ES2534085T3 - Inmunoconjugados dirigidos - Google Patents

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Ralf Hosse
Ekkehard Moessner
Michela Silacci-Melkko
Pablo Umana
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Abstract

Inmunconjugado que comprende: (a) por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla, y (b) una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno, en el que dicha fracción efectora de cadena sencilla es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), interferón-α (INF-α) e interleuquina-12 (IL-12), en donde cada una de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno es una molécula de Fab, en donde dicha primera fracción efectora de cadena sencilla comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción de unión a antígeno, y en donde dicha segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción efectora.

Description

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DESCRIPCIÓN
Inmunoconjugados dirigidos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un inmunoconjugado que comprende:(a) por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla, y (b) un primer y un segundo dominios de unión a antígeno, en el que dicha fracción de cadena sencilla es una citoquinas seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), interferón-α (INF-α) e interleuquina-12 (IL-12), en donde cada una de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno es una molécula de Fab, en donde dicha primera fracción efectora de cadena sencilla comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción de unión a antígeno, y en donde dicha segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción efectora. La presente invención se refiere de manera general a inmunoconjugados específicos de antígeno para administrar selectivamente fracciones efectoras que influyen sobre la actividad celular. Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichos inmunoconjugados, y a vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La invención se refiere además a métodos para producir los inmunoconjugados indicados en la presente memoria, y a composiciones que comprenden dichos inmunoconjugados para la utilización en el tratamiento de enfermedades.
Antecedentes de la técnica
La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo celular específico con frecuencia resulta deseable en una diversidad de contextos clínicos. Por ejemplo, es un objetivo primario de la terapia del cáncer destruir específicamente células tumorales, dejando intactas y sin daños las células y tejidos sanos. Una multitud de rutas de transducción de señales en la célula se encuentran ligadas a la supervivencia y/o muerte de la célula. Por consiguiente, la administración directa de un factor de la vía implicado en la supervivencia o muerte celulares se utiliza para el mantenimiento o destrucción de la célula.
Las citoquinas son moléculas de señalización celular que participan en la regulación del sistema inmunológico. Al utilizarse en la terapia del cáncer, las citoquinas pueden actuar como agentes inmunomoduladores que presentan efectos antitumorales y que pueden incrementar la inmunogenicidad de algunos tipos de tumores. Sin embargo, la rápida eliminación de la sangre y la falta de especificidad tumoral requieren la administración sistémica de dosis elevadas de la citoquina con el fin de conseguir una concentración de la citoquina en el sitio tumoral que resulte suficiente para activar una respuesta inmunológica o para presentar un efecto antitumoral. Estos niveles elevados de citoquina sistémica pueden conducir a toxicidad severa y a reacciones adversas.
Una manera de administrar un factor de ruta de transducción de señales, tal como una citoquina, en un sitio específico in vivo (por ejemplo un tumor o microambiente tumoral) es conjugar el factor con una inmunoglobulina específica para el sitio. Las primeras estrategias destinadas a administrar factores de la ruta de transducción de señales, tales como citoquinas, en un sitio específico in vivo incluían cadenas pesadas de inmunoglobulina conjugadas con diversas citoquinas, incluyendo linfotoxina, factor α de necrosis tumoral (TNF-α), interleuquina-2 (IL2) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM). Las cadenas pesadas de inmunoglobulina se conjugaron químicamente a una citoquina o el conjugado de inmunoglobulina-citoquina se expresó en forma de una proteína de fusión Ver Nakamura K. y Kubo A., Cancer Supplement 80:-2650-2655, 1997; Jun L. et al., Chin. Med. J. 113:151-153, 2000, y Becker J.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7826-7831, 1996. Los investigadores han observado que, no sólo eran capaces de dirigir citoquinas a sitios específicos in vivo, sino que también podían aprovechar el hecho de que los anticuerpos monoclonales presentan vidas medias en suero más largas que la mayoría de las demás proteínas. Debido a la toxicidad sistémica asociada a las dosis altas de determinadas citoquinas no conjugadas, es decir IL-2, la capacidad de una proteína de fusión de inmunoglobulina-citoquina de maximizar las actividades inmunoestimuladoras en el sitio de un tumor, manteniendo al mínimo los efectos sistémicos secundarios, a una dosis menor, llevó a los investigadores a creer que los inmunoconjugados de inmunoglobulina-citoquina eran agentes terapéuticos óptimos. Sin embargo, una de las principales limitaciones a la utilidad clínica de las inmunoglobulinas como agentes de administración es su incorporación inadecuada y pobre distribución en los tumores, parcialmente debido al gran tamaño de la molécula de inmunoglobulina Ver Xiang J. et al., Immunol. Cell Biol. 72:275-285 (1994). Además, se ha sugerido que los inmunoconjugados de inmunoglobulinacitoquina pueden activar el complemento e interactuar con receptores Fc. Esta característica inherente a las inmunoglobulinas se ha percibido desfavorablemente debido a que los inmunoconjugados terapéuticos pueden dirigirse a células que expresan receptores Fc y no a las células preferentes portadoras de antígenos. Un enfoque para superar dichos problemas es la utilización de fragmentos de inmunoglobulina manipulados. Numerosos estudios han detallado las características de los inmunoconjugados de fragmento de inmunoglobulina-citoquina . Ver Savage P. et al., Br. J. Cancer 67:304-310, 1993; Harvill E.T. y Morrison S.L., Immunotechnol. 1:95-105, 1995, y Yang J. et al., Mol. Immunol. 32:873-881, 1995 En general, existen dos constructos comunes de proteína de fusión
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de fragmento de inmunoglobulina-citoquina: F(ab’)2-citoquina expresado en células de mamífero y scFv-citoquina expresado en Escherichia coli. Ver Xiang J., Hum. Antibodies 9:23-36, 1999. Tanto la reactividad de unión a tumor de la molécula parental de inmunoglobulina como la actividad funcional de la citoquina se mantienen en la mayoría de dichos tipos de inmunoconjugado. Algunos estudios preclínicos recientes han demostrado que dichas proteínas de fusión son capaces de dirigir citoquinas a tumores que expresan el antígeno asociado a tumor in vivo, y de inhibir tumores tanto primarios como metastásicos en un modelo animal inmunológicamente competente.
Entre los ejemplos de inmunoconjugados de fragmento de inmunoglobulina-citoquina se incluyen el inmunoconjugado scFv-IL-2, tal como se proporciona en la solicitud publicada de patente PCT nº WO 2001/062298 A2, el inmunoconjugado de fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina-GM-CSF, tal como se proporciona en la patente US nº 5.650.150, el inmunoconjugado proporcionado en la solicitud publicada de patente PCT nº WO 2006/119897 A2, en el que la primera subunidad de scFv-IL-12 comparte únicamente uno o más enlaces disulfuro con la segunda subunidad de IL-12-scFv, y el inmunoconjugado tal como se describe en la solicitud publicada de patente PCT nº WO 99/29732 A2, en el que el fragmento de cadena pesada de Ig-IL-12 primera subunidad comparte únicamente uno o más enlaces disulfuro con la segunda subunidad de fragmento de cadena pesada de Ig-IL-12. También se han descrito inmunotoxinas basadas en fragmentos de inmunoglobulina. El documento nº wo 98/39363 describe inmunotoxinas en las que dos subunidades, consistiendo cada una de una fracción toxina acoplada con una fracción de unión a antígeno basada en un fragmento scFv o Fab, se unen mediante un enlace disulfuro para formar moléculas divalentes. El documento nº WO 2009/017823 describe inmunotoxinas diftéricas basadas en diacuerpos. Aunque estos inmunoconjugados de segunda generación presentan algunas propiedades mejoradas en comparación con los conjugados de inmunoglobulina-citoquina de primera generación, el desarrollo de más agentes terapéuticos específicos todavía más seguros resulta deseable para una mayor eficacia contra las células tumorales y una reducción del número y gravedad de los efectos secundarios de estos productos (por ejemplo toxicidad, destrucción de células no tumorales, etc.). Además, resulta deseable identificar maneras de estabilizar adicionalmente los inmunoconjugados manteniendo niveles de actividad terapéutica aceptables.
La presente invención proporciona inmunoconjugados que muestran una eficacia mejorada, una especificidad de acción elevada, toxicidad reducida, y estabilidad mejora en sangre en comparación con los inmunoconjugados conocidos.
BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona inmunoconjugados que muestran una eficacia mejorada, una especificidad de acción elevada, toxicidad reducida, y estabilidad mejorada en sangre en comparación con los inmunoconjugados conocidos. Los inmunoconjugdos de la presente invención pueden utilizarse para administrar selectivamente fracciones efectoras en un sitio diana in vivo. En otra realización, el inmunoconjugado administra una citoquina en un sitio diana, en el que la citoquina puede ejercer un efecto biológico localizado, tal como una respuesta inflamatoria local, la estimulación del crecimiento de las células T y la activación de las mismas, y/o la activación de células B y/o NK. La invención se refiere a los inmunoconjugados, polinucleótidos, células huésped y métodos siguientes para producir un inmunoconjugado, y a composiciones que comprenden un inmunoconjugado:
(1)
un inmunconjugado que comprende: (a) por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla, y (b) una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno, en el que dicha fracción de cadena sencilla es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), interferón-α (INF-α) e interleuquina-12 (IL-12), en donde cada una de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno es una molécula de Fab, en donde dicha primera fracción efectora de cadena sencilla comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción de unión a antígeno, y en donde dicha segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino- o carboxiterminal con dicha primera fracción efectora.
(2)
El inmunoconjugado de (1), en el que dicho inmunoconjugado consiste esencialmente de una primera fracción efectora y primera y segunda fracciones de unión a antígeno unidas mediante una o más secuencias conectoras.
(3)
El inmunoconjugado de (1) o (2), en el que dicha primera molécula de Fab se une en su extremo carboxi-terminal de cadena pesada o ligera con el aminoácido amino-terminal de dicha fracción efectora, y dicha fracción efectora se une en su aminoácido carboxi-terminal con el aminoácido amino-terminal de la cadena pesada o ligera de la segunda molécula de Fab.
(4)
El inmunoconjugado de cualquiera de (1) a (3), en el que las regiones variables de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el mismo antígeno.
(5)
El inmunoconjugado de cualquiera de (1) a (3), en el que las regiones variables de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para diferentes antígenos.
(6)
El inmunoconjugado de (4) o (5), en el que dichas primera y/o segunda fracción de unión a antígeno son específicas para un antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste de proteína activada por fibroblastos (PAF), el proteoglicano condroitín-sulfato del melanoma (PCSM), el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2), el dominio A2 de la tenascina (TNC-A1) y el dominio extra B de la fibronectina (DEB).
(7)
El inmunoconjugado de (6), en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 7, SEC ID nº 179, SEC ID nº 183, SEC ID nº 187, SEC ID nº 191, SEC ID nº 195, SEC ID nº 199, SEC ID nº 203 y SEC ID nº 207, y una secuencia
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de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 177, SEC ID nº 181, SEC ID nº 185, SEC ID nº 189, SEC ID nº 193, SEC ID nº 197, SEC ID nº 201, SEC ID nº 205.
(8)
El inmunoconjugado de (6), en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para la proteína activada por fibroblastos (PAF) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de: SEC ID nº 21, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 31, SEC ID nº 35, SEC ID nº 39, SEC ID nº 43, SEC ID nº 47, SEC ID nº 51, SEC ID nº 69, SEC ID nº 73, SEC ID nº 77, SEC ID nº 81, SEC ID nº 85, SEC ID nº 89, SEC ID nº 93, SEC ID nº 123, SEC ID nº 127, SEC ID nº 131, SEC ID nº 135, SEC ID nº 139, SEC ID nº 143, SEC ID nº 147, SEC ID nº 151, SEC ID nº 155, SEC ID nº 159, SEC ID nº 163, SEC ID nº 167, SEC ID nº 171 y SEC ID nº 175, y una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de: SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 23, SEC ID nº 29, SEC ID nº 33, SEC ID nº 37, SEC ID nº 41, SEC ID nº 45, SEC ID nº 49, SEC ID nº 67, SEC ID nº 71, SEC ID nº 75, SEC ID nº 79, SEC ID nº 83, SEC ID nº 87, SEC ID nº 91, SEC ID nº 121, SEC ID nº 125, SEC ID nº 129, SEC ID nº 133, SEC ID nº 137, SEC ID nº 141, SEC ID nº 145, SEC ID nº 149, SEC ID nº 153, SEC ID nº 157, SEC ID nº 161, SEC ID nº 165, SEC ID nº 169 y SEC ID nº 173.
(9)
El inmunoconjugado de (6), en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el proteoglicano crondroitín-sulfato del melanoma (PCSM) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de SEC ID nº 257 ó a la secuencia SEC ID nº 261 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID nº 259 ó a la secuencia SEC ID nº 271.
(10)
El inmunoconjugado de (1), en el que dicha citoquina es IL-2.
(11)
Un polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconjugado de cualquiera de (1) a (3), en el que dicho polinucleótido codifica (i) las cadenas pesadas de dicha primera y segunda fracciones de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora, (ii) las cadenas ligeras de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora, o (iii) una cadena ligera de dicha primera fracción de unión a antígeno, una cadena pesada de dicha segunda fracción de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora.
(12)
Una célula huésped que comprende el polinucleótido de (11).
(13)
Un método para producir el inmunoconjugado de cualquiera de (1) a (10), en el que el método comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 16 bajo condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado.
(14)
Una composición que comprende el inmunoconjugado de cualquiera de (1) a (10) y un portador farmacéutico.
(15)
El inmunoconjugado de cualquiera de (1) a (10) para el tratamiento de una enfermedad en un paciente en necesidad del mismo.
(16)
El inmunoconjugado de (15), en el que dicha enfermedad es el cáncer.
La invención se refiere de manera gneral a un inmunoconjugado que comprende por lo menos una primera fracción efectora y por lo menos una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno seleccionadas independientemente de entre el grupo que consiste de un Fv y un Fab, en el que una primera fracción efectora comparte un enlace peptídico aminoterminal o carboxiterminal con una primera fracción de unión a antígeno y una segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico aminoterminal o carboxiterminal con: i) la primera fracción efectora, o ii) la primera fracción de unión a antígeno.
Otro aspecto de la presente invención es un inmunoconjugado que comprende por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla unida en su aminoácido aminoterminal a una o más moléculas de scFv, y en el que la primera fracción efectora de cadena sencilla se encuentra unida en sus aminoácidos carboxiterminales a una o más moléculas de scFv.
Otro aspecto de la presente invención es un inmunoconjugado que comprende por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla y primera y segunda fracciones de unión a antígeno, en los que cada uno de entre la primera y la segunda fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxiterminal a una región constante que comprende un dominio constante de inmunoglobulina seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de: CH1 de IgG, Ckappa de IgG y CH4 de IgE, y en el que la primera fracción de unión a antígeno se encuentra unida en el aminoácido carboxiterminal de su región constante al aminoácido aminoterminal de uno de las fracciones efectoras, y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran unidas covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro. Otro aspecto de la presente invención es un inmunoconjugado que comprende por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla y primera y segunda fracciones de unión a antígeno, en los que cada uno de la primera y segunda fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de scFv unida en su extremo carboxiterminal a un dominio CH3 de IgG1, y en los que la primera fracción de unión a antígeno se encuentra unida en su aminoácido carboxiterminal al aminoácido aminoterminal de uno de las fracciones efectoras, y en los que la primera y la segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran unidas covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un inmunoconjugado que comprender una primera y una segunda fracciones efectoras de cadena sencilla y primera y segunda fracciones de unión a antígeno, en los que cada uno de las fracciones de unión a antígeno comprende una molécula Fab unida por el aminoácido carboxiterminal de cadena pesada o ligera a un dominio CH3 de IgG1, y en el que cada uno de los dominios CH3 de IgG1 se encuentra unido por su aminoácido carboxiterminal al aminoácido aminoterminal de una de las fracciones efectoras, y en el que la
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primera y la segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran unidas covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro.
En una realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 95. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 104. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 105. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 106. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 107. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 96. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 96 y una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 95 y 104 a 107. En otra realización, el inmunconjugado comprende un polipéptido que presenta una secuencia que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 95, 96 y 104 a 107.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 108. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 108. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 117. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 117. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 118. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 118. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 119. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 119. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 120. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 120. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 109. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 109.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 13 ó a la secuencia SEC ID nº 15. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 9 ó a la secuencia SEC ID nº 11. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 13 ó a la secuencia SEC ID nº 15, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 9 ó a la secuencia SEC ID nº 11.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 14 ó a la secuencia SEC ID nº 16. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 14 ó a la secuencia SEC ID nº 16. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 10 ó a la secuencia SEC ID nº 12. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID nº 10 ó a la secuencia SEC ID nº 12.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 99. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 100 ó a la secuencia SEC ID nº 215. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 101 ó a la secuencia SEC ID nº 235. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a
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la secuencia SEC ID nº 100, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 101. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 215, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº
235.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 112. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 112. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 113 ó a la secuencia SEC ID nº 216. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 113 ó a la secuencia SEC ID nº 216. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 114 ó a la secuencia SEC ID nº 236. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 114 ó a la secuencia SEC ID nº
236.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 7, SEC ID nº 179, SEC ID nº 183, SEC ID nº 187, SEC ID nº 191, SEC ID nº 195, SEC ID nº 199, SEC ID nº 203 y SEC ID nº 207. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 177, SEC ID nº 181, SEC ID nº 185, SEC ID nº 189, SEC ID nº 193, SEC ID nº 197, SEC ID nº 201 y SEC ID nº 205. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 7, SEC ID nº 179, SEC ID nº 183, SEC ID nº 187, SEC ID nº 191, SEC ID nº 195, SEC ID nº 199, SEC ID nº 203 y SEC ID nº 207 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 177, SEC ID nº 181, SEC ID nº 185, SEC ID nº 189, SEC ID nº 193, SEC ID nº 197, SEC ID nº 201 y SEC ID nº 205.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 8, SEC ID nº 180, SEC ID nº 184, SEC ID nº 188, SEC ID nº 192, SEC ID nº 196, SEC ID nº 200, SEC ID nº 204 y SEC ID nº 208. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 8, SEC ID nº 180, SEC ID nº 184, SEC ID nº 188, SEC ID nº 192, SEC ID nº 196, SEC ID nº 200, SEC ID nº 204 y SEC ID nº
208. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 178, SEC ID nº 182, SEC ID nº 186, SEC ID nº 190, SEC ID nº 194, SEC ID nº 198, SEC ID nº 202 y SEC ID nº 206. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 178, SEC ID nº 182, SEC ID nº 186, SEC ID nº 190, SEC ID nº 194, SEC ID nº 198, SEC ID nº 202 y SEC ID nº 206.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 239, SEC ID nº 241 y SEC ID nº 243. En otra realización, el conjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 245, SEC ID nº 247 y SEC ID nº
249. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 239, SEC ID nº 241 y SEC ID nº 243, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 245, SEC ID nº 247 y SEC ID nº 249.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una
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secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 240, SEC ID nº 242 y SEC ID nº 244. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 240, SEC ID nº 242 y SEC ID nº 244. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 246, SEC ID nº 248 y SEC ID nº 250. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 246, SEC ID nº 248 y SEC ID nº 250. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 21, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 31, SEC ID nº 35, SEC ID nº 39, SEC ID nº 43, SEC ID nº 47, SEC ID nº 51, SEC ID nº 69, SEC ID nº 73, SEC ID nº 77, SEC ID nº 81, SEC ID nº 85, SEC ID nº 89, SEC ID nº 93, SEC ID nº 123, SEC ID nº 127, SEC ID nº 131, SEC ID nº 135, SEC ID nº 139, SEC ID nº 143, SEC ID nº 147, SEC ID nº 151, SEC ID nº 155, SEC ID nº 159, SEC ID nº 163, SEC ID nº 167, SEC ID nº 171 y SEC ID nº 175. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 23, SEC ID nº 29, SEC ID nº 33, SEC ID nº 37, SEC ID nº 41, SEC ID nº 45, SEC ID nº 49, SEC ID nº 67, SEC ID nº 71, SEC ID nº 75, SEC ID nº 79, SEC ID nº 83, SEC ID nº 87, SEC ID nº 91, SEC ID nº 121, SEC ID nº 125, SEC ID nº 129, SEC ID nº 133, SEC ID nº 137, SEC ID nº 141, SEC ID nº 145, SEC ID nº 149, SEC ID nº 153, SEC ID nº 157, SEC ID nº 161, SEC ID nº 165, SEC ID nº 169 y SEC ID nº 173. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 21, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 31, SEC ID nº 35, SEC ID nº 39, SEC ID nº 43, SEC ID nº 47, SEC ID nº 51, SEC ID nº 69, SEC ID nº 73, SEC ID nº 77, SEC ID nº 81, SEC ID nº 85, SEC ID nº 89, SEC ID nº 93, SEC ID nº 123, SEC ID nº 127, SEC ID nº 131, SEC ID nº 135, SEC ID nº 139, SEC ID nº 143, SEC ID nº 147, SEC ID nº 151, SEC ID nº 155, SEC ID nº 159, SEC ID nº 163, SEC ID nº 167, SEC ID nº 171 y SEC ID nº 175, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 23, SEC ID nº 29, SEC ID nº 33, SEC ID nº 37, SEC ID nº 41, SEC ID nº 45, SEC ID nº 49, SEC ID nº 67, SEC ID nº 71, SEC ID nº 75, SEC ID nº 79, SEC ID nº 83, SEC ID nº 87, SEC ID nº 91, SEC ID nº 121, SEC ID nº 125, SEC ID nº 129, SEC ID nº 133, SEC ID nº 137, SEC ID nº 141, SEC ID nº 145, SEC ID nº 149, SEC ID nº 153, SEC ID nº 157, SEC ID nº 161, SEC ID nº 165, SEC ID nº 169 y SEC ID nº 173.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 22, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 40, SEC ID nº 44, SEC ID nº 48, SEC ID nº 52, SEC ID nº 70, SEC ID nº 74, SEC ID nº 78, SEC ID nº 82, SEC ID nº 86, SEC ID nº 90, SEC ID nº 94, SEC ID nº 124, SEC ID nº 128, SEC ID nº 132, SEC ID nº 136, SEC ID nº 140, SEC ID nº 144, SEC ID nº 148, SEC ID nº 152, SEC ID nº 156, SEC ID nº 160, SEC ID nº 164, SEC ID nº 168, SEC ID nº 172 y SEC ID nº 176. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 22, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 40, SEC ID nº 44, SEC ID nº 48, SEC ID nº 52, SEC ID nº 70, SEC ID nº 74, SEC ID nº 78, SEC ID nº 82, SEC ID nº 86, SEC ID nº 90, SEC ID nº 94, SEC ID nº 124, SEC ID nº 128, SEC ID nº 132, SEC ID nº 136, SEC ID nº 140, SEC ID nº 144, SEC ID nº 148, SEC ID nº 152, SEC ID nº 156, SEC ID nº 160, SEC ID nº 164, SEC ID nº 168, SEC ID nº 172 y SEC ID nº 176. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 30, SEC ID nº 34, SEC ID nº 38, SEC ID nº 42, SEC ID nº 46, SEC ID nº 50, SEC ID nº 68, SEC ID nº 72, SEC ID nº 76, SEC ID nº 80, SEC ID nº 84, SEC ID nº 88, SEC ID nº 92, SEC ID nº 122, SEC ID nº 126, SEC ID nº 130, SEC ID nº 134, SEC ID nº 138, SEC ID nº 142, SEC ID nº 146, SEC ID nº 150, SEC ID nº 154, SEC ID nº 158, SEC ID nº 162, SEC ID nº 166, SEC ID nº 170 y SEC ID nº 174. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 30, SEC ID nº 34, SEC ID nº 38, SEC ID nº 42, SEC ID nº 46, SEC ID nº 50, SEC ID nº 68, SEC ID nº 72, SEC ID nº 76, SEC ID nº 80, SEC ID nº 84, SEC ID nº 88, SEC ID nº 92, SEC ID nº 122, SEC ID nº 126, SEC ID nº 130, SEC ID nº 134, SEC ID nº 138, SEC ID nº 142, SEC ID nº 146, SEC ID nº 150, SEC ID nº 154, SEC ID nº 158, SEC ID nº 162, SEC ID nº 166, SEC ID nº 170 y SEC ID nº 174.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 209, SEC ID nº 211, SEC ID nº 213, SEC ID nº 217, SEC ID nº 219, SEC ID nº 221, SEC ID nº 223, SEC ID nº 225 y SEC ID nº 227. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia
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polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 229, SEC ID nº 231, SEC ID nº 233 y SEC ID nº 237. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 211, SEC ID nº 219 y SEC ID nº 221, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 231. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 209, SEC ID nº 223, SEC ID nº 225 y SEC ID nº 227, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 229. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 213, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 233. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 217, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 237.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 210, SEC ID nº 212, SEC ID nº 214, SEC ID nº 218, SEC ID nº 220, SEC ID nº 222, SEC ID nº 224, SEC ID nº 226 y SEC ID nº 228. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 210, SEC ID nº 212, SEC ID nº 214, SEC ID nº 218, SEC ID nº 220, SEC ID nº 222, SEC ID nº 224, SEC ID nº 226 y SEC ID nº 228. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 230, SEC ID nº 232, SEC ID nº 234 y SEC ID nº 238. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 230, SEC ID nº 232, SEC ID nº 234 y SEC ID nº 238.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 257 ó a la secuencia SEC ID nº 261. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 259 ó a la secuencia SEC ID nº 271. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 257 ó a la secuencia SEC ID nº 261, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 259 ó a la secuencia SEC ID nº 271.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 258 ó a la secuencia SEC ID nº 262. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 258 ó a la secuencia SEC ID nº 262. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 260 ó a la secuencia SEC ID nº 272. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID nº 260 ó a la secuencia SEC ID nº 272.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 251 ó a la secuencia SEC ID nº 255. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 253 ó a la secuencia SEC ID nº 265. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 251 ó a la secuencia SEC ID nº 255, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 253 ó a la secuencia SEC ID nº 265.
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En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 252 ó a la secuencia SEC ID nº 256. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 252 ó a la secuencia SEC ID nº 256. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 254 ó a la secuencia SEC ID nº 266. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID nº 254 ó a la secuencia SEC ID nº 266.
En otra realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción efectora, en el que la fracción efectora es una citoquina. En una realización específica, la fracción efectora es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), interferón-α (INF-α), interleuquina-12 (IL-12), interleuquina-8 (IL-8), proteína inflamatoria de macrófagos 1α (MIP-1α), proteína inflamatoria de macrófagos 1β (MIP-1β) y factor β de crecimiento transformante (TGF-β). En otra realización, por lo menos una fracción de unión a antígeno es específico de uno de los determinantes antigénicos siguientes: el dominio extra B de la fibronectina (EDB), el dominio A1 de la tenascina (TNC-A1), el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2), la proteína activada por fibroblastos (FAP) y el proteoglicano condroitín sulfato del melanoma (MCSP).
En otra realización, el inmunoconjugado descrito en la presente memoria se une a un receptor de fracción efectora que presenta una constante de disociación (KD) que es por lo menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 veces mayor que para una fracción efectora de control. En otra realización, el inmunoconjugado inhibe un incremento del volumen tumoral in vivo en por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más al final del periodo de administración. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% al administrarse en un mamífero que necesita del mismo, respecto a una fracción efectora de control o una fración efectora en una molécula de inmunoconjugado “diacuerpo”.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados codificantes de inmunoconjugados descritos en la presente memoria o fragmentos de los mismos. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende un casete de expresión que comprende las secuencias polinucleótidas descritas en la presente memoria.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a células huésped que expresan los inmunoconjugados descritos en la presene memoria o fragmentos de los mismos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para producir los inmunoconjugados descritos en al presente memoria o fragmentos de los mismos, en donde el método comprende cultivar células huésped transformadas con vectores de expresión codificantes de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria o fragmentos de los mismos bajo condiciones adecuadas para la expresión de los mismos. Otro aspecto de la presente invención se refiere a la estimulación de la proliferación y la diferenciación en un linfocito T activado, que comprenden poner en contacto un linfocito T activado con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la estimulación de la proliferación y la diferenciación en un linfocito B activado, que comprende poner en contacto un linfocito B activado con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria.
Otro aspecto de la invención se refiere a la estimulación de la proliferación y la diferenciación en una célula asesina natural (NK), que comprende poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria.
Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para estimular la proliferación y la diferenciación en un granulocito, un monocito o una célula dendrítica, que comprende poner en contacto un granulocito, un monocito o una célula dendrítica con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria. Otro aspecto de la invención se refiere a la estimulación de la diferenciación de los linfocitos T citotóxicos (LTC), que comprende poner en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria.
Otro aspecto de la invención se refiere a la inhibición de la replicación vírica, que comprende poner en contacto una célula infectada por virus con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria.
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Otro aspecto de la invención se refiere a la regulación positiva de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad 1 (CMH 1), que comprenden poner en contacto una célula diana con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a la inducción de la muerte celular, que comprende administrar en una célula diana una cantidad eficaz de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria. Otro aspecto de la invención se refiere a la inducción de quimiotaxis en una célula diana, que comprende administrar en una célula diana una cantidad eficaz del inmunoconjugado descrito en la presente memoria.
Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende las etapas de administrar en un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende el inmunoconjugado descrito en la presente memoria y un portador farmacéutico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS
FIGURA 1. Vista general esquemática de los diversos formatos de fusión de inmunoconjugados. Todos los constructos en la FIGURA 1 comprenden dos fragmentos scFv de anticuerpo (en la misma fracción de unión a antígeno) y una o dos moléculas de citoquina (como las fracciones efectoras) conectadas a ellos. Los paneles A a E muestran diferentes conectividades y estequiometrías de las fracciones de unión a antígeno y grupos efectores. El panel A) ilustra una fusión “diacuerpo” de IL-2. El “diacuerpo” ensambla no covalentemente dos cadenas polipeptídicas idénticas. El panel B muestra un inmunoconjugado que comprende una cadena pesada de una molécula Fab fusionada en su extremo carboxi-terminal con una citoquina que, a su vez, se fusiona en su extremo carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab. Se coexpresa una cadena ligera con el polipéptido cadena pesada de Fab-citoquina-cadena pesada de Fab para formar el inmunoconjugado. Alternativamente, las dos cadenas ligeras pueden fusionarse con la citoquina, y coexpresarse las cadenas pesadas. En el panel C, las dos cadenas pesadas de Fab se fusionan directamente entre sí. La citoquina comparte un enlace peptídico aminoterminal con la cadena pesada de la segunda fracción de unión a antígeno. Los dos formatos moleculares de los paneles B y C pueden modificarse de manera que la cadena de Fab se sustituya por un fragmento scFv, tal como en los paneles D y E. FIGURA 2. Vista general esquemática de inmunoconjugados adicionales que comprenden dos grupos de unión a antígeno y por lo menos uno o más grupos efectores. El panel A muestra una molécula Fab fusionada mediante su extremo carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgG. Con el fin de conseguir la homodimerización de la fracción de unión covalente a antígeno, puede introducirse un enlace disulfuro artificial en el extremo carboxi-terminal del dominio CH3 de IgG (inmunoconjugado a la derecha dentro del panel A). El dominio CH3 de IgG1 mostrado en el panel A puede sustituirse por un dominio CH4 de IgE. Los grupos Fab en el panel A se sustituyen por fragmentos scFv en el panel B. Para el inmunoconjugado del panel C, se fusionó la bisagra natural de IgG C-terminalmente con las moléculas Fab. Debido a que la región carboxi-terminal de la bisagra podría imponer algunas restricciones geométricas al ensamblaje de los dominios constantes que se encuentran fusionados C-terminalmente con la región bisagra de IgG, puede introducirse un línker artifical entre la región carboxi-terminal de la bisagra y el extremo amino-terminal del dominio CH3 de IgG. La región bisagra también puede introducirse entre un fragmento scFv y un dominio constante de inmunoglobulina, tal como se muestra en el panel D. En los paneles A a D, se utiliza un dominio CH3 de IgG1 o CH4 de IgE para homodimerizar los constructos. El panel E ilustra un inmunoconjugado en el que se consigue la dimerización mediante una interacción de heterodimerización CH1/Ckappa. El inmunoconjugado del panel D puede presentar una o dos citoquinas en cada inmunoconjugado. La FIGURA 3 presenta los resultados de un experimento de eficacia con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de interleuquina 2 diferentes específicos del estroma tumoral. Se inyectó subcutáneamente teratocarcinoma F9 en ratones 129SvEv y se midió el tamaño tumoral utilizando un calibrador. Se comparó la molécula “diacuerpo-IL-2 a dos concentraciones diferentes con el inmunoconjugado Fab-interleuquina-2-Fab (Fab-IL2-Fab), en donde las concentraciones reflejan un número similar de moléculas de inmunoconjugado. El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab se denomina “Fab-L19”, el control de interleuquina-2 no conjugado se denomina “rIL2 no conj.”, la molécula de “diacuerpo”-IL-2 se denomina “diacuerpo” en la FIGURA 3. Se utilizó el anticuerpo L19, dirigido contra el dominio extra B de la fibronectina (EDB), para generar las fracciones de unión a antígeno en los inmunoconjugados tanto de diacuerpo como Fab-L19. La cantidad de inmunoconjugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura. La FIGURA 4 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de interleuquina-2 diferentes específicos del estroma tumoral. Se inyectó intraesplénicamene la línea celular de tumor gástrico humano LS174T en ratones SCID-beige. El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab se denomina “Fab-L19”, el control de interleuquina-2 no conjugada se denomina “rIL-2 no conj.”, la molécula de “diacuerpo”-IL-2 se denomina “diacuerpo” en la FIGURA 4. Se utilizó el anticuerpo anti-EDB, L19, para generar las fracciones de unión a antígeno en los inmunoconjugados tanto de diacuerpo como Fab-L19. La cantidad de inmunoconjugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconjugado. La FIGURA 5 muestra las imágenes inmunohistoquímicas de tejido uterino humano a magnificaciones de 100X y 400X. La región variable 2B10 generada mediante los métodos descritos en el Ejemplo 3 se une al dominio A2 de la tenascina humana (TNC-A2). La región variable 2B10 en un fragmento Fab se ufisonó con un fragmento FLAG (SHD2B10-FLAG). Se prepararon muestras de tejido uterino humano sano y canceroso para la tinción
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inmunohistoquímica. A continuación, las muestras se incubaron con el fragmento Fab SHD2B10-FLAG. A continuación, las muestras se lavaron y se incubaron con un anticuerpo fluorescente específico para el epítopo FLAG. Las muestras de tejido canceroso mostraban niveles de expresión más altos de TNC-A2 que las muestras de tejido sano. La FIGURA 6 muestra los niveles de expresión de TNC-A2 en diversas muestras de tejido humano en términos de % de área superficial inmunofluorescente. Se incubaron diversas muestras de tejido humano procedentes de individuos sanos y de pacientes de cáncer con fragmento Fab SHD2B10-FLAG tal como se describe en la FIGURA 5. La FIGURA 7 muestra los niveles de expresión de proteína activada por fibroblastos (FAP) en diversas muestras de tejido humano en términos de % de área superficial inmunofluorescente. Se incubaron diversas muestras de tejido humano procedentes de individuos sanos y de pacientes de cáncer con un anticuerpo comercial contra FAP (Abcam). La parte superior de cada columna en el gráfico representa la expresión tumoral de FAP, mientras que la parte inferior de cada columna en el gráfico representa la expresión normal de FAP. La FIGURA 8 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de un anticuerpo de IgG conocido, L19, para EDB. La FIGURA 9 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de un inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab específico para EDB. Los fragmentos Fab en el inmunoconjugado se derivaron del anticuerpo L19. La FIGURA 10 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de una proteína de fusión “diacuerpo”-IL2 específica para EDB. El fragmento scFv de diacuerpo se derivó a partir del anticuerpo L19. La proteína de fusión “diacuerpo”-IL2 incluye un línker de 8 aminoácidos situada entre el fragmento scFv y la molécula de IL-2. La FIGURA 11 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de una proteína de fusión “diacuerpo”-IL2 específica para EDB. El fragmento scFv de diacuerpo se derivó a partir del anticuerpo L19. La proteína de fusión "diacuerpo"-IL2 incluye un conector de 12 aminoácidos entre el fragmento scFv y la molécula de IL-2. La figura 12 presenta los datos del BIACORE que muestran la afinidad de un anticuerpo IgG conocido, F16, para el dominio A1 de tenascina inmovilizado (TNC-A1). La FIGURA 12 también presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de un fragmento Fab del anticuerpo F16 para TNC-A1. Se indican en la figura las constantes de disociación (KD) calculadas para las moléculas IgG F16 y Fab . La FIGURA 13 presenta los datos de BIACORE que muestran la afinidad de IL-2 para el receptor de IL-2 inmovilizado. Se consiguió heterodimerizar las cadenas β y γ de IL-2R mediante la fusión de las cadenas respectivas con las variantes “botón en ojal” de la parte Fc de una IgG1 humana, tal como se describe en Merchant A.M. et al., Nat. Biotech. 16:677-681, 1998. Los valores de KD calculados a partir de los datos de BIACORE se indican en la figura. La FIGURA 14 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de una proteína de fusión “diacuerpo”-IL-2 para TNC-A1 y el receptor de IL-2. La molécula de scFv en el diacuerpo se deriva del anticuerpo F16. Los valores de KD calculados a partir de los datos de BIACORE se indican en la figura. La FIGURA 15 presenta los datos de BIACORE, que muestran la afinidad de un inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab para TNC-A1 y el receptor de IL-2. Las moléculas Fab en el inmunoconjugado se derivaron del anticuerpo F16. Los valores de KD calculados a partir de los datos de BIACORE se indican en la figura. La FIGURA 16 presenta los datos de BIACORE que muestran la afinidad de un inmunoconjugado scFv-IL-2-scFv para TNC-A1 y el receptor de IL-2. Las moléculas de scFv en el inmunoconjugado se derivaron a partir del anticuerpo F16. Los valores de KD calculados a partir de los datos de BIACORE se indican en la figura. La FIGURA 17 es una tabla resumen de los valores de KD obtenidos de los estudios BIACORE presentados en las figuras 12 a 16. La FIGURA 18 presenta los resultados de un experimento de eficacia que compara la molécula de “diacuerpo”-IL-2 con diana en el dominio EDB de la fibronectina con el inmunoconjugado Fab-interleuquina-2-Fab (denominado “Fab-SH2B10”, que comprende las regiones variables de cadenas pesada y ligera de secuencias SEC ID nº 3 y 7, respectivamente) con diana en el dominio A2 de la tenascina C. El control de interleuquina-2 no conjugada se denomina “rIL-2 no conj.”, la molécula de “diacuerpo”-IL-2 se denomina “diacuerpo L12” en la FIGURA 18. Se utilizó el anticuerpo anti-EDB, L19, para generar la fracción de unión a antígeno en el inmunoconjugado de diacuerpo. Se inyectó subcutáneamente la línea celular de teratocarcinoma F9 en ratones inmunocompetentes de la cepa 129. La cantidad de inmunoconjugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura. El tratamiento se inició el día 6 y se realizaron 5 inyecciones en total hasta el día 11 del experimento. La FIGURA 19 muestra la inducción de la proliferación de las células NK-92 por parte de los inmunoconjugados anti-FAP, anti-tenascina C y Fab-IL2-Fab (generados utilizando las secuencias de VH y de VL de los constructos 3F2, 3D9, 4B3 (anti-FAP), 2F11 y 2B10 (anti-tenascina C)) en comparación con la IL-2 humana no conjugada. Se midió la proliferación celular utilizando el sistema CellTiter Glo tras dos días de incubación. La FIGURA 20 presenta los resultados de un ensayo ELISA que mide la inducción de la producción de IFN-γ por parte de diversos inmunoconjugados que contienen interleuquina-12 en comparación con citoquinas no conjugadas,
o con inmunoconjugados que contienen los dominios p35 y p40 de IL-12 en moléculas separadas. El panel A muestra los resultados en placas recubiertas de fibronectina. El panel B muestra los resultados en solución. La FIGURA 21 muestran los análisis cinéticos basados en resonancia de plasmón superficial (SPR) de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan conjuntos de datos cinéticos procesados para la unión del clon 19G1 a FAP (A) humano (hu) y a FAP (B) murino (mu), para la unión del clon 20G8 a FAP hu (C), a FAP mu (D) y de unión del clon 4B9 a FAP hu (E) y a FAP mu (F). Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
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La FIGURA 22 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan conjuntos de datos cinéticos procesados para la unión del clon 5B8 a FAP hu (A) y a FAP mu (B), para la unión del clon 5F1 a FAP hu (C), a FAP mu (D) y para la unión del clon 14B3 a FAP hu (E) y a FAP mu (F). Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 23 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan datos cinéticos procesados para la unión del clon 16F1 a FAP hu (A) y a FAP mu (B), de unión del clon 16F8 a FAP hu (C), a FAP mu (D) y de unión del clon O3C9 a FAP hu (E) y a FAP mu (F). Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 24 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan datos cinéticos procesados para la unión del clon O2D7 a FAP hu (A) y a FAP mu (B), de la unión del clon 28H1 a FAP hu (C), a FAP mu (D), a FAP cyno (E) y para la unión del clon 22A3 a FAP hu (F), a FAP mu (G) y a FAP de Cynomolgus (cyno) (H). Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 25 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan datos cinéticos procesados para la unión del clon 29B11 a FAP hu (A), a FAP mu (B), a FAP cyno (C) y para la unión del clon 23C10 a FAP hu (D), a FAP mu (E) y a FAP cyno (F). Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 26 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-TNC A2 de afinidad madura que se unen a TNC A2 humana (hu). Se presentan datos cinéticos procesados para los clones 2B10_C3B6 (A), 2B10_6A12 (B), 2B10_C3A6 (C), 2B10_O7D8 (D), 2B10_O1F7 (E) y 2B10_6H10 (F). Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 27 proporciona una vista general de las tres etapas de purificación llevadas a cabo para la purificación de Fab-IL2-Fab basado en 3F2. La FIGURA 28 muestra los resultados de la purificación de Fab-IL2-Fab (A y B) basada en 3F2 y los resultados de la purificación de Fab-IL2-Fab (C y D) basada en 4G8. (A, C) SDS-PAGE Bis-Tris al 4-12% y Tris-acetato al 3-8% de fracciones del procedimiento de purificación y del producto final. (B, D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño tras las tres etapas de purificación aplicadas. La FIGURA 29 muestra los resultados de la purificación del inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10. (A) SDS-PAGE Bis-Tris al 4-12% de fracciones del procedimiento de purificación y del producto final. B) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño tras las tres etapas de purificación aplicadas. La FIGURA 30 muestra la evaluación de estabilidad del Fab-IL2-Fab basado en L19 anti-EDB de fibronectina. Se formuló Fab-IL2-Fab L19 en HCl de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 a una concentración de 6,3 mg/ml y se almacenó durante 4 semanas a temperatura ambiente y a 4ºC. Se analizaron muestras cada semana para: (A) la concentración, mediante espectroscopía de UV (tras la centrifugación para peletizar cualquier material potencialmente precipitado), y (B) contenido agregado mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaños. La FIGURA 31 muestra los análisis cinéticos basados en SPR de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 3F2 con diana en FAP para FAP de Cynomolgus (cyno) y receptor β/γ de IL-2 humana (IL2R bg) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 32 muestra análisis cinéticos basados en SPR de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 4G8 con diana en FAP para FAP humana, murina y de Cynomolgus (cyno) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 33 muestra los análisis cinéticos basados en SPR de constructos Fab-IL2-Fab 4G8 con diana en FAP para las cadenas β/γ and α del receptor de IL-2 humano y murino, según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de reacción de dos estados. La FIGURA 34 muestra los análisis cinéticos basados en SPR de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 3D9 con diana en FAP para FAP humana, murina y de Cynomolgus (cyno) y receptor β/γ de IL-2 humana (IL2R bg) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 35 muestra análisis cinéticos basados en SPR de constructos Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 para las proteínas de fusión TNC A2 quiméricas humanas, murinas y de Cynomolgus (cyno) y receptor β/γ de IL-2 humana (IL2R bg) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 36 ilustra la eficacia de los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab IL-2 dirigidos que reconocen TNC A2 (2B10)
o FAP (3F2 y 4G8) en la inducción de la proliferación de las células NK92 en comparación con IL-2 (proleuquina) y con el diacuerpo L19 que reconoce la EDB de la fibronectina. El eje x se normaliza respecto al número de moléculas de IL-2, debido a que el diacuerpo presenta dos fracciones efectoras de IL-2, mientras que los constructos Fab-IL2-Fab contienen únicamente una fracción efectora IL-2. Se midió la proliferación celular utilizando el sistema CellTiter Glo tras dos días de incubación. La FIGURA 37 muestra la inducción de la fosforilación de STAT5 como consecuencia de la señalización del receptor de IL-2 mediada por IL-2 tras la incubación con un inmunoconjugado Fab-IL2-Fab de IL-2 basado en 4G8 con diana en FAB que reconoce FAP en diferentes poblaciones de células efectoras, incluyendo: (A) células NK CD56+, (B) células T ayudante CD4+CD25-CD127+, (C) células T citotóxicas CD3+, CD8+, y (D) células T reguladoras CD4+CD25+FOXP3+ (Treg) procedentes de PBMC humanas en solución.
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La FIGURA 38 ilustra la eficacia de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab de IL-2 dirigidos que reconocen TNC A1 (2F11), TNC A2 (2B10) o FAP (3F2, 4B3 y 3D9) en la inducción de la liberación de IFN-gamma y la proliferación de células NK92 en comparación con IL-2, en el caso de que los inmunoconjugados se encuentren presentes en solución o inmovilizados mediante FAP o TNC A2 recubierto sobre placas de microtitulación. La FIGURA 39 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de IL-2 específicos para el estroma tumoral. Se inyectó intraesplénicamente en ratones SCID la línea celular de tumor de colon humano LS174T. El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 se denomina “SH2B10”, el control de IL-2 no conjugado se denomina “proleuquina”, la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina se denoina “diacuerpo”. La cantidad de inmunoconjugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconjugado. La FIGURA 40 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de IL-2 específicos para el estroma tumoral. Se inyectó intrarrenalmente en ratones SCID la línea celular renal humana ACHN. Los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP se denominan “FAP3F2” y “FAP-4G8”, el control de IL-2 no conjugado se denomina “proleuquina”, la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina se denomina “diacuerpo”. La cantidad de inmunoconjugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconjugado. La FIGURA 41 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de IL-2 específicos para el estroma tumoral. Se inyectó i.v. en ratones SCID la línea celular de NSCLC humana A549. El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 se denomina “2B10”, la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina se denomina “diacuerpo”. La cantidad de inmunoconjugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconjugado. La FIGURA 42 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab con L19 (ligante del ectodominio B de fibronectina) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab purificado. La FIGURA 43 presenta los resultados de un ensayo de proliferación dependiente de GM-CSF que compara el efecto de GM-CSF y el inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab con L19 (ligante del ectodominio B de la fibronectina) como Fab sobre células TF-1. La FIGURA 44 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab con 4G8 (ligante de FAP) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado. La FIGURA 45 presenta los resultados de un ensayo de la liberación de IFN-gamma inducida por IL-12, comparando el efecto de IL-12 y el inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado con 4G8 (ligante de FAP) como Fab, utilizando las PBMC aisladas a partir de sangre humana fresca procedente de un donante sano. La FIGURA 46 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconjugado Fab-IFNα2-Fab con L19 (ligante del ectodominio B de la fibronectina) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconjugado Fab-IFNα2-Fab purificado. La FIGURA 47 presenta los resultados de un ensayo que analizar la inhibición de la proliferación inducida por IFN-α de (A) células T Jurkat y
(B) células tumorales A549, comparando el efecto de IFN-α (Roferon A, Roche) y el inmunoconjugado purificado Fab-IFNα2-Fab con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina) como Fab. La FIGURA 48 muestra (A) los perfiles de elución de la purificación del Fab-IL2-Fab basado en MHLG con diana en MCSP, y (B) los resultados de la caracterización analítica del mismo Fab-IL2-Fab mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen, tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido). La FIGURA 49 muestra (A) los perfiles de elución de la purificación del Fab-IL2-Fab basado en MHLG con diana en PCSM, y (B) los resultados de la caracterización analítica del mismo Fab-IL2-Fab mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen, tampón de migración MOPS, reducido y no reducido). La FIGURA 50 presenta los resultados de un ensayo de la liberación de IFN-γ inducida por IL-2 comparando el efecto del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado con 4G8 (ligante de FAP) como Fab, y el inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado con MHLG KV9 (ligante de MCSP) como Fab, utilizando células NK92 privadas de IL-2. La FIGURA 51 presenta los resultados de un ensayo de la liberación de IFN-γ inducida por IL-2 comparando el efecto del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado con 4G8 (ligante de FAP) como Fab, y el inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado con MHLG KV9 (ligante de PCSM) como Fab, utilizando células NK92 privadas de IL-2. La FIGURA 52 muestar la unión del inmunoconjugado Fab-IL2-Fab MHLG1 KV9 con diana en PCSM a células Colo38, determinada mediante citometría de flujo. El anticuerpo secundario solo o células solas se muestran como controles negativos. La FIGURA 53 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con 2B10 (ligante de TNC A2) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 purificado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria de manera general presentan el mismo significado entendido comúnmente por el experto ordinario en la materia.
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Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos e hibridación descritos posteriormente son aquellos bien conocidos y utilizados comúnmente en la técnica. Las técnicas y procedimientos estándares se llevan a cabo generalmente según métodos convencionales de la técnica y diversas referencias generales (ver de manera general Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que se proporcionan durante la totalidad del presente documento.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “inmunoconjugado” se refiere a una molécula de polipéptido que incluye por lo menos una fracción efectora y por lo menos una fracción de unión a antígeno. En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción efector de cadena sencilla y por lo menos dos fracciones de unión a antígeno. La molécula de unión a antígeno puede unirse al grupo efecto mediante una diversidad de interacciones en una diversidad de configuraciones tal como se describe en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fracción efectora” se refiere a un polipéptido, por ejemplo una proteína o glucoproteína, que influye sobre la actividad celular, por ejemplo mediante transducción de señales u otras rutas celulares. Por consiguiente, la fracción efectora puede asociarse a la señalización mediada por receptores que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta en una célula que porta uno o más receptores de la fracción efectora. En una realización, un grupo efecto puede inducir una respuesta citotóxica en células que portan uno o más receptores dla fracción efectora. En otra realización, una fracción efectora puede inducir una respuesta proliferativa en células que portan uno o más receptores dla fracción efectora. En otra realización, un grupo efecto puede inducir la diferenciación en células que portan receptores dla fracción efectora. En otra realización, una fracción efectora puede alterar la expresión (es decir, regular positiva o negativamente) de una proteína celular endógena en células que portan receptores de la fracción efectora. Entre los ejemplos no limitativos de grupos efectores se incluyen citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. La fracción efectora puede asociarse a una fracción de unión a antígeno en una diversidad de configuraciones para formar un inmunoconjugado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “citoquina” se refiere a una molécula que media y/o regula una función o proceso biológico o celular (por ejemplo la inmunidad, la inflamación y la hematopoyesis). El término “citoquina” tal como se utiliza en la presente memoria incluye “linfoquinas”, “quimoquinas”, “monoquinas” e “interleuquinas”. Entre los ejemplos de citoquinas útiles se incluyen, aunque sin limitación, GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α y TNF-β.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "de cadena sencilla" se refiere a una molécula que comprende monómeros aminoácidos conectados linealmente mediante enlaces peptídicos. En una realización, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla. Entre los ejemplos no limitativos de grupos efectores de cadena sencilla se incluyen citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. En el caso de que la fracción efectora sea una citoquina y la citoquina de interés se encuentre normalmente en forma de multímero en la naturaleza, cada subunidad de la citoquina multimérica se encuentra secuencialmente codificada por la cadena única dla fracción efectora. De acuerdo con lo anterior, entre los ejemplos de fracciones efectoras de cadena sencilla útiles se incluyen FEC-GM, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFNβ, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α y TNF-β.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fracción efectora de control” se refiere a una fracción efectora no conjugada. Por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado de IL-2 descrito en la presente memoria con una fracción efectora de control, la fracción efectora de control es IL-2 no conjugada libre. De manera similar, por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado de IL-2 descrito en la presente memoria con una fracción efectora de control, ésta es IL-2 no conjugado libre (por ejemplo presente como proteína heterodimérica en la que las subunidades p40 y p35 comparten únicamente uno o más enlaces disulfuro).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “receptor de fracción efectora” se refiere a una molécula de polipéptido capaz de unirse específicamente a una fracción efectora. Por ejemplo, en el caso de que IL-2 sea la fracción efectora, el receptor dla fracción efectora que se une a una IL-2 (por ejemplo un inmunoconjugado que comprenda IL-2) es el receptor de IL-2. De manera similar, por ejemplo, en el caso de que IL-12 sea la fracción efectora de un inmunoconjugado, el receptor de la fracción efectora es el receptor de IL-12. En el caso de que una fracción efectora se una específicamente a más de un receptor, todos los receptores que se unen específicamente a la fracción efectora son “receptores de fracción efectora” para dicha fracción efectora.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fracción de unión a antígeno” se refiere a una molécula de polipéptido que se une específicamente a un determinante antigénico. En una realización, una fracción de unión a antígeno es capaz de dirigir la entidad a la que se encuentra unida (por ejemplo una fracción efectora o una segundo fracción de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. Entre las fracciones de unión a antígeno se incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, tal como se define adicionalmente en la presente memoria. La expresión “se une específicamente” se refiere a que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas. En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos un, típicamente dos o más, grupos de
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unión a antígeno con regiones constantes, tal como se define adicionalmente en la presente memoria y es conocido de la técnica. Entre las regiones constantes de cadena pesada que resultan útiles se incluyen cualquiera de los cinco isotipos: α, δ, ε, γ o μ. Entre las regiones constantes de cadena ligera que resultan útiles se incluyen cualquiera de los dos isotipos: κ and X.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “determinante antigénico” es sinónima de “antígeno” y “epítopo”, y se refiere a un sitio (por ejemplo un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida de diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une una fracción de unión a antígeno, formando un complejo de fracción de unión a antígeno-antígeno.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fracción de unión a antígeno de control” se refiere a una fracción de unión a antígeno tal como existiría libre de otras fracciones de unión a antígeno y fracciones efectoras. Por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado Fab-IL2-Fab descrito en la presente memoria con una fracción de unión a antígeno de control, la fracción de unión a antígeno de control es Fab libre, en la que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab y la molécula Fab libre pueden unirse ambas específicamente al mismo determinante antigénico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “primer” y “segundo” con respecto a las fracciones de unión a antígeno, fracciones efectoras, etc., se utilizan por conveniencia para distinguir en qué casos se encuentra presente más de uno de cada tipo de fracción. La utilización de dichas expresiones no pretende proporcionar un orden específico u orientación del inmunoconjugado a menos que ello se indique explícitamente.
En el caso de que existan dos o más definiciones de una expresión que se utilicen y/o se encuentren aceptadas en la técnica, la definición del término utilizada en la presente memoria pretenderá incluir la totalidad de dichos significados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es la utilización de la expresión “región determinante de complementariedad” (“CDR”) para referirse a los sitios de unión a antígeno no contiguos presentes dentro de la región variable de polipéptidos tanto pesados como ligeros. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 1986, y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, en las que las definiciones incluyen residuos aminoácidos solapantes o subconjuntos de residuos aminoácidos al compararlas entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de la misma pretende encontrarse comprendida dentro del alcance de la expresión según se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos aminoácidos apropiados que comprenden las CDRs tal como se definen en cada uan de las referencias citadas se proporcionan a continuación, en la Tabla 1, a modo comparativo. El número exacto de residuos que comprende una CDR particular varía dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. El experto en la materia podrá determinar rutinariamente qué residuos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
TABLA 1. Definiciones de CDR1
CDR
Kabat Chothia AbM2
VH CDR1
31-35 26-32 26-35
VH CDR2
50-65 52-58 50-58
VH CDR3
95-102 95-102 95-102
VL CDR1
24-34 26-32 24-34
VL CDR2
50-56 50-52 50-56
VL CDR3
89-97 91-96 89-97
1La numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 sigue las convenciones de numeración proporcionadas por Kabat et al. (ver posteriormente). 2 “AbM” con una “b” minúscula, tal como se utiliza en la Tabla 1, se refiere a las CDR según la definición del programa informático de modelaje de anticuerpos “AbM” de Oxford Molecular.
Kabat et al. también han definido un sistema de numeración para las secuencias de dominio variable que resulta aplicable a cualquier anticuerpo. El experto ordinario en la materia podrá asignar inequívocamente este sistema de “numeración de Kabat” a cualquier secuencia de dominio variable sin basarse en ningún dato experimental más allá
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de la secuencia misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “numeración de Kabat” se refiere al sistema de numeración proporcionado por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 1983. A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos aminoácidos en una fracción de unión a antígeno descrita en la presente memoria siguen el sistema de numeración de Kabat. Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias (es decir, SEC ID nº 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 96, 97, etc.) no se han numerado según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, se encuentra perfectamente comprendido dentro de los conocimientos del experto ordinario en la materia convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.
Inmunoconjugados
Los inmunoconjugados son moléculas de polipéptido que comprenden por lo menos una fracción efectora y por lo menos una fracción de unión a antígeno. En una realización, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla. En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos dos fracciones de unión a antígeno. Entre las fracciones de unión a antígeno y grupos efectores del inmunoconjugado se incluyen aquellos indicados en detalle en la presente memoria y posteriormente, y en las figuras adjuntas. La fracción de unión a antígeno del inmunoconjugado puede dirigirse contra una diversidad de moléculas diana (por ejemplo un determinante antigénico sobre una molécula de proteína expresada sobre una célula tumoral o estroma tumoral). Se proporcionan en la presente memoria ejemplos no limitativos de grupos de unión a antígeno. En una realización, el grupo o grupos de unión a antígeno se dirigen contra un determinante antigénico de uno o más de los polipéptidos representados en la Tabla 5, posteriormente en la presente memoria. Los inmunoconjugados descritos en la presente memoria típicamente muestran una o más de las propiedades siguientes: elevada especificidad de acción, toxicidad reducida y/o estabilidad mejorada, particularmente en comparación con los inmunoconjugados conocidos de diferentes configuraciones que presentan como diana los mismos determinantes antigénicos y que portan los mismos grupos efectores.
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una primera fracción efectora y por lo menos una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno. En una realización preferente, el primer grupo efector es una fracción efectora de cadena sencilla. En una realización preferente, la primera y la segunda fracciones de unión a antígeno se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste de un Fv y un Fab. En una realización específica, el primer grupo efector comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con una primera fracción de unión a antígeno, y una segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico aminoterminal o carboxi-terminal con: i) el primer grupo efector, o ii) el primer grupo de unión a antígeno. En otra realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente de una primera fracción efectora de cadena sencilla y primera y segunda fracciones de unión a antígeno.
En una realización, una primera fracción efectora comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una primera fracción de unión a antígeno y comparte además un enlace peptídico amino-terminal con una segunda fracción de unión a antígeno. En otra realización, una primera fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxi-temrinal con una primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, y comparte además un enlace peptídico amino-terminal con una segunda fracción de unión a antígeno. En otra realización, una primera fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino-terminal con una primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla y comparte además un péptido carboxiterminal con una segunda fracción de unión a antígeno.
En una realización, una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una primera región variable de cadena pesada, y comparte además un enlace peptídico amino-terminal con una segunda región variable de cadena pesada. En otra realización, una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una primera región variable de cadena ligera y comparte además un péptido amino-terminal con una segunda región variable de cadena ligera. En otra realización, se une una primera región variable de cadena pesada o ligera mediante un enlace peptídico carboxi-terminal a una primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de uan cadena, y se une adicionalmente mediante un enlace peptídico amino-terminal a una segunda región variable de cadena pesada o ligera. En otra realización, se une una primera región variable de cadena pesada o ligera mediante un enlace peptídico amino-terminal a una primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, y se une adicionalmente mediante un enlace peptídico carboxi-terminal a una segunda región variable de cadena pesada o ligera.
En una realización, una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una primera cadena pesada o ligera de un primer Fab y comparte además un enlace peptídico amino-terminal con una cadena pesada o ligera de un segundo Fab. En otra realización, una cadena pesada o ligera de un primer Fab comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una primera fracción efectora de cadena sencilla y comparte además un enlace peptídico amino-terminal con una cadena pesada o ligera de un segundo Fab. En otras realizaciones, una cadena pesada o ligera de un primer Fab comparte un enlace
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peptídico amino-terminal con una primera fracción efectora de cadena sencilla y comparte además un enlace peptídico carboxi-terminal con una cadena pesada o ligera de un segundo Fab.
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una primera fracción efectora que comparte un enlace peptídico amino-terminal con una o más moléculas scFv y en el que la primera fracción efectora comparte además un enlace peptídico carboxi-terminal con una o más moléculas de scFv. En una realización preferente, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla.
En otra realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, y primera y segunda fracciones de unión a antígeno, en las que cada uno de las fracciones de unión a antígeno incluye una molécula scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que incluye un dominio constante de inmunoglobulina, y en las que la primera fracción de unión a antígeno se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de la primera fracción efectora, y en las que la primera y la segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran covalentemente unidas mediante por lo menos un enlace disulfuro. En una realización preferente, la región constante se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste de los dominios CH1 de IgG, CH2 de IgG, CH3 de IgG, Ckappa de IgG, Clambda de IgG y CH4 de IgE. En una realización, el dominio de inmunoglobulina de la primera fracción de unión a antígeno se encuentra covalentemente unido al dominio de inmunoglobulina de la segunda fracción de unión a antígeno mediante un enlace disulfuro. En una realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado carboxi-terminal de los dominios de inmunoglobulina de la primera y segunda fracciones de unión a antígeno. En otra realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado aminoterminal de los dominios de inmunoglobulina de la primera y segunda fracciones de unión a antígeno. En otra realización, por lo menos dos enlaces disulfuro se localizan en el lado amino-terminal de los dominios de inmunoglobulina de la primera y segunda fracciones de unión a antígeno. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende primera y segunda fracciones de unión a antígeno, comprendiendo, cada una, una molécula scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CH1 de IgG, en el que la primera fracción de unión a antígeno se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de la primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran covalentemente unidas mediante por lo menos un enlace disulfuro. La segunda fracción de unión a antígeno del inmunoconjugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de una segunda fracción efectora. En una realización, la segunda fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla.
En una realización específica, el inmunoconjugado comprende primera y segunda fracciones de unión a antígeno, comprendiendo, cada una, una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxiterminal a una región constante que comprende un dominio Ckappa de IgG, en el que la primera fracción de unión a antígeno se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de la primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran unidas covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro. La segunda fracción de unión a antígeno del inmunoconjugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de una segunda fracción efectora. En una realización, la segunda fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla.
En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende primera y segunda fracciones de unión a antígeno, comprendiendo, cada una, una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CH4 de IgE, en el que la primera fracción de unión a antígeno se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de la primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran covalentemente unidas mediante por lo menos un enlace disulfuro. La segunda fracción de unión a antígeno del inmunoconjugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de una segunda fracción efectora. En una realización, la segunda fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla.
En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende primera y segunda fracciones de unión a antígeno, comprendiendo, cada una, una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgE, en el que la primera fracción de unión a antígeno se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de la primera fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran unidas covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro. La segunda fracción de unión a antígeno del inmunoconjugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de una segunda fracción efectora. En una realización, la segunda fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla.
En otra realización, el inmunoconjugado comprende primera y segunda fracciones efectoras, y primer y segunda fracciones de unión a antígeno, en las que cada uno de las fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de Fab unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o ligera a un dominio CH3 de IgG1, y en las que
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cada uno de los dominios CH3 de IgG1 se encuentra unido a su aminoácido carboxi-terminal respectivo en el aminoácido amino-terminal de una de las fracciones efectoras, y en las que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se encuentran covalentemente unidas mediante por lo menos un enlace disulfuro. En una realización preferente, la primera y/o segunda fracciones efectoras es una fracción efectora de cadena sencilla. En una realización adicional, los dominios CH3 de IgG1 de las fracciones de unión a antígeno pueden unirse mediante enlaces disulfuro. En otra realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado carboxi-terminal de los dominios CH3 de IgG1 de la primera y segunda fracciones de unión a antígeno. En otra realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado amino-terminal de los dominios CH3 de IgG1 de la primera y segunda fracciones de unión a antígeno. En otra realización, por lo menos dos enlaces disulfuro se localizan en el lado amino-terminal de los dominios CH3 de IgG1 de la primera y segunda fracciones de unión a antígeno.
En otra realización, el inmunoconjugado comprende uno o más sitios de corte proteolítico localizados entre fracciones efectoras y fracciones de unión a antígeno.
Los componentes del inmunoconjugado (por ejemplo fracciones de unión a antígeno y/o fracciones efectoras) pueden unirse directamente o mediante diversos conectores (por ejemplo conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2 a 10 aminoácidos) que se indican en la presente memoria
o que son conocidos de la técnica. En una realización particular, el inmunoconjugado presenta una estabilidad mejorada en solución, particularmente en comparación con preparaciones de inmunoconjugados conocidas. En una realización, el inmunoconjugado se une a un determinante antigénico con una constante de disociación (KD) que es por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 veces inferior a la de una fracción de unión a antígeno de control. En una realización más específica, el inmunoconjugado se une a un determinante antigénico con una KD que es aproximadamente 10 veces inferior a la de una fracción de unión a antígeno de control. En una realización, el inmunoconjugado se une a un determinante antigénico con una KD que es inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, o inferior a aproximadamente 0,1 nM.
En otra realización, el inmunoconjugado presenta un perfil de seguridad superior en comparación con preparaciones de inmunoconjugado conocidas. El inmunoconjugado preferentemente induce menos efectos secundarios y menos graves, tales como toxicidad, destrucción de células no tumorales, etc. La reducción de los efectos secundarios puede atribuirse a una afinidad de unión reducida de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria para los receptores de fracción efectora. En una realización, el inmunoconjugado se une a un receptor de fracción efectora con una KD que es por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 veces superior a la de una fracción efectora de control. En una realización más específica, el inmunoconjugado se une a un receptor de fracción efectora con una KD que es aproximadamente 2 veces superior a la de una fracción efectora de control. En otra realización, el inmunoconjugado se une a un receptor de fracción efectora con una KD que es aproximadamente 10 veces superior a la de una fracción efectora de control. En otra realización, el inmunoconjugado se une a un receptor de fracción efecxtora con una KD que es por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces superior a la de una fracción efectora correspondiente en una molécula de inmunoconjugado “diacuerpo”. En otra realización, el inmunoconjugado se une a un receptor de fracción efectora con una constante de disociación, KD, que es aproximadamente 10 veces superior a la de una fracción efectora correspondiente en un inmunoconjugado “diacuerpo”.
En otra realización, el inmunoconjugado presenta una eficacia superior, particularmente en comparación con preparaciones de inmunoconjugado conocidas. En una realización, el inmunoconjugado es más capaz de inhibir incrementos de volumen tumoral in vivo y/o más capaz de prolongar la supervivencia en mamíferos que presentan tumores malignos. En una realización, el inmunoconjugado inhibe un incremento del volumen tumoral in vivo en por lo menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% alcanzado el final del periodo de administración, de aproximadamente por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 días. En una realización, el inmunoconjugado inhibe un incremento del volumen tumoral in vivo en por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ó 75% alcanzado el final de un periodo de administración de 13 días. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos aproximadamente %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% al administrarse en un mamífero que lo necesita, en comparación con una fracción efectora de control. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 30%, 32% ó 35% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con una fracción efectora de control. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en aproximadamente 30% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con una fracción efectora de control. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con una fracción efectora en una molécula de inmunoconjugado “diacuerpo”. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 30%, 32% ó 35% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con una fracción efectora en una molécula de inmunoconjugado “diacuerpo”. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que
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presentan tumores malignos en aproximadamente 30% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con una fracción efectora en una molécula de inmunoconjugado “diacuerpo”. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 5%, 10% ó 15% en comparación con una fracción efectora de control o de una fracción efectora en una molécula de inmunoconjugado “diacuerpo”.
Fracciones de unión a antígeno
La fracción de unión a antígeno del inmunoconjugado descrito en la presente memoria es generalmente una molécula de polipéptido que se une a un determinante antigénico específico y es capaz de dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo una fracción efectora o una segunda fracción de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. El inmunoconjugado puede unirse a determinantes antigénicos presentes, por ejemplo, sobre las superficies de las células tumorales, sobre las superficies de las células infectadas por virus, sobre las superficies de otras células enfermas, libres en suero sanguíneo, y/o en la matriz extracelular (ECM).
Entre los ejemplos no limitativos de antígenos tumorales se incluyen MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (AD Abp), ciclofilina b, antígeno asociado a cáncer colorrectal (CCR)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (ACE) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, aml1, antígeno específico de próstata (AEP) y sus epítopos inmunogénicos AEP-1, AEP-2 y AEP-3, antígeno membranal específico de próstata (AMEP), receptor de células T/cadena CD3-zeta, familia MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, áfetoproteína, E-cadherina, á-catenina, â-catenina y ã-catenina, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de la poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, conexina 37, idiotipo Ig, p15, gp75, gangliósidos Gm2 y GD2, productos víricos, tales como las proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, P1A, antígeno 1 nuclear codificado por el VEB (ANEB), glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7 y c-erbB-2.
Entre los ejemplos no limitativos de antígenos víricos se incluyen la hemaglutinina del virus influenza, LMP-1 del virus de Epstein-Barr, la glucoproteína E2 del virus de la hepatitis C, gp160 del VIH y gp120 del VIH.
Entre los ejemplos no limitativos de los antígenos de la MEC se incluyen sindecan, heparanasa, integrinas, osteopontina, link, cadherinas, laminina, FCE de tipo laminina, lectina, fibronectina, notch, tenascina y matrixina.
Los inmunoconjugados descritos en la presente memoria pueden unirse a los ejemplos no limitativos específicos siguientes de antígenos de superficie celular: FAP, Her2, RFCE, CD2 (antígeno de superficie de células T), CD3 (heteromultímero asociado al RCT), CD22 (receptor de células B), CD23 (receptor de IgE de baja afinidad), CD25 (cadena α del receptor de IL-2), CD30 (receptor de citoquina), CD33 (antígeno de superficie de célula mieloide), CD40 (receptor del factor de necrosis tumoral), IL-6R (receptor de IL6), CD20, PCSM y PDGFβR (receptor β del factor de crecimiento derivado de plaquetas).
En una realización, el inmunoconjugado comprende dos o más fracciones de unión a antígeno, en el que cada uno de dichas fracciones de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En otra realización, el inmunoconjugado comprende dos o más fracciones de unión a antígeno, en las que cada una de dichas fracciones de unión a antígeno se une específicamente a diferentes determinantes antigénicos.
La fracción de unión a antígeno puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento del mismo que conserve la unión específica a un determinante antigénico. Entre los fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitación, fragmentos de VH, fragmentos de VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (ver, por ejemplo, Hudson y Souriau, Nature Med. 9:129134, 2003).
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos típicamente dos o más fracciones de unión a antígeno, que son específicos del dominio extra B de la fibronectina (DEB). En otra realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción de unión a antígeno, típicamente dos o más, que pueden competir con el anticuerpo monoclonal L19 para la unión a un epítopo de EDB Ver, por ejemplo, la solicitud publicada de patente PCT nº WO 2007/128563 A1. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL
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12 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IFN α que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de GM-CSF que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primer scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con un segundo scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19.
En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 95 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 96 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 95 y SEC ID nº 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 104 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 104 y SEC ID nº 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 105 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 105 y SEC ID nº 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 106 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 106 y SEC ID nº 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 107 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 107 y SEC ID nº 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, los polipéptidos se encuentran unidos covalentemente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro.
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción de unión a antígeno, típicamente dos
o más, que son específicas del dominio A1 de la tenascina (TNC-A1). En otra realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción de unión a antígeno, típicamente dos o más, que pueden competir con el anticuerpo monoclonal F16 para la unión a un epítopo de TNC-A1 Ver, por ejemplo, la solicitud publicada de patente PCT nº WO 2007/128563 A1. En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción de unión a antígeno, típicamente dos o más que son específicos para el dominio A1 y/o A4 de la tenascina (TNC-A1 o TNC-A4 o TNC-A1/A4). En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-12, una molécula de IFN α o una molécula de FEC-GM, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de la tenascina. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A1 de la tenascina. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primer scFv específico para el dominio A1 de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con un segundo scFv específico para el dominio A1 de la tenascina. En una realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 13 ó a la secuencia SEC ID nº 15, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuenica SEC ID nº 9 ó a la secuencia SEC ID nº 11, o
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variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 13 ó a la secuencia SEC ID nº 15 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 9 ó a la secuencia SEC ID nº 11 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 14 ó a la secuencia SEC ID nº 16. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida de la secuencia SEC ID nº 14 ó a la secuencia SEC ID nº 16. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 10 ó a la secuencia SEC ID nº 12. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 10 ó a la secuencia SEC ID nº 12. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID nº 99 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 100 ó a la secuencia SEC ID nº 215, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 101 ó a la secuencia SEC ID nº 235 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 100 y SEC ID nº 101 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 215 y SEC ID nº 235 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a SEC ID nº 112. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida de secuencia SEC ID nº 112. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a SEC ID nº 113 ó a la secuencia SEC ID nº 216. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida de secuencia SEC ID nº 113 ó a la secuencia SEC ID nº 216. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID nº 114 ó a la secuencia SEC ID nº 236. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida de la secuencia SEC ID nº 114 ó a la secuencia SEC ID nº
236.
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción de unión a antígeno, típicamente dos
o más, que son específicas del dominio A2 de la tenascina (TNC-A2). En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-2, una molécula de IFN α o una molécula de FEC-GM, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-temrinal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina. En una realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 7, SEC ID nº 179, SEC ID nº 183, SEC ID nº 187, SEC ID nº 191, SEC ID nº 195, SEC ID nº 199, SEC ID nº 203 y SEC ID nº 207, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 177, SEC ID nº 181, SEC ID nº 185, SEC ID nº 189, SEC ID nº 193, SEC ID nº 197, SEC ID nº 201 y SEC ID nº 205, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 7, SEC ID nº 179, SEC ID nº 183, SEC ID nº 187, SEC ID nº 191, SEC ID
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nº 195, SEC ID nº 199, SEC ID nº 203 y SEC ID nº 207, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 177, SEC ID nº 181, SEC ID nº 185, SEC ID nº 189, SEC ID nº 193, SEC ID nº 197, SEC ID nº 201 y SEC ID nº 205, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 8, SEC ID nº 180, SEC ID nº 184, SEC ID nº 188, SEC ID nº 192, SEC ID nº 196, SEC ID nº 200, SEC ID nº 204 y SEC ID nº 208. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 8, SEC ID nº 180, SEC ID nº 184, SEC ID nº 188, SEC ID nº 192, SEC ID nº 196, SEC ID nº 200, SEC ID nº 204 y SEC ID nº 208. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 178, SEC ID nº 182, SEC ID nº 186, SEC ID nº 190, SEC ID nº 194, SEC ID nº 198, SEC ID nº 202 y SEC ID nº 206. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 178, SEC ID nº 182, SEC ID nº 186, SEC ID nº 190, SEC ID nº 194, SEC ID nº 198, SEC ID nº 202 y SEC ID nº
206. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 239, SEC ID nº 241 y SEC ID nº 243, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 245, SEC ID nº 247 y la secuencia SEC ID nº 249, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 239, SEC ID nº 241 y SEC ID nº 243 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 245, SEC ID nº 247 y SEC ID nº 249 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 239 y a la secuencia SEC ID nº 247 ó a la secuencia SEC ID nº 249, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 241 y a la secuencia SEC ID nº 245 ó a la secuencia SEC ID nº 247, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 243 y SEC ID nº 245, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 240, SEC ID nº 242 y SEC ID nº 244. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID nº 240, SEC ID nº 242 y SEC ID nº 244. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 246, SEC ID nº 248 y SEC ID nº 250. En todavía otra realización específcia, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 246, SEC ID nº 248 y SEC ID nº 250.
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción de unión a antígeno, típicamente dos
o más, que son específicas para la proteína activada por fibroblastos (PAF). En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para PAF comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-12, una molécula de IFN α o una molécula de FEC-GM, que a su vez comparten un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para PAF. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para FAP. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-12, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para FAP. En una realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo
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menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 21, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 31, SEC ID nº 35, SEC ID nº 39, SEC ID nº 43, SEC ID nº 47, SEC ID nº 51, SEC ID nº 69, SEC ID nº 73, SEC ID nº 77, SEC ID nº 81, SEC ID nº 85, SEC ID nº 89, SEC ID nº 93, SEC ID nº 123, SEC ID nº 127, SEC ID nº 131, SEC ID nº 135, SEC ID nº 139, SEC ID nº 143, SEC ID nº 147, SEC ID nº 151, SEC ID nº 155, SEC ID nº 159, SEC ID nº 163, SEC ID nº 167, SEC ID nº 171 y SEC ID nº 175, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 23, SEC ID nº 29, SEC ID nº 33, SEC ID nº 37, SEC ID nº 41, SEC ID nº 45, SEC ID nº 49, SEC ID nº 67, SEC ID nº 71, SEC ID nº 75, SEC ID nº 79, SEC ID nº 83, SEC ID nº 87, SEC ID nº 91, SEC ID nº 121, SEC ID nº 125, SEC ID nº 129, SEC ID nº 133, SEC ID nº 137, SEC ID nº 141, SEC ID nº 145, SEC ID nº 149, SEC ID nº 153, SEC ID nº 157, SEC ID nº 161, SEC ID nº 165, SEC ID nº 169 y SEC ID nº 173, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 21, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 31, SEC ID nº 35, SEC ID nº 39, SEC ID nº 43, SEC ID nº 47, SEC ID nº 51, SEC ID nº 69, SEC ID nº 73, SEC ID nº 77, SEC ID nº 81, SEC ID nº 85, SEC ID nº 89, SEC ID nº 93, SEC ID nº 123, SEC ID nº 127, SEC ID nº 131, SEC ID nº 135, SEC ID nº 139, SEC ID nº 143, SEC ID nº 147, SEC ID nº 151, SEC ID nº 155, SEC ID nº 159, SEC ID nº 163, SEC ID nº 167, SEC ID nº 171 y SEC ID nº 175, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 23, SEC ID nº 29, SEC ID nº 33, SEC ID nº 37, SEC ID nº 41, SEC ID nº 45, SEC ID nº 49, SEC ID nº 67, SEC ID nº 71, SEC ID nº 75, SEC ID nº 79, SEC ID nº 83, SEC ID nº 87, SEC ID nº 91, SEC ID nº 121, SEC ID nº 125, SEC ID nº 209, SEC ID nº 133, SEC ID nº 137, SEC ID nº 141, SEC ID nº 145, SEC ID nº 149, SEC ID nº 153, SEC ID nº 157, SEC ID nº 161, SEC ID nº 165, SEC ID nº 169 y SEC ID nº 173, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID nº 22, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 40, SEC ID nº 44, SEC ID nº 48, SEC ID nº 52, SEC ID nº 70, SEC ID nº 74, SEC ID nº 78, SEC ID nº 82, SEC ID nº 86, SEC ID nº 90, SEC ID nº 94, SEC ID nº 124, SEC ID nº 128, SEC ID nº 132, SEC ID nº 136, SEC ID nº 140, SEC ID nº 144, SEC ID nº 148, SEC ID nº 152, SEC ID nº 156, SEC ID nº 160, SEC ID nº 164, SEC ID nº 168, SEC ID nº 172 y SEC ID nº 176. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID nº 22, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 40, SEC ID nº 44, SEC ID nº 48, SEC ID nº 52, SEC ID nº 70, SEC ID nº 74, SEC ID nº 78, SEC ID nº 82, SEC ID nº 86, SEC ID nº 90, SEC ID nº 94, SEC ID nº 124, SEC ID nº 128, SEC ID nº 132, SEC ID nº 136, SEC ID nº 140, SEC ID nº 144, SEC ID nº 148, SEC ID nº 152, SEC ID nº 156, SEC ID nº 160, SEC ID nº 164, SEC ID nº 168, SEC ID nº 172 y SEC ID nº
176. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 30, SEC ID nº 34, SEC ID nº 38, SEC ID nº 42, SEC ID nº 46, SEC ID nº 50, SEC ID nº 68, SEC ID nº 72, SEC ID nº 76, SEC ID nº 80, SEC ID nº 84, SEC ID nº 88, SEC ID nº 92, SEC ID nº 122, SEC ID nº 126, SEC ID nº 130, SEC ID nº 134, SEC ID nº 138, SEC ID nº 142, SEC ID nº 146, SEC ID nº 150, SEC ID nº 154, SEC ID nº 158, SEC ID nº 162, SEC ID nº 166, SEC ID nº 170 y SEC ID nº 174. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codifciada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 30, SEC ID nº 34, SEC ID nº 38, SEC ID nº 42, SEC ID nº 46, SEC ID nº 50, SEC ID nº 68, SEC ID nº 72, SEC ID nº 76, SEC ID nº 80, SEC ID nº 84, SEC ID nº 88, SEC ID nº 92, SEC ID nº 122, SEC ID nº 126, SEC ID nº 130, SEC ID nº 134, SEC ID nº 138, SEC ID nº 142, SEC ID nº 146, SEC ID nº 150, SEC ID nº 154, SEC ID nº 158, SEC ID nº 162, SEC ID nº 166, SEC ID nº 170 y SEC ID nº 174. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 209, SEC ID nº 211, SEC ID nº 213, SEC ID nº 217, SEC ID nº 219, SEC ID nº 221, SEC ID nº 223, SEC ID nº 225 y SEC ID nº 227, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 229, SEC ID nº 231, SEC ID nº 233 y SEC ID nº 237 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 211, SEC ID nº 219 y SEC ID nº 221 ó variantes de las
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mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 231 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 209, SEC ID nº 223, SEC ID nº 225 y SEC ID nº 227 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 229 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización específica adicional, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 213 y SEC ID nº 233 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 217 y SEC ID nº 237 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 221 y SEC ID nº 231 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 223 y SEC ID nº 229 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 225 y SEC ID nº 229 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a SEC ID nº 227 y SEC ID nº 229 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 210, SEC ID nº 212, SEC ID nº 214, SEC ID nº 218, SEC ID nº 220, SEC ID nº 222, SEC ID nº 224, SEC ID nº 226 y SEC ID nº 228. En todavía otra realización específcia, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 210, SEC ID nº 212, SEC ID nº 214, SEC ID nº 218, SEC ID nº 220, SEC ID nº 222, SEC ID nº 224, SEC ID nº 226 y SEC ID nº 228. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID nº 230, SEC ID nº 232, SEC ID nº 234 y SEC ID nº 238. En todavía otra realización específcia, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 230, SEC ID nº 232, SEC ID nº 234 y SEC ID nº 238.
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos una fracción de unión a antígeno, típicamente dos
o más, que son específicas del proteoglicano condroitín sulfato del melanoma (PCSM). En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para PCSM comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-12, una molécula de IFN α o una molécula de FEC-GM, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para PCSM. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para MCSP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para MCSP. En una realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 257 ó a la secuencia SEC ID nº 261 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 259 ó a la secuencia SEC ID nº 271 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 257 ó a la secuencia SEC ID nº 261 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 259 ó a la secuencia SEC ID nº 271, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 257, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 259. En otra realización específica, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 261, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 259. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una
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secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a SEC ID nº 258 ó a la secuencia SEC ID nº 262. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida de la secuencia SEC ID nº 258 ó a la secuencia SEC ID nº 262. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a SEC ID nº 260 ó a la secuencia SEC ID nº 272. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida de la secuencia SEC ID nº 260 ó a la secuencia SEC ID nº 272. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 251 ó a la secuencia SEC ID nº 255, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 253 ó a la secuencia SEC ID nº 265, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 251 ó a la secuencia SEC ID nº 255 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 253 ó a la secuencia SEC ID nº 265, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 251 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 253 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 255 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID nº 253 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a SEC ID nº 252 ó a la secuencia SEC ID nº 256. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida de secuencia SEC ID nº 252 ó a la secuencia SEC ID nº 256. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a SEC ID nº 254 ó a la secuencia SEC ID nº 266. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida de secuencia SEC ID nº 254 ó a la secuencia SEC ID nº 266.
En una realización, las fracciones de unión a antígeno comprenden por lo menos una región variable capaz de unirse a un determinante antigénico. Las regiones variables no limitativas que resultan útiles en los inmunoconjugados descritos en la presente memoria pueden ser de origen murino, de primate o humano. Las regiones variables humanas pueden derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados mediante el método del hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos han sido descritas, por ejemplo, por Kozbor et al., J. Immunol. 133:3001-3005, 1984, y Brodeur  , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 (Marcel Dekker Inc., New York, 1987). Las regiones variables humanas también pueden ser producidas por animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión (JH) de cadena pesada de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal resulta en la inhibición total de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la serie génica de inmunoglobulinas de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras el reto antigénico Ver, por ejemplo, Jakobovits, Nature 362:255-258, 1993.
Alternativamente, puede utilizarse la expresión fágica para producir anticuerpos humanos y regiones variables humanas in vitro a partir de repertorios génicos de dominio variable (V) de inmunoglobulina, por ejemplo de donantes no inmunizados (McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). En un ejemplo de esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo dentro del marco de un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresa en forma de fragmentos funcionales de anticuerpo sobre la superficie de la partícula fágica.
Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma fágico, las selecciones basadas en las propiedades funcionales de los anticuerpos/fragmentos de anticuerpo también resultan en la selección del gen codificante de los anticuerpos/fragmentos anticuerpo que muestran dichas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La expresión fágica puede llevarse a cabo en una diversidad de formatos. Para una revisión de los formatos de expresión fágica, ver Hoogenboom et al., Nucleic
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Acids Res. 19:4133-4137 (1991). Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos del gen V para la expresión fágica. Clackson et al. aislaron una serie diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados Ver Clackson et al. et al., J. Mol. Bio. 222:581-597, 1991. En una respuesta inmunológica natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones a una tasa elevada (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos proporcionan una afinidad más alta, y las células B que expresan inmunoglobulinas superficiales de alta afinidad se replicarán y diferenciarán preferentemente durante el reto de antígenos posterior. Este proceso natural puede ser imitado mediante la utilización de la técnica conocida como “reorganización de cadenas”.Ver Marks et al., Biotech. 10:779-783, 1992. En este método, la afinidad de los anticuerpos humanos “primarios” o de regiones variables obtenidas mediante expresión fágica puede mejorarse mediante la sustitución secuencial de los genes de región V de las cadenas pesada y ligera por repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes de dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y regiones variables con afinidades en el intervalo de nM. Una estrategia para preparar repertorios fágicos muy grandes de anticuerpos ha sido descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993, y el aislamiento de un anticuerpo humano de alta afinidad directamente a partir de dicha biblioteca fágica grande se informa en Griffith et al., J. Cell. Bio. 120:885-896, 1993. También puede utilizarse la reorganización génica para derivar anticuerpos humanos y regiones variables de anticuerpos de roedor, en los que el anticuerpo o región variable humana presenta afinidades y especificidades similares a las del anticuerpo o región variable de roedor de partida. Según este método, que también se denomina “modificación de epítopos”, el gen de dominio V de la cadena pesada o ligera de anticuerpos de roedor obtenido mediante técnicas de expresión fágica se sustituye por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando quimeras roedor-humano. La selección con antígeno resulta en el aislamiento de regiones variables humanas capaces de restaurar el sitio de unión a antígeno funcional, es decir, el epítopo gobierna (modifica) la elección de pareja. Al repetir el procedimiento para sustituir el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver la publicación de patente PCT nº WO 93/06213). Al contrario que la humanización tradicional de anticuerpos de roedor, la técnica de modificación de epítopos proporciona anticuerpos o regiones variables completamente humanos, que no presentan marco o residuos CDR de origen roedor.
Entre las regiones variables que pueden utilizarse también se incluyen secuencias de región variable murinas que han sido primatizadas o humanizadas, o secuencias de región variable de primate que han sido humanizadas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “humanizado” se refiere a una secuencia de región variable de grupo de unión a antígeno derivada de un anticuerpo no humano, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva o que conserva sustancialmente las propiedades de unión a antígeno de la molécula parental, pero que es menos inmunogénica en seres humanos. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante diversos métodos, incluyendo: (a) injertación de únicamente CDR no humanas en regiones marco humanas con o sin conservación de los residuos de marco críticos (por ejemplo, aquellos que resultan importantes para conservar una buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), y (b) “enmascaramiento” de las regiones variables no humanas con una sección de tipo humano mediante sustitución de los residuos superficiales. Dichos métodos se dan a conocer en Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun. 28:489-498, 1991; Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217, 1994. Existen de manera general 3 regiones determinantes de complementariedad, o CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada una de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo, que se encuentran flanqueadas por cuatro subregiones de marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Puede encontrarse un comentario sobre los anticuerpos con regiones variables humanizadas en, inter alia, la patente US nº 6.632.927, y en la solicitud publicada de patente US nº 2003/0175269.
De manera similar, tal como se utiliza en la presente memoria, el término “primatizado” se utiliza para referirse a una región variable de fracción de unión a antígeno derivada de un anticuerpo no de primate, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva, o que conserva sustancialmente, las propiedades de unión a antígeno de la molécula parental, pero que es menos inmunogénica en primates.
La elección de dominios variables humanos, tanto pesados como ligeros, durante la preparación de fracciones de unión a antígeno humanizadas resulta muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de “ajuste óptimo”, la secuencia de la región variable de una fracción de unión a antígeno de roedor se criba frente a la biblioteca completa de secuencias de región variable humanas conocidas. La secuencia humana más similar a la del roedor seguidamente se acepta como la región marco humana (FR) para la fracción de unión a antígeno humanizada (Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987). Otro método para seleccionar la secuencia de marco humana es comparar la secuencia de cada subregión individual del marco de roedor completo (FR1, FR2, FR3 y FR4) o alguna combinación de las subregiones individuales (p.ej. FR1 y FR2) con una biblioteca de secuencias de región variable humana conocidas que corresponden a dicha subregión de marco (p.ej. según se determina mediante numeración de Kabat) y seleccionar la secuencia humana para cada subregión o combinación que es más similar a la del roedor (solicitud publicada de patente US nº 2003/0040606A1). Otro método utiliza una región de marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse el mismo marco para varias
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fracciones de unión a antígeno humanizadas diferentes (Carter  , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993).
Generalmente, las fracciones de unión a antígeno del inmunoconjugado descrito en la presente memoria conservan una elevada afinidad para determinantes antigénicos específicos u otras propiedades biológicas favorables. Por consiguiente, se preparan regiones variables humanizadas mediante el análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente disponibles y resultarán familiares para el experto en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras tridimensionales probables de la conformación de secuencias de región variable de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de región variable de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la secuencia de región variable candidata para la unión a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR procedentes del receptor e importar secuencias de manera que se consiga la característica deseadadla fracción de unión a antígeno, tal como una afinidad incrementada para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable se encuentran directa y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión a antígeno.
En otra realización, las moléculas de unión a antígeno descritas en la presente memoria se manipulan para que presenten una afinidad de unión incrementada de acuerdo con, por ejemplo, los métodos dados a conocer en la solicitud publicada de patente US nº 2004/0132066. La capacidad del inmunoconjugado descrito en la presente memoria de unirse a un receptor de fracción efectora o a un determinante antigénico específico puede medirse mediante un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) u otra técnica que resulte familiar para el experto en la materia, por ejemplo la técnica de resonancia del plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad et al., Glyco. J. 17:323-329, 2000) y ensayos de unión tradicionales (Heeley R.P., Endocr. Res. 28:217229, 2002).
Fracciones efectoras
Las fracciones efectoras para la utilización en los inmunoconjugados descritos en la presente memoria generalmente son polipéptidos que influyen sobre la actividad celular, por ejemplo mediante rutas de transducción de señales. Por consiguiente, la fracción efectora del inmunoconjugado descrito en la presente meoria puede asociarse a la señalización mediada por receptor que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta dentro de la célula. Por ejemplo, una fracción efectora del inmunoconjugado puede ser una citoquina. En una realización particular, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla tal como se define en la presente memoria. En una realización, una o más fracciones efectoras, típicamente fracciones efectoras de cadena sencilla, de los inmunoconjugados descritos en la presente memoria son citoquinas seleccionadas de entre el grupo que consiste de: IL-2, GM-CSF, IFN-α e IL-12. En otra realización, una o más fracciones efectoras de cadena sencilla de los inmunoconjugados son citoquinas seleccionadas de entre el grupo que consiste de: IL-8, MIP1α, MIP-1β, and TGF-β.
En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es IL-2. En una realización específica, la fracción efectora de IL-2 puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la proliferación de linfocitos T activados, la diferenciación de linfocitos T activados, la actividad de células T citotóxicas (CTL), la proliferación de células B activadas, la diferenciación de células B activadas, la proliferación de células asesinas naturales (NK), la diferenciación de células NK, y la citotoxicidad antitumoral de NK/linfocitos asesinos activados (LAK). En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es GM-CSF. En una realización específica, la fracción efectora GM-CSF puede inducir la proliferación y/o diferenciación de granulocitos, monocitos o células dendríticas. En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es IFN-α. En una realización específica, la fracción efectora de IFN-α puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la inhibición de la replicación vírica en una célula infectada por virus, y la regulación positiva de la expresión del complejo de histocompatibilidad mayor I (MHC I). En otra realización específica, la fracción efectora de IFN α puede inhibir la proliferación en una célula tumoral. En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es IL-12. En una realización específica, la fracción efectora de IL12 puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la proliferación de células NK, la diferenciación de las células NK, la proliferación de las células T y la diferenciación de las células
T. En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es IL-8. En una realización específica, la fracción efectora IL-8 puede inducir la quimotaxis en neutrófilos. En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado, es MIP-1α. En una realización específica, la fracción efectora MIP-1α puede inducir la quimiotaxis en monocitos y en linfocitos T. En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es MIP-1β. En una realización específica, la fracción efectora MIP-1β puede inducir la quimiotaxis de monocitos y de linfocitos T. En una realización, la fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es TGF-β. En una realización específica, la fracción
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efectora de TGF-β puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la quimiotaxis de monocitos, la quimiotaxis de macrófagos, la regulación positiva de la expresión de IL-1 en macrófagos activados y la regulación positiva de la expresión de IgA en células B activadas.
Polipéptidos y polinucleótidos de inmunoconjugado
Los inmunoconjugados descritos en la presente memoria comprenden polipéptidos y fragmentos de los mismos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “polipéptido” pretende comprender un “polipéptido” singular además de una pluralidad de “polipéptidos”, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente mediante enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término “polipéptido” se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. De esta manera, dentro de la definición de “polipéptido” se incluyen péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, “proteína”, “cadena de aminoácidos” o cualquier otra expresión utilizada para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y el término “polipéptido” puede utilizarse en lugar de, o intercambiablemente con cualquiera de dichos términos. El término “polipéptido” también pretender referirse a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo, aunque sin limitación, la glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes, corte proteolítico o modificación con aminoácidos naturales. Puede derivarse un polipéptido de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, aunque no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácidos nucleicos designada. Puede generarse de cualquier manera, incluyendo mediante síntesis química.
Un polipéptido tal como se describe en la presente memoria puede presentar un tamaño de aproximadamente 3 ó más, 5 ó más, 10 ó más, 20 ó más, 25 ó más, 50 ó más, 75 ó más, 100 ó más, 200 ó más, 500 ó más, 1.000 ó más, ó 2.000 ó más aminoácidos. Los polipéptidos pueden presentar una estructura tridimensional definida, aunque no presentan necesariamente dicha estructura. Se hace referencia a los polipéptidos con una estructura tridimensional definida como plegados, y a los polipéptidos que no presentan una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, como no plegados.
Un polipéptido o variante del mismo “aislado”, o una variante o derivado del mismo, pretende referirse a un polipéptido que no se encuentra en su ambiente natural. No resulta necesario un nivel particular de purificación. Por ejemplo, puede extraerse un polipéptido aislado de su ambiente nativo o natural. Los polipéptidos producidos recombinantemente y las proteínas expresadas en células huésped se consideran aislados para los fines de la invención, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que han sido separados, fraccionados o parcial o sustancialmente purificados mediante cualquier técnica adecuada.
También se encuentran incluidos como polipéptidos según la presente exposición, los derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriormente indicados, y cualquier combinación de los mismos. Los términos “variante”, “derivado” y “análogo” en referencia a los polipéptidos descritos en la presente memoria incluyen cualesquiera polipéptidos que conserven por lo menos algunas de las propiedades biológicas, antigénicas o inmunogénicas del polipéptido nativo correspondiente. Entre las variantes de polipéptidos descritos en la presente memoria se incluyen polipéptidos que presentan secuencias alteradas de aminoácidos debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser naturales o no naturales. Pueden producirse variantes no naturales utilizando técnicas de mutagénesis conocidas de la técnica. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, deleciones o adicionaes de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Los derivados de los polipéptidos descritos en la presente memoria son polipéptidos que han sido alterados de manera que muestren características adicionales no presentes en el polipéptido nativo. Entre los ejemplos se incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden denominarse en la presente memoria "análogos de polipéptidos". Tal como se utiliza en la presente memoria, un "derivado" de un polipéptido se refiere a un polipéptido de la invención que presenta uno o más residuos químicamente derivatizados mediante reacción de un grupo lateral funcional. También incluidos como "derivados" se encuentran aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina, y la ornitina puede sustituirse por lisina. Alternativamente pueden sintetizarse o seleccionarse variantes recombinantes codificantes de polipéptidos iguales o similares, o seleccionarse mediante la utilización de la "redundancia" del código genético. Pueden introducirse diversas sustituciones de codones, tales como los cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, con el fin de optimizar la clonación en un plásmido o vector vírico o la expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. Las mutaciones en la secuencia polinucleótido pueden reflejarse en el polipéptido o dominios de otros péptidos añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para modificar características tales como las afinidades de unión de ligando, las afinidades entre cadenas o la tasa de degradación/renovación.
Preferentemente, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que presenta propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras. Pueden realizarse dichas sustituciones de aminoácidos "conservadoras" basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados.
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Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; entre los aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoácidos cargados positivamente (básicos) se incluyen arginina, lisina e histidina, y entre los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las "inserciones" o "deleciones" preferentemente son de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente de entre 1 y 10 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse experimentalmente llevando a cabo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptido utilizando técnicas de ADN recombinante y sometiendo a ensayo las variantes recombinantes resultantes para la actividad. Por un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idénticas" a una secuencia de aminoácidos problema descrita en la presente memoria pretende hacerse referencia a que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención es idéntica a la secuencia de pregunta, excepto en que la secuencia del polipéptido de la invención puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. En otras palabras, con el fin de obtener un polipéptido que presente una secuencia de aminoácidos idéntica por lo menos al 95% a una secuencia de aminoácidos problema, hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia de pregunta pueden insertarse, delecionarse o sustituirse por otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre dichas posiciones terminales, entre los residuos individualmente en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como cuestión práctica, puede determinarse si cualquier polipéptido particular es idéntico por lo menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a un polipéptido de referencia convencionalmente utilziando programas informáticos conocidos. Un método preferente para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia de pregunta (una secuencia descrita en la presente memoria) y una secuencia objeto, también denominado alineación global de secuencias, es la utilización del programa informático FASTDB en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. Appl. Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias, la secuencia de pregunta y de la invención son ambas secuencias de nucleótidos o son ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación global se secuencias se expresa en porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en una alineación de aminoácidos de FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuplo=2, penalización de no correspondencia=1, penalización de unión=20, longitud del grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1, tamaño de ventana=longitud de secuencia, penalización de hueco=5, penalización de tamaño de hueco=0,05, tamaño de ventana=500 ó la longitud de la secuencia de aminoácidos de la invención, la más corta de entre los dos valores
En el caso de que la secuencia objeto sea más corta que la secuencia de pregunta debido a deleciones N-o Cterminales, no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Lo anterior se debe a que el programa FASTDB no incluye truncaciones N- y C-terminales de la secuencia objeto al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos N-y C-terminal, respecto a la secuencia de pregunta, el porcentaje de identidad se corrige mediante el cálculo del número de residuos de la secuencia de pregunta que se encuentran en posición N- y C-terminal respecto a la secuencia objeto, que no son correspondientes/desalineadas con un residuo objeto correspondiente, como porcentaje del número total de bases de la secuencia de pregunta. Se determina si un nucleótido es correspondiente/alineado a partir de los resultados de la alineación de secuencias de FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, para alcanzar un puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación corregida es la utilizada para los fines de la presente invención. Únicamente las bases más allá de los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia objeto, que son no correspondientes/desalineados respecto a la secuencia de pregunta, son utilizadas para el cálculo para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Es decir, sólo las posiciones de residuo de la secuencia de pregunta más allá de los residuos N-terminales y C-terminales más alejados de la secuencia objeto.
Por ejemplo, se alinea una secuencia objeto de 90 aminoácidos con una secuencia de pregunta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo N-terminal de la secuencia objeto y, por lo tanto, la alineación de FASTD no muestra una correspondencia/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N-terminal. Las 10 bases no apareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos N-terminal y C-terminal no correspondientes/número total de bases de la secuencia de pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. En el caso de que los 90 residuos fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje final de identidad sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 residuos con una secuencia de pregunta de 100 residuos. En este caso las deleciones son deleciones internas, de manera que no hay residuos en los extremos N-terminal o C-terminal de la secuencia objeto que no sean correspondientes/alineadas con la secuencia de pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las posiciones de residuos en los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia objeto, tal como se muestran en la alineación de FASTDB, que no son correspondientes/alineadas con la secuencia de pregunta se corrigen manualmente. No debe realizarse ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.
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Entre los polinucleótidos descritos en la presente memoria se incluyen aquellos que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticos a las secuencias proporcionadas en las Tablas 3 y 4, posteriormente, incluyendo los fragmentos funcionales o variantes de los mismos. La invención comprende además polipéptidos que comprenden secuencias de la Tabla 3 o 4 con sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden estar codificados por un único polinucleótido. Alternativamente, pueden estar codificados por múltiples (por ejemplo dos o más) polinucleótidos, de manera que los polipéptidos son coexpresados. Los polipéptidos que son coexpresados a partir de múltiples polinucleótidos pueden asociarse mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconjugado funcional. Por ejemplo, la parte de cadena pesada de una fracción de unión a antígeno puede estar codificada por un polinucleótido separado de la parte del inmunoconjugado que comprende la parte de cadena ligera de la fracción de unión a antígeno y la fracción efectora. Al coexpresarse, los polipéptidos de cadena pesada se asocian con los polipéptidos de cadena pesada para formar la fracción de unión a antígeno. Alternativamente, en otro ejemplo, la parte de cadena ligera de una fracción de unión a antígeno puede estar codificada por un polinucleótido separado de la parte del inmunoconjugado que comprende la parte de cadena pesada de la fracción de unión a antígeno y la fracción efectora.
Los inmunoconjugados descritos en la presente memoria y fragmentos de los mismos generalmente están codificados por polinucleótidos. El término “polinucleótido” pretende comprender un único ácido nucleico, así como una pluralidad de ácidos nucleicos, y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico aislado, por ejemplo ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de un virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo un enlace amida, tal como el presente en los ácidos péptido-nucleicos (APN)). La expresión “ácidos nucleicos” se refiere a uno o más segmentos de ácidos nucleicos cualesquiera, por ejemplo fragmentos de ADN o de ARN, presentes en un polinucléotido. El término “aislado” referido a un ácido nucleico o polinucleótido se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido extraída de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante codificante de un polipéptido terapéutico contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Entre los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado se incluyen los polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o los polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Entre las moléculas de ARN aisladas se incluyen los transcritos de ARN in vivo o in vitro, así como las formas de cadena positiva y negativa, y las formas de doble cadena, de vectores pestivirus dados a conocer en la presente memoria.
Entre los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados según la presente invención se incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser, o puede incluir un elemento regulador, tal como un promotor, un sitio de unión ribosómica o un terminador de transcripción.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una “región codificante” es una parte de un ácido nucleico que consiste de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un “codón de parada” (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, en caso de encontrarse presente, mientras que cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión ribosómica, terminadores de transcripción, intrones, regiones 5’ y 3’ no traducidas y similares, no son parte de una región codificante. Pueden encontrarse presentes dos o más regiones codificantes descritas en la presente memoria, en un solo constructo polinucleótido, por ejemplo en un solo vector, o en constructos polinucléotidos separados, por ejemplo en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo un vector descrito en la presente memoria puede codificar una o más poliproteínas, que se separan post-traduccionalmente o cotraduccionalmente en las proteínas finales mediante corte proteolítico. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico descrito en la presente memoria puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas con un primer o segundo ácido nucleico codificante del inmunoconjugado descrito en la presente memoria, o variante o derivado del mismo. Entre las regiones codificantes heterólogas se incluyen, aunque sin limitación, elementos especializados o motivos, tales como un péptido de señal secretoria o un dominio funcional heterólogo.
En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico, que codifica un polipéptido, normalmente puede incluir un promotor y/o otros elementos de control de la transcripción o de la traducción operablemente asociados a una o más regiones codificantes. Una asociación operable se produce en el caso de que una región codificante de un producto génico, por ejemplo un polipéptido, se asocie a una o más secuencias reguladoras de manera que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a la misma) se encuentran “operablemente asociados” en el caso de que la inducción de la función del promotor resulte en la transcripción de ARNm codificante del producto génico deseado y en el caso de que la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiera con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico
o de interferir con la capacidad del molde de ADN de ser transcrito. De esta manera, una región promotora se encontraría operablemente asociada a un ácido nucleico codificante de un polipéptido en el caso de que el promotor
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fuera capaz de inducir la transcripción de dicho ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de un tipo de célula que dirige una transcripción sustancial del ADN únicamente en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, aparte de un promotor, por ejemplo intensificadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operablemente al polinucleótido para dirigir la transcripción específica de un tipo celular. Los promotores y otras regiones de control de la transcripción que resultan adecuados se dan a conocer en la presente memoria.
Una diversidad de regiones de control de la transcripción es conocida por el experto en la materia. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrado, tales como, aunque sin limitarse a ellos, segmentos de promotor e intensificador procedentes de citomegalovirus (por ejemplo el promotor temprano inmediato, conjuntamente con el intrón A), el virus 40 del simio (por ejemplo el promotor temprano) y los retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Entre otras regiones de control de la transcripción se incluyen aquéllas derivadas de genes de vertebrado, tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovina y ß-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en las células eucarióticas. Entre las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales se incluyen los promotores e intensificadores específicos de un tejido, así como los promotores inducibles por linfoquinas (por ejemplo los promotores inducibles por interferones o por interleuquinas).
De manera similar, el experto ordinario en la materia conocerá una diversidad de elementos de control de la transcripción. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, sitios de unión ribosómica, codones de inicio y terminación de la traducción, y elementos derivados de sistemas víricos (particularmente un sitio interno de entrada ribosómica, o IRES, también denominado secuencia CITE).
En otras realizaciones, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser de cadena sencilla o de doble cadena.
Las regiones codificantes polinucleótidas y de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria pueden encontrarse asociadas a regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretorios o de señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido descrito en la presente memoria. Según la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por las células de mamífero presentan un péptido de señal o secuencia líder secretoria que resulta cortada de la proteína madura tras iniciarse la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplasmático rugoso. El experto ordinario en la materia conocerá que los polipéptidos secretados por las células de vertebrado generalmente presentan un péptido de señal fusionado al extremo N-terminal del polipéptido, que resulta cortado del polipéptido completo o “de longitud completa” para producir una forma secretada o “madura” del polipéptido. En determinadas realizaciones, se utiliza el péptido de señal nativo, por ejemplo una cadena ligera de inmunoglobulina o péptido de señal de cadena ligera, o un derivado funcional de dicha secuencia que conserve la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido operablemente asociado al mismo. Alternativamente, puede utilizarse un péptido de señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede sustituirse por la secuencia líder del activador del plasminógeno tisular humano (APT) o de la β-glucuronidase de ratón.
La expresión “casete de expresión” se refiere a un polinucleótido generado recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante puede incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la parte de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácidos nucleicos que debe transcribirse y un promotor. En una realización, el casete de expresión descrito en la presente memoria comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconjugados descritos en la presente memoria o fragmentos de los mismos.
La expresión “vector de expresión” es sinónima de “constructo de expresión” y se refiere a una molécula de ADN que se utiliza para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se encuentra operablemente asociada en una célula diana. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez el vector de expresión se encuentra en el interior de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o la proteína que se encuentra codificada por el gen es producida por la maquinaria celular de transcripción y/o traducción. En una realización, el vector de expresión descrito en la presente memoria comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconjugados descritos en la presente memoria o fragmentos de los mismos.
El término “artificial” se refiere a una composición sintética o no derivada de la célula huésped, por ejemplo un oligonucleótido sintetizado químicamente.
Por un ácido nucleico o polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos por lo menos, por ejemplo, 95% “idéntica” a una secuencia de nucleótidos de referencia descrita en la presente memoria se hace referencia a que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de
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nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que presente una secuencia de nucleótidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de nucleótidos de hasta 5% del total de nucleótidos de la secuencia de referencia.
En la práctica, puede determinarse convencionalmente si cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos o de polipéptido descrita en la presente memoria utilizando programas informáticos conocidos. Un método preferente para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia problema (una secuencia descrita en la presente memoria) y una secuencia de la invención, también denominado alineación global de secuencias, es la utilización del programa informático FASTDB en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. Appl. Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias, las secuencias de pregunta y objeto son ambas secuencias de ADN. Puede compararse una secuencia de ARN mediante la conversión de las U en T. El resultado de dicha alineación global de secuencias se expresa en porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en una alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=unitaria, k-tuplo=4, penalización de no correspondencia=1, penalización de unión=30, longitud del grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1, penalización de hueco=5, penalización de tamaño de hueco=0,05, tamaño de ventana=500 ó la longitud de la secuencia objeto de aminoácidos, la más corta de entre los dos valores.
En el caso de que la secuencia objeto sea más corta que la secuencia de pregunta debido a deleciones 5’ ó 3’, no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Lo anterior se debe a que el programa FASTDB no incluye truncados 5’ y 3’ de la secuencia objeto al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos 5’ ó 3’, respecto a la secuencia de pregunta, el porcentaje de identidad se corrige mediante el cálculo del número de residuos de la secuencia de pregunta que se encuentran 5’ y 3’ respecto a la secuencia objeto, que no son correspondientes/desalineadas, como porcentaje del número total de bases de la secuencia de pregunta. Se determina si un nucleótido es correspondiente/alineado a partir de los resultados de la alineación de secuencias de FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, para alcanzar un puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación corregida es la utilizada para los fines de la presente invención. Únicamente las bases más allá de las bases 5’ y 3’ de la secuencia objeto, según muestra la alineación de FASTDB, que son no correspondientes/desalineados respecto a la secuencia de pregunta, son utilizadas para el cálculo para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad.
Por ejemplo, se alinea una secuencia objeto de 90 bases con una secuencia de pregunta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se producen en el extremo 5’ de la secuencia objeto y, por lo tanto, la alineación de FASTDB no muestra una correspondencia/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5’. Las 10 bases no apareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5’ y 3’ no correspondientes/número total de bases de la secuencia de pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. En el caso de que las 90 bases fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje final de identidad sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 bases con una secuencia de pregunta de 100 bases. En este caso las deleciones son deleciones internas, de manera que no hay bases en el extremo 5' o 3' de la secuencia objeto que no sean correspondientes/alineadas con la secuencia de pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las bases 5’ y 3’ de la secuencia objeto que no son correspondientes/alineadas con la secuencia de pregunta se corrigen manualmente. No debe realizarse ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.
Entre los polinucleótidos descritos en la presente memoria se incluyen aquellos que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticos a las secuencias proporcionadas en las Tablas 6 y 8, posteriormente, incluyendo los fragmentos funcionales o variantes de los mismos. Los polinucleótidos pueden expresarse en forma de un único polinucleótido que codifique el inmunoconjugado completo,
o en forma de múltiples (por ejemplo dos o más) polinucleótidos que se coexpresen. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan pueden asociarse mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconjugado funcional. Por ejemplo, la parte de cadena pesada de una fracción de unión a antígeno puede estar codificada por un polinucleótido separado de la parte del inmunoconjugado que comprende la parte de cadena ligera de la fracción de unión a antígeno y la fracción efectora. Al coexpresarse, los polipéptidos de cadena pesada se asocian con los polipéptidos de cadena ligera para formar la fracción de unión a antígeno. Alternativamente, en otro ejemplo, la parte de cadena ligera de una fracción de unión a antígeno puede estar codificada por un polinucleótido separado de la parte del inmunoconjugado que comprende la parte de cadena pesada de la fracción de unión a antígeno y la fracción efectora.
En una realización específica, un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria codifica un fragmento de un inmunoconjugado que comprende por lo menos una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, y por lo menos una fracción de unión a antígeno, preferentemente dos o más, en el que una primera fracción efectora comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con una primera fracción de unión a antígeno y una segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi
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terminal con la primera fracción efectora o la primera fracción de unión a antígeno. En una realización preferente, las fracciones de unión a antígeno se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste de Fv y Fab. En otra realización específica, el polinucleótido codifica las cadenas pesadas de dos de las fracciones de unión a antígeno y una de las fracciones efectoras.. En otra realización específica, el polinucleótido codifica las cadenas ligeras de dos de las fracciones de unión a antígeno y una de las fracciones efectoras. En otra realización específica, el polinucleótido codifica una cadena ligera de una de las fracciones de unión a antígeno, una cadena pesada de una segunda fracción de unión a antígeno y una de las fracciones efectoras.
En otra realización específica, un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleótido codifica las cadenas pesadas de dos moléculas de Fab y una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla.. En otra realización específica, un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleótido codifica las cadenas ligeras de dos moléculas de Fab y una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla.. En otra realización específica, un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleótido codifica la cadena pesada de una molécula de Fab, la cadena ligera de una segunda molécula de Fab y una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla.
En una realización, un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria codifica un inmunoconjugado que comprende por lo menos una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla, unida en sus aminoácidos amino-terminales o carboxi-terminales a una o más moléculas de scFv.
En una realización, un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria codifica un fragmento de inmunoconjugado que comprende por lo menos una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla y por lo menos una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno, en las que cada uno de las fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio constante de inmunoglobulina seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de CH1 de IgG1, Ckappa de IgG y CH4 de IgE, y en el que uno de las fracciones de unión a antígeno se unen en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de una de las fracciones efectoras, y en el que la primera y la segunda fracciones de unión a antígeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica una de las fracciones de unión a antígeno y una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla.
En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconjugado que comprende primera y segunda fracciones efectoras y dos fracciones de unión a antígeno, en el que cada uno de las fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio constante de inmunoglobulina, y en el que uno de las fracciones de unión a antígeno se une en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de una de las fracciones efectoras, y en el que la segunda fracción de unión a antígeno se une en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de la segunda fracción efectora, y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización preferente, la primera y/o segunda fracciones efectoras son fracciones efectoras de cadena sencilla. En una realización preferente, el dominio constante se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste de CH1 de IgG1, Ckappa de IgG y CH4 de IgE. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica una de las fracciones de unión a antígeno y una de las fracciones efectoras.
En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconjugado que comprende por lo menos una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla y por lo menos una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno, en el que cada una de las fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgG, y en el que una de las fracciones de unión a antígeno se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido aminoterminal de una de las fracciones efectoras, y en las que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica una de las fracciones de unión a antígeno y una fracción efectora, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla.
En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconjugado que comprende dos fracciones efectoras y dos fracciones de unión a antígeno, en el que cada una de las fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgG, y en el que una de las fracciones de unión se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido aminoterminal de uno de las fracciones efectoras, y en el que la segunda fracción de unión a antígeno se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de la segunda fracción efectora, y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización preferente, la primera y/o segunda fracciones efectoras son fracciones efectoras de cadena sencilla. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica uno de las fracciones de unión a antígeno y una de las fracciones efectoras, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla.
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En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconjugado que comprende dos fracciones efectoras y dos fracciones de unión a antígeno, en el que cada uno de los fracciones de unión a antígeno comprende una molécula de Fab unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o ligera a un dominio CH3 de IgG1, y en el que cada uno de los dominios CH3 de IgG1 se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de uno de las fracciones efectoras, y en el que la primera y segunda fracciones de unión a antígeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización preferente, la primera y/o segunda fracciones efectoras son fracciones efectoras de cadena sencilla. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia codificante de la región variable de cadena pesada de una de las fracciones de unión a antígeno y una de dichas fracciones efectoras, preferentemente una fracción de cadena sencilla. En todavía otra realización, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia codificante de la región variable de cadena ligera de una de las fracciones de unión a antígeno y una de las fracciones efectoras, preferentemente una fracción efectora de cadena sencilla.
En otra realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable tal como se muestra en la Tabla 3, posteriormente. En otra realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica tal como se muestra en la Tabla 4. En otra realización, la invención se refiere además a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en las Tablas 6 y 8, posteriormente. En otra realización, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en las Tablas 6 y 8. En otra realización, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos en la Tabla 3. En otra realización, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos en la Tabla 4. La invención comprende un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica las secuencias de región variable de la Tabla 3 con sustituciones conservadoras de aminoácidos. La invención también comprende un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado de la invención o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica las secuencias polipeptídicas de la Tabla 4 con sustituciones conservadoras de aminoácidos.
TABLA 2.
Constructo
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS SEC ID nº
Molde para la biblioteca DP47-3; región codificante completa de Fab que comprende la secuencia líder PelB + dominio V kappa Vk3_20 + dominio constante CL para la cadena ligera y PelB + dominio V VH3_23 + dominio constante CH1 para la cadena pesada; pMS25opt
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Constructo
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS SEC ID nº
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Molde para la biblioteca DP88-3; región codificante completa de Fab que comprende la secuencia líder PelB + dominio V kappa Vk1_17 + dominio constante CL para la cadena ligera y PelB + dominio V VH1_69 + dominio constante CH1 para la cadena pesada; pRJH32
2
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TABLA 3.
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
2B10; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYA ASSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 3
2B10(GS); VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 5
2B10; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 7
2F11; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQYTPPTF GQGTKVEIK 9
2F11(VI); VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQYTPPTFG QGTKVEIK 11
2F11; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDMAVYYCAK WRWMMFDYWGQGTLVTVSS 13
2F11(MT); VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK WRWMMFDYWGQGTLVTVSS 15
3F2; VL
EIVLTQSPGTLSLYPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 17
3F2(YS); VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 19
3F2; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK 21
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Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
GWFGGFNYWGQGTLVTVSS
3D9, VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQLIPPTFG QGTKVEIK 23
3D9, VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKGLEWV SAIGVSTGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGPFDYWGQGTLVTVSS 25
2D9(TA); VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIGVSTGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGPFDYWGQGTLVTVSS 27
4G8; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIG ASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQ GTKVEIK 29
4G8; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSS 31
4B3; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIY GAYIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQ GTKVEIK 33
4B3; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSS 35
4D6; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIQ GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFG QGTKVEIK 37
4D6; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSS 39
2C6; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQQIPPTFG QGTKVEIK 41
2C6; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSAGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGNFDYWGQGTLVTVSS 43
5H5; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGNQIPPTFG QGTKVEIK 45
5H5; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRRSPGKGLEWV SAISGGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFTPFDYWGQGTLVTVSS 47
2C4; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGNQIPPTFGQ GTKVEIK 49
2C4; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFTPFDYWGQGTLVTVSS 51
2D9; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGNQIPPTFG QGTKVEIK 67
2D9; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFTPFDYWGQGTLVTVSS 69
4B8; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFG QGTKVEIK 71
4B8; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSS 73
7A1; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQQIPPTFG QGTKVEIK 75
7A1; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGNFDYWGQGTLVTVSS 77
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Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
13C2; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQLIPPTFG QGTKVEIK 79
13C2; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGPFDYWGQGTLVTVSS 81
13E8; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGLNIPSTFG QGTKVEIK 83
13E8; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGPFDYWGQGTLVTVSS 85
14C10; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGHIIPPTFGQ GTKVEIK 87
14C10; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK AWMGPFDYWGQGTLVTVSS 89
17A11; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGLNIPSTFG QGTKVEIK 91
17A11; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGPFDYWGQGTLVTVSS 93
19G1; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 121
19G1; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIISSGGLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSS 123
20G8; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 125
20G8; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIIGSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSS 127
4B9; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 129
4B9; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSS 131
5B8; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 133
5B8; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIWGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 135
5F1; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 137
5F1; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIISSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSS 139
14B3; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 141
14B3; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAILASGAITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSS 143
16F1; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 145
16F1; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV 147
imagen38
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
SGIIGSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSS
16F8; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 149
16F8; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAILGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSS 151
O3C9; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 153
O3C9; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQSPGKGLEWV SAIIGSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSS 155
O2D7; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGTPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQAIMLPPTFG QGTKVEIK 157
O2D7; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSS 159
28H1; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIG ASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQ GTKVEIK 161
28H1; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWV SAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSS 163
22A3; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 165
22A3; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIIGSGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSS 167
29B11; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIK 169
29B11; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIIGSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSS 171
23C10; VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIG ASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQ GTKVEIK 173
23C10; VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWV SAISTNGNYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSS 175
2B10_C3B6; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 177
2B10_C3B6; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GAIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLY GYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 179
2B10_6A12; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 181
2B10_6A12; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GVIIPILGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLY GYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 183
2B10_C3A6; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAPKRLIYD SSSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 185
2B10_C3A6; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 187
2B10_D1A2_w t; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAPKRLIYD AYSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ 189
imagen39
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
GTKVEIK
2B10_D1A2_w t; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 191
2B10_D1A2_V D; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYD AYSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 193
2B10_D1A2_V D; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 195
2B10_O7D8; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNVLGWYQQKPGKAPKRLIYD VSSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 197
2B10_O7D8; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 199
2B10_O1F7; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAPKRLIYD ASSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 201
2B10_O1F7; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 203
2B10_6H10; VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAPKRLIQA ATSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIK 205
2B10_6H10; VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 207
MHLG1; VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEW VAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYY CTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS 257
KV9; VL
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPRPLIYS ASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGG GTKVEIKRT 259
MHLG; VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEW VAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYY CTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS 261
KV1; VL
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNVDTNLAWYQQKPGKAPKLLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEI KRT 269
KV7; VL
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKPLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEI KRT 271
TABLA 4:
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
Fab de cadena pesada derivado del anticuerpo monoclonal L19-variante C125A de Fab de cadena pesada de IL2 derivado del anticuerpo monoclonal L19
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWV SSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK PFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKKT QLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEE ELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETAT IVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCD 95
Fab de cadena ligera derivada del
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY YASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK 96
imagen40
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
anticuerpo monoclonal L19
VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19-línker de 8 aminoácidosvariante C125A de IL2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWV SSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK PFPYFDYWGQGTLVTVSSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEISVLSSSSGSSSSGSSS SGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKK ATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSET TFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT 97
Proteína F16-
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWV 98
diacuerpo-IL2
SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK AHNAFDYWGQGTLVTVSSASGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSL RSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGA QAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGA PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATE LKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFM CEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
scFv-IL2-scFv (F16, proteína)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK AHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALG QTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSS GSSSSGSSSSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRM LTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINV IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGG GSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQA PVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVY TMPPVVFGGGTKLTVLGSGGGSGGGSGGGSGSEVQLLESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLV TVS 99
Fab-IL2-Fab (F16, constructo de fusión de cadena pesada y citoquina, proteína)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK AHNAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSSSSGSSSSGSSSSGAPTSSSTKKTQ LQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEE LKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI VEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCD 100
F16, cadena
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYG 101
ligera,
KNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVF
proteína
GGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQV THEGSTVEKTVAPTECS
proteína de
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDG 102
fusión IL2R-β-
ALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTT
Fc(ojal),
VDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNIS
proteína
WEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPD TQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTGAQDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IL2R-γFc(botón), proteína
MLKPSLPFTSLLFLQLPLLGVGLNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSV STLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSDNDKVQ KCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQATQMLKLQN 103
imagen41
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
LVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQYRTDWDHSWTE QSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWG SNTSKENPFLFALEAGAQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
anticuerpo
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWV 104
L19 Fab-IL12-
SSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
Fab, scIL12
PFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD
murino,
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
proteína
ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAMWELEKDV YVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVK EFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAP NYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLD QRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIK PDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPRSYFSLKFFVRIQRKKEKM KETEEGCNQKGAFFVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACV PCRVRSGGDGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVK TAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSS TTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIIL DKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTR VVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCD
anticuerpo
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWV 105
L19 Fab-IL12-
SSIRGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
Fab scIL12
PFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD
humano,
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
proteína
ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGIWELKKDVYV VELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEF GDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE AKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVR GDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDI IKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKS KREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGG GGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKAR QTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNG SCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQN MLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDR VMSYLNASGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSIRGSSGTTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
anticuerpo
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWV 106
L19 Fab-
SSIRGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
GMCSF-Fab,
PFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD
GM-CSF
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
humano,
ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPARSPSPST
proteína
QPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLE LYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLK DFLLVIPFDCWEPVQESGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSIRGSSGTTYYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCD
Fab-IFNα2-Fab, anticuerpo
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWV SSIRGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK PFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD 107
imagen42
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
L19, proteína
YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGCDLPQTHSLG NRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMI QQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPL MNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQERL RRKESGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSIRGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
Fab-IL2-Fab 3F2 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSST KKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQC LEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCD 209
Fab-IL2-Fab 4G8 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKK TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA TIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCD 211
Fab-IL2-Fab 3D9 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKGLEWV SAIGVSTGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKK TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA TIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKGLEWVSAIGVSTGSTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGPFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCD 213
Fab-IL2-Fab 2F11 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK WRWMMFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSST KKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQC LEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWRWMMFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCD 215
Fab-IL2-Fab 4B3
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK 217
imagen43
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
(constructo de
GWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK
fusión cadena
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT
pesada-
YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKK
citoquina)
TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA TIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCD
Fab-IL2-Fab 4G8 (IL-12 murina; constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAMWELEKD VYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITV KEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEA PNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTL DQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDI IKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPRSYFSLKFFVRIQRKKEK MKETEEGCNQKGAFFVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWA CVPCRVRSGGDGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDM VKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRET SSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQ IILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFS TRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGS LRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCD 219
Fab-IL2-Fab 28H1 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWV SAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKK TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA TIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCD 221
Fab-IL2-Fab 29B11 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIIGSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKK TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA TIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGGITYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCD 223
Fab-IL2-Fab 19G1 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIISSGGLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG WFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSSTKK TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE 225
imagen44
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA TIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIISSGGLTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCD
Fab-IL2-Fab 20G8 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIIGSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSST KKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQC LEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGSRTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCD 227
cadena ligera
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIN 229
de 3F2
VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
cadena ligera
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIG 231
de 4G8
ASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
cadena ligera
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY 233
de 3D9
GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQLIPPTFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
cadena ligera
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY 235
de 2F11
GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQYTPPTFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
cadena ligera
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIY 237
de 4B3
GAYIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
Fab-IL2-Fab 2B10 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARL YGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSS TKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYAD ETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGQVQLVQSGAEV KKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYA QKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYYGAFDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCD 239
Fab-IL2-Fab C3B6 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GAIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLY GYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSST KKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQC 241
imagen45
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
LEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGAIIPILGIANYAQ KFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYYGAFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCD
Fab-IL2-Fab 6A12 (constructo de fusión cadena pesadacitoquina)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GVIIPILGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLY GYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPTSSST KKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQC LEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGQVQLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPILGTANYAQ KFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYGYAYYGAFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCD 243
cadena ligera
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYA 245
de 2B10
ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
cadena ligera
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYD 247
de D1A2
AYSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
cadena ligera
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNVLGWYQQKPGKAPKRLIYD 249
de O7D8
VSSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGLQPATFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
MHLG1 Fab-
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEW 251
IL2-Fab
VAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYY
(constructo de
CTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA
fusión cadena
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS
pesada-
SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPT
citoquina)
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCE YADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESG GGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAEIRLKSN NFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTYGNYV GHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
cadena ligera
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPRPLIYS 253
de KV9
ASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
Fab-IL2-Fab MHLG (constructo de fusión de cadena pesadacitoquina)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEW VAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYY CTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSGGGGSGGGGSGGGGAPT SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCE YADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTSGGGGSGGGGSGGGGEVQLVESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAEIRLKSN NFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTYGNYV GHYFDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY 255
imagen46
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
cadena ligera de KV1
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNVDTNLAWYQQKPGKAPKLLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC 263
cadena ligera de KV7
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKPLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC 265
TABLA 5: TABLA 6:
Constructo
SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID nº
Ectodominio de FAP humana+etiquet a polilys+etiqueta his6
RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNI VLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSY TATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEF NDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQE VPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQ TWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIH YIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGS YPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRT DQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKY PLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKL LYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALA SGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMA RAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQN HGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH 53
Ectodominio de FAP murina+etiqueta poli-lys+etiqueta his6
RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPNWISEQEYLHQSEDDNIV FYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTA TYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGD PPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPDGKFLAYVEFND SDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHVGPMEV PVPEMIASSDYYFSWLTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWHA WECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIH YIKDTVENAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISIGN SPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLHDGRT DQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQFDRSK KYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDK FLHAVYRKLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGGYVSSLAL ASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMA RAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQN HGILSGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH 55
 6
ASTGETPNLGEVVVAEVGWDALKLNWTAPEGAYEYFFIQVQEADTVEAA QNLTVPGGLRSTDLPGLKAATHYTITIRGVTQDFSTTPLSVEVLTASGLNDI FEAQKIEWHEGTHHHHHH 57
TNC-A1 humano+etiquet a avi+etiqueta his6
EQAPELENLTVTEVGWDGLRLNWTAADQAYEHFIIQVQEANKVEAARNLT VPGSLRAVDIPGLKAATPYTVSIYGVIQGYRTPVLSAEASTASGLNDIFEAQ KIEWHEGTHHHHHH 59
TNC-A1 murino+etiqueta avi+etiqueta his6
ISEFGSSTEEVPSLENLTVTEAGWDGLRLNWTADDLAYEYFVIQVQEANN VETAHNFTVPGNLRAADIPGLKVATSYRVSIYGVARGYRTPVLSAETSTAS GLNDIFEAQKIEWHEGTHHHHHH 61
TNC-A4 humano+etiquet a avi+etiqueta his6
EDLPQLGDLAVSEVGWDGLRLNWTAADNAYEHFVIQVQEVNKVEAAQNL TLPGSLRAVDIPGLEAATPYRVSIYGVIRGYRTPVLSAEASTASGLNDIFEA QKIEWHEGTHHHHHH 63
TNC-A4 murino+etiqueta avi+etiqueta his6
ISEFGSLTEDLPQLGGLSVTEVSWDGLTLNWTTDDLAYKHFVVQVQEAN NVEAAQNLTVPGSLRAVDIPGLKADTPYRVSIYGVIQGYRTPMLSTDVSTA SGLNDIFEAQKIEWHEGTHHHHHH 65
imagen47
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
2B10; VL
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGA TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 4
2B10(GS); VL
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGA TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 6
2B10; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 8
2F11; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCGTCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGTATAC TCCCCCCACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 10
2F11(VI); V 
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGTATAC TCCCCCCACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 12
2F11; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACATGGCCGTATAT TACTGTGCGAAATGGAGATGGATGATGTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 14
2F11(MT); VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTATAT TACTGTGCGAAATGGAGATGGATGATGTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 16
3F2; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTATCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 18
3F2(YS); VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC 20
imagen48
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA
3F2; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 22
3D9, VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 24
3D9, VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 26
2D9(TA); VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 28
4G8; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCCGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCATTGGGGCCTCCACCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACGGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 30
4G8; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 32
4B3; V 
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAA TTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGCGCCTACATCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 34
4B3; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 36
imagen49
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
4D6; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAA CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCCAGGGCGCCTCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 38
4D6; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 40
2C6; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGGCT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCAGAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 42
2C6; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGGAGTGCTGGTTATACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGTTTGGGAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 44
5H5; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTAATCAGAT TCCCCCTACGTTCGGTCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 46
5H5; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATACCATGAGCTGGGTCCGCCGGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTGGTGGTAGGACATACTACGCAGACTCCG TGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG TATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTA CTGTGCGAAAGGTTGGTTTACGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGAA CCCTGGTCACCGTCTCGAGT 48
 L
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGTAA CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGTGCCTCCATTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCA GTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTG GAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTAATCAGATT CCCCCTACGTTCGGTCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 50
2C4; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGCGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG CTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATA TTACTGTGCGAAAGGTTGGTTTACGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 52
2D9; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC 68
imagen50
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTAATCAGAT TCCCCCTACGTTCGGTCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA
2D9; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGCGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG CTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATA TTACTGTGCGAAAGGTTGGTTTACGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 70
4B8; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 72
4B8; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 74
7A1; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCAGAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 76
7A1; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGTTTGGGAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 78
13C2; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 80
 H
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 82
13E8; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCTGAATAT TCCCTCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 84
13E8; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG 86
imagen51
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGTTGGGTCCGTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT
14C10; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCATATTAT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 88
14C10; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGCTTGGATGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 90
17A11; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCTGAATAT TCCCTCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 92
17A11; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGTTGGGTCCGTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 94
19G1; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 122
19G1; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCGATTATTAGTAGTGGTGGTCTCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 124
20G8; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 126
20G8; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTATTGGGAGTGGTAGTCGTACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC 128
imagen52
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC
4B9; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 130
4B9; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTGCTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 132
5B8; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 134
5B8; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTTGGGGTGGTGGTCGTAGCACATACTACGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG CTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATA TTACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAG GAACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 136
5F1; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 138
5F1; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTATTAGTAGTGGGGCTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 140
14B3; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 142
 H
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTTTGGCTAGTGGTGCGATCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 144
16F1; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG 146
imagen53
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA
16F1; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGGTATTATTGGTAGTGGTGGTATCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 148
16F8; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 150
16F8; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTCTTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 152
O3C9; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 154
O3C9; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT TTGCCATGAGCTGGGTCCGTCAGTCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTAGTAACACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 156
O2D7; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCACCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGCTATTATGCT TCCTCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 158
O2D7; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGTCC 160
28H1; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCCGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCATTGGGGCCTCCACCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT 162
imagen54
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA
28H1; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTC ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTTGGGCTAGTGGGGAGCAATACTACGCAGACTCCG TGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG TATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTA CTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGAA CCCTGGTCACCGTCTCGAGT 164
22A3; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 166
22A3; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTAGTATCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 168
29B11; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGTAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCAATGTGGGCTCCCGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTATTATGCT TCCCCCGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 170
29B11; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTATTGGTAGTGGTGGTATCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 172
23C10; VL
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCCGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCATTGGGGCCTCCACCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAA 174
23C10; VH
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT CTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTACTAATGGTAATTATACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATT ACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 176
2B10_C3B6; VL
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGA TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 178
 H
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT 180
imagen55
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGCTATCATCCCGATCCTTGGTATCGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA
2B10_6A12; VL
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGA TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 182
2B10_6A12; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ATGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGTGATCATCCCTATCCTTGGTACCGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 184
2B10_C3A6; VL
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTCGTAATGT TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGATTCGTCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 186
2B10_C3A6; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 188
2B10_D1A2_wt; VL
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGGATTCGTAATGT TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGATGCTTACAGCTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 190
2B10_D1A2_wt; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 192
2B10_D1A2_VD; VL
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGGATTCGTAATGA TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGATGCTTACAGCTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 194
2B10_D1A2_VD; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT 196
imagen56
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA
2B10_O7D8; VL
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTCGTAATGT TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGATGTGTCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 198
2B10_O7D8; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 200
2B10_O1F7; VL
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTCGTAATGT TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGATGCGTCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGC GGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCA GCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCCTGCAGAATGGTCTGCAGCC CGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 202
2B10_O1F7; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 204
2B10_6H10; VL
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTCGTAATGT TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCCAGGCTGCTACCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGC GGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCA GCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCC CGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAG 206
2B10_6H10; VH
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 208
MHLG1; VH
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCG GGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACT ATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTG GGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGC TGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGA ACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCC GTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGAC CACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT 258
KV9; VL
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGC GACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAA CGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCACCTAGGCCTCTG ATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGC GGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCA ACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCT CTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACG 260
MHLG; VH
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGCG GGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACT 262
imagen57
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
ATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTG GGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGC TGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGA ACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCC GTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGAC CACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT
KV1; VL
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGA CCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACTTAG CTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTCG GCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC CGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCG CAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGA GGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG 270
KV7; VL
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGC GACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAA CGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCCTCTGA TCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAA CCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTC TGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG 272
TABLA 7:
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
Ectodominio de FAP humana+etiqueta poli-lys+etiqueta his6
CGCCCTTCAAGAGTTCATAACTCTGAAGAAAATACAATGAGAGCACTC ACACTGAAGGATATTTTAAATGGAACATTTTCTTATAAAACATTTTTTCC AAACTGGATTTCAGGACAAGAATATCTTCATCAATCTGCAGATAACAAT ATAGTACTTTATAATATTGAAACAGGACAATCATATACCATTTTGAGTAA TAGAACCATGAAAAGTGTGAATGCTTCAAATTACGGCTTATCACCTGAT CGGCAATTTGTATATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTTTGGAGATACT CTTACACAGCAACATATTACATCTATGACCTTAGCAATGGAGAATTTGT AAGAGGAAATGAGCTTCCTCGTCCAATTCAGTATTTATGCTGGTCGCC TGTTGGGAGTAAATTAGCATATGTCTATCAAAACAATATCTATTTGAAA CAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAAATAACATTTAATGGAAGAGAA AATAAAATATTTAATGGAATCCCAGACTGGGTTTATGAAGAGGAAATGC TTGCTACAAAATATGCTCTCTGGTGGTCTCCTAATGGAAAATTTTTGGC ATATGCGGAATTTAATGATACGGATATACCAGTTATTGCCTATTCCTAT TATGGCGATGAACAATATCCTAGAACAATAAATATTCCATACCCAAAGG CTGGAGCTAAGAATCCCGTTGTTCGGATATTTATTATCGATACCACTTA CCCTGCGTATGTAGGTCCCCAGGAAGTGCCTGTTCCAGCAATGATAG CCTCAAGTGATTATTATTTCAGTTGGCTCACGTGGGTTACTGATGAAC GAGTATGTTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTCCAGAATGTTTCGGTCCTGT CTATATGTGACTTCAGGGAAGACTGGCAGACATGGGATTGTCCAAAGA CCCAGGAGCATATAGAAGAAAGCAGAACTGGATGGGCTGGTGGATTC TTTGTTTCAACACCAGTTTTCAGCTATGATGCCATTTCGTACTACAAAA TATTTAGTGACAAGGATGGCTACAAACATATTCACTATATCAAAGACAC TGTGGAAAATGCTATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATAAA TATATTCAGAGTAACACAGGATTCACTGTTTTATTCTAGCAATGAATTT GAAGAATACCCTGGAAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAAGC TATCCTCCAAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAGG TGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCGACTACGCCAAGTACTATGCA CTTGTCTGCTACGGCCCAGGCATCCCCATTTCCACCCTTCATGATGGA CGCACTGATCAAGAAATTAAAATCCTGGAAGAAAACAAGGAATTGGAA AATGCTTTGAAAAATATCCAGCTGCCTAAAGAGGAAATTAAGAAACTTG AAGTAGATGAAATTACTTTATGGTACAAGATGATTCTTCCTCCTCAATT TGACAGATCAAAGAAGTATCCCTTGCTAATTCAAGTGTATGGTGGTCC CTGCAGTCAGAGTGTAAGGTCTGTATTTGCTGTTAATTGGATATCTTAT CTTGCAAGTAAGGAAGGGATGGTCATTGCCTTGGTGGATGGTCGAGG AACAGCTTTCCAAGGTGACAAACTCCTCTATGCAGTGTATCGAAAGCT GGGTGTTTATGAAGTTGAAGACCAGATTACAGCTGTCAGAAAATTCAT AGAAATGGGTTTCATTGATGAAAAAAGAATAGCCATATGGGGCTGGTC CTATGGAGGATACGTTTCATCACTGGCCCTTGCATCTGGAACTGGTCT TTTCAAATGTGGTATAGCAGTGGCTCCAGTCTCCAGCTGGGAATATTA CGCGTCTGTCTACACAGAGAGATTCATGGGTCTCCCAACAAAGGATGA TAATCTTGAGCACTATAAGAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAATAT 54
imagen58
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
TTCAGAAATGTAGACTATCTTCTCATCCACGGAACAGCAGATGATAAT GTGCACTTTCAAAACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTCTGGTTAATGCA CAAGTGGATTTCCAGGCAATGTGGTACTCTGACCAGAACCACGGCTTA TCCGGCCTGTCCACGAACCACTTATACACCCACATGACCCACTTCCTA AAGCAGTGTTTCTCTTTGTCAGACGGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGGGC CACCACCATCACCATCAC
Ectodominio de FAP murina+etiqueta poli-lys+etiqueta his6
CGTCCCTCAAGAGTTTACAAACCTGAAGGAAACACAAAGAGAGCTCTT ACCTTGAAGGATATTTTAAATGGAACATTCTCATATAAAACATATTTTCC CAACTGGATTTCAGAACAAGAATATCTTCATCAATCTGAGGATGATAAC ATAGTATTTTATAATATTGAAACAAGAGAATCATATATCATTTTGAGTAA TAGCACCATGAAAAGTGTGAATGCTACAGATTATGGTTTGTCACCTGA TCGGCAATTTGTGTATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTCTGGCGATAT TCATACACAGCGACATACTACATCTACGACCTTCAGAATGGGGAATTT GTAAGAGGATACGAGCTCCCTCGTCCAATTCAGTATCTATGCTGGTCG CCTGTTGGGAGTAAATTAGCATATGTATATCAAAACAATATTTATTTGA AACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAAATAACTTATACTGGAAGAG AAAATAGAATATTTAATGGAATACCAGACTGGGTTTATGAAGAGGAAAT GCTTGCCACAAAATATGCTCTTTGGTGGTCTCCAGATGGAAAATTTTTG GCATATGTAGAATTTAATGATTCAGATATACCAATTATTGCCTATTCTTA TTATGGTGATGGACAGTATCCTAGAACTATAAATATTCCATATCCAAAG GCTGGGGCTAAGAATCCGGTTGTTCGTGTTTTTATTGTTGACACCACC TACCCTCACCACGTGGGCCCAATGGAAGTGCCAGTTCCAGAAATGAT AGCCTCAAGTGACTATTATTTCAGCTGGCTCACATGGGTGTCCAGTGA ACGAGTATGCTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTGCAGAATGTCTCAGTCCT GTCTATATGTGATTTCAGGGAAGACTGGCATGCATGGGAATGTCCAAA GAACCAGGAGCATGTAGAAGAAAGCAGAACAGGATGGGCTGGTGGAT TCTTTGTTTCGACACCAGCTTTTAGCCAGGATGCCACTTCTTACTACAA AATATTTAGCGACAAGGATGGTTACAAACATATTCACTACATCAAAGAC ACTGTGGAAAATGCTATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATA TATATATTCCGCGTAACACAGGATTCACTGTTTTATTCTAGCAATGAAT TTGAAGGTTACCCTGGAAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAA ACTCTCCTCCGAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAA GGTGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCTACAAAGCCAAGTACTATG CACTCGTCTGCTATGGCCCTGGCCTCCCCATTTCCACCCTCCATGATG GCCGCACAGACCAAGAAATACAAGTATTAGAAGAAAACAAAGAACTGG AAAATTCTCTGAGAAATATCCAGCTGCCTAAAGTGGAGATTAAGAAGC TCAAAGACGGGGGACTGACTTTCTGGTACAAGATGATTCTGCCTCCTC AGTTTGACAGATCAAAGAAGTACCCTTTGCTAATTCAAGTGTATGGTG GTCCTTGTAGCCAGAGTGTTAAGTCTGTGTTTGCTGTTAATTGGATAAC TTATCTCGCAAGTAAGGAGGGGATAGTCATTGCCCTGGTAGATGGTC GGGGCACTGCTTTCCAAGGTGACAAATTCCTGCATGCCGTGTATCGAA AACTGGGTGTATATGAAGTTGAGGACCAGCTCACAGCTGTCAGAAAAT TCATAGAAATGGGTTTCATTGATGAAGAAAGAATAGCCATATGGGGCT GGTCCTACGGAGGTTATGTTTCATCCCTGGCCCTTGCATCTGGAACTG GTCTTTTCAAATGTGGCATAGCAGTGGCTCCAGTCTCCAGCTGGGAAT ATTACGCATCTATCTACTCAGAGAGATTCATGGGCCTCCCAACAAAGG ACGACAATCTCGAACACTATAAAAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAG AATATTTCAGAAATGTAGACTATCTTCTCATCCACGGAACAGCAGATGA TAATGTGCACTTTCAGAACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTTTGGTTAAT GCACAAGTGGATTTCCAGGCGATGTGGTACTCTGACCAGAACCATGG TATATTATCTGGGCGCTCCCAGAATCATTTATATACCCACATGACGCAC TTCCTCAAGCAATGCTTTTCTTTATCAGACGGCAAAAAGAAAAAGAAAA AGGGCCACCACCATCACCATCAC 56
TNC-A2 humano+etiqueta avi+etiqueta his6
GCGTCCACCGGGGAAACCCCGAACCTGGGCGAAGTGGTGGTGGCGG AAGTGGGTTGGGATGCGCTGAAACTGAACTGGACCGCGCCGGAAGG CGCGTATGAATATTTTTTCATCCAGGTGCAGGAAGCGGATACCGTTGA AGCGGCGCAGAACCTGACCGTTCCGGGCGGTCTGCGTAGCACCGAT CTGCCGGGCCTGAAAGCGGCGACCCATTATACCATTACCATCCGTGG GGTGACCCAGGATTTTAGCACCACCCCGCTGTCTGTGGAAGTGCTGA CCGCTAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGG CACGAAGGTACCCATCACCATCACCACCAC 58
TNC-A1 humano+etiqueta avi+etiqueta his6
GAACAAGCCCCTGAGCTGGAAAACCTCACCGTGACTGAGGTTGGCTG GGATGGCCTCAGACTCAACTGGACCGCGGCTGACCAGGCCTATGAGC ACTTTATCATTCAGGTGCAGGAGGCCAACAAGGTGGAGGCAGCTCGG 60
imagen59
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
AACCTCACCGTGCCTGGCAGCCTTCGGGCTGTGGACATACCGGGCCT CAAGGCTGCTACGCCTTATACAGTCTCCATCTATGGGGTGATCCAGG GCTATAGAACACCAGTGCTCTCTGCTGAGGCCTCCACAGCTAGCGGC CTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGGTAC CCATCACCATCACCACCAC
TNC-A1 murino+etiqueta avi+etiqueta his6
ATTTCAGAATTCGGATCCAGCACCGAAGAAGTGCCGAGCCTGGAAAA CCTGACCGTGACCGAAGCGGGCTGGGATGGCCTGCGTCTGAACTGG ACCGCGGATGATCTGGCCTATGAATATTTTGTGATCCAGGTGCAGGAA GCGAACAACGTTGAAACCGCGCATAACTTTACCGTGCCGGGCAATCT GCGTGCGGCGGATATTCCGGGCCTGAAAGTGGCGACCAGCTATCGT GTGAGCATTTATGGCGTGGCGCGTGGCTATCGTACCCCGGTTCTGAG CGCGGAAACCAGCACCGCTAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTC AGAAAATCGAATGGCACGAAGGTACCCATCACCATCACCACCAC 62
TNC-A4 humano+etiqueta avi+etiqueta his6
GAAGATCTGCCGCAGCTGGGCGATCTGGCCGTGAGCGAAGTGGGCT GGGATGGCCTGCGTCTGAACTGGACCGCGGCGGATAACGCGTATGA ACATTTTGTGATTCAGGTGCAGGAAGTGAACAAAGTTGAAGCGGCGCA GAACCTGACCCTGCCGGGCAGCCTGCGTGCGGTGGATATTCCGGGC CTGGAAGCGGCGACCCCGTATCGTGTGAGCATCTATGGCGTGATTCG TGGCTATCGTACCCCGGTTCTGAGCGCGGAAGCGAGCACCGCTAGC GGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGG TACCCATCACCATCACCACCAC 64
TNC-A4 murino+etiqueta avi+etiqueta his6
ATTTCAGAATTCGGATCCCTGACCGAAGATCTGCCGCAGCTGGGCGG TCTGAGCGTGACCGAAGTGAGCTGGGATGGCCTGACCCTGAACTGGA CCACCGATGATCTGGCCTATAAACATTTTGTGGTGCAGGTGCAGGAAG CGAACAACGTTGAAGCGGCGCAGAACCTGACCGTTCCGGGTAGCCTG CGTGCGGTGGATATTCCGGGCCTGAAAGCGGATACCCCGTATCGTGT GAGCATTTATGGCGTGATTCAGGGCTATCGTACCCCGATGCTGTCTAC CGATGTGAGCACCGCTAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGA AAATCGAATGGCACGAAGGTACCCATCACCATCACCACCAC 66
TABLA 8.
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
Fab de cadena pesada derivado del anticuerpo monoclonal L19variante C125A de Fab de cadena pesada de IL2 derivado del anticuerpo monoclonal L19
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACA AGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGC GGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAG CATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAA GAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAA GAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAA ACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTA AGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTA AAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCA ACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCA TCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCT GGCGGTGGCGGAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGG TACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAA GGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTACCACAT ACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAAT TCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGA CACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGC 108
imagen60
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGG CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTG AGCCCAAATCTTGTGACTGA
Fab de cadena
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG 109
ligera derivado
GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG
del anticuerpo
CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC
monoclonal L19
TCATCTATTATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCA GTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTG GAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGACGGGTCGTATT CCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACA CAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19línker de 8 aminoácidosvariante C125A de IL2
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGTAGCGGCGGGAGCGGCGGGGCTAGCGAAA TTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCAT CTATTATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTG GCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGACGGGTCGTATTCCT CCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCTCCGTGCTGTCTTC CTCATCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCTCCGGAGCACCTA CTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCT GGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAA CTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACA GAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAG GAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGG GACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCT GAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTA GAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACAC TGACTTGA 110
ADN de F16diacuerpo-IL2
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCCGGT ATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGCGCATAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTGTCGAGTGCTAGCGGCGGATCGTCTGAGCTGACTC AGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACA TGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCA GAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCG GCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACA CAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGAC TATTACTGTAACTCCTCTGTTTATACTATGCCGCCCGTGGTATTCGGC GGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTTCCTCATCGGGTAGTAG CTCTTCCGGCTCATCGTCCTCCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAA GAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGAT TTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTC 111
imagen61
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
ACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTC AGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAG CTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATAT CAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTG TGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATG GATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGA
scFv-IL2-scFv
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG 112
(F16, ADN)
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCCGGT ATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGCGCATAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTGTCGAGAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGC TCTGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTC TGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCC TCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCC CCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCA GACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATC ACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCTC TGTTTATACTATGCCGCCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGA CCGTCCTAGGCTCTTCCTCATCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGT CCTCCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAAC TGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAA TTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATG CCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAA CTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTT CACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTG GAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAG ACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAA GCATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGG TGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTCACTCAGGACCCTGCTG TGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGAC AGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACA GGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGAT CCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGAC CATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACT CCTCTGTTTATACTATGCCGCCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAG CTTACCGTACTAGGCTCAGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTTCTGGCG GCGGTAGCGGATCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTT GGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTTAGCCGGTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCAC ATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAG GACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGCGCATAATGCTTTTGACTAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGTGA
Fab-IL2-Fab (F16, constructo de fusión de cadena pesadacitoquina, ADN)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCCGGT ATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGCGCATAATGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTGTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT GGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGT CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGC CCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACTCTTCCTCATCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCTCCGGA GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCAT TTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGA 113
imagen62
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
ATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAA GGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACC TCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGA CCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAG GGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACC ATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAGCATCATCT CAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCTGG CGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTA CAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAC CTTTAGCCGGTATGGTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATAC TACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTC CAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACA CGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGCGCATAATGCTTTTGACTACTGGG GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCC ATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG CCCAAATCTTGTGACTGA
F16, cadena
TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACA 114
ligera, ADN
GACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATG CAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATC TATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGG CTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGG CGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCTCTGTTTATACTATGC CGCCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAA CCCAAGGCTGCCCCCAGCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCAGCGAGG AACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTCTGCCTGATCAGCGACTTC TACCCAGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCCCG TGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAA CAAGTACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGG AAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCA CCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCACCGAGTGCAGCTGA
proteína de fusión IL2R-β-Fc(ojal), ADN
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGCCTCCTGCTGCTCTG GTTCCCAGGTGCCAGGTGTGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACAT GCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATG GGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGA CGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATC CTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGA CCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTG CGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCT TCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCC ACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCCACTACTTTG AAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACAC CTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGG ATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGT GCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGG AGCCAGCCCCTGGCCTTCAGAACAAAGCCTGCAGCCCTTGGGAAGGA CACCGGAGCTCAGGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC CTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC 115
imagen63
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
IL2R-γ-Fc(botón), ADN
ATGTTGAAGCCATCATTACCATTCACATCCCTCTTATTCCTGCAGCTGC CCCTGCTGGGAGTGGGGCTGAACACGACAATTCTGACGCCCAATGGG AATGAAGACACCACAGCTGATTTCTTCCTGACCACTATGCCCACTGAC TCCCTCAGTGTTTCCACTCTGCCCCTCCCAGAGGTTCAGTGTTTTGTG TTCAATGTCGAGTACATGAATTGCACTTGGAACAGCAGCTCTGAGCCC CAGCCTACCAACCTCACTCTGCATTATTGGTACAAGAACTCGGATAAT GATAAAGTCCAGAAGTGCAGCCACTATCTATTCTCTGAAGAAATCACTT CTGGCTGTCAGTTGCAAAAAAAGGAGATCCACCTCTACCAAACATTTG TTGTTCAGCTCCAGGACCCACGGGAACCCAGGAGACAGGCCACACAG ATGCTAAAACTGCAGAATCTGGTGATCCCCTGGGCTCCAGAGAACCTA ACACTTCACAAACTGAGTGAATCCCAGCTAGAACTGAACTGGAACAAC AGATTCTTGAACCACTGTTTGGAGCACTTGGTGCAGTACCGGACTGAC TGGGACCACAGCTGGACTGAACAATCAGTGGATTATAGACATAAGTTC TCCTTGCCTAGTGTGGATGGGCAGAAACGCTACACGTTTCGTGTTCG GAGCCGCTTTAACCCACTCTGTGGAAGTGCTCAGCATTGGAGTGAAT GGAGCCACCCAATCCACTGGGGGAGCAATACTTCAAAAGAGAATCCT TTCCTGTTTGCATTGGAAGCCGGAGCTCAGGACAAAACTCACACATGC CCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGA 116
anticuerpo L19 Fab-IL12-Fab scIL12 murino, ADN
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCTATTTCCGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACA AGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGGGGC GGAGCCATGTGGGAGCTGGAAAAGGACGTGTACGTGGTGGAGGTGG ACTGGACCCCCGACGCCCCTGGCGAGACAGTGAACCTGACCTGCGA CACCCCCGAAGAGGACGACATCACCTGGACCAGCGACCAGCGGCAC GGCGTGATCGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCACCGTGAAAGAGTT TCTGGACGCCGGCCAGTACACCTGCCACAAGGGCGGCGAGACACTG AGCCACAGCCACCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGAACGGCATCTGGTC CACCGAGATCCTGAAGAACTTCAAGAACAAGACCTTCCTGAAGTGCGA GGCCCCCAACTACAGCGGCCGGTTCACCTGCAGCTGGCTGGTGCAG CGGAACATGGACCTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGCAGCAGCCCCCC TGACAGCAGGGCCGTGACCTGCGGCATGGCCAGCCTGAGCGCCGAG AAGGTGACCCTGGACCAGAGGGACTACGAGAAGTACAGCGTGAGCTG CCAGGAAGATGTCACCTGCCCCACCGCCGAGGAAACCCTGCCCATCG AGCTGGCCCTGGAAGCCCGGCAGCAGAACAAGTACGAGAACTACTCT ACCAGCTTCTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGACCCCCCCAAGAA CCTGCAGATGAAGCCCCTGAAGAACAGCCAGGTGGAGGTGTCCTGG 117
imagen64
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GAGTACCCTGACAGCTGGTCCACCCCCAGAAGCTACTTCAGCCTGAA GTTCTTCGTGAGAATCCAGCGGAAGAAAGAAAAGATGAAAGAGACAG AGGAAGGCTGCAACCAGAAGGGCGCCTTCTTCGTCGAGAAAACCAGC ACCGAGGTGCAGTGCAAGGGCGGCAACGTGTGCGTGCAGGCCCAGG ACCGGTACTACAACAGCAGCTGCAGCAAGTGGGCCTGCGTGCCCTGC AGAGTGCGGTCTGGCGGCGACGGCTCTGGCGGCGGAGGAAGCGGC GGAGGGGGCAGCAGAGTGATCCCCGTGAGCGGCCCTGCCCGGTGCC TGAGCCAGAGCCGGAACCTGCTGAAAACCACCGACGACATGGTGAAA ACCGCCAGAGAGAAGCTGAAGCACTACAGCTGCACAGCCGAGGACAT CGACCACGAGGACATCACCCGGGACCAGACCAGCACCCTGAAAACCT GCCTGCCCCTGGAACTGCACAAAAACGAGAGCTGCCTGGCCACCCG GGAGACAAGCAGCACCACCCGGGGCAGCTGCCTGCCTCCCCAGAAA ACCTCCCTGATGATGACCCTGTGCCTGGGCAGCATCTACGAGGACCT GAAGATGTACCAGACCGAGTTCCAGGCCATCAACGCCGCCCTGCAGA ACCACAATCACCAGCAGATCATCCTGGACAAGGGCATGCTGGTCGCC ATCGACGAGCTGATGCAGAGCCTGAACCACAACGGCGAAACCCTGCG GCAGAAACCCCCCGTGGGCGAGGCCGACCCCTACCGGGTGAAGATG AAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCAGCACCCGGGTGGTGACCAT CAACCGGGTGATGGGCTACCTGTCCTCTGCCGGGGGAGGGGGATCC GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAGCTGTTGGAGT CTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTTCCGGTA GTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACC ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCC GTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTG CTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAG AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCC AGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA
anticuerpo L19 Fab-IL12-Fab scIL12 humano, ADN
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACA AGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGGGGC GGAATCTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTG GTATCCCGACGCCCCTGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACC CCCGAAGAGGACGGCATCACCTGGACCCTGGACCAGAGCAGCGAGG TGCTGGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCCAGGTGAAAGAGTTCGGC GACGCCGGCCAGTACACCTGCCACAAGGGCGGCGAAGTGCTGTCCC ACAGCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGGATGGCATCTGGTCCACC GACATCCTGAAGGACCAGAAAGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGCG GTGCGAGGCCAAGAACTACAGCGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGA CCACCATCAGCACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGAGCAGCCGGGG CAGCAGCGACCCTCAGGGCGTGACCTGCGGAGCCGCCACCCTGAGC GCCGAGAGAGTGCGGGGCGACAACAAAGAGTACGAGTACAGCGTCG AGTGCCAGGAAGATAGCGCCTGCCCTGCCGCCGAGGAAAGCCTGCC CATCGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAACT ACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGACCCCCCC AAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACAGCCGGCAGGTGGAGG 118
imagen65
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
TGTCCTGGGAGTACCCTGACACCTGGTCCACCCCCCACAGCTACTTC AGCCTGACATTCTGTGTGCAGGTGCAGGGCAAGAGCAAGCGGGAGAA GAAAGACCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGCGCCACCGTGATCTGCC GGAAGAACGCCAGCATCAGCGTGCGGGCCCAGGACCGGTACTACAG CAGCTCCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGCAGCGGCGGAGGG GGCTCTGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCCGGAACCTG CCCGTGGCCACCCCCGACCCCGGCATGTTCCCCTGCCTGCACCACA GCCAGAACCTGCTGCGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAGGCCCG GCAGACCCTGGAATTCTACCCCTGCACCAGCGAGGAAATCGACCACG AGGACATCACCAAGGATAAGACCAGCACCGTGGAGGCCTGCCTGCCC CTGGAACTGACCAAGAACGAGAGCTGCCTGAACAGCCGGGAGACAAG CTTCATCACCAACGGCAGCTGCCTGGCCAGCAGAAAGACCAGCTTCA TGATGGCCCTGTGCCTGAGCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTAC CAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAA GCGGCAGATCTTCCTGGATCAGAACATGCTGGCCGTGATCGACGAGC TGATGCAGGCCCTGAACTTCAACAGCGAGACAGTGCCCCAGAAGTCC AGCCTGGAAGAGCCCGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCAT CCTGCTGCACGCCTTCAGAATCCGGGCCGTGACCATCGACCGGGTGA TGAGCTACCTGAACGCCAGCGGAGGGGGGGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGG CTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTG GATTCACCTTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACC ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGA CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGA GGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTA CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGG GGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA CCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTT GAGCCCAAATCTTGTGACTGA
anticuerpo L19 Fab-GMCSF-Fab GM-CSF humano, ADN
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACA AGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGC GGAGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGC ATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGA GACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATG TTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTA CAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTG ACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGA AACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAAC CTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTC CAGGAGTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTT AGCAGTTTTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGTGGGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGC AGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGA ACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC 119
imagen66
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GTATATTACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAG GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGT CTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACTGA
Fab-IFNα2-Fab, anticuerpo L19, ADN
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTT TTTCGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCTATTAGAGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAACCGTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACC CTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACA AGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGGGGC GGATGCGACCTGCCCCAGACCCACAGCCTGGGCAACAGACGGGCCC TGATCCTGCTGGCCCAGATGCGGCGGATCAGCCCCTTCAGCTGCCTG AAGGACCGGCACGACTTCGGCTTCCCCCAGGAAGAGTTCGACGGCAA CCAGTTCCAGAAGGCCCAGGCCATCAGCGTGCTGCACGAGATGATCC AGCAGACCTTCAACCTGTTCAGCACCAAGGACAGCAGCGCCGCCTGG GACGAGAGCCTGCTGGAAAAGTTCTACACCGAGCTGTACCAGCAGCT GAACGACCTGGAAGCCTGCGTGATCCAGGAAGTGGGCGTCGAGGAA ACCCCCCTGATGAACGTGGACAGCATCCTGGCCGTGAAGAAGTACTT CCAGCGGATCACCCTGTACCTGACCGAGAAGAAGTATAGCCCCTGCG CCTGGGAGGTGGTGCGGGCCGAGATCATGCGGAGCTTCAGCCTGAG CACCAACCTGCAGGAACGGCTGCGGCGGAAAGAGAGCGGCGGAGGG GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAGCTGT TGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTTTTCGATGAGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTA GAGGTAGTTCGGGTACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGG TTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATG AACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACC GTTTCCGTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC GAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCT CCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAA GGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCC TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA 120
Fab-IL2-Fab 3F2 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTTTAACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATC 210
imagen67
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
TTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGT GGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTG GAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATT ACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCC CAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACT CAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCA CTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGA ACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGAC AGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAG CATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGG CTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG GATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCA GGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAG CACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAG ACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGTGGTTTGGTGGTTT TAACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCA CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAG AAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA
Fab-IL2-Fab 4G8
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG 212
(constructo de
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT
fusión cadena
ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
pesada-citoquina)
GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGT GGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTG GAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATT ACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCC CAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACT CAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCA CTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGA ACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGAC AGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAG CATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGG CTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG GATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCA GGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAG CACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAG ACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTT TGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCA CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAG AAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA
imagen68
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
Fab-IL2-Fab 3D9
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG 214
(constructo de
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT
fusión cadena
ATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
pesada-citoquina)
GGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGTTGGCTGGGTCCTTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGT GGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTG GAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATT ACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCC CAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACT CAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCA CTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGA ACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGAC AGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAG CATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGG CTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG GATTCACCTTTAGCAGTTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTGGTGTTAGTACTGGTAGC ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGA CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCG AGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTTGGCTGGGTCCTTTT GACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC CGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC GTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGA AAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA
Fab-IL2-Fab 2F11 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTATAT TACTGTGCGAAATGGAGATGGATGATGTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGT GGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTG GAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATT ACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCC CAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACT CAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCA CTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGA ACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGAC AGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAG CATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGG 216
imagen69
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
CTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG GATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCA GGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAG CACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAG ACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACCGCCGTATATTACTGTGCGAAATGGAGATGGATGATGTTT GACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC CGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC GTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGA AAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA
Fab-IL2-Fab 4B3
GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG 218
(constructo de
GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTT
fusión cadena
ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
pesada-citoquina)
GGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGC TGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATAT TACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTTTGACTACTGGGGCCAAGG AACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGT GGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTG GAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATT ACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCC CAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACT CAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCA CTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGA ACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGAC AGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTGCCCAAAG CATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCCGGCGGAGGTG GCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGG CTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCG GATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCA GGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAG CACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAG ACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCC GAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGTGGCTGGGTAATTT TGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCA CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAG AAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA
Fab-IL2-Fab 4G8 (IL-12 murina; constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCG GCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAG CTACGCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAAT GGGTGTCCGCCATCAGCGGCAGCGGCGGCAGCACCTACTACGCCGA CAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACA CCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGCCA GGGCACTCTGGTCACAGTGTCTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGG TCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG 220
imagen70
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGA ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAAT CTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTGGCTCCGGAG GGGGCGGAGCCATGTGGGAGCTGGAAAAGGACGTGTACGTGGTGGA GGTGGACTGGACCCCCGACGCCCCTGGCGAGACAGTGAACCTGACC TGCGACACCCCCGAAGAGGACGACATCACCTGGACCAGCGACCAGC GGCACGGCGTGATCGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCACCGTGAA AGAGTTTCTGGACGCCGGCCAGTACACCTGCCACAAGGGCGGCGAG ACACTGAGCCACAGCCACCTGCTGCTGCACAAGAAAGAGAACGGCAT CTGGTCCACCGAGATCCTGAAGAACTTCAAGAACAAGACCTTCCTGAA GTGCGAGGCCCCCAACTACAGCGGCCGGTTCACCTGCAGCTGGCTG GTGCAGCGGAACATGGACCTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGCAGCAG CCCCCCTGACAGCAGGGCCGTGACCTGCGGCATGGCCAGCCTGAGC GCCGAGAAGGTGACCCTGGACCAGAGGGACTACGAGAAGTACAGCG TGAGCTGCCAGGAAGATGTCACCTGCCCCACCGCCGAGGAAACCCTG CCCATCGAGCTGGCCCTGGAAGCCCGGCAGCAGAACAAGTACGAGA ACTACTCTACCAGCTTCTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGACCCCC CCAAGAACCTGCAGATGAAGCCCCTGAAGAACAGCCAGGTGGAGGTG TCCTGGGAGTACCCTGACAGCTGGTCCACCCCCAGAAGCTACTTCAG CCTGAAGTTCTTCGTGAGAATCCAGCGGAAGAAAGAAAAGATGAAAGA GACAGAGGAAGGCTGCAACCAGAAGGGCGCCTTCTTCGTCGAGAAAA CCAGCACCGAGGTGCAGTGCAAGGGCGGCAACGTGTGCGTGCAGGC CCAGGACCGGTACTACAACAGCAGCTGCAGCAAGTGGGCCTGCGTG CCCTGCAGAGTGCGGTCTGGCGGCGACGGCTCTGGCGGCGGAGGAA GCGGCGGAGGGGGCAGCAGAGTGATCCCCGTGAGCGGCCCTGCCC GGTGCCTGAGCCAGAGCCGGAACCTGCTGAAAACCACCGACGACATG GTGAAAACCGCCAGAGAGAAGCTGAAGCACTACAGCTGCACAGCCGA GGACATCGACCACGAGGACATCACCCGGGACCAGACCAGCACCCTG AAAACCTGCCTGCCCCTGGAACTGCACAAAAACGAGAGCTGCCTGGC CACCCGGGAGACAAGCAGCACCACCCGGGGCAGCTGCCTGCCTCCC CAGAAAACCTCCCTGATGATGACCCTGTGCCTGGGCAGCATCTACGA GGACCTGAAGATGTACCAGACCGAGTTCCAGGCCATCAACGCCGCCC TGCAGAACCACAATCACCAGCAGATCATCCTGGACAAGGGCATGCTG GTCGCCATCGACGAGCTGATGCAGAGCCTGAACCACAACGGCGAAAC CCTGCGGCAGAAACCCCCCGTGGGCGAGGCCGACCCCTACCGGGTG AAGATGAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCAGCACCCGGGTGGT GACCATCAACCGGGTGATGGGCTACCTGTCCTCTGCCGGGGGAGGG GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAGGTGCAATTGC TGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACT GAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGTCTT GGGTCCGCCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCAT CAGCGGCAGCGGCGGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCA GATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCA AGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACTCTGGT CACAGTGTCTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACT CAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACA GTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACTGA
Fab-IL2-Fab 28H1 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCG GATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCC CACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATG GGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTG TGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTG TACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGGGGACAGGGC ACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCTCCGTGTT CCCCCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCCGCTC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCC TGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTTCCAGCCGT 222
imagen71
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGC CCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTG CGACAGTGGTGGGGGAGGATCTGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGT GGCGCTCCTACATCCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTCCAGCTGGA ACATCTCCTGCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAACTA CAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCC CAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAAC TGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGGCCCAGTCCAAGAACTTC CACCTGAGGCCTCGGGACCTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCT GGAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACG AGACAGCTACCATCGTGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCGCCC AGTCCATCATCTCCACCCTGACCTCCGGTGGTGGCGGATCCGGGGGA GGGGGTTCTGGCGGAGGCGGAGAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCG GAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGG CTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCCTCCGG CGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCC GGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGG GCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCA ACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCCGCC TCTACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTC TACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACTGA
Fab-IL2-Fab 29B11 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCG GATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCT ACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGG GTGTCCGCCATCATCGGCTCCGGCGGCATCACCTACTACGCCGACTC TGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCC TGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGTGCCAAGGGCTGGTTCGGAGGCTTCAACTACTGGGGACAGGG CACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCTCCGTGT TCCCCCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTC CTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTTCCAGCCG TGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTG CCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCA CAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCT GCGACAGTGGTGGGGGAGGATCTGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGG TGGCGCTCCTACATCCTCCAGCACCAAGAAAACCCAGCTCCAGCTGG AACATCTCCTGCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAACT ACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGC CCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTGCAGTGCCTGGAAGAGGAA CTGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGGCCCAGTCCAAGAACTT CCACCTGAGGCCTCGGGACCTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGC TGGAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTACGCCGAC GAGACAGCTACCATCGTGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCGC CCAGTCCATCATCTCCACCCTGACCTCCGGTGGTGGCGGATCCGGGG GAGGGGGTTCTGGCGGAGGCGGAGAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGG CGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCC GCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCTATGCCATGTCCTGGGTCCGACA GGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGCTCC GGCGGCATCACCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCC TGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGTT CGGAGGCTTCAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCT CCGCCTCTACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGC AAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG 224
imagen72
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCAC CCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGG TGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACTGA
Fab-IL2-Fab 19G1 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCG GCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGC TACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAAT GGGTGTCCGCCATCATCAGCTCTGGCGGCCTGACCTACTACGCCGAC AGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACA GGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC CGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCG TGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCA GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCA CCGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAA GAGCTGCGACTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGAGGCTCCGGA GGCGGAGGCGCTCCTACTAGCAGCTCCACCAAGAAAACCCAGCTCCA GCTGGAACATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCA ACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCT ACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAACATCTGCAGTGCCTGGAA GAGGAACTGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGGCCCAGAGCAA GAACTTCCACCTGAGGCCCAGGGACCTGATCAGCAACATCAACGTGA TCGTGCTGGAACTGAAGGGCAGCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTAC GCCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAATTTCTGAACCGGTGGATCAC CTTCGCCCAGAGCATCATCAGCACCCTGACAAGCGGAGGCGGCGGAT CCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGAGGAGGCGAGGTCCAGCTGCTCG AAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTC TTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGG TCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATC AGCTCTGGCGGCCTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGT TCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGG GATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACA GTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCC CCAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCT GGTCAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCG GAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTAGCTCTA GCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACTGA 226
Fab-IL2-Fab 20G8 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCG GCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGC TACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAAT GGGTGTCCGCCATCATCGGCTCTGGCAGCCGGACCTACTACGCCGAC AGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTG TACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACA GGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGACCCAGC GTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGC CGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCG TGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCA GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCA CCGTGCCTAGCTCTAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAA GAGCTGCGACTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGAGGCTCCGGA GGCGGAGGCGCTCCTACTAGCAGCTCCACCAAGAAAACCCAGCTCCA GCTGGAACATCTGCTGCTGGATCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCA ACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCCGGATGCTGACCTTCAAGTTCT ACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAACATCTGCAGTGCCTGGAA GAGGAACTGAAGCCTCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGGCCCAGAGCAA GAACTTCCACCTGAGGCCCAGGGACCTGATCAGCAACATCAACGTGA TCGTGCTGGAACTGAAGGGCAGCGAGACAACCTTCATGTGCGAGTAC 228
imagen73
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GCCGACGAGACAGCCACCATCGTGGAATTTCTGAACCGGTGGATCAC CTTCGCCCAGAGCATCATCAGCACCCTGACAAGCGGAGGCGGCGGAT CCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGAGGAGGCGAGGTCCAGCTGCTCG AAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTC TTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGG TCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATC GGCTCTGGCAGCCGGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGT TCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGG GATGGTTCGGCGGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACA GTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCC CCAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCT GGTCAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCG GAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAG CAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTAGCTCTA GCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACTGA
cadena ligera de 3F2
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGAGCCCTGG CGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGACCTCCT CCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCT GCTGATCAACGTGGGCAGTCGGAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGG TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCG GCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCATCA TGCTGCCCCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGT ACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCA GCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCT ACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCA GTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACA GCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTAC GAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTC CAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGATGA 230
cadena ligera de 4G8
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGAGCCCTGG CGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGTCCCGGT CCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCT GCTGATCATCGGCGCCTCTACCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGT TCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGG CTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGT CATCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTA CGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAG CTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTA CCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG TCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAG CACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACG AGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCC AGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGATGA 232
cadena ligera de 3D9
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGCTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGG TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTA CAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCC GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 234
cadena ligera de 2F11
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAG CTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT 236
imagen74
Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGTATAC TCCCCCCACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGG TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTA CAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCC GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
cadena ligera de 4B3
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAA TTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGCGCCTACATCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTC AGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACT GGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGGGTCAGGTTAT TCCCCCTACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGG TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTA CAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCC GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 238
Fab-IL2-Fab 2B10 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTT GAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTG GCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACA CAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATG GAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAA GTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCT AGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAG CAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTA ATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATG CTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCT TTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCC GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGACAGGTGCAATTGGTGCAGT CTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTG CAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCATCCC TATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCAC CATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTAC GGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCAC CGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTC CAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACT GA 240
Fab-IL2-Fab
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC 242
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Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
C3B6 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGCTATCATCCCGATCCTTGGTATCGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTT GAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTG GCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACA CAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATG GAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAA GTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCT AGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAG CAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTA ATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATG CTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCT TTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCC GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGACAGGTGCAATTGGTGCAGT CTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTG CAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCTACGCTATAAGCTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGCTATCATCCC GATCCTTGGTATCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCA CCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTA CGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCA CCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC CTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCT CCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC TGA
Fab-IL2-Fab 6A12 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCT ATGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGAGTGATCATCCCTATCCTTGGTACCGCAAACTACGCACAGAA GTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTAC TGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTT GAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGGTG GCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACA CAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATG GAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAA GTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCT AGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAG CAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTA ATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATG CTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCT TTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGATCC GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGACAGGTGCAATTGGTGCAGT 244
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Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
CTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTG CAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGCAGCTATGCTATAAGCTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGTGATCATCCCT ATCCTTGGTACCGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCAC CATTACTGCAGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCA GCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTAC GGTTACGCTTACTACGGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCAC CGTGACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTC CAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACT GA
cadena ligera de 2B10
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGAAATGA TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 246
cadena ligera de D1A2
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGGATTCGTAATGA TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGATGCTTACAGCTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 248
cadena ligera de O7D8
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGA GACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTCGTAATGT TTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGA TCTATGATGTGTCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCG GCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCTTGCAG CCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGAATGGTCTGCAGCCC GCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAGATCAAGCGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 250
Fab-IL2-Fab MHLG1 (constructo de fusión cadena pesada-citoquina)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCG GGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACT ATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTG GGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGC TGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGA ACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCC GTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGAC 252
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Constructo
SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID nº
CACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGTGCTAGCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAG TTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGG TGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAA CACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAA TGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTT AAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGT CTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAA AGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAAC GTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAAT ATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTA CCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGA TCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAAGTGCAGCTGGTGG AGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTC CTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGT GCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGA TTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCA GATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCA CATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGG ACCACCGTCACCGTCTCCAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTT GTGACTGA
cadena ligera de KV9
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGC GACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAA CGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCACCTAGGCCTCTG ATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGC GGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCA ACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCT CTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 254
Fab-IL2-Fab MHLG (constructo de fusión de cadena pesada-citoquina)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGCG GGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACT ATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTG GGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGC TGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGA ACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCC GTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGAC CACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGTGCTAGCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAG TTGAGCCCAAATCTTGTGACTCCGGCGGAGGAGGGAGCGGCGGAGG TGGCTCCGGAGGTGGCGGAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAA CACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAA 256
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TGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTT AAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGT CTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAA AGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAAC GTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAAT ATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTA CCTTTGCCCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTCCGGCGGAGGAGGA TCCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAGAAGTGCAGCTGGTGG AGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTC CTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGT GCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGA TTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCA GATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCA CATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGG ACCACCGTCACCGTCTCCAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGATAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTT GTGACTGA
cadena ligera de KV1
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGA CCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACTTAG CTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTCG GCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC CGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCG CAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGA GGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCAT CTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTG GATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGG ACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 264
cadena ligera de KV7
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGA CCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTG GCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCCTCTGATCTATTC GGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGA TCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTT CGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCG GAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTT CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGT GTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 266
Células huésped
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “célula huésped” se refiere a cualquier tipo de sistema
5 celular que puede manipularse para generar los inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos. En una realización, la célula huésped se manipula para permitir la producción de un fragmento de inmunoconjugado. Entre las células huésped se incluyen las células en cultivo, por ejemplo las células en cultivo de mamífero, tales como células CHO, HEK, BH, NS0, Sp2/0, de mieloma YO, de mieloma de ratón P3X63, PER, PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, de insecto, bacterianas y vegetales, entre otras, aunque también células
10 comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en cultivo. En una realización, la célula huésped de la invención comprende un vector de expresión que comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos. Las células huésped de la invención pueden ser eucarióticas o procarióticas.
15 Purificación de polipéptidos de inmunoconjugado y fragmentos de los mismos Los inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos pueden purificarse mediante técnicas conocidas, tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento, la cromatografía de intercambio iónico, la electroforesis en gel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales utilizadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, etc., y resultarán evidentes para el experto en la materia.
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Para la purificación mediante cromatografía de afinidad, puede utilizarse una matriz con proteína A o con proteína G. Alternativamente, para la purificación mediante cromatografía de afinidad, puede utilizarse cualquier anticuerpo que se una específicamente a la fracción efectora de cadena sencilla del inmunoconjugado. Para la producción de anticuerpos, diversos animales huésped, incluyendo, aunque sin limitación, conejos, ratones, ratas, etc., pueden inmunizarse mediante inyección con un inmunoconjugado de la invención o un fragmento del mismo. El inmunoconjugado puede unirse a un portador adecuado, tal como albúmina de suero bovino (ASB), por medio de un grupo funcional de cadena lateral o conectores unidos a un grupo funcional de cadena lateral. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, incluyendo, aunque sin limitación, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas en superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas, hemocianina de lapa americana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilos Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Por consiguiente, una realización incluye un método para producir los inmunoconjugados de la invención mediante el cultivo de una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos bajo condiciones adecuadas para la expresión de los mismos.
Métodos de utilización de inmunoconjugados
Los inmunoconjugados de la invención resultan útiles para dirigir determinantes antigénicos específicos y para inducir diversas respuestas celulares en células diana y reclutadas. El inmunoconjugado de la invención también resulta útil como reactivo diagnóstico. La unión de un inmunoconjugado a un determinante antigénico puede detectarse fácilmente mediante la utilización de un anticuerpo secundario específico para la fracción efectora. En una realización, el anticuerpo secundario y el inmunoconjugado facilitan la detección de la unión del inmunoconjugado a un determinante antigénico localizado sobre una célula o superficie de un tejido.
En algunas realizaciones, se administra a una célula una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención. En otras realizaciones, se administra en un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del inmunoconjugado de la invención para el tratamiento de una enfermedad. La expresión “cantidad eficaz” tal como se utiliza en la presente memoria se define como la cantidad del inmunoconjugado de la invención que resulta necesaria para provocar un cambio fisiológico en la célula o tejido en el que se administra. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” tal como se utiliza en la presente memoria se define como la cantidad del inmunoconjugado de la invención que elimina, reduce, retrasa, minimiza o evita efectos adversos de una enfermedad.
Los inmunoconjugados de la invención pueden administrarse en un sujeto per se o en forma de una composición farmacéutica. En una realización, la enfermedad es un trastorno proliferativo, tal como cáncer. Entre los ejemplos no limitativos de trastornos proliferativos, tales como cánceres, se incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de sangre, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Entre otros trastornos de la proliferación celular que pueden tratarse utilizando un inmunoconjugado de la presente invención se incluyen, aunque sin limitación, neoplasmas localizados en: abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroide, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se encuentran incluídas las condiciones o lesiones precancerosas y las metástasis de cáncer. De manera similar, otros trastornos de la proliferación celular también pueden tratarse mediante los inmunoconjugados de la presente invención. Entre los ejemplos de dichos trastornos de la proliferación celular se incluyen, aunque sin limitación: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad de la proliferación celular, aparte de neoplasia, localizada en un sistema orgánico indicado anteriormente. En otra realización, la enfermedad se relaciona con la autoinmunidad, el rechazo del trasplante, las respuestas inmunológicas post-traumáticas y las enfermedades infecciosas (por ejemplo VIH). Más específicamente, los inmunoconjugados pueden utilizarse para eliminar células implicadas en trastornos mediados por células inmunológicas, incluyendo linfoma, autoinmunidad, rechazo del trasplante, enfermedad de injerto contra huésped, isquemia e ictus. El experto en la materia reconocerá fácilmente que en muchos casos los inmunoconjugados podrían no proporcionar la curación sino únicamente un beneficio parcial. En algunas realizaciones, un cambio fisiológico que presente cierto beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. De esta manera, en algunas realizaciones, una cantidad de inmunoconjugado que proporcione un cambio fisiológico se considera una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz”.
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El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento típicamente es un mamífero, más específicamente un ser humano.
Composiciones, formulaciones, dosis y vías de administración
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de uno o más inmunoconjugados disueltos o dispersados en un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéutica
o farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra desfavorable al administrarse en un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según resulte apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contenga por lo menos un inmunoconjugado y opcionalmente un ingrediente activo adicional resultará conocida para el experto en la materia a la luz de la presente exposición, tal como se ejemplifica en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, incorporada como referencia en la presente memoria. Además, para la administración animal (por ejemplo humana), se entenderá que las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la FDA Office of Biological Standards o autoridades correspondientes en otros países.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por ejemplo agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, ligantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, pigmentos, tales como materiales y combinaciones de los mismos, tal como conocerá el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, páginas 1289 a 1329, incorporada como referencia en la presente memoria). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional resulte incompatible con el ingrediente activo, se encuentra contemplada su utilización en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
Los inmunoconjugados pueden comprender diferentes tipos de portador dependiendo de si debe administrarse en forma sólida, líquida o aerosol, y de si debe ser estéril para vías de administración tales como la inyección. La presente invención puede administrarse por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, interaperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada bañando las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones de lípidos (por ejemplo liposomas) o mediante cualquier método o combinación de los anteriores conocida por el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, incorporada como referencia en la presente memoria). La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, se utiliza más comúnmente para administrar moléculas de polipéptido, tales como los inmunoconjugados de la invención.
La cantidad real de dosis de una composición de la presente invención administrada en un sujeto puede determinarse a partir de factores físicos y fisiológicos, tales como el peso corporal, la severidad de la condición, el tipo de enfermedad bajo tratamiento, las intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, la idiopatía del paciente y la vía de administración. El responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del ingrediente o ingredientes activos en una composición y la dosis o dosis apropiadas para el sujeto individual.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 0,1% del inmunoconjugado de la invención. En otras realizaciones, los inmunoconjugados pueden comprender entre aproximadamente 2% y aproximadamente 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente 25% y aproximadamente 60%, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable dentro de dichos intervalos. En otros ejemplos no limitativos, una dosis también puede comprender entre aproximadamente 1 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 350 miligramo/kg peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg peso corporal y aproximadamente 1.000 miligramos/kg peso corporal, o más en cada administración, y cualquier intervalo derivable dentro de dichos intervalos. En ejemplos no limitativos de un intervalo derivable a partir de los números indicados en la presente memoria, puede administrarse un intervalo de entre aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal y aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc., basados en los números indicados anteriormente.
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En cualquier caso, la composición puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Además, la prevención de la acción de los microorganismos puede realizarse mediante conservantes, tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo, anque sin limitación, parabenes (por ejemplo metilparabenes, propilparabenes), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.
Los inmunoconjugados pueden formularse en una composición en forma de base libre, neutra o de sal. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo aquéllas formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos hidroclóricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos tales como los ácidos acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro, o de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína.
En realizaciones en las que la composición se encuentra en una forma líquida, un portador puede ser un solvente o medio de dispersión que comprende, aunque sin limitación, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina; mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido mediante dispersión en portadores tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante la utilización de surfactantes, tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de dichos métodos. En muchos casos, resulta preferible incluir agentes isotónicos, tales como, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico o combinaciones de los mismos, y/o agentes tamponadores para mantener los valores de pH fisiológicamente aceptables. En otras realizaciones, pueden utilizarse gotas oculares, soluciones nasales o sprays, aerosoles o inhalantes. Dichas composiciones generalmente se diseñan para que resulten compatibles con el tipo de tejido diana. En un ejemplo no limitativo, las soluciones nasales habitualmente son soluciones acuosas diseñadas para administrarse en las vías nasales en gotas o sprays. Las soluciones nasales se preparan de manera que resulten similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de manera que se mantenga la acción ciliar normal. De esta manera, en algunas realizaciones, las soluciones acuosas nasales habitualmente son isotónicas o ligeramente tamponadas para mantener un pH de entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5. Además, pueden incluirse en la formulación conservantes antimicrobianos, similares a los utilizados en preparaciones oftálmicas, fármacos o estabilizadores de fármaco apropiados, en caso de resultar necesarios. Por ejemplo, son conocidas diversas preparaciones nasales comerciales y entre ellas se incluyen fármacos tales como antibióticos o antihistamínicos.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado se prepara para la administración mediante dichas vías como ingestión oral. En estas realizaciones, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras, cápsulas (por ejemplo cápsulas de gelatina de cáscara dura o blanda), formulaciones de liberación sostenida, composiciones bucales, trociscos, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o combinaciones de los mismos. Pueden incorporarse composiciones orales directamente con los alimentos de la dieta. Los portadores preferentes para la administración oral comprenden diluyentes inertes, portadores comestibles asimilables o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral puede prepararse en forma de jarabe o elixir. Un jarabe o elixir puede comprender, por ejemplo, por lo menos un agente activo, un agente edulcorante, un conservante, un agente saborizante, un pigmento, un conservante, o combinaciones de los mismos.
En determinadas realizaciones, una composición oral puede comprender uno o más ligantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes saborizantes y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, una composición puede comprender uno o más de los siguientes: un ligante, tal como, por ejemplo, goma tragacanto, acacia, almidón de maíz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato de dicalcio, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un agente desintegrante, tal como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico o combinaciones de los mismos; un lubricante, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de los mismos; un agente saborizante, tal como, por ejemplo, menta, aceite de gaulteria (wintergreen), saborizante de cereza, saborizante de naranja, etc., o combinaciones de los mismos. En el caso de que la forma de dosificación unitaria sea una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anteriormente indicado, portadores tales como un portador líquido. Pueden encontrarse presentes diversos otros materiales como recubrimientos, o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con shellac, azúcar o ambos.
Entre las formulaciones adicionales que resultan adecuadas para otros modos de administración se incluyen los supositorios. Los supositorios son formas de dosificación sólidas de diversos pesos y formas, habitualmente medicados, para la inserción en el recto, la vagina o la uretra. Tras la inserción, los supositorios se ablandan, se funden o se disuelven en los líquidos de la cavidad. En general, para los supositorios, entre los portadores tradicionales pueden incluirse, por ejemplo, polialquilenglicoles, triglicéridos o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, los supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contengan, por ejemplo, el ingrediente activo en el intervalo de entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 10%, y preferentemente de entre aproximadamente 1% y aproximadamente 2%. Se preparan soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de los inmunoconjugados de la invención en la cantidad requerida en el solvente apropiado con diversos de los demás ingredientes indicados anteriormente, según resulte necesario, seguido de la esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los demás ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacío o las técnicas de liofilización que proporcionan polvos del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de un medio líquido del mismo previamente esterilizado mediante filtración. El medio líquido debería tamponarse convenientemente en caso necesario y en primer lugar convertir en isotónico el diluyente líquido previamente a la inyección utilizando suficiente solución salina o glucosa. La preparación de composiciones altamente concentradas para la inyección directa también se encuentra contemplada, en la que se contempla la utilización de DMSO como solvente para resultar en la penetración extremadamente rápida, administrando concentraciones elevadas de los agentes activos en un área reducida.
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La composición debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse como mínimo a un nivel seguro, por ejemplo menos de 0,5 ng/mg de proteína.
En realizaciones particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable puede llevarse a cabo mediante la utilización en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los inmunoconjugados de la invención pueden prepararse mediante procedimientos de mezcla convencional, disolución, granulado, preparación de grageas, levigación, emulsionación, encapsulado, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que faciliten el procesamiento de las proteínas en preparaciones que puedan utilizarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración seleccionada.
Para la administración tópica, los inmunoconjugados de la invención pueden formularse en forma de soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc., que son bien conocidas de la técnica.
Entre las formulaciones sistémicas se incluyen aquéllas diseñadas para la administración mediante inyección, por ejemplo la administración subcutánea, la inyección intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como aquéllas diseñadas para la administración transdérmica, transmucosal, por inhalación, oral o pulmonar.
Para la inyección, los inmunoconjugados de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes.
Alternativamente, los inmunoconjugados pueden presentarse en forma de polvos para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes de su utilización.
Para la administración transmucosal, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados a la barrera que debe permearse. Dichos penetrantes son generalmente conocidos de la técnica.
Para la administración oral, los inmunoconjugados pueden formularse fácilmente mediante combinación de los inmunoconjugados con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos de la técnica. Dichos portadores permiten permiten formular los inmunoconjugados de la invención como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas en suspensión, suspensiones y similares, para la ingestión oral del paciente que debe tratarse. Para formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y tabletas, entre los excipientes adecuados se incluyen rellenos, tales como azúcares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación y agentes de unión. Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, ágar o ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato sódico.
Si se desea, las formas de dosificación sólida pueden recubrirse con azúcar o con un recubrimiento entérico utilizando técnicas estándares. Para las preparaciones líquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, entre los portadores, excipientes o diluyentes adecuados se incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Además, pueden añadirse agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes y similares.
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Para la administración bucal, los inmunoconjugados pueden presentar la forma de tabletas, pastillas, etc., formuladas de manera convencional.
Para la administración mediante inhalación, los inmunoconjugados para la utilización según la invención se administran convenientemente en forma de un spray de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador utilizando un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de gelatina para la utilización en un inhalador o insuflador que contenga una mezcla de polvos del inmunoconjugado y una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón.
Los inmunoconjugados también pueden formularse en composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios
o enemas de retención, por ejemplo que contengan bases convencionales para supositorio, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones anteriormente indicadas, los inmunoconjugados también pueden formularse como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los inmunoconjugados pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados limitadamente solubles, por ejemplo como sal limitadamente soluble.
Alternativamente, pueden utilizarse otros sistemas de administración farmacéutica. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de administración que pueden utilizarse para administrar inmunoconjugados de la invención. Pueden utilizarse determinados solventes orgánicos, tales como el dimetilsulfóxido, aunque habitualmente al coste de una mayor toxicidad. Además, los inmunoconjugados pueden administrarse utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contengan el agente terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida y son bien conocidos del experto en la materia. Las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los inmunoconjugados, dependiendo de su naturaleza química, durante unas cuantas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y estabilidad biológica de los inmunoconjugados, pueden utilizarse estrategias adicionales para la estabilización de los inmunoconjugados. Debido a que los inmunoconjugados de la invención pueden contener cadenas laterales o extremos cargados, pueden incluirse en cualquiera de las formulaciones anteriormente indicadas en forma de ácidos o bases libres, o en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas sales que conservan sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que se preparan mediante la reacción con ácidos inorgánicos. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en solventes acuosos y otros solventes próticos que las formas de base libre correspondientes.
Los inmunoconjugados descritos en la presente memoria generalmente se utilizan en una cantidad eficaz para conseguir el propósito pretendido. Para la utilización en el tratamiento o prevención de una condición de enfermedad, los inmunoconjugados de la invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para mejorar o prevenir los síntomas, o para prolongar la supervivencia del paciente bajo tratamiento. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz se encuentran perfectamente dentro de las capacidades del experto en la materia, especialmente a la luz de la exposición detallada proporcionada en la presente memoria.
Para la administración sistémica, puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro una dosis terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones circulantes que incluya la IC50 según se determine en el cultivo celular. Puede utilizarse dicha información para determinar más exactamente dosis útiles en el ser humano.
También pueden estimarse dosis iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo modelos animales, utilizando técnicas que son bien conocidas de la técnica. El experto ordinario en la materia podría optimizar fácilmente la administración en seres humanos basándose en datos animales.
La cantidad e intervalo de las dosis puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de los inmunoconjugados que resulten suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosis habituales para el paciente para la administración mediante inyección se encuentran comprendidas en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 50 mg/kg/día, típicamente entre aproximadamente 0,5 y 1 mg/kg/día. Pueden conseguirse niveles séricos terapéuticamente eficaces mediante la administración de múltiples dosis cada día.
En los casos de la administración local o la incorporación selectiva, la concentración local eficaz de los inmunoconjugados podría no estar relacionada con la concentración plasmática. El experto en la materia podrá optimizar las dosis locales terapéuticamente eficaces sin necesidad de experimentación indebida.
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La cantidad de inmunoconjugado administrada dependerá evidentemente del sujeto tratado, del peso del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, del modo de administración y del criterio del médico responsable.
La terapia puede repetirse intermitentemente mientras resulten detectables síntomas, o incluso cuando ya no resulten detectables. La terapia puede proporcionarse sola o en combinación con otros fármacos. En el caso de los trastornos autoinmunológicos, entre los fármacos que pueden utilizarse en combinación con inmunoconjugados de la invención se incluyen, aunque sin limitación, los agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos.
Toxicidad
Una dosis terapéuticamente eficaz de los inmunoconjugados indicados en la presente memoria generalmente proporcionará un beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad de los inmunoconjugados puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo determinando la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100% de la población). La proporción de dosis entre el efecto tóxico y el efecto terapéutico es el índice terapéutico. En una realización, el inmunoconjugado muestra un elevado índice terapéutico. Los datos obtenidos de dichos ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosis que no resulte tóxico, por ejemplo para la utilización en el ser humano. La dosis de los inmunoconjugados indicada en la presente memoria preferentemente se encuentra comprendida dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de dicho intervalo dependiendo de la forma de dosificación y vía de administración utilizadas. La formulación, vía de administración y dosis exactas pueden ser seleccionadas por el médico individual en vista de la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, página 1.
Otros agentes y tratamientos
Se contempla que puedan utilizarse otros agentes en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Entre dichos agentes adicionales se incluyen agentes inmunomoduladores, agentes que afectan a la regulación positiva de los receptores de superficie celular y las uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de la adhesión celular, o agentes que incrementan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a los inductores apoptóticos. Entre los agentes inmunomoduladores se incluyen el factor de necrosis tumoral, los interferones α, beta y gamma, IL-2 y otras citoquinas, F42K y otros análogos de citoquina, o MIP-1, MIP-1 β, MCP-1, RANTES y otras quimoquinas. Se contempla adicionalmente que la regulación positiva de los receptores de superficie celular o sus ligandos, tales como el ligando Fas/Fas, DR4 o DR5/TRAIL podría potenciar las capacidades inductoras de la apoptosis de la presente invención mediante el establecimiento de un efecto autocrino o paracrino sobre las células hiperproliferativas. Los incrementos de la señalización intercelular mediante la elevación del número de uniones GAP podría incrementar los efectos antihiperproliferativos sobre la población celular hiperproliferativa vecina. En otras realizaciones, pueden utilizarse agentes citostáticos o de diferenciación en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia antihiperproliferativa de los tratamientos. Se contemplan inhibidores de la adhesión celular para mejorar la eficacia de la presente invención. Son ejemplos de inhibidores de la adhesión celular, los inhibidores de quinasa de adhesión focal (FAKs) y la lovastatina. Se contempla además que otros agentes que incrementan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a la apoptosis, tales como el anticuerpo C225, puedan utilizarse en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia del tratamiento.
También puede utilizarse la terapia hormonal conjuntamente con la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia del cáncer descrita anteriormente. Pueden utilizarse hormonas en el tratamiento de determinados cánceres, tales como el cáncer de mama, de próstata, de ovario o cervical para reducir el nivel o bloquear los efectos de determinadas hormonas, tales como la testosterona o el estrógeno. Este tratamiento con frecuencia se utiliza en combinación con por lo menos otra terapia del cáncer como opción de tratamiento o para reducir el riesgo de metástasis.
También pueden administrarse los inmunoconjugados descritos en la presente memoria conjuntamente con quimioterapia, terapia de radiación u otras inmunoterapias. Pueden seleccionarse agentes anticáncer par adicha terapia de combinación, por ejemplo, de entre los grupos de disruptores de los microtúbulos (por ejemplo alcaloides vinca, tales como vinblastina o vincristina, taxanos tales como docetaxel o paclitaxel, epotilones, tales como ixabepilón), antimetabolitos (por ejemplo antifolatos, tales como metotrexato o aminopterina, antipurinas, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina o 6-tioguanina, antipirimidinas tales como 5-fluorouracilo, capecitabina o gemcitabina, hidroxiurea), inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo camptotecina, irinotecán, topotecán, o podofilotoxinas, tales como etopósido), intercalantes de ADN (por ejemplo doxorubicina, daunorubicina, actinomicina, bleomicina), agentes alquilantes (por ejemplo ciclofosfamida, clorambucilo, nitrosoureas tales como carmustina o nimustina, estreptozocina, busulfán, cisplatino, oxaliplatino, trietilenmelamina, dacarbazina), terapias hormonales (por ejemplo glucocorticoides, inhibidores de la aromatasa, tales como tamoxifeno, antiandrógenos tales como flutamida, análogos de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) tales como leuprólido), antibióticos, inhibidores de quinasa (por ejemplo erlotinib, gefitinib, imatinib), antagonistas de receptor (por ejemplo anticuerpo con diana en receptores de superficie celular que es conocido que estimulan la carcinogénesis y el crecimiento tumoral), inhibidores enzimáticos (por ejemplo inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (CDK), enzimas reductores de aminoácidos (por ejemplo asparagina), leucovorina, retinoides, activadores de la apoptosis de células tumorales y agentes antiangiogénicos.
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Ejemplos
Ejemplo 1
En la primera administración de citoquinas mediada por anticuerpos, realizada por Harvill E.T. y Morrison S.L., Immunotech. 1(2):95-105, 1995, los constructos presentaban dos grupos de unión a antígeno para el direccionamiento a antígenos tumorales, y dos grupos de citoquina para inducir la activación de los linfocitos (una molécula de IL-2 fusionada a cada uno de los extremos C-terminales de cadena pesada de IgG3). La afinidad de la citoquina es generalmente elevada para su receptor. Una molécula que portase dos unidades de citoquina podría presentar una afinidad todavía más alta para los receptores de citoquina debido a efectos de avidez (o multivalencia). Este tipo de molécula podría, por lo tanto, activar fácilmente los linfocitos en el flujo sanguíneo, incluso antes de que tuviese lugar el direccionamiento al tumor. Este efecto no resultaría deseable para el paciente. En contraste, una molécula de inmunoconjugado que portase únicamente un grupo de citoquina y dos o más dominios de direccionamiento sería menos probable que activase los linfocitos en la circulación y podría dirigir la molécula de inmunoconjugado completa al tumor, mientras que la activación de los linfocitos tendría lugar a una velocidad menor. Por lo tanto, se construyeron moléculas tales como las ilustradas en las figuras 1 y 2, con interleuquina-2 (IL-2) como citoquina modelo. Todas las moléculas generadas eran bivalentes para el antígeno tumoral, y eran bivalentes o monovalentes para la citoquina IL-2 tal como se indica en los dibujos. Las afinidades para el antígeno se compararon para dos formatos de inmunoconjugado diferentes utilizando el anticuerpo L19 como ejemplo. Como referencia, dicho anticuerpo se clonó en el formato IgG1 humano, en el formato de diacuerpo (figura 1A) y en la fusión Fab-IL2-Fab (figura 1B). Se sometió a ensayo una variable en el formato de diacuerpo, de manera que el péptido línker entre VH y VL presentase una longitud de ocho o doce aminoácidos. El antígeno purificado dominio extra B de la fibronectina (EDB) se inmovilizó en un chip BIACORE, y se utilizó el constructo de fusión de anticuerpo como el analito soluble para la determinación de la afinidad. Las figuras 8 a 11 muestran los resultados de este experimento. Se consideró que IgG era el caso ideal de un suceso de unión bivalente. En este caso se observó una constante de afinidad de 260 pM. El constructo de fusión Fab-IL2-Fab presentaba una afinidad de 310 pM, que es esencialmente idéntica a la de IgG. Las dos variantes del diacuerpo (mostradas en las figuras 10 y 11) presentaban afinidades medidas de 270 pM y 360 pM, respectivamente. Por lo tanto, todos dichos constructos presentaban afinidades similares hacia el antígeno. La afinidad hacia el antígeno y el receptor de IL-2 se observaron utilizando constructos similares basados en la secuencia del anticuerpo F16 (Brack S.S. et al., Clin. Canc. Res. 12(10):3200-3208, 2006). La figura 12 muestra los sensogramas de BIACORE de la IgG de F16 y su fragmento Fab monovalente correspondiente, al inmovilizar el dominio TNC-A1 sobre el chip BIACORE. Bajo estas condiciones experimentales particulares, la molécula de IgG mostró una constante de afinidad de 2,6 nM, y las moléculas de Fab mostraron una constante de afinidad de 50 nM. En este caso, el incremento de afinidad atribuido a la bivalencia fue un factor de 20. Los inmunoconjugados de diacuerpo, Fab-IL2-Fab y scFv-IL2-scFv mostraron afinidades hacia el antígeno de 5 nM, 4,8 nM y 12 nM, respectivamente. Todos dichos constructos, por lo tanto, presentaban afinidades hacia el antígeno más estrechamente similares al carácter bivalente de una molécula IgG que el comportamiento monovalente del fragmento Fab.
Las diferencias fueron más pronunciadas al observar las afinidades para el receptor de IL-2. Para estudiar la afinidad de unión al receptor de IL-2, se generó una herramienta que permitía la expresión de un receptor de IL-2 heterodimérico; se fusionó la cadena β del receptor de IL-2 a una molécula de Fc que se manipuló para heterodimerizar (Fc(botón)) utilizando la tecnología de “botón-en-ojal” (Merchant A.M. et al., Nat. Biotech. 16:677681, 1998). A continuación, se fusionó la cadena gamma del receptor de IL-2 a la variante Fc(ojal), que se heterodimerizó con Fc(botón). Esta proteína de fusión de Fc heterodimérica seguidamente se utilizó como sustrato para analizar la interacción IL-2/receptor de IL-2. La figura 13 muestra el sensograma de BIACOERE de la IL-2 disponible comercialmente (proleuquina), como analito, con el receptor de IL-2 inmovilizado. La afinidad medida, de ~0,5 nM, está de acuerdo con los valores anteriormente publicados. Se resumen en la figura 17 las afinidades de los diversos constructos hacia el receptor de IL-2. Se observó un resultado importante: la diferencia entre el diacuerpo (F16 dia-IL2), que es bivalente con respecto a la citoquina, y la molécula Fab-IL2-Fab, que porta únicamente un grupo IL-2. La afinidad de unión del receptor de IL-2 del diacuerpo (0,8 nM) era similar a la de la IL-2 no conjugada (proleuquina) (0,5 nM) a pesar de que el diacuerpo era bivalente y la IL-2 era monovalente. La fusión Fab-IL2-Fab presentaba una afinidad de unión del receptor de IL-2 reducida prácticamente en un factor de 10 en comparación con el diacuerpo, lo que se reflejaba en una capacidad reducida para inducir la proliferación de las células NK92, tal como se muestra en la figura 19.
Ejemplo 2
Construction of Generic Fab-Libraries
Se construyeron bibliotecas genéricas de anticuerpos en el formato Fab basándose en los genes de la línea germinal humana utilizando los emparejamientos de dominio V siguientes: Cadena ligera kappa Vk3_20 con cadena pesada VH3_23 para la biblioteca DP47-3 y cadena ligera kappa Vk1_17 con cadena pesada de VH1_69 para la biblioteca DP88-3. Ver la Tabla 2. Se aleatorizaron ambas bibliotecas en la CDR3 de la cadena ligera (L3) y la CDR3 de la cadena pesada (H3) y se ensamblaron a partir de 3 fragmentos por biblioteca mediante procesamiento mediante PCR de extensión solapante (SOE). El fragmento 1 comprende el extremo 5’ del gen de anticuerpo,
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5 incluyendo L3 aleatorizado; el fragmento 2 es un fragmento constante central que abarca desde L3 a H3, mientras que el fragmento 3 comprende H3 aleatorizado y la parte 3’ del gen de anticuerpo.
Se utilizaron las combinaciones de cebadores siguientes para generar fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP47-3: fragmento 1 (LMB3 - LibL1b_new), fragmento 2 (MS63 - MS64), fragmento 3 (Lib2H - fdseqlong). Ver la
10 Tabla 9. Se utilizaron las combinaciones de cebadores siguientes para generar fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP88-3: fragmento 1 (LMB3 - RJH_LIB3), fragmento 2 (RJH31 - RJH32), fragmento 3 (LIB88_2 - fdseqlong). Ver la Tabla 10.
TABLA 9.
Cebadores utilizados en la biblioteca DP47-3
LMB3
CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC
LibL1b_new
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MS63
TTTCGCACAGTAATATACGGCCGTGTCC
MS64
ACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGG
Lib2H
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fdseqlong
GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG
TABLA 10.
Cebadores utilizados en la biblioteca DP88-3
LMB3
CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC
RJH_LIB3
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RJH31
ACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG
RJH32
TCTCGCACAGTAATACACGGCGGTGTCC
LIB88_2
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fdseqlong
GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG
El protocolo de PCR para la producción de fragmentos de biblioteca incluía: 5 minutos de desnaturalización inicial a 94ºC; 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 58ºC y 1 minuto a 72ºC; y alargamiento terminal durante 10 minutos
20 a 72ºC. Para la PCR de ensamblaje, como molde se utilizaron proporciones equimolares de los 3 fragmentos. El protocolo de PCR de ensamblaje incluía: 3 minutos de desnaturalización inicial a 94ºC; y 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 58ºC, y 2 minutos a 72ºC. En esta etapa, se añadieron los cebadores complementarios para secuenciar los fragmentos exteriores 1-3 y se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales antes de un alargamiento terminal durante 10 minutos a 72ºC.
25 Tras el ensamblaje de cantidades suficientes de constructos Fab aleatorizados de longitud completa, se digirieron los constructos de Fab con NcoI/NotI para la biblioteca DP47-3, y con NcoI/NheI para la biblioteca DP88-3 en paralelo a vector fagémido aceptor tratado de manera similar. Para la biblioteca DP47-3, se ligaron 22,8 µg de biblioteca de Fab con 16,2 µg de vector fagémido. Para la biblioteca DP88-3, se ligaron 30,6 µg de biblioteca de Fab
30 con 30,6 µg de vector fagémido.
Se utilizaron las ligaciones purificadas para 68 transformaciones para la biblioteca DP47-3, y 64 transformaciones para la biblioteca DP88-3, respectivamente, para obtener tamaños finales de biblioteca de 4,2x1010 para DP47-3 y 3,3x109 para DP88-3.
35 Las partículas fagémidas que expresaban las bibliotecas de Fab se rescataron y se purificaron con PEG/NaCl para las selecciones.
Ejemplo 3
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Selección de clon 2B10 anti-TNC A2 Las selecciones se llevaron a cabo contra TNC-A2 humano expresado en E. coli que se subclonó 5’ de una etiqueta avi y una etiqueta de 6xhis. Ver la secuencia SEC ID nº 57 en la Tabla 5. El antígeno se biotiniló in vivo tras la expresión. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémicas de la biblioteca DP88-3 y 100 nM de TNC A2 humano biotinilado durante 0,5 horas en un volumen total de 1 ml, (ii) captura de TNC-A2 humano biotinilado y fago unido mediante la adición de 5,4x107 perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina durante 10 minutos; (iii) lavado de las perlas utilizando 5x 1 ml de PBS/Tween 20 y 5x 1 ml de PBS, (iv) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 ml de TEA 100 mM (trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 μl de Tris 1 M/HCl, pH 7,4, y (v) reinfección de células TG1 de E. coli en fase logarítmica, infección con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores.
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Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas utilizando una concentración constante de antígeno de 100 nM. En la ronda 2, se llevó a cabo la captura de complejos de antígeno:fago en placas con neutravidina en lugar de sobre perlas con estreptavidina. Se identificaron los ligantes específicos mediante ELISA de la manera siguiente, utilizando: 100 μl de 100 nM de TNC-A2 humano biotinilado recubierto en cada pocillo de placas con neutravidina.
Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab ligantes mediante sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Tras la identificación, el clon 2B10 se expresó bacterianamente en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificó mediante afinidad y se caracterizó adicionalmente mediante análisis de SPR utilizando BIACORE T100. Ver las secuencias SEC ID nº 3 y 7 de la Tabla 3.
Ejemplo 4
Selección de clon 2F11 anti-TCN A1/A4
Las selecciones se llevaron a cabo contra TNC-A1 humano expresado en E. coli que se subclonó 5’ de una etiqueta avi y de una etiqueta de 6xhis. Ver la secuencia SEC ID nº 59 en la Tabla 5. El antígeno se biotiniló in vivo tras la expresión. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémicas de la biblioteca DP47-3 y 100 nM de TNC A1 humano biotinilado durante 0,5 horas en un volumen total de 1 ml, (ii) captura de TNC-A1 humano biotinilado y fago unido mediante la adición de 5,4x107 perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina durante 10 minutos; (iii) lavado de las perlas utilizando 5x 1 ml de PBS/Tween-20 y 5x 1 ml de PBS, (iv) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 ml de TEA 100 mM (trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 μl de Tris 1M/HCl, pH 7,4, y (v) reinfección de células TG1 de
E. coli en fase logarítmica, infección con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores.
Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas utilizando una concentración constante de antígeno de 100 nM. En la ronda 2, se llevó a cabo la captura de complejos de antígeno:fago en placas con neutravidina en lugar de sobre perlas con estreptavidina.
Todas las reacciones de unión se suplementaron con 100 nM de dominio constante CH3 de IgG humana no biotinilada que comprendía una etiqueta avi y una etiqueta de 6xhis carboxi-terminales para competir para los clones no deseados que reconocen las etiquetas del antígeno.
En una primera etapa de cribado, se identificaron ligantes específicos mediante ELISA de la manera siguiente: Se recubrió cada placa de neutravidina con 100 μl de TNC-A1 humano biotinilado 100 nM. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fabs que se unían específicamente a TNC-A1 humano a partir de sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP.
En una segunda etapa de cribado, se repitió la ELISA anteriormente indicado utilizando también TNC-A1 murino, TNC A4 humano y TNC A4 mu como antígenos con el fin de determinar la reactividad cruzada. Todos los antígenos comprendían las mismas etiquetas avi y 6xhis en su extremo C-terminal y se encontraban biotiniladas in vivo. Ver las secuencias SEC ID nº 50 y 61 de la Tabla 5.
Tras la identificación, el clon 2F11 se expresó bacterianamente en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificó mediante afinidad y se caracterizó adicionalmente mediante análisis de SPR utilizando BIACORE T100. Ver las secuencias SEC ID nº 9 y 13 de la Tabla 3.
Ejemplo 5
Selección de clones anti-FAP (selecciones primarias)
Las selecciones se llevaron a cabo contra el ectodominio de la proteína activadora de fibroblastos (FAP) humana o murina, que se clonaron cadena arriba de una polilisina y de una etiqueta 6xhis. Ver las secuencias SEC ID nº 53 y 55 de la Tabla 5. Antes de las selecciones, se recubrieron inmunotubos con los antígenos a una concentración de 10
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µg/ml or 5 µg/ml, dependiendo de la ronda de selección. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémidas de la biblioteca DP47-3 a FAP humano o murino inmovilizado durante 2 horas, ii) lavado de los inmunotubos utilizando 5 x 5 ml de PBS/Tween-20 y 5 x 5 ml de PBS,
(iii) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 ml de TEA 100 mM (trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 μl de Tris 1 M/HCl, pH 74, y (iv) reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de las partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores.
Las selecciones se llevaron a cabo en tres o cuatro rondas utilizando concentraciones decrecientes de antígeno de FAP humano y, en algunos casos, utilizando FAP murino a una concentración de 5 µg/ml en la ronda de selección final. Se definieron los ligantes específicos como señales 5 x más altas que el fondo y se identificaron mediante ELISA. Se recubrieron placas maxisorp de NUNC con 10 µg/ml de FAP humano o murino, seguido de la adición de sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y la detección de Fabs de unión específica mediante sus etiquetas Flagm ediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP.
Se expresaron bacterianamente los clones positivos en ELISA, como cultivos de 1 ml en formato de 96 pocillos y los sobrenadantes se sometieron a un experimento de cribado cinético utilizando BIACORE T100.
Ejemplo 6
Construcción de bibliotecas de maduración de afinidad anti-FAP
Se construyeron tres bibliotecas de maduración de afinidad basadas en anticuerpos preseleccionados de las selecciones primarias de anti-FAP. Más exactamente, se basaron en: (i) el clon 2D9 anti-FAP humana (biblioteca a.m.FAP2D9) (ver las secuencias SEC ID nº 67 y 69 de la Tabla 3), (ii) clon 4B8 anti-FAP murina (biblioteca a.m.FAP4B8) (ver las secuencias SEC ID nº 71 y 73 de la Tabla 3), e (iii) clones reactivos cruzadamente 7A1, 13B2, 13C2, 13E8, 14C10 y 17A11 (biblioteca a.m.FAPpool) (ver las secuencias SEC ID nº 75 y 77 de la Tabla 3, correspondiente a las secuencias de región variable de 7A1; secuencias SEC ID nº 79 y 81 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 13C2; secuencias SEC ID nº 83 y 85, correspondientes a las secuencias de región variable de 13E8; secuencias SEC ID nº 87 y 89, correspondientes a las secuencias de región variable de 14C10; secuencias SEC ID nº 91 y 93, correspondientes a las secuencias de región variable de 17A11).
Cada una de estas bibliotecas consiste de dos sub-bibliotecas, aleatorizadas en CDR1 y CDR2 de la cadena ligera (L1/L2) o en CDR1 y CDR2 de la cadena pesada (H1/H2), respectivamente. Se agruparon estas sub-bibliotecas tras la transformación. Se construyó cada una de dichas sub-bibliotecas mediante cuatro etapas posteriores de amplificación y ensamblaje.
Para las bibliotecas de L1/L2, el protocolo de amplificación y ensamblaje incluía: (i) amplificación del fragmento 1 (LMB3 - DPK22_CDR1_rand_ba_opt) y fragmento 2 (DPK22_CDR1_fo - DPK22_Ck_BsiWI_ba), (ii) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriorse LMB3 y DPK22_Ck_BsiWI_ba para crear el molde para el fragmento 3, (iii) amplificación del fragmento 3 (LMB3 - DPK22_CDR2_rand_ba) y fragmento 4 (DPK22_CDR2_fo -DPK22_Ck_BsiWI_ba), y (iv) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los utilizados anteriormente. Ver la Tabla 1 para las secuencias de los cebadores.
TABLA 11.
Cebadores utilizados en las bibliotecas de maduración de afinidad de L1/L2 para la maduración de afinidad de anti-FAP
LMB3
CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC
DPK22_CDR1_rand_ba_opt
CAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAGTAGCTGCTGCTAACACTCTGACT GGCCCTGCAAG
DPK22_CDR1_fo
TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTG
DPK22_Ck_BsiWI_ba
GGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCC
DPK22_CDR2_rand_ba
CTGTCTGGGATGCCAGTGGCCCTGCTGGAGGCGCCATAGATGAGG AGCCTGGGAGCCTG
DPK22_CDR2_fo
AGGGCCACTGGCATCCCAGACAG
En negrita: 60% base original y 40% aleatorización como M Subrayado: 60% base original y 40% aleatorización como M
Para las bibliotecas de H1/H2, el protocolo de amplificación y ensamblaje incluía: (i) amplificación del fragmento 1 (RJH53 - DP47_CDR1_rand_ba_opt) y fragmento 2 (DP47_CDR1_fo - MS5), (ii) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriores RJH53 y MS52 para crear el molde para el fragmento 3, (iii) amplificación del fragmento 3 (RJH53 - DP47_CDR2_rand_ba) y fragmento 4 (DP47_CDR2_fo - MS52), y (iv) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los utilizados anteriormente. Ver la Tabla 12 para las secuencias de los cebadores.
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TABLA 12.
Cebadores utilizados en las bibliotecas de maduración de afinidad de H1/H2 para la maduración de afinidad de anti-FAP
RJH53
CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC
DP47_CDR1_rand_ba_opt
GAGCCTGGCGGACCCAGCTCATGGCATAACTGCTAAAGGTG AATCCGGAGGC
DP47_CDR1_fo
ATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTC
MS52
GAAGACCGATGGGCCTTTGGTGCTAG
DP47_CDR2_rand_ba
CCTTCACGGAGTCTGCGTAGTATGTGCTACCACCA CTACCACTAATAGCTGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCC
DP47_CDR2_fo
ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGG
En negrita: 60% base original y 40% aleatorización como M Subrayado: 60% base original y 40% aleatorización como M
Los productos ensamblados finales se digirieron con NcoI/BsiWI para las sub-bibliotecas de L1/L2 de a.m.FAP2D9 y a.m.FAP4B8, con MunI y NheI para las sub-bibliotecas de H1/H2 de a.m.FAP2D9 y a.m.FAP4B8, así como con NcoI/BamHI para la biblioteca de L1/L2 de a.m.FAPpool y con BspEI/PstI para las bibliotecas de H1/H2 de a.m.FAPpool, respectivamente, en paralelo a vectores aceptores tratados de manera similar basados en preparaciones de plásmidos de los clones 2D9, 4B8 o una mezcla equimolar de los clones 7A1, 13B2, 13C2, 13E8, 14C10 y 17A11, respectivamente. Se ligaron las cantidades siguientes de dominios V (parciales) aleatorizados y el vector o vectores aceptores digeridos se ligaron para las bibliotecas respectivas (µg dominio V/µg vector): subbiblioteca de L1/L2 a.m.FAP2D9 (5,7/21,5), sub-biblioteca de H1/H2 a.m.FAP2D9 (4,1/15,5), sub-biblioteca de L1/L2 a.m.FAP4B8 (6,5/24,5), sub-biblioteca de H1/H2 a.m.FAP4B8 (5,7/21,5), sub-biblioteca de L1/L2 a.m.FAPpool (4,4/20), sub-biblioteca de H1/H2 a.m.FAPpool (3,4/15,5).
Las ligaciones purificadas de las sub-bibliotecas de L1/L2 y de H1/H2 se agruparon y se utilizaron para 60 transformaciones de cada una de las 3 bibliotecas de maduración de afinidad, para obtener tamaños finales de biblioteca de 6,2 x 109 para a.m.FAP2D9, 9,9 x 109 para a.m.FAP4B8 y 2,2 x 109 para a.m.FAPpool.
Las partículas fagémidas que expresaban las bibliotecas de Fab se rescataron y se purificaron con PEG/NaCl para selecciones secundarias.
Ejemplo 7
Selección de clones anti-FAP de afinidad madurada
Las selecciones se llevaron a cabo contra el ectodominio de la proteína activadora de fibroblastos (FAP) humana o murina, que se clonaron 5’ de una polilisina y de una etiqueta 6xhis. Ver las secuencias SEC ID nº 53 y 55 de la Tabla 5. Antes de las selecciones, se recubrieron inmunotubos con los antígenos a una concentración de 10 µg/ml, 5 µg/ml ó 0,2 µg/ml, dependiendo de la biblioteca y de la ronda de selección. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~1012 partículas fagémidas de la biblioteca a.m.FAP2D9, a.m.FAP4B8 o a.m.FAPpool a FAP humano o murino inmovilizado durante 2 horas, ii) lavado de los inmunotubos utilizando 10 a 20 x 5 ml de PBS/Tween-20 y 10 a 20 x 5 ml de PBS (dependiendo de la biblioteca y de la ronda de selección), (iii) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 ml de TEA 100 mM (trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 μl de Tris 1 M/HCl, pH 7,4, y (iv) reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica, infección con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de las partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores.
Las selecciones se llevaron a cabo en 2 rondas y se ajustaron las condiciones a cada una de las 3 bibliotecas individualmente. En detalle, los parámetros de selección fueron: a.m.FAP2D9 (5 µg /mL de FAP humana y 20 lavados en total para la ronda 1, 1 µg /mL de FAP humana y 30 lavados en total para la ronda 2), a.m.FAP4B8 (1 µg /mL FAP murina y 30 lavados en total para la ronda 1, 0,2 µg /mL FAP humana y 40 lavados en total para la ronda 2) y a.m.FAPpool (5 µg /mL FAP humana y 30 lavados en total para la ronda 1, 5 µg /mL FAP murina y 30 lavados en total para la ronda 2). Se definieron los ligantes específicos como señales 5 x más altas que el fondo y se identificaron mediante ELISA. Se recubrieron placas maxisorp de NUNC con 1 ó 0,2 µg/ml de FAP humano o murino, seguido de la adición de sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y la detección de Fabs de unión específica a partir de sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP.
Se expresaron bacterianamente los clones positivos en ELISA, como cultivos de 1 ml en formato de 96 pocillos y los sobrenadantes se sometieron a un experimento de cribado cinético utilizando BIACORE T100.
Ejemplo 8
Estudios de eficacia en diferentes formatos de IL-2 dirigida Se llevó a cabo un experimento de eficacia utilizando dos formatos moleculares diferentes de inmunoconjugado de interleuquina 2 específico para el estroma tumoral. Se inyectó subcutáneamente el teratocarcinoma F9 en ratones 129SvEv y se midió el tamaño tumoral utilizando un calibrador. Se comparó la molécula de “diacuerpo”-IL-2 a dos
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5 concentraciones diferentes con el inmunoconjugado Fab-interleuquina-2-Fab (Fab-IL2-Fab), en el que las concentraciones reflejaban un número similar de moléculas de inmunoconjugado. Se muestran los resultados en la figura 3. El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab muestra una inhibición significativa del crecimiento tumoral y es mejor que el formato de diacuerpo a las dos concentraciones diferentes y mejor que los controles.
10 También se examinó la supervivencia de ratones tratados con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de interleuquina-2 diferentes específicos para estroma tumoral. Se inyectó intraesplénicamente la línea celularr de tumor gástrico humano LS174T en ratones SCID-beige. Se comparó la molécula de “diacuerpo”-IL-2 a dos concentraciones diferentes con el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab, en el que las concentraciones reflejaban un número similar de moléculas de inmunoconjugado. Se muestran los resultados en la figura 4. El formato Fab-IL-2
15 Fab resultó en un porcentaje de supervivencia más alto en comparación con el formato de diacuerpo y los controles.
Ejemplo 9
Técnicas de ADN recombinante
20 Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
25 Se proporciona información general sobre secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación de NIH nº 91-3242, 1991.
Secuenciación de ADN
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Se determinaron las secuencias de ADN mediante secuenciación de la doble cadena.
Síntesis génica
35 Los segmentos génicos deseados fueron preparados por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automática. Los segmentos génico flanqueados por sitios únicos de corte por endonucleasa de restricción se clonaron en plásmidos pGA18 (ampR). El plásmido de ADN se purificó a partir de bacterias transformadas y la concentración se determinó mediante espectroscopía de UV. La secuencia del ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmó mediante
40 secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los vectores de expresión respectivos. Todos los constructos se diseñaron con una secuencia 5’terminal de ADN codificante de un péptido líder que presenta como diana proteínas para la secreción en células eucarióticas. Las Tablas 13 y 14 proporcionan péptidos líder ejemplares y secuencias polinucleótidas codificantes de los mismos, respectivamente.
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TABLA 13.
Secuencias líder para la secreción: secuencias polipeptídicas.
Secuencias polipeptídicas.
SEC ID nº
MDWTWRILFLVAAATGAHS
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MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC
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MGWSCIILFLVATATGVHS
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TABLA 14.
Secuencia polinucleótida
SEC ID nº
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Preparación de inmunoconjugados
Se subclonaron las secuencias de ADN resultantes en vectores de expresión de mamífero (una para la cadena ligera y una para la proteína de fusión de cadena pesada) bajo el control del promotor MPSV y cadena arriba de un sitio poliA sintético, incluyendo cada vector una secuencia OriP del EBV. Se produjeron inmunoconjugados tal como se aplican en los ejemplos mediante la cotransfección de células HEK293-EBNA en crecimiento exponencial con los vectores de expresión de mamífero utilizando una transfección con fosfato de calcio. Alternativamente, se transfectaron células HEK293 cultivadas en suspensión con polietilenimina (PEI) con los vectores de expresión, o se utilizaron grupos de células CHO establemente transfectadas. Aunque los constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP basados en 3F2 y 4G8 pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de proteína A, deben purificarse mediante cromatografía de afinidad en una matriz de proteína G, constructos Fab-IL2-Fab con diana en TNC A2 basados en 2B10. Brevemente, se purificó Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 a partir de sobrenadantes mediante una etapa de afinidad (proteína G) seguido de cromatografía de exclusión por tamaños (Superdex 200, GE Healthcare). Se equilibró la columna de proteína G en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante y se lavó la columna con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Se eluyó Fab-IL2-Fab con ácido fórmico 8,8 mM, pH 3. Las fracciones eluídas se agruparon y se purificaron mediante cromatografía por exclusión por tamaños en el tampón de formulación final. Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7. La figura 50 muestra los resultados ejemplares de la purificación y la analítica.
Se purificó Fab-IL2-Fab 3F2 o Fab-IL2-Fab 4G8 con diana FAP mediante un método similar compuesto de una etapa de afinidad (proteína A), seguido de cromatografía por exclusión de tamaños (Superdex 200, GE Healthcare). Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante, y la columna se lavó con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sodico 500 mM, pH 7,5, seguido de un lavado con fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. Opcionalmente se llevó a cabo un tercer lavado con MES 10 mM, cloruro sódico 50 mM, pH 5. Se eluyó Fab-IL2-Fab con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3. Las fracciones eluídas se agruparon y se purificaron mediante cromatografía por exclusión por tamaños en el tampón de formulación final. Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
Ejemplo 10
Construcción de bibliotecas adicionales de maduración de afinidad anti-FAP (basadas en los clones 3F2, 3D9, 4G8, 4B3 y 2C6)
Se construyeron cuatro bibliotecas adicionales de maduración de afinidad basándose en anticuerpos preseleccionados de reactividad cruzada procedentes de la primera campaña de maduración de afinidad de anticuerpos anti-FAP, es decir los clones 3F2, 3D9, 4G8, 4B3 y 2C6 (ver las secuencias SEC ID nº 17 y 21 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 3F2; secuencias SEC ID nº 23 y 25 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 3D9; secuencias SEC ID nº 33 y 35 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 4B3; secuencias SEC ID nº 41 y 43 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 2C6). Más exactamente, las cuatro bibliotecas se basaban en: 1) clones anti-FAP 3F2, 4G8 y 4B3 (biblioteca de VH, aleatorizada en las CDRs 1 y 2 de la cadena pesada variable, es decir, la biblioteca de H1/H2), 2) los clones anti-FAP 3D9 y 2C6 (biblioteca de VL, aleatorizada en las CDRs 1 y 2 de la cadena ligera variable, es decir, la biblioteca de L1/L2), 3) clon anti-FAP 3F2 (biblioteca de L3 con aleatorización suave en la CDR3 de la cadena ligera, es decir, la biblioteca de L3), y 4) clon anti-FAP 3F2 (biblioteca de H3 con aleatorización suave en la CDR3 de la cadena pesada, es decir, la biblioteca de H3). Se construyeron las dos primeras bibliotecas exactamente de la misma manera que se indica de manera general para la primera campaña de maduración de la afinidad de los anticuerpos anti-FAP, para las bibliotecas de L1/L2 y H1/H2, respectivamente. En contraste, para las bibliotecas de maduración de la afinidad de L3 y de H3 basadas en el clon 3F2, se utilizaron dos nuevos cebadores para introducir aleatorización suave en L3 AM_3F2_DPK22_L3_ba: CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC, con la bases subrayadas siendo 60% una base dada y 40% una mezcla N (mezcla de los cuatro nucleótidos: A, C, G y T) y H3 (AM_3F2_DP47_H3_fo: GGCCGTATATTACTGTGCG AAA GGG TGG TTT GGT GGT TTT AAC TACTGGGGCCAAGGAAC, con las bases subrayadas siendo 60% una base dada y 40% una mezcla N, siendo las
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bases en cursiva 60% una base dada y 40% G, y siendo las bases en cursiva subrayadas 60% una base dada y 40% una mezcla K (mezcla de los dos nucleótidos G y T) del clon parental. Los tamaños de biblioteca eran los siguientes: biblioteca de H1/H2 (1,13 × 1010), biblioteca de L1/L2 (5,6 × 109), biblioteca de L3 (2,3 × 1010) y biblioteca de H3 (2,64 × 1010).
Ejemplo 11
Selección de clones anti-FAP de afinidad madurada
Las selecciones se llevaron a cabo contra el ectodominio de la proteína activadora de fibroblastos (FAP) humana o murina, que se clonaron cadena arriba de una 6x-lisina y de una etiqueta 6xhis (ver las secuencias SEC ID nº 53 y 55 de la Tabla 5). Antes de las selecciones, se recubrieron inmunotubos con los antígenos a una concentración de 1 µg/ml, 0,2 µg/ml ó 0,02 µg/mL, dependiendo de la biblioteca y de la ronda de selección. Las selecciones y los cribados basados en ELISA se llevaron a cabo tal como se ha descrito para la primera campaña de maduración de la afinidad de los anticuerpos anti-FAP. Se llevaron a cabo los cribados secundarios utilizando un biosensor ProteOn XPR36 (Biorad) y se determinaron las constantes de tasa cinética y las afinidades mediante el análisis de preparaciones de Fab purificadas a partir de la afinidad en el mismo instrumento. Se identificaron los clones de afinidad madurada siguientes: 19G1 (ver las secuencias SEC ID nº 121 y 123 de la Tabla 3), 20G8 (ver las secuencias SEC ID nº 125 y 127 de la Tabla 3), 4B9 (ver las secuencias SEC ID nº 129 y 131 de la Tabla 3), 5B8 (ver las secuencias SEC ID nº 133 y 135 de la Tabla 3), 5F1 (ver las secuencias SEC ID nº 137 y 139 de la Tabla 3), 14B3 (ver las secuencias SEC ID nº 141 y 143 de la Tabla 3), 16F1 (ver las secuencias SEC ID nº 145 y 147 de la Tabla 3), 16F8 (ver las secuencias SEC ID nº 149 y 151 de la Tabla 3), O3C9 (ver las secuencias SEC ID nº 153 y 155 de la Tabla 3), 22A3 (ver las secuencias SEC ID nº 165 y 167 de la Tabla 3), 29B11 (ver las secuencias SEC ID nº 169 y 171 de la Tabla 3) (todos estos clones se seleccionaron de la biblioteca de H1/H2 y se derivaron del clon parental 3F2), O2D7 (ver las secuencias SEC ID nº 157 y 159 de la Tabla 3) (seleccionadas de la biblioteca de L3 basada en el clon parental 3F2) y 28H1 (ver las secuencias SEC ID nº 161 y 163 de la Tabla 3), y 23C10 (ver las secuencias SEC ID nº 173 y 175 de la Tabla 3) (estos dos clones se seleccionaron de la biblioteca de H1/H2 y se derivaron del clon parental 4G8).
Las figuras 21 a 25 muestran los sensogramas de la resonancia de plasmón superficial de los Fabs de afinidad madurada seleccionados contra FAP, y la Tabla 15 proporciona las afinidades respectivas. Los Fabs seleccionados abarcan un intervalo de afinidades alto, en el intervalo de pM a nM, y presentan reactividad cruzada para la FAP humana (hu) y murina (mu), así como la FAP de Cynomolgus (cyno) según se determinó para clones seleccionados. Los Fabs anti-FAP de afinidad madurada se convirtieron en el formato Fab-IL2-Fab y en anticuerpos IgG para el análisis de especificidad. Se demostró la especificidad de unión por la falta de unión a DPPIV como homólogo cercano de FAP, expresado sobre células HEK293 o CHO.
TABLA 15.
Resumen de las constantes cinéticas de equilibrio (KD) de anticuerpo anti-FAP de afinidad madurada en forma de fragmentos Fab (unión monovalente).
anticuerpo
afinidad (KD) para FAP hu [pM] afinidad (KD) para FAP mu [pM] afinidad (KD) para FAP cyno [pM]
19G1
76 2600 n.d.
20G8
69 2800 n.d.
4B9
157 3300 n.d.
5B8
690 3200 n.d.
5F1
243 4100 n.d.
14B3
377 3800 n.d.
16F1
193 3400 n.d.
16F8
301 3800 n.d.
O3C9
160 3700 n.d.
O2D7
619 8300 n.d.
28H1
200 9 3600
22A3
34 655 522
29B11
35 436 23
23C10
1600 125 990
Ejemplo 12 Construcción de bibliotecas de maduración de afinidad de anti-TNC A2 (basadas en el clon 2B10) Se construyó una biblioteca de maduración de afinidad basándose en el anticuerpo preseleccionado de las
selecciones primarias de TNC A2. Más exactamente, se basó en el clon parental 2B10 y consistía de dos sub93
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bibliotecas: 1) sub-biblioteca de VL, aleatorizado en CDR1 y CDR2 de la cadena ligera (L1/L2), y 2) sub-biblioteca de VH, aleatorizada en CDR1 y CDR2 de la cadena pesada (H1/H2). Se agruparon estas sub-bibliotecas tras la transformación. Se construyó cada una de dichas sub-bibliotecas mediante cuatro etapas posteriores de amplificación y ensamblaje. Para las bibliotecas de L1/L2: 1) amplificación del fragmento 1 (LMB3 AM_Vk1A30_L1_ba) y del fragmento 2 (RJH50 (Vk1A30_L1/L2_fo) - RJH51 (Vk1A30_BsiWI_ba)), 2) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriores LMB3 y RJH51 (Vk1A30_BsiWI_ba) para crear el molde para 3) amplificación del fragmento 3 (LMB3 - AM_Vk1A30_L2_ba) y el fragmento 4 (RJH52 (Vk1A30_L2/L3) -RJH51 (Vk1A30_BsiWI_ba)), y 4) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los indicados anteriormente. Para las bibliotecas de H1/H2: 1) amplificación del fragmento 1 (RJH53 - AM_DP88_H1_ba_opt) y del fragmento 2 (RJH54 (DP88_H1/H2_fo) - MS52), 2) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriores RJH53 y MS52 para crear el molde para 3) amplificación del fragmento 3 (RJH53
- AM_DP88_H2_ba) y el fragmento 4 (RJH55 (DP88_H2H3_fo) - MS52), y 4) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los indicados anteriormente. Los productos finales del ensamblaje se digirieron con NcoI/BsiWI para las sub-bibliotecas de VL y MunI y NheI para las sub-bibliotecas de VH, y se clonaron en vectores aceptores digeridos de manera similar. El tamaño de la biblioteca resultó en 1,16 x 1010 clones independientes.
TABLA 16.
Cebadores utilizados en las bibliotecas de maduración de afinidad de L1/L2 para 2B10 anti-ligante de TNC A2
LMB3
CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC
AM_Vk1A30_L1_ba
CCTGGCTTCTGCTGGTACCAGCCTAAATCATTACGAATGCCCTGACTT GCCCGGCAGGTGATG
RJH50(Vk1A30_L1/L2_fo)
GCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAG
RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba)
GGTGCAGCCACCGTACGCTTGATCTC
AM_Vk1A30_L2_ba
CTTGATGGGACGCCACTCTGCAAACTGGACGCAGCATAGATCAGGCG CTTAGGGGCTTTCC
RJH52(Vk1A30_L21L3)
TTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTC
Subrayado: 60% base original y 40% aleatorización, V y en negrita: 60% base original y 40% aleatorización, M
TABLA 17.
Cebadores utilizados en las bibliotecas de maduración de afinidad de H1/H2 para 2B10 anti-ligante deTNC A2
RJH53
CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC
AM_DP88_H1_ba_opt
GTCCAGGGGCCTGTCGCACCCAGCTTATAGCGTAGCT GCTGAATGTGCCTCCGGAGGCCTTG
RJH54(DP88_H1/H2_fo)
ATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGAC
MS52
GAAGACCGATGGGCCTTTGGTGCTAG
AM_DP88_H2_ba
GACCCTGCCCTGGAACTTCTGTGCGTAGTTTGCGGTAC CAAAGATAGGGATGATCCCTCCCATCCACTCGAGCCC TTGTCCAG
RJH55 (DP88_H2H3_fo)
TACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCAC
Subrayado: 60% base original y 40% aleatorización, V y en negrita: 60% base original y 40% aleatorización, M
Ejemplo 13
Selección de clones anti-TNC A2 de afinidad madurada
Se llevaron a cabo selecciones contra TNC A2 humana expresada en E. coli que se clonó cadena arriba de una etiqueta avi y una etiqueta 6xhis (ver la secuencia SEC ID nº 57 de la Tabla 5). Se biotiniló el antígeno in vivo tras la expresión. Se llevaron a cabo selecciones en solución tal como se describe para las selecciones primarias de TNC A2 utilizando concentraciones decrecientes de TNC A2 humana comprendidas entre 100 y 2 nM. Tras la identificación de clones de afinidad madura mediante ELIAS, se llevaron a cabo cribados secundarios utilizando un biosensor ProteOn XPR36 (Biorad) y se determinaron las constantes de tasa cinética y las afinidades mediante el análisis de preparaciones de Fab purificadas a partir de la afinidad en el mismo instrumento. Se identificaron los clones de afinidad madurada siguientes: 2B10_O1F7 (ver las secuencias SEC ID nº 201 y 203 de la Tabla 3), 2B10_6H10 (ver las secuencias SEC ID nº 205 y 207 de la Tabla 3), 2B10_C3A6 (ver las secuencias SEC ID nº 185 y 187 de la Tabla 3), 2B10_D1A2 (ver las secuencias SEC ID nº 189 y 191 de la Tabla 3), 2B10_O7D8 (ver las secuencias SEC ID nº 197 y 199 de la Tabla 3) (la totalidad de ellas se derivan de la sub-biblioteca de VL), así como 2B10_C3B6 (ver las secuencias SEC ID nº 177 y 179 de la Tabla 3), 2B10_6A12 (ver las secuencias SEC ID nº 181 y 183 de la Tabla 3) (estos dos clones se derivaron de la sub-biblioteca de VH). Además, para el clon 2B10_D1A2, se generó un mutante V32D (ver las secuencias SEC ID nº 193 y 195 de la Tabla 3) (numeración según Kabat).
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La figura 26 muestra los sensogramas de la resonancia de plasmón superficial de las Fab de afinidad madurada seleccionados contra TNC A2, y la Tabla 18 proporciona las afinidades respectivas. Las Fab seleccionadas abarcan un intervalo de afinidad elevada en el rango de las pM.
TABLA 18.
Resumen de las constantes cinéticas de equilibrio (KD) de anticuerpos anti-TNC A2 de afinidad madurada en forma de fragmentos Fab (unión monovalente
anticuerpo
afinidad (KD) para TNC A2 hu [pM]
2B10_C3B6
191
2B10_6A12
290
2B10_C3A6
497
2B10_O7D8
147
2B10_O1F7
56
2B10_6H10
810
Ejemplo 14
Purificación de constructos Fab-IL2-Fab basados en 2B10, 3F2 y 4G8
10 Se desarrolló otro método de purificación (además del indicado en el Ejemplo 9) para los constructos Fab-IL2-Fab basados en 2B10, 3F2 y 4G8. Aunque los constructos Fab-IL2-Fab basados en 3F2 y 4G8 pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de proteína A (por ejemplo MabSelect Sure), los constructos Fab-IL2-Fab basados en 2B10 deben purificarse mediante cromatografía de afinidad en una matriz de
15 proteína G. El procedimiento de purificación se basa en las cuatro etapas siguientes:
1.
Cromatografía de afinidad con MabSelect Sure o proteína G
2.
Mantenimiento de pH bajo para la inactivación retrovírica
3.
Cromatografía de intercambio aniónico - cromatografía CaptoQ, para eliminar el ADN
4.
Cromatografía de intercambio catiónico - cromatografía de SP sefarosa FF, para eliminar los agregados
20 Para la eliminación de agregados en cromatografía a pequeña escala, alternativamente puede utilizarse la cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (GE Healthcare).
Se proporciona un ejemplo del procedimiento de purificación posteriormente para Fab-IL2-Fab basado en 3F2. En
25 una primera etapa, se ajustó a pH 7 el sobrenadante procedente de células HEK293 transfectadas transitoriamente con PEI en medio Freestyle (Invitrogen) y se aplicó a una columna MabSelect de proteína A (GE Healthcare), se lavó con NaPO4 100 mM, NaCl 250 mM, pH 7, y se eluyó con formiato sódico 8,8 mM, pH 3. Se intercambiaron fracciones seleccionadas en tampón de lavado y se aplicaron a una columna CaptoQ (GE Healthcare), se lavaron con NaPO4 10 mM, NaCl 40 mM, pH 6,5, y se eluyeron con NaCl 2 M. Se ajustó el eluído a pH 5 y se aplicó a una
30 columna SP Sefarosa FF (GE Healthcare), se lavó con acetato sódico 25 mM, NaCl 25 mM, pH 5, y se eluyó con acetato sódico 25 mM, NaCl 300 mM, pH 5. Las fracciones se intercambiaron en el tampón de formulación final. La figura 27 muestra una vista general del procedimiento de purificación.
El Fab-IL2-Fab basado en 3F2 purificado era puro tras la purificación (figura 28A) y no contenía agregados (figura
35 28B). El procedimiento de purificación descrito se aplicó a un Fab-IL2-Fab basado en 4G8. El Fab-IL2-Fab basado en 4G8 se comportaba de manera similar al Fab-IL2-Fab basado en 3F2. El material purificado era puro tras la purificación y no contenía agregados (figura 28, C-D).
Se llevó a cabo la purificación para el formato Fab-IL2-Fab con 2B10 (ligante de TNC A2) como fragmento Fab. En
40 una primera etapa, se ajustó a pH 7 el sobrenadante procedente de células HEK293 transfectadas transitoriamente con PEI en medio Freestyle (Invitrogen) y se aplicó a una columna de proteína G (GE Healthcare), se lavó con NaPO4 100 mM, NaCl 250 mM, pH 7, y se eluyó con formiato sódico 8,8 mM, pH 3. Se intercambiaron fracciones seleccionadas en tampón de lavado y se aplicaron a una columna CaptoQ (GE Healthcare), se lavaron con NaPO4 10 mM, NaCl 40 mM, pH 6,5, y se eluyeron con NaCl 2 M. Se ajustó el eluído a pH 5 y se aplicó a una columna SP
45 Sefarosa FF (GE Healthcare), se lavó con acetato sódico 25 mM, NaCl 25 mM, pH 5, y se eluyó con acetato sódico 25 mM, NaCl 300 mM, pH 5. Las fracciones se intercambiaron en el tampón de formulación final.
La figura 29 muestra los resultados de: (A) la caracterización analítica del producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen, tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido), y (B) cromatografía analítica
50 de exclusión por tamaño del producto tras cada una de las tres etapas de purificación. Se detectó 2,3% de agregados en el producto final.
Ejemplo 15
55 Ensayo de estabilidad
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Se llevó a cabo el ensayo de estabilidad para el formato Fab-IL2-Fab con el ligante B19 del ectodominio B de la fibronectina como fragmento Fab. Para los ensayos de estabilidad, se purificó el constructo Fab-IL2-Fab mediante cromatografía de afinidad de proteína A con una etapa de elución a pH 3, seguido de la cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) tal como se ha descrito. Se sometieron a ensayo tres tampones diferentes y se identificó HCl de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 como tampón adecuado. A continuación, se formuló Fab-IL2-Fab L19 en HCl de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, a una concentración de 6,3 mg/ml y se almacenaron durante cuatro semanas a temperatura ambiente y a 4ºC. La figura 30 muestra datos de estabilidad ejemplares: Se analizaron sondas cada semana para la concentración mediante espectroscopia de UV (figura 30A) (tras la centrifugación para peletizar el material potencialmente precipitado) y para el contenido de agregados mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (figura 30B). Los resultados muestran que no se produjo agregación ni degradación al almacenar el constructo a 4ºC o a temperatura ambiente durante 28 días, así como tras un ciclo de congelación/descongelación a una concentración de 6 mg/ml. Estos datos demuestran que el formato Fab-IL2-Fab es altamente estable y que se comporta de manera comparable a los anticuerpos IgG.
Ejemplo 16
Afinidades de unión de Fab-IL2-Fab con diana en FAP mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore)
Se determinaron las afinidades de unión de los tres constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP: Fab-IL2-Fab 3F2, Fab-IL2-Fab 4G8 y Fab-IL2-Fab 3D9, mediante resonancia de plasmón superficial.
Para la determinación de la unión de FAP, se capturó FAP mediante un anticuerpo anti-His inmovilizado (Penta His, Qiagen nº 34660) y se utilizaron los constructos como analitos. La temperatura del análisis era 25ºC y los constructos Fab-IL2-Fab se diluyeron 1:5 de 10 nM a 3,2 pM. Se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 180 s, disociación: 900 s, caudal: 90 μl/min. Se regeneró el chip con glicina 10 mM, pH 2 durante 60 segundos. Las curvas se ajustaron al modelo 1:1 para obtener los valores de KD (Rmax local, RI=0).
Para determinar la afinidad para cadenas de receptor de IL-2 (IL-2R), se inmovilizaron las cadenas β y γ (b/g, constructo botón-en-ojal) o la cadena α (a) de IL-2R se inmovilizaron sobre el chip y se utilizaron los constructos Fab-IL2-Fab como analitos. Temperatura del análisis: 25ºC. Los constructos Fab-IL2-Fab 3F2 y 3D9 se diluyeron 1:2 de 25 nM a 0,78 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 100 s, disociación: 180 s, caudal: 90 μl/min. Se realizó la regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5, durante 20 segundos. Los constructos Fab-IL2-Fab 4G8 se diluyeron de 100 nM a 3,125 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 180 s, disociación: 180 s, caudal: 40 μl/min. Regeneración con MgCl2 3 M durante 30 segundos.
La Tabla 19 proporciona un resumen de las afinidades de unión de los inmunconjugados Fab-IL2-Fab 3F2, 4G8 y 3D9. Los valores picomolares de afinidad alcanzan el límite de detección del Biacore. Las figuras 31 a 34 muestran los sensogramas de Biacore y afinidades respectivas.
TABLA 19.
Resumen de las constantes de equilibrio cinético (KD) de constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP para FAP de diferentes especies, y receptor de IL-2 según determinación mediante resonancia de plasmón superficial
Constructo
FAP humana FAP murina FAP de Cynomolgus Afinidad para receptor de IL-2 (b/g) Receptor inmovilizado Afinidad para receptor de IL-2 (a) Receptor inmovilizado
Fab-IL2-Fab 3F2
Avidez: 25 pM Avidez: 49 pM Avidez: 24 pM IL-2R bg hu 2,7 nM ND
Fab-IL2-Fab 4G8
Avidez: 83 pM Avidez: 2.3 pM Avidez: 74 pM IL-2R bg hu 3,8 nM IL-2R bg mu 45,6 nM IL-2R a hu 4,5 nM IL-2R a mu 29 nM
Fab-IL2-Fab 3D9
Avidez: 96 pM Avidez: 63 pM Avidez: 105 pM IL-2R bg hu 2,7 nM ND
Ejemplo 17
Afinidades de unión de Fab-IL2-Fab con diana en TNC A2 mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore)
Para la determinación de la unión de TNC A2 a los antígenos biotinilados (dominios fn5-A1-A2-A3 de TNC, fusionados entre sí, expresados en E. coli. Mientras que los dominios fn5 y A3 en todos los casos son de origen humano, los dominios A1 y A2 son humanos, murinos o Cynomolgus) se inmovilizaron sobre un chip con estreptavidina y se utilizaron los constructos de inmunoconjugado como analitos. Temperatura del análisis: 25ºC. Los constructos Fab-IL2-Fab se diluyeron 1:2 de 25 nM a 0,39 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 180 s, disociación: 180 s, caudal: 50 ìl/min. Se regeneró el chip con glicina 10
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mM, pH 1,5 durante 60 segundos. Las curvas se ajustaron al modelo 1:1 para obtener los valores de KD. A modo de control negativo, se aplicaron los dominios 1 a 8 de TNC producidos en células HEK (HEK TNC 1 a 8).
Para determinar la afinidad para las cadenas β and γ de receptor de IL-2 (IL-2R) (b/g; constructo de botón en ojal), se inmovilizó el constructo IL-2R sobre el chip y se utilizaron los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab como analitos. Temperatura del análisis: 25ºC. Los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab se diluyeron 1:2 de 25 nM a 0,78 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 100 s, disociación: 180 s, caudal: 90 μl/min. Se realizó la regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5, durante 20 segundos. Los constructos Fab-IL2-Fab se diluyeron de 100 nM a 3,125 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: tiempo de asociación: 180 s; disociación: 180 s; caudal: 40 μl/min. Regeneración con MgCl2 3 M durante 30 segundos. La Tabla 20 proporciona un resumen de las afinidades de unión para el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10, la figura 35 muestra los sensogramas Biacore y afinidades respectivas.
TABLA 20.
Resumen de las constantes de equilibrio cinético (KD) de constructos Fab-IL2-Fab con diana en TNC A2 para TNC A2 de diferentes especies, y receptor-β/γ de IL-2 según determinación mediante resonancia de plasmón superficial
Constructo
TNC humana TNC murina TNC de Cynomolgus Afinidad para receptor hu de IL-2 (β/γ) receptor inmovilizado
Fab-IL2-Fab 2B10 Antígeno de E. coli inmov. HEK TNC 1-8 (cont. neg.)
Avidez: 0,12 nM Falta de unión Avidez: 0,77 nM Avidez: 0,12 nM 2,7 nM
Ejemplo 18
Ensayos de actividad biológica con inmunoconjugados Fab-IL2-Fab de IL2 dirigidos
Se investigó la actividad biológica de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab de IL-2 dirigidos en varios ensayos celulares en comparación con IL-2 (proleuquina).
Inducción de la proliferación de las células NK92
Se investigaron moléculas Fab-IL2-Fab de IL-2 dirigidas que reconocían TNC A2 (2B10) o FAP (3F2 y 4G8) para su potencial de inducir la proliferación de células NK92 en comparación con IL-2 (proleuquina) y el diacuerpo L19 de IL2 que reconoce la EDB de la fibronectina.
Se recubrieron los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos de fondo plano con 2 µg/ml de tenascina humana, FAP
o fibronectina durante la noche a 4ºC. Tras bloquear la placa, se titularon los constructos Fab-IL2-Fab o el diacuerpo en la placa y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente (RT) para la unión. Tras un lavado intensivo para eliminar los constructos no unidos, se añadieron células NK92 privadas de IL-2 (10.000 células/pocillo). A modo de control positivo se añadió proleuquina en solución a algunos de los pocillos. Las células se incubaron durante 2 días a 37ºC en un incubador humidificado (con 5% de CO2) antes de lisar las células para determinar la proliferación mediante la medición del ATP utilizando el kit CellTiter Glo (Promega). Los resultados en la figura 36 muestran que todos los constructos Fab-IL2-Fab fueron capaces de activar la señalización de IL-2R sobre las células NK92 y de estimular su proliferación. Debido a la afinidad de unión reducida para el heterodímero IL-2R β/γ requerida para la señalización, se redujo la potencia de la inducción del crecimiento celular en un factor de aproximadamente 10 ó más en comparación con la IL-2 (proleuquina). Sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de la IL-2 (proleuquina).
Inducción de la fosforilación de STAT5
En otro experimento los presentes inventores sometieron a ensayo la inducción de la fosforilación de STAT5 como consecuencia de la señalización de IL-2R mediada por IL-2 tras la incubación con una molécula de Fab-IL2-Fab de IL-2 que reconocía FAP (basada en 4G8) sobre diferentes poblaciones de células efectoras, incluyendo: A) células NK CD56+, B) células T ayudante CD4+CD25-CD127+, C) células T citotóxicas CD3+CD8+, y D) células T reguladoras (Treg) CD4+CD25+FOXP3+ de PBMCs humanas en solución.
Se trataron PBMCs aisladas a partir de sangre de donantes sanos, durante 20 minutos con diferentes concentraciones de proleuquina o Fab-IL2-Fab antes de fijar/permeabilizar las mismas y teñilas con anticuerpo anti-PhosphoSTAT5 (Becton Dickinson) según las instrucciones del suministrador. Tras la tinción intracelular de STAT5 fosforilado, así como FOXP3, se tiñeron marcadores de superficie (CD3, CD4, CD8, CD56 y CD127) para la determinación de las diferentes subpoblaciones mediante citometría de flujo (FACS Canto II).
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Los resultados en la figura 37 confirman los resultados de la figura 36 y muestran que el constructo Fab-IL2-Fab 4G8 era capaz de activar la señalización de IL-2R en diversas células efectoras positivas para IL-2R y de inducir la señalización cadena abajo de IL-2R y la fosforilación de STAT5. Debido a la afinidad de unión reducida para el heterodímero IL-2R β/γ requerida para la señalización, se redujo la potencia de la inducción de la fosforilación de STAT5 en un factor de aproximadamente 10 ó más en comparación con la IL-2 (proleuquina). Sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de la IL-2 (proleuquina).
Liberación de IFN-γ e inducción de la proliferación en solución y tras la inmovilización
En otro experimento, los presentes inventores pretendían imitar la situación producida en un tumor en el que se encuentra unido inmunoconjugado de IL-2 dirigido e inmovilizado sobre las células tumorales o el estroma tumoral y puede activar las células efectoras. Con el fin de llevar a cabo lo anterior, los presentes inventores llevaron a cabo un ensayo de liberación de IFN- γ con células NK92, así como un ensayo de proliferación con los inmunoconjugados en solución, o recubrieron placas de microtitulación con antígeno TNC o FAP de manera que los inmunoconjugados de IL-2 dirigidos se encontrasen inmovilizados tras la unión a TNC o FAP.
Se recubrieron los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos de fondo plano con 2 µg/ml de tenascina humana o FAP durante la noche a 4ºC. Tras bloquear la placa, se titularon los constructos Fab-IL2-Fab en la placa y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente (RT) para la unión. Tras un lavado intensivo para eliminar los constructos no unidos, se añadieron células NK92 privadas de IL-2 (10.000 células/pocillo). A modo de control positivo se añadió proleuquina en solución a algunos de los pocillos. Para determinar la proliferación de las células, éstas se incubaron durante 2 días a 37ºC en un incubador humidificado (con 5% de CO2) antes de lisar las células para determinar la proliferación mediante la medición del ATP utilizando el kit CellTiter Glo (Promega). Se midió la liberación de IFN-γ en un enfoque separado tras 24 horas de incubación con Fab-IL2-Fab en el sobrenadante de las células con el kit ELISA de IFN-γ humano de Becton Dickinson.
Los resultados confirmaron que todos los constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP, TNC A1 o TNC A2 eran capaces de activar la señalización de IL-2R sobre células NK92 y de inducir la proliferación (figura 38A) de las células, así como la secreción de IFN-γ (figura 38C) en caso de encontrarse presente en solución. Debido a la afinidad de unión reducida para el heterodímero IL-2R β/γ requerida para la señalización, se redujo la potencia de la inducción de la liberación de IFN-γ en un factor de aproximadamente 10 ó más en comparación con la IL-2 (proleuquina). Sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de la IL-2 (proleuquina). En el caso de que las placas de microtitulación se recubriesen con FAP o TNC, y los constructos se inmovilizasen sobre la placa, todos los constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP, TNC A1 o TNC A2 todavía eran capaces de activar la señalización de IL-2R sobre las células NK92 y de inducir el crecimiento celular (figura 38B) y la liberación de IFN- γ (figura 38D). En comparación con el ensayo realizado en solución, la diferencia de eficacia entre la IL-2 no recubierta (proleuquina) y los constructos Fab-IL2-Fab inmovilizados era un orden de magnitud más alta; sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de IL-2 (proleuquina).
Estos datos apoyan fuertemente el concepto de generar los inmunoconjugados dirigidos con baja exposición sistémica, pero que se acumulen en el sitio de la enfermedad, donde median en su función.
En el ejemplo siguiente, los presentes inventores investigador si dichas propiedades in vitro se traducían en una eficacia in vivo superior en modelos de xenoinjerto.
Ejemplo 19
Eficacia in vivo de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab dirigidos contra FAP y TNC A2 en xenoinjertos de líneas celulares tumorales humanas
Se sometieron a ensayo los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab dirigidos contra FAP y TNC A2 para su eficacia antitumoral en varios modelos de xenoinjerto.
Modelo de xenoinjerto LS174T
Se sometió a ensayo el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 en la línea celular colorrectal humana LS174T, inyectado intraesplénicamente en ratones SCID.
Las células LS174T (células de carcinoma de colon humano) se obtuvieron originalmente de ECACC (European Collection of Cell Culture) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. Se cultivaron LS174T en medio de Eagle MEM que contenía 10% de FCS (PAA Laboratories, Austria), glutamax al 1% y aminoácidos no esenciales MEM al 1% (Sigma). Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera saturada en agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase in vitro 15 para la inyección intraesplénica, a una viabilidad de 92,8%. Se
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realizó una incisión pequeña en el sitio abdominal izquierdo de ratones SCID/beige anestesiados. Se inyectaron cincuenta microlitros (3x106 células LS174T en medio AimV) de suspensión celular a través de la pared abdominal inmediatamente debajo de la cápsula del bazo. Se cerraron las heridas de la piel utilizando grapas.
Ratones SCID hembra; de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos de Taconics, Dinamarca) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos, con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad, de acuerdo con directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016). Tras su recepción, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo ambiente y para la observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular.
Los ratones recibieron inyecciones intraesplénicas el día de estudio 0 de 3x106 células LS174T, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron inyecciones i.v. de Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 (Fab-IL2-Fab-SH2B10), diacuerpo L19 de IL-2 con diana en EDB de la fibronectina, o proleuquina dos veces a la semana durante tres semanas.
Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 µl de la solución apropiada. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron una inyección de PBS y los grupos de tratamiento con el constructo Fab-IL2-Fab, el diacuerpo o la proleuquina. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por cada 200 µl, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.
La figura 39 muestra que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 medió una eficacia superior en términos de una mediana de supervivencia incrementada en comparación con la IL-2 desnuda (proleuquina) y la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina.
TABLA 21.
Compuesto
Dosis Tampón de formulación Concentración (mg/ml)
Diacuerpo L19 de IL-2
12 µg citrato sódico 20 mM, sacarosa 190 mM arginina 20 mM pH 6,5 2,00 (=solución madre)
Proleuquina (IL-2)
4 μg manitol laurilsulfato sódico fosfato sódico 1,0 (=solución madre)
Fab-IL2-Fab 2B10 (G65S) de TNC A2 hu = SBH2B10
16 μg fosfato de potasio 25 mM, NaCl 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7 1,86 (=solución madre)
Modelo de xenoinjerto de ACHN
Los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP se sometieron a ensayo en la línea celular renal humana ACHN, inyectados intrarrenalmente en ratones SCID.
Las células ACHN (células de adenocarcinoma renal humano) se obtuvieron originalmente de la ATCC (American Type Culture Collection) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. Se cultivaron ACHN en DMEM que contenía FCS al 10%. Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera saturada en agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase in vitro 9 para la inyección intrarrenal, a una viabilidad de 97,7%. Se realizó una incisión pequeña (2 cm) en el flanco derecho y en la pared peritoneal de los ratones SCID bajo anestesia. Se inyectaron cincuenta µl (1x106 células ACHN en medio AimV) de suspensión celular 2 mm subcapsularmente en el riñón. Se cerraron las heridas de la piel y de la pared peritoneal utilizando grapas.
Ratones SCID hembra; de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos de Charles River, Sulzfeld, Alemania) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos, con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016). Tras su recepción, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo ambiente y para la observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular.
Los ratones recibieron inyecciones intrarrenales el día de estudio 0 de 1x106 células ACHN, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron inyecciones i.v. de proleuquina, diacuerpo L19 de IL-2 o inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP dos veces a la semana durante tres semanas.
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Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 µl de la solución apropiada. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron inyecciones de PBS y los grupos de tratamiento, de proleuquina, diacuerpo L19 de IL-2 o inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por cada 200 µl, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.
La figura 40 muestra que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 3F2 y 4G8 con diana en FAP medió una eficacia superior en términos de una mediana de supervivencia incrementada en comparación con la IL-2 desnuda (proleuquina) y la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina. El Fab-IL2-Fab basado en 4G8, que presenta una afinidad más alta para la FAP murina, medió una eficacia superior que el Fab-IL2-Fab basado en 3F2.
TABLA 22.
Compuesto
Dosis Tampón de formulación Concentración (mg/ml)
Diacuerpo L19 de IL-2
12 µg citrato sódico 20 mM, sacarosa 190 mM arginina 20 mM, pH 6,5 2,00 (=solución madre)
Proleuquina (IL2)
4 µg manitol laurilsulfato sódico fosfato sódico 1,0 (=solución madre)
Fab-IL2-Fab 3F2 FAP = 3F2 FAP
16 µg fosfato de potasio 25 mM, NaCl 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7 2,46 (=solución madre)
Fab-IL2-Fab 4G8 FAP = 4G8 FAP
16 µg fosfato de potasio 25 mM, NaCl 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7 11,8 (=solución madre)
Modelo de xenoinjerto A549
Se sometió a ensayo el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 en la línea celular de NSCLC A549, inyectado i.v. en ratones transgénicos FcγRIII SCID-humanos.
Las células de carcinoma pulmonar de células no pequeñas A549 se obtuvieron orignalmente de la ATCC (CCL-185) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. La línea celular tumoral se cultivó rutinariamente en DMEM que contenía FCS al 10% (Gibco) a 37ºC en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase 2 para el trasplante, a una viabilidad de 98%. Se inyectaron i.v. 2x106 células por animal en la vena de la cola en 200 µl de medio de cultivo celular AimV (Gibco).
Ratones SCID-FcγRIII hembra (GLYCART-RCC), de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (criados en RCC, Suiza) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos, con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016). Tras su recepción, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo ambiente y para la observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular.
Los ratones recibieron inyecciones i.v. el día de estudio 0 de 5x106 células A549, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron inyecciones i.v. de Fab-IL2-Fab 2B10 o diacuerpo L19 de IL-2 dos veces a la semana durante tres semanas.
Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 µl de la solución apropiada. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron una inyección de PBS y el grupo de tratamiento, de constructo Fab-IL2-Fab o diacuerpo L19 de IL-2. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por cada 200 µl, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.
La figura 41 muestra que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 medió una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia incrementada en comparación con la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina.
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TABLA 23.
Compuesto
Dosis Tampón de formulación Concentración (mg/ml)
Diacuerpo L19 de IL-2
12 µg citrato sódico 20 mM, sacarosa 190 mM arginina 20 mM, pH 6,5 2.00 (=solución madre)
Fab-IL2-Fab 2B10 (G65S) de TNC A2 hu = 2B10
16 µg fosfato de potasio 25 mM, NaCl 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7 1.86 (=solución madre)
Ejemplo 20
5 Purificación de inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab de GM-CSF dirigido
La purificación inicial del inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina) como fragmento Fab se llevó a cabo en sobrenadantes de células HEK 293 EBNA transitoriamente transfectadas. Brevemente, se purificó Fab-GM-CSF-Fab mediante cromatografía de proteína A seguido de cromatografía de 10 exclusión por tamaño. Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Se cargó el sobrenadante y la columna se lavó en primer lugar con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, seguido de fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM, pH 7,5. Se eluyó GM-CSF dirigido utilizando citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM, glicina 100 mM, pH 3, y se neutralizó posteriormente. Para la formulación se aplicó el tampón siguiente: Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125
15 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 42 muestra los perfiles de elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen, tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido). El rendimiento fue 4,8 mg/l.
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Ejemplo 21
Ensayo de actividad biológica con inmunoconjugado dirigido Fab-GM-CSF-Fab de GM-CSF
25 El inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab purificado con L19 (ligante de ectodominio B de fibronectina) como Fab se analizó posteriormente en un ensayo de proliferación dependiente de GM-CSF. Brevemente, se sembraron células TF-1, que crecen en dependencia de GM-CSF, tras el ayuno durante la noche a una densidad de 10.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se titularon GM-CSF recombinante humano (Miltenyi nº 130-093-862) o inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab sobre las células en solución. Tras 2 días de proliferación a
30 37ºC en un incubador humidifcado con 5% de CO2, las células se lisaron y se midió el contenido de ATP con el ensayo CellTiter Glo de Promega. Las células no tratadas con GM-CSF se fijaron a 0% de crecimiento para el cálculo. Los resultados en la figura 43 muestran que el inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab indujo una fuerte proliferación de las células TF-1.
35 Ejemplo 22
Purificación de inmunoconjugado dirigido Fab-IL12-Fab de IL-2
La purificación inicial del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab 4G8 (ligante de FAP) como fragmento Fab se llevó a cabo
40 en sobrenadantes de células HEK 293 EBNA transitoriamente transfectadas. Brevemente, se purificó Fab-IL12-Fab mediante cromatografía de proteína A seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM y citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Se cargó el sobrenadante y la columna se lavó con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 500 mM, pH 7,5. Se llevó a cabo un segundo lavado con fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. Tras un tercer lavado
45 con MES 10 mM y cloruro sódico 50 mM, pH 5, se eluyó IL-12 dirigido utilizando citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3, y posteriormente se neutralizó. Para la formulación se aplicó el tampón siguiente: fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM y glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 44 muestra los perfiles de elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del
50 producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen; tampón de migración MOPS, reducido y no reducido). El rendimiento fue de 43 mg/l.
Ejemplo 23
55 Ensayos de actividad biológica con inmunoconjugados dirigidos Fab-IL2-Fab de IL2 El inmunoconjugado Fab-IL12-Fab 4G8 purificado (ligante de FAP) como Fab se analizó posteriormente para la liberación de IFN-γ inducida por IL-12, comparando el efecto de IL-12 y el inmunoconjugado Fab-IL12-Fab 4G8 purificado, en PBMC aisladas a partir de sangre humana fresca procedente de un donante sano.
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Brevemente, se aislaron PBMCs de sangre humana fresca procedente de un donante sano y se sembraron en una placa de 96 pocillos de fondo en U (1,5x105 células/pocillo) en medio AIM V. Se añadió a todos los pocillos una concentración constante de 10 ng/ml de IL-2 hu (Preprotech). El constructo Fab-IL12-Fab se diluyó en el medio y se tituló sobre las PBMC. Se recogieron los sobrenadantes tras aproximadamente 20 horas para determinar las concentraciones de IFN-γ utilizando el kit ELISA II para IFN-γ hu de Becton Dickinson (nº 550612).
Los resultados en la figura 45 muestran que: A) la cantidad seleccionada de IL-2 humano (hu) solo, así como de IL12 solo no era capaz de inducir una liberación significativa de IFN-γ por parte de las PBMCs humanas, mientras que la combinación de ambas citoquinas condujo a una liberación significativa de IFN-γ por parte de las PBMCs. B) El constructo Fab-IL-12-Fab indujo la liberación de IFN-γ por parte de las PBMCs humanas de una manera dependiente de la concentración en presencia de 10 ng/ml de IL-2 humana.
Ejemplo 24
Purificación de inmunoconjugado dirigido Fab-IFN α2-Fab de IFN-α
La purificación inicial del inmunoconjugado Fab-IFNα2-Fab con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina) como fragmento Fab se llevó a cabo en sobrenadantes de células HEK 293 EBNA transitoriamente transfectadas. Brevemente, se purificó Fab-IFNα2-Fab mediante cromatografía de proteína A seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM y citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Se cargó el sobrenadante y la columna se lavó en primer lugar con fosfato sódico 20 mM y citrato sódico 20 mM, pH 7,5, seguido de fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 100 mM, pH 7,5. Se eluyó el Fab-IFNα2-Fab con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3, y se neutralizó posteriormente. Para la formulación se aplicó el tampón siguiente: fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 46 muestra los perfiles de elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen, tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido). El rendimiento fue de 8,4 mg/l.
Ejemplo 25
Ensayo de actividad biológica de inmunoconjugado Fab-IFNα2-Fab de IFN-á
El inmunoconjugado Fab-IFNα2-Fab purificado con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina) como Fab posteriormente se analizó para la inhibición de la proliferación inducida por IFN-á de células T de Jurkat y células tumorales A549, comparando el efecto de IFN-á (Roferon A, Roche) y el inmunoconjugado Fab-IFNα2-Fab L19 purificado. Brevemente, las células A549 y T de Jurkat, que son susceptibles a la inhibición de la proliferación inducida por IFN-á se sembraron a una densidad de 5.000 células/pocillo (A549) ó 10.000 células/pocillo (Jurkat) en placas de 96 pocillos de fondo plano. Las diluciones de Roferon A (Roche) o de Fab-IFNα2-Fab en el medio de cultivo celular apropiado se titularon sobre las células en solución. Tras 2 días de proliferación a 37ºC en un incubador humidifcado con 5% de CO2, las células se lisaron y se midió el contenido de ATP con el ensayo CellTiter Glo de Promega. Las células no tratadas con IFN-á se fijaron a 0% de crecimiento para el cálculo.
Los resultados en la figura 47 muestran que los constructos Fab-IFNα2-Fab inhiben la proliferación de: A) células T de Jurkat, y B) células A549 de una manera dependiente de la concentración comparable a la de IFN-á (Roferon A).
Ejemplo 26
Preparación de inmunoconjugado Fab-IL2-Fab con diana en MCSP
El anticuerpo MHLG anti-MCSP humanizado se generó tal como se describe en el documento WO nº 2006/100582 (ver, en particular, el Ejemplo 1 en la misma), el contenido completo de la cual se incorpora en la presente memoria como referencia, y se convirtió al formato Fab-IL2-Fab (ver las secuencias SEC ID nº 255, 256, 261, 262).
Se generó el anticuerpo MHLG1 anti-PCSM humanizado de la manera siguiente: La secuencia de aminoácidos murina del anticuerpo anti-MCSP 225.28 (cadena ligera, y cadena pesada, ver posteriormente) se alineó a una colección de genes de anticuerpo V de la línea germinal humana y se clasificaron según la identidad y homología de las secuencias.
225.28 cadena ligera; GenBank nº de acceso CAA65007 (SEC ID nº 267): DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISN VQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK
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225.28 cadena pesada; GenBank nº de acceso disponible (SEC ID nº 268):
QVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWIAEIRLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRD DSKSSAYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS
Se seleccionó la secuencia aceptora potencial basándose en una homología global elevada, y la presencia de los residuos canónicos correctos ya en la secuencia aceptora. Se seleccionó la secuencia de la línea germinal humana IGHV3-15 (IMGT nº de acceso X92216) como el aceptor para la cadena pesada, y la secuencia IGKV1-9 (IMGT nº de acceso Z00013) para la cadena ligera. Los constructos humanizados se denominan M-KV1 (ver las secuencias SEC ID nº 263, 264, 269 y 270), 7 (SEC ID nº 265, 266, 271 y 272), y 9 (SEC ID nº 253, 254, 259, 260) para la cadena ligera, y MHLG1 (ver las secuencias SEC ID nº 251, 252, 257, 258), para la cadena pesada.
Los genes para dichas secuencias de anticuerpo diseñadas se generaron mediante técnicas de PCR convencional y se fusionaron a dominios constantes de IgG1 y kappa humanos para la construcción de los plásmidos de expresión.
Los anticuerpos se expresaron como IgG o como proteínas de fusión Fab-IL2-Fab en sistemas de cultivo celular de mamífero, por ejemplo HEK o CHO, y se purificaron mediante cromatografía de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. La comparación de los datos de unión de las variantes de cadena ligera M-KV1 y M-KV7 reveló que un residuo de prolina en la posición Kabat 46 resulta esencial para la unión funcional al antígeno. Se adoptaron dos enfoques diferentes para garantizar la presencia de dicho aminoácido: A) se introdujo una retromutación en el marco humano de IGKV1-9, y B) para evitar la presencia de retromutaciones, se intercambió la región de marco 2 completa (posiciones Kabat 35 a 49) por la región correspondiente del anticuerpo humano con la entrada de GenBank AAA17574. Este anticuerpo presenta naturalmente un residuo de prolina en la posición 46.
Se purificó Fab-IL2-Fab MHLG KV9 con diana en MCSP mediante el método descrito anteriormente (Ejemplo 9), compuesto de una etapa de afinidad (proteína A), seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare). Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante, y la columna se lavó con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sodico 500 mM, pH 7,5, seguido de un lavado con fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. Opcionalmente se llevó a cabo un tercer lavado con MES 10 mM y cloruro sódico 50 mM, pH 5. Se eluyó Fab-IL2-Fab con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3. Las fracciones eluídas se agruparon y se purificaron mediante cromatografía por exclusión por tamaños en el tampón de formulación final. Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 48 muestra: (A) los perfiles de elución de la purificación, y (B) los resultados de la caracterización analítica del Fab-IL2-Fab MHLG con diana en MCSP mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen; tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido). El rendimiento fue 30 mg/l.
Ejemplo 27
Ensayo de actividad biológica con inmunoconjugado dirigido Fab-IL2-Fab de PCSM
El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab purificado con MHLG KV9 (ligante de PCSM) como Fab se analizó posteriormente para la liberación de IFN-γ inducida por IL-2, comparando el efecto del Fab-IL2-Fab 4G8 purificado (ligante de FAP) con el de Fab-IL2-Fab MHLG sobre las células NK92.
Se sembraron células NK92 privadas de IL-2 en una placa de 96 pocillos de fondo en U (105 células/pocillo) en medio NK (MEMa + FCS al 10% + suero de caballo al 10% + 2-mercaptoetanol 0,1 mM + inositol 0,2 mM + ácido fólico 0,02 mM). El inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab basado en MHLG con diana en MCSP se diluyó en medio y se tituló sobre las células NK92 en una comparación directa entre el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab basado en 4G8 con diana en FAP. Se recogieron los sobrenadantes tras aproximadamente 22 horas para determinar las concentraciones de IFN-γ utilizando el kit ELISA II para IFN-γ hu de Becton Dickinson (nº 550612).
Los resultados en la figura 50 (para MHLG KV9 Fab-IL2-Fab) y en la figura 51 (para MHLG1 KV9 Fab-IL2-Fab) muestran que la totalidad de los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab, dirigidos contra PCSM o FAP, inducían una secreción de IFN-γ en células NK92 de una manera dependiente de la concentración, independientemente de la fracción de unión a antígeno utilizada.
Ejemplo 28
Ensayo de unión celular con el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab MHLG1 KV9 con diana en PCSM

Claims (15)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Inmunconjugado que comprende:
    (a)
    por lo menos una primera fracción efectora de cadena sencilla, y
    (b)
    una primera y una segunda fracciones de unión a antígeno, en el que dicha fracción efectora de cadena sencilla es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), interferón-α (INF-α) e interleuquina-12 (IL-12), en donde cada una de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno es una molécula de Fab, en donde dicha primera fracción efectora de cadena sencilla comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción de unión a antígeno, y en donde dicha segunda fracción de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino- o carboxi-terminal con dicha primera fracción efectora.
  2. 2.
    Inmunoconjugado según la reivindicación 1, en el que dicho inmunoconjugado consiste esencialmente de una primera fracción efectora y primera y segunda fracciones de unión a antígeno unidas mediante una o más secuencias conectoras.
  3. 3.
    Inmunoconjugado según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha primera molécula de Fab se une en su extremo carboxi-terminal de cadena pesada o ligera al aminoácido amino-terminal de dicha fracción efectora, y dicha fracción efectora se une en su aminoácido carboxi-terminal con el aminoácido amino-terminal de la cadena pesada o ligera de la segunda molécula de Fab.
  4. 4.
    Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las regiones variables de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el mismo antígeno.
  5. 5.
    Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las regiones variables de dichas primera y segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para antígenos diferentes.
  6. 6.
    Inmunoconjugado según la reivindicación 4 ó 5, en el que dichas primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para un antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste de proteína activada por fibroblastos (PAF), proteoglicano condroitín-sulfato del melanoma (PCSM), dominio A2 de la tenascina (TNC-A2), dominio A2 de la tenascina (TNC-A1) y dominio extra B de la fibronectina (DEB).
  7. 7.
    Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 7, SEC ID nº 179, SEC ID nº 183, SEC ID nº 187, SEC ID nº 191, SEC ID nº 195, SEC ID nº 199, SEC ID nº 203 y SEC ID nº 207, y una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 177, SEC ID nº 181, SEC ID nº 185, SEC ID nº 189, SEC ID nº 193, SEC ID nº 197, SEC ID nº 201, SEC ID nº 205.
  8. 8.
    Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para la proteína activada por fibroblastos (PAF) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de: SEC ID nº 21, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 31, SEC ID nº 35, SEC ID nº 39, SEC ID nº 43, SEC ID nº 47, SEC ID nº 51, SEC ID nº 69, SEC ID nº 73, SEC ID nº 77, SEC ID nº 81, SEC ID nº 85, SEC ID nº 89, SEC ID nº 93, SEC ID nº 123, SEC ID nº 127, SEC ID nº 131, SEC ID nº 135, SEC ID nº 139, SEC ID nº 143, SEC ID nº 147, SEC ID nº 151, SEC ID nº 155, SEC ID nº 159, SEC ID nº 163, SEC ID nº 167, SEC ID nº 171 y SEC ID nº 175, y una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de: SEC ID nº 17, SEC ID nº 19, SEC ID nº 23, SEC ID nº 29, SEC ID nº 33, SEC ID nº 37, SEC ID nº 41, SEC ID nº 45, SEC ID nº 49, SEC ID nº 67, SEC ID nº 71, SEC ID nº 75, SEC ID nº 79, SEC ID nº 83, SEC ID nº 87, SEC ID nº 91, SEC ID nº 121, SEC ID nº 125, SEC ID nº 129, SEC ID nº 133, SEC ID nº 137, SEC ID nº 141, SEC ID nº 145, SEC ID nº 149, SEC ID nº 153, SEC ID nº 157, SEC ID nº 161, SEC ID nº 165, SEC ID nº 169 y SEC ID nº 173.
  9. 9.
    Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicha primera y/o segunda fracciones de unión a antígeno son específicas para el proteoglicano crondroitín-sulfato del melanoma (PCSM) y en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID nº 257 ó a la secuencia SEC ID nº 261 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID nº 259 ó a la secuencia SEC ID nº 271.
  10. 10.
    Inmunoconjugado según la reivindicación 1, en el que dicha citoquina es IL-2.
  11. 11.
    Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polinucleótido codifica:
    (i)
    las cadenas pesadas de dicha primera y segunda fracciones de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora,
    (ii)
    las cadenas ligeras de dicha primera y segunda fracciones de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora, o
    318
    imagen2
    (iii) una cadena ligera de dicha primera fracción de unión a antígeno, una cadena pesada de dicha segunda fracción de unión a antígeno y dicha primera fracción efectora.
    5 12. Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 11.
  12. 13. Método para producir el inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el método comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 12 bajo condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado.
    10
  13. 14. Composición que comprende el inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador farmacéutico.
  14. 15. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la utilización en el tratamiento de 15 una enfermedad en un paciente en necesidad del mismo.
  15. 16. Inmunoconjugado para la utilización según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad es el cáncer.
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