CN105849565A - Shon作为癌症预后生物标志物并预测癌症内分泌治疗的疗效 - Google Patents

Abstract

研究了雌激素调控基因SHON，并发现SHON是新的乳腺癌致癌基因，而且与乳腺癌中雌激素受体和孕激素受体的表达显着相关。本专利包含预测癌症内分泌治疗法的疗效和检测无瘤肿生存和/或无远处扩散转移生存的预后诊断方法。

Description

SHON作为癌症预后生物标志物并预测癌症内分泌治疗的疗效

技术领域

本专利涉及生物技术、癌症细胞生物学和分子医学领域。此发明的独特性在于利用肿瘤样本中是否存在特定分子标记（即生物标志物）及其数量直接预测癌症内分泌治疗法的效果。更具体而言，此发明提供了能够预测乳腺癌患者对癌症内分泌治疗法效果的多种检测手段。此外，此发明还提供了预测乳腺癌患者的无瘤生存期和无远处转移生存期的多种诊断方法。

背景技术

乳腺癌现已成为发达国家和发展中国家中女性最为高发和普遍的癌症，预计每年约有1.38亿新患者出现；2008年乳腺癌致死人数达458,000例，成为因癌症致死女性中数量最多的一种 (Ferlay et al., 2010)。

（1）内分泌治疗法是当前激素依赖型乳腺癌的最有效治疗方法。乳腺癌是一类高度异质性疾病，包括大约20种形态学亚型 (Rosen, 2009) 或至少5种分子亚型 (Colomboet al., 2011)。虽然十分复杂，但乳腺癌也可概括分类为两种不同的亚型：即雌激素受体阳性 (ER+) 和阴性 (ER-) 。其中雌激素受体阳性 (ER+)患者约占总数的75%。内分泌治疗法亦称激素治疗法，是ER+患者系统疗法中最为有效的方法 (Pritchard, 2005)。当今内分泌治疗包括使用选择性ER调节子 (SERMs) 。例如，与雌激素竟争相同受体（ER）结合的三苯氧胺、雷洛普芬、托瑞米芬 (Cosman and Lindsay, 1999; Dowsett et al., 2005)，以及下调ER水平的氟维司群 (Osborne et al., 2004)，或芳香化酶抑制剂[如来罗唑，阿那曲唑和依西美坦，它们均能够不同程度阻断雌激素的产生 (Geisler et al., 2002)]。内分泌治疗在减少乳腺癌死亡率方面卓有成效，并提高了患者的整体存活率。例如，用三苯氧胺佐药治疗5年能使乳腺癌的年死亡率下降34%，并且15年致死率大幅下降9.2% (EarlyBreast Cancer Trialists` Collaborative Group (EBCTCG), 2005)。

（2）ER虽然是现行临床内分泌治疗的预测性生物标记，但由于原始或获得性抗性的缘故，并不能总是做到准确预测。内分泌治疗的机理是干扰雌激素对肿瘤生长和发育的刺激作用，所以ER已经用作临床预测患者内分泌治疗效果的生物标记。然而ER预测的准确性却不能令人满意，因为：A）尽管较之ER-肿瘤患者，ER+肿瘤患者对治疗的反应更频繁，但ER的表达量并不总能和治疗的敏感性保持一致；B）很大一部分ER+乳腺肿瘤患者起初对治疗敏感，但其后逐渐产生抗性 (Clarke et al., 2001)并且有高达40-50%的患者复发 (Maet al., 2009)；C）虽然约20%接受内分泌治疗的乳腺癌患者丧失ER 表达(Encarnacion etal., 1993; Gutierrez et al.,2005)，大多数对抗雌激素疗法产生抗性的肿瘤任然表达ER (Clarke et al., 2003)且呈现早期转移复发(Early Breast Cancer Trialists`Collaborative Group (EBCTCG), 2005)。因此概括而言，乳腺癌临床治疗的两大主要问题是（1）缺乏良好的预测生物标记和（2）内分泌抗性。

（3）迄今并无明确的方法用于区分肿瘤对内分疗法是否瘤有效(Al et al.,2011;Baumgarten and Frasor, 2012)。在过去的十年间，分子生物学，技术和生物信息学的进步迎来了一个新的纪元，可统称为“组学”。基因组学（DNA），转录组学（RNA），蛋白组学（蛋白质），和新陈代谢组学（代谢产物）陆续出现。这些平台已经产生了大量的多维数据，能够应用于产生多基因谱或特征性标记来预测内分泌治疗效果 (Musgrove and Sutherland,2009)。然而，它们几乎全部面临着诸如缺乏高水平证据、过度拟合计算模型和存在错误发现率等常见问题 (Hayes and Khoury, 2012)，且在准确预测方面，这些特征指标同已建立的良好病理学参数如组织学等级相比，通常也没有明显的提升 (Clarke et al., 2003;Fan et al., 2006; Yu et al., 2007; Thomassen et al., 2007; Haibe-Kains etal., 2008; Wirapati et al., 2008; Sgroi, 2009; Prat et al., 2012)。此外，与传统的IHC染色，大规模基因表达谱之类的方法不太可能很快在临床中得到应用。因此，为了提升乳腺癌的治疗管理，开发一种稳定的临床生物标记来预测内分泌治疗及诊断的效果可谓迫在眉睫。

（4）ER-调控基因提供了更好预测内分泌治疗效果的愿景。获得性内分泌治疗抗性的发生的准确机制仍不完清楚。目前提出了几种内分泌抗性的分子机制的假设 (Clarkeet al., 2001; Clarke et al., 2003; Riggins et al., 2005; Giuliano et al.,2011)。因为ER信号是内分泌治疗的靶标，而ER表达于大多数对已经产生了内分泌治疗的抗性的肿瘤仍表达ER (Clarke et al., 2003)，所以ER-调控的功能似乎在决定疗的效果中起重要作用。OncotypeDX是唯一通过FDA批准的多基因测试方法，它是一种基于反转录PCR的多基因检测法，能够检测出ER的mRNA水平和几个ER-调控的下游基因(PR, BCL-2,SCUBE2) 的表达量，然后运用一定的算法计算“复发指数”来预测患者对三苯氧胺的反应。相较之通过简单易行的IHC检测出的ER和PR水平。由于同用简单的传统IHC检测出的ER和PR水平比起来，OncotypeDX对于三苯氧胺反应并未提供新的生物学视角，所以还未被大范围应用于临床 (Kok and Linn, 2010)，尽管如此，一批用三苯氧胺佐药治疗的患者已经用这种方法准确鉴定出效果 (Paik et al., 2004; PAIK ET AL., 2006)。因此，ER-介导基因在预测内分泌治疗的分子标记的发展中具有光明前景。

专利目标

本专发明旨在克服上述方法的缺点，或至少提供一种有用的选择。

专利总结

本发明建立在我们在乳腺癌中发现了一个新的雌激素调控致癌基因，叫住SHON(Secreted Hominoid-specific Oncogene) (见Jung 等人, SHON是雌激素调控的新的乳腺癌症的致癌基因，能够预测患者对内分泌治疗的反应，《癌症研究》 2013)。SHON有三个转录变异体，分别编码三种SHON的蛋白亚型。迄今为止的研究表明，SHON在所有癌症细胞中均高度表达，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、肠癌和前列腺癌。较之其它基因，SHON能够促进细胞增殖、不依赖支持物生长、菌落生长、存活生长、迁移和侵入。更为重要的是，62%的乳腺癌中检测到SHON的表达，同时SHON还与ER、孕酮 (PR)，雄性激素 (AR)受体和BCL-2的表达呈高度正相关性，与EGFR和HER2的表达以及三阴性表型呈负相关。此外， SHON在ER-阳性/高风险 (Nottingham Prognostic Index (NPI) 分指数 ≥ 3.4)肿瘤中的表达能够预测患者对内分泌治疗的反应；较之SHON阳性(SHON+)，SHON阴性(SHON-)肿瘤患者10年肿瘤复发、转移和死亡率增加了两倍。如此，在高风险性ER+乳腺癌患者内分泌治疗中，SHON能提供并成为理想的临床预后生物标记。

专利公开

一方面，本专利提供了预测内分泌治疗肿瘤效果的方法，包括从患者获得样品以及确定多肽的表达，而此多肽包含至少一部分SEQ ID NO: 2,5和6附图氨基酸序列，或者与此同源的一个多肽，其中样品中SHON多肽的表达能够显示患者对内分泌治疗有效，且缺乏SHON多肽表达的样本表明此患者具有内分泌治疗抗性。

另一方面，本专利提供了一种检测无瘤肿生存期的预后诊断方法，包括了从患者获得样品以及确定多肽的表达量，而此多肽包含至少一部分SEQ ID NO: 2,5和6附图氨基酸序列，或者与此同源的一个多肽，其中样品中SHON多肽的表达能够显示良好较长的无瘤生存期的预后诊断，且缺乏SHON多肽表达的样本表明短期的无瘤生存期的预后诊断。

另一方面，本专利提供了一种预测肿瘤远处扩散转移的倾向的诊断方法，包括了从患者获得样品以及确定多肽的表达量，而此多肽包含至少一部分SEQ ID NO: 2,5和6附图氨基酸序列，或者与此同源的一个多肽，其中样品中SHON多肽的表达能够显示肿瘤病人会有较长的无远处转移生存期良好的预后诊断，且缺乏SHON多肽表达的样本表明短期的无远处转移生存期良好的预后诊断。

在本发明的实施中，样品可以是液体、组织或细胞。在本发明的另一实施例中，SHON多肽包含一种与SEQ ID NO: 2,5和6附图氨基酸序列高度相似的氨基酸序列，或者与此同源的一个多肽。在本发明的具体实施中，SHON多肽是从SHON中剪切下来的。在本发明的具体实施中，癌症包括ER+阳性或PR+阳性。在本发明的具体实施中，癌症包括但不局限于肺癌、胃癌、前列腺癌、子宫内膜癌、或卵巢癌。在本发明的具体实施中，也包括检测ER多肽表达，其中ER多肽的表达加上SHON多肽的表达表明患者对内分泌治疗有效，有较长的无瘤生存期和无远处转移生存期的良好预后诊断。

本专利为接受内分泌治疗的癌症患者提供了治疗决策依据的方法，包括获得患者样本；包括从患者处获得样本的步骤；并且鉴定样本中SHON多肽的表达水平，其样本中SHON多肽的表达能够显示其癌症对内分泌治疗有效果。

多肽的表达可直接或间接地得到检测。例如，样本可以结合选定多肽的特异性抗体（单克隆或多克隆）。或者，样本可以结合到一种能够与相应选择性多肽对应的mRNA杂交的核酸杂交探针。样本还可通过Northern blotting检测mRNA，由此检测多肽的表达。在这些检测mRNA的技术中，样本可通过核酸扩增程序，其中mRNA分子或选中的一个片段利用合适的核酸引物被扩增。

此项专利的另一特点是通过检测癌症样本中SHON的表达来确定内分泌治疗癌症的有效性的检测方法，尤其适用于乳腺癌、肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌，或其它癌症。此检测方法包括样本与接触至少一种所描述的抗体或抗体片段，从而鉴定SHON多肽的表达水平，例如任何一段与SEQ ID NO: 2,5和6附图氨基酸序列相似的氨基酸序列，或者与此同源的一个多肽。

本专利还包含一种诊断或监测癌症的方法，特别适用于乳腺癌、肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌，或其它癌症，此检测方法包括样本能够接触至少一种所描述的抗体或抗体片段， 从而鉴定SHON多肽的表达水平，例如任何一段与SEQ ID NO:2,5和6附图氨基酸序列相似的氨基酸序列，或者与此同源的一个多肽。

本专利能够作为诊断和治疗的试剂盒的一部分，特别适用于癌症，尤其是乳腺癌、肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌，或其它癌症，与公开方法一致。此试剂盒包括至少一种所描述的所描述的SHON组件（如一种抗体或抗体片段）；例如也可附有解释诊断和治疗癌症的使用说明方法。

下面的阐述使本专利的具体实施，特色和优势成为显而易见。但是应当指出，详尽的描述和具体的实例虽然是本专利的较好的实施例，但仅为应用展示范例，这是因为对于本领域的技术人员有了这些详尽的描述，在此发明的精神和范围内进行各种改变和修改是显而易见的。

本发明从广义上说包括申请说明书中提及或表明的部件，组件和特征，无能单独地或集体地，以两个或两个以上所述的部件，组件和特征的任意或全部组合的形式，以及特定整体提到的在本发明所涉及的技术中本领域的已知的等同物，这些已知的等同物被视为已并入本申请，就如同单独列出一样。

本专利包含有SHON的三个转录变异体a，b和c，已于2012年10月13日存入国际基因数据库GenBank，其登录号分别为JX965369，JX965370和JX965371。

本专利的其它方面和实施例如下文所述。

附图的简要说明

本专利的所有细节都应着全方位的考虑，下面描述的例子及附图使它们变得显而易见：

图1. SHON转录变异体a的核酸序列。 根据5'-RACE以及EST克隆 (GenBank序列号AY358103) 和基因组克隆（GenBank序列号NT007933）获得的SHON序列。5'-RACE确定了两个转录起始位点在核苷酸1（T）和21 （C）处，用粗体标出。5'RACE和RT-PCR中所用引物在序列上标明。翻译起始密码子ATG和终止密码子TGA用下划线和粗体标识。标准AATAAA多聚腺苷酸化信号也用下划线和斜体标出。*表明多聚（A）尾巴的可能位点（SHON转录变异体已于2012年10月13日录入GenBank中，序列号为JX965369）。

图2.SHON a蛋白的预测氨基酸序列。根据SHON转录变异体a，蛋白序列用单密码字符表示。预测的信号多肽（残基1-21）用小写标注。半胱氨酸用粗斜体表示。成熟蛋白中两个半胱氨酸之间预测的二硫键也同样标出。氨基酸数量显示在页面左侧。保守序列分析用的是Motif Scan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)，

OSUI (http://bp.nuap.nagoyau.ac.jp/sosui/sosui_submit_html)和

PredictProtein (http://www.predictprotein.org/)。

图3.A-B. SHON转录变异体b和c的核苷酸序列。通过5'RACE和EST克隆（图片：1286243）获得序列，EST克隆是从人扁桃体细胞（GenBank登录号CR745472和AA740612）和基因组克隆（GenBank登录号NT_007933）中获得。得到另外两个SHON转录变异体：一个较长的（SHONb）（A）和一个较短的（SHONc）（B）。与转录变异体b比较，由于下游受体的选择性剪切，转录变异体c具有较短的外显子2。转录变异体b特有的118 bp序列用小写标注。5'RACE中转录起始位点T位于核苷酸21处，用粗体标出。5'RACE和RT-PCR中使用的引物该序列上方标明。三个潜在的翻译起始密码子ATG和终止密码子TAG用下划线和粗体标出。标准AATAAA多聚腺苷酸化信号亦用下划线和斜体标明。表明5000bp长的内含子的位置；*表明多聚（A）尾巴的可能位置（SHON转录变异体b和c已于2012年10月13日录入GenBank中，序列号为No.JX965370和JX965371）。

图4A-B.SHON蛋白亚型β和γ的预测氨基酸序列。根据SHON转录变异体b和c，蛋白序列用单密码字符表示。半胱氨酸用粗斜体表示。成熟蛋白中两个半胱氨酸之间预测的二硫键也同样标出。氨基酸数量显示在页面左侧。保守序列分析用的是Motif Scan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)，SOSUI

(http://bp.nuap.nagoyau.ac.jp/sosui/sosui_submit_html)和Predict Protein

(http://www. predictprotein. org/)。

图5.SHON蛋白亚型的序列比较。SHON蛋白亚型α、β和γ分别由转录变异体a，b和c编码，由CLUSTAL V2.0.10（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)手动调试完成。对比序列用BOXSHADE V3.31C（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces /boxshade.html）涂上颜色。

图6A-C.SHON基因座的基因组学描述。（A）SHON基因座的结构示意图表明SHON转录变异体a，b和c和两个启动子的相对位置。转录变异体a包含一个单独外显子（阴影框），并利用启动子1，而转录变异体b和c有两个外显子，是通过下游受体的选择性剪切得到，且由启动子2控制。这些外显子（E 1，E2或E2`）用立体或暗阴影框标出。启动子序列用TATA，CAAT和GC盒注释。转录起始位点和保守聚腺苷酸化信号AATAAA位置如图。外显子和内含子的大小被标出。附图没按比例作出。（B和C）从基因组克隆（GenBank序列号NT_007933）中提取出SHON基因序列。内含子用小写标注，剪接供体（GT）和受体（AG）位点以粗体和斜体突出，外显子用大写标注，应转录变异体SHONb 特有的118bp序列用下划线表示。左侧数字表示相对于各自SHON转录变异体a, b和c转录起始位点（+1）序列的位置。一些潜在转录因子结合位点用TFSEARCH在线数据库（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）注释。许多潜在Sp1位点在启动子1中找到，但未标出。箭头指示链的极性。转录起始位点用粗体和斜体标出。转录启动密码子ATG和终止密码子TGA，和保守聚腺苷酸化信号AATAAA用下划线和粗体表示。SHON c的终止密码子TAG用框标出。

图7.MCF-7细胞中SHON mRNA的表达。SHON mRNA转录变异体在MCF-7细胞中经存在（+）或不存在（-）逆转录酶（RT）的逆转录后PCR扩增得到。用两对引物SHONc5/ SHONc3和SHONFl/ SHONc3（表1）来扩增SHON a / b（均为280bp）和b / c（b为456 bp，c为338bp）的转录变异体。M，1 Kb Plus DNA Ladder。

图8A-C.兔抗SHONα多克隆抗体的特性。（A）蛋白印迹大肠杆菌M15细胞携带pQE30-SHONα质粒（编码一个HIS标签SHONα融合蛋白HIS-SHONα），前期（一）和后期（+）加入IPTG，HIS-SHONα结合Ni-NTA珠子，且HIS-SHONα蛋白洗脱由SDS-PAGE分离，再转移到PVDF膜上，然后用小鼠抗HIS单克隆抗体探针杂交。HIS-SHONα最终检测为约6 kDa的条带。（B）蛋白印迹。纯化重组的GST-SHONα融合蛋白（每泳道5纳克）通过SDS-PAGE分离，并和免疫接种（预）前的兔血清作免疫杂交，在第一次免疫（一期）的3周后，和第二次加强免疫的3周后（二期）。抗血清明确识别GST-SHONα融合蛋白和SHONα片段。（C）蛋白印迹。纯化的HIS-SHONα与（B）中GST-SHONα培养的抗SHONα血清免疫杂交。抗血清能够检测出约6 kDa条带的HIS-SHONα。检测蛋白条带的分子量（M）以kDa显示在左侧。

图9A-E.兔抗SHONα多克隆抗体的特异性。（A）MCF-7细胞用SHONα表达质粒pIRESneo3-SHONα按照图上标注的量转染24小时。随后用细胞裂解液作蛋白印迹分析。而印迹为兔多克隆SHONα抗体的免疫印迹。质粒中强制表达的SHONα为12 kDa的特异性条带。（B）MCF-7细胞用SHONα表达质粒pIRESneo3-SHONα（MCF7-SHON）稳定转染，并用空载质粒pIRESneo3（MCF7-Vec）作为对照，或用SHON siRNA质粒pSilencer-siRNA（MCF7-siRNA）或阴性siRNA对照质粒pSilencer-CK（MCF7-CK）。反转录（RT）-PCR方法检测SHON mRNA的表达，并用兔多克隆SHONα抗体作蛋白印迹（WB）检测SHON蛋白量。(C)多肽封闭。稳定的 MCF7-Vec（载体） 和 MCF7-SHON（SHON）细胞的全细胞裂解液用所述用量与1µg/ml的SHONα抗体亲和纯化，抗体用1µg/ml BSA或重组HIS-SHONα多肽(HIS-SHON)预培养。(D)免疫沉淀。稳转的MCF7-Vec（载体） 和 MCF7-SHON（SHON）细胞的全细胞裂解液与亲和纯化的SHONα抗体(anti-SHON)和正常对照组兔IgG(Control IgG)作免疫沉淀。沉淀物与SHONα抗体作蛋白印迹分析。内源和外源的SHON蛋白表达以SHONα抗体作pulled-down试验，显示为全长12 kDa的条带。其中6 kDa条带可能为免疫沉淀中降解的结果。(E)在多种人乳腺癌细胞株中SHON蛋白的表达是利用亲和纯化SHONα抗体作蛋白印迹获得。β-actin作为上样对照。侧边显示RT-PCR 扩增产物的大小或分子量检测蛋白条带。

图10A-C.SHON mRNA 及蛋白在正常人组织，癌症细胞系和乳腺癌组织中均表达。(A) 用对应转录本a, b的特定引物 (SHONc5/SHONc3)作PCR（40循环）扩增SHON，并用从不同人组织cDNA（OriGene）作为平行对照。每条泳道样本如图。GAPDH 基因作cDNA样本对照。(B)人细胞系SHON mRNA 的表达用特定SHON引物作RT-PCR获得，并用兔多克隆SHONα抗体作蛋白印迹（WB）检测SHON蛋白量。β-actin作为RNA或细胞裂解上样的对照。(C) 乳腺癌cDNA实验（OriGene）中SHON mRNA的表达由特定SHON引物作PCR获得。实验包含48个样本，其中有5-正常, 11-一期, 8-IIA, 6-IIB, 8-IIIA, 2-IIIB, 4-IIIC和4-IV。β-actin作为RNA上样对照。右侧显示为PCR 扩增产物的大小。cDNA实验中SHON的相对表达量由ImageJ 软件（NIH） 的光密度分析获得，且β-actin作为正常对照。右侧为表示(RT-) PCR扩增产物的大小或分子量的蛋白条带。

图11A-D.SHONα是一种分泌蛋白，而SHONβ为一种前体蛋白。（A）蛋白印迹实验。HEK293细胞用带有HIS-标签的SHONα表达质粒pIRESneo3-SHONα-HIS (SHONα-HIS)和空白对照载体（载体）作转染。用SDS-PAGE分离全细胞提取液或浓缩溶剂，并用鼠抗-HIS单克隆抗体及抗-SHONα多克隆抗体作免疫印迹分析。β-actin为细胞裂解液的上样对照。(B) MCF-7 细胞用SHONα表达质粒pIRESneo3-SHONα，SHONβ表达质粒pIRESne03-SHONβ及空载对照pIRESneo3质粒作瞬时转染。SHON蛋白的表达用蛋白印迹分析，左侧为分子量标记，以KDa表示。(C) SHONβ的预测氨基酸序列。由前蛋白转化酶识别的保守序列(K/R)Xn(K/R)用粗体和下划线标出。(D) 用以下质粒转染HEK293细胞，空载pIRESneo3（载体)、SHONα表达质粒pIRESneo3-SHONα(SHONα)、SHONβ表达质粒pIRESneo3-SHONβ(SHONβ)、SHONβ突变质粒pIRESneo3-SHONβni(SHONβmut)，其中突变质粒为保守序列K⁶²R⁶³突变为N⁶²I⁶³，pIRESneo3-SHONα-Myc(SHONα-Myc)、pIRESneo3c-Myc-SHONβ-Myc(SHONβ-Myc)和pIRESneo3-SHONβni(SHONβmut -Myc)，此质粒C端表达c-Myc 标记的SHONα、SHONβ和SHONβ(N⁶²I⁶³)。用兔抗SHON多克隆抗体或c-Myc标签鼠多克隆抗体9E10作蛋白印迹检测SHON的蛋白表达量。β-actin为蛋白裂解液上样对照。右侧显示蛋白条带的分子量。

图12A-C.SHON是一种雌激素诱导基因。(A)RT-PCR。MCF-7细胞在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中培养24小时。然后在含10%炭脱色-FBS的无酚红培养基中进一步培养72 小时，再加入10nM 17β-雌激素(E2)。总RNA按照如图时间点提取，用SHON-特异性引物SHONc5和SHONc3(表1)，一步RT -PCR试剂盒（Qiagen）检测SHON mRNA的表达量。β-actin为RNA样本对照，正向引物：5`-ATCATATCGCCGCGCTCG-3`和反向引物5`-CGCTCGGTGAGGATCTTCA-3`。右侧显示扩增产物的大小。(B) MCF7-Vec 和 MCF7-SHON 细胞用二甲基亚砜 (-) 或10nM E2 (+) 处理72 小时，培养在含10%炭脱色-FBS的无红苯酚培养基中。用兔多克隆SHONα抗体作蛋白印迹分析全细胞裂解液中SHON的表达量。右侧显示检测蛋白条带的分子量。(C)总细胞数试验。MCF7-Vec 和 MCF7-SHON 细胞接种在含10%炭脱色-FBS的无酚红培养基中。然后用二甲基亚砜（Veh）、10nM 17β-雌激素(E2)或100nM ICI182,780(ICI)处理。按照图示天数细胞计数。所有数据显示为平均值±SD(标准偏差)。按照图示天数细胞计数。**, P<0.01; ***, P<0.001。

图13A-B.亲和纯化SHONα抗体的免疫细胞化学。(A)HEK293细胞用C端带有EGFP标签、编码EGFP蛋白的表达质粒pIRESneo3-SHONα-EGFP、编码EGFP蛋白的pEGFP-C1空载瞬时转染。24小时后，将细胞固定并用Triton X-100渗透，亲和纯化兔多克隆SHONα抗体作为初级抗体染色来进行免疫细胞化学。SHONα染色是用结合二抗（红色）的Cy5 菁染料，再用Hoechst 33258（蓝色）复染。用荧光显微镜（绿色）来检测EGFP或SHONα-EGFP的表达量。最右边柱为融合图像。pIRESneo3-SHONα-EGFP转染细胞通过绿色和红色荧光染色共定位表明，兔抗-SHONα抗体能够特异性识别SHON。比例尺，50µm。(B)HEK293 细胞用表达质粒plRESneo3-SHONα(SHON)和空白对照plRESneo3(载体)瞬时转染。48小时后收集细胞。细胞盘用4%多聚甲醛固定，并包埋在石蜡中。石蜡块用高压锅在10mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中煮20分钟来修复抗原，然后用兔抗-SHONα抗体染色。SHON蛋白用结合二抗（红色）的Cy5菁染料染色。细胞核用Hoechst 33258（蓝色）复染。融合图像显示于最右侧。兔抗-SHONα抗体能够在福尔马林固定，石蜡包埋的细胞格中识别SHON蛋白。比例尺，50µm。

图14A-B.正常组织和乳腺癌组织中SHON表达的显微图像。(A) IHC染色最优化对照。(B)正常代表样本和乳腺癌TMA核心中SHON的表达。ER，雌激素受体。

图15A-C.Kaplan-Meier生存曲线。依据SHON在本研究所有患者中的表达状态绘出乳腺癌特异生存(BCSS) (A)，无瘤生存(DFS)(B)，和无远处转移生存(DMFS)(C) 的Kaplan-Meier曲线。 表中P 值源自5 log等级测试；’n’代表每组中样本数。

图16A-C.以SHON表达预测内分泌治疗ER+乳腺癌的效果。以高风险性(NottinghamPrognostic Index≥3.4)/ER+乳腺癌患者的肿瘤为SHON阳性(+) 对比阴性(-)获得的乳腺癌特异生存(BCSS)(A)，无瘤生存(DFS)(B)，和无远处转移生存(DMFS)(C) Kaplan-Meier生存曲线。P 值代表生存率log-等级差异试验。

图17A-B.Kaplan-Meier生存曲线。未用蒽环霉素治疗(A)和蒽环霉素治疗(B)的ER-患者的无瘤生存Kaplan-Meier率。依据SHON的表达状态得出。表中P 值源自5log等级测试；’n’代表每组中样本数。

图18A-D.鼠抗SHON单克隆抗体的制备和特异性。(A)蛋白印迹。MCF-7细胞用SHONα表达质粒plRESneo3-SHONα(SHON)和空白对照plRESneo3(载体)稳定转染。全细胞裂解液用SDS-PAGE分离，再用从克隆mAb#4, mAb#5, mAb#8和mAb#8中纯化的鼠单克隆SHON抗体进行免疫印迹。M，蛋白标记用分子量kDa表示。(B)蛋白印迹。多种乳腺癌细胞系的SHON蛋白表达用从克隆mAb#5中得到的纯化鼠单克隆SHON抗体进行蛋白印迹分析。M，蛋白标记用分子量kDa表示。(C) HEK293细胞用带有C端EGFP标签，编码SHONα的表达质粒pIRESneo3-SHONα-EGFP瞬时转染。24小时后，将细胞固定并用Triton X-100渗透，再用亲和纯化鼠单克隆抗体克隆1H6或4G4，或鼠多克隆SHONα抗体(mPA#4)作为初级抗体染色来进行免疫细胞化学。SHONα染色是用结合二抗（红色）的Cy3 菁染料。用荧光显微镜（绿色）来检测SHONα-EGFP的表达量。最右边柱为融合图像。pIRESneo3-SHONα-EGFP转染细胞通过绿色和红色荧光染色共定位表明，鼠抗-SHONα抗体能够特异性识别SHON。(D)蛋白印迹。HEK293 细胞用C端带有EGFP标签，编码SHONα的表达质粒pIRESneo3-SHONα-EGFP和编码EGFP蛋白的pEGFP-C1空载来瞬时转染。24小时后，pIRESneo3-SHONα-EGFP转染细胞(+)和pEGFP-C1空载细胞(-)的细胞提取液由SDS-PAGE分离，再用从克隆1H6或4G4子克隆或鼠多克隆SHONα抗体(mAb#4)中获得的鼠单克隆抗体进行免疫印迹。泳道1，1H6子克隆1；泳道2，1H6子克隆2；泳道3，1H6子克隆3；泳道4和8，鼠多克隆SHONα抗体(mAb#4)；泳道5，4G4子克隆3；泳道6，4G4子克隆4；泳道7，4G4子克隆6。左侧标注蛋白标记的分子量。

专利详细注释

下面用一般性的术语描述本专利的应用， 包括较好的实施例。“实例”部分提供了支持本发明和特定的例子的实验数据，对专利进行了进一步的公开阐述。

本专利提供表达ER-调控基因的ER+乳腺癌患者的临床数据和观察结果。特别地，SHON的表达与内分泌治疗的有效性呈现出一种令人惊喜的、显着的相关。而这种相关开发了新的预测乳腺癌患者 （尤其是ER阳性者）的无瘤生存期和无远处转移生存期的诊断方法。本专利证明ER-调控的SHON是一种重要的分子生物标志物，可鉴定无瘤生存期和无远处转移生存期，选择对内分泌治疗的有反应的患者给予治疗。特别地，SHON基因表达水平可作为内分泌治疗的预言者和预后诊断的标记。明显地，SHON多肽的表达预测未接受内分泌治疗的患者的会有较好的无瘤生存期和无远处转移生存期，也同时作为接受内分泌治疗的患者的预后诊断指标。

名词定义

此处说明，“一个”可能代表一个或多个。同时声明，当与“包含/包括”连用时，“一个”可能代表一个或多于一个。文中“另外”表示至少另外一个或更多。

“无瘤生存”定义为治疗癌症患者第一次确断和/或第一次手术至第一次复发的时间。例如，如果癌症患者在肿瘤切除后五年内出现第一次复发，更具体地讲，如果癌症患者在五年内有少于约55%无瘤生存率，其无瘤生存则属“低”。例如，较高的无瘤生存则为五年内多于约55%无瘤生存率。

“乳腺癌特异性生存”定义为癌症患者从/或第一次手术治疗至因乳腺癌致死的时间。例如，长期的乳腺癌特异性生存指手术或其它治疗后至少生存五年，更理想的状况为八年，最理想的是十年。

“无远处转移生存”定义为癌症患者第一次确断和/或第一次手术至第一次肿瘤转移的时间。

“内分泌治疗”定义为对任何能通过腺体细胞内部输送分泌到血液中的导管或内分泌腺体的治疗方法。此种方法可能需要移除腺体，阻断荷尔蒙的合成，以及阻止激素与其受体结合。

“内分泌治疗有效患者”定义为患者在接受内分泌治疗后呈现理想的生理学效果，诸如治疗成效。

“SHON”代表，但不仅限于，SHON转录变异体a，SHON转录变异体b和SHON转录变异体c；以及SHON蛋白亚型α，SHON蛋白亚型β，SHON蛋白亚型γ。本专利中用的人的序列，但其它同源序列也可以使用。当提及SHON及其相关术语时，都包括全长序列、片段或修饰体（包括转录本）。

“SHON阳性（SHON+）”为表达SHON的癌症，而“SHON阴性（SHON-）”则不表达SHON的癌症。

“雌激素受体阳性（ER+）”为具有雌激素受体表达的肿瘤，而“雌激素受体阴性（ER-）”则没有雌激素受体表达的肿瘤。

“多肽”与“蛋白质”在文中交替使用，定义为包括多个氨基酸亚基的分子。多肽分子可能为蛋白质整体或蛋白质片段，如一个肽或寡肽分子。多肽可能包括对氨基酸亚基的修饰，如甲基化或乙酰化。多肽可能是自然生发的、重组的、合成或半合成的分子。文中引用的术语指自然生发蛋白质分子的氨基酸序列，并不局限于完整的原始的全长分子的氨基酸序列。当提及“多肽”及其相关术语时，都包括全长序列及任何修饰片段

“预后诊断”定义为对疾病可能的发展及结果的预测。例如本专利SHON是癌症病人对内分泌治疗反应的预后诊断诊断标记。

“预测”指患者对一种或一组药物产生有利的或不利的反应以及反应效果的程度的可能性，或者指患者手术移除初级肿瘤后和/或化疗治疗在一段时间内无肿瘤复发会存活的的可能性。在预测患者是否对诸如手术、特定药物或药物组合化疗、和/或辐射治疗的治疗方案会有好的响应方面，以及预测经手术和/或终止化疗或其它治疗后病人是否能够长期存活方面， 本专利的预测方法都是有价值的工具。

“SEQ ID NO”为每段序列或组合序列的标识。

“同SEQ ID NO：2，5和6高度相似”定义为例如一段多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：2，5和6至少有约70%相同或相似，且高度相似的多肽也具有SEQ ID NO：2，5和6多肽的生物学活性。

“治疗”及类似术语指预防、治疗或改善医学综合症（如医学疾病、状态或症状），或至少改善疾病的一种症状的方法。特别地，这种治疗方法能够预防或延后疾病；为了治疗、纠正、减少、拖延或改善疾病所致的痛苦。“治疗”在本文中多处出现，但并不意味着康复，仅代表治疗的过程。总之，“治疗”广泛应用于抑制、减少或预防细胞增殖、生长、迁移甚至致癌方面；改善细胞增殖、生长、迁移甚至致癌的症状或严重性；预防或减少细胞增殖、生长、迁移甚至致癌的风险性，例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌或其他癌症。

“样本”表示患者的样品。组织、细胞或体液样本能够从身体的几乎各个组织获得。取得样本最适宜的方法依推测或诊断的肿瘤类型而不同。活体组织切片方法包括针灸、内窥镜或切除。将肿瘤从机体移除后，依据诊断类型方法确定肿瘤样本或体液的治疗，用来鉴定SHON或ER的表达。

“抗体”从广泛意义上理解包括单克隆抗体和多克隆抗体。一些显示预期生理学意义的修饰性抗体也包含其中。抗体包含免疫球蛋白分子和具有免疫活性的免疫球蛋白（Ig）分子，如带有一个与抗原分子特异性结合（免疫活性）的抗原结合位点的分子。文中提及的抗体及类似的描述不仅包括完整抗体，也包含修饰类抗体。

“氨基酸序列”定义为寡肽、肽、多肽、蛋白或抗体序列，及任何自然发生的重组、合成、半合成分子的片段。本专利涉及序列包含至少5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸，更为理想的是5-10，5-15，10-15或12-15个氨基酸。更好地，这些序列保持有生物学活性（如细胞增殖、生长、转移或致癌作用）及原始氨基酸的免疫原性/免疫性活性。文中“氨基酸序列”及类似的术语不仅包括完整、原始的全长分子序列，还有修饰序列。

“表达”包括多核苷酸和多肽的产生，特别是由一个或一类基因产生的mRNA（如mRNA），和包含由一个RNA或一个、一类基因编码的多肽，以及表达相关的可检测分子。例如，一种复合体的形态，如多肽-多肽相互作用、多肽-核苷酸相互作用或类似的均属于“表达”的范畴。另一个例子是杂交探针或抗体等结合配体，与基因或其他多核苷酸或寡核苷酸，多肽或蛋白片段结合，并观察其结合。当进行如RNA印迹等杂交印迹，蛋白印迹等免疫印迹，微珠阵列，PCR分析时，通过显微镜放大的样本，亦包含在“表达”的生物分子中。

“同源性”定义为互补的程度。包含部分同源（如确定百分比的同一性）或完全同源（如100%的同一性）。部分同源序列指杂交中至少部分序列被抑制合成与目标核酸相同的序列，称为功能性术语“大量同源”。杂交中与目标片段完全互补序列的抑制能够在低严谨度的杂交实验（如DNA或RNA印迹，溶剂杂交等）中检测。在低严谨度条件下，大量同源片段或杂交探针与目标序列互补，并能抑制目标序列与完全同源序列的结合。另外，低严谨度不是非特异性结合；而是两段序列间存在特异性（如选择性）相互作用。

“杂交”定义为核酸链通过碱基配对与互补链结合。

“修饰”或“修饰的”描述改变的序列及序列片段、变异体和衍生物。包含文中提到的多肽、多核苷酸、抗体和抗原。

“核苷酸序列”或“核苷序列”定义为多肽、寡核苷酸或片段序列，片段指天然、重组、合成或半合成的单链或双链DNA或RNA，能够代表正义反义链、编码和非编码区。本专利中序列包含15，21，27，33，36，39，45，51，57及66个核苷酸，更可取的是至少15-36，25-66，36-66或45-66个核苷酸，或至少100个核苷酸，或至少1000个核苷酸。文中提及的“核苷酸序列”或“核苷序列”包括原始、全长序列，以及任何互补、修饰序列。此外，“多核苷酸”（或“寡核苷酸”、“探针”、“引物”等）均有特异的SEQ ID NO.，包括DNA和反义RNA序列。

“寡核苷酸”指多核苷酸，特别是探针或引物，无限制地包含单链DNAs，单链或双链RNAs，RNA: DNA杂交和双单链DNAs。如单链DNA探针的寡核苷酸能够通过化学方法合成，如商用的自动寡核苷酸合成子，体外表达体系，重组技术和在细胞、组织中表达。

多肽的“变异体”定义为改变了一个多个氨基酸的氨基酸序列。同样的，一个变异体抗体、变异体多核苷酸也被改变了一个或多个氨基酸。变异体可能导致替代的氨基酸序列有相似的结构或化学特性的“保守性”改变，如异亮氨酸替代亮氨酸。较少见的是变异体导致“非保守性”改变，如色氨酸替代甘氨酸。小的同功变异可能包括氨基酸的缺失和插入，或两者同时发生。由于氨基酸残基替换、插入或缺失导致生物活性或免疫原性丧失，这种现象的机制能够用广泛使用的电脑软件鉴定出，如LASERGENE软件（DNASTAR）。

本专利中涉及的变异体至少保留一种生物活性（如细胞增殖、生长、迁移和/或致癌）或免疫原性/免疫性的功能。理想的变异体包括至少80%，更优为至少90%与公开序列相同的序列。最理想的变异体包含至少95%、97%、98%或99%与公开序列相同的序列。同一性的百分比由两序列比对而得，首先检测比对序列中相同残基的数量，再通过专利（查询）序列的总残基数将数量分类，最后用100. A有力的比对程序Align X (Vector NTI)来计算结果。

本专利的实行除特别说明外包括方便的分子生物学技术（包括重组技术），显微生物学，细胞生物学和生物化学，均在本领域的技术范围内。以上技术可参阅如下文献：如，分子克隆：实验室手册，第二版，Sambrook等1989；分子克隆：实验室手册，第二版，Sambrook等，2000；寡核苷酸合成，MY Gaited等，1984；动物细胞培养，R．I．Freshney等，1987；酶学方法，学术印刷，Inc. ；实验免疫手册，第四版，D. M. Weir&CC. Blackwell, eds.,Blackwell Science Inc., 1987；哺乳动物细胞基因转移载体，JAM. Miller&MAP. Calos,eds., 1987；分子生物学手册，FEM. Ausubel et a1., eds., 1987；PCR：聚合酶链反应，Mullis et a1., eds., 1994。

本专利中所有方法均可用治疗组合物实现。文中所有关于本专利的叙述都通用。

检测SHON的方式

检测SHON所用试剂（如抗体或抗体片段）可以单独使用，或同一个或多个可用的药物级的稀释剂、载体、和/或赋形剂配合使用。

SHON多核苷酸和多肽

本专利中用于产生SHON抗体的多肽和肽，包括至少一个在附图中的SEQ ID NO：2, 5和6的多肽、片段和其修饰物。SHON抗体可与这些多肽一起用于癌症诊断，特别是乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，子宫内膜癌，肺癌，胃癌，肝癌，卵巢癌等。多肽可用于大规模合成和分离方法，例如商业化生产。

本专利中多肽包含至少一个选自以下的序列：(a) 多肽包含至少一段来自SEQ IDNO：2, 5和6的多肽氨基酸序列或其修饰序列；(b) 多肽包含的功能性区域源于至少一段来自SEQ ID NO：2, 5和6中的多肽氨基酸序列或其修饰序列；(c) 多肽包含一定数量的连续残基源于至少一段来自SEQ ID NO：2, 5和6中的多肽氨基酸序列或其修饰序列。在具体的实施例中，本专利中包括分离出的含至少一种SEQ ID NO：2, 5和6的氨基酸序列的多肽。以上所有序列在本专利中因而统称为此专利的多肽。

本专利中也包括用于生产SHON抗体的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1, 3和4中的编码序列和其修饰序列。因而，本专利包括使用这些多核苷酸来准备表达载体和宿主细胞，以及制备反义多核苷酸和iRNAs。本专利的这些多核苷酸也可作为组合成分，例如药剂成分。

本专利中多核苷酸包括至少一个选自以下的序列：(a) 核苷酸序列包含了至少一个氨基酸序列的编码序列是出自SEQ ID NO：1, 3和4中的序列或其修饰序列；(b)互补序列、反向序列和反向互补序列包含了至少一个氨基酸序列的编码序列是出自SEQ ID NO：1,3和4中的序列或其修饰序列；(c)开放式阅读框包含了至少一个氨基酸序列的编码序列是出自SEQ ID NO：1, 3和4中的序列或其修饰序列；(d)功能性区域包含了至少一个氨基酸序列的编码序列是出自SEQ ID NO：1, 3和4中的序列或其修饰序列；(e) 核苷酸序列包含一定数量的连续核苷酸，而它们从属于至少一个出自于SEQ ID NO：1, 3和4中的序列或其修饰序列的氨基酸序列的编码序列；(f) 核苷酸序列包含一定数量的SEQ ID NO：1, 3和4中的序列，或互补序列，或其修饰序列。在具体的实施例中，本专利中所包含分离出的核苷酸包含了至少一个氨基酸序列的编码序列是出自SEQ ID NO：1, 3和4中的序列。在另一实施例中，本专利包括分离出的含有核苷酸序列是源于SEQ ID NO：1, 3和4的核苷酸序列。我们也提供了寡核苷酸探针和引物及其修饰物。以上所有多核苷酸，和寡核苷酸探针及引物在专利中都被称为为此专利的多核苷酸。

本领域的研究人员可以理解，由于遗传密码的简并性，多种编码本专利多肽的核苷酸序列，一些与任何已知核苷酸序列和天然存在的基因同源的序列，都将被合成。如此本专利将由于基于可能密码子组合的选择性组合导致的每个及其可能的核苷酸序列变异都列入考虑。这些组合按照标准三联遗传密码子法则，应用于天然存在的氨基酸序列，并且所有变异体都被明确公开。

SHON核苷酸序列及其修饰物能与天然存在的核苷酸序列，在选择的合适严谨度条件下杂交。而有利于产生核苷酸序列及其修饰物，具有大量不同的密码子组合。选择密码子来增加发生在特定真核生物或原核生物宿主中的多肽的表达频率，与宿主中特定使用的密码子频率保持一致。另一个不改变编码氨基酸序列，而大量改变的核苷酸序列和其衍生物产生的原因是多种RNA转录变异体的产生，其预期性质如较之自然存在的转录本，具有更好的半衰期。

专利还指由化学合成的SHON或其修饰物多核苷酸的产生。之后利用普遍使用的试剂，合成序列可能插入到任何可用表达载体和细胞系统中。此外，化学合成可用于引入突变到核苷酸序列及其衍生物中。多核苷酸序列能够与特定的核苷酸序列杂交，特别是SEQ IDNO：1,3和4或互补、修饰序列，在不同严谨度条件下，Wahl, G. M. and S. L. Berger(1987; Methods Enzymol. 152: 399-407) and Kimmel, A. R. (1987; MethodsEnzymo1. 152: 507—511)。

本专利中DNA测序选用普遍使用的方法。这些方法涉及到如Klenow片段DNA聚合酶I，SEQUENASE (U. S. Biochemical Corp, Cleveland, OH)，Taq聚合酶 (Perkin Elmer)，耐热T7聚合酶 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)，或重组聚合酶，如在ELONGASE扩增系统 (Life Technologies, Gaithersburg, MID)中发现的校对核酸外切酶等酶。在自动化机器中完成扩增过程，如Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno,NV)，Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA)the ABICatalyst和373，377 DNA Sequencers (Perkin Elmer)，或the Genome Sequencer 20TM(Roche Diagnostics)．

核酸序列以一部分核苷酸序列为模板延伸，使用普遍适用的方法去检测如启动子和调控组件等上游序列。例如“限制性-位点”PCR这种方法，用通用引物去获取已知基因座邻近的未知序列 (Sarkar, G. (1993)PCR Methods Applic. 2: 318—322)。特别地，当有连接引物、对应已知序列区域的特异性引物时，基因组DNA首先被扩增。扩增片段然后用相同的连接引物和另一个特异性引物进行第二轮PCR。每一轮PCR的产物用适宜的RNA聚合酶转录，并用反转录酶测序。

商用的毛细管电泳系统可用于分析测序或PCR产物的大小，并确认核苷酸序列。特别地，毛细管测序电泳分离时采用流动聚合物，四种不同激光标记的荧光染料（分别对应每种核苷酸），并用电耦合摄像机检测所发射波长。输出/光强度使用适当软件（如GENOTYPER和序列NAVIGATOR，Perkin Elmer）可被转换为电信号，从样品装载、计算机分析到电子数据显示的整个过程均由计算机控制。毛细管电泳特别适用于特定样品中微量的小片段DNA的测序。

本专利中多核苷酸或其修饰物可用于重组DNA分子，来介导适当宿主中SHON多肽或其修饰物的表达。由于遗传密码的固有简并性，其它编码大量相同或功能等同的氨基酸序列的DNA序列产生，且这些序列可用于多肽的克隆与表达。用通用已知方法改造核苷酸序列，能够因不同原因而改变相应的氨基酸编码序列，包括但不仅限于修饰克隆、加工和/或表达基因产物的改变。用随机片段和PCR组装的基因片段来打乱DNA，合成的寡核苷酸用来改造核苷酸序列。例如定向突变能够用于插入新的限制性位点，改变糖基化模式，改变密码子偏好，引入突变等。

本专利中天然、修饰或编码多肽的重组核苷酸序列能配和到一段异质性序列中来编码融合蛋白。例如编码一段能够被商用抗体识别的嵌合序列。融合蛋白中加入一段切割位点，位于专利多肽和异质性蛋白序列之间，所以多肽能够切割下来并纯化去除异源部分。

核苷酸序列能够使用普遍的化学方法（见Caruthers, M. H. et a1. (1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et a1. (1980) Nucl. Acids Res.SymP. Ser. 225—232)部分或全部合成。换言之，多肽自身能够用化学方法被合成来产生氨基酸序列或其修饰物。例如多肽能够用不同的固相技术合成(Roberge, J. Y. et a1.(1995) Science 269: 202. 204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149—2154)和自动化合成，如ABI 431 A 多肽合成器 (Perkin Elmer)。多肽的不同片段都能分别化学合成，也能用化学方法合成全长分子。

新合成多肽可通过高效液相分离色谱（如Creighton, T.（1983）蛋白质结构与分子原理，WH Freeman和 Co．，New York，NY）分离。合成多肽的组分可通过氨基酸分析或测序（例如，Edman降解程序; Creighton，supra）鉴定。此外，多肽或其任何部分的氨基酸序列都可能在直接合成时改变，和/或用化学方法与从其他蛋白或其任何部分获得的序列组合，来合成修饰分子。

为表达由生物活性的多肽，编码多肽或同功物的核苷酸序列可能插入到适宜的表达载体中，如包含转录和翻译插入编码序列的必需组件的载体。此领域广泛使用的方法用来构建包含编码多肽和适宜转录、翻译调控组件的序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内基因重组。以上技术见Sambrook, J. et a1. (1989) 分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY；also，Sambrook, J. et a1.(2000) 分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY，and Ausubel，F．M．et a1．(1989)

当代分子生物学手册，John Wiley&Sons，New York，NY。多样的表达载体/宿主体系应用于本专利包含、表达编码多肽的序列中。这些包含但不仅限于，微生物如用于转染的重组噬菌体、质粒或克斯DNA表达载体等细菌；用真菌表达载体转染的真菌；感染病毒表达载体（如杆状病毒）的昆虫细胞系统；与病毒表达载体（如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV）或细菌表达载体（如Ti或pBR322质粒）转染的植物细胞体系；或动物细胞系统。对于细菌质粒包括Invitrogen的pET，pRSET，pTrcHis2，和pBAD质粒 ，Novagen的pET和pCDF质粒以及Sigma-Aidrich的Director^TM质粒。特别地，大肠杆菌用pET表达质粒。本专利不局限于使用的表达载体及宿主细胞。

“控制组件”或“调控序列”指一些非翻译区（如增强子、启动子、5`和3`非翻译区），能与宿主细胞蛋白相互作用来进行转录和翻译。以上组件的长度和特异性不同。依赖于所用载体系统和宿主，任何合适的，包含保守和诱导启动子的转录、翻译组件均可用到。例如在细菌系统中克隆时，诱导启动子如杂交lacZ启动子BLUESCRIPT噬菌粒（Stratagene,LaJolla, CA)或pSPORT1质粒（Life Technologies)等均可用到。杆状病毒多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞。从植物细胞（如热激、RUBISCO和储存蛋白基因）基因组或植物病毒（如病毒启动子或前导序列）中获得的启动子或增强子可被克隆到载体中。

在细菌系统中，一系列表达载体依据多肽用途而选择。如多肽需求量大时，选用介导融合蛋白高表达的纯化载体。载体包括但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体如BLUESCRIPT（Stratagene），其中编码多肽的序列与载体氨基端Met序列和连续的7个β-牛乳糖苷酶残基连接，杂交蛋白合成；pIN载体（Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989)J.Biol. Chem. 264: 5503—5509)等。

pGEX载体（Promega, Madison, WI）和pQE载体（Qiagen）可用来表达多肽，作为融合蛋白带有谷胱甘肽转移酶（GST），或HIS标签。总之，这样的融合蛋白是可溶且能从裂解细胞中纯化出来的，纯化是在自由谷胱甘肽洗脱后，通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖条带上而得。从此类体系中所得蛋白可能设计包括发卡、凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，由此目的克隆多肽从GST部分脱落。在酿酒酵母中，许多包含保守性或诱导性启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体可能被用到。具体参见Ausubel et al. (supra)和Grant et al. (1987)Methods Enzymol. 153: 516-544。

特异起始信号用于实现编码多肽的序列的高效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。当一段序列编码一个多肽时，其起始密码子和上游序列都被插入到合适的表达载体中，不需要其他转录或翻译调控信号。而当仅有编码序列或其修饰序列插入时，外源翻译调控信号包括ATG起始密码子也需要另外加入。并且，起始密码子应该处于正确的阅读框中，来确保整个插入片段的正确翻译。外源翻译组件和起始密码子可能来源各异，自然存在或人工合成。表达效率可以通过加入适合特定细胞体系，参考文献中提及（Scharf, D.Et al. (1994)Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162）的增强子来提高。

此外，宿主细胞根据其调节插入序列表达或处理预期表达多肽的能力来选择。这样的序列修饰包括但不限于酰基化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。翻译后过程中脱落的一种“prepro”形式的多肽可能用于促进正确的插入、折叠和/或功能。有翻译后活性相关的特异细胞机制和特征机制的不同宿主细胞均能在American Type CultureCollection（ATCC; Bethesda, MD）中找到，并选用来确保序列的正确修饰和处理。特异性宿主细胞包括但不限于红酵母、短梗霉、酿酒、掷孢酵母、假单胞菌、欧文氏菌和黄杆菌；或此类其它生物如埃希氏菌、乳杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等。特定的宿主细胞包括特别适用于本专利的大肠杆菌、酿酒酵母、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等。

下面介绍几种体外将核苷酸引入真核细胞的方法。包括化学方法(Felgner eta1., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 74l3-7417(1987); Bothwell et a1., 真核基因克隆和分子方法，Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass.(1990), Ausubel et a1., 分子生物学的简明手册，John Wiley and Sons, New York,NY (1992); and Farhood, Annal. NY Acad．Sci., 716: 23-34(1994))，原生质体的使用(Bothwell, supra) or电脉冲 (Vatteroni et a1., Mutn. Res., 291"163-169(1993)；Sabeinikov, Prog. Biophys. M01. Biol., 62: 119-152(1994); Bothwell et a1.,supra; and Ausubel et a1., supra)，减毒病毒的使用 (Davis et a1., J. Virol.1996, 70(6), 3781-3787; Brinster et a1. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369-381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82: 55-63(1994); and Bothwell et a1., supra), 和物理方法 (Fynan et a1., supra; Johnston et a1., Meth. Cell Bi01., 43(Pt A):353-365(1 994); Bothwell et a1., supra; and Ausubel et a1., supra)。

专利中检测和测量多肽表达的多种方法均用特异性蛋白的多克隆或单克隆抗体。如酶联免疫分析实验（ELISA）、放射免疫化验法（RIA）和荧光激活细胞分类（FACS）。一种双位点、单克隆的免疫实验能够用单克隆抗体与多肽上的两个不干涉抗原表位作用。以上叙述的所有方法见Hampton, R. et a1. (1990; 血清学方法，实验室手册，APS Press，StPaul, MY)and Maddox, D. E. et a1. (1983; J. Exp. Med. 158: 1211-1216)。

多种广泛应用的标记和连接技术用于文中许多核苷酸和氨基酸实验。合成标记杂交物或为检测与多肽相关序列的PCR探针的方法包括寡标记、缺口翻译、末端标记或用核苷酸标记PCR扩增产物。换言之，序列或其修饰片段可被克隆到载体中来产生mRNA探针的合成物。这些商用载体可被用来体外合成RNA探针，通过加入合适的RNS聚合酶如T7,T3或SP6和标记核苷酸。这些程序用多种商用试剂盒实现，Amersham Pharmacia Biotech，Promega和US Biochemical。方便检测、合适的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂，以及底物、共因子、抑制剂、磁性颗粒等。

表达载体或宿主细胞与表达载体转染时可培养在适宜多肽表达和恢复的条件下。培养包括体内及体外表达。体外表达组分包括兔网状红细胞裂解液、大肠杆菌裂解液和麦芽提取物，如Invitrogen的Expressway^TM or RiPs 系统，iNtRON Biotechnology的Genelator^TM 系统，Novagen的EcoPro^TM 或 STP3^TM 系统，Promega的TNT^® 快速耦合系统，和QIAGEN的 EasyXpress 系统。培养所得多肽可被分泌或保留在细胞内，依所用序列和/或载体不同而相异。特别地，编码噬菌体多肽的表达载体能够设计包含信号序列，来介导多肽通过真核或原核细胞膜的分泌。

另一种构建可包含能促进多肽纯化的氨基酸区域。这类区域包含却不限于金属螯合多肽如组氨酸-色氨酸（如6X-HIS）复合物，使免疫性的金属纯化，蛋白A区域能使具有免疫活性的免疫球蛋白纯化，且此区域用FLAG 延伸/亲和纯化系统（Immunex Corp.,Seattle. WA）合成。有效的抗原表位标记包括3X-FLAG^®，HA，VSV-G，V5，HSV，GST，GFP，MBP，GAL4，和β半乳糖苷酶。有效的质粒包括带有生物素标记（如Promega的PinPoint^TM质粒），钙调蛋白结合蛋白（如Stratagene的pCAL质粒），链霉亲和素结合肽（如Stratagene的InterPlay^TM质粒），c-myc或FLAG标记（如Sigma-Aldrich的免疫沉淀质粒），或组氨酸标记（如QIAGEN的QIAExpress质粒）。

为促进纯化，表达载体可加入一段切割连接序列如特异对应因子Xa或肠激酶（Invitrogen, San Diego, CA）。如载体可包含一个或多个连接子在纯化区域和多肽之间。这样的一个表达载体能表达融合蛋白，而融合蛋白包含专利中多肽或在氧硫还蛋白或肠激酶脱落位点之前、编码6个组氨酸残基的核苷酸。组氨酸残基促进IMAC（免疫金属离子亲和色谱，见Porath, J. et a1. (1992)Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)的纯化，而肠激酶脱落位点则提供了一种从融合蛋白中纯化多肽的方法。含融合蛋白的载体的讨论见Kroll,D. J. et a1. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441-453)。

SHON的抗体

本专利包含SHON的抗体，如至少结合部分或修饰序列的抗体。一方面，抗体可用于检测配体。文中相关原始功能将找到产生抗体片段的方法。本专利中的抗体片段包含一个完整抗体的一部分，普遍是抗原结合或抗体的可变区域。然而通过通用例子可知，片段能由完整抗体的蛋白消化生成，或通过重组核苷酸技术直接生成片段。

抗体的合成依据标准方法学操作。例如多克隆抗体的合成，由“多克隆抗体”方法论可被利用（Bean, 2000)。单克隆抗体和相应杂交瘤可被制备如与“单克隆抗体合成”方法论（Howard and Bethell, 2001）或“单克隆抗体合成技术与应用”（Schook, 1987）一致。杂交瘤可依据通用方法克隆、生长和培养。例如它们可体外生长和培养在如DMEM或PRMI-1640的培养基中。换言之，可视为体内腹水瘤。

专利中所用抗体可通过标准的重组技术合成，如Siegel的“重组单克隆抗体技术”(Siegel，2002)和Welschof等的“源自多种供体的模块化人scFv表达文库的合成与筛选”(Welschof et a1., 2003)。这些重组技术视为理想的、可商业规模合成抗体的方法。编码抗体的多核苷酸可用抗体的氨基酸序列、遗传密码子和通识简并度为基础来鉴定。多核苷酸编码抗体可从杂交瘤细胞中分离，如用标准程序作其后分类。例如一个多核苷酸探针可基于抗体的一部分氨基酸序列来设计，然后用于分离编码抗体的重和/或轻链的基因。换言之，多核苷酸能由标准化学合成方法合成，如亚磷酸胺和固相化学。本专利中抗体的氨基酸序列可用标准方法鉴定；如Edman降解法和HPLC或质谱法分析。

本专利包括三个转录变异体SHONa, SHONb 和SHONc，已于2012年10月13日存入国际基因数据库GenBank，其登录号分别为JX965369，JX965370和JX965371。

我们已经证明SHON的表达能促进癌细胞的生长、迁移和入侵，以及不贴壁生长和菌落生长（即致癌性），且这些活性能通过用siRNA降低SHON的表达水平，或用抗体来抑制SHON的活性，而高效地受到抑制。因此，我们证明了SHON可影响癌症细胞的凋亡、迁移和入侵，及不贴壁生长和菌落生长（即致癌性）。如此，我们可通过抑制这些生物学功能，用有效地限制癌症的发生、生长、转移和复发，特别是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、或其它腺癌。

我们的数据显示SHON抗体能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的入侵和不贴壁生长，这是瘤生长和转移中两种重要的生物学活性。如此，SHON抗体代表了理想的新型癌症治疗和诊断试剂，特别是对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、或其它腺癌。能抑制SHON生物活性和/或其表达水平的抗体可用来抑制细胞增殖、存活、迁移和/或致癌性，如癌症细胞。这些抗体抑制剂能与其它试剂，如化学复合物（如小分子），拮抗物，或其它抗体及iRNAs，配合使用。同样地，抗体或其片段可用于检测SHON的表达水平，探测癌症病情，如癌症发生、出现、发展、转移和复发。

我们的数据表明抗SHON抗体可用于诊断，如预测患者对内分泌治疗的反应效果，即从患者处取得样本，鉴定样本中SHON多肽的表达水平，其中，样本有SHON蛋白多肽的表达预示患者对内分泌治疗有效。另一方面，本专利提供了一种无瘤生存癌症的预后诊断方法，即从患者处取得样本，鉴定样本中SHON多肽的表达水平，其中，样本SHON蛋白多肽的表达预示肿瘤病人会有较长的无瘤生存期。

另一方面，本专利提供了一种预测肿瘤远距离转移倾向的方法，即从患者处取得样本，鉴定样本中SHON多肽的表达水平，其中，样本里SHON蛋白多肽得的表达预示肿瘤病人会有较长的无远处转移生存期。在诊断程序中，抗体不一定要含有抑制剂活性，或要降低配体的表达。但在某些应用中，可对抗体加以修饰，加上有可检测信号的复合物标签，如酶、荧光剂和放射性同位素。专利所指领域里的有基本技能的人很容易找到合适的标签系统。此外，可能亦可用作载体，如携带毒素、放射核甘酸、同位素、基因、或其它治疗性分子，将其带入到细胞或组织中以辅助治疗。该领域有基本技能的人很容易想到各种方法来检测抗体用于预防、降低或抑制细胞增殖、存活、迁移或/和致癌方面的有效性。但是作为举例而已，可使用此文其它地方描述的方法，包括在“示例”部分提及的一种或多种测定方法。

正如所意识到，抗体，或其片段，或其修饰物都可用于SHON的常规检测和纯化。配体可源于自然存在或人工培育，如细胞培养。而人的配体效果最佳。此外，在一些应用中，可对抗体加以修饰，加上有可检测信号的复合物标签，如酶、荧光剂和放射性同位素。专利所指领域里的有基本技能的人很容易找到合适的标签系统。专利所指领域里的有基本技能的人很容易找到合适的标签系统。因此，除抗体直接介导配体来实现治疗外，抗体也可辅助配体纯化或诊断。如附着在固相的抗体能辅助样本中配体的纯化和/或定量。专利所指领域里的有基本技能的人很容易想到实施这些的技术。但是作为举例而已，亲和色谱技术，即把抗体，抗体片段，或其修饰物固定到色谱支持体上。在诊断和纯化程序中，抗体不一定要含有抑制剂活性。

ELISA或相似实验可与直接或间接检测方法结合，且专利中抗体或其片段，及其修饰物都可用来捕获或检测抗体。本专利中一个或多个抗体可同时用于实验。如若两个抗体均不识别SHON的抗原决定簇，其中一个可用作捕获抗体，另一个为检测抗体。换言之，抗体能与已鉴定配体的抗体组合使用。除ELISA，也采用其他实验如蛋白印迹、放射免疫、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组化、流式细胞、Luminex^®实验和流式细胞小球微阵列术。

诊断或患者日常状态的观察信息可通过对样本中SHON表达水平直接比对获得，辅以鉴定基础水平或标准。如检测配体或正常样本的平均血清水平（正常样本即无疾病样本）。以基础水平浓度为准，高出浓度则表示患病。更为理想的是，疾病样本的检测结果为统计学意义显着高出正常样本。然而有时尽管不是统计学意义显着高出，其结果仍可作为样本状态的检测来提供重要信息。配体的正常范围随体液或组织不同而各异。同样地，局部配体的正常血清浓度有时可能超出标准范围。

针对样本状态的诊断或综合检查可通过比对完成，将样本中SHON水平与数据库中标准比对。标准或基础水平浓度并非从大量正常样本中获得，而是从同一个健康样本或疾病样本中获得。这种方法特别适用于患病或间歇性患病的样本状态的连续监测。如当疾病缓解时检测标准水平，且在不同时间点确定疾病状态后进行检测。由此来提供疾病相关的生存，或协助鉴定治疗是否有效。

一方面，专利中抗体能用于基于免疫组化的应用。如抗体染色用于在肿瘤中发现的异常细胞的诊断，或如细胞增殖或凋亡等特定细胞事件的分类，或评估生物组织中如SHON的蛋白局部或分化表达。在免疫组化中，抗体-配体相互作用可通过许多方法观察。特别地，抗体能与酶连接，如过氧化物酶，能催化有色产物的产生。换言之，抗体可用荧光探针标记，如FITC、玫瑰精、Texas Red、Alexa Fluor^®，或 DyLight^TM Fluor，能用免疫荧光显微镜观察。荧光标签对于共聚焦激光扫描显微镜特别有效，是高度敏感的，并能用来观察多种蛋白之间的相互作用。作为另一种方法，次级抗体能用来扩增抗体信号。其能与如生物素、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等报告酶、荧光剂结合。任何从切片检查获得的细胞或组织、生物学样本都能用于免疫组化。

抗体合成与专利一致，可找到其作为诊断剂的特殊使用，如预防、减少疾病或抑制细胞增殖、生长、迁移和/或致癌。广泛来讲，本专利提供了一种至少阻断一种配体与一个或多个受体相互作用的方法，此外阻断配体与结合剂相互作用的方法包含抗体或其片段，及其修饰物的使用。此方法在体内外均可实现。通用的实验方法用来鉴定抗体预防、减少疾病或抑制细胞增殖、生长或迁移。而由举例可见，文中叙述方法包括一种或多种实验。此外，抗体可用作载体，如携带毒素、放射核素、同位素、基因或其他治疗性分子，将其带入到细胞或组织中以辅助治疗。

本专利进一步包含免疫毒素为SHON抗体或其片段与毒素剂连接。这样的试剂包含能与抗体连接、并在细胞内呈生物活性的药物毒素，可发挥高效检测作用。用通用方法（如U.S. Pat. No. 4,340,535）制备免疫毒素。实验用毒素剂包括化学诊断剂、放射性同位素和细胞毒素。化学诊断剂是类固醇等激素；如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或氨蝶呤等反代谢物；蒽环霉素；丝裂霉素C；长春花生物碱；秋水仙胺；依托泊苷；光神霉素；或如苯丁酸氮芥或左旋溶肉瘤素的烷基化剂。高效免疫毒素包括植物-、真菌-或细菌-介导的毒素，如A链毒素、核糖体抑制蛋白、α-八叠球菌素、曲霉素、限制霉素、核糖体酶、白喉毒素或假单孢杆菌外毒素等。

由于毒素抗体能与抗体结合，它们广泛应用于免疫毒素。而不同毒素与抗体分子结合后能产生变异或提高毒性。一种与抗体结合的特殊类型的毒素是蓖麻毒素，尤其是带有去糖基化A链的蓖麻毒素。多种重组或遗传改造的蓖麻毒素分子广泛使用，本专利与其一致。去糖基化A链蓖麻毒素（dgA）十分有效由于其稳定的极性、更长的半衰期，并能大规模应用于临床。去除A链蓖麻毒素也用于研究，是其N端氨基酸被琼脂糖（Sigma）移除。带有免疫毒素的IgG较之其Fab`配对物，显示出典型更优结合能力和更小血液清除能力，而带有免疫毒素的Fab`片段较之前者，则有更好的组织渗透能力。

治疗方法

虽然发明者的主要研究涉及乳腺癌细胞，但SHON被预测也能在小肠和肾脏中起作用;同样在心脏，前列腺，子宫，正常结肠，胃，皮肤，气管，脑，小脑，胎脑，脊髓，胎盘，脂肪组织，软骨，以及在胸腺中也能起作用。具体来说， SHON被预测能在乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，子宫内膜癌，肺癌，胃癌，肝癌，卵巢癌和其他癌症中起作用。因此，发明人设想的预测值是适用于治疗各种由于增加或异常的细胞增殖，细胞存活，细胞运动和/或致瘤性导致的疾病。

在其中一个实施方案中，所述病症是乳腺癌，前列腺癌，结肠癌，肺癌，胰腺癌，子宫内膜癌，或卵巢癌，或鳞状细胞癌，或黑色素瘤，肾癌或肿瘤。关于乳腺癌，这些可以包括上皮性肿瘤（例如，来自细胞中衬导管或小叶组织）或非上皮性肿瘤（例如，来自支持基质），如血管肉瘤，原发性间质肉瘤，和乳腺叶状肿瘤。乳腺癌也可以包括肿瘤，例如原位癌，以及侵入癌症。原位癌又包括癌细胞内导管或小叶增殖和非侵入性基质扩散。原位小叶癌包括不可触及的病变，可以指示后续侵润性乳腺癌更高的风险。在乳腺癌中，侵润性癌通常包括腺癌，和大部分浸润性导管类型癌，其余的包括乳腺浸润性小叶癌。乳腺癌的罕见形式包括髓，粘液和管状癌。乳腺癌症疾病还包括佩吉特氏乳头病和转移性乳腺癌。

至于结肠癌，这通常可以包括结肠癌，直肠癌，肛门癌，尤其是腺癌，也包括肿瘤（例如，泄殖腔鳞癌），黑素瘤，淋巴瘤和肉瘤。表皮样（非角化鳞状细胞或基底细胞样）癌也包括在内。结肠癌可能与特定类型息肉或其他病变相关联，例如，管状腺瘤，管状绒毛状腺瘤（如宫颈容貌腺性息肉），绒毛（​​如，乳头状）腺瘤（有或没有腺癌），增生性息肉，错构瘤，幼年性息肉，息肉样癌，假性息肉，脂肪瘤或平滑肌瘤。这类癌症可能与家族性息肉病和相关病症如加德纳综合征或黑斑息肉综合征。癌症可以可能是相关的，例如，患慢性瘘管，肛照射皮肤，粘膜白斑，性病淋巴肉芽肿，鲍温样丘症病（内皮癌），尖锐湿疣或HPV。其他方面，癌症可能与基底细胞癌，特别是佩吉特氏乳头病，肛管-穴肛原癌或恶性黑色素瘤相关联。

关于子宫内膜癌，可以包括腺癌，乳头状浆液性腺癌，透明细胞癌，鳞癌和粘液癌。同样包括癌前病变，如子宫内膜增生。子宫内膜癌可能与这当中的与一个或多个相关联，包括肥胖，多囊卵巢综合征，未生育，绝经晚和雌激素导致的肿瘤。停止排卵（排卵功能障碍）和无孕激素的雌激素治疗和遗传性非息肉性结肠癌（HNPCC）综合征。

关于卵巢癌，这些通常起源于上皮并且可以包括囊腺癌以及Brenner肿瘤，透明细胞癌，子宫内膜癌，粘液癌，移行细胞癌，以及尚未分类的癌症。对于卵巢癌的生殖细胞起源，可以包括绒毛膜癌，无性细胞瘤，胚胎癌，内胚窦瘤，未成熟畸胎瘤和多胚瘤。对于性索间质细胞起源的卵巢癌，卵巢癌的性索间质细胞的起源，这其中就包括颗粒 - 卵泡膜细胞瘤和Sertoli-Leydig细胞瘤。对于转移导致的卵巢癌。主要包括由乳腺癌和肠胃癌以及其他癌症转移而来。

一般技术人员以本发明所涉及的技术可以很容易理解不同类型的病症，特别是考虑文中提供的SHON的表达。此外，它将能被本发明涉及的相关领域的普通技术人员理解，考虑到在此提到的本发明的性质和结果，目前的发明适用于各种不同的动物。因此，诊断细胞治疗方法可以适用于任何感兴趣的动物。特别适用于哺乳动物，尤其是人。

本发明所涉及到领域的普通技术人员将理解其中的各种方法和用于检测SHON的试剂。举例来说，可能会用到 SHON的抗体，或这种抗体的功能性修饰。本文将对典型的试剂进行详细说明。本发明中所使用的试剂都很好的表现一下一种或多种特点：1）检测SHON肽段的能力; 2）检测SHON转录本的能力。如本文所示，SHON作为细胞因子被编码，表达在某些癌细胞中，但不是由正常成人细胞。因此，SHON可以被认为是肿瘤相关抗原。很多方法都方法可以用于检测这些配体，基于其在正常细胞和癌细胞之间的表达差异(reviewed，generally，in Paul，Fundamental Immunology，1999，Lippincott—Raven Publishers，Philadelphia，PA，Chapter 37)。癌细胞易于以更高的水平表达肿瘤相关抗原，并且像这样在正常细胞和癌细胞之间表达水平的差异可以用于治疗（参见，如， Brown JP，et a1．，Quantitative analysis of melanoma-associated antigen p97 in normal andneoplastic tissues．Proc Natl Acad Sci USA 1981；78：539．543）。

本文描述的标题“示例”可用于确定使用与这项发明一致的试剂使用的适宜性。特别是，RT-PCR和Northern Blot分析可以用于在mRNA水平检测表达情况。Western Blot和直接或间接的免疫染色可用于在蛋白水平检测其表达情况。为了检测其活性，可以使用基于细胞对细胞增殖，细胞存活，细胞运动和/或致瘤性的测定。关于抑制转移，I可以使用如前所述的体内测定法，例如， Fidler，I．J．(1973)Nat．New Bi01．242，148—149；和 Price J．E．The biology of cancer

metastasis．Prog．Clin．Bi01．Res．，354A：237—255，1 990，or Kerbel R．S．什么是最佳用于抗肿瘤药物检测的啮齿动物模型？Cancer Metastasis Rev．，17：301．304，1998；Killion J．J．，Radinsky R．，Fidler I．J．正常的模型对于预测小鼠可移植性肿瘤是必须的。Cancer Metastasis Rev．，1 7：279—284，1 998；and Price J．E．分析转移表型。J．Cell．Biochem．．56：1 6．22．1 994。

用于治疗或诊断的试剂盒

本发明试剂盒中的试剂和组合物可适用于检测SHON，或这里所限定的病症。这些试剂和组合物也可用于诊断试剂盒。试剂盒含有一种本发明的试剂，存放于在合适的容器中。试剂盒可包括SHON抗体或抗体片段，一对特异性结合于SHON核苷酸序列的DNA引物或其中的一些修饰。试剂盒还可进一步包括一种或多种辅助试剂用于检测抗体或抗体片段和SHON或其部蛋白构成的复合体。这些也可于独立容器中提供，以作特殊用途。二抗能够与一抗结合，这样的二抗可以在试剂盒中提供，例如储存于单独的小瓶或容器。二级抗体，如果提供的话，通常是被标记的，并且可以用与前述抗体制剂相类似的方式描述。

作为一种试剂盒，本发明的抗体组合物可以单独提供或者与其他表位特异性抗体组合提供。抗体或抗体片段可以是被标记或未标记的，并且可以提供其辅助成分，举例来说可以是缓冲液，例如Tris，磷酸盐和碳酸盐，稳定剂，赋形剂，杀虫剂或惰性蛋白质，如牛血清白蛋白。通常这些附属材料将小于活性抗体5％重量，并且其总质量通常少于抗体浓度的0.001%。抗体或抗体片段可与辅助成分被提供为冻干混合物，或者抗体片段可与形容词UNCT成份被提供为冻干混合物，或者辅助成分可以单独提供，由使用者另行组合。

特定情况下，所述试剂盒可以包括，其量至少足够一次诊断测定使用的抗体，或其片段作为一个单独包装的试剂。这些抗体或抗体片段可以与固相支持物或珠子结合。这个试剂盒可直接分离SHON多肽、肽段或细胞表达的SHON。具体方面，所述试剂盒可以之直接用于FACS分析。该试剂盒可以包括本文所公开的杂交瘤细胞系，并且允许其生产SHON 抗体。具体来说，试剂盒还可以包括一个细胞培养基用于所述杂交瘤细胞系。甚至还可包括一个细胞培养基用于所述杂交瘤细胞系的培养。

在作为治疗剂的情况下，该抗体和抗体片段可配制适合后直接给药至受试者，例如作为药物成分。或者，该试剂盒可在一个容器中含有一个或多个试剂，同时药物稀释剂，载体或着赋形剂储存在另一个容器中;每个容器中的内容物于使用前混合在一起。任何适合于存储或使用试剂或组合物的容器均可用于该试剂盒中。合适的容器盒将得到本领域熟练技术人员的喜爱。例如，这样的容器可以是瓶子和注射器。该容器应易于灭菌并可以密封。此外，本发明的试剂盒还可以包括使用说明和试剂盒的组分。

诊断方法和组分

在其中一个实施方案中，使用本发明提供的在某一方法中使用的一种或多种试剂来检测与SHON相关的疾病中SHON的表达水平。

特殊病症可包括，例如：癌症（乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，子宫内膜癌，肺癌，胃癌，肝癌，卵巢癌）和子宫内膜异位症。这些病症已在文中详细叙述。

根据本发明，可特异性结合SHON的抗体可以通过检测SHON的表达改变来诊断病症，或监测患者是否被治愈。用于诊断目的的抗体可以上述相同的方法来制备。

诊断化验包括使用抗体的方法以及在人的体液或细胞组织提取物中检测相应肽或多肽的标记。抗体可以经过或不经过修饰使用，但最好是将标记作为一个报告分子与其共价或非共价结合。各种实验方案，如ELISA，RIA，和FACS都在这个领域被熟知，这为检测SHON异常的表达变化提供了基础。正常或标准的表达值通过正常哺乳动物，最好是人的体液或细胞提取物，并使用最有利于复合体形成条件下的抗体来获得。

标准复合物形成的数量可通过不同的方法来定量，但最好通过亮度测定法。受试者，对照和疾病，以及来自活检组织的表达量用来与标准值进行比较。受试者与标准之间的偏差可用来建立诊断疾病的参数。所述抗体或抗体片段可用于检测和定量活检组织的表达，该表达情况可能与疾病相关。诊断测定可以用来区分没有，存在和表达改变之间的区别，并监测干预治疗表达水平的改变。其中一个方面，核酸杂交可与抗体或抗体片段结合使用，其能够检测为SHON多肽序列或其片段，或所得到的修饰。例如，所述抗体或抗体片段可以识别本发明所用的氨基酸序列，例如，一个或多个SEQ ID NO：2,5，6，或其修饰后的序列。

SHON抗体可用于诊断其他与其表达量增加或减少有关的疾病。这些抗体或抗体片段也可被用于这个领域已被广泛使用的方法来进行定量或定性检测。在某一特殊方面，SHON抗体可以用于检测各种癌症的活化或诱导，特别是上面提到的那些。所述抗体或抗体片段可以通过标准方法标记，并且在适当的条件下加入到来自患者的体液或组织样品中形成复合物。适当孵育之后，将样品洗涤，对信号被定量并与标准值比较。如果活检或提取的样品中信号值与对照样本相比有明显的改变，样品中的氨基酸序列的改变水平表明存在相关病症。这种测定也可以用于评估在动物研究中，在临床试验中，或在病人的治疗监控中特异性治疗的功效。

为了提供与SHON表达相关的病症的诊断基础，必须建立正常或标准的表达谱。这可能需要通过组合取自正常人或动物的体液或细胞提取物与SHON抗体或抗体片段在合适的条件下结合。标准结合可以通过比较正常人和使用已知剂量基本上纯化的多肽的受试者来定量。

标准值可从正常样本获得，与具有明显病症的样本值具有可比性。正常值与受试值之间的偏差用来确立病症的存在。

同样可用来定量SHON表达水平的方法包括放射性标记的抗体，与对照肽的结合，实验结果可以用内插法替换的标准曲线。多个样品的定量的速度可以通过ELISA实验，将感兴趣的序列以不同稀释度和分光亮度法或者比色响应来进行迅速定量。

在进一步的实施方案中，抗体，抗体片段或如前所述的修饰物可以用作微阵列中的试剂。这个微阵列可用于同时监控大量样品的表达水平，用来改进或监控治疗试剂的活性。微阵列可根据本领域中已知的方法来制备和使用。微阵列基片可以是纸，尼龙或任何其它类型的膜，过滤器，芯片，板例如微量滴定板，载玻片，或任何其它合适的固相支持物。

一方面，一个网格阵列类似于一个点或狭缝杂交可以用于连接样品与支持物表面。另一方面，阵列可以手工产生或者通过可使用的设备，材料和机器（包括多通道吸量器或全自动仪器），并可能包括大约8,24,96,384,1536或6144的样品，或其他多个从2至1,000,000的样品，这适合于有效地利用市售的仪器仪表。

为了使用微阵列进行抽样分析，多肽可以从生物样品中提取。生物样品可从任何体液获得（例如，血液，尿液，唾液，痰，胃液等），培养的细胞，活检组织，或其他组织。标记的抗体或抗体片段可与微阵列进行温育，使其能与微阵列的多肽结合。温育的条件可以进行调整，以便特异性结合。除去未结合的抗体后，扫描仪可以用于确定标记的水平和模式。扫描图像进行检查以确定微阵列中多肽序列的相对丰度。一个检测系统可用来测量无，存在，以及同时为多个不同的序列所结合。

在其他实施方案中，本发明的抗体可用于基于免疫组织化学的应用。与标准免疫组化技术一致，可从感兴趣的组织取得组织薄片（如，约4-40um）可采取从感兴趣的组织，或使用整个组织。切片可以通过切片机来完成，并且薄片可以安装在滑动装置上。然后，组织进行破碎细胞膜处理，例如使用Triton X-100。此外也可以使用更多提到的步骤，如封闭来降低非特异性吸附。对于直接免疫组化，所关注的标记抗体（如，FITC共轭的抗血清）被用于结合在组织切片中的抗原。在间接免疫组化中，未标记的一抗用于结合组织抗原，标记的二抗用于与一抗反应。

所述抗体和抗体片段也可以用作体内诊断剂，以提供癌症细胞（例如，肿瘤）或各自转移的图像。可以使用各种诊断方法如图像磁共振成像（MRI），X射线成像，计算机化发射的X线断层摄影术和类似的技术。这类型成像中，抗体部分通常与癌症分子标志结合，如SHON。成像试剂将是一个在成像中可检测的试剂，例如顺磁性，放射性或荧光分子。许多合适的成像剂是本领域已知的，如对于它们附着到抗体的方法也是已知的（参见，例如，e.g．，US 5,02 1,236 和 US 4,472,509，在此都作为参考并入）。某些连接方法包括使用金属螯合络合物，例如将有机螯合剂DTPA连接到抗体（U.S. Pat. No. 4,472,509）。

抗体还可用酶在偶联剂的存在下发生反应例如戊二醛或高碘酸盐。荧光素标记的偶联物在偶联剂的存在下制备或通过与异硫氰酸酯反应。

在顺磁性离子的情况下，示例性的试剂包括铬（III），锰（II），铁（II），钴（II），镍（II），铜（II），钕（III），钐（11I）镱（III），钆（Ⅲ），钒（II），铽（III），镝（III），钬（III）和铒（III）中，其中钆是最好的。离子在其他情况下，诸如x射线成像中是有用的，包括但不限于镧（III），金（TH），铅（II），特别是铋（III）。在放射性同位素用于诊断应用的情况下，有用的剂包括砹²¹¹，碳¹⁴，铬⁵¹，氯³⁶，钴⁵⁷，钴⁵⁸，铜⁶⁷，Eu¹⁵²，镓⁶⁷，氢³，碘¹²³，碘¹²⁵，碘¹³¹ ，铟¹¹¹，铁⁵⁹，磷³²，铼¹⁸⁶，铼¹⁸⁸，硒⁷⁵，硫³⁵，锝^99m和钇⁹⁰。¹²⁵I是常用的，锝^99m和铟¹¹¹也经常使用，由于它们的低能量和适合远距离观测。元素在MRI中是特别有用的包括核磁共振自旋共振同位素¹⁵⁷Gd，⁵⁵Mn，¹⁶²Dy，⁵²Cr，和⁵⁶Fe，其中钆常常是优选的。

本发明中放射性标记的抗体和抗体片段可以是根据在本领域熟知的方法制备的。例如，抗体可以通过接触碘化钠或碘化钾以及化学氧化剂如次氯酸钠，或酶氧化剂，如乳过氧化物。本发明的抗体可以通过配体交换过程进行标记。例如，通过减少高锝酸与锡液，在葡聚糖柱中螯合还原锝，将抗体加入柱中或通过直接标记技术，比如通过孵育高锝酸，还原剂如SNCH，缓冲液如钠 - 钾酞溶液中，以及抗体。中间官能团往往用于结合放射性同位素使抗体绑定其中存在的金属离子，这些官能团通常是二亚乙基三乙酸（DTPA）和乙二胺四乙酸（EDTA）。

在选择放射性核素进行体内诊断要考虑的一个因素是， 核素的半衰期足够长以便它在目标吸收时仍是可检测的，但又足够短，使得对宿主的有害辐射以及背景被最小化。理想地，用于体内成像的放射性核素将缺乏离子发射，但是会产生大量在140 2000千电子伏范围的光子，其可容易地通过常规伽玛相机检测。标记的抗体的施用可以是局部的，全身的，静脉内完成的，动脉内，或经由脊髓液等。施用 也可以是皮内或腔内，根据检查取决于身体部位。经过足够长的时间，标签的抗体或片段结合到病变组织，这种情况下的癌组织，例如30分钟至48小时，所研究的对象的区域是通过成像技术检测的。 MRI，SPECT，平面闪烁成像等新兴的成像技术全部可以使用。结合的放射性同位素的分布，其随时间增加或减少均被监视和记录。通过与临床上正常的个体得到的结果比较，患病组织的存在和程度可被确定。确切的成像方法会根据特定的病人的因素发生必要的改变，并根据检查部位，给药方法，标签的类型来确定。

在进一步的实施方案中提供一种试剂包括至少一对特异性结合SHON核苷酸序列的DNA引物。

在另外的实施方案中，SHON抗体或抗体片段可以用于任何尚待开发的分子生物学技术中，提供依赖于目前已知的抗体特性的新技术，包括但不限于结合特异性等性能。

本发将参照下面的例子作进一步说明。

示例

本文所描述的实例是为了说明本发明的实施方式。其它的实施例，方法和分析类型是分子诊断该领域的普通技术人员能够掌握的，并不需要在这里进行详细说明。本领域范围内其它的实施例都被认为是本发明的一部分。

示例一：材料和方法

细胞培养

正常但永生化的人乳腺上皮细胞系MCF10A以及所有的癌细胞系均从美国典型培养物保藏中心获得的，包括肺癌（A549和H1975），胃癌（AGS和MKN-45），前列腺癌（DUl45，PC3和LnCaP），子宫内膜癌（RL95-2和AN3），乳腺癌（MCF-7，T47D，BT474，BT459和MDA-MB-231），卵巢癌（Ovca4）。所有细胞均在建议条件下培养，除了MCF-7 细胞系用RPMI 1640培养基补充有10％热灭活的胎牛血清（FBS），100单位​​/ ml的青霉素，1 00μg / ml的链霉素，和2mML-谷氨酰胺，在37℃，5％CO₂的增湿培养箱中培养。

质粒构建

哺乳动物表达质粒 - 全长人SHONα（图1）和β（图3A）编码序列被克隆到哺乳动物表达载体pIRESneo3中（Invitrogen, Life Technologies），分别命名为pIRESneo3-SHONα和pIRESneo3-SHONβ。SHONβ突变表达质粒pIRESneo3-SHONβni是通过PCR的定点突变把pIRESneo3-SHONβ中潜在的原蛋白转换酶motif K⁶²R⁶³突变为N⁶²I⁶³获得的。某些情况下，通过标准方法在于质粒表达的蛋白的C-端加上c-Myc表位（YALEQKLISEEDL，接头多肽以下划线标注），6 × HIS标签或EGFP（由pEGFP-C1载体编码）。

SHON siRNA载体– 为了生成针对SHON mRNA所有三种变体的siRNA，根据说明书来把DNA序列5'-AATCCATCACAAGCCACTTTC-3'（从所以5个测试序列中选出）克隆进siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 潮霉素载体（Ambion）。其合成的载体命名为pSilencer-siRNA。使用BLAST与人类基因组序列比对显示，仅SHON基因是其靶点。阴性对照siRNA质粒（pSilencer-CK）编码的siRNA与人的基因序列没有显着的序列相似性（Ambion）。

细菌表达质粒 - 成熟SHONα（图2）cDNA克隆到pGEX-4T 1载体（AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，USA），以产生在细菌中表达谷胱甘肽-S-转移酶（GST）重组蛋白的质粒pGEX-4T 1-SHONα。为了产生重组His标签成熟的SHONα蛋白，成熟的SHONα的cDNA克隆到pQE30载体（Qiagen）中，以产生pQE30-SHONα载体。

建立稳定的细胞系

使用Saint-Mix转染试剂（Synvolux Therapeutics B.V．，the Netherlands）MCF-7细胞稳定转染SHONα表达质粒pIRESneo3-SHONα（命名MCF7-SHON）或空白对照pIRESneo3载体（MCF7-VEC）作为对照。细胞克隆通过在培养基中加入800 µg/ml G418（Bio-RadLaboratories，CA）来筛选。转染的细胞系以阳性细胞池的形式产生。MCF-7细胞同样稳定转染SHON siRNA质粒pSilencer-siRNA（MCF7-siRNA）或阴性siRNA对照质粒pSilencer-CK（MCF7-CK）。siRNA稳定细胞克隆通过在培养基中加入潮霉素至100 µg/ml来筛选。通过RT-PCR和Western Blot确认稳定细胞系中SHON的过表达或内源性SHON的删除。

总RNA的制备

总RNA从培养的细胞中用Trizol试剂（Invitrogen）按说明书以1ml/cm²进行分离。RNA重悬于焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的无核酸酶的水中。RNA样品进行进一步用DNase I 37℃处理3 0分钟。反应通过加入25mM EDTA，65℃孵化15分钟终止。然后，RNA样品通过在苯酚/氯仿溶液（pH为5.2，苯酚：氯仿：异戊醇= 25：24：1）中萃取来纯化，再加入氯仿萃取和乙醇沉淀。RNA的定量和纯度通过A260 / A280吸亮度来评估， RNA质量则通过琼脂糖凝胶电泳进行评估。RNA样品A260 / A280的比率大于1.6，则可以储存于一80℃用于进一步分析。

通过使用基因特异性引物（详见表1），用一步法逆转录（RT）-PCR试剂盒（Qiagen）来测定某一mRNA的存在。对于RT-PCR，需要进行以下步骤。首先，1 µg总RNA稀释到0.1µg /µl以便最大化减少样品处理过程中的偏差。此稀释液用DNase I处理1 5分钟，随后通过加入终浓度5mM的 EDTA并在70℃加热15分钟使DNase失活。DNA酶处理后的RNA与含有RT-PCR缓冲液， 正义、反义引物，dNTP，RNA酶抑制剂，及按照说明书推荐浓度配制到50µl体积的反转录酶（Omniscript和Sensiscript）及热启动的Taq DNA聚合酶的混合溶液中。

温度-循环方案包括：逆转录反应为50℃ 60分钟，随后95℃ 15分钟使双链变性，并活化热启动DNA聚合酶。PCR扩增过程：95℃，20秒；54-62℃，30秒； 72℃， 1分钟进行30个循环。循环结束后再72℃延伸5分钟。使用0.2µg总RNA用相似的方法进行β-actin RT-PCR扩增作为内参。10µl RT-PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，RT-PCR产物通过其电泳条带的大小，限制内切酶消化情况和DNA测序来确认。

免疫印迹

哺乳动物细胞用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，加入裂解缓冲液（20mM Tris·HCl，pH 7.4，150mM氯化钠，1mM EDTA，1mM EGTA，l％ Triton^®X-100，1％ Nonidet P-40，1µg/ ml的蛋白酶抑制剂cocktail（GE Healthcare）和0.1mM PMSF）于4℃裂解。将裂解物进行超声处理，然后于4℃，15000g离心15分钟，获取上清。每个样品中加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）样品缓冲液（50mM Tris·HCI，pH 6.8； 2％ SDS； 2%β-巯基乙醇和溴酚蓝），并将样品煮沸5分钟。

大肠杆菌细胞直接用2×SDS-PAGE样品缓冲液（50mM Tris·HCI，pH 6.8； 2％SDS； 2%β-巯基乙醇和溴酚蓝）裂解，然后上样前将样品煮沸5分钟。

样品用15％分离胶进行不连续的SDS-PAGE，并使用标准电印迹程序将其转移至硝酸纤维素膜（Hybond^TM C-extra）。随后，膜用含有5％的脱脂奶粉及0.1％Tween^⑩20（PBST）的PBS室温封闭1小时。然后将印迹在含有1％脱脂牛奶的PBST中与一抗在4℃过夜结合。与适当的二抗室温孵育之后，免疫标记通过ECL plus^TM化学发光按照说明书来检测信号（GEHealthcare）。印迹剥离并用β-actin单克隆抗体再次标记，以确保等量的细胞蛋白上样量。印迹剥离通过在含有62.5 mM Tris·HCI，pH 6.7，2％ SDS，0.7％β-巯基乙醇的溶液中50℃孵育30分钟 。接着用PBST室温洗30分钟，洗的过程中换几次液。然后用ECL plus^TM检查剥离的效果。此后，印迹通过上述方法重新封闭并进行免疫标记。

在细菌生产重组人SHONα蛋白

通过用pGEX-4T1-SHONα质粒转化感受态的大肠杆菌BL21-DE3-LysS pLysS细胞，加入β-D-1-异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（50 µM）用来诱导表达重组谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标记的SHONα融合蛋白（GST-SHONα）。重组蛋白通过谷胱甘肽琼脂糖4B珠子（GE Healthcare，Little Chalfont，UK）在自然条件下纯化。透析的 GST-SHONα蛋白用来给兔子进行免疫接种。纯化蛋白质的产量通过Bradford’S分析测定。

HIS标记的SHONα蛋白（HIS-SHONα）通过用pQE30- SHONα质粒转化大肠杆菌M15菌株产生。用200 µM IPTG来诱导HIS-SHONα的表达，在天然条件下用镍珠（Qiagen）纯化HIS-SHONα蛋白。使用一系列浓度的咪唑来洗脱该重组蛋白。每次的洗脱液都通过SDS-PAGE和Western Blot来检测HIS-SHONα蛋白的表达和纯度。

生产兔多克隆抗体

抗人SHONα多克隆抗血清是采用如前所述（Bean，2000）的方法，将免疫原由皮下和肌肉注射到兔子体内获得的。简而言之，每两到三周向每只兔子注射400µg纯化的GST-SHONα抗原以及完全的Freunds' 佐剂（Sigma -Aldrich，MO，USA），随后再注射200µg抗原与不完全Freunds' 佐剂（Sigma-Aldrich公司，MO，USA）。

从抗血清中使用标准方法循序地进行亲和纯化获得SHONα抗体，即首先使用共价结合到谷胱甘肽琼脂糖4B珠子上的GST蛋白以除去抗GST的抗体，随后使用共价结合到谷胱甘肽琼脂糖4B珠子上的GST-SHONα蛋白。

通过5’互补DNA末端的快速扩增（5’RACE）测定SHON全mRNA序列

利用5’RACE(Frohman et al.,1988)测定以EST克隆（GenBank收入号AY358103）（Clarket al., 2003）为代表的SHON/PIKR2786/UNQ2786的5’上游序列。简而言之，用特异的SHON反义引物SHONc3（5’-ACTTCCCTAAAGCTTGAAAGTGG-3’,表1），使用M-MuLV逆转录酶（新英格兰生物实验室），从分离自乳腺癌MCF-7细胞的总RNA中合成cDNA。合成的cDNA经纯化后，外加dATP，用末端脱氧核酸转移酶（TdT）（新英格兰生物实验室）进行多聚腺苷酸化。多聚腺苷酸化的cDNA使用Vent DNA聚合酶通过PCR扩增。首先使用SHONc3引物和一个有义引物dT17TAG（5’-CCGGACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’）扩增40个循环，每个循环经历94℃，lmin；60℃，l min；72℃，1 min，最后72℃延长5min. 扩增的PCR产物应被稀释1000倍后，分别使用dT17TAG有义引物和两个SHON内部的反义引物SHONR2 (5’-GTGATGGATTGGGTGGGGAAC-3’)和SHPNR3 (5’-ACACCAAGGGTCTGGTTGGAG-3’)（图1）进行第二和第三轮PCR循环扩增。第三次循环的PCR产物直接克隆到pPCR-Script Amp SK（+）中的SrfI限制位点上。其克隆片段的序列由DNA测序获得。

用RT-PCR进行SHON转录物的测定

RT-PCR用于测定SHON mRNA在MCF-7细胞中的表达。因为转录b和c具有一个大的内含子（参见结果部分）开始，他们的mRNA表达物就很易于检测。然而，转录物a却很难检测，因为它没有内含子，因此无法设计针对转录物a的引物对。因此，采用了两个步骤法用来检测转录物a在MCF-7细胞中的表达；1）为了允许无内含子转录物a的侦测，RNA样品先用DNA酶I处理，然后在有逆转录酶（+RT）或者无逆转录酶(-RT)的条件下进行逆转录；2）每个RNA样品通过两对特殊引物SHONF 1／SHONc3 和 SHONc5／SHONc3(表1)扩增。SHONc5正向引物用于转录物a和b，SHONF1正向引物用于转录物b和c，SHONc3反向引物用于所有这三种转录物（a，b，和c）。

表1：用于RT-PCR的引物序列

mRNA表达分析

mRNA表达研究是通过用特异的SHON引物PCR，筛选cDNA模快（Primgen公司）。 该模快包含从人类的各种组织制备的第一链cDNA模板，每个10 ng。 按制造商推荐，人类β-2微球蛋白基因被用来当做cDNA 的输入对照。 SHON在各类癌细胞系中的表达也通过RT-PCR，以SHON a/b的特异性引物SHONc5/SHONc3（表一）来验证。这些细胞系包括人乳房癌细胞：MCF-7、T47D、BT459和MDA-MB-231；人前列腺癌细胞：DU145、PC3；子宫内膜癌细胞：RL95-2、AN3；卵巢癌细胞：Ovca4；肺癌细胞A549和H1975以及胃癌细胞AGS和MKH-45。

乳腺癌中SHON蛋白的免疫组化分析

研究的患者——这是一个对1237个患者进行的持续的回溯性研究，这些患者是于1990年至1999年间被确诊为初期扩散性乳腺癌，属于诺丁汉早期乳腺癌系列。该系列包含71岁以下的病人（平均年龄55岁），有长期的跟进研究，已进行了详细研究。所有的患者都统一的在一个机构进行治疗，并对患者人口统计资料和临床病例特征进行了详细的评估（表二）（Pinder et al.,1994）。患者在标准手术（乳房切除或大面积的局部切除）后接受放射治疗。基于诺丁汉预测指数（NPI）、雌激素受体-α状态（ER）以及患者更年期状态等可预测的特征及因素，安排患者进行全身辅助治疗（AT）。NPI指数＜3.4（低风险）的患者没有安排全身辅助治疗。雌激素受体阳性肿瘤以及NPI指数＞3.4（高风险）患者给予内分泌治疗（ET）。NPI指数≥3.4的绝经前患者给予传统的CMF化疗，如属雌激素受体阳性肿瘤，也给予ET。NPI指数≥3.4以及雌激素受体阳性肿瘤的绝经后的患者给予ET，但如属雌激素受体则给予CMF化疗(Elston and Ellis,1991)。

SHON表达检测分析亚分组 包括：淋巴结（LN）阴性和LN阳性组， 有和没有AT治疗的高风险病人组（NPI>3.4），有和没有ET治疗的ER阳性高风险病人组。

生存数据——包括生存时间、无瘤生存（DFS），以及限于局部和远处转移（DM）在内的生存数据均是回溯性的。平均的病人随访时间是111个月（范围从1-233）。DFS是从诊断到局部复发，局部LN复发或DM复发出现的月数。乳腺癌特异生存（BCSS）是从诊断到因乳腺癌而死亡的月数。无DM生存是从诊断到DM复发的月数。如患者仍然存活，失去随访或是由于其他原因死亡，其生存数据被剔除。

表2：所研究的全部样本的临床病理特征

*能够获得数据的病例数； NPI：诺丁汉预后指数；PG：预后群体

表3：每个免疫组化标记用到的抗原、第一抗体、克隆、来源、最佳稀释度以及评分系统

^a所有切片预先用0.1%的柠檬酸缓冲盐（pH 6）进行微波抗原修复，而HER2(无预处理)，EGFR（蛋白酶预处理10min）。 ^b参考文献（Callagyy et al.,2006;Tan et al.,2008;Abdel-Fatah et al.,2010a; Abdel-Fatah et al.,2010b）。^c参考文献（Sauter et al。，2009）。 MDM2，鼠双微体2；MDM4，鼠双微体4；ATM，共济失调 毛细血管扩张症；BRCA1，发病早期乳腺癌；estrogen receptor，雌激素受体蛋白；PR，孕激素受体；cytokeratin，细胞角蛋白；EGFR，表皮生长因子；TOP2A，拓扑异构酶IIα；Mab，单克隆抗体。

整个研究遵遵循“肿瘤预后标志物研究报道指南”（REMARK）标准（McShane etal。，2005）。本项目获得诺丁汉学术研究道德委员会批准。

组织芯片（TMA）和免疫组织化学 — 对每一标记从肿瘤的中心和边缘取两个0.6mm的核心，制作组织芯片。采用之前描述的免疫组织化学技术（(Abdel-Fatah et al.,2010a; Abdel-Fatah et al., 2010b），用SHON和其他生物抗体（表3）对组织芯片加以分析。免疫组织化学染色采用NOVOLINK检测试剂盒（Leica Microsystems），并根据使用说明书进行。用于免疫组织化学分析的抗SHONα的兔源特异性多克隆抗体在石蜡包埋样本里的特异性已经验（图13）。TMA切片用SHONα抗体（1:700）在室温下孵育1小时。TMA切片在柠檬酸-EDTA缓冲液（批pH =6.0）中预处理20分钟。为了验证可以使用TMA 进行免疫分型，40例肿瘤的全切片被然色，对不同抗体的蛋白丰度进行了比较。每一次试验，都包含阳性和阴性对照（不加一抗和IgG匹配的血清）。

免疫组化染色评估 — 不告知病人的临床病理学特征在两个不同的设置对在TMA核内的侵袭肿瘤细胞进行评价。观察者之间和同一观察者都有良好重复性（k > 0.8; 分别Cohen氏 k 和多速率k 测试）。对MTA核心进行全视野观察和按如下标准对核染色的丰度分组：0=未着色；1=弱着色；2=中等着色； 3=强着色。估计每个分类的比例。核着色的百分比作为一个持续的变量。另外，H-Score按之前的方法被计算（Abdel-Fatah et al., 2010a;Abdel-Fatah et al., 2010b）。阳性SHON表达（SHON+）定义为恶性肿瘤细胞核着色的中位数大于10%。由于一些核心缺失或没有包括足够的肿瘤细，所以并不是所有的TMA的核心都适合IHC分析。

统计分析 — 用SPSS进行数据分析（SPSS，version 1 7 Chicago，IL），适当时候使用Pearson’S 卡方检验，Fisher’S 精确检验，Student’S t检验 和ANOVA单因素方差检验。累计生存概率使用Kaplan-Meier方法。生存率之间的差异用log-rank检验。生存多方差检验使用Cox 风险模型。为每个变量估算风险比率（HR）和95%置信区间（95%CI）。所有试验估计为双尾，具有95% CI，P值＜0.05被认为是显着的。多重比较的P值根据Holm—Bonferroni矫正法进行调整 (Holm，1979) 。

案例二：结果

观察与讨论

SHON的鉴定

以EST序列（GenBank登录号 AY3581 03）为代表的PIKR2786（Genentech UNQ ID：UNQ2786）最初是从大规模的找出人类分泌和跨膜蛋白的努力中，通过生物信息学分析，发现的一个潜在的分泌跨膜蛋白 (Clark et a1．，2003)。然而，其生物学功能是不确定的。使用NCBI BLAST程序进行序列同源性搜索表明，UNQ2786属于类人猿物种特有的基因家族，在灵长类动物谱系之外没有已知的同源基因。我们已经证明 UNQ2786是一种分泌性蛋白，是一种人类乳腺上皮的癌基因，因此改名为SHONα。

为了鉴定全长SHONα mRNA，我们从乳腺癌细胞系MCF-7中分离mRNA，进行了5'RACE（即5'互补DNA末端快速扩增）分析以获得比EST AY358103长的5'端序列。我们并没有从5'RACE中鉴定到此EST额外的上游序列。因为发现了两个与此'EST 具有相同的3'端的转录本， 最初的EST就被定义为SHON 转录本a，另两个新鉴定的定义则为转录本b和转录本c。

SHON 转录本a和蛋白异构体α — 人类SHON转录本a的全长cDNA有725个核苷酸（图1）。5’RACE鉴定出两个转录起始位点分别在第 1位核苷酸（T）和第21位（C）。起始位点1的存在被4个克隆证实，而位点2的存在被7个克隆证实。两者都含有一个282 bp的开放阅读框。在3' UTR也含有保守的标准AATAAA多聚腺苷酸化信号。SHON a编码的蛋白，称为SHONα，它包含93个氨基酸残基，分子量为 9.7 kDa，等电点为7.8（图2）。SHONα被预测是一种可溶性蛋白，其平均平均疏水性为0.287096。通过SignalP 3（Bendtsen et al., 2004）预测该蛋白有信号肽MPIKRLSLLCLPSSVLASIPS（残基1-21）。分析还表明，成熟的SHONα蛋白可以在内部两个半胱氨酸（在核苷酸位置25和43）之间形成一个二硫键，包含一个潜在的PKC磷酸化位点（TAR 54-56），一个N-糖基化位点（NQTL 73-76），一个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点（KRLS 4-7）和N-豆蔻酰化位点（GVFPTQ77-82.）。

SHON 转录本b和蛋白异构体β — 在MCF 7细胞5’RACE鉴定出SHON转录本b只有一个转录起始位点，位于第 21位核苷酸（T）（图 3A）。此起始位点的的存在被9个克隆证实。5'端上游序列的扩展是基于人扁桃体细胞的EST克隆（IMAGE：1 286243，GenBank 访问号CR745472和AA740612）。因此，完整的人类SHONb cDNA为893个核苷酸（图3A）。它有三个潜在的框内起始翻译密码子ATG。最上游的一个预测一个456 bp开放阅读框，编码的多肽（SHONβ）为151个氨基酸残基，其分子量为16kDa， 等电点为9.2（图4A）。因为转录本a的翻译起始密码子ATG是在转录本b的阅读框内，所以SHON α和β蛋白的氨基酸序列有相同的C末端（图5）。像SHONα异构体，SHONβ也被预测为可溶性蛋白，平均疏水性为-0.060927。然而，预测它不是分泌蛋白。SHONβ蛋白将可能在四个半胱氨酸残基（43,68）和（83,101）之间形成两个内部二硫键。它也包含一个潜在的cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点[KRLS（62-65）]和三个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点 （SMK（7-9），SRR（20,22）和TAR（112-114）），一个N-糖基化位点（NQTL（131-134））和两个N—豆蔻酰化位点（GVGAGL（23-28），GVFPTQ（135-140））。

SHON转录本C和蛋白异构体γ — 在通过RT-PCR检测MCF 7细胞SHON表达时，发现了第三个转录体（见下文），被称为SHONc。相比SHONb转录变体，转录本c在外显子2有118 bp缺失， 原因是由于利用了下游受体选择性剪接（图3）。完整的人 SHONc cDNA为775个核苷酸长（图3B）。有三个潜在的框内起始密码子ATG。最上游的一个预测一个330 bp的开放阅读框， 它编码一个长为109个氨基酸残基的多肽（SHONγ），其分子量为11.8kDa，等电点为9.4（图4B）。SHONγ也被预测为可溶性蛋白，平均疏水性为-0.269725，可以三个半胱氨酸中的两个（核苷酸位置56和97）形成一个二硫键，它也包含一个潜在的酪蛋白激酶II磷酸化位点（SLPE（72-75））和四个潜在的蛋白激酶C 磷酸化位点（SMK（7-9），SRR（20-22），SSR（51-53），TFK（106—108）和一个 N-豆蔻酰化位点 GVGAGL(23—28)。SHONc转录本因在外显子2中的缺失致使阅读框架移码。因此，该亚型SHONγ与亚型β有相同的N端氨基酸序列，但是不同的C端序列（图5）。

SHON基因的基因组结构 — 比较SHON转录本和基因组的序列（GenBank登录号NT_007933）揭示，转录本a包含一个单外显子，而b和c包含两个外显子（图6）。与转录b相比，转录本 c因mRNA剪接使用了下游的受体，致使在第二个外显子里的缺失了118 bp。 SHON转录本b和c的 pre-mRNA有一个单内含子，位于核苷酸位置162和163，长度分别并为5000和5118bp。所有的外显子／内含子的剪接连接遵循GT-AG规则（图6B）。在SHONb和SHON c两基因里，外显子1编码基因的5'UTR和N-末端氨基酸残基，而外显子2编码3'UTR和C-末端残基。

三个转录本分别转录自两个不同的启动子（图6A-C）。转录本a 受是一个启动子调控，转录B和C由另一个启动子调节。两个启动子之间相距大约5 kb。

SHONa的启动子1：SHONa是一个有一个单个外显子基因，其启动子位于SHONb和c基因的大内含子中（图6A和6B）。两个重叠的TATA盒，TTATAAGAAAACAAG（或用反向表示CTTGTTTTCTTATAA）和CTATAATTACTTG分别位于SHONa启动子的 -15和 -25处。在后者的核心，TATAATTA与PISRT1基因功能性的TATA盒吻合(Pailhoux et al ，2001)。两个潜在的CCAAT盒（-35和 -73）也被确定。位于-73处的（CCAAAGT）类似于围绕在转录起始位点的Inr保守序列PyPyANA／TPyPy（Smale and Baltimore，1989），位于-35处的（CCTAT）则被发现可在人类MHCII Dpa基因（Turco et a1，1990）和cdc25基因（Zwicker PF et al，1 995）的启动子区同NF-Y结合。此外，在SHONa的启动子临近区有三个GC盒，分别位于-38，-47 和 -88处。使用TFSEARCH搜索额外的启动子组件（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）显示，SHONa基因启动子序列（核苷酸 -697到 -1）包含潜在的转录因子结合位点，其中包括转录因子SP1，AP-1，E2F，Lyf-1，IK-2，CREB，CRE-BP，Nkx-2和TATA-1/2/3（图6B）。因此，在5'RACE分析确定的转录起始位点最有可是SHONa全长的实际转录起始位点。

SHONa基因跨越约1 kb的基因组DNA。翻译起始密码子ATG在SHONb的阅读框内；因此，SHONα蛋白代表一个N端“截断”的具有相同C端序列的SHONβ（图5）。

SHONb和c的启动子2（图6A和6C）：序列分析显示SHON b和c基因启动子序列（核苷酸-959到 -1）是GC富集区（图6C）。在诸如 -18、-101和-105核苷酸位点处发现几个潜在的GC盒，在-70位点处发现了一个CCAAT盒。使用TFSEARCH寻找到其它的启动子组件，找到了几个潜在的转录因子结合位点，其中包括转录因子SPl，AP-2，E2F，p53，TATA-1/2，Egr1/2/3，NFKB 和 ATF(图6C)。

SHONα在MCF-7在乳腺癌细胞系中高表达

我们使用RT-PCR方法在MCF-7细胞系中寻找SHON转录本异构体的相关表达。由于转录本a没有内含子，因此无法设计只针对转录本a的引物。因此, 我们设计SHONc5/SHONc3和SHONF1/SHONc3两对引物（表1）来分别扩增转录本a/b（都是280bp）和 b/c（b是456bp，c是338bp。如图7中左侧显示，使用SHONF1/SHONc3引物做RT-PCR扩增出了较弱的条带 （456bp是b， 338bp 是c），说明在MCF-7细胞中SHON转录本b和c有较低的表达量。再次扩增后有两条带非常清晰的带（图7右侧），并且其序列已经经过DNA测序证实了。在相同条件下，使用SHONc5/SHONc3引物进行RT-PCR，转录本 a和b的280bp的条带都被扩增出来了。其强信号说明转录本a 的丰度比转录本b高， 因为转录本b的量很低。由于SHONc5/SHONc3引物只有在逆转录酶存在的情况下才扩增出了一条特异的条带，因此转录本a也被证实是没有内含子的。因此，在MCF-7细胞中，3种转录本都表达但转录本a的丰度最高。

抗SHONα多克隆抗体的生产和纯化

我们预测SHONα是一个分泌型蛋白。我们将成熟的SHONα的cDNA克隆进pGEX-4T1载体，构建构建了pGEX-4T1-SHONα表达载体，以便在细菌中表达GST-SHONα重组蛋白。纯化的GST-SHONα重组蛋白作为抗原免疫兔子产生兔源抗SHONα的多克隆抗体。我们从兔子血清中通过顺序亲和纯化，获到了SHONα抗体。血清在通过共价交联到谷胱甘肽葡聚糖4B珠子的GST柱子的过程中，抗GST的抗体被去除掉。结着，通过共价交联到谷胱甘肽葡聚糖4B珠子的GST-SHONα柱子纯化SHONα特异性的抗体。

经Western杂交证实，亲和纯化后的兔源SHONα的多克隆抗体可以特异性的识别GST-SHONα重组蛋白和带His标签的SHONα蛋白（图8A-C)。

兔源SHONα多克隆抗体的特异性

用表达SHONα的质粒pIRESneo3-SHONα瞬时转染MCF-7细胞，然后将转染的细胞裂解用于Western检测。如图9A所示，兔源SHONα多抗可以识别质粒表达的SHONα蛋白，即在12kDa的位置有带。转染质粒得的量增加时，Western杂交检测到的信号也增强。

为了检测SHONα抗体是否可以检测内源性的SHONα，将表达SHONα的质粒pIRESneo3-SHONα（称为MCF7-SHON）和pIRESneo3空载体（MCF7-Vec），或SHON的siRNA质粒pSilencer-siRNA（ MCF7-siRNA) 或与阴性对照siRNA 的质粒pSilencer-CK (MCF7-CK)稳定转染MCF-7细胞。在 MCF7-SHON细胞中SHONα的强制表达通过RT-PCR证实（图9B 顶端左侧）。使用全细胞裂解进行Western杂交分析，亲和纯化的SHONα抗体可以检测内源的和强制表达的SHON蛋白（图9B 底端左侧）。在MCF-7细胞中siRNA 介导的敲降内源的SHON也证实了这一点。稳定的MCF7-siRNA细胞系中对比MCF7-CK细胞siRNA对照组，SHON蛋白被siRNA敲降，这一点也通过RT-PCR证实了（图9B 顶端右侧）。SHON抗体可以在MCF7-siRNA细胞系检测到降低的SHON蛋白的表达（图9B 底端右侧）。

为了证实SHONα抗体在Western杂交中检测到带的特异性，我们做了抗原肽段封阻实验。如图9C所示，检测MCF-7细胞中的内源SHON和强制性的SHON的表达的SHONα的抗体的活性，在与重组的HIS-SHON预先孵育后，被完全阻断。

为了检测SHON抗体能否识别天然蛋白，我们做了免疫共沉淀实验。稳定转染的MCF7-Vec细胞系和MCF7-SHON细胞系的全细胞裂解物和亲和纯化的SHONα抗体进行免疫共沉淀实验。如图9D所示，内源的SHON和外源的SHON蛋白都可以被SHONα抗体拉下来并在12kDa处检测到，但正常的兔源IgG检测不到。

为了进一步确认SHONα抗体，我们还采用了其他的几个乳腺癌细胞系和正常但永生化的人乳腺癌细胞系MCF-10A进行Western杂交分析。如图9E，SHONα抗体在除MCF10A外的其它的乳腺癌细胞系 MCF-7，T47D，MDA23 1，BT549 和 BT474中检测到在不同水平的SHON表达。但是，MCF10A不表达SHON蛋白。

SHON在肿瘤细胞系和肿瘤组织中高表达

我们通过商业化的cDNA试剂盒进行PCR检测正常人类组织中SHON mRNA的表达情况（图10A)。 SHON基因的表达在所有48个组织都被检测到，但是表达水平较低(扩增40个循环是必须的）。SHON在肾上腺、骨髓、大脑、宫颈、视网膜、直肠和膀胱中表达量相对较高，然而其他组织包括乳腺中表达量较低。

我们进一步通过RT-PCR的方法检测SHON在人肿瘤细胞系中的表达情况。SHONmRNA 在所有检测的肿瘤细胞系中都有表达，包括乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、胃癌细胞系（图10B, 顶端）。使用亲和纯化的兔源SHONα多抗进行Western杂交检测了这些细胞系中SHON蛋白的表达。 与RT-PCR结果一致的是，在所有被测肿瘤细胞系中，兔源多克隆抗体都检测到预期大小（12kDa）的特异带（图10B，底端）。但在正常的人乳腺上皮细胞MCF10A中并没有检测到SHON的表达（图9E）。

为了确定人乳腺癌中SHON的表达与疾病的相关性，我们使用了商业化的乳腺癌cDNA阵列（Origene）进行PCR来评估SHON mRNA的表达情况。如图10 C所示，SHON mRNA在正常乳腺和乳腺癌细胞中都有表达。然而SHON mRNA在乳腺癌细胞中的表达水平比正常乳腺组织中高。而且SHON mRNA的表达水平与肿瘤发展的不同阶段紧密相关（图10C, 底端）。

SHONα是一种分泌型蛋白

由于SHONα是MCF-7细胞中表达的主要异构体，并且在N端有一个推定的蛋白分泌必须的信号肽，我们将C端含有HIS表位的SHONα的开放阅读框克隆到哺乳动物表达载体pIRESneo3上构建成pIRESneo3-SHONα-HIS质粒。该质粒和空载体被瞬时转染到HEK293细胞中。如图11A所示，带有HIS标签的SHONα无论在全细胞裂解液或是条件型培养基中都可以被HIS单克隆抗体或SHONα的多抗用Western检测到。

SHONβ是一种前蛋白

SHONα和SHONβ的C端序列一致，但SHONβ的N端有一个延长的58个氨基酸残基，这58个氨基酸序列并没有潜在的信号肽序列。有趣的是，当SHONα和SHONβ的表达质粒（pIRESneo3-SHONα和pIRESneo3-SHONβ）被瞬时转染到MCF-7细胞中时，分子量较大的SHONβ并不能够被针对SHONα C端设计的兔源多克隆抗体检测到，但SHONα C端序列与SHONβC端序列是一致的。但对于两个异构体来说，都检测到与MCF-7细胞中的内源性的SHON蛋白大小一致的带（图11B），这暗示了SHONβ可能是一种前蛋白。

前蛋白转化酶可以催化蛋白前体释放蛋白荷蒙和神经肽，如前阿片黑色素皮质素、肾素前体、前脑啡肽、前强啡肽、前生长激素抑制素和前胰岛素。前体通常会在保守的基序处（K/R)Xn(K/R)↓被切开，其n为0、2、4、6，X通常不是半胱氨酸(Karim．Jimenez et al.,2000；Khatib et al.,2001) 。 SHONβ包含3个这样的保守的结构域，KVLSRR、RESFER和KR（图11C）。为了鉴定 SHONβ是否是蛋白转化酶的底物，我们构建了一个 SHONβ突变体的表达质粒（pIRESneo3SHONβni），这个质粒中第三个保守的基序K⁶²R⁶³被突变成K⁶²I⁶³。我们构建了另一个含有K⁶²I⁶³突变序列和C端含有c-Myc标签的载体（命名为pIRESneo3-SHONβni-Myc）。这些质粒被瞬时转染到HEK293细胞中。使用兔源SHONα抗体进行Western杂交检测转染了pIRESneo3-SHONβ的HEK293细胞，检测到分子量为10kDa左右的蛋白条带，这与SHONα 分子量大小是一致的（图11D，顶端左侧）。除此之外，还检测到分子量在16kDa左右的蛋白条带，这个条带可能代表的是未处理过的SHONβ。这个潜在的前蛋白在MCF-7细胞中并没有表达（图11B）。 然而瞬时转染突变载体pIRESneo3-SHONβni后检测到10kDa左右的蛋白条带明显变弱，16kDa左右的蛋白条带变强。除此之外还检测到到14kDa左右的间歇条带。这些结果显示突变的K⁶²I⁶³序列影响了转化酶对前蛋白的剪切。细胞转染了c-Myc标签的SHONα和SHONβ后也观察到了同样的结果（图11D，顶端右侧）。使用鼠源的单抗9E10进一步确定了K⁶²R⁶³在蛋白裂解中的作用（图11D，中间）。这些数据清晰地说明了K⁶²R⁶³在SHONβ成熟过程中被前蛋白转化酶催化时必不可少的作用。

SHON是一个雌激素诱导型的基因

在乳腺癌细胞系中，ER⁺的细胞系如MCF-7，T47D, BT474中SHON的表达量比ER^-的细胞系如BT549和MDA-MB-231的表达量高（图9E，图10），暗示SHON有可能是受雌激素调节的基因。因此我们用17β-雌二醇（E2）处理ER⁺的细胞系MCF-7。17β-雌二醇处理导致SHON 的mRNA水平随时间延长而升高（图12A）。17β-雌二醇处理的MCF-Vec和MCF7-SHON细胞都检测到SHON蛋白的表达量升高（图12B）。因此，SHON是一个雌激素诱导型的基因。

使用17β-雌二醇处理MCF7-Vec和MCF7-SHON细胞，发现17β-雌二醇和SHON对促进细胞数量的增加有协同效应，但ER拮抗剂ICI17820可以部分抑制SHON对ER+ 的MCF-7细胞数量增加的效应，说明SHON信号部分受ER调节（图12C）。

SHON的表达对治疗的重要性

我们已证实SHON一新的乳腺癌癌基因。SHON的过表达显着促进癌细胞的增殖、存活和迁移。除此之外，SHON可以促进乳腺癌细胞系的成瘤性，而且可以将乳腺癌上皮细胞系MCF10A转化为致瘤性的细胞。更重要的是，敲除内源的SHON蛋白或功能性的抑制SHON可以减癌细胞的致瘤性。

为了确定SHON表达在乳腺癌中的临床相关性，我们检测了兔SHONα多克隆抗体在免疫组化研究的可用性。短暂性地用表达SHONα-EGFP的表达质粒PIRESneo-SHONα-EGFP或者空的pEGFP-c1载体侵染HEK293细胞。在UV可见荧光显微镜下观察SHONα-EGFP或者EGFP蛋白的绿色荧光（图13A，最左侧）。用经亲和层析纯化的兔多克隆的SHONα抗体为初级抗体，免疫染色SHON的表达，再用Cy5 青蓝染剂标记的二级抗体显色 （红色）。我们在PIRESneo3-SHONα-EGFP侵染的细胞中检测到强SHON信号，而在pEGFP-c1转染的对照组则没有（图13A，左侧第二栏）。除此以外，PIRESneo3-SHONα-EGFP转染细胞的绿色和红色共定位荧光染色表明，兔抗SHONα抗体可以特异性识别SHON（图13A，最右侧）。我们还检测了抗SHONα抗体是否可以在福尔马林固定的石蜡嵌入细胞块中识别SHON蛋白。我们用SHONα表达质粒PIRESneo3-SHONα 和空的对照PIRESneo3载体瞬时转染HEK293细胞。该细胞被用于准备福尔马林固定的石蜡嵌入的细胞块。如图图13B，抗-SHONα抗体可以检测福尔马林固定的石蜡嵌入的细胞块的SHON蛋白。这个结果明显证明抗-SHONα抗体适用于免疫组化的研究分析。

我们于是使用“诺丁汉大学医院国家卫生服务信托”人类组织库制作的乳腺癌组织芯片（TMAs）对乳腺癌中SHON蛋白质进行了大规模免疫组化分析。TMAs含有1650例非选择性的乳腺癌组织，并且曾经被用于对120种生物标记的频率和变异进行免疫组化研究（Rakha et al., 2004; Abd El-Rehim et al., 2005; Putti et al., 2005; Rakha etal., 2005a; Rakha et al., 2005b; Rakha et al., 2006a; Rakha et al., 2006b;Rakha et al., 2007; Rolland et al., 2007; Green et al., 2008; Elsheikh etal., 2008）。

正常的乳腺终末导管小叶单位呈现出强的SHON核表达和弱的细胞质表达（图14A-B）。总数1237例肿瘤适用于SHON表达分析。62%的肿瘤（766/1237）都是SHON阳性（表2）。表4展示了SHON在乳腺癌中的表达和临床病理性状的联系。阳性SHON表达和荷尔蒙受体的表达状况ER＋，PR＋以及AR＋高度相关。 特别地，SHON＋与ER＋／PR＋乳腺肿瘤高度相关。同时，SHON+与HER2-或其三阴性表型在统计学上也有着显着的关联性（分别为P=0.004，p＜0.001）。SHON表达也与很多临床病理特征相关，包括高等级、低增殖指数、高多型现象以及乳腺管形成。SHON表达也与肿瘤类型和淋巴管浸润有关。加之，SHON- 与上皮-间质转化表型有关，包括低CK5/6+ 和EGFR+、高频率的基底样型以及高水平的维生素。SHON与E-Cadherin蛋白有着微小但显着的正相关（P=0.016）。此外，SHON表达与BRCA1、ATM以及XRCC1的表达呈正相关。SHON+与p53、p16肿瘤抑制因子呈负相关，与BCL-2和TOP2A的表达呈正相关。

生存分析

与阳性SHON 表达相比， 乳腺肿瘤中的SHON-表达显示不良结果，其10年死亡风险（HR:1.85, 95% CI:1.4-2.4, p＜0.00001）、复发率（HR:5.5, 95% CI:1.2-1.9, p＝0.00001）以及远处转移率（HR:1.6, 95% CI:1.3-2.1, p＝0.00001）都增加有2倍（图15A-C）。通过调查 875个早期肿瘤患者的临床结果也证实SHON-表达的肿瘤比SHON+表达的肿瘤的预后更糟糕（数据未显示）。

SHON表达在ER+高风险的乳腺癌患者对内分泌治疗反应的预后诊断意义

通过对经过验证的预后因子、淋巴结阶段、组织学分级和肿瘤大小 （即NPI指数因子）等多变量Cox回归模型分析，证实SHON阴性表达是本研究中乳腺癌患者的临床结果的一个独立预测因子：HR:1.4, 95% CI:1.1-1.9, p＝0.017 (表5）。

此外，也发现SHON蛋白的表达是ER+而高风险（NPI≥3.4）的肿瘤患者的对内分泌治疗的反应的预后因子。相比SHON阳性表达的肿瘤患者，SHON阴性表达的肿瘤患者的10年死亡风险（HR:2.1, 95% CI:1.4-3.1, p＜0.0001）、复发率（HR:1.9, 95% CI:1.4-2.6, p＜0.0001）以及远处转移率（HR:1.8, 95% CI:1.2-2.5, p＝0.007）增加2倍（图16A-C）。然而SHON的表达并不与应用或未应用蒽环霉素治疗的ER-患者群的无病存活率显着相关（图17A-B）。

表4：SHON表达与其它临床病理变量的相关性。

^*, P<0.05；^**，P<0．01；^***，P<0.001；#，Nottingham 分级系统定义的级；BRCAl，乳腺癌l，早发型；HER2，人表皮生长因子受体2；ER, 雌激素受体；PR，孕激素受体；AR，雄激素受体；CK，细胞角蛋白；基底样型， ER-, HER2- 和CK5/6，CK 14 或EGFR任意一个表达；三阴型，ER-/PR-/HER2-。

表5：使用Cox回归分析的多变量分析确认SHON蛋白表达是独立预后因子

^*,P<0.05；^***，P<0.001；BCSS，乳腺癌特定生存率；DFS，无病生存率；DM-FS，无远端转移生存率；HR，风险比；CI，置信区间。

例3：鼠SHON单克隆抗体的生产

生产鼠单克隆SHON抗体使用的从SHON抗原： 1）合成的SHON多肽 GGTTDLPHGP,PATAPISNQT, NQTLGVFPTQ 和 PTQSITSHFQ （从艾比玛特生物医药(上海)有限公司完成定制生产）；2）纯化的GST-SHONα融合蛋白（由新加坡A*STAR生物医学科学研究所完成）。

表6：用合成SHON多肽生产的鼠单克隆SHON抗体的ELISA筛选

^* X，有待确定的。

例4：生产和鼠单抗抗SHON的特异性

34个鼠抗SHON单抗是使用合成的SHON多肽 （SHON peptides GGTTDLPHGP,PATAPISNQT, NQTLGVFPTQ 和 PTQSITSHFQ）为抗原从艾比玛特生物医药(上海)有限公司定制生产出来的，其抗体和抗原的亲和性由ELISA实验来检测 （表6）。其中4个单抗 （SHONmAb#4, mAb#5, mAb#8 and mAb#13）的特异性经使用稳定转染SHON表达质粒pIRESneo3-SHON和空载pIRESneo3质粒的MCF-7细胞的Western Blot实验来测定（图18A）。它们都能在MCF-7细胞中检测12kDa的内源性和过表达的SHON蛋白带。更大的比如24，36或者48kDa条带要么是非特异性的，要么是SHON蛋白的多聚体。

SHON mAb#5的特异性进一步是使用人的LNCaP前列腺癌细胞系， MBA-MD-231,T47D 和MCF-7乳腺癌细胞系，还有正常的乳腺细胞系MCF10A进行Western Blot来测定的。在除了MCF10A细胞系外的所有其它细胞系里，均检测到12kDa的单一条带（图18B，左侧），那些在更长时间的暴光后微弱的24和48kDa条带要么是非特异性的，要么是SHON蛋白的多聚体。

41个鼠抗SHON的单克隆抗体是使用纯化过的GST-SHONα融合蛋白为抗原，由新加坡A*STAR生物医学科学研究所生产。抗体与GST-SHONα或GST标签的亲和性由ELISA测定（表7）。其中两个单抗 （克隆1H6和4G4）的特异性使用免疫荧光染色法测定（图18C）。使用表达C末端带EGFP标记的SHONα的载体pIRESneo3-SHONa-EGFP瞬时转染HEK293细胞，SHONα的表达用这2种抗体来染色，接着用Cy3蓝色染料偶联的二抗体显色（红色）。SHONα-EGFP的表达使用荧光显微法来测定（绿色）。在pIRESneo3-SHONα-EGFP转染细胞中的红绿荧光染色的共定位表明鼠抗SHONα的单抗特异性识别SHON。

从克隆1H6和4G4分别生产了3个亚克隆，它们特异性Western Blot分析。表达质粒PIRESneo3-SHONα-EGFP编码C末端带EGFP标记的SHONα蛋白。pEGFP-C1空载体编码EGFP蛋白。使用PIRESneo3-SHONα-EGFP表达质粒和pEGFP-C1空载瞬时转染HEK293细胞。全部的6个亚克隆， 以及用来生产单克隆的鼠SHON多克抗体，都可以在期望的大约40kDa大小下特异性的识别SHONα-EGFP融合蛋白（图18D）。其模糊的小条带是蛋白质降解的结果。

因此，我们生产了适用于ELISA、Western Blot以及免疫组化染色的SHON蛋白的鼠单克隆抗体。

表7：用合成GST-SHONα生产的鼠抗SHON单克隆抗体的ELISA筛选

因此，本发明的优选方案比现有技术在预测肿瘤患者的内分泌治疗结果的准确率上更有优势。

本发明的各方面通过举例进行了描述，同时也应认识到，在不背离如所附权力要求声明的范围的前提下，可进行任何修改和改变。

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Claims (23)

1.通过检测病人样本中SHON蛋白多肽的表达预测肿瘤对内分泌治疗效果的方法，其SHON多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NOs 2， 5 和6高度相似，而样本中SHON蛋白多肽的表达预示肿瘤对内分泌治疗有效。

2.通过检测病人样本中编码SHON蛋白多肽的SHON mRNA的表达预测肿瘤对内分泌治疗效果的方法，其转录SHON mRNA核苷酸酸序列的SHON DNA序列与序列SEQ ID NOs 1， 3 和4高度相似，而样本中SHON mRNA的表达预示肿瘤对内分泌治疗有效。

3.对于权利要求1或2，样本里SHON蛋白多肽和/或SHON mRNA的表达预示肿瘤病人会有较长的无瘤生存期。

4.对于权利要求1或2，样本里SHON蛋白多肽和/或SHON mRNA的表达预示肿瘤病人会有较长的无远处转移生存期。

5.对于权利要求1至4，样本是体液，组织或细胞。

6.对于权利要求1至5，肿瘤是雌激素受体（ER）阳性或孕激素受体（PR）阳性。

7.对于权利要求1至6，肿瘤是乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，子宫内膜癌，肺癌，胃癌，肝癌，或卵巢癌。

8.对于权利要求1，包括检测病人样本中雌激素受体（ER）蛋白多肽的表达，其雌激素受体（ER）蛋白多肽的表达连同SHON蛋白多肽的表达预示肿瘤对内分泌治疗有效。

9.对于权利要求2，包括检测病人样本中编码雌激素受体（ER） mRNA表达，其雌激素受体（ER）mRNA的表达连同SHON mRNA的表达预示肿瘤对内分泌治疗的有效。

10.对于权利要求8，样本里SHON蛋白多肽的表达预示肿瘤病人有较长的无瘤生存期。

11.对于权利要求8，样本里SHON蛋白多肽的表达预示肿瘤病人有较长的无远处转移生存期。

12.对于权利要求9，样本里SHON mRNA的表达预示肿瘤病人有较长的无瘤生存期。

13.对于权利要求9，样本里SHON mRNA的表达预示肿瘤病人有较长的无远处转移生存期。

14.根据权利要求1，通过用标记的可特异与SHON蛋白多肽结合的抗体检测样本中SHON蛋白多肽的表达。

15.对于权利要求1，SHON蛋白多肽是选择性剪接产生的SHON蛋白异型体。

16.根据权利要求2，通过用核苷酸酸扩增方式扩增编码SHON蛋白多肽的SHON mRNA来检测样本中编码SHON蛋白多肽的SHON mRNA核苷酸酸序列的表达。

17.根据权利要求16，通过用能特异同编码SHON蛋白多肽的SHON mRNA杂交的杂交探针来检测样本。

18.用于权利要求1的试剂盒，里面包含至少一种可特异结合病人样本里序列SEQ IDNOs 2, 5或6 中 SHON蛋白多肽的抗体，从而预测肿瘤是否对对内分泌治疗的有效。

19.用于权利要求2的试剂盒，里面包含至少一对可特异结合病人样本里序列SEQ IDNOs 1， 3 或4中的 SHON核苷酸酸序列的互补DNA引物，从而预测肿瘤是否对对内分泌治疗的有效。

20.包含至少一种可特异结合序列SEQ ID NOs 2, 5或6 中SHON蛋白多肽的抗体的试剂。

21.包含至少一对可特异结合序列SEQ ID NOs 1， 3 或4中的 SHON核苷酸酸序列的互补DNA引物的试剂。

22.分离的SHON蛋白多肽，其SHON蛋白多肽序列与序列SEQ ID NOs 2, 5或6 中相似。

23.分离的编码SHON蛋白多肽的DNA，其DNA序列包含于序列SEQ ID NOs 1， 3 或4。