CN113874078A - 抗tauc3抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

描述了对TauC3的特异性比对全长tau(2N4R)的特异性高至少几个数量级的抗TauC3抗体。还描述了使用抗TauC3抗体的方法。

Description

抗TAUC3抗体及其应用
本申请要求于2019年4月5日提交的美国临时申请第62/829,774号的权益，在此通过引用并入。
背景技术
Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布于轴突并调节神经元中微管(MT)的组装、空间组织和行为。Tau蛋白由位于17号染色体上的单个基因编码。
Tau蛋白有六种已知的异构体。这些异构体的不同之处在于氨基末端区域是否存在29个或58个氨基酸的插入片段，以及在于在tau的羧基末端区域添加或删除串联重复序列(可以重复3或4次)，tau的羧基末端区域被称为微管结合域。微管结合域由31或32个氨基酸残基的不完美重复序列组成。最长的tau蛋白异构体(2N4R)长度为441个氨基酸，包含四个重复序列(R1、R2、R3和R4)和两个插入片段。最小的tau异构体包含352个氨基酸残基，在微管结合域中具有三个串联重复序列(R1、R3和R4)，没有氨基末端插入。在SEQ ID NO：1-6中提供了对应于人tau蛋白异构体的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1是最长的tau异构体htau40，包含两个N端插入片段和四个微管结合域(2N4R)，如下：
Figure BDA0003369900800000011
SEQ ID NO：2包含如下两个N端插入片段和三个微管结合域(2N3R)，如下：
Figure BDA0003369900800000012
Figure BDA0003369900800000021
SEQ ID NO：3包含一个N端插入片段和四个微管结合域(IN4R)，如下：
Figure BDA0003369900800000022
SEQ ID NO：4包含零个N端插入片段和四个微管结合域(0N4R)，如下：
Figure BDA0003369900800000023
SEQ ID NO：5包含一个N端插入片段和三个微管结合域(1N3R)，如下：
Figure BDA0003369900800000024
SEQ ID NO：6包含零个N端插入片段和三个微管结合域(0N3R)，如下：
Figure BDA0003369900800000025
TauC3是一种极其有害、成核的(nucleating)、预缠结、细胞内和优先分泌的、以天冬氨酸421结尾的C端截短的tau片段。与全长Tau(FLT)(2N4R)相比，TauC3以低丰度存在，但被证明会产生不成比例的巨大病理效应。TauC3可能促成，例如，tau病理性聚集的接种(seeding)和扩散。
tau在大脑中的病理性聚集和病理性扩散与20多种神经退行性疾病有关，包括例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等(统称为“tau蛋白病(tauopathies)”)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种嵌合抗体，其可用于诊断和治疗与TauC3在大脑中的病理活动相关的神经退行性疾病。
本发明的另一个目的是提供一种人源化抗体，其可用于诊断和治疗与TauC3在大脑中的病理活动相关的神经退行性疾病。
本发明的另一个目的是提供一种人抗体，其可用于诊断和治疗与TauC3在大脑中的病理活动相关的神经退行性疾病。
本发明的另一个目的是提供一种嵌合抗体，其对TauC3的C-末端具有特异性。
本发明的另一个目的是提供一种嵌合抗体，其对TauC3的C-末端具有特异性，并且具有1x10-3 s-1以下的解离率(Kd)。
本发明的另一个目的是提供一种人源化抗体，其对TauC3的C-末端具有特异性。
本发明的另一个目的是提供一种人源化抗体，其对TauC3的C-末端具有特异性，并且具有1x10-3 s-1以下的解离率(Kd)。
为促进上述目的和其他目的，本发明涉及对TauC3的C-末端具有特异性的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体(“抗TauC3抗体”)。抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10至1x10-12，对全长tau(“FLT”)(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。例如，抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)可为约5x10-12M至约1.2x10-10M，约1x10-11M至约1x10-10M，约1x10-11M至约9x10-11M，约1x10-11M至约8x10-11M，约1x10-11M至约7x10-11M，约1x10-11M至约6x10-11M，约1x10-11M至约5x10-11M，或约1x10-11M至约4x10-11M；并且对FLT的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。在优选的实施方案中，抗体在经受约40℃至约67℃的温度10分钟后仍能保持其结合能力，并且在37℃下在血清(例如小鼠)中孵育21天后仍保持其结合能力。抗TauC3抗体的高性能允许抗体靶向TauC3，而不影响FLT的正常生理功能。在一些实施方案中，抗体的特异性允许仅靶向最有害的tau种类。与不具有特异性且不区分不同种类tau的抗体相比，这可以允许例如潜在地降低有效治疗剂量。抗TauC3抗体及其抗原结合片段可用于例如诊断和治疗与TauC3在大脑中的病理活动相关的神经退行性疾病，包括例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等。抗TauC3抗体可具有50mg/ml或更高的水溶性(例如，约50mg/ml至约200mg/ml、约55mg/ml至约180mg/ml、约55mg/ml至约170mg/ml、约55mg/ml至约150mg/ml、约55mg/ml至约140mg/ml、约55mg/ml至约130mg/ml；或约60mg/ml至约130mg/ml)。
本发明进一步涉及与鼠抗TauC3抗体相比对TauC3具有更高结合亲和力(KD)的嵌合、人源化和人抗TauC3抗体。在一些实施方案中，嵌合、人源化和人抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)比鼠抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)高至少2倍、3倍或4倍。在一些实施方案中，鼠抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD为约4.9x10-11M，嵌合、人源化和人抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD为约1x10-11M至约2.5x10-11M。嵌合、人源化和人抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD可为例如约1.1x10-11M、约1.3x10-11M、约1.5x10-11M、约1.7x10-11M、约1.9x10-11M、约2.1x10-11M或约2.3x10-11M。抗TauC3抗体的水溶性可以为50mg/ml或更高(例如，约50mg/ml至约200mg/ml、约55mg/ml至约180mg/ml、约55mg/ml至约170mg/ml、约55mg/ml至约150mg/ml、约55mg/ml至约140mg/ml、约55mg/ml至约130mg/ml；或约100mg/ml至约200mg/ml、约100mg/ml至约180mg/ml、约100mg/ml至约170mg/ml、约100mg/ml至约150mg/ml，约100mg/ml至约140mg/ml，或约100mg/ml至约130mg/ml)。
本发明还涉及嵌合、人源化和人抗TauC3抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10至lx10-12，解离速率(Kd)为1x10-3s-1以下，并且对FLT的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。
抗TauC3抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区，其包含由序列GFTFNTYA(SEQID NO：7)表示的CDR1、由IRSKSNNYAT(SEQ ID NO：8)表示的CDR2，以及由VGGGDF(SEQ IDNO：9)表示的CDR3；以及(b)轻链可变区，其包含由序列QEISVY(SEQ ID NO：10)表示的CDR1、由序列GAF(SEQ ID NO：11)表示的CDR2和由序列LQYVRYPWT(SEQ ID NO：12)表示的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3以下的解离率(Kd)；并且对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT(SEQ ID NO：1)没有可检测到的结合。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区，其包含与序列GFTFNTYA(SEQ ID NO：7)同源的CDR1、与IRSKSNNYAT(SEQ ID NO：8)同源的CDR2，和与VGGGDF同源的CDR3(SEQ ID NO：9)；以及(b)轻链可变区，其包含与序列QEISVY(SEQ IDNO：10)同源的CDR1、与序列GAF(SEQ ID NO：11)同源的CDR2，和与序列LQYVRYPWT(SEQ IDNO：12)同源的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3以下的解离率(Kd)，并且对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT(SEQID NO：1)没有可检测到的结合。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区，其包含与序列GFTFNTYA(SEQ ID NO：7)相同的CDR1、与IRSKSNNYAT(SEQ ID NO：8)相同的CDR2，和与VGGGDF(SEQ ID NO：9)相同的CDR3；以及(b)轻链可变区，其包含与序列QEISVY(SEQ IDNO：10)相同的CDR1、与序列GAF(SEQ ID NO：11)相同的CDR2，和与序列LQYVRYPWT(SEQ IDNO：12)相同的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3以下的解离率(Kd)，并且对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4到1x10-8M，或与FLT(SEQID NO：1)没有可检测到的结合。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区，其包含序列GFTFNTYA(SEQ ID NO：7)的CDR1、序列IRSKSNNYAT(SEQ ID NO：8)的CDR2，和序列VGGGDF(SEQ ID NO：9)的CDR3；以及(b)轻链可变区，其包含序列QEISVY(SEQ ID NO：10)的CDR1、序列GAF(SEQ ID NO：11)的CDR2，和序列LQYVRYPWT(SEQ ID NO：12)的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3以下的解离率(Kd)，并且对SEQ IDNO：1的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与SEQ ID NO：1没有可检测到的结合，并且用于治疗阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)。该抗体还可用于诊断tau蛋白病，例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)或额颞叶变性(FTLD)。
一方面，本发明涉及抗TauC3抗体，其是人源化抗体，其包含(a)重链可变区，该重链可变区包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，以及由SEQ ID NO：9表示的CDR3；以及(b)轻链可变区，该轻链可变区包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3 s-1以下的解离率(Kd)(例如1x10-4至1x10-3s-1)，并且对FLT(SEQID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT没有可检测到的结合。因此，人源化抗体可包含(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：7的CDR1、SEQ ID NO：8的CDR2和SEQ IDNO：9的CDR3；以及(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：10的CDR1、SEQ ID NO：11的CDR2和SEQID NO：12的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3以下的解离率(Kd)(例如1x10-4至1x10-3 s-1)，以及对SEQ ID NO：1的结合亲和力(KD)为1x10-4到lx10-8M，或与FLT没有可检测到的结合，并用于治疗tau蛋白病，例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等。
在一个方面，本发明涉及抗TauC3抗体，其是人源化抗体，其包含(a)重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：7相同的CDR1、与SEQ ID NO：8相同的CDR2、和与SEQ IDNO：9相同的CDR3；以及(b)轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：7相同的CDR1、与SEQ ID NO：11相同的CDR2和与SEQ ID NO：12相同的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3 s-1以下的解离率(Kd)(例如，1x10-4至1x10-3s-1)，以及对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT没有可检测到的结合。因此，该人源化抗体可包含(a)重链可变区，其具有SEQ ID NO：7的CDR1、SEQ ID NO：8的CDR2和SEQ ID NO：9的CDR3；以及(b)轻链可变区，其具有SEQ ID NO：10的CDR1、SEQ ID NO：11的CDR2和SEQID NO：12的CDR3；并且对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下(例如，1x10-4到1x10-3s-1)，以及对SEQ ID NO：1的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT没有可检测到的结合，并用于治疗tau蛋白病，例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等。
一方面，本发明涉及抗TauC3抗体，其是人源化抗体，其包含(a)重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：7同源的CDR1、与SEQ ID NO：8同源的CDR2和与SEQ ID NO：9同源的CDR3；以及(b)轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：同源的CDR1、与SEQ IDNO：11同源的CDR2和与SEQ ID NO：12同源的CDR3；并且对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下(例如，1x10-4至1x10-3s-1)，以及对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT没有可检测的结合。因此，该人源化抗体可包含(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：7的CDR1、SEQ ID NO：8的CDR2和SEQ ID NO：9的CDR3；以及(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：10的CDR1、SEQ ID NO：11的CDR2和SEQ IDNO：12的CDR3；并且对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下(例如，1x10-4至1x10-3s-1)，以及对SEQ ID NO：1的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT没有可检测到的结合，并用于治疗tau蛋白病，例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等。
人源化抗体可以例如包含：
(a)重链可变区，其包含序列
LVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGLEWVARIRSKSNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKSMAYLQMDSLKTEDTAVYYCVGGGDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：13)或与SEQ ID NO：13同源的序列；和
(b)轻链可变区，其包含选自下组的序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISVYLGWFQQKPGKAPKRLIYGAFKLQSGVPSRFSGSRSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYVRYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：14)或与SEQ ID NO：14同源的序列，
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISVYLGWYQQKPGKAPKRLIYGAFTLQSGVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVRYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：15)或与SEQ ID NO：15同源的序列，
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISVYLGWYQQKPGKAPKRLIYGAFSLQSGVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVRYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：16)或与SEQ ID NO：16同源的序列，
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISVYLGWFQQKPGKAPKRLIYGAFKLQSGVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVRYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：17)或与SEQ ID NO：17同源的序列，和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEISVYLSWFQQKPGKAIKRLIYGAFSLQSGVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVRYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：18)或与SEQ ID NO：18同源的序列，和对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和9x10-12，对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4到1x10-8M，或与FLT没有可检测到的结合。
在某些实施方案中，人源化抗体包含SEQ ID NO：13的可变重链(VH)多肽和SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的可变轻链(VL)多肽。
在某些实施方案中，人源化抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，该可变重链(VH)多肽与SEQ ID NO：13具有至少70％的序列同一性；以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含SEQ IDNO：10表示的CDR1、SEQ ID NO：11表示的CDR2和SEQ ID NO：12表示的CDR3，该可变轻链(VL)多肽与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：SEQ IDNO：18具有至少70％的序列同一性。
在某些实施方案中，人源化抗体包含与SEQ ID NO：13具有至少75％序列同一性的VL链多肽，和与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少75％序列同一性的VH链多肽。
在某些实施方案中，人源化抗体包含与SEQ ID NO：13具有至少80％序列同一性的VL链多肽，和与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少80％序列同一性的VH链多肽。
在某些实施方案中，人源化抗体包含与SEQ ID NO：13具有至少85％序列同一性的VL链多肽，和与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少85％序列同一性的VH链多肽。
在某些实施方案中，人源化抗体包含与SEQ ID NO：13具有至少90％序列同一性的VL链多肽，和与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少90％序列同一性的VH链多肽。
在某些实施方案中，人源化抗体包含与SEQ ID NO：13具有至少95％序列同一性的VL链多肽，和与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少95％序列同一性的VH链多肽。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体包含可变重链(VH)多肽和可变轻链(VL)多肽，该可变重链(VH)多肽包含SEQ ID NO：13，该可变轻链(VL)多肽包含选自SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体包含(i)可变重链(VH)多肽，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDRl是SEQ ID NO：7的多肽，CDR2是SEQ ID NO：8的多肽，CDR3是SEQ ID NO：9的多肽；(ii)轻链(VL)多肽，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1是SEQ ID NO：10的多肽，CDR2是SEQ ID NO：11的多肽，CDR3是SEQ ID NO：12的多肽。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体包含(i)可变重链(VH)多肽；(ii)轻链(VL)多肽，其中可变重链(VH)多肽是SEQ ID NO：13的多肽，可变轻链(VL)多肽是SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的多肽。
抗TauC3抗体还可以是嵌合抗体，其包含(a)重链可变区，该重链可变区包含由SEQID NO：7或与SEQ ID NO：7同源的序列表示的CDR1，由SEQ ID NO：8或与SEQID NO：8同源的序列表示的CDR2，以及由SEQ ID NO：9或与SEQ ID NO：9同源的序列表示的CDR3；以及(b)轻链可变区，该轻链可变区包含由SEQ ID NO：10或与SEQ IDNO：10同源的序列表示的CDR1，由SEQ ID NO：11或与SEQ ID NO：11同源的序列表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12或与SEQ IDNO：12同源的序列表示的CDR3；并且对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下(例如，1x10-4至1x10-3s-1)，以及对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT(SEQ ID NO：1)没有可检测到的结合。
本发明还涉及抗体的抗原结合片段，其包含(a)重链可变区，该重链可变区包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3；以及(b)轻链可变区，该轻链可变区包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3；并且对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下(例如，1x10-4至1x10-3s-1)，以及对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT(SEQ ID NO：1)没有可检测到的结合。抗体的抗原结合片段可以例如是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段或scFv片段。
本发明还涉及抗体的抗原结合片段，其包含(a)重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：7同源的CDR1、与SEQ ID NO：8同源的CDR2和与SEQ ID NO：9同源的CDR3；(b)轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：10同源的CDR1、与SEQ ID NO：11同源的CDR2，和与SEQ ID NO：12同源的CDR3；并且对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下(例如，1x10-4至1x10-3s-1)，并且对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT(SEQ ID NO：1)没有可检测到的结合。抗体的抗原结合片段可以例如是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段或scFv片段。
本发明还涉及抗体的抗原结合片段，其包含(a)重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：7相同的CDR1、与SEQ ID NO：8相同的CDR2，和与SEQ ID NO：9相同的CDR3；以及(b)轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：10相同的CDR1、与SEQ ID NO：11相同的CDR2，和与SEQ ID NO：12相同的CDR3；并且对TauC3具有1x10-10和1x10-12的结合亲和力(KD)和1x10-3s-1以下的解离率(Kd)(例如，1x10-4至lx10-3s-1)，以及对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或与FLT(SEQ ID NO：1)没有可检测到的结合。抗体的抗原结合片段可以是例如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段或scFv片段。
本发明还涉及阻断病理性tau摄取(uptake)的方法、阻断病理性tau接种活动的方法、抑制病理性tau蛋白聚集的方法，以及阻断病理性tau、tau原纤维和tau聚集体从一个神经元扩散到另一个神经元或从大脑的一部分扩散到另一部分的方法。该方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗TauC3抗体。在这些实施方案的一些中，抗TauC3包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3；以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ IDNO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
一旦施用，抗TauC3抗体可以通过例如阻断或减慢TauC3接种活动(例如，通过基本上阻断或减慢TauC3的细胞内摄取)，来阻断或减缓病理性tau从一个神经元到另一个神经元或从大脑的一部分到另一部分的扩散。这种机制发生在细胞外，不需要抗TauC3抗体存在于神经元内部。抗TauC3抗体能够阻断或减缓TauC3 tau、包含TauC3的原纤维和包含TauC3的聚集体从一个神经元扩散到另一个神经元以及从大脑的一部分扩散到另一部分。聚集体可以包含全长tau(例如2N4R)、tau寡聚体和/或翻译后修饰的tau(截短或过度磷酸化)的异质群体。除了阻断TauC3和包含TauC3的原纤维的细胞内摄取外，抗TauC3抗体还可以阻断或减缓细胞(例如神经元)内的病理性tau聚集。由于抗体对全长tau(例如2N4R)基本上没有亲和力，因此抗体不会干扰全长tau的正常非病理功能。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
抗TauC3抗体还可以通过结合从细胞释放的细胞外TauC3和包含TauC3的聚集体，来减缓包含TauC3的原纤维和聚集体的扩散，从而阻止TauC3和包含TauC3的聚集体进入邻近细胞，并减缓tau聚集体从一个神经元到另一个神经元以及从大脑的一部分到另一部分的扩散。因此，抗TauC3抗体可用作防止TauC3或包含TauC3的聚集体进入细胞(例如神经元)的手段。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ IDNO：12表示的CDR3。
抗TauC3抗体还可用于减缓和/或减少tau聚集体的神经元到神经元扩散。例如，抗TauC3抗体可促进包含TauC3的蛋白质原纤维的解聚，阻断单体TauC3向包含TauC3的原纤维和/或聚集体的细胞内转化，并促进包含TauC3的原纤维和/或包含TauC3的聚集体的细胞内降解。除了TauC3之外，原纤维和聚集体还可以包含全长tau(例如2N4R)、tau寡聚体和/或翻译后修饰的tau(截短或过度磷酸化)的异质群体。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
抗TauC3抗体可以减少患有tau蛋白病的受试者的脑萎缩。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ IDNO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
抗TauC3抗体还可以抑制不溶性聚集体的形成，该聚集体包含全长tau(例如，2N4R)、tau寡聚体和/或翻译后修饰的tau(截短或过度磷酸化)的异质群体，例如减少大脑中病理性tau的量(例如，TauC3、包含TauC3的原纤维和包含TauC3的聚集体)。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体抑制全长Tau(例如，2N4R)的病理性聚集。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体的施用可以使受试者对发生tau蛋白病免疫。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
抗TauC3抗体的施用可以减轻受试者中tau蛋白病的症状和/或减缓受试者中tau蛋白病的进展。例如，在某些实施方案中，抗TauC3抗体的施用可以改善患有tau蛋白病的受试者的认知功能和/或运动/感觉运动功能。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ IDNO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQID NO：10表示的CDR1、由SEQ IDNO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明的抗TauC3抗体可用于治疗人类受试者的tau蛋白病。施用抗TauC3抗体用于特别是治疗阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2，和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，以及(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ IDNO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2，和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
在某些实施方案中，本发明涉及一种减少tau聚集在受试者大脑中扩散的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中该抗体结合TauC3，但不结合全长Tau。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明进一步涉及治疗受试者的tau蛋白病的方法，其包括向受试者施用足以阻断TauC3接种活性的治疗有效量的抗TauC3抗体，其中所述抗TauC3抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，人源化抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及治疗受试者的tau蛋白病的方法，包括向受试者施用足以阻断神经元对TauC3再摄取的治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ IDNO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及一种治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下，对FLT的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ IDNO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ IDNO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ IDNO：12表示的CDR3。
本发明还涉及治疗受试者的进行性核上性麻痹(PSP)的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10至1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下以下，对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及一种治疗受试者的额颞叶痴呆(FTD)的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10至1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下，对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及一种治疗受试者的外伤性脑损伤(TBI)的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10至1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下，对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及一种治疗受试者的皮克氏病(PiD)的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10至1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下，对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及治疗受试者的皮质基底节变性(CBD)的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下，对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及一种治疗受试者的额颞叶变性(FTLD)的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抗TauC3抗体，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下，对FLT的结合亲和力(KD)为1x10-4至lx10-8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。
本发明还涉及用于阻断病理性tau的细胞内摄取的治疗剂和组合物；用于阻断tau接种活动的治疗剂和组合物；用于阻断tau聚集的治疗剂和组合物；以及用于阻断tau、tau原纤维、tau聚集体和任何前述物质的片段从大脑的一部分到另一部分的病理性扩散的治疗剂和组合物，该病理性扩散是由TauC3诱导或调节的。治疗剂和组合物包含上文和下文所述的抗TauC3抗体。除了抗TauC3抗体之外，本发明的组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。治疗剂或组合物还可用于被动免疫和治疗tau蛋白病，例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等。在某些实施方案中，组合物还可以包括阻止TauC3产生的药剂(例如，半胱天冬酶抑制剂)或促进清除的药剂(例如，小分子TauC3聚集抑制剂)。
本发明进一步涉及包含抗TauC3抗体和一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，其中抗TauC3抗体是人源化或嵌合抗体，其对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，解离率(Kd)为1x10-3s-1以下，对FLT(SEQ ID NO：1)的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10- 8M。在一些实施方案中，抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽，其包含由SEQ ID NO：7表示的CDR1、由SEQ ID NO：8表示的CDR2和由SEQ ID NO：9表示的CDR3，(b)可变轻链(VL)多肽，其包含由SEQ ID NO：10表示的CDR1、由SEQ ID NO：11表示的CDR2和由SEQ ID NO：12表示的CDR3。组合物可以例如是液体组合物。该组合物包含有效量的抗TauC3抗体以治疗tau蛋白病，包括例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等。在某些优选的实施方案中，组合物是稳定的(即，组合物中至少90％的抗TauC3抗体在37℃下储存组合物21天后保持其结合能力)。
附图说明
图1是MoTau01κ轻链可变区的蛋白质和DNA序列。
图2是MoTau01κ重链可变区的蛋白质和DNA序列。
图3是pHuKLIC载体。
图4是pHuG4 LIC载体。
图5是嵌合MoTau01 VK的蛋白质和DNA序列。
图6是嵌合MoTau01 VH的蛋白质和DNA序列。
图7是使用结合酶联免疫吸附试验对嵌合Tau01与TauC3和FL Tau的结合力测试。
图8是使用Octet对鼠和嵌合Tau01抗体与TauC3和FL Tau的结合力测试。
图9是Tau01 HA的蛋白质和DNA序列。
图10是Tau01 HB的蛋白质和DNA序列。
图11是Tau01 HC的蛋白质和DNA序列。
图12是Tau01 KA的蛋白质和DNA序列。
图13是Tau01 KB的蛋白质和DNA序列。
图14是Tau01 KC的蛋白质和DNA序列。
图15是人源化和嵌合Tau01与TauC3的结合：A和B形式。
图16是人源化和嵌合Tau01与TauC3的结合酶联免疫吸附试验：HA至HL变体。
图17是针对TauC3的人源化Tau01抗体的Octet筛选：具有KA-KC的HB、HC和HF。
图18是人源化Tau01抗体与TauC3的结合酶联免疫吸附试验：KA与KJ变体。
图19是针对TauC3的人源化Tau01抗体的Octet筛选：具有KA至KJ变体的HB。
图20是第二轮人源化Tau01抗体与TauC3的结合酶联免疫吸附试验：HM、HN和HO变体。
图21是针对TauC3的第二轮人源化Tau01抗体的Octet筛选：HM、HN和HO变体。
图22是含有人源化抗体的HC和HM与TauC3的结合酶联免疫吸附试验。
图23是针对TauC3的第二轮人源化Tau01抗体的Octet筛选：HM变体。
图24是针对TauC3和FL Tau的第二轮人源化Tau01抗体的Octet筛选：先导变体(Lead variants)。
图25是使用Biacore对具有TauC3的先导(lead)人源化候选物的解离率排名。
图26是Biacore对FL Tau的结合力测试。
图27是嵌合和人源化候选抗体的热稳定性。
图28是纯化的Mo Tau01HuG4K和Tau01HCKB HuG4K抗体的SEC-MALS聚类分析。
图29是纯化的Tau01 HMKN、HMKO、HMKP、HMKE和HMKM HuG4K抗体的DLS分析。
图30是纯化的嵌合和人源化候选抗体的质谱。
图31是人源化候选抗体的Biacore动力学。
图32是人源化候选抗体的热位移分析。
图33是人源化候选抗体的非特异性蛋白质-蛋白质相互作用(交叉相互作用色谱)。
图34是纯化的人源化抗体候选物的溶解度评估。
图35是通过圆二色性对人源化候选抗体进行冷冻/解冻和热应激分析。
图36是毛细管等电聚焦以确定人源化候选物的等电点。
图37是人源化候选抗体的血清稳定性评估。
定义
如本文所用，“抗体”意在包括完整分子(即，全长抗体(IgM、IgG、IgA、IgE))及其片段，以及其合成和生物衍生物，例如Fab、F(ab′)2和Fv片段，其为游离的或表达在例如pIII或pVIII或其他表面蛋白上的丝状噬菌体表面上，或在细菌表面上，其能够结合抗原。缺乏完整抗体的FC片段的Fab、F(ab’)2和Fv片段从循环中清除更快，可能与抗体的非特异性组织结合较少。抗体可能是单克隆抗体。重组抗体包括术语“抗体”。术语“抗体”包括嵌合抗体和人源化抗体。抗体也可以是全人抗体(例如，来自转基因小鼠或噬菌体)。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指其中小鼠或其他非人抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体框架上的抗体。人抗体框架是指不包括CDR的整个人抗体。
如本文所用，术语“人抗体”是指其中全部序列源自人遗传库(例如，源自转基因小鼠或噬菌体)的抗体。
如本文所用，术语“同源”是指该序列与其同源的序列具有至少80％的同一性，并且包含该同源序列的聚合肽(例如，抗体)与包含其同源的序列的聚合肽具有基本相同的生物活性。例如，人源化抗体包含(a)重链可变区，其包含由序列GFTFNTYA(SEQ ID NO：7)表示的CDR1、由IRSKSNNYAT(SEQ ID NO：8)表示的CDR2和由VGGGDF(SEQ ID NO：9)表示的CDR3；(b)轻链可变区，其包含由序列QEISVY(SEQ ID NO：10)表示的CDR1、由序列GAF(SEQ ID NO：11)表示的CDR2和由序列LQYVRYPWT(SEQ ID NO：12)表示的CDR3；并且其中一个或多个CDR序列被同源序列替换的抗体对TauC3的结合亲和力(KD)为1x10-10和1x10-12，并且对FLT的结合亲和力(KD)为1x10-4至1x10-8M，或无法检测到与FLT的结合。根据定义，同源抗体具有基本相似的三维形状。
如本文所用，“CDR”是指“互补决定区”。CDR也可称为高变区。除非另有说明，本文公开的CDR序列由IMGT编号系统定义。
如本文所用，关于CDR序列的“由SEQ ID NO：表示”是指CDR的序列与所述的SEQ IDNO相同或同源。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中小鼠或大鼠抗体的整个可变区与人恒定区一起表达的抗体。
本文所用的术语“鼠抗TauC3抗体”是指在Nicholls，S.B.，S.L.DeVos，C.Commins，C.Nobuhara，R.E.Bennett，D.L.Corjuc，E.Maury等2017.“Characterization ofTauC3antibody and demonstration of its potential to block tau propagation.”PLoS ONE 12(5)：e0177914.中的“TauC3抗体”。
如本文所用，“轻链”是抗体的小多肽亚基。典型的抗体包含两条轻链和两条重链。
如本文所用，“重链”是抗体的大多肽亚基。抗体的重链包含一系列免疫球蛋白结构域，具有至少一个可变结构域和至少一个恒定结构域。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体分子与其表位结合的强度。使用Biacore动力学通过表面等离子体共振(SPR)确定亲和力。
本文所用的术语“KD”是指平衡解离常数(KD＝Kd/Ka，其中Kd是解离速率常数，Ka是结合速率常数)。
如本文所用，术语“免疫耗竭”是指通过使用抗体去除蛋白质。术语“免疫耗竭”与术语“免疫沉淀”可互换使用。该术语是指抗体从样本中降低或免疫沉淀(IP)目标抗原(这会导致免疫耗竭)的能力。
如本文所用，术语“治疗有效量”和“有效量”是指在受试者中导致可测量的临床效果的治疗剂(例如，抗TauC3抗体)或组合物的量。治疗剂的有效量由病例周围的情况决定，包括施用的化合物、施用途径、所治疗的症状的状态以及类似的受试者和施用情况等其他考虑因素。“有效量”通常包括约0.0001mg/kg至约100mg/kg，优选0.5mg/kg至20mg/kg的本文所述的抗TauC3抗体。在某些实施方案中，使用1mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、6mg/kg、8mg/kg或10mg/kg的量。
术语“病理性tau”包括TauC3、包含TauC3的原纤维和包含TauC3的聚集体(例如，包含全长tau、tau寡聚体和/或翻译后修饰的tau(截短或磷酸化)的异质群体)。除了TauC3，病理性tau还可以包括全长tau(例如，2N4R)、tau寡聚体和/或翻译后修饰的tau(截短或过度磷酸化)的异质群体。
术语“TauC3”是指在htau40(SEQ ID NO：1)的天冬氨酸421处结束的C末端截短的tau片段。
如本文所用，“FLT”是全长Tau(例如，htau40(SEQ ID NO：1)的缩写。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括与tau蛋白病相关的至少一种症状或症状体征的减弱、逆转或改善。
术语“接种”是指在TauC3、包含TauC3的原纤维和/或包含TauC3的聚集体细胞内聚集作为全长tau(例如2N4R)、tau寡聚体和/或翻译后修饰的tau(截短或过度磷酸化)的异质群体的一部分之前的细胞外活动。
术语“聚集”是指在TauC3和/或包含TauC3的原纤维和/或包含TauC3的聚集体被细胞吸收后在细胞内发生的活动。
“ExpiCHO”是中国仓鼠卵巢(CHO高密度/无血清)细胞的缩写。
“A”是腺嘌呤的缩写。
“bp”是碱基对的缩写。
“℃”是摄氏度的缩写。
“C”是胞嘧啶的缩写。
“MEM”是最小必须培养基的缩写。
“DNA”是脱氧核糖核酸的缩写。
“ELISA”是酶联免疫吸附试验的缩写。
“EC50”是引起50％最大反应的抗体浓度的缩写。
“EC80”是引起80％最大反应的抗体浓度的缩写。
“ECD”是胞外域的缩写。
“g”是克的缩写。
“G”是鸟嘌呤的缩写。
“HRP”是辣根过氧化物酶的缩写。
“IgG”是免疫球蛋白-G的缩写。
“K”是G或T的缩写(IUPAC协定)。
“LIC”是不依赖连接酶的克隆的缩写。
“min”是分钟的缩写。
“M”是A或C的缩写(IUPAC协定)。
“nm”是纳米的缩写。
“OD”是光密度的缩写。
“PBS”是磷酸盐缓冲盐水的缩写。
“PCR”是聚合酶链反应的缩写。
“R”是A或G的缩写(IUPAC约定)。
“RT”是室温的缩写。
“s”是秒的缩写。
“S”是C或G的缩写(IUPAC约定)。
“T”是胸腺嘧啶的缩写。
“TBS”是Tris缓冲盐水的缩写。
“UV”是紫外线的缩写。
“V”是A或C或G的缩写(IUPAC约定)。
“VCI”是游标(vernier)残基、规范(canonical)残基和界面(interface)残基的缩写。
“VH”是免疫球蛋白重链可变区的缩写。
“VK”是免疫球蛋白κ轻链可变区的缩写
“W”是A或T的缩写(IUPAC约定)。
“Y”是C或T的缩写(IUPAC约定)。
具体实施方式
TauC3是现存的许多高分子量物种中负责tau聚集和接种活性的物种之一。除了TauC3之外，tau聚集体还可能包含全长(正常tau)、tau寡聚体和/或翻译后修饰的tau(截短或过度磷酸化)的异质群体。已经表明，除散发性AD之外的其他神经退行性疾病也具有增加的TauC3水平。
TauC3具有神经毒性并且可能导致微管功能障碍。TauC3也可能负责将Tau原纤维从大脑的一部分传播到另一部分。
抗TauC3抗体
本发明的抗TauC3抗体识别聚集的、细胞外形式的病理性TauC3。本发明的抗TauC3抗体可以是例如嵌合的、人源化的或人抗TauC3抗体。
当针对重组TauC3蛋白进行测试时，抗TauC3抗体对目标半胱天冬酶切割的Tau蛋白显示出非常紧密的结合特异性。在某些实施方案中，抗TauC3抗体在生物传感器测定中阻断接种，并且有效阻断进入负责诱导细胞内tau聚集的物种的神经元(即，有效阻断TauC3和TauC3原纤维进入细胞)。
抗TauC3抗体通常对TauC3具有亚纳摩尔的特异性，并且对TauC3的特异性是对全长Tau(2N4R)的特异性的至少100倍(例如，对TauC3的特异性是对全长Tau的特异性的100倍或更高)。例如，抗TauC3抗体对TauC3的特异性可能是对全长Tau(2N4R)的特异性的150到5000倍。在某些实施方案中，抗TauC3抗体对TauC3的特异性是对全长Tau(2N4R)的特异性的500至2500倍。在某些实施方案中，抗TauC3抗体对TauC3的特异性是对全长Tau(2N4R)的特异性的750到2000倍。在某些实施方案中，抗TauC3抗体对TauC3的特异性是对全长Tau(2N4R)的特异性的1000到1500倍。在所有这些实施方案中，抗TauC3抗体可能与全长Tau(2N4R)没有可检测到的结合。
在某些实施方案中，本发明的抗体是嵌合、人源化或人抗TauC3抗体，其与鼠抗TauC3抗体相比，对TauC3具有更高的结合亲和力(KD)。在一些实施方案中，嵌合、人源化和人抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)比鼠抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)高至少2倍、3倍或4倍。在一些实施方案中，鼠抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD为约4.9x10-11M，嵌合、人源化和人抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD为约1x10-11M至约2.5x10-11M。本发明的嵌合、人源化和人抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD可为例如约1.1x10-11M、约1.3x10-11M、约1.5x10-11M、约1.7x10-11M、约1.9x10-11M、约2.1x10-11M或约2.3x10-11M。在一些实施方案中，鼠抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD为约3.9x10-11M，嵌合、人源化和人抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD为约1x10-11M至约2.5x10-11M。本发明的嵌合、人源化和人抗-TauC3抗体对TauC3的结合亲和力KD可为例如约1.1x10-11M、约1.3x10-11M、约1.5x10-11M、约1.7x10-11M、约1.9x10-11M、约2.1x10-11M，或约2.3x10-11M。
在某些实施方案中，抗体以1x10-10M至1x10-11M的平衡常数KD结合TauC3；并且与2N4R的平衡常数KD为1x10-4M至1x10-8M或显示与全长Tau(例如2N4R)没有可检测到的结合。在优选的实施方案中，抗TauC3抗体以1x10-9M至1x10-12M的平衡常数KD结合TauC3，并以1x10-8M至9x10-8M的平衡常数KD结合全长(例如2N4R)或显示与2N4R没有可检测到的结合。在这些实施方案中的一些中，抗体对TauC3的解离速率非常慢(即解离速率(Kd)为1x10-4至1x10-3s-1)并且对2N4R基本上没有亲和力(即ka小于100,0001/MS)。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体是嵌合或人源化抗体，其对TauC3的KD值为约5pM至约90pM、约10pM至约90pM、约10pM至约80pM，约10pM至约70pM，约10pM至约60pM，约10pM至约50pM，约10至约40pM，或约10pM至约35pM。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体是嵌合或人源化抗体，其对TauC3的KD值为约10至约90pM且解离速率非常缓慢，如小于2x10-3s-1的Kd值所示。换句话说，这些抗体对TauC3(TauC3是在患病状态下产生的靶蛋白)具有高度的特异性并且解离率很慢，这两者对于用于免疫策略的抗体来说都是理想的。
抗TauC3抗体包括但不限于单克隆、嵌合、人源化、单链、Fab片段和Fab表达文库。抗TauC3抗体可以是天然的或重组的、固定的、游离于溶液中或展示在各种分子或细菌、病毒的表面或其他表面上。
在某些实施方案中，抗TauC3抗体识别位于TauC3的C-末端的序列SSTGSIDMVD(SEQID.No.23)，但当相同的序列存在于FLT内部时则不识别该序列。
根据本发明有用的抗TauC3抗体(例如人源化抗体)可以施用于可能易患或患有tau蛋白病的受试者，以阻断TauC3的接种和/或聚集并因此治疗tau蛋白病的一种以上症状。
在本发明的又一个实施方案中，本发明的抗TauC3抗体可以与细胞保护剂或将促进和/或改善抗体穿过血脑屏障(“BBB”)能力的试剂缀合。细胞保护剂可以是抗氧化剂(例如褪黑素)；促进或改善抗体穿越血脑屏障能力的试剂是一种能够穿越血脑屏障的疏水性物质，通常被美国食品和药物管理局(“FDA”)认定为鼠尾草(GRAS)。细胞保护剂或促进或改善抗体穿过BBB能力的试剂可以直接或通过接头与抗体偶联。接头可以选自：肼接头、二亚硫酸盐接头、硫醚接头、肽接头。在某些实施方案中，抗体对TauC3的平衡常数KD比抗体对2N4R的平衡常数KD高2-3个数量级，并且细胞保护剂是褪黑素。
使用方法
在一个方面，本发明提供了用于患有tau蛋白病或有发展为tau蛋白病风险的活人的抗TauC3抗体。Tau蛋白病包括例如阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆(FTD)、外伤性脑损伤(TBI)、皮克氏病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶变性(FTLD)等。
阻断病理性Tau聚集体增殖的方法
一方面，本发明涉及一种阻断病理性tau从一个神经元扩散到另一个神经元或从大脑的一部分扩散到另一部分的方法。
一方面，本发明涉及阻断受试者脑中TauC3接种活动的方法。
在另一方面，本发明涉及一种减少病理性Tau聚集体在受试者脑中扩散的方法。
本发明进一步涉及减少包含TauC3的聚集体在受试者脑中扩散的方法。
本发明进一步涉及减少包含TauC3的原纤维在受试者脑中扩散的方法。
在本发明的另一方面，本发明涉及减少由TauC3和TauC3原纤维的细胞内摄取诱导的tau的细胞内聚集的方法。
在每个方面，该方法包括向人施用治疗有效量的抗TauC3抗体。抗TauC3抗体能够独特地识别聚集的细胞外形式的病理性tau，而不与生理性tau结合。在一个优选的实施方案中，抗TauC3抗体表位的关键部分是在对应于TauC3的最后十个C端残基的肽的C端残基处形成新表位的羧基(例如，TauC3或SEQ编号：23)。抗TauC3抗体对TauC3的平衡常数KD比抗体对2N4R和一种或多种药学上可接受的赋形剂的平衡常数KD高2-3个数量级。抗TauC3抗体以1x10-10M至1x10-11M的平衡常数KD结合TauC3，但与全长tau(例如，2N4R)的平衡常数KD为1x10-4M至1x10-8M，或与全长tau(例如，2N4R)没有可检测到的结合。在优选的实施方案中，抗TauC3抗体以1x10-11M至9x10-11M的平衡常数KD结合TauC3，以1x10-8M至9x10-8M的平衡常数KD结合2N4R，或显示与2N4R没有可检测到的结合。抗TauC3抗体优选与TauC3的解离速率非常慢，并且对2N4R基本上没有亲和力(即，ka小于100,0001/MS)。抗体可以例如选自人源化抗体、嵌合抗体或任何前述抗体的免疫片段。在优选的实施方案中，抗体是选自本文所述的人源化抗TauC3抗体的抗体。
在施用治疗有效量的抗TauC3抗体之前，人可能具有或不具有与tau聚集相关的症状。换句话说，人可能会或可能不会经历与tau接种和/或聚集相关的症状。本领域普通技术人员将理解，病理性tau接种和聚集可能在诊断或与tau聚集相关的症状出现之前开始。在一些实施方案中，人具有与tau接种和/或聚集相关的症状。在其他实施方案中，人不具有与tau接种和/或聚集相关的症状。在其他实施方案中，人具有可检测的tau病理，但没有任何其他与tau症状和/或聚集相关的症状。通过施用根据本发明的治疗剂和药物组合物来减少tau聚集体在人脑中的扩散可以减少与tau的病理性接种和/或聚集相关的症状的发展和/或进展。
因此，预防、抑制或减缓病理性tau聚集体的扩散可用于治疗与tau聚集体的产生和扩散相关的病理。与tau接种和/或聚集相关的症状的一种定义是指部分地由tau原纤维组成的tau聚集体形成而引起的任何症状。具有与tau聚集相关症状的示例性病症包括但不限于进行性核上性麻痹、拳击性痴呆症(慢性创伤性脑病)、额颞叶痴呆和与17号染色体相关的帕金森病、Lytico-Bodig病(关岛帕金森痴呆症)、缠结优势型痴呆、神经节胶质瘤和神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅脑病、结节性硬化症、苍白球黑质变性病(Hallervorden-Spatz病)、脂褐质沉着症、皮克氏病、皮质基底节变性、嗜银粒病(AGD)、额颞叶变性、阿尔茨海默病和额颞叶痴呆。诊断这些疾病的方法是本领域已知的。
与tau接种或聚集相关的示例性症状可以包括，例如，认知功能受损、行为改变、情绪失调、癫痫发作和神经系统结构或功能受损。受损的认知功能包括但不限于记忆力、注意力、注意力、语言、抽象思维、创造力、执行功能、计划和组织方面的困难。改变的行为包括但不限于身体或言语攻击、冲动、抑制力下降、冷漠、主动性下降、性格改变、滥用酒精、烟草或药物，以及其他与成瘾相关的行为。情绪失调包括但不限于抑郁、焦虑、躁狂、易怒和情绪失控。癫痫发作包括但不限于全身性强直阵挛发作、复杂部分性发作和非癫痫性心因性癫痫发作。受损的神经系统结构或功能包括但不限于脑积水、帕金森症、睡眠障碍、精神病、平衡和协调障碍。这包括运动障碍，例如单肢轻瘫、偏瘫、四肢瘫痪、共济失调、颤搐和震颤。这还包括感觉丧失或功能障碍，包括嗅觉、触觉、味觉、视觉和听觉。此外，这包括自主神经系统损伤，例如肠和膀胱功能障碍、性功能障碍、血压和体温失调。最后，这包括可归因于下丘脑和垂体功能障碍的激素损伤，例如生长激素、促甲状腺激素、促黄体激素、促卵泡激素、促性腺激素释放激素、催乳素和许多其他激素和调节剂的缺乏和失调。检测和评估与tau聚集相关的症状的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，与tau聚集相关的症状是指痴呆。痴呆本身并不是一种具体的疾病，而是一个整体术语，它描述了与记忆力或其他思维能力下降相关的广泛症状，下降的严重程度为足以降低一个人进行日常活动的能力。痴呆也是许多与tau蛋白聚集相关的疾病的共同临床特征。有经验的从业者会熟悉多种可用于诊断痴呆严重程度的方法。例如，本领域已知若干痴呆的认知测试和筛查问卷，所有这些都具有不同程度的敏感性和特异性。非限制性例子包括简易精神状态检测表(MMSE)、简易智力检测表(AMTS)、改良的简易精神状态检测表(3MS)、认知功能障碍筛检表(CASI)、连线测试(Trail-makingtest)、时钟绘图测试、老年人认知能力下降的调查问卷、全科医生认知评估、临床痴呆症评级(CDR)、8条目痴呆筛查表(AD8)。
在一些实施方案中，使用临床痴呆评分来量化痴呆症状的严重性。使用临床痴呆评分，0分表示没有症状，0.5分表示非常轻微的症状，1分表示症状较轻，2分表示中度症状，3分表示症状严重。因此，人的临床痴呆评分的任何增加都表明认知恶化和痴呆增加。此外，临床痴呆评分从0到大于0的变化表明痴呆的发展或开始。
在一些实施方案中，与tau接种或聚集相关的症状是指tau病理或tau蛋白病。术语“tau病理”或“tau蛋白病”是指tau的病理接种或聚集。在一些实施方案中，tau病理是指神经原纤维缠结。在其他实施方案中，tau病理是指过度磷酸化的tau。在其他实施方案中，tau病理是指在血液、血浆、血清、CSF或ISF中可检测到的高水平tau聚集体，比在没有疾病的个体中检测到的水平高2至约40倍。
施用
施用本文所述的抗TauC3抗体可用作治疗或免疫tau蛋白病的疗法。
优选为药物级的治疗有效量的抗体(包括免疫反应性片段)可以施用于人。使用标准有效技术进行给药，包括外周给药(即不给药至中枢神经系统)或局部给药至中枢神经系统。外周给药包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂给药。局部给药，包括直接进入中枢神经系统(CNS)，包括但不限于，通过腰椎、脑室内或实质内导管或使用手术植入的控释制剂。
适合治疗的人包括有患病风险但未表现出症状的个体，以及目前表现出症状的受试者。就阿尔茨海默病而言，几乎任何人都有患阿尔茨海默病的风险。因此，本方法可以预防性地施用于一般人群而无需对受试者的风险进行任何评估。这种预防性给药可以在例如50岁或更大年龄开始。本方法对于确实具有tau蛋白病(例如，阿尔茨海默病)已知遗传风险的个体特别有用。此类个体包括那些有亲属患过这种疾病的个体，以及通过遗传或生化标记分析确定其风险的个体。例如，阿尔茨海默病风险的遗传标记包括APP基因中的突变，特别是717位的突变以及670位和671位的突变，分别称为Hardy突变和Swedish突变。其他风险标志物是早老素基因(PS1和PS2)以及ApoE4的突变、AD家族史、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。目前患有阿尔茨海默病的个体可以通过上述风险因素的存在从特征性痴呆中识别出来。此外，许多诊断测试可用于识别患有AD的个体。这些包括成像和/或测量CSF tau和Aβ42水平。tau蛋白升高和Aβ42水平降低表明AD的存在。患有阿尔茨海默病的个体也可以通过阿尔茨海默病和相关疾病协会标准来诊断。
在无症状受试者中，治疗可以在任何年龄(例如，10、20、30、40、50或60)开始。然而，通常在受试者达到40、50、60、70、75或80岁之前不需要开始治疗。治疗通常需要在一段时间内多次给药。治疗可以通过分析抗体、或活化的T细胞或B细胞随时间对治疗剂的反应来监测。如果反应下降，则指示加强剂量。在潜在的唐氏综合症受试者的情况下，治疗可以在产前通过向母亲施用治疗剂或在出生后不久施用治疗剂来开始。
在预防性应用中，将药物组合物或药物以足以消除或降低风险、减轻严重性或延迟疾病发作的量施用于易患或有患tau蛋白病风险的受试者，包括出现在疾病发展过程中疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和中间病理表型。在治疗应用中，将组合物或药物以足以治愈或至少部分阻止疾病的生化、组织学和/或行为症状的量施用于怀疑或已经患有此类疾病的受试者，包括在疾病发展过程中的并发症和中间病理表型。在一些方法中，药剂的施用减少或消除轻度认知障碍。足以完成治疗或预防性治疗的量定义为治疗或预防有效剂量或量。在预防性和治疗性方案中，通常以数个剂量施用药剂，直至获得足够的免疫反应。通常，监测免疫反应并在免疫反应开始减弱时给予重复剂量。
本发明组合物用于治疗上述病症的有效剂量取决于许多不同因素，包括给药方式、靶位、受试者的生理状态、给药的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量需要在临床试验中逐案测试，并经常滴定以优化安全性和有效性。本发明的抗TauC3抗体在某些实施方案中的另一个优点可能是，对于相等的质量剂量，与包含对TauC3的特异性低于根据本发明的抗TauC3抗体的抗体组合物相比，本发明的抗TauC3抗体剂量包含更高摩尔剂量的有效清除和/或“使失活”抗体。通常，本发明的抗TauC3抗体将通过静脉内输注或皮下注射施用。通过静脉输注给药的抗TauC3抗体的量可以从每个受试者0.5到10mg不等。皮下注射通常需要更高的剂量才能以足够的量到达大脑。抗体(例如，完整的IgG分子)可以每月给药一次。
在一些方法中，同时施用具有相同或不同结合特异性的两种或更多种抗体(例如，重组、单克隆、嵌合和/或人源化的)，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量在所示范围内。在这种情况下，两种或更多种抗体都可以针对例如截短的tau。或者，一种或多种抗体可以针对例如截短的tau，并且一种或多种另外的抗体可以针对与阿尔茨海默病相关的淀粉样蛋白-β(Aβ)肽。抗体通常在多次给药。单次剂量之间的间隔可以是每小时、每天、每周、每月或每年。在某些方法中，调整剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在某些方法中为25-300μg/ml。或者，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况下需要较少的给药频率。
剂量和频率根据抗体在受试者中的半衰期而变化。一般来说，人源抗体的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人源抗体。给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些受试者会在他们的余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对较短的间隔内使用相对高的剂量，直到疾病的进展减缓或终止，优选直到受试者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者进行预防性治疗。
阻断TauC3接种的抗TauC3抗体的剂量不一定与抑制TauC3聚集的抗TauC3抗体的剂量相同。基于本说明书中提供的信息，具体剂量可通过常规实验确定。
可以通过测量血浆和/或CSF中的致病性tau或磷酸化tau的水平来评估施用/治疗的功效。基于这种评估，可以相应地调整给药剂量和/或频率。
在某些实施方案中，认知效果也可以被评估。
也可以通过MRI确定的脑萎缩程度来评估效果
给药/治疗的安全性可以通过经历不良事件(AE)、严重AE和临床实验室检查异常、生命体征、ECG、MRI以及身体和神经系统检查以及认知恶化的参与者数量来评估。基于这种评估，可以相应地调整给药剂量和/或频率。
抗TauC3抗体和免疫原可以通过鼻内、皮下注射、肌内注射、IV输注、经皮、口腔等方式给药，或如下文更详细描述的。
药物组合物
根据本发明的药物组合物包含本文所述的抗TauC3抗体或其片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。抗TauC3抗体以1x10-10M至1x10-11M的平衡常数KD结合TauC3，而与全长tau(例如，2N4R)的平衡常数KD为1x10-4M至1x10-8M，或与全长tau(例如，2N4R)没有可检测到的结合。在优选的实施方案中，抗TauC3抗体以1x10-11M至9x10-11M的平衡常数KD结合TauC3，以1x10-8M至9x10-8M的平衡常数KD结合2N4R或显示与4RTau没有可检测到的结合。优选地，抗TauC3抗体与TauC3的解离速率非常慢(即解离速率为1x10-4至1x10-3s-1)并且对4RTau基本上没有亲和力(即，ka小于100,0001/MS)。抗体可以是例如人源化、嵌合或人(例如来自tg小鼠)抗体。
药物组合物被设计成适合于所选择的给药方式，并且适当地使用药学上可接受的赋形剂，例如相容的分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。
通过静脉内或皮下注射的有效外周全身递送是对活体受试者给药的优选方法。用于此类注射的合适载体是易于理解的。
待施用的制剂中人源化抗体的浓度是一个有效量并且范围从低至约0.1重量％至高达约95或约99.9重量％，并且将主要基于流体体积、粘度等进行选择，根据需要选择特定的给药方式。在某些实施方案中，抗体可占组合物的约15重量％或约20重量％。
可将注射给受试者的组合物制成含有1-250ml磷酸盐缓冲盐水的无菌缓冲水和约1-5000mg本发明的抗TauC3抗体中的任一种或组合。制剂可在制成制剂后进行无菌过滤，或制成微生物学可接受的其他方式。用于静脉输注的典型组合物的体积可为1-250ml流体(例如无菌林格氏溶液)，抗tau抗体浓度可为1-100mg/ml或更高。该发现的治疗剂可以冷冻或冻干用于储存并于使用前在合适的无菌载体中重构。冻干和重构可能导致不同程度的抗体活性损失(例如，使用常规免疫球蛋白时，IgM抗体的活性损失往往比IgG抗体更大)。
给药剂量是用于指定目的的有效量，可能必须可以进行调整以补偿。将选择通常具有医药级质量的制剂的pH值以平衡抗体稳定性(化学和物理)和给药时受试者的舒适度。通常，可以容忍介于4和8之间的pH值。基于接受成功给药的个体的大小、体重和其他生理生物学特征，剂量将因个体而异。
在一个方面，典型剂量包含约0.1mg至约10mg本文所述的抗TauC3抗体。在某些实施方案中，典型剂量包含约0.5mg至约10mg的抗TauC3抗体。剂量可在约0.55mg/kg至约10mg/kg的范围内。完整IgG抗体的给药频率通常是每月一次，而抗体片段由于其半衰期较短而需要更频繁地给药，以有效治疗症状。
相对于疾病本身和治疗持续时间的治疗给药时间将取决于病例周围的情况。在诊断出与tau蛋白聚集相关的疾病后，可以开始治疗。或者，可以在临床确认与tau聚集相关的症状后开始治疗。此外，治疗可以在检测到tau病理后开始。治疗可以在医院或诊所立即开始，也可以在出院后或在门诊就诊后开始。治疗持续时间的范围可以从单一剂量一次性给药到终生过程的治疗。
虽然上述方法对于蛋白质如人源化抗体的给药似乎是最方便、最合适和最有效的，但通过适当的适应，也可以采用其他有效的给药技术，例如脑室内给药、透皮给药和口服给药，条件是此处使用了适当的制剂。
基于本文提供的信息和本领域可获得的知识，典型的有效量或剂量可以使用标准临床技术来确定和优化，并且将取决于施用模式。
实施例1：(小鼠MoTau01抗体序列测定)
MoTau01抗体的序列测定
从杂交瘤细胞制备RNA。
保存在-80℃的小鼠杂交瘤细胞(MoTau01)的冷冻沉淀由Genscript代表Tau-Biologic提供，并使用Qiagen RNeasy试剂盒处理以按照制造商的方案分离RNA。
第一链cDNA合成
按照制造商的方案，使用GE Life Sciences第一链cDNA合成试剂盒将MoTau01RNA(～21μg)逆转录以产生cDNA，并如实施例5中所述进行纯化。重复两次以产生3个独立的cDNA产物(第1、2和3轮)以检测和避免逆转录酶诱导的cDNA突变。
cDNA序列测定
MoTau01 cDNA如实施例5中所述通过PCR扩增。使用Phusion Flash高保真PCR预混液，用κ轻链引物加MKC(表1)或重链引物(1-12和14)加MHC混合物(表2)对免疫球蛋白cDNA进行PCR扩增。MoTau01 VH PCR引物组未能产生任何产品。
因此，基于先导区和末端区中的已知序列设计额外的引物，以促进从杂交瘤细胞克隆VH结构域。额外的引物序列包含在引物表中作为MHV13，在“额外引物”部分(表2)。
表1.用于扩增小鼠VK的PCR引物
Figure BDA0003369900800000291
Figure BDA0003369900800000301
Figure BDA0003369900800000311
模糊碱基码：W＝A或T；Y＝C或T；K＝G或T
MKV表示与小鼠κ轻链可变区基因的先导序列杂交的引物；MKC表示与小鼠κ恒定区基因杂交的引物。粗体下划线部分表示M13正向或M13反向测序引物。摆动碱基对(Wobblebase)在定义部分定义。
表2.扩增小鼠VH的PCR引物
Figure BDA0003369900800000312
Figure BDA0003369900800000321
Figure BDA0003369900800000331
模糊碱基码：R＝A或G；K＝G或T；M＝A或C。
MHV表示与小鼠重链可变区基因的先导序列杂交的引物。MHCG表示与小鼠恒定区基因杂交的引物。粗体下划线部分表示M13正向测序引物或M13反向测序引物。引物MHC混合物由引物MHCG1、MHCG2a、MHCG2b和MHCG3的等摩尔混合物组成。“摆动”碱基对在定义部分中定义。
每个PCR反应的结果是单个扩增产物，其使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，并使用M13-正向引物和M13-反向引物(表3)在两个方向上进行测序(通过Eurofins/GATCGenomics)以获得每个免疫球蛋白链的三组独立序列信息。
表3.通用PCR和测序引物
名称 序列(5′→3′)
HCMVi启动子 TGTTCCTTTCCATGGGTCTT(SEQ ID NO：59)
HuG4_LIC_反向 CTCTCGGAGGTGCTCCTGGAG(SEQ ID NO：60)
HuK LIC反向 GCAGTTCCAGATTTCAACTG(SEQ ID NO：61)
M13-正向 TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：62)
M13-反向 CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO：63)
VK和VH MoTau01DNA序列
MoTau01 VK PCR产物和MoTau01 VH PCR产物的共有DNA序列分别显示在图1和2中。获得的可变区DNA序列与Genscript确定的序列相同。MoTau01序列的种系分析显示κ轻链是鼠VK1 IGKV9-124*01，重链是鼠VH1 IGHV10-1*02。
实施例2：(嵌合MoTau01抗体的生成)
嵌合MoTau01表达载体的构建
MoTau01 VH和VK的基因由GenScript合成。使用GenScript专有的软件算法，通过沉默诱变优化MoTau01 VH和VK的序列，以使用人类细胞优先利用和合成的密码子。
嵌合表达载体的构建需要使用不依赖连接酶的克隆(LIC)将合成的可变区克隆到IgG/κ载体中(pHuK和pHuG4-分别为图3和4)。载体(pCMV修饰)用BfuA1(BspM1)消化，然后用T4 DNA聚合酶3′-5′核酸外切酶活性(+dATP)产生相容的突出端。
抗体序列(图5和6)如下产生：首先用含有先导序列3′端的引物(大部分序列存在于载体中)-正向引物-或恒定区的开头(IgG4或κ)-反向引物，通过PCR扩增合成的可变区，然后是可变区的开头(在每个方向)，表4。
表4.克隆和诱变引物
Figure BDA0003369900800000341
Figure BDA0003369900800000351
通过T4 DNA聚合酶+dTTP处理(方案在实施例5中提供)在PCR产物中产生互补突出端。载体和插入物在室温下孵育，转化为具有化学活性的TOP10细菌并接种在卡那霉素板上。分离几个克隆，并使用正向引物HCMVi启动子和HuG4 LIC反向引物(用于VH)或HuK LIC反向引物(用于VK)通过PCR进行筛选(表3)。
选择产生正确大小的PCR产物的克隆，使用QIAGEN试剂盒进行小量制备并使用相同的引物测序。
嵌合抗体的产生
使用ExpiFectamine CHO试剂，将在ExpiCHO转染培养基和抗生素中生长的ExpiCHO悬浮细胞与MoTau01_VH.pHuG4和MoTau01_VK.pHuK(各1μg DNA)共转染。细胞在1mL生长培养基中生长7天。在条件培养基中通过Octet定量测量了高达160μg/mL(表14A)的MoTau01 HuG4k抗体。
嵌合抗体的TauC3结合活性
TauC3和FL Tau抗原由Genscript产生和纯化，并分别以2.54mg/ml或0.24mg/ml的浓度提供。通过结合ELISA测定嵌合抗体与TauC3和FL Tau的结合。嵌合抗体能够以0.7nM的EC50结合TauC3(图7A)，但未观察到与FL Tau的结合(图7B)。没有观察到与任一抗原的非特异性结合，同种型证实观察到的结合是特异性的。使用生物层干涉测量法(OctetRed96，ForteBio第8.12节)测量小鼠和嵌合Tau01抗体与纯化的TauC3的结合。小鼠和嵌合抗体针对20nM-0.31nM TauC3的浓度系列进行了测定(图8A和图8B)。小鼠和嵌合抗体都能够以浓度依赖性方式结合TauC3。还测试了小鼠和嵌合抗体与FL Tau的结合，但观察到低信号或没有结合(图8C和图8D)，证实抗体的结合对TauC3具有特异性。
实施例3：Tau01人源化抗体变体的设计
人类VH和VK cDNA数据库
来源于国际免疫遗传学数据库2009(Lefranc，2015)和Kabat数据库的免疫学蛋白质序列第五版(最后一次更新1999-11-17)(Kabat等，1991)中人和小鼠免疫球蛋白的蛋白质序列被用来编译比对的人免疫球蛋白序列的数据库。该数据库包含10,406个VH和2,894个VK序列。
MoTau01的分子模型
MoTau01 VH和VK序列用于设计MoTau01抗体的人源化形式。MoTau01抗体可变区的同源模型已使用Maestro 11.5中的抗体预测面板生成。所选的人框架用于生成10个循环模型，这些模型是使用一步蛋白质制备向导程序制备的。为所有10个模型生成了蛋白质可靠性报告，在模型质量方面没有发现重大差异。所有10个模型都用于确定CDR环
Figure BDA0003369900800000361
内残基的一致性，以捕获CDR的不同方向。
人框架选择
人源化需要鉴定合适的人v区。使用序列分析程序Gibbs，使用各种选择标准，用MoTau01 VH和VK蛋白质序列查询人类VH和VK数据库。使用Maestro 11.5
Figure BDA0003369900800000363
软件，鉴定了小鼠Tau01抗体结构中CDR残基(IMGT定义)
Figure BDA0003369900800000362
内的FW残基，并将其命名为“
Figure BDA0003369900800000373
邻近残基”。在
Figure BDA0003369900800000374
邻近残基中与MoTau01 VH具有最高同一性的人类VH序列比对显示在表5中。表6列出了这些包膜(envelope)残基和VCI，以及FW、VCI或
Figure BDA0003369900800000371
邻近(proximity)残基中与表5序列的小鼠等效位置相同的残基数量。
从分析中去除人源化序列和不完整序列。选择序列DQ840895.1作为人重链供体候选物。该序列在序列同一性和相似性方面得分很高，并且只有2个来自其IGHV3-73*01 VH种系的体细胞突变。它有八个
Figure BDA0003369900800000372
邻近残基和一个VCI残基变化，但这是可获得的最少变化(表8)。
Figure BDA0003369900800000381
Figure BDA0003369900800000391
Figure BDA0003369900800000401
同样，选择序列L33034作为人κ轻链供体候选物。该序列与Tau01 VK的序列同一性和相似性得分很高，并且只有1个来自IGKV1-17*01种系的体细胞突变。它有五个潜在的
Figure BDA0003369900800000411
邻近残基和一个VCI残基变化。
κ轻链人源化策略的序列示于表12中。
Figure BDA0003369900800000421
Figure BDA0003369900800000431
Figure BDA0003369900800000441
Tau01人源化重链变体的设计
一旦确定了合适的人框架，就可以设计合成蛋白质和DNA序列。Tau01人源化形式的初始设计是将MoTau01 VH的CDR1、2和3嫁接到DQ840895.1的受体FW，从而产生变体Tau01HA。在人源化形式Tau01 HB中，然后将8个
Figure BDA0003369900800000451
邻近残基和1个VCI残基(位于1、4、35、49、58、61和76-78位)回复突变为小鼠等效残基，在以下变体中一次突变一个：序列在计算机中组装并指定为Tau01 HD至Tau01 HL。表8比较了Tau01 VH蛋白序列的鼠和人源化形式。
Tau01人源化轻链变体的设计
来自L33034的框架用于设计人源化构建体的DNA和蛋白质。来自Tau01 VK的CDR1、2和3显示为嫁接到L33034的受体FW中，以生成人源化Tau01的初始形式。在Tau01 KA的第34、36、44、53、69和71位有五个未匹配的
Figure BDA0003369900800000453
邻近残基和一个VCI残基，它们被回复突变为变体Tau01 KB中的小鼠等效残基(表12)。
在以下变体中，这些残基一次突变一个：在计算机中组装序列并命名为Tau01 KD至Tau01 KI。在Tau01 KG形式中，残基K，回复突变为小鼠残基T，也突变为人种系残基S。这个额外的变体被命名为Tau01 KJ。
重链和轻链C形式的设计
在最初人源化变体的设计之后，建立并评估了Tau01 HAKA的同源模型。后一个模型与小鼠抗体模型重叠。在模型中突出显示并检查了针对回复突变确定的每个位置以及这些位置周围的
Figure BDA0003369900800000452
残基。基于该数据，预测哪些残基对回复突变最重要，并且将这些残基掺入以形成重链的HC形式(表8)和轻链的KC形式(表12)。
实施例4：(人源化抗体的产生和特性)
Tau01人源化抗体的产生
Tau01 HA/B/C和KA/B/C的序列经过密码子优化以使用人类细胞优先利用的密码子并由Genscript合成。KA/B/C和HA/B/C构建体被PCR扩增并在不依赖连接酶的克隆反应中克隆到pHuK和pHuG4中，用于转化TOP10细菌。随后使用表4中的引物通过PCR诱变对HA或KA形式进行修改，以获得分别在表8或12中注释的其他人源化变体。
使用QIAGEN Plasmid Miniprep试剂盒或Qiagen Plasmid Maxiprep试剂盒对克隆进行测序并制备质粒DNA。表达构建体序列(HA、HB、HC、KA、KB和KC)如图9至14所示。
抗体表达
编码(人源化或嵌合)VH和VK的表达质粒制剂用于转染ExpiCHO细胞，在无血清培养基中培养7天，然后收获含有分泌抗体的条件培养基。ExpiCHO细胞条件培养基中IgG4κ抗体的浓度通过octet测量并显示在表14A-C中。大多数抗体以良好的表达水平产生。
表14.转染的ExpiCHO细胞条件培养基中的IgG水平
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*转染对照Hu1210 HuG1K的表达也降低(预期水平～100μg/ml)。
人源化抗体最初形式的抗原结合
人源化变体与所提供的TauC3抗原的结合通过如实施例5中所述的结合ELISA来测试。图15中所示的数据显示了TauC3与人源化抗体的ELISA结合，该人源化抗体由HA/HB重链和KA/KB轻链组成。HAKA和HAKB人源化抗体不与TauC3结合。MoTau01HuG4K嵌合体以0.65nM的EC50值与TauC3结合，HBKA和HBKB变体以类似的EC50值结合，HBKB形式最接近(0.78nM)。
考虑到该数据，表达了人源化重链和轻链的其他形式，每个形式具有单个回复突变(表8和12)。图16显示了重链单突变体和HC形式与KA-KC组合的结果，通过ELISA测试与TauC3的结合。数据显示重链单突变体不能像嵌合抗体一样结合TauC3。与KA-KC组合的HB和HC形式以最高的EC50值与TauC3结合，HBKB和HBKC显示出与嵌合抗体最接近的值(分别为0.81nM和0.84nM)。如第8.12节所述，在Octet仪器上使用一种浓度的TauC3进行筛选实验证实了这些结果(图17)。Octet数据不是最佳的，因为可以观察到两相结合和解离事件，这可能是由于TauC3蛋白的性质。然而，Octet数据足以筛选和排序人源化的候选物。
由于HB/HC是最好的重链形式，通过结合ELISA(图18)和Octet筛选试验(图19A和图19B)测试它们与所有轻链形式(KA-KJ)的组合与TauC3的结合。许多轻链单突变体能够保持与TauC3的结合，但轻链形式KE、KG、KI和KJ在两种测定中排名最高。
第二轮人源化抗体的设计与生成
基于初始人源化变体的次优结合结果，通过将额外的回复突变并入HC和KC形式(分别为HM-HO和KL和KM)或组合KA形式(KN-KP)的两个回复来设计第二轮变体(表8和12)。进行诱变、DNA制备、表达和定量。获得的表达水平显示在表14D和表14E中。大多数抗体以良好的表达水平产生。
表14.转染的ExpiCHO细胞条件培养基中的IgG水平
Figure BDA0003369900800000501
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第二轮人源化Tau01抗体的抗原结合
为了评价重链，通过ELISA(图20)和Octet(图21)测试了包含HM、HN和HO与轻链KA、KB、KG、KI、KJ组合的抗体变体针对TauC3的结合活性。HM和HO变体在两种测定中排名最高。HO和HM变体之间的唯一区别是位置4中L-V的额外回复突变，这也存在于HN变体中。由于HN形式的结合不如HM形式好，因此认为不需要L-V回复突变，因此从第二轮设计中选择HM作为头部重链。
表达先导重链HM与数条轻链；KA-KC，先前高亮选中的单突变体(KE，KG，KI，KJ)和第二轮设计的KL，KN，KO，KP。为了比较，这些轻链还与较早优选的重链HC组合表达。通过结合ELISA来测试这些人源化抗体变体针对TauC3的结合(图22)。总体而言，HM变体以比HC变体更高的EC50结合，因此在Octet筛选实验中评估了前一种变体(图23)。抗体变体HMKE、HMKN、HMKO和HMKP在两种测定中均排名最高。KM轻链也与HC/HM组合进行筛选，并通过Octet与先导抗体变体进行比较(图24A)。HMKM形式在Octet筛选实验中排名非常高，而HCKM排名最低。还使用Octet测试了人源化先导物对FL Tau的结合，以确定保留了多少选择性(图24B)。使用500nM的FL Tau获得的信号非常低(0.03-0.07nm)，处于非特异性结合的范围内。
为了进一步评估在Octet上观察到的结合数据，在Biacore200仪器上进行了解离率排序实验。Biacore提供比Octet更高的选择性，并通过稳定抗原的胺偶联促进TauC3固定到CM5芯片上。这将产生具有稳定基线和良好重复性反应的更高质量数据。一旦TauC3被固定化，加入一种浓度(5nM)的抗体，然后进行解离和再生步骤(第8.20节)。使用两相衰减模型拟合解离率(图25B)或使用单相衰减模型仅拟合第二个解离率(图25A)。然后根据使用拟合和比较获得的解离率对候选物进行排名。数据与Octet结果一致(尽管排名顺序不同)，突出显示Tau01 HMKM、HMKO、HMKP、HMKN和HMKE作为具有最慢解离率的人源化变体。通过将抗体负载到Protein G芯片上并添加250nM的FL Tau，Biacore也证实了FL Tau与嵌合和人源化候选物缺乏结合。图26显示没有观察到MoTau01HuG4k或Tau01 HCKB的结合。
人源化Tau01候选抗体的热稳定性
该实验的目的是测试嵌合抗体和一些人源化抗体(Tau01 HCKG、HCKN、HMKE、HMKN、HMKO、HMKP)在经受更高温度时的热稳定性，从35℃到95℃保持10分钟，冷却至4℃，并以每个候选物的EC80浓度用于结合ELISA(第8.15节)。所有人源化候选抗体都比嵌合抗体更稳定，保持与TauC3的结合能力直到67-68℃，然后与TauC3的结合降低(图27)。与嵌合抗体MoTau01 HuG4k相比，人源化变体表现出更高的热稳定性，前者仅在至多约55℃时保持结合。与测试的HC重链变体相比，含有HM重链的变体可在略微更高的温度下保持结合。
先导人源化Tau01候选抗体的选择
将所有这些结果放在一起，选择先导人源化抗体变体Tau01 HMKE、HMKM、HMKN、HMKO和HMKP进行放大，并使用亲和色谱和尺寸排阻色谱进行纯化，如第8.16节所述。在一系列生物物理测定中进一步表征纯化的抗体。与TauC3结合较弱的HCKB人源化候选物也被放大用于表达和纯化，以用作比较抗体，用于在接种试验中进行排名。这将使我们能够进一步测试体外抗体亲和力与细胞测定中的效力之间的相关性。
人源化Tau01候选抗体的聚集
作为纯化后QC过程的一部分，对抗体样品进行SEC-MALS/DLS，随后进行质谱分析。为了确定绝对摩尔质量并检查聚集情况，将纯化的抗体样品注射到HPLC系统中的尺寸排阻柱中，并通过多角度光散射进行分析。MoTau01 HuG4k和Tau01 HMKM的图没有显示的聚集迹象，平均分子量约为147-8kDa，这是该分析设置中IgG单体的预期范围(图28A)。Tau01 HCKB抗体谱具有宽峰，该峰使数据产生偏差，导致分子量为179.6kDa(图28B)。所有三种抗体都是单分散的(Mw/Mn＜1.05)并且没有显示聚集迹象。
动态光散射是静态光散射(SEC-MALS)的补充技术，用于检测可溶性聚集体，并用于QC人源化变体Tau01 HMKN、HMKO、HMKP和HMKE。抗体的Z-Ave或流体动力学直径预计约为10，如果样品是单分散的，则多分散指数(PdI)应＜0.1。如图29所示，所有抗体样品都包含一个主要群体，该群体是单分散的并且与单克隆抗体的大小一致。
为了确认抗体的准确分子量，对完整的和减少的抗体样品进行质谱分析，如图30A至图30G所示。分子量与所有测试的抗体的预测分子量相匹配，并确认了氨基酸序列。没有标记其他冗余(liabilities)。总体而言，纯化的嵌合抗体和人源化抗体通过了QC。
人源化Tau01候选抗体针对TauC3的动力学研究
为了确定结合相互作用的亲和力，开发了biacore动力学分析，其涉及通过胺偶联将TauC3固定在CM5芯片上，并在其上注射一系列浓度的相应抗体。嵌合抗体以57pM的KD结合TauC3(图31A)。
图31B显示Tau01 HCKB是最弱的TauC3结合剂(1.2nM)，其次是HMKM，其以110pM的亲和力结合TauC3(图31G)。图31C-F中所示的Tau01 HMKO、HMKN、HMKP和HMKE具有与嵌合抗体相当或更紧密的KD值。然而，与嵌合体相比，所有人源化候选物的解离率都略快(人源化为0.001-0.004，嵌合体为0.0007)。应该注意的是，ka处于仪器的极限值，因此应谨慎比较绝对值。可以得出结论，抗体HMKN、HMKP和HMKE在皮摩尔范围内结合，并且在所有测试的人源化变体中具有最慢的解离速率。
人源化Tau01候选抗体的解链温度(Tm)的测定
为了确定先导抗体Tau01HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP的解链温度，进行了热位移测定。在qPCR热循环仪(第8.21节)中，将样品与荧光染料(Sypro Orange)孵育71个循环，每个循环增加1℃。人源化抗体的Tm计算为68-69℃。(图32)。
人源化Tau01候选抗体的非特异性蛋白质与蛋白质相互作用(CIC)
使用大量纯化的人多克隆IgG的交叉相互作用色谱法是一种用于监测非特异性蛋白质与蛋白质相互作用的技术，并且可以提供任何溶解度问题的指示，这会引起下游制造问题，如实施例5中所解释的。保留指数(k′)升高表明自相互作用倾向和低溶解度。人源化Tau01 HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP候选抗体显示出低于0.038的保留指数，表明非特异性相互作用的低倾向和良好的溶解性(图33)。
人源化Tau01候选抗体的溶解度
使用溶剂吸收浓缩器(MWCO 7500kDa)浓缩人源化Tau01 HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP候选抗体，并定时间隔测量浓度。Tau01 HMKP浓缩至123mg/ml，Tau01 HMKN、HMKM和MoTau01HuG4K抗体浓缩至87-88mg/mL(图34)。Tau01 HMKO HuG4K浓缩至59mg/ml，没有明显沉淀，Tau01 HMKE HuG4K浓缩至57mg/ml。数据表明，抗体在高达57mg/mL的浓度下不易沉淀。
通过圆二色性对人源化Tau01候选抗体进行冻融和热应激分析
圆二色性(CD)是一种光谱技术，它允许我们观察纯化蛋白质样品的整体二级结构。
冻融(FT)应激实验包括将纯化的候选抗体样品在-80℃下进行10个15分钟的循环，然后在室温下解冻15分钟。为了进行热应激实验，将纯化的候选抗体样品暴露在a)4℃，b)室温(RT)，c)37℃和d)50℃的温度下25天。
然后通过圆二色性分析样品以检查是否保留了二级结构(图35)。测试的所有人源化变体都通过了我们的内部阈值。总的来说，数据表明热应激和冻融循环不影响人源化Tau01 HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP候选抗体的二级结构。
人源化Tau01候选抗体的等电点分析
使用毛细管等电聚焦(cIEF)进行人源化候选抗体的pI分析。该技术允许使用贯穿毛细管的pH梯度根据抗体的等电点(pI)分离抗体。图36显示了色谱图，表15显示了每种抗体的主要pI同种型(定义为大于10％的峰面积)和每种抗体的pI范围。人源化Tau01HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP候选的主要等电点为～8.86-8.81。
人源化Tau01候选抗体的血清稳定性评估
嵌合抗体和人源化抗体的纯化样品在小鼠、人和食蟹猴血清中孵育21天。通过对TauC3的结合ELISA，将在3种不同血清中孵育的Tau01 HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP候选抗体的结合与在PBS中孵育的抗体和4℃阳性对照样品进行比较(图37)。Tau01 HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP候选抗体在小鼠、人类和食蟹猴血清中孵育后仍保持其结合能力。
先导Tau01 HMKEHMKN、HMKO、HMKP、HMKM人源化候选物与MoTau01HuG4k相比的数据总结
表16显示了与嵌合抗体MoTau01 HuG4k相比，先导人源化Tau01 HMKE、HMKN、HMKO、HMKP、HMKM抗体候选物的结合、动力学亲和力和生物物理特性的总结。所有人源化候选物的结合都在皮摩尔范围内，但其中，Tau01 HMKN、HMKO和HMKP具有最高的亲和力和最慢的解离速率，并且还通过了我们所有的生物物理测定。考虑到所有数据，Tau01 HMKP被选为主要的人源化候选物，因为它具有最高的亲和力、缓慢的解离率并且在生物物理分析中没有显示出潜在的冗余。Tau01 HMKN和Tau01 HMKO和KMKE都是很好的后备人源化先导候选物，因为它们也具有优异的特性。
表16
最终人源化候选抗体总结
Figure BDA0003369900800000561
Figure BDA0003369900800000571
结论
本研究项目的目的是将MoTau01抗体人源化并确保所得抗体与嵌合抗体相比能够以相当的亲和力结合TauC3。MoTau01抗体已被设计并表达为人源化抗体，而不会显著损失结合亲和力。Tau01 HMKE、HMKM、HMKN、HMKO、HMKP人源化抗体在结合ELISA、Octet排序和使用Biacore的动力学研究中显示出高亲和力，在皮摩尔范围内(图31)，并且还通过了我们所有的生物物理测定。
Tau01 HMKP抗体显示出最好的药物样特征以及优异的结合动力学，因此被选为主要候选物(表16)。在我们看来，出色的结合、表达、热稳定性、亲和力和生物物理特性的组合使Tau01 HMKP成为适合进一步开发的候选抗体。Tau01HMKN、HMKO和HMKE也表现出优异的特性，是非常好的后备人源化先导候选物。
实施例5(方案)
在实施例1-4中使用了以下方案/程序。
用于分离总RNA(Qiagen)的RNeasy Mini方案
1.通过添加缓冲液RLT破坏细胞。对于沉淀的细胞，通过轻弹管彻底松开细胞沉淀。添加缓冲液RLT(600μl)，然后继续执行步骤2。注意：细胞沉淀的不完全松动可能会导致裂解效率低下和产量降低。
2.通过安装在无RNase注射器上的18-20号针头，将通过裂解液的细胞均质化至少5次。
3.向均质化的裂解液中加入1倍体积的70％乙醇，并通过移液器充分混合。不要离心。由于均质化过程中的损失，裂解物的体积可能小于600μl。
4.将至多700μl的样品(包括可能形成的任何沉淀物)转移到放置在2mL收集管中的RNeasy离心柱中。轻轻盖上盖子，以≥8000xg的速度离心15秒。弃去流穿液(flow-through)。重复使用步骤5中的离心管。
5.向RNeasy柱中加入700μl缓冲液RW1。轻轻盖上盖子，以≥8000xg离心15秒以清洗柱膜。弃去流穿液。重复使用步骤6中的离心管。
6.向RNeasy柱中加入500μl缓冲液RPE。轻轻盖上盖子，以≥8000xg离心15秒以清洗柱膜。弃去流穿液。在步骤7中重复使用离心管。
6.再向RNeasy柱中加入500μl缓冲液RPE。轻轻盖上盖子，以≥8000xg离心2分钟，以干燥RNeasy离心柱膜。
7.将RNeasy离心柱置于新的2mL收集管中，并弃去带有流穿液的旧收集管。轻轻盖上盖子，全速离心1分钟。
8.为了进行洗脱，将RNeasy柱转移至新的1.5mL收集管。将30μl无RNase的水直接添加到RNeasy离心柱膜上。轻轻关闭管子。静置1分钟，然后以≥8000xg离心1分钟。
第一链cDNA合成方案(GE Life Sciences)
1.将RNA样品放入微量离心管中，加入无RNase的水，使RNA达到合适的体积(20μL-12倍稀释，见表A)。
2.将RNA溶液加热至65℃保持10分钟，然后在冰上冷却。轻轻吸取大量第一链cDNA反应混合物以获得均匀的悬浮液。(储存时，BSA可能会在混合物中沉淀；这种沉淀物会在孵育过程中溶解)。
3.将大量第一链cDNA反应混合物(11μL)添加到无菌1.5或0.5mL微量离心管中。在该管中加入1μL的DTT溶液、1μL(0.2μg，1∶25稀释)的NotI-d(T)18引物和热变性的RNA。移液器上下数次混合。
4.在37℃孵育1小时，95℃加热灭活转录酶5分钟。
表A.第一链反应中组分的体积
大量第一链反应混合物 引物 DTT RNA 第一链反应最终体积
11μL 1μL 1μL 20μL 33μL
cDNA纯化
1.一个简单的方案，旨在去除可能干扰后续PCR反应的污染的第一链cDNA引物。
2.加入99μl缓冲液QG(来自Qiagen凝胶提取试剂盒，货号：28704)和33μl的IPA。混合并添加到QiaQuick凝胶提取柱中。旋转并弃去流穿液。
3.用500μl缓冲液QG清洗柱子一次。弃去流穿液。
4.用750μl缓冲液PE清洗柱子一次。弃去流穿液。
5.旋转色谱柱以除去任何残留的酒精并使色谱柱干燥。
6.用50μl预热至65℃的蒸馏水洗脱cDNA。
小鼠可变区的PCR克隆
1.使用表1和2中的引物对纯化的cDNA进行PCR反应。在每个反应中使用不同的正向引物(MHV1-12和14以及MKV1-11)，如下所示：
Figure BDA0003369900800000591
2.循环：
Figure BDA0003369900800000592
Figure BDA0003369900800000601
3.在2％(w/v)琼脂糖凝胶上对来自每个PCR反应的5μl样品进行电泳以确定哪个先导引物产生PCR产物。阳性PCR克隆的大小约为420-500bp。
4.对于阳性克隆，使用QIAGEN PCR纯化试剂盒对剩余样品进行PCR纯化，洗脱到40μL不含核酸酶的水中。送至外部承包商(例如GATC)，使用M13正向引物和M13反向引物进行PCR片段测序。
QIAquick PCR纯化的微量离心和真空方案(QIAGEN)
1.在传统台式微量离心机中，所有离心步骤均以17,900xg(13,000rpm)的速度进行。
2.将5倍体积的缓冲液PB添加到1倍体积的PCR反应物中并混合。如果混合物的颜色为橙色或紫色，则加入10μl的3M醋酸钠，pH5.0，并混合。混合物的颜色会变成黄色。
3.将QIAquick色谱柱放入提供的2mL收集管或真空歧管中。
4.为了结合DNA，将样品加到QIAquick柱上并离心30-60秒或对歧管施加真空直到所有样品都通过柱子。弃去流穿液并将QIAquick色谱柱放回同一管中。
5.洗涤时，向QIAquick柱中加入0.75mL缓冲液PE，离心30-60秒或抽真空。弃去流穿液并将QIAquick色谱柱放回同一管中。
6.将色谱柱在2mL收集管(已提供)中离心1分钟。
7.将每个QIAquick柱放入干净的1.5mL微量离心管中。
8.为了洗脱DNA，在QIAquick膜的中心加入40-50μl缓冲液EB(10mM Tris·Cl，pH8.5)，然后离心柱子1分钟。
通过LIC产生mAb表达载体
插入准备
1.使用序列生成LIC引物。
2.使用LIC引物对密码子优化的合成基因(Genscript)进行LIC PCR(表4)。
3.设置PCR反应：
Figure BDA0003369900800000602
Figure BDA0003369900800000611
注意：在此步骤中必须使用产生平末端PCR产物的聚合酶。其他产生T突出端的聚合酶不适用。
4.循环：
Figure BDA0003369900800000612
5.在凝胶上运行5μL PCR产物，以确保产物大小正确——应该在370bp左右。
6.PCR纯化产物使用Qiagen PCR纯化试剂盒去除核苷酸和引物。洗脱到40μL不含核酸酶的水中。
7.T4 DNA聚合酶处理插入片段：
Figure BDA0003369900800000613
8.在室温下孵育30分钟，然后在70℃下灭活酶20分钟。
载体制备
9.通过在50℃下孵育3小时或过夜，用BfuAI消化LlC载体(图3和4中显示的载体图)：
Figure BDA0003369900800000614
Figure BDA0003369900800000621
10.BfuAI消化后加入：2μL Bam HI，并在37℃下孵育2小时。
11.在含有1x SYBR Safe DNA染色剂的1％(w/v)琼脂糖/1x TAE凝胶上运行消化的载体。可能会看到两条带-切出较高MW带并使用凝胶提取试剂盒提取，在50μL的EB中洗脱。
12.T4 DNA聚合酶如下处理载体：
Figure BDA0003369900800000622
13.在室温下孵育30分钟，然后在70℃下灭活酶20分钟。
克隆
14.在室温下，将1μL插入物与0.5μL载体混合在总共10μL不含核酸酶的水中20分钟。始终进行载体单独转化。
15.按照制造商的说明，使用连接混合物转化25-50μL具有化学活性的InvitrogenTOP 10细菌，并涂抹在含有卡那霉素(50μg/mL)的90mm直径LB琼脂平板上。在37℃下孵育过夜。
从转化体中挑选克隆
16.使用Phusion PCR预混液进行PCR确认：
试剂 体积(对于20μl最终反应体积)
2x Phusion PCR预混液 25μL
HCMVi引物 1μL
HuG4/HuK LIC引物 1μL
dH<sub>2</sub>0 至23μL
DNA 菌落浸渍(同一菌落的日培养)
Figure BDA0003369900800000623
Figure BDA0003369900800000631
17.在2％琼脂糖E-Gel凝胶盒上运行每个PCR反应并运行15分钟以确定凝胶上任何PCR产物条带的大小。
18.使用补充有卡那霉素的LB将起始培养物培养过夜，以小量制备构建体，并对至少两个可变基因的独立阳性克隆的DNA进行测序(使用相同的引物)，以识别由于PCR反应本身导致的任何可能的错误。
TOP10TM大肠杆菌的转化(Invitrogen方案)
1.将装有连接反应物的小瓶短暂离心并置于冰上。
2.在冰上解冻一瓶50μL的One Shot细胞，用于一次或两次连接/转化。
3.用移液管将1至2μL的各连接反应液直接加入感受态细胞的小瓶中，轻轻敲击混合。不要通过移液上下混合。剩余的连接混合物可在-20℃下储存。
4.在冰上孵育小瓶15-30分钟。
5.在42℃水浴中孵育恰好30秒，然后置于冰上2分钟。
6.向每个小瓶中加入250μL预热的S.O.C培养基。
7.在摇动培养箱中以225rpm的速度在37℃下摇动小瓶恰好1小时。
8.将每个转化瓶中的200μL涂抹在单独的、标记的LB琼脂平板上，该LB琼脂平板含有500μg/mL卡那霉素。
9.翻转平板并在37℃下孵育过夜。
使用
Figure BDA0003369900800000632
对质粒DNA进行小量制备分离(Oiagen方案)
1.在250μL缓冲液P1中重悬沉淀的细菌细胞并转移到微量离心管中。确保RNase A已添加到缓冲液P1中。
2.加入250μL缓冲液P2，轻轻颠倒试管4-6次以混匀。
3.加入350μL缓冲液N3并立即轻轻颠倒试管4-6次。溶液应该变得混浊。
4.在台式微型离心机中以13,000rpm(～17,900xg)离心10分钟。将形成紧凑的白色颗粒。
5.通过移液将步骤4中的上清液加入QIAprep离心柱。
6.离心30-60秒。弃去流穿液。
7.通过添加0.5mL缓冲液PB并离心30-60s来洗涤柱。
8.通过添加0.75mL缓冲液PE并离心30-60s来洗涤柱。
9.弃去流穿液，再离心1分钟。
10.将QIAprep柱放入干净的1.5mL微量离心管中。洗脱DNA，向QIAprep离心柱中心加入50μL不含核酸酶的水，静置1分钟，然后离心1分钟。
24孔板中的ExpiCHO转染1ml转染(ExpiCHOTM表达系统试剂盒-Invitrogen)
1.传代并扩增expiCHO细胞，直到细胞密度达到大约4-6x106个活细胞/mL。
2.在转染前一天(第-1天)，将expiCHO培养物分成3-4x106个活细胞/mL的最终密度，让细胞生长过夜。
3.将细胞稀释至6x106个活细胞/mL。
4.将0.9mL细胞分装到用于转染的24孔板的每个孔中。
5.制备ExpiFectamine/DNA复合物。
6.通过将1μL DNA添加至终体积为50μL OptiPro的每个待转染的孔中来稀释质粒DNA(每毫升待转染培养体积1μg质粒DNA)。
7.对于每个待转染的孔，在46μL的OptiPro培养基中稀释4μL的ExpiFectamineCHO试剂(无需孵育时间)。
8.将稀释的ExpiFectamine CHO添加到稀释的DNA中，轻轻移液3-4次混合(孵育1到5分钟)。
9.向24孔板中含有培养物的每个孔中加入100μL复合混合物。
10.用透气的盖子盖住板。
11.将24孔板置于具有8％CO2的37℃培养箱中的轨道摇床上(对于轨道行程为19毫米的摇床，建议摇床速度为225rpm)。
12.转染后18-22小时添加ExpiFectamine增强剂(6ul ExpiCHO增强剂)和ExpiCHO进料(190ul ExpiCHO进料)
13.转染后第7-8天，蛋白质表达通常已完成，上清液已准备好收集。
通过Octet对IgG进行定量
1.按如下方式制备100μl的各浓度的标准曲线和ExpiCHO上清液：
a.HuG4K同种型标准品，浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.81、3.9μg/ml，使用ExpiCHO表达培养基作为稀释剂；
b.测试(未知)样品。
2.在200μl ExpiCHO表达培养基中预浸泡(≥10分钟)蛋白G包被的生物传感器(Pall ForteBio)。
3.将45μl标准品和测试样品分装到384孔倾斜底板中，一式两份，包括仅培养基对照。密封板并在台式离心机中旋转(1000rpm，1分钟)。
4.取下板密封件，并将板和预浸传感器插入Octet。
5.如下进行定量：
a.在10mM甘氨酸(pH 1.5)中再生蛋白G包被的传感器5秒，并在ExpiCHO表达培养基中中和5秒。重复三遍。
b.测量标准品或样品120秒。
c.重复上述再生和中和步骤。
6.将数据导入分析软件并将数据拟合到剂量响应的5PL加权拟合中，以给出IgG浓度(以μg/ml为单位)。
TauC3结合ELISA
1.在94/384孔MaxiSorp板的每个孔中，分别在96/384孔板的每孔中涂上50/30μL的1μg/mL TauC3的PBS等分试样。在4℃下孵育过夜。
2.用PBS-T(0.1％吐温20)洗涤3次。
3.在96/384孔板中，每孔分别用150/80μL PBS+5％BSA+0.1％吐温20封闭。
4.在37℃下孵育1小时。用PBS-T(0.1％吐温20)洗涤3次。
5.将在PBS+0.2％BSA+0.1％吐温20中连续稀释的50/30μl一抗添加到检测板(分别为96/384孔板)中。使用从～4μg/mL开始的3倍稀释系列。重复孵育和洗涤步骤(步骤4)。
6.在PBS+0.2％BSA+0.1％吐温20中每10ml稀释3ul抗人κ链HRP(Sigma A7164-1mL)，并在96/384孔板的每个孔中分别加入50/30μL。重复孵育和洗涤步骤(步骤4)。
7.每孔加入75/20μL的K-Blue底物(Neogen)并在室温下孵育5-10分钟。
8.通过向96/384孔板的每个孔中分别加入50/10μl的RED STOP溶液(Neogen)来停止反应。
9.使用Pherastar Plus读取650nm处的光密度。
通过Octet进行的Tau01变体筛选和亲和力测定
1.临使用前，将蛋白G包被的传感器(Pall ForteBio)在HBS-P+缓冲液中孵育10分钟。
2.将HBS-P+中的1μg/mL抗体装载到Protein G传感器上600秒(固定水平为0.8-1nm)。
3.让传感器在HBS-P+中平衡180秒。
4.对于筛选实验，使用10nM TauC3执行结合步骤600秒。对于动力学分析，在HBS-P+中装载～0.5μg/mL抗体10分钟，并使用浓度范围为20nM至0.31nM的TauC3的执行结合步骤10分钟。
5.在HBS-P+中执行解离步骤600秒。
6.用10mM甘氨酸(pH1.5-2.0)再生传感器5-30秒，然后通过在HBS-P+缓冲液中孵育30-60秒来中和。重复三遍。
QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(Stratagene)
1.如下所示准备反应：
a.5μL的10×反应缓冲液
b.0.12μL(25ng)的RHA或RKA模板
c.1.3μL(125ng)的寡核苷酸突变正向引物
d.1.3μL(125ng)的寡核苷酸突变反向引物
e.1μL的dNTP混合物
f.1.5μL的QuikSolution试剂
g.ddH2O至终体积为50μL
h.1μL的QuikChange Lightning酶。
2.使用下表中列出的循环参数循环每个反应：
Figure BDA0003369900800000661
3.加入2μL的Dpn I限制酶。
4.轻轻彻底混合每个反应，短暂微量离心，然后立即在37℃孵育5分钟以消化亲本dsDNA。
5.将来自每个反应的2μL Dpn I处理的DNA转化为单独的45μL(+2μL的β-ME)等分的XL10-Gold超感受态细胞(参见TOP10TM大肠杆菌的转化)。
6.使用Phusion方法、小量制备和序列筛选菌落以检查正确的突变。
Qiagen HiSpeed Maxiprep系统方案
1.从新鲜划线的选择性平板或目标克隆的甘油储备中挑选，并接种补充有卡那霉素的2-5ml LB培养基的起始培养物。在37℃下以250-300rpm振荡孵育约8小时。
2.将起始培养物稀释1/1000并接种150-250mL补充有来自起始培养物的卡那霉素的LB培养基，并在37℃下以250-300rpm振荡孵育过夜(12-16小时)。
3.以6,000×g的速度收集细胞15分钟。弃去上清液。
4.通过涡旋或移液将细胞沉淀完全重悬在10mL缓冲液P1中。
5.加入10mL缓冲液P2。剧烈颠倒4-6次以混合。在室温下孵育5分钟。
6.加入10mL冷却的缓冲液P3。剧烈颠倒4-6次以混合。
7.将裂解液倒入QIAfilter Cartridge的桶中。在室温下孵育10分钟。
8.加入10ml缓冲液QBT以平衡HiSpeed Maxi Tip，并通过重力流排空。
9.使用QIAfilter，将裂解液过滤到平衡的HiSpeed Maxi Tip中。允许裂解液通过重力流进入树脂。
10.用60ml缓冲液QC清洗HiSpeed Maxi Tip。
11.用15ml缓冲液QF洗脱DNA。
12.向洗脱的DNA中加入10.5ml异丙醇以沉淀DNA。在室温下混合并孵育5分钟。
13.将洗脱液/异丙醇混合物转移到30ml注射器中，并通过QIAprecipitator模块过滤。
14.用2ml70％乙醇清洗QIAprecipitator中的DNA。通过多次挤压使空气通过QIAprecipitator来干燥膜。
15.使用5ml注射器，在1ml不含核酸酶的水中洗脱DNA。将洗脱液转移到注射器中并进行第二次洗脱。
热稳定性比较
1.将完全人源化抗体和嵌合对照在PBS/0.2％吐温中稀释至1μg/mL，并以适当体积的EC80浓度等分试样到PCR管中。使用相同的缓冲液将体积调至100μl。
2.在30℃和85℃之间的温度下以5℃的间隔分别加热每管10分钟，然后冷却至4℃。
3.将1μg/mL的储备液冷冻1小时，然后稀释至EC80浓度。
4.在96孔板中，每孔使用100μl每种抗体(每个温度检测一式两份)，进行针对TauC3的结合检测(第8.11节)。
Tau01人源化抗体的Biacore解离率排序和动力学研究
解离率排序
1.在CM5芯片(GE Healthcare)中的1个流道上，在乙酸盐缓冲液pH5中，胺偶联0.5μg/mL人TauC3。使用固定向导(immobilization wizard)导向(aim)～15RU，以HBS-EP+作为运行缓冲区。
2.以30μL/min的流速装载2.5nM HBS-EP+缓冲液的抗体上清液300秒，然后解离600秒，使用3M的MgCl2进行30秒再生。导出原始数据，减去缓冲区基线并使用GraphPadPrism中的单相衰减或两相衰减拟合数据。
动力学
1.在CM5芯片的1个流道上，在乙酸盐缓冲液pH5中，胺偶联0.5μg/mL人TauC3。使用固定向导导向～15RU，以HBS-EP+作为运行缓冲区。
2.将每个抗体稀释至5nM，并在HBS-EP+缓冲液中产生2倍稀释系列至0.08nM。每个浓度以30μL/min注射300秒，然后解离600秒，使用3M的MgCl2再生30秒，循环之间的稳定期为600秒。使用1∶1全局拟合拟合数据。
结合试验FL Tau
1.将0.25μg/mL抗体的HBS-EP+缓冲液以10μL/分钟的速度装载到Protein G芯片(GE Healthcare)上30秒。将流速提高到30μL/分钟，并在HBS-EP+缓冲液中加入250nM FLTau180秒。使用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生30秒
抗体候选物的纯化
仪器：GE Healthcare
Figure BDA0003369900800000682
纯化系统
软件：UNICORN
色谱柱：HiTrap MabSelect SuRe，1mL；HiLoad 16/600Superdex200pg
流动相：IgG洗脱缓冲液；Dulbecco’s 1x PBS
样品制备：通过0.22μm过滤
注射量：200mL Expi293条件培养基(1：1)，在DPBS中
流速：上样量为0.5mL/min；以1.5mL/min进行凝胶过滤；以1mL/min洗脱
SEC-MALS
1.将10μl每个样品(1mg/mL)注入SEC色谱柱(AdvanceBio SEC
Figure BDA0003369900800000681
4.6x150mm，2.7μm，LC色谱柱，安捷伦)，随后由三个串联检测器检测：
a.UV(带有恒温柱温箱的Agilent 1260 Infinity HPLC系统)
b.光散射(Wyatt Technology DAWN HELEOS)
c.示差折光仪(Wyatt Technology Optilab TRex)
2.使用含有0.05％叠氮化钠的Gibco PBS(Thermo Fisher)流动相以0.4mL/min的恒定流速施加。所有实验均在25℃下进行。
3.使用Wyatt TechnologyASTRA软件(版本6.1.2.83)分析数据，并将折射率增量(dn/dc)设置为0.185(即用于蛋白质分析)。
4.在SEC-MALS分析之前，所有样品均在4℃下储存。
动态光散射(DLS)
1.制备50μl的1.3mg/ml样品(在Dulbecco PBS中；Sigma D8537)，并等分到384孔聚丙烯板(Greiner bio-one)中。
2.数据记录在Zetasizer APS(Malvern)上。所有值一式三份记录并使用相关的Zetasizer软件(7.11版)进行处理。
3.进行累积量分析以获得平均粒度(z-平均值)和多分散指数(PDI)。
质谱
图30中描述了纯化的嵌合候选抗体和人源化候选抗体的质谱分析。
热位移比较
1.将样品直接制备到96孔的白色PCR板中，终体积为25μL(纯化的抗体终浓度为1μM和2μM)。
2.Sypro Orange-在PBS缓冲液中制成1∶100的原液，然后以1∶10添加到最终样品中(例如25μL中的2.5μL)
3.装载到qPCR机器中并使用MxPro软件，SYBR Green方法，(过滤器＝FRROX，无参考染料)。热配置文件设置-71次循环，每增加1°
4.绘制结果并确定Tm。
交叉相互作用色谱(CIC)
1.样品通过两次单独的20μl进样(0.5mg/mL)进行分析；首先上样到与30mg人多克隆IgG(Sigma 14506)偶联的1mLNHS活化树脂(GE Healthcare)，然后上样到空白偶联的1mLNHS活化树脂，作为对照柱。
2.流动相由含有0.01％叠氮化钠(0.1mL/min)的Dulbecco PBS(Sigma D8537)组成，所有实验均在25℃下进行。
3.洗脱样品通过紫外吸光度检测(带有恒温柱温箱的Agilent 1260InfinityHPLC系统)，并使用Wyatt TechnologyASTRA软件(6.1.2.83版)分析数据以确定样品峰保留时间。然后使用这些来计算保留因子k’：
Figure BDA0003369900800000701
其中Tr是样品在poly-IgG柱上的保留时间，Tm是模拟(对照)柱上的保留时间。
溶解度
在Vivapore溶剂吸收浓缩器7500kDa MWCO(VP0502 Satorius)中加入3.5-5.0mlPBS中1mg/ml的抗体溶液。
1.每10分钟监测一次抗体浓度，在Nanodrop 2000(ε＝1.4)上采集少量样品进行测量，然后继续直到浓缩体积达到～30-50μl的死体积。
2.绘制浓度值(mg/ml)对相应时间点的图，以生成浓度曲线。
圆二色性
1.制备30μL样品，浓度为1mg/ml(在Dulbecco的PBS中；Sigma D8537)。
2.用10mM磷酸盐缓冲液将1mg/mL样品稀释至0.15倍。
3.读数取自1mM光谱纯石英比色皿。以4秒的DIT和20纳米/分钟的扫描速度、1纳米的步长读取读数。
4.从样品光谱中减去平均空白光谱，然后将光谱转换为Δε。然后将光谱相对于它们的256-260nm值归零。平滑性由savitsky-golay过滤器通过自定义excel函数sgFilter()，使用窗口大小为7(-2，3,6,7，6，3，-2)的二次多项式执行。光谱显示误差线，误差线是+/-2nm波长标准偏差的平均值。
使用cIEF进行PI分析
1.将样品浓缩至＞5mg/ml并脱盐至＜50mM NaCl水平，然后将10μl添加到240μl含有4.5/5.1/9.5和10等电点标记的Pharmalyte/尿素凝胶母液中。
2.将样品混合至少5分钟，然后向PCR样品小瓶中加入200μl。
3.将样品与cIEF凝胶、阴极电解液、阳极电解液和化学流动剂冲洗缓冲液一起装载到PA800样品块中。PA800装有中性毛细管，运行默认“条件”方法以准备毛细管进行样品分析。
4.使用正确的“分离”方法运行每个样品，该方法取决于样品中存在的尿素水平。
5.使用32Karat软件分析数据，pI标记提供标准曲线以量化样品峰值pI值。
抗体血清稳定性评估
1.在PBS中制备600μl 0.4mg/mL的抛光抗体。
2.使用来自Seralab的小鼠血清(SCD-808)、人血清(S-123)和Cyno血清(S-118)。将150ul血清和PBS对照分装在圆底96孔板中，在组织培养柜(BSL-2)中向每种血清类型中加入50ul 0.4mg/mL抗体溶液(在PBS中，终浓度为100ug/mL)，一式三份。将一些保存在4℃以用作对照。
血清培养板布局
PBS 小鼠血清 人血清 Cyno血清
PBS 小鼠血清 人血清 Cyno血清
PBS 小鼠血清 人血清 Cyno血清
3.封板，37℃孵育。
4.在无菌条件(BSL-2)下，以特定时间间隔(例如第10天、第20天)取20ul样品以避免污染。在-20℃下冷冻直至分析。
5.先分析孵化时间最长的。适当稀释样品，并通过为每个样品(3*稀释)生成ELISA结合曲线，测定抗原与TauC3的结合(第8.11节)。使用未孵育的抗体作为对照(NI)，比较同一板上每个mAb样品的PBS/所有血清。
本文引用的所有参考文献、出版物和专利文件，以及出现在图中和序列表中的文本，出于所有目的在相同程度上通过引用整体并入本文，如每个都被单独表示一样。
在前面的说明书中，已经参考具体的示例性实施方式及其实施例描述了本发明。然而，很明显，在不脱离所附权利要求中阐述的本发明的更广泛的精神和范围的情况下，可以对其进行各种修改和改变。因此，说明书和附图被认为是说明性的，而不是限制性的。
本文中任何文件的引用并不旨在承认此类文件是相关的现有技术，或被认为是对本申请的任何权利要求的可专利性的材料。关于任何文件的内容或日期的任何声明均基于申请人在提交申请时可获得的信息，并不构成对此类声明正确性的承认。
序列表
<110> TAUC3 生物制品有限公司(TAUC3 BIOLOGICS LIMITED)
<120> 抗TAUC3抗体及其应用
<130> 350011.1002PCT
<150> 62/829,774
<151> 2019-04-05
<160> 141
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> htau 40
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
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Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Leu Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln
305 310 315 320
Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly
325 330 335
Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys
340 345 350
Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val
355 360 365
Ser Gly Asp Thr Ser Pro Ala His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly
370 375 380
Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu
385 390 395 400
Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> Tau IN4R
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Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Gly Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
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Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Leu Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Leu Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser
245 250 255
Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Leu Asp Asn Ile Leu His Val Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys
275 280 285
Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly
290 295 300
Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
305 310 315 320
Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly
325 330 335
Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn
340 345 350
Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
355 360 365
Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
370 375 380
Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala
385 390 395 400
Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
<210> 4
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tau ON4R
<400> 4
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Leu Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Ala Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Leu Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu
210 215 220
Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys
225 230 235 240
His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp
245 250 255
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His
260 265 270
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
275 280 285
Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His
290 295 300
Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Leu Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
325 330 335
Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn
340 345 350
Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala
355 360 365
Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 5
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tau 1N3R
<400> 5
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser
245 250 255
Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp
275 280 285
Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu
305 310 315 320
Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
325 330 335
Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser
340 345 350
Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 6
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tau 0N3R
<400> 6
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser
245 250 255
Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp
275 280 285
Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu
305 310 315 320
Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
325 330 335
Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser
340 345 350
Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链 CDR1
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链 CDR2
<400> 8
Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VGGGDF
<400> 9
Val Gly Gly Gly Asp Phe
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链 CDR1
<400> 10
Gln Glu Ile Ser Val Tyr
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链 CDR2
<400> 11
Gly Ala Phe
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LQYVRYPWT
<400> 12
Leu Gln Tyr Val Arg Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链 HM
<400> 13
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链 KE
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链 KN
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链 KO
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链 KP
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链 KM
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫肽
<400> 19
Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp
1 5 10
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 20
tgtaaaacga cggccagtat gaagttgcct gttaggctgt tggtgctg 48
<210> 21
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 21
tgtaaaacga cggccagtat ggagwcagac acactcctgy tatgggtg 48
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 22
tgtaaaacga cggccagtat gagtgtgctc actcaggtcc tggsgttg 48
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 23
tgtaaaacga cggccagtat gaggrcccct gctcagwtty ttggmwtctt g 51
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 24
tgtaaaacga cggccagtat ggatttwagg tgcagattwt cagcttc 47
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 25
tgtaaaacga cggccagtat gaggtkckkt gktsagstsc tgrgg 45
<210> 26
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 26
tgtaaaacga cggccagtat gggcwtcaag atggagtcac akwyycwgg 49
<210> 27
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 27
tgtaaaacga cggccagtat gtggggayct ktttycmmtt tttcaattg 49
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 28
tgtaaaacga cggccagtat ggtrtccwca sctcagttcc ttg 43
<210> 29
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 29
tgtaaaacga cggccagtat gtatatatgt ttgttgtcta tttct 45
<210> 30
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 30
tgtaaaacga cggccagtat ggaagcccca gctcagcttc tcttcc 46
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 31
tgtaaaacga cggccagtat gragtywcag acccaggtct tyrt 44
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 32
tgtaaaacga cggccagtat ggagacacat tctcaggtct ttgt 44
<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 33
tgtaaaacga cggccagtat ggattcacag gcccaggttc ttat 44
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 34
tgtaaaacga cggccagtat gatgagtcct gcccagttcc tgtt 44
<210> 35
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 35
tgtaaaacga cggccagtat gaatttgcct gttcatctct tggtgct 47
<210> 36
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 36
tgtaaaacga cggccagtat ggattttcaa ttggtcctca tctcctt 47
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 37
tgtaaaacga cggccagtat gaggtgccta rctsagttcc tgrg 44
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 38
tgtaaaacga cggccagtat gaagtactct gctcagtttc tagg 44
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 39
tgtaaaacga cggccagtat gaggcattct cttcaattct tggg 44
<210> 40
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 40
caggaaacag ctatgaccac tggatggtgg gaagatgg 38
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 41
tgtaaaacga cggccagtat gaaatgcagc tggggcatst tcttc 45
<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 42
tgtaaaacga cggccagtat gggatggagc trtatcatsy tctt 44
<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 43
tgtaaaacga cggccagtat gaagwtgtgg ttaaactggg ttttt 45
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 44
tgtaaaacga cggccagtat gractttggg ytcagcttgr ttt 43
<210> 45
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 45
tgtaaaacga cggccagtat ggactccagg ctcaatttag ttttcctt 48
<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 46
tgtaaaacga cggccagtat ggctgtcytr gsgctrctct tctgc 45
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 47
tgtaaaacga cggccagtat ggratggagc kggrtctttm tctt 44
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 48
tgtaaaacga cggccagtat gagagtgctg attcttttgt g 41
<210> 49
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 49
tgtaaaacga cggccagtat ggmttgggtg tggamcttgc tattcctg 48
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 50
tgtaaaacga cggccagtat gggcagactt acattctcat tcctg 45
<210> 51
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 51
tgtaaaacga cggccagtat ggattttggg ctgatttttt ttattg 46
<210> 52
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 52
tgtaaaacga cggccagtat gatggtgtta agtcttctgt acctg 45
<210> 53
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 53
tgtaaaacga cggccagtat gaacaggctt acttcctcat tgctgctgc 49
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 54
caggaaacag ctatgaccca gtggatagac agatggggg 39
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 55
caggaaacag ctatgaccca gtggatagac cgatggggc 39
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 56
caggaaacag ctatgaccca gtggatagac tgatggggg 39
<210> 57
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 57
caggaaacag ctatgaccca agggatagac agatggggc 39
<210> 58
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 58
tgtaaaacga cggccagtga ggtgcaggtt gttgagtctg g 41
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 59
tgttcctttc catgggtctt 20
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 60
ctctcggagg tgctcctgga g 21
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 61
gcagttccag atttcaactg 20
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 62
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 63
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 64
ctctggctcc ctgataccac cggagaggtg caggtggtgg agagc 45
<210> 65
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 65
ctctggctcc ctgataccac cggagatatc cagatgacac agtct 45
<210> 66
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 66
gggcccttgg tggaggcgga gctcactgtc agggcggt 38
<210> 67
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 67
cgcttggtgc tgccacagtt ctcttgatct ccagctttgt gccg 44
<210> 68
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 68
ctctggctcc ctgataccac cggactggtg cagctggtgg aaagcg 46
<210> 69
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 69
ctctggctcc ctgataccac cggagaggtg caggtggtgg aaagcg 46
<210> 70
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 70
gggcccttgg tggaggcgga gctcactgtc accagggtg 39
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 71
cctgatacca ccggagaggt gcagctggtg 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 72
caccagctgc acctctccgg tggtatcagg 30
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 73
cggactggtg caggtggtgg aaagcgg 27
<210> 74
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 74
ccgctttcca ccacctgcac cagtccg 27
<210> 75
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 75
tttaacacat atgcaatgaa ctgggtgcgg cagg 34
<210> 76
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 76
cctgccgcac ccagttcatt gcatatgtgt taaa 34
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 77
ctggagtggg tggcccggat cagatct 27
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 78
agatctgatc cgggccaccc actccag 27
<210> 79
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 79
ctaagagcaa caattatgca acatattatg cagcatctgt gaagggcag 49
<210> 80
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 80
ctgcccttca cagatgctgc ataatatgtt gcataattgt tgctcttag 49
<210> 81
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 81
tatgcaacag catatgcaga ttctgtgaag ggcaggttca 40
<210> 82
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 82
tgaacctgcc cttcacagaa tctgcatatg ctgttgcata 40
<210> 83
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 83
ccgcgacgat tctaagagta cagcctatct gcaga 35
<210> 84
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 84
tctgcagata ggctgtactc ttagaatcgt cgcgg 35
<210> 85
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 85
tctcccgcga cgattctaag aatatggcct atctgcagat 40
<210> 86
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 86
atctgcagat aggccatatt cttagaatcg tcgcgggaga 40
<210> 87
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 87
gacgattcta agaatacagt ctatctgcag atggactcc 39
<210> 88
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 88
ggagtccatc tgcagataga ctgtattctt agaatcgtc 39
<210> 89
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 89
ctctggctcc ctgataccac cggagacatc cagatgaccc agtctc 46
<210> 90
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 90
ctctggctcc ctgataccac cggagacatc cagatgacac agtctc 46
<210> 91
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 91
cgcttggtgc tgccacagtt ctcttgatct ccacctttgt gccg 44
<210> 92
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 92
ttctgctgat accagctcag gtacacggag atc 33
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 93
tgtacctggg ctggtttcag cagaagccc 29
<210> 94
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 94
gggcttctgc tgaaaccagc ccaggtaca 29
<210> 95
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 95
gaagcccggc aaggccatta agcggctgat ctac 34
<210> 96
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 96
gtagatcagc cgcttaatgg ccttgccggg cttc 34
<210> 97
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 97
atctacggcg ccttcacgct gcagtccg 28
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 98
cggactgcag cgtgaaggcg ccgtagat 28
<210> 99
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 99
ggatccagat ctggcagcga gtttaccctg a 31
<210> 100
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 100
tcagggtaaa ctcgctgcca gatctggatc c 31
<210> 101
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 101
cagatctggc accgagtata ccctgacaat ctcta 35
<210> 102
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 102
tagagattgt cagggtatac tcggtgccag atctg 35
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 103
ctacggcgcc ttcagcctgc agtccggagt 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 104
actccggact gcaggctgaa ggcgccgtag 30
<210> 105
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 105
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1 5 10 15
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20 25 30
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100 105 110
Val Ser Ser
115
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 106
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
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100 105 110
Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 107
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
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Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<212> PRT
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<220>
<223> 重链
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1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<210> 111
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 111
Leu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 112
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 113
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 114
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 115
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 116
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr
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Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 117
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 118
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
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65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 119
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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100 105 110
Val Ser Ser
115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 120
Leu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Gly Gly Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链
<400> 121
Leu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
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50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210> 124
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 124
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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<210> 125
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Arg Leu Ile
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65 70 75 80
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 126
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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<210> 129
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 129
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 130
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Tyr Gly Ala Phe Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 131
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 131
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 132
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 133
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Tyr Gly Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链
<400> 134
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Val Tyr
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Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
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<210> 140
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 140
tgtaaaacga cggccagtat gacattgaac atgctgttgg ggc 43
<210> 141
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 141
gatctccgtg tacctgagct ggtatcagca gaa 33

Claims (15)

1.分离的抗tauC3抗体，其中，所述抗tauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)为1×10-10至1×10-12，所述抗tauC3抗体对全长tau的结合亲和力(KD)为1×10-4至1×10-8M，所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或完全人源化抗体。
2.如权利要求1所述的抗TauC3抗体，其中，所述抗tauC3抗体对TauC3的解离率Kd为1×10-4至1×10-3s-1。
3.如权利要求1或2所述的抗TauC3抗体，其中，所述抗TauC3抗体包含(a)可变重链(VH)多肽和(b)可变轻链(VL)多肽，所述可变重链(VH)多肽包含SEQ ID NO：7表示的CDR1、SEQ IDNO：8表示的CDR2和SEQ ID NO：9表示的CDR3，所述可变重链(VH)多肽与SEQ ID NO：13具有至少70％的序列同一性；所述可变轻链(VL)多肽包含SEQ ID NO：10表示的CDR1、SEQ IDNO：11表示的CDR2和SEQ ID NO：12表示的CDR3，所述可变轻链(VL)多肽与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少70％的序列同一性。
4.如权利要求3所述的抗TauC3抗体，其中，可变重链(VH)多肽包含SEQ ID NO：13；可变轻链(VL)多肽包含选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQID NO：18的序列。
5.如权利要求3所述的抗TauC3抗体，其中，在可变重链(VH)多肽上，CDR1是SEQ ID NO：7的多肽，CDR2是SEQ ID NO：8的多肽，CDR3是SEQ ID NO：9的多肽；在轻链(VL)多肽上，CDR1是SEQ ID NO：10的多肽，CDR2是SEQ ID NO：11的多肽，CDR3是SEQ ID NO：12的多肽。
6.如权利要求5所述的抗TauC3抗体，其中，可变重链(VH)多肽是SEQ ID NO：13的多肽，可变轻链(VL)多肽是SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：18的多肽。
7.如权利要求3所述的抗TauC3抗体，其中，所述抗TauC3抗体包含与SEQ ID NO：13具有至少95％序列同一性的VL链多肽，和与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少95％序列同一性的VH链多肽。
8.如权利要求1或2所述的抗TauC3抗体，其中，所述抗TauC3抗体的水溶性为约50mg/ml至约200mg/ml。
9.如权利要求11所述的抗TauC3抗体，其中，所述抗TauC3抗体对TauC3的结合亲和力(KD)为约10至约35pM。
10.如权利要求1所述的抗TauC3抗体，其中，所述抗TauC3抗体用于治疗tau蛋白病。
11.如权利要求10所述的抗TauC3抗体，其中，所述tau蛋白病选自阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、外伤性脑损伤、皮克氏病、皮质基底节变性和额颞叶变性。
12.如权利要求10所述的抗TauC3抗体，其中，所述tau蛋白病是阿尔茨海默病。
13.药物组合物，其包含权利要求1所述的抗TauC3抗体和一种以上药学上可接受的赋形剂。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中，所述抗TauC3包含(a)可变重链(VH)多肽和(b)可变轻链(VL)多肽，所述可变重链(VH)多肽包含SEQ ID NO：7表示的CDR1、SEQ ID NO：8表示的CDR2和SEQ ID NO：9表示的CDR3；所述可变轻链(VL)多肽包含SEQ ID NO：10表示的CDR1、SEQ ID NO：11表示的CDR2和SEQ ID NO：12表示的CDR3。
15.如权利要求17所述的药物组合物，其中，所述药物组合物对TauC3的结合亲和力(KD)为10pM至40pM。
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