CN107739405A - 骆驼科动物来源的抗原结合多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及骆驼科动物来源的抗原结合多肽。本发明涉及用于生产抗原结合多肽的技术平台，其中所述抗原结合多肽对期望靶标抗原具有特异性，该技术平台以骆驼科物种常规抗体库为基础，并且涉及使用该技术平台获得的抗原结合多肽。特别是，本发明提供了包含VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽，其中在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。
Description
本申请是申请号为200980134392.8的中国专利申请的分案申请，原申请是2009年7月2日提交的PCT国际申请PCT/IB2009/006329于2011年3月2日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明涉及用于产生抗原结合多肽(包括单克隆抗体)的新平台，其与人抗体可变结构域的序列和结构高度同源。
背景技术
单克隆抗体已被广泛地用作研究工具，并且越来越多地被用作治疗或诊断试剂。目前有超过20种不同的单克隆抗体已经获得监管部门的批准以用于治疗不同的疾病，其中包括癌症、炎症、自身免疫病、传染性疾病、哮喘、心血管疾病和移植排斥，而且在开发过程中的单克隆抗体药物的数量也在逐年增加。
啮齿类动物(特别是鼠)单克隆抗体由于其非人源性的相关问题(特别是其在人类宿主中的免疫原性)因而在人类治疗中的实用性具有局限。为了尽可能地降低人类对治疗性抗体药物的免疫应答，单克隆抗体技术已经从完全小鼠抗体发展到嵌合抗体(小鼠的可变结构域被嫁接到人IgG的骨架上)、人源化抗体(小鼠的CDR被嫁接到人IgG的骨架上)、“完全人”抗体(来源于合成文库或来源于经免疫的表达部分人IgG库的转基因小鼠)。
许多可以生产针对治疗性目的之靶标抗原的完全人或“人源化”单克隆抗体的技术平台已被开发。这些平台中的每一个都有其独特的特点和潜在的缺陷。
小鼠单克隆抗体的人源化最初通过将小鼠的可变结构域与人的恒定结构域结合而实现，产生具有约70％人源成份的所谓“嵌合抗体”。随后，更进一步的人源化通过将小鼠单克隆抗体的互补决定区(complementarity-determining region，CDR)嫁接到人抗体可变抗体结构域的框架区上实现。此外，发现存在于这些框架区中的一些氨基酸残与CDR或抗原相互作用，而后使人源化抗体中的这些氨基酸回复突变以提高结合。(Almagro等Frontiers in Bioscience，13：1619-1633(2008))。使用这种方法改造的单克隆抗体在人源化后与人类的VH和VL结构域序列有较高程度的一级序列同源性，但缺点是其可能以不具备人样结构的高变环(hypervariable loop)来结束，这是因为并非所有小鼠编码的CDR都使用标准的折叠和标准折叠的组合，而在人抗体中则没有这种情况发生(Almagro等，Mol.Immunol.34：1199-1214(1997)；Almagro等，Immunogen.47：355-63(1998))。更糟糕的是人源化此类抗体通常需要进行大量的突变(其过程复杂且费时)，由于人源化需要进行大量的改变并且鼠源库中主要使用VKappa结构域(而所有人抗体中约一半具有VLambda结构域)，抗体还有丧失亲和力和效力的风险。
作为对人源化小鼠单克隆抗体潜在的改进，“完全人”单克隆抗体可以通过两种非常不同的方法生产。第一种方法是从完全合成的人类组合抗体文库(例如MorphoSys)中筛选。这种方法的潜在缺点是，该合成文库只是接近于人类种系中天然存在的功能多样性，因而其多样性是较有限的。此外，使用这种方法产生的抗体不是来自于通过主动免疫而进行的体内CDR筛选，因而通常必须进行亲和力成熟(affinity maturation)以提高其对靶标抗原的亲和力。亲和力成熟是一个耗时的过程，其可能会大大增加筛选出抗体的时间。此外，在亲和力成熟过程中，某些氨基酸残基可能会被改变，这可能对所得的抗体的结合特异性或稳定性产生负面影响(Wu等，J.Mol.Biol.368：652-65(2o07))。
另一种“完全人”平台是基于用人类种系的抗体编码序列进行改造以取代鼠免疫球蛋白编码区的转基因小鼠(例如HuMab、Medarex)。这些系统的优点是：抗体是使用靶标抗原通过主动免疫而产生的，即它们具有针对抗原的高初始亲和力，并且不需要或只需最低限度地对原始抗体进行抗体改造以使它们更加人源化。然而，转基因小鼠品系必然是高度近交的，这对于抗体应答的强度和多样性具有不利影响。该平台的另一个缺点是在一些转基因小鼠系统中由于人类Fc/小鼠Fc受体相互作用可能导致B细胞成熟障碍。
另一种平台是基于免疫非人灵长类动物(特别是食蟹猴(cynomologousmonkey))。由于猴子与人类的免疫球蛋白之间氨基酸序列具有高度一致性，因此推断在猴子中产生的抗体将几乎不需要或不需要为使其适用于人类治疗而额外地对可变结构域进行“人源化”(见WO 93/02108)。
发明内容
本发明已认识到对这样的“人源化”单克隆抗体(抗原结合多肽)平台的需求，其避免了现有技术中人源化或完全人抗体平台所发现的部分或全部缺点，并且其可产生针对广泛的具有治疗意义的靶标抗原具有高度特异性和亲和力的抗体，同时最大限度地减小其在人类宿主中的免疫原性。
本发明人已发现，来自于骆驼科(Camelidae)动物常规抗体的VH和VL结构域与人抗体VH和VL结构域在框架区表现出高度的氨基酸序列一致性。事实上，骆驼科动物常规的VH结构域与人类VH结构域之间以及骆驼科动物常规的VL结构域与人类VL结构域之间的序列一致性程度可以接近于在人类与其它灵长类动物物种(例如食蟹猴)之间所观察到的程度，而这远远高于根据人类和骆驼科动物之间的进化距离所预期的程度。该发现是出人意料的，因为骆驼科动物抗体重链可变结构域(variable domain of heavy-chain camelidantibody，VHH)并未显示出与人类的可变结构域具有高度的序列同源性。
此外，本发明人还发现骆驼科动物VH和VL结构域的高变环(H1、H2、L1、L2和L3)与人类VH和VL结构域的高变环通常表现出高度的结构同源性，考虑到人类与骆驼科动物之间的进化距离，这又是意料之外的。骆驼科动物常规抗体(或更确切地说是该抗体的高变环)与人抗体之间的高度结构同源性也同样出人意料，这是因为已有报道骆驼科动物抗体重链的高变环在构象和长度上与人类和小鼠VH中相应的环差异很大(见综述De Genst等，Develop Compo Immunol.30：187-98(2006))。
与人抗体框架区具有氨基酸一级序列的高度同源性、与人抗体结合位点具有抗原结合位点(包括高变环)的高度结构同源性以及骆驼科动物常规抗体可由与人类有很大进化距离的远交动物种群主动免疫获得的事实使本发明人推测：骆驼科动物的常规抗体对于改造得到在人类治疗中具有潜在应用的单克隆抗体提供了诱人的新思路。
因此，根据本发明的第一方面，提供了包含VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽，其中在所述VH结构域和VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合多肽可以与靶标抗原发生免疫反应。在另一实施方案中，所述抗原结合多肽可以特异性与靶标抗原结合。
在一个非限制性的实施方案中，本发明的抗原结合多肽可以是重组多肽。
在一个非限制性的实施方案中，本发明的抗原结合多肽可以是嵌合多肽。
在一个非限制性的实施方案中，本发明的抗原结合多肽可以是单克隆抗体。
在一个非限制性的实施方案中，本发明的抗原结合多肽可以是重组表达的嵌合单克隆抗体。
在一个非限制性的实施方案中，本发明的抗原结合多肽可以包含通过骆驼科物种的主动免疫获得的高变环或互补决定区。
本发明的第二方面提供了用于制备与靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽的方法，该方法包括：
(a)确定编码骆驼科动物常规抗体VH和/或VL结构域之至少一个高变环或互补决定区(CDR)的核苷酸序列，其中所述抗体与所述靶标抗原发生免疫反应；以及
(b)表达与所述靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中VH或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)具有由(a)步骤确定的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
本发明的第三方面提供了用于制备与靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)的重组抗原结合多肽的方法，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中在VH结构域或VL结构域中至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种，所述方法包括以下步骤：
(a)分离编码骆驼科动物常规抗体VH和/或VL结构域之至少一个高变环或互补决定区(CDR)的骆驼科动物核酸，其中该抗体与所述靶标抗原发生免疫反应；
(b)制备包含编码如下高变环或互补决定区之核苷酸序列的多核苷酸，所述高变环或互补决定区具有与由步骤(a)分离的核酸编码的高变环或互补决定区一致的氨基酸序列，该多核苷酸编码包含VH和VL结构域的与所述靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)的抗原结合多肽；以及
(c)利用步骤(b)的重组多核苷酸表达所述抗原结合多肽。
步骤(b)中制备的多核苷酸优选地为重组多核苷酸。
本发明还提供了多核苷酸，其包含编码本发明第一方面所述的抗原结合多肽或者编码所述抗原结合多肽之片段的核苷酸序列，所述片段包含来自于骆驼科物种的VH或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)。
本发明还提供了包含上述多核苷酸(与允许该抗原结合多肽在宿主细胞或无细胞表达系统中表达的调控序列有效连接)的表达载体、含有表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统、以及生产重组抗原结合多肽的方法，该方法包括在允许抗原结合多肽表达的条件下培养宿主细胞或无细胞表达系统以及回收所表达之抗原结合多肽。
此外，本发明提供了检测试剂盒，其包含本发明第一方面所述的抗原结合多肽以及药物制剂(其包括本发明第一方面所述的抗原结合多肽和至少一种可药用的稀释剂、赋形剂或载体)。
附图说明
图1-显示ELISA的结果，其中经IL1-Beta免疫的大羊驼(llama)的血清在免疫后第0天及第28天用来检测IL1-Beta抗体的存在。
图2-示意与IL-1Beta发生免疫反应的两种Fab(编号为1E2和1F2)的“人源化”变体的氨基酸序列。根据与最接近的人类种系的比对，提出了在1E2和1F2的VH和Vλ框架区具有突变。除了完全人源化的(hum)和野生型的(wt)V区域以外，还提出了只有三个野生型残基保留的“安全变体”(safe)。
图3-显示ELISA的结果，其中使用重组表达的Fab来检测其与biot-IL-1Beta结合的能力。为此，利用包被有抗myc抗体的Maxisorp板捕获Fab。加入生物素化的人IL-1Beta(Biot-IL-1Beta)，然后使用经HRP缀合的链霉亲和素检测所结合的细胞因子。
图4-显示噬菌体ELISA的结果，其中检测了展示Fab 1E2和1F2之人源化变体的噬菌体与IL-1Beta的结合。
图5-显示ELISA的结果，其中检测了嵌合1E2与IL-1Beta的结合。
具体实施方式
本发明涉及一种新的用于生产对期望靶标抗原具有特异性的抗原结合多肽的技术平台，其基于骆驼科物种的常规抗体库，以及使用该技术平台获得的抗原结合多肽。
因此，在本发明第一方面提供了包含VH和VL结构域的抗原结合多肽，其中在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。
在下文中，本发明的不同方面会更详细地定义。由此定义的每一方面可以与任何其它方面结合，除非有明确相反的指示。特别是，任何被作为优选或有利的特征可与任何其它被作为优选或有利的特征结合。
定义
术语“抗原结合多肽”是指包含VH和VL结构域的任何多肽，其与靶标抗原发生免疫反应和特异性结合。如本文别处所述，示例性的抗原结合多肽包括抗体和免疫球蛋白，还包括抗体片段。
当提及与抗原结合多肽发生免疫反应的“靶标抗原”时，术语“抗原”具有本领域普通技术人员所通常理解的含义，其包括多肽、肽、多糖、糖蛋白、多核苷酸(例如DNA)或合成化学抗原等。
术语“抗原”也可以用来描述在制备本发明抗原结合多肽时用来免疫动物(例如骆驼科动物)的材料。在这种情况下，术语“抗原”可具有更广义的含义，其可以包括抗原的纯化形式，也可以是抗原的原始或半纯化制剂(例如细胞、细胞裂解物或上清液、细胞级分(例如细胞膜)等)，以及与适当载体蛋白缀合的半抗原。免疫方案中所使用的“抗原”并不一定与能够跟所产生的抗原结合多肽发生免疫反应的“靶标抗原”在结构上一致。通常，用于进行免疫的“抗原”可以是“靶标抗原”的截短形式，例如含有免疫原性表位的片段。用于进行主动免疫的“抗原”的其它特征将在本文别处进行描述，并可能是本领域技术人员通常已知的。
靶标抗原和抗原结合多肽之间的“特异性结合”是指免疫特异性。如果与其它表位相比，抗原结合多肽优先与靶标抗原上的表位结合，则抗原结合多肽与其靶标抗原“特异性地”结合。“特异性结合”并不排除与其它具有类似抗原表位的抗原发生交叉反应。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是糖蛋白，其表现出与(靶标)抗原的特异性结合。
已知骆驼科动物物种包括两种不同类型的抗体；经典的(或“常规”的)抗体以及重链抗体。
本文使用的术语“常规抗体”是指任何同种型的抗体，包括IgA、IgG、IgD、IgE或IgM。骆驼科动物本源的或天然的“常规”抗体通常是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中不同。每条重链和轻链链内也具有规则间隔的二硫桥。每条重链在一端(N端)具有可变结构域(VH)，其后是若干恒定结构域。每条轻链在一端(N端)具有可变结构域(VL)而在另一端具有恒定结构域(CL)，轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻、重链可变结构域之间的界面。
术语“重链抗体”是指已知在骆驼科物种中天然存在的第二种类型的抗体，该抗体天然缺失轻链(Hamers-Casterman等，Nature.1993；363；446-8)。重链抗体(heavy-chainantibody，HCAb)由共价二硫键连接的两条重链组成。HCAb中每条重链的一端具有可变结构域。为将它们与骆驼科动物“常规”抗体重链的可变结构域(VH)区分开，HCAb的可变结构域被称为“VHH”。VHH结构域与VH结构域完全不同，它们由骆驼科动物基因组中的不同基因区段编码。
本发明多肽的VL结构域可以是VLambda型或Vkappa型。因此，术语“VL结构域”是指骆驼科动物的VKappa和VLambda两种同种型以及由其改造的变体(相对于骆驼科动物的VL结构域来说，所述变体包含一个或多个氨基酸替换、插入或缺失)。
术语“VH结构域”是指骆驼科动物任何已知的重链同种型的VH结构域，包括γ、ε、δ、α或μ同种型以及由其改造的变体(相对于骆驼科动物的VH结构域来说，所述变体包含一个或多个氨基酸替换、插入或缺失)。术语“VH结构域”仅指骆驼科动物常规抗体的VH结构域，而不包括骆驼科动物的VHH结构域。
术语“可变”是指可变结构域VH和VL的某些部分的序列在抗体之间差异很大，并用于每个特定抗体针对其靶标抗原的结合及特异性。然而，可变性在抗体的可变结构域中并非均匀分布。它集中在每个VL结构域和VH结构域中被称为“高变环”的三个区段中，并形成抗原结合位点的一部分。VLambda轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，并可定义为包含VL结构域中的24-33位(L1(λ)，由9、10或11个氨基酸残基组成)、49-53位(L2(λ)，由3个残基组成)和90-96位(L3(λ)，由5个残基组成)残基(Morea等，Methods20：267-279(2000))。VKappa轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，并可定义为包含VL结构域中的25-33位(L1(κ)，由6、7、8、11、12或13个残基组成)、49-53位(L2(κ)，由3个残基组成)和90-97位(L3(κ)，由6个残基组成)残基(Morea等，Methods 20：267-279(2000))。VH结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为H1、H2和H3，并可定义为包含VH结构域中的25-33位(H1，由7、8或9个残基组成)、52-56位(H2，由3或4个残基组成)和91-105位(H3，其长度非常不等)残基(Morea等，Methods20：267-279(2000))。
除非另有说明，术语L1、L2和L3分别是指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括来自骆驼科动物Vkappa和Vlambda同种型二者的高变环。术语H1、H2和H3分别是指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括来自骆驼科动物任何已知重链同种型的高变环，包括γ、ε、δ、α或μ。
高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3可以各自包括“互补决定区”(或“CDR”)的一部分。术语“高变环”和“互补决定区”不是严格意义的同义词，因为高变环(HV)是基于结构定义的，而互补决定区(CDR)是基于序列可变性定义的(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.，1983)，并且HV和CDR的范围在某些VH和VL结构域中可以不同。
VL和VH结构域的CDR通常定义为包含下列氨基酸：轻链可变结构域24-34位(CDRL1)、50-56位(CDRL2)和89-97位(CDRL3)残基，以及重链可变结构域31-35位或31-35b位(CDRH1)、50-65位(CDRH2)和95-102位(CDRH3)残基；Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991)。因此，HV可以包含在相应的CDR中，并且本文中关于VH和VL结构域的“高变环”也应解释为包括相应的CDR，反之亦然，除非另有说明。
可变结构域保守性较高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，主要是采取β-片层构型，通过三个高变环相连接。每条链中的高变环通过FR而紧密联系在一起，并与其它链中的高变环一起促成抗体之抗原结合位点的形成。对抗体的结构分析表明序列与通过互补决定区形成的结合位点形状之间的关系(Chothia等，J.Mol.Biol.227：799-817(1992))；Tramontano等，J.Mol.Biol，215：175-182(1990))。尽管它们具有高度序列可变性，但六个环中有五个只采取了主链构象一小部分，称为“典型结构”。这些构象首先取决于环的长度，其次取决于环和框架区中某些位点关键残基的存在(其通过包装、氢键键合或决定不寻常主链构象的能力来确定构象)。
恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种不同的效应功能，如抗体参与抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。
在本发明的所有方面和实施方案中，骆驼科(或骆驼科动物)物种(本发明抗原结合多肽的高变环或CDR来源于此)可以是骆驼(camel)、大羊驼(llama)、单峰驼(dromedary)、小羊驼(vicunia)、原驼(guanaco)和阿尔帕卡羊驼(alpaca)，以及由其杂交的任何物种。大羊驼(Lama glama)和阿尔帕卡羊驼(Lama pacos)是本发明所有方面优选的骆驼科物种。
本发明抗原结合多肽的特征在于包含来自于骆驼科物种的VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区。为明确起见，术语“VH结构域”、“VL结构域”是指来自于骆驼科动物常规抗体的结构域。该定义排除了骆驼科动物只有重链的VHH抗体以及仅包含骆驼科动物VHH结构域之HV或CDR的重组构建体，这些不包括在本发明的范围内。
所谓“来自于骆驼科物种的VH结构域或VL结构域的高变环或互补决定区”是指高变环(HV)或CDR具有的氨基酸序列与由骆驼科免疫球蛋白基因编码的高变环或CDR的氨基酸序列一致或基本一致。此处的“免疫球蛋白基因”包括种系基因、已经历重排的免疫球蛋白基因以及体细胞突变基因。因此，来自于骆驼科物种VH或VL结构域的HV或CDR的氨基酸序列可以与存在于成熟的骆驼科常规抗体中的HV或CDR的氨基酸序列一致。本文中的术语“来自于”表明了结构关系，意思是本发明抗原结合多肽的HV或CDR代表了最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(或其略微发生改变的变体)。但是，对于制备本发明抗原结合多肽的生产方法而言，该术语并不一定意味着特定的关系。正如下面将要讨论地，若干方法可以用来制备包含HV或CDR(其氨基酸序列与最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的序列一致(或基本上一致))的抗原结合多肽。
为明确起见，术语“骆驼科动物常规抗体的VH结构域”和“来自于骆驼科物种的VH结构域”可同义使用，其包含这样的VH结构域，即合成的或经改造之重组基因(包括密码子经优化的合成基因)的产物，该VH结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VH结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。类似地，“骆驼科动物常规抗体的VL结构域”和“来自于骆驼科物种的VL结构域”可同义使用，其包含这样的VL结构域，即合成的或经改造之重组基因(包括密码子经优化的合成基因)的产物，该VL结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VL结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。
本发明的抗原结合多肽通常是重组表达的多肽，也可以是嵌合多肽。术语“嵌合多肽”是指通过将不连续存在的两个或更多个肽片段相邻放置而产生的人工(非天然)多肽。此定义中包括“物种”嵌合多肽，其由两个或更多个物种(例如骆驼科动物和人)编码的肽片段相邻放置形成。
本发明的抗原结合多肽不是天然的人抗体(特别是人类自身抗体)，因为需要来自于骆驼科动物的至少一个高变环(或CDR)。所谓“天然的”人抗体是指在人对象中天然表达的抗体。本发明范围内不包括具有与天然人抗体或其片段的氨基酸序列具有100％一致性的氨基酸序列的抗原结合多肽，其中天然抗体或片段不是嵌合的，并且在氨基酸序列上也没有受到任何经改造的变化(不包括体细胞突变)。
本发明的抗原结合多肽包含重链可变结构域(VH)结构域和轻链可变结构域(VL)结构域，并且特征在于在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区来自于骆驼科物种。
在一些替代性的实施方案中，VH结构域中的H1或H2或者H1和H2二者可以来自于骆驼科物种，并且与之独立地，VL结构域中的L1或L2或者L1和L2二者可以来自于骆驼科物种。在另一些实施方案中，VH结构域中的H3或VL结构域中的L3也可以来自于骆驼科物种。上述所有可能的排列都是允许的。
在一个具体的实施方案中，VH结构域和VL结构域中的每个高变环H1、H2、H3、L1、L2和L3都可以来自于骆驼科物种。
在一个实施方案中，整个VH结构域和/或整个VL结构域可以来自于骆驼科物种。然后，可以对骆驼科的VH结构域和/或骆驼科的VL结构域进行蛋白质改造，其中向骆驼科序列中引入一个或多个氨基酸替换、插入或缺失。这些经改造的变化优选地包括相对于骆驼科序列而言的氨基酸替换。这些变化包括“人源化”或“种系化(germlining)”，其中骆驼科动物编码的VH或VL结构域中的一个或多个氨基酸残基被来自于同源的人类编码的VH或VL结构域中的对应残基替代。
在某些实施方案中，骆驼科的高变环(或CDR)可以通过使用期望的靶标抗原对骆驼科物种进行主动免疫而获得。正如本文详细举例和讨论地，使用靶标抗原免疫骆驼科动物(本源动物或者经改造表达骆驼科物种免疫球蛋白库的转基因动物)后，可以鉴定由B细胞产生的对期望抗原具有特异性的(常规骆驼科)抗体，并且可以使用已知的技术分离编码该抗体之VH和VL结构域的多核苷酸。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了与靶标抗原发生免疫反应的重组抗原结合多肽，该多肽包含VH和VL结构域，其中VH或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区来自于骆驼科物种的VH或VL结构域，该抗原结合多肽通过包括以下步骤的方法获得：
(a)使用靶标抗原或编码该靶标抗原的多核苷酸免疫骆驼科物种，产生针对所述靶标抗原的抗体；
(b)确定如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与所述靶标抗原发生免疫反应的骆驼科常规抗体的VH和/或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；
(c)表达与所述靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)具有由步骤(a)所确定的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
通过主动免疫获得的分离的骆驼科VH和VL结构域可以用作改造本发明抗原结合多肽的基础。从完整的骆驼科VH和VL结构域开始，可以进行一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失，从而与初始骆驼科序列不同。在某些实施方案中，这样的替换、插入或缺失可存在于VH结构域和/或VL结构域的框架区。在一级氨基酸序列中进行这种改变的目的可以是为了减少推测的不利性质(例如在人类宿主中的免疫原性(所谓的人源化)、使潜在产物具有异质性和/或不稳定性的位点(糖基化、去酰胺、异构化等)或是为了提高分子的某些其它有利性质(例如溶解性、稳定性、生物可利用度等)。在另一些实施方案中，在一级氨基酸序列上的改变可以在通过主动免疫获得的骆驼科VH和/或VL结构域的一个或多个高变环(或CDR)上进行。可以引入这样的变化从而提高抗原结合的亲和力和/或特异性，或减少推测的不利性质(例如在人类宿主中的免疫原性(所谓的人源化)、使潜在产物具有异质性和/或不稳定性的位点(糖基化、去酰胺、异构化等))，或是为了提高分子的某些其它有利性质(如溶解性、稳定性、生物可利用度等)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了重组的抗原结合多肽，相对于通过采用靶标抗原对骆驼科物种进行主动免疫获得的骆驼科VH或VL结构域而言，其在VH结构域或VL结构域的至少一个框架区或CDR区中包含至少一个氨基酸替换。该特定的实施方案排除了通过主动免疫产生的含有本源骆驼科VH和VL结构域的抗原结合多肽。
作为使用靶标抗原(或者包含靶标抗原或编码靶标抗原之多核苷酸的组合物)进行“主动免疫”的一个替代方案，还可以利用患病骆驼科动物中的免疫应答或者骆驼科物种中的天然免疫应答作为VH和/或VL结构域(其可以用作具有期望抗原结合特性的抗原结合多肽的组成部分)的来源。该VH/VL结构域也可以用作以通过主动免疫获得的VH/VL结构域类似的方式改造抗原结合多肽的起始点。本发明还进一步包括使用非免疫文库，以及由此获得的抗原结合多肽。
在另一些实施方案中，本发明包括“嵌合”抗体分子，其包含来自骆驼科动物的VH和VL结构域(或其经改造的变体)和来自非骆驼科动物抗体的一个或多个恒定结构域，例如由人编码的恒定结构域(或其经改造的变体)。本发明还延伸至嵌合抗原结合多肽(例如抗体分子)，其中VH或VL结构域之一是经骆驼科动物编码的，而其它可变结构域是非骆驼科动物(例如人)的。在这样的实施方案中，优选VH结构域和VL结构域均来自于同一骆驼科动物物种，例如，VH和VL可以都来自于大羊驼或者VH和VL可以都来自于阿尔帕卡羊驼(之后引入经改造的氨基酸序列变化)。在这样的实施方案中，VH和VL结构域可以都来自于一只动物，尤其是一只已被主动免疫的动物。
作为在骆驼科VH和/或VL结构域的一级氨基酸序列上进行改造的一个替代方案，可将单个的骆驼科高变环或CDR或者它们的组合从骆驼科的VH/VL结构域中分离出来，并通过CDR嫁接将其转移到替代的(即非骆驼科的)框架(例如人VH/VL框架)内。
与人可变结构域一致/同源的序列
本发明人已发现，在框架区上，编码骆驼科物种常规抗体VH和VL结构域的骆驼科种系和经体细胞突变的DNA序列表现出与编码人抗体VH和VL结构域的人种系DNA序列具有高度的序列一致性/序列同源性。
因此，本发明的抗原结合多肽的特征在于它们与人抗体VH和VL结构域具有氨基酸序列高度同源性。
在一个实施方案中，本发明抗原结合多肽的VH结构域可以表现出与一个或多个人类VH结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有80％或更高的氨基酸序列一致性或序列同源性。在另一些实施方案中，本发明多肽的VH结构域与一个或多个人VH结构域之间的氨基酸序列一致性或序列同源性可以为85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或高达99％，或甚至100％，当然前提条件是至少有一个高变环或CDR来自于骆驼科动物，即其具有的氨基酸序列与骆驼科VH或VL基因编码的高变环或CDR的氨基酸序列一致(或基本一致)。
在一个实施方案中，本发明多肽的VH结构域可以相对于最匹配的人类VH序列而言在框架区FR1、FR2、FR3和FR4中包含一个或多个氨基酸序列不匹配。该后一实施方案明确排除了包含VH结构域或者VH和VL结构域二者的多肽，其中所述结构域中的框架区完全是人序列。
在另一个实施方案中，本发明抗原结合多肽的VL结构域可以表现出与一个或多个人类VL结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有80％或更高的序列一致性或序列同源性。在另一些实施方案中，本发明多肽的VL结构域与一个或多个人VL结构域之间的氨基酸序列一致性或序列同源性可达到80％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或高达99％，或甚至100％。
在一个实施方案中，本发明多肽的VL结构域可以相对于最匹配的人类VL序列而言在框架区FR1、FR2、FR3和FR4中包含一个或多个氨基酸序列不匹配。该后一实施方案明确排除了包含VL结构域或者VH和VL结构域二者的多肽，其中所述结构域中的框架区完全是人序列。
本发明的抗原结合多肽可以包括“完全人”的VH或VL结构域，条件是只存在一个完全人可变结构域，并且而后与包含来自于骆驼科之高变环或CDR的可变结构域结合。
所附实施例中包括骆驼科与人类种系序列的代表性比对，其显示骆驼科动物常规的VH和VL结构域表现出与人类相应结构域具有非常高的序列同源性。从这些实施例可以得出结论，在给定位置，VH或VL结构域的框架区上通常有小于8个(常常只有5个)氨基酸残基与最接近的人类种系编码的序列不同。由于这些位置与结构限制无关，因此预期通过定点突变进行的人源化会相对简单。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合多肽可以包含骆驼科常规抗体的VH和/或VL结构域，例如通过使用靶标抗原(或编码靶标抗原的多核苷酸)对骆驼科动物进行主动免疫获得的骆驼科常规抗体，其中所述VH和VL结构域已被(独立地)改造以在VH结构域和VL结构域中的一个或者两个的框架区FR1、FR2、FR3和FR4上引入总共1～10个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸替换。这样的氨基酸替换可以包括(但不限于)导致“人源化”的替换，其通过使用在人类种系编码的VH或VL结构域中发现的对应残基取代起始的骆驼科VH或VL结构域中的不匹配氨基酸残基来实现。其也可以独立地在所述骆驼科动物来源的VH和VL结构域的高变环(CDR)中进行氨基酸替换，而这些变体可构成本发明的一部分。本文中的“氨基酸替换”包括这样的替换，其中天然氨基酸被非天然的氨基酸或进行了翻译后修饰的氨基酸替换。
在分析骆驼科和人类种系VH和VL之间序列一致性的百分比前，可先确定典型折叠，其可用于识别具有H1和H2或者L1和L2(及L3)典型折叠之相同组合的人种系区段家族。随后，选择那些与目的骆驼科动物可变结构域具有高度序列同源性的人类种系家族成员用于计算序列同源性。高变环L1、L2、L3、H1和H2之正则标准类型(Chothia canonicalclasses)的确定通过使用在网站www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page上公开可用的生物信息学工具进行。该程序的输出结果显示了在数据文件中需要的关键残基。在这些数据文件中，显示出关键残基的位置以及每个位置上允许的氨基酸。抗体可变结构域序列被作为输入，并首先与按Kabat编码系统编码的共有抗体序列对齐。典型折叠的分析采用了一系列来自于Martin和Thornton发明的自动化方法的关键残基模板(Martin等，J.Mol.Biol.263：800-815(1996))。
使用已知特定的人类种系V区段(其使用与H1和H2或者L1和L2(及L3)同样的典型折叠的组合)，确定了就序列同源性而言最佳匹配的家族成员。使用生物信息学工具可以确定骆驼科VH和VL结构域的框架氨基酸序列与由人类种系编码的相应序列之间的序列一致性百分比，但实际上也可以使用手动比对这些序列。人类免疫球蛋白序列可以从若干蛋白质数据库中确定，如VBase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或Pluckthun/Honegger数据库(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germline)。为了比较人类序列与骆驼科VH或VL结构域的V区，可以使用序列比对算法(如通过像www.expasy.ch/tools/#align的网站可获得的)，而对于有限的序列同样可进行手动比对。与每条链的框架区1、2和3具有最高程度同源性的具有相同典型折叠组合的人类种系的轻链和重链序列家族被选出来，并与目的骆驼科可变结构域进行比较；FR4也与人类种系的JH和JK或JL区进行比较。
注意，在计算序列同源性的整体百分比时，使用与具有相同典型折叠组合的人类种系家族最匹配的序列来评估FR1、FR2和FR3的残基。只计算了与具有相同典型折叠的组合的同一家族中最匹配的成员或其它成员不同的残基(注：不包括任何引物编码的差异)。然而，为了人源化的目的，框架区中与其它人类种系家族成员一致的残基(其不具备相同的典型折叠的组合)可以被认为是“人的”，然而事实上，根据上述严格的条件，这些都被归为“阴性的”。这种假设是基于用于人源化的“混合与匹配(mix and match)”法，其中FR1、FR2、FR3和FR4均被分别与其最匹配的人类种系序列进行比较，并且人源化的分子因此包含了不同FR的组合，正如Qu及其同事(Qu等，Clin.Cancer Res.5：3095-3100(1999))和Ono及其同事(Ono等，Mol.Immunol.36：387-395(1999))所做的一样。
各框架区的边界可以使用IMGT编码系统来确定，其是正则编码系统(numberingscheme of Chothia)的改编版本(Lefranc等，NAR 27：209-212(1999)；http://imgt.cines.fr)。
虽然骆驼科动物与人类在VH和VL结构域的框架区有出乎意料的高序列同源性，但仍然可以通过对骆驼科动物和人类种系的VH和VL序列进行简单的序列比较而将骆驼科动物编码的高变环(CDR)与人类编码的高变环(CDR)区分开。
与人类编码的VH和VL结构域的结构同源性
如下文详细描述地，一个优选的实施方案也使用了具有人典型折叠或人样典型折叠的骆驼科动物的高变环或CDR。
因此，在一个实施方案中，在本发明抗原结合多肽的VH结构域或VL结构域中至少一个高变环或CDR来自于骆驼科物种的VH或VL结构域，但表现出预测的或实际的典型折叠结构(其与出现在人抗体中的典型折叠结构基本一致)。
本领域已熟知，虽然存在于由人类种系编码的VH和VL结构域中的高变环的氨基酸一级序列必然是高变的，但是所有高变环(除了VH结构域的CDR H3以外)均采取少数几种不同的结构构象，(称为典型折叠)(Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Tramontano等Proteins 6：382-94(1989))，其取决于高变环的长度以及所谓典型氨基酸残基的存在(Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。完整VH或VL结构域中高变环的实际典型结构可以通过结构分析(例如X-射线晶体学)来确定，但也可以根据具有特定结构特征的关键氨基酸残基来预测(详见下文)。事实上，确定每种典型结构的特定残基模式形成“识别标志”，这使得能够识别未知结构的VH或VL结构域中的高变环中的典型结构，因此典型结构也可以仅根据氨基酸一级序列来预测。
基于对种系和体细胞系突变的VH和VL序列的分析，本发明者预测，骆驼科VH和VL结构域(除了VH结构域的H3以及有时也除了VL结构域的L3)的高变环也采用了典型折叠结构，其与人抗体高变环采用的典型折叠结构基本一致。
可以使用从如下网站可公开获得的算法对抗原结合多肽中任何给定VH或VL序列的高变环的经预测典型折叠结构进行分析：www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html，www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/antibodies.html和www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html。这些工具可查询VH或VL序列与已知典型结构的人VH或VL结构域序列的比对，并对查询序列高变环的典型结构进行预测。
至于VH结构域，如果其至少符合下列第一个标准(优选地符合两个标准)，则来自于骆驼科的H1和H2环可以被认为具有与已知出现在人抗体中的典型折叠结构“基本一致”的典型折叠结构，：
1.通过确定残基数与最匹配的人典型结构类别具有一致的长度。
2.与相应的人H1和H2典型结构类别的关键氨基酸残基具有至少33％的一致性，优选地为至少50％的一致性。
(注：为了进行上述分析，H1和H2环被分别处理并且各自与其最匹配的人典型结构类别进行比较)
上述分析依赖于对骆驼科H1和H2环的典型结构的预测。如果已知H1和H2环的实际结构已知(例如基于X-射线晶体学)的话，即使环的长度与最匹配的人典型结构类别长度不同(通常相差±1或±2个氨基酸)而骆驼科H1和H2环的实际结构与人典型折叠的结构相匹配，那么来自于骆驼科的H1和H2环可以被认为具有与已知出现在人抗体中的典型折叠结构“基本一致”的典型折叠结构，。
在人典型结构类别中发现的针对人VH结构域(H1和H2)第一和第二高变环的关键氨基酸残基由Chothia等人描述(Chothia等，J.Mol.Biol.227：799-817(1992))，其内容作为整体通过引用并入本文中。特别地，在Chothia等第802页的表3(其通过引用具体并入本文中)列出了在人类种系中发现的针对H1典型结构的关键位点上的优选氨基酸残基，而同样通过引用具体并入本文中的第803页的表4列出了在人类种系中发现的针对CDR H2典型结构关键位点上的优选氨基酸残基。
所附的实施例包括对来自于骆驼科物种(特别是大羊驼和单峰驼)的种系VH序列的分析，其将骆驼科中发现的实际氨基酸残基与最接近的人类种系VH序列中的氨基酸残基中被认为是典型折叠结构之关键的H1和H2以及基本框架区中的每个位置进行比较(根据Chothia等，J Mol Biol.227：799-817(1992)的标准)。现已发现在骆驼科动物与人类之间一致的关键残基的数目往往超过33％，通常为50～100％。
在一个实施方案中，本发明抗原结合多肽VH结构域中的H1和H2来自于骆驼科物种的VH结构域，并表现出预测的或实际的典型折叠结构，其与出现在人抗体中的典型折叠结构基本一致。
本发明人推测，不仅高变环(特别是VH结构域中的H1和H2)各自具有天然存在于人抗体中的典型结构类型是非常重要的，同样重要的还有任何给定VH结构域的H1和H2形成典型折叠结构的组合(其与出现在至少一个人类种系VH结构域中的已知典型结构的组合一致)。现已发现H1和H2上只有某些典型折叠结构的组合实际发生在由人类种系编码的VH结构域中。本发明人出人意料地发现，所有可进行分析的可用骆驼科种系或体细胞突变的VH序列都不仅表现出H1和H2中各典型折叠结构与人抗体中所用的一致，而且表现出H1和H2中结构的正确组合也与人抗体中发现的组合匹配。与生产能在人类中进行潜在治疗应用的抗体的其它平台(其可产生出在H1和H2中具有“正确的”人样典型折叠结构的抗体，但其组合形式并不存在于人抗体中)相比，这展示出了独特的优势。例如，本发明人自己对来源于非人灵长类动物的抗体结构的分析(Biogen IDEC′s galiximab(anti-CD80)an lumiliximab(anti-CD23)and the non-human primate mAb against Anthrax Toxin，Pelat等，J.Mol.Biol.384：1400-7(2008))表明，它们在结构上并非与人抗体结构非常接近(特别是考虑到典型折叠的组合时)。H1和H2典型折叠的正确组合的缺失可导致给定抗原结合多肽(其在框架区被“人源化”)在人类宿主中具有免疫原性。
因此，在另一些实施方案中，本发明抗原结合多肽VH结构域中的H1和H2来自于骆驼科物种的VH结构域，并形成预测或实际的典型折叠结构的组合，该组合与已知出现在人类种系或体细胞突变的VH结构域中的典型折叠结构的组合一致。
在一些非限制性的实施方案中，本发明抗原结合多肽的VH结构域中的H1和H2来自于骆驼科物种的VH结构域，并形成下列典型折叠组合的一种：1-1、1-2、1-3、1-6、1-4、2-1、3-1和3-5。
优选地，本发明抗原结合多肽的VH结构域表现出与人VH的高度序列一致性/序列同源性，并且VH结构域的高变环表现出与人VH具有结构同源性。
将本发明抗原结合多肽VH结构域中H1和H2上存在的典型折叠及其组合“更正(correct)”为人VH种系序列(就整体一级氨基酸序列的一致性而言，其与本发明抗原结合多肽的VH结构域最匹配)可以是有利的。例如，如果与人类种系VH3结构域的序列匹配是最接近的，那么H1和H2(来自于骆驼科)形成人VH3结构域中天然存在的典型折叠的组合可以是有利的。
因此，在一个实施方案中，本发明抗原结合多肽的VH结构域可表现出与人VH结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或高达99％，或甚至100％的序列一致性或序列同源性，另外，同一抗原结合多肽中的H1和H2来自于骆驼科物种的VH结构域，形成预测的或实际的典型折叠结构的组合(其与已知的天然存在于相同人VH结构域中的典型折叠组合相同)。
在另一些实施方案中，本发明抗原结合多肽的VL结构域中的L1和L2均来自于骆驼科物种的VL结构域，并都表现出预测的或实际的典型折叠结构(其基本与出现在人抗体中的典型折叠结构基本一致)。
与VH结构域一样，VLambda和VKappa型VL结构域的高变环可以采取有限数目的构象或典型结构，这部分取决于长度，还取决于某些典型位置上关键氨基酸残基的存在。
如果符合下列至少第一个标准(优选地符合两个标准)，那么来自于骆驼科物种VL结构域的L1、L2和L3环也可以被认为具有与已知出现在人抗体中的典型折叠结构“基本一致”的典型折叠结构：
1.由残基数确定地，与最匹配的人类结构类别具有一致的长度。
2.与来自VLambda库或VKappa库的相应的人L1或L2典型结构类别的关键氨基酸残基具有至少33％的一致性，优选地为至少50％的一致性，。
(注，为了进行上述分析，L1和L2环被分别处理并且各自与其最匹配的人典型结构类别进行比较)
上述分析依赖于对骆驼科L1、L2和L3环的典型结构的预测。如果L1、L2和L3环的实际结构是已知的(例如基于X-射线晶体学)，即使环的长度与最匹配的人典型结构类别长度不同(通常相差±1或±2个氨基酸)，而骆驼科环的实际结构与人典型折叠的相匹配，那么来自于骆驼科的L1、L2和L3环也可被认为具有与已知出现在人抗体中的典型折叠结构“基本一致”的典型折叠结构。
在人典型结构类别中发现的针对人VLambda和VKappa结构域CDR的关键氨基酸残基由Morea等Methods，20：267-279(2000)以及Martin等，J.Mol.Biol.，263：800-815(1996)描述。人VKappa结构域的结构库(structural repertoire)由Tomlinson等，EMBO J.14：4628-4638(1995)描述，VLambda结构域的结构库由Williams等J.Mol.Biol.，264：220-232(1996)描述。所有这些文献均通过引用并入本文中。
所附的实施例包括对来源于骆驼科物种(特别是大羊驼和单峰驼)的种系VL序列或者kappa和lambda型的分析，其将骆驼科中发现的实际氨基酸残基与最接近的人类种系VLambda或VKappa序列中的氨基酸残基中被认为对于典型折叠结构关键的L1和L2中的每个位置进行比较。已发现在骆驼科动物和人类之间一致的关键残基的数目通常为33～100％，往往为50～100％，通常接近于100％。
VL结构域中的L1和L2可以形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，其与已知出现在人类种系VL结构域中的典型折叠结构的组合一致。
在一些非限制性的实施方案中，VLambda结构域中的L1和L2可以形成下列典型折叠的组合中的一种：11-7、13-7(A、B、C)、14-7(A、B)、12-11、14-11和12-12(如Williams等J.Mol.Biol.264：220-32(1996)中所定义地，并显示于www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html)。在一些非限制性的实施方案中，Vkappa结构域中的L1和L2可以形成下列典型折叠组合中的一种：2-1、3-1、4-1和6-1(如Tomlinson等EMBOJ.14：4628-38(1995)中所定义地，并显示于http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html)。
在另一实施方案中，VL结构域的L1、L2和L3三者可以都表现出基本的人结构。大多数人Vκ种系区段还编码L3环的单一构象(类型1)，其通过第95位上保守的顺式-脯氨酸而稳定，但是由于V-J连接过程以及该脯氨酸残基的可能丢失，因此重排序列也可以具有其它构象。可公开获得的体细胞突变的单峰驼Vκ序列具有L3(κ)的1型典型折叠(如同在人类kappa种系序列中发现的一样)，并且在七个单峰驼Vκ结构域中有六个在第95位出现了脯氨酸。因此，当抗原结合多肽包含Vκ结构域时，该结构域可以在第95位包含保守的脯氨酸残基。
Williams及其同事分析了人VL种系序列的结构库(Williams等，J.Mol.Biol.264：220-232(1996))。此处分析的三个家族编码相同的L2环构象。L3环的构象被认为是更高变的，因为其具有某些长度的变化，并且没有顺式-脯氨酸残基。事实上，可用的体细胞突变的单峰驼Vλ序列显示L3长度的高变性。其中大多具有L3的典型折叠(例如VLambda 3-1家族成员Camvl19(10A)和Camvl20(1/9A)，VLambda 2-18家族成员Camvl5、17、30、36和52(所有10B)和VLambda 1-40家族成员Camvl44(5/11A))。
优选地，本发明抗原结合多肽的VL结构域表现出与人VL具有高度的序列一致性/序列同源性，并且VL结构域的高变环表现出与人VL具有结构同源性。
在一个实施方案中，本发明抗原结合多肽的VL结构域可表现出与人VL结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或高达99％，或甚至100％的序列一致性，另外，高变环L1和高变环L2可以形成预测的或实际的典型折叠结构的组合(其与已知的天然存在于相同人VL结构域中的典型折叠的组合相同)。
当然，可以设想将表现出与人VH具有高度序列一致性/序列同源性并与人VH的高变环具有结构同源性的VH结构域与表现出与人VL具有高度序列一致性/序列同源性并与人VL的高变环具有结构同源性的VL结构域相结合以提供包含(骆驼科动物来源的)VH/VL对(其与人类编码的VH/VL对具有最高的序列和结构同源性)的抗原结合多肽，。本发明所提供的骆驼科动物平台的独特优势是VH和VL结构域都表现出与人抗体的可变结构域具有高度的序列和结构同源性。
抗原结合多肽的结构
只要VH和VL结构域都存在，本发明的抗原结合多肽可以采用多种不同的实施方案。因此，在一些非限制性的实施方案中，抗原结合多肽可以是免疫球蛋白、抗体或抗体片段。本文中使用的术语“抗体”从广义上来说包括(但不限于)单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们表现出对靶标抗原具有适当的特异性即可。本文使用的术语“单克隆抗体”是指由一群基本同源的抗体获得的抗体，即包含在该群体中的各个抗体是相同的(除了可能以少量存在的可能的天然突变以外)。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与常规的(多克隆)抗体制剂(其通常包括针对抗原上不同决定簇(表位)的不同抗体)不同的是，每个单克隆抗体只针对抗原上的单个决定簇或表位。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变结构域。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、双特异性Fab′s以及Fv片段、微型双功能抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子、单链可变片段(scFv)和由抗体片段组成的多特异性抗体(见Holliger和Hudson，Nature Biotechnol.23：1126-36(2005)，其通过引用并入本文中)。
在一些非限制性的实施方案中，本发明的抗体和抗体片段可以包含CH1结构域和/或CL结构域(其氨基酸序列完全或基本上是人的)。当本发明的抗原结合多肽是作为人类治疗用途的抗体时，抗体的整个恒定结构域或者至少其一部分通常具有完全或基本人的氨基酸序列。因此，本发明的抗体必须包含VH和VL结构域，其至少一个包含来源于骆驼科的至少一个高变环，但CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域，如果存在的话)中的一个或多个或者任意组合的氨基酸序列可完全或基本是人的。
有利地，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域，如果存在的话)可以都具有完全或基本人的氨基酸序列。就人源化或嵌合的抗体或抗体片段的恒定结构域而言，术语“基本上人的”是指氨基酸序列与人恒定结构域至少具有90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的一致性。此处的术语“人的氨基酸序列”是指人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，其中包括种系的、重排的和体细胞突变的基因。本发明还涵盖这样的多肽，其包含已被改变的“人”恒定结构域序列(对于人序列，其进行一个或多个氨基酸的添加、缺失或替换)。
正如本文别处所讨论地，预想到可以在重链和/或轻链的恒定结构域(特别是在Fc区中)进行一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失。氨基酸的替换可涉及使用不同的天然氨基酸或者使用非天然的或经修饰的氨基酸来取代被替换的氨基酸。其它结构修饰也是允许的，如改变糖基化模式(例如通过添加或删除N-或O-连接的糖基化位点来实现)。基于抗体的预期用途，修饰本发明抗体对Fc受体的结合特性可以是期望的，例如用以调节效应功能。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区中，从而使该区中形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可具有提高的内化能力和/或增强的补体介导之细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)以及Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。或者，抗体可以被改造成具有双Fc区，从而可具有增强的补体裂解和ADCC的能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。本发明还涉及包含本文所述抗体的免疫缀合物，其中所述抗体与细胞毒剂(如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物))相缀合。还可以改造Fc区以延长其半衰期。
在某些实施方案中，本发明可涉及嵌合的骆驼科动物/人抗体，特别是其中VH和VL结构域完全是骆驼科动物序列(例如大羊驼或阿尔帕卡羊驼)，而抗体的其余部分完全是人序列的嵌合抗体。在本发明的一些优选实施方案中，还包括“人源化”或“种系化”的骆驼科抗体以及骆驼科/人嵌合抗体，其中VH和VL结构域相对于通过主动免疫获得的骆驼科VH和VL结构域来说在框架区包含一个或多个氨基酸替换。通过使用在人类种系编码的VH或VL结构域中发现的对应残基取代起始骆驼科VH或VL结构域中的不匹配氨基酸残基，该“人源化”提高了与人类种系VH或VL结构域的序列一致性百分比。
本发明还包括CDR经嫁接的抗体，其中来自于骆驼科抗体(例如使用靶标抗原进行主动免疫获得的骆驼科抗体或者由骆驼科动物的基因编码的抗体)的CDR(或高变环)被嫁接到人VH和VL的框架上，而抗体的其它部分仍是完全人的。然而，考虑到骆驼科与人类免疫球蛋白之间发现的高度的氨基酸序列同源性和结构同源性，本发明人预期，在大多数情况下，通过“人源化”骆驼科动物来源的VH和VL结构域的框架区，而无需进行CDR嫁接或者通过将CDR嫁接到数量有限的不需要修饰的骨架序列上，便可能实现用于体内治疗使用的人类同源性水平(见Almagro等，Frontiers in Bioscience 13：1619-1633(2008)，其通过引用并入本文中)。
本发明人源化的、嵌合的和CDR嫁接的抗体(特别是包含来自于使用靶标抗原对骆驼科动物进行主动免疫获得之高变环的抗体)可以使用常规的重组DNA操作和表达技术容易地生产，其利用经改造的原核和真核宿主细胞(包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞，其中的一些在本文中有所描述并在所附实施例中举例说明)以产生目的多肽。
本发明还包括这样的抗原结合多肽，其中VH或VL结构域中的一个或另一个来自于骆驼科，或包含至少一个来自于骆驼科的CDR或高变环，并且“其它”可变结构域具有非骆驼科动物(例如人)的氨基酸序列。因此，预想到将骆驼科动物的VH结构域与人VL结构域配对，或者将人VH结构域与骆驼科动物VL结构域配对。这样的配对可以增加可用的抗原结合库(从中挑选具有所需抗原结合特性的高亲和力结合分子)。
本发明还进一步延伸至这样的抗原结合多肽，其中VH结构域和/或VL结构域的高变环或CDR来自于骆驼科，但相对于骆驼科动物编码的序列来说，其中至少一个所述(骆驼科动物来源的)高变环或CDR被改造成包含一个或多个氨基酸替换、添加或缺失。这些变化包括高变环/CDR的“人源化”。以这种方式改造的骆驼科动物来源之HV/CDR仍可以表现出与由骆驼科动物编码的HV/CDR之氨基酸序列“基本一致”的氨基酸序列。在这种情况下，“基本一致”可允许与骆驼科动物编码的HV/CDR含有不超过一个，或不超过两个氨基酸序列不匹配。
本发明的抗体可以是任何同种型。用于人类治疗用途的抗体类型通常为IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型，通常是IgG型，在这种情况下，它们可以属于IgG1、IgG2a和b、IgG3或IgG4四个亚类中的任何一种。在这些亚类中，允许在Fc部分进行一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失，或进行其它结构修饰，从而例如提高或降低Fc依赖的功能。
本发明的抗原结合多肽可以具有广泛的应用，包括在研究中以及在诊断和/或治疗疾病方面。由于与天然人抗体的VH和VL结构域具有高度的氨基酸序列同源性和高度的结构同源性(特别是如同在人抗体中发现的正确的典型折叠的组合)，本发明的抗原结合多肽(特别是以单克隆抗体的形式)将会对作为人类治疗性药物特别有用。
本发明提供了用于生产针对广泛抗原的抗原结合多肽(特别是单克隆抗体)的平台，并且从广义上讲，本发明不受靶标抗原之精确性质的限制，也不受与靶标抗原结合的特异性或亲和力的限制。然而，在一些具体的非限制性实施方案中，靶标抗原可以是非骆驼科动物的抗原、细菌抗原、病毒抗原或人类抗原。在一个优选的实施方案中，靶标抗原可以是具有特定治疗意义的抗原。术语“具有治疗意义的靶标”是指参与人类或动物疾病或与各疾病相关之作用的形成、发病、发展、介导的靶标。该定义包括这样的靶标，其表达水平和/或活性受到抗体结合的调节(例如受体活性可以受激动剂或拮抗剂抗体的结合而调节)，或者其活性和/或表达对疾病有直接或间接的影响。
例如，“人类抗原”可以包括这样的人天然多肽(蛋白质)，其行使受体、受体之配体、细胞信号传导分子、激素、细胞因子或细胞因子受体、神经递质等作用。“天然”是指多肽在发育之任何阶段的人体内表达，包括在疾病过程中人体所表达的多肽。
本发明抗原结合多肽的一些非限制性的实施方案包括：
包含VH结构域和VL结构域的嵌合抗原结合多肽，其中在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼(Lama glama)。
包含VH结构域和VL结构域的重组表达之抗原结合多肽，其中在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼(Lama glama)。
包含VH结构域和VL结构域的单克隆抗体，其中在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼。
包含VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽，其中在VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种的VH或VL结构域，并且其中所述抗原结合多肽与具有治疗或诊断意义的靶标抗原发生免疫反应。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼。
包含骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VH结构域、骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VL结构域以及人抗体的一个或多个恒定结构域或由其组成的嵌合抗原结合多肽。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼。
与具有治疗或诊断意义的靶标抗原发生免疫反应的嵌合抗原结合多肽，该抗原结合多肽包含骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VH结构域、骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VL结构域以及人抗体的一个或多个恒定结构域或由其组成。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼。
包含骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VH结构域、骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VL结构域以及选自IgG、IgM、IgD、IgE和IgA之人抗体同种型的恒定结构域或由其组成的嵌合抗体。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼。
与具有治疗或诊断意义的靶标抗原发生免疫反应的嵌合抗原结合多肽，该抗原结合多肽包含骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VH结构域、骆驼科动物(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)常规抗体的VL结构域以及选自IgG、IgM、IgD、IgE和IgA之人抗体同种型的恒定结构域或由其组成。在一个特定的实施方案中，VH结构域和VL结构域都来自于大羊驼。
在上述具体实施方案中，VH和VL结构域可以来自于骆驼科动物的同一物种(特别是大羊驼或阿尔帕卡羊驼)，甚至可以来自于该物种的同一只动物(例如，已进行主动免疫的单只动物)。特别是，VH和VL结构域可以来自于单个主动免疫的大羊驼。然而，这并非是排除VH和VL结构域可以来自于不同的动物或非免疫文库。
在上述的实施方案中，术语“骆驼科动物常规抗体的VH结构域”和“骆驼科动物常规抗体的VL结构域”意指包括这样的变体，其被改造成在氨基酸序列中引入一个或多个改变，例如，如本文别处所述地，在一个或多个框架区进行“人源化”或“种系化”的变体，并且还包括合成(例如密码子经优化的)基因的产物，如本文别处所述地。
多核苷酸、载体和重组表达
本发明还提供了编码本发明抗原结合多肽的多核苷酸分子、包含与调节序列有效连接的编码本发明抗原结合多肽之核苷酸序列的表达载体，其中所述调节序列允许抗原结合多肽在宿主细胞或无细胞表达系统中表达，以及包含该表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
编码本发明抗原结合多肽的多核苷酸分子包括例如重组DNA分子。
本文使用的术语“核酸”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”可互换使用，其是指任何DNA或RNA分子，无论是单链或双链的，并且如果是单链的话，还包括具有其互补序列的分子。在讨论核酸分子时，本文中可根据以5′至3′方向提供序列的标准惯例描述特定核酸分子的序列或结构。在本发明的一些实施方案中，核酸或多核苷酸是“分离”的。当涉及核酸分子时，该术语是指将核酸分子从其来源之生物体的天然基因组中与其直接相连的序列分离出来。例如，“分离的核酸”可以包括插入到载体(如质粒或病毒载体)中的DNA分子，或是整合到原核或真核细胞或非人类宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。当涉及RNA时，“分离的多核苷酸”主要是指由上述分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可指这样的RNA分子，其被从其它的核酸(所述RNA分子在自然状态下(即在细胞或组织内)与其混合(associate)在一起)中纯化/分离出来。分离的多核苷酸(DNA或RNA)还可表示通过生物或合成方法直接产生，并在其生产过程中与存在的其它组分分开的分子。
对于本发明抗原结合多肽的重组产生，可以制备(使用标准的分子生物学技术)编码其的重组多核苷酸并插入到可复制载体中以在选定的宿主细胞或无细胞表达系统中表达。合适的宿主细胞可以是原核生物、酵母或者高级真核细胞(特别是哺乳动物细胞)。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例有：通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞系(293细胞或亚克隆以悬浮培养生长的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581，ATCC CRL 8287)或NS0(HPA培养物保藏号no.85110503)、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(Hep G2，HB8065)、小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)，以及DSM′s PERC-6细胞系。适合于这些宿主细胞的表达载体也是本领域普遍已知的。
应注意，术语“宿主细胞”一般是指培养细胞系。引入编码本发明抗原结合多肽之表达载体的完整人类个体被明确排除在本发明的范围以外。
在一个重要的方面，本发明还提供了用于生产重组抗原结合多肽的方法，其包括在允许所述抗原结合多肽表达的条件下，培养包含编码重组抗原结合多肽之多核苷酸(例如表达载体)的宿主细胞(或无细胞表达系统)，并回收所表达的抗原结合多肽。该重组表达方法可用于本发明抗原结合多肽(包括旨在用于人类治疗用途的单克隆抗体)的大规模生产。用于大规模生产适用于体内治疗用途的重组抗体的合适载体、细胞系和生产方法都是在本领域常规可得的，并为本领域技术人员所熟知。
本发明的另一些方面涉及检测试剂盒，包括诊断试剂盒等，其包含本发明的抗原结合多肽，以及包含本发明抗原结合多肽的药物制剂。
当所述抗原结合多肽用于诊断时(例如，当抗原结合多肽特异性针对作为疾病状态或疾病易感性之生物标志物的抗原时)，可方便地提供该抗原结合多肽作为检测试剂盒的组分。诊断检测通常采用标准的免疫测定，如ELISA、放射免疫测定、Elispot等。这种检测试剂盒的组分可基于检测或测定(其旨在使用本发明的抗原结合多肽来实施)的性质而有所改变，但通常还包括使用本发明抗原结合多肽进行免疫测定所需的其它试剂。作为诊断试剂应用的抗原结合多肽可带有显示标记物(revealinglable)，如荧光基团、酶标记或放射性标记。
作为体内治疗应用的抗原结合多肽通常被配制成与一种或多种可药用稀释剂、载体或赋形剂组合的药物剂型(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980)。本发明的抗原结合多肽通常配制成无菌水溶液，以对有此需要的哺乳动物对象(通常是人类患者)通过静脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、肿瘤内、口服、瘤周、皮下、滑膜内、鞘内、局部、舌下或吸入途径施用。为预防或治疗疾病，抗原结合多肽的合适剂量将取决于待治疗之疾病的类型、疾病的严重程度和病程，以及患者的年龄、体重和病史，并由主治医师判断确定。
抗原结合多肽的生产方法
本发明的一个重要方面涉及用于生产针对目的靶标抗原具有高亲和力的抗原结合多肽(特别是单克隆抗体)的方法。
因此，本发明提供了制备与靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽的方法，所述方法包括：
(a)确定如下核苷酸序列，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的骆驼科常规抗体VH和/或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；以及
(b)表达与所述靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)具有步骤(a)所确定的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一个实施方案中，步骤(b)中表达的抗原结合多肽并不与步骤(a)的骆驼科常规抗体一致。
在一个非限制性的实施方案中，本发明提供了制备与靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)的重组抗原结合多肽的方法，所述抗原结合多肽包含VH结构域和VL结构域，其中VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种，所述方法包括以下步骤：
(a)分离如下骆驼科动物的核酸，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的骆驼科常规抗体VH结构域和/或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；
(b)制备包含编码如下高变环或互补决定区之核苷酸序列的重组多核苷酸，其中所述高变环或互补决定区具有与由步骤(a)分离的核酸编码的高变环或互补决定区一致的氨基酸序列，该重组多核苷酸编码包含与所述靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)之VH和VL结构域的抗原结合多肽；以及
(c)由步骤(b)的重组多核苷酸表达所述抗原结合多肽。
在一个实施方案中，步骤(c)中表达的抗原结合多肽并不与步骤(a)的骆驼科常规抗体一致。
上述方法在本文中可被称为制备抗原结合多肽的“常规方法”。
上述方法的第一步均可包括对骆驼科物种进行主动免疫以引起其对靶标抗原的免疫应答，从而产生与靶标抗原发生免疫反应的骆驼科常规抗体。对骆驼科动物免疫的方案在所附实施例中描述。用于免疫的抗原制剂可以是靶标抗原的纯化形式，例如重组表达的多肽或其免疫原性片段。然而，也可使用抗原的未加工制剂(例如表达或编码靶标抗原的细胞或组织制剂、细胞裂解物、细胞上清液或级分(如细胞膜)等)或编码所述靶标抗原的多核苷酸(DNA免疫)进行免疫。
该方法通常涉及骆驼科物种(包括，但不限于，大羊驼和阿尔帕卡羊驼)动物的免疫，并且有利的是这些动物属于远交种群。但是，还预想到使用包含骆驼科动物常规Ig基因座，或至少其一部分的转基因动物(例如转基因小鼠)。
一个日益感兴趣的话题似乎是体内和体外生成的抗体的互补决定区(CDR的)之间的差异。本发明人推测，体内选择对于免疫原性、功能性、稳定性具有有利的影响，并因此提高了所产生抗体的可制备性，而体外生成和选择的合成CDR从这些方面具有不利因素。这是很重要的，因为给定的治疗性抗体具有被来自患者的所谓抗独特型抗体应答中和的风险(Lonberg，Nature Biotechnology，23：1117-1125，(2005))。
本发明基于骆驼科动物主动免疫的方法的关键优势在于：所有骆驼科物种都能以大规模的远交种群来维系，其中每只动物都有不同的遗传背景。因此，可采用主动免疫来引起针对目的抗原的强的和多样性的免疫应答，并从中可获得多样的潜在抗原结合分子集合。如所附实施例所示，本发明人已发现骆驼科动物的主动免疫可产生具有高度免疫多样性的与靶标抗原结合之Fab片段。不希望受理论的约束，本发明人推测，人类和骆驼科动物之间的进化距离可能对于针对给定靶标抗原的多样性免疫应答的产生是重要的。相反地，非人灵长类动物在进化上与人类接近，因此在非人灵长类动物和人类之间具有高度同源性的靶标只可以在非人灵长类动物中引起强度和多样性上有限的免疫应答。
如果所产生的抗体与人抗体表现出低的序列和结构同源性(从而需要进行大规模的“蛋白质改造”来产生具有治疗潜能的候选抗体)，那么在远交种群(其与人的进化距离远)中使用主动免疫不会是特别有利的。因此，极为重要的是，本发明人已显示，骆驼科种系(以及体细胞突变的序列)编码的VH和VL结构域与人VH和VL结构域具有非常高的序列和结构同源性(如上所述)。这种高度同源性与大量远交种群的可用性相结合从而产生了非常强大的用于开发作为人类治疗用途的单克隆抗体的平台。
在使用靶标抗原进行主动免疫后，可从经免疫动物中分离出外周血淋巴细胞或活检样品(如淋巴结或脾活检样品)，并筛选出产生针对靶标抗原的骆驼科动物常规抗体。如实施例中所示，该阶段中可使用例如淘选(panning)或FACS分选的富集技术以减少待筛选的B细胞库的复杂性。然后，选出抗原特异性B细胞并用于提取总RNA以及随后cDNA合成。编码骆驼科动物本源VH和VL结构域的核酸(特异性针对靶标抗原)可通过PCR进行分离。
得到与靶标抗原发生免疫反应的骆驼科动物常规抗体并不一定要使用主动免疫。在另一些实施方案中，可利用骆驼科动物的自身免疫应答，无论是在动物中天然存在的免疫多样性，或者例如患病动物或已天然暴露于特定病原体的动物(例如通过正常的感染途径)。在这方面，本发明包括使用非免疫文库。如果骆驼科动物中的“天然”免疫应答已产生与目的靶标抗原结合的抗体，则可利用本文所述的基因改造以及本领域已知的其它标准技术来培养并分离产生该抗体的B细胞或产生该抗体的单克隆细胞培养物和/或确定编码该抗体VH和/或VL结构域的骆驼科动物基因区段的核苷酸序列。了解到该序列的信息，就可以改造出编码如下抗原结合多肽的重组DNA构建体，所述抗原结合多肽包含骆驼科动物来源的VH和/或VL或者高变环(或CDR)。
可以将编码骆驼科动物VH和VL结构域的核酸(无论是以主动免疫获得或是以其它方式获得)直接克隆到用于生产本发明抗原结合多肽的表达载体中。特别地，可以将这些序列克隆到还编码人抗体恒定结构域或其一部分的表达载体中以产生嵌合抗体。然而，通常是在克隆和表达人类恒定结构域序列之前，对分离的骆驼科动物VH和VL序列进行进一步操作。
第一步，可使用候选的骆驼科动物VH和VL序列(包括主动免疫后分离的序列)制备骆驼科动物文库(例如Fab文库，如所附实施例中所述地)。然后可针对与靶标抗原的结合来筛选文库(例如使用噬菌体展示技术)。可以对有前景的首选候选物针对与靶标抗原的结合进一步进行检测，例如使用Biacore或合适的生物测定来实现。最后，将最有前景的编码VH和VL结构域的序列与编码人抗体恒定结构域的序列进行框内融合克隆。
用于编码(骆驼科动物来源的)HV/CDR的多核苷酸序列(例如用于本发明抗原结合多肽的重组表达)不需要与骆驼科动物中天然编码HV/CDR的本源多核苷酸序列一致。因此，本发明包括/允许密码子优化以及在多核苷酸序列中涉及克隆和/或表达的其它改变，所述优化或改变不改变所编码的氨基酸序列。
在某些实施方案中，可进行“链改组(chain shuffling)”，其中已知与目的抗原结合的特定可变结构域与一系列相反类型的可变结构域中的一个配对(即VH库与VL库配对或相反亦然)以产生文库以及所得到的针对抗原亲和力和/或特异性进行检测的VH/VL“混杂”组合。或者，VH结构域文库可随机或以分级的方式与VL结构域文库配对，并检测所得到的组合(见Clackson等，Nature，卷352，624-638页，1991)。在该方法中，所述文库可以是来源于骆驼科动物(其表现出对目的抗原具有免疫性(包括已被主动免疫的动物))的重排VH和VL(Vκ或Vλ)的文库。该链改组过程可增加免疫多样性和生产具有显着增强的亲和力的配对。
本发明还预想到从骆驼科动物VH或VL结构域开始进行表位印迹选择(epitopeimprinted selection)(所谓“定向选择(guided selection)”)，其中另一可变结构域来自于非骆驼科动物物种(例如人)。因此，在一个实施方案中，骆驼科动物的VH结构域可被人编码的VL结构域文库“改组”，以取代本源的骆驼科动物编码的VL结构域，从而导致骆驼科动物VH/人VL配对。然后，可对这些配对中的一个或多个进行第二次链改组，其中人VL结构域针对VH结构域(其可以是人编码的)文库进行改组。该第二个步骤可产生人编码的VH/VL组合，其具有原先骆驼科动物编码之VH/VL组合的表位印迹。
本发明的范围还包括逆向的“链改组”方法，即从非骆驼科动物(优选人类)编码的VH/VL结构域组合(其与目的抗原结合)开始。例如，这可以是针对确定之疾病靶标的完全人治疗性抗体。从该VH/VL组合开始，可进行第一轮选择(其中VH结构域被骆驼科动物编码的VL结构域文库“改组”(或反之亦然))，并针对抗原结合检测该配对。然后，可将所选的非骆驼科动物(例如人)VH/骆驼科动物VL的配对进行第二轮选择，其中骆驼科动物编码的VL被骆驼科动物编码的VH文库改组，并针对抗原结合检测该配对。结果，可以产生骆驼科动物VH/骆驼科动物VL的组合，其携带了起始VH/VL组合的表位印迹。使用本文所述的任何方法，该骆驼科动物VH/VL的组合可根据需要进一步被改造/修饰以及与人类编码的恒定结构域结合。
在本发明的方法中，可对“本源的”骆驼科动物来源之VH和VL结构域进行蛋白质改造以引入一个或多个选择性的氨基酸替换，通常引入框架区中。将这样的替换引入“野生型”骆驼科动物序列的原因可以是(i)框架区的人源化，(ii)稳定性、生物利用度、产物均一性、组织渗透性的提高等，或(iii)靶标抗原结合能力的优化。
可根据已被认可的原则通过在框架区中选择性替换一个或多个氨基酸残基来进行骆驼科动物来源之VH和VL结构的“人源化”(如所附实施例所示，综述于Almagro等，Frontiers in Bioscience 13：1619-1633(2008)，其内容通过引用并入本文中)。应当理解，为实现任何给定VH结构域、VL结构域或其组合的可接受的“人源化”而进行的氨基酸改变的精确特征将视情况而定，因为这取决于来源于骆驼科的框架区的序列以及这些框架区与最匹配的人类种系(或体细胞突变的种系)框架区之间的起始同源性，并且也可能取决于形成抗原结合位点的高变环的序列和构象。
人源化的总体目标是产生这样的分子，当将其引入人对象中时，其中的VH和VL结构域都表现出尽可能小的免疫原性，而保留了由骆驼科动物编码的亲本VH和VL结构域(例如通过主动免疫获得的骆驼科动物VH/VL)形成的抗原结合位点的特异性和亲和力。有一些现成的办法可实现能达成这一目标的人源化。一般地，技术可分为理性方法或经验性方法。理性方法包括CDR嫁接、表面重修或修饰，超级人源化(superhumanization)和人类链组成优化(string content optimisation)。经验性方法包括FR文库方法、定向选择、FR改组和人源改造(humaneering)。所有这些技术综述于Almagro，Frontiers in Bioscience2008(同上)，并且任何这些技术或者其组合或修改均可用来制备本发明的“人源化”抗原结合多肽。
文库构建方法
在相关方面，本发明还包括产生如下表达载体文库的方法，所述表达载体编码骆驼科动物常规抗体的VH和/或VL结构域，所述方法包括以下步骤：
a)扩增编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的核酸分子区域以获得经扩增的基因区段，每个基因区段均包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或编码VL结构域的核苷酸序列，以及
b)将a)中获得的基因片段克隆到表达载体中，从而每个表达载体至少包含编码VH结构域的基因区段和/或编码VL结构域的基因区段，由此获得表达载体文库。
上述“文库构建”的方法也可构成用于生产本发明抗原结合多肽之一般方法的一部分。因此，在本发明的这一方面被描述为优选或有利的任何特征也可被认为在一般方法中是优选或有利的，反之亦然，除非另有说明。
在一个实施方案中，步骤a)中被扩增的核酸包括从骆驼科动物淋巴组织制备的cDNA或基因组DNA，所述淋巴组织包括一种或多种B细胞、淋巴结、脾细胞、骨髓细胞，或其组合。循环中B细胞是特别优选的。本发明人出人意料地发现外周血淋巴细胞(PBL)可作为编码骆驼科动物常规抗体之VH和VL结构域的核酸的来源，即在PBL样品中有足够量的(表达抗体的)浆细胞使得可以进行直接扩增。这是有利的，因为PBL可利用动物(骆驼科动物)的全血样品制备。这就避免了需要使用介入性方法来获取组织活检样品(例如，来自于脾或淋巴结)。这意味着采样程序可视需要而经常重复进行，同时对动物的影响最小。例如，可以主动免疫骆驼科动物，从该动物中抽取第一份血样，并制备PBL，然后使用“加强”剂量的同一抗原或不同抗原再次免疫同一动物，然后抽取第二份血样，并制备PBL。
据此，本发明这一方法的一个具体实施方案可包括：制备包含来自骆驼科动物之PBL的样品，从PBL制备cDNA或基因组DNA，并利用该cDNA或基因组DNA作为模板来扩增编码骆驼科动物常规抗体之VH或VL结构域的基因区段。
在一个实施方案中，淋巴组织(例如循环中B细胞)取自于被主动免疫的骆驼科动物，如本文别处所述。然而，该实施方案并不是限制性的，其还涉及制备非免疫文库和来自于患病骆驼科动物之淋巴组织的文库，如本文别处所述。
总RNA(或mRNA)可从淋巴组织样品(例如外周血细胞或组织活检样品)中方便地制备，然后使用标准技术转换为cDNA。另外，还可使用基因组DNA作为起始材料。
本发明的这一方面包括用于构建文库的多样性文库方法和B细胞选择方法。在多样性文库方法中，可从取自淋巴组织的核酸中扩增VH和VL编码基因区段的库，而不需事先进行B细胞选择。在B细胞选择方法中，可在核酸提取和扩增VH和VL编码之基因区段之前，选择那些展示具有期望抗原结合特性的抗体的B细胞。
可使用多种常规方法来选择表达具有期望抗原结合特性之抗体的骆驼科动物B细胞。例如，B细胞可被荧光标记的单克隆抗体(mAb，特异性识别来源于大羊驼或其它骆驼科动物的常规抗体)和其它荧光染料标记的靶标抗原染色以用于常规IgG的细胞表面展示。然后，利用FACS分离各个双阳性B细胞，并且从各个细胞中提取总RNA(或基因组DNA)。或者，可以对细胞进行体外增殖，然后可筛选含有分泌的IgG的培养上清，再从阳性细胞中提取总RNA(或基因组DNA)。在另一方法中，各个B细胞可经特定基因进行转化或与肿瘤细胞来融合以产生可以“根据需要”进行生长的细胞系，随后从这些细胞中制备总RNA(或基因组DNA)。
除了使用FACS进行分选，还可利用固定化的单克隆抗体(针对骆驼科动物的常规抗体)并随后利用固定化的靶标抗原对表达常规IgG的靶标特异性B细胞进行“淘选”。RNA(或基因组DNA)可从抗原特异性B细胞集合中提取，或者这些集合可被转化并可通过有限稀释或FACS克隆出单个细胞。
B细胞选择方法可包括阳性选择或阴性选择。
无论是使用不进行任何B细胞选择的多样性文库方法或是使用B细胞选择方法，对从淋巴组织制备出核酸(cDNA或基因组DNA)进行扩增步骤，从而扩增编码各VH或VL结构域的基因区段。
可将从淋巴组织(例如外周B细胞或组织活检样品)中提取的总RNA转化成随机引物cDNA，或者可使用寡dT引物合成cDNA，或者可用Ig特异性寡核苷酸引物合成cDNA，或者可在cDNA合成前使用寡dT纤维素从总RNA中纯化mRNA(即多聚腺苷酸RNA)。可将从B细胞中分离的基因组DNA用于PCR。
可使用与可变结构域5′端退火的FR1引物连同与CH1或Ckappa/Clambda区3′端退火的引物进行编码至少VH或VL的重链和轻链(κ和λ)基因区段的PCR扩增，其优势在于：就这些恒定结构域引物而言，每种类型只需要一种引物。该方法使骆驼科动物的Fab得以克隆。或者，可使用与可变结构域的3′端退火的一系列FR4引物用于克隆Fab(融合到编码恒定结构域的载体中)或scFv(单链Fv，其中重链和轻链的可变结构域通过柔性的连接序列相连)；或者，可变结构域可在这样的表达载体中克隆，所述表达载体允许产生在哺乳动物细胞上展示的全长IgG分子。
通常扩增以两步进行，在使用非标记引物的第一步中使用大量的cDNA(以保持多样性)，在第二步中，使用经标记的引物(其是延伸引物，在5′端引入了限制性酶切位点以进行克隆)在少数几个循环中对扩增产物进行再次扩增。在第二扩增步骤之前，可将第一扩增步骤(使用非标记的引物)中产生的扩增产物进行凝胶纯化以去除多余的引物。或者，可引入启动子序列，其使得可以转录成RNA用于核糖体展示。除了限制性位点以外，还可以引入重组位点(例如Cre-Lox或TOPO位点)，后者允许定点插入到适当的载体中。
然后，可将编码骆驼科动物常规VH和VL结构域的经扩增基因区段克隆到适合于VH/VL组合表达为功能性抗原结合多肽的载体中。例如，首先，可将来自B细胞集合(或未进行任何B细胞选择的其它淋巴组织)集合的经扩增VHCH1/VKCK/VLCL基因区段分别克隆作为单独的文库(最初的文库)，然后在第二步中，通过切下轻链片段并将其连接到编码重链片段的载体中组装成Fab或scFv文库。该两步法支持大型文库的构建，因为PCR产物的克隆是相对低效的(由于限制性酶的消化效果欠佳所致)。通过基于扩增产物序列中少部分重叠的“重叠剪接延伸(splicing-by-overlap extension，SOE)PCR”可生成编码scFv的DNA片段；在PCR中，通过混合编码连接序列的小DNA片段与编码VH和VL的扩增产物，利用其重叠序列形成单个DNA片段。
可以将包含编码VH和VL之基因区段的扩增产物克隆进噬菌体或噬菌粒载体中，其允许使用以噬菌体展示为基础的筛选方法来选择靶标特异性抗体片段。或者，可将扩增产物克隆到允许在酵母细胞上(作为Fab、scFv或全长IgG)或在哺乳动物细胞上(作为IgG)展示的表达载体中。
在另一些实施方案中，可通过使用核糖体展示的扩增产物来避免克隆，其中在扩增引物中包含T7(或其它)启动子序列和核糖体结合位点。在针对结合靶标抗原的筛选后，克隆该集合并对各个克隆进行分析。因为文库的克隆和噬菌体的选择仅限于1010至1012个克隆，因此从理论上讲，与噬菌体展示文库相比，使用该方法可得到更大的免疫库。
当使用B细胞分选时，可将包含编码单个靶标特异性B细胞的VH或VL之基因区段的扩增产物直接克隆到细菌或哺乳动物表达载体中用于生成抗体片段(scFv或Fab)或甚至全长IgG。
在“文库构建”方法的一个特定的非限制性的实施方案中，本发明提供了用于生成编码骆驼科动物常规抗体之VH和VL结构域的表达载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物，从而产生针对靶标抗原的骆驼科动物常规抗体；
b)从包含来自所述经免疫骆驼科动物(包括但不限于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的淋巴组织(如循环中B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得这样的扩增基因区段，所述每个基因区段都包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码VL结构域的核苷酸序列；以及
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，从而使每个表达载体都包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域的抗原结合多肽的表达，由此就得到了表达载体文库。
上述方法可用于制备骆驼科动物编码之VH和VL结构域(特别是大羊驼和阿尔帕卡羊驼的VH和VL结构域)的文库，其适合于将VH/VL组合表达为有功能的抗原结合多肽，如以scFv、Fab或全长抗体的形式。
根据上述方法制备的编码骆驼科动物(包括但不限于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)VH和VL结构域的表达载体文库也构成了本发明主题的一部分。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了编码Fab或scFv分子的噬菌体载体文库，其中该文库编码的每个Fab或scFv均包含骆驼科动物常规抗体的VH结构域和骆驼科动物常规抗体的VL结构域。
在一个实施方案中，文库是“多样性的”文库，其中文库中的大部分克隆编码具有独特氨基酸序列的VH结构域和/或具有独特氨基酸序列的VL结构域，其包括骆驼科动物VH结构域和骆驼科动物VL结构域的多样性文库。因此，就VH结构域和/或VL结构域的氨基酸序列而言，多样性文库中的大部分克隆(例如大于90％)编码的VH/VL对与同一文库中编码的任何其它VH/VL对是不同的。
本发明还包括包含编码VH和VL之基因区段的表达载体，所述基因区段分离自骆驼科动物(如大羊驼或阿尔帕卡羊驼)单个所选出的B细胞。
在另一个方面，本发明还提供了选择如下表达载体的方法，所述表达载体编码与靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，该方法包括以下步骤：
i)提供表达载体文库，其中所述文库中的每个载体都包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，其中所述VH结构域或所述VL结构域的至少一个来自于骆驼科动物常规抗体，并且其中所述文库中的每个载体都指导包含所述VH结构域和VL结构域之抗原结合多肽的表达；
ii)针对与所述靶标抗原的免疫反应性，筛选由所述文库编码的抗原结合多肽，并由此选择编码与所述靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽的表达载体。
本发明的方法包括从编码VH/VL对的克隆文库中筛选/选择与靶标抗原发生免疫反应的克隆。该方法还可包括文库构建，其可使用如上所述的文库构建方法进行。如下所述，可针对选定克隆进行可选的下游处理/优化步骤。该选择和筛选的方法也可构成上述用于生产本发明抗原结合多肽之一般方法的一部分。因此，在本发明的这一方面被描述为优选或有利的特征也可被认为在一般方法中是优选或有利的，反之亦然，除非另有说明。
与靶标抗原发生免疫反应之克隆的筛选和选择
筛选/选择通常包括将由文库中之克隆编码的表达产物(即以抗原结合多肽形式存在的VH/VL对，如Fab、scFv或抗体)与靶标抗原接触，并选择所编码的VH/VL对表现出期望之抗原结合特性的一个或多个克隆。
噬菌体展示文库可利用固定化的靶标抗原或可溶性(通常是生物素化的)的靶标抗原进行筛选。因其以单体存在并在噬菌体上以单价展示，所以Fab形式允许基于亲和力的筛选，而这对于scFv(由于会发生凝集并在噬菌体上以多价展示)和IgG(二价形式)是不适用的。通常需要两到三轮的筛选才能获得足够富集的靶标特异性结合物。
基于亲和力的筛选可通过在接下来的一轮筛选中降低靶标抗原量来进行，而使用非生物素化靶标进行延长清洗可鉴定出具有极佳亲和力的结合物。
该筛选方法能让使用者追踪(home in on)某些表位，而从固定化靶标上洗脱噬菌体克隆的经典方法是基于pH休克(其使得抗体片段和/或靶标变性)，与针对靶标抗原的参照mAb或可溶性受体或细胞因子的竞争导致展示与靶标相关表位结合的抗体片段的噬菌体得以洗脱(这自然也适用于其它展示系统，包括B细胞选择方法)。。
使用从细胞或培养上清液制备的周质级分(片段从细胞中“渗漏”入其中)，可将从选择产物中取得的单个克隆用于小规模抗原结合多肽(如抗体片段)的生产。表达可由诱导型启动子(例如lac启动子)驱动，这意味着一经加入诱导剂(IPTG)，便启动了片段的产生。前导序列确保了片段向周质的转运，在此处片段被适当地折叠并形成分子内二硫桥。
由此产生的粗蛋白级分可用于靶标结合测定(例如ELISA)。对于结合研究来说，从单个克隆制备的噬菌体可用来克服Fab的低表达产量(其通常获得非常低的结合信号)。还可以使用体外受体-配体结合测定来筛选这些蛋白级分，以鉴定拮抗抗体；可以使用基于ELISA的受体-配体结合测定，还可以使用如Alphascreen的高通量测定。
也可以通过放射性标记的配体结合测定来进行筛选，其中过表达受体之细胞系的膜级分被固定，后一测定极其灵敏，因为只需要皮摩尔量的放射性细胞因子，这意味着粗蛋白级分中极少量的拮抗性Fab就将给出阳性读数。或者，也可应用FACS进行抗体的筛选，其抑制了荧光标记的细胞因子与细胞上表达的其受体的结合，而FMAT是其高通量的变通方法。
可以将存在于周质级分中的或者通过其六组氨酸标签进行IMAC部分纯化的或者通过G蛋白(已知与Fab的CH1结构域结合)进行部分纯化的Fab直接用于使用细胞的生物测定(其对细菌杂质不敏感)中；或者，来自单个大肠杆菌细胞的Fab可以在哺乳动物系统中再克隆以用于Fab或IgG的表达，并随后在生物测定中进行筛选。
在确定阳性表达载体克隆(即编码与期望靶标抗原结合的功能性VH/VL组合的克隆)后，常规地确定该可变结构域核苷酸序列，并据此推导出其编码的VH和VL结构域的氨基酸序列。
如果需要，Fab(或scFv)编码区域可被再克隆到另一表达平台(例如，细菌表达载体(除了没有用于在噬菌体上展示所必需的基因3以外，其与噬菌粒载体相同))中，从而实现更大规模的编码片段生产和纯化。
纯化的Fab(或scFv)的靶标结合亲和力可以通过表面等离子体共振(例如Biacore)或其它方法确定以及通过使用体外受体-配体结合测定和基于细胞的测定来确定中和效力。
抗原结合的家族(特别是拮抗性Fab(或scFv))可基于序列分析(主要是VH，特别是VH结构域的CDR3的长度和氨基酸序列)来确定。
效力优化
如有需要，可对通过筛选/选择鉴定出的编码对期望靶标抗原具有亲和力的VH/VL组合的克隆进行以下下游步骤，其中对亲和力和/或中和效力进行优化。
每个VH家族表现最佳的成员的效力优化可以通过轻链改组、重链改组或其组合来实现，从而选出在动物中天然存在的亲和力变体。这在最初的骆驼科动物VH/VL结构域选自于主动免疫之骆驼科动物的实施方案中是特别有利的，因为可使用从同一经免疫动物制备的原始文库来进行链改组，从而筛选在同一经免疫动物中产生的亲和力变体。
对于轻链改组而言，可使用编码具有期望抗原结合特征的VH/VL对(例如拮抗性Fab)的VH区(或VHCH1)的基因区段来构建文库，在该文库中编码VH的单个基因区段与文库(所述克隆最初从该文库中挑出)中的轻链集合结合。例如，如果编码VH的区段选自于通过利用靶标抗原进行主动免疫而引起免疫应答的骆驼科动物制备的文库(例如，Fab文库)，那么可通过将该VH编码区段与同一经免疫骆驼科动物的轻链(VL)集合结合来构建“链改组”文库。然后，可利用所得到的文库来选择靶标抗原，但要在严格的条件(低靶标浓度、使用溶液中非生物素化的靶标进行彻底清洗)下，以确保分离出最高亲和力的变体。周质级分的解离速率筛选(off-rate screening)也可有助于鉴定出更优的克隆。在经过序列分析并再次克隆到细菌生产载体中后，可对纯化的选定Fab进行亲和力(如通过表面等离子体共振)和效力(如使用生物测定)的检测。
可通过将编码轻链改组后选定之克隆的轻链(VL)的基因区段克隆回来自于同一动物(原始VH/VL编码克隆从中选择)的原始重链文库而进行重链改组。或者，可使用CDR3特异性寡核苷酸引物来扩增VH区家族，其可被克隆为集合从而与拮抗性Fab的轻链结合。然后基于亲和力的筛选和解离速率筛选，可鉴定该家族内表现最优的VH。
应当理解，轻链改组和重链改组步骤在实践中可以任一顺序进行，即先进行轻链改组，随后进行重链改组，或先进行重链改组，随后进行轻链改组。这两种可能性都包含在本发明的范围内。
根据具有增强之亲和力和效力的VH/VL对(例如Fab)的轻链或重链，(特别是)CDR的序列可用于生成改造变体(其中组合了若干单个Fab的突变)。已知突变通常可以叠加，这意味着将这些突变进行组合可得到更高的亲和力.
为人类治疗用途而进行的种系化和改换形式(formatting)
可以对选定的编码VH/VL对的表达克隆(其表现出期望的抗原结合特征，例如编码scFv或Fab的噬菌体克隆)的VH和VL编码基因区段经历下游加工步骤并再次克隆到另外的表达平台(例如编码适合于人类治疗用途的抗原结合多肽的形式的载体(例如，具有完全人抗体恒定结构域的全长抗体))中.
有前景的“首选”选定克隆可被改造成在编码VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列中引入一个或多个改变，该改变可改变或不改变VH结构域和/或VL结构域所编码的氨基酸序列。VH或VL结构域序列中的这些改变可根据本文中别处所述的任何目的而设计，包括种系化或人源化、密码子优化、增强的稳定性和优化的亲和力等。
本文所述的种系化或人源化的一般原则同样适用于本发明的这一实施方案。例如，包含骆驼科动物编码的VH和VL结构域的首选克隆可以在它们的框架区(FR)中通过应用文库方法被种系化/人源化.如本文中别处详细描述地，在与最接近的人类种系(针对VH和VL)以及与具有相同CDR1和CDR2典型折叠的其它人类种系比对后，即可确定在FR中需要被改变的残基，并选定优选的人类残基.虽然种系化可以包括使用来自于最匹配的人类种系的对应残基替换骆驼科动物编码的残基，但是这不是必须的，也可使用来自于其它人类种系的残基.
对与人VH3家族成员具有氨基酸同源性的VH结构域进行种系化通常包括替换/替代多个与公开已知的大羊驼、阿尔帕卡羊驼或单峰驼(Camelus dromedarius)来源之种系序列不同的残基。允许用于大羊驼、阿尔帕卡羊驼或单峰驼(特别是大羊驼)的VH3结构域之种系化/人源化的氨基酸替代包括但不限于：在框架区的第71、83和84位(使用Kabat编号)中的任何一个或其任何组合上进行的氨基酸替换.这样的替换将包括使用不同的氨基酸(其可以是天然或非天然的氨基酸，并且优选是已知出现在人类编码的VH3结构域中对应位置上的氨基酸)代替这些位点上骆驼科动物编码的残基。例如，第71位的丙氨酸可以被丝氨酸或丙氨酸替换，第83位的赖氨酸可以被精氨酸替换，第84位的脯氨酸可以被丙氨酸替换。因此，本发明抗原结合多肽的特定的非限制性的实施方案包括包含表现出与人VH3结构域具有序列同源性的骆驼科动物(更具体地说是大羊驼、阿尔帕卡羊驼或单峰驼)VH结构域的变体，其中VH结构域在第71、83和84位(使用Kabat编号)中一个或多个或所有位点上包含氨基酸替换(相对于骆驼科动物编码的序列而言)。特别地，具有下列替换中的一个或多个或其任何组合的变体是允许的：在第71位A变为S，在第83位将K变为R，或在第84位将P变为A。
一旦知晓首选的VH和VL结构域(需要时，在效力优化后)的氨基酸序列，即可设计VH和VL的合成基因，其中与人类种系不同的残基被优选的人残基(来自于最匹配的人类种系，或使用出现在其它人类种系中的残基，或者甚至是骆驼科动物的野生型残基)替换.在该阶段，编码可变结构域的基因区段可以被再克隆到表达载体中，从而使其在基因合成中或通过克隆到合适的展示载体中而与Fab的人类恒定结构域融合.
所得的VH和VL合成基因可以与Fab文库重组，或者经种系化的VH可以与野生型VL重组(反之亦然，称为“杂交”文库)。基于亲和力的筛选允许分离出表现最优的种系化形式，就“杂交”文库而言，可将表现最优的种系化VH与表现最优的种系化VL进行重组。
可使用经种系化之Fab的氨基酸和核苷酸序列信息来生成密码子经优化的合成基因以产生优选同种型(IgG1(适用于ADCC和CDC)、IgG2(适用于有限的效应功能)、IgG4(类似于IgG2，但适用于需要单价结合的情况)的全长人IgG.对于非长期的应用和快速指示，也可制备细菌或哺乳动物细胞来产生人类Fab.
在一个具体的非限制性实施方案中，组合上述方法步骤，本发明提供了生产编码与靶标抗原发生免疫反应之嵌合抗原结合多肽的表达载体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物(包括但不限于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)，从而产生针对靶标抗原的骆驼科动物常规抗体；
b)从包含来自于所述经免疫骆驼科动物的淋巴组织(例如循环中B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得如下经扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码VL结构域的核苷酸序列；以及
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，从而使每个表达载体包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽的表达，由此就产生了表达载体文库；
e)筛选与所述靶标抗原具有免疫反应性的由步骤d)中获得的文库编码的抗原结合多肽，从而选择编码与所述靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的表达载体；
f)任选地，进行轻链改组步骤和/或重链改组步骤以选择这样的表达载体，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的效力经优化的抗原结合多肽；
g)任选地，对编码步骤e)或f)中选出之载体的VH结构域的基因区段和/或编码步骤e)或f)中选出之载体的VL结构域的基因区段进行种系化和/或密码子优化；以及
h)将编码步骤e)或f)中选出之载体的VH结构域的基因区段或步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VH基因区段以及编码步骤e)或f)中选出之载体的VL结构域的基因区段或步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VL基因片段克隆到另一表达载体中，并使其与编码人抗体之一个或多个恒定结构域的核苷酸序列进行有效连接，从而产生编码包含与人抗体之一个或多个恒定结构域相融合的VH和VL结构域的嵌合抗原结合多肽的表达载体。
本发明还涉及到根据上述方法制备的表达载体，并涉及生产与靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用上述方法制备编码与靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的表达载体；
b)在允许所编码的抗原结合多肽表达的条件下，将所述表达载体引入宿主细胞或无细胞表达系统中；以及
c)回收所表达的抗原结合多肽。
在一个实施方案中，后一方法包括本发明抗原结合多肽的批量生产，特别是旨在用作药学活性制剂的治疗性抗体的批量生产.在这样的实施方案中，步骤a)中制备的表达载体和步骤b)中使用的宿主细胞/表达系统选用适于大规模生产旨在施用于人类患者的重组抗体。针对此目的的合适载体和表达系统的一般特征为本领域众所周知。
参照以下非限制性的实施例来进一步理解本发明.
实施例1至9示意针对示例抗原(表示为“细胞因子x”)产生抗体的方法，其从免疫大羊驼开始。同样的一般操作方案可适用于任何骆驼科动物物种的任何靶标抗原，因而“细胞因子x”的确切身份并不重要。还针对制备与IL-1Beta结合的Fab对该方法进行举例说明(从实施例15开始).
在上文的描述以及以下的实施例中引用了多篇出版物，其中每一篇都作为整体通过引用并入本文中。
一般操作方案
实施例1
大羊驼的免疫
大羊驼(Lama glama)的免疫和外周血淋巴细胞的获取以及随后RNA的提取和抗体基因片段的扩增都依照De Haard及其同事所描述的方案进行(De Haard等，J.Bact.187：4531-4541(2005))。通过使用弗氏完全佐剂或适当的动物用佐剂Stimune(CediDiagnostics BV，The Netherlands)，将重组人类细胞因子x经肌内免疫一只大羊驼。细胞因子x(在被改造的人类细胞系中重组表达)是购买的.在免疫前，冻干的细胞因子x在PBS(Dulbecco)中以250μg/ml的浓度重溶。大羊驼每周接受6次注射，前两次注射每次注射使用100μg细胞因子，后四次注射每次使用50μg进行加强。在末次免疫后4天，从动物中抽取150ml的血液样品(PBL1)并制备血清.末次免疫后十天，抽取第二份150ml的血液样品(PBL2)并制备血清.使用Ficoll-Paque梯度(Amersham Biosciences)，将作为大羊驼免疫球蛋白基因来源的外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocytes，PBL)从血液样品中分离出来，得到1～5×108个PBL。抗体的最大多样性预期与取样的B淋巴细胞数目一致，约为PBL数量的10％(9.2～23.2％)(1～5×107)(De Genst等，Dev.Comp.Immunol.30：187-98(2006))。大羊驼血清中常规抗体的比例达到总免疫球蛋白量的80％，其可以推测出产生常规抗体之B淋巴细胞具有类似比例。因此，150ml血液样品中常规抗体的最大多样性被计算为0.8～4×107个不同分子.根据Chomczynski等Anal.Biochem.162：156-159(1987)的方法从PBL分离出总RNA。
实施例2
通过淘选或FACS分选来富集抗原反应性B细胞(可选)。
为了降低所采样的B细胞集合的复杂性使重组的Fab噬菌体展示文库得以有效克隆，通过使用荧光标记的抗原或特异性识别骆驼科动物常规抗体的mAb(作为B细胞标志物)进行FACS分选(Weitkamp等，J.Immunol.Meth.(2003)275：223-237)或通过利用固定化抗原进行过淘选(Lightwood等，J.Immunol.Meth.316：133-143(2006))来富集抗原反应性B细胞。
来自于经免疫动物的PBL通过利用上述Ficoll-Paque密度离心法进行分离.可选地，在室温下，通过将PBL沉淀用20ml的裂解缓冲液(8.29g/LNH4Cl、1.09g/LKHCO3和37mg/LEDTA)重悬，然后以200×g离心10分钟，以裂解一起纯化出的红细胞.同样可选的是去除单核细胞，其通过将它们粘附于T150培养瓶的塑料表面来实现.为此目的，将该细胞重悬在70毫升含10％胎牛血清、二聚谷氨酸(Glutamax)、25mM Hepes、青霉素-链霉素(Invitrogen)以及0.38％柠檬酸钠的RPMI(Invitrogen)中，并在37℃和5％CO2的培养箱中孵育2小时.回收包含所选出B细胞的上清液并进行细胞计数。
通过对特异性识别骆驼科动物常规抗体的mAb(使用荧光标记)和靶标抗原(使用另一种荧光染料标记)同时染色来对展示靶标特异性之常规抗体的(活的)B细胞进行大规模FACS分选.通过使用Gough及其同事的操作方案(Gough，Anal.Biochem.173：93-95(1988))或使用TRIzol试剂盒(Invitrogen)分选出1,000至100,000个抗原特异性细胞并用于RNA提取。总RNA被转换成随机引物cDNA(作为模板)以用于扩增抗体重链和轻链可变基因(参见实施例3及其后实施例)。
实施例3
可变结构域基因的扩增和克隆。
使用Superscript III第一链合成系统(Superscript III First-StrandSynthesis System，Invitrogen)进行RT-PCR，从80μg的PBL RNA中制备出随机引物cDNA。在8个独立反应体系(20μl反应体系)中，在2.5μM随机六核苷酸引物和500μM dNTP存在下，将RNA在65℃热变性5min.随后，根据供应商的说明，将缓冲液和二硫苏糖醇以及640单位的RNasOUT(40单位/μl，Invitrogen)和3200单位的SuperscriptIII逆转录酶(200单位/μl，Invitrogen)加入8×40μl的总最终体积中。在50℃孵育50min后，在85℃孵育5min然后在1℃孵育1min。加入RNAse H(～4U)并在37℃孵育20min.根据供应商的建议，使用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化所富集的cDNA并用于PCR。
根据来自于大羊驼和单峰驼的种系序列，设计退火到CH1的3′端和VH的5′和3′端的引物，所操作的序列可以从IMGT和根据De Genst及其同事(De Genst等，Dev.Comp.Immunol.30：187-198(2006))所述的其它数据库中获取。为了设计用于轻链扩增的寡核苷酸，使用重排的和体细胞突变的单峰驼序列(其在研究论文中发表(I.Legssyer，Free University Brussels)).
所有最初的PCR都使用退火到可变结构域5′端的独立BACK引物和退火到CH1之3′端的FOR引物相组合来进行，利用相对大量的随机引物cDNA为模板(高达2.5μl，对应于6μg的总RNA)，从而保持最大的多样性。可使用JHFOR引物和SfiI-标记的VHBACK引物组合再次扩增源自重链的扩增产物(其中JHFOR引物退火到VH的3′端并包含天然的BstEII位点，VHBACK引物退火到VH基因的5′端)，并且随后克隆为VH片段。轻链V基因通过PCR获得，其使用了一系列退火到恒定结构域3′端的CKFOR或CLFOR引物以及退火到V区5′端的BACK引物。使用CH1FOR(包含NotI位点)或CKFOR以及CLFOR(包含AscI位点)延伸引物，再次扩增来自首次PCR反应的扩增产物，并随后克隆为大羊驼Fab片段。或者，使用被限制性酶切位点标记的引物(FOR引物具有AscI位点，基于FR4的BACK引物具有XhoI位点)，DNA区段可被再次扩增并克隆为VL片段，从而形成包含大羊驼来源的、与人类C区相结合的V区的嵌合Fab。
PCR在50μL的反应体系中进行，其使用了Phusion聚合酶(Finnzymes)和500pM的每种引物，进行了28个循环(96℃1min，60℃1min以及72℃ 1min)。使用QIAex-II提取试剂盒(Qiagen)，从琼脂糖凝胶纯化所有产物。为了引入限制性酶切位点，作为再扩增的输入物，在100μl的反应体系中使用100～200ng经纯化的DNA片段作为模板.通过对琼脂糖凝胶上4μl“未扩增”的PCR混合物的分析来证实大量的输入，其保证了变异性。
实施例4
原始和二级骆驼科动物Fab库的构建。
为了构建原始重链和两个原始轻链的库，对附带限制性酶切位点的PCR产物进行凝胶纯化，而后进行酶切并与三个不同的VH、VK和VL家族组合成三个集合。VHCH1片段用SfiI和NotI酶切，VKCK和VLCL片段用ApaLI和AscI酶切，并被克隆到噬菌粒载体pCB3中(与经改造具有多克隆位点的pCES1载体相似)。使用T4-DNA连接酶(Fermentas)，将酶切片段(1～2μg)连接到经酶切及纯化的pCB3(2～4μg)上，在室温孵育几个小时，然后在37℃孵育1-2小时。将针对轻链或重链集合的经脱盐的连接混合物对大肠杆菌TG1进行电穿孔以构建单链的文库.
或者，可使用9个单位的T4-DNA连接酶于室温下在100～200μl的反应混合物中，将总共1.5μg的VH片段用(存在于VH中的)SfiI和BstEII酶切并连接到4μg经凝胶纯化的载体pCB4(类似于载体pCB3，但没有pIII基因)中.此外，VH基因区段可通过SfiI和BstEII来克隆，VK/VL基因区段通过ApaLI和XhoI来克隆，从而产生嵌合Fd和VKCK和VLCL。
通过将轻链片段(从制备自轻链库的质粒DNA酶切获得)克隆到包含重链文库的质粒集合中而获得Fab文库.从VL文库(供者载体)的至少3×109个细菌中分离的质粒DNA被ApaLI和AscI酶切用于在受者载体中克隆凝胶纯化的DNA片段，其中受者载体已经包含重链文库，从而创建独立的具有kappa轻链的Fab文库，以及由具有lambda轻链的Fab组成的另一文库，其大小为1～10×109个克隆.同样，来自单链文库的VLCL或VKCK可以使用ApaLI/AscI利用琼脂糖凝胶分离出来，并使用相同的限制性酶切位点克隆到VHCH文库载体中。
实施例5
文库的选择
使用辅助噬菌体M13-KO7或VCSM-13以2升的规模进行噬菌体颗粒援救(rescue)，其使用代表性数目的来自接种文库的细菌以保证来自每个克隆的至少10个细菌存在于起始接种体中。为进行选择，1013个克隆形成单位与固定在免疫管(Maxisorp tubes，Nunc)上或在96孔微量滴定板中的抗原或可溶性生物素化的抗原一起使用.在随后的几轮选择中，固定化抗原的量减少10～100倍，第1轮以10μg/ml开始。根据供应商的建议，抗原以每个抗原分子3～10个NHS-生物素(Pierce)分子的比率被生物素化并在生物测定中测试其生物活性。除非另有说明，抗原在第一轮中以1至10nM的浓度被用于选择，在随后的几轮中以10pM至1nM的浓度用于选择.
实施例6
拮抗性细胞因子x特异性Fab的筛选
如Marks等(Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991))中所述，从单个克隆中制备可溶性Fab，但优选地是单克隆噬菌体(Lee等，Blood108：3103-3111(2006))以提高灵敏度。包含可溶性Fab或展示Fab之噬菌体的培养上清在具有直接包被抗原的ELISA中进行检测，或通过固定化链霉亲和素捕获。在4℃，重组的人类细胞因子x和链霉亲和素以10μg/ml在0.1M碳酸氢钠(pH 9.6)的条件下被包被16h。在使用含0.1％(v/v)Tween 20的PBS洗涤3次后，将生物素化的抗原加入，其浓度为0.5μg/ml，在室温下孵育30至60分钟.将板在室温下用含有2％(w/v)半脱脂奶粉(Marvel)的PBS或1％酪蛋白溶液(在PBS中)封闭30min。培养上清液用2％(w/v)Marvel/PBS稀释1或5倍并孵育2h；使用抗Myc抗体9E10(其识别重Fd链羧基端的myc肽标记)(5μg/ml)和兔抗小鼠HRP缀合物(Dako)检测所结合的Fab。在最后一次孵育后，使用四甲基联苯胺和过氧化氢为底物进行染色然后加入0.5倍体积的1M H2SO4终止反应，测定450nm处的光密度。使用寡核苷酸引物M13-反向和geneIII-正向(4)扩增获得的PCR产物或单独的Fd和VKCK或VLCL扩增产物进行BstNI或HinfI指纹图谱分析从而分析在ELISA中得到阳性信号(超过背景2倍)的克隆.
对Fab干扰细胞因子x与其受体结合之能力的筛选在适当的受体-配体结合ELISA中进行.对此，利用经细胞因子x-受体包被的板，将少量的生物素化细胞因子x与培养上清中的Fab一起孵育，随后使用链霉亲和素HRP缀合物检测所结合的细胞因子x。将阳性命中物进行测序并纯化Fab以用于在体外的受体-配体测定中确定其效力(IC50)，并且在BIAcore中评估它们对被固定化细胞因子x的亲和力。
从单个克隆大规模产生可溶性Fab片段在包含100μg/ml羟苄青霉素(carbenicillin)和2％葡萄糖的2×TY中以50ml或250ml的规模进行。在37℃培养到OD600值为0.9后，沉淀细胞(2,934×g，10min)，然后用含有羟苄青霉素和1mM异丙基-1-硫-D-半乳糖苷(Isopropyl-1-thio-Dgalactopyranoside，IPTG)的2×TY悬浮。根据替代性的DeBellis方法(De Bellis和Schwartz，NAR(1990)18(5)：1311)(其用0.2％代替2％的葡萄糖)，从而允许直接向对数期后期细胞的培养基中加入IPTG。细菌在30℃生长3.5h后通过离心收获(如前)；通过用1ml冰冷PBS重悬细胞沉淀来制备周质级分.在4℃经过2～16h的颠倒旋转后，通过两步离心法去除原生质球；在以3400×g离心10分钟后，通过另一离心步骤(其在Eppendorf离心机中以13000×g离心10分钟)澄清上清液。获得的周质级分被直接用于不同的功能测定(靶标结合ELISA，体外受体-配体结合测定和Biacore)中。
对于测序，使用Qiagen Mini试剂盒(Qiagen)，从于30℃培养在包含100μg/ml羟苄青霉素和2％葡萄糖的LB培养基中的5ml培养物中制备质粒DNA，或使用退火到Fab插入物边界之载体引物M13-反向和geneIII-正向的扩增产物。
实施例7
首选Fab的大规模生产和纯化
通过ApaLI-NotI，在表达载体(称为pCB5)中将来自3到6个不同首选物的Fab插入片段进行再克隆，除了没有M13噬菌体的基因3以外，该表达载体与pCB3相同(都包含六组氨酸和与Fd羧基端相融合的c-Myc标签)。同样，使用适当的限制性内切酶组合再克隆V区，随后克隆进基因3缺失的、包含人CH1和CK或CL的载体中用于表达嵌合Fab.经过指纹图谱分析，再克隆后获得的单克隆以50ml或250ml的规模培养，并如上所述制备周质级分。使用IMAC纯化Fab片段，并将正确形成的Fab进一步通过使用Superdex 75HR柱(AmershamPharmacia Biotech)进行尺寸排阻色谱纯化。当进行基于细胞的测定时，需要将样品通过阴离子交换柱(Source30Q，GE Healthcare)以去除内毒素，其中离子交换柱在1M NaOH中过夜敏化，并随后用D-PBS进行平衡。产量通过测定在280nm处的光密度来确定，对于Fab其使用的摩尔消光系数为13。
通过体外受体-配体结合测定和Biacore测试经纯化的Fab，以确定Fab片段产生的观察结果与包含基因3之pCB3载体产生的相同.最后Fab的效力通过生物测定来确定。
实施例8
在本实施例中，将针对细胞因子x的大羊驼来源的首选Fab进行人源化，其通过使用靶向少部分框架残基的“软随机突变(soft randomization)”方法并通过在丝状噬菌体表面上单价展示所产生的Fab文库(从而通过基于亲和力的筛选确定具有高亲和力的框架序列(US2003/0190317A1，其通过引用并入本文中))来实现.例如，对于单峰驼来源的种系VH(IGHV1S20)建立了一个小文库，其中第5位(Val，Leu)、第55位(Gly，Ala)、第83位(Ala，Ser)、第95位(Lys，Arg)、第96位(Ser，Ala)和第101位(Met，Val)保留了70％的野生型残基(IMGT编号).高变环中的氨基酸可以类似的方式处理。
为修正PCR错误或引入额外的特定单个密码子改变，基本上按照Kunkel等，Curr.Protoc.Mol.Biol.CH8U8.1(2001)所述的方案或者从GeneArt定购的“编码变体的合成基因”进行定点突变。用于定点实验的模板是来自人源化Fab克隆的单链DNA。
定点突变也可直接用来为人源化或修饰目的来改变编码野生型或人源化Fab的DNA中有限数目的氨基酸密码子。
选出后，检测单个首选克隆的亲和力和效力，选择最佳的首选克隆用于再次改换为人类Fab/IgG形式。
实施例9
人Fab片段和人单克隆抗体的表达。
从人源化的VH和VL区开始，人源化Fab的表达按照Rauchenberger等J.Biol.Chem.278：38194-204(2003)中所述的方案进行。对于人单克隆抗体的表达，构建两个独立的基于pcDNA3.1载体的载体，一个针对轻链载体，一个针对重链构建体.针对轻链的表达载体包含在CMV启动子下游的人类C kappa或人类C lambda序列，以及允许轻链构建体作为KpnI/BsmBI片段克隆到CMV启动子下游并与轻链恒定结构域同读码框的限制性酶切位点。针对重链的表达载体包含在CMV启动子下游的人类CH1-铰链-CH2-CH3序列，以及允许VH构建体作为KpnI/BsmBI片段克隆到CMV启动子下游并与重链恒定结构域同读码框的限制性酶切位点。
VL和VH片段作为KpnI/BsmBI片段被克隆到合适的表达载体中，所述载体包含Kozak序列及其后的与各VH或VL序列同读码框的小鼠IgG kappa前导序列。这些序列通过基因合成获得并针对在哺乳动物细胞中表达而优化(Geneart)。
对于全长IgG的产生，VH和VL表达载体构建物被共转染到哺乳动物细胞(HEK-293(瞬时转染)或CHO(稳定转染))中。来自瞬时转染细胞或稳定转染细胞的上清液通过蛋白A进行层析。
通过受体结合测定和生物测定检测单克隆抗体或Fab，并选择最佳的首选物用于进一步开发。
实施例10-骆驼科动物与人类的同源性分析
方法
将编码FR4的大羊驼和单峰驼种系的J区序列与人类序列进行比较，其与人类序列完全一致(10个残基完全匹配)，唯一的例外是IGHJ4(其在FR4的第6位包含谷氨酰胺(而非亮氨酸或蛋氨酸))(其比对参见下文)。对于来自单峰驼的体细胞突变之VLambda FR4，10个残基中有9个匹配(90％的同源性)，因为大多数可获得的序列的第6位具有组氨酸而非赖氨酸或谷氨酸或谷氨酰胺(其比对参见下文).最后，在由六个可获得的体细胞突变之单峰驼VKappa序列组成的集合中的FR4也具有90％的一致性(10个残基中有9个匹配)，因为第3位丝氨酸残基与在人类种系JK区段中发现的(即谷氨酰胺、脯氨酸和甘氨酸)不同(其比对参见下文)。
对于VH、VLambda和VKappa的分析通过比对来进行(见下文)。序列比对是与最接近的具有相同H1和H2典型折叠的人类种系序列进行的。
不匹配、但出现在同一种系的另一家族成员(或亚类)中的残基被认为是同源的，其基于以下假设，即将它们突变回所述最接近之人类种系序列是可行的.
典型结构通过使用下列程序进行对比：
http：//www.bioinf.org.uk/abs/chothia/html和http：//www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html。
检查所分析的不完全拟合典型折叠算法的骆驼科动物抗体(或来自其它物种的抗体)的残基是否存在于具有相同典型折叠组合的人类种系家族匹配的成员序列中，或检查所述形成折叠的残基是否存在于所分析抗体所属之骆驼科动物抗体的家族中。
结果如下所示：
10.1-单峰驼VH
10.2-大羊驼VH
10.3-VL 1-40
10.4-VL 2-18
10.5-VL 3-1
10.6-VL 3-12
10.7-VKappa 2-40
10.8-大羊驼与人类J(H)区的比较
10.9-轻链J区的比较
10.10-阿尔帕卡羊驼(Lamapacos)VH同源性分析
10.11-大羊驼来源的VH同源性分析
10.12-大羊驼来源的VL分析
实施例11-分析H1和H2之典型折叠的关键残基，并对H1和H2残基与人类种系进行
比较
抗体的结构分析揭示了序列与由互补决定区形成之结合位点的形状之间的关系((Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Tramontano等，J.Mol.Biol.215：175-82(1990))。尽管它们具有高度的序列可变性，但六个环中有五个仅采取主链构象中的一小部分，称为“典型结构”。这些构象首先取决于环的长度，其次取决于环和框架区中某些位点关键残基的存在(其通过包装、氢键键合或决定不寻常主链构象的能力来确定构象)。
根据这些环的长度以及之前所提及的关键残基的存在，已对单峰驼和大羊驼种系的VH区段进行了H1和H2之预测典型结构的分析。对关键残基进行比较(表1)，这是因为关键残基出现在就存在相同典型折叠组合和整体序列同源性而言最匹配的人类种系中；此外，也显示出由Morea及其同事(Morea等，Methods 20：267-279(2000))所提出的与相应典型折叠相应的氨基酸。对于单峰驼种系的VH家族IGHV1S(1-19)(其H1形成典型折叠1(表1中示为H1：1)，H2形成折叠1(H2：1))，对于家族IGHV1S(20、22、23、24)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠3(H2：3))，对于家族IGHV1S(21，25-39)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠2(H2：2))，对于大羊驼种系的IGHV1S8(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠2(H2：2))，对于H1的典型折叠起关键作用的第24、26、27、29、34和94位残基与这些来自类似的具有相同典型折叠组合的人类种系家族的残基一起显示(表1的上半部分)。另外，对于单峰驼种系的VH家族IGHV1S(1-19)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠1(H2：1))，对于家族IGHV1S(20、22、23、24)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠3(H2：3))，对于家族IGHV1S(21，25-39)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠2(H2：2))，对于大羊驼种系的IGHV1S8(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠2(H2：2))，第52a或54或55位的关键残基连同第71位残基与这些来自类似的具有相同典型折叠组合的人类种系家族的残基一起显示(表1的下半部分)。
该分析清楚地显示了典型环的“人属性”，因为在骆驼科动物VH区段中发现的关键残基与在相应的人VH区段中发现的相同。例如，所有19个来自单峰驼编码之IGHV1S(1-19)种系的VH区段在第19位均为丙氨酸，第26位为甘氨酸，在第27和29位为苯丙氨酸，以及在第34位为蛋氨酸，正如它们主要出现在人类种系家族3成员(其与这些单峰驼种系序列相似，H1形成典型折叠类型1，H2形成折叠类型1)中一样。第94位只在(所有39个种系VH片段中的)一个种系的单峰驼中被编码，这意味着不可能有合适的分析。Nguyen及其同事(Nguyen等，EMBO J.19：921-930(2000))注意到，单峰驼种系VH和VHH区段“从保守的八聚体(即重组信号)跨越到FR3的半胱氨酸残基92”，而人类区段编码两个额外的残基(93和94)。不过，我们将利用对仅仅已知的六个体细胞突变的来源于骆驼科动物常规抗体的VH区段的分析，讨论这些残基。
几乎无一例外，与人类种系区段和Morea及其同事(Morea等，Methods 20：267-279(2000))所提出的关键残基都完美匹配，除了大羊驼种系IGHV1S6中第52a位残基(其在此位为丝氨酸，而人的类似物使用苏氨酸)以外，其中大羊驼种系IGHV1S6的环H2形成典型折叠类型2。令人鼓舞的发现是，在六个被公开的大羊驼VH(其来源于体细胞突变的常规抗体(Vu等，Mol.Immunol.34：1121-31(1997))中有四个在第52a位是苏氨酸。值得一提的是，丝氨酸和苏氨酸是密切相关的，因为它们都具有一个极性羟基和小侧链基团，这表明在人源化过程中可以互换这两个残基。
在第71位的谷氨酰胺似乎是相当特别的，在H2环具有典型折叠类型1的19个单峰驼种系VH区段中仅有1个出现了该氨基酸，而在H2环具有典型折叠类型2的16个单峰驼种系VH区段中仅有4个出现了该氨基酸。H2环覆盖第71位的残基并且环相对于框架的位置主要取决于该位点残基的大小。具有6个残基的典型结构2和3在H2环中。当第52a和71位残基为小型或中等大小的疏水残基时，会出现结构2，当第71位残基为精氨酸或赖氨酸时，会出现典型折叠3。在体细胞突变的常规抗体中无法预测在第71位具有谷氨酰胺的单峰驼种系片段的频率，但在使用该特定残基的首选抗体中，对该残基的人源化需要仔细检测。在单峰驼IGHV1S(20、22、23、24)家族成员中的第71位出现精氨酸和谷氨酰胺是相当意外的，其中该家族成员具有用于形成H2的典型折叠2，但在另一方面，人类种系VH1家族成员VH1-9、VH1-10和VH1-11(其H2形成典型折叠2)也具有精氨酸，VH5成员5-1(其H2形成典型折叠2)在此位置上携带谷氨酰胺。
当讨论人VH区段的结构库时，如Chothia及其同事们所做地(Chothia等，J.Mol.Biol.227：799-817(1992))，我们研究了单峰驼和大羊驼VH区段之H1和H2环的氨基酸残基和关键残基，并将这些与具有相同典型折叠组合的人类对应部分进行对较(表2)。对于单峰驼种系的VH家族IGHV1S(1-19)(其H1形成典型折叠1，H2形成折叠1)，对于家族IGHV1S(20、22、23、24)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠3(H2：3))，对于家族IGHV1S(21，25-39)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠2(H2：2))，对于大羊驼种系的IGHV1S8(其H1形成折叠1，H2形成折叠2)，H1的第26至33位残基与位于H1外的第24位和第94位关键残基一起显示(表2A)。另外，对于单峰驼种系的VH家族IGHV1S(1-19)(其H1形成典型折叠1(H1：1)，H2形成折叠1(H2：1))，对于家族IGHV1S(20、22、23、24)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠3(H2：3))，对于家族IGHV1S(21，25-39)(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠2(H2：2))，对于大羊驼种系的IGHV1S8(其H1形成折叠1(H1：1)，H2形成折叠2(H2：2))，H2的第52至56位残基与位于H2外的第71位关键残基一起分析(表2B)。
看到可变环中的高度序列同源性是出人意料的，特别是在H1中，几乎与相关的人类序列没有差异。例如，具有典型折叠组合H1：1/H2：1的种系单峰驼家族IGHV1S(1-19)主要包含第24位上的丙氨酸、第26位上的甘氨酸、第27位上的苯丙氨酸、第28位上的苏氨酸、第29位上的苯丙氨酸，第30、31位上的丝氨酸、第33位上的酪氨酸、第34位上的蛋氨酸和第35位上的丝氨酸，其与同样具有H1和H2典型折叠组合的人类种系家族3成员完全匹配。公开已知的例外仅有大羊驼种系VH区段上的第27位残基(苯丙氨酸)和第32位残基(丝氨酸)，但其同样在6个公开已知的体细胞突变之大羊驼VH中的4个中出现(Vu等，Mol.Immunol.34：1121-1131(1997))。在第32位具有酪氨酸，如在类似的人类种系中发现的一样。在单峰驼种系VH区段的H2环中也发现了同样的高度序列同源性，除家族IGHV1S(1-19)的第54位残基以外。特别是单峰驼家族IGHV1S(21，25-39)在H2环上有一些位点不同(即第53、54、56和58位)。具有相同折叠的大羊驼种系VH区段的H2环得分更高，但在第50、52、52a、54、55和58位也包含了一些不同的残基，但很难予以解释，因为仅仅使用了已知的种系区段来进行分析。对来源于大羊驼的体细胞突变的VH的分析表明，在这些位点上出现某些残基，其也出现相应的人类种系序列中，虽然很少发生(如，第50位上的甘氨酸、第52、58位上的天冬酰胺、第52a位上的苏氨酸和第55位上的甘氨酸)。
我们还分析了六个公开已知的来源于大羊驼之体细胞突变的VH序列(Vu等，Mol.Immunol.34：1121-31(1997))。下文显示了与人VH3成员3-23的比对，其显示了非常高的序列同源性：整体上，只观察到了3个不同残基(其中之一是由用于扩增的引物编码，而其它两个也发生在同类型的人类种系中)。甚至CDR也显示具有非常高的序列同源性：CDR1可能是一致的，CDR2只有三个残基是不同的。对典型折叠的分析表明，两个VH的H1形成折叠1，H2形成折叠2，如在唯一可得的大羊驼来源之种系VH中观察到的一样，但其它四个的H1形成折叠1，H2形成折叠3，如在3-23和大多数人类家族VH3种系区段中出现的一样。这可能暗示着，这些都来源于其它、至今未知的种系VH区段。支持典型折叠之关键残基的实验给出了与出现在具有相同典型折叠组合的人类种系中的残基完美匹配，其中相同典型折叠组合如已在表1中列举的大羊驼种系VH区段中所观察到的。非常有趣的发现是，这些体细胞突变序列中的第94位关键残基是赖氨酸(5个中有2个)、丝氨酸(5个中有1个)和精氨酸(5个中有1个)，其都在具有相同折叠组合的人类种系中被发现或者被Morea及其同事(Morea等，Methods 20：267-279(2000))推荐过。
实施例12-用于形成L1(λ)和L2(λ)的典型折叠的关键残基的分析以及L1(λ)和L2
(λ)残基与人类种系的比较
同样，我们根据环的长度和与典型折叠相关的关键残基的存在，为体细胞突变的单峰驼VLambda区段分析了预测的L1和L2的典型结构。使用这样的关键残基进行比较(表3)，其中关键残基出现在具有相同的典型折叠的组合和具有总的序列同源性的最匹配的人类种系中。对于体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-1(Camvl8、18、19、20和23)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-12/32(Camvl11)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL 1-40(Camvl44)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL2-18(Camvl5、17、30-33、36、52、57、59、60和65)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，与L1的典型折叠相关的第2、25、29、30、33和71位关键残基与这些来自类似的具有相同典型折叠组合的人类种系家族的残基一起显示(表3的上半部分)。对于体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-1(Camvl8、18、19、20和23)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-12/32(Camvl11)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL 1-40(Camvl44)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL2-18(Camvl5、17、30-33、36、52、57、59、60和65)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，对L2的典型折叠起重要作用的第48和64位关键残基与这些来自类似的具有相同典型折叠组合的人类种系家族的残基一起显示(表3的下半部分)。
如在VH中观察到的，分析显示了典型环L1和L2的“人属性”，因为骆驼科动物VLambda区段的关键残基与那些相应的人VLambda片段中的残基相同。例如，在单峰驼VL3-12/32、VL1-40和VL2-18中，所有L1的关键残基都与那些出现在相应的人类种系中的残基相同，并且在单峰驼VL3-1、VL3-12/32和VL2-18中，L2的关键残基与相应的人类种系VL区段完全匹配。基本上只有两个例外。首先，VL1-40的L2的第64位关键残基是谷氨酸，其与存在于人类种系Vλ1(其具有与VL1-40相同的L1/L2典型折叠组合)中的甘氨酸非常不同。这是很难得出一般性结论的，因为VL1-40仅由一个孤体组成(即Camvl44)。第二个例外是VL3-1，其中苯丙氨酸是最主要的在第30位出现的L1关键残基，而亮氨酸最常在人Vλ家族3成员(其与VL3-1都是L1形成折叠11，L2形成折叠7)中被发现。然而，亮氨酸也存在于五个VL3-1成员中的一个成员中。
我们分析了体细胞突变的单峰驼VLambda区段的L1和L2环的各个氨基酸残基和关键残基，并将其与共用相同典型折叠组合的人类对应部分进行比较(表4)。对于体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-1(Camvl8、18、19、20和23)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，以及体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-12/32(Camvl11)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，将L1的第27至33位残基与L1外的第71位关键残基与出现在相应的人类种系Vλ(其具有L1和L2形成的相同的折叠组合)中的相同残基进行比较(表4A上半部分)。对于体细胞突变的单峰驼VL1-40(Camvl44)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL2-18(Camvl5、17、30-33、36、52、57、59、60和65)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，将L1的第26至33位残基与L1外的第2和71位关键残基与出现在相应的人类种系Vλ家族(其具有L1和L2形成的相同的折叠组合)中的相同残基进行比较(表4A下半部分)。另外，对于体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-1(Camvl8、18、19、20和23)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL家族VL3-12/32(Camvl11)(其L1形成折叠11(L1：11)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL 1-40(Camvl44)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，对于体细胞突变的单峰驼VL2-18(Camvl5、17、30-33、36、52、57、59、60和65)(其L1形成折叠14(L1：14)，L2形成折叠7(L2：7))，将L2的第49至53位残基与位于L2外的第48和64位关键残基与出现在相应的人类种系Vλ家族(其L1和L2形成的相同的折叠组合)中的相同残基进行比较(表4B)。L1、L2、关键残基与人类种系序列之间具有高度的序列同源性，只有少数例外存在(其主要存在于VL3-12/32和VL1-40家族的孤体成员中)。对于VL3-12/32的L1，其第27、28、30、30a和30b位残基与相应的人类种系Vλ家族3不同，而VL1-40的同一环中第30b、31、和32位残基与相匹配的人类种系Vλ家族1不同。在VL3-12/32的孤体成员中，L2的第50位残基与人类似物中不同，而对于VL1-40的唯一成员，其第64位的关键残基与人类似物中不同。根本区别在于单峰驼家族VL2-18L1中的第28位残基(天冬酰胺或谷氨酸，相对于类似的人Vλ家族2中的丝氨酸来说)。
实施例13-用于形成L1(κ)和L2(κ)的典型折叠的关键残基的分析以及L1(κ)和L2
(κ)残基与人类种系的比较
我们根据环的长度和关键残基的存在为体细胞突变的单峰驼VKappa区段分析了预测的L1(κ)和L2(κ)的典型结构。如前所述，使用这样的关键残基进行比较(表5)，所述关键残基出现在具有相同的典型折叠的组合和具有总的序列同源性的最匹配之人类种系中。对于体细胞突变的单峰驼VK家族VK2-40(Kp1、3、6、7、10、20和48)(其L1形成折叠3(L1：3)，L2形成折叠1(L2：1))，与L1的典型折叠相关的第2、25、29、30e、33和71位关键残基与这些来自类似的具有相同典型折叠组合的人VKappa种系家族2的残基一起显示。另外，与如Morea等人所提出的相应典型折叠相应的关键氨基酸示于最下面一行。对于第2、25、33和71位关键残基来说具有完美匹配，而对于第29位残基则具有一定程度上的匹配。单峰驼VKappa的第30e位残基是谷氨酰胺(而非甘氨酸)，但Morea及同事(Morea等，Methods 20：267-279(2000))暗示该残基与L1形成的折叠3相容。
对于同样的体细胞突变的单峰驼VK家族VK2-40(Kp1、3、6、7、10、20和48)(其L1形成折叠3(L1：3)，L2形成折叠1(L2：1))，决定L1之典型折叠的第48和64位关键残基被与这些来自类似的人VKappa种系家族2的残基一起显示。此时匹配仍旧是完美的。
将体细胞突变的单峰驼VKappa区段的L1和L2环的各个氨基酸残基和关键残基与那些出现在人类相应部分(VK家族2)(其共用相同的典型折叠的组合)中的残基进行比较(表6)。对于体细胞突变的单峰驼VK家族VL2-40(Kp1、3、6、7、10、20和48)(其L1形成折叠3(L1：3)，L2形成折叠1(L2：1))，将L1和L2残基与那些在种系VK家族2(其具有相同的典型环的组合)中发现的残基进行比较。大部分残基在单峰驼体细胞突变的VK与人类种系之间共用，如第2位的异亮氨酸，第25、26、28和30b位的丝氨酸、第27位的谷氨酰胺，第32位的酪氨酸，第33位的亮氨酸以及第71位的苯丙氨酸。然而，一些残基与人类类似物不同，即第29位的缬氨酸(尽管人类种系中的亮氨酸也出现在单峰驼VK中)、第30位的苯丙氨酸(人类亮氨酸残基也出现在单峰驼的VK中)、第30a位的丝氨酸(人类谷氨酸残基经常出现在单峰驼VK中)、第30c位的丝氨酸、第30d位的天冬酰胺、第30e位的谷氨酰胺、第30f位的赖氨酸以及第31位的丝氨酸。
将体细胞突变的单峰驼VKappa区段L2环的残基和关键残基与那些出现在人类相应部分(VK家族2)(其共用相同的典型折叠的组合)中的残基进行比较(表6)。同样，从第48位的异亮氨酸、第49位的酪氨酸、第52位的丝氨酸、第64位的甘氨酸残基中观察到完美匹配，而在第50位(酪氨酸，而非人VK家族2中的苏氨酸)和第51位(丙氨酸，而非亮氨酸)具有不同。
总体结论
对于骆驼科动物VH和VL序列的分析显示了非常高的同源性，不然的话，也与人类的决定典型折叠的关键残基一致或与其高变环中发现的残基一致。这表明，绝大多数的骆驼科动物免疫球蛋白序列采用在人类种系中发现的典型折叠，不仅针对单个高变环，而且还针对在人VH和VL中发现的典型折叠的组合。
实施例14-对来自大羊驼的体细胞突变之VH、VK和VL的序列分析
从四只大羊驼中分离外周血淋巴细胞，如前所述进行RNA提取和随机引物cDNA合成(de Haard等，JBC 1999)。进行VHCH1、VLCL和VKCK的扩增，并将扩增产物克隆到载体pCB3中以产生重链或轻链文库。在使用PCR筛选克隆以确定抗体结构域插入片段存在后，培养单个克隆并纯化质粒DNA以进行序列分析。
14.A显示了λ轻链可变结构域被归到各家族中，其根据是最接近的人类种系类似物(其具有相同的CDR1和CDR2长度并推测具有相同的典型折叠的组合)。人类中最常使用λ种系，即VL1、VL2和VL3，也常在所分析的大羊驼序列中发现，此外还有VL4、VL5、VL6(未显示在14.A中)和VL8，这意味着在人类中发现的10个λ家族中有7个家族也在大羊驼中使用。14.B显示了三个κ轻链可变结构域中的两个(即VK1和VK4，VK2未显示)，其在约50％的人κ抗体中出现。在人抗体中最常使用(50％)的VK3家族的成员未鉴定到，但其很可能是所使用的扩增引物造成的，而其很可能也采用这类结构。14.C显示了VH序列的比对，其揭示了与最常使用的人VH3(存在于34％的人抗体中)和VH1(17％)区段的高度序列同源性。必须注意的是，最近Achour等人的出版物(J Immunol 2008)提到阿尔帕卡羊驼种系中存在VH2家族，其与人VH4家族最为密切相关(见实施例10.10)。
整体而言，可以得出结论，骆驼科动物使用了高度多样性的重链和轻链家族，其与在人类免疫系统中发现的类似，这意味着，通过使用人类疾病靶标进行主动免疫，最佳选择的首选抗体可预期与人抗体具有高度序列同源性，并因此可以容易地改造用于治疗用途。
实施例15-生成针对IL-1Beta的Fab
除非另有说明，下列研究中使用的材料和操作方案与实施例1-9所用使的类似。
大羊驼被IL-1Beta成功免疫
根据标准的操作方案，使用人类IL-1Beta对两只大羊驼(Lama glama)进行免疫(如实施例1所述)。
在免疫前(第0天)和免疫后(第28天)，使用ELISA对来自两只大羊驼的血清进行检测，以检测IL-1Beta抗体的存在。如图1所示，免疫后，即使在对血清进行10000倍稀释后，在ELISA中也观察到了针对IL-1Beta的特异性信号。该抗体高效价显示了特异性的和适当的免疫应当。
构建具有丰富多样性的Fab文库
使用de Haard等人(JBC 1999)所述的策略，将从两只经免疫大羊驼中分离的PBL用于RNA提取、RT-PCR以及将Fab PCR克隆到噬菌粒中以获取具有丰富多样性(2～5×108)的多样性文库。
使用下列引物：
用于克隆λ轻链的引物
用于克隆κ轻链的引物
用于克隆重链的无标签引物(步骤1)
用于克隆重链的带标签引物(步骤2)
使用单个(经标记)PCR步骤(30个循环)构建独立的VλCλ和VκCκ文库，以确保较高的克隆多样性。
同时，使用两步PCR(步骤1使用未经标记的引物进行25个循环，随后步骤2使用经标记引物进行10个循环)构建VHCH1文库。
然后，将来自VλCλ和VκCκ文库的轻链分别再克隆至表达VHCH1的载体中，以分别构建大羊驼“Lambda”和“Kappa”Fab文库(每只经免疫大羊驼构建两个文库)。使用PCR例行进行文库的质量控制。
随机检测的克隆中有高达93％的克隆包含全长Fab序列，这显示出文库的高品质.
选择人IL-1Beta特异性Fab
使用噬菌体展示技术来确定大量多样性的大羊驼Fab与生物素化的IL-1Beta的结合。使用生物素化的IL-1Beta来捕获以维持该蛋白质的活性构象.经过两轮选择后，观察到与对照相比的良好富集。噬菌体ELISA显示了表达细胞因子特异性Fab克隆的存在(数据未显示).
利用pH休克洗脱下与生物素化IL-1Beta结合的噬菌体。使用所得产物的连续稀释物(10-1～10-5)转染新鲜的大肠杆菌TG1细胞。所获得的克隆数显示了在选择中结合的噬菌体数目.在上面的实施例中，当使用100nM和10nM的biot-IL-1Beta进行选择时，5μl的产物得到了约105个噬菌体.相对于通过非特异性结合获得的102个噬菌体而言，这得到了1000倍的富集.
94个单克隆被培养并被用于产生单克隆噬菌体。这些噬菌体被用于噬菌体ELISA中。在利用生物素化的IL-1Beta进行二轮选择后，许多噬菌体显示出与biot-IL-1Beta的良好结合。
特异性针对人IL-1Beta的Fab与人类种系具有较高的起始同源性
将靶标特异性VH和Vλ结构域与常见的人类种系(其显示相同的CDR1和CDR2长度以及对应的典型折叠)中的VH和Vλ结构域进行匹配。随后，基于框架区中的序列同源性，选出最接近的人类种系。检查那些不相匹配的氨基酸残基在其它相关人类种系中的存在.如果没有匹配的话，这些残基被看作是异源的。
表7：大羊驼VH与人种系的整体序列同源性
表8：大羊驼VL与人种系的整体序列同源性
讨论与结论：
●基于初次筛选，鉴定出总共14个靶标特异性VH家族、9个靶标特异性Vλ家族和3个Vκ家族。
●这最初的14个抗IL-1Beta WT VH和12个抗IL-1Beta WT VL的集合显示与人类种系具有非常高的同源性.
●所述VH结构域中有33％与人类情况具有95％或更高的起始同源性，以及约44％的VL结构域与人类情况具有95％或更高的起始同源性，从而无需再进行人源化。
●VH结构域2D8是VH 1C2的人源化形式，因为与最接近的人类种系相比，它缺少了一个不同的氨基酸残基。其相应的VL结构域(VL 2D8)与最接近的人类种系具有95％的起始同源性，通过回复突变(VL 2G7)，其同源性进一步增加到96％.
●当使用上述方法进行评估时，所有VH和VL结构域无一例外都表现出人的3-D结合位点结构(即与所匹配的人类种系中出现的CDR1和CDR2典型折叠的组合相同)(数据未显示)。
Fab 1E2和1F2的人源化
在两个IL-1Beta特异性Fab(编号1E2和1F2)中进行人源化.基于与最接近的人类种系的比对，提出在其VH和Vλ框架区中的突变(图2)。与人VH3家族相匹配的VH的种系化通常涉及许多残基，这些残基在公开已知的大羊驼、阿尔帕卡羊驼或单峰驼来源的种系序列中是不同的.例如，可将第71位的丙氨酸(根据Kabat编号)、第83位的赖氨酸和第84位的脯氨酸分别改变为丝氨酸(虽然丙氨酸也存在于某些人类种系的VH3成员中)、精氨酸(虽然许多人VH3种系中也使用赖氨酸)和丙氨酸。对于轻链可变序列，没有可获得的骆驼科动物种系序列，但很可能在FR中存在许多与人类种系的不同，这将会在大部分的首选抗体中被改变。除了完全人源化的(hum)和野生型(wt)V区以外，还提出只保留了三个野生型残基的“安全变体”(safe).
Fab 1E2通过逐步法被改换形式，据此，将融合到人类恒定结构域的Vλ的各种形式(wt、safe和完全人源化)与融合到人类恒定结构域CH1结构域的VH的各种形式组合，产生表9所示Fab.
表9：Fab 1E2形式
这些Fab基因作为合成基因向GeneArt(德国)定购，随后在大肠杆菌中产生，并进行纯化以及检测其结合biot-IL-1Beta的能力。为此，利用经抗myc抗体包被的Maxisorp板来捕获Fab.加入生物素化的人IL-1Beta，并使用HRP缀合的链霉亲和素检测所结合的细胞因子。该测定的读数示于以下图3中。
●使用人类相应部分对野生型恒定结构域CH1和Cλ进行替换不影响结合能力。
●1E2的VH结构域的部分(wt Vλ/safe VH)和完全(wt Vλ/hum VH)人源化产生了功能性Fab。
使用表达基因3-Fab融合蛋白的噬菌体检测克隆1F2的人源化变体(图4)。针对每个构建体，从4个独立的克隆制备噬菌体：
●wt 1F2和wt 1E2(与人Cλ和CH1融合的大羊驼Vλ和VH)
●safe变体1F2和safe变体1E2(与人Cλ和CH1融合的部分人源化的Vλ)
●hum1F2和hum1E2(与人Cλ和CH1融合的完全人源化Vλ和VH)
对针对每个Fab的四个克隆进行检测以克服克隆变异(由于细菌生长、噬菌体生产效率和毒性等所致).通过利用中性亲和素包被的Maxisorp板捕获生物素化的IL-1Beta以及随后与粗噬菌体提取物(即细菌培养基)孵育来进行噬菌体ELISA。经过充分的洗涤，使用抗M13-HRP单克隆抗体检测所结合的噬菌体。当利用中性亲和素包被的孔(不含生物素化的IL-1Beta)检测时，同样的噬菌体制备物未得到信号(数据未显示)。
●1F2VL和VH结构域的框架区的回复突变到最接近的人类种系成功地产生了保持抗原特异性的部分(safe)和完全(hum)人源化的变体。
使用人类恒定结构域对骆驼科动物可变结构域进行成功的形式改换
IL-1Beta特异性克隆1E2的VL和VH可变结构域被成功融合到人类的Cλ和CH1恒定结构域，产生了“嵌合”Fab，对其进行生产和纯化。
通过在37℃诱导4h(o/d)或在28℃诱导16h(o/n)，该嵌合1E2Fab从pCB5噬菌粒(Δ基因3)中生产出来。通过在30℃诱导16h，野生型大羊驼1E2Fab从pCB3(包含gene3的噬菌粒)中生产出来。纯化后，这些Fab被加入到具有(变性)和不具有(非变性)DTT的SDS-PAGE中。进行考马斯染色，其很好地显示了这些Fab或其包含的轻、重链在期望的分子量条带上的出现(未显示)。
利用抗myc抗体包被的Maxisorp板捕获上述纯化的大羊驼和嵌合1E2Fab。在与生物素化的人IL-1Beta一起孵育和充分洗涤后，使用HRP-缀合的链霉亲和素检测结合到Fab上的生物素化IL-1Beta。纯化的大羊驼和嵌合1E2Fab都表现出功能性靶标结合(图5)。这一发现表明了将骆驼科动物来源的可变结构域与人IgG恒定结构域相结合的可行性。
显示功能性抑制靶标的Fab亚群
下表显示了来自以下ELISA实验的OD值。用已知抑制IL-1Beta与其受体结合的小鼠单克隆抗体(由Diaclone SAS提供)包被孔。
将生物素化的IL-1Beta与Fab的周质提取物一起加入到孔中，其中周质提取物是在经过两轮针对生物素化IL-1Beta的筛选后确定的。通过HRP标记的链霉亲和素检测所结合的生物素化IL-1Beta.降低的信号表明特异性Fab与封闭性小鼠单克隆抗体的竞争，这表明具有拮抗作用。
通过加入大量的竞争性小鼠单克隆抗体，向孔G12(表10中的孔12G)加入阳性对照.
表10：竞争测定的结果
鉴定出许多可成功地与封闭性小鼠单克隆抗体竞争的Fab(表10中的阴影格)。对竞争性克隆的序列分析显示，在48个筛选克隆(表10中标记为6A部分)中，三个Fab具有不同的VH。针对拮抗性Fab 1A1(在表10的竞争性试验中信号为0.205)、1B3(信号为0.444)和相关克隆1G1(信号为0.498)以及1C3(信号为0.386)的VH与最接近的人类种系进行序列比对和结构同源性分析显示如下。
这三个与匹配的人类种系都具有非常高的序列同源性，并且具有在人类种系中所发现的相同的典型折叠的组合。对于λ轻链，在这三个首选克隆中也观察到了该现象(数据未显示).Fab 1A1与拮抗性参照单克隆抗体强烈竞争(在基于ELISA的竞争试验中，IC50为12μg/ml)，而Fab 1C3几乎不显示竞争(只在浓度超过50μg/ml时)。然而，在生物测定中，1C3(IC50为3μg/ml)比1A1(IC50为10μg/ml)效力更高，这提示它们识别不同的表位.如这些抗体的两个中所发现地，不同拮抗性Fab的高频出现(48个筛选克隆中有3个不同)以及表位识别的差异证明了抗体的高度多样性，这是大羊驼远交特性的结果。与人类种系V区的高度序列同源性再加上(有效力)抗体的高度多样性以及广范的表位覆盖，使得从经免疫骆驼科动物鉴定出治疗性抗体的集合成为可能。
实施例16
与现成的小鼠单克隆抗体方法相比，以下实施例展示了本发明可实现的功能多样性.
使用小分子量的重组产生之细胞因子免疫10只BALB/c小鼠。在完成免疫步骤后，处死这些动物，将它们的脾细胞永生化以产生杂交瘤。在细胞因子结合ELISA中及随后的适当生物测定中检测由此产生的杂交瘤细胞上清液。可以鉴定出一个高度有效的拮抗剂和一个较弱的拮抗剂.
同样，使用本文所述的一般方法，用同样的重组产生之细胞因子免疫4只大羊驼.在完成免疫步骤后，收获外周B淋巴细胞并提取和纯化其总RNA。使用一系列大羊驼的特异性引物，通过噬菌体展示技术生成Fab文库。在细胞因子/细胞因子受体结合ELISA中检测这些Fab.可以从前两只大羊驼中鉴定出5个不同的VH家族，从后两只大羊驼中鉴定出6个另外的不同VH家族，其高效地抑制细胞因子/受体的相互作用，这意味着这些VH结构域包含不同的独特CDR(无论是长度还是氨基酸序列方面)。
因此，相对于大量的近交BALB/c小鼠，可以从少量的远杂大羊驼中获得更高的功能多样性。通过主动免疫大羊驼获得的所有VH家族与最接近的人类种系相比表现出很高的序列同源性，并且具有如相匹配的人类种系中一样的CDR1和CDR2形成的典型折叠组合。
实施例17
下表总结了阿尔帕卡羊驼种系VH结构域与最匹配的人类种系VH结构域之间的氨基酸序列同源性比较的结果。同源性百分比使用本文针对大羊驼所述的相同算法来计算。阿尔帕卡羊驼的原始VH序列数据未显示：
表11：阿尔帕卡羊驼种系VH与人类种系VH的氨基酸序列同源性
提供下标以相互对照本文列出的核苷酸和氨基酸序列，并且以ST.25格式提交的序列表用于检索目的。
表12：序列标示符的相互参考
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：
1.包含VH结构域和VL结构域的抗原结合多肽，其中在所述VH结构域或所述VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科(Camelidae)物种的VH或VL结构域。
2.根据项1的抗原结合多肽，其中所述VH结构域中的高变环H1或高变环H2、或者高变环H1和高变环H2二者来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。
3.根据项1或2的抗原结合多肽，其中所述VL结构域中的高变环L1或高变环L2、或者高变环L1和高变环L2二者来自于骆驼科物种的VH或VL结构域.
4.根据项2或3的抗原结合多肽，其中VH结构域中的高变环H3或者VL结构域中的高变环L3或者二者来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。
5.根据项1的抗原结合多肽，其中VH结构域和VL结构域中的每一个高变环或互补决定区都来自于骆驼科物种的VH或VL结构域。
6.根据前述任一项的抗原结合多肽，其中来自于骆驼科物种之VH或VL结构域的高变环或互补决定区(CDR)具有由骆驼科物种之VH或VL基因编码的氨基酸序列。
7.根据项1至5中任一项的抗原结合多肽，其中来自于骆驼科物种之VH或VL结构域的高变环或互补决定区具有的氨基酸序列与通过主动免疫骆驼科物种获得之常规抗体的高变环或互补决定区的氨基酸序列基本一致.
8.根据项1至5中任一项的抗原结合多肽，其与通过主动免疫骆驼科物种获得的骆驼科VH或VL结构域相比或者与由骆驼科物种之VH或VL基因编码的VH或VL结构域相比，在所述VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区中包含至少一个氨基酸替换。
9.根据项1至8中任一项的抗原结合多肽，其与通过主动免疫骆驼科物种获得的骆驼科VH或VL结构域相比或者与由骆驼科物种之VH或VL基因编码的VH或VL结构域相比，在所述VH结构域或VL结构域的至少一个框架区中包含至少一个氨基酸替换。
10.根据前述任一项的抗原结合多肽，其中与由人类种系或体细胞突变的VH基因所编码的VH结构域相比，所述VH结构域包含在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上的至少一个氨基酸序列不匹配。
11.根据前述任一项的抗原结合多肽，其中与由人类种系或体细胞突变的VL基因所编码的VL结构域相比，所述VL结构域包含在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上的至少一个氨基酸序列不匹配。
12.根据前述任一项的抗原结合多肽，其包含VH结构域，所述VH结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人VH结构域具有80％或更高、优选85％或更高的序列一致性。
13.根据项12的抗原结合多肽，其中所述VH结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人VH结构域具有90％或更高的序列一致性。
14.根据项13的抗原结合多肽，其中所述VH结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人VH结构域具有95％或更高的序列一致性。
15.根据项14的抗原结合多肽，其中所述VH结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人VH结构域具有97％或更高的序列一致性。
16.根据前述任一项的抗原结合多肽，其包含VL结构域，所述VL结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人VL结构域具有80％或更高、优选85％或更高的序列一致性。
17.根据项16的抗原结合多肽，其中所述VL结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人类VL结构域具有90％或更高的序列一致性。
18.根据项17的抗原结合多肽，其中所述VL结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人类VL结构域具有95％或更高的序列一致性。
19.根据项18的抗原结合多肽，其中所述VL结构域表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与一个或多个人类VL结构域具有97％或更高的序列一致性。
20.根据前述任一项的抗原结合多肽，其中所述VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环来自于骆驼科物种的VH或VL结构域并且表现出预测的或实际的典型折叠结构，该结构与人抗体中出现的典型折叠结构基本相同。
21.根据项20的抗原结合多肽，其中所述VH结构域中的高变环H1和高变环H2各自来自于骆驼科物种的VH结构域，并且各自表现出预测的或实际的典型折叠结构，该结构与在人抗体中出现的典型折叠结构基本相同。
22.根据项21的抗原结合多肽，其中所述VH结构域中的高变环H1和高变环H2形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，该组合与已知在人类种系VH结构域中出现的典型折叠结构的组合相同。
23.根据项22的抗原结合多肽，其中所述VH结构域中的高变环H1和高变环H2形成选自1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、2-1、3-1和3-5的典型折叠的组合.
24.根据项22或23的抗原结合多肽，其表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与人类VH结构域具有80％或更高的序列一致性，并且其中高变环H1和高变环H2形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，该组合与已知在相同人VH结构域中天然出现的典型折叠结构的组合相同。
25.根据项21至24中任一项的抗原结合多肽，其中所述VL结构域中的高变环L1和高变环L2各自来自于骆驼科物种的VH或VL结构域，并且各自表现出预测的或实际的典型折叠结构，该结构与在人抗体中出现的典型折叠结构基本相同.
26.根据项25的抗原结合多肽，其中所述VL结构域中的高变环L1和高变环L2形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，该组合与已知在人类种系VL结构域中出现的典型折叠结构的组合相同.
27.根据项26的抗原结合多肽，其中所述VL结构域中的高变环L1和高变环L2形成下列典型折叠组合中的一种：11-7、13-7(A，B，C)、14-7(A，B)、12-11、14-11、12-12、2-1、3-1、4-1和6-1。
28.根据项1的抗原结合多肽，其中所述VH结构域和/或VL结构域具有由骆驼科物种的VH或VL基因编码的氨基酸序列。
29.根据前述任一项的抗原结合多肽，其中所述骆驼科物种选自骆驼、大羊驼(llama)、单峰驼(dromedary)、小羊驼(vicunia)、原驼(guanaco)和阿尔帕卡羊驼(alpaca)。
30.根据前述任一项的抗原结合多肽，其与靶标抗原发生免疫反应。
31.根据前述任一项的抗原结合多肽，其特异性结合靶标抗原。
32.根据项30或31中的抗原结合多肽，其中所述靶标抗原是非骆驼科动物抗原。
33.根据项32中的抗原结合多肽，其中所述靶标抗原是人类抗原。
34.根据项32中的抗原结合多肽，其中所述靶标抗原是病毒抗原或细菌抗原.
35.根据项30至34中任一项的抗原结合多肽，其中所述靶标抗原是具有治疗或诊断价值的靶标。
36.根据前述任一项的抗原结合多肽，其是嵌合多肽。
37.根据前述任一项的抗原结合多肽，其是重组表达的多肽.
38.根据前述任一项的抗原结合多肽，其是抗体.
39.根据前述任一项的抗原结合多肽，其包含至少一个恒定结构域，所述恒定结构域具有由人类免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列或者与其具有至少90％一致性的氨基酸序列。
40.根据项39的抗原结合多肽，其包含人抗体的完整恒定结构域。
41.根据项1至37中的任何一项的抗原结合多肽，其是Fab、Fab′、F(ab′)2、双特异性Fab′、Fv片段、微型双功能抗体、线性抗体、单链可变片段(scFv)或由抗体片段形成的多特异性抗体.
42.编码项1至41中任一项所述抗原结合多肽或者编码所述抗原结合多肽之片段的多核苷酸分子，所述片段包含来自于骆驼科物种的VH或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)。
43.包含与调控序列有效连接的项42之多核苷酸分子的表达载体，所述调控序列允许所述抗原结合多肽在宿主细胞或无细胞表达系统中表达。
44.包含项43之表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统.
45.用于生产重组抗原结合多肽的方法，其包括在允许抗原结合多肽表达的条件下培养项44的宿主细胞或无细胞表达系统，并回收所表达的抗原结合多肽.
46.用于制备与靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的方法，所述方法包括：
(a)确定如下核苷酸序列，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的骆驼科常规抗体VH和/或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；以及
(b)表达与所述靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中所述VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)具有由步骤(a)所确定之核苷酸序列编码的氨基酸序列。
47.根据项46的方法，其中步骤(a)中的骆驼科常规抗体通过免疫骆驼科物种而获得，从而产生与所述靶标抗原发生免疫反应的常规抗体.
48.根据项46或47的方法，其中步骤(a)包括确定编码与所述靶标抗原发生免疫反应之骆驼科常规抗体VH和/或VL结构域的核苷酸序列；步骤(b)包括表达与所述靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中所述VH结构域或VL结构域中的至少一个具有由步骤(a)所确定之核苷酸序列编码的氨基酸序列。
49.根据项46至48中任一项的方法，其中步骤(b)中表达的抗原结合多肽包含非骆驼科动物抗体、优选人抗体的至少一个恒定结构域.
50.用于制备与靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)的重组抗原结合多肽的方法，所述抗原结合多肽包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于骆驼科物种，所述方法包括以下步骤：
(a)分离如下骆驼科核酸，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的骆驼科常规抗体VH和/或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；
(b)制备包含编码如下高变环或互补决定区之核苷酸序列的多核苷酸，所述高变环或互补决定区具有与由步骤(a)分离之核酸编码的高变环或互补决定区一致的氨基酸序列，该多核苷酸编码包含与所述靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)的VH和VL结构域的抗原结合多肽；以及
(c)由步骤(b)的重组多核苷酸表达所述抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽不与步骤(a)的骆驼科常规抗体相同。
51.根据项50的方法，其中(a)包括分离编码所述抗体之VH结构域和/或VL结构域的骆驼科核酸，以及改变所述核酸序列从而使其编码具有一个或多个氨基酸替换、缺失或添加的VH结构域和/或VL结构域。
52.根据项50或51的方法，其中步骤(b)制备的重组多核苷酸额外包含如下核苷酸序列，所述序列编码非骆驼科动物抗体、优选人抗体的一个或多个恒定结构域。
53.根据项50至52中任一项的方法，其中步骤(a)的骆驼科常规抗体通过免疫骆驼科物种而获得，从而产生抗所述靶标抗原的常规抗体.
54.根据项53的方法，其中所述骆驼科物种是骆驼、大羊驼、单峰驼、小羊驼、原驼和阿尔帕卡羊驼。
55.根据项53或54的方法，其中所述靶标抗原选自人类抗原、病毒抗原、细菌抗原以及具有治疗或诊断价值的靶标抗原.
56.根据项46至55中任一项的方法，其中通过该方法制备的抗原结合多肽不与步骤(a)的骆驼科常规抗体相同.
57.根据项1的抗原结合多肽，其可通过项46至56中任一项的方法获得。
58.检测试剂盒，其包含项1至41中任一项的抗原结合多肽.
59.根据项58的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包含至少一种对于使用所述抗原结合多肽进行免疫测定来说所需的另外试剂.
60.药物制剂，其包含项1至41中任一项的抗原结合多肽以及至少一种可药用的稀释剂、赋形剂或载体。
61.用于产生表达载体文库的方法，所述表达载体编码骆驼科常规抗体的VH和/或VL结构域，所述方法包括以下步骤：
a)扩增编码骆驼科常规抗体之VH和/或VL结构域的核酸分子的区域以获得经扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或编码骆驼科常规抗体之VL结构域的核苷酸序列，以及
b)将a)中获得的基因区段克隆入表达载体，从而使每个表达载体至少包含编码VH结构域的基因区段和/或编码VL结构域的基因区段，由此获得了表达载体文库。
62.根据项61的方法，其中步骤a)中扩增的核酸包括从骆驼科动物淋巴组织制备的cDNA或基因组DNA，所述淋巴组织包括一种或多种B细胞、淋巴结、脾细胞、骨髓细胞，或其组合。
63.根据项62的方法，其中所述淋巴组织从接受主动免疫的骆驼科动物获得。
64.根据项62或63的方法，其中所述淋巴组织包括选择用来表达骆驼科动物常规抗体的一种或多种B细胞，其中所述抗体具有期望的抗原结合特性.
65.根据项64的方法，其中所述靶标抗原选自人类抗原、病毒抗原、细菌抗原以及具有治疗或诊断价值的靶标抗原。
66.根据项61至65中任一项的方法，其中步骤b)包括将编码VH和VL结构域的基因区段克隆入表达载体以产生表达载体文库，其中所述文库中的每个表达载体包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域之抗原结合多肽的表达。
67.根据项61至66中任一项的方法，其中所述文库中的表达载体选自噬菌体载体、噬菌粒载体、酵母、哺乳动物表达载体和细菌表达载体.
68.用于产生表达载体文库的方法，所述表达载体编码骆驼科常规抗体的VH和VL结构域，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物，从而产生针对靶标抗原的常规骆驼科动物抗体；
b)从包含来自所述经免疫骆驼科动物之淋巴组织(例如循环中B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得经扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或包含编码骆驼科动物常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；以及
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，从而使每个表达载体包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域之抗原结合多肽的表达，由此获得表达载体文库.
69.项68的方法，其中步骤d)中获得的表达载体指导抗原结合多肽形式的所述VH结构域和所述VL结构域的表达，所述抗原结合多肽形式选自scFv、Fab和抗体.
70.根据项61至69中任一项的方法，其中所述骆驼科动物是大羊驼或阿尔帕卡羊驼。
71.通过项61至70中任一项的方法制备的表达载体文库。
72.用于制备表达载体的方法，所述表达载体编码与靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，该方法包括以下步骤：
i)制备表达载体的文库，其中所述文库中的每个载体都包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，其中所述VH结构域或所述VL结构域的至少一个来自于骆驼科动物常规抗体，并且其中所述文库中的每个载体都指导包含所述VH结构域和VL结构域之抗原结合多肽的表达；
ii)针对与所述靶标抗原的免疫反应性筛选由所述文库编码的抗原结合多肽，并由此选择编码与所述靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的表达载体。
73.项72的方法，其中所述VH结构域和所述VL结构域皆来自于骆驼科动物常规抗体。
74.根据项73的方法，其中步骤i)中的文库通过项66至69、72或73中任一项的方法制备。
75.根据项72至74中任一项的方法，其还包括步骤iii)：将编码步骤(ii)中选出之载体的VH结构域的基因区段和编码步骤(ii)中选出之载体的VL结构域的基因区段克隆到另一表达载体中，其与编码人抗体之一个或多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，从而产生编码嵌合抗原结合多肽的表达载体，所述嵌合抗原结合多肽包含与人抗体之一个或多个恒定结构域相融合的步骤(ii)中选出之VH和VL结构域。
76.根据项75的方法，其中在克隆到另一表达载体中之前，改造编码步骤(ii)中选出之载体的VH结构域的基因区段和/或编码步骤(ii)中选出之载体的VL结构域的基因区段，从而向编码所述VH和/或所述VL结构域的核苷酸序列中引入一个或多个改变.
77.根据项72至74中任一项的方法，其还包括轻链改组的方法，其包括以下步骤：
iii)制备第二表达载体文库，其中该文库中的每个载体包含编码在步骤(ii)中选出之表达载体的VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段；
iv)针对与所述靶标抗原的免疫反应性筛选由所述第二文库编码的抗原结合多肽，并由此选择编码与所述靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的表达载体.
78.根据项77的方法，其还包括步骤v)：将编码在步骤(iv)中选出之载体的VH结构域的基因区段和编码在步骤(iv)中选出之载体的VL结构域的基因区段克隆到另一表达载体中，其与编码人抗体之一个或多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，从而产生编码嵌合抗原结合多肽的表达载体，所述嵌合抗原结合多肽包含与人抗体之一个或多个恒定结构域相融合的在步骤(iv)中选出的VH和VL结构域。
79.根据项78的方法，其中在克隆到另一表达载体中之前，改造编码在步骤(iv)中选出之载体的VH结构域的基因区段和/或编码在步骤(iv)中选出之载体的VL结构域的基因区段，从而向编码所述VH和/或所述VL结构域的核苷酸序列中引入一个或多个改变。
80.根据项77的方法，其还包括重链改组的方法，其包括以下步骤：
v)制备第三表达载体文库，其中所述文库中的每个载体包含编码在步骤(iv)中选出之表达载体的VL结构域的基因区段和编码VH结构域的基因区段；
vi)针对与所述靶标抗原的免疫反应性筛选由所述第三文库编码的抗原结合多肽，并由此选择编码与所述靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的表达载体.
81.根据项80的方法，其还包括步骤vii)：将编码在步骤(vi)中选出之载体的VH结构域的基因区段和编码在步骤(vi)中选出之载体的VL结构域的基因区段克隆到另一表达载体中，其与编码人抗体之一个或多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，从而产生编码嵌合抗原结合多肽的表达载体，所述嵌合抗原结合多肽包含与人抗体之一个或多个恒定结构域相融合的在步骤(vi)中选出之载体的VH和VL结构域.
82.根据项81的方法，其中在克隆到另一表达载体中之前，改造编码在步骤(vi)中选出之载体的VH结构域的基因区段和/或编码在步骤(vi)中选出之载体的VL结构域的基因区段，从而向编码所述VH和/或所述VL结构域的核苷酸序列中引入一个或多个改变。
83.根据项72至82中任一项的方法制备的表达载体。
84.用于生产表达载体的方法，所述表达载体编码与靶标抗原发生免疫反应的嵌合抗原结合多肽，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫骆驼科动物(大羊驼或阿尔帕卡羊驼)，从而产生抗靶标抗原的常规骆驼科动物抗体；
b)从包含来自于所述经免疫骆驼科动物之淋巴组织(如循环中B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得经扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或编码骆驼科动物常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，从而使每个表达载体包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域之抗原结合多肽的表达，由此产生表达载体文库。
e)针对与所述靶标抗原的免疫反应性筛选由在步骤d)中获得之文库编码的抗原结合多肽，从而选择编码与所述靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的表达载体，
f)任选地，进行轻链改组步骤和/或重链改组步骤以选择这样的表达载体，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的效力经优化的抗原结合多肽；
g)任选地，对编码步骤e)或f)中选出之载体的VH结构域的基因区段和/或编码在步骤e)或f)中选出之载体的VL结构域的基因区段进行种系化和/或密码子优化；以及
h)将编码在步骤e)或f)中选出之载体的VH结构域的基因区段或在步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VH基因区段以及编码在步骤e)或f)中选出之载体的VL结构域的基因区段或在步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VL基因区段克隆到另一表达载体中，其与编码人抗体之一个或多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，从而产生编码嵌合抗原结合多肽的表达载体，所述嵌合抗原结合多肽包含与人抗体之一个或多个恒定结构域相融合的VH和VL结构域。
85.根据项84的方法制备的表达载体。
86.用于生产与靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用项72至82中任一项的方法或项84的方法制备表达载体，其编码与靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽；
b)在允许所编码的抗原结合多肽表达的条件下，将所述表达载体引入宿主细胞或无细胞表达系统；以及
c)回收所表达的抗原结合多肽。
Claims (10)
1.包含VH结构域和VL结构域的单克隆嵌合抗原结合多肽，其中VH结构域中高变环或互补决定区H1、H2和H3每一个和VL结构域中高变环或互补决定区L1、L2和L3每一个都来自于骆驼科物种的VH或VL结构域，所述骆驼科物种选自大羊驼(Ilama)、阿尔帕卡羊驼(alpaca)和单峰驼(dromedary)，并且其中所述抗原结合多肽还包含至少一个恒定结构域，所述恒定结构域具有由人类免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列或者与其具有至少90％一致性的氨基酸序列，
其中所述VH结构域中的高变环H1和高变环H2各自表现出预测的或实际的典型折叠结构，该结构与在人抗体中出现的典型折叠结构相同，并且其中所述VH结构域中的高变环H1和高变环H2形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，该组合与已知在人类种系VH结构域中出现的典型折叠结构的组合相同。
2.根据权利要求1的抗原结合多肽，其中所述VH结构域中的高变环H1和高变环H2形成选自1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、2-1、3-1和3-5的典型折叠的组合。
3.根据权利要求1或2的抗原结合多肽，其表现出在框架区FR1、FR2、FR3和FR4上与人类VH结构域具有80％或更高的序列一致性，并且其中高变环H1和高变环H2形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，该组合与已知在相同人VH结构域中天然出现的典型折叠结构的组合相同。
4.根据权利要求1至3中任一项的抗原结合多肽，其中所述VL结构域中的高变环L1和高变环L2各自来自于大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼的VH或VL结构域，并且各自表现出预测的或实际的典型折叠结构，该结构与在人抗体中出现的典型折叠结构基本相同。
5.根据权利要求4的抗原结合多肽，其中所述VL结构域中的高变环L1和高变环L2形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，该组合与已知在人类种系VL结构域中出现的典型折叠结构的组合相同。
6.根据权利要求5的抗原结合多肽，其中所述VL结构域中的高变环L1和高变环L2形成下列典型折叠组合中的一种：11-7、13-7(A，B，C)、14-7(A，B)、12-11、14-11、12-12、2-1、3-1、4-1和6-1。
7.用于制备与靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的方法，所述方法包括：
(a)确定如下核苷酸序列，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼常规抗体VH和/或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；以及
(b)表达与所述靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含VH和VL结构域，其中所述VH结构域或VL结构域的至少一个高变环或互补决定区(CDR)具有由步骤(a)所确定之核苷酸序列编码的氨基酸序列。
8.用于制备与靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)的重组抗原结合多肽的方法，所述抗原结合多肽包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)来自于大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼，所述方法包括以下步骤：
(a)分离如下大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼的核酸，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼常规抗体VH和/或VL结构域中的至少一个高变环或互补决定区(CDR)；
(b)制备包含编码如下高变环或互补决定区之核苷酸序列的多核苷酸，所述高变环或互补决定区具有与由步骤(a)分离之核酸编码的高变环或互补决定区一致的氨基酸序列，该多核苷酸编码包含与所述靶标抗原发生免疫反应(或特异性结合)的VH和VL结构域的抗原结合多肽；以及
(c)由步骤(b)的重组多核苷酸表达所述抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽不与步骤(a)的大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼常规抗体相同。
9.用于生产表达载体的方法，所述表达载体编码与靶标抗原发生免疫反应的嵌合抗原结合多肽，所述方法包括以下步骤：
a)主动免疫大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼，从而产生抗靶标抗原的大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼常规抗体；
b)从包含来自于所述经免疫大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼之淋巴组织(如循环中B细胞)的样品制备cDNA或基因组DNA；
c)扩增所述cDNA或基因组DNA的区域以获得经扩增的基因区段，每个基因区段包含编码大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或编码大羊驼、单峰驼或阿尔帕卡羊驼常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；
d)将c)中获得的基因区段克隆到表达载体中，从而使每个表达载体包含编码VH结构域的基因区段和编码VL结构域的基因区段，并且指导包含所述VH结构域和所述VL结构域之抗原结合多肽的表达，由此产生表达载体文库。
e)针对与所述靶标抗原的免疫反应性筛选由在步骤d)中获得之文库编码的抗原结合多肽，从而选择编码与所述靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的表达载体，
f)任选地，进行轻链改组步骤和/或重链改组步骤以选择这样的表达载体，其编码与所述靶标抗原发生免疫反应的效力经优化的抗原结合多肽；
g)任选地，对编码步骤e)或f)中选出之载体的VH结构域的基因区段和/或编码在步骤e)或f)中选出之载体的VL结构域的基因区段进行种系化和/或密码子优化；以及
h)将编码在步骤e)或f)中选出之载体的VH结构域的基因区段或在步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VH基因区段以及编码在步骤e)或f)中选出之载体的VL结构域的基因区段或在步骤g)中产生的经种系化和/或密码子优化的VL基因区段克隆到另一表达载体中，其与编码人抗体之一个或多个恒定结构域的核苷酸序列有效连接，从而产生编码嵌合抗原结合多肽的表达载体，所述嵌合抗原结合多肽包含与人抗体之一个或多个恒定结构域相融合的VH和VL结构域。
10.用于生产与靶标抗原发生免疫反应之抗原结合多肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)使用权利要求9的方法制备表达载体，其编码与靶标抗原发生免疫反应的抗原结合多肽；
b)在允许所编码的抗原结合多肽表达的条件下，将所述表达载体引入宿主细胞或无细胞表达系统；以及
c)回收所表达的抗原结合多肽。
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