BR112016002008B1 - Anticorpos anti-cxcr4, seu uso, conjugado anticorpo-fármaco e composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

anticorpos anti-cxcr4, seu método de produção, seu uso, conjugado anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, polinucleotídeo isolado, vetor e célula a presente invenção refere-se a anticorpos e moléculas relacionadas que se ligam ao receptor de quimiocinas 4 (cxcr4). a invenção fornece, ainda, conjugados anticorpo-fármaco que compreendem tais anticorpos, ácidos nucleicos que codificam anticorpo e métodos para obter tais anticorpos. a invenção refere-se, ainda, a métodos terapêuticos para uso desses anticorpos e conjugados anticorpo-fármaco anti-cxcr4 para o tratamento de um distúrbio associado à função ou à expressão de cxcr4 (por exemplo, câncer), tal como câncer de cólon, rcc, esôfago, gástrico, cabeça e pescoço, pulmão, ovário, pancreático ou cânceres hematológicos.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos e moléculas relacionadas que se ligam ao receptor de quimiocinas 4 (CXCR4). A presente invenção também se refere a moléculas compreendendo, ou alternativamente consistindo em anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpos, ou suas variantes. A presente invenção também se refere à codificação de sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos para tais anticorpos. A presente invenção também se refere a conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de fármacos de anticorpos) compreendendo os anticorpos anti-CXCR4, composições compreendendo os anticorpos CXCR4, e métodos para uso dos anticorpos anti- CXCR4, e seus conjugados para tratamento de condições associadas à expressão CXCR4 (por exemplo, câncer). A invenção também compreende o uso dos mencionados anticorpos, seus fragmentos de ligação aos antígenos, ou conjugados de fármacos de anticorpos e processos correspondentes, para detecção e diagnóstico de distúrbios patológicos associados com a expressão do CXCR4. Sob certos aspectos, os distúrbios são distúrbios oncogênicos associados com uma expressão aumentada de CXCR4 relativa à patologia normal ou a qualquer outra patologia conectada à superexpressão de CXCR4. Sob outros aspectos, os distúrbios são distúrbios inflamatórios ou imunoló- gicos, distúrbios alérgicos, infecções (infecção por HIV, etc.), distúrbios autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide), distúrbios de fibrose (por exemplo, pulmonares), e distúrbios cardiovasculares. A invenção compreende finalmente produtos e/ou composições ou kits compreendendo pelo menos tal anticorpo ou conjugados de fármacos de anticorpos para a prognose ou diagnóstico ou monitoração da terapia de tais distúrbios.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Quimiocinas são pequenos peptídeos secretados que controlam a migração de leucócitos ao longo do gradiente químico de li- gantes, conhecidos como gradiente quimiocina, especialmente durante as reações imunológicas (Zlotnik et al, 2000, Immunity, 12: 121 a 127). Elas são classificadas em quarto classes conforme a localização dos resíduos Cys no N-terminal. A classe CXC consiste de quimiocinas com um par de Cys separado por um único resíduo. Os elementos mais importantes dessa classe são interleucina-8 (IL-8, CXCL8), derivado do fator-1 estromal (SDF-I, CXCL12), proteínas indutivas de ga- ma-interferona 10 (IP-10, CXCLlO), fator de plaquetas-4 (PF-4, CXCL4), proteína ativadora de neutrófilo 2 (NAP-2, CXCL7) e atividade estimulante do crescimento do melanoma (MGSA, CXCLl). A classe CC das quimiocinas tem dois Cys adjacentes no N-terminal e inclui a proteína inflamatória do macrófago 1 (MIP- lα, CCL3; MIP- ljSa, CCL4), ajustada na ativação do T normal expresso e secretado (RANTES, CCL5), proteína quimioatraente de monócito -1 (MCP-I, CCL2). A classe CX3C de quimiocinas contém dois Cys separados por três resíduos no N-terminal e são representados por fractalcina/neurotactina (CX3CL1). As quimiocinas classe C contêm um único Cys no N- terminal e são representadas por linfotactina/ATAC/SCM (CLl). Receptores de quimiocinas são agrupados de acordo com sua seletividade de ligação às quimiocinas. Por exemplo, CXCR4 se liga ao SDF-I e o CXCR5 se liga às quimiocinas que atraem as células B (BCAl). A interação do CXCR4 e do SDF-1 desempenha uma função importante nas fases múltiplas do processo de formação de tumores, incluindo o crescimento do tumor, invasão, angiogênese e metástase.
[0003] CXCR4 é um receptor ligado a uma proteína transmembra- nar 7 G (GPCR) (Herzog et al., DNA Cell Biol. 12: 465 (1993); Rimland et al, Mol. Pharmacol. 40: 869 (1991); WO03014153, WO02061087). Muitos processos biológicos significativos do ponto de vista médico são mediados por reações de transdução de sinal que envolvem proteínas G (Lefkowitz, Nature, 351: 353 a 354, (1991)). Receptores de proteína G acoplada (GPCRs) são proteínas de membrana integral contendo 7 supostos domínios de transmembrana (TMs). Essas proteínas mediam sinais para o interior da célula através da ativação das proteínas G heterotriméricas que por sua vez ativam várias proteínas executoras, resultando enfim em uma resposta psicológica, homeós- tase e inflamação.
[0004] CXCR4 desempenha uma função na embriogênese mostrada para funcionar como um correceptor para isolados de T linfotrófi- co HIV-I (Feng, Y. et al, Science 272: 872 (1996)). CXCR4 também desempenha uma função pleiotrópica no câncer humano. Sua expressão é regulada geneticamente em muitos tipos de tumores, incluindo cânceres de mama, pulmão, cólon, pâncreas, cérebro, próstata, ovário, bem como cânceres hematopoiéticos. Alguns relatórios da literatura sugerem que SDF-1 pode agir através do CXCR4 como um fator de crescimento e/ou de sobrevivência para alguns tumores. CXCR4 é expresso em células tronco ou subpopulações de início de tumor de muitos tumores, e pode mediar a capacidade dessas células de suportar a repetição e o desenvolvimento metastático de cânceres. Adicionalmente, CXCR4 é expresso em células precursoras endoteliais (EPCs), e sua atividade é exigida para incorporação de EPCs nos vasos funcionais durante a angiogênese. Isto pode dar uma contribuição significativa para a vascularização e a sobrevivência de tumores. A sinalização do CXCR4 pode levar também à indução de citocinas pró- angiogênicas (por exemplo, VEGF), bem como integrinas, moléculas de aderência e enzimas degradantes da matriz que podem mediar a invasão por células de tumor. Além disso, a expressão do CXCR4 é detectada nos linfócitos e fibroblastos de infiltração de tumor, bem co mo macrófagos associados a tumores. Essas células tendem a suprimir o reconhecimento imunológico e atacar no tumor, e reconstruir o microambiente do tumor para encorajar o crescimento do tumor e a metástase.
[0005] As funções múltiplas do CXCR4 no crescimento do tumor, e na metástase, e sua ampla expressão em muitos tipos de tumores comuns, tornam esse receptor um alvo atraente para intervenção terapêutica usando agentes inibidores. Enquanto peptídeos e pequenos inibidores de moléculas de CXCR4 e anticorpos anti-CXCR foram identificados ou registrados na clínica, sua utilidade foi limitada pelas propriedades farmacocinéticas e toxicologia. Um agente, tal como um anticorpo ou um conjugado de fármacos de anticorpos, que é seletivo, tem uma meia-vida longa, uma eficácia melhorada, e o perfil de segurança seria um agente desejável para uso no tratamento de cânceres.
[0006] Embora haja vários agentes sob desenvolvimento que almejam o CXCR4, existe a necessidade de agentes terapêuticos adicionais que almejem o CXCR4 (tais como anticorpos e conjugados de fármacos de anticorpos) que tenham eficácia e perfil de segurança melhorados. E que sejam adequados para uso com pacientes humanos. Os anticorpos e os conjugados de fármacos de anticorpos da presente invenção são anticorpos anti-CXCR4 terapeuticamente úteis que possuem um número de propriedades desejáveis tais como redução de formação de tumores, do crescimento de tumores, da angiogênese e da metástase. Adicionalmente, anticorpos e conjugados de fármacos de anticorpos da presente invenção induzem a apoptose das células de tumor.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção fornece anticorpos isolados, fragmentos de ligação de antígenos e seus derivados e conjugados de fárma- cos de anticorpos que se ligam a receptores quimiocinas 4 (CXCR4). A invenção inclui as sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve dos anticorpos e suas sequências de ácido nucleico correspondentes.
[0008] Em um aspecto, a presente invenção inclui as sequências de regiões determinantes complementares (CDR) dos anticorpos para obter moléculas de ligação que compreendam uma ou mais regiões CDR, ou regiões CDR derivadas, que retêm a capacidade de ligação de CXCR4 da molécula principal da qual a(s) CDR(s) foi(foram) obti- da(s).
[0009] Em outro aspecto, a invenção fornece um conjugado de fármacos de anticorpos compreendendo os anticorpos anti-CXCR4 descritos aqui.
[0010] Em outro aspecto, a invenção compreende o uso de anticorpos anti-CXCR4, seus fragmentos de ligação de antígenos, e conjugados de fármacos de anticorpos e os processos correspondentes, para detectar e diagnosticar distúrbios associados com a expressão ou a função de CXCR4. Em um aspecto, os distúrbios são distúrbios de câncer associados com uma expressão aumentada de CXCR4 e, relação ao normal ou qualquer outra patologia conectada à superexpres- são de CXCR4.
[0011] Em outro aspecto, a invenção compreende produtos e/ou composições ou kits compreendendo pelo menos tal anticorpo, seus fragmentos de ligação de antígenos, ou conjugados de fármacos de anticorpos para a prognose ou o diagnóstico ou a monitoração da terapia de certos cânceres.
[0012] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou seu fragmento de ligação de antígeno, que liga o receptor quimioci- na 4 (CXCR4) e compreende: a) uma região de cadeia pesada variável (VH) compreendendo (i) um VH CDR1 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 107, 113, 114, 108, 109, 115, 116, 117, 121 e 122; (ii) um VH CDR2 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 162, 128, 110, 111, 118, 119, 154, 123, 158, 124, 159, 125, 160, 126, 161, 127, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 155, 129, 156, e 130, e, (iii) um VH CDR3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 112, e 120; e/ou; b) uma região de cadeia leve variável (VL) compreendendo (i) um VL CDR1 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 144, 131, 135, 138, 141, 142, 143, 146, 147, 148, 149, 150, e 151; (ii) um VL CDR2 selecionado do grupo consistindo em 145, 132, 136, e 152; e (iii) um VL CDR3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS 139, 133, 137, 140, e 153.
[0013] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou seu fragmento de ligação de antígeno, que liga o receptor quimioci- na 4 (CXCR4) e compreende: a) uma região de cadeia pesada variável (VH) compreendendo regiões determinantes complementares selecionadas do grupo consistindo em (i) um VH CDR1 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NOS: 107, 113, 114, 108, 109, 115, 116, 117, 121 ou 122; (ii) um VH CDR2 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NOS: 162, 128, 110, 111, 118, 119, 154, 123, 158, 124, 159, 125, 160, 126, 161, 127, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 155, 129, 156, ou 130; e (iii) um VH CDR3 compreendendo a sequên-cia ajustada como SEQ ID NOS: 112, ou 120; e/ou b) uma região de cadeia leve variável (VL) compreendendo regiões determinantes complementares selecionadas do grupo consistindo em (i) um VL CDR1 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NOS: 144, 131, 135, 138, 141, 142, 143, 146, 147, 148, 149, 150, ou 151; (ii) um VL CDR2 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NOS 145, 132, 136, ou 152; e (iii) um VL CDR3 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NOS 139, 133, 137, 140, ou 153.
[0014] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou seu fragmento de ligação de antígeno, que se liga ao receptor qui- miocina 4(CXCR4) e compreende: a) uma região de cadeia leve variável (VL) compreendendo (i) VL CDR1 compreendendo a sequência X1SX2X3SLFNSX4X5RKNYLX6 onde X1 é R ou K; X2 é S ou A; X3é W, N ou Q; X4 é H ou R; X5 é T ou F; e/ou X6 é A, L, N, ou M (SEQ ID NO: 151); (ii) um VL CDR2 compreendendo a sequência WASARX1S onde X1 é G ou E (SEQ ID NOS: 152), e (iii) VL CDR3 compreendendo a sequência KQSFX1LRT onde X1 é N ou R (SEQ ID NO: 153); e/ou b) uma região de cadeia pesada variável (VH) compreendendo (i) VH CDR1 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NOS: 107, 108, 109, 113, ou 114; (ii) um VH CDR2 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NO: 157 E (iii) um VH CDR3 compreendendo a sequência ajustada como SEQ ID NO: 112.
[0015] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou seu fragmento de ligação de antígeno, que se liga a CXCR4 e compreende: uma região de cadeia variável pesada (VH) compreendendo a sequência: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVR- QAPGKGLEWVX1FIRHKX2NX3X4TX5EYSTX6 X7 X8GRFTISRDX9SKNX10LYLQMNSLX11X12EDTAVYYCAX13DLPGFAY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 106), onde X1 é G ou S; X2é V ou A; X3 é G, F, K, V, T, L ou I; X4é E ou Y; X5é T ou R; X6é W ou S; X7é D ou V; X8é K, T ou R; X9é D ou N; X10é T ou S; X11 é R ou K; X12 é A ou T; e/ou X13 é K ou R.
[0016] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno que se liga ao receptor qui- miocina 4 (CXCR4) é selecionado do grupo consistindo em: a) uma região de cadeia leve variável (VL) tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107, 113 ou 114; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 ou 128 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região de cadeia leve variável (VL) tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; b) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 115, 116, 117, 121 ou 122; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 118 ou 119 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 120 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 135; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 136 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 137; c) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107, 108, 109, 113 ou 114; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 110 ou 111 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 131; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 133; d) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107, 108, 109, 113 ou 114; de VH CDR2 de SEQ ID NO: 154 ou 123 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; e e) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107, 108, 109, 113 ou 114; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 157 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 151; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 152 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 153.
[0017] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em: uma região de cadeia pesada variável (VH) tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região de cadeia leve variável (VL) tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; b) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 115; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 118 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 120 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 135; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 136 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 137; c) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 110 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 131; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 133; d) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 154 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; e e) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 157 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 151; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 152 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 153.
[0018] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em: a) uma região de cadeia pesada variável (VH) tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região de cadeia leve variável (VL) tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; b) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; c) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 150; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; d) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 141; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; e) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; f) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 147; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; g) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 159 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; h) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 160 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; i) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; 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um VH CDR2 de SEQ ID NO: 163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; t) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; u) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; v) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; e w) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140.Em aspectos particulares da invenção, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de an- tígeno compreende: uma região de cadeia pesada variável (VH) compreendendotrês CDRs ajustados como SEQ ID NOS: 107, 162 e 112. Em algum aspecto, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antí- geno compreende: uma região de cadeia leve variável (VL) compreen-dendotrês CDRs ajustados como SEQ ID NOS: 144, 145 e 139. Em alguns aspectos, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreende: uma região de cadeia pesada variável (VH) compreendendotrês CDRs ajustados como SEQ ID NOS: 107, 162 e 112; e uma região de cadeia leve variável (VL) compreendendo três CDRs ajustados como SEQ ID NOS: 144, 145 e 139.
[0020] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreende: uma região de cadeia pesadavariável (VH) compreendendo VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 a partir de uma região VH de SEQ ID NO: 33. Em outros aspectos, o anticorpo ou o seu fragmento de ligação de antígeno compreende: uma região de cadeia leve variável (VL) compreendendo VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 a partir de uma região VL de SEQ ID NO: 73.
[0021] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo isolado, ou seu fragmento de ligação de antígeno compreende: uma região de cadeia pesada variável (VH) compreendendo VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 a partir de uma região VH de SEQ ID NO: 33; e uma região de cadeia leve variável (VL) compreendendo VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 a partir de uma região VL de SEQ ID NO: 73.
[0022] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em: a) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 33 e uma região VL de SEQ ID NO: 73; b) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 13 e uma região VL de SEQ ID NO: 15; c) um anticorpo ou seu fragmento de liga-ção de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 5 e uma região VL de SEQ ID NO: 7; d) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 21 e uma região VL de SEQ ID NO: 47; e e) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 106 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132; e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139.
[0023] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo isolado ou seu fragmento antígeno compreende uma região de cadeia pesada variável tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve variável tendo uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 73.
[0024] Em aspectos particulares da invenção, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreende: a) uma região de cadeia pesada variável (VH) de SEQ ID NO: 33; e/ou b) uma região de cadeia leve variável (VL) de SEQ ID NO: 73.
[0025] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno compreende uma região de cadeia pesada variável (VH) produzida pelo vetor de expressão com N° de Acesso à ATCC PTA-121353. Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno compreende uma região de cadeia leve variável (VL) produzida pelo vetor de expressão com N° de Acesso à ATCC PTA-121354.
[0026] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em:
[0027] a) uma região de cadeia pesada variável (VH) tendo uma cadeia pesada variável (VH) tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região de cadeia leve variável (VL) tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139;
[0028] b) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; c) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 150; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; d) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 141; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; e) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; f) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 147; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; g) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 159 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; h) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 160 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; i) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 161 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; j) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; k) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; l) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 164 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; m) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 165 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; n) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 166 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; o) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 167 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; p) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 168 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; q) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 168 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 138; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; r) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140; s) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; t) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; u) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139; e v) uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 140.
[0029] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno, que liga o CXCR4, compete para ligar ao CXCR4 com e/ou se liga ao mesmo epítopo de CXCR4 como um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno descrito aqui.
[0030] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno compreende uma região VH tendo um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região VL tendo um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO: 139.
[0031] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é um CDR enxertado, humanizado, quimérico,ou um anticorpo humano recombinante. Em outros aspectos da invenção, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno não é caninizado ou felinizado.
[0032] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreende uma etiqueta contendo doador de acila glutamina modificada em um local específico.
[0033] Em alguns aspectos da invenção, são fornecidos conjugados de fármacos de anticorpos anti-CXCR4. O conjugado de fármacos de anticorpos da invenção é geralmente da fórmula: Ab-(T-L-D), onde: Ab é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antígeno que se liga ao receptor de quimiocina 4 (CXC4), T é uma etiqueta contendo doador acila que pode opcionalmente ser incluída, é um vinculador e D é um fármaco.
[0034] Em aspectos particulares, o conjugado de fármacos de anticorpos da invenção é selecionado do grupo consistindo em: a) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 107, 162 e 112 e uma região VL compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 144, 145 e 139; b) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 115, 118 e 120 e uma região VL compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 135, 136 e 137; c) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 107, 110 e 112 e uma região VL compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 131, 132 e 133; d) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 107, 154 e 112 e uma região VL compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 138, 132 e 139; e) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 107, 157 e 112 e uma região VL compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 151, 152 e 153; f) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 33 e uma região VL de SEQ ID NO: 73; g) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 13 e uma região VL de SEQ ID NO: 15; h) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 5 e uma região VL de SEQ ID NO: 7; e i) um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo uma região VH de SEQ ID NO: 21 e uma região VL de SEQ ID NO: 47.
[0035] Em alguns conjugados de fármacos de anticorpos da invenção, o Ab é um CDR enxertado, humanizado, quimérico, ou um anticorpo humano recombinante ou seu fragmento de ligação de antí- geno. Em alguns conjugados de fármacos de anticorpos da invenção, o T é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 171, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 172, 173, 102, 103 e LLQ. Em alguns conjugados de fármacos de anticorpos da invenção, o L é selecionado do grupo consistindo em acetil-lisina-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonil (AcLys-VC-PABC), amino PEG6-propionil, ma- leimidocaprônico-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil (vc) e ma- leimidocaproil (mc). Em alguns conjugados de fármacos de anticorpos da invenção, o D é selecionado de um grupo consistindo em um agentecitotóxico, um agente imunomodulador, um agente de imagem, uma proteína terapêutica, um biopolímero, e um oligonucleotídeo.
[0036] Qualquer conjugado de fármacos de anticorpos da invenção pode ser preparado com um fármaco que seja um agente citotóxi- co. O agente citotóxico pode ser uma antraciclina, uma auristatina, uma camptotecina, uma combretastaína, uma dolastatina, uma duo- carmicina, uma enediina, uma geldanamicina, um dímero indolino- benzodiazepina, uma maitansina, uma puromicina, um dímero pirrolo- benzodiazepina, um taxano, um vinca alcaloide, uma tubulisina, uma hemiasterlina, uma espliceostatina, um pladienolídeo e calicheamicina. Qualquer conjugado de fármacos de anticorpos da invenção pode ser preparado com uma droga que é auristatina. Em um aspecto da invenção, a auristatina pode ser 0101 (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3- metóóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidina-1-il}-5-metil-1-oxoheptano-4- il]-N-metil-L-valinamida), MMAD (Monometil Auristatina D ou monome- til dolastatina 10) e 8261 (2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóóxi-2-feniletil]amino}-1-metóóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidina-1-il}-3-metóóxi-5-metil-1-oxoheptano-4-il]-N-metil- L-valinamida).
[0037] Em aspectos particulares, o conjugado de fármacos de anticorpos da invenção é selecionado do grupo consistindo em: a) Ab- LLQGA (SEQ ID NO: 91)-(acetil-lisina-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonil (AcLys-VC-PABC))-0101; Ab-LLQGA (SEQ ID NO: 91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; c) Ab-LLQX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 102)-(AcLys-VC-PABC)-0101; d) Ab-LLQX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; e) Ab-GGLLQGA (SEQ ID NO: 92)- (AcLys-VC-PABC)-0101; e f) Ab-GGLLQGA (SEQ ID NO: 92)- (AcLys-VC-PABC)-MMAD.
[0038] Em alguns aspectos da invenção, um conjugado de fárma- cos de anticorpos CXCR4 compreendem qualquer um dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígenos, descritos aqui. Em um aspecto particular da invenção, o conjugado de fármacos da invenção compreende um anticorpo onde o anticorpo compreende uma região VH compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 107, 162 e 112 e uma região VL compreendendo CDRs de SEQ ID NOS: 144, 145 e 139.
[0039] São também fornecidas composições farmacêuticas compreendendo anticorpo CXCR4, seu fragmento de ligação de antígeno, ou um conjugado de fármacos de anticorpos descritos aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0040] Em alguns aspectos da invenção, são fornecidos polinu- cleotídeos isolados compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando qualquer um dos anticorpos anti-CXCR4 ou seus fragmentos de ligação de antígeno descritos aqui. Em alguns aspectos, são fornecidas células hospedeiras que produzem combinadamente o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno descritos aqui.
[0041] Em outros aspectos são fornecidos métodos de tratamento de um distúrbio associado com a função CXCR4 ou a expressão em uma pessoa compreendendo administrar à pessoa uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da presente invenção. Em aspectos particulares da invenção, o distúrbio é o câncer.
[0042] Em outros aspectos são fornecidos métodos para diminuir a metástase das células cancerosas expressas de CXCR4 em uma pessoa, compreendendo administrar à pessoa em sua necessidade uma quantidade eficaz da composição farmacêutica descrita aqui. Em outros aspectos são fornecidos métodos que induzem a regressão do tumor em uma pessoa que tenha um tumor expresso de CXCR4, compreendendo administrar à pessoa em sua necessidade uma quantida- de eficaz da composição farmacêutica descrita aqui.
[0043] Esses e outros aspectos da invenção serão apreciados por uma revisão do pedido como um todo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0044] A Figura 1 mostra o alinhamento da Cadeia Pesada variável (VH) h3G10.
[0045] A Figura 2 mostra o alinhamento da Cadeia Leve variável (VL) h3G10.
[0046] A Figura 3A mostra a reatividade cruzada do CXCR4 anti- humano Ab h3G10.1.91.A58B para o CXCR4 cinomólgo por citometria de fluxo em uma série de diluição (0,007 - 267 nM) em HPB-ALL (células humanas de leucemia T) e células CHO transfectadas.
[0047] A Figura 3B mostra a reatividade cruzada do CXCR4 anti- humano CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B para o CXCR4 cinomólgo por citometria de fluxo em uma série de diluição (0,007 - 267 nM) em Raji (NHL; Linfoma não Hodgkin humano) e HSC-F (cultura de células T de cinomólogo).
[0048] A Figura 4 mostra as atividades ADCC(A-C) e CDC(D-F) dos anticorpos CXCR4 anti-humanos em culturas de células humanas apresentando CXCR4.
[0049] A Figura 4A mostra as atividades de anticorpos anti- humanos CXCR4 ADCC de 12A11, 6B6 e 3G10 em células Ramos (NHL).
[0050] A Figura 4B mostra a comparação da atividade ADCC de anticorpos anti-humanos CXCR4 em células MOLT-4 (leucemia linfo- blástica T-aguda).
[0051] A Figura 4C mostra as atividades ADCC de anticorpos anti- humanos CXCR4 de camundongo (m3G10-) e humanizada (h3G10-) em células MOLT-4 (leucemia linfoblástica T-agudo).
[0052] A Figura 4D mostra as atividades CDC de anticorpos CXCR4 anti-humanos 12A11, 6B6 e 3G10 em células Ramos (NHL).
[0053] A Figura 4E mostra a comparação da atividade CDC de anticorpos CXCR4 anti-humanos m3G10-hIgG1 e m3G10-hIgG4 em células Daudi (NHL).
[0054] A Figure 4F mostra a atividade CDC de anticorpos CXCR4 anti-humanos de camundongo (m3G10-) e humanizada (h3G10-) em células Daudi (NHL).
[0055] A Figura 5 mostra a inibição do fluxo de cálcio pelos anticorpos CXCR4 anti-humanos 3G10, 6B6 e 12A11.
[0056] A Figura 6A mostra que anticorpos CXCR4 anti-humanos 3G10, 6B6 e 12A11 são capazes de induzir a morte da célula em células Ramos de uma maneira dependente da dosagem.
[0057] A Figura 6B mostra que a capacidade do anticorpo CXCR4 anti-humano 3G10’s para induzir a morte da célula é dependente da bivalência.
[0058] A Figura 7 mostra que os anticorpos CXCR4 anti-humanos 3G10, 6B6 e 12A11 inibem significativamente o crescimento do tumor em um modelo de Linfoma Não Hodgkin (NHL) (Ramos) comparado com o anticorpo de controle do isotipo.
[0059] A Figura 8A mostra que os anticorpos CXCR4 anti- humanos 3G10, 6B6 e 12A11 têm um efeito significativo comparado ao anticorpo de controle do isotipo na carga de tumor de animais implantados sistemicamente com células Raji-LUC.
[0060] A Figura 8B mostra que o tratamento com anticorpos CXCR4 anti-humanos 3G10, 6B6 e 12A11 tiveram atividade comparável e inibição significativa do crescimento do tumor (TGI) em relação ao anticorpo de controle do isotipo neste modelo.
[0061] A Figura 8C é uma curva de sobrevivência mostrando o efeito significativo dos anticorpos CXCR4 anti-humanos 3G10, 6B6 e 12A11 comparado ao anticorpo de controle do isotipo na sobrevivência de animais implantados sistemicamente com as células Raji-LUC.
[0062] A Figura 9A mostra o efeito de CXCR4 Ab 6B6 na carga de tumor em uma leucemia mieloide aguda (AML) modelo (MV4-11-LUC). É mostrada a imagem da bioluminescência representativa de 5 ani- mais/grupo de tratamento desde o Dia 20 ao Dia 41.
[0063] A Figura 9B mostra o efeito significativo do anticorpo anti- CXCR4 6B6 comparado ao anticorpo de controle do isotipo na sobrevivência de animais implantados sistemicamente com as células MV4- 11-LUC AML.
[0064] A Figura 9C mostra a redução significativa da carga de tumor AML humano no Sangue Periférico (PB) de animais tratados com o anticorpo anti-CXCR4 6B6 comparado com os animais tratados com controle de isotipo no Dia 35 do estudo.
[0065] A Figura 10A mostra a imagem representativa da luciferase em camundongos com Tumores de Leucemia Linfócita Sistêmica Crônica tratados com o anticorpo CXCR4 3G10.
[0066] A Figura 10B é uma curva de sobrevivência mostrando o efeito significativo do anticorpo CXCR4 anti-humano 3G10 comparado ao anticorpo de controle de isotipo na sobrevivência de animais implantados sistemicamente com células de Leucemia Linfócita Crônica.
[0067] A Figura 11 mostra os anticorpos CXCR4 anti-humanos humanizados inibiram significativamente o crescimento do tumor em um modelo de Linfoma de Não Hodgkin’s (NHL) (Ramos) comparado ao anticorpo de controle de isotipo.
[0068] A Figura 12A mostra o efeito de CXCR4 Ab h3G10.1.91.A58B na carga de tumor em um mieloma múltiplo (MM) modelo (OPM-2-LUC). É mostrada a imagem da bioluminescência representativa de 5 ani- mais/grupo de tratamento desde o Dia 8 até o Dia 30.
[0069] A Figura 12B mostra a quantificação da bioluminescência (atividade Luciferase) no Modelo de Mieloma Múltiplo (MM) Sistêmico de Camundongos tratados com o anticorpo CXCR4 anti-humano h3G10.1.91.A58B, comparado aos animais tratados com anticorpo de controle de isotipo e Melfalan.
[0070] A Figura 12C é uma curva de sobrevivência mostrando o efeito significativo de um anticorpo CXCR4 h3G10.1.91.A58B comparado ao anticorpo de controle de isotipo e ao Melfalan em camundongos implantados sistemicamente com as células OPM-2-Luc MM.
[0071] A Figura 13A mostra o efeito significativo antitumor de CXCR4 ADCs 3G10-TG6-vc0101 e 6B6-TG6-vc0101 no modelo de tumor Ramos (NHL).
[0072] A Figura 13B mostra o efeito significativo antitumor de CXCR4 ADC 3G10-TG6-vc0101 no modelo de tumor HPB-ALL (T-ALL).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0073] A invenção aqui descrita fornece anticorpos e conjugados de anticorpos (por exemplo, conjugados de fármacos de anticorpos) que se ligam ao CXCR4 (por exemplo, CXCR4 humano). A invenção também fornece polinucleotídeos que codificam esses anticorpos, composições compreendendo esses anticorpos, e métodos de produção e uso desses anticorpos. Em certos aspectos, os anticorpos dessa descrição são derivados de sequências germinativas de cadeias pesadas e leves particulares e/ou compreendem características estruturais particulares tais como regiões CDR compreendendo sequências particulares de aminoácidos. Essa descrição fornece anticorpos isolados, métodos de produção de tais anticorpos, seus fragmentos de ligação de antígenos, conjugados de fármacos de anticorpos e moléculas bi- específicas dessa descrição. Essa descrição também se refere a métodos de uso dos anticorpos, tais como detectar CXCR4, modular a atividade do CXCR4 e/ou para alvejar as células de expressão CXCR4 para destruição (por exemplo, ADCC, CDC, toxina), em distúrbios associados com a função ou a expressão de CXCR4 tais como câncer. A invenção também fornece métodos para o tratamento preventivo e/ou terapêutico de um distúrbio associado com a função ou expressão CXCR4 em uma pessoa, tal como câncer (por exemplo, cânceres de tumores sólidos ou cânceres hematológicos). Finalmente, a invenção compreende composições compreendendo tais anticorpos em conjugação (por exemplo, conjugados de fármacos de anticorpos) ou em combinação com outros compostos anticâncer, tais como anticorpos, toxinas, citotóxicos/citostáticos, e o uso do mesmo para prevenção e/ou tratamento de distúrbios associados com a função ou expressão CXCR4 tais como câncer.
TÉCNICAS GERAIS
[0074] As práticas da presente invenção empregarão, a menos que indicado de forma diferente, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro do escopo da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tais como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sam- brook et al, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, edição, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, edição, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, edição, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, edições, 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, edições); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, edições, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al, edições, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al, edições, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al, edições, 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., edição, IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, edições, Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); e, The Antibodies (M. Zanetti e J.D. Capra, edições, Harwood Academic Publishers, 1995).
DEFINIÇÕES E ABREVIAÇÕES
[0075] Os termos "Quimiocina (motivo C-X-C) receptor 4" e "CXCR4" conforme usados aqui se referem a um receptor de quimioci- na de domínio transmembrana-7 com proteína G acoplada, que está normalmente embutido na membrana de uma célula. Os termos também incluem variantes, isoformas, homólogos, ortólogos e parálogos. Ácido nucleico e sequências de polipeptídeos de CXCR4 humano estão descritos como GenBank Accession NOS. NM—003467 e NP— 003458, respectivamente. Outra descrição do CXCR4 humano pode ser descoberta em Federsppiel, B. et al Genomics 16(3): 707 a 712 (1993); Herzog, H. et al DNA Cell Biol. 12(6): 465 a 471 (1993); Jazin, E. E. et al Regul. Pept 47(3): 247 a 258 (1993); Nomura, H. E et al Int. Immunol. 5(10): 1.239 a 1.249 (1993); Loetscher, M. et al J. Biol. Chem. 269(1): 232 a 237 (1994); Moriuchi, M. et al J. Immunol. 159(9): 4.322 a 4.329 (1997); Caruz, A. et al FEBS Lett. 426(2): 271 a 278 (1998); e Wegner, S. A. et al J. Biol. Chem. 273(8): 4.754 a 4.760 (1998).
[0076] CXCR4 é também conhecido na técnica, por exemplo, como LESTR, CD 184, CD184 antígeno, C-X-C receptor de quimiocina tipo 4, CXCR-4, CXCL-12, CXCR-R4, D2S201E, FB22, fusão, Fusina, HM89, HSY3RR, LAP3, LCR1, receptor de domínio de transmembrana 7 derivado de leucócito, receptor NPY3R, NPYR, NPYRL, NPYY3R, SDF-1, ou receptor de fator 1 derivado de célula estromal.
[0077] Para os propósitos da presente invenção, o termo "antígeno CXCR4" engloba qualquer CXCR4, incluindo CXCR4 humano, CXCR4 de outro mamífero (tal como CXCR4 de camundongo, CXCR4 de ratos, CXCR4 de caninos, CXCR4 de felinos, ou CXCR4 de primatas), bem como formas diferentes de CXCR4 (por exemplo, CXCR4 glicosi- lado).
[0078] Os termos "anticorpo" e "Ab" como usados aqui se referem a uma molécula de imunoglobulina capaz de reconhecer e se ligar a um alvo o antígeno específico, tal como um carboidrato, polinucleotí- deo, lipídio, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um local de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo "anticorpo" pode englobar qualquer tipo de anticorpo, incluindo, mas não limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, e fragmentos de ligação de antígenos de anticorpos intactos que retêm a capacidade de se ligar especificamente um dado antígeno (por exemplo, CXCR4), anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, seus mutantes, proteínas de fusão tendo um anticorpo, anticorpos de cadeia única (ScFv) e domínio único (por exemplo, tubarão e camelídeos), maxicorpos, mini- corpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis- scFv (veja, por exemplo, Hollinger e Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1.126 a 1.136), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imuno- globulina que inclua um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos, e anticorpos modificados de maneira covalente. Os anticorpos podem ser murinos, de ratos, humanos, ou de qualquer outra origem, (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados). Em alguns aspectos da invenção, o anti- corpo, ou o seu fragmento de ligação de antígeno para uso nos métodos da invenção é um anticorpo quimérico, humanizado ou um anticorpo humano recombinante, ou seu fragmento de ligação de CXCR4.
[0079] Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser também divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas de alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respectivamente. As estruturas subunitárias e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[0080] Anticorpos nativos ou que ocorrem naturalmente são tipi-camenteglicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isoti- pos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve tem também pontes de dissulfeto intracadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia pesada tem uma extremidade em um domínio variável (VH) seguido de um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve, e o domíniovariável da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos aminoácidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leve e pesada. O termo "variável"se refere ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensamente em sequência entre os anticorpos.
[0081] Os termos "fragmento de ligação de antígeno", "porção de ligação de antígeno", e "porção de anticorpo" conforme usados aqui se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que retém a capacidade de se ligar a um antígeno dado (por exemplo, CXCR4). As funções de ligação de antígeno de um anticorpo podem ser executadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação de antígenos incluem Fab; Fab’; F(ab’)2; um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ward et al, Nature 341: 544 a 546, 1989), uma região determinando uma complementaridade isolada (CDR), um nanocorpo e uma região de cadeia pesada variável contendo um domínio variável único e dois domínios constantes. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados para genes separados, eles podem ser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um vinculador sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia de proteínas única na qual as regiões VL e VH se unem para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv), veja, por exemplo, Bird et al, Science 242: 423 a 426 (1988), e Huston et al, PNAS 85: 5.879 a 5.883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única também podem ser englobados dentro do termo "porção de ligação de antígeno"de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpos são obtidos usando-se técnicas con-vencionais conhecidas daqueles peritos na técnica, e os fragmentos são classificados para serem utilizados da mesma maneira, como anticorpos intactos.
[0082] O termo "CDR" como usado aqui se refere a uma região no domínio variável de um anticorpo que confere sua especificidade de ligação. Há 3 CDRs nos quais cada cadeia pesada e leve de um anticorpo. Os resíduos de aminoácido dentro da região variável que cons- tituem os CDRs podem ser identificados usando-se métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a Kabat (Kabat et al, 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição, Public Health Service, NIH, Washington D.C.), Chothia (Chothia et al, 1989, Nature 342: 877 a 883), o acúmulo de Kabat e Chothia, definição de AbM (que é um compromisso entre Kabat e Chothia é derivado usando-se Oxford Molecular's AbM antibody modeling software (agora Ac- celrys®), definição de contato (MacCallum et al, 1996, J. Mol. Biol., 262: 732 a 745), e/ou definições adaptáveis (Makabe et al, 2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1.156 a 1.166). Conforme usado aqui, um CDR pode se referir a CDRs definidos por qualquer abordagem conhecida na técnica, incluindo combinações de abordagens. Os métodos usados aqui podem utilizar CDRs definidos de acordo com qualquer uma dessas abordagens.
[0083] O termo "região Fc" conforme usado aqui se refere a uma região terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fc" pode ser uma sequência nativa de região Fc ou uma variante de região Fc. Embora as bordas da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de lgG humano é geralmente definida para expandir desde um resíduo ami- noácido na posição Cys226, ou desde Pro230, até o seu terminal car- boxila. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).
[0084] O termo "região Fc" conforme usado aqui se refere a uma região terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fc" pode ser uma sequência nativa de região Fc ou uma variante de região Fc. Embora as bordas da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de lgG humano é geralmente definida para expandir desde um resíduo ami- noácido na posição Cys226, ou desde Pro230, até o seu terminal car- boxila. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).
[0085] O termo "anticorpo isolado" conforme usado aqui se refere a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CXCR4 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam a antígenos diferentes de CXCR4). Um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CXCR4 pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tal como moléculas de CXCR4 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outros materiais celulares e/ou químicos.
[0086] Os termos "anticorpo humanizado" e "anticorpo enxertado CDR" conforme usados aqui se referem a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas, ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab')2 ou outras subsequências de ligações de antígenos de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada das imunoglo- bulinas não humanas. Preferivelmente, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpos recipientes) nos quais resíduos de uma região determinante complementar (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como um camundongo, rato, ou coelho que tenha especificidade, afinidade e capacidade desejadas.
[0087] Em alguns casos, resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não huma- nos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são descobertos nem no anticorpo recipiente nem no CDR importado nem nas sequências de estruturas, mas estão incluídos para também refinar e otimizar a performance dos anticorpos. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência consensual de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá otimamente pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. São preferidos anticorpos tendo regiões Fc modificadas como descrito no WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humanizados têm um ou mais CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, ou CDR H3) que são alterados em relação ao anticorpo original, que são também denominados um ou mais CDRs "derivados de" um ou mais CDRs do anticorpo original.
[0088] A humanização pode ser essencialmente executada seguindo o método de Winter e parceiros (Jones et al Nature 321: 522 a 525 (1986); Riechmann et al. Nature 332: 323 a 327 (1988); Verhoeyen et al Science 239: 1534 a 1536 (1988)), pela substituição de CDRs ou sequências de CDRs de roedores ou de roedores mutantes para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Veja também Patentes nos US 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205; aqui incorporados por referência. Em alguns casos, resíduos dentro das regiões de estrutura de uma ou mais regiões variáveis da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos (veja, por exemplo, Patentes nos US 5.585,089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370). Além disso, anticorpos humaniza- dos podem compreender resíduos que não são descobertos no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para também refinar a performance dos anticorpos (por exemplo, obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobuli- na não humana e todas ou substancialmente todas as regiões de estruturasão aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para maiores detalhes veja Jones e outra Nature 331: 522 a 525 (1986); Riechmann et al Nature 332: 323 a 329 (1988); e Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 a 596 (1992); aqui incorporados para referência. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" podem incluir anticorpos onde substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos de estruturas são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. Veja, por exemplo, Patentes nos US 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Veja também a Patente no US 6.180.370, e a Publicação Internacional no WO 01/27160, onde são descritos anticorpos humanizados e técnicas para produção de anticorpos humanizados tendo afinidade melhorada para um antígeno predeterminado.
[0089] O termo "anticorpo humano" como usado aqui se refere a um anticorpo tendo uma sequência de aminoácido correspondente àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que tenha sido feito usando-se qualquer uma das técnicas para produção de anticorpos humanos conhecidas daqueles peritos na técnica ou descritas aqui. Essa definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo humano de cadeia pesada ou pelo menos um polipeptídeo humano de cadeia leve. Um exemplo disso é um anticorpo compreendendo cadeia leve de murino e polipep- tídeos humanos de cadeia pesada. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando-se várias técnicas conhecidas na técnica. Em uma configuração, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fagos, em que essa biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al, Nature Biotechnology, 14: 309 a 314, (1996); Sheets et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 6.157 a 6.162, (1998); Hoogenbo- om e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381, (1991); Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581, (1991)). Anticorpos humanos podem também ser produzidos por imunização de animais nos quais foi introduzida transgenicamente imunoglobulina humana em lugar de locais endógenos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou totalmente desativados. Essa abordagem está descrita nas Patentes nos US 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; e 5,661,016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado pela imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um alvo antígeno (tais linfócitos B podem ser recuperados pela clonagem de uma célula única ou individual do cDNA, ou pode ter sido imunizado in vitro). Veja, por exemplo, Cole et al Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, (1985); Boerner et al, J. Immunol., 147 (1): 86 a 95, (1991); e Patente no US 5.750.373.
[0090] O termo "anticorpo quimérico"como usado aqui se refere a anticorpos nos quais as sequências de regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as sequências de regiões constantes são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo no qual as sequências de regiões variáveis são derivadas de um anticorpo de camundongo e as sequências de regiões constantes são derivados de um anticorpo humano. Para aplicações veterinárias, os domínios constantes do anticorpoquimérico podem ser derivados daquelas outras espécies, tais como um gato ou um cão.
[0091] Os termos "anticorpos caninos" e "anticorpos felinos"conforme usados aqui se referem a anticorpos quiméricos úteis como terapêuticos em caninos e felinos, respectivamente. Em ambos os casos, um domínio de ligação de antígenos a partir de um anticorpo doador de espécies heterólogas é combinado com um domínio de ligação não antígeno de um anticorpo recipiente da mesma espécie.
[0092] Os termos "preferencialmente ligados" ou "especificamente ligados" conforme usado aqui quando usado no contexto de ligação de um anticorpo a um alvo (por exemplo, proteína CXCR4) é um termo bem entendido na técnica. Métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial são também conhecidos na técnica. É dito que uma molécula exibe "ligação específica"ou "ligação preferencial" se ela reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substância particular do que com células ou substâncias alternativas. Um anti-corpo"se liga especificamente" ou "se liga preferencialmente" a um alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente, e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um epítopo CXCR4 é um anticorpo que se liga a esse epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que ele se liga a outro epítopo CXCR4 ou epítopos não CXCR4.
[0093] O termo "afinidade de ligação"e "KD" como usado aqui pre- tende se referir a uma dissociação constante de equilíbrio de uma interação de anticorpo antígeno particular. O KD é a razão da taxa de dissociação, também chamada de "constante da taxa para a associação"ou "kd", para a taxa de associação, ou " constante da taxa para a dissociação"ou "ka". Assim, KD é igual a kd/ ka e é expresso como uma concentração molar (M). Segue que quanto menor o KD, mais forte a afinidade da ligação. Portanto, um KD de 1 μM indica uma afinidade de ligação fraca comparado a um KD de 1 nM. Valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando-se métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar o KD de um anticorpo é usando-se ressonância do plásmon de superfície de usar tipicamente um sistema biossensor tal como um sistema BIACORE®.
[0094] O termo "competir" conforme usado aqui em relação a um anticorpo significa que um primeiro anticorpo se liga a um epítopo de maneira suficientemente similar à ligação de um segundo anticorpo de modo que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epíto- po cognato é detectavelmente diminuída na presença do segundo anticorpo se comparado com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. Anticorpos que competem pela ligação com o epítopo com um anticorpo da invenção são abrangidos pela presente invenção. Os peritos apreciariam, com base nos ensinamentos fornecidos aqui, que tais anticorpos competidores podem ser úteis para os métodos descritos aqui.
[0095] O termo "fármaco" conforme usado aqui se refere a qualquer substância que tenha atividade biológica ou detectável. O termo fármaco deve englobar agentes citotóxicos, agentes terapêuticos, agentes imunomoduladores, rótulos detectáveis, agentes de imagem, agentes de ligação, pró-fármacos (que são metabolizados para um agente ativo in vivo), fatores de crescimento, hormônios, citocinas, anti-hormônios, xantinas, interleucinas, interferonas e drogas citotóxicas. Fármacos podem ser pequenas moléculas, polipeptídeos, oligonucleo- tídeos ou biopolímeros. O fármaco pode ser conjugado a um anticorpo da invenção através de um vinculador para formar um conjugado anti- corpo-fármaco.
[0096] O termo "função causadora" conforme usado aqui se refere a atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo. Exemplos das funções causadoras de um anticorpo incluem, mas não são limitadas a citotoxicidade com imunidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), ligação do receptor Fc, citotoxicidade dependente do complemento (CDC), fagocitose, ligação C1q, regulamento debilitado de receptores de superfície de células (por exemplo, receptor de célula B; BCR). Veja, por exemplo, Patente no US 6.737.056. Tais funções causadoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e possa ser avaliada usando-se vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar tais funções causadoras de anticorpos. Uma medição exemplar da função causadora é através da ligação Fcy3 e/ou C1q.
[0097] O termo "epítopo"conforme usado aqui inclui qualquer determinante de proteína capaz de se ligar a uma imunoglobulina ou receptor de célula-T ou de interagir com uma molécula. Determinantes epitópicos geralmente consistem de grupamentos de superfícies quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou carboidrato ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm três características estruturais dimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Um epítopo pode ser "linear" ou "adaptável". Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula interagente (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência de aminoácido principal da proteína. Em um epítopo adaptável, os pontos de interação ocorrem através dos resíduos de aminoácidos na proteína que são separados entre si. Uma vez que um epítopo desejado ou um antígeno é determinado, é possível gerar anticorpos para aquele epítopo, por exemplo, usando-se as técnicas descritas na presente invenção. Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração e a caracterização de anticorpos podem elucidar a informação sobre os epítopos desejáveis. A partir dessa informação, é então possível classificar competitivamente os anticorpos para ligação com o mesmo epítopo. Uma abordagem para alcançar isto é conduzir estudos de competição para descobrir anticorpos que se ligam competitivamente entre si, isto é, os anticorpos competem para se ligarem ao epítopo. Um alto processo de rendimento para "descartar" anticorpos com base na sua competição está descrito no Pedido de Patente Internacional N° WO 03/48731. Conforme usado aqui, o termo "descartar" se refere a um método para agrupar anticorpos com base em suas características de ligação a antígenos.
[0098] Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucleico/nucleotídeo" e "oligonucleotídeo" conforme usados aqui se referem a formas poliméri- cas de nucleotídeos de qualquer comprimento, ou desoxiribonucleotí- deos ou ribonucleotídeos, seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em uma cadeia por DNA ou RNA polimerase. "Polinucleotídeos" podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem executar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os exemplos a seguir são exemplos não limitadores de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, mensageiro RNA (mRNA), veículo RNA, RNA em ribossomos, ribozimas, DNA, cDNA, DNA ge- nômico, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, provas de ácido nucleico e iniciadores. Polinu- cleotídeos podem ser de ocorrência natural, sintéticos, recombinantes ou qualquer de suas combinações. Um polinucleotídeo pode com- preender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se estiver presente, a modificação para a estrutura de nucleotídeos pode ser transmitida antes ou depois da montagem da cadeia. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentesnão nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode também ser modificadoapós a polimerização, tal como por conjugação com uma identificação de componente. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "cápsulas", substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações de internucleotí- deos tais como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfanatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, modificações de internucleotídeos tais como, por exemplo, aquelas com li-gações não carregadas (por exemplo, metil fosfanatos, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosfo- rotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles contendo metades pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aqueles com interca- ladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radiativos, boro, metais oxida- tivos, etc.), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer dos grupos hidroxila comumente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfanato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais aos nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos. Os terminais 5’ e 3’ OH podem ser fosforila- dos ou substituídos por aminas ou metades de grupos de cobertura orgânica de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podem também ser derivadas para grupos de proteção padrão. Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares ribose ou deso- xirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2’-O-metil-, 2’-O-alil, 2’-fluoro- ou 2’-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa- ou beta-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoeptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos tais como metil ribosídeos. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a configurações onde o fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH2 ("formacetal"), nos quais cada R ou R’ é independentemente H alquila substituído ou não substituído (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalqui- la, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleo- tídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente se aplica a todos os polinucleotídeos referidos aqui, incluindo RNA e DNA.
[0099] Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo"e "proteína"conforme usados aqui se referem a cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, preferivelmente relativamente curtos (por exemplo, aminoácidos 10-100). A cadeia pode ser linear ou ramificada, ela pode compreender aminoácidos modificados, e/ou pode ser interrompida por não aminoácidos. Os termos também englobam uma cadeia de aminoácido que tenha sido modificada naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosila- ção, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com uma identificação de componente.Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipep- tídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modi- ficações conhecidas na técnica. É entendido que os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas.
[00100] Aminoácidos podem ser referidos aqui ou pelos seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical.
[00101] Os termos "aminoácido"e "aminoácido natural" conforme usados aqui se referem à arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptofano, lisina, glicina, alanina, histidina, serina, prolina, ácido glutâ- mico, ácido aspártico, treonina, cistina, metionina, leucina, asparagina, isoleucina e valina.
[00102] O termo "aminoácido derivativo" conforme usado aqui se refere a um aminoácido que tenha substituições ou modificações por ligação covalente de um aminoácido matriz, tal como, por exemplo, por alquilação, glicosilação, acetilação, fosforilação, etc. Além disso, estão incluídos na definição de "derivativos", por exemplo, um ou mais análogos de um aminoácido com ligações substituídas, bem como outras modificações conhecidas na técnica.
[00103] O termo "vetor" conforme usado aqui se refere a uma construção capaz de entregar, e preferivelmente expressar, um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a vetores de expressão de DNA nu ou RNA, plasmídeos, cosmídeos ou vetores de fagoti- pagem, vetores de expressão de DNA ou RNA associados com agentes de condensação catiônica, vetores de expressão de DNA ou RNA envolvidos em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.
[00104] O termo "identidade de sequência percentual" conforme usado aqui se refere ao grau de similaridade entre duas sequências. No contexto das sequências de ácido nucleico, significa os resíduos em duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para má- xima correspondência. O comprimento da comparação de identidade de sequência pode estar acima do alcance de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, mais geralmente pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotídeos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucleotídeos, e preferivelmente pelo menos 36, 48 ou mais nucleotídeos. Há um número de algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos. Por exemplo, sequências de polinucleotídeos podem ser comparadas usando-se FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas da Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, fornecem alinhamentos e identidade sequencial percentual das regiões de melhor sobreposição entre as sequências de interrogação e procura. (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63 a 98 (1990); Pearson, Methods MoI. Biol. 132: 185 a 219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227 a 258 (1996); Pearson, J. MoI. Biol. 276: 71 a 84 (1998); incorporadas aqui como referência). A menos que especificado de forma diferente, são usados parâmetros- padrão para um programa ou algoritmo particular. Por exemplo, a identidade de sequência percentual entre sequências de ácido nucleico pode ser determinada usando-se FASTA com seus parâmetros padrão (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) ou usando o Gap com seus parâmetros padrão como fornecido na GCG Versão 6.1, incorporada aqui como referência.
[00105] A referência a uma sequência de nucleotídeos engloba seu complemento, a menos que especificado de maneira diferente. Assim, a referência a um ácido nucleico tendo uma sequência particular deve ser entendida como englobando sua linha complementar, com sua sequência complementar.
[00106] No contexto de sequências de aminoácidos, significa que duas sequências de aminoácidos, quando alinhadas otimamente, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando os pesos gap padrão conforme fornecidos pelos programas, dividem pelo menos 70%, 75% ou 80% da identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% da identidade de sequência, e mais preferivelmente pelo menos 97%, 98% ou 99% da identidade de sequência. Em algumas sequências de aminoácidos substancialmente similares, as posições dos resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservadoras de aminoácidos.
[00107] Polipeptídeos substancialmente similares também incluem variantes substituídas conservadoramente nas quais um ou mais resíduos foram substituídos conservadoramente por um resíduo funcionalmente similar. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro; a substituição de um resíduo polar (hidrófilo) por outro tal como entre arginina e lisina, entre gluta- mina e asparagina, entre glicina e serina; a substituição de um resíduo básico tal como lisina, arginina ou histidina por outro; ou a substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro.
[00108] Uma outra indicação de que duas proteínas são substan-cialmenteidênticas é que elas dividam uma estrutura total tridimensional, ou são biologicamente equivalentes funcionais.
[00109] O termo "atividade citotóxica"conforme usado aqui se refere a um efeito de matança de células, um efeito citostático, ou um efeito antiproliferativo de um anticorpo, um ADC ou um metabólito intracelular do mencionado ADC. A atividade citotóxica pode ser expressa como o valor IC50, que é a concentração (molar ou em massa) por unidade de volume na qual metade das células sobrevive.
[00110] O termo "contato" conforme usado aqui se refere a trazer um anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno da presente invenção e um alvo CXCR4, ou seu epítopo, juntos de tal maneira que o anticorpo possa afetar a atividade biológica do CXCR4. Tal "contato"pode ser consumado "in vitro," isto é, em um tubo de ensaio, uma placa de Petri ou similar. Em um tubo de ensaio, o contato pode envolver apenas um anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno e CXCR4 ou seu epítopo ou pode envolver células inteiras. As células podem também ser mantidas ou desenvolvidas em placas de cultura de células e contatadas com anticorpos ou suas porções de ligação de antí- genos naquele ambiente. Nesse contexto, a capacidade de um anticorpo particular ou sua porção de ligação de antígeno afetar o distúrbio relativo ao CXCR4, isto é, o IC50 do anticorpo, pode ser determinada antes de ser tentado o uso do anticorpo in vivo com organismos vivos mais complexos. Para células fora do organismo, existem múltiplosmétodos, e são bem conhecidos daqueles que são peritos na técnica, para contatar CXCR4 com os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígenos. Em outra configuração, uma quantidade significativa de eficácia é gerada pela função causadora. Funções causadoras imunes que foram mostradas para contribuir com uma citotoxicida- de mediada por anticorpos incluem, mas não estão limitadas à citoto- xicidade mediada por células dependente do anticorpo (ADCC), fagoci- tose mediada por células dependente do anticorpo (ADCP), e citotoxi- cidade dependente do complemento (CDC).
[00111] O termo "etiqueta contendo doador de acila glutamina" e "glutamina" conforme usados aqui de referem a um polipeptídeo ou a uma proteína contendo um ou mais resíduos Gln que agem como aceitante de amina transglutaminase. Veja, por exemplo, WO2012059882.
[00112] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável"e "excipien- te farmacêutico aceitável"conforme usado aqui se refere a qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e seja não reativo com o sistema imunológico do indivíduo. Exemplos incluem qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti- bacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardo da absorção, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Os veículos farmacêuticos-padrão incluem, mas não estão limitados a solução salina fosfato tamponada, água, emulsões tais como emulsão óleo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Os diluentes preferidos para administração pior aerossol ou parenteral são salino fosfato tampona- do (PBS) ou salino normal (0,9%). Composições compreendendo tais veículos são formuladas pelos métodos convencionais bem conhecidos (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A. Gennaro, edição, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21a Edição Mack Publishing, 2005). Preferivelmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo (por exemplo, anticorpo monoclonal, seu fragmento de ligação de antígeno, conjugado de fármaco de anticorpo) pode ser revestido com um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam desativar o composto.
[00113] A presente invenção também fornece para composições compreendendo, ou alternativamente consistindo em um, dois, três, quatro, cinco, dez, quinze, vinte ou mais anticorpos da presente invenção (incluindo moléculas compreendendo, ou alternativamente consistindo em fragmentos de anticorpos ou suas variantes). Uma composição da invenção pode compreender, ou alternativamente consistir em uma, duas, três, quatro, cinco, dez, quinze, vinte ou mais sequências de aminoácidos de um ou mais anticorpos ou fragmentos de suas variantes. Alternativamente, a composição da invenção pode compreender, ou alternativamente consistir em moléculas de ácido nucleico englobando um ou mais anticorpos da invenção.
[00114] O termo "distúrbio associado ao CXCR4"é qualquer condição onde a patologia é devida, pelo menos em parte, à expressão aumentada ou inadequada de CXCR4 ou à função inadequada de CXCR4. Exemplos de tais distúrbios incluem, mas não estão limitados a câncer associado com expressão aumentada de CXCR4 em relação ao normal, distúrbios inflamatórios e imunológicos, distúrbios alérgicos, infecções (infecção por HIV, etc.), distúrbios autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide), distúrbios de fibrose (por exemplo, pulmonar) e distúrbios cardiovasculares.
[00115] O termo "câncer"se refere à condição fisiológica ou distúrbio nos mamíferos que é tipicamente caracterizado pelo crescimento irregular das células. Um câncer hematológico se refere a um câncer de sangue incluindo, mas não limitado à leucemia, linfoma e mieloma entre outros. Um câncer sólido se refere a um câncer do tecido diferente do sangue incluindo, mas não limitado a câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, coriocarcinoma, câncer de cólon, câncer esofágico, câncer de estômago, glioblastoma, cânceres da cabeça e do pescoço, câncer nos rins, câncer de pulmão, câncer de boca, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de pele, câncer no fígado e carcinomas hepáticos, etc.
[00116] O termo "paciente" conforme usado aqui se refere a um indivíduo que sofre de distúrbio associado ao CXCR4. Patentes podem incluir, mas não estão limitadas a humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), ratos, camundongos, porquinhos da Índia, porcos, cabras, vacas, cavalos, cães, gatos, pássaros e aves domésticas. Em configurações preferidas, os pacientes aos quais foram admi- nistrados um anticorpo ou um conjugado de fármacos de anticorpos é um ser humano.
[00117] Os termos "quantidade eficaz" ou "dosagem eficaz"conforme usados aqui se referem a uma quantidade de um fármaco, composto ou composição farmacêutica necessário para alcançar um ou mais resultados terapêuticos benéficos ou desejados. Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem eliminar ou reduzir o risco, diminuindo a severidade, ou retardando o início do distúrbio, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais do distúrbio suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento do distúrbio. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos tais como redução da incidência ou melhora de um ou mais sintomas do distúrbio, capacidade de diminuir a dose de outros fármacos necessários para tratar o distúrbio, aumentar o efeito de outro fármaco usado para tratar o distúrbio, e/ou retardar a progressão do distúrbio.
[00118] Para os propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a um ou mais entre os seguintes: reduzir a proliferação de (ou destruir) células neo- plásticas ou cancerosas em um distúrbio associado ao CXCR4, reduzir ou inibir a metástase de células neoplásticas em um distúrbio associado ao CXCR4, encolher ou diminuir o tamanho do tumor expresso de CXCR4, remissão de um distúrbio associado ao CXCR4, aumentar a expectativa de vida de um indivíduo afetado por um distúrbio associado ao CXCR4, diminuir os sintomas resultantes de um distúrbio associado ao CXCR4, aumentar a qualidade de vida daqueles que sofrem de um distúrbio associado ao CXCR4, capacidade de diminuir a dosa-gem de outros fármacos necessários para tratar um distúrbio associado ao CXCR4 sem efeito prejudicial, retardar a progressão do distúrbio associado ao CXCR4, curar um distúrbio associado ao CXCR4 e/ou prolongar a sobrevivência de pacientes que tenham um distúrbio associado ao CXCR4.
[00119] A menos que definido de forma diferente, os termos científicos e técnicos usados em conexão coma presente invenção devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles que têm conhecimento da técnica. Por exemplo, os termos "compreende", "compreendendo", "contendo" e "tendo" e similares podem ter o signi-ficadoatribuído a eles na lei de Patente dos EUA e podem significar "inclui", "incluindo" etc.; "consistindo essencialmente em" ou "consiste essencialmente" na mesma forma têm o significado atribuído na lei de Patente dos EUA e o termo é aberto, permitindo a presença de mais que aquele que é relatado até aqui como características básicas ou novas daquilo que é relatado não é mudado pela presença de mais do que aquilo que é relatado, mas exclui as configurações da técnica anterior.
[00120] Além disso, a menos que exigido de forma diferente por contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular.
[00121] Referência a "cerca" um valor ou um parâmetro aqui inclui (e descreve) configurações que são direcionadas para aquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição referindo-se a "cerca de X" inclui a descrição de "X". Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. Onde os aspectos das configurações da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outro grupamento de alternativas, a presente invenção abrange não apenas todo o grupo listado como um todo, mas cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal, mas também o grupo principal com a ausência de um ou mais dos elementos do grupo. A presente invenção também contempla a exclusão ex-plícita de um ou mais de qualquer um dos membros do grupo na in- venção reivindicada.
[00122] Através desse relatório e reivindicações, a palavra "compreendem", ou variações como "compreende" ou "compreendendo"será entendido implicar a inclusão de um número inteiro determinado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. A menos que exigido de maneira diferente por contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos no plural devem incluir o singular.
[00123] A menos que definido de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o entendido comumente por aquele que tem conhecimento da técnica à qual essa invenção pertence. Em caso de conflito, a presente especificação incluindo definições, controlará. Métodos e materiais exemplaresestão descritos aqui, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem também ser usados na prática ou nos testes da presente invenção. Os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitadores.
QUAISQUER ANTICORPOS ANTI-CXCR4 E MÉTODOS PARA SUA PRODUÇÃO
[00124] A presente invenção fornece anticorpos anti-CXCR4 ou fragmentos de ligação de antígenos que ligam ao CXCR4 humano. Nessaseção da especificação, funções e características estruturais de anticorpos exemplares anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação de antíge- no da descrição estão descritos em detalhes. Deve ser entendido que anticorpos ou fragmentos de ligação de antígenos da descrição podem ser descritos com base em qualquer um ou mais (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) das estruturas e/ou características funcionais descritas aqui. Através dessa porção da descrição, quando uma característica funcional ou estrutural é descrita em relação aos anticorpos da descrição, deve ser entendido que, exceto onde o contexto indica claramente de modo diferente, tais características estruturais ou funcionais podem similarmente ser usadas para descrever um fragmento de ligação de antígeno da descrição.
[00125] A sequência de nucleotídeos do CXCR4 cDNA humano e a sequência de aminoácidos predita da proteína CXCR4 humana estão mostradas como SEQ ID NOS: 104 e 105, respectivamente (Tabela 1). O gene CXCR4 humano, que é aproximadamente 1679 nucleotídeos de comprimento, abrange a proteína de comprimento total tendo um peso molecular de aproximadamente 38,7 kD e que tem aproximadamente 352 resíduos de aminoácidos de comprimento. Outra descrição do ácido nucleico CXCR4 humano e as sequências de polipeptídeos podem ser descobertas em GenBank Accession NOS. NM—003467 e NP—003458, respectivamente; bem como em Federsppiel, B. et al Genomics 16(3): 707 a 712 (1993); Herzog, H. et al DNA Cell Biol. 12(6): 465 a 471 (1993); Jazin, E. E. et al Regul. Pept 47(3): 247 a 258 (1993); Nomura, H. et al Int. Immunol. 5(10):1.239 a 1.249 (1993); Loetscher, M. et al J. Biol. Chem. 269(1): 232 a 237 (1994); Moriuchi, M. et al J. Immunol. 159(9): 4.322 a 4.329 (1997); Caruz, A. et al FEBS Lett. 426(2): 271 a 278 (1998); e Wegner, S. A. et al J. Biol. Chem. 273(8): 4.754 a 4.760 (1998). TABELA 1
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[00126] A sequência CXCR4 humana conforme usada aqui pode diferir do CXCR4 humano de SEQ ID NO: 105 por ter, por exemplo, mutações conservadas ou mutações em regiões não conservadas e o CXCR4 rem substancialmente a mesma função biológica que o CXCR4 humano de SEQ ID NO: 105. Por exemplo, a função biológica do CXCR4 humano é ter um epítopo no domínio extracelular de CXCR4 que seja ligado por um anticorpo da descrição momentânea ou a função biológica do CXCR4 humano é ligação de quimiocina ou envolvimento no processo metastático.
[00127] Uma sequência particular de CXCR4 humano será geralmente pelo menos 90% idêntica em sequência de aminoácidos ao CXCR4 humano de SEQ ID NO: 105 e certos resíduos de aminoácidos que identificam a sequência de aminoácidos como sendo humana quando comparado com as sequências de aminoácido CXCR4 de outrasespécies (por exemplo, murino). Em certos casos, um CXCR4 humano pode ser pelo menos 95%, ou mesmo pelo menos 96", 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácidos ao CXCR4 de SEQ ID NO: 105. Em alguns aspectos da invenção, uma sequência CXCR4 humana exibirá não mais que 10 diferenças de aminoácidos do CXCR4 de SEQ ID NO: 105. Em certos aspectos da invenção, o CXCR4 humano pode exibir não mais que 5, ou mesmo não mais que 4, 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácido do CXCR4 SEQ ID NO: 105. A identidade percentual pode ser determinada conforme descrito aqui.
[00128] Os anticorpos, seus fragmentos de ligação de antígenos, e conjugados de fármacos de anticorpos da invenção são caracterizados por qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) ligação ao CXCR4; (b) diminuição ou regulação para baixo da expressão de proteína do CXCR4; (c) tratar, evitar, melhorar um ou mais sintomas do distúrbio associado com a função ou expressão CXCR4 em um indivíduo (por exemplo, câncer, tal como NHL, AML, MM, CLL, T-ALL, gástrico, de cabeça e pescoço, pulmão, ovário ou pancreático). (d) diminuir ou inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo (que tenha um tumor expressando CXCR4); (e) diminuir ou inibir a n=metástase das células cancerosas expressando CXCR4 em um indivíduo (que tenha uma ou mais células cancerosas expressando CXCR4); (f) induzir a regressão (por exemplo, regressão de longo prazo) de um tumor expressando CXCR4 (g) exercer atividade citotóxica nas células com expressão de CXCR4; (h) desativar ou regular para menos o caminho do CXCR4; e (i) bloquear a interação do CXCR4 com parceiros de ligação extracelular CXCR4. Por exemplo, o anticorpo, seu fragmento de ligação de antígeno, e o conjugado de fármacos de anticorpos da invenção bloqueiam a função de SDF-1.
[00129] Os anticorpos úteis na presente invenção podem englobar anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia única (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção anticorpo (por exemplo, um domínio anticorpo), anticorpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antí- geno da especificidade exigida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos, e anticorpos modificados covalentemente. Os anticorpos podem ser mu- rino, ratos, humano, ou de qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados).
[00130] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo CXCR4 conforme descrito aqui conforme descrito aqui é um anticorpo monoclonal. Por exemplo, o anticorpo anti-CXCR4 é um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo monoclonal quimérico.
[00131] Em alguns aspectos da invenção, anticorpos da presente invenção reagem de modo cruzado com o CXCR4 de outras espécies que não a humana, tais como o CXCR4 de camundongo, rato, canino, felino, ou primata, bem como diferentes formas de CXCR4 (por exemplo, CXCR4 glicosilado). Em alguns aspectos da invenção, os anticor-posespecíficos para CXCR4 humano podem ser completamente es-pecíficos para CXCR4 humano e podem não apresentar espécies ou outros tipos de reatividade cruzada.
[00132] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo CXCR4 conforme descrito aqui é um anticorpo canino, ou um anticorpo felino. Anticorpos conforme a presente invenção que tenham sido caninizados ou felinizados são capazes de se ligar a pelo menos uma proteína CXCR4 canina ou proteína CXCR4 felina. Em um aspecto, um anticorpo monoclonal da presente invenção se liga a uma proteína CXCR4 canina ou a uma proteína CXCR4 felina e evita sua ligação a um fator- 1 derivado de célula estromal (SDDF-1).
[00133] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como, por exemplo, sem limitação, uma região constante que tenha potencial aumentado para provocar uma resposta imunológica. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para ter afinidade aumentada a um receptor Fc ga- ma tal como, por exemplo, FCYRI, FCYRIIA ou FCYIII.
[00134] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que tenha afinidade aumentada a um receptor Fc gama humano, que seja imunologicamente inerte, isto é, tendo um potencial reduzido para pro-vocar uma resposta imunológica. Em alguns aspectos da invenção, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol., 29: 2.613 a 2.624, 1999; Pedido de PCT no PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente no UK 98099518. O Fc pode ser IgG1 humano, IgG2 humano, IgG3 humano, ou IgG4 humano. O Fc pode ser IgG2 humano contendo a mutação A330P331 a S330S331 (IgG2Δa), no qual os resíduos de aminoácidos são numerados em relação à sequência lgG2 do tipo selvagem. Eur. J. Immunol., 29: 2.613 a 2.624, 1999. Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo compreende uma região constante de IgG4 compreendendo as seguintes mutações (Armouret al, Molecular Immunology 40 585 a 593, 2003): E233F234L235 a P233V234A235 (IgG4Δc), nas quais a numeração é em relação ao lgG4 tipo selvagem. Em ainda outros aspectos da invenção, o Fc é lgG4 humano E233F234L235 a P233V234A235 com supressão G236 (IgG4Δb). Em outro aspecto da invenção, o Fc é qualquer lgG4 Fc humano (IgG4, IgG4Δb ou IgG4Δc) contendo mutação estabilizadora dobradiça S228 a P228 (Aalberse et al, Immunology 105, 9 a 19, 2002). Em um aspecto particular da invenção, o Fc pode ser Fc aglicosilado.
[00135] Em alguns aspectos da invenção, a região constante é agli- cosilada pela mutação dos resíduos de ligação oligossacarídeos (tais como Asn297) e/ou resíduos de flanqueamento que são parte da se-quência de reconhecimento de glicosilação na região constante. Em alguns aspectos da invenção, a região constante é aglicosilada enzi- maticamente por glicosilação N-ligada. A região constante pode ser aglicosilada enzimaticamente por glicosilação N-ligada ou por expressão em uma célula hospedeira de glicolisação deficiente.
[00136] Uma forma de determinar a afinidade de ligação de anticorpos ao CXCR4 é medindo-se a afinidade de ligação de fragmentos Fab monofuncionais do anticorpo. Para obter os fragmentos Fab mo- nofuncionais, um anticorpo (por exemplo, lgG) pode ser clivado com papaína ou expresso recombinantemente. A afinidade de um fragmento Fab do CXCR4 de um anticorpo pode ser determinada por ressonância do plásmon de superfície (sistema de ressonância de plásmon de superfície (SPR) Biacore™3000™, Biacore™, INC, Piscataway NJ) equipado com chips de sensor de estreptavidina pré-imobilizada (AS) ou Fc anticamundongo ou Fc anti-humano usando-se tampão contínuo HBS-EP (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v Surfactant P20). WGA biotinilado pode ser revestido no chip SA para facilitar a captura de lipopartículas contendo proteínas CXCR4. Uma série de diluição (fator de diluição 3X, com 5 membros, com uma concentração top de 10 ou 30 nM) de Fab foi injetada de baixa para alta concentração (com um tempo de associação de 3 minutos para cada concentração) para executar a análise cinética dos dados usando-se uma metodologia de "titulação cinética"como descrito em Karlsson, et al, (Karlsson, R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. & Myszka, D. G. Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors. Anal. Bio- chem. 349, 136-147 (2006). Para alguns ciclos de análise, tampão foi injetado sobre partículas capturadas ao invés de Fab para fornecer ciclos vazios para propósitos de dupla referenciação (a dupla referenciação foi executada conforme descrito em Myszka et al.), (Myszka, D. G. Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999).
[00137] As concentrações de proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou eletroforese SDS-PAGE usando-se uma Fab de concentração conhecida (como determinada pela análise de aminoácido) co- mo um padrão. As taxas de associação cinética (kon) e dissociação ci-nética(koff) são obtidas simultaneamente ajustando-se os dados glo-balmente para um modelo de ligação 1:1 Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99 a 110) usando o programa BIAevaluation. Valores constantes de dissociação de equilíbrio são calculados como koff/kon. Esse protocolo é adequado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo a qualquer CXCR4, incluindo CXCR4 humano, CXCR4 de outro mamífero (tal como CXCR4 de camundongos, CXCR4 de ratos, CXCR4 canino ou CXCR4 de primatas), bem como a diferentes formas de CXCR4 (por exemplo, CXCR4 glicosilado). A afinidade de ligação de um anticorpo é geralmente medida a 25 °C, mas po de também ser medida a 37 °C.
[00138] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno, que se liga ao CXCR4, tem um MFI de menos de 10.000 μg/ml. Em aspectos particulares da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno, que se liga ao CXCR4, tem um MFI de menos de 6.000 μg/ml. Em aspectos particulares da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antíge- no, que se liga ao CXCR4, tem um MFI de menos de 5.000 μg/ml. Em aspectos particulares da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno, que se liga ao CXCR4, tem um MFI na faixa de 2.000 μg/ml a 5000 μg/ml.
[00139] Conforme usado aqui, "MFI" se refere a intensidade média de fluorescência ou intensidade de fluorescência mediana.
[00140] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno, que se liga ao CXCR4 tem um EC50 de menos de 3,00E-09 M. Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno, que se liga ao CXCR4 tem um EC50 em uma faixa de cerca de 1,00E-09 M a cerca de 3,00E- 09 M. Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antí- geno, que se liga ao CXCR4 tem um EC50 de 2,00E-09 M.
[00141] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno se liga ao CXCR4, inibe o fluxo de cálcio induzido do SDF-1. Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno inibe o fluxo de cálcio induzido alfa do SDF-1, com IC50s para inibição dentro da faixa de cerca de 1 nM a 50 nM. Em um aspecto, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno inibe o fluxo de cálcio induzido alfa do SDF-1, com IC50s para inibição de menos de 30 nM. Em um aspecto, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno inibe o fluxo de cálcio induzido alfa do SDF-1, com IC50s para inibição de menos de 2 nM.
[00142] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno reduz significativamente o número de células AML em modelos de células AML. Por exemplo, o número dos números células humanas foi diminuído significativamente em animais tratados com o anticorpo 6B6 anti-CXCR4. Além disso, a sobrevivência dos animais tratados com os anticorpos anti-CXCR4 da presente invenção foram significativamente aumentados.
[00143] Em alguns aspectos, anticorpos da presente invenção au-mentaram o tempo de sobrevivência e diminuíram a carga do tumor em um linfoma sistêmico não Hodgkin’s (NHL) de camundongo e modelos de células de leucemia mieloide aguda (AML). Em um aspecto, anticorpos da presente invenção aumentaram a sobrevivência em um modelo de tumor de leucemia linfoide crônica sistêmica (CLL) de camundongo. Em um aspecto, anticorpos da presente invenção inibiram o crescimento do tumor NHL in vivo. Em alguns aspectos, anticorpos da presente invenção aumentaram o tempo de sobrevivência e diminuíram a carga de tumor em um modelo de mieloma múltiplo sistêmico (MM) de camundongo.
[00144] Anticorpos da invenção podem ser produzidos usando-se técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, tecnologias recom- binantes, tecnologias de exibição de fago, tecnologias sintéticas ou combinações de tais tecnologias ou outras tecnologias prontamente conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1.628 a 1.650 (1999) e Fellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4): 924 a 940 (2007)).
[00145] Os anticorpos anti-CXCR4 ou seus fragmentos de ligação de antígenos como descrito aqui podem ser feitos por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, para a produção de linhas de células hibridoma, o caminho e a programação da imunização do animal hospedeiro são geralmente mantidos com as técnicas estabelecidas e convencionais para simulação e produção de anticorpos, como também descrito aqui. Técnicas gerais para produção de anticorpos humanos e de camundongos são conhecidas na técnica e/ou estão descritas aqui.
[00146] É contemplado que qualquer mamífero incluindo humanos ou células produtoras de anticorpos deles podem ser manipuladas para servir como base para a produção de linhas de células mamíferas, inclusive humanas e hibridomas. Tipicamente, o animal hospedeiro é inoculado intraperitonealmente, intramuscularmente, oralmente, subcu- taneamente, intraplantar, e/ou intradermicamente com uma quantidade de antígeno, incluindo como descrito aqui.
[00147] Hibridomas podem ser preparados a partir de linfócitos e células mieloma imortalizadas usando-se a técnica de hibridização da célula somática geral de Kohler, B. e Milstein, C., Nature 256: 495 a 497 (1975) ou como modificado por Buck, D. W., et al., In Vitro, 18: 377 a 381 (1982). Linhas de mieloma disponíveis, incluindo mas não limitadas a X63-Ag8.653 e aquelas do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, podem ser usadas na hibridização. Geralmente, a técnica envolve fundir células de mieloma e células lin- foides usando-se um fusogênio tal como polietileno glicol, ou por mei-oselétricos bem conhecidos daqueles peritos na técnica. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão e crescem em um meio de crescimento seletivo, tal como um meio de hipoxantina- ami- nopterina-timidina (HAT), para eliminar as células matrizes não hibridi- zadas. Qualquer um dos meios descritos aqui, suplementado com ou sem soro, pode ser usado para cultivar hibridomas que secretem anticorpos monoclonais. Como outra alternativa para a técnica de fusão de células, células B imortalizadas EBV podem ser usadas para produzir anticorpos CXCR4 monoclonais da invenção. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são examinados quanto à atividade antiantígena pelos procedimentos de imunoensaio convencional (por exemplo, radioimunoensaio, imunoen- saio de enzimas, ou imunoensaio de fluorescência).
[00148] Hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos englobam todos os derivados, células de progenitura dos hibrido- mas matrizes que produzem anticorpos monoclonais específicos para CXCR4, ou uma porção deles.
[00149] Hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser de-senvolvidos in vitro ou in vivo usando-se procedimentos conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou dos fluidos do corpo, pelos procedimentos convencionais de purificação da imunoglobulina tais como precipitação de sulfato de amônio, gel eletroforese, diálise, cromatografia. E ultrafiltração, se desejado. Atividade indesejada, se presente, pode ser removida, por exemplo, executando-se a preparação sobre os absorventes feitos de antígeno anexado a uma fase sólida e eluindo ou liberando os anticorpos dese-jados do antígeno. A imunização de um animal hospedeiro com um CXCR4 humano, ou um fragmento contendo a sequência de aminoá- cido alvo conjugada a uma proteína que seja antígena nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina de lapa, albumina do soro, tiroglobulina bovina, inibidores de tripsina da soja usando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster de maleimido- benzoil sulfosuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N=C=NR, onde R e R1são grupos alquila diferentes, podem produzir uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais).
[00150] Se desejado, o anticorpo anti-CXCR4 (monoclonal ou poli- clonal) de interesse pode ser sequenciado e a sequência de polinu- cleotídeos pode então ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que englobe o anticorpo de interesse pode ser mantida em vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso future. A produção de anticorpos monoclonais recombinantes na cultura da célula pode ser executada através da clonagem de genes de anticorpos a partir das células B por meios conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Tiller et al, J. Immunol. Methods 329, 112 (2008); Patente no US 7.314.622.
[00151] Em uma alternativa, a sequência de polinucleotídeos pode ser usada para manipulação genética para "humanizar" o anticorpo ou para melhorar a afinidade, ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser projetada para parecer mais proximamente com regiões constantes humanas para evitar respostas imunológicas se o anticorpo for usado em testes clínicos e tratamentos em seres humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência de anticorpos para obter maior afinidade com o CXCR4 e/ou maior eficácia em inibir o CXCR4.
[00152] Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo mo-noclonal. Elas são: (1) determinar o nucleotídeo e a sequência de ami- noácido projetada dos domínios variáveis leve e pesado do anticorpo de partida; (2) projetar o anticorpo humanizado, isto é, decidir que região da estrutura do anticorpo usar durante o processo de humanização;(3) as metodologias/técnicas de humanização atuais; e (4) a transfecção e a expressão do anticorpo humanizado. Veja, por exemplo, Patentes nos US 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; e 6,180,370.
[00153] Foi descrito um número de moléculas de anticorpos "huma-nizados" compreendendo um local de ligação de antígeno derivadas de uma imunoglobulina não humana, incluindo anticorpos quiméricos tendo regiões de roedores ou de roedores modificados V e seus CDRs associados fundidos para regiões constantes humanas. Veja., por exemplo, Winter et al Nature 349: 293 a 299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4.220 a 4.224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138: 4.534 a 4.538 (19870, e Brown et al. Cancer Res. 47: 3.577 a 3.583 (1987). Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertados em uma região humana de estrutura de suporte (FR) antes da fusão com uma região constante de anticorpo humano adequado. Veja, por exemplo, Riechmann et al. Nature 332: 323 a 327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239: 1.534 a 1.536 (1988), e Jones et al. Nature 321: 522 a 525 (1986). Outra referência descreve CDRs de roedores apoiados pela região de estrutura de roedores projetadas re- combinantemente. Veja, por exemplo, Publicação de Patente Europeia no 0519596. Essas moléculas "humanizadas" são designadas para minimizar respostas imunológicas indesejáveis para moléculas de anticorpos anti-humanos de roedores que limitam a duração e a efetividade das aplicações terapêuticas dessas metades de recipientes humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser projetada de modo que seja imunologicamente inerte (por exemplo, não dispara a lise complementar). Veja, por exemplo, Publicação PCT no PCT/GB99/01441; Pedido de Patente noUK 9809951.8. Outros métodos de anticorpos humanizantes que podem também ser utilizados estão descritos por Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19: 2.471 a 2.476, 1991, e nas Patentes nos US 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671; e 6.350.861; e na Publicação PCT no WO 01/27160.
[00154] Os princípios gerais relacionados a anticorpos humanizados discutidos acima são também aplicáveis a anticorpos de personalização para uso, por exemplo, em cães, gatos, primatas, equinos e bovinos. Além disso, um ou mais aspectos de humanizar um anticorpo descrito aqui pode ser combinado, por exemplo, com enxerto de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.
[00155] Em alguns aspectos da invenção, anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos usando-se camundongos disponibilizados comercialmente que tenham sido projetados para exprimir proteínas imunoglobulina humana específicas. Animais transgênicos que são projetados para produzir uma resposta imunológica mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) ou mais robusta pode também ser usados para geração de anticorpos humanizados ou humanos. Métodos para obter anticorpos humanos a partir de camundongos transgênicos são descritos por Green et al, Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg et al, Nature 368: 856 (1994), e Taylor et al, Int. Immun. 6: 519 (1994). Um exemplo não limitativo de tal Sistema é o XenoMouse® {por exemplo, Green et al., J. Immunol. Methods 231: 11 a 23 (1999), incorporada aqui para referência) de Abgenix (Fremont, CA). NO XenoMouse® e animais similares, os gemes do anticorpo de camundongo foram desativados e substituídos por genes de anticorpos humanos funcionais, enquanto o restante do sistema imunológico do camundongo permanece intacto.
[00156] O XenoMouse® foi transformado com YACs com linha germinativa configurada (cromossomos artificiais de levedura) que continham porções do lgH humano e locais Igkappa, incluindo a maioria das sequências de região variável, juntamente com genes acessórios e sequências regulatórias. O repertório da região variável humana pode ser usado para gerar células B que produzam anticorpos, que possam ser processadas em hibridomas por técnicas conhecidas. Um XenoMouse® imunizado com um antígeno alvo produzirá anticorpos humanos pela resposta imunológica normal, que pode ser colhida ou produzida por técnicas padrão descritas acima. Uma variedade de cepas de XenoMouse® está disponível, cada uma das quais é capaz de produzir uma classe diferente de anticorpo. Transgenicamente, anticorpos humanos produzidos mostraram ter potencial terapêutico, enquanto retinham as propriedades farmacocinéticas dos anticorpos humanos normais (Green et al, J. Immunol. Methods 231: 11 a 23 (1999)). A pessoa perita verificará que as composições e métodos reivindicadosnão são limitados ao uso do sistema XenoMouse® mas podem utilizar qualquer animal transgênico que tenha sido projetado geneticamente para produzir anticorpos humanos.
[00157] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo pode ser preparado usando-se um anticorpo que tenha uma ou mais das se-quências VH ou VL descritas aqui como material de partida para produzir um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas a partir do anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser produzido modificando-se um ou mais resíduos dentro de uma ou de ambas as regiões variáveis (VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser produzido modificando-se resíduos dentro de região (regiões) constan- te(s), por exemplo, para alterar a(s) função (funções) de efeito do anticorpo. Em certos aspectos, um enxerto de CDR pode ser usado para produzir regiões variáveis de anticorpos. Os anticorpos interagem com os antígenos alvo predominantemente através de resíduos aminoáci- dos que estão localizados nas seis regiões que determinam a com-plementaridade de cadeias pesada e leve (CDRs). Por essa razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que em sequências fora dos CDRs. Como as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações an- ticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades dos anticorpos específicos que ocorrem natu-ralmente pela construção de vetores de expressão que incluem se-quências de CCDR a partir do anticorpo específico que ocorre natu-ralmente enxertado nas sequências de estrutura a partir de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja, por exemplo, Riechmann, L et al., Nature 332 323 a 327 (1995), Jones, P et al., Nature 32J. 522 a 525 (1986), Queen, C et al, Proc Natl Acad See EUA 86 10029-10033 (1989), Patentes nos US 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; e 6.180.370).
[00158] Tais sequências de estruturas podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos de linha germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linha germinativa para genes de regiões variáveis de cadeias pesada e leve humanas podem ser encontrados no banco de dados de sequência de linha germinativa humana "Vbase"(disponível na internet em www mrc-cpe cam ac uk/vbase) bem como em Kabat, E A , et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U S. Department of Health and Human Services, NIH Publication NO 91-3242, Tomlinson, I M , et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" Cox, J P L et al, J MoI. Biol TTL 776-798 (1994) "A Directory of Human Germ line Vn Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Ew. J. Immunol 2A 827-836, cujos teores de cada uma delas estão expressamente incorporados aqui como referência. Como outro exemplo, as sequências de DNA de linha germinativa para genes de regiões de cadeia variável pesada e leve humana podem ser encontradas no banco de dados Genbank. Por exemplo, as seguintes sequências de linhas germi- nativas de cadeia pesada encontradas no camundongo HCo7 HuMAb estão disponíveis no acesso ao Genbank anexo números 1 -69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637). Como outro exemplo, as seguintes sequências de linhas germinativas de cadeia pesada encontradas no camundongo HCoI 2 HuMAb estão disponíveis estão disponíveis no acesso ao Genbank anexo números 1 -69 (NG_0010109, NT_024637 e BCO7O333), 5-51 (NG_0010109 e NT_024637), 4-34 (NG_0010109 e NT_024637), 3-30 3 (CAJ556644) e 3-23 (AJ406678). Ainda outra fonte de sequências de linhas germi- nativas de cadeias pesada e leve humana é o banco de dados de genes de imunoglobulina humana disponível do IMGT (http://imgt.cines.fr).g.
[00159] Sequências de estrutura preferidas para uso nos anticorpos dessa descrição são aqueles que são estruturalmente similares às se-quências de estruturas usadas pelos anticorpos selecionados dessa descrição. As sequências VH CDR1, CDR2, e CDR3, e as sequências VL CDR1, CDR2, e CDR3, podem ser enxertadas nas regiões de es-trutura que tenham sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinativa da qual a sequência de estrutura deriva, ou as sequências CDR podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que contenham uma ou mais mutações se comparado com as sequências de linha germinativa. Outro tipo de modificação de estrutura envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de células T para assim reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem é também referida como "desi- munização"e está descrita em maiores detalhes na Publicação de Patenteno US 20030153043.
[00160] Em adição ou alternativa a modificações feitas dentro da estrutura ou regiões CDR, anticorpos dessa descrição podem ser pro-jetados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar um ou mais propriedades funcionais do anticorpo, como meia- vida de soro, fixação de complemento, ligação do receptor Fc e/ou ci- totoxicidade celular dependente de antígeno. Adicionalmente, um anti-corpo dessa descrição pode ser quimicamente modificado (por exemplo, um ou mais metades químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar um ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em detalhes adicionais abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é aquela do índice EU de Kabat e/ou Chothia. Por exemplo, foi constatado que em certos casos é benéfico para a mutação de resíduos dentro das regiões de estrutura para manter ou aumentar a habilidade de ligação de antígeno do anticorpo (ver, por exemplo, Patentes U.S. nos 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762). Em alguns aspectos da invenção, a região de articulação de CHl é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de articulaçãoseja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é descrita adicionalmente em Patente U.S. no 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de articulação de CHl é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo. Em alguns aspectos da invenção, a região de articulação Fc de um anticorpo sofre mutação para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoáci- do são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de articulação Fc de modo que o anticorpo tenha prejudicado a ligação de proteína Staphylococcyl A (SpA) em relação a ligação SpA de domínio de articulação Fc nativa. Essa abordagem é descrita em detalhes adicionais em Patente U.S. no 6.165.745 por Ward et al.
[00161] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas T252L, T254S, T256F, conforme descrito em Patente U.S. no 6.277.375. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CHl ou CL para conter um epítopo de ligação de receptor selvagem tomado a partir de dois laços de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito em Patentes U.S. nos 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.
[00162] Em alguns aspectos da invenção, os anticorpos podem ser feitos de modo recombinante e expressos com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Em outra alternativa, anticorpos podem ser feitos de modo recombinante por tecnologia de exibição de fago. Ver, por exemplo, Patentes U.S. nos 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; e 6.265.150; e Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994). Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago (McCafferty et al., Nature 348:552 a 553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de imunoglobulina variável (V) repertórios de gene de domínio a partir de doadores não imunizados. De acordo com esse conjunto de procedimentos, genes de domínio V de anticorpo são clonados in-frame em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula de fago. Devido ao fato de que a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de filamento único do genoma de fago, seleções à base das propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Desse modo, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fago pode ser executada em uma variedade de formatos; para revisão, ver, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564 a 571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para exibição de fago. Clackson et al., Nature 352:624 a 628 (1991), isolou um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona de uma biblioteca combinatória aleatória pequena de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V a partir de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos a um conjunto diverso de antígenos (incluindo autoantíge- nos) podem ser isolados seguindo essencialmente os conjuntos de procedimentos descritos por Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581 a 597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Em uma reposta imunológica natural, genes de anticorpo acumulam mutações em uma taxa alta (hipermutação somática). Algumas das mudanças introduzidasirão conferir afinidade mais alta, e células B que exibem imunoglo- bulina de superfície de afinidade alta são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante desafio de antígeno subsequente. Esse processo natural pode ser imitado empregando-se o conjunto de procedimentos conhecido como "embaralhamento de cadeia." (Marks et al., Bio/Technol. 10:779 a 783 (1992)). Nesse método, a afinidade de anticorpos humanos "primários"obtidos por exibição de fago pode ser melhorada substituindo-se sequencialmente os genes de região V de cadeias pesada e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente(repertórios) de genes de domínio V obtidos a partir de doadoresnão imunizados. Esse conjunto de procedimentos permite a pro- dução de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades na faixa pM-nM. Uma estratégia para fazer repertórios de anticorpo de fago muito grandes (também conhecido como "a mãe de todas as bibliotecas") foi descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265 a 2266 (1993). O embaralhamento de gene também pode ser usado para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos de roedores, em que o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor inicial. De acordo com esse método, que também é referido como "imprinting de epítopo", o gene de domínio V de cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedores obtido por conjunto de procedimentos de exibição de fago é substituído por um repertório de genes de domínio V humano, que cria quimeras roedor-humano. A seleção em antígeno resulta em um isolamento de regiões variáveis humanas com capacidade para restaurar um local de ligação de antígeno funcional, isto é, o epítopo governa (faz imprinting) a escolha de parceiro. Quando o processo é repetido a fim de substituir o domínio V de roedor restante, um anticorpo humano é obtido (ver Publicação PCT no WO 93/06213). Diferente de humanização tradicional de anticorpos de roedores por enxerto de CDR, esse conjunto de procedimentos fornece anticorpos completamente humanos, que não têm estrutura ou resíduos CDR de origem de roedor.
[00163] Anticorpos podem ser feitos de modo recombinante isolando-se primeiramente os anticorpos e anticorpo produzindo-se células a partir de animais hospedeiros, obtendo-se a sequência de gene e usando-se a sequência de gene para expressar o anticorpo de modo recombinante em células hospedeiras (por exemplo, células CHO). Outro método que pode ser empregado é para expressar a sequência de anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Métodos para expressar anticorpos de modo recombinante em plantas ou leite foram revelados. Ver, por exemplo, Peeters, et al., Vaccine 19:2756, (2001); Lonberg, N. e D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995); e Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147 (1999). Métodos para fazer derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeiaúnica, etc. são conhecidos na técnica.
[00164] Conjuntos de procedimentos de classificação de imunoen- saios e citometria de fluxo como classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) também podem ser empregados para isolar anti-corpos que são específicos para CXCR4.
[00165] Os anticorpos, conforme descrito aqui, podem ser ligados a muitos carreadores diferentes. Carreadores podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de carreadores bem conhecidos incluem polipropri- leno, poliestireno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, vidro, natural e celuloses modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para propósitos da invenção. Aqueles versados na técnica conhecerão outros veículos adequados para anticorpos de ligação, ou poderão verificar os mesmos, com uso de experimentação rotineira. Em alguns aspectos da invenção, o veículo compreende uma metade que almeja o miocárdio.
[00166] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeo que têm capacidade para se ligarem especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais). As células hi- bridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão (como vetores de expressão revelados em Publicação PCT no WO 87/04462), que são então transfectados em células hospedeiras como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Ver, por exemplo, Publicação PCT no WO 87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo-se a sequência de codificação apara regiões constantes de cadeias pesada e leve humanas no lugar de sequências murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984, ou unindo-se covalentemente à sequência de codificação de imunoglobulina inteira ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não imunoglobulina. Nessa maneira, anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" são preparados de modo que têm a especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal CXCR4 aqui.
[00167] Métodos para determinar a especificidade de ligação de um anticorpo anti-CXCR4 são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Métodos gerais são fornecidos, por exemplo, por Mole, "Epitope Mapping," em METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOLUME 10: IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS, Manson (ed.), páginas 105 a 116 (The Humana Press, Inc. 1992).
[00168] Os anticorpos anti-CXCR4 ou fragmentos de ligação de an- tígeno dos mesmos, conforme descrito aqui, podem ser identificados ou distinguidos com uso de métodos conhecidos na técnica, pelos quais a redução de níveis de expressão de CXCR4 é detectada e/ou medida. Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo anti-CXCR4, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é identificado incubando-se um agente candidato com CXCR4 e monitorando-se a ligação e/ou redução atendida de níveis de expressão de CXCR4. O ensaio de ligação pode ser executado com polipeptídeo(s) CXCR4 purifi- cado(s), ou com células que expressam naturalmente, ou são transfec- tadas para expressar, polipeptídeo(s) CXCR4. Em um aspecto, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitivo, em que a habilidade de um anticorpo candidato de competir com um anticorpo anti- CXCR4 conhecido, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, para ligação CXCR4 é avaliado. O ensaio pode ser executado em vários formatos, incluindo o formato ELISA.
[00169] Seguinte à identificação inicial, a atividade de um anticorpo anti-CXCR4 candidato, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, pode ser confirmado adicionalmente e refinado por bioensaios, conhecidos por testar as atividades biológicas almejadas. Alternativamente, bioensaios podem ser usados para classificar candidatos diretamente. Alguns dos métodos para identificar e distinguir anticorpos anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, são descritos em detalhes nos Exemplos.
[00170] Anticorpos anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação de antí- geno dos mesmos, podem ser distinguidos com uso de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é identificar o epítopo ao qual se ligam ou "mapeamento de epítopo." Há muitos métodos co-nhecidos na técnica para mapeamento e distinguir a localização de epítopos em proteínas, incluindo resolver a estrutura cristalina de um complexo anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de ex-pressão de fragmento de gene e ensaios à base de peptídeo sintético, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epítopo pode ser usado para determinar a sequência a qual um anticorpo anti-CXCR4, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, se liga. O mapeamento de epítopo está comerci-almentedisponível a partir de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holanda). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um alcance único de ami- noácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que podem não necessariamente estar contidos em um alcance único. Peptídeos de comprimentos variáveis (por exemplo, de pelo menos 4 a 6 aminoácidos) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, de modo recombinante) e usados para ensaios de ligação com um anticorpo anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo. Em outro exemplo, o epítopo ao qual o anticorpo anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo,ligações podem ser determinadas em uma classificação sistemática usando-se peptídeos sobrepostos derivados a partir da sequência CXCR4 e determinando-se a ligação pelo anticorpo anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo. De acordo com os ensaios de expressão de fragmento de gene, o quadro de leitura aberta que codifica CXCR4 é fragmentado aleatoriamente ou por construções genéticas específicas e a reatividade dos fragmentos expressos de CXCR4 com o anticorpo a ser testado é determinada. Os fragmentos de gene podem, por exemplo, ser produzidos por PCR e então transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos. A ligação do anticorpo aos fragmentos CXCR4 radioativamente rotulados é então determinada por imunoprecipitação e eletroforese em gel. Certos epítopos também podem ser identificados usando- se bibliotecas grandes de sequências de peptídeo aleatórias exibidas na superfície de partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, uma biblioteca definida de fragmentos de peptídeo sobrepostos pode ser testada para ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, mutagênese de um domínio de ligação de antígeno, experimentos de troca de domínio e mutagê- nese de varredura de alanina podem ser executados para identificar resíduos exigidos, suficientes, e/ou necessários para ligação de epíto- po. Por exemplo, experimentos de troca de domínio podem ser executados com uso de um CXCR4 mutante em que vários fragmentos da proteína CXCR4 foram substituídos (trocados) com sequências de CXCR4 de outras espécies (por exemplo, camundongo), ou uma pro- teína intimamente relacionada, mas distinta de modo antigênico (por exemplo, CXCR4). Avaliando-se a ligação do anticorpo ao CXCR4 mu-tante, a importância do fragmento CXCR4 particular à ligação de anti-corpo pode ser avaliada.
[00171] Ainda outro método que pode ser usado para distinguir um anticorpo anti-CXCR4 é usar ensaios de competição com outros anti-corpos conhecidos como que ligam o mesmo antígeno, isto é, vários fragmentos em CXCR4, para determinar se o anticorpo anti-CXCR4 compete com e/ou se liga ao mesmo epítopo como outros anticorpos. Ensaios de competição são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00172] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga CXCR4, compete para ligar ao CXCR4 com e/ou se liga ao mesmo epítopo de CXCR4. Entre anticorpos que competem para ligação a CXCR4 e/ou se ligam ao mesmo epítopo de CXCR4 incluem anticorpos que compreendem pelo menos uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) um VH CDR1 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NOs:107, 113, 114, 108, 109, 115, 116, 117, 121 e 122; (ii) um VH CDR2 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NOs: 162, 128, 110, 111, 118, 119, 154, 123, 158, 124, 159, 125, 160, 126, 161, 127, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 155, 129, 156, e 130, e (iii) um VH CDR3 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NOs: 112; e 120; e/ou; pelo menos uma região variável de cadeia leve (VL) região que compreende (i) um VL CDR1 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NOs: 144, 131, 135, 138, 141, 142, 143, 146, 147, 148, 149, 150 e 151; (ii) um VL CDR2 selecionado do grupo que consistindo em 145, 132, 136 e 152; e (iii) um VL CDR3 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NO: 139, 133, 137, 140 e 153
[00173] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo compete para ligar ao CXCR4 com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs como SEQ ID NOs: 107, 162 e 112.
[00174] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo compete para ligar ao CXCR4 com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende três CDRs como SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
[00175] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo compete para ligar ao CXCR4 com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs como SEQ ID NOs: 107, 162 e 112; e b) uma região de cadeia leve variável (VL) que compreendetrês CDRs como SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
[00176] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo compete para ligar ao CXCR4 com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 a partir de uma região VH de SEQ ID NO: 33; e/ou b) uma região de cadeia leve variável (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 a partir de uma região VL de SEQ ID NO: 73.
[00177] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo compete para ligar ao CXCR4 com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que compreende a) uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 33; e/ou b) uma região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 73.
[00178] Um vetor de expressão pode ser usado para direcionar a expressão de um anticorpo anti-CXCR4, ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo. Uma pessoa versada na técnica é familiar com a administração de vetores de expressão para obter expressão de uma proteína exógena in vivo. Consulte, por exemplo, Patentes U.S. n° 6.436.908; 6.413.942 e 6.376.471. A administração de vetores de ex-pressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, ad-ministração oral, pistola de partículas ou administração por cateter e administração tópica. Em outro aspecto da invenção, o vetor de ex-pressão é administrado diretamente ao tronco simpático ou gânglio, ou em uma artéria coronária, átrio, ventrículo ou pericárdio.
[00179] A entrega almejada de composições terapêuticas que contêm um vetor de expressão ou polinucleotídeos subgenômicos também pode ser usada. Conjuntos de procedimentos de entrega de DNA mediada por receptor são descritos em, por exemplo, Findeis et al., Trends Biotechnol. 11:202 (1993); Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 263:621 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem., 269:542 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655 (1990); e Wu et al., J. Biol. Chem., 266:338 (1991). Composições terapêuticas que contêm um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia de gene. Faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 μ g a cerca de 2 mg, cerca de 5 μ g a cerca de 500 μ g e cerca de 20 μ g a cerca de 100 μ g de DNA também podem ser usadas durante um protocolo de terapia de gene. Os polinucleotídeos terapêuticos e polipep- tídeos podem ser entregues usando-se veículos de entrega de gene. O veículo de entrega de gene pode ser de origem viral ou não viral (ver, geralmente, Jolly et al., Cancer Gene Therapy,1:51 (1994); Kimura, Human Gene Therapy, 5:845 (1994); Connelly et al., Human Gene Therapy,1:185 (1995); e Kaplitt, Nature Genetics, 6:148 (1994)). A expressão de tais sequências de codificação pode ser induzida com uso de promotores mamíferos endógenos ou heterólogos. A expressão da sequência de codificação pode ser constitutiva ou regulada.
[00180] Vetores à base de vírus para entrega de um polinucleotídeo desejado e expressão em uma célula desejada são bem conhecidos na técnica. Veículos à base de vírus exemplificativos incluem, mas sem limitação, retrovírus recombinantes (ver, por exemplo, Publicação PCT nos WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patente U.S. nos 5.219.740 e 4.777.127; Patente GB no 2.200.651; e Patente EP no 0 345 242), vetores à base de alfavírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus Semliki forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírus de encefalite equina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e vetores de vírus adenoassociados (AAV) (ver, por exemplo, Publicação PCT nos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). A administração de DNA ligada a adenovírus morto conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147 também pode ser empregada.
[00181] Veículos de entrega não virais e métodos também podem ser empregados, incluindo, mas sem limitação, DNA condensado poli- catiônico ligado ou não ligado a adenovirus morto independente (ver, por exemplo, Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3:147 (1992)); DNA ligado de ligante (ver, por exemplo, Wu, J. et al., Biol. Chem., 264:16985 (1989)); células de veículos de entrega de célula eucariótica (ver, por exemplo, Patente U.S. no 5,814,482; Publicação PCT nos WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nucleica ou fusão com membranas de célula. DNA desnudotambém pode ser empregado. Métodos de introdução de DNA desnudo exemplificativos são descritos em Publicação PCT no WO 90/11092 e Patente U.S. no 5.580.859. Lipossomos que podem agir como veículos de entrega de gene são descritos em Patente U.S. no 5.422.120; Publicação PCT nos WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e EP 0524968. Abordagens adicionais são descritas em Philip et al., Mol. Cell Biol., 14:2411 (1994) e em Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581 (1994).
[00182] Em alguns aspectos da invenção, a invenção abrange composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem anticorpos descritos aqui ou feitos pelos métodos e tendo as ca-racterísticas descritas aqui. Conforme usado aqui, as composições compreendem um ou mais anticorpos que se ligam a CXCR4, e/ou um ou mais polinucleotídeos que compreendem sequências que codificam um ou mais desses anticorpos. Essas composições podem compreender adicionalmente excipientes adequados, como excipientes farma- ceuticamente aceitáveis incluindo tampões, os quais são bem conhe-cidos na técnica.
[00183] Consequentemente, a invenção fornece qualquer um dos seguintes, ou composições (incluindo composições farmacêuticas) que compreendem qualquer uma das sequências seguintes: TABELA 2
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[00184] Na Tabela 2, as sequências sublinhadas são sequências CDR, de acordo com Kabat, e em negrito, de acordo com Chothia.
[00185] A invenção também fornece porções CDR de anticorpos a CXCR4 (incluindo Chothia, Kabat CDRs e regiões de contato CDR). A determinação de regiões CDR está satisfatoriamente dentro da habilidade da técnica. É entendido que em alguns aspectos da invenção, CDRs podem ser uma combinação do CDR Kabat e Chothia (também denominados "CRs combinados" ou "CDRs estendidos"). Em algumas modalidades, os CDRs são os CDRs Kabat. Em outras modalidades, os CDRs são os CDRs Chothia. Em outras palavras, em modalidades com mais de um CDR, os CDRs podem ser qualquer um dentre Kabat, Chothia, CDRs de combinação ou combinações dos mesmos. As Tabelas 3 e 4 fornecem exemplos de sequências CDR fornecidas aqui. TABELA 3
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TABELA 4
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Figure img0026
[00186] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a CXCR4 e/ou compete com o anticorpo conforme descrito aqui, como m6B6, h6B6, m12A11, h12A11, m3G10, h3G10, h3G10.A57, h3G10.B44, h3G10.1.7, h3G10.1.60, h3G10.2.5, h3G10.1.91, h3G10.2.37, h3G10.2.45, h3G10.2.42, h3G10.1.33, h3G10.3.25, h3G10, h3G10.2.72, h3G10.A11A, h3G10.A18A, h3G10.A19A, h3G10.A58A, h3G10.A65A, e h3G10.B12A, h3G10.B13A, h3G10.B18A, h3G10.A11B, h3G10.A18B, h3G10.A19B, h3G10.A58B, h3G10.A65B, h3G10.B12B, h3G10.B13B, h3G10.B18B, h3G10.2.25, h3G10.A59, h3G10.A62 ou h3G10.L94D.
[00187] Em outro aspecto, o anticorpo compete com a ligação de CXCR4 com anticorpo m6B6, h6B6, m12A11, h12A11, m3G10, h3G10, h3G10.A57, h3G10.B44, h3G10.1.7, h3G10.1.60, h3G10.2.5, h3G10.1.91, h3G10.2.37, h3G10.2.45, h3G10.2.42, h3G10.1.33, h3G10.3.25, h3G10, h3G10.2.72, h3G10.A11A, h3G10.A18A, h3G10.A19A, h3G10.A58A, h3G10.A65A, e h3G10.B12A, h3G10.B13A, h3G10.B18A, h3G10.A11B, h3G10.A18B, h3G10.A19B, h3G10.A58B, h3G10.A65B, h3G10.B12B, h3G10.B13B, h3G10.B18B, h3G10.2.25, h3G10.A59, h3G10.A62 ou h3G10.L94D.
[00188] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo compete com a ligação de CXCR4 com um anticorpo da presente invenção e tem uma afinidade de ligação de anticorpo monovalente (KD) de cerca de qualquer um ou menos que cerca de qualquer um dentre 6,5 nM, 6,0nM, 5,5 nM, 5,0 nM, 4,5 nM, 4.0 nM, 3,5 nM, 3,0 nM, 2,5 nM, 2,0 nM, 1,5 nM, 1,0 nM, 0,5 nM ou 0,25 nM conforme medido por ressonância do plásmon de superfície. Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo compete com a ligação de CXCR4 com anticorpo h3G10 e tem uma afinidade de ligação de anticorpo monovalente (KD) de cerca de qualquer um ou menos que qualquer um dentre 30 nM, 25 nM, 22 nM, 20 nM, 15nM ou 10 nM.
[00189] Em alguns aspectos, a invenção também fornece porções CDR de anticorpos a anticorpos anti-CXCR4 com base em regiões de contato CDR. As regiões de contato CDR são regiões de um anticorpo que confere especificidade ao anticorpo para um antígeno. Em geral, regiões de contato CDR incluem as posições de resíduo nos CDRs e zonas Vernier que são constritas a fim de manter estrutura de laço apropriada para o anticorpo para se ligar a um antígeno específico. Ber, por exemplo, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156 a 1166, 2007. A determinação de regiões de contato CDR está satisfatoriamente dentro da habilidade da técnica.
[00190] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga a um re-ceptor de quimiocinas 4 (CXCR4) compreende: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) um VH CDR1 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NOs:107, 113, 114, 108, 109, 115, 116, 117, 121 e 122; (ii) um VH CDR2 selecionado do grupo que con-sistindo em SEQ ID NOs: 162, 128, 110, 111, 118, 119, 154, 123, 158, 124, 159, 125, 160, 126, 161, 127, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 155, 129 156, e 130, e (iii) um VH CDR3 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NOs: 112; e 120; e/ou; b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) um VL CDR1 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NOs: 144, 131, 135, 138, 141, 142, 143, 146, 147, 148, 149, 150 e 151; (ii) um VL CDR2 selecionado do grupo que consistindo em 145, 132, 136 e 152; e (iii) um VL CDR3 selecionado do grupo que consistindo em SEQ ID NO: 139, 133, 137, 140 e 153
[00191] Em um aspecto, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga a CXCR4 compreende regiões CDR variáveis de cadeia pesada (VH) que compreendem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NOs: 107, 113, 114, 108, 109, 115, 116, 117, 121, 122; 162, 128, 110, 111, 118, 119, 154, 123, 158, 124, 159, 125, 160, 126, 161, 127, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 155, 129, 156, 130, 112 e 120. Em um aspecto, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga a CXCR4 compreende regiões CDR variáveis de cadeia pesada (VL) que com-preendem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NOs: 144, 131, 135, 138, 141, 142, 143, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 145, 132, 136, e 152, 139, 133, 137, 140 e 153.
[00192] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga ao CXCR4 compreende: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que com-preenderegiões determinantes complementares selecionadas a partir do grupo consistindo em (i) um VH CDR1 que compreende a sequência como SEQ ID NOs:107, 113, 114, 108, 109, 115, 116, 117, 121 E 122; (ii) um VH CDR2 que compreende a sequência como SEQ ID NOs: 162, 128, 110, 111, 118, 119, 154, 123, 158, 124, 159, 125, 160, 126, 161, 127, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 155, 129, 156, E 130 e; (iii) um VH CDR3 que compreende a sequência como SEQ ID NOs: 112; ou 120; e/ou b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreenderegiões determinantes complementares selecionadas do grupo que consistindo em (i) um VL CDR1 que compreende a sequência como SEQ ID NOs: 144, 131, 135, 138, 141, 142, 143, 146, 147, 148, 149, 150, ou 151; (ii) a VL CDR2 que compreende a sequência como SEQ ID NOs 145, 132, 136, ou 152; e (iii) um VL CDR3 que compreende a sequência como SEQ ID NOs: 139, 133, 137, 140 ou 153. Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga ao CXCR4, compreende: a) uma região de cadeia leve variável (VL) que compreende (i) VL CDR1 que compreende a sequência X1SX2X3SLFNSX4X5RKNYLX6 em que X1 é R ou K; X2é S ou A; X3é W, N ou Q; X4é H ou R; X5é T ou F; e/ou X6 é A, L, N ou M (SEQ ID NOs: 151); (ii) um VL CDR2 que compreende a sequência WASARX1S em que X1 é G ou E (SEQ ID NOs: 152), e (iii) VL CDR3 que compreende a sequência KQSFX1LRT em que X1 é N ou R (SEQ ID NO: 153); e/ou b) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) VH CDR1 que compreende a sequência como SEQ ID NOs:107, 108, 109, 113 ou 114; (ii) um VH CDR2 que compreende a sequência como SEQ ID NO: 157 e (iii) um VH CDR3 que compreende a sequência como SEQ ID NO: 112.
[00193] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga ao recep tor de quimiocinas 4 (CXCR4) e compreende: uma sequência de região variável de cadeia pesada (VH) que compreende: EVQLVES- GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVR- QAPGKGLEWVX1FIRHKX2NX3X4TX5EYSTX6X7X8GRFTISRDX9SKNX1 0LYLQMNSLX11X12EDTAVYYCAX13DLPGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 106), em que X1 é G ou S; X2 é V ou A; X3 é G , F, K, V, T, L ou I; X4é E ou Y; X5é T ou R; X6é W ou S; X7é D ou V; X8é K, T ou R; X9 é D ou N; X10é T ou S; X11 é R ou K; X12 é A ou T; e X13 é K ou R.
[00194] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que liga ao receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) é selecionado do grupo que consistindo em: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107, 113 ou 114; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 ou 128 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de cadeia leve variável (VL) que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; b) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:115, 116, 117, 121 ou 122; um VH CDR2 de SEQ ID NO:118 ou 119 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:120 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:135; um VL CDR2 de SEQ ID NO:136 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:137; c) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107, 108, 109, 113 ou 114; um VH CDR2 de SEQ ID NO:110 ou 111 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:131; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:133; d) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107, 108, 109, 113 ou 114; um VH CDR2 de SEQ ID NO:154 ou 123 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; e e) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107, 108, 109, 113 ou 114; um VH CDR2 de SEQ ID NO:157 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:151; um VL CDR2 de SEQ ID NO:152 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:153.
[00195] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga ao receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) é selecionado do grupo que consistindo em: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de cadeia leve variável (VL) que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; b) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:115; um VH CDR2 de SEQ ID NO:118 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:120 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:135; um VL CDR2 de SEQ ID NO:136 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:137; c) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:110 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:131; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:133; d) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:154 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; e e) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:157 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:151; um VL CDR2 de SEQ ID NO:152 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:153.
[00196] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga ao receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) é selecionado do grupo que consistindo em: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de cadeia leve variável (VL) que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; b) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; c) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:150; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; d) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:141; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; e) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; f) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:147; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; g) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:159 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; h) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:160 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; i) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:161 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; j) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; k) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; l) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:164 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; m) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:165 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; o) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:166 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; p) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:167 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; q) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:168 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; r) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:168 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; s) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; t) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; u) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; v) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; e w) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140.
[00197] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendem: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs como SEQ ID NOs: 107, 162 e 112. Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendem: uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende três CDRs como SEQ ID NOs: 144, 145 e 139. Em al- guns aspectos da invenção, um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendem: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs como SEQ ID NOs: 107, 162 e 112; e b) uma região de cadeia leve variável (VL) que com-preendetrês CDRs como SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
[00198] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 a partir de uma região VH de SEQ ID NO: 33. Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende: uma região de cadeia leve variável (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 a partir de uma região VL de SEQ ID NO: 73. Ainda em outros aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação de an- tígeno do mesmo compreende: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 a partir de uma região VH de SEQ ID NO: 33; e b) uma região de cadeia leve variável (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 a partir de uma região VL de SEQ ID NO: 73.
[00199] Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é selecionado do grupo que consistindo em: a) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:33 e uma região VL de SEQ ID NO:73; b) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:13 e uma região VL de SEQ ID NO: 15; c) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO: 5 e uma região VL de SEQ ID NO:7; d) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:21 e um região VL de SEQ ID NO:47; e e) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:106 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139.
[00200] Em um aspecto da invenção, um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreende: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 33; e/ou b) uma região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 73.
[00201] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga ao CXCR4, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência mostrada em SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 85, 87 ou 106; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência mostrada em SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 15, 19- 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 169. Em um aspecto, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga a CXCR4 compreende uma região CDR variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 85, 87 ou 106. Em um aspecto, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga a CXCR4 compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 15, 19- 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ou 169.
[00202] Em alguns aspectos da invenção, é fornecido o anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, selecionado do grupo consistindo em: a) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que com-preende uma região VH de SEQ ID NO:33 e a região VL de SEQ ID NO:73; b) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:13 e a região VL de SEQ ID NO:15; c) um anticorpo ou fragmento de ligação de antíge- no do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:5 e a região VL de SEQ ID NO:7; d) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:21 e a região VL de SEQ ID NO:47; e e) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:106 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132; e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139.
[00203] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende a) uma região de cadeia pesada variável (VH) de SEQ ID NO: 33; e/ou b) uma região de cadeia leve variável (VL) de SEQ ID NO: 73. Em aspectos particulares, o fragmento de ligação de anticorpo ou antígeno da mesma compreende uma região de cadeia pesada variável (VH) produzida pelo vetor de expressão com No de Acesso à ATCC PTA-121353. Em outros aspectos, o fragmento de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma região de cadeia leve variável (VL) produzida pelo vetor de expressão com No de Acesso à ATCC PTA-121354.
[00204] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga ao receptor de quimioci- na 4 (CXCR4) é selecionado a partir do grupo que consiste em: a) uma região de cadeia pesada variável (VH) que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de cadeia leve variável (VL) que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; b) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; c) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:150; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; d) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:141; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; e) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; f) a região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:147; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; g) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:159 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; h) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:160 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; i) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:161 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; j) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; k) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; l) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:164 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; m) uma região VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:165 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; n) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:166 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; o) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:167 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; p) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:168 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; q) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:168 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:138; um VL CDR2 de SEQ ID NO:132 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; r) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140; s) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:158 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; t) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; u) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:163 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139; e v) uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO:107; um VH CDR2 de SEQ ID NO:162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO:112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO:144; um VL CDR2 de SEQ ID NO:145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:140.
[00205] Em aspectos particulares da invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região de VH que tem um VH CDR1 de SEQ ID NO: 107; um VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 e um VH CDR3 de SEQ ID NO: 112 e uma região de VL que tem um VL CDR1 de SEQ ID NO: 144; um VL CDR2 de SEQ ID NO: 145 e um VL CDR3 de SEQ ID NO:139.
[00206] A afinidade de ligação (KD) do anticorpo anti-CXXR4 ou fra-gmentos de ligação de antígeno do, conforme descrito no presente do- cumento, ao CXCR4 (tal como CXCR4 humano) é cerca de 0,002 a cerca de 200 nM. Em alguns aspectos da invenção, a afinidade de ligação é qualquer uma dentre cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 45 nM, cerca de 40 nM, cerca de 35 nM, cerca de 30 nM, cerca de 25 nM, cerca de 20 nM, cerca de 15 nM, cerca de 10 nM, cerca de 8 nM, cerca de 7.5 nM, cerca de 7 nM, cerca de 6.5 nM, cerca de 6 nM, cerca de 5.5 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM ou cerca de 2 pM. Em alguns aspectos da invenção, a afinidade de ligação é menor do que qualquer uma dentre cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 30 nM, cerca de 20 nM, cerca de 10 nM, cerca de 7.5 nM, cerca de 7 nM, cerca de 6.5 nM, cerca de 6 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4.5 nM, cerca de 4 nM, cerca de 3.5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2.5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1.5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM ou cerca de 2 pM.
[00207] Em alguns aspectos da invenção, a afinidade de ligação (por exemplo, ligação de anticorpo monovalente) dos anticorpos conforme descrito no presente documento é cerca de 35 nM ou menos conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície. Em alguns aspectos da invenção, a afinidade de ligação (por exemplo, ligação de anticorpo monovalente) dos anticorpos conforme descrito no presente documento é cerca de 6,5 nM ou menos conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície.
[00208] A invenção fornece também métodos para produzir qualquer desses anticorpos. Os anticorpos desta invenção podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra degrada- ção dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos únicos ou de fusão) conforme descrito acima ou por síntese química. Polipeptídeos dos anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos com cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente produzidos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, um anticorpo poderia ser produzido por um sintetizador de polipeptídeo automatizado que emprega o método da fase sólida. Consulte também, os Documentos de Patente no U.S. 5.807.715; 4.816.567 e 6.331.415.
[00209] Em outro aspecto da invenção, os anticorpos podem ser produzidos de modo recombinante através do uso de procedimento que são bastante conhecidos na técnica. Em outro aspecto, um polinucleotí- deo compreende uma sequência que codifica as regiões de cadeia pe-sada e/ou a cadeia leve variáveis de anticorpo m6B6, h6B6, m12A11, h12A11, m3G10, h3G10(VH), h3G10.A57, h3G10.B44, h3G10.1.7, h3G10.1.60, h3G10.2.5, h3G10.1.91, h3G10.2.37, h3G10.2.45, h3G10.2.42, h3G10.1.33, h3G10.3.25, h3G10.2.54, h3G10.A59, h3G10.A62, h3G10 (VL), h3G10.2.72, h3G10.A11A, h3G10.A18A, h3G10.A19A, h3G10.A58A, h3G10.A65A e h3G10.B12A, h3G10.B13A, h3G10.B18A, h3G10.A11B, h3G10.A18B, h3G10.A19B, h3G10.A58B, h3G10.A65B, h3G10.B12B, h3G10.B13B, h3G10.B18B, h3G10.2.25 ou h3G10.L94D. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. Vetores (o que inclui vetores de expressão) e células hospedeiras são descritos adicionalmente no presente documento.
[00210] A invenção engloba também scFv de anticorpos desta invenção. Fragmentos de região de cadeia variável únicos são produzidos ao ligar regiões de cadeia leve e/ou pesada variáveis através do uso de um peptídeo de ligação curta (Bird et al., Science 242:423 a 426, 1988). Um exemplo de um peptídeo de ligação é (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 89) que faz pontes de aproximadamente 3,5 nm entre os carbóxi terminais de uma região variável e da projetada e usada (Bird et al., 1988, supra). Os vinculadores devem ser polipeptídeos flexíveis e curtos e preferencialmente com menos do que cerca de 20 resíduos de aminoácidos. Por sua vez, os vinculadores podem ser modificados para funções adicionais, tal como ligação de fármaco ou ligação de sustentações sólidas. As variantes de cadeia única podem ser produ-zidas recombinantemente ou sinteticamente. Para produção sintética de scFv, um sintetizador automatizado pode ser usado. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado que contém poli- nucleotídeo que codifica a scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, eucariótica, tal como célula de levedura, planta, inseto ou mamífero ou procariótica, amino terminal da outra região va-riável. Os vinculadores de outras sequências foram tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam a scFv de interesse podem ser pro-duzidos por manipulações de rotina tal como ligação de polinucleotí- deos. A scFv resultante pode ser isolada através do uso de técnicas de purificação de proteína padrão conhecidas na técnica.
[00211] Outras formas de anticorpos de cadeia única, tal como dia- corpos ou minicorpos são englobados também. Diacorpos são bivalentes, anticorpos biespecíficos nos quais os domínios da cadeia pesadavariável (VH) e cadeia leve variável (VL) são expressos em uma única cadeia de polipeptídeos, mas através do uso de um vinculador que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia e assim força os domínios a parearem com domínios complementares de outra cadeia e criarem dois locais de ligação de antígeno (consulte, por exemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444 a 6448 (1993); Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121 a 1123 (1994)). Minicorpo inclui os domínios VL e VH de um anticorpo nativo fundido à região de articulação e ao domínio CH3 da molécula de imunoglobulina. Consulte, por exemplo, o Documento de Patente no U.S. 5.837.821.
[00212] Um anticorpo biespecífico é um anticorpo que pode ligar simultaneamente dois alvos diferentes. Os anticorpos biespecíficos (bsAb) e fragmentos de anticorpo biespecífico (bsFab) podem ter pelo menos um braço que se liga, por exemplo, a um antígeno associado a tumor e pelo menos um outro braço que se liga a um conjugado alve- jável que suporta um agente terapêutico ou diagnóstico. Uma variedade de proteínas de fusão biespecíficas pode ser produzida através do uso de engenharia molecular.
[00213] Por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos monoclo- nais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antíge- nos diferentes, podem ser preparados através do uso dos anticorpos revelados no presente documento. Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Su- resh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos se baseou na coexpressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imuno- globulina, sendo que as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Millstein e Cuello, Nature 305, 537 a 539 (1983)).
[00214] De acordo com uma abordagem para produzir anticorpos biespecíficos, domínios de anticorpo variável com as especificidades de ligação desejadas (locais de ligação de anticorpo-antígeno) são fundidos a sequências de região constante de imunoglobulina. A fusão é preferencialmente com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende pelo menos parte das regiões de arti-culação, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) com o local necessário para a ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro ade-quado. Isso fornece grande flexibilidade para ajustar as proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem produções ideais. Contudo, é possível inserir as sequências codificadoras para duas ou todas as três cadeias de polipep- tídeo em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em grandes produções ou quando as razões não têm são significativas.
[00215] Em alguns aspectos da invenção, os anticorpos biespecífi- cos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeias leve-cadeia pesada de imunoglobulina híbrido (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Essa estrutura assimétrica, com uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica, facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas. Essa abordagem é descrita no Documento WO 1994/004690.
[00216] Em outro aspecto, os anticorpos biespecíficos são compostos de modificação de aminoácido na primeira região de articulação em um braço e o aminoácido substituído/restituído na primeira região de articulação tem uma carga oposta ao aminoácido correspondente na segunda região de articulação em outro braço. Essa abordagem é descrita no Documento WO 2011/143545.
[00217] Em outro aspecto, os anticorpos biespecíficos podem ser gerados através do uso de uma etiqueta de peptídeo que contém glu- tamina projetada para o anticorpo direcionada para um epítopo (por exemplo, CXCR4) em um braço e outra etiqueta de peptídeo (por exemplo, uma etiqueta de peptídeo que contém Lys ou um Lys endógeno reativo) projetada para um segundo anticorpo direcionado para um segundo epítopo em outro braço na presença de transglutaminase. Essa abordagem é descrita na Publicação do PCT no WO 2012/059882.
[00218] Os anticorpos heteroconjugados que compreendem dois anticorpos unidos de modo covalente estão também dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos foram usados para almejar células do sis-temaimunológico em células indesejadas (Documento de Patente no U.S. 4.676.980) e para tratamento de infecção com HIV (Publicação do PCT no WO 1991/000360). Anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos através do uso de quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados e técnicas são bastante conhecidos na técnica e são descritos no Documento de Patente no U.S. 4.676.980.
[00219] Anticorpos quiméricos ou híbridos podem ser também pre-paradosin vitro através do uso de métodos conhecidos de química de proteína sintética, o que inclui aqueles que envolvem agentes de reti- culação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas através do uso de uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esse propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.
[00220] A invenção engloba modificações nos anticorpos e polipep- tídeos das variantes da invenção mostrados na Tabela 2, o que inclui anticorpos funcionalmente equivalentes que não afetam significativa-mente as propriedades dos mesmos e variantes que têm atividade e/ou afinidade aprimorada ou diminuída. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode sofrer mutação para obter um anticorpo com a afi-nidade de ligação desejada para CXCR4. A modificação dos polipeptí- deos é prática de rotina na técnica e não precisa ser descrita em deta-lhes no presente documento. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com modificações de sequência conservadoras. Conforme usado no presente documento, o termo "modificações de sequência conservadoras" pretende se referir às modificações de ami- noácido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservadoras incluem substituições, adições e de- leções de aminoácidos que não mudam significativamente de modo deletério a atividade funcional ou que amadurecem (intensificam) a afinidade do polipeptídeo com o ligante do mesmo ou o uso de análogosquímicos.
[00221] As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo dessa descrição por técnicas-padrão conhecidas na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácidos conservadoras são aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoá- cido que tem cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Es-sasfamílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exem-plo,ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não car-regadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), ca-deias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, iso- leucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalani- na, triptofano, histidina). Portanto, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões de CDR de um anticorpo dessa descrição podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado em relação à fun-ção retida (isto é, as funções estabelecidas acima) através do uso dos ensaios funcionais descritos no presente documento.
[00222] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de amino- e/ou carbóxi terminal que variam em comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, assim como inserções de intrassequência de resíduos de ami- noácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções de terminal incluem um anticorpo com um resíduo de metionil N terminal ou o anticorpo fundido com uma etiqueta de epítopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N ou C terminal do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo na circulação sanguínea.
[00223] Variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removida e um resíduo diferente inserido no lugar da mesma. Os locais de maior interesse para muta- gênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas altera-ções de FR são contempladas também. Substituições conservadoras são mostradas na Tabela 5 abaixo do cabeçalho de "substituições conservadoras". Se tais substituições resultam em uma mudança na atividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela 5 ou conforme descrito adi-cionalmente abaixo em referência às classes de aminoácido podem ser introduzidas e os produtos examinados. TABELA 5 SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDO
Figure img0027
[00224] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são alcançadas através da seleção de substituições que di-ferem significativamente no efeito das mesmas na manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeos na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns:
[00225] (1) Não polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[00226] (2) Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[00227] (3) Ácido (negativamente carregado): Asp, Glu;
[00228] (4) Básico (positivamente carregado): Lys, Arg;
[00229] (5) Resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gly, Pro; e
[00230] (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.
[00231] Substituições não conservadoras são feitas através da troca de um membro de uma dessas classes para outra classe.
[00232] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo pode ser substituído também, geralmente por serina, para intensificar a estabilidade oxidativa da mo-lécula e prevenir reticulação aberrante. De modo contrário, ligação(s) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para intensificar a estabilidade do mesmo, particularmente quando o anticorpo é um fra-gmento de anticorpo tal como um fragmento de Fv.
[00233] Modificações de aminoácido podem variar de mudar ou modificar um ou mais aminoácidos para a reprojeção completa de uma região, tal como a região variável. As mudanças na região variável podem alterar a afinidade de ligação e/ou a especificidade. Em alguns aspectos da invenção, não mais do que de uma a cinco substituições de aminoácidos conservadoras são feitas dentro de um domínio CDR. Em outros aspectos da invenção, não mais do que uma a três substi-tuições de aminoácidos conservadoras são feitas dentro de um domínio CDR.
[00234] As modificações incluem também polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, assim como polipeptídeos com outras modificações pós-translacionais, tal como, por exemplo, a glicosilação com açúcares diferentes, acetilação e fosforilação. Anticorpos são glicosilados em posições conservadas nas regiões constantes dos mesmos (Jefferis e Lund, Chem. Immunol. 65:111 a 128 (1997); Wright e Morrison, Tib- TECH 15:26 a 32 (1997)). As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311 a 1318 (1996); Wittwe e Howard, Biochem. 29:4175 a 4180 (1990)) e a interação intramolecular entre as porções da glicopro- teína, o que pode afetar a conformação e superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Jefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409 a 416 (1996)). Os oligossacarídeos podem servir também para almejar uma dada glicoproteína em certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. A glicosilação de anticorpos foi relatada também por afetar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em particular, as células de CHO com expressão regulada por tetraciclina de β(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII), uma formação catalisadora de glicosiltransferase de GlcNAc em bisseção foram relatadas com atividade de ADCC intensificada (Umana et al., Mature Biotech. 17:176 a 180 (1999)).
[00235] A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada em N ou ligada em O. Ligada em N se refere à ligação da metade de carboidratoà cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tri- peptídeo asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X- cisteína, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as se-quências de reconhecimento para ligação enzimática da metade de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Portanto, a presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um local de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada em O se refere à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, apesar de 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também poderem ser usados.
[00236] A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é conve-nientementealcançada através da alteração da sequência de aminoá- cidos de modo que a mesma contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo descritas acima (para locais de glicosilação com ligação em N). A alteração pode ser feita também pela adição ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação com ligação em O).
[00237] O padrão de glicosilação dos anticorpos pode ser alterado também sem alterar a sequência de nucleotídeos subjacente. A glico- silação depende em grande parte da célula hospedeira usada para ex-pressar o anticorpo. Visto que o tipo de célula usado para expressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como tera-pêuticos potenciais é raramente a célula nativa, as variações no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (consulte, por exemplo, Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062 a 9070 (1997)).
[00238] Adicionalmente à escolha das células hospedeiras, os fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem modo de crescimento, formulação de meio, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Váriosmétodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação alcançado em um organismo hospedeiro particular o que inclui introduzir ou superexpressar certas enzimas envolvidas na produção de oligos- sacarídeos (Documentos de Patente N— U.S. 5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). A glicosilação ou certos tipos de glicosilação podem ser removidos de modo enzimático da glicoproteína, por exemplo, através do uso de endoglicosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endoglicosi- dase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Adicionalmente, a célula hospedeira recombinante pode ser projetada geneticamente para ser defeituosa ao processar certos tipos de polissacarídeos. Essas e técnicas similares são bastante conhecidas na técnica em questão.
[00239] Outra modificação dos anticorpos no presente documento que é contemplada por essa descrição é a pegilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pegilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, é tipicamente reagido com polietileno gli- col (PEG), tal como um éster reativo ou derivados de aldeído de PEG, em condições nas quais um ou mais grupos de PEG se tornar ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferencialmente, a pegila- ção é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme usado no presente documento, o termo "polietileno glicol" pretende englobar qualquer forma de PEG que foi usada para derivar outras proteínas, tal como mono (Cl-ClO) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certos aspectos da invenção, o anticorpo a ser peguilado é um anti- corpoaglicosilado. Métodos para peguilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos dessa descrição (Consulte, por exemplo, EP 0154316 por Nishimura et al. e EP0401384 por Ishikawa et al).
[00240] A presente invenção não se limita a anticorpos tradicionais e inclui o uso de fragmentos de anticorpo e miméticos de anticorpo. Variedades amplas de fragmento de anticorpo e tecnologias de mime-tismo de anticorpo foram desenvolvidos e são bastante conhecidos na técnica. Enquanto inúmeras dessas tecnologias, tal como anticorpos de domínio, Nanocorpos e unicorposUnicorpos fazem uso de fragmentos de, ou outras modificações para estruturas de anticorpo tradicionais,há também tecnologias alternativas, tal como aficorpos, DARPins, Avimers, Anticalins e Versabodies que empregam estruturas de ligação que, apesar de mimetizarem o anticorpo tradicional, são geradas a partir de e funcionam através de mecanismos distintos.
[00241] Anticorpos de domínio (dAbs) são as menores unidades de ligação funcionais de anticorpos que correspondem às regiões variáveis das cadeias pesada (VH) ou leve (VL) de anticorpos humanos. Domantis desenvolveu uma série de bibliotecas grandes e altamente funcionais de dAbs VH e VL humanos (mais de dez bilhões de sequências diferentes em cada biblioteca) e usa essas bibliotecas para selecionar dAbs que são específicos para alvos terapêuticos. Em contraste com muitos anticorpos convencionais, os Anticorpos de Domínio são bastante expressos em sistemas de célula de bactéria, levedura e mamífero. Detalhes adicionais de anticorpos de domínio e métodos de produção dos mesmos podem ser obtidos por referência aos Documentos de Patente no U.S. 6.291.158, 6.582.915, 6.593.081, 6.172.197 e 6.696.245, Documentos de Patente no U.S. 2004/0110941, Documentos de Patente Europeu no 1433846 e Patentes Europeias 0368684 & 0616640, WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 e WO03/002609, sendo que cada um é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[00242] Os nanocorpos são proteínas derivadas de anticorpo que contêm as propriedades estruturais e funcionais únicas de anticorpos de cadeia pesada que ocorrem naturalmente. Esses anticorpos de ca- deia pesada contêm um domínio variável único (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3). O domínio VHH clonado e isolado é um poli- peptídeo perfeitamente estável que possui a capacidade de ligação de antígeno completa do anticorpo de cadeia pesada original. Os nano- corpos têm uma homologia alta com os domínios VH de anticorpos humanos e podem ser humanizados adicionalmente sem qualquer perda de atividade. Ademais, nanocorpos combinam as vantagens de anticorpos convencionais com recursos importantes de fármacos de molécula pequena como anticorpos convencionais. Os nanocorpos mostram alta especificidade de alvo, alta afinidade para os alvos dos mesmos e baixa toxicidade inerente. Os nanobodies são codificados por genes únicos e são produzidos de modo eficiente na maioria dos hospedeiros procarióticos e eucarióticos, por exemplo, E. coli (consulte, por exemplo, o Documento de Patente no U.S. 6.765.087, que está incorporado no presente documento a título de referência em sua tota-lidade), moldes (por exemplo, Aspergillus ou Tπchoderma) e levedura (por exemplo, Saccharomyces, Kluiveromices, Hansenula ou Pichia) (consulte, por exemplo, o Documento de Patente no U.S. 6.838.254, que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade).
[00243] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece o uso de Unicorpos. Os unicorpos são outra tecnologia de fragmento de anticorpo com base na remoção da região de articulação de anticorpos lgG4. A deleção da região de articulação resulta em uma molécula que é essencialmente metade do tamanho de anticorpos lgG4 tradicionais e tem uma região de ligação univalente em vez da região de ligação bivalente de anticorpos lgG4. É bastante conhecido também que anti-corpos lgG4 são inertes e, portanto, não interagem com o sistema imunológico, o que pode ser vantajoso para o tratamento de doenças nas quais uma resposta imunológica não seja desejada e essa vanta- gem é passada para os unicorpos. Por exemplo, os unicorpos podem funcionar para inibir ou silenciar, mas não matar, as células às quais os mesmos estão ligados. Adicionalmente, o unicorpo que se liga a células cancerígenas não estimula as mesmas a proliferar. Além disso, devido ao fato de os unicorpos terem aproximadamente a metade do tamanho de anticorpos lgG4 tradicionais, os mesmos podem mostrar melhor distribuição por tumores sólidos maiores com unicorpos de eficácia potencialmente vantajosa eliminado do corpo com uma taxa similar a anticorpos lgG4 integrais e tem capacidade para se ligar com uma afinidade similar para os antígenos dos mesmos como anticorpos integrais. Detalhes adicionais de unicorpos podem ser obtidos por refe-rência na Publicação PCT WO2007/059782, que é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[00244] Em alguns aspectos, a presente invenção engloba moléculas de aficorpo. As moléculas de aficorpo são uma nova classe de proteínas de afinidade com base em um domínio de proteína de 58 resíduos de aminoácido derivado de um dentre os domínios de ligação de IgG de proteína staphylococcal A. Esse domínio de conjunto de tripla hélice foi usado como um arcabouço para a construção de bibliotecas de fagomídeos combinatória, a partir das quais as variantes de aficor- po que almejam as moléculas desejadas podem ser selecionadas através do uso de tecnologia de exibição de fago (Nord K, Gunnetts- son E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 15 772-7 (1997), Ronmark J, Gronlund H, Uh- len M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem.,269 264755 (2002)). A estrutura simples e robusta das moléculas de aficorpo em combinação com o peso molecular baixo das mesmas (6 kDa), faz do mesmo adequado para uma ampla variedade de aplicações, por exemplo, como reagentes de detecção (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods,261 199 a 211 (2002)) e para inibir interações de receptor (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co- stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial engineering, protein Eng.,16 691 a 697 (2003)). Detalhes adicionais de aficorpos e métodos de produção dos mesmos podem ser obtidos por referência no Documento de Patente no U.S. 5.831.012 que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.
[00245] Outra tecnologia de mimetismo de anticorpo útil no contexto da presente invenção é Avimers. Avimers são evoluídos de uma grande família de domínios de receptor extracelular humano por embaralhamento de éxon in vitro e exibição de fago que gera proteínas multi- domínios com propriedades de ligação e inibitórias. Ligar múltiplos domínios de ligação independente mostrou criar avidez e resultados em afinidade e especificidade intensificadas em comparação com proteínas de ligação de epítopo único convencional. Outras vantagens potenciais incluem produção simples e eficiente de moléculas específicas de múltiplos alvos em Escherichia coli, termoestabilidade intensificada e resistência a proteases Avimers com afinidades subnanomola- res foram obtidas contra uma variedade de alvos. Informações adicionais com relação a Avimers podem ser encontradas nos Documentos de Patente no U.S.2006/0286603, 2006/0234299, 2006/02231 14, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, todos os quais estão aqui incorporadas, por referência, em sua totalidade.
[00246] Versabodies são outra tecnologia mimética de anticorpo que poderia ser usada no contexto da presente invenção. Versabodies são pequenas proteínas de 3 a 5 kDa com > 15% de cisteínas, as quais formam uma armação de alta densidade de dissulfeto, que substitui o núcleo hidrofóbico que proteínas típicas têm. A substituição de um grande número de aminoácidos hidrofóbicos, o que compreende o núcleo hidrofóbico, com um pequeno número de dissulfetos resulta em uma proteína que é menor, mais hidrofílica (menor agregação e ligação não específica), mais resistência a proteases e calor e tem uma densidade mais baixa de epítopos de célula T, pois os resíduos que contribuem mais para a apresentação de MHC são hidrofóbicos. Todas essas propriedades são bem conhecidas por afetar imunogenici- dade e se espera que juntas as mesmas causem uma grande diminuição em imunogenicidade. Informações adicionais com relação a Ver- sabodies podem ser encontradas no Documento de Patente no U.S 2007/0191272 que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.
[00247] A descrição detalhada do fragmento de anticorpo e tecno-logiasmiméticas de anticorpo fornecida acima não pretende ser uma lista abrangente de todas as tecnologias que poderiam ser usadas no contexto do presente relatório descritivo. Por exemplo, e também sem ser uma forma de limitação, uma variedade de tecnologias poderia ser usada no contexto da presente invenção adicionais o que inclui tecno-logias com base em polipeptídeos alternativa, tal como fusões de regiões de determinação complementares conforme descrito em Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921 a 929 (2007), que é incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade, assim como tecnologias com base em ácido, tal como as tecnologias de aptâmero de RNA descritas nos Documentos de Patente no U.S. 5.789.157; 5.864.026; 5.712.375; 5.763.566; 6.013.443; 6.376.474; 6.613.526; 6.114.120; 6.261.774 e 6.387.620, todos o quais são incorporados no presente documento por referência em sua totalidade.
[00248] Outros métodos de modificação incluem através do uso de técnicas de acoplamento conhecidas na técnica em questão, o que inclui, mas sem limitação, meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. Modificações podem ser usadas, por exemplo, para ligação de rótulos para imunoensaio. Polipeptídeos modificados são produzi-dosatravés do uso de procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser examinados através do uso de ensaios-padrão conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos a seguir e nos Exemplos.
[00249] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que tem afinidade aumentada com um receptor gama Fc humano, é imuno- logicamente inerte ou parcialmente inerte, por exemplo, não aciona lises mediadas por complemento, não estimula citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou não ativa macrófagos ou tem atividades reduzidas (em comparação com o anticorpo não modificado) em qualquer um dentre os seguintes: acionar lise mediada por complemento, estimular citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou ativar microglia. Modificações diferentes da região constante podem ser usadas para alcançar nível ideal e/ou combinação de funções efetoras. Consulte, por exemplo, Morgan et al., Immunology 86:319 a 324 (1995); Lund et al., J. Immunology 57:4963-9 157:4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989) e Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Em alguns aspectos da invenção, a região constante é modifica conforme descrito em Eur. J. Immunol., 29:2613-2624 (1999); Publicação PCT no WO1999/058572. Em outros aspectos da invenção, o anticorpo compreende uma região constante lgG2 de cadeia pesada humana que compreende as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à sequência lgG2 do tipo selvagem). Eur. J. Immunol., 29:2613-2624 (1999). Em ainda outros aspec- tos da invenção, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada em N. Em alguns aspectos da invenção, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada em N ao mutar o resíduo de ami- noácido glicosilado ou resíduos em flanqueamento que são parte da sequência de reconhecimento de glicosilação em N na região constante. Por exemplo, local de glicosilação em N N297 pode sofrer mutação para A, Q, K, ou H. Consulte, Tao et al., J. Immunology 143: 25952601 (1989) e Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Em alguns aspectos da invenção, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada em N. A região constante pode ser aglicosila- da para glicosilação ligada em N de modo enzimático (tal como ao remover carboidrato por enzima PNGase) ou pela expressão em uma célula hospedeira diferente em glicosilação.
[00250] Outras modificações de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados conforme descrito na Publicação PCT no WO 99/58572. Esses anticorpos compreendem, adicionalmente a um domínio de ligação direcionado para a molécula-alvo, um domínio de ligação efetor que tem uma sequência de aminoácidos substancialmentehomóloga a toda ou parte de uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Esses anticorpos têm capacidade de ligar a molécula-alvo sem acionar lises dependentes de complemento significativas ou destruição do alvo mediada por célula. Em alguns aspectos da invenção, o domínio efetor tem capacidade de ligar FcRn e/ou FcYRIIb. Esses são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Anticorpos modificados dessa maneira são particularmente adequados para o uso em terapia de anticorpo crônica para evitar reações inflamatórias e outras reações adversas na terapia de anticorpo convencional.
[00251] A invenção inclui anticorpos com afinidade madura. Por exemplo, anticorpos com afinidade aprimorada podem ser produzidos pelo procedimento conhecido na técnica (Marks et al., Bio/Technology, 10:779 a 783 (1992); Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809 a 3813 (1994); Schier et al., Gene, 169:147 a 155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155:1994 a 2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995), Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889 a 896 (1992) e Publicação PCT no WO2004/058184).
[00252] Os métodos a seguir podem ser usados para ajustar a afinidade de um anticorpo e para caracterizar uma CDR. Uma forma de caracterizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como aprimorar) a afinidade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, se chama "mutagênese de varredura de biblioteca". Em geral, muta- gênese de varredura de biblioteca funciona da seguinte forma. Uma ou mais posições de aminoácido na CDR são substituídas por dois ou mais (tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) aminoácidos através do uso de métodos reconhecidos na técnica. Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em alguns aspectos da invenção, uma para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos são substituídos a cada posição). Em geral, a biblioteca inclui também um clone que compreende o aminoácido nativo (não substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20 a 80 clones (dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca são examinados em relação à afinidade de ligação ao polipeptídeo-alvo (ou outro alvo de ligação) e os candidatos com ligação aumentada, com a mesma ligação ou com nenhuma são identifi-cados.Métodos para determinar a afinidade de ligação são bem co-nhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser determinada através do uso de análise de ressonância plasmônica de superfície Biacore™, que detecta diferenças em afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou mais. Biacore™ é particularmente útil quando o anticorpo inicial já se liga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo, um KD de cerca de 10 nM ou menos. Examinar através do uso de res-sonância plasmônica de superfície Biacore™ é descrito nos Exemplos no presente documento.
[00253] Em outro aspecto, a invenção se refere ao anticorpo ou fra-gmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga CXCR4, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo tem um EC50 de menos do que 100 nM. Em ainda outro aspecto, a invenção se refere ao anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga CXCR4, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo tem um EC50 de menos do que 50 nM. Em ainda outro aspecto, a invenção se refere ao anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que liga CXCR4, sendo que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo tem um EC50 de menos do que 1 nM. O termo "EC50" significa a concentração do anticorpo de teste, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo-fármaco que é exigido para 50% de inibição em relação ao efeito máximo do mesmo in vitro. O termo "IC50"é definido como "a concentração inibitória de 50%"
[00254] Afinidade de ligação pode ser determinada através do uso de Kinexa Biocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imuno- ensaio ORIGEN (IGEN), arrefecimento de fluorescência, transferência de fluorescência e/ou exibição de levedura. Afinidade de ligação pode ser também examinada através do uso de um bioensaio adequado.
[00255] Em alguns aspectos da invenção, cada posição de aminoá- cido em uma CDR é substituída (em algumas modalidades, uma de cada vez) com todos os 20 aminoácidos naturais através do uso de métodos de mutagênese reconhecidos na técnica (alguns dos quais são descritos no presente documento). Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em alguns aspectos da invenção, uma para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de 20 membros (se todos os 20 aminoácidos são substituídos em cada posição).
[00256] Em alguns aspectos da invenção, a biblioteca a ser examinada compreende substituições em duas ou mais posições, as quais podem estar na mesma CDR ou em duas ou mais CDRs. Portanto, a biblioteca pode compreender substituições em duas ou mais posições em uma CDR. A biblioteca pode compreender a substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs. A biblioteca pode compreender a substituição em 3, 4, 5 ou mais posições, as ditas posições encontradas em dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs. A substituição pode ser preparada através do uso de códons de baixa redundância. Consulte, por exemplo, Tabela 2 de Balint et al., Gene 137(1):109 a 118 (1993).
[00257] A CDR pode ser CDRH3 e/ou CDRL3. A CDR pode ser uma ou mais de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e/ou CDRH3. A CDR pode ser uma Kabat CDR, uma Chothia CDR ou uma CDR estendida.
[00258] Candidatos com ligação aprimorada podem ser sequencia- dos, o que identifica um mutante de substituição de CDR que resulta em afinidade aprimorada (também chamada de uma substituição "aprimorada"). Candidatos que se ligam podem ser também sequenci- ados e identificar uma substituição de CDR que retém a ligação.
[00259] Múltiplos ciclos de exame podem ser conduzidos. Por exemplo, candidatos (cada um com uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições de uma ou mais CDR) com ligação aprimoradasão também úteis para projetar uma segunda biblioteca que contém pelo menos o aminoácido original e substituído em cada posição de CDR aprimorada (isto é, posição de aminoácido na CDR na qual um mutante de substituição mostrou ligação aprimorada). A preparação, exame e seleção dessa biblioteca são discutidos mais abaixo.
[00260] A mutagênese de varredura de biblioteca fornece também um meio de caracterizar uma CDR, na medida em que a frequência de clones com ligação aprimorada, a mesma ligação ou nenhuma ligação também fornece informações com relação à importância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do complexo anticorpo- antígeno. Por exemplo, se uma posição da CDR retém a ligação quando alterada para todos os 20 aminoácidos, essa posição é identificada como uma posição que é improvável de ser exigida para a ligação de antígeno. De modo contrário, se uma posição da CDR retém ligação em apenas uma pequena porcentagem de substituições, essa posição é identificada como uma posição que é importante para a função da CDR. Portanto, os métodos de mutagênese de varredura de biblioteca geram informações com relação a posições nas CDRs que podem ser alteradas para muitos aminoácidos diferentes (o que inclui todos os 20 aminoácidos) e posições nas CDRs as quais não podem ser alteradas ou as quais podem ser alteradas somente para alguns poucos aminoácidos.
[00261] Candidatos com afinidade aprimorada podem ser combinados em uma segunda biblioteca, o que inclui o aminoácido aprimorado, o aminoácido original naquela posição e pode incluir adicionalmente outras substituições naquela posição, dependendo da complexidade da biblioteca que é desejada ou permitida através do uso do método de seleção ou exame desejado. Adicionalmente, se desejado, a posição de aminoácido adjacente pode ser randomizada para pelo menos dois ou mais aminoácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade conformacional adicional na CDR mutante, o que pode, por sua vez, permitir ou facilitar a introdução de um grande número de mutações de aprimoramento. A biblioteca pode compreender também substituição em posições que não mostram afi-nidade aprimorada no primeiro ciclo de exame.
[00262] A segunda biblioteca é examinada ou selecionada para membros de biblioteca com afinidade de ligação aprimorada e/ou alteradaatravés do uso de qualquer método conhecido na técnica, o que inclui examinar através do uso de análise de ressonância plasmônica de superfície Biacore™ e seleção através do uso de qualquer método conhecido na técnica para seleção, o que inclui exibição de fago, exibição de levedura e exibição de ribossoma.
[00263] A invenção engloba também proteínas de fusão que com-preendem um ou mais fragmentos ou regiões dos anticorpos desta in-venção. Em alguns aspectos da invenção, um polipeptídeo de fusão é fornecido o qual compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região de cadeias de região de VH mostrada nos SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 85, 87 e 106; e/ou pelo menos 10 aminoácidos da região de região VL mostrada nos SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 15, 19, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 e 169. Em vários aspectos da invenção, um polipeptídeo de fusão é fornecido o qual compreende pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25 ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região de cadeia leve variável e/ou pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25 ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região de cadeia pesada variável. Em outro aspecto, o polipeptídeo de fusão compreende uma região de cadeia leve variável e/ou uma região de cadeia pesada variável, conforme mostrado em qualquer dos pares de sequência na Tabela 2. Por exemplo, SEQ ID NOs:3 e 5; 3 e 9; 7 e 5; 11 e 13; 15 e 13; 19 e 17; 69 e 31; 49 e 37 e 33 e 73. Em alguns aspectos, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou mais CDR(s). Em ainda outros aspectos, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 (VH CDR3) e/ou CDR L3 (VL CDR3). Para propósitos desta invenção, uma proteína de fusão contém um ou mais anticorpos e outra sequência de aminoácidos à qual a mesma não se liga na molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região. Sequências heterólogas exemplificativas incluem, mas sem limitação uma "etiqueta" tal como uma etiqueta FLAG ou uma etiqueta 6His. As etiquetas são bastante conhecidas na técnica.
[00264] Um polipeptídeo de fusão pode ser criado pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou de modo re- combinante. Tipicamente, as proteínas de fusão desta invenção são produzidas ao preparar e expressar um polinucleotídeo que codifica as mesmas através do uso de métodos recombinantes descritos no pre-sente documento, apesar das mesmas poderem ser também preparadas por outros meios conhecidos na técnica, o que inclui, por exemplo, síntese química.
[00265] Esta invenção fornece também composições que compreendem anticorpos conjugados (por exemplo, ligados) a um agente que facilita o acoplamento a um suporte sólido (tal como biotina ou avidi- na). Por uma questão de simplicidade, referência será feita em geral aos anticorpos com a compreensão de que esses métodos se aplicam a qualquer do anticorpo anti-CXXR4 ou fragmentos de ligação de antí- geno do mesmo, modalidades descritas no presente documento. A conjugação se refere em geral a ligar esses componentes conforme descrito no presente documento. A ligação (que em geral está afixando esses componentes em associação próxima pelo menos para administração) pode ser alcançada de inúmeras formas. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada uma possui um substituinte com capacidade de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, tal como um grupo amino ou sulfidril, pode ter a capacidade de reagir com um grupo que contém carbonil, tal como um anidrido ou um ácido haleto ou com um grupo alquila que contém um grupo de saída boa (por exemplo, um haleto) no outro.
[00266] A invenção fornece também polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos da invenção e vetores e células hospedeiras que compreendem o polinucleotídeo.
[00267] Desse modo, a invenção fornece polinucleotídeos (ou com-posições, o que inclui composições farmacêuticas) que compreendem polinucleotídeos que codificam qualquer dos seguintes: m6B6, h6B6, m12A11, h12A11, m3G10, h3G10, h3G10.A57, h3G10.B44, h3G10.1.7, h3G10.1.60, h3G10.2.5, h3G10.1.91, h3G10.2.37, h3G10.2.45, h3G10.2.42, h3G10.1.33, h3G10.3.25, h3G10, h3G10.2.72, h3G10.A11A, h3G10.A18A, h3G10.A19A, h3G10.A58A, h3G10.A65A e h3G10.B12A, h3G10.B13A, h3G10.B18A, h3G10.A11B, h3G10.A18B, h3G10.A19B, h3G10.A58B, h3G10.A65B, h3G10.B12B, h3G10.B13B, h3G10.B18B, h3G10.2.25, h3G10.A59 h3G10.A62, h3G10.L94D ou qualquer fragmento ou parte do mesmo que tem a capacidade de se ligar a CXCR4.
[00268] Em alguns aspectos, a invenção fornece polinucleotídeos que codificam qualquer dos anticorpos (o que inclui fragmentos de anticorpo) e polipeptídeos descritos no presente documento, tal como anticorpos e polipeptídeos que tem função debilitada ou aprimorada. Os polinucleotídeos podem ser produzidos e expressos pelo procedimento conhecido na técnica.
[00269] Em outros aspectos, a invenção fornece composições (tal como composições farmacêuticas) que compreendem qualquer dos polinucleotídeos da invenção. Em alguns aspectos, a composição compreende um vetor de expressão que compreende um polinucleotí- deo que codifica qualquer dos anticorpos descritos no presente docu- mento. Por exemplo, a composição compreende um dos ou ambos os polinucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 2 e 4 ou SEQ ID NO: 6 e 8 ou SEQ ID NO: 86 e 68.
[00270] Vetores de expressão e administração de composições de polinucleotídeo são descritos adicionalmente no presente documento.
[00271] Em outros aspectos, a invenção fornece um método de produzir qualquer dos polinucleotídeos descritos no presente documento.
[00272] Os polinucleotídeos complementares a quaisquer de tais sequências são englobados também pela presente invenção. Os poli- nucleotídeos podem ser de filamento único (codificadores ou antissen- so) ou de filamento duplo e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. Moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de uma maneira um para um e moléculas de mRNA que não contêm íntrons. Sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, mas não precisa ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.
[00273] Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção da mesma) ou pode compreender uma variante de tal sequência. As variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções de modo que a imunorreati- vidade do polipeptídeo codificado não é diminuída com relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imunorreatividade do poli- peptídeo codificado pode em geral ser avaliado conforme descrito no presente documento. As variantes preferencialmente exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80% de identidade, ainda mais preferencialmente, pelo me- nos cerca de 90% de identidade e com a maior preferência, pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de polinucleotí- deo que codifica um anticorpo nativo ou uma porção do mesmo.
[00274] Dois polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeo são ditos serem "idênticas"se a sequência de nucleotídeos ou aminoáci- dos nas duas sequências é a mesma quando alinhados para máxima correspondência conforme descrito abaixo. As comparações entre du-assequências são tipicamente realizadas ao comparar as sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação" conforme usada no presente documento, se refere a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente 30 a cerca de 75, ou 40 a cerca de 50, nas quais uma sequência pode estar em comparação com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois das duas sequências serem idealmente alinhadas.
[00275] Alinhamento ideal das sequências para comparação pode ser conduzido através do uso do programa Megalign no pacote de software de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), através do uso de parâmetros padrão. Esse programa incorpora diversos esquemas de alinhamento descritos nas referências a seguir: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345 a 358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M., CABIOS 5:151 a 153 (1989); Myers, E.W. e Muller W., CABIOS 4:11 a 17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor. 11:105 (1971); Santou, N., Nes, M., Mol. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. E Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726 a 730 (1983).
[00276] Preferencialmente, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada por comparação com duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, sendo que a porção do polinucleotídeo ou da sequência de po- lipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou de- leções (isto é, vãos) de 20 porcento ou menos, geralmente 5 a 15 porcento ou 10 a 12 porcento, como em comparação às sequências de referência (que não compreendem adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada ao determinar o número de posições nas quais as bases de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idênticos ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, ao dividir o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicar o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.
[00277] As variantes podem também, ou alternativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo ou uma porção ou complemento do mesmo. Tais variantes de polinucleotídeo têm capa-cidade para hibridizar em condições moderadamente estringentes para uma sequência de DNA que ocorre naturalmente que codifica um anti-corpo nativo (ou uma sequência complementar).
[00278] "Condições moderadamente estringentes" adequadas in-cluempré-lavar em uma solução de 5 X SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0); hibridizar a 50°C a 65°C, 5 X SSC , durante uma noite; em seguida uma lavagem dupla a 65 °C por 20 minutos com ca- da SSC 2X, 0,5X e 0,2X com 0,1% de SDS.
[00279] Conforme usado no presente documento, "condições altamente estringentes" ou "condições de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam força iônica baixa e temperatura alta para lavar, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de só- dio/0,1% de dodecil sulfato sódico a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) formamida com 0,1% de albumina sérica bovina/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão de fosfato sódi- co com pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42 °C; ou (3) emprega 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x de solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 μg/ml), 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido de uma lavagem d alta estringência que consiste em 0,1 x SSC que contémEDTA a 55°C. A pessoa versada reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica, etc. conforme necessário para acomodar os fatores tal como comprimento da sonda e similares.
[00280] Será observado por aqueles com conhecimento comum na técnica que, como um resultado da degenerescência do código genéti-co,há muitas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptí- deo conforme descrito no presente documento. Alguns desses polinu- cleotídeos possuem homologia mínima com a sequência de nucleotí- deos de qualquer gene nativo. Mesmo assim, os polinucleotídeos que variam devido às diferenças em uso de códon são especificamente contemplados pela presente invenção. Além disso, os alelos dos genes que compreendem as sequências de polinucleotídeo fornecidas no presente documento estão dentro do escopo da presente invenção. Os alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de um ou mais mutações, tal como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados através do uso de técnicas padrão (tal como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequência de base de dados).
[00281] Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos através do uso de síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Métodos de síntese de polinucleotídeo químico são bastante conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes no presente documento. Uma pessoa versada na técnica pode usar as sequências fornecidas no presente documento e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.
[00282] Para preparar polinucleotídeos através do uso de métodos recombinantes, um polinucleotídeo que compreende uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, conforme discutido adicionalmente no presente documento. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. As células são transformadas ao introduzir um polinucleotídeo exógeno por absorção direta, endocitose, transfecção, conjugação com F ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmí- deo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo amplificado desse modo pode ser isolado da célula hospedeira por métodos bastante conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989.
[00283] Alternativamente, a PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bastante conhecida na técnica e é descrita nos Documentos de Patente no U.S. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, assim como PCR: The Polymerase cadeia Re-action, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
[00284] O RNA pode ser obtido através do uso do DNA isolado em um vetor apropriado e pela inserção do mesmo em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado através do uso de métodos bastante conhecidos para aqueles versados na técnica, conforme estabelecido em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.
[00285] Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Apesar do vetor de clonagem selecionado poder variar de acordo com a célula hospedeira que se pretende usar, vetores de clonagem úteis terão a capacidade, em geral, de se autorreplicar, podem possuir um alvo único para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem carregar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones que contém o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e os derivados dos mesmos, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores shuttle tais como pSA3 e pAT28. Esses e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis junto aos vendedores comerciais tal como BioRad, Strategene e Invi- trogen.
[00286] Vetores de expressão em geral são construtos de polinu- cleotídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Fica implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossômico. Vetores de expressão adequados incluem, mas sem limitação plasmídeos, vetores virais, o que inclui adenovírus, vírus associados a adeno, retrovírus, cosmídeos e vetor(es) de ex-pressão revelados na Publicação PCT no WO 87/04462. Componentes de vetor podem incluir em geral, mas sem limitação, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricional adequados (tal como promotores, intensificadores e terminador). Para expressão (isto é, translação), um ou mais elementos de controle translacio- nal são também geralmente exigidos, tal como locais de ligação de ribossomo, locais de iniciação de translação e códons de interrupção.
[00287] Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por inúmeros meios apropriados, o que inclui eletroporação, transfecção que emprega cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias; bombardeamento de microprojétil; lipofecção e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso tal como vírus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos irá frequentemente depender da célula hospedeira.
[00288] A invenção fornece também células hospedeiras que com-preendem qualquer dos polinucleotídeos descritos no presente docu-mento. Quaisquer células hospedeiras com capacidade de superex- pressar DNAs heterólogos podem ser usadas para o propósito de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitantes de células hospedeiras de mamífero incluem, mas sem limitação COS, HeLa e células CHO. Consulte também a Publicação PCT no WO 87/04462. Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem procariotes (tal como E. coli ou B. subtillis) e levedura (tal como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). Prefe-rencialmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes mais alto, mais preferencialmente, 10 vezes mais alto, ainda mais preferencialmente, 20 vezes mais alto do que do anticorpo endógeno correspondente ou proteína de interesse, se pre-sente, nas células hospedeiras. Examinar as células hospedeiras para uma ligação específica a um CXCR4 ou um domínio de CXCR4 (por exemplo, domínios 1 a 4) é afetado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.
CONJUGADOS ANTICORPO-FÁRMACO ANTI-CXXR4
[00289] A presente invenção fornece anticorpo-fármaco da fórmula Ab-(T- L-D), sendo que a) Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que se liga a CXCR4, b) T é uma etiqueta de doador de acila contendo glutamina que pode ser opcionalmente incluído; c) L é um vinculador; e d) D é um fármaco. São fornecidos também métodos de preparar e fabricar tais conjugados anticorpo- fármaco e o uso dos mesmos em aplicações clínicas. O "Conjugado anticorpo-fármaco"ou "ADC" se refere a anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, o que inclui derivados de anticorpo que se ligam a CXCR4 e são conjugados a um fármaco.
[00290] Em alguns aspectos da invenção, Ab é selecionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região de VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 107, 162 e 112 e uma região de VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 144, 145 e139; b) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região de VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 115, 118 e 120 e uma região de VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs:135, 136 e 137; c) um anticorpo ou fragmento de ligação de antí- geno do mesmo que compreende uma região de VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 107, 110 e 112 e uma região de VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs:131, 132 e 133; d) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região de VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 107, 154 e 112 e uma região de VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs:138, 132 e 139; e) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região de VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 107, 157 e112 e uma região de VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs:151, 152 e 153; f) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região de VH de SEQ ID NO:33 e uma região de VL de SEQ ID NO:73; g) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região de VH de SEQ ID NO:13 e uma região de VL de SEQ ID NO:15; h) um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região de VH de SEQ ID NO:5 e uma região de VL de SEQ ID NO:7; e i) um anticorpo ou fragmento de ligação de antíge- no do mesmo que compreende uma região de VH de SEQ ID NO:21 e uma região de VL de SEQ ID NO:47.
[00291] Métodos para conjugar agente citotóxico ou outros agentes terapêuticos a anticorpos foram descritos em várias publicações. Por exemplo, modificação química pode ser feita nos anticorpos tanto por aminas de cadeia lateral de lisina ou através de grupos sulfidrila cisteí- na ativados pela redução das ligações de dissulfeto intercadeia para a reação de conjugação ocorrer. Consulte, por exemplo, Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092 a 2096, (2005) e Gentle et al., Bioconjug. Chem. 15:658 a 663, (2004). Resíduos de cisteína reativos projetados em locais específicos de anticorpos para conjugação de fármaco específica com estoiquiometria definida foram descritos também. Consulte, por exemplo, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925 a 932, (2008). A conjugação através do uso de uma etiqueta de doador de acila contendo glutamina e/ou uma glutamina endógena tornada reativa (isto é, a capacidade de formar uma ligação covalente como um doador acila) ao projetar o polipeptídeo na presença de transglutami nase e uma amina (por exemplo, um agente citotóxico que compreende ou se anexa a uma amida reativa) é descrita também no Documento de Patente Internacional de no de série PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882), Strop et al., Chem. Biol. 20(2):161 a 167 (2013) e Farias et al., Bioconjug. Chem. 25(2):245 a 250 (2014).
[00292] Um exemplo de um procedimento de conjugação adequado tem por base a conjugação de hidrazidas e outros nucleófilos aos al-deídosgerados pela oxidação dos carboidratos que ocorrem naturalmente nos anticorpos. Conjugados que contêm hidrazona podem ser produzidos com grupos carbonila introduzidos os quais fornecem as propriedades de liberação de fármaco desejadas. Os conjugados podemtambém ser produzidos com um vinculador que tem um dissulfeto em uma extremidade e uma cadeia de alquila no meio e um derivado de hidrazina na outra extremidade. As antraciclinas são um exemplo de citotoxinas que podem ser conjugadas aos anticorpos através do uso dessa tecnologia.
[00293] Em outros aspectos da invenção, o anticorpo anti-CXXR4 ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou o conjugado conforme descrito no presente documento compreende uma etiqueta que contém glutamina de doador acila (T) projetada em um local específico do anticorpo (por exemplo, um terminal carboxila, um terminal amino ou em outro local no anticorpo anti-CXXR4). Em alguns aspectos da invenção, a etiqueta compreende uma glutamina aminoácida (Q) ou uma sequência de aminoácidos LLQGG (SEQ ID NO: 171), GGLLQGG (SEQ ID NO: 90), LLQGA (SEQ ID NO: 91), GGLLQGA (SEQ ID NO: 92), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 93), LLQGPG (SEQ ID NO: 94), LLQGPA (SEQ ID NO: 95), LLQGP (SEQ ID NO: 96), LLQP (SEQ ID NO: 97), LLQPGK (SEQ ID NO: 98), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 99), LLQGAPG (SEQ ID NO: 100), LLQGAP (SEQ ID NO: 101), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 172), LLQGPP (SEQ ID NO: 173), LLQX1X2X3X4X5, sendo que X1 é G ou P, sendo que X2 é A, G, P, ou ausente, sendo que X3 é A, G, K, P ou ausente, sendo que X4 é K, G ou ausente e sendo que X5 é K ou ausente (SEQ ID NO: 102) ou LLQX1X2X3X4X5, sendo que X1 é qualquer aminoácido que ocorre natu-ralmente e sendo que X2, X3, X4, e X5 são quaisquer aminoácidos que ocorrem naturalmente ou ausente (SEQ ID NO: 103. Em um aspecto particular da invenção, T é selecionado a partir do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 91, 92 e 102.
[00294] Em outros aspectos da invenção, é fornecido um anticorpo isolado que compreende uma etiqueta de doador de acila que contém glutamina e uma modificação de aminoácido na posição 222, 340 ou 370 do anticorpo (esquema de numeração EU), sendo que a modificação é uma deleção, inserção, substituição, mutação de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, a modificações de aminoácido é K222R, K340R e K370R.
[00295] Em algum aspecto da invenção, um conjugado do anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno é conjugado com um fármaco, sendo que o fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em um agente citotóxico, um agente imunomodulador, um agente de ima- geamento, um agente terapêutico (por exemplo, proteína terapêutica), um biopolímero e um oligonucleotídeo.
[00296] Em alguns aspectos da invenção, um fármaco pode ser ligado ou conjugado ao anticorpo anti-CXXR4 ou ao fragmento de ligação de antígeno do mesmo conforme descrito no presente documento para entrega em local almejado do fármaco para tumores (por exemplo, CXCR4 que expressa tumor). Em aspectos particulares da invenção, o fármaco é um agente citotóxico. Exemplos de um agente incluem, mas sem limitação, uma antraciclina, uma auristatina, uma camp- totecina, uma combretastapina, uma dolastatina, uma duocarmicina, uma enediina, uma geldanamicina, um dímero indolino- benzodiazepina, uma maitansina, uma puromicina, um dímero de pir- rolobenzodiazepina, um taxano, um alcaloide vinca, uma tubulisina, uma hemiaesterlina, uma espliceostatina, uma pladienolida, caliquea- micina e estereoisômeros, isoésteres, análogos e derivados dos mesmos. Em alguns aspectos da invenção, as antraciclinas são derivadas da bactéria Strepomyces e foram usadas para tratar uma ampla faixa de cânceres, tal como leucemias, linfomas, mama, uterino, ovário e cânceres de pulmão. Antraciclinas exemplificativas incluem, mas sem limitação, daunorrubicina, doxorrubicina (isto é, adriamicina), epirrubi- cina, idarrubicina, valrubicina e mitoxantrona.
[00297] Dolastatinas e os análogos peptídicos das mesmas e derivados, auristatinas, são agentes antimitóticos altamente potentes que mostraram ter atividade anticâncer e antifúngica. Consulte, por exemplo, o Documento de Patente no U.S. 5.663.149 e Pettit et al., Antimi- crob. Agents Chemother. 42:2961 a 2965 (1998). Dolastatinas exem- plificativas e auristatinas incluem, mas sem limitação, dolastatina 10, auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), MMAD (Auristatina Monometil D ou dolastatina monometil 10), MMAF (Aurista- tina Monometil F ou N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina- fenilalanina), MMAE (Auristatina Monometil E ou N-metilvalina-valina- dolaisoleuina-dolaproina-norefedrina), éster de 5-ácido benzoilvalérico- AE (AEVB) e outras auristatinas novas (tal como aquelas descritas no Documento de Publicação US no 20130129753).
[00298] Em aspectos particulares da invenção, a auristatina é sele-cionada a partir do grupo que consiste em 0101 (2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida), MMAD (Auristatina Monometil D ou dolastatina monometil 10 e 8261( 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil- 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida).
[00299] Em alguns aspectos da presente invenção, a auristatina é 0101 (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tem a seguinte es-trutura:
Figure img0028
[00300] Em outros aspectos, a auristatina é 3377 (N,2-dimetilalanil- N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxil-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]- 4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida) que tem a seguinte estrutura:
Figure img0029
[00301] Em outros aspectos da invenção, a auristatina é 0131 (2-metil- L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil] ami- no}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tem a seguinte estrutura:
Figure img0030
[00302] Em alguns aspectos, a auristatina é 0121(2-metil-L-proli-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan- 2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tem a seguinte estrutura:
Figure img0031
[00303] Em outros aspectos, a auristatina é 8261, (8261 2-Metilalanil- N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]- N-metil-L-valinamida), que tem a seguinte estrutura:
Figure img0032
[00304] Camptotecina é um alcaloide quinolina citotóxico que inibe a enzima topoisomerase I. Exemplos de camptotecina e derivados do mesmo incluem, mas sem limitação, topotecano e irinotecano e os me- tabólitos dos mesmos, tal como SN-38.
[00305] Combretastatinas são fenóis naturais com propriedades de disrupção vascular em tumores. Combretastatinas exemplificativas e os derivados das mesmas incluem, mas sem limitação, combretastati- na A-4 (CA-4) e ombrabulina.
[00306] Duocarmicinas são agente alquilantes de DNA com potên-ciacitotóxica. Consulte Boger e Johnson, PNAS 92:3642 a 3649 (1995). Duocarmicinas exemplificativas incluem, mas sem limitação, duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA e CC-1065. Ene- diinas são uma classe de produtos bacterianos antitumor caracterizados por anéis de nove ou dez membros ou pela presença de um sis-temacíclico de ligações tripla-dupla-tripla conjugadas. Enediínas exemplificativas incluem, mas sem limitação, caliqueamicina, espera- micina e dinemicina.
[00307] Geldanamicinas são antibióticos ansamicina benzoquinona que se ligam a Hsp90 (Proteína de choque térmico 90) e foram usadas em fármaco antitumor. Geldanamicinas exemplificativas incluem, mas sem limitação, 17-AAG (17-N-Alilamino-17-Demetoxigeldanamicina) e 17-DMAG (17-Dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina).
[00308] Maitansinas ou derivados da mesma maitansinóides inibem a proliferação celular ao inibir a formação de microtúbulos durante a mitose através da inibição da polimerização da tubulina. Consulte Remillard et al., Science 189:1002 a 1005 (1975). Maitansinas e maitan- sinoides exemplificativos incluem, mas sem limitação, mertansina (DM1) e os derivados da mesma assim como ansamitocina.
[00309] Dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBDs) e dímeros de indolino-benzodiazepina (IGNs) são agentes antitumor que contêm um ou mais grupos funcionais imina ou equivalentes dos mesmos que se ligam ao DNA duplex. Moléculas de PBD e IGN são baseadas no produto natural de atramicina e interagem com DNA de uma maneira seletiva de sequência, com uma preferência para sequências de purina- guanina-purina. PBDs exemplificativos e análogos dos mesmos incluem, mas sem limitação, SJG-136.
[00310] Espliceostatinas e pladienolidas são compostos antitumor que inibem a divisão e interagem com espliceosoma, SF3b. Exemplos de espliceostatinas incluem, mas sem limitação, espliceostatina A, FR901464. Exemplos de pladienolides incluem, mas sem limitação, Pladienolide B, Pladienolide D e E7107.
[00311] Taxanos são diterpenos que atuam como agentes antitubu- lina ou inibidores mitóticos. Os taxanos exemplificativos incluem, porém, sem limitação, paclitaxel (por exemplo, TAXOL®) e docetaxel (TAXOTERE®).
[00312] Alcaloides da vinca são também agentes antitubulina. Os alcaloides da vinca exemplificativos incluem, porém, sem limitação, vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina.
[00313] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco é um agente imunomodulador. Os exemplos de um agente imunomodulador inclu-em,porém, sem limitação, ganciclovier, etanercepte, tacrolimus, siro- limus, voclosporina, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatiopri- na, micofenolato de mofetil, metotrextrato, glucocorticoide e seus aná-logos, citocinas, fatores de crescimento de célula tronco, linfotoxinas, fator de necrose tumoral (TNF), fatores hematopoiéticos, interleucinas (por exemplo, interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 e IL-21), fatores estimulantes de colônia (por exemplo, fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF) e fator estimulante de colônia de macrófagos e granulócito (GM-CSF)), interferons (por exemplo, interfe- rons-α, -β e -Y),o fator de crescimento de célula tronco designado "fator S 1", eritropoietina e trombopoietina ou uma combinação dos mesmos.
[00314] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco é um agente de imageamento (por exemplo, um fluorófo ou um quelante), tal como fluo- resceína, rodamina, fósforos de lantanídeos e derivados dos mesmos. Os exemplos de fluoróforos incluem, porém, sem limitação, iso-tiocianato de fluoresceína (FITC) (por exemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por exemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor® (por exemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 ou 750), carboxitetrametilrodamina (TAMRA) (por exemplo, 5,-TAMRA), tetrametilrodamina (TMR) e sulforo- damina (SR) (por exemplo, SR101). Os exemplos de quelantes incluem, porém, sem limitação, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'',N'''- tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano,1-ácido glutárico-4,7-acético (NODAGA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) e ácido 1,2-bis(o-aminofenóxi) etano-N ,N,N', N-tetraacético)(BAPTA).
[00315] Em alguns aspectos da invenção, os radioisótopos terapêuticos ou de diagnóstico ou outras identificações (por exemplo, identificações PET ou SPECT) podem ser incorporadas no fármaco paras a conjugação aos anticorpos anti-CXCR4 ou aos fragmentos de ligação ao antígeno conforme descrito no presente documento. Os exemplos de um radioisótopo ou outras identificações incluem, porém, sem limi- 3 11 13 14 15 15 35 18 32 33 47 51 57 taç o, H, C, N, C, N, O, S, F, P, P, Sc, Cr, Co, 58 59 62 64 67 67 68 75 76 77 86 89 90 Co, Fe, Cu, Cu, Cu, Ga, Ga, Se, Br, Br, Y, Zr, Y, rj/ rjc rj"7 nn d r\Q d r\c d r\c d r\~7 d r\r» d d d d d d 94 95 97 99 103 105 105 107 109 111 111 Tc, Ru, Ru, Tc, Ru, Rh, Ru, Hg, Pd, Ag, In, d OC d OC d O d d Qd d O d d QO d/O d/Q 125 125 126 131 131 133 142 143 I, Te, I, I, In, I, Pr, Pr 153 153 161 165 166 166 167 168 169 177 186 Pb, Sm, Tb, Tm, Dy, H, Tm, Tm, Yb, Lu, Re, d Qo d on d Ck~7 d no d nn ond ono nd d od o od o od Q 188 189 197 198 199 201 203 211 212 212 213 Re, Re, Pt, Au, Au, Tl, Hg, At, Bi, Pb, Bi,223Ra, 224Ac e 225Ac.
[00316] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco é uma proteína terapêutica incluindo, porém, sem limitação, uma toxina, um hormônio, uma enzima e um fator de crescimento.
[00317] Os exemplos de uma proteína de toxina (ou polipeptídeo) incluem, porém, sem limitação, difteria (por exemplo, cadeia de difteria A), exotoxina e endotoxina de Pseudomonas, ricina (por exemplo, cadeia de ricina A), abrina (por exemplo, cadeia de abrina A), modecina (por exemplo, cadeia de modecina A), alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, ribonuclease (RNase), DNase I, ente- rotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de Phytolaca, gelonina, toxina de difterina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, peptídeos de nó inibidor de cistina (ICK) (por exemplo, ceratotoxinas) e conotoxina (por exemplo, KIIIA ou SmIIIa).
[00318] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco é um polímero biocompatível. Os anticorpos anti-CXCR4 ou os fragmentos de ligação de antígeno conforme descritos no presente documento podem ser conjugados ao polímero biocompatível para aumentar a meia-vida sé- rica e a bioatividade e/ou para estender as meias-vidas in vivo. Os exemplos de polímeros biocompatíveis incluem polímero solúvel em água, tal como polietileno glicol (PEG) ou seus derivados e polímeros biocompatíveis que contêm zwitterion (por exemplo, um polímero que contém fosforilcolina).
[00319] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco é um oligonu- cleotídeo, tais como oligonucleotídeos antissenso.
[00320] Em outro aspecto, a invenção fornece um conjugado do anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno conforme descrito no presente documento, em que o conjugado anticorpo-fármaco compreende a fórmula: anticorpo-(c)-(vinculador)-(fármaco), em que a etiqueta que contém glutamina doadora de acila é modificada em um sítioespecífico do anticorpo ou do fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, em um terminal carboxila da cadeia pesada ou leve ou em outro sítio), em que a etiqueta é conjugada a um vinculador (por exemplo, um vinculador que contém uma ou mais aminas reativas (por exemplo, amina primária NH2)) e em que o vinculador é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, MMAD ou outras auristatinas conforme descritas no presente documento). Em alguns aspectos da invenção, o conjugado anticorpo-fármaco não compreende a etiqueta que contém glutamina doadora de acila.
[00321] Os exemplos de um vinculador que contém uma ou mais aminas reativas incluem, porém, sem limitação, acetil-lisina-valina- citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (AcLys-VC-PABC) ou amino PEG6- propionila. Consultar, por exemplo, o documento n° WO2012/059882.
[00322] Em alguns aspectos da invenção, o vinculador pode ser um vinculador de dipeptídeo, tal como uma valina-citrulina (val-cit), um vinculador de fenulalanina-lisina (phe-lys) ou vinculador de maleimido- caprônico-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (vc). Em outro as-pecto, o vinculador pode ser Sulfossuccinimidil-4-[Nmaleimidometil] ciclo-hexano-1-carboxilato (smcc). A conjugação de Sulfo-smcc ocorre por meio de um grupo maleimida que reage com sulfifrilos (tióis, -SH), enquanto seu éster de Sulfo-NHS é reativo para aminas primárias (conforme encontrado na Lisina e no terminal N de proteína ou peptí- deo). Ademais, o vinculador pode ser maleimidocaproila (mc). Em alguns aspectos da invenção, a etiqueta que contém glutamina doadora de acila compreende LLQGG (SEQ ID NO: 171), GGLLQGG (SEQ ID NO:90), LLQGA (SEQ ID NO:91), GGLLQGA (SEQ ID NO:92), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 93), LLQGPG (SEQ ID NO: 94), LLQGPA (SEQ ID NO: 95), LLQGP (SEQ ID NO: 96), LLQP (SEQ ID NO: 97), LLQPGK (SEQ ID NO: 98), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 99), LLQGAPG (SEQ ID NO: 100), LLQGAP (SEQ ID NO: 101), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 172), LLQGPP (SEQ ID NO: 173), LLQX1X2X3X4X5, em que X1 é G ou P, em que X2 é A, G, P ou ausente, em que X3 é A, G, K, P ou ausente, em que X4 é K, G ou ausente e em que X5 é K ou ausente (SEQ ID NO: 102) ou LLQX1X2X3X4X5, em que X1 é um aminoácidos de ocorrência natural e em que X2, X3, X4 eX5 são quaisquer aminoáci- dos de ocorrência natural ou ausentes (SEQ ID NO: 103).
[00323] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo anti-CXCR4 ou o conjugado conforme descrito no presente documento compreende uma substituição de aminoácido de asparagina (N) por glutamina (Q) ou de N por alanina (A) na posição 297 do anticorpo anti-CXCR4.
[00324] Em alguns aspectos da invenção, a etiqueta que contém glutamina doadora de acila que compreende, por exemplo, LLQ, SEQ ID NOs: 91, 90, 94, 95, 95, 97, 98, 99, 100, 171,101, 172 ou 173 é modificada no C-terminal da cadeia pesada de anticorpo, em que o resíduo de lisina no C-terminal é deletado. Em outros aspectos, a eti-queta que contém glutamina doadora de acila (por exemplo, GGLLQGA (SEQ ID NO: 92)) é modificada no C-terminal da cadeia leve do anticorpo. Os exemplos do anticorpo incluem, porém, sem limitação, o m6B6, h6B6, m12A11, h12A11, m3G10, h3G10, h3G10.A57, h3G10.B44, h3G10.1.7, h3G10.1.60, h3G10.2.5, h3G10.1.91, h3G10.2.37, h3G10.2.45, h3G10.2.42, h3G10.1.33, h3G10.3.25, h3G10, h3G10.2.72, h3G10.A11A, h3G10.A18A, h3G10.A19A, h3G10.A58A, h3G10.A65A, e h3G10.B12A, h3G10.B13A, h3G10.B18A, h3G10.A11B, h3G10.A18B, h3G10.A19B, h3G10.A58B, h3G10.A65B, h3G10.B12B, h3G10.B13B, h3G10.B18B, h3G10.2.25, h3G10.A59, h3G10.A62 ou h3G10.L94D.
[00325] Em outros aspectos da invenção, o conjugado compreende a fórmula: anticorpo-(etiqueta que contém glutamina doadora de acila)- (L)-(agente citotóxico). Em alguns aspectos da invenção, o conjugado é a) Ab-LLQGA (SEQ ID NO: 91)-(acetil-lisina-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonila (AcLys-VC-PABC))-0101; b) Ab-LLQGA (SEQ ID NO: 91)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; c) Ab-LLQX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 102)-(AcLys-VC-PABC)-0101; d) Ab-LLQX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 102)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; e) Ab-GGLLQGA (SEQ ID NO: 92)- (AcLys-VC-PABC)-0101; e f) Ab-GGLLQGA (SEQ ID NO: 92)-(AcLys- VC-PABC)-MMAD.
[00326] Os exemplos do anticorpo incluem, porém, sem limitação, o m6B6, h6B6, m12A11, h12A11, m3G10, h3G10, h3G10.A57, h3G10.B44, h3G10.1.7, h3G10.1.60, h3G10.2.5, h3G10.1.91, h3G10.2.37, h3G10.2.45, h3G10.2.42, h3G10.1.33, h3G10.3.25, h3G10, h3G10.2.72, h3G10.A11A, h3G10.A18A, h3G10.A19A, h3G10.A58A, h3G10.A65A, e h3G10.B12A, h3G10.B13A, h3G10.B18A, h3G10.A11B, h3G10.A18B, h3G10.A19B, h3G10.A58B, h3G10.A65B, h3G10.B12B, h3G10.B13B, h3G10.B18B, h3G10.2.25, h3G10.L94D, h3G10.A59, h3G10.A62 ou h3G10.L94D.
[00327] Em alguns aspectos da invenção, Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma região VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 107, 162 e 112 e uma região VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
[00328] Em alguns aspectos da invenção, o conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco induz a regressão tumoral.
MÉTODO PARA USAR OS ANTICORPOS ANTI-CXCR4, FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DOS MESMOS OU OS CONJUGADOS ANTICORPO-FÁRMACO DOS MESMOS
[00329] Os anticorpos e os conjugados anticorpo-fármaco da presente invenção são úteis em várias aplicações incluindo, porém, sem limitação, métodos de tratamento terapêuticos e métodos de tratamento de diagnóstico.
[00330] Em alguns aspectos da invenção, quando administrado a um paciente, o anticorpo ou conjugado e os veículos farmaceutica- mente aceitáveis são estéreis. Água é um veículo exemplificativo quando o composto ou o conjugado é administrada por via intravenosa. As soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e de glicerol podem também ser utilizadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. As presentes composições podem também, se desejado, conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes ou agentes de tamponamento de pH.
[00331] As presentes composições podem tomar a forma de soluções, péletes, pós, formulações de liberação prolongada ou qualquer outra forma adequada para o uso. Outros exemplos de veículos far- macêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.
[00332] Em alguns aspectos, o anticorpo da invenção e/ou o conju-gadoanticorpo-fármaco do mesmo são formulados em conformidade com os procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para a administração intravenosa a animais, particularmente seres humanos. Tipicamente, os veículos ou veículos para a adminis-tração intravenosa são soluções de tampão aquosas isotônicas estéreis. Quando necessário, as composições podem também incluir um agente solubilizante. As composições para a administração intravenosa podem compreender opcionalmente um anestésico local tal como lignocaína para diminuir a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientessão supridos ou separadamente ou misturados em conjunto em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente vedado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Quando um composto da invenção e/ou conjugado anti- corpo-fármaco do mesmo tiver que ser administrado por infusão, o mesmo pode ser distribuído, por exemplo, com uma garrafa de infusão que contém água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Quando o composto da invenção e/ou conjugado anticorpo-fármaco do mesmo for administrado por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[00333] A composição pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam um invólucro de revestimento ao redor dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o invólucro de revestimento são tipicamente inertes e podem ser selecionados a partir de, por exemplo, açúcar, goma-laca e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser envolvidos em uma cápsula de gelatina.
[00334] Na forma sólida ou líquida, as presentes composições podem incluir um agente farmacológico usado no tratamento de câncer. Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma afec- ção associada à expressão de CXCR4 em um indivíduo. Em alguns aspectos da invenção, o método para tratar um distúrbio associado à função ou expressão de CXCR4 em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende os anticorpos anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos ou os conjugados anticorpo anti-CXCR4-fármaco conforme descritos no presente documento. Os distúrbios associados à expressão de CXCR4 incluem, porém, sem limitação, expressão de CXCR4 anormal, expressão de CXCR4 alterada ou aberrante, superex- pressão de CXCR4 e um distúrbio proliferativo (por exemplo, câncer).
[00335] Consequentemente, em alguns aspectos fornecidos está um método para tratar câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco conforme descrito no presente documento. Conforme usado no presente documento, cânceres incluem, porém, sem limitação câncer de bexiga, de mama, cervical, coriocarcinoma, cólon, esofágico, gástrico, glioblastoma, de cabeça e pescoço, do rim, do pulmão, oral, do ovário, pancreático, de próstata, de pele e hematológico. Em alguns aspectos da invenção, é fornecido um método para diminuir a progressão ou o crescimento tumoral em um indivíduo que tem um tumor que expressa CXCR4 que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composi- ção que compreende um anticorpo anti-CXCR4 ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou um conjugado anticorpo anti-CXCR4- fármaco conforme descrito no presente documento. Em outros aspectos,é fornecido um método para diminuir a metástase de células de câncer que expressam CXCR4 em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou um conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco conforme descrito no presente documento. Em outros aspectos, é fornecido um método para induzir a regressão de um tumor que expressa CXCR4 em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo anti-CXCR4 ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou um conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco conforme descrito no presente documento.
[00336] Em alguns aspectos, a invenção fornece um anticorpo isolado, um fragmento de ligação de antígeno ou um conjugado anticor- po-fármaco de qualquer um dos anticorpos conforme descrito no presente documento para o uso na detecção, diagnóstico e tratamento dos distúrbios patológicos associados à função ou expressão de CXCR4. Em um aspecto, os distúrbios são distúrbios oncogênicos associadosà expressão aumentada de CXCR4 em relação ao normal ou qualquer outra patologia conectada à superexpressão de CXCR4.
[00337] Em alguns aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar um câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) um VH CDR1 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 107, 113, 114, 108, 109, 115, 116, 117, 121 e 122; (ii) um VH CDR2 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 162, 128, 110, 111, 118, 119, 154, 123, 158, 124, 159, 125, 160, 126, 161, 127, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 155, 129, 156, e 130 e (iii) um VH CDR3 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 112; e 120; e/ou; b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) um VL CDR1 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 144, 131, 135, 138, 141, 142, 143, 146, 147, 148, 149, 150 e 151; (ii) um VL CDR2 selecionado a partir do grupo que consiste em 145, 132, 136 e 152; e (iii) um VL CDR3 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 139, 133, 137, 140 e 153.
[00338] Em alguns aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar um câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende: uma região va-riável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs definidos como SEQ ID NOs: 107, 162 e 112. Em alguns aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar um câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em que o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende três CDRs definidos como SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
[00339] Em alguns aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar um câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindi-cações anteriores, em que o anticorpo compreende: a região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs definidos como SEQ ID NOs: 107, 162 e 112; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende três CDRs definidos como SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
[00340] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método para tratar um câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga a CXCR4 e compreende: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 de uma região VH de SEQ ID NO: 33; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de uma região VL de SEQ ID NO: 73.
[00341] Em ainda outros aspectos, a presente invenção fornece um método para tratar um câncer em um indivíduo que compreende admi-nistrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo compreende: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 33; e b) uma região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 73.
[00342] Em alguns aspectos, a invenção fornece um uso de um anticorpo isolado, um fragmento de ligação de antígeno ou um conjugado anticorpo-fármaco de qualquer um dos anticorpos conforme descrito no presente documento na fabricação de um remédio para tratar um distúrbio associado à função ou expressão de CXCR4. Em um aspecto, os distúrbios são distúrbios oncogênicos associados à expressão aumentada de CXCR4 em relação ao normal ou qualquer outra patologia conectada à superexpressão de CXCR4.
[00343] Em outros aspectos da invenção, um conjugado anticorpo- fármaco anti-CXCR4 inclui um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que tem pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve, em que a pelo menos uma região variável de cadeia pesada inclui três CDRs definidos como SEQ ID NOs: 107, 113, 114, 162, 128, e 112. Em alguns aspectos da invenção, um conjugado anticorpo-fármaco anti- CXCR4 inclui um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que tem pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve, em que a pelo menos uma região variável de cadeia leve inclui três CDRs definidos como SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
[00344] Em alguns aspectos da invenção, um conjugado anticorpo- fármaco, que se liga a CXCR4, inclui um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que tem uma região variável de cadeia pesada definida como qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 33, 5, 9, 13, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 85 ou 87 e/ou uma região variável de cadeia leve definida como qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 73, 3, 7, 11, 15, 19, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 75, 77, 79, 81, 83 ou 169. Por exemplo, um conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco da invenção pode incluir um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que tem uma região variável de cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 73; ou um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que tem uma região variável de cadeia pesada definida como SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos definida como SEQ ID NO: 73.
[00345] Em aspectos particulares da invenção, o anticorpo não é caninizado ou felinizado.
[00346] Os anticorpos podem também ser modificados, por exemplo, nos domínios variáveis das cadeias pesadas e/ou leves, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões CDR para aumentar ou diminuir o KD de um anticorpo anti-CXCR4, para aumentar ou diminuir o koff ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo. As técnicas na mutagênese direcionada para sítio são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook et al. e Ausubel et al., supra.
[00347] Em alguns aspectos da invenção, é fornecido um método para detectar, diagnosticar e/ou monitorar um distúrbio associado à função ou expressão de CXCR4. Por exemplo, os anticorpos anti- CXCR4 conforme descrito no presente documento podem ser identificados com uma metade detectável tal como um agente de imagea- mento e uma identificação de enzima-substrato. Os anticorpos conforme descritos no presente documento podem também ser usados para os ensaios de diagnóstico in vivo, tal como imageamento in vivo (por exemplo, PET ou SPECT) ou um reagente de manchamento.
[00348] Em um aspecto da invenção, é fornecido um método para detectar, diagnosticar e/ou monitorar um distúrbio associado à função ou expressão de CXCR4 que compreende as etapas de: (i) obter uma amostra biológica de um paciente com suspeita de ter um distúrbio as-sociadoà função ou expressão de CXCR4 ; (ii) contatar a amostra a ser testada com o anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e o CXCR4 de antígeno de proteína (iii) detectar o dito complexo de anticorpo-antígeno de proteína, em que a presença do dito complexo de anticorpo-antígeno de proteína é indicativa de que o dito paciente tem um distúrbio associado à função ou expressão de CXCR4. Em um aspecto particular da invenção, o método compreende adicionalmente administrar ao paciente uma quantidade eficaz terapêutica do anticorpo isolado, fragmento de ligação de antígeno ou con-jugadoanticorpo-fármaco de qualquer um dos anticorpos conforme descrito no presente documento.
[00349] Em alguns aspectos da invenção, uma ADC pode ser usada para almejar compostos (por exemplo, agentes terapêuticos, identificações, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) a células que têm receptores de superfície celular CXCR4 ligando-se tais compostos ao anticorpo ou um fragmento do mesmo. Assim, em alguns aspectos da invenção, são fornecidos métodos para localizar células ex vivo ou in vivo que expressam CXCR4 (por exemplo, identificação detectável, tal como radioisótopo, composto fluorescente como enzima. Alternativamente, os ADCs podem ser usados para exterminar as células que têm receptores de superfície celular CXCR4 almejando as citotoxinas ou radiotoxinas ao CXCR4.
[00350] Em alguns aspectos da invenção, os métodos descritos no presente documento compreendem adicionalmente uma etapa para tratar um indivíduo com uma forma adicional de terapia. Em alguns aspectos, a forma adicional de terapia é uma terapia anticâncer adicional incluindo, porém, sem limitação, quimioterapia, radiação, cirurgia, terapia hormonal e/ou imunoterapia adicional.
[00351] Em alguns aspectos da invenção, a forma adicional de terapia compreende administrar um ou mais agentes terapêuticos adicionalmente a um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de an- tígeno do mesmo ou um conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco conforme descrito no presente documento. Os agentes terapêuticos incluem, porém, sem limitação, um segundo anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-HER2, anticorpo anti-CD25 e/ou um anticorpo anti-CD20), um inibidor de angiogênese, um agente citotóxico, um agente anti-inflamatório (por exemplo, paclitaxel, doce taxel, cisplatina, doxorrubicina, prednisona, mitomicina, progesterona, tamoxifeno ou fluorouracila). Em um aspecto, as formas adicionais de terapia podem ser administradas simultânea ou sequencial ou conco-mitantemente com um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou um conjugado anticorpo anti-CXCR4- fármaco conforme descrito no presente documento.
[00352] O anticorpo anti-CXCR4, os fragmentos de ligação de antí- geno do mesmo ou o conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco da presente invenção pode ser administrado a um indivíduo por meio de qualquer rota adequada. Deve ser entendido por versados na técnica que os exemplos descritos no presente documento não se destinam a serem limitantes, mas a serem ilustrativos das técnicas disponíveis. Consequentemente, em alguns aspectos da invenção, o anticorpo anti- CXCR4, os fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou o conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco é administrado a um indivíduo de acordo com os métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, por intramuscular, intraperitoneal, intracere- brospinal, intracraniana, transdérmica, subcutânea, intra-articular, de forma sublingual, intrasinovial, por meio de insuflação, intratecal, oral, inalação ou rotas tópicas. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa ou localizada. Nebulizadores comercialmentedisponíveis para formulações líquidas, incluindo nebuli- zadores a jato e nebulizadores ultrassônicos são úteis para a administração. As formulações líquidas podem ser diretamente nebulizadas e o pó liofilizado pode ser nebulizado após a reconstituição. Alternativamente, o anticorpo anti-CXCR4, os fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou o conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco pode ser borrifado em aerossol com o uso de uma formulação de fluorcarbono e um inalador de dose medida ou inalado como um pó liofilizado e tritu- rado. Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo anti-CXCR4, os fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou o conjugado anticor-poanti-CXCR4-fármaco pode ser administrado por meio de inalação, conforme descrito no presente documento. Em outros aspectos, o an-ticorpo anti-CXCR4, os fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou os conjugados anticorpo anti-CXCR4-fármaco da presente invenção podem ser combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis tais como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e similares. O regime de dosagem particular, isto é, a dose, temporizaçãoe repetição, dependerá do indivíduo particular e o histórico médico desse indivíduo.
[00353] Em um aspecto, o anticorpo anti-CXCR4, os fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou o conjugado anticorpo anti-CXCR4- fármaco é administrado por meio de técnicas de entrega locais especí-ficas para sítio ou almejadas. Os exemplos de técnicas de entrega lo-caisespecíficas para sítio ou almejadas incluem várias fontes de depósito implantável do anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou do conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco ou cateteres de entrega local, tais como cateteres de infusão, catete- res permanentes ou cateteres de agulha, enxertos sintéticos, envoltóriosadventícios, shunts e stents ou outros dispositivos implantáveis, veículos específicos para sítio, injeção direta ou aplicação direta. Consultar, por exemplo, a Publicação PCT n° WO 00/53211 e a Patente n° U.S. 5.981.568.
[00354] Várias formulações do anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou do conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco podem ser usadas para a administração. Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo anti-CXCR4, (fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou o conjugado anticorpo anti-CXCR4- fármaco) e um excipiente farmaceuticamente aceitável podem estar em várias formulações. Algumas formulações da presente invenção compreendem excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipien- tes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipien- te pode proporcionar formar ou consistência ou atuar como um diluen- te. Os excipientes adequados incluem, porém, sem limitação, agentes estabilizantes, agentes umectantes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade, agentes de encapsulamento, tampões e intensificadores de penetração na pele. Os excipientes assim como as formulações para entrega de fármaco parenteral e não parenteral são definidos em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Edição. Mack Publishing, 2000.
[00355] Geralmente, para a administração de um anticorpo anti- CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo e/ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco, uma dosagem candidata inicial pode ser cerca de 2 mg/kg. Para o propósito da presente invenção, uma dosagemdiária típica pode estar na faixa de cerca de qualquer um dentre 3 μg/kg a 30 μg/kg a 300 μg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, a dosagem de cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg e cerca de 25 mg/kg pode ser usada. Para administrações repetidas ao longo de diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até uma supressão desejada dos sintomas ocorrer ou até níveis terapêuticos suficientes serem alcançados, por exemplo, para inibir ou atrasar o crescimento/progressão tumoral ou a metástase das células de câncer. Um regime de dosagem exemplificativo compreende administrar uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou do conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco, ou seguida por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg a cada duas semanas. Outro regime de dosagem exemplificativo compreende administrar doses crescentes (por exemplo, dose inicial de 1 mg/kg e aumento gradual para uma ou mais doses maiores a cada semana ou por um período de tempo maior). Outros regimes de dosagem podem também ser úteis, dependendo do padrão do decaimento farmacociné- tico que o profissional deseja alcançar. Por exemplo, em alguns aspectos, a dosagem de uma a quatro vezes por semana é contemplada. Em outros aspectos, a dosagem uma vez por mês ou uma vez a cada dois meses ou a cada três meses é contemplada. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o anticorpo anti-CXCR4, os fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou o conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco usado) pode variar ao longo do tempo.
[00356] Para o propósito da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antíge- no do mesmo ou um conjugado de anticorpo anti-CXCR4 dependerá do anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou do conjugado anticorpo CXCR4-fármaco (ou composições do mesmo) empregado, do tipo e da severidade dos sintomas a serem tratados, se o agente é administrado para propósitos terapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente e da resposta ao agente, da taxa de liberação do paciente para o agente administrado e do critério do médico responsável. Tipicamente, o médico administrará um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou um conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco até uma dosagem ser alcançada que alcança o resultado desejado. A dose e/ou a frequência pode variar ao longo do curso de tratamento. As considerações empíricas, tal como a meia via, contribuirão, geralmente, para a determinação da dosagem. Por exemplo, os anticorpos que são com-patíveis com o sistema imunológico humano, tais como anticorpos humanizados ou anticorpos completamente humanos, podem ser usados para prolongar a meia vida do anticorpo e para impedir o anticorpo de ser atacado pelo sistema imunológico do hospedeiro. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada ao longo do curso de terapia e se baseia geralmente, mas não necessariamente, no tratamento e/ou supressão e/ou melhora e/ou atraso dos sintomas, por exemplo, inibição ou atraso do crescimento tumoral, etc. Alternativamente, as formulações de liberação contínua prolongada de anticorpos anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos ou conjugados anticorpo anti-CXCR4-fármaco podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para alcançar a liberação prolongada são conhecidos na técnica.
[00357] Em alguns aspectos da invenção, as dosagens para o anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações do anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou seu conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco. Os indivíduos recebem dosagens incrementais de um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco. Para avaliar a eficácia, um indicador da doença pode ser seguido.
[00358] A administração de um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco em conformidade com o método na presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se o propósito da administração for terapêutico ou profilático e outros fatores conhecidos por profissionais versados. A administração de um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco pode ser essencialmente contínua ao longo de um período de tempo pré-selecionado ou pode estar em uma séria de doses espaçadas.
[00359] Em alguns aspectos da invenção, mais do que um anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco pode estar presente. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco diferentes ou mais anticorpos anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugados anticorpo anti-CXCR4- fármaco podem estar presentes. Em geral, aqueles anticorpos anti- CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugados anticorpo anti-CXCR4-fármaco podem ter atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Por exemplo, um ou mais dos seguintes anticorpos anti-CXCR4 podem ser usados: um primeiro anticorpo anti-CXCR4 direcionado a um epítopo no CXCR4 e um segundo anticorpo anti-CXCR4 direcionado a um epítopo diferente no CXCR4.
[00360] As formulações terapêuticas do anticorpo anti-CXCR4, fra-gmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco usadas em conformidade com a presente invenção são preparadas para o armazenamento misturando-se um anticorpo que tem um grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21a Edição. Mack Publishing, 2005), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações empregadas e podem compreendertampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais tais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpir- rolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidi- na, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; con- traíons formadores de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEENTM, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG).
[00361] Os lipossomas que contêm o anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:3.688 (1985); O'Hare et al., Proc. Natl Acad. Sci. EUA 77:4.030 (1980); e Patentes n° U.S. 4.485.045 e 4.544.545. Os lipossomas com tempo de circulação aprimorado são revelados na Patente n° U.S. 5.013.556. Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase inversa com uma composição de lipídio que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolami- na derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para render os lipossomas com o diâmetro desejado.
[00362] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcáp- sulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetil- celulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respec-tivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21a Edição. Mack Publishing, 2005.
[00363] Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contém o anticorpo, sendo que tais matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidro- géis (por exemplo, poli(2-hidroxietil- metacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactíceos (Patente n° U.S. 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradá- vel, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolíme- ro de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolídeo), isobutirato de acetato de sacarose e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[00364] As formulações a serem usadas para a administração in vivo devem ser estéreis. Isso é prontamente alcançado, por exemplo, pela filtração através de membranas de filtração estéreis. As composições de anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco terapêuticas são geralmente colocadas em um recipiente que tem uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa que tem um batente perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00365] As composições de acordo com a presente invenção podem estar em formas de dosagem unitárias tais como tabletes, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões ou supositórios para administração oral, parenteral ou retal ou administração por inalação ou insuflação.
[00366] Para preparar composições sólidas, tais como tabletes, o ingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico, por exemplo, ingredientes de formação de tabletes convencionais tais como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas, e outros diluen- tes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitávelnão tóxico do mesmo. Ao se referir a essas composições de pré- formulação como homogêneas, entende-se que o ingrediente ativo é disperso de maneira uniforme por toda a composição de modo que a composição possa ser prontamente subdividida em formas de dosagemunitária igualmente eficazes tais como tabletes, pílulas e cápsulas. A composição de pré-formulação sólida é então subdividida formando formas de dosagem unitárias do tipo descrito acima contendo de 0,01 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os tabletes ou pílulas da composição inovadora podem ser revestidos ou, de outro modo, compostos para proporcionar uma forma de dosagem que obtenha a vantagem de uma ação prolongada. Por exemplo, o tablete ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e de dosagem externa, sendo que o segundo está sob a forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto pelo duodeno ou seja liberado de maneira retardada. Uma variedade de materiais pode ser usada nessas camadas ou revestimentos entéricos,sendo que tais materiais incluem vários ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.
[00367] Os agentes ativos em superfície adequados incluem, parti-cularmente, agentes não iônicos, tais como polioxietilenossorbitano (por exemplo, TweenTM 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, SpanTM 20, 40, 60, 80 ou 85). As composições com um agente ativo em superfície compreenderão convenientemente entre 0,05 e 5% de agente ativo em superfície e podem estar entre 0,1 e 2,5%. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.
[00368] As emulsões adequadas podem ser preparadas com o uso de emulsões de gordura comercialmente disponíveis, tais como Intrali- pidTM, LiposynTM, InfonutrolTM, LipofundinTM e LipiphysanTM. O ingrediente ativo pode ser ou dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada ou, alternativamente, o mesmo pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de açafrão, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho ou óleo de amêndoa) e uma emulsão formada mediante a mistura com um fosfolipídio (por exemplo, fosfolipídios de ovo, fosfolipídios de soja ou lecitina de soja) e água. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. As emulsões adequadas conterão tipicamente até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão de gordura pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 μm, particularmente, 0,1 e 0,5 μm e têm um pH na faixa de 5,5 a 8,0.
[00369] As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas misturando-se um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco com IntralipidTM ou os componentes do mesmo (óleo de soja, fosfolipí- dios de ovo, glicerol e água).
[00370] As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuti- camente aceitáveis ou misturas dos mesmos e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados conforme estabelecidos acima. Em alguns aspectos da invenção, as composições são administradas pela via respiratória nasal ou oral para o efeito local ou sistêmico. As composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis, de preferência, estéreis podem ser nebulizadas pelo uso de gases. As soluções nebulizadas podem ser respiradas diretamente a partir do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser fixado a uma máscara facial, tenda ou máquina de respiração de pressão positiva intermitente. As composições de solução, suspensão ou em pó podem ser administradas, de preferência, oral ou nasalmente, a partir de dispositivos que entregam a formulação de uma maneira apropriada.
COMPOSIÇÕES
[00371] As composições usadas nos métodos da invenção compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco conforme descrito no presente documento. Os exemplos de tais composições, assim como o modo de formular, são também descritos em uma seção anterior e abaixo. Em alguns aspectos da invenção, a composição compreende um ou mais anticorpos anti- CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugados anticorpo anti-CXCR4-fármaco. Por exemplo, o anticorpo anti-CXCR4 reconhece o CXCR4 humano. Em alguns aspectos, o anticorpo CXCR4 é um anticorpo humano, um CDR enxertado, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em outros aspectos, o anticorpo anti-CXCR4 compreende uma região constante que tem a capa- cidade de ativar uma resposta imunológica desejada, tal como a lise mediada por anticorpo ou ADCC. Em ainda outros aspectos, o anticorpo anti-CXCR4 compreende uma região constante que não ativa uma resposta imunológica não desejada ou indesejável, tal como a lise me-diada por anticorpo ou ADCC. Em alguns aspectos da invenção, o an-ticorpo anti-CXCR4 compreende um ou mais CDR(s) de um anticorpo anti-CXCR4 ou um anti-CXCR4 ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento (tal como um, dois, três, quatro, cinco ou, em algumas modalidades, todos os seis CDRs).
[00372] Entende-se que as composições podem compreender mais do que um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco (por exemplo, uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 que reconhecem diferentes epítopos de CXCR4). Outras composições exemplificativas compreendem mais do que um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco que reconhece o(s) mesmo(s) epítopo(s) ou diferentes espécies de anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco que se ligam a diferentes epítopos de CXCR4 (por exemplo, CXCR4 humano).
[00373] A composição usada na presente invenção pode compreender adicionalmente veículos, excipientes ou estabilizadores farma- ceuticamente aceitáveis (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21a Edição, 2005, Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K. E. Hoover), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações e podem compreender tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxi- dantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; cate- col; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hi- drofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose ou dextranos; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, ma- nitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polieti- leno glicol (PEG). Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são adicionalmente descritos no presente documento. KITS
[00374] A invenção também fornece kits para o uso nos presentes métodos. Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes que compreendem um anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco con-forme descrito no presente documento e instruções para o uso em conformidade com qualquer um dos métodos da invenção descritos no presente documento. Geralmente, essas instruções compreendem uma descrição da administração do anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti- CXCR4-fármaco para os tratamentos terapêuticos descritos acima.
[00375] As instruções em relação ao uso do anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco, conforme descritos no presente documento, in-cluem geralmente as informações quanto à dosagem, programação de dosagem e rota de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, pacotes em batelada (por exemplo, pacotes de múltiplas doses) ou doses de subunidade. As ins-truções supridas nos kits da invenção são, tipicamente, instruções es-critas em uma identificação ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, ins-truções carregadas em um disco de armazenamento magnético ou óp-tico)são também aceitáveis.
[00376] Os kits desta invenção estão em embalagem adequada. A embalagem adequada inclui, porém, sem limitação, frascos, garrafas, jarras, embalagem flexível (por exemplo, bolsas de plástico ou Mylar vedadas) e similares. São também contempladas embalagens para o uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão tal como uma minibomba. O kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que têm um batente perfu- rável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente pode também ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que têm um batenteperfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti-CXCR4. O recipiente pode compreender adicionalmente um segundo agente farmaceutica- mente ativo.
[00377] Os kits podem fornecer opcionalmente componentes tais como tampões e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e uma identificação ou bula(s) no ou associada ao recipiente.
MUTAÇÕES E MODIFICAÇÕES
[00378] Para expressar os anticorpos anti-CXCR4 ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção, fragmentos de DNA que codificam as regiões VH e VL podem ser primeiramente obtidos com o uso de qualquer um dos métodos descritos acima. Várias modificações, por exemplo, mutações, substituições, deleções e/ou adições podem também ser introduzidas nas sequências de DNA com o uso de métodos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a mutagênese pode ser executada com o uso de métodos-padrão,tais como a mutagênese mediada por PCR, na qual os nucleotídeos que sofreram mutação são incorporados nos iniciadores de PCR de modo que o produto de PCR contenha as mutações desejadas ou mutagênese direcionada para sítio.
[00379] Um tipo de substituição, por exemplo, que pode ser feito é alterar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que pode ser quimicamente reativo, para outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Por exemplo, pode haver uma substituição de uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em um CDR ou região de arcabouço de um domínio variável ou na região constante de um anticorpo. Em alguns aspectos da invenção, a cisteína é canônica.
[00380] Os anticorpos podem também ser modificados, por exemplo, nos domínios variáveis das cadeias pesadas e/ou leves, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões CDR para aumentar ou diminuir o KD do anticorpo para CXCR4, para aumentar ou diminuir o koff ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo. As técnicas na mutagênese direcionada para sítio são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook et al. e Ausubel et al., supra.
[00381] Uma modificação ou mutação pode também ser feita em uma região de arcabouço ou região constante para aumentar a meia- vida de um anticorpo anti-CXCR4. Consultar, por exemplo, a Publica- ção PCT n° WO 00/09560. Uma mutação em uma região de arcabouço ou região constante pode também ser feita para alterar a imunogenici- dade do anticorpo para fornecer um sítio para a ligação covalente ou não covalente a outra molécula ou para alterar tais propriedades como a fixação de complemento, ligação de FcR e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo. De acordo com a invenção, um único anticorpo pode ter mutações em qualquer um ou mais dos CDRs ou regiões de arcabouço do domínio variável ou na região constante.
[00382] Em um processo conhecido como "linhagem germinativa", determinados aminoácidos nas sequências VH e VL podem sofrer mu-tação para corresponder àqueles encontrados naturalmente nas se-quências VH e VL de linhagem germinativa. Particularmente, as se-quências de aminoácidos das regiões de arcabouço nas sequências VH e VL podem sofrer mutação para corresponder às sequências de linhagem germinativa para reduzir o risco de imunogenicidade quando o anticorpo é administrado. As sequências de DNA de linhagem ger- minativa para genes VH e VL humanos são conhecidas na técnica (consultar, por exemplo, o banco de dados de linhagem germinativa humana "Vbase"; consultar também Kabat, E. A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776 a 798 (1992); e Cox et al., Eur. J. Immunol. 24:827 a 836 (1994).
[00383] Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é remover os sítios proteolíticos potenciais no anticorpo. Tais sítios podem ocorrer em um CDR ou região de arcabouço de um domínio variável ou na região constante de um anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e remoção de sítios proteolíticos pode diminuir o risco de heterogeneidade no produto de anticorpo e, assim, aumentar sua homogeneidade. Outro tipo de substituição de aminoácido é elimi- nar pares de asparagina-glicina, que formam sítios de desamidação potencial, alterando-se um ou ambos os resíduos. Em outro exemplo, a lisina C-terminal da cadeia pesa de um anticorpo anti-CXCR4 da in-venção pode ser clivada. Em vários aspectos da invenção, as cadeias pesadas e leves dos anticorpos anti-CXCR4 podem incluir opcionalmente uma sequência de sinal.
[00384] Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam os segmentos VH e VL da presente invenção são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes de cadeia de anticorpos de comprimento completo, em genes de fragmento Fab ou em um gene scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH é operacionalmente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um vinculador flexível. O termo "operacionalmente ligado", conforme usado neste contexto, pretende significar que dois fragmentos de DNA são unidos de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam em quadro.
[00385] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento completo ligando- se operacionalmente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humanossão conhecidas na técnica (consultar, por exemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), e os fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos pela amplificação de PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas, de preferência máxima, é uma região constante IgG1 ou IgG2. A sequência de região constante IgG pode ser qualquer um dos vários alelos ou alótipos conhecidos por ocorrer dentre diferentes indivíduos, tais como Gm(1), Gm(2), Gm(3) e Gm(17). Esses alótipos representam a substituição de aminoácido de ocorrência natural nas regiões constantes IgG1. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser ope-racionalmente ligado à outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada CH1 pode ser derivada de qualquer um dos genes de cadeia pesada.
[00386] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento completo (assim como um gene de cadeia leve Fab) ligando-se covalentemente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes de região constante de cadeia leve humanos são conhecidas na técnica (consultar, por exemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), e os fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos pela amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda. A região constante kappa pode ser qualquer um dos vários alelos conhecidos por ocorrer dentre diferentes indivíduos, tais como Inv(1), Inv(2) e Inv(3). A região constante lambda pode ser derivada de qualquer um dos três genes lambda.
[00387] Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL são operacionalmente ligados a outro fragmento que codifica um vinculador flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, (SEQ ID NO: 80) de modo que as sequên- cias VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo vinculador flexível (consultar, por exemplo, Bird et al., Science 242:423 a 426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:5.879 a 5.883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552 a 554 (1990). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas um único VH e VL for usado, bivalente, se dois VH e VL forem usados, ou polivalente, se mais do que dois VH e VL forem usados. Anticorpos biespecíficos ou polivalentes podem ser gerados que se ligam a CXCR4 e a outra molécula.
[00388] Em alguns aspectos da invenção, uma imunoadesina ou anticorpo de fusão pode ser feito que compreende todo ou uma porção de um anticorpo anti-CXCR4 da invenção ligado a outro polipeptídeo. Em outros aspectos, apenas os domínios variáveis do anticorpo anti- CXCR4 são ligados ao polipeptídeo. Em alguns aspectos da invenção, o domínio VH de um anticorpo anti-CXCR4 é ligado a um primeiro po- lipeptídeo, enquanto que o domínio VL de um anticorpo anti-CXCR4 é ligado a um segundo polipeptídeo que se associa ao primeiro polipep- tídeo de maneira que os domínios VH e VL possam interagir um com o outro para formar um sítio de ligação de antígeno. Em outros aspectos, o domínio VH é separado do domínio VL por um vinculador de modo que os domínios VH e VL possam interagir um com o outro. O anticorpo VH-vinculador-VL é, então, ligado ao polipeptídeo de interesse. Adicionalmente, anticorpos de fusão podem ser criados nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia única são ligados um ao outro. Isso é útil for desejado criar um anticorpo bivalente ou polivalente em uma única cadeia de polipeptídeo ou se for desejado criar um anticorpo bi- específico.
[00389] Em alguns aspectos da invenção, outros anticorpos modificados podem ser preparados com o uso de moléculas de ácido nuclei- co que codificam o anticorpo anti-CXCR4. Por exemplo, "Kappa bodi es"(Ill et al., Protein Eng. 10:949 a 957 (1997)), "Minibodies"(Martin et al., EMBO J., 13:5.303 a 5.309 (1994)), "Diabodies"(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6.444 a 6.448 (1993)) ou "Janusins"(Traunecker et al., EMBO J. 10:3.655 a 3.659 (1991) e Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51 a 52 (1992)) podem ser preparados com o uso de técnicas biológicas moleculares padrão seguindo os ensinamentos do relatório descritivo.
[00390] Os anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação de antígeno podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab’. Consultar, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315 a 321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1.547 a 1.553 (1992). Adicionalmente, os anticorpos biespecíficos podem ser formados como "diabodies"ou "Janusins". Em alguns aspectos da invenção, o anticor-pobiespecífico se liga a dois epítopos diferentes de CXCR4. Em alguns aspectos, os anticorpos modificados descritos acima são preparados com o uso de um ou mais dos domínios variáveis ou regiões CDR dos anticorpos anti-CXCR4 fornecidos no presente documento.
[00391] Em um aspecto, a presente invenção compreende o uso de anticorpos multiespecíficos. Um anticorpo multiespecífico é um anticorpo que pode se ligar simultaneamente a pelo menos dois alvos que são de estrutura diferente, por exemplo, dois antígenos diferentes, dois epítopos diferentes no mesmo antígeno ou um hapteno e/ou um antí- geno ou epítopo. Os anticorpos multiespecíficos e multivalente são construtos que têm mais do que um sítio de ligação, e os sítios de ligação são de especificidade diferente.
[00392] Os materiais representativos da presente invenção foram depositados na Coleção de Cultura do Tipo Americana (ATCC) em 19 de junho de 2014. Um vetor que tem número de acesso ATCC PTA- 121353 é um polinucleotídeo que codifica uma região variável de ca- deia pesada de anticorpo anti-CXCR4 humanizado, e o vetor que tem número de acesso ATCC PTA-121354 é um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo anti-CXCR4 humanizado. Os depósitos foram feitos sob as provisões do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para o Propósito de Procedimento de Patente e Regulamentos sob o mesmo (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será tornado disponível pela ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste e submetido a um acordo entre Pfizer, Inc. e ATCC, o que garante disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante concessão da patente U.S. pertinente ou mediante abertura ao público de qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade da progênie a alguém determinado pelo Comissário de Patentes e Marcas Registradas dos EUA a ter direito à mesma de acordo com 35 U.S.C. Seção 122 e as regras do Comissário de acordo com o mesmo (incluindo 37 C.F.R. Seção 1.14 com referência particular a 886 OG 638).
[00393] O cessionário do presente pedido concordou que se uma cultura dos materiais em depósito morrer ou for perdida ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais devem ser prontamente substituídos sob notificação por outros dos mesmos. A disponibilidade do material depositado não deve ser interpretada como uma licença para praticar a invenção em contravenção dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo em conformidade com suas leis de patente.
[00394] A invenção também se refere ao uso desses anticorpos an- ti-CXCR4, por exemplo, anticorpos de comprimento completo, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugados anticorpo- fármaco anti-CXCR4 e composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos de receptor CXCR4, por exemplo, anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, no tratamento de doenças e afecções associadas à modulação de CXCR4, tal como transplante de medula óssea, quimiossensibilização, câncer, doença metastática (por exemplo, câncer), doença autoimune (por exemplo, artrite reumatoide), doença de fibrose (por exemplo, pulmonar), infecção por AIDS, doença cardiovascular, uveíte, doenças inflamatórias, doença celíaca, infecção por HIV e medicina regenerativa baseada em células-tronco.
CÂNCER
[00395] O receptor CXCR4 é superexpresso em um grande número de cânceres, incluindo, porém, sem limitação, de mama (Muller, A. et al. Nature 410:50 a 56 (2001)); ovariano (Scotton, C. et al. Br. J. Cancer 85:891 a 897 (2001); de próstata (Taichman, R.S. et al. Cancer Res. 62:1.832 a 1.837 (2002); de pulmão de células não pequenas (Spano J.P. et al. Ann. Oncol. 15:613 a 617 (2004)); pancreático (Kos- hiba, T. et al. Clin. Cancer Res. 6:3.530 a 3.535 (2000)); de tireoide (Hwang, J.H. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:408 a 416 (2003)); carcinoma nasofaríngeo (Wang, N. et al. J. Transl. Med. 3:26 a 33 (2005)); melanoma (Scala, S. et al. Clin. Cancer Res. 11:1.835 a 1.841 (2005)); carcinoma de células renais (Staller, P. et al. Nature 425:307 a 311 (2003)); linfoma (Bertolini, F. et al. Cancer Res. 62:3.530 a 3.535 (2002)); neuroblastoma (Geminder, H. et al. J. Immunol. 167:4.747 a 4.757 (2001)); glioblastoma (Rempel, S.A. et al. Clin. Cancer Res. 6:102 a 111 (2000)); rabdomiosarcoma (Libura, J. et al. Blood 100:2.597 a 2.606 (2002)); colorretal (Zeelenberg, I.S. et al. Cancer Res. 63:3.833 a 3.839 (2003)); renal (Schrader, A.J. et al. Br. J. Cancer 86:1.250 a 1.256 (2002)); osteosarcoma (Laverdiere, C. et al. Clin. Cancer Res. 11:2.561 a 2.567 (2005)); leucemia linfoide aguda (Craz- zolara, R. et al. Br. J. Haematol. 115:545 a 553 (2001)); e leucemia mieloide aguda (Rombouts, E.J.C. et al. Blood 104:550 a 557 (2004)).
[00396] Em vista do anterior, o anticorpo anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 desta descrição pode ser usado no tratamento de cânceres, incluindo, porém, sem limitação, de mama, ovariano, de próstata, de pulmão de células não pequenas, pancreático, de tireoide, carcinoma nasofaríngeo, melanoma, carcinoma de células renais, linfoma, neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiosarcoma, colorretal, renal, os-teosarcoma, leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), mieloma múltiplo (MM), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de Hodgkin, linfoma de células do manto (MCL), linfoma folicular, macro- globulinemia de Waldenstrom (WM) e linfoma de células B e linfoma de grandes células B difuso (DLBCL). O anticorpo pode ser usado sozinho ou em combinação com outros tratamentos contra câncer, tais como cirurgia e/ou radiação, e/ou com outros agentes antineoplásti- cos, tais como os agentes antineoplásticos discutidos e apresentados acima, incluindo fármacos quimioterápicos e outros anticorpos de antí- geno antitumorais, tais como aqueles que ligam CD20, Her2, PSMA, Campath-1, EGFR e similares.
[00397] Em alguns aspectos, os anticorpos anti-CXCR4 da presente invenção podem ser usados em combinação com anticorpos anti CD22 ou anti CD33, conjugados anticorpo-fármaco ou composições que compreendem tais anticorpos. Por exemplo, os anticorpos anti- CXCR4 da presente invenção podem ser combinados com inotuzuma- be ozogamicina ou gentuzumabe ozogamicina (Mylotarg®) .
[00398] "Terapia de combinação"ou administração "em combinação com"um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea, concomitante ou consecutiva em qualquer ordem. A admi- nistração dos constituintes das preparações combinadas da presente invenção pode ser realizada de modo simultâneo, separado ou se-quencial.
[00399] De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para o tratamento de cânceres que compreende a administração simultânea, concomitante ou consecutiva de anticorpos anti-CXCR4 da presente invenção e inotuzumabe ozogamicina. Por exemplo, os anticorpos anti-CXCR4 podem ser administrados antes ou após ou simultaneamente com inotuzumabe ozogamicina. Adicionalmente, a presente invenção fornece no presente documento um método para o tratamento de cânceres, tal como AML, que compreende a administração simultânea, concomitante ou consecutiva de anticorpos anti-CXCR4 da presente invenção e Mylotarg. Por exemplo, os anticorpos anti-CXCR4 podem ser administrados antes ou após ou simultaneamente com Mylotarg.
[00400] O anticorpo anti-CXCR4, ou um fragmento do mesmo, pode ser conjugado a uma metade terapêutica e/ou agente diagnóstico, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são referidos no presente documento como conjugados anticorpo-fármaco. Os conjugados anticorpo- fármaco podem incluir uma ou mais citotoxinas.
[00401] Em alguns aspectos da invenção, o tratamento compreende administrar um anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antíge- no do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 da presente invenção com um ou mais agentes bioativos selecionados dentre anticorpos, fatores de crescimento, hormônios, citocinas, anti- hormônios, xantinas, interleucinas, interferons e fármacos citotóxicos. Em aspectos particulares da invenção, o agente bioativo é um anticorpo, e é direcionado contra um antígeno de superfície celular expresso em malignidades de células B.
[00402] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo direcionado contra antígenos de superfície celular expressos em malignidades de células B é selecionado de um grupo que consiste em anticorpos anti- CD19, anti-CD20 e anti-CD33. Tais anticorpos incluem o anticorpo anti-CD20, rituximabe (Rituxan™).
[00403] Em alguns aspectos da invenção, os agentes bioativos são citocinas ou fatores de crescimento e incluem, porém, sem limitação, interleucina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF e G-CSF. Em aspectos parti-culares da invenção, os agentes bioativos são hormônios e incluem estrogênios, androgênios, progestinas e corticosteroides.
[00404] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco é um fármaco selecionado dentre doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, aclarubi- cina, zorubicina, mitoxantrona, epirubicina, carubicina, bendamustina, bevacizumabe, bortesomibe, lenalidomida, melfalan, nogalamicina, menogaril, pitarubicina, valrubicina, citarabina, gencitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuri- dina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gou- gerotina, puromicina, tegafur, tiazofurina, adriamicina, cisplatina, car-boplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mito- xantrona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, metotrexato de pro- carbazina, flurouracilas, etoposídeo, taxol, análogos de taxol e mitomi- cina.
[00405] Em alguns aspectos da invenção, a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CXCR4, um fragmento do mesmo ou o conju-gadoanticorpo-fármaco anti-CXCR4 da presente invenção é administrada juntamente com um ou mais combinações de inibidores de tirosi- na quinase. Os inibidores de tirosina quinase incluem tanto metades proteicas como não proteicas. Um inibidor de tirosina quinase pode ser, por exemplo, um anticorpo, um ligante de receptor ou um inibidor de molécula pequena. Os exemplos de inibidores de tirosina quinase adequados para uso nos métodos da presente invenção incluem, porém, sem limitação, gefitinibe, sunitinibe, erlotinibe, lapatinibe, canerti- nibe, semaxinibe, vatalanibe, sorafenibe, imatinibe, dasatinibe, leflu- nomida, vandetanibe, derivados dos mesmos, análogos dos mesmos e combinações dos mesmos. Os inibidores de tirosina quinase adicionais adequados para uso na presente invenção são conforme descritos, por exemplo, nas Patentes n° US 5.618.829; 5.639.757; 5.728.868; 5.804.396; 6.100.254; 6.127.374; 6.245.759; 6.306.874; 6.313.138; 6.316.444. 6.329.380; 6.344.459; 6.420.382; 6.479.512; 6.498.165; 6.544.988; 6.562.818; 6.586.423; 6.586.424; 6.740.665; 6.794.393; 6.875.767. 6.927.293; e 6.958.340.
[00406] Em alguns aspectos da invenção, a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CXCR4, um fragmento do mesmo ou o conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 da presente invenção é administrada juntamente com um ou mais combinações de fármacos como uma parte de um regime de tratamento, em que a combinação de agentes citotóxicos é selecionada dentre: CHOPP (ciclofosfamida, do- xorubicina, vincristina, prednisona e procarbazina); CHOP (ciclofosfa- mida, doxorubicina, vincristina e prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina e prednisona); m-BACOD (meto- trexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexame- tasona e leucovorina); ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, do- xorrubicina, ciclofosfamida, etoposídeo, leucovorina, mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina); ProMACE-CytaBOM (predni- sona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposídeo, leucovo- rina, citarabina, bleomicina e vincristina); MACOP-B (metotrexato, do- xorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina e leu- covorina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazi- na); ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblastina e dacar- bazina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina) alternando com ABV (adriamicina/doxorrubicina, bleomicina e vinblas- tina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina) alternando com ABVD (adriamicina/doxorubicina, bleomicina, vinblas- tina e dacarbazina); ChIVPP (clorambucil, vinblastina, procarbazina e prednisona); IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato e etoposídeo); MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato e etoposídeo); DHAP (dexameta- sona, citaribina em alta dose e cisplatina); ESHAP (etoposídeo, metil- predisolona, citaribina em alta dose e cisplatina); CEPP(B) (ciclofosfa- mida, etoposídeo, procarbazina, prednisona e bleomicina); CAMP (lo- mustina, mitoxantrona, citarabina e prednisona); CVP-1 (ciclofosfami- da, vincristina e prednisona), ESHOP (etoposídeo, metilpredisolona, citarabina em alta dose, vincristina e cisplatina); EPOCH (etoposídeo, vincristina e doxorrubicina por 96 horas com doses de bolo de ciclofos- famida e prednisona oral), ICE (ifosfamida, ciclofosfamida e etoposí- deo), CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposídeo, procarbazina, prednisona e bleomicina), CHOP-B. (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona e bleomicina), CEPP-B (ciclofosfamida, etoposídeo, pro- carbazina e bleomicina) e P/DOCE (epirrubicina ou doxorrubicina, vin- cristina, ciclofosfamida e prednisona).
[00407] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco pode ser ad-ministrado de modo simultâneo, sequencial ou concomitante com o anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou anti-CXCR4 conjugado anticorpo-fármaco conforme descrito no presente documento. Por exemplo, o anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4- fármaco pode ser administrado antes da administração de uma ou mais combinações de agentes citotóxicos como uma parte de um regime de tratamento. Em alguns aspectos da invenção, as doses tera- peuticamente eficazes do anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco são administradas subsequentemente à administração de uma ou mais combinações de agentes citotóxicos como parte de um regime de tratamento.
[00408] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco são administradas subsequentemente juntamente com uma ou mais combinações de agentes citotóxicos como parte de um regime de tratamento.
[00409] O anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 da presente invenção também pode ser administrado em conjunto com tratamento de não fármaco, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia, imuno- terapia e regimes de dieta/exercícios. A outra terapia pode ser admi-nistrada antes, concomitantemente com ou após o tratamento com o anticorpo anti-CXCR4, um fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4 -fármaco da presente invenção. Pode também haver um atraso de diversas horas, dias e, em alguns casos, semanas entre a administração dos diferentes tratamentos, de modo que o anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo anti-CXCR4-fármaco da presente invenção possa ser administrado antes ou após o outro tratamento.
USO TERAPÊUTICO DE CXCR4
[00410] Em conformidade com vários aspectos da invenção, os an-ticorpos anti-CXCR4, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ou anticorpo anti-CXCR4-fármaco podem ser usados para tratar ou pro-duzirfármacos para tratar uma variedade de distúrbios, incluindo vá-rioscânceres, distúrbios inflamatórios, distúrbios alérgicos, infecções (infecção por HIV, etc.), distúrbios autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide), distúrbio de fibrose (por exemplo, pulmonar) e distúrbios cardiovasculares. Os distúrbios de câncer incluem cânceres de tumor sólido (por exemplo, cânceres gástrico, de cabeça de pescoço, pulmão, ovariano e pancreático) e cânceres hematológicos (por exemplo, síndromes mielodisplásticas, distúrbios mieloproliferativos e leucemias agudas). Os exemplos de distúrbios hematopoiéticos incluem derivados de linhagem não B, tais como leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfoide aguda de células não B (ALL), distúrbios mielodisplásticos, distúrbios mieloproliferativos, policitemias, trombocitemias ou linfoproliferações imunológicas atípicasnão B. Os exemplos de distúrbio derivado de células B ou de linhagem de células B incluem leucemia linfoide crônica (CLL), leucemia de linhagem de linfócito B, mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia pró-linfoide de células B, leucemia linfoblástica de precursor B, leucemia de células pilosas ou distúrbios de células do plasma, por exemplo, amiloidose ou macroglobulinemia de Waldenstrom.
DISTÚRBIOS HEMATOLÓGICOS
[00411] Os distúrbios hematológicos compreendem doenças do sangue e todos seus constituintes assim como doenças de órgãos e tecidos envolvidos na geração ou na degradação de todos os constituintes do sangue. Em alguns aspectos da invenção, o distúrbio hematológicoinclui, porém, sem limitação, leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide crônica (CLL), linfo- ma linfocítico pequeno (SLL), mieloma múltiplo (MM), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de Hodgkin, linfoma de células do manto (MCL), linfoma folicular, macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), linfoma de células B e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). NHL pode incluir Linfoma Não Hodgkin indolente (iNHL) ou Linfoma Não Hodgkin agressivo (aNHL). Em determinados aspectos, os indivíduos são rein- cidentes ou refratários de outro tratamento. Em determinados aspectos, os indivíduos são reincidentes ou refratários de pelo menos dois ou mais outros tratamentos. Em alguns aspectos da invenção, os indivíduos são reincidentes ou refratários de pelo menos três ou mais outros tratamentos. Em alguns aspectos da invenção, os indivíduos são reincidentes ou refratários de pelo menos cinco ou mais outros trata-mentos.
[00412] A presente invenção contempla o uso de anticorpo anti- CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti-CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de distúr-bioshematológicos. Tal composição pode conter anticorpos anti- CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais. Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 monoclonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anti- corpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo anti- CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonal e fármaco.
LEUCEMIA LINFOIDE CRÔNICA
[00413] As células de CLL expressam altos níveis de CXCR4. (Burger JA, Burger M, Kipps TJ. Chronic lymphocytic leukemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptors that mediate spontaneous migration beneath bone marrow stromal cells. 33, 3.658 a 3.667 (1999). A presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti- CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende um anticorpo anti- CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de leucemia linfoide crônica de células B (CLL). Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais ou uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais. Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 mo- noclonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonal e fármaco
OUTROS LINFOMAS DE CÉLULAS B
[00414] A expressão de CXCR4 foi demostrada em linfoma não Hodgkin (NHL) de células B (Burger et. al., Chronic lymphocytic leukemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptors that mediate spontaneous migration beneath bone marrow stromal cells. Blood. 94:3.658 a 3.667 (1999)) e células T (Trentin L, Agostini C, Facco M, et al. The chemokine receptor CXCR4 is expressed on malignant B cells and mediates chemotaxis. J Clin Invest. 104:115 a 121 (1999)). As células B malignas de pacientes com B-NHL expressam receptores de CXCR4 funcionais. Acredita-se que o padrão distinto de expressão de receptor de quimiocina esteja envolvido em tráfego e endereçamento de células de linfoma e pode permitir a distinção de diferentes subconjuntos de NHL. (Jones D, Benjamin RJ, Shahsafaei A, Dorfman DM. O receptor de quimiocina CXCR4 é expresso em um subconjunto de linfomas de célula B e é um marcador de leucemia lin- foide crônica de células B. Blood. 95:627 a 632 (2000)). Em um modelo de animal, camundongos foram estimulados com células de hibri- doma de células T que foram modificadas para reter CXCR4 dentro do citoplasma. Em outro modelo de camundongo de NHL de alto grau humano, a neutralização de CXCR4 por anticorpos monoclonais inibiu a circulação de células de NHL e aprimorou a sobrevivência. (Bertolini F, Dell’Agnola C, Mancuso P, et al. CXCR4 neutralization, a novel therapeutic approach for non-Hodgkin’s lymphoma. Cancer Res. 62:3.106 a 3.112 (2002)), portanto, sugeriu a neutralização de CXCR4 como uma abordagem terapêutica inovadora em NHL. A presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti-CXCR4 como a composição terapêutica principal para o tratamento de linfomas de células B crônicos. Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti- CXCR4 monoclonais. Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 monoclonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo anti-CXCR4-fármaco ou mistura de conjugados anticorpo anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonal e fármaco.
CXCR4 EM MIELOMA MÚLTIPLO
[00415] O mieloma múltiplo (MM) é um grande neoplasma incurável de células do plasma. O receptor de quimiocina CXCR4 é expresso pela maioria das células de MM dos pacientes. O mesmo promove a migração e o endereçamento de células do mieloma para o compartimento da medula óssea (BM), dá suporte à sobrevivência das células tumorais e protege as células do mieloma contra apoptose induzida por quimioterapia. De modo correspondente, o anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo ou conjugado anticorpo- fármaco anti-CXCR4 que compreende um anticorpo anti-CXCR da presente invenção que inibe a atividade de CXCR4 (por exemplo, anti-corpos antagonistas) pode ser usado no tratamento de distúrbios he-matológicos,tal como mieloma múltiplo. Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 monoclonais direcionados a diferentes epíto- pos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo- fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonal e fármaco
CXCR4 EM LEUCEMIAS AGUDAS
[00416] Devido ao fato de que o CXCR4 exerce um papel essencial para a retenção de progenitores hematopoiéticos na medula, diversos grupos examinaram o papel exercido pelo CXCR4 em leucemias de células progenitoras. A leucemia linfoide aguda (ALL) de células B precursoras expressa receptores CXCR4 funcionais (Bradstock KF, Makrynikola V, Bianchi A, Shen W, Hewson J, Gottlieb DJ. Effects of the chemokine stromal cell-derived factor-1 on the migration and localization of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells within bone marrow stromal layers. Leukemia. 14:882 a 888 (2000)) que participam no endereçamento de células de leucemia para a medula em camundongos imunodeficientes combinados com diabete severa não obesos (NOD/SCID).(Shen W, Bendall LJ, Gottlieb DJ, Bradstock KF. The chemokine receptor CXCR4 enhances integrin- mediated in vitro adhe-sion and facilitates engraftment of leukemic precursor-B cells in the bone marrow. Exp Hematol. 29:1.439 a 1.447 (2001).) Em um modelo de animal refinado, Sipkins et al (Sipkins DA, Wei X, Wu JW, et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435: 969 a 973 (2005)) forneceu evidência de que o CXCR4 funcional é necessário para o endereçamento de células de ALL para o microambiente da medula. A presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti-CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de leucemia linfoide aguda (ALL). Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti- CXCR4 monoclonais.
[00417] Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 mono- clonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonal e fár- maco.
CXCR4 EM LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (AML)
[00418] A despeito de uma sensibilidade geral á quimioterapia, a sobrevivência sem doença em longo prazo em AML permanece baixa devido ao fato de que a maioria dos pacientes reincide de doença re-sidual mínima (MRD). O CXCR4 parece ser o regulador central de sinais de sobrevivência que explicam a resistência a fármaco anticâncer. Esse conceito é suportado pela conclusão de que a expressão em alto nível de CXCR4 por células de leucemia é um indicador prognóstico adverso em AML. Spoo AC, Wierda WG, Burger JA. The CXCR4 score: a new prognostic marker in acute myelogenous leukemia [abstract]. Blood. 104:304a (2004). A presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti-CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de leucemia mieloide aguda (AML)._Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais.
[00419] Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 mono- clonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonal e fár- maco
CXCR4 EM CÂNCERES NÃO HEMATOPOIÉTICOS
[00420] Um dos papéis mais intrigantes e talvez mais importantes que as quimiocinas e os receptores de quimiocina têm é regular a me- tástase de tumores sólidos. CXCR4 é um dos receptores de quimioci- nas mais bem estudados, que se liga seletivamente ao fator 1 derivado de célula estromal de quimiocina CXC (SDF-1), também conhecido como CXCL12 (Fredriksson et. al., Mol Pharmacol. 63:1.256 a 1.272 (2003)). Até a presente data, o CXCR4 demonstrou ser superexpresso em mais de 20 malignidades humanas, incluindo câncer de mama, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de cólon, câncer de tireoide e câncer pancreático (Müller et al., Nature 410: 50 a 6 (2001); Akashi et al. Cancer Sci. 99(3):539 a 542 (2008); Maréchal et al. Br J Cancer, 100, 1.444 a 1.451 (2009); Wang et al., Clin Exp Metastasis, 26, 1.049 a 1.054.(2009); He X et al., Pathol Res Pract, 206, 712 a 715. (2010)).
[00421] A presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti- CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti-CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de cânceresnão hematopoiéticos. Tal composição pode conter anticorpos anti- CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais. Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 monoclonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anti- corpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo- fármaco anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonais.
CXCR4 EM CÂNCER DE MAMA
[00422] A expressão de alto nível de CXCR4 em células neoplásti- cas está associada à sobrevivência geral relativamente ruim em pacientes com câncer de mama. (Li YM, Pan Y, Wei Y, et al. Up-regulation of CXCR4 is essential for HER2-mediated tumor metastasis. Cancer Cell. 6:459 a 469 (2004)). A expressão de alto nível de HER2/neu, que é observada em cerca de 30% de todos os cânceres de mama, também está associada a um prognóstico relativamente ruim. Li et. al. re-centemente demonstrou que HER2/neu intensifica a expressão e a função de CXCR4 por inibição da degradação de CXCR4. (Li YM, Pan Y, Wei Y, et al. Up-regulation of CXCR4 is essential for HER2- mediated tumor metastasis. Cancer Cell. 6:459 a 469 (2004)). Portanto, a presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo- fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti-CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de câncer de mama. Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais. Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti- CXCR4 monoclonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 e anti- CXCR4 monoclonais
CXCR4 EM CÂNCER DE PULMÃO
[00423] O câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) é um ne-oplasma agressivo e com metástase rápida com uma alta propensão a comprometimento da medula. Mesmo com tratamento de quimioterapia e radioterapia em combinação, a sobrevivência de 5 anos é apenas cerca de 5% devido ao rápido desenvolvimento de resistência a fármaco. Em células de SCLC, a ativação de CXCR4 induz respostas migratórias e invasivas e a adesão às células estromais da medula de uma forma dependente de CXCR4 e integrina. O CXCR4 pode direcionar o padrão metastático distinto observado em pacientes com SCLC. Assim, a presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugadoanticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti- CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de câncer de pulmão. Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais. Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 monoclonais direcionados a diferentes epíto- pos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo- fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti- CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonais.
CXCR4 EM CARCINOMA DE CÉLULA RENAL (RCC)
[00424] Recentemente, o papel do CXCR4 em mRCC tem sido completamente elucidado. Os resultados demonstraram que a alta ex-pressão de CXCR4 estava fortemente associada à baixa sobrevivência de pacientes com mRCC (Wang et al., Clin Exp Metastasis, 26, 1.049 a 1.054(2009); Zhao et al., Mol Biol Rep, 38, 1.039 a 1.045 (2011)). Além disso, os resultados em um modelo murino mostram que a capa-cidademetastática de células de RCC que expressam CXCR4 correla-cionou-se fortemente com o nível de proteína CXCR4 em células can-cerosas e a expressão de SDF-1α nos órgãos alvo. (Motzer et. Al. The New England Journal of Medicine, volume 335, número 12, página 865 a 875 (1996)). De modo correspondente, o CXCR4 pode ser um agen-teterapêutico interessante em uma terapia multimodal de carcinoma renal de células claras.
[00425] A presente invenção contempla o uso de um anticorpo anti- CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado anticorpo-fármaco anti-CXCR4 que compreende anticorpos anti-CXCR como a composição terapêutica principal para o tratamento de carcinoma de células renais (RCC). Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais.
[00426] Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 mono- clonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclo- nais.
CXCR4 EM INDICAÇÕES NÃO ONCOLÓGICAS
[00427] Os receptores de quimiocina são expressos em várias célu-lasespecíficas e em um tempo específico. Estão amplamente associados ao controle de respostas inflamatórias e imunológicas através de um mecanismo pelo quais suas células efetoras acumulam-se em um local em que a quimiocina é produzida. Por exemplo, mostrou-se que SDF-1 inibe especificamente a infecção de HIV direcionado a células T (X4) in vitro (Bleul et al. Nature, 382:829 a 833 (1996), Oberlin et al. Nature, 833 a 835 (1996)). Pode-se considerar que SDF-1 liga-se a CXCR4 antes do HIV, tomando, assim, um arcabouço para infectar uma célula de HIV, resultando em inibição de infecção por HIV. Além disso, um inibidor de infecção por HIV mostrou ser um antagonista de CXCR4 (Nat. Med., 4, 72 (1998)).
[00428] De modo correspondente, a presente invenção contempla o uso de anticorpo anti-CXCR4, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou anticorpos anti-CXCR de conjugado anticorpo-fármaco an- ti-CXCR4 como uma composição terapêutica para o tratamento de doenças inflamatórias ou autoimunes, doenças alérgicas, infecções (infecção por HIV, etc.), doenças associadas à infecção por HIV (síndro- me da imunodeficiência adquirida, etc.). Tal composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais.
[00429] Adicionalmente, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 monoclo- nais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonais.
SÍNDROME DE WHIM
[00430] A síndrome de WHIM é um distúrbio de imunodeficiência congênito caracterizado pelas principais manifestações clínicas: verru-gas, hipogammaglobulinemia, infecções bacterianas recorrentes e mi- elocatexia [McDermott, DH et al. Blood 118 (18): 4.957 a 4.962 (2011); Mcermott DH et al. J. Cell. Mol. Med. 15(10): 2.071 a 2.081 (2011)]. A mielocatexia pode ser, ainda, caracterizada como um distúrbio hema-tológicoincomum em que os neutrófilos maduros falham em sais da medula óssea e a abundância ou função de células B e T é deficiente (Zueler WW et al. N. Engl. J. Med. 270: 699 a 704 (1964)). Hernandez PA et al descreveram pela primeira vez que mutações no CXCR4 estão associadas à síndrome de WHIM, em que CXCR4R334Xé a variante mais comum e mais bem estudada (Hernandez PA et al. Nature Genetics 34: 70 a 74 (2003)). CXCR4R334X , como uma mutação de ganho de função, exibe capacidade de sinalização intensificada para o ligante endógeno CXCL12. Portanto, o controle da capacidade de sinalização aumentada do CXCR4R334X pode ser utilizado para tratar a síndrome de WHIM.
[00431] Em alguns aspectos da invenção, a presente invenção contempla o uso de um conjugado anticorpo-fármaco que compreende anticorpos anti-CXCR4 como a composição terapêutica principal para o tratamento de síndrome de WHIM, em que a dita composição pode conter anticorpos anti-CXCR4 policlonais ou anti-CXCR4 monoclonais. Além disso, uma composição terapêutica da presente invenção pode conter uma mistura de anticorpos anti-CXCR4 monoclonais direcionados a diferentes epítopos de CXCR4 de não bloqueio ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 ou mistura de conjugados anticorpo-fármaco anti-CXCR4 e anti-CXCR4 monoclonais Adicionalmente, em alguns aspectos, a composição terapêutica revelada pela presente invenção pode ser administrada sozinha ou em combinação com alguns tratamentos atuais para a síndrome de WHIM, tal como G- CSF (filgrastim (Neupogen; Amgen Inc.)), imunoglobulina intravenosa e um antagonista de CXCR4 de molécula pequena AMD3100 (plerixa- for, nome comercial Mozobil (Genyzme Corporation)).
[00432] Os exemplos a seguir são oferecidos para propósitos ilustrativos apenas e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de nenhuma forma. De fato, várias modificações da invenção adi-cionalmenteàquelas mostradas e descritas no presente documento serão tornadas evidentes aos versados na técnica a partir da descrição anterior e estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLO 1 DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO PARA ANTICORPOS DE CAMUNDONGO ANTI-CXCR4 QUIMÉRICOS
[00433] A ligação de anticorpos quiméricos anti-CXCR4 de camundongo 12A11, 6B6 e 3G10 (expressos como o subtipo hIgG1) foi avaliada em células Ramos de Linfoma não Hodgkin (NHL) humano que expressa CXCR4 por citometria de fluxo. 100.000 célula foram incubadas com anticorpos anti-CXCR4 diluídos em série em 100 μl de tampão de ligação (PBS + 0,5% de BSA), seguido por incubação com anticorpo secundário Fc anti-humano conjugado a Dylight488 do Jackson Immunoresearch Laboratories. A % foi derivada por normalização de valores de MFI de cada diluição ao valor máximo. EC50 foi calculado pelo software PRISM. TABELA 6
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EXEMPLO 2 LIGAÇÃO DE FAB 3G10 HUMANIZADO A CÉLULAS HPB-ALL QUE EXPRESSAM CXCR4
[00434] A ligação de Fabs 3G10 humanizados foi avaliada em células HPB-ALL de expressão de CXCR4 por citometria de fluxo. 150.000 células foram incubadas com vários Fabs h3G10 a 2,5 ou 0,25 μg/ml em 100 μl de tampão de ligação (PBS + 0,5% de BSA), seguido por incubação com anticorpo secundário específico para Fab anti-humano de cabra conjugado com APC da R&D systems. TABELA 7
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EXEMPLO 3 LIGAÇÃO DE ANTICORPO DE CXCR4: LIGAÇÃO CELULAR E MEDIÇÃO DE AFINIDADE DE FABS DE AB CXCR4
[00435] A ligação de Fabs de CXCR4 a células que expressam CXCR4 foi medida por citometria de fluxo em células HPB-ALL (leucemia de células T humana). 150.000 células HPB-ALL foram ressus- pensas em 100 μl de tampão FACS (IxPBS + 0,5% de BSA) em placas de 96 cavidades. Fabs Anti-CXCR4 foram adicionados a cada cavidade à concentração final de 0,25 μg/ml e incubados a 4 graus por 30 min. Após a remoção dos anticorpos primários, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e, então, ressuspensas em tampão FACS e 2 μl (3 μg) de Ab secundário (IgG anti-humana de cabra conjugada a Alexa Fluor 647, F(ab’)2 específico, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA) foram, então, adicionados a cada cavidade. As placas foram incubadas a 4 graus por mais 30 min. Os sinais de fluorescência foram adquiridos pelo analisador celular LSRII (BD Biosciences, San Jose CA). É mostrada na tabela a MFI (Intensidade de Fluorescência Média) de cada amostra.
[00436] A afinidade de ligação de cada Fab foi determinada com o uso de lipopartículas enriquecidas com CXCR4 humanas (LEV101, Integral Molecular, Filadélfia, PA). WGA biotinilado (Sigma Aldrich, St. Louis MO) pode ser revestido no chip SA para facilitar a captura de lipopartículas contendo proteínas CXCR4. Uma série de diluições (fator de diluição 3X, com 5 membros, com uma concentração top de 10 ou 30 nM) de Fab foi injetada de baixa para alta concentração (com um tempo de associação de 3 minutos para cada concentração) para executar a análise cinética dos dados usando-se uma metodologia de "titulação cinética" como descrito em Karlsson, et al. (Karlsson, R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. & Myszka, D. G. Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors. Anal. Biochem. 349, 136 a 147 (2006). Para alguns ciclos de análise, tampão foi injetado sobre as partículas capturadas em vez de Fab para fornecer ciclos em branco para propósitos de referência dupla (a referência dupla foi realizada conforme descrito em Myszka et al. Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit. 12, 279 a 284 (1999)). TABELA 8
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EXEMPLO 4 LIGAÇÃO DE AB DE CXCR4 A CXCR4 DE MACACO CYNO E HUMANO
[00437] O Ab de CXCR4 anti-humano h3G10.1.91.A58B foi testado por sua reatividade cruzada ao CXCR4 cinomolgo por citometria de fluxo em uma série de diluições (0,007 a 267 nM) em 1) células HPB- ALL (leucemia de células T humana) e CHO transfectadas com Cyno- CXCR4 e 2) Raji (Linfoma não Hodgkin) e HSC-F (linhagem de células T de Cynomolgus). A ligação foi detectada por Ab secundário (IgG anti-humana de cabra conjugada a Alexa Fluor 647, Fcgama específico, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA) e adquirida com o analisador celular LSRFortessa (BD Biosciences, San Jose CA). O cálculo de ajuste de curva e o EC50 foi realizado com o software Prism (GraphPad Software, La Jolla CA). Tabelas 9A e 9B e as Figuras Figures 3A e 3B. TABELA 9 A
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TABELA 9B
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EXEMPLO 5 FUNÇÃO EFETORA DE ANTICORPOS DE CXCR4
[00438] Os anticorpos terapêuticos recombinantes contam com dois tipos de funcionalidades para atingir eficácia clínica: ligação alvo- específica pelo domínio de Fab (fragmento de ligação de antígeno) e funções efetoras imunomediadas — tal como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) — através de interação do domínio Fc do anticorpo com receptores de Fc em vários tipos de células. Em ADCC, a região Fc do anticorpo liga-se aos receptores de Fc (FCYRS) na superfície de células efetoras imunológicas, tais como exterminado- ras naturais e macrófagos, levando à fagocitose ou lise das células alvo. Em CDC, os anticorpos exterminam as células alvo por direcionamento da cascata complementar na superfície celular. A porção Fc de um anticorpo terapêutico pode, portanto, tem um papel importante em seu mecanismo de ação através de sua influência em ADCC ou CDC.
[00439] Cada subclasse de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) exibe um perfil distinto de função efetora, que é ditado por ligação diferencial a cada um dos FCYRS e proteínas complexas de complemento. Embora tanto IgG1 como IgG3 se liguem de modo relativamente forte, IgG2 e IgG4 têm afinidade muito mais baixa aos receptores de Fc e não produzem níveis altos de ADCC. IgG1 também tem alta afinidade para as proteínas complexas de complemento, com muito menos CDC produzida por IgG2, IgG3 e IgG4.
[00440] A atividade de ADCC (citotoxicidade dependente de anticorpo) de anticorpos anti-CXCR4 foi determinada com o kit de ensaio de citotoxicidade não reativo cytoTox 96 (Promega, Madison WI). As células tumorais humanas que expressam CXCR4 foram semeadas em 10.000 células no dia anterior ao ensaio. As células PBMC doadoras foram isoladas através de gradiente Ficoll e cultivadas de um dia para o outro a 37 °C em meio x-vivo. No dia seguinte, 10 ou 20 μg/ml de anticorpos foram adicionados às cavidades com ou sem a adição de 1.000.000 células PBMC (E:T=100:1) em RPMI+5% de FBS. As placas foram, então, incubadas a 37 °C por 4 horas. No ponto de tempo de 3 horas e meia, 20 μl da solução de lise foram adicionados às cavidades de células alvo sozinhas. Após rotação da placa a 8.000 rpm por 3 min, 50 μl de sobrenadantes foram transferidos para outra placa. 50 μl de substrato foram, então, adicionados a cada cavidade e a placa foi incubada à temperatura ambiente por 30 min no escuro. A reação foi interrompida por adição de 50 μl de solução de parada a cada cavidade. As placas foram, então, lidas a 490 nm com um espec- trômetro (Molecular Devices). As porcentagens (%) de lise específica foram calculadas com a seguinte fórmula: % de lise específica = (liberação de LDH de tratamento - liberação de LDH espontânea de célula alvo - liberação de LDH espontânea de célula efetora) / (liberação de LDH máxima de célula alvo - liberação de LDH espontânea de célula alvo) x 100
[00441] A atividade de CDC (citotoxicidade dependente de complemento) de anticorpos anti-CXCR4 foi determinada com o kit de ensaio de citotoxicidade não reativo cytoTox 96 (Promega, Madison WI). As células tumorais humanas que expressam CXCR4 foram semeadas em 10.000 células no dia anterior ao ensaio. No dia seguinte, 5 a 20μg/ml de cada Ab foram adicionados às células sozinhas ou com 2,5%, 10% ou 20% de complemento AB doador (junto à Innovative Biotech ou Sigma). As placas foram desenvolvidas e lise específica analisada similarmente ao ensaio de ADCC.
[00442] O ensaio de ADCC foi realizado em células Ramos (NHL) ou MOLT-4 (leucemia de célula T humana) que expressam CXCR4 com o uso de 20 μg/ml (Figura 4A) ou 10 μg/ml (Figura 4C) de anticorpo mais razão de 100:1 (Efetor:Alvo) de células PBMC doadoras normais. Após 4 horas de incubação, foi evidente a atividade de ADCC de Abs de camundongo CXCR4 anti-humano 12A11, 6B6 e 3G10 produzidos como hIgG1 quimérica em células Ramos (NHL) (Figura 4A) ou anticorpos 3G10 humanizados em células MOLT-4 (Figura 4C). Aproximadamente 80% de lise celular foram vistos a partir de tratamento com m3G10-hIgG1, em comparação a aproximadamente 20% de lise celular a partir de subtipo m3G10-hIgG4 em células MOLT-4 (Figura 4B).
[00443] A atividade de CDC foi observada a partir do tratamento de 20 μg/ml de anticorpos quiméricos 12A11-, 6B6- e 3G10-hIgG1 de ca-mundongo em células Ramos que expressam CXCR4 (Figura 4D) e com 5 μg/ml de anticorpos humanizados em células Daudi (NHL) (Figura 4F). Um máximo de 20 a 30% de atividade de lise específica foi detectado com 5 μg/ml de anticorpo anti-CXCR4 3G10 em cadeia prin-cipal de IgG1, similarmente ao anticorpo de controle positivo Rituxan em células Daudi, enquanto 3G10 em formato hIgG4 não mostrou atividade de CDC (Figura 4E)
EXEMPLO 6 INIBIÇÃO DE FLUXO DE CÁLCIO INDUZIDO POR SDF-1 POR ANTICORPOS ANTI-CXCR4
[00444] Mediante a ligação de SDF-1 (ligante) ao receptor de CXCR4, uma reação de fluxo de cálcio é ativada. Como evidência para a atividade antagonística funcional dos Abs de CXCR4, a capacidade dos anticorpos de CXCR4 anti-humanos de inibir fluxo de cálcio induzido por SDF-1, células de leucemia de célula T humana (Jurkat) foram usadas em conjunto com o kit de ensaio de cálcio Fluo-NW Calcium (Molecular Probes/life technologies). As células foram cultivadas para subconfluência em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal, 1% de glutamina a 37 °C em um incubador de CO2. No dia do ensaio, as células foram plaqueadas em uma placa com 384 cavidades de fundo claro e preta a 70.000 células por cavidade em 25 μl de tampão de ensaio. Corante de ensaio de kit foi, então, adicionado às placas, 25 μl/cavidade por 110 min à temperatura ambiente, protegido da luz. Uma diluição em série de 1:3 de 11 pontos foi preparada no tampão de kit de ensaio Fluo-NW Ca para cada anticorpo de CXCR4 anti-humano, resultando em uma faixa de concentração de 500 nM a 8 pM. As células foram incubadas com anticorpos à temperatura ambiente por 20 minutos. As células foram, então, estimuladas com SDF- 1 alfa (Invitrogen) a uma concentração final de 8 nM. Fluxo de cálcio foi, então, medido por 95 segundos com o uso de um FLIPR Tetra (Molecular Devices). O controle positivo consistiu em células na presençade SDF-1 alfa e nenhum tratamento com anticorpo. A linha de base foi medida a partir de células sem SDF-1 alfa e sem tratamento com anticorpo. A indução com SDF-1 alfa de cálcio foi medida por de-senvolvimento de sinal de fluorescência ao longo do tempo. Os dados foram exportados e plotados com o uso do software GraphPad Prism e um ajuste de curva não linear com fórmula de resposta de dose sig- moide foi usado para calcular os valores de EC50. A inibição resultante de fluxo de cálcio por anticorpos de CXCR4 anti-humanos é mostrada na Figura 5. Os anticorpos 3G10, 6B6 e 12A11 inibiram o fluxo de cálcio induzido por SDF-1 alfa, com IC50s para inibição de 1,555 nM, 1,418 nM e 27,07 nM, respectivamente (Tabela 10). Os IC50s para anticorpos de CXCR4 humanizados avaliados no ensaio Funcional de Fluxo de Cálcio são sumarizados na Tabela 11 (n médio=3 experimentos independentes /anticorpo). Em suma, o potencial dos anticorpos de CXCR4 humanizados é similar àquele do anticorpo m3G10 quimérico nesse ensaio. TABELA 10: ATIVIDADE DE FLUXO DE CÁLCIO DE ANTICORPOS DE CXCR4 QUIMÉRICOS
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TABELA 11: ATIVIDADE DE FLUXO DE CÁLCIO DE ANTICORPOS DE CXCR4 HUMANIZADOS
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EXEMPLO 7 ATIVIDADE DE ANTICORPOS DE CXCR4 EM UMA CÉLULA DE AMP CÍCLICO (CAMP) COM BASE EM ENSAIO FUNCIONAL
[00445] Mediante a inibição de CXCL12 (ligante) ao receptor de CXCR4, sabe-se que cAMP é inibido. Como evidência para a atividade antagonista dos Abs de CXCR4, um ensaio de cAMP foi realizado com o uso de células CHO-K1 transfectadas com CXCR4 humano, adquirido junto à DiscoveRx, Fremont, CA. O kit de ensaio cAMP Hunter eXpress GPCR (DiscoveRx) foi usado para realizar o ensaio. Na ausência de anticorpos de CXCR4, o tratamento dom o ligante de CXCR4, CXCL12, inibiu a produção de cAMP. Mediante o tratamento com anticorpos de CXCR4, essa inibição foi anulada, e a produção de cAMP aumentou. O EC50 para essa resposta é mostrado na Tabela 12. Em suma, todos os anticorpos de CXCR4 testados tiveram atividade potencial similar nesse ensaio, na faixa de 24,3 a 45,6 nM. Esse estudo confirmou que o 3G10 de camundongo (quimérico) e os anticorpos de 3G10 humanizados podem competir e bloquear a atividade de ligante de CXCR4 no ensaio funcional de cAMP. TABELA 12: EC50S SUMÁRIOS DE ABS ANTI-CXCR4 EM ENSAIO DE CAMP
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EXEMPLO 8 INDUÇÃO DE MORTE CELULAR POR ANTICORPOS ANTI-CXCR4
[00446] Os anticorpos anti-CXCR4 foram examinados quanto à ha bilidade de induzir a morte celular na linhagem de células Ramos de Linfoma Não Hodgkin. As células foram cultivadas para subconfluência em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal e 2 nM de glu- tamina a 37 °C em um incubador de CO2. As células foram semeadas em meio de crescimento em uma placa com 48 cavidades a 2,5 x 106 células/ml. Os anticorpos anti-CXCR4, diluídos em PBS a concentrações indicadas foram adicionados às células e incubados por 24 h a 37 °C. A morte celular foi medida por Anexina V-PE e sinal florescente de iodeto de propídio (PI) medido por Citômetro de Fluxo LSRII (BD Biosciences). A morte celular total foi determinada por adição da Ane- xina V+/PI+ população (tardia) com a Anexina V+/PI- população (precoce).
[00447] Os resultados na Figura 6A demonstram que os anticorpos anti-CXCR4 6B6 e 3G10 têm capacidade para induzir a morte celular em células Ramos de uma maneira dependente de dose. Na concentração mais alta testada, 100 nM, 3G10 e 6B6 resultaram em > 70% de morte celular. Esse efeito foi maior que a Estaurosporina de controle positivo (STS), um indutor de morte celular potente conhecido (aproximadamente 60%). As células não tratadas mostraram aproximadamente 30% de morte celular nesse ensaio. O anticorpo anti-CXCR4 12A11 não teve capacidade para induzir a morte celular sob as condições testadas. Resultados similares foram observados ao testar a atividade desses anticorpos em células de linfoma não Hodgkin Raji.
[00448] Em um estudo similar, (Fab) de cadeia única e F(ab)2’ bivalente foram gerados a partir do anticorpo 3G10. O Fab é um anticorpo de cadeia única (monovalente) e contém as regiões variáveis de imu- noglobulina que são parte do local de ligação de antígeno e a primeira região constante de imunoglobulina. Esse fragmento foi obtido por di-gestão do anticorpo 3G10 com a enzima proteolítica papaína. O F(ab’)2 foi gerado por digestão de pepsina para remover a maior parte da região Fc enquanto deixa intacta parte da região de dobradiça. Os fragmentos F(ab')2 tiveram duas porções Fab de ligação de antígeno ligadas juntas por ligações de bissulfeto e, portanto, são bivalentes. O Fab e F(ab’)2 foram testados lado a lado com o anticorpo 3G10 de comprimento completo quanto a sua capacidade de induzir a morte celular de células Ramos. Os resultados mostrados na Figura 6B indicam que a capacidade de induzir a morte celular é dependente de bi- valência, com o anticorpo intacto (3G10) e os anticorpos F(ab’)2 com capacidade de induzir morte celular, enquanto o Fab 3G10 teve efeito muito limitado sobre a morte celular.
EXEMPLO 9 INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO DE TUMOR SÓLIDO DE LINFOMA NÃO HODGKIN IN VIVO POR ANTICORPOS ANTI-CXCR4
[00449] Acredita-se que a sinalização de SDF-1/CXCR4 exerça um papel importante em múltiplos estágios do desenvolvimento tumoral, incluindo crescimento de tumor, angiogênese, invasão e metástase. Para avaliar a capacidade dos Abs de CXCR4 anti-humanos de inibir o crescimento de tumor, um modelo de xenoenxerto de tumor que usa camundongos CB17 SCID Beige com 4 a 6 semanas de vida fêmeas (Jackson Laboratories) e células Ramos de Linfoma Não Hodgkin implantadas por via subcutânea foi empregado. As células foram cultivadas a 37 °C em um incubador de CO2 a 5% em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal. Nesse estudo, 5 x 106células foram implantadas na região de flanco traseiro direito de cada camundongo e deixadas crescer como tumores sólidos até o volume de tamanho médio de aproximadamente 175 mm3, calculado pela fórmula (volu- me=comprimento x largura2)/2. Os camundongos foram, então, ran- domizados em 4 grupos de tratamento diferentes, n=10 animais por grupo. Os grupos de camundongos foram tratados com injeção intravenosa (i.v.) dos anticorpos em uma solução de PBS estéril: (i) Ab de Controle de Isotipo (15 mg/kg); (ii) 3G10 (15 mg/kg); (iii) 6B6 (15mg/kg); e (iv) 12A11 (15 mg/kg). Os animais foram dosados com anticorpos uma vez por semana durante 3 semanas, por um total de 3 doses. Os volumes de tumor foram medidos quanto ao calibre uma a três vezes por semana durante a duração do estudo. Os resultados do experimento são apresentados na Figura 7. Os resultados indicam que todos os 3 anticorpos anti-CXCR4 testados inibiram significativamente o crescimento tumoral em relação ao anticorpo de controle de isotipo. Os resultados indicam que os anticorpos anti-CXCR4 têm capacidade para inibir o crescimento de um tumor sólido estabelecido in vivo. Esse efeito inibidor de crescimento tumoral foi mantido por um longo período de tempo (42 dias) após a dosagem de anticorpo ter sido interrompida. A atividade de todos os três anticorpos anti-CXCR4 testados foi com-parável nesse modelo de tumor sólido. Figura 7.
EXEMPLO 10 TEMPO DE SOBREVIVÊNCIA AUMENTADO E CARGA DE TUMOR DIMINUÍDA POR ANTICORPOS ANTI-CXCR4 EM UM MODELO DE CÉLULA DE LINFOMA NÃO HODGKIN SISTÊMICO DE CAMUNDONGO
[00450] A atividade antitumoral de anticorpos anti-CXCR4 foi, ainda, investigada em um modelo de linfoma hematológico com o uso de células de Linfoma Não Non-Hodgkin Raji. As células Raji usadas nesse estudo foram transfectadas com o gene luciferase (LUC) para permitir monitoramento "em vida" da carga de tumor ao longo do tempo. As células foram cultivadas a 37 °C em um incubador de CO2 a 5% em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal. O modelo foi estabelecido por injeção de 1 x 106 células Raji-LUC em camundongos fêmeas SCID Beige com 6 a 8 semanas de vida (do Charles River La- oratories) através da veia da cauda. No Dia 0 (dia do implante) as células Raji-LUC se alojaram nos pulmões, indicando a injeção i.v. precisa das células tumorais em todos os animais. Um dia após o implante das células, os camundongos foram atribuídos a grupos de tratamento (10 animais por grupo) com base na presença de bioluminescência do pulmão. Os camundongos foram tratados com anticorpo de Controle de Isotipo, 3G10, 6B6 e 12A11, a 10 mg/kg em uma solução de PBS estéril uma vez por semana por via intraperitoneal (i.p.), até o Dia 67. A carga de tumor foi monitorada por imagem de bioluminescência com o uso do sistema de imagem Xenogen IVIS 200. Os camundongos foram imageados a cada 5 dias em posição ventral, a foi entregue IP a 15 mg/ml, 200 μl de injeção e a bioluminescência do corpo todo foi de-terminada com o uso de Xenogen Living Image. Quando os camun-dongoscomeçaram a mostrar paralisia dos membros traseiros ou atin-giram outros pontos finais humanos, sofreram eutanásia. Tanto a carga de tumor (por bioluminescência) como a sobrevivência foram avaliadas como pontos finais.
[00451] As Figuras 8A e B mostram os resultados de biolumines- cência desse estudo. A diminuição na carga de tumor é mostrada por diminuição no nível de bioluminescência ao longo do tempo. A Figura 8A mostra a imagem representativa de 4 a 5 animais de cada grupo nos Dias 0 (Linha de Base de Implante), 15 e 25 do estudo. Todos os três anticorpos anti-CXCR4 diminuíram significativamente a carga de tumor conforme medida por nível de luminescência. A Figura 8B mostra que o tratamento com os anticorpos 3G10, 6B6 e 12A11 teve atividade de TGI comparável em relação ao anticorpo de controle de isoti- po nesse modelo.
[00452] A curva de sobrevivência mostrada na Figura 8C demonstra um efeito muito significativo dos anticorpos anti-CXCR4 3G10, 6B6 e 12A11 em comparação ao anticorpo de controle de isotipo na sobrevivência de animais implantados com as células Raji-LUC sistemica- mente. Enquanto os animais tratados com controle de isotipo mostra-ramsobrevivência média de 18 dias, os animais tratados com os anti- corpos anti-CXCR4 não atingiram a sobrevivência média antes do tér-mino do estudo. O efeito de todos os 3 anticorpos anti-CXCR4 testados foi comparável sem nenhuma diferença estatística entre os mesmos. A sobrevivência dos animais tratados com anticorpo anti-CXCR4 foi prolongada bem além do Dia 67, quando a última dose de anticorpo foi administrada.
EXEMPLO 11 TEMPO DE SOBREVIVÊNCIA AUMENTADO E CARGA DE TUMOR DIMINUÍDA POR ANTICORPOS ANTI-CXCR4 EM UM MODELO DE CÉLULA DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (AML) SISTÊMICO DE CAMUNDONGO
[00453] O anticorpo anti-CXCR4 6B6 foi testado quanto á sua capacidade de aumentar a sobrevivência e reduzir a carga de tumor de camundongos NSG com o uso de um modelo intravenoso dissemina- do/sistêmico de AML. A linhagem de câncer AML humana MV4-11 foi transduzida com o gene luciferase (MV4-11-LUC) para permitir monitoramento"em vida" da carga de tumor ao longo do tempo. As células foram cultivadas a 37 °C em um incubador de CO2 a 5% em meio IMDM contendo 10% de soro bovino fetal com 1 μg/ml de puromicina para seleção de expressão de luciferase. Camundongos fêmeas NSG com 4 a 6 semanas de vida (do Jackson Laboratories) foram injetados por via intravenosa com células de AML MV4-11-LUC (1 x 106/animal).
[00454] No Dia 13 após o implante das células, os camundongos foram randomizados em três grupos de tratamento (10 animais por grupo) com base na intensidade de bioluminescência corporal total. O tratamento com anticorpo subcutâneo (s.c.) semanal a 10 mg/kg em uma solução de PBS estéril foi iniciado no Dia 13 (controle de isotipo e anticorpo anti-CXCR4 6B6) e no Dia 20 (anticorpo anti-CXCR4 6B6), conforme indicado na figura (Dia 13; Dia 20). A carga de tumor foi avaliada com o uso do sistema de imagem Xenogen IVIS 200. Os camun- dongos foram imageados a cada 7 dias em uma posição ventral e a bioluminescência de corpo inteiro foi determinada com o uso do software Xenogen Living Image. Quando os camundongos começaram a mostrar paralisia dos membros traseiros ou atingiram outros pontos finais humanos, sofreram eutanásia. Tanto a carga de tumor (por bio- luminescência) quanto a sobrevivência foram avaliadas como pontos finais. O número de células de AML humanas em circulação no san-gueperiférico (PB) de camundongos (n=10 por grupo) foi monitorado em amostras de sangue coletadas no Dia 35 do estudo. Os marcadores CD45 e CD33 de AML foram usados para determinar a porcentagem de células de AML humanas em circulação por manchamento de citometria de fluxo com anticorpos CD45 anti-humano e CD33 anti- humano (da BD Biosciences)
[00455] A Figura 9A mostra a imagem de bioluminescência repre-sentativa de 5 animais/grupo de tratamento para esse estudo (do Dia 20 ao Dia 41). A diminuição na carga de tumor é mostrada por diminuição no nível de bioluminescência ao longo do tempo. A inibição de carga de tumor com o anticorpo anti-CXCR4 6B6 com início precoce (Dia 13) foi mais pronunciada que quando a mesma foi iniciada uma semana depois (Dia 20). O anticorpo anti-CXCR4 6B6 diminuiu significativamente a carga de tumor em ambos os grupos de tratamento em comparação ao anticorpo de controle de isotipo, indicando que o anticorpo anti-CXCR4 é eficaz na inibição da carga de tumor em um modelo de camundongo disseminado em estágios de AML humana.
[00456] A curva de sobrevivência mostrada na Figura 9B demonstra um efeito significativo do anticorpo anti-CXCR4 6B6 comparado ao anticorpo de controle do isotipo na sobrevivência de animais implantados sistemicamente com as células MV4-11-LUC AML. Enquanto os animais tratados com controle de isotipo mostraram sobrevivência média de 40 dias, os animais tratados com o anticorpo anti-CXCR4 6B6 no Dia 13 e no Dia 20 tiveram sobrevivências médias de 53 e 61 dias, respectivamente. Essas diferenças foram estatisticamente significativas (p<0,05) por teste Mantel-Cox.
[00457] A Figura 9C mostra a redução significativa de números de células de AML em animais tratados com o anticorpo anti-CXCR4 6B6 comparado com os animais tratados com controle de isotipo no Dia 35 do estudo.
EXEMPLO 12 SOBREVIVÊNCIA AUMENTADA POR ANTICORPO ANTI-CXCR4 EM UM MODELO DE TUMOR DE LEUCEMIA LINFOIDE CRÔNICA SISTÊMICO DE CAMUNDONGO
[00458] A atividade antitumoral de anticorpo de CXCR4 foi, ainda, investigada em um modelo de Leucemia Linfoide Crônica (CLL) intra-venoso disseminado. A linhagem de células tumorais JVM-13 humana estavelmente transfectada para expressar o gene luciferase foi cultivada a 37 °C em um incubador de CO2 a 5% em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal e 0,25 mg/ml de Puromicina. O modelo foi estabelecido por injeção de 1 x 106células JVM-13-Luc em camun-dongosfêmeas SCID Beige com 6 a 8 semanas de vida través da veia da cauda. 21 dias após o implante das células, os camundongos foram atribuídos a grupos de tratamento (10 animais por grupo) com base na leitura de bioluminescência (BLI). Os camundongos foram tratados com anticorpo de Controle de Isotipo e 3G10 e foram dosados a 10 mg/kg em uma solução de PBS estéril uma vez por semana por via subcutânea (s.c.). Rituximabe, um Ab anti-CD20, aprovado para o tratamento de pacientes com CLL, foi usado como controle positivo. O rituximabe foi dosado a 10 mg/kg em uma solução de PBS estéril uma vez por semana, s.c. A carga de tumor foi avaliada com o uso do sistema de imagem Xenogen IVIS 200. Os camundongos foram imagea- dos a cada 7 dias em uma posição ventral e a bioluminescência de corpo inteiro foi determinada com o uso do software Xenogen Living Image. Quando os camundongos começaram a mostrar paralisia dos membros traseiros ou atingiram outros pontos finais humanos, sofre-rameutanásia. Tanto a carga de tumor (por bioluminescência) quanto a sobrevivência foram avaliadas como pontos finais.
[00459] A Figura 10A mostra a imagem de atividade de luciferase representativa para camundongos em cada grupo de tratamento nos Dias 28, 35, 42, 49 e 56 do estudo. O tratamento com 3G10 diminuiu significativamente a carga de tumor JVM-13-Luc em ossos grandes, conforme medida por nível de luminescência ao longo do tempo, em comparação ao anticorpo de controle de isotipo. O tratamento com Ri- tuximabe também reduziu significativamente a carga de tumor em comparação ao anticorpo de controle de isotipo.
[00460] A Figura 10B mostra uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meyer para esse estudo. O aumento significativo na sobrevivência foi observado para os anticorpos 3G10 e Rituximabe em comparação ao Ab de controle de isotipo (p<0,0001). Enquanto os animais tratados com anticorpo de controle de isotipo mostraram sobrevivência média de 32,5 dias, os animais tratados com Rituxan mostraram sobrevivência média de 45 dias e os animais tratados com 3G10 não atingiram a sobrevivência média antes do Dia 60. Os resultados desse estudo indicam que o anticorpo anti-CXCR4 é eficaz na inibição da carga de tumor em um modelo de camundongo disseminado em estágios de CLL humana.
EXEMPLO 13: INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO DE TUMOR DE LINFOMA NÃO HODGKIN RAMOS IN VIVO POR ANTICORPOS ANTI-CXCR4 HUMANIZADOS
[00461] Para avaliar a capacidade dos Abs de CXCR4 humanizados de inibir o crescimento de tumor, um modelo de xenoenxerto de tumor que usa camundongos CB17.cg-Prkdc SCID Beige com 4 a 6 semanas de vida fêmeas (Charles River) e células Ramos de Linfoma Não Hodgkin implantadas por via subcutânea foi empregado. As células foram cultivadas a 37 °C em um incubador de CO2 a 5% em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal. Nesse estudo, 5 x 106 células foram implantadas na região de flanco traseiro direito de cada camundongo e deixadas crescer como tumores sólidos até o volume de tamanho médio de aproximadamente 350 mm3, calculado pela fórmula (volu- me=comprimento x largura2)/2. Os camundongos foram, então, rando- mizados em 7 grupos de tratamento diferentes, n=10 animais por grupo. Os grupos de camundongos foram tratados por via subcutânea (s.c.) com 10 mg/kg de cada anticorpo em uma solução de PBS estéril: (anti-corpo de Controle de Isotipo; m3G10; h3G10.A57.WT; h3G10.2.37.2.72; h3G10.A57.A58; h3G10.1.91.A58A; h3G10.1.91.A58B. Os animais foram dosados com anticorpos uma vez por semana durante 2 semanas, por um total de 2 doses. Os volumes de tumor foram medidos quanto ao calibre duas vezes por semana durante a duração do estudo. Os resul-tados do experimento são apresentados na Figura 11. Os resultados indicam que todos os anticorpos anti-CXCR4 testados inibiram significa-tivamente o crescimento tumoral em relação ao anticorpo de controle de isotipo. Os resultados indicam que os anticorpos de CXCR4 humanizados testados tiveram eficácia similar àquela do anticorpo m3G10 quimérico. O efeito inibidor de crescimento de tumor foi mantido por diversos dias após a dosagem de anticorpo ter sido interrompida (Dia 7).
EXEMPLO 14 TEMPO DE SOBREVIVÊNCIA AUMENTADO E CARGA DE TUMOR DIMINUÍDA POR ANTICORPO ANTI-CXCR4 HUMANIZADO EM UM MODELO DE MIELOMA MÚLTIPLO (MM) SISTÊMICO DE CAMUNDONGO
[00462] O anticorpo anti-CXCR4 humanizado h3G10.1.91.A58B foi testado quanto à sua capacidade de aumentar a sobrevivência e reduzir a carga de tumor de camundongos NSG com o uso de um modelo intravenoso disseminado/sistêmico de MM. A linhagem de câncer MM humana OPM-2 foi transduzida com o gene luciferase (OPM-2-LUC) para permitir monitoramento "em vida" da carga de tumor ao longo do tempo. As células foram cultivadas a 37 °C em um incubador de CO2 a 5% em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal com 0,5μg de puromicina para seleção de expressão de luciferase. Camundongos fêmeas NSG com 4 a 6 semanas de vida foram injetados por via intra-venosa com células OPM-2-Luc (5 x 106/animal).
[00463] No Dia 8 após o implante das células, os camundongos foram randomizados em três grupos de tratamento (10 animais por grupo) com base na intensidade de bioluminescência corporal total. O tratamento com anticorpo subcutâneo (s.c.) semanal a 10 mg/kg em uma solução de PBS estéril foi iniciado e executado por 5 semanas. Melfa- lan, um dos fármacos aprovados para o tratamento de pacientes com mieloma múltiplo, foi dosado a 1 mg/kg, duas vezes/semana e executado por 3 semanas. A carga de tumor foi avaliada com o uso do sistema de imagem Xenogen IVIS 200. Os camundongos foram imagea- dos a cada 7 dias em uma posição ventral e a bioluminescência de corpo inteiro foi determinada com o uso do software Xenogen Living Image. Quando os camundongos começaram a mostrar paralisia dos membros traseiros ou atingiram outros pontos finais humanos, sofrerameutanásia. Tanto a carga de tumor (por bioluminescência) quanto a sobrevivência foram avaliadas como pontos finais.
[00464] As Figuras 12A e B mostram os resultados de biolumines- cência (atividade de Luciferase) nesse estudo. A diminuição na carga de tumor é mostrada por diminuição no nível de bioluminescência ao longo do tempo. A Figura 12A mostra a imagem de bioluminescência representativa de 5 animais/grupo de tratamento para esse estudo. A Figura 12B mostra que o tratamento com o anticorpo de CXCR4 h3G10.1.91.A58B inibiu significativamente o crescimento de tumor em comparação ao anticorpo de controle de isotipo ao longo do tempo (p<0,0001 no Dia 30), indicando que o anticorpo anti-CXCR4 é eficaz na inibição da carga de tumor em um modelo de xenoenxerto disseminado em estágios de mieloma múltiplo humano. A curva de sobrevivência para esse estudo é mostrada na Figura 12C e demonstra um efeito significativo do anticorpo anti-CXCR4 6h3G10.1.91.A58B comparado ao anticorpo de controle do isotipo na sobrevivência de animais implantados sistemicamente com as células de MM OPM-2-Luc. Enquanto os animais tratados com controle de isotipo e Melfalan mostraramsobrevivências médias de 33,5 e 36 dias, respectivamente, os animais tratados com o anticorpo de CXCR4 h3G10.1.91.A58B tiveram sobrevivência média indefinida, sem morte observadas até o Dia 50 do estudo. Tabela 13. Essas diferenças foram estatisticamente significativas (p<0,0001) por teste Mantel-Cox. TABELA 13
Figure img0041
EXEMPLO 15 CITOTOXICIDADE DE ANTI-CXCR4-ADCS EM CÉLULAS CXCR4- POSITIVAS
[00465] Os anticorpos anti-CXCR4 (por exemplo, 3G10) foram expressos como subtipos de IgG1 humana e modificados com etiqueta de trans-glutaminase contendo glutamina ("Q") TG6(SEQ ID NO: 91 (LLQGA)) e conjugado com AcLys-vc-PABC-MMAD (Acetil-Lisina-Valina-Citrulina-p- aminobenziloxicarbonil-MMAD) e AcLys-vc-PABC-0101 ((2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4- il]-N-metil-L-valinamida). As etiquetas de transglutaminase foram modificadas no C-terminal de cadeia pesada do anticorpo. A conjugação do anticorpo anti-CXCR4 ao agente citotóxico MMAD ou 0101 foi, então, atingida através de reação de transamidação catalisada por transglutaminase microbiana entre o anticorpo anti-CXCR4 que porta a etiqueta contendo glu- tamina no local específico (por exemplo, terminal carboxila da cadeia pesada do anticorpo) e um derivado contendo amina da carga útil (por exemplo, MMAD ou 0101). Em alguns casos, o aminoácido do tipo selvagem lisina no terminal carboxila (posição 447 em conformidade com o esquema de numeração EU) foi deletado e substituído pela etiqueta Q. Em outros casos, o aminoácido do tipo selvagem lisina na posição 222 (em conformidade com o esquema de numeração EU) foi substituído pelo aminoácido arginina ("K222R"). A substituição de K222R forneceu o efeito significativo de resultar em conjugado de anticorpo e carga útil mais homogêneo e/ou reticulação intermolecular melhor entre o anticorpo e a carga útil. Na reação de transamidação, a glutamina na etiqueta contendo glutamina atuou como um doador de acila e o composto contendo amina atuou como um aceitante de acila (doador de amina). O anticorpo anti-CXCR4 purificado foi incubado com aceitante de acila em excesso na presença de transglutaminase de Streptoverticil- lium mobaraense (ACTIVA™, Ajinomoto, Japão) em 150 a 900 mM de NaCl, e 25 mM de MES, HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanossulfônico] ou tampão Tris HCl em faixa de pH de 6,2 a 8,8. As condições de reação foram ajustadas para os derivados de aceitante de acila individuais. Após a incubação à temperatura ambiente por 2,5 horas, o conjugado anticorpo-fármaco foi purificado em resina MabSelect (GE Healthcare, Waukesha, WI) com o uso de métodos de cromatografia de afinidade padrão conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, tal como cromatografia de afinidade comercial da GE Healthcare.
[00466] As células que expressam CXCR4 foram, então, semeadas em placas de fundo claro com paredes brancas a 4.000 a 8.000 célu- las/cavidade por 24 horas antes do tratamento. As células foram, então, tratadas com conjugados anticorpo-fármaco diluídos em série 4 vezes em triplicata. A viabilidade celular foi determinada pelo Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente 96 CellTiter-Glo® (Promega, Madison WI) 96 horas após o tratamento. A viabilidade celular relativa foi determinada como porcentagem de controle não tratado. O IC50 foi, então, calculado. Os anticorpos anti-CXCR4 conjugados a MMAD ou 0101 através de etiqueta de transglutaminase exercem atividade de extermínio celular potente em células que expressam CXCR4. TABELA 14: CITOTOXICIDADE DE CXCR4 ADCS EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM CXCR4
Figure img0042
EXEMPLO 16 ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO DE CXCR4-ADCS
[00467] A eficácia antitumoral in vivo de ADCs de CXCR4 foi avaliada em modelos de xenoenxerto de Ramos (NHL) e HPB-ALL (T-ALL). Camundongos fêmeas com 4 a 4 semanas de vida CB17 SCID (Jackson Laboratories) foram implantados por via subcutânea com 5 x 106 de Ramos (NHL) conforme descrito no Exemplo 9 até volume de ta-manhomédio de aproximadamente 500 mm3, calculado pela fórmula (volume=comprimento x largura2)/2. 10 x 106células HPB-ALL foram implantadas em camundongos fêmeas com 4 a 6 semanas de vida CB17 SCID até o tamanho médio de tumor também atingir aproximadamente 500 mm3. No modelo de Ramos, os grupos de camundongos foram tratados com injeção intravenosa (i.v.) em dose única de ADC de controle negativo (controle negativo-TG6-vc0101) a 6,0 mg/kg ou CXCR4 ADCs (3G10-TG6-vc0101 e 6B6-TG6-vc0101) a 1,5, 3,0 ou 6,0 mg/kg. Os volumes de tumor foram medidos quanto ao calibre uma vez por semana durante a duração do estudo. Os resultados do experimentosão apresentados na Figura 13A. Os resultados indicam que ambos os ADCs de CXCR4 induziram a regressão de tumor em doses > 3 mg/kg. O ADC de controle não teve efeito sobre o crescimento de tumor. No modelo de HPB-ALL, 1,5 mg/kg de injeção em dose única de 3G10-TG6-vc0101 é suficiente para induzir a regressão do tumor (Figura 13B).

Claims (17)

1. Anticorpo humanizado isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga ao receptor de quimiocina 4 (CXCR4) e que compreende: a) uma região de cadeia pesada variável (VH) que possui uma VH CDR1 de SEQ ID NOs:107, 113 ou 114; uma VH CDR2 de SEQ ID NO: 162 ou 128, e uma VH CDR3 de SEQ ID NOs: 112; e b) uma região de cadeia leve variável (VL) que possui uma VL CDR1 de SEQ ID NOs: 144; uma VL CDR2 de SEQ ID NO: 145; e uma VL CDR3 de SEQ ID NO: 139.
2. Anticorpo humanizado isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: a) uma região de cadeia pesada variável (VH) que possui uma VH CDR1 de SEQ ID NOs:107; uma VH CDR2 de SEQ ID NO: 162, e uma VH CDR3 de SEQ ID NOs: 112; e b) uma região de cadeia leve variável (VL) que possui uma VL CDR1 de SEQ ID NOs: 144; uma VL CDR2 de SEQ ID NO: 145; e uma VL CDR3 de SEQ ID NO: 139.
3. Anticorpo humanizado isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável (VH) que compreende VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 de uma região VH de SEQ ID NO:33; e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de uma região VL de SEQ ID NO: 73.
4. Anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que consiste em um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 33; e/ou uma região de cadeia leve variável (VL) de SEQ ID NO: 73.
5. Anticorpo humanizado isolado ou o fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada variável (VH) produzida pelo vetor de expressão com o N° de Acesso à ATCC PTA-121353 ou uma região de cadeia leve variável (VL) produzida pelo vetor de expressão com o N° de Acesso à ATCC PTA-121354.
6. Anticorpo humanizado isolado ou o fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é CDR-enxertado humanizado, quimérico.
7. Anticorpo humanizado isolado ou o fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um marcador doador acila contendo glutamina projetado a um sítio específico
8. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que apresenta fórmula: Ab-(T-L-D), em que: (a) Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que se liga ao receptor de quimiocinas 4 (CXC4); (b) T é um marcador doador acila contendo glutamina que pode estar opcionalmente incluída; (c) L é um ligante; e (d) D é um fármaco.
9. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindi-cação 8, caracterizado pelo fato de que Ab é selecionado do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 107, 162 e 112 e uma região VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 144, 145 e 139; ou b) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região VH de SEQ ID NO:33 e uma região VL de SEQ ID NO:73.
10. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindi-cação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que (a) Ab é um anticorpo humanizado, quimérico, CDR- enxertado ou humano recombinante ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo,; (b) T é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 171, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 172, 173, 102, 103 and LLQ; ou (c) L é selecionado do grupo que consiste em acetil-lisina- valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil (AcLys-VC-PABC), amino PEG6-propionil, maleimidocapronico-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonil (vc) e maleimidocaproil (mc); ou (d) o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é conjugado a um fármaco, em que D é selecionado do grupo que consiste de um agente citotóxico, um agente imunomodulador, um agente de imagem, uma proteína terapêutica, um biopolímero e um oligonucleotídeo.
11. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindi-cação 10, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste em uma antraciclina, uma auristatina, uma camptotecina, uma combretastain, uma dolastatina, uma duocarmicina, um enedine, uma geldanamicina, um dímero de indolino-benzodiazepina, uma maitansina, uma puromicina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, um taxano, um alcalóide de vinca, uma tubulisina, um hemiasterlin, um spliceostatin, um pladienolida e caliqueamicina.
12. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em a) Ab-LLQGA (SEQ ID NO: 91) - (acetil-lisina-valina- citrulina-p-aminobenziloxicarbonil (AcLis-VC-PABC)) - 0101; b) Ab-LLQGA (SEQ ID NO: 91)-(AcLis-VC-PABC)-MMAD; c) Ab-LLQX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 102)-(AcLis-VC-PABC)- 0101; d) Ab-LLQX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 102)-(AcLis-VC-PABC)- MMAD; e) Ab-GGLLQGA (SEQ ID NO: 92)- (AcLis-VC-PABC)- 0101; e f) Ab-GGLLQGA (SEQ ID NO: 92)-(AcLis-VC-PABC)- MMAD.
13. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindi-cação 12, caracterizado pelo fato de que Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região VH que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 107, 162 e 112 e uma região VL que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 144, 145 e 139.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou o conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
16. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 15.
17. Uso de um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, do conjugado anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição para o tratamento de câncer.
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