CN104520317A - 针对高度保守靶标的包含来自骆驼科之序列的抗体 - Google Patents

针对高度保守靶标的包含来自骆驼科之序列的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN104520317A
CN104520317A CN201380038485.7A CN201380038485A CN104520317A CN 104520317 A CN104520317 A CN 104520317A CN 201380038485 A CN201380038485 A CN 201380038485A CN 104520317 A CN104520317 A CN 104520317A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
structural domain
antibody
binding polypeptides
coding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380038485.7A
Other languages
English (en)
Inventor
约翰内斯·约斯夫·威廉默斯·德哈德
克里斯托夫·弗雷德里克·杰罗姆·布朗什托
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ArgenX SE
Original Assignee
ArgenX SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ArgenX SE filed Critical ArgenX SE
Publication of CN104520317A publication Critical patent/CN104520317A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及抗原结合多肽，并且特别是来源于骆驼科物种的常规抗体，所述抗体与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是自身抗原或者高度保守抗原。本发明还涉及抗独特型抗原结合肽，其与包含获得自骆驼科物种的抗体之可变区的靶抗原结合。

Description

针对高度保守靶标的包含来自骆驼科之序列的抗体
技术领域
本发明涉及抗原结合多肽，并且特别是来源于骆驼科(camelid)物种的常规抗体，所述抗体与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是自身抗原或高度保守抗原。
背景技术
单克隆抗体作为研究工具具有许多应用，并且越来越多地作为治疗或诊断剂。特别地，治疗性抗体的开发是医药行业中增长最快的领域之一。产生针对给定治疗靶标的高质量单克隆抗体是在治疗性抗体药物的开发中成功的关键。迄今为止，已经开发了许多可以生产针对治疗目的之靶抗原的单克隆抗体(包括全人或“人源化”抗体)的不同技术平台。这些技术平台可大致分为体内的方法(基于使用经免疫的动物)，以及体外的方法，其中抗体序列是使用技术(例如噬菌体展示)从抗体可变链cDNA文库中选择的。
尽管均可使用用于单克隆抗体开发的体内和体外平台，但是生产与跨物种“高度保守的”抗原特异性结合的抗体和生产针对“自身”抗原的抗体仍是特别困难的。Zhuo等，PLoS ONE，第4卷，第6期，2009年6月讨论了由于免疫耐受性，在针对小鼠自身抗原或者在小鼠与人类之间高度保守抗原的抗体生产中使用基于免疫动物(特别是小鼠)的常规单克隆抗体方法所出现的特别困难之处。
为克服与自身抗原或高度保守抗原相关之免疫耐受性的之前的尝试已经包括使用特异性敲除小鼠或者使用具有受损的免疫耐受性的小鼠品系。然而，存在与这些方法中的每个相关的缺点；产生对于每个保守的目的抗原的敲除小鼠是昂贵且耗时的，而通过免疫具有受损耐受性的小鼠产生的抗体可能是质量可变的，即可表现出低亲和力和/或对靶抗原的低特异性。
在别处已经报道了可以从非免疫人噬菌体展示文库分离针对人抗原的人抗体(Griffiths等EMBO J.第12卷.，725-734，1993)。这种方法的潜在缺点是，合成的噬菌体展示文库只是接近天然存在于人类种系的功能多样性，因而多样性是比较有限的。此外，使用非免疫文库产生的抗体不是来源于通过主动免疫体内选择的CDR，因而通常必须进行亲和力成熟(affinity maturation)以提高对靶抗原的亲和力。亲和力成熟是一个冗长的过程，其可能会大大增加抗体发现过程的时间。此外，在亲和力成熟过程中，可能会改变某些氨基酸残基，这可能对所得的抗体的结合特异性或可制造性(例如表达水平、溶解性、物理化学稳定性等)产生负面影响(Wu等，J.Mol.Biol.368：652-65(2007))。
发明内容
开发用于产生针对高度保守靶抗原的抗体之技术上简单的平台仍是本领域中的一个目标，其不受现有技术方法所遇到的问题(例如，低亲和力、低特异性、多样性差)困扰。特别地，期望开发用于产生针对高度保守靶抗原之抗体的平台，其基于通过主动免疫体内选择CDR，因而避免了对亲和力成熟的需求和与所得抗体的“可制造性”相关的问题。
现在已经观察到可通过骆驼科(Camelidae)物种的主动免疫产生针对自身抗原和高度保守靶抗原的高亲和力免疫特异性抗体。即便使用展示出与最近的骆驼科同源物具有高于90％，并且高达97％氨基酸序列同一性的人多肽，通过动物的简单免疫可产生高特异性、高亲和力的抗体，而无需产生敲除或以其他方式操作动物的遗传背景或其天然免疫功能。通过骆驼科动物的简单免疫来打破自身耐受性屏障的能力是非常出乎意料的，并且提高了产生有用的抗体的机会，所述有用抗体包括具有潜在治疗效用的针对一系列高度保守靶标的抗体，之前认为这是超越已知的单克隆抗体平台的范围的。
因此，在第一个方面，本发明提供了包含VH结构域和VL结构域之分离的抗原结合多肽，其中在所述VH结构域或所述VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)获得自骆驼科物种的VH或VL结构域，其特征在于，所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是在包括至少所述抗原结合多肽之表位的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在一个实施方案中，靶抗原是在包括包含抗原结合多肽之表位的靶抗原的至少一个结构域的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在一个实施方案中，靶抗原是在全长的靶抗原表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
靶抗原可包含与来自所述骆驼科物种的比较物蛋白质中存在的表位具有基本上相同结构的至少一个表位。在线性表位的情况下，形成所述表位的氨基酸序列在靶抗原与比较物骆驼科动物蛋白质之间可以是100％保守的。
在一个实施方案中，靶抗原可以是高度保守抗原，其中所述高度保守抗原是来自所述骆驼科物种之外的物种的多肽，其在包括至少抗原结合多肽之表位的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％的氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，高度保守抗原是在包括包含抗原结合多肽之表位的靶抗原的至少一个结构域的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在一个实施方案中，靶抗原是在全长的靶抗原表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的高度保守抗原。
在每一个前述实施方案中，所述高度保守抗原可包含与来自所述骆驼科物种的比较物蛋白质中存在的表位具有基本上相同结构的至少一个表位。
在一些优选的实施方案中，高度保守抗原可以是来自所述骆驼科物种之外的物种的多肽，其在如上所定义的序列比较窗口或全长的靶抗原表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少95％、96％、97％、98％或者甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些特定的实施方案中，高度保守抗原可以来自选自以下之物种的多肽：人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猪、狗、豚鼠、兔、羊、牛或鸡。在一些特别优选的实施方案中，所述高度保守抗原是人多肽。
在一些特定的实施方案中，所述骆驼科物种选自骆驼(camel)、大羊驼(llama)、单峰驼(dromedary)、骆马原驼(guanaco)和羊驼(alpaca)。在一个优选的实施方案中，所述骆驼科物种是大羊驼(Lama glama)。
在一个特别优选的实施方案中，高度保守抗原是人多肽并且所述骆驼科物种是大羊驼。在该实施方案中，所述高度保守抗原(即，人多肽)在如上所定义的序列比较窗口可表现出与同源的大羊驼蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％、98％，或者甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在另一个实施方案中，靶抗原可以是来自骆驼科物种的自身抗原或者骆驼科动物来源的抗原，其是在包括至少抗原结合多肽之表位的序列比较窗口表现出与骆驼科自身抗原具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在一个实施方案中，靶抗原是骆驼科动物来源的抗原，其在包括包含抗原结合多肽之表位的靶抗原的至少一个结构域的序列比较窗口表现出与骆驼科动物自身抗原具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％的氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，靶抗原是骆驼科动物来源的抗原，其在全长的靶抗原表现出与骆驼科动物自身抗原具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％的氨基酸序列同一性。
所述骆驼科动物来源的抗原可保留其所来源的骆驼科动物自身抗原的表位，或者其可包含与在该自身抗原中存在的表位具有基本上相同结构的至少一个表位。
在一个特定的实施方案中，靶抗原是从所述骆驼科物种获得之抗体的可变区或者表现出与其至少90％氨基酸序列同一性的序列变体。在一些特定的实施方案中，序列变体可表现出与从所述骆驼科物种获得之抗体的可变区具有至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在骆驼科动物常规抗体的情况下，用于对变体与从所述骆驼科物种获得之抗体的可变区进行序列比较的比较窗口可包括全长的VH结构域和全长的VL结构域。在包含VHH结构域的骆驼科动物之只有重链的抗体的情况下，序列比较窗口可以是全长的VHH结构域。序列变体可保留其所来源的骆驼科动物抗体可变结构域的表位(或独特型)。
在第二个方面，本发明提供了用于制备与靶抗原特异性结合的重组抗原结合多肽的方法，所述抗原结合多肽包含VH结构域和VL结构域，其中在所述VH结构域或所述VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)获得自骆驼科物种，所述方法包括以下步骤：
(a)免疫骆驼科物种，由此产生针对所述靶抗原的常规抗体；
(b)分离编码与所述靶抗原免疫反应的骆驼科常规抗体之VH和/或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)的骆驼科核酸；
(c)制备包含编码如下高变环或互补决定区之核苷酸序列的多核苷酸，所述高变环或互补决定区具有与由步骤(a)分离的核酸编码的高变环或互补决定区一致的氨基酸序列，所述多核苷酸编码与所述靶抗原免疫反应(或特异性结合)的包含VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽；以及
(d)由步骤(c)的重组多核苷酸表达所述抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽是与所述部分(b)的骆驼科常规抗体不一致的，其特征在于所述靶抗原是在包括至少抗原结合多肽之表位的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在一个实施方案中，靶抗原是在包括包含抗原结合多肽之表位的靶抗原的至少一个结构域的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％或者至少95％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在一个实施方案中，靶抗原是在全长的靶抗原表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在该方法的一个优选实施方案中，步骤(a)中产生的抗体所针对的靶抗原是高度保守抗原，其中所述高度保守抗原是来自所述骆驼科物种之外的物种的多肽，所述多肽在如上所定义的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少90％或者至少95％、96％、97％或98％的氨基酸序列同一性。
在所述方法的另一些优选的实施方案中，高度保守抗原可以是来自所述骆驼科物种之外的物种的多肽，所述多肽在如上所定义的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在一些特定的实施方案中，所述高度保守抗原可以是来自选自以下物种的多肽：人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猪、狗、豚鼠、兔、羊、牛或鸡。在一些特别优选的实施方案中，所述高度保守抗原是人多肽。
在一些特定的实施方案中，与靶抗原发生免疫的骆驼科物种是选自：骆驼、大羊驼、单峰驼、骆马、原驼和羊驼。在一个优选的实施方案中，所述骆驼科物种是大羊驼。
在一个特别优选的实施方案中，高度保守抗原是人多肽并且与所述高度保守抗原发生免疫的骆驼科物种是大羊驼。在该实施方案中，所述高度保守抗原(即，人多肽)在如上所定义的序列比较窗口将可表现出与同源的大羊驼蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在一个特定的、非限制性实施方案中，靶抗原可以是从所述骆驼科物种获得之抗体的可变区或者在如上所定义的序列比较窗口表现出具有与其至少90％氨基酸序列同一性的序列变体。在一些特定的实施方案中，序列变体在如上所定义的序列比较窗口可表现出具有与从所述骆驼科物种获得之抗体的可变区至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
附图说明
图1说明由HMGB1和HMGB2 ELISA所确定之纯化的大羊驼来源的Fab的结合特性。
图2说明通过ELISA所测量的由大羊驼来源的Fab 2A1抑制HMGB1/RAGE相互作用。
图3说明通过ELISA评估大羊驼IgG形式的抗独特型抗体11E1(la11E1)与一组抗体的结合谱(profile)。
图4证明了大羊驼IgG形式的抗独特型抗体11E1(la11E1)在食蟹猴(cynomolgus monkey)血浆背景中检测靶抗体68F2和129D3的能力。
图5示出通过ELISA所测量的与61H7(mAb)结合之7C6(Fab)的Log(剂量)-响应曲线，其中将在620nm处的吸收对7C6 Fab的浓度对数作图，使得能够计算EC50。
图6说明通过ELISA所测量的抗独特型mAb与41D12(Fab)的结合。
具体实施方式
本发明已经从出乎意料的观察结果得出可通过骆驼科物种的主动免疫产生针对高度保守靶抗原并且甚至是自身抗原的高亲和力、高特异性抗体。因此，在本发明最广泛的方面，其提供了骆驼科动物来源的抗原结合多肽(即，包含VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽，其中在所述VH结构域或所述VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)获得自骆驼科物种)，其特征在于与靶抗原特异性结合，所述靶抗原高度类似于骆驼科动物自身抗原的序列和/或结构。本发明还提供了骆驼科动物来源的抗原结合多肽，其与骆驼科动物自身抗原特异性结合。
在本申请人自己早些时候的公开WO 2010/001251和WO2011/080350中描述了骆驼科动物来源的常规抗体的一般特征，所述申请的内容通过引用以其整体并入本文。骆驼科动物来源的常规抗体的重链和轻链可变结构域(如区别于骆驼科动物只有重链的抗体)的特征在于其与人抗体之间特别高的同源性，无论是在重链和轻链可变结构域之框架区中的一级氨基酸序列水平上，还是在有助于抗原结合位点之CDR的三维构象上(在WO 2010/001251中广泛的详细讨论)。此外，骆驼科动物常规抗体的可变结构域可通过“种系化(germlining)”的简单方法变得更加人样化，其中框架区中选定的少量氨基酸被来自人种系的同源氨基酸所替换(在WO2011/080350中广泛讨论)。
现在已经观察到可产生针对一组靶抗原的高亲和力高特异性骆驼科动物常规抗体，之前认为使用已知的抗体开发技术，特别是使用依赖于对宿主动物进行免疫的抗体平台是很难靶向所述靶抗原的。这些“难以靶向”抗原的特征在于其与靶抗体将在其中产生的系统中(例如，宿主骆驼科动物)天然表达的抗原有非常接近的序列和/或类似结构，并且包括自身抗原以及多肽抗原两者，所述自身抗原来自于抗体将在其中产生的骆驼科物种，所述多肽抗原表现出与来自抗体将在其中产生的同一骆驼科物种之最接近匹配的骆驼科动物多肽具有至少90％的氨基酸序列相似性。本文提供的抗原结合多肽不仅表现出对“难以靶向”抗原的高亲和力特异性结合，而且保留骆驼科动物常规抗体的特别优点，即，与人抗体的可变结构域之非常高的序列同源性和结构同源性。
定义
术语“抗原结合多肽”是指包含VH结构域和VL结构域的任何多肽，其与靶抗原免疫反应(对靶抗原表现出特异性结合)。如本文别处所讨论的，示例性的抗原结合多肽包括抗体和免疫球蛋白，还包括抗体片段。
术语“靶抗原”是指抗原结合多肽针对其免疫反应的抗原。
术语“靶抗原”或“抗原物质”还可用来描述在制备与目的靶抗原反应的抗原结合多肽期间用来免疫动物(例如骆驼科动物)的材料。在本文的上下文中，术语“靶抗原”可涵盖抗原的经纯化形式，并且还可以是抗原的未处理的或半纯化制剂(例如细胞、细胞裂解物或上清液、细胞级分(例如细胞膜)等)，以及与适当载体蛋白缀合的半抗原，或者靶抗原的截短形式(例如含有免疫原性表位的片段)，或者甚至是能够编码靶抗原的多核苷酸，因为将用于“DNA免疫”。用于主动免疫骆驼科动物的“靶抗原”或“抗原物质”的另一些特征在本文别处进行描述，并且将是本领域技术人员通常已知的。
抗原结合多肽与靶抗原之间的“特异性结合”是指免疫特异性。如果抗原结合多肽优先于其它表位与靶抗原上的表位结合，则所述抗原结合多肽与其靶抗原“特异性”结合。“特异性结合”并不排除与其它具有类似抗原表位的抗原发生交叉反应。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是糖蛋白，其表现出与(靶)抗原的特异性结合。
已知骆驼科动物物种具有两种不同类型的抗体；经典的或“常规”的抗体以及重链抗体。
如本文所使用的，术语“常规抗体”是指任何同种型的抗体，包括IgA、IgG、IgD、IgE或IgM。自然的或天然存在的“常规”骆驼科动物抗体通常是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端(N端)具有可变结构域(VH)，其后是若干恒定结构域。每条轻链在一端(N端)具有可变结构域(VL)而在其另一端具有恒定结构域(CL)；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐(align)，且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。
术语“重链抗体”是指已知在骆驼科动物物种中天然存在的第二种类型的抗体，这样的抗体天然缺失轻链(Hamers-Casterman等，Nature.1993；363；446-8)。重链抗体(缩写为HCAb)由共价二硫键连接的两条重链构成。HCAb中每条重链的一端具有可变结构域。为了将其与“常规”骆驼科动物抗体重链的可变结构域(VH)区分开，HCAb的可变结构域被称为“VHH”。VHH结构域与VH结构域完全不同，其由骆驼科动物基因组中的不同基因区段编码。
本发明多肽的VL结构域可以是Vλ型或Vκ型。因此，术语“VL结构域”是指来自骆驼科的Vκ和Vλ两种同种型以及由其改造的变体(相对于骆驼科的VL结构域来说，所述变体包含一个或更多个氨基酸替换、插入或者缺失)。
术语“VH结构域”是指骆驼科任何已知的重链同种型的VH结构域，包括γ、ε、δ、α或μ同种型以及其改造的变体(相对于骆驼科的VH结构域来说，所述变体包含一个或更多个氨基酸的替换、插入或者缺失)。术语“VH结构域”仅指骆驼科动物常规抗体的VH结构域，而不涵盖骆驼科动物的VHH结构域。
术语“可变”是指可变结构域VH和VL的某些部分的序列在抗体之间差异很大的事实，并且用于每个特定抗体针对其靶抗原的结合及特异性。然而，可变性在抗体的可变结构域中并非均匀分布。其集中于每个VL结构域和VH结构域中被称为“高变环(hypervariable loop)”的三个区段中，其形成抗原结合位点的一部分。Vλ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，并且可定义为包含VL结构域中的24位至33位(L1(λ)，由9个、10个或11个氨基酸残基组成)、49位至53位(L2(λ)，由3个残基组成)和90位至96位(L3(λ)，由5个残基组成)残基(Morea等，Methods 20：267-279(2000))。Vκ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，并且可定义为包含VL结构域中的25位至33位(L1(κ)，由6个、7个、8个、11个、12个或13个残基组成)、49位至53位(L2(κ)，由3个残基组成)和90位至97位(L3(κ)，由6个残基组成)残基(Morea等，Methods 20：267-279(2000))。VH结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为H1、H2和H3，并且可定义为包含VH结构域中的25位至33位(H1，由7个、8个或9个残基组成)、52位至56位(H2，由3个或4个残基组成)和91位至105位(H3，其长度高度可变)残基(Morea等，Methods 20：267-279(2000))。
除非另有说明，否则术语L1、L2和L3分别是指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖获得自骆驼科的Vκ和Vλ同种型的高变环。术语H1、H2和H3分别是指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖获得的自骆驼科的任何已知重链同种型(包括γ、ε、δ、α或μ)的高变环。
高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3可以各自包括“互补决定区”或“CDR”的一部分。术语“高变环”和“互补决定区”不是严格意义的同义词，因为高变环(HV)是基于结构定义的，而互补决定区(CDR)是基于序列可变性定义的(Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.，1983)，并且HV和CDR的界限在一些VH和VL结构域中可以不同。
VL和VH结构域的CDR通常定义为包含以下氨基酸：轻链可变结构域中的24位至34位(CDRL1)、50位至56位(CDRL2)和89位至97位(CDRL3)残基，以及重链可变结构域中的31位至35位或31-35b位(CDRH1)、50位至65位(CDRH2)和95位至102位(CDRH3)残基；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)。因此，HV可以包含在相应的CDR中，并且本文中提及的VH和VL结构域的“高变环”也应解释为涵盖相应的CDR，反之亦然，除非另有说明。
可变结构域的保守性较高的部分称为框架区(framework region，FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，主要是采取β片层构型，通过三个高变环相连接。每条链中的高变环通过FR而紧密地合在一起，并与其它链中的高变环一起促进抗体之抗原结合位点的形成。对抗体的结构分析揭示了序列与通过互补决定区形成的结合位点形状之间的关系(Chothia等，J.Mol.Biol.227：799-817(1992))；Tramontano等，J.Mol.Biol，215：175-182(1990))。尽管它们具有高序列可变性，但六个环中有五个只采取了主链构象的一小部分库(repertoire)，称为“规范结构(canonical structure)”。这些构象首先取决于环的长度，其次取决于环和框架区中某些位点关键残基的存在(通过其包装、氢键或呈现不寻常主链构象的能力来确定构象)。
恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应功能，例如抗体参与抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cellular toxicity，ADCC)或补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。
在本发明的所有方面和实施方案中，骆驼科(或骆驼科动物)物种(从其获得本发明抗原结合多肽的高变环或CDR)可以是骆驼、大羊驼、单峰驼、骆马、原驼或羊驼，以及其任何的杂交物种。大羊驼(Lama glama)和羊驼(Lama pacos)是本发明所有方面优选的骆驼科物种。
如果抗原结合多肽包含获得自骆驼科物种的VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区，则认为其是“骆驼科动物来源的”。为了避免疑问，术语“VH结构域”、“VL结构域”是指来源于骆驼科动物常规抗体的结构域。该定义排除了骆驼科动物只有重链的VHH抗体以及仅包含骆驼科动物VHH结构域之HV或CDR的重组构建体，其不涵盖在本发明的范围内。
所谓“获得自骆驼科物种的VH结构域或VL结构域的高变环或互补决定区”意指高变环(HV)或CDR具有的氨基酸序列与由骆驼科免疫球蛋白基因编码的高变环或CDR的氨基酸序列一致或基本一致。在本文的上下文中，“免疫球蛋白基因”包括种系基因、已经历重排的免疫球蛋白基因以及体细胞突变基因。因此，获得自骆驼科物种VH或VL结构域的HV或CDR的氨基酸序列可以与存在于成熟的骆驼科常规抗体中的HV或CDR的氨基酸序列一致。本文上下文中的术语“获得自”表明了结构关系，意思是本发明抗原结合多肽的HV或CDR包含最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(或其略微发生改变的变体)。然而，对于用于制备本发明抗原结合多肽的生产方法而言，其并不一定意味着特定的关系。正如下面将要讨论的，有若干方法可用来制备包含HV或CDR(其氨基酸序列与最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的序列一致(或基本上一致))的抗原结合多肽。
术语“骆驼科动物常规抗体的VH结构域”和“获得自骆驼科物种的VH结构域”可同义使用，并且涵盖这样的VH结构域，其为合成的或经改造之重组基因(包括密码子优化的合成基因)的产物，该VH结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VH结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。类似地，术语“骆驼科动物常规抗体的VL结构域”和“获得自骆驼科物种的VL结构域”可同义使用，并且涵盖这样的VL结构域，其为合成的或经改造之重组基因(包括密码子优化的合成基因)的产物，该VL结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VL结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。
本文提供的抗原结合多肽通常是重组表达的多肽，并且可以是嵌合多肽。术语“嵌合多肽”是指通过将不连续存在的两个或更多个肽片段相邻而产生的人工(非天然存在)多肽。此定义中包括“物种”嵌合多肽，其通过将两个或更多个物种(例如骆驼科动物和人)编码的肽片段相邻而产生。
本文提供的抗原结合不是天然存在的人抗体(特别是人类自身抗体)，因为需要来自于骆驼科动物的至少一个高变环(或CDR)。所谓“天然存在的”人抗体意指在人对象内天然表达的抗体。本发明的范围排除具有与天然存在人抗体或其片段的氨基酸序列100％一致的氨基酸序列的抗原结合多肽，其中天然抗体或片段不是嵌合的，并且在氨基酸序列中也没有受到任何经改造的变化(排除体细胞突变)。
本文提供的抗原结合多肽包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域二者，并且特征在于在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区获得自骆驼科物种。
在一些替代的实施方案中，VH结构域中的H1或H2或者H1和H2二者均可以获得自骆驼科物种，并且独立地，VL结构域中的L1或L2或者L1和L2二者均可以获得自骆驼科物种。在另一些实施方案中，VH结构域中的H3或VL结构域中的L3也可以获得自骆驼科物种。上述所有可能的排列都是允许的。在一个具体的实施方案中，VH结构域和VL结构域两者中的每个高变环H1、H2、H3、L1、L2和L3都可以获得自骆驼科物种。
在一个实施方案中，整个VH结构域和/或整个VL结构域可以获得自骆驼科物种。然后，可以对骆驼科的VH结构域和/或骆驼科的VL结构域进行蛋白质改造，其中向骆驼科序列中引入一个或更多个氨基酸替换、插入或者缺失。这些经改造的变化优选地包括相对于骆驼科序列而言的氨基酸替换。这样的变化包括“人源化”或“种系化”，其中骆驼科动物编码的VH或VL结构域中的一个或更多个氨基酸残基被来自于同源的人编码的VH或VL结构域中的等效残基所取代。
在某些实施方案中，骆驼科的高变环(或CDR)可以通过使用与期望的目的“靶抗原”反应能够诱发抗体的抗原物质对骆驼科物种进行主动免疫而获得。如本文详细讨论和举例的，使用能够与靶抗原免疫反应诱发抗体的抗原物质来免疫骆驼科(天然动物或者经改造的转基因动物以表达骆驼科动物物种免疫球蛋白库)之后，可以鉴定由B细胞产生的对期望抗原具有特异性的(常规骆驼科)抗体，并且可以使用已知的技术来分离编码这样的抗体之VH和VL结构域的多核苷酸。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了与靶抗原免疫反应的重组抗原结合多肽，所述多肽包含VH结构域和VL结构域，其中VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区获得自骆驼科物种的VH或VL结构域，并且特征在于所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是在包括至少抗原结合多肽之表位的序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原，所述抗原结合多肽通过包括以下步骤的方法获得：
(a)免疫骆驼科物种并且由此产生针对所述靶抗原的抗体；
(b)确定核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与所述靶抗原免疫反应的骆驼科常规抗体之VH和/或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；以及
(c)表达与所述靶抗原免疫反应的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)具有由部分(a)所确定的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
分离的通过主动免疫获得的骆驼科VH和VL结构域可以用作改造根据本发明的抗原结合多肽的基础。从完整的骆驼科VH和VL结构域开始，可以进行一个或更多个氨基酸替换、插入或者缺失的改造，从而与开始的骆驼科序列不同。在某些实施方案中，这样的替换、插入或缺失可存在于VH结构域和/或VL结构域的框架区。在一级氨基酸序列中进行这些变化的目的可以是为了减少推测的不利性质(例如在人宿主中的免疫原性(所谓的人源化)、为了减少使潜在产物具有异质性和/或不稳定性的位点(糖基化、脱酰胺、异构化等)或是为了提高分子的一些其它有利性质(例如溶解性、稳定性、生物利用率等)。在另一些实施方案中，在一级氨基酸序列中的变化可以在通过主动免疫获得的骆驼科VH和/或VL结构域的一个或更多个高变环(或CDR)中进行改造。可以引入这样的变化从而提高抗原结合的亲和力和/或特异性，或者减少推测的不利性质(例如在人宿主中的免疫原性(所谓的人源化或种系化)、减少使潜在产物具有异质性和/或不稳定性的位点(糖基化、脱酰胺、异构化、移除含硫氨基酸例如甲硫氨酸等)，或是为了提高分子的一些其它有利性质(例如溶解性、稳定性、生物利用率、可制造性等)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了重组的抗原结合多肽，相比于通过用靶抗原对骆驼科物种进行主动免疫所获得的骆驼科VH或VL结构域，其在VH结构域或VL结构域的至少一个框架区或CDR区中包含至少一个氨基酸替换，特征在于所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。该特定的实施方案排除了通过主动免疫产生的含有天然骆驼科VH和VL结构域的抗原结合多肽。
在另一些实施方案中，本发明涵盖“嵌合”抗体分子，其包含来自骆驼科的VH和VL结构域(或其经改造的变体)以及来自非骆驼科动物抗体的一个或更多个恒定结构域，例如人编码的恒定结构域(或其经改造的变体)。在这样的实施方案中，优选的是VH结构域和VL结构域均获得自同一骆驼科动物物种，例如，VH和VL可以都来自大羊驼或者VH和VL可以都来自羊驼(之后引入经改造的氨基酸序列变化)。在这样的实施方案中，VH和VL结构域可以都来自于单个动物，尤其是已被主动免疫的单个动物。本发明还延伸至嵌合抗原结合多肽(例如抗体分子)，其中VH或VL结构域之一是经骆驼科动物编码的，而其它可变结构域是非骆驼科动物(例如人)的。
作为在骆驼科VH和/或VL结构域的一级氨基酸序列中进行改造产生变化的一个替代方案，可将单个的骆驼科高变环或CDR或者其组合从骆驼科VH/VL结构域中分离出来，并通过CDR移植将其转移到替代的(即非骆驼科的)框架(例如人VH/VL框架)。
与高度保守抗原结合的抗原结合多肽
在本发明一个优选的实施方案中，表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的靶抗原可能是“高度保守”抗原。在由骆驼科动物物种的主动免疫产生抗原结合多肽的情况下，如果靶抗原与同一骆驼科动物物种(如同在其中产生抗原结合多肽的骆驼科动物物种)的天然抗原的序列和/或结构极其类似，那么认为所述靶抗原是“高度保守的”。例如，在抗原结合多肽是大羊驼来源的情况下，“高度保守”靶抗原是来自大羊驼之外物种的高度类似于天然大羊驼抗原的多肽。
在多肽抗原的情况下，高度保守抗原与天然骆驼科动物多肽(其在结构上最接近相关的)之间的相似度可表示为氨基酸序列的％相似性。因此，在一些优选的实施方案中，高度保守抗原是来自所述骆驼科物种之外的物种的多肽，其表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少90％的氨基酸序列同一性。在另一些优选的实施方案中，高度保守抗原可以是来自所述骆驼科物种之外的物种的多肽，其表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
除非本申请中另外说明，否则两个氨基酸序列之间的％序列同一性可通过比较这两个以最佳方式比对的序列来确定并且其中待比较的两个氨基酸序列可包含相对于参考序列的添加或缺失以得到这两个序列之间的最佳比对。通过测定两个序列之间相同的氨基酸残基的位置数，将该相同的位置数除以所选序列比较窗口中的位置总数并且将所得结果乘以100从而获得这两个序列之间的同一性百分比来计算同一性百分比。例如，可使用BLAST程序，可在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上得到的“BLAST 2序列”(Tatusova等，″Blast 2 sequences-a new toolfor comparing protein and nucleotide sequences″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，所使用的参数是默认给出的那些(特别是参数“开放空缺罚分(open gap penalty)”：5，以及“延伸空缺罚分(extension gappenalty)”：2；选择的矩阵为例如，由程序建议的矩阵“BLOSUM 62”)，由程序直接计算出待比较的两个序列之间的同一性百分比。
对于任何给定的靶抗原，技术人员还可使用公共可得的搜索和比对工具，例如BLAST程序，其中靶抗原作为单个查询序列。从返回的结果，可确定多肽抗原是否表现出与来自相关骆驼科物种(即抗原结合多肽的高变环和互补决定区来源于其的骆驼科物种)的蛋白质具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在本发明的所有方面和实施方案中，在其将靶抗原与比较物骆驼科动物蛋白质相比较的“序列比较窗口”必须是包括至少抗原结合多肽之表位的靶抗原的区。所述序列比较可以是，例如，靶蛋白质的至少20个氨基酸，或至少30个氨基酸，或至少50个氨基酸，或至少100个氨基酸的连续序列，其包含抗原结合多肽的表位。
在某些实施方案中，序列比较窗口可包括包含抗原结合多肽之表位的靶抗原的至少一个结构域。
在另一些实施方案中，序列比较窗口可以是全长的靶抗原，其通过限定将包括抗原结合多肽的表位，即使表位的确切特征/位置未知。
在每一个前述实施方案中，所述靶抗原可包含与来自所述骆驼科物种的比较物蛋白质中存在之表位具有基本上相同结构的表位(对于抗原结合多肽)。在线性表位的情况下，形成表位的氨基酸序列可以是在靶抗原与比较物骆驼科动物蛋白质之间100％保守的。
高度保守抗原可以是基本上来自任何物种的多肽，所述物种包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猪、狗、豚鼠、兔、牛或鸡。然而，在一些特别优选的实施方案中，所述高度保守抗原可以是人多肽，例如治疗靶标或生物标志物。在一些特别优选的实施方案中，所述高度保守抗原可以是治疗或诊断相关的靶抗原。人多肽的确切性质不是实质问题；本发明提供了用于产生针对人多肽的抗体的平台，所述人多肽是“高度保守的”无论人多肽的确切特征如何。人多肽(可针对其产生本发明的抗原结合多肽)的特征在于其与天然骆驼科动物抗原的相似程度(在氨基酸序列中)。通过非限制性实例的方式，一个可针对其产生抗体的“高度保守的”人多肽是高迁移率族1(the high mobility group box 1，HMGB1)蛋白质，其是在人与小鼠之间99％保守的并且在人与大羊驼之间97％保守的。
在另一些实施方案中，高度保守抗原可以是非多肽抗原，例如糖类抗原(例如，寡糖或多糖)或者包含多肽和糖类组分两者的抗原，例如，糖蛋白。在靶抗原是糖蛋白的情况下，糖蛋白靶抗原可表现出与同源的骆驼科动物蛋白质的糖基化模式基本上相同的糖基化模式。抗原结合分子所结合的抗原决定簇可以是糖类表位或者其可以是由多肽决定簇(例如一个或更多个氨基酸残基)和糖类决定簇(例如，糖蛋白的寡糖/聚糖侧链的一个或更多个糖部分)的组合所形成的表位。
与骆驼科动物自身抗原和骆驼科动物来源抗原结合的抗原结合多肽
在本发明的第二个优选的实施方案中，表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的靶抗原可以是骆驼科动物自身抗原或骆驼科动物来源抗原。在由骆驼科动物物种的主动免疫产生的抗原结合多肽的情况下，术语“自身抗原”是指天然骆驼科动物抗原，即，天然存在于同一骆驼科动物物种中的抗原。例如，在由大羊驼的主动免疫产生抗原结合多肽的情况下，术语“自身抗原”是指天然大羊驼抗原，即，天然存在于大羊驼中的抗原。
骆驼科动物(例如，大羊驼)自身抗原可包括多肽、肽、多糖、糖蛋白、多核苷酸(例如，DNA)、抗原等，其中多肽自身抗原是特别优选的。“多肽自身抗原”可包括天然骆驼科动物多肽还有骆驼科动物多肽的合成形式，例如重组表达的多肽。
本文所使用的术语“骆驼科动物来源抗原”是指靶抗原，其是来源于天然骆驼科动物抗原的变体，所述变体在结构/序列上与骆驼科动物抗原高度相似，例如骆驼科动物多肽的经改造的序列变体。骆驼科来源多肽抗原可具有与其所来源的天然骆驼科动物蛋白质的氨基酸序列高度类似的氨基酸序列，例如氨基酸序列具有与天然骆驼科动物多肽至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％，或者甚至至少99％的同一性。
抗独特型
在一个特别重要的实施方案中，抗原结合多肽可以是抗独特型抗原结合多肽(例如，抗独特型抗体或其抗原结合片段)，其与包含获得自骆驼科物种之抗体的可变区的靶抗原结合。骆驼科来源抗体(抗独特型与其结合)可以是常规的骆驼科动物抗体(即，包含成对的VH和VL结构域的骆驼科动物抗体)或者只有重链的抗体(即包含VHH结构域的骆驼科动物抗体)。在其中产生抗独特型抗原结合多肽的骆驼科动物物种可与抗体可变区所来源的骆驼科动物物种相同。因此，通过非限制性实例的方式，一个优选的实施方案是大羊驼来源的抗独特型抗原结合多肽(例如，大羊驼抗独特型抗体)，其与大羊驼来源抗体的可变区中的表位(靶抗原)结合。形成抗独特型抗体的靶抗原之大羊驼来源的抗体可以是常规大羊驼抗体或者只有重链的大羊驼抗体。
抗独特型抗原结合多肽所结合的骆驼科动物来源的(例如，大羊驼来源的)抗体之可变区中的表位可位于骆驼科动物来源的(例如，大羊驼来源的)常规抗体的VH结构域中，或者骆驼科动物来源的(例如，大羊驼来源的)常规抗体的VL中，或者所述表位可由骆驼科动物来源的(例如，大羊驼来源的)常规抗体的VH结构域和VL结构域两者中的氨基酸来形成。抗独特型抗原结合多肽的“表位”最通常地由其所结合的抗体可变区的CDR来形成。
形成抗独特型抗原结合多肽之靶向抗原的骆驼科动物来源的(例如，大羊驼来源的)常规抗体的可变区可来源于天然骆驼科动物(例如，大羊驼)常规抗体，例如通过采用目的抗原主动免疫骆驼科动物(例如，大羊驼)所产生的抗体，或者实际上其可以是天然骆驼科动物(例如，大羊驼)常规抗体的合成的或经改造的序列变体。因此，在本文的上下文中，“常规的骆驼科动物来源抗体的可变区”不仅包括天然骆驼科动物常规抗体的可变区(即，与骆驼科动物中产生的抗体具有相同序列)，而且涵盖经改造的变体，例如相对于天然骆驼科动物序列，在相关的框架区和/或CDR中具有氨基酸替换的变体，前提是经改造的变体仍可保持与天然骆驼科动物来源的常规抗体的可变结构域(VH和/或VL)具有最小至少90％的氨基酸序列同一性。在这样的实施方案中，用于评估％氨基酸序列同一性的序列比较窗口可包括整个VH结构域和整个VL结构域。
WO 2010/001251描述了骆驼科动物(并且特别是大羊驼)作为用于产生针对一系列靶抗原的常规、四链抗体之平台的用途，所述靶抗原包括治疗目的的人多肽靶标。那个申请描述的是许多用于产生针对目的靶抗原的常规骆驼科动物抗体的技术。一旦已经分离出对靶抗原具有适当结合特异性的天然骆驼科动物(例如，大羊驼)常规抗体，通常对在天然骆驼科动物抗体的可变结构域中的一级氨基酸序列进行一个或更多个改变以提高其特性，例如使其更适于人类治疗用途。这样的改变可包括在VH结构域和/或VL结构域的框架区内的氨基酸替换，并且还包括在有助于抗原结合位点的VH和/或VL结构域内的一个或更多个CDR中的氨基酸替换。如上文所述，抗独特型抗原结合多肽的“表位”最通常是由其所结合的抗体可变区的CDR来形成的。因此，还期望将通过用来自同一物种的靶抗体的可变区来主动免疫(例如，用大羊驼Fab来免疫)骆驼科动物物种(例如，大羊驼)所产生的抗独特型抗原结合多肽与那些可变区的种系化变体(例如，大羊驼Fab的种系化形式)相结合，特别地如果将为了“种系化”目的所引入的氨基酸替换限制于框架区，那么就使得CDR在序列和结构构象方面基本保持不变。
本发明现在提供了通过其产生高特异性、高亲和力的抗独特型抗原结合多肽的方法，所述抗独特型抗原结合多肽具有对常规骆驼科动物来源抗体的可变区的结合特异性，即使考虑后者可为由于免疫耐受难以靶向的骆驼科动物自身抗原。
如本文所述的抗独特型抗原结合多肽的一个主要实际应用是作为对于旨在用作人治疗剂之骆驼科动物来源抗体的药代动力学研究的工具。
抗原结合多肽的结构
只要VH和VL结构域都存在，那么本发明的抗原结合多肽就可以采用多种不同的实施方案。因此，在一些非限制性的实施方案中，抗原结合多肽可以是免疫球蛋白、抗体或抗体片段。本文的术语“抗体”以最广义来使用，并涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们表现出对靶抗原具有适当的特异性即可。本文使用的术语“单克隆抗体”是指获得自基本同源的抗体之群体的抗体，即包含在该群体中的各个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的天然突变以外。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与常规的(多克隆)抗体制剂(其通常包含针对抗原上不同决定簇(表位)的不同抗体)不同的是，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇或表位。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合或可变结构域。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、双特异性Fab′s以及Fv片段、双抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子、单链可变片段(scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体(参见Holliger和Hudson，Nature Biotechnol.23：1126-36(2005)，其内容通过引用并入本文)。
在一些非限制性实施方案中，根据本发明的抗体和抗体片段可包含CH1结构域和/或CL结构域(其氨基酸序列完全或基本上是人的)。当本发明的抗原结合多肽是旨在用于人治疗用途的抗体时，抗体的整个恒定结构域或者至少其一部分通常具有完全或基本上为人的氨基酸序列。因此，本发明的抗体必须包含VH和VL结构域，其至少一个包含来源于骆驼科的至少一个高变环，但CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域，如果存在的话)中的一个或更多个或者任意组合的氨基酸序列可完全或基本上是人的。
有利地，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域，如果存在的话)可以都具有完全或基本上为人的氨基酸序列。就人源化或嵌合抗体或抗体片段的恒定结构域而言，术语“基本上为人的”是指与人恒定结构域具有至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的氨基酸序列同一性。在本文的上下文中，术语“人的氨基酸序列”是指由人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，其包括种系的、重排的和体细胞突变的基因。本发明还涵盖这样的多肽，其包含已被改变的“人”序列恒定结构域(通过一个或更多个氨基酸的添加、缺失或者替换来对于人序列进行改变)。
正如本文别处所讨论的，预想到可以在重链和/或轻链的恒定结构域(特别是在Fc区内)内进行一个或更多个氨基酸的替换、插入或缺失。氨基酸的替换可导致使用不同的天然存在氨基酸或者使用非天然的或经修饰的氨基酸来取代被替换的氨基酸。其它结构修饰也是允许的，例如改变糖基化模式(例如通过添加或缺失N-或O-连接的糖基化位点)。取决于抗体的预期用途，可以期望修饰本发明抗体对Fc受体的结合特性，例如用来调节效应功能。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区中，从而使该区中形成链间二硫键。由此产生的同源二聚体抗体可具有提高的内化能力和/或增强的补体介导之细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)以及Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。或者，可以将抗体改造成具有双Fc区，从而可具有增强的补体裂解和ADCC的能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。本发明还预期包含本文所述抗体的免疫缀合物，其中所述抗体与细胞毒剂(例如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物))相缀合。还可以改造Fc区以延长半衰期。
在某些实施方案中，本发明可涵盖与靶抗原特异性结合的嵌合骆驼科/人抗体，所述靶抗原是来自所述骆驼科物种的自身抗原或者表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。一些优选的实施方案包括嵌合抗体，其中VH和VL结构域完全是骆驼科动物序列(例如大羊驼或羊驼)，而抗体的其余部分完全是人序列。在一些优选的实施方案中，本发明还涵盖“种系化”的骆驼科抗体以及骆驼科/人嵌合抗体，其中VH和VL结构域相比于通过主动免疫获得的骆驼科VH和VL结构域来说在框架区中包含一个或更多个氨基酸替换。通过使用在人种系编码的VH或VL结构域中发现的等效残基来取代起始骆驼科VH或VL结构域中的错配氨基酸残基，“种系化”方法(如在WO2010/001251和WO 2011/080350中所述，其通过引用并入本文)提高了与人种系VH或VL结构域的％序列同一性。
本发明还进一步涵盖CDR移植的抗体，其中将来源于与靶抗原(其是来自所述骆驼科物种的自身抗原或者表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原)特异性结合的骆驼科抗体(例如通过使用靶抗原进行主动免疫产生的骆驼科抗体或者由骆驼科动物的基因编码的抗体)的CDR(或高变环)移植到人VH和VL框架上，而抗体的其余部分还是完全人来源的。
根据本发明种系化的、嵌合的和CDR移植的抗体(特别是包含来源于使用靶抗原对骆驼科进行主动免疫获得之高变环的抗体)可以使用常规的重组DNA操作和表达技术容易地产生，其利用经改造的原核和真核宿主细胞(包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞，其中的一些如本文所述并在所附实施例中说明)以产生目的多肽。
本发明还进一步延伸至这样的抗原结合多肽，其中VH结构域和/或VL结构域的高变环或CDR获得自骆驼科，但相对于骆驼科动物编码的序列来说，其中将至少一个所述(骆驼科动物来源的)高变环或CDR已被改造成包含一个或更多个氨基酸替换、添加或者缺失。这些变化包括高变环/CDR的“人源化”。已经以这种方式改造的骆驼科动物来源之HV/CDR仍可以表现出与骆驼科动物编码的HV/CDR之氨基酸序列“基本一致”的氨基酸序列。在本文的上下文中，“基本一致”可允许与骆驼科动物编码的HV/CDR有不超过一个，或不超过两个氨基酸序列错配。
根据本发明的抗体可以是任何同种型，所述抗体与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。用于人类治疗用途的抗体通常为IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型，通常是IgG型，在这种情况下，其可属于IgG1、IgG2a和b、IgG3或IgG4四个亚类中的任何。在这些亚类中的每一个中，允许在Fc部分内进行一个或更多个氨基酸的替换、插入或缺失，或者进行其它结构修饰，从而例如提高或降低Fc依赖的功能。
与靶抗原(其是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原)特异性结合的抗原结合多肽可用于广泛的应用中，包括在研究中以及在诊断和/或治疗疾病中。由于与天然人抗体的VH和VL结构域具有高度的氨基酸序列同一性和高度的结构同源性(特别是如在人抗体中发现的正确的典型折叠的组合)，本发明的抗原结合多肽(特别是以单克隆抗体的形式)将发现作为人治疗剂的特别用途。
多核苷酸、载体和重组表达
本发明还提供了编码本发明抗原结合多肽的多核苷酸分子、包含与调节序列有效连接的编码本发明抗原结合多肽之核苷酸序列的表达载体，以及包含该表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统，所述调节序列允许抗原结合多肽在宿主细胞或无细胞表达系统中表达。
编码本发明抗原结合多肽的多核苷酸分子包括例如重组DNA分子。
如本文所使用的术语“核酸”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”可互换使用，其是指任何DNA或RNA分子，无论是单链或双链的，并且如果是单链的话，还包括其互补序列的分子。在讨论核酸分子时，本文中可根据以5′至3′方向提供序列的标准惯例来描述特定核酸分子的序列或结构。在本发明的一些实施方案中，核酸或多核苷酸是“分离”的。当用于核酸分子时，该术语是指将核酸分子从其来源之生物体的天然存在基因组中与其紧密相邻的序列分离出来。例如，“分离的核酸”可以包括插入到载体(如质粒或病毒载体)中的DNA分子，或者是整合到原核或真核细胞或非人类宿主生物体之基因组DNA中的DNA分子。当用于RNA时，“分离的多核苷酸”主要是指由上文定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可指这样的RNA分子，其已经被从其它的核酸(在自然状态下(即在细胞或组织中)所述RNA分子与其他核酸联系(associate)在一起)纯化/分离出来。分离的多核苷酸(DNA或RNA)还可表示通过生物或合成手段直接产生，并在其生产过程中与存在的其它组分分开的分子。
在WO 2010/001251和WO 2011/080350中描述了用于根据本发明的抗原结合多肽之重组生产的标准技术，其内容通过引用整体地并入本文。
应注意，术语“宿主细胞”一般是指培养的细胞系。将已经引入编码根据本发明的抗原结合多肽之表达载体的完整人类明确地排除在本发明的范围以外。
在一个重要的方面，本发明还提供了生产重组抗原结合多肽的方法，其包括在允许所述抗原结合多肽表达的条件下，培养包含编码重组抗原结合多肽之多核苷酸(例如表达载体)的宿主细胞(或无细胞表达系统)，并回收所表达的抗原结合多肽。该重组表达方法可用于根据本发明抗原结合多肽(包括旨在用于人类治疗用途的单克隆抗体)的大规模生产。用于大规模生产适用于体内治疗用途之重组抗体的合适载体、细胞系和生产方法都是在本领域通常可得的，并为本领域技术人员所公知。
本发明的另一些方面涉及测试药盒，包括诊断药盒等，其包含根据本发明的抗原结合多肽，还有包含根据本发明之抗原结合多肽的药物制剂。
当抗原结合多肽旨在用于诊断用途时(例如，当所述抗原结合多肽特异性针对作为疾病状态或疾病易感性之生物标志物的抗原时)，然后可方便地提供所述抗原结合多肽作为测试药盒的组分。诊断测试通常采用标准的免疫测定形式，如ELISA、放射免疫测定、Elispot等。这种测试药盒的组分可取决于测试或测定(其旨在使用本发明的抗原结合多肽来实施)的性质而有所不同，但通常还包括使用本发明抗原结合多肽进行免疫测定所需的另外试剂。用作诊断试剂的抗原结合多肽可带有显示标记(revealing lable)，如荧光部分、酶促标记或放射性标记。
通常将用于体内治疗用途的抗原结合多肽与一种或更多种可药用稀释剂、载体或赋形剂一起配制成药物剂型(Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编，1980)。通常将根据本发明的抗原结合多肽配制成无菌水溶液，以对有此需要的哺乳动物对象(通常是人患者)静脉内、或通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、肿瘤内、经口、肿瘤周边(peritumoral)、皮下、滑膜内(intra-synovial)、鞘内、表面、舌下或吸入途径施用。为预防或治疗疾病，抗原结合多肽的合适剂量将取决于待治疗之疾病的类型、疾病的严重程度和临床病程，以及患者的年龄、体重和病史，并由主治医师判断确定。
抗原结合多肽的生产方法
本发明的一个重要方面涉及用于生产针对目的靶抗原具有高亲和力的抗原结合多肽(特别是单克隆抗体)的方法，其中所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
因此，本发明方法用于制备与靶抗原特异性结合的重组抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH结构域和VL结构域，其中VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)获得自骆驼科物种，所述方法包括以下步骤：
(a)免疫骆驼科物种(使用靶抗原)，从而产生针对所述靶抗原的常规抗体；
(b)分离骆驼科核酸，其编码与所述靶抗原免疫反应之骆驼科常规抗体VH和/或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；
(c)制备包含编码如下高变环或互补决定区之核苷酸序列的多核苷酸，所述高变环或互补决定区具有与由步骤(a)分离的核酸编码的高变环或互补决定区一致的氨基酸序列，所述多核苷酸编码包含与所述靶抗原免疫反应(或特异性结合)之VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽；以及
(d)由步骤(c)的重组多核苷酸来表达所述抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽与部分(b)的骆驼科常规抗体不一致，特征在于所述靶抗原表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％的氨基酸序列同一性。
该方法的第一步骤包括对骆驼科物种进行主动免疫以引起针对靶抗原的免疫应答，从而产生与所述靶抗原免疫反应的骆驼科动物常规抗体。对骆驼科动物免疫的方案描述于所附实施例中。用于免疫的抗原物质可以是靶抗原的纯化形式，例如重组表达的多肽或其免疫原性片段。然而，也可使用靶抗原的未加工制剂(例如表达或编码所述靶抗原的分离的细胞或组织制剂、细胞裂解物、细胞上清液或级分(例如细胞膜)等，或脂质颗粒、珠、小泡或在其表面上含有抗原的其它颗粒)或者使用编码所述靶抗原的多核苷酸进行免疫(DNA免疫)。该方法通常涉及骆驼科物种(包括，但不限于，大羊驼和羊驼)动物的免疫，并且有利的是这些动物属于完全远系种群(outbred population)。然而，还预期使用包含骆驼科动物常规Ig基因座，或至少其一部分的转基因动物(例如转基因小鼠)。
基于骆驼科动物主动免疫的方法的一个关键优势出于所有骆驼科物种都可以以大的远系种群(其中动物个体都有不同的遗传背景)来维持的事实。因此，可采用主动免疫来引起针对目的抗原之强的和多样的免疫应答，并从中可获得多样的潜在抗原结合分子池(pool)。如所附实施例所示，骆驼科动物的主动免疫可产生具有高度免疫多样性的与高度保守靶抗原(例如，可与骆驼科动物多肽共享大于90％氨基酸序列同一性的多肽抗原)结合的Fab片段。
在使用靶抗原进行主动免疫后，可从经免疫的动物中分离出外周血淋巴细胞或活检样品(例如淋巴结或脾活检样品)，并进行筛选用于产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体。如实施例中所示，该阶段中可使用例如淘选(panning)或FACS分选的富集技术以减少待筛选的B细胞库的复杂性。然后，选出抗原特异性B细胞并用于提取总RNA以及随后的cDNA合成。编码天然骆驼科动物VH和VL结构域的核酸(特异性针对靶抗原)可通过PCR进行分离。
可以将编码骆驼科动物VH和VL结构域的核酸直接克隆到用于生产根据本发明之抗原结合多肽的表达载体中。特别地，可以将这些序列克隆到还编码人抗体恒定区或其一部分的表达载体中以产生嵌合抗体。然而，通常是在克隆和表达人类恒定区序列之前，对分离的骆驼科动物VH和VL序列进行进一步操作。
第一步，可使用候选的骆驼科动物VH和VL序列(主动免疫后分离的)制备骆驼科动物文库(例如Fab文库，如所附实施例中所述的)。然后可针对与靶抗原的结合来筛选文库(例如使用噬菌体展示)。可以对有前景的首选候选物针对与靶抗原的结合进一步进行测试，例如使用Biacore或合适的生物测定。最后，将最有前景的首选编码VH和VL结构域的序列与编码人抗体恒定区的序列进行框内融合克隆。
用来编码(骆驼科动物来源的)HV/CDR的多核苷酸序列(例如用于本发明抗原结合多肽的重组表达)不需要与骆驼科动物中天然编码HV/CDR的天然多核苷酸序列一致。因此，本发明涵盖/允许密码子优化以及在多核苷酸序列中涉及克隆和/或表达的其它变化，这不改变所编码的氨基酸序列。
在某些实施方案中，可进行“链改组(chain shuffling)”，其中将已知与目的抗原结合的特定可变结构域与一系列相反类型的可变结构域中的每一个配对(即VH与VL文库配对或相反亦然)以产生文库以及所得到的针对抗原亲和力和/或特异性进行测试的VH/VL组合。或者，VH结构域文库可随机或以分级的方式与VL结构域的文库配对，并测试所得到的组合(参见Clackson等，Nature，卷352，624-638页，1991)。在该方法中，所述文库可以是来自骆驼科动物(其表现出对目的抗原具有免疫性(包括已被主动免疫的动物))的重排VH和VL(Vκ或Vλ)的文库。所述链改组过程可增加免疫多样性并产生具有显著增强的亲和力的配对。
在本发明的方法中，可对“天然的”骆驼科动物来源VH和VL结构域进行蛋白质改造以引入一个或更多个选择性的氨基酸替换，通常引入框架区中。将这样的替换引入“野生型”骆驼科动物序列的原因可以是(i)框架区的人源化，(ii)稳定性、生物利用率、产物均一性、组织渗透性的提高等，或者(iii)靶抗原结合的优化。
可根据广泛接受的原则通过框架区中选择性取代一个或更多个氨基酸残基来进行骆驼科动物来源的VH和VL结构域的“种系化”(如在WO 2010/001251和WO 2011/080350中所说明的，其内容通过引用特定地并入本文)。应当理解，为实现任何给定VH结构域、VL结构域或其组合的可接受的“种系化”而进行之氨基酸改变的确切特征将视具体情况而变化，因为这将取决于来源于骆驼科之框架区的序列以及这些框架区与最对应的人种系(或体细胞突变的)框架区之间的起始同源性，并且也可能取决于形成抗原结合位点之高变环的序列和构象。种系化过程的总体目标是产生这样的分子，当将其引入人对象中时，其中的VH和VL结构域都表现出最小的免疫原性，而保留了由骆驼科编码的亲本VH和VL结构域(例如通过主动免疫获得的骆驼科动物VH/VL)形成的抗原结合位点的特异性和亲和力。
文库构建的方法
在一个相关方面，本发明还涵盖产生编码骆驼科常规抗体之VH和VL结构域的表达载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物，从而产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体；
b)从包含来自所述经免疫骆驼科动物的淋巴组织(例如循环B细胞)的样品来制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得这样的扩增基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码骆驼科常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；以及
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，使得每个表达载体都包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域的抗原结合多肽的表达，由此得到表达载体文库，其特征在于所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
上述“文库构建”的方法也可构成上述用于生产本发明抗原结合多肽之一般方法的一部分。因此，被描述为涉及本发明的这一方面优选或有利的任何特征也可被认为涉及一般方法是优选或有利的，反之亦然，除非另有说明。
在一个实施方案中，步骤a)中被扩增的核酸包括从骆驼科动物淋巴组织制备的cDNA或基因组DNA，所述淋巴组织包括一种或更多种B细胞、淋巴结、脾细胞、骨髓细胞，或其组合。循环B细胞是特别优选的。外周血淋巴细胞(PBL)可用作编码常规骆驼科动物抗体之VH和VL结构域的核酸的来源，即在PBL样品中存在足够量的(表达抗体的)浆细胞以使得可以进行直接扩增。这是有利的，因为PBL可从动物(骆驼科动物)采集的全血样品制备。这就避免了需要使用侵入性程序来获取组织活检样品(例如，来自于脾或淋巴结)，并且这意味着采样程序可视需要而经常重复进行，同时对动物的影响最小。例如，可以主动免疫骆驼科动物，从该动物中抽取第一血样，并制备PBL，然后使用“加强”剂量的同一抗原或不同抗原第二次免疫同一动物，然后抽取第二血样，并制备PBL。
因此，该方法的一个特定实施方案可包括：制备来自骆驼科动物之含PBL的样品，从PBL制备cDNA或基因组DNA，并利用该cDNA或基因组DNA作为模板来扩增编码骆驼科动物常规抗体之VH或VL结构域的基因区段。在一个实施方案中，淋巴组织(例如循环B细胞)获得自已经被主动免疫的骆驼科动物，如本文别处所述。总RNA(或mRNA)可从淋巴组织样品(例如外周血细胞或组织活检样品)中方便地制备，并且通过标准技术转换为cDNA。还可使用基因组DNA作为起始材料。
本发明的这一方面涵盖用于构建文库的多样性文库方法和B细胞选择方法。在一种多样性文库方法中，可从由淋巴组织制备的核酸扩增编码VH和VL之基因区段的库，而不需任何的事先B细胞选择。在一种B细胞选择方法中，可在核酸提取和扩增编码VH和VL之基因区段之前，选择展示具有期望抗原结合特性之抗体的B细胞。
可使用多种常规方法来选择表达具有期望抗原结合特性之抗体的骆驼科动物B细胞。例如，B细胞可被荧光标记的单克隆抗体(mAb，特异性识别来源于大羊驼或其它骆驼科动物的常规抗体)和其它荧光染料标记的靶抗原染色以用于常规IgG的细胞表面展示。然后，可通过FACS分离各双阳性B细胞，并且从各个细胞中提取总RNA(或基因组DNA)。或者，可以对细胞进行体外增殖，并可筛选含有分泌的IgG的培养上清液，以及从阳性细胞提取总RNA(或基因组DNA)。在另一种方法中，各个B细胞可经特定基因进行转化或与肿瘤细胞系来融合以产生可以“根据需要(at will)”生长的细胞系，随后从这些细胞制备总RNA(或基因组DNA)。
除了通过FACS进行分选，还可在固定化的单克隆抗体(针对骆驼科动物常规抗体)并随后在固定化的靶抗原上对表达常规IgG的靶标特异性B细胞进行“淘选”。可从抗原特异性B细胞池提取RNA(或基因组DNA)，或者可转化这些池并可通过有限稀释或FACS克隆出单个细胞。
B细胞选择方法可包括阳性选择或阴性选择。无论是使用不进行任何B细胞选择的多样性文库方法或是使用B细胞选择方法，对从淋巴组织制备的核酸(cDNA或基因组DNA)进行扩增步骤，从而扩增编码各VH结构域或VL结构域的基因区段。
可将从淋巴组织(例如外周B细胞或组织活检样品)提取的总RNA转化成随机引物cDNA，或者寡dT引物，可用于合成cDNA，或者Ig特异性寡核苷酸引物可用于合成cDNA，或者可在cDNA合成前使用寡dT纤维素从总RNA纯化mRNA(即，聚A RNA)。可将从B细胞分离的基因组DNA用于PCR。
可使用于可变区5′端退火的FR1引物组合CH1或Cκ/Cλ区3′端退火的引物进行编码至少VH或VL的重链和轻链(κ和λ)基因区段的PCR扩增，其优势在于：就这些恒定结构域引物而言，每种类型只需要一种引物。该方法使骆驼科动物的Fab得以克隆。或者，可使用于可变区的3′端退火的一系列FR4引物再次克隆Fab(融合到编码恒定区的载体中)或scFv(单链Fv，其中重链和轻链的可变区通过柔性的接头序列相连)；或者，可在这样的表达载体中克隆可变区，所述表达载体允许产生在哺乳动物细胞上展示的全长IgG分子。
通常扩增以两步进行，在使用非标记引物的第一步中使用大量的cDNA(以保持多样性)，并且在第二步中，使用经标记的引物(其是延伸引物，在5′端引入了限制性位点以进行克隆)仅在少数几个循环中对扩增子进行再次扩增。在第二扩增步骤之前，可将第一扩增步骤(非标记的引物)中产生的扩增子进行凝胶纯化以去除多余的引物。或者，可引入启动子序列，其使得可以转录成RNA用于核糖体展示。除了限制性位点以外，还可以引入重组位点(如Cre-Lox或TOPO位点)，其允许定点插入到适当的载体中。
然后，可将编码骆驼科动物常规VH和VL结构域的经扩增基因区段克隆到适合于表达VH/VL组合为功能性抗原结合多肽的载体中。例如，首先，可将来自B细胞池(或未进行任何B细胞选择的其它淋巴组织)的经扩增VHCH1/VKCK/VLCL基因区段分别克隆为单独的文库(最初的文库)，然后在第二步中，可通过切下轻链片段并将其连接到编码重链片段的载体中组装成Fab或scFv文库。所述两步程序支持大型文库的构建，因为PCR产物的克隆是相对低效的(由于限制性酶的消化效果欠佳所致)。通过基于扩增子序列中少部分重叠的重叠剪接延伸PCR(splicing-by-overlap extension，SOE)可生成编码scFv的DNA片段；在PCR中，通过将编码VH和VL的扩增子与编码接头的小DNA片段混合，由于其重叠序列而形成单个DNA片段。
可以将包含编码VH和VL之基因区段的扩增子克隆到噬菌体或噬菌粒载体中，其允许通过使用基于噬菌体展示的选择方法来选择靶标特异性抗体片段。或者，可将扩增子克隆到允许在酵母细胞上(如Fab、scFv或全长IgG)或在哺乳动物细胞上(如IgG)展示的表达载体中。
在另一些实施方案中，可通过使用核糖体展示的扩增子来避免克隆，其中在扩增引物中包含T7(或其它)启动子序列和核糖体结合位点。在针对结合靶抗原的选择后，克隆该池并对各个克隆进行分析。因为文库的克隆和噬菌体的选择仅限于1010至1012个克隆，所以从理论上讲，与噬菌体展示文库方法相比，使用该方法可采样到更多的免疫库(immunerepertoire)。
当使用B细胞分选时，可将包含单个靶标特异性B细胞之编码VH或VL的基因区段的扩增子直接克隆到细菌或哺乳动物表达载体中用于产生抗体片段(scFv或Fab)或甚至全长的IgG。
在“文库构建”方法的一个特定的非限制性实施方案中，本发明提供了用于生产编码骆驼科动物常规抗体之VH和VL结构域的表达载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物，从而产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体；
b)从包含来自所述经免疫骆驼科动物(包括但不限于大羊驼或羊驼)的淋巴组织(例如循环B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得这样的扩增基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码骆驼科动物常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；以及
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，使得每个表达载体都包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域之抗原结合多肽的表达，由此得到表达载体文库，其特征在于所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
上述方法可用于制备骆驼科动物编码之VH和VL结构域(特别是大羊驼和羊驼的VH和VL结构域)的文库，其适于将VH/VL组合表达为有功能的抗原结合多肽，例如以scFv、Fab或全长抗体的形式。
根据上述方法制备的编码骆驼科动物(包括但不限于大羊驼或羊驼)VH和VL结构域的表达载体文库也构成了本发明主题的一部分。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了编码Fab或scFv分子的噬菌体载体文库，其中所述文库中编码的每个Fab或scFv均包含骆驼科动物常规抗体的VH结构域和骆驼科动物常规抗体的VL结构域。
在一个实施方案中，文库是“多样性”文库，其中所述文库中的大部分克隆编码具有独特氨基酸序列的VH结构域和/或具有独特氨基酸序列的VL结构域，包括骆驼科动物VH结构域和骆驼科动物VL结构域的多样性文库。因此，就VH结构域和/或VL结构域的氨基酸序列而言，多样性文库中的大部分克隆(例如大于90％)编码的VH/VL对与同一文库中编码的任何其它VH/VL对是不同的。
本发明还包括涵盖编码VH和VL之基因区段的表达载体，所述基因区段分离自骆驼科动物(例如大羊驼或羊驼)之单独选出的B细胞。
在另一个方面，本发明还提供了选择如下表达载体的方法，所述表达载体编码与靶抗原免疫反应的抗原结合多肽，所述方法包括以下步骤：
i)提供表达载体文库，其中所述文库中的每个载体都包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，其中所述VH结构域或所述VL结构域的至少一个来自于骆驼科动物常规抗体，并且其中所述文库中的每个载体都指导包含所述VH结构域和VL结构域之抗原结合多肽的表达；
ii)就与所述靶抗原的免疫反应性，筛选由所述文库编码的抗原结合多肽，并由此选择编码与所述靶抗原免疫反应的抗原结合多肽的表达载体，其特征在于所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
本发明的此方法涵盖从编码VH/VL对的克隆文库筛选/选择与靶抗原免疫反应的克隆，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。所述方法还可涵盖文库构建，其可使用如上所述的文库构建方法进行。如下所述，可针对所选克隆进行任选的下游处理/优化步骤。该选择和筛选的方法也可构成上述用于生产本发明抗原结合多肽之一般方法的一部分。因此，被描述为涉及本发明的这一方面的优选或有利的任何特征也可被认为涉及一般方法是优选或有利的，反之亦然，除非另有说明。
与靶抗原免疫反应之克隆的筛选和选择
筛选/选择通常包括将由文库中克隆编码的表达产物(即以抗原结合多肽形式的VH/VL对，例如Fab、scFv或抗体)与靶抗原接触，并选择所编码的VH/VL对表现出期望的抗原结合特性(即与靶抗原结合)的一个或更多个克隆，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
噬菌体展示文库可在固定化的靶抗原或可溶性(通常是生物素化的)的靶抗原上进行选择。由于其以单体存在并在噬菌体上以单价展示，所以Fab形式允许亲和力驱动的选择，这对于scFv(由于聚集并在噬菌体上以多价展示的结果)和IgG(二价形式)是不适用的。通常需要两到三轮的选择才能获得足够富集的靶标特异性结合物。
亲和力驱动的选择可通过在后续几轮选择中降低靶抗原量来进行，而使用非生物素化靶标进行延长洗涤能够鉴定出具有极佳亲和力的结合物。
该选择程序能让使用者追踪(home in on)某些表位；而从固定化靶标上洗脱噬菌体克隆的经典方法是基于pH休克(其使得抗体片段和/或靶标变性)，与针对靶抗原的参照mAb或可溶性受体或细胞因子的竞争导致展示出与靶标相关表位结合的抗体片段的噬菌体得以洗脱(这自然也适用于其它展示系统，包括B细胞选择方法)。
使用从细胞或培养上清液制备的周质级分(片段从细胞中“泄漏”入其中)，可将从选择产物中取得的单个克隆用于小规模抗原结合多肽(例如抗体片段)的生产。表达可由诱导型启动子(例如lac启动子)驱动，这意味着添加诱导剂(IPTG)后，启动片段的产生。前导序列确保了片段向周质的转运，其中将片段适当地折叠并形成分子内二硫桥。
由此产生的粗蛋白级分可用于靶标结合测定，例如ELISA。对于结合研究来说，从单个克隆制备的噬菌体可用来克服Fab的低表达产量(其通常给出非常低的结合信号)。还可以使用体外受体-配体结合测定来筛选这些蛋白质级分，以鉴定拮抗抗体；可以使用基于ELISA的受体-配体结合测定，还可以使用如Alphascreen的高通量测定。也可以在放射性标记的配体结合测定中进行筛选，其中将过表达受体之细胞系的膜级分固定；后一测定极其灵敏，因为只需要皮摩尔量的放射性细胞因子，这意味着粗蛋白质级分中存在极少量的拮抗性Fab就会给出阳性读数。或者，可应用FACS来筛选抗体，其抑制了荧光标记的细胞因子与细胞上表达的其受体的结合，而FMAT是该方法的高通量变体。
可以将存在于周质级分中的或者通过其六组氨酸标签上的IMAC部分纯化的或者通过蛋白G(已知与Fab的CH1结构域结合)进行部分纯化的Fab直接用于使用细胞的生物测定(其对细菌杂质不敏感)中；或者，可以在哺乳动物系统中再克隆来自单个大肠杆菌(E.coli)细胞的Fab以用于Fab或IgG的表达，并随后在生物测定中进行筛选。
在鉴定阳性表达载体克隆(即编码与期望靶抗原结合的功能性VH/VL组合的克隆)后，常规地确定该可变区的核苷酸序列，并据此推导出所编码的VH和VL结构域的氨基酸序列。
如果需要，可将Fab(或scFv)编码区再克隆到另一表达平台(例如，细菌表达载体(除了没有用于在噬菌体上展示所必需的基因3以外，其与噬菌粒载体相同))中，这实现更大量的编码片段的生产和纯化。
可通过表面胞质基因共振(例如Biacore)或经由其它方法确定纯化的Fab(或scFv)的靶标结合亲和力以及使用体外受体-配体结合测定和基于细胞的测定来测试中和效力。
抗原结合的家族(特别是拮抗性Fab(或scFv))可基于序列分析(主要是VH，特别是VH结构域的CDR3的长度和氨基酸序列)来鉴定。
效力优化
如有需要，可对通过筛选/选择鉴定出的编码对期望靶抗原具有亲和力的VH/VL组合之克隆进行下游步骤，其中对亲和力和/或中和效力进行优化。
每个VH家族表现最佳的成员的效力优化可以通过轻链改组、重链改组或其组合来实现，从而选出在动物中天然存在的亲和力变体。这在一些实施方案中是特别有利的，其中最初的骆驼科动物VH/VL结构域选自主动免疫的骆驼科动物，因为可使用从同一经免疫动物制备的原始文库来进行链改组，从而筛选在同一经免疫动物中产生的亲和力变体。
对于轻链改组而言，可使用编码具有期望抗原结合特性的VH/VL对(例如拮抗性Fab)的VH区(或VHCH1)的基因区段来构建文库，其中该编码VH的单个基因区段与文库(克隆最初从该文库中选择)中的轻链库组合。例如，如果编码VH的区段选自通过进行主动免疫而引起针对靶抗原的免疫应答之骆驼科动物制备的文库(例如，Fab文库)，那么可通过将该VH编码区段与同一经免疫骆驼科动物的轻链(VL)库组合来构建“链改组”文库。然后，可利用所得到的文库来选择靶抗原，但要在严格的条件(低靶标浓度，使用溶液中非生物素化的靶标进行彻底洗涤)下，以确保分离出最高亲和力的变体。周质级分的解离速率筛选(off-ratescreening)也可有助于鉴定改善的克隆。在经过序列分析并再克隆到细菌生产载体中后，可对纯化的经选择Fab进行亲和力(例如通过表面胞质基因共振)和效力(例如通过生物测定)的测试。
可通过将轻链改组后选择之克隆的编码轻链(VL)的基因区段克隆回来自于同一动物(原始VH/VL编码克隆从中选择)的原始重链文库来进行重链改组。或者，可使用CDR3特异性寡核苷酸引物来扩增VH区家族，其可被克隆为与拮抗性Fab的轻链组合的库。然后亲和力驱动的选择和解离速率筛选可鉴定该家族内表现最优的VH。
应当理解，轻链改组和重链改组步骤在实际中可以以任一顺序进行，即可先进行轻链改组，随后进行重链改组，或可先进行重链改组，随后进行轻链改组。这两种可能性均涵盖在本发明的范围内。在其他情况下，可不必同时进行轻链改组和重链改组，因此还涵盖了仅包括轻链改组或仅包括重链改组的方法。
由具有改善的亲和力和效力的VH/VL对(例如Fab)的轻链或重链，特别地，CDR的序列可用于生成经改造的变体(其中组合了单个Fab的突变)。已知突变通常可以叠加，这意味着将这些突变进行组合可得到甚至更高的亲和力。
为人类治疗用途而进行的种系化和格式化(formatting)
可以使选定的编码表现出期望的抗原结合特性之VH/VL对的表达克隆(例如编码scFv或Fab的噬菌体克隆)的VH和VL编码基因区段进行下游处理步骤并再克隆到另外的表达平台，例如编码适合于人类治疗用途之抗原结合多肽形式的载体(例如，具有完全人恒定结构域的全长抗体)中。
可将有前景的“首选(lead)”经选择克隆改造成在编码VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列中引入一个或更多个变化，所述变化可改变或可不改变编码的VH结构域和/或VL结构域的氨基酸序列。VH或VL结构域序列中的这些变化可根据本文中别处所述的任何目的进行改造，包括种系化或人源化、密码子优化、增强的稳定性和优化的亲和力等。
本文所述的种系化的一般原则同样适用于本发明的该实施方案。例如，可以在其框架区(FR)中通过应用文库方法来将包含骆驼科动物编码的VH和VL结构域的首选克隆种系化。如WO 2010/001251和WO2011/080350中所述，在与最接近的人种系(针对VH和VL)以及与具有相同CDR1和CDR2典型折叠的其它人种系比对之后，即可鉴定在FR中被改变的残基，并选择优选的人残基。虽然种系化可以包括使用来自于最匹配人种系的等效残基来取代骆驼科动物编码的残基，但是这不是必需的，也可使用来自于其它人种系的残基。
一旦已知首选的VH和VL结构域(需要时，在效力优化后)的氨基酸序列，即可设计VH和VL的合成基因，其中与人种系不同的残基被优选的人残基(来自于最匹配的人种系，或使用出现在其它人种系中的残基，或者甚至是骆驼科动物野生型的残基)取代。在该阶段，可以将编码可变结构域的基因区段再克隆到表达载体中，其中使其在基因合成中或通过克隆到合适的展示载体中而与人的Fab恒定区融合。
可将所得的VH和VL合成基因重组到Fab文库中，或者可将经种系化的VH与野生型VL重组(反之亦然，称为“杂合”文库)。亲和力驱动的选择允许分离出表现最优的种系化形式，就“杂合”文库而言，可将表现最优的种系化VH与表现最优的种系化VL进行重组。
可使用经种系化之Fab的氨基酸和核苷酸序列信息来生成经密码子优化的合成基因以产生优选同种型(IgG1(适用于ADCC和CDC)、IgG2(适用于有限的效应功能)、IgG4(类似于IgG2，但当单价结合时需要))的全长人IgG。对于非长期的应用和快速指示，也可产生细菌或哺乳动物细胞产生的人Fab。
在一个具体的非限制性实施方案中，组合上述方法步骤，本发明提供了生产编码与靶抗原免疫反应之嵌合抗原结合多肽的表达载体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物(包括但不限于大羊驼或羊驼)，从而产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体；
b)从包含来自于所述经免疫骆驼科动物的淋巴组织(例如循环B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得如下经扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码骆驼科动物常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，使得每个表达载体包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽的表达，由此产生了表达载体文库；
e)就与所述靶抗原的免疫反应性，筛选由步骤d)中获得的文库编码的抗原结合多肽，并且由此选择编码与所述靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的表达载体；
f)任选地，进行轻链改组步骤和/或重链改组步骤以选择表达载体，所述表达载体编码与所述靶抗原免疫反应的经效力优化的抗原结合多肽；
g)任选地，对编码步骤e)或步骤f)中所选载体之VH结构域的基因区段和/或编码步骤e)或步骤f)中所选载体之VL结构域的基因区段进行种系化和/或密码子优化；以及
h)将编码部分e)或f)中所选载体之VH结构域的基因区段或步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VH基因区段以及编码部分e)或f)中所选载体之VL结构域的基因区段或步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VL基因区段克隆到另一表达载体中，并与编码人抗体的一个或更多个恒定结构域的核苷酸序列进行有效连接，从而产生编码包含与人抗体的一个或更多个恒定结构域相融合的所述VH和VL结构域之嵌合抗原结合多肽的表达载体，其特征在于所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
本发明还延伸到根据上述方法制备的表达载体，并延伸到产生与靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使用上述方法制备编码与靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的表达载体；
b)在允许所编码的抗原结合多肽表达的条件下，将所述表达载体引入宿主细胞或无细胞表达系统中；以及
c)回收所表达的抗原结合多肽，其特征还在于所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％，或者至少95％、96％、97％或98％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
在一个实施方案中，后一方法涵盖通过重组表达进行的本发明抗原结合多肽的批量生产，特别是旨在用作药学活性剂之治疗性抗体的批量生产。在这样的实施方案中，选择步骤a)中制备的表达载体和步骤b)中使用的宿主细胞/表达系统以适于大规模生产旨在向人患者施用的重组抗体。用于该目的的合适载体和表达系统的一般特征是本领域公知的。
将参照以下非限制性实验实施例来进一步理解本发明。
实验实施例
实施例1-针对HMGB1的抗体
1.1靶抗原
该实施例的靶抗原是高迁移率族1(HMGB1)，在几乎所有细胞类型的细胞核和细胞质中高度保守的、普遍存在的蛋白质。人和小鼠HMGB1具有215aa的长度和97％的序列同一性。HMGB1是非组蛋白染色质相关的蛋白质和基因功能调节子，但是其还可作为警报素(alarmin)。
已将HMGB1与炎性病症相联系，例如脓毒症(sepsis)、SLE和RA，以及多种癌症。
专注于该靶标的原因之一为其是极度保守的靶标并且由于免疫系统移除自身抗体而难以通过主动免疫产生抗体。HMGB1是高度保守的，如由在人与小鼠/大鼠蛋白质之间有97％的氨基酸序列同一性的事实所说明。为了评估人与大羊驼HMGB1之间的保守度，在来自羊驼(Lamapacos)的全基因组鸟枪序列数据库(Whole Genome Shotgun sequencedatabase)上用人HMGB1序列来进行同源BLAST检索(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/206581138)。这些检索鉴定了三个基因组序列，其中一个包含前两个外显子(序列ID：ABRR01273630.1)并且另一个编码第四个和最后一个外显子(序列ID：ABRR01273631.1)，而基因的中间部分是由另一个命中(hit)编码的(序列ID：ABRR01227803.1)，表明大羊驼HMGB1基因的组织与人基因组织相同。人与大羊驼HMGB1之间的总序列同一性是96％，尽管已经强调了来自全基因组鸟枪数据库的序列不是完全可靠的并且可包含测序误差。
1.2免疫大羊驼
使用弗氏不完全佐剂用重组HMGB1(HMGBiotech，HM114)对四只大羊驼进行免疫。在第一次注射期间，给予80μg的靶蛋白质，随后进行每两周施用一次40μg的靶蛋白质的四次注射。在最后一次注射之后三天，取400ml血液进行PBL的纯化。
1.3构建Fab文库
将从用在费氏不完全佐剂中之HMGB1抗原免疫的四只大羊驼中分离的PBL用于RNA提取，使用由De Haard H等，J.Biol.Chem.274，1999描述的两步克隆方案在噬菌粒(pCB3)中进行Fab的RT-PCR和PCR克隆。对于抗体库的扩增而言，应用在WO 2010/001251中所述的扩增引物。
使用两步PCR来构建独立的VλCλ和VκCκ文库，其中用未标记的引物进行25个循环，接着用这些引物的标记形式(包含用于库克隆的限制性位点)进行10个循环。使用同一方法平行建立VHCH1文库。用于VH、Vλ和Vκ基因扩增的一系列引物可见于WO 2010/001251中。在pCB3中制造初级重链和轻链文库，这些文库的大小范围为从1×107个至3×108个克隆(colony)。
接着，将来自初级VλCλ和VκCκ文库的轻链编码插入物分别再克隆到VHCH1表达载体中以分别产生“λ”和“κ”Fab文库。通过PCR常规进行的文库质量控制观察具有全长Fab插入的克隆的百分比。所获得的Fab文库是大的，具有2×108至9×108个克隆的大小。从每个文库随机测试的大量克隆包含全长Fab序列，表明文库的高质量。
1.4HMGB1特异性Fab的选择
使用噬菌体展示来募集(recruit)与直接包被的HMGB1相结合的不同组(panel)的大羊驼Fab。在四轮选择之后，通过使用胰蛋白酶洗脱获得了良好的富集。
使来源于这些选择的各克隆在96深孔板中生长(1ml表达)并且制备噬菌体并在噬菌体结合ELISA中测试。简言之，在HMGB1(100ng/100μl，Genway(10-663-46237))和酪蛋白包被的孔上孵育来源于各克隆的噬菌体以测定针对HMGB1的特异性结合。使用抗M13-HRP抗体(GE Healthcare，27-9421-01)来检测噬菌体结合。
为了测试与HMGB1特异性结合的克隆的序列多样性，进行指纹图谱(fingerprint)分析。因此，通过标准的PCR技术来扩增这些克隆之编码Fab的插入物。用限制性内切酶HaeIII和AluI来消化PCR片段并且将所消化的样品在2.5％的琼脂糖凝胶上跑样。一些克隆/指纹图谱出现了多次(结果未示出)，但是总体而言，多样性很高。
使具有独特指纹图谱的克隆再次在96深孔板中生长(1ml表达)并且制备噬菌体和周质提取物，其分别在噬菌体ELISA和Fab ELISA中对HMGB1结合再测试(数据未示出)。在这两种情况下，大多数克隆的HMGB1结合再次取得了阳性。
对于每个克隆，测定了VH和Vλ二者或Vκ片段的序列。基于HCDR3序列总共获得了6个不同VH家族，其包含VH和Vλ亲和力变体，即含有体细胞突变。发现了含有Vλ和Vκ轻链的两种克隆。
表1.所有HMGB1结合克隆之最接近的人种系和％人同一性以及％人同源性。
1.5解离速率和HMGB1特异性
以20ml规模制备了所有具有独特序列的HMGB1结合克隆的周质提取物。在Biacore中在HMGB1包被的CM5芯片上测试了这些周质提取物的解离速率(见表2，第二列)。
开始所选择克隆的大规模表达(350ml规模)，通过IMAC使用TALON珠从其中纯化Fab。在Biacore中再次测试经纯化Fab的解离速率(表2中的第三列)。将与HMGB1共享81％序列同源性的HMGB2包被在同一芯片上。HMGB2对周质提取物和经纯化Fab二者的解离速率值也在表2中示出。
表2.在Biacore中在包被有HMGB1/HMGB2的CM5芯片上测定的对周质提取物(表示为peri)和经纯化(pur)Fab的解离速率值。
3F11 8.16 13.2 4.41
1.6针对HMGB1和HMGB2的反应性
在结合ELISA中测试克隆2A1和3F11的经纯化Fab以证实由Biacore所观察到的不同的HMGB1/HMGB2结合特性(参见表2)。因此，将HMGB1、HMGB2或酪蛋白直接包被在微量滴定板上。使用抗-myc-HRP抗体(Imtec Diagnostics，A190-105P)来检测Fab结合。结果在图1中示出。ELISA数据证实了SIMPLE抗体3F11的HMGB2交叉反应性谱和SIMPLE抗体2A1的交叉反应性的缺失，如在Biacore中所观察到的。
1.7抗HMGB1抗体的拮抗特性
测试了纯化的Fab 2A1和3F11对HMGB1与其配体RAGE结合竞争的能力。因此，开发了基于ELISA的结合测定，其中包被HMGB1并且使RAGE-Fc融合(R&D系统，1145-RG)与靶标相互作用。用HRP缀合的抗-Fc抗体(Jackson ImmunoResearch，109-035-008)来检测结合的RAGE。
在添加RAGE-Fc(最终浓度为200ng/ml)之前一小时，将克隆2A1和3F11的Fab以及不相关的Fab(5μg/ml)在包被有HMGB1的孔中孵育。如在图2中所见，HMGB1特异性Fab 2A1产生比没有添加样品或添加不相关Fab时低得多的信号。相反，相比于没有添加样品的对照孔，HMGB2交叉反应的Fab 3F11产生了信号。
由此可以得出结论，Fab 2A1拮抗HMGB1与RAGE的结合，而Fab3F11不影响该相互作用。
实施例2-针对与人细胞因子抗原结合之大羊驼Fab的抗独特型抗体
2.1靶抗原
该实施例的靶抗原是与人靶蛋白质特异性结合的两只大羊驼来源的单克隆抗体，所述人靶蛋白质是细胞因子。这些单克隆抗体包含用人抗体的恒定区(Fc)格式化之大羊驼来源的Fab区(表示为129D3/68F2和111A7/61H7)。
Fab 129D3是表示为68F2的大羊驼来源Fab的种系化变体。大羊驼来源的Fab 68F2是通过用靶抗原(人细胞因子)对完全远系的大羊驼进行免疫来自身产生的。Fab 129D3是来源于68F2的变体，其通过在框架区内引入13个氨基酸替换从而将其与最接近的人种系的总序列同一性增加至达95.2％。129D3和68F2表现出对于靶人抗原的相同结合特异性，然而Fab 129D3更适于用作人治疗剂，由于其更高的人FR序列同一性，特别是当用完全的人Fc区格式化为单克隆抗体时。129D3和68F2(越过VH和VL两者)之间的总氨基酸序列同一性为94％。
第二大羊驼来源的Fab 111A7是表示为61H7的大羊驼来源Fab的种系化变体。Fab 61H7也是通过用靶抗原(人细胞因子)对完全远系的大羊驼进行免疫产生的。Fab 111A7是来源于61H7的变体，其通过在框架区内引入13个氨基酸替换从而将其与最接近的人种系的总序列同一性增加至达96.3％。111A7和61H7表现出对于靶人抗原的相同结合特异性和亲和力/效力。111A7和61H7(越过VH和VL两者)之间的总氨基酸序列同一性为93％。
Fab 103A1是61H7的序列变体，其与61H7一样对相同的人细胞因子有特异性。
开发与Fab 129D3(即，68F2的种系化变体)和Fab 111A7(即，61H7的种系化变体)特异性结合的抗独特型Fab(或mAb)是有商业利益的，特别是促进在包含Fab 129D3或Fab 111A7的mAb之临床试验期间所需的药代动力学(PK)研究。
2.2免疫大羊驼
为了优化针对单克隆抗体68F2和61H7的抗独特型抗体的生产，首先用大羊驼IgG1(即，大羊驼中的常规抗体类型)的恒定区取代人恒定区来改造抗体。该技术特征驱动了对于V区而不针对大羊驼Fc的免疫应答，确保大羊驼的免疫应答集中针对68F2和61H7的特异性CDR(独特型)而不针对抗体的恒定区。此外，大羊驼IgG1的包含Fc的单克隆抗体将在免疫之后于大羊驼中表现出长的半衰期，这意味着免疫原存在(around)长时间以帮助免疫系统增加应答。大羊驼IgG1(重链)和大羊驼Cκ和Cλ的序列在PCT公开WO 2011/001251中给出。
对于用靶单克隆抗体主动免疫而言，使用两只大羊驼。在一周一次的基础上在6周期间通过在颈部肌内注射来使大羊驼接受抗原(靶mAb)。将抗原等分为500μl的级分来用于单个大羊驼的每周注射。将含有100μg抗原的500μl用于前两周。其余四周每次注射包含50μg抗原/500μl。将抗原在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中缓冲。抗原由mAb L68F2、L61H7和L103A1以2∶1∶1的比组成。在注射之前，将抗原与不完全费氏佐剂(IFA)混合。IFA由石蜡和二缩甘露醇一油酸(mannide mono-oleate)组成。其增强抗原的寿命并提高至免疫系统主要位点的转运。这放大了免疫应答。
在第零天，从大羊驼收集血清，并且在第40天(在最后一次免疫之后五天)，收集400ml包含外周血淋巴细胞(PBL)的免疫血液。通过在Ficoll-Paque梯度上离心来纯化外周血淋巴细胞并用于总RNA提取。
2.3文库构建
使用逆转录酶将总RNA转化成随机引物的cDNA并且使用该cDNA作为模板通过PCR来扩增编码重链(VHCH1)以及两种类型的轻链(VκCκ和VλCλ)的基因序列。使用一些中间克隆步骤，在pCB3载体中制造组合Fab文库，其中将所有不同的VHCH1扩增子与所有不同的轻链扩增子组合。对于κ型轻链和λ型轻链两者均进行该步骤。因此，这导致每个大羊驼产生2个Fab文库：κ文库和λ文库。
文库的优选大小是＞1×109CFU，具有大于75％的正确插入率以尽可能全面地覆盖完全的抗体库并且提高初始VH-VL组合存在的机会。
2.4选择和筛选
用Fab文库(质粒)转化细菌，随后用VCSM13辅助噬菌体感染所述细菌。因此，大肠杆菌细胞产生和分泌噬菌体，所述噬菌体展示出由存在于被感染细菌中的噬菌粒基因组所编码的Fab片段的单拷贝。使用PEG沉淀方法从细菌中纯化噬菌体。将这些噬菌体用于选择。
选择方法1：基于使用人血清的反选择的方法：
针对人血清的反选择旨在从文库中移除Fab，所述文库识别在人抗体上的常见表位。将从所述文库制备的并通过PEG沉淀纯化的噬菌体在20％正常人血清(包含约3mg/ml IgG1)/PBS中稀释十倍并且在将100μl该混合物转移到包被有L68F2或L61H7的孔之前，将其在头过头旋转器(a head-over-head rotator)中孵育30分钟。
在来自经免疫的一只大羊驼的κ和λ文库上进行选择方法1并且导致鉴定了针对61H7(103A1)的五种Fab：来自κ文库的8D6/8H7和来自λ文库的7C6/7B4/7C12。将这五种Fab再克隆到特异性表达载体(pCB4)中以产生适量的Fab蛋白质以用于进一步表征。此外，将Fab8H7和7C6的可变结构域与大羊驼和人IgG1的恒定结构域融合。
选择方法2：基于使用人血清和不相关同种型人单克隆抗体(36C4)的反 选择的方法：
再次，反选择旨在从文库中移除Fab，所述文库识别在人抗体上的常见表位。将噬菌体在20％正常人血清中稀释十倍，但是现在以500μg/ml的浓度添加人mAb。
选择方法2导致鉴定出一个针对68F2的Fab，11E1。将11E1 Fab的重链和轻链可变结构域融合到人和大羊驼IgG1的重链和轻链恒定结构域中。人IgG1形式(称为hu11E1)和大羊驼IgG1形式(称为la11E1)二者均在HEK293细胞中表达并且提供足够的蛋白质以用于表征。
2.5抗独特型抗体的表征
2.5.1针对68F2的抗独特型抗体11E1的表征
一旦可得到11E1的抗独特型人和大羊驼IgG形式，就进行不同实验以更好地表征分子：
·表面胞质基因共振分析来定义hu11E1(11E1的人IgG形式)的亲和力和解离速率
·ELISA来测定la11E1(11E1的大羊驼IgG形式)针对不同mAb的结合特性从而确定分子的特异性
·药代动力学实验来证明la11E1可用作药代动力学研究的可靠工具
2.5.1.1：测定抗独特型mAb hu11E1与独特型mAb 68F2之间相互作用的 解离常数(K D )和解离速率(k off )
使用SPR基于与独特型的结合来筛选抗独特型Fab与从周质级分提取之68F2的特异性结合。这是使用Biacore 3000(Biacore AB/GEHealthcare)来完成的。将68F2用作配体并且固定在CM5芯片(BiacoreAB)的流动池(flowcell)2中，具有3000响应单位[RU]的密度。将作为背景对照的PBS“固定”在流动池1中。在运行缓冲液HBS-EP(10mMHEPES、3mM EDTA、150mM NaCl、0.005％Tween-20)中将周质级分稀释8倍。将流动设置为30μl/分钟并且分析物注射由60μl分析物组成。此外，设置3分钟的解离时间并测量动力学。根据制造商的建议进行所有使用的方法，并且使用BiaEvaluation 4.1(Biacore AB)软件来分析数据。对于68F2，hu11E1的KD为36pM，且koff为4.83×10-5s-1。没有针对61H7或针对与相同人靶抗原结合的市售mAb的结合。因此11E1与68F2特异性结合。
2.5.1.2：描述la11E1对于不同抗体的结合谱从而验证la11E1对68F2的特 异性。
为了确定la11E1的特异性，设置ELISA。以2μg/ml浓度包被一组相关单克隆抗体，在4℃下过夜。在包被之后，在室温下用含有1％酪蛋白的PBS封闭ELISA板2个小时。然后用100μl的lal1E1(大羊驼IgG)取代封闭溶液，所述la11E1以10μg/ml的浓度开始，以稀释3倍的稀释系列直到达到14ng/ml的浓度。通过添加小鼠抗大羊驼IgG1(27E10)单克隆抗体并且随后添加与HRP缀合的驴抗小鼠IgG抗体来检测结合的发生。
对于特异性，概述测试的抗体组，包括68F2和61H7，以及与相同人靶抗原结合的市售抗体和作为同种型对照的与不相关人靶抗原结合的不相关大羊驼来源的抗体(36C4)。还包括的是与不相关大羊驼来源的VH或VL错配的68F2。VH68VL48包含68F2的VH但是不包含VL，而VH48VL68与之相反。
在该组抗体中，la11E1示出对于68F2的高特异性结合(图3)。特别重要地是，不识别对照抗体36C4。这是用与68F2相同的技术分离的同种型对照(相同的Fc变体)抗体。如果不识别36C4，则可有很高的机会在大的抗体池(如人血浆)中非常特异性地结合68F2。这确实由进一步的实验所证实(见后面)。
感兴趣地是，也在包含68F2的重链但具有不相关抗体的轻链之错配mAb(VH68VL48)中识别了68F2的重链。对该错配VH68VL48的结合比完全的68F2抗体少约100倍。这表明68F2上结合表位的主要部分位于其可变重链部分但是其可变轻链序列也有助于la11E1的结合。
2.5.1.3：使用129D3来证明la11E1用于药代动力学研究的可用性。
129D3是68F2的种系化衍生物并且与68F2仅相差框架区中的几个氨基酸。
首先，需要证明在血浆的存在下la11E1与129D3的特异性结合。使用68F2作为阳性对照。
用3μg/ml la11E1大羊驼形式包被Maxisorp板，在4℃下过夜。次日，在室温下用含有1％酪蛋白的PBS封闭该板2个小时。同时，向所用的来自三只食蟹猴之混合零天血浆中掺加(spike)50μg/ml浓度的129D3或68F2。零天意指猴子还没有用任何类型的mAb处理。在封闭之后，将1％的该掺加的混合血浆添加到ELISA板(500ng/ml终浓度)。在相邻的孔中进行稀释系列，在每个孔中稀释2倍。在包含1％混合血浆的PBS中进行稀释以保持每个孔中的基质相等。最后一个孔使用没有添加单克隆抗体的1％的血浆以观察背景信号。
在室温下，使68F2或129D3与板覆盖层(coating)结合2小时。在2小时之后，允许与HRP(Bethyl-lot#A80-319P-14)缀合的猴子缺失的(depleted)抗人Fc多克隆抗体来检测独特型(68F2或129D3，其包含人Fc部分)与抗独特型(la11E1，其包含大羊驼Fc部分)的结合，持续1小时。然后，将其用s(HS)-TMB(SDT-试剂)着色并在10分钟之后终止着色反应。
11E1的大羊驼IgG形式(la11E1)能够以同等方式在混合食蟹猴血浆背景中检测68F2和129D3两者(图4)。这表明la11E1确实可用于检测129D3。背景信号非常低。
2.5.2 61H7抗独特型抗体的表征
将存在于噬菌粒载体pCB3中的来自克隆7B4、7C6、7C12、8D6和8H7的插入物再克隆到pCB4表达载体中来大规模生产Fab。将这些产物用于初始表征。注意到，这不同于表征人和大羊驼IgG1形式时的11E1的。
2.5.2.1：验证所选的Fab 7B4、7C6、7C12、8D6和8H7针对其靶标61H7 的结合以评估结合特异性。
用人61H7靶抗体来包被96孔板。将7B4、7C6、7C12、8D6和8H7的经纯化Fab以3倍稀释系列(800nM、267nM、89nM、30nM、10nM和3.3nM)添加至孔。用抗MYC HRP进行检测。在不同的两天将该实验进行两次。在第一次实验中，包括以下的阴性对照：与相同人靶抗原结合的市售抗体、68F2以及36C4(同种型对照，针对不相关人靶抗原的大羊驼来源的抗体)。将阴性对照分子包被在板上并用200nM的Fab孵育。在第二次实验中，阴性对照是针对相同人靶标蛋白质的市售抗体、大羊驼68F2和人68F2。此外，包括大羊驼61H7和103A1(61H7的微小序列变体)以验证61H7的这些形式也由Fab所识别。
该测定结果证明：
·7C6 Fab与其靶标61H7明显地特异性结合
·7C6 Fab与独特型mAb人61H7结合，具有约1.13×10-7M的EC50(图5)
·7C6不与阴性对照人68F2、大羊驼68F2、针对相同靶标的市售抗体以及36C4结合
·由7C6识别的大羊驼61H7和大羊驼103A1(类似于61H7)
实施例3-针对与人TNF配体家族抗原结合之大羊驼Fab的抗独特型抗 体
3.1靶抗原
该实施例的靶抗原是与人靶蛋白质特异性结合的大羊驼来源的单克隆抗体，所述人靶蛋白质是TNF配体家族成员。该单克隆抗体由连接至Cλ区的大羊驼来源的可变Vλ区(表示为41D2)和连接至人IgG1的CH1-铰链-CH2CH3之大羊驼来源的VH所组成。
Fab 41D12是表示为27B3的大羊驼来源Fab的种系化变体。大羊驼来源的Fab 27B是通过用表达靶抗原的细胞(人TNF配体家族成员)对完全远系的大羊驼进行免疫来自身产生的。Fab 41D12是来源于27B3的变体，其通过在框架区内引入15个氨基酸替换从而将其与最接近的人种系的总序列同一性增加至达95.7％。41D12和27B3表现出对于靶人抗原相同的结合特异性和亲和力，然而Fab 41D12更适于用作人治疗剂，特别是当用完全的人Fc区格式化为单克隆抗体时。
开发与Fab 41D12(即，27B3的种系化变体)特异性结合的抗独特型Fab(或mAb)是有商业利益的，特别是促进在包含Fab 41D12的mAb之临床试验期间所需的药代动力学(PK)研究。
3.4免疫大羊驼
用27B3-大羊驼-Fc免疫两只大羊驼。27B3是41D12的非种系化形式，即，在VH和VL结构域二者中框架区均具有“完全大羊驼”序列。使用大羊驼来源的Fab 27B3，而不是种系化变体41D12，来免疫大羊驼以确保大羊驼的免疫应答直接针对Fab(抗独特型)的抗原结合区而不是针对由种系化变体41D12的框架区中引入的氨基酸替换所形成的任何表位。类似地，使用大羊驼Fc来免疫以避免针对Fc部分的免疫应答。
为了评估针对41D12所产生的免疫应答的强度，在ELISA中在直接包被的41D12上测试来自大羊驼的免疫前和免疫血清之41D12特异性抗体的存在。使用抗大羊驼IgG1进行检测。所获得的结果(未示出)证明来自经免疫的一只大羊驼的良好免疫应答和来自第二只大羊驼的较弱应答。
3.5文库构建
将从经免疫的大羊驼中分离的PBL用于RNA提取，使用由De HaardH等，J.Biol.Chem.274，1999描述的方案采用WO 2010/001251中描述的引物在噬菌粒(pCB3)中进行编码Fab基因区段的RT-PCR和克隆以获得大的文库。
使用两步PCR来构建独立的VλCλ和VκCκ文库，其中用未标记的引物进行25个循环，接着用这些引物的标记形式进行10个循环。使用同一方法平行建立VHCH1文库。在pCB3中制造子文库。这些文库的大小为108cfu至109cfu。
接着，将来自VλCλ和VκCκ文库的轻链分别再克隆到包含VHCH1的载体中以分别产生“λ”和“κ”大羊驼Fab文库。使用PCR常规地进行文库的质量控制。这些文库的大小为109cfu至1010cfu。
3.6选择和筛选
使用噬菌体展示来募集(recruit)与41D12相结合的不同组大羊驼Fab。在直接包被的41D12上进行选择，并且通过添加20％的人血清进行反选择。
对于每次选择，使24个单个克隆在96深孔板中生长(1ml表达)并且制备周质级分并在结合ELISA中测试。在27B3-大羊驼-Fc、41D12和表示为57A10的阴性对照mAb(包含与不同的、不相关人蛋白质结合的大羊驼来源之Fab的mAb)上测量结合。使用抗c-myc-HRP mAb进行检测。
结果(未示出)证明在所有文库中均发现Fab与41D12特异性结合而不与57A10结合。
在Biacore中在包被41D12和57A10的CM5芯片上测试周质提取物的解离速率。一些克隆的结果在表3中示出。可证明与独特型抗体41D12的高亲和力和特异性结合。
表3-通过Biacore测量包含大羊驼来源的抗独特型Fab之周质级分与独特型mAb和阴性对照mAb的结合
克隆 41D12的Ro[RU] 57A10的Ro[RU] 解离速率[s-1]
66B2 128 2 1.60E-03
66E1 148 2 1.63E-03
66D1 133 7 4.46E-03
66B1 33 13 2.76E-03
66D3 282 8 1.41E-03
66E3 266 1 2.64E-04
66C8 12 3 7.90E-04
66B3 238 5 1.45E-03
67H3 25 7 1.20E-03
66E8 44 6 4.84E-03
66H1 56 8 1.54E-03
3.7通过ELISA之大羊驼来源的抗独特型mAb与在人血浆中掺加的独特 型mAb的结合
该ELISA的目标是确定使用抗独特型mAb是否可在人血浆中特异性检测出41D12，证明抗独特型mAb作为开发人PK测定的工具的效用。
将抗独特型mAb 66E8、66E3、66A9和67H3以及不相关的mAb(66G3也具有大羊驼Fc)以5μg/ml包被在Nunc 96孔微量滴定板中，在4℃下过夜。在洗涤之后，将板用2％BSA封闭2小时，然后以系列稀释施加41D12(所述系列稀释以10μg/ml开始)，在1％人血浆中稀释3倍。将样品在RT下孵育2小时。在洗涤之后，使用抗人Fc HRP(Jackson109-035-008)在5000倍稀释下检测41D12。洗涤板并将TMB底物用于染色，在OD620nm处测量OD。结果在图6中示出。
所述结果证明可以在人血浆中以高灵敏度检测出41D12(检测限约5ng/ml)。但是，该测定中的背景非常高。这是因为抗人Fc HRP(Jackson109-035-008)也检测包被mAb的大羊驼Fc。在这方面，之前使用的检测抗体(与来自Bethyl的HRP缀合之猴IgG缺失的抗人Fc多克隆抗体)是优选的，因为其不与大羊驼IgG交叉反应(参见实施例2.5.1.3)。
本发明不限于由本文描述之特定实施方案的范围。实际上，除本文所描述的那些之外，根据前面的说明书和附图对本发明进行的各种修改对本领域技术人员来说是明显的。这样的修改旨在落入所附权利要求书的范围之内。此外，认为本文描述的本发明的所有方面和实施方案是广泛适用的并且可与任何和所有其他一致的实施方案组合，包括适当地取自本发明的其他方面的那些(包括分离)。
本文引用的各种出版物，其公开内容均通过引用以其整体并入本文。

Claims (34)

1.分离的抗原结合多肽，其包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域或所述VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)获得自骆驼科(Camelidae)物种的VH或VL结构域，其特征在于所述抗原结合多肽与靶抗原特异性结合，所述靶抗原是在序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原，所述序列比较窗口至少包括所述抗原结合多肽之表位，或者包括包含所述抗原结合多肽之表位的所述靶抗原的至少一个结构域，或者全长的所述靶抗原。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合多肽，其中所述靶抗原是高度保守抗原，其中所述高度保守抗原是来自所述骆驼科物种之外的物种的多肽，所述多肽在所述序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少90％的氨基酸序列同一性。
3.根据权利要求2所述的分离的抗原结合多肽，其中所述高度保守抗原在所述序列比较窗口表现出与来自所述骆驼科物种的同源蛋白质具有至少95％的氨基酸序列同一性。
4.根据权利要求2或3所述的分离的抗原结合多肽，其中所述高度保守抗原是来自选自以下之物种的多肽：人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猪、狗、豚鼠、兔、羊、牛或鸡。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的分离的抗原结合多肽，其中所述高度保守抗原是人多肽。
6.根据权利要求1所述的分离的抗原结合多肽，其中所述靶抗原是来自所述骆驼科物种的自身抗原或者在所述序列比较窗口表现出与所述骆驼科自身抗原具有至少90％氨基酸序列同一性的骆驼科动物来源的抗原。
7.根据权利要求1所述的分离的抗原结合多肽，其中所述靶抗原是获得自所述骆驼科物种之抗体的可变区或者在包括所述抗体整个可变区的序列比较窗口表现出与获得自所述骆驼科物种之抗体的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性的变体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的抗原结合多肽，其中所述骆驼科物种选自骆驼、大羊驼、单峰驼、骆马、原驼和羊驼。
9.根据权利要求8所述的分离的抗原结合多肽，其中所述骆驼科物种是大羊驼(Lama glama)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合多肽，其中在所述VH结构域和所述VL结构域两者中的每个高变环或互补决定区均获得自骆驼科物种的VH或VL结构域。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合多肽，其是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含具有由人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的至少一个恒定结构域，或者所述嵌合多肽包含人抗体的完整恒定区。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合多肽，其是与所述靶抗原特异性结合的嵌合羊驼属-人抗体，所述抗原结合多肽包含成对的VH和VL结构域，其中所述VH结构域和所述VL结构域各自与人抗体的一个或更多个IgG恒定结构域配对，并且其中所述VH和VL结构域包含来源于通过使用所述靶抗原主动免疫所述羊驼属物种所获得之常规抗体的高变环。
13.多核苷酸分子，其编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗原结合多肽，或者编码所述抗原结合多肽的片段，所述片段包含获得自骆驼科物种之VH或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)。
14.表达载体，其包含与允许所述抗原结合多肽在宿主细胞或无细胞表达系统中表达的调节序列有效连接的权利要求13所述的多核苷酸分子。
15.宿主细胞或无细胞表达系统，其包含权利要求14所述的表达载体。
16.生产重组抗原结合多肽的方法，其包括在允许所述抗原结合多肽表达的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞或无细胞系统并且回收所表达的抗原结合多肽。
17.药物制剂，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗原结合多肽和至少一种可药用稀释剂、赋形剂或载体。
18.用于制备与靶抗原特异性结合的重组抗原结合多肽的方法，所述抗原结合多肽包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域或所述VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)获得自骆驼科物种，所述方法包括以下步骤：
(a)免疫骆驼科物种，由此产生针对所述靶抗原的常规抗体；
(b)分离骆驼科核酸，其编码与所述靶抗原免疫反应的骆驼科常规抗体的VH和/或VL结构域之至少一个高变环或互补决定区(CDR)；
(c)制备包含编码如下高变环或互补决定区之核苷酸序列的多核苷酸，所述高变环或互补决定区具有与由步骤(a)分离的核酸编码的高变环或互补决定区一致的氨基酸序列，所述多核苷酸编码与所述靶抗原免疫反应(或特异性结合)之包含VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽；以及
(d)由步骤(c)的重组多核苷酸表达所述抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽与部分(b)的骆驼科常规抗体不一致，其特征在于所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤(b)包括分离编码所述抗体的VH结构域和/或VL结构域的骆驼科核酸以及改变所述核酸的序列使得其编码具有一个或更多个氨基酸替换、缺失或者添加的VH结构域和/或VL结构域。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中在步骤(c)中制备的所述重组多核苷酸还包含编码人抗体的一个或更多个恒定结构域的核苷酸序列。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述骆驼科物种是骆驼、大羊驼、单峰驼、骆马、原驼或羊驼。
22.用于生产编码骆驼科常规抗体的VH和VL结构域之表达载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物，从而产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体；
b)由包含来自所述经免疫骆驼科动物的淋巴组织(例如循环B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得这样的经扩增基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码骆驼科常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；以及
d)将c)中获得的所述基因区段克隆到表达载体中，使得每个表达载体都包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域的抗原结合多肽的表达，由此得到表达载体文库，其特征在于所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
23.用于制备编码与靶抗原免疫反应的抗原结合多肽之表达载体的方法，所述方法包括以下步骤：
i)使用权利要求22所述的方法制备表达载体文库；
ii)就与所述靶抗原的免疫反应性，筛选由所述文库编码的抗原结合多肽，并由此选择编码与所述靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的表达载体，其特征在于所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
24.根据权利要求23所述的方法，其包括另外的步骤iii)，在所述步骤iii)中将编码部分(ii)中所选载体之VH结构域的基因区段和编码部分(ii)中所选载体之VL结构域的基因区段克隆到另外的表达载体中，与编码人抗体的一个或更多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，由此产生编码包含与人抗体的一个或更多个恒定结构域相融合的步骤ii)中所选VH和VL结构域之嵌合抗原结合多肽的表达载体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在克隆到所述另外的表达载体之前，改造编码部分(ii)中所选载体之所述VH结构域的基因区段和/或编码部分(ii)中所选载体之所述VL结构域的基因区段以在编码所述VH和/或所述VL结构域的核苷酸序列中引入一个或更多个变化。
26.根据权利要求23所述的方法，其还包括轻链改组方法，所述轻链改组方法包括以下步骤：
iii)制备表达载体的第二文库，其中所述文库中的每个载体包含编码VL结构域的基因区段和编码步骤ii)中所选表达载体之VH结构域的基因区段；
iv)就与所述靶抗原的免疫反应性，筛选由所述第二文库编码的抗原结合多肽，并且由此选择编码与所述靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的表达载体。
27.根据权利要求26所述的方法，其包括另外的步骤v)，在所述步骤v)中将编码部分(iv)中所选载体之VH结构域的基因区段和编码部分(iv)中所选载体之VL结构域的基因区段克隆到另外的表达载体中，与编码人抗体的一个或更多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，由此产生编码包含与人抗体的一个或更多个恒定结构域相融合的步骤iv)中所选VH和VL结构域之嵌合抗原结合多肽的表达载体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中在克隆到所述另外的表达载体之前，改造编码部分(iv)中所选载体之所述VH结构域的基因区段和/或编码部分(iv)中所选载体之所述VL结构域的基因区段以在编码所述VH和/或所述VL结构域的核苷酸序列中引入一个或更多个变化。
29.根据权利要求26所述的方法，其还包括重链改组方法，所述重链改组方法包括以下步骤：
v)制备表达载体的第三文库，其中所述文库中的每个载体包含编码VH结构域的基因区段和编码步骤iv)中所选表达载体之所述VL结构域的基因区段；
vi)就与所述靶抗原的免疫反应性，筛选由所述第三文库编码的抗原结合多肽，并且由此选择编码与所述靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的表达载体。
30.根据权利要求29所述的方法，其包括另外的步骤vii)，在所述步骤vii)中将编码部分(vi)中所选载体之所述VH结构域的基因区段和编码部分(vi)中所选载体之所述VL结构域的基因区段克隆到另外的表达载体中，与编码人抗体的一个或更多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，由此产生编码包含与人抗体的一个或更多个恒定结构域相融合的步骤vi)中所选载体的VH和VL结构域之嵌合抗原结合多肽的表达载体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在克隆到所述另外的表达载体之前，改造编码部分(vi)中所选载体之所述VH结构域的基因区段和/或编码部分(vi)中所选载体之所述VL结构域的基因区段以在编码所述VH和/或所述VL结构域的核苷酸序列中引入一个或更多个变化。
32.用于生产编码与靶抗原免疫反应之嵌合抗原结合多肽的表达载体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物(大羊驼或羊驼)，从而产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体；
b)从包含来自于所述经免疫骆驼科动物的淋巴组织(例如循环B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得这样的经扩增基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码骆驼科动物常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；
d)将c)中获得的所述基因区段克隆到表达载体中，以使得每个表达载体包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域的抗原结合多肽的表达，由此产生表达载体文库；
e)就与所述靶抗原的免疫反应性，筛选由步骤d)中获得的所述文库编码的抗原结合多肽，并且由此选择编码与所述靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的表达载体；
f)任选地，进行轻链改组步骤和/或重链改组步骤以选择表达载体，所述表达载体编码与所述靶抗原免疫反应之经效力优化的抗原结合多肽；
g)任选地，对编码步骤e)或步骤f)中所选载体之VH结构域的基因区段和/或编码步骤e)或步骤f)中所选载体之VL结构域的基因区段进行种系化和/或密码子优化；以及
h)将编码部分e)或f)中所选载体之VH结构域的基因区段或者步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VH基因区段以及编码部分e)或f)中所选载体之VL结构域的基因区段或者步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VL基因区段克隆到另外的表达载体中，与编码人抗体的一个或更多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，从而产生编码包含与人抗体的一个或更多个恒定结构域相融合的所述VH和VL结构域之嵌合抗原结合多肽的表达载体，其特征在于所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
33.用于生产与靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使用权利要求23至32中任一项所述的方法制备编码与靶抗原免疫反应之抗原结合多肽的表达载体；
b)在允许所编码的抗原结合多肽表达的条件下，将所述表达载体引入宿主细胞或无细胞表达系统中；以及
c)回收所表达的抗原结合多肽，其特征在于所述靶抗原是表现出与来自所述骆驼科物种的蛋白质具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽抗原。
34.根据权利要求18至33中任一项所述的方法，其中所述靶抗原如权利要求1至7中任一项所限定。
CN201380038485.7A 2012-07-20 2013-07-19 针对高度保守靶标的包含来自骆驼科之序列的抗体 Pending CN104520317A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1212940.9 2012-07-20
GB1212940.9A GB2504139B (en) 2012-07-20 2012-07-20 Antibodies to highly conserved targets produced by the immunisation of Camelidae species
PCT/EP2013/065350 WO2014013075A2 (en) 2012-07-20 2013-07-19 Antibodies to highly conserved targets

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104520317A true CN104520317A (zh) 2015-04-15

Family

ID=46881721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380038485.7A Pending CN104520317A (zh) 2012-07-20 2013-07-19 针对高度保守靶标的包含来自骆驼科之序列的抗体

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20150191548A1 (zh)
EP (1) EP2875048A2 (zh)
JP (1) JP2015524404A (zh)
CN (1) CN104520317A (zh)
AU (1) AU2013291937A1 (zh)
CA (1) CA2877446A1 (zh)
GB (1) GB2504139B (zh)
IL (1) IL236525A0 (zh)
IN (1) IN2015DN00091A (zh)
WO (2) WO2013064701A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110139952A (zh) * 2016-12-09 2019-08-16 深圳华大生命科学研究院 骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用
CN110177806A (zh) * 2016-11-16 2019-08-27 瑞泽恩制药公司 与met结合的抗met抗体、双特异性抗原结合分子及其使用方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6482757B2 (ja) 2010-07-26 2019-03-13 トリアンニ インコーポレイテッドＴｒｉａｎｎｉ，Ｉｎｃ． トランスジェニック動物および使用方法
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
RU2604196C2 (ru) * 2011-03-16 2016-12-10 арДЖЕН-ИКС Н.В. Антитела против cd70
CN115160441A (zh) * 2013-09-26 2022-10-11 埃博灵克斯股份有限公司 双特异性纳米抗体
GB201414823D0 (en) 2014-08-20 2014-10-01 Argen X Bv Multispecific antibodies
KR20170136536A (ko) * 2015-03-16 2017-12-11 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 항-met 항체 및 그 사용 방법
WO2016156475A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin b
DK4089113T3 (da) 2015-03-31 2024-02-05 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polypeptider
WO2016156474A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin a
US10520511B2 (en) * 2015-05-12 2019-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multimeric protein purity determination
EP3384030A4 (en) 2015-12-03 2019-07-03 Trianni, Inc. IMPROVED IMMUNOGLULINIVITY
AU2017213633B2 (en) 2016-02-04 2023-08-03 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
GB201612337D0 (en) 2016-07-15 2016-08-31 Argen-X N V Ant-il-22r antibodies
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
JP2021506310A (ja) 2017-12-22 2021-02-22 アルゲン−エックス ビーブイビーエー 二重特異性抗原結合コンストラクト
US20220242945A1 (en) 2019-06-21 2022-08-04 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
US20230056445A1 (en) 2019-06-21 2023-02-23 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
CA3146933A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Marcus KELLY Radiolabeled met binding proteins for immuno-pet imaging
WO2024039920A1 (en) * 2022-08-15 2024-02-22 Mbrace Therapeutics, Inc. Cell-free methods of producing antibodies to intracellular targets
WO2024086852A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Diagonal Therapeutics Inc. Heteromeric agonistic antibodies to il-18 receptor

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216328A (zh) * 2008-07-02 2011-10-12 阿尔金-X公司 骆驼科动物来源的抗原结合多肽

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
JP3683278B2 (ja) * 1995-12-20 2005-08-17 ザ ユニバーシティ オブ ケンタッキー リサーチ ファウンデーション マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体１１ｄ１０およびその使用方法
CA2538763C (en) * 2003-09-11 2015-05-05 Critical Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies against hmgb1
CN102731654A (zh) * 2004-10-22 2012-10-17 米迪缪尼有限公司 抗hmgb1的高亲和力抗体及其用法
IL198545A0 (en) 2008-05-14 2011-07-31 Metheresis Translational Res Sa High affinity binding site of hgfr and methods for identification of antagonists thereof
US8444976B2 (en) * 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
MX2011010169A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-1/anti-c-met.
PT2606070T (pt) * 2010-08-20 2017-03-31 Novartis Ag Anticorpos para o recetor 3 do fator de crescimento epidérmico (her3)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216328A (zh) * 2008-07-02 2011-10-12 阿尔金-X公司 骆驼科动物来源的抗原结合多肽

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110177806A (zh) * 2016-11-16 2019-08-27 瑞泽恩制药公司 与met结合的抗met抗体、双特异性抗原结合分子及其使用方法
CN110177806B (zh) * 2016-11-16 2024-03-15 瑞泽恩制药公司 与met结合的抗met抗体、双特异性抗原结合分子及其使用方法
CN110139952A (zh) * 2016-12-09 2019-08-16 深圳华大生命科学研究院 骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用
CN110139952B (zh) * 2016-12-09 2022-11-25 深圳华大生命科学研究院 骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用

Also Published As

Publication number Publication date
IN2015DN00091A (zh) 2015-05-29
WO2014013075A2 (en) 2014-01-23
AU2013291937A1 (en) 2015-01-22
WO2014013075A3 (en) 2014-12-18
GB201212940D0 (en) 2012-09-05
EP2875048A2 (en) 2015-05-27
US20150191548A1 (en) 2015-07-09
US20180016351A1 (en) 2018-01-18
GB2504139A (en) 2014-01-22
WO2013064701A3 (en) 2013-07-18
CA2877446A1 (en) 2014-01-23
GB2504139B (en) 2014-12-31
JP2015524404A (ja) 2015-08-24
IL236525A0 (en) 2015-02-26
WO2013064701A2 (en) 2013-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104520317A (zh) 针对高度保守靶标的包含来自骆驼科之序列的抗体
US11512129B2 (en) TIGIT antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
KR102662387B1 (ko) B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
CN106243226B (zh) 抗人ifnar1的抗体及其用途
CN107108747A (zh) 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
CN111744013B (zh) 抗tigit抗体联合pd-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合
CN107739405A (zh) 骆驼科动物来源的抗原结合多肽
CN110066336B (zh) 抗cd47单克隆抗体、片段及其医药用途
CN111533805B (zh) 一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用
CN105820250B (zh) 一种抗basigin人源化抗体及其应用
JP2020508658A (ja) Ｔｉｍ−３抗体、その抗原結合断片、及びそれらの医学的使用
CN114746440A (zh) 新型多肽复合物
CN111526887A (zh) 用于使血清中的蛋白质半衰期增加的组合物和方法
CN116829587A (zh) Her2抗体及其应用
CN113227148B (zh) 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
Karadag et al. Physicochemical determinants of antibody-protein interactions
CN115298216A (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
CN110407942B (zh) 针对kn044的单域抗体
CN112646029B (zh) 成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒
CN112574305B (zh) 针对前体脑源性神经营养因子的抗体及其应用
Lee et al. Structural basis of interleukin-17B receptor in complex with a neutralizing antibody for guiding humanization and affinity maturation
WO2022037527A1 (zh) 结合bcma的单可变结构域及抗原结合分子
CN115975029A (zh) 靶向人lilrb2的纳米抗体及其应用
CN116234573A (zh) 抗trop-2抗体、其抗原结合片段或其突变体、及其医药用途
JP2011200164A (ja) シガトキシン類を認識するヒト化抗体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Holland Breda

Applicant after: ARGEN-X N.V.

Address before: Holland Breda

Applicant before: Argen X. B. V.

COR Change of bibliographic data
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150415

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication