TR201812636T4 - İnsan anti-tau antikorları. - Google Patents

İnsan anti-tau antikorları. Download PDF

Info

Publication number
TR201812636T4
TR201812636T4 TR2018/12636T TR201812636T TR201812636T4 TR 201812636 T4 TR201812636 T4 TR 201812636T4 TR 2018/12636 T TR2018/12636 T TR 2018/12636T TR 201812636 T TR201812636 T TR 201812636T TR 201812636 T4 TR201812636 T4 TR 201812636T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
tau
antibodies
human
binding
Prior art date
Application number
TR2018/12636T
Other languages
English (en)
Inventor
Chen Feng
Grimm Jan
Baeriswyl Jean-Luc
Nitsch Roger
Hock Christoph
Original Assignee
Biogen Int Neuroscience Gmbh
Univ Zurich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Int Neuroscience Gmbh, Univ Zurich filed Critical Biogen Int Neuroscience Gmbh
Publication of TR201812636T4 publication Critical patent/TR201812636T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

Yeni insan tauya-özgü antikorların yanı sıra bunun fragmanları, türevleri ve varyantları, ayrıca bununla ilgili yöntemler sağlanmaktadır. Tauya özgü antikorlarla ilgili tayinler, kitler ve sağlam destekler de açıklanmaktadır. Antikor, bunun immünoglobülin zincir(ler)i, ayrıca fragmanları, türevleri ve varyantları, sırasıyla, tau hedefli immünoterapi ve tanı için farmasötik ve tanısal bileşimlerde kullanılabilir.

Description

TARIFNAME INSAN ANTI-TAU ANTIKORLARI BULUSUN ALT YAPISI Bulusun Alani Mevcut bulus genel olarak, patolojik olarak fosforile tau ve taunun kümelenmis formlari dahil olmak üzere, tau proteinini taniyan yeni tauya-özgü insan antikorlarinin yani sira bunlarin fragmanlariyla ilgilidir. Ek olarak, mevcut bulus, Alzheimer hastaligi (AD), amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksi (ALS-PDC), argirofilik gren demansi (AGD), Ingiliz tipi amiloid anjiyopati, serebral amiloid anjiyopati, kortikobazal dejenerasyon (CBD), Creutzfeldt-Jakob hastaligi (CJD), pugilistik demans, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklar, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom 17'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demans (FTDP-l7), frontotemporal lober dejenerasyon, Gerstmann-Straussler-Scheinker hastaligi, Hallervorden-Spatz hastaligi, inklüzyon cisimcigi miyoziti, multipl sistem atrofisi, miyotonik distrofi, Niemann-Pick hastaligi tip C (NP-C), nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaligi, Pick hastaligi (PiD), postensefalitik parkinsonizm, prion proteini serebral amiloid anjiyopati, progresif subkortikal gliyoz, progresif supranükleer palsi (PSP), subakut sklerozan panensafilt, sadece yumak demansi, multipl enfarktli demans ve iskemik inme gibi nörodejeneratif tauopatilerin tedavisi için, her ikisi de plazmada ve CSF'de ve ayrica pasif asilama stratejilerinde taunun ve toksik tau türlerinin tanimlanmasi için tanisal bir araç olarak degerli olan bu tip antikorlari ve bunlarin fragmanlarini içeren farmasötik ve tanisal bilesimlerle ilgilidir.
Altyapi Teknigi Protein birikimi, modifikasyonlari ve kümelesmesi, sayisi nörodejeneratif hastaliklarin patolojik yönleridir.
Hiperfosforile tau konformerleri dahil olmak üzere patolojik olarak modifiye ve kümelenmis tau, tauopatilerin degismez bir ayirici özelligidir ve hastalik siddetiyle koreledir.
Tau, mikrotübülleri stabilize etme temel fonksiyonuna sahip, merkezi sinir sisteminde eksprese edilen. mikrotübül-iliskili bir` proteindir. Taunun, esas olarak yetiskin insan beyninde eksprese edilen, alternatif uç birlestirmeyle bir tek genden türetilen alti asil izoformu bulunmaktadir. Patolojik kosullar altinda, tau proteini, tübülin baglanmasinin bir kaybiyla ve mikrotübüllerin istikrarsizlasmasiyla, ardindan patojenik nörofibriler yumaklarinda taunun kümelesmesiyle ve birikmesiyle sonuçlanan sekilde hiperfosforile hale gelir. Tau ile ilgili - toplu olarak nörodejeneratif tauopatiler olarak ifade edilen - rahatsizliklar, digerleri arasinda Alzheimer hastaligi (AD), progresif supranükleer palsi, Pick hastaligi, kortikobazal dejenerasyon, FTDP-17 dahil olmak üzere, proteini yanlis katlayan bir rahatsizliklar grubunun parçasidir. Tau geninde 40'tan fazla mutasyonun, tau geni mutasyonlarinin nörodejenerasyonu tetiklemek için yeterli oldugunu gösterir sekilde kalitimsal frontotemporal demansla iliskili oldugu 40). Transgenik farelerde ve hücre kültüründeki çalismalar, AD'de tau patolojisine, Aß'nin taunun akis yukarisinda yer aldigi patolojik bir kaskadin neden oldugunu göstermektedir bulgular, her iki kaskadin birbirinden bagimsiz olarak islev gördügü bir ikili-yolak modelini isaret etmektedir (van de Nes amiloid peptidini hedefleyen immünoterapiler, havyan modellerinde cesaretlendirici sonuçlar saglamis ve klinik deneylerde umut göstermistir. Az sayidaki süjelerden daha yakin dönemdeki otopsi verileri, ilerlemis AD'si olan hastalarda. beta-amiloid. plaklarin klirensinin, AD için ilave terapötik stratejilere olan ihtiyaci vurgulayacak sekilde, bilissel bozulmayi durdurmak için yeterli olamayabilecegini hayvan modellerinde Abeta-esasli bagisiklama terapisinin basarisi yolunda, aktif immünoterapi kavrami tau proteinine genisletilmistir. Ancak, dogal tip farelerin tau proteini kullanilarak aktif asilamasinin, merkezi sinir sisteminde, nörofibriler yumaklarin, aksonal hasarin ve tek çekirdekli infiltratlarin, nörolojik eksikliklerin eslik ettigi olusumunu indükledigi bulunmustur (Rosenmann et al., Arch Neurol. 63 kullanilarak transgenik fare çizgilerindeki müteakip çalismalar, beyinde tau agregatlarinin indirgenmis beyin seviyelerini ve davranis bozukluklarinin yavaslamis ilerleyisini ortaya çikarmistir (Sigurdsson, J. Alzheimers. tauyu hedefleyen aktif immünoterapi yaklasimlariyla iliskili muazzam riskleri de vurgulamaktadir. Etkili ve güvenli terapiyle patolojik tau proteinlerine deginen yeni terapötik stratejilere acil olarak ihtiyaç bulunmaktadir.
WO 03/014960 A2, hücre içi kullanim için faj üzerinde eksprese edilen insan antikor fragmanlarinin (scFv'ler) bir kitapligindan (scFv faj görüntüleme kitapligi) izole edilen monoklonal anti-tau scFv antikorlarini açiklamaktadir.
WO 98/22120 A1, anti-tau antikorlarinin izole edilmesi için, otopsi-türevi normal yetiskin tausuna, fötal tauya, PHP-tauya, fosforile ve fosforile-olmayan rekombinan tau peptitlerine baglanan antikorlarin taranmasini içeren bir yöntemi açiklamaktadir.
Saglikli insan süjelerden türetilen, evrimsel olarak optimize edilen ve insan bagisiklik sistemiyle afinite olgunlastirilan insan antikorlariyla pasif bagisiklama, mükemmel etkililik ve güvenlik için yüksek bir olasilikla umut verici yeni bir terapötik yol saglayabilir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, istemlerde karakterize edilen uygulamalarla tanimlanir. mevcut bulusun sahipleri, dogal anti-tauya özgü insan monoklonal antikorlarin izolasyonu için saglikli insan süjelerin tauya-özgü bagisiklik yanitindan faydalanmistir. Özellikle, bulusun sahipleri tarafindan gerçeklestirilen deneyler, hiç nörodejeneratif bir tauopati belirtisi olmayan saglikli insan süjelerin bir havuzundan monoklonal tauya-özgu antikorlarin izolasyonunda basarili olmustur.
Mevcut bulus böylelikle, istemlerde karakterize edildigi üzere, spesifik olarak tauyu taniyabilen insan antikorlarina, antijen-baglayici fragmanlara ve benzer antijen-baglayici moleküllere yöneliktir. “Spesifik olarak tauyu taniyan”, tauya/tau için özgül antikor” ve “anti-tau antikoru” terimleriyle, spesifik, genel ve toplu, olarak, taunun natif formu veya kümelenmis veya patolojik olarak modifiye tau izoformlari için antikorlar kastedilmektedir. Burada, tam-boy, patolojik olarak fosforile ve kümelenmis formlar için seçimli insan antikorlari saglanmaktadir.
Mevcut bulusun belirli bir uygulamasinda, insan antikoru veya bunun antijen-baglayici fragmani, Sekil 1'de gösterildigi üzere VH ve/veya VL ile karakterize bir antikorun immünolojik baglanma karakteristiklerini göstermektedir.
Antikorun antijen-baglayici fragmani, bir tek Zincirli FV fragmani, bir F(ab') fragmani, bir F(ab) fragmani ve bir F(ab')2fragmani veya herhangi bir diger antijen-baglayici fragman olabilir. Asagidaki spesifik bir uygulamada, antikor veya bunun fragmani, bir insan IgG izotip antikordur.
Alternatif olarak, antikor bir kimerik insan-murin veya murinlestirilmis antikor olup, ikincisi hayvanlarda tanisal yöntemler ve çalismalar için özellikle faydalidir.
Dahasi, mevcut bulus, mevcut bulusun antikorunu veya aktif fragmanlarini içeren bilesimlerle ve bir tauopatinin engellenmesinde, tani konulmasinda veya tedavisinde kullanim için, bu tip bilesimleri kullanan immünoterapötik. ve immüno- tanisal yöntemlerle ilgili olup, burada bilesimin etkili bir miktari ihtiyaç duyan bir hastaya verilir.
Dogal olarak, mevcut bulus, asagida tanimlandigi sekilde ayri ve benzersiz karakteristiklere sahip antikoru üreten, ölümsüzlestirilmis, sirasiyla, insan B hafiza akyuvarina ve B hücresine kadar ulasir.
Mevcut bulus ayrica, bulusun antikorunu kodlayan polinükleotidlerle de ilgilidir.
Dolayisiyla, mevcut bulus ayrica, söz konusu polinükleotidleri içeren vektörlerin ve orada dönüstürülen konak hücrelerin yani sira tauya özgü bir antikorun ve esdeger baglanma moleküllerinin üretiminde bunlarin kullanimlarini kapsamaktadir. Antikorlarin ve bunlarin taklitlerinin rekombinan üretimi için araçlarin ve yöntemlerin yani sira antikorlar olabilenr veya olmayabilen rekabetçi baglanma moleküllerin taranmasi için yöntemler teknikte bilinmektedir.
Ancak, burada tarif edildigi üzere, özellikle insandaki terapötik uygulamalarla ilgili olarak, mevcut bulusun antikoru, söz konusu antikorun uygulanmasinin büyük ölçüde, aksi kimerik ve hatta insanlastirilmis antikorlarda görülen bu tip antikora yönelik, bir bagisiklik yanitindan muaf olmasi bakimindan bir insan antikorudur.
Dahasi burada, numunelerde taunun tanimlanmasi için kullanilabilen bilesimler ve yöntemler açiklanmaktadir.
Açiklanan anti-tau antikorlari, numunelerde taunun varligi için, örnegin, ELISA-tabanli veya yüzey uyarlamali tayin kullanilarak insan kaninin, CSF'nin ve idrarin taranmasi için kullanilabilir. Burada açiklanan yöntemler ve bilesimler, Alzheimer hastaligi gibi nörodejeneratif tauopatilerin tanisinda yardimci olabilir ve hastalik ilerleyisiyle terapötik etkililigin takip edilmesi için kullanilabilir.
Dolayisiyla, mevcut bulusun belirli bir amaci, Alzheimer hastaligi, amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksi, argirofilik gren demansi, Ingiliz tipi amiloid anjiyopati, serebral amiloid anjiyopati, kortikobazal dejenerasyon, Creutzfeldt-Jakob hastaligi, pugilistik demans, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklar, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom l7'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demans, frontotemporal lober dejenerasyon, Gerstmann-Straussler-Scheinker hastaligi, Hallervorden-Spatz hastaligi, inklüzyon cisimcigi miyoziti, multipl sistem atrofisi, miyotonik distrofi, Niemann-Pick hastaligi tip C, nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaligi, Pick hastaligi, postensefalitik parkinsonizm, prion proteini serebral amiloid anjiyopati, progresif subkortikal gliyoz, progresif supranükleer palsi, subakut sklerozan. panensafilt, sadece yumak demansi, multipl enfarktli demans ve iskemik inme gibi bir nörodejeneratif tauopatinin tedavisinde, tani konulmasinda veya engellenmesinde kullanim için bir insan antikoru veya antikor fragmani saglamaktir.
Mevcut bulusun diger` uygulamalari, tarifnameden ve asagidaki Örneklerden anlasilacaktir. ÇIZIMLERIN/SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL 1. Insan antikorlari NI-lOS-, NI-105-'nin degisken bölgelerinin, yani, agir zincir ve lambda hafif zincir bölgelerinin amino asit ve nükleotid› dizileri. Çerçeve (FR) ve tamamlayicililik belirleme bölgeleri (CDR'ler), CDR'lerin alti çizili olarak gösterilmektedir. Klonlama stratejisi nedeniyle, agir zincirin ve hafif zincirin N-ucundaki amino asit dizisi potansiyel olarak FRl'te primer-indüklü degisimler ihtiva edebilir, ancak bu durum antikorun biyolojik aktivitesini büyük ölçüde etkilemez. Bir konsensüs insan antikoru saglamak için, Özgün klonun nükleotid ve amino asit dizileri, veritabanindaki gerekli insan germ hatti degisken bölge dizileriyle hizalanmistir ve bunlara göre ayarlanmistir; bakiniz, örnegin, MRC Protein Mühendisligi Merkezinin (Cambridge, BK) sahibi oldugu Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). PRC primeri nedeniyle konsensüs germ hatti dizisinden potansiyel olarak sapiyor olarak ve bu nedenle amino asit dizisinde degistirilmis olarak degerlendirilen bu amino asitler koyu harfle gösterilmektedir.
SEKIL 2. ELISA plakalari l ug/ml'de rekombinan insan tausu (izoform hTau40) ile kaplandi ve NI-105.4E4 antikorunun gösterilen konsantrasyonlariyla inkübe edildi. Rekombinan insan türevi antikoru NI-105.4E4, 2 nM ECm'de yüksek afiniteyle rekombinan tauya baglanir.
SEKIL 3. PHFTau ve rekombinan hTau4O gradyan SDS-PAGE tarafindan çözüldü ve ardindan Western Blot analizi yapildi. Lekeler primer antikorlar NI-l05.4E4 (insan) veya fare monoklonal Tau12 antikoruyla, ardindan HRP- konjuge sekonder antikorlarla inkübe edildi. Rekombinan insan tau antikoru NI-105.4E4, rekombinan hTau40'in yani sira Western blot analizinde AD'li beyinden ekstrakte edilen patolojik› olarak, modifiye tau izoformlarina (PHFTau) baglanir.
SEKIL 4. hTau4O üzerinde NI-105.4E4 baglama epitopu haritalamasi. PepSpot (JPT) teknolojisi: Bitisik peptit grubu spesifik olarak, sadece (B) antikorunun saptanmasina kiyasla, N1105.4E4 tarafindan tanimlandi (A ve A'). HRP-konjuge keçi anti-insan IgG saptama antikoru tek basina tek nokta (peptit 50) üzerinde güçlü bir saptamaz. Alanin tarama: (C) Noktalari #35-50 ve #51-68 özgün peptitleri (noktalar #35 ve #51) ve bunlarin ikameli varyantlarini (#36-50 ve #52-68) (D ve E) ihtiva eder. Özgün ve ikameli peptitlerin (#35-50 ve #51-68) amino asit dizisi. Alanin taramasi, V339, E342, D387, katkida bulundugunu ortaya koymaktadir.
SEKIL 5. Insan rekombinan NI-105.4E4 antikorunun spesifik olarak, hTau40'in 333-346 amino asitlerine karsilik gelen bir tau peptidine baglandiginin teyidi.
SEKIL 6. NI-105.4E4, AD'li beyinde ve insan TauP30lL eksprese eden farelerde nörofibriler yumaklara (NET), distrofik nöritlere ve nöropil ipliklere baglanir. NIlO5- 4E4 lekeleme AD'li beyinde (A), saglikli kontrol süjesinin (B) beyninde tauya hiç kayda deger baglanma olmadan NFT'leri ve nöropil iplikleri tanimlar. TauP301L transgenik farede (E-I) NI-105.4E4 güçlü bir sekilde, NFT'ye (E, F ve H), nöropil ipliklere (E ve G) ve distrofik nöritlere (E ve H) benzeyen patolojik tauya baglanir. Ek olarak, Nl-105.4E4 ayrica yumak-öncesi asamada tau agregatlarini da tanimlar (I). NI-105.4E4 Isveç ve Arktik mutasyon ve TauP30lL ile insan APP'sini eksprese eden transgenik farede NFT'ye, distrofik nöritlere ve nöropil ipliklere baglanir; ok simgesi, NI- lO5.4E4 tarafindan taninan distrofik nöritlerle çevrili bir beta-amiloid plagini isaret etmektedir (J). Yalnizca ikincil antikor hem insan AD'sinde (C) hem saglikli kontrolde (D) sinyal vermez.
SEKIL 7. ELISA plakalari 3 ug/ml'de rekombinan insan tausu (hTau40) ile kaplandi ve NI-105.24B2 antikorunun gösterilen konsantrasyonlariyla inkübe edildi. Rekombinan insan türevi antikoru NI-105.24B2, 6 nM ECm'de yüksek afiniteyle hTau40'a baglanir.
SEKIL 8. PHFTau ve rekombinan hTau4O gradyan SDS-PAGE tarafindan çözüldü ve ardindan Western Blot analizi yapildi. Lekeler primer antikorlar NI-105.4E4 (insan) antikorlariyla, ardindan HRP-konjuge anti-insan. IgG ile gece boyunca inkübe edildi. Rekombinan insan tau antikoru NI-105.4E4, rekombinan hTau40'in yani sira Western. blot analizinde AD'li beyinden ekstrakte edilen patolojik olarak modifiye tau izoformlarina (PHFTau) baglanir.
SEKIL 9. Doku amiloid plagi immünreaktivite (TAPIR) tayini - Yasli süjelerden ekstrakte edilen serum histolojik AD'li beyin kesitlerine eklendi. Bir kiyaslama olarak piyasada bulunan ATlOO anti-fosfo-tau antikoruyla immünohistolojik bir boyama gerçeklestirildi.
Nörofibriler yumaklar kontrol boyamasinda, izole seraya tabi tutuldugunda ATlOO anti-fosfo-tau antikoruyla boyandi; bu da test edilen serada nörofibriler yumaklarla-tepken antikor türlerinin varligini göstermektedir.
SEKIL lO. Rekombinan insan antikoru NI-105.4A3 spesifik olarak ELISA ile insan tausuna baglanir. BSA'da hiç baglanma gözlenmez.
SEKIL ll. NI-105.4E4 ve NI-lO5.4A3 epitoplari ve yaygin olarak kullanilan piyasada bulunan fare monoklonal tau antikorlarinin epitoplari gösterilmektedir. Insan antikoru NI-105.4E4, bir tanesi taunun, fizyolojik mikrotübül-iliskili tauda gizlenen mikrotübül baglanma alaninda (R4) yer alan iki dogrusal polipeptid içeren benzersiz bir epitopu hedefler. Tau-12 (Covance, California, A.B.D.), HT7, AT8, AT180 (Thermo Scientific, 1491).
SEKIL 12. ELISA plakalari rekombinan insan tausu (hTau40, lug/ml), PHFTau (1:100) ve kontrol preparasyonuyla (1:100) kaplandi ve NI-105.4A3'ün gösterilen konsantrasyonuyla inkübe edildi. 4A3 rTau'ya 1,4 nM ECSO'de, PHFTau'ya 1,2 nM EC50'de baglanir.
SEKIL 13. NI-105.4A3 baglanma epitopunun hTau4O üzerinde haritalanmasi. (A) Dört örtüsen hTau4O alaninin (alan 1 ve alan IV (AA 355-441)) sematik temsilcisi kullanilir.
(B) NI-105.4A3 sadece tau alan I ve tam boy hTau40 polipeptide baglanir. (C) Western lekeleme, NI-105.4A3'ün tau alan I'e spesifik baglanmasini teyit eder.
SEKIL 14. PepSpot (JPT) teknolojisi (A) ve alanin taramasiyla (B ve C) NI-105.4A3 epitop haritalama.
SEKIL 15. ch4E4 ve varyantlarinin rekombinan tauya baglanmasi (ELISA).
SEKIL 16. 30 mg/kg 4E4 veya 4A3 insan anti-tau antikorunun intraperitoneal verilisinin ardindan farelerin plazmasindaki insan IgG seviyeleri.
SEKIL 17. 30 mg/kg 4E4 veya 4A3 insan anti-tau antikorunun intraperitoneal verilisinin ardindan farelerin beyin homojenatindaki insan IgG seviyeleri.
BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Tanimlar Nörodejeneratif tauopatiler, baslica nöronlardaki ve/Veya gliyal hücrelerdeki patolojik olarak hiper-fosforile taudan ibaret anormal filamanlarin hücreiçi agregatlarindan olusan ortak bir patolojik lezyonu paylasan nörodejeneratif rahatsizliklarin çesitli bir grubudur. Tauopatilerin klinik özellikleri heterojendir ve demans ve/Veya motor sendromlariyla karakterizedir. Filamentöz tau inklüzyonlarinin ilerleyici birikimi, örnegin, Alzheimer hastaliginda beta- amiloid gibi veya kromozom l7'ye bagli frontotemporal demansin Ve parkinsonizmin (FTDP-l7) familyal formlariyla iliskili olan tau genindeki mutasyonlarla örneklendigi üzere yegane bir patojenik varlik gibi diger birikintilerle kombinasyon halinde nöronal ve gliyal dejenerasyona neden olabilir. Klinik belirtilerinin heterojenligi nedeniyle, Alzheimer hastaligi, amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksi, argirofilik gren demansi, Ingiliz tipi amiloid anjiyopati, serebral amiloid anjiyopati, kortikobazal dejenerasyon, Creutzfeldt-Jakob hastaligi, pugilistik demans, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklar, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom 17'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demans, frontotemporal lober dejenerasyon, Gerstmann- Straussler-Scheinker hastaligi, Hallervorden-Spatz hastaligi, inklüzyon cisimcigi miyoziti, multipl sistem atrofisi, miyotonik distrofi, Niemann-Pick hastaligi tip C, nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaligi, Pick hastaligi, postensefalitik parkinsonizm, prion proteini serebral amiloid anjiyopati, progresif subkortikal gliyoz, progresif supranükleer palsi, subakut sklerozan panensafilt, sadece yumak demansi, multipl enfarktli demans ve iskemik inme dahil olmak üzere tauopatik hastaliklarin potansiyel olarak teferruatli-olmayan bir listesi saglanabilir; bir inceleme için bakiniz, örnegin, Tablo 1'in tauopatilerin benzersiz üyelerini listeledigi Lee et al., Annu. Rev. Neurosci. 24 Bu spesifikasyonda, “tau” terimleri, spesifik olarak taunun natif' monomer formuna atifta bulunmak. için degisimli olarak kullanilmaktadir. “Tau” terimi ayrica genel olarak, taunun diger konformerlerini, örnegin, taunun oligomerlerini veya agregatlarini tanimlamak için kullanilmaktadir. “Tau” terimi ayrica, toplu olarak taunun tüm tiplerini ve formlarini ifade etmek için de kullanilmaktadir. Alternatif uç birlestirme nedeniyle, insan beyninde 6 tau izoformu mevcuttur. Bu izoformlar için protein dizileri sunlardir:352aa'nin izoform Fetal-tausu H î'tl'wl'îl i ii '-1' H'. ii 381aa'nin izoform Tau-B'si i i ' « .L i in 5 lHI'.d\nLE " ' " ' 410aa'nin izoform Tau-C'si ›1:I ' il 1HI] I 11`i' 5' NITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSS TGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID No:3) 383aa'nin izoform Tau-D'si “Tau-4” veya “tam-boy tau” olarak da atifta bulunulan, 44laa'nin izoform Tau-F'si ile temsil edilir (SEQ ID NO: 6).
Taunun amino asit dizisi literatürden ve ilgili veritabanlarindan edinilebilir; bakiniz Goedert et al., Proc.
J. 8(l, 4225- 4230 ve GenBank UniProtKB/swissprot: locus TAUIHUMAN, erisim numaralari PlO ve PlO636-4 ila -8 (B ila F arasindaki Izoformlar).
Tau proteininin bir baska çarpici özelligi, 79 potansiyel serin (Ser) ve treonin (Thr) fosforilasyon alanlarinin yaklasik 30'unda meydana gelen fosforilasyondur. Tau, beyin gelisimi esnasinda oldukça fosforlanir. Fosforilasyon seviyesi yetiskinlikte geriler. Fosforilasyon alanlarinin bazilari, taunun mikrotübül baglayici alanlari içerisinde yer alir ve tau fosforilasyonunun bir artisinin, mikrotübüllerin baglanmasini olumsuz olarak düzenledigi kanitlanmistir. Örnegin, mikrotübül baglayici motifler içerisinde veya bunlara bitisik yer alan Ser262 ve Ser396, AD hastalarinin beynindeki nörofibriler yumaklarin (NFT'ler) ana bir bileseni olan, anormal çiftlenmis sarmal filamanlarin (PHF'ler) tau proteinlerinde hiper-fosforlanir. PHF'ler tau proteinlerinin, anormal olarak hiper-fosforlanan ve spesifik anti-tau antikorlariyla boyanabilen ve isik mikroskopisiyle saptanabilen filamentöz agregatlaridir. Bu durumun aynisi, düz tau. filamanlari denilen. filamanlar için. de geçerlidir.
PHF'ler, yaklasik 80nm'lik dönemsellikle birbiri çevresinde bükümlü iki filamandan olusan bükümlü kurdeleler olusturur. Bu patolojik özellikle yaygin olarak “tau-patolojisi”, edilir. Tauopatilerin nöropatolojik özelliklerinin daha ayrintili bir tarifnamesi için, bakiniz Lee et al., Annu. Rev. mikrotübülleri stabilize eder. Patolojik fosforilasyon, mikrotübüllerin istikrarsizlastirilmasina ve bozulmus hücresel tasimaya neden olan anormal tau lokalizasyonuna ve kümelesmesine yol açar. Kümelenmis tau in vitro nörotoksiktir Ancak, kesin nörotoksik tür, nöronal ölüme yol açtiklari mekanizma(lar) gibi belirsizligini korumaktadir. Taunun agregatlari, Alzheimer hastaligi (AD), Frontotemporal demans, supranükleer palsi, Pick hastaligi, Argirofilik gren demansi (AGD), kortikobazal dejenerasyon, FTDP-17, ParkinSOn hastaligi, Pugilistik demans gibi birçok tauopatideki nörofibriler yumaklarin (NFT) ana bilesenleri olarak gözlemlenebilir (Gendron ve Petrucelli, Mol. Neurodegener. 4:13 (2009)'da incelenmistir). Bu gözlemlerin yaninda, tau- aracili nöronal ölümün, yumak olusumunun yoklugunda bile meydana gelebilecegini gösteren kanitlar bulunmaktadir. Çözünür fosfo-tau türleri CSF'de mevcuttur (Aluise et al., yanlis katlanmis bir hali bir hücrenin disindan içine iletebilir ve es-kültürlenen hücreler arasinda aktarabilir Nörodejeneratif tauopatilere dahil olmaya ek olarak, iskemi/reperfüzyon esnasinda ve sonrasinda tau fosforilasyonundan gözlemlenen degisimler, taunun, iskemik inme gibi damar ve sinir rahatsizliklarinin nöronal hasarinda ve klinik patofizyolojisinde çok önemli bir yol oynamakta oldugunu ortaya koymaktadir (Zheng et al., J. Cell. Biochem.
Burada açiklanan anti-tau antikorlari Özgül olarak. tauya ve bunun epitoplarina. ve taunun. ve bunun epitoplarinin. çesitli konformasyonlarina baglanir. Örnegin, burada, özgül olarak tauya, tam-boydaki tauya, patolojik olarak modifiye tau formlarina ve tau agregatlarina baglanan antikorlar açiklanmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle, tauya “özgül10 olarak baglanan”, “seçimli olarak baglanan” veya “tercihli olarak baglanan” bir antikora yapilan atif, diger iliskisiz proteinlere baglanmayan bir antikoru ifade etmektedir. Bir örnekte, burada açiklanan bir tau antikoru tauya veya bunun epitopuna baglanabilir ve diger proteinler için yaklasik 1,5 kaç arka planin üzerinde baglanma göstermez. Bir tau konformerine “özgül olarak baglanan” veya “seçimli olarak baglanan” bir antikor, taunun tüm konformasyonlarina baglanmayan, yani, en az bir adet baska tau konformerine baglanmayan bir antikoru ifade etmektedir. Örnegin, burada, AD dokusunda taunun kümelenmis formlarina tercihli olarak baglanabilen antikorlar açiklanmaktadir. Mevcut bulusun insan anti-tau antikorlari bir tauya-özgü bagisiklik yaniti sergilemekte olan saglikli insan süjelerin havuzundan izole edilmis oldugundan, mevcut bulusun tau antikorlari ayrica, bu antikorlarin gerçekten de süjeler tarafindan eksprese edilmis oldugunu ve örnegin, simdiye dek insan-benzeri antikorlar saglamaya çalismak için yaygin bir yöntemi temsil etmis olan faj kitapligini eksprese eden bir insan immünoglobülinden izole edilmemis oldugunu vurgulamak için “insan oto- antikorlari” olarak da adlandirilabilir. fazlasini ifade ettigi kaydedilmelidir; örnegin, “bir antikor”, bir veya daha fazla antikoru temsil ediyor olarak anlasilmalidirx Bu itibarla, “bir” (“a (ya. da an”)), “bir veya daha fazla” ve “en az bir” terimleri burada degisimli olarak kullanilabilir.
Burada kullanildigi sekliyle, “polipeptit” terimi, bir tekil amaçlidir ve dogrusal olarak (peptit baglari olarak da bilinen) amid baglari tarafindan bagli monomerlerden (amino asitlerden) olusan bir molekülü ifade etmektedir. “Polipeptit” terimi, iki veya daha fazla amino asitli herhangi bir zinciri veya zincirleri ifade etmektedir ve ürünün spesifik bir uzunlugunu ifade etmez. Böylelikle, iki veya daha fazla amino asitli herhangi bir zinciri veya zincirleri ifade etmek için kullanilan peptitler, dipeptitler, tripeptitler, oligopeptitler, “protein”, “amino asit zinciri” veya herhangi bir diger terim, “polipeptit” tanimina dahildir ve bunlarla degisimli olarak kullanilabilir. kaydiyla, glikosilasyon, asetilasyon, fosforilasyon, amidasyon, bilinen koruyucu/bloke edici gruplar tarafindan türevlendirme, proteolitik yarilma veya dogal olusumlu-olmayan amino asitler tarafindan modifikasyon da dahil olmak üzere, polipeptidin ekspresyon-sonrasi modifikasyonlarinin ürünlerini de ifade etme amaçlidir. Bir polipeptit dogal bir kaynaktan türetilebilir veya rekombinan teknolojiyle üretilebilir, ancak belirlenmis bir nükleik asit dizisinden transle edilmesi gerekli degildir. Kimyasal sentez dahil olmak üzere herhangi bir biçimde olusturulabilir.
Açiklamanin bir polipeptidi, yaklasik 3 veya daha fazla, 5 1.000 veya daha fazla veya 2000 veya daha fazla amino asitlik bir boyutta olabilir. Polipeptitler, her ne kadar bu tip bir yapiya sahip olmalari sart degilse de tanimli bir üç-boyutlu yapiya sahip olabilir. Tanimli bir üç-boyutlu yapiya sahip polipeptitler katlanmis olarak ifade edilir ancak daha ziyade daha çok sayida farkli konformasyonlari benimseyebilirler' ve katlanmamis olarak ifade edilirler. Burada. kullanildigi sekliyle, glikoprotein terimi, bir amino asit kalintisinin, Örnegin, bir serin kalintisinin veya bir asparajin kalintisinin bir oksijen-ihtiva eden veya bir nitrojen-ihtiva eden yan zinciri vasitasiyla proteine ekli en az bir adet karbonhidrat kismina baglantili bir proteini ifade etmektedir.
Bir “izole” polipeptitle veya bunun bir fragmani, varyanti veya türeviyle, dogal ortaminda olmayan bir polipeptit kastedilmektedir. Saflastirmanin belirli bir seviyesi gerekli degildir. Örnegin, bir izole protein, natif veya dogal çevresinden çikarilabilir. Rekombinan olarak üretilen polipeptitler ve konak hücrelerde eksprese edilen proteinler, herhangi bir uygun teknikle ayrilmis, kesitlenmis veya kismen veya büyük ölçüde saflastirilmis natif veya rekombinan polipeptitler olduklarindan, bulusun amaçlari dogrultusunda izole edilmis olarak degerlendirilirler.
Polipeptitle olarak ayrica, yukaridaki polipeptitlerin fragmanlari, türevleri, analoglari veya varyantlari ve bunlarin herhangi bir kombinasyonu da dahil edilmektedir.
Mevcut açiklamanin antikorlarina veya antikor polipeptitlerine atifta bulunulurken “fragman”, “varyant”, “türev” ve “analog" terimleri, karsilik gelen natif baglayici molekülün, antikorun veya polipeptidin antijen-baglayici özelliklerinin en azindan bir kismini muhafaza eden herhangi bir polipeptidi içerir.
Mevcut açiklamanin polipeptitlerinin fragmanlarina, burada diger kisimlarda müzakere edilen spesifik antikor fragmanlarina ek olarak proteolitik fragmanlarin yani sira silinti fragmanlari da dahildir. Mevcut açiklamanin antikorlarinin ve antikor polipeptitlerinin varyantlarina, yukarida tarif edildigi sekilde fragmanlar ve ayrica amino asit ikameleri, silintileri veya katmalar nedeniyle degistirilmis amino asit dizilerine sahip polipeptitler de dahildir. Varyantlar dogal olarak meydana gelebilir veya dogal olusumlu-olmayanr olabilir. Dogal olusumlu-olmayan› varyantlar, teknikte-bilinen mutajenez teknikler kullanilarak üretilebilir. Varyant polipeptitler, konservatif veya konservatif-olmayan amino asit ikamelerini, silintilerini ve eklentilerini içerebilir. Tauya özgü baglayici moleküllerin, örnegin, mevcut açiklamanin antikorlarinin ve antikor polipeptitlerinin türevleri, natif polipeptit üzerinde bulunmayan ilave Özellikleri sergilemeleri amaciyla degistirilmis olan polipeptitlerdir. Örneklere füzyon proteinleri dahildir. Varyant polipeptitler burada ayrica kullanildigi sekliyle bir baglayici molekülün veya bunun fragmaninin, bir antikorun veya bir antikor polipeptidinin bir olarak türetilen bir veya daha fazla kalintiya sahip bir konu polipeptidi ifade etmektedir. “Türevler” olarak ayrica, yirmi standart amino asitlik bir veya daha fazla dogal olusumlu amino asit türevi ihtiva eden peptitler de dahil edilmektedir. Örnegin, 4-hidroksipirolin pirolin yerine ikame edilebilir; 5- hidroksilisin lisin yerine ikame edilebilir; 3-metilhistidin histidin yerine ikame edilebilir; homoserin serin yerine ikame edilebilir ve ornitin lisin yerine ikame edilebilir. Çogul nükleik asitleri de kapsama amaçlidir ve bir izole nükleik asit molekülünü veya yapisini, Örnegin, mesajci RNA'yi (mRNA) veya plazmid DNA'yi (pDNA) ifade etmektedir. Bir polinükleotid, bir konvansiyonel fosfodiester bagi veya bir konvansiyonel-olmayan bag (örnegin, peptit nükleik asitlerinde (PNA) bulunan gibi bir amid bagi) içerebilir. “Nükleik asit” terimi, bir polinükleotidde mevcut olan herhangi bir veya daha fazla nükleik asit segmentini, Örnegin, DNA veya RNA fragmanlarini ifade etmektedir. “Izole” nükleik asit veya polinükleotid terimiyle, natif ortamindan çikarilmis olan bir nükleik asit molekülü, DNA veya RNA kastedilmektedir. Örnegin, bir vektörde ihtiva edilen bir antikoru kodlayan bir rekombinan polinükleotid, bulusun amaçlari dogrultusunda izole olarak degerlendirilmektedir. Bir izole polinükleotidin diger örneklerine, heterolog konak hücrelerde muhafaza edilen rekombinan polinükleotidler veya solüsyon (kismen veya büyük ölçüde) saflastirilan polinükleotidler dahildir. Izole RNA moleküllerine, mevcut bulusun polinükleotidlerinin in vivo veya in vitro RNA transkriptleri dahildir. Mevcut bulusa göre izole polinükleotidler veya nükleik asitler ayrica, sentetik olarak üretilen bu tip moleküller de dahildir. Ek olarak, polinükleotid veya bir nükleik asit, bir promotör, ribozom baglanma alani veya bir transkripsiyon sonlandirici gibi düzenleyici bir eleman olabilir veya bunu içerebilir.
Burada kullanildigi sekliyle, bir “kodlama bölgesi", nükleik asidin, amino asitlerin içine transle edilmis kodonlardan olusan bir parçasidir. Her ne kadar bir “durdurma kodonu” (TAG, TGA veya TAA) bir amino asidin içine transle edilmese de, bir kodlama bölgesinin parçasi olarak degerlendirilebilir, ancak herhangi bir kusatan dizi, örnegin promotörler, ribozom baglanma alanlari, transkripsiyonel sonlandiricilar, intronlar ve benzerleri bir kodlama bölgesinin parçasi degildir. Mevcut bulusun iki veya daha fazla kodlama bölgesi, bir tekli polinükleotid. yapisinda, örnegin, bir tekli vektör üzerinde veya ayri polinükleotid. yapilarinda, örnegin, ayri (farkli) vektörler üzerinde mevcut olabilir. Dahasi, herhangi bir vektör bir tekli kodlama bölgesi ihtiva edebilir veya iki veya daha fazla kodlama bölgesi içerebilir, örnegin, bir tekli vektör` bir immünoglobülin. agir zincir degisken. bölgesini ve bir immünoglobülin hafif zincir degisken bölgesini ayri ayri kodlayabilir. Ek olarak, bulusun bir vektörü, polinükleotidi veya nükleik asidi, bir baglayici molekülü, bir antikoru veya bunun fragmanini, varyantini veya türevini kodlayan bir nükleik aside kaynastirilmis veya kaynastirilmamis heterolog kodlama bölgelerini kodlayabilir. Heterolog kodlama bölgelerine, sinirlama olmadan, bir salgilayici sinyal peptidi veya bir heterolog fonksiyonel alan gibi özellestirilmis Belirli uygulamalarda, polinükleotid veya nükleik asit DNA'dir. DNA. olmasi durumunda, bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asit içeren bir polinükleotid normalde, uygun sekilde bir veya daha fazla kodlama bölgesiyle iliskili bir promotör ve/veya diger transkripsiyon veya translasyon kontrol ögeleri içerebilir. Uygun sekilde bir iliski, bir gen ürününün, örnegin, bir polipeptit için bir kodlama bölgesinin, gen ürününün ekspresyonunun düzenleyici dizinin (dizilerin) etkisi veya kontrolü altina verildigi sekilde bir veya daha fazla düzenleyici diziyle iliskili oldugundaki iliskidir. (Bir polipeptit kodlama bölgesi ve bunuyla iliskili bir promotör gibi) iki DNA fragmani, promotör fonksiyonunun indüklenmesi, arzu edilen. gen ürününü kodlayan. mRNA'nin transkripsiyonuyla sonuçlanirsa ve iki DNA fragmani arasindaki baglantinin yapisi, ekspresyon düzenleyici dizilerin gen ürününün ekspresyonunu yönetme yetisine müdahale etmezse veya DNA kalibinin transkribe olma yetisine müdahale etmezse “uygun sekilde iliskilidir" veya “uygun sekilde baglidir”.
Böylelikle, bir promotör bölgesi bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asitle, promotör o nükleik. asidin transkripsiyonunu etkileyebilmisse uygun sekilde iliskili olabilir. Promotör, DNA'nin önemli transkripsiyonunu yalnizca önceden belirlenen hücrelerde yöneten bir hücreye-özgü promotör olabilir. Bir promotörün yani sira diger transkripsiyon kontrolü ögeleri, örnegin güçlendiriciler, operatörler, baskilayicilar transkripsiyon sonlandirma sinyalleri, hücreye-özgü transkripsiyonu yönetmek için polinükleotidle uygun sekilde iliskili olabilir. Uygun promotörler` ve diger transkripsiyon kontrol bölgeleri burada açiklanmaktadir. Çesitli transkripsiyon kontrol bölgeleri teknikte uzman kisilerce bilinmektedir. Bunlara, sinirlama olmadan, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sitomegalovirüslerden (intron-A ile birlikte hemen erken promotör), simyan Virüsü 40'tan (erken promotör) ve (Rous sarkoma virüsü gibi) retrovirüslerden promotör ve güçlendirici segmentleri gibi omurgali hücrelerinde islev gören transkripsiyon kontrol bölgeleri dahildir. Diger transkripsiyon kontrol bölgelerine, aktin, isi sok proteini, sigir büyüme hormonu ve tavsan ß-globin gibi omurgali genlerinden türetilenlerin yani sira ökaryotik hücrelerde gen ekspresyonunu kontrol edebilen diger diziler de dahildir. Ilave uygun transkripsiyon kontrol bölgelerine, dokuya-özgü promotörler ve güçlendiricilerin yani sira lenfokin-indüklü promotörler (örnegin, interferonlar veya interlökinler tarafindan indüklenebilen promotörler) dahildir.
Benzer sekilde, çesitli kontrol ögeleri teknikte normal uzmanliga sahip kisilerce bilinmektedir. Bunlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, ribozom baglayici alanlar, translasyon baslatma ve sonlandirma kodonlari ve pikornavirüslerden türetilen ögeler (özellikle, bir CITE dizisi olarak da ifade edilen bir dahili ribozom giris alani veya IRES) dahildir.
Diger uygulamalarda, mevcut bulusun bir polinükleotidi, Örnegin, mesajci RNA (mRNA) formunda RNA'dir.
Mevcut bulusun polinükleotid ve nükleik asit kodlayan bölgeleri, salgisal veya sinyal peptitlerini kodlayan, mevcut bulusun bir polinükleotidi tarafindan kodlanan bir polipeptidin salgilanmasini kodlayan ilave kodlama bölgeleriyle iliskili olabilir. Sinyal hipotezine göre, memeli hücreler tarafindan salgilanan proteinler, sert endoplazmik retikulum boyunca büyümekte olan protein zincirinin ihraci baslatildiginda olgun proteinden yarilan bir sinyal peptidine veya salgisal lider dizisine sahiptir. Teknikte normal uzmanliga sahip kisiler, omurgali hücreleri tarafindan salgilanan polipeptitlerin genellikle polipeptidin N-ucuna kaynastirilan, polipeptidin salgilanan veya “olgun" bir formunu üretmek için tam veya “tam-boy” polipeptidden yarilan bir sinyal peptidine sahip oldugunun farkindadir. Belirli uygulamalarda, natif sinyal peptidi, örnegin, bir immünoglobülin agir zinciri veya hafif zinciri sinyal peptidi veya bununla uygun sekilde iliskili olan polipeptidin salgilanmasini yönetme yetisini muhafaza eden o dizinin bir fonksiyonel türevi kullanilir. Alternatif olarak, bir heterolog memeli sinyal peptidi veya bunun fonksiyonel bir türevi de kullanilabilir- Örnegin, dogal-tip lider dizi, insan dokusu plazminojen aktivatörünün (TPA) veya fare ß- glukuronidazinin lider dizisiyle ikame edilebilir.
Aksi belirtilmedigi sürece, “rahatsizlik” ve “hastalik" terimleri burada degisimli olarak kullanilmaktadir.
Burada kullanildigi sekliyle bir “baglayici molekül” esas olarak antikorlarla ve bunlarin fragmanlariyla ilgilidir ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, hormonlar, reseptörler, ligandlar, majör histokompatibilite kompleksi (MHC) molekülleri, isi sok proteinleri (HSP) gibi saperonlarin yani sira kaderin, integrin, C-tipi lesitin ve immünoglobülin (Ig) süper familyalarinin üyeleri gibi hücre-hücre adezyonu molekülleri dahil olmak üzere diger antikor-olmayan molekülleri de ifade edebilir. Asagidaki uygulamalar, terapötik ve tanisal ajanlarin gelistirilmesi için baglayici moleküllerin spesifik bir uygulamasini temsil eden antikorlar ve antikor-benzeri moleküller açisindan müzakere edilmektedir. olarak kullanilmaktadir. Bir antikor veya immünoglobülin, en azindan bir agir zincirin degisken alanini içeren ve normalde bir agir zincir ve bir hafif zincirin degisken alanlarini ihtiva eden bir tau-baglayici moleküldür. Omurgali sistemlerindeki temel immünoglobülin yapilari nispeten iyi anlasilmaktadir; bakiniz, Örnegin, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Asagida daha ayrintili olarak müzakere edilecegi üzere, polipeptitlerin çesitli genis siniflarini içerir. Teknikte uzman kisiler, agir zincirlerin, aralarinda bazi alt-siniflar olacak sekilde (örnegin, yl-y4) gama, mu, alfa, delta veya epsilon (y, u, d, 6, 8) olarak siniflandirildigini anlayacaktir. Antikorun “sinifini”, sirasiyla, IgG, lgM, IgA Immünoglobülin alt siniflari (izotipler) örnegin, IgGl, IgG2, lgG3, IgG4, IgAl vb. iyi karakterizedir ve fonksiyonel özellesme sagladiklari bilinmektedir. Bu siniflarin ve izotiplerin her birinin modifiye versiyonlari, bu açiklama göz önüne alindiginda teknikte uzman kisi kolayca fark edilir ve dolayisiyla, bu bulusun kapsami dahilindedir. Tüm immünoglobülin siniflari net bir sekilde mevcut bulusun kapsami dahilindedir, asagidaki müzakere genel olarak immünoglobülin moleküllerinin IgG sinifina yönelik olacaktir. 23.000 Daltonluk moleküler agirliga sahip iki özdes hafif özdes agir zincir içerir. Dört zincir tipik olarak bir “Y" yapilandirmasinda disülfit baglarla birlestirilmekte olup, burada hafif zincirler agir zincirleri “Y”'nin agzinda baslayarak ve degisken bölge boyunca devam ederek çevreler.
Hafif zincirler ya kappa veya lambda (K, A) olarak siniflandirilir. Her bir agir zincir sinifi ya bir kappa veya bir lambda hafif zincirle baglanabilir. Genelde, hafif ve agir zincirler birbirlerine esdegerli olarak baglidir ve iki agir zincirin “kuyruk” kisimlari birbirlerine esdegerli disülfit baglarla veya immünoglobülinler ya hibridomlarla, B hücreleriyle veya genetigi degistirilmis konak hücrelerle olusturuldugunda esdegerli-olmayan baglarla baglidir. Agir zincirde, amino asit dizileri Y yapilandirmasinin çatal uçlarinda bir N-ucundan her bir zincirin dibindeki C-ucuna Hem hafif hem agir zincirler, yapisal ve fonksiyonel homoloji bölgelerine bölünür. “Sabit” ve “degisken” terimleri fonksiyonel olarak kullanilmaktadir. Bu bakimdan, hem hafif (VL) hem agir (Vh) zincir kisimlarinin degisken alanlari taninma. ve özgüllügü belirler. Bunun aksine, hafif zincirin (CL) ve agir zincirin (CHl, CHZ veya CH3) sabit alanlari, salgilama, transplasental hareketlilik, Fc reseptörü baglanmasi, kompleman baglanma ve benzerleri gibi önemli biyolojik özellikler kazandirir. Genel kabule göre, sabit bölge alanlarinin numaralandirilmasi, antijen-baglanma alanindan veya antikorun amino-ucundan daha uzak hale geldikçe artar. N-uç kismi degisken bir bölgedir ve C-uç kisminda sabit bir bölgedir; CH3 ve CL alanlari fiili olarak, sirasiyla, agir ve hafif zincirin karboksi-uçlarini içerir.
Yukarida gösterildigi üzere, degisken bölgeler antikorun, antijenler üzerindeki epitoplari seçimli olarak tanimasina ve özgül olarak baglanmasina olanak saglar. Yani, bir antikorun VL alani ve VH alani veya tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR'ler), üç-boyutlu bir antijen-baglanma alani tanimlayan degisken bölgeyi olusturmak için birlesir. Bu dördüncül antikor yapisi, Y'nin her bir kolunun ucunda mevcut olan antijen-baglanma alanini olusturur. Daha spesifik olarak, antijen-baglanma alani, VH ve VL zincirlerinin her birindeki üç CDR tarafindan tanimlanir. Tauya özgül olarak baglanmak için yeterli yapi ihtiva eden herhangi bir antikor veya immünoglobülin fragmani burada degisimli olarak, bir gösterilmektedir.
Dogal olusumlu antikorlarda, bir antikor, her bir antijen- baglanma alaninda mevcut olan, antikor üç boyutlu yapilandirmasini sulu bir ortamda üstüne aldigindan antijen- baglanma alanini olusturmak için spesifik olarak konumlandirilan amino asitlerin kisa, bitisik-olmayan dizileri olan, bazen “tamamlayicilik belirleme bölgeleri” veya içerir. CDR'ler daha az moleküller-arasi degiskenlik gösteren dört adet nispeten korunmus “çerçeve" bölgeleriyle veya tabakasi konformasyonunu benimser ve CDR'ler, ß-tabakasi yapisina baglanan ve bazi durumlarda bunun bir parçasini olusturan halkalari olusturur. Böylelikle, çerçeve bölgeleri, CDR'lerin zincir-arasi, esdegerli-olmayan etkilesimlerle dogru yönlendirmede konumlandirilmasini saglayan bir iskele olusturma görevi görür. Konumlandirilmis CDR'ler tarafindan olusturulan antijen-baglanma alani, immünoreaktif antijen üzerindeki epitopa tamamlayici bir yüzey tanimlar. Bu tamamlayici yüzey, antikorun kognat epitopuna esdegerli- olmayan baglanmasini tesvik eder. Sirasiyla, CDR'leri ve Çerçeve bölgelerini içeren amino asitler, kesin olarak tanimlanmis olduklarindan, herhangi belirli agir veya hafif zincir degisken bölgesi için teknikte normal uzmanliga sahip biri tarafindan kolayca tanimlanabilir; bakiniz, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., U.S.
Department of Health and Human Services, (1983); ve Chothia ve Teknik dahilinde kullanilan ve/veya kabul edilen bir terimin iki veya daha fazla taniminin oldugu durumda, terimin burada kullanildigi sekliyle tanimi, aksi kesin bir sekilde belirtilmedigi sürece tüm bu anlamlari içerme amaçlidir.
Spesifik bir örnek, hem agir hem hafif Zincirli polipeptitlerin degisken bölgesi içerisinde bulunan bitisik- olmayan antijen birlestirme alanlarini tarif etmek için kullanilmasidir. Bu belirli bölge, tanimlarin, birbirlerine karsilastirildiginda örtüsen amino asit kalintilarini veya bunlarin alt kümelerini içerdigi Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of de, her iki tanimin bir antikorun veya bunun varyantlarinin bir CDR'sini ifade etmek için uygulanmasi, burada tanimlandigi ve kullanildigi sekilde terimin kapsami dahilinde olma amaçlidir. Yukarida anilan referanslarin her biri tarafindan tanimlandigi sekilde CDR'leri kapsayan uygun amino asit kalintilari, asagidaki Tablo 1'de bir kiyaslama olarak ortaya konulmaktadir. Belili bir CDR'yi kapsayan net kalinti sayilari, CDR'nin dizisine ve boyutuna bagli olarak degisecektir. Teknikte uzman kisiler, hangi kalintilarin antikorun degisken bölge amino asit dizisi göz önüne alindiginda insan IgG alt türünün belirli bir hiper-degisken bölgesini veya CDR'sini içerdigini rutin olarak belirleyebilir.
Tablo 1: CDR Tanimlaril Kabat Chothia VH CDRl 31-35 26-32 VL CDRl 24-34 26-32 1Tablo 1'deki tüm CDR tanimlarin numaralandirilmasi, Kabat et al. tarafindan ortaya konan numaralandirma uzlasmalarina göredir (bakiniz asagisi).
Kabat et al. ayrica, degisken alan dizileri için herhangi bir antikor için geçerli bir numaralandirma sistemi de tanimlamaktadir. Teknikte normal uzmanliga sahip bir kisi, bu herhangi bir deneysel veriyi esas almadan herhangi bir degisken alan dizisine belirsiz olmayacak bir sekilde atayabilir. Burada kullanildigi sekliyle, “Kabat numaralandirma”, Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983) tarafindan ortaya konan numaralandirma sistemini ifade etmektedir. Aksi belirtilmedigi sürece, mevcut bulusun bir antikorundaki veya bunun antijen-baglayici fragmanindaki spesifik amino asit kalinti konumlarinin numaralandirilmasina yapilan atiflar, gelgelelim teorik olan ve mevcut bulusun her antikoru için esit sekilde geçerli olmayabilen Kabat numaralandirma sistemine göredir. Örnegin, birinci CDR'nin konumuna bagli olarak, takip eden CDR'ler her iki yönde degistirilebilir.
Bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari, monoklonal, çoklu-özgül veya insan antikorlariyla, tek zincirli antikorlarla, epitop-baglayici fragmanlarla, örnegin, Fab, Fab' ve F(ab')2, Fd, Fvs, tek- zincirli Fvs (scFv), tek-zincirli antikorlarla, disülfit-bagli Fvs (dev), ya bir VL veya VH alani içeren fragmanlarla, bir Fab ekspresyon kitapligi tarafindan üretilen fragmanlarla ve anti-idiotipik (anti-Id) antikorlarla sinirli degildir. ScFv molekülleri teknikte bilinmektedir ve Örnegin, 5.892.019 numarali US patentinde tarif edilmektedir. Bulusun immünoglobülin veya antikor molekülleri herhangi bir tipte (Örnegin, IgG, IgE, IgM, IgD, lgA ve lgY), siniftan (örnegin, molekülünün alt-sinifinda olabilir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun antikoru bes-degerli bir yapiya sahip IgM veya bunun bir türevi degildir. Bilhassa, mevcut bulusun spesifik uygulamalarinda, özellikle terapötik kullanimda, IgM'ler bes-degerli yapilari ve afinite olgunlugu yoksunluklari nedeniyle siklikla spesifik olmayan çapraz- tepkenlikler ve çok düsük afinite gösterdiginden, lgM'ler baglayici moleküllerden daha az faydalidir.
Belirli bir uygulamada, mevcut bulusun antikoru bir poliklonal antikor degildir, yani, bir plazma immünoglobülin numunesinden elde edilen bir karisim olmaktan ziyade esasen bir adet belirli antikor türünden olusur.
Tek-Zincirli antikorlar dahil olmak üzere antikor fragmanlari, tek basina veya asagidakilerin tamamiyla veya bir kismiyla kombinasyon halinde degisken bölge(ler) içerebilir: destek bölgesi, CHl, CH2 ve CH3 alanlari. Bulusta ayrica, yine degisken bölgenin (bölgelerin) bir destek bölgesi, CHl, CH2 ve CH3 alanlariyla herhangi bir kombinasyonunu içeren tau- baglayici fragmanlari da içerilmektedir. Mevcut bulusun antikorlari veya bunlarin immünospesifik fragmanlari, kuslar ve memeliler dahil olmak üzere herhangi bir hayvan kökenli olabilir. Bir uygulamada, antikorlar insan, murin, esek, tavsan, keçi, kobay faresi, deve, lama, at veya tavuk antikorlaridir. Bir baska uygulamada, degisken bölge köken olarak kondriktoid (örnegin, köpekbaliklarindan) olabilir.
Bir yönden, mevcut bulusun antikoru, bir insandan izole edilen bir insan monoklonal antikorudur. Opsiyonel olarak, insan antikorunun çerçeve bölgesi, veritabanindaki uygun insan germ hatti degisken bölge dizileriyle hizalidir ve buna göre benimsenir; bakiniz, örnegin, MRC Protein Mühendisligi Merkezinin (Cambridge, BK) sahibi oldugu Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Örnegin, potansiyel olarak gerçek germ hatti dizisinden sapiyor olarak degerlendirilen amino asitler, klonlama islemi esnasinda katilan PCR. primer dizileri nedeniyle olabilir. Antikor kitapligini ve ksenojenik fareleri sergileyen bir fajdan tek Zincirli antikor fragmanlari (scFv'ler) gibi yapay olarak üretilen insan- benzeri antikorlara kiyasla, mevcut bulusun insan nwnoklonal antikoru (i) hayvan vekillerinkinden ziyade insan bagisiklik yaniti kullanilarak elde edilmesiyle, yani antikorun insan vücudundaki ilgili konformasyonunda› dogal tauya yanit olarak üretilmis olmasiyla, (ii) bireyi korumus olmasiyla veya taunun varligi için en azindan önemli olmasiyla ve (iii) antikor insan kökenli oldugundan, öz-antijenlere çapraz-tepkenlik risklerinin asgariye indirgenmesiyle karakterizedir.
Böylelikle, mevcut bulusa göre “insan monoklonal antikoru”, benzerleri, insan kökenli olan, yani bir E hücresi veya bunun hibridomu gibi bir insan hücresinden izole edilmis olan veya cDNA'si dogrudan bir insan hücresinin mRNA'sindan, örnegin bir insan hafiza B hücresinden klonlanmis olan bir tau baglayici molekülü belirtmek için kullanilmaktadir. Örnegin, baglanma karakteristiklerini gelistirmek için antikorda amino asit ikameleri yapilsa bile, bir insan antikoru yine de “insandir”.
Insan immünoglobülin kitapliklarindan veya bir veya daha fazla insan immünoglobülini için transgenik. olan hayvanlardan türetilen ve asagida ve örnegin Kucherlapati et al. tarafindan .939.598 numarali US patentinde tarif edildigi üzere endojen immünoglobülinleri eksprese etmeyen antikorlar, bunlarin mevcut bulusun gerçekten insan antikorlarindan ayirt edilmesi amaciyla insan-benzeri antikorlar olarak ifade edilmektedir. Örnegin, tipik olarak faj görüntülemeden izole edilen sentetik ve yari-sentetik antikorlar gibi insan-benzeri antikorlarin agir ve hafif zincirlerinin çiftlenmesinin, özgün insan B hücresinde meydana geldigi için özgün çiftlemeyi yansitmasi sart degildir. Dolayisiyla, önceki teknikte yaygin olarak kullanildigi üzere rekombinan ekspresyon kitapliklarindan elde edilen Fab ve scFv fragmanlari, immünojenesite ve stabilite üzerindeki tüm olasi iliskili etkilerle birlikte yapay olarak degerlendirilebilir.
Aksine, mevcut bulus seçili insan süjelerden izole edilen, insanda terapötik kullanimlariyla ve toleranslariyla karakterize afinite-olgun antikorlar saglamaktadir.
Burada kullanildigi sekliyle, “murinlestirilmis antikor” veya insan antikorundan bir veya daha fazla CDR içeren bir antikoru ve bir fare antikor dizisine dayali amino asit ikameleri ve/veya silintileri ve/veya katmalari ihtiva eden bir insan çerçeve bölgesini ifade etmektedir. CDR'leri saglayan insan immünoglobülini, ana veya “akseptör” olarak adlandirilir ve çerçeve degisiklerini saglayan fare antikoru “donör” olarak adlandirilir. Sabit bölgelerin mevcut olmalari gerekli degildir, ancak mevcutlarsa, çogunlukla fare antikoru sabit bölgelerine büyük› ölçüde özdes, yani en az yaklasik› %85-90, yaklasik %99 veya daha fazla özdestir. Dolayisiyla, bazi uygulamalarda, bir tam-boy murinlestirilmis insan agir veya hafif Zincirli immünoglobülin bir fare sabit bölgesi, insan CDR'leri KK; bir dizi “murinlestirici” amino asit ikamelerine sahip büyük ölçüde insan bir çerçeve ihtiva eder. Tipik olarak, “murinlestirilmis bir antikor", bir murinlestirilmis degisken hafif zincir ve/veya bir murinlestirilmis degisken agir zincir içeren bir antikordur. Örnegin, murinlestirilmis bir antikor tipik bir kimerik antikoru kapsamayabilir, çünkü, örnegin, bir kimerik antikorun tümr degisken bölgesi fare- olmayandir. “Murinlestirme” islemiyle “murinlestirilmis” olan modifiye bir antikor, ana antikora kiyasla, CDR'leri saglayan ve çogunlukla farelerde daha az immünojen olan ana antikorla ayni antijene baglanir.
Burada kullanildigi sekliyle, “agir zincir kismi” terimi, bir immünoglobülin agir zincirinden türetilen amino asit dizilerini içerir. Bir agir zincir kismi içeren bir polipeptit asagidakilerin en az birini içerir: bir CHl alani, bir destek (örnegin, üst, orta ve/veya alt destek gölgesi) alani, bir CH2 alani, bir CH3 alani veya bunun bir varyanti veya fragmani. Örnegin, bulusta kullanim için bir baglayici protein, bir CHl alani içeren bir polipeptit zinciri; bir CHl alani, bir destek alaninin en azindan bir kismini ve bir CH2 alani içeren bir polipeptit zinciri; bir CHl alani ve bir CH3 alani içeren bir polipeptit zinciri; bir CHl alani, bir destek alaninin en azindan bir kismini ve bir` CH3 alani içeren bir polipeptit zinciri veya bir CHl alani, bir destek alaninin en azindan bir kismini, bir CHZ alani ve bir CH3 alani içeren bir polipeptit zinciri içerebilir. Bir baska uygulamada, bulusun bir polipeptidi, bir CH3 alani içeren bir polipeptit zinciri içerir. Ayrica, bulusta kullanim için bir baglayici polipeptit, en azindan bir CH2 alaninin bir kismindan (örnegin, bir CH2 alaninin tamamindan veya bir parçasindan) yoksun olabilir. Yukarida ortaya konuldugu üzere, teknikte normal uzmanliga sahip bir kisi tarafindan, bu alanlarin (örnegin, agir zincir kisimlarinin), dogal olusumlu immünoglobülin molekülünden amino asit dizisinde degisecekleri sekilde modifiye edilebilecekleri anlasilacaktir.
Burada açiklanan belirli antikorlarda veya bunlarin antijen- baglayici fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde, bir multimerin bir adet polipeptit zincirinin agir zincir kisimlari, multimerin bir ikinci polipeptit zinciri üzerindekilere özdestir. Alternatif olarak, bulusun agir zincir kisim-ihtiva eden monomerleri özdes degildir. Örnegin, her bir Hmnomer, örnegin, bir iki-özgül antikor veya diakor olusturan farkli bir hedef baglama alani içerebilir.
Bir baska uygulamada, burada açiklanan antikorlar veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari, varyantlari veya türevleri, scFv'ler gibi bir tekli polipeptit zincirinden olusur ve potansiyel in Vivo terapötik ve tanisal uygulamalar için intraselüler olarak eksprese edileceklerdir (intrakorlar).
Burada açiklanan tanisal ve tedavi yöntemlerinde kullanim için bir baglayici proteinin agir zincir kisimlari, farkli immünoglobülin moleküllerinden türetilebilir. Örnegin, bir polipeptidin bir agir zincir kismi, bir IgGl molekülünden türetilen bir CHl alani ve bir IgG3 molekülünden türetilen bir destek bölgesi içerebilir. Bir baska örnekte, bir agir zincir kismi, kismen bir IgGl molekülünden ve kismen bir IgG3 molekülunden türetilen bir destek bölgesi içerebilir. Bir baska örnekte, bir agir zincir kismi, kismen bir IgGl molekülunden ve kismen bir IgG4 molekülunden türetilen bir kimerik destek içerebilir.
Burada kullanildigi sekliyle, “hafif zincir kismi” terimi, bir immünoglobülin hafif zincirinden türetilen amino asit dizilerini içerir. Bir uygulamada, hafif zincir kismi, bir VL veya CL alaninin en az birini içerir.
Bir antikor için bir peptidin veya polipeptit epitopunun minimuni boyutunun, yaklasik dört ila bes amino asit oldugu düsünülmektedir. Peptit veya polipeptit epitoplari en az yedi, en az dokuz veya en az yaklasik 15 ila yaklasik 30 arasinda amino asit ihtiva edebilir. Bir CDR bir antijenik peptidi veya polipeptidi üçüncül formunda taniyabildiginden, bir epitop içeren amino asitlerin bitisik olmasi gerekli degildir ve bazi durumlarda, ayni peptit zinciri üzerinde bile olmayabilirler.
Mevcut bulusta, mevcut bulusun antikorlari tarafindan taninan bir peptit veya polipeptit epitopu, taununun en az 4, en az 5, , en az 25 veya yaklasik 5 ila yaklasik 30, yaklasik 10 ila yaklasik 30 veya yaklasik 15 ila yaklasik 30 arasinda bitisik veya bitisik-olmayan amino asitlik bir dizisini ihtiva eder.
Burada degisimli olarak kullanilan “özgül olarak baglanma” veya “özgül olarak tanima” terimleriyle, genel olarak bir baglayici molekülünün, Örnegin, bir antikorun bir epitopa antijen-baglanma alani vasitasiyla baglandigi ve baglanmanin, antijen-baglanma alaniyla epitop arasinda bir takim tamamlayiciliga. yol açtigi kastedilmektedir. Bu tanima göre, bir antikorun bir epitopa, o epitopa. antijen-baglanma alani vasitasiyla, bir rastgele, ilgisiz epitopa baglandigindan daha kolayca baglandiginda “özgül olarak baglandigi" söylenir.
Teknikte uzman bir kisi, bir antikorun, bitisik-olmayan bir epitopun bir dogrusal kismina karsilik gelen amino asit kalintilari içeren veya bunlardan olusan izole bir polipeptide özgül olarak baglanabildigini veya bunu özgül olarak taniyabildigini anlar. “Özgüllük” terimi burada, belirli bir antikorun belirli bir epitopa baglandigi bagil afiniteyi nitelemek için kullanilmaktadir. Örnegin, “A” antikoru, belirli bir epitop için “B” antikorundan daha yüksek bir özgüllüge sahip olarak farz edilebilir` veya “A” antikorunun yüksek bir özgüllükle baglandigi söylenebilir.
Mevcut oldugunda, bir antikorun bir antijenle “immünolojik baglanma karakteristikleri” veya diger baglanma karakteristikleri, tüm gramatik biçimlerinde, bir antikorun Özgüllük, afinite, çapraz-tepkenlik ve diger baglanma karakteristiklerini ifade etmektedir. örnegin, antikorun bir epitopa, bir ilgili, benzer, homolog veya analog epitopa baglanabildiginden daha kolayca özgül olarak baglandigi kastedilmektedir. Böylelikle, belirli bir epitopa “tercihli olarak baglanan” bir antikor o epitopa baglanmasi, bu tip bir antikor ilgili epitopla çapraz- tepkiyebilse de, ilgili bir epitoptan daha olasidir.
Sinirlayici-olmayan örnek yoluyla, bir baglayici molekülün, örnegin, bir antikorun bir birinci epitopa, söz konusu birinci epitopa antikorun ikinci epitopu için ayrisma sabitinden (Km daha az bir KD ile baglanirsa tercihli olarak baglandigi kabul edilmektedir. Bir baska sinirlayici-olmayan örnekte, bir antikorun bir birinci antijene, birinci epitopa antikorun ikinci epitop için Ko'sinden en az bir büyüklük derecesi daha az bir afiniteyle baglanirsa, tercihli olarak baglandigi kabul edilmektedir. Bir baska sinirlayici-olmayan örnekte, bir antikorun bir birinci epitopa, birinci epitopa antikorun ikinci epitop için KD'sinden en az iki büyüklük derecesi daha az bir afiniteyle baglanirsa, tercihli olarak baglandigi kabul edilmektedir.
Bir baska sinirlayici-olmayan örnekte, bir baglayici molekülün, örnegin, bir antikorun bir birinci antijene, birinci epitopa antikorun ikinci epitop için bir azalma oranindan (k(off)) daha az bir k(off) ile baglanirsa, tercihli olarak baglandigi kabul edilmektedir. Bir baska sinirlayici- olmayan örnekte, bir baglayici molekülün, örnegin, bir antikorun bir birinci antijene, birinci epitopa antikorun ikinci epitop için bir (k(off))'undan en az bir büyüklük derecesi daha az bir k(off) ile baglanirsa, tercihli olarak baglandigi kabul edilmektedir. Bir baska sinirlayici-olmayan örnekte, bir baglayici leekülün, örnegin, bir antikorun bir birinci antijene, birinci epitopa antikorun ikinci epitop için bir (k(off))'undan en az iki büyüklük derecesi daha az bir k(off) ile baglanirsa, tercihli olarak baglandigi kabul edilmektedir.
Burada açiklanan bir baglayici molekülün, örnegin, bir antikorun veya bunun antijen-baglayici fragmaninin, varyantinin veya türevinin bir tauya veya bunun bir fragmani snü'den daha az veya buna esit bir azalma oraniyla (k(off)) baglandigi söylenebilir. Bir uygulamada, bulusun bir antikorunun tauya veya bunun bir fragmani veya varyantina 5 x azalma oraniyla (k(off)) baglandigi söylenebilir.
Burada açiklanan bir baglayici molekülün, örnegin, bir antikorun veya bunun antijen-baglayici fragmaninin, varyantinin veya türevinin bir tauya veya bunun bir fragmani x 104 Drlsecü'den daha büyük veya buna esit bir artma oraniyla (k(on)) baglandigi söylenebilir. Bir uygulamada, bulusun bir antikorunun tauya veya bunun bir fragmani veya sn'l veya 107 DT1 snü'den büyük veya buna esit bir artma oraniyla (k(on)) baglandigi söylenebilir.
Bir baglayici molekülün, örnegin, bir antikorun, bir referans antikorun belirli bir epitopa baglanmasini, o epitopa, referans antikorun epitopa baglanmasini bir dereceye kadar bloke ettigi ölçüce tercihli olarak baglaniyorsa rekabetçi bir biçimde önledigi söylenir. Rekabetçi önleme, teknikte bilinen herhangi bir yöntemle, örnegin rekabet ELISA tayinleriyle belirlenebilir. Bir antikorun, referans antikorun belirli bir epitopa baglanmasini en az %90, en az %80, en az %70, en az söylenebilir. Teknikte uzman bir kisi, bir antikorun epitopuna baglanmasinin ayrica, bir antikor olmayan bir baglayici molekül tarafindan da rekabetçi sekilde önlenebildigini anlar. Örnegin, burada tarif edilen bir antikorun tauya, örnegin, hTau40'a özgül baglanmasi mikrotübüller tarafindan rekabetçi sekilde önlenebilir.
Burada kullanildigi sekliyle, “afinite” terimi, bir baglayici molekülün, Örnegin, bir immünoglobülin molekülünün CDR'sine sahip bir nwnferit epitopun baglanma kuvvetinin bir ölçüsünü ifade etmektedir; bakiniz, örnegin, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) sayfalar 27-28. Burada kullanildigi sekliyle antijen arasindaki kompleksin genel stabilitesini, yani, bir immünoglobülin karisiminin antijenle fonksiyonel birlesme kuvvetini ifade etmektedir; bakiniz, örnegin, Harlow sayfalar 29-34. Avidite, hem popülasyondaki münferit immünoglobülin moleküllerinin spesifik epitoplarla afinitesiyle hem immünoglobülinlerin ve antijenin degerlikleriyle ilgilidir. Örnegin, bir iki-degerli monoklonal antikorla, polimer gibi oldukça tekrarlayici bir epitop yapisina sahip bir antijen arasindaki etkilesim, yüksek aviditeli olabilir. Bir antikorun bir antijen için afinitesi ve aviditesi deneysel olarak herhangi bir uygun yöntem kullanilarak belirlenebilir; bakiniz, örnegin, Berzofsky et al., “Antibody-Antigen lnteractions” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W.
H. Freeman ve Company New York, N Y (1992) ve burada tarif edilen yöntemler. Bir antikorun bir antijen için afinitesinin ölçülmesi için genel tekniklere ELISA, RIA ve yüzey plazmon rezonansi dahildir. Belirli bir antikor-antijen etkilesiminin ölçülen afinitesi, fakli kosullar, örnegin, tuz konsantrasyonu, pH altinda ölçülürse degisebilir. Böylelikle, afinitenin ve diger antijen-baglanma parametrelerinin, örnegin, KD, ICm'nin ölçümleri tercihen, antikorun ve antijenin ve standardize bir tamponun standardize solüsyonlariyla yapilir.
Bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari ayrica, çapraz-tepkenlikleri açisindan da tarif edilebilir veya belirtilebilir. Burada kullanildigi sekliyle, bir ikinci antijenle tepkime yetisini; iki farkli antijenik madde arasindaki iliskinin bir ölçüsünü ifade etmektedir.
Böylelikle, bir antikor, olusumunu indükledigi epitoptan farkli bir epitopa baglanirsa çapraz tepkendir. Çapraz tepken epitop genellikle, indükleyici epitopla ayni tamamlayici yapisal özelliklerin birçogunu ihtiva eder ve bazi durumlarda, özgün olandan fiilen daha iyi uyar. Örnegin, belirli antikorlar, baglandiklari ilgili, ancak özdes-olmayan epitoplar, örnegin, referans bir epitopa (teknikte bilinen ve burada tarif edilen yöntemler kullanilarak hesaplandigi üzere) en az %95, en az %90, en az az %55 Km; en az %50 özdeslige sahip epitoplar açisindan bir çapraz-tepkenlik derecesine sahiptir. Bir antikor referans bir epitopa (teknikte bilinen ve burada tarif edilen yöntemler kullanilarak hesaplandigi üzere) %95'ten az, %90'dan az, çok az çapraz-tepkenlige sahip oldugu veya hiç olmadigi söylenebilir. Bir antikor, o epitopun herhangi bir diger analoguna, ortologuna veya homologuna baglanmazsa belirli bir epitop için “oldukça özgül” olarak farz edilebilir.
Bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari ayrica, tauya baglanma afiniteleri açisindan da tarif edilebilir veya belirtilebilir. Bir uygulamada, baglanma sabitine veya Kd'ye sahip olanlar da dahildir. Önceden gösterildigi üzere, çesitli immünoglobülin yapilarinin sabit bölgelerinin alt-birim yapilari ve üç boyutlu yapilandirmasi iyi bilinmektedir. Burada kullanildigi sekliyle, “vg alani” terimi, bir immünoglobülin agir zincirinin amino uç degisken alanini içerir ve “CHl alani” terimi, bir immünoglobülin agir zincirinin birinci sabit bölge alanini (en amino uç) içerir. CHl alani VH alanina bitisiktir ve bir immünoglobülin agir zincir molekülünün destek bölgesine amino Burada kullanildigi sekliyle “CH2 alani” terimi, bir agir zincir inolekülunun, bir` antikorun örnegin, 244 kalintisindan 360 kalintisina, konvansiyonel numaralandirma semalari kullanilarak uzanan kismini içerir (244 ila 360 arasindaki kalintilar, Kabat numaralandirma sistemi ve kalintilar 231- 340, EB numaralandirma sistemi; bakiniz adi geçen Kabat EA et al). CH2 alani, bir baska alanla yakin sekilde çiftlenmemesi açisindan benzersizdir. Daha ziyade, bir bozulmamis natif IgG molekülünün iki CH2 alani arasinda iki N-bagli dalli karbonhidrat zinciri yer alir. Ayrica, CH3 alaninin CH2 alanindan IgG molekülünün C-ucuna uzandigi ve yaklasik 108 kalinti içerdigi iyi sekilde belgelenmistir.
Burada kullanildigi sekliyle, “destek bölgesi” terimi, bir agir zincir molekülünün, CHl alanini CH2 alanina birlestiren kismini içermektedir. Bu destek bölgesi yaklasik olarak 25 kalinti içerir ve esnektir, böylelikle iki N-ucu antijen- baglanma bölgesinin bagimsiz olarak hareket etmesine olanak saglar. Destek bölgeleri üç ayri alana ayrilabilir: üst, orta ve alt ve destek alanlari; bakiniz Roux et al., J. Immunol.
Burada kullanildigi sekliyle “disülfit bag” terimi, iki sülfür atomu arasinda olusan esdegerli bagi içermektedir. Amino asit sisteini, bir disülfit bagi olusturabilen veya bir ikinci tiyol grubuyla köprülenebilen bir tiyol grubu içerir. Dogal olusumlu IgG moleküllerinin çogunda, CHl ve CL alanlari bir disülfit bagiyla baglidir ve iki agir zincir, Kabat numaralandirma sistemi kullanilarak 239 ve 242'ye karsilik gelen konumlarda iki disülfit bagiyla baglidir (konum 226 veya 229, AB numaralandirma sistemi).
Burada kullanildigi sekliyle, “bagli”, “kaynastirilmis” veya terimler, iki veya daha fazla ögenin veya bilesenin, kimyasal konjugasyon veya rekombinan araçlar dahil olmak üzere herhangi bir araçla bir araya getirilmesini ifade etmektedir. Bir çerçevesi (ORF) olusturmak için, özgün ORF'lerin dogru translasyonel okuma Çerçevesini muhafaza eden bir biçimde, iki veya daha fazla polinükleotid açik okuma çerçevesinin (ORF'ler) birlestirilmesini ifade etmektedir. Böylelikle, bir rekombinan füzyon proteini, özgün ORF'ler tarafindan kodlanan polipeptitlere karsilik gelen iki veya daha fazla segment (normalde dogada bu sekilde birlesmeyen segmentler) ihtiva eden bir tekli proteindir. Her ne kadar okuma çerçevesi kaynastirilmis segmentler* boyunca bu sekilde kesintisiz hale getirilse de, segmentler fiziksel veya mekansal olarak, örnegin, çerçeve-içi baglayici dizilerle ayrilmis hale getirilebilir. Örnegin, bir immünoglobülinin CDR'lerini kodlayan polinükleotidler, çerçeve-içi, kaynastirilabilir ancak, “kaynastirilmis” CDR'ler kesintisiz bir polipeptidin parçasi olarak es-transle edildigi sürece, en az bir immünoglobülin çerçeve bölgesini veya ilave CDR bölgelerini kodlayan bir polinükleotid tarafindan ayrilmis olabilir.
Burada kullanildigi sekliyle “ekspresyon” terimi, sayesinde bir genin bir biyokimyasal, örnegin, bir RNA veya polipeptit ürettigi bir islemi ifade etmektedir. Islem, hücre içerisindeki genin fonksiyonel varliginin, sinirlama olmadan, gen nakavtinin yani sira hem geçici ekspresyon hem stabil ekspresyon dahil olmak üzere herhangi bir belirtisini içerir.
Sinirlama olmadan genin mesajci RNA'nin (mRNA), transfer RNA'nin (tRNA), küçük toka RNA'nin (shRNA), küçük müdahil RNA'nin (siRNA) veya herhangi bir diger RNA ürününün içine transkripsiyonunu ve bu tip mRNA'nin polipeptidin (polipeptitlerin) içine translasyonunu içerir. Arzu edilen nihai ürün bir biyokimyasalsa, ekspresyon o biyokimyasalin ve herhangi öncüllerin yaratilmasini içerir. Bir genin ekspresyonu, bir gen ürünü" üretir. Burada kullanildigi sekliyle, bir gen ürünü ya bir nükleik. asit, örnegin, bir genin transkripsiyonuyla üretilen bir mesajci RNA veya bir transkriptten transle edilen bir polipeptit olabilir. Burada tarif edilen gen ürünleri ayrica, post transkripsiyonel modifikasyonlarla, Örnegin, poliadenilasyonla nükleik asitleri veya post transkripsiyonel modifikasyonlarla, örnegin, metillemeyle, glikosilasyonla, lipitlerin ilavesiyle, diger protein alt üniteleriyle iliskiyle, proteolitik yarilmayla ve benzerleriyle polipeptitleri içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, “numune terimi”, bir süjeden veya hastadan elde edilen herhangi bir biyolojik materyali ifade etmektedir. Bir yönde, bir numune kan, beyin-omurilik sivisi (“CSF") veya idrar içerebilir. Diger yönlerde, bir numune tam kan, plazma, kan numunelerinden zenginlestirilmis B hücreleri ve kültürlenmis hücreler (tam kan, plazma, kan numunelerinden zenginlestirilmis B hücreleri ve kültürlenmis hücreler (örnegin, bir süjeden B hücreleri) içerebilir. Bir numune ayrica, bir biyopsi veya sinir dokusu dahil olmak üzere doku numunesi de içerebilir. Yine diger yönlerde, bir numune tam hücreleri ve/veya hücrelerin bir lizatini da içerebilir.
Kan numuneleri teknikte bilinen yöntemlerle alinabilir. Bir Nonidet, l mM EDTA, l mM PMSF, 0,1M NaCl, IX Sigma Proteaz inhibitörü ve IX Sigma Fosfataz Inhibitörleri 1 ve 2) içinde girdaplamayla yeniden süspanse edilebilir. Süspansiyon, fasilali girdaplamayla 20 dakika süreyle buz üzerinde tutulabilir. 15.000 x g'de 5 döndürdükten sonra, süzüntü kesitleri yaklasik -70°C'de depolanabilir.
Burada kullanildigi sekliyle, “tedavi etmek” veya “tedavi" terimleri, hem terapötik tedaviyi hem profilaktik veya engelleyici önlemleri ifade etmekte olup, burada amaç, Parkinsonizmin gelismesi gibi, arzu edilmeyen bir fizyolojik degisikligin veya rahatsizligin engellenmesi veya yavaslatilmasidir (azaltilmasidir). Faydali veya arzu edilen sonuçlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, semptomlarin hafifletilmesi, hastaligin derecesinin azaltilmasi, hastaligin stabilize edilmis durumu (yani, kötülesmemesi), hastalik ilerleyisinin geciktirilmesi veya yavaslatilmasi, hastalik durumunun iyilestirilmesi veya hafifletilmesi ve saptanabilir olsun veya olmasin (kismi veya total) gerilemesi dahildir. uzatilan sagkalim anlamina da gelmektedir. Tedavi ihtiyaci içinde olanlara, halihazirda durumu veya rahatsizligi olanlarin yani sira duruma veya rahatsizliga yatkin olanlar veya durumun veya rahatsizligin belirtilerinin engellenmesi gerekenler dahildir. terimleriyle, kendisi için tani, prognoz, engelleme veya terapinin arzu edildigi herhangi bir süje, özellikle bir memeli süje, örnegin, bir insan hasta kastedilmektedir.
Mevcut bulus genel olarak, istemlerde karakterize edildigi üzere insan anti-tau antikorlariyla ve bunlarin antijen- baglayici fragmanlariyla ilgilidir. Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, Örneklerde resmedilen antikorlar için Özetlendigi üzere immünolojik baglanma karakteristikleri ve/veya biyolojik özellikler sergiler. Mevcut bulusa göre, tauya özgü insan monoklonal antikorlar, saglikli insan süjelerin bir havuzundan klonlanmistir.
Mevcut bulusa göre gerçeklestirilen deneyler süresince, ilk tesebbüsler tauya özgü antikorlari klonlamada basarisiz olmus ancak her zaman yanlis-pozitif klonlarla sonuçlanmistir. Bu problemin üstesinden gelmek amaciyla, insan hafiza B hücrelerinin kosullu vasatindaki antikorlar, rekombinan tau proteinine, AD'li beyinden, saglikli kontrol beyin ekstraktlarindan ve sigir serumu albümininden (BSA) ekstrakte edilmis PHFTau'ya baglanma açisindan paralel olarak taranmistir. Yalnizca, rekombinan tau ve/veya PHFTAU için pozitif olan ancak beyin ekstraktini veya BSA'yi kontrol etmeyen B-hücresi kültürleri antikor klonlamaya tabi tutulmustur.
Spesifik antikorlara izole etmek için ilk tesebbüsler, dolasimdaki tau antikorlari plazmasinin yükselmis seviyeleri hakkinda fikir verecek sekilde, tauya yüksek plazma baglanma aktivitesine sahip saglikli insan süjelerin havuzlarina odaklanmistir. Beklenmedik bir sekilde, bu tesebbüsler tauya özgü insan hafiza B hücrelerinin üretilmesinde basarisiz olmustur ve mevcut bulusta tarif edilen antikorlar, yüksek tau plazma tepkenligi açisindan önceden seçilmemis veya tauya düsük plazma tepkenligine sahip saglikli insan süjelerin havuzlarindan izole edilmistir.
Bu önleni nedeniyle, çesitli antikorlar` izole edilebilmistir.
Seçilen antikorlar, sinif ve hafif zincir alt-sinif belirlenmesi için daha da analiz edilmistir. Hafiza. B hücre kültürlerinden seçilen ilgili antikor mesajlari daha sonra RT- PCR ile transkribe edilmis, klonlanmis ve rekombinan üretim için ekspresyon vektörleri halinde birlestirilmistir; bakiniz ekli Örnekler. HEK293 veya CHO hücrelerindeki insan antikorlarinin rekombinan ekspresyonu ve müteakiben bunlarin tam boy tauya yönelik baglanma özgüllükleri (Sekil 2, Sekil 7 ve Sekil 12), Western Lekeleme üzerinde bunlarin patolojik olarak Inodifiye formlari (Sekil 3 ve Sekil 8) ve patolojik olarak kümelenmis tauya ayirt edici baglanmalari, klonlanmis olan insan antikorlarinin tauya oldukça özgül oldugunu ve tau proteininin patolojik olarak modifiye formlarini ayirt ederek tanidigini ilk kez teyit etmistir.
Böylelikle, mevcut bulus genel olarak bir izole dogal olusumlu insan monoklonal anti-tau antikoruyla ve bunun baglayici fragmanlariyla ilgilidir. Bulusun bir uygulamasinda, antikor, SEQ ID NO: 7'nin amino asit dizisini içeren ve (i) patolojik olarak modifiye tauyu baglayabilen, (ii) beyindeki norofibriler yumaklarda (NFT), nöropil ipliklerde ve/Veya distrofik nöritlerde, yumak-öncesi asamada patolojik olarak kümelenmis tauya baglanan ve (iii) immünohistokimyasal boyamayla tayin edildiginde, taunun saglikli bir donörün beynindeki fizyolojik formlarina büyük ölçüde baglanmayan bir Bir uygulamada, mevcut açiklama, antikorun NI-105-4E4 veya NI- 105.4A3 referans antikoruyla taunun ayni epitopuna özgül olarak baglandigi bir anti-tau antikoruna veya bunun antijen- baglayici fragmanina yöneliktir. Ek olarak, emsal antikor NI- 105-4E4 ile gerçeklestirilen dogrudan ELISA tayinlerinin ön sonuçlari, NI-lO5-4E4'ün taunun C-ucunu özgül olarak tanidigini ortaya çikarmaktadir. Gerçeklestirilen ilave tayinler, NI-lOS-4E4'ün iki dogrusal dizi içeren kesikli bir epitopu tanidigini ortaya koymaktadir: Sekil ll'de gösterildigi üzere R4 mikrotübül baglanma alani içerisinde bir birinci dogrusal dizi ve R4 ila C bölgeleri arasindaki bölge içerisinde bir ikinci dogrusal dizi. Bir uygulamada, bir kesintili-olmayan epitop veya bu bulusla saglanan bir antikor tarafindan bir epitop tarafindan içerilen bir dogrusal polipeptit, taunun, fizyolojik mikrotübül-iliskili tauda gizlenen mikrotübül baglanma alaninda yer alir. Epitop haritalama, aa337-343 VEVKSEK dahil olmak üzere insan tausunun mikrotübül baglanma alaninin içerisinde bir birinci diziyi (SEQ ID NO: 7), bu bulusun NI-105.4E4 antikoru tarafindan taninan epitop tarafindan içerilen bir benzersiz dogrusal polipeptit olarak tanimlamistir. Piyasadan temin edilen bir AT18O fare monoklonal tau antikoruyla ilave deneyler ve karsilastirma, NI-105.4E4'ün, SEQ ID NO: 7'nin benzersiz epitopunu özgül olarak tanidigini teyit etmistir. En avantajli olarak, bu bulusun NI-lO5.4E4 antikoru tarafindan taninan SEQ amino asit dizilerinin insan beyninde ve fare ve siçan gibi diger türlerde mevcut 6 tau izoformunun tümünde %100 korunur ve ayrica ilgili hayvan modellerinde mevcut bulusun antikorlariyla ilave bir arastirma araci saglar. Ileri deneyler, DEQ ID NO: 7'nin, SEQ ID NO: 6'nin V339 ve E342 kalintilarina karsilik gelen 3 ve 6 kalintilarinin, NI- 105.4E4'ün baglanmasina katkida bulundugunu göstermistir.
Epitop haritalama ayrica, SEQ ID NO: 6'nin aa387-397'si dahil olmak üzere insan tausunun mikrotübül baglayici alani içerisinde bu, bulusun NI-lOS.4E4 antikoru, tarafindan taninan epitop tarafindan içerilen bir benzersiz dogrusal polipeptit olarak bir ikinci dizi (SEQ ID NO: 41) tanimlamistir. SEQ ID karsilik gelen 1, 5 ve 9 kalintilari, NI-105.4E4'ün baglanmasina katkida bulunur.
Bir uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, SEQ ID NO: 7'nin amino asit kalintilarini içeren bir epitopta özgül olarak baglanir. Bir baska uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, SEQ ID NO: 41'in amino asit kalintilarini içeren bir epitopta özgül olarak baglanir. Spesifik bir uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, SEQ ID NO: 7 ve SEQ ID NO: 41'in amino asit kalintilarini içeren bir epitopta özgül olarak baglanir. Bir diger uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, SEQ ID NO: 6'nin V339, E342, D387, E391 ve K395 kalintilarindan olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla amino asit kalintisini içeren, bir epitopta özgül olarak baglanir. Epitop, SEQ ID NO: 6'nin V339, E342, D387, E391 ve K395 kalintilarindan olusan gruptan herhangi birini, herhangi ikisini, herhangi üçünü, herhangi dördünü veya besinin tümünü içerebilir. Spesifik bir uygulamada, tau hTau40'tir.
Bir uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, taunun mikrotübül baglayici alanini içeren bir epitopta baglanir.
Spesifik bir uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, Sekil ll'de gösterildigi üzere taunun R4 bölgesinden amino asit kalintilari içeren bir epitopta baglanir. Bir uygulamada, burada tarif edilen bir antikor, tauya özgül baglanma için mikrotübüllerle rekabet eder. Bir baska uygulamada, burada tarif edilen bir antikor mikrotübül iliskili tauya, antikorlarin mikrotübüllerle iliskili olmayan tauya baglanma afinitesine kiyasla indirgenmis baglanma afinitesine sahiptir. Bir diger uygulamada, burada tarif edilen bir antikor, mikrotübüllerle iliskili tauya baglanmaz veya büyük ölçüde baglanmaz. Spesifik uygulamalarda, tau proteini natif tau proteini veya rekombinan tau proteini olabilir. Spesifik bir uygulamada, tau hTau40'tir.10 Epitop haritalama ayrica, SEQ ID NO: 6'nin aa35-49'u dahil olmak üzere insan tausunun bir dizisini (SEQ ID NO: 42), bu bulusun NI-105.4A3 antikoru tarafindan taninan bir benzersiz epitop olarak tanimlamistir. SEQ ID NO: 42'nin, SEQ ID NO: kalintilari, NI-105.4A3'ün baglanmasina katkida bulunur. Bir uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, SEQ ID NO: 42'nin amino asit kalintilarini içeren bir epitopta özgül olarak baglanir. Bir diger uygulamada, burada tarif edilen bir antikor tauya, SEQ ID NO: 6'nin D40, A4l ve K44 kalintilarindan olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla amino asit kalintisi içeren bir epitopta özgül olarak baglanir. Epitop, SEQ ID NO: 6'nin D40, A41 ve K44 kalintilarindan olusan gruptan herhangi birini, herhangi ikisini veya üçünün tamamini içerebilir. Spesifik bir uygulamada, tau hTau40'tir.
Ayrica, Örneklerde kanitlandigi ve Sekil 6'da gösterildigi üzere ilk deneysel gözlemlere bagli kalmadan, mevcut bulusun insan monoklonal NI-105-4E4 anti-tau antikoru, patolojik olarak kümelenmis tauya özgül olarak baglanmasiyla ve tauyu beyin dokusundaki fizyolojik formunda büyük ölçüde tanimamasiyla karakterizedir. Bir uygulamada, mevcut bulusun bir insan anti-tau antikoru patolojik olarak kümelenmis tauya özgül olarak baglanabilir ve tauya beyin dokusundaki fizyolojik formunda büyük ölçüde baglanmayabilir. Ek olarak, mevcut bulusun bir insan anti-tau antikoru ayrica tauyu, beyindeki yumak-öncesi asamada, nörofibriler yumaklarda (NFT), nörOpil ipliklerde ve/veya distrofik nöritlerde tanima yetisiyle de karakterize edilebilir. Dolayisiyla, mevcut bulus baglanma özgüllüklerine sahip, böylelikle özellikle tanisal ve terapötik amaçlar için faydali insan tau antikorlarinin bir grubunu saglamaktadir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun antikoru, Örneklerde tarif edildigi üzere, emsal Nl-105-4E4 antikorunun baglanma Özelliklerini sergiler. Ek veya alternatif olarak, mevcut bulusun bir anti-tau antikoru, özellikle Örnek 4'e göre analiz edildiginde, fizyolojik formlardan ziyade patolojik olarak kümelenmis tauyu tercihli olarak tanir. Ek veya alternatif olarak, mevcut bulusun bir anti-tau antikoru, insan tausunun hastaliga neden mutantlarina, özellikle Örnek 4'te tarif edilenlere baglanir. Bu baglamda, baglanma özgüllükleri, sirasiyla, Sekil 2 ve Sekil lZ'dek. emsal NI-lOS-4E4 ve NI- l054A3 antikorlariyla gösterilen aralikta, yani, dogal-tip tau için yaklasik 100 pM ila 100 nM arasinda yari maksimal etkili konsantrasyonlara (EC50) veya yaklasik 100 pM ila 10 nM arasinda bir EC50'ye sahip olabilir.
Dolayisiyla, mevcut bulusun bir anti-tau antikoru, beyinde taunun patolojik olarak modifiye formlarina, örnegin Örnek 4'te tarif edilen immünohistokimyasal boyamayla örneklendigi üzere, taunun patolojik agregatlarina tercihli olarak baglanir. Bir` baska uygulamada, mevcut› bulusun. bir anti-tau antikoru, Örnek 2'de Western Lekelemeyle örneklendigi üzere hem rekombinan tauya hem taunun patolojik olarak modifiye formlarina tercihli olarak baglanir.
Mevcut bulus ayrica, antikorun, NI-lO5-4E4 veya NI-105.4A3 antikorununkine Özdes bir antijen-baglanma alani içerdigi bir antikora veya bunun antijen-baglayici fragmanina yakindir.
Mevcut bulus ayrica, degisken bölgelerinde, örnegin baglanma alanlarinda, Sekil 1A veya lC'de gösterilen amino asit dizilerini içeren VH ve VL degisken bölgesinin tamamlayicilik belirleme bölgelerini (CDR'ler) içermesiyle karakterize edilebilen bu tip antikorlari ve bunlarin baglayici fragmanlarini örnekler. Yukarida-tanimlanan degisken bölgeleri kodlayan karsilik gelen nükleotid dizileri, asagidaki Tablo10 2'de ortaya konulmaktadir. VE ve V1 bölgesinin yukaridaki amino asit dizilerinin emsal bir CDR grubu, Sekil 1A ve lC'de gösterildigi gibidir. Ancak, asagida müzakere edildigi üzere teknikte uzman bir kisi, ek veya alternatif olarak, amino asit dizlerinde Sekil 1'de gösterilenden CDR2 ve CDR3 durumunda bir, iki, üç veya daha fazla amino asit olarak farklilik gösteren CDR'lerin kullanilabilecegi unsurunun gayet farkindadir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, SEQ ID NO: 23-25, asit dizisi içeren veya bundan olusan CDR'leri içerir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, SEQ ID NO: 23'ün bir VH CDRl'ini; SEQ ID NO: 24'ün bir VH CDRZ'sini ve SEQ ID NO: 25'in bir VH CDR3'ünü içeren bir agir zincir degisken bölgesi içerebilir ve ayrica SEQ ID NO: 26'nin bir VL CDRl'ini; SEQ ID NO: 27'nin bir VL CDRZ'sini ve SEQ ID NO: 28'in bir VL CDR3'ünü içeren bir hafif zincir degisken bölgesi Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, SEQ ID NO: 35'in bir VH CDRl'ini; SEQ ID NO: 36'nin bir VH CDRZ'sini ve SEQ ID NO: 37'nin bir VH CDR3'ünü içeren bir agir zincir degisken bölgesi içerebilir ve ayrica SEQ ID NO: 38'in bir VL CDRl'ini; SEQ ID NO: 39'un bir VL CDR2'sini ve SEQ ID NO: 40'in bir VL CDR3'ünü içeren bir hafif zincir degisken bölgesi içerir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun antikoru, Sekil 1A veya 1C'de gösterildigi üzere VE ve V1 bölgesinin bir amino asit dizisini içeren bir antikordur. Bir uygulamada, mevcut bulusun antikoru, agir ve hafif zincirin kognat çiftlenmesinin insan B-hücresinde mevcut oldugu sekilde korunmasiyla karakterizedir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, SEQ ID NO: 9, 17 ve 93'ten olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içeren veya bundan olusan bir agir zincir degisken bölgesi (VH) içerir ve ayrica SEQ ID NO: ll ve 19'dan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içeren veya bundan olusan bir hafif zincir degisken bölgesi (VL) içerir. Spesifik bir uygulamada, antikor SEQ ID NO: 9'un bir VH'sini ve SEQ ID NO: ll'in bir VL'sini veya SEQ ID NO: 93'ün bir VH'sini ve SEQ ID NO: ll'in bir VL'sini veya SEQ ID NO: l7'nin bir VH'sini ve SEQ ID NO: l9'un bir VL'sini içerir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun antikoru, kültürlenen tekli veya oligoklonal B-hücrelerinin kültürleriyle saglanir ve kültürün, söz konusu B-hücreleri tarafindan üretilen antikorlari ihtiva eden süzüntüsü, buradaki anti-tau antikorlarinin varligi ve afinitesi için taranir. Tarama islemi, uluslararasi WOZOO4/O95031'de tarif edildigi gibi bir hassas doku amiloid plagi immünreaktivite (TAPIR) tayini; PHFTau'ya baglanma için beyin kesitleri üzerinde tarama; fosfat gruplarina sahip SEQ ID NO: 6 tarafindan temsil edilen amino asit dizisinin tausundan türetilen bir peptidin baglanmasi için söz konusu dizinin Ser-202 ve Thr-205 amino asitleri üzerinde, Thr-23l amino asidi üzerinde ve/Veya Ser- 396 ve Ser-404 amino asitleri üzerinde tarama; SEQ ID NO: 6 tarafindan temsil edilen amino asit dizisinin rekombinan insan tausunun baglanmasi için tarama ve baglanmanin saptandigi antikorun veya söz konusu antikoru üreten hücrenin izole edilmesi adimlarini içerir.
Yukarida belirtildigi üzere, bir insan bagisiklik yaniti üzerinde olusmasi nedeniyle, mevcut bulusun insan nmnoklonal antikoru, belirli patolojik baglantili olan ve sirasiyla, örnegin, fare Inonoklonal antikorlarinin olusturulmasi ve faj görüntüleme kitapliklarinin in vitro taranmasi için bagisiklama islemleri durumunda erisilebilir olmayabilen veya daha az immünojen olabilen epitoplari taniyacaktir.
Dolayisiyla, mevcut bulusun insan anti-tau antikorunun epitopunun benzersiz olmasini ve mevcut bulusun insan monoklonal antikoru tarafindan taninan epitopa baglanabilen antikor disinda baska hiç antikorun var olmamasini sart kosmak antikorlarinin benzersiz epitoplarini gösteren Sekil 11.
Antikorlar arasindaki rekabet, test edilen immünoglobülinin, bir referans antikorunun tau gibi bir ortak antijene özgül baglanmasini önledigi bir tayinle belirlenir. Rekabetçi baglanma tayinlerinin sayisiz tipleri bilinmektedir, örnegin: kati faz dogrudan veya dolayli radyoimmün-tayin (RIA), kati faz dogrudan veya dolayli enzim. immün-tayin (EIA), sandviç rekabet tayini; bakiniz Stahli et al., Methods in Enzymology 9 etiketli tayin, kati faz dogrudan etiketli sandviç tayin; bakiniz Harlow ve Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); IH5 etiketi kullanilarak kati faz dogrudan etiket RIA; bakiniz Morel et al, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 ve Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Tipik olarak, bu tip bir tayin, bir kati yüzeye bagli saflastirilmis taunun veya bunun agregatlarinin veya bunlarin herhangi birini tasiyan hücrelerin, bir etiketlenmemis test immünoglobülininin ve bir etiketli referans immünoglobülinin, yani, mevcut bulusun insan monoklonal antikorunun kullanilmasini içerir. Rekabetçi önleme, test immünoglobülininin varliginda. kati yüzeye bagli etiketin veya hücrelerin miktarinin belirlenmesiyle ölçülür. Çogunlukla test immünoglobülini fazla miktarda mevcuttur. Bir uygulamada, rekabetçi baglanma tayini, ekli Örneklerde ELISA tayini için tarif edilen sekildeki kosullar altinda gerçeklestirilir. Rekabet tayiniyle tanimlanan antikorlar (rekabetçi antikorlar), referans antikorla ayni epitopa baglanan antikorlar ve sterik engellemenin meydana gelmesi için referans antikor tarafindan baglanan epitopa yeterince yakin bir bitisik epitopa baglanan antikorlar dahildir. Çogunlukla, bir rekabetçi antikor fazla miktarda mevcut oldugunda, bir referans antikorun bir ortak antijene özgül baglanmasini en az %50 veya %75 önleyecektir.
Bir immünoglobülin veya kodlayici cDNA'si da modifiye edilebilir. Böylelikle, bir diger uygulamada mevcut bulusun yöntemi, bir kimerik antikor, murinlestirilmis antikor, tek- zincirli antikor, Fab-fragmani, iki-özgül antikor, füzyon antikoru, etiketli antikor veya bunlarin herhangi birinin bir analogunu. üretme adim(lar)inin. herhangi birini içerir. Uygun yöntemler teknikte uzman kisi tarafindan bilinmektedir ve örnegin, Harlow ve Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring' Harbor (1988)'de tarif edilmektedir. Söz konusu antikorlarin türevleri faj görüntüleme teknigiyle elde edildiginde, burada tarif edilen antikorlarin herhangi birininkiyle ayni epitopa baglanan faj antikorlarinin etkililigini arttirmak. için, BIAcore sisteminde kullanildigi sekilde yüzey plazmon rezonansi kullanilabilir (Schier, Human örnegin, uluslararasi yayin WO89/O9622'de tarif edilmektedir.
Insanlastirilmis antikorlarin üretilmesi için yöntemler, örnegin, Avrupa basvurusu EP-Al O 239 400'de ve uluslararasi yayin WO90/07861'de tarif edilmektedir. Mevcut bulusa göre kullanilacak olan antikorlarin bir diger kaynagi, ksenojenik antikorlar olarak adlandirilan antikorlardir. Farelerdeki insan-benzeri antikorlar gibi ksenojenik antikorlarin üretilmesi için genel prensip, örnegin, uluslararasi 96/33735'te tarif edilmektedir. Yukarida müzakere edildigi üzere, bulusun antikoru, tamamlanmis antikorlarin yani sira, örnegin, Fv, Fab ve F(ab)2 dahil olmak üzere çesitli formlarda ve ayrica tekli zincirlerde de var olabilir; bakiniz örnegin uluslararasi basvuru W088/O9344.
Mevcut bulusun antikorlari veya bunlarin karsilik gelen immünoglobülin zincir(ler)i, teknikte bilinen konvansiyonel teknikler kullanilarak, örnegin, ya tek basina veya kombinasyon halinde amino asit silintisi (silintileri), katmasi (katmalari), ikamesi (ikameleri), eklemesi (eklemeleri) ve/veya rekombinasyonu (rekombinasyonlari) ve/veya teknikte bilinen herhangi diger modifikasyon(lar) kullanilarak daha da nmdifiye edilebilir. Bir immünoglobülin zincirinin bir amino asit dizisinin altinda yatan DNA dizisinde bu tip modifikasyonlarin karilmasi için yöntemler teknikte uzman kisi tarafindan iyi bilinmektedir; bakiniz, örnegin, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. ve Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates ve Wiley Interscience, N.Y. (1994). Bulusun antikorunun modifikasyonlarina, yan zincir modifikasyonlari, belkemigi modifikasyonlari ve asetilasyon, hidroksilleme, metilleme, amidasyon ve karbonhidrat veya lipit kisimlarinin, kofaktörlerinin eklenmesi ve benzerleri dahil olmak üzere N- ve C-terminal modifikasyonlari dahil olmak üzere bir veya daha fazla yapitasi amino asitte kimyasal ve/veya enzimatik türetmeler dahildir. Benzer sekilde, mevcut bulus, karboksil uçlarinda bir immünostimülatör gibi heterolog moleküle kaynastirilmis amino uçlarinda tarif edilen antikoru veya bunun bazi fragmanlarini içeren kimerik proteinlerin üretimini kapsamaktadir; karsilik gelen teknik ayrintilar için bakiniz, örnegin, uluslararasi basvuru WOOO/30680.
Ek olarak, mevcut açiklama, yukarida tarif edilen sekilde bir baglayici molekül ihtiva edenleri, örnegin belirtilen antikorlarin herhangi birinin degisken bölgesinin CDR3 bölgesini, agir zincir CDR3'ün (HCDR3) antijen-antikor etkilesimde daha büyük bir degiskenlik. derecesine ve baskin bir katilima sahip oldugu siklikla gözlemlendiginden özellikle agir zincirin CDR3'ünü ihtiva edenler dahil olmak üzere peptitleri kapsar. Bu tip peptitler, bulusa göre faydali bir baglayici ajan üretmek için rekombinan araçlarla kolayca sentezlenebilir veya üretilebilir. Bu tip yöntemler, teknikte normal uzmanliga sahip kisilerce iyi bilinmektedir. Peptitler, örnegin, piyasada bulunan otomatik peptit sentezleyiciler kullanilarak sentezlenebilir. Peptitler ayrica, peptidi eksprese eden DNA bir ekspresyon vektörünün içine katilarak ve hücreler peptit üretmek için ekspresyon vektörüyle dönüstürülerek rekombinan tekniklerle de üretilebilir.
Dolayisiyla, mevcut bulus, mevcut bulusun insan anti-tau antikorlarina dogru yönlendirilen ve belirtilen özellikleri sergileyen, yani istemlerde karakterize edildigi üzere tauyu özgül olarak taniyan herhangi bir antikorla veya bunun baglayici fragmaniyla ilgilidir. Bu tip antikorlar ve baglayici moleküller, baglanma özgüllükleri ve afiniteleri için burada tarif edildigi üzere ELISA ve Western Lekeleme ve immünohistokimya ile test edilebilir, bakiniz, örnegin, Örnekler. Dahasi, mevcut bulusa göre gerçeklestirilen müteakip deneylerin ön sonuçlari, mevcut bulusun insan anti-tau antikorunun, özellikle NI-105.4E4 antikorunun birincil olarak, ek olarak Alzheimer hastaligindan (AD) muzdarip hastalarin insan beyin kesitleri üzerinde mevcut olan nörofibriler yumaklara (NFT), nöropil ipliklere benzeyen patolojik olarak kümelenmis tauya baglandigini ortaya çikarmistir. Böylelikle, mevcut bulusun özellikle tercih edilen bir uygulamasinda, insan antikoru veya bunun baglayici fragmani insan AD'li beyin kesitleri üzerinde tauyu tanir. Üstelik, NI-105.4E4 antikorunun, tau patolojilerine farkli açilardan belirgin baglanma yetisi de insan tausu P301L'yi asiri eksprese eden transgenik farede gösterilebilir. Halihazirda belirtilmis olan NFT'lere ve nöropil ipliklere ek olarak, NI-105.4E4 antikoru fare beyin kesitleri üzerinde ayrica distrofik nöritlere de baglanir ve yumak-öncesi asamada ta agregatlarini tanimlar; bakiniz Örnek 4 ve Sekil 6.
Immünoglobülinlerin dogrudan ölümsüzlestirilmis B hücrelerinden veya hafiza B hücrelerinden elde edilmesine bir alternatif olarak, ölümsüzlestirilmis hücreler, müteakip ekspresyon ve/veya genetik manipülasyon için yeniden düzenlenmis agir zincir ve hafif zincir konumlarinin bir kaynagi olarak kullanilabilir. Yeniden düzenlenmis antikor genleri, cDNA üretmek için uygun mRNA'lardan ters transkribe edilebilir. Arzu edilirse, agir zincir sabit bölgesi, farkli bir izotipinkiyle degis tokus edilebilir veya hep birlikte ortadan kaldirilabilir. Degisken bölgeler, tek Zincirli FV bölgelerini kodlamak için baglanabilir. Çoklu FV bölgeleri, birden fazla hedefe baglanma yetisi kazandirmak için baglanabilir veya kimerik agir ve hafif zincir kombinasyonlari kullanilabilir. Genetik materyal mevcut oldugunda, yukarida tarif edildigi üzere arzu edilen hedefe baglanma yetilerini muhafaza eden analoglarin tasarimi kolaydir. Antikor degisken bölgelerinin klonlanmasi ve rekombinan antikorlarin üretilmesi için yöntemler, teknikte uzman kisi tarafindan bilinmektedir ve örnegin, Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; edilmektedir.
Uygun genetik materyal elde edildiginde ve arzu edilirse, bir analog kodlamak için modifiye edildiginde, minimumda, agir ve hafif zincirin degisken bölgelerini kodlayanlar dahil olmak üzere kodlama dizileri, standart rekombinan konak hücrelerin içine transfekte edilebilen vektörler üzerinde bulunan ekspresyon sistemlerinin içine sokulabilir. Bu tip çesitli konak hücreler kullanilabilir; ancak, etkili isleme için, memeli hücreleri göz önüne alinabilir. Bu amaç dogrultusunda faydali tipik memeli hücrelerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, CHO hücreleri, HEK 293 hücreleri veya NSO hücreleri dahildir.
Antikorun veya analogun üretimi daha sonra, modifiye rekombinan konagin, konak hücrelerin büyümesi ve kodlama dizilerinin ekspresyonu için uygun kültür kosullari altinda kültürlenmesiyle üstlenilir. Antikorlar daha sonra, kültürden izole edilmeleriyle geri kazanilir. Ekspresyon sistemleri sinyal peptitlerini içermeleri için tasarlanir, böylece olusan antikorlar vasatin içine salgilanir; ancak, hücre için üretim de mümkündür.
Yukaridakine göre, mevcut bulus ayrica, mevcut bulusun antikoru veya esdeger baglayici molekülünü kodlayan bir polinükleotidler ilgilidir. Bir uygulamada, polinükleotid, yukarida tarif edilen antikorun bir immünoglobülin zincirinin en az bir degisken bölgesini kodlar. Tipik olarak, polinükleotid tarafindan kodlanan söz konusu degisken bölge, söz konusu antikorun degisken bölgesinin VH ve Vi'sinin tamamlayicilik belirleme bölgelerini (CDR'ler) içerir.
Teknikte uzman kisi, yukarida-tarif edilen degisken alana sahip antikorun degisken alaninin, arzu edilen özgüllükte ve biyolojik fonksiyonda diger polipeptitlerin veya antikorlarin insa. edilmesi için kullanilabilecegini kolayca. anlayacaktir.
Böylelikle, mevcut bulus ayrica, yukarida-tarif edilen degisken alanin en azindan CDR'lerini içeren ve avantajli olarak ekli örneklerde tarif edilen antikorla büyük ölçüde ayni veya benzer baglanma özelliklerine sahip polipeptitleri ve antikorlari da kapsar. Teknikte uzman kisi, baglanma afinitesinin, amino asit ikamelerinin CDR'lerin içinde veya Kabat tarafindan tanimlandigi üzere CDR'lerle kismen örtüsen hiper-degisken halkalarin içinde yapilmasiyla güçlendirilebilecegini bilir (Chothia ve Lesk, J. Mol. Biol.10 her iki immünoglobülin zincirlerinde, Sekil 1A ve 1C'de ortaya konuldugu üzere degisken bölgelerin üç CDR'sinin tümünü Bulusun antikorlari veya antijen-baglayici fragmanlari, teknikte normal uzmanliga sahip kisiler tarafindan bilindigi üzere, bir 'veya daha fazla efektör fonksiyonlarina aracilik eden bir sabit bölge içerebilir. Örnegin, komplemanin C1 bileseninin bir antikor sabit bölgesine baglanmasi, kompleman sistemini aktive edebilir. Komplemanin aktivasyonu, hücre patojenlerinin opsonizasyonu ve lizisinde önemlidir.
Komplemanin aktivasyonu ayrica enflamatuar yaniti da uyarir ve ayrica otoimmün asiri duyarlilikta da yer alabilir. Ayrica, antikorlar reseptörlere, antikor FC bölgesi üzerindeki bir PC reseptörü baglanma alaninin bir hücre üzerindeki bir Fc reseptörüne (FcR) baglanmasiyla, Fc bölgesi vasitasiyla baglanir. IgG (gama reseptörleri), IgE (epsilon reseptörleri), üzere antikorun farkli siniflari için özgül olan bir dizi Fc reseptörü vardir. Antikorun hücre üzerinde Fc reseptörlerine baglanmasi, antikor-kapli partiküllerin yutulmasi ve yikimi, immün komplekslerinin klirensi, antikor-kapli hedef hücrelerin (antikor-bagimli hücre-aracili sitotoksisite veya ADCC olarak adlandirilan) katil hücreler tarafindan lizisi, enflamatuar aracilarin salinmasi, plasental aktarim ve immünoglobülin üretiminin kontrolü dahil olmak üzere bir dizi önemli ve çok yönlü biyolojik yanitlari tetikler.
Dolayisiyla, mevcut bulusun belirli uygulamalari, yaklasik olarak ayni immünojenesiteye sahip bir tam, degistirilmemis antikorla karsilastirildiginda indirgenmis efektör fonksiyonlar, esdegerli-olmayan dimerize yetisi, tau kümelesmesi ve birikimi alaninda artan lokalize olma yetisi, indirgenmis seruni yari-ömrü 'veya arttirilmis seruni yari-ömrü gibi arzu edilen biyokimyasal karakteristikler saglamak amaciyla, sabit bölge alanlarinin birinin veya daha fazlasinin en az bir kesitinin silinmis oldugu veya baska sekillerde degistirildigi bir antikoru veya bunun antijen-baglayici fragmanini içerir. Örnegin, burada tarif edilen tanisal ve tedavi yöntemlerinde kullanim için belirli antikorlar, bir immünoglobülin agir zincirine benzer bir polipeptit zincir içeren, ancak bir veya daha fazla agir zincir alaninin en azindan bir kismindan yoksun olan, alani silinmis antikorlardir. Örnegin, belirli antikorlarda, modifiye antikorun sabit bölgesinin bir tam alani silinecektir, örnegin, CH2 alaninin tamami veya bir* parçasi silinecektir.
Diger uygulamalarda, burada tarif edilen tanisal ve tedavi yöntemlerinde kullanim için belirli antikorlar, glikosilasyonun saf disi edilmesi için degistirilen, bir sabit bölgeye sahiptir` ve buradaki diger` bölümlerde aglikosilatli veya “agli” antikorlar olarak ifade edilir. Bu tip “agli” antikorlar enzimatik olarak ve ayrica sabit bölgedeki konsensüs glikosilasyon alan(lar)inin islenmesiyle hazirlanabilir. Teoriye bagli kalinmadan, “agli” antikorlarin, in vivo gelismis bir güvenlik ve stabilite profiline sahip olabildigine inanilmaktadir. Arzu edilen efektör fonksiyonuna sahip aglikosilatli antikorlarin üretilmesi yöntemleri, Burada tarif edilen belirli antikorlarda veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde, efektör fonksiyonunu azaltmak için FC kismi teknikte bilinen teknikler kullanilarak mutasyona ugratilabilir. Örnegin, bir sabit alanin (nokta mutasyonlar veya diger araçlar yoluyla) silinmesi veya inaktivasyonu, dolasimdaki modifiye antikorun FC reseptörü baglanmasini azaltabilir ve böylece tau lokalizasyonunu arttirir. Diger durumlarda, kompleman baglanmasini hafifleten ve böylelikle serum yari-ömrünü ve konjuge bir sitotoksinin özgül-olmayan iliskisini azaltan unsur, mevcut bulusla tutarli o sabit bölge modifikasyonlari olabilir. Yine de sabit bölgenin modifikasyonlari, artan antijen özgüllügü veya antikor esnekligi nedeniyle güçlendirilmis lokalizasyonuna olanak saglayan disülfit baglantilarini veya oligosakkarit kesitlerini modifiye etmek için kullanilabilir. Tau lokalizasyonu, biyodagilim ve serum yari-ömrü gibi modifikasyonlarin olusan fizyolojik profili, biyoyararlanimi ve diger biyokimyasal etkileri, gereksiz deneyler olmadan iyi bilinen immünolojik teknikler kullanilarak kolayca ölçülebilir ve miktarlari belirlenebilir.
Burada tarif edilen belirli antikorlarda veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde, Fc kismi, örnekleme yoluyla antikorlarin reseptör-aracili endositozunun Fcy reseptörleri, LRP veya Thyl reseptörleri araciligiyla veya antikorlarin onlara zarar vermeden canli hücrelerin içine tasinmasini sagladigi söylenen güçlendirilmesiyle antikorlarin hücresel alimini arttirmak için mutasyona ugratilabilir veya alternatif protein dizileri için degis tokus edilebilir (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Örnegin, antikor baglanma bölgesinin füzyon proteinlerinin ve hücre yüzeyi reseptörlerinin kognat protein ligandlarinin veya taunun yani sirar bir hücre yüzeyi reseptörüne baglanan spesifik bir diziye sahip iki- veya çoklu-özgül antikorlarin olusturulmasi, teknikte bilinen teknikler kullanilarak islenebilir.
Burada tarif edilen belirli antikorlarda veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarinda, varyantlarinda veya türevlerinde, Fc kismi alternatif protein dizileri için mutasyona ugratilabilir veya degis tokus edilebilir veya antikor, kan beyin bariyeri penetrasyonunun arttirilmasi için kimyasal olarak modifiye edilebilir.
Bulusun antikorlarinin veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarinin modifiye formlari, teknikte bilinen teknikler kullanilarak tam öncül veya ana antikorlardan yapilabilir.
Emsal teknikler burada daha ayrintili olarak müzakere edilmektedir. Bulusun antikorlari veya bunlarin antijen- baglayici fragmanlari, teknikte bilinen teknikler kullanilarak yapilabilir veya üretilebilir. Belirli uygulamalarda, antikor molekülleri veya bunlarin fragmanlari “rekombinan olarak üretilir”, yani, rekombinan DNA teknolojisi kullanilarak üretilir. Antikor moleküllerinin veya bunlarin fragmanlarinin yapilmasi için emsal teknikler, buradaki diger bölümlerde daha ayrintili olarak müzakere edilmektedir.
Bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari ayrica, örnegin, herhangi bir tipte molekülün antikora, esdegerli eklenmenin antikorun kendi kognat epitopuna özgül olarak baglanmasini engellemedigi sekilde esdegerli eklenmesiyle modifiye edilen türevleri de içerir. Örnegin, ancak sinirlama olmadan, antikor türevlerine, örnegin, glikosilasyonla, asetilasyonla, pegilasyonla, fosforilasyonla, amidasyonla, bilinen koruyucu/bloke edici gruplar, proteolitik yarilma, bir hücresel liganda veya diger proteine baglanti vb tarafindan türevlemeyle modifiye edilmis olan antikorlar dahildir. Sayisiz kimyasal modifikasyonun herhangi biri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kimyasal yarilma, asetilasyon, formilasyon, tunisamisinin metabolik sentezi vb dahil olmak üzere bilinen tekniklerle gerçeklestirilebilir. Ek olarak, türev bir veya daha fazla klasik-olmayan amino asit ihtiva edebilir.
Belirli uygulamalarda, bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari, tedavi edilecek hayvanda, örnegin, bir insanda zararli bir bagisiklik yanitina neden olmayacaktir. Belirli uygulamalarda, baglayici moleküller, Örnegin, bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari bir hastadan, Örnegin, bir insan hastadan türetilir ve müteakiben türetildikleri ayni türde, örnegin, insanda, zararli bagisiklik yanitlarinin ortaya çikmasini hafifleterek veya minimuma indirgeyerek kullanilir.
Bagisiksizlastirma ayrica, bir antikorun immünojenesitesini azaltmak için de kullanilabilir. Burada kullanildigi sekliyle, epitoplarini modifiye etmesinin degistirilmesini içerir; bakiniz, örnegin, uluslararasi basvurular WO98/52976 ve WOOO/343l7. Örnegin, baslangiç antikorundan VH ve VL dizileri analiz edilir ve her bir V bölgesinden, dizi içerisindeki tamamlayicilik belirleme bölgeleriyle (CDR'ler) ve diger kilit kalintilarla ilgili olarak epitoplarin konumunu gösteren bir insan T hücresi epitopu “haritasi” çikarilir. T hücresi epitopu haritasindan münferit T hücresi epitoplari, nihai antikorun aktivitesinin degistirilmesinin düsük. bir riskiyle alternatif amino asit ikamelerini tanimlamak amaciyla analiz edilir. Bir dizi alternatif Vh ve VL dizisi, amino asit ikamelerinin kombinasyonlarini içererek tasarlanir ve bu diziler müteakiben, burada açiklanan tanisal ve tedavi yöntemlerinde kullanim. için, daha sonra fonksiyon için test edilen bir dizi baglayici polipeptidin, örnegin, tauya-özgü antikorlarin veya bunlarin immünospesifik fragmanlarinin içine katilir. Tipik olarak, 12 ila 24 arasinda varyant antikoru olusturulur ve test edilir. Modifiye V ve insan C bölgeleri içeren tam agir ve zincir genleri daha sonra, tam antikorun üretilmesi için ekspresyon vektörlerinin ve hücre çizgilerinin içine eklenen müteakip plazmidlerin içine klonlanir.
Antikorlar daha sonra uygun biyokimyasal ve biyolojik tayinlerde karsilastirilir ve optimal varyant tanimlanir.
Monoklonal antikorlar, hibridoni kullanimi, rekombinan ve faj görüntüleme teknolojileri veya bunlarin bir kombinasyonu dahil olmak üzere teknikte bilinen çok çesitli teknikler kullanilarak hazirlanabilir. Örnegin, monoklonal antikorlar, teknikte bilinen ve örnegin, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory› Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies ve T- dahil olmak üzere hibridom teknikleri kullanilarak üretilebilir. Burada kullanildigi sekliyle, “monoklonal antikor” terimi, hibridom teknolojisi yoluyla üretilen antikorlarla sinirli degildir. “Monoklonal antikor" terimi, herhangi bir ökaryotik, prokaryotik veya faj klonu dahil olmak üzere bir tekli klondan türetilen bir antikoru ifade etmektedir ve üretildigi yöntemi ifade etmez. Böylelikle, üretilen antikorlarla sinirli degildir. Belirli uygulamalarda, mevcut bulusun antikorlari, burada tarif edildigi üzere, Epstein-Barr Virüsüyle transformasyon vasitasiyla ölümsüzlestirilmis olan insan B hücrelerinden türetilir.
Iyi-bilinen hibridom isleminde (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495), bir memeliden nispeten kisa-ömürlü veya ölümlü lenfositler, Örnegin, burada tarif edildigi üzere bir insan süjeden türetilen B hücreleri, bir ölümsüz tümör hücre çizgisiyle (örnegin, bir miyelom hücre çizgisiyle) kaynastirilir, böylelikle, hem ölümsüz olan hem B hücresinin genetik olarak kodlanan antikorunu üretebilen melez hücreleri veya “hibridomlari” üretir. Olusan melezler, her bir münferit susun bir tekli antikorun olusumu için spesifik genler içermesi seklinde, seçimle, seyreltmeyle ve yeniden büyütmeyle tekli genetik suslara ayrilir. Arzu edilen bir antijene karsi homojen olan antikorlari üretirler ve saf genetik ebeveynliklerine istinaden, “monoklonal” terimi verilir.
Bu sekilde hazirlanan hibridom hücreleri, kaynastirilmamis, parental miyelom hücrelerinin büyümesini veya sagkalimini önleyen bir veya daha fazla madde ihtiva eden uygun bir kültür vasatinda tohumlanir ve büyütülür. Teknikte uzman kisiler, hibridomlarin olusturulmasi, seçilmesi ve büyütülmesi için belirteçlerin, hücre çizgilerinin ve vasatin piyasada bir dizi kaynaktan temin edilebilecegini ve standardize protokollerin iyi olusturuldugunu anlayacaktir. Genel olarak, hibridom hücrelerinin içinde büyüdügü kültür vasati, arzu edilen antijene karsi monoklonal antikorlarin üretimi için tayin edilir. Hibridom hücreleri tarafindan üretilen monoklonal antikorlarin baglanma özgüllügü, burada tarif edildigi üzere immünopresipitasyon, radyoimmün-tayini (RIA) veya enzime-bagli bagisiklik tayini (ELISA) gibi in vitro tayinlerle belirlenir.
Arzu edilen özgüllük, afinite ve/veya aktiviteye sahip antikorlari üreten hibridom hücreleri tanimlandiktan sonra, klonlar, standart yöntemler ile seyreltme prosedürlerinin ve büyümenin sinirlanmasiyla alt klonlanabilir; bakiniz, örnegin, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986). Ayrica, alt klonlar tarafindan salgilanan monoklonal antikorlarin, örnegin, protein-A, hidroksilapatit kromatografi, jel elektroforez, diyaliz veya afinite kromatografi gibi konvansiyonel saflastirma prosedürleriyle kültür vasatindan, assit sivisindan veya serumdan ayrilabilecegi de anlasilacaktir.
Bir baska uygulamada, lenfositler mikro-manipülasyonla seçilebilir ve degisken genler izole edilir. Örnegin, periferik kan tek çekirdekli hücreler, bagisiklanmis veya dogal olarak bagisik bir memeliden, örnegin, bir insandan izole edilebilir ve yaklasik 7 süreyle in vitro kültürlenebilir. Kültürler, tarama kriterlerini karsilayan spesifik IgG'ler için taranabilir. Pozitif kuyucuklardan hücreler izole edilebilir. Münferit Ig-üreten B hücreleri FACS ile veya bunlari bir kompleman-aracili hemolitik plak tayininde tanimlayarak izole edilebilir. Ig-üreten B hücreleri bir tüpün içine mikro-manipüle edilebilir ve V3 ve V1 genleri, Örnegin, RT-PCR kullanilarak güçlendirilebilir. VE ve VL genleri, ekspresyon için bir antikor ekspresyon vektörünün içine klonlanabilir ve hücrelerin (örnegin, ökaryotik veya prokaryotik hücrelerin) içine transfekte edilebilir.
Alternatif olarak, antikor-üreten hücre çizgileri, teknikte uzman kisi tarafindan iyi bilinen teknikler kullanilarak seçilebilir ve kültürlenebilir. Bu tip teknikler çesitli laboratuar kilavuzlarinda ve baslica yayinlarda tarif edilmektedir. Bu açidan, asagida tarif edildigi sekilde bulusta. kullanini için uygun teknikler, Current Protocols in and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)'de tarif edilmektedir.
Spesifik antikorlari taniyan antikor fragmanlari bilinen tekniklerle olusturulabilir. Örnegin, Fab ve F(ab')2 fragmanlari rekombinan olarak. veya (Fab fragmanlari üretmek için) papain veya (F(ab')2 fragmanlari üretmek, için) pepsin gibi enzimler kullanilarak, immünoglobülin leeküllerinin proteolitik yarilmasiyla üretilebilir. F(ab')2 fragmanlari degisken bölgeyi, hafif zincir sabit bölgesini ve agir zincirin CHl alanini içerir. Bu fragmanlar, örnegin, immünoglobülinlerin immünospesifik kisimlarinin radyoizotoplar gibi saptama belirteçlerine eslestirilmesini içeren immüno- tanisal prosedürlerde kullanim için yeterlidir.
Burada tarif edilen sekilde oldugu gibi insan antikorlari özellikle insan hastalarda terapötik kullanim için arzu edilir. Mevcut bulusun insan antikorlari, örnegin, yaslari nedeniyle bir tauopatik rahatsizliga, örnegin, Alzheimer hastaligina yakalanma riskinde olduklarindan süphelenebilen saglikli insan süjelerden veya rahatsizligi olan ancak olagandisi bir stabil hastalik seyri olan bir hastadan izole edilir. Ancak, sirasiyla, yasli saglikli ve semptomsuz süjelerin koruyucu anti-tau antikorlarini daha genç süjelerden daha düzenli gelistirebilecegini beklemek sagduyulu olsa da, daha genç süjeler de mevcut bulusun bir insan antikorunun elde edilmesi için bir kaynak olarak kullanilabilir. Bu durum, bir tauopatik hastaligin ailesel bir formunu gelistirmeye meyilli ancak bagisiklik sistemi fonksiyonlari daha yasli hastalardan daha etkili islev gördügünden semptomsuz kalan daha genç hastalar için özellikle geçerlidir.
Mevcut bulusun antikorlari teknikte antikorlarin sentezi için bilinen herhangi bir yöntemle, özellikle, burada tarif edildigi sekilde kimyasal sentezle veya rekombinan ekspresyon teknikleriyle üretilebilir.
Bir uygulamada, bulusun bir antikoru veya bunun antijen- baglayici fragmani, bir veya daha fazla alanin kismen veya tamamen silindigi bir sentetik sabit bölge içerir (“alani- silinmis antikorlar"). Belirli uygulamalarda, uyumlu modifiye antikorlar, tüm CH2 alaninin çikarilmis oldugu alani silinmis yapilari veya varyantlari içerecektir (ACHZ yapilar). Diger uygulamalar için, degisken bölge için esneklik ve hareket serbestisi saglamak amaciyla kisa bir baglayici peptit silinen alanin yerine ikame edilebilir. Teknikte uzman kisiler, bu tip yapilarin, antikorun katabolik hizi üzerinde CHZ alaninin düzenleyici özellikleri nedeniyle özellikle tercih edildigini anlayacaktir. Alani silinmis yapilar, bir IgG1 insan sabit alani kodlayan bir vektör kullanilarak türetilebilir, bakiniz, Bu vektör, CHZ alanini silmek ve bir alani silinmis IgGi sabit bölgesi eksprese eden bir sentetik vektör saglamak için islenir.
Belirli uygulamalarda, mevcut bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari minikorlardir.
Minikorlar, teknikte tarif edilen yöntemler kullanilarak yapilabilir, bakiniz, Örnegin, US patenti 5.837.821 veya uluslararasi basvuru WO 94/09817.
Bir uygulamada, bulusun bir antikoru veya bunun antijen- baglayici fragmani, monomerik alt üniteler arasindaki iliskiye izin 'verdigi sürece birkaç veya hatta› bir tek amino asidin silintisine veya ikamesine sahip bir immünoglobülin agir zinciri içerir. Örnegin, CH2 alaninin seçilen alanlarinda tek bir amino asidin mutasyonu, Fc baglanmasini büyük ölçüde indirgemek ve böylece tau lokalizasyonunu arttirmak için yeterli olabilir. Benzer sekilde, efektör fonksiyonunun (Örnegin, kompleman baglanmasinin) module edilmesini kontrol eden bir veya daha fazla sabit bölge alaninin o parçasinin basitçe silinmesi de arzu edilebilir. Sabit bölgelerin bu tip kismi silintileri, konu sabit bölge alaniyla iliskili diger arzu edilen fonksiyonlari bozulmamis halde birakirken, antikorun seçilen özelliklerini (serum, yari-ömrü) iyilestirebilir. Üstelik, yukarida kisaca bahsedildigi üzere, açiklanan antikorlarin sabit bölgeleri, ortaya çikan yapinin profilini güçlendiren bir veya daha fazla amino asidin mutasyonu veya ikamesi yoluyla sentetik olabilir. Bu bakimdan, modifiye antikorun yapilandirmasi ve immünojenik profili büyük Ölçüde muhafaza edilirken korunmus bir baglanma, alani (örnegin, FC baglanma) tarafindan saglanan aktivitenin engellenmesi mümkün olabilir. Yine de diger uygulamalar, efektör fonksiyonu gibi arzu edilen karakteristikleri güçlendirmek veya daha fazla sitotoksin veya karbonhidrat eklenmesini saglamak için sabit bölgeye bir veya daha fazla amino asidin ilave edilmesini içerir. Bu tip uygulamalarda, seçilen sabit bölge alanlarindan türetilen spesifik dizilerin sokulmasi veya kopyalanmasi arzu edilebilir.
Mutasyonlarin, bir antikor molekülünün yalnizca çerçeve bölgelerinde veya yalnizca CDR bölgelerinde katilmasi mümkündür. Katilan Hmtasyonlar sessiz veya nötr yanlis anlam mutasyonlari olabilir, Örnegin, bir antikorun antijen baglama yetisi üzerinde hiç veya çok az etkiye sahip olabilir, gerçekten de bu tip bazi mutasyonlar amino asit dizisini hiçbir sekilde degistirmez. Bu tiplerdeki mutasyonlar, kodon kullanimini optimize etmek için faydali olabilir veya bir hibridömun antikor üretimini gelistirir. Mevcut bulusun antikorlarini kodlayan kodon-optimize kodlayici bölgeler buradaki diger bölümlerde açiklanmaktadir. Alternatif olarak, nötr-olmayan yanlis anlam mutasyonlari, bir antikorun antijen baglama yetisini degistirebilir. Her ne kadar bu nmtlak bir gereklilik olmasa da, birçok sessiz ve nötr yanlis anlam mutasyonlarinin konumu muhtemelen çerçeve bölgelerindeyken, birçok nötr-olmayan yanlis anlam mutasyonlarin konumu muhtemelen CDR'dedir. Teknikte uzman bir kisi, antijen-baglama aktivitesinde sifir degisiklik veya baglanma aktivitesinde degisiklik (örnegin, antijen-baglama aktivitesinde iyilesmeler veya antikor özgüllügünde degisim) gibi arzu edilen özelliklere sahip mutant molekülleri tasarlayabilecek ve test edebilecektir. Mutajenezin ardindan, kodlanan protein rutin olarak eksprese edilebilir ve kodlanan proteinin fonksiyonel ve/veya biyolojik aktivitesi (örnegin, taunun en az bir epitopunu immünospesifik olarak baglama yetisi), burada tarif edilen teknikler kullanilarak veya teknikte bilinen rutin olarak modifiye edici tekniklerle belirlenebilir.
Mevcut bulusun tau baglayici antikorlari, nörodejeneratif taUOpatilerin herhangi bir in vitro veya in Vivo modeli kullanilarak karakterize edilebilir. Teknikte uzman bir kisi, bulusun bir tau baglayici ajaninin (örnegin, bir antikorun), nörodejeneratif tauopatiler için bir fare modelinde karakterize edilebilecegini kolayca anlar, örnegin, bununla sinirli kalmamak kaydiyla, mevcut bulusun tau antikorlarini (ve bunlarin baglanma özgüllüklerine sahip moleküllerini) karakterize etmek ve dogrulamak amaciyla, tauopatiler için asagidaki üç farkli modelin herhangi biri kullanilabilir. l. Transgenik TauP30lL fareleri (çizgil83): murin Thyl.2 promotörü altinda P30lL mutasyonlu insan Tau4O eksprese eder (Bu transgenik hayvanlarin üretilmesi, Götz et al., J. Biol. 2. Murin PrP promotörü altinda P301L mutasyonlu en kisa 4R insan tau izoformunu eksprese eden JNPL3 fareleri (Taconic, Hudson, NY, A.B.D. firmasindan temin edilebilir). 3. Murin PrP promotörü altinda P30lS mutasyonlu insan tausu eksprese eden P3015Tau (çizgi P819) fareleri (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, A.B.D. firmasindan temin edilebilir).
Teknikte uzman bir kisi, nörodejeneratif tauopatilerin deneysel bir modelinin önleyici bir düzenlemede kullanilabilecegini veya terapötik bir düzenlemede kullanilabilecegini anlar. Önleyici bir düzenlemede, hayvanlarin dozlamasi, nörodejeneratif tauopatilerin veya bunlarin semptomlarinin baslamasi öncesinde baslar. Önleyici düzenlemelerde, bulusun bir tau baglayici ajani (örnegin, antikoru), nörodejeneratif tauopatilerin veya bunlarin semptomlarinin baslamasini engelleme, indirgeme veya geciktirme yetisi açisindan degerlendirilir. Terapötik bir düzenlemede, hayvanlarin dozlamasi, nörodejeneratif tauopatilerin veya bunun bir semptomunun baslamasindan sonra baslar. Terapötik bir düzenlemede, bulusun bir tau baglayici ajani (örnegin, antikoru), nörodejeneratif tauopatileri veya bunun bir semptomunu tedavi etme, indirgeme veya hafifletme yetisi açisindan degerlendirilir. Nörodejeneratif tauopatilerin semptomlarina, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, denegin nöronlarinda, beyninde, omuriliginde, beyin- omurilik sivisinda veya serumunda patolojik tau birikintilerinin kümelesmesi, nörofibriler yumaklar (NFT), hiper-fosforile tau polipeptidi, çözünmez tau kesitleri dahildir. Teknikte uzman bir kisi, nörodejeneratif tauopatilerin herhangi bir hayvan modelinde pozitif bir önleyici veya terapötik çiktinin, belirli tau baglayici ajanin (örnegin, antikorun), deneysel model organizmasindan farkli bir süjede önleyici veya terapötik amaçlar için kullanilabilecegini, örnegin, ihtiyaç duyan bir insan süjede nörodejeneratif tauopatilerin tedavi edilmesi için kullanilabilecegini gösterdigini anlar.
Bir uygulamada, bulusun bir tau baglayici ajani (örnegin, bir antikoru) bir tauopati fare modeline ve karsilik gelen kontrol dogal tip farelere verilebilir. Verilen antikor, mevcut bulusun murinlestirilmis bir antikoru veya mevcut bulusun bir antikorunun bir insan-murin-kimerasi olabilir. Bakiniz, örnegin, Örnek 6 ve 7. Tau baglayici ajan (örnegin, bir antikor) teknikte bilinen herhangi bir araçla, örnegin, intraperitoneal, intrakraniyal, intramusküler, intravenöz, subkütan, oral veya aerosol verilisle verilebilir. Deney hayvanlarina tau baglayici ajanin (örnegin, bir antikorun) veya PBS gibi bir kontrol bilesiminin bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla dozu verilebilir. Bir uygulamada, deney hayvanlarina bir tau baglayici ajanin (örnegin, bir antikorun) bir veya iki dozu verilecektir. Bakiniz, örnegin, Örnek 9. Bir baska uygulamada, hayvanlar birçok hafta veya ay boyunca kronik olarak tau baglayici ajanla (örnegin, bir antikorla) dozlanir. Bakiniz, örnegin, Örnek lO. Teknikte uzman bir kisi, deneysel amaca uyan bir dozlama rejimini, örnegin, akut çalismalar için dozlama rejimini, kronik çalismalari için dozlama rejimini, toksisite çalismalari için dozlama rejimini, önleyici veya terapötik çalismalar için dozlama rejimini kolayca tasarlayabilir. Tau baglayici ajanin (örnegin, antikorun), deney hayvanlarinin belirli bir doku bölmesindeki, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, serum, kan, beyin-omurilik sivisi, beyin dokusundaki varligi, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak olusturulabilir. Bakiniz, örnegin, Örnek 9 ve 10. Bir uygulamada, bulusun bir tau baglayici ajani (örnegin, antikoru) -, kan beyin bariyerine nüfuz edebilir. Teknikte uzman bir kisi, tau baglayici ajan (örnegin, antikor) dozunun ve dozlama sikliginin ayarlanmasiyla, deney hayvanlarinda arzu edilen bir tau baglayici ajan (örnegin, antikor) konsantrasyonunun muhafaza edilebilecegini anlar. Mevcut bulusun bir tau baglayici ajaninin (örnegin, antikorunun) tauopati modellerindeki herhangi bir etkisi, tedavi ve kontrol hayvanlarinda taunun seviyesinin, biyokimyasal karakteristiklerinin veya dagiliminin karsilastirilmasiyla tayin edilebilir. Bir örnekte, nörofibriler yumaklar (NFT), Gallyas'in gümüs doyurma teknigi kullanilarak veya NFT'de patolojik olarak fosforile tauyu taniyan monoklonal fare antikoru ATlOO ve AT18O ile immüno-boyamayla incelenir. Antikorla tedavi edilen farelerde ve kontrol hayvanlarinda, beyinde ve omurilikte Gallyas- pozitif nöronlarin ve/veya ATlOO, AT180 etiketli nöronlarin sayisi veya sikligi, antikor tedavisinin etkisinin degerlendirilmesi için belirlenebilir. Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir hayvan modelinde beyindeki veya omurilikteki nörofibriler yumaklarin seviyesini, miktarini veya konsantrasyonunu indirgeyebilir. Antikor nörofibriler yumaklarin seviyesini, miktarini 'veya konsantrasyonunu ama az indirgeyebilir. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir hayvan modelinde beyindeki veya omurilikteki Gallyas-pozitif nöronlarin sayisini veya sikligini, örnegin, fazla indirgeyebilir. Bir diger uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir hayvan modelinde beyindeki veya omurilikteki ATlOO veya AT18O antikoru pozitif nöronlarin sayisini veya sikligini, örnegin, en az yaklasik %5, %10, %20, %30, %50, antikorunun etkisi ayrica, antikor verilisinin ardindan taunun dagiliminin ve biyokimyasal özelliklerinin incelenmesiyle de tayin edilebilir. Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir hayvan modelinde beyindeki tau proteininin miktarini veya konsantrasyonunu, örnegin, en az yaklasik %5, %10, %20, %30, uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir hayvan modelinde beyindeki çözünmez tau proteininin miktarini veya konsantrasyonunu, örnegin, en az yaklasik %5, %10, %20, %30, kismi, örnegin, Örnek 10'da veya Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159 (l992)'de tarif edildigi üzere hazirlanabilir. Bir biyolojik. numunedeki tau proteini miktari, örnegin, Örnek 10'da tarif' edildigi üzere teknikte uzman kisi tarafindan bilinen herhangi bir yöntemle belirlenebilir. Bir diger uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir hayvan nwdelinde beyindeki hiper-fosforile tau proteininin miktarini veya konsantrasyonunu, örnegin, en az indirgeyebilir. Hiper-fosforile tau, ATlOO veya AT180 gibi, taunun patolojik olarak hiper-fosforile formlarina özgü antikorlar kullanilarak saptanabilir. Mevcut bulusun bir antikoru ayrica, kandaki, serumdaki veya beyin-omurilik sivisindaki veya bir hayvan modelinde tau konsantrasyonunu, daha fazla degistirebilir, örnegin, indirgeyebilir veya arttirabilir. Bir uygulamada, indirgeme veya arttirma %'si, tedaviden önce var olan seviyeye, sayiya, sikliga, miktara veya konsantrasyona veya tedavi edilmemis/kontrol tedavili bir süjede var olan seviyeye, sayiya, sikliga, miktara veya konsantrasyona kiyasla görelidir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin en az bir semptomunun baslamasini engelleyebilir veya geciktirebilir. Bir uygulamada, mevcut bulusun bir antikoru, bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin en az bir semptomunu indirgeyebilir veya ortadan kaldirabilir. Semptom, bir süjenin beyninde veya omuriliginde patolojik tau birikintilerinin, hiper-fosforile tau birikintilerinin, çözünmez tau birikintilerinin, nörofibriler liflerin, yumak-öncesi fosfor tau agregatlarinin, intranöronal nörofibriler yumaklarin veya ekstranöronal nörofibriler yumaklarin olusumu olabilir. Bakiniz, örnegin, Augustinack et serumdaki, kandaki, idrardaki veya beyin-omurilik sivisindaki varligi veya yükselmis konsantrasyonu veya miktari da olabilmekte olup, burada yükselmis konsantrasyon miktari saglikli bir süjeyle karsilastirilir. Semptoni bir nörolojik semptom, örnegin, degistirilmis kosullu tat tiksintisi, degistirilmis baglamsal korku kosullanma, bellek bozuklugu, motor fonksiyon kaybi olabilir. Bir uygulamada, bellek bozuklugu bir iki-denemeli Y-labirent görevi kullanilarak tayin edilir. Spesifik bir uygulamada, iki-denemeli Y-labirent görevi büyük ölçüde Örnek lO'da tarif edildigi sekilde gerçeklestirilir. Bir uygulamada, en az bir semptom en az indirgenir. Bir baska uygulamada, iki-denemeli Y-labirenti görev orani bir antikorla tedavili süjede bir kontrol süjesinden kayda deger sekilde daha yüksektir. Spesifik bir uygulamada, iki-denemeli Y-labirenti görevi orani en az oraninda artar. Bir baska uygulamada, iki-denemeli Y-labirenti görevi orani en az yaklasik iki kat, üç kat, dört kat, bes kat, on kat veya yirmi kat daha yüksektir. Mevcut bulus ayrica, ihtiyaç duyan bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin en az bir semptomunun baslamasinin engellenmesinin veya geciktirilmesinin, burada tarif edilen bir tau antikorunun terapötik olarak etkili bir miktarinin verilmesini içeren bir yöntemini de saglamaktadir. Mevcut bulus ayrica, ihtiyaç duyan bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin en az bir semptomunun indirgenmesinin veya ortadan kaldirilmasinin, burada tarif edilen bir tau antikorunun terapötik olarak etkili bir miktarinin verilmesini içeren bir yöntemini de saglamaktadir. Bir uygulamada, süje, bununla sinirli kalmamak kaydiyla, transgenik fareler gibi bir deney organizmasidir.
Bir uygulamada, süje bir insandir.
Bir antikoru veya bunun antijen-baglayici fragmanini, varyantini veya türevini kodlayan bir polinükleotid, modifiye edilmemis RNA. veya DNA. veya modifiye RNA veya DNA olabilen herhangi bir poliribonükleotidden veya polideoksiribonükleotidden olusabilir. Örnegin, bir antikoru veya bunun antijen-baglayici fragmanini, varyantini veya türevini kodlayan bir polinükleotid, tek- ve çift-sarmalli DNA'dan, tek- ve çift-sarmalli bölgelerin. bir karisimi olan DNA'dan, tek- ve çift-sarmalli RNA'dan ve tek- ve çift- sarmalli bölgelerin bir karisimi olan RNA'dan, tek-sarmalli veya daha tipik olarak çift-sarmalli veya tek- ve çift- sarmalli bölgelerin bir karisimi olan DNA ve RNA'yi içeren melez moleküllerden olusabilir. Ek olarak, bir antikoru veya bunun antijen-baglayici fragmanini, varyantini veya türevini kodlayan bir polinükleotid, RNA veya DNA veya hem RNA hem DNA içeren üç-sarmalli bölgelerden olusabilir. Bir antikoru veya bunun antijen-baglayici fragmanini kodlayan bir polinükleotid ayrica, stabilite veya diger nedenlerden dolayi modifiye edilen bir veya daha fazla modifiye baz veya DNA 'veya RNA omurgasi da ihtiva edebilir. “Modifiye" bazlara, örnegin, tritilatli bazlar ve inosin gibi olagandisi bazlar dahildir.
DNA> ve RNA'ya çesitli modifikasyonlar yapilabilir; böylelikle, “polinükleotid”, kimyasal, enzimatik veya metabolik olarak modifiye formlari kapsar.
Bir immünoglobülinden (örnegin, bir immünoglobülin agir zincir kismi veya hafif zincir kismi) türetilen bir peptidin bir dogal-olmayan varyantini kodlayan bir izole polinükleotid, bir veya daha fazla nükleotid ikamesinin, eklentisinin veya silintisinin immünoglobülinin nükleotid dizisinin içine, bir veya daha fazla amino asit ikamesinin, eklentisinin veya silintisinin kodlanan proteinin içine eklendigi sekilde katilmasiyla yaratilabilir. Mutasyonlar, alana-yönelik mutajenez ve PCR-aracili. mutajenez gibi standart tekniklerle katilabilir. Bir uygulamada, konservatif amino asit ikameleri, bir veya daha fazla esansiyel-olmayan amino asit kalintilarinda yapilir.
Iyi bilindigi gibi, RNA özgün B hücrelerinden, hibridom hücrelerinden veya diger dönüstürülmüs hücrelerden, guanidinyum izotiyosiyanat ekstraksiyonu ve çökeltmesinin ardindan santrifüjleme veya kromatografi ile izole edilebilir.
Arzu edildigi durumlarda, mRNA total RNA'dan, oligo dT selüloz üzerinde kromatografi gibi standart tekniklerle izole edilebilir. Uygun teknikler, teknikte asinadir. Bir uygulamada, antikorun hafif ve agir zincirlerini kodlayan cDNA'lar, iyi bilinen yöntemlere göre ters transkriptaz ve DNA polimerazi kullanilarak. yas eszamanli olarak 'veya ayri ayri yapilabilir. PCR, yayinlanan agir ve hafif zincir DNA'ya ve amino asit dizilerine dayali olarak konsensüs sabit bölge primerleriyle veya daha spesifikr primerlerle baslatilabilir.
Yukarida müzakere edildigi üzere, PCR ayrica, antikor hafif ve agir zincirleri kodlayan DNA klonlarinin izole edilmesi için de kullanilabilir. Bu durumda, kitapliklar konsensüs primerleri veya insan sabit bölge problari gibi daha büyük problarla taranabilir.
DNA, Çogunlukla plazmid DNA, hücrelerden teknikte bilinen teknikler kullanilarak izole edilebilir, kisitlama haritalanabilir ve örnegin, rekombinan DNA teknikleriyle ilgili önceki referanslarda ayrintili olarak ortaya konan standart, iyi bilinen tekniklere göre dizilenir. Elbette, DNA, mevcut bulusa göre izolasyon islemi veya müteakip analiz esnasinda herhangi bir noktada sentetik olabilir.
Mevcut bulus, VH-CDRl, VH-CDRZ ve lm-CDR3 bölgelerinin, Sekil lA veya lC'de gösterilen VH-CDRl, VH-CDR2 ve VH-CDR3 gruplarina özdes oldugu polipeptit dizilerine sahip oldugu bir immünoglobülin agir zincir degisken bölgesini (V3) kodlayan bir nükleik asit içeren, esasen bundan olusan ya bundan olusan bir izole polinükleotid saglar. VH CDRl'in amino asit dizisi SEQ NO: 24 veya 36'dir ve VH CDR3'ün amino asit dizisi SEQ ID NO: veya 37'dir.
Mevcut bulus, \h-CDR1, \h-CDR2 ve \h-CDR3 bölgelerinin, Sekil 1A veya lC'de gösterilen VL-CDRl, VL-CDRZ ve Vi-CDR3 gruplarina özdes oldugu polipeptit dizilerine sahip oldugu bir immünoglobülin agir zincir degisken bölgesini (VL) kodlayan bir nükleik asit içeren, esasen bundan olusan ya bundan olusan bir izole polinükleotid saglar. VL CDRl'in amino asit dizisi SEQ NO: 27 veya 39'dur ve VL CDR3'ün amino asit dizisi SEQ ID NO: 28 veya 40'tir.
Teknikte bilindigi üzere, iki polipeptit veya iki polinükleotid arasindaki “özdeslik yüzdesi”, bir polipeptidin veya polinükleotidin amino asit veya nükleik asit dizisinin, bir ikinci polipeptidinin veya polinükleotidin bir dizisiyle karsilastirilmasiyla belirlenir. Burada nüzakere edildiginde, herhangi bir belirli polinükleotidin bir baska polipeptide en sinirli kalmamak kaydiyla, BESTFIT programi (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) gibi yöntemler ve bilgisayar programlari/yazilimi kullanilarak belirlenebilir. BESTFIT, iki dizi arasindaki homolojinin en iyi segmentini bulmak için Smith ve Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489'un lokal homoloji algoritmasini kullanir. Belirli bir dizinin mevcut bulusa göre bir referans diziye, örnegin, %95 özdes olup olmadigini belirlemek için BESTFIT veya herhangi bir diger dizi hizalama programi kullanilirken, elbette, özdeslik. yüzdesinin, referans polipeptit dizisinin tam. boyu üzerinden hesaplandigi ve referans dizideki toplam amino asit sayisinin %5'ine kadar homoloji bosluklarina izin verildigi sekilde parametreler ayarlanir.
Mevcut bulusun bir uygulamasinda, polinükleotid, Tablo 2'de gösterildigi üzere bir anti-tau antikorunun VH veya VL bölgesinin bir polinükleotid dizisine sahip bir nükleik asit içerir, esasen bundan olusur veya bundan olusur. Bu bakimdan, teknikte uzman kisi, en azindan hafif ve/veya agir zincirin degisken alanini kodlayan polinükleotidlerin, her iki immünoglobülin zincirinin veya yalnizca birinin degisken alanini kodlayabildigini kolayca anlayacaktir. Mevcut bulus ayrica, SEQ ID: 93'ün amino asit dizisini kodlayan bir nükleotid dizisi içeren veya bundan olusan bir polinükleotid Tablo 2: Tauya özgü antikorlarin VH veya VL bölgelerinin nükleotid dizileri.
Antikor Degisken agir (VH) ve degisken hafif (VL) zincirlerin nükleotid dizileri 105.4E4 - Antikor .24B2- .24B2- .4A3- .4A3- Degisken agir (VH) ve degisken hafif (VL) zincirlerin nükleotid dizileri CAGGTG CÄ(CTPGTGGAGTCTGGGGGACCCGkGGTLGAG GC GJGGT CCTGAGHCICTpCTGT ”AG CTCLGFÄTTCÄCCMT0AGTGACTAT CCA TGCACTGGGTCCGCCÂG CTCGßbGÇhÄ”GGGÇTGCAGmGG TGGCÃwTT apCTTTuCCTCuqgÄCAGCLÄÃGCÄCCTC”AFCGTÃLCTCAÜTÃCTCCG CCAGGGÄACCCLGGTCÄCCGiCTLCMCG Antikor Degisken agir (VH) ve degisken hafif (VL) zincirlerin nükleotid dizileri Bir uygulamada, mevcut bulus, referans agir zincir VH'ye en az immünoglobülin agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir nükleik asit içeren, esasen bundan olusan veya bundan olusan bir izole polinükleotid saglar. Bir uygulamada, referans agir zincir degisken bölgesinin amino asit dizisi SEQ ID NO: 9, 17 veya 93'tür.
Bir uygulamada, mevcut bulus, referans hafif zincir VL'ye en bir immünoglobülin agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir nükleik asit içeren, esasen bundan olusan veya bundan olusan bir izole polinükleotid saglar. Bir uygulamada, referans agir zincir degisken bölgesinin amino asit dizisi SEQ ID NO: 11, l9'dur.
Mevcut bulus ayrica, burada. diger` bölümlerde tarif edildigi üzere, bulusun. polinükleotidlerinin fragmanlarini da içerir.
Burada tarif edildigi üzere, füzyon polinükleotidlerini, Fab fragmanlarini ve diger türevleri kodlayan ilave polinükleotidler de bulus tarafindan tasarlanmaktadir.
Polinükleotidler, teknikte bilinen herhangi bir yöntemle üretilebilir veya imal edilebilir. Örnegin, antikorun nükleotid dizisi biliniyorsa, antikoru kodlayan bir polinükleotid, örnegin, kisaca, antikoru kodlayan dizinin kisimlarini ihtiva eden oligonükleotidlerin örtüsmesini, o nükleotidlerin tavlanmasini ve ligatlanmasini ve daha sonra ligatlanmis oligonükleotidlerin PCR. ile güçlendirilmesini edildigi üzere, kimyasal olarak sentezlenmis oligonükleotidlerden toplanabilir.
Alternatif olarak, bir antikoru veya bunun antijen-baglayici fragmanini kodlayan bir polinükleotid, uygun bir kaynaktan gelen nükleik asitten olusturulabilir. Belirli bir antikoru kodlayan bir nükleik asit ihtiva eden bir klon mevcut degilse ancak antikor molekülünün dizisi biliniyorsa, antikoru kodlayan bir nükleik asit kimyasal olarak sentezlenebilir veya uygun bir kaynaktan (örnegin, bir antikoru eksprese etmesi için seçilen hibridom hücreleri gibi tauya-özgü antikoru eksprese eden herhangi bir dokudan veya hücreden izole edilen nükleik asitten, tercihen poliA+ RNA'dan olusturulan bir antikor cDNA kitapligi veya bir cDNA kitapligi), dizinin 3' ve ' uçlarina melezlenebilen sentetik primerler kullanilarak PCR güçlendirmesiyle veya örnegin, antikoru kodlayan bir cDNA kitapligindan bir CDNA klonunu tanimlamak için belirli gen dizisine özgü bir oligonükleotid probu kullanilarak klonlamayla elde edilebilir. PCR tarafindan üretilen güçlendirilmis nükleik asitler daha sonra, teknikte iyi bilinen herhangi bir yöntem kullanilarak kopyalanabilir klonlama vektörlerinin içine klonlanabilir.
Antikorun veya bunun antijen-baglayici fragmaninin, varyantinin veya türevinin nükleotid dizisi ve karsilik gelen amino asit dizisi belirlendiginde, bunun nükleotid dizisi, nükleotid dizilerinin manipülasyonu için teknikte iyi bilinen yöntemler, örnegin, rekombinan DNA 'teknikleri, alana yönelik mutajenez, PCR Vb kullanilarak nanipüle edilebilir (bakiniz, örnegin, farkli bir amino asit dizisine sahip antikorlarin olusturulmasi, örnegin amino asit ikamelerinin, silintilerinin ve/veya eklemelerinin yaratilmasi için Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) ve Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)'de tarif edilen teknikler).
Bulusun antikorlarinin veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarinin saglanmasi için izole genetik materyalin manipülasyonunun ardindan, antikorlari kodlayan polinükleotidler tipik olarak, antikorun arzu edilen miktarini üretmek için kullanilabilen konak hücrelerin içine ekleme için bir ekspresyon vektörünün içine sokulur. Bir antikorun veya bunun fragmaninin, türevinin veya analogunun, örnegin, bir hedef moleküle baglanan bir antikorun bir agir veya hafif zincirinin rekombinanv ekspresyonuv burada. tarif edilmektedir.
Bulusun bir antikor molekülünü veya bir antikorun bir agir veya hafif zincirini veya bunun (tercihen agir veya hafif zincir degisken alanini ihtiva eden) kismini kodlayan bir polinükleotid elde edildiginde, antikor molekulünün üretimi için vektör, teknikte iyi bilinen teknikler kullanilarak rekombinan DNA teknolojisiyle üretilebilir. Böylelikle, bir antikor kodlayan nükleotid dizisi ihtiva eden bir polinükleotidin eksprese edilmesiyle bir proteinin hazirlanmasi için yöntemler burada tarif edilmektedir. Antikor kodlayan dizileri ve uygun transkripsiyonel ve translasyonel kontrol sinyallerini ihtiva eden ekspresyon vektörlerinin insa edilmesi için, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen yöntemler kullanilabilir. Bu yöntemlere, örnegin, in vitro rekombinan DNA teknikleri, sentetik teknikler ve in vivo genetik rekombinasyon dahildir. Bulus, böylelikle, bulusun bir antikor molekülünü veya bunun bir agir veya hafif zincirini veya bir promotöre uygun sekilde bagli bir agir veya hafif zincir alanini içeren kopyalanabilir vektörler saglar. Bu tip vektörler antikor molekülünün sabit bölgesini kodlayan nükleotid dizisini içerebilir (bakiniz, örnegin, uluslararasi .122.464) ve antikorun degisken alani, tüm agir ve hafif zincirin ekspresyonu için bu tip bir vektörün içine klonlanabilir. bulusa göre, bir konak hücrenin içine arzu edilen bir genin eklenmesi ve eksprese edilmesi için bir araç olarak kullanilan vektörleri kast etmek için kullanilmaktadir. Teknikte uzman kisilerce bilindigi üzere, bu tip vektörler, plazmidlerden, fajlardan, virüslerden ve retrovirüslerden olusan gruptan kolayca seçilebilir. Genelde, bu bulusla uyumlu vektörler, bir seçini markörü, arzu edilen genin klonlanmasini ve ökaryotik veya prokaryotik hücrelerde girme ve/veya kopyalanma yetisini kolaylastirmak için uygun kisitlama alanlari içerecektir. Bu bulusun amaçlari dogrultusunda, sayisiz ekspresyon vektör sistemi kullanilabilir. Örnegin, vektörün bir sinifi, sigir papiloma Virüsü, polyoma Virüsü, adenovirüs, vaksinia Virüsü, bakulovirüs, retrovirüsler (RSV, MMTV veya. MOMLV) veya SV4O Virüsü gibi hayvan virüslerinden türetilen DNA ögelerinden faydalanir. Digerleri, dahili ribozom baglama alanlarina sahip polisistronik sistemlerin kullanimini içerir. Ek olarak, DNA'yi kromozomlarinin içine bütünlestirmis olan hücreler, transfekte konak hücrelerin seçimine olanak saglayan bir veya daha fazla markörün eklenmesiyle seçilebilir. Markör, bir oksotrofik. konaga prototrofi, biyosit direnci (örnegin, antibiyotikler) veya bakir gibi agir metallere direnç saglayabilir. Seçilebilir markör ya eksprese edilecek DNA dizilerine dogrudan baglanabilir veya es-transformasyonla ayni hücrenin içine eklenir. mRNA'nin optimal sentezi için ilave ögelere de ihtiyaç olabilir. Bu ögelere sinyal dizileri, uç birlestirme sinyalleri ve ayrica transkripsiyonel promotörler, güçlendiriciler ve sonlandirma sinyalleri dahil olabilir.
Belirli uygulamalarda, klonlanan degisken bölge genleri, yukarida müzakere edildigi üzere agir ve hafif zincir sabit bölge genleriyle (örnegin, insan agir ve hafif zincir sabit bölge genleri) birlikte bir ekspresyon vektörünün içine sokulur. Bir uygulamada, bu, Biogen IDEC, Inc. firmasina ait, NEOSPLA. olarak adlandirilan, US patent no 6.159.730'da açiklanan tescilli bir ekspresyon vektörü kullanilarak gerçeklestirilir. Bu vektör, sitomegalovirüs promotörünü/güçlendiricisini, fare beta globin majör promotörünü, SV40 kökenli replikasyonu, sigir` büyüme hormonu poliadenilasyon dizisini, neomisin fosfotransferaz ekson 1 ve ekson 2'yi, dihidrofolat redüktaz genini ve lider diziyi ihtiva eder. Bu vektörün, degisken ve sabit bölge genlerinin eklenmesi, CHO hücrelerinde transfeksiyon, ardindan G418 ihtiva eden vasatta seçim ve metotreksat güçlendirmesi üzerine antikorlarin çok yüksek seviyede ekspresyonuyla sonuçlandigi bulunmustur. Elbette, ökaryotik hücrelerde ekspresyonu saglayabilen herhangi bir ekspresyon vektörü mevcut bulusta kullanilabilir. Uygun vektörlerin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, (Invitrogen, San Diego, CA firmasindan temin edilebilen) pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRC/HCMVZ, pSV40/Ze02, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl ve pZeoSVZ ve (Promega, Madison, WI firmasindan temin edilebilen) pCI plazmidleri dahildir.
Genelde, immünoglobülin agir ve hafif zincirlerinin uygun sekilde yüksek seviyelerinin kendileri için eksprese edildigi dönüstürülmüs hücrelerin yüksek miktarlarinin taranmasi, Örnegin, robotik sistemlerle gerçeklestirilebilen rutin deneydir. Vektör sistemleri ayrica, US patentleri no 5.736.137 ve 5.658.570'te de ögretilmektedir. Bu sistem, yüksek ekspresyon seviyeleri, örnegin, > 30 pg/hücre/gün saglar.
Diger emsal vektör sistemleri, örnegin, US patent no 6.413.777'de açiklanmaktadir.
Diger uygulamalarda, bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari, US patent. basvurusu yayini no kullanilarak eksprese edilebilir. Bu ekspresyon sistemlerinde, antikorlarin agir ve hafif zincirleri gibi ilgi konusu çoklu gen ürünleri, bir tekli polisistronik yapidan üretilebilir. Bu sistemler, nispeten yüksek seviyelerde antikorlar saglamak için avantajli bir sekilde bir dahili ribozom giris alani (IRES) kullanir. Uyumlu IRES dizileri, US patent no 6.193.980'de açiklanmaktadir. Teknikte uzman kisiler, bu tip ekspresyon sistemlerinin, bu basvuruda açiklanan antikorlarin tüm çesitlerini etkili bir sekilde üretmek için kullanilabilecegini anlayacaktir.
Daha genel olarak, antikorun bir monomerik alt birimini kodlayan vektör* veya DNA dizisi hazirlanmis oldugunda, ekspresyon vektörü uygun bir konak hücrenin içine eklenebilir.
Plazmidin konak hücrenin içine eklenmesi, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen çesitli tekniklerle basarilabilir.
Bunlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, Fugene® veya lipofektamin kullanilarak lipotransfeksiyon dahil olmak üzere transfeksiyon, protoplast füzyonu, kalsiyum fosfat çökeltmesi, sarili DNA ile hücre füzyonu, mikroenjeksiyon ve bozulmamis virüsle enfeksiyon dahildir. Tipik olarak, konagin içine plazmid eklenmesi, standart kalsiyum fosfat es-çökeltme yöntemi vasitasiyla olur. Ekspresyon yapisini barindiran konak hücreler, hafif zincirlerin ve agir zincirlerin üretimi için uygun kosullar altinda büyütülür ve agir ve/veya hafif zincir protein sentezi için tayin edilir. Emsal tayin tekniklerine, enzime-bagli bagisiklik tayini (ELISA), radyoimmün-tayini (RIA) veya flor isimayla-aktive hücre siniflandirma analizi (FACS), immünokimya ve benzerleri dahildir.
Ekspresyon vektörü bir konak hücreye konvansiyonel tekniklerle aktarilir ve transfekte edilen hücreler daha sonra, burada tarif edilen yöntemlerde kullanim için bir antikorun üretilmesi amaciyla konvansiyonel tekniklerle kültürlenir.
Böylelikle, bulus, bulusun bir antikorunu veya bunun bir agir veya hafif zincirini kodlayan, bir heterolog promotöre uygun sekilde bagli bir polinükleotid. ihtiva. eden konak hücreleri içerir. Çift-Zincirli antikorlarin ekspresyonu için belirli uygulamalarda, hem agir hem hafif zincirleri kodlayan vektörler konak hücrede, asagida ayrintili olarak açiklandigi üzere tüm immünoglobülin molekülünün ekspresyonu için es- eksprese edilebilir.
Konak hücre, bulusun iki ekspresyon vektörüyle, bir agir Zincirli türetilmis polipeptidi kodlayan birinci vektörle ve bir hafif Zincirli türetilmis polipeptidi kodlayan ikinci vektörle es-transfekte edilebilir. Iki vektör, agir ve hafif zincir polipeptitlerinin esit ekspresyonunu saglayan özdes seçilebilir markörler ihtiva edebilir. Alternatif olarak, hem agir hem hafif zincir polipeptitlerini kodlayan bir tekli vektör de kullanilabilir. Bu durumlarda, bir toksik içermeyen agir zincirin fazlaligini önlemek için hafif zincir avantajli olarak agir zincirden önce yerlestirilir; bakiniz Proudfoot, (1980), 2197. Agir ve hafif zincirler için kodlama dizileri, cDNA veya genomik DNA içerebilir.
Burada kullanildigi sekliyle, “konak hücreler”, rekombinan DNA teknikleri kullanilarak ve en az bir heterolog genin kodlanmasiyla insa edilen vektörleri barindiran hücreleri ifade etmektedir. Antikorlarin rekombinan konaklardan izolasyonu için islemlerin tarifnamelerinde, “hücre” ve “hücre kültürü” terimleri, aksi net bir sekilde belirtilmedigi sürece antikorun kaynagini simgelemek için degisimli olarak kullanilir. Diger bir deyisle, “hücrelerden" polipeptidin geri kazanilmasi, ya asagi çekilmis tam hücrelerden veya hem vasati hem süspanse edilmis hücreleri ihtiva eden hücre kültüründen anlamina gelebilir. Çesitli konak-ekspresyon vektör sistemleri, burada tarif edilen yöntemlerde kullanim için antikor moleküllerinin eksprese edilmesi amaciyla kullanilabilir. Bu tip konak- ekspresyon sistemleri, sayelerinde ilgi konusu kodlama dizilerinin üretilebildigi ve müteakiben saflastirilabildigi araçlari temsil etmektedir, ancak ayrica, uygun nükleotid kodlayan dizilerle dönüstürüldügünde veya transfekte edildiginde, bulusun bir antikor molekülünü in situ eksprese edebilen hücreleri de temsil etmektedir. Bunlara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, rekombinan bakteriyofaj DNA, plazmid DNA veya antikor kodlayan dizileri ihtiva eden kozmid DNA ekspresyon vektörleri ile dönüstürülen bakteriler (örnegin, E. coli, B. subtilis); antikor kodlayan dizileri ihtiva eden rekombinan maya ekspresyon vektörleriyle dönüstürülen maya (örnegin, Saccharomyces, Pichia); antikor kodlayan diziler ihtiva eden rekombinan virüs ekspresyon vektörleriyle (örnegin, bakulovirüs) enfekte edilen böcek hücre sistemleri; rekombinan virüs ekspresyon vektörleriyle (örnegin, karnabahar mozaik virüsü, CaMV; tütün mozaik Virüsü, TMV) enfekte edilen veya antikor kodlama dizileri ihtiva eden rekombinan plazmid ekspresyon vektörleriyle (örnegin, Ti plazmid) dönüstürülen bitki hücre sistemleri veya memeli hücrelerinin genomundan (örnegin, metalotiyoneinin promotörü) veya memeli virüslerinden (örnegin, adenovirüs geç promotörü; vaksinia virüsü 7,5K promotörü) türetilen promotörleri ihtiva eden rekombinan ekspresyon yapilarini barindiran memeli hücre sistemleri (örnegin, COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3 hücreleri) gibi mikroorganizmalar dahildir. Bir uygulamada, Escherichia coli gibi bakteriyel hücreler ve daha tercihen, özellikle tam rekombinan antikor molekülünün ekspresyonu için, Ökaryotik hücreler bir rekombinan antikor nmlekülünün ekspresyonu için kullanilir. Örnegin, insan sitomegalovirüsünden majör hemen erken gen promotörü ögesi gibi bir vektörle birlikte, Çin Hemstiri Yumurtalik (CHO) hücreleri gibi memeli hücreleri, antikorlar için etkili bir ekspresyon sistemidir; bakiniz, örnegin, Foecking et al., Gene 45 (1986), lOl; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.
Protein ekspresyonu için kullanilan konak hücre çizgisi siklikla memeli kökenlidir; teknikte uzman kisiler, burada eksprese edilecek arzu edilen gen ürünü için en uygun belirli konak hücre çizgilerini belirleme yetisine sahiptir. Emsal konak hücre çizgilerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, CHO (Çin Hemstiri Yumurtalik), DG44 ve DUXBll (Çin Hemstiri Yumurtalik çizgileri, DHFR eksi), HELA (insan servikal karsinom), CVI (maymun böbrek çizgisi), COS (CVI'in SV4O T antijeniyle bir türevi), VERY, BHK (bebek hemstir böbregi), MDCK, WI38, R1610 (Çin Hemstiri fibroblast) BALBC/3T3 (fare fibroblasti), HAK (hemstir böbrek çizgisi), SPZ/O (fare miyelomu), P3x63-Ag3.653 (fare miyelomu), BFA-lclBPT (sigir endotelyal hücreleri), RAJI (insan lenfositi) ve 293 (insan böbregi) dahildir. Spesifik bir uygulamada, konak hücre çizgileri CHO veya 293 hücreleridir. Konak hücre çizgileri tipik olarak ticari hizmetlerden, Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonundan veya yayinlamis literatürden elde edilebilir.
Ek olarak, sokulan dizilerin ekspresyonunu modüle eden veya gen ürününü arzu edilen spesifik biçimde modifiye eden ve isleyen bir konak hücre susu seçilebilir. Bu tip modifikasyonlar (örnegin, glikosilasyon) ve protein ürünlerinin islenmesi (örnegin, yarilma), proteinin fonksiyonu için önemli olabilir. Farkli konak hücreleri, proteinlerin ve gen ürünlerinin post-translasyonel islenmesi ve Hmdifikasyonu için karakteristik ve spesifik mekanizmalara sahiptir. Uygun hücre çizgileri veya konak sistemleri, ekSprese edilen yabanci proteinin dogru modifikasyonunun ve islenmesinin temin edilmesi için seçilebilir. Bu amaçla, primer transkriptin düzgün islenmesi, gen ürününün glikosilasyonu ve fosforilasyonu için hücresel mekanizmalara haiz ökaryotik Rekombinan proteinlerin uzun-süreli, yüksek-randimanli üretimi için, stabil ekspresyon tercih edilir. Örnegin, antikor molekülünü stabil olarak eksprese eden hücre çizgileri islenebilir. Viral replikasyon kökenlerini ihtiva eden ekspresyon vektörlerinin kullanilmasindan ziyade, konak hücreler, uygun ekspresyon kontrol ögeleriyle (Örnegin, promotör, güçlendirici, diziler, transkripsiyon sonlandiricilar, poliadenilasyon alanlari vb) ve bir seçilebilir markörle kontrol edilen DNA ile dönüstürülebilir.
Yabanci DNA'nin eklenmesinin ardindan, islenen hücrelerin zenginlestirilmis bir vasatta 1-2 gün süreyle büyümesine izin verilebilir ve daha sonra seçimli bir vasata degistirilir.
Rekombinan plazmiddeki seçilebilir markör seçime direnç kazandirir ve hücrelerin plazmidi kromozomlarinin içine stabil olarak bütünlesmesine ve hücre çizgilerinin içine klonlanabilen ve genisletilebilen odak noktalarinin olusturulmasi için büyümesine olanak saglar. Bu yöntem, antikor molekülünü stabil olarak eksprese eden hücre çizgilerinin islenmesi için avantajli olarak kullanilabilir.
Bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sirasiyla, tk-, hgprt- veya aprt-hücrelerinde kullanilabilen herpes simpleks virüsü timidin kinazi (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. US 48 (1992), 202) ve adenin fosforibosiltransferaz (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) genleri dahil olmak üzere bir dizi seçim sistemleri kullanilabilir. Ayrica, asagidaki genler için seçini dayanagi olarak anti-metabolit direnç de kullanilabilir: metotreksata direnç kazandiran dhfr (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. US 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US 78 (1981), 1527); mikofenolik aside direnç kazandiran gpt aminoglikosid G-418'e direnç kazandiran neo (Goldspiel et al., higro (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147). Rekombinan DNA teknolojisinin kullanilabilen en yaygin bilinen yöntemleri, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer ve Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); ve Bölümler 12 ve 13'te, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981) tarif edilmektedir.
Bir antikor molekülünün ekspresyon seviyeleri, vektör güçlendirmesiyle arttirilabilir, bir inceleme için, bakiniz amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)”. Antikoru eksprese eden bir vektör sistemindeki bir markör güçlendirilebilir oldugunda, konak hücrenin kültüründe mevcut olan inhibitörün seviyesindeki artis, markör genin kopyalarinin sayisini arttiracaktir. Güçlendirilen bölge antikor geniyle iliskili oldugundan, antikorun üretimi de artacaktir; bakiniz Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), In vitro üretim, arzu edilen polipeptitlerin büyük miktarlarinin saglanmasi için büyütmeye olanak saglar. Doku kültürü kosullari altinda. memeli hücre yetistirme teknikleri teknikte bilinmektedir ve örnegin, bir havadan tasima reaktöründe veya bir kesintisiz karistirici reaktöründe homojen süspansiyon kültürünü veya örnegin, bos lifler, mikrokapsüller içinde veya agaroz mikro-boncuklar veya seramik kartuslar üzerinde hareketsizlestirilmis veya tutulmus hücre kültürünü içerir. Gerekirse ve/veya arzu edilirse, polipeptitlerin solüsyonlari, örnegin, bir sentetik destek bölgesi polipeptidinin tercihli biyosentezinden sonra veya burada tarif edilen HIC kromatografi öncesinde veya müteakiben, geleneksel kromatografi yöntemleriyle, örnegin jel filtrasyonla, iyon-degisimi kromatografisiyle, DEAE-selüloz üzerinde kromatografiyle veya (immüno-)afinite kromatografiyle saflastirilabilir.
Bulusun antikorlarini veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarini kodlayan genler ayrica, bakteriler veya böcek veya maya veya bitki hücreleri gibi memeli-olmayan hücrelerde de eksprese edilebilir. Nükleik asitleri kolayca alan bakterilere, Escherichia 0011 veya Salmonella; Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus ve Haemophilus influenzae gibi Bacillaceae suslari gibi enterobacteriaceae üyeleri dahildir. Ayrica, bakterilerde eksprese edildiklerinde, heterolog polipeptitlerin tipik olarak inklüzyon maddelerinin bir parçasi haline geldigi de anlasilacaktir. Heterolog polipeptitler izole edilmeli, saflastirilmali ve daha sonra fonksiyonel moleküllerin içine toplanmalidir. Antikorlarin dört degerli formlari arzu edildiginde, alt birimler bu durumda dört degerli antikorlarin için kendinden-toplanir; bakiniz, örnegin, uluslararasi basvuru WOOZ/O96948.
Bakteriyel sistemlerde, bir dizi ekspresyon vektörü, eksprese edilmekte olan antikor molekülü için istenen amaca bagli olarak avantajli sekilde seçilebilir. Örnegin, bu tip proteinin büyük bir miktarinin üretilmesi gerektiginde, kolayca saflastirilan füzyon proteinin ürünlerinin yüksek seviyelerinin ekspresyonunu yöneten vektörler arzu edilebilir.
Bu tip vektörlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, antikor kodlayan dizinin, bir füzyon proteininin üretildigi sekilde münferit olarak lacZ kodlama bölgesiyle çerçeve içindeki vektörün içine ligatlanabildigi E. coli ekspresyon vektörü pUR; pIN vektörleri benzerleri dahildir. pGEX vektörleri ayrica, glutatiyon S- transferaza (GST) sahip füzyon proteinleri olarak yabanci polipeptitlerin eksprese edilmesi için de kullanilabilir.
Genelde, bu tip füzyon proteinleri çözünürdür ve çözünmüs hücrelerden adsorpsiyonla ve glutatiyon-agaroz boncuklarinin bir anayapisina baglamayla, ardindan serbest glutatiyon varliginda ayristirmayla kolayca saflastirilabilir. pGEX vektörleri, trombin veya faktör Xa proteazi yarilma alanlarini içerecek sekilde tasarlanir, böylece klonlanan hedef gen ürünü GST bölütünden salinabilir.
Prokaryotlara ek olarak, ökaryotik mikroplar da kullanilabilir. Saccharomyces cerevisiae veya yaygin ekmek mayasi, her ne kadar bir dizi diger suslar da, örnegin, Pichia pastoris, yaygin olarak mevcut olsa da ökaryotik mikroorganizmalar arasinda en yaygin kullanilandir.
Saccharomyces içinde ekspresyon için YRp7 plazmidi, örnegin, (Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., yaygin olarak kullanilir. Bu plazmid. halihazirda, triptofan içinde büyüme yetisinden yoksun bir mutant sus için bir seçim markörü saglayan TRPl genini, örnegin ATCC No. 44076 veya PEP4-l (Jones, Genetics 85 (1977), 12) ihtiva eder. Bu durumda, maya konak hücre genomunun bir karakteristigi olarak trpl lezyonunun varligi, triptofan yoklugunda büyümeyle transformasyonun saptanmasi için etkili bir ortam saglar.
Bir böcek sisteminde, yabanci genlerin bir vektörü olarak çogunlukla Autographa californica nükleer polihedroz virüsü (AcNPV) kullanilir. Virüs, Spodoptera frugiperda hücrelerinde10 büyür. Antikor kodlayan dizi münferit olarak, virüsün esansiyel-olmayan bölgelerinin (örnegin polihedrin geni) içine klonlanabilir ve bir ACNPV promotörünün (örnegin polihedrin promotörü) kontrolü altina verilir.
Bulusun bir antikor molekülü rekombinan olarak eksprese edilmis oldugunda, mevcut bulusun tam antikorlari, bunlarin dimerleri, münferit hafif ve agir zincirleri veya diger immünoglobülin formlari, örnegin, kromatografiyle (örnegin, iyon degisimi, afinite, özellikle Protein A ve boyutlama kolon kromatografisinden sonra spesifik antijen için afiniteyle), santrifüjlemeyle, farklilastirma çözünürlügüyle, Örnegin, amonyum. sülfat çökeltmeyle veya proteinlerin saflastirilmasi için herhangi bir diger standart teknigiyle dahil olmak üzere, teknigin standart prosedürlerine göre saflastirilabilir; bakiniz, örnegin, Scopes, “Protein Purification”, Springer Verlag, N.Y. (1982). Alternatif olarak, bulusun antikorlarinin afinitesinin arttirilmasi için bir baska yöntem, US patent V. Füzyon Proteinleri ve Konjugatlari Belirli uygulamalarda, antikor polipeptidi, bir antikorlar normalde iliskili olmayan bir amino asit dizisi veya bir veya daha fazla. bölüt içerir. Emsal modifikasyonlar asagida daha ayrintili olarak tarif edilmektedir. Örnegin, bulusun bir tek- zincirli fv antikoru bir esnek baglayici dizi içerebilir veya bir fonksiyonel bölüt (örnegin, PEG, bir ilaç, bir toksin veya bir floresan, radyoaktif, enzim, nükleer manyetik, agir metal ve benzerleri gibi bir etiket) eklemek. için modifiye edilebilir.
Bulusun bir antikor polipeptidi, bir füzyon proteini içerebilir, esasen bundan olusabilir veya bundan olusabilir.
Füzyon proteinleri, örnegin, en az bir hedef baglanma alanina ve en az bir heterolog kisma, yani, dogada dogal olarak bagli olmadigi bir kisma sahip bir immünoglobulin tau-baglayici alan içeren kimerik moleküllerdir. Amino asit dizileri normal olarak, füzyon proteininde bir araya getirilen ayri proteinlerde var olabilir veya normal olarak ayni proteinde vardirlar ancak füzyon polipeptidinde yeni bir düzenlemeye koyulurlar. Füzyon proteinleri, örnegin, kimyasal sentezle veya peptit bölgelerinin arzu edilen iliskide kodlandiklari bir polinükleotidin yaratilmasiyla ve transle edilmesiyle yaratilabilir.
Bir polinükleotid veya bir polipeptit için geçerli oldugu sekliyle “heterolog” terimi, polinükleotidin veya polipeptidin, karsilastirilmakta oldugu varliginin gerisindeki ayri bir varliktan türetildigi anlamina gelmektedir. Örnegin, burada kullanildigi sekliyle, bir antikora veya bunun bir antijen-baglayici fragmanina, varyantina veya analoguna kaynastirilacak. olan bir “heterolog polipeptit”, ayni türde bir immünoglobülin-olmayan polipeptidden veya farkli bir türde bir immünoglobülin veya immünoglobülin-olmayan polipeptidden türetilir.
Buradaki diger bölümlerde daha ayrintili olarak müzakere edildigi üzere, buluSUn antikorlari veya bunlarin antijen- baglayici fragmanlari ayrica, N- veya C-ucunda bir heterolog polipeptide rekombinan olarak kaynastirilabilir veya polipeptitlere veya diger bilesimlere kimyasal olarak (esdegerli ve esdegerli-olmayan konjugasyonlar dahil olmak üzere) konjuge edilebilir. Örnegin, antikorlar, saptama tayinlerinde etiketler olarak faydali moleküllere ve heterolog polipeptitler, ilaçlar, radyonüklitler veya toksinler gibi efektör moleküllere rekombinan. olarak. kaynastirilabilir veya konjuge edilebilir; bakiniz, örnegin, uluslararasi basvurular ve Avrupa patent basvurusu EP O 396 387.10 Bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari, birbirlerine peptit baglarla veya modifiye peptit baglariyla, yani, peptit izoesterleriyle birlestirilen amino asitlerden olusabilir ve 20 gen-kodlu amino asitlerden farkli amino asitler ihtiva edebilir. Antikorlar, teknikte iyi bilinen posttranslasyonel isleme veya kimyasal modifikasyon teknikleri gibi dogal islemlerle modifiye edilebilir. Bu tip modifikasyonlar temel metinler ve daha ayrintili monograflarin yani sira çok miktarda arastirma literatüründe iyi bir sekilde tarif edilmektedir. Modifikasyonlar, peptit omurgasi, amino asit yan-zincirleri ve amino veya karboksil uçlari veya karbonhidratlar gibi bölütler dahil olmak üzere antikorun herhangi bir yerinde meydana gelebilir. Ayni tipte modifikasyonun, belirli bir antikorun çesitli alanlarinda ayni veya degisen seviyelerde mevcut olabilecegi anlasilacaktir.
Ayrica, belirli bir antikor birçok tipte modifikasyon ihtiva edebilir. Antikorlar, örnegin, ubikutin eklemenin bir sonucu olarak dalli olabilir ve dallanma olsun veya olmasin siklik olabilir. siklik, dalli ve dalli siklik antikorlar, translasyon sonrasi dogal islemlerden kaynaklanabilir veya sentetik yöntemlerle yapilabilir. Modifikasyonlara, asetilasyon, asilasyon, ADP-ribosilasyon, amidasyon, flavinin esdegerli eklenmesi, bir heme bölütünün esdegerli eklenmesi, bir nükleotid veya nükleotid. türevinin esdegerli eklenmesi, bir lipit veya lipit türevinin esdegerli eklenmesi, fosfatidinilositolün esdegerli eklenmesi, çapraz-baglama, siklizasyon, disülfit bag olusumu, demetilleme, esdegerli çapraz-baglarin olusum, sistein olusumu, piroglutamat olusumu, formilasyon, gama-karboksilasyon, glikosilasyon, GPI dübel olusumu, hidroksilleme, iyodinasyon, metilleme, miristoilasyon, oksidasyon, pegilasyon, proteolitik isleme, fosforilasyon, prenilasyon, rasemizasyon, selenoilasyon, sülfasyon, amino asitlerin proteinlere arjinilasyon ve ubikutin ekleme gibi transfer-RNA aracili ilavesi dahildir; bakiniz, örnegin, Proteins - Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman ve Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, Mevcut bulus ayrica, bir antikor veya bunun antijen-baglayici fragmanini ve bir heterolog polipeptit içeren füzyon proteinlerini de saglar. Füzyon proteini, bulusun bir antikorunun veya bunun bir tau-baglayici fragmaninin en az bir VH bölgesinin amino asit dizisine ve bir heterolog polipeptit dizisine sahip bir polipeptit içerir. Bir uygulamada, füzyon proteininin VE ve VL bölgeleri, özgül olarak tauya baglanan bir tekli kaynak antikoruna (veya scFV veya Fab fragmanina) karsilik gelir. Yine bir baska uygulamada, burada açiklanan tanisal ve tedavi yöntemlerinde kullanim için bir füzyon proteini, bir antikorun VH CDR'lerinin amino asit dizisine ve bir antikorun veya bunun tau-baglayici fragmaninin VL CDR'lerinin amino asit dizisine ve bir; heterolog' polipeptit dizisine sahip bir polipeptit içerir. Bir uygulamada, VH- CDR(ler) veya Vi-CDR(1er), bulusun tekli kaynak antikoruna (veya scFV veya Fab fragmanina) karsilik gelir. Bu füzyon proteinlerini kodlayan nükleik asit molekülleri de bulus tarafindan kapsanmaktadir.
Literatürde bildirilmis olan emsal füzyon proteinlerine T hücresi reseptörünün füzyonlari (Gascoigne et al., Proc. Natl. (yuvalanma reseptörü) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1991) ve IgE reseptörü a (Ridgway ve Gorman, J. Cell. Biol.
Buradaki diger bölümlerde müzakere edildigi üzere, bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari, polipeptitlerin in vivo yari-ömrünün arttirilmasi veya immüno- tayinlerde kullanim için, teknikte bilinen yöntemler kullanilarak heterolog polipeptitlere kaynastirilabilir. Örnegin, bir uygulamada, PEG bulusun bu antikorlarinda, yari- ömürlerini in vivo arttirmak için konjuge edilebilir; bakiniz, Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; veya Weir et al., Biochem.
Soc. Transactions 30 (2002), 512. Üstelik, bulusun antikorlari veya antijen-baglayici fragmanlari, saflastirilmalarini veya saptanmalarini kolaylastirmak için bir peptit gibi markör dizilerine kaynastirilabilir. Belirli uygulamalarda, markör amino asit dizisi, birçogu piyasada bulunabilen digerleri arasinda, pQE vektöründe (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311) saglanan etiket gibi bir heksa-histidin peptididir (HIS). Örnegin, Gentz et al., Proc. Natl. Acad. histidin, füzyon proteinin elverisli saflastirilmasini saglar.
Saflastirma için faydali diger peptit etiketlerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, influenza hemaglutinin proteininden türetilen bir epitopa karsilik gelen “HA” etiketi (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767) ve “isaret” etiketi dahildir.
Füzyon proteinleri, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak hazirlanabilir; bakiniz örnegin US patentleri no. proteininin salgilanma veya baglanma karakteristiklerini optimize etmek için deneysel olarak seçilebilir. Füzyon proteinini kodlayan DNA daha sonra, ekspresyon için bir konak hücrenin içine transfekte edilir.
Mevcut bulusun antikorlari konjuge-olmayan formda kullanilabilir veya örnegin, molekülün terapötik özelliklerinin iyilestirilmesi, hedef saptamanin veya hastanin görüntülenmesinin veya terapisinin kolaylastirilmasi için çesitli moleküllerin en az birine konjuge edilebilir. Bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari, saflastirma gerçeklestirildiginde, saflastirmadan ya önce veya sona etiketlenebilir veya konjuge edilebilir. Özellikle, bulusun antikorlari veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlari terapötik ajanlara, prodroglara, peptitlere, proteinlere, enzimlere, virüslere, lipitlere, biyolojik yanit degistiricilere, farmasötik ajanlara veya PEG'e konjuge edilebilir.
Konvansiyonel antikorlar dahil olmak üzere immünotoksinler olan konjugatlar, teknikte genis bir sekilde tarif edilmistir.
Toksinle antikorlara konvansiyonel eslestirme teknikleriyle eslestirilebilir veya protein toksini kisimlari ihtiva eden immünotoksinler, füzyon proteinleri olarak üretilebilir.
Mevcut bulusun antikorlari, bu tip immünotoksinlerin elde edilmesi için uygun bir sekilde kullanilabilir. Bu tip immünotoksinlerin örnekleri, Byers, Seminars Cell. Biol. 2 51-54 tarafindan tarif edilenlerdir.
Teknikte uzman kisiler, konjugatlarin ayrica, konjuge edilecek seçilen ajana bagli olarak çesitli teknikler kullanilarak da bir araya getirilebilecegini anlayacaktir. Örnegin, biyotinle konjugatlar örnegin bir tau baglayici polipeptidin, biyotinin biyotin N-hidroksisüksinimit esteri gibi aktive bir esteriyle tepkimeye sokulmasiyla hazirlanir. Benzer sekilde, bir floresan markörle konjugatlar, bir eslestirme ajaninin, örnegin burada listelenenlerin farliginda veya bir izotiyosiyanat veya floresin-izotiyosiyanatla tepkimeye sokularak hazirlanabilir. Bulusun antikorlarinin veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarinin konjugatlari, analog bir biçimde hazirlanir.
Mevcut bulus ayrica, bulusun, bir tanisal veya terapötik ajana konjuge edilmis antikorlarini veya bunlarin antijen-baglayici fragmanlarini kapsar. Antikorlar, örnegin, bir nörolojik hastaligin varligini kanitlamak, nörolojik bir hastaliga yakalanma riskini göstermek, bir nörolojik hastaligin gelismesini veya ilerleyisini takip etmek için tanisal olarak, yani bir klinik test prosedürünun parçasi olarak tauopatik hastaligin, örnegin, belirli bir tedavinin ve/veya engelleme rejiminin etkililigini belirlemek için kullanilabilir.
Saptama, antikorun veya bunun antijen-baglayici fragmaninin saptanabilir bir maddeye eslestirilmesiyle kolaylastirilabilir. Saptanabilir maddelerin örneklerine çesitli enzimler, prostetik gruplar, floresan materyaller, isildayan materyaller, biyoisildayan materyaller, radyoaktif materyaller, çesitli pozitron emisyon tomografileri ve kullanilarak pozitron yayan materyaller radyoaktif-olmayan paramanyetik metal iyonlari dahildir; mevcut bulusa göre tanilayicilar olarak kullanim için antikorlara konjuge edilebilen metal iyonlari için bakiniz, Örnegin, US patent no. 4.741.900. Uygun enzimlerin örneklerine, yabanturpu peroksidaz, alkalin fosfat, ß-galaktosidaz veya asetilkolinesteraz dahildir; uygun prostetik grup komplekslerinin örneklerine streptavidin/biyotin ve avidin/biyotin dahildir; uygun floresan materyallerin örneklerine umbeliferon, floressein, floressein izotiyosiyanlar, rodamin, diklorotriazinilamin floressein, dansil klorür veya fikoeritrin dahildir; isildayan. bir materyalin bir örnegi luminol içerir; biyoisildayan materyallerin örneklerine lusiferaz, lusiferin ve aekuorin dahildir ve uygun radyoaktif materyalin örneklerine lül, 131I, 111In veya 99Tc dahildir.
Bir antikor veya bunun antijen-baglayici fragmani ayrica, bir kemiluminesan bilesige eslestirilmesiyle saptanabilir sekilde etiketlenebilir. Kemiluminesan-etiketli antikorun varligi daha sonra, bir kimyasal tepkimenin seyri esnasinda ortaya çikan isildamanin varliginin saptanmasiyla belirlenir. Özellikle faydali kemiluminesan etiketleme bilesiklerinin örnekleri, luminol, izoluminol, teromatik akridinyum ester, imidazol, akridinyum tuzu ve oksalat esteridir.
Bulusun bir antikorunun veya bunun antijen-baglayici fragmaninin saptanabilir sekilde etiketlenebildigi yollardan biri, fragmanin bir enzime baglanmasi ve baglanan ürünün bir enzini immüno-tayinde (EIA) kullanilmasidir (Voller, A., “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)” Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7): Voller et al., J. Clin. 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme lmmunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). Antikora baglanan enzim, örnegin, spektrofotometrik, florimetrik veya görsel araçlarla saptanabilen bir kimyasal bölütün üretilecegi bir sekilde, uygun bir substratla, tercihen bir Kromojenik substratla tepkimeye girecektir. Antikorun saptanabilir sekilde etiketlenmesi için kullanilabilen enzimlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, malat dehidrojenaz, stafilokokal nükleaz, delta-5-steroid izomeraz, maya alkol dehidrojenaz, alfa-gliserofosfat, dehidrojenaz, trioz fosfat izomeraz, yabanturpu peroksidaz, alkalin. fosfataz, asparajinaz, glikoz oksidaz, beta-galaktosidaz, ribonükleaz, üreaz, katalaz, glikoz-6-fosfat dehidrojenaz, glukoamilaz ve asetilkolinesteraz dahildir. Ek olarak, saptama, enzim için bir kromojenik substrat kullanan kolorimetrik yöntemlerle basarilabilir. Saptama ayrica, bir substratin enzimatik tepkimesinin benzer sekilde hazirlanan standartlara kiyasla seviyesinin görsel karsilastirilmasiyla basarilabilir.
Saptama ayrica, çesitli diger immüno-tayinlerin herhangi biri kullanilarak da basarilabilir. Örnegin, antikorun veya bunun antijen-baglayici fragmaninin radyoaktif sekilde etiketlenmesiyle, antikorun bir radyoimmün-tayininin (RIA) kullanilmasi yoluyla saptanmasi mümkündür (bakiniz, örnegin, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)). Radyoaktif izotop, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir gama sayaci, bir sintilasyon sayaci veya otoradyografi dahil araçlarla saptanabilir.
Bir antikor veya bunun antijen-baglayici fragmani ayrica, leu veya lantanid serilerinin digerleri gibi florisima yayan metaller kullanilarak da saptanabilir sekilde etiketlenebilir.
Bu metaller antikora, dietilentriaminpentasetik asit (DTPA) veya etilendiamintetraasetikr asit (EDTA) gibi bu tip metal selatlayici gruplar kullanilarak eklenebilir. Çesitli bölütlerin bir antikora veya bunun antijen-baglayici fragmanina konjuge edilmesi için teknikler, iyi bilinmektedir, bakiniz, örnegin, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For lmmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985) ve Thorpe et al., “The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62 Belirtildigi üzere, belirli uygulamalarda, bir antikorun veya bunun immünospesifik fragmaninin stabilitesini veya etkililigini arttiran bir bölüt konjuge edilebilir. Örnegin, bir uygulamada, PEG bulusun baglayici moleküllerine, bunlarin yari-ömrünün in Vivo arttirilmasi için konjuge edilebilir.
Leong et. al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug' Deliv.
Rev. 54 (2002), 531; veya Weir et al., Biochem. Soc.
Transactions 30 (2002), 512.
VI. Bilesimler ve Kullanim Yöntemleri Mevcut bulus, yukarida belirtilen tau baglayici molekülünü, örnegin, mevcut bulusun antikorunu veya bunun antijen- baglayici fragmanini veya bulusun polinükleotidini, vektörünü veya hücresini içeren bilesimlerle ilgilidir. Mevcut bulusun bilesimi ayrica, farmakolojik olarak kabul edilen bir tasiyici da içerebilir. Dahasi, mevcut bulusun farmasötik bilesimi, farmasötik. bilesimin amaçlanan kullanimina bagli olarak interlökinler veya interferonlar gibi diger ajanlari da içerebilir. Bir tauopatik hastaligin, örnegin, Alzheimer hastaliginin tedavisinde kullanim için, ilave ajan, küçük organik moleküllerden, anti-tau antikorlarindan ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilebilir. Dolayisiyla, belirli bir uygulamada mevcut bulus, bir tauopatik hastaligin profilaktik ve terapötik. tedavisi, bir süjede bir tauopatik hastaligin ilerleyisinin veya bir tauopatik hastalik tedavisine bir yanitin takip edilmesi veya bir süjenin bir tauopatik hastaliga yakalanma riskinin belirlenmesi için, tau baglayici nwlekülün, örnegin, bulusun antikorunun veya bunun antijen-baglayici kisminin veya bunlarin herhangi birinin ayni baglanma özgüllüklerine büyük ölçüde sahip bir baglayici molekülün, mevcut bulusun› polinükleotidinin, vektörunün veya hücresinin kullanimiyla ilgilidir.
Dolayisiyla, bir uygulamada mevcut bulus, sirasiyla, beyinde ve merkezi sinir sisteminde taunun anormal kümelesmesiyle ve/Veya. birikmesiyle karakterize bir nörolojik rahatsizligin tedavisinde kullanim için bulusun yukarida-tarif edilen tau baglayici molekülleriyle, antikorlariyla, polinükleotidleriyle, vektörleriyle veya hücreleriyle ilgilidir. “Nörolojik rahatsizlik” terimi, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Alzheimer hastaligi, amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksi, argirofilik gren demansi, Ingiliz tipi amiloid anjiyopati, serebral amiloid anjiyopati, kortikobazal dejenerasyon, Creutzfeldt-Jakob hastaligi, pugilistik demans, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklar, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom l7'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demans, frontotemporal lober dejenerasyon, Gerstmann-Strâussler-Scheinker hastaligi, Hallervorden-Spatz hastaligi, inklüzyon cisimcigi miyoziti, multipl sistem atrofisi, miyotonik distrofi, Niemann-Pick hastaligi tip C, nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaligi, Pick hastaligi, postensefalitik parkinsonizm, prion proteini serebral amiloid anjiyopati, progresif subkortikal gliyoz, progresif supranükleer palsi, subakut sklerozan panensafilt, sadece yumak demansi, multipl enfarktli demans ve iskemik inme gibi tauopatik hastaliklari içerir.
Aksi belirtilmedigi sürece, nörodejeneratif, nörolojik veya nöropsikiyatrik terimleri burada degisimli olarak kullanilmaktadir.
Mevcut bulusun terapötik yaklasiminin belirli bir avantaji, mevcut bulusun antikorlarinin, bir tauopatik hastaligin hiçbir belirtisinin olmadigi saglikli insan süjelerden gelen B hücrelerinden veya B hafiza hücrelerinden türetilmesi ve böylelikle, belirli bir olasilikla, bir klinik belirtili tauopatik hastaligi engelleyebilmesi veya klinik belirtili hastaligin ortaya çikma riskini azaltabilmesi veya klinik belirtili hastaligin baslamasini veya ilerleyisini geciktirebilmesi gerçeginde yatmaktadir. Tipik olarak, mevcut bulusun antikorlari halihazirda, somatik olgunlasmadan, yani, hedef tau nwlekülüne antikorun degisken bölgelerinin somatik varyasyonu araciligiyla yüksek afinite baglanmada seçimlilik ve etkililige göre optimizasyonundan basarili bir sekilde geçmistir. Örnegin, bir insan in vivo kmi tip hücrelerin otoimmünolojik veya alerjik reaksiyon açisindan ilgili veya diger fizyolojik proteinler veya hücre yapilari araciligiyla aktive edilmemis oldugu bilgisi de, bu duruni klinik test evresinden basarili bir sekilde sag çikmanin kayda deger sekilde artan bir sansini gösterdiginden büyük tibbi öneme sahiptir. Tabiri caizse, etkililik, kabul edilebilirlik ve tolere edilebilirlik, en az bir insan süjede profilaktik veya terapötik antikorun klinik- öncesi ve klinik gelisiminden önce çoktan kanitlanmistir.
Böylelikle, mevcut bulusun insan anti-tau antikorlarinin hem terapötik ajan olarak hedef yapiya-özgü etkililiginin hem yan etkilerinin azalan olasiliginin, klinik basari olasiligini kayda deger sekilde arttirmasi beklenebilir.
Mevcut bulus ayrica, yukarida tarif edilen içeriklerin, örnegin mevcut bulusun anti-tau antikorunun, baglayici fragmaninin, polinükleotidinin veya hücresinin biri veya daha fazlasiyla dolu bir veya daha fazla konteynir içeren, sirasiyla, bir farmasötik ve tanisal paket veya kit de saglamaktadir. Bu tip konteynir(lar)la iliskili olarak, farmasötiklerin veya biyolojik ürünlerin üretimini, kullanimini veya satisini düzenleyen bir hükümet kurumu tarafindan yazilan biçimde, insan kullanimi için üretimin, kullanimin veya satisim kurum tarafindan onayini yansitan bir not olabilir. Bilesim, Örnegin mevcut bulusun kiti elbette, tau varliginin eslik ettigi bir hastaligin risk degerlendirmesi, tanisi, engellenmesi ve tedavisi için özellikle uygundur ve Alzheimer hastaliginin (AD), amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksinin (ALS-PDC), argirofilik gren demansinin (AGD), Ingiliz tipi amiloid anjiyopatinin, serebral amiloid anjiyopatinin, kortikobazal dejenerasyonun (CBD), Creutzfeldt-Jakob hastaliginin (CJD), pugilistik demansin, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklarin, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom l7'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demansin (FTDP-l7), frontotemporal lober dejenerasyonun, Gerstmann-Straussler- Scheinker hastaliginin, Hallervorden-Spatz hastaliginin, inklüzyon cisimcigi miyozitinin, multipl sistem. atrofisinin, miyotonik distrofinin, Niemann-Pick hastaligi tip C'nin (NP- C), nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaliginin, Pick hastaliginin (PiD), postensefalitik parkinsonizmin, prion proteini serebral amiloid anjiyopatinin, progresif subkortikal gliyozun, progresif supranükleer palsinin (PSP), subakut sklerozan panensafiltin, sadece yumak demansinin, multipl enfarktli demansin ve iskemik inmenin tedavisi için özellikle uygulanabilir.
Mevcut bulusun farmasötik bilesimleri teknikte iyi bilinen yöntemlere göre formüle edilebilir; bakiniz örnegin Philadelphia Bilim Üniversitesi tarafindan Remington: The Uygun farmasötik tasiyicilarin örnekleri teknikte iyi bilinmektedir ve bunlara fosfat tamponlu salin solüsyonlari, su, yag/su emülsiyonlari gibi emülsiyonlar, çesitli islatici maddeler, steril solüsyonlar vb dahildir. Bu tip tasiyicilari içeren bilesimler, iyi bilinen konvansiyonel yöntemlerle formüle edilebilir. Bu farmasötik bilesimler süjeye uygun bir dozda verilebilir. Uygun bilesimlerin verilisi farkli yollarla, örnegin, intravenöz, intraperitoneal, subkütan, intramusküler, intranazal, topikal veya intradermal verilis veya omurilige veya beyne aktarimla gerçeklestirilebilir.
Burun spreyi formülasyonlari gibi aerosol formülasyonlari, koruyucu ajanlarla ve izotonik ajanlarla birlikte aktif maddenin saflastirilmis sulu veya diger solüsyonlarini içerir.
Bu tip formülasyonlar, burun mukoza membranlariyla uyumlu bir pH ve izotonik duruma ayarlanir. Rektal veya vajinal verilis için formülasyonlar, uygun bir tasiyiciyla bir süpozituar olarak sunulabilir.
Dahasi, mevcut bulus, mevcut. bulusun. bir ilacinin verilmesi için artik standart (ancak maalesef nadir) olan, kafatasinda ufak bir deligin açilmasi prosedürünü içerirken, bir yönde, baglayici molekül, özellikle mevcut bulusun antikoru veya antikor esasli ilaci kan-beyin bariyerini geçebilir ve bu da intravenöz veya oral verilise olanak saglar.
Dozaj rejimi, uzman. doktor tarafindan ve klinik faktörlerle belirlenecektir. Tibbi tekniklerde iyi bilindigi üzere, herhangi bir hasta için dozajlar, hastanin boyu, vücut yüzey alani, yasi, verilecek olan belirli bilesik, cinsiyet, verilis süresi ve yolu, genel saglik ve eszamanli olarak verilmekte olan diger ilaçlar gibi birçok aktöre baglidir. Tipik bir doz, örnegin, 0,001 ila 1000 ug araliginda (veya bu aralikta ekspresyon için veya ekspresyonun önlenmesi için nükleik asit) olabilir; ancak, bu emsal araligin altindaki veya üstündeki dozlar, özellikle yukarida belirtilen faktörler göz önüne alinarak öngörülmektedir. Genel olarak, doz konak vücut agirligina göre, örnegin, yaklasik 0,0001 ila 100 mg/kg arasinda ve daha siklikla 0,01 ila 5 mg/kg arasinda (örnegin, mg/kg Vb) degisebilir. Örnegin dozajlar 1 mg/kg vücut agirligi veya 10 mg/kg vücut agirligi veya l-lO mg/kg araliginda veya en az 1 mg/kg olabilir. Yukaridaki araliklar arasindaki dozlarin da bulusun kapsami dahilinde olmasi amaçlanmaktadir.
Süjelere bu dozlar günlük olarak, degisen günlerde, haftalik olarak 'veya deneysel analizle belirlenen› herhangi bir diger programa göre verilebilir. Emsal bir tedavi, uzun bir periyot, örnegin, en az alti ay boyunca çoklu dozajlarin verilisini gerektirir. Ilave emsal tedavi rejimleri, iki haftada bir bir kez veya ayda bir bir kez veya 3 ila 6 ayda bir bir kez verilisi gerektirir. Emsal dozaj programlarina ardisik günlerde 1-10 mg/kg veya 15 mg/kg, degisen günlerde 30 mg/kg veya haftalik olarak 60 mg/kg dahildir. Bazi yöntemlerde, farkli baglanma özgüllüklerine sahip iki veya daha fazla monoklonal antikorlar eszamanli olarak verilir, bu durumda verilen her bir antikorun dozaji, belirtilen araliklara denk gelir. Gelisme, periyodik degerlendirmeyle takip edilebilir.
Parenteral verilis için preparasyonlara steril sulu veya sulu- olmayan solüsyonlar, süspansiyonlar ve emülsiyonlar dahildir.
Sulu-olmayan çözücülerin örnekleri propilen glikol, polietilen glikol, zeytinyagi gibi bitkisel yaglar ve etil oleat gibi enjekte edilebilir organik esterlerdir. Sulu tasiyicilara su, alkollü/sulu solüsyonlar, salin ve tamponlanmis vasat gibi emülsiyonlar veya süspansiyonlar dahildir. Parenteral araçlara sodyum klorür solüsyonlari, Ringer dekstrozu, dekstroz ve sodyum klorür, laktatli Ringer veya sabit yaglar dahildir.
Intravenöz araçlara sivi ve besleyici yenileyiciler, (Ringer dekstrozuna dayali olanlar gibi) elektrolit yenileyiciler ve benzerleri dahildir. Örnegin, Antimikrobiyaller, anti- oksidanlar, selatlayici ajanlar ve etkisiz gazlar ve benzerleri gibi koruyucular ve diger katkilar da mevcut olabilir. Dahasi, bulusun farmasötik bilesimi, farmasötik bilesimin amaçlanan kullanimina bagli olarak, dopamin veya psikofarmakolojik ilaçlar gibi diger ajanlari içerebilir.
Dahasi, mevcut bulusun belirli bir uygulamasinda farmasötik bilesim, örnegin, bulusun farmasötik bilesimi pasif bagisiklama için bir anti-tau antikorunu veya bunun baglayici fragmanini, türevini veya varyantini içeriyorsa, bir asi olarak formüle edilebilir. Arka plan bölümünde belirtildigi üzere, fosfor-tau türleri ekstraselüler olarak plazmada ve CSF'de bildirilmistir (Aluise et al., Biochim. Biophys. Acta. asilama kullanilarak transgenik fare çizgilerinde yapilan çalismalar, beyinde tau agregatlarinin indirgenmis beyin seviyelerini ve davranis bozukluklarinin yavaslamis ilerleyisini ortaya çikarmistir (Sigurdsson, J. Alzheimers antikorlariyla ve esdeger tau baglayici molekülleriyle pasif bagisiklamanin, arka plan bölümünde önceden müzakere edildigi üzere aktif bagisiklama terapi kavramlarinin, çesitli advers etkilerinin üstesinden gelmeye yardimci olabilecegini beklemek sagduyuludur. Bu nedenle, mevcut bulusun mevcut anti-tau antikorlari ve bunlarin esdegerleri, AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-l7, NP-C, PiD, PSP gibi tauopatik hastaliklarin veya önceden belirtildigi üzere diger tauopatilerin engellenmesi veya hafifletilmesi için bir asi olarak özellikle faydali olacaktir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun antikorunun rekombinan iki- Özgül veya çoklu-Özgül yapilarini kullanmak faydali olabilir.
Bir referans için bakiniz Fischer ve Léger, Pathobiology 74 (2007), 3-14. Bu tip iki-özgül molekül, bir baglayici kol ve AB gibi bir baska patolojik varlikla veya alfa-sinükleinle veya bir ikinci baglayici kola sahip taunun farkli bir patolojik konformasyonuyla tauyu hedeflemek için tasarlanabilir. Alternatif olarak, ikinci baglayici kol, beynin içine antikor penetrasyonunun kolaylastirilmasi için kan-beyin-bariyerinde mevcut bir proteini hedeflemek için tasarlanabilir.
Bir uygulamada, mevcut bulusun antikorunun, bir hücre membranina daha kolay nüfuz edebilen rekombinan Fab (rFab) ve tek Zincirli fragmanlarini (scFv'ler) kullanmak faydali olabilir. Örnegin, önceden internette yayinlanan Robert et N-uç bölgesinde bir epitopu taniyan WO-2 monoklonal antikorun kimerik rekombinan Fab (rFab) ve tek zincirli fragmanlarinin (scFv'ler) kullanimini tarif etmektedir. Islenen fragmanlar (i) amilod. fibrilizasyonunu engelleyebilmistir, (ii) önceden olusmus Aßl-42 fibrillerini çözüstürebilmistir ve (iii) tam lgG molekülü kadar etkili olarak in vitro Aßl-42 oligomer- aracili nörotoksisiteyi önleyebilmistir. Efektör fonksiyonündan yoksun küçük Fab ve scFv islenmis antikor formatlarinin kullanilmasinin farkina varilan avantajlarina, kan-beyin, bariyeri boyunca daha etkili geçis ve enflamatuar yan tepkimelerin tetiklenmesi riskinin. minimuma indirgenmesi dahildir. Dahasi, scFV ve tek-alanli antikorlarin, tam-boy antikorlarin baglanma özgüllügünü muhafaza etmelerinin yani sira, katlanmanin, etkilesimlerin, modifikasyonlarin veya hedeflerinin hücre alti lokalizasyonunun degistirilmesi potansiyeliyle, tekli genler ve memeli hücrelerinde intraselüler sekilde intrakorlar olarak eksprese edilebilirler; inceleme için bakiniz, örnegin, Miller ve Farkli bir yaklasimda, Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. canli hücrelerin içine onlara zarar vermeden tasinmalarini sagladigi söylenen bir teknoloji platformunu tarif etmektedir.
Bu tip, hücreye-nüfuz eden antikorlar yeni tanisal ve terapötik firsatlar sunmaktadir. Bu antikorlar için Bir diger uygulamada, bir tauopatik hastaligin tedavisinde faydali diger antikorlarin es-verilisi veya ardisik verilisi arzu edilebilir. Bir uygulamada, ilave antikor, mevcut bulusun farmasötik bilesiminde içerilir. Bir süjenin tedavi edilmesi için kullanilabilen antikorlarin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, beta-amiloid, alfa-sinükleini, TDP-43'ü ve SOD-l'i hedefleyen antikorlar dahildir.
Bir diger uygulamada, bir tauopatik hastaligin tedavisi için faydali diger nöro-koruyucu ajanlarin es-verilisi veya ardisik verilisi arzu edilebilir. Bir uygulamada, ilave ajan, mevcut bulusun farmasötik bilesiminde içerilir. Bir süjenin tedavi edilmesi için kullanilabilen nöro-koruyucu ajanlarin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir asetilkolinesteraz inhibitörü, bir glutamaterjik reseptör antagonisti, kinaz inhibitörleri, HDAC inhibitörleri, anti- enflamatuar ajanlar, divalporeks sodyum veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu dahildir. Mevcut bulusun farmasötik bilesiminin beraberinde kullanilabilen diger nöro-koruyucu ajanlarin örnekleri teknikte tarif edilmektedir; bakiniz, örnegin uluslararasi basvuru WOZOO7/Oll907. Bir uygulamada, ilave ajan dopamin veya bir dopamin reseptörü agonistidir.
Terapötik olarak etkili bir doz veya miktar, etken maddenin, semptomlarin veya durumun iyilestirilmesi için yeterli miktarini ifade etmektedir. Bu tip bilesiklerin terapötik etkililigi_ ve toksisitesi, hücre kültürlerinde *veya deneysel hayvanlarda standart farmasötik prosedürlerle belirlenebilir, örnegin, EDSO (popülasyonun %50'sinde terapötik olarak etkili doz) ve LDw (popülasyonun %SO'si için ölümcül doz). Terapötik ve toksik etkilerin arasindaki doz orani terapötik endekstir ve LDm/EDm orani olarak ifade edilebilir. Bir uygulamada, bilesimdeki terapötik ajan, daha önceden belirtildigi üzere AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-l7, NP-C, PiD, PSP veya diger tauopatik hastaliklar durumunda normal davranisi ve/veya bilissel özellikleri geri kazandirmak veya korumak için yeterli bir miktarda mevcuttur.
Yukarida anlatilanlardan yola çikilarak, mevcut bulusun yukarida tarif edilen antikorun, özellikle yukarida belirtildigi üzere bir tauopatik hastaligin, özellikle Alzheimer hastaliginin tanisi ve/veya tedavisi için herhangi bir kullanimini kapsadigi bellidir. Ek olarak, mevcut basvuru, burada önceden tarif edilen belirtilmis antikorlarin herhangi birinin anti-idiotipik antikorlarini açiklamaktadir. Bunlar, bir antikorun, antijen-baglanma alaninin yakinindaki degisken bölgesinde yer alan benzersiz antijenik peptit dizisine baglanan antikorlar veya diger baglayici moleküllerdir ve örnegin, bir süjenin numunesindeki anti-tau antikorlarinin saptanmasi için faydalidir.
Bir baska uygulamada mevcut bulus, bulusun yukarida tarif edilen tau baglayici antikorlarinin, antijen-baglayici fragmanlarinin, polinükleotidlerinin, vektörlerinin veya hücrelerinin veya saptama için immüno veya nükleik asit tabanli tanisal yöntemlerde konvansiyonel olarak kullanilan belirteçler gibi opsiyonel olarak uygun araçlarin herhangi birini içeren bir tanisal bilesimle ilgilidir. Bulusun antikorlari, örnegin, sivi evrede kullanilabildikleri veya bir kati evre tasiyiciya baglanabildikleri immüno-tayinlerde kullanim için uygundur. Bulusun antikorunu kullanabilen immüno-tayinlerin örnekleri, ya bir dogrudan veya dolayli formatta rekabetçi ve rekabetçi-olmayan immüno-tayinlerdir. Bu tip immüno-tayinlerin örnekleri, radyoimmün-tayini (RIA), sandviç (immünometrik tayin), akis sitometrisi ve Western lekeleme tayinidir. Bulusun antijenleri ve antikorlari birçok farkli tasiyiciya baglanabilir ve özgül olarak baglandiklari hücreleri izole etmek için kullanilabilir. Iyi bilinen tasiyicilarin örneklerine cam, polistiren, polivinil klorür, polipropilen, polietilen, polikarbonat, dekstran, naylon, amilozlar, dogal ve modifiye selülozlar, poliakrilamitler, agarozlar ve magnetit dahildir. Tasiyicinin dogasi, bulusun amaçlari dogrultusunda ya çözünür veya çözünmez olabilir.
Teknikte normal uzmanliga sahip kisilerce bilinen birçok farkli etiketler ve etiketleme yöntemleri bulunmaktadir.
Mevcut bulusta kullanilabilen etiket tiplerinin örneklerine enzimler, radyoizotoplar, koloidal metaller, floresan bilesikler, kemiluminesan bilesikler ve biyoluminesan bilesikler dahildir; bakiniz ayrica burada yukarida müzakere edilen uygulamalar.
Bir diger uygulamayla, tau baglayici moleküller, özellikle mevcut bulusun antikorlari ayrica, bir bireydeki bir rahatsizligin tanisi için bir yöntemde, test edilen bireyden bir kan numunesi, bir lenf numunesi olabilen bir vücut sivisi numunesinin veya herhangi bir diger vücut sivisi numunesinin alinmasiyla ve vücut sivisi numunesinin mevcut bulusun bir antikoruyla, antikor-antijen komplekslerinin olusumunu saglayan kosullar altinda temas ettirilmesiyle kullanilabilir.
Bu tip komplekslerin seviyesi daha sonra teknikte bilinen yöntemlerle, bir kontrol numunesinde olusmus olandan kayda deger sekilde daha yüksek bir seviyenin test edilen bireyde hastaligi gösterdigi sekilde belirlenir. Ayni sekilde, bulusun antikorlari tarafindan baglanan spesifik antijen de kullanilabilir. Böylelikle, mevcut bulus, bulusun baglayici molekülünü, örnegin, antikorunu veya antijen-baglayici fragmanini içeren bir in vitro immüno-tayinle ilgilidir.
Bu baglamda, mevcut bulus ayrica, bu amaç için spesifik olarak tasarlanan araçlarla da ilgilidir. Mesela, örnegin mevcut bulusun, tauyu özgül olarak taniyan antikorlariyla veya esdeger antijen-baglayici molekülleriyle yüklenen bir antikor- esasli dizilis kullanilabilir. Mikro-dizilis immüno- tayinlerinin tasarimi, Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 bulus ayrica, mevcut bulusa göre tanimlanan tau baglayici moleküllerle yüklenen mikro-dizilislerle de ilgilidir.
Bir uygulamada, mevcut bulus, bir süjedeki bir tauopatik hastaligin tanilanmasinin bir yöntemiyle ilgili olup, yöntem, mevcut bulusun en az bir antikoruyla tani konulacak olan süjeden alinan bir numunede taunun `ve/veya patolojik olarak modifiye ve/veya kümelenmis taunun, bunun tau baglayici bir fragmaninin veya bunlarin herhangi biriyle ayni baglanma özgüllüklerine sahip bir tau-baglayici molekülün varliginin belirlenmesini içermektedir; burada patolojik olarak modifiye ve/veya kümelenmis taunun varligi bir nörodejeneratif tauopatinin göstergesidir ve patolojik olarak modifiye ve/veya kümelenmis taunun seviyesinin, fizyolojik tau formlarina kiyasla bir artisi, söz konusu süjede bir nörodejeneratif tauopatinin ilerleyisinin göstergesidir.
Tani konulacak süje semptomsuz veya hastalik için klinik öncesi olabilir. Bir uygulamada, kontrol süjesi önceden belirtildigi üzere bir tauopatik hastaliga, örnegin, AD, ALS- PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP veya diger tauopatilere sahip olup, burada patolojik olarak modifiye ve/veya kümelenmis taunun seviyesiyle referans standart arsindaki bir benzerlik, süjeye bir tauopatik hastalik tanisi konulacagini göstermektedir. Alternatif veya ek olarak, bir ikinci kontrol olarak kontrol süjesi bir tauopatik hastaliga sahip degildir, burada taunun ve/veya patolojik olarak modifiye ve/veya kümelenmis taunun seviyesiyle referans standart arsindaki bir benzerlik, süjeye bir tauopatik hastalik tanisi konulacagini göstermektedir. Bir uygulamada, tani konulacak süje ve kontrol süjesi (süjeleri) yas-eslidir.
Analiz edilecek numune, patolojik olarak modifiye ve/veya kümelenmis tau ihtiva ettiginden süphelenilen herhangi bir Vücut sivisi, örnegin bir kan, CSF veya idrar numunesi olabilir.
Taunun ve/veya patolojik olarak modifiye ve/veya kümelenmis taunun seviyesi, teknikte bilinen, örnegin, asagidakilerden seçilen bir veya daha fazla teknikle analiz etmeyi içeren herhangi bir uygun yöntemle tayin edilebilir; Western lekeleme, immünopresipitasyon, enzime-bagli bagisiklik tayini (ELISA), radyoimmün-tayini (RIA), floresanla aktive hücre siniflandirma (FACS), iki-boyutlu jel elektroforezi, kütle spektrometrisi (MS), kaçis-MS'sinin matris-yardimcili lazer disari salma/iyonlastirma-süresi (MALDI-TOF), kaçisin yüzey- güçlendirilmis lazer disari salma iyonlastirma-süresi (SELDI- TOF), yüksek performansli sivi kromatografi (HPLC), hizli protein sivi kromatografi (FPLC), çok-boyutlu sivi kromatografi (LC) ve ardindan ikili kütle spektrometrisi (MS/MS) ve lazer dansitometrisi. Bir uygulamada, taunun söz konusu in vivo görüntülenmesi pozitron emisyon tomografisini (PET), tekli foton emisyon tomografisini (SPECT), yakin kizilötesi (NIR) optik› görüntülemeyi veya manyetik rezonans görüntülemeyi (MRI) içerir.
Alzheimer hastaligi gibi bir tauopatik hastaligin tanilanmasi, bir tauopatik hastalik ilerleyisinin takip edilmesi ve antikorlar ve mevcut bulusa göre uyarlanabilen ilgili araçlar kullanilarak bir tauopatik hastalik tedavisinin takip edilmesi yöntemleri ayrica, uluslararasi basvurular W093/08302, WOZOO4/Ol6655'te de tarif edilmektedir. Benzer sekilde, tau için antikor esasli saptama yöntemleri, uluslararasi basvuru WOZOO5/O80986'dar tarif edilmektedir. Bu yöntemler tarif edildigi sekilde ancak mevcut bulusun bir tauya özgü antikoruyla veya baglayici fragmaniyla uygulanabilir.
Mevcut basvuru ayrica, taunun mevcut bulusun herhangi bir antikoru tarafindan özgül olarak taninan bir epitopuna sahip peptitleri de açiklamaktadir. Bir uygulamada, bu tip peptit, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42'de gösterildigi üzere bir amino asit dizisi veya bunun, bir, iki, üç, dört, bes, alti, yedi veya daha fazla amino asidin ikame edildigi, silindigi ve/veya eklendigi bir modifiye diziyi içermekte olup, burada peptit mevcut bulusun herhangi bir antikoru tarafindan taninir.
Bu tip bir peptit, bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin, söz konusu bir biyolojik numunede bir peptide baglanan. bir antikorun varliginin, belirlenmesinin bir adimini içeren tanilanmasi ve söz konusu süjede bir tauopatinin, yukarida tarif edilen peptidi taniyan antikorlarin seviyelerinin ölçülmesiyle ve ölçümlerin benzer yas ve cinsiyetteki saglikli süjelerde bulunan seviyelerle karsilastirilmasiyla tanilanmasi için kullanilmasi için kullanilabilir. Söz konusu peptit için özgül olan ölçülen antikorlarin yükselmis bir seviyesi, söz konusu süjede bir tauopatinin tanilanmasinin göstergesi olacaktir. Peptit, burada önceden tarif edildigi üzere, sirasiyla, bir dizilis, bir kit ve bilesimde formüle edilebilir.
Bunlar ve diger uygulamalar, mevcut bulusun tarifnamesi ve örnekleri tarafindan açiklanmakta ve kapsanmaktadir. Mevcut bulusa göre kullanilacak olan materyallerin, yöntemlerin, kullanimlarin ve bilesiklerin herhangi biriyle ilgili diger literatür, örnegin elektronik cihazlar kullanilarak halk kütüphanelerinden ve veritabanlarindan edinilebilir. Örnegin, Biyoteknoloji Bilgileri Ulusal Merkezinin ve/veya Milli Saglik Enstitüsündeki Milli Tip Kütüphanesinin sahibi oldugu Biyoloji Laboratuarinin (EMBL) bir bölümü olan Avrupa Biyoinformatik Enstitüsüne (EBI) ait olanlar gibi diger veritabanlari ve web adresleri teknikte uzman kisi tarafindan bilinmektedir ve ayrica internet arama motorlari kullanilarak da elde edilebilir. Biyoteknolojideki patent bilgisinin bir genel bakisi ve geriye dönük arama ve mevcut farkindalik için faydali patent bilgisinin ilgili kaynaklarinin bir incelemesi, Yukaridaki açiklama genel olarak mevcut bulusu tarif etmektedir. Aksi belirtilmedigi sürece, burada kullanildigi sekliyle bir terime, 2000 senesinde revize edilen ve 2003 senesinde yeniden basilan Oxford Dictionary of Biochemistry ve Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, ISBN O 19 850673 2'de saglanan tanim verilmektedir. Bu spesifikasyonun metni boyunca, birçok belge anilmaktadir. Anilan herhangi bir belgenin gerçekte mevcut bulusa göre önceki teknik olduguna dair bir kabullenme yoktur.
Daha tam bir anlama, burada yalnizca örnekleme amaçlari dogrultusunda saglanan ve bulusun kapsamini sinirlama amacinda olmayan asagidaki spesifik örneklere istinaden elde edilebilir. ÖRNEKLER Asagidaki örnekler bulusu daha ayrintili olarak resmetmektedir, ancak herhangi bir sekilde bulusun kapsamini sinirladiklari manasi çikarilmamalidir. Asagidaki 1 ila 4 arasindaki Örneklerdeki deneyler, klonlandiklari sekilde NI- degisken agir ve hafif zincirlerinin germ hatti (GL) dizileriyle ayarlanmadan çerçeve 1 (FRl) Ig-degisken bölgelerine göre resmedilmekte ve tarif edilmektedir; bakiniz Gereç ve Yöntemler Burada kullanilanlar gibi konvansiyonel yöntemlerin ayrintili tarifnameleri, anilan literatürde bulunabilir; bakiniz ayrica Beers ve Berkow tarafindan düzenlenen “The Merck Manual of Diagnosis ve Therapy” On yedinci baski (Merck & Co., Inc. 2003).
Mevcut bulusun uygulanmasi, aksi belirtilmedigi sürece, hücre biyolojisinin, hücre kültürünün, moleküler biyolojinin, transgenik biyolojinin, mikrobiyolojinin, rekombinan DNA ve immünolojinin teknikte uzmanlik dahilinde olan konvansiyonel tekniklerini kullanacaktir. Bu bulusun uygulanmasinda faydali olan genel tekniklerin diger ayrintilari için, pratisyen hücre biyolojisi ve doku kültüründeki standart ders kitaplarina ve incelemelerine basvurabilir; bakiniz ayrica, örneklerde anilan referanslar. Moleküler ve hücresel biyokimyadaki genel yöntemler, asagidakiler gibi standart ders kitaplarinda bulunabilir; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.
(Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Ciltler I ve II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames ve Higgins eds. 1984); Transcription ve Translation (Hames ve Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney ve Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller ve Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology ve Short Protocols in Molecular; Biology, 3ncü Baski (Ausubel et al., eds.) ve Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller ve Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory): Methods In Enzymology, Sayilar 154 ve ; Immobilized Cells ve Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); tez, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell ve Molecular Biology (Mayer ve walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I- al., John Wiley & Sons 1996); Non-Viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); 1997); ve Cell ve Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Bu açiklamada atifta bulunulan genetik manipülasyon için belirteçler, klonlama vektörleri ve kitler, BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich ve ClonTech gibi piyasadaki saticilardan temin edilebilir. Hücre kültür ve vasat toplanmasindaki genel teknikler su kaynaklarda özetlenmektedir; Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); ve Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information Tauya-özgü B-hücrelerinin tanimlanmasi ve ilgili antikorlarin klonlanmasi yöntemleri Aksi asagida belirtilmedigi sürece, tauya-özgü B hücrelerinin tanimlanmasi ve ilgi konusu özgüllügü sergileyen anti-tau antikorlarinin klonlanmasinin yani sira bunlarin rekombinan ekspresyonu ve fonksiyonel karakterizasyonu, Örneklerde ve basvurusunun Tamamlayici Yöntemler kisminda tarif edildigi sekilde gerçeklestirilmistir veya genel olarak gerçeklestirilebilir. Tauya-özgü B hücrelerinin tanimlanmasi ve ilgi konusu özgüllügü sergileyen anti-tau antikorlarinin klonlanmasinin yani sira bunlarin rekombinan ekspresyonu ve fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir yöntem bu basvuru dahilinde saglanmaktadir. Yukarida tarif edildigi üzere mevcut bulusun bir uygulamasinda, tekli veya oligoklonal B- hücrelerinin kültürleri kültürlenir ve söz konusu B-hücreleri tarafindan üretilen antikorlari ihtiva eden kültürün süzüntüsü, içindeki yeni anti-tau antikorlarinin varligi ve afinitesi için taranir. Tarama islemi, Örnek l'de tarif edildigi ve Sekil 9'da tarif edildigi gösterildigi sekilde bir hassas doku amiloid plagi immünreaktivite (TAPIR) tayini; Örnek 2'de tarif edildigi ve Sekiller 3 ve 8'de gösterildigi üzere PHFTau'ya baglanma için beyin ekstraktlari üzerinde tarama; benzer olarak Örnek 3'te tarif edildigi ve Sekil 5'te gösterildigi üzere SEQ ID NO: 6 tarafindan temsil edine amino asit dizisinin tausundan türetilen bir peptidin, söz konusu dizinin, NI-105.4E4 antikoru için epitop konfirmasyon deneyleri nedeniyle fosforile-olmayan peptitlere sahip Ser-202 ve Ser-205 amino asitleri üzerindeki, Thr-23l amin asidi üzerindeki ve/veya Ser-396 ve Ser-404 amino asitleri üzerindeki fosfat gruplariyla baglanmasi için tarama; uluslararasi patent WO2008/O8lOO8'de tarif edildigi üzere ve Örnek l'de tarif edildigi üzere ve Sekiller 2, 5 ve 7'te gösterildigi üzere SEQ ID NO: 6 tarafindan temsil edilen amino asit dizisinin tam-boy tausunun baglanmasi için bir tarama ve baglanmanin saptandigi antikorun veya söz konusu antikoru üreten hücrenin izole edilmesi adimlarini içerir.
Antijenin saflastirilmasi Rekombinan insan Tau40, rPeptide (Bogart, GA, US) firmasindan satin alindi. PHFTau AD'li beyinden ekstrakte edildi.
Patolojik olarak fesforile tau filamanlarini (PHFTau) ihtiva eden çiftlenmis sarmal filamanlarin izolasyonu, modifikasyonlar yapilarak Goedert et al. (Goedert et al., gerçeklestirildi. AD'li beyin dokusunun bir grami, görünür tüm kan damarlari çikarilarak 5 mm'lik parçalar halinde kesildi.
Doku üç kez 40 ml buz gibi soguk yikama solüsyonuyla (lOOmM Tris pH ile yikandi ve ardindan 20 ml lizis tamponuyla (lOmM Tris pH 7,4, 0,8M NaCl, lmM EGTA, 1. x proteaz inhibitörü kokteyli, 1 mM NaýKh, lmM NaF, ImM AEBSF, %10 sükroz) homojenize edildi. Homojenat 4°C'de 20'OOOxg'da. 20 dk süreyle santrifüjlendi. Süzüntü %1 (w/v) N-loroil sarkosinat (Sigma, Isviçre) ilavesiyle toplandi. 37°C'de çalkalayarak iki saat inkübasyondan sonra, süzüntü 4°C'de 100'OOOxg'da bir saat süreyle santrifüjlendi.
Pelet toplandi ve PES içinde yeniden-süspanse edildi. Olasi kirletici immünoglobülinlerin protein A manyetik boncuklariyla temizlenmesinden sonra, PHFTau süspansiyonu kullanimdan önce - 80°C'de depolandi. Saglikli kontrol insan beyin dokusundan bir kontrol ekstrakti benzer sekilde hazirlandi.
Insan tau antikoru taramasi 96 kuyucuklu yarim alan mikroplakalar (Corning), gece boyunca 4°C'de karbonat ELISA kaplama tamponunda (pH 9,6) 1 ug/ml'lik standart bir konsantrasyonda rekombinan Tau proteiniyle (rPeptide, Bogart, US) kaplandi. PHFTau taramasi için, 96 kuyucuklu Immobilizer Mikroplakalari (Nunc, Danimarka), gece boyunca 4°C'de karbonat ELISA kaplama tamponunda (pH 9,6) insan AD'li beyinden ekstrakte edilmis, 1:100 seyreltilmis PHFTau ile kaplandi. Plakalar PBS-T pH 7,6 içinde yikandi ve özgül-olmayan baglanma alanlari 2 saat süreyle %2 BSA (Sigma, Buchs, Isviçre) ihtiva eden PBS-T ile OS'de bloke edildi. B hücresi kosullu vasat hafiza B hücre kültürü plakalarindan ELISA plakalarina aktarildi ve bir saat süreyle OS'de inkübe edildi. ELISA plakalari PBS-T içinde yikandi ve daha sonra yabanturpu peroksidaz (HRP)-konjuge esek anti-insan IgG (Fcy fragmanina özgü) poliklonal antikorlariyla (Jackson immunoResearch, Newmarket, BK) inkübe edildi. PBS-T ile yikamadan sonra, insan antikorlarinin baglanmasi, standart bir kolorimetrik tayinde HRP aktivitesinin ölçülmesiyle belirlendi.
MULTI-ARRAY® mikroplaka taramasi Standard 96 kuyucuklu lO-Spotlu MULTI-SPOT plakalari (Meso Scale Discovery, US) PBS içinde 30 ug/ml rTau (rPeptide), PHFTau beyin ekstrakti ve saglikli kontrol beyin ekstrakti ile kaplandi. Özgül-olmayan baglanma alanlari 1 saat süreyle OS'de hücresi kosullu vasatla 1 saat süreyle OS'de inkübe edildi.
Plakalar PBS-T içinde yikandi ve daha sonra SULFO-Tag konjuge anti-insan poliklonal antikoruyla (Meso Scale Discovery, US) inkübe edildi. PBS-T ile yikamadan sonra, antikorun baglanmasi, bir snTOR Imager kullanilarak elektro-kemiluminesans ölçümüyle saptandi.
Tau antikorlarinin moleküler klonlanmasi Hafiza B hücreleri ihtiva eden numuneler, saglikli insan süjelerden elde edildi. Seçilen hafiza B hücre kültürlerinin canli B hücreleri hasat edildi ve mRNA hazirlanir. Daha sonra, immünoglobülin agir ve hafif zincir dizileri bir iç içe PCR yaklasimi kullanilarak elde edilir.
Insan immünoglobülin germ hatti dagarciginin tüm dizi familyalarini temsil eden primerlerin bir kombinasyonu, lider peptitlerin, V-segmentlerinin ve J-segmentlerinin güçlendirilmesi için kullanilir. Birinci tur güçlendirme, 5'- ucunda lider peptide-özgü primerlerin ve 3'-ucunda sabit bölgeye-özgü primerlerin kullanilmasiyla gerçeklestirilir ve kappa hafif zincirleri için, ikinci tur güçlendirme, 5'- ucunda V-segmentine-özgü primerler ve 3'-ucunda J-segmentine- özgü primerler kullanilarak gerçeklestirilir. Lambda hafif zincirleri için, ikinci tur güçlendirme, 5'-ucunda V- segmentine özgü primerler ve 3'-ucunda C-bölgesine-özgü primer kullanilarak gerçeklestirilir` (Marks et al., Mol. Biol. 222 Arzu edilen özgüllüge sahip antikorun tanimlanmasi, tam antikorlarin rekombinan ekspresyonu üzerine ELISA üzerinde yeniden-taranmayla gerçeklestirilir. Tam insan IgGl antikorlarinin veya kimerik IgG2a antikorlarinin rekombinan ekspresyonu, “dogru okuma çerçevesindeki” degisken agir ve hafif zincir dizilerinin, degisken bölge dizisini 5'-ucunda bir lider peptidi kodlayan bir diziyle ve 3'-ucunda uygun sabit alan(lar)i kodlayan bir diziyle tamamlayan ekspresyon vektörlerinin içine sokulmasi üzerine elde edilir. Bu amaçla, kisitlama alanlari ihtiva eden primerler, degisken agir ve hafif zincirlerinin antikor ekspresyon vektörlerinin içine klonlanmasinin kolaylastirilmasi için tasarlanir. Agir zincir immünoglobülinleri, çerçeve içindeki immünoglobülin agir zincir RT-PCR ürününün, bir sinyal peptidi ve insan immünoglobülin gama 1 veya fare immünoglobülin gama 2a'nin sabit alanlarini tasiyan bir agir zincir ekspresyon vektörünün içine sokulmasiyla eksprese edilir. Kappa hafif zincir immünoglobülinleri, çerçeve içindeki kappa hafif zincir RT-PCR ürününün, bir sinyal peptidi ve insan kappa hafif zincir immünoglobülini saglayan bir hafif zincir ekspresyon vektörünün içine sokulmasiyla eksprese edilir. Lambda hafif zincir immünoglobülinleri, çerçeve içindeki lambda hafif zincir RT-PCR ürününün, bir sinyal peptidi ve insan veya fare lambda hafif zincir immünoglobülini saglayan bir lambda hafif zincir ekspresyon vektörünün içine sokulmasiyla eksprese Fonksiyonel rekombinan monoklonal antikorlari, bir Ig-agir- zincir ekspresyon vektörünün ve bir kappa veya lambda Ig- hafif-zincir ekspresyon vektörünün HEK293 veya CHO hücrelerinin (veya insan veya fare kökenli herhangi bir diger uygun alici hücre çizgisinin) içine es-transfeksiyon 'üzerine elde edilir. Müteakiben rekombinan insan monoklonal antikoru, standart bir Protein A kolon saflastirmasi kullanilarak kosullu vasattan saflastirilir. Rekombinan insan monoklonal antikoru, ya geçici veya stabil olarak transfekte edilen hücreler kullanilarak sinirsiz miktarlarda üretilebilir.
Rekombinan insan monoklonal antikor üreten hücre çizgileri, ya degisken bölgelerin, farkli ekspresyon vektörlerinin içine yeniden-klonlanmasiyla olusturulabilir. F(ab), F(ab)2 veya scFV gibi türevler de bu Ig-degisken bölgelerinden üretilebilir.
Antikorlar Fare monoklonal anti-insan tau antikoru TaulZ (Covance, California, A.B.D.) ve fare monoklonal tau antikoru AT18O (Thermo Scientific, A.B.D.), üreticinin protokolüne göre kullanildi. Rekombinan insan tau antikorlari NI-lO5.4E4 ve NI- eksprese edildi, kosullu vasattan saflastirildi ve aksi belirtilmedigi sürece dogrudan müteakip uygulamalarda kullanildi. 1 ila 4 arasindaki Örneklerde, mevcut bulusun saflastirilmis rekombinan antikorlari kullanildi.
Dogrudan ELISA 96 kuyucuklu mikroplakalar (Costar, Corning, US), 4°C'de gece boyunca, karbonat ELISA, kaplama tamponunda (50mM, pH9,6) l pg/ml'lik bir konsantrasyona seyreltilen rekombinan Tau proteiniyle (hTau40, rPeptide, Bogart, US) kaplandi. Özgül- olmayan baglama alanlari 2 saat süreyle OS'de, %2 BSA (Sigma, Buchs, Isviçre) ve %O,5 Tween20 ihtiva eden PBS ile bloke edildi. Mevcut bulusun insan antikorlarinin (NI-105.4E4, NI- insan IgG Fcv (Jackson immunoResearch, Newmarket, BK) kullanilarak ve ardindan standart bir kolorimetrik tayinde HRP aktivitesinin ölçülmesiyle belirlendi. ECw degerleri, GraphPad Prisni yazilimi (San Diego, US) kullanilarak dogrusal-olmayan Western Lekeleme protein boyama PHFTau ve rekombinan hTau40, gradyan SBS-PAGE (NuPAGE %4-12; Invitrogen, Basel, Isviçre) tarafindan ve ardindan nitroselüloz membranlar üzerinde elektro-lekelemeyle ayristirildi. Oda sicakligindar bir saat süreyle %2 BSAV ile spesifik-olmayan baglanmanin bloke edilmesinden sonra, lekeler antikorlarla veya Tau12 (fare monoklonal antikoru, Covance, California, A.B.D.) ile, ardindan bir HRP-konjuge keçi anti- insan IgGFcy (insan için primer antikorlar) veya bir HRP- konjuge keçi anti-fare IgG sekonder antikoru tarafindan inkübe Lekeler, ECL ve ImageQuant 350 saptama (GE Healthcare, Otelfingen, Isviçre) kullanilarak gelistirildi.
AD'li beyinden PHFTau ekstraksiyonu Patolojik olarak fosforile tau filamanlari (PHFTau) ihtiva eden çiftlenmis sarmal filamanlarin izolasyonu, modifikasyonlar yapilarak Goedert et al. (Goedert et al., gerçeklestirildi. AD'li beyin dokusunun bir grami, görünür tüm kan damarlari çikarilarak 5 nmVlik parçalar halinde kesildi.
Doku üç kez 40 ml buz gibi soguk yikama solüsyonuyla (lOOmM Tris pH ile yikandi ve ardindan 20 ml lizis tamponuyla (lOmM Tris pH 7,4, 0,8M NaCl, lmM EGTA, ]. x proteaz inhibitörü kokteyli, ]. mM DkmVO4, ImM NaF, ImM AEBSF, %10 sükroz) homojenize edildi. Homojenat 4°C'de 20'OOOxg'da. 20 dk süreyle santrifüjlendi. Süzüntü %1 (w/v) N-loroil sarkosinat (Sigma, Isviçre) ilavesiyle toplandi. 37°C'de çalkalayarak iki saat inkübasyondan sonra, süzüntü 4°C'de lOO'OOOXg'da bir saat süreyle santrifüjlendi.
Pelet toplandi. ve PES içinde yeniden-süspanse edildi. Olasi kirletici immünoglobülinlerin protein A manyetik boncuklariyla temizlenmesinden sonra, PHFTau süspansiyonu kullanimdan önce - 80°C'de depolandi. Saglikli kontrol insan beyin dokusundan bir kontrol ekstrakti benzer sekilde hazirlandi.
Tau peptitleri sentezi NI-105.4E4'ün PepSpot haritalamayla saptanan epitopunu (amino karsilik gelen bir peptit (awGGGQVEVKSEKLDFma), Schafer-N (Kopenhag, Danimarka) ile sentezlendi. Immobilizer Mikroplakalara. (Nunc, Danimarka) esdegerli baglanmaya olanak saglanmasi için C-ucuna ilave bir sistein eklendi. Piyasada bulunan fare monoklonal tau antikoru ATl80'in (Thermo Scientific, US) kognat epitopu olan, insan tausunun 226-239 amino asitlerine karsilik gelen bir ikinci peptit (26VAVVRpTPPKSPSSA2w), benzer sekilde sentezlendi ve kontrol olarak kullanildi.
Transgenik fareler Mevcut bulusun tau antikorlarinin (ve bunlarin baglanma özgüllüklerine sahip moleküllerinin) degerlendirilmesi amaciyla, tauopatiler için üç farkli hayvan modeli kullanilir. 1. Transgenik TauP30lL fareleri (Çizgil83): murin Thy1.2 promotörü altinda P30lL mutasyonlu insan Tau40 eksprese eder (Bu transgenik hayvanlarin üretilmesi, Götz et al., J. Biol. 2. Murin PrP promotörü altinda P301L mutasyonlu en kisa 4R insan tau izoformunu eksprese eden JNPL3 fareleri (Taconic, Hudson, NY, A.B.D. firmasindan temin edilebilir). 3. Murin PrP promotörü altinda P30lS mutasyonlu insan tausu eksprese eden P30lSTau (çizgi PSl9) fareleri (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, A.B.D. firmasindan temin edilebilir).
Tauopatilerin fare modelleri ve karsilik gelen dogal tip fareler, yiyecek ve suya serbest erisimle geri çevrilmis bir lZsaat:12saat aydinlik/karanlik döngüsünde standart yuva kosullarinda muhafaza edilir. Tedavi gruplari yas ve cinsiyet açisindan dengelenir.
Insan tau-antikorlarinin hedef ve baglanma özgüllügünün dogrulanmasi Taunun, izole antikorlarin taninan bir hedefi olarak dogrulanmasi için, yukarida tarif edildigi sekilde dogrudan ELISA. tayinleri gerçeklestirildi. Emsal rekombinan insan. NI- 105.4A3 antikoru için, 96 kuyucuklu mikroplakalar (Costar, Corning, US), 3 ug/ml'lik bir konsantrasyona seyreltilen rekombinan insan tausuyla (hTau40, rPeptide, Bogart, US) veya karbonat ELISA kaplama tamponunda (pH 9,6) BSA ile kaplandi ve antikorun baglanma etkinligi test edildi. Emsal NI-105.4A3 antikoru insan tausuna ELISA ile özgül olarak baglanir. BSA'ya hiç baglanma gözlenmez (Sekil 10). etkili konsantrasyonunun (ECw) belirlenmesi için, degisen antikor konsantrasyonlariyla ilave dogrudan ELISA deneyleri gerçeklestirildi. 96 kuyucuklu mikroplakalar (Costar, Corning, US), karbonat ELISA kaplama tamponunda (NI-105.4E4 Antikoruyla tayin için) 1 pg/ml'lik veya (NI-105.24B2 Antikoruyla tayin için) 3 üg/ml'lik. bir konsantrasyona seyreltilen rekombinan insan tausu (hTau40, rPeptide, Bogart, US) ile kaplandi ve antikorun baglanma etkinligi test edildi. ECm degerleri, GraphPad Prism yazilimi kullanilarak dogrusal-olmayan bir gerilemeyle hesaplandi. Rekombinan insan-türevi antikor N1- 105.4E4, hTau40'a, 2,4 nM ECw'de düsük nanomolar aralikta yüksek afiniteyle baglanir (Sekil 2). NI-105.24B2, hTau40'a, 6,6 nM ECm'de düsük nanomolar aralikta yüksek afiniteyle baglanir (Sekil 7).
Emsal antikor NI-105.4A3'ün yari maksimal etkili konsantrasyonu da (ECw) dogrudan ELISA deneyleri kullanilarak belirlendi. ELISA plakalari rekombinan insan tausu (hTau40, lug/ml), PHFTau (1:100) ve kontrol preparasyonuyla (1:100) kaplandi ve degisen antikor konsantrasyonlariyla inkübe edildi. NI-105.4A3, rTau'ya, 1,4 nM ECm'de düsük nanomolar aralikta yüksek afiniteyle baglanir. N1-105.4A3, PHFTau'ya, 1,2 nM ECm'de düsük nanomolar aralikta yüksek afiniteyle baglanir (Sekil 12).
AD'li beyinden ekstrakte edilen rekombinan tau. ve jpatolojik tauya, rekombinan insan antikorlarinin baglanma analizi patolojik tau türlerine baglanma kapasitesinin belirlenmesi için, yukarida ayrintili olarak tarif edildigi üzere SDS-PAGE ve Western Leke analizi gerçeklestirildi. Lekeler gece boyunca monoklonal antikoru, Covance, California, A.B.D.) primer antikorlariyla, ardindan (insan antikorlari için) bir HRP- konjuge keçi anti-insan IgGFcy veya bir HRP-konjuge keçi anti- insan IgG sekonder antikorla inkübe edildi.
(Sekil 8) western lekelemede hTau40'in yani sira, AD'li beyinden ekstrakte edilen patolojik olarak modifiye PHFTau'yu da tanir. Beklendigi üzere, kontrol antikoru TaulZ her iki tau türünü de tanir (Sekil 3).
Ek olarak, yukaridaki Örnek 1'de müzakere edildigi üzere, emsal antikor NI-105.4A3'ün yari maksimal etkili konsantrasyonu (ECm), PHFTau kullanilarak dogrudan ELISA deneylerinde belirlendi. NI-lO5.4A3 PHFTau'ya 1,2 nM ECso'de düsük nanomolar aralikta yüksek afiniteyle baglanir (Sekil haritalanmasi Iki bitisik peptit arasinda 11 amino asitlik bir örtüsmeyle tam-boy hTau40'i (amino asitler 1-144) örten 118 peptit dizili bir peptit sirasi, bir nitroselüloz membran (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Almanya) üzerinde görüldü.
Antikorlarin immün-etiketlenmesinin yani sira membran yenilemesi üreticinin talimatlarina göre gerçeklestirildi.
Saptama antikorunun özgül-olmayan baglanmasini hariç birakmak için, membran ilk olarak, primer antikoru es geçen HRP-konjuge keçi anti-insan IgG tarafindan sondalandi (Sekil 4B).
Yenilemeden sonra membran 100 nM rekombinan NI-105.4E4 antikoruyla sondalandi. Bagli antikor, ECL ve ImageQuant 350 saptama (GE Healthcare, Otelfingen, Isviçre) kullanilarak saptandi.
Bitisik peptit noktalarinin (peptit 83, 84 ve 85; peptit 96 ve 97) iki grubu, yalnizca saptama antikoruyla (Sekil 4B) karsilastirildiginda NIlO5.4E4 tarafindan tanimlandi (Sekil 4A ve A'). Peptitlerin bu iki grubu tarafindan örtülen diziler, gelmektedir. Bu veriler, NI-105.4E4'ün, iki dogrusal dizi içeren kesikli bir epitopu tanidigini ortaya koymaktadir: biri R4 mikrotübül baglanma alaninin içerisinde ve diger bir baskasi da C-terminal alaninda. amino asit kalintilarini içerir. PepSpot (JPT) verileri, NI- lO5.4E4'ün hTau'da, insan tausunun 337-343 amino asitlerini içeren bir epitopu tanidigini ortaya koymaktadir. Bu. bölge, taunun mikrotübül baglayici alani içerisinde yer alir ve tüm nöronal insan tau izoformlari arasinda ve ayrica fare ve siçan dahil olmak üzere diger türler arasinda korunur.
Bu alan fizyolojik mikrotübül-iliskili taudaki mikrotübüllere bagli oldugundan, NI-105.4E4'ün tercihen, mikrotübüllerden kopan taunun patolojik olarak ilgili havuzunu hedeflemesi beklenmektedir.
NI-lO5.4E4 baglanma peptitleri içerisindeki kilit kalintilarin belirlenmesi için, alanin içerisindeki her bir kalintiyi teker teker ikame etmek için alanin taramasi gerçeklestirildi. Özgün dizideki alanin kalintilari (A384 ve A390) prolin ve glisine amino asit dizileri Sekil 4D ve E'de gösterilen özgün peptitler (nokta 35 `ve nokta 51) 've bunlarin alanin ikameli K395'in NI-105.4E4 baglanmasi için gerekli oldugunu ortaya koymaktadir.
Ilave bir deney, NI-105.4E4'ün tau peptitlerine baglanmasinin test edilmesiyle gerçeklestirilmistir. Dogrudan ELISA, NI- 343 amino asit kalintilarini ihtiva eden 333-346 amino aside karsilik gelen bir peptidi özgül olarak tanidigini göstermektedir (Sekil 5). NI-105.4E4'ün, AT18O epitopunu örten kontrol peptidine hiç çapraz-tepkimesi gözlemlenmez. Tersine, AT180 bunun peptit ihtiva eden kognat peptidini tanir ancak NI-105.4E4'e özgü peptide baglanmada basarisiz olur. Türe-özgü sekonder antikorlar peptitlerin herhangi birine baglanmaz.
Birlikte, kaplanmis peptitlerle dogrudan ELISA, NI-105.4E4'ün özgül olarak, PepSpot haritalamayla tanimlanan insan tausunun 337-343 amino asit kalintilarini ihtiva eden bir peptidi tanidigini teyit eder.
NI-lO5-4A3 baglanma epitopunu hTau4O üzerinde genis sekilde haritalamak için, dört adet tau alani polipeptidi (Tau alan I, alan II, alan III ve alan IV) üretildi. GeneArt® (Invitrogen) kullanilarak sentezlenen, her bir Tau alanini N-uçlarinda etiketlenen 6xHis ile kodlayan DNA fragmanlari, PRSET-A ekspresyon vektörünün (Invitrogen) içine klonlandi, E. Coli BLZl (DE3) (New England Biolabs) içine transfekte edildi. His- etiketli Tau alanlarinin ekspresyonlari, bakteriler selenleme yoluyla lizozomla lize edilmeden önce alti saat süreyle 0,5mM (Qiagen) ile daha da saflastirilmadan önce bes dakika süreyle kaynatildi. Ayristirilmis His-etiketli Tau alanlari ELISA plakalari üzerine kaplandi veya Western Lekeleme için poliakrilamid jel üzerine yüklendi. Bu sirali olarak örtüsen tam alani polipeptitleri, hTau40'in tani boyunu örter (Sekil l3A). Saflastirilmis tau alanlari ELISA plakasi üzerine sadece tau alan I'e ve tani boy hTau40'a baglanir ve bu da epitopun, hTau40'in N-uç parçasi (aal-l36) içerisinde oldugunu gösterir (Sekil l3B). Western lekeleme, NI-105.4A3'ün tau alan PepSpot (JPT) teknolojisiyle NI-105.4A3 epitop haritalama, insan Tau40'inin Q35-Q49 amino asitlerini tanimladi (Sekil 14A ve C). NI-105.4A3 baglanmasi için epitop içerisindeki kilit kalintilarin belirlenmesi için, alanin içerisindeki her bir kalintiyi teker teker ikame etmek için alanin taramasi gerçeklestirildi. Özgün dizideki alanin kalintilari (A4l) glisin veya prolinle ikame edildi (Sekil l4B). soldan saga 1 ve 17 olarak numaralanan noktalar, amino asit dizileri Sekil l4C'de gösterilen özgün peptitler (nokta l) ve bunlarin alanin baglanmasi için kilit kalintilar oldugunu ortaya koymaktadir.
NI-105.4E4'ün tau AD'li beyin dokularinin fizyolojik formlarinin yani sira patolojik agregatlarina ve insan tau transgenik fareler içinde baglanmasinin tayini Hiper-fosforile tau filamanlarindan olusan nörofibriler yumaklar (NFT), AD'nin nöropatolojik bir ayirici özelligidir.
Hiper-fosforile tau filamanlari ayrica, her ikisi de AD'deki yaygin nöropatolojik özellikler olan distrofik nöritlerin ve nöropil ipliklerin ana bilesenleridir. Farelerde familyal P301L tau mutasyonunu ihtiva eden insan tausunun asiri ekspresyonu, alti aylikken NFT olusumun indükler (Gotz et al., Rekombinan tau antikorunun, taunun fizyolojik formlarinin yani sira patolojik agregatlarina baglanmasini tayin edilmesi için, AD'li beyin dokularinda. ve TauP30ll. transgenik farelerde bu bulusun emsal NI-105.4E4 antikoruyla immünohistolojik boyamalar gerçeklestirildi.
Fareler oda sicakliginda derin anestezi altinda 20 ml 100 mM TrisCl/6 mM EGTA (pH7,4) ile perfüze edildi. Beyinler çikarildi ve fiksasyon için 4°C'de gece boyunca PBS (pH 7,4) içinde %4 PFA'ya batirildi ve ardindan parafine gömüldü. Insan dokusu için, AD'li ve saglikli kontrol süjelerinden beyin dokularinin parafin bloklari kullanildi. Standart protokoller izlenerek DAB boyama gerçeklestirildi. Pozitif kontrol olarak, fare monoklonal antikoru Tau-lZ (Covance, California, A.B.D.) kullanildi. Primer antikorlar içermeyen HRP-konjuge saptama antikorlari da dahil edildi.
Rekombinan insan antikoru NI-105.4E4, AD'li beyinde (Sekil 6A), saglikli kontrol beyninde (Sekil 6B) mevcut olmayan sayisiz NFT ve nöropil ipliklerini tanimlar. Tek basina ikincil antikor hem AD'de (Sekil 6C) hem kontrol beyninde Sekil 6D) sinyaller vermez. P30lL tau transgenik fare beyninde, NI-, nöropil ipliklere (Sekil 6E ve G) ve distrofik nöritlere (Sekil 6E ve H) benzer patolojik tauya baglanir. Ek olarak, NI-105.4E4 ayrica, yumak-öncesi asamada tau agregatlarini tanimlar (Sekil 6 I). Hem insan P30lL tausunu hem insan APP'sini Isveç ve Arktik mutasyonlariyla asiri eksprese eden transgenik farelerin beyninde, NI-105.4E4 özgül olarak, beta- amiloid plaklari çevreleyen distrofik nöritlere baglanir (Sekil 6 J).
Mevcut bulusun antikorlarinin in ViVO testleri Yukarida halihazirda tarif edildigi üzere, transgenik fare çizgilerinde fosforile tau peptitleriyle aktif asilama kullanilarak yapilan çalismalar, beyinde tau agregatlarinin indirgenen beyin seviyelerini ve davranis bozukluklarinin yavaslayan ilerleyisini ortaya çikarmistir (Sigurdsson, J. özellikle kullanilabilir olmayabilir çünkü yasli popülasyonun kayda deger bir kisminin asilamaya yanit-vermez olmasi beklenmektedir. Dahasi, bir tauya-yönelik bagisiklik yanitiyla iliskili potansiyel yan etkilerin kontrol edilmesi zor olabilir. Mevcut bulusun tau baglanma moleküllerinin makul sekilde, patolojik tau türlerine karsi benzer baglanma özgüllükleri nedeniyle fare antikorlari için yukarida tarif edildigi üzere tau agregatlarinin beyin seviyelerinde benzer indirgemeler elde etmesi beklenebilir. Ancak, insan bagisiklik sistemi içerisindeki evrimsel optimizasyon ve afinite olgunlasmasi yüzünden, mevcut bulusun antikorlari, mükemmel güvenlik profili ve immünojenesite yoksunlugu için yüksek olasilikla sagilikli insan süjelerden izole edilmeleri nedeniyle degerli bir terapötik araç saglar. Bu beklenen terapötik etkilerin konfirmasyonu, fare antikorlariyla yapilan yukarida belirtilen deneylerde tarif edildigi sekildeki test yöntemleriyle saglanabilir. Özellikle, taranacak antikorlar hayvanlara, intraperitoneal antikor enjeksiyonu, intrakraniyal enjeksiyon, intraventriküler beyin infüzyonu gibi çesitli olasi yollara uygulanabilir ve tedavi etkileri için test edilebilir. Yukarida belirtilen uygulama olasiliklarinin herhangi biri ayrica, beta amiloid-indüklü tau patolojisi üzerindeki tedavi etkilerini degerlendirmek için tau transgenik farelerin beyninin içine beta-amiloid preparasyonlarin önceki beyin enjeksiyonundan sonra da kullanilabilir.
Tedavi etkilerinin degerlendirilmesi, Gallyas pozitif hücre sayimlarinin miktar belirlemesini, toplam insan tau boyamasini, fosforile taunun beyin yükünü ve/veya sirali beyin ekstraksiyonu üzerine beyinde çözünür ve çözünmez tau ve fosfor-tau seviyelerinin biyokimyasal bir belirlenmesini içeren histokimyasal yöntemlerle gerçeklestirilebilir. Daha sonra, mevcut bulusun antikorlarinin terapötik etkilerinin bir konfirmasyonu için, tedavi edilen farelerin davranis testleri, örnegin, kosullu tat tiksintisi veya baglamsal korku kosullama gerçeklestirilebilir (Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006), 4E4 ve 4A3 antikorlarinin fare IgG2a sabit alanlarla kimerizasyonu Kronik tedavi çalismalarinda kullanim için indirgenmis immünojenesiteye sahip antikorlar üretmek amaciyla, 4E4 ve 4A3 antikorlarinin fare kimerik versiyonlari, rekombinan DNA teknolojisi kullanilarak üretildi. Fare Fc-gama reseptörlerine yüksek afiniteyle baglanan ve bu nedenle bir bagisiklik efektör yanitini tetikleyebilen bir molekül üretmek amaciyla, bu kimerik antikorlar için bu fare IgGZa/lambda izotipi seçildi. Kimerik 4E4 (ch4E4) ve kimerik 4A3 (ch4A3) agir ve hafif zincir yapilarinin amino asit dizileri asagida gösterilmektedir.
Tablo 3: Kimerik 4E4 (ch4E4) ve kimerik 4A3 (ch4A3) amino asit dizileri ch4E4 olgun SYELTQPPSVSVSPGQTARIscFGDTLPKQYTYWYQQKPGQAEVLVIYKB TERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTIS~VQAEDEADYYCLSADNSATWVFGG ch4E4 'GTKVTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWK . VDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTEEG hafif HTVEKSLSRADCS 4E4 ve 4A3 antikorlarinin fare IgG2a sabit alanlarla kimerizasyonu Bir konsensüs N-bagli glikosilasyon alani, 4E4 agir zincirinin CDRl bölgesinde tanimlandi. Memeli (CHO) hücre ekspresyonu üzerine, öngörülen N-glikosilasyon alani (Asn-30), kütle spektrometriyle kanitlandigi üzere, glikan tarafindan tamamen isgal edildi. Bu bölgede N-glikosilasyonu ortadan kaldirmak ve ürün heterojenligini indirgemek amaciyla, ch4E4'ün agir zincirinin Asn-30'u. Gln'ye degistirildi (Tablo 4). CHO hücrelerinden üretildiginde ve saflastirildiginda, modifiye antikor rekombinan tauya, özgün, glikosile antikora göre ~4- kat daha yüksek görünür afiniteyle baglandi (bakiniz Sekil Tablo 4: Olgun ch4E4(N3OQ) agir zincirinin (fare IgGZa) amino asit dizileri. Ikameli Gln kalintisi koyu renkte, alti çizilidir. ch4E4(N3OQ) agir zincir Aglikosile kimerik 4E4 (ch4E4(N30Q) mIgGl Agli) üretimi Antikor efektörü fonksiyonu ve aktivitesi arasindaki iliskinin degerlendirilmesi amaciyla, 4E4'ün bir fare kimerik aglikosile varyanti üretildi (ch4E4(N30Q) IgGl-Agly). Agir zincir için, konsensüs FC glikosilasyon alaninin ortadan kaldirilmasi için 4E4'ün degisken alani, bir Asn'den Gln'ye mutasyon ihtiva eden bir fare IgGl agir zincir sabit bölgesine kaynastirildi. Agir zincir degisken bölgesi ayrica, CDRl'de konsensüs N- glikosilasyon alanini ortadan kaldirmak amaciyla N3OQ degisimi de ihtiva etti (Örnek 7). Hafif zincir, yukarida tarif edilen ch4E4 lambda hafif zincirdi.
Insan 4E4 ve 4A3'ün akut beyin penetrasyon çalismasi Insan 4E4 ve 4A3, CHO hücrelerinin geçici transfeksiyonuyla üretildi ve afinite saflastirmayla saflastirildi. Endotoksin seviyeleri kontrol edildi ve tamamil EU/mg'nin altinda oldu.
TauPBOlL farelerine lnci günde ve 4ncü günde 30 mg/kg 4E4 edildi. 5nci günde, fareler anestezi altinda, 1 Ünite/m1 heparin ihtiva eden PBS ile perfüze edildi. Kan, beyin ve omurilik analizler için alindi. Parafin bloguna gömülmeden ve kesilmeden önce, beynin sag yariküresi -80°C'de donduruldu, beynin sol yariküresi ve omurilik 4°C'de iki gün süreyle %10 nötralize formalin içinde sabitlendi. Plazma -80°C'de kisimlar halinde depolandi.
Beyin proteini ekstraksiyonu: donuk sag yariküre tartildi ve 50 mM NaCl, %O,2 dietilamin, proteaz inhibitörleri (Roche Diagnostics GmbH) ve fosfataz inhibitörü (Roche Diagnostics GmbH) ihtiva eden 5 hacimlik (yas dokunun 5 mL/g'i) bir solüsyonda homojenize edildi. Numuneler daha sonra polikarbonat tüplere aktarildi, bir diger 5 hacim homojenizasyon solüsyonu eklendi ve 30 dk süreyle buz üzerinde tutuldu. Çözünür kesit daha sonra 100.000 g'da, 4°C'de 30 dk süreyle santrifüjlemeden sonra toplandi. Pelet, 3 hacim, proteaz ve fosfataz inhibitörüne sahip PBS içinde yeniden- süspanse edildi. 16.000 g'da, 4°C'de 30 dk süreyle santrifüjlemeden sonra, süzüntüler ve peletler, sonraki Çözünür tau ekstraksiyonu için ayri ayri -80°C'de depolandi.
Peletler modifiye sarkozil ekstraksiyonuyla daha da ekstrakte edildi (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA.
Neuron 8, 159 (1992)).
Insan IgG-özgü sandviç ELISA; 50 mM karbonat ELISA, kaplama tamponundan (pH 9,6) 2 ug/ml keçi anti-insan IgG Fab (Jackson) yakalama antikoru olarak kullanildi. Yarim-alanli 96-kuyucuklu mikrotitre plakalari, 4°C'de gece boyunca 30 ul/kuyucuk yakalama antikoruyla kaplandi. Plaka daha sonra, %2 BSA ihtiva eden 50 ul/kuyucuk PBS ile oda sicakliginda bir saat süreyle inkübe edilmeden önce 4 kez, %0,1 Tween 20 ihtiva eden PBS ile yikandi. Beyin ekstraktlarinin, plazma numunelerinin ve antikor standardinin (4A3) çözünür kesitleri, %2 BSA ve %0,1 Tween 20 ihtiva eden PBS içinde seyreltildi. Seyreltilen numunelerin 30 ul'si her bir kuyucuga eklendi ve oda sicakliginda bir saat süreyle inkübe edildi. Plaka daha sonra, oda sicakliginda bir saat süreyle HRP-konjuge esek anti-insan Fcv (Jackson, %2 BSA ve %0,1 Tween 20 ihtiva eden PBS içinde l:l0.000'de seyreltilmis) ile inkübe edilmeden önce dört kez Plaka daha sonra, 20 ul/kuyucuk TMB (10 mM sitrat solüsyonunda pH=4,1 1:20) eklenmeden önce dört kez %0,1 Tween 20 ihtiva eden 200 ul/kuyucuk PBS ile yikandi. Tepkime daha sonra, her bir kuyucuga 10 ul lM HZSO4 eklenerek durduruldu. Antikor standart egrisi, 4A3'ün seri seyreltilmelerinden elde edildi.
Plazma ve beyin numunelerindeki antikor konsantrasyonlari, standartlara. göre hesaplandi. Beyin insan IgG seviyesi daha sonra, Sekil l7'de gösterildigi üzere (lg/10 ml varsayilarak) ug antikor/gram taze beyin dokusuna dönüstürüldü.
Insan IgG'sinin yüksek seviyeleri, tüm 4E4 ve 4A3 tedavili farelerin plazmasinda saptandi. Aksine, PBS tedavili farelerin plazmasinda hiç insan IgG'si saptanmadi (Sekil 16). Insan beyin homojenatlarinda saptandi (Sekil 17).
Kimerik 4E4 ve 4A3 ile kronik çalisma Özgün insan antikorunun degisken alanlarini ve fare 1gG2a'sinin sabit bölgelerini ihtiva eder kimerik 4E4 ve 4A3, CHO hücrelerinin geçici transfeksiyonuyla üretilebilir ve afinite saflastirmayla saflastirilabilir. Antikorlarin her bir partisindeki endotoksin seviyeleri kontrol edilecek ve 1 Eu/mg altindar tutulacaktir. 7,5-8 aylikr cinsiyet dengeli TauP301L farelerine 10 mg/kg, 3 mg/kg antikor solüsyonu veya PBS kontrolünün esit miktari intraperitoneal olarak enjekte edilecektir. Her bir tedavi grubu 20-25 farelere sahip olacaktir. Tedavi, 26 hafta süreyle haftada bir kez gerçeklestirilecektir. Alternatif olarak, tedavi, 13 hafta süreyle haftada iki kez gerçeklestirilecektir. Vücut agirligi iki haftada bir takip edilecektir. Fareler tedavi periyodunun sonunda anestezi altinda perfüze edilecektir. Beyin, omurilik ve kan alinacaktir. Yarim beyin ve omurilik, parafin bloguna gömülmeden önce üç gün süreyle %10 formail içinde post- sabitlenebilir. Bu doku bloklarindan kesilen 4-6 um kalinligindaki kesitler, immünokimya çalismalari için kullanilabilir. Diger yarim beyin tartilacak ve biyokimyasal analizler için -80°C'de derin dondurulacaktir.
Ilaç etkileri, tedavili ve kontrol numunelerinde nörofibriler yumaklarin (NFT) seviyesinin ve tau seviyesinin karsilastirilmasiyla degerlendirilecektir. NFT, Gallyas gümüs doyurmayla (F Gallyas Acta Morphol. Acad. Sci. Hung 19.1 (1971)) veya NFT'de patolojik olarak fosforile tauyu taniyan monoklonal fare antikoru AT100 ve AT18O ile immüno-boyamayla görsellestirilebilir. Antikor tedavili farelerde ve kontrol hayvanlarinda beyindeki ve omurilikteki Gallyas-pozitif nöronlarin ve/veya AT100, AT18O etiketli nöronlarin sayisi veya sikligi, antikor tedavisinin etkisinin degerlendirilmesi için belirlenebilir. Çözünür` ve çözünmez tau, burada tarif edilen beyin protein ekstraksiyonunun ardindan ekstrakte edilebilir. Alternatif olarak, çözünür ve çözünme tau, modifiye sarkozil ekstraksiyonuyla ekstrakte edilebilir (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther* RA. Neuron 8, 159 (1992)). Kisaca, donmus beyin, 10 mM TriS°HCl (pH 7,4), 0,8 M NaCl, 1 mM EGTA, Diagnostics GmbH) ve fosfataz inhibitöründen (Roche Diagnostics GmbH) olusan 10 hacimlik (w/V) %10 sükroz homojenat tamponundan homojenize edilir. Homojenat 20 dk süreyle 20.000g'de çevrilir ve süzüntü muhafaza edilir. Pelet, lO hacimlik homojenizasyon tamponunda homojenize edilir ve ikinci bir kez santrifüjlenir. Süzüntüler birlikte havuzlanabilir ve %l'lik (w/v) nihai konsantrasyon olacak sekilde N-loril-sarkosinat (Sigma) eklenir ve 37°C'de 300 rpm dönüsle 1,5 saat süreyle inkübe edilir, ardindan 100.000 g'de 1 saat süreyle santrifüjlenir. Süzüntü, sarkosil çözünür kesit olarak toplanir ve 1 gramlik beyin dokusu peleti PHF kesiti olarak 0,2 ml 50 mM Tris'HCl (pH 7,4) içinde yeniden süspanse Çözünür ve çözünmez taunun seviyeleri, piyasada bulunan Tau ELISA kitleriyle (Invitrogen) ölçülecektir. Ek olarak, beyin protein ekstraktlari %4-12 Bis-Tris SBS-PAGE ile ve ardindan AT18O (pT23l) ve El78 (pS396) antikorlariyla immüno- lekelemeyle ayrilacaktir. Yari-kantitatif analiz, her bir numunenin tümlesik yogunlugunun, taunun bilinen miktarlarinin standartlarina karsi ölçülerek gerçeklestirilecektir.
Ek olarak, davranis testleri, yukaridaki Örnek 5'te belirtildigi sekilde gerçeklestirilebilir. Örnegin, antikor tedavili TauP30lL farelerinde isleyen bellegin gelisimi, bir iki-denemeli Y-labirenti görevi (örnegin, Pennanen, Genes Labirentin üç kolu 22cm uzunlugunda, 5 cm. eninde ve 15 cm derinligindedir. Siyah ve beyaz soyut ipuçlari, labirenti saran bir siyah perde üzerine yerlestirilir. Deneyler, karanlik evre esnasinda 6 lükslük bir ortam isigi seviyesinde yürütülür. Her bir deney bir egitim seansi ve bir gözlem seansi içerir. Egitim seansi esnasinda, bir fare, 4 dk süreyle serbestçe kesfedilebilen, üç kolun ikisine (baslama kolu ve ikinci kol), üçüncü kola (yeni kol) hiç erisim olmadan atanir.
Fare daha sonra labirentten çikarilir ve labirent kokuyla ilgili ipuçlarinin yok edilmesi için %70 etanol ile derinlemesine temizlenirken 1,5-5 dk süreyle bir tasima kafesinde tutulur. Fare daha sonra, üç kolun tamamina 4 dk süreyle erisimle gözlem için yeniden labirentin içine geri konulur. Giris siralamasi, her bir kola giris sayisi ve her bir kolda harcanan süre kaydedilir. Bu kayittan, yeni üçüncü kolda harcanan sürenin diger iki kolda (baslama kolu ve ikinci kol) harcanan sürenin ortalamasina orani hesaplanir ve tauopati fare modelindeki ve karsilik gelen kontrol dogal tip farelerindeki farkli tedavi gruplari arasinda karsilastirilir.
Kemirgenler tipik olarak, önceden ziyaret edilmis olana geri dönmek yerine yeni bir kolu arastirmayi tercih etmektedir.
Antikorlarin etkileri, rahatsizlikla-ilgili isleyen bellek bozukluklari nedeniyle tedavi edilmemis farelerin ayirt edici- olmayan davranisina kiyasla, tedavi edilen tauopati modeli fareleri tarafindan bu tercihin geri kazanilmasi açisindan takip edilebilir. Bu nedenle, l'e yakin bir oran, bozulmus isleyen bellegi gösterir. Daha yüksek bir oran, daha iyi isleyen bellegi gösterir. TauP301L farelerindeki bozulmus isleyen bellek, insan tausunun asiri ekspresyonundan kaynaklanan tau patolojisi nedeniyle oluyor olarak degerlendirilmektedir. Bu nedenle, anti-tau antikoru tedavili TauP30lL farelerinde, kontrol TauP301L farelerinden kayda deger sekilde daha yüksek gözlemlenen bir oran, anti-tau antikorunun tau patolojisi üzerinde terapötik etkiye sahip oldugunu gösterecektir.
DIZI LISTESI <110> Chen, Feng Grimm, Jan Baeriswyl, Jean-Luc Nitsch, Roger Hock, Christoph Panima Pharmaceuticals AG University of Zurich <120> INSAN ANTI-TAU ANTIKORLARI <140> Devredilecek <14l> Bununla birlikte <160> 93 <170> PatentIn versiyonu 3.5 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIT <222> (1)..(352) <223> Izoform Fötal-Tau <300> <301> Goedert M., Wischik C., Crowther R., Walker J., Klug A. <302> Alzheimer hastaliginin esli sarmal ipliginin Çekirdek proteinini kodlayan cDNA'nin klonlanmasi ve dizilmesi: mikrotübül-iliskili protein tau olarak tanimlama <303> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. <304> 85 <300> <308> ?10636-2 <313> (1)..(352) <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 25 30 .1 ...
Ar - 'at-i." Arz' 13' .- 13 . ..42.1 1L;~.' P..i: Bu; ;Lu :Kizi: 5-; ;ya 11-.: 1.1:: 'I'iu Arit.: 11-:) 3.; El: î5_ii I'.ir: 'ni-i- â.:- "'.<' 109!.. .Al-:i Asp ".l . Ve rh?" A :I '59:' '9. :- s i.,s _: i' :_: -f -.;._ <210> 2 <21l> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <22l> PEPTIDE <222> (1)..(381) <223> Izoform Tau-B <300> <301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A. <302> Insan mikrotübül-iliskili protein tau'nun çoklu izoformlari: Alzheimer hastaliginin nörofibriler yumaginda diziler ve lokalizasyon. <303> Noron <304> 3 <306> 519-526 <300> <308> P10636-4 <313> (1)..(381) .`i.:;. fan.. L_r` Ayin --. '--J --1 Ty; In; M::.. 11-.: Su; 'ÇAL' î.-- î'L-..i Sirt; Pm* 'li' .I ..yu *r . "Ily .'.r '5,' '3: I â a “,'s ›,' Als. '. "95 Tv I-,-s " e :n a 'l'i' 'f'~':: :i c . TM: '-;s I-,'S 'lal :- a :a---zi "'-- rr- 7' T 5 ie“ ' :- '“. ta( i' :i- i firig Lt”. 'lrit ; . -- ni_ Mc" .-~:' ..i;. . ?41: <210> 3 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <22l> PEPTIDE <222> (1)..(410) <223> Izoform Tau-C <300> <30l> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A. <302> Insan mikrotübül-iliskili protein tau'nun çoklu izoformlari: Alzheimer hastaliginin nörofibriler yumaginda diziler ve lokalizasyon. <303> Noron <304> 3 <306> 519-526 <300> <308> P10636-5 <313> (1)..(410) <400> 3 XI::. Al.: SLI; I'r '2;' Ili.' .tvii i 3: ›".~-'_:: .'ir'ii Iyi.' A-:p' ' i 3.' ..y .'1," .tir !11-- H Iê-;. En; SLI; SLI; '3.5 15: . 1.5.- ;l 1 Su; E'- i ;i .
I". “2" 1 T'.' 'I'I'iy I "I ›`i.'f;. `-I`i' nn" 'IIiz ""î ihr': 2`i.: ff** `:1', 'I'I'il' Ri'i' 7 = '7: 0" Sr:- ..:1':: I`m:: mi::: Ist-j.' .` .y .t :' "11." IL' z.' ..',x- ..y:: fu.: ..1.':: :Il y v '1. - 4 . J *3 .^ :'.îl'w ` i`.'~ :- :i avci' :ile “l'r arti ` ›:- ?“ A -: 'n' 5 '-"': t; .A ' ;9 'ml i› i': 'I-: ve. "g" '›:-›. '..-5 ".'r "'~' -:. '-.". I.-. '.'..- LE: il.: CLI. L":. _1._ Aug. -..u -'_.'.. tir-.3 32.; 'Sin 4.' ':_=, ': ' .10` i ?01` ›- I, A,” I'i -i i :or-:i is --L ::er RS %1 i-i .. 'I'm' i'_ Se* 'le Ass Me: V; %5: Se” “": S n 7%. R e "r IeJ A 3 Asp G . <210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(383) <223> Izoform Tau-D <300> <301> Goedert M., Spillantini M.G., Potier M.-C., Ulrich J., Crowther R.A. <302> Dört ardisik tekrar içeren mikrotübül-iliskili protein tau'nun bir izoformunu kodlayan CDNA'nin klonlanmasi ve dizilimi: insan beyninde tau proteini mRNA'larinin diferansiyel ifadesi. <303> EMBO J. <304> 8 <306> 393-399 <300> <308> P10636-6 <313> (1)..(383) 1.31. -i Iii'qsiî .AI-'I n 5 S AS” "I I , - c`- _ÇIJ ' i- 'v'î- "',vi' .f 2.' .51' 5.i i :L <210> 5 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(412) <223> Izoform Tau-E <300> <301> Goedert M., Spillantini M.G., Crowther R.A.
Jakes R., Rutherford D. <302> Insan mikrotübül-iliskili protein tau'nun çoklu izoformlari: Alzheimer hastaliginin nörofibriler yumaginda diziler ve lokalizasyon. <303> Nöron <304> 3 <306> 519-526 <300> <308> P10636-7 <313> (1)..(412) 17-Ii .13:32 <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <300> <301> 1. L,“ I-' 5-3 _i_ I.` 1 I- fx" i y: i *' I-'I ': .:1 ..:5 YAiH'i' r \1 I, 'Trt, Homo sapiens (1)..(441) Izoform Tau-F Goedert M., Spillantini M.G., Crowther R.A. r ini `Hiz K K Jakes R., Rutherford D. <302> Insan mikrotübül-iliskili protein tau'nun çoklu izoformlari: Alzheimer hastaliginin nörofibriler yumaginda diziler ve lokalizasyon. <303> <304> <306> <307> <300> <308> <309> <313> 519-526 1989-10-01 P10636-8 2010-10-05 (1)..(441) <400> 6 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 ~ ` I 11;' i ' 17'!' .0; '1 * .11 *1 i ' '_.v l.r›". 'In-z '.`. ': kir.' lîi i“i :nil ç . - . 7.; - . ; J :CL _i, su. ;ii . L - H 2 , un. 5 . - , _ßi - . 1.1'. 4' ASF' Â". .- ` 'I', ' `Jel iîe- I ":1 ;Gly 5-1-2' n:: i› .i ' ' î' ; _. "A :0?" Sn: fari: .ru ' 1:. .W k-i. . : Pir' : i .ok-1; Lv:: v* ,'11 7 'i :- . ; 333 4 . -.' 1 i :I J ,_, _ 1' 3 '4 7.- ' '4 `r '. rw . -: MW` '-.'::' . 1 Hr- I I 1 'i v :-1 A` .i l i Al 4› v Â"i <2lO> <2ll> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <400> 1) .5 ;_i A 51;) 53.1' r NI-105.4E4 antikoru tarafindan taninan epitop (1)..(7) Epitop NI-105.4E4 <2lO> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> Homo sapiens (1)..(363) NI-lOS.4E4-VH degisken agir zincir (VH) dizisi V_bölgesi (91)..(105) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VH-CDRl Výbölgesi (148)..(204) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VH-CDRZ V_bölgesi (301)..(330) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VH-CDR3 <400> 8 Lan: Lan: kisi; sis.: .i'm <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Lu.: 1.1:: :::u SL::. kaçi' 3:-: Id.: En.: ASI. I'.i.: SL::. - . â q 'Is A"3 Sér 1`› ”is Asn Tyr â 5 “'V 1%; “y~ A a a a =.ê `s' LEL Ve: 3%- :e Iei _ i Tki u . :5' M#t A 3 V' *n 1 ci: ]:i-. :to: ' Jly “" 'êL ”3 " va <2lO> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-lOS.4E4-VL degisken hafif zincir (VL) dizisi, burada l-3 konumlarindaki amino asit dizisi Ser-Tyr-Glu, ayni zamanda Leu-Pro-Val olabilir <220> <221> V_bölgesi <222> (67)..(99) <223> tamamlayicilik belirleme bölgesi <220> <221> V_bölgesi <222> (145)..(165) <223> tamamlayicilik belirleme bölgesi <220> <221> V_bölgesi <222> (262)..(291) <223> tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VL-CDRl (CDR) VL-CDRZ 3:::: I?...i .721: 47:55› Ty; I_L "`_: L› `It - I-.Li Ar'y "vr IHL :1-: I..- I-;. 2:. 1;` :5 .4.11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 IL.: .-`~.L-. hu; i 'Ilii 12: . En.: Ly:: 3-1; Ty!. Il::. 1. 4? J 19-:: 'Il',' 'I'fit '.lir '.'.il .3.2 l.i:.i '1:i: I_i': :îr: .'.y Kin.: î`î'.i: 9.1.: I.' fu; .':I.i .'~.I.i .^.!:L› ;-_.'r :1;: I'::: l.i:.i Su: .-\_.1 i`m; h::.
ALA 'lzir Url_- Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 12 <211> 345 <2l2> <213> <220> <22l> <222> <223> NI-105.24B2-VH degisken agir zincir dizinin l konumundaki Gln, <220> Homo sapiens (1)..(345) (VH) dizisi burada ayni zamanda Glu olabilir <221> V_bölgesi <222> <223> <220> (91)..(105) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VH-CDRl <221> V_bölgesi <222> <223> <220> (148)..(198) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VH-CDRZ <221> V_bölgesi <222> <223> <400> (295)..(312) tamamlayicilik belirleme bölgesi i -.'i'. ç V n: i * Z'I ', I , ' l".'i7 lila"- 'i'îiî i.'='› , " 4.0 _ i'4' « i l i! li f~'i' ' " * î:-' 'I'FiY H'i'r I 11 ,* <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> Homo sapiens 11 :::1 "3.1- !3. 1,: :î-s-i i , n;324 Homo sapiens (1)..(324) NI-105.24B2-VL degisken hafif zincir dizide 3 konumundaki Glu, <220> <221> <222> <223> V_bö1gesi (67)..(99) tamamlayicilik belirleme bölgesi - '11 L; 1.1 E'; (3.:: 1.: Asp *i - c ç ", Tyii (VL) dizisi burada ayni zamanda Val olabilir (CDR) VL-CDRl V_bölgesi (145)..(165) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VL-CDRZ Výbölgesi (262)..(294) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VL-CDR3 .L A. Il, ( TH: C' Sir ` 7 E 'I Lun L C I I -° 2 iL u .NL ” I .4:,n'ü .. yu..
Homo sapiens <400> 15 Ty; ".1 Is_ Iêiii Lyr. -J- 3. --.-,' :Slm A;.-i ?Lu "fal Lu.: Lui; I`.i: :yi 3., N ›. 91°; `Z'i 7? "0 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Arg Ser Giy Ala Leu 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 16 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <223> NI-105.4A3-VH degisken agir zincir (VH) dizisi burada dizinin l konumundaki Gln ayni zamanda Glu olabilir ve dizinin 7 konumundaki Ser ayni zamanda Thr olabilir <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <22l> V_bölgesi (91)..(105) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VH-CDRl V_bölgesi (148)..(198) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VH-CDRZ V_bölgesi <222> <223> <400> (295)..(345) tamamlayicilik belirleme bölgesi 31:? 335 <2lO> <211> <212> <213> .1.19 '.. - L_ L.
Homo sapiens 1' y 7' 31: . .'v'i °- .e,i "V-3 '-E-L '::ei' "j-;s 3- & Fal-s. '-.î-:iz' 5.1 .- Whe- "r' -:- .-_'.-;--° Asi': ".-'i- 2.› ;in Mi:: 32:; St::. Lu. ?tig Va; CELL' Atil. Il:: :1-: -:.`. 73'; ?li <210> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> Homo sapiens (1)..(324) NI-105.4A3-VL degisken hafif zincir (VL) dizisi V_bölgesi (67)..(99) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VL-CDRl V_bölgesi (145)..(165) tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) VL-CDRZ V_bölgesi <222> (262)..(294) <400> 18 56-" _v " IJI _i <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 51;.! îi't::. '5-3' 12;.: Fx-: ;1:4 .PL-2 Lg:: Lg:: Ty; ama r.- .1 L '~-J :Z - `\ :. \-i II L dtz.. T. - I.I :- L Lê-! :1-: ;11. 7:_ &:1 Yapay dizi Ch4E4 Lg:: ;mu Gul. CH; agir zincir (fare IgGZa) 7.... . <2lO> 21 <211> 213 <212> PRT <213> Yapay dizi <223> olgun ch4E4 hafif zincir (fare lambda) <400> 21 Su; ?1; ;Lu '_›.:i_› Ilii. (â-.. Fu-' 3;-' S::: V.- Se:: `fal Su; E'i'. ;:-i- Ilê-i. 2.; Al.: ?tig IL:: SL::. ".I'-:› Put: `313.' A:: - Ilk!. 21:.. Flv.: Ly:: `15'.i. Ty; Ilu.
. . . ' Tir.] vi_ TJ) ?gr 4." 49 -1. -25.
L 17.' L ' '. `i - ' i`ii'i_: Is] -. hap Ey:: Gitr <210> 22 <211> 451 ..1: I Ch4E4(N3OQ) zincir (fare IgGZa) *:5 - , les _ L 1 rR e _ IEJ '5 A 0 ..1:'. .'h" 'I`i" Asli :jigii' :` in.' :. ~> i:-"- .vu-t 'lv.- 'l'r `..:. &si i" .. II' C 7“.
Asir. Â=' '4 1)_- - ` Ili'- 'I's" "-'ÃI Aci“. .'-i' "1.1. '-,'.-.. u i 'Jul "'. ?II 3" 'n >' > i :. H -. î 'TI, * '-I›i :1 ~ 3 l 2 '.- 31› i.. '21-5- -' ' :: Im.: :3 y .tev "fal A ”3 :- a Im:: ;i ' :› - -1 1. ;'_i _i T: re. Rsr Ser 3 v 'pr '-9 Ve: *,« w Lvê ~9J :r: v; <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay dizi NI-105.4E4-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CDRl Yapay dizi NI-105.4E4-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CDR2 Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu 'ryr Ala Ala Ser 10 15 Yapay dizi NI-lOS.4E4-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CDR3 Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr 1011 Yapay dizi NI-lO5.4E4-VL (degisken hafif zincir dizisi VL) CDRl Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr Tyr <2lO> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> Yapay dizi NI-105.4E4-VL (degisken hafif zincir dizisi VL) CDRZ Yapay dizi NI-lOS.4E4-VL (degisken hafif zincir dizisi VL) CD3 Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp Val Yapay dizi NI-105.24B2-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CDRl Yapay dizi NI-l05.24B2-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CD2 Asn Pro Asn Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 10 15 <2lO> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Yapay dizi <220> <223> NI-105.24B2-VH (degisken agir zincir dizisi VH) <400> 31 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Yapay dizi <220> <223> NI-lOS.24B2-VL (degisken hafif zincir dizisi VL) <400> 32 Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Phe Val Tyr <210> 33 <211> 7 <212> PRT <2l3> Yapay dizi <220> <223> NI-105.24B2-VL (degisken hafif zincir dizisi VL) <400> 33 <210> 34 <2ll> 11 <212> PRT <213> Yapay dizi <220> <223> NI-105.24B2-VL (degisken hafif zincir dizisi VL) <400> 34 Gln Ser Ala Asp Arg Ser Gly Ala Leu Trp Val <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <21l> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> Yapay dizi NI-105.4A3-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CDRl Yapay dizi NI-105.4A3-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CDRZ Ser Tyr Giu Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 10 15 Yapay dizi NI-lOS.4A3-VH (degisken agir zincir dizisi VH) CDR3 Ala Phe Ala Ser Gly Gln Arg Ser Thr Ser Thr Val Pro Asp 10 15 Yapay dizi NI-105.4A3-VL (degisken hafif zincir dizisi VL) CDRl <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Yapay dizi Yapay dizi NI-lO5.4A3-VL Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala Tyr (degisken hafif zincir dizisi VL) (degisken hafif zincir dizisi VL) Thr Asp Ile Ser Gly Asp Leu Arg Val Yapay dizi Peptide Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Yapay dizi <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Ala Glu vai Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Ala Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Ala Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Ala Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Val Glu vai Lys Ala Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Ala Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Ala Leu Asp Phe Lys Asp Arg 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Ala Asp Phe Lys Asp Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Val Glu vai Lys Ser Glu Lys Leu Ala Phe Lys Asp Arg 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Ala Lys Asp Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Ala Asp Arg 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Ala Arg 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Val Glu vai Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Ala 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Ala Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Ala Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Ala His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Lys Thr Asp Ala Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Ala Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Gly Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Pro Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <2ll> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Lys Thr Asp His Gly Ala Ala Ile Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ala Val Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Ala Tyr Lys Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Pro 10 1515 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Ala Ser Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ala Pro 10 15 Yapay dizi Alanin mutagenez 4E4 epitopu Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile vai Tyr Lys Ser Ala 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Ala Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Ala Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Ala Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Gly Asp Thr Ala Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Gly Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Pro Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Ala Ala Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <2l2> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Gly Asp Thr Asp Ala Gly Ala Lys Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Ala Glu Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Ser Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ala Pro Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Ala Leu Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Ala Gln 10 15 Yapay dizi Alanin Mutagenezi Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Ala 10 15 Yapay dizi VH antikoru 311". ' ..u B Nl-lûf 343241& (degisken agir zum: diZiSi VH: SEQ ID NO: 13:› ( N1-1054A3-\H(degisken agir zincir dizisi VH; SEQ ID NO: 171 41"! koiiamirzasrom [pH] Insan antikoru Fare monoklonal

Claims (1)

ISTEMLER
1.SEQ ID NO: 7'nin amino asit dizisini içeren bir tau epitopuna özgül olarak baglanan ve asagidakileri gerçeklestiren izole bir insan monoklonal anti-tau antikoru veya bunun bir tau-baglayici fragmanidir: ve (i) patolojik olarak modifiye tauyu baglayabilir; (ii) yumak-öncesi asamada, beyindeki nörofibriler yumaklarda (NFT), nöropil ipliklerde ve/Veya distrofik nöritlerde patolojik olarak kümelenmis tauya baglanir; ve (iii) immünohistokimyasal boyamayla tayin edildiginde saglikli bir donörün beyninde taunun fizyolojik formlarina büyük ölçüde baglanmaz. .Izole bir insan monoklonal anti-tau antikoru veya bunun tau-baglayici bir fragmani olup özelligi asagidakileri içermesidir: (a) sirasiyla, SEQ ID NO: 23, 24 ve 25'in amino asit dizilerini içeren bir agir zincir CDRl, CDRZ ve CDR3 içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve sirasiyla, SEQ hafif zincir CDRl, CDR2 ve CDR3 içeren bir hafif zincir degisken bölgesi; veya (b) sirasiyla, SEQ ID NO: 35, 36, 37'nin amino asit dizilerini içeren bir agir zincir CDRl, CDR2 ve CDR3 içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve sirasiyla, SEQ hafif zincir CDRl, CDR2 ve CDR3 içeren bir hafif zincir degisken bölgesi. .Istem 2'ye göre antikor veya bunun tau-baglayici fragmani olup, özelligi asagidakileri içermesidir: (a) sirasiyla, SEQ ID NO: 9 ve ll'in amino asit dizilerini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve bir (b) sirasiyla, SEQ ID NO: 93 ve ll'in amino asit dizilerini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve bir hafif zincir degisken bölges; veya (c) sirasiyla, SEQ ID NO: 17 ve 19'un amino asit dizilerini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve bir .Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre antikor veya bunun tau-baglayici fragmani olup, özelligi bir tek Zincirli FV fragmani (scFV), bir F(ab') fragmani, bir F(ab) fragmani ve bir F(ab')2 fragmanindan olusan gruptan seçilmesidir. .Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikoru veya bunun tau-baglayici fragmanini kodlayan bir polinükleotid veya polinükleotidlerdir. .Istem 5'e göre polinükleotidi veya polinükleotidleri içeren bir vektör veya vektörlerdir. .Bir konak hücre olup, özelligi istem 5'e göre polinükleotidi veya polinükleotidleri veya istem 6'ya göre vektörü veya vektörleri içermesidir. .Bir anti-tau antikorunun veya bunun tau-baglayici fragmaninin hazirlanmasi için bir yöntem olup, asagidakileri içermektedir: (a) istem 7'ye göre konak hücrenin kültürlenmesi; ve (b) söz konusu antikorun veya bunun tau baglayici fragmaninin kültürden izole edilmesi. .Istem 5'e polinükleotid veya polinükleotidler tarafindan kodlanan veya istem 8'e göre yöntemle elde edilebilen bir anti-tau antikoru veya bunun tau-baglayici fragmanidir. Istemler 1 ila 4'ten veya istem 9'dan herhangi birine göre antikor veya bunun tau-baglayici fragmani olup,özelligi (a) saptanabilir sekilde etiketlenir, burada saptanabilir etiket, bir enzim, bir radyoizotop, bir florofor ve bir agir metalden olusan gruptan seçilmesidir; veya (b) bir ilaca eklenir. Istemler 1 ila 4, 9 veya lO'un herhangi birine göre antikor veya bunun tau-baglayici fragmanini, istem 5'e göre polinükleotidi veya polinükleotidleri, istem 6'ya göre vektör veya vektörler veya istem 7'ye göre konak hücreyi içeren bir bilesim olup, özelligi bilesimin (i) ayrica, farmakolojik olarak kabul edilen bir tasiyici içeren farmasötik bir bilesim olmasidir; veya (ii) ayrica, konvansiyonel olarak immün- veya nükleik asit-esasli tanisal yöntemlerde kullanilan bir veya daha fazla belirteç içeren bir tanisal bilesimdir. Istem 11'e göre bilesim olup, özelligi ayrica, bir nörodejeneratif tauopatinin tedavisi için faydali bir nöro-koruyucu ajan içermesidir. Insan bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin profilaktik veya terapötik tedavisinde kullanim için, istemler 1 ila 4, 9 veya lO'un herhangi birine göre anti- tau antikor veya bunun tau-baglayici fragmani olup, özelligi nörodejeneratif tauopati, Alzheimer hastaligi, amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksi, argirofilik gren demansi, Ingiliz tipi amiloid anjiyopati, serebral amiloid anjiyopati, kortikobazal dejenerasyon, Creutzfeldt-Jakob hastaligi, pugilistik demans, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklar, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom 17'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demans, frontotemporal lober dejenerasyon, Gerstmann-Straussler-Scheinker hastaligi, Hallervorden-Spatz hastaligi, inklüzyon cisimcigi miyoziti, multipl sistem atrofisi, miyotonik distrofi, Niemann-Pick hastaligi tip C, nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaligi, Pick hastaligi, postensefalitik parkinsonizm, prion proteini serebral amiloid anjiyopati, progresif subkortikal gliyoz, progresif supranükleer palsi, subakut sklerozan panensafilt, sadece yumak demansi, multipl enfarktli demans ve iskemik inmeden olusan gruptan seçilmesidir. Istem 13'e kullanim için anti-tau antikor veya bunun tau-baglayici fragmani olup, özelligi nörodejeneratif tauopatinin Alzheimer hastaligi olmasidir. Insan bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin ilerleyisinin veya insan bir süjede bir nörodejeneratif tauopatiye yanitin takibinde kullanim için, istemler 1 ila 4, 9 veya lO'un herhangi birine göre anti-tau antikoru veya bunun tau-baglayici fragmani olup, özelligi nörodejeneratif tauopatinin, Alzheimer hastaligi, amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksi, argirofilik gren demansi, Ingiliz tipi amiloid anjiyopati, serebral amiloid anjiyopati, kortikobazal dejenerasyon, Creutzfeldt-Jakob hastaligi, pugilistik demans, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklar, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom l7'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demans, frontotemporal lober dejenerasyon, Gerstmann-Strâussler-Scheinker hastaligi, Hallervorden-Spatz hastaligi, inklüzyon cisimcigi miyoziti, multipl sistem atrofisi, miyotonik distrofi, Niemann-Pick hastaligi tip C, nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaligi, Pick hastaligi, postensefalitik parkinsonizm, prion proteini serebral amiloid anjiyopati, progresif subkortikal gliyoz, progresif supranükleer palsi, subakut sklerozan panensafilt, sadece yumak demansi, multipl enfarktli demans ve iskemik inmeden olusan gruptan seçilir. Insan bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin tanilanmasi veya ilerleyisinin takibi için bir yöntem olup, özelligi yöntemin asagidakileri içermesidir (a) Istemler ]. ila 4, 9 veya 10'un herhangi birine göre en az bir antikorla tani konulacak olan insan süjeden alinan bir numunede patolojik olarak modifiye veya kümelenmis taunun seviyesinin tayin edilmesi; ve (b) modifiye veya kümelenmis taunun seviyesinin, bir veya daha fazla insan süjedeki patolojik olarak modifiye veya kümelenmis taunun seviyesini gösteren bir referans standartla karsilastirilmasi olup, özelligi patolojik olarak modifiye veya kümelenmis taunun seviyesiyle referans standart arasindaki bir fark veya benzerlik, süjenin bir nörodejeneratif tauopatisi oldugunu göstermesidir, burada nörodejeneratif tauopati, Alzheimer hastaligi, amyotrofik lateral skleroz/parkinsonizm-demans kompleksi, argirofilik gren demansi, Ingiliz tipi amiloid anjiyopati, serebral amiloid anjiyopati, kortikobazal dejenerasyon, Creutzfeldt-Jakob hastaligi, pugilistik demans, kireçlenmeli difüze nörofibriler yumaklar, Down sendromu, frontotemporal demans, kromozom l7'ye bagli parkinsonizimli frontotemporal demans, frontotemporal lober dejenerasyon, Gerstmann-Straussler-Scheinker hastaligi, Hallervorden-Spatz hastaligi, inklüzyon cisimcigi miyoziti, multipl sistem atrofisi, miyotonik distrofi, Niemann-Pick hastaligi tip C, nörofibriler yumakli Guamli-olmayan motor nöron hastaligi, Pick hastaligi, postensefalitik parkinsonizm, prion proteini serebral amiloid anjiyopati, progresif subkortikal gliyoz, progresif supranükleer' palsi, subakut sklerozan panensafilt, sadece yumak demansi, multipl enfarktli demans ve iskemik inmeden olusan gruptan seçilir. Insan veya hayvan vücudunda tauya terapötik veya tanisal bir ajanin in vivo saptanmasi veya hedeflenmesinde kullanim için istemler ]. ila 4, 9 veya lO'un herhangi birine göre antikor veya bunun tau- baglayici fragmani olup, özelligi söz konusu in vivo saptama, pozitron emisyon tomografisini (PET), tek foton emisyon topografisini (SPECT), yakin kizilötesi (NIR) optik görüntülemeyi veya manyetik rezonans görüntülemeyi (MRI) içermesidir. Insan bir süjede bir nörodejeneratif tauopatinin tanisi için bir yöntem olup, özelligi söz konusu süjenin biyolojik bir numunesinde istemler 2 veya 3'e göre antikora baglanan taunun varliginin saptanmasini içermesidir. Bir nörodejeneratif tauopatinin tanisinda faydali bir kit olup, özelligi söz konusu kit belirteçler veya kullanim talimatlariyla birlikte, istemler 1 ila 4, 9 veya 10'un herhangi birine göre antikoru veya bunun tau- baglayici fragmanini, istem 5'e göre polinükleotidi veya polinükleotidleri, istem 6'ya göre vektörü veya vektörleri veya istem 7'ye göre konak hücreyi içermesidir.
TR2018/12636T 2010-10-11 2011-10-11 İnsan anti-tau antikorları. TR201812636T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39175110P 2010-10-11 2010-10-11
EP10013494 2010-10-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201812636T4 true TR201812636T4 (tr) 2018-09-21

Family

ID=43602869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/12636T TR201812636T4 (tr) 2010-10-11 2011-10-11 İnsan anti-tau antikorları.

Country Status (23)

Country Link
US (6) US20130295021A1 (tr)
EP (1) EP2627672B1 (tr)
JP (2) JP2014503178A (tr)
CN (1) CN103339146B (tr)
AU (1) AU2011315181B2 (tr)
BR (1) BR112013008765B8 (tr)
CA (1) CA2813493C (tr)
CY (1) CY1120951T1 (tr)
DK (1) DK2627672T3 (tr)
EA (1) EA031698B1 (tr)
ES (1) ES2686550T3 (tr)
HR (1) HRP20181320T8 (tr)
IL (1) IL225670B (tr)
LT (1) LT2627672T (tr)
MX (1) MX345092B (tr)
NZ (1) NZ609984A (tr)
PL (1) PL2627672T3 (tr)
PT (1) PT2627672T (tr)
SG (1) SG189174A1 (tr)
SI (1) SI2627672T1 (tr)
TR (1) TR201812636T4 (tr)
WO (1) WO2012049570A1 (tr)
ZA (1) ZA201303175B (tr)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
EP2627672B1 (en) 2010-10-11 2018-08-01 Biogen Idec International Neuroscience GmbH Human anti-tau antibodies
ES2714692T3 (es) * 2011-01-31 2019-05-29 Tau Bio Logic Corp Tratamiento de tauopatías
EP2794654B1 (en) 2011-12-20 2019-05-22 Janssen Biotech, Inc. Anti-phf-tau antibodies and their uses
CN108623682A (zh) * 2012-07-03 2018-10-09 华盛顿大学 针对tau的抗体
WO2014016737A1 (en) * 2012-07-24 2014-01-30 Pfizer Inc. Novel chicken monoclonal antibodies against human phosphorylated tau and uses thereof
NZ730763A (en) * 2012-08-16 2018-06-29 Ipierian Inc Methods of treating a tauopathy
US20140056901A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 The Institute For Molecular Medicine Anti-tau antibodies and compositions for and methods of making and using in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
CA2896066C (en) * 2012-12-21 2022-07-12 Biogen Ma Inc. Human anti-tau antibodies
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
SG11201506244VA (en) 2013-03-13 2015-09-29 Prothena Biosciences Ltd Tau immunotherapy
KR102233349B1 (ko) * 2013-03-15 2021-03-31 에이씨 이뮨 에스.에이. 항-타우(tau) 항체 및 사용 방법
PL3007726T3 (pl) * 2013-06-10 2021-01-11 Ipierian, Inc. Metody leczenia tauopatii
GB201312226D0 (en) * 2013-07-08 2013-08-21 Adx Neurosciences Improved antibodies
CN111569063A (zh) * 2013-11-27 2020-08-25 伊皮埃里安股份有限公司 治疗tau病变的方法
JP6608827B2 (ja) 2013-12-20 2019-11-20 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ヒト化抗タウ（ｐＳ４２２）抗体及び使用方法
NZ630610A (en) 2014-02-14 2019-05-31 Ipierian Inc Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
ZA201608812B (en) 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
EP3160999B1 (en) 2014-06-26 2018-11-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
TW202136296A (zh) 2014-06-27 2021-10-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
EP3200832B1 (en) * 2014-09-30 2020-07-29 Washington University Tau kinetic measurements
CA3001724A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 National Research Council Of Canada Anti-tau antibody and uses thereof
US10160799B2 (en) * 2014-11-19 2018-12-25 Axon Neuroscience Se Humanized tau antibodies in a alzheimer's disease
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
CA2977648C (en) 2015-02-24 2024-01-02 Rpeptide, Llc Anti-tau antibodies
AR103713A1 (es) * 2015-02-26 2017-05-31 Lilly Co Eli Anticuerpos contra tau y sus usos
WO2016164530A1 (en) * 2015-04-07 2016-10-13 University Of Maryland, College Park Compositions and methods for high throughput protein sequencing
CN107849124B (zh) 2015-06-05 2021-09-24 基因泰克公司 抗tau抗体及使用方法
EP3313877B1 (en) 2015-06-24 2020-06-03 H. Hoffnabb-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
BR112017028101A2 (pt) 2015-07-06 2018-09-04 Ucb Biopharma Sprl anticorpos de ligação à tau
JO3711B1 (ar) * 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
CN105388302A (zh) * 2015-12-22 2016-03-09 中国医学科学院输血研究所 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法
MA43723A (fr) 2016-03-14 2021-05-19 Biogen Int Neuroscience Gmbh Essai employant la phagocytose à médiation cellulaire initié par anticorps pour mesurer des protéines agrégées
ES2933491T3 (es) 2016-05-02 2023-02-09 Prothena Biosciences Ltd Inmunoterapia tau
AU2017259038B2 (en) 2016-05-02 2024-05-23 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing Tau
CN109415434B (zh) 2016-05-02 2022-12-30 普罗塞纳生物科学有限公司 识别tau的抗体
JP2019517540A (ja) 2016-06-07 2019-06-24 バイオジェン インターナショナル ニューロサイエンス ゲーエムベーハー アルツハイマー病を治療する方法
JOP20180117B1 (ar) 2016-07-12 2022-03-14 H Lundbeck As أجسام مضادة انتقائية لـ tau فائق المعالجة بفوسفوريلات وطرق لاستخدامها
JP2018035137A (ja) 2016-07-13 2018-03-08 マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーＭａｂｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｇ 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）結合薬剤およびその使用
EP3487524A4 (en) * 2016-07-20 2020-03-25 Anahit Ghochikyan HUMANIZED ANTI-TAU ANTIBODIES, COMPOSITIONS AND MANUFACTURING METHODS AND METHODS OF USE IN THE TREATMENT, DIAGNOSIS AND MONITORING OF TAUOPATHIES
US20190330318A1 (en) 2016-07-25 2019-10-31 Biogen Ma Inc. Anti-hspa5 (grp78) antibodies and uses thereof
WO2018031361A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Eli Lilly And Company Combination therapy
WO2018049219A1 (en) * 2016-09-08 2018-03-15 Regenerative Research Foundation Bi-functional anti-tau polypeptides and use thereof
WO2018106781A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc Anti-tau antibodies and methods of use
KR20240035636A (ko) 2016-12-07 2024-03-15 제넨테크, 인크. 항-타우 항체 및 이의 이용 방법
US20200031895A1 (en) 2016-12-16 2020-01-30 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
JP2020508054A (ja) * 2017-02-17 2020-03-19 デナリ セラピューティクス インコーポレイテッドＤｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 抗タウ抗体及びその使用方法
JOP20180014A1 (ar) 2017-02-27 2019-01-30 Teijin Pharma Ltd جسم مضاد متوافق مع البشر لعلاج أو الوقاية من الاضطرابات الإدراكية، وعملية لإنتاجه، وعامل لعلاج أو الوقاية من الاضطرابات الإدراكية باستخدامه
JOP20180021A1 (ar) 2017-03-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتلات خيوط بروتين تاو (tau) الحلزونية المزدوجة واستخداماتها
WO2018178077A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules that specifically bind to tau
TW201836640A (zh) 2017-03-28 2018-10-16 美商建南德克公司 治療神經退化性疾病之方法
AU2018241860A1 (en) * 2017-03-28 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for detection of tau protein aggregation modulating compounds
MX2019013045A (es) * 2017-05-02 2020-02-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau.
MX2019015071A (es) * 2017-06-16 2020-02-13 Bristol Myers Squibb Co Composiciones y metodos para tratar tauopatias.
MX2020001855A (es) 2017-08-22 2020-08-13 Biogen Ma Inc Composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos anti-beta-amiloides.
EP3691639B1 (en) 2017-10-02 2023-11-15 Merck Sharp & Dohme LLC Chromane monobactam compounds for the treatment of bacterial infections
PE20210115A1 (es) 2017-10-16 2021-01-19 Eisai Randd Man Co Ltd Anticuerpos anti-tau y uso de los mismos
AU2018380765A1 (en) * 2017-12-04 2020-06-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules that specifically bind to tau
WO2019113711A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 University Of Ottawa Exosome packaging and targeted autophagy
WO2019161384A1 (en) * 2018-02-19 2019-08-22 New York University Tau single domain antibodies
NL2020520B1 (en) * 2018-03-02 2019-09-12 Labo Bio Medical Invest B V Multispecific binding molecules for the prevention, treatment and diagnosis of neurodegenerative disorders
BR112020018112A2 (pt) * 2018-03-05 2020-12-22 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorpos anti-phf-tau e usos dos mesmos
EP3774889A4 (en) * 2018-03-11 2021-12-08 Koorosh Shahpasand CONFORMITY INDEPENDENT ANTIBODIES AGAINST NEUROTOXIC TAU PROTEINS
WO2020028141A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Eli Lilly And Company Combination therapy
JP2022509372A (ja) 2018-10-29 2022-01-20 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 血液脳関門輸送の促進のためのヒト化され安定化されたｆｃ５バリアント
US20220153821A1 (en) * 2018-11-08 2022-05-19 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
EP3935083A4 (en) 2019-03-03 2022-11-30 Prothena Biosciences Limited ANTIBODIES RECOGNIZING TAU PROTEIN
CN113874078A (zh) 2019-04-05 2021-12-31 Tauc3生物制品有限公司 抗tauc3抗体及其应用
JP7181438B2 (ja) 2019-08-06 2022-11-30 アプリノイア セラピューティクス リミテッド 病理学的タウ種に結合する抗体及びその使用
US20210101993A1 (en) * 2019-09-20 2021-04-08 Navi Bio-Therapeutics, Inc. Personalized cancer immunotherapy
CN116723856A (zh) 2020-06-25 2023-09-08 默沙东有限责任公司 靶向丝氨酸413处磷酸化的tau的高亲和力抗体
US20240101654A1 (en) * 2020-12-29 2024-03-28 Neurimmune Ag Human anti-tau antibodies
TW202328177A (zh) 2021-08-27 2023-07-16 美商建南德克公司 治療ｔａｕ病理學之方法
WO2023041805A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for improving the efficacy of hdac inhibitor therapy and predicting the response to treatment with hdac inhibitor
CA3239708A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Aubin MICHALON Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
WO2023178049A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Genentech, Inc. Predicting neurodegenerative diseases based on speech analyses
WO2023250326A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Genentech, Inc. Detecting longitudinal progression of alzheimer's disease (ad) based on speech analyses
WO2024026471A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Alector Llc Cd98hc antigen-binding domains and uses therefor
TW202405020A (zh) 2022-07-29 2024-02-01 美商阿列克特有限責任公司 轉鐵蛋白受體抗原結合域及其用途
CN116948025B (zh) * 2023-09-14 2024-04-02 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种抗Tau蛋白的抗体
CN117106081B (zh) * 2023-09-28 2024-05-07 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种抗nfl蛋白的捕获抗体

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
WO1989012624A2 (en) 1988-06-14 1989-12-28 Cetus Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0521985B1 (en) 1990-03-20 1997-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
EP0574395B1 (en) 1990-11-09 2002-06-12 GILLIES, Stephen D. Cytokine immunoconjugates
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
WO1993008302A1 (en) * 1991-10-25 1993-04-29 Itt Automotive Europe Gmbh Monoclonal antibodies directed against the microtubule-associated protein tau
AU3328493A (en) * 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU675661B2 (en) 1992-07-24 1997-02-13 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69232604T2 (de) 1992-11-04 2002-11-07 City Of Hope Duarte Antikörperkonstrukte
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP0669986B1 (en) 1992-11-13 2003-04-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
JP2879975B2 (ja) 1992-12-14 1999-04-05 エヌ・ブイ・インノジェネティクス・ソシエテ・アノニム 微小管関連タンパク質タウに対するモノクローナル抗体、これらの抗体を分泌するハイブリドーマ、これらのモノクローナル抗体による抗原認識及びこれらの応用
US6008024A (en) 1993-12-21 1999-12-28 Innogenetics, N.V. Monoclonal antibodies specific for PHF-tau, hybridomas secreting them, antigen recognition by these antibodies and their applications
WO1996004309A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Innogenetics N.V. Monoclonal antibodies specific for an epitope of a particular subclass or form of phosphorylated tau, hybridomas secreting them, antigen recognition of these antibodies and their applications
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
AU5508798A (en) * 1996-11-19 1998-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
JP4128227B2 (ja) 1997-03-14 2008-07-30 バイオジェン・アイデック・インコーポレイテッド 哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO2000030680A1 (en) 1998-11-23 2000-06-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Tumor antigen-specific antibody-gp39 chimeric protein constructs
US20040110938A1 (en) 2000-02-24 2004-06-10 Parekh Rajesh Bhikhu Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of schizophrenia
WO2002102855A2 (en) 2000-11-17 2002-12-27 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
EA007388B1 (ru) 2001-01-29 2006-10-27 Идек Фармасьютикалз Корпорейшн Модифицированные антитела и способы применения
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
AT500379B8 (de) 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
WO2003014960A2 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
ATE360988T1 (de) 2001-08-24 2007-05-15 Univ Zuerich Methode zur induzierung neurofibrillärer tangles in transgenen tieren
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
WO2004016655A1 (ja) 2002-08-14 2004-02-26 Mitsubishi Chemical Corporation 中枢性タウ蛋白質特異的抗体
WO2004095031A1 (en) 2003-04-24 2004-11-04 Universität Zürich Method of monitoring immunotherapy
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
US7238788B2 (en) 2004-02-18 2007-07-03 University Of Iowa Foundation Antibodies to phosphorylated tau, methods of making and methods of use
JP4730584B2 (ja) * 2004-12-06 2011-07-20 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US7083854B1 (en) 2005-05-10 2006-08-01 Cornell Research Foundation, Inc. Fibers from polymer nanoclay nanocomposites by electrospinning
WO2007011907A2 (en) 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
WO2007068105A1 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 Robarts Research Institute Method of diagnosing amyotrophic lateral sclerosis
US8012936B2 (en) * 2006-03-29 2011-09-06 New York University Tau fragments for immunotherapy
CN101622275B (zh) 2007-01-05 2013-11-06 苏黎世大学 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
US20110301217A1 (en) * 2008-09-16 2011-12-08 David Jaro Vocadlo Selective Glycosidase Inhibitors and Uses Thereof
EP2440234A4 (en) * 2009-06-10 2013-11-06 Univ New York IMMUNOLOGICAL TARGETING OF PATHOLOGICAL TAU PROTEINS
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
WO2011053565A2 (en) 2009-10-29 2011-05-05 Biomedical Sciences Research Centre "Alexander Fleming" Compositions and methods for detecting a tauopathy
ES2548686T3 (es) 2010-10-07 2015-10-20 Ac Immune S.A. Anticuerpos que reconocen fosfo-Tau
EP2627672B1 (en) 2010-10-11 2018-08-01 Biogen Idec International Neuroscience GmbH Human anti-tau antibodies
ES2714692T3 (es) 2011-01-31 2019-05-29 Tau Bio Logic Corp Tratamiento de tauopatías
US8697076B2 (en) 2011-04-27 2014-04-15 Northwestern University Antibodies selective for pathological tau dimers and prefibrillar pathological tau oligomers and their uses in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
US20120323214A1 (en) 2012-05-16 2012-12-20 Totada R Shantha Alzheimer's disease treatment with multiple therapeutic agents delivered to the olfactory region through a special delivery catheter and iontophoresis
CA2896066C (en) 2012-12-21 2022-07-12 Biogen Ma Inc. Human anti-tau antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CY1120951T1 (el) 2019-12-11
BR112013008765B8 (pt) 2023-05-02
CA2813493C (en) 2019-07-09
PT2627672T (pt) 2018-11-16
EA201390453A1 (ru) 2013-08-30
HRP20181320T8 (hr) 2018-12-14
PL2627672T3 (pl) 2018-11-30
US9605059B2 (en) 2017-03-28
WO2012049570A1 (en) 2012-04-19
MX2013003879A (es) 2014-07-09
JP6300842B2 (ja) 2018-03-28
CN103339146B (zh) 2017-09-01
SI2627672T1 (sl) 2018-10-30
US20150252102A1 (en) 2015-09-10
MX345092B (es) 2017-01-17
JP2016138102A (ja) 2016-08-04
US20190233506A1 (en) 2019-08-01
EP2627672A1 (en) 2013-08-21
US20180002409A1 (en) 2018-01-04
SG189174A1 (en) 2013-05-31
ES2686550T3 (es) 2018-10-18
ZA201303175B (en) 2021-05-26
BR112013008765A2 (pt) 2020-09-15
US20210238265A1 (en) 2021-08-05
AU2011315181B2 (en) 2016-07-28
BR112013008765B1 (pt) 2022-07-12
IL225670B (en) 2018-04-30
US20120087861A1 (en) 2012-04-12
EP2627672B1 (en) 2018-08-01
JP2014503178A (ja) 2014-02-13
LT2627672T (lt) 2018-12-10
NZ609984A (en) 2015-05-29
DK2627672T3 (en) 2018-08-27
CA2813493A1 (en) 2012-04-19
AU2011315181A1 (en) 2013-05-09
CN103339146A (zh) 2013-10-02
HRP20181320T1 (hr) 2018-10-19
EA031698B1 (ru) 2019-02-28
US8940272B2 (en) 2015-01-27
US20130295021A1 (en) 2013-11-07
IL225670A0 (en) 2013-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210238265A1 (en) Human Anti-Tau Antibodies
JP6841449B2 (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）アミロイドーシスに対する抗体療法及びそのためのヒト由来抗体
US10703808B2 (en) Human anti-alpha-synuclein antibodies
US20200262895A1 (en) Human anti-tau antibodies
AU2013314301B2 (en) Human islet amyloid polypeptide (HIAPP) specific antibodies and uses thereof
TR201815563T4 (tr) Anti-alfa sinüklein bağlayıcı moleküller.
CN107074937B (zh) 人源抗亨廷顿蛋白(htt)抗体及其用途