CN1399646A - 重组融合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高细胞内一种蛋白产量的方法，特别是在植物细胞内的产量。本发明也涉及重组免疫融合复合物，特别是在植物体内的表达。本发明也揭示了包含与抗体的重链恒定区或其局部融合的gp120的特异性结构以及此结构在产生免疫应答中的应用。

Description

重组融合分子
本发明涉及一种提高细胞内蛋白产量的方法，特别是在植物细胞内的生成。此发明也涉及重组免疫融合复合物，特别是它们在植物体的表达。
重组蛋白已在多种转基因植物中获得表达。其中存在一个难以攻克的问题——表达水平低，给后序的纯化和加工带来困难。为此，采取了多种措施来克服这个问题，例如用不同的调节基因结构或构建人工基因，但取得的进展是有限的。目前报道的可溶性蛋白的表达水平为0.5％，而许多实例是少于0.01％的。抗体在植物体中的表达是一个显著的反例。我们的试验中，通常1％的表达水平是预料之中的，也可达到5～8％的表达水平。造成这种不同的原因还不清楚，我们认这与抗体分子在植物体中的固有的稳定性，以及植物细胞器处理这些蛋白的方式有关。
免疫复合物包含抗体和抗原，并产生经典的免疫应答。通常，当抗原与抗体混合时，它们通过抗体的结合位点和抗原表位允许分子结合，从而产生免疫复合物。这一过程的缺点是，免疫复合物要求在体外将抗原和抗体在最佳浓度下小心地混合。
本发明提供一种提高细胞内蛋白产量的方法，包括表达编码重组融合蛋白的重组DNA，该重组融合蛋白包含一种融合到抗体重链的恒定区或所述恒定区的部分的所需蛋白。
为方便起见，术语“重链恒定区”在以下的描述中根据上下文用来指免疫球蛋白重链恒定区的全长或者该区域的一部分(片段)。根据抗体的分类，恒定区包含许多的区域(结构域)。对于IgG抗体，恒定区包括三个区域(结构域)即CH1，CH2，和CH3；CH3结构域是C-末端结构域。因此，代替使用全长恒定区，也可以使用它的截短部分包括结合的CH1/CH2，CH2/CH3，或CH1/CH3结构域。
通过使用免疫球蛋白的高表达，我们发现它可能会提高重组融合蛋白的表达水平。
这种所需蛋白可以是任何蛋白包括报道分子，例如β-牛乳糖，荧光素酶和GFP，也可以是一种可选择的标记，例如抗生素。
优选的所需蛋白是一种食物蛋白例如一种储存蛋白，像菜豆蛋白或麦谷蛋白(wheat gluten)。
优选的所需蛋白是一种治疗蛋白。治疗上有效的蛋白包括受体例如囊性纤维化受体(CFTR)、酶包括药物前体活化酶，例如硝基还原酶、配体、调节应子、激素和结构蛋白。治疗蛋白也包括编码核蛋白、细胞质蛋白、线粒体蛋白、分泌蛋白、原生质膜结合蛋白和血清蛋白。所需蛋白也可以选自脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、激素、生长因子、酶、凝血因子如第十三因子和第九因子等、阿朴脂蛋白、受体、促红细胞生成素、药物、致癌基因和肿瘤抑制基因。这些化合物中的具体例子包括：胰岛素原，生长激素，雄激素受体、胰岛素样生长因子I，胰岛素样生长因子II，胰岛素样生长因子结合蛋白，表皮生长因子，血管生成因子(酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子和血管生成素)、间质蛋白(IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、层粘连蛋白)、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、致癌基因(ras，fos，myc，erb，src，sis，jun)、E6或E7转化序列、p53蛋白、Rb基因产物、细胞因子受体、IL-1、IL-6、IL-8、病毒衣壳蛋白和机体内其它有用的蛋白。此可被融合的所需蛋白，仅受限于编码被合并的蛋白或多肽的核酸序列的可获得性。本领域技术熟练人员很容易地认识到随着更多的蛋白和多肽被鉴别，它们可被整合到本发明的重组融合蛋白上。
特别优选的所需蛋白是一种抗原。这里使用的术语“抗原”指能在动物体内如哺乳动物，特别是在人体内产生免疫应答的任何蛋白。优选地，这里使用的术语“抗原”指在动物体内刺激一系列反应的蛋白，该反应由白细胞包括淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞介导。优选的抗原包括病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、寄生抗原、肿瘤抗原和来自病毒、细胞和寄生物的可用来引起免疫应答反应的蛋白。优先的抗原不能是一种毒素。毒素在这里定义为对细胞有直接的毒性影响并引起细胞死亡的蛋白。最优选的抗原是人免疫缺陷病毒gp120，无毒的C-破伤风毒素片段或牛呼吸道合胞病毒(BRSV)F-蛋白。
所需蛋白可以通过可包括肽剪切位点的中间连接肽直接或间接地连接到恒定区或其部分，这将允许所需蛋白为纯化目的从恒定区或其部分(如果需要)分离。所需蛋白对恒定区或其部分的附着可经重链或其部分的C末端实现。或者，抗原可被融合到抗体上，融合位点在恒定区内或其部分内。
本发明的方法适用在任何真核细胞中生产所需蛋白。优选地，该所需蛋白在能产生免疫球蛋白的真核细胞中生产。更优选地，该所需蛋白在哺乳动物细胞中生产，最优选的是在植物细胞中生产。
本发明的方法具有这样的效果：允许所需蛋白在细胞中的产量大于当所需蛋白不作为包含抗体重链恒定区的融合蛋白的一部分生成时的产量。通常，所需蛋白在转基因植物中低水平表达，而抗体分子常积累至较高水平。通过所需蛋白与抗体分子的一个组分的基因融合，抗体组分作为一种携带者及起稳定分子作用，并允许所需蛋白的更大产量和积累。
本发明也提供第一种重组融合蛋白，包含一种融合到抗体重链恒定区或其部分的抗原。除了该融合蛋白包含一种上面定义的抗原外，以上定义的重组融合蛋白与本发明的方法有关。
本发明也提供第二种重组融合蛋白，包含一种融合到抗体重链恒定区或其部分的所需蛋白，其中融合蛋白不包含功能性抗原结合区域。除了该融合蛋白不包含功能性抗原结合区域外，以上定义的重组融合蛋白与本发明的方法有关。
功能性抗原结合区域在这里定义为抗体上接触并结合抗原的区域。该区域包含本领域技术熟练人员所熟知的、容易被鉴别的抗体互补性决定区(CDRs)。优选的该区域为抗体的重链和/或轻链的可变区。本发明中的第二种重组融合蛋白可包含一种抗体，该抗体的一个或多个可变区被去除。或者，本发明的第二种重组融合蛋白可包含一种具有一个或多个非功能可变区的抗体。此可变区可通过去除CDRs而成为非功能性的。对本领域技术熟悉人员也熟知其它的产生带有非功能性抗原结合区的抗体的方法。
本发明也提供一种重组抗体分子，该分子含有一种融合到抗体分子的抗原，其中抗体分子对抗原具有亲和力。本发明的重组抗体分子通过抗体的抗原结合位点与本发明中的其它重组抗体分子相结合，从而形成免疫复合物。这样的免疫复合物类似于，但不同于经典的免疫复合物。与传统的免疫复合物体外制备需要在最佳浓度下小心地混合抗原和抗体相比较而言，由本发明中的重组抗体分子形成的免疫复合物的一个显著优点在于容易制备。我们的例子中，抗体与抗原分子的表达比例一般固定在1∶1，此条件最适于形成免疫复合物。
本发明中的重组抗体分子具有高的免疫原性，特别是当它形成免疫复合物时，并且它适于系统免疫和粘膜免疫而不需要免疫佐剂。免疫佐剂常被混合入疫苗组分以提高免疫应答。由于本发明中的重组抗体分子具有高的免疫原性，不需要免疫佐剂获得免疫作用是可能的。
使用本发明的重组抗体分子形成的免疫复合物充分地具有与内源生成的免疫复合物或传统生产的免疫复合物同样的增强免疫原性。
本发明的重组抗体分子能包含任何抗体分子，只要它对与其融合的抗原具有亲和力。此抗体分子可以是一个完整的单克隆抗体或者是它的一个抗原结合片段例如Fv、Fab或者F(ab’)2片段。优选的抗体分子包含一个抗体重链恒定区。
构建编码抗原-抗体融合蛋白的基因结构，对构成组分的种属没有限制。本发明尤对人类医药具有特别的利益，但其它灵长类动物和其它动物抗原/抗体结合物可按该产品的生物学应用来使用。例如，抗原和抗体重链及轻链可以是人的、啮齿动物的、兔的、牛的、绵羊的、公山羊的、家禽的、犬科动物的、骆驼的、猫科动物的或灵长类动物的。
为说明本发明的应用范围，用三种模式抗原来进行说明，即人免疫缺陷病毒gp120，无毒的C-破伤风毒素片段和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)F-蛋白，以及他们各自的特异性单克隆抗体。对每一种抗原而言，有无数种可能的结构，其中抗原融合到单抗隆抗体(Mab)全长重链的C末端或由1、2或3个恒定区域组成的截短重链区上。或者，抗原融合到恒定区，融合点在恒定区内。
本发明还提供一种表达重组融合蛋白的转基因植物，该重组融合蛋白包含融合到抗体重链恒定区的所需蛋白。
本发明还提供一种表达本发明的第一种、第二种重组蛋白或重组抗体分子的转基因植物。
转基因植物的生产方法是本领域技术熟练人员都非常熟悉的。
本发明的转基因植物可为每种抗原表达融合蛋白的许多分子结构，允许选择正确组成的融合蛋白分子结构，允许最高水平的表达以及允许提取和纯化融合蛋白。也可能通过对装配的分子结构、被一组抗体的识别和对一组抗体的亲合性的分析来表征植物衍生融合蛋白。
这一技术的优点在于可以研制一种新型的基因工程分子，该分子适于很多传染性疾病的预防接种。通过使用三种不同的抗原，我们能够确定这种方法对标准细菌免疫原、重要的人病毒被膜蛋白和可致严重粘膜感染的牛病毒跨膜融合蛋白的效力。由抗原和抗体分子融合所产生的重组抗体分子，具有介导刺激免疫应答的免疫复合物所需的所有成分，我们的方法提供了一种确保抗原/抗体复合的便利方法。本发明的重组抗体分子也可以在植物中构建更大的免疫复合物(见图1)用于免疫作用。并非这种抗体分子的所有部分都是必不可少的，例如位于IgG抗体的恒定区内的FcR结合和补体激活的位点。因此我们也包含了截短抗体分子的应用，该分子缺少Cγ3结构域(它不包括在抗原的识别内)或Cγ1结构域。
也可将本发明的第一重组融合蛋白或第二重组融合蛋白(其中所需蛋白是抗原)用以免疫作用。特别地，包含抗体分子和抗原的融合蛋白，可用来将抗原传递至吞噬细胞以及引起补体激活作用，该抗体分子不包括功能性抗原结合区。通过排除抗原识别的需要，由于抗原是与抗体恒定区结合的融合蛋白，从而可能帮助防止由于抗体掩蔽T-细胞抗原表位导致的抗原加工的调节现象。
利用植物生产本发明的重组融合蛋白是非常适合的，不仅因为免疫接种时可能的大量需要，而且因为那些包括全长抗体、或与轻链装配的复合物都不易从大多数其他的表达系统得到。
为构建编码抗原-抗体融合蛋白的遗传结构，编码抗原或抗原片段的DNA可通过PCR进行扩增。编码鼠科动物、人、或其它哺乳动物的针对这些抗原的特异性单克隆抗体的轻链和重链的基因也被克隆。利用这些DNA序列即可构建编码所需的重组融合蛋白的基因结构。例如，下列每个抗原的基因结构可被制备用以植物转化：
遗传结构，显示出包括在每一免疫复合物结构中的Ig区：A-重链。
I).结构#1可变区-Cγ1-Cγ2-Cγ3-连接肽-抗原
II).结构#2可变区-Cγ1-Cγ2-连接肽-抗原
III).结构#3 Cγ2-Cγ3-连接肽-抗原
IV).结构#4 Cγ2连接肽-抗原B-轻链
可变区-CL
这些结构以图表的形式列在图1，还显示了植物中产物的最终装配。
如图2所示的连接肽可能是(GGGGS)3。一个常规的6x组氨酸标记和一个蛋白酶剪切位点(如尿激酶，Xa因子或凝血酶)也可为纯化目的引入到抗原的C-末端。此外，一种不同的蛋白酶剪切位点(如尿激酶，Xa因子或凝血酶)也可被引入到连接肽和抗原之间。另外的或选择性的肽标记和蛋白酶剪切位点也可被合并。为证实的目的，基因结构被测序并为植物转化而被插入到植物表达载体中。
为产生表达12个结构(每种抗原有4个结构)的转基因植物，烟草烟叶(Nicotiana tabacum)是一种方便的使用土壤杆菌介导转化的植物宿主。对结构I和II，为生成重组融合蛋白，免疫球蛋白的轻链基因和重链基因结构可被导入如图1所示的不同植物系。在第一代转化体的再生后，将轻链和重链转化植物杂交授粉，并为生产最终产物而筛选第二代植物。对于结构III和IV，对轻链没有要求，最终产物可在第一代转化植物中得到。
为得到稳定的纯合转基因植物系，表达正确装配产物的转基因植物被用来产生纯合植物母株(stocks)。植物生长至成熟，自体授粉后，得到的种子通过与非转化植物回交来筛选，以确定那些是纯合子的。通过自体授粉可产生更多的母株并可作为种子贮存。
为描述植物产物的每一个分子式以及为进一步研究而提取和纯化物质，筛选主要的植物转化体以确定哪种产物已被最佳地表达和装配。这种研究可对植物粗提物用蛋白质印迹分析(Western blotanalysis)及酶联免疫吸附测定(ELISA)来进行，所用的一系列抗血清及单克隆抗体可以购买得到。所选择的重组产物的提取及纯化可通过下列方法实现：硫酸氨沉淀，接着是过滤和使用免疫球蛋白或特定的肽如亲和标记的亲和层析。进一步特征化以确定分子结构、一组抗体对半抗原的识别以及结合亲和性。
附图说明：
图1表示植物中的免疫复合物及可能的装配排列。
图2表示基本分子结构。
图3表示pEXG13主要的克隆位点。
图4表示转基因植物的RT-PCR分析。
图5表示ELISA俘获CH2-CH3-gP120的结果
图6表示ELISA俘获在植物中表达的重组gP120的结果。
图7表示还原和非还原条件下的10％SDS凝胶。
实施例
产生和获得包含gP120和抗体重链恒定区的重组融合分子HIV gp120结构的克隆和基因构建
HIV gp120抗原DNA是来自一株具传染性的HIVIIIB克隆化的分离菌，此类DNA能从医学研究委员会艾滋病试剂项目组(NIBSC，Blanche Lane，Sonth Mimms.Potters Bar，Herts EN6 3QG，UK)获得。克隆编码一种HIV gp120特定单克隆抗体的重链和轻链的基因(例如Gorny et al.，1991，Proceedings of the National Academy of sciences，USA.88：3238-3243)按Ma，J.K-C.，等描述的克隆(Ma，J.K-C.，T.Lehner，P.Stabila，C.I.Fux and A.Hiatt.1994.转基因烟草植物单克隆抗体IgG1和IgA重链区域的装配，Eur.J.Immunol.，24：131-138)。RNA是运用一个标准的抽提试剂盒(例如Promega SV总的RNA分离系统)从相关的杂交瘤细胞抽提，cDNA通过使用反转录酶反应制备。编码抗原或特定抗原的单克隆抗体的重轻链或这些抗体序列片段的DNA，是运用合成的寡核苷酸(如图2所示)通过PCR扩增。寡核苷酸引物1和2对应于抗体重链的5’和3’末端，寡核苷酸引物3和4对应于抗原的5’和3’末端。抗原的5’引物也包括编码交联肽和蛋白酶切割位点的序列。这些引物包括相应的限制性酶切位点(例如5’BamHI and3’XmaI为gp120；5’XhoI and 3’BamHI为免疫球蛋白重链)和编码交联肽(GGGSGGGSGGGS)的特别序列或蛋白酶切位点(例如Xa因子IEGR)。如果需要一条轻链，能按Drake等(在植物中的抗体生产。P.Shepherd and Dean(eds)，Monoclonal Antibodies-A practicalapproach，Oxford University Press 2000)所描述的操作方法克隆基因。
DNA构建工程通过标准化技术在标准的克隆载体pBluescript(Stratagene)和pET32(New England Biolabs)中进行，标准化技术正如1982年Maniatis，Fritsch和Sambrook所写的分子克隆实验手册中所述。实质上，编码抗原的DNA首先使用多克隆位点克隆进入载体，随后编码抗体或抗体片段的重链和可选择的轻链的DNA进入载体。在一些情况下，顺序相反，即抗体基因先被克隆入载体。正转化体由相应的限制性酶消化的正确大小的DNA片段的释放或运用相应的5’和3’寡核苷酸引物的PCR来鉴别。四个嵌合免疫球蛋白重链结构是构建了，其中抗原以与免疫球蛋白重链的可变区相融合被表达(如图1所示)。
克隆与HIVgp120片段融合的Ig重链CH2-CH3区域(图1中结构III)的具体例子如图2所示，二个PCR产物使用寡核苷酸1-2对和3-4对扩增。HIVgp120DNA序列编码一个截短的多肽，从N端开始，直到并包括KEYAL序列(aa147)，其后立即为一个终止密码子。这些基因被克隆进入pET32载体——该载体中已经具有构建的克隆位点的重要特性(见图3)。gp120基因片段同载体BamHI-XamI位点结合，然后Ig重链基因被克隆在NcoI-BamHI位点的上游。整个构建通过PCR再次扩增，包括下游肠激酶切割位点和His标记，5’XhoI和3’EcoRI末端限制性位点。这一片段被克隆进pBluescript以验证序列。
在适用于大肠杆菌中初筛的质粒(pMON530)内，按上面叙述的克隆方法，切割完整的基因结构，然后分别克隆进植物表达序列盒，(Drake et al.，2000)。这种类型的质粒可广泛地获得，譬如pGreen系统(www.pgreen.ac.uk)。此实验中植物表达序列盒包含来自烟草蚀纹病毒的5’未翻译区(稳定植物细胞中的RNA)和鼠IgG上游前沿序列(图3)，此序列引导重组蛋白分泌出植物细胞。重组载体被用来转化E.coli(DH5-α)。被转化克隆的筛选通过Southern印迹法，使用来自原始PCR产物的辐射标记了的DNA探针。质粒DNA从正转化体(Promega Qiaprep kit)纯化出来，并运用冷冻/融解程序用于根瘤土壤杆菌的转化(strain LBA 4404-Gibco/BRL，UK)。冷冻/融解程序如下：
1、接种土壤杆菌，加入50ml含壮观霉素(50μg/ml(Sigma)的LB。
2、暗室28℃振荡培养至OD 600为1.0。
3、无菌试管3000g离心土壤杆菌15分钟。
4、弃上清液，并放试管于冰浴中，用1ml冰冷的10mM CaCl2重新悬浮细菌沉淀。
5、将100ml细菌重新悬浮液的等分部分装入无菌微离心管中，然后放入液氮中。
6、使用冷冻的的土壤杆菌直接作DNA转化或贮存于-80℃。
7、用移液管吸10ml由DNA小量制备来的双元质粒到100ml处于感受态的冷冻土壤杆菌的表面上。
8、在37℃水浴中温育DNA-细菌混合物5分钟。
9、加1ml LB到细菌中，并于28℃振荡4小时。
10、12,000xg离心细菌2分钟，然后用100ml LB重新悬浮该细菌沉淀。
11、涂布50ml细菌悬浮液在LB培养基上(用15g/L琼脂做成半固体)，LB培养基含有壮观霉素，为选择携带双元且去除(disarmed)Ti辅助质粒的土壤杆菌用。密封平板，28℃培养2-3天。
12、在各别的皮氏培养皿中的选择性LB培养基上，重新划线目的菌落，28℃培养2天。
植物转化和再生：全部基因结构输入烟草烟叶，var.xanthii。带有根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的烟草转化是通过标准化程序进行。从表面消毒过的烟草叶子切下叶盘，同含有cDNA插入片段的重组根瘤土壤杆菌的培养物共同培养。被感染的叶盘转移到含有诱导嫩芽再生的含有培养基的培养板上，并补以卡那霉素和卡比西林(Sigma，UK)。嫩芽培养阶段结束后，在其上切口，移植到添加过卡那霉素的诱导生根的培养基中。在根长出后，已生根的幼芽移植入土壤。详细的操作方法如下：
1、从-80℃取出土壤杆菌(含双元载体)，在一9cm皮氏培养皿中的半固体LB培养基(含相应抗体)上划线培养。于28℃培养2天。
2、将取自于皮氏培养皿的土壤杆菌接种入10ml LB中。
3、于28℃振荡培养至OD 600为1.0。
4、取出4ml土壤杆菌悬浮液，并加入16ml无菌蒸馏水于无菌的9厘米的皮氏培养皿中。
5、从表面消毒过的叶子上切取0.5～1.0cm叶盘，浸入稀释的土壤杆菌悬浮液5分种。
6、用无菌滤纸稍稍吸干叶盘。
7、放置叶盘于嫩芽再生培养基上，10～15片叶盘/20ml培养基/9cm皮氏培养皿。于25℃16小时光照周期下培养2天。
8、向嫩芽再生培养基转移叶盘，该培养基含有500mg/l卡比西林和相应浓度的转化植物细胞的选择性试剂，16小时光照周期下于25℃培养21天。
9、向在无菌的175ml玻璃罐中的嫩芽再生培养基转移叶盘，该培养基含有500mg/l头孢氨噻和200mg/l卡那霉素，16小时光照周期下于25℃培养。
10、当嫩芽叶盘达到一适当长度(大约0.5cm)，嫩芽培养基被换掉，移入生根的培养基(3-4根嫩芽/40ml培养基/175ml玻璃罐)，于25℃，16小时光照周期下培养14天。
11、缺少根的嫩芽在培养时间被修整，被再次放入新鲜生根培养基培养21天或直至根出现。
12、生根的嫩芽被移植至植物花盆中，施肥，浇水，补充营养成份。植物保持在种子盘内，施肥后用盖子盖上24小时，减少初始水份丧失。
运用可获得的抗血清和单克隆抗体，原始叶提取物经过Westernblot和ELISA分析免疫球蛋白链及其抗原的表达，筛选出再生的植物。转基因植物是自体授粉建立了纯合植物系，杂交授粉则产生了产抗体的植物。RNA抽提
总的RNA从新生不到一月的植物中抽提出来，使用的是Promega植物RNA抽提试剂盒(Rneasy Plant mini kit)，或者将叶子组织于液氮中冷冻并迅速研磨成细粉末状。该物与2体积的冰冷的盐酸胍缓冲液(8M盐酸胍，20mM MES，20mM EDTA，50mM β-巯基乙醇，PH7)混合。振荡后，它被加入到1体积苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，的溶液中，充份混合后，在10,000rpm转速下离心45分钟。收集上层(水相)液体，加入0.7体积预先冷却的乙醇和0.2体积1M醋酸，在-200℃下培养16小时。离心后，沉淀物以3M醋酸钠，PH5.2，洗三次，70％乙醇洗一次。将这沉淀溶于无RNA酶的无菌水中(Sigma，UK)，该水含有无RNA酶的DNA酶(Promega，UK)，置于37℃培养1小时，然后在70℃下培养5分钟。
RNA的浓度和纯度由Gene Quant II RNA/DNA Calculator(Pharmacia Bio Tech，UK)来评估。RNA于-20℃储存于无RNA酶的无菌水中。
RT-PCR可使用适当的寡核苷酸引物来进行，以确定正确的RNA转录物是由假定已转化的植物制得。来自植物的重组免疫复合物的鉴定及选择
为确定植物中每一段基因的表达，叶的萃取物通过ELISA和Western blot分析来检查。样品以含亮抑蛋白酶肽(10mg/ml)的150mMNaCl和20mM tris，PH8(TBS)液(Calbiochem)萃取。ELISA俘获分析是通过将植物萃取物置于事先覆盖一个特殊对HIV gp120的单克隆抗体(ADP 401 from the MRC Aids Directed Program)的微滴定板中培养来进行，然后用含5％脱脂奶粉的TBS溶液阻断。在4℃下培养过夜后，该板用含0.05％吐温20的TBS洗，然后或以辣根过氧化物酶标记的绵羊抗鼠(Sheep anti-Mouse)IgG抗血清(The Binding Site，UK)进行培养，或以一组gp120特异性单克隆抗体中的一种(MRC AidsDirected Program)进行培养，之后再用相应的辣根过氧化物酶抗血清(The Binding Site，UK)进行培养。这个测定是用TMB底物(Sigma，UK)展开，吸收峰在450nm处可读出。
为蛋白质印迹分析，植物萃取物在非还原或还原条件下(通过加入0.1％β巯基乙醇)在75mM tris-HCl(PH 6.8)和2％SDS中煮沸。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以10％丙烯酰胺或4-20％梯度凝胶来进行。将凝胶印迹到硝酸纤维素薄膜上，并在含0.05％吐温20和1％脱脂奶粉的TBS溶液中阻断。然后该印迹在适当的抗血清中于37℃培养2小时。洗涤后，外加适当的第二层(second-layer)碱性的磷酸酶接合的抗血清于37℃作用2小时。抗体结合通过用氮蓝四唑(300mg/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(150mg/ml)(Promega，UK)培养来检测。
糖基化通过蛋白质印迹检测，检测对凝集素的结合譬如伴刀豆球蛋白A，或通过使用聚糖特殊的抗血清(由Dr.Loic Faye友情提供，Rouen大学)来检测。对可得到的单克隆抗体的抗原结合亲和性的功能性研究可以使用表面质粒基因组共振技术来进行。重组蛋白纯化
进行纯化所使用的方法，与我们先前对来自于转基因植物的萃取IgG的测定方法是相同的。原植物的萃取物用硫酸铵得到以下的初始沉淀物，重组抗体通过使用一YM30分子量截断过滤器(Amicon.UK)的搅拌的细胞过滤被浓缩。纯化是通过使用琼脂糖偶联到抗-鼠或人IgG抗体(Sigma，UK)作为配基的亲和层析进行。以0.1M甘氨酸-HClPH2.5溶液洗脱。
重组重链也可以设计为允许进一步的亲和纯化步骤，该步骤是使用带有固定金属螫合剂的6xHis融合肽标记的亲和层析，它随后能够通过凝血酶来剪切。
这些融合蛋白的表达不受植物的限制，并可以在其它真核细胞中表达，特殊的细胞如哺乳动物细胞可以产生免疫球蛋白。
免疫球蛋白链序列可以被其它类型的免疫球蛋白序列所替换。
除了抗原表位标记和蛋白酶剪切位点以外，其它序列也可以被合并到结构内。例如，它们能为其它功能区域编码，如标记，酶活(enzymeactivity)，或与其它活性分子化学偶联的位点。
除了HIVgp120，两个进一步的例子被研制了。相似的结构通过使用破伤风毒素非毒性C-片断(由Dr.Neil Feil Fairweather，伦敦，Imperial Colledge友情赠送)和破伤风毒素特异性鼠单克隆抗体(由Dr.Claus koch，哥本哈根，State Serum Institute友情赠送)已得到。此外，我们已制备了牛呼吸道合胞病毒的F-蛋白和特异性鼠单克隆抗体基因(由Dr.K.G.Madsen Danish Veterinary Institute for VirusResearch友情提供)的相应的结构。
在本发明的优点中，以下是值得注意点：
(i)抗体与抗原的共表达，增加了抗原表达水平。
(ii)抗原和整个抗体是基因连接形成免疫复合物的一种类型。在其它结构中，抗原和抗体片断(可能包括或可能不包括抗原结合位点)连接形成融合蛋白。
(iii)重组抗体分子和抗原是自动以1∶1比例进行表达，在包含整个IgG结构情况下，较大的复合物可能会自发形成。
(iv)抗原-抗体融合分子容易生产。
(V)使用植物来生产这些分子可以显著降低成本，特别是产品是大规模生产的话。
(Vi)对于口服疫苗，食用转基因植物的消费提供了一个可选择的给予免疫复合物疫苗的安全模式。
(vii)可能不需要增加辅助，由于基因工程分子已是高度免疫原性的。CH2和CH3免疫球蛋白结构域包括补体激活和吞噬细胞调理作用的位点。结果
结果已从两个描述的结构-CH2-gp120和CH2-CH3-gp120中获得。RT-PCR确认了我们所期望大小的特异性mRNA已通过转基因植物获得(图4)。
以ELISA俘获分析证明两个结构都被植物表达。我们充分研究了CH2-CH3-gp120并以ELISA证明它含有IgG2a抗原表位，同样含有gp120抗原表位，如图5和图6所描述的那样。而且，在表达CH2-CH3-gp120结构的植物中，重组gp120的表达大于那些仅仅是gp120的表达，或带有C-末端HDEL标记的gp120的表达，或CH2-gp120的表达。初步结果表明了gp120的表达水平约为0.8％。
植物衍生物的纯化已实行，蛋白质印迹分析证明蛋白带的存在，它通过gp120和鼠IgG2a的特异性抗体(图7)被确认。在还原条件下，最明显的带的分子量大小符合所期望的约为50Kd，在非还原条件下，检测到较高分子量接近100Kd。这符合同源二聚体的结构，通过重链的CH2和CH3结构域的结合。
以单个恒河猴的免疫原性的初步调查研究已实行。通过2次对纯化植物衍生的CH2-CH3-gp120(150μg每剂量)用SPDP双功能试剂与佐剂分枝杆菌热振荡蛋白70以共价键相连的处理，检测了特异性抗体和细胞免疫应答。三次免疫接种后，不仅对植物CH2-CH3-gp120结构，而且对在中国仓鼠卵巢细胞内表达的纯化重组gp120，检测了非常重要的T细胞增殖应答。这表明植物重组gp120以免疫原性的构象被正确表达及折叠，进一步，四只恒河猴通过阴道内的粘膜途径免疫，四只通过靶的骼骨淋巴结节途径免疫(Lehner et al.，Nature Medicine，2：767-775，1996)。两次免疫接种后，γ-干扰素和白细胞介素4的诱导被检测到，表明了TH1和TH2的应答都被诱出。进一步的免疫研究正在恒河猴和老鼠上进行。

Claims (69)

1.一种提高细胞中蛋白产量的方法，包括表达编码重组融合蛋白的重组DNA，该重组融合蛋白包括一种融合到抗体重链恒定区或所述恒定区部分的所需的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所需蛋白融合到抗体重链的全长恒定区。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所需蛋白融合到抗体重链的截短恒定区。
4.根据权利要求3所述的方法，其中截短区由任何抗体重链的一个或多个恒定区组成。
5.根据权利要求4所述的方法，其中截短区来自于IgG类抗体并由一个或多个CH1、CH2和CH3结构域组成。
6.根据权利要求1～5中任何一项所述的方法，其中所需蛋白融合到抗体重链恒定区或所述恒定区的部分的C-末端。
7.根据权利要求1～5中任何一项所述的方法，其中所需蛋白融合到抗体重链恒定区或所述恒定区的部分，融合点位于恒定区内或所述恒定区部分内。
8.根据权利要求1～7中任何一项所述的方法，其中所需蛋白直接融合到所述恒定区或其部分。
9.根据权利要求1～7中任何一项所述的方法，其中所需蛋白通过一个连接肽间接地融合到所述恒定区或其部分。
10.根据上述任何一项权利要求所述的方法，其中重链属于针对抗原的特异性抗体。
11.根据上述任何一项权利要求所述的方法，其中融合蛋白包含一个剪切位点，用于所需的蛋白从稳定区或其部分可能的分离。
12.根据上述任何一项权利要求所述的方法，其中融合蛋白包含肽标记。
13.根据上述任何一项权利要求所述的方法，其中所需蛋白是一种食物蛋白或治疗蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所需蛋白一种抗原。
15.根据权利要求14所述的方法，其中抗原是人免疫缺陷病毒gp120。
16.根据上述任何一项权利要求所述的方法，其中重组DNA在包括植物、真菌、昆虫或哺乳动物的真核生物宿主细胞内表达。
17.根据权利要求16所述的方法，其中重组DNA在能表达免疫球蛋白的真核生物宿主细胞内表达。
18.根据权利要求1～15中任何一项所述的方法，其中重组DNA在包括双子叶、单子叶、豆科或茄科植物的植物细胞内表达。
19.根据上述任何一顶权利要求所述的方法，其中抗体重链是人的、啮齿动物的、兔的、牛的、绵羊的、山羊的、家禽的、犬科动物的、骆驼的、猫科动物的或灵长类动物的。
20.根据上述任何一项权利要求的方法，其中抗体重链来自免疫球蛋白超基因家族的任一成员。
21.一种重组融合蛋白，包含一种融合到抗体重链恒定区或所述恒定区的部分的抗原。
22.根据权利要求21所述的重组融合蛋白，其中抗原是人免疫缺陷病毒gp120。
23.一种融合蛋白，包含一种融合到抗体重链恒定区或所述恒定区部分的所需蛋白，其中融合蛋白不包含功能性抗原结合区域。
24.根据权利要求21～23中任何一项所述的融合蛋白，其中抗原融合到抗体重链的全长稳定区。
25.根据权利要求21～23中任何一项所述的融合蛋白，其中抗原融合到抗体重链的截短恒定区。
26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中截短区来自于IgG类抗体并由一个或多个CH1、CH2和CH3结构域组成。
27.根据权利要求21～26中任何一项所述的融合蛋白，其中抗原或所需蛋白融合到恒定区或其部分的C-末端。
28.根据权利要求21～26中任何一项所述的融合蛋白，其中抗原或所需蛋白融合到抗体重链恒定区或所述恒定区的部分，融合点位于恒定区内或所述恒定区的部分内。
29.根据权利要求21～28中任何一项所述的融合蛋白，其中抗原或所需蛋白直接融合到所述恒定区或其部分。
30.根据权利要求21～28中任何一项所述的重组融合蛋白，其中抗原或所需蛋白通过一个连接肽间接融合到所述恒定区或其部分。
31.根据权利要求21或22所述的融合蛋白，其中，重链属于针对抗原的特异性抗体。
32.根据权利要求21～31中任何一项所述的融合蛋白，它包含一个剪切位点，用于抗原或所需蛋白与恒定区或其部分可能的分离。
33.根据权利要求21～32中任何一项所述的融合蛋白，它包含肽标记。
34.根据权利要求21～33中任何一项所述的融合蛋白，其中抗体重链和轻链来源于人、啮齿动物、兔、牛、绵羊、山羊、家禽、犬科动物、骆驼、猫科动物或灵长类动物。
35.根据权利要求21～34中任何一项所述的融合蛋白，其中抗体序列来自免疫球蛋白超基因家族的任一成员。
36.根据权利要求21～35中任何一项所述的融合蛋白，其中所需的蛋白序列是HIVgp120被膜蛋白的全部或部分，该被膜蛋白与一种IgG类抗体的结合重链CH2-CH3结构域连接。
37.一种抗原/抗体复合物，包含两种如权利要求21～36中任何一项所述的相应顺序的融合蛋白。
38.根据权利要求37所述的抗原/抗体复合物，它也包含抗体的轻链，该轻链与融合蛋白的重链或其部分一起构成抗体或其部分特有的双元对称结构。
39.根据权利要求21～36中任何一项所述的融合蛋白或根据权利要求37或38所述的抗原/抗体复合物，它们产生于植物内或植物细胞内。
40.一种疫苗，包括根据权利要求21～36中任何一项所述的重组融合蛋白或根据权利要求37或38中所述的抗原/抗体复合物。
41.一种形成根据权利要求21～36中任何一项所述的融合蛋白或根据权利要求37或38所述的抗原/抗体复合物的方法，包含表达重组DNA，该重组DNA编码包括植物、真菌、哺乳动物或杆状病毒在内的真核生物宿主细胞内的组分。
42.一种形成根据权利要求21～36中任何一项所述的融合蛋白或根据权利要求37或38所述的抗原/抗体复合物的方法，包括表达重组DNA，该重组DNA编码能表达免疫球蛋白的真核生物细胞内的组分。
43.一种形成根据权利要求21～36中任何一项所述的融合蛋白或根据权利要求37或38所述的抗原/抗体复合物的方法，包括表达重组DNA，该重组DNA编码双子叶、单子叶、豆科或茄科植物的植物细胞内的组分。
44.一种形成根据权利要求38所述的融合蛋白的方法，包括在不同植物内表达抗体重链和轻链或其部分，分离重链和轻链并允许链相连接而形成抗原/抗体复合物。
45.一种形成根据权利要求38所述的抗原/抗体复合物的方法，包括在表达重链和轻链的植物内表达抗体的重链和轻链或部分。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，表达重链和轻链的植物是由产生重链的植物和产生轻链的植物杂交形成的。
47.根据权利要求45所述的方法，其中宿主是一种植物，并且抗体重链和轻链是在同一植物中共表达。
48.一种具有融合到抗体分子的抗原的重组抗体分子，其中抗体分子对该抗原有亲和性。
49.根据权利要求48所述的重组抗体分子，其中抗原是人免疫缺陷病毒gp120。
50.根据权利要求48或49所述的重组抗体分子，其中抗体分子是完全单克隆抗体或其抗原结合片段。
51.根据权利要求48～50中任何一项所述的重组抗体分子，其中抗体分子包括抗体重链的一个全长恒定区，并且抗原融合到全长恒定区。
52.根据权利要求48～50中任何一项所述的重组抗体分子，其中抗体分子包括抗体重链的一个截短恒定区，并且抗原融合到截短恒定区。
53.根据权利要求52所述的重组抗体分子，其中截短区来自于IgG类抗体并由一个或多个CH1、CH2和CH3结构域组成。
54.根据权利要求51～53中任何一项所述的重组抗体分子，其中抗原融合到恒定区或其部分的C-末端。
55.根据权利要求51～53中任何一项所述的重组抗体分子，其中抗原融合到抗体重链恒定区或所述恒定区的部分，融合点位于恒定区内或所述恒定区的部分。
56.根据权利要求48～55中任何一项所述的重组抗体分子，其中，抗原直接融合到所述抗体分子。
57.根据权利要求48～55中任何一项所述的重组抗体分子，其中抗原通过一个连接肽间接融合到所述抗体分子。
58.根据权利要求48～57中任何一项所述的重组抗体分子，其中包含一个剪切位点，用于抗原或所需的蛋白抗体分子可能的分离。
59.根据权利要求48～58中任何一项所述的重组抗体分子，其中抗体分子包含肽标记。
60.根据权利要求48～59中任何一项所述的重组抗体分子，其中抗体重链和轻链是人的、啮齿动物的、兔的、牛的、绵羊的、山羊的、家禽的、犬科动物的、骆驼的、猫科动物的或灵长类动物的。
61.根据权利要求48～60中任何一项所述的抗体分子，其中抗体序列来自免疫球蛋白超基因家族的任一成员。
62.根据权利要求48～61中任何一项所述的重组抗体分子，它在植物或植物细胞内产生。
63.一种免疫复合物，包括权利要求48～62中任何一项所述的重组抗体分子的复合物。
64.一种疫苗，包括权利要求48～62中任何一项所述的重组抗体分子或权利要求63所述的免疫复合物。
65.一种形成权利要求48至62中任何一项所述的重组抗体分子的方法，包括表达重组DNA，该重组DNA编码包括细菌和古细菌在内的原核生物宿主细胞内的组分。
66.一种形成权利要求48～62中任何一项所述的重组抗体分子的方法，包括表达重组DNA，该重组DNA编码包括植物、真菌、哺乳动物或杆状病毒的真核生物宿主细胞内的组分。
67.一种形成根据权利要求48～62中任何一项所述的重组抗体分子的方法，包括表达重组DNA，该重组DNA编码双子叶、单子叶、豆科或茄科植物的植物细胞内的组分。
68.一种表达重组融合蛋白的转基因植物，包括一种融合到抗体重链恒定区的所需蛋白。
69.一种转基因植物，它表达根据权利要求21～36中任何一项所述的重组融合蛋白或根据权利要求48～62中任何一项所述的重组抗体分子。
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