KR20130012132A - 암의 치료를 위한 인간화 항-cxcr4 항체들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CXCR4에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 CXCR4 호모이중체들 및/또는 헤테로이중체들의 입체형태적 변화를 유도할 수 있는 새로운 분리된 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 CXCR4에 특이적인 hz515H7 항체들 뿐만 아니라 암의 치료를 위한 그들의 용도에 관한 것이다. 이러한 항체들로 구성되는 약제학적 조성물들 및 이러한 항체들을 선별하는 방법도 또한 포괄된다.

Description

암의 치료를 위한 인간화 항-CXCR4 항체들 {Humanized anti-CXCR4 antibodies for the treatment of cancer}
본 발명은 케모카인 수용체 (CXCR)들에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 항체, 상세하게는 인간화 단일클론 항체 뿐만 아니라 이러한 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열들에 관한 것이다. 한 가지 관점으로, 본 발명은 CXCR4 에 특이적으로 결합할 수 있고 강한 항-종양 활성들을 가지는 새로운 항체, 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들에 관한 것이다. 또한 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료적 처치를 위한 약물로서 뿐만 아니라 암의 진단과 관련된 방법들 또는 키트들에서 이러한 항체의 용도를 포함한다. 마지막으로, 본 발명은 항체들, 독소들, 세포독성/세포증식억제 제제들과 같은 기타 항암 화합물(들)과 조합 또는 결합시킨 이러한 항체를 포함하는 조성물들, 또한 소정의 암들의 예방 및/또는 치료를 위한 그들의 용도를 포함한다.
케모카인들 (chemokines)은. 케모카인 구배 (chemokine gradient)라고 알려져 있는 리간드의 화학적 구배를 따라 특히 면역 반응 시 백혈구의 이동을 조절하는 작은 분비 단백질이다 (Zlotnick A. et al., 2000). 그들은 NH2-말단 시스테인 잔기들의 위치를 기초로 하여 두 가지의 주요 서브패밀리, CC 및 CXC로 분류되고, G 단백질과 연결된 수용체들에 결합하여 이들의 두 가지 주요 서브패밀리들은 CCR 및 CXCR이라고 명명된다. 지금까지 50가지 이상의 인간 케모카인들 및 18가지의 케모카인 수용체들이 발견되어 왔다.
많은 암들은 종양의 면역세포 침윤뿐만 아니라 종양세포 성장, 생존, 이동 (migration) 및 혈관형성 (angiogenesis)에 영향을 주는 복잡한 케모카인 연결망 (network)를 가진다. 면역세포, 내피세포 및 종양세포는 스스로 케모카인 수용체들을 발현시키고 케모카인 구배들에 반응할 수 있다. 인간 암 생검 시료와 마우스 암 모델의 연구는 암 세포의 케모카인-수용체 발현이 전이 능력 (metastatic capacity)의 증가와 관련된 점을 보여준다. 서로 다른 암 유형들로부터 나온 악성 (malignant) 세포들은 서로 다른 케모카인-수용체 (chemokine-receptor) 발현의 프로파일들을 가지지만, 케모카인 수용체 4 (CXCR4)는 가장 공통적으로 발견되고 있다. 표피 (epithelial), 중간엽 (mesenchymal) 및 조혈 (haematopoietic) 기원의 적어도 23가지 서로 다른 유형들의 인간 암들로부터 나온 세포들이 CXCR4 수용체를 발현한다 (Balkwill F. et al ., 2004).
케모카인 수용체 4 [퓨신 (fusin), CD184, 레스터 (LESTR) 또는 험스터 (HUMSTR)라고도 알려져 있음]는 352개 또는 360개의 아미노산들을 포함하는 두 가지 이소형들로서 존재한다. Asn 11번 잔기는 당화되고 (glycosylated) Tyr 21번 잔기는 설페이트기의 부가에 의해 변형되어 있으며 Cys 109번 및 186번은 수용체의 세포외 (extracellular) 부분 상에 디설파이드 연결 (disulfide bridge)로 결합되어 있다 (Juarez J. et al., 2004).
본 수용체는 서로 다른 종류의 정상 조직들, 그대로의 (naive) 비-메모리 T-세포, 조절 T-세포, B-세포, 호중성구, 내피세포, 일차 단핵구, 가지세포 (dendritic cells), 자연 킬러 세포, CD34+ 조혈 줄기세포에 의해, 또한 낮은 수준으로는 심장, 결장, 간, 신장 및 뇌에서 발현된다. CXCR4는 백혈구 포집 (trafficking), B 세포 백혈구형성 (lymphopoiesis) 및 골수형성 (myelopoiesis)에서 중요한 역할을 한다.
CXCR4 수용체는, 이에 제한되는 것은 아니지만 결장 (Ottaiano A et al ., 2004), 유방 (Kato M. et al., 2003), 전립선 (Sun Y. X. et al., 2003), 폐 [소세포- 및 비-소세포 암종 (Phillips R. J. et al., 2003)], 난소 (Scotton C. J. et al., 2002), 췌장 (Koshiba T. et al., 2000), 신장, 뇌 (Barbero S. et al., 2002), 아교모세포종 (glioblastoma) 및 림프종 (lymphomas)을 포함하는 많은 암들에서 과다-발현 (over-express)된다.
지금까지 기술된 CXCR4 수용체의 유일한 리간드는 간질세포-유래 인자-1 (Stromal-cell-derived factor-1, SDF-1) 또는 CXCL12 이다. SDF-1은 림프절, 골수, 간, 폐에서 다량 분비되고, 보다 소량으로는 신장, 뇌 및 피부에 의해 분비된다. 또한 CXCR4는 제 Ⅲ형 인간 허피스바이러스에 의해 인코딩되는 길항적 케모카인 (antagonistic chemokine)인 바이러스성 대식세포 염증 단백질 Ⅱ (vMIP-Ⅱ)에 의해 인식된다.
CXCR4/SDF-1 주축 (axis)은 암에서 중요한 역할을 하고, 전이를 유도하는 이동, 침투에 직접적으로 관여되어 있다. 따라서, 암 세포들은 CXCR4 수용체를 발현하고, 그들은 이동하여 전신적 순환 (systemic circulation)에 들어간다. 다음으로 암세포들은 높은 수준의 SDF-1를 생산하는 기관의 혈관 베드에 정지하게 되고 여기에서 그들은 증식하고 혈관형성을 유도하며 전이성 종양을 형성한다 (Murphy P. M., 2001). 본 주축은 또한 세포외-신호-조절된 키나제 (ERK) 경로의 활성화를 통한 세포 증식 (Barbero S. et al ., 2001) 및 혈관형성 (Romagnani P., 2004)에도 관여한다. 따라서, CXCR4 수용체 및 그의 리간드 SDF-1은 이후에 CXCR4/SDF-1의 발현을 증가시키는 VEGF-A 발현을 촉진시킴으로써 혈관형성을 확실하게 촉진시킨다 (Bachelder R. E. et al ., 2002). 또한 종양 관련된 대식세포 (tumor associated macrophages, TAM)가 종양의 저산소 (hypoxic) 영역에 축적되었고, 자극되어 종양세포와 협력하고 혈관형성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 저산소증 (hypoxia)이 TAM을 포함한 다양한 세포 유형에서 CXCR4의 발현을 선택적으로 상승-조절하는 (up-regulate) 것이 관찰되었다 (Mantovani A. et al., 2004). 최근에는 CXCR4/SDF-1 주축이 CXCR4+ 조혈 줄기/전구체 세포 (HSC)의 운반 (trafficking)/회귀 (homing)를 조절하고 신생혈관증식 (neovascularization)에서 역할을 담당할 수 있는 것으로 기술되어 왔다. HSC 이외에 기능적 CXCR4도 역시 다른 조직으로부터 나온 줄기세포 (조직-고정 줄기세포 = TCSCs) 상에서 발현되어 기관/조직 재생에 필요한 CXCR4+ TCSCs를 화학적 유도하는 데 결정적인 역할을 할 수 있지만, 이들 TCSC도 또한 암 발생의 세포성 기원이 될 수 있는 것 (암 줄기세포 이론)을 증거로 보여준다. 암 줄기세포 기원은 인간 백혈병에 대해 또한 최근에는 뇌 및 유방과 같은 몇 가지의 고형 종양에 대해 기술되었다. 백혈병, 뇌 종양, 소세포 폐암, 유방암, 간모세포종 (hepatoblastoma), 난소 및 자궁경부 암과 같은 정상 CXCR4+ 조직/기관-특이 줄기세포로부터 유래할 수 있는 CXCR4+ 종양의 몇 가지 예가 있다 (Kucia M. et al ., 2005).
CXCR4 수용체로의 간섭에 의해 암 전이를 표적하는 것 (targeting cancer metastasis)이 CXCR4 수용체에게로 유도되는 (directed against) 모노클론 항체를 사용하여 생체내 (in vivo)에서 전시되었다 (Muller A. et al ., 2001). 간략하게, CXCR4 수용체에게로 유도되는 모노클론 항체 (Mab 173 R&D 시스템사)는 SCID 마우스의 동소적 (orthotopic) 유방암 모델 (MDA-MB231)에서 림프절 전이의 숫자를 유의하게 감소시켰던 것을 보여주었다. 또한 또 다른 연구도 SDF-1에 대한 폴리클론 항체를 사용하여 동소적 폐 암종 모델 (A549)에서 전이에서의 SDF-1/CXCR4 주축의 결정적 역할을 보여주었지만, 이 연구 모두에서 종양 성장 또는 혈관형성에 미치는 효과는 전혀 없었다. 여러 다른 연구들도 역시 CXCR4의 siRNAs 이중체 (duplexes)를 사용한 생체내 전이 (Liang Z. et al ., 2005), 생물안정한 (biostable) CXCR4 펩타이드 길항제 (antagonists) (Tamamura H. et al ., 2003), 또는 AMD 3100 (Rubin J. B. et al ., 2003; De Falco V. et al ., 2007)나 Mab (국제특허출원 제 WO2004/059285 A2호)와 같은 CXCR4의 소분자 길항체를 사용한 생체내 종양 성장의 저해에 대해 기술하였다. 따라서, CXCR4는 암에 대한 입증된 치료적 표적 (therapeutic target)이다.
또 다른 케모카인 수용체인 케모카인 수용체 2 (chemokine receptor 2, CXCR2)도 역시 종양학에서 흥미로운 표적으로서 기술되고 있다. 따라서, CXCR2는 여러 종양세포 유형에서 자가분비 (autocrine) 세포성장 신호를 전달하고 또한 혈관생성을 촉진시킴으로써 직접적으로 종양 성장에 영향을 줄 수 있다 (Tanaka T. et al ., 2005).
CXCR2 케모카인 수용체는 360개 아미노산으로 구성된다. 이것은 주로 내피세포에서 특히 신생혈관 형성 시 발현된다. 다수의 케모카인이 ERL+ 전-혈관형성 (pro-angiogenic) 케모카인에 속하는 CXCR2 수용체: CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-α,-β 및 -γ와 결합한다. 이 CXCR2 수용체는 CXCR4 수용체와 서열 상동성 (sequence homology)을 공유한다: 37% 서열 일치도 (sequence identity) 및 48% 서열 상동성. CXCR2/리간드 주축은 전이 (Singh R. K. et al ., 1994), 세포 증식 (Owen J. D. et al ., 1997)과 같은 여러 종양 성장 기작에 또한 ERL+ 케모카인-매개성 (chemokine-mediated) 혈관형성 (Strieter R. M. et al ., 2004; Romagnani et al., 2004)에 관여한다. 마지막으로, 종양-관련 대식세포 및 호중성구는 염증-유도성 종양 성장의 중요한 요소이고, CXCL5, IL-8 및 GRO-α은 호중성구 채용 (neutrophile recruitment)을 개시시킨다.
이중합 (dimerization)는 케모카인 수용체가 속하는 G-단백질-연결 수용체의 기능을 조절하기 위한 공통적인 기작으로서 나왔다 (Wang J. and Norcross M., 2008). 케모카인 결합에 반응한 호모- 및 헤테로-이중합는 많은 케모카인 수용체에 의한 신호전달 (signaling)의 개시 및 변화에 필요한 것으로 관찰되어 왔다. 점차 많이 나오고 있는 증거는 수용체 이중체 (dimers) 또는 올리고머 (oligomers)가 아마도 케모카인 수용체의 기본 기능적 단위일 것이라는 개념을 지지하고 있다. 케모카인 수용체 이중체가 리간드 부재 시에 발견되고 있고 케모카인은 수용체 이중체의 입체형태적 변화를 유도한다. CXCR4는 호모이중체 뿐만 아니라 헤테로이중체도, 예를 들어 δ-아편 수용체 (δ-opioid receptor, DOR) (Hereld D., 2008) 또는 CCR2 (Percherancier Y. et al ., 2005)와 함께 형성하는 것으로 알려져 있다. 후자의 예에서는, CXCR4의 막통과 도메인 (transmembrane domains)으로부터 유래된 펩타이드가 이중체의 리간드-유도성 형태 전이 (conformational transitions)를 방해하여 활성화를 저해하였다 (Percherancier Y. et al., 2005). 또 다른 연구는 CXCR4의 막통과 부위의 합성 펩타이드인 CXCR4-TM4 펩타이드가 CXCR4 호모이중체의 프로모터 간 에너지 전달을 감소시키고 악성 세포에서 SDF-1-유도성 이동 및 액틴 다중화 (actin polymerization)를 저해하는 것을 보여주었다 (Wang J. et al ., 2006). 또한 더욱 최근에는, CXCR7이 CXCR4와 기능적 헤테로이중체를 형성하고 SDF-1-유도성 신호전달을 증진시키는 것도 기술되었다 (Sierro F. et al ., 2007). 전신발현 (constitutive) 헤테로이중체의 기타 예로는 CXCR1 및 CXCR2가 상호작용할 뿐만 아니라 각각 호모이중체도 형성하는 것을 보여주는 연구를 들 수 있다. 이들 어느 경우에도 또 다른 GPCR [알파(1A)-아드레노수용체 (adrenoreceptor)]와의 상호작용은 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 CXCR1와 CXCR2의 상호작용의 특이성을 나타낸다 (Wilson S. et al ., 2005).
앞서 언급된 바와 같이, CXCR1 및 CXCR2 수용체들은 흥미로운 종양 표적들이다. 이들 수용체로 간섭하는 것은 종양세포 증식, 혈관형성, 종양세포 이동 및 침투 (invasion), 종양에 의한 호중성구 및 대식세포의 채용을 감소시켜 또한 CXCR4 암 줄기세포를 저해하여 매우 효율적인 방식으로 종양 성장 및 전이 (metastases)를 저해해야 한다.
본 발명의 발명적 관점의 하나는 CXCR4 이중체의 입체형태적 변화 (conformational change)를 유도하는 마우스 모노클론 항체를 생성하는 것이다. 본 발명은 CXCR4 호모이중체 및 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 둘 다를 결합시킬 수 있고 이들의 입체형태적 변화를 유도할 수 있으며 강한 항-종양 활성을 가지는 CXCR4 Mab hz515H7 (또는 그의 단편들)을 포괄한다. 그들은 CXCR4 호모이중체들 상에서 뿐만 아니라 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체들 상에서도 입체형태적 변화를 유도한다. 이러한 새로운 특성은 이들 두 가지 케모카인 수용체들은 암에서 중요한 역할이 주어지기 때문에 암 치료법의 적용에 당연히 흥미로운 것이 된다.
수용체의 호모- 및 헤테로-이중체 둘 다를 표적하는 것은 이미 Mab의 치료적 효과를 증가시키는 것으로 밝혀져 왔다. 따라서, 예를 들어 IGF-1R 및 인슐린/IGF-1 하이브리드 수용체들 둘 다를 표적하는 Mab (h7C10)가 생체내 종양 성장을 저해하는 데 있어 IGF-1R만을 표적하는 Mab보다 더 강력하였던 것이 이미 기술되었다 (Pandini G., 2007).
더우기 항-CXCR4 Mabs hz515H7은 CXCR4에 대한 침묵의 길항제 (silent antagonists)이고, 이것은 시험관내 분석법 (in vitro assays)에서 기저 신호 (basal signal)를 변화시키지 않지만 다른 분석법에서 (GTPγS 결합, cAMP 방출) SDF-1에 의해 유도되는 신호전달을 저해하며, 또한 SDF-1 유도성 종양세포 증식 및 이동도 시험관내에서 저해할 수 있다.
부분적 작동제들 (partial agonists) 또는 역 작동제들 (inverse agonists)로서 작용하는 분자들은 리간드 부재 시 고유의 (intrinsic) 활성을 나타낸다. 이들 유형의 분자들은 심지어 리간드 부재 시라도 고-친화성 또는 저-친화성 GPCR 상태를 각각 안정화시키고 이에 의해 하위 신호전달 연쇄반응 (downstream signalling cascades)을 활성화 시키거나 저해시킨다 (Galandin et al ., 2007; Kenakin, 2004).
hz515H7 Mab의 경우, 이것은 SDF-1 부재 시 CXCR4 수용체에 대한 고유의 활성이 전혀 없는 침묵의 길항제로서 행동한다. 본 약제학적 특성은 아편 수용체 리간드에 대해 이미 관찰된 바와 같이, 부분적 또는 역 작동제에 비해 부작용이 덜 유해한 것과 연관되는 것 같다 (Bosier and Hermans, 2007). 따라서, hz515H7 Mab 기능적 활성은 전체적으로 SDF-1의 존재에 의존하게 되고 CXCR4 수용체 활성의 조정 (modulation)은 SDF-1 리간드가 발현, 분비 또는 혈액 순환에 의해 공급되지 않는 조직 및 기관에서 전혀 관찰되지 않을 것이다. 따라서, hz515H7 Mab는 양성적 또는 음성적 효능을 가지는 다른 CXCR4 수용체 리간드들에 비해 독성을 덜 띠는 것 같다. 또한, 침묵의 길항제는 약제학적 영역에서는 소수인 종류이다 (Wurch et al., 1999; Kenakin, 2004).
놀랍게도, 처음부터 본 발명자들은 CXCR4에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 CXCR4 호모이중체들 및/또는 헤테로이중체들의 형태적 변화도 유도할 수 있는 항체를 생산하려고 시도하여 왔다. 보다 상세하게, 본 발명의 항체는 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 뿐만 아니라 CXCR4 호모이중체의 입체형태적 변화도 유도할 수 있다.
하기 본 명세서에서, 복수의 용어 표현 "CXCR4 이중체 (CXCR4 dimers)"는 CXCR4 호모이중체들 또한 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체들도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 단계에서 이러한 항체가 선행 기술에는 전혀 기술되지 않았던 점은 반드시 언급되어야 한다. 더우기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체들의 존재도 전혀 기술되지 않았던 점이 언급되어야 한다.
본 발명의 일부분은 CXCR4 및 CXCR2에 의해 형성되는 헤테로이중체의 존재가 발견된 것이다.
따라서 상세한 관점에서, 본 발명은 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체를 포함하거나 이로 구성되는 분리된 복합체 (isolated complex)를 기재하고 있다.
상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 CXCR4 화합물 부분은
- 진뱅크 (Genebank) 기탁번호 제 NP_003458호 하에 나타난 바와 같은 서열을 가지는 케모카인 (C-X-C 모티브) 수용체 4 이소형 b [호모 사피엔스] (서열번호 1);
- 진뱅크 기탁번호 제 NP_001008540호 하에 나타난 바와 같은 서열을 가지는 케모카인 (C-X-C 모티브) 수용체 4 이소형 a [호모 사피엔스] (서열번호 2);
- 서열번호 1 또는 2를 가지는 이들 b 또는 a 이소형들의 하나와 적어도 95% 일치도를 가지는 임의적인 전사 스프라이싱 변형체 (transcriptional splice variant) 또는 그의 자연적 변형체; 또한
- 그의 자연적 리간드 간질세포-유래 인자-1 (SDF-1)에 의해 특이적으로 인식될 수 있고 바람직하게는 적어도 100, 150 및 200개 아미노산의 길이를 가지는 그의 단편:
으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 두 가지의 인간 CXCR4 이소형들의 하나이다.
상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 CXCR2 화합물 부분은
- 진뱅크 기탁번호 제 NP_001548호 하에 나타난 바와 같은 서열을 가지는 인터루킨 8 수용체 베타 [호모 사피엔스] (서열번호 3);
- 서열번호 3을 가지는 본 인터루킨 8과 적어도 95% 일치도를 가지는 임의적인 전사 스프라이싱 변형체 또는 그의 자연적 변형체; 또한
- IL-8에 의해 특이적으로 인식될 수 있고 바람직하게는 적어도 100, 150 및 200개 아미노산의 길이를 가지는 그의 단편:
으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 상세한 관점에서, 본 발명은 또한 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 분리된 RNA 또는 DNA를 기재하고 있다.
본 발명은 좀 더 나아가 적어도 하나의 핵산 제작물 (nucleic construct), 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 CXCR4 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터, 또한 두 번째 제작물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 CXCR2 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 관점에서, 본 발명은 좀 더 나아가 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체를 발현하는 재조합 숙주세포를 제조하는 방법을 기재하고 있고, 여기에서 본 방법은 상기 숙주세포를
a) 핵산 제작물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체를 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터로; 또는
b) 적어도 하나의 핵산 제작물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 CXCR4 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터, 및 두 번째 제작물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 CXCR2 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터로:
형질전환시키는 단계를 포함한다.
상기 숙주세포는 포유동물 세포와 같은 진핵세포이다.
상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체를 인코딩하는 핵산 제작물(들)도 역시 luc 마커와 같은 CXCR4 서열과 연관되어 있는 (상세하게는 공유 결합에 의해) 첫 번째 마커, 또한 GFP 마커 (예로, BRET 분석법의 경우)와 같은 CXCR2 서열과 연관되어 있는 (상세하게는 공유 결합에 의해) 두 번째 마커를 인코드한다.
또한 본 발명은 항암 활성을 가지는 화합물을 선별하는 방법, 또는 암의 치료를 위한 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 방법을 기재하고 있고, 상기 방법은
a) 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체를 발현하는 본 발명의 재조합 숙주세포를 테스트할 화합물과 접촉시키고; 또한
b) 본 화합물이 상기 재조합 숙주세포에서 이 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 활성을 조정할 수 있는지 여부, 바람직하게는 저해할 수 있는지 여부를 결정하는:
단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다.
첫 번째 관점에서, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 항체들을 생성하고 선별하는 방법이다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 CXCR4의 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 활성화 둘 다를 저해할 수 있는 항-CXCR4 인간화 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나를 선별하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
i) 생성된 인간화 항체들을 검색하여 CXCR4에 특이적으로 결합하면서도 CXCR4 활성화도 조정할 수 있는 항체들을 선별하고;
ii) 단계 i)의 상기 선별된 항체들을 테스트하여 CXCR4 호모이중체들의 입체형태적 변화를 유도할 수 있는 항체들을 선별하고; 또한 다음으로
iii) 단계 ii)의 상기 선별된 항체들을 테스트하여 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체의 입체형태적 변화를 유도할 수 있는 항체들을 선별한다.
용어 표현 "조정하는 것 (to modulate)"에 의해, 이것은 증가 또는 저해로 이해되어야 한다. 바람직하게, 본 발명의 선별된 항체들은 CXCR4 활성화를 저해해야 한다.
이전에 설명된 바와 같이, CXCR4 이중체들 입체형태적 변화들의 유도는 이러한 항체가 더 많은 환자들의 집단에게 실제적인 이익을 줄 것이기 때문에 본 발명의 중대한 관점이 된다.
예를 들어 면역접종된 마우스 또는 선별된 마이엘로마 세포들과 양립가능한 (compatible) 기타 다른 종 (species)들로부터 나온 비장세포와 마이엘로마 세포의 융합에 의해 분비된 마우스 항체들의 서열결정된 CDRs로부터 설계된 재조합 인간화 항체들로부터 나온 것과 같은 항체의 생산은 당업자가 숙지하고 있는 모든 방법들에 의해서 실현될 수 있다 [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497]. 면역접종된 동물로는 인간 면역글로불린 좌위 (loci)를 가지고 직접적으로 인간 항체들을 생산하는 형질전환 마우스를 포함할 수 있다. 또 다른 가능한 구현예는 라이브러리들을 검색하기 위해 파지 디스플레이 기법들 (phage display technologies)을 사용하는 것으로 구성될 수 있다.
상기 검색하는 단계 i)은 당업자가 숙지하고 있는 방법 또는 공정에 의해 실현될 수 있다. 비제한적인 예로서, 엘라이자 (ELISA), BIAcore, 면역조직화학법 (immunohistochemistry), FACS 분석법 및 기능적 검색법 (functional screens)이 언급될 수 있다. 바람직한 방법은 생산된 항체가 종양 세포 상의 자연 그대로 (native) 수용체도 역시 인식할 수 있을 것인지 확인하기 위하여 CXCR4 형질전환체 상 및 적어도 종양 세포주 상의 FACS 분석법에 의한 검색으로 이루어진다. 본 방법은 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술될 것이다.
용어 표현 "CXCR4 활성화를 조정하는 것 (to modulate CXCR4 activation)"에 의해, 이것은 하기와 같이 마우스 항체의 경우 실시예들 4, 5, 7 및 11, 키메라 항체의 경우 실시예들 16, 17 및 19, 또한 인간화 항체의 경우 실시예들 27, 24 및 28에서 나타낸 활성들의 적어도 하나를 조정하는 것을 의도하고,
바람직하게
- 상세하게는 인간 야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 막과 같은 진핵성 형질전환된 세포의 막 상의 경쟁에 의한, CXCR4 수용체 상의 리간드 SDF-1의 세포막들에 대한 특이적 결합 (실시예 4, 16, 27 참조);
- CXCR4 수용체 상의, 상세하게는 야생형 CXCR4 수용체 막들을 안정적으로 또한 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포들과 같은 진핵성 형질전환된 세포 막 상의 GTPγS의 세포막들에 대한 특이적 결합 (실시예 5, 17, 24 참조);
- cAMP 생산의 CXCR4-매개성 저해 (실시예 7 참조); 또한
- 세포내 저장 칼슘의 CXCR4 수용체-매개성 가동화 (mobilization) (실시예 11, 19, 28 참조):
를 조정하는 것이다.
더욱 바람직하게는, 이들 활성의 적어도 하나의 본 조정은 활성의 저해이다.
본 발명의 선별 방법의 단계 ii) 및iii)의 바람직한 구현예에서, 상기 단계 ii) 및 iii)는 CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP 및 CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP를 각각 발현하는 세포들 상에서 BRET 분석법에 의해 항체들을 평가하여, BRET 신호의 적어도 40%, 바람직하게는 45%, 50%, 55%, 또한 가장 바람직하게는 60%를 저해할 수 있는 항체들을 선별하는 것으로 이루어진다.
BRET 기법은 단백질 이중합 (dimerization)에 있어서 대표적인 것이라고 알려진 기법이다 [Angers et al ., PNAS, 2000, 97: 3684-89].
본 방법의 단계 ii) 및 iii)에 사용된 BRET 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 하기 실시예들에서 상세하게 기술될 것이다. 보다 상세하게는, BERT (생물발광 공명 에너지 전이, Bioluminescence Resonance Energy Transfer)는 생물발광 공여자 [레닐라 루시퍼라제 (Renila Luciferase)(Rluc)] 및 GFP (녹색 형광 단백질, Green Fluorescent Protein) 또는 YFP (노란색 형광 단백질, Yellow Fluorescent Protein) 간에 일어나는 비-방사성 에너지 전이이다. 본 경우에는 EYFP (증진된 노란색 형광 단백질, Enhanced Yellow Fluorescent Protein)가 사용되었다. 전이의 효능 (efficacy of transfer)은 공여자와 수여자 간의 방향 및 거리에 의존한다. 따라서 에너지 전이는 두 개의 분자가 매우 근접한 거리 (1 - 10 nm)에 있는 경우에만 일어날 수 있다. 본 특성은 단백질-단백질 상호작용 분석법 (interaction assay)을 생성하는 데 이용된다. 따라서, 두 개 파트너 간 상호작용을 연구하기 위하여, 첫 번째 파트너는 레닐라 루시퍼라제와 또한 두 번째 파트너는 GFP의 노란색 돌연변이와 유전적으로 융합된다. 융합 단백질은 일반적으로 강제적이 아니더라도 포유동물 세포에서 발현된다. Rluc는 그의 막투과성 기질 [실렌터라진 (coelenterazine)]의 존재 시 파란색 빛을 방출한다. GFP 돌연변이가 Rluc로부터 10 nm 이내로 근접하는 경우 에너지 전이가 일어날 수 있고, 부가적인 노란색 신호이 검출될 수 있다. BRET 신호는 수여자에 의해 방출되는 빛과 공여자에 의해 방출되는 빛 간의 비율로서 측정된다. 따라서 BRET 신호는 두 가지 융합 단백질이 근접하게 될수록 또는 형태적 변화가 Rluc 및 GFP 돌연변이를 근접하게 만드는 경우 증가될 것이다.
BRET 분석법이 바람직한 구현예로 구성되는 경우라면, 당업자라면 숙지하고 있는 방법이라면 모두가 CXCR4 이중체의 입체형태적 변화를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 하기 기법이 이에 제한되지 않고 언급될 수 있다: FRET (형광 공명 에너지 전이, Fluorescence Resonance Energy Transfer), HTRF (균질한 시간에 따른 형광, Homogenous Time resolved Fluorescence), FLIM (형광수명 영상 현미경 분석법, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) 또는 SW-FCCS (단일 파장 형광 교차-상호연관 분광분석법, Single Wavelength Fluorescence Cross-Correlation spectroscopy).
또한 공동-면역침전법 (Co-immunoprecipitation), 알파 검색 (alpha screen), 화학적 교차-연결 (chemical cross-linking), 이중-하이브리드 (Double-Hybrid), 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography), 엘라이자 (ELISA) 또는 파 웨스턴 블럿 (Far western blot)과 같은 다른 고전적인 기법들도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 상세한 관점에서, 단계 ii)는 CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP 둘 다를 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 항체를 평가하여 BRET 신호의 적어도 40%를 저해할 수 있는 항체를 선별하는 것으로 이루어진다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 상세한 관점에서, 단계 iii)는 CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP 둘 다를 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 항체를 평가하여 BRET 신호의 적어도 40%를 저해할 수 있는 항체를 선별하는 것으로 이루어진다.
두 번째 관점에서, 본 발명의 주제는 상기 방법으로 획득된 분리된 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 하나이다. 상기 분리된 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 하나는 인간 CXCR4에 특이적으로 결합할 수 있고, 더구나 필요한 경우 바람직하게는 그의 리간드의 자연적 부착 (natural attachment)을 저해할 수 있으며, 또한 상기 항체는 CXCR4 이중체의 형태적 변화를 유도할 수 있다.
용어 표현 "기능적 단편들 및 유도체들 (functional fragments and derivatives)"는 이후 본 명세서에서 자세하게 정의될 것이다.
본 발명은 자연적 형태의 항체들에 관한 것이 아니라, 다시 말해 그들은 자연 환경에 존재하지는 않지만 자연적 출처들로부터 분리되거나 획득되거나 그 외에도 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있었으며, 하기 좀 더 기술될 바와 같이 그들은 비자연적인 아미노산들도 다시 포함할 수 있는 것으로 본 명세서에서 이해되어야 한다.
보다 상세하게는 본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나가 기술되고 있고, 상기 인간화 항체는 서열번호 4 내지 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDRs로부터 선택되는, IMGT에 따라 정의된 바와 같이 적어도 하나의 상보적 결정 부위 CDR을 포함하는 것을 특징으로 한다.
두 번째 관점에 따르면, 본 발명은 서열번호 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 서열의 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR 또는 그의 서열이 서열번호 4, 5, 6, 7, 8 또는 9의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는, IMGT에 따라 정의된 바와 같이 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 분리된 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
항체의 "기능적 단편 (functional fragment)"은 상세하게 단편들 Fv, scFv [sc = 단일 사슬 (single chain)], Fab, F(ab')2, Fab' 또는 scFv-Fc 단편 또는 다이아체들 (diabodies), 또는 반감기가 연장될 수 있었던 단편이라면 모두와 같은, 부모 항체와 동일한 CXCR4에 대한 특이성을 가지는 항체 단편을 의미한다. 이러한 기능적 단편들은 이후 본 발명의 기술내용에 상세하게 기재될 것이다.
항체의 "유래된 화합물 (derived compound)" 또는 "유도체 (derivative)"는 상세하게 CXCR4를 인식하는 그의 능력을 보존하도록 펩타이드 스캐폴드 및 고유 항체 (original antibody)의 적어도 하나의 CDRs로 구성되는 결합 단백질 (binding protein)을 의미한다. 이러한 유래된 화합물들은 당업자에게 잘 알려져 있고 이후 본 발명의 기술내용에 보다 상세하게 기재될 것이다.
더욱 바람직하게, 본 발명은 유전적 재조합 (genetic recombination) 또는 화학적 합성에 의해 획득된 본 발명에 따른 인간화 항체, 그들의 유래된 화합물들 또는 그들의 기능적 단편들을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들은 모노클론 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.
"모노클론 항체 (monoclonal antibody)"는 거의 균질한 (nearly homogeneous) 항체의 집단으로부터 유래한 항체를 의미하는 것으로 이해된다. 보다 상세하게는, 집단의 개별 항체들은 최소 비율로 발견될 수 있는 자연적으로 발생하는 소수의 가능한 돌연변이를 제외하고는 일치한다. 달리 말하면, 모노클론 항체는 단 하나의 세포 클론 (예를 들어, 하이브리도마, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 진핵성 숙주세포, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 원핵성 숙주세포 등등)의 성장으로부터 나오는 균질한 항체로 구성되고, 일반적으로 한 가지 및 동일한 클래스와 서브클래스의 중쇄 그리고 단 한 가지 유형의 경쇄에 의해 특성이 결정된다. 모노클론 항체는 매우 특이적이고 단일 항원에게로 유도된다 (directed against). 또한, 통상적으로 서로 다른 결정기 (determinants) 또는 에피토프 (epitopes)에게로 유도되는 서로 다른 항체들을 포함하는 폴리클론 항체의 조제물과는 대조적으로, 각 모노클론 항체는 항원의 단일 에피토프에게로 유도된다.
본 발명은 자연적 형태의 인간화 항체들에 관한 것이 아니고, 즉 그들은 자연 환경으로부터 가져올 수는 없지만 자연적 출처로부터 분리되거나 정제에 의해 획득되거나 또는 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득되며, 따라서 하기에 기술될 바와 같이 그들은 비자연적인 아미노산도 보유할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
보다 상세하게는, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들은 서열번호 4, 5 또는 6의 아미노산 서열 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 4, 5 또는 6의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄; 또는 서열번호 7, 8 또는 9의 아미노산 서열 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 7, 8 또는 8의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.
선호되는 방식으로, 본 발명의 인간화 항체들, 또는 그들의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 다음의 세 가지 CDRs, 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하고, 여기에서:
- CDR-H1는 서열번호 4의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 4의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;
- CDR-H2는 서열번호 5의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 5의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고; 또한
- CDR-H3는 서열번호 6의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 6의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함한다.
상세한 구현예에 따르면, 항체들, 또는 그들의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 서열번호 4 서열의 CDR-H1, 서열번호 5 서열의 CDR-H2 및 서열번호 6 서열의 CDR-H3를 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 항체들, 또는 그들의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 다음의 세 가지 CDRs, 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하고, 여기에서:
- CDR-L1는 서열번호 7의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 7의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;
- CDR-L2는 서열번호 8의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 8의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고; 또한
- CDR-L3는 서열번호 9의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 9의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함한다.
상세한 구현예에 따르면, 항체들, 또는 그들의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 서열번호 7 서열의 CDR-L1, 서열번호 8 서열의 CDR-L2 및 서열번호 9 서열의 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 기술내용에서, 용어들 " 폴리펩타이드 (polypeptides)", "폴리펩타이드 서열 (polypeptide sequences)", "펩타이드 (peptides)" 및 "항체 화합물들 또는 그들의 서열들에 부착된 단백질들"은 상호교환이 가능하다.
본 발명은 자연적 형태의 항체들에 관한 것이 아니고, 즉 그들은 자연 환경으로부터 가져올 수는 없지만 자연적 출처로부터 분리되거나 정제에 의해 획득되거나 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있으며, 따라서 하기 에 기술될 바와 같이 그들은 비자연적인 아미노산도 보유할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
독특한 IMGT 번호매김 시스템 (IMGT unique numbering system)은 어떤 항원 수용체, 사슬 유형 또는 종이라도 가변 도메인을 비교할 수 있도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 상기 번호매김 시스템에서, 보존되는 아미노산은 항상 23번 시스테인 (1st-CYS), 41번 트립토판 (보존되는 TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2nd-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 TRP)과 같이 동일한 위치를 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김 시스템은 구조틀 부위 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 또한 상보성 결정 부위 (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획 (standardized delimitation)을 제공한다. "공간 (gaps)"은 채워지지 않은 위치를 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이 (괄호들 사이에 나타나고 점으로 분리됨)는 결정적인 정보가 된다. IMGT 시스템은 IMGT 진주목걸이 (IMGT pearl necklace)라고도 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 전시 및 IMGT/3D 구조-DB 라고 언급되는 3차원 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data . Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]로 사용된다.
세 가지의 중쇄 CDRs 및 세 가지의 경쇄 CDRs가 존재한다. 본 명세서에서, 용어 "CDR" 및 "CDRs"는 경우에 따라 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 부여할 수 있는 대다수의 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 이들 부위, 또는 심지어 부위 전체를 가르키는 데 사용된다.
본 발명의 의미에서, 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 "일치도 퍼센트 (percentage identity)"는 최적의 정렬에 따라 획득되어 비교되는 두 개의 서열들 간에 일치하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 퍼센트를 의미하고, 이 퍼센트는 순수하게 통계적이고 이 두 서열들 간의 차이는 그들 서열 전체를 통하여 무작위적으로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 서열 비교는 통상적으로 그들을 최적으로 정렬시킨 이후 서열들을 비교하여 수행되고, 상기 비교는 분절마다 또는 "비교창 (comparison window)"에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수동적으로 수행되는 것과 함께 스미스 및 워터맨 (Smith and Waterman) (1981)의 로칼 상동성 알고리즘 [local homology algorithm; Ad. App. Math. 2:482]에 의해, 네들만 및 운쉬 (Neddleman and Wunsch) (1970)의 로칼 상동성 알고리즘 [J. Mol. Biol. 48:443]에 의해, 피어슨 및 립만 (Pearson and Lipman) (1988)의 유사도 조사 방법 (similarity search method)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P 에 의해)에 의해 수행될 수 있다.
두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 일치도 퍼센트는 비교되는 핵산 또는 아미노산 서열이 이들 두 서열들 간 최적의 정렬을 위한 기준 서열 (reference sequence)에 비해 부가 (addition) 또는 결실 (deletion)을 포함할 수 있는 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다. 일치도 퍼센트는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 개 서열들 간에 일치하는 동일한 위치의 숫자를 결정하고, 동일한 위치의 숫자를 정렬창에서의 전체 위치 숫자로 나눈 다음 획득된 결과를 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트를 얻기 위하여 100으로 곱하여 계산된다.
예를 들어, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열" (Tatusova et al ., "Blast 2 서열- 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위한 새로운 도구", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250)이 디폴트 매개변수 (명확하게, 매개변수 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)"의 경우: 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들어 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음)와 함께 사용될 수 있고; 비교를 위한 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트는 프로그램에 의해 직접 계산될 수도 있다.
기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 아미노산 서열로는, 기준 서열, 소정의 변형 (modifications), 명확하게 적어도 하나의 아미노산의 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substituiton), 절단 (truncation) 또는 연장 (extension)을 가지는 것들을 바람직한 예로 들 수 있다. 하나 이상의 연속적 (consecutive) 또는 비-연속적 (non-consecutive) 아미노산(들)의 치환의 경우에서, 치환된 아미노산이 "동등한 (equivalent)" 아미노산에 의해 대체되는 치환이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 표현 "동등한 아미노산 (equivalent amino acids)"은 해당하는 항체 및 하기 정의된 특정 항체 예들의 생물학적 활성을 근본적으로 변형시키지 않지만, 구조적 아미노산의 하나가 치환될 수 있는 아미노산이라면 모두를 표시하려고 한다.
동등한 아미노산은 치환되어진 아미노산들과의 구조적인 상동성 (structural homology)을 기초로 하거나 생산될 수 있는 다양한 항체들 간의 생물학적 활성의 비교 테스트 결과들을 기초로 하여 결정될 수 있다.
비-제한적인 예로서, 하기 표 1 은 해당되는 변형된 항체의 생물학적 활성의 유의한 변형을 유발하지 않고도 수행될 수 있는 가능한 치환을 정리하고 있고; 역 치환들 (inverse substituitons)은 동일한 조건들 하에서 자연적으로 가능하다.
Figure pct00001
당업자라면 당해 기술분야의 현재의 상황에서 여섯 가지 CDRs 간의 가장 큰 다양성 (길이 및 조성)이 세 가지의 중쇄 CDRs, 보다 상세하게는 본 중쇄의 CDR-H3에서 발견되는 점을 숙지하고 있다. 결과적으로, 본 발명의 항체들, 그들의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나의 바람직한 특징적 CDRs는 중쇄의 세 가지 CDRs가 될 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는
다음의 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄:
서열번호 4의 서열 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 4의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 서열의 CDR-H1;
서열번호 5의 서열 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 5의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 서열의 CDR-H2;
서열번호 6의 서열 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 6의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 서열의 CDR-H3;
또한 다음의 세 가지의 CDRs를 포함하는 경쇄:
서열번호 7의 서열 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 7의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 서열의 CDR-L1;
서열번호 8의 서열 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 8의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 서열의 CDR-L2;
서열번호 9의 서열 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 9의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 서열의 CDR-L3;
를 포함하는 항체, 또는 그의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들을 기재하고 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기에 기술된 인간화 항체의 기능적 단편들에 관한 것이다. 당업자라면 자명할 것인 바와 같이, 기능적 단편은 반드시 결합 단편, 예로 부모 항체와 동일한 표적에 결합할 수 있는 단편이다. 더우기, 기능적 단편은 부모 항체의 기능을 보유한다. 상세하게, 본 발명의 기능적 단편은 CXCR4의 활성을 조정할 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 기능적 단편은 CXCR4의 활성화를 저해할 수 있다. 한 가지 구현예에서, CXCR4 활성화는 리간드 의존적이고; 또 다른 구현예에서, 상기 CXCR4 활성화는 리간드 비의존적이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 기능적 단편들은 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 활성을 조정하는 것으로 구성되는 부모 항체의 기능을 보유한다. 바람직하게, 상기 기능적 단편들은 CXCR4/CXCR2 헤테로이중체 복합체의 활성을 저해하는 능력을 보유한다.
보다 상세하게, 본 발명은 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc 단편 및 다이아체들 (diabodies), 또는 PEG화된 (PEGylated) 단편과 같이 반감기가 증가되었던 단편이라면 모두로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 유래된 화합물들 또는 기능적 단편들을 지향한다.
본 발명에 따른 항체의 이러한 기능적 단편들, 예를 들어 Fv, scFv (sc = 단순한 사슬), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 다이아체, 또는 폴리(에틸렌)글리콜 ["PEG화 (PEGylation)"] (PEG화된 단편은 Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG, Fab'-PEG로 약칭된다.)과 같은 폴리알킬렌글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형에 의해 또는 리포좀, 미세구들 (microspheres) 또는 PLGA 내의 삽입에 의해 반감기가 연장되었던 단편이라면 모두로 구성되고, 상기 단편들은 항체가 유래한 항체의 활성을 부분적일지라도 일반적인 방식으로 명백하게 나타낼 수 있는 본 발명의 인간화 항체들의 특징적인 CDRs의 적어도 하나를 소유한다.
바람직하게, 상기 기능적 단편들은 그들이 유래한 항체의 다양한 중쇄 또는 경쇄의 부분적 서열로 구성되거나 이를 포함할 것이며, 상기 부분적 서열은 그들이 유래한 항체와 동일한 결합 특이성 및 그들이 유래한 항체와의 적절한 친화도 (affinity), 바람직하게는 적어도 100분의 1, 더욱 바람직하게는 적어도 10분의 1에 해당하는 친화도를 보유하면 충분하다.
이러한 기능적 단편은 그들이 나온 항체의 서열로부터 적어도 5개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 또는 100개의 연속적 아미노산을 포함할 것이다.
바람직하게, 이들 기능적 단편은 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 유형 또는 다이아체들일 것이고, 이는 일반적으로 그들이 획득된 항체와 동일한 결합특이성을 갖는다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체의 단편들은 상기 기술된 항체로부터 시작하여 펩신 (pepsin) 또는 파파인 (papain)을 포함하는 효소 소화 (enzyme digestion)와 같은 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 연결의 절단 (cleavage)에 의해 획득될 수 있다. 또한 항체 단편들은 당업자라면 역시 숙지하고 있는 유전적 재조합 기법에 의해 또는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems) 등이 시판하는 것들과 같은 자동 펩타이드 합성기 (automatic peptide synthesizers) 수단에 의한 펩타이드 합성에 의해 획득될 수도 있다.
보다 상세하게, 본 발명은 본 명세서에서 i) HZ515H7, Hz515H7 또는 hz515H7 Mab 및 ii) HZ515H7-2, Hz515H7-2 또는 hz515H7-2 Mab 또는 iii) 항체 변형체들의 경쇄 및/또는 중쇄의 조합이라면 모두라고 명명되는 마우스 515H7 Mab의 서로 다른 인간화 항체 변형체들에 관한 것이다.
보다 명확하게 하기 위해, 하기 표 2a는 본 발명의 인간화 변형체들 (형태들이라고도 명명함) hz515H7 및 hz515H7-2의 CDRs에 해당하는 다양한 아미노산 서열들을 정리하고 있고; 하기 표 2b는 본 발명의 인간화 형태 hz515H7의 다양한 변형체들의 다양한 도메인들 및 전장의 서열들에 해당하는 다양한 아미노산 서열들을 정리하고 있고; 또한 하기 표 2c는 본 발명의 인간화 형태 hz515H7-2의 다양한 도메인들 및 전장의 서열들에 해당하는 다양한 아미노산 서열들을 정리하고 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

예로서, 혼란을 피하기 위해서, 용어 표현 "VH1"은 용어 표현 "VH 변형체 1 (VH Variant 1)", "VH 변형체 1 (VH variant 1)", "VH Var 1" 또는 "VH var 1"와 유사하다.
본 발명의 보다 또 다른 상세한 관점은 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 부위들이 각각 람다 또는 카파 부위 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위인 것을 특징으로 하는, 인간화 항체들, 또는 그의 유래 화합물들 또는 기능적 단편들에 관한 것이다.
본 발명은 프랑스 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소)에 2008년 6월 25일자 수탁번호 제 I-4019호로 기탁된 모노클론 항체를 분비하는 마우스 하이브리도마를 기술하고 있다. 상기 하이브리도마는 면역접종된 Balb/c 마우스 비장세포들과 Sp 2O Ag 14 마이엘로마 세포들의 융합에 의해 획득되었다.
본 명세서에서 515H7이라고 명명된 마우스 모노클론 항체는 2008년 6월 25일자로 수탁번호 제 I-4019호 하에 기탁된 상기 하이브리도마에 의해 분비된다.
본 발명은 키메라 항체들도 역시 기술하고 있다.
키메라 항체는 해당 종의 항체로부터 유래된 자연적 가변 부위 (경쇄 및 중쇄)를 상기 해당 종과 이종유래인 종의 항체 경쇄 및 중쇄의 불변 부위와 조합하여 포함하는 것이다.
이들 항체들, 또는 그들의 키메라 단편들은 재조합 유전학의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터 및 본 발명의 비인간, 명확하게 마우스의 모노클론 항체의 가변 부위를 코딩하는 서열, 및 인간 항체의 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하는 것에 의해 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 인코드되는 본 발명의 키메라 항체는 예를 들어 마우스-인간 키메라일 수 있고, 이 항체의 특이성은 마우스 DNA 로부터 유래한 가변 부위에 의해 결정되고 그의 이소형은 인간 DNA 로부터 유래한 불변 부위에 의해 결정된다. 키메라 항체를 제조하는 방법을 위해, 버호인 등의 문헌 (Verhoeyn et al., BioEssays, 8: 74, 1988)을 참조하라.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83으로 선택된 서열의 가변 부위를 포함하는 키메라 항체 중쇄 (c515H7 VH라고 명명됨)에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 84로 선택된 서열의 가변 부위를 포함하는 키메라 항체 경쇄 (c515H7 VL이라고 명명됨)에 관한 것이다.
상세한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "인간화 항체 (humanized antibody)"는 비-인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 부위들을 포함하고 기타 다른 부분들은 인간 기원이 되는, 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 항체를 말한다 (예를 들어, 상기 다른 부분들은 하나 (또는 여럿)의 인간 항체들로부터 유래할 수 있다). 용어 표현 "인간화 항체"에 의하여, 본 발명은 따라서 두 번째 사슬이 키메라 또는 마우스 사슬이 되는 단 하나의 인간화 사슬을 가진 항체들을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 "인간화 항체"는 두 가지의 인간화 사슬들을 포함하고, 예로 중쇄 및 경쇄 둘 다가 인간화된다.
본 발명의 인간화 항체 또는 그의 단편들은 당업자가 숙지하고 있는 기법들에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992의 문헌들에 기술되어 있는 것과 같음). 이러한 인간화 항체는 시험관내 진단들 또는 생체내 예방적 및/또는 치료적인 처치가 관여하는 방법들에서의 사용이 바람직하다. 기타 다른 인간화 기법들도 역시, 예를 들어 유럽특허 제 EP 0 451 261호, 제 EP　0　682 040호, 제 EP 0 939 127호, 제 EP 0 566 647호 또는 미국특허 제 US 5,530,101호, 제 US 6,180,370호, 제 US　5,585,089호 및 제 US 5,693,761호 특허들로 PDL에 의해 기술된 "CDR 이식 (CDR Grafting)"과 같은 선행기술을 통해 당업자가 잘 숙지하고 있다. 또한 미국 특허 제 US　5,639,641호, 제 US 6,054,297호, 제 US 5,886,152호 및 제 US 5,877,293호도 인용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기에 기술된 마우스 항체 515H7으로부터 나온 인간화 항체들에 관한 것이다.
바람직한 방식으로, 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 부위들은 각각 람다 또는 카파 부위 또한 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위이다.
보다 상세하게, 본 발명은 i) 인간 항체 중쇄의 구조틀 부위에 해당하는 동종유래 구조틀 부위들, 및 ii) 서로 다른 포유동물 종으로부터 유래한 항체의 CDRs에 해당하는 동종유래 CDRs를 포함하는 인간화 항체 중쇄를 포함하고, 상기 CDRs는 서열번호 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3로 구성되는 인간화 항체 중쇄에 관한 것이다.
달리 말하면, 본 발명은 서열번호 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3로 구성되는 CDRs를 가지는 인간화 항체 중쇄에 관한 것이다. 서로 다른 배아계열들 (germlines)이 항체 515H7의 인간화 (humanization)를 위해 선택되고, 다음으로 서로 다른 형태들의 인간화 515H7를 유도할 수 있는 점은 당업자에게는 자명할 것이다. 보다 상세하게는, 바람직한 비제한적인 구현예에서, 서로 다른 배아계열들이 v 유전자들을 코딩하는 서열에 사용될 수 있는 한편 동일한 배아계열들이 j-유전자들에 대하여 보존될 것이다.
본 발명을 위하여, 사용될 수 있는 배아계열들은 두 가지의 상보성 판단기준들을 기초로 하여 선택된다:
- 각 CDRs의 경우 아미노산들의 길이가 마우스 CDR 및 배아계열에서의 동등물 간에 일치해야 하고;
- 아미노산들에서 배아계열 서열은 부모 마우스 서열과 적어도 70%의 일치도를 가져야 한다.
본 명세서에서는 혼란을 피하기 위하여, 본 발명이 동일한 항체 515H7의 두 가지의 바람직한 비제한적인 인간화 형태들 (버전들이라고도 약칭함)을 포괄하는 것으로 생각한다. Hz515H7이라고 명명되는 첫 번째 것은 중쇄의 경우 배아계열들 IGHV3-49*04 (서열번호 77) 및 IGHJ4*01 (서열번호 81) 또한 경쇄의 경우 IGKV4-1*01 (서열번호 78) 및 IGKJ1*01 (서열번호 82)를 가지고 획득된 인간화 항체로 구성된다. Hz515H7-2이라고 명명되는 두 번째 것은 중쇄의 경우 배아계열들 IGHV3-73*01 (서열번호 79) 및 IGHJ4*01 (서열번호 81) 또한 경쇄의 경우 IGKV2D-40*01 (서열번호 80) 및 IGKJ1*01 (서열번호 82)를 가지고 획득된 인간화 항체로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 12, 13, 85 또는 87로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 중쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 12 또는 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7 중쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 85 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 중쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 중쇄에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 H35S, V48L, R50F, A61D, D76N 및 A81L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는, 서열번호 87 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 중쇄에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 21, 22, 23, 24, 89 또는 91로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 중쇄에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 21, 22, 23 또는 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 중쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 89의 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 중쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91의 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 중쇄에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 H35S, V48L, R50F, A61D, D76N 및 A81L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는, 서열번호 91 서열의 인간화 항체 H515H7-2 중쇄에 관한 것이다.
보다 상세하게, 본 발명은 i) 인간 항체 경쇄의 구조틀 부위에 해당하는 동종유래 구조틀 부위들, 및 ii) 서로 다른 포유동물 종으로부터 유래한 항체의 CDRs에 해당하는 동종유래 CDRs를 포함하는 인간화 항체 경쇄를 포함하고, 상기 CDRs는 서열번호 7, 8 및 9의 서열들을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되는 인간화 항체 경쇄에 관한 것이다.
달리 말하면, 본 발명은 서열번호 7, 8 및 9의 서열들을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되는 CDRs를 가지는 인간화 항체 경쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 또는 88로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7 경쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7 경쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 86 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 경쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 88 서열의 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 경쇄에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 L9S, I21M, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y 및/또는 V89L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는, 서열번호 88 서열의 인간화 항체 H515H7-2 경쇄 가변 부위에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 또는 92 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 경쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 H515H7 경쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 90의 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 경쇄에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 92의 완전한 서열을 포함하는 인간화 항체 H515H7-2 경쇄에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 L9S, I21M, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y 및/또는 V89L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는, 서열번호 92 서열의 인간화 항체 H515H7-2 경쇄에 관한 것이다.
보다 상세하게, 본 발명은 i) 인간 항체의 구조틀 부위에 해당하는 동종유래 구조틀 부위들, 및 ii) 서로 다른 포유동물 종으로부터 유래한 항체의 CDRs에 해당하는 동종유래 CDRs를 가지는 각 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 CDRs는 서열번호 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 중쇄의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또한 서열번호 7, 8 및 9의 서열들을 각각 포함하는 경쇄의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되는 인간화 항체, 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
달리 말하면, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3로 구성되는 CDRs를 가지고 상기 경쇄는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되는 CDRs를 가지며, 또한 상기 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3는 서열번호 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하고 상기 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3는 서열번호 7, 8, 및 9의 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 12, 13, 83, 84 또는 87로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 84, 86 또는 88로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체, 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 12 또는 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 85 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 86 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 85 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 86 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 H35S, V48L, R50F, A61D, D76N 및 A81L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위, 또한 D40A, L43Q, Y59A, A61D, S69T, G74E 및 D76Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 키메라 경쇄와 조합된 인간화 중쇄를 포함하는 인간화 항체에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화 경쇄와 조합된 키메라 중쇄를 포함하는 인간화 항체에 관한 것이다.
보다 상세하게, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 또한 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 또는 88로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체, 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기술하고 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 15 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7 VL1 T59A E61D, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 16 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7 VL2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 17 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7 VL2.1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 18 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7 VL2.2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 19 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7 VL2.3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 20 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7 VL3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 86 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 83 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 c515H7 VH / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10, 11, 12, 13, 85 또는 87로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 84 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기술하고 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 84 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 / c515H7 VL, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 84 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N / c515H7 VL, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 12 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 84 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 V48L D76N / c515H7 VL, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 13 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 84 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH2 / c515H7 VL, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 85 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 85 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 84 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / c515H7 VL, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 21, 22, 23, 24, 89 또는 91로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 중쇄 또한 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 또는 92로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 21, 22, 23 또는 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 중쇄 또한 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 H515H7에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 89 서열의 중쇄 및 서열번호 90 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 H35S, V48L, R50F, A61D, D76N 및 A81L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는 서열번호 91 서열의 중쇄, 또한 D40A, L43Q, Y59A, A61D, S69T, G74E 및 D76Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 H515H7-2에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 16 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 27 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 17 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2.1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 28 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2.1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 18 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2.2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 29 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2.2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 19 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2.3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 30 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N VL2.3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 12 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 23 서열의 중쇄 및 서열번호 25 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 12 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 15 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 T59A E61D, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 23 서열의 중쇄 및 서열번호 26 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 T59A E61D, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 21 서열의 중쇄 및 서열번호 25 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 11 서열의 중쇄 및 서열번호 88 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 12 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 V48L D76N / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 13 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH2 / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 21 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 D76N / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 23 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 V48L D76N / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 24 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7 VH1 / Hz515H7-2 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 15 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL1 T59A E61D, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 16 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 17 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2.1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 18 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2.2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 19 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2.3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 20 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 25 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 26 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL1 T59A E61D, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 27 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 28 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2.1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 29 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2.2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 30 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL2.3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 31 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체 Hz515H7-2 VH1 / Hz515H7 VL3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
상기 예시된 VH/VL 조합들은 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 당업자라면 물론 불필요한 부담 없이 발명적 기술을 적용하지 않고도 본 명세서에서 기재된 VH 및 VL 모두를 재배열할 수 있다. 따라서 당업자라면 본 명세서에서 기재되어 있는 VH 및 VL 모두의 조합들 모두에 해당하는 인간화 항체들 모두를 획득할 수 있다.
본 발명의 새로운 관점은 다음의 핵산들 (반복적 유전암호 (degenerative genetic code)라면 모두를 포함함) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 인간화 항체 중쇄, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
b) 본 발명에 따른 인간화 항체 경쇄, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
c) 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
d) a), b) 또는 c)에 정의된 바와 같은 핵산에 상보적인 핵산;
e) 서열번호 38 내지 41, 49 내지 52, 93 또는 95의 핵산 서열들을 포함하는 중쇄의 적어도 하나, 바람직하게는 IMGT 또는 카밧 (Kabat) CDR 번호매김에 따른 3가지 CDRs의 적어도 하나와 매우 엄격한 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드들의 핵산; 또한
f) 서열번호 42 내지 48, 53 내지 59, 94 또는 96의 핵산 서열들을 포함하는 경쇄의 적어도 하나, 바람직하게는 IMGT 또는 카밧 (Kabat) CDR 번호매김에 따른 3가지 CDRs의 적어도 하나와 매우 엄격한 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드들의 핵산.
또한 본 발명은 중쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 32의 CDR-H1 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 33의 CDR-H2 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 34의 CDR-H3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 인간화 항체의 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또한 본 발명은 경쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 35의 CDR-L1 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 36의 CDR-L2 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 37의 CDR-L3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 인간화 항체의 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또한 본 발명은 중쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 32의 CDR-H1 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 33의 CDR-H2 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 34의 CDR-H3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
경쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 35 또는 60의 CDR-L1 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 36 또는 61의 CDR-L2 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 37 또는 62의 CDR-L3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는;
인간화 항체의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
하기 표 3a는 본 발명의 항체 hz515H7의 CDRs에 해당하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열들을 정리하고 있고; 표 3b는 본 발명의 인간화 항체 hz515H7의 다양한 변형체들의 가변 도메인들 및 전장의 서열들에 해당하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열들을 정리하고 있다. 표 3c는 본 발명의 인간화 항체 hz515H7-2의 다양한 변형체들의 가변 도메인들 및 및 전장의 서열들에 해당하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열들을 정리하고 있다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009

용어 표현 "최적화된 서열 (optimized sequence)"은 관심 있는 단백질 (본 명세서에서는 항체 가변 도메인들)의 전신적 (constitutive) 아미노산들을 인코딩하는 코돈들이 사용할 세포 유형, 본 명세서에서는 포유동물 세포들에서 해독 기작에 의해 더 나은 인식 (recognition)을 위해 최적화되었던 것을 의미한다. 본 관점으로, 최적화된 서열에 의해 인코드되는 해당 단백질의 아미노산 서열은 비-최적화된 서열의 것과 일치하지만, 뉴클레오타이드 서열은 서로 다르다. 최적화도 역시 G/C 함량 적응 및 안정한 RNA 2차 구조의 방지를 포함한다 (예를 들어, Kim et al., 1997 Gene 199(1-2): 293-301을 참조하라).
예를 들어, 마우스 CDR-H1 (서열번호 71)의 뉴클레오타이드 서열은 최적화되어 인간화된 CDR-H1 (서열번호 32)의 뉴클레오타이드 서열에 해당하게 되고, 여기에서 코돈들 ggg, act 및 gat (각각 Gly, Thr 및 Arp 잔기들을 코딩함)은 코돈들 ggc, acc 및 gac (역시 각각 Gly, Thr 및 Arp 잔기들을 코딩함)에 의해 치환되었다.
CDR-H2 및 CDR-H3 (각각 서열번호 72 및 72)에 관하여, 그들도 역시 최적화되었고 각각 서열번호 33 및 34의 최적화된 CDRs에 해당한다.
이것은 경쇄의 세 가지 CDRs (각각 서열번호 74, 75 및 76)를 위하여 VL1, VL2 및 VL3 (각각 서열번호 35, 36 및 37) 또한 VL2.1, VL2.2 및 VL2.3 (각각 서열번호 60, 61 및 62)에 해당하는 두 가지의 인간화되고 최적화된 형태들과 동일하다.
다음의 표 4는 고유의 CDRs, 예로 마우스 비-최적화된 서열들을 정리하고 있다.
Figure pct00010
본 발명의 기술내용에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 표현 " 핵산 (nucleic acid)", "핵산 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열 (nucleic acid sequence)", "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)", "올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)", "폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence)" 및 " 뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)"은 변형 여부에 상관없이 핵산의 단편 또는 부위를 정의하며 비-자연적 뉴클레오타이드를 포함하기도 하고 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또는 상기 DNAs의 전사 산물로 존재하는 뉴클레오타이드들의 명확한 서열을 의미한다.
또한 본 명세서에서 본 발명은 그들의 자연적 염색체 환경에서, 예로 자연적 상태에서의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이 아니라는 점이 포함되어야 한다. 본 발명의 서열은 이미 분리되어 및/또는 정제되었고, 다시 말해 예를 들어 복제에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 시료수집되었으며, 그들의 환경은 적어도 부분적으로는 변형되었던 것이다. 본 명세서에서는 또한 예를 들어 숙주세포를 사용하는 유전적 재조합에 의해 획득되거나 또는 화학적 합성에 의해 획득되는 분리된 핵산이 언급되어야 한다.
"바람직한 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도 퍼센트를 나타내는 핵산 서열들"은 기준 핵산 서열에 대하여 상세하게 결실 (deletion), 절단 (truncation), 연장 (extension), 키메라 융합 (chimeric fusion) 및/또는 치환 명확하게 점 치환 (punctual substitution))과 같은 소정의 변형을 나타내는 핵산 서열을 의미한다. 바람직하게, 그들은 유전적 암호의 반복성 (degeneracy)과 관련이 있는 기준 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열 또는 기준 서열과, 바람직하게는 높은 엄격도 명확하게 하기 본 명세서에서 정의된 조건 하에서 특이적으로 혼성화할 수 있는 상보적인 서열이다.
높은 엄격도의 조건 하에서의 혼성화는 온도 (temperature) 및 이온 강도 (ionic strength)에 관한 조건이 그들이 두 가지 상보적인 DNA 단편들 간에 혼성화를 유지하도록 하는 방식으로 선별되는 것을 의미한다. 자세하게 설명하면, 상기에서 기술된 폴리뉴클레오타이드 단편을 정의하려는 목적으로 혼성화 단계의 높은 엄격도 조건은 하기와 같은 것이 유리하다.
DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 단계로 수행된다: (1) 5 x SSC (1 x SSC 는 0.15 M NaCl + 0.015 M 소듐 사이트레이트 용액에 해당한다), 50% 포름아마이드, 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 10 x 덴하르트 용액 (Denhardt's), 5% 덱스트란 설페이트, 1% 연어정자 DNA를 포함하는 포스페이트 완충용액에서 42℃에서 3시간 동안 전혼성화 (prehybridization); (2) 탐침의 길이에 의존적인 온도에서 (예로, > 100개 뉴클레오타이드 길이의 탐침의 경우 42℃) 20시간 동안 일차적으로 혼성화, 이어서 2 x SSC + 2% SDS에서 20분 동안 20℃에서 두 번 세척, 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 20분 동안 20℃에서 한 번 세척. 최종 세척은 > 100개 뉴클레오타이드 실이의 탐침의 경우 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 수행된다. 정해진 크기의 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기에서 기술된 매우 높은 엄격도는, 샘브룩 등에 기술된 방법에 따라 (Sambrook et al., 1989, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 연구소, 제 3판, 2001) 더 길거나 더 짧은 길이의 올리고뉴클레오타이드의 경우 당업자에 의해 적응될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
명확하게 본 발명은 이러한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터를 지향한다.
본 발명의 벡터는 바람직하게 해당 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현 및/또는 분비를 허용하는 요소 (elements)를 포함한다. 따라서 본 벡터는 프로모터, 해독 개시 및 종결 신호뿐만 아니라 적합한 전사 조절 부위를 포함해야 한다. 이것은 숙주세포에서 안정한 방식으로 유지될 수 있어야 하고, 임의적으로 해독된 단백질의 분비를 특정하는 특정한 신호를 가질 수 있다. 이들 다양한 요소들은 선택되어 사용된 세포 숙주에 따라 당업자에 의해 최적화된다. 이러한 목적으로, 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주 내에서 자가-복제하는 (self-replicating) 벡터 내로 삽입될 수 있거나 선택된 숙주의 융합 벡터 (intergrative vector)가 될 수 있다.
이러한 벡터는 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있고 그 결과 얻은 클론은 리포펙션 (lipofection), 전기천공법 (electroporation), 열 충격 (heat shock) 또는 화학적 방법들과 같은 표준 방법들에 의해 적합한 숙주 내로 도입될 수 있다.
본 벡터는, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 기원의 벡터이다. 그들은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열들을 클론하거나 발현시키기 위하여 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같은 벡터로 형질전환되거나 이를 포함하는 숙주세포를 포함한다.
세포 숙주는 원핵성 또는 진핵성 시스템, 예를 들어 박테리아 세포뿐만 아니라 효모 세포 또는 동물 세포, 특히 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다. 곤충 세포 또는 식물 세포도 역시 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 세포를 가지는, 사람을 제외한 동물에 관한 것이다.
또 다른 관점에 따르면, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 숙주세포에 적합한 배지 및 배양 조건에서의 배양; 및
b) 상기 배양 배지로부터 또는 상기 배양된 세포로부터 생산된 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편의 하나의 회수:
단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법에서 유용하다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 재조합 형태로 제조하는 방법은 상기 방법이 벡터 및/또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하고, 이들도 역시 본 발명에 포함된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포는 상기 폴리펩타이드의 발현 및상기 재조합 펩타이드의 회수를 가능하게 하는 조건 하에서 배양된다.
이미 언급되었던 바와 같이, 세포 숙주는 원핵성 또는 진핵성 시스템들 중에서 선택될 수 있다. 상세하게는, 이러한 원핵성 또는 진핵성 시스템에서 분비를 용이하게 하는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 확인하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 서열을 보유하는 본 발명에 따른 벡터는 분비될 재조합 단백질을 생산하는데 유리하게 사용될 수 있다. 따라서. 관심 있는 이들 재조합 단백질의 정제 과정은 그들이 숙주 내포의 내부보다는 오히려 세포 배양의 상청액에 존재하는 사실로 인해 용이해질 것이다.
또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 화학적 합성에 의해 제조하는 것이 가능하다. 이러한 제조 방법의 하나도 역시 본 발명의 목적이 된다. 당업자라면 고체상을 사용하는 방법 (명확하게 Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 제 2판, (1984)를 참조하라) 또는 부분적 고체상을 사용하는 기법과 같은 단편의 응축 수단에 의한, 또는 용액에서의 통상적인 합성에 의한 화학적 합성의 방법을 숙지하고 있다. 화학적 합성에 의해 획득되고 해당하는 비-자연적 아미노산을 포함할 수 있는 폴리펩타이드도 역시 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명의 방법에 의해 획득될 수 있는 항체들, 또는 그들의 유래 화합물들 또는 기능적 단편들도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 보다 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 또한 인간 케모카인 패밀리 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 및/또는 이러한 수용체의 신호전달을 특이적으로 저해할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 기술된 바와 같은 항체에 관한 것이다.
새로운 구현예에 따르면, 본 발명은 항체가 예를 들어 VEGFR, VEGF, EGFR, IGF-1R, HER2neu, HGF, cMET, FGF, 테트라스패닌 (tetraspanins), 인테그린 (intergrins), CXCR4 (본 발명의 항체가 아닌, 예로 또 다른 에피토프를 표적하는 것), CXCR7 또는 CXCR2와 같은 종양의 발달에 관련이 있는 수용체라면 모두와 상호작용할 수 있는 두 번째 모티브를 포함한다는 의미에서 이중특이적 (bispecific) 항체로 이루어진 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
이중특이적, 또는 이중기능적 (bifunctional) 항체는 두 가지 서로 다른 가변 부위가 동일한 분자에 결합되어 있는 모노클론 항체의 두 번째 세대로 구성된다 (Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). 그들의 유용성은 새로운 효과기 기능을 채용하거나 또는 종양 세포의 표면 상에 다수의 분자를 표적시키는 능력으로 인해 진단 분야 및 치료적 분야 둘 다에서 발휘되어 왔다. 이들 항체는 화학적 방법 (Glennie M J et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382) 또는 체세포 방법 (Staerz U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457; Suresh M. R. et al. 1986 Method Enzymol. 121: 210-228)뿐만 아니라, 바람직하게는 헤테로이중합 (heterodimerization)를 가능하게 하고 또한 찾고 있는 항체의 정제 방법을 용이하게 하는 유전적 조작 기법에 의해 획득될 수 있다 (Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677-681).
이들 이중특이적 항체는 전체 IgGs, 이중특이적 Fab'2s, Fab'PEGs 또는 다이아체들 또는 이중특이적 scFvs로서 뿐만 아니라 두 가지의 고정 부위가 표적된 항원 또는 그의 단편 각각에 존재하는 사가 (tetravalent)의 이중특이적 항체로서 (Park et al., 2000 Mol. Immunol. 37(18): 1123-30) 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이 제작될 수 있다.
이중특이적 항체의 생산 및 투여가 두 가지 특이적 항체의 개별 생산보다 저렴하다는 경제적인 장점 이외에도, 이러한 이중특이적 항체의 사용은 치료의 독성을 감소시키는 장점도 가진다. 따라서, 이중 특이적 항체의 사용은 순환하는 항체의 전체 양 그리고 그 결과, 가능한 독성을 감소시키는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체는 이가 (divalent) 또는 사가 (tetravalent) 항체이다.
마지막으로, 본 발명은 약제로서 사용되기 위한 상기에서 기술되는 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편으로 구성되는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체에 의해 보충될 수 있다.
또한 본 발명은 추가적으로 동시적 (simultaneous), 개별적 (separated) 또는 연장된 (extended) 방식으로 사용하기 위한 조합 산물로서 CXCR4에게로 유도되는 항체가 아닌 항-종양 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
보다 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 적어도 IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR 또는 VEGF와 같은 수용체의 타이로신 키나제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 화합물 중에서 선택되는 두 번째 항종양 화합물, 또는 당업자에게 알려져 있는 그 외 다른 항종양 화합물을 포함하는 상기에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 두 번째 바람직한 관점에서, 상기 두 번째 화합물은 증식 및/또는 항-세포사멸 및/또는 혈관형성 및/또는 상기 수용체에 의해 촉진되는 전이성 전염 (metastatic dissemination)의 유도 활성을 저해할 수 있는, 분리된 항체 항EGFR, 항IGF-IR, 항HER2/neu, 항cMET, VEGFR, VEGF 등, 또는 그들의 기능적 단편 및 유래된 화합물 중에서 선택될 수 있다.
또한 리투시마브 (rituximab), 이브리투모마브 (ibritumomab) 또는 토시투모마브 (tositumomab)와 같은 항CD20 항체; 젬투주마브 (gemtuzumab) 또는 린투주마브 (lintuzumab)와 같은 항CD33 항체; 에프라투주마브 (epratuzumab)와 같은 항CD22 항체; 아렘투주마브 (alemtuzumab)와 같은 항CD52 항체; 에드레코로마브 (edrecolomab), Ch 17-1A 또는 IGN-101과 같은 항EpCAM 항체; 크사액틴 (Xactin)과 같은 항CTP21 또는 16 항체; 131I-코타라 TNT-1과 같은 항DNA-Ag 항체; 펨투모마브 또는 R1150과 같은 항MUC1 항체; ABX-MA1과 같은 항MUC18 항체; 미투모마브 (mitumomab)와 같은 항GD3 항체; 시박 (CeaVac) 또는 라베투주마브 (labetuzumab)와 같은 항ECA 항체; 오바렉스 (OvaRex)와 같은 항CA125 항체; 아포리주마브 (apolizumab)와 같은 항HLA-DR 항체; MDX-010과 같은 항CTLA4 항체; MDX-070, 111In & 90Y-J591, 177Lu J591, J591-MDI와 같은 항PSMA 항체; IGN311와 같은 항루이스 Y 항체; AS1405 및 90YmuBCI와 같은 항혈관형성 항체; TRAIL R1mAb 또는 TRAIL R2mAb와 같은 항트레일-R1 항체가 언급하기에 적합하다.
또한 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 상기에서 기술된 바와 같이 동시적, 개별적 또는 연장된 사용을 위한 조합 또는 결합 산물로서 세포독성/세포증식억제 제제를 추가적으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
"동시적 사용 (simutaneous use)"는 하나 및 동일한 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지 화합물의 투여로서 이해된다.
"개별적 사용 (separate use)"은 별도의 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지 화합물의 일시적 (at the same time) 투여로서 이해된다.
"연장된 사용 (extended use)"은 각각 별도의 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지 화합물의 연속적인 투여로서 이해된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 조성물은 암 치료의 효능을 유의하게 증가시킨다. 다른 말로 하면, 본 발명의 항체의 치료적 효과는 세포독성제의 투여에 의해 예측하지 못하는 방식으로 증진된다. 본 발명의 조성물에 의해 생산되는 또 다른 주요 연속적 장점은 더 낮은 유효량의 활성 성분을 사용할 수 있는 가능성에 대한 것이고, 이는 나타날 수 있는 이차적인 효과 특히 세포독성제의 효과의 위험성을 회피하거나 감소시키는 것을 가능하게 한다. 더우기, 본 발명에 따른 이러한 조성물은 당연히 기대되는 치료적 효과를 더욱 신속하게 달성하는 것을 허용한다.
"치료적 항암제 (therapeutic anticancer agent)" 또는 "세포독성제 (cytotoxic agent)"는 환자에게 투여될 때 환자에서 암의 발생을 치료하거나 예방하는 물질로서 이해해야 한다. 이러한 제제의 비-제한적인 예로는, "알킬화 (alkylating)"제, 항대사물질 (antimetabolites), 항종양 항생제 (antitumour antibiotics), 세포분열 저해제 (mitotic inhibitors), 크로마틴 기능 저해제 (chromatin function inhibitors), 항혈관형성제 (antiangiogenics), 항에스트로전 (antiostrogens), 항안드로겐 (antiandrogens) 및 면역조절자 (immunomodulators)를 들 수 있다.
이러한 제제는 예를 들어 VIDAL에서 종양학 및 혈액학에 할애된 페이지 상에 "세포독성 (cytotoxic)"이라는 제목 하에 언급되고; 이 문헌에 관한 참고문헌을 통해 언급되는 세포독성 화합물은 본 명세서에서 바람직한 세포독성제로서 언급된다.
"알킬화제 (alkylating agents)"는 세포 내에서 공유적으로 결합할 수 있거나, 어떤 분자라도 바람직하게는 핵산 (예로: DNA)을 알킬화할 수 있는 물질이라면 모두를 말한다. 이러한 알킬화제의 예로는 메클로에타민 (mechlorethamine), 클로르암부실 (chlorambucil), 멜팔란 (melphalan), 클로르하이드레이트 (chlorhydrate), 피포브로만 (pipobroman), 프레드니무스틴 (prednimustine), 디소듐 포스페이트 (disodium phosphate) 또는 에스트라무스틴 (estramustine)과 같은 질소 머스타드; 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 알트레타민 (altretamine), 트로포스파마이드 (trofosfamide), 설포포스파마이드 (sulfofosfamide) 또는 이포스파마이드 (ifosfamide)과 같은 옥사조포스포린 (oxazophosphorines); 아지리딘 (aziridies) 또는 티오테파 (thiotepa), 트리에틸렌아민 (triethyleneamine) 또는 알테트라아민 (altetramine)과 같은 에틸렌-이민 (ethylene-imines); 카무스틴 (carmustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 포테무스틴 (fotemustine) 또는 로무스틴 (lomustine)과 같은 니트로소우레아 (nitrosourea); 부설판 (busulfan), 트레오설판 (treosulfan) 또는 임프로설판 (improsulfan)과 같은 알킬 설포네이트 (alkyl sulfonates); 다카바진 (dacarbazine)과 같은 트리아젠 (triazenes); 또는 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 또는 카보플라틴 (carboplatin)과 같은 백금 복합체가 포함된다.
"항대사물질 (antimetabolites)"은 소정의 활성들, 일반적으로 DNA 합성에 의해 간섭하여 세포 성장 및/세포 대사를 차단하는 물질을 말한다. 항대사물질의 예로는 메토트렉세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 플로스우리딘 (floxuridine), 5-플루오로데옥시우리딘 (5-fluorodeoxyuridine), 카페시타빈 (capecitabine), 사이타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 사이토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 6-티오구아닌 (6-thioguanine, 6-TG), 클로로데옥시아데노신 (chlorodeoxyadenosine), 5-아자사이티딘 (5-azacytidine), 젬시타빈 (gemcitabine), 클라드리빈 (cladribine), 데옥시코포르마이신 (deoxycoformycin) 및 펜토스타딘 (pentostatin)이 포함된다.
"항종양 항생제 (antitumour antibiotics)"는 DNA의, RNA의 및/또는 단백질의 합성을 방해하거나 억제할 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 항종양 항생제의 예로는 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin), 미토크산트론 (mitocantrone), 닥티노마이신 (dactinomycin), 미스라마이신 (mithramycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미토마이신 C (mitomycin C), 블레오마이신 (bleomycin) 및 프로카바진 (procarbazine)이 포함된다.
"세포분열 저해제 (mitotic inhibitors)"는 세포 주기 (cell cycle) 및 세포 분열 (mitosis)의 정상적인 진행을 막는다. 일반적으로 파크리탁셀 (paclitaxel) 및 독세탁셀 (docetaxel)과 같은 미세소관 저해제 (microtubule inhibitors) 또는 "탁셀류 (taxoids)"는 세포분열을 저해할 수 있다. 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (ncristine), 빈데신 (vindesine) 및 비노렐빈 (vinorelbine)과 같은 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloids)도 역시 세포 분열을 저해할 수 있다.
"크로마틴 기능 저해제 (chromatin function inhibitors)" 또는 "토포이소머라제 저해제 (topoisomerase inhibitors)"는 토포이소머라제 I 및 II와 같은 크로마틴을 형성하는 단백질의 정상적인 기능을 저해하는 물질이다. 이러한 저해제의 예로는 토포이소머라제 I의 경우 캄프토테신 (camptothecin) 및 이리노테칸 (irinotecan) 또는 토포테칸 (topotecan)과 같은 그의 유도체가; 토포이소머라제 II의 경우는 에토포사이드 (etoposide), 에티포사이드 포스페이트 (etiposide phosphate) 및 테니포사이드 (teniposide)가 포함된다.
"항혈관형성제 (antiangiogenic)"는 혈관의 성장을 저해하는 약제, 화합물, 물질 또는 제제라면 모두를 말한다. 항-혈관형성제의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 라족신 (razoxin), 마리마스탯 (marimastat), 바티마스탯 (batimastat), 프리노마스탯 (prinomastat), 태노마스탯 (tanomastat), 일로마스탯 (ilomastat), CGS-27023A, 할로푸지논 (halofuginone), COL-3, 네오바스탯 (neovastat), BMS-275291, 탈리도마이드 (thalidomide), CDC　501, DMXAA, L-651582, 스쿠알라민 (squalamine), 엔도스타틴 (endostatin), SU5416, SU6668, 인터페론-알파 (interferon-alpha), EMD121974, 인터루킨-2 (interleukin-12), IM862, 안지오스타틴 (angiostatin) 및 비탁신 (vitaxin)이 포함된다.
"항에스트로겐 (antiestrogen)" 또는 "에스트로겐 길항제 (estrogen antagonist)"는 에스트로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 이러한 제제들의 예로는 태목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 라록시펜 (raloxifene), 드로록시펜 (droloxifene), 이오독시펜 (iodoxyfene), 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸 (letrozole) 및 엑세메스탄 (exemestane)이 포함된다.
"항안드로겐 (antiandrogens)" 또는 "안드로겐 길항제 (androgen antagonist)"는 안드로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 항안드로겐의 예로는 플루타마이드 (flutamide), 닐루타마이드 (nilutamide), 비칼루카마이드 (bicalutamide), 스피로노락톤 (spironolactone), 사이프로테론 아세테이트 (cyproterone acetate), 피나스테라이드 (finasteride) 및 시미티딘 (cimitidine)이 포함된다.
면역조절자 (immunomodulators)는 면역 시스템을 자극하는 물질이다. 이러한 면역조절자의 예로는 인터페론 (interferons), 알데스루킨 (aldesleukin), OCT-43, 데니루킨 디플리톡스 (denileukin diflitox) 또는 인터루킨-2 (interleukin-2)와 같은 인터루킨 (interleukins), 태소너민 (tasonermin)과 같은 종양 괴사인자 (tumour necrosis factors), 또는 렌티난 (lentinan), 시조피란 (sizofiran), 로퀴니멕스 (roquinimex), 피도티모드 (pidotimod), 페가데마제 (pegademase), 티모펜틴 (thymopentin), 폴리 I:C, 또는 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil)과 조합된 레바미졸 (levamosole)과 같은 다른 유형의 면역조절자가 포함된다.
더 상세한 사항을 위해, 당업자라면 프랑스 치료 화학의 교사 협회 (French Association of Teachers of Therapeutic Chemistry)에서 발행한 "치료적 화학 (Therapeutic Chemistry), Vol. 6, 항종양 약제 및 암 치료에서의 전망, TEC 및 DOC 개정판, 2003 (프랑스어판)"이라는 제목의 매뉴얼을 참조할 수 있을 것이다.
상세한 바람직한 구현예에서, 조합 산물 형태로의 본 발명의 상기 조성물은 상기 세포독성제가 동시적 사용을 위해 상기 항체에 화학적으로 결합되는 것을 특징으로 한다.
상세한 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 상기 세포독성/세포증식억제 제제가 방추체 저해제 (spindle inhibitor) 또는 안정제, 바람직하게는 비노렐빈 (vinorelbine) 및/또는 빈플루닌 (vinflunine) 및/또는 빈크리스틴 (vincristine) 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 세포독성제와 본 발명에 따른 상기 항체 간의 결합을 용이하게 하기 위하여, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리(알킬렌)글리콜 또는 아미노산과 같은 공간 분자 (spacer molecules)가 결합될 두 가지 화합물들 사이에 도입될 수 있고; 또는 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 항체와 반응할 수 있는 기능이 도입되었던 상기 세포독성제의 활성 유도체가 사용될 수 있다. 이들 결합 기법은 당업자에게 잘 알려져 있어 본 기술내용에서 더욱 상세하게 논의되지는 않을 것이다.
다른 EGFR 저해제로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 단일클론 항체 C225 및 항EGFR 22Mab (임클론 시스템사), ABX-EGF (앱제닉스사/셀 젠시스사), EMD-7200 (머크 KgaA사) 또는 화합물 ZD-1834, ZD-1838 및 ZD-1839 (아스트라제네카사), PKI-166 (노바티스사), PKI-166/CGP-75166 (노바티스사), PTK 787 (노바티스사), CP 701 (세팔론사), 플루노마이드 (파마시아사/수젠사), CI-1033 (워너 람버트 파크 데이비스사), CI-1033/PD 183, 805 (워너 람버트 파크 데이비스사), CL-387, 785 (와이스-아어스트사), BBR-1611 (뵈링거 만하임 GMBH사/로슈사), 마아미딘 A (Naamidine A) (브리스톨-보드 마이어스 스퀴브사), RC-3940-II (파마시아사), BIBX-1382 (뵈링거 인겔하임사), OLX-103 (머크사), VRCTC-310 (벤테크 리서치사), EGF 융합 독소 (세라젠사), DAB-389 (세라젠사/릴간드사), ZM-252808 (임페리알 암연구소 기금), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (파커 휴그 암 센터), WHI-P97 (파커 휴그 암센터), GW-282974 (글락소사), KT-8391 (교와 하코사) 또는 "EGFR 백신" (요크 메디칼사/분자면역학 센터)이 포함된다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 적어도 하나가 세포 독소 및/또는 방사성 동위원소와 조합되거나 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 독소 또는 상기 방사성 동원원소는 종양 세포의 성장 또는 증식을 방해할 수 있고, 명확하게는 상기 종양 세포를 완전히 불활성화시킬 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 독소는 엔테로박테리아 독소, 명확하게는 슈도모나스 엑소톡신 A (Pseudomonas exotoxin A)이다.
바람직하게 치료적 항체와 결합된 방사성 동위원소는 감마선, 바람직하게는 요오드 (iodide)131, 이트륨 (yttrium)90, 금199, 팔라듐 (palladium)100, 구리67, 비스무스 (bismuth)217 및 안티몬 (antimony)211를 방출하는 방사성 동워원소이다. 베타선 및 알파선을 방출하는 방사성 동위원소도 역시 치료에 사용될 수 있다.
"본 발명의 항체 적어도 하나, 또는 그의 기능적 단편과 결합된 독소 또는 방사성 동위원소"는 상기 독소 또는 상기 방사성 동위원소를 적어도 하나의 상기 항체에, 명확하게는 결합 분자를 도입하거나 하지 않고 두 가지 화합물들 간 공유 결합에 의해 결합시킬 수 있게 하는 수단이라면 모두를 말한다.
접합체 (conjugate) 요소의 전부 또는 일부의 화학적 (공유적), 정전기적 또는 비-공유적 연결 (bonding)을 허용하는 제제들의 예로는, 상세하게 벤조퀴논 (benzoquinone), 카보디이미드 (carbodiimide), 더욱 상세하게는 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]-카보디이미드 하이드로클로라이드), 디말레이미드 (dimaleimide), 디티오비스-니트로벤조산 (dithiobis-nitro-benzoic acid, DTNB), N-숙시니미딜 S-아세틸 티오아세테이트 (N-succinimidyl S-acetyl thio-acetate, SATA), 하나 이상의 그룹을 가지며, 자외선 (UV)과 반응하는 하나 이상의 페닐아자이드 그룹을 가지는 연결제들 (bridging agents), 가장 바람직하게는 N-[4-(아지도살리실아미노)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드 (APDP), N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 6-하이드라진-니코틴아미드 (HYNIC)가 포함된다.
명확하게 방사성 동위원소를 위한 결합의 또 다른 형태는 이중기능적 이온 킬레이트제 (bifunctional ion chelator)의 사용으로 구성될 수 있다.
이러한 킬레이트제의 예로는 금속, 상세하게는 방사성 금속을 면역글로불린과 결합시키기 위해 개발되었던 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 DTPA (디에틸렌트리아미노펜타아세트산)으로부터 유래된 킬레이트제가 포함된다. 따라서, DTPA 및 그의 유도체는 탄소 사슬 상에서 서로 다른 그룹에 의해 치환될 수 있어 리간드-금속 복합체의 안정성 및 경도 (rigidity)를 증가시킨다 (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); US patent 4,831,175).
예를 들어, DTPA (디에틸렌트리아미노펜타아세트산) 및 그의 유도체들은 약물 및 생물학에서 그의 자유형 형태로 또는 금속 이온과의 복합체 형태로 오랫동안 널리 사용되어 왔으며, 암 치료법에 사용되는 방사성-면역 접합체 (radio-immuno conjugate)의 개발을 위해 치료적 또는 진단적으로 흥미로운 단백질과 결합될 수 있는 금속 이온과 안정한 킬레이트를 형성하는 탁월한 특성을 나타낸다 (Meases et al., 1984; Gansow et al. 1990).
또한 바람직하게, 상기 접합체를 형성하는 상기 적어도 하나의 본 발명의 항체는 그의 기능적 단편, 명확하게는 scFv 단편과 같은 그들의 Fc 성분이 상실되었던 단편들 중에서 선택된다.
본 발명은 또한 암의 예방 또는 치료를 위해 의도된 약물을 제조하기 위한 조성물의 용도를 포함한다.
또한 본 발명은 종양 세포들의 성장을 저해하는 약물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편, 바람직하게는 인간화된 것 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 약물을 제조하기 위한 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편, 바람직하게는 인간화된 것 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
예방되고 및/또는 치료될 수 있는 바람직한 암들로는 전립선 암 (prostate cancer), 골육종 (osteosarcoma), 폐암 (lung cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁내막 암 (endometrial cancer), 결장암 (colon cancer), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer) 또는 기타 다른 암이 포함된다.
또한 본 발명은 세포에서 CXCR4 활성을 조정하는 약물을 제조하기 위한 상기에서 기술된 바와 같은 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편, 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 CXCR4 발현 수준과 관련된 질환을 진단하는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에서의 기술된 바와 같은 항체의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 진단 방법에서 상기 CXCR4 단백질과 관련된 질환들은 암들일 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 생물학적 시료에서 CXCR4 단백질을 시험관내 검출하고 및/또는 정량하는 방법에, 명확하게는 암과 같은 이 단백질의 비정상적인 발현과 관련된 질환을 진단하는 방법에 적용될 수 있고, 본 명세서에서 상기 방법은,
a) 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 접촉하도록 두고;
b) 가능한 형성된 항원-항체 복합체를 전시하는: 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 요소들:
a) 본 발명의 폴리클론 또는 모노클론 항체;
b) 임의적으로, 면역학적 반응을 선호하는 배지를 구성하기 위한 반응시약;
c) 임의적으로, 면역학적 반응에 의해 생산되는 항체-항원 복합체를 검출하는 반응시약:를 포함하는 기술된 방법을 실시하기 위한 키트 (kits) 또는 부속기기 (accessories)를 포함한다.
일반적인 방식으로, 본 발명은 CXCR4의 발현과 연관된 종양원성 장애를 시험 관내에서 진단, 또는 CXCR4의 발현과 연관된 종양원성 장애에 대한 예후를 시험관 내에서 결정하기 위한, 다음의 세 가지 CDRs, 각각 서열번호 4, 5 및 6 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄; 또한 다음의 CDRs, 각각 서열번호 7, 8 및 9 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 용도에 관한 것이다.
본 관점에 관하여, 상세하게 본 발명은 CXCR4의 발현과 연관된 종양원성 장애를 시험관내에서 진단, 또는 CXCR4의 발현과 연관된 종양원성 장애에 대한 예후를 시험관내에서 결정하기 위한, 본 발명에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 인간화 항체 경쇄 및/또는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 용도를 지향한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 개체로부터 나온 시료를 다음의 세 가지 CDRs, 각각 서열번호 4, 5 및 6 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄; 또한 다음의 CDRs, 각각 서열번호 7, 8 및 9 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 접촉시키고; 또한
(b) 상기 시료와 상기 항체의 결합을 검출하는:
단계들을 포함하는, 개체에서 CXCR4를 발현하는 종양의 존재 및/또는 위치를 시험관내에서 검출하는 방법을 지향한다.
상세하게, 본 발명은
(a) 개체로부터 나온 시료를 본 발명에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 인간화 항체 경쇄 및/또는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 접촉시키고; 또한
(b) 상기 시료와 상기 항체의 결합을 검출하는:
단계들을 포함하는, 개체에서 CXCR4를 발현하는 종양의 존재 및/또는 위치를 시험관내에서 검출하는 방법을 지향한다.
비제한적인 예로서, 이러한 검출은 FACS, 또는 당업자가 숙지하고 있는 기법이라면 모두에 의해 시행될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체로부터 나온 CXCR4 발현 종양에서 CXCR4의 발현 수준을 시험관내에서 결정하는 방법을 지향하고, 여기에서 상기 방법은 (a') 개체로부터 나온 시료를 다음의 세 가지 CDRs, 각각 서열번호 4, 5 및 6 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄; 또한 다음의 CDRs, 각각 서열번호 7, 8 및 9 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 접촉시키고; 또한 (b') 상기 시료에서 CXCR4에 대한 항체 결합의 수준을 정량하는 단계들을 포함한다.
상세하게, 본 발명은 개체로부터 나온 CXCR4 발현 종양에서 CXCR4의 발현 수준을 시험관내에서 결정하는 방법을 지향하고, 여기에서 상기 방법은
(a) 개체로부터 나온 시료를 본 발명에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 인간화 항체 경쇄 및/또는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 접촉시키고; 또한
(b) 상기 시료에서 CXCR4에 대한 항체 결합의 수준을 정량하는:
단계들을 포함한다.
바람직한 구현예에서, CXCR4 발현 수준은 면역조직화학 (IHC)에 의해 측정된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 CXCR4 발현 종양을 시험관내에서 진단 또는 개체에서 CXCR4 발현 종양이 진행하는 예후를 시험관내에서 결정하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 상기 방법은 (i) 상세하게 본 발명의 인간화 항체들이 관여하는, 본 발명에 따른 CXCR4의 발현 수준을 결정하고, 또한 (ii) 단계 (i)의 발현 수준을 정상 조직으로부터 나온 CXCR4의 기준 발현 수준과 비교하는 단계들을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 개체 종양의 CXCR4 상태를 시험관내에서 결정하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 상기 방법은 (1) 상세하게 본 발명의 인간화 항체들이 관여하는, 본 발명에 따른 CXCR4의 발현 수준을 결정하고, (2) CXCR4 발현 수준에 대해 상기 종양을 점수 매기고, 또한 (3) 대조군 시료로부터 획득된 점수를 상기 점수와 비교하는 단계들을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 종양원성 장애가 항-CXCR4 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체로의 치료에 민감한지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 상기 방법은
(a) 본 발명에 따른 개체 종양의 CXCR4의 발현 수준을 시험관내에서 결정하고; 또한
(b) 상기 상태가 CXCR4(+)인 경우라면, 종양원성 장애가 항-CXCR4 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체로의 치료에 민감한지 여부를 결정하는:
단계들을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은
a) CXCR4 발현 세포들을 선별하고;
b) 상기 세포들을 다음의 세 가지 CDRs, 각각 서열번호 4, 5 및 6 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄; 또한 다음의 CDRs, 각각 서열번호 7, 8 및 9 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 반응시키고;
c) CXCR4에 대한 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나 간 결합의 잠재적인 저해를 하는 테스트될 분자들을 평가하고;
d) 상기 저해를 할 수 있는 분자들을 선별하는;
단계들을 포함하는 CXCR4 길항제 항-종양제들로서 분자들을 검색하고 및/또는 확인하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상세하게
a) CXCR4 발현 세포들을 선별하고;
b) 상기 세포들을 본 발명에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 인간화 항체 경쇄 및/또는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 반응시키고;
c) CXCR4에 대한 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나 간 결합의 잠재적인 저해를 하는 테스트될 분자들을 평가하고;
d) 상기 저해를 할 수 있는 분자들을 선별하는;
단계들을 포함하는 CXCR4 길항제 항-종양제들로서 분자들을 검색하고 및/또는 확인하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음의 세 가지 CDRs, 각각 서열번호 4, 5 및 6 서열들의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄; 또한 다음의 CDRs, 각각 서열번호 7, 8 및 9 서열들의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하는 적어도 하나의 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 포함하고, 바람직하게 상기 항체는 표지된, 키트에 관한 것이다.
본 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 인간화 항체 경쇄 및/또는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 포함하고, 바람직하게 상기 항체는 표지된, 키트에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 종양의 CXCR4 상태를 시험관내에서 결정하는 본 발명에 따른 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 좀 더 나아가
i) 상기 항-CXCR4 항체 및 CXCR4 간의 결합 정도를 검출하는 데 유용한 반응시약; 또한
ii) CXCR4 발현 수준을 점수 매기는 데 유용한 양성 및 음성 대조군 시료들을 포함한다.
유익하게, 상기 항체들 또는 그의 기능적 단편들은 지지체, 명확하게는 단백질 칩 상에 고정될 수 있다. 이러한 단백질 칩 하나가 본 발명의 목적이다.
유익하게, 단백질 칩은 생물학적 시료에서 CXCR4 단백질을 검출하고 및/또는 정량하는 데 필요한 키트들 또는 부속기기들에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "생물학적 시료 (biological sample)"는 살아있는 생물로부터 가져온 시료 (명확하게는, 포유동물 명확하게는 사람으로부터 가져온 혈액, 조직, 기관 또는 기타 시료) 또는 하나의 이러한 CXCR4 단백질을 포함할 수 있는 시료 (필요한 경우 형질전환되는 세포들의 시료와 같은)라면 모두에 관한 것이라는 점이 언급되어야 한다.
상기 항체, 또는 그의 기능적 단편은 검출가능한 (detectable) 및/또는 정량가능한 (quantifiable) 신호를 획득하기 위해 표지된 면역접합체 (immunoconjugate) 또는 항체의 형태일 수 있다.
본 발명의 표지된 항체들 또는 그의 기능적 단편들은, 예를 들어 퍼옥시다제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase), α-D-갈락토시다제 (α-D-galactosidase), 글루코스 옥시다제 (glucose oxidase), 글루코스 아밀라제 (glucose amylase), 카보닉 안하이드라제 (carbonic anhydrase) 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase), 라이소자임 (lysozyme), 말레이트 디하이드로게나제 (malate dehydrogenase) 또는 글루코스-6 포스페이트 디하이드로게나제 (glucose-6 phosphate dehydrogenase)와 같은 효소와 결합되는 또는 바이오틴 (biotin), 디옥시게닌 (digoxigenin) 또는 5-브로모-데옥시우리딘 (5-bromo-deoxyuridine)과 같은 분자에 의해 결합될 수 있는 항체 접합체 (면역접합체)를 포함한다. 또한 형광 표지도 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편과 결합될 수 있고, 명확하게는 이는 플루오레신 (fluorescein) 및 그의 유도체, 플루오로크롬 (fluorochrome), 로다민 (rhodamine) 및 그의 유도체, 녹색 형광 단백질 (GFP), 단실 (dansyl), 엄벨리페론 (umbelliferone) 등을 포함한다. 이러한 접합체에서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은 당업자가 숙지하고 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그들은 효소 또는 형광 표지를 사용하여 직접적으로; 폴리알데하이드 (polyaldehyde), 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA)와 같은 공간 그룹 또는 연결 그룹 (linking group)에 의해; 또는 치료적 접합체로서 상기 언급된 것들과 같은 결합제의 존재 시 결합될 수 있다. 플루오레신 표지를 가지는 접합체는 이소티오시아네이트 (isothiocyanate)와의 반응에 의해 제조될 수 있다.
기타 다른 접합체로는 루미놀 (luminol) 및 디옥세탄 (dioxetanes)과 같은 화학발광 표지, 루시페라제 (luciferase) 및 루시페린 (luciferin)과 같은 생물발광 표지, 또는 요오드 (iodide)123, 요오드125, 요오드126, 요오드133, 브로민 (bromine)77, 테크네티움 (technetium)111, 인디움 (indium)111, 인디움113 m, 갈륨 (gallium)67, 갈륨68, 루테늄(ruthenium)95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 수은 (mercury)107, 수은203, 레늄 (rhenium)99m, 레늄101, 레늄105, 스캔듐 (scandium)47, 텔륨 (tellium)121m, 텔륨122 m, 텔륨125 m, 툴륨 (thulium)165, 툴륨167, 툴륨168, 플루오린 (fluorine)18, 이트리움 (yttrium)199, 요오드131와 같은 방사성 표지도 역시 포함될 수 있다. 당업자에게 이미 알려져 있는 방사성 동위원소를 항체에 직접적으로 또는 상기에서 언급된 EDTA 또는 DTPA와 같은 킬레이팅제에 의해 결합시키는 방법은 진단적 방사성 동위원소에도 사용될 수 있다. 따라서 클로라민 T 기법 [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194: 495]에 의해 [I125]Na를 사용한 표지; 크로포드 등 (Crockford et al., 미국 특허 제 US 4 424 200호)에 의해 기술된 바와 같은 테크네티움99 m 을 사용한 표지; 또는 나토위치 (Hnatowich, 미국 특허 제 US 4 479 930호)에 의해 기술된 바 있는 DTPA 를 통해 고정되는 것이 언급되어야 한다.
또한 본 발명의 항체의 바이오마커로서의 용도도 기재되고 있다, 본 방법들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 유방암 (breast cancer), 난소암 (ovarian cancer), 전립선암 (prostate cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 피부암들 (skin cancers), 식도암 (oesophageal cancer), 폐암 (lung cancer), 두경부암 (head and neck cancer), 방광암 (bladder cancer), 결장직장암 (colorectal cancer), 골육종 (osteosarcomas), 심경모세포종 (neuroblastoma), 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia), 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 림프종 (lymphomas), 신장암 (renal cancer), 교아세포종 (glioblastoma), 갑상선암 (thyroid cancer), 가로무늬근육종 (rhabdomyosarcoma), 또는 CXCR4의 발현과 연관된 기타 다른 암으로 예시되는 CXCR4의 발현과 관련된 다양한 과다증식성 종양원 유전자 장애들을 검출하거나 진단하는 데 사용될 수 있다. 당업자라면 인식하고 있을 바와 같이, 특정한 장애와 연관된 항체 발현의 수준은 기존 병폐의 성질 및/또는 중증도에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 항체들의 당업자가 알고 있는 통상적인 방식이라면 모두 (예로, 국소적, 비경구적, 근육내 등)에 의한 투여는 시료에서 이상형성 (dysplastic) 세포들을 검출할 뿐만 아니라 의사가 CXCR4의 발현과 연관되거나 이에 의해 매개된 과다증식성 장애의 치료를 받고 있는 환자의 치료적 섭생을 감시하도록 하는, 매우 유용한 방법을 제공할 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표지되고 생체내에서 CXCR4과 결합하는 상기 모노클론 항체 또는 그의 단편; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 CXCR4의 발현과 연관된 종양원 유전자성 장애를 생체내 영상화하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 CXCR4의 발현과 연관된 다양한 병리학들의 검출, 진단, 및 단계 결정 (staging)을 포함하는 다양한 의학적 또는 연구적 목적으로 용도를 찾게 될 것이다.
단계 결정 (stage determination)은 잠재적인 예후적 가치를 가지고 최적의 치료법을 설계하는 판정기준을 제공한다. 심슨 등 (Simpson et al., J. Clin. Oncology, 18: 2059 (2000)). 예를 들어 일반적으로, 유방암의 병리학적 단계 결정은 전자가 더 정확한 예후를 주기 때문에 임상적 단계 결정에 바람직하다. 그러나, 임상적 단계 결정은 이것이 병리학적 평가를 위해 조직을 획득하는 침습적 절차에 의존하지 않기 때문에 병리학적 단계 만큼 정확한 경우라면 더욱 바람직할 것이다.
상세하게, 본 발명의 항체는 적합한 표지들 또는 기타 적절한 검출가능한 생체분자 (biomolecule) 또는 화합물들과 함께 사용될 때, 시험관내 및 생체내 진단적 및 예후적 적용들에 유용하다.
면역검정법들 (immunoassays)에 사용되는 표지들은 일반적으로 당업자에게 알려져 있고 효소들, 방사성 동위원소들, 또한 형광성, 발광성 및 콜로이드 골드 또는 라텍스 비드들과 같은 색상 입자들을 포함하는 발색성 (chromogenic) 물질들을 포함한다. 적합한 면역검정법으로는 효소-결합 면역흡착 검정법 (enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)를 포함한다. 본 발명의 항체들에 표지들을 결합시키는 다양한 유형의 표지들 및 방법들은 하기에 설명되는 것들과 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 바, 용어 "CXCR4의 발현과 연관된 종양원 유전자성 장애 (an oncogenic disorder associated with expression of CXCR4)"는 장애로 고생하는 개체에서 CXCR4 (이상성)의 높은 수준들 또는 비정상적으로 낮은 수준들의 존재가 관찰되었거나 이것이 질병의 병리생리학 또는 질병 악화의 원인이 되는 요인을 부여하는 것으로 의심되는 질환들 및 기타 다른 장애들을 포함하는 것을 의도한다. 임의적으로, 이러한 장애들은 예를 들어 세포 표면 상에서 CXCR4 수준의 증가에 의해 또는 장애로 고생하는 개체의 세포들 또는 조직들에서 증가된 타이로신 자가인산화 (tyrosine autophosphorylation) CXCR4으로 입증될 수 있다. CXCR4 수준들에서의 증가는 예를 들어 본 발명의 항체 515H7 또는 hz515H7을 사용하여 검출될 수 있다. 보다 상세하게는, 이것은 비교적 자발성 성장을 나타내는 세포들을 말하고 따라서 그들은 세포 증식의 조절의 유의한 상실을 특징으로 하는 이상성장 표현형을 나타낸다. 임의적으로, 세포들은 정상적 수준의 CXCR4을 발현할 수 있지만 비정상적 증식에 의해 구별된다.
소정의 구현예들에서, "증가된 발현 (increased expression)"은 CXCR4에 관한 것일 때 대조군과 대비하여 통계적으로 유의한 발현에서의 증가를 (RNA 발현 또는 단백질 발현에 의해 측정됨) 보여주는 단백질 또는 유전자 발현 수준들을 말한다.
보다 상세하게, CXCR4의 발현과 연관된 종양원 유전자성 장애를 시험관내에서 진단하거나 CXCR4의 발현과 연관된 종양원 유전자성 장애 예를 들어 CXCR4의 발현과 연관된 암을 생성하는 예후를 시험관내에서 결정하는, 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 용도가 고려된다.
본 발명에 따른 또 다른 광범위 관점은 시료에서 CXCR4를 보유하는 세포들의 존재 또는 부재를 결정하고, 또한 상기 CXCR4 보유하는 세포들의 존재 또는 부재를 근거로 하여 병리학적 병폐 또는 병리학적 병폐에 대한 취약성 (susceptibility)을 진단하는 것을 포함하는, 개체에서 병리학적 과다증식 종양원 유전자성 장애 또는 CXCR4 발현과 연관된 병리학적 병폐에 대한 취약성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체의 진단적 용도들은 일차 종양들, 암 전이들 (metastases)을 포함한다. 본 항체는 검출가능한 및/또는 정량가능한 신호를 획득하도록 표지된 항체 (labeled antibody) 또는 면역결합체 (immunoconjugate)의 형태로 존재할 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명에 따른 바람직한 주제는 (a) 개체로부터 나온 시료를 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체와 접촉시키고, 또한 (b) 상기 시료와 상기 항체의 결합을 검출하는 단계들을 포함하는, 개체에서 CXCR4 발현하는 종양의 존재 및/또는 위치를 시험관내에서 검출하는 방법이다. 본 주제의 또 다른 관점은 CXCR4 표적된 치료법에 대한 반응으로서, 임상 시험기간 동안, 보다 상세하게는 CXCR4 수용체의 저하조절 (downregulation) 또는 분해 (degradation)가 테스트된 화합물의 작용 기작의 하나의 구성성분일 때 CXCR4 발현의 추적 (follow-up)이다.
당업자에게는 자명하게 될 바, 본 발명의 항체의 결합 검출은 다양한 검정법들에 의해 밝혀질 수 있다. 검정법들을 수행하기 위한 수단이라면 모두가 본 발명과 양립가능하긴 하지만, 예로서, FACS, ELISA 또는 IHC가 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "시료 (sample)"는 결장, 위, 직장, 유방, 난소, 전립선, 신장, 폐, 혈액, 뇌 또 신생물 (neoplastic) 세포를 포함하거나 포함할 것으로 의심되는 기타 다른 기관 또는 조직으로부터 나온 세포와 같은 신생물 세포를 포함하거나 잠재적으로 포함하는 생물학적 체액, 세포, 조직, 기관 또는 그의 일부라면 모두를 의미하도록 의도된다. 본 용어는 개인에서 존재하는 시료들 뿐만 아니라 개인으로부터 획득되거나 유래된 시료들도 포함한다. 예를 들어, 시료는 생검에 의해 획득된 표본의 조직 절편 또는 조직 배양에 놓여지거나 이에 적응된 세포들일 수 있다. 시료는 좀 더 나아가 세포하 (subcellular) 분획 또는 추출물, 또는 조 (crude) 또는 실질적으로 순수한 핵산 분자 또는 단백질 제조물일 수 있다.
임상적 시료는 개체로부터 획득되고, 예를 들어 CXCR4 발현 수준들을 결정하거나 검출하는 진단적 또는 감시하는 테스트와 같은 본 발명의 절차에 유용한 다양한 시료 유형들을 포괄하도록 의도된다. 정의는 수술적 제거, 병리학 표본, 보관된 시료, 또는 생검 표본, 조직 배양들 또는 그의 유래된 세포들 및 그의 자손, 및 이들 출처라면 모두로부터 제조된 절편들 또는 도말들에 의해 획득된 고형 조직 시료들을 포괄한다. 제한되지 않는 예로는 유방 조직, 림프절, 결장, 췌장, 전립선 등으로부터 획득된 시료들이다. 또한 정의는 생물적 기원의 액체 시료들을 포괄하고, 본 명세서에서의 세포들 또는 세포 단편들, 또는 액체 배지 및 그의 용질물들 (solutes)을 말한다.
본 발명에 따른 또 다른 관점은 (a') 개체로부터 나온 시료를 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체와 접촉시키고, 또한 (b') 상기 시료에서 CXCR4에 결합하는 항체의 수준을 정량하는 단계들을 포함하는, 개체로부터 나온 CXCR4 발현하는 종양에서 CXCR4의 발현 수준을 시험관내에서 결정하는 방법에 관한 것이다.
당업자에게는 자명한 바와 같이, CXCR4에 결합하는 항체의 수준은 다양한 검정법들과 같은 많은 방식들로 정량될 수 있다. 검정법들을 수행하기 위한 수단이라면 모두가 본 발명과 양립가능하지만, 바람직한 방법은 엘라이자 (ELISA) 기법에 따라, 면역형광 (immunofluorescence)에 의해, 면역조직화학 (immunohistochemistry) 또는 방사성-면역검정법 (radio-immunoassay, RIA) 또는 동등한 것에 의한 면역효소적 공정들을 작동시키게 된다
바람직하게, 생물학적 시료는 인간 기원의 혈청, 전혈, 세포들, 조직 시료 또는 생검들로 형성된다. 시료는 예를 들어 생검된 조직을 포함할 수 있고, 이는 CXCR4의 발현과 연관된 병리학적 과다증식 종양원 유전자성 장애의 존재가 편리하게 검정될 수 있다.
일단 테스트 시료에 존재하는 CXCR4의 양이 결정되면, 결과들이 테스트 시료들과 유사한 방식으로 획득되지만 CXCR4의 발현과 연관된 과다증식성 종양원 유전자성 장애를 가지지 않거나 이것이 존재하지 않는 개인으로부터 나온 대조군 시료의 결과들과 비교될 수 있다. CXCR4의 수준이 테스트 시료에서 유의하게 올라가는 경우, 유래된 개체로부터 상기 장애를 가지거나 발생시킬 가능성의 증가가 존재하는 것으로 판단될 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명은 (i) 상기 기술된 바와 같이 CXCR4의 발현 수준을 결정하고, 또한 (ii) 단계 (i)의 발현 수준을 정상 조직 또는 발현하지 않는 CXCR4 조직으로부터 나온 기준 (reference) CXCR4의 발현 수준과 비교하는 단계들을 포함하는, 개체에서 CXCR4을 발현하는 종양을 시험관내에서 진단하거나 CXCR4 발현하는 종양을 발생시키는 예후를 시험관내에서 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 출원에서 사용되는 바, 질환을 "진단하는 것 (diagnosing)"은 예를 들어 CXCR4의 발현과 연관되거나 이에 의해 매개되는 병리학적 과다증식성 종양원 유전자 장애의 존재를 진단하거나 검출하는 것, 질환의 진행을 감시하는 것 또한 CXCR4의 발현과 연관된 장애를 가르키는 세포들 또는 시료들을 확인하거나 검출하는 것을 포함하는 것을 의도한다.
본 출원에서 사용되는 바, "예후 (prognosis)"는 질환으로부터의 회복 가능성 (likelihood) 또는 질환의 가능한 발생 또는 결과의 예측을 의미한다. 예를 들어 개체로부터 나온 시료가 본 발명의 항체로 염색에 대해 양성인 경우라면, 다음으로 해당 개체의 "예후"는 시료가 CXCR4 염색에 대해 음성이었던 경우보다 더 호전된 것이다. 시료들은 이하 본 명세서에서 보다 자세하게 설명될 바와 같이 적절한 척도 (scale) 상에서 CXCR4 발현 수준들에 대해 점수가 매겨질 수 있다.
그러나 본 발명의 또 다른 관점은 또한 CXCR4의 분해를 유도하는 치료적 화합물들의 경우 그들의 작용 기작의 하나로서 CXCR4 발현을 감시하는 것에 관한 것이다. 이 경우에, 이어지는 세포막 상에서의 CXCR4 발현이 임상 시험들 및 "개인적인 (personalized)" 치료법들 기간 동안 치료의 효능을 평가하도록 결정적인 도구가 될 수 있다.
유익하게, CXCR4의 발현 수준은 "기준 수준 (reference level)" 또는 "기준 발현 수준 (reference expression level)"이라고도 명명되는 대조군 세포 또는 시료에서의 수준들에 대비하여 비교되거나 측정된다. "기준 수준". "기준 발현 수준", "대조군 수준 (control level)" 및 "대조군 (control)"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 광범위하게 말하자면, "대조군 수준"은, 일반적으로 질환 또는 암이 없는 비교가능한 대조군 세포에서 측정된 별도의 기본선 (baseline) 수준을 의미한다. 이것은 동일한 개인으로부터 또는 정상이거나 질환을 가지거나 테스트 시료가 획득된 것과 동일한 질환을 가지지 않는 또 다른 개인으로부터 나올 수 있다. 본 발명의 문맥 내에서, 용어 표현 "기준 수준"은 환자의 암세포-포함 시료에서 CXCR4 발현의 테스트 수준을 평가하는 데 사용되는 CXCR4 발현의 "대조군 수준"을 말한다. 예를 들어, 환자의 생물학적 시료에서 CXCR4 수준이 CXCR4의 기준 수준보다 더 높을 때, 세포들은 CXCR4의 발현의 높은 수준, 또는 이의 과다발현을 가지는 것으로 고려될 것이다. 기준 수준은 다수의 방법들에 의해 결정될 수 있다. 따라서 발현 수준들은 CXCR4을 보유하는 세포들 또는 임의적으로 CXCR4을 발현하는 세포들의 숫자와는 독립적으로 CXCR4의 발현 수준을 정의할 수 있다. 따라서 각 환자를 위한 기준 수준은 CXCR4의 기준 비율에 의해 처방될 수 있고, 여기에서 기준 비율은 본 명세서에서 기술된 기준 수준들을 결정하는 방법들이라면 모두에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 대조군은 다양한 형태들을 취할 수 있는 선결정된 수치 (predetermined value)일 수 있다. 이것은 중앙값 또는 평균값과 같은 단일한 컷-오프 수치 (cut-off value)일 수 있다. "기준 수준"은 모든 환자에게 개인적으로 동등하게 적용가능한 단일한 수이거나, 기준 수준은 환자들의 특정한 소집단들에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 예를 들어 동일한 암의 경우 나이든 남자들은 젊은 남자들과는 다른 기준 수준을 가질 수 있고, 동일한 암의 경우 여자들은 남자들과는 다른 기준 수준을 가질 수 있다. 임의적으로, "기준 수준"은 테스트될 신생물 세포들의 조직과 동일한 조직으로부터 나온 비-종양원 유전자성 암 세포들에서 CXCR4의 발현 수준을 측정하여 결정될 수 있다. 마찬가지로, "기준 수준"은 환자의 신생물 세포들에서의 CXCR4의 동일한 환자 안에서 비-종양 세포들에서의 CXCR4 수준들에 대비한 소정의 비율일 수 있다. 또한 "기준 수준"은 시험관내에서 배양된 세포들의 CXCR4 수준일 수 있고, 이것은 종양 세포들을 자극하도록 조작될 수 있거나 기준 수준을 정확하게 결정하는 발현 수준들을 수득하는 기타 다른 방식이라면 모두에서 조작될 수 있다. 한편으로, "기준 수준"은 올라간 CXCR4 수준들을 가지지 않는 실험군들 및 올라간 CXCR4 수준들을 가진 실험군들에서와 같은 비교군들에 기초하여 확립될 수 있다. 비교군들의 또 다른 예로는 특정한 질환, 병폐 또는 증상들을 가지는 실험군들 및 질환이 없는 실험군들일 수 있다. 선결정된 수치는, 예를 들어 테스트된 집단이 저-위험군, 중-위험군 및 고-위험군과 같은 실험군들로 또는 4가지 (quadrants) 또는 5가지 (quintiles) 실험군들로, 가장 낮은 4가지 또는 5가지 실험군은 가장 낮은 위험도 또는 가장 많은 양의 CXCR4를 가진 개인이고 가장 높은 4가지 또는 5가지 실험군은 가장 높은 위험도 또는 가장 적은 양의 CXCR4를 가진 개인이 되도록 균등하게 (또는 비균등하게) 나뉘어지 곳에 배정될 수 있다.
또한 기준 수준은 동일한 암을 가진 환자들의 집단들에서 CXCR4 수준의 비교에 의해 결정될 수 있다. 이것은 예를 들어 환자들의 전체 군집 (cohort)이 그래프로 표현되는 히스토그램 분석에 의해 성취될 수 있고, 여기에서 첫 번째 축은 CXCR4의 수준을 나타내고, 두 번째 축은 종양성 세포들이 주어진 수준으로 CXCR4을 발현하는 군집에서 환자들의 수를 나타낸다. 둘 이상의 분리된 환자들의 실험군들이 동일하거나 유사한 수준의 CXCR4을 가지는 군집의 소집단 (subsets populations)을 확인하여 결정될 수 있다. 다음으로 기준 수준의 결정이 이들 분리된 실험군들을 가장 잘 구별하는 수준에 근거하여 이루어질 수 있다. 또한 기준 수준은 하나가 CXCR4이 되는 둘 이상의 마커들의 수준들을 나타낼 수 있다. 둘 이상의 마커들은 예를 들어 각 마커의 수준들에 대한 수치의 비율에 의해 나타내질 수 있다.
마찬가지로, 외관상으로 건강한 집단은 CXCR4의 발현과 연관된 병폐를 가지는 것으로 알려진 집단이 가지는 것보다 '정상'인 서로 다른 범위를 가질 것이다. 따라서, 선택된 선결정된 수치는 개인이 배정되는 카테고리를 고려할 수 있다. 적절한 범위들 및 카테고리들은 당업자에 의한 단지 일상적인 실험으로 선택될 수 있다. "올라간 (elevated)" "증가된 (increased)"에 의하여, 이것은 선택된 대조군에 대비하여 높은 것을 의미한다. 전형적으로 대조군은 적절한 연령 분포 내에서 외관상으로 건강한 정상의 개인들에 기초하게 될 것이다.
또한 본 발명에 따른 대조군들은 선결된 수치들에 추가하여, 실험적 물질들로 동등하게 테스트된 물질들의 시료들일 수 있는 것으로도 이해될 것이다. 예로서 동일한 개체로부터 동시에 획득된 조직 또는 세포들, 예를 들어 단일한 생검의 부분들, 또는 개체로부터 나온 단일한 세포 시료의 부분들을 포함한다.
CXCR4 매개성 질환들을 가지는 환자들의 임상적 진단 또는 감시하는 것에서, CXCR4을 발현하는 세포들 또는 CXCR4 수준들에서 증가의 검출은 정상 개체 또는 비-암성 조직을부터 나온 해당 생물학적 시료에서 수준과 비교하여, 일반적으로 CXCR4 매개성 장애를 가지거나 이를 표현하는 것으로 의심되는 환자의 표시이다.
상기에 따르면, 본 발명은 조직 시료에서 암에 대한 취약성 (susceptibility)을 표시하는 존재로서 CXCR4의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는 암에 대한 취약성을 예측하는 방법을 제공하고, 여기에서 CXCR4 발현의 정도는 취약성의 정도와 상호관련되어 있다. 따라서 특정한 구현예들에서, 예를 들어 전립선 조직, 골육종 조직, 폐 조직, 취장 조직, 결장 조직, 유방 조직, 교아종 조직, 난소 조직, 또는 CXCR4을 발현하는 세포들이 의심되는 기타 조직이라면 모두에서 CXCR4의 발현이 암 취약성 또는 조직 특이적 종양의 출현 또는 존재의 표시 (indication)를 제공하는 시료에서 CXCR4의 존재로 조사된다.
또한 종양의 공격성 (aggressiveness)을 평가하는 방법도 제공된다. 한 가지 구현예에서, 개인에서 시간 경과 시 악성도 (malignancy)의 진행을 관찰하는 방법은 종양의 시료에서 세포들에 의해 발현되는 CXCR4의 수준을 결정하고, 상기 수준을 동일한 개인으로부터 동시에 가져온 동등한 조직 시료에서 발현되는 CXCR4의 결정된 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기에서 종양 시료에서 시간 경과 시 CXCR4 발현의 정도는 암의 진행에 관한 정보를 제공한다.
보다 또 다른 구현예에서, 응용 (application)은 개체를 위한 적절한 치료적 프로토콜을 결정하는 방법들을 제공한다.
본 발명에 따른 CXCR4 수준에서 존재 또는 부재 또는 변화는 개체가 CXCR4과 연관된 재발성 또는 진행성 또는 영구적 암을 가질 가능성을 표시할 수 있다. 따라서, CXCR4을 발현하는 세포들의 수에서의 증가 또는 다양한 조직들 또는 세포들에 존재하는 CXCR4의 농도에서의 변화를 측정하여, CXCR4과 연관된 악성도를 개선할 목적을 가진 특정한 치료적 섭생이 효과적인지 여부를 결정하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 주제는 CXCR4의 발현과 연관된 종양원 유전자성 장애를 영상화하는 생체내 방법이다. 예를 들어, 이러한 방법은 종양원 유전자성 장애의 증상들을 표현하는 환자 상에서 사용될 수 있다. 환자가 예를 들어 CXCR4의 증가된 발현 수준들을 가지는 경우라면, 다음으로 환자는 암성 장애로 고생할 가능성이 있다. 마찬가지로, 본 방법은 이전에 CXCR4 매개성 암으로 진단되었던 환자들에서 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 감시하는 데 유용할 수 있다. 상기 목적에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 포함하는, 바람직하게는 표지된, 특히 방사선 표지된 생체내 영상화 반응시약 및 의학적 영상화에서 그의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 일반적인 방법은 환자에게 상기 기술된 표지된 항체와 같은 영상화 반응시약 및 약제학적으로 유효한 담체의 영상화-유효량 (imaging-effective amount)을 투여한 다음 시료에 존재하는 CXCR4에 결합시킨 이후 제제들을 검출하여 달성된다. 소정의 구현예들에서, 본 방법은 표적하는 소부분 (targeting moiety) 및 활성을 가진 소부분 (active moiety)을 포함하는 영상화-유효량의 영상화제를 투여하여 달성된다. 영상화제는 인간과 같은 포유동물에서 진단적 용도에 효과적인 양으로 투여된 다음 영상화제의 정착 (localization) 및 축적 (accumulation)이 검출된다. 영상화제의 정착 및 축적은 방사성 핵종 영상화 (radionuclide imaging), 방사성 섬광분석법 (radioscintigraphy), 핵자기 공명 영상화 (nuclear magnetic resonance imaging), 전산화 단층촬영법 (computed tomography), 양전자 방출 단층촬영법 (positron emission tomography), 전산화 축상 단층촬영법 (computerized axial tomography), X-선 또는 자기공명 영상화 방법 (magnetic resonance imaging method), 형광 검출 (fluorescence detection), 및 화학발광 검출 (chemiluminescent detection)에 의해 검출될 수 있다.
표적화된 항종양 치료법의 개발의 관점에서, 면역조직학적 기법들을 사용한 진단은 자리에서 (in situ) 수용체 발현 수준에 관한 정보를 제공하고 이러한 치료에 필요한 수용체들의 발현 수준에 이어지는 치료될 취약한 환자들을 선별하는 것을 가능하게 한다.
모노클론 항체들을 사용하는 면역치료법의 경우, 치료에 대한 반응은 인간화된 항-Her2 모노클론 항체 트라스투주 Mab (trastuzumab)의 출시 (advent)와 함께 유방 암종에서 Her2 과다발현의 결정이 주요한 임상적 중요성을 가지는 트라스투주 Mab로의 치료와 같이 수용체 표적된 발현 수준에 의존한다. Her2 과다발현의 전시는 이것이 Her2를 과다발현하는 암종 세포들을 특이적으로 표적하여 작용하기 때문에 트라스투주 Mab로의 치료를 위해 선결조건이 된다. Her2에 대한 정확한 테스트는 비용이 많이 들고 잠재적으로 독성을 가지는 트라스투주 Mab 치료가 비-과다발현하는 종양들을 가지는 환자들에 주어지지 않고 트라스트주 Mab로부터 유익이 되는 모든 환자가 적절한 치료를 받는 것을 입증하는 것을 목적으로 한다.
트라스투주 Mab에서의 가르침은, 과다발현된 Her2가 모노클론 항체로의 치료법을 사용할 때 수용체의 발현 수준을 결정하고 동시에 치료적 모노클론 항체보다는 환자 선별에 사용될 수 있는 모노클론 항체를 개발하는 데 유익이 되는 것을 보여주었던, 환자 선별과 관련되어 있다.
결론적으로, 본 발명은 (1) 상기 기술된 바와 같이 CXCR4의 발현 수준을 결정하고, (2) CXCR4 발현 수준에 대해 상기 종양을 점수 매기고, 또한 (3) 상기 점수 매긴 것을 대조군 시료로부터 획득된 것과 비교하는 단계들을 포함하는, 개체의 종양의 CXCR4 상태를 시험관내에서 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 의미에서, "CXCR4 상태 (CXCR4 status)"는 면역조직화학 (IHC), 형광 제자리 혼성화 (fluorescence in situ hybridization, FISH), 비색성 자리 혼성화 (colorimetric in situ hybridization, CISH), 유전자 칩 (gene chip) 또는 당업자가 숙지하고 있는 다른 방법들과 같은 방법들이라면 모두에 의해 측정되는 바와 같이, CXCR4 유전자의 발현 수준의 결정에 기초하여 CXCR4 양성 [CXCR4(+)] 또는 CXCR4 음성 [CXCR4(-)] 부류 (class)로 종양의 분류 (classification)에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 진단용 항체는 조직 시료들이 포르말린으로 고정되고, 글리오-픽스 (Glyo-fixx) 고정되고, 파라핀에 함몰되고 및/또는 냉동될 때 표적된 수용체와 결합할 수 있어야 한다.
보다 상세하게, CXCR4 발현 수준은 면역조직화학 (immunohistochemistry, IHC)에 의해 측정된다.
예로서, 시료들은 CXCR4 발현 수준을 위해 항체 염색의 수준으로 0으로부터 3+까지의 척도 상에 점수가 매겨질 수 있고, 여기에서는 증가하는 강도의 반정량적인 4 단계들에서 0은 음성이고 1+ - 3+은 양성을 나타낸다. 점수 1+ - 3+은 각 양성 점수가 재발 및 치명적 질환에 대한 유의하게 감소된 위험도와 연관될 수 있기 때문에 점수 0와 대비될 때 양성으로서 기록될 수 있지만, 양성 점수들 중에서 증가하는 강도는 추가적인 위험도 감소를 제공할 수 있다. 통상적인 위험 분석 방법은 CXCR4의 예후적 수치를 추정하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 분석 방법들로는 검열된 사례들의 존재 시 생존 또는 시간-대-사건 결과를 모델링하는 반매개변수적 (semiparametric) 방법인 콕스 회귀 분석 (Cox regression analysis)을 포함한다 (Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972). 다른 생존 분석법들, 예로 라이프 표들 또는 카프란-메이어 (Kaplan-Meyer)와는 대조적으로, 콕스는 모델들에서 예측인자 변수들 (공동분산 (covariates)의 포함을 허용한다. 통상적인 분석 방법, 예로 콕스를 사용하여, 일차 종양의 CXCR4 발현 상태에 대비한 질환 재발 (무-질환 생존 기간, 또는 전이적 질환까지의 시간)의 시간-대-발생, 또는 질환으로 사망까지의 시간 (전체 생존 기간)의 상호관련성에 관한 가설들을 테스트할 수 있을 것이다. 콕스 회귀 분석은 콕스 비율적 위험 분석법 (Cox proportional hazard analysis)으로도 역시 알려져 있다. 본 방법은 환자 생존기간에 관한 종양 마커의 예후적 수치를 테스트하는 표준이 된다. 다중분산 방식으로 사용될 때, 여러 개의 공동분산의 효과는 동일 선상에서 테스트되고, 독립적인 예후적 수치를 가지는 개별 공동분산은 예로 가장 유용한 마커들을 확인할 수 있다. 용어 표현, 종양의 양성 또는 음성 "CXCR4 상태" [CXCR4(+) 또는 CXCR4(-)라고도 명명됨]는 각각 점수들 0 또는 점수들 1+ - 3+를 말한다.
시료는 예를 들어 유방암과 같은 암의 진단 또는 감시하는 동안 "점수 매기기 (scored)"될 수 있다. 가장 단순한 형태로, 점수 매기기는 면역조직화학에 의해 시료들의 시각적 조사로 판단되는 바와 같이 분류적 음성 또는 양성이 될 수 있다. 더욱 정량적인 점수 매기기는 염색의 강도 및 시료 수집된 염색된 세포들 ("양성")의 비율, 두 가지 매개변수들을 판단하는 것이 관여한다. 이들 두 가지 매개변수들에 기초하여, 양성 염색의 증가하는 수준들을 반영하는 수치들이 배당될 수 있다. 올레드 등 (Allred et al., Allred, Harvey et al. 1998)은 이것을 성취하는 한 가지 방식을 기술하였고, 여기에는 0 (음성)으로부터 3+까지의 척도 상에 매개변수들 둘 다를 점수 매기고, 또한 개별 매개변수들의 점수들을 전체 점수에 합산하는 것이 관여된다. 이것은 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 가능한 점수들을 가진 척도를 가져온다 (점수 1은 올레드 척도에서는 가능하지 않은 점을 주목하라). 약간 더 단순한 점수 매기기 방법은 핵 염색의 강도 및 염색된 핵을 나타내는 세포들의 비율을 0으로부터 3+까지의 조합된 척도 내로 통합시킨다. 점수 매기기 방법이라면 모두가 세포 핵에서 활성화된 Stat5 염색의 강도 및 비율을 점수 매기는 데 적용될 수 있다. 용어, 본 기술내용에 사용되는 종양들의 양성 또는 음성 "CXCR4 상태"는 단순화된 척도 상에 각각 점수들 0 또는 1+ - 3+에 해당하는 CXCR4의 발현 수준들을 말한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 테스트 또는 검정법의 결과들은 다양한 형식들 (formats)이라면 모두로 표현될 수 있다. 결과들은 정성적인 방식 (qualitative fashion)으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 테스트 보고서는 특정 폴리펩타이드가 검출되었는지 여부만을 아마도 검출의 한계도 역시 표시하여 가르킬 수 있다. 결과들은 반-정량적인 (semi-quantitative) 방식으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 다양한 범위들이 정의될 수 있고, 범위들은 소정의 양의 정량적 정보를 제공하는 점수 (예로, 1+ 내지 3+)를 배당할 수 있다. 이러한 점수는 다양한 요인들, 예로 CXCR4이 검출되는 세포들의 수, 신호의 강도 (CXCR4의 발현 수준 또는 CXCR4을 보유하는 세포들을 가르킬 수 있음) 등을 반영할 수 있다. 결과들은 정량적인 방식 (quantitative fashion) 방식으로, 예로 폴리펩타이드 (CXCR4)이 검출되는 세포들의 백분율, 단백질 농도 등으로서 표현될 수 있다. 당업자라면 이해할 바와 같이, 테스트에 의해 제공되는 결과 (output)의 유형은 테스트의 기술적인 한계들 및 폴리펩타이드의 검출과 연관된 생물학적 유의성에 의존하여 달라질 것이다. 예를 들어, 소정의 폴리펩타이드들의 경우에는 순수하게 정성적인 결과가 (예로, 폴리펩타이드가 소정의 검출 수준으로 검출되는 지 여부) 유의한 정보를 제공한다. 다른 경우에는, 더욱 정량적인 결과가 (예로, 테스트되는 시료에서 폴리펩타이드의 발현 수준의 정상 수준에 대비한 비율) 필요하다.
더욱 바람직한 구현예에서, CXCR4 발현 수준의 점수 매기기는 반응 산물의 강도 및 양성 세포들의 백분율의 평가에 기초하여 0으로부터 3+까지의 등급이 매겨진다. 더욱 명확하게 하기 위해, 본 명세서에서 하기 표 5는 이들 매개변수들을 정리하고 있다. 침습성 종양의 완벽한 주변 막 반응성만이 고려되어야 하고 종종 "육각형 철장 (chicken wire)" 모양을 닮아있다. 현재의 지침들 하에서, CXCR4 IHC에 대한 경계선 (2+ 이상의 점수)으로 점수가 매겨진 시료들은 CXCR4(+)로서 고려되어야 하고 심화된 평가를 거질 것이 요구된다. 비-제한적인 예로서, 대조군은 예상한 바와 같지 않고, 대부분의 시료에 오염물질 (artifacts)을 포함하며 시료가 정상 유방 관들의 강한 막 양성도를 가지고 과다한 항원 복구를 제시하는 경우라면 IHC 분석법은 거부되고, 분석이 반복되거나 FISH 또는 기타 다른 방법에 의해 검증되어야 한다.
CXCR4 상태 IHC 기술
0 반응 없음 또는 10% 이하의 종양 세포들에서 막 반응성
1+ 희미한/약간 감지가능한 반응성이 10% 이상의 종양 세포들에서 검출된다.
세포는 막의 일부분에서만 면역반응성이다.
2+ 약한 내지 적당한 완전 반응성이 10% 이상의 종양세포들에서 관찰된다.
3+ 강한 완전 반응성이 10% 이상의 종양 세포들에서 관찰된다.
본 발명에 따른 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 점수 매기기는 염색의 강도 및 양성 세포들의 백분율이 되는 두 가지 매개변수들에 기초하여 적절한 척도를 사용하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 0 내지 3+의 척도가 되는 적절한 척도를 말하고, 여기에서 종양 세포들의 막 반응성 없음은 0으로 점수 매겨지고 10% 이상의 종양 세포들에서의 강한 완전 반응성은 3+로 점수 매겨진다.
더욱 자세하게는, 상기에 기술된 바와 같이 상기 적절한 척도는 종양 세포들의 막 반응성 없음은 0으로 점수를 매기고; 10% 이상의 종양 세포들에서 희미하게 감지가능한 막 반응성은 1+로 점수를 매기고; 10% 이상의 종양 세포들에서 약한 내지 적당한 완전 막 반응성은 2+로 점수를 매기고; 또한 10% 이상의 종양 세포들에서 강한 완전 막 반응성은 3+로 점수를 매기는, 0 내지 3의 척도이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 2+의 점수를 가진 CXCR4(+)이다.
본 발명의 상세한 관점에서, 종양은 3+의 점수를 가진 CXCR4(+)이다.
본 발명의 또 다른 상세한 관점에서, 종양은 2+ 또는 3+의 점수를 가진 CXCR4(+)이다.
본 발명에 따르면, 본 방법은 (a) 상기 기술된 바와 같이 개체의 종양의 CXCR4 상태를 시험관내에서 결정하고, 또한 (b) 상기 상태가 CXCR4(+)인 경우라면, 종양원 유전자성 장애가 항-CXCR4 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체로의 치료에 민감한 (susceptible) 것을 결정하는 단계들을 포함하는, 종양원 유전자성 장애가 항-CXCR4 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체로의 치료에 민감한지 여부를 결정하는 방법도 또한 기술된다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 항체를 포함하는 이러한 진단 또는 예후 진단하는 방법에 유용한 키트가 고려된다.
편의성을 위해, 진단적 검정법을 수행하기 위한 설명서들와 함께 선결정된 양들의 반응시약들의 포장된 조합물 (packaged combination), 예로 키트들도 역시 본 발명의 범위에 속한다. 본 키트는 CXCR4의 시험관내에서, 예로 엘라이자 또는 웨스턴 블럿으로 검출 및 정량을 위한 항체들을 포함하고 있다. 본 발명의 항체는 CXCR4의 시험관내에서, 예로 엘라이자 또는 웨스턴 블럿으로 검출 및 정량을 위한 키트로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 곳에서는, 키트가 효소에 의해 요구되는 기질들 및 보조인자들을 포함할 것이다 (예로, 검출가능한 발색단 (chromophore) 또는 형광단 (fluorophore)을 제공하는 기질 전구체). 또한, 다른 첨가물이 안정화제들 (stabilizers), 완충용액들 (예로, 차단 완충용액 또는 용해 완충용액) 등과 같이 포함될 수 있다. 이러한 키트는 바이알들, 튜브들 등과 같은 하나 이상의 용기들 (containers)을 수용하도록 구분되어진 저장용기 (receptacle)를 포함할 수 있고, 이러한 용기들은 본 발명의 별도의 요소들을 보관한다. 예를 들어, 하나의 용기는 불용성 또는 부분적으로 수용성 담체에 결합된 첫 번째 항체를 포함할 수 있다. 두 번째 용기는 냉동건조된 형태로 또는 용액에 넣어 수용성, 검출가능하게-표지된 두 번째 항체를 포함할 수 있다. 또한 저장용기는 냉동건조된 형태로 또는 용액에 넣어 수용성, 검출가능하게 표지된 세 번째 항체를 보관하는 세 번째 용기도 포함할 수 있다. 이러한 성질의 키트는 본 발명의 샌드위치 검정법에 사용될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물의 기술내용 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단적 용도를 위한 설명서들을 제공할 수 있다.
다양한 반응시약들의 상대적 양들은 검정법의 민감도를 실질적으로 최적화하는 반응시약들의 용액 농도를 제공하도록 광범위하게 달라질 수 있다. 상세하게, 반응시약들은, 용해 시 적절한 농도를 가지는 반응시약 용액을 제공할 부형제들을 포함하는 건조 파우더, 보통 냉동건조된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 좀 더 나아간 관점에서, 본 명세서에서 자세하게 기술된 바와 같은 모노클론 항체들 또는 그들의 결합 단편들이 검출가능한 소부분으로 표지되어 제공되어, 예를 들어 상기 언급된 항원을 가지는 세포들을 진단하거나 확인하도록 키트들로 포장되고 사용된다. 이러한 표지들의 비-제한적인 예로는 플루오레신 이소티오시아네이트와 같은 형광단들, 발색단들, 방사성 핵종들, 또는 효소들을 포함한다. 이러한 표지된 항체들 또는 결합 단편들은, 예를 들어 항원의 조직학적 정착, 엘라이자, 세포 선별 (cell sorting), 뿐만 아니라 CXCR4, 및 본 항원 본 항원을 보유하는 세포들을 검출하거나 정량하는 다른 면역학적 기법들에 사용될 수 있다.
또한 세포사멸 검정법 (apoptosis assay)들의 양성 대조군으로서 유용한 키트들이 세포들로부터 나온 CXCR4의 정제 또는 면역침전을 위해 제공된다. CXCR4의 분리 및 정제를 위해, 키트들은 비드들을 (예로, 세파로스 비드들) 결합시킨 본 명세서에서 기술된 항체들 또는 그들의 항원 결합 단편들을 포함할 수 있다. CXCR4의 시험관내에서, 예로 엘라이자 또는 웨스턴 블럿으로 검출 및 정량을 위한 항체들을 포함하는 키트들이 제공될 수 있다. 제조의 문헌을 참조하여, 키트들은 용기 및 라벨 또는 용기와 연관된 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 적어도 하나의 본 발명의 항-CXCR4 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 보관한다. 예로, 희석제들, 완충용액들 및 대조군 항체들을 포함하는 추가적인 용기들이 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물의 기술내용 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단적 용도를 위한 설명서들을 제공할 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명은 당업자가 숙지하고 있는 방법이라면 모두에 의해 종양의 CXCR4 상태의 결정을 위한 키트에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 실시예에서 기술될 바와 같이, 본 발명은 IHC 방법들에 의해 종양의 CXCR4 상태의 결정을 위한 키트에 관한 것이다.
상세한 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같이 적어도 하나의 항-CXCR4 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 포함하는 키트로 구성되고, 바람직하게 상기 항체는 표지된다.
표지 방법이라면 모두가, 예를 들어 상기 언급된 표지들의 사용과 같이 당업자에 의해 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 키트는 좀 더 나아가 상기 항-CXCR4 항체 및 CXCR4 간의 결합 정도를 검출하는 데 유용한 반응시약을 포함하는, 개체에서 CXCR4을 발현하는 종양의 존재 및/또는 위치를 시험관내에서 검출하는 데 유용한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트는 좀 더 나아가 상기 항-CXCR4 항체 및 CXCR4 간의 결합 수준을 정량하는 데 유용한 반응시약을 포함하는, CXCR4을 발현하는 종양에서 CXCR4의 발현 수준을 시험관내에서 결정하는 데 유용한 것이다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 키트는 좀 더 나아가
i) 상기 항-CXCR4 항체 및 CXCR4 간의 결합 정도를 검출하는 데 유용한 반응시약; 또한
ii) CXCR4 발현 수준을 점수 매기는 데 유용한 양성 및 음성 대조군 시료들:
을 포함하는, 종양의 CXCR4 상태를 시험관내에서 결정하는 데 유용한 것이다.
상기 종양의 CXCR4 상태를 시험관내에서 결정하는 키트는 좀 더 나아가 마우스 항체들에 특이적인 폴리클론 항체를 포함하고, 바람직하게 상기 마우스 항체들에 특이적인 폴리클론 항체는 표지된다.
또한 본 발명은 CXCR4 발현 또는 과다발현 세포들에게 생물학적으로 활성을 가지는 화합물에 특이적으로 표적하는 약물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다.
본 명세서의 의미에서 "생물학적으로 활성을 가진 화합물 (biologically active compound)"은 세포의 활성, 명확하게는 성장, 증식, 전사 또는 유전자 해독을 조정할 수 있는, 명확하게는 저해할 수 있는 화합물이라면 모두가 된다.
또한 본 발명은, 바람직하게 표지된, 명확하게는 방사성 표지된 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편으로 구성되는 생체내 진단 반응시약 (diagnostic reagent), 또한 의학적 영상촬영에서의, 명확하게는 CXCR4의 세포 발현 또는 과다발현과 관련된 암을 검출하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 약물로서 사용되는, 본 발명에 따른 조합 산물로의 조성물 또는 항-CXCR4/독소 접합체 또는 방사성 동위원소에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 조합 산물로서의 조성물 또는 상기 접합체는 부형제 및/또는 약제학적 담체에 의해 보충될 것이다.
본 발명의 기술내용에서, "약제학적 담체 (pharmaceutical vehicle)"는 이차적인 반응을 유발하지 않고, 예를 들어 활성을 가진 화합물의 투여를 용이하게 하며, 생물에서 그의 수명 및/또는 효능을 증가시키고, 용액에서 그의 수용성을 증가시키며 또는 그의 저장성을 향상시키는 약제학적 조성물에 들어가는 화합물 또는 화합물의 조합을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체는 잘 알려져 있고, 선택된 활성을 가진 화합물의 본성 및 투여 경로에 따라 당업자에게 응용될 수 있다.
바람직하게는, 이들 화합물은 전신 경로 (systemic route), 명확하게는 정맥내 (intravenous), 근육내 (intramuscular), 피내 (intradermic), 복강내 (intraperitoneal), 피하 (subcutaneous), 또는 경구 (oral) 경로에 의해 투여될 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체로 구성되는 조성물은 동일한 시간차를 두고 여러 번 용량으로 투여될 것이다.
그들의 투여 경로, 용량 섭생 및 최적의 생약 형태 (galenic form)는, 예를 들어 환자의 나이 또는 체중, 그의 일반적 상태의 중증도, 그의 치료에 대한 인내심 및 경험상의 부작용과 같은 환자에 적합한 치료를 확립할 때 일반적으로 고려되는 판단기준에 따라 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 CXCR4 발현 또는 과다발현하는 세포들에게 생물학적으로 활성을 가지는 화합물에 특이적으로 표적화하는 약물의 제조를 위한 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나의 용도에 관한 것이다.
이전에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 CXCR4 Mabs는 암 치료의 분야에서 강한 활성들을 가지므로, 이러한 항체들은 암을 치료하도록 CXCR4 길항제인 항-종양제들을 확인하는 검색 검정법들에 사용될 수 있다. 이들 검정법들의 첫 번째 단계에서, CXCR4를 발현하는 세포들은 본 발명의 항체들과 배양된 다음 분자들은 항체들 결합을 저해하는 그들의 잠재력에 대해 평가될 수 있다. 본 유형의 검정법들에 사용되는 세포들은 CHO-CXCR4, NIH3T3-CXCR4 또는 U373-MAGI-CXCR4와 같은 CXCR4 형질전환된 인간 세포주들와 같은 형질전환된 세포주들, NALM6와 같은 CXCR4를 발현하는 인간 세포주들 또는 PBMC와 같은 일차 세포들일 수 있다. CXCR4 발현 세포들 상의 항체들 결합을 저해하는 CXCR4의 길항제를 검색하는 데 사용되는 방법은 자오 등 (Zhao Q. et al., AIDS Research And Human Retroviruses, 2003, 19, pp947-955)에 기술된 바와 같이 세포-기초 경쟁적 효소-결합 면역흡착 검정법 (competitive enzyme-linked immunosorbent Assay, ELISA) 또는 후아레스 등 (Juarez J. et al., Leukemia 2003, 17, ppl294-1300)에 의해 기술된 바와 같은 형광-활성화된 세포 선별법 (Fluorescence-Activated cell Sorting, FACS)일 수 있다.
따라서 본 발명의 상세한 관점에서, 본 발명은
a) CXCR4 발현 세포들을 선별하고;
b) 상기 세포들을 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들과 반응시키고;
c) CXCR4에 대한 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나 간 결합의 잠재적인 저해를 하는 테스트될 분자들을 평가하고;
d) 상기 저해를 할 수 있는 분자들을 선별하는;
단계들을 포함하는 CXCR4 길항제 항-종양제들로서 분자들을 검색하고 및/또는 확인하는 방법이 고려된다.
본 발명의 기타 다른 특징들 및 장점들은 좀 더 나아가 실시예들 및 하기에 설명이 주어진 도면들과 함께 하기 기술내용에 나타날 것이다.
도 1A 및 도 1B는 암 세포들에서의 CXCR4 및 CXCR2 발현을 qPCR 분석법에 의해 각각 나타낸 것이다.
도 2는 암 세포들에서의 CXCR4 및 CXCR2 단백질 발현을 FACS 분석법에 의해 나타낸 것이다.
도 3A 및 3B는 야생형 인간 CXCR4를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포의 세포막 상에서 표지되지 않은 SDF-1 (도 3A) 및 515H7 Mab (도 3B)에 의한 특이적 [125I]SDF1 결합의 경쟁을 나타낸 것이다 (T: 전체 결합; NS: 비-특이적 결합).
도 4는 NIH-2T3 세포에서 안정적으로 발현되는 야생형 CXCR4 수용체에서 [35S]GTPγS 결합 반응들을 감시하여 515H7 Mab에 의한 G 단백질의 활성화 조정을 나타낸 것이다.
도 5는 SDF-1 (10 및 100 nM)로 자극된 HeLa 인간 종양세포들에서 [35S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 항-CXCR4 Mab 515H7에 의한 G 단백질의 조정을 나타낸 것이다.
도 6A 내지 도 6C는 HEK293 세포들에서 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET) 접근법에 의해 SDF-1에 의한 및 515H7 Mab에 의한 서로 다른 상호작용 파트너와의 CXCR4 수용체 연관성의 조정을 나타낸 것이다. (도 6A: CXCR4:CXCR4 호모-이중합; 도 6B: CXCR2:CXCR4 헤테로-이중합; 또한 도 6C: CXCR4-매개성 β-아레스틴의 채용).
도 7A 및 도 7B는 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 NIH-3T3 세포들에서 SDF-1 및 515H7 Mab에 의한 포스콜린 (forskolin)-자극성 cAMP 생산의 저해를 나타낸 것이다.
도 8은 CHO-K1 세포들에서 안정적으로 발현되는 전신적 활성을 가진 돌연변이 Asn119Ser CXCR4 수용체에서 [35S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 항-CXCR4 Mab 515H7에 의한 G 단백질 활성화의 조정을 나타낸 것이다.
도 9는 시험관내 Mab 515H7에 의한 SDF-1 유도성 U937 세포들 이동의 저해를 나타낸 것이다.
도 10은 Nod/Scid 마우스에서 항-CXCR4 Mab 515H7에 의한 MDA-MB-231 이종이식 종양 성장의 저해를 나타낸 것이다.
도 11A 내지 도 11C는 CHO-CXCR4 세포 (도 11A), MDA-MB-231 (도 11B), 및 U937 (도 11C) 암 세포들에서 항-CXCR4 Mab 515H7에 의한 SDF-1-유도성 칼슘 방출 저해를 나타낸 것이다.
도 12는 U937 Nod/Scid 마우스 생존 모델에서 마우스 항-CXCR4 Mab m515H7의 활성을 나타낸 것이다.
도 13은 Nod/Scid 마우스에서 T-세포 KARPAS 299 이종이식 종양 성장의 저해 시 마우스 항-CXCR4 Mab m515H7의 활성을 나타낸 것이다.
도 14는 야생형 인간 CXCR4를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포들의 세포막들 상에서 마우스 m515H7 Mab 및 키메라 Mab c515H7에 의한 특이적 [125I]SDF1 결합의 경쟁을 나타낸 것이다 (T: 전체 결합; NS: 비-특이적 결합).
도 15은 SDF-1 (10 nM)로 자극된 NIH-3T3 세포들에서 안정적으로 발현되는 야생형 CXCR4 수용체에서 [35S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 마우스 m515H7 Mab에 의한 및 키메라 m515H7 Mab에 의한 G 단백질의 조정을 나타낸 것이다.
도 16은 SDF-1 (10 nM)로 자극된 HeLa 인간 종양세포에서 [35S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 항-CXCR4 마우스 m515H7 Mab에 의한 및 키메라 m515H7 Mab에 의한 G 단백질의 조정을 나타낸 것이다.
도 17A 내지 도 17C는 HEK293 세포에서 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET) 접근법에 의해 SDF-1에 의한 또한 m515H7 및 c515H7에 의한 서로 다른 상호작용 파트너와의 CXCR4 수용체 연관성의 조정을 나타낸 것이다. (도 17A: CXCR4:CXCR4 호모-이중합; 도 17B: CXCR2:CXCR4 헤테로-이중합; 또한 도 17C: CXCR4-매개성 β-아레스틴의 채용).
도 18A 및 도 18B는 CHO-CXCR4 세포 (도 18A) 및 U937 세포 (도 18B)에서 SDF-1-유도성 칼슘 방출의 저해를 나타낸 것이다.
도 19는 시험관내 항-CXCR4 Mabs m515H7 및 c515H7에 의한 SDF-1 유도성 U937 세포들 이동의 저해를 나타낸 것이다.
도 20은 U937 Nod/Scid 마우스 생존 모델에서 항-CXCR4 키메라 Mab c515H7 활성을 나타낸 것이다.
도 21은 515H7 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열들의 정렬을 인간 배아계열 IGHV3-49*04 및 IGHI4*01과 함께 나타낸 것이다. 515H7 VH 아미노산 서열이 선택된 인간 수여자 구조틀 서열들과 정렬된다. VH1 및 VH2 (VH3는 미도시 된다) 서열들은 굵게 표시된 역 돌연변이된 잔기들을 가진 조작된 515H7 VH 도메인의 인간화 변형체들에 해당한다. 변형체 1 VH1은 역 돌연변이된 잔기를 보유하지 않고 전적인 인간 변형체를 보여준다. 변형체 VH2는 8개의 역 돌연변이들을 가지고 가장 마우스에 가까운 변형체이다. 변형체 VH3는 5개의 역 돌연변이들을 보유한다 (미도시).
도 22는 515H7 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열들의 정렬을 인간 배아계열 IGKV4-1*01 및 IGKJ1*01과 함께 나타낸 것이다. 515H7 VL 아미노산 서열이 선택된 인간 수용체 구조틀 서열들과 정렬된다. VL1 내지 VL3 서열들은 굵게 표시된 역 돌연변이된 잔기들을 가진 조작된 515H7 VL 도메인의 인간화 변형체들에 해당한다. 변형체 1 VL1은 역 돌연변이된 잔기를 보유하지 않고 가장 인간과 가까운 변형체를 보여준다. 변형체 VL2는 13개의 역 돌연변이들을 가지고 가장 마우스에 가까운 변형체이다. 변형체 VL3는 5개의 역 돌연변이들을 보유한다.
도 23A 내지 도 23F는 키메라 515H7 및 서로 다른 인간화 515H7 변형체들에 의한 바이오틴화된 마우스 항체 515H7의 교차 차단을 나타낸 것이다. 515H7의 인간화 변형체 (hz515H7)의 부모 마우스 항체 515H7을 교차 차단하는 활성은 CXCR4 형질전환된 NIH3T3 세포들을 사용하는 유동세포측정법에 의해 평가되었다. 인간화 변형체들의 활성은 키메라 515H7과 대비되었다. 키메라 VL (cVL)과 조합된 VH (VH1 내지 VH3)의 세 가지의 서로 다른 변형체들의 교차 차단 활성은 매우 유사하였다 (도 23A 내지 도 23B). VL의 변형체 1 및 2가 조합될 때 VH 변형체 1의 활성에서 감소가 전혀 측정되지 않았다. 활성의 유의한 감소는 제작물 hz515H7 VH1 VL3의 경우 검출되었다.
도 24는 인간화 항체 515H7 변형체 VH1 VLl의 활성을 테스트하는 BRET 검정법을 나타낸 것이다. 인간화 변형체 515H7 VH 변형체 1 VL 변형체 1 (hz515H7 VH1 VLl)의 활성이 SDF-1 매개성 신호 전달을 재해하는 그의 능력에 의해 평가되었다. 본 변형체는 BRET에 의해 결정된 바와 같이 SDF-1 매개성 신호 전달의 단지 일부의 저해만을 보여주었다. SDF-1는 100 nM의 농도로 사용되었다.
도 25A 내지 도 25D는 단일 또는 이중 역 돌연변이들을 가지는 VH1의 서로 다른 돌연변이들 또한 hz515H7 VH1 D76N과 서로 다른 VL 변형체들의 조합들의 비교를 나타낸 것이다. 단일 및 이중 역 돌연변이들이 VH1에서 만들어지고 VL1과 조합되었다. 이들 제작물들은 BRET 검정법들로 평가되었다 (도 25A 내지 도 25C). 이들 단일 역 돌연변이들 중에서 역 돌연변이 D76N를 가진 제작물들만이 SDF-1 매개성 신호 전달의 증가된 저해를 보여주었다. VH에서의 이중 돌연변이는 전혀 강한 저해 활성을 가지지 않았다 (도 25C). VH1의 단일 역 돌연변이 D76N는 VL의 서로 다른 변형체들과 조합되었다. SDF-1는 100 nM의 농도로 사용되었다.
도 26은 제작물 VH1 D76N VL2와 대비하여 단일 또는 이중 역 돌연변이들을 가지는 VH1 및 VL1의 서로 다른 돌연변이체의 순위매김을 나타낸 것이다. 단일 및 이중 역 돌연변이들이 VH1에서 만들어지고 Vl1과 조합되었다. 모든 제작물들은 BRET 검정법들 및 계산된 그들의 저해 퍼센트로 평가되었다. SDF-1는 100 nM의 농도로 사용되었다.
도 27A 및 도 27B는 인간화 515H7의 서로 다른 제작물들에 의한 SDF-1 결합의 저해 및 FACS 및 BRET에 의해 획득된 결과 간의 상호관련성을 나타낸 것이다. β-아레스틴의 채용을 차단하는 강한 활성을 가진 인간화 항체 515H7의 서로 다른 변형체들은 바이오틴화된 SDF-1의 결합을 저해하는 그들의 능력이 유동세포측정법 (FACS)에 의해 테스트되었다 (A). 이들은 VH1 및 VLl과 비교되었다. FACS-기초한 검정법으로부터 나온 결과들은 BRET에 의해 획득된 결과들과 상호관련된다 (B).
도 28은 hz515H7 VL2 및 심화 인간화 버전들 515H7 VL2.1, 515H7 VL2.2 및 515H7 VL2.3의 아미노산 정렬을 나타낸 것이다. 515H7 VL 아미노산 서열은 선택된 인간 수여자 구조틀 서열들과 함께 정렬된다. VL2.1, VL2.2 및 VL2.3 서열들은 굵게 표시된 돌연변이된 잔기들을 가진 인간화 515H7 VL2의 조작된 인간화 변형체들에 해당한다. VL2.1 및 VL2.2는 4개 이상의 인간화 잔기들을 가지는 한편, VL2.3는 5개 이상의 인간 잔기들을 포함한다.
도 29A 내지 도 29C는 NIH3T3-CXCR4 (도 29A), U937 (도 29B) 및 Ramos 세포들 (도 29C) 상의 CXCR4와 특이적으로 결합하는 515H7 인간화 Mabs (hz515H7 VHl D76N VL2, hz515H7 VHl D76N VL2.1, hz515H7 VHl D76N VL2.2 및 hz515H7 VHl D76N VL2.3)을 나타낸 것이다.
도 30A 내지 도 30D 및 도 31은 SDF-1 (10 nM 또는 100 nM)으로 자극된 NIH-3T3 세포들에서 안정적으로 발현되는 CXCR4 수용체에서 [35S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 인간화 Mabs 515H7 (hz515H7 VHl D76N VL2 (도 30A), hz515H7 VHl D76N VL2.1 (도 30B), hz515H7 VHl D76N VL2.2 (도 30C) 및 hz515H7 VHl D76N VL2.3 (도 30D))에 의한 G 단백질 활성화의 조정을 나타낸 것이다.
도 32A 내지 도 32C는 HEK293 세포에서 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET) 접근법에 의해 SDF-1에 의한 또한 인간화 항체 515H7 Mabs (hz515H7 VHl D76N VL2, hz515H7 VHl D76N VL2.1, hz515H7 VHl D76N VL2.2 및 hz515H7 VHl D76N VL2.3)에 의한 서로 다른 상호작용 파트너들과 CXCR4 수용체 연관성의 조정을 나타낸 것이다. (도 32A: CXCR4:CXCR4 호모-이중합; 도 32B: CXCR2:CXCR4 헤테로-이중합; 또한 도 32C: CXCR4-매개성 β-아레스틴의 채용).
도 33A 내지 도 33D은 a) 및 c)가 515H7을 사용한 IHC 염색 또한 b) 및 d)가 mIgG1을 사용한 IHC 염색으로 글리오픽스 (Glyofixx)-고정된 RAMOS 및 KARPAS299 이종이식 종양들을 나타낸 것이다.
도 34A 내지 도 34D은 a) 및 c)가 515H7을 사용한 IHC 염색 또한 b) 및 d)가 mIgG1을 사용한 IHC 염색으로 포몰 (Formol)-고정된 RAMOS 및 KARPAS299 이종이식 종양들을 나타낸 것이다.
도 35A 내지 도 35D는 야생형 인간 CXCR4를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포들의 세포막들 상에서 인간화 hz515H7 Mabs (hz515H7 VHl D76N VL2 (도 35A 및 도 35B), hz515H7 VHl D76N VL2.1 (도 35A 및 도 35C), hz515H7 VHl D76N VL2.2 (도 35A 및 도 35D), hz515H7 VH1 D76N VL2.3 (도 35A))에 의한 특이적 [125I]SDF1 결합의 경쟁을 나타낸 것이다 (T: 전체 결합; NS: 비-특이적 결합).
도 36은 U937 세포들에서 hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab에 의한 SDF1-유도성 칼슘 방출의 저해를 나타낸 것이다.
도 37A 및 도 37B는 시험관내 CXCR4 인간화 Mab hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab에 의한 SDF-1 유도성 U937 세포들 이동의 저해를 나타낸 것이다.
도 38은 a) 및 c)가 바이오틴화 hz515H7 VH1 D76N VL2을 사용한 IHC 염색 또한 b) 및 d)가 바이오틴화 hIgG1을 사용한 IHC 염색으로 글리오픽스-고정된 RAMOS 및 KARPAS299 이종이식 종양들을 나타낸 것이다.
도 39는 a) 및 c)가 바이오틴화 hz515H7 VH1 D76N VL2을 사용한 IHC 염색 또한 b) 및 d)가 바이오틴화 hIgG1을 사용한 IHC 염색으로 포몰-고정된 RAMOS 및 KARPAS299 이종이식 종양들을 나타낸 것이다.
도 40은 Scid 마우스에서 B 세포 Ramos 이종이식 종양 성장에 미치는 키메라 515H7 (c515H7) Mab의 효과를 나타낸 것이다.
도 41은 Scid 마우스에서 B 세포 Ramos 이종이식 종양 성장에 미치는 버전 hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab의 효과를 나타낸 것이다.
도 42는 Scid 마우스에서 B 세포 Ramos 이종이식 종양 성장에 미치는 버전 hz515H7 VH1 D76N VL2.1 Mab의 효과를 나타낸 것이다.
실시예 1: 암 세포에서 CXCR4 및 CXCR2 의 발현
-Q- PCR 분석법
서로 다른 암 세포주들에서 CXCR4 및 CXCR2의 상대적인 발현을 정량하기 위하여 실시간 RT-PCR이 사용되었다.
RNA 시료는 RNeasy 미니 또는 미디 프로토콜 (프랑스, 퀴아젠사)을 사용하여 서로 다른 세포주들로부터 추출되었다. 다음으로 RNA 시료는 엑스페리온 자동화된 전기영동 시스템 (Experion automated electrophoresis system) (프랑스, 바이오-래드사)을 사용하여 조절되었고 우수한 품질/통합성 (quality/integrity)을 보여주었다. 각 RNA 시료의 1 μg이 아이스크립트 cDNA 합성 키트 (iScript cDNA synthesis kit) (프랑스, 바이오-래드사)를 사용하여 cDNA 주형으로 전환되었다. cDNA 수준은 CXCR2의 경우 TaqMan 프로브 또는 CXCR4의 경우 사이버그린 (SYBERGreen) 둘 중 하나로 qPCR을 실시하여 정량되었다. 비교할 시료는 정상화 (normalization)를 필요로 하고, 따라서 내부적 기준 RPL0가 되입되었다. TaqMan 프로브 (CXCR2의 경우 사용됨)는 5' FAM 리포터 표지 및 3' TAMRA 제거인자 (quencher) 그룹을 보유하였다. PCR 효소는 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분 동안 가열하여 활성화되었다. 전체 50 μl의 부피에 5 μl의 cDNA 주형 (1/20 희석), 1 x qPCR 마스터믹스 (TaqMan 유니버설 PCR 마스터믹스, 미국 뉴저지 브랜치버그, 어플라이드 바이오시스템사), 50 내지 900 nM의 각 프라이머 및 50 내지 100 nM의 프로브를 포함하는 PCR 혼합액에서 두 단계 과정 95℃에서 15초 및 62℃에서 1분이 40 또는 45회 반복 사용되었다. 모든 반응은 아이사이클러 기기 (iCycler instrument, 바이오-래드사)를 사용하여 수행되었다. Q-PCR은 사이클 한계치 (Cycle threshold, Ct)를 결정하도록 하였다. Ct값이 더 작아질수록, 테스트된 유전자는 더 많이 발현되는 것이다. 인간 리보좀 단백질, 라지 P0에 대한 프라이머들 및 프로브들은 다음과 같았다:
전방 프라이머 (서열번호 63);
Figure pct00011
역방 프라이머 (서열번호 64);
Figure pct00012
프로브 (서열번호 65).
Figure pct00013
인간 CXCR4 (케모카인 수용체 4)에 대한 프라이머들은 다음과 같았다:
전방 프라이머 (서열번호 66);
Figure pct00014
역방 프라이머 (서열번호 67).
Figure pct00015
인간 CXCR2 (케모카인 수용체 2)에 대한 프라이머들은 다음과 같았다:
전방 프라이머 (서열번호 68);
Figure pct00016
역방 프라이머 (서열번호 69);
Figure pct00017
프로브 (서열번호 70).
Figure pct00018
우리의 비교 연구에서, 두 가지 유전자의 발현 [테스트된 유전자 (CXCR4 또는 CXCR2) 및 RPL0]이 두 가지 서로 다른 시료에서 정량되었다: 테스트된 세포주 및 기준 세포주. 기준 세포주는 정량된 유전자의 가장 낮은 발현을 포함하는 세포주에 해당한다. 비교 유전자 발현은 하기 공식을 사용하여 계산되었다:
상대적 유전자 발현 = (1 + E유전자)-△ Ct (1) / (1 + ERPL0)-△ Ct (2)
E유전자 = 정량된 유전자의 프로브/프라이머를 사용한 PCR 효율
ERPL0 = RPL0 프라이머/프로브를 사용한 PCR 효율
Ct = 순환 한계값
△Ct(1) = Ct유전자 (테스트된 세포주) - Ct유전자 (기준 세포주)
△Ct(2) = CtRPL0 (테스트된 세포주) - CtRPL0 (기준 세포주)
일련의 PCR 각각의 경우, 상대적 유전자 정량 값이 계산되었고, 암 세포주들은 가장 높은 것부터 음성인 것까지 그들의 발현 수준을 고려하여 그룹으로 분류되었다. 모든 데이타는 도 1A 및 도 1B에 나타나 있다. 테스트된 암 세포주들 모두는 CXCR2의 경우에 DU145 및 U-87MG 세포를 제외하고 CXCR4 (도 1A) 및 CXCR2 (도 1B)를 발현하였다.
- FACS 분석법
MDA-MB-231, PC3 및 U937 암 세포주들은 투과 처리되었고 (permeabilized), 다음으로 10 μg/mL의 항-CXCR4 모노클론 항체 [클론 44717 (R & D 시스템사)] 및 그의 이소형 대조군 IgG2b (시그마사) 또는 10 μg/mL의 항-CXCR2 모노클론 항체 (항 h-CXCR2, 클론 48311, R & D 시스템사, Mab 331 대비 그의 이소형 대조군 IgG2a) 둘 중 하나와 배양되었다. 다음으로 이 세포는 1% BSA/PBS/0.01% NaN3로 세척되었다. 이후, 알렉사-표지된 (Alexa-labelled) 이차 항체가 세포에 첨가되었고 4℃에서 20분 동안 배양되도록 하였다. 다음으로 세포는 다시 두 번 세척되었다. 두 번째 세척에 이어서, FACS 분석법이 수행되었다. 이들 결합 연구의 결과는 도 2에 제공된다. 따라서, MDA-MB-231, PC3 및 U937과 같은 종양세포들은 CXCR4 및 CXCR2 단백질 둘 다를 발현하였다.
실시예 2: 인간 CXCR4 에 대한 모노클론 항체 ( Mabs )의 생성
CXCR4에 대한 모노클론 항체를 생성하기 위하여, Balb/c 마우스가 재조합 NIH3T3-CXCR4 세포 및/또는 CXCR4 세포외 N-말단 및 루프 구조들에 해당하는 펩타이드로 면역접종되었다. 첫 번째 면역접종 시 6 내지 16주령이 된 마우스가 완전 프런드 아쥬반트 (complete Freund's adjuvant)에 녹인 항원으로 한 번 피하로 (s.c.) 면역접종되었고, 이어서 불완전 프런드 아쥬반트에 녹인 항원으로 피하로 2 내지 6번 더 면역접종되었다. 면역 반응은 안와후방 채혈 (retroorbital bleeds)에 의해 감시되었다. 혈청은 엘라이자 (ELISA)에 의해 검색되었고 (하기 기술된 바와 같이) 더 높은 항-CXCR4 항체의 역가 (titers)를 가진 마우스가 융합에 사용되었다. 마우스는 희생시켜 비장을 제거하기 이틀 전에 항원으로 정맥내 추가자극 (boost)되었다.
- 엘라이자 ( ELISA )
항-CXCR4 항체를 생산하는 마우스를 선별하기 위하여, 면역접종된 마우스로부터 나온 혈청이 엘라이자에 의해 테스트 되었다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트는 BSA에 결합된 정제된 [1-41] N-말단 펩타이드를 사용하여 5 μg의 동등한 펩타이드/mL, 100 μL/웰 농도로 코팅되었고 4℃에서 하룻밤 동안 배양된 다음 250 μL/웰 농도로 PBS에 녹인 0.5% 젤라틴을 사용하여 블록킹시켰다. CXCR4-면역접종된 마우스로부터 나온 혈장의 희석액이 각 웰에 첨가되었고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 플레이트는 PBS로 세척된 다음 HRP에 접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (잭슨 연구소)로 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 세척 이후에, 플레이트는 TMB 기질을 사용하여 현상되었고, 반응은 5분 경과시 100 μL/웰의 1 M H2SO4의 첨가에 의해 정지되었다. 더 높은 항-CXCR4 항체의 역가를 가진 마우스가 항체 생성을 위해 사용되었다.
- CXCR4 에 대한 Mabs 를 생산하는 하이브리도마의 생성
더 높은 항-CXCR4 항체의 역가를 나타내었던 Balb/c 마우스로부터 분리된 마우스 비장세포가 PEG를 사용하여 마우스 마이엘로마 세포주 Sp2/O에 융합되었다. 세포는 마이크로타이터 플레이트에 대략 1 x 105/웰 농도로 도말되었고, 이어서 두 주 동안 초배양 배지 + 2 mM L-글루타민 + 1 mM 소듐 피루베이트 + 1 x HAT을 포함하는 선택 배지로 배양되었다. 다음으로, 웰은 항-CXCR4 모노클론 IgG 항체에 대해 엘라이자에 의해 검색되었다. 다음으로 하이브리도마를 분비하는 항체가 희석을 제한하여 적어도 두 번 서브클론 되었고 심화된 분석법을 위한 항체를 생성하기 위하여 시험관내 배양되었다.
실시예 3: FACS 분석법에 의한 항- CXCR4 Mabs 515 H7 결합 특이성 및 암 세포주들 인식의 특성 분석
본 실험에서는, 항-CXCR4 Mab 515H7의 인간 CXCR4에 대한 특이적 결합이 FACS 분석법에 의해 조사되었다.
NIH-3T3, NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포, MDA-MB-231, HeLa 및 U937 암 세포주가 10 μg/mL의 단일클론 항체 515H7와 함께 배양되었다. 다음으로 세포는 1% BSA/PBS/0.01% NaN3로 세척되었다. 이후, 알렉사-표지된 이차 항체가 세포에 첨가되었고 4℃에서 20분 동안 배양되도록 하였다. 다음으로 세포는 다시 두 번 세척되었다. 두 번째 세척에 이어서, FACS 분석법이 수행되었다. 이들 결합 연구의 결과들은 하기 표 4에 제공되고, 이는 항-CXCR4 Mab 515H7가 인간 CXCR4-NIH3T3 형질전환된 세포주에 특이적으로 결합하는 반면 부모 NIH3T3 세포 상에서는 전혀 인식이 없는 점을 [FACS에 의해 획득된 평균 형광 강도 (MFI)]로 보여준다. 또한 본 Mab는 인간 암 세포주, 예를 들어 MDA-MB-231 유방암 세포, U937 전골수암 세포 및 HeLa 자궁경부암 세포를 인식할 수 있었다.
항-CXCR4 Mab 515H7는 NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포를 인식하였던 반면 부모 NIH3T3 야생형 세포의 인식은 전혀 없었다. Mab 515H7는 또한 암 세포주들을 인식할 수 있었다.
Figure pct00019
실시예 4: 인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO - K1 세포막에서 [ 125 I]SDF-1에 대한 항- CXCR4 Mab 515 H7 의 결합 경쟁
본 분석법은 515H7 Mab가 인간 CXCR4 수용체에 대한 방사선 표지된 [125I]SDF-1 결합과 경쟁하는 능력을 오소스테릭 (orthosteric) 또는 알로스테릭 (allosteric) 결합 부위에서 평가하도록 한다.
인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 인간 CXCR4 수용체의 전체 코딩 서열 (RefSeq NM_003467)을 보유하는 포유동물 발현 벡터를 사용한 CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61)의 형질전환으로 획득되었다. 세포는 완전 배양 배지 [5% 우태아 혈청 (FCS) 및 500 μg/ml의 제네티신이 보충된 DMEM-햄 F12]에서 증식되었다. 방사성 리간드 결합 (radioligand binding) 실험이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스 (HEPES), pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 CHO-CXCR4 세포의 기계적 긁어내기 (mechanical scrapping)로 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [125I]SDF-1 결합 (특이적 활성: 1500 Ci/mmol)은 SPA 기술을 사용하여 수행되었다 [신틸레이션 근접 분석법 (scintillation proximity assay) - GE 헬스케어사]. 간략하게, 세포막 (30 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 1 mM의 CaCl2, 5 mM의 MgCl2, 150 mM의 NaCl, 1% BSA]에서 평가될 화합물 (SDF-1 또는 mAb), 방사성 리간드 (1 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 평형 (binding equilibrium)에는 25℃에서 1시간 이후에 도달하였다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 [scintillation counter, 탑카운트 (TopCount), 퍼킨 엘머사]로 측정되었다. 비-특이적 결합은 10 μM의 표지되지 않은 SDF-1의 존재 시 조사되었다.
표지되지 않은 SDF-1은 7.75 ± 0.27 nM (n = 4)의 pKi 값 (IC50 = 특이적 [125I]SDF-1 결합의 50% 저해를 가져오는 리간드 농도)으로 [125I]SDF-1 결합을 용량-의존적으로 저해하였다 (도 3A). 동일한 실험적 조건들 하에서, 515H7 (100 nM)은 하기 [125I]SDF-1 결합에 대해 효율적으로 경쟁하였다: (64 ± 3%) (도 3B).
실시예 5: 야생형 CXCR4 수용체를 발현하는 세포막에서 항- CXCR4 Mab 515 H7 에 의한 [ 35 S] GTP γS 결합의 조정
본 기능적 분석법은 CXCR4 리간드 및 515H7 Mab에 의한 야생형 인간 CXCR4 수용체를 통한 G 단백질 활성화 및 그의 조정을 감시하도록 한다.
야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포는 상기 CHO-K1 세포에 대한 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. HeLa (인간 자궁경부 암종) 세포는 완전 배양 배지 [10% FCS, 1% L-글루타민, 2μM 소듐 바이카보네이트가 보충된 EMEM]에서 증식되었다. [35S]GTPγS 결합이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 기계적 긁어내기로 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [35S]GTPγS (특이적 활성: 1000 Ci/mmol)의 도입 및 검출은 SPA 기술 (신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사)을 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포막 (10 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, 3 μM의 GDP, 10 mM의 MgCl2, 100 mM의 NaCl, 100 mM의 EDTA, pH = 7.4]에서 평가될 화합물 (흥미로운 SDF-1 또는 Mab), [35S]GTPγS (0.2 - 0.4 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 반응은 25℃에서 1 시간 동안 수행되었다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 (탑카운트, 퍼킨 엘머사)로 측정되었다. 길항제 효능 (antagonist potency)은 쳉 프루소프 방정식 (Cheng Prussof equation)을 적용하여 계산되었다:
K = [길항제 농도] / {(EC50'/EC50)-1}
여기에서 EC50 및 EC50'는 각각 mAb 부재 및 존재 시의 SDF-1 효능이다.
SDF-1은 CXCR4 수용체에 의한 G 단백질 활성화의 결과로서, [35S]GTPγS 결합의 용량-의존적 증가를 유도하였다. [35S]GTPγS 결합의 최대 자극은 각각 HeLa 및 NIH3T3/CXCR4 세포막에 대한 기저 [35S]GTPγS 결합에 대비하여 167% 및 320%를 나타낸다. SDF-1의 효능은 세포주 둘 다에서 유사하였고 41.3 ± 9.7 nM에 해당하였다 (도 4). 이들 실험적 조건들 하에서, 515H7 Mab의 길항제 효능은 NIH3T3/CXCR4 세포에서 결정된 바, 15 nM이었다. 유사한 길항제 효능이 HeLa 세포에 대해서도 관찰되었다 (도 5).
실시예 6: 서로 다른 상호작용 파트너와 CXCR4 의 연관성: 호모 및 헤테로이중합 , 생물발광 공명 에너지 전이 ( BRET ) 접근법를 통한 β- 아레스틴의 채용 및 이들 이중체들 상에 미치는 515 H7 Mab 의 효과
본 기능적 분석법은 CXCR4 수용체에 결합하는 SDF-1 및/또는 515H7 Mab 상에 유도되는 입체형태적 변화를 CXCR4 호모-이중체 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 형성뿐만 아니라 β-아레스틴-2 신호전달 단백질의 채용의 수준에서 평가하도록 한다.
조사된 상호작용 파트너 각각의 발현 벡터는 통상적인 분자생물학 기법을 적용하여 해당되는 염색 (레닐라 레니포르미스 루시페라제, Rluc 및 노란색 형광 단백질, YFP)을 가진 융합 단백질로서 제작되었다. BRET 실험을 수행하기 이틀 이전에, HEK293 세포가 해당되는 BRET 파트너를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질전환되었다: CXCR4 호모 이중합를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP], CXCR4 및 CXCR2 헤테로 이중합를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4:YFP] 또한 β-아레스틴-2의 CXCR4-매개성 채용을 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + β-arr2:YFP]. 그 날 이후에, 세포는 완전 배양 배지 [10% FBS가 보충된 DMEM]를 사용하여 폴리-라이신 전코팅된 흰색 96 MW 플레이트에 분배시켰다. 먼저 세포는 플레이트에 세포 부착을 허용하기 위해 37℃에서 5% CO2 조건으로 배양되었다. 다음으로 세포는 200 μl DMEM/웰로 처리하여 하룻밤 동안 굶겼다. BRET 실험 직전에, DMEM은 제거되었고 세포는 PBS로 신속하게 세척되었다. 다음으로 세포는 항체의 존재 또는 부재 시 PBS로 37℃에서 10분 동안 배양되었으며, 이후 300 nM의 SDF-1이 있거나 없이 5μM의 실렌터라진 H (coelenterazine H)가 최종 부피 50 μl로 첨가되었다. 37℃에서 10분 더 배양한 이후에, 미스라스 LB 940 다중표지 리더기 (베르톨드사)를 사용하여 485 nm 및 530 nm에서 빛-방출의 측정이 시작되었다 (상온에서 1s/파장/웰이 15회 반복되었다).
BRET 비율의 계산은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Angers et al ., 2000): [(방출530 nm)-(방출485 nm) X Cf] / (방출485 nm), 여기에서 동일한 실험 조건 하에서 Rluc 융합 단백질을 단독 발현하는 세포의 경우 Cf =(방출530 nm) / (방출485 nm). 이 방정식을 단순화하면 BRET 비율이 두 가지 BRET 파트너가 존재할 때 획득되는 530/485 nm 비율에 해당하고, 이는 분석법에 Rluc에 융합된 파트너만이 존재할 때 동일한 실험 조건 하에서 획득되는 530/485 nm 비율에 의해 교정되는 것을 보여준다. 해석 (readability)을 위해, 결과는 밀리BRET 유닛 (mBU)으로 표현된다; mBU은 1000을 곱한 BRET 비율에 해당한다.
SDF1 (300 nM)이 CXCR4 수용체에 융합된 연결자 (adaptor) 및 수여자 (acceptor) 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 20% 증가시켰고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모-이중체의 형성 또는 기존 이중체의 입체형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 6A 및 도 6B). 흥미롭게도, SDF1 (300 nM)이 CXCR2 및 CXCR4에 융합된 연결자 및 수여자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 24% 감소시켰고, 이는 마찬가지로 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체의 형성 또는 기존 이중체의 입체형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 6C 및 6D). 이러한 후자의 경우에, CXCR2/CXCR4의 SDF-1-활성화된 형태는 BRET 에너지 전이를 덜 선호하는 것으로 보인다. 둘 다의 경우에서, 515H7 Mab는 CXCR4 호모-이중체에 대한 SDF-1-유도성 입체형태적 변화 (SDF-1-유도성 BRET 증가의 69% 저해, 도 6A)뿐만 아니라 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 형성 (SDF-1-유도성 BRET 감소의 90% 저해, 도 6B)을 조정할 수 있었다. 또한 515H7 Mab는 스스로 CXCR4/CXCR4 및 CXCR2/CXCR4 공간적 근접을 조정할 수 있었고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 둘 다의 입체형태에 미치는 515H7 Mab의 영향을 나타내었다 (도 6A 및 도 6B).
SDF-1 (300 nm)에 의한 CXCR4 활성화는 BRET 신호가 233% 증가된 것에서 나타난 바와 같이, 세포내 신호전달 분자인 β-아레스틴의 강한 채용을 가져왔다 (도 6C). 이러한 채용은 515H7 Mab에 의해 부분적으로 저해되었고 (약 95% 저해, 도 6C), 신호전달에 미치는 515H7 Mab의 효과를 보여주었다.
실시예 7: cAMP 생산의 CXCR4 - 매개성 저해
본 기능적 검정법은 저해성 Gi/o 단백질들을 통해 아데닐레이트 사이클라제 (adenylate cyclases)의 수준에서 신호전달하는 CXCR4 수용체를 감시하기 위해 설계되었다.
cAMP 랜스 (cAMP LANCE) 방법 (퍼킨 엘머사)이 공급사에 의해 자세하게 기술된 바와 같이 적용되었다. 야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포는 상기에서 기술된 바와 같이 획득되어 증식되었다. 세포는 트립신-제거제인 베르센 (Versene)을 사용하여 수집되었고 알렉사형광 (AlexaFluor)-결합 항cAMP Mab (1/100 희석) 및 화합물 (포스콜린, SDF-1 및/또는 515H7 Mab)을 포함하는 용액에 106 세포/ml의 농도로 재현탁되었다. 상온에서 30분 동안 배양하고 나서, 유로피움-스트렙트아비딘 (1/125배 희석) 및 바이오틴-cAMP (1/125배 희석) 복합체가 포함된 검출 믹스가 첨가되었다. 상온에서 1시간 동안 배양한 다음, 이로부터 나온 FRET 신호가 미스라스 LB940 (베르톨드사) 다중표지 리더기로 측정되었다. 결과는 임의적 형광 측정값으로서 또는 FK 효과를 차감한 SDF-1 반응에 대한 상대적 자극으로서 표현된다.
포스콜린 (FK)는 NIH3T3/CXCR4 세포에서 약 0.3 μM의 효능을 가지고 cAMP 생산을 용량-의존적으로 자극시켰다 (도 7A). SDF-1이 함께 존재 시, 세포내 cAMP 수준은 CXCR4 수용체에 의한 저해성 Gi/o 단백질 활성화의 결과로서 감소하였다. SDF-1의 효능은 5.0 ± 3.1 nM이었다 (도 7A). 515H7 Mab는 SDF-1의 포스콜린-자극성 효과를 80% 이상 효율적으로 저해하였다 (도 7B).
실시예 8: 전신적으로 활성을 가진 돌연변이체 Asn 119 Ser CXCR4 수용체를 발현하는 세포막에서 Mab 515 H7 에 의한 [ 125 I] SDF -1 결합의 조정
본 기능적 검정법은 전신적으로 활성을 가진 돌연변이 (CAM) Asn119Ser CXCR4 수용체를 통한 G 단백질 활성화를 감시하도록 한다 (Zhang et al ., 2002 참조). 본 민감한 분석법은 CXCR4 리간드를 그들 고유의 활성에 근거하여 구별되도록 한다 (부분적 작동제, 침묵의 길항제 또는 역 작동제). 이전에 장 (Zhang)과 그의 동료에 의해 기술된 바와 같이, AMD3100 또는 T140과 같은 CXCR4 리간드는 CAM CXCR4 수용체에서 부분적 작동제 및 역 작동제로서 각각 행동한다. 침묵의 길항제는 이 분자의 부류가 CXCR4의 활성 부위 및 불활성 부위 둘 다에 유사한 친화성을 나타내야 하기 때문에 확인하는 것이 어려울 수 있다 (Wurch et al ., 1999).
CXCR4 수용체의 코딩 서열에 Asn119Ser 돌연변이를 도입하는 것은 통상적인 분자생물학 기법 (QuickChange 부위 유도된 돌연변이화 키트, 미국 스트라타젠사)을 적용하여 수행되었다. CAM CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포가 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. [35S]GTPγS 결합이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서의 기계적 긁어내기에 의해 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [35S]GTPγS (특이적 활성: 1000 Ci/mmol)의 도입은 SPA 기술 (신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사)을 사용하여 수행되었다 . 간략하게, 세포막 (10 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, 3 μM의 GDP, 10 mM의 MgCl2, 10 mM의 NaCl, 100 mM의 EDTA, pH = 7.4]에서 평가될 화합물 (SDF-1 또는 Mab), [35S]GTPγS (0.2 - 0.4 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 반응은 25℃에서 1 시간 동안 수행되었다. 원심분리 시 [1000 g에서 10분 동안] 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 (탑카운트, 퍼킨 엘머사)로 측정되었다.
SDF-1 (100 nM)은 [35S]GTPγS 결합을 130% 자극시켰다. 역 작동제 T140은 기저 (-17%) 및 SDF-1 자극된 (-159%) [35S]GTPγS 결합을 둘 다 저해하였다. 대조적으로, 515H7 Mab는 기저 [35S]GTPγS 결합 (도 8)을 변화시키지 않지만 SDF-1 유도성 [35S]GTPγS 결합 (도 8)을 저해하면서 CAM CXCR4에서 침묵의 길항제로서 행동하였다.
실시예 9: SDF -1-유도성 U937 세포들 이동에 미치는 항- CXCR4 Mab 515 H7 의 효과
항-CXCR4 모노클론 항체 515H7가 이동 과정에 미치는 저해 효과를 평가하기 위하여, 2% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지에 100,000개의 U937 세포가 이동 체임버 (8-μm 기공 크기를 가진 24웰 플레이트)의 상부 체임버에 웰의 하부 부분에 SDF-1의 존재 시 또는 부재 시 상부 체임버에 Mab 515H7가 있거나 없는 상태에서 도말되었다. 본 테스트에서는, 마우스 IgG2b가 이소형 대조군으로 도입되었다. 도말 2시간 이후에, 이동하는 세포가 측정되었다. 도 9에 표현된 결과는 예상된 바와 같이 SDF-1이 U-937 세포 이동의 유의한 증가를 유도할 수 있었던 것을 보여주었다. 세포가 IgG2 이소형 대조군과 배양되었을 때는 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, 515H7 Mab와 함께 배양된 세포의 경우 SDF-1-유도성 U937 세포 이동에서 유의하고도 재생가능한 감소가 관찰되었다: 80% 이상.
실시예 10: Nod / Scid 마우스에서 MDA - MB -231 이종이식 종양 성장의 항- CXCR4 Mab 515 H7 저해
이들 실험의 목표는 Nod/Scid 마우스에서 MDA-MB-231 이종이식 종양 성장을 저해하는 항-CXCR4 Mab 515H7의 능력을 평가하는 것이었다.
ECACC로부터 입수된 MDA-MB-231 세포는 10% FCS (미국 세인트루이스, 시그마사)가 포함된 DMEM 배지 (영국 스코틀랜드, 인비트로겐사)에서 일상적으로 배양되었다. 세포는 이식 48시간 이전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 10백만 개의 MDA-MB-231 세포는 PBS에 넣어 7주령 된 Nod/Scid 마우스 (프랑스 찰스 리버사)에 이식되었다. 이식 5일 이후에, 종양은 측정 가능하였고 (34 mm3 < V3 < 40 mm3) 동물은 비교가능한 종양 크기를 가지는 6개의 마우스 그룹으로 나뉘었다. 마우스는 2 mg/마우스 로딩 용량의 Mab 515H7로 복강내 (i.p.) 처리되었다.
다음으로, 마우스는 0.5 mg/용량/마우스의 Mab 515H7로 주당 세 번 주입되었다. 본 실험에서 PBS 그룹이 대조군 그룹으로서 도입되었다. 종양 부피는 주당 두 번 측정되었고, 공식: π/6 X 길이 X 너비 X 높이에 의해 계산되었다. 통계적 분석법이 만-휘트니 테스트 (Mann-Whitney test)를 사용하여 각 측정에서 수행되었다.
이들 실험들에서, 처리하는 동안 치사는 전혀 관찰되지 않았다. PBS 그룹에 비해, 0.5 mg/용량의 515H7의 경우 종양 성장의 유의한 저해가 있었고, 처리 5주 이후에 평균 종양 부피는 Mab 515H7의 경우 PBS 대비 50% 감소되었다 (도 10).
실시예 11: 세포내 칼슘 저장물의 CXCR4 수용체- 매개성 가동화
본 기능적 검정법은 세포질 세망 (endoplasmic reticulum)으로부터 나온 세포내 저장물로부터 칼슘 방출을 유도하는 포스포리파제 C (phospholipase C) 경로의 자극을 통한 CXCR4 수용체 신호전달을 감시하기 위하여 고안되었다.
야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포들은 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. MDA-MB-231 (인간 유방 샘암종) 및U937 (인간 림프종) 세포가 완전 배양 배지 [10% FCS가 보충된 DMEM] 및 [10% FCS, 2 mM의 헤페스, 1% 비-필수 아미노산 용액, 1% 소듐 피루베이트, 1% L-글루타민, 4.5 g/l 포도당이 보충된 RPMI 1640]에서 각각 증식되었다. 모든 유형의 세포가 적절한 배양 배지를 넣은 검은색 96MW 플레이트에 100,000 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포는 실험을 실시하기 전에 하룻밤 동안 굶겼다. 로딩 완충용액 [1x HBSS, 20 mM의 헤페스, 20 mM의 프로베니시드 산 (probenicid acid)]에 녹인 형광 칼슘 염색약 (Fluo-4 세척 없음, 미국 인비트로겐사)과 함께 37℃에서 30분 동안 로딩되었고 이어서 25℃에서 30분 동안 이루어졌다. SDF-1에 의한 자극은 각 웰 내로 직접 주입되어 수행되었다. 길항기작 (antagonism) 실험을 위해, 10 μl의 Mab 용액이 SDF-1 처리 적어도 10분 이전에 로딩 완충용액 내로 직접 첨가되었다. 동적 형광 측정은 하기 세팅을 사용하는 다중-방식 형광 마이크로플레이트 리더기, 미스라스 LB940 (베르톨드사) 상에서 수행되었다: 485 nm에서 여기, 535 nm에서 방출, 10000 임의적 유닛의 여기 에너지. 각 웰에서의 형광은 SDF-1 주입 (기저 신호) 이전에 0.1초 동안 매초마다 또한 20초의 기간 동안 기록되었다. 다음으로 20 μl의 SDF-1이 주입되고 데이타 기록은 2분의 기간 동안 이어졌다. 각 실험 조건은 두 벌로 수행되었다. 각 웰에 대한 측정값은 먼저 기저 형광 및 세포가 없는 대조군 웰에 의해 방출되는 형광을 차감하여 교정되었다. 상대적인 데이타는 SDF-1 (100 nM)에 의해 획득되는 최대 자극의 퍼센트로서 표현되었다.
SDF-1 (100 nM)은 재조합 CHO/CXCR4에서 세포내 칼슘의 신속하고도 강한 방출을 유도하였던 반면, 그대로의 CHO-K1 세포에서는 형광 신호가 전혀 검출되지 않았다. 최대 강도는 기저 형광에 대해 > 160%에 도달하였고 SDF-1에 의해 자극하고 나서 약 30초에 관찰되었다; SDF-1 (100 nM)에 의한 최대 형광 강도가 더 낮긴 하지만 (기저 값에 대해 130 - 140%), 유사한 운동 곡선이 MDA-MB-231 및 U-937 둘 다에서 관찰되었다 (도 11A, 도 11B, 도 11C). 515H7 항체 (133 nM)는 세 가지 조사된 세포주들 모두에서 SDF-1 (100 nM)-유도성 칼슘 신호의 강하고도 거의 완벽한 저해를 가져왔다.
실시예 12: U937 마우스 생존 모델에서 항- CXCR4 Mab 515 H7 의 활성
ATCC로부터 입수된 U937 세포는 10% FCS, 1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 세포는 이식 이틀 전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 10백만 개의 U937 세포는 암컷 NOD/SCID 마우스에 복강내 주입되었다. 이식 이틀 후에, 마우스는 2 mg의 515H7 Mab/마우스의 로딩 용량으로 피하적으로 처리되었고 다음으로 1 mg의 항체/마우스로 주당 두 번 처리되었다. 대조군 마우스는 이전 연구에서 보여주었던 바와 같이 PBS 주입을 받았고, PBS가 주입된 마우스와 마우스 IgG 이소형 대조군이 투여된 마우스 간 생존에서의 차이점은 전혀 관찰되지 않았다. 마우스 생존은 매일 감시되었다.
도 12에 묘사된 결과는 515H7 Mab로 처리된 마우스가 수명에서 약 280 T/C%의 극적이고도 유의한 증가를 나타낸 것을 보여주었다 (도 12).
실시예 13: Nod / Scid 마우스에서 T-세포 KARPAS 299 이종이식 종양 성장의 항- CXCR4 Mab 515 H7 저해
본 실험의 목표는 Nod/Scid 마우스에서 KARPAS 299 이종이식의 성장을 저해하는 항-CXCR4 Mab 515H7의 능력을 평가하는 것이었다.
ECACC로부터 입수된 KARPAS 299 세포는 1% L-Glu, 10% FCS (미국 세인트루이스, 시그마사)가 포함된 RPMI 배지에서 일상적으로 배양되었다. 세포는 이식 48시간 이전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 5백만 개의 KARPAS 299 세포는 PBS에 넣어 7주령 된 Nod/Scid 마우스 (프랑스 찰스 리버사)에 이식되었다. 이식 5일 이후에, 종양은 측정 가능하였고 (32 mm3 < V3 < 49 mm3) 동물은 비교가능한 종양 크기를 가지는 6개의 마우스 그룹으로 나뉘었다. 마우스는 2 mg/마우스 로딩 용량의 Mab 515H7으로 복강내 (i.p.) 주입되었다.
다음으로, 마우스는 1 mg/용량/마우스의 Mab 515H7으로 주당 두 번 주입되었다. 본 실험에서 PBS 그룹이 대조군 그룹으로서 도입되었다. 종양 부피는 주당 두 번 측정되었고, 공식: π/6 X 길이 X 너비 X 높이에 의해 계산되었다. 통계적 분석법이 만-휘트니 테스트를 사용하여 각 측정에서 수행되었다.
이들 실험에서, 처리하는 동안 치사는 전혀 관찰되지 않았다. PBS 그룹에 비해, 1 mg/용량의 Mab 515H7의 경우 D7 및 D33 (p ≤ 0.002) 간의 종양 성장의 유의한 저해가 있었고, 처리 5주 이후에 평균 종양 부피는 Mab 515H7의 경우 PBS 대비 63% 감소되었다 (도 13).
실시예 14: 항- CXCR4 키메라 Mab c515H7 의 생산
마우스 c515H7 Mab의 키메라 형식이 설계되었다: 이것은 인간 C카파 (Ckappa) 및 IgG1 불변 도메인들에 유전적으로 융합된, 관심 있는 마우스 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들에 해당한다. 재조합 Mab는 pCEP4 발현 벡터를 가진 HEK293/EBNA 시스템 (미국, 인비트로겐사)을 사용하는 일시적 형질전환 (transient transfection) 직후에 생산되었다.
515H7 Mab 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인들에 해당하는 전체 뉴클레오타이드 서열들이 글로벌 유전자 합성 (룩셈부르크, 진큐스트사)에 의해 합성되었다. 그들은 인간 IgG1 면역글로불린의 경쇄 [C카파] 또는 중쇄 [CH1-힌지-CH2-CH3]의 불변 도메인의 전체 코딩 서열을 보유하는 pCEP4 벡터 (미국, 인비트로겐사) 내로 서브클론 되었다. 모든 클로닝 단계는 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같은 통상적인 분자생물학 기법에 따라 또는 공급자의 지침에 따라 수행되었다. 각 유전적 작제 (construct)는 빅 염색 종결자 사이클 (Big Dye terminator cycle) 시퀀싱 키트 (미국, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정에 의해 완전히 확인되었고 3100 유전적 분석기 (3100 Genetic Analyzer)(미국, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 분석되었다.
현탁배양-적응된 HEK293 EBNA 세포 (미국, 인비트로겐사)는 50 mL의 6 mM 글루타민이 보충된 무혈청 배지 Excell 293 (SAFC 바이오사이언스사)가 들어있는 250 ml 플라스크로 궤도 진탕기 (orbital shaker) 상에서 (100 rpm의 회전 속도) 성장시켰다. 일시적 형질전환은 직쇄상 1 mg/ml의 최종 농도로 물에 녹인 25 kDa 폴리에틸렌이민 (PEI)(폴리사이언스사) 및 플라스미드 DNA (1 : 1의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 비율에 대하 1.25 μg/ml의 최종 농도)를 사용하여 2.106 세포/ml 농도로 수행되었다. 형질전환 4시간 이후에, 배양액은 106 세포/ml의 최종 농도로 맞추기 위하여 동일한 부피의 새로운 배양 배지로 희석되었다. 배양 과정은 세포 생존도 및 Mab 생산을 근거로 하여 감시되었다. 일반적으로, 세포 배양은 4 내지 5일 동안 유지되었다. Mab는 통상적인 크로마토그래피 접근법을 사용하여 단백질 A 레진 (미국, GE 헬스케어사) 상에서 정제되었다. 모든 서로 다른 Mabs가 기능적 평가에 적합한 수준으로 생산되었다. 생산성 수준은 일반적으로 정제된 Mab의 6 및 15 mg/l 사이 범위이다.
실시예 15: FACS 분석법에 의한 항- CXCR4 키메라 Mab c515H7 결합 특이성 및 암 세포주 인식의 특성 분석
본 실험에서는, 항-CXCR4 키메라 Mab c515H7의 인간 CXCR4에 대한 특이적 결합이 FACS 분석법에 의해 조사되었다.
NIH-3T3, NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포, MDA-MB-231 암 세포주가 10 μg/mL의 단일클론 항체 c515H7와 함께 배양되었다. 다음으로 세포는 1% BSA/PBS/0.01% NaN3로 세척되었다. 이후, 알렉사-표지된 이차 항체가 세포에 첨가되었고 4℃에서 20분 동안 배양되도록 하였다. 다음으로 세포는 다시 두 번 세척되었다. 두 번째 세척에 이어서, FACS 분석법이 수행되었다. 이들 결합 연구의 결과는 하기 표 7에 제공되고, 이는 항-CXCR4 키메라 Mab c515H7가 인간 CXCR4-NIH3T3 형질전환된 세포주에 특이적으로 결합하고 또한 인간 암 세포주, 예를 들어 MDA-MB-231 유방암 세포를 인식하는 점을 [FACS에 의해 획득된 평균 형광 강도 (MFI)]로 보여준다.
Figure pct00020
실시예 16: 인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO - K1 세포막에서 [ 125 I]SDF-1에 대한 항- CXCR4 마우스 Mab m515H7 및 키메라 Mab c515H7 의 결합 경쟁
본 검정법은 마우스 Mab m515H7 및 키메라 Mab c515H7가 인간 CXCR4 수용체에 대한 방사선 표지된 [125I]SDF-1의 결합과 경쟁하는 능력을 오소스테릭 또는 알로스테릭 결합 부위에서 평가하도록 한다.
인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 인간 CXCR4 수용체의 전체 코딩 서열 (RefSeq NM_003467)을 보유하는 포유동물 발현 벡터를 사용한 그대로의 CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61)의 형질전환 직후에 획득되었다. 세포는 완전 배양 배지 [5% 우태아 혈청 (FCS) 및 500 μg/ml의 제네티신이 보충된 DMEM-햄 F12]에서 증식되었다. 방사성 리간드 결합 실험이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스 (HEPES), pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 CHO-CXCR4 세포의 기계적 긁어내기 직후에 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [125I]SDF-1 결합 (특이적 활성: 1500 Ci/mmol)은 SPA 기술을 사용하여 수행되었다 [신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사]. 간략하게, 세포막 (30 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 1 mM의 CaCl2, 5 mM의 MgCl2, 150 mM의 NaCl, 1% BSA]에서 평가될 화합물 (SDF-1 또는 mAb), 방사성 리간드 (1 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)과 함께 배양되었다. 결합 평형에 25℃에서 1시간 이후에 도달하였다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 [탑카운트 (TopCount), 퍼킨 엘머사]로 측정되었다. 비-특이적 결합 (NS)은 10 μM의 표지되지 않은 SDF-1의 존재 시 조사되었다.
항-CXCR4 Mab (100 nM)는 다음의 랭킹 순서의 경쟁 효능 ([125I]SDF-1의 % 저해)을 가지고 [125I]SDF-1 결합에 대해 효율적으로 경쟁하였다: m515H7 (62 ± 10%) 및 c515H7 (55 ± 4%) (도 14).
실시예 17: 야생형 CXCR4 수용체를 발현하는 세포막에서 항- CXCR4 마우스 Mab m515H7 및 키메라 Mab c515H7 에 의한 [ 35 S] GTP γS 결합의 조정
본 기능적 검정법은 항-CXCR4 마우스 Mab m515H7 또한 키메라 Mabs c515H7에 의한 야생형 인간 CXCR4 수용체를 통한 G 단백질 활성화를 감시하도록 한다.
야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포는 상기 CHO-K1 세포에 대하여 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. HeLa (인간 자궁경부 암종) 세포는 완전 배양 배지 [10% FCS, 1% L-글루타민, 2μM 소듐 바이카보네이트가 보충된 EMEM]에서 증식되었다. [35S]GTPγS 결합이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 기계적 긁어내기 직후에 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [35S]GTPγS (특이적 활성: 1000 Ci/mmol)의 도입 및 검출은 SPA 기술 (신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사)을 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포막 (10 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, 3 μM의 GDP, 10 mM의 MgCl2, 100 mM의 NaCl, 100 mM의 EDTA, pH = 7.4]에서 평가될 화합물 (흥미로운 SDF-1 또는 Mab), [35S]GTPγS (0.2 - 0.4 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 반응은 25℃에서 1시간 동안 수행되었다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 (탑카운트, 퍼킨 엘머사)로 측정되었다. IC50 값이 각 Mab에 대해 계산되었다.
이들 실험적 조건들 하에서, m515H7 및 c515H7 Mabs의 IC50 값은 NIH3T3/CXCR4 세포에서 결정된 바, 각각 1.9 nM 및 1.5 nM이었다 (도 15). 동일한 실험적 조건들에서 HeLa 세포들을 사용하여 결정된 m515H7 및 c515H7 Mabs의 IC50 값은 각각 0.2 nM 및 0.6 nM이었다 (도 16).
실시예 18 : 서로 다른 상호작용 파트너들과 CXCR4 의 연관성: 호모 및 헤테로이중합 , 생물발광 공명 에너지 전이 ( BRET ) 접근법을 통한 β- 아레스틴의 채용 및 이들 이중체들 상에 미치는 마우스 Mab m515H7 및 키메라 Mab c515H7 의 효과
본 기능적 검정법은 CXCR4 수용체에 결합하는 SDF-1 및/또는 m515H7 마우스 Mab 및 c515H7 키메라 Mab 상에 유도되는 입체형태적 변화를 CXCR4 호모-이중체 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 형성뿐만 아니라 β-아레스틴-2 신호전달 단백질의 채용의 수준에서 평가하도록 한다.
조사된 상호작용 파트너들 각각의 발현 벡터는 통상적인 분자생물학 기법을 적용하여 해당되는 염색 (레닐라 레니포르미스 루시페라제, Rluc 및 노란색 형광 단백질, YFP)을 가진 융합 단백질로서 제작되었다. BRET 실험을 수행하기 이틀 전에, HEK293 세포가 해당되는 BRET 파트너를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질전환 되었다: CXCR4 호모 이중합를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP], CXCR4 및 CXCR2 헤테로 이중합를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4:YFP] 또한 β-아레스틴-2의 CXCR4-매개성 채용을 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + β-arr2:YFP]. 그 날 이후에, 세포는 완전 배양 배지 [10% FBS가 보충된 DMEM]를 사용하여 폴리-라이신 전코팅된 흰색 96 MW 플레이트에 배분시켰다. 먼저 세포는 플레이트에 세포 부착을 가능하게 하기 위해 37℃에서 5% CO2 조건으로 배양되었다. 다음으로 세포는 200 μl DMEM/웰로 처리하여 하룻 밤 동안 굶겼다. BRET 실험 직전에, DMEM은 제거되었고 세포는 PBS로 신속하게 세척되었다. 다음으로 세포는 항체의 존재 또는 부재 시 PBS로 37℃에서 10분 동안 배양되었으며, 이후 300 nM의 SDF-1이 있거나 없이 5μM의 실렌터라진 H가 최종 부피 50 μl로 첨가되었다. 37℃에서 10분 더 배양한 이후에, 미스라스 LB 940 다중표지 리더기 (베르톨드사)를 사용하여 485 nm 및 530 nm에서 빛-방출의 측정이 시작되었다 (상온에서 1s/파장/웰로 15회 반복수행되었다).
BRET 비율은 이전에 기술된 바와 같이 계산되었다 (Angers et al ., 2000): [(방출5 30 nm)-(방출485 nm) X Cf] / (방출485 nm), 여기에서 동일한 실험 조건 하에서 Rluc 융합 단백질을 단독 발현하는 세포의 경우 Cf =(방출530 nm) / (방출485 nm). 이 방정식을 단순화하면 BRET 비율이 두 가지 BRET 파트너가 존재할 때 획득되는 530/485 nm 비율에 해당하고, 이는 분석법에 Rluc에 융합된 파트너만이 존재할 때 동일한 실험 조건 하에서 획득되는 530/485 nm 비율에 의해 교정되는 것을 보여준다. 해독가능성을 위해, 결과는 밀리BRET 유닛 (mBU)으로 표현된다; mBU은 1000을 곱한 BRET 비율에 해당한다.
SDF1 (100 nM)이 CXCR4 수용체에 융합된 연결자 및 수여자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 10% 증가시켰고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모-이중체의 형성 또는 기존 이중체의 입체형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 17A). 흥미롭게도, SDF1 (100 nM)이 CXCR2 및 CXCR4에 융합된 연결자 및 수여자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 17% 감소시켰고, 이는 마찬가지로 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체의 형성 또는 기존 이중체의 입체형태적 변화를 나타낸다 (도 17B). 이러한 후자의 경우에, CXCR2/CXCR4의 SDF-1-활성화된 형태는 BRET 에너지 전이를 덜 선호하는 것으로 보인다. 둘 다의 경우에서, m515H7 및 c515H7 Mabs는 CXCR4 호모-이중체에 대한 SDF-1-유도성 입체형태적 변화 (c515H7의 경우 SDF-1-유도성 BRET 증가의 96% 저해, 도 17A)뿐만 아니라 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 형성 (c515H7의 경우 SDF-1-유도성 BRET 감소의 98% 저해, 도 17B)을 조정할 수 있었다. 또한 m515H7 및 c515H7 Mabs는 그들 스스로 CXCR4/CXCR4 및 CXCR2/CXCR4 공간적 근접을 각각 조정할 수 있었고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 입체형태에 미치는 이들 Mabs의 영향을 나타내었다 (도 17A 및 도 17B).
SDF-1 (100 nm)에 의한 CXCR4 활성화는 BRET 신호가 400% 증가된 것에서 나타난 바와 같이, 세포내 신호전달 분자인 β-아레스틴의 강한 채용을 가져왔다 (도 17C). 본 채용은 c515H7 Mab에 의해 부분적으로 저해되었고 (약 93% 저해, 도 17C), 신호전달에 미치는 이들 Mabs의 효과를 보여주었다.
실시예 19: 세포내 칼슘 저장물의 CXCR4 수용체- 매개성 가동화
본 기능적 검정법은 세포질 세망으로부터 나온 세포내 저장물로부터 칼슘 방출을 유도하는 포스포리파제 C 경로의 자극을 통한 CXCR4 수용체 신호전달을 감시하기 위하여 고안되었다.
야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. U937 (인간 백혈병) 세포가 완전 배양 배지 [10% FCS가 보충된 DMEM] 및 [10% FCS, 2 mM의 헤페스, 1% 비-필수 아미노산 용액, 1% 소듐 피루베이트, 1% L-글루타민, 4.5 g/l 포도당이 보충된 RPMI 1640]에서 각각 증식되었다. 모든 유형의 세포가 적절한 배양 배지를 넣은 검은색 96MW 플레이트에 100,000 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포는 실험을 실시하기 전에 하룻밤 동안 굶겼다. 로딩 완충용액 [1x HBSS, 20 mM의 헤페스, 20 mM의 프로베니시드 산]에 녹인 형광 칼슘 염색약 (Fluo-4 세척 없음, 미국 인비트로겐사)과 함께 37℃에서 30분 동안 로딩되었고 이어서 25℃에서 30분 동안 이루어졌다. SDF-1에 의한 자극은 각 웰 내로 직접 주입되어 수행되었다. 길항기작 실험을 위해, 10 μl의 Mab 용액이 SDF-1 처리 적어도 10분 전 로딩 완충용액 내로 직접 첨가되었다. 동적 형광 측정은 하기 세팅을 사용하는 다중-방식 형광 마이크로플레이트 리더기, 미스라스 LB940 (베르톨드사) 상에서 수행되었다: 485 nm에서 여기, 535 nm에서 방출, 10000 임의적 유닛의 여기 에너지. 각 웰에서의 형광은 SDF-1 주입 (기저 신호) 이전에 0.1초 동안 매초마다 또한 20초의 기간 동안 기록된다. 다음으로 20 μl의 SDF-1이 주입되고 데이타 기록은 2분의 기간 동안 이어진다. 각 실험 조건은 두 벌로 수행된다. 각 웰에 대한 측정값은 먼저 기저 형광 및 세포가 없는 대조군 웰에 의해 방출되는 형광을 차감하여 교정된다. 상대적인 데이타는 SDF-1 (100 nM)에 의해 획득되는 최대 자극의 퍼센트로서 표현된다.
SDF-1 (100 nM)은 재조합 CHO/CXCR4에서 세포내 칼슘의 신속하고도 강한 방출을 유도하였던 반면, 그대로의 CHO-K1 세포에서는 형광 신호가 전혀 검출되지 않았다. 최대 강도는 기저 형광에 대해 > 140%에 도달하였고 SDF-1에 의해 자극하고 나서 약 40초에 관찰되었다; 유사한 운동 곡선이 U-937 세포를 사용하여 관찰되었다 (도 18A 및 도 18B). 키메라 항체 c515H7 (133 nM)는 조사된 세포주 둘 다에서 SDF-1 (100 nM)-유도성 칼슘 신호의 강하고도 거의 완벽한한 저해를 가져왔다.
실시예 23: SDF -1-유도성 U937 세포 이동에 미치는 항- CXCR4 마우스 Mab m515H7 및 키메라 Mab c515H7 의 효과
항-CXCR4 항체 m515H7 및 c515H7가 이동 과정에 미치는 저해 효과를 평가하기 위하여, 2% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지에 넣은 100,000개의 U937 세포가 이동 체임버 (8-μm 기공 크기를 가진 24웰 플레이트)의 상부 체임버에 웰의 하부 부분에 SDF-1의 존재 시 또는 부재 시 상부 체임버에 Mab m515H7 및 c515H7가 있거나 없는 상태에서 도말되었다. 본 테스트에서는, 마우스 IgG2b가 이소형 대조군으로 도입되었다. 도말 2시간 이후에, 이동하는 세포가 측정되었다. 도 19에 표현된 결과들은, 예상된 바와 같이 SDF-1가 U-937 세포 이동의 유의한 증가를 유도할 수 있었던 것을 보여주었다. 세포가 IgG2 이소형 대조군과 배양되었을 때는 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, c515H7 및 m515H7 Mabs와 배양된 세포의 경우 SDF-1-유도성 U937 세포 이동에서 유의하고도 재생가능한 감소가 관찰되었다: c515H7 및 m515H7 Mab로 약 80% 이상.
실시예 21: U937 마우스 생존 모델에서 항- CXCR4 키메라 Mab c515H7 의 활성
ATCC로부터 입수된 U937 세포는 10% FCS, 1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 세포는 이식 이틀 전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 10백만 개의 U937 세포는 암컷 Nod/Scid 마우스에 복강내 주입되었다. 이식 이틀 후에, 마우스는 2 mg의 c515H7 Mab/마우스의 로딩 용량으로 피하적으로 처리된 다음 1 mg의 항체/마우스로 주당 두 번 처리되었다. 대조군 마우스는 이전 연구에서 보여주었던 바와 같이 PBS 주입을 받았고, PBS가 주입된 마우스와 마우스 IgG 이소형 대조군이 투여된 마우스 간에 생존에서의 차이점은 전혀 관찰되지 않았다. 마우스 생존은 매일 감시되었다.
도 20에 묘사된 결과는 c515H7 Mab로 처리된 마우스가 수명에서 약 180 T/C%의 극적이고도 유의한 증가를 나타낸 것을 보여주었다.
실시예 22: 515 H7 항- CXCR4 마우스 항체의 인간화
- 일반적인 절차
515H7 항-CXCR4 마우스 항체의 인간화는 CDR-이식 (CDR-grafting)의 보편적 규칙들을 적용하여 수행되었다. 면역유전학적 분석 및 CDR과 구조틀 (FR) 부위들의 정의는 독특한 IMGT 번호매김 설계 뿐만 아니라 IMGT 라이브러리들 및 도구들을 적용하여 수행되었다 (Lefranc, 1997- www.imgt.org).
인간화 과정의 효율은 β-아레스틴의 SDF1-매개성 채용을 저해하는 능력에 대한 조작된 항체들의 기능적 활성을 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET) 검정법에 의해 테스트하여 평가되었다. 본 검정법에서 CXCR4는 루시페라제 및 YFP를 가진 β-아레스틴으로 태그 표지되었다. CXCR4에 대한 β-아레스틴의 SDF1-매개성 채용이 CXCR4의 신호 전달에서 중요한 단계이다. 515H7의 인간화 변형체들의 결합도 역시 인간 CXCR4로 안정하게 형질전환된 NIH3T3 세포주 상에서 결정되었다. 결합 활성은 바이오틴화된 마우스 항체와 경쟁 분석법에 의해 평가되었다. 두 번째 시도에서, 인간화 항체들은 RAMOS 세포에 대한 바이오틴화된 SDF-1의 결합을 저해하는 그들의 능력에 대해 평가되었다. RAMOS 세포는 CXCR4의 높은 발현 및 CXCR7과 SDF-1의 낮은 발현 때문에 선택되었다.
이들 검정법들은 항-CXCR4 항체의 재조합 인간화 버전을 특성분석하는 데 사용되었다. 가변 도메인들은 IgG1/k 불변 도메인으로 형식화되었고 포유동물 발현 벡터 pCEP 내로 클론되었다. 재조합 IgG1/κ-유래 항체들이 HEK293 세포에서 일시적으로 발현되었다. 발현 배양 상청액은 여과되었으며 항체들은 프로테인 A 세파로스를 사용하여 정제되었다. 정제된 항체들은 PBS를 넣어 재완충되었으며 항체 농도는 엘라이자에 의해 결정되었다.
- 515 H7 가변 도메인들의 인간화
CDR 이식을 위한 적정한 인간 배아계열을 선별하기 위하여, 515H7 VH 마우스 서열과 가장 높은 상동성을 가지는 인간 배아계열 유전자가 확인되었다. IMGT 데이타베이스들 및 도구들의 도움을 받아, 인간 IGHV3-49*04 배아계열 유전자 및 인간 IGHJ4*01 J 배아계열 유전자가 마우스 515H7 VH CDRs를 위한 인간 수여자 서열들로서 선택되었다. 인간 V-유전자 IGHV3-49*04는 마우스 515H7 중쇄의 가변 도메인의 V-유전자와 80.27%의 상동성을 가진다. 인간 J-유전자 IGHJ4*01 J에 대한 상동성은 87.50%이다. 19개의 잔기들이 선택된 인간 배아계열 유전자들 및 마우스 항체 515H7의 VH 도메인 간에 서로 다르다. 부모 항체의 VH 도메인 및 배아계열 서열들 간의 정렬은 도 21에 나타나 있다.
경쇄의 가변 도메인에 관하여, 인간 배아계열 유전자들 IGKV4-1*01 및 IGKJ1*01이 선택되었다 (도 22). 인간 V-유전자 IGKV4-1*01와의 상동성은 79.12%이다. 경쇄의 515H7 J-유전자는 인간 J-유전자 IGKJ1*01에 대한 84.84%의 상동성을 가진다.
해독된 인간 배아계열 유전자들 IGHV3-49*04 및 IGKV4-1*01의 아미노산 서열은 결정화되었던 동종유래 항체들을 확인하는 데 사용되었다. 중쇄의 경우 RCSB 단백질 데이타은행 (RCSB Protein Data Bank)에서 수탁번호 1MAM를 가진 항체가 모델로서 선택된 한편, 경쇄의 경우는 1SBS가 선택되었다. 두 가지 도메인들이 컴퓨터 프로그램 DS 비주얼 (DS visual)을 사용하여 조립되었고 인간화 항체 515H7를 위한 모델로서 사용되었다.
부모 항체 및 해당하는 인간 배아계열 서열 간에 서로 다른 각 잔기의 위치를 기초로 하여, 우선도의 랭킹 순서가 인간 및 마우스 서열들 간에 서로 다른 각 잔기에 대해 주어졌다 (도 21 및 도 22). 이들 우선도들은 각각 VHl, VH2 및 VH3라고 명명되는 인간화 가변 도메인들의 세 가지의 서로 다른 변형체들을 만드는 데 사용되었다.
첫 번째 일련의 실험들에서, 우리는 세 가지의 첫 번째 인간화 변형체들을 제작하였고 그들의 항-CXCR4 결합 활성들을 분석하였다. VH 변형체 1 (VH1)은 마우스 VL과 조합되었고 이들 제작물은 바이오틴화된 마우스 515H7 부모 항체의 결합을 저해하는 그들의 능력으로 평가되었다. 모든 제작물들은 마우스 항체과 경쟁하는 유사한 능력을 보여주었다 (도 23A 내지 도 23C). 이것은 가장 인간과 가까운 VH 변형체가 인간과 덜 가까운 변형체들과 동일한 결합 능력을 가지는 점을 가르킨다. 따라서, VH1은 VL의 세 가지 서로 다른 변형체들과 조합되었다 (도 23D 내지 도 23F). VHl 및 VL3의 조합만이 감소된 바이오틴화된 마우스 항체와 경쟁하는 능력을 보여주었던 한편, 구조틀 상에 역 돌연변이들을 보유하지 않는 가장 인간과 가까운 변형체 VHl VLl는 키메라 항체와 동일한 교차 차단 활성을 보여주었다.
본 변형체 VHl VLl는 좀 더 나아가 BRET 검정법들에서 β-아레스틴의 SDF-1 매개성 채용을 저해하는 그의 능력에 대해 테스트되었다 (도 24). 부모 항체의 교차 차단에 의해 결정된 바와 같이 수용체에 대한 원하던 결합 활성에도 불구하고, 제작물 VHl VLl는 β-아레스틴의 채용의 약한 저해만을 보여주었다. 이러한 강한 저해적 활성의 결여는 필요한 마우스 잔기들로 인간 구조틀 잔기들의 치환을 만들어낸다. 단일한 역 돌연변이들이 VH1을 위해 제작되었다. 다음의 잔기들이 치환되었다: V48L, E61D, D76N 및 A81L (일차 아미노산 서열에 따른 번호매김). 변형체 VH1의 이들 단일 역 돌연변이체들은 변형체 VL1과 조합되었다. 이들 중에서 역 돌연변이 D76N만이 BRET 검정법에 의해 평가되는 바와 같은 신호 전달의 증가된 저해를 유도하였다 (도 25B).
본 제작물의 활성을 증가시키고 좀 더 나아가 다른 잔기들의 중요성을 평가하기 위하여, 서로 다른 이중 역 돌연변이체들이 VH1을 위해 제작되었다. 이들 제작물들의 저해적 활성은 유의하게 개선되었지만 (약 40 내지 50%의 평균 저해), 만족할만 하지 못하다 (도 25C). 다음으로 단일한 역 돌연변이체 D76N는 세 가지의 서로 다은 VL 변형체들과 조합되었다 (도 25D). 제작물 hz515H7 VH D76N VL2은 키메라 항체와 동일한 범위에 있는 평균 상의 88.2%의 활성을 보여주었다.
단일 및 이중 역 돌연변이들이 변형체 VL1 도메인에서 제작되었고 제작물 hz515H7 VH1 D76N VL2의 활성이 비교되었다 (도 26). 테스트된 조합들의은 본 제작물과 동일하거나 더 나은 활성을 전혀 가지지 않았다.
hz515H7 VH1 D76N VL2의 경우 구조틀에서 인간 잔기들의 퍼센트가 계산되었고: 이것은 180개 잔기들에서 나온 14개의 비-인간 잔기들을 포함하고, 이는 92.2%의 《배아도 지표 (germinality index)》와 동일하다. 비교하여, 인간화되고 시판되는 항체들 베박시주마브 (bevacizumab) 및 트라스투주마브 (trastuzumab)는 그들의 가변 도메인들에서 각각 30개 및 14개의 비-인간 잔기들을 포함한다.
SDF1-매개성 β-아레스틴의 채용을 저해하는 능력의 가장 강력한 효능을 보여주는 네 가지 최고의 인간화 형태들도 역시 바이오틴화된 SDF-1의 결합을 저해하는 그들의 능력에 대하여 테스트되었다 (도 27A). SDF-1 결합의 저해 및 β-아레스틴 채용의 밀접한 상호연관성이 결정되었다. 본 상호연관성은 SDF-1 결합의 저해가 신호 전달의 저해의 주요한 기작과 가장 유사한 점을 가르킨다.
좀 더 나아가 hz515H7 VHl D76N VL2 변형체를 인간화하기 위하여, 세 가지의 추가적인 변형체들이 도 26에서 평가된 이중 및 삼중 돌연변이체들로 얻어진 정보를 사용하여 설계되었다. 네 개 및 다섯 개의 추가적인 잔기들이 변형체 VL2.1, VL2.2 및 VL2.3 (VL2-1, VL2-2 및 VL2-3라고도 명명됨) 각각이 인간화되었다, 그들은 잔기들 D9, P49, D66, S69, S83, L84; V89에 해당한다. VL2와 비교하여 이들 세 가지의 변형체들의 정렬이 도 28에 나타나있다.
이들 VL2 변형체들이 SDF1-매개성 β-아레스틴의 채용을 저해하는 능력이 측정되었다. 인간화 hz515H7 VH1 D76N VL2, VL2.1, VL2.2 및 VL2.3 변형체들은 키메라 항체 c515H7과 유사한 활성을 보여주었다 (도 26).
- 515 H7 -2 가변 도메인들의 인간화
CDR 이식을 위한 또 다른 인간화 형태, 또 다른 적절한 인간 배아계열을 생성하기 위하여, 경쇄 및 중쇄들의 가변 도메인을 위한 둘 다가 선택되었다. 그들 둘 다의 경우, 배아계열이 마우스 서열과의 상동성 퍼센트를 고려할 뿐만 아니라 그들이 각각 마우스 515H7의 VH 및 VL과 동일한 CDR 길이를 가지도록 선택되었다.
IMGT 데이타베이스들 및 도구들의 도움을 받아, 인간 IGHV3-73*01 배아계열 유전자 및 인간 IGHJ4*01 J 배아계열 유전자가 마우스 515H7 VH CDRs을 위한 인간 수여자 서열들로서 선택되었다. 인간 V-유전자 IGHV3-73*01는 마우스 515H7 중쇄의 가변 도메인의 V-유전자 대비 79% 이상의 상동성을 가진다. 인간 J-유전자 IGHJ4*01 J에 대한 상동성은 87.50%이다.
경쇄의 가변 도메인에 관하여, 인간 배아계열 유전자들 IGKV2D-40*01 및 IGKJ1*01가 선택되었다. 인간 V-유전자 IGKV2D-40*01와의 상동성은 70% 이상이다. 경쇄의 515H7 J-유전자는 인간 J-유전자 IGKJ1 *01 대비 84.85%의 상동성을 가진다.
부모 항체 및 해당하는 인간 배아계열 서열 간에 서로 다른 각 잔기의 위치및 당업자의 지식을 기초로 하여, 여러 가지의 결정적인 잔기들이 역 돌연변이될 잔기들로서 확인되었다.
중쇄에 관하여, 이들 잔기들은 H35S, V48L, R50F, A61D, D76N 및/또는 A81L이다 (표 2c의 서열번호 86 및 90을 참조하라).
경쇄의 측면에서, 이들 잔기들은 L9S, I21M, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y 및/또는 V89L이다 (표 2c의 서열번호 85 및 89를 참조하라).
실시예 23: FACS 분석법에 의한 항- CXCR4 인간화 Mab 515 H7 의 결합 특이성 및 암세포주들 인식의 특성분석
본 실험에서는 항-CXCR4 인간화 Mabs 515H7의 인간 CXCR4에 대한 특이적 결합이 FACS 분석법에 의해 조사되었다.
NIH-3T3, NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포가 0으로부터 10 μg/mL까지의 인간화 Mabs 515H7 (hz515H7 VHl D76N VL2 [=hz515H7VL2], hz515H7 VHl D76N VL2.1 [=hz515H7VL2.1], hz515H7 VHl D76N VL2.2 [=hz515H7VL2.2] 및 hz515H7 VHl D76N VL2.3 [=hz515H7VL2.3])와 4℃ 암소에서 20분 동안 100 μl의 Facs 완충용액에 넣어 배양되었다. Facs 완충용액으로 3번 세척한 이후에, 세포는 이차 항체인 염소 항-인간 알렉사 488 (1/500 희석)을 사용하여 4℃ 암소에서 20분 동안 배양되었다. Facs 완충용액으로 3번 세척한 이후에, 프로피디움 요오드가 각 웰에 첨가되었고 살아있는 세포만 FACS에 의해 분석되었다. 적어도 5,000개의 살아있는 세포가 각 조건에서 형광 강도의 평균 값을 측정하는 데 평가되었다.
이들 결합 연구의 결과는 도 29A 내지 도 29C에 제공되고, 이는 항-CXCR4 인간화 Mabs hz515H7가 인간 CXCR4-NIH3T3 형질전환된 세포주에 특이적으로 결합하고 (도 29A) (NIH3T3 부모 세포의 경우, MFI = 2.2) 또한 인간 암 세포주들, 예를 들어 U937 (도 29B) 및 Ramos (도 29C)를 인식하는 사실 [FACS에 의해 획득된 평균 형광 강도 (MFI)]을 보여준다.
실시예 24: 야생형 CXCR4 수용체를 발현하는 세포막에서 항- CXCR4 인간화 Mabs 515 H7 에 의한 [ 35 S] GTP γS 결합의 조정
본 기능적 검정법은 항-CXCR4 인간화 Mabs 515H7에 의한 야생형 인간 CXCR4 수용체를 통한 G 단백질 활성화를 감시하도록 한다.
야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포는 상기 CHO-K1 세포에 대하여 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. HeLa (인간 자궁경부 암종) 세포는 완전 배양 배지 [10% FCS, 1% L-글루타민, 2μM 소듐 바이카보네이트가 보충된 EMEM]에서 증식되었다. [35S]GTPγS 결합이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 기계적 긁어내기 직후에 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [35S]GTPγS (특이적 활성: 1000 Ci/mmol)의 도입 및 검출은 SPA 기술 (신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사)을 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포막 (10 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, 3 μM의 GDP, 10 mM의 MgCl2, 100 mM의 NaCl, 100 mM의 EDTA, pH = 7.4]에서 평가될 화합물 (흥미로운 SDF-1 또는 Mab), [35S]GTPγS (0.2 - 0.4 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 반응은 25℃에서 1시간 동안 수행되었다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 (탑카운트, 퍼킨 엘머사)로 측정되었다. IC50 값이 각 Mab에 대해 계산되었다.
이들 실험적 조건들 하에서, 인간화 (hz) 515H7 Mabs의 IC50 값은 NIH3T3/CXCR4 세포에서 결정된 바, hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab의 경우 3.86 nM (도 30A), hz515H7 VH1 D76N VL2-1 Mab의 경우 4.05 nM (도 30B), hz515H7 VH1 D76N VL2-2 Mab의 경우 5.19 nM (도 30C) 또한 hz515H7 VH1 D76N VL2-3 Mab의 경우 8.5 nM (도 30D)이었다.
또한 hz515H7 Mabs도 SDF-1 (100 nM)에 의해 자극된 [35S]GTPγS 결합을 hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab의 경우 86%, hz515H7 VH1 D76N VL2-1 Mab의 경우 69%, hz515H7 VH1 D76N VL2-2 Mab의 경우 66%, hz515H7 VH1 D76N VL2-3 Mab의 경우 58% 저해의 a%로 저해할 수 있었다 (도 31).
실시예 25: 서로 다른 상호작용 파트너들과 CXCR4 의 연관성: 호모 및 헤테로이중합 , 생물발광 공명 에너지 전이 ( BRET ) 접근법를 통한 β- 아레스틴의 채용 및 이들 이중체들 상에 미치는 인간화 Mabs 515 H7 의 효과
본 기능적 검정법은 CXCR4 수용체에 결합하는 SDF-1 및/또는 515H7 인간화 Mabs 상에 유도되는 입체형태적 변화를 CXCR4 호모-이중체 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 형성뿐만 아니라 β-아레스틴-2 신호전달 단백질의 채용의 수준에서 평가하도록 한다.
조사된 상호작용 파트너들 각각의 발현 벡터는 통상적인 분자생물학 기법을 적용하여 해당되는 염색 (레닐라 레니포르미스 루시페라제, Rluc 및 노란색 형광 단백질, YFP)을 가진 융합 단백질로서 제작되었다. BRET 실험을 수행하기 이틀 이전에, HEK293 세포가 해당되는 BRET 파트너를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질전환되었다: CXCR4 호모 이중합를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP], CXCR4 및 CXCR2 헤테로 이중합를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4:YFP] 또한 β-아레스틴-2의 CXCR4-매개성 채용을 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + β-arr2:YFP]. 그 날 이후에, 세포는 완전 배양 배지 [10% FBS가 보충된 DMEM]를 사용하여 폴리-라이신 미리-코팅된 흰색 96 MW 플레이트에 분배시켰다. 먼저 세포는 플레이트에 세포 부착을 허용하기 위해 37℃에서 5% CO2 조건으로 배양되었다. 다음으로 세포는 200 μl DMEM/웰로 처리하여 하룻밤 동안 굶겼다. BRET 실험 직전에, DMEM은 제거되었고 세포는 PBS로 신속하게 세척되었다. 다음으로 세포는 항체의 존재 또는 부재 시 PBS로 37℃에서 10분 동안 배양되었으며, 이후 300 nM의 SDF-1이 있거나 없이 5μM의 실렌터라진 H (coelenterazine H)가 최종 부피 50 μl로 첨가되었다. 37℃에서 10분 더 배양한 이후에, 미스라스 LB 940 다중표지 리더기 (베르톨드사)를 사용하여 485 nm 및 530 nm에서 빛-방출의 측정이 시작되었다 (상온에서 1s/파장/웰이 15회 반복되었다).
BRET 비율의 계산은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Angers et al ., 2000): [(방출530 nm)-(방출485 nm) X Cf] / (방출485 nm), 여기에서 동일한 실험 조건 하에서 Rluc 융합 단백질을 단독 발현하는 세포의 경우 Cf =(방출530 nm) / (방출485 nm). 이 방정식을 단순화하면 BRET 비율이 두 가지 BRET 파트너가 존재할 때 획득되는 530/485 nm 비율에 해당하고, 이는 분석법에 Rluc에 융합된 파트너만이 존재할 때 동일한 실험 조건 하에서 획득되는 530/485 nm 비율에 의해 교정되는 것을 보여준다. 해독가능성을 위해, 결과는 밀리BRET 유닛 (mBU)으로 표현된다; mBU은 1000을 곱한 BRET 비율에 해당한다.
SDF1 (100 nM)이 CXCR4 수용체에 융합된 연결자 및 수여자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 12% 증가시켰고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모-이중체들의 형성 또는 기존 이중체들의 입체형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 32A). 흥미롭게도, SDF1 (100 nM)이 CXCR4 및 CXCR2에 융합된 연결자 및 수여자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 16% 감소시켰고, 이는 마찬가지로 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체들의 형성 또는 기존 이중체들의 형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 32B). 본 후자의 경우에, CXCR4/CXCR2의 SDF-1-활성화된 형태는 BRET 에너지 전이를 덜 선호하는 것으로 보인다. 둘 다의 경우에서, 515H7 인간화 Mabs는 CXCR4 호모-이중체들에 대하여 hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab의 경우 약 88%, hz515H7 VH1D76N-VL2.1 Mab의 경우 65%, hz515H7 VH1D76N-VL2.2 Mab의 경우 33% 또한 hz515H7 VH1D76N-VL2.3 Mab의 경우 21%의 SDF-1-유도성 BRET 증가의 저해 퍼센트 (도 32A)로, 뿐만 아니라 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체에 대하여 hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab의 경우 약 100% 또한 hz515H7 VH1D76N-VL2.1, hz515H7 VH1D76N-VL2.2 및 hz515H7 VH1D76N-VL2.3 Mabs의 경우 50%의 SDF-1-유도성 BRET 증가의 저해 퍼센트 (도 32B)로 SDF-1-유도성 입체형태적 변화를 조정할 수 있었다. 또한 515H7 인간화 Mabs는 스스로 CXCR4/CXCR4 및 CXCR2/CXCR4 공간적 근접을 조정할 수 있었고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중체 둘 다의 입체형태에 미치는 이들 Mabs의 영향을 가르켰다 (도 32A 및 도 32B).
SDF-1 (100 nm)에 의한 CXCR4 활성화는 BRET 신호가 390% 증가된 것에서 나타난 바와 같이, 세포내 신호전달 분자인 β-아레스틴의 강한 채용을 가져왔다 (도 32C). 이러한 채용은 515H7 인간화 Mabs에 의해 부분적으로 저해되고 hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab의 경우 약 94% 저해, hz515H7 VH1D76N-VL2.1 Mab의 경우 81%, hz515H7 VH1D76N-VL2.2 Mab의 경우 82%, 또한 hz515H7 VH1D76N-VL2.3 Mab의 경우 71% 저해로 (도 32C) 신호전달에 미치는 이들 Mabs의 효과를 보여주었다.
실시예 26: 면역조직화학 연구들 ( IHC )
조직편들은 파라핀 제거되고 재수화되어 열-유도성 에피토프 회수를 위해 미리 데워 98℃로 EDTA pH8에서 7분 동안 놓아둔다. 트리스 완충 생리식염수-0.05% 트윈 20 (TBS-T) (다코사 S3006)으로 3번 세척한 이후에, 내인성 퍼옥시다제 활성이 퍼옥시다제 블록킹 반응시약 (다코사 K4007)을 사용하여 5분 동안 차단되었다 조직편들은 TBS-T로 세척되었고, 대조군으로서 항-CXCR-4 마우스 모노클론 항체 (50 μg/mL, 클론 515H7, 피에르 파브르사 (Pierre Fabre)) 또는 마우스 IgGl/카파 (50 μg/mL, X0931, 다코사)와 하룻밤 동안 4℃에서 배양하기 이전에 차단 반응시약 (UltraV block-TA-125UB-랩 비전사 (Lab Vision))으로 5분 동안 반응시켰다. 조직편들은 TBS-T로 세척되었으며 인비전 듀얼 링크 (Envision Dual Link)와 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 디아미노벤지딘 (diaminobenzidine)이 상온에서 갈색 반응 산물 (다코사 3468)의 발색을 위해 사용되었다. 슬라이드들은 헤마톡실린에 4분 동안 담구어 반대염색을 실시하고 (다코사 S3309) 파라마운크 마운팅 배지를 더한 커버슬립에 올리기 이전에 PBS로 세척하였다. 본 면역조직화학방법에서, 갈색 반응 산물은 세포막의 양성 염색과 상호연관되고 갈색 산물의 결여는 세포막의 음성 염색 및 발색 없음과 상호연관된다.
항-CXCR4 마우스 모노클론 항체, 클론 515H7는 다양한 종양 유형들의 세포막을 차별적으로 염색하였다. 도 33 및 도 34는 515H7의 경우 항-종양 활성이 기술되었던, 2가지의 이종이식 모델들에서 수행된 염색을 묘사하였다: RAMOS 및 KARPAS299. 도 33 및 도 34에서 나타난 바와 같이, 획득된 염색은 고정액 (fixative) 의존적이다. 따라서, 막 염색은 조직에 포르말린으로 고정되었을 때 더 약한 한편 (도 34a 및 도 34c), 글리오-픽스 (Glyo-fixx) (포르말린의 대체물)이 사용되었을 때, 막 염색은 유의하게 증가되었다 (도 33a 및 도 33c).
실시예 27: 인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO - K1 세포막에서 [ 125 I]SDF-1에 대한 항- CXCR4 인간화 Mabs 515 H7 의 결합 경쟁
본 검정법은 인간화 Mabs 515H7이 인간 CXCR4 수용체에 대한 방사선 표지된 [125I]SDF-1 결합과 경쟁하는 능력을 오소스테릭 또는 알로스테릭 결합 부위들에서 평가하도록 한다.
인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 인간 CXCR4 수용체의 전체 코딩 서열 (RefSeq NM_003467)을 보유하는 포유동물 발현 벡터를 사용한 그대로의 CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61)의 형질전환으로 획득되었다. 세포는 완전 배양 배지 [5% 우태아 혈청 (FCS) 및 500 μg/ml의 제네티신이 보충된 DMEM-햄 F12]에서 증식되었다. 방사성 리간드 결합 실험이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스 (HEPES), pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 CHO-CXCR4 세포의 기계적 긁어내기로 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [125I]SDF-1 결합 (특이적 활성: 1500 Ci/mmol)은 SPA 기술을 사용하여 수행되었다 [신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사]. 간략하게, 세포막 (30 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 1 mM의 CaCl2, 5 mM의 MgCl2, 150 mM의 NaCl, 1% BSA]에서 평가될 화합물 (SDF-1 또는 mAb), 방사성 리간드 (1 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 평형에는 25℃에서 1시간 이후에 도달하였다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 [탑카운트, 퍼킨 엘머사]로 측정되었다. 비-특이적 (NS) 결합은 10 μM의 표지되지 않은 SDF-1의 존재 시 측정되었다.
항-CXCR4 Mabs는 다음의 경쟁 효능의 랭킹 순서로 [125I]SDF-1 결합을 위해 경쟁하였다 ([I25I]SDF-1의 저해%): hz515H7 VH1D76N VL2 (77%), hz515H7 VH1D76N VL2.1 (68%), hz515H7 VH1D76N VL2.2 (61%) 및 hz515H7 VH1D76N VL2.3 (49 %) (도 35A).
Hz515H7 Mabs는 hz515H7 VH1D76N VL2 Mab의 경우 1.44 nM의 IC50 (도 35B), hz515H7 VH1D76N VL2.1 Mab의 경우 6.67 nM (도 35C), hz515H7 VH1D76N VL2.2 Mab의 경우 5.91 nM (도 35D)로 용량-의존적으로 [I25I]SDF-1 결합을 저해하였다.
실시예 11: 세포내 칼슘 저장물의 CXCR4 수용체- 매개성 가동화
본 기능적 검정법은 세포질 세망으로부터 나온 세포내 저장물로부터 칼슘 방출을 유도하는 포스포리파제 C 경로의 자극을 통한 CXCR4 수용체 신호전달을 감시하기 위하여 설계되었다.
U937 (인간 백혈병) 세포들이 완전 배양 배지 [10% FCS가 보충된 DMEM] 및 [10% FCS, 2 mM의 헤페스, 1% 비-필수 아미노산 용액, 1% 소듐 피루베이트, 1% L-글루타민, 4.5 g/l 포도당이 보충된 RPMI 1640]에서 증식되었다. 세포들은 적절한 배양 배지를 넣은 검은색 96MW 플레이트에 100,000 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포는 실험을 실시하기 전에 하룻밤 동안 굶겼다. 로딩 완충용액 [1x HBSS, 20 mM의 헤페스, 20 mM의 프로베니시드 산]에 녹인 형광 칼슘 염색약 (Fluo-4 세척 없음, 미국 인비트로겐사)과 함께 37℃에서 30분 동안 로딩되었고 이어서 25℃에서 30분 동안 이루어졌다. SDF-1에 의한 자극은 각 웰 내로 직접 주입되어 수행되었다. 길항기작 실험을 위해, 10 μl의 Mab 용액이 SDF-1 처리 적어도 10분 전 로딩 완충용액 내로 직접 첨가되었다. 동적 형광 측정은 하기 세팅을 사용하는 다중-방식 형광 마이크로플레이트 리더기, 미스라스 LB940 (베르톨드사) 상에서 수행되었다: 485 nm에서 여기, 535 nm에서 방출, 10000 임의적 유닛의 여기 에너지. 각 웰에서의 형광은 SDF-1 주입 (기저 신호) 이전에 0.1초 동안 매초마다 또한 20초의 기간 동안 기록된다. 다음으로 20 μl의 SDF-1이 주입되고 데이타 기록은 2분의 기간 동안 이어진다. 각 실험 조건은 두 벌로 수행된다. 각 웰에 대한 측정값은 먼저 기저 형광 및 세포가 없는 대조군 웰에 의해 방출되는 형광을 차감하여 교정된다. 상대적인 데이타는 SDF-1 (100 nM)에 의해 획득되는 최대 자극의 퍼센트로서 표현된다.
SDF-1 (100 nM)은 U937 세포들에서 세포내 칼슘의 신속하고도 강한 방출을 유도하였다. 최대 강도는 기저 형광에 대해 > 340%에 도달하였고 SDF-1에 의해 자극하고 나서 약 40초에 관찰되었다. hz515H7 VH1D76N VL2 Mab (133 nM)은 U937 세포주들에서 SDF-1 (100 nM)-유도성 칼슘 신호의 부분적인 저해를 생성하였다 (도 36, 여기에서 상기 Mab는 설명란에서 hz515H7VL2라고 명명됨).
실시예 29: SDF -1-유도성 U937 세포들 이동에 미치는 항- CXCR4 Mab 인간화 hz515H7의 효과
항-CXCR4 인간화 Mab hz515H7 VH1D76N VL2 (hz515H7이라고도 명명함)가 이동 과정에 미치는 저해 효과를 평가하기 위하여, U937 세포들이 2% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 100 μg/mL의 항체들과 함께 40분 동안 37℃로 5% C02에서 배양되었다. 전체 5 x 104개의 세포들을 상부 트랜스웰 체임버 (transwell chamber) (코닝로웰사, MA, USA) 내에 놓아두었다. 하부 체임버에는 SDF-1 (100 ng/mL)이 2% FBS를 포함하는 배지에 첨가되었다. U937 세포들은 상부 체임버 내에 세포들을 접종하고 2시간 이후에 트랜스웰 체임버로부터 이동하였던 세포들의 숫자를 계수하여 측정되었다. 이동된 세포들은 ATP 정량을 기초로 하여 배양액의 생존 세포들의 숫자를 측정하는 세포 적정 Glo? 발광 세포 생존도 검정법 (CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay)을 사용하여 계수되었다.
도 37A에 나타난 결과들은 예상된 바와 같이 SDF-1이 U-937 세포들 이동의 유의한 증가를 유도할 수 있는 점을 보여주었다. 세포가 IgG2 이소형 대조군과 배양되었을 때는 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, 도 37A는 hz515H7 VHl D76N VL2 Mab의 10 μg/mL로의 SDF1-유도성 U937 세포들 이동의 저해를 보여준다. 결과들은 세 벌로 수행된 세 번의 독립적인 실험들의 평균 +/- SD를 나타낸다.
도 37B은 SDF1-유도성 세포 이동에 미치는 hz515H7 VHl D76N VL2 Mab의 용량 범위의 효과를 나타낸다. 결과들은 네 번의 독립적인 실험들의 평균 +/- S.E.M을 나타낸다 (IC50 = 4.53 10-3 μg/mL +/- 2.2 10-3).
실시예 30: hz515H7 VHl D76N VL2 로의 면역조직화학 연구들 ( IHC )
조직편들은 파라핀 제거되고 재수화되어 열-유도성 에피토프 회수를 위해 미리 데워 98℃ EDTA pH8에 서 7분 동안 놓아둔다. 트리스 완충 생리식염수-0.05% 트윈 20 (TBS-T) (다코사 S3006)으로 3번 세척한 이후에, 내인성 퍼옥시다제 활성이 퍼옥시다제 블록킹 반응시약 (다코사 K4007)을 사용하여 5분 동안 차단되었다 조직편들은 TBS-T로 세척되었고, 대조군으로서 항-CXCR-4 마우스 모노클론 항체 (50 μg/mL, 클론 515H7, 피에르 파브르사) 또는 마우스 IgGl/카파 (50 μg/mL, X0931, 다코사)와 하룻밤 동안 4℃에서 배양하기 이전에 차단 반응시약 (UltraV block-TA-125UB-랩 비전사)으로 5분 동안 반응시켰다. 조직편들은 TBS-T로 세척되었으며 인비전 듀얼 링크와 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 디아미노벤지딘이 상온에서 갈색 반응 산물 (다코사 3468)의 발색을 위해 사용되었다. 슬라이드들은 헤마톡실린에 4분 동안 담구어 반대염색을 실시하고 (다코사 S3309) 파라마운크 마운팅 배지를 더한 커버슬립에 올리기 이전에 PBS로 세척하였다. 본 면역조직화학방법에서, 갈색 반응 산물은 세포막의 양성 염색과 상호연관되고 갈색 산물의 결여는 세포막의 음성 염색 및 발색 없음과 상호연관된다.
바이오틴화된 항-CXCR4 인간화 항체 hz515H7 VHl D76N VL2는 다양한 종양 유형들의 세포막을 차별적으로 염색하였다. 도 38 및 도 39는 마우스가 515H7로 처리되었을 때 항-종양 활성이 기술된 2가지의 이종이식 모델들에서 수행된 염색들을 묘사하였다: RAMOS 및 KARPAS299. 도 38 및 도 39에서 나타난 바와 같이, 획득된 염색은 고정액-의존적이다. 따라서, 막 염색은 조직에 포르말린으로 고정되었을 때 더 약한 한편 (도 39a 및 도 39c), 글리오-픽스 (Glyo-fixx) (포르말린의 대체물)가 사용되었을 때, 막 염색은 유의하게 증가된다 (도 38a 및 도 38c).
실시예 31: Scid 마우스에서 B 세포 Ramos 이종이식 종양 성장에 미치는 키 메라 515 H7 ( c515H7 ), 인간화 형태들 hz515H7 VH1D76N VL2 및 hz515H7 VHl D76N VL2.1 Mabs 의 효과
ATCC로부터 나온 Ramos 세포들은 10% FCS 및 2 mM L-Glu가 첨가된 RPMI 1640 배지 (시그마사, 세인트루이스 MD, 미국)에서 일상적으로 배앵되었다. 세포들은 이식 48시간 이전에 분리되어 기하급수적 성장기로 준비되었다. 10백만 개의 Ramos 세포들이 7주령 된 암컷 SCID 마우스 (챨스 리버, 프랑스)에 PBS에 넣어 이식되었다. 이식하고 5일째, 종양들은 측정가능하였고 (평균 100 mm3) 동물들은 비교가능한 종양 크기를 가지는 6개의 마우스 그룹들로 나뉘었다. 마우스는 2 mg/마우스 로딩 용량의 Mabs c515H7, hz515H7 VH1D76N VL2 또는 hz515H7 VHl D76N VL2.1로 복강내 처리되었다. 다음으로, 마우스는 1 mg/용량/마우스의 Mabs c515H7, hz515H7 VHl D76N VL2 또는 hz515H7VHl D76N로 주당 두 번 주사되었다. PBS 그룹이 본 실험에서 대조군으로서 도입되었다. 종양 부피는 주당 두 번 계수되었고 공식: π/6 X 길이 X 너비 X 높이에 의해 계산되었다. 통계적 분석법들이 만-휘트니 테스트를 사용하여 각 측정에서 수행되었다.
이들 실험들에서, 처리하는 동안 치사는 전혀 관찰되지 않았다. PBS 그룹과 대비하여, 1 mg/용량의 c515H7 Mab (도 40), hz515H7 VHl D76N VL2 Mab (도 41) 및 hz515H7 VHl D76N VL2.1 (도 42)의 경우 D11 및 D54 간에 종양 성장의 유의한 저해가 존재하였고, 처리 4주 이후에 평균 종양 부피는 c515H7 및 hz515H7 Mabs로 처리된 마우스의 경우 PBS 그룹 대비 92% 감소되었다.
COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES CNCM04019 20080625
SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> NOVEL HUMANIZED ANTI CXCR4 ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> D28523 <150> EP 10290167.5 <151> 2010-03-30 <160> 96 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met 1 5 10 15 Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu 20 25 30 Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile 35 40 45 Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly 50 55 60 Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu 65 70 75 80 Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val 85 90 95 Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val 100 105 110 His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala 115 120 125 Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser 130 135 140 Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val 145 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gcctggaatg ggtgggacgc atacggaaca aggccaacgg ctataccaca 180 gcttatgcag catcagtcaa gggcagattt actatcagtc gtgacgattc taaaaatact 240 gcctatctcc aaatgaattc cctcaagacc gaggataccg cagtgtacta ctgcgctagg 300 gacgtaggat ccaattactt cgactactgg gggcagggaa ccacccttac agtgtccagt 360 <210> 94 <211> 336 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 94 gacatcgtta tgacccagac ccctctctca ctcccagtca ctcctggaga gcccgcatcc 60 atatcctgta ggagttctca gagtctgttc aactccagga cacgtaaaaa ctacctggac 120 tggtacctgc agaaacccgg ccagagtcca caactgctga tctattgggc ctcttacaga 180 gcctcagggg tccccgatag attctctggg tccggcagcg gtaccgactt cactttgaag 240 attagccgcg tggaagctga agatgtgggt gtgtattatt gcatgcagag ctttaatctc 300 cggacatttg gccagggaac caaggtggag atcaag 336 <210> 95 <211> 1347 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 95 gaggtacagt tggtggaatc tgggggtggc ctggttcagc caggtggttc attgaagctg 60 agctgtgccg cttctggatt cacattcact gataactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 agcggcaaag gcctggaatg ggtgggacgc atacggaaca aggccaacgg ctataccaca 180 gcttatgcag catcagtcaa gggcagattt actatcagtc gtgacgattc taaaaatact 240 gcctatctcc aaatgaattc cctcaagacc gaggataccg cagtgtacta ctgcgctagg 300 gacgtaggat ccaattactt cgactactgg gggcagggaa ccacccttac agtgtccagt 360 gcaagcacaa aagggcctag cgttttcccg ctagccccca gcagcaagag caccagcggc 420 ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 600 tacatctgta acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agtggagccc 660 aagagctgtg acaagaccca cacctgcccc ccctgcccag cccccgagct gctgggcgga 720 cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780 gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaggtgaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 900 agcacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gtaaggtgtc caacaaggcc ctgccagccc caatcgaaaa gaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccaag agagccccag gtgtacaccc tgccacccag cagggaggag 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaagg gcttctaccc aagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac ccccccagtg 1200 ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgtc cccaggc 1347 <210> 96 <211> 657 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 96 gacatcgtta tgacccagac ccctctctca ctcccagtca ctcctggaga gcccgcatcc 60 atatcctgta ggagttctca gagtctgttc aactccagga cacgtaaaaa ctacctggac 120 tggtacctgc agaaacccgg ccagagtcca caactgctga tctattgggc ctcttacaga 180 gcctcagggg tccccgatag attctctggg tccggcagcg gtaccgactt cactttgaag 240 attagccgcg tggaagctga agatgtgggt gtgtattatt gcatgcagag ctttaatctc 300 cggacatttg gccagggaac caaggtggag atcaagcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360 ttcatcttcc ccccaagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 420 ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657

Claims (26)

  1. 서열번호 4, 5 및 6의 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3로 구성되는 CDRs를 가지는 인간화 항체 중쇄.
  2. 제 1항에 있어서,
    서열번호 10, 11, 12, 13, 85 또는 87로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체 중쇄.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    서열번호 21, 22, 23, 24, 89 또는 91로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완전한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체 중쇄.
  4. 서열번호 7, 8 및 9의 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되는 CDRs를 가지는 인간화 항체 경쇄.
  5. 제 4항에 있어서,
    서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 또는 88로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열의 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체 경쇄.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
    서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 또는 92로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완전한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체 경쇄.
  7. 인간화 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3로 구성되는 CDRs를 가지고, 상기 경쇄는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성되는 CDRs를 가지고, 상기 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3는 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열들을 포함하고, 상기 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3는 각각 서열번호 7, 8 및 9의 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
  8. 제 7항에 있어서,
    서열번호 10, 11, 12, 13, 83, 84 또는 87로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 84, 86 또는 88로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    서열번호 21, 22, 23, 24, 89 또는 91로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열의 중쇄 및 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 또는 92로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
  10. 제 7항에 있어서,
    - 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 16 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 27 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 17 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 28 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 18 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 29 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 19 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 30 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 12 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 23 서열의 중쇄 및 서열번호 25 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 12 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 15 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 23 서열의 중쇄 및 서열번호 26 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 10 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 21 서열의 중쇄 및 서열번호 25 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 10 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 21 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 11 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 22 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 12 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 23 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 13 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 88 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 24 서열의 중쇄 및 서열번호 92 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 25 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 15 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 26 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 16 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 27 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 17 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 28 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 18 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 29 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 19 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 30 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 87 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 20 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    - 서열번호 91 서열의 중쇄 및 서열번호 31 서열의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편;
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 인간화 항체, 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
  11. 다음의 핵산들 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자:
    a) 제 1항, 제 2항 또는 제 3항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 중쇄, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
    b) 제 4항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 경쇄, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
    c) 제 7항 내지 제 10항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
    d) a), b) 또는 c)에 정의된 바와 같은 핵산에 상보적인 핵산;
    e) 서열번호 38 내지 41, 49 내지 52, 93 또는 95의 핵산 서열들을 포함하는 중쇄의 3가지 CDRs의 적어도 하나와 매우 엄격한 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드들의 핵산; 또한
    f) 서열번호 42 내지 48, 53 내지 59, 94 또는 96의 핵산 서열들을 포함하는 경쇄의 3가지 CDRs의 적어도 하나와 매우 엄격한 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드들의 핵산.
  12. 제 11항에 있어서,
    - 중쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32의 CDR-H1 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 33의 CDR-H2 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 34의 CDR-H3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 인간화 항체의 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 핵산 서열;
    - 경쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 35 또는 60의 CDR-L1 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 36 또는 61의 CDR-L2 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 37 또는 62의 CDR-L3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 인간화 항체의 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 핵산 서열; 또한
    - i) 중쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32의 CDR-H1 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 33의 CDR-H2 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 34의 CDR-H3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 또한
    ii) 경쇄 가변 부위 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 35 또는 60의 CDR-L1 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 36 또는 61의 CDR-L2 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 37 또는 62의 CDR-L3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는;
    인간화 항체의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 핵산 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 따른 핵산으로 구성되는 벡터.
  14. 제 13항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포.
  15. 제 14항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포를 포함하는 인간을 제외한, 형질전환 동물.
  16. 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 생산하는 방법:
    - 제 14항에 따른 숙주세포의 배지 및 적합한 배양 조건들에서 배양; 또한
    - 배양 배지 또는 상기 배양된 세포들로부터 생산된 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편들 하나의 회수.
  17. 약물로서 사용되는, 제 7항 내지 제 10항의 어느 하나에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
  18. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 제 4항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 경쇄로 구성되는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 조성물.
  19. 제 18항에 있어서,
    제 7항 내지 제 10항 및 제 17항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편으로 구성되는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 조성물.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서,
    상기에 더하여 CXCR4에게로 유도되는 항체가 아닌 항종양 항체를 동시적, 개별적 또는 연장된 방식으로 사용하는 조합 산물로서 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 18항 내지 제 20항의 어느 한 항에 있어서,
    상기에 더하여 세포독성/세포증식억제 제제, 세포성 독소 및/또는 방사성 동위원소를 동시적, 개별적 또는 연장된 방식으로 사용하는 조합 또는 결합 산물로서 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 약물로서 사용되는, 제 18항 내지 제 21항의 어느 한 항에 따른 조성물.
  23. 암의 예방 또는 치료에 사용되는, 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 제 4항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 경쇄 및/또는 제 7항 내지 제 10항의 어느 한 항 또는 제 17항에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편, 및/또는 제 18항 내지 제 22항의 어느 한 항에 따른 조성물.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 골육종, 폐암, 유방암, 자궁내막암, 다발성 골수종, 난소암, 췌장암, 및 결장암 중에서 선택되는 암인 것을 특징으로 하는, 인간화 항체 중쇄 및/또는 경쇄(들) 및/또는 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
  25. (a) 개체로부터 나온 시료를 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 제 4항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 경쇄 및/또는 제 7항 내지 제 10항의 어느 한 항 또는 제 17항에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 접촉시키고; 또한
    (b) 시료와 상기 항체의 결합을 검출하는:
    단계들을 포함하는, 개체에서 CXCR4를 발현하는 종양의 존재 및/또는 위치를 시험관내에서 검출하는 방법.
  26. 적어도 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 중쇄 및/또는 제 4항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 인간화 항체 경쇄, 및/또는 제 7항 내지 제 10항의 어느 한 항 또는 제 17항에 따른 인간화 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 포함하고, 바람직하게 상기 항체는 표지되는, 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180118246A (ko) * 2013-08-02 2018-10-30 화이자 인코포레이티드 항-cxcr4 항체 및 항체-약물 접합체

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2246364A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-03 Pierre Fabre Médicament Anti CXCR4 antibodies for the treatment of HIV
CN103180342A (zh) * 2010-10-27 2013-06-26 皮埃尔法布雷医药公司 用于治疗hiv的抗体
US20140120555A1 (en) * 2011-06-20 2014-05-01 Pierre Fabre Medicament Anti-cxcr4 antibody with effector functions and its use for the treatment of cancer
WO2012178137A1 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Gillies Stephen D Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
IL302725A (en) * 2016-01-13 2023-07-01 Regeneron Pharma Rodents with an engineered DIVERSITY region of the heavy chain
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
WO2019191133A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Real-time monitoring of protein concentration using ultraviolet signal
WO2020172658A1 (en) 2019-02-24 2020-08-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating a protein
CN114245869A (zh) 2019-05-23 2022-03-25 百时美施贵宝公司 监测细胞培养基的方法
US20230374064A1 (en) 2020-10-05 2023-11-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for concentrating proteins
EP4005923B1 (de) 2020-11-30 2023-08-30 Bucher Leichtbau AG Bordverpflegungsstation
WO2023173011A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Bristol-Myers Squibb Company Transient expression of therapeutic proteins

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4424200A (en) 1979-05-14 1984-01-03 Nuc Med Inc. Method for radiolabeling proteins with technetium-99m
US4479930A (en) 1982-07-26 1984-10-30 Trustees Of The University Of Massachusetts Amines coupled wth dicyclic dianhydrides capable of being radiolabeled product
US4831175A (en) 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8924581D0 (en) 1989-11-01 1989-12-20 Pa Consulting Services Bleaching of hair
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
US20050002939A1 (en) 2002-12-23 2005-01-06 Albert Zlotnik Tumor killing/tumor regression using CXCR4 antagonists
EP1649001A2 (en) * 2003-06-30 2006-04-26 Bio-Technology General (Israel) Ltd. Antibodies and uses thereof
US8450464B2 (en) * 2006-10-02 2013-05-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies that bind CXCR4
FR2907341B1 (fr) * 2006-10-18 2012-08-17 Pf Medicament Utilisation d'un anticorps anti-cd151 pour le traitement du cancer
EP2119452B1 (en) * 2006-12-26 2020-03-04 Centro de Inmunologia Molecular Pharmaceutical composition, comprising an anti-cd6 monoclonal antibody used in the diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis
MX2010012435A (es) * 2008-05-14 2011-05-03 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-cxcr4.
US9212226B2 (en) * 2008-05-16 2015-12-15 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against CXCR4 and other GPCRs and compounds comprising the same
EP2172485A1 (en) * 2008-10-01 2010-04-07 Pierre Fabre Medicament Novel anti CXCR4 antibodies and their use for the treatment of cancer
EP2246364A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-03 Pierre Fabre Médicament Anti CXCR4 antibodies for the treatment of HIV

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180118246A (ko) * 2013-08-02 2018-10-30 화이자 인코포레이티드 항-cxcr4 항체 및 항체-약물 접합체

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