或者由根据权利要求12所述的方法获得的抗体。
14.根据权利要求13所述的抗体，所述抗体被可检测性地标记。
15.根据权利要求14所述的抗体，其中，所述标记选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的抗体，所述抗体附着至药物。
17.一种组合物，包括根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或权利要求13至16中任一项所述的抗体、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的载体或根据权利要求11所述的细胞。
18.根据权利要求17所述的组合物，所述组合物是药物组合物并且还包括药学上可接受的载体。
19.根据权利要求18所述的组合物，所述组合物还包括可用于治疗2型糖尿病(T2D)和/或治疗或预防伴随临床胰岛移植的胰岛排斥反应的另外的药剂。
20.根据权利要求17所述的组合物，所述组合物是诊断组合物，并且包括常规用于基于免疫或核酸的诊断方法中的试剂。
21.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或权利要求13至16中任一项所述的抗体、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的载体或根据权利要求11所述的细胞在制备用于预防性治疗、治疗性治疗与IAPP和/或proIAPP相关的疾病和/或监测与IAPP和/或proIAPP相关的疾病的进展或对与IAPP和/或proIAPP相关的疾病的治疗的反应的药物或诊断组合物中的应用。
22.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或13至16中任一项所述的抗体在制备用于在受试者中诊断或监测胰岛淀粉样变性的进展的药物中的应用，其中，至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或13至16中任一项所述的抗体被用于确定在来自待诊断的受试者的样品中IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的存在，其中，IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的存在是症状前、前驱或临床2型糖尿病(T2D)和/或伴随临床胰岛移植的β细胞衰竭的指示，并且IAPP和/或proIAPP寡聚物、聚集体或原纤维的水平相比于生理性IAPP的水平或相比于来自健康对照受试者的参照样品或来自相同受试者的对照样品的增加指示在所述受试者中症状前、前驱或已确立的2型糖尿病(T2D)和/或伴随临床胰岛移植的胰岛衰竭的进展。
23.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或13至16中任一项所述的抗体在制备用于体内检测或者在人体或动物体内将治疗和/或诊断剂靶向IAPP和/或proIAPP的组合物中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用，其中，所述体内检测包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
25.一种用于诊断或监测胰岛淀粉样变性的进展的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或13至16中任一项所述的抗体，根据权利要求9所述的多核苷酸，根据权利要求10所述的载体或根据权利要求11所述的细胞。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括试剂和/或使用说明书。
CN201380047659.6A 2012-09-12 2013-09-12 人胰岛淀粉样多肽(hiapp)特异性抗体及其用途 Active CN104812774B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011111797.4A CN112225808A (zh) 2012-09-12 2013-09-12 人胰岛淀粉样多肽（hiapp）特异性抗体及其用途

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261700110P 2012-09-12 2012-09-12
EP12184134.0 2012-09-12
EP12184134 2012-09-12
US61/700,110 2012-09-12
PCT/EP2013/068907 WO2014041069A1 (en) 2012-09-12 2013-09-12 Human islet amyloid polypeptide (hiapp) specific antibodies and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011111797.4A Division CN112225808A (zh) 2012-09-12 2013-09-12 人胰岛淀粉样多肽（hiapp）特异性抗体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104812774A CN104812774A (zh) 2015-07-29
CN104812774B true CN104812774B (zh) 2020-11-06

Family

ID=46832278

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011111797.4A Pending CN112225808A (zh) 2012-09-12 2013-09-12 人胰岛淀粉样多肽（hiapp）特异性抗体及其用途
CN201380047659.6A Active CN104812774B (zh) 2012-09-12 2013-09-12 人胰岛淀粉样多肽(hiapp)特异性抗体及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011111797.4A Pending CN112225808A (zh) 2012-09-12 2013-09-12 人胰岛淀粉样多肽（hiapp）特异性抗体及其用途

Country Status (18)

Country Link
US (4) US9475866B2 (zh)
EP (1) EP2895512B1 (zh)
JP (2) JP6225189B2 (zh)
KR (1) KR102117969B1 (zh)
CN (2) CN112225808A (zh)
AU (1) AU2013314301B2 (zh)
CA (1) CA2884581C (zh)
DK (1) DK2895512T3 (zh)
EA (1) EA201590459A1 (zh)
ES (1) ES2687520T3 (zh)
HK (1) HK1210185A1 (zh)
HR (1) HRP20181398T1 (zh)
LT (1) LT2895512T (zh)
MX (1) MX365387B (zh)
PL (1) PL2895512T3 (zh)
RS (1) RS57807B1 (zh)
SI (1) SI2895512T1 (zh)
WO (1) WO2014041069A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
US9475866B2 (en) 2012-09-12 2016-10-25 Neurimmune Holding Ag Human islet amyloid polypeptide (hIAPP) specific antibodies and uses thereof
US9850302B2 (en) 2013-07-12 2017-12-26 Prothena Biosciences Limited Antibodies that recognize IAPP
US20150191541A1 (en) * 2013-12-06 2015-07-09 Neotope Biosciences Limited Antibodies that recognize iapp
AU2015228818B2 (en) 2014-03-12 2021-02-11 Neurimmune Holding Ag Novel compounds capable of antagonizing islet amyloid polypeptide (IAPP) induced beta-cell damage and impaired glucose tolerance
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
KR101893244B1 (ko) * 2015-05-22 2018-08-30 가천대학교 산학협력단 당뇨병에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도
CN106279414A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 天津医科大学总医院 人源性抗胰淀素抗体及其制备方法
AU2018321335A1 (en) 2017-08-22 2020-02-27 Biogen Ma Inc. Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
US20200147026A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Diagnosis of diabetes by detecting aggregated amylin in erythrocytes
US20220119468A1 (en) * 2019-02-22 2022-04-21 Loyola Marymount University Amyloid peptide variants
TW202144387A (zh) * 2020-02-11 2021-12-01 美商聯合生物醫學公司 針對胰島澱粉樣多肽（iapp）的胜肽免疫原及其預防和治療與聚集iapp相關疾病的製劑
US20230312728A1 (en) * 2020-08-18 2023-10-05 The Regents Of The University Of California Methods and Compositions for Diabetes Treatment and Beta-Cell Regeneration
WO2023099788A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003092619A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Wyeth Holdings Corporation Prevention and treatment of type 2 diabetes
WO2011151833A1 (en) * 2010-06-03 2011-12-08 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods of treating diabetes and compositions capable of same

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5298605A (en) * 1986-10-08 1994-03-29 Regents Of The University Of Minnesota Antibodies to islet amyloid polypeptide (IAPP) and subunits thereof
GB8709871D0 (en) * 1987-04-27 1987-06-03 Turner R C Peptides
US5266561A (en) * 1988-01-11 1993-11-30 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of type 2 diabetes mellitus
KR101155294B1 (ko) * 2000-06-16 2013-03-07 캠브리지 안티바디 테크놀로지 리미티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
AU2003207973A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-02 Tel Aviv University Future Technology Development L.P. Peptides antibodies directed thereagainst and methods using same for diagnosing and treating amyloid-associated diseases
AU2003210060B2 (en) 2002-03-22 2010-02-25 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
JP4662719B2 (ja) * 2002-04-19 2011-03-30 ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント アルツハイマー病の処置のための免疫学的方法および組成物
EP2719394B1 (en) 2003-06-30 2015-07-29 Tel Aviv University Future Technology Development L.P. Peptides for treating amyloid-associated diseases
CN1980954A (zh) * 2004-02-11 2007-06-13 安米林药品公司 胰岛淀粉样多肽家族肽及其制备和使用方法
WO2005079830A1 (en) * 2004-02-23 2005-09-01 Paul Fraser Inhibitors of amyloid fibril formation and uses thereof
CA2504471A1 (en) * 2004-06-18 2005-12-18 Neurochem (International) Limited Pharmaceutical formulations of amyloid inhibiting compounds
GB0501348D0 (en) * 2005-01-24 2005-03-02 Zyentia Ltd Compositions and methods
AU2008278803A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to KDR and uses thereof - 035
EA036059B1 (ru) 2007-12-28 2020-09-21 Протена Байосайенсиз Лимитед Способ получения антитела или его фрагмента, которое специфически связывается с агрегированным амилоидным белком
US9475866B2 (en) 2012-09-12 2016-10-25 Neurimmune Holding Ag Human islet amyloid polypeptide (hIAPP) specific antibodies and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003092619A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Wyeth Holdings Corporation Prevention and treatment of type 2 diabetes
WO2011151833A1 (en) * 2010-06-03 2011-12-08 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods of treating diabetes and compositions capable of same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018057381A (ja) 2018-04-12
LT2895512T (lt) 2018-09-25
CN112225808A (zh) 2021-01-15
MX2015003150A (es) 2015-12-16
AU2013314301A1 (en) 2015-04-16
US20150210759A1 (en) 2015-07-30
EP2895512A1 (en) 2015-07-22
US20180346558A1 (en) 2018-12-06
DK2895512T3 (en) 2018-10-15
CN104812774A (zh) 2015-07-29
US10882902B2 (en) 2021-01-05
US20160376354A1 (en) 2016-12-29
US20210107972A1 (en) 2021-04-15
RS57807B1 (sr) 2018-12-31
JP2015535682A (ja) 2015-12-17
EP2895512B1 (en) 2018-07-04
US9475866B2 (en) 2016-10-25
US10072074B2 (en) 2018-09-11
KR20150043562A (ko) 2015-04-22
JP6225189B2 (ja) 2017-11-01
SI2895512T1 (sl) 2018-10-30
PL2895512T3 (pl) 2018-11-30
WO2014041069A1 (en) 2014-03-20
AU2013314301B2 (en) 2018-02-15
CA2884581A1 (en) 2014-03-20
HK1210185A1 (zh) 2016-04-15
ES2687520T3 (es) 2018-10-25
HRP20181398T1 (hr) 2018-10-19
MX365387B (es) 2019-05-31
EA201590459A1 (ru) 2015-11-30
CA2884581C (en) 2024-01-23
KR102117969B1 (ko) 2020-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104812774B (zh) 人胰岛淀粉样多肽(hiapp)特异性抗体及其用途
JP6841449B2 (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）アミロイドーシスに対する抗体療法及びそのためのヒト由来抗体
US10703808B2 (en) Human anti-alpha-synuclein antibodies
JP6302517B2 (ja) 抗アルファシヌクレイン結合分子
JP7235939B2 (ja) ヒト由来抗ハンチンチン（ｈｔｔ）抗体及びその使用
CN108064248B (zh) 人源抗二肽重复(dpr)抗体
TR201812636T4 (tr) İnsan anti-tau antikorları.
EA042691B1 (ru) Специфические антитела к островковому амилоидному полипептиду человека (hiapp) и их применение
BR112015005549A2 (pt) anticorpos específicos polipeptídicos amiloides de ilhota humanos (hiapp) e suas utilizações
NZ618914B2 (en) Anti-alpha synuclein binding molecules

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant