CN105399832A - 一种无标签单链型人源双特异性抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及编码包含人源CD3抗体可变区与人源CD19抗体可变区片段的重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白等。本发明提供的是一种无标签的单链型人源CD3-CD19双特异性抗体，并提供了相应的检测方法。本发明的双特异性抗体不仅可用于传统的直接给药疗法，还可以在体外重塑T淋巴细胞，以靶向性细胞疗法在极低效靶比情况下杀伤肿瘤细胞。因此，本发明双特异性抗体具有更佳的人体适用性和更广泛的用途。

Description

一种无标签单链型人源双特异性抗体及其用途

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及一种单链型人源双特异性抗体及其用途。

背景技术

B细胞恶性肿瘤是一类B淋巴细胞相关的恶性肿瘤，包括弥漫大B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、B淋巴细胞白血病等，发病率较高，严重危害人类健康。B细胞恶性肿瘤细胞表面表达较高的CD分子，如CD19、CD20和CD22等，可以作为抗体药物的治疗靶点。针对这些CD分子的抗体药物能够介导肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗疾病的目的。目前，针对CD19分子开发的抗体药物美罗华(Rituximab)已经被批准上市，用于治疗B细胞淋巴瘤。

T淋巴细胞是杀伤肿瘤的重要免疫细胞，其表面有CD3、白介素-2受体等分子。研究表明，CD3抗体和白介素-2配体可以有效激活T淋巴细胞，诱导其活化和增殖，从而提高其杀伤肿瘤细胞的活性，这些作用也已经被应用于肿瘤的免疫疗法。然而由于缺乏针对肿瘤细胞的特异靶向性，因此这些T淋巴细胞对肿瘤杀伤的效能不足。如果把能够激活T淋巴细胞的CD3抗体与靶向B细胞恶性肿瘤细胞的CD19抗体融合制备成CD3-CD19双特异性抗体，则能够有效地在肿瘤细胞周围富集和活化T淋巴细胞，赋予T淋巴细胞特异靶向性，从而显著提高T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的效果。

作为一种肿瘤免疫疗法，T细胞治疗近年来发展迅速，受到很大关注。传统的T细胞治疗如LAK、CIK等，借助细胞因子在体外使目标T细胞大量扩增，然后输入肿瘤患者体内发挥抗肿瘤作用。这种疗法的显著不足是缺乏针对肿瘤细胞的特异靶向性，因此所需要的T细胞数量很大，不利于生产。CAR-T是另一种T细胞治疗方法，采用转基因技术使T细胞获得肿瘤靶向性。然而，转基因技术操作相对复杂，质量控制难度较大，而且伦理上还有待完善。

人体内的天然抗体是由重链和轻链组成，其中重链可变区和轻链可变区结构对于抗原的结合特别重要。由重链可变区和轻链可变区组成的融合蛋白(即单链抗体)仍然具有良好的抗原结合活性。由两个不同单链抗体融合而成的单链型双特异性抗体的体积较小，亲和力适中，具有较好的组织渗透能力。然而，单链抗体缺乏抗体恒定区，难以检测，因此常规在单链抗体末端加入标签蛋白(如6个组氨酸标签、Flag标签、生物素标签等)，以达到检测和纯化的目的。然而，当带有标签蛋白的单链抗体用于人体治疗时，很有可能产生抗标签蛋白抗体，从而影响药效，这在一定程度上限制了单链抗体作为药物的应用。

发明内容

本发明要解决的主要技术问题是现有单链抗体末端需要加入标签蛋白，从而可能在使用时产生抗标签蛋白抗体，药效不佳的问题。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种单链型双特异性抗体。该其单链型双特异性抗体是由抗人CD3的单链抗体和抗人CD19的单链抗体直接连接得到或者通过连接肽连接得到，且不含标签蛋白。

其中，上述的单链型双特异性抗体中的抗人CD3的单链抗体的为：

a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.2所示的单链抗体；

或者：

b)氨基酸序列为在SEQIDNO.2所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。

其中，上述的单链型双特异性抗体中的抗人CD19所述的抗人CD19的单链抗体为：

a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.4所示的单链抗体；

或者：

b)氨基酸序列为在SEQIDNO.4所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。

优选的，上述的单链型双特异性抗体为：

a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.6所示的抗体；

或者：

b)氨基酸序列为在SEQIDNO.6所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的与a)中所述的抗体的功能相同或相似的抗体。

进一步的，上述的单链型双特异性抗体的氮端还连接有信号肽。

此外，本发明还提供了编码上述单链型双特异性抗体的编码基因。

进一步的，上述的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.5；或者其核苷酸序列为SEQIDNO.5的简并序列。

本发明还提供了含有上述编码基因的重组载体。所述的重组载体可为质粒载体或者病毒载体。

本发明还提供了含有上述重组载体的宿主细胞。所述的宿主细胞可以为原核细胞或者真核细胞。

同时，本发明还提供了上述单链型双特异性抗体在制备预防或者治疗B细胞恶性肿瘤的药物中的用途。

其中，所述的B细胞恶性肿瘤为：弥漫大B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、急性B淋巴细胞白血病等B细胞恶性肿瘤。

本发明的单链型双特异性抗体是由来自抗CD3抗体的可变区与抗CD19抗体的可变区构成，之间由一条连接肽(Linker)相连。特别的是，该双特异性抗体不带有标签蛋白。

上述单链型双特异性抗体中的抗CD3抗体单链抗体由抗CD3抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)融合而成，可表示为CD3scFv。进一步的，重链和轻链可变区间由连接肽连接。常用的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.7)，可表示为(G4S)3。优选的，上述治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体中的CD3抗体可变区的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

上述单链型双特异性抗体中的抗D19单链抗体是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)融合而成，可表示为CD19scFv。进一步的，重链和轻链可变区间由连接肽连接。常用的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，可表示为(G4S)3。优选的，上述治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体中的CD19抗体可变区的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

上述双特异性抗体的两个scFv结构之间可以使用链接肽连接接，其目的在于提供一定的柔韧性，以避免CD3scFv和CD19scFv形成结构上的空间位阻。连接肽氨基酸序列和长度均可以有一定的变化，也可以有很多本领域常用的链接肽供选择。比如，最常用的连接肽的氨基酸序列为GGGGS(SEQIDNO.8)。

进一步的，上述治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体由CD3scFv和CD19scFv通过连接肽融合而成，可表示为CD3scFv-CD19scFv。优选的，上述治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。

本发明还提供了含有上述编码治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体核苷酸序列的基因载体。该载体可选自质粒、病毒、DNA或RNA片段。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种无标签的单链型人源CD3-CD19双特异性抗体，相应的还提供了其检测方法。本发明的双特异性抗体可以稳定地与T淋巴细胞和B细胞恶性肿瘤结合，这使得该双特异性抗体不仅可用于传统的药物疗法，还可以在体外重塑T淋巴细胞，以细胞治疗的方式在极低效靶比情况下杀伤肿瘤细胞。因此，本发明的双特异性抗体具有更佳的人体适用性和更广泛的用途。

附图说明

图1.重组载体双酶切鉴定。

图2.免疫印迹检测宿主细胞表达分泌双特异性抗体。

图3.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测双特异性抗体的纯化。

图4.流式细胞术显示本发明双特异性抗体可以特异结合相应的靶细胞。A：K562；B：Jurkat；C：SU-DHL-6。

图5.免疫荧光显示本发明双特异性抗体可以特异结合相应的靶细胞。A：K562；B：T淋巴细胞；C：Ramos。

图6.ELISA检测本发明双特异性抗体与靶细胞结合的时间效应。A：Jurkat；B：Raji。

图7.本发明双特异性抗体介导的T淋巴细胞与Pfeiffer细胞的桥接作用。A：双特异性抗体；B：OKT3。

图8.本发明双特异性抗体可以激活人外周血T淋巴细胞。A：双特异性抗体(10ng/mL)；B：双特异性抗体(1000ng/mL)；C：PBS；D：OKT3(1000ng/mL)。

图9.本发明双特异性抗体能够以直接给药方式介导T淋巴细胞杀伤SU-DHL-6细胞。

图10.本发明双特异性抗体重塑后的T淋巴细胞能够以细胞治疗方式杀伤Raji细胞。

图11.本发明双特异性抗体重塑后的LAK细胞能够以细胞治疗方式杀伤RS4；11细胞。

图12.本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK可靶向到荷瘤小鼠的肿瘤部位。A：PBS；B：LAK；C：靶向性LAK。

图13.本发明双特异性抗体能够以靶向性LAK细胞疗法抑制小鼠体内B细胞恶性肿瘤的生长。

具体实施方式

本发明设计并构建了一种含有CD3scFv和CD19scFv的双特异性抗体，使其具有足够的结合活性和生物活性。更重要的是，此单链型双特异性抗体不带有标签蛋白，具有全人源序列，可以避免临床治疗中可能的抗-抗体现象，提高药物的利用率。本发明也提供了不依赖于标签的抗体检测方法。此外，与T淋巴细胞的稳定结合使得该双特异性抗体可以在体外重塑T淋巴细胞，用于细胞疗法，拓展了双特异性抗体的应用。

人体内的天然抗体是由重链和轻链组成，其中重链可变区和轻链可变区结构对于抗原的结合特别重要。本发明的研究表明，由重链可变区和轻链可变区组成的融合蛋白(即单链抗体)仍然具有良好的抗原结合活性。此单链抗体分子量仅约25kD，体积仅为天然抗体的1/6，因此具有较好的组织渗透能力。天然抗体可变区是由重链可变区和轻链可变区两条肽链组成的异二聚体，而scFv是由重链可变区和轻链可变区组成的融合单链，可能会形成空间位阻，难以形成有效的抗原结合构象。因此，需要在重链可变区和轻链可变区之间引入一条柔性连接肽，从而保证单链抗体能够形成正确的空间构象，具备有效的抗原结合活性。此外，为保证双特异性抗体的两个不同的scFv具有各自的抗原结合活性，还需在两个scFv之间引入一条柔性连接肽，以此避免两个scFv之间可能形成的空间位阻。

本发明的双特异性抗体的设计也可以用于CD3scFv与其他抗肿瘤抗体的scFv融合，所形成的双特异性抗体一方面可以发挥靶向肿瘤细胞的作用，另一方面可以激活T淋巴细胞，从而发挥T淋巴细胞的肿瘤靶向杀伤作用。

本发明描述的双特异性抗体可通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如《分子克隆》第三版(JosephSambrook，科学出版社)及类似的实验手册所记载。所用的CD3单链抗体、CD19单链抗体以及重组的CD3-CD19双特异性抗体可分别是：

1.CD3人源抗体的可变区，表示为CD3scFv，编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。

2.CD19人源抗体的可变区，表示为CD19scFv，编码核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。

3.重组的CD3-CD19双特异性抗体，表示为CD3scFv-CD19scFv，编码核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.6所示。

上述双特异性抗体的DNA可以通过常规的基因重组技术获得。所需编码CD3scFv和CD19scFv的DNA序列分别来源于人类抗体胚系基因。将编码上述scFv的DNA序列用PCR获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒、DNA或RNA片段。在编码上述双特异性抗体的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证双特异性抗体能够从细胞中分泌。载体序列中包括用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌和真核细胞中的复制和表达。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。

本发明双特异性抗体发挥作用的区段为两个独立的scFv，因此在保证scFv完整的情况下，scFv两端的氨基酸序列和长度可以有一定的变化而不减弱其生物活性，它们都属于本发明的范畴。

本发明双特异性抗体中scFv的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的排列方式以及两个scFv的排列方式可以互换，它们都属于本发明的范畴。

本发明双特异性抗体的氨基酸序列可以通过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸等方法改造，从而获得与本发明双特异性抗体的功能相似的抗体,它们都属于本发明的范畴。

编码本发明双特异性抗体的核苷酸序列可以为简并序列，或者在限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，其所编码的抗体与本发明双特异性抗体功能相同或相似。

本发明双特异性抗体内部连接肽的目的在于提供更好的柔韧性，以避免CD3scFv和CD19scFv内部和之间形成结构上的空间位阻，因此连接肽氨基酸序列和长度均可以有一定的变化，它们都属于本发明的范畴。

本发明双特异性抗体可以与其他蛋白进一步融合，以达到其他额外的作用，而不影响其靶向性，它们都属于本发明的范畴。

在完成含编码上述双特异性抗体的DNA序列的质粒构建以后，可以用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些双特异性抗体的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等。由于原核细胞表达双特异性抗体容易形成包涵体，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达双特异性抗体的哺乳动物细胞有多种，例如CHO细胞、293细胞、NS0细胞、COS细胞等，它们都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述双特异性抗体基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。

一种较佳的蛋白表达方法是利用稳定转染的宿主细胞表达。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染无新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加新霉素的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株；又例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX)的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株。

哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如昆虫细胞、酵母、细菌等也可以用于表达本发明的双特异性抗体，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是容易形成包涵体，因此需要进一步蛋白复性。

本发明双特异性抗体属于单链抗体，不带有标签蛋白，无法采用传统的抗标签抗体来实现检测。本发明为无标签单链抗体提供了相应的免疫印迹、ELISA、流式细胞术、免疫荧光检测方法。辣根过氧化物酶(HRP)标记的PoteinL(HRP-ProteinL)适用于免疫印迹和ELISA检测。ProteinL和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗ProteinL抗体(FITC-AntiProteinL)适用于流式细胞术和免疫荧光检测。本发明提供的上述检测方法和思想可拓展到其他类似的抗体检测。

从重组体培养液中获得相应的双特异性抗体后，可以用流式细胞术来检测其对靶细胞的结合活性，实验表明，本发明的双特异性抗体能够结合CD3阳性的细胞，也能够结合CD19阳性的细胞，但不结合CD3阴性和CD19阴性的细胞，因此本发明所构建的双特异性抗体可以有效靶向T淋巴细胞和B细胞恶性肿瘤细胞。ELISA分析显示，本发明的双特异性抗体可以稳定持久地与靶细胞结合，显示出较好的时间效应，这是本发明双特异性抗体用于靶向性细胞疗法的理论基础。本发明的双特异性抗体可以在体外使T淋巴细胞重塑为靶向性T淋巴细胞，减少了细胞治疗所需的效应细胞数量，提高了细胞治疗的疗效，从而拓展了双特异性抗体的应用和细胞治疗的理念。

应用纯化方法获得高纯度的双特异性抗体后，可以检测其对T淋巴细胞的激活作用，还可以用LDH释放法等方法检测其对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤作用。一方面，本发明的双特异性抗体可以直接给药方式介导T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应；另一方面本发明的双特异性抗体还可以重塑T淋巴细胞，以靶向性细胞治疗的方式发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。

本发明的双特异性抗体还可以用病毒载体来运载和表达，这些病毒载体包括但不限于腺病毒载体(adenoviralvectors)、腺相关病毒载体(adeno-associatedviralvectors)、反转录病毒载体(retroviralvectors)、单纯疱疹病毒载体(herpessimplexvirus-basedvectors)、慢病毒载体(lentiviralvectors)。

本发明的双特异性抗体可以按照药剂学常规技术制备成各种形式的药物制剂，较优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。

本发明的双特异性抗体可以与其他药物形成药物组合物，包括任何一种或几种其他的具有协同作用的抗肿瘤药物，所述组合物可以和其他治疗方法一起治疗肿瘤，所述其他治疗方法包括化学疗法、放射疗法、生物疗法。

以下实例对本发明所涉及的双特异性抗体的构建、试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容和用途并不仅限于实例的范畴。

实施例一克隆编码双特异性抗体的DNA序列及构建重组载体

本发明中编码双特异性抗体的基因片段可以通过经典的分子生物技术获得，并且该基因序列可针对哺乳表达系统优化，以便得到更佳的表达量。双特异性抗体基因片段与相应的表达载体重新连接可获得重组载体，以适应哺乳细胞的表达和筛选。

1、构建编码CD3-CD19双特异性抗体的重组载体

本发明中的人源CD3抗体可变区基因和人源CD19抗体可变区基因分别来源于人类抗体胚系基因。本发明的双特异性抗体由CD3scFv和CD19scFv融合而成，在CD3scFv与CD19scFv之间有一连接肽。双特异性抗体N端加上了小鼠免疫球蛋白kappa轻链(Igkappa)的分泌信号肽，能够保证其分泌到哺乳细胞外。本发明中CD3-CD19双特异性抗体基因片段是通过上述几个片段由拼接PCR扩增所得。获得的完整PCR基因片段后,可以进一步与IRES(内部核糖体进入位点)和DHFR(二氢叶酸还原酶)基因融合，插入到质粒pcDNA3.1(+)中，从而获得编码CD3-CD19双特异性抗体的重组载体。重组质粒利用CMV启动子来表达融合蛋白，并包含多聚腺苷酸(PolyA)元件以保证其转录终止。该重组质粒含有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因，以利于其在细菌中复制。该重组质粒还含有新霉素(Neomycin)抗性基因，以利于重组载体稳定转染宿主细胞后，使用G418筛选出稳定表达细胞株。重组载体中的IRES和DHFR基因原件可以使双特异性抗体基因在DHFR缺陷的细胞中实现高表达。将编码所述双特异性抗体的重组质粒转化工程化大肠杆菌后加入LB培养基培养过夜，以获取大量重组质粒的拷贝，用质粒提取试剂盒(Qiagen公司)提取质粒后进行BamHI和EcoRI双酶切和测序鉴定(见图1)，所获得的编码双特异性抗体的DNA序列如SEQIDNO.5所示。

实施例二本发明双特异性抗体在宿主细胞中的表达和纯化

本发明中双特异性抗体是在CHO-DG44细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用离子交换和凝胶层析的方法纯化所得。

1、双特异性抗体在CHO-DG44细胞中的表达

获得高纯度编码双特异性抗体的重组质粒后，利用Lipofectamine2000质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)将重组质粒转染DG44细胞，在无血清培养基中培养三天后收集DG44细胞上清液，可以用免疫印迹检测双特异性抗体的表达(见图2)，所用检测试剂为HRP(辣根过氧化物酶)标记的ProteinL。

上述瞬时表达方法可用于快速地获取少量的双特异性抗体蛋白，如希望获取较多量的双特异性抗体蛋白，则可以在DG44细胞中的实现稳定表达。将编码双特异性抗体的重组质粒用Lipofectamine2000质粒转染试剂盒转染DG44细胞，在含有新霉素和MTX的无血清培养基中培养，大约14天后挑取细胞克隆进行扩大培养，并选取状态良好的细胞在液氮中冷冻保存。稳定转染的DG44细胞可以采用无血清悬浮培养的方式继续加大MTX浓度以获得高表达细胞株，然后就可以进一步获得包含双特异性抗体的细胞培养液。

2、双特异性抗体的纯化

上述获得的包含双特异性抗体的细胞培养液可采用阳离子交换层析和凝胶层析进行纯化。将CaptoMMC弱阳离子交换柱(GEHealthcare)平衡后，将浓缩过的细胞培养液上清液进样，以A280(nm)进行监测，用清洗液洗至非特异结合的蛋白全部被洗脱，然后用洗脱液洗脱双特异性抗体。进一步采用Superdex200Increase10/300GL凝胶层析柱(GEHealthcare)纯化后，可以用超滤方法将缓冲液置换为PBS，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测双特异性抗体的纯化效果(见图3)。纯化后的双特异性抗体可置于4℃短期保存，也可置于-20℃长期保存。

实施例三流式细胞术检测本发明双特异性抗体与靶细胞的结合活性

本发明提供了可用于流式细胞术的检测方法，可用于分析无标签双特异性抗体的结合活性。本发明以CD3阳性的Jurkat细胞、CD19阳性的SU-DHL-6细胞、CD3和CD19阴性的K562细胞作为细胞模型，并以流式细胞术来检测双特异性抗体的结合活性。

针对每种细胞的孵育条件分为3组，如表1所示。

表1

孵育体系为0.1mL，细胞数目为2×10⁶个，双特异性抗体浓度为0.1mg/mL，ProteinL浓度为0.04mg/mL，FITC(异硫氰酸荧光素)标记的抗ProteinL抗体浓度为0.02mg/mL。每种试剂的孵育条件为冰上30分钟，每种试剂孵育后用PBS洗涤2次，最后采用流式细胞仪进行分析。结果显示，本发明的双特异性抗体能够特异结合CD3阳性的Jurkat细胞、CD19阳性的SU-DHL-6细胞，而不结合CD3和CD19阴性的K562细胞(见图4)。

实施例四免疫荧光检测本发明双特异性抗体与靶细胞的结合活性

本发明提供了可用于免疫荧光的检测方法，可用于分析无标签双特异性抗体与靶细胞的结合情况。本发明以CD3阳性的T淋巴细胞、CD19阳性的Ramos细胞、CD3和CD19阴性的K562细胞作为细胞模型，采用免疫荧光技术来检测本发明中的双特异性抗体与靶细胞的结合。

按照实施例三中的孵育条件分别孵育T淋巴细胞、Ramos细胞、K562细胞。孵育完毕后至于荧光显微镜下观察。结果显示，T淋巴细胞和Ramos细胞的表面显示出明显的荧光，而K562细胞的荧光不明显，说明本发明的双特异性抗体结合在靶细胞的细胞表面(见图5)。

实施例五ELISA检测本发明双特异性抗体与靶细胞结合的时间效应

本发明提供了可用于ELISA的检测方法，可用于分析无标签双特异性抗体与靶细胞的结合情况。本发明以CD3阳性的Jurkat细胞、CD19阳性的Raji细胞作为细胞模型，并以ELISA来检测本发明双特异性抗体与细胞结合的时间效应。

针对每种细胞的孵育条件分为2组，如表2所示。

表2

孵育体系为0.1mL，细胞数目为2×10⁶个。双特异性抗体(0.1mg/mL)与待测细胞于冰上孵育40分钟后，用PBS洗涤2次，置于4℃分别静置1、4、8、12、24小时，然后再与HRP-ProteinL(60ng/mL)于冰上孵育30分钟，最后用PBS洗涤3次，用TMB进行显色分析。结果显示，本发明的双特异性抗体能够稳定地与CD3阳性的Jurkat细胞和CD19阳性的Raji细胞结合，显示出较好的时间效应(见图6)。

实施例六本发明双特异性抗体可以桥接T淋巴细胞与Pfeiffer细胞

本发明的双特异性抗体可以桥接人T淋巴细胞与肿瘤靶细胞。本发明以人T淋巴细胞、CD19阳性的Pfeiffer细胞作为细胞模型，并以本发明中的双特异性抗体和OKT3对照抗体来检测细胞桥接作用。

将人T淋巴细胞(2×10⁵个)分别与双特异性抗体(1μg/mL)和OKT3(1μg/mL)于室温孵育30分钟，PBS清洗1次，然后加入Pfeiffer细胞(1×10⁶个)于室温孵育30分钟，最后置于倒置显微镜下观察。结果显示，本发明的双特异性抗体可以桥接T淋巴细胞与Pfeiffer细胞，形成典型的细胞花环；而OKT3则没有诱导形成典型的细胞花环现象(见图7)。

实施例七本发明双特异性抗体可以激活人外周血T淋巴细胞

本发明利用人外周血淋巴细胞来检测本发明双特异性抗体对T淋巴细胞的激活效应。

在6板内接种人外周血淋巴细胞(0.5×10⁶/孔)，将双特异性抗体加入到细胞培养孔(10ng/mL和1000ng/mL)。阳性对照孔中加入OKT3对照抗体(1000ng/mL)，阴性对照孔中加入等体积PBS。继续培养细胞48小时后，在显微镜下观察T淋巴细胞增殖情况。结果显示，在加入本发明双特异性抗体的孔中，可以见到明显的T淋巴细胞增殖克隆，其与阳性对照OKT3相似，而阴性对照PBS孔中则未见明显的T淋巴细胞克隆形成，说明本发明的双特异性抗体能够有效激活T淋巴细胞(见图8)。

实施例八本发明双特异性抗体可以在体外能够以多种治疗方式介导T淋巴细胞杀伤B细胞恶性肿瘤细胞

本发明利用人T淋巴细胞、弥漫大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-6、Burkitt淋巴瘤细胞Raji、急性B淋巴细胞白血病细胞RS4；11作为模型，并采用直接给药、细胞疗法等多种方式来检测双特异性抗体介导的T淋巴细胞对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤作用。

1、本发明双特异性抗体可以直接给药方式介导T淋巴细胞杀伤SU-DHL-6细胞。

在96孔细胞培养板内接种SU-DHL-6细胞(1×10⁴/孔)，按照T淋巴细胞与SU-DHL-6细胞的不同比例(效靶比＝10、20、50)，将T淋巴细胞加入到培养板内，同时将不同浓度的双特异性抗体(PBS，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL)加入到细胞培养孔，继续培养细胞96小时，最后采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测试剂盒检测细胞的杀伤效应，分析细胞的生长情况。结果显示，本发明的双特异性抗体能够有效介导T淋巴细胞对SU-DHL-6细胞的杀伤(见图9)。

2、本发明双特异性抗体重塑后的T淋巴细胞可以有效杀伤Raji细胞。

在本实验中，先使用不同浓度的双特异性抗体(PBS，0.25ug/mL，0.5ug/mL，1ug/mL)在室温条件下孵育T淋巴细胞30分钟，完成对T淋巴细胞的体外重塑。重塑完毕后，使用PBS洗涤T淋巴细胞2次，以去除未结合的游离抗体。按照T淋巴细胞与Raji细胞的不同比例(效靶比＝10、20、50)，将重塑的T淋巴细胞加入到含有Raji细胞(1×10⁴/孔)的96孔板内，继续培养细胞96小时，最后采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测试剂盒检测细胞的杀伤效应，分析细胞的生长情况。结果显示，本发明双特异性抗体重塑的T淋巴细胞能够有效杀伤Raji细胞(见图10)。

3、本发明双特异性抗体重塑后的LAK细胞可以有效杀伤RS4；11细胞。

在本实验中，先使用不同浓度的双特异性抗体(PBS，1ug/mL)在室温条件下孵育LAK细胞30分钟，完成对LAK细胞的体外重塑。重塑完毕后，使用PBS洗涤LAK细胞2次，以去除未结合的游离抗体。按照LAK细胞与RS4；11细胞的不同比例(效靶比＝1、2、5)，加入到含有RS4；11细胞(1×10⁴/孔)的96孔板内，继续培养细胞96小时，最后采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测试剂盒检测细胞的杀伤效应，分析细胞的生长情况。结果显示，本发明双特异性抗体重塑的LAK细胞在极低的效靶比情况下(效靶比＝1、2、5)就可以有效杀伤RS4；11细胞(见图11)。

实施例九本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK可以靶向到荷瘤小鼠的肿瘤部位

本发明通过活体成像技术，分析本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK在荷瘤小鼠体内的分布情况，来探究靶向性LAK在荷瘤小鼠体内的肿瘤靶向性。

使用近红外荧光(NIR)染料对LAK细胞孵育标记40分钟，用培养基清洗1次并重悬，然后再分别与双特异性抗体(1μg/mL)和OKT3(1μg/mL)孵育30分钟，以完成对LAK细胞的重塑。重塑完毕后，用培养基清洗1次，以去除未结合的游离抗体。把细胞重悬于PBS，于尾静脉部位注射入已建立好的Raji皮下瘤NOD/SCID小鼠体内。注射2小时后，采用活体成像仪进行检测分析。结果显示，本发明双特异性抗体重塑的LAK可以靶向到荷瘤小鼠的肿瘤部位，而对照LAK缺乏良好的肿瘤靶向性，说明本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK具有较好的肿瘤靶向性(见图12)。

实施例十本发明双特异性抗体以靶向性LAK细胞疗法抑制小鼠体内B细胞恶性肿瘤的生长

本发明以Raji皮下瘤NOD/SCID小鼠为模型，采用本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK来分析本发明双特异性抗体的抗肿瘤应用。

将NOD/SCID雌鼠随机分为三组，每组5只。三组小鼠均在无菌条件下于腹背右侧皮下接种Raji细胞(为5×10⁶个)。接瘤24小时后进行治疗。第一组小鼠给予PBS；第二组小鼠给予OKT3孵育后的LAK细胞(效靶比＝1)；第三组小鼠给予本发明双特异性抗体重塑后的靶向性LAK细胞(效靶比＝1)。每天尾静脉注射1次，连续治疗4天，30天后检测小鼠成瘤性。结果表明，PBS组和非靶向LAK组中的5只小鼠均成瘤。相反，靶向性LAK组的5只小鼠中仅有2只成瘤，且肿瘤体积较小，这说明本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK在极低效靶比情况下就可以发挥明显的抑瘤作用(见图13)。

上述实例表明，本发明的无标签单链型人源CD3-CD19双特异性抗体可以在DG44细胞中表达，并可以被本发明中采用的多种无标签检测方法检测。本发明的双特异性抗体能够特异结合CD3阳性和CD19阳性的靶细胞，并且可以激活人外周血T淋巴细胞。本发明的双特异性抗体除了传统的直接给药疗法外，还可以在极低效靶比情况下以靶向性细胞疗法来杀伤B细胞恶性肿瘤，因此该双特异性抗体具有更佳的人体适用性和更广泛的用途。

Claims (10)

1.单链型双特异性抗体，其特征在于：是由抗人CD3的单链抗体和抗人CD19的单链抗体直接连接得到或者通过连接肽连接得到，且不含标签蛋白。

2.根据权利要求1所述的单链型双特异性抗体，其特征在于：所述的抗人CD3的单链抗体为：

a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.2所示的单链抗体；

或者：

b)氨基酸序列为在SEQIDNO.2所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。

3.根据权利要求1所述的单链型双特异性抗体，其特征在于：所述的抗人CD19的单链抗体为：

a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.4所示的单链抗体；

或者：

b)氨基酸序列为在SEQIDNO.4所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。

4.根据权利要求1所述的单链型双特异性抗体，其特征在于所述的单链型双特异性抗体为：

a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.6所示的抗体；

或者：

b)氨基酸序列为在SEQIDNO.6所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的与a)中所述的抗体的功能相同或相似的抗体。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的单链型双特异性抗体，其特征在于，在其氮端还连接有信号肽。

6.编码权利要求1～5中任一项所述的单链型双特异性抗体的编码基因。

7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO.5；或者其核苷酸序列为SEQIDNO.5的简并序列。

8.含权利要求6或7所述编码基因的重组载体。

9.含权利要求8所述重组载体的宿主细胞。

10.权利要求1～5中任一项所述的单链型双特异性抗体在制备预防或者治疗B细胞恶性肿瘤的药物中的用途。