CN102939306A - 用于治疗癌症的人源化抗cxcr4抗体 - Google Patents

用于治疗癌症的人源化抗cxcr4抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能够结合至CXCR4但还诱导CXCR4同源二聚体和/或异源二聚体的构象变化的，新分离的人源化抗体、或其衍生化合物或功能性片段。更特别的是，本发明涉及特异于CXCR4蛋白质的hz515H7抗体，以及其治疗癌症的用途。本发明还涵盖了由此抗体组成的药物组合物及用于选择此抗体的方法。

Description

用于治疗癌症的人源化抗CXCR4抗体
技术领域
本发明涉及能够特异性结合至趋化因子受体（CXCR）的新抗体，特别是人源化单克隆抗体，以及编码此抗体的氨基酸和核酸序列。从一方面讲，本发明涉及能够特异性结合至CXCR4并具有对抗肿瘤的强活性的新抗体、衍生化合物或功能性片段。本发明还包括此抗体作为预防和/或治疗癌症的药物、以及癌症诊断相关的过程或试剂盒中的用途。最后，本发明包括含有这种抗体联合上或者缀合有其它抗癌症化合物，比如抗体、毒素、细胞毒性/细胞生长抑制剂的组合物，及其用于预防和/或治疗某些癌症的用途。
背景技术
趋化因子是小的分泌肽，特别是免疫反应期间其控制着白细胞沿配体化学梯度（被称为趋化因子梯度）的迁移（Zlotnick A.等人，2000）。基于其NH2-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体（其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR）的结合，趋化因子被分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止人们已发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。
许多癌症具有复杂的趋化因子网状，其影响肿瘤的免疫细胞浸润以及肿瘤细胞生长、存活、迁移和血管生成。免疫细胞、内皮细胞和肿瘤细胞自身表达趋化因子受体，并可以响应趋化因子梯度。人类癌症活检样本和小鼠癌症模型的研究表明癌细胞趋化因子受体的表达与转移能力的增加有关。来自不同癌症类型的恶性细胞具有趋化因子受体表达的不同谱，但是趋化因子受体4（CXCR4）是最常发现的。来自至少23种不同类型的上皮起源、间充质起源和造血起源的人类癌症的细胞表达CXCR4受体（Balkwill F.等人，2004）。
趋化因子受体4（也称为融合素、CD184、LESTR或HUMSTR）作为包含352个或360个氨基酸的两种同种型存在。残基Asn11是糖基化的，残基Tyr21是通过添加硫酸基团修饰的，Cys 109和186通过二硫桥在受体的细胞外部分进行结合（Juarez J.等人，2004）。
该受体由不同类型的正常组织、天然的、非记忆T细胞、调节性T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、初级单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、CD34+造血干细胞表达，且在心脏、结肠、肝、肾和脑中以低水平表达。CXCR4在白细胞转运（trafficking）、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。
CXCR4受体在大量癌症中过表达，所述癌症包括但不限于结肠癌（Ottaiano A.等人，2004）、乳癌（Kato M.等人，2003）、前列腺癌（Sun Y.X.等人，2003）、肺癌（小细胞癌和非小细胞癌（Phillips R.J.等人，2003））、卵巢癌（Scotton C.J.等人，2002）、胰腺癌（Koshiba T.等人，2000）、肾癌、脑癌（Barbero S等人，2002）、恶性胶质瘤和淋巴瘤。
迄今描述的CXCR4受体的唯一配体是间质细胞衍生因子-1（SDF-1）或CXCL12。SDF-1在淋巴结、骨髓、肝、肺中大量分泌，肾、脑和皮肤分泌程度更少。CXCR4也被拮抗趋化因子识别，该拮抗趋化因子是III型人疱疹病毒编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II（vMIP-II）。
CXCR4/SDF-1轴在癌症中起关键作用，直接参与导致转移的迁移、侵入。实际上，癌细胞表达CXCR4受体，它们迁移并进入体循环。然后，癌细胞被滞留（arrested）在产生高水平SDF-1的器官中的血管床中，在那儿其增殖、诱导血管生成和形成转移性肿瘤（Murphy PM.,2001）。该轴也通过激活细胞外信号调节的激酶（ERK）途径（Barbero S.等人，2003）和血管生成（Romagnani P.,2004）参与细胞增殖。实际上，CXCR4受体及其配体SDF-1通过刺激VEGF-A表达显然地促进了血管生成，其转而增加了CXCR4/SDF-1的表达（Bachelder R.E.等人，2002）。还已知与肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）聚集在肿瘤的缺氧区域，受刺激会与肿瘤细胞合作，并促进血管生成。据观察缺氧选择性地上调包括TAM的各种细胞类型中CXCR4的表达（Mantovani A.等人，2004）。最近证实CXCR4/SDF-1轴调节CXCR4+造血干细胞/祖细胞（HSC）的转运/归巢，可在新生血管形成中起作用。证据显示除了HSC之外，功能性CXCR4也在来自其它组织（组织定向干细胞=TCSCs）的干细胞上表达，因此SDF-1可在器官/组织再生所需的化学引诱（chemottracting）CXCR4+TCSC中起关键作用，但是这些TCSC也可以是癌症发展的细胞起源（癌症干细胞理论）。对于人类白血病，和最近对于几种实体肿瘤，比如脑和乳房肿瘤，证实了癌症的干细胞起源。存在几个可以衍生自正常CXCR4+组织/器官特异性干细胞的CXCR4+的肿瘤实例，比如白血病、脑肿瘤、小细胞肺癌、乳癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌和宫颈癌（Kucia M.等人，2005）。
使用针对CXCR4受体的单克隆抗体在体内证实了通过干扰CXCR4受体可以靶向癌症转移（MullerA.等人，2001）。简而言之，已表明针对CXCR4受体（Mab173 R & D系统）的单克隆抗体显著地减少了SCID小鼠中常位乳癌模型（MDA-MB231）中淋巴结转移的数量。另一个研究（Phillips R.J等人，2003）使用抗SDF-1多克隆抗体也显示SDF-1/CXCR4轴在常位肺癌模型（A549）的转移中起决定性作用，但是在该研究中，其对于肿瘤生长和血管生成都没有作用。几个其它研究也描述了使用CXCR4的siRNA双链体（Liang Z.等人，2005）生物稳定的CXCR4肽拮抗剂（Tamamura H.等人，2003）对体内转移的抑制，或使用CXCR4的小分子拮抗剂如AMD 3100（Rubin J.B.等人，2003；De Falco V.等人，2007）或Mab（专利WO2004/059285 A2）对体内肿瘤生长的抑制。因此，CXCR4是用于癌症的经验证的治疗靶。
趋化因子受体2（CXCR2）是另一种趋化因子受体，也被描述为肿瘤学中感兴趣的靶。实际上，CXCR2在几种肿瘤细胞类型中传递自分泌细胞生长信号，也可以通过促进血管生成间接地影响肿瘤生长（Tanaka T.等人2005）。
CXCR2趋化因子受体包含360个氨基酸。其主要在内皮细胞中表达，尤其是在新生血管形成期间。几种趋化因子结合CXCR2受体：CXCL5、-6、-7、IL-8、GRO-α、-β和.γ，其属于ERL+促血管生成趋化因子。所述CXCR2受体与CXCR4受体共享序列同源性：37%的序列同一性和48%的序列同源性。CXCR2/配体轴参与几种肿瘤生长机制，比如转移（Singh RK.等人，1994）、细胞增殖（Owen J.D.等人，1997）和ERL+趋化因子介导的血管生成（Strieter R.M.等人，2004；Romagnani等人，2004）。最后，肿瘤相关的巨噬细胞和嗜中性粒细胞是炎症诱导的肿瘤生长的关键元素，趋化因子比如CXCL5、IL-8和GRO-α启动嗜中性粒细胞的募集。
二聚化作为调节G蛋白偶联受体功能的常见机制出现，其中有趋化因子受体（Wang J.和Norcross M.2008）。已经表明响应趋化因子结合的同源二聚化和异源二聚化是通过许多趋化因子受体的信号转导的启动和改变所需要的。不断有证据支持所述受体二聚体或寡聚体可能是趋化因子受体的基本功能单元的概念。在没有配体的情况下，趋化因子受体被发现为二聚体，趋化因子诱导受体二聚体的构象变化。已知CXCR4与例如δ阿片类受体（DOR）（Hereld D.,2008）或CCR2（Percherancier Y.等人,2005）形成同源二聚体，也形成异源二聚体。在后一个实例中，源自CXCR4的跨膜结构域的肽通过阻断配体诱导的所述二聚体的构象转换而抑制激活（Percherancier Y.等人，2005）。另一个研究表明CXCR4-TM4肽（CXCR4的跨膜区的合成肽）降低了CXCR4同源二聚体的原体（protomer）之间的能量转移，并且抑制了恶性细胞中SDF-1诱导的迁移和肌动蛋白聚合（Wang J.等人，2006）。最近，也描述了CXCR7与CXCR4形成的功能性异源二聚体，并且增强了SDF-1诱导的信号转导（Sierro F.等人，2007）。组成型异源二聚体的其它实例包括显示CXCR1和CXCR2相互作用以及形成各自同源二聚体的研究。对于它们中任一个都没有注意到与另外的GPCR（α(1A)肾上腺素受体）的相互作用，这表明CXCR1和CXCR2相互作用的特异性（Wilson S.等人，2005）。
如前所述，CXCR4和CXCR2受体是令人感兴趣的肿瘤靶。干扰那些受体将通过减少肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤细胞迁移和侵入、肿瘤对嗜中性粒细胞和巨噬细胞的募集和通过抑制CXCR4癌症干细胞，以非常有效的方式抑制肿瘤生长和转移。
本发明的一个发明方面是产生诱导CXCR4二聚体构象变化的人源化单克隆抗体。本发明包括能够结合和诱导CXCR4同源二聚体和CXCR4/CXCR2异源二聚体构象变化的CXCR4 Mab hz515H7（或其片段），并具有强抗肿瘤活性。Hz515H7诱导CXCR4同源二聚体的构象变化，但也诱导CXCR4/CXCR2异源二聚体的构象变化。考虑到这两种趋化因子受体在癌症中的重要作用，这一新性质将是癌症疗法应用所感兴趣的。
已经发现靶向受体的同源二聚体和异源二聚体增强了Mab的治疗效果。实际上，已经证实例如靶向IGF-1R和胰岛素/IGF-1杂交受体的Mab（h7C10）对于抑制体内肿瘤生长比仅靶向IGF-1R的Mab更有效（Pandini G.,2007）。
而且，抗CXCR4 Mab hz515H7是CXCR4的沉默拮抗剂（silent antagonists），在体外分析中，其不会改变基础信号，但是在不同分析（GTPγS结合、Ca2+释放）中其抑制SDF-1诱导的信号转导，并且也能够在体外抑制SDF-1诱导的肿瘤细胞迁移。
充当部分激动剂或反向激动剂的分子在不存在配体的情况下显示出内在活性。这些类型的分子甚至在不存在配体的情况下，分别稳定高亲和性或低亲和性的GPCR状态，从而激活或抑制下游信号转导级联（Galandin等人，2007；Kenakin,2004）。
在hz515H7 Mab的情况下，其表现为沉默拮抗剂，在不存在SDF-1的情况下对于CXCR4受体没有任何内在活性。与部分或反向激动剂相比，该药理学特征很可能与较少的不利副作用有关，如已经对于阿片类受体配体观察到的（Bosier和Hermans，2007）。实际上，hz515H7 Mab的功能活性完全取决于SDF-1的存在，在血流不表达、分泌或提供SDF-1配体的组织和器官中，没有观察到CXCR4受体活性的调节。因此，与具有阳性或阴性功效的其它CXCR4受体配体相比，hz515H7Mab可能毒性更小。另外，沉默拮抗剂是药理学空间（pharmacological space）中的少数种类（Wurch等人，1999、Kenakin,2004）。
发明内容
令人惊奇地，本发明人首次设法产生了能够结合CXCR4，还能够诱导CXCR4同源二聚体和/或异源二聚体构象变化的人源化抗体。更特别地，本发明的人源化抗体能够诱导CXCR4同源二聚体的构象变化，还诱导CXCR4/CXCR2异源二聚体的构象变化。
在下文说明书中，复数表述“CXCR4二聚体”必须理解为涵盖CXCR4同源二聚体和CXCR4/CXCR2异源二聚体。
在此阶段必须提及的是，现有技术中从来没有描述过这样的人源化抗体。而且，必须提及的是，从来没有描述过CXCR4/CXCR2异源二聚体的存在。
本发明的一部分是发现了CXCR4和CXCR2形成的异源二聚体的存在。
因此，在一个具体方面，本发明公开了一种分离的复合物，其包含CXCR4/CXCR2异源二聚体或由其组成。
所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的CXCR4复合部分是选自下述的两个人类CXCR4同种型之一：
-趋化因子（C-X-C基序）受体4同种型b（人类（Homo sapiens）），其具有如在Genbank登录号NP 003458下描述的序列（SEQ ID No.1）；
-趋化因子（C-X-C基序）受体4同种型a（人类），其具有如在Genbank登录号NP 001008540下描述的序列（SEQ ID No.2）；
-替换性的转录剪接变体或其天然变体，其与具有SEQ ID No.1或2的这些b或a同种型之一具有至少95%的同一性；和
-其片段，该片段能够被其天然配体间质细胞衍生的因子1（SDF-1）特异性识别，并且优选地具有至少100、150和200个氨基酸长度。
所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的CXCR2复合部分选自：
-白细胞介素8受体β（人类），其具有如在Genbank登录号NP 001548下描述的序列（SEQ ID No.3）；
-替换性的转录剪接变体或其天然变体，其与具有SEQ ID No.3的白细胞介素8受体β具有至少95%的同一性；和
-其片段，该片段能够被IL-8特异性识别，并且优选地具有至少100、150和200个氨基酸长度。
在这一具体方面，本发明还公开了编码包括所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的多肽的分离的RNA或DNA。
本发明进一步公开了编码所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的核构建体，优选表达载体，比如质粒。
本发明进一步包括包含至少一种编码所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的部分CXCR4的核构建体，优选表达载体，比如质粒，和编码所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的部分CXCR2的第二构建体，优选表达载体，比如质粒。
在这一方面，本发明进一步公开了表达所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的重组宿主细胞的制备方法，其中该方法包括转化所述宿主细胞的步骤：
a)采用编码所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的核构建体，优选表达载体，比如质粒；或
b)采用至少一种编码所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的部分CXCR4的核构建体，优选表达载体，比如质粒，和编码所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的部分CXCR2的第二构建体，优选表达载体，比如质粒。
所述宿主细胞是真核细胞，比如哺乳动物细胞。
编码所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的核构建体还编码结合（特别地通过共价偶联）CXCR4序列的第一标记，比如luc标记，和结合（特别地通过共价偶联）CXCR2序列的第二标记，比如GFP标记（即，用于BRET分析）。
本发明还公开了一种选择具有抗癌活性或可用于制备用于治疗癌症的组合物的化合物的方法，其特征在于所述方法包括步骤：
a)用待测试的化合物接触本发明的重组宿主细胞，该细胞表达所述CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物；和
b)确定该化合物是否能够调节，优选地抑制重组宿主细胞中该CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的活性。
在第一个方面，本发明的一个主题是产生和选择根据本发明的人源化抗体的方法。
在第一个方面，本发明涉及一种选择能够抑制CXCR4的配体依赖性和配体非依赖性激活的抗CXCR4人源化抗体，或其功能片段或衍生物之一的方法，所述方法包括下列步骤：
i)筛选产生的人源化抗体，并且选择能够特异性结合CXCR4和调节CXCR4激活的抗体；
ii)测试步骤i)中的所选抗体，并且选择能够诱导CXCR4同源二聚体构象变化的抗体，然后
iii)测试步骤ii)中的所选抗体，并且选择能够诱导CXCR4/CXCR2异源二聚体构象变化的抗体。
表述“调节”必须理解为增加或抑制。优选地，本发明的所选抗体必须抑制CXCR4激活。
如前面解释的，诱导CXCR4二聚体的构象变化是本发明的一个重要方面，因为这样的抗体将为更大群体的患者提供真正的好处。
抗体的产生可以由本领域技术人员通过任何已知方法来实现，比如例如通过根据鼠抗体经测序的CDR而设计的重组人源化抗体，所述鼠抗体由来自免疫的小鼠或与所选骨髓瘤细胞相容的其它物种的脾细胞融合的骨髓瘤细胞所分泌（Kohler和Milstein,1975,Nature,256:495-497）。所述免疫的动物可以包括转基因小鼠，其具有人类免疫球蛋白基因座，然后直接产生人类抗体。另一个可能的实施方式可以包括使用噬菌体展示技术筛选文库。
筛选步骤i)可以由本领域技术人员通过任何已知方法或过程来实现。作为非限制性的实例，可以提及ELISA、BIAcore、免疫组织化学、FACS分析和功能性筛选。一个优选的过程包括通过FACS分析CXCR4转染子和至少一个肿瘤细胞系以确保产生的抗体也能够识别肿瘤细胞上的天然受体的筛选。该过程将更准确地描述在下列实施例中。
通过表述“调节CXCR4激活”旨在调节至少一个在如下对于鼠抗体的实施例4、5、7和11，对于嵌合抗体的实施例16、17和19以及对于人源化抗体实施例27、24和28中描述的活性：
优选地调节：
-在细胞膜上受体CXCR4上的配体SDF-1的特异性结合（参见实施例4、16、27），特别地在稳定地表达人野生型CXCR4受体的真核转化细胞膜，比如CHO-K1膜上通过竞争的特异性结合；
-在细胞膜上受体CXCR4上的GTPγS的特异性结合（参见实施例5、17、24），特别地是在稳定地和组成性（constitutively）表达野生型CXCR4受体膜的真核转化细胞膜上，比如NIH-3T3细胞膜上；
-CXCR4介导的cAMP生成的抑制（参见实施例7）；和
-CXCR4受体介导的细胞内钙贮存的动员（参见实施例11、19、28）。
更优选地，至少一种这些活性的调节是抑制所述活性。
在本发明的方法选择的步骤ii)和iii)一个优选的实施方式中，所述步骤ii)和iii)包括通过BRET分析分别在表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP和CXCR4-Rluc/CXCR2-YFP的细胞上评价抗体，并选择能够抑制BRET信号至少40%，优选地45%、50%、55%和最优选地60%的抗体。
BRET技术是一种称为蛋白质二聚化的代表技术（Angers等人，PNAS,2000，97:3684-89）。
在该方法的步骤ii)和iii)中使用的BRET技术是本领域技术人员所熟知的，将详细描述在下述实施例中。更特别地，BRET（生物发光共振能量转移）是一种生物发光供体（Renilla荧光素酶（Rluc））和荧光受体GFP的突变体（绿色荧光蛋白）或YFP（黄色荧光蛋白）之间出现的非放射性能量转移。在目前的情况下，使用EYFP（增强的黄色荧光蛋白）。转移的功效取决于供体和受体之间的方向和距离。然后，只有当两个分子非常接近（1-10nm）时才出现能量转移。该性质可用于进行蛋白质-蛋白质相互作用测定。实际上，为了研究两个配偶体（partners）之间的相互作用，将第一个配偶体遗传融合至Renilla荧光素酶，将第二个配偶体遗传融合至GFP的黄色突变体。融合蛋白通常（但不是必须地）在哺乳动物细胞中表达。在其膜可渗透性底物（腔肠素（coelenterazine））的存在下，Rluc发射蓝光。如果GFP突变体距离Rluc小于10纳米，则可以出现能量转移，可以检测到另外的黄色信号。BRET信号测量为受体发射的光和供体发射的光的比例。因此，当使两个融合蛋白接近时，或者如果构象变化引起Rluc和GFP突变体接近时，BRET信号将增加。
如果BRET分析包括在优选的实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的任何方法测量CXCR4二聚体的构象变化。可以提及下述技术，但不限于此：FRET（荧光共振能量转移）、HTRF（均相时间分辨荧光）、FLIM（荧光寿命成像显微镜检查）或SW-FCCS（单波长荧光交叉相关光谱）。
也可以使用其它经典技术，比如免疫共沉淀、α筛选、化学交联、双杂交、亲和色谱、ELISA或Far western印迹。
在根据本发明的方法的一个具体的方面，步骤ii)包括在同时表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP的细胞上通过BRET分析来评价抗体和选择能够抑制至少40%的BRET信号的抗体。
在根据本发明方法的另一个具体的方面，步骤iii)包括在同时表达CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP的细胞上通过BRET分析来评价抗体和选择能够抑制至少40%的BRET信号的抗体。
在第二个方面，本发明的一个主题是通过所述方法获得的分离的人源化抗体或其功能片段或衍生物之一。所述人源化抗体或其所述片段或衍生物之一能够特异性结合人类CXCR4，而且，如有必要，其优选地还能够抑制其配体的自然连接，所述人源化抗体也能够诱导CXCR4二聚体的构象变化。
表述“功能片段和衍生物”将在本说明书中随后详细地定义。
在此必须理解，本发明并不涉及天然形式的抗体，即其不是在其自然环境中，而是其能够通过纯化从天然来源分离或获得，或者通过遗传重组或通过化学合成获得，以及其可以包含将进一步描述的非天然氨基酸。
更特别地，根据本发明的另一个方面，其描述一种抗体、或其功能片段或衍生物之一，所述人源化抗体的其特征在于其包含至少一个选自包含氨基酸序列SEQ ID No.4至9的CDR的互补决定区CDR（根据IMGT所定义的）。
根据第二个方面，本发明涉及一种分离的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其包含至少一个选自序列SEQ ID No.4、5、6、7、8或9的CDR的CDR或至少一个如下CDR（根据IMGT所定义的）：在最佳比对之后，其序列与序列SEQ ID No.4、5、6、7、8或9具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%的同一性。
抗体的“功能片段”特别地是指对于CXCR4具有与母体抗体相同特异性的抗体片段，比如片段Fv、scFv（sc=单链）、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体（diabodies）、或半衰期已增加的任何片段。这样的功能片段将在本说明书中随后详细描述。
抗体的“衍生化合物”或“衍生物”特别地指由肽骨架和用于保持其识别CXCR4能力的原始抗体的至少一个CDR组成的结合蛋白。这样的衍生化合物是本领域技术人员熟知的，将在本说明书中随后更详细地描述。在本发明的另一个实施方式中，衍生化合物或衍生物可包括原始抗体的至少2个，优选至少3个，更优选4个，更优选5个或，最优选6个CDR。
更优选地，本发明包括通过遗传重组或化学合成获得的根据本发明的人源化抗体、其衍生化合物或其功能片段。
根据一个优选的实施方式，根据本发明的人源化抗体或其衍生化合物或功能片段的特征在于其由单克隆抗体组成。
“单克隆抗体”应理解为指来源于几乎同一的抗体群的抗体。更特别地，除了可以以最小比例发现的很少可能天然出现的突变之外，群中的单个抗体是相同的。换句话说，单克隆抗体是由来源于单个细胞克隆（例如杂交瘤、用编码同一的抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码同一的抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等）生长的同一的抗体组成，其特征通常是一个且仅一个种类和亚类的重链，和仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的，并针对单一抗原。另外，与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原的单一表位。
在此必须理解，本发明并不涉及天然形式的人源化抗体，即，其不是从其自然环境中取得的，而是通过纯化从天然来源分离或获得的，或者通过遗传重组或化学合成获得的，因而，其可以带有如下所述的非天然氨基酸。
更特别地，根据本发明的一个优选的实施方式，所述人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段的特征在于其包括重链，该重链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No.4、5或6的CDR的CDR，或至少一个在最佳比对之后其序列与序列SEQ ID No.4、5或6具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的CDR；或其包括轻链，该轻链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No.7、8或9的CDR的CDR，或至少一个在最佳比对之后其序列与序列SEQ ID No.7、8或9具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的CDR。
在一个优选的方式中，本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括包含下述三种CDR的重链：分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：
-CDR-H1包含序列SEQ ID No.4，或在最佳比对之后与序列SEQ ID No.4具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
-CDR-H2包含序列SEQ ID No.5，或在最佳比对之后与序列SEQ ID No.5具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
-CDR-H3包含序列SEQ ID No.6，或在最佳比对之后与序列SEQ ID No.6具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
根据一个具体的实施方式，抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括重链，该重链包含序列SEQ ID No.4的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2和序列SEQ ID No.6的CDR-H3。
甚至更优选，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能片段之一特征在于其包括轻链，该轻链包含如下三种CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
-CDR-L1包含序列SEQ ID No.7，或在最佳比对之后与序列SEQ ID No.7具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
-CDR-L2包含序列SEQ ID No.8，或在最佳比对之后与序列SEQ ID No.8具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
-CDR-L3包含序列SEQ ID No.9，或在最佳比对之后与序列SEQ ID No.9具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
根据一个具体的实施方式，抗体或其衍生化合物或功能片段之一的特征在于其包括轻链，该轻链包含序列SEQ ID No.7的CDR-L1、序列SEQ ID No.8的CDR-L2和序列SEQ ID No.9的CDR-L3。
在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“附着至抗体化合物或其序列的蛋白”是可互换的。
在此必须理解，本发明并不涉及天然形式的抗体，即，其不是从自然环境中取得的，而是通过纯化从天然来源分离或获得的，或者通过遗传重组或化学合成获得的，因而，其可以带有如下所述的非天然氨基酸。
无论抗原受体或链类型或物种是什么，将IMGT唯一的编号定义为与可变结构域比较（Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)）。在IMGT唯一编号中，保守性氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23（第1个CYS），色氨酸41（保守性TRP）、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104（第2个CYS）、苯丙氨酸或色氨酸118（J-PHE或J-TRP）。所述IMGT唯一编号提供了框架区（FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128）和互补决定区CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117的标准化定界。由于空位（gap）代表未占用的位置，CDR-IMGT长度（在括号之间显示，并用点分开，例如[8.8.13]）成为关键信息。在2D图解中使用IMGT唯一编号，命名为IMGT Colliers de Perles（Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)），以及在IMGT/3D结构DB中的3D结构中使用（Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structuraldata.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)）。
存在三条重链CDR和3条轻链CDR。此处使用术语CDR用于指，取决于具体情形，包含大多数如下氨基酸残基的这些区域中的一种或几种或者甚至全部这些区域，这些氨基酸残基负责抗体与其识别的抗原或表位的亲和性结合。
在本发明的意义上，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”指两个进行比较的序列之间在最佳比对后获得的相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯粹统计学上的，并且两个序列之间的区别沿其长度随机分布。两个核酸或氨基酸序列之间的比较通常通过比较两个在最佳比对后的序列而进行，所述比较能够分段进行或使用“比对窗口”进行。用于比较的序列的最佳比对，除了手工比较之外，可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)（Ad.App.Math.2：482）、通过Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)（J.Mol.Biol.48:443）、通过Pearson和Lipman的相似性查找法(1988)（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444）或通过使用这些算法的计算机软件（威斯康星遗传学软件包,遗传学计算机组,575 Science Dr.,Madison,WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P）进行。
两个核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性通过比较两个最佳比对的序列确定，其中，与用于两个序列之间最佳比对的参考序列相比，待比较的核酸或氨基酸序列可以具有添加或缺失。通过如下方法计算百分比同一性：确定两个序列，优选两个全序列之间相同氨基酸核苷酸或残基的位置数目，将相同位置的数目除以比对窗口中的位置总数，并将结果乘以100以获得两个序列之间的百分比同一性。
例如，可使用在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html可获得的BLAST程序“BLAST 2序列”（Tatusova等人，“Blast 2 sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol，1999，Lett.174：247-250），使用缺省参数（特别是参数“开放空位罚分”：5，和“延伸空位罚分”：2；所选的矩阵是例如程序建议的“BLOSUM 62”矩阵）；直接通过该程序计算两个待比较序列之间的百分比同一性。
对于显示出与参考氨基酸序列具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，优选的实例包括包含参考序列、某些修饰，特别是至少一个氨基酸的删除、添加或置换、截短或延伸的那些。在置换一个或多个连续或不连续氨基酸的情况下，其中被置换的氨基酸被“等同”氨基酸替换的置换是优选的。在此，表述“等同氨基酸”指可能置换结构性氨基酸之一，然而并未改变相应抗体和下述定义的那些具体实例的生物活性的任何氨基酸。
等同氨基酸可根据其与被置换氨基酸的结构同源性或根据各种可能产生的抗体之间生物活性的比较性试验结果而确定。
作为非限制性实例，下表1概述了可能进行却没有引起相应修饰抗体的生物活性发生显著改变的可能的置换；在相同条件下，反向置换当然是可能的。
表1
原始残基 取代
Ala(A) Val、Gly、Pro
Arg(R) Lys、His
Asn(N) Gln
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala
His(H) Arg
Ile(I) Leu
Leu(L) Ile、Val、Met
Lys(K) Arg
Met(M) Leu
Phe(F) Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr、Cys
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Phe、Trp
Val(V) Leu、Ala
本领域技术人员已知，在本领域的现状下，发现六个CDR之间的最大可变性（长度和组成）位于三条重链CDR上，更特别地，在这条重链的CDR-H3上。因此，很显然：本发明所述抗体或其衍生化合物或功能片段之一的优选特征性CDR是重链的三种CDR。
本发明另一个实施方式公开了一种抗体或其衍生化合物或功能片段，其包括：
包含下列三种CDR的重链：
CDR-H1，其序列为SEQ ID No.4，或为在最佳比对之后与序列SEQ ID No.4具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
CDR-H2，其序列为SEQ ID No.5，或为在最佳比对之后与序列SEQ ID No.5具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
CDR-H3，其序列为SEQ ID No.6，或为在最佳比对之后与序列SEQ ID No.6具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
以及包含下列三种CDR的轻链：
CDR-L1，其序列为SEQ ID No.7，或为在最佳比对之后与序列SEQ ID No.7具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
CDR-L2，其序列为SEQ ID No.8，或为在最佳比对之后与序列SEQ ID No.8具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
CDR-L3，其序列为SEQ ID No.9，或为在最佳比对之后与序列SEQ ID No.9具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
本发明的另一个方面涉及上述人源化抗体的功能片段。对于本领域技术人员将是显而易见的，功能片段必需是结合片段，即能够结合至和母体抗体相同的靶的片段。此外，功能片段保留了母体抗体的功能。尤其是，本发明的功能片段能够调节CXCR4的激活。更优选，根据本发明的功能片段能够抑制CXCR4的激活。在一个实施方式中，CXCR4激活是配体依赖性的；在另一个实施方式中，所述CXCR4激活是配体非依赖性的。
在一个优选的实施方式中，本发明的功能片段保留母体抗体的功能，所述功能包括调节CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的活性。优选，所述功能片段保留抑制CXCR4/CXCR2异源二聚体复合物的活性能力。
更特别地，本发明的目标是抗体或其衍生化合物或功能片段，其特征在于所述功能片段选自片段Fv、Fab、(Fab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc和双特异抗体，或任何其半衰期增加的片段，如PEG化的片段。
根据本发明的抗体的这种功能片段由下列组成，例如，片段Fv、scFv（sc＝单链）、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体或任何其半衰期通过化学修饰而增加的片段，比如添加聚亚烷基二醇，比如聚乙二醇（PEG化）（PEG化的片段被称作Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG和Fab’-PEG），或通过掺入脂质体、微球体或PLGA，所述片段具有至少一个本发明的人源化抗体的特征性CDR，其显著地能够以通常方式发挥出其来源抗体的活性，即使是部分活性。
优选地，所述功能片段包含或包括衍生其的抗体可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性，和足够的亲和性，优选至少等于其来源抗体的亲和性的1/100，更优选至少是其来源抗体的亲和性的1/10。
这样的功能片段将包含其来源抗体序列的至少五个氨基酸，优选6、7、8、10、15、25、50或100个连续氨基酸。
优选地，这些功能片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、F(ab’)、scFv-Fc或双特异抗体类型，这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。根据本发明，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法从上述抗体获得。抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
更特别地，本发明涉及鼠515H7 Mab的不同人源化抗体变体，在本说明书中称为i)HZ515H7、Hz515H7或hz515H7 Mab以及ii）HZ515H7-2、Hz515H7-2或hz515H7-2 Mab或iii）所述抗体变体的轻链和/或重链的任何组合。
为了更清楚，下表2a概述了对应于本发明人源化变体（也称作形式）hz515H7和hz515H7-2的CDR的各种氨基酸序列；表2b概述了对应于本发明人源化形式hz515H7的各种变体的可变结构域和全长序列的各种氨基酸序列；以及表2c概述了对应于本发明人源化形式hz515H7-2的可变结构域和全长序列的各种氨基酸序列。
表2a
Figure BDA00002425225000131
表2b
Figure BDA00002425225000132
Figure BDA00002425225000141
表2c
Figure BDA00002425225000142
作为一个实例，为了避免疑问，表述“VH1”和表述“VH变体1”、“VH变体1”，“VH Var1”或“VH var1”相似。在实施例22中描述了“一致”序列的获得。
本发明的再一个具体方面涉及人源化抗体，或其衍生化合物或功能片段，其特征在于源自人抗体的轻链和重链的恒定区分别是λ或κ区和γ-1、γ-2或γ-4区。
本发明描述分泌单克隆抗体的鼠杂交瘤，其于2008年6月25日以编号I-4019提交至法国微生物培养物中心（CNCM，法国，巴黎，巴斯德研究所）。所述杂交瘤是通过将Balb/C免疫接种的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/O-Ag14系的细胞融合而获得。
在此处称为515H7的鼠单克隆抗体是由2008年6月25日以保藏号I-4019提交至CNCM的杂交瘤分泌的。
本发明还描述了嵌合抗体。
嵌合抗体是由一种包含来源于给定物种的天然可变区（轻链和重链）和与所述给定物种异源的物种的抗体轻链和重链的恒定区结合而成的抗体。这些抗体或抗体的嵌合片段可通过使用重组遗传学技术制备。例如，嵌合抗体可以通过克隆包含启动子和编码本发明的非人类单克隆抗体（特别是鼠单克隆抗体）可变区的序列和编码人抗体恒定区的序列的重组DNA而产生。根据本发明的由这样的重组基因编码的嵌合抗体可以是，例如，小鼠-人嵌合体，这种抗体的特异性通过来源于鼠DNA的可变区确定，其同种型通过来源于人DNA的恒定区确定。用于制备嵌合抗体的方法参见Verhoeyn等人（BioEssays，8:74，1988）。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含选择的序列SEQ ID No.83的可变区的嵌合抗体重链（称为c515H7 VH）。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含序列SEQ ID No.84的可变区的嵌合抗体轻链（称为c515H7 VL）。
在一个具体的优选实施方式中，本发明的嵌合抗体、或其衍生化合物或功能片段包括包含氨基酸序列SEQ ID No.83的重链序列，以及包含氨基酸序列SEQ IDNo.84的轻链序列。
如此处所用“人源化抗体”涉及包括至少一条重链或一条轻链的抗体，所述重或轻链含有源自非人源抗体的CDR区，抗体分子的其它部分是人源的（例如，所述其它部分可源自一种（或多种）人抗体）。通过表述“人源化抗体”，本发明因此包括仅具有一条人源化链、第二条是嵌合或鼠的链的抗体。优选本发明的“人源化抗体”包括两条人源化链，即重链和轻链都是人源化的。
本发明的人源化抗体或其片段可以通过本领域技术人员已知的技术制备（比如例如在文献Singer等人，J.Immun.,150:2844-2857,1992；Mountain等人,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10:1-142,1992；和Bebbington等人，Bio/Technology，10:169-175,1992中描述的那些）。这样的人源化抗体因其在包括体外诊断或体内预防性和/或治疗性治疗方法中的用途而是优选的。也可以引用也是本领域技术人员已知的其它人源化技术，比如例如，PDL在专利EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0939 127、EP 0 566 647或US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089和US 5,693,761中描述的“CDR接枝”技术。US专利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293也被引用。
本发明涉及来源于如上所述鼠抗体515H7的人源化抗体。
在一个优选的方式中，源自人抗体的轻链和重链的恒定区分别为λ或κ以及γ-1、γ-2或γ-4区。
更特别地，本发明涉及人源化抗体重链，其包括：i)与人抗体重链相对应的框架区同源的框架区，以及ii）与源自不同哺乳动物物种的抗体相对应的CDR同源的CDR，其中所述CDR由分别包括序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3组成。
换言之，本发明涉及具有由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3组成的CDR的人源化抗体重链，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包括序列SEQ ID No.4、5和6。对于本领域技术人员显而易见的是，针对抗体515H7的人源化可以选择不同的种系，然后产生人源化515H7的不同形式。更特别地，在优选的非限定性实施方式中，不同种系可用于编码v基因的序列，而对于j基因相同的种系将是保守的。
对于本发明，基于两点互补准则选择可用的种系：
-鼠CDR和种系中的等同物之间的各CDR的氨基酸长度必须一致；以及
-氨基酸的种系序列与母体鼠序列必须具有至少70%的同一性。
为了避免疑问，此处提醒的是本发明包括相同抗体515H7的两种优选非限定性人源化形式（也称作版本）。第一种，称为Hz515H7，由用针对重链的种系IGHV3-49*04（SEQ ID No.77）和IGHJ4*01（SEQ ID No.81）以及针对轻链的IGKV4-1*01（SEQ ID No.78）和IGKJ1*01（SEQ ID No.82）获得的人源化抗体组成。第二种，称为Hz515H7-2，由用针对重链的种系IGHV3-73*01（SEQ ID No.79）和IGHJ4*01（SEQ ID No.81）以及针对轻链的IGKV2D-40*01（SEQ ID No.80）和IGKJ1*01（SEQ ID No.82）获得的人源化抗体组成。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.10、11、12、13、85或87的序列的可变区的人源化抗体重链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.10、11、12或13的序列的可变区的人源化抗体H515H7重链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括序列SEQ ID No.85的可变区的人源化抗体H515H7-2重链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括序列SEQ ID No.87的可变区的人源化抗体H515H7-2重链。
在又一个实施方式中，本发明还涉及序列SEQ ID No.87的人源化抗体H515H7-2重链可变区，其包括一个或多个选自H35S、V48L、R50F、A61D、D76N和A81L的氨基酸取代。
在又一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.21、22、23、24、89或91的完整序列的人源化抗体重链。
在又一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.21、22、23或24的完整序列的人源化抗体重链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括完整序列SEQ ID No.89的人源化抗体H515H7-2重链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括完整序列SEQ ID No.91的人源化抗体H515H7-2重链。
在又一个实施方式中，本发明还涉及序列SEQ ID No.91的人源化抗体H515H7-2重链，其包括一个或多个选自H35S、V48L、R50F、A61D、D76N和A81L的氨基酸取代。
更特别地，本发明涉及人源化抗体轻链，其包括：i)与人抗体轻链相对应的框架区同源的框架区，以及ii）与源自不同哺乳动物物种的抗体相对应的CDR同源的CDR，其中所述CDR由分别包括序列SEQ ID No.7、8和9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成。
换言之，本发明涉及具有由CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成的CDR的人源化抗体轻链，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别包括序列SEQ ID No.7、8和9。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.14、15、16、17、18、19、20、86或88的序列的可变区的人源化抗体轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.14、15、16、17、18、19或20的序列的可变区的人源化抗体H515H7轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括序列SEQ ID No.86的可变区的人源化抗体H515H7-2轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括序列SEQ ID No.88的可变区的人源化抗体H515H7-2轻链。
在又一个实施方式中，本发明还涉及序列SEQ ID No.88的人源化抗体H515H7-2轻链可变区，其包括一个或多个选自L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Y和/或V89L的氨基酸取代。
在又一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.25、26、27、28、29、30、31、90或92的完整序列的人源化抗体轻链。
在又一个实施方式中，本发明涉及包括选自SEQ ID No.25、26、27、28、29、30或31的完整序列的人源化抗体H515H7轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括完整序列SEQ ID No.90的人源化抗体H515H7-2轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及包括完整序列SEQ ID No.92的人源化抗体H515H7-2轻链。
在又一个实施方式中，本发明还涉及序列SEQ ID No.92的人源化抗体H515H7-2轻链，其包括一个或多个选自L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Y和/或V89L的氨基酸取代。
更特别地，本发明涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，特征在于其包括重和轻链，各重和轻链具有i）与人抗体相对应的框架区同源的框架区，以及ii）与源自不同哺乳动物物种的抗体相对应的CDR同源的CDR，其中所述CDR由分别包括序列SEQ ID No.4、5和6的重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及分别包括序列SEQ ID No.7、8和9的轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成。
换言之，本发明涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述人源化抗体包括重和轻链，所述重链具有由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3组成的CDR，以及所述轻链具有由CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成的CDR，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包括序列SEQ ID No.4、5和6，以及所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别包括序列SEQ ID No.7、8和9。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其包括选自SEQ ID No.10、11、12、13、83、85或87的序列的重链可变区以及选自SEQ ID No.14、15、16、17、18、19、20、84、86或88的序列的轻链可变区。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7，其包括选自SEQ IDNo.10、11、12或13的重链可变区以及选自SEQ ID No.14、15、16、17、18、19或20的序列的轻链可变区。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7-2，其包括序列SEQ IDNo.85的重链可变区以及序列SEQ ID No.86的轻链可变区。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7-2，其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7-2，其包括序列SEQ IDNo.85的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7-2，其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.86的轻链可变区。
在又一个实施方式中，本发明还涉及包括序列SEQ ID No.87的重链可变区（其包括一个或多个选自H35S、V48L、R50F、A61D、D76N和A81L的氨基酸取代）以及SEQ ID No.88的轻链可变区（其包括一个或多个选自D40A、L43Q、Y59A、A61D、S69T、G74E和D76Y的氨基酸取代）的人源化抗体H515H7-2。
在又一个实施方式中，本发明涉及包括结合了嵌合轻链的人源化重链的人源化抗体。
在又一个实施方式中，本发明涉及包括结合了人源化轻链的嵌合重链的人源化抗体。
更特别地，本发明描述人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其包括SEQID No.83的重链可变区以及选自SEQ ID No.14、15、16、17、18、19、20、86或88的序列的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQID No.14的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7 VL1T59A E61D或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQ ID No.15的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7 VL2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQID No.16的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7 VL2.1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQ ID No.17的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7 VL2.2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQ ID No.18的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7 VL2.3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQ ID No.19的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7 VL3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQID No.20的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQ ID No.86的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体c515H7 VH/Hz515H7-2 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.83的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区。
在另一个实施方式中，本发明描述人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其包括选自SEQ ID No.10、11、12、13、85或87的序列的重链可变区以及序列SEQ ID No.84的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1/c515H7 VL或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.10的重链可变区以及序列SEQID No.84的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1 D76N/c515H7VL或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.11的重链可变区以及序列SEQ ID No.84的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 V48LD76N/c515H7 VL或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.12的重链可变区以及序列SEQ ID No.84的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH2/c515H7 VL或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.13的重链可变区以及序列SEQID No.84的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.85的重链可变区以及序列SEQ ID No.84的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/c515H7 VL或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.84的轻链可变区。
在又一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其包括选自SEQ ID No.21、22、23、24、89或91的序列的重链以及选自SEQ IDNo.25、26、27、28、29、30、31、90或92的序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7，其包括选自SEQ IDNo.21、22、23或24的序列的重链以及选自SEQ ID No.25、26、27、28、29、30或31的序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7-2，其包括序列SEQ IDNo.89的重链以及序列SEQ ID No.90的轻链。
在另一个实施方式中，本发明涉及人源化抗体H515H7-2，其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.92的轻链。
在又一个实施方式中，本发明还涉及包括序列SEQ ID No.91的重链（其包括一个或多个选自H35S、V48L、R50F、A61D、D76N和A81L的氨基酸取代）以及SEQ ID No.92的轻链（其包括一个或多个选自D40A、L43Q、Y59A、A61D、S69T、G74E和D76Y的氨基酸取代）的人源化抗体H515H7-2。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.11的重链可变区以及序列SEQID No.16的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.22的重链以及序列SEQ IDNo.27的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2.1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.11的重链可变区以及序列SEQ ID No.17的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2.1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.22的重链以及序列SEQ IDNo.28的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2.2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.11的重链可变区以及序列SEQ ID No.18的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2.2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.22的重链以及序列SEQ IDNo.29的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2.3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.11的重链可变区以及序列SEQ ID No.19的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N VL2.3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.22的重链以及序列SEQ IDNo.30的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 V48L D76NVL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.12的重链可变区以及序列SEQ ID No.14的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 V48L D76NVL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.23的重链以及序列SEQID No.25的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 V48L D76NVL1 T59A E61D或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.12的重链可变区以及序列SEQ ID No.15的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 V48L D76NVL1 T59A E61D或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.23的重链以及序列SEQ ID No.26的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.10的重链可变区以及序列SEQ IDNo.14的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.21的重链以及序列SEQ ID No.25的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1/Hz515H7-2VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.10的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1D76N/Hz515H7-2 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.11的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 V48LD76N/Hz515H7-2 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.12的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH2/Hz515H7-2VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.13的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1/Hz515H7-2VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.21的重链以及序列SEQID No.92的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1D76N/Hz515H7-2 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.22的重链以及序列SEQ ID No.92的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 V48LD76N/Hz515H7-2 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.23的重链以及序列SEQ ID No.92的轻链。
在另一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH2/Hz515H7-2VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.24的重链以及序列SEQID No.92的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.14的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL1 T59A E61D或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.15的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.16的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2.1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.17的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2.2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.18的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2.3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.19的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.20的轻链可变区。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.91的重链以及序列SEQID No.25的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL1 T59A E61D或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.91的重链以及序列SEQ ID No.26的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.91的重链以及序列SEQID No.27的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2.1或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.91的重链以及序列SEQID No.28的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2.2或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.91的重链以及序列SEQID No.29的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL2.3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.91的重链以及序列SEQID No.30的轻链。
在一个优选实施方式中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7-2 VH1/Hz515H7VL3或其衍生化合物或功能片段，其包括序列SEQ ID No.91的重链以及序列SEQID No.31的轻链。
必须理解上述例证VH/VL组合不是限制性的。当然，本领域技术人员，无需过度负担并无需采用创造性技巧，能够重排本说明书中公开的所有VH和VL。因此技术人员能获得对应着所有本申请中公开的所有VH和VL的所有组合的所有人源化抗体。
本发明的一个新方面涉及分离的核酸，特征在于其选自下列核酸（包括任意简并遗传密码子）：
a）核酸（DNA或RNA），其编码根据本发明的人源化抗体重链或其衍生化合物或功能片段；
b）核酸（DNA或RNA），其编码根据本发明的人源化抗体轻链或其衍生化合物或功能片段；
c）核酸（DNA或RNA），其编码根据本发明的人源化抗体或其衍生化合物或功能片段；
d）如a）、b）或c）中定义的核酸的互补核酸；
e）至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨的条件下与包括核酸序列SEQ IDNo.38至41、49至52、93或95的至少一个重链，优选与根据IMGT或根据KabatCDR编号的其三个CDR的至少一个杂交；
f）至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨的条件下与包括核酸序列SEQ IDNo.42至48、53至59、94或96的至少一个轻链，优选与根据IMGT或根据KabatCDR编号的其三个CDR的至少一个杂交。
本发明还涉及分离的核酸分子，其包括编码人源化抗体重链可变区的核酸序列，所述重链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.32的CDR-H1核苷酸序列；SEQID NO.33的CDR-H2核苷酸序列；以及SEQ ID NO.34的CDR-H3核苷酸序列。
本发明还涉及分离的核酸分子，其包括编码人源化抗体轻链可变区的核酸序列，所述轻链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.35或60的CDR-L1核苷酸序列；SEQ ID NO.36或61的CDR-L2核苷酸序列；以及SEQ ID NO.37或62的CDR-L3核苷酸序列。
本发明还涉及分离的核酸分子，其包括编码人源化抗体重链可变区和轻链可变区的核酸序列。
所述重链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.32的CDR-H1核苷酸序列；SEQID NO.33的CDR-H2核苷酸序列；以及SEQ ID NO.34的CDR-H3核苷酸序列。
所述轻链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.35或60的CDR-L1核苷酸序列；SEQ ID NO.36或61的CDR-L2核苷酸序列；以及SEQ ID NO.37或62的CDR-L3核苷酸序列。
下表3a概述了对应于本发明抗体hz515H7的CDR的优化的核苷酸序列；表3b概述了对应于本发明人源化抗体hz515H7的各种变体的可变结构域和全长序列的各种优化的核苷酸序列。表3c概述了对应于本发明人源化版本hz515H7-2的可变结构域和全长序列的各种优化的核苷酸序列。
表3a
表3b
Figure BDA00002425225000242
Figure BDA00002425225000251
表3c
Figure BDA00002425225000252
表述“优化的序列”表示编码兴趣蛋白质（此处是抗体可变结构域）构成的氨基酸的密码子已通过指定细胞类型中（此处为哺乳动物细胞）的翻译机制而进行优化以便更好的识别。这一方面，优化序列编码的给定蛋白质的氨基酸序列与非优化的序列的氨基酸序列相同，但是核苷酸序列不同。优化还包括G/C含量适应和防止稳定的RNA二级结构（参见作为实例Kim等人，1997Gene199(1-2):293-301）。
例如，鼠CDR-H1（SEQ ID No.71）的核苷酸序列已经过优化并对应着人源化CDR-H1（SEQ ID No.32）的核苷酸序列，其中密码子ggg，act和gat（分别编码残基Gly、Thr和Asp）分别被密码子ggc、acc和gac（也分别编码残基Gly、Thr和Asp）替换。
关于CDR-H2和CDR-H3（分别SEQ ID No.72和73），它们也经过优化并分别对应着SEQ ID No.33和34的优化CDR。
同样地，对于有两种人源化形式的轻链的三个CDR（分别SEQ ID No.74、75和76），其对应着VL1、VL2和VL3（分别SEQ ID No.35、36和37）以及对应着VL2.1、VL2.2和VL2.3（分别SEQ ID No.60、61和62）。
下表4概述了原始CDR，即鼠非优化的序列。
表4
术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换地使用，指修饰或未修饰的核苷酸的精确序列，其定义了核酸的一个片段或一个区域，包含或不包含非天然核苷酸，并且是双链DNA、单链DNA、或所述DNA的转录产物。
此处还应包括：本发明不涉及天然染色体环境中的，即天然状态的核苷酸序列。本发明的序列是已分离和/或纯化的，即它们是直接或间接取样的，例如通过拷贝，其环境至少已部分改变的。本文还应提及通过例如宿主细胞的重组遗传学获得的，或通过化学合成获得的分离的核酸。
“显示出在最佳比对后与优选序列具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%的百分比同一性的核序列”指，相对于参考核序列，显示出某些修饰（比如特别是删除、截短、延伸、嵌合融合和/或置换，特别是准时的（punctual））的核序列。优选地，这些是编码与参考序列相同的氨基酸序列的序列，这与遗传密码子的简并相关，或是可能与参考序列特异性杂交的互补性序列（优选在高度严谨条件下杂交），特别是下列定义的那些序列。
在高度严谨条件下杂交是指以能使两条互补性DNA片段之间保持杂交的方式选择涉及温度和离子强度的条件。基于纯粹解释的基础上，为了定义如上所述多核苷酸片段的目的，杂交步骤的高度严谨条件有利地为如下。
DNA-DNA或DNA-RNA杂交以两个步骤进行：（1）在42℃，在包含5×SSC（1×SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠溶液）、50%甲酰胺、7%十二烷基磺酸钠（SDS）、10×Denhardt’s、5%硫酸右旋糖苷和1%鲑精DNA的磷酸盐缓冲液中预杂交3小时；（2）初步杂交20小时，温度取决于探针长度（即：对于长度＞100个核苷酸的探针是42℃），接着是在20℃下在2×SSC+2%SDS中洗涤两次，每次20分钟，在20℃下在0.1×SSC+0.1%SDS中洗涤一次20分钟。对于长度＞100个核苷酸的探针，最后一次洗涤是在60℃下，在0.1×SSC+0.1%SDS中进行30分钟。如上所述对于确定尺寸的多核苷酸的高度严格性杂交条件可由本领域技术人员根据Sambrook等人（Molecular cloning：a laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory；第3版，2001）描述的方法对较长或较短的寡核苷酸进行适应性调整。
本发明还涉及包含本发明所述的核酸的载体。
本发明特别地靶向包含这样的核苷酸序列的克隆和/或表达载体。
本发明的载体优选地包含能够在给定宿主细胞内表达和/或分泌核苷酸序列的要素。因此，载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号，以及合适的转录调控区。它必须能以稳定方式在宿主细胞内保持，并且可以任选地具有指定翻译蛋白分泌的特异性信号。这几种要素可由本领域技术人员根据所用宿主细胞选择和优化。为此目的，核苷酸序列可插入在所选宿主体内自我复制的载体或是所选宿主的整合性载体。
这样的载体是通过本领域技术人员一般使用的方法制备的，而且得到的克隆可以通过标准方法（比如脂转染法、电穿孔、热休克或化学方法）引入合适的宿主体内。
所述载体是，例如，质粒或病毒来源的载体。其用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。
本发明还包含被本发明中描述的载体转化的宿主细胞或包含本发明中描述的载体的宿主细胞。
宿主细胞可以选自原核或真核系统，比如细菌细胞，例如，以及酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。也可以使用昆虫或植物细胞。
本发明还涉及具有根据本发明的转化细胞的动物，不包括人。
本发明的另一方面涉及用于制备根据本发明的抗体或其功能片段之一的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤：
a）在培养基中和合适的培养条件下培养根据本发明的宿主细胞；和
b）从培养基中或从所述培养细胞中回收如此产生的所述抗体或其功能片段之
根据本发明的转化细胞用于制备根据本发明的重组多肽的方法中。用于制备根据本发明的重组形式多肽的方法的特征在于，所述方法使用载体和/或根据本发明的载体转化的细胞，该方法也包括在本发明中。优选地，在使上述多肽表达和回收所述重组肽的条件下培养根据本发明的载体转化的细胞。
如已经提及的，宿主细胞可以选自原核或真核系统。特别地，可能鉴定在这样的原核或真核系统中促进分泌的本发明的核苷酸序列。因此，带有这样的序列的根据本发明的载体可有利地用于制备待分泌的重组蛋白。实际上，这些目的重组蛋白的纯化可由于其存在于细胞培养物的上清液中而不是宿主细胞内的事实而变得容易。
本发明的多肽也可以通过化学合成制备。一种这样的制备方法也是本发明的目的。本领域技术人员已知化学合成的方法，比如固相技术（特别参见Steward等人，1984，Solid phase peptides synthesis，Pierce Chem.Company，Rockford，111，第2版）或部分固相技术（通过片段缩合或在溶液中常规合成）。通过化学合成获得的并能够含有相应非天然氨基酸的多肽也包括在本发明中。
可能通过本发明的方法获得的抗体或其衍生化合物或功能片段也包括在本发明中。
根据又一个方面，本发明涉及如上所述的抗体，其特征在于它额外地能够特异性结合人趋化因子家族受体和/或能够特异性抑制这种受体的信号转导。
根据新的实施方式，本发明涉及抗体或其衍生化合物或功能片段，其由是双特异性的抗体组成，所述双特异性的意义是其包含能够与参与肿瘤发展的任何受体相互作用的第二基序，所述受体比如例如VEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、HER2neu、HGF、cMET、FGF、四跨膜蛋白（tetraspanins）、整合素、CXCR4（不同于本发明的抗体，即靶向另外的表位）、CXCR7或CXCR2。
双特异性或双功能性抗体构成第二代单克隆抗体，其中两种不同可变区组合在同一分子中（Hollinger和Bohlen，1999，Cancer and metastasis，rev.18：411-419）。与其募集新的效应子功能或靶向肿瘤细胞表面上的几种分子有关，其在诊断性和治疗性领域的应用已得到证实；这样的抗体可通过化学方法（Glennie MJ等人，1987,J.Immunol.139,2367–2375；Repp R等人，1995,J.Hemat.,377-382）或体细胞方法（Staerz U.D.和Bevan M.J.,1986,PNAS 83,1453-1457；Suresh M.R.等人，1986,Method Enzymol.,121:210-228）获得，也可优选通过遗传工程技术获得，遗传工程技术使促进异源二聚体成为可能并因此促进目标抗体的纯化（Merchand等人，1998,Nature Biotech.,16:677-681）。
这些双特异性抗体可以构建为完整IgG、双特异性Fab’2、Fab’PEG、双特异抗体或双特异性scFv，也可构建为四价的双特异性抗体，其中对于每个靶抗原存在两个结合位点（Park等人，2000，MoL.Immunol，37（18）：1123-30）或如上所述的其片段。
除了考虑到双特异性抗体的生产和给药比两个特异性抗体的生产更便宜的特定的经济优势外，使用这种双特异性抗体还具有降低治疗毒性的优势。实际上，使用双特异性抗体有可能降低循环抗体的总量和随之产生的可能的毒性。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述双特异性抗体是二价抗体或四价抗体。
最后，本发明涉及如上所述的抗体或其衍生化合物或功能片段，用作药物。
本发明还涉及包含由本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段之一组成的化合物作为活性成分的药物组合物。优选地，所述抗体中补充了赋形剂和/或可药用载体。
本发明还涉及组合物，特征在于其另外包括作为用于同时、分开或延长方式使用的联合产品的不同于抗CXCR4抗体的抗肿瘤抗体。
根据又一个实施方式，本发明还涉及包括至少一个第二抗肿瘤化合物的如上所述的药物组合物，所述第二抗肿瘤化合物选自能够特异性抑制受体（比如IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET、VEGFR或VEGF）的酪氨酸激酶活性的化合物或本领域技术人员已知的任何其它抗肿瘤化合物。
在本发明的第二个优选的方面，所述第二化合物可以选自抗EGFR、抗IGF-IR、抗HER2/neu、抗cMET、VEGFR、VEGF等分离的抗体，或其功能片段和衍生化合物，上述分离的抗体或其功能片段和衍生化合物能够抑制所述受体促进的转移性扩散的增殖和/或抗凋亡和/或血管生成和/或诱导活性。
还可以提及抗CD20抗体，比如利妥昔单抗、替伊莫单抗（ibritumomab）或托西莫单抗；抗CD33抗体，比如吉姆单抗或林妥珠单抗；抗CD22抗体，比如依帕珠单抗；抗CD52抗体，比如阿仑单抗；抗EpCAM抗体，比如依决洛单抗、Ch 17-1A或IGN-101；抗CTP21或16抗体，比如Xactin；抗DNA-Ag抗体，比如131I-Cotara TNT-1；抗MUC1抗体，比如pemtumomab或R1150；抗MUC18抗体，比如ABX-MA1；抗GD3抗体，比如米妥莫单抗；抗ECA抗体，比如CeaVac或拉贝珠单抗（labetuzumab）；抗CA125抗体，比如OvaRex；抗HLA-DR抗体，比如apolizumab（无对应译文）；抗CTLA4抗体，比如MDX-010；抗PSMA抗体，比如MDX-070、111In和90Y-J591、177Lu J591、J591-DM1；抗Lewis Y抗体，比如IGN311；抗血管发生抗体，比如AS1405和90YmuBC1；抗Trail-R1抗体，比如TRAIL R1mAb或TRAIL R2mAb。
本发明补充性的另一个实施方式由如上所述的组合物组成，其另外还包含作为联合或缀合产品用于同时、分开或延长使用的细胞毒性/细胞增殖抑制剂。
“同时使用”指给予包含在单一剂型中的组合物中的两种化合物。
“分开使用”指同时给予包含在不同剂型中的组合物中的两种化合物。
“延长使用”指连续给予包含在不同剂型中的组合物中的两种化合物。
通常，根据本发明的组合物显著地提高了癌症治疗功效。换句话讲，通过给予细胞毒性剂而以出人意料的方式增强了本发明的抗体的治疗效果。本发明的组合物产生的另一主要后续优势与可以使用较低有效剂量的活性成分有关，其因此可能避免或降低副作用出现的风险，特别是细胞毒性剂的效应。而且，该组合物可能更快地达到预期的治疗效果。
“治疗性抗癌剂”或“细胞毒性剂”指当将其给予患者时，治疗或预防患者癌症发展的物质。这样的试剂的非限制性实例包括“烷化”剂、抗代谢剂、抗肿瘤性抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂和免疫调节剂。.
例如，在VIDAL中在肿瘤学和血液学相关化合物的那一页，在“细胞毒的”题目下引用了这样的试剂；将参考该文献引用的细胞毒化合物引入本文作为优选的细胞毒性剂。
“烷化剂”指可在细胞内与任何分子优选核酸（例如DNA）共价结合或能使这些分子烷化的任何物质。这样的烷化剂的实例包括氮芥类，比如氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、盐酸氮芥、哌泊溴烷、泼尼莫司汀、磷酸二钠或雌莫司汀；氧氮磷环类（oxazaphosphorine），比如环磷酰胺、六甲密胺、曲磷胺、磺基磷酰胺（sulfofosfamide）或异环磷酰胺；氮丙啶类或乙撑亚胺类，比如如塞替派、三亚乙基二胺（triethyleneamine）或altetramine（无对应中译文）；亚硝基脲类，比如卡莫司汀、链脲菌素（streptozocine）、福莫司汀或洛莫司汀；烷基磺酸盐类，比如白消安、曲奥舒凡或英丙舒凡；三氮烯类，比如达卡巴嗪；或铂复合物，比如顺铂、奥克赛铂（oxaliplatine）或碳铂。
“抗代谢剂”指通过干扰某些活性（通常是DNA合成）阻断生长和/或细胞代谢的物质。抗代谢剂的实例包括甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、胞嘧啶阿糖胞苷、6-巯基嘌呤（6-MP）、6-巯基鸟嘌呤（6-TG）、氯脱氧腺苷、5-氮胞苷、吉西他滨、克拉屈滨、脱氧柯福霉素和喷司他丁。
“抗肿瘤性抗生素”指可预防或抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成的化合物。这样的抗肿瘤性抗生素的实例包括多柔比星、柔红霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌、更生霉素、光神霉素、普卡霉素、丝裂霉素C、博来霉素和丙卡巴肼。
“有丝分裂抑制剂”阻止细胞周期和有丝分裂的正常进行。通常，微管抑制剂或“紫杉烷”比如紫杉醇和紫杉萜能够抑制有丝分裂。长春花属生物碱类比如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨也能够抑制有丝分裂。
“染色质抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”是抑制形成染色质的蛋白比如拓扑异构酶I和II的正常功能的物质。这样的抑制剂的实例包括，对于拓扑异构酶I有喜树碱及其衍生物，比如伊立替康或托泊替康；对于拓扑异构酶II，有依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。
“抗血管生成剂”是抑制血管生长的任何药物、化合物、物质或试剂。抗血管生成剂的实例包括，但不限于雷佐生、马立马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、卤夫酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙利度胺、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鲨胺、内皮抑素（endostatine）、SU5416、SU6668、干扰素α、EMD121974、白介素12、IM862、血管他丁和vitaxin（无对应中译文）。
“抗雌激素剂”或“雌激素拮抗剂”指降低、拮抗或抑制雌激素作用的任何物质。这样的试剂的实例是他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene（无对应中译文）、阿那曲唑、来曲唑（letrozole）和依西美坦。
“抗雄激素剂”或“雄激素拮抗剂”指降低、拮抗或抑制雄激素作用的任何物质。抗雄激素剂的实例包括氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、螺内酯、乙酸环丙孕酮、非那雄胺和甲氰咪胍。
免疫调节剂是刺激免疫系统的物质。免疫调节剂的实例包括干扰素，白细胞介素比如阿地白介素、OCT-43、地尼白介素-毒素连接物或白介素-2，肿瘤坏死因子比如他索纳明（tasonermine）或其它类型的免疫调节剂，比如蘑菇多糖、西佐喃、罗喹美克、匹多莫德、培加酶、胸腺五肽（thymopentine）、poly I：C或与5-氟尿嘧啶联合的左旋咪唑。
对于进一步的细节，本领域技术人员可参照the French Association ofTherapeutic Chemistry Teachers出版的名为“Therapeutic Chemistry，vol.6，Antitumordrugs and perspectives in the treatment of cancer，TEC and DOC edition，2003（法语）”的手册。
在一个特别优选的实施方式中，作为联合产物的本发明的所述组合物的特征在于所述细胞毒性剂以化学方式结合至所述抗体上用于同时使用。
在一个特别优选的实施方式中，所述组合物的特征在于所述细胞毒性/细胞增殖抑制剂选自纺锤体抑制剂或稳定剂，优选长春瑞滨和/或长春氟宁和/或长春新碱。
为了促进所述细胞毒性剂与根据本发明的抗体之间的结合，可在待结合的两种化合物之间引入间隔分子，比如聚（亚烷基）二醇聚乙二醇或氨基酸；或者，在另一个实施方式中，可以使用其中已引入能够与所述抗体反应的功能的所述细胞毒性剂的活性衍生物。这些结合技术是本领域技术人员熟知的，在本说明书中将不再更详细地讨论。
其它EGFR抑制剂包括，但不限于单克隆抗体C225和抗EGFR 22Mab（ImClone Systems Incorporated）、ABX-EGF（Abgenix/Cell Genesys）、EMD-7200（Merck KgaA）或化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839（AstraZeneca）、PKI-166（Novartis）、PKI-166/CGP-75166（Novartis）、PTK 787（Novartis）、CP 701（Cephalon）、来氟米特（flunomide,Pharmacia/Sugen）、CI–1033（Warner LambertParke Davis）、CI-1033/PD 183、805（Warner Lambert Parke Davis）、CL-387、785（Wyeth-Ayerst）、BBR-1611（Boehringer Mannheim GMBH/Roche）、Naamidine A（Bristol-board Myers Squibb）、RC-3940-II（Pharmacia）、BIBX-1382（BoehringerIngelheim）、OLX-103（Merck & Co）、VRCTC-310（Ventech Research）,EGF融合毒素（Seragen Inc.）、DAB-389（Seragen/Lilgand）、ZM-252808（Imperial CancerResearch Fund）、RG-50864（INSERM）、LFM-A12（Parker Hughes Center Cancer）、WHI-P97（Parker Hughes Center Cancer）、GW-282974（Glaxo）、KT-8391（KyowaHakko）或“EGFR疫苗”（York Medical/Centro of Immunologia Molecular）。
本发明的另一个方面涉及特征在于至少一种所述抗体或其衍生化合物或功能片段与细胞毒素和/或放射性同位素联合或结合的组合物。
优选地，所述毒素或所述放射性同位素能够阻止肿瘤细胞的生长或增殖，特别是能够完全灭活所述肿瘤细胞。
还优选地，所述毒素是肠道细菌毒素，特别是假单胞菌外毒素A。
优选与治疗性抗体联合使用的放射性同位素是放射γ射线的放射性同位素，优选碘131、钇90、金199、钯100、铜67、铋217和锑211。在治疗上也可以使用放射α和β射线的放射性同位素。
“与至少一种本发明的抗体或其功能片段联合的毒素或放射性同位素”指使所述毒素或所述放射性同位素可能与至少一种抗体结合，特别是通过两个化合物之间的共价结合（引入或不引入结合分子）的任何方法。
使全部或部分缀合物元素形成化学键（共价键）、静电键、或非共价键的试剂的实例包括，特别是苯醌、碳化二亚胺，更特别地是EDC（1-乙基-3-[3-二甲基-氨基丙基]-碳二亚胺-盐酸盐）、二马来酰亚胺、二硫代双硝基苯甲基（DTNB）酸、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）、具有一个或多个基团的桥键试剂、具有一个或多个侧苯基（phenylaside）基团（与紫外线（UV）反应）的桥键试剂，最优选N-[-4（叠氮水杨酰氨基）丁基]-3’-（2’-二硫代吡啶基）-丙酰胺（APDP）、N-琥珀酰亚胺基3（2-二硫代吡啶基）丙酸酯（SPDP）和6-肼基-烟酰胺（HYNIC）。
特别是对于放射性同位素，另一种结合形式可以由双功能离子螯合剂组成。
这样的螯合剂的实例包括来源于EDTA（乙二胺四乙酸）或DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）的螯合剂，其被开发用于使金属，特别是放射性金属与免疫球蛋白结合。因此，DTPA及其衍生物可以在碳链上被各种基团置换以增加配基-金属复合体的稳定性和刚性（Krejcarek等人，1977；Brechbiel等人，1991；Gansow，1991；美国专利4,831,175）。
例如，DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）及其衍生物，以其游离形式或以其与金属离子复合的形式，长时间广泛应用于药物和生物学，显示出与金属离子形成稳定螯合剂的显著特征，该稳定螯合剂可以与治疗目的或诊断目的的蛋白比如抗体偶联，以开发用于癌症治疗的放射免疫缀合物（Meases等人，1984；Gansow等人，1990）。
还优选地，形成所述缀合物的本发明的所述至少一种抗体选自其功能片段，特别是丧失其Fc成分的片段，如scFv片段。
本发明还包含所述组合物在制备旨在用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
本发明还涉及抗体或其衍生化合物或功能片段（优选人源化的）和/或根据本发明的组合物在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。通常，本发明涉及抗体或其衍生化合物或功能片段（优选人源化的）和/或组合物在制备用于癌症预防或治疗的药物中的用途。
可以预防和/或治疗的优选的癌症包括前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌或任何其它癌症。
本发明还涉及如上所述的抗体、或其衍生化合物或功能片段和/或其组合物在制备用于调节细胞中CXCR4活性的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及所述的抗体在与CXCR4表达水平相关的疾病的诊断方法，优选体外诊断方法中的用途。优选地，在所述诊断方法中的所述CXCR4蛋白的相关疾病是癌症。
因此，本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段可以用于生物样本中的CXCR4蛋白的体外检测和/或定量方法中，特别是用于与该蛋白异常表达相关的疾病比如癌症的诊断中，其中所述方法包括下述步骤：
a）使生物样本与根据本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段接触；
b）证实可能形成的抗原-抗体复合体。
因此，本发明还包括用于实施所述方法的试剂盒或配件，其包括下述元素：
a）本发明的多克隆或单克隆抗体；
b）任选地，构成有益于免疫反应的介质的试剂；
c）任选地，显示免疫反应产生的抗原-抗体复合体的试剂。
以通常的方式，本发明涉及抗体或其衍生化合物或功能片段用于体外诊断CXCR4表达相关致癌疾病或用于体外确定发展成CXCR4表达相关致癌疾病的预后的用途，所述抗体或其衍生化合物或功能片段包括包含以下三种CDR的重链：分别为序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含以下三种CDR的轻链：分别为序列SEQ ID No.7、8、9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
关于这方面，本发明尤其涉及根据本发明的人源化抗体重链和/或人源化抗体轻链和/或人源化抗体或其衍生化合物或功能片段用于体外诊断CXCR4表达相关致癌疾病或用于体外确定发展成CXCR4表达相关致癌疾病的预后的用途。
在另一方面，本发明涉及体外检测受试者中表达CXCR4的肿瘤的存在和/或位置的方法，其中所述方法包括步骤：（a）用抗体或其衍生化合物或功能片段接触来自受试者的样本，所述抗体或其衍生化合物或功能片段包括包含以下三种CDR的重链：分别为序列SEQ IDNo.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含以下三种CDR的轻链：分别为序列SEQ ID No.7、8、9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；以及（b）检测所述抗体与样本的结合。
特别地，本发明涉及体外检测受试者中表达CXCR4的肿瘤的存在和/或位置的方法，其中所述方法包括步骤：
（a）用根据本发明的人源化抗体重链和/或人源化抗体轻链和/或人源化抗体或其衍生化合物或功能片段接触来自受试者的样本；以及
（b）检测所述抗体与样本的结合。
作为非限定性实例，这种检测可以通过FACS或本领域技术人员已知的任何其它技术进行。
另一方面，本发明涉及在来自受试者的表达CXCR4的肿瘤中体外确定CXCR4表达水平的方法，其中所述方法包括步骤：（a’）用抗体或其衍生化合物或功能片段接触来自受试者的样本，所述抗体或其衍生化合物或功能片段包括包含以下三种CDR的重链：分别为序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含以下三种CDR的轻链：分别为序列SEQ ID No.7、8、9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；以及（b’）在所述样本中定量结合CXCR4的抗体的水平。
特别地，本发明涉及在来自受试者的表达CXCR4的肿瘤中体外确定CXCR4表达水平的方法，其中所述方法包括步骤：
（a’）用根据本发明的人源化抗体重链和/或人源化抗体轻链和/或人源化抗体或其衍生化合物或功能片段接触来自受试者的样本；以及
（b’）在所述样本中定量结合CXCR4的抗体的水平。
在一个优选实施方式中，通过免疫组化（IHC）测量CXCR4表达水平。
另一方面，本发明涉及体外诊断受试者中表达CXCR4的肿瘤或体外确定发展成表达CXCR4的肿瘤的预后的方法，其中所述方法包括步骤（i）根据本发明，尤其是涉及的本发明人源化抗体，确定CXCR4表达水平，以及（ii）将步骤（i）的表达水平和来自正常组织的CXCR4参考表达水平进行比较。
另一方面，本发明涉及体外确定受试者肿瘤的CXCR4状态的方法，其中所述方法包括步骤（1）根据本发明，尤其是涉及的本发明人源化抗体，确定CXCR4表达水平，（2）给所述肿瘤的CXCR4表达水平评分，以及（3）将所述评分与获自对照样本的评分进行比较。
另一方面，本发明涉及确定致癌疾病是否易感于使用抗CXCR4抗体、或其片段或衍生物的治疗，其中所述方法包括步骤：
（a）根据本发明体外确定受试者肿瘤的CXCR4状态，以及
（b）如果状态是CXCR4（+），则确定致癌疾病易感于使用抗CXCR4抗体、或其片段或衍生物的治疗。
另一方面，本发明涉及筛选和/或鉴定作为CXCR4拮抗剂抗肿瘤剂的分子的方法，包括步骤：
a）选择表达CXCR4的细胞，
b）用抗体、或其衍生化合物或功能片段孵育所述细胞，所述抗体、或其衍生化合物或功能片段包括包含以下三种CDR的重链：分别为序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含以下三种CDR的轻链：分别为序列SEQ ID No.7、8、9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，以及
c）评价受试分子对抗体、或其功能片段或衍生物之一与CXCR4之间的结合的潜在抑制，以及
d）选择能够具有所述抑制的分子。
在这方面，本发明尤其涉及用于筛选和/或鉴定作为CXCR4拮抗剂抗肿瘤剂的分子的方法，包括步骤：
a）选择表达CXCR4的细胞，
b）用根据本发明的人源化抗体重链和/或人源化抗体轻链和/或人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段孵育所述细胞，以及
c）评价受试分子对抗体、或其功能片段或衍生物之一与CXCR4之间的结合的潜在抑制，以及
d）选择能够具有所述抑制的分子。
另一方面，本发明涉及至少包括抗体或其衍生化合物或功能片段的试剂盒，其包括包含以下三种CDR的重链：分别为序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含以下三种CDR的轻链：分别为序列SEQ ID No.7、8、9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述抗体优选是标记的。
在这方面，本发明尤其涉及至少包括根据本发明的人源化抗体重链和/或人源化抗体轻链和/或人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，所述抗体优选是标记的。
另一方面，本发明涉及用于体外确定肿瘤CXCR4状态的根据本发明的试剂盒，所述试剂盒还包括：
i）用于检测所述抗CXCR4抗体和CXCR4之间的结合程度的试剂；以及
ii）用于给CXCR4表达水平评分的阳性和阴性对照样本。
有利地，可以将抗体或其功能片段固定在支持物上，特别是固定在蛋白芯片上。一种这样的蛋白芯片是本发明的目标。
有利地，可以将蛋白芯片用于检测和/或定量生物样本中的CXCR4蛋白所需的试剂盒或配件中。
必须指出，术语“生物样本”在本文中涉及取自活生物体的样本（特别是血液、组织、器官或其它取自哺乳动物特别是人的样本）或任何可能包含一种这样的CXCR4蛋白的样本（比如，细胞样本，如果需要的话，是转化的细胞样本）。
所述抗体或其功能片段可以是免疫缀合物的形式或标记抗体的形式，以获得可检测和/或可定量的信号。
本发明的标记抗体或其功能或片段包括，例如抗体缀合物（免疫缀合物），其可以例如与酶结合，这些酶比如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱脂酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6磷酸脱氢酶，或者可以与分子结合，比如生物素、地高辛或5-溴代脱氧尿嘧啶核苷。荧光标记也可以结合本发明的抗体或其功能片段，包括特别是荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明（rhodamine）及其衍生物、绿色荧光蛋白（GFP）、丹酰、伞形酮等。在这样的缀合物中，本发明的抗体或其功能片段也可以通过本领域技术人员已知的方法制备。它们可以与酶或荧光标记直接结合；通过间隔子基团或连接基团比如多醛、戊二醛、乙二胺四乙酸（EDTA）或二亚乙基三胺五乙酸（DPTA）结合；或者在结合剂比如上述提及的用于治疗性缀合物的结合剂的存在下结合。带有荧光标记的缀合物可以与异硫氰酸酯发生反应来制备。
其它缀合物还可以包括化学发光标记，比如鲁米诺和二氧杂环丁烷（dioxetane），生物发光标记比如荧光素酶和荧光素，或放射性标记，比如碘123、碘125、碘126、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞107、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、氟18、钇199和碘131。可以使用放射性同位素与抗体结合的本领域技术人员已知的现有方法用于作为诊断性的放射性同位素，既可以是直接结合也可以是通过螯合剂比如上述提及的EDTA或DTPA结合。因此，应该提到，通过氯胺T技术用[I125]钠标记（Hunter W.M.和Greenwood F.C.（1962）Nature194:495）；用Crockford等人描述的锝99m标记（美国专利4,424,200）或者通过Hnatowich描述的DTPA结合（美国专利4,479,930）。
还公开了本发明的抗体作为标记物的用途。方法可用于检测或诊断各种和CXCR4表达相关的过度增殖性致癌疾病，例如但不限于乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、食道癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、结直肠癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肾癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、横纹肌肉瘤或与CXCR4表达相关的任何其它癌症。正如本领域普通技术人员将认识到的，与特定疾病相关的抗体表达水平将取决于预先存在的疾病状态的性质和/或严重性而不同。
本发明的抗体以本领域技术人员已知常规方式的施用（如局部的、非肠胃的、肌肉内等）将提供极为有用的在样本中检测发育不良的细胞以及允许临床人员监测经受与CXCR4表达相关或由其介导的过度增殖性疾病治疗的患者的治疗方案的方法。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于与CXCR4表达相关的致癌疾病体内成像的药物组合物，包括以上单克隆抗体或其片段，单克隆抗体或其片段是被标记的并且体内结合CXCR4；以及包括可药用载体。
本发明的抗体，或其功能片段或衍生物，将用于各种医学或研究目的，包括各种与CXCR4表达相关的病理的检测、诊断和分期。
分期确定具有潜在预后价值并提供用于设计最佳疗法的准则（Simpson等人，J.Clin.Oncology 18:2059(2000)）。通常，乳癌的病理分期例如有利于临床分期，因为前者给出更精确的预后。然而，如果临床分期和病理分期一样精确，它将是优选的，因为它不依赖侵入性步骤来获得用于病理评价的组织。
当与合适的标记或其它适当的可检测生物分子或化学品使用时，本发明的抗体尤其用于体外和体内诊断和预后应用。
用于免疫分析的标记通常是本领域技术人员已知的，并且包括酶、放射性同位素和发荧光的、发光的和发色的物质，其包括有色颗粒比如胶体金或乳胶珠。合适的免疫分析包括酶联免疫吸附测试（ELISA）。各种类型的标记以及向本发明抗体缀合标记的方法是本领域技术人员已知的，比如下面所述的那些。
如此处所用，术语“CXCR4表达相关的致癌疾病”旨在包括这样的疾病和其它疾病，其中在患有疾病的受试者中高水平或异常低水平的CXCR4（异常）的存在已被显示是或者疑似负责疾病的病理生理或促进疾病恶化的一个因素。或者，这种疾病可被，例如患有疾病的受试者的受感染细胞或组织中的细胞表面上CXCR4水平的增加所证明。例如使用本发明的抗体515H7或hz515H7，CXCR4水平的增加可被检测到。并且，其涉及表现出相对自主性生长的细胞，从而它们表现出异常生长表型，其特征在于细胞增殖控制的显著丧失。或者，细胞可表达正常水平的CXCR4，但特点是异常增殖。
在某些实施方式中，如所涉及的CXCR4“增加的表达”指相对于对照，蛋白质或基因的表达水平表现出统计学上显著的表达增加（如由RNA表达或蛋白质的表达所测量的）。
更特别地，考虑根据本发明所述的抗体、或其功能性片段或衍生物用于体外诊断CXCR4表达相关致癌疾病或用于体外确定发展成CXCR4表达相关致癌疾病的预后的用途，例如CXCR4表达相关的癌症。
根据本发明的另一个广泛的方面，涉及在受试者中诊断病理过度增殖性致癌疾病或者对CXCR4表达相关的病理状态的易感性的方法，包括确定样本中所述具有CXCR4细胞的存在或不存在，以及基于所述具有CXCR4细胞的存在或不存在，诊断病理状态或对病理状态的易感性。本发明的抗体的诊断用途包括原发性肿瘤、癌症转移、癌干细胞。抗体可以免疫缀合物或者标记抗体的形式存在从而获得可检测和/或可量化的信号。
更特别地，根据本发明的优选主题是在受试者中体外检测表达CXCR4的肿瘤的存在和/或位置的方法，其中所述方法包括步骤（a）用根据本发明的抗体或其功能片段或衍生物接触来自受试者的样本，和（b）检测所述抗体与样本的结合。主题的另一个方面是临床试验期间CXCR4表达作为对CXCR4靶向疗法的反应的追踪，更具体地当CXCR4受体的下调和/或降解是测试化合物的作用机制的组成之一时。
正如对于本领域技术人员将是显而易见的，可通过各种分析揭示本发明的抗体结合的检测。尽管用于进行分析的任何手段与本发明是兼容的，可以提到的是，作为实例，FACS、ELISA或IHC。
如此处所用，术语“样本”旨在表示包括或可能包括瘤形成的细胞的任何生物流体、细胞、组织、器官或其部分，比如来自含有或疑似含有瘤形成的细胞的结肠、胃、直肠、乳房、卵巢、前列腺、肾、肺、血液、脑、皮肤、甲状腺、淋巴结、骨髓或其它器官或组织的细胞。术语包括在个体中存在的样本以及获自或源自个体的样本。例如，样本可以是通过活检获得的标本的组织切片，或置于或适应组织培养的细胞。样本还可以是亚细胞馏分或提取物、或粗（crude）的或基本上纯的核酸分子或蛋白质制剂。
临床样本旨在涵盖获自受试者并用于本发明过程的多种样本类型，比如例如，确定或检测CXCR4表达水平的诊断或监测测试。定义包括获自手术切除的实体组织样本、病理标本、归档样本、或活检标本、组织培养或由此衍生的细胞及其后代、以及从任何这些来源制备的切片或涂片。非限制性实例是获自结肠、胃、直肠、乳房、卵巢、前列腺、肾、肺、血液、脑、皮肤、甲状腺、淋巴结、骨髓等的样本。定义还包括生物来源的流体样本以及可涉及悬浮在其中的细胞或细胞碎片、或涉及液体基质及其溶质。
根据本发明的另一方面，涉及在来自受试者的表达CXCR4的肿瘤中体外确定CXCR4表达水平的方法，其中所述方法包括步骤（a’）用根据本发明的抗体、或其功能片段或衍生物接触来自受试者的样本，以及（b’）在所述样本中定量结合CXCR4的抗体水平。
可以以多种方式定量结合CXCR4的抗体水平，这对本领域技术人员将是显而易见的，比如通过各种分析。尽管用于进行分析的任何手段和本发明是兼容的，优选方法是通过免疫荧光、通过免疫组织化学或放射免疫法（RIA）技术或等同技术进行根据ELISA技术的免疫酶方法，。
优选，生物样本通过生物流体，比如人类来源的血清、全血、细胞、组织样本或活检形成的。所述样本，例如可包括，活检组织，其可以方便地用来分析和CXCR4表达有关的病理性过度增殖性致癌疾病的存在。
一旦确定了CXCR4存在于测试样本中的量，其结果可以和对照样本的值比较，所述对照样本的值是以和测试样本相似的方式获得的，但是其来自未患有或不存在和CXCR4表达有关的过度增殖性致癌疾病的个体。如果CXCR4水平在测试样本中显著提高，可得出这样的结论，其所来自的受试者患有或将发展为所述疾病的可能性增加。
更具体地，本发明涉及体外诊断受试者中表达CXCR4的肿瘤或体外确定表达CXCR4的肿瘤发展预后的方法，其中所述方法包括步骤（i）如上述确定CXCR4表达水平，以及（ii）比较步骤（i）的表达水平和来自正常组织或非表达CXCR4组织的CXCR4参考表达水平。
如本申请中所用“诊断”疾病意图包括，例如，诊断或检测和CXCR4表达有关或介导的病理性过度增殖性致癌疾病的存在、监测疾病的进展、以及鉴定或检测预示和CXCR4表达有关的疾病的细胞或样本。
如本申请中所用“预后”表示疾病复发的可能性或预测疾病可能的发展或发生。例如，如果来自受试者的样本用本发明抗体染色呈阳性，那么对那个受试者的“预后”优于CXCR4染色呈阴性的样本。以合适的等级，针对CXCR4表达水平给样本评分，如将在此后详细描述。
然而，本发明的另一方面还涉及，针对将诱导CXCR4降解作为其作用机制之一的治疗性化合物，监测CXCR4表达。在该情况下，CXCR4表达于细胞膜上之后将成为重要的工具来评价临床试验和“个性化”治疗期间的治疗效果。
有利地，将CXCR4表达水平相对于对照细胞或样本中的水平（也作“参考水平”或“参考表达水平”）进行比较或测量。“参考水平”、“参考表达水平”、“对照水平”和“对照”在本说明书中是可互换的。广义上讲，“对照水平”表示在相比较的对照细胞中测量的独立的基线水平，其通常是没有疾病或癌症的。其可能来自相同的个体或来自另一个个体，所述另一个个体是正常的或不存在和获得患病或测试样本的个体相同的疾病。在本发明的内容中，术语“参考水平”涉及CXCR4表达的“对照水平”，其用于评价患者含癌细胞样本中CXCR4表达的测试水平。例如，当CXCR4在患者生物样本中的水平高于CXCR4参考水平时，所述细胞将被认为具有CXCR4的高水平表达、或过度表达。可以通过很多方法确定参考水平。表达水平可因此确定具有CXCR4的细胞或作为替代独立于表达CXCR4的细胞的数目的CXCR4表达水平。因此，可以通过CXCR4参考比例排除各患者的参考水平，其中可以通过此处所述的任何确定参考水平的方法确定所述参考比例。
例如，对照可以是预定的值，其可以采取各种形式。其可以是单个的截止值（cut-off值），比如中位数或均值。所述“参考水平”可以是单个数字，均等地适用于每个个体患者，或参考水平可以根据具体的患者亚群而不同。因此，例如，对于相同的癌症，年长的男性和年轻的男性相比，可能具有不同的参考水平，以及对于相同的癌症，女性和男性相比，可能具有不同的参考水平。或者，所述“参考水平”可以通过测量与待测试瘤形成的细胞的组织相同组织的非致癌癌症细胞中的CXCR4表达水平来确定。而且，所述“参考水平”可能是相同患者的瘤形成的细胞中CXCR4水平相对于非肿瘤细胞中的CXCR4水平的CXCR4的特定比例。所述“参考水平”也可以是体外培养细胞的CXCR4水平，其可以经操作来模拟肿瘤细胞、或可以以任何其它方式操作产生准确确定参考水平的表达水平。另一方面，可以基于可比较的组建立“参考水平”，比如在不具有升高的CXCR4水平的组和具有升高的CXCR4水平的组中。可比较的组的另一个实例是具有特定疾病、病症或症状的组以及没有疾病的组。可以安排预定值，例如，当测试群体等（或不等）分至各组，比如低-风险组、中等-风险组和高-危组、或分至四分之一或五分之一，最低的四分之一或五分之一是具有最低风险或最高量CXCR4的个体，而最高的四分之一或五分之一是具有最高风险或最低量CXCR4的个体。
也可以通过比较患有相同癌症的患者群体中CXCR4水平确定参考水平。可以通过，例如，柱状图分析来完成，其中整个患者群体以图形呈现，其中第一个轴代表CXCR4水平，第二个轴代表群体中其肿瘤细胞表达给定水平CXCR4的患者数目。可以通过鉴定具有相同或相似CXCR4水平的群体亚群来确定两个或更多个独立的患者组。然后可以基于最能区分这些独立的组的水平来确定参考水平。参考水平还可以代表两个或更多个标志物的水平，其中之一是CXCR4。可以通过，例如，各标志物水平值的比，表示两个或更多个标志物。
同样，明显健康的群体将具有和认为患有和CXCR4表达有关的疾病的群体不同的“正常”范围。因此，所选的预定值可考虑个体落入的类别。本领域普通技术人员可以只用常规实验选择合适的范围和类别。通过“升高的”、“增加的”表示高于所选的对照。通常，对照将基于合适的年龄段内明显健康的正常个体。
还应了解，根据本发明的对照可能是，除了预定值外，和实验材料平行检测的材料样本。实例包括同时从相同受试者获得的组织或细胞，例如，单个活检标本的部分、或来自受试者单细胞样本的部分。
在患有CXCR4介导的疾病的患者的临床诊断或监测中，和来自正常受试者或非-癌组织相应生物样本中的水平比较，检测到CXCR4表达细胞或CXCR4表达水平提高，通常表示患者具有或疑似显示有CXCR4介导的疾病。
根据上述，本发明提供用于预测对癌症的易感性的方法，其包括检测组织样本中的CXCR4表达水平，其存在表示对癌症易感，其中CXCR4表达的程度和易感性程度有关。因此，在一些具体的实施方案中，检验例如乳房组织、卵巢组织、前列腺组织、胰腺组织、皮肤组织、食道组织、肺组织、头颈组织、膀胱组织、结直肠组织、骨肉瘤组织、神经母细胞瘤组织、急性淋巴细胞性白血病细胞、急性髓细胞性白血病细胞、慢性髓细胞性白血病细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、多发性骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞、肾组织、胶质母细胞瘤组织、甲状腺组织、横纹肌肉瘤组织、或任何疑似表达CXCR4的细胞的其它组织中的CXCR4的表达，在样本中出现CXCR4提供了癌症易感性或组织特异性肿瘤的出现或存在的指示。
还提供了评价肿瘤侵袭性的方法。在一个实施方案中，用于在个体中一段时间内观察恶性肿瘤进展的方法，包括确定肿瘤样本中细胞表达的CXCR4的水平，比较这样确定的水平和在不同时间从相同个体取出的相同组织样本中表达的CXCR4水平，其中肿瘤样本中一段时间内CXCR4表达的程度提供癌症进展的信息。
在另一个实施方案中，本申请提供用于确定受试者合适的治疗方案的方法。
根据本发明存在或不存在或CXCR4水平变化可表示受试者倾向于患有和CXCR4相关的癌症复发或进行性、或持久性癌症。因此，通过测量表达CXCR4的细胞数目的增加或各种组织或细胞中CXCR4浓度变化，有可能确定目的在于改善和CXCR4有关的恶性肿瘤的特定治疗方案是否有效。
本发明的另一个目的是和CXCR4表达有关的致癌疾病体内成像的方法。例如，这种方法可用于出现致癌疾病症状的患者。如果患者具有，例如提高的CXCR4表达水平，那么所述患者可能患有癌性疾病。同时，所述方法可用于在患者中监测对治疗的进展和/或响应，所述患者之前诊断患有CXCR4介导的癌症。根据上述目的，本发明提供体内成像试剂，其包括根据本发明的抗体、或其功能片段或衍生物，优选标记的，尤其是放射标记的，及其在医学成像中的用途。因此，根据本发明的一般方法是通过如下发挥作用的：向患者施用成像有效量的成像试剂（比如上述的标记的单克隆抗体）和可药用载体，然后在其结合样本中存在的CXCR4之后检测该试剂。在某些实施方案中，所述方法是通过施用包括靶向部分和活性部分的成像有效量的成像试剂发挥作用的。以在哺乳动物比如人类中诊断用途的有效量施用成像试剂，然后检测成像试剂的定位和积累。可通过放射性核素成像、放射性闪烁摄影术、核磁共振成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、计算机轴断层扫描、X-射线或磁共振成像法、荧光检测和化学发光检测来检测成像试剂的定位和积累。
关于靶向抗肿瘤治疗的发展，采用免疫组织学技术的诊断给出，受体表达水平的原位信息，从而跟随该治疗所需的受体表达水平之后，能够选择对治疗易感的患者。
对于使用单克隆抗体的免疫疗法，对治疗的响应取决于受体靶向的表达水平，正如用曲妥珠单抗的治疗，其中，随着人化抗-Her2单克隆抗体曲妥珠单抗的出现，确定乳癌中Her2的过度表达现今具有主要的临床重要性。显示出Her2过度表达，是用曲妥珠单抗治疗的前提条件，因为其通过特异性靶向Her2过度表达的癌细胞来发挥作用。准确的Her2测试目的在于保证没有给非-过度表达的肿瘤患者施加昂贵的和潜在毒性的曲妥珠单抗治疗，以及保证每个可能受益于曲妥珠单抗的患者接受合适的治疗。
曲妥珠单抗的教导关注选择过度表达Her2的患者，其表明当采用使用单克隆抗体的治疗时确定受体表达水平的益处，以及同时相比较治疗性单克隆抗体，发展可用于患者选择的单克隆抗体的益处。
结果，本发明涉及体外确定受试者肿瘤CXCR4状态的方法，其中所述方法包括步骤（1）如上述确定CXCR4表达水平，（2）为所述肿瘤的CXCR4表达水平评分，以及（3）比较所述评分和对照样本获得的评分。
“CXCR4状态”在本发明含义内，涉及将肿瘤划分至CXCR4阳性（CXCR4(+)）或CXCR4阴性（CXCR4(-)）类别，其基于CXCR4基因的表达水平的确定，如通过任何方法所测量的，比如免疫组织化学（IHC）、原位荧光杂交（FISH）、比色原位杂交（CISH）、基因芯片或其它本领域技术人员公知的方法。
在一个优选实施方案中，当组织样本是福尔马林固定、Glyco-fixx固定的、石蜡包埋的和/或冰冻的，用于诊断的抗体应能够结合靶向受体。
更具体地，通过免疫组织化学（IHC）测量CXCR4表达水平。
作为实例，在从0到3+的抗体染色水平状态上，针对CXCR4表达水平给样本评分，其中，采用四个强度逐渐提高的半定量状态，0是阴性，以及1+-3+代表阳性染色。得分1+-3+可被记录为阳性，因为各阳性评分和零分（阴性）比较时，可能和显著降低的复发和致命性疾病的风险有关，但是阳性评分中提高的强度可能提供额外的风险降低。任何常规的危害分析方法可用于评价CXCR4预后值。代表性的分析方法包括Cox回归分析，这是用于，在已校对的情况下，存活或时间-对-事件数据建模的半参数方法（Hosmer和Lemeshow,1999;Cox,1972）。相对于其它存活分析，如寿命表或Kaplan-Meyer，Cox允许在模型中纳入预测变量（协变量）。用常规分析方法，如，Cox，可能够检验关于原发性肿瘤中CXCR4表达状态和时间-对-发生（疾病复发（无疾病存活时间、或时间对转移性疾病）或时间对因疾病死亡（整个存活时间））的相关性的假说。Cox回归分析也被视为Cox比例风险分析。这种方法是检验肿瘤标志物对患者存活时间预后值的标准方法。当用于多变量模型时，平行测试多种协变量的作用，从而可以确定具有独立预后值的各协变量，即最有用的标志物。术语肿瘤的阳性或阴性“CXCR4状态”（用作CXCR4(+)或CXCR4(-)）分别涉及0分或1+-3+分。
在诊断或监测乳癌期间可给样本“评分”。以其最简单的形式，通过免疫组织化学目测检验样本判断的评分可确信无疑地是阴性或阳性。更加定量的评分涉及判断两个参数，取样细胞的染色强度和染色细胞（“阳性”）的百分比。基于这两个参数，可以指定数值来反应阳性染色的提高水平。Allred等人（Allred,Harvey等人1998）已经描述了获得这种的一种途径，其中涉及在从0（阴性）至3+的状态上评分两个参数，并综合各参数的评分获得总分。状态中的结果具有可能的评分0、2、3、4、5、6、7或8（注意到在Allred状态中1分是不可能的）。一个多少更简单些的评分方法，以从0至3+的组合状态，整合了核染色强度以及显示核染色的细胞比例。各评分方法均可用于在细胞核中激活的Stat5的的强度和染色比例的评分。用于本说明书的术语肿瘤的阳性或阴性“CXCR4状态”分别涉及在简化等级上对应着评分0或1+-3+的CXCR4表达水平。
通常，根据本发明的测试或分析结果可以以任何各种格式体现。结果可以以定性形式体现。例如，测试报告可仅表示是否检测了特定的多肽，也许还表明检测限度。结果可以以半定量形式体现。例如，可以确定各种范围，以及范围可以指定为提供定量信息的特定程度的评分（如1+至3+）。这种评分可体现各种因素，如在其中检测到CXCR4的细胞数目、信号强度（其可表示CXCR4的表达水平或具有CXCR4的细胞）等。结果可以以定量形式体现，如，作为在其中检测到多肽（CXCR4）的细胞百分比、作为蛋白浓度等。如对于本领域普通技术人员是显而易见的，测试提供的输出类型将依据测试的技术限制以及和多肽检测有关的生物重要性而不同。例如，在某些多肽的情况下，纯定性输出（如在特定检测水平是否检测到多肽）提供重要的信息。在其它情况下，更加定量的输出（如待测试样本中多肽表达水平相对于正常水平的比例）是必要的。
在更优选实施方案中，CXCR4表达水平评分的状态从0至3+，其基于对反应产物强度和阳性细胞百分比的评价。为了更加清楚，随后表5总结了这些参数。只有侵袭性肿瘤的完整的周围膜反应性应当被考虑，并通常类似“鸡爪样”外观。根据目前的指南，样本被CXCR4 IHC评分为交界性肿瘤的（评分2+或以上）必须认为是CXCR4(+)的，并需要经历进一步评价。作为非限定性实例，如果对照不符合预期、伪影参与大部分样本以及样本具有正常乳腺导管（内对照）的强的膜阳性（这表明过度的抗原复原），应当拒绝IHC分析，并通过FISH或任何其它方法重复或检测IHC分析。
表5
Figure BDA00002425225000431
根据本发明的方法的一个更优选实施方案中，所述评分包括使用基于两个参数的适当的等级，其中所述参数为染色强度和阳性细胞百分比。
在一个优选实施方案中，本发明的方法涉及适当等级是0至3+的等级，其中没有肿瘤细胞膜反应性得分为0，在10％以上肿瘤细胞中强烈完整的反应性得分为3+。
更具体地，如上所述，所述适当等级是0至3的等级，其中肿瘤细胞没有膜反应性得分为0；在10％以上肿瘤细胞中微弱察觉的膜反应性得分为1+；在10％以上肿瘤细胞中从弱到中等完整的膜反应性得分为2+；以及在10％以上肿瘤细胞中强烈完整的反应性得分为3+。
在本发明的一个具体方面中，肿瘤是得分为2+的CXCR4(+)。
在本发明的一个具体方面中，肿瘤是得分为3+的CXCR4(+)。
在本发明的另一个具体方面中，肿瘤是得分为2+或3+的CXCR4(+)。
根据本发明，还描述了确定致癌疾病对用抗-CXCR4抗体、或其片段或衍生物的治疗是否敏感的方法，其中所述方法包括步骤（a）如上述，体外确定受试者的肿瘤CXCR4状态，以及（b）如果状态是CXCR4(+)，确定致癌疾病对用抗-CXCR4抗体、或其片段或衍生物的治疗敏感。
在本发明的另一方面中，考虑用于这种诊断或预后方法的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体。
以一种方便的方式，用于进行诊断分析的带有说明书的以预定量的试剂包装组合的组合套装，如试剂盒，也包括在本发明范围内。所述试剂盒包含用于体外检测和定量CXCR4的抗体，如在ELISA或Western免疫印迹中。本发明所述抗体可以在试剂盒中提供，用于体外检测和定量CXCR4，如在ELISA或Western免疫印迹中。当抗体用酶标记时，试剂盒将包括底物和酶所需的辅因子（如底物前体，其提供可检测的发色团或荧光团）。此外，可包括其它添加剂比如稳定剂、缓冲液（如封闭缓冲液或裂解缓冲液）等。这种试剂盒可包括容器，其经划分来容纳一个或更多个容器比如瓶、管等，这种容器盛放本发明独立的组件。例如，一个容器可包含结合至不溶或部分可溶载体的一抗。第二容器可包含以冻干形式或溶液中的可溶、可检测-标记的二抗。容器还可含有第三容器，其盛放以冻干形式或溶液中的可检测标记的第三抗体。这种性质的试剂盒可用于本发明的三明治分析。标记或包装插页可提供组合物的描述以及体外预期或诊断用途的说明。
各种试剂的相对量可以在很大范围内变化，以供试剂溶液的浓缩，其实质上优化了检测的灵敏度。具体地，可以包括赋形剂的干粉，通常为冻干粉的形式提供试剂，经溶解提供具有合适浓度的试剂溶液。
在本发明的另一方面中，提供此处详述的单克隆抗体或其结合片段，其标记有可检测部分，从而其可包装于和用于，例如，试剂盒中，来诊断或鉴定具有前述抗原的细胞。这种标记的非限定性实例包括荧光团比如异硫氰酸荧光素；发色团、放射性核素、或酶。这种标记抗体或结合片段可用于，例如，抗原的组织学定位、ELISA、细胞分选以及用于检测或定量CXCR4和具有此抗原的细胞的其它免疫技术。
试剂盒还提供用于凋亡分析、用于从细胞中纯化或免疫沉淀CXCR4的阳性对照。为了分离和纯化CXCR4，试剂盒可包含偶联至珠（如琼脂糖珠）的此处所述的抗体或其抗原结合片段。可以提供试剂盒，其包含用于体外检测和定量CXCR4的抗体，如在ELISA或Western免疫印迹中。如同制造品，试剂盒包括容器以及容器上或附着的标签或包装插页。容器容纳包括至少一种本发明抗-CXCR4抗体或其结合片段的组合物。可包括其它容器，其包含，如稀释剂和缓冲液、对照抗体。标签或包装插页可提供组合物的描述以及体外预期或诊断用途的说明。
更具体地，本发明涉及通过本领域技术人员公知的任何方法确定肿瘤CXCR4状态的试剂盒。优选实施方案中，正如将在实施例中描述，本发明涉及通过IHC方法确定肿瘤CXCR4状态的试剂盒。
在一个具体实施方案中，本发明由包括至少包括抗-CXCR4抗体、或其功能片段或衍生物的试剂盒，如上所述，所述抗体优选经标记。
必须了解，本领域技术人员可以使用任何标记方法比如，例如，使用上述标记。
在一个优选实施方案中，用于体外检测受试者中表达CXCR4的肿瘤的存在和/或位置的本发明的试剂盒，还包括用于检测所述抗-CXCR4抗体和CXCR4之间结合程度的试剂。
在另一个优选实施方案中，用于在体外确定表达CXCR4的肿瘤中的CXCR4的表达水平的本发明的试剂盒，还包括用于定量所述标记抗体和CXCR4之间结合水平的试剂。
在另一个实施方案中，用于体外确定肿瘤的CXCR4状态的本发明的试剂盒还包括：
i)用于检测所述标记抗体和CXCR4之间结合程度的试剂；以及
ii)用于CXCR4表达水平评分的阳性和阴性对照样本。
用于体外确定肿瘤的CXCR4状态的所述试剂盒还包括对鼠科抗体特异的多克隆抗体，优选所述对鼠科抗体特异的多克隆抗体是经标记的。
本发明还涉及根据本发明的抗体在制备用于将具有生物活性的化合物特异性靶向表达或过表达CXCR4的细胞的药物中的用途。
在本说明书的意义上，“具有生物活性的化合物”是任何能够调节特别是抑制细胞活性，特别是生长活性、增殖活性、转录和基因翻译活性的化合物。
本发明还涉及由根据本发明的抗体或其功能片段，优选标记的抗体或其功能片段，特别是放射性标记的抗体或其功能片段组成的体内诊断试剂，及其在医学成像中的用途，特别是在细胞表达或过表达CXCR4相关癌症的检测中的用途。
本发明还涉及作为联合产物的组合物或涉及用作药物的根据本发明的抗CXCR4/毒素缀合物或放射性同位素。
优选地，所述作为联合产物的组合物或所述缀合物中补充有赋形剂和/或药物载体。
在本说明书中，“药物载体”指进入药物组合物中的化合物或联合的化合物，不会引起次级反应，并且例如促进活性化合物的给药、延长其在生物体中的存在时间和/或有效性、增强其在溶液中的溶解性或改善其贮存。这样的药物载体是本领域技术人已熟知的，并且可由本领域技术人员根据所选活性化合物的性质和给药途经进行适应性调整。
优选地，这样的化合物通过全身途径给药，特别是通过静脉内、肌内、皮内、腹膜腔内、皮下或口服途径给药。更优选地，由根据本发明的抗体组成的组合物随相同的时间间隔以几次剂量给药。
根据制定适合患者的治疗方法时一般考虑的条件，比如例如，患者的年龄或体重、其一般状态的严重程度、其对治疗的耐受性和经历过的副作用，可以确定其给药途径、剂量时间表和最佳盖仑形式。
因此，本发明涉及抗体或其功能片段之一在制备用于将具有生物活性的化合物特异性靶向表达或过表达CXCR4的细胞的药物中的用途。
如之前所示，根据本发明的CXCR4 Mab在癌症治疗领域具有强烈的活性，因此这种抗体可用于鉴定治疗癌症的CXCR4拮抗剂抗肿瘤剂的筛选分析。在这些分析的第一步骤，表达CXCR4的细胞和本发明抗体孵育，然后可以评价分子抑制抗体结合的潜力。用于这种类型分析的细胞可以是转染细胞系比如CHO-CXCR4、NIH3T3-CXCR4或CXCR4转染的人细胞系比如U373-MAGI-CXCR4、表达CXCR4的人细胞系比如NALM6或原代细胞比如PBMC。用于筛选抑制抗体结合CXCR4表达细胞的CXCR4的拮抗剂的方法可以是如Zhao Q等人所述的基于细胞竞争的酶联免疫吸附分析（ELISA）（AIDS Research And Human Retroviruses,2003,19,pp947-955）或使用荧光激活细胞分选（FACS）的操作，比如Juarez J.等人所描述的（Leukemia 2003,17,pp1294-1300）。
因此，在本发明的一个具体方面，考虑用于筛选和/或鉴定作为CXCR4拮抗剂抗肿瘤剂的分子的方法，其包括步骤：
a）选择表达CXCR4的细胞，
b）用根据本发明的抗体、或其功能片段或衍生物孵育所述细胞，以及
c）评价受试分子对抗体、或其功能片段或衍生物之一与CXCR4之间的结合的潜在抑制，以及
d）选择能够具有所述抑制的分子。
本发明的其它特征和优点用实施例和附图（其图例如下显示）在说明书中进一步描述。
附图说明
图1A和1B分别显示qPCR分析的癌细胞中CXCR4和CXCR2的表达。
图2显示FACS分析的癌细胞中CXCR4和CXCR2蛋白的表达。
图3A和3B显示在稳定地表达野生型人类CXCR4的CHO-K1细胞的细胞膜上，未标记的SDF-1（图3A）和515H7 Mab（图3B）对特异性[125I]SDF1结合的竞争（T:全部结合；NS:非特异性结合）。
图4显示通过监测NIH-3T3细胞中稳定地表达野生型CXCR4受体的[35S]GTPγS结合反应，515H7 Mab对G蛋白激活的调节。
图5显示通过监测SDF-1（10和100nM）刺激的HeLa人肿瘤细胞的[35S]GTPγS结合反应，抗CXCR4 Mab 515H7对G蛋白激活的调节。
图6A-6C显示在HEK293细胞中，通过生物发光共振能量转移（BRET）分析，通过SDF-1和通过515H7 Mab调节CXCR4受体与不同相互作用配偶体的结合。（图6A:CXCR4:CXCR4同源二聚化；图6B:CXCR2:CXCR4异源二聚化，图6C:CXCR4介导的β-抑制蛋白（arrestin）的募集）。
图7A和7B显示在稳定地表达CXCR4受体的NIH3T3细胞中，SDF-1和515H7Mab对福斯高林刺激的cAMP生成的抑制。
图8显示通过监测稳定地表达于CHO-K1细胞中的组成性活性突变体Asn119Ser CXCR4受体的[35S]GTPγS结合反应，抗CXCR4 Mab 515H7对G蛋白激活的调节。
图9显示在体外CXCR4 Mab 515H7对SDF-1诱导的U937细胞迁移的抑制。
图10显示在Nod/Scid小鼠中，抗CXCR4Mab 515H7对MDA-MB-231异种移植物肿瘤生长的抑制。
图11A-11C显示在CHO-CXCR4细胞（图11A）和MDA-MB-231（图11B）、U937（图11C）癌细胞中，抗CXCR4 Mab 515H7对SDF-1诱导的钙释放的抑制。
图12显示在U937 Nod/Scid小鼠存活模型中，鼠的抗CXCR4 Mab m515H7的活性。
图13显示在Nod/Scid小鼠中，鼠的抗CXCR4 Mab m515H7在抑制T细胞KARPAS 299异种移植物肿瘤生长中的活性。
图14显示在稳定地表达野生型人类CXCR4的CHO-K1细胞的细胞膜上，鼠的m515H7 Mab和嵌合的c515H7 Mab对特异性[125I]SDF1结合的竞争（T:全部结合；NS:非特异性结合）。
图15显示通过监测用SDF-1（10nM）刺激的NIH-3T3细胞中稳定地表达的野生型CXCR4受体的[35S]GTPγS结合反应，鼠的m515H7 Mab和嵌合的c515H7Mab对G蛋白激活的调节。
图16显示通过监测用SDF-1（10nM）刺激的HeLa人肿瘤细胞的[35S]GTPγS结合反应，抗CXCR4鼠的m515H7 Mab和嵌合的c515H7 Mab对G蛋白激活的调节。
图17A-17C显示在HEK293细胞中，通过生物发光共振能量转移（BRET）分析，由SDF-1和由m515H7和c515H7 Mab调节的CXCR4受体与不同相互作用配偶体的结合。（图17A:CXCR4:CXCR4同源二聚化；图17B:CXCR2:CXCR4异源二聚化，图17C:CXCR4介导的β-抑制蛋白的募集）。
图18A和18B显示在CHO-CXCR4细胞（图18A）和U937细胞（图18B）中，SDF-1诱导的钙释放的抑制。
图19显示在体外抗CXCR4 Mab m515H7和c515H7对SDF-1诱导的U937细胞迁移的抑制。
图20显示在U937 Nod/Scid小鼠存活模型中，抗CXCR4嵌合的Mab c515H7的活性。
图21显示515H7重链可变区与人种系IGHV3-49*04和IGHJ4*01的氨基酸序列比对。515H7 VH氨基酸序列与所选的人受体构架序列进行比对。VH1和VH2（VH3未体现）序列对应着实施的515H7 VH结构域人源化变体，具有粗体显示的回复突变的残基。变体1 VH1不携带回复突变的残基并代表完整的人变体。变体VH2有8个回复突变，最是鼠的变体。变体VH3携带5个回复突变（未体现）。
图22显示515H7轻链与人种系IGKV4-1*01和IGKJ1*01的氨基酸序列比对。515H7 VL氨基酸序列与所选的人受体构架序列进行比对。VL1至VL3序列对应着实施的515H7 VL结构域人源化变体，具有粗体显示的回复突变的残基。变体VL1不携带回复突变的残基并最代表人的变体。变体VL2有13个回复突变，最是鼠的变体。变体VL3携带5个回复突变。
图23A-23F显示通过嵌合515H7和人源化515H7的不同变体的生物素化鼠抗体515H7的交叉阻断。通过流式细胞术使用CXCR4转染的NIH3T3细胞评价515H7的人源化变体（hz515H7）交叉阻断母体鼠抗体515H7的活性。人源化变体的活性与嵌合515H7进行比较。结合有嵌合VL（cVL）的VH（VH1-VH3）的三个不同变体的交叉阻断活性是非常相似的（图23A-图23C）。当结合VL的变体1和2时，没有确定到VH变体1（VH1，没有回复突变的变体）的活性降低。对于构建体hz515H7VH1 VL3检测到显著的活性降低。
图24显示测试人源化抗体515H7变体VH1 VL1活性的BRET分析。通过其抑制SDF-1介导的信号转导的能力评价人源化变体515H7 VH变体1VL变体1（hz515H7 VH1 VL1）的活性。如通过BRET所确定的，这种变体只显示轻微的SDF-1介导的信号转导的抑制。以100nM的浓度使用SDF-1。
图25A-25D显示具有单或双回复突变的VH1的不同变体和具有hz515H7 VH1D76N的不同VL变体的组合的比较。在VH1中产生单和双回复突变，并结合VL1。在BRET分析中评价这些构建体（图25A-25C）。这些单回复突变当中，只有具有回复突变D76N的构建体显示增加的SDF-1介导的信号转导的抑制。VH中的双回复突变均没有强抑制活性（图25C）。VH1的单回复突变D76N和VL的不同变体结合。SDF-1浓度为100nM。
图26显示具有单或双回复突变的VH1和VL1的不同突变体相比较构建体VH1 D76N VL2的排名。在VH1中产生单和双回复突变，并结合VL1。在BRET分析中评价所有构建体并计算其抑制百分比。SDF-1浓度为100nM。
图27A-27B显示通过人源化515H7的不同构建体的SDF-1结合的抑制，以及获自FACS和BRET的结果之间的相关性。对在阻断β-抑制蛋白的募集方面具有强活性的人源化抗体515H7的不同变体进行测试，在流式细胞术（FACS）中测试其抑制生物素化SDF-1结合的能力（A）。这些与VH1和VL1进行比较。来自基于FACS分析的结果与获自BRET的结果相关（B）。
图28显示hz515H7 VL2和其它人源化版本515H7 VL2.1、515H7 VL2.2和515H7 VL2.3的氨基酸序列比对。515H7 VL氨基酸序列与所选人受体构架序列进行比对。VL2.1、VL2.2和VL2.3序列对应着实施的人源化515H7 VL2的人源化变体，其具有粗体显示的突变残基。VL2.1和VL2.2多携带4个人源化残基而VL2.3多含5个人残基。
图29A-29C显示在NIH3T3-CXCR4（图29A）U937（图29B）和Ramos细胞（图29C）上特异性结合CXCR4的515H7人源化Mab（hz515H7VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1 D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2和hz515H7 VH1 D76NVL2.3）。
图30A-30D和31显示通过监测用SDF-1（10nM或100nM）刺激的NIH-3T3细胞中稳定地表达的野生型CXCR4受体的[35S]GTPγS结合反应，通过人源化Mab515H7（hz515H7 VH1 D76N VL2[图30A]、hz515H7 VH1 D76N VL2.1[图30B]、hz515H7 VH1D76N VL2.2[图30C]和hz515H7 VH1 D76N VL2.3[图30D]）对G蛋白激活的调节。
图32A-32C显示在HEK293细胞中，通过生物发光共振能量转移（BRET）分析，由SDF-1和由人源化515H7 Mab（hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2和hz515H7 VH1 D76N VL2.3）调节CXCR4受体与不同相互作用配偶体的结合。（图32A:CXCR4:CXCR4同源二聚化；图32B:CXCR2:CXCR4异源二聚化和图32C:CXCR4介导的β-抑制蛋白的募集）。
图33A-33D说明Glyofixx固定的RAMOS和KARPAS299异种移植肿瘤，其中a）和c）是使用515H7的IHC染色/b）和d）是使用mIgG1的IHC染色。
图34A-34D说明甲醛固定的RAMOS和KARPAS299异种移植肿瘤，其中a）和c）是使用515H7的IHC染色/b）和d）是使用mIgG1的IHC染色。
图35A-35D显示稳定地表达野生型人类CXCR4的CHO-K1细胞的细胞膜上，人源化hz515H7 Mab（hz515H7 VH1 D76N VL2[图35A&B]、hz515H7 VH1 D76NVL2.1[图35A&35C]、hz515H7 VH1 D76N VL2.2[图35A&35D]、hz515H7 VH1D76N VL2.3[图35A]）对特异性[125I]SDF1结合的竞争（T:全部结合；NS:非特异性结合）。
图36显示在U937细胞中hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab对SDF-1诱导的钙释放的抑制。
图37A-37B显示体外CXCR4人源化Mab hz515H7 VH1 D76N VL2对SDF-1诱导的U937细胞迁移的抑制。
图38：Glyofixx固定的RAMOS和KARPAS299异种移植肿瘤，其中a）和c）是使用生物素化hz515H7 VH1 D76N VL2的IHC染色以及b）和d）是使用生物素化hIgG1的IHC染色。
图39：甲醛固定的RAMOS和KARPAS299异种移植肿瘤，其中a）和c）是使用生物素化hz515H7 VH1 D76N VL2的IHC染色以及b）和d）是使用生物素化hIgG1的IHC染色。图40显示嵌合515H7（c515H7）Mab在Scid小鼠中对B细胞Ramos异种移植肿瘤生长的作用。
图41显示版本hz515H7 VH1 D76N VL2Mab在Scid小鼠中对B细胞Ramos异种移植肿瘤生长的作用。
图42显示版本hz515H7VH1 D76N VL2.1Mab在Scid小鼠中对B细胞Ramos异种移植肿瘤生长的作用。
具体实施方式
实施例
实施例1∶癌细胞中CXCR4和CXCR2的表达
-Q-PCR分析：
为了定量不同癌细胞系中CXCR4和CXCR2的相对表达，使用实时RT-PCR。
使用RNeasy Mini或Midi Protocols（Qiagen Corporation,France）从不同的细胞系提取RNA样本。然后，使用Experion自动电泳系统（BIO-RAD Corporation,France）监控RNA样本，其显示出良好的质量/完整性。使用iScript cDNA合成试剂盒（BIO-RAD Corporation,France）将1μg的每种RNA样本转化为cDNA模板。对于CXCR2，用TaqMan探针，对于CXCR4，用SYBERGreen，使用qPCR定量cDNA水平。比较样本需要标准化，因此引入内参考RPL0。TaqMan探针（用于CXCR2）带有5’FAM受体标记和3’TAMRA猝灭剂基团。通过在50℃下加热2分钟和在95℃下加热10分钟激活PCR酶。使用两个步骤的方法，在包含5μl的cDNA模板（1/20稀释）、1×qPCR Mastermix（TaqMan Universal PCR Master Mix,Applied Biosystems corporation,Branchburg New Jersey，USA）、50至900nM的每种引物和50至100nM探针的PCR混合物（总体积50μl）中，95℃下15秒，和62℃下1分钟，进行40或45个循环。使用iCycler仪器（BIO-RAD Corporation）进行所有的反应。使用Q-PCR测定循环阈值（Ct）。Ct值越小，待测试的基因表达的越多。用于大的人核糖体蛋白P0的引物和探针为：
正向引物，5’-GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG-3’（SEQ ID No.63）；
反向引物，5’-AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA-3’（SEQ ID No.64）；
探针，5-（FAM）-TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA-（TAMRA）-3’（SEQ ID No.65）。
用于人CXCR4（趋化因子受体4）的引物为：
正向引物，5’-CTCCTTCATCCTCCTGGAAATC-3’（SEQ ID No.66）；
反向引物，5’-CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG-3’（SEQ ID No.67）。
用于人CXCR2（趋化因子受体2）的引物和探针为：
正向引物，5’-GTGGTCATTATCTATGCCCTGG-3’（SEQ ID No.68）；
反向引物，5’-CGACCCTGCTGTATAAGATGAC-3’（SEQ ID No.69）；
探针，5-（FAM）-TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA-（TAMRA）-3’（SEQID No.70）。
在我们的比较研究中，在两个不同的样本：待试验的细胞系和参考细胞系中定量两个基因[试验的基因（CXCR4或CXCR2）和RPL0]）的表达。所述参考细胞系对应于包含最低表达定量基因的细胞系。使用下式进行比较性基因表达的计算：
相对基因表达=（1+E基因）-ΔCt(1）/（1+ERPL0）--ΔCt(2）
E基因=使用定量基因的引物/探针的PCR效率
ERPL0=使用RPL0引物/探针的PCR效率
Ct=阈值循环数
ΔCt（1）=Ct基因（试验细胞系）-Ct基因（参考细胞系）
ΔCt（2）=Ct RPL0（试验细胞系）-Ct RPLO（参考细胞系）
对于每种PCR系列，计算相对基因定量值，考虑从最高到阴性的表达水平，将癌细胞系分组。将所有数据都列在图1A和1B中。除了DU145和U-87MG只表达CXCR2（图1B），待试验的其它所有癌细胞系都表达CXCR4（图1A）和CXCR2。
-FACS分析：
渗透化处理MDA-MB-231、PC3和U937癌细胞系，然后，用10μg/mL的抗CXCR4单克隆抗体[44717（R & DSystems）对比其同种型对照IgG2b（SIGMA）或10μg/mL的抗-CXCR2单克隆抗体（抗h-CXCR2、克隆48311，R & D Systems，Mab 331对比其同种型对照IgG2a）进行孵育。接着，用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤细胞。接着，将Alexa标记的第二抗体加入细胞中，并使其在4℃下孵育20分钟。然后，再次洗涤细胞两次。在第二次洗涤之后，进行FACS分析。这些结合研究的结果提供在图2中。因此，肿瘤细胞比如MDA-MB-231、PC3和U937同时表达CXCR4和CXCR2蛋白。
实施例2：抗人CXCR4的单克隆抗体（Mab）的产生
为了产生CXCR4的单克隆抗体，用重组NIH3T3-CXCR4细胞和/或对应于CXCR4细胞外N末端和环的肽免疫接种Balb/c小鼠。在第一次免疫接种时，用完全Freund氏佐剂中的抗原皮下（s.c）免疫接种6-16周龄的小鼠一次，接着用不完全Freund氏佐剂中的抗原皮下免疫接种2至6次。通过眶后放血监测免疫应答。通过ELISA（如下描述的）筛选血清，并且使用具有较高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行融合。在处死并切除脾脏前两天，用抗原静脉内免疫加强（boost）小鼠。
-ELISA
为了选择产生抗CXCR4抗体的小鼠，通过ELISA试验来自免疫接种的小鼠的血清。简而言之，用以5μg当量肽/mL结合BSA的纯化的[1-41]N末端肽包被微量滴定板，在4℃下以100μl/孔孵育过夜，然后用250μl/孔的PBS中的0.5%明胶封闭。将来自CXCR4免疫的小鼠的血浆稀释液加入至每孔中，并在37℃下孵育2小时。用PBS洗涤板，然后，在37℃下，用结合HRP（Jackson Laboratories）的山羊抗小鼠IgG抗体孵育1小时。在洗涤之后，用TMB底物使板显影，在5分钟之后，通过加入100μl/孔的1M H2SO4终止该反应。使用出现最高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行抗体产生。
-产生CXCR4的Mab的杂交瘤的生成
用PEG将从出现最高滴度的抗CXCR4抗体的Balb/c小鼠中分离的小鼠脾细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O。将细胞以约1×105/孔涂布于微量滴定板，接着在包含超培养基+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+1x HAT的选择培养基中孵育2周。然后，通过ELISA筛选各孔的抗CXCR4单克隆IgG抗体。然后，通过有限稀释，将分泌的抗体杂交瘤亚克隆至少两次，体外培养以产生抗体，用于进一步的分析。
实施例3：通过FACS分析的抗CXCR4 Mab 515H7结合特异性和癌细胞系识别的鉴定
在该实验中，通过FACS分析检查了抗CXCR4 Mab 515H7的对人CXCR4的特异性结合。
用10μg/ml的单克隆抗体515H7孵育NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞、MDA-MB-231、Hela和U937癌细胞系。然后，用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤该细胞。接着，将Alexa标记的第二抗体加入至所述细胞中，并在4℃下孵育20min。然后，再次洗涤该细胞两次。在第二次洗涤之后，进行FACS分析。将这些结合研究的结果提供在下表6中，其显示[通过FACS获得的平均荧光强度（MFI）]抗CXCR4 Mab 515H7特异性结合人CXCR4-NIH3T3转染的细胞系，而在亲代NIH3T3细胞上无识别。这种Mab也能够识别人癌细胞系，例如MDA-MB-231乳癌细胞、U937早幼粒细胞性癌细胞和Hela宫颈癌细胞。
抗CXCR4 Mab 515H7识别NIH3T3-hCXCR4转染子，而不能识别亲代NIH3T3野生型细胞。Mab 515H7也能够识别癌细胞系。
表6
Figure BDA00002425225000521
实施例4：在稳定地表达人CXCR4受体的CHO-K1膜上，抗CXCR4 Mab515H7对[125I]SDF-1的竞争结合
该测定允许评价515H7Mab在正构（orthosteric）结合位点或变构（allosteric）结合位点，竞争放射标记的[125I]SDF-1与人CXCR4受体结合的能力。
稳定地和组成性表达人CXCR4受体的CHO-K1细胞是用带有人CXCR4受体的全部编码序列（RefSeq NM_003467）的哺乳动物表达载体转染原态CHO-K1细胞（ATCC CCL-61）时获得的。将细胞在完全培养基[补充有5%胎牛血清（FCS）和500μg/ml遗传霉素的DMEM-Ham’s F12]中繁殖。放射性配体结合实验在将CHO/CXCR4细胞机械性粉碎（mechanical scrapping）于裂解缓冲剂[Hepes 20mM，pH 7.4，NaCl 150mM]中，接着离心（10000g,15min）时获得的细胞膜上进行。使用SPA技术（闪烁亲近测定法-GE Healthcare）进行[125I]SDF-1结合（比活度：1500Ci/mmol）。简而言之，将细胞膜（30μg/孔）与评价的化合物（SDF-1或mAb）、放射性配体（1nM）和最后与SPA-WGA-PVT珠子（7.3mg/孔）一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,CaCl2 1mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中孵育。在25℃下1小时之后，达到结合平衡。当离心[1000g，10分钟]时，在闪烁计数器（TopCount,Perkin Elmer）中测量放射性计数。在10μM未标记的SDF-1的存在下，评价非特异性结合。
未标记的SDF-1剂量依赖性抑制了[125I]SDF-1结合，pKi值（IC50=产生特异性[125I]SDF-1结合50%抑制的配体浓度）为7.75±0.27nM（n=4）（图3A）。在相同的实验条件下，515H7（100nM）有效地竞争[125I]SDF-1结合（[125I]SDF-1的抑制%）：（64±3%）（图3B）。
实施例5∶抗CXCR4 Mab 515H7对表达野生型CXCR4受体的细胞膜上[35S]GTPγS结合的调节
该功能性分析能够通过野生型人CXCR4受体监测G蛋白激活及CXCR4配体和515H7 Mab对其的调节。
如上述实施例中对于CHO-K1细胞所描述的，获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的NIH-3T3细胞。将HeLa（人宫颈癌）细胞繁殖在完全培养基[补充有10%FCS、1%L-谷氨酰胺、2μ碳酸氢钠的EMEM]中。在机械性粉碎在裂解缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中，并进一步离心（10000g,15min）时获得的细胞膜上进行[35S]GTPγS结合。使用SPA技术（闪烁亲近测定法-GEHealthcare）进行[35S]GTPγS（比活度：1000Ci/mmol）的掺入和检测。简而言之，将细胞膜（10μg/孔）与评价的化合物（SDF-1或目的mAb）、[35S]GTPγS（0.2-0.4nM）和最后与SPA-WGA-PVT珠子（7.3mg/孔）一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,GDP3μM，MgCl210mM，NaCl 100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中孵育。在25℃下，在1小时期间进行结合反应。离心[1000g，10min.]，在闪烁计数器（TopCount,PerkinElmer）中测量放射性计数。通过应用Cheng Prussof方程式计算拮抗剂效价：
KB=[拮抗剂浓度]/{（EC50’/EC50）-1}其中EC50和EC50’分别为在不存在或存在mAb下，SDF-1的效价。
作为CXCR4受体激活G蛋白的结果，SDF-1诱导[35S]GTPγS结合的剂量依赖性增加。[35S]GTPγS结合的最大刺激分别表示高于对HeLa和NIH3T3/CXCR4细胞膜的基础[35S]GTPγS结合的167%和320%。对于这两种细胞系，SDF-1的效价类似，对应于41.3±9.7nM（图4）。在这些实验条件下，如在NIH3T3/CXCR4细胞中测定的515H7Mab的拮抗剂效价为15nM。对于HeLa细胞，观察到类似的拮抗剂功效（图5）。
实施例6：通过生物发光共振能量转移（BRET）分析的CXCR4与不同相互作用配偶体的结合：同源二聚化和异源二聚化，β-抑制蛋白的募集，及515H7 Mab对这些二聚体的作用
该功能性分析能够评价当SDF-1和/或515H7 Mab以CXCR4同源二聚体和CXCR2/CXCR4异源二聚体形成的水平结合CXCR4受体以及募集β抑制蛋白-2信号转导蛋白时诱导的构象变化。
通过采用常规分子生物学技术将每个研究的相互作用配偶体的表达载体构建成具有相应染料（海肾（Renilla reniformis）荧光素酶，Rluc和黄色荧光蛋白，YFP）的融合蛋白。在进行BRET实验前两天，用编码如下相应BRET配偶体的表达载体瞬时转染HEK293细胞：研究CXCR4同源二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP]、研究CXCR4和CXCR2异源二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR2:YFP]和研究CXCR4介导的β抑制蛋白-2募集的[CXCR4/Rluc+β-arr2:YFP]。第二天，将细胞分配至聚赖氨酸预包被的白色96MW板中的完全培养基[补充有10%FBS的DMEM]中。在37℃下，用5%CO2首先培养细胞，以使细胞粘附该板。然后，用200μl的DMEM/孔使细胞饥饿过夜。在BRET试验之前，立即除去DMEM，并用PBS快速洗涤细胞。然后，在存在或不存在抗体下，在37℃下，将细胞在PBS中孵育10分钟，之后加入有或无SDF-1 300nM的腔肠素（coelenterazine）H 5μM，最终体积50μl。在37℃下进一步孵育10分钟，使用Mithras LB940多标记读数器（Berthold）（1s/波长/孔，在室温下重复15次）开始在485nm和530nm的光发射采集。
如前所述（Angers等人，2000）进行BRET比例的计算：[（发射530nm）-（发射485nm）×Cf]/（发射485nm），其中对于在相同实验条件下单独表达Rluc融合蛋白的细胞，Cf=（发射530nm）/（（发射485nm）。简单化该方程式显示出BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的比例530/485nm，当该测定中仅仅存在融合Rluc的配偶体时，通过在相同实验条件下获得的比例530/485nm进行校正。为了易读起见，将结果以milliBRET单位（mBU）表示；mBU对应于BRET比例乘以1000。
由融合CXCR4受体的接头蛋白和受体蛋白的空间接近性引起SDF1（300nM）增加大约20%的BRET信号，其可能表明CXCR4/CXCR4同源二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化（图6A）。令人感兴趣的是，由融合CXCR2和CXCR4的接头蛋白和受体蛋白的空间接近性引起的SDF1（300nM）降低大约24%的BRET信号，这或许也表明CXCR2/CXCR4异源二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化（图6B）。在后者情况下，SDF-1激活的CXCR4/CXCR2的构象似乎对于BRET能量转移较不利。在两种情况下，515H7Mab能够调节SDF-1诱导的CXCR4同源二聚体（SDF-1诱导的BRET增加抑制69%，图6A）以及CXCR2/CXCR4异源二聚体的形成（对于515H7，SDF-1诱导的BRET减少抑制90%，图6B）的构象改变。515H7 Mab其本身也能够分别调节CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4的空间接近性，表明515H7 Mab对于CXCR4/CXCR4同源二聚体和CXCR2/CXCR4异源二聚体的构象都有影响（图6A和6B）。
SDF-1（300nM）对CXCR4的激活引起强的细胞内信号转导分子β抑制蛋白的募集，如BRET信号增强233%所示（图6C）。该募集部分地被515H7 Mab抑制（约95%抑制，图6C），显示出Mab 515H7对信号转导的作用。
实施例7：CXCR4介导的cAMP产生的抑制
该功能性分析设计用于监测腺苷酸环化酶水平上通过抑制性Gi/o蛋白的CXCR4受体信号传导。
按照供应商提供的详细描述应用cAMP LANCE方法（Perkin Elmer）。简而言之，获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的NIH3T3细胞，并如上所述繁殖。使用不含胰蛋白酶的试剂Versene收集细胞，并将其以106细胞/ml的浓度重悬于包含结合AlexaFluor的抗cAMP Mab（1/100稀释）和化合物（福斯高林，SDF-1和/或515H7Mab）的溶液中。在室温下培养30分钟，加入包含铕-抗生蛋白链菌素（1/125稀释）和生物素-cAMP（1/125稀释）复合物的检测混合物。在室温下孵育1小时，在Mithras LB940（Berthold）多标记读数器中测量得到的FRET信号。将数据表示为任意的荧光值或相对于减去FK作用时的SDF-1反应的相对刺激。
福斯高林（FK）剂量依赖性刺激NIH3T3/CXCR4细胞中的cAMP产生，效价为约0.3μM（图7A）。在SDF-1共同存在下，由于CXCR4受体对抑制性Gi/o蛋白的激活，细胞内cAMP水平降低。SDF-1的效价为5.0±3.1nM（图7A）。515H7Mab有效地抑制了福斯高林刺激的SDF-1（100nM）作用在80%以上（图7B）。
实施例8：Mab 515H7对表达组成性活性突变体Asn119Ser CXCR4受体的细胞膜上[35S]GTPγS结合的调节
该功能性分析能够监测通过组成性活性突变体（CAM）Asn119Ser CXCR4受体的G蛋白激活（参见Zhang等人，2002）。该灵敏的测定能够基于CXCR4配体的内在活性（部分激动剂，沉默拮抗剂或反向激动剂）区别CXCR4配体。如Zhang及其同事之前描述的，CXCR4配体比如AMD3100或T140分别表现为CAMCXCR4受体的部分激动剂和反向激动剂。沉默拮抗剂的鉴定可能很困难，因为这类分子必须对于活性和无活性状态的CXCR4都显示出类似的亲和性（Wurch等人，1999）。
通过应用常规分子生物学技术（QuickChange位点定向诱变试剂盒，StratageneUS）进行CXCR4受体编码序列中Asn119Ser突变的引入。如上述实施例中所述，获得了稳定地和组成性表达CAM CXCR4受体的CHO-K1细胞。在裂解缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]的机械粉碎和进一步离心（10000g,15min）时获得的细胞膜上进行[35S]GTPγS结合。使用SPA技术（闪烁亲近测定法-GEHealthcare）进行[35S]GTPγS的掺入（比活度：1000Ci/mmol）。简而言之，将细胞膜（10μg/孔）与评价的化合物（SDF-1或mAb）、[35S]GTPγS（0.2-0.4nM）和最后与SPA-WGA-PVT珠子（7.3mg/孔）一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,GDP 3μM，MgCl210mM,NaCl 100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中孵育。在25℃下，在1小时期间进行结合反应。离心[1000g，10min.]，在闪烁计数器（TopCount,Perkin Elmer）中测量放射性计数。
SDF-1（100nM）以130%刺激[35S]GTPγS结合。反向激动剂T140抑制基础的（-17%）和SDF-1刺激的（-159%）[35S]GTPγS结合。相反，515H7 Mab表现为CAM CXCR4的沉默拮抗剂，而没有改变基础的[35S]GTPγS结合（图8），但是抑制了SDF-1诱导的[35S]GTPγS结合（图8）。
实施例9:抗CXCR4 Mab 515H7对SDF-1诱导的U937细胞迁移的作用
为了评价抗CXCR4单克隆抗体515H7对迁移过程的抑制作用，在孔的底部存在或不存在SDF-1下，且在上室中有或没有Mab 515H7下，将补充有2%FCS的RPMI 1640培养基中的100 000个U-937细胞涂布于迁移室的上室中（具有8-μm孔径的24孔板）。在该试验中，将鼠的IgG2b引入作为同种型对照。在涂布两小时之后，计数迁移细胞。呈现在图9中的结果证实，如预期的，SDF-1能够诱导U-937细胞迁移的显著增加。当用IgG2b同种型对照孵育细胞时，没有观察到任何作用。相反，对于用515H7Mab孵育的细胞，观察到SDF-1诱导的U937细胞迁移的显著和可再现的减少超过80%。
实施例10：在Nod/Scid小鼠中，抗CXCR4 Mab 515H7对MDA-MB-231异种移植物肿瘤生长的抑制
这些实验的目的是评价抗CXCR4 Mab 515H7抑制Nod/SCID小鼠中MDB-MB-231异种移植物生长的能力。
将来自ECACC的MDA-MB-231细胞常规培养在DMEM培养基（InvitrogenCorporation,Scotland,UK）、10%的FCS（Sigma,St Louis MD,USA）中。在移植物移入之前48小时，使细胞分开，以便使其处于指数生长期。将在PBS中的一千万个MDA-MB-231细胞移入7周龄的Nod/Scid小鼠（Charles River,France）中。在植入五天之后，肿瘤是可测量的（34mm3<V3<40mm3），将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的6只小鼠的组。腹腔内注射2mg/小鼠加载剂量的Mab 515H7处理小鼠。
然后，给小鼠每周两次注射0.5mg/剂量/小鼠的Mab 515H7，每周三次。在该实验中，引入PBS组作为对照组。每周测量肿瘤体积两次，并通过下式计算：π/6×长度×宽度×高度。使用Mann-Whitney检验进行每个测量的统计分析。
在该实验中，处理期间没有观察到死亡。与PBS组相比，对于515H70.5mg/剂量，D7和D39（p≤0.002）之间存在显著的肿瘤生长抑制，在处理5周之后，与PBS相比，对于515H7，平均肿瘤体积减小了50%（图10）。
实施例11：CXCR4受体介导的细胞内钙贮存的动员
该功能性分析设计用于监测通过刺激磷脂酶C途径、诱导来自内质网的细胞内贮存的钙释放的CXCR4受体信号转导。
如上述实施例中描述的获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的CHO-K1细胞。将MDA-MB-231（人乳癌腺癌）和U937（人白血病）细胞分别在完全培养基[补充有10%FCS的DMEM]和[补充有10%FCS、20mM HEPES、1%非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠、1%L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖的RPMI 1640]中繁殖。将所有的细胞类型都涂布于黑色96MW板中的合适的培养基中，密度为100,000个细胞/孔。在进行实验之前，使细胞饥饿过夜。在37℃下30min.，接着在25℃下30min.，使细胞负载加样缓冲液[HBSS 1x,HEPES 20mM,丙磺舒酸（Probenicid acid）25mM]中的荧光钙染料（Fluo-4No Wash,Invitrogen US）。通过直接注射到每个孔中进行SDF-1的刺激。对于拮抗实验，在加入SDF-1之前至少10min.，将10μl的Mab溶液直接加入加样缓冲液中。使用下述设置，在多模式荧光微量板读数器Mithras LB940（Berthold）上进行动力学荧光测量：在485nm下激发，在535nm下发射，激发能为10000个任意单位。在每一秒的0.1秒期间记录每孔中的荧光，在SDF-1注射之前，记录20秒的时期（基础信号）。然后，注射20μl的SDF-1，数据记录持续2min的时期。每个实验条件进行一式双份。首先通过减去基础荧光和没有细胞的对照孔发射的荧光校正每孔的值。相对数据可以表示为SDF-1（100nM）获得的最大刺激的百分比。
SDF1（100nM）诱导重组CHO/CXCR4中细胞内钙的快速和强的释放，而在原态CHO-K1细胞中没有检测到荧光信号。最大强度达到超过基础荧光的＞160%，并且当SDF-1刺激时在约30秒处观察到；用MDA-MB-231和U-937观察到类似的动力学曲线（图11A、11B、11C），虽然SDF-1（100nM）的最大荧光强度较低（基础的130-140%）。在所有三个研究的细胞系中，515H7抗体（133nM）产生SDF-1（100nM）诱导的钙信号的强的和几乎完全的抑制。
实施例12：U937小鼠存活模型中抗CXCR4 Mab 515H7的活性
将来自ATCC的U937细胞培养在RPMI 1640培养基、10%FCS、1%L-谷氨酰胺中。在移植物移入之前两天，分开细胞，以便使其处于指数生长期。将一千万个U937细胞腹腔内注射到雌性NOD/SCID小鼠中。在植入两天之后，用加载剂量2mg的515H7 Mab/小鼠腹腔注射处理小鼠，接着用1mg的抗体/小鼠每周两次处理小鼠。对照小鼠接受已经在前述研究中显示的PBS注射剂，在注射PBS的小鼠和给予小鼠IgG同种型对照的小鼠之间没有观察到存活率的差异。每天监测小鼠存活率。
描述在图12中的结果显示出用515H7 Mab处理的小鼠具有引人注意的和显著的寿命增加，对于515H7 Mab，T/C%为约280（图12）。
实施例13：在Nod/Scid小鼠中，抗CXCR4 Mab 515H7对T细胞KARPAS 299异种移植物肿瘤生长的抑制
该实验的目的是评价抗CXCR4 Mab 515H7抑制Nod/Scid小鼠中KARPAS 299异种移植物生长的能力。
将来自ECACC的KARPAS 299细胞常规培养在RPMI培养基、1%L-Glu和10%FCS（Sigma,St Louis MD,USA）中。在移植物移入之前48小时，分开细胞，以便使其处于指数生长期。将PBS中的五百万个KARPAS 299细胞移入7周龄Nod/SCID小鼠（Charles River,France）中。在植入5天之后，肿瘤是可测量的（32mm3<v3<49mm3），并将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的6只小鼠的组。腹腔内注射2mg/小鼠加载剂量的Mab 515H7处理小鼠。
然后，给小鼠注射1mg/剂量/小鼠的Mab 515H7，每周两次。在该实验中，将PBS组引入作为对照组。每周测量肿瘤体积两次，并通过下式计算：π/6×长度×宽度×高度。使用Mann-Whitney检验进行每次测量的统计分析。
在这些实验中，处理期间没有观察到死亡。与PBS组相比，对于515H7 Mab1mg/剂量，D7和D33（p≤0.002）之间存在显著的肿瘤生长抑制，在处理5周之后，与PBS相比，对于Mab 515H7，平均肿瘤体积减小了63%（图13）。
实施例14：抗CXCR4嵌合Mab c515H7的产生
设计了鼠的515H7 Mab的嵌合形式：其对应于目的鼠抗体的轻链和重链可变结构域，遗传性地融合至人Ckappa和IgG1恒定结构域。重组Mab都是在使用具有pCEP4表达载体的HEK293/EBNA系统（InVitrogen,US）瞬时转染时产生的。
对应于515H7 Mab轻链和重链可变结构域的全部核苷酸序列是通过全基因（global gene）合成（Genecust,Luxembourg）来合成的。将它们亚克隆到pCEP4载体（InVitrogen US）中，该载体带有人IgG1免疫球蛋白的轻链[Ckappa]或重链[CH1-铰链-CH2-CH3]恒定结构域的全部编码序列。根据实验手册（Sambrook和Russel,2001）描述的常规分子生物学技术或根据供应商的说明书进行所有的克隆步骤。每个遗传构建体都是通过使用Big Dye终止子循环测序试剂盒（AppliedBiosystems,US）的核苷酸测序充分证实的，并使用3100 Genetic Analyzer（AppliedBiosystems,US）分析。
将适应悬浮液的HEK293 EBNA细胞（InVitrogen,US）按常规培养在定轨振荡器（110rpm转速）上250ml烧瓶中的50ml不含血清的培养基Excell 293（SAFCBiosciences）中，该不含血清的培养基Excell 293补充有6mM的谷氨酰胺。使用在水中以混合最终浓度1mg/mL制备的直链25kDa聚乙烯亚胺（PEI）（Polysciences）和质粒DNA（最终浓度1.25μg/ml，重链与轻链质粒的比例为1:1），以2.106个细胞/ml进行瞬时转染。在转染后4小时，将该培养物用一倍体积的新鲜培养基稀释，以获得最终106个细胞/ml的细胞密度。基于细胞生存力和Mab生产监测培养过程。通常，将培养物保持4至5天。在蛋白A树脂（GE Healthcare,US）上，使用常规色谱方法纯化Mab。Mab都是以适于功能评价的水平产生的。生产率水平通常在6至15mg/L的纯化Mab的范围。
实施例15：通过FACS分析的抗CXCR4嵌合Mab c515H7结合特异性和癌细胞系识别的鉴定
在该实验中，通过FACS分析检查了抗CXCR4嵌合Mab c515H7对人CXCR4的特异性结合。
用10μg/mL的单克隆抗体c515H7孵育NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞和MDA-MB-231癌细胞系。然后，用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤该细胞。接着，将Alexa标记的第二抗体加入所述细胞中，并使其在4℃下孵育20分钟。然后，再次洗涤所述细胞两次。在第二次洗涤之后，进行FACS分析。将这些结合研究的结果提供在下表7中，其显示[通过FACS获得的平均荧光强度（MFI）]抗CXCR4嵌合Mab c515H7特异性结合人CXCR4-NIH3T3转染的细胞系，且还识别人癌细胞系，例如MDA-MB-231乳癌细胞。
表7
Mab 细胞系上的MFI
（10μg/ml） NIH3T3-CXCR4 MDA-MB-231
c515H7 2294 118
实施例16：抗CXCR4鼠的Mab m515H7和嵌合的Mab c515H7对稳定地表达人CXCR4受体的CHO-K1膜上的[125I]SDF-1的竞争性结合
该测定能够评价鼠Mab m515H7和嵌合的Mab c515H7在正构或变构结合位点上，竞争放射标记的[125I]SDF-1对人CXCR4受体结合的能力。
稳定地和组成性表达人CXCR4受体的CHO-K1细胞是用带有人CXCR4受体的全部编码序列（RefSeq NM_003467）的哺乳动物表达载体转染原态CHO-K1细胞（ATCC CCL-61）时获得的。将细胞在完全培养基[补充有5%胎牛血清（FCS）和500μg/ml的遗传霉素的DMEM-Ham’s F12]中繁殖。放射性配体结合实验是将CHO/CXCR4细胞机械性粉碎在裂解缓冲剂[Hepes 20mM，pH 7.4，NaCl 150mM]中，接着离心（10000g,15min）时获得的细胞膜上进行的。使用SPA技术（闪烁亲近测定法-GE Healthcare）进行[125I]SDF-1结合（比活度：1500Ci/mmol）。简而言之，将细胞膜（30μg/孔）与评价的化合物（SDF-1或mAb）、放射性配体（1nM）和最后与SPA-WGA-PVT珠子（7.3mg/孔）一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,CaCl21mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中孵育。在25℃下1小时之后，达到结合平衡。离心[1000g，10分钟]，在闪烁计数器（TopCount,Perkin Elmer）中测量放射性计数。在10μM未标记的SDF-1的存在下，评价非特异性（NS）结合。
抗CXCR4Mab（100nM）有效地竞争[125I]SDF-1结合，具有下述状态次序的竞争功效（[125I]SDF-1的抑制%）：m515H7（62±10%）和c515H7（55±4%）（图14）。
实施例17:抗CXCR4鼠的Mab m515H7和嵌合的Mab c515H7对表达野生型CXCR4受体的细胞膜上[35S]GTPγS结合的调节
该功能性分析能够监测通过野生型人CXCR4受体的G蛋白激活及抗CXCR4鼠的Mab m515H7和嵌合的Mab c515H7对其的调节。
如上述实施例中对于CHO-K1细胞所描述的，获得了稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的NIH-3T3细胞。将HeLa（人宫颈癌）细胞繁殖在完全培养基[补充有10%FCS、1%L-谷氨酰胺、2μM碳酸氢钠的EMEM]中。在机械性粉碎在裂解缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中，并进一步离心（10000g,15min）时获得的细胞膜上进行[35S]GTPγS结合。使用SPA技术（闪烁亲近测定法-GEHealthcare）进行[35S]GTPγS（比活度：1000Ci/mmol）的掺入和检测。简而言之，将细胞膜（10μg/孔）与评价的化合物（SDF-1和目的Mab）、[35S]GTPγS（0.2-0.4nM）和最后与SPA-WGA-PVT珠子（7.3mg/孔）一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,GDP3μM，MgCl2 10mM，NaCl 100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中孵育。在25℃下，在1小时期间进行结合反应。离心[1000g，10min.]，在闪烁计数器（TopCount,PerkinElmer）中测量放射性计数。对于每种Mab计算IC50。
在这些实验条件下，NIH3T3/CXCR4细胞中测定的m515H7和c515H7 Mab的IC50分别为1.9nM和1.5nM（图15）。在相同的实验条件下，使用Hela细胞测定的m515H7和c515H7 Mab的IC50分别为0.2nM和0.6nM（图16）。
实施例18：通过生物发光共振能量转移（BRET）分析的CXCR4与不同相互作用配偶体的结合：同源二聚化和异源二聚化，β抑制蛋白的募集，及鼠的Mabm515H7和嵌合的Mab c515H7对这些二聚体的作用
该功能性分析能够评价当SDF-1和/或m515H7鼠的Mab和c515H7嵌合的Mab以CXCR4同源二聚体和CXCR2/CXCR4异源二聚体形成的水平结合CXCR4受体以及β抑制蛋白-2信号转导蛋白募集时诱导的构象变化。
通过应用常规分子生物学技术，将每个研究的相互作用配偶体的表达载体构建成具有相应染料（海肾荧光素酶，Rluc和黄色荧光蛋白，YFP）的融合蛋白。在进行BRET实验前两天，用编码如下相应BRET配偶体的表达载体瞬时转染HEK293细胞：研究CXCR4同源二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP]、研究CXCR4和CXCR2异源二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR2-YFP]和研究CXCR4介导的β抑制蛋白-2募集的[CXCR4-Rluc+β-arr2-YFP]。第二天，将细胞分配在聚赖氨酸预包被的白色96MW板中的完全培养基[补充有10%FBS的DMEM]中。在37℃下，用5%CO2首先培养细胞，以使细胞粘附该板。然后，以200μl的DMEM/孔使细胞饥饿过夜。在BRET实验之前，立即除去DMEM，并用PBS快速洗涤细胞。然后，在存在或不存在抗体下，在37℃下，将细胞在PBS中孵育15分钟，之后加入有或无SDF-1 100nM的腔肠素H 5μM，最终体积50μl。仅仅对同源二聚体和异源二聚体在37℃下孵育5分钟和在室温下进一步孵育20分钟之后，使用MithrasLB940多标记读数器（Berthold）（1s/波长/孔，在室温下重复15次）开始在485nm和530nm的光发射采集。
如前所述（Angers等人，2000）进行BRET比例的计算：[（发射530nm）-（发射485nm）×Cf]/（发射485nm），其中对于相同的实验条件下单独表达Rluc融合蛋白的细胞，Cf=（发射530nm）/（发射485nm）。简单化该方程式显示出BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的比例530/485nm，当该测定中仅仅存在融合Rluc的配偶体时，以相同实验条件下获得的比例530/485nm进行校正。为了易读起见，将结果以milliBRET单位（mBU）表示；mBU对应于BRET比例乘以1000。
由融合CXCR4受体的供体和受体蛋白的空间接近性引起SDF1（100nM）增加BRET信号约10%，这可能表明CXCR4/CXCR4同源二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化（图17A）。令人感兴趣的是，由融合CXCR4和CXCR2的供体蛋白和受体蛋白的空间接近性引起的SDF1（100nM）降低BRET信号约17%，这或许也表明CXCR2/CXCR4异源二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化（图17B）。在后者情况下，SDF-1激活的CXCR4/CXCR2的构象似乎对于BRET能量转移较不利。在两种情况下，m515H7和c515H7Mab能够调节SDF-1诱导的CXCR4同源二聚体（对于c515H7，SDF-1诱导的BRET增加抑制96%，图17A）以及CXCR2/CXCR4异源二聚体形成（对于c515H7，SDF-1诱导的BRET减少抑制98%，图17B）的构象变化。m515H7和c515H7 Mab其自身也能够分别调节CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4的空间接近性，表明这些Mab对于CXCR4/CXCR4同源二聚体和CXCR2/CXCR4异源二聚体构象都存在影响（图17A和17B）。
SDF-1（100nM）对CXCR4的激活引起强的细胞内信号转导分子β抑制蛋白的募集，如BRET信号增强400%所示（图17C）。该募集部分地被c515H7 Mab抑制（约93%，图17C），显示出这些Mab对信号转导的作用。
实施例19：CXCR4受体介导的细胞内钙贮存的动员
该功能性分析设计用于监测通过刺激磷脂酶C途径、诱导来自内质网的细胞内贮存的钙释放的CXCR4受体信号转导。
如上述实施例中描述的获得稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的CHO-K1细胞。将U937（人白血病）细胞繁殖在完全培养基中，分别为[补充有10%FCS的DMEM]和[补充有10%FCS、20mM HEPES、1%非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠、1%L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖的RPMI 1640]。将所有的细胞类型都涂布于黑色96MW板中的合适培养基中，密度为100,000个细胞/孔。在进行实验之前，使细胞饥饿过夜。在37℃下30min.，接着在25℃下30min.，使细胞负载加样缓冲液[HBSS 1x,HEPES 20mM,丙磺舒酸25mM]中的荧光钙染料（Fluo-4No Wash,Invitrogen US）。通过直接注射到每个孔中进行SDF-1的刺激。对于拮抗试验，在SDF-1之前至少10min.，将10μl的Mab溶液直接加入加样缓冲液中。使用下述设置，在多模式荧光微量板读数器Mithras LB940（Berthold）上进行动力学荧光测量：在485nm下激发，在535nm下发射，激发能为10000个任意单位。在每一秒的0.1秒期间记录每孔中的荧光，在SDF-1注射之前，记录20秒的时期（基础信号）。然后，注射20μl的SDF-1，数据记录持续2min的时期。每个实验条件进行一式双份。首先通过减去基础荧光和没有细胞的对照孔发射的荧光校正每孔的值。相对数据可以表示为SDF-1（100nM）获得的最大刺激的百分比。
SDF1（100nM）诱导重组CHO/CXCR4中细胞内钙的快速和强的释放，而在原态CHO-K1细胞中没有检测到荧光信号。最大强度达到超过基础荧光的＞140%，并且当SDF-1刺激时在约40秒处观察到；用U-937细胞观察到类似的动力学曲线（图18A、18B）。在两个研究的细胞系中，嵌合抗体c515H7（133nM）产生SDF-1（100nM）诱导的钙信号的强的和几乎完全的抑制。
实施例20：抗CXCR4鼠的Mab m515H7和嵌合的Mab c515H7对SDF-1诱导的U937细胞迁移的作用
为了评价抗CXCR4 Mab m515H7和c515H7对迁移过程的抑制作用，在孔的底部存在或不存在SDF-1下，且上室中有或没有Mab c515H7和m515H7下，将补充有2%FCS的RPMI 1640培养基中的100000个U-937细胞涂布于迁移室的上室中（具有8μm孔径的24孔板）。在该试验中，将鼠的IgG2b引入作为同种型对照。在涂布两小时之后，计数迁移细胞。显示于图19中的结果证实，如预期的，SDF-1能够诱导U-937细胞迁移的显著增加。当用IgG2同种型对照孵育细胞时，没有观察到任何作用。相反，对于用c515H7和m515H7 Mab孵育的细胞，观察到SDF-1诱导的U937细胞迁移的显著和可再现的减少：用c515H7和m515H7 Mab减少约80%以上。
实施例21：U937小鼠存活模型中抗CXCR4嵌合的Mab c515H7的活性
将来自ATCC的U937细胞培养在RPMI 1640培养基、10%FCS、1%L-谷氨酰胺中。在移植物移入之前两天，分开细胞，以便使其处于指数生长期。将一千万个U937细胞腹腔内注射到雌性NOD/SCID小鼠中。在植入两天之后，用加载剂量2mg的c515H7 Mab/小鼠皮下注射处理小鼠，接着用1mg的抗体/小鼠处理小鼠，每周两次。对照小鼠接受已经在前述研究中显示的PBS注射剂，在注射PBS的小鼠和给予小鼠IgG同种型对照的小鼠之间没有观察到存活率的差异。每天监测小鼠存活率。
描述在图20中的结果显示出用c515H7 Mab处理的小鼠具有引人注意的和显著的寿命增加，T/C%为约180。
实施例22：515H7抗CXCR4鼠抗体的人源化
一般步骤
通过应用CDR嫁接的整体规则进行515H7抗CXCR4抗体的人源化。通过应用IMGT唯一编号方案及IMGT文库和工具（Lefranc,1997–www.imgt.org）进行CDR和框架（FR）区域的免疫遗传分析和定义。
通过生物发光共振能量转移（BRET）分析测试工程化抗体抑制SDF-1介导的β抑制蛋白募集能力的功能活性评价人源化方法的功效。在该分析中，用荧光素酶进行标记CXCR4且用YFP进行标记β抑制蛋白。SDF-1介导的β抑制蛋白募集至CXCR4在CXCR4信号转导中是重要步骤。在稳定转染人CXCR4的NIH3T3细胞系上确定515H7人源化变体的结合。以和生物素化小鼠抗体竞争的分析来评估结合活性。在第二次尝试中，评价人源化抗体抑制生物素化SDF-1与RAMOS细胞结合的能力。选择RAMOS细胞，因为其高表达CXCR4和低表达CXCR7和SDF-1。
用这些分析来鉴定抗CXCR4抗体的重组人源化版本。可变区与人IgG1/k恒定区格式化并被克隆至哺乳动物表达载体pCEP。在HEK293细胞中瞬时表达重组IgG1/κ-衍生的抗体。过滤表达培养上清，并使用蛋白质A琼脂糖纯化抗体。在PBS中重新缓冲纯化的抗体并以ELISA确定抗体浓度。
515H7可变结构域的人源化
为了选择用于CDR嫁接的合适人种系，鉴定具有和515H7 VH鼠序列最高同源性的人种系基因。借助IMGT数据库和工具，人IGHV3-49*04种系基因和人IGHJ4*01 J种系基因选作用于鼠515H7 VH CDR的人受体序列。人V基因IGHV3-49*04具有同鼠515H7重链的可变结构域V基因80.27%的同源性。对于人J基因IGHJ4*01的同源性是87.50%。所选的人种系基因和鼠抗体515H7的VH结构域之间有19个残基是不同的。母体抗体的VH结构域和种系序列之间的比对描述于图21中。
关于轻链的可变结构域，选择人种系基因IGKV4-1*01和IGKJ1*01（图22）。同人V基因IGKV4-1*01的同源性是79.12%。轻链的515H7 J基因具有同人J基因IGKJ1*0184.85%的同源性。
翻译的人种系基因IGHV3-49*04和IGKV4-1*01的氨基酸序列用于鉴定结晶的同源抗体。对于重链，在RCSB蛋白质数据库中登录号为1MAM的抗体选作模型，而对于轻链，选择抗体1SBS。两个结构域用计算机程序DS visual进行组装，并用作人源化抗体515H7的模型。
基于母体抗体和对应的人种系序列之间不同的各残基的位置，针对人和鼠序列之间不同的各残基给予优先排列状态（图21和22）。这些优先用于产生各人源化可变结构域的三种不同变体，即分别为VH1、VH2和VH3。
在第一系列的实验中，我们构建并分析了三种第一人源化变体的抗CXCR4结合活性。VH变体1（VH1）结合鼠VL，并且评价这些构建体抑制生物素化鼠515H7母体抗体结合的能力。所有构建体显示竞争鼠抗体的相似能力（图23A-C）。这表明最人的VH变体具有与较低人变体相同的结合能力。因此，VH1结合VL的三种不同变体（图23D-F）。只有VH1和VL3的组合显示降低的竞争生物素化鼠抗体的能力，而在框架中不携带回复突变的最人的变体VH1 VL1显示和嵌合抗体相同的交叉阻断活性。
还在BRET分析中测试变体VH1 VL1抑制SDF-1介导的β抑制蛋白募集的能力（图24）。尽管通过母体抗体的交叉阻断所确定的期望的受体结合活性，构建体VH1 VL1仅显示β抑制蛋白募集的微弱抑制。这种强烈抑制活性的缺失使得人框架残基被鼠残基的取代成为必要。针对VH1构建单回复突变。取代如下残基：V48L、E61D、D76N和A81L（根据一级氨基酸序列编号）。变体VH1的这些单回复突变结合变体VL1。这些当中，正如BRET分析所评价的，只有回复突变D76N导致信号转导的抑制增加（图25B）。
为了增加这种构建体的活性并进一步评价其它残基的重要性，针对VH1构建不同的双回复突变。这些构建体的抑制活性稍改善（约45-50%的平均抑制），但是不令人满意（图25C）。然后单回复突变D76N结合三种不同VL变体（图25D）。构建体hz515H7 VH D76N VL2显示平均88.2%的活性，其和嵌合抗体的在相同范围内。
在变体VL1结构域中构建单和双回复突变，并和构建体hz515H7 VH1 D76NVL2的活性比较（图26）。测试的组合中没有与这种构建体相似或更好活性的组合。
针对hz515H7 VH1 D76N VL2计算框架中人残基的百分比：180个残基中其含有14个非人残基，这等于92.2%的“发展性指数”（germinality index）。通过比较，人源化的和市售抗体贝伐单抗和曲妥珠单抗在其可变结构域中分别含有30和14个非人残基。
，，测试四种最人源化的形式抑制生物素化SDF-1结合的能力（图27A），其显示抑制SDF-1介导的β抑制蛋白募集的强烈功效的。确定SDF-1结合抑制和β抑制蛋白募集的密切相关性。这种相关性表明SDF-1结合抑制是抑制信号转导最可能的主要机制。
为了进一步人源化hz515H7 VH1 D76N VL2变体，通过使用图26中评价的双和三突变体而获得的信息，设计三种其它变体。在变体VL2.1、VL2.2和VL2.3中分别人源化四种和五种其它残基（也称VL2-1、VL2-2和VL2-3）。它们对应着残基D9、P49、D66、S69、S83、L84；V89。这三种变体相较于VL2的比对显示于图28中。
评价这些VL2变体抑制SDF-1介导的β抑制蛋白的募集的能力。人源化hz515H7 VH1 D76N VL2、VL2.1、VL2.2和VL2.3变体显示和嵌合抗体c515H7相似的活性（图26）。
515H7-2可变结构域的人源化
为了产生另一人源化形式，对于轻链和重链的可变结构域，选择了另一合适的用于CDR嫁接的人种系。对于两者，选择种系，不仅涉及和鼠序列同源性的百分比，它们还分别具有与鼠515H7的VL和VH相同的CDR长度。
借助IMGT数据库和工具，人IGHV3-73*01种系基因和人IGHJ4*01J种系基因选作用于鼠515H7 VH CDR的人受体序列。人V基因IGHV3-73*01具有同鼠515H7重链的可变结构域V基因79%以上的同源性。对于人J基因IGHJ4*01的同源性是87.50%。
关于轻链的可变结构域，选择人种系基因IGKV2D-40*01和IGKJ1*01。同人V基因IGKV2D-40*01的同源性是70%以上。轻链的515H7J基因具有同人J基因IGKJ1*0184.85%的同源性。
基于母体抗体和对应的人种系序列之间不同的各残基的位置以及本领域技术人员的知识，若干关键残基鉴定为待回复突变的残基。
关于重链，这些残基是H35S、V48L、R50F、A61D、D76N和/或A81L（见Table 2c的SEQ ID No.86和90）。
至于轻链，这些残基是L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Y和/或V89L（见Table 2c的SEQ ID No.85和89）。
实施例23：通过FACS分析对抗CXCR4人源化Mab 515H7的结合特异性和癌细胞系识别的鉴定
在此实验中，通过FACS分析检查抗CXCR4人源化Mab 515H7对人CXCR4的特异结合。
NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞和Ramos、U934癌细胞系与0至10μg/ml的人源化Mab 515H7（hz515H7 VH1 D76N VL2[＝hz515H7VL2]、hz515H7VH1 D76N VL2.1[=hz515H7VL2.1]、hz515H7 VH1 D76N VL2.2[=hz515H7VL2.2]和hz515H7 VH1 D76N VL2.3[＝hz515H7VL2.3]）在4°C在黑暗中于100μl Facs缓冲液中孵育20min。以Facs缓冲液洗涤三次后，用二抗（羊抗人Alexa488（1/500稀释））在4°C在黑暗中孵育细胞20分钟。以Facs缓冲液洗涤三次后，在各孔中加入碘化丙啶，只有活细胞通过Facs分析。至少5000个活细胞进行了评估，以评价每个条件的荧光强度的平均值。
图29A-29C提供了这些结合研究的结果（通过FACS获得的平均荧光强度（MFI）），显示抗CXCR4人源化Mab hz515H7特异性结合人CXCR4-NIH3T3转染细胞系（图29A）（MFI=2.2，具有NIH3T3亲代细胞），并识别人癌细胞系，例如U937（图29B）和Ramos（图29C）。
实施例24：抗CXCR4人源化Mab 515H7对表达野生型CXCR4受体的细胞膜上[35S]GTPγS结合的调节
该功能性分析能够监测通过野生型人CXCR4受体的G蛋白激活及抗CXCR4人源化Mab 515H7对其的调节。
如上述实施例中对于CHO-K1细胞所描述的，获得了稳定地和组成性表达野生型CXCR4受体的NIH-3T3细胞。在机械性粉碎在裂解缓冲液[Hepes 20mM,pH7.4,NaCl 150mM]中，并进一步离心（10000g,15min）时获得的细胞膜上进行[35S]GTPγS结合。使用SPA技术（闪烁亲近测定法-GE Healthcare）进行[35S]GTPγS（比活度：1000Ci/mmol）的掺入和检测。简言之，将细胞膜（10μg/孔）与评价的化合物（SDF-1和目的Mab）、[35S]GTPγS（0.2-0.4nM）和最后与SPA-WGA-PVT珠子（7.3mg/孔）一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,GDP 3μM，MgCl210mM，NaCl100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中孵育。在25℃下，在1小时期间进行结合反应。离心[1000g，10min.]，在闪烁计数器（TopCount,Perkin Elmer）中测量放射性计数。对于每种Mab计算IC50。
在这些实验条件下，NIH3T3/CXCR4细胞中测定的人源化（hz）515H7 Mab的IC50为：对于hz515H7 VH1 D76N VL2Mab（图30A）是3.86nM、对于hz515H7VH1 D76N VL2-1Mab（图30B）是4.05nM、对于hz515H7 VH1 D76N VL2-2Mab（图30C）是5.19nM以及对于hz515H7 VH1 D76N VL2-3Mab（图30D）是8.5nM。
hz515H7Mab还能够抑制SDF-1（100nM）刺激的[35S]GTPγS结合，对于hz515H7VH1 D76N VL2Mab抑制%为86%、对于hz515H7 VH1 D76N VL2-1Mab是69%、对于hz515H7 VH1 D76N VL2-2Mab是66%、对于hz515H7 VH1 D76NVL2-3 Mab是58%（图31）。
实施例25：通过生物发光共振能量转移（BRET）分析的CXCR4与不同相互作用配偶体的结合：同源二聚化和异源二聚化，β抑制蛋白的募集，及人源化Mab 515H7对这些二聚体的作用
该功能性分析能够评价当SDF-1和/或515H7人源化Mab以CXCR4同源二聚体和CXCR2/CXCR4异源二聚体形成的水平结合CXCR4受体以及β抑制蛋白-2信号转导蛋白募集时诱导的构象变化。
通过应用常规分子生物学技术，将每个研究的相互作用配偶体的表达载体构建成具有相应染料（海肾荧光素酶，Rluc和黄色荧光蛋白，YFP）的融合蛋白。在进行BRET实验前两天，用编码如下相应BRET配偶体的表达载体瞬时转染HEK293细胞：研究CXCR4同源二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP]、研究CXCR4和CXCR2异源二聚化的[CXCR4/Rluc+CXCR2-YFP]和研究CXCR4介导的β抑制蛋白-2募集的[CXCR4-Rluc+β-arr2-YFP]。第二天，将细胞分配在聚赖氨酸预包被的白色96MW板中的完全培养基[补充有10%FBS的DMEM]中。在37℃下，用5%CO2首先培养细胞，以使细胞粘附该板。然后，以200μl的DMEM/孔使细胞饥饿过夜。在BRET实验之前，立即除去DMEM，并用PBS快速洗涤细胞。然后，在存在或不存在抗体下，在37℃下，将细胞在PBS中孵育15分钟，之后加入有或无SDF-1 100nM的腔肠素H 5μM，最终体积50μl。仅仅对同源二聚体和异源二聚体，在37℃下孵育5分钟和在室温下进一步孵育20分钟之后，使用MithrasLB940多标记读数器（Berthold）（1s/波长/孔，在室温下重复15次）开始在485nm和530nm的光发射采集。
如前所述（Angers等人，2000）进行BRET比例的计算：[（发射530nm）-（发射485nm）×Cf]/（发射485nm），其中对于相同的实验条件下单独表达Rluc融合蛋白的细胞，Cf=（发射530nm）/（发射485nm）。简单化该方程式显示出BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的比例530/485nm，以该测定中仅仅存在融合Rluc的配偶体时，相同实验条件下获得的比例530/485nm进行校正。为了易读起见，将结果以milliBRET单位（mBU）表示；mBU对应于BRET比例乘以1000。
由融合CXCR4受体的供体和受体蛋白的空间接近性引起SDF1（100nM）增加BRET信号约12%，这可能表明CXCR4/CXCR4同源二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化（图32A）。令人感兴趣的是，由融合CXCR4和CXCR2的供体蛋白和受体蛋白的空间接近性引起SDF1（100nM）降低BRET信号约16%，这或许也表明CXCR2/CXCR4异源二聚体形成或先前存在的二聚体的构象变化（图32B）。在后者情况下，SDF-1激活的CXCR4/CXCR2的构象似乎对于BRET能量转移较不利。在两种情况下，515H7人源化Mab能够调节SDF-1诱导的CXCR4同源二聚体的构象变化，对于hz515H7 VH1 D76N-VL2 Mab，SDF-1诱导的BRET增加的抑制百分比约88%、对于hz515H7 VH1 D76N-VL2.1 Mab是65%、对于hz515H7 VH1 D76N-VL2.2 Mab是33%、对于hz515H7 VH1 D76N-VL2.3 Mab是21%（图32A），以及对于CXCR2/CXCR4异源二聚体，对于hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab，SDF-1诱导的BRET降低的抑制百分比约100%、对于hz515H7VH1 D76N-VL2.1、hz515H7 VH1 D76N-VL2.2和hz515H7 VH 1D76N-VL2.3 Mab是50%（图32B）。515H7人源化Mab其自身也能够分别调节CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4的空间接近性，表明这些Mab对于CXCR4/CXCR4同源二聚体和CXCR2/CXCR4异源二聚体构象都存在影响（图32A和32B）。
SDF-1（100nM）对CXCR4的激活引起强的细胞内信号转导分子β抑制蛋白的募集，如BRET信号增强390%所示（图32C）。该募集部分地被515H7人源化Mab抑制，对于hz515H7 VH1 D76N-VL2 Mab约94%抑制、对于hz515H7 VH1D76N-VL2.1 Mab为81%、对于hz515H7 VH1 D76N-VL2.2 Mab为82%和对于hz515H7 VH1 D76N-VL2.3 Mab为71%（图32C），显示出这些Mab对信号转导的作用。
实施例26：免疫组织化学研究（IHC）
切片进行脱蜡处理、再水化，在预热98°C EDTA pH8中放置7分钟以便热诱导的表位修复。在Tris缓冲盐-0.05%吐温20（TBS-T）（Dako S3006）中洗涤三次后，使用过氧化物酶阻断剂（Dako K4007）阻断内源性过氧化物酶活性持续5分钟。在使用作为对照的抗CXCR-4鼠单克隆抗体（50μg/ml，克隆515H7，PierreFabre）或鼠IgG1/kappa（50μg/ml,X0931,Dako）4°C孵育过夜之前，用TBS-T洗涤切片并在阻断剂（UltraV block-TA-125UB-LabVision）中孵育5分钟。用TBS-T洗涤切片并用Envision Dual Link在室温下孵育1小时。二氨基联苯胺用于棕色反应产物的显色（Dako K3468）。玻片浸入苏木精（Dako S3309）4分钟进行复染，在装到Faramount封固介质及盖玻片（Faramount mounting medium plus coverslipe）之前，在PBS中洗涤。在这种免疫组织化学程序中，棕色反应产物与细胞膜的阳性染色相关，缺失棕色反应产物与阴性染色和未见细胞膜相关。
抗CXCR4鼠单克隆抗体，克隆515H7，对各种肿瘤类型的细胞膜差别染色。图33和34说明在2个异种移植物模型中进行的染色，其中对于515H7已经描述了抗肿瘤活性：RAMOS和KARPAS299。如图33和34所示，获得的染色是定影剂依赖性的。的确，当组织是福尔马林固定的时，膜染色更弱（图34a和34c），然而，当使用Glyo-fixx（福尔马林的替代品）时，膜染色显著增加（图33a和33c）。
实施例27：抗CXCR4人源化Mab 515H7对稳定地表达人CXCR4受体的CHO-K1膜上的[125I]SDF-1的竞争性结合
该测定能够评价人源化Mab 515H7在正构或变构结合位点上，竞争放射标记的[125I]SDF-1对人CXCR4受体结合的能力。
稳定地和组成性表达人CXCR4受体的CHO-K1细胞是用带有人CXCR4受体的全部编码序列（RefSeq NM_003467）的哺乳动物表达载体转染原态CHO-K1细胞（ATCC CCL-61）时获得的。将细胞在完全培养基[补充有5%胎牛血清（FCS）和500μg/ml的遗传霉素的DMEM-Ham’s F12]中繁殖。放射性配体结合实验是将CHO/CXCR4细胞机械性粉碎在裂解缓冲剂[Hepes 20mM，pH 7.4，NaCl 150mM]中，接着离心（10000g,15min）时获得的细胞膜上进行的。使用SPA技术（闪烁亲近测定法-GE Healthcare）进行[125I]SDF-1结合（比活度：1500Ci/mmol）。简言之，将细胞膜（30μg/孔）与评价的化合物（SDF-1或mAb）、放射性配体（1nM）和最后与SPA-WGA-PVT珠子（7.3mg/孔）一起在结合缓冲液[Hepes 20mM,pH 7.4,CaCl21mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中孵育。在25℃下1小时之后，达到结合平衡。离心[1000g，10分钟]，在闪烁计数器（TopCount,Perkin Elmer）中测量放射性计数。在10μM未标记的SDF-1的存在下，评价非特异性（NS）结合。
抗CXCR4 Mab有效地竞争[125I]SDF-1结合，具有下述状态次序的竞争功效（[125I]SDF-1的抑制%）：hz515H7 VH1 D76N VL2（77%）、hz515H7 VH1 D76NVL2.1（68%）、hz515H7 VH1 D76N VL2.2（61%）和hz515H7 VH1 D76N VL2.3（49%）（图35A）。
Hz515H7Mab剂量依赖性抑制了[125I]SDF-1结合，对于hz515H7 VH1 D76NVL2 Mab，IC50为1.44nM（图35B）、对于hz515H7 VH1 D76N VL2.1 Mab为6.69nM（图35C）、对于hz515H7 VH1 D76N VL2.2 Mab为5.91nM（图35D）。
实施例28：CXCR4受体介导的细胞内钙贮存的动员
该功能性分析设计用于监测通过刺激磷脂酶C途径、诱导来自内质网的细胞内贮存的钙释放的CXCR4受体信号转导。
U937（人白血病）细胞在完全培养基[补充有10%FCS、20mM HEPES、1%非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠、1%L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖的RPMI 1640]中繁殖。将细胞涂布于黑色96MW板中的合适的培养基中，密度为100 000个细胞/孔。在进行实验之前，使细胞饥饿过夜。在37℃下30min.，接着在25℃下30min.，使细胞负载加样缓冲液[HBSS 1x,HEPES 20mM,丙磺舒酸25mM]中的荧光钙染料（Fluo-4No Wash,Invitrogen US）。通过直接注射到每个孔中进行SDF-1的刺激。对于拮抗实验，在加入SDF-1之前至少10min.，将10μl的Mab溶液直接加入加样缓冲液中。使用下述设置，在多模式荧光微量板读数器Mithras LB940（Berthold）上进行动力学荧光测量：在485nm下激发，在535nm下发射，激发能为10000个任意单位。在每一秒的0.1秒期间记录每孔中的荧光，在SDF-1注射之前，记录20秒的时期（基础信号）。然后，注射20μl的SDF-1，数据记录持续2min的时期。每个实验条件进行一式双份。首先通过减去基础荧光和没有细胞的对照孔发射的荧光校正每孔的值。相对数据可以表示为SDF-1（100nM）获得的最大刺激的百分比。
SDF1（100nM）诱导U397细胞中细胞内钙的快速和强的释放。最大强度达到超过基础荧光的＞340%，并且当SDF-1刺激时在约40秒处观察到。hz515H7VH1 D76N VL2 Mab（133nM）在U397细胞系中产生对SDF-1（100nM）诱导的钙信号的部分抑制（图36，其中所述Mab正是附图标记中的hz515H7 VL2）。
实施例29：抗CXCR4人源化Mab hz515H7对SDF-1诱导的U937细胞迁移的作用
为了评价抗CXCR4人源化Mab hz515H7 VH1 D76N VL2（称为hz515H7）对迁移过程的抑制作用，用10μg/ml抗体在含有2%FBS的RPMI1640培养基中在37°C下在5%CO2中孵育U937细胞。总共5x104细胞置于透孔（transwell）小室上部（Corning Lowell,MA,USA）。在小室的下部，在含有2%FBS的培养基中加入SDF-1（100ng/ml）。将细胞接种至小室上部2小时后，通过计数从透孔小室迁移的细胞数目测量U937细胞的迁移。使用CellTiter-
Figure BDA00002425225000691
发光细胞活力分析计数迁移的细胞，该分析基于ATP的定量测量培养物中的活细胞数目。
图37A中呈现的结果说明，正如所预期的，SDF-1能够诱导U-937细胞迁移的显著增加。当用IgG1同种型对照孵育细胞时，没有观察到作用。相反，图37A显示通过10μg/ml hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab的SDF-1诱导的U-937细胞迁移的抑制。结果代表一式三份进行的三个独立实验的平均值+/-SD。
图37B代表hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab对SDF-1诱导的细胞迁移的剂量范围的作用。结果代表4个独立实验的平均值+/-SEM（IC50=4.5310-3μg/ml+/-2.210-3）。
实施例30：hz515H7 VH1 D76N VL2的免疫组织化学研究（IHC）
切片进行脱蜡处理、再水化，在预热98°C EDTA pH8中放置7分钟以便热诱导的表位修复。在Tris缓冲盐-0.05%吐温20（TBS-T）（Dako S3006）中洗涤三次后，使用过氧化物酶阻断剂（Dako K4007）阻断内源性过氧化物酶活性持续5分钟。在使用作为同种型对照的生物素化人源化抗CXCR4抗体（50μg/ml，hz515H7VH1 D76N VL2，Pierre Fabre）或生物素化人IgG1（50μg/ml,BP078,The BindingSite）4°C孵育过夜之前，用TBS-T洗涤切片并在阻断剂（UltraV block-TA-125UB-LabVision）中孵育5分钟。用TBS-T洗涤切片并用链霉亲和素HRP在室温下孵育1小时。二氨基联苯胺用于棕色反应产物的显色（Dako K3468）。玻片浸入苏木精Dako S3309）4分钟进行复染，在装到Faramount封固介质及盖玻片（Faramountmounting medium plus coverslipe）之前，在PBS中洗涤。在这种免疫组织化学程序中，棕色反应产物与细胞膜的阳性染色相关，缺失棕色反应产物与阴性染色和未见细胞膜相关。
生物素化抗CXCR4人源化抗体515H7 VH1 D76N VL2对各种肿瘤类型的细胞膜差别染色。图38和39说明在2个异种移植物模型中进行的染色，其中当用515H7处理的小鼠时描述了抗肿瘤活性：RAMOS和KARPAS299。如图38和39所示，获得的染色是定影剂依赖性的。的确，当组织是福尔马林固定的时，膜染色较弱（图39a和39c），然而，当使用Glyo-fixx（福尔马林的替代品）时，膜染色显著增加（图38a和38c）。
实施例31：在Scid小鼠中，嵌合515H7（c515H7）、人源化形式hz515H7VH1D76N VL2和hz515H7 VH1 D76N VL2.1 Mab对B细胞Ramos异种移植肿瘤生长的作用
来自ATCC的Ramos细胞常规培养于RPMI 1640培养基、10%FCS和2mML-Glu中（Sigma,St Louis MD,USA）。在移植物移入之前，将细胞分离48小时，以便使其处于指数生长期。将在PBS中的一千万个Ramos细胞皮下移植到7周龄雌性SCID小鼠（Charles River,France）中。在植入五天之后，肿瘤是可测量的（平均100mm3），将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的6只小鼠的组。腹腔内注射2mg/小鼠加载剂量的Mab c515H7、hz515H7 VH1D76N VL2或hz515H7 VH1 D76N VL2.1处理小鼠。然后，给小鼠注射1mg/剂量/小鼠的Mabc515H7、hz515H7 VH1D76N VL2或hz515H7 VH1 D76N VL2.1，每周2次。在该实验中，引入PBS组作为对照组。每周测量肿瘤体积两次，并通过下式计算：π/6×长度×宽度×高度。使用Mann-Whitney检验进行每个测量的统计分析。
在这些实验中，处理期间没有观察到死亡。与PBS组相比，对于c515H7 Mab（Figure 40）、hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab（图41）和hz515H7 VH1 D76N VL2.1（图42）1mg/剂量，D11和D54之间存在显著的肿瘤生长抑制，处理4周后，与PBS组相比，对于用c515H7和hz515H7 Mab处理的小鼠，平均肿瘤体积减小了92%。
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Claims (26)

1.一种人源化抗体重链，其具有由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3组成的CDR，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包括序列SEQ ID No.4、5和6。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体重链，其特征在于其包括选自SEQ IDNo.10、11、12、13、85或87的序列的可变区。
3.根据权利要求1或2所述的人源化抗体重链，其特征在于其包括选自SEQID No.21、22、23、24、89或91的完整序列。
4.一种人源化抗体轻链，其具有由CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成的CDR，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别包括序列SEQ ID No.7、8和9。
5.根据权利要求4所述的人源化抗体轻链，其特征在于其包括选自SEQ ID No.14、15、16、17、18、19、20、86或88的序列的可变区。
6.根据权利要求4或5所述的人源化抗体轻链，其特征在于其包括选自SEQID No.25、26、27、28、29、30、31、90或92的完整序列。
7.一种人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于所述人源化抗体包括重链和轻链，所述重链具有由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3组成的CDR，以及所述轻链具有由CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成的CDR，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别包括序列SEQ ID No.4、5和6以及所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别包括序列SEQ ID No.7、8和9。
8.根据权利要求7所述的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括选自SEQ ID No.10、11、12、13、83、85或87的序列的重链可变区，以及选自SEQ ID No.14、15、16、17、18、19、20、84、86或88的序列的轻链可变区。
9.根据权利要求7或8所述的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括选自SEQ ID No.21、22、23、24、89或91的序列的重链以及选自SEQ ID No.25、26、27、28、29、30、31、90或92的序列的轻链。
10.根据权利要求7所述的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其选自：
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.11的重链可变区以及序列SEQ IDNo.16的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.22的重链以及序列SEQ ID No.27的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.11的重链可变区以及序列SEQ IDNo.17的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.22的重链以及序列SEQ ID No.28的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.11的重链可变区以及序列SEQ IDNo.18的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.22的重链以及序列SEQ ID No.29的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.11的重链可变区以及序列SEQ IDNo.19的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.22的重链以及序列SEQ ID No.30的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.12的重链可变区以及序列SEQ ID No.14的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.23的重链以及序列SEQ ID No.25的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.12的重链可变区以及序列SEQ ID No.15的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.23的重链以及序列SEQ ID No.26的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.10的重链可变区以及序列SEQ ID No.14的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.21的重链以及序列SEQ ID No.25的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.10的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.21的重链以及序列SEQ ID No.92的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.11的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.22的重链以及序列SEQ ID No.92的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.12的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.23的重链以及序列SEQ ID No.92的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.13的重链可变区以及序列SEQ ID No.88的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.24的重链以及序列SEQ ID No.92的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.14的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.25的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.15的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.26的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.16的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.27的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.17的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.28的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.18的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.29的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.19的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.30的轻链；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.87的重链可变区以及序列SEQ ID No.20的轻链可变区；
-人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括序列SEQ IDNo.91的重链以及序列SEQ ID No.31的轻链。
11.一种分离的核酸分子，其特征在于其选自如下核酸：
a）核酸，DNA或RNA，其编码根据权利要求1、2或3任一项所述的人源化抗体重链或其衍生化合物或功能片段；
b）核酸，DNA或RNA，其编码根据权利要求4、5或6任一项所述的人源化抗体轻链或其衍生化合物或功能片段；
c）核酸，DNA或RNA，其编码根据权利要求7至10任一项所述的人源化抗体或其衍生化合物或功能片段；
d）如a）、b）或c）中定义的核酸的互补核酸；
e）至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨的条件下与包括核酸序列SEQ IDNo.38至41、49至52、93或95的重链的三个CDR的至少一个杂交；
f）至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨的条件下与包括核酸序列SEQ IDNo.42至48、53至59、94或96的轻链的三个CDR的至少一个杂交。
12.根据权利要求11所述的分离的核酸分子，其包括选自如下的核酸序列：
-编码人源化抗体重链可变区的核酸序列，所述重链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.32的CDR-H1核苷酸序列、SEQ ID NO.33的CDR-H2核苷酸序列以及SEQ ID NO.34的CDR-H3核苷酸序列；
-编码人源化抗体轻链可变区的核酸序列，所述轻链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.35或60的CDR-L1核苷酸序列、SEQ ID NO.36或61的CDR-L2核苷酸序列以及SEQ ID NO.37或62的CDR-L3核苷酸序列；以及
-编码人源化抗体重链可变区和轻链可变区核酸序列的核酸序列，
i）所述重链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.32的CDR-H1核苷酸序列、SEQ ID NO.33的CDR-H2核苷酸序列以及SEQ ID NO.34的CDR-H3核苷酸序列；以及
ii）所述轻链可变区核苷酸序列包括SEQ ID NO.35或60的CDR-L1核苷酸序列、SEQ ID NO.36或61的CDR-L2核苷酸序列以及SEQ ID NO.37或62的CDR-L3核苷酸序列。
13.一种载体，其包含根据权利要求11或12任一项所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其包括根据权利要求13所述的载体。
15.一种转基因动物，除了人类，其包括被权利要求14所述的载体所转化的细胞。
16.一种生产人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
-在培养基中和合适的培养条件下培养根据权利要求14所述的宿主细胞；和
-从培养基中或从所述培养细胞中回收如此产生的所述抗体或其功能片段之
17.根据权利要求7至10任一项所述的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段作为药物的用途。
18.一种组合物，其包括由根据权利要求1至3所述的人源化抗体重链和/或根据权利要求4至6所述的人源化抗体轻链组成的化合物作为活性成分。
19.根据权利要求18所述的组合物，其包括由根据权利要求7至10和17任一项所述的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段组成的化合物作为活性成分。
20.根据权利要求18或19所述的组合物，其特征在于其另外包括作为用于同时、分开或延长方式使用的联合产品的不同于抗CXCR4抗体的抗肿瘤抗体。
21.根据权利要求18至20任一项所述的组合物，其特征在于其另外还包含作为联合或缀合产品用于同时、分开或延长方式使用的细胞毒性剂/细胞增殖抑制剂、细胞毒素和/或放射性同位素。
22.根据权利要求18至21任一项所述的组合物作为药物的用途。
23.根据权利要求1至3任一项所述的人源化抗体重链和/或根据权利要求4至6任一项所述的人源化抗体轻链和/或根据权利要求7至10或17任一项所述的人源化抗体或其衍生化合物或功能片段、和/或根据权利要求18至22任一项所述的组合物，用于预防或治疗癌症。
24.根据权利要求23所述的人源化抗体重和/或轻链和/或人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段、和/或组合物，其特征在于所述癌症是选自如下的癌症：前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌和结肠癌。
25.一种体外检测受试者中表达CXCR4的肿瘤的存在和/或位置的方法，其中所述方法包括步骤：
（a）用根据权利要求1至3任一项所述的人源化抗体重链和/或根据权利要求4至6任一项所述的人源化抗体轻链和/或根据权利要求7至10或17任一项所述的人源化抗体或其衍生化合物或功能片段接触来自受试者的样本，以及
（b）检测所述抗体与样本的结合。
26.一种试剂盒，其至少包括根据权利要求1至3任一项所述的人源化抗体重链和/或根据权利要求4至6任一项所述的人源化抗体轻链和/或根据权利要求7至10或17任一项所述的人源化抗体或其衍生化合物或功能片段，所述抗体优选是标记的。
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