JP2003512860A - 組換え融合分子 - Google Patents

組換え融合分子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞におけるタンパク質の産生、特に植物細胞における産生を増加させる方法に関する。本発明はまた、組換え免疫融合複合体、特に植物におけるそれらの発現に関する。抗体の重鎖定常部またはそれらの一部に融合するｇｐ１２０を含む具体的な構築物、ならびに免疫応答を発生する際におけるかかる構築物の使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、細胞におけるタンパク質の産生、特に植物細胞における産生を増加
させる方法に関する。本発明はまた、組換え免疫融合複合体、特に植物における
それらの発現に関する。
【０００２】 組換えタンパク質は、多くのグループによりトランスジェニック植物において
発現されてきた。不変的な問題は低レベルの発現であり、それは精製およびプロ
セシングを複雑にする。これを克服するために、様々なアプローチ、例えば、種
々の調節遺伝子構築物を用いること、または合成遺伝子を構築することがなされ
てきたが、成功例は限られたものだった。したがって、従来報告される発現レベ
ルは、全可溶性タンパク質で最大０．５％であり、多くの例が０．０１％未満で
ある。１つの注目すべき例外は、植物における抗体発現であった。本発明での本
発明者等の実験で、１％のレベルが通常期待され、５〜８％を達成する場合もあ
る。これらの違いの理由は明確ではないが、本発明者等は、それが、植物におけ
る抗体分子固有の安定性、ならびにこれらのタンパク質が植物細胞機構により取
り扱われる様式に関連していると考える。
【０００３】 免疫複合体は、抗体および抗原を含み、古典的な免疫応答を引き起こす。免疫
複合体は、抗原を抗体と混合し、分子を抗体の結合部位および抗原の特異的エピ
トープを介して結合させることにより、従来作製されてきた。このプロセスの欠
点は、インビトロ（in vitro）での免疫複合体は、最適濃度で抗原を抗体と慎重
に混合する必要があることである。
【０００４】 本発明は、抗体の重鎖の定常部または該定常部の一部に融合する所望のタンパ
ク質を含む組換え融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡを発現することを含
む、細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法を提供する。
【０００５】 便宜的に「重鎖定常部」という用語は、以下の説明全体にわたって、文脈が許
す限り、完全長免疫グロブリン重鎖定常部またはこの領域の一部（断片）を指す
のに用いられるであろう。定常部は、抗体のクラスに依存した多数の領域（ドメ
イン）を含む。ＩｇＧ抗体に関して、定常部は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と
して知られる３つの領域（ドメイン）を含み、ＣＨ３ドメインは、Ｃ末端ドメイ
ンである。したがって、完全長定常部を用いる代わりに、結合されたＣＨ１／Ｃ
Ｈ２、ＣＨ２／ＣＨ３またはＣＨ１／ＣＨ３ドメインを含むこの短小化(truncat
ed)定常部を用いてもよい。
【０００６】 高発現の免疫グロブリンを用いることにより、本発明者等は、組換え融合タン
パク質の発現レベルをつり上げることができることを見出した。
【０００７】 所望のタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびＧＦＰの
ようなレポーター分子（reporter molecule）を含むいかなるタンパク質であり
得る。所望のタンパク質はまた、抗生物質のような選択可能なマーカーであって
もよい。
【０００８】 好ましくは、所望のタンパク質は、貯蔵タンパク質のような食品タンパク質、
すなわちファゼオリン（phaseolin）またはコムギグルテンである。
【０００９】 所望のタンパク質が治療用タンパク質であることもまた好ましい。治療学的に
有用なタンパク質としては、レセプター（例えば、嚢胞性線維症レセプター（Ｃ
ＦＴＲ））、プロドラッグ活性化酵素を含む酵素（例えば、ニトロレダクターゼ
（nitroreductase））、リガンド、調節因子、ホルモン、および構造タンパク質
が挙げられる。治療用タンパク質はまた、核内タンパク質、細胞質タンパク質、
ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜関連タンパク質および血
清タンパク質をコードする配列を含む。所望のタンパク質はまた、リポタンパク
質、糖タンパク質およびリンタンパク質、ホルモン、成長因子、酵素、第ＸＩＩ
Ｉ因子およびＩＸ因子等のような凝固因子、アポリポタンパク質、レセプター、
エリスロポイエチン、薬剤、がん遺伝子および腫瘍抑制因子から選択されてもよ
い。これらの化合物の具体例としては、プロインスリン、成長ホルモン、アンド
ロゲンレセプター、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、イン
スリン様成長因子結合タンパク質、上皮成長因子、血管新生因子（酸性線維芽細
胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子およびアンギオゲニ
ン）、マトリックスタンパク質（ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ラミ
ニン）、フェニルアラニンヒロドキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、がん
遺伝子（ｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｓｉｓ、ｊｕｎ）、Ｅ６ま
たはＥ７トランスフォーミング配列（transforming sequence）、ｐ５３タンパ
ク質、Ｒｂ遺伝子産物、サイトカインレセプター、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−
８、ウイルスキャプシドタンパク質、体内にある有意義な他のタンパク質が挙げ
られる。融合し得る所望のタンパク質は、組み込まれるべきタンパク質またはポ
リペプチドをコードする核酸配列の利用可能性によってのみ限定される。より多
くのタンパク質およびポリペプチドが確認されるようになると、それらは本発明
の組換え融合タンパク質に組み入れられ得ることを、当業者は容易に認識するで
あろう。
【００１０】 所望のタンパク質が抗原であることが特に好ましい。本明細書中で用いる「抗
原」という用語は、哺乳動物のような動物、好ましくはヒトにおいて免疫応答を
引き起こすいかなるタンパク質をも指す。好ましくは、本明細書中で用いる「抗
原」という用語は、リンパ球、好中球および単球を含む白血球細胞によって媒介
される動物における一連の反応を刺激するタンパク質を指す。好ましい抗原とし
ては、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原、腫瘍抗原、および
免疫応答を誘発するのに用いられ得る、ウイルス、細菌および寄生虫生物由来の
タンパク質が挙げられる。抗原は毒素でないこともまた好ましい。毒素は、本明
細書中では細胞に直接毒性効果を及ぼし、細胞死を引き起こすタンパク質と定義
する。抗原は、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、無毒性破傷風毒素断片または
ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）Ｆタンパク質であることが最も好ましい。
【００１１】 所望のタンパク質は、直接的に、またはペプチド切断部位を含み得る中間ペプ
チドリンカーを通じて間接的に、定常部またはその一部に連結されてもよい。こ
のことにより、（必要な場合）精製目的で、定常部またはその一部から所望のタ
ンパク質を分離することが可能となるであろう。定常部またはその一部への所望
のタンパク質の付着は、重鎖またはその一部のＣ末端を介して行われてもよい。
あるいは、抗原は、定常部内またはその一部内にある部位で、抗体に融合しても
よい。
【００１２】 本発明の方法は、いかなる真核細胞における所望のタンパク質の産生にも適用
可能である。好ましくは、所望のタンパク質は、免疫グロブリンを産生すること
が可能な真核細胞において産生される。より好ましくは、所望のタンパク質は、
哺乳動物細胞において、最も好ましくは植物細胞において産生される。
【００１３】 本発明の方法は、所望のタンパク質が抗体の重鎖の定常部を含む融合タンパク
質の一部として産生されない場合よりも、より高レベルで細胞において所望のタ
ンパク質を産生することができるという有益性を有する。所望のタンパク質は、
一般にトランスジェニック植物にて低レベルで発現するが、抗体分子は通常、か
なり高レベルで蓄積される。抗体分子の成分と所望のタンパク質を遺伝的に融合
することにより、抗体成分は、キャリアおよび安定化分子として作用し、所望の
タンパク質のかなり高レベルの産生および蓄積が可能となる。
【００１４】 本発明はまた、抗体の重鎖の定常部または該定常部の一部に融合する抗原を含
む第１の組換え融合タンパク質を提供する。融合タンパク質が、上記に定義した
抗原を含む以外は、組換え融合タンパク質は、本発明の方法に関連して上記に定
義する通りである。
【００１５】 本発明はまた、抗体の重鎖の定常部または該定常部の一部に融合する所望のタ
ンパク質を含む第２の融合タンパク質を提供し、ここで融合タンパク質は、機能
性抗原結合ドメインを含まない。融合タンパク質は、機能性抗原結合ドメインを
含まない以外は、組換え融合タンパク質は、本発明の方法に関連して上記に定義
する通りである。
【００１６】 機能性抗原結合ドメインは、本明細書中では、抗原と接触して結合する抗体ド
メインと定義する。このドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
それは当業者に公知であり、容易に同定され得る。ドメインは、好ましくは、抗
体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインである。本発明の第２の組換え融合
タンパク質は、その可変ドメインの１つまたはそれ以上が除去された抗体を含み
得る。あるいは、本発明の第２の組換え融合タンパク質は、１つまたはそれ以上
の非機能性可変ドメインを有する抗体を含み得る。可変ドメインは、ＣＤＲを欠
失することにより機能しないようにすることができる。非機能性抗原結合ドメイ
ンを有する抗体を産生する他の方法は、当業者に公知である。
【００１７】 本発明はまた、抗体分子に融合する抗原を有する組換え抗体分子を提供し、こ
こで該抗体分子は、抗原に対する親和性を有する。本発明の組換え抗体分子は、
抗体の抗原結合部位を通じて本発明の他の組換え抗体分子と結合することにより
、免疫複合体を形成することができる。かかる免疫複合体は、古典的な免疫複合
体に似ているが、同一ではない。本発明の組換え抗体分子から形成される免疫複
合体の有意な利点は、最適濃度で抗原を抗体と慎重に混合する必要があるインビ
トロでの免疫複合体の従来の調製に比べて調製しやすいことである。本発明者等
の場合では、抗体：抗原分子の発現比が一般に１：１で固定されることで、免疫
複合体を形成する可能性を最も効果的にする。
【００１８】 本発明の組換え抗体分子は、特にそれが免疫複合体を形成する場合に、高度に
免疫原性があり、アジュバンドは必要なく、全身免疫感作および粘膜免疫感作の
両方に適切である。アジュバンドは一般に、ワクチン組成物に組み込まれて、免
疫応答を改良する。本発明の組換え抗体分子は高度に免疫原性があるので、アジ
ュバンドの必要なく免疫感作を得ることが可能である。
【００１９】 本発明の組換え抗体分子を用いて形成される免疫複合体は、内因的に作製され
る免疫複合体または従来的に作製される免疫複合体と実質的に同じ、高められた
免疫原性のある特性を有するであろう。
【００２０】 本発明の組換え抗体分子は、抗体分子が、融合する抗原に対する親和性を有す
るのであれば、いかなる抗体分子をも含み得る。抗体分子は、完全モノクローナ
ル抗体、またはＦｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）2断片のようなそれらの抗原
結合断片であり得る。好ましくは、抗体分子は、抗体の重鎖の定常部を含む。
【００２１】 抗原−抗体融合タンパク質をコードする遺伝的構築物を操作するために、これ
らの成分のどの種にも制限はない。本発明は、ヒト医薬品に関して格別に興味を
ひくものであるが、他の霊長類および他の動物抗原／抗体の組合せは、生成物の
意図される生物学的適用に応じて使用され得る。例えば、抗原ならびに抗体重鎖
および軽鎖は、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、
ラクダ、ネコまたは霊長類起源であってもよい。
【００２２】 本発明の適用範囲を説明するために、３つのモデル抗原、すなわち、それぞれ
特異的なモノクローナル抗体を有する、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、無毒
性破傷風毒素断片およびウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）Ｆタンパク質を使用した
。各抗原に関して、多数の構築物が考えられ、ここで抗原は、モノクローナル抗
体（Ｍａｂ）完全長重鎖のＣ末端、または１つ、２つもしくは３つの定常部ドメ
インから構成される短小化重鎖ドメインに融合する。あるいは、抗原は、定常部
内にある場所で、定常部に融合する。
【００２３】 本発明はまた、抗体の重鎖の定常部に融合する所望のタンパク質を含む組換え
融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物を提供する。
【００２４】 本発明はまた、本発明の第１および第２の組換えタンパク質、または本発明の
組換え抗体分子を発現するトランスジェニック植物を提供する。
【００２５】 トランスジェニック植物を生成する方法は、当業者に公知である。
【００２６】 本発明のトランスジェニック植物は、各抗原のための多くの分子形態の融合タ
ンパク質を発現し、正しく形成された分子形態の融合タンパク質および最も高レ
ベルでのその発現を選択することが可能であるため、融合タンパク質を抽出およ
び精製することが可能となる。集合分子形態の分析、および抗体のパネルに対す
る親和性による認識により、植物由来の融合タンパク質を特性化することも可能
である。
【００２７】 この研究から得られる進歩は、様々な感染疾患におけるワクチン接種に適した
新しい型の改変分子の開発である。３つの異なる抗原を用いることにより、本発
明者等は、標準的な細菌免疫原である、重要なヒトウイルスのエンベロープタン
パク質および重篤な粘膜感染を引き起こすウシウイルスの膜貫通融合タンパク質
に関するこのアプローチの有効性を確定することができる。抗体分子との抗原の
融合から生じる組換え抗体分子は、免疫応答の免疫複合体媒介性刺激に要するす
べての成分を有し、本発明者等のアプローチは、抗原／抗体複合体形成を確実に
する利便性のよい方法を提供する。本発明の組換え抗体分子はまた、植物界(pla
nta)におけるより大きな免疫複合体を形成することができ、それは免疫感作に使
用され得る（図１参照）。ＩｇＧ抗体の定常ドメインに存在するＦｃＲ結合およ
び補体活性化用部位のような、抗体分子のすべての部分が必須であるわけではな
い。したがって、本発明者等はまた、Ｃγ３ドメイン（抗原認識に関与しない）
またはＣγ１ドメインを欠如する短小化抗体分子の使用も含む。
【００２８】 免疫感作のために、本発明の第１の組換え融合タンパク質または本発明の第２
の組換え融合タンパク質（ここで所望のタンパク質は抗原である）を使用するこ
ともまた可能である。特に、機能性抗原結合ドメインを含まない抗体分子および
抗原を含む融合タンパク質を用いて、食細胞に抗原を送達し、また補体活性化を
開始させることができる。抗原は抗体の定常部と融合するタンパク質であるので
、抗原認識のための要件を除外することにより、Ｔ細胞エピトープの抗体マスキ
ングにより生じる抗原プロセシングの変調現象を防止する助けとなり得る。
【００２９】 植物の使用は、ワクチン接種目的のために大量に要求されるという潜在的要件
からの理由だけでなく、完全長抗体を含むその複合体、または軽鎖との集合はた
いていの他の発現系において容易に産生されないという理由のため、本発明の組
換え融合タンパク質の産生に理想的に適している。
【００３０】 抗原−抗体融合タンパク質をコードする遺伝的構築物を操作するために、抗原
または抗原断片をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅してもよい。これらの抗
原に特異的な、マウス、ヒトもしくは他の哺乳動物のモノクローナル抗体の軽鎖
および重鎖をコードする遺伝子はまたクローニングされる。これらのＤＮＡ配列
を用いて、遺伝子構築物に所望の組換え融合タンパク質をコードさせてもよい。
例えば、下記に記載の各々の抗原の遺伝子構築物を植物形質転換のために調製し
得る。
【００３１】 Ｉｇドメインを示す遺伝的構築物が、各免疫複合体構築物に含まれるであろう
。
【００３２】 Ａ−重鎖 Ｉ）構築物＃１ 可変−−−Ｃγ１−−−Ｃγ２−−−Ｃγ３−−−リンカー
ペプチド−−−抗原 ＩＩ）構築物＃２ 可変−−−Ｃγ１−−−Ｃγ２−−−リンカーペプチド−
−−抗原 ＩＩＩ）構築物＃３ Ｃγ２−−−Ｃγ３−−−リンカーペプチド−−−抗原 ＩＶ）構築物＃４ Ｃγ２−−−リンカーペプチド−−−抗原
【００３３】 Ｂ−軽鎖 可変−−−ＣＬ
【００３４】 これらの構築物を、図１に図式的に示し、それはまた植物における産物の最終
集合を示す。
【００３５】 図２に示すようなリンカーペプチドは、便宜的に（ＧＧＧＧＳ）3である。従
来型６×ヒスチジン標識(tag)およびプロテアーゼ切断部位（例えば、エンテロ
キナーゼ、第Ｘａ因子またはトロンビン）もまた、精製用途で抗原のＣ末端に導
入されてもよい。また、さらに異なるプロテアーゼ切断部位（例えば、エンテロ
キナーゼ、第Ｘａ因子またはトロンビン）もまたリンカーペプチドおよび抗原間
に導入されてもよい。さらなるまたは代替的ペプチド標識およびプロテアーゼ切
断部位が組み込まれてもよい。遺伝子構築物は、確認目的で配列決定し、植物形
質転換のための植物発現ベクターに挿入される。
【００３６】 １２個（各抗原に対して４個）の構築物を発現するトランスジェニック植物を
作製するために、タバコ(Nicotiana tabacum)は、アグロバクテリウム属媒介形
質転換を用いた便利な植物宿主である。構築物ＩおよびＩＩに関して、組換え融
合タンパク質を生成するために、図１に示すように免疫グロブリン軽鎖遺伝子お
よび重鎖構築物を別個の植物系統に導入してもよい。これらの第１世代形質転換
体の再生後に、軽鎖および重鎖形質転換植物を交雑受精させ、第２世代植物を、
最終産物の産生に関してスクリーニングする。構築物ＩＩＩおよびＩＶに関して
、軽鎖に関する要件はなく、最終産物は、第１世代形質転換植物において産生さ
れ得る。
【００３７】 安定なホモ接合トランスジェニック植物系統を生成するために、正しく集合し
た産物を発現するトランスジェニック植物を用いて、ホモ接合植物ストックを生
成する。植物は、成熟するまで成長させ、自家受粉させ、得られた種子を非形質
転換植物ともどし交配させることによりスクリーニングして、ホモ接合であるも
のを確定する。さらなるストックは、自家受粉により作製し、種として貯蔵する
ことができる。
【００３８】 植物産物の各分子形態を特性化し、さらなる研究のための物質を抽出および精
製するために、主な植物形質転換体をスクリーニングして、どの型の産物が最善
に発現されて集合するかを確定する。この研究は、市販の様々な抗血清およびモ
ノクローナル抗体を用いて、粗植物抽出物のウエスタンブロット分析およびＥＬ
ＩＳＡにより実施され得る。選択組換え産物の抽出およひ精製は、硫酸アンモニ
ウム沈殿、続く濾過、および親和性標識として免疫グロブリン領域または特異的
なペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより達成され得る。さら
なる特性化を行い、分子構造、抗体のパネルによる抗原部分の認識および結合親
和性を確定する。
【００３９】 ［実施例］ ｇｐ１２０および抗体の重鎖の定常ドメインを含む組換え融合分子の作製およ
び使用 ＨＩＶｇｐ１２０構築物のクローニングおよび遺伝子操作 ＨＩＶｇｐ１２０抗原のためのＤＮＡ源は、ＨＩＶ ＩＩＩＢの感染クローン
化分離体であった。かかるＤＮＡは、Medical research Council AIDS Reagents
Project (NIBSC, Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, Herts EN6 3QG,
UK)から得ることができる。ＨＩＶｇｐ１２０特異的モノクローナル抗体の重鎖
および軽鎖をコードする遺伝子（例えば、Gorny et al., 1991, Proceedings of
the National Academy of Sciences, USA 88:3238-3242)を、(Ma, J. K-C., T.
Lehner, P. Stabila. C. I. Fux and A. Hiatt. 1994 Assembly of monoclonal
antibodies with IgG1 and IgA heavy chain domains in transgenic tobacco
plant. Eur. J. Immunol., 24: 131-138) に記載されるようにクローニングした
。標準的な抽出キット（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ全ＲＮＡ分離系)を用い
て、関連ハイブリドーマ細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素反応を用いてｃＤ
ＮＡを調製した。抗原をコードするＤＮＡ、または抗原に特異的なモノクローナ
ル抗体の重鎖および軽鎖、あるいはこれら抗体配列をコードする断片を、図２に
示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させた
。オリゴヌクレオチドプライマー１および２は、抗体重鎖の５’および３’末端
に対応し、オリゴヌクレオチドプライマー３および４は、抗原の５’および３’
末端に対応する。抗原の５’プライマーはまた、リンカーペプチドおよびプロテ
アーゼ切断部位の配列を含む。プライマーは、適切な制限酵素部位（ｇｐ１２０
に関して５’ＢａｍＨＩおよび３’ＸｍａＩ、Ｉｇ重鎖に関して５’ＸｈｏＩお
よび３’ＢａｍＨＩ等）、およびリンカーペプチドをコードする特別(extra)配
列（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）またはプロテアーゼ切断部位（例えば、第Ｘａ
因子 ＩＥＧＲ）を含んでいた。軽鎖が必要である場合、Drake et al., Antibo
dy production in plants. P. Shepherd and Dean (eds). Monoclonal Antibodi
es - A pratical approach. Oxford University Press. 2000) によって記載さ
れる方法論に従って、遺伝子をクローニングすることができる。
【００４０】 ＤＮＡ構築物の操作は、Maniatis, Fritsch and Smabrook (1982) - Molecula
r Cloning, A Laboratory Manualに記載されるように、標準的な技法により、標
準的なクローニングベクター、すなわちpBluescript(Stratagene)およびｐＥＴ
３２(New England Biolabs)にて実行された。本質的には、まず抗原をコードす
るＤＮＡ、続いて抗体または抗体断片の重鎖および任意に軽鎖をコードするＤＮ
Ａを、複数のクローニング部位を用いてベクターにクローニングした。場合によ
っては、順序が逆転し、まず抗体遺伝子をクローニングした。適切な制限酵素で
の消化後の正確な大きさを有するＤＮＡ断片の放出、または適切な５’および３
’オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、陽性形質転換体を同定
した。４つのキメラ免疫グロブリン重鎖構築物を操作し、そこで抗原は、図１に
示すように様々な免疫グロブリン重鎖の部位と融合して発現された。
【００４１】 ＨＩＶｇｐ１２０断片と融合したＩｇ重鎖ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（図１の構
築物ＩＩＩ）をクローニングする具体例を図２に示す。１−２および３−４のオ
リゴヌクレオチド対を用いて、２つのＰＣＲ産物を増幅させた。ＨＩＶｇｐ１２
０ＤＮＡ配列は、Ｎ末端から開始し、すぐ後に停止コドンを有する配列ＫＥＹＡ
Ｌ（ａａ１４７）に至ってそれを含む短小化ペプチドをコードする。図３に示す
このベクター内にクローニング部位の重要な特徴を有する、従来操作されてきた
ｐＥＴ３２に基づくベクターに、これらをクローニングした。ｇｐ１２０遺伝子
断片を、ベクターのＢａｍＨＩ−ＸｍａＩ部位に連結し、次にＩｇ重鎖遺伝子を
ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にて上流にクローニングした。次に全構築物をＰＣＲ
により再増幅させて、下流のエンテロキナーゼ切断部位およびＨｉｓ標識を含み
、５’ＸｈｏＩおよび３’ＥｃｏＲＩ末端制限部位を含んだ。この断片を、確認
用配列決定のためのpBluescriptにクローニングした。
【００４２】 次に、完全遺伝的構築物を切除して、大腸菌における初期スクリーニングに適
したプラスミド（ｐＭＯＮ５３０）内にある上記(Drake et al., 2000)のような
植物発現カセットに別個にクローニングした。この型のプラスミドは、ｐＧｒｅ
ｅｎ系(www. pgreen. ac. uk)のように広く利用可能である。この場合での植物
発現カセットは、植物細胞においてｍＲＮＡを安定化するタバコエッチ(tobacco
etch)ウイルス由来の５’非翻訳領域、ならびに植物細胞からの組換えタンパク
質の分泌を誘導する上流マウスＩｇＧリーダー配列(leader sequence)を含有す
る（図３）。この組換えベクターを用いて、大腸菌（ＤＨ５−α）を形質転換し
た。形質転換クローンのスクリーニングは、元のＰＣＲ産物由来の放射標識ＤＮ
Ａプローブを用いて、サザンブロット法に従った。プラスミドＤＮＡを陽性形質
転換体（promegaQiaprepキット）から精製し、以下に示すように凍結融解手法を
用いて、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacients
）株（株ＬＢＡ４４０４−Gibco/BRL, UK)の形質転換に使用した。
【００４３】 １．アグロバクテリウム属をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）(Sigma)
を含有するルリアブロス（ＬＢ）５０ｍｌ中に接種する。 ２．ＯＤ６００が１．０になるまで、暗所にて２８℃で振とうする。 ３．滅菌チューブ中のアグロバクテリア属を３０００ｇで１５分間遠心分離す
る。 ４．上澄みを除去して、氷上にチューブを保ちながら、総量１ｍｌの氷冷１０
ｍＭＣａＣｌ2に細菌ペレットを再懸濁させる。 ５．滅菌微量遠心チューブに細菌再懸濁液の１００ｍｌ分取量を移し、次に液
体窒素中に入れる。 ６．ＤＮＡ形質転換用に直接凍結アグロバクテリアを使用するか、または−８
０℃で保管する。 ７．コンピテント凍結アグロバクテリア１００ｍｌの表層のＤＮＡミニプレッ
プからバイナリープラスミド（binary plasmid）１０ｍｌをピペットで取る。 ８．水浴中にて３７℃で５分間ＤＮＡ−細菌混合物をインキュベートする。 ９．細菌にＬＢ１ｍｌを添加し、２８℃で４時間振とうする。 １０．１２，０００×ｇで２分間、細菌を遠心分離し、ＬＢ１００ｍｌ中にこ
のペレットを再懸濁させる。 １１．バイナリーおよび安全化(disarmed)Ｔｉヘルパープラスミドを保有する
アグロバクテリアの選択に要するスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地（１５
ｇｌ-1寒天で半固形状にした）上に細菌懸濁液５０ｍを広げる。プレートを密封
し、２８℃で２〜３日間インキュベートする。 １２．別個のペトリ皿の選択ＬＢ培地上に得られたコロニーに再度線状に接種
し、２８℃にて２時間インキュベートする。
【００４４】 植物形質転換および再生：すべての遺伝子構築物を、Nicotiana tabacum 株、
変種キサンチ(xanthii)に導入した。Ａ．ツメファシエンス（tumefaciens）での
タバコ形質転換は、標準的な手法に従った。表面を滅菌したタバコの葉からリー
フディスク（leaf disc）を切り出し、ｃＤＮＡ挿入断片を含有する、組換え体
Ａ．ツメファシエンスの培養液とともにインキュベートした。感染したディスク
を、カナマイシンおよびカルベニシリン(Sigma, UK)を補充した、苗条の再生を
誘発する培地を含有する培養プレートに移す。この段階後に発生した苗条を切除
し、カナマイシンを補充した根誘発培地上に植え換える。根が出現した後に、根
付いた苗木を土壌に植え換える。詳細な方法論は下記の通りである： １．−８０℃から（バイナリーベクターを含有する）アグロバクテリウム属を
取り出し、９ｃｍペトリ皿中の半固形ＬＢ培地（適切な抗生物質を有する）上へ
線状に接種する。２８℃で２日間インキュベートする。 ２．ペトリ皿から１０ｍｌＬＢ中にアグロバクテリウム属を接種する。 ３．ＯＤ６００が１．０になるまで２８℃で振とうする。 ４．滅菌９ｃｍペトリ皿中にてアグロバクテリウム属懸濁液４ｍｌを除去し、
滅菌蒸留水１６ｍｌを添加する。 ５．表面を滅菌した葉から０．５〜１．０ｃｍのリーフディスク切り出し、希
釈アグロバクテリウム懸濁液中にて５分間浸漬させる。 ６．滅菌濾紙上でリーフディスクを手早く乾燥させる。 ７．各９ｃｍペトリ皿において培地２０ｍｌにつき１０〜１５個のディスクの
割合で、苗条再生培地上にリーフディスクを載せる。１６時間の光周期で、２５
℃にて２日間インキュベートする。 ８．カルベニシリン５００ｍｇ／ｌおよび形質転換植物細胞のための適切な濃
度の選択薬剤を含有する苗条再生培地にリーフディスクを移す。１６時間の光周
期で、２５℃にて２１日間インキュベートする。 ９．５００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび２００ｇ／ｌカナマイシンを含有す
る、滅菌１７５ｍｌガラスジャー中の苗条再生培地にリーフディスクを移す。１
６時間の光周期で、２５℃にてインキュベートする。 １０．発生した苗条が手頃な大きさ（約０．５ｃｍ長）に達したら取り出して
、根付け培地（３〜４苗条／４０ｍｌ培地／１７５ｍｌガラスジャー）に移す。
１６時間の光周期で、２５℃にて１４日間インキュベートする。 １１．根の欠如した苗を基部で刈り込んで、さらに２１時間または根が出現す
るまで、新鮮な根付け培地に交換する。 １２．根付いた苗条を植物ポットに移して堆肥を施し、水をやり、養分を補充
する。移して堆肥を施した後に、植物を種子トレイに保ち、２４時間蓋をかぶせ
、初期の水損失を最低限にする。
【００４５】 入手可能な抗血清およびモノクローナル抗体（例えば、MRC AIDS Directed 試
薬プログラムより、上述の住所）を用いて粗葉抽出物のウエスタンブロットおよ
びＥＬＩＳＡにより、免疫グロブリン鎖および各抗原の発現に関して、再生した
植物をスクリーニングした。トランスジェニック植物は自家受粉して、ホモ接合
植物系統を樹立し、交配受精して抗体産生植物を生成する。
【００４６】 ＲＮＡ抽出： Ｐｒｏｍｅｇａ植物ＲＮＡ抽出キット（Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ
ｋｉｔ）を用いて、１ヶ月齢未満の植物から、全ＲＮＡを抽出した。あるいは
、葉の組織を液体窒素中で凍結させて、迅速に微粉に粉砕した。これを、２倍容
量の氷冷グアニジン塩酸塩緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭ ＭＥＳ、
２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ７）と混合し
た。撹拌後に、それを、１倍容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアル
コール（２５：２４：１）に添加して、完全に混合し、１０，０００ｒｐｍで４
５分間遠心分離した。上（水）相を収集し、予冷したエタノール（０．７倍容量
）および１Ｍ酢酸（０．２倍容量）と混合し、−２００℃にて１６時間インキュ
ベートした。遠心分離後、沈殿物を３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）で３回、
７０％エタノールを用いて１回洗浄した。ペレットを、ＲＮアーゼ非含有ＤＮア
ーゼ(Promega, UK)を含有する滅菌ＲＮアーゼ非含有水(Sigma, UK)に溶解させ、
３７℃で１時間、続いて７０℃で５分間インキュベートした。
【００４７】 ＲＮＡ濃度および純度は、GeneQuantＩＩ ＲＮＡ／ＤＮＡ Calculator(Phar
macia BioTech, UK)を用いて評価した。ＲＮＡは、滅菌ＲＮアーゼ非含有水中で
、−２０℃にて保管した。
【００４８】 適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、推定形質
転換植物により、正確なＲＮＡ転写物が作製されていることを確定した。
【００４９】 植物からの組換え免疫複合体の特性化および選択 植物における各操作構築物の発現を確認するため、ＥＬＩＳＡおよびウエスタ
ンブロット分析により、葉抽出物を検査した。ロイペプチン(Calbiochem)（１０
ｍｇ／ｍｌ）を有する１５０ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス、ｐＨ８（ＴＢ
Ｓ）中で試料を抽出した。ＨＩＶｇｐ１２０に特異的なモノクローナル抗体(ADP
401, MRC Aids Directed Programから)であらかじめ被覆したマイクロタイター
プレート上で植物抽出物をインキュベートすることにより、キャプチャーＥＬＩ
ＳＡ分析を実施し、ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロックした。４℃での一晩のイ
ンキュベーション後、０．０５％ツイーン２０を有するＴＢＳでプレートを洗浄
し、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗血清
(The Binding Site, UK)、またはｇｐ１２０特異的モノクローナル抗体(MRC Aid
s Directed Program)のパネルの１つとともに、続いて関連ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ抗血清(The Binding Site, UK)とともにインキュベートした。
ＴＭＢ基質(Sigma, UK)を用いて、アッセイを発色させ、４５０ｎｍで吸光度を
読みとった。
【００５０】 ウエスタンブロット分析に関して、（０．１％βメルカプトエタノールの添加
により）非還元または還元条件下において、７５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８
）および２％ＳＤＳ中にて植物抽出物を沸騰させた。１０％アクリルアミドまた
は４〜２０％勾配ゲルのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
を実施した。ニトロセルロース紙上にゲルをブロットし、０．０５％ツイーン２
０および１％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ中でブロックした。次に、このブロット
を適切な抗血清中で３７℃にて２時間インキュベートした。洗浄後、適切な第２
の層アルカリホスファターゼ複合抗血清を３７℃にて２時間適用した。ニトロブ
ルーテトラゾリウム（３００ｍｇ／ｍｌ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルホスフェート（１５０ｍｇ／ｍｌ）(Promega, UK)とともにインキュ
ベートすることにより、抗体結合を検出した。
【００５１】 コンカナバリンＡのようなレクチンへの結合を調べるウエスタンブロットによ
り、またはグリカン特異的抗血清（Dr, Loic Faye, University of Rouenにより
ご厚意で提供）を用いることにより、グルコシル化を確定する。利用可能なモノ
クローナル抗体に対する抗原結合親和性の機能性の研究が、表面プラスモン共鳴
技術を用いて行われ得る。
【００５２】 組換えタンパク質精製 精製は、本発明者らがトランスジェニック植物からのＩｇＧ抽出のために予め
決定した手順を用いて行った。硫酸アンモニウムを用いた粗植物抽出物からの初
期沈殿後に、ＹＭ３０分子量カットオフフィルター(Amicon, UK)を用いて、撹拌
細胞濾過により、組換え抗体を濃縮した。精製は、リガンドとして抗マウスまた
はヒトＩｇＧ抗体(Sigma, UK)に結合したアガロースを用いたアフィニティクロ
マトグラフィーに従った。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌｐＨ２．５中で溶出した。
【００５３】 組換え重鎖はまた、固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによ
る６ｘＨｉｓ融合ペプチド標識を用いたさらなるアフィニティ精製工程を可能に
するように設計されてもよく、それは後にトロンビンによって切断され得る。
【００５４】 これらの融合タンパク質の発現は、植物に限定されず、任意の他の真核細胞、
特に、哺乳動物細胞のような免疫グロブリンを産生することができる細胞におい
て実施することができる。
【００５５】 免疫グロブリン鎖配列は、他のクラスの免疫グロブリン由来の配列と交換する
ことができる。
【００５６】 エピトープ標識およびプロテアーゼ切断部位の他に、他の配列を構築物に組み
込むことができる。例えば、これらは、マーカー、酵素活性、または他の活性分
子と化学的に結合するための部位のような他の機能性領域をコードすることがで
きるだろう。
【００５７】 ＨＩＶｇｐ１２０の他に、２つのさらなる例を展開させた。破傷風毒素無毒性
Ｃ断片(Dr. Neil Fairweather at Imperial College, Londonによりご厚意で寄
贈）および破傷風毒素特異的マウスモノクローナル抗体(Dr. Claus Koch at the
State Serum Institute, Copenhagenよりご厚意で寄贈）を用いて、同様の構築
物を調製した。さらに、本発明者等は、ウシＲＳウイルスのＦタンパク質および
特異的なマウスモノクローナル抗体に関する相当する構築物を調製し、それらの
ための遺伝子は、Dr. K. G. Madsen (at the Danish Veterinary Institute for
Virus Research)によりご厚意で提供された。
【００５８】 本発明の有益性のうち、以下に示すものが顕著である： （ｉ）抗原との抗体の同時発現は、抗原の発現レベルを増加させる。 （ｉｉ）抗原および全抗体は遺伝的に連結されて、免疫複合体の型を形成する
。他の構築物では、抗原および抗体断片（それは抗原結合部位を含んでも、含ま
なくてもよい）が連結して、融合タンパク質を形成する。 （ｉｉｉ）組換え抗体分子および抗原は、自動的に１：１の比で発現する。全
ＩｇＧを含む構築物の場合には、自然により大きな複合体が形成し得る。 （ｉｖ）抗原−抗体融合分子が産生しやすい。 （ｖ）植物の使用により、特に生産を農業規模へ増加する場合に、これらの分
子を作製する費用は相当減少する。 （ｖｉ）経口ワクチンに関して、食用トランスジェニック植物の消費は、免疫
複合ワクチンのための代替的な安全様式の送達を提供する。 （ｖｉｉ）操作分子はすでに高度の免疫原性があるので、アジュバンドの添加
の必要は潜在的にない。ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンドメインは、食細胞
の補体活性化およびオプソン化用部位を含む。
【００５９】 結果 記載の構築物、すなわちＣＨ２−ｇｐ１２０およびＣＨ２−ＣＨ３−ｇｐ１２
０の２つに関して結果が得られた。ＲＴ−ＰＣＲは、所望の大きさの特異的ｍＲ
ＮＡがトランスジェニック植物によって生産されることを確認した（図４）。
【００６０】 キャプチャーＥＬＩＳＡによる分析は、両方の構築物が植物によって発現する
ことを実証した。本発明者等は、より十分にＣＨ２−ＣＨ３−ｇｐ１２０の特性
化を続け、図５および６に示すように、ＥＬＩＳＡによりそれがＩｇＧ２ａエピ
トープならびにｇｐ１２０エピトープを含有することを実証した。さらに、組換
えｇｐ１２０の発現は、ｇｐ１２０単独、Ｃ末端ＨＤＥＬ標識を有するｇｐ１２
０、またはＣＨ２−ｇｐ１２０を発現する植物よりも、ＣＨ２−ＣＨ３−ｇｐ１
２０構築物を発現する植物において多い。予備結果は、約０．８％のｇｐ１２０
発現レベルを示す。
【００６１】 植物由来物質の精製を行い、ウエスタンブロット分析は、ｇｐ１２０およびマ
ウスＩｇＧ２ａに対して特異的な抗体によって認識されるタンパク質バンドの存
在を実証する（図７）。還元条件下では、最も目立つバンドは、約５０Ｋｄと予
想されるものと一致する分子の大きさを有する。非還元条件下では、１００Ｋｄ
に近いより高度な分子量形態が検出される。このことは、重鎖のＣＨ２およびＣ
Ｈ３ドメインの結合を介した、ホモ二量体の形成と一致する。
【００６２】 免疫原性の予備調査を単一のアカゲザルにて行った。ＳＰＤＰ二官能性試薬（
bifunctional reagent）を用いて、アジュバンドマイコバクテリア熱ショックタ
ンパク質７０（adjuvant mycobacterial heat shock protein 70）と共有結合さ
せた精製植物由来ＣＨ２−ＣＨ３−ｇｐ１２０（１回用量につき１５０μｇ）を
２回投与した後に、特異的抗体および細胞免疫応答を検出した。３回の免疫感作
後に、植物ＣＨ２−ＣＨ３−ｇｐ１２０構築物に対してだけでなく、チャイニー
ズハムスター卵巣細胞（chinese hamster ovary cells）にて発現した精製組換
えｇｐ１２０に対しても、非常に有意なＴ細胞増殖性応答が検出された。このこ
とは、植物組換ｇｐ１２０が、正確に発現され、免疫原性の立体配座にフォール
ディングされていることを示す。さらに、粘膜膣内経路により、４匹のマカクを
免疫し、標的腸骨リンパ節経路により、４匹のマカクを免疫化した(Lehner et a
l., Nature Medicine, 2: 767-775, 1996)。２回の免疫感作後に、インターフェ
ロン−γおよびインターロイキン４の誘発が検出され、ＴＨ１およびＴＨ２応答
の両方が誘発されることを示した。アカゲザルならびにマウスにて、さらなる免
疫感作研究を行っている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、植物における免疫複合体および潜在的集合配列を概略的に示す図であ
る。
【図２】 図２は、基本的な分子設計を概略的に示す図である。
【図３】 図３は、ｐＥＸＧ１３主要クローニング部位を概略的に示す図である。
【図４】 図４は、トランスジェニック植物のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図５】 図５は、ＣＨ２−ＣＨ３−ｇｐ１２０に関するキャプチャーＥＬＩＳＡの結果
を示す図である。
【図６】 図６は、植物において発現した組換えｇｐ１２０に関するキャプチャーＥＬＩ
ＳＡの結果を示す図である。
【図７】 図７は、還元条件および非還元条件下における１０％ＳＤＳゲルを示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 7/04 ４Ｈ０４５ 3/10 7/06 7/04 11/00 7/06 35/00 11/00 Ｃ０７Ｋ 16/10 35/00 19/00 Ｃ０７Ｋ 16/10 14/00 19/00 14/155 // Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 14/155 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヤコブセン，ペール ホイ デンマーク ステンローズ ディーケー− 3660 カールスコブ バッケ ７ ガンロ ーズ (72)発明者 マンカ，ファブリジオ イタリア ジェノア アイ−16132 10 ラルゴ アール．ベンジ ユニット オブ レトロバイラル イミュノロジー アド バンスド バイオテクノロジー センター (72)発明者 チャージレグー，ダニエル モーリス イギリス ロンドン エスイー１ ９アー ルティー 28ス フロアー ガイズ ホス ピタル ガイス タワー デパートメント オブ オーラル メディシン キングス カレッジ ロンドン (72)発明者 ドレーク，パスカル マーク ウェイン イギリス ロンドン イー４ ７エイチユ ー チンフォード エルムフィールド ロ ード 46 (72)発明者 レナー，トーマス イギリス ハーツ イーエヌ４ ０エルエ ル バーネット ハドリー ウッド ウッ ド ライド ２ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CB02 CD07 CD09 CD10 CD13 4B024 AA01 BA41 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 AG27 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CA20 CC24 DA01 4C084 AA01 4C085 AA03 AA13 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA05 CA40 DA76 DA86 EA20 FA72 FA74

Claims (69)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗体の重鎖の定常部または該定常部の一部に融合する所望の
    タンパク質を含む組換え融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡを発現させる
    ことを含む、細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法。
  2. 【請求項２】 前記所望のタンパク質は、抗体の重鎖の完全長定常部に融合
    する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記所望のタンパク質は、抗体の重鎖の短小化定常部に融合
    する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記短小化定常部は、任意の抗体の重鎖の定常ドメインの１
    つまたはそれ以上から構成される、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記短小化定常部は、ＩｇＧクラス抗体由来であり、ＣＨ１
    、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの１つまたはそれ以上から構成される、請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記所望のタンパク質は、抗体の重鎖の定常部のＣ末端また
    は該定常部の一部に融合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記所望のタンパク質は、抗体の重鎖の定常部内または該定
    常部の一部内にある場所で、前記定常部または該定常部の一部に融合する、請求
    項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記所望のタンパク質は、前記定常部またはその一部に直接
    的に融合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記所望のタンパク質は、連結ペプチドを介して、前記定常
    部またはその一部に間接的に融合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 前記重鎖は、抗原に特異的な抗体の重鎖である、請求項１
    〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記融合タンパク質は、前記定常部またはその一部から前
    記所望のタンパク質を分離できる切断部位を含む、請求項１〜１０のいずれか１
    項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記融合タンパク質は、ペプチド標識を含有する、請求項
    １〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記所望のタンパク質は、食品タンパク質または治療用タ
    ンパク質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記所望のタンパク質は、抗原である、請求項１３に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 前記抗原は、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０である、請
    求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記組換えＤＮＡは、植物、真菌、昆虫もしくは哺乳動物
    の細胞を含む真核宿主細胞において発現する、請求項１〜１５のいずれか１項に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記組換えＤＮＡは、免疫グロブリンを発現することが可
    能な真核宿主細胞において発現する、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記組換えＤＮＡは、双子葉植物、単子葉植物、マメ科植
    物またはナス科植物の細胞を含む植物細胞において発現する、請求項１〜１５の
    いずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記抗体の重鎖は、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ
    、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ラクダ、ネコまたは霊長類である、請求項１〜１８の
    いずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記抗体の重鎖は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミ
    リーの任意の一員由来である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 抗体の重鎖の定常部または該定常部の一部に融合する抗原
    を含む組換え融合タンパク質。
  22. 【請求項２２】 前記抗原は、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０である、請
    求項２１に記載の組換え融合タンパク質。
  23. 【請求項２３】 抗体の重鎖の定常部または該定常部の一部に融合する所望
    のタンパク質を含む融合タンパク質であって、機能性抗原結合ドメインを含まな
    い融合タンパク質。
  24. 【請求項２４】 前記抗原は、前記抗体の前記重鎖の完全長定常部に融合す
    る、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  25. 【請求項２５】 前記抗原は、前記抗体の前記重鎖の短小化定常部に融合す
    る、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  26. 【請求項２６】 前記短小化部は、ＩｇＧクラス抗体由来であり、ＣＨ１、
    ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの１つまたはそれ以上から構成される、請求項２５
    に記載の融合タンパク質。
  27. 【請求項２７】 前記抗原または所望のタンパク質は、前記定常部またはそ
    の一部のＣ末端に融合する、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の融合タン
    パク質。
  28. 【請求項２８】 前記抗原または所望のタンパク質は、抗体の重鎖の定常部
    内または該定常部の一部内にある場所で、前記定常部または該定常部の一部に融
    合する、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  29. 【請求項２９】 前記抗原または所望のタンパク質は、前記定常部またはそ
    の一部に直接的に融合する、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の融合タン
    パク質。
  30. 【請求項３０】 前記抗原または所望のタンパク質は、連結ペプチドを介し
    て、前記定常部またはその一部に間接的に融合する、請求項２１〜２８のいずれ
    か１項に記載の融合タンパク質。
  31. 【請求項３１】 前記重鎖は、前記抗原に対して特異的な抗体の重鎖である
    、請求項２１または２２に記載の融合タンパク質。
  32. 【請求項３２】 前記定常部もしくはその一部から前記抗原または所望のタ
    ンパク質を分離できる切断部位を含む、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載
    の融合タンパク質。
  33. 【請求項３３】 ペプチド標識を含有する、請求項２１〜３２のいずれか１
    項に記載の融合タンパク質。
  34. 【請求項３４】 前記抗体重鎖および軽鎖は、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ
    、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ラクダ、ネコまたは霊長類である、請求項２
    １〜３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  35. 【請求項３５】 前記抗体配列は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリ
    ーの任意の一員由来である、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載の融合タン
    パク質。
  36. 【請求項３６】 前記所望のタンパク質配列は、ＩｇＧクラス抗体の複合重
    鎖ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに結合したＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質
    の全部または一部である、請求項２１〜３５のいずれか１項に記載の融合タンパ
    ク質。
  37. 【請求項３７】 並列アラインメントにある請求項２１〜３６のいずれか１
    項に記載の２つの融合タンパク質を含む抗原／抗体複合体。
  38. 【請求項３８】 前記融合タンパク質の重鎖またはそれらの一部とともに、
    抗体またはその一部の特徴的な二重鎖対称構造を形成する抗体軽鎖も含む、請求
    項３７に記載の抗原／抗体複合体。
  39. 【請求項３９】 植物または植物細胞において産生される、請求項２１〜３
    ６のいずれか１項に記載の融合タンパク質あるいは請求項３７または３８に記載
    の抗原／抗体複合体。
  40. 【請求項４０】 請求項２１〜３６のいずれか１項に記載の組換え融合タン
    パク質又は請求項３７もしくは３８に記載の抗原／抗体複合体を含むワクチン。
  41. 【請求項４１】 請求項２１〜３６のいずれか１項に記載の融合タンパク質
    あるいは請求項３７または３８に記載の抗原／抗体複合体を形成する方法であっ
    て、植物、真菌、もしくは哺乳動物、またはバキュロウイルスの細胞を含む真核
    宿主細胞においてそれらの成分をコードする組換えＤＮＡを発現させることを含
    む方法。
  42. 【請求項４２】 請求項２１〜３６のいずれか１項に記載の融合タンパク質
    あるいは請求項３７または３８に記載の抗原／抗体複合体を形成する方法であっ
    て、免疫グロブリンを発現することが可能な真核細胞においてそれらの成分をコ
    ードする組換えＤＮＡを発現させることを含む方法。
  43. 【請求項４３】 請求項２１〜３６のいずれか１項に記載の融合タンパク質
    あるいは請求項３７または３８に記載の抗原／抗体複合体を形成する方法であっ
    て、双子葉植物、単子葉植物、マメ科またはナス科である植物において、それら
    の成分をコードする組換えＤＮＡを発現させることを含む方法。
  44. 【請求項４４】 別個の植物において前記抗体の前記重鎖および軽鎖または
    それらの一部を発現させること、前記重鎖および軽鎖を単離すること、および前
    記鎖を結合させて前記抗原／抗体複合体を形成することを含む、請求項３８に記
    載の抗原／抗体複合体を形成する方法。
  45. 【請求項４５】 前記重鎖および軽鎖の両方を発現する植物において、前記
    抗体の前記重鎖および軽鎖またはそれらの一部を発現させることを含む、請求項
    ３８に記載の抗原／抗体複合体を形成する方法。
  46. 【請求項４６】 前記重鎖および軽鎖の両方を発現する前記植物は、前記重
    鎖を産生する植物を、前記軽鎖を産生する植物と交配させることにより生産され
    る、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記宿主は植物であり、抗体の前記重鎖および軽鎖は、同
    じ植物において同時発現する、請求項４５に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 抗体分子に融合する抗原を有する組換え抗体分子であって
    、前記抗体分子は、前記抗原に対する親和性を有する組換え抗体分子。
  49. 【請求項４９】 前記抗原は、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０である、請
    求項４８に記載の組換え抗体分子。
  50. 【請求項５０】 前記抗体分子は、完全モノクローナル抗体またはその抗原
    結合断片である、請求項４８または４９に記載の組換え抗体分子。
  51. 【請求項５１】 前記抗体分子は、抗体の重鎖の完全長定常部を含み、前記
    抗原は、該完全長定常部に融合する、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の
    組換え抗体分子。
  52. 【請求項５２】 前記抗体分子は、抗体の重鎖の短小化定常部を含み、前記
    抗原は、短小化定常部に融合する、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の組
    換え抗体分子。
  53. 【請求項５３】 前記短小化部は、ＩｇＧクラス抗体由来であり、ＣＨ１、
    ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの１つまたはそれ以上から構成される、請求項５２
    に記載の組換え抗体分子。
  54. 【請求項５４】 前記抗原は、前記定常部またはその一部のＣ末端に融合す
    る、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の組換え抗体分子。
  55. 【請求項５５】 前記抗原は、抗体の重鎖の定常部内または該定常部の一部
    内にある場所で、前記定常部または該定常部の一部に融合する、請求項５１〜５
    ３のいずれか１項に記載の組換え抗体分子。
  56. 【請求項５６】 前記抗原は、前記抗体分子に直接的に融合する、請求項４
    ８〜５５のいずれか１項に記載の組換え抗体分子。
  57. 【請求項５７】 前記抗原は、連結ペプチドを介して、前記抗体分子に間接
    的に融合する、請求項４８〜５５のいずれか１項に記載の組換え抗体分子。
  58. 【請求項５８】 前記抗体分子から前記抗原または所望のタンパク質を分離
    できる切断部位を含む、請求項４８〜５７のいずれか１項に記載の組換え抗体分
    子。
  59. 【請求項５９】 前記抗体分子はペプチド標識を含む、請求項４８〜５８の
    いずれか１項に記載の組換え抗体分子。
  60. 【請求項６０】 前記抗体重鎖および軽鎖は、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ
    、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ラクダ、ネコまたは霊長類である、請求項４
    ８〜５９のいずれか１項に記載の組換え抗体分子。
  61. 【請求項６１】 前記抗体配列は、免疫グロブリンスーパーファミリーの任
    意の一員由来である、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の抗体分子。
  62. 【請求項６２】 植物または植物細胞において産生される、請求項４８〜６
    １のいずれか１項に記載の組換え抗体分子。
  63. 【請求項６３】 請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組換え抗体分子
    の複合体を含む免疫複合体。
  64. 【請求項６４】 請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組換え抗体分子
    あるいは請求項６３に記載の免疫複合体を含むワクチン。
  65. 【請求項６５】 請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組換え抗体分子
    を形成する方法であって、細菌または古細菌の細胞を含む原核宿主細胞において
    、その成分をコードする組換えＤＮＡを発現させることを含む方法。
  66. 【請求項６６】 請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組換え抗体分子
    を形成する方法であって、植物、真菌、もしくは哺乳動物、またはバキュロウイ
    ルスの細胞を含む真核宿主細胞において、その成分をコードする組換えＤＮＡを
    発現させることを含む方法。
  67. 【請求項６７】 請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組換え抗体分子
    を形成する方法であって、双子葉植物、単子葉植物、マメ科またはナス科である
    植物において、その成分をコードする組換えＤＮＡを発現させることを含む方法
    。
  68. 【請求項６８】 抗体の重鎖の定常部に融合した所望のタンパク質を含む組
    換え融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物。
  69. 【請求項６９】 請求項２１〜３６のいずれか１項に記載の組換え融合タン
    パク質を、あるいは請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組換え抗体分子を
    発現するトランスジェニック植物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012520073A (ja) * 2009-03-10 2012-09-06 ベイラー リサーチ インスティテュート 抗原提示細胞ターゲティングワクチン

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101044154A (zh) * 2002-02-14 2007-09-26 威廉·J·鲁特 治疗宿主中切割的嵌合分子
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
TW200526778A (en) * 2003-11-14 2005-08-16 Sembiosys Genetics Inc Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants
WO2006058890A2 (en) * 2004-11-30 2006-06-08 Novo Nordisk A/S Method of producing antibodies
CN101300355A (zh) * 2005-10-13 2008-11-05 威瑞克斯医药公司 包含丙型肝炎病毒多肽和用于引起免疫应答的Fc片段的嵌合抗原
US8444976B2 (en) 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
GB2461546B (en) * 2008-07-02 2010-07-07 Argen X Bv Antigen binding polypeptides
CN106432493B (zh) 2009-03-10 2020-01-31 贝勒研究院 抗-cd40抗体及其用途
AU2015202777B2 (en) * 2009-11-18 2017-09-14 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Angiogenin expression in plants (2)
NZ600007A (en) 2009-11-18 2014-08-29 Agriculture Victoria Serv Pty Angiogenin expression in plants
WO2015106281A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Baylor Research Institute Novel vaccines against hpv and hpv-related diseases
CN106572645A (zh) * 2014-06-12 2017-04-19 中央大学校产学协力团 用于制备产生免疫原性复合蛋白的转基因植物的方法及由其获得的免疫原性复合蛋白
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09506761A (ja) * 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
EP0973933A1 (en) * 1997-02-13 2000-01-26 American National Red Cross Immunological tolerance to hiv epitopes
HUP0100813A3 (en) * 1998-02-25 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012520073A (ja) * 2009-03-10 2012-09-06 ベイラー リサーチ インスティテュート 抗原提示細胞ターゲティングワクチン
JP2016026160A (ja) * 2009-03-10 2016-02-12 ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 抗原提示細胞ターゲティングワクチン

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