KR102042174B1

KR102042174B1 - 인간화 및 친화도 성숙된 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102042174B1
Application number: KR1020130034889A
Authority: KR
Inventors: 이승현; 김경아; 정광호; 송호영
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2019-11-08
Also published as: US9249221B2; US20140294814A1; KR20140119964A

Abstract

항 c-Met 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 의하면, 암을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

인간화 및 친화도 성숙된 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도{Humanized and affinity-matured anti c-Met antibody and uses thereof}

인간화 및 친화도 성숙된 항 c-Met 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

c-Met은 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종 양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로 그 자체가 암유발 유전자이며 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 타겟으로 주목받는 단백질이다.

특히 c-Met은 기존에 알려진 항암제의 작용 기작에서 약물 내성에 관여됨이 알려지면서 더욱 더 개인맞춤형 치료에 중요성이 인식되고 있다. EGFR (ERBB1)을 표적으로 하는 대표적인 항암 치료제인 얼비툭스(Erbitux) 또는 타세바(Tarceva)와 같은 약물은 암 발생 기작과 관련된 신호 전달을 차단함으로써 작동한다. 또한 유방암 치료제로 잘 알려진 허셉틴(Herceptin)은 ERBB2 (HER2)를 표적으로 세포의 증식에 필요한 신호 전달을 차단함으로써 작동한다. 그러나 상기 약물에 대한 내성이 있는 환자 중, c-Met 단백질의 과발현 등으로 항암제의 작동을 피해 세포의 증식을 유도하는 다른 신호 전달 기작이 활성화된다는 연구들이 최근 발표되고 있다. 이러한 이유로 인해, c-Met은 항암제와 관련하여 다수의 제약사들이 주목하고 있는 표적 분자가 되고 있다.

관련 기술은 c-Met의 작용을 저해하는 항체 치료제를 개시하고 있다. 그러나, 상기 관련 기술은, 항체가 원래의 구조를 가진 경우 c-Met 분자들이 이량체화(dimerization)가 되도록 유발함으로써, 암을 유발하는 문제점이 발견되었다.

c-Met의 작용을 저해하는 항체 치료제를 개시하는 다른 관련 기술은 c-Met의 리간드인 HGF c-Met에 결합하지 못하도록 저해하는 기능은 있으나, 항체 자체의 결합에 의해 리간드와 상관없이 c-Met을 이량체화시켜 오히려 암을 유발하는 신호가 전달되도록 하는 효능제(agonist)로 작용하는 부작용이 발견이 되었다.

또 다른 관련 기술은 c-Met의 이량체화를 방지하기 위해 원래는 효능제 (agonist)인 양팔 항체 (two-armed antibody)를 유전자 재조합 방식으로 변형시킨 c-Met에 대한 한팔 길항(one-armed antagonistic) 항체를 개시하고 있으며, 현재 이에 대한 임상시험 단계의 제품 개발이 진행되고 있다. 그러나 상기 관련 기술에서도 상기 항체는 화학요법과 병용치료일 경우에만 효과를 보이며, 항체를 단독으로 처리하는 경우에는 항암 효과가 크지 않은 것으로 확인되었다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, c-Met의 작용을 저해하는 새로운 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 개발이 여전히 요구되고 있다.

본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 5, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열번호 6 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

다른 예는 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

용어, "c-Met" 또는 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

별도의 언급이 없는 한, 항 c-Met 항체는 항체 또는 항원 결합 단편을 의미하는 것으로 사용된다. 상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 21) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 21) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 22 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 22의 아미노산 서열 중 서열번호 24(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 22, 서열번호 23 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 22의 아미노산 서열 중 서열번호 24(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서 제공되는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 5, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열번호 6 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 5, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열번호 6 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 한국 특허공개 제2011-0047698호에 기재된 마우스 항체 AbF46을 인간화 및 친화도 성숙시킨 것이다. 상기 마우스 항체 AbF46의 경쇄 가변 부위(서열번호 20)의 S27E 위치(L1 내 위치), A94 위치 (L3 내 위치), 및 중쇄 가변 부위(서열번호 19)의 M34 위치(H1 내 위치)의 잔기가 트립토판(W; S27E->W), 아르기닌(R; A94->R), 및 이소류신(I; M34->I)로 변이된 경우, 항원에 대한 친화도가 개선되는 것으로 확인되었다. 여기에 더하여, 경쇄 가변 부위의 G27F, N28, L33, S52, S56, 및 중쇄 가변 부위의 T30, S62, K64로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 위치가 다른 아미노산으로 치환된 경우 항원에 대한 친화도가 보다 개선될 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에 있어서 CDR 내의 아미노산 위치는 Kabat 넘버링에 따라서 기재하였다.

항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질에 대한 결합 친화도(Kd)가 1 nM 이하, 예컨대, 0.00001 nM 내지 1 nM, 또는 0.2 nM 이하, 예컨대, 0.00001 nM 내지 0.2 nM일 수 있다.

다른 예는 c-Met 단백질에 상기 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 이와 같이 경쟁적으로 결합하는 항체는 앞서 기술한 SEMA 도메인에 위치하는 에피토프와 3차원 구조상의 인접한 부위를 에피토프로 인식하는 항체일 수 있다. 상기 경쟁적으로 결합하는 항체는 c-Met 단백질과의 결합 친화도(Kd)가 1 nM 이하, 예컨대, 0.00001 nM 내지 1 nM, 또는 0.2 nM 이하, 예컨대, 0.00001 nM 내지 0.2 nM인 것일 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편일 수 있다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역 또는 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 힌지영역(비변형 인간 힌지)을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 25 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 c-Met 관련 질병 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 c-Met 관련 질병 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, c-Met 관련 질병 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 c-Met 관련 질병은 c-Met 발현 또는 과발현에 의하여 유발되는 모든 질병을 의미하는 것으로, 대표적으로 암을 들 수 있다. 상기 암은, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 암 이외에도 c-Met 관련 질병으로 임신성 당뇨 등을 들 수 있다.

상기 약학적 유효량은 목적하는 효과, 예컨대 c-Met 억제 (분해) 효과, c-Met 관련 질병의 예방 또는 치료 효과를 얻기 위하여 필요한 투여량을 의미하는 것으로, 목적하는 효과, 질병 또는 증상의 종류 및 경중, 환자의 상태, 투여 경로, 제형 형태 등에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 이의 약학적 유효량을 포함하는 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 이의 약학적 유효량을 포함하는 약학 조성물의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

상기 항 c-Met 항체 또는 이의 약학적 유효량을 포함하는 약학 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 약학적 유효량을 포함하는 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 c-Met 단백질의 길항제(antagonist) 작용을 하는 것일 수 있다.

용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체를 의미한다. 길항제는 리간드에 대한 수용체의 결합에 의해, 수용체 인산화(phosphorylation)를 감소시키거나, 리간드에 의해 활성화되었던 세포를 무능력화시키거나, 또는 사멸시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 길항제는 수용체-리간드 사이의 상호 작용을 완전히 단절시키거나, 수용체의 3차 구조의 변화, 또는 감소 조절(down regulation)에 의해 상기 상호 작용을 실질적으로 감소시킬 수 있다.

또 다른 예는 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 c-Met 단백질 관련 질병의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 c-Met 단백질 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 c-Met 단백질 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 c-Met 단백질 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

한편, 상기 환자는 인간, 개, 고양이, 마우스, 등과 같은 포유류일 수 있으며, 경우에 따라서는 인간을 제외한 동물일 수 있다.

일 구체예에 따른 항 c-Met 항체 및 이를 포함하는 c-Met 단백질 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 의하면, 관련 질병을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1 및 2는 마우스 AbF46 항체의 경쇄 가변부위와 인간 germ line의 Blast P search 데이터를 보여주는 것이다.
도 3은 인간화된 경쇄 가변 부위의 DNA 및 단백질 서열을 보여준다.
도 4a 및 4b는 마우스 AbF46 항체의 중쇄 가변부위와 인간 germ line의 Blast P search 데이터를 보여주는 것이다.
도 5는 인간화된 중쇄 가변부위의 DNA 및 단백질 서열을 보여준다.
도 6은 H1P1에서 유래하는 Fabs의 항원(c-Met(NP_000236))에 대한 결합 정도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 인간화 Fab의 항원(c-Met(NP_000236))에 대한 결합 정도를 보여주는 그래프이다.
도 8a와 8b는 스크리닝 과정에서의 클론의 CDR 서열을 보여준다.
도 9와 10은 스크리닝된 대표적인 클론으로부터 얻어진 인간화 Fab의 항원(c-Met(NP_000236))에 대한 결합 정도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 조합 라이브러리로부터 스크리닝된 인간화 Fab의 항원(c-Met(NP_000236))에 대한 결합 정도를 보여주는 그래프이다.
도 12는 상기 도 11의 결과에서 선택된 클론의 인간화 Fab의 항원(c-Met(NP_000236))에 대한 결합 정도를 보여주는 그래프이다.
도 13은 인간화 및 친화도 성숙을 통하여 최종 도출된 항체의 CDR 서열을 보여준다.
도 14는 인간화 및 친화도 성숙을 통하여 최종 도출된 항체의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 서열을 보여준다.
도 15는 인간화 및 친화도 성숙을 통하여 최종 도출된 항체의 BrdU assay 에세이 결과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 인간화 및 친화도 성숙을 통하여 최종 도출된 항체의 MKN45 세포 증식 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 17은 인간화 및 친화도 성숙을 통하여 최종 도출된 항체의 Akt 인산화 정도를 보여주는 그래프이다.
도 18은 인간화 및 친화도 성숙을 통하여 최종 도출된 항체의 c-Met 분해 정도를 보여주는 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: c- Met 에 대한 마우스 항체 AbF46 의 생산

(1) 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 쥐에 한마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.

(2) 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 10⁸개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양배지(DMEM)에 들어있는 45 %(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

(3) c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 (2)에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다. 상기 (2)에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 대한민국 서울시 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다.

(4) 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 (3)에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS이 포함된 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖을 세포 침전물에 재현탁시킨 후 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 4℃에 보관하거나 바로 모아서 50 ㎖ 내지 300 ㎖의 배양액으로부터 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다. 상기 얻어진 항체를 AbF46로 명명하였다.

실시예 2: AbF46 가변 부위의 클로닝

아미노산 서열 분석 결과, 상기 실시예 1에서 제작된 항체 AbF46의 경쇄가변(VL) 및 중쇄가변(VH) 부위 및 각 CDR의 아미노산 서열을 다음의 표 1에 나타내었다:

	중쇄	경쇄
가변부위	EVKLVESGGG LVQPGGSLRL SCATSGFTFT DYYMSWVRQP PGKALEWLGF IRNKANGYTT EYSASVKGRF TISRDNSQSI LYLQMDTLRA EDSATYYCAR DNWFAYWGQG TLVTVSA (서열번호 19)	DILMTQSPSS LTVSAGEKVT MSCKSSQSLL ASGNQNNYLA WHQQKPGRSP KMLIIWASTR VSGVPDRFIG SGSGTDFTLT INSVQAEDLA VYYCQQSYSA PLTFGAGTKL ELKRT (서열번호 20)
CDR1	DYYMS (서열번호 31)	KSSQSLLASGNQNNYLA (서열번호 32)
CDR2	FIRNKANGYTTEYSASVKG (서열번호 2)	WASTRVS (서열번호 5)
CDR3	DNWFAY (서열번호 3)	QQSYSAPLT (서열번호 33)

상기의 아미노산 서열 정보를 기반으로 중쇄가변부위와 경쇄가변부위를 코딩하는 단일가닥 DNA를 제작하고, 상기 얻어진 단일가닥 DNA를 인간 kappa 경쇄의 불변부위 및 인간 IgG1의 CH1 부위의 코딩 유전자를 포함하는 phage-based vector(MabPrex)에 클로닝하여 키메릭 클론을 얻었다.

실시예 3: 항체 IgG AbF46 의 인간화

(1) 경쇄 가변부위의 인간화

마우스 AbF46 항체의 경쇄 가변부위 (VL)를 Blast P search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 에 의하여 인간 항체 골격(framework; 인간 생식선 세포주 유전자(germ line gene) 이용)와 alignment를 수행하였다 (도 1 및 2 참조). 마우스 AbF46 항체와 단백질 서열 상동성이 높은 인간 생식선 세포주 IGKV2-28*01(ACCESSION number: HC873376)를 선택하여 사용하였다. IGKV2-28*01의 CDR L1의 아미노산 길이는 16aa로 마우스 AbF46 항체의 CDR L1의 길이(17 aa)와 유사하여, 다른 생식선 세포주보다 인간화 항체 제작에 사용하기에 적합한 것으로 판단하였다. CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3의 Kabat 정의 및 Kabat 넘버링 시스템을 사용하였다. CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3는 마우스 AbF46의 DNA 서열을 사용하였다. 유전자 합성 동안에, CDR L1의 N30 위치(실시예 2의 표의 경쇄가변부위 아미노산 서열(서열번호 20) 중 36번째 위치에 해당)를 프롤린(P)으로 치환하였으며, 이는 이후의 클로닝 과정에서 무작위화되었다. 이와 같이 인간화된 경쇄 가변 부위의 DNA 및 단백질 서열을 도 3에 나타내었다.

(2) 중쇄 가변부위의 인간화

마우스 AbF46 항체의 중쇄 가변부위 (VH)를 Blast P search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)에 의하여 인간 항체 골격(framework; 인간 생식선 세포주 유전자(germ line gene) 이용)와 alignment를 수행하였다 (도 4a 및 4b 참조). 그 결과 IGHV3-72*01이 마우스 AbF46 항체와 단백질 서열 상동성이 높은 것으로 선택되었다. CDR-H2 및 CDR-H3의 Kabat 정의 및 Kabat 넘버링 시스템을 사용하였고, CDR-H1는 Chothia 정의 및 Kabat 넘버링 시스템을 사용하였다. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3는 마우스 DNA 서열을 사용하였다.

유전자 합성 동안에, CDR H1의 M34 위치(실시예 2의 표의 중쇄가변영역의 아미노산 서열(서열번호 19) 중 34번째 위치에 해당)를 이소류신(I)로, CDR H2의 N53 위치(실시예 2의 표의 중쇄가변영역의 아미노산 서열(서열번호 19) 중 56번째 위치에 해당)를 류신(L)으로 각각 치환하였으며, 이는 이후 클로닝 단계에서 무작위화되었다. M34 위치에서의 변이는 이 위치에서의 산화 가능성을 제거하기 위한 것이고, N53 위치에서의 변이는 탈아민화(deamidation)를 피하기 위한 것이다. 인간화된 중쇄 가변부위의 DNA 및 단백질 서열을 도 5에 나타내었다.

실시예 4: 인간화 항체 AbF46 의 가변부위의 클로닝 및 친화도 성숙

상기 실시예 3의 인간화 항체 AbF46의 가변부위를 코딩하는 DNA를 설계하고 합성하였다. 상기 설계 및 합성한 단일가닥 DNA를 인간 kappa 경쇄의 불변부위 및 인간 IgG1의 CH1 부위의 코딩 유전자를 포함하는 phage-based vector(MabPrex)에 클로닝하였다.

상기 방법으로, 완전하게 인간화되고, 상기 실시예 3에서 설명한 CDR에서의 3개의 변이를 모두 갖는 클론 'H1P1'(Fab 단편)이 구축되었다. 클론 H1P1에서의 변이는 다음과 같다: CDR L1: N30P, CDR H1: M34I 및 CDR H2: N53L. 즉, H1P1은 위에서 언급한 IGHV3-72*01 및 IGKV2-28*01 생식선 세포 유전자를 framework으로 가지며 CDR-L1의 N30P, CDR-H1의 M34I, CDR-H2의 N53L 돌연변이가 도입된 클론이다.

상기 클론 H1P1를 배양하고, 삼투 충격에 의하여 대장균의 주변세포질 공간으로 소량의 Fab를 방출시켰다. ELISA를 수행한 결과, 클론 H1P1의 Fab는 잘 발현하지만 항원인 c-Met(NP_000236)에는 잘 결합하지 못하는 것으로 확인되었다.

위 결과는 완벽하게 인간화된 항체 클론이 잘 발현하지만 항원을 인지하지 못함을 의미한다. 따라서 인간화 과정에서 손실된 항원 결합 활성을 회복하기 위하여 클론 H1P1 내의 CDR 변이들 중 하나 이상을 wild type 으로 복귀시키는 과정을 수행하였다.

이를 위하여 마우스 항체 AbF46로부터 CDR-H1의 M34I 돌연변이만 적용된 'LH2' 클론 및 CDR-L1의 N30P만 적용된 'LH3' 클론을 추가로 구축하였다

이러한 복귀돌연변이(back mutation) 클론으로부터 얻어진 항원 결합 시험(ELISA) 데이터를 도 6에 나타내었다.

상기 결과는 L1와 H2 내의 상기 변이 위치에서의 아스파라긴(Asn)의 존재가 항원 결합에 있어서 중요함을 보여준다. H1 내의 메티오닌(Met) 또한 항원 결합에 수반되는 것으로 보이지만, LH3에 비하여 LH2의 결합력이 높게 나타난 결과에 비추어, 이 위치(H1의 변이위치)에서는 이소류신(Ile)이 보다 적합한 것으로 보인다. 클론 LH2 및 LH3는 c-Met(NP_000236)항원에 대하여 약하지만 재현가능한 결합력을 보였다.

항원(c-Met(NP_000236))에 대한 인간화 클론의 결합력을 강화시키도록 선별된 CDR 라이브러리 (L2, L3 및 H3)를 구축을 위하여, H1P1 및 LH2(CDR-H1의 M34I 돌연변이만 적용)를 템플리트로 하여 CDR-L2, CDR-L3, CDR-H3를 각각 randomization하여 라이브러리를 구축하였다. CDR 라이브러리 중 하나인 LH2 상에 구축된 L3 라이브러리는 filter lift 상에서 양성 스팟을 나타내었다 (1,000개의 클론 중 약 10개에서 양성 관찰). 이들 클론을 분리하고, 서열을 분석하였다. 결합 ELISA 수행 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 보여지는 바와 같이, CDR L3의 94번 위치(실시예 2의 표 1의 경쇄가변영역 아미노산 서열(서열번호 20) 중 100번째 위치에 해당) 에서의 단일 변이는 인간화 클론의 c-Met(NP_000236)항원에 대한 결합력을 현저하게 증가시킨다. CDR L3의 94번 위치의 알라닌(Ala)을 아르지닌(Arg) (클론 L3D 및 L3E) 또는 히스티딘 (His) (클론 L3A)으로 치환하는 것이 특히 결합력 증진 효과가 우수한 것으로 나타났다. CDR L3의 92번 위치에서의 치환 (Y92G; 클론 L3F)도 어느 정도의 결합 개선 효과를 보였다.

위 결과는 경쇄 가변부위의 94번에 위치하는 아미노산(CDR L3 내 위치) 1개의 변환 만으로 c-Met(NP_000236)항원에 대한 결합력이 증가하고, 92번 아미노산도 약간의 결합력이 향상되는 효과를 보임을 확인시킨다.

실시예 5: 친화도 성숙을 위한 CDR 라이브러리의 제작

상기 실시예 4에서 가장 좋은 친화성을 보인 클론 L3E는 경쇄 가변부위의 골격은 인간 생식선 세포주 유전자 IGKV2-28*01를, 중쇄 가변 부위의 골격은 인간 생식선 세포주 유전자 IGHV3-72*01를 사용하여 완전하게 인간화된 클론이다. CDR은 마우스 항체 AbF46로부터 유래한 것에 다음의 변이를 부가한 것이다: CDR-L3의 94번째 잔기: Ala에서 Arg로 변이, CDR-H1의 34번째 잔기: Met에서 Ile로 변이.

상기 클론 L3E를 CDR 라이브러리를 구축하기 위한 템플리트로 사용하였다. 이 때 사용된 각각의 CDR은 다음과 같다:

L3E의　CDR	아미노산 서열
CDR-H1	DYY I S (서열번호 1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3	DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1	KSSQSLLAWGNQNNYLA(서열번호 4)
CDR-L2	WASTRVS(서열번호 5)
CDR-L3	QQSYS R PLT(서열번호 6)

이 때, CDR-L1과 CDR-H2는 CDR의 길이가 너무 길어 하나의 CDR에 대하여 2개의 라이브러리로 분리하여 구축하였다. 각 라이브러리는 모든 가능한 CDR 위치에 모든 아미노산이 도입될 수 있도록 디자인되었다.

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 돌연변이를 주고자 하는 부위에 4종의 염기가 완전 무작위로 도입되도록 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 혼합된 혼합물을 이용하여 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하였다.

상기 변이 유발된(mutagenized) DNA를 E. coli에 형질전환시키고, 얻어진 플라크 중 c-Met(NP_000236)와 결합하는 것을 선별하였다. 상기 선별은 항-인간 카파 경쇄로 코팅된 필터가 플레이트 표면에 CDR 라이브러리로부터 얻어진 플라크를 갖는 아가 플레이트 상에 놓여 있는 filter lifts를 사용하여 수행하였다.

각각의 클론으로부터 생산된 Fab를 항-인간 카파 필터로 캡쳐하고, 필터를 바이오틴화 c-Met(NP_000236)로 probing하였다. 바이오틴화 c-Met(NP_000236)와의 결합은 알칼라인 포스페이트에 콘쥬게이트된 NeutrAvidin(Pierce, 31002)을 사용하여 가시화하였다. 100 pM 내지 20 nM의 다양한 농도의 바이오틴화 c-Met(NP_000236)와 함께 1 내지 4시간 동안 필터를 probing 하였다.

상기 실시예 4에 기재된 방법을 참조하여 각 항체에 대하여 소량의 Fab를 생산하였다. 상기 제작된 Fab를 ELISA로 정량화하고, ELISA로 c-Met(NP_000236)와의 결합 정도를 시험하였다. 무작위로 서열화된 클론 및 filter lifts에 의하여 선택된 클론의 CDR 서열을 도 8a 및 8b에 나타내었다.

각 CDR 라이브러리의 스크리닝은 다양한 서열을 선택하였다. CDR-L2와 같은 일부 라이브러리의 스크리닝 결과 제한된 수의 위치(잔기)에서의 변이가 선택된 반면, CDR-L3 등의 다른 라이브러리의 경우에는 많은 잔기에서의 변이가 선택되었다. ELISA 포맷에서 모든 클론(인간화 Fab)의 c-Met(NP_000236)에 대한 결합 능력을 시험하고, 얻어진 대표적인 ELISA 결합 데이터를 도 9 및 10에 나타내었다.

도 9 및 10에서 확인되는 바와 같이, L3E 템플리트의 결합력을 개선시키는 다수의 CDR 변이가 존재하였다. 이 중에서 결합력 개선에 중요한 효과를 보이는 2개의 변이가 조사되었으며, 이들은 모두 경쇄에 존재하는 것으로 확인되었다. 클론 L1bA (S27E->W)와 클론 L3I (T97->S)는 템플리트인 L3E와 비교하여 현저하게 개선된 결합력을 나타내었을 뿐 아니라, 키메릭 클론의 결합력을 훨씬 능가하는 결합력을 보였다. ELISA 분석을 통하여 Kd 값을 측정한 결과, L3E의 경우 약 30 nM, 키메릭 클론의 경우 약 4 nM, 클론 L1bA의 경우 약 0.3 nM 정도로 측정되었다. 클론 L1bA의 단일 변이 (S27E->W)는 템플리트 클론인 L3E와 비교하여 약 100배 정도의 결합력 향상 결과를 가져오는 것을 확인하였다.

실시예 6: 조합 라이브러리( combinatorial library )의 제작

친화도 성숙의 마지막 단계로서, 단일 CDR 라이브러리로부터 얻어진 최적 변이들의 조합을 수행하였다. 상기 실시예 5에서 가장 우수한 친화도를 보인 클론 L1bA을 조합 라이브러리 구축을 위한 템플리트로 선택하고, 이 이외의 친화도가 향상된 클론들의 hot spot을 분석하여 추가적인 친화도 개량을 수행하였다. 상기 hot spot(mutation)을 분석 결과는 다음과 같다:

상기 Hot spot (L33A (L1bF), N28F(L1bY), S52I(L2A), S56G(L2D), T97S(L3I), T30Q(H1E), K64R(H2bI), S62G(H2bK)) 각각에 대하여 변이 전과 후 각각 2개의 아미노산을 도입하여 총 256개의 변이체를 구축하고, 스크리닝된 변이체들에 대하여 ELISA를 수행하여 c-Met(NP_000236)에 대한 결합력을 측정하였다 (도 11 참조).

조합 라이브러리의 템플리트 클론인 L1bA보다 우수한 결합력을 나타내는 3개의 클론을 동정하고, 각각 1-F3, C28 및 C30라고 명명하였다. 이들 클론에 대하여 c-Met(NP_000236)에 대한 결합력을 다시 측정하여, 얻어진 대표적인 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12 중 negative는 항체 단편 (scFv)가 발현되지 않은 파지를 의미한다.

한편, C28 항체에서 VL46번의 L을 M으로 VL49번의 Y를 I로, VL96번 L을 Y로 각각 치환하여 디자인하였고, 합성의뢰한 후 (바이오니아) Wild-type과 동일한 벡터에 클로닝하여 C28의 변이 항체인 C28m항체의 경쇄를 제작하였다.

또한, 상기와 같이 인간화 및 친화도 성숙 및 조합 라이브러리 설계를 통하여 최종 도출된 항체의 CDR 서열을 도 13에 나타내고, 상기 CDR을 포함하는 중쇄 가변부위와 경쇄 가변 부위의 서열을 도 14 및 아래의 표 3 내지 표 7에 나타내었다.

L1bA

	중쇄	경쇄
가변부위	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYYISWVRQA PGKGLEWVGF IRNKANGYTT EYSASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR DNWFAYWGQG TLVTVSS (서열번호 13)	DILMTQSPSS LTVSAGEKVT MSCKSSQSLL ASGNQNNYLA WHQQKPGRSP KMLIIWASTR VSGVPDRFIG SGSGTDFTLT INSVQAEDLA VYYCQQSYSA PLTFGAGTKL ELKRT (서열번호 14)
CDR1	DYYIS (서열번호 1)	KSSQSLLAWGNQNNYLA (서열번호 4)
CDR2	FIRNKANGYTTEYSASVKG (서열번호 2)	WASTRVS (서열번호 5)
CDR3	DNWFAY (서열번호 3)	QQSYSRPLT (서열번호 6)

C28

	중쇄	경쇄
가변부위	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYYISWVRQA PGKGLEWVGF IRNKANGYTT EYSASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR DNWFAYWGQG TLVTVSS (서열번호 13)	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCKSSQSLL AWSNQNNYLA WYLQKPGQSP QLLIYWAITR VGGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCQQSYSR PLTFGQGTKL EIKRT (서열번호 15)
CDR1	DYYIS (서열번호 1)	KSSQSLLAWSNQNNYLA (서열번호 7)
CDR2	FIRNKANGYTTEYSASVKG (서열번호 2)	WAITRVG (서열번호 11)
CDR3	DNWFAY (서열번호 3)	QQSYSRPLT (서열번호 6)

C30

	중쇄	경쇄
가변부위	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYYISWVRQA PGKGLEWVGF IRNKANGYTT EYSASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR DNWFAYWGQG TLVTVSS (서열번호 13)	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCKSSQSLL AWGFQNNYLA WYLQKPGQSP QLLIYWASTR VGGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCQQSYSR PLTFGQGTKL EIKRT (서열번호 16)
CDR1	DYYIS (서열번호 1)	KSSQSLLAWGFQNNYLA (서열번호 8)
CDR2	FIRNKANGYTTEYSASVKG (서열번호 2)	WASTRVG (서열번호 10)
CDR3	DNWFAY (서열번호 3)	QQSYSRPLT (서열번호 6)

1-F3

	중쇄	경쇄
가변부위	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYYISWVRQA PGKGLEWVGF IRNKANGYTT EYSASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR DNWFAYWGQG TLVTVSS (서열번호 13)	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCKSSQSLL AWGNQNNYAA WYLQKPGQSP QLLIYWASTR VSGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCQQSYSR PLTFGQGTKL EIKRT (서열번호 17)
CDR1	DYYIS (서열번호 1)	KSSQSLLAWGNQNNYAA (서열번호 9)
CDR2	FIRNKANGYTTEYSASVKG (서열번호 2)	WASTRVS (서열번호 5)
CDR3	DNWFAY (서열번호 3)	QQSYSRPLT (서열번호 6)

C28m

	중쇄	경쇄
가변부위	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYYISWVRQA PGKGLEWVGF IRNKANGYTT EYSASVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCAR DNWFAYWGQG TLVTVSS (서열번호 13)	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCKSSQSLL AWSNQNNYLA WYLQKPGQSP QMLIIWAITR VGGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCQQSYSR PYTFGQGTKL EIKRT (서열번호 18)
CDR1	DYYIS (서열번호 1)	KSSQSLLAWSNQNNYLA (서열번호 7)
CDR2	FIRNKANGYTTEYSASVKG (서열번호 2)	WAITRVG (서열번호 11)
CDR3	DNWFAY (서열번호 3)	QQSYSRPYT (서열번호 12)

조합 클론의 경쇄에 포함된 아미노산 변이는 특정 패턴을 갖지 않는 것으로 보이는 반면, 중쇄는 전혀 변이가 나타나지 않았다. 조합 클론에서의 결합력 개선 정도는 약 3배 정도였다. 또한, 이미 클론 L1bA (S27E->W)와 L3E (A94->R)에서 상당한 결합력 증가가 나타났다. 이들 클론의 Kd 값을 계산하여 다음의 표 8에 나타내었다:

실시예 7: 항체 제작

선별된 항체들의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-human IgG2 CH-XhoI'(이때 VH는 각 항체의 중쇄가변부위; CH: 중쇄불변부위)의 코딩 뉴클레오티드 서열로 구성되며, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI' (VL: 각 항체의 경쇄가변부위, CL: 경쇄불변부위 (kappa)) 의 코딩 뉴클레오티드 서열로 구성되도록 각각 디자인하여, 이들 폴리뉴클레오티드를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 항체들의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(Invitrogen; 2.5 x 10⁷)에 2M CaCl₂를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 항체들을 정제하였다.

상기 정제된 항체들의 중쇄가변부위와 경쇄가변부위 및 각 CDR의 아미노산 서열은 앞서 3 내지 7에 나타낸 바와 같다.

실시예 8: 선별된 친화도 개선 항체의 인 비트로( in vitro ) 생물학적 활성 분석

(1) BrdU assay

상기 실시예 7에서 제작된 친화도가 개선된 항체(L1bA, C28, C30, 1-F3, 및 C28m)들에 있어서 안전성에 취약점이 있는지 여부를 확인하기 위해 BrdU assay를 수행하였다. 인간 폐암 세포인 NCI-H441 세포(ATCC Cat.# HTB-174)를 RPMI 1640 배지(Gibco)에 2x10⁵ 세포/ml로 현탁하여 현탁액을 100 ul씩 96-well tissue culture plate (Corning, Lowell, MA) 에 분주하였다. 24시간 동안 37℃에서 5% CO₂의 조건으로 배양하고, 배지를 완전히 제거한 후에 항체를 희석한 RPMI 1640 배지로 교체하였다. 21시간 동안 37℃에서 5% CO₂의 조건으로 배양한 후, 5-브로모-2'-디옥시우리딘(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)을 첨가하고 3시간을 추가로 배양한 뒤에 BrdU assay (Roche, Indianapolis, IN)를 수행하였다. 세포를 플레이트 상에서 denaturation/fixation한 후에 항-BrdU 항체(Roche)를 넣고 1시간 후에 기질을 첨가하여 370 nm에서 ELISA spectraMax reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 발색반응을 측정하였다. 비교 대상은 키메릭 항체 AbF46의 작용성을 기준으로 하였다. 작용제(agonist)로 잘 알려진 5D5 항체(ATCC Cat. # HB11895 하이브리도마 세포에서 분리 정제)를 양성 대조군으로 사용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보는 바와 같이, 상기 제작된 5종의 항체 모두가 작용성(agonism)의 부작용이 감소되는 것으로 나타나, 안전성이 개선된 것으로 나타났다.

(2) 인 비트로( in vitro ) 세포증식 분석법

상기 실시예 7에서 제작된 5종의 친화도 개선 항체의 암세포 증식 억제에 의한 항암 효과를 확인하기 위하여, c-Met 분자를 세포 표면에 발현하는 MKN45 위암 세포(일본 암연구 세포주 은행, Japanese Cancer Research Bank, JCRB, Tokyo, Japan)를 이용한 인 비트로(in vitro) 세포증식 분석법을 수행하였다.

96-웰 플레이트에 웰당 1 x 10⁴개의 MKN45 세포를 50 ㎕의 5% FBS/DMEM 배양액과 분주하고, 상기 제작된 5종의 항체를 0.0016, 0.008, 0.04, 0.2, 1 및 5 ug/㎖의 농도로 50 ㎕를 처리한 후, 72시간 동안 배양한 다음, CellTiter-Glo

Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega, G7570)를 사용하여 leuminometer (PerkinElmer, 2104 Multilabel reader)로 세포의 수를 정량하였다. 대조군으로 키메릭 항체 AbF46를 사용하고, 비교군으로 5D5 항체를 사용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 5 종의 항체는 모두 키메릭 항체 AbF46와 5D5 항체보다 세포 사멸율이 현저하게 증가하여, 우수한 항암 효과를 보이는 것으로 확인되었다.

(3) Akt 인산화

Akt에 의해 조절되는 세포 작용들은 세포 증식, 세포 생존, 세포 크기 조절, 가용 영양분에 대한 반응성, 중간 대사과정, 혈관신생(angiogenesis), 조직침해(tissue invasion) 등을 포함한다. 이 모든 과정들은 암의 특징을 대표하는 것으로 수 많은 종양 발생 단백질(oncoprotein)과 종양 발생 억제물질(tumor suppressor)은 Akt 경로 상에서 상호 교차적으로 영향을 미치며, 신호전달과 고전적인 대사조절의 연결점에서 세포의 작용을 미세하게 조절하는 기능을 수행한다. 따라서, 이 Akt의 활성형인 인산화된 Akt의 정도가 높을수록 암세포가 더욱 활성형인 것으로 판단할 수 있다. 본 실시예에서는 친화도가 개선된 4종의 항체가 Akt의 인산화를 얼마나 저해할 수 있는지를 실험하였다.

상기 실시예 7에서 제작된 5종의 친화도 개선 항체의 작용성(agonism) 정도를 비교하기 위하여, Caki-1 세포(한국 세포주 은행)를 사용하여, Akt 단백질의 인산화 정도를 확인하였다. 음성 대조군으로는 배지를 사용하였으며, 작용제(agonist)로 잘 알려진 5D5 항체와 항체 AbF46를 양성 대조군으로 사용하였다.

2 x 10⁵ 세포/ml 의 Caki-1 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 무혈청 상태에서 각각 5 ug/ml의 항체를 30분 동안 처리하였다. 항체가 처리된 세포를 용해(lysis)시키고 PathScan phospho-AKT1 (Ser473) chemiluminescent Sandwich ELISA kit (Cell Signaling, cat.no　#7134S)를 이용하여 Akt 인산화 정도를 측정한 후 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 보는 바와 같이, 5종의 항체 모두 친화도 개선 전보다 Akt의 인산화를 더욱 저해하는 것을 확인할 수 있다.

(4) c- Met 의 분해 정도 확인

상기 실시예 7에서 제작된 5종의 친화도 개선 항체의 항암 효능을 확인하기 위하여, 항체와 결합된 c-Met 단백질의 분해 정도를 확인하였다. 이는 상대적인 총 c-Met량은 항체가 c-Met에 결합하여 내재화를 일으켜 c-Met의 분해(degradation)가 일어나는 것을 이용하여, 총 c-Met양의 증감을 파악하여 항체의 효능을 검사하는 것이다.

2 x 10⁵cells/ml　MKN45 세포와 5 ug/ml의 항체를 96-웰 플레이트에 동시에 뿌려준 후, 24시간 동안　배양하였다. 이후, 항체가 처리된 세포를 용해(lysis)시키고 Human total HGF R/c-MET ELISA KIT (R&D systems, DYC358)를 이용하여　총 c-Met　양의 변화를 측정한 후 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 보는 바와 같이, 5종의 친화도 개선 항체는 모두 키메릭 항체 AbF46에 비하여 c-Met 분해 정도가 증가함을 확인할 수 있다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00220

20091006

<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Humanized and affinity-matured anti c-Met antibody and uses thereof <130> DPP20125856KR <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 1 Asp Tyr Tyr Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of L1bA <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of L1bA and 1-F3 <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of L1bA, 1-F3, C28, and C30 <400> 6 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of C28 and C28m <400> 7 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of C30 <400> 8 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Gly Phe Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of 1-F3 <400> 9 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Ala 1 5 10 15 Ala <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of C30 <400> 10 Trp Ala Ser Thr Arg Val Gly 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of C28 and C28m <400> 11 Trp Ala Ile Thr Arg Val Gly 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of C28m <400> 12 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of L1bA, 1-F3, C28, C28m, and C30 <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of L1bA <400> 14 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr 115 <210> 15 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of C28 <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ile Thr Arg Val Gly Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr 115 <210> 16 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of C30 <400> 16 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Phe Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Val Gly Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr 115 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of 1-F3 <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Ala Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr 115 <210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of C28m <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Met Leu Ile Ile Trp Ala Ile Thr Arg Val Gly Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr 115 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of chAbF46 <400> 19 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asp Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 20 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of chAbF46 <400> 20 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr 115 <210> 21 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEMA domain of c-Met <400> 21 Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val 1 5 10 15 Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro 20 25 30 Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys 35 40 45 Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu 50 55 60 Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val 65 70 75 80 Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val 115 120 125 Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr 130 135 140 Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val 145 150 155 160 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln 165 170 175 Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys 180 185 190 Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val 195 200 205 Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg 210 215 220 Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu 225 230 235 240 Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu 245 250 255 Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln 260 265 270 Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly 275 280 285 Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser 290 295 300 Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys 305 310 315 320 Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro 325 330 335 Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly 340 345 350 Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu 355 360 365 Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr 370 375 380 Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly 385 390 395 400 Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro 405 410 415 Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro 420 425 430 Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly 435 440 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 22 Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 23 Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro 1 5 10 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 24 Glu Glu Pro Ser Gln 1 5 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U7-HC6) <400> 25 Glu Pro Ser Cys Asp Lys His Cys Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U6-HC7) <400> 26 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U3-HC9) <400> 27 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U6-HC8) <400> 28 Glu Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U8-HC5) <400> 29 Glu Lys Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human hinge region <400> 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of chAbF46 <400> 31 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of chAbF46 <400> 32 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of chAbF46 <400> 33 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr 1 5

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
하기 (1) 내지 (5)로 이루어지는 군에서 선택된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(1) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
(2) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
(3) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
(4) 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
(5) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제1항에 있어서,
서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, c-Met 단백질에 대한 결합 친화도(Kd)가 1 nM 이하인, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항의 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁적으로 c-Met 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서, c-Met 단백질에 대한 결합 친화도(Kd)가 1 nM 이하인, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c-Met 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 것인 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.