CN113683695A - 抗cxcr4抗体及抗体-药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合趋化因子受体4(CXCR4)的抗体及相关分子。本发明进一步提供包含此类抗体的抗体‑药物缀合物、编码抗体的核酸及获得此类抗体的方法。本发明进一步涉及使用这些抗体及抗CXCR4抗体‑药物缀合物的治疗方法，其用于治疗与CXCR4功能或表达相关的病症(例如癌症)，诸如结肠癌、RCC、食管癌、胃癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或血液癌症。

Description

抗CXCR4抗体及抗体-药物缀合物
本申请为申请日为2014年7月28日、申请号为201480043780.6、发明名称为“抗CXCR4抗体及抗体-药物缀合物”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及结合趋化因子受体4(CXCR4)的抗体及相关分子。本发明还涉及包含全长抗体、抗体片段或其变异体或者由其组成的分子。本发明进一步涉及编码此类抗体的氨基酸及核酸序列。本发明还涉及包含抗CXCR4抗体的抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物)、包含抗CXCR4抗体的组合物及使用抗CXCR4抗体及其缀合物治疗与CXCR4表达相关的病状(例如癌症)的方法。本发明进一步包含所述抗体、其抗原结合片段或抗体-药物缀合物及相应方法用于检测及诊断与CXCR4表达相关的病理学病症的用途。在某些方面中，病症为与CXCR4表达相对于正常增加相关的致癌病症或任何其他与CXCR4过度表达有关的病理学。在其他方面中，病症为炎症及免疫病症、过敏性病症、感染(HIV感染等)、自身免疫病症(例如类风湿性关节炎)、纤维化病症(例如肺)及心血管病症。本发明最终包含含有至少此类抗体或抗体-药物缀合物的产品和/或组合物或试剂盒，其用于此类病症的预后或诊断或治疗监测。
背景技术
趋化因子为小的分泌肽，其尤其在免疫反应期间控制白细胞沿配体的化学梯度(称为趋化因子梯度)迁移(Zlotnik等人,2000,Immunity,12:121-127)。根据Cys残基在N末端的位置，其分成四个类别。CXC类别由一对Cys由单个残基分开的趋化因子组成。此类别的最突出成员为白介素-8(IL-8、CXCL8)、基质细胞衍生因子-1(SDF-I、CXCL12)、γ-干扰素诱导性蛋白-10(IP-10、CXCL10)、血小板因子-4(PF-4、CXCL4)、嗜中性粒细胞活化蛋白-2(NAP-2、CXCL7)及黑色素瘤生长刺激活性(MGSA、CXCLl)。趋化因子的CC类别在N末端具有两个相邻Cys且包括巨噬细胞炎症蛋白质-1(MIP-lα、CCL3；MIP-ljSa、CCL4)、经活化调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES、CCL5)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1、CCL2)。CX3C类别的趋化因子在N末端含有两个由三个残基分开的Cys，其代表是不规则趋化因子(fractalkine)/神经元趋化因子(neurotactin)(CX3CL1)。C类别趋化因子在N末端含有单个Cys，其代表是淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)/ATAC/SCM(CLl)。趋化因子受体根据其与趋化因子结合的选择性来分组。例如，CXCR4结合SDF-1，而CXCR5结合吸引B细胞的趋化因子1(BCAl)。CXCR4与SDF-1的相互作用在肿瘤形成的多个阶段，包括肿瘤生长、侵入、血管生成及癌转移中发挥重要作用。
CXCR4为七次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)(Herzog等人DNA Cell Biol.12:465(1993)；Rimland等人Mol.Pharmacol.40:869(1991)；WO03014153、WO02061087)。许多医学上重要的生物过程由涉及G蛋白的信号转导通路介导(Lefkowitz,Nature,351:353-354,(1991))。G蛋白偶联受体(GPCR)为含有7个推定跨膜结构域(TM)的完整膜蛋白。这些蛋白质经由异源三聚体G蛋白的活化将信号介导至细胞内部，继而活化各种效应蛋白，最终产生生理反应。
CXCR4在胚胎发生、内稳态及炎症中发挥作用。此外，CXCR4经证实充当T亲淋巴性HIV-I分离株的共同受体(Feng,Y.等人Science 272:872(1996))。CXCR4还在人类癌症中发挥多效性作用。其表达在许多肿瘤类型中上调，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、卵巢癌以及造血性癌症。一些文献报导表明，SDF-1可经由CXCR4，作为一些肿瘤的生长和/或存活因子。CXCR4在许多肿瘤的干细胞样或肿瘤起始亚群上表达，且可介导这些细胞支持癌症复发及转移性扩散的能力。此外，CXCR4在内皮前体细胞(EPC)上表达，且其活性为血管生成期间EPC进入功能血管中所需的。这可显著地促进血管形成及肿瘤存活。CXCR4信号传导还可诱导促血管生成细胞因子(例如VEGF)，以及可介导肿瘤细胞侵入的整合素、粘附分子及基质降解酶。此外，在肿瘤浸润的淋巴细胞及纤维母细胞以及肿瘤相关的巨噬细胞上检测到CXCR4表达。这些细胞倾向于抑制肿瘤上的免疫识别及攻击，并重塑肿瘤微环境以促进肿瘤生长及转移。
CXCR4在肿瘤生长及转移中的多重作用及其在许多常见肿瘤类型中的广泛表达使得此受体成为使用抑制剂进行治疗性干预的有吸引力的靶标。虽然CXCR4的肽及小分子抑制剂及抗CXCR抗体已鉴别或进入临床，但其效用受药物动力学特性及毒理学限制。诸如抗体或抗体-药物缀合物的具有选择性、半衰期长、功效及安全性能提高的药剂将是用于癌症治疗的合乎需要的药剂。
虽然有各种靶向CXCR4的药剂处在开发中，但对功效及安全性能提高且适用于人类患者的靶向CXCR4的其他治疗剂(诸如抗体或抗体-药物缀合物)存在需要。本发明的抗体及抗体-药物缀合物为治疗学上适用的抗CXCR4抗体，其具有多种合乎需要的特性，诸如减少肿瘤形成、肿瘤生长、血管生成及转移。此外，本发明的抗体及抗体-药物缀合物诱导肿瘤细胞的细胞凋亡。
发明内容
本发明提供结合趋化因子受体4(CXCR4)的分离的抗体、其抗原结合片段及衍生物以及抗体-药物缀合物。本发明包括抗体的可变重链及轻链的氨基酸序列及其对应核酸序列。
在一个方面中，本发明包括抗体的互补决定区(CDR)序列以获得包含一或多个CDR区域或CDR衍生区域的结合分子，所述结合分子保留获得CDR的母体分子的CXCR4结合能力。
在另一方面中，本发明提供包含本文所揭示的抗CXCR4抗体的抗体-药物缀合物。
在另一方面中，本发明包含抗CXCR4抗体、其抗原结合片段及抗体-药物缀合物及相应方法用于检测及诊断与CXCR4表达或功能相关的病症的用途。在一个方面中，所述病症为与CXCR4表达相对于正常增加相关的癌症或任何其他与CXCR4过度表达有关的病理学。
在另一方面中，本发明包含含有至少此类抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物的产品和/或组合物或试剂盒，其用于某些癌症的预后或诊断或治疗监测。
在一个方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合趋化因子受体4(CXCR4)且包含：a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：(i)VH CDR1，所述VHCDR1选自SEQ ID NO:107、113、114、108、109、115、116、117、121及122，(ii)VH CDR2，所述VHCDR2选自SEQ ID NO:162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130，及(iii)VH CDR3，所述VH CDR3选自SEQ ID NO:112及120；和/或b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含：(i)VL CDR1，所述VL CDR1选自SEQ ID NO:144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151，(ii)VL CDR2，所述VL CDR2选自145、132、136及152，及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3选自SEQ ID NO:139、133、137、140及153。
在另一方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合趋化因子受体4(CXCR4)且包含：a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含选自以下的互补决定区：(i)VH CDR1，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:107、113、114、108、109、115、116、117、121或122所示的序列；(ii)VH CDR2，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156或130所示的序列；及(iii)VH CDR3，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:112或120所示的序列；和/或b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含选自以下的互补决定区：(i)VL CDR1，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150或151所示的序列；(ii)VL CDR2，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:145、132、136或152所示的序列；及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:139、133、137、140或153所示的序列。
在另一方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合趋化因子受体4(CXCR4)且包含：a)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含：(i)VL CDR1，所述VLCDR1包含序列X1SX2X3SLFNSX4X5RKNYLX6，其中X1为R或K；X2为S或A；X3为W、N或Q；X4为H或R；X5为T或F，和/或X6为A、L、N或M(SEQ ID NO:151)；(ii)VL CDR2，所述VL CDR2包含序列WASARX1S，其中X1为G或E(SEQ ID NO:152)，及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3包含序列KQSFX1LRT，其中X1为N或R(SEQ ID NO:153)；和/或b)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：(i)VH CDR1，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:107、108、109、113或114所示的序列；(ii)VH CDR2，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:157所示的序列，及(iii)VH CDR3，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:112所示的序列。
在一个方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合CXCR4且包含：重链可变(VH)区序列，所述重链可变(VH)区序列包含：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVX1FIRHKX2NX3X4TX5E YSTX6X7X8GRFTISRDX9SKNX10LYLQMNSLX11 X12EDTAVYYCAX13DLPGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:106)，其中X1为G或S；X2为V或A；X3为G、F、K、V、T、L或I；X4为E或Y；X5为T或R；X6为W或S；X7为D或V；X8为K、T或R；X9为D或N；X10为T或S；X11为R或K；X12为A或T，和/或X13为K或R。
在一个方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合趋化因子受体4(CXCR4)，其选自：a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ ID NO:107、113或114的VH CDR1、SEQ ID NO:162或128的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，及轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；b)VH区，所述VH区具有SEQ ID NO:115、116、117、121或122的VHCDR1、SEQ ID NO:118或119的VH CDR2及SEQ ID NO:120的VH CDR3，及VL区，所述VL区具有SEQ ID NO:135的VL CDR1、SEQ ID NO:136的VL CDR2及SEQ ID NO:137的VL CDR3；c)VH区，所述VH区具有SEQ ID NO:107、108、109、113或114的VH CDR1、SEQ ID NO:110或111的VHCDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，及VL区，所述VL区具有SEQ ID NO:131的VL CDR1、SEQ IDNO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:133的VL CDR3；d)VH区，所述VH区具有SEQ ID NO:107、108、109、113或114的VH CDR1、SEQ ID NO:154或123的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，及VL区，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；及e)VH区，所述VH区具有SEQ ID NO:107、108、109、113或114的VH CDR1、SEQ IDNO:157的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，及VL区，所述VL区具有SEQ ID NO:151的VLCDR1、SEQ ID NO:152的VL CDR2及SEQ ID NO:153的VL CDR3。
在一个方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其选自：a)重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ IDNO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；b)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:115的VH CDR1、SEQ ID NO:118的VH CDR2及SEQ ID NO:120的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:135的VL CDR1、SEQ ID NO:136的VL CDR2及SEQ ID NO:137的VLCDR3；c)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:110的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:131的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VLCDR2及SEQ ID NO:133的VL CDR3；d)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:154的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；及e)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:157的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:151的VL CDR1、SEQ ID NO:152的VL CDR2及SEQ ID NO:153的VLCDR3。
在一个方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其选自：a)重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ IDNO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；b)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VLCDR3；c)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:150的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VLCDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；d)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:141的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；e)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；f)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:147的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；g)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:159的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；h)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:160的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；i)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:161的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；j)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；k)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；l)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:164的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；m)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:165的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；o)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:166的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；p)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:167的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；q)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:168的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；r)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:168的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；s)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；t)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VLCDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；u)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；v)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；及w)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VLCDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3。
在本发明的特定方面中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR。在一些方面中，抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR。在一些方面中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR。
在本发明的一些方面中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含来自SEQ ID NO:33的VH区的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。在其他方面中，抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含来自SEQ ID NO:73的VL区的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含来自SEQ ID NO:33的VH区的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，所述轻链可变(VL)区包含来自SEQ ID NO:73的VL区的VL CDR1、VL CDR2及VLCDR3。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段选自：a)包含SEQ ID NO:33的VH区及SEQ ID NO:73的VL区的抗体或其抗原结合片段；b)包含SEQ ID NO:13的VH区及SEQ ID NO:15的VL区的抗体或其抗原结合片段；c)包含SEQ ID NO:5的VH区及SEQ ID NO:7的VL区的抗体或其抗原结合片段；d)包含SEQ ID NO:21的VH区及SEQ ID NO:47的VL区的抗体或其抗原结合片段；及e)包含SEQ ID NO:106的VH区，及具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3的VL区的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原片段包含重链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:33至少95％相同的氨基酸序列，及轻链可变区，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:73至少95％相同的氨基酸序列。
在本发明的特定方面中，抗体或其抗原结合片段包含：a)SEQ ID NO:33的重链可变(VH)区；和/或b)SEQ ID NO:73的轻链可变(VL)区。
在本发明的一些方面中，抗体或抗原结合片段包含由具有ATCC登录号PTA-121353的表达载体产生的重链可变(VH)区。在本发明的一些方面中，抗体或抗原结合片段包含由具有ATCC登录号PTA-121354的表达载体产生的轻链可变(VL)区。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段选自：
a)重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；
b)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VHCDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；c)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VHCDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:150的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；d)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:141的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VLCDR3；e)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VLCDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；f)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:147的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；g)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:159的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；h)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:160的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；i)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:161的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；j)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；k)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；l)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:164的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；m)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:165的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；n)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:166的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；o)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:167的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；p)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:168的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；q)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:168的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；r)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VLCDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；s)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；t)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；u)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VLCDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；及v)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VLCDR3。
在本发明的一些方面中，一种结合CXCR4的分离的抗体或其抗原结合片段与本文所揭示的抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4和/或与本文所揭示的抗体或其抗原结合片段结合相同的CXCR4的表位。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VLCDR3。
在本发明的一些方面中，抗体或其抗原结合片段为人源化、嵌合、CDR移植或重组人抗体。在本发明的其他方面中，抗体或其抗原结合片段未犬科化或猫科化。
在本发明的一些方面中，抗体或其抗原结合片段包含在特定位点经改造的含有酰基供体谷氨酰胺的标签。
在本发明的一些方面中，提供抗CXCR4抗体-药物缀合物。本发明的抗体-药物缀合物一般具有公式：Ab-(T-L-D)，其中：Ab为结合趋化因子受体4(CXCR4)的抗体或其抗原结合片段；T为可任选包括的含有酰基供体谷氨酰胺的标签；L为接头；且D为药物。
在特定方面中，本发明的抗体药物缀合物选自：a)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、162及112的CDR，所述VL区含有SEQ ID NO:144、145及139的CDR；b)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:115、118及120的CDR，所述VL区含有SEQ ID NO:135、136及137的CDR；c)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、110及112的CDR，所述VL区含有SEQID NO:131、132及133的CDR；d)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、154及112的CDR，所述VH区含有SEQ ID NO:138、132及139的CDR；e)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、157及112的CDR，所述VH区含有SEQ ID NO:151、152及153的CDR；f)包含SEQ ID NO:33的VH区及SEQ ID NO:73的VL区的抗体或其抗原结合片段；g)包含SEQ ID NO:13的VH区及SEQ ID NO:15的VL区的抗体或其抗原结合片段；h)包含SEQ ID NO:5的VH区及SEQ ID NO:7的VL区的抗体或其抗原结合片段；及i)包含SEQ ID NO:21的VH区及SEQ ID NO:47的VL区的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些抗体-药物缀合物中，Ab为人源化、嵌合、CDR移植或重组人抗体或其抗原结合片段。在本发明的一些抗体-药物缀合物中，T选自SEQ ID NO:171、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、172、173、102、103及LLQ。在本发明的一些抗体-药物缀合物中，L选自乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC)、氨基PEG6-丙酰基、马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(vc)及马来酰亚胺己酸基(mc)。在本发明的一些抗体-药物缀合物中，D选自细胞毒性剂、免疫调节剂、显像剂、治疗蛋白质、生物聚合物及寡核苷酸。
本发明的任何抗体-药物缀合物可用作为细胞毒性剂的药物制备。细胞毒性剂可为蒽环霉素(anthracycline)、奥瑞他汀(auristatin)、喜树碱(camptothecin)、考布他汀(combretastain)、多拉司他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、烯二炔(enediyne)、格尔德霉素(geldanamycin)、引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体(indolino-benzodiazepine dimer)、美登素(maytansine)、嘌呤霉素(puromycin)、吡咯并苯二氮杂卓二聚体(pyrrolobenzodiazepine dimer)、紫杉烷(taxane)、长春花生物碱(vincaalkaloid)、特吡莱辛(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)、斯考他汀(spliceostatin)、普拉地内酯(pladienolide)及卡奇霉素(calicheamicin)。本发明的任何抗体-药物缀合物均可用药物奥瑞他汀制备。在一个方面中，奥瑞他汀可为0101(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)、MMAD(单甲基奥瑞他汀D或单甲基多拉司他汀10及8261(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。
在特定方面中，本发明的抗体-药物缀合物选自：a)Ab-LLQGA(SEQ ID NO:91)-(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC))-0101；Ab-LLQGA(SEQ IDNO:91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；c)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO:102)-(AcLys-VC-PABC)-0101；d)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO:102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；e)Ab-GGLLQGA(SEQ IDNO:92)-(AcLys-VC-PABC)-0101；及f)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO:92)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD。
在本发明的一些方面中，CXCR4抗体-药物缀合物包含任何本文所揭示的抗体或其抗原结合片段。在本发明的一特定方面中，本发明的抗体-药物缀合物包含抗体，其中所述抗体包含VH区及VL区，所述VH区含有SEQ ID NO:107、162及112的CDR，所述VL区含有SEQ IDNO:144、145及139的CDR。
进一步提供药物组合物，其包含本文所揭示的CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗体-药物缀合物及药物学可接受的载体。
在本发明的一些方面中，提供分离的多核苷酸，其包含编码任何本文所揭示的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。在一些方面中，提供重组产生本文所揭示的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。
在其他方面中，提供治疗对象中与CXCR4功能或表达相关的病症的方法，其包含向所述对象施用有效量的本发明的药物组合物。在本发明的特定方面中，病症为癌症。
在其他方面中，提供减少对象中表达CXCR4的癌细胞转移的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的本文所揭示的药物组合物。在其他方面中，提供诱导具有表达CXCR4的肿瘤的对象中肿瘤消退的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的本文所揭示的药物组合物。
本发明的这些及其他方面将通过整体上本申请的评述来了解。
附图简要说明
图1展示h3G10重链可变区(VH)比对。
图2展示h3G10轻链可变区(VL)比对。
图3A展示抗人CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B与猕猴CXCR4的交叉反应性，其通过流式细胞术，在HPB-ALL(人类T细胞白血病)及经猕猴-CXCR4转染的CHO细胞上进行逐级稀释(0.007-267nM)进行。
图3B展示抗人CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B与猕猴CXCR4的交叉反应性，其通过流式细胞术，在Raji(NHL；人类非霍奇金淋巴瘤(Human non-Hodgkin Lymphoma))及HSC-F(猕猴T细胞系)上进行逐级稀释(0.007-267nM)进行。
图4展示抗人CXCR4抗体对表达CXCR4的人类细胞系的ADCC(A-C)及CDC(D-F)活性。
图4A展示12A11、6B6及3G10抗人CXCR4抗体对Ramos(NHL)细胞的ADCC活性。
图4B展示m3G10-hIgG1及m3G10-hIgG4抗人CXCR4抗体对MOLT-4(T急性淋巴母细胞白血病)细胞的ADCC活性的比较。
图4C展示小鼠(m3G10-)及人源化(h3G10-)抗人CXCR4抗体对MOLT-4(T急性淋巴母细胞白血病)细胞的ADCC活性。
图4D展示12A11、6B6及3G10抗人CXCR4抗体对Ramos(NHL)细胞的CDC活性。
图4E展示m3G10-hIgG1及m3G10-hIgG4抗人CXCR4抗体对Daudi(NHL)细胞的CDC活性的比较。
图4F展示小鼠(m3G10-)及人源化(h3G10-)抗人CXCR4抗体对Daudi(NHL)细胞的CDC活性。
图5展示3G10、6B6及12A11抗人CXCR4抗体对钙流动的抑制。
图6A展示3G10、6B6及12A11抗人CXCR4抗体能够在Ramos细胞中以剂量依赖性方式诱导细胞死亡。
图6B展示抗人CXCR4抗体3G10诱导细胞死亡的能力是二价依赖性的。
图7展示在非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)模型(Ramos)中，与同型对照抗体相比，NHL3G10、6B6及12A11抗人CXCR4抗体显著抑制肿瘤生长。
图8A展示与同型对照抗体相比，抗人CXCR4抗体3G10、6B6及12A11对全身性植入Raji-LUC细胞的动物的肿瘤负荷具有显著作用。
图8B展示在此模型中，相对于同型对照抗体，用抗人CXCR4抗体3G10、6B6及12A11处理具有相当及显著的肿瘤生长抑制(TGI)活性。
图8C为存活曲线，其展示与同型对照抗体相比，抗人CXCR4抗体3G10、6B6及12A11在全身性植入Raji-LUC细胞的动物的存活中的显著作用。
图9A展示在急性骨髓白血病(AML)模型(MV4-11-LUC)中CXCR4 Ab 6B6对肿瘤负荷的作用。展示第20天至第41天每个处理组5只动物的代表性生物发光成像。
图9B展示与同型对照抗体相比，抗CXCR4抗体6B6在全身性植入MV4-11-LUC AML细胞的动物的存活中的显著作用。
图9C展示在研究第35天，与同型对照处理的动物相比，在用抗CXCR4 6B6抗体处理的动物的周边血液(PB)中人类AML肿瘤负荷显著降低。
图10A展示在用CXCR4 3G10抗体处理的具有全身性慢性淋巴细胞性白血病肿瘤的小鼠中的代表性萤光素酶成像。
图10B为存活曲线，其展示与同型对照抗体相比，抗人CXCR4抗体3G10在全身性植入慢性淋巴细胞性白血病细胞的动物的存活中的显著作用。
图11展示与同型对照抗体相比，在非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)模型(Ramos)中，人源化抗人CXCR4抗体显著抑制肿瘤生长。
图12A展示在多发性骨髓瘤(MM)模型(OPM-2-LUC)中CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B对肿瘤负荷的作用。展示第8天至第30天每个处理组5只动物的代表性生物发光成像。
图12B展示与用同型对照抗体及美法仑(Melphalan)处理的动物相比，在用抗人CXCR4抗体h3G10.1.91.A58B处理的小鼠全身性多发性骨髓瘤(MM)模型中生物发光(萤光素酶活性)的定量。
图12C为存活曲线，其展示与同型对照抗体及美法仑相比，抗CXCR4抗体h3G10.1.91.A58B在全身性植入OPM-2-Luc MM细胞的小鼠中的显著作用。
图13A展示CXCR4 ADC 3G10-TG6-vc0101及6B6-TG6-vc0101在Ramos(NHL)肿瘤模型中的显著抗肿瘤作用。
图13B展示CXCR4 ADC 3G10-TG6-vc0101在HPB-ALL(T-ALL)肿瘤模型中的显著抗肿瘤作用。
具体实施方式
本文所揭示的本发明提供结合CXCR4(例如人CXCR4)的抗体及抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物)。本发明还提供编码这些抗体的多核苷酸、包含这些抗体的组合物，及制备和使用这些抗体的方法。在某些方面中，本发明的抗体来源于特定重链及轻链生殖系序列和/或包含特定结构特征，诸如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备此类抗体、其抗原结合片段、抗体-药物缀合物及包含此类抗体的双特异性分子的方法和含有本发明的抗体、其抗原结合片段、抗体-药物缀合物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用抗体例如以检测CXCR4、调节CXCR4活性和/或用于靶向表达CXCR4的细胞以在与CXCR4功能或表达相关的病症(诸如癌症)中进行破坏(例如ADCC、CDC、毒素)的方法。本发明还提供用于预防性和/或治疗性治疗对象中与CXCR4功能或表达相关的病症，诸如癌症(例如实体肿瘤癌症或血液癌症)的方法。最终，本发明包含组合物，所述组合物含有此类抗体，所述抗体与其他抗癌化合物(诸如抗体、毒素、细胞毒素/细胞生长抑制剂)缀合(例如抗体-药物缀合物)或组合，以及所述组合物用于预防和/或治疗与CXCR4功能或表达相关的病症，诸如癌症的用途。
一般技术
除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域中的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术。这些技术在诸如以下的文献中充分解释：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)ColdSpring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods inMolecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell编辑,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(AcademicPress,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,1987)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd及C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；及The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)。
定义及缩写
如本文所用的术语“趋化因子(C-X-C基序)受体4”及“CXCR4”是指G蛋白偶联的7次跨膜结构域趋化因子受体，其通常嵌入细胞膜内。所述术语还包括变体、同种型、同源物、直系同源物及旁系同源物。人CXCR4的核酸及多肽序列分别以GenBank登录号NM_003467及NP_003458公开。人CXCR4的进一步描述可见于Federsppiel,B.等人Genomics 16(3):707-712(1993)；Herzog,H.等人DNA Cell Biol.12(6):465-471(1993)；Jazin,E.E.等人Regul.Pept 47(3):247-258(1993)；Nomura,H.等人Int.Immunol.5(10):1239-1249(1993)；Loetscher,M.等人J.Biol.Chem.269(1):232-237(1994)；Moriuchi,M.等人J.Immunol.159(9):4322-4329(1997)；Caruz,A.等人FEBS Lett.426(2):271-278(1998)；及Wegner,S.A.等人J.Biol.Chem.273(8):4754-4760(1998)中。
CXCR4在本领域中还称为例如LESTR、CD 184、CD184抗原、C-X-C趋化因子受体类型4、CXCR-4、CXCL-12、CXCR-R4、D2S201E、FB22、融合物、Fusin、HM89、HSY3RR、LAP3、LCR1、白细胞衍生七次跨膜结构域受体、NPY3R、NPYR、NPYRL、NPYY3R、SDF-1受体或基质细胞衍生因子1受体。
出于本发明的目的，术语“CXCR4抗原”涵盖任何CXCR4，包括人CXCR4、另一哺乳动物的CXCR4(诸如小鼠CXCR4、大鼠CXCR4、犬科CXCR4、猫科CXCR4蛋白质或灵长类动物CXCR4)以及CXCR4的不同形式(例如糖基化CXCR4)。
如本文所用的术语“抗体”及“Ab”是指一种免疫球蛋白分子，其能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点，识别及结合诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特定靶标或抗原。如本文所用，术语“抗体”可涵盖任何类型的抗体，包括(但不限于)单克隆抗体、多克隆抗体及保留特异性结合既定抗原(例如CXCR4)的能力的完整抗体的抗原结合片段、双特异性抗体、异缀合(heteroconjugate)抗体、其突变体、具有抗体的融合蛋白、单链(ScFv)及单域抗体(例如鲨鱼及骆驼抗体)、最大抗体、微型抗体、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、v-NAR及双-scFv(参见例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology 23(9):1126-1136)、人源化抗体、嵌合抗体及包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。所述抗体可为鼠类、大鼠、人类或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在本发明的一些方面中，用于本发明的方法中的抗体或其抗原结合片段为嵌合、人源化或重组人抗体或其CXCR4结合片段。
免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些类别中数个类别可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ及μ。免疫球蛋白的不同类别的次单元结构及三维构型是熟知的。
原生或天然存在的抗体通常为约150,000道尔顿(dalton)的异源四聚体，由两条相同的轻(L)链及两条相同的重(H)链构成。各轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链间，二硫键的数目不同。各重链及轻链还具有有规律间隔的链内二硫桥。各重链在一端具有可变域(VH)，其后为大量恒定域。各轻链在一端具有可变域(VL)且在另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准且轻链可变域与重链的可变域对准。特定氨基酸残基据信在轻链可变域与重链可变域之间形成界面。术语“可变”是指抗体间可变域的某些部分的序列广泛不同。
如本文所用的术语“抗原结合片段”、“抗原结合部分”及“抗体部分”是指保留结合既定抗原(例如CXCR4)能力的完整抗体的一或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体的片段执行。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、由VH及CH1结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段。单域抗体(dAb)片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989)、分离的互补决定区(CDR)、纳米抗体及含有单一可变域及两个恒定域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)由独立基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头连接，所述接头能够使其制造成VL与VH区成对以形成单价分子的单蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,Science 242:423-426(1988)，及Huston等人,PNAS 85:5879-5883(1988))。所述单链抗体还意欲涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，且以与完整抗体相同的方式就效用对所述片段进行筛选。
如本文所用的术语“CDR”是指抗体可变域中赋予其结合特异性的区域。抗体每一重链及轻链上存在3个CDR。可变区内构成CDR的氨基酸残基可使用本领域中已知的方法鉴别，所述方法包括(但不限于)Kabat(Kabat等人,1992,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,NIH,Washington D.C.)、Chothia(Chothia等人,1989,Nature 342:877-883)、Kabat与Chothia的累积、AbM定义(其为Kabat与Chothia之间的折中方案且使用Oxford Molecular's AbM抗体建模软件(now
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)产生)、接触定义(MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745)和/或构形定义(Makabe等人,2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166)。如本文所用，CDR可指由本领域中已知的任何方法，包括方法的组合所界定的CDR。本文所用的方法可利用根据任何这些方法界定的CDR。
如本文所用的术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区。“Fc区”可为天然序列Fc区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但人类IgG重链Fc区通常定义为自位置Cys226或自Pro230处的氨基酸残基伸展至其羧基末端。Fc区中的残基编号为Kabat的EU索引的编号(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”及“mAb”是指获自实质上均质的抗体群体的抗体，即构成所述群体的各个抗体除可能天然存在的可少量存在的突变外均相同。单克隆抗体针对单一抗原位点具高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每一单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”指抗体自实质上均质的抗体群体获得的特征，且不应理解为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如，根据本发明欲使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler及Milstein,1975,Nature,256:495所述的杂交瘤方法来制得，或可通过诸如美国专利第4,816,567号中所述的重组DNA方法制得。单克隆抗体还可从使用例如McCafferty等人,1990,Nature,348:552-554中所述的技术产生的噬菌体文库分离。
如本文中所用的术语“分离的抗体”是指实质上不含其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如特异性结合CXCR4的分离的抗体实质上不含特异性结合除CXCR4以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CXCR4的分离的抗体可对诸如来自其他物种的CXCR4分子的其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可实质上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用的术语“人源化抗体”及“CDR移植抗体”是指作为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)的非人类(例如鼠类)抗体的形式。人源化抗体优选为人类免疫球蛋白(受者抗体)，其中所述受者的互补决定区(CDR)的残基经具有所需特异性、亲和力及能力的非人类物种(诸如小鼠、大鼠或兔)抗体(供者抗体)的CDR的残基置换。
在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基经对应非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含既未在受者抗体中也未在引入CDR或框架序列中发现，但被包括以进一步改善及优化抗体效能的残基。一般而言，人源化抗体将包含实质上全部的至少一个、通常两个可变域，其中全部或实质上全部CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区且全部或实质上全部FR区为人类免疫球蛋白共同序列的FR区。人源化抗体最好还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或域(Fc)、通常为人类免疫球蛋白的恒定区或域。优选为具有如WO 99/58572中所描述经修饰的Fc区的抗体。人源化抗体的其他形式具有一或多个相对于原始抗体改变的CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，还称为一或多个“来源于”来自原始抗体的一或多个CDR的CDR。
人源化可基本上遵循Winter及同事的方法(Jones等人Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人Science 239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物或突变啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来进行。还参见美国专利第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、第5,859,205号，其以引用的方式并入本文中。在一些情况下，人类免疫球蛋白的一或多个可变区的框架区中的残基经对应非人类残基替换(参见例如美国专利第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号及第6,180,370号)。此外，人源化抗体可包含受者抗体或供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步提高抗体效能(例如以获得所需亲和力)。一般而言，人源化抗体将包含实质上全部的至少一个、通常两个可变域，其中全部或实质上全部高变区对应于非人类免疫球蛋白的高变区且全部或实质上全部框架区为人类免疫球蛋白序列的框架区。人源化抗体任选还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人类免疫球蛋白的恒定区。涉及进一步细节参见Jones等人Nature 331:522-525(1986)；Riechmann等人Nature 332:323-329(1988)；及Presta Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)；以引用的方式并入本文中。因此，所述“人源化”抗体可包括实质上少于完整人类可变域已被来自非人类物种的对应序列取代的抗体。实际上，人源化抗体通常为一些CDR残基及可能一些框架残基经来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代的人抗体。参见例如美国专利第5,225,539号；第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,859,205号。还参见美国专利第6,180,370号及国际公开第WO 01/27160号，其中揭示人源化抗体及用于产生对预定抗原的亲和力提高的人源化抗体的技术。
如本文所用的术语“人抗体”是指氨基酸序列对应于人类产生的抗体和/或已使用本领域技术人员已知或本文所揭示的任何用于制备人抗体的技术制得的抗体。人抗体的该定义包括包含至少一个人类重链多肽或至少一个人类轻链多肽的抗体。一种该实例为包含鼠类轻链及人类重链多肽的抗体。可使用本领域中已知的各种技术来产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人,Nature Biotechnology,14:309-314,(1996)；Sheets等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:6157-6162,(1998)；Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381,(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581,(1991))。人抗体还可通过免疫接种动物来制得，所述动物已通过转基因方法引入人类免疫球蛋白基因座代替内源性基因座，例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠。此方法描述于美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号及第5,661,016号中。或者，人抗体可通过使产生针对靶抗原的抗体的人类B淋巴细胞(此类B淋巴细胞可从对象或从cDNA的单细胞克隆回收或可在体外已进行免疫接种)永生化来制备。参见例如Cole等人Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,第77页,(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95,(1991)；及美国专利第5,750,373号。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一物种的抗体，诸如可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定域可来源于其他物种，诸如猫或狗。
如本文所用的术语“犬科化抗体”及“猫科化抗体”是指分别适用作犬科动物及猫科动物中的治疗剂的嵌合抗体。在两种情况下，来自异源物种供者抗体的抗原结合域与同一物种受者抗体的非抗原结合域组合。
如本文所用的术语“优先结合”或“特异性结合”在用于抗体结合靶标(例如CXCR4蛋白质)的情形下时为本领域中充分了解的术语。确定此类特异性或优先结合的方法也为本领域中熟知。若分子与特定细胞或物质的反应或结合比其与其他细胞或物质更频繁、更快速，持续时间更长和/或亲和力更大，则称其显示“特异性结合”或“优先结合”。若抗体与靶标的结合比抗体与其他物质的结合亲和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，则抗体“特异性结合”或“优先结合”于靶标。例如，特异性结合或优先结合CXCR4表位的抗体为与此表位的结合比抗体与其他CXCR4表位或非CXCR4表位的结合亲和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。
如本文所用的术语“结合亲和力”及“KD”意指特定抗原-抗体相互作用的平衡解离常数。KD为解离速率(还称为“解离率”或“kd”)与结合速率或“结合率”或“ka”的比率。因而，KD等于kd/ka且以摩尔浓度(M)表示。因而KD越小，结合亲和力越强。因此，与1nM的KD相比，1μM的KD指示结合亲和力弱。抗体的KD值可使用本领域中充分确立的方法确定。一种确定抗体KD的方法通过使用表面等离子共振，通常使用生物感应器系统，诸如
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系统。
涉及抗体，如本文所用的术语“竞争”是指第一抗体以足够类似于第二抗体的结合的方式结合表位，使得在第二抗体存在下第一抗体与其同源表位的结合的结果与在缺乏第二抗体下第一抗体的结合相比可检测地降低。本发明涵盖与本发明抗体竞争结合表位的抗体。基于本文所提供的教示，本领域技术人员将了解，此类竞争抗体可用于本文所揭示的方法。
如本文所用的术语“药物”是指具有生物或可检测活性的任何物质。术语药物意在涵盖细胞毒性剂、治疗剂、免疫调节剂、可检测标记、成像剂、结合剂、前药(其在活体内代谢成活性剂)、生长因子、激素、细胞因子、抗激素、黄嘌呤、白介素、干扰素及细胞毒性药物。药物可为小分子、多肽、寡核苷酸或生物聚合物。药物可经由接头与本发明抗体缀合以形成抗体-药物缀合物。
如本文所用的术语“效应功能”是指可归因于抗体Fc区的生物活性。抗体效应功能的实例包括(但不限于)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、Fc受体结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、吞噬作用、C1q结合及细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调。参见例如美国专利第6,737,056号。此类效应功能一般需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合且可使用本领域中已知用于评估此类抗体效应功能的各种测定来评估。效应功能的一种例示性测量是经由Fcγ3和/或C1q结合。
如本文所用的术语“表位”包括能够结合免疫球蛋白或T细胞受体或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定子。表位决定子一般由诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的分子的化学活性表面分组组成且一般具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可为“线性”或“构象性”。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点沿着蛋白质的主要氨基酸序列线性出现。在构象表位中，相互作用点穿过蛋白质上彼此隔开的氨基酸残基而出现。一旦确定抗原上的所要表位，则可例如使用本发明所述的技术产生针对该表位的抗体。或者，在发现过程中，抗体的产生及表征可阐明所需表位的有关信息。根据此信息，则可竞争性筛选结合相同表位的抗体。一种实现其的方法为进行竞争研究，以寻找彼此竞争性结合的抗体，即抗体竞争结合表位。用于基于竞争对抗体“划分(bin)”的高通量方法描述于国际专利申请案第WO 03/48731号中。如本文所用的术语“划分”是指一种基于抗体的抗原结合特征将其分组的方法。
如本文所用的术语“多核苷酸”、“核酸/核苷酸”及“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物形式、其类似物或可由DNA或RNA聚合酶进入链中的任何底物。多核苷酸可具有任何三维结构，且可执行任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、DNA、cDNA、基因组DNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针及引物。多核苷酸可为天然存在、合成、重组的或其任何组合。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在，则可在装配链之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可由非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后诸如通过与标记组分缀合来进一步修饰。其他类型的修饰包括例如“加帽”，一或多个天然存在的核苷酸经类似物取代，核苷酸间修饰，诸如具有不带电键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)及带电键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的多核苷酸，含有诸如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的侧位部分的多核苷酸，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素(psoralen)等)的多核苷酸，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的多核苷酸，含有烷化剂的多核苷酸，具有经修饰键的多核苷酸(例如α异头核酸等)以及多核苷酸的未经修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基可例如经膦酸酯基、磷酸酯基置换，经标准保护基保护，或经活化以制备与其他核苷酸的其他键，或可与固体支撑物结合。5'及3'末端OH可经磷酸化或经1至20个碳原子的胺或有机加帽基部分取代。其他羟基还可衍生成标准保护基。多核苷酸还可含有本领域中一般已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose))、非环状类似物及去碱基核苷类似物，诸如甲基核糖核苷。一或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括(但不限于)磷酸酯经P(O)S(“硫醇酯”)、P(S)S(“二硫醇酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中各R或R'独立地是H或任选含有醚(-O-)键的经取代或未经取代的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中的所有键无需相同。上述描述适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所用的术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”是指任何长度、优选相对较短(例如10-100个氨基酸)的氨基酸链。链可为线性或支链，其可包含经修饰的氨基酸，和/或可间杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已天然或通过介入来修饰的氨基酸序列；例如形成二硫键、糖基化作用、脂化作用、乙酰化作用、磷酸化作用，或任何其他操纵或修饰(诸如与标记组分缀合)。定义内还包括例如含有氨基酸的一或多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应了解，多肽可以单链或结合链出现。
在本文中氨基酸可通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB Biochemical推荐的一字母符号提及。
如本文所用的术语“氨基酸”及“天然氨基酸”是指精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸。
如本文所用的术语“氨基酸衍生物”是指通过母体氨基酸的共价附着，诸如通过烷基化、糖基化、乙酰化、磷酸化及其类似方式进行取代或修饰的氨基酸。“衍生物”定义内进一步包括例如具有经取代键以及本领域中已知的其他修饰的氨基酸的一或多种类似物。
如本文所用的术语“载体(vector)”是指能够在宿主细胞中递送且优选表达一或多种相关基因或序列的构建体。载体的实例包括(但不限于)：病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子型缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、囊封于脂质体中的DNA或RNA表达载体，及某些真核细胞(诸如生产细胞)。
如本文所用的术语“序列相同性百分比”是指两个序列之间的类似程度。在核酸序列的情形下，其是指两个序列中当针对最大对应而比对时相同的残基。序列相同性比较的长度可在至少约9个核苷酸，一般至少约18个核苷酸，更一般至少约24个核苷酸，通常至少约28个核苷酸，更通常至少约32个核苷酸，且优选至少约36、48个或更多的核苷酸的长度上。本领域中已知多种不同算法，可用于测量核苷酸序列相同性。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit来比较多核苷酸序列，所述算法为Wisconsin Package 10.0版,GeneticsComputer Group(GCG),Madison,Wisconsin中的程序。包括例如程序FASTA2及FASTA3的FASTA提供查询与搜索序列之间最好重叠区域的比对及序列相同性百分比(Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol.266:227-258(1996)；Pearson,J.Mol.Biol.276:71-84(1998)；以引用的方式并入本文中)。除非另外规定，否则使用特定程序或算法的默认参数。例如，核酸序列之间的序列相同性百分比可使用GCG 6.1版(其以引用的方式并入本文中)中所提供的具有其默认参数(字号6及NOPAM系数用于计分矩阵)的FASTA或具有其默认参数的Gap测定。
除非另有说明，否则对核苷酸序列的提及涵盖其互补序列。因此，应理解对具有特定序列的核酸的提及应涵盖其互补链及其互补序列。
在氨基酸序列的情形下，其是指两个氨基酸序列当诸如通过程序GAP或BESTFIT，使用与程序一起提供的默认缺口权重进行最佳比对时，享有至少70％、75％或80％序列相同性，优选至少90％或95％序列相同性，且更优选至少97％、98％或99％序列相同性。在一些实质上类似的氨基酸序列中，不相同的残基位置差别之处在于保守性氨基酸取代。
实质上类似的多肽还包括保守性取代的变体，其中一或多个残基已被功能上类似的残基保守性取代。保守性取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基(诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)被另一个非极性(疏水性)残基取代；一个极性(亲水性)残基被另一个极性(亲水性)残基取代，诸如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间；一个碱性残基(诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被另一个碱性残基取代；或一个酸性残基(诸如天冬氨酸或谷氨酸)被另一个酸性残基取代。
两个蛋白质实质上相同的另一指示在于其共享整体三维结构或为生物功能等同物。
如本文所用的术语“细胞毒性活性”是指抗体、ADC或所述ADC的细胞内代谢物的杀死细胞、细胞生长抑制或抗增殖作用。细胞毒性活性可以IC50值表示，其为一半细胞存活时每单位体积的浓度(摩尔或质量)。
如本文所用的术语“接触”是指使本发明的抗体或其抗原结合部分与靶CXCR4或其表位以使抗体可影响CXCR4生物活性的方式在一起。所述“接触”可“体外”(即在试管、皮氏培养皿或其类似物中)实现。在试管中，接触可仅仅涉及抗体或其抗原结合部分及CXCR4或其表位，或其可涉及整个细胞。细胞还可维持或生长在细胞培养皿中且在所述环境中与抗体或其抗原结合部分接触。在此情形下，特定抗体或其抗原结合部分影响CXCR4相关病症的能力，即抗体的IC50值，可在尝试在更复杂的活生物体下体内使用抗体之前确定。对于在生物体外的细胞，存在多种方法，且为本领域技术人员熟知，来使CXCR4与抗体或其抗原结合片段接触。在另一实施方案中，效应功能产生大量功效。已展示促成抗体介导的细胞毒性的免疫效应功能包括(但不限于)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)及补体依赖性细胞毒性(CDC)。
如本文所用的术语“含有酰基供体谷氨酰胺的标签”及“谷氨酰胺标签”是指含有一或多个Gln残基的多肽或蛋白质，其充当转谷氨酰胺酶的胺受体。参见例如WO2012059882。
如本文所用的术语“药物学可接受的载体”及“药物学可接受的赋形剂”是指当与活性成分组合时允许成分保留生物活性且与对象的免疫系统无反应性的任何物质。实例包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及其类似物。标准医药载体包括(但不限于)磷酸盐缓冲生理食盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液)及各种类型湿润剂。用于气溶胶或非经肠施用的优选稀释剂为磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)或生理食盐水(0.9％)。包含这些载体的组合物通过熟知的常规方法来调配(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.Gennaro编辑,MackPublishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice ofPharmacy第21版Mack Publishing,2005)。载体优选适于静脉内、肌肉内、皮下、非经肠、脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。视施用途径而定，活性化合物(例如单克隆抗体、其抗原结合片段、抗体-药物缀合物)可用保护化合物免受酸及可使化合物失活的其他天然条件作用的材料包覆膜衣。
本发明还提供包含一种、两种、三种、四种、五种、十种、十五种、二十种或更多种本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体或者由其组成的分子)或者由其组成的组合物。本发明的组合物可包含一或多种抗体或其片段或变体的一种、两种、三种、四种、五种、十种、十五种、二十种或更多种氨基酸序列或者由其组成。或者，本发明的组合物可包含编码一或多个本发明抗体的核酸分子或者由其组成。
术语“CXCR4相关病症”为其中病理学至少部分归因于CXCR4表达增加或不当或CXCR4功能不当的任何病状。此类病症的实例包括(但不限于)与CXCR4表达相对于正常增加相关的癌症、炎症及免疫病症、过敏性病症、感染(HIV感染等)、自身免疫病症(例如类风湿性关节炎)、纤维化病症(例如肺)及心血管病症。
术语“癌症”是指哺乳动物中通常特征在于不受调控的细胞生长的生理病状或病症。血液癌症是指血液的癌症，其尤其包括(但不限于)白血病、淋巴瘤及骨髓瘤。实体癌症是指身体组织而非血液的癌症，包括(但不限于)膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌(liver cancer)及肝癌(hepatic carcinoma)等等。
如本文所用的术语“患者”是指罹患CXCR4相关病症的对象。患者可包括(但不限于)人类、非人类灵长类动物(例如猴)、大鼠、小鼠、豚鼠、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟类及家禽。在优选实施方案中，施用本发明的抗体或抗体-药物缀合物的患者为人类。
如本文所用的术语“有效量”或“有效剂量”是指药物、化合物或药物组合物实现一或多种有益或所要治疗结果需要的量。出于预防性用途，有益或所要结果包括排除或降低病症(包括病症的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症及在出现病症期间呈现的中间病理学表达型)风险、减轻其严重性或延缓其开始。出于治疗性用途，有益或所要结果包括诸如以下的临床结果：降低病症的一或多种症状发生率或改善病症的一或多种症状、能够减少治疗病症所需的其他药剂的剂量、增强用于治疗病症的另一药剂的作用和/或延缓病症进展。
为达成本发明的目的，有益或所要临床结果包括(但不限于)一或多种以下结果：减少CXCR4相关病症中赘生性或癌细胞的增殖(或破坏)；减少或抑制CXCR4相关病症中赘生性细胞的转移；使表达CXCR4的肿瘤的尺寸收缩或减小；缓解CXCR4相关病症；增加患有CXCR4相关病症的对象的预期寿命；减少由CXCR4相关病症产生的症状；增加罹患CXCR4相关病症者的生活品质；能够在无不利的影响下减少治疗CXCR4相关病症所需的其他药剂的剂量；延缓CXCR4相关病症的进展；治愈CXCR4相关病症；和/或延长患有CXCR4相关病症的患者的存活。
除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语将具有本领域技术人员通常所了解的含义。例如，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”及“具有”及其类似术语可具有美国专利法中归属于其的含义且可是指“包括(includes)”、“包括(including)”及其类似术语；同样，“基本上由……组成”或“基本上组成”具有美国专利法中归属于其的含义且所述术语为开放的，允许存在多于所述者，只要所述者的基本或新颖特征不因存在多于所述者而变化即可，但不包括现有技术的实施方案。
另外，除非上下文另有需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
本文中对“约”一值或参数的提及包括(及描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括界定所述范围的数字。在本发明的方面或实施方案根据马库什或其他替代分组进行描述的情况下，本发明不仅涵盖整体列出的整个群组，而且还各自涵盖群组的每一成员及主群组的所有可能子组，且还涵盖缺乏一或多个群组成员的主群组。本发明还预期明确排除所主张的发明中的任何群组成员中的一或多种。
贯穿本说明书及申请专利范围，词语“包含(comrpise)”或其变化形式(诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)应理解为是指包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。除非上下文另有需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
除非另外定义，否则本文中所用的所有科技术语均具有与本领域技术人员通常所理解相同的含义。在出现矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。本文中描述例示性的方法及材料，不过类似或等同于本文所述的方法及材料的方法及材料还可用于实施或测试本发明。材料、方法及实例仅为说明性的且无意限制。
抗CXCR4抗体及其制备方法
本发明提供结合人CXCR4的抗CXCR4抗体或抗原结合片段。在说明书的本部分中，详细描述例示性的本发明的抗CXCR4抗体或抗原结合片段的功能及结构特征。应了解，本发明的抗体或抗原结合片段可基于本文中所描述的结构和/或功能特征的任一或多种(2、3、4、5、6、7、8、9等)来描述。遍及本发明此部分，当针对本发明的抗体描述功能或结构特征时，应了解，除非上下文另外明确指示，否则此类结构或功能特征可类似地用于描述本发明的抗原结合片段。
人CXCR4 cDNA的核苷酸序列及人CXCR4蛋白质的预测氨基酸序列分别如SEQ IDNO:104及105所示(表1)。长度为约1679个核苷酸的人CXCR4基因编码分子量为约38.7kD且长度为约352个氨基酸残基的全长蛋白质。人CXCR4核酸及多肽序列的进一步描述可分别见于GenBank登录号NM_003467及NP_003458中；以及Federsppiel,B.等人Genomics 16(3):707-712(1993)；Herzog,H.等人DNA Cell Biol.12(6):465-471(1993)；Jazin,E.E.等人Regul.Pept 47(3):247-258(1993)；Nomura,H.等人Int.Immunol.5(10):1239-1249(1993)；Loetscher,M.等人J.Biol.Chem.269(1):232-237(1994)；Moriuchi,M.等人J.Immunol.159(9):4322-4329(1997)；Caruz,A.等人FEBS Lett.426(2):271-278(1998)；及Wegner,S.A.等人J.Biol.Chem.273(8):4754-4760(1998)。
表1
Figure BDA0002752729640000161
Figure BDA0002752729640000171
如本文所用的人CXCR4序列与SEQ ID NO:105的人CXCR4的不同之处可在于具有例如保守突变或非保守区域的突变，且所述CXCR4具有与SEQ ID NO:105的人CXCR4实质上相同的生物功能。例如，人CXCR4的生物功能为在由本发明抗体结合的CXCR4的细胞外域中具有表位，或人CXCR4的生物功能为结合趋化因子或参与转移过程。
特定人CXCR4序列在氨基酸序列上一般将与SEQ ID NO:105的人CXCR4至少90％相同，且含有当与其他物种(例如鼠类)的CXCR4氨基酸序列相比时鉴别氨基酸序列为人类的氨基酸残基。在某些情况下，人CXCR4可与SEQ ID NO:105的CXCR4在氨基酸序列上至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。在本发明的一些方面中，人CXCR4序列将呈现与SEQ ID NO:105的CXCR4不超过10个氨基酸差异。在本发明的某些方面中，人CXCR4可呈现与SEQ ID NO:105的CXCR4不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。相同性百分比可如本文所述来确定。
本发明的抗体、其抗原结合片段及抗体-药物缀合物特征在于任意一或多个以下特征：(a)结合CXCR4；(b)减少或下调CXCR4的蛋白质表达；(c)治疗、预防、改善对象中与CXCR4功能或表达相关的病症(例如癌症，诸如NHL、AML、MM、CLL、T-ALL、胃癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌或胰腺癌)的一或多种症状；(d)减少或抑制对象(其具有表达CXCR4的肿瘤)中肿瘤生长或进展；(e)减少或抑制对象(其具有一或多种表达CXCR4的癌细胞)中表达CXCR4的癌细胞的转移；(f)诱导表达CXCR4的肿瘤消退(例如长期消退)；(g)在表达CXCR4的细胞中发挥细胞毒性活性；(h)使CXCR4通路去活化或下调CXCR4通路；以及(i)阻断CXCR4与CXCR4细胞外结合配偶体的相互作用。例如，本发明的抗体、其抗原结合片段及抗体-药物缀合物阻断SDF-1的功能。
适用于本发明的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异缀合抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分(例如结构域抗体)的融合蛋白、人源化抗体及免疫球蛋白分子的包含所需特异性的抗原识别位点的任何其他经修饰的构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。所述抗体可为鼠类、大鼠、人类或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。
在本发明的一些方面中，如本文所述的抗CXCR4抗体为单克隆抗体。例如，抗CXCR4抗体为人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。
在本发明的一些方面中，本发明的抗体与来自非人类物种的CXCR4，诸如小鼠、大鼠、犬科动物、猫科动物或灵长类动物的CXCR4，以及CXCR4的不同形式(例如糖基化CXCR4)交叉反应。在本发明的一些方面中，对人CXCR4具有特异性的抗体可完全对人CXCR4具有特异性且可不显示物种或其他类型的交叉反应性。
在本发明的一些方面中，如本文所述的抗CXCR4抗体为犬科化抗体或猫科化抗体。已经犬科化或猫科化的根据本发明的抗体能够结合犬科动物CXCR4蛋白或猫科动物CXCR4蛋白中的至少一种。在一个方面中，本发明的单克隆抗体结合犬科动物CXCR4蛋白或猫科动物CXCR4蛋白且防止其结合基质细胞衍生因子-1(SDF-1)。
在本发明的一些方面中，抗体包含经修饰的恒定区，诸如(但不限于)引起免疫反应的可能性增加的恒定区。例如，恒定区可经修饰以具有增加的对Fcγ受体(诸如FcγRI、FcγRIIA或FcγIII)的亲和力。
在本发明的一些方面中，抗体包含经修饰的恒定区，诸如具有增加的对人类Fcγ受体的亲和力，免疫惰性，即引起免疫反应的可能性降低的恒定区。在本发明的一些方面中，恒定区如以下中所描述进行修饰：Eur.J.Immunol.,29:2613-2624,1999；PCT申请案第PCT/GB99/01441号；和/或英国专利申请案第98099518号。Fc可为人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。Fc可为含有A330P331至S330S331突变(IgG2Δa)的人IgG2，其中氨基酸残基参考野生型IgG2序列编号。Eur.J.Immunol.,29:2613-2624,1999。在本发明的一些方面中，抗体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区含有以下突变(Armour等人,Molecular Immunology 40585-593,2003)：E233F234L235突变成P233V234A235(IgG4Δc)，其中编号参考野生型IgG4。在本发明的其他方面中，Fc为人类IgG4，E233F234L235突变成P233V234A235，缺失G236(IgG4Δb)。在本发明的另一方面中，Fc为任何人类IgG4 Fc，其含有S228至P228的铰链稳定化突变(IgG4、IgG4Δb或IgG4Δc)(Aalberse等人,Immunology 105,9-19,2002)。在本发明的一特定方面中，Fc可为去糖基化(aglycosylated)Fc。
在本发明的一些方面中，通过使寡糖附着残基(诸如Asn297)和/或作为恒定区中糖基化识别序列一部分的侧翼残基突变而使恒定区去糖基化。在本发明的一些方面中，针对N连接的糖基化以酶促方式使恒定区去糖基化。以酶促方式或通过在糖基化缺乏宿主细胞中表达，可使恒定区针对N连接的糖基化而去糖基化。
测定抗体与CXCR4的结合亲和力的一种方式是通过测量抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。为获得单功能Fab片段，抗体(例如IgG)可用木瓜蛋白酶裂解或重组表达。抗体的CXCR4 Fab片段的亲和力可通过装备有预固定链霉亲和素传感器芯片(SA)的表面等离子共振(BiacoreTM3000TM表面等离子共振(SPR)系统,BiacoreTM,INC,Piscataway NJ)或抗小鼠Fc或抗人Fc，使用HBS-EP操作缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v表面活性剂P20)测定。生物素化的WGA可包被于SA芯片上以有助于捕获含有CXCR4蛋白质的脂质粒子。注射自低至高浓度(每一浓度具有3分钟结合时间)的Fab的逐级稀释液(5成员，3×稀释因子，最高浓度为10或30nM)，以使用如Karlsson等人,(Karlsson,R.,Katsamba,P.S.,Nordin,H.,Pol,E.及Myszka,D.G.Analyzing a kinetic titrationseries using affinity biosensors.Anal.Biochem.349,136-147(2006))中所描述的“动力学滴定”方法对数据进行动力学分析。对于一些分析循环，用缓冲液代替Fab注射在捕获的粒子上，以提供用于双重参考目的的空白循环(双重参考如Myszka等人中所描述进行)(Myszka,D.G.Improving biosensor analysis.J.Mol.Recognit.12,279-284(1999))。
Fab蛋白质的浓度使用已知浓度(如由氨基酸分析所确定)的Fab作为标准通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳法来确定。通过使用BIAevaluation程序，将数据总体拟合于1:1朗缪尔结合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).MethodsEnzymology 6.99-110)来同时获得动力学结合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值以koff/kon计算。此方案适用于确定抗体对任何CXCR4，包括人CXCR4、另一哺乳动物的CXCR4(诸如小鼠CXCR4、大鼠CXCR4、犬科动物CXCR4或灵长类动物CXCR4)以及CXCR4的不同形式(例如糖基化CXCR4)的结合亲和力。抗体的结合亲和力一般在25℃下测量，但还可在37℃下测量。
在本发明的一些方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段具有低于10,000μg/mL的MFI。在本发明的特定方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段具有低于6000μg/mL的MFI。在本发明的特定方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段具有低于5000μg/mL的MFI。在本发明的特定方面中，在本发明的一些方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段具有在2000μg/mL至5000μg/mL范围内的MFI。
如本文所用，“MFI”是指平均萤光强度或中位萤光强度。
在本发明的一些方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段具有低于3.00E-09M的EC50。在本发明的一些方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段具有在约1.00E-09M至约3.00E-09M范围内的EC50。例如，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段具有2.00E-09M的EC50。
在本发明的一些方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段抑制SDF-1诱导的钙流动。例如，抗体或其抗原结合片段抑制SDF-1α诱导的钙流动，其中抑制的IC50在约1nM至50nM范围内。在一个方面中，抗体或其抗原结合片段抑制SDF-1α诱导的钙流动，其中抑制的IC50低于30nM。在一个方面中，抗体或其抗原结合片段抑制SDF-1α诱导的钙流动，其中抑制的IC50低于2nM。
在本发明的一些方面中，抗体或其抗原结合片段显著减少AML细胞模型中的AML细胞数目。例如，人类细胞数的数目在用抗CXCR4 6B6抗体处理的动物中显著降低。此外，用本发明的抗CXCR4抗体处理的动物的存活显著增加。
在一些方面中，本发明的抗体在小鼠全身性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及急性骨髓白血病(AML)细胞模型中增加存活时间且降低肿瘤负荷。在一个方面中，本发明的抗体在小鼠全身性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)肿瘤模型中增加存活。在一个方面中，本发明的抗体抑制NHL肿瘤在体内生长。在一些方面中，本发明的抗体在小鼠全身性多发性骨髓瘤(MM)模型中增加存活时间且降低肿瘤负荷。
本发明的抗体可使用本领域中熟知的技术，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术的组合或本领域中容易获知的其他技术产生(参见例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50(1999)及Fellouse,F.A.等人,J.Mol.Biol.,373(4):924-40(2007))。
如本文所述的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段可通过本领域中已知的任何方法制备。例如，为产生杂交瘤细胞系，宿主动物免疫接种的途径及时间表一般与已建立及常规的用于抗体刺激及产生的技术一致，如本文中进一步描述。产生人类及小鼠抗体的一般技术为本领域中已知和/或描述于本文中。
预期包括人类的任何哺乳动物对象或来自其的抗体产生细胞可经操纵以充当产生包括人类的哺乳动物及杂交瘤细胞系的基础。通常，以包括本文所述的一定量的免疫原对宿主动物进行腹膜内、肌肉内、经口、皮下、足底和/或皮内接种。
杂交瘤可由淋巴细胞及永生化骨髓瘤细胞，使用Kohler,B.及Milstein,C.,Nature 256:495-497(1975)的一般体细胞杂交技术或如Buck,D.W.等人,In Vitro,18:377-381(1982)修改来制备。包括(但不限于)X63-Ag8.653的可用骨髓瘤株及来自SalkInstitute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA.的那些骨髓瘤株可用于杂交中。一般而言，所述技术包含使用诸如聚乙二醇的促融剂或通过本领域技术人员熟知的电学方式使骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合。融合之后，将细胞从融合培养基分离，且在诸如次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基的选择性生长培养基中生长，以除去未杂交的母体细胞。补充或未补充血清的本文所述任何培养基可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一替代技术，EBV永生化B细胞可用于产生本发明的CXCR4单克隆抗体。必要时，使杂交瘤扩展并亚克隆，且通过常规免疫测定程序(例如放射性免疫测定、酶免疫测定或萤光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤涵盖产生对CXCR4有特异性的单克隆抗体的亲本杂交瘤的所有衍生物、子代细胞，或其一部分。
产生所述抗体的杂交瘤可使用已知程序在体外或体内生长。单克隆抗体必要时可通过常规免疫球蛋白纯化程序(诸如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析及超滤)从培养基或体液分离。不希望的活性若存在则可例如通过使制剂在由附着于固相的免疫原制成的吸附剂之上流动并从免疫原洗脱出或释放出所要抗体来移除。用使用双功能或衍生剂(例如顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基磺酸基丁二酰亚胺酯(经由半胱氨酸残基缀合)、N-羟基丁二酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R及R1为不同烷基)缀合在待免疫接种的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔戚血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)的人CXCR4或含有靶氨基酸序列的片段对宿主动物进行免疫接种可产生抗体(例如单克隆抗体)群体。
必要时，可对相关抗CXCR4抗体(单克隆或多克隆)测序且接着可将多核苷酸序列克隆至载体中用于表达或增殖。可将编码相关抗体的序列维持于宿主细胞中的载体中且可接着扩展及冷冻宿主细胞以备将来使用。细胞培养物中重组单克隆抗体的产生可经由利用本领域中已知的方式自B细胞克隆抗体基因来进行。参见例如Tiller等人,J.Immunol.Methods 329,112(2008)；美国专利第7,314,622号。
作为替代方法，可将多核苷酸序列用于遗传操纵以使抗体“人源化”或改良抗体的亲和力或其他特征。例如，恒定区可经改造以更类似人类恒定区以避免当抗体用于人类临床试验及治疗时的免疫反应。可能需要对抗体序列进行基因操纵以获得更大的对CXCR4的亲和力和/或更大的抑制CXCR4的功效。
使单克隆抗体人源化一般有四个步骤。这些步骤为：(1)确定起始抗体轻及重可变域的核苷酸及预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪个抗体框架区；(3)实际的人源化方法/技术；及(4)转染及表达人源化抗体。参见例如美国专利第4,816,567号；第5,807,715号；第5,866,692号；第6,331,415号；第5,530,101号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,585,089号；及第6,180,370号。
已描述多种包含来源于非人类免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，其包括具有啮齿动物或经修饰的啮齿动物V区及其相关CDR与人类恒定区融合的嵌合抗体。参见例如Winter等人Nature 349:293-299(1991)；Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:4220-4224(1989)；Shaw等人J Immunol.138:4534-4538(1987)；Brown等人CancerRes.47:3577-3583(1987)。其他参考文献描述在与适当人抗体恒定区融合前移植至人类支撑框架区(FR)中的啮齿动物CDR。参见例如Riechmann等人Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人Science 239:1534-1536(1988)，及Jones等人Nature 321:522-525(1986)。另一参考文献描述通过重组改造的啮齿动物框架区支撑的啮齿动物CDR。参见例如欧洲专利公开案第0519596号。这些“人源化”分子经设计以将对啮齿动物抗人抗体分子的非所需免疫反应降至最低，所述非所需免疫反应限制那些部分在人类受者中的治疗应用的持续时间及效用。例如，可对所述抗体恒定区进行改造以使得其呈免疫惰性(例如不触发补体溶解)。参见例如PCT公开案第PCT/GB99/01441号、英国专利申请案第9809951.8号。还可利用的人源化抗体的其他方法揭示于以下中：Daugherty等人,Nucl.Acids Res.19:2471-2476,1991；及美国专利第6,180,377号；第6,054,297号；第5,997,867号；第5,866,692号；第6,210,671号；及第6,350,861号；及PCT公开案第WO 01/27160号。
与上文所论述的人源化抗体有关的一般原理还适用于定制用于例如狗、猫、灵长类动物、马科动物及牛科动物的抗体。此外，本文中所描述的使抗体人源化的一或多个方面可组合，例如CDR移植、框架突变及CDR突变。
在本发明的一些方面中，完全人抗体可通过使用已被改造以表达特定人类免疫球蛋白的市售小鼠获得。经设计以产生更合需要(例如完全人抗体)或更稳固的免疫反应的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法揭示于Green等人,Nature Genet.7:13(1994)；Lonberg等人,Nature 368:856(1994)；及Taylor等人,Int.Immun.6:519(1994)中。此类系统的一个非限制性实例为来自Abgenix(Fremont,CA)的
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(例如Green等人,J.Immunol.Methods 231：11-23(1999)，以引用的方式并入本文中)。在
Figure BDA0002752729640000212
及类似动物中，小鼠抗体基因已被功能性人抗体基因失活并置换，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
Figure BDA0002752729640000213
经生殖系构型的YAC(酵母人工染色体)转化，所述生殖系构型的YAC含有人类IgH及Igκ基因座的部分，包括可变区序列大部分，连同附加基因及调控序列。人类可变区谱系可用于产生抗体产生B细胞，其可通过已知技术加工成杂交瘤。经靶抗原免疫接种的
Figure BDA0002752729640000214
将通过正常免疫反应产生人抗体，所述人抗体可通过上文所论述的标准技术收集和/或产生。多种
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株可供使用，其中每一种均能够产生不同类别的抗体。以转基因方式产生的人抗体已证实具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物动力学特性(Green等人,J.Immunol.Methods 231:11-23(1999))。本领域技术人员将认识到请求保护的组合物及方法不限于
Figure BDA0002752729640000216
系统的使用，还可利用已被基因改造以产生人抗体的任何转基因动物。
在本发明的一些方面中，抗体可使用具有本文所揭示的VH和/或VL序列中的一或多种作为改造修饰抗体的起始物质来制备，所述修饰抗体可具有从起始抗体改变的特性。抗体可通过修饰一或两种可变区(即VH和/或VL)内，例如在一或多个CDR区内和/或在一或多个框架区内的一或多个残基来改造。或者，抗体可通过修饰在恒定区内的残基例如以改变所述抗体的效应功能来改造。在某些方面中，CDR移植可用以改造抗体的可变区。抗体主要经由位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于此原因，在个别抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列差异更大。因为CDR序列造成大部分抗体-抗原相互作用，所以可通过构建表达载体，表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列，所述CDR序列移植至来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(参见例如Riechmann,L等人,Nature 332323-327(1995)；Jones,P等人,Nature 32J.522-525(1986)；Queen,C等人,Proc Natl AcadSee U.S.A 86 10029-10033(1989)；美国专利第5,225,539号；第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号；及第6,180,370号)。
此类框架序列可获自公共DNA数据库或包括生殖系抗体基因序列的公开文献。例如，人类重链及轻链可变区基因的生殖系DNA序列可见于“VBase”人类生殖系序列数据库(在因特网www mrc-cpe cam ac uk/vbase上可得)以及Kabat,E A等人(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第五版,U S.Department of Health andHuman Services,NIH公开号91-3242；Tomlinson,I M等人(1992)“The Repertoire ofHuman Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops”；Cox,J P L等人,J MoI.Biol TTL 776-798(1994)“ADirectory of Human Germ-line Vn Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Ew.J.Immunol 2A 827-836，每一个的内容以引用的方式明确并入本文中。作为另一实例，人类重链及轻链可变区基因的生殖系DNA序列可见于Genbank数据库。例如，以下在HCo7 HuMAb小鼠中发现的重链生殖系序列可以以随附Genbank登录号1-69(NG_0010109、NT_024637及BC070333)、3-33(NG_0010109及NT_024637)及3-7(NG_0010109及NT_024637)获得。作为另一实例，以下在HCoI 2HuMAb小鼠中发现的重链生殖系序列可以以随附Genbank登录号1-69(NG_0010109、NT_024637及BCO7O333)、5-51(NG_0010109及NT_024637)、4-34(NG_0010109及NT_024637)、3-30 3(CAJ556644)及3-23(AJ406678)获得。人类重链及轻链生殖系序列的又一个来源为可从IMGT(http://imgt.cines.fr)获得的人类免疫球蛋白基因的数据库。
用于本发明抗体的优选框架序列为结构上类似于所选本发明抗体使用的框架序列的框架序列。VH CDR1、CDR2及CDR3序列及VL CDR1、CDR2及CDR3序列可移植于框架区上，所述框架区与框架序列所来源的生殖系免疫球蛋白基因中所见序列相同，或CDR序列可移植于相较于生殖系序列含有一或多个突变的框架区上。另一类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一或多个CDR区内的一或多个残基突变以移除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。此方法还称为“去免疫”，并进一步详细描述于美国专利公开案第20030153043号中。
除框架区或CDR区内所作的修饰以外，或取而代之，本发明的抗体可经改造以包括Fc区内的修饰，通常以改变所述抗体的一或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可经化学修饰(例如，可将一或多个化学部分附着于抗体上)或经修饰以改变其糖基化，再改变所述抗体的一或多种功能特性。以下进一步详细描述这些实施方案中的每一个。Fc区中的残基编号为Kabat和/或Chothia的EU索引的编号。例如，已发现在某些情况下使框架区内的残基突变是有益的，以维持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号)。在本发明的一些方面中，CH1的铰链区经修饰，以使得铰链区中的半胱氨酸残基数改变，例如增加或减少。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数经改变以例如促进轻链及重链的组装或增加或降低所述抗体的稳定性。在本发明的一些方面中，抗体的Fc铰链区经突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中以使得抗体所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合相对于天然Fc铰链域SpA结合削弱。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利第6,165,745号中。
在本发明的一些方面中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。多种方法可行。例如，可引入以下突变中的一或多种：T252L、T254S、T256F，如美国专利第6,277,375号中所述。或者，为延长生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内改变以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获取的挽救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所述。
在本发明的一些方面中，抗体可重组制得且使用本领域中已知的任何方法表达。或者，抗体可通过噬菌体展示技术重组制得。参看例如美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；及第6,265,150号；及Winter等人,Annu.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。或者，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990))从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因谱系体外产生人抗体及抗体片段。根据此技术，使抗体V结构域基因符合读码框地克隆至丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，且以功能性抗体片段的形式展示于噬菌体粒子的表面上。由于所述丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA复本，所以基于抗体功能特性的选择还选择出编码体现那些性质的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可通过多种形式执行；对其评论见例如Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Current Opinion in StructuralBiology3:564-571(1993)。噬菌体展示可使用若干来源的V基因区段。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)从源自免疫小鼠的脾的V基因的小随机组合文库分离出一系列抗噁唑酮抗体。可构建来自未免疫人类供体的V基因谱系，针对一系列抗原(包括自体抗原)的抗体可基本上按照由Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBOJ.12:725-734(1993)所述的技术来分离。在天然免疫反应中，抗体基因高速积累突变(体细胞超突变)。所引入的一些变化将赋予较高亲和力，且呈现高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在随后抗原攻击期间优先复制及分化。此天然过程可通过使用称作“链改组”的技术来仿效(Marks等人,Bio/Technol.10:779-783(1992))。在此方法中，通过噬菌体展示所获得的“初级”人抗体的亲和力继而可通过以获自未经免疫供体的V结构域基因的天然存在的变体(谱系)的谱系来替代重链及轻链V区基因而得以改良。此技术产生具有在pM-nM范围内的亲和力的抗体及抗体片段。用于制造极大型噬菌体抗体谱系(也称为“所有文库的母库”)的策略已由Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.21:2265-2266(1993)描述。基因改组还可用于从啮齿动物抗体衍生人抗体，其中所述人抗体具有与起始啮齿动物抗体类似的亲和力及特异性。根据还称作“表位印记”的此方法，用人类V结构域基因谱系置换通过噬菌体展示技术所获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因，产生啮齿动物-人类嵌合体。抗原的选择使得分离能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区，即表位控制(印记)配偶体的选择。当重复所述方法以置换剩余啮齿动物V结构域时，获得人抗体(参见PCT公开案第WO 93/06213号)。与传统的通过CDR移植使啮齿动物抗体人源化不同，此技术提供完全人抗体，其不具有啮齿动物起源的框架或CDR残基。
可通过首先从宿主动物分离抗体及抗体产生细胞，获得基因序列，并使用基因序列在宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达抗体来重组制得抗体。可采用的另一方法为在植物(例如烟草)或转基因牛奶中表达抗体序列。已揭示在植物或牛奶中重组表达抗体的方法。参见例如Peeters等人,Vaccine19:2756,(2001)；Lonberg,N.及D.HuszarInt.Rev.Immunol 13:65(1995)；及Pollock等人,J Immunol Methods 231:147(1999)。用于制备例如人源化、单链等抗体衍生物的方法为本领域中已知。
免疫测定及流式细胞仪分选技术(诸如荧光活化细胞分选(FACS))也可用于分离对CXCR4有特异性的抗体。
如本文所述的抗体可结合许多不同载体。载体可为活性和/或惰性的。熟知载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然及经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖及磁铁矿。为达成本发明的目的，载体的性质可为可溶或不可溶的。本领域技术人员将了解结合抗体的其他适合载体，或将能够使用常规实验确定所述载体。在本发明的一些方面中，载体包含靶向心肌的部分。
使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)易于分离编码单克隆抗体的DNA且对其测序。杂交瘤细胞用作所述DNA的优选来源。一旦分离，则可将DNA置于表达载体(诸如PCT公开案第WO 87/04462中所揭示的表达载体)中，接着将其转染至并不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。参见例如PCT公开案第WO 87/04462号。DNA还可例如通过用人类重链及轻链恒定区的编码序列代替同源鼠类序列(Morrison等人,Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,1984)，或通过将所有或一部分非免疫球蛋白多肽的编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接来修饰。以此方式，制备具有本文中CXCR4单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。
用于确定抗CXCR4抗体的结合特异性的方法为本领域技术人员所熟知。一般方法例如提供于Mole,“Epitope Mapping”,METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第10卷:IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS,Manson(编辑),第105-116页(The Humana Press,Inc.1992)。
如本文所述的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段可使用本领域中已知的方法鉴别或表征，其中检测和/或测量CXCR4表达量的降低。在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体或其抗原结合片段通过将候选药剂与CXCR4一起温育并监测结合和/或伴随的CXCR4表达量降低来鉴别。结合测定可用纯化的CXCR4多肽进行，或用天然表达或经转染以表达CXCR4多肽的细胞进行。在一个方面中，结合测定为一种竞争性结合测定，其中评估候选抗体与已知的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4的能力。可以多种方式来执行所述测定，包括ELISA方式。
在初始鉴别之后，可通过已知测试目标生物活性的生物测定进一步证实及优化候选抗CXCR4抗体或其抗原结合片段的活性。或者，可使用生物测定直接筛选候选物。一些用于鉴别及表征抗CXCR4抗体或其抗原结合片段的方法在实施例中详细描述。
抗CXCR4抗体或其抗原结合片段可使用本领域中熟知的方法表征。例如，一种方法为鉴别其结合的表位或“表位定位(mapping)”。本领域中已知许多方法用于定位及表征蛋白质上表位的位置，包括解出抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定及基于合成肽的测定，如例如以下中所描述：Harlow及Lane,Using Antibodies,aLaboratory Manual,第11章,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York,1999。在另一实例中，表位定位可用以确定抗CXCR4抗体或其抗原结合片段结合的序列。表位定位有多种商业化来源，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219PH Lelystad,The Netherlands)。表位可以是线性表位，即包含于氨基酸的单一一段序列中，或是构象表位，由并不需要包含于单一一段序列中的氨基酸的三维相互作用所形成。可分离或合成(例如重组)变化长度(例如至少4-6个氨基酸长)的肽并用于与抗CXCR4抗体或其抗原结合片段的结合测定。在另一实例中，抗CXCR4抗体或其抗原结合片段结合的表位可在系统筛选中，通过使用来源于CXCR4序列的重叠肽及测定抗CXCR4抗体或其抗原结合片段的结合来确定。根据基因片段表达测定，随机或通过特定遗传构建使编码CXCR4的开放阅读框架分段并确定CXCR4的经表达的片段与待测试的抗体的反应性。例如，可通过PCR产生基因片段，然后在放射性氨基酸存在下体外转录并翻译成蛋白质。抗体与经放射性标记的CXCR4片段的结合随后通过免疫沉淀反应及凝胶电泳法来确定。某些表位还可通过使用在噬菌体粒子(噬菌体库)表面上展示的随机肽序列的大型文库来鉴别。或者，可在简单结合测定中测试针对重叠肽片段的限定文库与测试抗体的结合。在另一实例中，可进行抗原结合域的诱变、结构域交换实验及丙氨酸扫描诱变以鉴别表位结合所需、足够和/或必需的残基。例如，结构域交换实验可使用突变CXCR4(其中CXCR4蛋白质的各种片段已被来自另一物种(例如小鼠)CXCR4的序列置换(交换))，或紧密相关但抗原性不同的蛋白质(例如CXCR4)进行。通过评估抗体与突变CXCR4的结合，可评估特定CXCR4片段对抗体结合的重要性。
可用以表征抗CXCR4抗体的又一种方法是使用与已知结合相同抗原(即CXCR4上的各种片段)的其他抗体的竞争测定，以确定抗CXCR4抗体是否与其他抗体竞争和/或结合与其他抗体相同的表位。竞争测定为本领域技术人员所熟知。
在本发明的一些方面中，结合CXCR4的分离的抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4和/或结合CXCR4的相同表位。竞争结合CXCR4和/或结合CXCR4的相同表位的抗体包括以下抗体，所述抗体包含至少重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含(i)选自SEQ IDNO:107、113、114、108、109、115、116、117、121及122的VH CDR1，(ii)选自SEQ ID NO:162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130的VH CDR2，及(iii)选自SEQ ID NO:112及120的VH CDR3；和/或至少轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含(i)选自SEQ ID NO:144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151的VL CDR1，(ii)选自145、132、136及152的VLCDR2，及(iii)选自SEQ ID NO:139、133、137、140及153的VL CDR3。
在本发明的一些方面中，抗体与包含含有SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR的重链可变(VH)区的抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4。
在本发明的一些方面中，抗体与包含含有SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR的轻链可变(VL)区的抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4。
在本发明的一些方面中，抗体与包含a)含有SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR的重链可变(VH)区及b)含有SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR的轻链可变(VL)区的抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4。
在本发明的一些方面中，抗体与包含a)含有来自SEQ ID NO:33的VH区的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3的重链可变(VH)区及b)含有来自SEQ ID NO:73的VL区的VL CDR1、VLCDR2及VL CDR3的轻链可变(VL)区的抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4。
在本发明的一些方面中，抗体与包含a)SEQ ID NO:33的重链可变(VH)区及b)SEQID NO:73的轻链可变(VL)区的抗体或其抗原结合片段竞争结合CXCR4。
表达载体可用以直接表达抗CXCR4抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员熟悉表达载体的施用以在体内获得外源性蛋白质的表达。参见例如美国专利第6,436,908号；第6,413,942号；及第6,376,471号。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、经口施用、粒子枪或导管施用及表面施用。在本发明的另一方面中，表达载体直接施用至交感干或神经节，或冠状动脉、心房、心室或心包膜。
还可使用含有表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术描述于例如Findeis等人,Trends Biotechnol.11:202(1993)；Chiou等人,Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff编辑,1994；Wu等人,J.Biol.Chem.,263:621(1988)；Wu等人,J.Biol.Chem.,269:542(1994)；Zenke等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3655(1990)；及Wu等人,J.Biol.Chem.,266:338(1991)。对于基因治疗方案中的局部施用，含有多核苷酸的治疗组合物以约100ng至约200mg范围内的DNA施用。在基因治疗方案期间还可使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg及约20μg至约100μg的DNA浓度范围。治疗多核苷酸及多肽可使用基因递送载体递送。基因递送载体可来源于病毒或非病毒(一般参见Jolly等人,Cancer GeneTherapy,1:51(1994)；Kimura,Human Gene Therapy,5:845(1994)；Connelly等人,HumanGene Therapy,1:185(1995)；及Kaplitt,Nature Genetics,6:148(1994))。可使用内源性哺乳动物或异源启动子来诱导这些编码序列的表达。编码序列的表达可为组成性或经调节的。
在本领域中熟知用于递送所需多核苷酸及在所需细胞中表达的基于病毒的载体。例示性基于病毒的载体包括(但不限于)重组反转录病毒(参见例如PCT公开案第WO 90/07936号；第WO 94/03622号；第WO 93/25698号；第WO 93/25234号；第WO 93/11230号；第WO93/10218号；第WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号及第4,777,127号；英国专利第2,200,651号；及EP专利第0 345 242号)、基于α病毒的载体(例如辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)载体、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委内端拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))，及腺相关病毒(AAV)载体(参见例如PCT公开案第WO 94/12649号；第WO 93/03769号；第WO 93/19191号；第WO 94/28938号；第WO 95/11984号及第WO 95/00655号)。还可采用如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3:147中所描述的连接于杀死腺病毒的DNA的施用。
还可采用非病毒递送载体及方法，包括(但不限于)连接或未连接于单独杀死腺病毒的聚阳离子缩合的DNA(参见例如Curiel等人,Hum.Gene Ther.,3:147(1992))；配体连接的DNA(参见例如Wu,J.等人,Biol.Chem.,264:16985(1989))；真核细胞递送载体细胞(参见例如美国专利第5,814,482号；PCT公开案第WO 95/07994号；第WO 96/17072号；第WO 95/30763号；及第WO 97/42338号)及细胞核与细胞膜电荷中和或融合。还可采用裸DNA。例示性裸DNA导入方法描述于PCT公开案第WO 90/11092号及美国专利第5,580,859号中。可充当基因递送载体的脂质体描述于美国专利第5,422,120号；PCT公开案第WO 95/13796号；第WO94/23697号；第WO 91/14445号；及第EP 0524968号中。其他方法描述于Philip等人,Mol.Cell Biol.,14:2411(1994)及Woffendin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:1581(1994)中。
在本发明的一些方面中，本发明涵盖包含本文中所描述或通过所述方法制得且具有本文中所描述的特征的抗体的组合物，包括药物组合物。如本文所用，组合物包含一或多种结合CXCR4的抗体和/或一或多种包含编码一或多种这些抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含本领域中熟知的适合赋形剂，诸如药物学可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
因此，本发明提供以下各物中的任一种，或包含以下序列中的任一种的组合物(包括药物组合物)：
表2
Figure BDA0002752729640000251
Figure BDA0002752729640000261
Figure BDA0002752729640000271
Figure BDA0002752729640000281
Figure BDA0002752729640000291
Figure BDA0002752729640000301
Figure BDA0002752729640000311
Figure BDA0002752729640000321
Figure BDA0002752729640000331
Figure BDA0002752729640000341
Figure BDA0002752729640000351
表2中，带下划线的序列为根据Kabat的CDR序列，粗体是根据Chothia的CDR序列。
本发明还提供CXCR4抗体的CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR及CDR接触区)。本领域技术人员完全能够确定CDR区。应了解在本发明的一些方面中，CDR可为Kabat与ChothiaCDR的组合(还称为“组合CR”或“延伸CDR”)。在一些实施例中，CDR为Kabat CDR。在其他实施例中，CDR为Chothia CDR。换言之，在具有一种以上CDR的实施方案中，CDR可为Kabat、Chothia、组合CDR或其组合中的任一种。表3及4提供本文所提供的CDR序列的实例。
表3
Figure BDA0002752729640000352
Figure BDA0002752729640000361
Figure BDA0002752729640000371
Figure BDA0002752729640000381
表4
Figure BDA0002752729640000382
Figure BDA0002752729640000391
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其结合CXCR4和/或与诸如m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D的如本文所述的抗体竞争。
在另一方面中，抗体与抗体m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D竞争结合CXCR4。
在本发明的一些方面中，抗体与本发明的抗体竞争结合CXCR4，且具有通过表面等离子共振所测量的约以下任一个或小于约以下任一个的单价抗体结合亲和力(KD)：6.5nM、6.0nM、5.5nM、5.0nM、4.5nM、4.0nM、3.5nM、3.0nM、2.5nM、2.0nM、1.5nM、1.0nM、0.5nM或0.25nM。在本发明的一些方面中，抗体与抗体h3G10竞争结合CXCR4，且具有约以下任一个或小于约以下任一个的单价抗体结合亲和力(KD)：30nM、25nM、22nM、20nM、15nM或10nM。
在一些方面中，本发明还提供基于CDR接触区的抗CXCR4抗体的抗体CDR部分。CDR接触区为赋予抗体对抗原的特异性的抗体区域。一般而言，CDR接触区包括CDR及游标区(Vernier zone)中的残基位置，其经限定以维持抗体结合特定抗原的适当环结构。参见例如Makabe等人,J.Biol.Chem.,283:1156-1166,2007。本领域技术人员完全能够确定CDR接触区。
在本发明的一些方面中，一种结合趋化因子受体4(CXCR4)的分离的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含(i)VH CDR1，所述VH CDR1选自SEQ ID NO:107、113、114、108、109、115、116、117、121及122，(ii)VH CDR2，所述VH CDR2选自SEQ ID NO:162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130，及(iii)VH CDR3，所述VH CDR3选自SEQ IDNO:112及120；和/或b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含(i)VL CDR1，所述VLCDR1选自SEQ ID NO:144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151，(ii)VLCDR2，所述VL CDR2选自145、132、136及152，及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3选自SEQ ID NO:139、133、137、140及153。
在一个方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段包含重链可变(VH)CDR区，所述重链可变(VH)CDR区包含与SEQ ID NO:107、113、114、108、109、115、116、117、121、122；162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156、130、112及120至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变(VL)CDR区，所述轻链可变(VL)CDR区包含与SEQ ID NO:144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150、151、145、132、136及152、139、133、137、140及153至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在本发明的一些方面中，结合CXCR4的分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含选自以下的互补决定区：(i)VH CDR1，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:107、113、114、108、109、115、116、117、121及122所示的序列；(ii)VH CDR2，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130所示的序列；及(iii)VHCDR3，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:112或120所示的序列；和/或b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含选自以下的互补决定区：(i)VL CDR1，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150或151所示的序列；(ii)VL CDR2，所述VLCDR2包含SEQ ID NO:145、132、136或152所示的序列；及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:139、133、137、140或153所示的序列。在本发明的一些方面中，结合CXCR4的分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含(i)VL CDR1，所述VL CDR1包含序列X1SX2X3SLFNSX4X5RKNYLX6，其中X1为R或K；X2为S或A；X3为W、N或Q；X4为H或R；X5为T或F，和/或X6为A、L、N或M(SEQ ID NO:151)；(ii)VL CDR2，所述VL CDR2包含序列WASARX1S，其中X1为G或E(SEQ ID NO:152)，及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3包含序列KQSFX1LRT，其中X1为N或R(SEQ ID NO:153)；和/或b)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含(i)VH CDR1，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:107、108、109、113或114所示的序列；(ii)VHCDR2，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:157所示的序列，及(iii)VH CDR3，所述VH CDR3包含SEQID NO:112所示的序列。
在另一方面中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合趋化因子受体4(CXCR4)，并且其包含：重链可变(VH)区序列，所述重链可变(VH)区序列包含：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYY MSWVRQAPGKGLEWVX1FIRHKX2NX3X4TX5EYSTX6X7X8GRFTISRDX9SKNX10LYLQMNSLX11X12EDTAVYYCAX13DLPGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:106)，其中X1为G或S；X2为V或A；X3为G、F、K、V、T、L或I；X4为E或Y；X5为T或R；X6为W或S；X7为D或V；X8为K、T或R；X9为D或N；X10为T或S；X11为R或K；X12为A或T；且X13为K或R。
在本发明的一些方面中，一种结合趋化因子受体4(CXCR4)的分离的抗体或其抗原结合片段选自：a)重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ IDNO:107、113或114的VH CDR1、SEQ ID NO:162或128的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ IDNO:139的VL CDR3；b)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:115、116、117、121或122的VHCDR1、SEQ ID NO:118或119的VH CDR2及SEQ ID NO:120的VH CDR3，所述VL区具有SEQ IDNO:135的VL CDR1、SEQ ID NO:136的VL CDR2及SEQ ID NO:137的VL CDR3；c)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107、108、109、113或114的VH CDR1、SEQ ID NO:110或111的VHCDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:131的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:133的VL CDR3；d)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107、108、109、113或114的VH CDR1、SEQ ID NO:154或123的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3区，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VLCDR3；及e)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107、108、109、113或114的VH CDR1、SEQID NO:157的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:151的VLCDR1、SEQ ID NO:152的VL CDR2及SEQ ID NO:153的VL CDR3。
在本发明的一些方面中，一种结合趋化因子受体4(CXCR4)的分离的抗体或其抗原结合片段选自：a)重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VLCDR3；b)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:115的VH CDR1、SEQ ID NO:118的VH CDR2及SEQ ID NO:120的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:135的VL CDR1、SEQ ID NO:136的VLCDR2及SEQ ID NO:137的VL CDR3；c)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:110的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:131的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:133的VL CDR3；d)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:154的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；及e)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:157的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:151的VL CDR1、SEQ ID NO:152的VL CDR2及SEQ ID NO:153的VL CDR3。
在本发明的一些方面中，一种结合趋化因子受体4(CXCR4)的分离的抗体或其抗原结合片段选自：a)重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3的重链可变(VH)区，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQID NO:139的VL CDR3的轻链可变(VL)区；b)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VHCDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；c)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:150的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VLCDR3；d)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:141的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VLCDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；e)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VLCDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；f)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:147的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；g)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:159的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；h)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:160的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；i)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:161的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；j)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；k)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；l)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:164的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；m)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:165的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；o)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:166的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；p)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:167的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；q)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:168的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；r)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:168的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VLCDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；s)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；t)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；u)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VLCDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；v)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；及w)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR。在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ IDNO:144、145及139所示的三个CDR。在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR；及b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含来自SEQ ID NO:33的VH区的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含来自SEQ ID NO:73的VL区的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本发明的其他方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含来自SEQID NO:33的VH区的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含来自SEQ ID NO:73的VL区的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在本发明的一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段选自：a)包含SEQ ID NO:33的VH区及SEQ ID NO:73的VL区的抗体或其抗原结合片段；b)包含SEQ ID NO:13的VH区及SEQ ID NO:15的VL区的抗体或其抗原结合片段；c)包含SEQ ID NO:5的VH区及SEQ ID NO:7的VL区的抗体或其抗原结合片段；d)包含SEQ ID NO:21的VH区及SEQ ID NO:47的VL区的抗体或其抗原结合片段；及e)包含SEQ ID NO:106的VH区，及具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3的VL区的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个方面中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)SEQ ID NO:33的重链可变(VH)区；和/或b)SEQ ID NO:73的轻链可变(VL)区。
在一个方面中，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其结合CXCR4，其中所述抗体包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区含有SEQ ID NO:1、5、9、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、85、87或106中所示的序列；和/或轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区含有SEQ ID NO:3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或169中所示的序列。在一个方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含与SEQ ID NO:1、5、9、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、85、87或106至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面中，结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含与SEQ ID NO:3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或169至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在本发明的一些方面中，提供权利要求6的分离的抗体或其抗原结合片段，其选自：a)包含SEQ ID NO:33的VH区及SEQ ID NO:73的VL区的抗体或其抗原结合片段；b)包含SEQ ID NO:13的VH区及SEQ ID NO:15的VL区的抗体或其抗原结合片段；c)包含SEQ ID NO:5的VH区及SEQ ID NO:7的VL区的抗体或其抗原结合片段；d)包含SEQ ID NO:21的VH区及SEQ ID NO:47的VL区的抗体或其抗原结合片段；及e)包含SEQ ID NO:106的VH区，及具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3的VL区的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些方面中，抗体或其抗原结合片段包含：a)SEQ ID NO:33的重链可变(VH)区；和/或b)SEQ ID NO:73的轻链可变(VL)区。在特定方面中，抗体或其抗原结合片段包含由具有ATCC登录号PTA-121353的表达载体产生的重链可变(VH)区。在其他方面中，抗体或抗原结合片段包含由具有ATCC登录号PTA-121354的表达载体产生的轻链可变(VL)区。
在本发明的一些方面中，一种结合趋化因子受体4(CXCR4)的抗体或其抗原结合片段选自：a)重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；b)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQID NO:140的VL CDR3；c)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:150的VL CDR1、SEQID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；d)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:141的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；e)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQID NO:140的VL CDR3；f)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:147的VL CDR1、SEQID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；g)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:159的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；h)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:160的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQID NO:140的VL CDR3；i)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:161的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；j)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；k)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQID NO:140的VL CDR3；l)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:164的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3区，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；m)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:165的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；n)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:166的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQID NO:140的VL CDR3；o)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:167的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；p)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:168的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；q)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:168的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:138的VL CDR1、SEQ ID NO:132的VL CDR2及SEQID NO:140的VL CDR3；r)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3；s)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:158的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；t)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQID NO:139的VL CDR3；u)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:163的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3；及v)VH区及VL区，所述VH区具有SEQ IDNO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:140的VL CDR3。
在本发明的特定方面中，抗体或其抗原结合片段包含VH区及VL区，所述VH区具有SEQ ID NO:107的VH CDR1、SEQ ID NO:162的VH CDR2及SEQ ID NO:112的VH CDR3，所述VL区具有SEQ ID NO:144的VL CDR1、SEQ ID NO:145的VL CDR2及SEQ ID NO:139的VL CDR3。
如本文所述的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段对CXCR4(诸如人CXCR4)的结合亲和力(KD)为约0.002至约200nM。在本发明的一些方面中，结合亲和力为以下任一个：约200nM、约100nM、约50nM、约45nM、约40nM、约35nM、约30nM、约25nM、约20nM、约15nM、约10nM、约8nM、约7.5nM、约7nM、约6.5nM、约6nM、约5.5nM、约5nM、约4nM、约3nM、约2nM、约1nM、约500pM、约100pM、约60pM、约50pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约2pM。在本发明的一些方面中，结合亲和力低于以下任一个：约250nM、约200nM、约100nM、约50nM、约30nM、约20nM、约10nM、约7.5nM、约7nM、约6.5nM、约6nM、约5nM、约4.5nM、约4nM、约3.5nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约500pM、约100pM、约50pM、约20pM、约10pM、约5pM或约2pM。
在本发明的一些方面中，如表面等离子共振所测量，如本文所述的抗体的结合亲和力(例如单价抗体结合)为约35nM或更低。在本发明的一些方面中，如表面等离子共振所测量，如本文所述的抗体的结合亲和力(例如单价抗体结合)为约6.5nM或更低。
本发明还提供任意这些抗体的制备方法。本发明的抗体可通过本领域中已知的程序来制造。多肽可通过抗体的蛋白水解或其他降解、通过如上所述的重组方法(即单一或融合多肽)或通过化学合成来产生。通过化学合成便利地制造抗体的多肽，尤其至多约50个氨基酸的较短多肽。化学合成方法在本领域中已知且可商业化提供。例如，通过采用固相方法的自动化多肽合成仪可产生抗体。还参见美国专利第5,807,715号；第4,816,567号；及第6,331,415号。
在本发明的另一方面中，抗体可使用本领域中熟知的程序重组制得。在另一方面中，多核苷酸包含编码抗体m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10(VH)、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10.2.54、h3G10.A59、h3G10.A62、h3G10(VL)、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25或h3G10.L94D的重链和/或轻链可变区的序列。可将编码相关抗体的序列维持于宿主细胞中的载体中，然后可使宿主细胞扩展及冷冻以备将来使用。在本文中进一步描述载体(包括表达载体)及宿主细胞。
本发明还涵盖本发明抗体的scFv。单链可变区片段通过使用短的连接肽连接轻链可变区和/或重链可变区来制得(Bird等人,Science 242:423-426,1988)。连接肽的一个实例为(GGGGS)3(SEQ ID NO:89)，其在一个可变区的羧基末端与另一个可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm，具其他序列的接头已被设计出并使用(Bird等人,1988,上述)。接头应为短的柔韧的多肽且优选包含低于约20个氨基酸残基。接着接头可经修饰以用于额外功能，诸如附着药物或附着至固体载体。可以重组或合成方式来产生单链变体。为以合成方式产生scFv，可使用自动化合成仪。为重组产生scFv，含有编码scFv的多核苷酸的适合质粒可引入适合宿主细胞(真核，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核)中其他可变区的氨基末端。其他序列的接头已被设计出并使用(Bird等人,1988)。接头可经修饰以具有额外功能，诸如药物的附着或附着至固体支撑物。单链变体可为重组地或合成地生产。对于scFv的合成生产，可使用自动化合成机。对于scFv的重组生产，含有编码所述scFv的多核苷酸的适当质粒可引入适当的宿主细胞，其为真核，诸如酵母菌、植物、昆虫或哺乳类细胞，或为原核诸如大肠杆菌。编码相关scFv的多核苷酸可通过诸如多核苷酸连接的常规操纵来制得。使用本领域中已知的标准蛋白质纯化技术可分离所得scFv。
还涵盖单链抗体的其他形式，诸如双功能抗体或微型抗体。双功能抗体为二价双特异性抗体，其中重链可变(VH)及轻链可变(VL)域在单一多肽链上表达，但使用的接头过短而无法使同一链上的两个结构域之间配对，由此迫使结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak,R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。微型抗体包括与免疫球蛋白分子的铰链区及CH3结构域融合的天然抗体的VL及VH结构域。参见例如美国专利第5,837,821号。
双特异性抗体为可同时结合两个不同靶标的抗体。双特异性抗体(bsAb)及双特异性抗体片段(bsFab)可具有至少一个结合例如肿瘤相关抗原的臂及至少一个结合携有治疗剂或诊断剂的可靶向的缀合物的其他臂。多种双特异性融合蛋白可使用分子改造来产生。
例如，可使用本文所揭示的抗体来制备双特异性抗体，其为对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。本领域中已知制造双特异性抗体的方法(参见例如Suresh等人,1986,Methods in Enzymology 121:210)。传统上，重组产生双特异性抗体是基于共同表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个重链具有不同特异性(Millstein及Cuello,Nature 305,537-539(1983))。
根据制造双特异性抗体的一种方法，使具有期望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选具有包含铰链、CH2及CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区。优选使含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合物的至少一种中。将编码免疫球蛋白重链融合物及必要时免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，且共同转染至适合的宿主生物体中。这为在构建中所使用的三个多肽链的不等比率提供最好产率的实施例中调整三个多肽片段的相互比例提供了极大灵活性。然而，当等比率的至少两个多肽链的表达产生高产率或当比率并非特别重要时，可将两个或全部三个多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在本发明的一些方面中，双特异性抗体是由一臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链及另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。仅在一半双特异性分子中具有免疫球蛋白轻链的该不对称结构有利于从不需要的免疫球蛋白链组合分离所期望的双特异性化合物。该方法描述于PCT公开案WO 1994/004690中。
在另一方面中，双特异性抗体由一臂中的第一铰链区中的氨基酸修饰构成，且第一铰链区中经取代/置换的氨基酸具有与另一臂中第二铰链区中的对应氨基酸相反的电荷。该方法描述于PCT公开案第WO 2011/143545号中。
在另一方面中，双特异性抗体可在转谷氨酰胺酶存在下，在一臂中使用经改造至针对表位(例如CXCR4)的抗体的含有谷氨酰胺的肽标签，及在另一臂中使用经改造至针对第二表位的第二抗体的另一肽标签(例如含有Lys的肽标签或反应性内源性Lys)产生。此方法描述于PCT公开案第WO 2012/059882号中。
包含两个共价连接的抗体的异缀合抗体也处于本发明的范畴内。此类抗体已用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利第4,676,980号)及用于治疗HIV感染(PCT公开案第1991/000360号)。异缀合抗体可使用任何便利的交联方法制造。适合交联剂及技术为本领域中熟知，且描述于美国专利第4,676,980号中。
还可使用合成蛋白质化学的已知方法(包括那些涉及交联剂的方法)在体外制备嵌合或杂交抗体。例如，可使用二硫基交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于达成此目的的适合试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)及甲基-4-巯基丁酰亚胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
本发明涵盖表2中所示的本发明变体的抗体及多肽，包括不显著影响其特性的功能等同抗体，及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。例如，氨基酸序列可突变以获得对CXCR4具有所要结合亲和力的抗体。多肽修饰为本领域中的常规操作且无需在本文中详细描述。经修饰的多肽的实例包括具有保守性序列修饰的多肽。如本文中所用，术语“保守性序列修饰”意指并不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括不显著不利地改变功能活性或使多肽对其配体的亲和力成熟(增强)的氨基酸取代、添加及缺失，或化学类似物的使用。
可利用本领域中已知的标准技术，诸如定点诱变及PCR介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体中。保守性氨基酸取代为其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行定义。所述家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，本发明抗体的CDR区内的一或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，且可使用本文所述的功能测定测试改变的抗体的保留功能(即以上阐述的功能)。
氨基酸序列插入物包括长度为一个残基至含有一百个或更多残基的多肽范围内的氨基和/或羧基末端融合物，以及具有单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N末端甲硫胺酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其他插入型变体包括与酶或多肽的抗体的N或C末端的融合物，这增加抗体在血液循环中的半衰期。
取代型变体在抗体分子中移除至少一个氨基酸残基且在其位置处插入不同残基。最引人关注的取代型诱变位点包括高变区，但还涵盖FR改变。保守性取代展示于表5中的标题“保守性取代”下。若所述取代导致生物活性变化，则可引入更实质变化(在表5中命名为“例示性取代”，或如下文参考氨基酸类别进一步描述)，且筛选产物。
表5
氨基酸取代
Figure BDA0002752729640000471
对抗体生物特性的实质修饰可通过选择取代来实现，所述取代以下作用方面显著不同：维持(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构象；(b)分子靶标位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链体积。天然存在的氨基酸残基基于常见侧链特性分组：
(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)极性，无电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电)：Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；及
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
通过将这些类别中的一成员交换成另一类别来制造非保守性取代。
还可取代任何未参与维持抗体的适当构象的半胱氨酸残基，一般以丝氨酸来取代以提高分子的氧化稳定性且防止异常的交联。相反地，可将半胱氨酸键添加至抗体中以提高其稳定性，尤其在抗体为诸如Fv片段的抗体片段时。
氨基酸修饰的范围可自改变或修饰一或多个氨基酸，至完全再设计诸如可变区的区域。可变区的改变可改变结合亲和力和/或特异性。在本发明的一些方面中，在CDR结构域内进行不超过一个至五个保守性氨基酸取代。在本发明的其他方面中，在CDR结构域内进行不超过一个至三个保守性氨基酸取代。
修饰还包括糖基化及非糖基化多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，诸如用不同糖的糖基化、乙酰化及磷酸化。抗体在其恒定区中的保守位置处糖基化(Jefferis及Lund,Chem.Immunol.65:111-128(1997)；Wright及Morrison,TibTECH 15:26-32(1997))。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等人,Mol.Immunol.32:1311-1318(1996)；Wittwe及Howard,Biochem.29:4175-4180(1990))及糖蛋白的部分之间的分子内相互作用，其可影响糖蛋白的构象及呈现的三维表面(Jefferis及Lund,上述；Wyss及Wagner,CurrentOpin.Biotech.7:409-416(1996))。寡糖还可用以使既定糖蛋白基于特异性识别结构靶向某些分子。还已报导抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具体地，已报导具有经四环素调节的β(1,4)-N-乙酰基葡糖氨基转移酶III(GnTIII)(催化二等分GlcNAc的形成的糖基转移酶)表达的CHO细胞具有提高的ADCC活性(Umana等人,Mature Biotech 17:176-180(1999))。
抗体的糖基化通常为N连接型或O连接型。N连接型是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸及天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)为识别序列，用于碳水化合物部分酶促附着于天冬酰胺侧链。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在产生潜在糖基化位点。O连接型糖基化是指蔗糖N-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖中的一种附着于羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，不过还可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
在抗体中添加糖基化位点方便地通过改变氨基酸序列，以使其含有上述三肽序列中的一或多种来实现(针对N连接型糖基化位点)。所述改变还可通过在原始抗体的序列中添加一或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行取代来实现(针对O连接型糖基化位点)。
还可在不改变根本核苷酸序列的情况下改变抗体的糖基化模式。糖基化很大程度上取决于用以表达抗体的宿主细胞。因为用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白(例如抗体)的细胞类型很少为天然细胞，所以可预期抗体的糖基化模式变化(参见例如Hse等人,J.Biol.Chem.272:9062-9070(1997))。
除宿主细胞的选择之外，在抗体重组产生期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基调配、培养物密度、氧合作用、pH值、纯化方案及其类似因素。已提出各种方法来改变在特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括引入或过度表达某些参与寡糖产生的酶(美国专利第5,047,335号；第5,510,261号及第5,278,299号)。糖基化或某些类型糖基化可以酶促方式从糖蛋白移除，例如使用内切糖苷酶H(内切H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。另外，重组宿主细胞可经基因改造成在加工某些类型的多糖上有缺陷。这些及类似技术为本领域中熟知。
本发明涵盖的本文中抗体的另一修饰为聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以例如增加所述抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，通常使所述抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，诸如PEG的反应性酯或醛衍生物，在使一或多个PEG基团附着于所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用的术语“聚乙二醇”意欲涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在本发明的某些方面中，待聚乙二醇化的抗体为去糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域中已知，且可应用于本发明的抗体。参见例如Nishimura等人的EP 0154316及Ishikawa等人的EP0401384。
本发明不限于传统抗体且包括抗体片段及抗体模拟物的使用。各种抗体片段及抗体模拟技术已研发且为本领域中已知。虽然多种这些技术，诸如结构域抗体、纳米抗体及单抗体利用传统抗体结构的片段或其他修饰，但还存在替代性技术，诸如采用结合结构的亲和抗体、DARPin、高亲和性多聚体、抗运载蛋白及万能抗体，其虽然模拟传统的抗体结合，但由独特机制产生且经由独特机制起作用。
结构域抗体(dAb)为抗体的最小功能结合单元，对应于人抗体的重(VH)或轻(VL)链的可变区。Domantis已研发出完全人类VH及VL dAb的一系列大型及高度功能文库(各文库中超过一百亿不同序列)，且使用这些文库选择对治疗靶标具有特异性的dAb。与许多常规抗体相比，结构域抗体在细菌、酵母及哺乳动物细胞系统中表达良好。结构域抗体及其产生方法的进一步细节可参考以下获得：美国专利第6,291,158号、第6,582,915号、第6,593,081号、第6,172,197号及第6,696,245号；美国专利申请案第2004/0110941号；欧洲专利申请案第1433846号及欧洲专利0368684及0616640、WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及WO03/002609，每一个以全文引用的方式并入本文中。
纳米抗体为来源于抗体的治疗蛋白质，其含有天然存在的重链抗体的独特结构及功能特性。这些重链抗体含有单一可变域(VHH)及两个恒定域(CH2及CH3)。克隆及分离的VHH结构域为具有原始重链抗体的完整抗原结合能力的十分稳定的多肽。纳米抗体与人抗体的VH结构域具有高度同源性且可进一步进行人源化而无任何活性损失。此外，纳米抗体组合常规抗体的优点与类似常规抗体的小分子药物的重要特征。纳米抗体展示高靶标特异性、对其靶标的高亲和力及低固有毒性。纳米抗体通过单一基因编码且在几乎所有的原核及真核宿主中有效产生，所述原核及真核宿主为例如大肠杆菌(参见例如美国专利第6,765,087号，其以全文引用的方式并入本文中)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))及酵母(例如酵母(Saccharomyce)、克鲁维酵母(Kluyveromyce)、汉森酵母(Hansenula)或毕赤酵母(Pichia))(参见例如美国专利第6,838,254号，其以全文引用的方式并入本文中)。
在一些方面中，本发明提供单抗体的使用。单抗体为另一抗体片段技术，基于IgG4抗体的铰链区的移除。缺失铰链区会产生尺寸基本上为传统IgG4抗体的一半且具有单价结合区而非IgG4抗体的二价结合区的分子。还熟知IgG4抗体为惰性的，因而不与免疫系统相互作用，这有利于治疗不希望有免疫反应的疾病，且该益处传给单抗体。例如，单抗体可用以抑制或沉默但不杀死其结合的细胞。此外，单抗体结合癌细胞不刺激其增殖。此外，因为单抗体尺寸为传统IgG4抗体的一半，所以其可显示在较大实体肿瘤上更优的分布，具有潜在有利的功效。单抗体以类似于全IgG4抗体的速率从身体清除，且能够以与全抗体类似的亲和力结合其抗原。单抗体的进一步细节可参考以全文引用的方式并入本文中的PCT公开案WO2007/059782获得。
在一些方面中，本发明涵盖亲和抗体分子。亲和抗体分子为新的亲和蛋白质类别，其基于来源于葡萄球菌蛋白A的一个IgG结合域的58个氨基酸残基的蛋白质结构域。这三个螺旋束结构域已用作组合噬菌粒文库构建的骨架，从所述文库，可使用噬菌体展示技术选择靶向期望分子的亲和抗体变体(Nord K,Gunnettsson E,Ringdahl J,Stahl S,Uhlen M,Nygren PA,Binding proteins selected from combinatorial libraries of anα-helical bacterial receptor domain,Nat Biotechnol 15 772-7(1997)；Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligandsfrom combinatorial engineering of protein A,Eur J Biochem.,269 2647-55(2002))。亲和抗体分子的简单坚固结构加上其低分子量(6kDa)，使得其适合于各种应用，例如作为检测试剂(Ronmark J,Hansson M,Nguyen T等人,Construction andcharacterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli,JImmunol Methods,261 199-211(2002))，以及抑制受体相互作用(Sandstorm K,Xu Z,Forsberg G,Nygren PA,Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by aCD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering,Protein Eng.,16 691-7(2003))。亲和抗体及其产生方法的进一步细节可通过参考以全文引用的方式并入本文中的美国专利第5,831,012号来获得。
适用于本发明的情形的另一抗体模拟物技术为高亲和性多聚体。高亲合性多聚体是通过体外外显子改组及噬菌体展示，产生具有结合及抑制特性的多结构域蛋白质，而从人类胞外受体结构域大家族演化而来。连接多个独立结合域已显示会产生亲合力且使得亲和力及特异性相较于常规单一表位结合蛋白得到改良。其他潜在优点包括在大肠杆菌中简单且有效产生多靶标特异性分子、热稳定性及对蛋白酶的抗性提高。已获得针对多种靶标的具有低于纳摩尔亲和力的高亲和性多聚体。涉及高亲和性多聚体的其他信息可见于美国专利申请公开案第2006/0286603号、第2006/0234299号、第2006/0223114号、第2006/0177831号、第2006/0008844号、第2005/0221384号、第2005/0164301号、第2005/0089932号、第2005/0053973号、第2005/0048512号、第2004/0175756号，均以全文引用的方式并入本文中。
万能抗体为可用于本发明的情形的另一抗体模拟物技术。万能抗体为3-5kDa的具有>15％半胱氨酸的小蛋白质，所述半胱氨酸形成高二硫化物密度骨架，替换典型蛋白质所具有的疏水性核心。用少数二硫化物替换构成疏水性核心的大量疏水性氨基酸使得蛋白质更小、更具亲水性(聚集及非特异性结合更少)、对蛋白酶及热更具抗性且具有更低T细胞表位密度，因为最有助于MHC呈现的残基为疏水性的。熟知所有这些特性均影响免疫原性，且在一起，预期其引起免疫原性大幅度减少。涉及万能抗体的其他信息可见于以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请公开案第2007/0191272号中。
以上提供的抗体片段及抗体模拟物技术的详细描述并非意在作为可用于本说明书的情形中的所有技术的全面清单。例如，以及无意限制，多种其他技术可用于本发明的情形中，包括替代性的基于多肽的技术，诸如如Qui等人,Nature Biotechnology,25(8)921-929(2007)(其以引用的方式并入本文中)中概述的互补决定区的融合物；以及基于核酸的技术，诸如美国专利第5,789,157号；第5,864,026号；第5,712,375号；第5,763,566号；第6,013,443号；第6,376,474号；第6,613,526号；第6,114,120号；第6,261,774号及第6,387,620号(均以引用的方式并入本文中)中所述的RNA适体技术。
其他修饰方法包括使用本领域中已知的偶联技术，包括(但不限于)酶促方式、氧化取代及螯合。可例如针对免疫分析的标记附着使用修饰。经修饰的多肽使用本领域中的已建立程序制得，且可使用本领域中已知的标准分析来筛选，其中一些分析在下文及实例中描述。
在本发明的一些方面中，抗体包含经修饰的恒定区，诸如具有增加的对人类Fcγ受体的亲和力，免疫惰性或部分惰性，例如不触发补体介导的溶解，不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或失活巨噬细胞的恒定区；或具有减少的以下任一或多个方面的活性(与未经修饰的抗体相比)的恒定区：触发补体介导的溶解、刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或活化小神经胶质细胞。恒定区的不同修饰可用以达成效应功能的最好水准和/或组合。参见例如Morgan等人,Immunology86:319-324(1995)；Lund等人,J.Immunology 157:4963-9 157:4963-4969(1996)；Idusogie等人,J.Immunology 164:4178-4184,(2000)；Tao等人,J.Immunology 143:2595-2601(1989)；及Jefferis等人,Immunological Reviews 163:59-76(1998)。在本发明的一些方面中，恒定区如以下中所描述进行修饰：Eur.J.Immunol.,29:2613-2624(1999)；PCT公开案第WO1999/058572号。在本发明的其他方面中，抗体包含含有以下突变的人类重链IgG2恒定区：A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2序列)。Eur.J.Immunol.,29:2613-2624(1999)。在本发明的其他方面中，针对N连接的糖基化将恒定区去糖基化。在本发明的一些方面中，针对N连接的糖基化，通过使糖基化的氨基酸残基或作为恒定区中N-糖基化识别序列的一部分的侧翼残基突变将恒定区去糖基化。例如，N-糖基化位点N297可突变为A、Q、K或H。参见Tao等人,J.Immunology 143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人,Immunological Reviews 163:59-76(1998)。在本发明的一些方面中，针对N连接的糖基化将恒定区去糖基化。以酶促方式(诸如通过酶PNGase来移除碳水化合物)或通过在糖基化缺乏宿主细胞中表达，可针对N连接的糖基化将恒定区去糖基化。
其他抗体修饰包括已如PCT公开案第WO 99/58572号中所述来修饰的抗体。除针对靶标分子的结合域外，这些抗体还包含具有实质上与人类免疫球蛋白重链的恒定域的全部或部分同源的氨基酸序列的效应结构域(effector domain)。这些抗体能够结合靶标分子而不触发显著的补体依赖性溶解或细胞介导的靶标破坏。在本发明的一些方面中，效应结构域能够特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些效应结构域通常基于来源于两个或两个以上人类免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以此方式修饰的抗体尤其适用于慢性抗体疗法中以避免常规抗体疗法的炎症及其他不良反应。
本发明包括亲和力成熟的抗体。例如，亲和力成熟的抗体可通过本领域中已知的程序产生(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Barbas等人,ProcNat.Acad.Sci,USA91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.,154(7):3310-9(1995),Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)；及PCT公开案第WO2004/058184号)。
以下方法可用于调节抗体的亲和力且用于表征CDR。一种表征抗体的CDR和/或改变(诸如提高)诸如抗体的多肽的结合亲和力的方法称为“文库扫描诱变(libraryscanning mutagenesis)”。一般而言，文库扫描诱变如下工作：使用本领域认可的方法，将CDR中的一或多个氨基酸位置经两个或两个以上(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸置换。这产生克隆的小文库(在本发明的一些方面中，每个分析的氨基酸位置一个)，每一文库具有两个或两个以上成员的复杂性(若每一位置经两个或两个以上氨基酸取代)。一般而言，所述文库还包括包含天然(未经取代)氨基酸的克隆。将来自各文库的少量克隆(例如约20-80个克隆(视文库的复杂性而定))针对其对靶标多肽(或其他结合靶标)的结合亲和力筛选，且鉴别具有增大、相同、减小或无结合的候选物。在本领域中熟知测定结合亲和力的方法。可使用BiacoreTM表面等离子共振分析来测定结合亲和力，所述分析检测约2倍或更大的结合亲和力差异。当起始抗体已以相对较高亲和力结合时，例如约10nM或10nM以下的KD，BiacoreTM尤其适用。在本文实例中描述使用BiacoreTM表面等离子共振的筛选。
在另一方面中，本发明涉及结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有低于100nM的EC50。在又一方面中，本发明涉及结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有低于50nM的EC50。在又一方面中，本发明涉及结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有低于1nM的EC50。术语“EC50”是指在体外抑制测试抗体、其抗原结合片段或抗体-药物缀合物最大作用的50％所需的浓度。术语“IC50”含义被定义为“50％抑制浓度”。
可使用Kinexa Biocensor、闪烁迫近分析、ELISA、ORIGEN免疫分析(IGEN)、萤光猝灭、萤光转移和/或酵母展示来测定结合亲和力。还可使用适合的生物测定来筛选结合亲和力。
在本发明的一些方面中，CDR中的每一氨基酸位置使用本领域认可的诱变方法(其中一些在本文中描述)经所有20种天然氨基酸置换(在一些实施例中一次一个)。这产生克隆的小文库(在本发明的一些方面中，每个分析的氨基酸位置一个)，每一文库具有20个成员的复杂性(若每一位置经所有20种氨基酸取代)。
在本发明的一些方面中，待筛选的文库包含可在相同CDR中或在两个或两个以上CDR中的两个或两个以上位置的取代。因此，文库可包含在一个CDR中的两个或两个以上位置的取代。文库可包含在两个或两个以上CDR中的两个或两个以上位置的取代。文库可包含在3、4、5个或5个以上位置的取代，所述位置存在于二、三、四、五或六个CDR中。使用低冗余密码子来制备所述取代。参见例如Balint等人,Gene 137(1):109-18(1993)的表2。
CDR可为CDRH3和/或CDRL3。CDR可为CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中的一或多种。CDR可为Kabat CDR、Chothia CDR或延伸CDR。
可对具有改良结合的候选物测序，由此鉴别引起亲和力提高(也称为取代“改良”)的CDR取代突变体。还可对结合的候选物测序，由此鉴别保留结合的CDR取代。
可进行多轮筛选。例如，具有改良结合的候选物(各包含在一或多个CDR的一或多个位置的氨基酸取代)还适用于设计在各改良CDR位置(即，取代突变体展示改良的结合的CDR中的氨基酸位置)含有至少原始及经取代氨基酸的第二文库。以下进一步讨论此文库的制备及筛选或选择。
文库扫描诱变还提供一种表征CDR的方式，就具有改良结合、相同结合、减小结合或无结合的克隆的频率而言，还提供与各氨基酸位置对抗体-抗原复合物稳定性的重要性有关的信息。例如，若CDR的位置在改变为所有20种氨基酸时保留结合，则将所述位置鉴别为不太可能为抗原结合所需的位置。相反地，若CDR的位置在仅小百分比的取代中保留结合，则将所述位置鉴别为对CDR功能重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生涉及CDR中可改变为多种不同氨基酸(包括所有20种氨基酸)的位置及CDR中不能改变或仅能改变为少数氨基酸的位置的信息。
可在第二文库中组合具有改良亲和力的候选者，所述第二文库包括改良的氨基酸、在该位置处的原始氨基酸，且视所要或使用所要筛选或选择方法所允许的文库的复杂性而定，其可进一步包括在该位置处的额外取代。另外，若需要，则可将相邻氨基酸位置随机化为至少两种或两种以上的氨基酸。相邻氨基酸的随机化可允许突变CDR中的额外构象灵活性，其又可允许或促进引入较大数目的改良突变。文库还可包含在第一轮筛选中未展示改良亲和性的位置的取代。
使用本领域中已知的任何方法，包括使用BiacoreTM表面等离子共振分析的筛选及使用在选择技术中已知的任何方法(包括噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示)的选择来针对具有改良和/或改变结合亲和力的文库成员筛选或选择第二文库。
本发明还涵盖包含来自本发明抗体的一或多个片段或区域的融合蛋白。在本发明的一些方面中，提供融合多肽，其包含SEQ ID NO:1、5、9、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、85、87及106中所示的VH区的至少10个相邻氨基酸；和/或SEQ ID NO:3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83及169中所示的VL区的至少10个氨基酸。在本发明的各种方面中，提供融合多肽，其包含可变轻链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个相邻氨基酸和/或可变重链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个相邻氨基酸。在另一方面中，融合多肽包含如表2中任一序列对中所示的轻链可变区和/或重链可变区。例如，SEQ ID NO:3与5；3与9；7与5；11与13；15与13；19与17；69与31；49与37；及33与73。在一些方面中，融合多肽包含一或多个CDR。在其他方面中，融合多肽包含H3(VH CDR3)和/或CDRL3(VL CDR3)。出于本发明的目的，融合蛋白含有一或多种抗体及其在天然分子中未附着的另一氨基酸序列，例如异源序列或来自另一区域的同源序列。例示性异源序列包括(但不限于)“标签”，诸如FLAG标签或6His标签。标签在本领域中是熟知的。
可通过本领域中已知的方法，例如以合成或重组方式来产生融合多肽。尽管本发明的融合蛋白还可通过本领域中已知的其他方式，例如化学合成来制备，但通常使用本文所述的重组方法，通过制备表达编码它们的多核苷酸来制造本发明的融合蛋白。
本发明还提供包含抗体与有助于偶联于固体支撑物(诸如生物素或抗生素蛋白)的试剂结合(例如连接)的组合物。为简单起见，通常提及抗体时，一般认为这些方法适用于抗CXCR4抗体或其抗原结合片段、本文描述的实施例中的任一个。结合一般是指连接如本文所述的这些组分。所述连接(其一般至少出于施用而将这些组分固定于紧密结合中)可以多种方式达成。例如，在各拥有能够与另一种反应的取代基时，在试剂与抗体之间的直接反应是可能的。例如，诸如氨基或巯基的亲核基团一方面能够与诸如酸酐或酰基卤的含羰基基团反应或另一方面能够与含有良好离去基团(例如卤基)的烷基反应。
本发明还提供编码本发明抗体的分离的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的载体及宿主细胞。
因此，本发明提供包含编码以下任一种的多核苷酸的多核苷酸(或组合物，包括药物组合物)：m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62、h3G10.L94D或能够结合CXCR4的任何片段或其部分。
在一些方面中，本发明提供编码所述抗体任一种(包括抗体片段)的多核苷酸及本文所述的多肽，诸如具有减弱或增强的效应功能的抗体及多肽。多核苷酸可通过本领域中已知的程序制造及表达。
在另一方面中，本发明提供包含任何本发明多核苷酸的组合物(诸如药物组合物)。在一些方面中，组合物包含含有编码本文所述的任一抗体的多核苷酸的表达载体。例如，组合物包含SEQ ID NO:2与4或SEQ ID NO:6与8或SEQ ID NO:86与68中所示的多核苷酸中的一或两种。
本文中进一步描述表达载体及多核苷酸组合物的施用。
在其他方面中，本发明提供一种制造本文所述的任一多核苷酸的方法。
本发明还涵盖与任何这些序列互补的多核苷酸。多核苷酸可为单链(编码或反义)或双链且可为DNA(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子且以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子及不含有内含子的mRNA分子。其他编码或非编码序列可(但不必需)存在于本发明的多核苷酸内，且多核苷酸可(但不必需)与其他分子和/或支撑材料连接。
多核苷酸可包含天然序列(即编码抗体或其一部分的内源序列)或可包含此类序列的变体。多核苷酸变体含有一或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得被编码多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子不减小。一般可如本文中所述来评定对经编码多肽的免疫反应性的影响。变体优选显示与编码天然抗体或其一部分的多核苷酸序列至少约70％相同性、更优选至少约80％相同性、但更优选至少约90％相同性且最好至少约95％相同性。
当如下所述针对最大相同性进行比对时若两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸的序列相同，则所述两个序列称作“相同”。两个序列之间的比较通常是通过将所述序列在比较窗口上比较以鉴别及比较序列类似性的局部区域来进行。如本文中所用的“比较窗口”是指至少约20个邻接位置的区段(通常30至约75个，40至约50个)，其中在一序列与具有相同数目的邻接位置的参考序列进行最佳比对之后，所述两个序列可进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)的Lasergene套件的Megalign程序，使用默认参数来进行。此程序体现以下参考文献中所述的若干比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas ofProtein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷,增刊3,第345-358页；Hein J.,1990,Unified Approach toAlignment and Phylogenes第626-645页Methods in Enzymology第183卷,AcademicPress,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,CABIOS 5:151-153(1989)；Myers,E.W.及Muller W.,CABIOS 4:11-17(1988)；Robinson,E.D.,Comb.Theor.11:105(1971)；Santou,N.,Nes,M.,Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of NumericalTaxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730(1983)。
优选地，“序列相同性的百分比”是通过将两个经最佳比对的序列在至少20个位置的比较窗口上比较来确定，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含20％或更少、通常5％至15％或10％至12％的添加或缺失(即缺口)用于使两个序列最佳比对。通过以下方法来计算百分比：确定两个序列中出现一致核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到相匹配的位置的数目，用相匹配的位置的数目除以参考序列中的位置总数(即窗口尺寸)且结果乘以100，从而得到序列相同性的百分比。
变体还可(或者)实质上与天然基因或其一部分或补体同源。这些多核苷酸变体能够在适度严格条件下与编码天然抗体(或互补序列)的天然存在的DNA序列杂交。
适合的“适度严格条件”包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5X SSC下杂交过夜；接着在65℃下用含有0.1％SDS的2X、0.5X及0.2XSSC中的每一种洗涤两次，历时20分钟。
如本文所用，“高度严格条件”或“高严格性条件”为以下条件：(1)采用低离子强度及高温用于洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，在50℃下；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲剂pH 6.5及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50％(v/v)甲酰胺，在42℃下；或(3)采用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x登哈特溶液(Denhardt's solution)、超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，在42℃下，以及在42℃下在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)及50％甲酰胺中在55℃下洗涤，接着由含有EDTA的0.1x SSC、在55℃下组成的高严格性洗涤。本领域技术人员将知道如何视需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度及其类似物的因素。
本领域技术人员应了解，由于遗传密码子的简并，因此存在多种编码如本文中所述的多肽的核苷酸序列。一些这些多核苷酸具有与任何天然基因的核苷酸序列的最小同源性。尽管如此，由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸特定涵盖于本发明中。此外，包含本文中所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因处于本发明的范畴内。等位基因为由于诸如核苷酸缺失、添加和/或取代的一或多种突变而改变的内源性基因。所得mRNA及蛋白质可(但并不必须)具有改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴别。
使用化学合成、重组方法或PCR可获得本发明的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法为本领域中所熟知且在本文中不需要详细描述。本领域技术人员可使用本文中所提供的序列及商业DNA合成仪来产生所需DNA序列。
为使用重组方法制备多核苷酸，包含所要序列的多核苷酸可插入适合载体中，且继而载体可引入适合宿主细胞中进行复制及扩增，如本文中进一步论述。多核苷酸可通过本领域中已知的任何方式插入宿主细胞中。细胞通过利用直接吸收、内吞作用、转染、F-配对或电穿孔将外源性多核苷酸引入来转化。一旦引入，外源性多核苷酸可作为未整合载体(诸如质粒)维持在细胞内或整合至宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可通过本领域内熟知的方法从宿主细胞分离。参见例如Sambrook等人,1989。
或者，PCR允许DNA序列复制。PCR技术在本领域中熟知且描述于美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号及第4,683,202中以及PCR:The Polymerase ChainReaction,Mullis等人编辑,Birkauswer Press,Boston,1994。
通过使用在适当载体中的分离DNA且将其插入适合宿主细胞中来获得RNA。当将细胞复制物及DNA转录于RNA中时，可接着使用本领域技术人员所熟知的方法分离RNA，例如如Sambrook等人,1989,上述中所阐明。
适合克隆载体可根据标准技术构建，或可选自大量在本领域中可获得的克隆载体。虽然所选的克隆载体可根据意欲使用的宿主细胞变化，但适用的克隆载体一般将能够自我复制，可具有特定限制核酸内切酶的单一靶标，和/或可载有可用于选择含有载体的克隆的标记物的基因。适合实例包括质粒及细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBSSK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA及穿梭载体，诸如pSA3及pAT28。这些及许多其他克隆载体可从诸如BioRad、Strategene及Invitrogen的商业供应商获得。
表达载体一般为含有根据本发明的多核苷酸的可复制的多核苷酸构建体。其表明表达载体必须在宿主细胞中可复制为附加体(episome)或染色体DNA的组成部分。适合表达载体包括(但不限于)质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒)、粘粒及PCT公开案第WO 87/04462号中所揭示的表达载体。载体组分一般可包括(但不限于)以下一或多种：信号序列；复制起点；一或多种标记物基因；适合转录控制元件(诸如启动子、增强子及终止子)。对于表达(即翻译)，还通常需要一或多种翻译控制元件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点及终止密码子。
通过大量适当方式中的任一种，包括电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂质转染(lipofection)；及感染(例如，其中载体为诸如牛痘病毒的传染剂)，可将含有相关多核苷酸的载体引入宿主细胞中。引入载体或多核苷酸的选择将常常视宿主细胞的特征而定。
本发明还提供包含本文所述的任一多核苷酸的宿主细胞。为达成分离编码相关抗体、多肽或蛋白质的基因的目的，任何能够过度表达异源DNA的宿主细胞均可使用。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括(但不限于)COS、HeLa及CHO细胞。还参见PCT公开案第WO87/04462号。适合的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌或枯草芽胞杆菌(B.subtillis))及酵母(诸如啤酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。宿主细胞优选以比宿主细胞中对应相关内源性抗体或蛋白质(若存在)的水准高约5倍、更优选高10倍、甚至更优选高20倍的水准来表达cDNA。筛选宿主细胞与CXCR4或CXCR4结构域(例如结构域1-4)的特异性结合通过免疫分析或FACS实现。可鉴别过度表达相关抗体或蛋白质的细胞。
抗CXCR4抗体-药物缀合物
本发明提供式Ab-(T-L-D)的抗体-药物，其中a)Ab为结合CXCR4的抗体或其抗原结合片段，b)T为任选可包括的含有酰基供体谷氨酰胺的标签；c)L为接头；且d)D为药物。还提供此类抗体-药物缀合物的制备及制造方法，及其在临床应用中的用途。“抗体-药物缀合物”或“ADC”是指包括结合CXCR4且与药物结合的抗体衍生物的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些方面中，Ab选自：a)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、162及112的CDR，所述VL区含有SEQ ID NO:144、145及139的CDR；b)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:115、118及120的CDR，所述VL区含有SEQ ID NO:135、136及137的CDR；c)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、110及112的CDR，所述VL区含有SEQ ID NO:131、132及133的CDR；d)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、154及112的CDR，所述VL区含有SEQ ID NO:138、132及139的CDR；e)包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、157及112的CDR，所述VL区含有SEQID NO:151、152及153的CDR；f)包含SEQ ID NO:33的VH区及SEQ ID NO:73的VL区的抗体或其抗原结合片段；g)包含SEQ ID NO:13的VH区及SEQ ID NO:15的VL区的抗体或其抗原结合片段；h)包含SEQ ID NO:5的VH区及SEQ ID NO:7的VL区的抗体或其抗原结合片段；及i)包含SEQ ID NO:21的VH区及SEQ ID NO:47的VL区的抗体或其抗原结合片段。
用于将细胞毒性剂或其他治疗剂与抗体缀合的方法已在各种公开案中描述。例如，化学修饰可经由赖氨酸侧链胺或经由通过还原链间二硫键活化的半胱氨酸巯基在抗体中进行，以使缀合反应发生。参见例如Tanaka等人,FEBS Letters 579:2092-2096,(2005)及Gentle等人,Bioconjug.Chem.15:658-663,(2004)。还已描述在以限定化学计量进行特定药物缀合的抗体特定位点经改造的反应性半胱氨酸残基。参见例如Junutula等人,Nature Biotechnology,26:925-932,(2008)。使用含有酰基供体谷氨酰胺的标签和/或引起反应性的内源性谷氨酰胺(即能够作为酰基供体形成共价键)通过多肽改造在转谷氨酰胺酶及胺(例如包含反应性胺或附着于反应性胺的细胞毒性剂)存在下的缀合还描述于国际专利申请案第PCT/IB2011/054899(WO2012/059882)号；Strop等人,Chem.Biol.20(2):161-167(2013)；及Farias等人,Bioconjug.Chem.25(2):245-250(2014)。
适合缀合程序的一个实例依赖于酰肼及其他亲核试剂与通过抗体上天然存在的碳水化合物氧化所产生的醛的缀合。含有腙的缀合物可通过引入的提供所要药物释放特性的羰基制得。缀合物还可用在一端具有二硫化物、在中间具有烷基链且在另一末端具有肼衍生物的接头制得。蒽环霉素为可使用此技术结合抗体的细胞毒素的一个实例。
在本发明的其他方面中，抗CXCR4抗体或其抗原结合片段或如本文所述的缀合物包含在抗体特定位点(例如羧基端、氨基端或在抗CXCR4抗体中的另一位点)经改造的含有酰基供体谷氨酰胺的标签(T)。在本发明的一些方面中，标签包含氨基酸谷氨酰胺(Q)或氨基酸序列LLQGG(SEQ ID NO:171)、GGLLQGG(SEQ ID NO:90)、LLQGA(SEQ ID NO:91)、GGLLQGA(SEQ ID NO:92)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO:93)、LLQGPG(SEQ ID NO:94)、LLQGPA(SEQ ID NO:95)、LLQGP(SEQ ID NO:96)、LLQP(SEQ ID NO:97)、LLQPGK(SEQ ID NO:98)、LLQGAPGK(SEQ ID NO:99)、LLQGAPG(SEQ ID NO:100)、LLQGAP(SEQ ID NO:101)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:172)、LLQGPP(SEQ ID NO:173)、LLQX1X2X3X4X5(其中X1为G或P，其中X2为A、G、P或不存在，其中X3为A、G、K、P或不存在，其中X4为K、G或不存在，且其中X5为K或不存在(SEQID NO:102)或LLQX1X2X3X4X5(其中X1为任何天然存在的氨基酸且其中X2、X3、X4及X5为任何天然存在的氨基酸或不存在)(SEQ ID NO:103)。在本发明的特定方面中，T选自SEQ ID NO:91、92及102。
在本发明的其他方面中，提供一种分离的抗体，其包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签及在抗体位置222、340或370(EU编号方案)的氨基酸修饰，其中修饰为氨基酸缺失、插入、取代、突变或其任何组合。例如，氨基酸修饰为K222R、K340R及K370R。
在本发明的一些方面中，抗体或抗原结合片段的缀合物缀合于药物，其中所述药物选自：细胞毒性剂、免疫调节剂、显像剂、治疗剂(例如治疗蛋白质)、生物聚合物及寡核苷酸。
在本发明的一些方面中，药物可连接或结合如本文所述的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段以将药物靶向性的局部递送至肿瘤(例如表达CXCR4的肿瘤)。在本发明的特定方面中，药物为细胞毒性剂。细胞毒性剂的实例包括(但不限于)蒽环霉素、奥瑞他汀、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素、引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体、美登素、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮杂卓二聚体、紫杉烷、长春花生物碱、特吡莱辛、哈米特林、斯考他汀、普拉地内酯、卡奇霉素及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。在本发明的一些方面中，蒽环霉素来源于细菌链霉菌属(Strepomyce)且已用于治疗各种癌症，诸如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌及肺癌。例示性蒽环霉素包括(但不限于)柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(即阿霉素(adriamycin))、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone)。
多拉司他汀及其肽类似物及衍生物奥瑞他汀为高度有效的抗有丝分裂剂，其已展示具有抗癌及抗真菌活性。参见例如美国专利第5,663,149号及Pettit等人,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965(1998)。例示性多拉司他汀及奥瑞他汀包括(但不限于)多拉司他汀10、奥瑞他汀E、奥瑞他汀EB(AEB)、奥瑞他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基奥瑞他汀D或单甲基多拉司他汀10)、MMAF(单甲基奥瑞他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基奥瑞他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脯氨酸-去甲麻黄碱)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)及其他新颖奥瑞他汀(诸如美国公开案第20130129753号中所述的奥瑞他汀)。
在本发明的特定方面中，奥瑞他汀选自：0101(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)、MMAD(单甲基奥瑞他汀D或单甲基多拉司他汀10及8261(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。
在本发明的一些方面中，奥瑞他汀为具有以下结构的0101(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0002752729640000561
在其他方面中，奥瑞他汀为具有以下结构的3377(N,2-二甲基丙胺酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0002752729640000571
在本发明的其他方面中，奥瑞他汀为具有以下结构的0131(2-甲基-L-脯胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0002752729640000572
在其他方面中，奥瑞他汀为具有以下结构的0121(2-甲基-L-脯胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0002752729640000573
在其他方面中，奥瑞他汀为具有以下结构的8261(8261 2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
Figure BDA0002752729640000574
喜树碱为抑制酶拓扑异构酶I的细胞毒性喹啉生物碱。喜树碱及其衍生物的实例包括(但不限于)托泊替康(topotecan)及伊立替康(irinotecan)及其代谢物，诸如SN-38。
考布他汀(Combretastatin)为在肿瘤中具有脉管破坏特性的天然苯酚。例示性考布他汀及其衍生物包括(但不限于)考布他汀A-4(CA-4)及奥瑞布林(ombrabulin)。
多卡米星为具有细胞毒性效能的DNA烷基化剂。参见Boger及Johnson,PNAS 92:3642-3649(1995)。例示性多卡米星包括(但不限于)多卡米星A、多卡米星B1、多卡米星B2、多卡米星C1、多卡米星C2、多卡米星D、多卡米星SA及CC-1065。烯二炔为特征在于九元及十元环或存在具有共轭的三-双-三键的环状系统的一类抗肿瘤细菌产品。例示性烯二炔包括(但不限于)卡奇霉素(calicheamicin)、埃斯波霉素(esperamicin)及达米辛(dynemicin)。
格尔德霉素为结合Hsp90(热休克蛋白90)且已用作抗肿瘤药物的苯醌安沙霉素(ansamycin)抗生素。例示性格尔德霉素包括(但不限于)17-AAG(17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)及17-DMAG(17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)。
美登素或其衍生物类美登素通过抑制微管蛋白聚合，抑制有丝分裂期间微管形成，来抑制细胞增殖。参见Remillard等人,Science 189:1002-1005(1975)。例示性美登素及类美登素包括(但不限于)美他素(mertansine)(DM1)及其衍生物以及安丝菌素(ansamitocin)。
吡咯并苯二氮杂卓二聚体(PBD)及引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体(IGN)为含有一或多个结合双螺旋DNA的亚胺(immine)官能团或其等同物的抗肿瘤剂。PBD及IGN分子基于天然产物athramycin，且与DNA以序列选择性方式相互作用，优选嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列。例示性PBD及其类似物包括(但不限于)SJG-136。
斯考他汀及普拉地内酯为抑制剪接且与剪接体SF3b相互作用的抗肿瘤化合物。斯考他汀的实例包括(但不限于)斯考他汀A、FR901464。普拉地内酯的实例包括(但不限于)普拉地内酯B、普拉地内酯D及E7107。
紫杉烷为充当抗微管蛋白剂或有丝分裂抑制剂的二萜。例示性紫杉烷包括(但不限于)紫杉醇(paclitaxel)(例如
Figure BDA0002752729640000581
)及多西紫杉醇(docetaxel)
Figure BDA0002752729640000582
长春花生物碱还是抗微管蛋白剂。例示性长春花生物碱包括(但不限于)长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)及长春瑞滨(vinorelbine)。
在本发明的一些方面中，药物为免疫调节剂。免疫调节剂的实例包括(但不限于)更昔洛韦(gancyclovier)、依那西普(etanercept)、他罗利姆(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、伏环孢素(voclosporin)、环孢灵(cyclosporine)、雷帕霉素(rapamycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolgatemofetil)、甲氨蝶呤(methotrextrate)、糖皮质激素及其类似物、细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素(lymphotoxin)、肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子、白介素(例如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21)、集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ)、称为“S1因子”的干细胞生长因子、促红细胞生成素及血小板生成素或其组合。
在本发明的一些方面中，药物为显像剂(例如萤光团或螯合剂)，诸如萤光素、若丹明、镧系元素磷光体及其衍生物。萤光团的实例包括(但不限于)萤光异硫氰酸盐(FITC)(例如5-FITC)、萤光素酰胺(FAM)(例如5-FAM)、曙红、羧基萤光素、赤藓红、
Figure BDA0002752729640000583
(例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基若丹明(TAMRA)(例如5,-TAMRA)、四甲基若丹明(TMR)及磺酰罗丹明(SR)(例如SR101)。螯合剂的实例包括(但不限于)1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷、1-戊二酸-4,7-乙酸(NODAGA)、二乙撑三胺五乙酸(DTPA)及1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)(BAPTA)。
在本发明的一些方面中，治疗性或诊断性放射性同位素或其他标记(例如PET或SPECT标记)可整合入用于缀合如本文所述的抗CXCR4抗体或抗原结合片段的药物中。放射性同位素或其他标记的实例包括(但不限于)3H、11C、13N、14C、15N、15O、35S、18F、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Se、76Br、77Br、86Y、89Zr、90Y、94Tc、95Ru、97Ru、99Tc、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、111Ag、111In、113In、121Te、122Te、123I、124I、125I、125Te、126I、131I、131In、133I、142Pr、143Pr、153Pb、153Sm、161Tb、165Tm、166Dy、166H、167Tm、168Tm、169Yb、177Lu、186Re、188Re、189Re、197Pt、198Au、199Au、201Tl、203Hg、211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、224Ac及225Ac。
在本发明的一些方面中，药物为治疗性蛋白质，包括(但不限于)毒素、激素、酶及生长因子。
毒素蛋白质(或多肽)的实例包括(但不限于)白喉(例如白喉A链)、绿脓杆菌外毒素及内毒素、蓖麻毒素(例如蓖麻毒素A链)、相思豆毒蛋白(例如相思豆毒蛋白A链)、莫迪素(例如莫迪素A链)、α-帚曲菌素、油桐蛋白质、石竹素蛋白质、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白质、白树毒素、白喉毒素、美洲商陆蛋白质(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)、霉菌毒素(tricothecene)、抑制剂胱胺酸结头(ICK)肽(例如赛拉毒素(ceratotoxin))及芋螺毒素(conotoxin)(例如KIIIA或SmIIIa)。
在本发明的一些方面中，药物为生物相容性聚合物。如本文所述的抗CXCR4抗体或抗原结合片段可结合生物相容性聚合物以增加血清半衰期及生物活性，和/或延长体内半衰期。生物相容性聚合物的实例包括水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)或其衍生物，及含有两性离子的生物相容性聚合物(例如含有磷酸胆碱的聚合物)。
在本发明的一些方面中，药物为寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸。
在另一方面中，本发明提供如本文所述的抗体或抗原结合片段的缀合物，其中抗体-药物缀合物包含公式：抗体-(含有酰基供体谷氨酰胺的标签)-(接头)-(药物)，其中含有酰基供体谷氨酰胺的标签在抗体或抗原结合片段的特定位点(例如在重链或轻链的羧基端或在另一位点)经改造，其中标签缀合于接头(例如含有一或多种反应性胺(例如一级胺NH2)的接头)且其中接头结合细胞毒性剂(例如MMAD或如本文所述的其他奥瑞他汀)。在本发明的一些方面中，抗体-药物缀合物不包含含有酰基供体谷氨酰胺的标签。
含有一或多种反应性胺的接头的实例包括(但不限于)乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC)或氨基PEG6-丙酰基。参见例如WO2012/059882。
在本发明的一些方面中，接头可为二肽接头，诸如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头或马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(vc)接头。在另一方面中，接头可为磺基丁二酰亚氨基-4-[N顺丁烯二酰亚氨基甲基]环己烷-1-羧酸酯(smcc)。磺酸基-smcc结合经由顺丁烯二酰亚氨基，与巯基(硫醇，-SH)反应来产生，同时其磺酸基-NHS酯对一级胺(如在赖氨酸及蛋白质或肽N末端中发现)具有反应性。此外，接头可为马来酰亚胺己酸基(mc)。在本发明的一些方面中，含有酰基供体谷氨酰胺的标签包含LLQGG(SEQ ID NO:171)、GGLLQGG(SEQ ID NO:90)、LLQGA(SEQ ID NO:91)、GGLLQGA(SEQID NO:92)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO:93)、LLQGPG(SEQ ID NO:94)、LLQGPA(SEQ ID NO:95)、LLQGP(SEQ ID NO:96)、LLQP(SEQ ID NO:97)、LLQPGK(SEQ ID NO:98)、LLQGAPGK(SEQID NO:99)、LLQGAPG(SEQ ID NO:100)、LLQGAP(SEQ ID NO:101)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:172)、LLQGPP(SEQ ID NO:173)、LLQX1X2X3X4X5(其中X1为G或P，其中X2为A、G、P或不存在，其中X3为A、G、K、P或不存在，其中X4为K、G或不存在，且其中X5为K或不存在)(SEQ ID NO:102)或LLQX1X2X3X4X5(其中X1为任何天然存在的氨基酸，且其中X2、X3、X4及X5为任何天然存在的氨基酸或不存在)(SEQ ID NO:103)。
在本发明的一些方面中，如本文所述的抗CXCR4抗体或缀合物包含在抗CXCR4抗体的位置297处天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)或N至丙氨酸(A)的氨基酸取代。
在本发明的一些方面中，包含例如LLQ、SEQ ID NO:91、90、94、95、95、97、98、99、100、171、101、172或173的含有酰基供体谷氨酰胺的标签在抗体重链的C末端经改造，其中C末端赖氨酸残基缺失。在其他方面中，含有酰基供体谷氨酰胺的标签(例如GGLLQGA(SEQ IDNO:92))在抗体轻链的C末端经改造。抗体的实例包括(但不限于)m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D。
在本发明的其他方面中，缀合物包含公式：抗体-(含有酰基供体谷氨酰胺的标签)-(L)-(细胞毒性剂)。在本发明的一些方面中，缀合物为a)Ab-LLQGA(SEQ ID NO:91)-(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC))-0101；b)Ab-LLQGA(SEQ ID NO:91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；c)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO:102)-(AcLys-VC-PABC)-0101；d)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO:102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；e)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO:92)-(AcLys-VC-PABC)-0101；及f)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO:92)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD。
抗体的实例包括(但不限于)m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.L94D、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D。
在本发明的一些方面中，Ab为包含VH区及VL区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区含有SEQ ID NO:107、162及112的CDR，所述VL区含有SEQ ID NO:144、145及139的CDR。
在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体-药物缀合物引起肿瘤消退。
使用抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或其抗体-药物缀合物的方法
本发明的抗体及抗体-药物缀合物适用于各种应用，包括(但不限于)治疗性治疗方法及诊断性治疗方法。
在本发明的一些方面中，当向患者施用时，抗体或缀合物及药物学可接受的载体为无菌的。当静脉内施用化合物或缀合物时，水为例示性载体。盐溶液及含水右旋糖及甘油水溶液也可用作液体载体，尤其用于可注射的溶液。若需要，本发明的组合物还可含有微量湿润剂或乳化剂或pH值缓冲剂。
本发明的组合物可呈溶液、丸粒、粉剂、持续释放制剂或任何其他适于使用形式的形式。适合医药载体的其他实例由E.W.Martin于“Remington's PharmaceuticalSciences”中描述。
在一些方面中，本发明的抗体和/或其抗体-药物缀合物根据常规程序调配为适合于静脉内施用给动物、尤其人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的载体或媒介为无菌等渗缓冲水溶液。必要时，组合物还可包括溶解剂。用于静脉内施用的组合物可任选包含局部麻醉剂(诸如利诺卡因(lignocaine))以减轻注射部位的疼痛。一般而言，成分分开供给或以单位剂型混合于一起，例如呈于指示活性剂的量的密封容器(诸如安瓿或药囊)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。在本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物将通过输注施用的情况下，其可例如用含有无菌医药级水或盐水的输注瓶分配。在本发明的化合物和/或抗体-药物缀合物通过注射施用的情况下，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以使得成分可在施用之前混合。
组合物可包括各种物质，所述物质改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可包括在活性成分周围形成包衣外壳的材料。形成包衣外壳的材料通常为惰性的，且可选自例如糖、紫草茸及其他包覆肠衣试剂。或者，活性成分可装入明胶胶囊中。
无论呈固体还是液体形式，本发明的组合物均可包括用于治疗癌症的药剂。在一个方面中，本发明提供一种用于治疗对象中与CXCR4表达相关的病状的方法。在本发明的一些方面中，治疗对象中与CXCR4功能或表达相关的病症的方法包含向有需要的所述对象施用有效量的包含如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的组合物(例如药物组合物)。与CXCR4表达相关的病症包括(但不限于)异常CXCR4表达、改变或异常CXCR4表达、CXCR4过度表达及增殖性病症(例如癌症)。
因此，在一些方面中，提供一种治疗对象的癌症的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的组合物。如本文所用，癌症包括(但不限于)膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌及血液癌症。在本发明的一些方面中，提供一种减少具有表达CXCR4的肿瘤的对象中肿瘤生长或进展的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含如本文所述的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的组合物。在其他方面中，提供一种减少对象中表达CXCR4的癌细胞转移的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的组合物。在其他方面中，提供一种诱导对象中表达CXCR4的肿瘤消退的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含如本文所述的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的组合物。
在一些方面中，本发明提供如本文所述的任一抗体的分离的抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物，其用于检测、诊断及治疗与CXCR4功能或表达相关的病理学病症。在一个方面中，所述病症为与CXCR4表达相对于正常增加相关的癌症或任何其他与CXCR4过度表达有关的病理学。
在本发明的一些方面中，提供一种治疗对象的癌症的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的组合物，所述组合物包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含(i)选自SEQ ID NO:107、113、114、108、109、115、116、117、121及122的VH CDR1，(ii)选自SEQ ID NO:162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130的VH CDR2，及(iii)选自SEQ ID NO:112及120的VH CDR3；和/或b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含(i)选自SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151的VL CDR1，(ii)选自145、132、136及152的VL CDR2，及(iii)选自SEQ ID NO:139、133、137、140及153的VL CDR3。
在本发明的一些方面中，提供一种治疗对象的癌症的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述抗体包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR。在本发明的一些方面中，提供一种治疗对象的癌症的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述抗体包含：轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR。
在本发明的一些方面中，提供一种治疗对象的癌症的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含如前述技术方案中任一种的抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述抗体包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:107、162及112所示的三个CDR；及轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR。
在一些方面中，本发明提供一种治疗对象的癌症的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含分离的抗体或其抗原结合片段的组合物，所述分离的抗体或其抗原结合片段结合CXCR4且包含：重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含来自SEQ ID NO:33的VH区的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含来自SEQ ID NO:73的VL区的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在其他方面中，本发明提供一种治疗对象的癌症的方法，其包含向有需要的所述对象施用有效量的包含如前述技术方案中任一种的抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述抗体包含：a)SEQ ID NO:33的重链可变(VH)区；及b)SEQ ID NO:73的轻链可变(VL)区。
在一些方面中，本发明提供如本文所述的分离的抗体、抗原结合片段或任一抗体的抗体-药物缀合物在制造用于治疗与CXCR4功能或表达相关的病症的药剂(medicament)中的用途。在一个方面中，所述病症为与CXCR4表达相对于正常增加相关的癌症或任何其他与CXCR4过度表达有关的病理学。
在本发明的其他方面中，抗CXCR4抗体-药物缀合物包括具有至少一个重链可变区及至少一个轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中所述至少一个重链可变区包括SEQID NO:107、113、114、162、128及112所示的三个CDR。在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体-药物缀合物包括具有至少一个重链可变区及至少一个轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中所述至少一个轻链可变区包括SEQ ID NO:144、145及139所示的三个CDR。
在本发明的一些方面中，结合CXCR4的抗体-药物缀合物包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO:33、5、9、13、17、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、85或87中的任一种所示的重链可变区，和/或SEQ ID NO:73、3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、75、77、79、81、83或169中的任一种所示的轻链可变区。例如，本发明的抗CXCR4抗体-药物缀合物可包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有氨基酸序列与SEQ ID NO:33至少90％相同的重链可变区，及氨基酸序列与SEQ ID NO:73至少90％相同的轻链可变区；或具有SEQ ID NO:33所示的重链可变区，及具有SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明的特定方面中，抗体未犬科化或猫科化。
抗体还可例如在重链和/或轻链的可变结构域中经修饰，例如以改变抗体的结合特性。例如，突变可在一或多个CDR区中进行以增加或减少抗CXCR4抗体的KD、增加或减少koff或改变抗体的结合特异性。定点诱变的技术为本领域中熟知。参见例如Sambrook等人及Ausubel等人，上述。
在本发明的一些方面中，提供一种检测、诊断和/或监测与CXCR4功能或表达相关的病症的方法。例如，如本文所述的抗CXCR4抗体可经诸如显像剂及酶-底物标记的可检测部分标记。如本文所述的抗体还可用于体内诊断分析，诸如体内成像(例如PET或SPECT)或染色试剂。
在本发明的一个方面中，提供一种检测、诊断和/或监测与CXCR4功能或表达相关的病症的方法，其包含以下步骤：(i)从怀疑患有与CXCR4功能或表达相关的病症的患者获得生物样品；(ii)使待测试的样品与抗体或其抗原结合部分在允许抗体与蛋白质抗原CXCR4之间形成复合物的条件下接触；(iii)检测所述抗体-蛋白质抗原复合物，其中所述检测的抗体-蛋白质抗原复合物的存在指示所述患者患有与CXCR4功能或表达相关的病症。在本发明的一特定方面中，所述方法进一步包含向所述患者施用治疗有效量的如本文所述的任一抗体的分离的抗体、抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
在本发明的一些方面中，ADC可用以通过将此类化合物连接于抗体或其片段来将化合物(例如治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有CXCR4细胞表面受体的细胞。因而，在本发明的一些方面中，提供用于离体或体内定位表达CXCR4的细胞的方法(例如可检测标记，诸如放射性同位素、萤光化合物作为酶)。或者，ADC可用以通过使细胞毒素或放射性毒素靶向CXCR4来杀死具有CXCR4细胞表面受体的细胞。
在本发明的一些方面中，本文所述的方法进一步包含用其他形式疗法治疗对象的步骤。在一些方面中，其他治疗形式为其他抗癌疗法，包括(但不限于)化学疗法、放射、手术、激素疗法和/或其他免疫疗法。
在本发明的一些方面中，其他形式疗法包含除如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的外，还施用一或多种治疗剂。所述治疗剂包括(但不限于)第二抗体(例如抗VEGF抗体、抗HER2抗体、抗CD25抗体和/或抗CD20抗体)、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、消炎剂(例如紫杉醇、多烯紫杉醇、顺铂(cisplatin)、多柔比星、泼尼松(prednisone)、丝裂霉素(mitomycin)、孕酮(progesterone)、他莫昔芬(tamoxifen)或氟脲嘧啶(fluorouracil))。在一个方面中，其他形式疗法可与如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物同时或连续或并行施用。
本发明的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可经由任何适合的途径施用给对象。本领域技术人员应了解本文所述的实例并不意欲为限制性的，而是说明可供使用的技术。因此,在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物根据已知的方法施用给对象，所述方法为诸如静脉内施用，例如快速注射或通过在一段时间内连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、颅内、经皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内、经由吹入、鞘内、经口、吸入或表面途径。施用可为全身性的(例如静脉内施用)或局部的。包括喷嘴式喷雾器及超声波式喷雾器的用于液体制剂的市售喷雾器适用于施用。可直接使液体制剂形成喷雾且冻干粉末可在复原后雾化。或者，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可使用碳氟化合物制剂及定量吸入器雾化或呈冻干及研磨粉末形式吸入。在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可经由吸入施用，如本文所述。在其他方面中，本发明的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可与药物学可接受的媒介(诸如盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及其类似物)组合。特定给药方案(即剂量、时间选择及重复)将视特定对象及所述对象的病史而定。
在一个方面中，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物经由位点特异性或靶向性局部递送技术施用。位点特异性或靶向性局部递送技术的实例包括抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的各种可植入储槽式来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管或针状导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器及支架或其他可植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接涂覆。参见例如PCT公开案第WO 00/53211号及美国专利第5,981,568号。
抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的各种制剂可用于施用。在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体(其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物)及药物学可接受的赋形剂可在各种制剂中。本发明的一些制剂包含药物学可接受的赋形剂。药物学可接受的赋形剂在本领域中已知且为促进药理学上有效的物质施用的相对惰性物质。例如，赋形剂可赋予形状或稠度或充当稀释剂。适合的赋形剂包括(但不限于)稳定剂、湿润剂及乳化剂、改变渗透性的盐、囊封剂、缓冲剂及皮肤穿透增强剂。用于非经肠及经肠药物递送的赋形剂以及制剂阐述于Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000中。
一般而言，对于抗CXCR4抗体、其抗原结合片段和/或抗CXCR4抗体-药物缀合物的施用，初始候选剂量可为约2mg/kg。出于本发明的目的，典型日剂量可在约3μg/kg至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中的任一种的范围内，视上述因素而定。例如，可使用约1mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg及约25mg/kg的剂量。对于若干天或更长时间内的重复施用，视病状而定，持续治疗，直至产生所要症状抑制或直至实现足够治疗水准，例如抑制或延迟肿瘤生长/进展或癌细胞转移。一种例示性给药方案包含施用约2mg/kg的初始剂量，接着约1mg/kg抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的每周维持剂量，或接着每隔一周约1mg/kg的维持剂量。其他例示性给药方案包含施用递增剂量(例如1mg/kg的初始剂量及逐步增至每周或更长时间段一或多个较高剂量)。其他剂量方案还可适用，视从医者希望实现的药物动力学衰变模式而定。例如，在一些方面中，涵盖一周一至四次给药。在其他方面中，涵盖一个月一次或每隔一个月或每隔三个月一次给药。此疗法的进程易于通过常规技术及分析监测。给药方案(包括所用的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物)可随时间变化。
出于本发明的目的，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体缀合物的适当剂量将视所采用的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或CXCR4抗体-药物缀合物(或其组合物)、待治疗的症状的类型及严重性、药剂是否出于治疗性目的而施用、先前疗法、患者的临床病史及对药剂的反应、患者对施用药剂的清除速率及主治医师的判断而定。通常临床医师将施用抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物，直至达到实现所要结果的剂量。剂量和/或频率可在治疗过程内变化。诸如半衰期的经验性考虑因素一般将有助于确定量。例如，与人类免疫系统相容的抗体(诸如人源化抗体或完全人抗体)可用于延长抗体半衰期且预防抗体受宿主的免疫系统攻击。施用频率可在治疗过程内确定及调节，且一般(但不一定)基于症状的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟，例如肿瘤生长抑制或延迟等。或者，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的持续连续释放制剂可为适当的。达成持续释放的各种制剂及装置在本领域中已知。
在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的剂量可凭经验在已一或多次施用抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或其抗CXCR4抗体-药物缀合物的对象中确定。给与对象递增剂量的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物。为评估功效，可根据疾病的指示物。
根据本发明中的方法的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的施用可为连续或间歇的，视例如受者的生理条件、施用目的为治疗性还是预防性及熟练从医者已知的其他因素而定。抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的施用可在预选时段内基本上为连续的，或可在一系列间隔剂量中。
在本发明的一些方面中，可存在一种以上抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物。可存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同或更多种抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物。一般而言，那些抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可具有不会不利地影响彼此的互补活性。例如，可使用一或多种以下抗CXCR4抗体：针对CXCR4上的一种表位的第一抗CXCR4抗体及针对CXCR4上的不同表位的第二抗CXCR4抗体。
根据本发明使用的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的治疗制剂通过将具有所要纯度的抗体与任选选用的药物学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版Mack Publishing,2005)混合来制备成冻干制剂或水溶液形式，以供储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下对受者无毒性，且可包含缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂，(诸如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵、苄索氯铵；苯酚、丁基醇或苄醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相对离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的脂质体通过本领域中已知的方法制备，所述方法诸如描述于Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；及美国专利第4,485,045号及第4,544,545号。具有增强的循环时间的脂质体揭示于美国专利第5,013,556号中。尤其适用的脂质体可通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体经具有界定孔径的过滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。
活性成分还可包裹于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中，包裹于胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或包裹于粗乳状液中。所述技术揭示于Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版MackPublishing,2005中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，这些基质呈成形物品(例如膜或微囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物与醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体))及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
欲用于体内施用的制剂必须无菌。这易于例如通过经由无菌过滤膜过滤来实现。治疗性抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物组合物一般放置于具有无菌进入孔的容器中，例如静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶。
根据本发明的组合物可呈单位剂型，诸如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒、溶液或悬浮液或栓剂，用于经口、非经肠或经直肠施用或通过吸入或吹入施用。
对于制备固体组合物(诸如片剂)而言，将主要活性成分与医药载体(例如常规压片成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)及其他医药稀释剂(例如水)混合，以形成含有本发明化合物或其药物学可接受的无毒盐的均质混合物的固体预调配组合物。当提及这些预调配组合物为均质时，是指活性成分遍及组合物均匀分布，因此组合物可易于再分成等效的单位剂型，诸如片剂、丸剂及胶囊。接着将所述固体预调配组合物再分成含有0.1至约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂型。新颖组合物的片剂或丸剂可包覆包衣或以其他方式混合以提供具有延长作用的优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量及外部剂量组分，后者呈包覆前者的包膜形式。可通过用以抵抗在胃中崩解且允许所述内层组分完整地进入十二指肠或延缓释放的肠衣层将两种组分分开。各种材料可用于所述肠衣层或包衣，所述材料包括多种聚合酸及聚合酸与诸如紫草茸、十六烷醇及乙酸纤维素的材料的混合物。
适合表面活性剂尤其包括非离子剂，诸如聚氧化乙烯脱水山梨醇(例如TweenTM20、40、60、80或85)及其他脱水山梨醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物宜包含0.05％与5％之间的表面活性剂，且其量可在0.1％与2.5％之间。应了解必要时可添加其他成分，例如甘露醇，或其他药物学可接受的媒介。
可使用诸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM的市售脂肪乳液制备适合的乳液。活性成分可溶解于预混乳液组合物中，或者其可溶解于油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合后形成的乳液中。应了解可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液张力。适合乳液通常将含有至多20％的油，例如在5％与20％之间。脂肪乳液可包含0.1与1.0μm、尤其0.1与0.5μm之间的脂肪滴且具有在5.5至8.0范围内的pH值。
乳液组合物可为通过混合抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制备的乳液组合物。
用于吸入或吹入的组合物包括在药物学可接受的水性溶剂或有机溶剂或其混合物中的溶液及悬浮液，以及粉剂。液体或固体组合物可含有如上所述的适合的药物学可接受的赋形剂。在本发明的一些方面中，组合物通过口或鼻呼吸途径施用来达成局部或全身作用。优选无菌的药物学可接受的溶剂中的组合物可通过使用气体来雾化。雾化溶液可从喷雾装置直接呼吸，或可使喷雾装置附着于面罩、帷罩或间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可从以适当方式递送制剂的装置，优选经口或经鼻施用。
组合物
本发明方法中所用的组合物包含有效量的如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物。此类组合物的实例以及如何调配还描述于前面部分及下文中。在本发明的一些方面中，组合物包含一或多种抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物。例如，抗CXCR4抗体识别人CXCR4。在一些方面中，CXCR4抗体为人抗体、CDR移植抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在其他方面中，抗CXCR4抗体包含能够触发所要免疫反应(诸如抗体介导的溶解或ADCC)的恒定区。在其他方面中，抗CXCR4抗体包含不触发非所需或不合需要的免疫反应(诸如抗体介导的溶解或ADCC)的恒定区。在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体包含如本文所述的抗CXCR4抗体或抗CXCR4或其抗原结合片段的一或多个CDR(诸如一个、两个、三个、四个、五个或在一些实施例中所有六个CDR)。
应了解组合物可包含一种以上抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物(例如识别CXCR4表位的不同表位的抗CXCR4抗体的混合物)。其他例示性组合物包含一种以上识别相同表位的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物或结合CXCR4(例如人CXCR4)不同表位的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物。
本发明中所用的组合物可进一步包含药物学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and practice of Pharmacy第21版,2005,LippincottWilliams及Wilkins,编辑K.E.Hoover)，呈冻干制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在剂量及浓度下对受者无毒性且可包含：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相对离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。药物学可接受的赋形剂将在本文中进一步描述。
试剂盒
本发明还提供用于本发明方法中的试剂盒。本发明的试剂盒包括一或多个包含如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的容器及根据本文所述的任一本发明方法使用的说明书。一般而言，这些说明书包含涉及抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物施用以用于上述治疗性治疗的描述。
涉及如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物的使用的说明书一般包括涉及用于达成预期治疗的剂量、给药时间表及施用途径的信息。容器可为单位剂量、散装(例如多剂量包装)或次单位剂量。本发明的试剂盒中所提供的说明书通常为书写于标签或药品说明书(例如试剂盒中包括的纸单)上的说明，但机器可读说明(例如磁性或光学储存碟片上所载有的说明)也可接受。
本发明的试剂盒位于适合包装中。适合包装包括(但不限于)小瓶、瓶子、罐、柔韧的包装(例如密封Mylar或塑胶袋)及其类似物。还涵盖用于与特定装置(诸如吸入器、经鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置(诸如迷你泵))组合的包装。试剂盒可具有无菌进入孔(例如所述容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为抗CXCR4抗体。所述容器可进一步包含第二医药活性剂。
试剂盒可任选提供诸如缓冲剂的其他组分及解释信息。通常，试剂盒包含容器及在容器上或与容器相联的标签或药品说明书。
突变及修饰
为表达本发明的抗CXCR4抗体或其抗原结合片段，编码VH及VL区的DNA片段可首先使用任一上述方法获得。例如突变、取代、缺失和/或添加的各种修饰还可使用本领域技术人员已知的标准方法引入DNA序列中。例如，诱变可使用标准方法进行，所述方法为诸如PCR介导的诱变，其中突变核苷酸进入PCR引物中，使得PCR产物含有所要突变，或定点诱变。
例如可进行的一种类型取代为将抗体中可化学反应的一或多个半胱氨酸改变成诸如(但不限于)丙氨酸或丝氨酸的另一残基。例如，可进行非典型半胱氨酸的取代。取代可在抗体可变域的CDR或框架区或在恒定区中进行。在本发明的一些方面中，半胱氨酸为典型的。
抗体还可例如在重链和/或轻链的可变结构域中经修饰，例如以改变抗体的结合特性。例如，突变可在一或多个CDR区中进行以增加或减少抗体对CXCR4的KD、增加或减少koff或改变抗体的结合特异性。定点诱变的技术为本领域中熟知。参见例如Sambrook等人及Ausubel等人，上述。
修饰或突变还可在框架区或恒定区中进行以增加抗CXCR4抗体的半衰期。参见例如PCT公开案第WO 00/09560号。还可在框架区或恒定区中进行突变以改变抗体的免疫原性，提供共价或非共价结合另一分子的位点，或改变诸如补体结合、FcR结合及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的特性。根据本发明，单一抗体可在可变域的任一或多个CDR或框架区中或在恒定区中具有突变。
在称为“生殖系化(germlining)”的过程中，VH及VL序列中的某些氨基酸可突变以匹配在生殖系VH及VL序列中天然发现的氨基酸。具体地，VH及VL序列中的框架区的氨基酸序列可突变以匹配生殖系序列，从而降低施用抗体时免疫原性的风险。人类VH及VL基因的生殖系DNA序列为本领域中已知(参见例如“Vbase”人类生殖系序列数据库；还参见Kabat,E.A.等人(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242；Tomlinson等人,J.Mol.Biol.227:776-798(1992)；及Cox等人,Eur.J.Immunol.24:827-836(1994))。
可进行的另一类型氨基酸取代为移除抗体中的潜在蛋白水解位点。所述位点可在抗体可变域的CDR或框架区中或在恒定区中进行。半胱氨酸残基的取代及蛋白水解位点的移除可降低抗体产物中异质性的风险且因而增加其同质性。另一类型氨基酸取代为去除形成潜在脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对，通过改变所述残基中的一或两者来进行。在另一实例中，本发明抗CXCR4抗体的重链的C端赖氨酸可裂解。在本发明的各种方面中，抗CXCR4抗体的重链及轻链可任选包括信号序列。
一旦获得编码本发明的VH及VL区段的DNA片段，这些DNA片段即可通过标准重组DNA技术进一步操纵，例如以将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接于编码另一蛋白质(诸如抗体恒定区或柔韧的接头)的另一DNA片段。如上下文中所用，术语“可操作地连接”是指两种DNA片段接合，使得由两种DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读码框。
编码VH区的分离的DNA可通过将编码VH的DNA可操作地连接于编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列为本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最好为IgG1或IgG2恒定区。IgG恒定区序列可为已知存在于不同对象中的各种等位基因或同种异型(allotype)中的任一种，诸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。这些同种异型代表IgG1恒定区中天然存在的氨基酸取代。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可操作地连接于仅仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。CH1重链恒定区可来源于任一重链基因。
编码VL区的分离的DNA可通过将编码VL的DNA可操作地连接于编码轻链恒定区CL的另一DNA分子来转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列为本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区。κ恒定区可为已知存在于不同对象中的各种等位基因中的任一种，诸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恒定区可来源于三种λ基因中的任一种。
为产生scFv基因，编码VH及VL的DNA片段可操作地连接于编码柔韧的接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO:80)的另一片段，使得VH及VL序列可表达为相邻单链蛋白质，其中VL及VH区由柔韧的接头接合(参见例如Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990))。若仅仅使用单一VH及VL，则单链抗体可为单价，若使用两个VH及VL，则为二价，或若使用两个以上VH及VL，则为多价。可产生结合CXCR4及另一分子的双特异性或多价抗体。
在本发明的一些方面中，可制造包含本发明的抗CXCR4抗体所有或一部分连接于另一多肽的融合抗体或免疫粘附素。在其他方面中，仅仅抗CXCR4抗体的可变结构域连接于多肽。在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体的VH结构域连接于第一多肽，而抗CXCR4抗体的VL结构域连接于第二多肽，所述第二多肽以使得VH与VL结构域可彼此相互作用以形成抗原结合位点的方式与第一多肽结合。在其他方面中，VH结构域与VL结构域通过使VH与VL结构域可彼此相互作用的接头分开。随后VH-接头-VL抗体连接于相关多肽。此外，可产生融合抗体，其中两种(或两种以上)单链抗体彼此连接。若想要在单一多肽链上产生二价或多价抗体或若想要产生双特异性抗体，则此适用。
在本发明的一些方面中，其他经修饰的抗体可使用编码核酸分子的抗CXCR4抗体制备。例如，“κ体”(Ill等人,Protein Eng.10:949-57(1997))、“微型抗体”(Martin等人,EMBO J.,13:5303-9(1994))、“双功能抗体”(Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))或“Janusin”(Traunecker等人,EMBO J.10:3655-3659(1991)及Traunecker等人,Int.J.Cancer(增刊)7:51-52(1992))可使用标准分子生物学技术遵循本说明书的教示制备。
双特异性抗体或抗原结合片段可通过多种方法，包括杂交瘤融合或连接Fab'片段来产生。参见例如Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。此外，双特异性抗体可形成为“双功能抗体”或“Janusin”。在本发明的一些方面中，双特异性抗体结合CXCR4的两个不同表位。在一些方面中，上述经修饰的抗体使用来自本文所提供的抗CXCR4抗体的一或多个可变结构域或CDR区制备。
在一个方面中，本发明包含多特异性抗体的用途。多特异性抗体为可同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如两种不同抗原、相同抗原上的两种不同表位或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。多特异性多价抗体为具有一个以上结合位点的构建体且所述结合位点具有不同特异性。
本发明的代表性材料于2014年6月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。具有ATCC登录号PTA-121353的载体为编码人源化抗CXCR4抗体重链可变区的多核苷酸，具有ATCC登录号PTA-121354的载体为编码人源化抗CXCR4抗体轻链可变区的多核苷酸。这些保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(布达佩斯条约)的规定进行。这确保自保藏日开始30年内维持该保藏物为活的培养物。该保藏物将依照布达佩斯条约的规定由ATCC提供，且将受限于辉瑞(Pfizer,Inc.)与ATCC的合约，该合约确保当提出相关美国专利或公开任何美国或外国专利申请时(以先到者为主)，该保藏物的培养子代可永久且不受限制地供公众使用，且确保由美国专利商标专员依据35U.S.C.第122节及该专员所依据的法则(包括37C.F.R.第1.14节，特别参照886OG638)确定获得该子代者的可得性。
本申请的受让人已同意若保藏中材料的培养物在适合条件下培养时死亡或损失或破坏，则将通知立即以另一相同物替换所述材料。不应将保藏材料的利用性理解为在违背任何政府当局根据其专利法授予的权利下实践本发明的许可。
本发明还涉及这些抗CXCR4抗体(例如全长抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物)及包含CXCR4受体抗体(例如全长抗体或其抗原结合片段)的药物组合物的用途，其用于治疗与CXCR4调节相关的疾病及病状，诸如骨髓移植、化学致敏、癌症、转移性疾病(例如癌症)、自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎)、纤维化疾病(例如肺)、AIDS感染、心血管疾病、葡萄膜炎、炎症性疾病、乳糜泻、HIV感染及基于干细胞的再生医学。
癌症
CXCR4受体在多种癌症中过度表达，所述癌症包括(但不限于)乳腺癌(Muller,A.等人Nature 410:50-56(2001))；卵巢癌(Scotton,C.等人Br.J.Cancer 85:891-897(2001)；前列腺癌(Taichman,R.S.等人Cancer Res.62:1832-1837(2002)；非小细胞肺癌(Spano J.P.等人Ann.Oncol.15:613-617(2004))；胰腺癌(Koshiba,T.等人Clin.CancerRes.6:3530-3535(2000))；甲状腺(Hwang,J.H.等人J.Clin.Endocrinol.Metab.88:408-416(2003))；鼻咽癌(Wang,N.等人J.Transl.Med.3:26-33(2005))；黑色素瘤(Scala,S.等人Clin.Cancer Res.11:1835-1841(2005))；肾细胞癌(Staller,P.等人Nature 425:307-311(2003))；淋巴瘤(Bertolini,F.等人Cancer Res.62:3530-3535(2002))；神经母细胞瘤(Geminder,H.等人J.Immunol.167:4747-4757(2001))；胶质母细胞瘤(Rempel,S.A.等人Clin.Cancer Res.6:102-111(2000))；横纹肌肉瘤(Libura,J.等人Blood 100:2597-2606(2002))；结肠直肠癌(Zeelenberg,I.S.等人Cancer Res.63:3833-3839(2003))；肾癌(Schrader,A.J.等人Br.J.Cancer 86:1250-1256(2002))；骨肉瘤(Laverdiere,C.等人Clin.Cancer Res.11:2561-2567(2005))；急性淋巴母细胞白血病(Crazzolara,R.等人Br.J.Haematol.115:545-553(2001))；及急性骨髓白血病(Rombouts,E.J.C.等人Blood104:550-557(2004))。
鉴于上文，本发明的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可用于治疗癌症，包括(但不限于)乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤、结肠直肠癌、肾癌、骨肉瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)及B细胞淋巴瘤及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。抗体可单独或与诸如手术和/或放射的其他癌症治疗组合使用，和/或与其他抗肿瘤剂组合使用，所述抗肿瘤剂为诸如以上论述及阐述的抗肿瘤剂，包括化学治疗药物及其他抗肿瘤抗原抗体，诸如结合CD20、Her2、PSMA、Campath-1、EGFR及其类似物的抗体。
在一些方面中，本发明的抗CXCR4抗体可与抗CD22或抗CD33抗体、抗体-药物缀合物或包含此类抗体的组合物组合使用。例如，本发明的抗CXCR4抗体可与奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)或吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin，
Figure BDA0002752729640000701
)组合。
“组合疗法”或与一或多种其他治疗剂“组合”施用包括按任何次序同时、并行及连续施用。本发明的组合制剂的组分的施用可同时、分开或连续进行。
根据本发明，提供一种用于治疗癌症的方法，其包含同时、并行或连续施用本发明的抗CXCR4抗体及奥英妥珠单抗。例如，抗CXCR4抗体可在奥英妥珠单抗之前或之后或同时施用。此外，本发明在本文中提供一种用于治疗诸如AML的癌症的方法，其包含同时、并行或连续施用本发明的抗CXCR4抗体及Mylotarg。例如，抗CXCR4抗体可在Mylotarg之前或之后或同时施用。
抗CXCR4抗体或其片段可缀合于治疗部分和/或诊断剂，诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素。此类缀合物在本文中称为抗体-药物缀合物。抗体-药物缀合物可包括一或多种细胞毒素。
在本发明的一些方面中，治疗包含施用本发明的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物与一或多种选自抗体、生长因子、激素、细胞因子、抗激素、黄嘌呤、白介素、干扰素及细胞毒性药物的生物活性剂。在本发明的特定方面中，生物活性剂为抗体，且针对在B细胞恶性肿瘤上表达的细胞表面抗原。
在本发明的一些方面中，针对在B细胞恶性肿瘤上表达的细胞表面抗原的抗体选自抗CD19、抗CD20及抗CD33抗体。所述抗体包括抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab)(RituxanTM)。
在本发明的一些方面中，生物活性剂为细胞因子或生长因子且包括(但不限于)白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF及G-CSF。在本发明的特定方面中，生物活性剂为激素且包括雌激素、雄激素、孕酮及皮质类固醇。
在本发明的一些方面中，药物为选自以下的药物：多柔比星、柔红霉素、伊达比星、阿柔比星(aclarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星(carubicin)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝伐单抗(bevacizumab)、硼替佐米(bortesomib)、仑氨西林(lenalidomide)、美法仑、诺拉霉素(nogalamycin)、美诺立尔(menogaril)、吡柔比星(pitarubicin)、戊柔比星、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、曲氟尿苷(trifluridine)、安西他滨(ancitabine)、依诺他滨(enocitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、喷司他丁(pentostatin)、溴尿苷(broxuridine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladribine)、地西他滨(decitabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、谷氏菌素(gougerotin)、嘌呤霉素(puromycin)、喃氟啶(tegafur)、噻唑羧胺核苷(tiazofurin)、阿霉素、顺铂、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)、长春碱、长春新碱、米托蒽醌、博莱霉素(bleomycin)、氮芥(mechlorethamine)、泼尼松、丙卡巴肼(procarbazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氟脲嘧啶(flurouracil)、依托泊苷(etoposide)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇类似物及丝裂霉素。
在本发明的一些方面中，治疗有效剂量的本发明的抗CXCR4抗体、其片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物与酪氨酸激酶抑制剂的一或多种组合一起施用。酪氨酸激酶抑制剂包括蛋白质与非蛋白质部分。酪氨酸激酶抑制剂可为例如抗体、受体配体或小分子抑制剂。适用于本发明的方法中的酪氨酸激酶抑制剂的实例包括(但不限于)吉非替尼(gefitinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、卡奈替尼(canertinib)、赛玛西尼(semaxinib)、凡塔蓝尼(vatalanib)、索拉非尼(sorafenib)、伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、来氟米特(leflunomide)、凡德他尼(vandetanib)、其衍生物、其类似物及其组合。适用于本发明中的其他酪氨酸激酶抑制剂如描述于例如美国专利第5,618,829号；第5,639,757号；第5,728,868号；第5,804,396号；第6,100,254号；第6,127,374号；第6,245,759号；第6,306,874号；第6,313,138号；第6,316,444号、第6,329,380号；第6,344,459号；第6,420,382号；第6,479,512号；第6,498,165号；第6,544,988号；第6,562,818号；第6,586,423号；第6,586,424号；第6,740,665号；第6,794,393号；第6,875,767号、第6,927,293号；及第6,958,340号中。
在一些方面中，治疗有效剂量的本发明的抗CXCR4抗体、其片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物与作为治疗方案一部分的一或多种药物组合一起施用，其中细胞毒性剂组合选自：CHOPP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松及丙卡巴肼)；CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱及泼尼松)；COP(环磷酰胺、长春新碱及泼尼松)；CAP-BOP(环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博莱霉素、长春新碱及泼尼松)；m-BACOD(甲氨蝶呤、博莱霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松及甲酰四氢叶酸(leucovorin))；ProMACE-MOPP(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、甲酰四氢叶酸、氮芥、长春新碱、泼尼松及丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、甲酰四氢叶酸、阿糖胞苷、博莱霉素及长春新碱)；MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博莱霉素及甲酰四氢叶酸)；MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松及丙卡巴肼)；ABVD(阿霉素/多柔比星、博莱霉素、长春碱及达卡巴嗪)；MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松及丙卡巴肼)与ABV(阿霉素/多柔比星、博莱霉素及长春碱)交替；MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松及丙卡巴肼)与ABVD(阿霉素/多柔比星、博莱霉素、长春碱及达卡巴嗪)交替；ChIVPP(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼及泼尼松)；IMVP-16(异环磷酰胺(ifosfamide)、甲氨蝶呤及依托泊苷)；MIME(丙咪腙(methyl-gag)、异环磷酰胺、甲氨蝶呤及依托泊苷)；DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷及顺铂)；ESHAP(依托泊苷、甲泼尼松(methylpredisolone)、高剂量阿糖胞苷及顺铂)；CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松及博莱霉素)；CAMP(洛莫司汀(lomustine)、米托蒽醌、阿糖胞苷及泼尼松)；CVP-1(环磷酰胺、长春新碱及泼尼松)，ESHOP(依托泊苷、甲泼尼松、高剂量阿糖胞苷、长春新碱及顺铂)；EPOCH(依托泊苷、长春新碱及多柔比星96小时，与单次剂量的环磷酰胺及口服泼尼松)；ICE(异环磷酰胺、环磷酰胺及依托泊苷)；CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松及博莱霉素)；CHOP-B(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松及博莱霉素)、CEPP-B(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼及博莱霉素)及P/DOCE(表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺及泼尼松)。
在本发明的一些方面中，药物可与如本文所述的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物同时或连续或并行施用。例如，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可在作为治疗方案一部分的一或多种细胞毒性剂组合施用之前施用。在本发明的一些方面中，治疗有效剂量的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物在作为治疗方案一部分的一或多种细胞毒性剂组合施用之后施用。
在本发明的一些方面中，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可连同作为治疗方案一部分的一或多种细胞毒性剂组合一起施用。
本发明的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物还可与诸如手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法及饮食/锻炼方案的非药物治疗结合施用。其他治疗可在用本发明的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物治疗之前、并行或之后施用。在不同治疗施用之间还可存在数小时、数天及在一些情况下数周的延迟，使得本发明的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物缀合物可在其他治疗之前或之后施用。
CXCR4的治疗用途
根据本发明的各种方面，抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR4抗体-药物可用于治疗包括以下各病的多种病症或产生治疗包括以下各病的多种病症的药剂：各种癌症、炎症病症、过敏性病症、感染(HIV感染等)、自身免疫病症(例如类风湿性关节炎)、纤维化病症(例如肺)及心血管病症。癌症包括实体肿瘤癌症(例如胃癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌及胰腺癌)及血液癌症(例如骨髓发育不良综合征、骨髓增殖病症及急性白血病)。造血病症的实例包括非B谱系衍生的病症，诸如急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)、非B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓发育不良病症、骨髓增殖病症、红细胞增多症、血小板增多症或非B非典型免疫淋巴组织增殖。B细胞或B细胞谱系衍生病症的实例包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞谱系白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、B细胞原淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞白血病、毛细胞白血病或浆细胞病症，例如淀粉样变性或沃尔登斯特伦巨球蛋白血症。
血液病症
血液病症包含血液及所有其组分的疾病以及参与血液所有组分产生或降解的器官及组织的疾病。在本发明的一些方面中，血液病症包括(但不限于)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、B细胞淋巴瘤及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。NHL可包括惰性非霍奇金氏淋巴瘤(iNHL)或侵袭性非霍奇金氏淋巴瘤(aNHL)。在某些方面中，对象复发或难以由其他治疗治愈。在某些方面中，对象复发或难以由至少两种或两种以上其他治疗治愈。在本发明的一些方面中，对象复发或难以由至少三种或三种以上其他治疗治愈。在本发明的一些方面中，对象复发或难以由至少五种或五种以上其他治疗治愈。
本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗血液病症的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
慢性淋巴细胞性白血病
CLL细胞表达高水准的CXCR4。(Burger JA,Burger M,Kipps TJ.Chroniclymphocytic leukemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptorsthat mediate spontaneous migration beneath bone marrow stromalcells.Blood.94:3658-3667(1999))。本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体，或多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体的混合物。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
其他B细胞淋巴瘤
CXCR4表达已展现在B细胞(Burger等人,Chronic lymphocytic leukemia Bcells express functional CXCR4 chemokine receptors that mediate spontaneousmigration beneath bone marrow stromal cells.Blood.94:3658-3667(1999))及T细胞(Trentin L,Agostini C,Facco M等人,The chemokine receptor CXCR4 is expressedon malignant B cells and mediates chemotaxis.J Clin Invest.104:115-121(1999))、非霍奇金淋巴瘤(NHL)中。来自B-NHL患者的恶性B细胞表达功能性CXCR4受体。趋化因子受体表达的独特模式被认为与淋巴瘤细胞移动及归巢有关且可允许区分不同NHL子集。(Jones D,Benjamin RJ,Shahsafaei A,Dorfman DM.The chemokine receptor CXCR4is expressed in a subset of B-cell lymphomas and is a marker of B-cellchronic lymphocytic leukemia.Blood.95:627-632(2000))。在一动物模型中，小鼠用经改造以保留细胞质内CXCR4的T细胞杂交瘤细胞攻击。在人类高度NHL的另一小鼠模型中，通过单克隆抗体中和CXCR4抑制循环NHL细胞的归巢且提高存活率(Bertolini F,Dell'Agnola C,Mancuso P等人,CXCR4 neutralization,a novel therapeutic approach fornon-Hodgkin's lymphoma.Cancer Res.62:3106-3112(2002))，因此提出CXCR4中和作为一种新颖的NHL治疗方法。本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗B细胞慢性B细胞淋巴瘤的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
多发性骨髓瘤中的CXCR4
多发性骨髓瘤(MM)为巨大的不可治愈的浆细胞赘瘤。趋化因子受体CXCR4由大部分患者的MM细胞表达。其促进骨髓瘤细胞迁移及归巢至骨髓(BM)隔室，支撑肿瘤细胞存活且保护骨髓瘤细胞免于化学疗法诱导的细胞凋亡。因此，本发明的抑制CXCR4活性的抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR4抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物(例如拮抗抗体)可用于治疗血液病症，诸如多发性骨髓瘤。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
急性白血病中的CXCR4
因为CXCR4在保持骨髓中的造血祖细胞中发挥关键作用，所以若干课题组已检查CXCR4在祖细胞白血病中所发挥的作用。前体B细胞急性淋巴母细胞白血病(ALL)表达功能性CXCR4受体(Bradstock KF,Makrynikola V,Bianchi A,Shen W,Hewson J,GottliebDJ.Effects of the chemokine stromal cell-derived factor-1on the migration andlocalization of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells within bonemarrow stromal layers.Leukemia.14:882-888(2000))，其与非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中白血病细胞归巢至骨髓中有关。(Shen W,Bendall LJ,Gottlieb DJ,Bradstock KF.The chemokine receptor CXCR4 enhances integrin-mediated in vitro adhesion and facilitates engraftment of leukemic precursor-B cells in the bone marrow.Exp Hematol.29:1439-1447(2001))。在巧妙的动物模型中，Sipkins等人(Sipkins DA,Wei X,Wu JW等人,In vivo imaging of specialized bonemarrow endothelial microdomains for tumour engraftment.Nature.435:969-973(2005))直接证明功能性CXCR4为ALL细胞归巢至骨髓微环境所需。本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗急性淋巴母细胞白血病(ALL)的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。
此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
急性骨髓白血病(AML)中的CXCR4
尽管普遍对化学疗法敏感，但AML中的长期无疾病存活时间保持较低，因为大部分患者由最小残留疾病(MRD)复发。CXCR4看似为造成抗癌药物抗性的存活信号的重要调节剂。此概念由如下发现支持：白血病细胞高水准表达CXCR4是AML中的不良预后指示。SpooAC,Wierda WG,Burger JA.The CXCR4 score：a new prognostic marker in acutemyelogenous leukemia[abstract].Blood.104:304a(2004)。本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗急性骨髓白血病(AML)的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。
此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
非造血癌症中的CXCR4
趋化因子及趋化因子受体具有的最引起兴趣及可能的重要作用之一为调节实体肿瘤的转移。CXCR4为研究最透彻的趋化因子受体之一，其选择性结合CXC趋化因子基质细胞衍生因子1(SDF-1)，还称为CXCL12(Fredriksson等人,Mol Pharmacol.63:1256-72(2003))。迄今为止，CXCR4已展现在超过20种人类恶性肿瘤中过度表达，包括乳腺癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌及胰腺癌(Müller等人,Nature 410:50-6(2001)；Akashi等人Cancer Sci.99(3):539-542(2008)；Maréchal等人Br J Cancer,100,1444-51(2009)；Wang等人,Clin Exp Metastasis,26,1049-54.(2009)；He X等人,Pathol Res Pract,206,712-5.(2010))。
本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗非造血癌症的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
乳腺癌中的CXCR4
赘生性细胞上CXCR4的高水准表达与乳腺癌患者中相对不良整体存活相关。(LiYM,Pan Y,Wei Y等人,Up-regulation of CXCR4 is essential for HER2-mediatedtumor metastasis.Cancer Cell.6:459-469(2004))。在所有乳腺癌的约30％中观测到的HER2/neu高水准表达也与相对不良预后相关。Li等人最近证明HER2/neu通过抑制CXCR4降解而增强CXCR4的表达及功能。(Li YM,Pan Y,Wei Y等人,Up-regulation of CXCR4 isessential for HER2-mediated tumor metastasis.Cancer Cell.6:459-469(2004))。因此，本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗乳腺癌的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
肺癌中的CXCR4
小细胞肺癌(SCLC)为一种侵袭性的快速转移的赘瘤，高度倾向于骨髓侵犯。即使在组合化学疗法及放射线疗法治疗下，5年存活期仅约5％，因为迅速出现抗药性。在SCLC细胞中，CXCR4活化以CXCR4及整合素依赖性方式诱导迁移及侵袭性反应及粘附至骨髓基质细胞。CXCR4可引导在SCLC患者中观测到的独特转移模式。因此，本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗肺癌的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
肾细胞癌(RCC)中的CXCR4
最近，已彻底阐明了CXCR4在mRCC中的作用。结果证明CXCR4的高表达与mRCC患者的不良存活强烈相关(Wang等人,Clin Exp Metastasis,26,1049-54(2009)；Zhao等人,MolBiol Rep,38,1039-45(2011))。此外，在鼠类模型中得出结果，其中表达CXCR4的RCC细胞的转移能力与癌细胞上CXCR4蛋白质含量及靶标器官中SDF-1α表达强烈相关(Motzer等人TheNew England Journal of Medicine,第335卷,第12期,第865-875页(1996))。因此，CXCR4可为肾透明细胞癌的多模态疗法中的令人感兴趣的治疗靶标。
本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或包含抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗肾细胞癌(RCC)的主要治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。
此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
非肿瘤学适应症中的CXCR4
趋化因子受体在各种特定细胞及特定时间表达。其主要与炎症及免疫反应经由使其效应细胞积聚在产生趋化因子的位点的机构的控制相关。例如，已证实SDF-1在体外特异性抑制T细胞导向(X4)HIV的感染(Bleul等人Nature,382:829-833(1996)；Oberlin等人Nature,833-835(1996))。这可视为SDF-1在HIV之前结合CXCR4，由此带走使细胞感染HIV的骨架，从而抑制HIV感染。此外，HIV感染抑制剂经证实为CXCR4拮抗剂(Nat.Med.,4,72(1998))。
因此，本发明涵盖抗CXCR4抗体、其抗原结合片段或抗CXCR抗体的抗CXCR4抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗炎症及免疫疾病、过敏性疾病、感染(HIV感染等)、与HIV感染相关的疾病(后天免疫缺乏综合征等)的治疗组合物。所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。
此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。
WHIM综合征
WHIM综合征为一种罕见的先天性免疫缺乏病症，其特征在于以下主要临床表现：疣、低γ球蛋白血症、复发性细菌感染及中性粒细胞减少症。[McDermott,DH等人Blood 118(18):4957-4962(2011)；Mcermott DH等人J.Cell.Mol.Med.15(10):2071-2081(2011)]。中性粒细胞减少症的进一步特征为不寻常血液病症，其中成熟嗜中性粒细胞无法离开骨髓且缺乏大量B及T细胞或其功能(Zueler WW等人N.Engl.J.Med.270:699-704(1964))。Hernandez PA等人首先描述CXCR4中的突变与WHIM综合征相关，其中CXCR4R334X为最常见且研究最透彻的变体(Hernandez PA等人Nature Genetics 34:70-74(2003))。CXCR4R334X作为获得功能的突变，显示增强的信号传导至内源性配体CXCL12的能力。因此，可利用CXCR4R334X增加的信号传导能力治疗WHIM综合征。
在本发明的一些方面中，本发明涵盖包含抗CXCR4抗体的抗体-药物缀合物的用途，其用作治疗WHIM综合征的主要治疗组合物，其中所述组合物可含有多克隆抗CXCR4抗体或单克隆抗CXCR4抗体。此外，本发明的治疗组合物可含有针对不同的非阻断CXCR4表位的单克隆抗CXCR4抗体的混合物或抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物或单克隆抗CXCR4抗体与抗CXCR4抗体-药物缀合物的混合物。此外，在一些方面中，本发明所揭示的治疗组合物可单独或与WHIM综合征的一些当前治疗组合施用，所述当前治疗为诸如G-CSF(非格司亭(filgrastim)(Neupogen；Amgen Inc.))、静脉内免疫球蛋白及小分子CXCR4拮抗剂AMD3100(普乐沙福(plerixafor)，商标名Mozobil(Genyzme Corporation))。
以下实施例仅作为示例性目的提供，且不意欲以任何方式限制本发明的范畴。实际上，除本文所示及所述以外，本发明的各种修改将为本领域技术人员由前面描述显而易见且属于所附权利要求的范畴内。
实施例1
嵌合抗CXCR4小鼠抗体的抗体结合亲和力测定
通过流式细胞术，在表达CXCR4的人类非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)Ramos细胞上评估嵌合小鼠抗CXCR4抗体12A11、6B6及3G10(表达为hIgG1亚型)的结合。100,000个细胞与逐级稀释的抗CXCR4抗体一起在100μL结合缓冲液(PBS+0.5％BSA)中温育，接着与来自JacksonImmunoresearch Laboratories的缀合Dylight488的山羊抗人Fc二抗一起温育。通过将每一稀释液的MFI值相对于最大值进行标准化以推导％。通过PRISM软件计算EC50。
表6
μg/mL 12A11 6B6 3G10
50 100.0％ 100.0％ 100.0％
20 79.1％ 97.5％ 103.8％
5 38.0％ 90.7％ 91.1％
2 13.4％ 87.8％ 88.0％
0.5 5.9％ 79.8％ 77.8％
0.2 3.1％ 67.3％ 65.7％
0.05 1.6％ 44.6％ 25.4％
0.02 0.1％ 12.8％ 10.2％
0.005 0.1％ 3.8％ 3.2％
0.002 0.0％ 3.0％ 2.0％
EC50(μg/mL) 7.28 0.09 0.13
EC50(nM) 48.51 0.63 0.89
实施例2
人源化3G10 Fab与表达CXCR4的HPB-ALL细胞的结合
通过流式细胞术，在表达CXCR4的HPB-ALL细胞上评估人源化3G10 Fab的结合。150,000个细胞与在100μL结合缓冲液(PBS+0.5％BSA)中的2.5或0.25μg/mL的不同h3G10Fab一起温育，接着与来自R&D systems的APC缀合的山羊抗人Fab特异性二抗一起温育。
表7
Figure BDA0002752729640000771
实施例3
CXCR4抗体结合：CXCR4 Ab Fab的细胞结合及亲和力测量
通过流式细胞术，在HPB-ALL(人类T细胞白血病)细胞上测量CXCR4 Fab与表达CXCR4的细胞的结合。使150,000个HPB-ALL细胞在96孔板上重悬于100μL FACS缓冲液(1×PBS+0.5％BSA)中。将抗CXCR4 Fab添加至每一孔中，至0.25μg/mL的最终浓度，并在4℃下温育30分钟。在移除一抗之后，细胞用FACS缓冲液洗涤两次，接着重悬于FACS缓冲液中，随后添加2μL(3μg)二抗(Alexa Fluor 647缀合的山羊抗人IgG，F(ab')2特异性，JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove PA)至每一孔中。平板在4℃下再温育30分钟。通过细胞分析器LSRII(BD Biosciences,San Jose CA)获得荧光信号。表中示出每一样品的MFI(平均萤光强度)。
使用富含人CXCR4的脂质粒子(LEV101，Integral Molecular,Philadelphia PA)确定每一Fab的结合亲和力。生物素化的WGA(Sigma Aldrich,St.Louis MO)可包被于SA芯片上以帮助捕获含有CXCR4蛋白质的脂质粒子。注射由低至高浓度(每一浓度具有3分钟结合时间)的Fab的逐级稀释液(5组，3X稀释因子，最高浓度为10或30nM)，以使用如Karlsson等人中所描述的“动力学滴定”方法对数据进行动力学分析(Karlsson,R.,Katsamba,P.S.,Nordin,H.,Pol,E.及Myszka,D.G.Analyzing a kinetic titration series usingaffinity biosensors.Anal.Biochem.349,136-147(2006))。对于一些分析循环，缓冲液而非Fab注射在捕获粒子上，以提供用于双重参考目的的空白循环(双重参考如Myszka等人Improving biosensor analysis.J.Mol.Recognit.12，279-284(1999)中所描述进行)。
表8
Figure BDA0002752729640000781
实施例4
CXCR4 Ab与猕猴及人CXCR4的结合
通过流式细胞术，在逐级稀释液(0.007-267nM)中，测试抗人CXCR4 Abh3G10.1.91.A58B与猕猴CXCR4对1)HPB-ALL(人类T细胞白血病)及猕猴CXCR4转染的CHO细胞及2)Raji(人类非霍奇金淋巴瘤)及HSC-F(猕猴T细胞系)的交叉反应性。通过二抗(AlexaFluor 647缀合的山羊抗人IgG，Fcγ特异性，Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove PA)检测结合并用LSRFortessa细胞分析器(BD Biosciences,San Jose CA)获得。曲线拟合及EC50计算用Prism软件(GraphPad软件,La Jolla CA)进行。表9A及9B及图3A及3B。
表9A
HPB-ALL CHO-猕猴CXCR4
EC50(nM) 0.27 0.16
表9B
Figure BDA0002752729640000782
Figure BDA0002752729640000791
实施例5
CXCR4抗体的效应功能
治疗性裸抗体依赖于两种类型的功能来实现临床功效：通过Fab(抗原结合片段)结构域的靶标特异性结合，以及经由抗体的Fc结构域与各种细胞类型上的Fc受体的相互作用的免疫介导的效应功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)及补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体Fc区结合免疫效应细胞(诸如天然杀伤细胞及巨噬细胞)表面上的Fc受体(FcγR)，导致靶向细胞的吞噬或溶解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联来杀死靶向细胞。因此，治疗抗体的Fc部分经由对ADCC或CDC的影响，可在其作用机制中具有重要作用。
人类IgG(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)的每一子类别均显示效应功能的独特性能，所述效应功能的独特性能由与FcγR及补体复合蛋白中的每一种的不同结合规定。虽然IgG1及IgG3结合相对较强，但IgG2及IgG4对Fc受体的亲和力低得多，且不引发高水平的ADCC。IgG1还对补体复合蛋白具有较高亲和力，而IgG2、IgG3及IgG4引起的CDC低得多。
抗CXCR4抗体的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性用cytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega,Madison WI)确定。在测定前一天，表达CXCR4的人类肿瘤细胞以10,000个细胞接种。供体PBMC细胞经由Ficoll梯度分离且在37℃下在x-vivo培养基中培养过夜。第二天，添加10或20μg/mL抗体至孔中，添加或不添加位于RPMI+5％FBS中的1000,000个PBMC细胞(E:T＝100:1)。随后平板在37℃下温育4小时。在3.5个小时的时间点，添加20μL裂解液至仅含靶标细胞的孔中。在8000rpm下旋转平板3分钟之后，将50μL上清液转移至另一平板。随后添加50μl底物至每一孔中且平板在室温下在黑暗中温育30分钟。通过添加50μL停止液至每一孔来停止反应。随后用分光光度计(Molecular Devices)在490nm下读取平板。特异性溶解百分比(％)按公式计算：
特异性溶解％＝(处理LDH释放-靶标细胞自发LDH释放-效应细胞自发LDH释放)/(靶标细胞最大LDH释放-靶标细胞自发LDH释放)×100
抗CXCR4抗体的CDC(抗体依赖性细胞毒性)活性用cytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega,Madison WI)确定。在测定前一天，表达CXCR4的人类肿瘤细胞以10,000个细胞接种。第二天，添加5-20μg/mL各Ab至仅细胞或具有2.5％、10％或20％供体AB补体(来自Innovative Biotech或Sigma)的细胞中。与ADCC测定类似地处理平板并进行特异性裂解分析。
在表达CXCR4的Ramos(NHL)或MOLT-4(人类T细胞白血病)细胞中，使用20μg/mL(图4A)或10μg/mL(图4C)抗体加100:1(效应:靶标)比率的正常供体PBMC细胞进行ADCC测定。温育4小时之后，作为嵌合hIgG1在Ramos(NHL)细胞上产生的抗人CXCR4小鼠Ab 12A11、6B6及3G10(图4A)或MOLT-4细胞上的人源化3G10抗体(图4C)的ADCC活性是明显的。与MOLT-4细胞上m3G10-hIgG4亚型的约20％细胞裂解相比，m3G10-hIgG1处理可见约80％细胞溶解(图4B)。
在表达CXCR4的Ramos细胞中用20μg/mL嵌合小鼠12A11、6B6及3G10-hIgG1抗体处理(图4D)，以及在Daudi(NHL)细胞上用5μg/mL人源化抗体处理(图4F)观察到CDC活性。5μg/mL IgG1骨架的抗CXCR4 3G10抗体检测到最大20％-30％特异性溶解活性，类似于Daudi细胞上的阳性对照抗体Rituxan，而hIgG4形式的3G10未显示CDC活性(图4E)。
实施例6
抗CXCR4抗体对SDF-1诱导的钙流动的抑制
SDF-1(配体)结合CXCR4受体时，触发钙流动反应。为了证实CXCR4 Ab的功能性拮抗活性，即抗人CXCR4抗体抑制SDF-1诱导的钙流动的能力，将人类T细胞白血病(Jurkat)细胞与Fluo-NW钙测定试剂盒(Molecular Probes/life technologies)结合使用。将细胞在含有10％胎牛血清、1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中于37℃下在CO2温育箱中培养至亚汇合。在测定当天，将细胞于25μl测定缓冲液中以每孔70,000个细胞铺于黑色、透明底部的384孔平板中。随后添加试剂盒测定染料至平板，每孔25μl，在室温下110分钟，避光。针对各抗人CXCR4抗体，在Fluo-NW Ca测定试剂盒缓冲液中制备11个点的1:3逐级稀释液，产生500nM至8pM的浓度范围。将细胞与抗体一起在室温下温育20分钟。随后用SDF-1α(Invitrogen)以8nM的最终浓度刺激细胞。随后使用FLIPR Tetra(Molecular Devices)测量钙流动，历时95秒。阳性对照由在SDF-1α存在下且无抗体处理的细胞组成。由不含SDF-1α且无抗体处理的细胞测量基线。通过荧光信号随时间的发展，测量钙的SDF-1α诱导。使用GraphPad Prism软件输出并绘制数据，且使用具有S形剂量效应公式的非线性曲线拟合计算EC50值。所得到的抗人CXCR4抗体对钙流动的抑制示于图5中。抗体3G10、6B6及12A11抑制SDF-1α诱导的钙流动，其中抑制IC50分别为1.555nM、1.418nM及27.07nM(表10)。在钙流动功能测定中评估的人源化CXCR4抗体的IC50概述于表11(平均n＝3独立实验/抗体)。概言之，人源化CXCR4抗体的效能类似于该测定中嵌合m3G10抗体的效能。
表10：嵌合CXCR4抗体的钙流动活性
3G10 6B6 12A11
IC50 1.555 1.418 27.07
表11：人源化CXCR4抗体的钙流动活性
Figure BDA0002752729640000801
实施例7
循环AMP(cAMP)的基于细胞功能的测定中的CXCR4抗体活性
在CXCL12(配体)结合CXCR4受体时，已知cAMP受抑制。为了证实CXCR4 Ab的拮抗活性，使用经人CXCR4转染的CHO-K1细胞(购自DiscoveRx,Fremont,CA)进行cAMP测定。cAMPHunter eXpress GPCR测定试剂盒(DiscoveRx)用于执行所述测定。在不存在CXCR4抗体下，用CXCR4配体CXCL12处理抑制cAMP产生。在用CXCR4抗体处理时，此抑制消除，且增加cAMP产生。此反应EC50示于表12中。概言之，所有测试的CXCR4抗体在此测定中均具有类似的有效活性，在24.3至45.6nM范围内。该研究证实小鼠(嵌合)3G10及人源化3G10 CXCR4抗体在cAMP功能测定中可竞争并阻断CXCR4配体活性。
表12：cAMP测定中抗CXCR4 Ab的EC50概述
Figure BDA0002752729640000802
Figure BDA0002752729640000811
实施例8
抗CXCR4抗体对细胞死亡的诱导
检测抗CXCR4抗体在人类非霍奇金氏淋巴瘤Ramos细胞系中诱导细胞死亡的能力。将细胞在含有10％胎牛血清及2nM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中于37℃下在CO2温育箱中培养至亚汇合。细胞以2.5×106个细胞/毫升接种于48孔板中的生长培养基中。将在PBS中稀释至指定浓度的抗CXCR4抗体添加至细胞中并在37℃下温育24小时。通过在LSRII流式细胞测定器(BD Biosciences)中测量的Annexin V-PE及碘化丙锭(PI)荧光信号来测量细胞死亡。通过将Annexin V+/PI+(后期)群体与Annexin V+/PI-(早期)群体相加，确定总体细胞死亡。
图6A的结果显示6B6及3G10抗人CXCR4抗体能够在Ramos细胞中以剂量依赖性方式诱导细胞死亡。在最高测试浓度100nM下，3G10及6B6引起>70％细胞死亡。此作用超过阳性对照星形孢菌素(Staurosporin，STS)，其为一种已知的有效的细胞死亡诱导剂(约60％)。在该测定中未处理细胞显示约30％的细胞死亡。抗CXCR412A11抗体在测试条件下不能诱导细胞死亡。当在Raji非霍奇金氏淋巴瘤细胞上测试这些抗体的活性时观测到类似结果。
在类似研究中，单链(Fab)及二价F(ab)2'由3G10抗体产生。Fab为单链抗体(单价)且含有作为抗原结合位点一部分的免疫球蛋白可变区以及第一免疫球蛋白恒定区。通过用蛋白水解酶木瓜蛋白酶消化3G10抗体来获得此片段。通过胃蛋白酶消化移除大多数Fc区同时使一些铰链区完整，来产生F(ab')2。F(ab')2片段具有两个通过二硫键连接在一起的抗原结合Fab部分，并因此为二价。Fab及F(ab')2与二价全长3G10抗体一同测试其诱导Ramos细胞的细胞死亡的能力。图6B示出的结果表明诱导细胞死亡的能力是二价依赖性的，其中完整抗体(3G10)及F(ab')2抗体能够诱导细胞死亡，而3G10 Fab对细胞死亡的作用非常有限。
实施例9
抗CXCR4抗体在体内对非霍奇金氏淋巴瘤实体肿瘤生长的抑制
SDF-1/CXCR4信号传导被认为在肿瘤发展的多个阶段，包括肿瘤生长、血管生成、侵入及转移中起重要作用。为评估抗人CXCR4 Ab抑制肿瘤生长的能力，采用使用雌性4-6周龄的CB17 SCID Beige小鼠(Jackson Laboratories)及皮下植入的人类非霍奇金氏淋巴瘤Ramos细胞的肿瘤异种移植模型。细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中于37℃下在5％CO2温育箱中培养。在该研究中，5×106个细胞植入各小鼠的右后侧腹区中，并允许以实体肿瘤生长至约175mm3的平均尺寸体积，体积由式(体积＝长度×宽度2)/2算出。随后小鼠随机化在4个不同处理组中，每组n＝10只动物。将各组小鼠用抗体于无菌PBS溶液中的静脉内(i.v.)注射液处理：(i)同种型对照Ab(15mg/kg)；(ii)3G10(15mg/kg)；(iii)6B6(15mg/kg)；及(iv)12A11(15mg/kg)。一周给与动物抗体一次，历时3周，总共3剂。在研究持续时间内，肿瘤体积通过卡尺一周测量一次至三次。实验结果如图7所示。结果表明与同种型对照抗体相比，所有3种测试的抗CXCR4抗体均显著抑制肿瘤生长。结果表明抗CXCR4抗体能够在体内抑制已长成的实体肿瘤的生长。在停止给与抗体之后，该肿瘤生长抑制作用持续较长时间(42天)。所有三种测试的抗CXCR4抗体的活性在该实体肿瘤模型中相当。图7。
实施例10
在小鼠全身性非霍奇金氏淋巴瘤细胞模型中抗CXCR4抗体增加存活时间及降低肿 瘤负荷
使用Raji非霍奇金氏淋巴瘤细胞，在血液淋巴瘤模型中进一步研究抗CXCR4抗体的抗肿瘤活性。此研究中所用的Raji细胞经萤光素酶基因(LUC)转染以允许随时间“体内(in life)”监测肿瘤负荷。细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中于37℃下在5％CO2温育箱中培养。通过将1×106个Raji-LUC细胞经尾静脉注射至雌性6-8周龄SCID Beige小鼠(来自Charles River Laoratories)中建立模型。在第0天(植入当天)，Raji-LUC细胞存在于肺中，表明所有动物中准确的静脉内注射肿瘤细胞。细胞植入后一天，基于肺生物发光的存在，将小鼠分配至处理组(每组10只动物)。将小鼠用含10mg/kg的同种型对照抗体3G10、6B6及12A11的无菌PBS溶液一周腹膜内(i.p.)处理一次，直至第67天。通过生物发光成像，使用Xenogen IVIS200成像系统监测肿瘤负荷。在腹部位置每5天对小鼠成像，萤光素以15mg/mL经腹膜内递送，注射200μl，且使用Xenogen Living Image测定整个身体生物发光。当小鼠开始展示后肢麻痹或达到其他人道终点时，将其处死。肿瘤负荷(通过生物发光测定)与存活均评估为终点。
图8A及8B示出此研究的生物发光结果。肿瘤负荷的降低通过生物发光水平随时间的降低来显示。图8A示出研究第0天(植入物基线)、第15天及第25天各组4-5只动物的代表性成像。如通过发光水平所测量，所有三种抗CXCR4抗体显著降低肿瘤负荷。图8B示出在该模型中，相对于同种型对照抗体，用3G10、6B6及12A11抗体处理具有可比较的TGI活性。
图8C中所示的存活曲线证实与同种型对照抗体相比，抗人CXCR4抗体3G10、6B6及12A11在全身性植入Raji-LUC细胞的动物的存活中具有极显著作用。虽然同种型对照处理的动物显示18天的中位存活，但用抗CXCR4抗体处理的动物在研究终止前未到达中位存活。所有3种测试的抗CXCR4抗体的作用相当，其间无统计差异。抗CXCR4抗体处理的动物的存活良好持续，超出第67天-施用最后抗体剂量的时间。
实施例11
在小鼠全身性急性骨髓白血病(AML)细胞模型中抗CXCR4抗体增加存活时间及降 低肿瘤负荷
使用AML的散播性/全身性静脉内模型，测试抗CXCR4抗体6B6增加NSG小鼠的存活及减少其肿瘤负荷的能力。人类AML癌症细胞系MV4-11经萤光素酶基因(MV4-11-LUC)转导以允许“体内”监测随时间的肿瘤负荷。将细胞在含有10％胎牛血清及1μg/mL用于萤光素酶表达选择的嘌呤霉素的IMDM培养基中于37℃下在5％CO2温育箱中培养。向4-6周龄NSG雌性小鼠(来自Jackson Laboratories)经静脉内注射MV4-11-LUC AML细胞(1×106个/动物)。
在细胞植入后第13天，基于总身体生物发光强度，将小鼠随机化至三个处理组(每组10只动物)。在第13天(同种型对照及抗CXCR4 6B6抗体)及第20天(抗CXCR46B6抗体)，开始在无菌PBS溶液中10mg/kg的每周皮下(s.c.)抗体处理，如图中所示(第13天；第20天)。使用Xenogen IVIS 200成像系统评估肿瘤负荷。每7天在腹部位置使小鼠成像且使用XenogenLiving Image软件测定整个身体生物发光。当小鼠开始显示后肢麻痹或达到其他人道终点时，将其处死。在终点时评估肿瘤负荷(通过生物发光测定)与存活。对在研究第35天收集的血液样品监测小鼠(每组n＝10)周边血液(PB)中循环的人AML细胞数目。通过用抗人CD45及抗人CD33抗体(来自BD Biosciences)进行流式细胞术染色，AML CD45及CD33标记物用于确定循环的人AML细胞百分比。
图9A示出该研究(从第20天至第41天)的5只动物/处理组的代表性生物发光成像。肿瘤负荷的降低通过生物发光水准随时间的降低来显示。更早开始(第13天)的抗CXCR46B6抗体的肿瘤负荷抑制与后一周(第20天)开始时相比更显著。与同种型对照抗体相比，6B6抗CXCR4抗体显著降低两个处理组中的肿瘤负荷，表明抗CXCR4抗体有效抑制人AML的分期散播性小鼠模型中的肿瘤负荷。
图9B中所示存活曲线证实与同种型对照抗体相比，抗人CXCR4抗体6B6在全身性植入MV4-11-LUC AML细胞的动物的存活中具有显著作用。虽然同种型对照处理的动物显示40天的中位存活，但在第13天及第20天用抗CXCR4 6B6抗体处理的动物分别具有53天及61天的中位存活。通过Mantel-Cox检验，这些差异为统计显著(p<0.05)。
图9C示出在研究第35天，与同种型对照处理的动物相比，在用抗CXCR4 6B6抗体处理的动物中人AML细胞数目显著降低。
实施例12
在小鼠全身性慢性淋巴细胞性白血病肿瘤模型中抗CXCR4抗体增加存活
CXCR4抗体的抗肿瘤活性在散播性静脉内慢性淋巴细胞性白血病(CLL)模型中进一步研究。经稳定转染以表达萤光素酶基因的人JVM-13肿瘤细胞在含有10％胎牛血清及0.25mg/mL嘌呤霉素的RPMI 1640培养基中于37℃下在5％CO2温育箱中培养。通过将1×106个JVM-13-Luc细胞经尾静脉注射至雌性6-8周龄SCID Beige小鼠中来建立模型。基于生物发光(BLI)读数，在细胞植入后第21天，将小鼠分配至处理组(每组10只动物)。用同种型对照抗体处理小鼠，3G10以10mg/kg在无菌PBS溶液中皮下(s.c.)给与，一周一次。利妥昔单抗(一种批淮用于治疗CLL患者的抗CD20 Ab)用作阳性对照。利妥昔单抗以10mg/kg在无菌PBS溶液中皮下给与，一周一次。使用Xenogen IVIS 200成像系统评估肿瘤负荷。每7天在腹部位置使小鼠成像并使用Xenogen Living Image软件测定整个身体生物发光。当小鼠开始显示后肢麻痹或达到其他人道终点时，将其处死。肿瘤负荷(通过生物发光测定)与存活均评估为终点。
图10A示出在研究第28、35、42、49及56天，各处理组中的小鼠的代表性萤光素酶活性成像。如通过随时间的发光水平所测量，与同种型对照抗体相比，用3G10处理显著降低大骨中的JVM-13-Luc肿瘤负荷。与同种型对照抗体相比，用利妥昔单抗处理还显著减少肿瘤负荷。
图10B示出该研究的卡普兰-梅耶(Kaplan-Meyer)存活曲线。与同种型对照Ab相比，观测到3G10及利妥昔单抗抗体使存活显著增加(p<0.0001)。虽然同种型对照抗体处理的动物显示32.5天的中位存活，但用Rituxan处理的动物显示45天的中位存活且用3G10处理的动物在第60天前未到达中位存活。该研究结果表明抗CXCR4抗体在人类CLL的分期散播性小鼠模型中有效抑制肿瘤负荷。
实施例13
人源化抗CXCR4抗体在体内抑制Ramos非霍奇金氏淋巴瘤的肿瘤生长
为评估人源化CXCR4 Ab抑制肿瘤生长的能力，采用使用雌性4-6周龄的CB17.cg-Prkdc SCID Beige小鼠(Charles River)及皮下植入的人类非霍奇金氏淋巴瘤Ramos细胞的肿瘤异种移植模型。细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中于37℃下在5％CO2温育箱中培养。在该研究中，5×106个细胞植入各小鼠的右后侧腹区中，并允许呈实体肿瘤生长至约350mm3的平均尺寸体积，体积由式(体积＝长度×宽度2)/2算出。随后小鼠随机化在7个不同处理组中，每组n＝10只动物。各组小鼠用含10mg/kg各抗体的无菌PBS溶液皮下(s.c.)处理：(同种型对照抗体；m3G10；h3G10.A57.WT；h3G10.2.37.2.72；h3G10.A57.A58；h3G10.1.91.A58A；h3G10.1.91.A58B)。一周给与动物抗体一次，历时2周，总共2剂。在研究持续时间内，肿瘤体积通过卡尺一周测量两次。实验结果如图11所示。结果表明与同种型对照抗体相比，所有测试的抗CXCR4抗体均显著抑制肿瘤生长。结果表明测试的人源化CXCR4抗体具有类似于嵌合m3G10抗体的功效。在停止抗体给与(第7天)之后，肿瘤生长抑制作用持续若干天。
实施例14
人源化抗CXCR4抗体在小鼠全身性多发性骨髓瘤(MM)模型中增加存活时间并降低 肿瘤负荷
使用MM的散播性/全身性静脉内模型，测试人源化抗CXCR4抗体h3G10.1.91.A58B增加NSG小鼠的存活及减少肿瘤负荷的能力。人MM癌症细胞系OPM-2经萤光素酶基因(OPM-2-LUC)转导以允许“体内”监测随时间的肿瘤负荷。细胞在含有10％胎牛血清及0.5μg/mL用于萤光素酶表达选择的嘌呤霉素的RPMI1640培养基中于37℃下在5％CO2温育箱中培养。向4-6周龄NSG雌性小鼠静脉内注射OPM-2-Luc细胞(5×106个/动物)。
在细胞植入后第8天，基于总身体生物发光强度，将小鼠随机化至三个处理组(每组10只动物)。开始10mg/kg于无菌PBS溶液中的每周皮下(s.c.)抗体处理且进行5周。美法仑(批淮用于治疗多发性骨髓瘤患者的药物之一)以1mg/kg给与，一周两次，进行3周。使用Xenogen IVIS 200成像系统评估肿瘤负荷。每7天在腹部位置使小鼠成像且使用XenogenLiving Image软件测定整个身体生物发光。当小鼠开始显示后肢麻痹或达到其他人道终点时，将其处死。肿瘤负荷(通过生物发光测定)与存活均评估为终点。
图12A及12B示出该研究中的生物发光(萤光素酶活性)结果。肿瘤负荷的降低通过生物发光水准随时间的降低来显示。图12A示出该研究的5只动物/治疗组的代表性生物发光成像。图12B示出与同种型对照抗体相比，用CXCR4抗体h3G10.1.91.A58B处理随时间显著抑制肿瘤生长(第30天p<0.0001)，表明抗CXCR4抗体在人类多发性骨髓瘤的分期散播性异种移植模型中有效抑制肿瘤负荷。图12C中所示该研究的存活曲线证实与同种型对照抗体相比，抗CXCR4抗体h3G10.1.91.A58B在全身性植入OPM-2-Luc MM细胞的动物的存活中具有显著作用。虽然同种型对照及美法仑处理的动物分别显示33.5及36天的中位存活，但用h3G10.1.91.A58B CXCR4抗体处理的动物具有不确定的中位存活，在研究第50天未观测到死亡。表13。通过Mantel-Cox检验，这些差异为统计显著的(p<0.0001)。
表13
同种型对照 h3G10.1.91.A58B 美法仑
中位存活(天) 33.5 不确定 36
实施例15
CXCR4阳性细胞中抗CXCR4 ADC的细胞毒性
抗CXCR4抗体(例如3G10)表达为人类IgG1亚型，并经含有谷氨酰胺的转谷氨酰胺酶(“Q”)标签TG6(SEQ ID NO:91(LLQGA))改造，并与AcLys-vc-PABC-MMAD(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基-MMAD)及AcLys-vc-PABC-0101((2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)缀合。转谷氨酰胺酶标签在抗体的重链C末端改造。随后经由在特异性位点(例如抗体重链的羧基末端)上带有含有谷氨酰胺的标签的抗CXCR4抗体与有效负载(例如MMAD或0101)的含胺衍生物之间的微生物转谷氨酰胺酶催化的转酰胺反应，实现抗CXCR4抗体与细胞毒性剂MMAD或0101的缀合。在一些情况下，羧基末端(根据EU编号方案位置447)野生型氨基酸赖氨酸缺失且被Q-标签置换。在其他情况下，位置222的野生型氨基酸赖氨酸(根据EU编号方案)被氨基酸精氨酸置换(“K222R”)。K222R取代提供产生更均质抗体及有效负载缀合物的显著作用，和/或使抗体与有效负载之间更好地进行分子间交联。在转酰胺反应中，含有谷氨酰胺的标签上的谷氨酰胺用作酰基供体，且含胺化合物用作酰基受体(胺供体)。在茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)转谷氨酰胺酶(ACTIVATM，Ajinomoto,Japan)存在下，经纯化的抗CXCR4抗体与过量酰基受体在150-900mM NaCl及25mM MES、HEPES[4-(2-羟基乙基)-1-派嗪乙烷磺酸]或Tris HCl缓冲液中，在6.2-8.8范围内的pH值下一起温育。反应条件针对个别酰基受体衍生物调整。在室温下温育2.5小时后，使用本领域技术人员已知的标准亲和层析法(诸如来自GE Healthcare的商业亲和层析法)，在MabSelect树脂(GE Healthcare,Waukesha,WI)上纯化抗体-药物缀合物。
随后在处理之前24小时，将表达CXCR4的细胞以每孔4000-8,000个细胞接种在白壁、透明底的平板上。随后用4倍逐级稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过
Figure BDA0002752729640000852
发光细胞活力测定96(Promega,Madison WI)测定细胞活力。相对细胞活力以占未处理对照的百分比确定。随后计算IC50。经由转谷氨酰胺酶标签缀合于MMAD或0101的抗CXCR4抗体在表达CXCR4的细胞中发挥有效的杀死细胞活性。
表14：表达CXCR4的细胞上CXCR4 ADC的细胞毒性
Figure BDA0002752729640000851
实施例16
CXCR4-ADC的体内抗肿瘤活性
在Ramos(NHL)及HPB-ALL(T-ALL)的异种移植模型中评估CXCR4 ADC的体内抗肿瘤功效。如实施例9中所描述，向雌性4-6周龄CB17 SCID小鼠(Jackson Laboratories)皮下植入5×106个Ramos(NHL)，直至约500mm3的平均尺寸体积，平均尺寸体积由式(体积＝长度×宽度2)/2算出。将10×106个HPB-ALL细胞植入雌性4-6周龄CB17 SCID小鼠中，直至平均肿瘤尺寸体积还达到约500mm3。在Ramos模型中，用6.0mg/kg阴性对照ADC(阴性对照-TG6-vc0101)或1.5、3.0或6.0mg/kg的CXCR4 ADC(3G10-TG6-vc0101及6B6-TG6-vc0101)的单剂量静脉内(静脉内)注射液处理各组小鼠。在研究持续时间内，肿瘤体积通过卡尺一周测量一次。实验结果如图13A所示。结果表明两种CXCR4 ADC在剂量≥3mg/kg下诱导肿瘤消退。对照ADC对肿瘤生长无作用。在HPB-ALL模型中，1.5mg/kg 3G10-TG6-vc0101的单剂量注射液足以诱导肿瘤消退(图13B)。
序列表
<110> 辉瑞公司
<120> 抗CXCR4抗体及抗体-药物缀合物
<130> PC71971A
<150> 61/861,706
<151> 2013-08-02
<160> 173
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 1
His Val Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr
20 25 30
Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln
65 70 75 80
Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala
85 90 95
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
gaggtaaagt tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgagttgggt ccgccagcct 120
ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180
gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240
ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300
gatctcccgg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 3
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Gly Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 4
gacatagtta tgtcgcagtc tccatcctcc ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca aatccagtca gagtctgtac aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccgctagg 180
gaatctgggg tccctggtcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cgctctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
gaagtccagc tggttgaaag tggtggcggc ctggtgcagc cgggcggctc tctgcgcctg 60
tcatgcgctg catccggctt taccttcagc gactattaca tgagctgggt tcgccaagcg 120
cccggcaaag gcctggaatg ggtgggattc attcgaaata aagcgaacgg ctataccacc 180
gaatatagcg catctgtcaa gggccggttc accatctccc gcgatgattc caagaacagc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgaagacg gaagataccg ccgtctatta ttgtgcccgc 300
gatctgcctg gctttgccta ttggggccaa ggcactctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 8
gacatcgtta tgacacagtc accagatagc ttagccgtgt ccctgggaga acgtgctacc 60
attaattgca aaagctccca gagcctgtat aacagccgga cacggaagaa ttatctggca 120
tggtatcagc agaaacccgg acagccgcct aagctgctga tttattgggc cagcgcacgc 180
gaaagtggtg tgcccgaccg cttttccggc agcggtagtg gcactgactt caccctgacc 240
atctcaagct tgcaagccga agacgtggca gtatattatt gcaagcagtc gtacaatctg 300
cgcacctttg gcggcggcac aaaagtggag atcaaa 336
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Gly Ser Arg Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
gaaatacagt tgcagcagtc cgggcctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactataata tatactgggt gaagcagagc 120
catggacaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtgg gaccaggtat 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240
atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttttgtgc aagaacctac 300
ggtagtcggt acgttggggc tatggactac tggggtcaag gaacctcggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Pro Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12
gatatcgtta tgacgcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttatattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctaatat atcggatgtc caaccctgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtcgagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Gly Ser Arg Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 14
caggttcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaagtg 60
tcctgcaagg cgagtggata taccttcacc gattacaata tttattgggt tcgccaggcc 120
accgggcagg gcctggagtg gatgggctac attgatccat ataacggtgg cacccgctac 180
aaccagaagt ttaaaggccg cgtgaccatg acccgcaata cctcgatctc caccgcctat 240
atggaactga gcagcttacg ctctgaagat acggccgtgt actactgtgc ccgcacctac 300
gggtctcgct acgttggcgc gatggattat tggggtcagg gcaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Pro Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 16
gacatcgtga tgacccagag cccgctgtct ctgccagtga cccctggtga gccagccagt 60
attagctgcc gcagcagcaa aagtctgctg cacagcaatg gaaacaccta cctgtattgg 120
tatctgcaga aaccgggtca gtcaccccag ctgctgatct accgcatgtc taacccggcc 180
agcggcgtcc ctgatcgctt tagcggcagc ggttccggaa ccgattttac cctgaagatc 240
tcccgcgttg aggccgaaga cgtcggcgtc tactattgca tgcagcacct ggaatatccg 300
ctgacattcg gtggcggtac caaagtggaa ctcaaa 336
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 17
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Leu Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 18
gaagtgaaat tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggagttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cttctgggtt caccttcact gattactaca tgagctgggt ccgccagcct 120
ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attagacaca aggctaatgg ttacacaaca 180
gaatacagta catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc cctaagcatc 240
ctctatcttc aaatgaacac cctgagacct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300
gatctcccgg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 19
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 20
gatattgtta tgtcgcagtc gccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
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gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttttaatctt 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
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<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 22
gaagtccagc tggttgaaag tggtggcggc ctggtgcagc cgggcggctc tctgcgcctg 60
tcatgcgctg catccggctt taccttcagc gactattaca tgagctgggt tcgccaagcg 120
cccggcaaag gcctggaatg ggtgggattc attcgacata aagcgaacgg ctataccacc 180
gaatatagca catctgtcaa gggccggttc accatctccc gcgatgattc caagaacagc 240
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gatctgcctg gctttgccta ttggggccaa ggcactctgg tcaccgtctc ctca 354
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<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 24
gaagtccagc tggttgaaag tggtggcggc ctggtgcagc cgggcggctc tctgcgcctg 60
tcatgcgctg catccggctt taccttcagc gactattaca tgagctgggt tcgccaagcg 120
cccggcaaag gcctggaatg ggtgggattc attcgacata aagcgaactt ttataccacc 180
gaatatagca catctgtcaa gggccggttc accatctccc gcgatgattc caagaacagc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgaagacg gaagataccg ccgtctatta ttgtgcccgc 300
gatctgcctg gctttgccta ttggggccaa ggcactctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
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gaagtccagc tggttgaaag tggtggcggc ctggtgcagc cgggcggctc tctgcgcctg 60
tcatgcgctg catccggctt taccttcagc gactattaca tgagctgggt tcgccaagcg 120
cccggcaaag gcctggaatg ggtgggattc attcgacata aagcgaacac gtataccacc 180
gaatatagca catctgtcaa gggccggttc accatctccc gcgatgattc caagaacagc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgaagacg gaagataccg ccgtctatta ttgtgcccgc 300
gatctgcctg gctttgccta ttggggccaa ggcactctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 87
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Leu Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 88
gaagtccagc tggttgaaag tggtggcggc ctggtgcagc cgggcggctc tctgcgcctg 60
tcatgcgctg catccggctt taccttcagc gactattaca tgagctgggt tcgccaagcg 120
cccggcaaag gcctggaatg ggtgggattc attcgacata aagcgaacct gtataccacc 180
gaatatagca catctgtcaa gggccggttc accatctccc gcgatgattc caagaacagc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgaagacg gaagataccg ccgtctatta ttgtgcccgc 300
gatctgcctg gctttgccta ttggggccaa ggcactctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 89
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 90
Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly
1 5
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 91
Leu Leu Gln Gly Ala
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 92
Gly Gly Leu Leu Gln Gly Ala
1 5
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 93
Leu Leu Gln Gly Pro Gly Lys
1 5
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 94
Leu Leu Gln Gly Pro Gly
1 5
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 95
Leu Leu Gln Gly Pro Ala
1 5
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 96
Leu Leu Gln Gly Pro
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 97
Leu Leu Gln Pro
1
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 98
Leu Leu Gln Pro Gly Lys
1 5
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 99
Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly Lys
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 100
Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly
1 5
<210> 101
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 101
Leu Leu Gln Gly Ala Pro
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> G or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> A, G, P, or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> A, G, K, P, or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K, G or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> K or absent
<400> 102
Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> any naturally occurring amino acids or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(8)
<223> any naturally occurring amino acids or absent
<400> 103
Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 104
<211> 1691
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 104
aacttcagtt tgttggctgc ggcagcaggt agcaaagtga cgccgagggc ctgagtgctc 60
cagtagccac cgcatctgga gaaccagcgg ttaccatgga ggggatcagt atatacactt 120
cagataacta caccgaggaa atgggctcag gggactatga ctccatgaag gaaccctgtt 180
tccgtgaaga aaatgctaat ttcaataaaa tcttcctgcc caccatctac tccatcatct 240
tcttaactgg cattgtgggc aatggattgg tcatcctggt catgggttac cagaagaaac 300
tgagaagcat gacggacaag tacaggctgc acctgtcagt ggccgacctc ctctttgtca 360
tcacgcttcc cttctgggca gttgatgccg tggcaaactg gtactttggg aacttcctat 420
gcaaggcagt ccatgtcatc tacacagtca acctctacag cagtgtcctc atcctggcct 480
tcatcagtct ggaccgctac ctggccatcg tccacgccac caacagtcag aggccaagga 540
agctgttggc tgaaaaggtg gtctatgttg gcgtctggat ccctgccctc ctgctgacta 600
ttcccgactt catctttgcc aacgtcagtg aggcagatga cagatatatc tgtgaccgct 660
tctaccccaa tgacttgtgg gtggttgtgt tccagtttca gcacatcatg gttggcctta 720
tcctgcctgg tattgtcatc ctgtcctgct attgcattat catctccaag ctgtcacact 780
ccaagggcca ccagaagcgc aaggccctca agaccacagt catcctcatc ctggctttct 840
tcgcctgttg gctgccttac tacattggga tcagcatcga ctccttcatc ctcctggaaa 900
tcatcaagca agggtgtgag tttgagaaca ctgtgcacaa gtggatttcc atcaccgagg 960
ccctagcttt cttccactgt tgtctgaacc ccatcctcta tgctttcctt ggagccaaat 1020
ttaaaacctc tgcccagcac gcactcacct ctgtgagcag agggtccagc ctcaagatcc 1080
tctccaaagg aaagcgaggt ggacattcat ctgtttccac tgagtctgag tcttcaagtt 1140
ttcactccag ctaacacaga tgtaaaagac ttttttttat acgataaata actttttttt 1200
aagttacaca tttttcagat ataaaagact gaccaatatt gtacagtttt tattgcttgt 1260
tggatttttg tcttgtgttt ctttagtttt tgtgaagttt aattgactta tttatataaa 1320
ttttttttgt ttcatattga tgtgtgtcta ggcaggacct gtggccaagt tcttagttgc 1380
tgtatgtctc gtggtaggac tgtagaaaag ggaactgaac attccagagc gtgtagtgaa 1440
tcacgtaaag ctagaaatga tccccagctg tttatgcata gataatctct ccattcccgt 1500
ggaacgtttt tcctgttctt aagacgtgat tttgctgtag aagatggcac ttataaccaa 1560
agcccaaagt ggtatagaaa tgctggtttt tcagttttca ggagtgggtt gatttcagca 1620
cctacagtgt acagtcttgt attaagttgt taataaaagt acatgttaaa cttaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa a 1691
<210> 105
<211> 352
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met
1 5 10 15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu
20 25 30
Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile
35 40 45
Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly
50 55 60
Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu
65 70 75 80
Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val
85 90 95
Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val
100 105 110
His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala
115 120 125
Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser
130 135 140
Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val
145 150 155 160
Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn
165 170 175
Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn
180 185 190
Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu
195 200 205
Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser
210 215 220
Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr
225 230 235 240
Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr
245 250 255
Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln
260 265 270
Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu
275 280 285
Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe
290 295 300
Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val
305 310 315 320
Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly
325 330 335
His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser
340 345 350
<210> 106
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> G or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> G , F, K, V, T, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> E or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> T or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> W or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> D or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> K, T, or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(89)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(90)
<223> A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> K or R
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Xaa Phe Ile Arg His Lys Xaa Asn Xaa Xaa Thr Xaa Glu Tyr Ser Thr
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Xaa Ser Lys Asn Xaa
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Xaa Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 107
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 108
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 109
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 110
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 110
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 111
Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 112
Asp Leu Pro Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 113
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
1 5
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 114
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 115
Asp Tyr Asn Ile Tyr
1 5
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 116
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 117
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 118
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 119
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 119
Asp Pro Tyr Asn Gly Gly
1 5
<210> 120
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 120
Thr Tyr Gly Ser Arg Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 121
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 122
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr
1 5 10
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 123
Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 124
Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 125
Arg His Lys Ala Asn Lys Tyr Thr
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 126
Arg His Lys Ala Asn Val Tyr Thr
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 127
Arg His Lys Ala Asn Ile Tyr Thr
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 128
Arg His Lys Ala Asn Phe Glu Thr
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 129
Arg His Lys Ala Asn Thr Tyr Thr
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 130
Arg His Lys Ala Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 131
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 132
Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser
1 5
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 133
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr
1 5
<210> 134
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 134
gacatcgtta tgacacagtc accagatagc ttagccgtgt ccctgggaga acgtgctacc 60
attaattgca aaagctccca gagcctgttt aacagccgga cacggaagaa ttatctggca 120
tggtatcagc agaaacccgg acagccgcct aagctgctga tttattgggc cagcgcacgc 180
gaaagtggtg tgcccgaccg cttttccggc agcggtagtg gcactgactt caccctgacc 240
atctcaagct tgcaagccga agacgtggca gtatattatt gcaagcagtc gttcaatgat 300
cgcacctttg gcggcggcac aaaagtggag atcaaa 336
<210> 135
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 135
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 136
Arg Met Ser Asn Pro Ala Ser
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 137
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 138
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 139
Lys Gln Ser Phe Asn Leu Arg Thr
1 5
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 140
Lys Gln Ser Phe Arg Leu Arg Thr
1 5
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 141
Lys Ser Ala Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 142
Lys Ser Ser Trp Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 143
Lys Ser Ser Asn Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 144
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser His Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 145
<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 145
Trp Ala Ser Ala Arg Gly Ser
1 5
<210> 146
<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 146
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Phe Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 147
<211> 17
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<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 147
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Leu
<210> 148
<211> 17
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<220>
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<400> 148
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Asn
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<211> 17
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<220>
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<400> 149
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Met
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<400> 150
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
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<222> (1)..(1)
<223> R or K
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Xaa Ser Xaa Xaa Ser Leu Phe Asn Ser Xaa Xaa Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Xaa
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<223> G or E
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Trp Ala Ser Ala Arg Xaa Ser
1 5
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<222> (5)..(5)
<223> N or R
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1 5
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1 5 10 15
Val Lys Gly
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Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Thr Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<400> 156
Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Leu Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<222> (8)..(8)
<223> G , F, K, V, T, L or I
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<223> T or R
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<223> D or V
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<222> (18)..(18)
<223> K, T or R
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1 5 10 15
Xaa Xaa Gly
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Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<400> 159
Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<400> 160
Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Val Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<400> 161
Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<211> 19
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<400> 162
Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Glu Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<211> 19
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Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr Arg Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Arg Gly
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Phe Ile Arg His Lys Val Asn Phe Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Val Thr Gly
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<400> 168
Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Phe Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Asp Lys Gly
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<211> 112
<212> PRT
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<223> Synthetic Construct
<400> 169
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Asn Asp Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 170
<211> 7
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<400> 170
Lys Gln Ser Phe Asn Asp Arg
1 5
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<211> 5
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Leu Leu Gln Gly Gly
1 5
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<211> 8
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<400> 172
Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro
1 5
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<211> 6
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 173
Leu Leu Gln Gly Pro Pro
1 5

Claims (35)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合趋化因子受体4(CXCR4)且包含：
a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：(i)VH CDR1，所述VH CDR1选自SEQ IDNO:108、109、115、116、117、121及122；(ii)VH CDR2，所述VH CDR2选自SEQ ID NO:110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130；及(iii)VH CDR3，所述VH CDR3选自SEQ ID NO:120；和
b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含：(i)VL CDR1，所述VL CDR1选自SEQ IDNO:131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151；(ii)VL CDR2，所述VL CDR2选自132、136及152；及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3选自SEQ ID NO:133、137、140及153。
2.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合CXCR4且包含：
a)重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含选自以下的互补决定区：(i)VH CDR1，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:115、121或122所示的序列；(ii)VH CDR2，所述VH CDR2包含SEQID NO:118或119所示的序列；及(iii)VH CDR3，所述VH CDR3包含SEQ ID NO:120所示的序列；和
b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含选自以下的互补决定区：(i)VL CDR1，所述VL CDR1包含SEQ ID NO:135所示的序列；(ii)VL CDR2，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:136所示的序列；及(iii)VL CDR3，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:137所示的序列。
3.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:13的VH区及SEQ IDNO:15的VL区。
4.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化、嵌合、CDR移植或重组人抗体。
5.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体未犬科化或猫科化。
6.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含在特定位点经改造的含有酰基供体谷氨酰胺的标签。
7.一种抗体-药物缀合物，其具有公式：
Ab-(T-L-D)，
其中：
a)Ab为结合趋化因子受体4(CXCR4)的抗体或其抗原结合片段；
b)T为可任选包括的含有酰基供体谷氨酰胺的标签；
c)L为接头；且
d)D为药物。
8.权利要求7的抗体-药物缀合物，其中Ab为前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求7的抗体-药物缀合物，其中Ab为人源化、嵌合、CDR移植或重组人抗体或其抗原结合片段。
10.权利要求7或8的抗体-药物缀合物，其中T选自SEQ ID NO:171、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、172、173、102、103及LLQ。
11.权利要求7或8的抗体-药物缀合物，其中T选自SEQ ID NO:91、92及102。
12.权利要求7或8的抗体-药物缀合物，其中L选自乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC)、氨基PEG6-丙酰基、马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(vc)及马来酰亚胺己酸基(mc)。
13.权利要求12的抗体-药物缀合物，其中L为乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC)。
14.权利要求13的抗体或抗原结合片段的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段与药物缀合，其中所述D选自：细胞毒性剂、免疫调节剂、显像剂、治疗蛋白质、生物聚合物及寡核苷酸。
15.权利要求14的抗体-药物缀合物，其中所述D为细胞毒性剂。
16.权利要求15的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自：蒽环霉素、奥瑞他汀、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素、引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体、美登素、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮杂卓二聚体、紫杉烷、长春花生物碱、特吡莱辛、哈米特林、斯考他汀、普拉地内酯及卡奇霉素。
17.权利要求15的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂为奥瑞他汀。
18.权利要求17的抗体-药物缀合物，其中所述奥瑞他汀选自：0101(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基--1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)、MMAD(单甲基奥瑞他汀D或单甲基多拉司他汀10及8261(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。
19.权利要求7-18中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述缀合物选自：
a)Ab-LLQGA(SEQ ID NO:91)-(乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC))-0101；
b)Ab-LLQGA(SEQ ID NO:91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；
c)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO:102)-(AcLys-VC-PABC)-0101；
d)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO:102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；
e)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO:92)-(AcLys-VC-PABC)-0101；及
f)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO:92)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD。
20.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求7-19中任一项的缀合物及药物学可接受的载体。
21.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
22.一种载体，其包含权利要求21的多核苷酸。
23.一种分离的宿主细胞，其重组产生权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段。
24.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在使所述抗体或其抗原结合片段产生的条件下培养权利要求23的宿主细胞，并从所述宿主细胞或培养基分离所述抗体或其抗原结合片段。
25.一种治疗对象中与CXCR4功能或表达相关的病症的方法，其包含向有需要的对象施用有效量的权利要求20的药物组合物。
26.权利要求25的方法，其中所述病症为癌症。
27.权利要求26的方法，其中所述癌症为血液癌症。
28.权利要求25的方法，其中所述癌症为B细胞或T细胞恶性肿瘤。
29.权利要求25的方法，其中所述癌症选自：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、B细胞淋巴瘤及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
30.权利要求25的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及皮肤癌。
31.一种减缓具有表达CXCR4的肿瘤的对象中肿瘤生长或进展的方法，包含向有需要的对象施用有效量的权利要求20的药物组合物。
32.一种减少对象中表达CXCR4的癌细胞转移的方法，包含向有需要的对象施用有效量的权利要求20的药物组合物。
33.一种诱导具有表达CXCR4的肿瘤的对象中肿瘤消退的方法，包含向有需要的对象施用有效量的权利要求20的药物组合物。
34.权利要求1-6中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或权利要求7-19中任一项的缀合物，其用于检测、诊断和/或治疗与CXCR4表达相关的病症。
35.权利要求1-6中任一项的分离的抗体或权利要求7-19中任一项的缀合物在制造用于治疗与CXCR4表达相关的病症的药剂中的用途。
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