CN109180798A - 一种增强型治疗性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，本发明具体涉及一种增强型治疗性抗体由治疗性抗体和鱼精蛋白组成的构建、制备和应用。本发明可以提高治疗性抗体的作用时间和弥补治疗性抗体的功能缺失。本发明的增强型治疗性抗体对疾病治疗有更高的价值。

Description

一种增强型治疗性抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种增强型治疗性抗体构建、制备和应用。
背景技术
鱼精蛋白是一种存在于各种动物精巢组织中的碱性蛋白质，它是以与DNA结合的核精蛋白形式存在。目前已经从鲑鱼、鲱鱼等多种鱼类及其它水生动物中提取到鱼精蛋白。鱼精蛋白是一种富含精氨酸的、多聚阳离子的碱性蛋白质，溶于水和烯酸，不易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，稳定性好，加热不凝固，分为单鱼精蛋白、双鱼精蛋白和三鱼精蛋白3种，不同鱼种鱼精蛋白在氨基酸组成比例上有很大的差别，但是它们存在很多相似的特征。鱼精蛋白主要在鱼类(如鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼等)成熟精子细胞核中作为和DNA结合的核精蛋白存在，这种结合使负电荷沿着DNA的磷酸二酯骨架起中和作用，使相邻的DNA分子紧密结合在一起。在哺乳动物中发现的两种鱼精蛋白P1和P2是最广泛研究的。P1包装精子DNA在所有哺乳动物中，而鱼精蛋白P2只存在于灵长类动物和啮齿动物的精子。鱼精蛋白主要生物学作用：(1)促进细胞繁殖和发育；(2)增强肝功能；(3)抑制肿瘤生长；(4)通过激活补体经典途径，通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，发挥补体依赖的细胞毒性，所形成的攻膜复合物对靶细胞(如肿瘤细胞)发挥裂解效应。鱼精蛋白在中性和碱性介质中显示出很强的抑菌能力，并有较高的热稳定性，在210℃条件下，加热1小时仍具有活性，同时抑菌范围和食品防腐范围均较广，它对枯草杆菌、芽孢杆菌、干酪乳杆菌、胚芽乳杆菌、乳酸菌、霉菌、芽抱耐热菌和革兰氏阳性菌等均有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌抑制效果不明显。鱼精蛋白是激动剂，通过Ca2+Sensing Receptor(CaR)介导细胞内Ca2+的增加，增加T细胞活性。更重要的是，鱼精蛋白是市售的，已作为一种临床治疗性药物，目前的不足之处：(1)应用治疗范围非常有限；(2)剂量使用不当时，易引起不良反应。鱼精蛋白只用作用于中和肝素的抗凝活性(例如，体外循环术后)和胰岛素的稳定剂，未发现用于与治疗性抗体融合和联合应用，也未发现用于针对免疫系统的治疗上。
抗体分为天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体，抗体如IgG抗体分子是有两条V区和C区组成。治疗性抗体多为基因工程抗体，在临床应用中，治疗性抗体和抗体衍生物已广泛应用于抗恶性肿瘤或癌症治疗、免疫性疾病、器官移植和炎症性疾病的治疗。在用基因工程技术构建治疗性抗体时，将面临着工程化改造的治疗性抗体C区片段的问题。虽治疗性抗体V区决定了主要功效作用，但其C区通过在体内对分子结构的影响，发挥抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞发挥抗体依赖的细胞毒性作用(CDC)，也同时对基因工程治疗性抗体在体内的药效学、药动学和毒理性有影响作用。治疗性抗体和抗体衍生物可以分为含有抗体Fc和不含有抗体Fc。含有抗体Fc具有较好的半衰期和稳定性，Fc介导抗体的补体依赖性细胞作用。目前，治疗性抗体药物种类比较多，主要包括：鼠源单抗、人－鼠嵌合抗体、人源化单抗、全人源单抗，其鼠源性蛋白质的成分从100％下降为33％乃至0％。治疗性人－鼠嵌合抗体的出现使得抗体的人源化程度达到66％，临床应用会产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)。确定了HAMA反应中最主要的免疫原性成分来自鼠源抗体的C区，约有90％抗抗体是针对抗体的C区部分的。最佳的人源化抗体不仅含有鼠源性抗体特异性抗原结合强度所需的最少的氨基酸数量(总量的5％－10％)，还具有人免疫系统的能力。有些治疗性抗体是来源于基因工程抗体，尤其是小分子抗体、双特异性抗体或双功能抗体、微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体等等，其抗体结构中不含有抗体Fc段，缺乏抗体Fc段介导的长循环效应则半衰期端和稳定性较差。小分子抗体和双特异性抗体或双功能抗体在体内的血浆半衰期为2～3小时。治疗性抗体也失去抗体的补体依赖性细胞毒性作用(主要针对肿瘤细胞)。因此，如何延长治疗性抗体和抗体衍生物在体内半衰期和稳定性，如何更好地发挥治疗性抗体和抗体衍生物在体内治疗作用，是治疗性抗体和抗体衍生物作为药物在临床治疗中必须要解决的问题。
发明内容
为进一步优化或改进治疗性抗体的治疗效果，需要一种具有增强功能成分，一方面能提高治疗性抗体在体内半衰期和稳定性，另一方面发挥鱼精蛋白作用，通过增强型抗体的功能，介导补体依赖的细胞毒性的生物学功能。具体为：
一种增强型治疗性抗体，包括以下组分：抗体、鱼精蛋白。
所述的抗体，所述的抗体包括：人抗体。
所述的抗体，所述的抗体包括：治疗性抗体、药物性抗体、抗体药物、或其抗原结合的抗体部分或抗体片段。任选一种。
所述的鱼精蛋白，所述的鱼精蛋白包括：人鱼精蛋白。
所述的鱼精蛋白，所述的鱼精蛋白包括：鱼精蛋白1、鱼精蛋白2、鱼精蛋白3。任选一种。所述的治疗性抗体还包括基因工程抗体、天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗体，任选一种。任选地，所述基因工程抗体、天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗体。
所述的增强型治疗性抗体，鼠抗体人源化，包括人-鼠嵌合抗体、改型抗体或人源化抗体或重构型抗体或CDR移植抗体；小分子抗体，包括Fab抗体、Fc抗体、Fv抗体单链抗体、单域抗体、超变区多肽；双特异性抗体或双功能抗体；三功能抗体；抗体融合蛋白；催化抗体；重组特异性抗体；人源性抗体或全人抗体；新型抗体和抗体衍生物，包括单价小分子抗体、多价小分子抗体如微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体，任选一种。
所述的鱼精蛋白，所述的鱼精蛋白，其特征在于，鱼精蛋白1、鱼精蛋白2、鱼精蛋白3；所述鱼精蛋白具有如下特征中的一个或多个：
(1)SEQ ID No.1，鱼精蛋白1包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.1人鱼精蛋白1的氨基酸序列(51aa)
(2)SEQ ID No.2，鱼精蛋白1包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.2人鱼精蛋白1的N-端氨基酸序列
(3)SEQ ID No.3，鱼精蛋白1包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.3人鱼精蛋白1的C-端氨基酸序列
(4)SEQ ID No.4，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.4人鱼精蛋白2的氨基酸序列(102aa)
(5)SEQ ID No.5，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.5人鱼精蛋白2的N-端氨基酸序列
(6)SEQ ID No.6，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.6人鱼精蛋白2的C-端氨基酸序列
(7)SEQ ID No.7，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.7鱼精蛋白2的分泌肽氨基酸序列
(8)SEQ ID No.8，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.8鱼精蛋白2成熟氨基酸序列
(9)SEQ ID No.9，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.鱼9精蛋白2的前体氨基酸序列
(10)SEQ ID No.10，鱼精蛋白3包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.19人鱼精蛋白3氨基酸序列(103aa)
(11)SEQ ID No.11，鱼精蛋白3包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.11人鱼精蛋白3的N-端氨基酸序列
(12)SEQ ID No.12，鱼精蛋白3包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.12人鱼精蛋白3的C-端氨基酸序列
SEQ ID No.1，所示的SEQ ID No.1人鱼精蛋白1的氨基酸序列(51aa)
MARYRCCRSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRSCQTRRRAMRCCRPRYRPRCRRH
SEQ ID No.2，所示的SEQ ID No.2人鱼精蛋白1的N-端氨基酸序列
MARYRCCRSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRSCQTRRRAM
SEQ ID No.3，所示的SEQ ID No.3人鱼精蛋白1的C-端氨基酸序列
RCCRPRYRPRCRRH
SEQ ID No.4，所示的SEQ ID No.4人鱼精蛋白2的氨基酸序列(102aa)
MVRYRVRSLSERSHEVYRQQLHGQEQGHHGQEEQGLSRMHVEVYERTHGQSQYRRRHC
SRRRLHRIHRRQHRSCRRRKRRSCRHRRRHRRGCRTRKRTCRRH
SEQ ID No.5，所示的SEQ ID No.5人鱼精蛋白2的N-端氨基酸序列
MVRYRVRSLSERSHEVYRQQLHGQEQGHHGQEEQGLSRMHVEVYERTHGQSQYRRRH
SEQ ID No.6，所示的SEQ ID No.6人鱼精蛋白2的C-端氨基酸序列
CSRRRLHRIHRRQHRSCRRRKRRSCRHRRRHRRGCRTRKRTCRRH
SEQ ID No.7，所示的SEQ ID No.7鱼精蛋白2的分泌肽氨基酸序列
MVRYRVRSLSERSHEVYRQQLHGQEQGHHGQEEQGLSRMHVEVYE
SEQ ID No.8，所示的SEQ ID No.8鱼精蛋白2成熟氨基酸序列
RTHGQSQYRRRHCSRRRLHRIHRRQHRSCRRRKRRSCRHRRRHRRGCRTRKRTCRRH
SEQ ID No.9，所示的SEQ ID No.鱼9精蛋白2的前体氨基酸序列
RTHGQSQYRRR
SEQ ID No.10，所示的SEQ ID No.19人鱼精蛋白3氨基酸序列(103aa)
MGSRCAKLNTGQSPGHSPGHSTGHGRGHESSMKKLMACVSQDNFSLSSAGEEEEEEEEE
GEEEEKEELPVQGKLLLLEPERQEEGHKDNAEAQQSPEPKRTPS
划线处“S”为磷酸化位点。
SEQ ID No.11，所示的SEQ ID No.11人鱼精蛋白3的N-端氨基酸序列
MGSRCAKLNTGQSPGHSPGHSTGHGRGHESSMKKLMACVSQDNFSLSSAGEEEEEEEEE
GEEEEKEELPV
SEQ ID No.12，所示的SEQ ID No.12人鱼精蛋白3的C-端氨基酸序列
QGKLLLLEPERQEEGHKDNAEAQQSPEPKRTPS
划线处“S”为磷酸化位点。
(10)与SEQ ID No.1-12其中之一所示的鱼精蛋白的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性、且具有所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列或多肽序列。
任选地，所述鼠抗体人源化(包括人－鼠嵌合抗体、改型抗体或人源化抗体或重构型抗体或CDR移植抗体)、小分子抗体(包括Fab抗体、Fc抗体、Fv抗体单链抗体、单域抗体、超变区多肽)、双特异性抗体或双功能抗体、三功能抗体、抗体融合蛋白、催化抗体、重组特异性抗体、人源性抗体或全人抗体、新型抗体和抗体衍生物(包括单价小分子抗体、多价小分子抗体如微型抗体、双链抗体、三链抗体)。
所述的增强型治疗性抗体是治疗性抗体与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽的结合形成的一种融合蛋白质，融合蛋白质的抗体融合或结合的部分形式包括以下：Fab与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、Fc与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、VH包括超变区第31～37、第51～68、第84～91、第101～110氨基酸序列与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、VL包括超变区第26～32、第50～56、第89～95氨基酸序列与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、互补决定区CDR(CDR1、CDR2、CDR3)或HVR(HVR1、HVR2、HVR3)与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、骨架区FR(FR1、FR2、FR3、FR4)与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、CH与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、CL与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽。任选一种。
所述的增强型治疗性抗体的核苷酸，包括以下：治疗性抗体的cDNA和鱼精蛋白的cDNA、治疗性抗体的cDNA和鱼精蛋白的mRNA、治疗性抗体的基因DNA和鱼精蛋白的基因DNA连接，而获得蛋白质或融合蛋白质或抗体或多肽形式。任选一种。
任选地，所述治疗性抗体的核苷酸，包括治疗性抗体cDNA和鱼精蛋白的cDNA、治疗性抗体的cDNA和鱼精蛋白的mRNA、治疗性抗体的基因DNA和鱼精蛋白的基因DNA连接，而获得蛋白质或融合蛋白质或抗体或多肽形式。任选一种。
所述的增强型治疗性抗体的核苷酸，包括治疗性抗体的cDNA、mRNA和基因DNA分别与鱼精蛋白的cDNA、mRNA和基因DNA连接，而获得蛋白质或融合蛋白质或抗体或多肽形式，其形式是，鱼精蛋白分别连接上述治疗性抗体的两端或插入治疗性抗体的中间。任选一种。
任选地，所述治疗性抗体的核苷酸，包括治疗性抗体的cDNA、mRNA和基因DNA分别与鱼精蛋白的cDNA、mRNA和基因DNA连接而获得蛋白质或融合蛋白质或抗体或多肽形式。任选一种。
所述的鱼精蛋白分别连接治疗性抗体的两端(N－端或C－端)或插入治疗性抗体的中间。任选一种。
所述的鱼精蛋白分别连接治疗性抗体的两端(N－端或C－端)或插入治疗性抗体的中间。在鱼精蛋白处连接His6标签便于纯化。任选一种。
增强型治疗性抗体所对应的效应细胞或靶细胞包括以下：T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、干细胞、肿瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞或骨髓瘤细胞中的任选一种。
任选地，所述T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、干细胞、肿瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞或骨髓瘤细胞。
所述的增强型治疗性抗体的遗传工程化的宿主细胞包括核苷酸的载体、转化或转导或转染到宿主细胞。
所述的增强型治疗性抗体的遗传工程化的宿主细胞表达系统包括哺乳动物表达系统、原核细胞表达系统、昆虫表达系统、酵母细胞表达系统和植物表达系统中任选一种。
所述的增强型治疗性抗体，哺乳动物表达系统的宿主细胞(CHO细胞、鼠骨髓瘤细胞、COS细胞、BHK-1细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、SP2/0、NIH/3T3)、原核细胞表达系统的宿主细胞(大肠埃希菌、枯草杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、苏云金杆菌、芽胞杆菌、链霉菌)、酵母细胞表达系统的(酿酒酵母、毕赤酵母、甲醇酵母、裂殖酵母)、昆虫表达系统的、植物表达系统的。任选一种。
所述的增强型治疗性抗体的纯化方法包括多种，具体包括(1)根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤、密度梯度离心、凝胶过滤；(2)根据溶解度差别分离：等电点沉淀法、盐溶与盐析；(3)根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；(4)根据蛋白质的选择吸附分离：颗粒吸附力；(5)根据配体特性的分离：亲和层析；(6)根据低温有机溶剂：沉淀法。任选一种。
所述的增强型治疗性抗体在治疗疾病上的应用，包括治疗以下疾病上的应用：恶性肿瘤或实体瘤或癌症、血液肿瘤(白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤)。
所述的增强型治疗性抗体，用于检测分析用途，包括成分组合和应用范围的增强型治疗性抗体或其免疫偶联物(ADC)。
所述的增强型治疗性抗体，用于治疗临床用途，包括成分组合和应用范围的增强型治疗性抗体或其免疫偶联物(ADC)。
本发明的技术方案的有益的技术效果有：
1.由治疗性抗体和鱼精蛋白组成而构建的增强型治疗性抗体，并非影响治疗性抗体本身的治疗性效应，相反，增加了治疗性抗体的治疗性作用。
2.由治疗性抗体和鱼精蛋白组成而构建的增强型治疗性抗体，可以减小该抗体在血管内皮细胞系统中被吞噬，从而延长治疗性抗体在血液循环系统中的时间，使治疗性抗体尽可能多的到达靶向目的。
3.由治疗性抗体和鱼精蛋白组成而构建的增强型治疗性抗体，可以减缓该抗体的代谢和降解，延长了该抗体的半衰期，尤其对治疗性抗体中的Fab抗体、Fc抗体、Fv抗体单链抗体、单域抗体、超变区多肽)、双特异性抗体或双功能抗体、三功能抗体、抗体融合蛋白、催化抗体、重组特异性抗体、人源性抗体或全人抗体、新型抗体和抗体衍生物(包括单价小分子抗体、多价小分子抗体如微型抗体、双链抗体、三链抗体效果更好。
4.由治疗性抗体和鱼精蛋白组成而构建的增强型治疗性抗体的鱼精蛋白，发挥鱼精蛋白作用，一方面通过T细胞的活化能力，另一方面激活补体系统的经典途径，介导补体依赖的细胞毒性的生物学功能，因此，弥补了该抗体的补体依赖的细胞毒性的生物学功能，发挥杀伤靶细胞如肿瘤细胞和炎症细胞的作用。
5.由治疗性抗体和鱼精蛋白组成而构建的增强型治疗性抗体的鱼精蛋白，发挥鱼精蛋白作用的同时，没有人抗鼠抗体(HAMA)的产生。
6.这种增强型治疗性抗体，尤其对悬浮的肿瘤细胞杀伤作用强，因此，该抗体对白血病细胞和实体瘤经血道转移的肿瘤细胞也具有较强的杀伤作用。
7.增加鱼精蛋白在临床上适应证的治疗范围。
附图和表说明
图1.实施例2中增强型治疗性抗体质粒构建。
图2.实施例3中增强型治疗性抗体纯化后ELISA鉴定。
图3.实施例3中增强型治疗性抗体纯化后WB鉴定。
图4.实施例3中增强型治疗性抗体的目的治疗性抗体和人鱼精蛋白WB鉴定。
图5.实施例4中增强型治疗性抗体的半衰期。
图6.实施例5中增强型治疗性抗体介导补体依赖性细胞毒性作用。
图7.实施例6中增强型治疗性抗体对B-NHL和B-ALL细胞的作用。
具体实施方式
实施例1鱼精蛋白cDNA和氨基酸序列
(1)SEQ ID No.13人鱼精蛋白1核苷酸序列如SEQID No.13所示，氨基酸序列如SEQID No.1所示。
人鱼精蛋白1mRNA(共304bp，其中划线为cDNA编码氨基酸序列156bp)
GACTCACAGCCCACAGAGTTCCACCTGCTCACAGGTTGGCTGGCTCAGCCAAGGTGGTGCCCTGCTCTGAGCATTCAGGCCAAGCCCATCCTGCACCATGGCCAGGTACAGATGCTGTCGCAGCCAGAGCCGGAGCAGATATTACC GCCAGAGACAAAGAAGTCGCAGACGAAGGAGGCGGAGCTGCCAGACACGGAGGAGAGCCATGAGGTGCTGCCGCCCC AGGTACAGACCGCGATGTAGAAGACACTAATTGCACAAAATAGCACATCCACCAAACTCCTGCCTGAGAATGTTACCAGACTTCAAGATCCTCTTGCCACATCTTGAAAATGCCACCATCCAATAAAAATCAGGAGCCTGCTAAGGAACAATGCCGCCTGTCAATAAATGTTGAAAAGTCATCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
(2)SEQ ID No.14人鱼精蛋白2核苷酸序列如SEQID No.14所示，氨基酸序列如SEQID No.4所示。
人鱼精蛋白2mRNA(共651bp，其中划线为cDNA编码氨基酸序列309bp)
GGTGGGCAGGCCTCCGCCCTCCTCCCCTACTCCAGGGCCCACTGCAGCCTCAGCCCAGGAGCCACCAGATCTCCCAACACCATGGTCCGATACCGCGTGAGGAGCCTGAGCGAACGCTCGCACGAGGTGTACAGGCAGCAGTTGCA TGGGCAAGAGCAAGGACACCACGGCCAAGAGGAGCAAGGGCTGAGCCGTATGCACGTCGAGGTCTACGAGAGGACCC ATGGCCAGTCTCAGTATAGGCGCAGACACTGCTCTCGAAGGAGGCTGCACCGGATCCACAGGCGGCAGCATCGCTCC TGCAGAAGGCGCAAAAGACGCTCCTGCAGGCACCGGAGGAGGCATCGCAGAGGCTGCAGAACCAGGAAGAGAACATG CAGAAGGCACTAAGCTTCCTGGGCCCCTCACCCCCAGCTGGAAATTAAGAAAAAGTCGCCCGAAACACCAAGTGAGGCCATAGCAATTCCCCTACATCAAATGCTCAAGCCCCCAGCTGGAAGTTAAGAGAAAGTCACCTGCCCAAGAAACACCGAGTGAGGCCATAGCAACTCCCCTACATCAAATGCTCAAGCCCTGAGTTGCCGCCGAGAAGCCCACAAGATCTGAAGTGAAATTGTGCAAAGTCACCTGCCCAATAAAGCTTGACAAGAC
(3)SEQ ID No.15人鱼精蛋白3的C-端核苷酸序列如SEQID No.12所示，氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
人鱼精蛋白3mRNA(共397bp，其中划线为cDNA编码氨基酸序列312bp)
ATGGGTTCCCGCTGTGCCAAGCTCAACACAGGCCAGAGCCCAGGCCACAGCCCAGGCCACAGCACGGG CCATGGCCGGGGCCACGAATCCTCCATGAAAAAGCTCATGGCCTGTGTGAGTCAGGATAACTTCTCCTTGTCATCA GCGGGCGAGGAAGAGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGGGGAAGAGGAGGAGAAAGAAGAGCTGCCGGTGCAGGGCAAGC TGCTGCTGCTGGAGCCTGAGCGGCAGGAGGAGGGCCACAAGGACAACGCCGAGGCCCAGCAGAGCCCCGAGCCCAA GCGGACACCCTCCTGACCCGCAACGAAGGCCCAGGAAGGGACGCCCACTGCTGCTCCGGCGACAGTGTTCAGAGAAGAGTCAATAAAAAGTCTCTGAGGAA实施例2增强型治疗性抗体构建和表达
增强型治疗性抗体的基本模式：目的治疗性抗体：(N-)抗人CD19重链可变区抗体+抗人轻链可变区抗体(C-)+人鱼精蛋白2+His6。基本扩增条件：95℃ 5min后，30次循环，95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，最后延长72℃ 5min。EcoR I和BamH I酶切位点引入PCR引物中。(N-)抗人CD19重链可变区抗体+抗人轻链可变区抗体(C-)+人鱼精蛋白2+His6cDNA(增强型治疗性抗体cDNA)克隆到pMD18T/L19表达质粒中，测序得到正确序列。
增强型治疗性抗体cDNA构建在pMD18T/L19表达质粒中，转导Escherichia colistrain BL21(DE3)(Novagen,Madison,WI)，LB(Luria Broth)培养基中添加Carbenicillin(50mg/ml)，在37℃加入0.4mM异丙基-D-硫半乳糖苷(IPTG)诱导生产目的蛋白质，其达到A600的0.6～0.8，表达持续4～5小时，达到A600的4～5。将培养物离心8000g×20分钟，再悬浮于250毫升含有50mM Tri/HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM EDTA、100g/ml溶菌酶、10g/mlDNase和10g/ml RNase的缓冲液中，然后在4℃下30分钟用超声波彻底裂解。随后，在4℃下，离心14000g×20分钟，用SDS/PAGE分析，确定表达目的蛋白质的特征。根据抗His标签抗体、抗人鱼精蛋白抗体和抗c-myc抗体进行鉴定。
实施例3增强型治疗性抗体的纯化和鉴定
纯化表达的目的蛋白质，从培养基中得到的球团用缓冲液(20mM Tris/HCl，pH8.0，3％(V/V)Triton X-100和1M尿素)洗涤两次，再悬浮于200ml变性缓冲液中(20mMTris/HCl，pH 8.0，8M尿素，150mM NaCl，10mM咪唑和10mM2-巯基乙醇)。在25℃保存，轻轻摇晃，以确保渗透体完全溶解。用固定化金属离子亲和色谱(immobilized metal-ion-affinity chromatography,IMAC)在变性条件下纯化蛋白质。在4℃下，变性混合物，14000g×20分钟，上清液。包涵体在溶解缓冲液中溶解20:1比例(7M盐酸胍-丁氨酸，50mM Tris，50mM NaCl，5mM乙基二氨基四乙酸，50mM二硫代苏糖醇，pH 8.0)，37℃，孵育1小时。离心后上清液用复性缓冲液(50mM Tr-HCl，50mMNaCl，0.8mM L-精氨酸，20％甘油，5mM EDTA，1mMGSSG，pH 8.0)稀释(20倍)，4℃，孵育2天。在4℃下，14000g×20分钟，获得上清液。将上清液加载到10ml Ni-NTA琼脂糖柱上，与上述变性缓冲液预平衡，流速为0.5ml/min。在装入混合物后，用缓冲液(20mM TrI/HCl，pH 8.0，8M尿素，500mM NaCl，20mM咪唑和10mM 2-巯基乙醇)洗涤柱，以1ml/min洗涤，直到衰减达到基线。用缓冲液(20mM TrI/HCl，pH 8.0，8M尿素，150mM NaCl，250mM咪唑和10mM 2-巯基乙醇)洗脱目标蛋白，并用SDS/PAGE检查其纯度。对于目的蛋白质复性，将纯化的蛋白质用变性缓冲液稀释到250g/ml，在透析袋中，并对硼酸盐缓冲液(0.9％(W/V)硼酸和0.3％(W/V)NaOH，pH 9.5)含有尿素(4,2,1和0M)进行逐步尿素去除透析(1:50，V/V)。每次透析步骤4小时，利用L-精氨酸(0.5M)和GSH/GSSG(1mM/1mM)作为2,1和0M尿素的复性添加剂。在逐步透析后，将蛋白质溶液在4℃下用100倍体积的Tri/HCl(pH 8.0)缓冲液再透析两次，以除去残余杂质。在4℃下，离心14000g×30分钟，然后将蛋白溶液通过0.22mm孔径的过滤器，以除去潜在的抗体和微生物。最后，用超常离心法浓缩蛋白，使用CysCimon微集中器(Ashesam Bisosistices)，用BSA法定量，以BSA为对照，冻干使用。采用TSK-G3000SWXL色谱柱(7.8mm×300mm；Tosoh公司)，用脱气1×PBS(pH 7.4)平衡，进行HPLC凝胶过滤分析。目的蛋白质用于TSK-G3000-SWXL柱校准，使用标准蛋白。测定目的蛋白质分子量。
(1)ELISA：CD19和人鱼精蛋白2抗体100ng/100l/孔分别结合到96孔平底板，4℃，孵育18小时。用1×PBS(pH 7.4)(pH 7.4)洗涤后，加入100l/孔封闭液，在37℃条件下放置2小时。用1×PBS(pH 7.4)洗涤后，采用HRP偶联的抗His标签抗体或HRP偶联的抗人鱼精蛋白2抗体或HRP偶联的抗c-myc抗体检测目的蛋白质。显色100l/孔，含有0.016％(v/v)H2O2的邻苯二胺(OPD)溶液。用ELISA阅读器测定每个孔在490nm处的吸光度。设立阳性对照和阴性对照。结果：增强型治疗性抗体结合CD9与增强型治疗性抗体结合鱼精蛋白2抗体质基本一致。说明表达的增强型治疗性抗体是由抗人CD19抗体和人鱼精蛋白2组成。如图2所示。
(2)Western Blot：在12％TIS-甘氨酸的SDS-PAGE电泳条件下，将样品分离并转移至硝酸纤维素膜上，采用HRP偶联的抗His标抗体或HRP偶联的抗人鱼精蛋白2抗体或HRP偶联的抗c-myc抗体检测目的蛋白质。
结果：用抗人鱼精蛋白2抗体确定增强型治疗性抗体的浓度情况。如图3所示。
结果：用抗人鱼精蛋白2抗体或抗c-myc抗体或抗His标签抗体检测增强型治疗性抗体的分子量。如图4所示。
实施例4增强型治疗性抗体的半衰期
人血清稀释增强型治疗性抗体至15g/ml(至少20倍)，孔径为0.2m(MeBrPaule，LOrrWeeRiver，德国)MeBrimx 4CA过滤器进行过滤。在无菌条件下，制备等分试样(100l)，保存于37℃。在给定时间点，将等分试样冷冻保存在80℃。样品活性进行分析。结果：(1)增强型治疗性抗体半衰期约33时；(2)治疗性抗体半衰期约15小时；(3)增强型治疗性抗体半衰期是治疗性抗体半衰期的一倍。
实施例5增强型治疗性抗体对补体的作用
5×104细胞接种于96孔板中(100l/孔，Nunc)，在人补体(1:20最终稀释液，QuidelCorp.)存在条件下，加入连续稀释(浓度范围，3.33×10-8～2.6×10-10mol/L)的增强型治疗性抗体，培养箱条件2h，37℃，5％CO2。用VyBrand细胞代谢分析ResaZurin试剂盒(Invitrogen)对活细胞进行定量。结果：细胞数减少提示补体依赖性细胞毒性作用。
实施例6增强型治疗性抗体的抗肿瘤作用
5×104非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和急性B细胞型淋巴细胞性白血病(B-ALL)细胞系分别接种于96孔板中(100l/孔)，在RPMI 1640培养基中添加10％胎牛血清和100U/mlpenicillin/streptomycin的二氧化碳细胞培养箱中进行培养。细胞培养第2天，加入增强型治疗性抗体(100g/ml)。定期对细胞进行计数。结果：增强型治疗性抗体细胞具有杀伤作用。
实施例7增强型治疗性抗体构建和表达
增强型治疗性抗体的基本模式：目的增强型治疗性抗体：人鱼精蛋白2+(N-)抗人CD19重链可变区抗体+抗人轻链可变区抗体(C-)+His6。基本扩增条件：95℃ 5min后，30次循环，95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，最后延长72℃ 5min。EcoR I和BamH I酶切位点引入PCR引物中。人鱼精蛋白2+(N-)抗人CD19重链可变区抗体+抗人轻链可变区抗体(C-)+His6cDNA(增强型治疗性抗体cDNA)克隆到pMD18T/L19表达质粒中，测序得到正确序列。
增强型治疗性抗体cDNA构建在pMD18T/L19表达质粒中，转导Escherichia colistrain BL21(DE3)(Novagen,Madison,WI)，LB(Luria Broth)培养基中添加Carbenicillin(50mg/ml)，在37℃加入0.4mM异丙基-D-硫半乳糖苷(IPTG)诱导生产目的蛋白质，其达到A600的0.6～0.8，表达持续4～5小时，达到A600的4～5。将培养物离心8000g×20分钟，再悬浮于250毫升含有50mM Tri/HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM EDTA、100g/ml溶菌酶、10g/mlDNase和10g/ml RNase的缓冲液中，然后在4℃下30分钟用超声波彻底裂解。随后，在4℃下，离心14000g×20分钟，用SDS/PAGE分析，确定表达目的蛋白质的特征。根据抗His标签单克隆抗体、抗人鱼精蛋白单克隆抗体和抗c-myc单克隆抗体进行鉴定。结果：目的治疗性抗体：人鱼精蛋白2+(N-)抗人CD19重链可变区抗体+抗人轻链可变区抗体(C-)+His6的效果与实施例3增强型治疗性抗体纯化和鉴定、实施例4增强型治疗性抗体对半衰期、实施例5增强型治疗性抗体对补体作用、实施例6增强型治疗性抗体对抗肿瘤作用基本一致。
实施例8增强型治疗性抗体构建和表达
增强型治疗性抗体的基本模式：目的增强型治疗性抗体：(N-)抗人CD19重链可变区抗体+人鱼精蛋白2+抗人轻链可变区抗体(C-)+His6。基本扩增条件：95℃ 5min后，30次循环，95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，最后延长72℃5min。EcoR I和BamH I酶切位点引入PCR引物中。(N-)抗人CD19重链可变区抗体+人鱼精蛋白2+抗人轻链可变区抗体(C-)+His6cDNA(增强型治疗性抗体cDNA)克隆到pMD18T/L19表达质粒中，测序得到正确序列。
增强型治疗性抗体cDNA构建在pMD18T/L19表达质粒中，转导Escherichia colistrain BL21(DE3)(Novagen,Madison,WI)，LB(Luria Broth)培养基中添加Carbenicillin(50mg/ml)，在37℃加入0.4mM异丙基-D-硫半乳糖苷(IPTG)诱导生产目的蛋白质，其达到A600的0.6～0.8，表达持续4～5小时，达到A600的4～5。将培养物离心8000g×20分钟，再悬浮于250毫升含有50mM Tri/HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM EDTA、100g/ml溶菌酶、10g/mlDNase和10g/ml RNase的缓冲液中，然后在4℃下30分钟用超声波彻底裂解。随后，在4℃下，离心14000g×20分钟，用SDS/PAGE分析，确定表达目的蛋白质的特征。根据抗His标签抗体、抗人鱼精蛋白抗体和抗c-myc抗体进行鉴定。结果：目的治疗性抗体：(N-)抗人CD19重链可变区抗体+抗人轻链可变区抗体(C-)+人鱼精蛋白2+His6的效果与实施例3增强型治疗性抗体纯化和鉴定、实施例4增强型治疗性抗体对半衰期、实施例5增强型治疗性抗体对补体作用、实施例6增强型治疗性抗体对抗肿瘤作用基本一致。
除非另作定义，本发明权利要求书和说明书中使用的技术术语或科学术语应当为本发明所属技术领域内具有一般技能人士所理解的通常意义。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对本发明要求保护的范围不起任何限定作用。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉原生药谷生物医药科技有限公司
<120> 一种增强型治疗性抗体及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 304
<212> mRNA
<213> 人鱼精蛋白1 mRNA
<400> 1
GACTCACAGCCCACAGAGTTCCACCTGCTCACAGGTTGGCTGGCTCAGCCAAGGTGGTGCCCTGCTCTGAGCATTCAGGCCAAGCCCATCCTGCACCATGGCCAGGTACAGATGCTGTCGCAGCCAGAGCCGGAGCAGATATTACCGCCAGAGACAAAGAAGTCGCAGACGAAGGAGGCGGAGCTGCCAGACACGGAGGAGAGCCATGAGGTGCTGCCGCCCCAGGTACAGACCGCGATGTAGAAGACACTAATTGCACAAAATAGCACATCCACCAAACTCCTGCCTGAGAATGTTACCAGACTTCAAGATCCTCTTGCCACATCTTGAAAATGCCACCATCCAATAAAAATCAGGAGCCTGCTAAGGAACAATGCCGCCTGTCAATAAATGTTGAAAAGTCATCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 2
<211> 651
<212> mRNA
<213> 人鱼精蛋白2 mRNA
<400> 2
GGTGGGCAGGCCTCCGCCCTCCTCCCCTACTCCAGGGCCCACTGCAGCCTCAGCCCAGGAGCCACCAGATCTCCCAACACCATGGTCCGATACCGCGTGAGGAGCCTGAGCGAACGCTCGCACGAGGTGTACAGGCAGCAGTTGCATGGGCAAGAGCAAGGACACCACGGCCAAGAGGAGCAAGGGCTGAGCCGTATGCACGTCGAGGTCTACGAGAGGACCCATGGCCAGTCTCAGTATAGGCGCAGACACTGCTCTCGAAGGAGGCTGCACCGGATCCACAGGCGGCAGCATCGCTCCTGCAGAAGGCGCAAAAGACGCTCCTGCAGGCACCGGAGGAGGCATCGCAGAGGCTGCAGAACCAGGAAGAGAACATGCAGAAGGCACTAAGCTTCCTGGGCCCCTCACCCCCAGCTGGAAATTAAGAAAAAGTCGCCCGAAACACCAAGTGAGGCCATAGCAATTCCCCTACATCAAATGCTCAAGCCCCCAGCTGGAAGTTAAGAGAAAGTCACCTGCCCAAGAAACACCGAGTGAGGCCATAGCAACTCCCCTACATCAAATGCTCAAGCCCTGAGTTGCCGCCGAGAAGCCCACAAGATCTGAAGTGAAATTGTGCAAAGTCACCTGCCCAATAAAGCTTGACAAGAC
<210> 3
<211> 397
<212> mRNA
<213> 人鱼精蛋白3 mRNA
<400> 3
ATGGGTTCCCGCTGTGCCAAGCTCAACACAGGCCAGAGCCCAGGCCACAGCCCAGGCCACAGCACGGGCCATGGCCGGGGCCACGAATCCTCCATGAAAAAGCTCATGGCCTGTGTGAGTCAGGATAACTTCTCCTTGTCATCAGCGGGCGAGGAAGAGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGGGGAAGAGGAGGAGAAAGAAGAGCTGCCGGTGCAGGGCAAGCTGCTGCTGCTGGAGCCTGAGCGGCAGGAGGAGGGCCACAAGGACAACGCCGAGGCCCAGCAGAGCCCCGAGCCCAAGCGGACACCCTCCTGACCCGCAACGAAGGCCCAGGAAGGGACGCCCACTGCTGCTCCGGCGACAGTGTTCAGAGAAGAGTCAATAAAAAGTCTCTGAGGAA

Claims (12)

1.一种增强型治疗性抗体，包括以下组分：抗体、鱼精蛋白。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包括：人抗体；具体包括治疗性抗体、药物性抗体、抗体药物、或其抗原结合的抗体部分或抗体片段，所述的治疗性抗体包括基因工程抗体、天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的增强型治疗性抗体，其特征在于，所述的基因工程抗体包括以下：鼠抗体人源化，包括人-鼠嵌合抗体、改型抗体或人源化抗体或重构型抗体或CDR移植抗体；小分子抗体，包括Fab抗体、Fc抗体、Fv抗体单链抗体、单域抗体、超变区多肽；双特异性抗体或双功能抗体；三功能抗体；抗体融合蛋白；催化抗体；重组特异性抗体；人源性抗体或全人抗体；新型抗体和抗体衍生物，包括单价小分子抗体、多价小分子抗体如微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体。
4.根据权利要求1所述的鱼精蛋白，其特征在于，所述的鱼精蛋白包括：人鱼精蛋白；具体包括鱼精蛋白1、鱼精蛋白2、鱼精蛋白3，其中，鱼精蛋白氨基酸序列包括鱼精蛋白1氨基酸序列、鱼精蛋白2氨基酸序列、鱼精蛋白3氨基酸序列，所述鱼精蛋白氨基酸序列具有如下特征中的一个或多个：
(1)SEQ ID No.1，鱼精蛋白1包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.1人鱼精蛋白1的氨基酸序列51aa；
(2)SEQ ID No.2，鱼精蛋白1包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.2人鱼精蛋白1的N-端氨基酸序列；
(3)SEQ ID No.3，鱼精蛋白1包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.3人鱼精蛋白1的C-端氨基酸序列；
(4)SEQ ID No.4，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.4人鱼精蛋白2的氨基酸序列102aa；
(5)SEQ ID No.5，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.5人鱼精蛋白2的N-端氨基酸序列；
(6)SEQ ID No.6，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.6人鱼精蛋白2的C-端氨基酸序列；
(7)SEQ ID No.7，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.7鱼精蛋白2的分泌肽氨基酸序列；
(8)SEQ ID No.8，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.8鱼精蛋白2成熟氨基酸序列；
(9)SEQ ID No.9，鱼精蛋白2包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.鱼9精蛋白2的前体氨基酸序列；
(10)SEQ ID No.10，鱼精蛋白3包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.19人鱼精蛋白3氨基酸序列103aa；
(11)SEQ ID No.11，鱼精蛋白3包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.11人鱼精蛋白3的N-端氨基酸序列；
(12)SEQ ID No.12，鱼精蛋白3包括氨基酸序列如所示的SEQ ID No.12人鱼精蛋白3的C-端氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的鱼精蛋白氨基酸序列，所述的鱼精蛋白氨基酸序列，鱼精蛋白氨基酸序列SEQ ID No.1-12其中之一所示的氨基酸序列与具有80％或80％以上同源性、且具有所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列或多肽序列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的增强型治疗性抗体，所述的增强型治疗性抗体是治疗性抗体与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽结合形成的一种融合蛋白质，其特征在于，融合蛋白质的抗体部分的融合或结合形式包括以下：Fab抗体与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、Fc抗体与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、VH包括超变区第31～37、第51～68、第84～91、第101～110氨基酸序列与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、VL包括超变区第26～32、第50～56、第89～95氨基酸序列与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、互补决定区CDR(CDR1、CDR2、CDR3)或HVR(HVR1、HVR2、HVR3)与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、骨架区FR(FR1、FR2、FR3、FR4)与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、CH与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽、CL与鱼精蛋白或鱼精蛋白片段或鱼精蛋白多肽。
7.根据权利要求6所述的增强型治疗性抗体，其特征在于，包括以下：治疗性抗体的核苷酸序列和鱼精蛋白的核苷酸序列；治疗性抗体的氨基酸序列和鱼精蛋白的氨基酸序列；治疗性抗体的核苷酸序和鱼精蛋白的氨基酸序列；治疗性抗体的氨基酸序列和鱼精蛋白的核苷酸序列连接而获得蛋白质或融合蛋白质或抗体或多肽形式，所述多肽包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包括如权利要求1-6任一项权利要求所述的鱼精蛋白。
8.根据权利要求7任一项所述的增强型治疗性抗体，其特征在于，所述的鱼精蛋白分别连接治疗性抗体的两端或插入治疗性抗体的中间，在鱼精蛋白处连接His6标签便于纯化；所述的治疗性抗体的两端为N－端或C－端。
9.根据权利要求1-4任一项所述的增强型治疗性抗体，其特征在于，所述的增强型治疗性抗体包括效应细胞或靶细胞，包括以下：T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞DC、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、干细胞、肿瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞或骨髓瘤细胞中的任意一种。
10.根据权利要求1-4任一项所述的增强型治疗性抗体，其特征在于，所述的增强型治疗性抗体包括遗传工程化的宿主细胞，包括以下：核苷酸的载体、转化或转导或转染到宿主细胞；所述的增强型治疗性抗体包括宿主表达系统，包括以下：哺乳动物表达系统、原核细胞表达系统、酵母细胞表达系统、昆虫表达系统或植物表达系统。
11.根据权利要求1-4任一项所述的增强型治疗性抗体，其特征在于，所述的增强型治疗性抗体的遗传工程化的宿主细胞，包括以下：哺乳动物表达系统的宿主细胞，即CHO细胞、鼠骨髓瘤细胞、COS细胞、BHK-1细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、SP2/0、或NIH/3T3；原核细胞表达系统的宿主细胞，即大肠埃希菌、枯草杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、苏云金杆菌、芽胞杆菌、或链霉菌；酵母细胞表达系统的酿酒酵母、毕赤酵母、甲醇酵母、或裂殖酵母；昆虫表达系统和植物表达系统。
12.根据权利要求1-11任一项所述的增强型治疗性抗体在制备治疗恶性肿瘤或实体瘤或癌症、血液肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤的药物上的应用。
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