TW201734047A - 抗ｃｘｃｒ４抗體及抗體-藥物結合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供結合於趨化激素受體4(CXCR4)之抗體及相關分子。本發明進一步提供包含此類抗體之抗體-藥物結合物、編碼抗體之核酸及獲得此類抗體之方法。本發明進一步關於使用此等抗體及抗CXCR4抗體-藥物結合物之治療方法，其用於治療與CXCR4功能或表現相關之病症(例如癌症)，諸如結腸癌、RCC、食道癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌或血液癌症。

Description

抗CXCR4抗體及抗體-藥物結合物
本發明係關於結合於趨化激素受體4(CXCR4)之抗體及相關分子。本發明亦關於包含全長抗體、抗體片段或其變異體或者由其組成之分子。本發明進一步關於編碼此類抗體之胺基酸及核酸序列。本發明亦關於包含抗CXCR4抗體之抗體結合物(例如抗體-藥物結合物)、包含抗CXCR4抗體之組合物及使用抗CXCR4抗體及其結合物治療與CXCR4表現相關之病狀(例如癌症)的方法。本發明進一步包含該等抗體、其抗原結合片段或抗體-藥物結合物及對應方法用於偵測及診斷與CXCR4表現相關之病理學病症的用途。在某些態樣中，病症為與CXCR4表現相對於正常增加相關之癌症或任何其他與CXCR4過度表現有關之病變。在其他態樣中，病症為發炎及免疫病症、過敏性病症、感染(HIV感染等)、自體免疫病症(例如類風濕性關節炎)、纖維化病症(例如肺)及心血管病症。本發明最終包含含有至少此類抗體或抗體-藥物結合物之產品及/或組合物或套組，其用於此類病症之預後或診斷或治療監測。
趨化激素為小的分泌肽，其尤其在免疫反應期間控制白細胞沿配體之化學梯度(稱為趨化激素梯度)遷移(Zlotnik等人，2000,Immunity,12：121-127)。根據Cys殘基在N端之位置，其分成四個類 別。CXC類別由一對Cys由單個殘基分開之趨化激素組成。此類別之最突出成員為介白素-8(IL-8、CXCL8)、基質細胞衍生因子-1(SDF-I、CXCL12)、γ-干擾素誘導性蛋白-10(IP-10、CXCL10)、血小板因子-4(PF-4、CXCL4)、嗜中性白血球活化蛋白-2(NAP-2、CXCL7)及黑色素瘤生長刺激活性(MGSA、CXCL1)。趨化激素之CC類別在N端具有兩個相鄰Cys且包括巨噬細胞發炎蛋白質-1(MIP-1α、CCL3；MIP-1jSa、CCL4)、經活化調節正常T細胞表現和分泌因子(RANTES、CCL5)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1、CCL2)。CX3C類別之趨化激素在N端含有兩個由三個殘基分開之Cys且由不規則趨化激素(fractalkine)/神經元趨化激素(neurotactin)表示(CX3CL1)。C類別趨化激素在N端含有單個Cys且由淋巴細胞趨化激素(lymphotactin)/ATAC/SCM(CL1)表示。趨化激素受體根據其與趨化激素結合之選擇性來分組。舉例而言，CXCR4結合SDF-1，而CXCR5結合吸引B細胞之趨化激素1(BCA1)。CXCR4與SDF-1之相互作用在腫瘤形成之多個階段，包括腫瘤生長、侵入、血管生成及癌轉移中發揮重要作用。
CXCR4為七跨膜G蛋白偶合受體(GPCR)(Herzog等人DNA Cell Biol.12：465(1993)；Rimland等人Mol.Pharmacol.40：869(1991)；WO03014153、WO02061087)。許多醫學上重要之生物過程藉由涉及G蛋白之信號轉導路徑介導(Lefkowitz,Nature,351：353-354,(1991))。G蛋白偶合受體(GPCR)為含有7個假定跨膜結構域(TM)之完整膜蛋白。此等蛋白質經由活化異三聚體G蛋白將信號介導至細胞內部，繼而活化各種效應蛋白，最終產生生理反應。
CXCR4在胚胎發生、恆定及發炎中發揮作用。此外，已展示CXCR4充當T親淋巴性HIV-I分離株之共同受體(Feng,Y.等人Science 272：872(1996))。CXCR4亦在人類癌症中發揮多效性作用。其表現在 許多腫瘤類型中上調，包括乳房、肺、結腸、胰臟、腦、前列腺、卵巢之癌症以及造血性癌症。一些文獻報導表明，SDF-1可經由作為一些腫瘤之生長及/或存活因子的CXCR4起作用。CXCR4在許多腫瘤之幹細胞樣或腫瘤起始亞群上表現，且可介導此等細胞支持癌症復發及轉移性擴散之能力。此外，CXCR4在內皮前驅細胞(EPC)上表現，且其活性為血管生成期間EPC併入功能血管中所需的。此可顯著地促進血管形成及腫瘤存活。CXCR4信號傳導亦可誘發促血管生成細胞因子(例如VEGF)，以及可介導腫瘤細胞侵入之整合素、黏附分子及基質降解酶。此外，在腫瘤浸潤之淋巴細胞及纖維母細胞以及腫瘤相關之巨噬細胞上偵測到CXCR4表現。此等細胞傾向於抑制腫瘤上免疫識別及攻擊，且重塑腫瘤微環境以促進腫瘤生長及轉移。
CXCR4在腫瘤生長及轉移中之多重作用及其在許多常見腫瘤類型中之廣泛表現使得此受體成為使用抑制劑進行治療性干預的有吸引力的標靶。雖然CXCR4之肽及小分子抑制劑及抗CXCR抗體已鑑別或進入臨床，但其效用受藥物動力學特性及毒理學限制。諸如抗體或抗體-藥物結合物之具有選擇性、半衰期長、功效及安全型態提高的藥劑將為一種用於治療癌症之合乎需要的藥劑。
雖然有各種靶向CXCR4之藥劑處在開發中，但對功效及安全型態提高且適用於人類患者之靶向CXCR4之其他治療劑(諸如抗體或抗體-藥物結合物)存在需要。本發明之抗體及抗體-藥物結合物為治療學上適用之抗CXCR4抗體，其具有多種合乎需要之特性，諸如減少腫瘤形成、腫瘤生長、血管生成及轉移。此外，本發明之抗體及抗體-藥物結合物誘發腫瘤細胞之細胞凋亡。
本發明提供結合於趨化激素受體4(CXCR4)之分離之抗體、其抗原結合片段及衍生物以及抗體-藥物結合物。本發明包括抗體之可變 重鏈及輕鏈的胺基酸序列及其對應核酸序列。
在一個態樣中，本發明包括抗體之互補決定區(CDR)序列以獲得保留獲得CDR之母體分子之CXCR4結合能力的包含一或多個CDR區或CDR衍生區域之結合分子。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所揭示之抗CXCR4抗體的抗體-藥物結合物。
在另一態樣中，本發明包含抗CXCR4抗體、其抗原結合片段及抗體-藥物結合物及對應方法用於偵測及診斷與CXCR4表現或功能相關之病症的用途。在一個態樣中，該等病症為與CXCR4表現相對於正常增加相關之癌症或任何其他與CXCR4過度表現有關之病變。
在另一態樣中，本發明包含含有至少此類抗體、抗原結合片段或抗體-藥物結合物之產品及/或組合物或套組，其用於某些癌症之預後或診斷或治療監測。
在一個態樣中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)且包含：a)重鏈可變(VH)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121及122組成之群的VH CDR1，(ii)選自由SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130組成之群的VH CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：112及120組成之群的VH CDR3；及/或b)輕鏈可變區(VL)，其包含(i)選自由SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151組成之群的VL CDR1，(ii)選自由145、132、136及152組成之群的VL CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：139、133、137、140及153組成之群的VL CDR3。
在另一態樣中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片 段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)且包含：a)包含選自由以下組成之群的互補決定區之重鏈可變(VH)區：(i)包含闡述為SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121或122之序列的VH CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156或130之序列的VH CDR2；及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：112或120之序列的VH CDR3；及/或b)包含選自由以下組成之群的互補決定區之輕鏈可變(VL)區：(i)包含闡述為SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150或151之序列的VL CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：145、132、136或152之序列的VL CDR2；及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：139、133、137、140或153之序列的VL CDR3。
在另一態樣中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)且包含：a)輕鏈可變(VL)區，其包含(i)包含序列X1SX2X3SLFNSX4X5RKNYLX6之VL CDR1，其中X1為R或K；X2為S或A；X3為W、N或Q；X4為H或R；X5為T或F，及/或X6為A、L、N或M(SEQ ID NO：151)；(ii)包含序列WASARX1S之VL CDR2，其中X1為G或E(SEQ ID NO：152)，及(iii)包含序列KQSFX1LRT之VL CDR3，其中X1為N或R(SEQ ID NO：153)；及/或b)重鏈可變(VH)區，包含(i)包含闡述為SEQ ID NO：107、108、109、113或114之序列的VH CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：157之序列的VH CDR2，及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：112之序列的VH CDR3。
在一個態樣中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於CXCR4且包含：重鏈可變(VH)區序列，其包含：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVX1FIRHKX2NX3X4TX5EYSTX6 X7 X8GRFTISRDX9SKNX10LYLQMNSLX11X12EDTAVYYCAX13DLPGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：106)，其中X1為G或S；X2為V或A；X3為G、F、K、V、T、L或I；X4為E或Y；X5為T或R；X6為W或S；X7為D或V；X8為K、T或R；X9為D或N；X10為T或S；X11為R或K；X12為A或T，及/或X13為K或R。
在一個態樣中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)，係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：162或128之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：115、116、117、121或122之VH CDR1、SEQ ID NO：118或119之VH CDR2及SEQ ID NO：120之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：135之VL CDR1、SEQ ID NO：136之VL CDR2及SEQ ID NO：137之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：110或111之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：131之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：133之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：154或123之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及e)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：157之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：151之VL CDR1、SEQ ID NO：152之VL CDR2及SEQ ID NO：153之VL CDR3的VL區。
在一個態樣中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片 段，其係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：115之VH CDR1、SEQ ID NO：118之VH CDR2及SEQ ID NO：120之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：135之VL CDR1、SEQ ID NO：136之VL CDR2及SEQ ID NO：137之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：110之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：131之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：133之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：154之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：157之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：151之VL CDR1、SEQ ID NO：152之VL CDR2及SEQ ID NO：153之VL CDR3的VL區。
在一個態樣中，本發明提供一種分離之抗體或其抗原結合片段，其係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：150之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：141之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；f)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：147之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；g)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：159之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；h)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：160之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；i)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：161之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；j)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；k)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；l)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：164之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；m)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：165之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；o)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：166之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；p)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：167之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；q)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；r)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；s)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；t)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；u)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；v) 具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及w)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區。
在本發明之特定態樣中，抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變(VH)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：107、162及112之CDR。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含：輕鏈可變(VL)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變(VH)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：107、162及112之CDR；及輕鏈可變(VL)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR。
在本發明之一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變(VH)區，其包含來自SEQ ID NO：33之VH區的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。在其他態樣中，抗體或其抗原結合片段包含：輕鏈可變(VL)區，其包含來自SEQ ID NO：73之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變(VH)區，其包含來自SEQ ID NO：33之VH區的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及輕鏈可變(VL)區，其包含來自SEQ ID NO：73之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)包含SEQ ID NO：33之VH區及SEQ ID NO：73之VL區的抗體或其抗原結合片段；b)包含SEQ ID NO：13之VH區及SEQ ID NO：15之VL區的抗體或其抗原結合片段；c)包含SEQ ID NO：5之VH區及SEQ ID NO：7之VL區的抗體或其抗原結合片段；d)包含SEQ ID NO：21之VH區及SEQ ID NO：47之VL區的抗體或其抗原結合片段；及e)包含SEQ ID NO：106之VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區的抗體或其抗原結合片段。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原片段包含具有與SEQ ID NO：33至少95%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO：73至少95%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在本發明之特定態樣中，抗體或其抗原結合片段包含：a)SEQ ID NO：33之重鏈可變(VH)區；及/或b)SEQ ID NO：73之輕鏈可變(VL)區。
在本發明之一些態樣中，抗體或抗原結合片段包含由具有ATCC寄存編號PTA-121353之表現載體產生的重鏈可變(VH)區。在本發明之一些態樣中，抗體或抗原結合片段包含由具有ATCC寄存編號PTA-121354之表現載體產生的輕鏈可變(VL)區。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：150之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：141之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；f)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：147之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；g)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：159之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；h)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：160之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；i)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：161之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；j)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；k)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3 的VL區；l)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：164之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；m)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：165之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；n)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：166之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；o)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：167之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；p)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；q)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；r)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；s)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；t)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之 VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；u)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及v)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區。
在本發明之一些態樣中，一種結合CXCR4之分離之抗體或其抗原結合片段與本文所揭示之抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4及/或結合於與本文所揭示之抗體或其抗原結合片段相同的CXCR4的抗原決定基。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區。
在本發明之一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為人類化、嵌合、CDR移植或重組人類抗體。在本發明之其他態樣中，抗體或其抗原結合片段未犬科化或貓科化。
在本發明之一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含在特定位點經工程改造之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤。
在本發明之一些態樣中，提供抗CXCR4抗體-藥物結合物。本發明之抗體-藥物結合物一般具有下式：Ab-(T-L-D)，其中：Ab為結合於趨化激素受體4(CXCR4)之抗體或其抗原結合片段；T為可視情況包括之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤；L為連接子；且D為藥物。
在特定態樣中，本發明之抗體藥物結合物係選自由以下組成之 群：a)包含含有SEQ ID NO：107、162及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：144、145及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；b)包含含有SEQ ID NO：115、118及120之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：135、136及137之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；c)包含含有SEQ ID NO：107、110及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：131、132及133之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；d)包含含有SEQ ID NO：107、154及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：138、132及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；e)包含含有SEQ ID NO：107、157及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：151、152及153之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；f)包含SEQ ID NO：33之VH區及SEQ ID NO：73之VL區的抗體或其抗原結合片段；g)包含SEQ ID NO：13之VH區及SEQ ID NO：15之VL區的抗體或其抗原結合片段；h)包含SEQ ID NO：5之VH區及SEQ ID NO：7之VL區的抗體或其抗原結合片段；及i)包含SEQ ID NO：21之VH區及SEQ ID NO：47之VL區的抗體或其抗原結合片段。
在本發明之一些抗體-藥物結合物中，Ab為人類化、嵌合、CDR移植或重組人類抗體或其抗原結合片段。在本發明之一些抗體-藥物結合物中，T係選自由SEQ ID NO：171、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、172、173、102、103及LLQ組成之群。在本發明之一些抗體-藥物結合物中，L係選自由乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC)、胺基PEG6-丙醯基、順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(vc)及順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)組成之群。在本發明之一些抗體-藥物結合物中，D係選自由細胞毒性劑、免疫調節劑、顯影劑、治療蛋白質、生物聚合物及寡核苷酸組成之群。
本發明之任何抗體-藥物結合物可用作為細胞毒性劑之藥物製 備。細胞毒性劑可為蒽環黴素(anthracycline)、奧瑞他汀(auristatin)、喜樹鹼(camptothecin)、考布他汀(combretastain)、海兔毒素(dolastatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、烯二炔(enediyne)、格爾德黴素(geldanamycin)、吲哚啉并-苯并二氮呯二聚體(indolino-benzodiazepine dimer)、美登素(maytansine)、嘌呤黴素(puromycin)、吡咯并苯并二氮呯二聚體(pyrrolobenzodiazepine dimer)、紫杉烷(taxane)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、特吡萊辛(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)、斯考他汀(spliceostatin)、普蘭立德(pladienolide)及卡奇黴素(calicheamicin)。本發明之任何抗體-藥物結合物均可用藥物奧瑞他汀製備。在一個態樣中，奧瑞他汀可為0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、MMAD(單甲基奧瑞他汀D或單甲基海兔毒素10及8261(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。
在特定態樣中，本發明之抗體-藥物結合物係選自由以下組成之群：a)Ab-LLQGA(SEQ ID NO：91)-(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC))-0101；Ab-LLQGA(SEQ ID NO：91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；c)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：102)-(AcLys-VC-PABC)-0101；d)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；e)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO：92)-(AcLys-VC-PABC)-0101；及f)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO：92)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD。
在本發明之一些態樣中，CXCR4抗體-藥物結合物包含任何本文 所揭示之抗體或其抗原結合片段。在本發明之一特定態樣中，本發明之抗體-藥物結合物包含抗體，其中該抗體包含含有SEQ ID NO：107、162及112之CDR的VH區及含有SEQ ID NO：144、145及139之CDR的VL區。
進一步提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑。
在本發明之一些態樣中，提供分離之聚核苷酸，其包含編碼任何本文所揭示之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。在一些態樣中，提供以重組方式產生本文所揭示之抗體或其抗原結合片段的宿主細胞。
在其他態樣中，提供治療個體中與CXCR4功能或表現相關之病症的方法，其包含向該個體投與有效量之本發明之醫藥組合物。在本發明之特定態樣中，病症為癌症。
在其他態樣中，提供減少個體中表現CXCR4之癌細胞轉移的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之本文所揭示之醫藥組合物。在其他態樣中，提供誘發具有表現CXCR4之腫瘤的個體中腫瘤消退的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之本文所揭示之醫藥組合物。
本發明之此等及其他態樣將藉由整體上本申請案之評述來瞭解。
圖1展示h3G10重鏈可變區(VH)比對。
圖2展示h3G10輕鏈可變區(VL)比對。
圖3A展示抗人類CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B與獼猴CXCR4之交叉反應性，此藉由流動式細胞測量術，在HPB-ALL(人類T細胞白血病)及經獼猴-CXCR4轉染之CHO細胞上進行連續稀釋(0.007-267nM) 進行。
圖3B展示抗人類CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B與獼猴CXCR4之交叉反應性，此藉由流動式細胞測量術，在Raji(NHL；人類非霍奇金淋巴瘤(Human non-Hodgkin Lymphoma))及HSC-F(獼猴T細胞株)上進行連續稀釋(0.007-267nM)進行。
圖4展示抗人類CXCR4抗體對表現CXCR4之人類細胞株的ADCC(A-C)及CDC(D-F)活性。
圖4A展示12A11、6B6及3G10抗人類CXCR4抗體對Ramos(NHL)細胞之ADCC活性。
圖4B展示m3G10-hIgG1及m3G10-hIgG4抗人類CXCR4抗體對MOLT-4(T急性淋巴母細胞白血病)細胞之ADCC活性的比較。
圖4C展示(m3G10-)及人類化(h3G10-)抗人類CXCR4抗體對MOLT-4(T急性淋巴母細胞白血病)細胞之ADCC活性。
圖4D展示12A11、6B6及3G10抗人類CXCR4抗體對Ramos(NHL)細胞之CDC活性。
圖4E展示m3G10-hIgG1及m3G10-hIgG4抗人類CXCR4抗體對Daudi(NHL)細胞之CDC活性的比較。
圖4F展示(m3G10-)及人類化(h3G10-)抗人類CXCR4抗體對Daudi(NHL)細胞之CDC活性。
圖5展示3G10、6B6及12A11抗人類CXCR4抗體對鈣流動之抑制。
圖6A展示3G10、6B6及12A11抗人類CXCR4抗體能夠在Ramos細胞中以劑量依賴性方式誘發細胞死亡。
圖6B展示抗人類CXCR4抗體3G10誘發細胞死亡之能力視二價而定。
圖7展示在非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)模型(Ramos)中，與同型對照 抗體相比，NHL3G10、6B6及12A11抗人類CXCR4抗體顯著抑制腫瘤生長。
圖8A展示與同型對照抗體相比，抗人類CXCR4抗體3G10、6B6及12A11對全身性植入Raji-LUC細胞之動物的腫瘤負荷具有顯著作用。
圖8B展示在此模型中，相對於同型對照抗體，用抗人類CXCR4抗體3G10、6B6及12A11處理具有相當及顯著之腫瘤生長抑制(TGI)活性。
圖8C為存活曲線，其展示與同型對照抗體相比，抗人類CXCR4抗體3G10、6B6及12A11在全身性植入Raji-LUC細胞之動物之存活中的顯著作用。
圖9A展示在急性骨髓白血病(AML)模型(MV4-11-LUC)中CXCR4 Ab 6B6對腫瘤負荷之作用。展示第20天至第41天每個處理組5隻動物之代表性生物發光成像。
圖9B展示與同型對照抗體相比，抗CXCR4抗體6B6在全身性植入MV4-11-LUC AML細胞之動物之存活中的顯著作用。
圖9C展示在研究第35天，與同型對照處理之動物相比，在用抗CXCR4 6B6抗體處理之動物的周邊血液(PB)中人類AML腫瘤負荷顯著降低。
圖10A展示在用CXCR4 3G10抗體處理的具有全身性慢性淋巴細胞性白血病腫瘤之小鼠中的代表性螢光素酶成像。
圖10B為存活曲線，其展示與同型對照抗體相比，抗人類CXCR4抗體3G10在全身性植入慢性淋巴細胞性白血病細胞之動物之存活中的顯著作用。
圖11展示與同型對照抗體相比，在非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)模型(Ramos)中，人類化抗人類CXCR4抗體顯著抑制腫瘤生長。
圖12A展示在多發性骨髓瘤(MM)模型(OPM-2-LUC)中CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B對腫瘤負荷之作用。展示第8天至第30天每個處理組5隻動物之代表性生物發光成像。
圖12B展示與用同型對照抗體及美法侖(Melphalan)處理之動物相比，在用抗人類CXCR4抗體h3G10.1.91.A58B處理之小鼠全身性多發性骨髓瘤(MM)模型中生物發光(螢光素酶活性)之定量。
圖12C為存活曲線，其展示與同型對照抗體及美法侖相比，抗CXCR4抗體h3G10.1.91.A58B在全身性植入OPM-2-Luc MM細胞之小鼠中的顯著作用。
圖13A展示CXCR4 ADC 3G10-TG6-vc0101及6B6-TG6-vc0101在Ramos(NHL)腫瘤模型中之顯著抗腫瘤作用。
圖13B展示CXCR4 ADC 3G10-TG6-vc0101在HPB-ALL(T-ALL)腫瘤模型中之顯著抗腫瘤作用。
本文所揭示之本發明提供結合於CXCR4(例如人類CXCR4)之抗體及抗體結合物(例如抗體-藥物結合物)。本發明亦提供編碼此等抗體之聚核苷酸、包含此等抗體之組合物及製備及使用此等抗體之方法。在某些態樣中，本發明之抗體來源於特定重鏈及輕鏈生殖系序列及/或包含特定結構特徵，諸如包含特定胺基酸序列之CDR區。本發明提供分離之抗體、製備此類抗體、其抗原結合片段、抗體-藥物結合物及包含此類抗體之雙特異性分子的方法及含有本發明之抗體、其抗原結合片段、抗體-藥物結合物或雙特異性分子的醫藥組合物。本發明亦關於使用抗體例如以偵測CXCR4，調節CXCR4活性及/或用於靶向表現CXCR4之細胞以在與CXCR4功能或表現相關之病症(諸如癌症)中進行破壞(例如ADCC、CDC、毒素)的方法。本發明亦提供用於預防性及/或治療性治療個體中與CXCR4功能或表現相關之病症，諸如癌 症(例如實體腫瘤癌症或血液癌症)的方法。最終，本發明包含含有此類抗體結合(例如抗體-藥物結合物)或組合其他抗癌化合物(諸如抗體、毒素、細胞毒素/細胞生長抑制劑)之組合物，及其用於預防及/或治療與CXCR4功能或表現相關之病症，諸如癌症之用途。
一般技術
除非另外指明，否則本發明之實施將採用在此項技術內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此等技術在諸如以下之文獻中充分解釋：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編輯，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編輯，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編輯，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編輯，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.編輯，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd及C.Dean編 輯，Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；及The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra編輯，Harwood Academic Publishers,1995)。
定義及縮寫
如本文所用之術語「趨化激素(C-X-C基元)受體4」及「CXCR4」係指G蛋白偶合之7跨膜結構域趨化激素受體，其通常嵌入細胞膜內。該術語亦包括變異體、同功異型物、同源物、直系同源物及旁系同源物。人類CXCR4之核酸及多肽序列分別作為GenBank寄存編號NM_003467及NP_003458揭示。人類CXCR4之進一步描述可見於Federsppiel,B.等人Genomics 16(3)：707-712(1993)；Herzog,H.等人DNA Cell Biol.12(6)：465-471(1993)；Jazin,E.E.等人Regul.Pept 47(3)：247-258(1993)；Nomura,H.等人Int.Immunol.5(10)：1239-1249(1993)；Loetscher,M.等人J.Biol.Chem.269(1)：232-237(1994)；Moriuchi,M.等人J.Immunol.159(9)：4322-4329(1997)；Caruz,A.等人FEBS Lett.426(2)：271-278(1998)；及Wegner,S.A.等人J.Biol.Chem.273(8)：4754-4760(1998)中。
CXCR4在此項技術中亦稱為例如LESTR、CD 184、CD184抗原、C-X-C趨化激素受體類型4、CXCR-4、CXCL-12、CXCR-R4、D2S201E、FB22、融合體、Fusin、HM89、HSY3RR、LAP3、LCR1、白細胞衍生七跨膜結構域受體、NPY3R、NPYR、NPYRL、NPYY3R、SDF-1受體或基質細胞衍生因子1受體。
出於本發明之目的，術語「CXCR4抗原」涵蓋任何CXCR4，包括人類CXCR4、另一哺乳動物之CXCR4(諸如小鼠CXCR4、大鼠CXCR4、犬科CXCR4、貓科CXCR4蛋白質或靈長類動物CXCR4)以及CXCR4之不同形式(例如糖基化CXCR4)。
如本文所用之術語「抗體」及「Ab」係指一種免疫球蛋白分子，其能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區中的抗原識別位點，識別及結合於諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等特定標靶或抗原。如本文所用，術語「抗體」可涵蓋任何類型之抗體，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體及保留特異性結合於既定抗原(例如CXCR4)之能力的完整抗體之抗原結合片段、雙特異性抗體、異結合抗體、其突變體、具有抗體之融合蛋白、單鏈(ScFv)及單域抗體(例如鯊魚及駱駝抗體)、最大抗體、微型抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv(參見例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology 23(9)：1126-1136)、人類化抗體、嵌合抗體及包括所需特異性之抗原識別位點的免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之組態，包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及共價修飾之抗體。該等抗體可為鼠類、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合或人類化抗體)。在本發明之一些態樣中，用於本發明之方法中的抗體或其抗原結合片段為嵌合、人類化或重組人類抗體或其CXCR4結合片段。
免疫球蛋白有五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中數個類別可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱作α、δ、ε、γ及μ。熟知免疫球蛋白之不同類別之次單元結構及三維組態。
原生或天然存在之抗體通常為約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體，由兩條一致輕(L)鏈及兩條一致重(H)鏈構成。各輕鏈係藉由一個共價雙硫鍵與重鏈連接，而不同免疫球蛋白同型之重鏈間，雙硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律間隔之鏈內雙硫橋。各重鏈在一末端具有可變域(VH)，其後為大量恆定域。各輕鏈在一端具有可變 域(VL)且在另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域係與重鏈之第一恆定域對準且輕鏈可變域係與重鏈之可變域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面。術語「可變」係指抗體間可變域之某些部分之序列廣泛不同。
如本文所用之術語「抗原結合片段」、「抗原結合部分」及「抗體部分」係指保留結合於既定抗原(例如CXCR4)能力的完整抗體之一或多個片段。抗體之抗原結合功能可藉由完整抗體之片段執行。抗原結合片段之實例包括Fab；Fab'；F(ab')2；Fd片段，由VH及CH1結構域組成；Fv片段，由抗體單臂之VL及VH結構域組成；單域抗體(dAb)片段(Ward等人，Nature 341：544-546,1989)、分離之互補決定區(CDR)、奈米抗體及含有單一可變域及兩個恆定域之重鏈可變區。此外，儘管Fv片段的兩個結構域(VL及VH)由獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該連接子能夠使其製造成VL與VH區成對以形成單價分子的單蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，Science 242：423-426(1988)，及Huston等人，PNAS 85：5879-5883(1988))。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知的習知技術來獲得，且以與完整抗體相同之方式來就效用對該等片段進行篩檢。
如本文所用之術語「CDR」係指抗體可變域中賦予其結合特異性之區域。抗體每一重鏈及輕鏈上存在3個CDR。可變區內構成CDR之胺基酸殘基可使用此項技術中已知之方法鑑別，該等方法包括(但不限於)Kabat(Kabat等人，1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NIH,Washington D.C.)、Chothia(Chothia等人，1989,Nature 342：877-883)、Kabat與Chothia之累積、AbM定義(其為Kabat與Chothia之間的折中方案且使用Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體(now Accelrys®)產生)、接觸定義 (MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.,262：732-745)及/或構形定義(Makabe等人，2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166)。如本文所用，CDR可指由此項技術中已知之任何方法，包括方法之組合所界定的CDR。本文所用之方法可利用根據任何此等方法界定之CDR。
如本文所用之術語「Fc區」係指免疫球蛋白重鏈之C端區。「Fc區」可為天然序列Fc區或變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常係界定為自位置Cys226或自Pro230處之胺基酸殘基伸展至其羧基端。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引之編號(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
如本文所使用之術語「單株抗體」及「mAb」係指獲自實質上均質之抗體群體之抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可能天然存在之可少量存在之突變外均一致。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得之特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明欲使用之單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein,1975,Nature,256：495所述之融合瘤方法來製得，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法製得。單株抗體亦可自使用例如McCafferty等人，1990,Nature,348：552-554中所述之技術產生之噬菌體文庫分離。
如本文中所用之術語「分離之抗體」係指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如特異性結合CXCR4之分離之抗體實質上不含特異性結合除CXCR4以外之抗原的抗體)。然而，特異性 結合CXCR4之分離之抗體可對諸如來自其他物種之CXCR4分子的其他抗原具有交叉反應性。此外，分離之抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文所用之術語「人類化抗體」及「CDR移植抗體」係指作為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列之其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)的非人類(例如鼠類)抗體之形式。人類化抗體較佳為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中該接受者之互補決定區(CDR)之殘基經具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠或兔)抗體(供者抗體)之CDR的殘基置換。
在某些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經對應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含既未在接受者抗體中亦未在輸入CDR或框架序列中發現，但經包括以進一步改善及優化抗體效能之殘基。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域的實質上所有，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之FR區。人類化抗體最佳亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區或域(Fc)、通常為人類免疫球蛋白之恆定區或域。較佳為具有如WO 99/58572中所描述經修飾之Fc區的抗體。人類化抗體之其他形式具有一或多個相對於原始抗體改變之CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，亦稱為一或多個「來源於」來自原始抗體之一或多個CDR的CDR。
人類化可基本上遵循Winter及同事之方法(Jones等人Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人Science 239：1534-1536(1988))，藉由用嚙齒動物或突變嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之對應序列來進行。亦參見 美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,859,205號，其以引用的方式併入本文中。在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個可變區之構架區中的殘基經對應非人類殘基替換(參見例如美國專利第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第6,180,370號)。此外，人類化抗體可包含接受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步提高抗體效能(例如以獲得所需親和力)。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上所有，其中所有或實質上所有高變區對應於非人類免疫球蛋白之高變區且所有或實質上所有構架區為人類免疫球蛋白序列之構架區。人類化抗體視情況亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常人類免疫球蛋白之恆定區。關於進一步細節參見Jones等人Nature 331：522-525(1986)；Riechmann等人Nature 332：323-329(1988)；及Presta Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)；以引用的方式併入本文中。因此，該等「人類化」抗體可包括實質上少於完整人類可變域已經來自非人類物種之對應序列取代之抗體。實際上，人類化抗體通常為一些CDR殘基及可能一些構架殘基經來自嚙齒動物抗體之類似位點之殘基取代的人類抗體。參見例如美國專利第5,225,539號；第5,585,089號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,859,205號。亦參見美國專利第6,180,370號及國際公開案第WO 01/27160號，其中揭示人類化抗體及用於產生對預定抗原之親和力提高之人類化抗體的技術。
如本文所用之術語「人類抗體」係指胺基酸序列對應於人類產生之抗體及/或已使用熟習此項技術者已知或本文所揭示之任何用於製備人類抗體之技術製得的抗體。人類抗體之此定義包括包含至少一個人類重鏈多肽或至少一個人類輕鏈多肽之抗體。一種此類實例為包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。可使用此項技術中已知之各種技 術來產生人類抗體。在一個實施例中，人類抗體係選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人，Nature Biotechnology,14：309-314,(1996)；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162,(1998)；Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381,(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581,(1991))。人類抗體亦可藉由將已藉由轉殖基因方法引入人類免疫球蛋白基因座代替內源性基因座的動物(例如內源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之小鼠)免疫接種來製得。此方法描述於美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號中。或者，人類抗體可藉由使產生針對標靶抗原之抗體的人類B淋巴細胞(此類B淋巴細胞可自個體或自cDNA之單細胞選殖回收或可在活體外已進行免疫接種)永生化來製備。參見例如Cole等人Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁，(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1)：86-95,(1991)；及美國專利第5,750,373號。
如本文所用之術語「嵌合抗體」係指其中可變區序列來源於一個物種且恆定區序列來源於另一物種之抗體，諸如可變區序列來源於小鼠抗體且恆定區序列來源於人類抗體之抗體。對於獸醫學應用，嵌合抗體之恆定域可來源於其他物種，諸如貓或狗。
如本文所用之術語「犬科化抗體」及「貓科化抗體」係指分別適用作犬科動物及貓科動物中之治療劑的嵌合抗體。在兩種情況下，來自異源物種供者抗體之抗原結合域與同一物種接受者抗體之非抗原結合域組合。
如本文所用之術語「優先結合」或「特異性結合」在用於抗體結合於標靶(例如CXCR4蛋白質)之情形下時為此項技術中充分瞭解之術語。確定此類特異性或優先結合之方法亦為此項技術中熟知。若分子與特定細胞或物質之反應或締合比其與替代性細胞或物質更頻繁、 更快速，持續時間更長及/或親和力更大，則稱其顯示「特異性結合」或「優先結合」。若抗體與標靶之結合比抗體與其他物質之結合親和力、親合力更大、更容易及/或持續時間更長，則抗體「特異性結合」或「優先結合」於標靶。舉例而言，特異性結合或優先結合於CXCR4抗原決定基之抗體為與此抗原決定基之結合比抗體與其他CXCR4抗原決定基或非CXCR4抗原決定基之結合親和力、親合力更大、更容易及/或持續時間更長的抗體。
如本文所用之術語「結合親和力」及「KD」意指特定抗原-抗體相互作用之平衡解離常數。KD為解離速率(亦稱為「解離速率」或「kd」)與締合速率或「締合速率」或「ka」之比率。因而，KD等於kd/ka且以莫耳濃度(M)表示。因而KD愈小，結合親和力愈強。因此，與1nM之KD相比，1μM之KD指示結合親和力弱。抗體之KD值可使用此項技術中充分確立之方法確定。一種確定抗體KD之方法係藉由使用表面電漿子共振，通常使用生物感應器系統，諸如BIACORE®系統。
關於抗體，如本文所用之術語「競爭」意謂第一抗體以足夠類似於第二抗體之結合的方式結合於抗原決定基，使得在第二抗體存在下第一抗體與其同源抗原決定基之結合的結果與在缺乏第二抗體下第一抗體之結合相比可偵測地降低。本發明涵蓋與本發明抗體競爭結合抗原決定基的抗體。基於本文所提供之教示，熟習此項技術者將瞭解，此類競爭抗體可用於本文所揭示之方法。
如本文所用之術語「藥物」係指具有生物或可偵測活性之任何物質。術語藥物意謂涵蓋細胞毒性劑、治療劑、免疫調節劑、可偵測標記、成像劑、結合劑、前藥(其在活體內代謝成活性劑)、生長因子、激素、細胞因子、抗激素、黃嘌呤、介白素、干擾素及細胞毒性藥物。藥物可為小分子、多肽、寡核苷酸或生物聚合物。藥物可經由連接子結合於本發明抗體以形成抗體-藥物結合物。
如本文所用之術語「效應功能」係指可歸因於抗體Fc區之生物活性。抗體效應功能之實例包括(但不限於)抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、Fc受體結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、吞噬作用、C1q結合及細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調。參見例如美國專利第6,737,056號。此類效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用此項技術中已知用於評估此類抗體效應功能之各種分析來評估。效應功能之一種例示性量測係經由Fcγ3及/或C1q結合。
如本文所用之術語「抗原決定基」包括能夠結合於免疫球蛋白或T細胞受體或以其他方式與分子相互作用之任何蛋白質決定子。抗原決定子一般係由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈之分子之化學活性表面分組組成且一般具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。抗原決定基可為「線性」或「構形性」。在線性抗原決定基中，蛋白質與相互作用分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質之主要胺基酸序列線性出現。在構形抗原決定基中，相互作用點穿過蛋白質上彼此隔開之胺基酸殘基而出現。一旦確定抗原上之所要抗原決定基，則可例如使用本發明所述之技術產生彼抗原決定基之抗體。或者，在發現過程中，抗體之產生及表徵可闡明所需抗原決定基之有關資訊。根據此資訊，則可競爭性篩檢結合於相同抗原決定基之抗體。一種實現此之方法為進行競爭研究，以尋找彼此競爭性結合的抗體，亦即抗體競爭結合於抗原決定基。用於基於競爭對抗體『重新分級(binning)』之高通過量方法描述於國際專利申請案第WO 03/48731號中。如本文所用之術語『重新分級』係指一種基於抗體之抗原結合特徵將其分組之方法。
如本文所用之術語「聚核苷酸」、「核酸/核苷酸」及「寡核苷酸」係指任何長度之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合物 形式、其類似物或可由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何受質。聚核苷酸可具有任何三維結構，且可執行任何已知或未知的功能。以下為聚核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、DNA、cDNA、基因組DNA、重組聚核苷酸、分支鏈聚核苷酸、質體、載體、任何序列之分離DNA、任何序列之分離RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可為天然存在、合成、重組的或其任何組合。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在裝配鏈之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列可由非核苷酸組分中斷。聚核苷酸可在聚合後諸如藉由與標記組分結合來進一步修飾。其他類型之修飾包括例如「封端」；一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)及帶電鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之聚核苷酸，含有諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)之側位部分之聚核苷酸，具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素(psoralen)等)之聚核苷酸，含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之聚核苷酸，含有烷化劑之聚核苷酸，具有經修飾鍵之聚核苷酸(例如α變旋異構核酸等)以及聚核苷酸之未經修飾形式。另外，通常存在於糖中之任何羥基可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護，或經活化以製備與其他核苷酸之其他鍵，或可與固體支撐物結合。5'及3'端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose))、非環狀類似 物及去鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性連接基團置換。此等替代性連接基團包括(但不限於)磷酸酯經P(O)S(「硫醇酯」)、P(S)S(「二硫醇酯」)、(O)NR2(「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。聚核苷酸中之所有鍵無需一致。上述描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所用之術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」係指任何長度、較佳相對較短(例如10-100個胺基酸)之胺基酸鏈。鏈可為線性或分支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，及/或可間雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋已天然或藉由介入來修飾之胺基酸序列；例如形成雙硫鍵、糖基化作用、脂化作用、乙醯化作用、磷酸化作用，或任何其他操縱或修飾(諸如與標記組分結合)。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應瞭解，多肽可呈單一鏈或締合鏈出現。
在本文中胺基酸可藉由其通常已知之三字母符號或藉由IUPAC-IUB Biochemical推薦之一字母符號提及。
如本文所用之術語「胺基酸」及「天然胺基酸」係指精胺酸、麩醯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、甘胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、天冬醯胺、異白胺酸及纈胺酸。
如本文所用之術語「胺基酸衍生物」係指藉由母體胺基酸之共價附接，諸如藉由烷基化、糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似方式進行取代或修飾的胺基酸。「衍生物」定義內進一步包括例如具有經取代鍵以及此項技術中已知之其他修飾的胺基酸之一或多種類似物。
如本文所用之術語「載體」係指能夠在宿主細胞中傳遞且較佳表現一或多種相關基因或序列的構築體。載體之實例包括(但不限於)：病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子型縮合劑締合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞(諸如生產細胞)。
如本文所用之術語「序列一致性%」係指兩個序列之間的類似程度。在核酸序列之情形下，其意謂兩個序列中當針對最大對應而比對時相同的殘基。序列一致性比較之長度可在至少約9個核苷酸，一般至少約18個核苷酸，更一般至少約24個核苷酸，通常至少約28個核苷酸，更通常至少約32個核苷酸，且較佳至少約36、48個或更多之核苷酸的長度上。此項技術中已知多種不同演算法，可用於量測核苷酸序列一致性。舉例而言，可使用FASTA、Gap或Bestfit來比較聚核苷酸序列，該等演算法為Wisconsin Package 10.0版，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin中之程式。包括例如程式FASTA2及FASTA3之FASTA提供查詢與搜索序列之間最佳重疊區域之比對及序列一致性%(Pearson,Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol.266：227-258(1996)；Pearson,J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；以引用的方式併入本文中)。除非另外規定，否則使用特定程式或演算法之預設參數。舉例而言，核酸序列之間的序列一致性百分比可使用GCG 6.1版(其以引用的方式併入本文中)中所提供之具有其預設參數(字號6及NOPAM係數用於計分矩陣)之FASTA或具有其預設參數之Gap測定。
除非另有說明，否則對核苷酸序列之提及涵蓋其互補序列。因此，應理解對具有特定序列之核酸的提及應涵蓋其互補鏈及其互補序列。
在胺基酸序列之情形下，其意謂兩個胺基酸序列當諸如藉由程式GAP或BESTFIT，使用與程式一起提供之預設間隙權數進行最佳比對時，享有至少70%、75%或80%序列一致性，較佳至少90%或95%序列一致性，且更佳至少97%、98%或99%序列一致性。在一些實質上類似之胺基酸序列中，不一致之殘基位置差別之處在於保守性胺基酸取代。
實質上類似的多肽亦包括保守性取代之變異體，其中一或多個殘基已經功能上類似的殘基保守性取代。保守性取代之實例包括一個非極性(疏水性)殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)經另一個非極性(疏水性)殘基取代；一個極性(親水性)殘基經另一個極性(親水性)殘基取代，諸如精胺酸與離胺酸之間、麩醯胺酸與天冬醯胺之間、甘胺酸與絲胺酸之間；一個鹼性殘基(諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸)經另一個鹼性殘基取代；或一個酸性殘基(諸如天冬胺酸或麩胺酸)經另一個酸性殘基取代。
另一指示兩個蛋白質實質上一致在於其享有整體三維結構或為生物功能相等物。
如本文所用之術語「細胞毒性活性」係指抗體、ADC或該ADC之細胞內代謝物之殺死細胞、細胞生長抑制或抗增生作用。細胞毒性活性可以IC50值表示，其為一半細胞存活時每單位體積之濃度(莫耳或質量)。
如本文所用之術語「接觸」係指使本發明之抗體或其抗原結合部分與標靶CXCR4或其抗原決定基以使抗體可影響CXCR4生物活性之方式在一起。該「接觸」可「活體外」(亦即在試管、皮氏培養皿或其類似物中)實現。在試管中，接觸可僅僅涉及抗體或其抗原結合部分及CXCR4或其抗原決定基，或其可涉及整個細胞。細胞亦可維持或生長在細胞培養皿中且在該環境中與抗體或其抗原結合部分接觸。在 此情形下，特定抗體或其抗原結合部分影響CXCR4相關病症之能力，亦即抗體之IC50值，可在嘗試在更複雜之活生物體下活體內使用抗體之前確定。對於在生物體外之細胞，存在多種方法，且為熟習此項技術者熟知，來使CXCR4與抗體或其抗原結合片段接觸。在另一實施例中，效應功能產生大量功效。已展示促成抗體介導之細胞毒性的免疫效應功能包括(但不限於)抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。
如本文所用之術語「含有醯基供體麩醯胺酸之標籤」及「麩醯胺酸標籤」係指含有一或多個Gln殘基之多肽或蛋白質，其充當轉麩醯胺酸酶胺受體。參見例如WO2012059882。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受之載劑」及「醫藥學上可接受之賦形劑」係指當與活性成分組合時允許成分保留生物活性且與個體之免疫系統無反應性的任何物質。實例包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物。標準醫藥載劑包括(但不限於)磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)及各種類型潤濕劑。用於氣溶膠或非經腸投與之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)或生理食鹽水(0.9%)。包含此等載劑之組合物係藉由熟知之習知方法來調配(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro編輯，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版Mack Publishing,2005)。載劑較佳適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(例如單株抗體、其抗原結合片段、抗體-藥物結合物)可用保護化合物免受酸及可使化合物不活化之其他天然條件作用的材料包覆膜衣。
本發明亦提供包含一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十五種、二十種或更多種本發明之抗體(包括包含抗體片段或其變異體或者由其組成的分子)或者由其組成的組合物。本發明之組合物可包含一或多種抗體或其片段或變異體的一種、兩種、三種、四種、五種、十種、十五種、二十種或更多種胺基酸序列或者由其組成。或者，本發明之組合物可包含編碼一或多個本發明抗體之核酸分子或者由其組成。
術語「CXCR4相關病症」為其中病變至少部分歸因於CXCR4表現增加或不當或CXCR4功能不當的任何病狀。此類病症之實例包括(但不限於)與CXCR4表現相對於正常增加相關之癌症、發炎及免疫病症、過敏性病症、感染(HIV感染等)、自體免疫病症(例如類風濕性關節炎)、纖維化病症(例如肺)及心血管病症。
術語「癌症」係指哺乳動物中通常特徵在於不受調控之細胞生長之生理病狀或病症。血液癌症係指血液之癌症，其尤其包括(但不限於)白血病、淋巴瘤及骨髓瘤。實體癌症係指身體組織而非血液之癌症，包括(但不限於)膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨膜癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、腎癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌及肝癌瘤及其類似癌症。
如本文所用之術語「患者」係指罹患CXCR4相關病症之個體。患者可包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物(例如猴)、大鼠、小鼠、天竺鼠、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥類及家禽。在較佳實施例中，投與本發明之抗體或抗體-藥物結合物的患者為人類。
如本文所用之術語「有效量」或「有效劑量」係指藥物、化合物或醫藥組合物實現一或多種有益或所要治療結果需要的量。出於預防性用途，有益或所要結果包括排除或降低病症(包括病症之生物化學、組織學及/或行為症狀、其併發症及在出現病症期間呈現之中間 病理學表現型)風險、減輕其嚴重性或延緩其開始。出於治療性用途，有益或所要結果包括諸如以下之臨床結果：降低病症之一或多種症狀發生率或改善病症之一或多種症狀、能夠減少治療病症所需之其他藥劑之劑量、增強用於治療病症之另一藥劑之作用及/或延緩病症進展。
為達成本發明之目的，有益或所要臨床結果包括(但不限於)一或多種以下結果：減少CXCR4相關病症中贅生性或癌細胞之增殖(或破壞)；減少或抑制CXCR4相關病症中贅生性細胞之轉移；使表現CXCR4之腫瘤之尺寸收縮或減小；緩解CXCR4相關病症；增加患有CXCR4相關病症之個體的預期壽命；減少由CXCR4相關病症產生之症狀；增加罹患CXCR4相關病症者之生活品質；能夠在無不利之影響下減少治療CXCR4相關病症所需之其他藥劑之劑量；延緩CXCR4相關病症之進展；治癒CXCR4相關病症；及/或延長患有CXCR4相關病症之患者的存活。
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般技術者通常所瞭解之含義。舉例而言，術語「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有」及「具有」及其類似術語可具有美國專利法中歸屬於其之含義且可意謂「包括(includes)」、「包括(including)」及其類似術語；同樣，「基本上由……組成」或「基本上組成」具有美國專利法中歸屬於其之含義且該術語為開放的，允許存在多於所述者，只要所述者之基本或新穎特徵不因存在多於所述者而變化即可，但不包括先前技術實施例。
另外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本文中對「約」一值或參數之提及包括(及描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，涉及「約X」之描述包括「X」之描述。 數值範圍包括界定該範圍之數字。在本發明之態樣或實施例根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代分組進行描述的情況下，本發明不僅涵蓋整體列出之整個群組，而且亦個別涵蓋群組之每一成員及主群組之所有可能子組，且亦涵蓋缺乏一或多個群組成員之主群組。本發明亦預期明確排除所主張之發明中之任何群組成員中的一或多者。
貫穿本說明書及申請專利範圍，詞語「包含(comrpise)」或其變化形式(諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」)應理解為意謂包括所述整數或整數組但不排除任何其他整數或整數組。除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術與科學術語均具有與一般技術者通常所理解相同之含義。在出現矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。本文中描述例示性的方法及材料，不過類似或同等於本文所述之方法及材料的方法及材料亦可用於實施或測試本發明。材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲作限制。
抗CXCR4抗體及其製備方法
本發明提供結合於人類CXCR4之抗CXCR4抗體或抗原結合片段。在本說明書本部分中，詳細描述例示性的本發明之抗CXCR4抗體或抗原結合片段的功能及結構特徵。應瞭解，本發明之抗體或抗原結合片段可基於本文中所描述之結構及/或功能特徵之任一或多者(2、3、4、5、6、7、8、9等)來描述。遍及本發明此部分，當功能或結構特徵關於本發明之抗體描述時，應瞭解，除非上下文另外明確指示，否則此類結構或功能特徵可類似地用於描述本發明之抗原結合片段。
人類CXCR4 cDNA之核苷酸序列及人類CXCR4蛋白質之預測胺基酸序列分別展示為SEQ ID NO：104及105(表1)。長度為約1679個核苷酸之人類CXCR4基因編碼分子量為約38.7kD且長度為約352個胺基 酸殘基的全長蛋白質。人類CXCR4核酸及多肽序列之進一步描述可分別見於GenBank寄存編號NM_003467及NP_003458中；以及Federsppiel,B.等人Genomics 16(3)：707-712(1993)；Herzog,H.等人DNA Cell Biol.12(6)：465-471(1993)；Jazin,E.E.等人Regul.Pept 47(3)：247-258(1993)；Nomura,H.等人Int.Immunol.5(10)：1239-1249(1993)；Loetscher,M.等人J.Biol.Chem.269(1)：232-237(1994)；Moriuchi,M.等人J.Immunol.159(9)：4322-4329(1997)；Caruz,A.等人FEBS Lett.426(2)：271-278(1998)；及Wegner,S.A.等人J.Biol.Chem.273(8)：4754-4760(1998)。
如本文所用之人類CXCR4序列與SEQ ID NO：105之人類CXCR4的不同之處可在於具有例如保守突變或非保守區域之突變，且該CXCR4具有與SEQ ID NO：105之人類CXCR4實質上相同的生物功能。舉例而言，人類CXCR4之生物功能為在由本發明抗體結合之CXCR4之細胞外域中具有抗原決定基或人類CXCR4之生物功能為結合趨化激素或參與轉移過程。
特定人類CXCR4序列在胺基酸序列上將一般與SEQ ID NO：105之人類CXCR4至少90%一致，且含有當與其他物種(例如鼠類)之CXCR4胺基酸序列相比時鑑別胺基酸序列為人類之胺基酸殘基。在某些情況下，人類CXCR4可與SEQ ID NO：105之CXCR4在胺基酸序列上至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。在本發明之一些態樣中，人類CXCR4序列將呈現與SEQ ID NO：105之CXCR4不超 過10個胺基酸差異。在本發明之某些態樣中，人類CXCR4可呈現與SEQ ID NO：105之CXCR4不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。一致性百分比可如本文所述來確定。
本發明之抗體、其抗原結合片段及抗體-藥物結合物特徵在於任一或多個以下特徵：(a)結合於CXCR4；(b)減少或下調CXCR4之蛋白質表現；(c)治療、預防、改善個體中與CXCR4功能或表現相關之病症(例如癌症，諸如NHL、AML、MM、CLL、T-ALL、胃癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌或胰臟癌)的一或多種症狀；(d)減少或抑制個體(其具有表現CXCR4之腫瘤)中腫瘤生長或進展；(e)減少或抑制個體(其具有一或多種表現CXCR4之癌細胞)中表現CXCR4之癌細胞的轉移；(f)誘發表現CXCR4之腫瘤消退(例如長期消退)；(g)在表現CXCR4之細胞中發揮細胞毒性活性；(h)使CXCR4路徑去活化或下調CXCR4路徑；以及(i)阻斷CXCR4與CXCR4細胞外結合搭配物之相互作用。舉例而言，本發明之抗體、其抗原結合片段及抗體-藥物結合物阻斷SDF-I之功能。
適用於本發明之抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異結合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分(例如結構域抗體)之融合蛋白、人類化抗體及免疫球蛋白分子之包含所需特異性之抗原識別位點的任何其他經修飾之組態，包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及共價修飾之抗體。該等抗體可為鼠類、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合或人類化抗體)。
在本發明之一些態樣中，如本文所述之抗CXCR4抗體為單株抗體。舉例而言，抗CXCR4抗體為人類化單株抗體或嵌合單株抗體。
在本發明之一些態樣中，本發明之抗體與來自非人類物種之CXCR4，諸如小鼠、大鼠、犬科動物、貓科動物或靈長類動物之 CXCR4，以及CXCR4之不同形式(例如糖基化CXCR4)交叉反應。在本發明之一些態樣中，對人類CXCR4具有特異性之抗體可完全對人類CXCR4具有特異性且可不顯示物種或其他類型之交叉反應性。
在本發明之一些態樣中，如本文所述之抗CXCR4抗體為犬科化抗體或貓科化抗體。已經犬科化或貓科化之根據本發明之抗體能夠結合於犬科動物CXCR4蛋白或貓科動物CXCR4蛋白中之至少一者。在一個態樣中，本發明之單株抗體結合於犬科動物CXCR4蛋白或貓科動物CXCR4蛋白且防止其結合於基質細胞衍生因子-1(SDF-1)。
在本發明之一些態樣中，抗體包含經修飾之恆定區，諸如(但不限於)引起免疫反應之可能性增加的恆定區。舉例而言，恆定區可經修飾以具有增加之對Fcγ受體(諸如FcγRI、FcγRIIA或FcγIII)之親和力。
在本發明之一些態樣中，抗體包含經修飾之恆定區，諸如具有增加之對人類Fcγ受體之親和力，免疫惰性，亦即引起免疫反應之可能性降低的恆定區。在本發明之一些態樣中，恆定區如以下中所描述進行修飾：Eur.J.Immunol.,29：2613-2624,1999；PCT申請案第PCT/GB99/01441號；及/或英國專利申請案第98099518號。Fc可為人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4。Fc可為含有突變A330P331至S330S331(IgG2△a)之人類IgG2，其中胺基酸殘基參考野生型IgG2序列編號。Eur.J.Immunol.,29：2613-2624,1999。在本發明之一些態樣中，抗體包含含有以下突變之IgG4恆定區(Armour等人，Molecular Immunology 40 585-593,2003)：E233F234L235至P233V234A235(IgG4△c)，其中編號參考野生型IgG4。在本發明之其他態樣中，Fc為具有缺失G236(IgG4△b)之人類IgG4 E233F234L235至P233V234A235。在本發明之另一態樣中，Fc為含有鉸鏈穩定化突變S228至P228之任何人類IgG4 Fc(IgG4、IgG4△b或IgG4△c)(Aalberse等 人，Immunology 105,9-19,2002)。在本發明之一特定態樣中，Fc可為去糖基化Fc。
在本發明之一些態樣中，藉由使寡醣附接殘基(諸如Asn297)及/或作為恆定區中糖基化識別序列一部分之側接殘基突變來使恆定區去糖基化，在本發明之一些態樣中，針對N連接之糖基化以酶促方式使恆定區去糖基化。以酶促方式或藉由在糖基化缺乏宿主細胞中表現，可使恆定區針對N連接之糖基化而去糖基化。
測定抗體與CXCR4之結合親和力之一方式係藉由量測抗體之單功能Fab片段之結合親和力。為獲得單功能Fab片段，抗體(例如IgG)可用木瓜蛋白酶裂解或重組地表現。抗體之CXCR4 Fab片段之親和力可藉由裝備有預固定抗生蛋白鏈菌素感測晶片(SA)之表面電漿子共振(BiacoreTM3000TM表面電漿子共振(SPR)系統，BiacoreTM,INC,Piscataway NJ)或抗小鼠Fc或抗人類Fc，使用HBS-EP操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15 NaCl、3mM EDTA、0.005% v/v界面活性劑P20)測定。生物素標記之WGA可塗佈於SA晶片上以有助於捕獲含有CXCR4蛋白質之脂質粒子。注射自低至高濃度(每一濃度具有3分鐘締合時間)之Fab之連續稀釋液(5員，3X稀釋因子，最高濃度為10或30nM)，以使用如Karlsson等人，(Karlsson,R.,Katsamba,P.S.,Nordin,H.,Pol,E.及Myszka,D.G.Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.Anal.Biochem.349,136-147(2006))中所描述之「動力學滴定」方法對數據進行動力學分析。對於一些分析循環，緩衝液注射在俘獲之粒子上代替Fab，以提供用於雙重參考目的之空白循環(雙重參考如Myszka等人中所描述進行)(Myszka,D.G.Improving biosensor analysis.J.Mol.Recognit.12,279-284(1999))。
Fab蛋白質之濃度係使用已知濃度(如由胺基酸分析所確定)之Fab作為標準藉由ELISA及/或SDS-PAGE電泳法來確定。藉由使用 BIAevaluation程式，將數據總體擬合於1：1朗繆爾結合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)來同時獲得動力學締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)值依koff/kon計算。此方案適用於確定抗體對任何CXCR4，包括人類CXCR4、另一哺乳動物之CXCR4(諸如小鼠CXCR4、大鼠CXCR4、犬科動物CXCR4或靈長類動物CXCR4)以及CXCR4之不同形式(例如糖基化CXCR4)的結合親和力。抗體之結合親和力一般在25℃下量測，但亦可在37℃下量測。
在本發明之一些態樣中，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段具有低於10,000μg/mL之MFI。在本發明之特定態樣中，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段具有低於6000μg/mL之MFI。在本發明之特定態樣中，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段具有低於5000μg/mL之MFI。在本發明之特定態樣中，在本發明之一些態樣中，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段具有在2000μg/mL至5000μg/mL範圍內之MFI。
如本文所用，「MFI」係指平均螢光強度或中位螢光強度。
在本發明之一些態樣中，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段具有低於3.00E-09 M之EC50。在本發明之一些態樣中，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段具有在約1.00E-09 M至約3.00E-09 M範圍內之EC50。舉例而言，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段具有2.00E-09 M之EC50。
在本發明之一些態樣中，結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段抑制SDF-1誘發之鈣流動。舉例而言，抗體或其抗原結合片段抑制SDF-1α誘發之鈣流動，其中抑制IC50在約1nM至50nM範圍內。在一個態樣中，抗體或其抗原結合片段抑制SDF-1α誘發之鈣流動，其中抑制IC50低於30nM。在一個態樣中，抗體或其抗原結合片段抑制 SDF-1α誘發之鈣流動，其中抑制IC50低於2nM。
在本發明之一些態樣中，抗體或其抗原結合片段顯著減少AML細胞模型中之AML細胞數目。舉例而言，人類細胞數之數目在用抗CXCR4 6B6抗體處理之動物中顯著降低。此外，用本發明之抗CXCR4抗體處理之動物的存活顯著增加。
在一些態樣中，本發明之抗體在小鼠全身性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及急性骨髓白血病(AML)細胞模型中增加存活時間且降低腫瘤負荷。在一個態樣中，本發明之抗體在小鼠全身性慢性淋巴細胞性白血病(CLL)腫瘤模型中增加存活。在一個態樣中，本發明之抗體抑制NHL腫瘤在活體內生長。在一些態樣中，本發明之抗體在小鼠全身性多發性骨髓瘤(MM)模型中增加存活時間且降低腫瘤負荷。
本發明之抗體可使用此項技術中熟知之技術，例如重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術或此類技術之組合或此項技術中容易獲知之其他技術產生(參見例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50(1999)及Fellouse,F.A.等人，J.Mol.Biol.,373(4)：924-40(2007))。
如本文所述之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段可藉由此項技術中已知之任何方法製備。舉例而言，為產生融合瘤細胞株，宿主動物免疫接種之途徑及時程一般與已建立及習知之用於抗體刺激及產生的技術一致，如本文中進一步描述。產生人類及小鼠抗體之一般技術為此項技術中已知及/或描述於本文中。
預期包括人類之任何哺乳動物個體或來自其之抗體產生細胞可經操縱以充當產生哺乳動物、包括人類及融合瘤細胞株之基礎。通常，以包括本文所述者之一定量之免疫原對宿主動物進行腹膜內、肌肉內、經口、皮下、蹠內及/或皮內接種。
融合瘤可由淋巴細胞及永生化骨髓瘤細胞，使用Kohler,B.及Milstein,C.,Nature 256：495-497(1975)之一般體細胞雜交技術或如 Buck,D.W.等人，In Vitro,18：377-381(1982)修改來製備。包括(但不限於)X63-Ag8.653之可用骨髓瘤株及來自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA.之彼等骨髓瘤株可用於雜交中。一般而言，該技術包含使用諸如聚乙二醇之促融劑或藉由熟習此項技術者熟知之電學方式使骨髓瘤細胞與淋巴細胞融合。融合之後，將細胞自融合培養基分離，且在諸如次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)培養基之選擇性生長培養基中生長，以除去未雜交之母體細胞。補充或未補充血清之本文所述任何培養基可用於培養分泌單株抗體之融合瘤。作為細胞融合技術之另一替代技術，EBV永生化B細胞可用於產生本發明之CXCR4單株抗體。必要時，使融合瘤擴展及次選殖，且藉由習知免疫分析程序(例如放射性免疫分析、酶免疫分析或螢光免疫分析)分析上清液的抗免疫原活性。
可用作抗體來源之融合瘤涵蓋產生對CXCR4有特異性之單株抗體之親本融合瘤的所有衍生物、子代細胞，或其一部分。
產生該等抗體之融合瘤可使用已知程序在活體外或活體內生長。單株抗體必要時可藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如硫酸銨沈澱、凝膠電泳、透析、層析及超濾)自培養基或體液分離。不希望之活性若存在則可例如藉由使製劑在由附著於固相之免疫原製成之吸附劑之上流動且自免疫原溶離出或釋放出所要抗體來移除。用使用雙功能或衍生劑(例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基磺酸基丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N=C=NR，其中R及R1為不同烷基)結合於在待免疫接種之物種中具有免疫原性的蛋白質(例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)的人類CXCR4或含有標靶胺基酸序列之片段對宿主動物進行免疫接種可產生抗體(例如單株抗體)群體。
必要時，可對相關抗CXCR4抗體(單株或多株)測序且接著可將聚核苷酸序列選殖至載體中用於表現或增殖。可將編碼相關抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中且可接著擴展及冷凍宿主細胞以備將來使用。細胞培養物中重組單株抗體之產生可經由利用此項技術中已知之方式自B細胞選殖抗體基因來進行。參見例如Tiller等人，J.Immunol.Methods 329,112(2008)；美國專利第7,314,622號。
作為替代方法，可將聚核苷酸序列用於遺傳操縱以使抗體「人類化」或改良抗體之親和力或其他特徵。舉例而言，恆定區可經工程改造以更類似人類恆定區以避免當抗體用於人類臨床試驗及治療時的免疫反應。可能需要對抗體序列進行基因操縱以獲得更大的對CXCR4之親和力及/或更大的抑制CXCR4之功效。
使單株抗體人類化一般有四個步驟。此等步驟為：(1)確定起始抗體輕及重可變域之核苷酸及預測之胺基酸序列；(2)設計人類化抗體，亦即決定哪個抗體構架區在人類化過程中使用；(3)實際人類化方法/技術；及(4)轉染及表現人類化抗體。參見例如美國專利第4,816,567號；第5,807,715號；第5,866,692號；第6,331,415號；第5,530,101號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,585,089號；及第6,180,370號。
已描述多種包含來源於非人類免疫球蛋白之抗原結合位點的「人類化」抗體分子，其包括具有嚙齒動物或經修飾之嚙齒動物V區及其相關CDR與人類恆定區融合之嵌合抗體。參見例如Winter等人Nature 349：293-299(1991)；Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224(1989)；Shaw等人J Immunol.138：4534-4538(1987)；Brown等人Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其他參考文獻描述在與適當人類抗體恆定區融合前移植至人類支撐構架區(FR)中之嚙齒動物CDR。參見例如Riechmann等人Nature 332：323-327(1988)； Verhoeyen等人Science 239：1534-1536(1988)，及Jones等人Nature 321：522-525(1986)。另一參考文獻描述藉由以重組方式工程改造之嚙齒動物構架區支撐的嚙齒動物CDR。參見例如歐洲專利公開案第0519596號。此等「人類化」分子經設計以將對嚙齒動物抗人類抗體分子之非所需免疫反應降至最低，該非所需免疫反應限制彼等部分在人類接受者中之治療應用的持續時間及效用。舉例而言，可對該抗體恆定區進行工程改造以使得其呈免疫惰性(例如不觸發補體溶解)。參見例如PCT公開案第PCT/GB99/01441號、英國專利申請案第9809951.8號。亦可利用之人類化抗體之其他方法揭示於以下中：Daugherty等人，Nucl.Acids Res.19：2471-2476,1991；及美國專利第6,180,377號；第6,054,297號；第5,997,867號；第5,866,692號；第6,210,671號；及第6,350,861號；及PCT公開案第WO 01/27160號。
與上文所論述之人類化抗體有關的一般原理亦適用於定製用於例如狗、貓、靈長類動物、馬科動物及牛科動物之抗體。此外，本文中所描述之使抗體人類化之一或多個態樣可組合，例如CDR移植、構架突變及CDR突變。
在本發明之一些態樣中，全人類抗體可藉由使用已經工程改造以表現特定人類免疫球蛋白之市售小鼠獲得。經設計以產生更合需要(例如全人類抗體)或更穩固之免疫反應的轉殖基因動物亦可用於產生人類化或人類抗體。用於自轉殖基因小鼠獲得人類抗體之方法揭示於Green等人，Nature Genet.7：13(1994)；Lonberg等人，Nature 368：856(1994)；及Taylor等人，Int.Immun.6：519(1994)中。此類系統之一非限制性實例為來自Abgenix(Fremont,CA)之XenoMouse®(例如Green等人，J.Immunol.Methods 231：11-23(1999)，以引用的方式併入本文中)。在XenoMouse®及類似動物中，小鼠抗體基因已經功能性人類抗體基因不活化及置換，而小鼠免疫系統之其餘部分保持完整。
XenoMouse®經生殖系組態之YAC(酵母人工染色體)轉型，該生殖系組態之YAC含有人類IgH及Igκ基因座之部分，包括可變區序列大部分，連同輔助基因及調控序列。人類可變區譜系可用於產生抗體產生B細胞，其可藉由已知技術加工成融合瘤。經標靶抗原免疫接種之XenoMouse®將藉由正常免疫反應產生人類抗體，可藉由上文所論述之標準技術採集及/或產生其。多種XenoMouse®株可供使用，其中每一者均能夠產生不同類別之抗體。以轉殖基因方式產生之人類抗體已展示具有治療潛能，同時保留正常人類抗體之藥物動力學特性(Green等人，J.Immunol.Methods 231：11-23(1999))。熟習此項技術者將認識到主張之組合物及方法不限於XenoMouse®系統之使用，亦可利用已經基因工程改造以產生人類抗體之任何轉殖基因動物。
在本發明之一些態樣中，抗體可使用具有本文所揭示之VH及/或VL序列中之一或多者作為工程改造修飾抗體之起始物質來製備，該修飾抗體可具有自起始抗體改變之特性。抗體可藉由修飾一或兩種可變區(亦即VH及/或VL)內，例如在一或多個CDR區內及/或在一或多個構架區內之一或多個殘基來工程改造。或者或另外，抗體可藉由修飾在恆定區內之殘基例如以改變該抗體之效應功能來工程改造。在某些態樣中，CDR移植可用以工程改造抗體之可變區。抗體主要經由位於六個重及輕鏈互補決定區(CDR)內之胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，在個別抗體之間，CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列差異更大。因為CDR序列造成大部分抗體-抗原相互作用，所以可藉由建構包括移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的來自特定天然存在之抗體之CDR序列的表現載體表現模擬特定天然存在之抗體之特性的重組抗體(參見例如Riechmann,L等人，Nature 332 323-327(1995)；Jones,P等人，Nature 32J.522-525(1986)；Queen,C等人，Proc Natl Acad See U.S.A 86 10029-10033(1989)；美國專利第 5,225,539號；第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號；及第6,180,370號)。
此類構架序列可獲自公共DNA資料庫或包括生殖系抗體基因序列之公開文獻。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫(在網際網路上www mrc-cpe cam ac uk/vbase可得)以及Kabat,E A等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242；Tomlinson,I M等人(1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」；Cox,J P L等人，J MoI.Biol TTL 776-798(1994)「A Directory of Human Germ-line Vn Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Ew.J.Immunol 2A 827-836，每一者之內容以引用之方式明確併入本文中。作為另一實例，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於Genbank資料庫。舉例而言，以下在HCo7 HuMAb小鼠中發現之重鏈生殖系序列可以隨附Genbank寄存編號1-69(NG_0010109、NT_024637及BC070333)、3-33(NG_0010109及NT_024637)及3-7(NG_0010109及NT_024637)獲得。作為另一實例，以下在HCoI 2 HuMAb小鼠中發現之重鏈生殖系序列可以隨附Genbank寄存編號1-69(NG_0010109、NT_024637及BCO7O333)、5-51(NG_0010109及NT_024637)、4-34(NG_0010109及NT_024637)、3-30 3(CAJ556644)及3-23(AJ406678)使用。人類重鏈及輕鏈生殖系序列之又一個來源為可自IMGT(http：//imgt.cines.fr)獲得的人類免疫球蛋白基因之資料庫。
用於本發明抗體之較佳構架序列為結構上類似於所選本發明抗體使用之構架序列的構架序列。VH CDR1、CDR2及CDR3序列及VL CDR1、CDR2及CDR3序列可移植於序列與構架序列所來源之生殖系免疫球蛋白基因中所見序列一致的構架區上，或CDR序列可移植於相較於生殖系序列，含有一或多個突變之構架區上。另一類型之構架修飾涉及使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於美國專利公開案第20030153043號中。
除構架區或CDR區內所作之修飾以外，或取而代之，本發明之抗體可經工程改造以包括Fc區內之修飾，通常以改變該抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分附接於抗體上)或經修飾以改變其糖基化，再改變該抗體之一或多種功能特性。以下進一步詳細描述此等實施例中之每一者。Fc區中之殘基編號為Kabat及/或Chothia之EU索引之編號。舉例而言，已發現在某些情況下使構架區內的殘基突變為有益的，以維持或增強抗體之抗原結合能力(參見例如美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號)。在本發明之一些態樣中，CH1之鉸鏈區經修飾，以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低該抗體之穩定性。在本發明之一些態樣中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中以使得抗體所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合削弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在本發明之一些態樣中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。多 種方法可行。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如美國專利第6,277,375號中所述。或者，為延長生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有結合自IgG之Fc區之CH2結構域之兩個環獲取的抗原決定基的救助受體，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。
在本發明之一些態樣中，抗體可以重組方式製得且使用此項技術中已知之任何方法表現。或者，抗體可藉由噬菌體呈現技術以重組方式製得。參看例如美國專利第5,565,332號；第5,580,717號；第5,733,743號；及第6,265,150號；及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。或者，可使用噬菌體呈現技術(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))自未免疫供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系活體外產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，使抗體V結構域基因同框選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要鞘蛋白基因中，且以功能性抗體片段之形式呈現於噬菌體粒子之表面上。由於該絲狀粒子含有噬菌體基因組之單鏈DNA複本，所以基於抗體功能特性之選擇亦選擇出編碼展示彼等性質之抗體之基因。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。噬菌體呈現可藉由多種格式執行；對其評論見例如Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。噬菌體呈現可使用若干V基因區段來源。Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)自源自免疫小鼠之脾的V基因的小隨機組合文庫分離出多樣性抗噁唑酮抗體陣列。可自未免疫人類供體構築V基因譜系且針對多樣性抗原(包括自體抗原)陣列之抗體可基本上按照由Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)所述之技術來分離。在天然免疫反應中，抗體基因以高速積累突變(體細胞超突變)。所引人之一些變化將賦予較高親和力，且呈現高親和力表面免疫球蛋白之B細胞在隨後 抗原攻擊期間優先複製及分化。此天然過程可藉由使用稱作「鏈改組」之技術來仿效。(Marks等人，Bio/Technol.10：779-783(1992))。在此方法中，藉由噬菌體呈現所獲得的「原生」人類抗體之親和力可繼而藉由以獲自未經免疫供體之V結構域基因的天然存在之變異體(譜系)之譜系來替代重及輕鏈V區基因而得以改良。此技術產生具有在pM-nM範圍內之親和力之抗體及抗體片段。用於製造極大型噬菌體抗體譜系(亦稱為「所有文庫之母庫」)之策略已由Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述。基因改組亦可用於自嚙齒動物抗體衍生人類抗體，其中該人類抗體具有與起始嚙齒動物抗體類似之親和力及特異性。根據亦稱作「抗原決定基刻印」之此方法，用人類V結構域基因譜系置換藉由噬菌體呈現技術所獲得之嚙齒動物抗體之重鏈或輕鏈V結構域基因，產生嚙齒動物-人類嵌合體。抗原上之選擇使得能夠恢復功能性抗原結合位點之人類可變區得以分離，亦即抗原決定基控制(刻印)搭配物的選擇。當重複該方法以置換剩餘嚙齒動物V結構域時，獲得人類抗體(參見PCT公開案第WO 93/06213號)。與傳統的藉由CDR移植使嚙齒動物抗體人類化不同，此技術提供完全人類抗體，其不具有嚙齒動物起源之構架或CDR殘基。
抗體可藉由首先自宿主動物分離抗體及抗體產生細胞，獲得基因序列及使用基因序列在宿主細胞(例如CHO細胞)中以重組方式表現抗體來以重組方式製得。可採用之另一方法為在植物(例如菸草)或轉殖基因牛奶中表現抗體序列。已揭示在植物或牛奶中以重組方式表現抗體之方法。參見例如Peeters等人，Vaccine 19：2756,(2001)；Lonberg,N.及D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65(1995)；及Pollock等人，J Immunol Methods 231：147(1999)。用於製備例如人類化、單鏈等抗體衍生物之方法為此項技術中已知。
免疫分析及流式細胞儀分選技術(諸如螢光活化細胞分選(FACS)) 亦可用於分離對CXCR4有特異性之抗體。
如本文所述之抗體可結合於許多不同載劑。載劑可為活性及/或惰性的。熟知載劑之實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐綸(nylon)、澱粉酶、玻璃、天然及經修飾之纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖及磁鐵礦。為達成本發明之目的，載劑之性質可為可溶或不可溶的。熟習此項技術者將瞭解結合抗體之其他適合載劑，或將能夠使用常規實驗確定該等載劑。在本發明之一些態樣中，載劑包含靶向心肌之部分。
使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)易於分離編碼單株抗體之DNA且對其測序。融合瘤細胞用作該DNA之較佳來源。一旦分離，則可將DNA置於表現載體(諸如PCT公開案第WO 87/04462中所揭示之表現載體)中，接著將其轉染至並不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以在重組宿主細胞中實現單株抗體之合成。參見例如PCT公開案第WO 87/04462號。DNA亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定區之編碼序列代替同源鼠類序列(Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851,1984)，或藉由將所有或一部分非免疫球蛋白多肽之編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價接合來修飾。以此方式，製備具有本文中CXCR4單株抗體之結合特異性的「嵌合」或「混合」抗體。
用於確定抗CXCR4抗體之結合特異性的方法為熟習此項技術者所熟知。一般方法例如提供於Mole,「Epitope Mapping」,METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷：IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS,Manson(編輯)，第105-116頁(The Humana Press,Inc.1992)。
如本文所述之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段可使用此項技術 中已知之方法鑑別或表徵，其中偵測及/或量測CXCR4表現量之降低。在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體或其抗原結合片段藉由將候選藥劑與CXCR4一起培育且監測結合及/或伴隨之CXCR4表現量降低來鑑別。結合分析可用純化之CXCR4多肽進行，或用天然表現或經轉染以表現CXCR4多肽之細胞進行。在一個態樣中，結合分析為一種競爭性結合分析，其中評估候選抗體與已知之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段競爭結合CXCR4的能力。可以多種格式來執行該分析，包括ELISA格式。
在初始鑑別之後，可藉由已知測試目標生物活性之生物分析進一步證實及優化候選抗CXCR4抗體或其抗原結合片段的活性。或者，可使用生物分析直接篩檢候選物。一些用於鑑別及表徵抗CXCR4抗體或其抗原結合片段之方法在實例中詳細描述。
抗CXCR4抗體或其抗原結合片段可使用此項技術中熟知之方法表徵。舉例而言，一種方法為鑑別其結合之抗原決定基或「抗原決定基定位」。此項技術中已知許多方法用於定位及表徵蛋白質上抗原決定基之位置，包括解出抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭分析、基因片段表現分析及基於合成肽之分析，如例如以下中所描述：Harlow及Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual，第11章，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999。在另一實例中，抗原決定基定位可用以確定抗CXCR4抗體或其抗原結合片段結合之序列。抗原決定基定位可購自多種來源，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。抗原決定基可為線性抗原決定基(亦即包含於胺基酸之單一伸展段中)，或由並不需要包含於單一伸展段中之胺基酸的三維相互作用所形成之構形抗原決定基。可分離或合成(例如以重組方式)變化長度(例如至少4-6個胺基酸長)之肽且用於與抗CXCR4抗體或其 抗原結合片段的結合分析。在另一實例中，抗CXCR4抗體或其抗原結合片段結合之抗原決定基可在系統篩檢中，藉由使用來源於CXCR4序列之重疊肽及測定抗CXCR4抗體或其抗原結合片段之結合來確定。根據基因片段表現分析，隨機或藉由特定遺傳構築使編碼CXCR4之開放閱讀框架分段且確定CXCR4之經表現之片段與待測試之抗體的反應性。舉例而言，可藉由PCR產生基因片段且接著在放射性胺基酸存在下活體外轉錄及轉譯成蛋白質。抗體與經放射性標記之CXCR4片段的結合隨後係藉由免疫沈澱反應及凝膠電泳法來確定。某些抗原決定基亦可藉由使用在噬菌體粒子(噬菌體庫)表面上呈現之隨機肽序列之大型文庫來鑑別。或者，可在簡單結合分析中針對重疊肽片段之界定文庫測試與測試抗體之結合。在另一實例中，可進行抗原結合域之突變誘發、結構域交換實驗及丙胺酸掃描突變誘發以鑑別抗原決定基結合所需、足夠及/或需要的殘基。舉例而言，結構域交換實驗可使用CXCR4蛋白質之各種片段已經來自另一物種(例如小鼠)CXCR4之序列置換(交換)的突變CXCR4，或緊密相關但抗原性獨特的蛋白質(例如CXCR4)進行。藉由評估抗體與突變CXCR4之結合，可評估特定CXCR4片段對抗體結合之重要性。
可用以表徵抗CXCR4抗體的又一種方法為使用與已知結合於相同抗原(亦即CXCR4上之各種片段)之其他抗體的競爭分析，以確定抗CXCR4抗體是否與其他抗體競爭及/或結合於與其他抗體相同的抗原決定基。競爭分析為熟習此項技術者所熟知。
在本發明之一些態樣中，結合CXCR4的分離之抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4及/或結合於CXCR4之相同抗原決定基。競爭結合於CXCR4及/或結合於CXCR4之相同抗原決定基的抗體包括包含以下之抗體：至少重鏈可變(VH)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121及122組成之群的 VH CDR1，(ii)選自由SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130組成之群的VH CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：112及120組成之群的VH CDR3；及/或至少輕鏈可變(VL)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151組成之群的VL CDR1，(ii)選自由145、132、136及152組成之群的VL CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：139、133、137、140及153組成之群的VL CDR3。
在本發明之一些態樣中，抗體與包含含有闡述為SEQ ID NO：107、162及112之三個CDR之重鏈可變(VH)區的抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4。
在本發明之一些態樣中，抗體與包含含有闡述為SEQ ID NO：144、145及139之三個CDR之輕鏈可變(VL)區的抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4。
在本發明之一些態樣中，抗體與包含a)含有闡述為SEQ ID NO：107、162及112之三個CDR之重鏈可變(VH)區及b)含有闡述為SEQ ID NO：144、145及139之三個CDR之輕鏈可變(VL)區的抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4。
在本發明之一些態樣中，抗體與包含a)含有來自SEQ ID NO：33之VH區的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之重鏈可變(VH)區及b)含有來自SEQ ID NO：73之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之輕鏈可變(VL)區的抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4。
在本發明之一些態樣中，抗體與包含a)SEQ ID NO：33之重鏈可變(VH)區及b)SEQ ID NO：73之輕鏈可變(VL)區的抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4。
表現載體可用以直接表現抗CXCR4抗體或其抗原結合片段。熟習此項技術者熟悉表現載體之投與以在活體內實現外源性蛋白質之表現。參見例如美國專利第6,436,908號；第6,413,942號；及第6,376,471號。表現載體之投與包括局部或全身投與，包括注射、經口投與、粒子槍或導管投與及表面投與。在本發明之另一態樣中，表現載體直接投與交感幹或神經節，或冠狀動脈、心房、心室或心包膜。
亦可使用含有表現載體或子基因組聚核苷酸之治療組合物的目標傳遞。受體介導之DNA傳遞技術描述於例如Findeis等人，Trends Biotechnol.11：202(1993)；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff編輯，1994；Wu等人，J.Biol.Chem.,263：621(1988)；Wu等人，J.Biol.Chem.,269：542(1994)；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：3655(1990)；及Wu等人，J.Biol.Chem.,266：338(1991)。對於基因治療方案中之局部投與，含有聚核苷酸之治療組合物以約100ng至約200mg範圍內之DNA投與。在基因治療方案期間亦可使用約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg及約20μg至約100μg之DNA濃度範圍。治療聚核苷酸及多肽可使用基因傳遞媒劑傳遞。基因傳遞媒劑可來源於病毒或非病毒(一般參見Jolly等人，Cancer Gene Therapy,1：51(1994)；Kimura,Human Gene Therapy,5：845(1994)；Connelly等人，Human Gene Therapy,1：185(1995)；及Kaplitt,Nature Genetics,6：148(1994))。可使用內源性哺乳動物或異源啟動子來誘導此等密碼序列之表現。編碼序列之表現可為組成性或經調節的。
在此項技術中熟知用於傳遞所需聚核苷酸及在所需細胞中表現之基於病毒之載體。例示性基於病毒之媒劑包括(但不限於)重組反轉錄病毒(參見例如PCT公開案第WO 90/07936號；第WO 94/03622號；第WO 93/25698號；第WO 93/25234號；第WO 93/11230號；第WO 93/10218號；第WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號及第4,777,127號；英國專利第2,200,651號；及EP專利第0 345 242號)、基於α病毒之載體(例如辛德畢斯病毒(Sindbis virus)載體、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委內端拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))，及腺相關病毒(AAV)載體(參見例如PCT公開案第WO 94/12649號；第WO 93/03769號；第WO 93/19191號；第WO 94/28938號；第WO 95/11984號及第WO 95/00655號)。亦可採用如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147中所描述之連接於殺死腺病毒之DNA的投與。
亦可採用非病毒傳遞媒劑及方法，包括(但不限於)連接或未連接於單獨殺死腺病毒的聚陽離子縮合之DNA(參見例如Curiel等人，Hum.Gene Ther.,3：147(1992))；配體連接之DNA(參見例如Wu,J.等人，Biol.Chem.,264：16985(1989))；真核細胞傳遞媒劑細胞(參見例如美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號；第WO 96/17072號；第WO 95/30763號；及第WO 97/42338號)及細胞核與細胞膜電荷中和或融合。亦可採用裸DNA。例示性裸DNA引入方法描述於PCT公開案第WO 90/11092號及美國專利第5,580,859號中。可充當基因傳遞媒劑之脂質體描述於美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號；第WO 94/23697號；第WO 91/14445號；及第EP 0524968號中。其他方法描述於Philip等人，Mol.Cell Biol.,14：2411(1994)及Woffendin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,91：1581(1994)中。
在本發明之一些態樣中，本發明涵蓋包含本文中所描述或藉由該等方法製得且具有本文中所描述之特徵之抗體的組合物，包括醫藥組合物。如本文所用，組合物包含一或多種結合於CXCR4之抗體及/ 或一或多種包含編碼一或多種此等抗體之序列的聚核苷酸。此等組合物可進一步包含此項技術中熟知之適合賦形劑，諸如醫藥學上可接受之賦形劑，包括緩衝劑。
因此，本發明提供以下各物中之任一者，或包含以下序列中之任一者之組合物(包括醫藥組合物)：
表2中，帶下劃線之序列為根據Kabat之CDR序列且粗體係根據Chothia。
本發明亦提供CXCR4抗體之CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR 及CDR接觸區)。此項技術中完全能夠確定CDR區。應瞭解在本發明之一些態樣中，CDR可為Kabat與Chothia CDR之組合(亦稱為「組合CR」或「延伸CDR」)。在一些實施例中，CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，CDR為Chothia CDR。換言之，在具有一種以上CDR之實施例中，CDR可為Kabat、Chothia、組合CDR或其組合中之任一者。表3及4提供本文所提供之CDR序列之實例。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其結合於CXCR4及/或與諸如m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D之如本文所述之抗體競爭。
在另一態樣中，抗體與抗體m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D競爭結合CXCR4。
在本發明之一些態樣中，抗體與本發明之抗體競爭結合CXCR4，且如藉由表面電漿子共振所量測，單價抗體結合親和力(KD)為約以下中之任一者或小於約以下中之任一者：6.5nM、6.0nM、5.5nM、5.0nM、4.5nM、4.0nM、3.5nM、3.0nM、2.5nM、2.0nM、1.5nM、1.0nM、0.5nM或0.25nM。在本發明之一些態樣中，抗體與抗體h3G10競爭結合CXCR4且單價抗體結合親和力(KD)為約以下中之任一者或小於約以下中之任一者：30nM、25nM、22nM、20nM、 15nM或10nM。
在一些態樣中，本發明亦提供基於CDR接觸區之抗CXCR4抗體之抗體CDR部分。CDR接觸區為賦予抗體對抗原之特異性的抗體區域。一般而言，CDR接觸區包括CDR及游標區(Vernier zone)中之殘基位置，其經限定以維持抗體結合特定抗原之適當環結構。參見例如Makabe等人，J.Biol.Chem.,283：1156-1166,2007。此項技術中完全能夠確定CDR接觸區。
在本發明之一些態樣中，一種結合於趨化激素受體4(CXCR4)的分離之抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變(VH)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121及122組成之群的VH CDR1，(ii)選自由SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130組成之群的VH CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：112及120組成之群的VH CDR3；及/或b)輕鏈可變(VL)區，包含(i)選自由SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151組成之群的VL CDR1，(ii)選自由145、132、136及152組成之群的VL CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：139、133、137、140及153組成之群的VL CDR3。
在一個態樣中，結合於CXCR4之抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列與SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121、122；162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156、130、112及120至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變(VH)CDR區。在一個態樣中，結合於CXCR4之抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列與SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150、151、145、132、136及152、139、133、137、140及153至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變(VL)CDR區。
在本發明之一些態樣中，結合CXCR4之分離之抗體或其抗原結合片段包含：a)包含選自由以下組成之群的互補決定區之重鏈可變(VH)區：(i)包含闡述為SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121及122之序列的VH CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130之序列的VH CDR2；及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：112或120之序列的VH CDR3；及/或b)包含選自由以下組成之群的互補決定區之輕鏈可變(VL)區：(i)包含闡述為SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150或151之序列的VL CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：145、132、136或152之序列的VL CDR2；及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：139、133、137、140或153之序列的VL CDR3。在本發明之一些態樣中，結合於CXCR4之分離之抗體或其抗原結合片段包含：a)輕鏈可變(VL)區，其包含(i)包含序列X1SX2X3SLFNSX4X5RKNYLX6之VL CDR1，其中X1為R或K；X2為S或A；X3為W、N或Q；X4為H或R；X5為T或F，及/或X6為A、L、N或M(SEQ ID NO：151)；(ii)包含序列WASARX1S之VL CDR2，其中X1為G或E(SEQ ID NO：152)，及(iii)包含序列KQSFX1LRT之VL CDR3，其中X1為N或R(SEQ ID NO：153)；及/或b)重鏈可變(VH)區，其包含(i)包含闡述為SEQ ID NO：107、108、109、113或114之序列的VH CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：157之序列的VH CDR2及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：112之序列的VH CDR3。
在另一態樣中，本發明提供一種結合於趨化激素受體4(CXCR4)之分離之抗體或其抗原結合片段且包含：重鏈可變(VH)區序列，其包含：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVX1FIRHKX2NX3X4TX5EYSTX6X7X8GRFTISRDX9SKNX10LYLQMNSLX11X12EDTAVYYCAX13DLPGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：106)，其中X1為G或S；X2為V或A；X3為G、F、K、V、T、L或I；X4為E或Y；X5為T或R；X6為W或S；X7為D或V；X8為K、T或R；X9為D或N；X10為T或S；X11為R或K；X12為A或T；且X13為K或R。
在本發明之一些態樣中，一種結合於趨化激素受體4(CXCR4)之分離之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：162或128之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：115、116、117、121或122之VH CDR1、SEQ ID NO：118或119之VH CDR2及SEQ ID NO：120之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：135之VL CDR1、SEQ ID NO：136之VL CDR2及SEQ ID NO：137之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：110或111之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：131之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：133之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：154或123之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及e)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：157之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：151之 VL CDR1、SEQ ID NO：152之VL CDR2及SEQ ID NO：153之VL CDR3的VL區。
在本發明之一些態樣中，一種結合於趨化激素受體4(CXCR4)之分離之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：115之VH CDR1、SEQ ID NO：118之VH CDR2及SEQ ID NO：120之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：135之VL CDR1、SEQ ID NO：136之VL CDR2及SEQ ID NO：137之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：110之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：131之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：133之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：154之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：157之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：151之VL CDR1、SEQ ID NO：152之VL CDR2及SEQ ID NO：153之VL CDR3的VL區。
在本發明之一些態樣中，一種結合於趨化激素受體4(CXCR4)之分離之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：150之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：141之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；f)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：147之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；g)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：159之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；h)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：160之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；i)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：161之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；j)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3 的VL區；k)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；l)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：164之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；m)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：165之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；o)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：166之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；p)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：167之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；q)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；r)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；s)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；t)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之 VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；u)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；v)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及w)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變(VH)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：107、162及112之CDR。在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：輕鏈可變(VL)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR。在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：a)重鏈可變(VH)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：107、162及112之CDR；及b)輕鏈可變(VL)區，其包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變(VH)區，其包含來自SEQ ID NO：33之VH區的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：輕鏈可變(VL)區，其包含來自SEQ ID NO：73之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本發明之其他態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：a)重鏈可變(VH)區，其包含來自SEQ ID NO：33之VH區的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3；及b)輕鏈可變 (VL)區，其包含來自SEQ ID NO：73之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在本發明之一些態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)包含SEQ ID NO：33之VH區及SEQ ID NO：73之VL區的抗體或其抗原結合片段；b)包含SEQ ID NO：13之VH區及SEQ ID NO：15之VL區的抗體或其抗原結合片段；c)包含SEQ ID NO：5之VH區及SEQ ID NO：7之VL區的抗體或其抗原結合片段；d)包含SEQ ID NO：21之VH區及SEQ ID NO：47之VL區的抗體或其抗原結合片段；及e)包含SEQ ID NO：106之VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區的抗體或其抗原結合片段。
在本發明之一個態樣中，分離之抗體或其抗原結合片段包含：a)SEQ ID NO：33之重鏈可變(VH)區；及/或b)SEQ ID NO：73之輕鏈可變(VL)區。
在一個態樣中，本發明提供一種結合於CXCR4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含含有SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、85、87或106中所示之序列的重鏈可變(VH)區；及/或含有SEQ ID NO：3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或169中所示之序列的輕鏈可變(VL)區。在一個態樣中，結合於CXCR4之抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列與SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、85、87或106至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變(VH)區。在一個態樣中，結合於CXCR4之抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列與SEQ ID NO：3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、 63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或169至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變(VL)區。
在本發明之一些態樣中，提供技術方案6之分離之抗體或其抗原結合片段，其係選自由以下組成之群：a)包含SEQ ID NO：33之VH區及SEQ ID NO：73之VL區的抗體或其抗原結合片段；b)包含SEQ ID NO：13之VH區及SEQ ID NO：15之VL區的抗體或其抗原結合片段；c)包含SEQ ID NO：5之VH區及SEQ ID NO：7之VL區的抗體或其抗原結合片段；d)包含SEQ ID NO：21之VH區及SEQ ID NO：47之VL區的抗體或其抗原結合片段；及e)包含SEQ ID NO：106之VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區的抗體或其抗原結合片段。
在本發明之一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含：a)SEQ ID NO：33之重鏈可變(VH)區；及/或b)SEQ ID NO：73之輕鏈可變(VL)區。在特定態樣中，抗體或其抗原結合片段包含由具有ATCC寄存編號PTA-121353之表現載體產生的重鏈可變(VH)區。在其他態樣中，抗體或抗原結合片段包含由具有ATCC寄存編號PTA-121354之表現載體產生的輕鏈可變(VL)區。
在本發明之一些態樣中，一種結合於趨化激素受體4(CXCR4)之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：150之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：141之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；f)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：147之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；g)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：159之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；h)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：160之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；i)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：161之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；j)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；k)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3 的VL區；l)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：164之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；m)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：165之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；n)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：166之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；o)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：167之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；p)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；q)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；r)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；s)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；t)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之 VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；u)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及v)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區。
在本發明之特定態樣中，抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區。
如本文所述之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段對CXCR4(諸如人類CXCR4)之結合親和力(KD)為約0.002至約200nM。在本發明之一些態樣中，結合親和力為以下中之任一者：約200nM、約100nM、約50nM、約45nM、約40nM、約35nM、約30nM、約25nM、約20nM、約15nM、約10nM、約8nM、約7.5nM、約7nM、約6.5nM、約6nM、約5.5nM、約5nM、約4nM、約3nM、約2nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM或約2pM。在本發明之一些態樣中，結合親和力低於以下中之任一者：約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約30nM、約20nM、約10nM、約7.5nM、約7nM、約6.5nM、約6nM、約5nM、約4.5nM、約4nM、約3.5nM、約3nM、約2.5nM、約2nM、約1.5nM、約1nM、約500pM、約100pM、約50pM、約20pM、約10pM、約5pM或約2pM。
在本發明之一些態樣中，如表面電漿子共振所量測，如本文所 述之抗體的結合親和力(例如單價抗體結合)為約35nM或更低。在本發明之一些態樣中，如表面電漿子共振所量測，如本文所述之抗體的結合親和力(例如單價抗體結合)為約6.5nM或更低。
本發明亦提供任一此等抗體之製備方法。本發明之抗體可藉由此項技術中已知之程序來製造。多肽可藉由抗體之蛋白水解或其他降解、藉由如上所述之重組方法(亦即單一或融合多肽)或藉由化學合成來產生。藉由化學合成便利地製造抗體之多肽，尤其至多約50個胺基酸之較短多肽。化學合成方法係在此項技術中已知且可購得。舉例而言，藉由採用固相方法之自動化多肽合成儀可產生抗體。亦參見美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第6,331,415號。
在本發明之另一態樣中，抗體可使用此項技術中熟知之程序以重組方式製得。在另一態樣中，聚核苷酸包含編碼抗體m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10(VH)、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10.2.54、h3G10.A59、h3G10.A62、h3G10(VL)、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25或h3G10.L94D之重鏈及/或輕鏈可變區的序列。可將編碼相關抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中且接著可使宿主細胞擴展及冷凍以備將來使用。在本文中進一步描述載體(包括表現載體)及宿主細胞。
本發明亦涵蓋本發明抗體之scFv。單鏈可變區片段藉由使用短的連接肽連接輕鏈可變區及/或重鏈可變區來製得(Bird等人，Science 242：423-426,1988)。連接肽之一個實例為(GGGGS)3(SEQ ID NO： 89)，其在一個可變區之羧基端與另一個可變區之胺基端之間橋接約3.5nm，具其他序列之連接子已被設計出並使用(Bird等人，1988，上述)。連接子應為短的可撓性多肽且較佳包含低於約20個胺基酸殘基。接著連接子可經修飾以用於額外功能，諸如附接藥物或附接至固體載體。可以重組或合成方式來產生單鏈變異體。為以合成方式產生scFv，可使用自動化合成儀。為重組產生scFv，含有編碼scFv之聚核苷酸的適合質體可引入適合宿主細胞(真核，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，或原核)中其他可變區之胺基端。其他序列之連接子已被設計出並使用(Bird等人，1988)。連接子可經修飾以具有額外功能，諸如藥物之附接或附接至固體支撐物。單鏈變異體可為重組地或合成地生產。對於scFv之合成生產，可使用自動化合成機。對於scFv之重組生產，含有編碼該scFv之聚核苷酸的適當質體可引入適當的宿主細胞，其為真核，諸如酵母菌、植物、昆蟲或哺乳類細胞，或為原核諸如大腸桿菌。編碼相關scFv之聚核苷酸可藉由諸如聚核苷酸連接之常規操縱來製得。使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術可分離所得scFv。
亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體或微型抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中重鏈可變(VH)及輕鏈可變(VL)域在單一多肽鏈上表現，但使用的連接子過短而無法使同一鏈上之兩個結構域之間配對，由此迫使結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448(1993)；Poljak,R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。微型抗體包括與免疫球蛋白分子之鉸鏈區及CH3結構域融合的天然抗體之VL及VH結構域。參見例如美國專利第5,837,821號。
雙特異性抗體為可同時結合於兩個不同標靶之抗體。雙特異性抗體(bsAb)及雙特異性抗體片段(bsFab)可具有至少一個結合於例如腫 瘤相關抗原之臂及至少一個結合於攜有治療劑或診斷劑之可靶向之結合物的其他臂。多種雙特異性融合蛋白可使用分子工程改造來產生。
舉例而言，可使用本文所揭示之抗體來製備雙特異性抗體，其為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體。此項技術中已知製造雙特異性抗體之方法(參見例如Suresh等人，1986,Methods in Enzymology 121：210)。傳統上，重組產生雙特異性抗體係基於共同表現兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩個重鏈具有不同特異性(Millstein及Cuello,Nature 305,537-539(1983))。
根據製造雙特異性抗體之一種方法，使具有所要結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定區序列融合。該融合較佳具有包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分之免疫球蛋白重鏈恆定區。較佳使含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於融合物之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及必要時免疫球蛋白輕鏈之DNA插入分開的表現載體中，且共同轉染至適合宿主生物體中。此為在構築中所使用之三個多肽鏈的不等比率提供最佳產率的實施例中調整三個多肽片段之相互比例提供了極大靈活性。然而，當等比率之至少兩個多肽鏈的表現產生高產率或當比率並非特別重要時，可將兩個或全部三個多肽鏈之編碼序列插入一個表現載體中。
在本發明之一些態樣中，雙特異性抗體係由一臂中具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。僅在一半雙特異性分子中具有免疫球蛋白輕鏈之此不對稱結構有利於自不需之免疫球蛋白鏈組合分離所要的雙特異性化合物。此方法描述於PCT公開案WO 1994/004690中。
在另一態樣中，雙特異性抗體由一臂中之第一鉸鏈區中之胺基酸修飾構成，且第一鉸鏈區中經取代/置換之胺基酸具有與另一臂中第二鉸鏈區中之對應胺基酸相反的電荷。此方法描述於PCT公開案第 WO 2011/143545號中。
在另一態樣中，雙特異性抗體可在轉麩醯胺酸酶存在下在一臂中使用經工程改造至針對抗原決定基(例如CXCR4)之抗體的含有麩醯胺酸之肽標籤及在另一臂中使用經工程改造至針對第二抗原決定基之第二抗體的另一肽標籤(例如含有Lys之肽標籤或反應性內源性Lys)產生。此方法描述於PCT公開案第WO 2012/059882號中。
包含兩個共價接合之抗體的異結合抗體亦處於本發明之範疇內。此類抗體已用於將免疫系統細胞靶向非所需細胞(美國專利第4,676,980號)及用於治療HIV感染(PCT公開案第1991/000360號)。異結合抗體可使用任何便利的交聯方法製造。適合交聯劑及技術為此項技術中熟知，且描述於美國專利第4,676,980號中。
亦可使用合成蛋白質化學之已知方法(包括彼等涉及交聯劑之方法)在活體外製備嵌合或雜交抗體。舉例而言，可使用二硫基交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於達成此目的之適合試劑之實例包括亞胺基硫醇酯(iminothiolate)及甲基-4-巰基丁醯亞胺酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
本發明涵蓋表2中所示之本發明變異體的抗體及多肽，包括不顯著影響其特性的功能上相等之抗體及具有增強或降低之活性及/或親和力的變異體。舉例而言，胺基酸序列可突變以獲得對CXCR4具有所要結合親和力之抗體。多肽修飾為此項技術中之常規實踐且無需在本文中詳細描述。經修飾之多肽之實例包括具有保守性序列修飾之多肽。如本文中所用，術語「保守性序列修飾」意指並不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。此類保守性修飾包括不顯著不利地改變功能活性或使多肽對其配體之親和力成熟(增強)的胺基酸取代、添加及缺失，或化學類似物之使用。
可利用此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介 導之突變誘發，將修飾引入本發明之抗體中。保守性胺基酸取代為其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在此項技術中進行定義。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電之極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-分支鏈側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因而，本發明抗體之CDR區內的一或多個胺基酸殘基可經來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且可使用本文所述之功能分析測試改變之抗體的保留功能(亦即以上闡述之功能)。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合體，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與抗原決定基標籤融合之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括與酶或多肽之抗體的N或C端的融合體，此增加抗體在血液循環中之半衰期。
取代型變異體在抗體分子中移除至少一個胺基酸殘基且在其位置處插入不同殘基。最引人關注之取代型突變誘發位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。保守性取代展示於表5中之標題「保守性取代」下。若該等取代導致生物活性變化，則可引入更實質變化(表5命名為「例示性取代」，或如下文參考胺基酸類別進一步描述)，且篩檢產物。
表5胺基酸取代
對抗體生物特性之實質修飾可藉由選擇取代來實現，該等取代在其對維持以下各物之作用方面顯著不同：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如摺疊或螺旋構形；(b)分子標靶位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。天然存在之胺基酸殘基基於常見側鏈特性分組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)極性，無電荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電)：Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly，Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
藉由將此等類別中之一成員交換成另一類別來製造非保守性取代。
亦可取代任何未參與維持抗體之適當構形的半胱胺酸殘基，一般以絲胺酸來取代以提高分子之氧化穩定性且防止異常之交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以提高其穩定性，尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段時。
胺基酸修飾之範圍可自改變或修飾一或多個胺基酸至完全再設計諸如可變區之區域。可變區之改變可改變結合親和力及/或特異性。在本發明之一些態樣中，在CDR結構域內進行不超過一個至五個保守性胺基酸取代。在本發明之其他態樣中，在CDR結構域內進行不超過一個至三個保守性胺基酸取代。
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽，以及具有其他轉譯後修飾之多肽，諸如用不同糖之糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體係在其恆定區中之保守位置處糖基化(Jefferis及Lund,Chem.Immunol.65：111-128(1997)；Wright及Morrison,TibTECH 15：26-32(1997))。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人，Mol.Immunol.32：1311-1318(1996)；Wittwe及Howard,Biochem.29：4175-4180(1990))及醣蛋白之部分之間的分子內相互作用，其可影響醣蛋白之構形及呈現之三維表面(Jefferis及Lund，上述；Wyss及Wagner,Current Opin.Biotech.7：409-416(1996))。寡醣亦可用以使既定醣蛋白基於特異性識別結構靶向某些分子。亦已報導抗體之糖基化影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。詳言之，已報導具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)(催化對分GlcNAc之形成的糖基轉移酶)之經四環素調節的表現的CHO細胞具有提高之ADCC活性(Umana等人，Mature Biotech 17：176-180(1999))。
抗體之糖基化通常為N連接型或O連接型。N連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸、天冬醯胺-X-蘇胺酸及天冬醯胺-X-半胱胺酸(其中X為除脯胺酸外 之任何胺基酸)為用於碳水化合物部分酶促附接於天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中任一此等三肽序列之存在產生潛在糖基化位點。O連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附接於羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
在抗體中添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列，以使其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(針對N連接型糖基化位點)。該改變亦可藉由在原始抗體之序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基進行取代來實現(針對O連接型糖基化位點)。
亦可在不改變根本核苷酸序列的情況下改變抗體之糖基化模式。糖基化很大程度上視用以表現抗體之宿主細胞而定。因為用於表現作為潛在治療劑之重組醣蛋白(例如抗體)的細胞類型很少為天然細胞，所以可預期抗體之糖基化模式變化(參見例如Hse等人，J.Biol.Chem.272：9062-9070(1997))。
除宿主細胞的選擇之外，在抗體重組產生期間影響糖基化之因素包括生長模式、培養基調配、培養物密度、氧合作用、pH值、純化方案及其類似因素。已提出各種方法來改變在特定宿主生物體中實現之糖基化模式，包括引入或過度表現某些參與寡醣產生之酶(美國專利第5,047,335號；第5,510,261號及第5,278,299號)。糖基化或某些類型糖基化可以酶促方式自醣蛋白移除，例如使用內切糖苷酶H(內切H)、N-糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3。另外，重組宿主細胞可經基因工程改造成在加工某些類型之多醣上有缺陷。此等及類似技術為此項技術中熟知。
本發明涵蓋的本文中抗體之另一修飾為聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以例如增加該抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體聚 乙二醇化，通常使該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物，在使一或多個PEG基團附接於該抗體或抗體片段之條件下反應。較佳地，經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)進行醯化反應或烷基化反應來進行聚乙二醇化。如本文所用之術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任何形式之PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在本發明之某些態樣中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化抗體。聚乙二醇化蛋白質之方法為此項技術中已知，且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0154316及Ishikawa等人之EP0401384。
本發明不限於傳統抗體且包括抗體片段及抗體模擬物之使用。各種抗體片段及抗體模擬技術已研發且為此項技術中已知。雖然多種此等技術，諸如結構域抗體、奈米抗體及單抗體利用傳統抗體結構之片段或其他修飾，但亦存在替代性技術，諸如採用結合結構之親和抗體、DARPin、高親和性多聚體、抗運載蛋白及萬能抗體，其雖然模擬傳統的抗體結合，但由獨特機制產生且經由獨特機制起作用。
結構域抗體(dAb)為抗體之最小功能結合單元，對應於人類抗體之重(VH)或輕(VL)鏈之可變區。Domantis已研發出完全人類VH及VL dAb之一系列大型及高度功能文庫(各文庫中超過一百億不同序列)，且使用此等文庫選擇對治療標靶具有特異性之dAb。與許多習知抗體相比，結構域抗體在細菌、酵母及哺乳動物細胞系統中表現良好。結構域抗體及其產生方法之進一步細節可參考以下獲得：美國專利第6,291,158號、第6,582,915號、第6,593,081號、第6,172,197號及第6,696,245號；美國專利申請案第2004/0110941號；歐洲專利申請案第1433846號及歐洲專利0368684及0616640、WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及 WO03/002609，每一者以全文引用的方式併入本文中。
奈米抗體為來源於抗體之治療蛋白質，其含有天然存在之重鏈抗體之獨特結構及功能特性。此等重鏈抗體含有單一可變域(VHH)及兩個恆定域(CH2及CH3)。選殖及分離之VHH結構域為具有原始重鏈抗體之完整抗原結合能力的完全穩定多肽。奈米抗體與人類抗體之VH結構域具有高度同源性且可進一步進行人類化而無任何活性損失。此外，奈米抗體組合習知抗體之優點與小分子藥物(如習知抗體)之重要特徵。奈米抗體展示高標靶特異性、對其標靶之高親和力及低固有毒性。奈米抗體藉由單一基因編碼且在幾乎所有的原核及真核宿主中有效產生，該等原核及真核宿主為例如大腸桿菌(參見例如美國專利第6,765,087號，其以全文引用的方式併入本文中)、黴菌(例如麴菌屬(Aspergillus)或木黴屬(Trichoderma))及酵母(例如酵母(Saccharomyce)、克魯維酵母(Kluyveromyce)、漢森酵母(Hansenula)或畢赤酵母(Pichia))(參見例如美國專利第6,838,254號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些態樣中，本發明提供單抗體之使用。單抗體為基於IgG4抗體之鉸鏈區移除的另一抗體片段技術。缺失鉸鏈區會產生尺寸基本上為傳統IgG4抗體之一半且具有單價結合區而非IgG4抗體之二價結合區的分子。亦熟知IgG4抗體為惰性的，因而不與免疫系統相互作用，此有利於治療不希望有免疫反應之疾病，且此益處傳給單抗體。舉例而言，單抗體可用以抑制或靜默但不殺死其結合之細胞。此外，單抗體結合於癌細胞不刺激其增殖。此外，因為單抗體尺寸為傳統IgG4抗體之一半，所以其可展示在較大實體腫瘤上更佳分佈，具有潛在有利之功效。單抗體以類似於全IgG4抗體之速率自身體清除且能夠以與全抗體類似之親和力結合其抗原。單抗體之進一步細節可參考以全文引用的方式併入本文中的PCT公開案WO2007/059782獲得。
在一些態樣中，本發明涵蓋親和抗體分子。親和抗體分子為新的親和蛋白質類別，其基於來源於葡萄球菌蛋白A之一個IgG結合域的58個胺基酸殘基之蛋白質結構域。此三個螺管束結構域已用作組合噬菌粒文庫構築之骨架，自該文庫，可使用噬菌體呈現技術選擇靶向所要分子之親和抗體變異體(Nord K,Gunnettsson E,Ringdahl J,Stahl S,Uhlen M,Nygren PA,Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain,Nat Biotechnol 15 772-7(1997)；Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A,Eur J Biochem.,269 2647-55(2002))。親和抗體分子之簡單堅固結構與其低分子量(6kDa)組合，使得其適合於各種應用，例如作為偵測試劑(Ronmark J,Hansson M,Nguyen T等人，Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli,J Immunol Methods,261 199-211(2002))及抑制受體相互作用(Sandstorm K,Xu Z,Forsberg G,Nygren PA,Inhibition of the CD28-CD80 co- stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering,Protein Eng.,16 691-7(2003))。親和抗體及其產生方法之進一步細節可藉由參考以全文引用的方式併入本文中之美國專利第5,831,012號來獲得。
適用於本發明之情形的另一抗體模擬物技術為高親和性多聚體。高親合性多聚體係藉由活體外外顯子改組及噬菌體呈現，產生具有結合及抑制特性之多結構域蛋白質而自人類細胞外受體結構域大家族演化而來。連接多個獨立結合域已顯示會產生親合力且使得親和力及特異性相較於習知單一抗原決定基結合蛋白得到改良。其他潛在優點包括在大腸桿菌中簡單且有效產生多標靶特異性分子、熱穩定性及對蛋白酶之抗性提高。已獲得針對多種標靶之具有低於奈莫耳親和力 之高親和性多聚體。關於高親和性多聚體之其他資訊可見於美國專利申請公開案第2006/0286603號、第2006/0234299號、第2006/0223114號、第2006/0177831號、第2006/0008844號、第2005/0221384號、第2005/0164301號、第2005/0089932號、第2005/0053973號、第2005/0048512號、第2004/0175756號，均以全文引用的方式併入本文中。
萬能抗體為可用於本發明之情形的另一抗體模擬物技術。萬能抗體為3-5kDa之具有>15%半胱胺酸之小蛋白質，該等半胱胺酸形成高二硫化物密度骨架，替換典型蛋白質所具有之疏水性核心。用少數二硫化物替換構成疏水性核心之大量疏水性胺基酸使得蛋白質更小、更具親水性(聚集及非特異性結合更少)、對蛋白酶及熱更具抗性且具有更低T細胞抗原決定基密度，因為最有助於MHC呈現之殘基為疏水性的。熟知所有此等特性均影響免疫原性，且在一起，預期其引起免疫原性大幅度減少。關於萬能抗體之其他資訊可見於以全文引用的方式併入本文中的美國專利申請公開案第2007/0191272號中。
以上提供之抗體片段及抗體模擬物技術之詳細描述不欲為可用於本說明書之情形中之所有技術的全面清單。舉例而言，以及不以限制之方式，多種其他技術可用於本發明之情形中，包括替代性基於多肽之技術，諸如如Qui等人，Nature Biotechnology,25(8)921-929(2007)(其以引用的方式併入本文中)中概述之互補決定區之融合物；以及基於核酸之技術，諸如美國專利第5,789,157號；第5,864,026號；第5,712,375號；第5,763,566號；第6,013,443號；第6,376,474號；第6,613,526號；第6,114,120號；第6,261,774號及第6,387,620號(均以引用的方式併入本文中)中所述之RNA適體技術。
其他修飾方法包括使用此項技術中已知之偶合技術，包括(但不限於)酶促方式、氧化取代及螯合。可例如針對免疫分析之標記附接 使用修飾。經修飾之多肽係使用此項技術中之已建立程序製得且可使用此項技術中已知之標準分析來篩檢，其中一些分析在下文及實例中描述。
在本發明之一些態樣中，抗體包含經修飾之恆定區，諸如具有增加之對人類Fcγ受體之親和力，免疫惰性或部分惰性，例如不觸發補體介導之溶解，不刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或不活化巨噬細胞的恆定區；或具有減少之以下任一或多個方面之活性(與未經修飾之抗體相比)的恆定區：觸發補體介導之溶解、刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或活化微神經膠質細胞。恆定區之不同修飾可用以達成效應功能之最佳水準及/或組合。參見例如Morgan等人，Immunology 86：319-324(1995)；Lund等人，J.Immunology 157：4963-9 157：4963-4969(1996)；Idusogie等人，J.Immunology 164：4178-4184,(2000)；Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76(1998)。在本發明之一些態樣中，恆定區如以下中所描述進行修飾：Eur.J.Immunol.,29：2613-2624(1999)；PCT公開案第WO1999/058572號。在本發明之其他態樣中，抗體包含含有以下突變之人類重鏈IgG2恆定區：A330P331至S330S331(胺基酸編號參考野生型IgG2序列)。Eur.J.Immunol.,29：2613-2624(1999)。在本發明之其他態樣中，針對N連接之糖基化將恆定區去糖基化。在本發明之一些態樣中，針對N連接之糖基化，藉由使糖基化之胺基酸殘基或作為恆定區中N-糖基化識別序列之一部分的側接殘基突變將恆定區去糖基化。舉例而言，N-糖基化位點N297可突變為A、Q、K或H。參見Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76(1998)。在本發明之一些態樣中，針對N連接之糖基化將恆定區去糖基化。以酶促方式(諸如藉由酶PNGase來移除碳水 化合物)或藉由在糖基化缺乏宿主細胞中表現，可針對N連接之糖基化將恆定區去糖基化。
其他抗體修飾包括已如PCT公開案第WO 99/58572號中所述來修飾之抗體。除針對標靶分子之結合域外，此等抗體亦包含具有實質上與人類免疫球蛋白重鏈之恆定域的全部或部分同源之胺基酸序列的效應結構域。此等抗體能夠結合標靶分子而不觸發顯著的補體依賴性溶解或細胞介導之標靶破壞。在本發明之一些態樣中，效應結構域能夠特異性結合FcRn及/或FcγRIIb。此等效應結構域通常係基於來源於兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈CH2結構域之嵌合結構域。以此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗體療法中以避免習知抗體療法之發炎及其他不良反應。
本發明包括親和力成熟之抗體。舉例而言，親和力成熟之抗體可藉由此項技術中已知之程序產生(Marks等人，Bio/Technology,10：779-783(1992)；Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene,169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.,155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.,154(7)：3310-9(1995),Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226：889-896(1992)；及PCT公開案第WO2004/058184號)。
以下方法可用於調節抗體之親和力且用於表徵CDR。一種表徵抗體之CDR及/或改變(諸如提高)諸如抗體之多肽之結合親和力的方法稱為「文庫掃描突變誘發(library scanning mutagenesis)」。一般而言，文庫掃描突變誘發如下工作。使用此項技術認可之方法，將CDR中之一或多個胺基酸位置經兩個或兩個以上(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸置換。此產生純系的小文庫(在本發明之一些態樣中，每個分析之胺基酸位置一個)，每一文庫具有兩個或兩個以上成員之複雜性(若每一位置經兩 個或兩個以上胺基酸取代)。一般而言，該文庫亦包括包含天然(未經取代)胺基酸之純系。將來自各文庫之少量純系(例如約20-80個純系(視文庫之複雜性而定))針對其對標靶多肽(或其他結合標靶)之結合親和力篩檢，且鑑別具有增大、相同、減小或無結合之候選物。在此項技術中熟知測定結合親和力之方法。可使用BiacoreTM表面電漿子共振分析來測定結合親和力，該分析偵測約2倍或更大之結合親和力差異。當起始抗體已以相對較高親和力結合時，例如約10nM或10nM以下之KD，BiacoreTM尤其適用。在本文實例中描述使用BiacoreTM表面電漿子共振之篩檢。
在另一態樣中，本發明係關於結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有低於100nM之EC50。在又一態樣中，本發明係關於結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有低於50nM之EC50。在又一態樣中，本發明係關於結合CXCR4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有低於1nM之EC50。術語「EC50」意謂在活體外抑制測試抗體、其抗原結合片段或抗體-藥物結合物最大作用之50%所需的濃度。術語「IC50」含義被定義為「50%抑制濃度」。
可使用Kinexa Biocensor、閃爍近接分析、ELISA、ORIGEN免疫分析(IGEN)、螢光猝滅、螢光轉移及/或酵母呈現來測定結合親和力。亦可使用適合生物分析來篩檢結合親和力。
在本發明之一些態樣中，CDR中之每一胺基酸位置使用此項技術認可之突變誘發方法(其中一些在本文中描述)經所有20種天然胺基酸置換(在一些實施例中一次一個)。此產生純系的小文庫(在本發明之一些態樣中，每個分析之胺基酸位置一個)，每一文庫具有20個成員之複雜性(若每一位置經所有20種胺基酸取代)。
在本發明之一些態樣中，待篩檢之文庫包含可在相同CDR中或在 兩個或兩個以上CDR中的兩個或兩個以上位置之取代。因此，文庫可包含在一個CDR中之兩個或兩個以上位置之取代。文庫可包含在兩個或兩個以上CDR中之兩個或兩個以上位置之取代。文庫可包含在3、4、5個或5個以上位置之取代，該等位置存在於二、三、四、五或六個CDR中。使用低冗餘密碼子來製備該取代。參見例如Balint等人，Gene 137(1)：109-18(1993)之表2。
CDR可為CDRH3及/或CDRL3。CDR可為CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3中之一或多者。CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR或延伸CDR。
可對具有改良結合之候選物測序，藉此鑑別引起親和力提高(亦稱為取代「改良」)之CDR取代突變體。亦可對結合之候選物測序，藉此鑑別保留結合之CDR取代。
可進行多輪篩檢。舉例而言，具有改良結合之候選物(各包含在一或多個CDR之一或多個位置的胺基酸取代)亦適用於設計在各改良CDR位置(亦即，取代突變體展示改良之結合的CDR中之胺基酸位置)含有至少原始及經取代胺基酸的第二文庫。以下進一步討論此文庫之製備及篩檢或選擇。
文庫掃描突變誘發亦提供一種表徵CDR之方式，就具有改良結合、相同結合、減小結合或無結合之純系的頻率而言，亦提供與各胺基酸位置對抗體-抗原複合物穩定性之重要性有關之資訊。舉例而言，若CDR之位置在改變為所有20種胺基酸時保留結合，則將該位置鑑別為不太可能為抗原結合所需之位置。相反地，若CDR之位置在僅小百分比之取代中保留結合，則將該位置鑑別為對CDR功能重要之位置。因此，文庫掃描突變誘發方法產生關於CDR中可改變為多種不同胺基酸(包括所有20種胺基酸)之位置及CDR中不能改變或僅能改變為少數胺基酸之位置的資訊。
可在第二文庫中組合具有改良親和力之候選者，該第二文庫包括改良之胺基酸、在彼位置處之原始胺基酸，且視所要或使用所要篩檢或選擇方法所允許之文庫的複雜性而定，其可進一步包括在彼位置處之額外取代。另外，若需要，則可將相鄰胺基酸位置隨機化為至少兩種或兩種以上之胺基酸。相鄰胺基酸之隨機化可允許突變CDR中之額外構形靈活性，其可又允許或促進引入較大數目之改良突變。文庫亦可包含在第一輪篩檢中未展示改良親和性之位置的取代。
使用此項技術中已知之任何方法，包括使用BiacoreTM表面電漿子共振分析之篩檢及使用在選擇技術中已知之任何方法(包括噬菌體呈現、酵母呈現及核糖體呈現)的選擇來針對具有改良及/或改變結合親和力之文庫成員篩檢或選擇第二文庫。
本發明亦涵蓋包含來自本發明抗體之一或多個片段或區域的融合蛋白。在本發明之一些態樣中，提供融合多肽，其包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、85、87及106中所示之VH區之至少10個相鄰胺基酸；及/或SEQ ID NO：3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83及169中所示之VL區之至少10個胺基酸。在本發明之各種態樣中，提供融合多肽，其包含可變輕鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個相鄰胺基酸及/或可變重鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個相鄰胺基酸。在另一態樣中，融合多肽包含如表2中任一序列對中所示之輕鏈可變區及/或重鏈可變區。舉例而言，SEQ ID NO：3與5；3與9；7與5；11與13；15與13；19與17；69與31；49與37；及33與73。在一些態樣中，融合多肽包含一或多個CDR。在其他態樣中，融合多肽包含H3(VH CDR3)及/或CDR L3(VL CDR3)。出於本發明之目的，融合蛋 白含有一或多種抗體及其在天然分子中未附接之另一胺基酸序列，例如異源序列或來自另一區域之同源序列。例示性異源序列包括(但不限於)「標籤」，諸如FLAG標籤或6His標籤。標籤在此項技術中係熟知的。
可藉由此項技術中已知之方法，例如以合成或重組方式來產生融合多肽。儘管本發明之融合蛋白亦可藉由此項技術中已知之其他方式，例如化學合成來製備，但通常使用本文所述之重組方法，藉由表現編碼其之聚核苷酸來製造本發明之融合蛋白。
本發明亦提供包含抗體與有助於偶合於固體支撐物(諸如生物素或抗生素蛋白)之試劑結合(例如連接)的組合物。為簡單起見，一般將在瞭解此等方法適用於抗CXCR4抗體或其抗原結合片段、本文描述之實施例中之任一者下來提及抗體。結合一般係指連接如本文所述之此等組分。該連接(其一般至少出於投藥而將此等組分固定於緊密締合中)可以多種方式達成。舉例而言，在各擁有能夠與另一者反應之取代基時，在試劑與抗體之間的直接反應係可能的。舉例而言，諸如胺基或硫氫基之親核基團一方面可能夠與諸如酸酐或醯基鹵之含羰基基團反應或另一方面可能夠與含有良好離去基(例如鹵基)之烷基反應。
本發明亦提供編碼本發明抗體的分離之聚核苷酸以及包含該聚核苷酸之載體及宿主細胞。
因此，本發明提供包含編碼以下任一者之聚核苷酸的聚核苷酸(或組合物，包括醫藥組合物)：m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及 h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62、h3G10.L94D或能夠結合CXCR4之任何片段或其部分。
在一些態樣中，本發明提供編碼該等抗體任一者(包括抗體片段)之聚核苷酸及本文所述之多肽，諸如具有減弱或增強之效應功能的抗體及多肽。聚核苷酸可藉由此項技術中已知之程序製造及表現。
在另一態樣中，本發明提供包含任何本發明聚核苷酸之組合物(諸如醫藥組合物)。在一些態樣中，組合物包含含有編碼本文所述之任一抗體之聚核苷酸的表現載體。舉例而言，組合物包含SEQ ID NO：2與4或SEQ ID NO：6與8或SEQ ID NO：86與68中所示之聚核苷酸中之一或兩者。
本文中進一步描述表現載體及聚核苷酸組合物之投藥。
在其他態樣中，本發明提供一種製造本文所述之任一聚核苷酸的方法。
本發明亦涵蓋與任何此等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股且可為DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子之HnRNA分子及不含有內含子之mRNA分子。其他編碼或非編碼序列可(但不必需)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但不必需)與其他分子及/或支撐物質連接。
聚核苷酸可包含天然序列(亦即編碼抗體或其一部分之內源序列)或可包含此類序列之變異體。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，使得經編碼多肽之免疫反應性相對於天然免疫反應性分子不減小。一般可如本文中所述來評定對經編碼多肽之免疫 反應性的影響。變異體較佳顯示與編碼天然抗體或其一部分之聚核苷酸序列至少約70%一致性、更佳至少約80%一致性、但更佳至少約90%一致性且最佳至少約95%一致性。
當如下所述針對最大一致性進行比對時若兩個聚核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則該兩個序列稱作「一致」。兩個序列之間的比較通常係藉由將該等序列在比較窗口上比較以鑑別及比較序列類似性之局部區域來進行。如本文中所用之「比較窗口」係指至少約20個鄰接位置之區段(通常30至約75個，40至約50個)，其中在一序列與具有相同數目之鄰接位置的參考序列進行最佳比對之後，該兩個序列可進行比較。
用於比較之序列的最佳比對可使用生物資訊軟體(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)之Lasergene套件之Megalign程式，使用預設參數來進行。此程式具體化以下參考文獻中所述之若干比對方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.Dayhoff,M.O.(編輯)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷，增刊3，第345-358頁；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes第626-645頁Methods in Enzymology第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,CABIOS 5：151-153(1989)；Myers,E.W.及Muller W.,CABIOS 4：11-17(1988)；Robinson,E.D.,Comb.Theor.11：105(1971)；Santou,N.,Nes,M.,Mol.Biol.Evol.4：406-425(1987)；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730(1983)。
較佳地，「序列一致性之百分比」係藉由將兩個經最佳比對之序列在至少20個位置之比較窗口上比較來確定，其中比較窗口中之聚核苷酸或多肽序列之部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含20%或更少、通常5%至15%或10%至12%的添加或缺失(亦即間隙)用於使兩個序列最佳比對。藉由以下方法來計算百分比：確定兩個序列中出現一致核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目以得到相匹配之位置的數目，用相匹配之位置之數目除以參考序列中之位置總數(亦即窗口尺寸)且結果乘以100，從而得到序列一致性之百分比。
變異體亦可(或者)實質上與天然基因或其一部分或補體同源。此等聚核苷酸變異體能夠在適度嚴格條件下與編碼天然抗體(或互補序列)之天然存在之DNA序列雜交。
適合的「適度嚴格條件」包括在5X SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃-65℃、5X SSC下雜交隔夜；接著在65℃下用含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC中之每一者洗滌兩次，歷時20分鐘。
如本文所用，「高度嚴格條件」或「高嚴格性條件」為以下條件：(1)採用低離子強度及高溫用於洗滌，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，在50℃下；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如具有0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝劑pH 6.5及750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉之50%(v/v)甲醯胺，在42℃下；或(3)採用50%甲醯胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5x登哈特溶液(Denhardt's solution)、超音波處理之鮭魚精DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，在42℃下，以及在42℃下在0.2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)及50%甲醯胺中在55℃下洗滌，接著由含有EDTA之0.1x SSC、在55℃下組成之高嚴格性洗滌。熟習此項 技術者將知道如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似物之因素。
一般技術者應瞭解，由於遺傳密碼子之簡併，因此存在多種編碼如本文中所述之多肽的核苷酸序列。一些此等聚核苷酸具有與任何天然基因之核苷酸序列的最小同源性。儘管如此，由於密碼子使用的差異而不同之聚核苷酸特定涵蓋於本發明中。此外，包含本文中所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因係處於本發明之範疇內。對偶基因為由於諸如核苷酸缺失、添加及/或取代之一或多種突變而改變之內源性基因。所得mRNA及蛋白質可(但並不必須)具有改變之結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來鑑別。
使用化學合成、重組方法或PCR可獲得本發明之聚核苷酸。化學聚核苷酸合成之方法為此項技術中所熟知且在本文中不需要詳細描述。熟習此項技術者可使用本文中所提供之序列及商業DNA合成儀來產生所需DNA序列。
為使用重組方法製備聚核苷酸，包含所要序列之聚核苷酸可插入適合載體中，且繼而載體可引入適合宿主細胞中進行複製及擴增，如本文中進一步論述。聚核苷酸可藉由此項技術中已知之任何方式插入宿主細胞中。細胞藉由利用直接吸收、內吞作用、轉染、F-配對或電穿孔將外源性聚核苷酸引入來轉型。一旦引入，外源性聚核苷酸可作為未整合載體(諸如質體)維持在細胞內或整合至宿主細胞基因組中。如此擴增之聚核苷酸可藉由此項技術內熟知之方法自宿主細胞分離。參見例如Sambrook等人，1989。
或者，PCR允許DNA序列複製。PCR技術在此項技術中熟知且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202中以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編輯， Birkauswer Press,Boston,1994。
藉由使用在適當載體中之分離DNA且將其插入適合宿主細胞中來獲得RNA。當將細胞複製物及DNA轉錄於RNA中時，可接著使用熟習此項技術者所熟知之方法分離RNA，例如如Sambrook等人，1989，上述中所闡明。
適合選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量在此項技術中可獲得之選殖載體。雖然所選之選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞變化，但適用之選殖載體一般將能夠自我複製，可具有特定限制核酸內切酶之單一標靶，及/或可載有可用於選擇含有載體之純系的標記物之基因。適合實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可自諸如BioRad、Strategene及Invitrogen之商業供應商獲得。
表現載體一般為含有根據本發明之聚核苷酸的可複製之聚核苷酸構築體。其表明表現載體必須在宿主細胞中可複製為游離基因體或染色體DNA之不可分割部分。適合表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分一般可包括(但不限於)以下一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記物基因；適合轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)，亦通常需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯啟動位點及終止密碼子。
藉由大量適當方式中之任一者，包括電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質轉染(lipofection)；及感染(例如，其中載體為諸如牛痘病毒之感染劑)， 可將含有相關聚核苷酸之載體引入宿主細胞中。引入載體或聚核苷酸之選擇將常常視宿主細胞之特徵而定。
本發明亦提供包含本文所述之任一聚核苷酸的宿主細胞。為達成分離編碼相關抗體、多肽或蛋白質的基因之目的，任何能夠過度表現異源DNA之宿主細胞均可使用。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於)COS、海拉(HeLa)及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。適合的非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草芽胞桿菌(B.subtillis))及酵母(諸如啤酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克魯維酵母(K.lactis))。宿主細胞較佳以比宿主細胞中對應相關內源性抗體或蛋白質(若存在)之水準高約5倍、更佳高10倍、甚至更佳高20倍之水準來表現cDNA。篩檢宿主細胞與CXCR4或CXCR4結構域(例如結構域1-4)之特異性結合藉由免疫分析或FACS實現。可鑑別過度表現相關抗體或蛋白質之細胞。
抗CXCR4抗體-藥物結合物
本發明提供式Ab-(T-L-D)之抗體-藥物，其中a)Ab為結合於CXCR4之抗體或其抗原結合片段，b)T為視情況可包括之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤；c)L為連接子；且d)D為藥物。亦提供此類抗體-藥物結合物之製備及製造方法，及其在臨床應用中之用途。「抗體-藥物結合物」或「ADC」係指包括結合於CXCR4且與藥物結合之抗體衍生物的抗體或其抗原結合片段。
在本發明之一些態樣中，Ab係選自由以下組成之群：a)包含含有SEQ ID NO：107、162及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：144、145及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；b)包含含有SEQ ID NO：115、118及120之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：135、136及137之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；c)包含含有SEQ ID NO：107、110及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：131、132及 133之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；d)包含含有SEQ ID NO：107、154及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：138、132及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；e)包含含有SEQ ID NO：107、157及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：151、152及153之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；f)包含SEQ ID NO：33之VH區及SEQ ID NO：73之VL區的抗體或其抗原結合片段；g)包含SEQ ID NO：13之VH區及SEQ ID NO：15之VL區的抗體或其抗原結合片段；h)包含SEQ ID NO：5之VH區及SEQ ID NO：7之VL區的抗體或其抗原結合片段；及i)包含SEQ ID NO：21之VH區及SEQ ID NO：47之VL區的抗體或其抗原結合片段。
用於將細胞毒性劑或其他治療劑與抗體結合之方法已在各種公開案中描述。舉例而言，化學修飾可經由離胺酸側鏈胺或經由藉由還原鏈間二硫鍵活化之半胱胺酸硫氫基在抗體中進行，以使結合反應發生。參見例如Tanaka等人，FEBS Letters 579：2092-2096,(2005)及Gentle等人，Bioconjug.Chem.15：658-663,(2004)。亦已描述在以界定化學計量進行特定藥物結合之抗體特定位點經工程改造的反應性半胱胺酸殘基。參見例如Junutula等人，Nature Biotechnology,26：925-932,(2008)。使用含有醯基供體麩醯胺酸之標籤及/或引起反應性之內源性麩醯胺酸(亦即能夠作為醯基供體形成共價鍵)藉由多肽工程改造在轉麩醯胺酸酶及胺(例如包含反應性胺或附接於反應性胺之細胞毒性劑)存在下的結合亦描述於國際專利申請案第PCT/IB2011/054899(WO2012/059882)號；Strop等人，Chem.Biol.20(2)：161-167(2013)；及Farias等人，Bioconjug.Chem.25(2)：245-250(2014)。
適合結合程序之一個實例依賴於醯肼及其他親核試劑與藉由抗體上天然存在之碳水化合物氧化所產生之醛的結合。含有腺之結合物可藉由引入之提供所要藥物釋放特性的羰基製得。結合物亦可用在一 端具有二硫化物、在中間具有烷基鏈且在另一末端具有肼衍生物的連接子製得。蒽環黴素為可使用此技術結合於抗體之細胞毒素之一個實例。
在本發明之其他態樣中，抗CXCR4抗體或其抗原結合片段或如本文所述之結合物包含在抗體特定位點(例如羧基端、胺基端或在抗CXCR4抗體中之另一位點)經工程改造的含有醯基供體麩醯胺酸之標籤(T)。在本發明之一些態樣中，標籤包含胺基酸麩醯胺酸(Q)或胺基酸序列LLQGG(SEQ ID NO：171)、GGLLQGG(SEQ ID NO：90)、LLQGA(SEQ ID NO：91)、GGLLQGA(SEQ ID NO：92)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO：93)、LLQGPG(SEQ ID NO：94)、LLQGPA(SEQ ID NO：95)、LLQGP(SEQ ID NO：96)、LLQP(SEQ ID NO：97)、LLQPGK(SEQ ID NO：98)、LLQGAPGK(SEQ ID NO：99)、LLQGAPG(SEQ ID NO：100)、LLQGAP(SEQ ID NO：101)、GGLLQGPP(SEQ ID NO：172)、LLQGPP(SEQ ID NO：173)、LLQX1X2X3X4X5(其中X1為G或P，其中X2為A、G、P或不存在，其中X3為A、G、K、P或不存在，其中X4為K、G或不存在，且其中X5為K或不存在(SEQ ID NO：102)或LLQX1X2X3X4X5(其中X1為任何天然存在之胺基酸且其中X2、X3、X4及X5為任何天然存在之胺基酸或不存在)(SEQ ID NO：103)。在本發明之特定態樣中，T係選自由SEQ ID NO：91、92及102中之任一者組成之群。
在本發明之其他態樣中，提供一種分離之抗體，其包含含有醯基供體麩醯胺酸之標籤及在抗體位置222、340或370(EU編號方案)之胺基酸修飾，其中修飾為胺基酸缺失、插入、取代、突變或其任何組合。舉例而言，胺基酸修飾為K222R、K340R及K370R。
在本發明之一些態樣中，抗體或抗原結合片段之結合物係結合於藥物，其中該藥物係選自由以下組成之群：細胞毒性劑、免疫調節 劑、顯影劑、治療劑(例如治療蛋白質)、生物聚合物及寡核苷酸。
在本發明之一些態樣中，藥物可連接或結合於如本文所述之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段以將藥物靶向局部傳遞至腫瘤(例如表現CXCR4之腫瘤)。在本發明之特定態樣中，藥物為細胞毒性劑。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)蒽環黴素、奧瑞他汀、喜樹鹼、考布他汀、海兔毒素、倍癌黴素、烯二炔、格爾德黴素、吲哚啉并-苯并二氮呯二聚體、美登素、嘌呤黴素、吡咯并苯并二氮呯二聚體、紫杉烷、長春花生物鹼、特吡萊辛、哈米特林、斯考他汀、普蘭立德、卡奇黴素及其立體異構體、電子等排體、類似物或衍生物。在本發明之一些態樣中，蒽環黴素來源於細菌鏈黴菌屬(Strepomyce)且已用於治療各種癌症，諸如白血病、淋巴瘤、乳癌、子宮癌、卵巢癌及肺癌。例示性蒽環黴素包括(但不限於)道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)(亦即阿德力黴素(adriamycin))、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)、伐柔比星(valrubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone)。
海兔毒素及其肽類似物及衍生物奧瑞他汀為高度有效的抗有絲分裂劑，其已展示具有抗癌及抗真菌活性。參見例如美國專利第5,663,149號及Pettit等人，Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965(1998)。例示性海兔毒素及奧瑞他汀包括(但不限於)海兔毒素10、奧瑞他汀E、奧瑞他汀EB(AEB)、奧瑞他汀EFP(AEFP)、MMAD(單甲基奧瑞他汀D或單甲基海兔毒素10)、MMAF(單甲基奧瑞他汀F或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-海兔異白胺酸-海兔脯胺酸-苯丙胺酸)、MMAE(單甲基奧瑞他汀E或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-海兔異白胺酸-海兔脯胺酸-降麻黃鹼)、5-苯甲醯基戊酸-AE酯(AEVB)及其他新穎奧瑞他汀(諸如美國公開案第20130129753號中所述之奧瑞他汀)。
在本發明之特定態樣中，奧瑞他汀係選自由以下組成之群： 0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、MMAD(單甲基奧瑞他汀D或單甲基海兔毒素10及8261(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。
在本發明之一些態樣中，奧瑞他汀為具有以下結構之0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)：
在其他態樣中，奧瑞他汀為具有以下結構之3377(N,2-二甲基丙胺醯基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基}-N-甲基-L-纈胺醯胺)：
在本發明之其他態樣中，奧瑞他汀為具有以下結構之0131(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5- 甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)：
在其他態樣中，奧瑞他汀為具有以下結構之0121(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)：
在其他態樣中，奧瑞他汀為具有以下結構之8261(8261 2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)：
喜樹鹼為抑制酶拓撲異構酶I之細胞毒性喹啉生物鹼。喜樹鹼及其衍生物之實例包括(但不限於)拓朴替康(topotecan)及伊立替康(irinotecan)及其代謝物，諸如SN-38。
風車子抑素(Combretastatin)為在腫瘤中具有脈管破壞特性之天然 苯酚。例示性風車子抑素及其衍生物包括(但不限於)康柏斯達汀(combretastatin)A-4(CA-4)及奧瑞布林(ombrabulin)。
倍癌黴素為具有細胞毒性效能之DNA烷基化劑。參見Boger及Johnson,PNAS 92：3642-3649(1995)。例示性倍癌黴素包括(但不限於)倍癌黴素A、倍癌黴素B1、倍癌黴素B2、倍癌黴素C1、倍癌黴素C2、倍癌黴素D、倍癌黴素SA及CC-1065。烯二炔為特徵在於九員及十員環或存在具有共軛之參-雙-參鍵之環狀系統的一類抗腫瘤細菌產品。例示性烯二炔包括(但不限於)卡奇黴素(calicheamicin)、埃斯培拉黴素(esperamicin)及達米辛(dynemicin)。
格爾德黴素為結合於Hsp90(熱休克蛋白90)且已用作抗腫瘤藥物之苯醌安沙黴素(ansamycin)抗生素。例示性格爾德黴素包括(但不限於)17-AAG(17-N-烯丙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素)及17-DMAG(17-二甲基胺基乙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素)。
美登素或其衍生物類美登素係藉由抑制微管蛋白聚合，抑制有絲分裂期間微管形成，來抑制細胞增殖。參見Remillard等人，Science 189：1002-1005(1975)。例示性美登素及類美登素包括(但不限於)美他素(mertansine)(DM1)及其衍生物以及安絲菌素(ansamitocin)。
吡咯并苯并二氮呯二聚體(PBD)及吲哚啉并-苯并二氮呯二聚體(IGN)為含有一或多個結合於雙螺旋DNA之亞胺(immine)官能基或其相等物的抗腫瘤劑。PBD及IGN分子係基於天然產物安麯黴素(athramycin)，且與DNA以序列選擇性方式相互作用，優選嘌呤-鳥嘌呤-嘌呤序列。例示性PBD及其類似物包括(但不限於)SJG-136。
斯考他汀及普蘭立德為抑制剪接且與剪接體SF3b相互作用之抗腫瘤化合物。斯考他汀之實例包括(但不限於)斯考他汀A、FR901464。普蘭立德之實例包括(但不限於)普蘭立德B、普蘭立德D及E7107。
紫杉烷為充當抗微管蛋白劑或有絲分裂抑制劑之二萜。例示性紫杉烷包括(但不限於)太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如TAXOL®)及多西紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®)。
長春花生物鹼亦為抗微管蛋白劑。例示性長春花生物鹼包括(但不限於)長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞賓(vinorelbine)。
在本發明之一些態樣中，藥物為免疫調節劑。免疫調節劑之實例包括(但不限於)更昔洛韋(gancyclovier)、依那西普(etanercept)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、伏環孢素(voclosporin)、環孢靈(cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸酯(mycophenolgate mofetil)、甲胺喋呤(methotrextrate)、糖皮質激素及其類似物、細胞因子、幹細胞生長因子、淋巴毒素(lymphotoxin)、腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子、介白素(例如介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21)、群落刺激因子(例如粒細胞群落刺激因子(G-CSF)及粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ)、稱為「S1因子」之幹細胞生長因子、紅血球生成素及血小板生成素或其組合。
在本發明之一些態樣中，藥物為顯影劑(例如螢光團或螯合劑)，諸如螢光素、若丹明、鑭系元素磷光體及其衍生物。螢光團之實例包括(但不限於)螢光異硫氰酸鹽(FITC)(例如5-FITC)、螢光素醯胺(FAM)(例如5-FAM)、曙紅、羧基螢光素、紅螢素、Alexa Fluor®(例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基若丹明(TAMRA)(例如5,-TAMRA)、四甲基若丹明(TMR)及磺醯羅丹明(SR)(例如SR101)。螯合劑之實例包括(但不限於)1,4,7,10-四氮雜環十二烷 -N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷、1-戊二酸-4,7-乙酸(NODAGA)、二伸乙三胺五乙酸(DTPA)及1,2-雙(鄰胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)(BAPTA)。
在本發明之一些態樣中，治療性或診斷性放射性同位素或其他標記(例如PET或SPECT標記)可併入用於結合於如本文所述之抗CXCR4抗體或抗原結合片段之藥物中。放射性同位素或其他標記之實例包括(但不限於)3H、11C、13N、14C、15N、15O、35S、18F、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Se、76Br、77Br、86Y、89Zr、90Y、94Tc、95Ru、97Ru、99Tc、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、111Ag、111In、113In、121Te、122Te、123I、124I、125I、125Te、126I、131I、131In、133I、142Pr、143Pr、153Pb、153Sm、161Tb、165Tm、166Dy、166H、167Tm、168Tm、169Yb、177Lu、186Re、188Re、189Re、197Pt、198Au、199Au、201Tl、203Hg、211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、224Ac及225Ac。
在本發明之一些態樣中，藥物為治療性蛋白質，包括(但不限於)毒素、激素、酶及生長因子。
毒素蛋白質(或多肽)之實例包括(但不限於)白喉(例如白喉A鏈)、綠膿桿菌外毒素及內毒素、蓖麻毒素(例如蓖麻毒素A鏈)、相思子毒素(例如相思子毒素A鏈)、莫迪素(例如莫迪素A鏈)、α-帚麴菌素、油桐蛋白質、康乃馨蛋白質、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白質、白樹素、白喉毒素、美洲商陸蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、黴菌毒素(tricothecene)、抑制劑胱胺酸結頭(ICK)肽(例如賽拉毒素(ceratotoxin))及芋螺毒素 (conotoxin)(例如KIIIA或SmIIIa)。
在本發明之一些態樣中，藥物為生物相容性聚合物。如本文所述之抗CXCR4抗體或抗原結合片段可結合於生物相容性聚合物以增加血清半衰期及生物活性，及/或延長活體內半衰期。生物相容性聚合物之實例包括水溶性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)或其衍生物，及含有兩性離子之生物相容性聚合物(例如含有磷酸膽鹼之聚合物)。
在本發明之一些態樣中，藥物為寡核苷酸，諸如反義寡核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供如本文所述之抗體或抗原結合片段的結合物，其中抗體-藥物結合物包含下式：抗體-(含有醯基供體麩醯胺酸之標籤)-(連接子)-(藥物)，其中含有醯基供體麩醯胺酸之標籤在抗體或抗原結合片段之特定位點(例如在重鏈或輕鏈之羧基端或在另一位點)經工程改造，其中標籤結合於連接子(例如含有一或多種反應性胺(例如一級胺NH2)之連接子)且其中連接子結合於細胞毒性劑(例如MMAD或如本文所述之其他奧瑞他汀)。在本發明之一些態樣中，抗體-藥物結合物不包含含有醯基供體麩醯胺酸之標籤。
含有一或多種反應性胺之連接子的實例包括(但不限於)乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC)或胺基PEG6-丙醯基。參見例如WO2012/059882。
在本發明之一些態樣中，連接子可為二肽連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、苯丙胺酸-離胺酸(phe-lys)連接子或順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(vc)連接子。在另一態樣中，連接子可為磺基丁二醯亞胺基-4-[N順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯(smcc)。磺酸基-smcc結合經由順丁烯二醯亞胺基，與硫氫基(硫醇，-SH)反應來產生，同時其磺酸基-NHS酯對一級胺(如在離胺酸及蛋白質或肽N端中發現)具有反應性。此外，連接子可為順丁 烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在本發明之一些態樣中，含有醯基供體麩醯胺酸之標籤包含LLQGG(SEQ ID NO：171)、GGLLQGG(SEQ ID NO：90)、LLQGA(SEQ ID NO：91)、GGLLQGA(SEQ ID NO：92)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO：93)、LLQGPG(SEQ ID NO：94)、LLQGPA(SEQ ID NO：95)、LLQGP(SEQ ID NO：96)、LLQP(SEQ ID NO：97)、LLQPGK(SEQ ID NO：98)、LLQGAPGK(SEQ ID NO：99)、LLQGAPG(SEQ ID NO：100)、LLQGAP(SEQ ID NO：101)、GGLLQGPP(SEQ ID NO：172)、LLQGPP(SEQ ID NO：173)、LLQX1X2X3X4X5(其中X1為G或P，其中X2為A、G、P或不存在，其中X3為A、G、K、P或不存在，其中X4為K、G或不存在，且其中X5為K或不存在)(SEQ ID NO：102)或LLQX1X2X3X4X5(其中X1為任何天然存在之胺基酸，且其中X2、X3、X4及X5為任何天然存在之胺基酸或不存在)(SEQ ID NO：103)。
在本發明之一些態樣中，如本文所述之抗CXCR4抗體或結合物包含在抗CXCR4抗體之位置297天冬醯胺(N)至麩醯胺酸(Q)或N至丙胺酸(A)之胺基酸取代。
在本發明之一些態樣中，包含例如LLQ、SEQ ID NO：91、90、94、95、95、97、98、99、100、171、101、172或173之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤在抗體重鏈之C端經工程改造，其中C端離胺酸殘基缺失。在其他態樣中，含有醯基供體麩醯胺酸之標籤(例如GGLLQGA(SEQ ID NO：92))在抗體輕鏈之C端經工程改造。抗體之實例包括(但不限於)m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及 h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D。
在本發明之其他態樣中，結合物包含下式：抗體-(含有醯基供體麩醯胺酸之標籤)-(L)-(細胞毒性劑)。在本發明之一些態樣中，結合物為a)Ab-LLQGA(SEQ ID NO：91)-(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC))-0101；b)Ab-LLQGA(SEQ ID NO：91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；c)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：102)-(AcLys-VC-PABC)-0101；d)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；e)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO：92)-(AcLys-VC-PABC)-0101；及f)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO：92)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD。
抗體之實例包括(但不限於)m6B6、h6B6、m12A11、h12A11、m3G10、h3G10、h3G10.A57、h3G10.B44、h3G10.1.7、h3G10.1.60、h3G10.2.5、h3G10.1.91、h3G10.2.37、h3G10.2.45、h3G10.2.42、h3G10.1.33、h3G10.3.25、h3G10、h3G10.2.72、h3G10.A11A、h3G10.A18A、h3G10.A19A、h3G10.A58A、h3G10.A65A及h3G10.B12A、h3G10.B13A、h3G10.B18A、h3G10.A11B、h3G10.A18B、h3G10.A19B、h3G10.A58B、h3G10.A65B、h3G10.B12B、h3G10.B13B、h3G10.B18B、h3G10.2.25、h3G10.L94D、h3G10.A59、h3G10.A62或h3G10.L94D。
在本發明之一些態樣中，Ab為包含含有SEQ ID NO：107、162及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：144、145及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段。
在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體-藥物結合物引起腫瘤消 退。
使用抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或其抗體-藥物結合物之方法
本發明之抗體及抗體-藥物結合物適用於各種應用，包括(但不限於)治療性治療方法及診斷性治療方法。
在本發明之一些態樣中，當向患者投與時，抗體或結合物及醫藥學上可接受之載劑為無菌的。當靜脈內投與化合物或結合物時，水為例示性載劑。生理食鹽水溶液及右旋糖及甘油水溶液亦可用作液體載劑，尤其用於可注射之溶液。若需要，本發明之組合物亦可含有微量濕潤劑或乳化劑或pH值緩衝劑。
本發明之組合物可呈溶液、丸粒、散劑、持續釋放調配物或任何其他適合於使用之形式的形式。適合醫藥載劑之其他實例係由E.W.Martin於「Remington's Pharmaceutical Sciences」中描述。
在一些態樣中，本發明之抗體及/或其抗體-藥物結合物根據常規程序調配為適合於靜脈內投與動物、尤其人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈內投與之載劑或媒劑為無菌等張緩衝水溶液。必要時，組合物亦可包括溶解劑。用於靜脈內投與之組合物可視情況包含局部麻醉劑(諸如利諾卡因(lignocaine))以減輕注射部位之疼痛。一般而言，成分係分開供給或以單位劑型混合於一起，例如呈於指示活性劑之量之密封容器(諸如安瓿或藥囊)中的乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式。在本發明之化合物及/或其抗體-藥物結合物將藉由輸注投與的情況下，其可例如用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸注瓶分配。在本發明之化合物及/或抗體-藥物結合物藉由注射投與的情況下，可提供無菌注射用水或生理食鹽水之安瓿，以使得成分可在投與之前混合。
組合物可包括各種物質，該等物質改變固體或液體劑量單位之物理形式。舉例而言，組合物可包括在活性成分周圍形成包衣外殼之材料。形成包衣外殼之材料通常為惰性的，且可選自例如糖、蟲膠及 其他包覆腸衣試劑。或者，活性成分可裝入明膠膠囊中。
無論呈固體還是液體形式，本發明之組合物均可包括用於治療癌症之藥劑。在一個態樣中，本發明提供一種用於治療個體中與CXCR4表現相關之病狀的方法。在本發明之一些態樣中，治療個體中與CXCR4功能或表現相關之病症之方法包含向有需要之該個體投與有效量之包含如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的組合物(例如醫藥組合物)。與CXCR4表現相關之病症包括(但不限於)異常CXCR4表現、改變或異常CXCR4表現、CXCR4過度表現及增生性病症(例如癌症)。
因此，在一些態樣中，提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的組合物。如本文所用，癌症包括(但不限於)膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨膜癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、腎癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌及血液癌症。在本發明之一些態樣中，提供一種減少具有表現CXCR4之腫瘤之個體中腫瘤生長或進展的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含如本文所述之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的組合物。在其他態樣中，提供一種減少個體中表現CXCR4之癌細胞轉移的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的組合物。在其他態樣中，提供一種誘發個體中表現CXCR4之腫瘤消退的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含如本文所述之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的組合物。
在一些態樣中，本發明提供如本文所述之任一抗體的分離之抗 體、抗原結合片段或抗體-藥物結合物，其用於偵測、診斷及治療與CXCR4功能或表現相關之病理學病症。在一個態樣中，該等病症為與CXCR4表現相對於正常增加相關之癌症或任何其他與CXCR4過度表現有關之病變。
在本發明之一些態樣中，提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含以下之組合物：重鏈可變(VH)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121及122組成之群的VH CDR1，(ii)選自由SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130組成之群的VH CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：112及120組成之群的VH CDR3；及/或b)輕鏈可變(VL)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151組成之群的VL CDR1，(ii)選自由145、132、136及152組成之群的VL CDR2，及(iii)選自由SEQ ID NO：139、133、137、140及153組成之群的VL CDR3。
在本發明之一些態樣中，提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含抗體或其抗原結合片段的組合物，其中該抗體包含：包含三個闡述為SEQ ID NO：107、162及112之CDR的重鏈可變(VH)區。在本發明之一些態樣中，提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含抗體或其抗原結合片段的組合物，其中該抗體包含：包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR的輕鏈可變(VL)區。
在本發明之一些態樣中，提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含如前述技術方案中任一者之抗體或其抗原結合片段的組合物，其中該抗體包含：包含三個闡述為 SEQ ID NO：107、162及112之CDR的重鏈可變(VH)區；及包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR的輕鏈可變(VL)區。
在一些態樣中，本發明提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含分離之抗體或其抗原結合片段的組合物，該分離之抗體或其抗原結合片段結合於CXCR4且包含：包含來自SEQ ID NO：33之VH區之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3的重鏈可變(VH)區；及包含來自SEQ ID NO：73之VL區之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的輕鏈可變(VL)區。
在其他態樣中，本發明提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之包含如前述技術方案中任一者之抗體或其抗原結合片段的組合物，其中該抗體包含：a)SEQ ID NO：33之重鏈可變(VH)區；及b)SEQ ID NO：73之輕鏈可變(VL)區。
在一些態樣中，本發明提供如本文所述之任一抗體的分離之抗體、抗原結合片段或抗體-藥物結合物的用途，其用於製造供治療與CXCR4功能或表現相關之病症的藥劑。在一個態樣中，該等病症為與CXCR4表現相對於正常增加相關之癌症或任何其他與CXCR4過度表現有關之病變。
在本發明之其他態樣中，抗CXCR4抗體-藥物結合物包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個重鏈可變區包括三個闡述為SEQ ID NO：107、113、114、162、128及112之CDR。在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體-藥物結合物包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個輕鏈可變區包括三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR。
在本發明之一些態樣中，結合於CXCR4之抗體-藥物結合物包括具有闡述為SEQ ID NO：33、5、9、13、17、21、23、25、27、29、 31、35、37、39、41、43、45、85或87中之任一者之重鏈可變區及/或闡述為SEQ ID NO：73、3、7、11、15、19、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、75、77、79、81、83或169中之任一者之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段。舉例而言，本發明之抗CXCR4抗體-藥物結合物可包括具有胺基酸序列與SEQ ID NO：33至少90%一致之重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：73至少90%一致之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段；或具有闡述為SEQ ID NO：33之重鏈可變區及具有闡述為SEQ ID NO：73之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段。
在本發明之特定態樣中，抗體未犬科化或貓科化。
抗體亦可例如在重鏈及/或輕鏈之可變結構域中經修飾，例如以改變抗體之結合特性。舉例而言，突變可在一或多個CDR區中進行以增加或減少抗CXCR4抗體之KD、增加或減少koff或改變抗體之結合特異性。定點突變誘發之技術為此項技術中熟知。參見例如Sambrook等人及Ausubel等人，上述。
在本發明之一些態樣中，提供一種偵測、診斷及/或監測與CXCR4功能或表現相關之病症的方法。舉例而言，如本文所述之抗CXCR4抗體可經諸如顯影劑及酶-受質標記之可偵測部分標記。如本文所述之抗體亦可用於活體內診斷分析，諸如活體內成像(例如PET或SPECT)或染色試劑。
在本發明之一個態樣中，提供一種偵測、診斷及/或監測與CXCR4功能或表現相關之病症的方法，其包含以下步驟：(i)自懷疑患有與CXCR4功能或表現相關之病症的患者獲得生物樣品；(ii)使待測試之樣品與抗體或其抗原結合部分在容許在抗體與蛋白質抗原CXCR4之間形成複合物的條件下接觸；(iii)偵測該抗體-蛋白質抗原複合物，其中該偵測之抗體-蛋白質抗原複合物的存在指示該患者患有 與CXCR4功能或表現相關之病症。在本發明之一特定態樣中，該方法進一步包含向該患者投與治療有效量之如本文所述之任一抗體的分離之抗體、抗原結合片段或抗體-藥物結合物。
在本發明之一些態樣中，ADC可用以藉由將此類化合物連接於抗體或其片段來將化合物(例如治療劑、標記、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制劑等)靶向具有CXCR4細胞表面受體之細胞。因而，在本發明之一些態樣中，提供用於離體或活體內定位表現CXCR4之細胞的方法(例如可偵測標記，諸如放射性同位素、螢光化合物作為酶)。或者，ADC可用以藉由使細胞毒素或放射性毒素靶向CXCR4來殺死具有CXCR4細胞表面受體之細胞。
在本發明之一些態樣中，本文所述之方法進一步包含用其他形式療法治療個體之步驟。在一些態樣中，其他治療形式為其他抗癌療法，包括(但不限於)化學療法、放射、手術、激素療法及/或其他免疫療法。
在本發明之一些態樣中，其他形式療法包含除如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物之外，亦投與一或多種治療劑。該等治療劑包括(但不限於)第二抗體(例如抗VEGF抗體、抗HER2抗體、抗CD25抗體及/或抗CD20抗體)、血管生成抑制劑、細胞毒性劑、消炎劑(例如太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇、順鉑(cisplatin)、小紅莓、潑尼松(prednisone)、絲裂黴素(mitomycin)、孕酮(progesterone)、他莫昔芬(tamoxifen)或氟尿嘧啶(fluorouracil))。在一個態樣中，其他形式療法可與如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物同時或依序或並行投與。
本發明之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可經由任何適合之途徑投與個體。熟習此項技術者應瞭解本文 所述之實例並不意欲為限制性的，而是說明可供使用之技術。因此，在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物根據已知之方法投與個體，該等方法為諸如靜脈內投與，例如快速注射或藉由在一段時間內連續輸注、藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、顱內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內、經由吹入、鞘內、經口、吸入或表面途徑。投藥可為全身性的(例如靜脈內投藥)或局部的。包括噴嘴式噴霧器及超音波式噴霧器的用於液體調配物之市售噴霧器適用於投藥。可直接使液體調配物形成噴霧且凍乾粉末可在復原後霧化。或者，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可使用碳氟化合物調配物及定劑量吸入器霧化或呈凍乾及研磨粉末形式吸入。在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可經由吸入投與，如本文所述。在其他態樣中，本發明之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可與醫藥學上可接受之媒劑(諸如生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及其類似物)組合。特定給藥方案(亦即劑量、時間選擇及重複)將視特定個體及該個體之病史而定。
在一個態樣中，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物經由位點特異性或靶向局部傳遞技術投與。位點特異性或靶向局部傳遞技術之實例包括抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的各種可植入儲槽式來源或局部傳遞導管，諸如輸注導管、留置導管或針狀導管、合成移植物、外膜包裹物、分流器及支架或其他可植入裝置、位點特異性載劑、直接注射或直接塗覆。參見例如PCT公開案第WO 00/53211號及美國專利第5,981,568號。
抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物之 各種調配物可用於投與。在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體(其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物)及醫藥學上可接受之賦形劑可在各種調配物中。本發明之一些調配物包含醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中已知且為促進藥理學上有效之物質投與的相對惰性物質。舉例而言，賦形劑可賦予形狀或稠度或充當稀釋劑。適合賦形劑包括(但不限於)穩定劑、濕潤劑及乳化劑、改變容積莫耳滲透濃度之鹽、囊封劑、緩衝劑及皮膚穿透增強劑。用於非經腸及經腸藥物傳遞之賦形劑以及調配物係闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000中。
一般而言，對於抗CXCR4抗體、其抗原結合片段及/或抗CXCR4抗體-藥物結合物之投與，初始候選劑量可為約2mg/kg。出於本發明之目的，典型日劑量可在約3μg/kg至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多中之任一者的範圍內，視上述因素而定。舉例而言，可使用約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg及約25mg/kg之劑量。對於若干天或更長時間內的重複投藥，視病狀而定，持續治療，直至產生所要症狀抑制或直至實現足夠治療水準，例如抑制或延遲腫瘤生長/進展或癌細胞轉移。一種例示性給藥方案包含投與約2mg/kg之初始劑量，接著約1mg/kg抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的每週維持劑量，或接著每隔一週約1mg/kg之維持劑量。其他例示性給藥方案包含投與遞增劑量(例如1mg/kg之初始劑量及逐步增至每週或更長時間段一或多個較高劑量)。其他劑量方案亦可適用，視從醫者希望實現之藥物動力學衰變模式而定。舉例而言，在一些態樣中，涵蓋一週一至四次給藥。在其他態樣中，涵蓋一個月一次或每隔一個月或每隔三個月一次給藥。此療法之進程易於藉由習知技術及分析監測。 給藥方案(包括所用的抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物)可隨時間變化。
出於本發明之目的，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體結合物之適當劑量將視所採用之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或CXCR4抗體-藥物結合物(或其組合物)、待治療之症狀之類型及嚴重性、藥劑是否出於治療性目的而投與、先前療法、患者的臨床病史及對藥劑之反應、患者對投與藥劑之清除速率及主治醫師之判斷而定。通常臨床醫師將投與抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物，直至達到實現所要結果之劑量。劑量及/或頻率可在治療過程內變化。諸如半衰期之經驗性考慮因素一般將有助於確定劑量。舉例而言，與人類免疫系統相容之抗體(諸如人類化抗體或全人類抗體)可用於延長抗體半衰期且預防抗體受宿主之免疫系統攻擊。投與頻率可在治療過程內確定及調節，且一般(但不一定)基於症狀之治療及/或抑制及/或改善及/或延遲，例如腫瘤生長抑制或延遲等。或者，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的持續連續釋放調配物可為適當的。達成持續釋放之各種調配物及裝置在此項技術中已知。
在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物之劑量可憑經驗在已一或多次投與抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或其抗CXCR4抗體-藥物結合物之個體中確定。給與個體遞增劑量之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物。為評估功效，可根據疾病之指示物。
根據本發明中之方法的抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物之投與可為連續或間歇的，視例如接受者之生理條件、投與目的為治療性還是預防性及熟練從醫者已知之其他因素而定。抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合 物之投與可在預選時段內基本上為連續的，或可在一系列分開劑量中。
在本發明之一些態樣中，可存在一種以上抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物。可存在至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同或更多種抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物。一般而言，彼等抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可具有不會不利地影響彼此之互補活性。舉例而言，可使用一或多種以下抗CXCR4抗體：針對CXCR4上之一種抗原決定基的第一抗CXCR4抗體及針對CXCR4上之不同抗原決定基的第二抗CXCR4抗體。
根據本發明使用的抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物之治療調配物藉由將具有所要純度之抗體與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版Mack Publishing,2005)混合來製備成凍乾調配物或水溶液形式，以供儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁基醇或苄醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬 錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物之脂質體藉由此項技術中已知之方法製備，該等方法諸如描述於Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號。具有增強之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。
活性成分亦可包裹於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中，包裹於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或包裹於巨乳液中。該等技術揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版Mack Publishing,2005中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，此等基質呈成形物品(例如膜或微囊)之形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與7-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物與醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
欲用於活體內投藥之調配物必須無菌。此易於例如藉由經由無 菌過濾膜過濾來實現。治療性抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物組合物一般置放於具有無菌進入孔之容器中，例如靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞子之小瓶。
根據本發明之組合物可呈單位劑型，諸如錠劑、丸劑、膠囊、散劑、顆粒、溶液或懸浮液或栓劑，用於經口、非經腸或經直腸投與或藉由吸入或吹入投與。
對於製備固體組合物(諸如錠劑)而言，將主要活性成分與醫藥載劑(例如習知製錠成分，諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠)及其他醫藥稀釋劑(例如水)混合，以形成含有本發明化合物或其醫藥學上可接受之無毒鹽之均質混合物的固體預調配組合物。當提及此等預調配組合物為均質時，意謂活性成分係遍及組合物均勻分佈，因此組合物可易於再分成等效之單位劑型，諸如錠劑、丸劑及膠囊。接著將該固體預調配組合物再分成含有0.1至約500mg本發明活性成分之上述類型的單位劑型。新穎組合物之錠劑或丸劑可包覆包衣或以其他方式混配以提供具有延長作用之優勢的劑型。舉例而言，錠劑或丸劑可包含內部劑量及外部劑量組分，後者呈包覆前者之包膜形式。可藉由用以抵抗在胃中崩解且允許該內層組分完整地進入十二指腸或延緩釋放的腸衣層將兩種組分分開。各種材料可用於該等腸衣層或包衣，該等材料包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、十六烷醇及乙酸纖維素之材料的混合物。
適合表面活性劑尤其包括非離子劑，諸如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他脫水山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑之組合物宜包含0.05%與5%之間的界面活性劑，且其量可在0.1%與2.5%之間。應瞭解必要時可添加其他成分，例如甘露醇，或其他醫藥學上可接受之媒劑。
可使用諸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM之市售脂肪乳液製備適合乳液。活性成分可溶解於預混乳液組合物中，或者其可溶解於油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及在與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合後形成的乳液中。應瞭解可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節乳液張力。適合乳液通常將含有至多20%之油，例如在5%與20%之間。脂肪乳液可包含0.1與1.0μm、尤其0.1與0.5μm之間的脂肪滴且具有在5.5至8.0範圍內的pH值。
乳液組合物可為藉由混合抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物與IntralipidTM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所製備的乳液組合物。
用於吸入或吹入之組合物包括於醫藥學上可接受之水性溶劑或有機溶劑或其混合物中之溶液及懸浮液，以及散劑。液體或固體組合物可含有如上所述之適合的醫藥學上可接受之賦形劑。在本發明之一些態樣中，組合物藉由口或鼻呼吸途徑投與來達成局部或全身作用。較佳無菌之醫藥學上可接受之溶劑中的組合物可藉由使用氣體來霧化。霧化溶液可自噴霧裝置直接呼吸，或可使噴霧裝置附接於面罩、帷罩或間歇性正壓呼吸機。溶液、懸浮液或粉末組合物可自以適當方式傳遞調配物之裝置，較佳經口或經鼻投與。
組合物
本發明方法中所用之組合物包含有效量之如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物。此類組合物之實例以及如何調配亦描述於前面部分及下文中。在本發明之一些態樣中，組合物包含一或多種抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物。舉例而言，抗CXCR4抗體識別人類CXCR4。在一些態樣中，CXCR4抗體為人類抗體、CDR移植抗體、 人類化抗體或嵌合抗體。在其他態樣中，抗CXCR4抗體包含能夠觸發所要免疫反應(諸如抗體介導之溶解或ADCC)之恆定區。在其他態樣中，抗CXCR4抗體包含不觸發非所需或不合需要之免疫反應(諸如抗體介導之溶解或ADCC)的恆定區。在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體包含如本文所述之抗CXCR4抗體或抗CXCR4或其抗原結合片段的一或多個CDR(諸如一個、兩個、三個、四個、五個或在一些實施例中所有六個CDR)。
應瞭解組合物可包含一種以上抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物(例如識別CXCR4抗原決定基之不同抗原決定基之抗CXCR4抗體的混合物)。其他例示性組合物包含一種以上識別相同抗原決定基之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物或結合於不同物種CXCR4(例如人類CXCR4)之不同抗原決定基的抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物。
本發明中所用之組合物可進一步包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy第21版，2005,Lippincott Williams及Wilkins，編輯K.E.Hoover)，呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對接受者無毒性且可包含：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二 醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。醫藥學上可接受之賦形劑將在本文中進一步描述。
套組
本發明亦提供用於本發明方法中之套組。本發明之套組包括一或多個包含如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物的容器及根據本文所述之任一本發明方法使用的說明書。一般而言，此等說明書包含關於抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物投與以用於上述治療性治療的描述。
關於如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物之使用的說明書一般包括關於用於達成預期治療之劑量、給藥時程及投藥途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中所提供之說明書通常為書寫於標籤或藥品說明書(例如套組中包括之紙單)上之說明，但機器可讀說明(例如磁性或光學儲存碟片上所載有之說明)亦可接受。
本發明之套組位於適合包裝中。適合包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋用於與特定裝置(諸如吸入器、經鼻投藥裝置(例如霧化器)或輸注裝置(諸如迷你泵))組合之包裝。套組可具有無菌進入孔(例如該容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞子之小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞子之小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為抗CXCR4抗體。該容器可進一步包含第二醫藥活性劑。
套組可視情況提供諸如緩衝劑之其他組分及解釋資訊。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相聯之標籤或藥品說明書。
突變及修飾
為表現本發明之抗CXCR4抗體或其抗原結合片段，編碼VH及VL區之DNA片段可首先使用任一上述方法獲得。例如突變、取代、缺失及/或添加之各種修飾亦可使用熟習此項技術者已知之標準方法引入DNA序列中。舉例而言，突變誘發可使用標準方法進行，該等方法為諸如PCR介導之突變誘發，其中突變核苷酸併入PCR引子中，使得PCR產物含有所要突變，或定點突變誘發。
例如可進行之一種類型取代為將抗體中可化學反應之一或多個半胱胺酸改變成諸如(但不限於)丙胺酸或絲胺酸之另一殘基。舉例而言，可進行非典型半胱胺酸之取代。取代可在抗體可變域之CDR或構架區或在恆定區中進行。在本發明之一些態樣中，半胱胺酸為典型的。
抗體亦可例如在重鏈及/或輕鏈之可變結構域中經修飾，例如以改變抗體之結合特性。舉例而言，突變可在一或多個CDR區中進行以增加或減少抗體對CXCR4之KD、增加或減少koff或改變抗體之結合特異性。定點突變誘發之技術為此項技術中熟知。參見例如Sambrook等人及Ausubel等人，上述。
修飾或突變亦可在構架區或恆定區中進行以增加抗CXCR4抗體之半衰期。參見例如PCT公開案第WO 00/09560號。亦可在構架區或恆定區中進行突變以改變抗體之免疫原性，提供共價或非共價結合於另一分子之位點，或改變諸如補體結合、FcR結合及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性之特性。根據本發明，單一抗體可在可變域之任一或多個CDR或構架區中或在恆定區中具有突變。
在稱為「生殖系化」之過程中，VH及VL序列中之某些胺基酸可 突變以匹配在生殖系VH及VL序列中天然發現之胺基酸。詳言之，VH及VL序列中之構架區之胺基酸序列可突變以匹配生殖系序列，從而降低投與抗體時免疫原性之風險。人類VH及VL基因之生殖系DNA序列為此項技術中已知(參見例如「Vbase」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat,E.A.等人(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242；Tomlinson等人，J.Mol.Biol.227：776-798(1992)；及Cox等人，Eur.J.Immunol.24：827-836(1994))。
可進行之另一類型胺基酸取代為移除抗體中之潛在蛋白分解位點。該等位點可在抗體可變域之CDR或構架區中或在恆定區中進行。半胱胺酸殘基之取代及蛋白分解位點之移除可降低抗體產物中異質性之風險且因而增加其同質性。另一類型胺基酸取代為去除形成潛在去醯胺位點之天冬醯胺-甘胺酸對，其係藉由改變該等殘基中之一或兩者來進行。在另一實例中，本發明抗CXCR4抗體之重鏈之C端離胺酸可裂解。在本發明之各種態樣中，抗CXCR4抗體之重鏈及輕鏈可視情況包括信號序列。
一旦獲得編碼本發明之VH及VL區段之DNA片段，此等DNA片段即可藉由標準重組DNA技術進一步操縱，例如以將可變區基因轉變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接於編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)之另一DNA片段。如此上下文中所用，術語「可操作地連接」意欲意謂兩種DNA片段接合，使得由兩種DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框。
編碼VH區之分離之DNA可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接於編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子而轉變成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如 Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242)且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為已知存在於不同個體中的各種對偶基因或同種異型抗免疫球蛋白(allotype)中之任一者，諸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。此等同種異型抗免疫球蛋白代表IgG1恆定區中天然存在之胺基酸取代。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接於僅僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。CH1重鏈恆定區可來源於任一重鏈基因。
編碼VL區之分離之DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接於編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子來轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242)且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區可為已知存在於不同個體中的各種對偶基因中之任一者，諸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恆定區可來源於三種λ基因中之任一者。
為產生scFv基因，編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接於編碼可撓性連接子，例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：80)之另一片段，使得VH及VL序列可表現為相鄰單鏈蛋白質，其中VL及VH區由可撓性連接子接合(參見例如Bird等人，Science 242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990))。若僅僅使用單一VH及VL，則單鏈抗體可為單價，若使用兩個VH及VL，則為二 價，或若使用兩個以上VH及VL，則為多價。可產生結合於CXCR4及另一分子之雙特異性或多價抗體。
在本發明之一些態樣中，可製造包含本發明之抗CXCR4抗體所有或一部分連接於另一多肽的融合抗體或免疫黏附素。在其他態樣中，僅僅抗CXCR4抗體之可變結構域連接於多肽。在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體之VH結構域連接於第一多肽，而抗CXCR4抗體之VL結構域連接於第二多肽，該第二多肽以使得VH與VL結構域可彼此相互作用以形成抗原結合位點之方式與第一多肽締合。在其他態樣中，VH結構域與VL結構域藉由使VH與VL結構域可彼此相互作用之連接子分開。隨後VH-連接子-VL抗體連接於相關多肽。此外，可產生融合抗體，其中兩種(或兩種以上)單鏈抗體彼此連接。若想要在單一多肽鏈上產生二價或多價抗體或若想要產生雙特異性抗體，則此適用。
在本發明之一些態樣中，其他經修飾之抗體可使用編碼核酸分子之抗CXCR4抗體製備。舉例而言，「κ體」(Ill等人，Protein Eng.10：949-57(1997))、「微型抗體」(Martin等人，EMBO J.,13：5303-9(1994))、「雙功能抗體」(Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))或「Janusin」(Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659(1991)及Traunecker等人，Int.J.Cancer(增刊)7：51-52(1992))可使用標準分子生物學技術遵循本說明書之教示製備。
雙特異性抗體或抗原結合片段可藉由多種方法，包括融合瘤融合或連接Fab'片段來產生。參見例如Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。此外，雙特異性抗體可形成為「雙功能抗體」或「Janusin」。在本發明之一些態樣中，雙特異性抗體結合於CXCR4之兩個不同抗原決定基。在一些態樣中，上述經修飾之抗體 使用來自本文所提供之抗CXCR4抗體的一或多個可變結構域或CDR區製備。
在一個態樣中，本發明包含多特異性抗體之用途。多特異性抗體為可同時結合於至少兩個具有不同結構之標靶(例如兩種不同抗原、相同抗原上之兩種不同抗原決定基或半抗原及/或抗原或抗原決定基)之抗體。多特異性多價抗體為具有一個以上結合位點之構築體且該等結合位點具有不同特異性。
本發明之代表性材料於2014年6月19日寄存於美國菌種保存中心(American Type Collection，ATCC)。具有ATCC寄存編號PTA-121353之載體為編碼人類化抗CXCR4抗體重鏈可變區之聚核苷酸，且具有ATCC寄存編號PTA-121354之載體為編碼人類化抗CXCR4抗體輕鏈可變區之聚核苷酸。按照《國際承認用於專利程序的微生物寄存布達佩斯條約》(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)之規定及其下條例(布達佩斯條約)進行寄存。此舉確保自寄存之日起保持寄存物之可存活培養物30年。該寄存物將藉由ATCC依布達佩斯條約款項可獲得，且服從在Pfizer,Inc.與ATCC之間的協議，其確保一旦相關美國專利公佈或一旦使任何美國或國外專利申請案(無論何者首先出現)變得公諸於眾，公眾即可獲得寄存物之培養物的子代永久及無限制的利用性，且確保根據35 U.S.C.章節122及依照其之委員會細則(包括37 C.F.R.章節1.14，具體參考886 OG 638)，由美國專利與商標委員會確定有資格者對子代之利用性。
本申請案之受讓人已同意若寄存中材料之培養物在適合條件下培養時死亡或損失或破壞，則將通知立即以另一相同物替換該等材料。不應將寄存材料之利用性理解為在違背任何政府當局根據其專利法授予之權利下實踐本發明之許可。
本發明亦關於此等抗CXCR4抗體(例如全長抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物)及包含CXCR4受體抗體(例如全長抗體或其抗原結合片段)之醫藥組合物的用途，其用於治療與CXCR4調節相關之疾病及病狀，諸如骨髓移植、化學致敏、癌症、轉移性疾病(例如癌症)、自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎)、纖維化疾病(例如肺)、AIDS感染、心血管疾病、葡萄膜炎、發炎性疾病、乳糜瀉、HIV感染及基於幹細胞之再生醫學。
癌症
CXCR4受體在多種癌症中過度表現，該等癌症包括(但不限於)乳癌(Muller,A.等人Nature 410：50-56(2001))；卵巢癌(Scotton,C.等人Br.J.Cancer 85：891-897(2001)；前列腺癌(Taichman,R.S.等人Cancer Res.62：1832-1837(2002)；非小細胞肺癌(Spano J.P.等人Ann.Oncol.15：613-617(2004))；胰臟癌(Koshiba,T.等人Clin.Cancer Res.6：3530-3535(2000))；甲狀腺(Hwang,J.H.等人J.Clin.Endocrinol.Metab.88：408-416(2003))；鼻咽癌(Wang,N.等人J.Transl.Med.3：26-33(2005))；黑色素瘤(Scala,S.等人Clin.Cancer Res.11：1835-1841(2005))；腎細胞癌(Staller,P.等人Nature 425：307-311(2003))；淋巴瘤(Bertolini,F.等人Cancer Res.62：3530-3535(2002))；神經母細胞瘤(Geminder,H.等人J.Immunol.167：4747-4757(2001))；神經膠母細胞瘤(Rempel,S.A.等人Clin.Cancer Res.6：102-111(2000))；橫紋肌肉瘤(Libura,J.等人Blood 100：2597-2606(2002))；結腸直腸癌(Zeelenberg,I.S.等人Cancer Res.63：3833-3839(2003))；腎癌(Schrader,A.J.等人Br.J.Cancer 86：1250-1256(2002))；骨肉瘤(Laverdiere,C.等人Clin.Cancer Res.11：2561-2567(2005))；急性淋巴母細胞白血病(Crazzolara,R.等人Br.J.Haematol.115：545-553(2001))；及急性骨髓白血病(Rombouts,E.J.C.等人Blood 104：550-557 (2004))。
鑒於上文，本發明之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可用於治療癌症，包括(但不限於)乳癌、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、腎細胞癌、淋巴瘤、神經母細胞瘤、神經膠母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、結腸直腸癌、腎癌、骨肉瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、多發性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(WM)及B細胞淋巴瘤及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。抗體可單獨或與諸如手術及/或放射之其他癌症治療組合使用，及/或與其他抗贅生劑組合使用，該等抗贅生劑為諸如以上論述及闡述之抗贅生劑，包括化學治療藥物及其他抗腫瘤抗原抗體，諸如結合CD20、Her2、PSMA、坎帕斯-1(Campath-1)、EGFR及其類似物之抗體。
在一些態樣中，本發明之抗CXCR4抗體可與抗CD22或抗CD33抗體、抗體-藥物結合物或包含此類抗體之組合物組合使用。舉例而言，本發明之抗CXCR4抗體可與奧英妥珠單抗(inotuzumab ozogamicin)或吉妥單抗(ozogamicin，Mylotarg®)組合。
「組合療法」或「組合」一或多種其他治療劑投與包括按任何次序同時、並行及連續投藥。本發明之組合製劑之組分的投與可同時、分開或依序進行。
根據本發明，提供一種用於治療癌症之方法，其包含同時、並行或連續投與本發明之抗CXCR4抗體及奧英妥珠單抗。舉例而言，抗CXCR4抗體可在奧英妥珠單抗之前或之後或同時投與。此外，本發明在本文中提供一種用於治療諸如AML之癌症之方法，其包含同 時、並行或連續投與本發明之抗CXCR4抗體及Mylotarg。舉例而言，抗CXCR4抗體可在Mylotarg之前或之後或同時投與。
抗CXCR4抗體或其片段可結合於治療部分及/或診斷劑，諸如細胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素。此類結合物在本文中稱為抗體-藥物結合物。抗體-藥物結合物可包括一或多種細胞毒素。
在本發明之一些態樣中，治療包含投與本發明之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物與一或多種選自抗體、生長因子、激素、細胞因子、抗激素、黃嘌呤、介白素、干擾素及細胞毒性藥物之生物活性劑。在本發明之特定態樣中，生物活性劑為抗體，且針對在B細胞惡性病上表現之細胞表面抗原。
在本發明之一些態樣中，針對在B細胞惡性病上表現之細胞表面抗原的抗體係選自由抗CD19、抗CD20及抗CD33抗體組成之群。該等抗體包括抗CD20抗體利妥昔單抗(rituximab)(RituxanTM)。
在本發明之一些態樣中，生物活性劑為細胞因子或生長因子且包括(但不限於)介白素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF及G-CSF。在本發明之特定態樣中，生物活性劑為激素且包括雌激素、雄激素、孕酮及皮質類固醇。
在本發明之一些態樣中，藥物為選自以下之藥物：小紅莓、道諾黴素、艾達黴素、阿克拉黴素(aclarubicin)、左柔比星(zorubicin)、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星(carubicin)、苯達莫司汀(bendamustine)、貝伐單抗(bevacizumab)、硼替佐米(bortesomib)、來那度胺(lenalidomide)、美法侖、諾加黴素(nogalamycin)、美諾立爾(menogaril)、吡柔比星(pitarubicin)、伐柔比星、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、曲氟尿苷(trifluridine)、安西他濱(ancitabine)、依諾他濱(enocitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、噴司他丁(pentostatin)、溴尿苷(broxuridine)、 卡培他濱(capecitabine)、克拉屈濱(cladribine)、地西他濱(decitabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉賓(fludarabine)、穀氏菌素(gougerotin)、嘌呤黴素(puromycin)、喃氟啶(tegafur)、噻唑呋林(tiazofurin)、阿德力黴素、順鉑、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺、達卡巴嗪(dacarbazine)、長春鹼、長春新鹼、米托蒽醌、博萊黴素(bleomycin)、氮芥(mechlorethamine)、潑尼松、丙卡巴肼(procarbazine)、甲胺喋呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(flurouracil)、依託泊苷(etoposide)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇類似物及絲裂黴素。
在本發明之一些態樣中，治療有效劑量之本發明之抗CXCR4抗體、其片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物與酪胺酸激酶抑制劑之一或多種組合一起投與。酪胺酸激酶抑制劑包括蛋白質與非蛋白質部分。酪胺酸激酶抑制劑可為例如抗體、受體配體或小分子抑制劑。適用於本發明之方法中的酪胺酸激酶抑制劑之實例包括(但不限於)吉非替尼(gefitinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、卡奈替尼(canertinib)、賽瑪西尼(semaxinib)、凡塔藍尼(vatalanib)、索拉非尼(sorafenib)、伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)、來氟米特(leflunomide)、凡德他尼(vandetanib)、其衍生物、其類似物及其組合。適用於本發明中之其他酪胺酸激酶抑制劑如描述於例如美國專利第5,618,829號；第5,639,757號；第5,728,868號；第5,804,396號；第6,100,254號；第6,127,374號；第6,245,759號；第6,306,874號；第6,313,138號；第6,316,444號、第6,329,380號；第6,344,459號；第6,420,382號；第6,479,512號；第6,498,165號；第6,544,988號；第6,562,818號；第6,586,423號；第6,586,424號；第6,740,665號；第6,794,393號；第6,875,767號、第6,927,293號；及第6,958,340號中。
在一些態樣中，治療有效劑量之本發明之抗CXCR4抗體、其片 段或抗CXCR4抗體-藥物結合物與作為治療方案一部分的一或多種藥物組合一起投與，其中細胞毒性劑組合係選自：CHOPP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)；CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼松)；COP(環磷醯胺、長春新鹼及潑尼松)；CAP-BOP(環磷醯胺、小紅莓、丙卡巴肼、博萊黴素、長春新鹼及潑尼松)；m-BACOD(甲胺喋呤、博萊黴素、小紅莓、環磷醯胺、長春新鹼、地塞米松及甲醯四氫葉酸(leucovorin))；ProMACE-MOPP(潑尼松、甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、依託泊苷、甲醯四氫葉酸、氮芥、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM(潑尼松、甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、依託泊苷、甲醯四氫葉酸、阿糖胞苷、博萊黴素及長春新鹼)；MACOP-B(甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、長春新鹼、潑尼松、博萊黴素及甲醯四氫葉酸)；MOPP(氮芥、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)；ABVD(阿德力黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼及達卡巴嗪)；MOPP(氮芥、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)與ABV(阿德力黴素/小紅莓、博萊黴素及長春鹼)交替；MOPP(氮芥、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)與ABVD(阿德力黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼及達卡巴嗪)交替；ChIVPP(苯丁酸氮芥、長春鹼、丙卡巴肼及潑尼松)；IMVP-16(異環磷醯胺(ifosfamide)、甲胺喋呤及依託泊苷)；MIME(丙咪腙(methyl-gag)、異環磷醯胺、甲胺喋呤及依託泊苷)；DHAP(地塞米松、高劑量阿糖胞苷及順鉑)；ESHAP(依託泊苷、甲潑尼松(methylpredisolone)、高劑量阿糖胞苷及順鉑)；CEPP(B)(環磷醯胺、依託泊苷、丙卡巴肼、潑尼松及博萊黴素)；CAMP(洛莫司汀(lomustine)、米托蒽醌、阿糖胞苷及潑尼松)；CVP-1(環磷醯胺、長春新鹼及潑尼松)，ESHOP(依託泊苷、甲潑尼松、高劑量阿糖胞苷、長春新鹼及順鉑)；EPOCH(依託泊苷、長春新鹼及小紅莓96小時與快速給與之環磷醯胺及口服潑尼松)；ICE(異環磷 醯胺、環磷醯胺及依託泊苷)；CEPP(B)(環磷醯胺、依託泊苷、丙卡巴肼、潑尼松及博萊黴素)；CHOP-B(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、潑尼松及博萊黴素)、CEPP-B(環磷醯胺、依託泊苷、丙卡巴肼及博萊黴素)及P/DOCE(表柔比星或小紅莓、長春新鹼、環磷醯胺及潑尼松)。
在本發明之一些態樣中，藥物可與如本文所述之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物同時或依序或並行投與。舉例而言，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可在作為治療方案一部分的一或多種細胞毒性劑組合投與之前投與。在本發明之一些態樣中，治療有效劑量之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物在作為治療方案一部分之一或多種細胞毒性劑組合投與之後投與。
在本發明之一些態樣中，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可連同作為治療方案一部分的一或多種細胞毒性劑組合一起投與。
本發明之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物亦可與諸如手術、放射療法、化學療法、免疫療法及飲食/鍛煉方案之非藥物治療結合投與。其他治療可在用本發明之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物治療之前、並行或之後投與。在不同治療投與之間亦可存在數小時、數天及在一些情況下數週的延遲，使得本發明之抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物結合物可在其他治療之前或之後投與。
CXCR4之治療用途
根據本發明之各種態樣，抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR4抗體-藥物可用於治療包括以下各病之多種病症或產生治療包括以下各病之多種病症的藥劑：各種癌症、發炎病症、過敏性病症、 感染(HIV感染等)、自體免疫病症(例如類風濕性關節炎)、纖維化病症(例如肺)及心血管病症。癌症包括實體腫瘤癌症(例如胃癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌及胰臟癌)及血液癌症(例如骨髓發育不良症候群、骨髓增生病症及急性白血病)。造血病症之實例包括非B譜系衍生之病症，諸如急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)、非B細胞急性淋巴細胞性白血病(ALL)、骨髓發育不良病症、骨髓增生病症、紅血球增多、血小板增多或非B非典型免疫淋巴組織增生。B細胞或B細胞譜系衍生病症之實例包括慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、B淋巴細胞譜系白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、B細胞原淋巴細胞性白血病、前驅B淋巴母細胞白血病、毛細胞白血病或漿細胞病症，例如澱粉樣變性或瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症。
血液病症
血液病症包含血液及所有其組分之疾病以及參與血液所有組分產生或降解之器官及組織之疾病。在本發明之一些態樣中，血液病症包括(但不限於)急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、多發性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(WM)、B細胞淋巴瘤及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。NHL可包括惰性非霍奇金氏淋巴瘤(iNHL)或侵襲性非霍奇金氏淋巴瘤(aNHL)。在某些態樣中，個體復發或難以由其他治療治癒。在某些態樣中，個體復發或難以由至少兩種或兩種以上其他治療治癒。在本發明之一些態樣中，個體復發或難以由至少三種或三種以上其他治療治癒。在本發明之一些態樣中，個體復發或難以由至少五種或五種以上其他治療治癒。
本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體 之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療血液病症之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
慢性淋巴細胞性白血病
CLL細胞表現高水準之CXCR4。(Burger JA,Burger M,Kipps TJ.Chronic lymphocytic leukemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptors that mediate spontaneous migration beneath bone marrow stromal cells.Blood.94：3658-3667(1999))。本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)之主要治療組合物。該等組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體，或多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體之混合物。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
其他B細胞淋巴瘤
CXCR4表現已展現在B細胞(Burger等人，Chronic lymphocytic leukemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptors that mediate spontaneous migration beneath bone marrow stromal cells.Blood.94：3658-3667(1999))及T細胞(Trentin L,Agostini C,Facco M等人，The chemokine receptor CXCR4 is expressed on malignant B cells and mediates chemotaxis.J Clin Invest.104：115-121(1999))、非霍奇金淋巴瘤(NHL)中。來自B-NHL患者之惡性B細胞表現功能性CXCR4受 體。認為趨化激素受體表現之獨特模式與淋巴瘤細胞移動及歸巢有關且可允許區分不同NHL子集。(Jones D,Benjamin RJ,Shahsafaei A,Dorfman DM.The chemokine receptor CXCR4 is expressed in a subset of B-cell lymphomas and is a marker of B-cell chronic lymphocytic leukemia.Blood.95：627-632(2000))。在一動物模型中，小鼠用經工程改造以保留細胞質內CXCR4之T細胞融合瘤細胞攻擊。在人類高度NHL之另一小鼠模型中，藉由單株抗體中和CXCR4抑制循環NHL細胞之歸巢且提高存活率(Bertolini F,Dell'Agnola C,Mancuso P等人，CXCR4 neutralization,a novel therapeutic approach for non-Hodgkin's lymphoma.Cancer Res.62：3106-3112(2002))，因此提出CXCR4中和作為一種新穎的NHL治療方法。本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療B細胞慢性B細胞淋巴瘤之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
多發性骨髓瘤中之CXCR4
多發性骨髓瘤(MM)為巨大的不可治癒之漿細胞贅瘤。趨化激素受體CXCR4由大部分患者MM細胞表現。其促進骨髓瘤細胞遷移及歸巢至骨髓(BM)隔室，支撐腫瘤細胞存活且保護骨髓瘤細胞免於化學療法誘發之細胞凋亡。因此，本發明之抑制CXCR4活性的抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR4抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物(例如拮抗抗體)可用於治療血液病症，諸如多發性骨髓瘤。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合 物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
急性白血病中之CXCR4
因為CXCR4在保持骨髓中之造血祖細胞中發揮關鍵作用，所以若干群組已檢查CXCR4在祖細胞白血病中所發揮之作用。前驅B細胞急性淋巴母細胞白血病(ALL)表現功能性CXCR4受體(Bradstock KF,Makrynikola V,Bianchi A,Shen W,Hewson J,Gottlieb DJ.Effects of the chemokine stromal cell-derived factor-1 on the migration and localization of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells within bone marrow stromal layers.Leukemia.14：882-888(2000))，其與非肥胖型糖尿病/重症聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中白血病細胞歸巢至骨髓中有關。(Shen W,Bendall LJ,Gottlieb DJ,Bradstock KF.The chemokine receptor CXCR4 enhances integrin- mediated in vitro adhesion and facilitates engraftment of leukemic precursor-B cells in the bone marrow.Exp Hematol.29：1439-1447(2001))。在精緻動物模型中，Sipkins等人(Sipkins DA,Wei X,Wu JW等人，In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.Nature.435：969-973(2005))直接證明功能性CXCR4為ALL細胞歸巢至骨髓微環境所需。本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療急性淋巴母細胞白血病(ALL)之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。
此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
急性骨髓白血病(AML)中之CXCR4
儘管普遍對化學療法之敏感，但AML中之長期無疾病存活時間保持低，因為大部分患者由微量殘留病(MRD)復發。CXCR4看似為造成抗癌藥物抗性之存活信號的重要調節劑。此概念由如下發現支持：白血病細胞高水準表現CXCR4為AML中之不良預後指示。Spoo AC,Wierda WG,Burger JA.The CXCR4 score：a new prognostic marker in acute myelogenous leukemia[abstract].Blood.104：304a(2004)。本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療急性骨髓白血病(AML)之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。
此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
非造血癌症中之CXCR4
趨化激素及趨化激素受體具有之最引起興趣及可能重要作用之一為調節實體腫瘤之轉移。CXCR4為最佳研究之趨化激素受體之一，其選擇性結合於CXC趨化激素基質細胞衍生因子1(SDF-1)，亦稱為CXCL12(Fredriksson等人，Mol Pharmacol.63：1256-72(2003))。迄今為止，CXCR4已展現在超過20種人類惡性病中過度表現，包括乳癌、前列腺癌、腎癌、結腸癌、甲狀腺癌及胰臟癌(Müller等人，Nature 410：50-6(2001)；Akashi等人Cancer Sci.99(3)：539-542(2008)；Maréchal等人Br J Cancer,100,1444-51(2009)；Wang等人，Clin Exp Metastasis,26,1049-54.(2009)；He X等人，Pathol Res Pract,206,712-5.(2010))。
本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體 之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療非造血癌症之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
乳癌中之CXCR4
贅生性細胞上CXCR4之高水準表現與乳癌患者中相對不良整體存活相關。(Li YM,Pan Y,Wei Y等人，Up-regulation of CXCR4 is essential for HER2-mediated tumor metastasis.Cancer Cell.6：459-469(2004))。在所有乳癌的約30%中觀測到之HER2/neu高水準表現亦與相對不良預後相關。Li等人最近證明HER2/neu藉由抑制CXCR4降解而增強CXCR4之表現及功能。(Li YM,Pan Y,Wei Y等人，Up-regulation of CXCR4 is essential for HER2-mediated tumor metastasis.Cancer Cell.6：459-469(2004))。因此，本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療乳癌之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
肺癌中之CXCR4
小細胞肺癌(SCLC)為一種侵襲性的快速轉移之贅瘤，高度傾向於與骨髓有關。即使在組合化學療法及放射線療法治療下，5年存活期僅約5%，因為迅速發展抗藥性。在SCLC細胞中，CXCR4活化以CXCR4及整合素依賴性方式誘發遷移及侵襲性反應及黏附至骨髓基 質細胞。CXCR4可引導在SCLC患者中觀測到之獨特轉移模式。因此，本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療肺癌之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
腎細胞癌中之CXCR4(RCC)
最近，已澈底闡明CXCR4在mRCC中之作用。結果證明CXCR4之高表現與mRCC患者之不良存活強烈相關(Wang等人，Clin Exp Metastasis,26,1049-54(2009)；Zhao等人，Mol Biol Rep,38,1039-45(2011))。此外，在鼠類模型中得出結果，其中表現CXCR4之RCC細胞之轉移能力與癌細胞上CXCR4蛋白質含量及標靶器官中SDF-1α表現強烈相關(Motzer等人The New England Journal of Medicine，第335卷，第12期，第865-875頁(1996))。因此，CXCR4可為腎透明細胞癌之多模態療法中的令人感興趣之治療標靶。
本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或包含抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療腎細胞癌(RCC)之主要治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。
此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
非腫瘤學適應症中之CXCR4
趨化激素受體在各種特定細胞及特定時間表現。其主要與發炎 及免疫反應經由使其效應細胞積聚在產生趨化激素之位點之機構的控制相關。舉例而言，已展示SDF-1在活體外特定抑制T細胞導向(X4)HIV之感染(Bleul等人Nature,382：829-833(1996)；Oberlin等人Nature,833-835(1996))。此可視為SDF-1在HIV之前結合於CXCR4，由此帶走使細胞感染HIV之骨架，從而抑制HIV感染。此外，展示HIV感染抑制劑為CXCR4拮抗劑(Nat.Med.,4,72(1998))。
因此，本發明涵蓋抗CXCR4抗體、其抗原結合片段或抗CXCR抗體之抗CXCR4抗體-藥物結合物的用途，其用作治療發炎及免疫疾病、過敏性疾病、感染(HIV感染等)、與HIV感染相關之疾病(後天免疫缺乏症候群等)的治療組合物。該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。
此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。
WHIM症候群
WHIM症候群為一種罕見的先天性免疫缺乏病症，其特徵在於以下主要臨床表現：疣、低γ球蛋白血症、復發性細菌感染及中性粒細胞減少症。[McDermott,DH等人Blood 118(18)：4957-4962(2011)；Mcermott DH等人J.Cell.Mol.Med.15(10)：2071-2081(2011)]。中性粒細胞減少症之進一步特徵為不尋常血液病症，其中成熟嗜中性白血球無法離開骨髓且缺乏大量B及T細胞或其功能(Zueler WW等人N.Engl.J.Med.270：699-704(1964))。Hernandez PA等人首先描述CXCR4中之突變與WHIM症候群相關，其中CXCR4R334X為最常見及最佳研究之變異體(Hernandez PA等人Nature Genetics 34：70-74(2003))。CXCR4R334X作為獲得功能之突變，顯示增強之信號傳導至 內源性配體CXCL12之能力。因此，可利用CXCR4R334X增加之信號傳導能力治療WHIM症候群。
在本發明之一些態樣中，本發明涵蓋包含抗CXCR4抗體之抗體-藥物結合物的用途，其用作治療WHIM症候群之主要治療組合物，其中該組合物可含有多株抗CXCR4抗體或單株抗CXCR4抗體。此外，本發明之治療組合物可含有針對不同的非阻斷CXCR4抗原決定基之單株抗CXCR4抗體的混合物或抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物或單株抗CXCR4抗體與抗CXCR4抗體-藥物結合物之混合物。此外，在一些態樣中，本發明所揭示之治療組合物可單獨或與WHIM症候群之一些當前治療組合投與，該等當前治療為諸如G-CSF(非格司亭(filgrastim)(Neupogen；Amgen Inc.))、靜脈內免疫球蛋白及小分子CXCR4拮抗劑AMD3100(普樂沙福(plerixafor)，商標名Mozobil(Genyzme Corporation))。
提供以下實例僅為達成說明之目的，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實際上，除本文所示及所述以外，本發明之各種修改將為熟習此項技術者自前面描述顯而易見且屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
實例1 嵌合抗CXCR4小鼠抗體之抗體結合親和力測定
藉由流動式細胞測量術，對表現CXCR4之人類非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)Ramos細胞評估嵌合小鼠抗CXCR4抗體12A11、6B6及3G10(表現為hIgG1亞型)之結合。100,000個細胞與連續稀釋之抗CXCR4抗體一起於100μL結合緩衝液(PBS+0.5%BSA)中培育，接著與來自Jackson Immunoresearch Laboratories之Dylight488結合之山羊抗人類Fc二級抗體一起培育。%藉由每一稀釋液之MFI值相對於最大值標準化推導。EC50藉由PRISM軟體計算。
實例2 人類化3G10 Fab與表現CXCR4之HPB-ALL細胞的結合
藉由流動式細胞測量術，對表現CXCR4之HPB-ALL細胞評估人類化3G10 Fab之結合。150,000個細胞與各種h3G10 Fab在100μL結合緩衝液(PBS+0.5%BSA)中2.5或0.25μg/mL下一起培育，接著與來自R&D systems之APC結合之山羊抗人類Fab特異性二級抗體一起培育。
實例3 CXCR4抗體結合：CXCR4 Ab Fab之細胞結合及親和力量測
藉由流動式細胞測量術，對HPB-ALL(人類T細胞白血病)細胞量測CXCR4 Fab與表現CXCR4之細胞的結合。使150,000個HPB-ALL細胞再懸浮於96孔盤上之100μL FACS緩衝液(1×PBS+0.5% BSA)中。將抗CXCR4 Fab添加至每一孔中達0.25μg/mL之最終濃度，且在4℃下培育30分鐘。在移除初級抗體之後，細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，接著再懸浮於FACS緩衝液中，隨後添加2μL(3μg)二級抗體(Alexa Fluor 647結合之山羊抗人類IgG，F(ab')2特異性，Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove PA)至每一孔中。培養盤在4℃下再培育30分鐘。藉由細胞分析器LSRII(BD Biosciences,San Jose CA)獲得螢光信號。表中展示每一樣品之MFI(平均螢光強度)。
使用富含人類CXCR4之脂質粒子(LEV101，Integral Molecular,Philadelphia PA)測定每一Fab之結合親和力。生物素標記之WGA(Sigma Aldrich,St.Louis MO)可塗佈於SA晶片上以幫助捕獲含有CXCR4蛋白質之脂質粒子。注射低至高濃度(每一濃度具有3分鐘締合時間)的Fab之連續稀釋液(5員，3X稀釋因子，最高濃度為10或30nM)，以使用如Karlsson等人中所描述之「動力學滴定」方法對數據進行動力學分析(Karlsson,R.,Katsamba,P.S.,Nordin,H.,Pol,E.及Myszka,D.G.Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.Anal.Biochem.349,136-147(2006))。對於一些分析循環，緩衝液注射在俘獲粒子上而非Fab，以提供用於雙重參考目的之空白循環(雙重參考如Myszka等人Improving biosensor analysis.J.Mol.Recognit.12，279-284(1999)中所描述進行)。
實例4 CXCR4 Ab與獼猴及人類CXCR4之結合
藉由流動式細胞測量術，在連續稀釋液(0.007-267nM)中，對1)HPB-ALL(人類T細胞白血病)及獼猴CXCR4轉染之CHO細胞及2)Raji(人類非霍奇金淋巴瘤)及HSC-F(獼猴T細胞株)，測試抗人類CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B與獼猴CXCR4之交叉反應性。藉由二級抗體(Alexa Fluor 647結合之山羊抗人類IgG，Fcγ特異性，Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove PA)偵測結合且用LSRFortessa細胞分析器(BD Biosciences,San Jose CA)獲得。曲線擬合及EC50計算用Prism軟體(GraphPad軟體，La Jolla CA)進行。表9A及9B及圖3A及3B。
實例5 CXCR4抗體之效應功能
治療性裸抗體依賴於兩種類型功能性來實現臨床功效：藉由Fab(抗原結合片段)結構域之標靶特異性結合，及經由抗體之Fc結構域與各種細胞類型上之Fc受體的相互作用的免疫介導之效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體Fc區結合於免疫效應細胞(諸如天然殺手細胞及巨噬細胞)表面上之Fc受體(FcγR)，導致靶向細胞吞噬或溶解。在CDC中，抗體藉由觸發細胞表面之補體級聯來殺死靶向細胞。因此，治療抗體之Fc部分經由對ADCC或CDC之影響，可在其作用機制中具有重要作用。
人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)之每一子類別均顯示效應功能之獨特型態，該效應功能之獨特型態由與FcγRs及補體複合蛋白中之每一者的不同結合規定。雖然IgG1及IgG3結合相對較強，但IgG2及IgG4對Fc受體之親和力低得多，且不引發高程度之ADCC。IgG1亦對補體複合蛋白具有較高親和力，而IgG2、IgG3及IgG4引起之CDC低得多。
抗CXCR4抗體之ADCC(抗體依賴性細胞毒性)活性用cytoTox 96非放射性細胞毒性分析套組(Promega,Madison WI)測定。在分析前一天，表現CXCR4之人類腫瘤細胞以10,000個細胞接種。供體PBMC細胞經由Ficoll梯度分離且在37℃下在離體培養基中培養隔夜。第二天，添加10或20μg/mL抗體至孔中，添加或不添加含1000,000個PBMC細胞(E：T=100：1)之RPMI+5% FBS。隨後培養盤在37℃下培育4小時。在3.5個小時之時間點，添加20μL溶解溶液至僅含標靶細胞之孔中。在8000rpm下旋轉培養盤3分鐘之後，將50μL上清液轉移至另一培養盤。隨後添加50μl受質至每一孔中且培養盤在室溫下在黑暗中培育30分鐘。藉由添加50μL停止溶液至每一孔來停止反應。隨後用 分光光度計(Molecular Devices)在490nm下讀取培養盤。特異性溶解百分比(%)按下式計算：特異性溶解%=(處理LDH釋放-標靶細胞自發LDH釋放-效應細胞自發LDH釋放)/(標靶細胞最大LDH釋放-標靶細胞自發LDH釋放)×100
抗CXCR4抗體之CDC(抗體依賴性細胞毒性)活性用cytoTox 96非放射性細胞毒性分析套組(Promega,Madison WI)測定。在分析前一天，表現CXCR4之人類腫瘤細胞以10,000個細胞接種。第二天，添加5-20μg/mL各Ab至僅細胞或具有2.5%、10%或20%供體AB補體(來自Innovative Biotech或Sigma)之細胞中。培養盤顯影且類似於ADCC分析來分析特異性溶解。
在表現CXCR4之Ramos(NHL)或MOLT-4(人類T細胞白血病)細胞中，使用20μg/mL(圖4A)或10μg/mL(圖4C)抗體加100：1(效應：標靶)比率之正常供體PBMC細胞進行ADCC分析。培育4小時之後，作為嵌合hIgG1在Ramos(NHL)細胞上產生之抗人類CXCR4小鼠Ab 12A11、6B6及3G10(圖4A)或MOLT-4細胞上之人類化3G10抗體(圖4C)的ADCC活性為明顯的。與MOLT-4細胞上m3G10-hIgG4亞型的約20%細胞溶解相比，自m3G10-hIgG1處理見到約80%細胞溶解(圖4B)。
自表現CXCR4之Ramos細胞中20μg/mL嵌合小鼠12A11、6B6及3G10-hIgG1抗體(圖4D)及Daudi(NHL)細胞上5μg/mL人類化抗體(圖4F)之處理觀測到CDC活性。在IgG1骨架中5μg/mL抗CXCR4 3G10下偵測到最大20%-30%特異性溶解活性，類似於Daudi細胞上之陽性對照抗體Rituxan，而hIgG4格式中之3G10未顯示CDC活性(圖4E)。
實例6 抗CXCR4抗體對SDF-1誘發之鈣流動的抑制
SDF-1(配體)結合於CXCR4受體時，觸發鈣流動反應。作為 CXCR4 Ab之功能性拮抗活性的證據-抗人類CXCR4抗體抑制SDF-1誘發之鈣流動的能力，將人類T細胞白血病(Jurkat)細胞與Fluo-NW鈣分析套組(Molecular Probes/life technologies)結合使用。將細胞在含有10%胎牛血清、1%麩醯胺酸之RPMI 1640培養基中在37℃下在CO2培育箱中培養至亞匯合。在分析當天，將細胞於25μl分析緩衝液中以每孔70,000個細胞塗鋪於黑色透明底部之384孔培養盤中。隨後添加套組分析染料至培養盤，每孔25μl，在室溫下110分鐘，避光。針對各抗人類CXCR4抗體，在Fluo-NW Ca分析套組緩衝液中製備11點之1：3連續稀釋液，產生500nM至8pM之濃度範圍。將細胞與抗體一起在室溫下培育20分鐘。隨後用SDF-1α(Invitrogen)以8nM之最終濃度刺激細胞。隨後使用FLIPR Tetra(Molecular Devices)量測鈣流動，歷時95秒。陽性對照由在SDF-1α存在下之細胞及無抗體處理組成。自不含SDF-1α且無抗體處理之細胞量測基線。藉由螢光信號隨時間之發展，量測鈣之SDF-1α誘發。使用GraphPad Prism軟體輸出及繪製數據，且使用具有S形劑量反應公式之非線性曲線擬合計算EC50值。所得到之抗人類CXCR4抗體對鈣流動之抑制展示在圖5中。抗體3G10、6B6及12A11抑制SDF-1α誘發之鈣流動，其中抑制IC50分別為1.555nM、1.418nM及27.07nM(表10)。在鈣流動功能分析中評估之人類化CXCR4抗體之IC50概述於表11(平均n=3獨立實驗/抗體)。概言之，人類化CXCR4抗體之效能類似於此分析中嵌合m3G10抗體之效能。
實例7 基於循環AMP(cAMP)細胞之功能分析中的CXCR4抗體活性
在CXCL12(配體)結合於CXCR4受體時，已知cAMP受抑制。作為CXCR4 Ab之拮抗活性之證據，使用經人類CXCR4轉染之CHO-K1細胞(購自DiscoveRx,Fremont,CA)進行cAMP分析。cAMP Hunter eXpress GPCR分析套組(DiscoveRx)用於執行該分析。在不存在CXCR4抗體下，用CXCR4配體CXCL12處理抑制cAMP產生。在用CXCR4抗體處理後，此抑制消除，且增加cAMP產生。此反應EC50展示在表12中。概言之，所有測試之CXCR4抗體在此分析中均具有類似的有效活性，在24.3至45.6nM範圍內。此研究證實小鼠(嵌合)3G10及人類化3G10 CXCR4抗體在cAMP功能分析中可競爭及阻斷CXCR4配體活性。
實例8 抗CXCR4抗體對細胞死亡之誘發
檢測抗CXCR4抗體在人類非霍奇金氏淋巴瘤Ramos細胞株中誘發細胞死亡之能力。將細胞在含有10%胎牛血清及2nM麩醯胺酸之RPMI 1640培養基中在37℃下在CO2培育箱中培養至亞匯合。細胞在48孔盤中生長培養基中以2.5×106個細胞/毫升接種。將在PBS中稀釋至指示濃度之抗CXCR4抗體添加至細胞中且在37℃下培育24小時。藉由在LSRII流動式細胞測量儀(BD Biosciences)中量測之磷脂結合蛋白V-PE 及碘化丙錠(PI)螢光信號來量測細胞死亡。藉由將磷脂結合蛋白V+/PI+(後)群體與磷脂結合蛋白V+/PI-(早期)群體相加，確定總體細胞死亡。
圖6A之結果顯示6B6及3G10抗人類CXCR4抗體能夠在Ramos細胞中以劑量依賴性方式誘發細胞死亡。在最高測試濃度100nM下，3G10及6B6引起>70%細胞死亡。此作用超過陽性對照星形孢菌素(Staurosporin，STS)，其為一種已知之有效細胞死亡誘發劑(約60%)。在此分析中未處理細胞顯示約30%細胞死亡。抗CXCR4 12A11抗體在測試條件下不能誘發細胞死亡。當在Raji非霍奇金氏淋巴瘤細胞上測試此等抗體之活性時觀測到類似結果。
在類似研究中，單一鏈(Fab)及二價F(ab)2'自3G10抗體產生。Fab為單鏈抗體(單價)且含有作為抗原結合位點一部分之免疫球蛋白可變區及第一免疫球蛋白恆定區。藉由用蛋白分解酶木瓜蛋白酶消化3G10抗體來獲得此片段。藉由胃蛋白酶消化移除大多數Fc區同時使一些鉸鏈區完整，來產生F(ab')2。F(ab')2片段具有兩個藉由二硫鍵連接在一起之抗原結合Fab部分且因此為二價。Fab及F(ab')2與二價全長3G10抗體並排測試其誘發Ramos細胞之細胞死亡的能力。圖6B上展示之結果表明誘發細胞死亡之能力為二價依賴性的，其中完整抗體(3G10)及F(ab')2抗體能夠誘發細胞死亡，而3G10 Fab對細胞死亡之作用非常有限。
實例9 活體內抗CXCR4抗體對非霍奇金氏淋巴瘤實體腫瘤生長的抑制
認為SDF-1/CXCR4信號傳導在腫瘤發展之多個階段，包括腫瘤生長、血管生成、侵入及轉移中起重要作用。為評估抗人類CXCR4Ab抑制腫瘤生長之能力，採用使用雌性4-6週齡之CB17 SCID米色小鼠(Jackson Laboratories)及皮下植入之人類非霍奇金氏淋巴瘤Ramos細 胞的腫瘤異種移植模型。細胞在含有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中在37℃下在5% CO2培育箱中培養。在此研究中，5×106個細胞植入各小鼠之右後側腹區中且呈實體腫瘤生長至約175mm3之平均尺寸體積，體積由式(體積=長度×寬度2)/2算出。隨後小鼠隨機化在4個不同處理組中，每組n=10隻動物。將各組小鼠用抗體於無菌PBS溶液中之靜脈內(靜脈內)注射液處理：(i)同型對照Ab(15mg/kg)；(ii)3G10(15mg/kg)；(iii)6B6(15mg/kg)；及(iv)12A11(15mg/kg)。一週給與動物抗體一次，歷時3週，總共3劑。在研究持續時間內，腫瘤體積藉由測徑規一週量測一次至三次。圖7上呈現實驗結果。結果表明與同型對照抗體相比，所有3種測試之抗CXCR4抗體均顯著抑制腫瘤生長。結果表明抗CXCR4抗體能夠在活體內抑制已長成之實體腫瘤之生長。在停止給與抗體之後此腫瘤生長抑制作用持續長時間(42天)。所有三種測試之抗CXCR4抗體的活性在此實體腫瘤模型中相當。圖7。
實例10 在小鼠全身性非霍奇金氏淋巴瘤細胞模型中抗CXCR4抗體增加存活時間及降低腫瘤負荷
使用Raji非霍奇金氏淋巴瘤細胞，在血液淋巴瘤模型中進一步研究抗CXCR4抗體之抗腫瘤活性。此研究中所用之Raji細胞經螢光素酶基因(LUC)轉染以容許隨時間「活體內」監測腫瘤負荷。細胞在含有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中在37℃下在5% CO2培育箱中培養。模型藉由將1×106個Raji-LUC細胞經尾靜脈注射至雌性6-8週齡SCID米色小鼠(來自Charles River Laoratories)中來建立。在第0天(植入當天)，Raji-LUC細胞存在於肺中，表明所有動物中準確靜脈內注射腫瘤細胞。細胞植入後一天，基於肺生物發光之存在，小鼠分配至處理組(每組10隻動物)。將小鼠用含10mg/kg之同型對照抗體3G10、 6B6及12A11之無菌PBS溶液一週腹膜內(腹膜內)處理一次，直至第67天。藉由生物發光成像，使用Xenogen IVIS 200成像系統監測腫瘤負荷。在腹部位置每5天對小鼠成像，螢光素以15mg/mL經腹膜內傳遞，注射200μl，且使用Xenogen Living Image測定整個身體生物發光。當小鼠開始展示後肢麻痹或達到其他人類終點時，將其處死。在終點時評估腫瘤負荷(藉由生物發光測定)與存活。
圖8A及8B展示此研究之生物發光結果。腫瘤負荷之降低藉由生物發光水準隨時間之降低來顯示。圖8A展示研究第0天(植入物基線)、第15天及第25天各組4-5隻動物之代表性成像。如藉由發光水準量測，所有三種抗CXCR4抗體顯著降低腫瘤負荷。圖8B展示在此模型中，相對於同型對照抗體，用3G10、6B6及12A11抗體處理具有可比較的TGI活性。
圖8C中所展示之存活曲線說明與同型對照抗體相比，抗人類CXCR4抗體3G10、6B6及12A11在全身性植入Raji-LUC細胞之動物之存活中具有極顯著作用。雖然同型對照處理之動物顯示18天之中位存活，但用抗CXCR4抗體處理之動物在研究終止前未達至中位存活。所有3種測試之抗CXCR4抗體之作用為相當的，其間無統計差異。抗CXCR4抗體處理之動物的存活良好持續，超出第67天-投與最後抗體劑量時。
實例11 在小鼠全身性急性骨髓白血病(AML)細胞模型中抗CXCR4抗體增加存活時間及降低腫瘤負荷
使用AML之散播性/全身性靜脈內模型，測試抗CXCR4抗體6B6增加NSG小鼠之存活及減少其腫瘤負荷之能力。人類AML癌症細胞株MV4-11經螢光素酶基因(MV4-11-LUC)轉導以容許「活體內」監測隨時間之腫瘤負荷。將細胞在含有10%胎牛血清及1μg/mL用於螢光素 酶表現選擇之嘌呤黴素之IMDM培養基中在37℃下在5% CO2培育箱中培養。向4-6週齡NSG雌性小鼠(來自Jackson Laboratories)經靜脈內注射MV4-11-LUC AML細胞(1×106個/動物)。
在細胞植入後第13天，基於總身體生物發光強度，將小鼠隨機化至三個處理組(每組10隻動物)。在第13天(同型對照及抗CXCR4 6B6抗體)及第20天(抗CXCR4 6B6抗體)，開始於無菌PBS溶液中10mg/kg之每週皮下(s.c.)抗體處理，如圖中所指示(第13天；第20天)。使用Xenogen IVIS 200成像系統評估腫瘤負荷。每7天在腹部位置使小鼠成像且使用Xenogen Living Image軟體測定整個身體生物發光。當小鼠開始展示後肢麻痹或達到其他人類終點時，將其處死。在終點時評估腫瘤負荷(藉由生物發光測定)與存活。對在研究第35天收集之血液樣品監測小鼠(每組n=10)周邊血液(PB)中循環之人類AML細胞數目。藉由用抗人類CD45及抗人類CD33抗體(來自BD Biosciences)進行流動式細胞測量術染色，AML CD45及CD33標記物用於確定循環之人類AML細胞百分比。
圖9A展示此研究(第20天至第41天)之5隻動物/處理組的代表性生物發光成像。腫瘤負荷之降低藉由生物發光水準隨時間之降低來顯示。更早開始(第13天)之抗CXCR4 6B6抗體之腫瘤負荷抑制與後一週(第20天)開始時相比更顯著。與同型對照抗體相比，6B6抗CXCR4抗體顯著降低兩個處理組中之腫瘤負荷，表明抗CXCR4抗體有效抑制人類AML之分期散播性小鼠模型中之腫瘤負荷。
圖9B中所展示之存活曲線說明與同型對照抗體相比，抗人類CXCR4抗體6B6在全身性植入MV4-11-LUC AML細胞之動物之存活中具有顯著作用。雖然同型對照之處理動物顯示40天之中位存活，但在第13天及第20天用抗CXCR4 6B6抗體處理之動物分別具有53天及61天之中位存活。藉由Mantel-Cox檢驗，此等差異為統計顯著(p<0.05)。
圖9C展示在研究第35天，與同型對照處理之動物相比，在用抗CXCR4 6B6抗體處理之動物中人類AML細胞數目顯著降低。
實例12 在小鼠全身性慢性淋巴細胞性白血病腫瘤模型中抗CXCR4抗體增加存活
CXCR4抗體之抗腫瘤活性在散播性靜脈內慢性淋巴細胞性白血病(CLL)模型中進一步研究。經穩定轉染以表現螢光素酶基因之人類JVM-13腫瘤細胞在含有10%胎牛血清及0.25mg/mL嘌呤黴素之RPMI 1640培養基中在37℃下在5% CO2培育箱中培養。藉由將1×106個JVM-13-Luc細胞經尾靜脈注射至雌性6-8週齡SCID米色小鼠中來建立模型。基於生物發光(BLI)讀數，在細胞植入後第21天，小鼠分配至處理組(每組10隻動物)。用同型對照抗體處理小鼠且3G10以於無菌PBS溶液中10mg/kg皮下(s.c.)給與，一週一次。利妥昔單抗(一種批准用於治療CLL患者之抗CD20 Ab)用作陽性對照。利妥昔單抗以於無菌PBS溶液中10mg/kg皮下給與，一週一次。使用Xenogen IVIS 200成像系統評估腫瘤負荷。每7天在腹部位置使小鼠成像且使用Xenogen Living Image軟體測定整個身體生物發光。當小鼠開始展示後肢麻痹或達到其他人類終點時，將其處死。在終點時評估腫瘤負荷(藉由生物發光測定)與存活。
圖10A展示在研究第28、35、42、49及56天，處理各組中之小鼠的代表性螢光素酶活性成像。如藉由隨時間之發光水準量測，與同型對照抗體相比，用3G10處理顯著降低大骨中之JVM-13-Luc腫瘤負荷。與同型對照抗體相比，用利妥昔單抗處理亦顯著減少腫瘤負荷。
圖10B展示此研究之卡普蘭-梅耶(Kaplan-Meyer)存活曲線。與同型對照Ab相比，觀測到3G10及利妥昔單抗抗體使存活顯著增加(p<0.0001)。雖然同型對照抗體處理之動物顯示32.5天之中位存活， 但用Rituxan處理之動物顯示45天之中位存活且用3G10處理之動物在第60天前未達至中位存活。此研究結果表明抗CXCR4抗體在人類CLL之分期散播性小鼠模型中有效抑制腫瘤負荷。
實例13 在活體內人類化抗CXCR4抗體抑制Ramos非霍奇金氏淋巴瘤之腫瘤生長
為評估人類化CXCR4 Ab抑制腫瘤生長之能力，採用使用雌性4-6週齡之CB17.cg-Prkdc SCID米色小鼠(Charles River)及皮下植入之人類非霍奇金氏淋巴瘤Ramos細胞的腫瘤異種移植模型。細胞在含有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中在37℃下在5% CO2培育箱中培養。在此研究中，5×106個細胞植入各小鼠之右後側腹區中且呈實體腫瘤生長至約350mm3之平均尺寸體積，體積由式(體積=長度×寬度2)/2算出。隨後小鼠隨機化在7個不同處理組中，每組n=10隻動物。各組小鼠用含10mg/kg各抗體之無菌PBS溶液皮下(s.c.)處理：(同型對照抗體；m3G10；h3G10.A57.WT；h3G10.2.37.2.72；h3G10.A57.A58；h3G10.1.91.A58A；h3G10.1.91.A58B)。一週給與動物抗體一次，歷時2週，總共2劑。在研究持續時間內，腫瘤體積藉由測徑規一週量測兩次。圖11上呈現實驗結果。結果表明與同型對照抗體相比，所有測試之抗CXCR4抗體均顯著抑制腫瘤生長。結果表明測試之人類化CXCR4抗體具有類似於嵌合m3G10抗體之功效。在停止抗體給與(第7天)之後，腫瘤生長抑制作用持續若干天。
實例14 在小鼠全身性多發性骨髓瘤(MM)模型中人類化抗CXCR4抗體增加存活時間及降低腫瘤負荷
使用MM之散播性/全身性靜脈內模型，測試人類化抗CXCR4抗體h3G10.1.91.A58B增加NSG小鼠之存活及減少腫瘤負荷的能力。人 類MM癌症細胞株OPM-2經螢光素酶基因(OPM-2-LUC)轉導以容許「活體內」監測隨時間之腫瘤負荷。細胞在含有10%胎牛血清及0.5μg/mL用於螢光素酶表現選擇之嘌呤黴素的RPMI 1640培養基中在37℃下在5% CO2培育箱中培養。向4-6週齡NSG雌性小鼠靜脈內注射OPM-2-Luc細胞(5×106個/動物)。
在細胞植入後第8天，基於總身體生物發光強度，將小鼠隨機化至三個處理組(每組10隻動物)。開始於無菌PBS溶液中10mg/kg之每週皮下(s.c.)抗體處理且進行5週。美法侖(批准用於治療多發性骨髓瘤患者之藥物之一)以1mg/kg給與，一週兩次，進行3週。使用Xenogen IVIS 200成像系統評估腫瘤負荷。每7天在腹部位置使小鼠成像且使用Xenogen Living Image軟體測定整個身體生物發光。當小鼠開始展示後肢麻痹或達到其他人類終點時，將其處死。在終點時評估腫瘤負荷(藉由生物發光測定)與存活。
圖12A及12B展示此研究中之生物發光(螢光素酶活性)結果。腫瘤負荷之降低藉由生物發光水準隨時間之降低來顯示。圖12A展示此研究之5隻動物/治療組的代表性生物發光成像。圖12B展示與同型對照抗體相比，用CXCR4抗體h3G10.1.91.A58B處理隨時間顯著抑制腫瘤生長(第30天p<0.0001)，表明抗CXCR4抗體在人類多發性骨髓瘤之分期散播性異種移植模型中有效抑制腫瘤負荷。圖12C中所展示之此研究之存活曲線說明與同型對照抗體相比，抗CXCR4抗體h3G10.1.91.A58B在全身性植入OPM-2-Luc MM細胞之動物之存活中具有顯著作用。雖然同型對照及美法侖處理之動物分別顯示33.5及36天之中位存活，但用h3G10.1.91.A58B CXCR4抗體處理之動物具有未定界之中位存活，在研究第50天未觀測到死亡。表13。藉由Mantel-Cox檢驗，此等差異為統計顯著的(p<0.0001)。
表13
實例15 CXCR4陽性細胞中抗CXCR4 ADC之細胞毒性
抗CXCR4抗體(例如3G10)表現為人類IgG1亞型且經含有麩醯胺酸之轉麩醯胺酸酶(「Q」)標籤TG6(SEQ ID NO：91(LLQGA))工程改造且結合AcLys-vc-PABC-MMAD(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基-MMAD)及AcLys-vc-PABC-0101((2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。轉麩醯胺酸酶標籤在抗體之重鏈C端工程改造。隨後抗CXCR4抗體與細胞毒性劑MMAD或0101之結合經由在特異性位點(例如抗體重鏈之羧基端)上帶有含有麩醯胺酸之標籤的抗CXCR4抗體與有效負載(例如MMAD或0101)之含胺衍生物之間的微生物轉麩醯胺酸酶催化之轉醯胺反應來實現。在一些情況下，羧基端(根據EU編號方案位置447)野生型胺基酸離胺酸缺失且經Q-標籤置換。在其他情況下，位置222之野生型胺基酸離胺酸(根據EU編號方案)經胺基酸精胺酸置換(「K222R」)。K222R取代提供產生更均質抗體及有效負載結合物之顯著作用，及/或使抗體與有效負載之間更好地進行分子間交聯。在轉醯胺反應中，含有麩醯胺酸之標籤上的麩醯胺酸用作醯基供體，且含胺化合物用作醯基受體(胺供體)。經純化之抗CXCR4抗體與過量醯基受體在茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)轉麩醯胺酸酶(ACTIVATM，Ajinomoto,Japan)存在下在150-900mM NaCl及25mM MES、HEPES[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸]或Tris HCl緩衝液中在6.2-8.8範圍內之pH值下一起培育。反應條件針對個別醯基受體衍生物調整。在室溫下培育2.5 小時後，使用熟習此項技術者已知之標準親和層析法(諸如來自GE Healthcare之商業親和層析法)，在MabSelect樹脂(GE Healthcare,Waukesha,WI)上純化抗體-藥物結合物。
隨後在處理之前24小時，將表現CXCR4之細胞以每孔4000-8,000個細胞接種在白壁透明底之培養盤上。隨後用4倍連續稀釋之抗體-藥物結合物處理細胞，一式三份。在處理後96小時，藉由CellTiter-Glo®發光細胞活力分析96(Promega,Madison WI)測定細胞活力。相對細胞活力作為未處理對照之百分比確定。隨後計算IC50。經由轉麩醯胺酸酶標籤結合於MMAD或0101之抗CXCR4抗體在表現CXCR4之細胞中發揮有效的殺死細胞活性。
實例16 CXCR4-ADC之活體內抗腫瘤活性
在Ramos(NHL)及HPB-ALL(T-ALL)之異種移植模型中評估CXCR4 ADC之活體內抗腫瘤功效。如實例9中所描述，向雌性4-6週齡CB17 SCID小鼠(Jackson Laboratories)皮下植入5×106個Ramos (NHL)，直至約500mm3之平均尺寸體積，平均尺寸體積由式(體積=長度×寬度2)/2算出。將10×106個HPB-ALL細胞植入雌性4-6週齡CB17 SCID小鼠中，直至平均腫瘤尺寸體積亦達至約500mm3。在Ramos模型中，用6.0mg/kg陰性對照ADC(陰性對照-TG6-vc0101)或1.5、3.0或6.0mg/kg之CXCR4 ADC(3G10-TG6-vc0101及6B6-TG6-vc0101)的單劑量靜脈內(靜脈內)注射液處理各組小鼠。在研究持續時間內，腫瘤體積藉由測徑規一週量測一次。圖13A上呈現實驗結果。結果表明兩種CXCR4 ADC在劑量3mg/kg下誘發腫瘤消退。對照ADC對腫瘤生長無作用。在HPB-ALL模型中，1.5mg/kg 3G10-TG6-vc0101之單劑量注射液足以誘發腫瘤消退(圖13B)。
<110> 美商輝瑞大藥廠 何維賢 劉淑惠 弗拉維亞 莫瑟爾 帕納瑟堤
<120> 抗CXCR4抗體及抗體-藥物結合物
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<223> 合成構築體
<400> 83
<210> 84
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 84
<210> 85
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 85
<210> 86
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 86
<210> 87
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 87
<210> 88
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 90
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 92
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 98
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 101
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> G或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> A、G、P或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> A、G、K、P或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K、G或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> K或不存在
<400> 102
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何天然存在之胺基酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(8)
<223> 任何天然存在之胺基酸或不存在
<400> 103
<210> 104
<211> 1691
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
<210> 105
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
<210> 106
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> G或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> G、F、K、V、T、L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> E或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> T或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> W或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> D或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> K、T或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> D或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> T或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(89)
<223> R或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(90)
<223> A或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> K或R
<400> 106
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 107
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 108
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 109
<210> 110
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 110
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 111
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 112
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 113
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 114
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 115
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 116
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 117
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 118
<210> 119
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 119
<210> 120
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 120
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 121
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 122
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 123
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 124
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 125
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 126
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 127
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 128
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 129
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 130
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 131
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 132
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 133
<210> 134
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 134
<210> 135
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 135
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 136
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 137
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 138
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 139
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 140
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 141
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 142
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 143
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 144
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 145
<210> 146
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 146
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 147
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 148
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 149
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 150
<210> 151
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> R或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> S或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> W、N或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> H或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> T或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> A、L、N或M
<400> 151
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> G或E
<400> 152
<210> 153
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> N或R
<400> 153
<210> 154
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 154
<210> 155
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 155
<210> 156
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 156
<210> 157
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> V或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G、F、K、V、T、L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> E或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> T或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> W或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> D或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> K、T或R
<400> 157
<210> 158
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 158
<210> 159
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 159
<210> 160
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 160
<210> 161
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 161
<210> 162
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 162
<210> 163
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 163
<210> 164
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 164
<210> 165
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 165
<210> 166
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 166
<210> 167
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 167
<210> 168
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 168
<210> 169
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 169
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 170
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 171
<210> 172
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 172
<210> 173
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 173

Claims (54)

  1. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)且包含：a)重鏈可變(VH)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121及122組成之群的VH CDR1；(ii)選自由SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156及130組成之群的VH CDR2；及(iii)選自由SEQ ID NO：112及120組成之群的VH CDR3；及/或b)輕鏈可變(VL)區，其包含(i)選自由SEQ ID NO：144、131、135、138、141、142、143、146、147、148、149、150及151組成之群的VL CDR1；(ii)選自由145、132、136及152組成之群的VL CDR2；及(iii)選自由SEQ ID NO：139、133、137、140及153組成之群的VL CDR3。
  2. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於CXCR4且包含：a)重鏈可變(VH)區，其包含選自由以下組成之群的互補決定區：(i)包含闡述為SEQ ID NO：107、113、114、108、109、115、116、117、121或122之序列的VH CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：162、128、110、111、118、119、154、123、158、124、159、125、160、126、161、127、163、164、165、166、167、168、155、129、156或130之序列的VH CDR2；及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：112或120之序列的VH CDR3；及/或b)輕鏈可變(VL)區，其包含選自由以下組成之群的互補決定區：(i)包含闡述為SEQ ID NO：144、131、135、138、141、 142、143、146、147、148、149、150或151之序列的VL CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：145、132、136或152之序列的VL CDR2；及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：139、133、137、140或153之序列的VL CDR3。
  3. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於CXCR4且包含：a)輕鏈可變(VL)區，其包含(i)包含序列X1SX2X3SLFNSX4X5RKNYLX6之VL CDR1，其中X1為R或K；X2為S或A；X3為W、N或Q；X4為H或R；X5為T或F；及/或X6為A、L、N或M(SEQ ID NO：151)；(ii)包含序列WASARX1S之VL CDR2，其中X1為G或E(SEQ ID NO：152)；及(iii)包含序列KQSFX1LRT之VL CDR3，其中X1為N或R(SEQ ID NO：153)；及/或b)重鏈可變(VH)區，其包含(i)包含闡述為SEQ ID NO：107、108、109、113或114之序列的VH CDR1；(ii)包含闡述為SEQ ID NO：157之序列的VH CDR2；及(iii)包含闡述為SEQ ID NO：112之序列的VH CDR3。
  4. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於CXCR4且包含：重鏈可變(VH)區序列，其包含：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVX1FIRHKX2NX3X4TX5EYSTX6 X7 X8GRFTISRDX9SKNX10LYLQMNSLX11X12EDTAVYYCAX13DLPGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：106)，其中X1為G或S；X2為V或A；X3為G、F、K、V、T、L或I；X4為E或Y；X5為T或R；X6為W或S；X7為D或V；X8為K、T或R；X9為D或N；X10為T或S；X11為R或K；X12為A或T；及/或X13為K或R。
  5. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)，其係選自由以下組成之群： a)具有SEQ ID NO：107、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：162或128之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：115、116、117、121或122之VH CDR1、SEQ ID NO：118或119之VH CDR2及SEQ ID NO：120之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：135之VL CDR1、SEQ ID NO：136之VL CDR2及SEQ ID NO：137之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：110或111之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：131之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：133之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：154或123之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及e)具有SEQ ID NO：107、108、109、113或114之VH CDR1、SEQ ID NO：157之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：151之VL CDR1、SEQ ID NO：152之VL CDR2及SEQ ID NO：153之VL CDR3的VL區。
  6. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區； b)具有SEQ ID NO：115之VH CDR1、SEQ ID NO：118之VH CDR2及SEQ ID NO：120之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：135之VL CDR1、SEQ ID NO：136之VL CDR2及SEQ ID NO：137之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：110之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：131之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：133之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：154之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：157之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：151之VL CDR1、SEQ ID NO：152之VL CDR2及SEQ ID NO：153之VL CDR3的VL區。
  7. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)，其係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區； c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：150之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：141之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；f)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：147之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；g)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：159之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；h)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：160之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；i)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：161之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO： 138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；j)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；k)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；l)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：164之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；m)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：165之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；o)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：166之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；p)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：167之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區； q)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；r)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；s)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；t)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；u)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；v)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及w)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO： 144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區。
  8. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含三個闡述為SEQ ID NO：107、162及112之CDR的重鏈可變(VH)區。
  9. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR的輕鏈可變(VL)區。
  10. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：a)包含三個闡述為SEQ ID NO：107、162及112之CDR的重鏈可變(VH)區；及b)包含三個闡述為SEQ ID NO：144、145及139之CDR的輕鏈可變(VL)區。
  11. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含來自SEQ ID NO：33之VH區之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3的重鏈可變(VH)區。
  12. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：包含來自SEQ ID NO：73之VL區之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的輕鏈可變(VL)區。
  13. 如請求項1至4中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：a)包含來自SEQ ID NO：33之VH區之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3的重鏈可變(VH)區；及b)包含來自SEQ ID NO：73之VL區之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3的輕鏈可變(VL)區。
  14. 如請求項6之分離之抗體或其抗原結合片段，其係選自由以下組成之群：a)包含SEQ ID NO：33之VH區及SEQ ID NO：73之VL區的抗體 或其抗原結合片段；b)包含SEQ ID NO：13之VH區及SEQ ID NO：15之VL區的抗體或其抗原結合片段；c)包含SEQ ID NO：5之VH區及SEQ ID NO：7之VL區的抗體或其抗原結合片段；d)包含SEQ ID NO：21之VH區及SEQ ID NO：47之VL區的抗體或其抗原結合片段；及e)包含SEQ ID NO：106之VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區的抗體或其抗原結合片段。
  15. 如請求項14之分離之抗體或其抗原片段，其中該抗體或其抗原片段包含具有與SEQ ID NO：33至少95%一致之胺基酸序列的重鏈可變區及具有與SEQ ID NO：73至少95%一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  16. 如請求項14之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：a)SEQ ID NO：33之重鏈可變(VH)區；及/或b)SEQ ID NO：73之輕鏈可變(VL)區。
  17. 如請求項8之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含由具有ATCC寄存編號PTA-121353之表現載體產生的重鏈可變(VH)區。
  18. 如請求項9之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含由具有ATCC寄存編號PTA-121354之表現載體產生的輕鏈可變(VL)區。
  19. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於趨化激素受體4(CXCR4)，其係選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的重鏈可變(VH)區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的輕鏈可變(VL)區；b)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；c)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：150之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；d)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：141之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；e)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；f)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：147之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；g)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：159之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；h)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：160之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；i)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：161之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；j)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；k)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；l)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：164之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；m)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：165之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；n)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：166之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140 之VL CDR3的VL區；o)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：167之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；p)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；q)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：168之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：138之VL CDR1、SEQ ID NO：132之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；r)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區；s)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：158之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；t)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；u)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：163之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區；及v)具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：140之VL CDR3的VL區。
  20. 一種結合CXCR4之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與如請求項1至19中任一項之抗體或其抗原結合片段競爭結合於CXCR4及/或結合於與如請求項1至19中任一項之抗體或其抗原結合片段相同的CXCR4的抗原決定基。
  21. 如請求項20之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含具有SEQ ID NO：107之VH CDR1、SEQ ID NO：162之VH CDR2及SEQ ID NO：112之VH CDR3的VH區及具有SEQ ID NO：144之VL CDR1、SEQ ID NO：145之VL CDR2及SEQ ID NO：139之VL CDR3的VL區。
  22. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人類化、嵌合、CDR移植或重組人類抗體。
  23. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體未犬科化或貓科化。
  24. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含在特定位點經工程改造之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤。
  25. 一種抗體-藥物結合物，其具有下式：Ab-(T-L-D)，其中：a)Ab為結合於趨化激素受體4(CXCR4)之抗體或其抗原結合 片段；b)T為可視情況包括之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤；c)L為連接子；且d)D為藥物。
  26. 如請求項25之抗體-藥物結合物，其中Ab係選自由以下組成之群：a)包含含有SEQ ID NO：107、162及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：144、145及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；b)包含含有SEQ ID NO：115、118及120之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：135、136及137之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；c)包含含有SEQ ID NO：107、110及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：131、132及133之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；d)包含含有SEQ ID NO：107、154及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：138、132及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；e)包含含有SEQ ID NO：107、157及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：151、152及153之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段；f)包含SEQ ID NO：33之VH區及SEQ ID NO：73之VL區的抗體或其抗原結合片段；g)包含SEQ ID NO：13之VH區及SEQ ID NO：15之VL區的抗體或其抗原結合片段；h)包含SEQ ID NO：5之VH區及SEQ ID NO：7之VL區的抗體或 其抗原結合片段；及i)包含SEQ ID NO：21之VH區及SEQ ID NO：47之VL區的抗體或其抗原結合片段。
  27. 如請求項25之抗體-藥物結合物，其中Ab為人類化、嵌合、CDR移植或重組人類抗體或其抗原結合片段。
  28. 如請求項25之抗體-藥物結合物，其中T係選自由SEQ ID NO：171、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、172、173、102、103及LLQ組成之群。
  29. 如請求項25之抗體-藥物結合物，其中T係選自由SEQ ID NO：91、92及102中之任一者組成之群。
  30. 如請求項25之抗體-藥物結合物，其中L係選自由乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC)、胺基PEG6-丙醯基、順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(vc)及順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)組成之群。
  31. 如請求項29之抗體-藥物結合物，其中L為乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC)。
  32. 如請求項25之抗體或抗原結合片段之抗體-藥物結合物，其中該抗體或該抗原結合片段結合於藥物，其中該D係選自由以下組成之群：細胞毒性劑、免疫調節劑、顯影劑、治療蛋白質、生物聚合物及寡核苷酸。
  33. 如請求項32之抗體-藥物結合物，其中該D為細胞毒性劑。
  34. 如請求項33之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性劑係選自由以下組成之群：蒽環黴素(anthracycline)、奧瑞他汀(auristatin)、喜樹鹼(camptothecin)、考布他汀(combretastain)、海兔毒素(dolastatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、烯二炔(enediyne)、格爾德黴素(geldanamycin)、吲哚啉并-苯并二氮呯二聚體(indolino- benzodiazepine dimer)、美登素(maytansine)、嘌呤黴素(puromycin)、吡咯并苯并二氮呯二聚體(pyrrolobenzodiazepine dimer)、紫杉烷(taxane)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、特吡萊辛(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)、斯考他汀(spliceostatin)、普蘭立德(pladienolide)及卡奇黴素(calicheamicin)。
  35. 如請求項34之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性劑為奧瑞他汀。
  36. 如請求項35之抗體-藥物結合物，其中該奧瑞他汀係選自由以下組成之群：0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基--1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、MMAD(單甲基奧瑞他汀D或單甲基海兔毒素10及8261(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚烷-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。
  37. 如請求項25至36中任一項之抗體-藥物結合物，其中該結合物係選自由以下組成之群：a)Ab-LLQGA(SEQ ID NO：91)-(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(AcLys-VC-PABC))-0101；b)Ab-LLQGA(SEQ ID NO：91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD；c)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：102)-(AcLys-VC-PABC)-0101；d)Ab-LLQX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD； e)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO：92)-(AcLys-VC-PABC)-0101；及f)Ab-GGLLQGA(SEQ ID NO：92)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD。
  38. 如請求項37之抗體-藥物結合物，其中Ab為包含含有SEQ ID NO：107、162及112之CDR之VH區及含有SEQ ID NO：144、145及139之CDR之VL區的抗體或其抗原結合片段。
  39. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至24中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項25至38中任一項之結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  40. 一種分離之聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至24中任一項之抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。
  41. 一種載體，其包含如請求項40之聚核苷酸。
  42. 一種分離之宿主細胞，其以重組方式產生如請求項1至24中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  43. 一種產生抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在使該抗體或其抗原結合片段產生之條件下培養如請求項42之宿主細胞，且自該宿主細胞或培養基分離該抗體或其抗原結合片段。
  44. 一種治療個體中與CXCR4功能或表現相關之病症的方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如請求項39之醫藥組合物。
  45. 如請求項44之方法，其中該病症為癌症。
  46. 如請求項45之方法，其中該癌症為血液癌症。
  47. 如請求項45之方法，其中該癌症為B細胞或T細胞惡性病。
  48. 如請求項44之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、多發性骨髓瘤 (MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia，WM)、B細胞淋巴瘤及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
  49. 如請求項45之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨膜癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、頭頸部癌、腎癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌及皮膚癌。
  50. 一種減緩具有表現CXCR4之腫瘤的個體中腫瘤生長或進展的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之如請求項39之醫藥組合物。
  51. 一種減少個體中表現CXCR4之癌細胞轉移的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之如請求項39之醫藥組合物。
  52. 一種誘發具有表現CXCR4之腫瘤的個體中腫瘤消退的方法，其包含向有需要之該個體投與有效量之如請求項39之醫藥組合物。
  53. 如請求項1至24中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段或如請求項25至38中任一項之抗體-藥物結合物，其用於偵測、診斷及/或治療與CXCR4表現相關之病症。
  54. 一種如請求項1至24中任一項之分離之抗體或如請求項25至38中任一項之抗體-藥物結合物的用途，其用於製造供治療與CXCR4表現相關之病症的藥劑。
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