CN110337448B - 使用与程序性死亡配体1(pd-l1)结合的抗体的免疫疗法 - Google Patents

使用与程序性死亡配体1(pd-l1)结合的抗体的免疫疗法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了与程序性死亡配体1(PD‑L1)特异性地结合的分离的抗体及其抗原结合片段。这些PD‑L1抗体或其抗原结合片段具有对PD‑L1的高亲和力，发挥抑制PD‑L1的功能，与它们的未修饰的亲本抗体相比在给定的物种(例如，人类)中的免疫原性较低，能够在混合淋巴细胞反应中增加T细胞增殖和IL‑2分泌，并且可以被用于治疗人类疾病(例如，癌症、传染病、自身免疫性疾病、哮喘、移植排斥和炎性紊乱(inflammatory disorder))。

Description

使用与程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的免疫疗法
相关的专利申请
本申请要求于2016年12月23日提交的美国临时申请第62/438,622号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
用于治疗癌症的免疫疗法正在从全局地和非特异性地模拟免疫系统的疗法快速地发展到对免疫系统的个体组分的更为靶向性的活化，引起增加的效力和减少的毒性。主要关注的是抑制程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡1(PD-1)之间的相互作用的疗法，程序性死亡配体1(PD-L1)存在于肿瘤或抗原呈递细胞的表面上，程序性死亡1(PD-1)存在于活化的淋巴细胞的表面上。
程序性死亡1(PD-1)是CD28受体家族的成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。程序性死亡配体1(PD-L1)是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)，所述两种细胞表面糖蛋白配体在与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌(Ohigashi等人,Clin Cancer Res,11:2947-53,2005)。PD-L1已经被表明通过增加抗原特异性T细胞克隆的凋亡而在肿瘤免疫中发挥作用(Dong等人,Nat Med,8:793-800,2002)。在癌症中，PD-L1和PD-1/PD-L1途径可以保护肿瘤免受细胞毒性T细胞的侵害，最终通过使肿瘤微环境中的细胞毒性T细胞失活来抑制抗肿瘤免疫应答，并且防止淋巴结中新的T细胞的激发(priming)和活化以及随后招募至肿瘤(Chen和Irving,Clin Cancer Res.,18:6580-6587,2012)。
PD-1/PD-L1相互作用的抑制在临床前模型中介导有效的抗肿瘤活性(美国专利第8,008,449号和第7,943,743号)，并且使用PD-1/PD-L1相互作用的Ab抑制剂治疗癌症已经进入临床试验(参见例如Topalian等人,Curr Opin Immunol.,24:207-212,2012；Brahmer等人,N Engl J Med.,366(26):2455-65,2012；Garon等人,N Engl J Med,372:2018-2028,2015；Philips等人,Int.Immunol.,27(1):39-46,2015)。已经在几种鼠和人类癌症(包括人类肺癌、卵巢癌和结肠癌和多种骨髓瘤)中发现了PD-L1表达，并且由例如Brsitol-MyersSquibb(BMS-936559)、Medimmune(MEDI4736)、Genentech(MPDL3280A)、Merck/Pfizer(MSB0010718C)开发的抗PD-L1抗体已经或目前正在进行临床评价。
PD-1途径阻断剂的耐受性及其独特的作用机制已经使其成为用于组合方案开发的理想的支柱(ideal backbone)。在黑素瘤患者中将CTLA-4和PD-L1阻断组合的最近的临床数据显示出与单独地阻断任一检查点相比的增加的客观的肿瘤应答率，支持了组合的检查点阻断可以引起增加的临床益处的观点(Wolchok等人,N Engl J Med,366:2443-54,2012)。
本发明基于新型PD-L1抗体及其抗原结合片段的鉴定。因此，本发明涉及使用本文描述的新型人类抗PD-L1抗体及其抗原结合片段用于诊断、预后和治疗将受益于调节PD-L1和/或PD-1的状况(例如，癌症、持续性传染病、自身免疫性疾病、哮喘、移植排斥和炎性紊乱(inflammatory disorder))的组合物和方法。
本发明的公开内容
在本发明的一个方面中，提供了与程序性死亡配体1(PD-L1)特异性地结合的分离的抗体及其抗原结合片段。这些PD-L1抗体或其抗原结合片段具有对PD-L1的高亲和力，发挥抑制PD-L1的功能，与它们的未修饰的亲本抗体相比在给定的物种(例如，人类)中的免疫原性较低，能够在混合淋巴细胞反应中增加T细胞增殖和IL-2分泌，并且可以被用于治疗人类疾病(例如，癌症、传染病、自身免疫性疾病、哮喘、移植排斥和炎性紊乱)。
在多个实施方案中，抗体或抗原结合片段选自人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、Fab片段、Fab’片段、Fab2片段、F(ab)’2片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体或在铰链区中具有减轻形成H链内二硫键的倾向的至少一个突变的IgG4抗体。在多个实施方案中，抗体是嵌合抗体。在多个实施方案中，抗体是人源化抗体。在多个实施方案中，抗体是完全人类抗体。在多个实施方案中，提供了具有对SEQ ID NO:1的人类PD-L1蛋白的高亲和力的分离的抗体及其抗原结合片段。
在多个实施方案中，抗体或抗原结合片段以至少约1×10-6M、至少约1×10-7M、至少约1×10-8M、至少约1×10-9M、至少约1×10-10M、至少约1×10-11M、或至少约1×10-12M的解离常数(KD)与PD-L1蛋白结合。
在多个实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含以下任一项：(a)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列与选自SEQ ID NO:10-11的CDR3序列相同、基本上相同或基本上相似；(b)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与选自SEQ IDNO:5-6的CDR3序列相同、基本上相同或基本上相似；或(c)(a)的轻链CDR3序列和(b)的重链CDR3序列。
在多个实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段还包含选自以下的氨基酸序列：(d)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列与选自SEQ ID NO:7-8的CDR1序列相同、基本上相同或基本上相似；(e)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与选自SEQ ID NO:9的CDR2序列相同、基本上相同或基本上相似；(f)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与选自SEQ ID NO:2的CDR1序列相同、基本上相同或基本上相似；(g)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列与选自SEQID NO:3-4的CDR2序列相同、基本上相同或基本上相似；(h)(d)的轻链CDR1序列和(f)的重链CDR1序列；或(i)(e)的轻链CDR2序列和(g)的重链CDR2序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含：(a)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列与选自SEQ ID NO:7-8的CDR1序列相同、基本上相同或基本上相似；(b)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与选自SEQ IDNO:9的CDR2序列相同、基本上相同或基本上相似；(c)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列与选自SEQ ID NO:10-11的CDR3序列相同、基本上相同或基本上相似；(d)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与选自SEQ ID NO:2的CDR1序列相同、基本上相同或基本上相似；(e)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列与选自SEQ ID NO:3-4的CDR2序列相同、基本上相同或基本上相似；和(f)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与选自SEQ ID NO:5-6的CDR3序列相同、基本上相同或基本上相似。
在多个实施方案中，本发明的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含：(a)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列与SEQ ID NO:7相同、基本上相同或基本上相似；(b)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与SEQ ID NO:9相同、基本上相同或基本上相似；(c)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列与SEQ ID NO:10相同、基本上相同或基本上相似；(d)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与SEQ ID NO:2相同、基本上相同或基本上相似；(e)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列与SEQ ID NO:3相同、基本上相同或基本上相似；和(f)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与SEQ ID NO:5相同、基本上相同或基本上相似。
在多个实施方案中，本发明的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含：(a)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列与SEQ ID NO:8相同、基本上相同或基本上相似；(b)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列与SEQ ID NO:9相同、基本上相同或基本上相似；(c)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列与SEQ ID NO:11相同、基本上相同或基本上相似；(d)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列与SEQ ID NO:2相同、基本上相同或基本上相似；(e)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列与SEQ ID NO:4相同、基本上相同或基本上相似；和(f)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列与SEQ ID NO:6相同、基本上相同或基本上相似。
在多个实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含：(a)一种或更多种重链可变结构域和/或一种或更多种轻链可变结构域，所述一种或更多种可变结构域具有三个轻链CDR1、CDR2和CDR3的组，和/或三个重链CDR1、CDR2和CDR3的组，所述三个轻链CDR1、CDR2和CDR3与SEQ ID NO:7-8、9和10-11相同、基本上相同或基本上相似，所述三个重链CDR1、CDR2和CDR3与SEQ ID NO:2、3-4和5-6相同、基本上相同或基本上相似；和(b)来自人类免疫球蛋白(IgG)的四个可变区框架区的组。在多个实施方案中，抗体可以任选地包含铰链区。在多个实施方案中，框架区选自人类种系外显子XH、JH、Vκ和Jκ序列。在多个实施方案中，抗体是完全人源化抗体。在多个实施方案中，抗体是完全人类抗体。
在多个实施方案中，当与人类PD-L1结合时，分离的抗体或抗原结合片段：(a)以与参考抗体基本上相同或更大的Kd与人类PD-L1结合；(b)与所述参考抗体竞争结合人类PD-L1；或(c)在人类受试者中的免疫原性低于所述参考抗体，其中所述参考抗体包含选自SEQID NO:12/16和14/18的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列的组合。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46相同、基本上相同或基本上相似的序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47相同、基本上相同或基本上相似的序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:55中列出的重链序列和SEQ ID NO:56中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:57中列出的重链序列和SEQ ID NO:58中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:59中列出的重链序列和SEQ ID NO:60中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:61中列出的重链序列和SEQ ID NO:62中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:63中列出的重链序列和SEQ ID NO:64中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体的重链可变区与人类PD-L1结合，并且包含a)选自由SEQ ID NO:55、57、59、61和63的氨基酸20-49组成的组的FR1；b)选自由SEQ ID NO:55、57、59、61和63的氨基酸55-68组成的组的FR2；c)选自由SEQ ID NO:55、57、59、61和63的氨基酸86-117组成的组的FR3；和d)选自由SEQ ID NO:55、57、59、61和63的氨基酸127-137组成的组的FR4。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体的轻链可变区与人类PD-L1结合，并且包含a)选自由SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸20-42组成的组的FR1；b)选自由SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸54-68组成的组的FR2；c)选自由SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸76-107组成的组的FR3；和d)选自由SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸117-126组成的组的FR4。
在另一个方面中，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的本发明的分离的抗体或抗原结合片段。在多个实施方案中，药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的分离的人类抗体。在多个实施方案中，药物组合物被配制成用于通过选自由以下组成的组的途径施用：皮下注射、腹膜内注射、肌肉内注射、胸骨内注射、静脉内注射、动脉内注射、鞘内注射、心室内注射(intraventricular injection)、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射或通过输注。
在另一个方面中，本发明涉及治疗患有T细胞相关疾病(T-cell-relateddisease)或可以通过加强或抑制或延长免疫应答来减轻或预防的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本发明的抗体或其抗原结合片段。在多个实施方案中，受试者是人类受试者。
在另一个方面中，本发明涉及治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本发明的分离的抗体或抗原结合片段。在多个实施方案中，癌症是与PD-L1的升高的表达相关的癌症。在多个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、结肠直肠癌(CRC)、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌。在多个实施方案中，受试者先前响应于用抗癌疗法的治疗，但在疗法停止后，遭受复发(下文称为“复发性癌症(recurrent cancer)”)。在多个实施方案中，受试者患有耐受性(resistant)癌症或难治性癌症。
在另一个方面中，本发明涉及治疗受试者中的传染病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本发明的分离的抗体或抗原结合片段。在多个实施方案中，受试者患有耐受使用常规疫苗的治疗或通过使用常规疫苗的治疗未被有效治疗的传染病。
在另一个方面中，本发明涉及被设计成治疗受试者中的癌症或传染病的组合疗法，所述组合疗法包括向受试者施用a)治疗有效量的本发明的分离的抗体或抗原结合片段，和b)一种或更多种另外的疗法，所述一种或更多种另外的疗法选自由免疫疗法、化学疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法、疫苗接种方案和干细胞移植组成的组，其中组合疗法提供了对肿瘤细胞的增加的细胞杀伤，即当被共施用时，分离的抗体或抗原结合片段和另外的疗法之间存在协同作用。
在另一个方面中，提供了分离的免疫缀合物或融合蛋白，所述免疫缀合物或融合蛋白包含与效应物分子缀合、连接(或以其他方式稳定地缔合)的抗体或抗原结合片段。在多个实施方案中，效应物分子是免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化学治疗剂。
在另一个方面中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以与另外的功能部分共价地连接(或以其他方式稳定地缔合)，所述另外的功能部分诸如标记物或赋予期望的药代动力学特性的部分。在多个实施方案中，标记物选自由以下组成的组：荧光标记物、放射性标记物和具有独特的核磁共振特征的标记物。
在另一个方面中，本发明提供了用于体外或体内检测样品中人类PD-L1抗原的存在的方法，例如，用于诊断人类PD-L1相关疾病的方法。
在另一个方面中，提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含编码本文所公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列。还提供了包含本发明的核酸的表达载体。还提供了包含本发明的表达载体的分离的细胞。在多个实施方案中，细胞是包含本发明的表达载体的宿主细胞。在多个实施方案中，细胞是杂交瘤，其中细胞的染色体包含本发明的核酸。还提供了制备本发明的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许细胞表达本发明的抗体或抗原结合片段的条件下培养或孵育细胞。
用于实施本发明的方式
本发明涉及与人类PD-L1特异性地结合的抗原结合蛋白，诸如抗体或其抗原结合片段。在一个方面中，提供了分离的抗体及其抗原结合片段，所述分离的抗体及其抗原结合片段与PD-L1特异性地结合，具有对PD-L1的高亲和力，发挥抑制PD-L1的功能，与它们的未修饰的亲本抗体相比在给定的物种(例如，人类)中的免疫原性较低，并且可以被用于治疗人类疾病(例如，癌症)、感染和由PD-L1介导的其他紊乱。还提供了核酸分子及其衍生物和片段，所述核酸分子及其衍生物和片段包含编码与PD-L1结合的整个多肽或多肽的一部分的多核苷酸的序列，诸如编码整个抗PD-L1抗体或抗PD-L1抗体的部分、抗体片段或抗体衍生物的核酸。还提供了包含这样的核酸的载体和质粒，和包含这样的核酸和/或载体和质粒的细胞或细胞系。还提供了制备、鉴定或分离与人类PD-L1结合的抗原结合蛋白(诸如抗PD-L1抗体)的方法、确定抗原结合蛋白是否与PD-L1结合的方法、制备包含与人类PD-L1结合的抗原结合蛋白的组合物(诸如药物组合物)的方法、和用于向受试者施用与PD-L1结合的抗体或其抗原结合片段的方法，例如用于治疗由PD-L1介导的状况的方法。
定义
除非另外定义，否则与本发明关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常地，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交关联使用的命名法和技术是本领域中通常地使用和众所周知的那些命名法和技术。除非另有指示，否则本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法和如在整个本说明书中引用和讨论的多个一般性和更具体的参考文献中描述地进行。参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)，该文献通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明进行，如本领域中通常地完成或如本文描述的。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及药学和药物化学关联使用的命名法和实验程序和技术是本领域中通常地使用和众所周知的那些命名法和实验程序和技术。标准的技术被用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者的治疗。
使用标准单字母缩写或三字母缩写指示多核苷酸和多肽序列。除非另有指示，多肽序列在左侧具有它们的氨基末端并且在右侧具有它们的羧基末端，并且单链核酸序列和双链核酸序列的上方的链在左侧具有它们的5’末端并且在右侧具有它们的3’末端。多肽的特定部分可以通过氨基酸残基编号诸如氨基酸80至119，或通过在该位点处的实际的残基诸如Ser80至Ser119来命名。特定多肽或多核苷酸序列还可以基于其与参考序列如何不同来描述。特定轻链可变结构域和重链可变结构域的多核苷酸和多肽序列被命名为L1(“轻链可变结构域1”)和H1(“重链可变结构域1”)。包含轻链和重链的抗体通过将轻链的名称和重链可变结构域的名称组合来指示。例如，“L4H7”指例如包含L4的轻链可变结构域和H7的重链可变结构域的抗体。
本文使用术语“抗体”指包含一个或更多个多肽并且具有对肿瘤抗原的特异性或具有对在病理学状态中过表达的分子的特异性的蛋白，所述多肽基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及这些基因的亚型和大量免疫球蛋白可变区基因。轻链(LC)被分类为κ或λ。重链(HC)被分类为γ、μ、α、δ或ε，其继而分别地定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(例如，抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体包含相同的两对多肽链，每一对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端定义主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。
在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中被缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域，CH1、CH2和CH3(并且在一些实例中，CH4)。每条轻链包含轻链可变区(在本文中被缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可以被进一步子分类为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着被称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL包含按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。已经定义了框架区和CDR的范围。不同的轻链或重链的框架区的序列在物种诸如人类中是相对地保守的。抗体的框架区，即轻链和重链组分的组合框架区，起在三维空间中定位和排列CDR的作用。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常地被称为CDR1、CDR2、CDR3，从N-末端开始顺序地编号，并且还通常通过特定CDR位于其中的链来鉴定。因此，VH CDR3位于在其中发现它的抗体重链的可变结构域，而VL CDR1是来自在其中发现它的抗体轻链的可变结构域的CDR1。具有不同的特异性的抗体(即针对不同的抗原的不同结合位点)具有不同的CDR。尽管CDR在抗体与抗体之间变化，但在CDR中只有有限数目的氨基酸位置直接地参与抗原结合。CDR中的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。
Kabat定义是用于对抗体中的残基进行编号的标准，并且通常用于鉴定CDR区。Kabat数据库现在保持在线，并且可以确定CDR序列，例如，参见在互联网上可得的IMGT/V-QUEST程序3.2.18版，2011年3月29日，和Brochet,X.等人,Nucl.Acids Res.36,W503-508,2008。Chothia定义与Kabat定义相似，但Chothia定义考虑了某些结构环区域的位置。参见例如Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901-17,1986；Chothia等人,Nature,342:877-83,1989。AbM定义使用由Oxford Molecular Group生产的将抗体结构建模的一套整合的计算机程序。参见例如Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272,1989；"AbMTM,AComputer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,"Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定义使用知识数据库和从头方法的组合，诸如由Samudrala等人,"Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach,"PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198,1999中描述的那些，从一级序列对抗体的四级结构建模。接触定义是基于可得的复杂晶体结构的分析。参见例如MacCallum等人,J.Mol.Biol.,5:732-45,1996。
使用术语“Fc区”以定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，其可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体生成。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。抗体的Fc部分介导几个重要的效应物功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体与抗原-抗体复合物的半衰期/清除率(例如，新生的FcR(FcRn)在内体(endosome)中的酸性pH与IgG的Fc区结合并且保护IgG免受降解，从而对IgG的长血清半衰期作出贡献)。替换Fc部分中的氨基酸残基以改变抗体效应物功能是本领域中已知的(参见例如Winter等人,美国专利第5,648,260号和第5,624,821号)。
抗体作为完整的免疫球蛋白或作为许多良好表征的片段存在。这样的片段包括与靶抗原结合的Fab片段、Fab’片段、Fab2、F(ab)’2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合，而在dsFv中，链已经被突变以引入稳定所述链的缔合的二硫键。尽管已经关于完整抗体的消化定义了多种抗体片段，技术人员将理解，这样的片段可以化学地或通过使用重组DNA方法被从头合成。因此，如本文使用的，术语抗体包括例如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、从至少2种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人类抗体、人源化抗体、骆驼源化抗体(camelised antibody)、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、表现出期望的生物学活性的抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、细胞内抗体(intrabody)和表位结合片段或以上任一个的抗原结合片段。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的被称为“Fab”片段的抗原结合片段，每个片段具有单个抗原结合位点。“Fab片段”包含一条轻链和一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一条重链分子形成二硫键。“Fab’片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，所述重链的一部分包含VH结构域和CH1结构域并且还包含CH1和CH2结构域之间的区域，使得链间二硫键可以在两个Fab’片段的两条重链之间形成，以形成F(ab’)2分子。
胃蛋白酶处理抗体产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab’)2片段。“F(ab’)2片段”包含两条轻链和两条重链，两条重链包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段包含通过两条重链之间的二硫键结合在一起的两个Fab’片段。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺乏恒定区。
“单链抗体”是其中重链可变区和轻链可变区已经通过柔性接头连接以形成单个多肽链的Fv分子，所述多肽链形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公布第WO 88/01649号、美国专利第4,946,778号和第5,260,203号中详细讨论，三篇文献的公开内容通过引用并入。
如本文使用的术语“抗原结合片段”和“抗原结合蛋白”意指与特定靶抗原结合的任何蛋白。“抗原结合片段”包括但不限于抗体及其结合部分，诸如免疫学上有功能的片段。抗体的示例性抗原结合片段是一个或更多个重链CDR和/或一个或更多个轻链CDR，或重链可变区和/或轻链可变区。
如本文使用的，术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫学上有功能的片段”(或简称“片段”)是一种抗原结合蛋白，其包含缺乏在全长链中存在的至少一些氨基酸但仍能够与抗原特异性地结合的抗体的一部分(无论该部分是如何获得或合成的)。这样的片段是生物学上有活性的，因为它们与靶抗原结合并且可以与其他抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定表位。在一些实施方案中，片段是中和片段。在一个方面中，这样的片段将保留在全长轻链或重链中存在的至少一个CDR，并且在一些实施方案中，将包含单条重链和/或轻链或其一部分。这些生物学上有活性的片段可以通过重组DNA技术产生，或可以通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促裂解或化学裂解产生。免疫学上有功能的免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、双抗体、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可以来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、骆驼或兔。还考虑了本文公开的抗原结合蛋白的功能部分，例如一种或更多种CDR，可以与第二种蛋白或小分子共价地结合，以产生具有双功能治疗特性或具有延长的血清半衰期的针对在身体中的特定靶的治疗剂。
双抗体(diabody)是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的VH和VL区，所述接头太短以至于不允许同一条链上的两个区之间配对，从而允许每个区与另一条多肽链上的互补区配对(参见例如Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-48,1993；和Poljak等人,Structure,2:1121-23,1994)。如果双抗体的两条多肽链是相同的，那么由它们的配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有两个不同的抗原结合位点的双抗体。相似地，三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)分别是包含三条和四条多肽链并且分别形成可以是相同的或不同的三个和四个抗原结合位点的抗体。
双特异性抗体或片段可以具有几种构型。例如，双特异性抗体可以与单个抗体(或抗体片段)相似，但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。在多个实施方案中，双特异性抗体可以通过化学技术(Kranz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:5807,1981)；通过“多瘤(polydoma)”技术(参见例如美国专利第4,474,893号)；或者通过重组DNA技术来产生。在多个实施方案中，本公开内容的双特异性抗体可以具有对至少两种不同的表位(其中至少一种是肿瘤相关的抗原)的结合特异性。在多个实施方案中，抗体和片段还可以是异种抗体(heteroantibody)。异种抗体是连接在一起的两种或更多种抗体或抗原结合片段(例如，Fab)，每种抗体或片段具有不同的特异性。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外构成该群的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同的决定簇(表位)的不同的抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对在抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
如本文使用的术语“嵌合抗体”是指具有来自一个物种(诸如人类)的框架残基和来自另一个物种的CDR(其通常地赋予抗原结合)的抗体，诸如与靶向的抗原特异性地结合的鼠抗体。
如本文使用的，术语“人类抗体”意图包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开内容的人类抗体可以包括未被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，所述氨基酸残基例如在CDR中并且特别是在CDR3中。然而，如本文使用的术语“人类抗体”不意图包括其中来源于另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被接枝到人类框架序列上的抗体。
如本文使用的术语“人源化抗体”是指包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有通过取自供体框架的氨基酸的有限数目的取代。人源化抗体或其他单克隆抗体可以具有另外的保守氨基酸取代，这些另外的保守氨基酸取代对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。在多个实施方案中，框架区选自人类种系外显子XH、JH、Vκ和Jκ序列。例如，用于VH结构域的FR的人源化的受体序列可以选自种系VH外显子VH 1-18(Matsuda等人,Nature Genetics 3:88-94,1993)或VH 1-2(Shin等人,EMBO J.10:3641-3645,1991)并且对于铰链区(JH)，可以选自外显子JH-6(Mattila等人,Eur.J.Immunol.25:2578-2582,1995)。在其他实例中，种系Vκ外显子B3(Cox等人,Eur.J.Immunol.24:827-836,1994)和Jκ外显子Jκ-1(Hieter等人,J.Biol.Chem.257:1516-1522,1982)可以被选择作为用于VL结构域人源化的受体序列。
如本文使用的，术语“重组人类抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组、组合的人类抗体文库分离的抗体；从对于人类免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体；或通过包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在多个实施方案中，这样的重组人类抗体经历体外诱变(或，当使用人类Ig序列的转基因动物时，则经历体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列尽管来源于人类种系VH和VL序列并且与人类种系VH和VL序列相关，但可以不天然地存在于体内人类抗体种系库(repertoire)中。所有这类重组手段是本领域普通技术人员众所周知的。
如本文使用的术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由化学活性表面分组的分子(chemically active surface groupings of molecules)组成，诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链，并且通常地具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白和相互作用分子(诸如抗体)之间的所有相互作用的点都沿着蛋白的一级氨基酸序列线性地存在。在构象表位中，相互作用的点跨越蛋白上彼此分离的氨基酸残基存在。一旦确定了抗原上的期望的表位，那么生成针对该表位的抗体则是可能的，例如，使用本公开内容中描述的技术。可选地，在发现过程期间，抗体的生成和表征可以阐明关于期望的表位的信息。然后根据该信息，竞争性地筛选结合相同表位的抗体则是可能的。实现这一点的方法是进行交叉竞争(cross-competition)研究，以找到彼此竞争性地结合的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。
如果抗原结合蛋白(包括抗体)以如通过解离常数(KD，或对应的Kb，如以下定义的)值确定的高结合亲和力与抗原结合，则抗原结合蛋白(包括抗体)与抗原“特异性地结合”，所述解离常数值为至少1×10-6M，或至少1×10-7M，或至少1×10-8M，或至少1×10-9M，或至少1×10-10M，或者至少1×10-11M。与感兴趣的人类抗原特异性地结合的抗原结合蛋白也可以能够以相同或不同的亲和力与来自其他物种的相同的感兴趣的抗原结合。如本文使用的术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
如本文使用的术语“表面等离子共振(surface plasmon resonance)”是指一种光学现象，其允许通过检测在生物传感器基质中的蛋白浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden和Piscataway,N.J.)。对于进一步的描述，参见Jonsson U.等人,Ann.Biol.Clin.,51:19-26,1993；Jonsson U.等人,Biotechniques,11:620-627,1991；Jonsson B.等人,J.Mol.Recognit.,8:125-131,1995；和Johnsson B.等人,Anal.Biochem,198:268-277,1991。
如本文使用的术语“免疫原性”是指当被施用至接受者时，抗体或抗原结合片段引发免疫应答(体液应答或细胞应答)的能力，并且包括例如人类抗小鼠抗体(HAMA)应答。当来自受试者的T细胞对施用的抗体产生免疫应答时，启动了HAMA应答。然后，T细胞招募B细胞以生成特异性“抗抗体(anti-antibody)”抗体。
如本文使用的术语“免疫细胞”意指参与调控针对抗原(例如，自身抗原)的免疫应答的造血谱系的任何细胞。在多个实施方案中，免疫细胞是例如T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、朗氏细胞或Kuffer细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。在多个实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”是氨基酸的α碳通过肽键连接的氨基酸的链。因此在链的一个末端(氨基末端)处的末端氨基酸具有游离氨基基团，而在链的另一个末端(羧基末端)处的末端氨基酸具有游离羧基基团。如本文使用的，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指在肽的氨基末端处的氨基酸上的游离α-氨基基团，或指在该肽中的任何其他位置处的氨基酸的α-氨基基团(当参与肽键时为亚氨基)。相似地，术语“羧基末端”是指在肽的羧基末端上的游离羧基基团，或在该肽中的任何其他位置处的氨基酸的羧基基团。肽还包括基本上任何多氨基酸，包括但不限于肽模拟物(peptide mimetic)诸如通过醚键而非酰胺键连接的氨基酸。
如本文使用的术语“重组多肽”意图包括所有多肽，包括通过重组手段制备、表达、产生、来源于或分离的融合分子，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽。
本公开内容的多肽包括以任何方式和出于任何原因已经被修饰的多肽，例如，以：(1)降低对蛋白水解的易感性、(2)降低对氧化的易感性、(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力、(4)改变结合亲和力、和(5)赋予或修饰其他物理化学或功能特性。例如，单个氨基酸取代或多于一个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的一个或更多个结构域以外的一部分多肽中进行)。“保守氨基酸取代”是指在多肽中氨基酸被功能上相似的氨基酸取代。以下六组各自包含彼此为保守取代的氨基酸：
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
精氨酸(R)和赖氨酸(K)
异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
“非保守氨基酸取代”是指这些类别之一的成员取代为来自另一个类别的成员。在进行这样的改变中，根据多个实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。基于氨基酸的疏水性和电荷特征，每种氨基酸已经被指定了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白的相互作用的生物学功能中的重要性(参见例如Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-131)。已知某些氨基酸可以被具有相似的亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然保留相似的生物学活性。在基于亲水指数进行改变中，在多个实施方案中，包括了其亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在多个实施方案中，包括在±1内的那些，并且在多个实施方案中，包括在±0.5内的那些。
本领域还理解，可以基于亲水性有效地进行相似的氨基酸的取代，特别是在从而产生的生物学上有功能的蛋白或肽被意图用于在如本文公开的免疫学实施方案中使用的情况中。在多个实施方案中，蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻的氨基酸的亲水性决定的)与其免疫原性和抗原性，即，与蛋白的生物学特性相关。
以下亲水性值已经被指定至这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变中，在多个实施方案中，包括其亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在多个实施方案中，包括在±1内的那些，并且在多个实施方案中，包括在±0.5内的那些。示例性氨基酸取代在表1中列出。
表1
如本文使用的术语“多肽片段”和“截短的多肽”是指如与对应的全长蛋白相比具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失的多肽。在多个实施方案中，片段的长度可以是例如至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在多个实施方案中，片段的长度还可以是例如至多1000个、至多900个、至多800个、至多700个、至多600个、至多500个、至多450个、至多400个、至多350个、至多300个、至多250个、至多200个、至多150个、至多100个、至多50个、至多25个、至多10个或至多5个氨基酸。片段还可以在其任一个或两个末端处包含一个或更多个另外的氨基酸，例如，来自不同的天然存在的蛋白的氨基酸的序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
如本文使用的术语“多肽变体”和“多肽突变体”是指包含这样的氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列中，相对于另一个多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入到该氨基酸序列中、从该氨基酸序列缺失和/或被取代到该氨基酸序列中。在多个实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的长度。本公开内容的变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是已经被化学修饰的多肽，所述化学修饰例如缀合至另一个化学部分诸如例如聚乙二醇、白蛋白(例如，人血清白蛋白)，磷酸化和糖基化。
术语“％序列同一性”与术语“％同一性”在本文中可互换使用并且是指当使用序列比对程序比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性的水平或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性的水平。例如，如本文使用的，80％同一性与通过定义的算法确定的80％序列同一性意指相同的事物，并且意指给定的序列与另一种长度的另一个序列至少80％相同。在多个实施方案中，％同一性选自，例如，与给定的序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同一性。在多个实施方案中，％同一性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约99％的范围内。
术语“％序列同源性”与术语“％同源性”在本文中可互换使用并且是指当使用序列比对程序比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同源性的水平或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性的水平。例如，如本文使用的，80％同源性与通过定义的算法确定的80％序列同源性意指相同的事物，并且因此给定的序列的同源物具有相对于给定的序列的长度大于80％的序列同源性。在多个实施方案中，％同源性选自例如与给定的序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同源性。在多个实施方案中，％同源性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约99％的范围内。
可以用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于在互联网在NCBI的网站上公开地可得的BLAST程序的套件，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN。还见Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990(特别参考公开的默认设置，即参数w＝4、t＝17)和Altschul等人,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997。当相对于GenBank蛋白序列和其他公开数据库中的氨基酸序列评价给定的氨基酸序列时，通常使用BLASTP程序进行序列搜索。BLASTX程序优选用于针对在GenBank蛋白序列和其他公开数据库中的氨基酸序列搜索在所有阅读框中已经被翻译的核酸序列。使用开放空位(gap)罚分为11.0和延伸空位罚分为1.0的默认参数并且使用BLOSUM-62矩阵运行BLASTP和BLASTX二者。参见同上。
除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总概率(P(N))，所述最小总概率提供在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总概率为例如小于约0.1、小于约0.01或小于约0.001，则该核酸被认为与参考序列相似。
在多肽序列的上下文中，术语“基本相似性(substantial similarity)”或“基本上相似(substantially similar)”指示多肽区域具有与参考序列至少70％、通常至少80％、更通常至少85％、或至少90％或至少95％序列相似性的序列。例如，多肽与第二多肽基本上相似，例如，其中两个肽的差别在于一个或更多个保守取代。
“多核苷酸”是指包含核苷酸单元的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，诸如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包括这样的类似物，所述类似物包含非天然地存在的碱基、以除天然存在的磷酸二酯键以外的连接与其他核苷酸衔接(engage)的核苷酸、或包含通过除了磷酸二酯键以外的连接附接的碱基的核苷酸。因此，核苷酸类似物包括例如并且不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。这类多核苷酸可以例如使用自动化的DNA合成仪来合成。术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这还包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。
本文使用常规符号描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手末端为5’-末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称作5’-方向。向新生RNA转录物添加核苷酸的5’至3’方向被称作转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链被称作“编码链”；在具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列的DNA链上并且位于RNA转录物的5’-末端的5’的序列被称作“上游序列”；在具有与RNA相同的序列的DNA链上并且在编码RNA转录物的3’-末端的3’的序列被称作“下游序列”。
“互补的”是指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，这两个分子可以被描述为互补的，并且更进一步地，接触表面特征是彼此互补的。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列基本上相同，或如果第一多核苷酸可以与第二多核苷酸在严格的杂交条件下杂交，则第一多核苷酸是与第二多核苷酸互补的。
“与...特异性地杂交”或“特异性杂交”或“与...选择性地杂交”是指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时，核酸分子优先与特定核苷酸序列在严格的条件下的结合、双链体化或杂交。术语“严格的条件”是指在该条件下探针将优先与其靶子序列杂交，并且在较小程度上与其他序列杂交或根本不与其他序列杂交的条件。在核酸杂交实验诸如DNA杂交和RNA杂交的背景中，“严格的杂交”和“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。核酸的杂交的广泛指导可以在以下中发现：Tijssen,1993,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分,第2章,“Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,N.Y.；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,3.sup.rd.ed,NY；和Ausubel等人编著,现行版,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY。
通常，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为比特定序列在定义的离子强度和pH的热解链点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。非常严格的条件被选择为等于特定探针的Tm。在DNA印迹或RNA印迹中的过滤器上，用于具有多于约100个互补残基的互补核酸的杂交的严格的杂交条件的实例是在42℃，50％福尔马林与1mg肝素，其中杂交被过夜进行。高度严格的洗涤条件的实例是在72℃，0.15M NaCl，持续约15分钟。严格的洗涤条件的实例是在65℃，0.2×SSC洗涤，持续15分钟。对于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook等人。高严格度洗涤之前可以进行低严格度洗涤以去除背景探针信号。对于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性中等严格度洗涤是在45℃，1×SSC，持续15分钟。对于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性低严格度洗涤是在40℃，4-6×SSC，持续15分钟。一般而言，比起在特定杂交测定中对于不相关的探针观察到的2×(或更高)的信噪比指示出检测到特异性杂交。
“引物”是指能够与指定的多核苷酸模板特异性地杂交并且提供用于互补的多核苷酸的合成的起始点的多核苷酸。当多核苷酸引物被放置在其中合成被诱导的条件下，即在核苷酸、互补的多核苷酸模板和用于聚合的剂诸如DNA聚合酶的存在下，发生这样的合成。引物通常是单链的，但可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但许多种合成的和天然存在的引物对于许多应用是有用的。引物与模板互补，其被设计成与模板杂交以用作合成起始的位点，但不需要反映模板的精确序列。在这样的情况中，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格度。引物可以用例如，显色的、放射性的或荧光部分标记并且用作可检测的部分。
当在提及多核苷酸中使用时，“探针”是指能够与指定的另一个多核苷酸序列特异性地杂交的多核苷酸。探针与靶互补多核苷酸特异性地杂交，但不需要反映模板的精确互补序列。在这样的情况中，探针与靶的特异性杂交取决于杂交条件的严格度。探针可以用例如，显色的、放射性的或荧光部分标记并且用作可检测的部分。在其中探针提供互补多核苷酸的合成的起始点的实例中，探针也可以是引物。
“载体”是可以被用于将与其连接的另一个核酸引入到细胞中的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以将另外的核酸区段连接到其中的线性或环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)，其中另外的DNA区段可以被引入到病毒基因组中。某些载体能够在引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体(episomalmammalian vector))。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是可以指导选择的多核苷酸的表达的一种类型的载体。
“调控序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时机或位置)的核酸。调控序列可以例如直接对被调控的核酸发挥其作用，或通过一种或更多种其他分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用发挥其作用。调控序列的实例包括启动子、增强子及其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。调控序列的其他实例在例如Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,AcademicPress,San Diego,Calif.和Baron等人,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06中描述。如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时机或位置)，则核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”。
“宿主细胞”是可以被用于表达本公开内容的多核苷酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，或者宿主细胞可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人类细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养的细胞，所述核酸然后可以在宿主细胞中被表达。短语“重组宿主细胞”可以被用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是包含核酸但不以期望的水平表达该核酸的细胞，除非调控序列被引入到宿主细胞中，使得调控序列变成与该核酸可操作地连接。将理解，术语宿主细胞不仅是指特定的受试者细胞，而且指这样的细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可以由于，例如突变或环境影响而在随后世代中发生，这样的子代实际上可以与亲本细胞不相同，但仍然被包括在如本文使用的该术语的范围内。
术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽或多核苷酸)是这样的分子：该分子凭借其起源或衍生的来源(1)不与在其天然状态中伴随其的、天然地缔合的组分缔合，(2)基本上不含来自相同物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。因此，化学合成的、或在与其天然起源的细胞不同的细胞系统中表达的分子将是与其天然缔合的组分“分离”的。还可以使用本领域中众所周知的纯化技术，通过分离使分子变得基本上不含天然缔合的组分。分子纯度或同质性可以通过本领域中众所周知的多种手段来测定。例如，多肽样品的纯度可以使用本领域中众所周知的技术使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和对凝胶染色以使多肽可视化来测定。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域中众所周知的用于纯化的其他手段来提供更高的分辨率。
当样品的至少约60％至75％表现为单一种类的多肽时，蛋白或多肽是“基本上纯的”、“基本上同质的”或“基本上纯化的”。多肽或蛋白可以是单体的或多体的(multimeric)。基本上纯的多肽或蛋白将通常包含约50％、60％、70％、80％或90％W/W的蛋白样品，更通常约95％，并且优选地将超过99％纯。蛋白纯度或同质性可以通过本领域中众所周知的许多手段来指示，所述手段诸如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后是用本领域中众所周知的染色剂对凝胶进行染色后使单个多肽条带可视化。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域中众所周知的用于纯化的其他手段来提供更高的分辨率。
“接头”是指共价地或通过离子、范德华力或氢键连接两个其他分子的分子，例如在5’末端处与一个互补的序列杂交并且在3’末端处与另一个互补的序列杂交，因此连接两个非互补的序列的核酸分子。“可裂解的接头”是指可以被降解或以其他方式切断以使通过该可裂解的接头连接的两个组分分离的接头。可裂解的接头通常被酶，通常是肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等裂解。可裂解的接头还可以通过环境因素，诸如例如温度、pH、盐浓度等的改变来裂解。
如本文使用的术语“标记物(label)”或“标记的(labeled)”是指在抗体中掺入另一种分子。在一个实施方案中，标记物是可检测的标志物，例如掺入放射性标记的氨基酸或附接至可以通过标记的亲和素检测的生物素基部分的多肽(例如，包含荧光标志物的链霉亲和素或可以通过光学方法或量热法检测的酶活性)。在另一个实施方案中，标记物或标志物可以是治疗性的，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域中已知的并且可以被使用。用于多肽的标记物的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)；荧光标记物(例如FITC、罗丹明、镧系元素荧光团)；酶标记物(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标志物；生物素基基团；由第二报告物识别的预先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链配对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；磁性剂(magnetic agent)，诸如钆螯合物；毒素诸如百日咳毒素(pertussis toxin)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同系物。在一些实施方案中，标记物由各种长度的间隔臂(spacer arm)附接，以降低潜在的空间位阻。
如本文使用的，术语“免疫疗法”是指癌症治疗，其包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体(depleting antibody)的治疗；使用抗体-药物缀合物的治疗；使用针对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)的激动抗体、拮抗抗体或阻断抗体的治疗，所述共刺激或共抑制分子(免疫检查点)诸如PD-1、PD-L1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA；使用双特异性T细胞接合抗体诸如博纳吐单抗(blinatumomab)的治疗；涉及施用生物应答修饰剂(modifier)诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继性转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因的)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；和使用免疫刺激剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗。
如本文使用的术语“免疫缀合物”或“融合蛋白”是指包含直接地或间接地与效应物分子缀合(或连接)的抗体或其抗原结合片段的分子。效应物分子可以是可检测的标记物、免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化学治疗剂。抗体或其抗原结合片段可以通过肽接头与效应物分子缀合。免疫缀合物和/或融合蛋白保留抗体或抗原结合片段的免疫反应性，例如抗体或抗原结合片段在缀合后具有与缀合前近似地相同的或仅略微降低的与抗原结合的能力。如本文使用的，免疫缀合物也可以被称作抗体药物缀合物(ADC)。因为免疫缀合物和/或融合蛋白最初从具有单独的功能的两种分子制备，诸如抗体和效应物分子，它们有时也被称作“嵌合分子”。
“药物组合物”是指适用于动物中的药学用途的组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的载体。“药理学有效量”是指有效产生预期的药理学结果的剂的量。“药学上可接受的载体”是指任何标准的药物载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖的水性溶液，和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，和多种类型的润湿剂和/或佐剂。合适的药学载体和制剂在Remington的PharmaceuticalSciences,第21版2005,Mack Publishing Co,Easton中描述。“药学上可接受的盐”是指可以被配制成用于药学用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨的盐或有机胺的盐。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻或消除生物学紊乱和/或其至少一个伴随症状的方法。如本文使用的，“减轻”疾病、紊乱或状况意指降低该疾病、紊乱或状况的症状的严重性和/或发生频率。如本文使用的，“治疗(treatment)”是用于获得有益的或期望的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下任何一个或更多个：减轻一种或更多种症状、减轻疾病的程度、预防或延迟疾病的扩散(例如转移，例如转移至肺或至淋巴结)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病状态和缓解(无论是部分的还是全部的)。“治疗(treatment)”还包括降低增生性疾病的病理学后果。本发明的方法考虑治疗的这些方面的任何一个或更多个。
如本文使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗特定紊乱、状况或疾病诸如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或更多种症状的化合物或组合物的量。在提及NHL和其他癌症或其他不期望的细胞增殖中，有效量包含足以(i)减少癌细胞的数目；(ii)减小肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓并且优选地停止癌细胞浸润到周围器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减缓，并且优选地停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解一种或更多种与癌症相关的症状的量。有效量可以以一次或更多次施用来施用。
“耐受性或难治性癌症”是指不响应于先前的抗癌疗法的肿瘤细胞或癌症，所述先前的抗癌疗法包括例如化学疗法、手术、放射疗法、干细胞移植和免疫疗法。肿瘤细胞可以在治疗的开始时是耐受性或难治性的，或者它们可以在治疗期间变成耐受性或难治性的。难治性肿瘤细胞包括在治疗的开始时不响应的肿瘤，或最初持续短的时间段作出响应但不能响应治疗的肿瘤。难治性肿瘤细胞还包括响应于使用抗癌疗法的治疗但不能响应于随后几轮疗法的肿瘤。出于本发明的目的，难治性肿瘤细胞还包括通过使用抗癌疗法的治疗表现出被抑制但在治疗停止后长达5年，有时长达10年或更长时间而复发的肿瘤。抗癌疗法可以使用单独的化学治疗剂、单独的放射、单独的靶向疗法、单独的手术或其组合。为了便于描述而非限制性，将理解的是，难治性肿瘤细胞与耐受性肿瘤是可互换的。
将理解的是，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“由所述方面和实施方案组成”和/或“主要由所述方面和实施方案组成”。
本文中，提及“约”值或参数包括(并且描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
除非上下文另外明确指出，如本文和所附的权利要求中使用的单数形式“一种/一个”、“或”和“该”包含复数指代物。将理解，本文描述的本发明的方面和变化包括“由所述方面和变化组成”和/或“主要由所述方面和变化组成”。
PD-L1抗原
如本文使用的术语“PD-L1”包括人类PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同种型和物种同源物以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。在多个实施方案中，如本文使用的hPD-L1多肽可以包含NCBI参考序列NP_054862.1(SEQ ID NO:1)中列出的氨基酸序列：
在多个实施方案中，PD-L1多肽包含与SEQ ID NO:1的人类PD-L1序列共有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的观察到的同源性(observed homology)的氨基酸序列。在一些实施方案中，PD-L1多肽具有SEQ ID NO:1的人类PD-L1的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少1×、至少1.5×、至少2×、至少2.5×、或至少3×的活性。在本文中，PD-L1的多肽变体可以通过参考SEQ ID NO:1的233个氨基酸的序列中的给定的位置处存在的氨基酸残基的添加、缺失或取代来描述。因此，例如，术语“P21W”指SEQ ID NO:1的位置21处的“P”(脯氨酸，以标准单个字母代码)残基已经被“W”(色氨酸，以标准单个字母代码)取代。
抗体
生成与人类PD-L1多肽结合的新型抗体的方法是本领域普通技术人员已知的。例如，用于生成与PD-L1多肽特异性地结合的单克隆抗体的方法可以包括向小鼠施用一定量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含有效刺激可检测的免疫应答的PD-L1多肽，从小鼠获得产生抗体的细胞(例如，来自脾的细胞)并且使产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤，以及测试产生抗体的杂交瘤以鉴定产生与PD-L1多肽特异性地结合的单克隆抗体的杂交瘤。获得后，杂交瘤可以在细胞培养物中繁殖，任选地在其中来源于杂交瘤的细胞产生与PD-L1多肽特异性地结合的单克隆抗体的培养条件中繁殖。单克隆抗体可以从细胞培养物纯化。然后，用于测试抗体:抗原相互作用以鉴定特别期望的抗体的多种不同的技术是可得的。
可以使用产生或分离具有必需的特异性的抗体的其他合适的方法，包括例如从文库选择重组抗体的方法，或依赖于对能够产生人类抗体的完整贮库(full repertoire)的转基因动物(例如小鼠)进行免疫接种的方法。参见例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-2555,1993；Jakobovits等人,Nature,362:255-258,1993；Lonberg等人,美国专利第5,545,806号；Surani等人,美国专利第5,545,807号。
抗体可以以多种方式被工程化。它们可以被制备为单链抗体(包括小模块免疫药物(small modular immunopharmaceutical)或SMIPsTM)、Fab和F(ab’)2片段等。抗体可以是人源化的、嵌合的、去免疫的(deimmunized)或完全人类的。多个出版物列出了许多类型的抗体和工程化这样的抗体的方法。例如参见美国专利第6,355,245号；第6,180,370号；第5,693,762号；第6,407,213号；第6,548,640号；第5,565,332号；第5,225,539号；第6,103,889号；和第5,260,203号。
嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。例如，用限制酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，以去除编码鼠Fc的区域，并且取代为编码人类Fc恒定区的基因的等效部分(参见Robinson等人,国际专利公布PCT/US86/02269；Akira,等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,国际申请WO 86/01533；Cabilly等人.美国专利第4,816,567号；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人,Science,240:1041-1043,1988；Liu等人,PNAS USA,84:3439-3443,1987；Liu等人,J.Immunol.139:3521-3526,1987；Sun等人,PNAS USA,84:214-218,1987；Nishimura等人,Canc.Res.47:999-1005,1987；Wood等人,Nature 314:446-449,1985；和Shaw等人,J.Natl Cancer Inst.,80:1553-1559,1988)。
本领域中已经描述了用于使抗体人源化的方法。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能地一些框架区残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于一个完整的人类可变区已经被来自非人类物种的对应的序列取代。在某种程度上，这可以与人源化技术和使用适当的文库的展示技术关联来实现。将理解的是，鼠抗体或来自其他物种的抗体可以使用本领域众所周知的技术进行人源化或灵长类化(primatized)(参见例如Winter等人,Immunol Today,14:43-46,1993；和Wright等人,Crit.Reviews in Immunol.,12125-168,1992)。感兴趣的抗体可以通过重组DNA技术来工程化，以用对应的人类序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(参见WO 92/02190和美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号和第5,777,085号)。此外，使用IgcDNA用于构建嵌合免疫球蛋白基因是本领域中已知的(Liu等人,P.N.A.S.84:3439,1987；J.Immunol.139:3521,1987)。mRNA从杂交瘤或产生抗体的其他细胞分离并用于产生cDNA。感兴趣的cDNA可以使用特定引物通过聚合酶链式反应扩增(美国专利第4,683,195号和第4,683,202号)。可选地，制备并筛选文库以分离感兴趣的序列。编码抗体的可变区的DNA序列然后与人类恒定区序列融合。人类的恒定区基因的序列可以在Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,N.I.H.公开号91-3242中发现。人类C区基因是从已知的克隆容易地可得的。同种型的选择将通过期望的效应物功能诸如补体固定(complement fixation)或抗体依赖性细胞毒性的活性来指导。在多个实施方案中，同种型选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。可以使用人类轻链恒定区κ或λ的任一个。嵌合的、人源化抗体然后通过常规方法表达。
Queen等人的美国专利第5,693,761号公开了对Winter等人对于使抗体人源化的改进，并且基于这样的前提：将亲合力(avidity)损失归因于人源化框架的结构基序方面的问题，其由于空间不相容性或其他化学不相容性，干扰CDR折叠成在小鼠抗体中发现的能够结合的构象。为了解决该问题，Queen教导了使用线性肽序列与待人源化的小鼠抗体的框架序列密切同源的人类框架序列。因此，Queen的方法关注于比较物种之间的框架序列。通常，将所有可得的人类可变区序列与特定小鼠序列进行比较，并计算在对应的框架残基之间的百分比同一性。选择具有最高百分比的人类可变区以提供用于人源化项目的框架序列。Queen还教导了，在人源化框架中保留对于支持能够结合的构象中的CDR至关重要的来自小鼠框架的某些氨基酸残基是重要的。从分子模型评价潜在的重要性。用于保留的候选残基通常是在线性序列中与CDR相邻或物理地在任何CDR残基的内的那些。
在其他方法中，一旦获得低亲合力人源化构建体，特定框架氨基酸残基的重要性通过将单个残基恢复(reversion)至小鼠序列并测定抗原结合由实验确定，如由Riechmann等人,1988所描述的。用于鉴定框架序列中的重要氨基酸的另一个示例方法由Carter等人,美国专利第5,821,337号和Adair等人,美国专利第5,859,205号公开。这些参考文献公开了框架中特定Kabat残基位置，其在人源化抗体中可能需要用对应的小鼠氨基酸取代以保持亲合力。
被称作“框架改组(framework shuffling)”的另一种使抗体人源化的方法依赖于生成组合文库，所述组合文库具有符合读框地(in frame)融合至单个人类种系框架的池中的非人类CDR可变区(Dall’Acqua等人,Methods,36:43,2005)。然后，筛选文库以鉴定编码保留良好结合的人源化抗体的克隆。
在制备期望的人源化抗体中待使用的人类可变区(轻链和重链二者)的选择对降低抗原性是非常重要的。根据被称为“最佳拟合”的方法，针对已知的人类可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变区的序列。然后，接受最接近啮齿动物的序列的人类序列作为用于人源化抗体的人类框架区(框架区)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296,1993；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901,1987)。另一个方法使用来源于特定亚组的轻链可变区或重链可变区的所有人类抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可以被用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285,1992；Presta等人,J.Immunol.,151:2623,1993)。
取代到人类可变区中的非人类残基的选择可以被多种因素影响。这些因素包括例如氨基酸在特定位置中的稀有性、与CDR或抗原相互作用的可能性和参与轻链可变结构域界面和重链可变结构域界面之间的界面的可能性。(参见例如美国专利第5,693,761号、第6,632,927号和第6,639,055号)。分析这些因素的一个方法是通过使用非人类序列和人源化序列的三维模型。三维免疫球蛋白模型是通常可得的，并且是本领域技术人员熟悉的。说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得的。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以该方式，非人类残基可以被选择并且取代为人类可变区残基，以便于实现期望的抗体特征，诸如对一个或更多个靶抗原的增加的亲和力。
本领域中已经描述了用于制备完全人类抗体的方法。以举例的方式，用于产生抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法包括以下步骤：在噬菌体上合成人类抗体的文库、用PD-L1或其抗体结合部分筛选文库、分离与PD-L1结合的噬菌体和从噬菌体获得抗体。以另一个实例的方式，用于制备用于在噬菌体展示技术中使用的抗体的文库的一种方法包括以下步骤：用PD-L1或其抗原性部分对包括人类免疫球蛋白基因座的非人动物进行免疫接种以产生免疫应答、从经免疫接种的动物提取产生抗体的细胞、从提取的细胞分离编码本发明的抗体的重链和轻链的RNA、逆转录RNA以产生cDNA、使用引物扩增cDNA、并且将cDNA插入到噬菌体展示载体中，使得抗体在噬菌体上表达。本发明的重组抗PD-L1抗体可以以该方式获得。
本发明的重组人类抗PD-L1抗体还可以通过筛选重组组合抗体文库来分离。优选地，文库是使用从B细胞分离的mRNA制备的人类VL和VH cDNA生成的scFv噬菌体展示文库。用于制备和筛选这类文库的方法是本领域已知的。用于生成噬菌体展示文库的试剂盒是商购可得的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统,目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒,目录号240612)。还存在可以在生成和筛选抗体展示文库中使用的其他方法和试剂(参见例如美国专利第5,223,409号；PCT公布第WO 92/18619号、第WO91/17271号、第WO 92/20791号、第WO 92/15679号、第WO 93/01288号、第WO 92/01047号、第WO 92/09690号；Fuchs等人,Bio/Technology 9:1370-1372(1991)；Hay等人,Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85,1992；Huse等人,Science 246:1275-1281,1989；McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990；Griffiths等人,EMBO J.12:725-734,1993；Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896,1992；Clackson等人,Nature 352:624-628,1991；Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576-3580,1992；Garrad等人,Bio/Technology9:1373-1377,1991；Hoogenboom等人,Nuc.Acid Res.19:4133-4137,1991；和Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982,1991，出于教导噬菌体展示文库的制备和筛选的目的，每篇文献通过引用并入本文。
人类抗体还通过用人类IgE抗原对非人类转基因动物进行免疫接种来产生，所述非人类转基因动物在其基因组中包含一些或所有人类免疫球蛋白重链和轻链基因座，例如XenoMouseTM动物(Abgenix,Inc./Amgen,Inc.--Fremont,Calif.)。XenoMouseTM小鼠是包含人类免疫球蛋白重链和轻链基因座的大的片段并且在小鼠抗体产生方面是缺陷的工程化小鼠系。参见例如Green等人,Nature Genetics,7:13-21,1994；和美国专利第5,916,771号、第5,939,598号、第5,985,615号、第5,998,209号、第6,075,181号、第6,091,001号、第6,114,598号、第6,130,364号、第6,162,963号和第6,150,584号。还参见WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560、和WO 00/037504。XenoMouseTM小鼠产生完全人类抗体的成人样人类贮库(adult-like human repertoire)，并且生成抗原特异性人类抗体。在一些实施方案中，通过在酵母人工染色体(YAC)中引入人类重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的、种系配置片段，XenoMouseTM小鼠包含人类抗体V基因贮库的大约80％。在其他实施方案中，XenoMouseTM小鼠还包含大约所有的人类λ轻链基因座。参见Mendez等人,NatureGenetics,15:146-156,1997；Green和Jakobovits,J.Exp.Med.188:483-495(1998)和WO98/24893(出于教导完全人类抗体的制备的目的，每篇文献通过引用整体并入)。在另一个方面中，本发明提供了用于通过用PD-L1抗原对包含人类免疫球蛋白基因座的非人类转基因动物进行免疫接种，从非人、非小鼠动物制备抗PD-L1抗体的方法。人们可以使用在以上提及的文件中描述的方法生产这样的动物。
抗体与抗原结合的表征
可以通过例如标准ELISA来测试本发明的抗体与PD-L1的结合。作为一个实例，将微量滴定板用在PBS中的纯化的PD-L1包被，并且然后用在PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体的稀释物(例如，来自PD-L1免疫接种的小鼠的血浆的稀释物)添加至每个孔，并且在37℃孵育持续1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤，并且然后用与碱性磷酸酶缀合的第二试剂(例如，对于人类抗体，山羊抗人类IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃孵育持续1小时。在洗涤后，将板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并且在OD为405-650分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将被用于融合。ELISA测定也可以被用于筛选显示出与PD-L1免疫原呈阳性反应性的杂交瘤。将以高亲合力与PD-L1结合的杂交瘤亚克隆并进一步表征。可以从每个杂交瘤选择保留亲本细胞的反应性(通过ELISA)的一个克隆，用于制备储存在-140℃的5-10小瓶细胞库，并且用于抗体纯化。
为了确定选择的抗PD-L1单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用商购可得的试剂(Pierce,Rockford,Ill.)将每种抗体生物素化。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用如以上描述的PD-L1包被的-ELISA板进行。生物素化的mAb结合可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶(strep-avidin-alkaline phosphatase)探针来检测。为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人类单克隆抗体的同种型，微量滴定板的孔可以用1μg/ml的抗人类免疫球蛋白在4℃包被过夜。在用1％BSA封闭后，将板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度反应持续1小时至2小时。然后可以将孔与人类IgG1或人类IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。将板如以上描述地显色和分析。
抗PD-L1人类IgG可以通过蛋白印迹进一步测试与PD-L1抗原的反应性。简而言之，可以制备PD-L1并且使PD-L1经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。人类IgG结合可以使用抗人类IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)显色。
抗PD-L1抗体的鉴定
本发明提供了与PD-L1抗原特异性地结合的单克隆抗体及其抗原结合片段。
在本发明中还包括与本发明的抗PD-L1抗体结合相同的表位的抗体。为了确定抗体是否可以竞争结合由本发明的抗PD-L1抗体结合的表位相同的表位，可以进行交叉阻断测定，例如竞争性ELISA测定。在示例性竞争性ELISA测定中，包被在微量滴定板的孔上的PD-L1与或不与候选竞争性抗体预孵育，并且然后添加本发明的生物素标记的抗PD-L1抗体。在孔中与PD-L1抗原结合的标记的抗PD-L1抗体的量使用亲和素-过氧化物酶缀合物和适当的底物测量。抗体可以用放射性标记物或荧光标记物或一些其他可检测且可测量的标记物标记。与抗原结合的标记的抗PD-L1抗体的量将具有与候选竞争性抗体(测试抗体)竞争结合相同的表位的能力的间接相关性，即测试抗体对相同的表位的亲和力越大，标记的抗体将越少地与抗原包被的孔结合。如果与不存在候选竞争性抗体时平行进行的对照相比，候选抗体可以阻断PD-L1抗体的结合至少20％，优选地至少20-50％，甚至更优选地至少50％，则认为候选竞争性抗体是与本发明的抗PD-L1抗体基本上结合相同的表位的抗体或竞争结合相同的表位的抗体。将理解的是，可以进行该测定的变化形式以达到相同的定量的值。在多个实施方案中，本发明的抗体包括与命名为PDL1#1的单克隆抗体结合相同的表位的抗体。在多个实施方案中，本发明的抗体包括与命名为PDL1#10的单克隆抗体结合相同的表位的抗体。
如本文描述地生成的两种鼠抗体PDL1#1和PDL1#10的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列显示在下表2中。
表2
重链CDR
轻链CDR
在本发明的多个实施方案中，抗体或抗原结合片段是鼠抗体PDL1#1，其包含SEQID NO:12的重链可变区序列，和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列，SEQ ID NO:12为：
SEQ ID NO:16为：
在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含重链可变区，并且其中重链可变区包含与如SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:13具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:13为：
并且其中轻链包含轻链可变区，并且其中轻链可变区包含与如SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:17具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:17为：
在本发明的多个实施方案中，抗体或抗原结合片段是鼠抗体PDL1#10，其包含SEQID NO:14的重链可变区序列，和SEQ ID NO:18的轻链可变区序列，SEQ ID NO:14为：
SEQ ID NO:18为：
在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含重链可变区，并且其中重链可变区包含与如SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:15具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:15为：
并且其中轻链包含轻链可变区，并且其中轻链可变区包含与如SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:19具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:19为：
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46相同、基本上相同或基本上相似的序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47相同、基本上相同或基本上相似的序列。
在多个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含与具有SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46中列出的氨基酸序列的重链可变结构域的序列仅在15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个或0个残基处不同的氨基酸的序列，其中每个这样的序列差异独立地是一个氨基酸残基的缺失、插入或取代。在多个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含与如SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46中列出的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含与具有SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45或47中列出的轻链可变结构域的序列仅在15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个或0个残基处不同的氨基酸的序列，其中每个这样的序列差异独立地是一个氨基酸残基的缺失、插入或取代。在多个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与如SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45或47中列出的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列。
在另一个实施方案中，重链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸的序列，该多核苷酸在中等严格的条件下与编码具有SEQ ID NO:13或15的序列的重链可变结构域的多核苷酸的互补物(complement)杂交。在另一个实施方案中，重链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸的序列，该多核苷酸在严格的条件下与编码具有SEQ ID NO:13或15的序列的重链可变结构域的多核苷酸的互补物杂交。在另一个实施方案中，轻链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸在中等严格的条件下与编码具有SEQ ID NO:17或19的序列的轻链可变结构域的多核苷酸的互补物杂交。在另一个实施方案中，轻链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸在严格的条件下与编码具有SEQID NO:17或19的序列的轻链可变结构域的多核苷酸的互补物杂交。
在多个实施方案中，抗体是包含重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，所述重链可变区具有SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列。在多个实施方案中，抗体是包含重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，所述重链可变区具有SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列。在多个实施方案中，抗体是包含重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，所述重链可变区具有SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQID NO:25中列出的氨基酸序列。在多个实施方案中，抗体是包含重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，所述重链可变区具有SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。在多个实施方案中，抗体是包含重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，所述重链可变区具有SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。
在本公开内容的多个实施方案中，抗体可以是抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体具有与包含如SEQ ID NO:55、57、59、61和63的任一项中列出的重链序列的抗体的抗原-结合亲和力相同或更高的抗原-结合亲和力。在多个实施方案中，抗体可以是与包含如SEQ IDNO:55、57、59、61和63的任一项中列出的重链序列的抗体结合至相同的表位的抗PD-L1抗体。在多个实施方案中，抗体是与包含如SEQ ID NO:55、57、59、61和63的任一项中列出的重链序列的抗体竞争的抗PD-L1抗体。在多个实施方案中，抗体可以是包含如SEQ ID NO:55、57、59、61和63的任一项中列出的重链序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗PD-L1抗体。
在多个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:55、57、59、61和63的任一项共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观察到的同源性的氨基酸序列。在多个实施方案中，抗体包含与SEQ IDNO:65、67、69、71和73的任一项共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观察到的同源性的核酸序列。
在本公开内容的多个实施方案中，抗体可以是抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体具有与包含如SEQ ID NO:56、58、60、62和64的任一项中列出的轻链序列的抗体的抗原-结合亲和力相同或更高的抗原-结合亲和力。在多个实施方案中，抗体可以是与包含如SEQ IDNO:56、58、60、62和64的任一项中列出的轻链序列的抗体结合至相同的表位的抗PD-L1抗体。在多个实施方案中，抗体是与包含如SEQ ID NO:56、58、60、62和64的任一项中列出的轻链序列的抗体竞争的抗PD-L1抗体。在多个实施方案中，抗体可以是包含如SEQ ID NO:56、58、60、62和64的任一项中列出的轻链序列的至少一个(诸如2个或3个)CDR的抗PD-L1抗体。
在多个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:56、58、60、62和64的任一项共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观察到的同源性的氨基酸序列。在多个实施方案中，抗体包含与SEQ IDNO:66、68、70、72和74的任一项共有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观察到的同源性的核酸序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:55中列出的重链序列和SEQ ID NO:56中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:57中列出的重链序列和SEQ ID NO:58中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:59中列出的重链序列和SEQ ID NO:60中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:61中列出的重链序列和SEQ ID NO:62中列出的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1结合并且包含SEQ ID NO:63中列出的重链序列和SEQ ID NO:64中列出的轻链序列。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含本领域中已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是，例如κ或λ型轻链恒定区，例如人类κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是，例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM型重链恒定区。在多个实施方案中，轻链恒定区或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白(mutein)。
用于从感兴趣的抗体衍生不同的子类或同种型的抗体，即子类转换(subclassswitching)的技术是已知的。因此，IgG抗体可以来源于例如IgM抗体，反之亦然。这类技术允许制备具有给定的抗体(亲本抗体)的抗原结合特性但还表现出与该亲本抗体不同的抗体同种型或子类相关的生物学特性的新的抗体。可以使用重组DNA技术。可以在这类程序中使用编码特定抗体多肽的克隆的DNA，例如，编码期望的同种型的抗体的恒定结构域的DNA。还参见Lanitto等人,Methods Mol.Biol.178:303-16,2002。
在多个实施方案中，本发明的抗体还包含轻链κ或λ恒定结构域或其片段，并且还包含重链恒定结构域或其片段。在例举的抗体中使用的轻链恒定区和重链恒定区的序列以及编码它们的多核苷酸在以下提供。
轻链(κ)恒定区
轻链(λ)恒定区
重链恒定区
本发明的抗体也可以根据它们的交叉反应性来描述或指定。与PD-L1多肽结合的抗体也包括在本发明中，所述PD-L1多肽与人类PD-L1具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(如使用本领域中已知的和本文描述的方法计算的)。
本发明还包括与本发明的抗PD-L1抗体结合至相同的表位的抗体。为了确定抗体是否可以竞争结合由本发明的抗PD-L1抗体结合的表位相同的表位，可以进行交叉阻断测定，例如竞争性ELISA测定。在示例性竞争性ELISA测定中，包被在微量滴定板的孔上的PD-L1与或不与候选竞争性抗体预孵育，并且然后添加本发明的生物素标记的抗PD-L1抗体。在孔中与PD-L1抗原结合的标记的抗PD-L1抗体的量使用亲和素-过氧化物酶缀合物和适当的底物测量。抗体可以用放射性标记物或荧光标记物或一些其他可检测且可测量的标记物标记。与抗原结合的标记的抗PD-L1抗体的量将具有与候选竞争性抗体(测试抗体)竞争结合相同的表位的能力的间接相关性，即测试抗体对相同的表位的亲和力越大，标记的抗体将越少地与抗原包被的孔结合。如果与不存在候选竞争性抗体时平行进行的对照相比，候选抗体可以阻断PD-L1抗体的结合至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，则认为候选竞争性抗体是与本发明的抗PD-L1抗体基本上结合相同的表位的抗体或竞争结合相同的表位的抗体。将理解的是，可以进行该测定的变化形式以达到相同的定量的值。
在本发明的多个实施方案中，抗体或抗原结合片段是来源于鼠PDL1#10的鼠-人类嵌合抗体，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:51的重链序列和SEQ ID NO:53的轻链序列，并且其中SEQ ID NO:51的氨基酸1-19是前导序列：
并且其中SEQ ID NO:53的氨基酸1-19是前导序列：
在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的鼠-人类嵌合抗体，其中重链包含与如SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:52具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:52为：
并且其中轻链包含与如SEQ ID NO:53中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:54具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:54为：
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG，所述抗体包含SEQ ID NO:55的重链序列和SEQ ID NO:56的轻链序列，并且其中SEQ ID NO:55的氨基酸1-19是前导序列：
并且其中SEQ ID NO:56的氨基酸1-19是前导序列：
在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含与如SEQID NO:55中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:65具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:65为：
并且其中轻链包含与如SEQ ID NO:56中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:66具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:66为：
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG，所述抗体包含SEQ ID NO:57的重链序列和SEQ ID NO:58的轻链序列，并且其中SEQ ID NO:57的氨基酸1-19是前导序列：
并且其中SEQ ID NO:58的氨基酸1-19是前导序列：
在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含与如SEQID NO:57中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:67具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:67为：
并且其中轻链包含与如SEQ ID NO:58中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:68具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:68为：
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG，所述抗体包含SEQ ID NO:59的重链序列和SEQ ID NO:60的轻链序列，并且其中SEQ ID NO:59的氨基酸1-19是前导序列：
并且其中SEQ ID NO:60的氨基酸1-19是前导序列：
在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含与如SEQID NO:59中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:69具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:69为：
并且其中轻链包含与如SEQ ID NO:60中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:70具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:70为：
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG，所述抗体包含SEQ ID NO:61的重链序列和SEQ ID NO:62的轻链序列，并且其中SEQ ID NO:61的氨基酸1-19是前导序列：
并且其中SEQ ID NO:62的氨基酸1-19是前导序列：
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在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含与如SEQID NO:61中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:71具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:71为：
并且其中轻链包含与如SEQ ID NO:62中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:72具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:72为：
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG，所述抗体包含SEQ ID NO:63的重链序列和SEQ ID NO:64的轻链序列，并且其中SEQ ID NO:63的氨基酸1-19是前导序列：
并且其中SEQ ID NO:64的氨基酸1-19是前导序列：
在某些可选的实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含与如SEQID NO:63中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:73具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:73为：
并且其中轻链包含与如SEQ ID NO:64中列出的氨基酸序列或其对应的多核苷酸序列SEQ ID NO:74具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％同一性的序列，SEQ ID NO:74为：
在某些可选的实施方案中，本发明的抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)中的一个或更多个残基，或通过修饰一个或更多个恒定区中的残基，例如以改变抗体的一种或更多种效应物功能来工程化。在多个实施方案中，抗体的可变区将通过使用框架序列进行CDR接枝而被修饰，所述框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献获得(例如，Tomlinson,I.M.,等人,J.Mol.Biol.227:776-798,1992；和Cox,J.P.L.等人,Eur.J.Immunol.24:827-836,1994；每篇文献的内容通过引用明确地并入本文)。在多个实施方案中，抗体可以使用定点诱变或PCR-介导的诱变来修饰，以在VH和/或VL中引入一个或更多个突变，所述突变改善结合亲和力和/或降低免疫原性。在多个实施方案中，可以在Fc区中修饰抗体，以用于改变抗体的血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性的目的。在多个实施方案中，可以修饰抗体，以用于修饰抗体的糖基化的目的。用于进行本文描述的每种修饰的方法以及其他方法是本领域技术人员众所周知的。
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如以上描述的抗体或其抗原结合片段。本发明的药物组合物、方法和用途因此还包括与其他活性剂组合(共施用)的实施方案，如以下详述的。
通常，本发明的抗体或其抗原结合片段适于作为与一种或更多种药学上可接受的赋形剂联合的制剂被施用。本文使用术语“赋形剂”来描述除本发明的一种或更多种化合物以外的任何成分。一种或更多种赋形剂的选择将很大程度上取决于诸如特定的施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响和剂型的性质的因素。如本文使用的，“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的赋形剂的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲的盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况中，在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇类诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠将是优选的。药学上可接受的物质的另外的实例是润湿剂或少量的辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其延长抗体的货架期或增强抗体的效力。本发明的药物组合物和用于其制备的方法对于本领域技术人员而言将是十分明显的。这类组合物和用于其制备的方法可以在例如Remington的Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Company,1995)中发现。优选在GMP条件下制造药物组合物。
本发明的药物组合物可以以单一单位剂量或以多于一个单一单位剂量制备、包装或大量销售。如本文使用的，“单位剂量”是包含预先确定的量的活性成分的药物组合物的分散的量。活性成分的量通常等于将被施用至受试者的活性成分的剂量或这样的剂量的方便的部分，例如这样的剂量的一半或三分之一。
本领域中公认的用于施用肽、蛋白、或抗体的任何方法可以适当地被用于本发明的抗体和部分。
本发明的药物组合物通常适用于肠胃外施用。如本文使用的，药物组合物的“肠胃外施用”包括以以下为特征的任何施用途径：物理穿破(physical breaching)受试者的组织并且通过组织中的缺口(breach)施用药物组合物，因此通常引起直接施用到血流中、到肌肉中或到内脏器官中。因此，肠胃外施用包括但不限于，通过注射组合物施用药物组合物、通过经手术切口应用组合物、通过经组织渗透性非手术伤口应用组合物等。特别是，预期肠胃外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或输注；和肾透析输注技术。多个实施方案包括静脉内和皮下途径。
适用于肠胃外施用的药物组合物的制剂往往通常包含与药学上可接受的载体诸如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。这样的制剂可以以适用于团注施用(bolusadministration)或用于连续施用的形式被制备、包装或销售。可注射的制剂可以以单位剂型被制备、包装或销售，诸如在安瓿中或在包含防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油或水性媒介物中的乳液、糊剂等。这样的制剂还可以包含一种或更多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于与合适的媒介物(例如无菌的无热原水)重构,然后在肠胃外施用所重构的组合物。肠胃外制剂还包括水性溶液，所述水性溶液可以包含赋形剂诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地至从3至9的pH)，但对于一些应用，它们可能更适于被配制为无菌非水溶液或与合适的媒介物诸如无菌的、无热原的水一起使用的干燥的形式。示例性肠胃外施用形式包括在无菌水性溶液，例如水性丙二醇或右旋糖溶液中的溶液或悬浮液。如果期望，这样的剂型可以被合适地缓冲。其他有用的可肠胃外施用的制剂包括包含呈微晶形式的活性成分的那些，或呈脂质体制备物的那些。用于肠胃外施用的制剂可以被配制为即时释放和/或改良释放(modifiedrelease)。改良释放制剂包括延迟的、持续的、脉冲的、受控的、靶向的和编程的释放。
例如，在一个方面中，无菌可注射溶液可以通过将需要的量的抗PD-L1抗体掺入具有以上列举的一种成分或成分的组合的适当溶剂中来制备，如果需要，随后过滤灭菌。通常，分散剂通过将活性化合物掺入到包含基础分散介质和来自以上列举的那些的需要的其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的期望的成分的粉末。适当的溶液流动性可以例如，通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散剂的情况中通过维持需要的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持。可注射组合物的延长的吸收可以由在组合物中包括延迟吸收的剂例如单硬脂酸盐和明胶引起。
本发明的抗体还可以鼻内施用或通过吸入施用，通常以干燥粉末的形式(单独的、作为混合物或作为混合的组分颗粒，例如与合适的药学上可接受的赋形剂混合)从干粉吸入器施用、作为气雾剂喷雾从压力容器、泵、喷雾器(spray)、雾化器(优选地使用电水动力学以产生细雾(fine mist)的雾化器)、或喷雾器(nebulizer)施用，使用或不使用合适的推进剂，或作为滴鼻液施用。
压力容器、泵、喷雾器(spray)、雾化器、或喷雾器(nebulizer)通常包含本发明的抗体的溶液或悬浮液，所述溶液或悬浮液包含例如用于分散、溶解或延长活性剂的释放的合适的剂、作为溶剂的一种或更多种推进剂。
在干燥粉末或悬浮液制剂中使用前，药物产品通常地被微粉化至适用于通过吸入递送的尺寸(通常小于5微米)。这可以通过任何适当的粉碎方法进行，诸如螺旋气流粉碎、流化床气流粉碎、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压均质或喷雾干燥。
用于在吸入器或吹药器(insufflator)中使用的胶囊、泡罩和药筒可以被配制为包含本发明的化合物、合适的粉末基质和性能修饰剂(performance modifier)的粉末混合物。
合适的调味剂(flavour)诸如薄荷脑和左薄荷脑，或甜味剂诸如糖精或糖精钠，可以被添加至意图用于吸入/鼻内施用的本发明的那些制剂。
用于吸入/鼻内施用的制剂可以被配制为即时释放和/或改良释放。改良释放制剂包括延迟的、持续的、脉冲的、受控的、靶向的和编程的释放。
在干粉吸入器和气雾剂的情况中，剂量单位借助递送计量的量的阀的手段来确定。根据本发明的单位通常被布置以施用本发明的抗体的计量的剂量或“喷出(puff)”本发明的抗体。总每日剂量将通常以单一剂量施用，或更通常地，作为分次剂量整天施用。
本发明的抗体和抗体部分还可以被配制为用于口服途径施用。口服施用可以涉及吞咽，使得化合物进入胃肠道、和/或经颊、经舌或舌下施用，通过这些方式化合物从口直接进入血流。
适用于口服施用的制剂包括固体、半固体和液体系统，诸如片剂；包含多颗粒或纳米颗粒、液体或粉末的软胶囊或硬胶囊；锭剂(包括填充液体的)；咀嚼剂(chews)；凝胶；快速分散的剂型；薄膜；卵形剂(ovule)；喷雾剂和颊/黏膜黏附贴剂(buccal/mucoadhesivepatch)。
意图用于口服使用的药物组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法制备，并且这样的组合物可以包含选自由甜味剂组成的组的一种或更多种剂以提供药学上巧妙(elegant)且可口的制剂。例如，为了制备可口服递送的片剂，将抗体或其抗原结合片段与至少一种药物赋形剂混合，并且根据已知方法压缩所述固体制剂以形成片剂，用于递送至胃肠道。片剂组合物通常与添加剂一起配制，所述添加剂例如糖类或纤维素载体、粘合剂诸如淀粉糊或甲基纤维素、填充剂、崩解剂或往往通常在医用制剂的制造中使用的其他添加剂。为了制备可口服递送的胶囊，将DHEA与至少一种药物赋形剂混合，并且将固体制剂放置在适用于递送至胃肠道的胶囊容器中。包含抗体或其抗原结合片段的组合物可以如Remington的Pharmaceutical Sciences,第18版.1990(Mack PublishingCo.Easton Pa.18042)的第89章中一般描述的来制备，该文献通过引用并入本文。
在多个实施方案中，药物组合物被配制为包含与适用于制造片剂的非毒性药学上可接受的赋形剂混合的抗体或其抗原结合片段的可口服递送的片剂。这些赋形剂可以是惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如，玉米淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者它们可以用已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并且从而在更长的时间段内提供持续的作用。例如，可以使用时间延迟材料诸如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或与蜡一起使用。
在多个实施方案中，药物组合物被配制为硬明胶胶囊，其中将抗体或其抗原结合片段与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或被配制为软明胶胶囊，其中将抗体或其抗原结合片段与水性介质或油介质，例如花生油(arachisoil)、花生油(peanut oil)、液体石蜡或橄榄油混合。
液体制剂包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。这样的制剂可以作为软胶囊或硬胶囊(从例如明胶或羟丙基甲基纤维素制成)中的填充剂使用，并且通常包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油，以及一种或更多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂还可以通过重构例如来自小袋的固体制备。
治疗用途
在另一个方面中，本发明涉及用于治疗患有T细胞相关疾病或可以通过加强或抑制或延长免疫应答来减轻或预防的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本发明的抗体或其抗原结合片段。在多个实施方案中，受试者是人类受试者。
在另一个方面中，本发明提供了用于治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本发明的抗体或其抗原结合片段。这样的紊乱包括但不限于实体肿瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌(cancerof the head or neck)、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌(carcinoma of the fallopian tube)、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤以及所述癌症的组合。在多个实施方案中，受试者先前响应于使用抗癌疗法的治疗，但在疗法停止后，遭受复发(下文称为“复发性癌症”)。在多个实施方案中，受试者患有耐受性癌症或难治性癌症。在多个实施方案中，癌细胞是免疫原性肿瘤(例如，使用肿瘤本身进行疫苗接种可以引起对肿瘤攻击的免疫的那些肿瘤)。在多个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、结肠直肠癌(CRC)、肾癌、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌。
在多个实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段可以被用于在体内直接杀伤或消融癌细胞。直接杀伤包括向需要这类治疗的受试者施用抗体(其任选地与细胞毒性药物融合)。在多个实施方案中，癌症包括以比可比较的组织的非癌性细胞更高的水平表达PD-L1的癌细胞。因为抗体识别癌细胞上的PD-L1，与抗体结合的任何这类细胞被破坏。在抗体被单独地使用以杀伤或消融癌细胞的情况中，这样的杀伤或消融可以通过引发内源性宿主免疫功能诸如CDC和/或ADCC来起作用。用于确定抗体是否以该方式杀伤细胞的测定在本领域技术人员的范围(purview)内。
在多个实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段可以被用于促进癌性肿瘤细胞的生长和/或增殖的抑制。这些方法可以抑制或预防所述受试者的癌细胞的生长，诸如例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。因此，在癌症是实体肿瘤的情况中，本发明的抗体及其抗原结合片段可以将实体肿瘤的尺寸减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
癌细胞增殖的抑制可以通过基于细胞的测定来测量，诸如溴脱氧尿苷(BRDU)掺入(Hoshino等人,Int.J.Cancer 38,369,1986；Campana等人,J.Immunol.Meth.107:79,1988)；[3H]-胸苷掺入(Chen,J.,Oncogene 13:1395-403,1996；Jeoung,J.,J.Biol.Chem.270:18367-73,1995；染料阿尔玛蓝(Alamar Blue)(从BiosourceInternational可得)(Voytik-Harbin等人,In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46,1998)。癌细胞的锚定非依赖性生长(anchorage independent growth)通过在软琼脂中的集落形成测定来评价，诸如通过对在软琼脂之上形成的癌细胞集落的数目进行计数来评价(参见实施例和Sambrook等人,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,1989)。
在受试者中的癌细胞生长的抑制可以通过监测受试者中，例如动物模型中或人类受试者中的癌症生长来评价。一种示例性监测方法是肿瘤发生能力测定。在一个实例中，异种移植物包含来自预先存在的肿瘤或来自肿瘤细胞系的人类细胞。肿瘤异种移植物测定是本领域已知的，并在本文中描述(参见例如Ogawa等人,Oncogene 19:6043-6052,2000)。在另一个实施方案中，使用中空纤维测定来监测肿瘤发生能力，中空纤维测定在美国专利第5,698,413号中描述，该美国专利通过引用以其整体并入本文。
抑制的百分比通过比较在调节剂治疗(modulator treatment)下和在阴性对照条件(通常不使用调节剂治疗)下的癌细胞增殖、锚定非依赖性生长或癌细胞生长来计算。例如，在癌细胞或癌细胞集落(集落形成测定)的数目，或PRDU或[3H]-胸苷掺入为A(在调节剂的治疗下)和C(在阴性对照条件下)的情况中，抑制百分比将是(C-A)/C×100％。
来源于人类肿瘤并且可用于体外和体内研究中使用的肿瘤细胞系的实例包括但不限于白血病细胞系(例如CCRF-CEM、HL-60(TB)、K-562、MOLT-4、RPM1-8226、SR、P388和P388/ADR)；非小细胞肺癌细胞系(例如A549/ATCC、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522和LXFL 529)；小细胞肺癌细胞系(例如DMS 114和SHP-77)；结肠癌细胞系(例如COLO 205、HCC-2998、HCT-116、HCT-15、HT29、KM12、SW-620、DLD-1和KM20L2)；中枢神经系统(CNS)癌细胞系(例如SF-268、SF-295、SF-539、SNB-19、SNB-75、U251、SNB-78和XF 498)；黑素瘤细胞系(例如LOX I MVI、MALME-3M、M14、SK-MEL-2、SK-MEL-28、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、RPMI-7951和M19-MEL)；卵巢癌细胞系(例如IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8和SK-OV-3)；肾癌细胞系(例如786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF 393、SN12C、TK-10、UO-31、RXF-631和SN12K1)；前列腺癌细胞系(例如PC-3和DU-145)；乳腺癌细胞系(例如MCF7、NCI/ADR-RES、MDA-MB-231/ATCC、HS 578T、MDA-MB-435、BT-549、T-47D和MDA-MB-468)；和甲状腺癌细胞系(例如SK-N-SH)。
在另一个方面中，本发明提供了用于治疗受试者中的传染病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本发明的分离的抗体或抗原结合片段。在多个实施方案中，受试者患有由病原性病毒引起的传染病。在多个实施方案中，受试者患有由病原性细菌引起的传染病。在多个实施方案中，受试者患有由病原性真菌引起的传染病。在多个实施方案中，受试者患有由病原性寄生虫引起的传染病。在多个实施方案中，受试者患有耐受使用常规疫苗的治疗或通过使用常规疫苗的治疗未被有效治疗的传染病。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指将使被治疗的紊乱的一种或更多种症状缓解至一定程度的被施用的治疗剂的量。
治疗有效剂量可以通过确定IC50从细胞培养物测定初始地评估。然后，可以配制剂量以在动物模型中实现包括如在细胞培养物中确定的IC50的循环血浆浓度范围。这类信息可以被用于更精确地确定人类中有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过HPLC测量。确切的组合物、施用途径和剂量可以由单独的医师鉴于受试者的状况来选择。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望的应答(例如，治疗应答或预防应答)。例如，可以施用单次团注，可以随时间施用几个分次剂量(多个或重复或维持)并且剂量可以根据治疗情境的迫切需要所指示的按比例减少或增加。为了便于施用和剂量的一致性，配制呈剂量单位形式的胃肠外组合物是特别有益的。如本文使用的剂量单位形式是指合适作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理分散的单位；每一个单位包含与需要的药物载体一起的被计算产生期望的治疗作用的预先确定的量的活性化合物。本公开内容的剂量单位形式的规格将主要由抗体的独特特征和待实现的特定治疗作用或预防作用决定。
因此，技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，根据治疗领域中众所周知的方法调整剂量和给药方案。即，最大可耐受剂量可以被容易地确定，并且向受试者提供可检测的治疗益处的有效量也可以被确定，向受试者提供可检测的治疗益处而施用每个剂的时间要求同样可以被确定。因此，尽管在本文中例举了某些剂量和施用方案，这些实例绝不限制在实践本公开内容时可以向受试者提供的剂量和施用方案。
应注意到，剂量值可以随着待减轻的状况的类型和严重性而变化，并且可以包括单个剂量或多于一个剂量。还应理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用组合物或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。另外，本公开内容的组合物的剂量方案可以基于多个因素，包括疾病的类型、受试者的年龄、体重、性别、医学状况、状况的严重性、施用途径和使用的特定抗体。因此，剂量方案可以广泛变化，但可以使用标准方法常规地确定。例如，剂量可以基于药代动力学或药效动力学参数调整，所述参数可以包括临床作用诸如毒性作用和/或实验值。因此，本公开内容包括如由技术人员确定的受试者内的剂量递增(intra-subject dose-escalation)。确定适当的剂量和方案是相关技术领域中众所周知的并且将被理解为一旦提供本文所公开的教导，则由技术人员掌握。
对于向人类受试者施用，当然取决于施用的模式，本公开内容的抗体或其抗原结合片段的总每月剂量可以在0.5-1200mg/受试者、0.5-1100mg/受试者、0.5-1000mg/受试者、0.5-900mg/受试者、0.5-800mg/受试者、0.5-700mg/受试者、0.5-600mg/受试者、0.5-500mg/受试者、0.5-400mg/受试者、0.5-300mg/受试者、0.5-200mg/受试者、0.5-100mg/受试者、0.5-50mg/受试者、1-1200mg/受试者、1-1100mg/受试者、1-1000mg/受试者、1-900mg/受试者、1-800mg/受试者、1-700mg/受试者、1-600mg/受试者、1-500mg/受试者、1-400mg/受试者、1-300mg/受试者、1-200mg/受试者、1-100mg/受试者或1-50mg/受试者的范围内。例如，每月静脉内剂量可以需要约1-1000mg/受试者。在多个实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以以约1-200mg/受试者、1-150mg/受试者或1-100mg/受试者被施用。总每月剂量可以以单个剂量或分次剂量来施用，并且可以以医师的判断，落在本文给出的典型范围之外。
本公开内容的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量或预防有效量的示例性、非限制性每日给药范围可以是0.001mg/kg体重至100mg/kg体重、0.001mg/kg体重至90mg/kg体重、0.001mg/kg体重至80mg/kg体重、0.001mg/kg体重至70mg/kg体重、0.001mg/kg体重至60mg/kg体重、0.001mg/kg体重至50mg/kg体重、0.001mg/kg体重至40mg/kg体重、0.001mg/kg体重至30mg/kg体重、0.001mg/kg体重至20mg/kg体重、0.001mg/kg体重至10mg/kg体重、0.001mg/kg体重至5mg/kg体重、0.001mg/kg体重至4mg/kg体重、0.001mg/kg体重至3mg/kg体重、0.001mg/kg体重至2mg/kg体重、0.001mg/kg体重至1mg/kg体重、0.010mg/kg体重至50mg/kg体重、0.010mg/kg体重至40mg/kg体重、0.010mg/kg体重至30mg/kg体重、0.010mg/kg体重至20mg/kg体重、0.010mg/kg体重至10mg/kg体重、0.010mg/kg体重至5mg/kg体重、0.010mg/kg体重至4mg/kg体重、0.010mg/kg体重至3mg/kg体重、0.010mg/kg体重至2mg/kg体重、0.010mg/kg体重至1mg/kg体重、0.1mg/kg体重至50mg/kg体重、0.1mg/kg体重至40mg/kg体重、0.1mg/kg体重至30mg/kg体重、0.1mg/kg体重至20mg/kg体重、0.1mg/kg体重至10mg/kg体重、0.1mg/kg体重至5mg/kg体重、0.1mg/kg体重至4mg/kg体重、0.1mg/kg体重至3mg/kg体重、0.1mg/kg体重至2mg/kg体重、0.1mg/kg体重至1mg/kg体重、1mg/kg体重至50mg/kg体重、1mg/kg体重至40mg/kg体重、1mg/kg体重至30mg/kg体重、1mg/kg体重至20mg/kg体重、1mg/kg体重至10mg/kg体重、1mg/kg体重至5mg/kg体重、1mg/kg体重至4mg/kg体重、1mg/kg体重至3mg/kg体重、1mg/kg体重至2mg/kg体重、或1mg/kg体重至1mg/kg体重。应注意到，剂量值可以随着待减轻的状况的类型和严重性而变化。还应理解，对于任何特定受试者，具体剂量方案应根据个体需要和施用组合物或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
在多个实施方案中，施用的总剂量将实现在例如约1μg/ml至1000μg/ml、约1μg/ml至750μg/ml、约1μg/ml至500μg/ml、约1μg/ml至250μg/ml、约10μg/ml至1000μg/ml、约10μg/ml至750μg/ml、约10μg/ml至500μg/ml、约10μg/ml至250μg/ml、约20μg/ml至1000μg/ml、约20μg/ml至750μg/ml、约20μg/ml至500μg/ml、约20μg/ml至250μg/ml、约30μg/ml至1000μg/ml、约30μg/ml至750μg/ml、约30μg/ml至500μg/ml、约30μg/ml至250μg/ml的范围内的血浆抗体浓度。
本发明的药物组合物的毒性和治疗指数可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序，例如用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)的标准药学程序来确定。毒性剂量和治疗有效剂量之间的剂量比是治疗指数，并且治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物通常是优选的。
在多个实施方案中，药物组合物的单次施用或多于一次施用取决于受试者需求和耐受的剂量和频率来施用。无论如何，组合物应提供充分量的至少一种本文公开的抗体或其抗原结合片段以有效地治疗受试者。剂量可以被施用一次，但可以被周期性地应用直到实现治疗结果或直到副作用警告停止疗法。
施用抗体或其抗原结合片段药物组合物的给药频率取决于疗法的性质和被治疗的特定疾病。受试者可以以规律间隔治疗，诸如每周地或每月地，直到实现期望的治疗结果。示例性给药频率包括但不限于：无间断地每周一次；每隔一周地每周一次；每2周一次；每3周一次；无间断地每周一次，持续2周，然后每月一次；无间断地每周一次，持续3周，然后每月一次；每月一次；每两个月一次；每3个月一次；每4个月一次；每5个月一次；或每6个月一次，或每年一次。
组合疗法
如本文使用的，提及本公开内容的抗体或其抗原结合片段和一种或更多种其他治疗剂时，术语“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administered)”和“与...组合(in combination with)”意图意指，并且的确是指并且包括以下：本公开内容的抗体或其抗原结合片段和一种或更多种治疗剂的这样的组合同时施用至需要治疗的受试者，当这样的组分被一起配制成单一剂型时，所述单一剂型在基本上相同的时间将所述组分释放至所述受试者；本公开内容的抗体或其抗原结合片段和一种或更多种治疗剂的这样的组合基本上同时施用至需要治疗的受试者，当这样的组分彼此分开配制成单独的剂型时，所述单独的剂型在基本上相同的时间被所述受试者服用，届时所述组分基本上在相同的时间释放至所述受试者；本公开内容的抗体或其抗原结合片段和一种或更多种治疗剂的这样的组合顺序施用至需要治疗的受试者，当这样的组分彼此分开配制成单独的剂型时，所述单独的剂型被所述受试者在连续的时间服用，每次施用之间具有显著的时间间隔，届时所述组分在基本上不同的时间释放至所述受试者；以及，本公开内容的抗体或其抗原结合片段和一种或更多种治疗剂的这样的组合顺序施用至需要治疗的受试者，当这样的组分一起配制成单一剂型时，所述单一剂型以受控方式释放所述组分，届时它们在相同和/或不同的时间同时、连续和/或重叠地释放至所述受试者，其中每个部分可以通过相同或不同的途径施用。
在另一个方面中，本发明涉及被设计成治疗受试者中的癌症或传染病的组合疗法，所述组合疗法包括向受试者施用a)治疗有效量的本发明的分离的抗体或抗原结合片段、和b)一种或更多种另外的疗法，所述一种或更多种另外的疗法选自由免疫疗法、化学疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法、疫苗接种方案和干细胞移植组成的组，其中组合疗法提供了对肿瘤细胞的增加的细胞杀伤，即当被共施用时，分离的抗体或抗原结合片段和另外的疗法之间存在协同作用。
在多个实施方案中，免疫疗法选自由以下组成的组：使用针对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)诸如PD-1、PD-L1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA的激动抗体、拮抗抗体或阻断抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体诸如博纳吐单抗的治疗；涉及施用生物应答修饰剂诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF以及IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继性转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；和使用免疫刺激剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗。
已经显示出许多常规化合物具有抗肿瘤活性。这些化合物已经被用作化学疗法中的药剂以缩小实体肿瘤、预防转移和进一步生长、或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中的恶性T细胞的数目。尽管化学疗法在治疗多种类型的恶性肿瘤中已经是有效的，但许多抗肿瘤化合物诱导不期望的副作用。已经显示出，当将两种或更多种不同的治疗组合时，所述治疗可以协同地工作，并且允许降低每种治疗的剂量，从而降低每种化合物在较高的剂量产生的有害副作用。在其他实例中，对于治疗是难治性的恶性肿瘤可以响应于两种或更多种不同的治疗的组合疗法。
当本文公开的抗体或抗原结合片段与另一种常规抗肿瘤剂伴随地或顺序地组合施用时，这样的抗体或抗原结合片段可以增强抗肿瘤剂的治疗效果或克服细胞对这样的抗肿瘤剂的耐受性。这允许减少抗肿瘤剂的剂量，从而降低不期望的副作用，或恢复抗肿瘤剂在耐受性T细胞中的有效性。
仅为了说明，可以被用于组合抗肿瘤疗法的药物化合物包括：氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、天冬酰胺酶(asparaginase)、bcg、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素(bleomycin)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、喜树碱(campothecin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡氮芥(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯膦酸盐(clodronate)、秋水仙碱(colchicine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、氮烯咪胺(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、双烯雌酚(dienestrol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟氢化可的松(fludrocortisone)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、吉西他滨(gemcitabine)、染料木碱(genistein)、戈舍瑞林、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素、伊立替康(irinotecan)、ironotecan、来曲唑(letrozole)、亚叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、环己亚硝脲(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、氨甲蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼鲁米特(nilutamide)、诺考达唑(nocodazole)、奥曲肽(octreotide)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸盐(pamidronate)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、泡非美(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、利妥昔单抗(rituximab)、链脲霉素(streptozocin)、苏拉明(suramin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮(testosterone)、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、二氯二茂钛(titanocene dichloride)、拓泊替康(topotecan)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、和长春瑞滨(vinorelbine)。
这些化学治疗抗肿瘤化合物可以通过它们的作用的机制被分类为例如以下组：抗代谢物/抗癌剂，诸如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟苷(floxuridine)、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关的抑制剂(巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖剂/抗有丝分裂剂，包括天然产物诸如长春花生物碱类(长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰剂诸如紫杉烷(taxane)(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素类(epothilones)和诺维本(navelbine)、表二鬼臼毒素类(epidipodophyllotoxins)(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环霉素类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺(cytoxan)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基三聚氰胺、奥沙利铂、异环磷酸胺、美法仑、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉酚(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和依托泊苷(VP 16))；抗生素诸如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环霉素类、米托蒽醌、博来霉素类、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其全身性地代谢L-天冬酰胺，并且剥夺不具有合成它们自己的天冬酰胺的能力的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂的烷化剂诸如氮芥类(氮芥、环磷酰胺及类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类(六甲基三聚氰胺和塞替派)、烷基磺酸盐-白消安(alkyl sulfonates-busulfan)、亚硝基脲类(卡氮芥(BCNU)及类似物、链脲霉素)、trazenes-dacarbazinine(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂的抗代谢物诸如叶酸类似物(氨甲蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素类，激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(anticoagulant)(肝素、合成肝素盐以及其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(fibrinolytic agents)(诸如组织纤溶酶原活化剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂(antimigratory agent)；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil))；抗血管发生化合物(TNP-470、染料木碱)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断物；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓泊替康、伊立替康)；皮质激素类(corticosteroid)(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松、和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬蛋白酶活化剂；和染色质干扰剂。
在多个实施方案中，化学疗法包含选自由以下组成的组的化学治疗剂：柔红霉素、更生霉素、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、苯达莫司汀、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春花碱、依托泊苷、替尼泊苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂、喷司他丁、克拉屈滨、阿糖胞苷、吉西他滨、普拉曲沙(pralatrexate)、米托蒽醌、己烯雌酚(DES)、氟达拉滨、异环磷酰胺、羟基脲紫杉烷类(hydroxyureataxanes)(诸如紫杉醇和多西他赛)和/或蒽环霉素抗生素，以及剂，诸如但不限于DA-EPOCH、CHOP、CVP或FOLFOX的组合。
在多个实施方案中，小分子激酶抑制剂靶向疗法包含选自由以下组成的组的小分子激酶抑制剂：Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂、SYK抑制剂(例如entospletinib)、AKT抑制剂、mTOR抑制剂、Src抑制剂、JAK/STAT抑制剂、Ras/Raf/MEK/ERK抑制剂和Aurora抑制剂(参见D’Cruz等人,Expert Opin Pharmacother,14(6):707-21,2013)。
在多个实施方案中，组合疗法包括同时施用抗体或其抗原结合片段和一种或更多种另外的疗法。在多个实施方案中，抗体或其抗原结合片段组合物和一种或更多种另外的疗法被顺序施用，即，在施用一种或更多种另外的疗法之前或之后施用抗体或其抗原结合片段组合物。
在多个实施方案中，抗体或其抗原结合片段组合物和一种或更多种另外的疗法的施用是同时进行的，即，抗体或其抗原结合片段组合物和一种或更多种另外的疗法的施用时间段彼此重叠。
在多个实施方案中，抗体或其抗原结合片段组合物和一种或更多种另外的疗法的施用不是同时进行的。例如，在多个实施方案中，在施用一种或更多种另外的疗法之前，终止抗体或其抗原结合片段组合物的施用。在多个实施方案中，在施用抗体或其抗原结合片段组合物之前，终止一种或更多种另外的疗法的施用。
当本文公开的抗体或其抗原结合片段与一种或更多种另外的疗法伴随地或顺序地组合施用时，这样的抗体或其抗原结合片段可以增强一种或更多种另外的疗法的治疗效果或克服细胞对一种或更多种另外的疗法的耐受性。这允许减少一种或更多种另外的疗法的剂量或缩短一种或更多种另外的疗法的持续时间，从而降低不期望的副作用，或恢复一种或更多种另外的疗法的效力。
诊断用途
在另一个方面中，本发明提供了用于在体外或在体内检测样品中的人类PD-L1抗原的存在的方法，例如，用于诊断人类PD-L1相关的疾病。在一些方法中，这通过将待测试的样品以及对照样品与本发明的人类序列抗体或人类单克隆抗体或其抗原结合部分(或双特异性分子或多特异性分子)在允许抗体和人类PD-L1之间的复合物形成的条件下接触来实现。然后在两个样品中检测(例如，使用ELISA)复合物形成，并且样品之间在复合物形成方面的任何统计上显著的差异都指示人类PD-L1抗原在测试样品中的存在。
在多个实施方案中，提供了用于在受试者中检测癌症或确定癌症的诊断的方法。该方法包括将来自受试者的生物样品与本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触，并且检测分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段与样品的结合。与分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段与对照样品的结合相比，分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段与样品的结合的增加检测出受试者中的癌症或确定了受试者中的癌症的诊断。对照可以是来自已知不患有癌症的受试者的样品，或标准值。样品可以是任何样品，包括但不限于来自活组织检查、尸体解剖和病理标本的组织。生物样品还包括组织切片，例如，出于组织学目的采集的冷冻切片。生物样品还包括体液，诸如血液、血清、血浆、痰和脊髓液。
在一个实施方案中，提供了用于检测生物样品(诸如血液样品)中的PD-L1的试剂盒。用于检测多肽的试剂盒通常将包含与PD-L1特异性地结合的人类抗体，诸如本文公开的任何抗体。在一些实施方案中，抗体片段诸如Fv片段包括在试剂盒中。对于体内使用，抗体可以是scFv片段。在另外的实施方案中，抗体被标记(例如用荧光、放射性或酶标记物标记)。
在一个实施方案中，试剂盒包括公开了使用与PD-L1特异性地结合的抗体的手段的说明材料。说明材料可以以电子形式(诸如计算机软盘或光盘)编写，或可以是可视的(诸如视频文件)。试剂盒还可以包括促进试剂盒被设计用于其的特定应用的另外的组分。因此，例如，试剂盒可以另外包含检测标记物的工具(means)(诸如用于酶标记物的酶底物、检测荧光标记物的过滤器组、适当的二级标记物诸如二级抗体等)。试剂盒可以另外地包含缓冲剂和常规用于实践特定方法的其他试剂。这样的试剂盒和适当的成分是本领域技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，诊断试剂盒包含免疫测定。尽管免疫测定的细节可以随使用的特定格式而变化，但检测生物样品中的PD-L1的方法通常包括将生物样品与抗体接触的步骤，所述抗体在免疫学反应条件下特异性地与PD-L1反应。允许抗体在免疫学反应条件下特异性地结合以形成免疫复合物，并且免疫复合物(结合的抗体)的存在被直接地或间接地检测。
在多个实施方案中，抗体或抗原结合片段可以被标记或不被标记以用于诊断目的。通常，诊断测定需要检测由抗体与PD-L1的结合产生的复合物的形成。抗体可以被直接地标记。可以使用多个标记物，包括但不限于放射性核素、荧光剂(fluorescer)、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素、半抗原)。许多适当的免疫测定是技术人员已知的(参加例如美国专利第3,817,827号；第3,850,752号；第3,901,654号；和第4,098,876号)。当未被标记时，抗体可以在测定，诸如凝集测定中使用。未标记的抗体还可以与另外的(一种或更多种)合适的试剂组合使用，所述试剂可以被用于检测抗体，诸如与第一抗体(例如，抗独特型抗体或对未标记的免疫球蛋白特异性的其他抗体)反应的标记的抗体(例如第二抗体)或其他合适的试剂(例如，标记的蛋白A)。
本文提供的抗体或抗原结合片段还可以在检测哺乳动物对某些疾病的易感性的方法中使用。为了说明，该方法可以被用于检测哺乳动物对疾病的易感性，所述疾病基于在细胞上存在的PD-L1的量和/或哺乳动物中的PD-L1阳性细胞的数目进展。在一个实施方案中，本申请提供了一种检测哺乳动物对肿瘤的易感性的方法。在该实施方案中，待测试的样品与结合PD-L1或其部分的抗体在适于所述抗体与其结合的条件下接触，其中样品包含在正常个体中表达PD-L1的细胞。检测抗体的结合和/或结合的量，其指示个体对肿瘤的易感性，其中较高水平的受体与个体对肿瘤的增加的易感性相关。
在多个实施方案中，抗体或抗原结合片段被附接至能够被检测的标记物上(例如，标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。活性部分可以是放射性剂，诸如：放射性重金属诸如铁螯合物、钆或锰的放射性螯合物、氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射物、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I或99Tc。附着至这类部分的结合剂可以被用作成像剂，并且以对于哺乳动物诸如人类中的诊断用途有效的量施用，并且然后检测成像剂的定位和累积。成像剂的定位和累积可以通过放射性闪烁照相法、核磁共振成像、计算机断层摄影或正电子发射断层摄影来检测。
使用针对PD-L1的抗体或抗原结合片段的免疫闪烁照相法可以被用于检测和/或诊断癌症和血管系统。例如，针对用99锝、111铟或125碘标记的PD-L1标志物的单克隆抗体可以被有效地用于这样的成像。如对本领域技术人员将是明显的，待施用的放射性同位素的量取决于放射性同位素。本领域普通技术人员可以基于用作活性部分的给定放射性核素的比活性和能量容易地配制待施用的成像剂的量。通常，每剂量的成像剂施用0.1-100毫居里，或1-10毫居里，或2-5毫居里。因此，所公开的组合物作为成像剂是有用的，所述成像剂包含与放射性部分缀合的靶向部分，所述放射性部分包含0.1-100毫居里，在一些实施方案中包含1-10毫居里，在一些实施方案中包含2-5毫居里，在一些实施方案中包含1-5毫居里。
免疫缀合物
本申请还提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物包含直接或间接地与效应物分子缀合(或连接)的本发明的抗体或其抗原结合片段。在该方面中，术语“缀合的”或“连接的”是指使两个多肽形成一个连续的多肽分子。该连接可以通过化学手段或重组手段进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗体部分和效应物分子之间的反应已经产生了在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可以任选地包含在抗体和效应物分子之间。在多个实施方案中，抗体或抗原结合片段与效应物分子连接。在其他实施方案中，与效应物分子连接的抗体或抗原结合片段还与脂质、蛋白或肽连接，以增加其在体内的半衰期。因此，在多个实施方案中，本公开内容的抗体可以被用于递送多种效应物分子。
效应物分子可以是可检测的标记物、免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化学治疗剂。
免疫毒素的具体的、非限制性实例包括但不限于相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)(PE，诸如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(diphtheria toxin)(DT)、肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)、cholix毒素或其修饰的毒素，或直接或间接地抑制细胞生长或杀伤细胞的其他毒性剂。
“细胞因子”是由一个细胞群体释放的、作为细胞间介导物作用于另一个细胞的一类蛋白或肽。细胞因子可以作为免疫调节剂起作用。细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子和传统多肽激素。因此，实施方案可以利用干扰素(例如，IFN-α、IFN-β和IFN-γ)；肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员；人类生长激素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松弛素；前松弛素；促卵泡激素(FSH)；促甲状腺激素(TSH)；促黄体生成激素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘泌乳激素、OB蛋白；TNF-α；TNF-β；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子诸如NGF-β.；血小板生长因子；TGF-α；TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞生成素(EPO)；集落刺激因子(CSF)诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL-1至IL-21)、kit-配体或FLT-3、血管抑制素、血小板反应蛋白或内皮生长抑素。这些细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物学上有活性的等效物。
趋化因子也可以与本文公开的抗体缀合。趋化因子是一个小的(近似地约4kDa至约14kDa)、诱导型和分泌型促炎性细胞因子的超家族，主要作为特定白细胞亚型的化学引诱剂和活化剂起作用。趋化因子的产生由炎性细胞因子、生长因子和病原性刺激物诱导。趋化因子蛋白基于保守氨基酸序列基序分成子家族(α、β和δ)，并且基于与氨基末端相邻的前两个半胱氨酸的位置分类成四个高度保守的组——CXC、CC、C和CX3C。迄今，已经发现多于50种趋化因子，并且至少存在18种人类七次跨膜结构域(7TM)趋化因子受体。使用的趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MCP-1和fractalkine。
治疗剂可以是化学治疗剂。本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化学治疗剂(例如参见Harrison的Principles of Internal Medicine,第14版的第86章,Slapak和Kufe,Principles of Cancer Therapy；Perry等人,Abeloff,Clinical Oncology2.sup.nd ed.中的第17章,Chemotherapy.COPYRIGHT.2000 Churchill Livingstone,Inc；Baltzer L.,Berkery R.(编著):Oncology Pocket Guide to Chemotherapy,第二版St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer D S,Knobf M F,Durivage H J(编著):TheCancer Chemotherapy Handbook,第4版St.Louis,Mosby-Year Book,1993)。用于制备免疫缀合物的有用的化学治疗剂包括auristatin、海兔毒素(dolastatin)、MMAE、MMAF、AFP、DM1、AEB、多柔比星、柔红霉素、氨甲蝶呤、美法仑、苯丁酸氮芥、长春花生物碱类、5-氟尿苷、丝裂霉素-C、紫杉醇、L-天冬酰胺酶、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲类、顺铂、卡铂、丝裂霉素、氮烯咪胺、丙卡巴肼、拓泊替康、氮芥类、环磷酰胺(cytoxan)、依托泊苷、BCNU、伊立替康、喜树碱、博来霉素、依达比星、更生霉素、普卡霉素、米托蒽醌、天冬酰胺酶、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇、和多西他赛及其盐、溶剂化物或衍生物。在多个实施方案中，化学治疗剂是auristatin E(在本领域中也称作海兔毒素-10)或其衍生物以及其药学上的盐或溶剂化物。典型的auristatin衍生物包括DM1、AEB、AEVB、AFP、MMAF和MMAE。auristatin E及其衍生物，以及接头的合成和结构在例如美国专利申请公布第20030083263号；美国专利申请公布第20050238629号；和美国专利第6,884,869号(每篇文献通过引用以其整体并入本文)中描述。在多个实施方案中，治疗剂是auristatin或auristatin衍生物。在多个实施方案中，auristatin衍生物是dovaline-缬氨酸-dolaisoleunine-dolaproine-苯丙氨酸(MMAF)或monomethyauristatin E(MMAE)。在多个实施方案中，治疗剂是美登素(maytansinoid)或美登醇(maytansinol)类似物。在多个实施方案中，美登素是DM1。
效应物分子可以使用本领域技术人员已知的任何数目的手段连接至本发明的抗体或抗原结合片段。可以使用共价附接和非共价附接手段二者。将效应物分子附接至抗体的程序根据效应物分子的化学结构变化。多肽通常包含多种官能团；诸如羧酸(COOH)、游离胺(--NH2)或巯基(--SH)基团，其可用于与抗体上的合适的官能团反应以引起效应物分子的结合。可选地，抗体被衍生化以暴露或附接另外的反应性官能基团。衍生化可以包括附接许多接头分子的任何一个，诸如从Pierce Chemical Company,Rockford,III可得的那些。接头可以是被用于将抗体连接至效应物分子的任何分子。接头能够与抗体和与效应物分子二者形成共价键。合适的接头是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在抗体和效应物分子是多肽的情况中，接头可以通过其侧链基团(诸如通过与半胱氨酸的二硫键连接)连接至组成型氨基酸或至连接末端氨基酸的α碳氨基和羧基基团。
在一些情况中，期望当免疫缀合物已经到达其靶位点时，效应物分子从抗体中游离出来。因此，在这些情况中，免疫缀合物将包含在靶位点附近可裂解的连接。裂解接头以从抗体释放效应物分子可以由免疫缀合物在靶细胞中或在靶位点附近经历的酶促活性或条件来促进。
用于将抗体与效应物分子缀合的程序先前已经描述过，并且在本领域技术人员的范围内。例如，用于制备免疫毒素的酶学上有活性的多肽的程序在WO84/03508和WO85/03508中描述，该文献出于其具体教导的目的通过引用并入本文。其他技术在Shih等人,Int.J.Cancer 41:832-839(1988)；Shih等人,Int.J.Cancer 46:1101-1106(1990)；Shih等人,美国专利第5,057,313号；Shih Cancer Res.51:4192、国际公布WO 02/088172；美国专利第6,884,869号；国际专利公布WO2005/081711；美国公布的申请2003-0130189 A；和美国专利申请第20080305044号中描述，出于教导这类技术的目的，每篇文献通过引用并入本文。
本发明的免疫缀合物保留抗体或抗原结合片段的免疫反应性，例如抗体或抗原结合片段在缀合后具有与缀合前近似相同、或仅略微降低的与抗原结合的能力。如本文使用的，免疫缀合物也被称作抗体药物缀合物(ADC)。
双特异性分子
在另一方面中，本发明的特征在于包含本发明的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可以被衍生化或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白(例如，另一种抗体或受体的配体)，以生成与至少两种不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体可以事实上被衍生化或连接至多于一种其他功能分子，以生成与多于两种不同的结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子还意图由如本文使用的术语“双特异性分子”所包括。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一种或更多种其他结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得双特异性分子产生。在多个实施方案中，本发明包括能够与表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和与表达PD的靶细胞二者结合的双特异性分子。在这样的实施方案中，双特异性分子将表达PD-L1的细胞靶向至效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如，表达PD-L1的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子的生成。制备本发明的双特异性分子的方法是本领域中众所周知的。
多核苷酸和抗体表达
本申请还提供了包含编码抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列编码一种抗体氨基酸序列。本申请还提供了在例如，如本文定义的严格的杂交条件或较低严格的杂交条件下与编码与人类PD-L1结合的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。
严格的杂交条件包括但不限于，在约45℃与在6×SSC中的过滤器结合的DNA杂交，随后是在约50-65℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤一次或更多次，高度严格的条件诸如在约45℃与在6×SSC中的过滤器结合的DNA杂交随后是在约60℃在0.1×SSC/0.2％SDS中洗涤一次或更多次，或本领域技术人员已知的任何其他严格的杂交条件(参见例如Ausubel,F.M.等人,编著1989 Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,GreenPublishing Associates,Inc.和John Wiley and Sons,Inc.,NY，在6.3.1页至6.3.6页和2.10.3页)。
可以通过本领域中已知的任何方法获得多核苷酸并确定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸组装(例如如Kutmeier等人，BioTechiques 17:242(1994)中描述的)，简而言之，其包括合成包含编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸、退火和连接这些寡核苷酸、并且然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。在一个实施方案中，使用的密码子包括对于人类或小鼠而言是典型的那些密码子(参见例如Nakamura,Y.,Nucleic Acids Res.28:292(2000))。
编码抗体的多核苷酸还可以由来自合适的来源的核酸生成。如果包含编码特定抗体的核酸的克隆无法获得，但抗体分子的序列是已知的，那么编码免疫球蛋白的核酸可以化学地合成或从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞生成的cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞分离的核酸，优选polyA+RNA，所述组织或细胞诸如被选择表达抗体的杂交瘤细胞)获得，所述获得通过使用与序列的3’末端和5’末端可杂交的合成引物的PCR扩增进行，或通过使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针进行克隆以鉴定例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆。然后，通过PCR生成的扩增的核酸可以用本领域众所周知的任何方法克隆到可复制的克隆载体中。
本发明还涉及表达本发明的PD-L1多肽和/或抗PD-L1抗体的宿主细胞。本领域中已知的许多种宿主表达系统可以被用于表达本发明的抗体，包括原核(细菌)表达系统和真核表达系统(诸如酵母、杆状病毒(baculovirus)、植物、哺乳动物和其他动物细胞、转基因动物和杂交瘤细胞)，以及噬菌体展示表达系统。
本发明的抗体可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组地表达抗体，用一种或更多种携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段的重组表达载体将宿主细胞转化、转导、感染等，使得轻链和/或重链在宿主细胞中被表达。重链和轻链可以独立地从它们在一个载体中可操作地连接的不同的启动子表达，或可选地，重链和轻链可以独立地从在两个载体中可操作地连接的不同的启动子表达，一个载体表达重链并且一个载体表达轻链。任选地，重链和轻链可以在不同宿主细胞中表达。
另外地，重组表达载体可以编码促进抗体轻链和/或重链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体轻链和/或重链基因可以被克隆到载体中，使得信号肽在框架内可操作地连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。优选地，重组抗体被分泌到培养宿主细胞的培养基中，从培养基中可以回收或纯化抗体。
编码HCVR的分离的DNA可以通过将编码HCVR的DNA可操作地连接至编码重链恒定区的另一种DNA分子而转化为全长重链基因。人类以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的。包含这些区域的DNA片段可以通过例如标准PCR扩增来获得。重链恒定区可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或子类恒定区及其任何异型变体，如在Kabat(上文)中描述的。
编码LCVR区的分离的DNA可以通过将编码LCVR的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区的另一种DNA分子而转化为全长轻链基因(以及转化为Fab轻链基因)。人类以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的。包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
除了一种或更多种抗体重链和/或轻链基因之外，本发明的重组表达载体携带控制一种或更多种抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意图如需要的包括启动子、增强子和控制一种或更多种抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。表达载体的设计，包括调控序列的选择，可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白的表达的水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平的蛋白表达的病毒元件，诸如来源于巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和/或多瘤病毒的启动子和/或增强子。
另外地，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，诸如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和一个或更多个可选择标志物基因。可选择标志物基因促进已经引入载体的宿主细胞的选择。例如，通常，可选择标志物基因赋予已经引入载体的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的可选择标志物基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于在用氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr阴性宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)和在用于选择/扩增的谷氨酰胺合成酶(GS)阴性细胞系(诸如NSO)中的GS。
为了表达轻链和/或重链，编码重链和/或轻链的一个或更多个表达载体通过标准技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、转导、感染等引入宿主细胞中。尽管在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达本发明的抗体理论上是可能的，但真核细胞是优选的，并且最优选哺乳动物宿主细胞，因为这样的细胞更有可能组装和分泌恰当地折叠的和免疫学上有活性的抗体。用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr阴性CHO细胞，如Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20,1980中描述的，与DHFR可选择标志物一起使用，如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159:601-21,1982中描述的]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2/0细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞中时，抗体通过将宿主细胞培养持续足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间段来产生，或更优选地，将抗体分泌到其中宿主细胞在本领域中已知的适当条件下生长的培养基中。抗体可以使用标准纯化方法从宿主细胞和/或培养基回收。
本发明提供了包含根据本发明的核酸分子的宿主细胞。优选地，本发明的宿主细胞包含一种或更多种包含本发明的核酸分子的载体或构建体。例如，本发明的宿主细胞是已经引入本发明的载体的细胞，所述载体包含编码本发明的抗体的LCVR的多核苷酸和/或编码本发明的HCVR的多核苷酸。本发明还提供了一种已经引入本发明的两种载体的宿主细胞；一种载体包含编码本发明的抗体的LCVR的多核苷酸，并且一种载体包含编码在本发明的抗体中存在的HCVR的多核苷酸，并且每种多核苷酸可操作地连接至增强子/启动子调控元件(例如，来源于SV40、CMV、腺病毒等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)，以驱动基因的高水平的转录。
表达之后，本发明的完整抗体、单个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲和(例如蛋白A)、反相、疏水相互作用柱色谱、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳等。治疗性抗体的纯化的标准程序例如由Feng L1,Joe X.Zhou,Xiaoming Yang,Tim Tressel和Brian Lee在题为“Current TherapeuticAntibody Production and Process Optimization”的文章(BioProcessing Journal,2005年9月/10月)(出于教导治疗抗体的纯化的目的，通过引用以其整体并入)中描述。另外，用于从重组地表达的抗体制剂去除病毒的标准技术是本领域已知的(参见例如GerdKern和Mani Krishnan，“Viral Removal by Filtration:Points to Consider”(BiopharmInternational,2006年10月))。已知从治疗抗体的制剂去除病毒的过滤的有效性至少部分取决于待过滤的溶液的蛋白和/或抗体的浓度。用于本发明的抗体的纯化过程可以包括过滤以从一个或更多个色谱操作的主流中去除病毒的步骤。优选地，在过滤通过药物级纳米过滤器以去除病毒之前，稀释或浓缩包含本发明的抗体的色谱主流，以给予约1g/L至约3g/L的总蛋白浓度和/或总抗体浓度。甚至更优选地，纳米过滤器是DV20纳米过滤器(例如PallCorporation；East Hills,N.Y.)。优选至少约90％、约92％、约94％或约96％同质性的，并且最优选约98％至约99％或更高同质性的基本纯的免疫球蛋白用于制药用途。一旦如期望的部分纯化或纯化至同质性，然后无菌抗体可以如本文指导的被治疗上使用。
鉴于上文提及的讨论，本发明还涉及通过包括培养宿主细胞使得核酸被表达并且任选地，从宿主细胞培养基回收抗体的步骤的方法可获得的抗体，所述宿主细胞包括但不限于已经被包含编码本发明的抗体的核酸分子的多核苷酸或载体转化的哺乳动物、植物、细菌、转基因动物或转基因植物细胞。
在某些方面中，本申请提供了杂交瘤细胞系，以及由这些杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。所公开的细胞系具有除了用于产生单克隆抗体之外的其他用途。例如，细胞系可以与其他细胞(诸如合适地药物标记的人类骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人类-小鼠杂合骨髓瘤或人类类淋巴母细胞细胞)融合以产生另外的杂交瘤，并且因此提供编码单克隆抗体的基因的转移。此外，细胞系可以被用作编码抗PD-L1免疫球蛋白链的核酸的来源，其可以被分离和表达(例如，在使用任何合适的技术转移至其他细胞时)(参见例如Cabilly等人,美国专利第4,816,567号；Winter,美国专利第5,225,539号))。例如，包含重排的抗PD-L1轻链或重链的克隆可以分离(例如，通过PCR)，或cDNA文库可以从由细胞系分离的mRNA制备，并且编码抗PD-L1免疫球蛋白链的cDNA克隆可以被分离。因此，编码抗体的重链和/或轻链或其部分的核酸可以根据用于在多种宿主T细胞中或体外翻译系统中产生特异性免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其变体(例如，人源化免疫球蛋白)的重组DNA技术获得和使用。例如，编码变体诸如人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链的核酸，包括cDNA或其衍生物，可以被放置到合适的原核载体或真核载体(例如表达载体)中，并且通过适当的方法(例如转化、转染、电穿孔、感染)引入合适的宿主T细胞中，使得核酸可操作地连接至一个或更多个表达控制元件(例如在载体中或整合到宿主T细胞基因组中)。为了产生，宿主T细胞可以被维持在适用于表达的条件下(例如在诱导剂的存在下、补充有适当的盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的合适的培养基)，由此产生编码的多肽。如果期望，可以回收和/或分离编码的蛋白(例如从宿主T细胞或培养基)。将理解，生产的方法包括在转基因动物的宿主T细胞中的表达(参见例如1992年3月19日公布的GenPharm International的WO 92/03918)(通过引用以其整体并入)。
宿主细胞也可以用于通过常规的技术产生完整抗体的部分或片段，例如Fab片段或scFv分子。例如，可以期望用编码本发明的抗体的轻链或重链的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除编码对于与人类PD-L1结合而言不必需的轻链和重链之一或二者的一些或所有DNA。本发明的抗体还包括从这样的截短的DNA分子表达的分子。
已经描述了用于从细菌诸如大肠杆菌(E.coli)表达单链抗体和/或再折叠成适当的活性形式，包括单链抗体的方法，并且这些方法是众所周知的，并且适用于本文公开的抗体(参见例如Buchner等人,Anal.Biochem.205:263-270,1992；Pluckthun,Biotechnology9:545,1991；Huse等人,Science 246:1275,1989和Ward等人,Nature 341:544,1989,全部通过引用并入本文)。
通常，来自大肠杆菌或其他细菌的有功能的异源蛋白从包涵体分离，并且需要使用强变性剂增溶，并且随后再折叠。在增溶步骤期间，如本领域中众所周知的，还原剂必须存在以分离二硫键。具有还原剂的示例性缓冲液是：0.1M Tris pH 8、6M胍、2mM EDTA、0.3MDTE(二硫代赤藓糖醇)。二硫键的再氧化可以在呈还原的和氧化的形式的低分子量硫醇试剂的存在的情况中发生，如在Saxena等人,Biochemistry 9:5015-5021,1970中描述的(通过引用并入本文)，并且特别地如由Buchner等人上文描述的。
复性通常通过将变性的且还原的蛋白稀释(例如，100倍)到再折叠缓冲液中来实现。示例性缓冲液是0.1M Tris,pH 8.0、0.5M L-精氨酸、8mM氧化的谷胱甘肽(GSSG)和2mMEDTA。
作为对双链抗体纯化方案的修改，重链区和轻链区被单独地增溶和还原，并且然后在再折叠溶液中组合。当这两种蛋白以使得一种蛋白相对于另一种蛋白不超过5倍摩尔过量的摩尔比混合时，获得了示例性产率。在氧化还原改组完成后，可以将过量的氧化的谷胱甘肽或其他氧化低分子量化合物添加至再折叠溶液。
除了重组方法之外，本文公开的抗体、标记的抗体及其抗原结合片段还可以全部或部分使用标准的肽合成来构建。长度小于约50个氨基酸的多肽的固相合成可以通过将序列的C-末端氨基酸附接至不可溶的支持物，随后顺序添加在序列中的剩余的氨基酸来完成。用于固相合成的技术由Barany&Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷:Special Methods in Peptide Synthesis,A部分3-284页；Merrifield等人,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156,1963和Stewart等人,Solid Phase PeptideSynthesis,第2版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.,1984描述。较大长度的蛋白可以通过较短的片段的氨基末端和羧基末端的缩合来合成。通过羧基末端的活化来形成肽键的方法(诸如通过使用偶联剂N,N’-二环己基碳二亚胺)是本领域众所周知的。
提供以下实施例以更充分地说明本发明，但以下实施例不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1
特异性靶向人类PD-L1的单克隆抗体的生成
构建了在C-末端具有人类IgG1(Pro100-Lys330)标签的人类PD-L1(NP_054862.1，Phe19-Thr239)(命名为PDL1/Fc融合蛋白)，在小鼠骨髓瘤细胞系(NSO)中表达，通过蛋白A柱纯化并且用作免疫原。基于还原条件下的SDS-PAGE并且通过银染色可视化，PDL1/Fc的估计的纯度高于90％。
将雌性Balb/c和C57Bl/6小鼠用50μg PDL1/Fc/小鼠腹膜内(i.p.)免疫接种三次(每两周一次)。在第一次免疫接种时，将抗原作为与完全弗氏佐剂(Sigma,St.Louis,MO)的1:1混合物注射，并且在第二和第三剂量中作为与不完全弗氏佐剂(Sigma,St.Louis,MO)的1:1混合物注射。通过尾静脉注射用25μg的PDL1/Fc给予小鼠最终加强，并且在4天后收获脾细胞用于与来自ATCC(Allendale,NJ)的骨髓瘤细胞系NS0融合。使用电融合方法以获得杂交瘤细胞，并且然后针对抗原结合、配体阻断、IgG分析(binning)、参考抗体结合和FACS结合对杂交瘤上清液进行筛选。从初始的结合剂筛选选择16种mAb用于亚克隆(有限稀释法)和进一步评价。使用BD细胞MAb培养基以在滚瓶中生长杂交瘤，以用于收集上清液用于抗体生产。mAb用蛋白A亲和色谱纯化。基于SDS-PAGE考马斯染色，mAb的估计的纯度高于90％。12种纯化的mAb的二次筛选包括：PD-L1结合测定(ELISA)、鼠PD-L1结合测定(ELISA)、通过FACS的PD1/PD-1配体阻断测定和表位分析(epitope binning)筛选。三种mAb示出了小鼠交叉反应性，并且表位分析(epitope binning)鉴定了3个表位。
基于二次测定的累积结果，选择纯化的mAb PDL1#1和PDL1#10用于测序和进一步分析。遵循试剂的技术手册从冷冻杂交瘤细胞提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA。遵循PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。然后进行PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)，然后将其单独地克隆到标准的克隆载体中并测序。mAb PDL1#1和PDL1#10分别包含SEQ IDNO:12和14中列出的重链可变区序列，和分别包含SEQ ID NO:16和18中列出的轻链可变区序列。mAb PDL1#1和PDL1#10的重链可变区分别由SEQ ID NO:13和15中列出的核酸序列编码，并且mAb PDL1#1和PDL1#10的轻链可变区分别由SEQ ID NO:17和19中列出的核酸序列编码。
在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中评价PDL1#10，以评价PDL1#10对T细胞活化的效力。通过由T细胞分泌的白介素-2(IL-2)的浓度来测量T细胞活化。从健康供体的人类外周血单核细胞(PBMC)分离树突细胞(DC)和CD 4+ T细胞。CD4+ T细胞通过CD4+ T细胞分离试剂盒纯化。树突细胞用Pan单核细胞分离试剂盒纯化，并且在FACS测定中进行分析以确定其共刺激分子和MHC II类的表达。确定了DC被刺激，并且观察到其表面标志物CD1a、CD83、CD86和H LA-DR的表达。MLR中(Merck&Co.)对T细胞活化的效力被用作监测测定性能的内部对照。半数最大有效浓度(EC50)值通过GraphPad Prism，用Sigmoidal剂量-应答非线性回归拟合分析。PDL1#10对T细胞活化的EC50值是.104μg/mL，而内部对照/>对T细胞活化的EC50值是.19μg/mL。PDL1#10对T细胞活化的IC50值是0.2nM，而内部对照/>对T细胞活化的IC50值是1.5nM。这证明PDL1#10能够在混合淋巴细胞反应中增加T细胞增殖和IL-2分泌。
使用mAb PDL1#10的HCVR序列和LCVR序列制备了鼠-人类嵌合Fab(下文称为“嵌合Fab”)，并且所述鼠-人类嵌合Fab包含SEQ ID NO:51中列出的重链序列和SEQ ID NO:53中列出的轻链序列。嵌合Fab的重链和轻链分别由SEQ ID NO:52和54中列出的核酸编码。
实施例2
特异性靶向人类PD-L1的人源化Fab的生成
组合的人源化噬菌体展示文库使用mAb PDL1#10的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列来构建。简而言之，选择与PDL1#10具有高序列同一性的人类抗体的框架，并且使用重叠PCR进行组装。该人源化Fab噬菌体展示文库针对PD-L1 Fc融合蛋白进行淘选(panned)。个体输出噬菌体克隆在96深孔板中进行扩增，并且通过针对PD-L1 Fc融合蛋白的ELISA测定扩增的噬菌体。当发现良好百分比的噬菌体克隆与PD-L1蛋白结合时，淘选结束。编码输出噬菌体的Fab片段的DNA被扩增并被插入pFASEBA载体(Genscript)中，用于筛选最佳人源化的抗体克隆。个体Fab克隆在96深孔板中表达并且由大肠杆菌分泌至培养基的粗蛋白通过针对BSA和抗原PD-L1蛋白的ELISA进行测定，以分别用于评价表达和结合活性。筛选了数以千计的人源化克隆，并鉴定了许多具有较低的解离率(off-rate)的克隆，其中具有最高的结合亲和力的14个克隆经历了多循环亲和力测量。使用用于多循环亲和力测量的表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200(GE Healthcare)确定14种纯化的Fab对加His-标签的PD-L1蛋白的结合亲和力。通过捕获法将Fab固定在传感器芯片上。加His-标签的抗原PD-L1蛋白被用作分析物。使用Biacore T200评价软件处理解离(kd)和缔合(ka)速率常数的数据。从kd对ka的比率计算平衡解离常数(KD)。结果描绘在下表4中：
表4
Fab Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
AS01790 5.0E+05 1.7E-04 3.5E-10
AS02013 5.0E+05 2.0E-04 3.8E-10
AS01981 5.2E+05 1.5E-04 2.8E-10
AS01798 5.5E+05 1.9E-04 3.5E-10
AS01814 6.8E+05 1.1E-04 1.6E-10
AS01789 3.3E+05 3.6E-04 1.1E-09
AS01995 4.5E+05 1.7E-04 3.7E-10
AS01979 4.7E+05 1.9E-04 4.0E-10
AS01817 3.4E+05 3.2E-04 9.3E-10
AS01824 6.2E+05 5.4E-04 8.7E-10
AS01807 2.6E+05 3.5E-04 1.4E-09
AS01825 3.6E+05 3.9E-04 1.1E-09
AS02002 3.1E+05 4.2E-04 1.5E-09
AS01978 2.9E+05 4.5E-04 1.6E-09
嵌合Fab 7.3E+05 2.1E-04 2.9E-10
14种人源化Fab的HCVR和LCVR描绘在表5中：
表5
Fab HCVR LCVR
AS01790 SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：21
AS02013 SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23
AS01981 SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25
AS01798 SEQ ID NO：26 SEQ ID NO：27
AS01814 SEQ ID NO：28 SEQ ID NO：29
AS01789 SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：31
AS01995 SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：33
AS01979 SEQ ID NO：34 SEQ ID NO：35
AS01817 SEQ ID NO：36 SEQ ID NO：37
AS01824 SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：39
AS01807 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41
AS01825 SEQ ID NO：42 SEQ ID NO：43
AS02002 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45
AS01978 SEQ ID NO：46 SEQ ID NO：47
实施例3
特异性靶向人类PD-L1的人源化IgG的生成
基于亲和力排序和多循环亲和力排序测量的结果，选择AS01814、AS01981、AS02013、AS01790和AS01798克隆用于全长IgG表达、纯化和亲和力测量。扩增编码AS01814、AS01981、AS02013、AS01790和AS01798的DNA序列(包括前导序列)，并将其插入到pTT5中以制备全长IgG的表达质粒。将重链和轻链表达质粒用于共转染HEK293细胞(100ml细胞培养物)。使用蛋白A亲和色谱纯化分泌至培养基的重组IgG。在非还原条件下的SDS-PAGE中，纯化的IgG作为～170kDa条带迁移，在还原条件下的SDS-PAGE中，纯化的IgG作为～55kDa条带和～30kDa条带迁移。每种人源化克隆的纯度、产量和内毒素水平在下表6中描绘。
表6
/>
使用Biacore T200评价软件处理每种抗体的结合数据并将其拟合至1∶1相互作用模型。所有实验数据可以良好地拟合至模型。如从表7中可以看出的，所有5种人源化抗体(AS01790、AS01798、AS01814、AS01981和AS02013)具有比小鼠-人类嵌合抗体更高的抗原结合亲和力。
表7
IgG Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
AS01790 3.29E+05 2.53E-04 7.69E-10
AS01798 3.58E+05 2.72E-04 7.59E-10
AS01814 3.76E+05 1.73E-04 4.61E-10
AS01981 3.05E+05 1.99E-04 6.53E-10
AS02013 3.67E+05 2.76E-04 7.51E-10
嵌合IgG 3.36E+05 3.38E-04 1.00E-09
5种人源化IgG的HC和LC的氨基酸序列在表8中描绘：
表8
Fab HC LC
AS01790 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：56
AS02013 SEQ ID NO：57 SEQ ID NO：58
AS01981 SEQ ID NO：59 SEQ ID NO：60
AS01798 SEQ ID NO：61 SEQ ID NO：62
AS01814 SEQ ID NO：63 SEQ ID NO：64
实施例4
通过混合淋巴细胞反应评价PD-L1 mAb效力
进行混合淋巴细胞反应(MLR)测定以评价嵌合Fab、AS01790、AS01814和AS01981对T细胞活化的效力。T细胞的活化通过由T细胞分泌的白介素2(IL-2)的浓度测量。树突细胞(DC)和CD 4+ T细胞从人类外周血单核细胞(PBMC)分离。MLR中对T细胞活化的效力被用作监测测定性能的内部对照。通过GraphPad Prism，用激动剂剂量-应答变量斜率(四个参数)拟合分析半数最大有效浓度(EC50)值。嵌合Fab、AS01790、AS01814和AS01981对T细胞活化的EC50值分别是1.048μg/ml、0.174μg/ml、0.089μg/ml和0.106μg/ml。阴性对照，人类IgG4，对T细胞活化不具有任何作用。在所有五个板中来自内部对照(MLR中Keytruda对T细胞的活化)的T细胞活化数据与GenSript的历史数据(.19μg/ml)一致，因此证实了本研究。这证明了人源化PD-L1抗体能够在混合淋巴细胞反应中增加T细胞增殖和IL-2分泌。
本文公开和请求保护的所有的物品和方法鉴于本公开内容均可被制备和执行，无需过度实验。尽管已经根据优选的实施方案描述了本发明的物品和方法，但对本领域技术人员而言将是明显的是，变化形式可以被应用至所述物品和方法而不偏离本发明的精神和范围。对于本领域技术人员明显的所有这类变化形式和等效物，无论是现有的或以后开发的，都被认为是在本发明的精神和范围中，如由所附权利要求限定的。在说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物指示本发明所属领域的普通技术人员的水平。出于所有目的，所有专利、专利申请和出版物通过引用以其全部内容并入本文，并且其程度如同每个单独的出版物具体地并且单独地被指示出于任何和所有目的通过引用以其全部内容并入。本文示例性地描述的本发明可以在本文未具体地公开的任何一个或更多个要素不存在的条件下被合适地实践。因此，应理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选的特征被具体地公开，但是本领域技术人员可以寻求本文所公开的概念的修改和变化形式，并且认为这类修改和变化形式在本发明的如由所附权利要求限定的范围中。
序列表
如在37 C.F.R.1.822中规定的，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码示出了随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:1是人类PD-L1多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是与PD-L1特异性地结合的单克隆抗体中的重链CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3-4是与PD-L1特异性地结合的单克隆抗体中的重链CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5-6是与PD-L1特异性地结合的单克隆抗体中的重链CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7-8是与PD-L1特异性地结合的单克隆抗体中的轻链CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是与PD-L1特异性地结合的单克隆抗体中的轻链CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10-11是与PD-L1特异性地结合的单克隆抗体中的轻链CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12和14是与PD-L1特异性地结合的鼠单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13和15是编码与PD-L1特异性地结合的鼠单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:16和18是与PD-L1特异性地结合的鼠单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17和19是编码与PD-L1特异性地结合的鼠单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46是与PD-L1特异性地结合的人源化单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47是与PD-L1特异性地结合的人源化单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48和49是单克隆抗体的轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50是单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是与PD-L1特异性地结合的鼠-人类嵌合抗体的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52是与PD-L1特异性地结合的鼠-人类嵌合抗体的重链的核酸序列。
SEQ ID NO:53是与PD-L1特异性地结合的鼠-人类嵌合抗体的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54是与PD-L1特异性地结合的鼠-人类嵌合抗体的轻链的核酸序列。
SEQ ID NO:55、57、59、61和63是与PD-L1特异性地结合的人源化单克隆抗体的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56、58、60、62和64是与PD-L1特异性地结合的人源化单克隆抗体的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:65、67、69、71和73是与PD-L1特异性地结合的人源化单克隆抗体的重链的核酸序列。
SEQ ID NO:66、68、70、72和74是与PD-L1特异性地结合的人源化单克隆抗体的轻链的核酸序列。
序列表
SEQ ID NO:1-PD-L1抗原氨基酸序列
SEQ ID NO:2-鼠单克隆抗体重链CDR1氨基酸序列
SYSIN
SEQ ID NO:3-鼠单克隆抗体重链CDR2氨基酸序列
YIYIGNGYTEYNEKFKG
SEQ ID NO:4-鼠单克隆抗体重链CDR2氨基酸序列
YFYVGNGYTDYNEKFKG
SEQ ID NO:5-鼠单克隆抗体重链CDR3氨基酸序列
WSLPNGMDY
SEQ ID NO:6-鼠单克隆抗体重链CDR3氨基酸序列
GGLPYYFDY
SEQ ID NO:7-鼠单克隆抗体轻链CDR1氨基酸序列
KASQDVGISVA
SEQ ID NO:8-鼠单克隆抗体轻链CDR1氨基酸序列
KTSQDVNTAVA
SEQ ID NO:9-鼠单克隆抗体轻链CDR2氨基酸序列
WASTRHT
SEQ ID NO:10-鼠单克隆抗体轻链CDR3氨基酸序列
QQYSTYRT
SEQ ID NO:11-鼠单克隆抗体轻链CDR3氨基酸序列
QQHYNTPLT
SEQ ID NO:12-鼠单克隆抗体重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:13-鼠单克隆重链可变区核酸序列
SEQ ID NO:14-鼠单克隆抗体重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:15-鼠单克隆重链可变区核酸序列
SEQ ID NO:16-鼠单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:17-鼠单克隆轻链可变区核酸序列
SEQ ID NO:18-鼠单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:19-鼠单克隆轻链可变区核酸序列
SEQ ID NO:20-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:21-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:22-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:23-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:24-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:25-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:26-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:27-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:28-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:29-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:30-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:31-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:32-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:33-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:34-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:35-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:36-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:37-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:38-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:39-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:40-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:41-人源化轻链可变区氨基酸序列
/>
SEQ ID NO:42-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:43-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:44-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:45-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:46-人源化重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:47-人源化轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:48-轻链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:49-轻链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:50-重链恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:51-鼠-人类嵌合抗体的重链氨基酸序列
SEQ ID NO:52-鼠-人类嵌合抗体的重链核酸序列
SEQ ID NO:53-鼠-人类嵌合抗体的轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:54-鼠-人类嵌合抗体的轻链核酸序列
SEQ ID NO:55-人源化重链氨基酸序列
SEQ ID NO:56-人源化轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:57-人源化重链氨基酸序列
/>
SEQ ID NO:58-人源化轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:59-人源化重链氨基酸序列
SEQ ID NO:60-人源化轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:61-人源化重链氨基酸序列
SEQ ID NO:62-人源化轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:63-人源化重链氨基酸序列
SEQ ID NO:64-人源化轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:65-人源化重链核酸序列
SEQ ID NO:66-人源化轻链核酸序列
SEQ ID NO:67-人源化重链核酸序列
SEQ ID NO:68-人源化轻链核酸序列
SEQ ID NO:69-人源化重链核酸序列
SEQ ID NO:70-人源化轻链核酸序列
SEQ ID NO:71-人源化重链核酸序列
SEQ ID NO:72-人源化轻链核酸序列
SEQ ID NO:73-人源化重链核酸序列
SEQ ID NO:74–人源化轻链核酸序列
/>
序列表
<110> 瑞美德生物医药科技有限公司
<120> 使用与程序性死亡配体1 (PD-L1)结合的抗体的免疫疗法
<130> CACRE1.0012WO
<160> 74
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
Ser Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 5
Trp Ser Leu Pro Asn Gly Met Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 6
Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 7
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ser Val Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 8
Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 9
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Arg Thr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ser Leu Pro Asn Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 354
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 13
gaggtccagc ttcagcagtc tggagctgaa ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctggata ttcattcaca agttacagta taaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gcctggaatg ggttgcatat atttatattg gaaatggtta tactgaatat 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acttcagaca caccctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggat tctgcaatct atttctgtgc aagatggtca 300
ctacccaatg gaatggacta ctgggggcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 354
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 15
gaggtccagc ttcagcagtc tggagctgaa ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatg 60
tcctgcaaga cttctggata tacattcaca agttacagta taaattgggt gaagcagagg 120
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atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcaatct atttctgtgc acgagggggc 300
ctaccctact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Asn Lys
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<210> 17
<211> 318
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 17
gacattgtga tgacccagtc tcacaaactc atgtccacat caataggaga cagggtcaac 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt atttctgtag cctggtatca acagaaacca 120
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cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagtaa tgtgcagtct 240
gaggacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcacct atcggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaaacaaa 318
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
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<210> 19
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 19
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagttggaga cagggtcagc 60
atcacctgca agaccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120
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gaagacctgg cactttatta ctgtcagcaa cattataaca ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaggc tggagctgaa a 321
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 23
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 24
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ala Ser
115
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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115
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
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20 25 30
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115
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 37
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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100 105
<210> 38
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 39
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 42
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 43
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 44
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链可变区
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链可变区
<400> 47
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 49
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 50
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
20 25 30
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
35 40 45
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
50 55 60
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
85 90 95
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
100 105 110
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
115 120 125
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
130 135 140
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
145 150 155 160
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
165 170 175
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
180 185 190
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
195 200 205
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
210 215 220
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
225 230 235 240
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
245 250 255
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
290 295 300
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 51
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的嵌合抗体的重链
<400> 51
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Ala Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 52
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的嵌合抗体的重链
<400> 52
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgc agcagagcgg ggcagaactg gtgcggcctg ggtcaagcgt gaagatgtca 120
tgtaaaacaa gcggctatac tttcacatcc tactctatca actgggtgaa gcagaggcca 180
ggacagggac tggagtggat cgcctacttc tatgtgggca acggctacac cgactataat 240
gagaagttta agggcaaggc caccctgaca agcgatacaa gctcctctac cgcctatatg 300
cagctgagct ccctgaccag cgaggactcc gccatctact tctgcgcaag gggaggactg 360
ccatactatt ttgattattg gggccagggc accacactga cagtgtctag cgccagcacc 420
aagggaccat ccgtgttccc actggcacca tgcagcagat ccacatctga gagcaccgcc 480
gccctgggat gtctggtgaa ggactacttc cctgagccag tgaccgtgtc ttggaatagc 540
ggcgccctga caagcggagt gcacaccttt cctgccgtgc tgcagtcctc tggcctgtac 600
tccctgagct ccgtggtgac agtgccctct agctccctgg gcaccaagac atatacctgc 660
aacgtggacc acaagccttc taataccaag gtggataaga gggtggagag caagtacgga 720
ccaccttgcc caccatgtcc agcacctgag tttctgggag gaccaagcgt gttcctgttt 780
cctccaaagc ctaaggacac actgatgatc agccgcacac ctgaggtgac ctgcgtggtg 840
gtggacgtgt cccaggagga tccagaggtg cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900
gtgcacaatg ccaagaccaa gcctagggag gagcagttta actctacata ccgcgtggtg 960
agcgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aggagtataa gtgcaaggtg 1020
tctaataagg gcctgccatc tagcatcgag aagacaatct ccaaggcaaa gggacagcct 1080
agggagccac aggtgtacac cctgccccct tcccaggagg agatgacaaa gaaccaggtg 1140
tctctgacct gtctggtgaa gggcttctat ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagtcc 1200
aatggccagc ccgagaacaa ttacaagacc acaccacccg tgctggactc cgatggctct 1260
ttctttctgt attcccggct gaccgtggat aagtctagat ggcaggaggg caacgtgttc 1320
agctgttctg tgatgcacga agcactgcac aaccattaca ctcagaagtc cctgtccctg 1380
tccctgggca aa 1392
<210> 53
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的嵌合抗体的轻链
<400> 53
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val
35 40 45
Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn
100 105 110
Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Leu Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 54
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的嵌合抗体的轻链
<400> 54
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgat 60
atcgtgatga cccagagcca caagtttatg agcaccagcg tcggagacag agtcagtatt 120
acctgcaaaa ccagccagga tgtgaacacc gccgtggcct ggtaccagca gaagccaggc 180
cactctccca agctgctgtt ctattgggca agcaccaggc acacaggagt gccagaccgc 240
tttaccggag gaggatccgg aacagattac accctgacaa tcagctccgt gcaggcagag 300
gacctggccc tgtactattg ccagcagcac tataataccc ctctgacatt cggcgcagga 360
accaggctgg agctgaagag aacagtggcc gccccaagcg tgttcatctt tcccccttcc 420
gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctct gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480
cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggat aacgccctgc agtccggcaa ttctcaggag 540
agcgtgaccg agcaggactc caaggattct acatatagcc tgtctagcac cctgacactg 600
tctaaggccg attacgagaa gcacaaggtg tatgcctgcg aggtcactca ccaggggctg 660
tcttcaccag tcaccaagtc cttcaatcgg ggggaatgc 699
<210> 55
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链 - 19 aa前导序列
<400> 55
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Phe Tyr Val Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 56
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链 - 19 aa前导序列
<400> 56
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Val
35 40 45
Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn
100 105 110
Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
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<220>
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<400> 66
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ccttactatt ttgactactg gggacaggga acactggtga ccgtctcctc tgcctctaca 420
aagggcccct ccgtgtttcc actggctccc tgcagcaggt ctacatccga gagcaccgct 480
gctctgggat gtctggtgaa ggattacttc cctgagccag tgaccgtgag ctggaactcc 540
ggagctctga catccggagt gcacaccttt cctgctgtgc tgcagagctc tggcctgtac 600
agcctgtcca gcgtggtgac agtgccatct tccagcctgg gcaccaagac atatacctgc 660
aacgtggacc ataagcccag caataccaag gtggataaga gagtggagtc taagtacgga 720
ccaccttgcc caccatgtcc agctcctgag tttctgggag gaccatccgt gttcctgttt 780
cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc tctcgcacac ccgaggtgac ctgtgtggtg 840
gtggacgtgt cccaggagga tcctgaggtg cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900
gtgcacaatg ctaagaccaa gcctagggag gagcagttta acagcacata ccgggtggtg 960
tctgtgctga ccgtgctgca tcaggactgg ctgaacggca aggagtataa gtgcaaggtg 1020
agcaataagg gcctgccatc ttccatcgag aagacaatct ctaaggctaa gggacagcct 1080
agggagccac aggtgtacac cctgccccct tcccaggagg agatgacaaa gaaccaggtg 1140
agcctgacct gtctggtgaa gggcttctat ccttctgaca tcgctgtgga gtgggagtcc 1200
aatggccagc cagagaacaa ttacaagacc acaccacccg tgctggactc cgatggcagc 1260
ttctttctgt attccaggct gaccgtggat aagagccggt ggcaggaggg caatgtgttt 1320
tcttgttccg tgatgcacga agcactgcac aaccactaca ctcagaagtc cctgtcactg 1380
tccctgggca ag 1392
<210> 68
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链 - 19 aa前导序列
<400> 68
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgac 60
atccagctga cccagagccc aagtagcctg agcgcaagcg tcggggacag agtgactatt 120
acctgcaaga caagccagga cgtgaacacc gcagtggcat ggtaccagca gaagccagga 180
caggcaccta ggctgctgat ctattgggcc tctacccggc acacaggcgt gccaagcaga 240
ttctctggca gcggctccgg caccgacttt accctgacaa tcagctccct gcagcccgag 300
gatttcgcca catactattg ccagcagcat tacaacactc ctctgacatt cggggggggg 360
acaaaactgg aaatcaaaag gaccgtggcc gctcccagtg tcttcatttt tccccctagc 420
gacgaacagc tgaaatccgg gactgcttct gtggtctgtc tgctgaacaa tttctaccct 480
cgcgaagcca aagtgcagtg gaaggtcgat aacgctctcc agagtggcaa ttcacaggag 540
agcgtgacag aacaggactc caaagattct acttatagtc tgtctagtac actgactctg 600
tccaaggcag actacgagaa gcacaaagtg tatgcctgtg aagtcaccca tcagggcctg 660
tcaagccccg tgacaaagtc ttttaacaga ggggagtgt 699
<210> 69
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链 - 19 aa前导序列
<400> 69
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagccag 60
atgcagctgg tccagtcagg cgcagaagtc aagaaaaccg ggtcaagcgt caaagtgtca 120
tgtaaagcaa gcggatatac cttcacatct tacagcatca actgggtgcg gcaggcacca 180
ggcaagggcc tggagtgggt ggcctacttc tatgtgggca acggctacac cgactataat 240
gagaagttta agggccgggt gaccatgaca agagatacct ccacatctac cgtgtatatg 300
gagctgagct ccctgaggag cgaggacaca gccgtgtact attgcgcccg cggggggctg 360
ccatactact ttgactattg gggacaggga acactggtga ccgtctcatc agcctctaca 420
aagggcccct ccgtgtttcc actggctccc tgcagcaggt ctacatccga gagcaccgct 480
gctctgggat gtctggtgaa ggattacttc cctgagccag tgaccgtgag ctggaactcc 540
ggagctctga catccggagt gcacaccttt cctgctgtgc tgcagagctc tggcctgtac 600
agcctgtcca gcgtggtgac agtgccatct tccagcctgg gcaccaagac atatacctgc 660
aacgtggacc ataagcccag caataccaag gtggataaga gagtggagtc taagtacgga 720
ccaccttgcc caccatgtcc agctcctgag tttctgggag gaccatccgt gttcctgttt 780
cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc tctcgcacac ccgaggtgac ctgtgtggtg 840
gtggacgtgt cccaggagga tcctgaggtg cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900
gtgcacaatg ctaagaccaa gcctagggag gagcagttta acagcacata ccgggtggtg 960
tctgtgctga ccgtgctgca tcaggactgg ctgaacggca aggagtataa gtgcaaggtg 1020
agcaataagg gcctgccatc ttccatcgag aagacaatct ctaaggctaa gggacagcct 1080
agggagccac aggtgtacac cctgccccct tcccaggagg agatgacaaa gaaccaggtg 1140
agcctgacct gtctggtgaa gggcttctat ccttctgaca tcgctgtgga gtgggagtcc 1200
aatggccagc cagagaacaa ttacaagacc acaccacccg tgctggactc cgatggcagc 1260
ttctttctgt attccaggct gaccgtggat aagagccggt ggcaggaggg caatgtgttt 1320
tcttgttccg tgatgcacga agcactgcac aaccactaca ctcagaagtc cctgtcactg 1380
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<210> 70
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的轻链 - 19 aa前导序列
<400> 70
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgac 60
attcagatga cccagtctcc aagctcagtc tcagccagtg tgggcgaccg agtgacaatt 120
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caggcaccta ggctgctgat ctattgggca tctaccaggc acacaggagt gccagacaga 240
ttctctggca gcggctccgg cacagatttt accctgacaa tcagctccct gcaggcagag 300
gacgtggcag tgtactattg ccagcagcat tacaatactc ctctgacatt cgggggcgga 360
accaaactgg aaatcaaaag gaccgtggcc gctcccagtg tcttcatttt tccccctagc 420
gacgaacagc tgaaatccgg gactgcttct gtggtctgtc tgctgaacaa tttctaccct 480
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agcgtgacag aacaggactc caaagattct acttatagtc tgtctagtac actgactctg 600
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tcaagccccg tgacaaagtc ttttaacaga ggggagtgt 699
<210> 71
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 与PD-L1结合的人源化抗体的重链 - 19 aa前导序列
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ccttattatt ttgactattg gggacagggg acactggtga ccgtctcttc agcctctaca 420
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gctctgggat gtctggtgaa ggattacttc cctgagccag tgaccgtgag ctggaactcc 540
ggagctctga catccggagt gcacaccttt cctgctgtgc tgcagagctc tggcctgtac 600
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aacgtggacc ataagcccag caataccaag gtggataaga gagtggagtc taagtacgga 720
ccaccttgcc caccatgtcc agctcctgag tttctgggag gaccatccgt gttcctgttt 780
cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc tctcgcacac ccgaggtgac ctgtgtggtg 840
gtggacgtgt cccaggagga tcctgaggtg cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900
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<220>
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ccaccttgcc caccatgtcc agctcctgag tttctgggag gaccatccgt gttcctgttt 780
cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc tctcgcacac ccgaggtgac ctgtgtggtg 840
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gacttcgccg tgtactattg ccagcagcat tacaatacac cactgacatt cggggggggg 360
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agcgtgacag aacaggactc caaagattct acttatagtc tgtctagtac actgactctg 600
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tcaagccccg tgacaaagtc ttttaacaga ggggagtgt 699

Claims (19)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与人类程序性死亡配体1 (PD-L1)特异性地结合并且包含：SEQ ID NO: 8中列出的轻链CDR1序列、SEQID NO: 9中列出的轻链CDR2序列、SEQ ID NO: 11中列出的轻链CDR3序列、SEQ ID NO: 2中列出的重链CDR1序列、SEQ ID NO: 4中列出的重链CDR2序列和SEQ ID NO: 6中列出的重链CDR3序列。
2.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1特异性地结合并且包含：(a) SEQ ID NO: 8中列出的轻链CDR1序列、SEQ ID NO: 9中列出的轻链CDR2序列、SEQ ID NO: 11中列出的轻链CDR3序列、SEQ ID NO: 2中列出的重链CDR1序列、SEQ ID NO: 4中列出的重链CDR2序列和SEQ ID NO: 6中列出的重链CDR3序列；和(b)来自人类免疫球蛋白的四个可变区框架区的组。
3.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述人类免疫球蛋白是IgG。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段以至少1×10-6 M的解离常数(KD)与PD-L1蛋白结合。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段以至少1×10-7 M的解离常数(KD)与PD-L1蛋白结合。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段以至少1×10-8 M的解离常数(KD)与PD-L1蛋白结合。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段以至少1×10-9 M的解离常数(KD)与PD-L1蛋白结合。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段以至少1.6×10-10 M的解离常数(KD)与PD-L1蛋白结合。
9.一种分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1特异性地结合并且包含：
与SEQ ID NO: 20相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 21相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 22相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 23相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 24相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 25相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 26相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 27相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 28相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 29相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 30相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 31相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 32相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 33相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 34相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 35相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 36相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 37相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 38相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 39相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 40相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 41相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 42相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 43相同的轻链可变区序列；
与SEQ ID NO: 44相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 45相同的轻链可变区序列；或者
与SEQ ID NO: 46相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 47相同的轻链可变区序列。
10.一种分离的人源化抗体或其抗原结合片段，所述分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人类PD-L1特异性地结合并且包含：
SEQ ID NO: 55中列出的重链序列和SEQ ID NO: 56中列出的轻链序列；
SEQ ID NO: 57中列出的重链序列和SEQ ID NO: 58中列出的轻链序列；
SEQ ID NO: 59中列出的重链序列和SEQ ID NO: 60中列出的轻链序列；
SEQ ID NO: 61中列出的重链序列和SEQ ID NO: 62中列出的轻链序列；或者
SEQ ID NO: 63中列出的重链序列和SEQ ID NO: 64中列出的轻链序列。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的根据权利要求1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗实体肿瘤的药物组合物中的用途，其中所述实体肿瘤由PD-L1介导。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗实体肿瘤的药物组合物中的用途，其中所述实体肿瘤由PD-L1介导，其中所述治疗还包括一种或更多种另外的疗法，所述一种或更多种另外的疗法选自由小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法、疫苗接种方案和干细胞移植组成的组，并且其中当被共施用时，所述分离的抗体或抗原结合片段和所述另外的疗法之间存在协同作用。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗实体肿瘤的药物组合物中的用途，其中所述实体肿瘤由PD-L1介导，其中所述治疗还包括免疫疗法，并且其中当被共施用时，所述分离的抗体或抗原结合片段和所述免疫疗法之间存在协同作用。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗实体肿瘤的药物组合物中的用途，其中所述实体肿瘤由PD-L1介导，其中所述治疗还包括化学疗法，并且其中当被共施用时，所述分离的抗体或抗原结合片段和所述化学疗法之间存在协同作用。
16.一种分离的免疫缀合物或融合蛋白，所述分离的免疫缀合物或融合蛋白包含与效应物分子偶联的根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
17.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含编码根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。
18.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含根据权利要求17所述的分离的核酸。
19.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求18所述的载体。
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