CN107893052A - 融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式I所示的融合蛋白，以及在表面表达所述融合蛋白的免疫效应细胞Z‑A‑L‑BI其中，Z是任选的信号肽；A是抗体结合区；L是任选的接头部分；B是内吞功能区。本发明还提供一种表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述免疫细胞还表达融合蛋白，该融合蛋白含有抗体结合区和内吞功能区。本发明的免疫效应细胞可以用所述抗体结合区的特异性抗体偶联药物进行杀伤，具备优异的差异毒性。并且，由于该融合蛋白能够介导内吞，使得在结合抗体偶联药物后，使得抗体偶联药物被内吞入细胞内，进而在细胞内发挥对细胞的杀伤，从而具备显著的杀伤能力。

Description

融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及控制嵌合抗原受体免疫 效应细胞或TCR-T细胞的融合蛋白及其应用。
背景技术
近年来，针对恶性肿瘤的过继免疫疗法(adoptive cell therapy，ACT)，如 CAR-T、TCR-T等取得了长足的进展，其中CAR-T疗法的发展最为显著。
然而，伴随着CAR-T细胞疗法临床实验的开展，也出现了很多严重的副反 应，如细胞因子风暴、脱靶效应等，当出现严重不良反应时，如果不能及时抑 制CAR-T细胞，会导致严重的不良反应甚至危及患者生命。因此，在使用CAR-T 治疗时，有必要同时引入一种安全开关，当患者使用CAR-T细胞后产生严重不 良反应危机生命时，体内的CAR-T细胞能被有效且特异性的清除。
目前应用于细胞治疗的安全开关主要包括两种形式：自杀基因和标记基 因。
自杀基因主要包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidinekinase,HSV-TK)以及可诱导的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(inducible caspase-9,iCasp9)。HSV-TK自杀基因是通过在T细胞上表达HSV-TK，大大增强 了T细胞对更昔洛韦药物的敏感性。然而，由于HSV-TK会在病人体内产生免疫 原性，并且接受细胞治疗的病人将不能继续使用更昔洛韦作为抗病毒药物，这 两点极大地限制了HSV-TK在临床上的使用。iCasp9是通过在病人体内施加小分 子药物(AP20187)，从而诱导表达iCasp9自杀基因的T细胞的发生凋亡。只是 AP20187尚未完成商业化，限制了iCasp9自杀基因的普及。
标记基因通过在T细胞表面表达一种能被抗体识别的特异性标志物，使得T 细胞具备了能够被分选、检测以及清除。如Hum Gene Ther,11(4):611-20报导 了在T细胞表面表达CD20受体，使得T细胞能够被抗CD20单克隆抗体识别并被 杀死；Blood,118(5):1255-1263报导了在CAR-T细胞上共表达一段能够被抗 EGFR单克隆抗体识别的截短的EGFR受体。
标志基因的发展拓宽了安全开关的应用范围，但是由于其杀伤效果往往是 由补体依赖的细胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC)以及抗体依 赖的细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC) 所介导的，其杀伤效果依赖于补体系统和体内NK细胞的活性。当病人体内补体 系统或NK细胞活性出现缺陷时，其杀伤能力往往受限。这些缺点限制了这些标 志基因的应用。
因此，伴随着细胞治疗快速发展及临床应用，本领域迫切需要一种能够有 效且特异地杀伤T细胞的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述免疫 效应细胞的表面同时表达有一种融合蛋白，借助该融合蛋白，可以利用特异性 抗体偶联药物对该免疫效应细胞进行高效杀伤。
在第一方面，本发明提供一种在表面表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞， 所述免疫细胞还表达式I所示的融合蛋白，
Z-A-L-B
I
其中，Z是任选的信号肽；
A是抗体结合区；
L是任选的接头部分；
B是内吞功能区。
本发明还提供这样的表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述免疫细胞还 表达一融合蛋白，该融合蛋白含有抗体结合区和内吞功能区。
在优选的实施方式中，所述抗体结合区为在正常细胞中不存在、或者在正 常细胞中为隐蔽状态、或者在正常细胞中低表达的多肽。
在具体的实施方式中，所述的抗体结合区选自以下抗原或其片段： EGFRvIII、EGFR、CD20、CD22、CD19、BCMA、proBDNF前体蛋白、GPC3、 CLD18.2、CLD6、间皮素、PD-L1、PD-1、WT-1、IL13Ra2、Her-2、Her-1、 Her-3；
优选的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列或者含有与以下氨基 酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％ 同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43；
更优的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列的活性片段：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43。
在具体的实施方式中，所述抗体结合区与EGFR抗体特异性结合。
在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的胞外部分与所述的融合蛋白不 具有结合能力。
在具体的实施方式中，所述内吞功能区衍生自叶酸受体、LDL、CD30、 CD33、CD3、EGFR、TFR1；优选衍生自叶酸受体和CD30；更优地，所述内吞 功能区具有SEQ ID NO：32或44所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：32或44 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一 性的氨基酸序列，或者为SEQ ID NO:32或44所示的氨基酸序列的活性片段。
在具体的实施方式中，所述信号肽为叶酸受体信号肽。
在具体的实施方式中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序 列或者含有与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列或其活性片段。
在具体的实施方式中，所述融合蛋白与嵌合抗原受体在免疫效应细胞表面 单独表达或融合表达，优选单独表达。
在优选的实施方式中，所述的内吞功能区能将与所述的抗体结合区或内吞 功能区结合的物质转运入所述的免疫效应细胞内。
在优选的实施方式中，所述物质转运入所述的免疫效应细胞后启动对所述 免疫效应细胞的杀伤。
在优选的实施方式中，所述物质是抗体药物偶联物或抗体药物缀合物 (ADC)。
在第二方面，本发明提供一种表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述细 胞还表达内吞功能区，所述的内吞功能区能将与所述内吞功能区结合的物质转 运入所述的免疫效应细胞内。
在优选的实施方式中，所述物质转运入所述的免疫效应细胞后启动对所述 免疫效应细胞的杀伤。
在优选的实施方式中，所述物质是抗体药物偶联物或抗体药物缀合物 (ADC)。
在具体的实施方式中，所述内吞功能区衍生自叶酸受体、LDL、CD30、 CD33、CD3、EGFR、TFR1；优选衍生自叶酸受体和CD30；更优地，所述内吞 功能区具有SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:32或44具 有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性 的氨基酸序列，或者为SEQ ID NO:32或44所示的氨基酸序列的活性片段。
在具体的实施方式中，所述内吞功能区与嵌合抗原受体在免疫效应细胞表 面单独表达或融合表达，优选单独表达。
在第三方面，本发明提供式I所示的融合蛋白，
Z-A-L-B
I
其中，Z是任选的信号肽；
A是抗体结合区；
L是任选的接头部分；
B是内吞功能区。
本发明还提供这样的融合蛋白，所述融合蛋白包含抗体结合区和内吞功能 区。
在优选的实施方式中，所述抗体结合区为在正常细胞中不存在、或者在正 常细胞中为隐蔽状态、或者在正常细胞中低表达的多肽。
在具体的实施方式中，所述的抗体结合区选自以下抗原或其片段： EGFRvIII、EGFR、CD20、CD22、CD19、BCMA、proBDNF前体蛋白、GPC3、 CLD18.2、CLD6、间皮素、PD-L1、PD-1、WT-1、IL13Ra2、Her-2、Her-1、 Her-3；
优选的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列或者含有与以下氨基 酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％ 同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43；
更优的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列的活性片段：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43。
在具体的实施方式中，所述抗体结合区与EGFR抗体特异性结合。
在具体的实施方式中，所述内吞功能区衍生自叶酸受体、LDL、CD30、 CD33、CD3、EGFR、TFR1；优选衍生自叶酸受体和CD30；更优地，所述内吞 功能区具有SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：32或44 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一 性的氨基酸序列，或者为SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列的活性片段。
在具体的实施方式中，所述信号肽为叶酸受体信号肽。
在具体的实施方式中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序 列或者含有与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列或其活性片段。
在第四方面，本发明提供本发明第三方面所述的融合蛋白的编码核酸。
在第五方面，本发明提供一种表达载体，包含本发明第三方面所述的编码 核酸。
在第六方面，本发明提供一种宿主细胞，包含本发明第五方面所述的表达 载体或基因组中整合有本发明第四方面所述的编码核酸。
在第七方面，本发明提供一种免疫辍合物，所述免疫辍合物包括：
细胞杀伤性功能部分；和
特异性结合本发明第一方面所述免疫效应细胞中的抗体结合区或内吞功 能区的抗体或者特异性结合本发明第二方面所述免疫效应细胞中的内吞功能 区的抗体。
在优选的实施方式中，所述细胞杀伤性功能部分为小分子药物或杀伤性细 胞因子，包括但不限于MMAF、Auristatin、卡奇霉素、美登素、美坦辛、阿霉 素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、DM1、DM4、MGBA、SN-38(参见：Sassoon I,Blanc V.Antibody-Drug Conjugate(ADC)Clinical Pipeline:A Review[M]// Antibody-Drug Conjugates.Humana Press,2013:1-27)。
在第八方面，本发明提供本发明第七方面所述免疫辍合物在特异性杀伤本 发明第一或第二方面所述免疫效应细胞中的用途。
在第九方面，本发明提供一种试剂盒，包含本发明第一或第二方面所述的 免疫效应细胞或本发明第七方面所述的免疫缀合物。
在第十方面，本发明提供特异性清除本发明第一或第二方面所述免疫效应 细胞的方法，所述方法包括给予本发明第七方面所述的免疫缀合物的步骤。
在优选的实施方式中，所述免疫缀合物的给予浓度不低于0.1μg/ml；优选 0.1μg/ml～100μg/ml；更优的，为1μg/ml-100μg/ml；更优的，为10μg/ml。
在优选的实施方式中，所述物质对不表达本发明第三方面所述融合蛋白的 细胞几乎没有杀伤。
在第十一方面，本发明提供一种分选或富集本发明第一或第二方面所述的 免疫效应细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
将分选试剂加入包含所述免疫效应细胞的体系，所述分选试剂包含能够特 异性结合本发明第一方面所述免疫效应细胞中的抗体结合区或内吞功能区的 物质或者特异性结合本发明第二方面所述免疫效应细胞中的内吞功能区的物 质；和
将结合有所述免疫效应细胞的物质从所述体系分离的步骤。
在优选的实施方式中，所述物质是抗体或其活性片段。
在具体的实施方式中，能够特异性结合本发明第一方面所述免疫效应细胞 中的抗体结合区或内吞功能区的物质或者特异性结合本发明第二方面所述免 疫效应细胞中的内吞功能区的物质固定于固相载体，从而能够实现结合有所述 免疫效应细胞的物质从所述体系分离。
在优选的实施方式中，所述固相载体是磁珠或树脂。
在优选的实施方式中，所述物质是抗体或其活性片段。
在优选的实施方式中，所述分选试剂的浓度不低于0.01μg/ml；优选0.01 μg/ml～100μg/ml；更优的，为0.1μg/ml-10μg/ml；更优的，为10μg/ml。
在优选的实施方式中，所述分选试剂对所述免疫效应细胞的分选效率大于 80％。
在第十二方面，本发明提供检测本发明第一或第二方面所述的免疫效应细 胞的方法，所述方法包括：
给予特异性结合本发明第一方面所述免疫效应细胞中的抗体结合区或内 吞功能区的检测试剂或者特异性结合本发明第二方面所述免疫效应细胞中的 内吞功能区的检测试剂，所述检测试剂与可检测标记物相连；和
检测所述检测试剂与所述免疫效应细胞形成的复合物。
在优选的实施方式中，所述检测试剂是抗体或其活性片段。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了构建本发明融合蛋白的示意图；
图2A显示了表达FR806融合蛋白的T细胞与CH12抗体的流式测试图；图2B 显示了表达EGFR的Keratinocyte细胞和HEK-293T细胞与CH12抗体的流式测试 图；
图3显示了CH12-biotin对FR806的亲和力；
图4显示了利用CH12-biotin分选FR806阳性细胞的结果；
图5显示了FR806融合受体介导CH12抗体的内吞；
图6A显示了CH12-MMAF和CH12与表达FR806的T细胞的结合能力；图6B 显示了CH12-MMAF被FR806+T-cells的内吞情况；图6C显示了不同浓度的 CH12-MMAF在不同的时间对表达FR806的T细胞的杀伤；图6D显示了 CH12-MMAF对人Keratinocy细胞的杀伤作用；
图7A显示了CCK8检测的CH12-MMAF及游离MMAF对FR806阳性和阴性T 细胞的杀伤效果；图7B显示了CH12-MMAF及游离MMAF对FR806阳性和阴性 的293T细胞的杀伤效果；
图8A显示了FR806与αCD19CAR及与eGFP的拼接模式；图8B显示了表面表 达有CAR19及FR806的CAR-T细胞的流式分析结果；图8C显示了采用 CH12-biotin对FR806-CAR19的T细胞的分选；
图9A显示了FR806与αCD19CAR的拼接方式，图9B显示了表达有按照 CAR19和FR806的T细胞的流式分析结果；
图10A显示了表达FR806和不表达FR806的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤 结果；图10B显示了表达FR806和不表达FR806的CAR-T细胞的细胞因子释放结 果；
图11A显示了CH12-MMAF对共表达FR806和CAR的T细胞的杀伤；图11B 为CH12-MMAF的浓度对共表达FR806和CAR的T细胞的杀伤作用；
图12A为人CD3+细胞圈门分析eGFP阳性率的图；图12B显示了CH12-MMAF及生理盐水对表达FR806-CAR19-eGFP的CAR-T细胞的体内杀伤 效果；图12C显示了给予CH12-MMAF和生理盐水后，CD3+/eGFP+在小鼠血液、 脾脏、及骨髓中的检出率，n＝6；
图13显示了CH12-MMAF对共表达CD30806和CAR的T细胞的杀伤。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在表达嵌合抗原受体的免 疫效应细胞表面表达包含抗体结合区、任选的接头部分以及内吞功能区构成的 融合蛋白，得到的免疫效应细胞可以用所述抗体结合区的特异性抗体杀伤。所 述抗体结合区优选在正常细胞中不存在，当施予特异性结合该抗体结合区的抗 体时，不会和正常细胞结合，因此，不会杀伤正常细胞；而即便在正常细胞上 有暴露，由于杀伤免疫效应细胞的给药量很少，也不会对正常细胞造成太大影 响。并且，由于该融合蛋白能够介导内吞，使得对细胞的杀伤在细胞膜内部完 成，杀伤能力显著。本发明还提供仅表达内吞功能区的表达嵌合抗原受体的免 疫效应细胞，所述的内吞功能区能将与所述内吞功能区结合的物质或与所述免 疫效应细胞表面的抗原结合的物质转运入所述的免疫效应细胞内。由于所述物 质在内吞后对所述免疫效应细胞的杀伤作用也在细胞膜内完成，杀伤能力显 著。在此基础上完成了本发明。
本发明的融合蛋白及免疫效应细胞
为特异性地杀伤免疫效应细胞，发明人在表达嵌合抗原受体的免疫效应细 胞表面表达由抗体结合区、任选的接头部分以及内吞功能区构成的融合蛋白， 即，安全开关。在本发明中，“本发明的融合蛋白”与“安全开关”具有相同的意 义。在具体的实施方式中，所述免疫效应细胞包括但不限于T细胞或NK细胞。 此外，在本文中，所用的术语“活性片段”是指具有某种活性的蛋白或多肽的一 部分，即，活性片段并非全长的蛋白或多肽，但具有与该蛋白或多肽相同或相 似的活性。
在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白如式I所示
Z-A-L-B
I
其中，Z是任选的信号肽；
A是抗体结合区；
L是任选的接头部分；
B是内吞功能区。
基于本发明的教导，本领域技术人员可以想到并测试用于本发明融合蛋白 中的各种合适接头，所述接头可以是本领域任何合适的接头，只要该接头能够 起到连接本发明融合蛋白的各部分并且对最终的融合蛋白的功能不会产生不 利影响。上述任选的接头包括含有接头和不含有接头，因此，在具体的实施方 式中，本发明的融合蛋白可以仅包含抗体结合区和内吞功能区。
本发明的融合蛋白通过抗体结合区与特异性抗体结合，然后内吞功能区使 得所述融合蛋白和抗体被内吞入免疫细胞内部。因此，基于本发明的教导，本 领域技术人员可自主选择本文所述的“抗体结合区”。本发明融合蛋白中的抗体 结合区优选是正常细胞中不存在的，或者，是正常细胞中为隐蔽状态的或低表 达的多肽。例如，所述抗体结合区表位在正常细胞(包括但不限于表达EGFR 的正常细胞)中为表位隐蔽状态。
在具体的实施方式中，所述抗体可以是但不限于EGFR抗体、GPC3抗体、 间皮素抗体等特异性结合，例如CH12抗体。所述抗体结合区具体选自以下抗原 或其片段：EGFRvIII、EGFR、CD20、CD22、CD19、BCMA、proBDNF前体 蛋白、GPC3、CLD18.2、CLD6、间皮素、PD-L1、PD-1、WT-1、IL13Ra2、 Her-2、Her-1、Her-3；优选地，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列或 者含有与以下氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43；更优地，所述的抗体结合区含有以下任一 氨基酸序列的活性片段：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43。在具体的实施方式中，所述抗体结合区与EGFR抗体特异性 结合。
本文所用的术语“内吞功能区”是指当所述融合蛋白与所述抗体结合区的特 异性结合物质，例如抗体结合后，使得所述融合蛋白和所述物质被内吞入所述 免疫细胞内部的功能部分。所述内吞功能区可以衍生自叶酸受体、LDL、CD30、 CD33、CD3、EGFR、TFR1；优选衍生自叶酸受体和CD30；更优地，所述内吞 功能区具有SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：32或44 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一 性的氨基酸序列，或者为SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列的活性片段。
本领域技术人员知晓，本发明的融合蛋白中的信号肽是起到帮助融合蛋白 牵出细胞膜的功能。本领域技术人员可以自主决定具体的信号肽。例如，所述 信号肽可以是叶酸受体信号肽、CD30受体信号肽、CD33信号肽、CD8信号肽， 优选叶酸受体信号肽。本发明的融合蛋白中的信号肽和内吞功能区可以来自相 同或不同的蛋白。
在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白可以具有SEQ ID NO:10所示的 氨基酸序列或者含有与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列或其活性片段。
基于本发明的教导，本领域技术人员应理解，本发明的融合蛋白可以与嵌 合抗原受体在免疫效应细胞表面单独表达或融合表达。在具体的实施方式中， 本发明的融合蛋白与嵌合抗原受体在免疫效应细胞表面单独表达。在本文中， 所述“单独表达”是指融合蛋白和嵌合抗原受体分别表达在免疫效应细胞表面， 二者不为融合状态；而“融合表达”是指融合蛋白和嵌合抗原以融合蛋白的形式 表达在免疫效应细胞表面。
在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白与嵌合抗原受体在免疫效应细胞 表面融合表达。
基于本发明的教导，本领域技术人员可以选择针对不同肿瘤抗原的嵌合抗 原受体，例如，CD19-CAR、GPC3-CAR、CD30-CAR、Mesothelin-CAR等。在 具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:12所 示。本领域技术人员还可利用本领域已知的技术手段促进本发明的融合蛋白与 嵌合抗原受体在免疫效应细胞表面的融合表达，包括但不限于利用自剪切序列 进行融合蛋白与嵌合抗原受体的融合表达。在具体的实施方式中，所述自剪切 序列优选F2A或P2A。其中，F2A是来自口蹄疫病毒的2A(或称为“自剪切多肽2A”) 的一段核心序列，具备2A的“自剪切”功能，可以实现上游和下游基因的共表达。 2A由于其剪切效率高、上下游基因表达平衡性高及自身序列短小的优点为构建 基因治疗多顺反子载体提供了一种有效的可行策略。在优选的实施方式中，所 述自剪切序列是vkqtlnfdllklagdvesnpgp(SEQ ID NO:30)。
在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白如SEQ ID NO:31所示。
表达本发明融合蛋白的免疫效应细胞可以利用所述抗体结合区的特异性 抗体实现高效杀伤，特别是当所述融合蛋白中抗体结合区在正常细胞中不存在 或者隐蔽表达时，利用所述抗体结合区的特异性抗体杀伤免疫效应细胞时不会 杀伤其它正常细胞，从而具备优异的差异毒性。
本发明的免疫效应细胞可以利用免疫辍合物特异性杀伤，所述免疫辍合物 包括：特异性结合本发明融合蛋白中的抗体结合区的抗体，和细胞杀伤性功能 部分。所述细胞杀伤性功能部分包括细胞毒性分子；优选地，所述功能部分选 自MMAF、MMAE、Auristatin、卡奇霉素、美登素、美坦辛、阿霉素、紫杉醇、 5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、DM1、DM4、MGBA、SN-38。所述抗体与所述细胞 杀伤性功能部分可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合物。
本领域技术人员知晓，所述特异性结合所述融合蛋白的抗体结合区的抗体 是与本发明融合蛋白中的正常细胞中不存在的抗体结合区相对应的。在具体的 实施方式中，所述特异性结合所述融合蛋白的抗体结合区的抗体是CH12抗体， 但不限于此。本领域技术人员可以基于现有技术中的知识将所述免疫缀合物制 备成具有合适的尺寸，从而利于内吞入本发明的免疫效应细胞以便发挥杀伤作 用。
本领域技术人员知晓，所述免疫辍合物的一种具体形式即是抗体药物偶联 物或抗体药物缀合物(ADC)。在抗体药物偶联物或抗体药物缀合物(ADC)进入 细胞后，其偶联的毒性药物在细胞内酸性环境下释放，并在细胞内发生毒性作 用。因此，细胞上仅具有内吞功能区的受体与其相应的抗体药物偶联物或抗体 药物缀合物(ADC)结合后，介导抗体药物偶联物或抗体药物缀合物(ADC)内吞， 抗体药物偶联物或抗体药物缀合物(ADC)进入细胞后，其偶联的毒性药物在细 胞内酸性环境下释放，并在细胞内发生毒性作用。
因此，本发明还提供这样一种表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述免 疫效应细胞表达内吞功能区，所述的内吞功能区能将与所述内吞功能区结合的 物质转运入所述的免疫效应细胞内。所述物质转运入所述的免疫效应细胞后启 动对所述免疫效应细胞的杀伤。因此，本文所述的内吞功能区能将与所述内吞 功能区结合的物质或与所述抗体结合区结合的物质转运入所述的免疫效应细 胞内。
优选地，所述物质是抗体药物偶联物或抗体药物缀合物(ADC)。在具体的 实施方式中，所述内吞功能区与嵌合抗原受体在免疫效应细胞表面单独表达或 融合表达，优选单独表达。
在本发明的融合蛋白的基础上，本发明还提供了本发明的融合蛋白的编码 核酸，包含所述编码核酸的表达载体以及包含所述表达载体或基因组中整合有 所述编码核酸的宿主细胞。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含本发明的免疫效应细胞或免疫缀合物 用来进行治疗或对免疫效应细胞进行杀伤；即，通过给予本发明的免疫缀合物 来杀伤所述免疫效应细胞。
本发明的优点：
1.本发明的免疫效应细胞可以被特异性抗体识别，并且能被该抗体衍生出 的抗体偶联药物杀伤，同时对其它正常细胞的影响较小，因此，具备优异的差 异毒性；
2.本发明的免疫效应细胞表面表达的融合蛋白能够在与特异性抗体结合 后，使得所述融合蛋白和所述抗体偶联药物被内吞入所述免疫细胞内部，从而 在细胞膜内部利用偶联的毒性强力的毒素分子完成对所述免疫效应细胞的杀 伤，因此杀伤能力显著；和
3.本发明的技术方案对免疫效应细胞的杀伤主要是在细胞内完成的，受其 他因素(如CDC和ADCC作用所依赖的补体系统和体内NK细胞活性)的影响少， 从而能够对多种环境下的表达有本申请提供的融合蛋白的免疫效应细胞实现 杀伤。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版， 科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。例如，实施 例中涉及的流式分析采用Beckman流式分析仪测定，测定结果采用FlowJo软件 处理。以下实施例中所用的材料也均是市售可得的。
实施例1.融合蛋白FR806的表达
在本实施例中，选择eGFP作为荧光标记物进行分析测试，eGFP为增强型 绿色荧光蛋白。选择F2A作为自剪切序列，F2A是来自口蹄疫病毒的2A(或称为 “自剪切多肽2A”)的一段核心序列，具备2A的“自剪切”功能；选择人的叶酸受 体的亚型1(FOLR1)的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:32)和EGFR的部分序列 (SEQ ID NO:28)表达为融合蛋白FR806(SEQ ID NO:44)，信号肽选择FOLR1的 信号肽。用本领域技术人员已知的标准方法进行以下基因工程操作。 eGFP-F2A-FR806的核苷酸(SEQ ID NO:1)的制备方法如下：
SEQ ID NO:1
(eGFP加粗显示，F2A以下划线显示，FR SP(叶酸受体信号肽)以加粗下划 线显示，806表位以斜体显示，其余为叶酸受体剩余部分)
eGFP-F2A-FR806的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)为：
1、eGFP-F2A-FR806核苷酸序列的制备
1.1、参照J.Biol.Chem.264:14893-14901(1989)中的实验操作及Genebank登录号NM_016729.2的序列，制备得到如SEQ ID NO：3所示的FOLR1信号肽以及如SEQ ID NO：4所示的FOLR1其余部分的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3
Atggctcagcggatgacaacacagctgctgctccttctagtgtgggtggctgtagtaggggaggctcagaca
SEQ ID NO：4
Aggattgcatgggccaggactgagcttctcaatgtctgcatgaacgccaagcaccacaaggaaaagccaggccccgaggacaagttgcatgagcagtgtcgaccctggaggaagaatgcctgctgttctaccaacaccagccaggaagcccataag gatgtttcctacctatatagattcaactggaaccactgtggagagatggcacctgcctgcaaacggcatttcatccaggacacct gcctctacgagtgctcccccaacttggggccctggatccagcaggtggatcagagctggcgcaaagagcgggtactgaacg tgcccctgtgcaaagaggactgtgagcaatggtgggaagattgtcgcacctcctacacctgcaagagcaactggcacaaggg ctggaactggacttcagggtttaacaagtgcgcagtgggagctgcctgccaacctttccatttctacttccccacacccactgttc tgtgcaatgaaatctggactcactcctacaaggtcagcaactacagccgagggagtggccgctgcatccagatgtggttcgac ccagcccagggcaaccccaatgaggaggtggcgaggttctatgctgcagccatgagtggggctgggccctgggcagcctg gcctttcctgcttagcctggccctaatgctgctgtggctgctcagc
参照Journal of Biological Chemistry,2004,279(29),30375-30384中的实验操作 及Genebank登录号X00588.1的序列，制备得到EGFR的284-304表位的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
SEQ ID NO：5
Gtccgagcctgtggggccgacagctatgagatggaggaagacggcgtccgcaagtgtaagaag
将核苷酸序列SEQ ID NO：3、核苷酸序列SEQ ID NO：4、以及核苷酸序列SEQ IDNO：5按顺序组合后委托苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因组合成后， 得到FR806的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的基因片段。
SEQ ID NO:6
1.2、为得到3’端包含F2A(66bp)及和下游拼配的少许核酸(20bp)的eGFP核酸片段，以CN201310164725.X所采用的pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ为模板，模板的序 列参见CN201310164725.X中的SEQ ID NO：28。
以上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:7)和下游引物5’-gttgtcatccgctgagccatgggcccagggttggactc-3’(SEQ ID NO:8)进行PCR扩增，得到3’端 包含F2A(66bp)及和下游拼配的少许核酸(20bp)的eGFP核酸片段。。
1.3将等摩尔的步骤1.2获得的3’端包含F2A(66bp)及和下游拼配的少许核酸(20bp)的eGFP核酸片段与步骤1.1获得的FR806核苷酸序列片段按图1所示的模式进 行拼接并PCR，图1中FR SP表述叶酸受体的信号肽(SEQ ID NO:3)，806epitope表示 EGFR284-304表位(SEQ ID NO:5)，FR表示叶酸受体除信号肽外的其他部分(SEQ ID NO:4)。。补充DNA聚合酶，加入上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:7)，下游引物5’-ctcgaggtcgacctagctgagcagccacagc-3‘(SEQ ID NO:9)后PCR，得到 两端包含MulⅠ个SalⅠ酶切位点的eGFP-F2A-FR806的核苷酸序列的基因片段，理 论大小为2047bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
2、eGFP-F2A-FR806慢病毒载体的构建
本实施例采用的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载 体系统，该系统包括：编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2、编码 VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G及基于空载体pWPT-eGFP的编码目的基因 eGFP-F2A-FR806的重组表达载体。
在空载体中pWPT-eGFP中，延长因子-1α(elongation factor-1α,EF-1α)的启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表达，而在编码目的基因eGFP-F2A-FR806的重组表达载体中通过来自口蹄疫病毒的核糖体跳跃 序列(food and mouth disease virus，FMDV,ribosomal skipping sequence，F2A)实现 eGFP与目的基因FR806共表达。
将上述实施例1.1中所得的两端包含MulⅠ个SalⅠ酶切位点的 eGFP-F2A-FR806的核苷酸序列的基因片段，通过MluⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶 切，连入同样双酶切的pWPT载体中，构建得到由F2A相连的eGFP与FR806共表达 的质粒pWPT-eGFP-F2A-FR806。
3、慢病毒包装与浓缩
以1.25×107的密度将293T细胞(ATCC)接种于15cm培养皿中，培养基为含10％ 胎牛血清(Gbico公司)的L110DMEM培养基(Gbico)。
将27.5μg的pWPT-eGFP-F2A-FR806的质粒和27.5μg的pWPT-eGFP(Mock)对 照质粒分别和20.7μg的包装质粒PAX2、8.3μg包膜质粒pMD2.G溶于2200ul不含血 清的DMEM培养基中，将165μg PEI(polyscience公司)溶于2200ul不含血清的DMEM 培养基中，再将两者混匀，加入293T中，72h后收集包含病毒的上清液过滤，纯化 后收集病毒浓缩液。
4、慢病毒转导T淋巴细胞
将人外周血单个核细胞以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养基液培养，并按 照磁珠:细胞比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen公司) 和终浓度300U/mL的重组人IL-2(上海华新生物高技术有限公司)活化48h。
将活化好的T细胞按照1×106cell/ml的浓度加入Retronectin(购买自takara公司) 包被的板(24孔板)中，加入步骤3所得的病毒浓缩液(MOI≈10)，离心，放入培养箱 中培养，得到表达融合蛋白FR806及eGFP的T细胞(CAR-FR806-T细胞)以及Mock T 细胞，其中，FR806融合蛋白序列还含有信号肽，如SEQ ID NO:10所示：
SEQ ID NO：10
5、流式检测T细胞中融合受体FR806及eGFP的表达
取步骤4得到的CAR-FR806-T细胞和Mock T细胞，。一抗用CN 200810038848.8 所公开的CH12抗体(10μg/ml)孵育45min，随后1％FBS的PBS洗两遍。二抗为PE标 记的羊抗人IgG(Santa公司)，1:50稀释孵育45min。其后1％FBS的PBS洗两遍重悬后， 流式分析，结果如图2A所示，说明表达了FR806融合蛋白的T细胞能够与CH12抗体 有效结合，并且能与eGFP在T细胞中共表达。CH12抗体的轻链如SEQ ID NO:46所 示，重链如SEQ ID NO:45所示。
选择表达EGFR的Keratinocyte细胞和HEK-293T细胞，FACS分析CH12抗体与 二者的结合情况，结果显示CH12抗体与表达EGFR的Keratinocyte细胞和HEK-293T 细胞均不结合(图2B)。
实施例2、CH12-biotin的合成及滴定
将CH12抗体用biotin进行标记。将CH12抗体稀释到2.5mg/ml，PBS pH7.4，标 记体积1.6ml；取1mg的Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo公司)，加入180ul的超纯水溶 解；取79ul的Biotin加入到1.6ml的CH12抗体中，反应过夜。使用PD-10脱盐柱(美国 GE公司)脱盐，置换到PBS 5％甘油缓冲液中，得到CH12-Biotin，OD280/1.45测浓 度为0.77mg/ml。
用含有1％FBS的PBS将CH12-biotin稀释成不同浓度(100μg/ml、10μg/ml、1 μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0μg/ml)，分别与表达eGFP-F2A-FR806的T细胞孵 育45min，随后PBS洗涤，二抗为PE-SA(ebioscience公司)1∶300培基稀释，加入重 悬细胞后，孵育45min。PBS洗两次后，流式分析，结果如图3所示，显示随着 CH12-biotin浓度越高，亲和力越强，10μg/ml与100μg/ml的结合水平相似。
实施例3、利用CH12-biotin分选FR806阳性的T细胞
取1×107表达eGFP-F2A-FR806的T细胞，PBS洗涤，CH12-biotin(10μg/ml，含 有1％FBS的PBS稀释)4℃孵育45min，随后PBS洗涤，加入抗Biotin分选磁珠(购买自 美天旎公司)，按照该分选磁珠产品所给出的步骤分选出FR806的T细胞。取适量分 选前后的细胞，流式分析，结果如图4所示，显示表达FR806的T细胞在与CH12-biotin 结合后能被抗Biotin分选磁珠有效分选出，分选阳性率达95％。
实施例4、表达FR806的T细胞的内吞实验
取实施例1所得的感染慢病毒载体pWPT-eGFP-F2A-FR806及 pWPT-eGFP(Mock)的T细胞，PBS洗涤；取实施例2中合成的CH12-biotin(10μg/ml， 培基稀释)，二抗为PE-SA(ebioscience公司)1∶300培基稀释，加入重悬细胞后，孵 育45min，PBS洗两次后孵育4h。随后，多聚甲醛固定，DAPI染色液(罗氏公司)染 色，在共聚焦显微镜下观察，结果如图5所示，在表达FR806的T细胞中，CH12-biotin (红色荧光表示)出现在了细胞膜内部，显示其能被T细胞有效内吞。
实施例5、抗体偶联药物CH12-MMAF的合成及细胞杀伤活性测定
取1ml(0.033mM)CH12抗体，加入10ul DTPA(Thermo公司)和1ul 100mM的 TCEP(Thermo公司)，，按照抗体:MMAF＝10:1的比例加入MMAF的DMSO溶液(浓 度3.4mM)，4℃维持3h，除去多余的MMAF，得到抗体偶联药物CH12-MMAF。
流式检测CH12抗体和CH12-MMAF对表达FR806的T细胞的结合能力，结果如 图6A所示。
参照实施例4的操作，取感染pWPT-eGFP-F2A-FR806及pWPT-eGFP(Mock) 的T细胞，PBS洗涤；取CH12-MMAF(10μg/ml，培基稀释)4℃孵育45min，PBS 洗涤；二抗为羊抗人PE(上海联科生物技术有限公司)，1：50稀释，加入重悬细胞 后孵育45min。PBS洗两次后，培养箱孵育4h。随后多聚甲醛固定，DAPI染色液 (罗氏公司)1∶500稀释，二抗染色2min，共聚焦显微镜下观察拍摄，结果如图6B 所示，CH12-MMAF能够被表达FR806的T细胞内吞。
流式检测感染Mock、eGFP-FR806的T细胞的阳性率后，通过添加适当比例未 感染病毒的T细胞，将Mock(对照组)与eGFP-FR806(实验组)的T细胞的阳性率调整 至50％，铺于6孔板中，每孔2×106个细胞，2ml培养基(AIM-Ⅴ培基+2％human AB serum、IL-2 500U/ml)。用PBS将CH12-MMAF药物分别稀释到0.01、0.1、1、10、 以及100μg/ml后加入到实验组和对照组细胞中，每24h流式检测eGFP阳性率变化， 共测定96h，结果如图6C所示，显示在加入CH12-MMAF后，对表达FR806的T细胞 的有明显的杀伤，且随着CH12-MMAF浓度的增加，对表达FR806的T细胞的杀伤 增强，在用量为10μg/ml时，96h，对表达FR806的T细胞的杀伤作用可达88％。对于 不表达FR806的T细胞(Mock)，则CH12-MMAF不显出杀伤，说明CH12-MMAF的安 全性好。
检测CH12-MMAF对人Keratinocy细胞的杀伤作用，结果如图6D所示， CH12-MMAF对人Keratinocy细胞没有杀伤，说明CH12-MMAF安全性好。
实施例6、CCK8测定CH12-MMAF药物及游离的MMAF对表达FR806的T细 胞的杀伤
实验组：取实施例3分选后的表达eGFP-FR806的T细胞，将其铺于96孔板 中，每孔3×104个细胞，100ul培基，每个药物浓度5个复孔，再设定一组只加培基 的空白组。对照组：取未感染病毒的T细胞，参照实验组的操作铺于96孔板中。 分别取100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0μg/ml六种溶度的 CH12-MMAF分别加入到实验组和对照组T细胞中，做成六个梯度(即，前述的100 μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0μg/ml六种溶度)。72h后每孔 加入10ul CCK8试剂(Dojindo公司)37℃孵育3h后酶标仪测定450nm处吸光度，分别 计算细胞活力。
参照上述操作取分选后的感染eGFP-FR806的T细胞，将其铺于96孔板中，每 孔3×104个细胞，100ul培基，每个药物浓度5个复孔，再设定一组只加培基的空白 组。对照组为未感染病毒的T细胞，相同方法铺于96孔板中。将1000nM、 500nM、100nM、50nM、10nM、0nM六种溶度的游离MMAF按照特定浓度加入到 T细胞中，做成六个梯度(即，前述的六种溶度)。72h后每孔加入10ul CCK8试剂 (Dojindo公司)37℃孵育3h后酶标仪测定450nm处吸光度，分别计算细胞活力。
计算公式为：细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]
结果如图7A所示，显示CH12-MMAF能特异杀伤FR806阳性的T细胞。游离的 MMAF对表达和不表达FR806的T细胞的杀伤水平相当。
进一步的，申请人选择EGFR+的HEK293T细胞，将其表达FR806，并进行细 胞杀伤实验，结果如图7B所示，显示CH12-MMAF对FR806阳性的HEK293T有显著 的细胞杀伤，而对FR806阴性的HEK293T无明显杀伤，MMAF对FR806阳性和阴性 的HEK293T均有杀伤。说明即使细胞显示EGFR阳性，但不表达FR806时， CH12-MMAF不会产生杀伤。
实施例7、FR806-CAR19T细胞的制备
本实施例选择eGFP作为荧光标记物，eGFP为增强型绿色荧光蛋白。用本领域 技术人员已知的标准方法进行以下基因工程操作。
本实施例中，选择US20060193852A1公开的αCD19的单链抗体的核苷酸片段 (SEQID NO:11)作为CAR的抗CD19抗体序列，选择CD8-CD137-CD3ζ作为CAR的 跨膜域和胞内域。
SEQ ID NO:11
gatatccagctgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcaaggccagcc aaagtgttgattatgatggtgatagttatttgaactggtaccaacagattccaggacagccacccaaactcctcatctatgatgcat ccaatctagtttctgggatcccacccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggagaa ggtggatgctgcaacctatcactgtcagcaaagtactgaggatccgtggacgttcggtggagggaccaagctcgagatcaaa ggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctcaggtgcagctgcagcagtctggggctgagctggtga ggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggc ctggacagggtcttgagtggattggacagatttggcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtaaagcca ctctgactgcagacgaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctagcatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagacgggagactacgacggtaggccgttattactatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcc
1、FR806-F2A-CAR(CD19)-F2A-eGFP的核苷酸序列的制备
1.1、3’端及5’端分别带有部分F2A片段的αCD19CAR核苷酸序列
委托苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因组合成，得到αCD19CAR的核 苷酸序列的基因片段(SEQ ID NO:12)，含有CD8α信号肽序列、αCD19的单链抗体 的核苷酸片段、以及包含有铰链区、跨膜区、胞内段的序列的CD8-CD137-CD3ζ核 酸片段。
SEQ ID NO:12(加粗部分为CD8α信号肽序列，下划线为αCD19CAR核苷酸序 列，斜体加粗为CD8-CD137-CD3ζ核苷酸序列)
1.2、以上述合成的αCD19CAR(SEQ ID NO:12)的核苷酸序列的基因片段为模 板，扩增采取的引物对为上游引物 5’-ccttctgaagttggcaggagacgttgagtccaaccctgggcccatggccttaccagtg-3‘(SEQ ID NO:13)，下 游引物5’-tcctgccaacttcagaaggtcaaaattcaaagtctgtttcacgcgagggggcagggc-3‘(SEQ ID NO:14)，得到3’端及5’端分别带有部分F2A片段的αCD19CAR核苷酸序列。PCR扩 增条带通过琼脂糖凝胶电泳确定符合预计的片段大小。
2、FR806-F2A-CAR19-F2A-eGFP的核酸序列的制备
为制备FR806、αCD19CAR及eGFP的拼接序列 FR806-F2A-CAR19-F2A-eGFP(SEQ IDNO:15)，使用以下操作：
SEQ ID NO:15(FR806以下划线显示，αCD19CAR以加粗下划线显示，F2A加 粗显示，eGFP正常显示)
2.1、以实施例1中构建的eGFP-F2A-FR806慢病毒载体为模板进行PCR扩增， 扩增采取的引物对为上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggctcagcggatg -3‘(SEQ ID NO:16)，下游引物 5’-gtctcctgccaacttcagaaggtcaaaattcaaagtctgtttcacgctgagcagccac-3‘(SEQ ID NO:17)。目 的扩增条带的大小为910bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃， 40s；退火：58℃，40s；延伸：68℃，1min；25个循环后再总延伸68℃，10min。 PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确定符合目的扩增条带的大小。
2.2、5’端带有部分F2A片段的eGFP-F2A-FR806序列的扩增
以实施例2中构建的eGFP-F2A-FR806慢病毒载体为模板，扩增采取的引物对 为上游引物5’-accttctgaagttggcaggagacgttgagtccaaccctgggcccatggtgagcaagggc-3'(SEQID NO:18)，下游引物5’-ctcgaggtcgacctacttgtacagctcg-3’(SEQ ID NO:19)。得到5’端带有部分F2A片段的eGFP-F2A-FR806核酸片段。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电 泳确定符合预计的片段大小。
2.3、将等摩尔的3’端及5’端分别带有部分F2A片段的αCD19CAR的核苷酸序 列与3’端带有部分F2A片段的FR806序列按图8A所示的模式进行拼接并PCR。补充 DNA聚合酶，加入上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggctcagcggatg -3’(SEQ ID NO:16)，下游引物 5’-tcctgccaacttcagaaggtcaaaattcaaagtctgtttcacgcgagggggcagggc-3’(SEQ ID NO:14)后 PCR25个循环，得到FR806与αCD19CAR的核苷酸序列的拼接片段。理论大小为 2458bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
2.4、将等摩尔的FR806与αCD19CAR的核苷酸序列的拼接片段与5’端带有部 分F2A片段的eGFP序列按图8A所示的模式进行拼接并PCR。补充DNA聚合酶，加 入上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggctcagcggatg-3‘(SEQ ID NO:16)， 下游引物5’-ctcgaggtcgacctacttgtacagctcg-3‘(SEQ ID NO:19)后PCR25个循环，得到两 端带有MluⅠ和SalⅠ限制性内切酶位点的FR806与αCD19CAR与eGFP的拼接片段 FR806-F2A-CAR19-F2A-eGFP。理论大小为3214bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与 理论大小一致。
3、FR806-F2A-CAR19-F2A-eGFP慢病毒载体的构建
参照实施例1中慢病毒载体的构建的操作，将所得的 FR806-F2A-CAR19-F2A-eGFP的核苷酸序列通过MluⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶 切，连入同样双酶切的pWPT载体中，构建得到由F2A相连的FR806、αCD19CAR 与eGFP共表达的慢病毒表达载体。
4、质粒转染293T包装慢病毒
参照实施例1中步骤3的操作，将本实施例步骤2所得的慢病毒表达载体、 pWPT-eGFP对照质粒、包装质粒PAX2、包膜质粒pMD2.G溶于2200ul不含血清的 DMEM培养基中，进行慢病毒包装。
5、慢病毒转导T细胞
参照实施例1中步骤4的操作，将本实施例步骤3所得的包装后的慢病毒转染T 细胞，得到表面表达有CAR19及FR806的CAR-T细胞，即FR806-CAR19T细胞，将 FR806-CAR19T细胞进行流式分析，结果如图8B所示，显示三种蛋白FR806、eGFP、 和αCD19CAR均能在T细胞中能有效的表达。
参照实施例3的操作，采用CH12-biotin和抗-biotin磁珠分选FR806-CAR19T细胞，结果如图8C所示，显示FR806-CAR19T细胞在与CH12-biotin结合后能被抗 Biotin分选磁珠有效分选出，分选阳性率达94.3％。
参照上述操作，按照9A所示的模式进行拼接并PCR，得到表达FR806和CAR19 的T细胞(FR806-CAR19T细胞)，流式分析，结果如图9B所示。
实施例8、FR806-CAR19T细胞对肿瘤细胞的杀伤以及细胞因子释放
参照实施例7的操作，制备得到表达CAR19，不表达FR806的T细胞，即CAR19 T细胞。将参照图9A拼接所得的FR806-CAR19T细胞进行细胞杀伤实验。
以Daudi细胞为靶细胞，效应细胞为FR806-CAR19T细胞和CAR19T细胞，效 靶比分别为20:1，10:1，5:1，2.5:1，靶细胞数量为10000/孔，根据不同效靶比设定 不同数量效应细胞。各组均设5个复孔。实验组为FR806-CAR19T细胞和CAR19T 细胞与Daudi细胞共孵育，对照组为感染Mock病毒的T细胞与Daudi细胞共孵育。共 孵育4h后通过CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒(Promega公司)检测上清中LDH 含量，计算其杀伤活性。具体参照CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒说明书。结 果如图10A显示，FR806-CAR19T细胞的细胞杀伤活性略好于CAR19T细胞。
按效靶比为1:1，将CAR19T细胞、CAR19-FR806T细胞以及空质粒转染的T 细胞(Mock)与Daudi细胞共孵育24h，ELISA检测IFN-γ,IL-2and TNF-α的分泌水平， 结果如图10B所示，显示表达FR806对CAR-T细胞的细胞因子释放水平基本无影响。
实施例9、CH12-MMAF对FR806-CAR19T细胞的体外杀伤效果
将参照图8A拼接所得的FR806-CAR19T细胞及对照组mock的初始阳性率调 整为50％，加入10μg/ml的CH12-MMAF，每24h对eGFP的阳性率进行流式检测，共 检测96h，结果如图11A所示，在24h，FR806-CAR19的T细胞数量已降低，72h， FR806-CAR19的T细胞数量降低约80％。
将FR806-CAR19T细胞铺于96孔板，每孔3×104个细胞，100ul培基，每个药 物浓度5个复孔，再设定一组只加培基的空白组。对照组：取未感染病毒的T细 胞，参照实验组的操作铺于96孔板中。分别取100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1 μg/ml、0.01μg/ml、0μg/ml六种溶度的CH12-MMAF分别加入到实验组和对照组 T细胞中，做成六个梯度(即，前述的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、 0.01μg/ml、0μg/ml六种溶度)。72h后每孔加入10ul CCK8试剂(Dojindo公司)37℃ 孵育3h后酶标仪测定450nm处吸光度，分别计算细胞活力。
计算公式为：细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]
结果如图11B所示，显示CH12-MMAF能特异杀伤FR806阳性的CAR T细胞， 而不杀伤Mock细胞。
实施例10、测定CH12-MMAF对FR806-CAR19T细胞的体内杀伤效果
将参照图8A拼接所得的FR806-CAR19T细胞进行下述实验。
在NOD/SCID小鼠接种3×106Daudi细胞，第12天，NOD/SCID小鼠环磷酰胺 (100mg/kg)清淋。第十四天，小鼠尾静脉注射FR806-CAR19T细胞(3×107细胞/只)。 第15天，实验组给药CH12-MMAF，0.1mg/只，对照组给生理盐水。第18天，取 小鼠外周血、骨髓、脾脏，红细胞裂解液(ebioscience公司)裂解红细胞，PBS洗涤 干净后，加入PE标记的羊抗人CD3抗体(1：50，含有1％FBS的PBS稀释)，4度孵育45分钟后，含有1％FBS的PBS洗涤，如图12A所示流式分析eGFP阳性率。
流式结果如11B和11C所示，给予CH12-MMAF后，人CD3+/eGFP+的细胞在血 液中降低了93％，在脾脏中降低了94％，在骨髓中降低了64％，而对照组中，人 CD3+/eGFP+的细胞在血液、脾脏、以及骨髓中的检出量分别是40.8％、37.7％、52.8％ 结果说明，CH12-MMAF能够有效清除小鼠体内的FR806-CAR19T细胞。
实施例11、eGFP-F2A-CD30806在T细胞的表达
在本实施例中，选择eGFP作为荧光标记物进行分析测试，eGFP为增强型绿色 荧光蛋白。选择F2A作为自剪切序列，F2A是来自口蹄疫病毒的2A(或称为“自剪切 多肽2A”)的一段核心序列，具备2A的“自剪切”功能，可以实现上游和下游基因的 共表达。选择CD30的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:44)和EGFR的部分序列(SEQ ID NO:28)表达为融合蛋白CD30806，信号肽选择CD30的信号肽。用本领域技术人员 已知的标准方法进行以下基因工程操作。eGFP-F2A-CD30806的核苷酸(SEQ ID NO:20)的制备方法如下：
SEQ ID NO:20
其中，eGFP加粗显示，F2A以下划线显示，CD30SP以加粗下划线显示，806 表位以斜体显示，linker以斜体下划线显示，其余为CD30受体跨膜区及胞内段。
eGFP-F2A-CD30806的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)为：
1、eGFP-F2A-CD30806核苷酸序列的制备
1.1、参照Cell.1992 Feb 7；68(3):421-7中的实验操作及Genebank登录号 NM_001243.4的序列，制备得到如SEQ ID NO：22所示的CD30信号肽以及如SEQ ID NO：23所示的CD30受体跨膜区及胞内段核苷酸序列。
SEQ ID NO：22
Atgcgcgtcctcctcgccgcgctgggactgctgttcctgggggcgctacgagcc
SEQ ID NO：23
ccagtgctcttctgggtgatcctggtgttggttgtggtggtcggctccagcgccttcctcctgtgccaccggagggcctg caggaagcgaattcggcagaagctccacctgtgctacccggtccagacctcccagcccaagctagagcttgtggattccaga cccaggaggagctcaacgcagctgaggagtggtgcgtcggtgacagaacccgtcgcggaagagcgagggttaatgagcc agccactgatggagacctgccacagcgtgggggcagcctacctggagagcctgccgctgcaggatgccagcccggccgg gggcccctcgtcccccagggaccttcctgagccccgggtgtccacggagcacaccaataacaagattgagaaaatctacatc atgaaggctgacaccgtgatcgtggggaccgtgaaggctgagctgccggagggccggggcctggcggggccagcagag cccgagttggaggaggagctggaggcggaccataccccccactaccccgagcaggagacagaaccgcctctgggcagct gcagcgatgtcatgctctcagtggaagaggaagggaaagaagaccccttgcccacagctgcctctggaaag
参照Journal of Biological Chemistry,2004,279(29),30375-30384中的实验操作 及Genebank登录号X00588.1的序列，制备得到表皮生长因子受体284-304表位的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
SEQ ID NO：5
Gtccgagcctgtggggccgacagctatgagatggaggaagacggcgtccgcaagtgtaagaag
参照本实验室申请的编码GPC-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC-3嵌合 抗原受体蛋白的T淋巴细胞专利(中国申请专利CN201310164725.X)中的序列 GPC3-Z(SEQ IDNO:18)得到连接806表位和CD30跨膜段和胞内段的linker的核苷 酸序列(SEQ ID NO:24)。
SEQ ID NO：24
ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg(为GPC3-Z中的一段linker)
将核苷酸序列SEQ ID NO：22、核苷酸序列SEQ ID NO：23、核苷酸序列SEQ ID NO：24、以及核苷酸序列SEQ ID NO：5按顺序组合后委托苏州金唯智生物科 技有限公司进行全基因组合成后，得到CD30806的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)的基 因片段。
SEQ ID NO:25
1.2、为得到3’端包含F2A(66bp)及和下游拼配的少许核酸(20bp)的eGFP核酸片段，以CN201310164725.X所采用的pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ为模板，模板的序 列参见CN201310164725.X中的SEQ ID NO：28。
以上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:7)和下游引物 5’-gcggcgaggaggacgcgcatgggcccagggttggactc-3’(SEQ ID NO:26)进行PCR扩增，得到 3’端包含F2A(66bp)及和下游拼配的少许核酸(20bp)的eGFP核酸片段。1.3将等摩尔 的步骤1.2获得的3’端包含F2A(66bp)及和下游拼配的少许核酸(20bp)的eGFP核酸片 段与步骤1.1获得的CD30806核苷酸序列片段进行拼接并PCR。补充DNA聚合酶， 加入上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:7)，下游引物5’- ctcgaggtcgacctactttccagaggcagctg-3‘(SEQ ID NO:27)后PCR25个循环，得到两端包含 MulⅠ个SalⅠ酶切位点的eGFP-F2A-CD30806的核苷酸序列的基因片段。理论大小 为2023bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
2、eGFP-F2A-CD30806慢病毒载体的构建
本实施例采用的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载 体系统，该系统包括：编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2、编码 VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G及基于空载体pWPT-eGFP的编码目的基因 eGFP-F2A-FR806的重组表达载体。
在空载体中pWPT-eGFP中，延长因子-1α(elongation factor-1α,EF-1α)的启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表达，而在编码目的基因eGFP-F2A-FR806的重组表达载体中通过来自口蹄疫病毒的核糖体跳跃 序列(food and mouth disease virus，FMDV,ribosomal skipping sequence，F2A)实现 eGFP与目的基因FR806共表达。
将上述实施例1.1中所得的两端包含MulⅠ个SalⅠ酶切位点的eGFP-F2A- CD30806的核苷酸序列的基因片段，通过MluⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切，连入 同样双酶切的pWPT载体中，构建得到由F2A相连的eGFP与CD30806共表达的质粒 pWPT-eGFP-F2A-CD30806，进行病毒包装和T细胞转染，得到表达CD30-806融合 蛋白及eGFP的T细胞。
CAR-T细胞杀伤活性实验：取感染了eGFP-CD30806的T细胞(简称CD30-806)， 3×105密度铺板，分别在每孔中加入不同浓度的CH12-MMAF，72h后收集细胞，流 式细胞术观察每孔中eGFP阳性(即CD30-806阳性的细胞)细胞的比例。结果如图 13所示，随着CH12-MMAF加药浓度的提高，CD30-806阳性的细胞比例也逐渐减少， 说明CH12-MMAF对CD30-806阳性的细胞有较强的杀伤毒性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 科济生物医药(上海)有限公司
上海市肿瘤研究所
<120> 融合蛋白及其应用
<130> P2017-1352
<150> CN201610817555.4
<151> 2016-09-09
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eGFP-F2A-FR806的核苷酸序列
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt ctgaagttgg caggagacgt tgagtccaac 780
cctgggccca tggctcagcg gatgacaaca cagctgctgc tccttctagt gtgggtggct 840
gtagtagggg aggctcagac agtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 900
gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagaggatt gcatgggcca ggactgagct tctcaatgtc 960
tgcatgaacg ccaagcacca caaggaaaag ccaggccccg aggacaagtt gcatgagcag 1020
tgtcgaccct ggaggaagaa tgcctgctgt tctaccaaca ccagccagga agcccataag 1080
gatgtttcct acctatatag attcaactgg aaccactgtg gagagatggc acctgcctgc 1140
aaacggcatt tcatccagga cacctgcctc tacgagtgct cccccaactt ggggccctgg 1200
atccagcagg tggatcagag ctggcgcaaa gagcgggtac tgaacgtgcc cctgtgcaaa 1260
gaggactgtg agcaatggtg ggaagattgt cgcacctcct acacctgcaa gagcaactgg 1320
cacaagggct ggaactggac ttcagggttt aacaagtgcg cagtgggagc tgcctgccaa 1380
cctttccatt tctacttccc cacacccact gttctgtgca atgaaatctg gactcactcc 1440
tacaaggtca gcaactacag ccgagggagt ggccgctgca tccagatgtg gttcgaccca 1500
gcccagggca accccaatga ggaggtggcg aggttctatg ctgcagccat gagtggggct 1560
gggccctggg cagcctggcc tttcctgctt agcctggccc taatgctgct gtggctgctc 1620
agc 1623
<210> 2
<211> 541
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eGFP-F2A-FR806的氨基酸序列
<400> 2
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
225 230 235 240
Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
245 250 255
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu
260 265 270
Leu Leu Leu Leu Val Trp Val Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Val
275 280 285
Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg
290 295 300
Lys Cys Lys Lys Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val
305 310 315 320
Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys
325 330 335
Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr
340 345 350
Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe
355 360 365
Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe
370 375 380
Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp
385 390 395 400
Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val
405 410 415
Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr
420 425 430
Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser
435 440 445
Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe
450 455 460
Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser
465 470 475 480
Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met
485 490 495
Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe
500 505 510
Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe
515 520 525
Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser
530 535 540
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FOLR1信号肽的核苷酸序列
<400> 3
atggctcagc ggatgacaac acagctgctg ctccttctag tgtgggtggc tgtagtaggg 60
gaggctcaga ca 72
<210> 4
<211> 699
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FOLR1其余部分的核苷酸序列
<400> 4
aggattgcat gggccaggac tgagcttctc aatgtctgca tgaacgccaa gcaccacaag 60
gaaaagccag gccccgagga caagttgcat gagcagtgtc gaccctggag gaagaatgcc 120
tgctgttcta ccaacaccag ccaggaagcc cataaggatg tttcctacct atatagattc 180
aactggaacc actgtggaga gatggcacct gcctgcaaac ggcatttcat ccaggacacc 240
tgcctctacg agtgctcccc caacttgggg ccctggatcc agcaggtgga tcagagctgg 300
cgcaaagagc gggtactgaa cgtgcccctg tgcaaagagg actgtgagca atggtgggaa 360
gattgtcgca cctcctacac ctgcaagagc aactggcaca agggctggaa ctggacttca 420
gggtttaaca agtgcgcagt gggagctgcc tgccaacctt tccatttcta cttccccaca 480
cccactgttc tgtgcaatga aatctggact cactcctaca aggtcagcaa ctacagccga 540
gggagtggcc gctgcatcca gatgtggttc gacccagccc agggcaaccc caatgaggag 600
gtggcgaggt tctatgctgc agccatgagt ggggctgggc cctgggcagc ctggcctttc 660
ctgcttagcc tggccctaat gctgctgtgg ctgctcagc 699
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 表皮生长因子受体284-304表位的核苷酸序列
<400> 5
gtccgagcct gtggggccga cagctatgag atggaggaag acggcgtccg caagtgtaag 60
aag 63
<210> 6
<211> 834
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR806的核苷酸序列
<400> 6
atggctcagc ggatgacaac acagctgctg ctccttctag tgtgggtggc tgtagtaggg 60
gaggctcaga cagtccgagc ctgtggggcc gacagctatg agatggagga agacggcgtc 120
cgcaagtgta agaagaggat tgcatgggcc aggactgagc ttctcaatgt ctgcatgaac 180
gccaagcacc acaaggaaaa gccaggcccc gaggacaagt tgcatgagca gtgtcgaccc 240
tggaggaaga atgcctgctg ttctaccaac accagccagg aagcccataa ggatgtttcc 300
tacctatata gattcaactg gaaccactgt ggagagatgg cacctgcctg caaacggcat 360
ttcatccagg acacctgcct ctacgagtgc tcccccaact tggggccctg gatccagcag 420
gtggatcaga gctggcgcaa agagcgggta ctgaacgtgc ccctgtgcaa agaggactgt 480
gagcaatggt gggaagattg tcgcacctcc tacacctgca agagcaactg gcacaagggc 540
tggaactgga cttcagggtt taacaagtgc gcagtgggag ctgcctgcca acctttccat 600
ttctacttcc ccacacccac tgttctgtgc aatgaaatct ggactcactc ctacaaggtc 660
agcaactaca gccgagggag tggccgctgc atccagatgt ggttcgaccc agcccagggc 720
aaccccaatg aggaggtggc gaggttctat gctgcagcca tgagtggggc tgggccctgg 780
gcagcctggc ctttcctgct tagcctggcc ctaatgctgc tgtggctgct cagc 834
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 7
gcaggggaaa gaatagtaga ca 22
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 8
gttgtcatcc gctgagccat gggcccaggg ttggactc 38
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 9
ctcgaggtcg acctagctga gcagccacag c 31
<210> 10
<211> 278
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR806融合蛋白的序列（含有信号肽）
<400> 10
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser
20 25 30
Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Arg Ile Ala
35 40 45
Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His
50 55 60
Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro
65 70 75 80
Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His
85 90 95
Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu
100 105 110
Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr
115 120 125
Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser
130 135 140
Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys
145 150 155 160
Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn
165 170 175
Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val
180 185 190
Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val
195 200 205
Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser
210 215 220
Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly
225 230 235 240
Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly
245 250 255
Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met
260 265 270
Leu Leu Trp Leu Leu Ser
275
<210> 11
<211> 750
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> αCD19的单链抗体的核苷酸片段
<400> 11
gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120
caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180
gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc 360
tccggtggtg gtggttctca ggtgcagctg cagcagtctg gggctgagct ggtgaggcct 420
gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctatg cattcagtag ctactggatg 480
aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat ttggcctgga 540
gatggtgata ctaactacaa tggaaagttc aagggtaaag ccactctgac tgcagacgaa 600
tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctagcat ctgaggactc tgcggtctat 660
ttctgtgcaa gacgggagac tacgacggta ggccgttatt actatgctat ggactactgg 720
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc 750
<210> 12
<211> 1485
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> αCD19CAR核苷酸序列
<400> 12
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggatatcc agctgaccca gtctccagct tctttggctg tgtctctagg gcagagggcc 120
accatctcct gcaaggccag ccaaagtgtt gattatgatg gtgatagtta tttgaactgg 180
taccaacaga ttccaggaca gccacccaaa ctcctcatct atgatgcatc caatctagtt 240
tctgggatcc cacccaggtt tagtggcagt gggtctggga cagacttcac cctcaacatc 300
catcctgtgg agaaggtgga tgctgcaacc tatcactgtc agcaaagtac tgaggatccg 360
tggacgttcg gtggagggac caagctcgag atcaaaggtg gtggtggttc tggcggcggc 420
ggctccggtg gtggtggttc tcaggtgcag ctgcagcagt ctggggctga gctggtgagg 480
cctgggtcct cagtgaagat ttcctgcaag gcttctggct atgcattcag tagctactgg 540
atgaactggg tgaagcagag gcctggacag ggtcttgagt ggattggaca gatttggcct 600
ggagatggtg atactaacta caatggaaag ttcaagggta aagccactct gactgcagac 660
gaatcctcca gcacagccta catgcaactc agcagcctag catctgagga ctctgcggtc 720
tatttctgtg caagacggga gactacgacg gtaggccgtt attactatgc tatggactac 780
tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 840
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 900
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 960
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1020
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1080
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1140
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1200
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1260
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1320
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1380
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1440
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1485
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 13
ccttctgaag ttggcaggag acgttgagtc caaccctggg cccatggcct taccagtg 58
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 14
tcctgccaac ttcagaaggt caaaattcaa agtctgtttc acgcgagggg gcagggc 57
<210> 15
<211> 3168
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR806-F2A-CAR19-F2A-eGFP的核苷酸序列
<400> 15
atggctcagc ggatgacaac acagctgctg ctccttctag tgtgggtggc tgtagtaggg 60
gaggctcaga cagtccgagc ctgtggggcc gacagctatg agatggagga agacggcgtc 120
cgcaagtgta agaagaggat tgcatgggcc aggactgagc ttctcaatgt ctgcatgaac 180
gccaagcacc acaaggaaaa gccaggcccc gaggacaagt tgcatgagca gtgtcgaccc 240
tggaggaaga atgcctgctg ttctaccaac accagccagg aagcccataa ggatgtttcc 300
tacctatata gattcaactg gaaccactgt ggagagatgg cacctgcctg caaacggcat 360
ttcatccagg acacctgcct ctacgagtgc tcccccaact tggggccctg gatccagcag 420
gtggatcaga gctggcgcaa agagcgggta ctgaacgtgc ccctgtgcaa agaggactgt 480
gagcaatggt gggaagattg tcgcacctcc tacacctgca agagcaactg gcacaagggc 540
tggaactgga cttcagggtt taacaagtgc gcagtgggag ctgcctgcca acctttccat 600
ttctacttcc ccacacccac tgttctgtgc aatgaaatct ggactcactc ctacaaggtc 660
agcaactaca gccgagggag tggccgctgc atccagatgt ggttcgaccc agcccagggc 720
aaccccaatg aggaggtggc gaggttctat gctgcagcca tgagtggggc tgggccctgg 780
gcagcctggc ctttcctgct tagcctggcc ctaatgctgc tgtggctgct cagcgtgaaa 840
cagactttga attttgacct tctgaagttg gcaggagacg ttgagtccaa ccctgggccc 900
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 960
ccggatatcc agctgaccca gtctccagct tctttggctg tgtctctagg gcagagggcc 1020
accatctcct gcaaggccag ccaaagtgtt gattatgatg gtgatagtta tttgaactgg 1080
taccaacaga ttccaggaca gccacccaaa ctcctcatct atgatgcatc caatctagtt 1140
tctgggatcc cacccaggtt tagtggcagt gggtctggga cagacttcac cctcaacatc 1200
catcctgtgg agaaggtgga tgctgcaacc tatcactgtc agcaaagtac tgaggatccg 1260
tggacgttcg gtggagggac caagctcgag atcaaaggtg gtggtggttc tggcggcggc 1320
ggctccggtg gtggtggttc tcaggtgcag ctgcagcagt ctggggctga gctggtgagg 1380
cctgggtcct cagtgaagat ttcctgcaag gcttctggct atgcattcag tagctactgg 1440
atgaactggg tgaagcagag gcctggacag ggtcttgagt ggattggaca gatttggcct 1500
ggagatggtg atactaacta caatggaaag ttcaagggta aagccactct gactgcagac 1560
gaatcctcca gcacagccta catgcaactc agcagcctag catctgagga ctctgcggtc 1620
tatttctgtg caagacggga gactacgacg gtaggccgtt attactatgc tatggactac 1680
tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 1740
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 1800
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 1860
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1920
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1980
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 2040
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 2100
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 2160
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 2220
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2280
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2340
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgcgtgaa acagactttg 2400
aattttgacc ttctgaagtt ggcaggagac gttgagtcca accctgggcc catggtgagc 2460
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 2520
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 2580
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 2640
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 2700
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 2760
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 2820
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 2880
tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 2940
gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 3000
cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 3060
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 3120
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaag 3168
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 16
cttacgcgtc ctagcgctac cggtcgccac catggctcag cggatg 46
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 17
gtctcctgcc aacttcagaa ggtcaaaatt caaagtctgt ttcacgctga gcagccac 58
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 18
accttctgaa gttggcagga gacgttgagt ccaaccctgg gcccatggtg agcaagggc 59
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 19
ctcgaggtcg acctacttgt acagctcg 28
<210> 20
<211> 1581
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eGFP-F2A-CD30806的核苷酸序列
<400> 20
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt ctgaagttgg caggagacgt tgagtccaac 780
cctgggccca tgcgcgtcct cctcgccgcg ctgggactgc tgttcctggg ggcgctacga 840
gccgtccgag cctgtggggc cgacagctat gagatggagg aagacggcgt ccgcaagtgt 900
aagaagggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc gccagtgctc 960
ttctgggtga tcctggtgtt ggttgtggtg gtcggctcca gcgccttcct cctgtgccac 1020
cggagggcct gcaggaagcg aattcggcag aagctccacc tgtgctaccc ggtccagacc 1080
tcccagccca agctagagct tgtggattcc agacccagga ggagctcaac gcagctgagg 1140
agtggtgcgt cggtgacaga acccgtcgcg gaagagcgag ggttaatgag ccagccactg 1200
atggagacct gccacagcgt gggggcagcc tacctggaga gcctgccgct gcaggatgcc 1260
agcccggccg ggggcccctc gtcccccagg gaccttcctg agccccgggt gtccacggag 1320
cacaccaata acaagattga gaaaatctac atcatgaagg ctgacaccgt gatcgtgggg 1380
accgtgaagg ctgagctgcc ggagggccgg ggcctggcgg ggccagcaga gcccgagttg 1440
gaggaggagc tggaggcgga ccataccccc cactaccccg agcaggagac agaaccgcct 1500
ctgggcagct gcagcgatgt catgctctca gtggaagagg aagggaaaga agaccccttg 1560
cccacagctg cctctggaaa g 1581
<210> 21
<211> 527
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eGFP-F2A-CD30806的氨基酸序列
<400> 21
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
225 230 235 240
Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
245 250 255
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly
260 265 270
Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Arg Ala Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp
275 280 285
Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Val Leu
305 310 315 320
Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe
325 330 335
Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu
340 345 350
His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val
355 360 365
Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser
370 375 380
Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu
385 390 395 400
Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro
405 410 415
Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu
420 425 430
Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys
435 440 445
Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala
450 455 460
Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu
465 470 475 480
Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu
485 490 495
Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu
500 505 510
Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
515 520 525
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD30信号肽的核苷酸序列
<400> 22
atgcgcgtcc tcctcgccgc gctgggactg ctgttcctgg gggcgctacg agcc 54
<210> 23
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD30受体跨膜区及胞内段核苷酸序列
<400> 23
ccagtgctct tctgggtgat cctggtgttg gttgtggtgg tcggctccag cgccttcctc 60
ctgtgccacc ggagggcctg caggaagcga attcggcaga agctccacct gtgctacccg 120
gtccagacct cccagcccaa gctagagctt gtggattcca gacccaggag gagctcaacg 180
cagctgagga gtggtgcgtc ggtgacagaa cccgtcgcgg aagagcgagg gttaatgagc 240
cagccactga tggagacctg ccacagcgtg ggggcagcct acctggagag cctgccgctg 300
caggatgcca gcccggccgg gggcccctcg tcccccaggg accttcctga gccccgggtg 360
tccacggagc acaccaataa caagattgag aaaatctaca tcatgaaggc tgacaccgtg 420
atcgtgggga ccgtgaaggc tgagctgccg gagggccggg gcctggcggg gccagcagag 480
cccgagttgg aggaggagct ggaggcggac catacccccc actaccccga gcaggagaca 540
gaaccgcctc tgggcagctg cagcgatgtc atgctctcag tggaagagga agggaaagaa 600
gaccccttgc ccacagctgc ctctggaaag 630
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GPC3-Z中的一段接头
<400> 24
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45
<210> 25
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD30806的核苷酸序列
<400> 25
atgcgcgtcc tcctcgccgc gctgggactg ctgttcctgg gggcgctacg agccgtccga 60
gcctgtgggg ccgacagcta tgagatggag gaagacggcg tccgcaagtg taagaagggt 120
ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgccagtgct cttctgggtg 180
atcctggtgt tggttgtggt ggtcggctcc agcgccttcc tcctgtgcca ccggagggcc 240
tgcaggaagc gaattcggca gaagctccac ctgtgctacc cggtccagac ctcccagccc 300
aagctagagc ttgtggattc cagacccagg aggagctcaa cgcagctgag gagtggtgcg 360
tcggtgacag aacccgtcgc ggaagagcga gggttaatga gccagccact gatggagacc 420
tgccacagcg tgggggcagc ctacctggag agcctgccgc tgcaggatgc cagcccggcc 480
gggggcccct cgtcccccag ggaccttcct gagccccggg tgtccacgga gcacaccaat 540
aacaagattg agaaaatcta catcatgaag gctgacaccg tgatcgtggg gaccgtgaag 600
gctgagctgc cggagggccg gggcctggcg gggccagcag agcccgagtt ggaggaggag 660
ctggaggcgg accatacccc ccactacccc gagcaggaga cagaaccgcc tctgggcagc 720
tgcagcgatg tcatgctctc agtggaagag gaagggaaag aagacccctt gcccacagct 780
gcctctggaa ag 792
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 26
gcggcgagga ggacgcgcat gggcccaggg ttggactc 38
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 27
ctcgaggtcg acctactttc cagaggcagc tg 32
<210> 28
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR284-304表位
<400> 28
Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val
1 5 10 15
Arg Lys Cys Lys Lys
20
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR287-302表位
<400> 29
Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys
1 5 10 15
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 自剪切序列
<400> 30
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 31
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 不含信号肽，只含806和叶酸受体其他部分的氨基酸序列
<400> 31
Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val
1 5 10 15
Arg Lys Cys Lys Lys Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn
20 25 30
Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp
35 40 45
Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser
50 55 60
Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg
65 70 75 80
Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His
85 90 95
Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro
100 105 110
Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn
115 120 125
Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg
130 135 140
Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr
145 150 155 160
Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His
165 170 175
Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His
180 185 190
Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln
195 200 205
Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg
210 215 220
Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro
225 230 235 240
Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser
245 250
<210> 32
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 叶酸受体其他部分的氨基酸序列
<400> 32
Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala
1 5 10 15
Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln
20 25 30
Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln
35 40 45
Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His
50 55 60
Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr
65 70 75 80
Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val
85 90 95
Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys
100 105 110
Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys
115 120 125
Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys
130 135 140
Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro
180 185 190
Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala
195 200 205
Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu
210 215 220
Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser
225 230
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GPC3-546-551表位
<400> 33
Asp Asn Glu Ile Ser Thr
1 5
<210> 34
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GPC3-524-580表位
<400> 34
Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser
1 5 10 15
Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu
20 25 30
Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser
35 40 45
Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val His
50 55
<210> 35
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GPC3-524-580表位
<400> 35
Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser
1 5 10 15
Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu
20 25 30
Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys
35 40
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GPC3-544-553表位
<400> 36
Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His
1 5 10
<210> 37
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18A2-loop1表位
<400> 37
Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala
1 5 10 15
Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser
20 25 30
Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala
35 40 45
Met Leu Gln Ala Val Arg Ala
50 55
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18A2-loop2表位
<400> 38
Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr
1 5 10 15
Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe
20 25 30
Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp
35 40
<210> 39
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18A2-loopD3表位
<400> 39
Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys
1 5 10 15
Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly
20
<210> 40
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCMA胞外段
<400> 40
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala
50
<210> 41
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19胞外段
<400> 41
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
20 25 30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
210 215 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
260 265 270
<210> 42
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 全长CD20
<400> 42
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 43
<211> 668
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD22胞外段
<400> 43
Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu Tyr Ala Trp
1 5 10 15
Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala Leu Asp Gly
20 25 30
Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr Asn Lys Asn
35 40 45
Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asp Gly
50 55 60
Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly Asp Lys Asn
65 70 75 80
Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp Met Glu Arg
100 105 110
Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His Ile Gln Leu
115 120 125
Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr Cys Leu Leu
130 135 140
Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp Leu Leu Glu
145 150 155 160
Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser Leu Thr Ile
165 170 175
Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro Gln Trp Ser
180 185 190
His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala Asp Gly Lys
195 200 205
Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His Thr Pro Lys
210 215 220
Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg Glu Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro Glu Tyr Thr
245 250 255
Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys Gln Asn Thr
260 265 270
Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser Gly Lys Tyr
275 280 285
Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser Glu Glu Val
290 295 300
Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val Gln Ile Leu
305 310 315 320
His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu Cys Met Ser
325 330 335
Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro Lys Ile Leu
355 360 365
Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn Ile Leu Gly
370 375 380
Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln Tyr Pro Pro
385 390 395 400
Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile Arg Glu Gly
405 410 415
Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Ser Val
420 425 430
Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu Pro Ser Leu
435 440 445
Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr Thr Ile Ala
450 455 460
Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro Val Ala Leu
465 470 475 480
Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys Ile Lys Pro
485 490 495
Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln Cys Asp Phe
500 505 510
Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly
515 520 525
Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser Ile Ser Pro
530 535 540
Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser Ile Gly Gln
545 550 555 560
Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg
565 570 575
Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu Gly Lys Ser
580 585 590
Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val Ser His Tyr
595 600 605
Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His Ser Gln Lys
610 615 620
Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys
625 630 635 640
Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu
645 650 655
Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg
660 665
<210> 44
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD30跨膜域和胞内域
<400> 44
Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg
20 25 30
Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu
35 40 45
Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser
50 55 60
Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser
65 70 75 80
Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu
85 90 95
Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro
100 105 110
Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys
115 120 125
Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr
130 135 140
Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu
145 150 155 160
Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro
165 170 175
Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu
180 185 190
Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser
195 200 205
Gly Lys
210
<210> 45
<211> 464
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH12的重链
<400> 45
Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe
1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Ala Tyr Ser Val Thr
35 40 45
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Met Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ser Arg Gln Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225 230 235 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 46
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH12的轻链
<400> 46
Met Asp Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Asn Ser Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ser Phe Lys Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln
100 105 110
Tyr Ala Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235

Claims (28)

1.一种在表面表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫细胞还表达式I所示的融合蛋白，
Z-A-L-B
I
其中，Z是任选的信号肽；
A是抗体结合区；
L是任选的接头部分；
B是内吞功能区。
2.一种表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫细胞还表达一融合蛋白，该融合蛋白含有抗体结合区和内吞功能区。
3.如权利要求1或2所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述的抗体结合区选自以下抗原或其片段：EGFRvIII、EGFR、CD20、CD22、CD19、BCMA、proBDNF前体蛋白、GPC3、CLD18.2、CLD6、间皮素、PD-L1、PD-1、WT-1、IL13Ra2、Her-2、Her-1、Her-3；
优选的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列或者含有与以下氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43；
更优的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列的活性片段：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43。
4.如权利要求3所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述抗体结合区与EGFR抗体特异性结合。
5.如权利要求1或2所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述内吞功能区衍生自叶酸受体、LDL、CD30、CD33、CD3、EGFR、TFR1；优选衍生自叶酸受体和CD30；更优地，所述内吞功能区具有SEQ ID NO：32或44所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：32或44具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，或者为SEQ ID NO:32或44所示的氨基酸序列的活性片段。
6.如权利要求1所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述信号肽为叶酸受体信号肽。
7.如权利要求6所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者含有与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1或2所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述融合蛋白与嵌合抗原受体在免疫效应细胞表面单独表达或融合表达，优选单独表达。
9.一种表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，其特征在于，所述细胞还表达内吞功能区，所述的内吞功能区能将与所述内吞功能区结合的物质转运入所述的免疫效应细胞内。
10.如权利要求9所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述内吞功能区衍生自叶酸受体、LDL、CD30、CD33、CD3、EGFR、TFR1；优选衍生自叶酸受体和CD30；更优地，所述内吞功能区具有SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:32或44具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，或者为SEQ ID NO:32或44所示的氨基酸序列的活性片段。
11.如权利要求9或者10所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述内吞功能区与嵌合抗原受体在免疫效应细胞表面单独表达或融合表达，优选单独表达。
12.式I所示的融合蛋白，
Z-A-L-B
I
其中，Z是任选的信号肽；
A是抗体结合区；
L是任选的接头部分；
B是内吞功能区。
13.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含抗体结合区和内吞功能区。
14.如权利要求12或13所述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗体结合区选自以下抗原或其片段：EGFRvIII、EGFR、CD20、CD22、CD19、BCMA、proBDNF前体蛋白、GPC3、CLD18.2、CLD6、间皮素、PD-L1、PD-1、WT-1、IL13Ra2、Her-2、Her-1、Her-3；
优选的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列或者含有与以下氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43；
更优的，所述的抗体结合区含有以下任一氨基酸序列的活性片段：SEQ ID NO:28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43。
15.如权利要求14所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗体结合区与EGFR抗体特异性结合。
16.如权利要求12或13所述的融合蛋白，其特征在于，所述内吞功能区衍生自叶酸受体、LDL、CD30、CD33、CD3、EGFR、TFR1；优选衍生自叶酸受体和CD30；更优地，所述内吞功能区具有SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：32或44具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，或者为SEQ ID NO:32或44所示氨基酸序列的活性片段。
17.如权利要求12所述的融合蛋白，其特征在于，所述信号肽为叶酸受体信号肽。
18.如权利要求17所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者含有与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求12-18中任一项所述的融合蛋白的编码核酸。
20.一种表达载体，包含权利要求19所述的编码核酸。
21.一种宿主细胞，包含权利要求20所述的表达载体或基因组中整合有权利要求19所述的编码核酸。
22.一种免疫辍合物，所述免疫辍合物包括：
细胞杀伤性功能部分；和
特异性结合权利要求1-8所述免疫效应细胞中的抗体结合区或内吞功能区的抗体或者特异性结合权利要求9-11所述免疫效应细胞中的内吞功能区的抗体。
23.如权利要求22所述免疫辍合物在特异性杀伤权利要求1-11中任一项所述免疫效应细胞中的用途。
24.一种试剂盒，包含权利要求1-11中任一项所述的免疫效应细胞或权利要求22所述的免疫缀合物。
25.特异性清除权利要求1-11中任一项所述免疫效应细胞的方法，所述方法包括给予权利要求22所述的免疫缀合物的步骤。
26.一种分选或富集权利要求1-11中任一项所述的免疫效应细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
将分选试剂加入包含所述免疫效应细胞的体系，所述分选试剂包含能够特异性结合权利要求1-8所述免疫效应细胞中的抗体结合区或内吞功能区的物质或者特异性结合权利要求9-11所述免疫效应细胞中的内吞功能区的物质；和
将结合有所述免疫效应细胞的物质从所述体系分离的步骤。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，能够特异性结合权利要求1-8所述免疫效应细胞中的抗体结合区或内吞功能区的物质或者特异性结合权利要求9-11所述免疫效应细胞中的内吞功能区的物质固定于固相载体，从而能够实现结合有所述免疫效应细胞的物质从所述体系分离。
28.检测权利要求1-11中任一项所述的免疫效应细胞的方法，所述方法包括：
给予特异性结合权利要求1-8所述免疫效应细胞中的抗体结合区或内吞功能区的检测试剂或者特异性结合权利要求9-11所述免疫效应细胞中的内吞功能区的检测试剂，所述检测试剂与可检测标记物相连；和
检测所述检测试剂与所述免疫效应细胞形成的复合物。
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