TWI549689B - 用於治療癌症的新穎擬人化抗ｃｘｃｒ４抗體 - Google Patents

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Description

用於治療癌症的新穎擬人化抗CXCR4抗體
本發明是有關於一種能夠專一性地結合至化學激素受體(chemokine receptors,CXCR)的新穎抗體(特別是一擬人化單株抗體)，以及編碼此一抗體的胺基酸與核酸序列。從一方面，本發明是有關於一種能夠專一性地結合至CXCR4並且具有強的抗腫瘤活性的新穎抗體、衍生化合物或功能性片段。本發明亦包含有此一抗體作為一用於預防性和/或治療性治療癌症的藥物之用途，以及有關於癌症診斷(cancer diagnosis)的操作程序或套組。最後，本發明包含有含有此一抗體組合或綴合以其它抗癌化合物(們)[諸如抗體、毒素(toxins)、細胞毒性(cytotoxic)/細胞生長抑制劑(cytostatic)]的組成物，以及它們用於預防和/或治療某些癌症的用途。
化學激素是控制白血球(leukocytes)沿著一配位子(ligand)的化學梯度(被知曉為化學激素梯度)移動(特別地在免疫反應的期間)的小的、被分泌的胜肽(peptides)(Zlotnick A. et al.,2000)。它們根據它們的NH2-端半胱胺酸殘基(cysteine residues)的位置而被分成2個主要的次族群CC以及CXC，並且結合至G蛋白質偶合受體(G protein coupled receptors)(它們的2個主要次族群被命名為CCR以及CXCR)。超過50種擬人化學激素以及18種化學激素受體迄今已被發現。
許多癌症具有一影響腫瘤的免疫細胞滲透以及腫瘤生長、殘存(survival)、移動(migration)與血管生成(angiogenesis)的複雜化學激素網路。免疫細胞、內皮細胞(endothelial cells)以及腫瘤細胞它們本身表現化學激素受體並且可對化學激素梯度反應。人類癌症生物檢體樣品(human cancer biopsy samples)以及小鼠癌症模型的研究顯示：癌細胞化學激素-受體表現與增加的轉移能力(metastatic capacity)有關。來自不同癌症類型的惡性細胞(malignant cells)具有不同的化學激素-受體表現的圖譜(profiles)，但是化學激素受體4(Chemokine receptor 4,CXCR4)是最常被發現的。來自至少23種不同類型的上皮(epithelial)、間質(mesenchymal)以及生血(haematopoietic)來源的人類癌症的細胞表現CXCR4受體(Balkwill F. et al.,2004)。
化學激素受體4[亦被知曉為融合素(fusin)、CD184、LESTR或HUMSTR]存在有如2種包含有352或360個胺基酸的異構型(isoforms)。在受體的外細胞部分上，殘基Asn11被醣化(glycosylated)、殘基Tyr21藉由添加一硫酸基團而被修飾，以及Cys 109與186被結合以一雙硫鍵(disulfide bridge)(Juarez J. et al.,2004)。
這個受體由不同種類的正常組織、天然的無記憶T細胞(non-memory T-cells)、調節T細胞(regulatory T cells)、B細胞、嗜中性球(neutrophils)、內皮細胞(endothelial cells)、初級單核球(primary monocytes)、樹狀細胞(dendritic cells)、天然的殺手細胞(Natural Killer cells)、CD34+造血幹細胞(CD34+ hematopoietic stem cells)所表現，並且在心臟、結腸(colon)、肝臟、腎臟以及腦中呈一低位準。CXCR4在白血球運輸(leukocytes trafficking)、B細胞淋巴器形成(B cell lymphopoiesis)以及骨髓形成(myelopoiesis)上扮演一關鍵角色。
CXCR4受體被過度表現在一大數量的癌症，包括但不限於結腸(colon)(Ottaiano A. et al.,2004)、乳房(breast)(Kato M. et al.,2003)、前列腺(prostate)(Sun Y.X. et al.,2003)、肺[小-細胞-(small-cell-)以及非-小-細胞-癌(non-small-cell-carcinoma)(Phillips R.J. et al.,2003)]、卵巢(ovary)(Scotton C.J. et al.,2002)、胰臟(pancreas)(Koshiba T. et al.,2000)、腎臟(kidneys)、腦(brain)(Barbero S et al.,2002)、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)以及淋巴瘤(lymphomas)。
迄今所描述的CXCR4受體的獨特配位子是基質-細胞-衍生的因子-1(Stromal-cell-Derived Factor-1(SDF-1)或CXCL12。SDF-1呈大數量被分泌在淋巴結(lymph nodes)、骨髓、肝、肺以及至一較少的程度在腎臟、腦與皮膚。CXCR4亦由一拮抗的(antagonistic)化學激素[由人類疱疹病毒第III型(human herpesvirus type III)所編碼的病毒性巨噬細胞發炎蛋白質II(viral macrophage inflammatory protein II,vMIP-II)]所辨識。
CXCR4/SDF-1軸(axis)在癌症中扮演一關鍵角色並且直接地被牽連在移動(migration)、侵入(invasion)導致轉移(metastases)。確實，癌症細胞表現CXCR4受體，它們移動並且進入系統循環(systemic circulation)。接著癌細胞在它們增殖、誘發血管生成(angiogenesis)以及形成轉移性腫瘤的產生高位準的SDF-1之器官的血管床(vascular beds)中被阻止(Murphy PM.,2001)。這個軸亦涉及經由活化細胞外-信號-調節激酶(Extracellular-signal-Regulated Kinase,ERK)途徑的細胞增殖(Barbero S. et al.,2003)以及血管生成(Romagnani P.,2004)。確實，CXCR4受體以及它的配位子SDF-1藉由刺激VEGF-A表現(依次增加CXCR4/SDF-1表現)清楚地促進血管生成(Bachelder R.E. et al.,2002)。亦被知曉的是腫瘤有關的巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAM)累積在腫瘤的缺氧區域(hypoxic areas)並且被刺激以與腫瘤細胞共運作(co-operate)並且促進血管生成。被觀察到的是：在各種不同的細胞類型(包括TAM)中，缺氧選擇性地向上調節CXCR4的表現(Mantovani A. et al.,2004)。近來已被證明的是：CXCR4/SDF-1軸調節CXCR4+造血幹/前驅細胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSC)的運輸(trafficking)/回歸(homing)，並且可在新血管形成(neovascularization)上扮演一角色。證據指出除了HSC，功能性CXCR4亦在來自其他組織的幹細胞[組織定向幹細胞(tissue-committed stem cells)=TCSC)]上被表現，因此SDF-1可在器官/組織再生所需的化學吸引CXCR4+TCSC上扮演一中樞角色，但是這些TCSC亦可以是癌症發展的一細胞起源[癌幹細胞學說(cancer stem cells theory)]。一幹細胞起源的癌症被證明為人類白血病(leukemia)以及近來數種固態腫瘤(solid tumors)[諸如腦以及乳房]。有數種可能衍生自正常CXCR4+組織/器官專一性幹細胞的CXCR4+腫瘤的實例，諸如白血病、腦腫瘤、小細胞肺癌、乳癌、肝母細胞瘤(hepatoblastoma)、卵巢與子宮頸癌(ovarian and cervical cancers)(Kucia M. et al.,2005)。
藉由干擾CXCR4受體的標靶癌症轉移使用一針對CXCR4受體的單株抗體而在活體內被證明(Muller A. et al.,2001)。簡言之，顯示在SCID小鼠中一針對CXCR4受體的單株抗體(Mab 173 R&D Systems)在一正位乳癌模型(orthotopic breast cancer mode)(MDA-MB231)中顯著地降低淋巴結轉移的數目。另一個研究(Phillips R.J et al.,2003)使用對抗SDF-1的多株抗體亦顯示SDF-1/CXCR4軸在一正位肺癌模型(orthotopic lung carcinoma model)(A549)的轉移上的關鍵角色，但是這個研究在腫瘤生長或在血管生成上沒有效用。數種其他研究亦描述使用CXCR4的siRNA雙鏈體(duplexes)生物安定的CXCR4胜肽拮抗物(peptide antagonists)(Tamamura H. et al.,2003)抑制活體內轉移或者使用CXCR4的小分子拮抗物[像AMD 3100(Rubin J.B. et al.,2003；De Falco V. et al.,2007)或Mab(專利WO2004/059285 A2)]抑制活體內腫瘤生長。因此，CXCR4是一用於癌症的有效治療標靶。
化學激素受體2(CXCR2)(另一種化學激素受體)亦在腫瘤學(oncology)中被描述作為一感興趣的標靶。確實，CXCR2在數種腫瘤細胞類型中傳送一自體分泌細胞生長信號(autocrine cell growth signal)並且亦可藉由促進血管生成而間接地影響腫瘤生長(Tanaka T. et al. 2005)。
CXCR2化學激素受體包含有360個胺基酸。它主要被表現在內皮細胞以及特別地在新血管形成的期間。數種化學激素結合CXCR2受體：屬於ERL+前-血管生成化學激素(pro-angiogenic chemokines)的CXCL5、-6、-7、IL-8、GRO-α、-β以及γ。CXCR2受體與CXCR4受體共有序列同源性(sequence homologies)：37%序列相同性以及48%序列同源性。CXCR2/配位子軸涉及數種腫瘤生長機制(諸如轉移)(Singh RK. et al.,1994)細胞增殖(Owen J.D. et al.,1997)以及ERL+化學激素-調節的血管生成(Strieter R.M. et al.,2004;Romagnani et al.,2004)。最後，腫瘤有關的巨噬細胞以及嗜中性球是發炎-誘發的腫瘤生長以及化學激素(諸如CXCL5、IL-8以及GRO-α初始嗜中性球)補充的關鍵要素。
在這些是化學激素受體中，二聚合作用(dimerrzation)已出現作為一用於調節G-蛋白質-偶和的受體的功能的普遍機制(Wang J. and Norcross M.,2008)。反應化學激素結合的同-(Homo-)以及異二聚合作用(heterodimerization)已被顯示對於藉由許多化學激素受體的起始以及改變信號是需要的。生長證據支持受體二聚體或寡聚物(oligomers)可能是化學激素受體的基本功能單位的概念。化學激素受體二聚體在缺乏配位子時被發現，並且化學激素誘發受體二聚體的構形改變。CXCR4被知曉會形成同二聚體以及異二聚體[例如與δ-類鴉片受體(δ-opioid receptor,DOR)(Hereld D.,2008)或CCR2(Percherancier Y. et al.,2005)]。在後者的實例中，衍生自CXCR4的穿膜領域(transmembrane domains)的胜肽藉由阻斷二聚體的配位子-誘發的構形轉變(conformational transitions)抑制活化(Percherancier Y. et al.,2005)。另一個研究顯示：CXCR4-TM4胜肽(CXCR4的穿膜區域的一種合成胜肽)在惡性細胞中降低在CXCR4同二聚體的原聚體(protomer)之間的能量轉移(energy transfer)並且抑制SDF-1-誘發的移動以及肌動蛋白聚和作用(actin polymerization)(Wang J. et al.,2006)。最近，亦被描述的是：CXCR7與CXCR4形成功能性異二聚體並且增強SDF-1-誘發的信號(SDF-1-induced signaling)(Sierro F. et al.,2007)。組成的異二聚體的其他實例包括顯示CXCR1與CXCR2交互作用以及形成個別的同二聚體的研究。它們的任一者與另一個GPCR[α(1A)-腎上腺素受體(alpha(1A)-adrenoreceptor)]沒有交互作用被注意到，指示CXCR1與CXCR2交互作用的專一性(Wilson S. et al.,2005)。
如先前所提到的，CXCR4與CXCR2受體是有趣的腫瘤標靶。與那些受體的干擾應該以一非常有效的方式(藉由降低腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤細胞移動與侵入、藉由腫瘤的嗜中性球與巨噬細胞補充以及藉由抑制CXCR4癌症幹細胞)抑制腫瘤生長以及轉移。
本發明的發明方面的一者是產生一誘發CXCR4二聚體構形改變的擬人化單株抗體。本發明包含有能夠結合以及誘發CXCR4同二聚體與CXCR4/CXCR2異二聚體這兩者的構形改變並且具有強的抗腫瘤活性的CXCR4 Mab hz515H7(或它的片段)。Hz515H7誘發在CXCR4同二聚體以及CXCR4/CXCR2異二聚體上的構形改變。這個新的特性應該具有提供這2種化學激素受體在癌症中的重要角色的癌症治療應用的利益。
標靶受體的同-以及異-二聚體這兩者已被發現增加Mab治療效用。確實，已證明例如一標靶IGF-1R和胰島素/IGF-1雜合受體(hybrid receptor)這兩者的Mab(h7C10)要比一僅標靶IGF-1R的Mab對於抑制活體內的腫瘤生長更有效(Pandini G.,2007)。
再者，該抗-CXCR4 Mab hz515H7是一用於CXCR4的無症狀拮抗物，它在活體外分析中沒有改變基礎信號但是在不同分析(GTPγS結合、Ca2+釋放)中抑制由SDF-1所誘發的信號，並且亦能夠抑制活體外SDF-1誘發的腫瘤細胞移動。
作用有如部分促效物(partial agonists)或反促效物(inverse agonists)的分子在缺乏配位子下展現內在活性。這些類型的分子甚至在缺乏配位子下安定[分別地一高-親和力(high-affinity)或一低-親和力GPCR狀態]，因此活化或抑制下游信號級聯(signaling cascade)(Galandin et al.,2007;Kenakin,2004)。
在該hz515H7 Mab的例子中，它在SDF-1缺乏下表現有如一無症狀的拮抗物，而沒有任何在CXCR4受體的內在活性。如在類鴉片受體配位子中已被觀察到的，這個藥理學特徵相較於部分或反促效物可能是與較少的不良副作用有關(Bosier and Hermans,2007)。確實，hz515H7 Mab的功能性活性完全視SDF-1的存在而定，並且沒有調控CXCR4受體活性將在SDF-1配位子沒有被表現、分泌或由血流提供的組織或器官中被觀察到。因此，hz515H7 Mab相較於其他具有正或負效力的CXCR4受體配位子可能是較少毒性的。此外，無症狀的拮抗物在藥理學空間中是少數的種類(Wurch et al.,1999,Kenakin,2004)。
令人驚訝地，發明人第一次做到產生一能夠結合至CXCR4而且能夠誘發CXCR4同二聚體和/或異二聚體構形改變的擬人化抗體。更特別地，本發明的擬人化抗體譨構誘發CXCR4同二聚體而且CXCR4/CXCR2異二聚體的構形改變。
在下列說明書中，複數的措辭“CXCR4二聚體”必須被瞭解為包含有CXCR4同二聚體以及CXCR4/CXCR2異二聚體。
在這個階段必須被提及的是：此等擬人化抗體從未已被描述在先前技藝中。再者，必須被提及的是：CXCR4/CXCR2異二聚體的存在從未被描述。
本發明的一部分是發現一由CXCR4與CXCR2所形成的異二聚體的存在。
因此，在一特別的方面，本發明揭示一包含有或由CXCR4/CXCR2異二聚體所構成的經分離的複合物。
該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的CXCR4化合物部分是選自於由下列所構成的群組的2種人類CXCR4異構型的一者：-具有如被描寫在GenBank寄存編號(Genbank accession number)NP_003458(SEQ ID No. 1)的序列之化學激素[C-X-C要素(C-X-C motif)]受體4異構型b[智慧人(Homo sapiens)]；-具有如被描寫在GenBank寄存編號NP_001008540(SEQ ID No.2)的序列之化學激素(C-X-C要素)受體4異構型a[智慧人]；-與這些具有SEQ ID No. 1或2的b或a異構型的一者具有至少95%相同性的它們的一另擇的轉錄接合變異體(transcriptional splice variant)或一天然變異體；以及-能夠藉由它的天然配位子基質細胞-衍生的因子-1(SDF-1)專一性地辨識並且具有較佳地至少100、150以及200個胺基酸長度的它們的一片段。
該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的CXCR2化合物部分是選自於由下列所構成的群組：-具有如被描寫在GenBank寄存編號NP_001548(SEQ ID No. 3)的序列之介白素8受體β(interleukin 8 receptor beta)；-與這個具有SEQ ID No. 3的介白素8受體β具有至少95%相同性的它的一另擇的轉錄接合變異體或一天然變異體；以及-能夠藉由IL-8專一性地辨識並且具有較佳地至少100、150以及200個胺基酸長度的它的一片段。
在這個特別的方面，本發明亦揭示一編碼一包含有該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的多肽之經分離的RNA或DNA。
本發明進一步揭示一核酸建構物(nucleic construct)，較佳地一表現載體(expression vector)[諸如一編碼該異二聚體複合物的質體(plasmid)]。
本發明進一步包含有一組成物，其包含有至少一核酸建構物[較佳地一表現載體，諸如一編碼該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的CXCR4部分的質體]以及一第二建構物[較佳地一表現載體，諸如一編碼該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的CXCR2部分的質體]。
在這個方面，本發明進一步揭示一種用於製備一表現該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物重組宿主細胞(recombinant host cell)的方法，其中這個方法包含有一轉形該宿主的步驟：a)以一核酸建構物[較佳地一表現載體，諸如一編碼該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的質體]；或b)以至少一核酸建構物[較佳地一表現載體，諸如一編碼該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的CXCR4部分的質體]以及一第二建構物[較佳地一表現載體，諸如一編碼該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的CXCR2部分的質體]。
該宿主細胞是一真核細胞(eukaryotic cell)[諸如一哺乳動物細胞(mammalian cell)]。
該編碼該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的核酸建構物(們)亦編碼一與CXCR4序列結合(特別地藉由共價偶和)的第一標記(first marker)(諸如luc標記)以及一與CXCR2序列結合(特別地藉由共價偶和)的第二標記[諸如GFP標記(亦即，用於BRET分析)]。
本發明亦揭示一種用於篩選一具有一抗癌活性或可被用於製備一用來治療癌症的組成物的化合物的方法，其特徵在於該方法包含有下列步驟：
a)令一表現該CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的本發明的重組宿主細胞與要被測試的化合物接觸；
b)測定這個化合物是否能夠調控(較佳地抑制)在該重組宿主細胞中的這個CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的活性。
在一第一個方面，一本發明的標的是一種用於產生以及選擇依據本發明的擬人化抗體的方法。
在一第一個方面，本發明關於一種用於選擇一能夠抑制配位子-依賴以及配位子-獨立活化的CXCR4這兩者的抗CXCR4擬人化抗體或者它的功能性片段或衍生物之一者的方法，該方法包含有下列步驟：
i)　篩選被產生的擬人化抗體並且選擇能夠專一性地結合至CXCR4以及亦調控CXCR4活化的抗體；
ii)　測試該等步驟i)的經選擇的抗體並且選擇能夠誘發CXCR4同二聚體構形改變的抗體，以及接著
iii)測試該等步驟ii)的經選擇的抗體並且選擇能夠誘發CXCR4/CXCR2異二聚體構形改變的抗體。
關於措辭“調控”，它必須被瞭解為一增加或一抑制。較佳地，本發明的經選擇的抗體必須抑制CXCR4活化。
如先前所解釋的，CXCR4二聚體構形改變的誘發是本發明的一重要方面，因為此等抗體對一大族群的病患將存在一真正的利益。
該抗體的產生可藉由熟習此技藝者所知曉的任何方法而被實現，諸如例如從鼠類抗體的經定序的CDR[藉由一骨髓瘤細胞與來自被免疫的小鼠或其他與被選擇的骨髓瘤細胞相容的物種的脾臟細胞的一融合所分泌]所設計的重組擬人化抗體[Kohler & Milstein,1975,Nature,256:495-497]。被免疫的動物可包括接著直接生產人類抗體的具有人類免疫球蛋白基因座(immunoglobulin loci)的基因轉殖小鼠。另一個可能的具體例可在於使用噬菌體呈現技術(phage display technologies)以篩選庫(libraries)。
篩選步驟i)可藉由熟習此技藝者所知曉的任何方法或程序而被實現。ELISA、BIAcore、免疫組織化學(immunohistochemistry)、FACS分析以及功能性篩選(functional screens)可被提及作為非限制性實例。一較佳的方法在於一藉由在CXCR4轉染物(transfectant)上以及在至少一腫瘤細胞株上的FACS分析的篩選俾以確定所生產的抗體亦將能夠辨識在腫瘤細胞上的天然受體。這個方法將被更精確地描述在下列實施例中。
關於措辭“調控CXCR4活化”，它意欲調控下列被描寫在關於鼠類抗體的實施例4、5、7與11、關於嵌合抗體的實施例16、17與19以及關於擬人化抗體的實施例27、24與28中的活性的至少一者：較佳地調控：-配位子SDF-1在受體CXCR4上的細胞膜的專一性結合(參見實施例4、16、27)[特別地藉由在安定地表現人類野生型CXCR4受體的真核轉形的細胞膜(諸如CHO-K1膜)上競爭]；-GTPγS在受體CXCR4上的細胞膜的專一性結合(參見實施例5、17、24)[特別地在安定地以及持續表現野生型CXCR4受體膜的真核轉形的細胞膜(諸如NIH-3T3細胞)]-CXCR4-調節的抑制cAMP生產(參見實施例7)；以及-CXCR4受體-調節的調動細胞內鈣儲存(參見實施例11、19、28)。
更佳地，這些活性的至少一者的這個調控是一活性的抑制。
在本發明的方法的選擇的步驟ii)與iii)的一較佳具體例中，該等步驟ii)與iii)在於藉由在分別表現CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP與CXCR4-R1uc/CXCR2-YFP的細胞上的BRET分析評估抗體，以及選擇能夠抑制至少40%、較佳地45%、50%、55%以及最佳地60%的BRET信號的抗體。
技術BRET是一種被知曉為代表蛋白質二聚合作用的技術[Angers et al.,PNAS,2000,97:3684-89]。
被使用在該方法的步驟ii)與iii)中的技術BRET是熟習此技藝者所熟知並且將被詳述在下列實施例中。更特別地，BRET[生物發光共振能量轉移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer)]是一種發生在一生物發光供體(bioluminescent donor)[海腎螢光素酶(Renilla Luciferase,Rluc))與一螢光受體(fluorescent acceptor)、GFP的一突變物(綠螢光蛋白質)或YFP(黃螢光蛋白質)之間的無輻射性能量轉移。在現在的例子中，EYFP[增強的黃螢光蛋白質(Enhanced Yellow Fluorescent Protein)]被使用。轉移的效力視在供體以及受體之間的方位以及距離而定。接著，只有2個分子呈緊密的接近(1-10 nm)，能量轉移可發生。這個性質被使用以產生蛋白質-蛋白質交互作用分析。確實，為了研究在2個夥伴之間的交互作用，第一者被基因地融合至海腎螢光素酶並且第二者被基因地融合至GFP的黃色突變物。融合蛋白質一般而言但非必須的被表現在哺乳動物細胞中。在它的膜可滲透基質[腔腸素(coelenterazine)]的存在下，Rluc發射藍光。若該GFP突變物比10 nm更接近於Rluc，一能量轉移可發生並且一額外的黃色信號可被偵測。BRET被測量有如在由受體所發射的光與由供體所發射的光之間的比率。因此BRET信號將增加，因為該等2個融合蛋白質被促使鄰近或者若一構形改變促使Rluc與GFP突變物更接近。
若BRET分析在一較佳具體例中構成，熟習此技藝者所熟悉的任何方法可被使用以測量CXCR4二聚體構形改變。沒有限制，下列技術可被提及：FRET[螢光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)]、HTRF[同質時差性螢光(Homogenous Time resolved Fluorescence)]、FLIM[螢光生命期造影顯微術(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)]或SW-FCCS單一波長螢光互關聯光譜(single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy)。
其他傳統的技術亦可被使用，諸如共免疫沉澱(co-immunoprecipitation)、α篩選(alpha screen)、化學交聯(chemical cross-linking)、雙-雜合(double-Hybrid)、親和層析法(affinity Chromatography)、ELISA或遠端西方墨點法(far western blot)。
在依據本發明的方法的一特別方面，步驟ii)在於藉由在表現CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP這兩者的細胞上的BRET分析評估抗體以及選擇能夠抑制至少40%的BRET信號的抗體。
在依據本發明的方法的另一個特別方面，步驟iii)在於藉由在表現CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP這兩者的細胞上的BRET分析評估抗體以及選擇能夠抑制至少40%的BRET信號的抗體。
在一第二個方面，本發明的一標的是藉由該方法所獲得的一經分離的擬人化抗體或它的功能性片段或衍生物。該擬人化抗體或它的該等片段或衍生物的一者能夠專一性地結合至人類CXCR4以及，若需要，並且較佳地能夠抑制它的配位子的天然附接，該擬人化抗體亦能夠誘發CXCR4二聚體構形改變。
措辭“功能性片段與衍生物”稍後將被詳細定義在本說明書中。
在此必須瞭解的是：本發明與呈天然形式的抗體無關，那是說它們不是在它們的天然環境中但是它們已能夠藉由從天然來源純化而被分離或獲得，或者藉由基因重組或藉由化學合成而被另外獲得，並且它們可接著含有如將被進一步描述的非天然胺基酸。
更特別地，依據本發明的另一個方面，描述一抗體或它的功能性片段或衍生物，該擬人化抗體的特徵在於它包含有至少一如依據IMGT所定義的互補決定區域(complementary determining region)CDR(被選自於包含有胺基酸序列SEQ ID Nos. 4至9的CDR)。
依據一第二方面，本發明是有關於一經分離的擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有在序列SEQ ID Nos. 4、5、6、7、8或9中所選擇的至少一CDR或者至少一如依據IMGT所定義的CDR(它的序列在與SEQ ID Nos. 4、5、6、7、8或9最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性)。
一抗體的一“功能性片段”意指特別地一具有如親代抗體對CXCR4相同專一性的抗體片段，諸如片段Fv、scFv(sc=單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc或雙功能抗體(diabodies)，或者任何半衰期已被增加的片段。此等功能性片段稍後將被詳細描述在本說明中。
一抗體的一“衍生化合物”或“衍生物”意指特別地為了保存它辨識CXCR4的能力，一包含有一胜肽支架(peptide scaffold)以及原始抗體的CDR的至少一者之結合蛋白質。一熟習此技藝者所熟知的此等衍生化合物稍後將被更詳細描述在本說明中。在本發明的另一個具體例中，該衍生化合物或衍生物可包含有原始抗體的至少2、較佳地至少3、更佳地4、又更佳地5或最佳地6個CDR。
更佳地，本發明包含有由基因重組或化學合成所獲得的依據本發明的擬人化抗體、它們的衍生化合物或它們的功能性片段。
依據一較佳的具體例，依據本發明的擬人化抗體或它的衍生化合物或功能性片段的特徵在於它由一單株抗體構成。
“單株抗體”被瞭解為意指一從一幾乎同質的抗體族群所產生的抗體。更特別地，一族群的個別抗體是同樣的，除了可在最小族群中被發現的很少數可能天然地發生的突變。換句話說，一單株抗體由從一單一細胞克隆(single cell clone)[例如一融合瘤(hybridoma)、一被轉染以一編碼同質抗體的DNA分子的真核宿主細胞、一被轉染以一編碼同質抗體的DNA分子的原核宿主細胞等等]的生長產生的一同質抗體構成，並且一般而言特徵在於唯一一類與次類(subclass)的重鏈(heavy chains)以及僅一類型的輕鏈(light chains)。單株抗體是高度專一性的並且針對一單一抗原。此外，不同於多株抗體[典型地包括針對各種不同的決定位(determinants)或表位(epitopes)的各種不同的抗體]的製備，各個單株抗體是針對抗原的一單一表位。
在此必須被瞭解的是：本發明與呈天然形式的擬人化抗體無關，亦即它們不是從它們的天然環境中被取得但是藉由從天然來源純化而被分離或獲得，或者藉由基因重組或藉由化學合成而被獲得，並且因此它們可攜帶如下面所描述的非天然胺基酸。
更特別地，依據本發明的一較佳具體例，該擬人化抗體或它的衍生化合物或功能性片段的特徵在於：它包含有一含有在胺基酸序列SEQ ID Nos. 4、5或6的CDR中所選擇的至少一CDR或者序列在與序列SEQ ID Nos. 4、5或6最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的至少一CDR的重鏈；或者它包含有一含有在胺基酸序列SEQ ID Nos. 7、8或9的CDR中所選擇的至少一CDR或者序列在與序列SEQ ID Nos. 7、8或9最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的至少一CDR的輕鏈。
在一個較佳方式中，本發明的擬人化抗體或者它們的衍生化合物或功能性片段的一者的特徵在於：它們包含有一含有下列3個CDR(分別地CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)的重鏈，其中：-CDR-H1包含有序列SEQ ID No. 4或一在與序列SEQ ID No. 4最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列；-CDR-H2包含有序列SEQ ID No. 5或一在與序列SEQ ID No.5最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列；以及-CDR-H3包含有序列SEQ ID No.6或一在與序列SEQ ID No.6最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列。
依據一特別的具體例，抗體或者它們的衍生化合物或功能性片段的一者的特徵在於：它們包含有一含有序列SEQ ID No.4的CDR-H1、序列SEQ ID No.5的CDR-H2以及序列SEQ ID No.6的CDR-H3之重鏈。
甚至更佳地，本發明的抗體或者它們的衍生化合物或功能性片段的一者的特徵在於：它們包含有一含有下列3個CDR(分別地CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)的輕鏈，其中：-CDR-L1包含有序列SEQ ID No.7或一在與序列SEQ ID No.7最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列；-CDR-L2包含有序列SEQ ID No.8或一在與序列SEQ ID No.8最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列；以及-CDR-L3包含有序列SEQ ID No.9或一在與序列SEQ ID No.9最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列。
依據一特別的具體例，抗體或它們的衍生化合物或功能性片段的一者的特徵在於：它們包含有一含有序列SEQ ID No.7的CDR-L1、序列SEQ ID No.8的CDR-L2以及序列SEQ ID No. 9的CDR-L3之輕鏈。
在本說明中，術語“多肽(polypeptides)”、“多肽序列(polypeptide sequences)”、“胜肽(peptides)”以及“附接至抗體化合物或它們的序列的蛋白質”是可互換的。
在此必須被瞭解的是：本發明與呈天然形式的擬人化抗體無關，亦即它們不是從它們的天然環境中被取得但是藉由從天然來源純化而被分離或獲得，或者藉由基因重組或藉由化學合成而被獲得，並且因此它們可攜帶如下面所描述的非天然胺基酸。
不管抗原受體、鏈類型或物種，IMGT獨特的編號已被定義以比較可變領域(variable domains)[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommi,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V. and Lefranc,Dev. Comp. Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT獨特的編號中，保守的胺基酸通常具有相同的位置，例如半胱胺酸23(1st-CYS)、色胺酸(tryptophan)41(保守的-TRP)、疏水性胺基酸(hydrophobic amino acid)89、半胱胺酸104(2nd-CYS)、苯丙胺酸(phenylalanine)或色胺酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特的編號提供框架區域(framework regions)(FR1-IMGT：位置1至26、FR2-IMGT：39至55、FR3-IMGT：66至104以及FR4-IMGT：118至128)以及互補決定區域(complementarity determining regions)：CDR1-IMGT：27至38、CDR2-IMGT：56至65以及CDR3-IMGT：105至117的一標準化定界。如缺口(gaps)代未被佔據的位置，CDR-IMGT長度(在括號之間被顯示並且藉由點而被分開，例如[8.8.13])變成重要的資訊。IMGT獨特的編號被使用在2D圖示(graphical representations)(被稱為IMGT Colliers de Perles)[Ruiz,M. and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q. and Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]，以及在3D結構(在IMGT/3D結構-DB)[Kaas,Q.,Ruiz,M. and Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res.,32,D208-D210(2004)]。
3種重鏈CDR以及3種輕鏈CDR存在。術語CDR或CDRs在此被使用為了指出，依據例子，這些含有藉由抗體與它辨識的抗原或表位的親和力對結合負責的多數胺基酸殘基之區域的一者或者這些區域的數個或甚至全部。
在本發明的意義中，在核酸或胺基酸的2個序列之間的“百分比相同性(percentage identity)”意指在最佳比對之後所獲得的在2個要被比較的序列之間相同的核苷酸或胺基酸殘基的百分比，這個百分比是純粹統計的並且在2個序列之間的差異是沿著它們的長度被隨機地分佈。2個核酸或胺基酸序列的比較藉由在已最佳地對齊它們之後比較序列而被傳統地進行，該比較能夠藉由分節(segment)或藉由使用一“比對視窗(alignment window)”而被處理。除了藉由手比較以外，用於比較的最佳比對序列可藉由Smith and Waterman(1981)[Ad. App. Math. 2:482]的局部同源演算法(local homology algorithm)的方式、藉由Neddleman and Wunsch(1970)[J. Mol. Biol. 48:443]的局部同源演算法的方式、藉由Pearson and Lipman(1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]的類似檢索方法的方式或者藉由使用這些演算法的電腦軟體(在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA，或者藉由比較軟體BLAST NR或BLAST P)的方式而被進行。
在2個核酸或胺基酸序列之間的百分比相同性藉由比較2個被最佳地對齊的序列而被測定，其中要比較的核酸或胺基酸序列相較於用於在2個序列之間最佳比對的參考序列可具有增加(additions)或刪除(deletions)。百分比相同性藉由測定在2個序列之間(較佳地在2個完整的序列之間)胺基酸核苷酸或殘基相同的位置的數目、將相同位置的數目除以在比對視窗中位置的總數目以及將結果乘以100而被計算出俾以獲得在2個序列之間的百分比相同性。
例如，BLAST程式[在網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html上可獲得的“BLAST 2序列(BLAST 2 sequences)”(Tatusova et al.,“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett. 174:247-250)]可以系統預設參數[尤其是參數“開啟間隙懲罰(open gap penalty)”：5以及“延伸間隙懲罰(extension gap penalty)”：2；被選擇的矩陣(matrix)是例如由程式所建議的“BLOSUM 62”矩陣]而被使用；在2個要比較的序列之間的百分比相同性藉由該程式而被直接計算。
關於展現出與一參考胺基酸序列至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的胺基酸序列，較佳的實例包括含有參考序列、某些修飾(尤其是至少一胺基酸的一刪除、添加或取代、截斷或延伸)的那些。在一或多個保守性或非保守性胺基酸的取代的例子中，取代較佳的在被取代的胺基酸是由“等價(equivalent)”胺基酸所替換。在此，措辭“等價的胺基酸”被意指指示可能取代結構胺基酸的一者然而沒有修飾對應的抗體以及下面所定義的那些專一性實例的生物活性的任何胺基酸。
等價胺基酸可在它們與它們所取代的胺基酸的結構同源性上或在可能被產生的各種不同的抗體之間的生物活性的比較測試的結果上而被決定。
作為一非限制性實例，下面的表1概述可能被進行而沒有導致對應的經修飾抗體的生物活性的一顯著修飾的可能取代；反向取代在相同條件下是天然地可能的。
那些熟習此技藝者所知曉的是：在本技藝的現今狀態，在6個CDR之間的最大變化性(長度以及組成物)被發現在3個重鏈CDR中，並且更特別地在這個重鏈的CDR-H3。因此，顯然本發明的抗體或者它們的衍生化合物或功能性片段的較佳特徵的CDR將是重鏈的3個CDR。
本發明的另一個具體例揭示一抗體或者它的衍生化合物或功能性片段，其包含有：一包含有下列3個CDR的重鏈：具有序列SEQ ID No. 4或一在與序列SEQ ID No. 4最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列的CDR-H1；具有序列SEQ ID No. 5或一在與序列SEQ ID No. 5最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列的CDR-H2；具有序列SEQ ID No. 6或一在與序列SEQ ID No. 6最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列的CDR-H3；以及一包含有下列3個CDR的輕鏈：具有序列SEQ ID No. 7或一在與序列SEQ ID No. 7最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列的CDR-L1；具有序列SEQ ID No. 8或一在與序列SEQ ID No. 8最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列的CDR-L2；具有序列SEQ ID No. 9或一在與序列SEQ ID No. 9最佳比對之後具有至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%相同性的序列的CDR-L3。
本發明的另一個方面是有關於上面所描述的擬人化抗體的功能性片段。因為對熟習此技藝者顯而易見的，一功能性片段必定是一結合片段，亦即一能夠結合至如親代抗體的相同標靶。另外，一功能性片段維持親代抗體的功能。特別地，本發明的一功能性片段能夠調控CXCR4的活性。更特別地，依據本發明的一功能性片段能夠抑制CXCR4的活化。在一具體例中，CXCR4活化是配位子依賴的；在另一個具體例中，該CXCR4活化是配位子獨立的。
在一較佳具體例中，本發明的功能性片段維持親代抗體的功能在於調控CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的活性。較佳地，該等功能性片段維持抑制CXCR4/CXCR2異二聚體複合物的活性的能力。
更特別地，本發明標靶一抗體或者它的衍生化合物或功能性片段，特徵在於該功能性片段是在片段Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc以及雙功能抗體或者任何半衰期已被增加的片段[諸如PEG化的片段(PEGylated fragments)]中被選擇。
依據本發明的抗體的此等功能性片段由例如片段Fv、scFv(sc=單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc或雙功能抗體或者任何半衰期已藉由化學修飾{諸如添加聚烯烴基二醇(polyalkylene glycol)[諸如聚乙二醇(polyethylene glycol)(PEG化)(PEG化片段被意指為Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG以及Fab’-PEG)}或者藉由併入一脂質體(liposome)、微球體(microspheres)或PLGA而被增加的片段構成，該等片段擁有特別能夠以一般方式的活性運用的本發明的擬人化抗體的特徵化CDR的至少一者，甚至它出現的抗體的部分。
較佳地，該等功能性片段將包含有或包括它們所衍生的抗體的可變重或輕鏈的一部分序列，該部分序列足以維持如它出現的抗體的相同結合專一性以及足夠的親和力[較佳地至少相等於1/100(更佳地至少1/10)的它出現的抗體所具者]。
此一功能性片段將含有它出現的抗體的序列的至少5個胺基酸，較佳地6、7、8、10、15、25、50或100個連續胺基酸。
較佳地，這些功能性片段將是一般而言具有如產生它們的抗體的相同結合專一性的類型Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、F(ab’)、scFv-Fc或雙功能抗體。依據本發明，本發明的抗體的片段可藉由諸如酵素消化(enzyme digestion)[包括胃蛋白酶(pepsin)或木瓜酶(papain)]和/或藉由化學還原切割雙硫鍵的方法而從上面描述的抗體被獲得。該等抗體片段亦可藉由一熟習此技藝者已知的重組基因技術或藉由例如自動化胜肽合成器(automatic peptide synthesizers)(諸如由Applied BioSystems所銷售的那些)的胜肽合成等等而被獲得。
更佳地，本發明是有關於的鼠類515H7 Mab的不同擬人化抗體變異體，在本說明書中被意指為i)HZ515H7、Hz515H7或hz515H7Mab以及ii)HZ515H7-2、Hz515H7-2或hz515H7-2Mab或者iii)該等抗體變異體的一輕鏈和/或一重鏈的任何組合。
為了更清楚，下面的表2a概述對應於本發明的擬人化變異體(亦意指為形式)hz515H7與hz515H7-2的CDR的各種不同的胺基酸序列；表2b概述對應於本發明的擬人化形式hz515H7的各種不同的變異體的可變領域與全長序列的各種不同的胺基酸序列；以及表2c概述對應於本發明的擬人化形式hz515H7-2的可變領域與全長序列的各種不同的胺基酸序列。
作為一實例，為了避免混淆。措辭“VH1”類似於措辭“VH變異1(VH Variant 1)”、“VH變異1(VH variant 1)”、“VH Var 1”或“VH var 1)。“一致”序列的獲得被描述在實施例22。
本發明的又另一個特別方面是有關於一擬人化抗體或者它的衍生化合物或功能性片段，其特徵在於衍生自人類抗體的輕鏈和重鏈的保守區域分別是λ(lambda)或κ(kappa)區域以及γ-1(gamma-1)、γ-2或γ-4區域。
本發明描述在西元2008年6月25日以編號I-4019被提申在法國微生物培養收集中心(French collection for microorganism cultures)(CNCM,Institut Pasteur,Paris,France)的分泌一單株抗體的鼠類融合瘤。該融合瘤藉由融合Balb/C經免疫的小鼠脾細胞(Balb/C immunized mice splenocytes)以及骨髓瘤Sp2/O-Ag 14株的細胞而被獲得。
鼠類單株抗體(在此被意指為515H7)是由在西元2008年6月25日以編號I-4019被提申在CNCM的融合瘤所分泌。
本發明亦描述嵌合抗體。
一嵌合抗體是含有一衍生自一特定物種的一抗體的天然可變區域(輕鏈與重鏈)組合以一與該特定物種異源的物種的一抗體的輕鏈與重鏈的保守區域的一者。
這些抗體或它們的嵌合片段可藉由使用重組遺傳學的技術而被製備。例如，該嵌合抗體可藉由選殖含有一啟動子與一編碼本發明的一非人類單株抗體(特別是鼠類)的可變區域的序列以及一編碼人類抗體保守區域的序列的重組DNA而被產生。由一此重組基因所編碼的依據本發明的一嵌合抗體可以是例如一小鼠-人類嵌合體(mouse-human chimera)，這個抗體的專一性藉由衍生自鼠類DNA的可變區域而被決定並且它的同型(isotype)藉由衍生自人類DNA的保守區域而被決定。參考Verhoeyn et al.(BioEssays,8:74,1988)關於用於製備嵌合抗體的方法。
在另一個具體例中，本發明是有關於一包含有被選擇的序列SEQ ID No. 83的可變區域的嵌合抗體重鏈(被意指為c515H7 VH)。
在另一個具體例中，本發明是有關於一包含有一序列SEQ ID No. 84的可變區域的嵌合抗體輕鏈(被意指為c515H7 VL)。
在一特別較佳的具體例中，本發明的嵌合抗體或它的一衍生化合物或功能性片段包含有一含有胺基酸序列SEQ ID No. 83的重鏈序列以及一含有胺基酸序列SEQ ID No. 84的輕鏈序列。
如此處所用的，一“擬人化抗體”意指一包含有至少一重鏈或一輕鏈的抗體，該重或輕鏈含有衍生自一非人類來源的抗體的CDR區域，該抗體分子的其它部分是人類來源[例如，該等其他部分可被衍生自一(或數種)人類抗體]。根據措辭“擬人化抗體”，本發明的因此包含有具有僅一擬人化鏈、第二個是一嵌合或鼠類鏈的抗體。較佳地，本發明的一“擬人化抗體”包含有2個擬人化鏈，亦即，重鏈與輕鏈這兩者是擬人化的。
本發明的擬人化抗體或它們的片段可藉由一熟習此技藝者已知的技術(諸如，例如被描述在文件Singer et al.,J. Immun.,150:2844-2857,1992;Mountain et al.,Biotechnol. Genet. Eng. Rev.,10:1-142,1992；以及Bebbington et al.,Bio/Technology,10:169-175,1992的那些)而被製備。此等擬人化抗體較佳的是它們在涉及活體外診斷或者活體內預防性和/或治療性治療的方法中的使用。其它擬人化技術亦被一熟習此技藝者所知曉，諸如，例如，由PDL在專利案EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 0 566 647或US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089以及US 5,693,761中所描述的“CDR移植(CDR grafting)”技術。美國專利案5,639,641或6,054,297、5,886,152以及5,877,293亦可被引用。
本發明是有關於產生自上面所描述的鼠類抗體515H7的擬人化抗體。
在一較佳的方式中，衍生自人類抗體的輕鏈和重鏈的保守區域分別是λ或κ以及γ-1、γ-2或γ-4區域。
更特別地，本發明是有關於一擬人化抗體重鏈，其包含有i)一與一人類抗體重鏈的對應框架區域同源的框架區域；以及ii)與一衍生自一不同的哺乳動物物種的抗體的對應CDR同源的CDR，其中該等CDR由分別包含有序列SEQ ID Nos. 4、5以及6的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3構成。
換句話說，本發明是有關於一具有由CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3構成的CDR的擬人化抗體重鏈，該CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含有序列SEQ ID Nos. 4、5以及6。對熟習此技藝者顯而易見的是：不同的生殖系列(germlines)可被選擇用於抗體515H7的擬人化，導致不同形式的擬人化515H7。更特別地，在一較佳的非限制性具體例中，不同的生殖系列可被使用於編碼v基因的序列，而相同的生殖系列對於j-基因是保守的。
關於本發明，可被使用的生殖系列根據2個補充準則而被選擇：-各個CDR的胺基酸長度在鼠類CDR以及在生殖系列的等效物(equivalent)之間必須是相同的；以及-生殖系列的胺基酸序列與親代鼠類序列必須具有至少70%相同性。
為了避免懷疑，在此提醒的是：本發明包含有相同抗體515H7的2個較佳非限制性擬人化形式(亦被意指為版本)。第一者(被意指為Hz515H7)由一以用於重鏈的IGHV3-49*04(SEQ ID No. 77)與IGHJ4*01(SEQ ID No. 81)以及用於輕鏈的IGKV4-1*01(SEQ ID No. 78)與IGKJ1*01(SEQ ID No. 82)的生殖系列所獲得的擬人化抗體構成。第二者(被意指為Hz515H7-2)由一以用於重鏈的IGHV3-49*04(SEQ ID No.77)與IGHJ4*01(SEQ ID No.81)以及用於輕鏈的IGKV4-1*01(SEQ ID No.78)與IGKJ1*01(SEQ ID No.82)的生殖系列所獲得的擬人化抗體構成。第二者(被意指為Hz515H7-2)由一以用於重鏈的IGHV3-73*01(SEQ ID No. 79)與IGHJ4*01(SEQ ID No. 81)以及用於輕鏈的IGKV2D-40*01(SEQ ID No. 80)與IGKJ1*01(SEQ ID No. 82)的生殖系列所獲得的擬人化抗體構成。
在另一個具體例中，本發明是有關於一包含有一選自於由SEQ ID Nos. 10、11、12、13、85或87所構成的群組的序列的可變區域之擬人化抗體重鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於一包含有一選自於由SEQ ID Nos. 10、11、12或13所構成的群組的序列的可變區域之擬人化抗體H515H7重鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於一包含有一序列SEQ ID No. 85的可變區域之擬人化抗體H515H7-2重鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於一包含有一序列SEQ ID No. 87的可變區域之擬人化抗體H515H7-2重鏈。
在又另一個具體例中，本發明亦有關於序列SEQ ID No. 87的擬人化抗體H515H7-2重鏈可變區域，其包含有一或多個選自於由H35S、V48L、R50F、A61D、D76N以及A81L所構成的群組的胺基酸取代(們)。
在又另一個具體例中，本發明是有關於一包含有選自於由SEQ ID Nos. 21、22、23、24、89或91所構成的群組的完整序列的擬人化抗體重鏈。
在又另一個具體例中，本發明是有關於一包含有選自於由SEQ ID Nos. 21、22、23或24所構成的群組的完整序列的擬人化抗體重鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於包含有完整序列SEQ ID No. 89的擬人化抗體H515H7-2重鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於包含有完整序列SEQ ID No. 91的擬人化抗體H515H7-2重鏈。
在又另一個具體例中，本發明亦有關於序列SEQ ID No. 91的擬人化抗體H515H7-2重鏈，其包含有一或多個選自於由H35S、V48L、R50F、A61D、D76N以及A81L所構成的群組的胺基酸取代(們)。
更特別地，本發明是有關於一擬人化抗體輕鏈，其包含有i)一與一人類抗體輕鏈的對應框架區域同源的框架區域，以及ii)與一衍生自一不同的哺乳動物物種的抗體的對應CDR同源的CDR，其中該等CDR由分別包含有序列SEQ ID Nos. 7、8以及9的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3構成。
換句話說，本發明是有關於一具有由分別包含有序列SEQ ID Nos. 7、8以及9的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3構成的CDR之擬人化抗體輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於一包含有一選自於由SEQ ID Nos. 14、15、16、17、18、19、20、86或88所構成的群組的序列的可變區域之擬人化抗體輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於該包含有一選自於由SEQ ID Nos. 14、15、16、17、18、19或20所構成的群組的序列的可變區域之擬人化抗體H515H7輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於該包含有一序列SEQ ID No. 86的可變區域之擬人化抗體H515H7-2輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於該包含有一序列SEQ ID No. 88的可變區域之擬人化抗體H515H7-2輕鏈。
在又另一個具體例中，本發明亦有關於序列SEQ ID No. 88的擬人化抗體H515H7-2輕鏈可變區域，其包含有一或多個選自於由L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Y和/或V89L所構成的群組的胺基酸取代(們)。
在又另一個具體例中，本發明是有關於一包含有選自於由SEQ ID Nos. 25、26、27、28、29、30、31、90或92所構成的群組的完整序列的擬人化抗體輕鏈。
在又另一個具體例中，本發明是有關於該包含有選自於由SEQ ID Nos. 25、26、27、28、29、30或31所構成的群組的完整序列的擬人化抗體H515H7輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於該包含有完整序列SEQ ID No. 90的擬人化抗體H515H7-2輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於該包含有完整序列SEQ ID No. 92的擬人化抗體H515H7-2輕鏈。
在又另一個具體例中，本發明亦有關於序列SEQ ID No. 92的擬人化抗體H515H7-2輕鏈，其包含有一或多個選自於由L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Y和/或V89L所構成的群組的胺基酸取代(們)。
更特別地，本發明是有關於一擬人化抗體或它的一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於它包含有重與輕鏈，各個具有i)與一人類抗體的對應框架區域同源的框架區域，以及ii)與一衍生自一不同的哺乳動物物種的抗體的對應CDR同源的CDR，其中該等CDR由分別包含有序列SEQ ID Nos. 4、5與6的重鏈的CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3以及分別包含有序列SEQ ID Nos. 7、8與9的輕鏈的CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3構成。
換句話說，本發明是有關於一擬人化抗體或它的一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於該擬人化抗體包含有重與輕鏈，該重鏈具有由CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3構成的CDR，以及該輕鏈具有由CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3構成的CDR，其中該CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3分別包含有序列SEQ ID Nos. 4、5與6，以及該CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3分別包含有序列SEQ ID Nos. 7、8與9。
在另一個具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體或它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一選自於由SEQ ID Nos. 10、11、12、13、83、85或87所構成的群組的序列的重鏈可變區域以及一選自於由SEQ ID Nos. 14、15、16、17、18、19、20、84、86或88所構成的群組的序列的輕鏈可變區域。
在另一個具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體H515H7，其包含有一選自於由SEQ ID Nos. 10、11、12或13所構成的群組的重鏈可變區域以及一選自於由SEQ ID Nos. 14、15、16、17、18、19或20所構成的群組的序列的輕鏈可變區域。
在另一個具體例中，本發明是有關於該擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No. 85的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 86的輕鏈可變區域。
在另一個具體例中，本發明是有關於該擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 88的輕鏈可變區域。
在另一個具體例中，本發明是有關於該擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No. 85的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 88的輕鏈可變區域。
在另一個具體例中，本發明是有關於該擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 86的輕鏈可變區域。
在又另一個具體例中，本發明亦有關於該擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域[它包含有一或多個選自於由H35S、V48L、R50F、A61D、D76N以及A81L所構成的群組的胺基酸取代(們)]以及序列SEQ ID No. 88的輕鏈可變區域[它包含有一或多個選自於由D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E以及D76Y所構成的群組的胺基酸取代(們)]在又另一個具體例中，本發明是有關於一種包含有一擬人化重鏈組合以一嵌合輕鏈的擬人化抗體。
在又另一個具體例中，本發明是有關於一種包含有一嵌合重鏈組合以一擬人化輕鏈的擬人化抗體。
更特別地，本發明描述一擬人化抗體或它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一選自於由SEQ ID Nos. 14、15、16、17、18、19、20、86或88所構成的群組的序列的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 14的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7 VL1 T59A E61D或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 15的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7 VL2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 16的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7 VL2.1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 17的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7 VL2.2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No.83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 18的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7 VL2.3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 19的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7 VL3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 20的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 86的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體c515H7 VH/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 83的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 88的輕鏈可變區域。
在另一個具體例中，本發明描述一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一選自於由SEQ ID Nos. 10、11、12、13、85或87所構成的群組的序列的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 84的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體Hz515H7 VH1/c515H7 VL或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 10的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 84的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N/c515H7 VL或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 84的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N/c515H7 VL或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 12的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 84的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體Hz515H7 VH2/c515H7 VL或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 13的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 84的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體或者它的一衍生的化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 85的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 84的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/c515H7 VL或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 84的輕鏈可變區域。
在又另一個具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一選自於由SEQ ID Nos.21、22、23、24、89或91所構成的群組的序列的重鏈以及一選自於由SEQ ID Nos.25、26、27、28、29、30、31、90或92所構成的群組的序列的輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體H515H7，其包含有一選自於由SEQ ID Nos.21、22、23或24所構成的群組的序列的重鏈以及一選自於由SEQ ID Nos.25、26、27、28、29、30或31所構成的群組的序列的輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No.89的重鏈以及一序列SEQ ID No.90的輕鏈。
在另一個具體例中，本發明是有關於一擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.92的輕鏈。
在又另一個具體例中，本發明亦有關於該擬人化抗體H515H7-2，其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈[它包含有一或多個選自於由H35S、V48L、R50F、A61D、D76N以及A81L所構成的群組的胺基酸取代(們)]以及序列SEQ ID No.92的輕鏈[它包含有一或多個選自於由D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E以及D76Y所構成的群組的胺基酸取代(們)]在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No.11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.16的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 22的重鏈以及一序列SEQ ID No. 27的輕鏈。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 17的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 22的重鏈以及一序列SEQ ID No. 28的輕鏈。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 18的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 22的重鏈以及一序列SEQ ID No. 29的輕鏈。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No19的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 22的重鏈以及一序列SEQ ID No. 30的輕鏈。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 12的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 14的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 23的重鏈以及一序列SEQ ID No. 25的輕鏈。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 T59A E61D或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 12的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 15的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 T59A E61D或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 23的重鏈以及一序列SEQ ID No. 26的輕鏈。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 10的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 14的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 21的重鏈以及一序列SEQ ID No. 25的輕鏈。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 10的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 88的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 88的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 12的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 88的輕鏈可變區域。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH2/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No.13的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.88的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 21的重鏈以及一序列SEQ ID No. 92的輕鏈。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 22的重鏈以及一序列SEQ ID No. 92的輕鏈。
在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 23的重鏈以及一序列SEQ ID No. 92的輕鏈。在另一個較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7 VH2/Hz515H7-2 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 24的重鏈以及一序列SEQ ID No. 92的輕鏈。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 14的輕鏈可變區域。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL1 T59A E61D或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 15的輕鏈可變區域。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 16的輕鏈可變區域。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2.1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 17的輕鏈可變區域。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2.2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 18的輕鏈可變區域。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2.3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 19的輕鏈可變區域。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No. 20的輕鏈可變區域。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 91的重鏈以及一序列SEQ ID No. 25的輕鏈。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL1 T59A E61D或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 91的重鏈以及一序列SEQ ID No. 26的輕鏈。
在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 91的重鏈以及一序列SEQ ID No. 27的輕鏈。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2.1或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 91的重鏈以及一序列SEQ ID No. 28的輕鏈。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2.2或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 91的重鏈以及一序列SEQ ID No. 29的輕鏈。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL2.3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 91的重鏈以及一序列SEQ ID No. 30的輕鏈。在一較佳具體例中，本發明是有關於擬人化抗體Hz515H7-2 VH1/Hz515H7 VL3或者它的一衍生化合物或功能性片段，其包含有一序列SEQ ID No. 91的重鏈以及一序列SEQ ID No. 31的輕鏈。
必須被瞭解的是：上面所例示的VH/VL組合不是限制的。熟習此技藝者沒有過度責任以及沒有應用創造技巧而可當然重新排列被揭示在本說明書的所有VH與VL。此技藝者可因此獲得對應於被揭示在本申請案的所有VH與VL的所有組合之所有擬人化抗體。
本發明的一新穎方面是有關於一經分離的核酸，其特徵在於它在下列核酸(包括任何退化的基因密碼)之中被選擇：a)一編碼依據本發明的一擬人化抗體重鏈或它的一衍生化合物或功能性片段的核酸、DNA或RNA；b)一編碼依據本發明的一擬人化抗體輕鏈或它的一衍生化合物或功能性片段的核酸、DNA或RNA；c)一編碼依據本發明的一擬人化抗體或它的一衍生化合物或功能性片段的核酸、DNA或RNA；d)一互補於一如在a)、b)或c)所定義的核酸之核酸；e)一能夠在高度嚴厲的條件下與至少一包含有核酸序列SEQ ID Nos.38至41、49至52、93或95的重鏈[較佳地具有依據IMGT或卡巴特CDR(Kabat CDR)編號的它的3個CDR的至少一者]雜合的具有至少18個核苷酸的核酸；f)一能夠在高度嚴厲的條件下與至少一包含有核酸序列SEQ ID Nos.42至48、53至59、94或96的輕鏈(較佳地具有依據IMGT或卡巴特CDR編號的它的3個CDR的至少一者)雜合的具有至少18個核苷酸的核酸；本發明亦有關於一包含有一編碼一擬人化抗體的一重鏈可變區域的核酸序列之經分離的核酸分子，該重鏈可變區域核苷酸序列包含有一SEQ ID No.32的CDR-H1核苷酸序列；一SEQ ID No.33的CDR-H2核苷酸序列；以及一SEQ ID No.34的CDR-H3核苷酸序列。
本發明亦有關於一包含有一編碼一擬人化抗體的一輕鏈可變區域的核酸序列之經分離的核酸分子，該輕鏈可變區域核苷酸序列包含有一SEQ ID No.35或60的CDR-L1核苷酸序列；一SEQ ID No. 36或61的CDR-L2核苷酸序列；以及一SEQ ID No. 37或62的CDR-L3核苷酸序列。
本發明亦有關於一包含有一編碼一擬人化抗體的一重鏈可變區域與一輕鏈可變區域的核酸序列之經分離的核酸分子，該重鏈可變區域核苷酸序列包含有一SEQ ID No. 32的CDR-H1核苷酸序列；一SEQ ID No. 33的CDR-H2核苷酸序列；以及一SEQ ID No. 34的CDR-H3核苷酸序列；該輕鏈可變區域核苷酸序列包含有一SEQ ID No. 35或60的CDR-L1核苷酸序列；一SEQ ID No. 36或61的CDR-L2核苷酸序列；以及一SEQ ID No. 37或62的CDR-L3核苷酸序列。
下面的表3a概述對應於本發明的抗體hz515H7的CDR之最佳化核苷酸序列；表3b概述對應於本發明的擬人化抗體hz515H7的各種不同的變異體的可變領域與全長序列的各種不同的最佳化核苷酸序列。表3c概述對應於本發明的擬人化版本hz515H7-2的可變領域與全長序列的各種不同的最佳化核苷酸序列。
措辭“最佳化序列”意指編碼構成感興趣的蛋白質(在此是抗體可變領域)的胺基酸的密碼子(codons)已被最佳化用以在一專屬的細胞類型(據此哺乳動物細胞)中藉由轉譯機制的一最佳辨識。關於這個方面，由最佳化序列所編碼的特定蛋白質的胺基酸序列是相同於非-最佳化序列所具者，但是核苷酸序列是不同的。最佳化亦包括G/C含量適當(G/C content adaptation)以及預防安定的RNA二級結構(secondary structure)(參見例如Kim et al.,1997 Gene199(1-2):293-301)。例如，鼠類CDR-H1的核苷酸序列(SEQ ID No.71)已被最佳化並且對應於擬人化CDR-H1的核苷酸序列(SEQ ID No.32)，其中密碼子ggg、act以及gat(分別編碼殘基Gly、Thr以及Asp)已分別由密碼子ggc、acc以及gac(亦分別編碼殘基Gly、Thr以及Asp)所代替。關於CDR-H2與CDR-H3(分別是SEQ ID Nos.72與73)，它們亦已被最佳化並且分別對應於SEQ ID Nos.33與34的最佳化CDR。
同樣的，輕鏈的3個CDR(分別是SEQ ID Nos.74、75與76)具有2個對應於VL1、VL2與VL3(分別是SEQ ID Nos.35、36與37)以及VL2.1、VL2.2與VL2.3(分別是SEQ ID Nos. 60、61與62)的擬人化最佳形式。下列表4概述原始的CDR，亦即鼠類非最佳化序列：
在本描述中可被交換地使用的術語“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“聚核苷酸序列”以及“核苷酸序列”意指一核苷酸(經修飾的或沒有)的精確序列定義一核酸(含有非天然的核苷酸或沒有)的一片段或一區域並且是一雙股DNA、一單股DNA或該等DNA的轉錄產物。
在此亦被包括的是：本發明沒有與在它們的自然染色體環境(亦即，呈一自然狀態)中的核苷酸序列有關。本發明的序列已被分離和/或純化，亦即，它們被直接或間接地取樣(例如藉由一複製)，它們的環境已至少被部分地修飾。由重組遺傳學藉由例如宿主細胞所獲得或者藉由化學合成所獲得的經分離的核酸在此亦應該被提到。
“在與一較佳序列最佳比對之後展現至少80%、較佳地85%、90%、95%以及98%的百分比相同性的核酸序列”意指相較於參考核酸序列，展現出某些修飾[諸如，特別的，一刪除、一截斷、一延伸、一嵌合融合和/或一取代(特別是點狀的)]的核酸序列。較佳地，這些是編碼如參考序列的相同胺基酸序列之序列，這個是有關於基因密碼的退化，或者可能專一性地與參考序列雜合(較佳地在高度嚴厲的條件下，特別是下面所定義的那些)的互補序列。
在高度嚴厲的條件下雜合意指與溫度和離子強度有關的條件以它們容許雜合被維持在2個互補的DNA片段之間此一條件而被選擇。在一純粹例示的基礎上，用於定義上面所描述的聚核苷酸片段的目的的雜合步驟的高度嚴厲條件是如下有利的。
DNA-DNA或DNA-RNA雜合以下列2個步驟而被進行：(1)於42℃下在含有5X SSC(1X SSC相當於一為0.15 M NaCl+0.015 M檸檬酸鈉的溶液)的磷酸緩衝液(20 mM,pH 7.5)、50%甲醯胺(formamide)、7%十二基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、10X丹哈特氏(Denhardt’s)、5%硫酸葡聚醣(dextran sulfate)以及1%鮭魚精子(salmon sperm)DNA中預雜合歷時3小時；(2)在一視探針(probe)(亦即：42℃用於一長度>100個核苷酸的探針)而定的溫度下主要雜合(primary hybridization)歷時20小時，繼而於20℃下在2X SSC+2% SDS中的2次20分鐘清洗、於20℃下在0.1X SSC+0.1% SDS中的一次20分鐘清洗。對於一>100個核苷酸的探針，最後的清洗於60℃下在0.1X SSC+0.1% SDS中被進行歷時30分鐘。上面所描述用於一具有被定義的尺寸的聚核苷酸之高度嚴厲的雜合條件可由一熟習此技藝者依據被描述在Sambrook,et al.(Molecular cloning: a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory;3rd edition,2001)的操作程序而被改造用於更長或更短的寡核苷酸。本發明亦有關於一包含有一如本發明所描述的核酸的載體。本發明特別標靶含有此一核苷酸序列的選殖和/或表現載體。
本發明的載體較佳地含有容許在一特定宿主細胞中表現和/或分泌核苷酸序列的要素。該載體因此必須含有一啟動子(promoter)、轉譯起始和終止信號，以及適合的轉錄調節區域(transcription regulation regions)。它必須能夠以一安定的方式被維持在宿主細胞中，並且可選擇性地具有指明被轉譯的蛋白質的分泌的特殊信號。這些各種不同的要素被選擇並且由一熟習此技藝者依據所使用的宿主細胞而被最佳化。為了這個目的，該等核苷酸序列可被插在被選擇的宿主內的自我複製載體或者被選擇的宿主的整合型載體(integrative vectors)中。
此等載體藉由一熟習此技藝者所典型地使用的方法而被製備，並且所形成的克隆(clones)可藉由標準方法[諸如脂質轉染(lipofection)、電穿孔(electroporation)、熱休克(heat shock)或化學方法]而被導入至一適合的宿主內。載體是例如，質體或病毒來源的載體。為了選殖或表現本發明的核苷酸序列，它們被使用以轉形宿主細胞。本發明亦包含有由一如本發明所描述的載體所轉形或含有一如本發明所描述的載體的宿主。宿主細胞可在原核或真核系統[例如，諸如細菌細胞，以及酵母細胞(yeast cells)或動物細胞(特別是哺乳動物細胞)]中被選擇。昆蟲或植物細胞亦可被使用。本發明亦有關於具有一依據本發明的轉形細胞的動物(不是人類)。
本發明的另一個方面是有關於一種用於生產一依據本發明的抗體或它的功能性片段的一者之方法，其特徵在於該方法包含有下列步驟：a)在一介質(medium)以及適合的培養條件下培養一依據本發明的宿主細胞；以及b)回收該因此從該培養介質或從該被培養的細胞中所生產的抗體或它的功能性片段的一者。
依據本發明的轉形細胞在用於製備依據本發明的重組多肽的方法中是有用的。用於製備呈重組形式的依據本發明的多肽的方法(特徵在於該等方法使用一載體和/或一藉由一依據本發明的載體所轉形的細胞)亦可被包含在本發明中。較佳地，一藉由一依據本發明的載體所轉形的細胞在容許上述多肽的表現以及該重組胜肽的回收的條件下被培養。
如已經被提到的，該宿主細胞可在原核或真核系統中被選擇。特別地，鑑定促進在此一原核或真核系統中分泌的本發明的核苷酸序列是可能的。一攜帶此一序列的依據本發明的載體可因此被有利地使用於生產要被分泌的重組蛋白質。確實，這些感興趣的重組蛋白質的純化將由它們存在於細胞培養的懸浮液而不是在宿主細胞內的事實而被促進。
本發明的多肽亦可藉由化學合成而被製備。一此製備的方法亦是本發明的一目的。一熟習此技藝者知曉用於化學合成的方法，諸如固相技術(solid-phase techniques)(特別是參見Steward et al.,1984,Solid phase peptides synthesis,Pierce Chem. Company,Rockford,111,2nd ed.)或部分固相技術(partial solid-phase techniques)、藉由濃縮片段或藉由在溶液中的傳統合成。由化學合成所獲得並且能夠含有對應的非天然胺基酸的多肽亦被包含在本發明。可能由本發明的方法所獲得的抗體或者它們的衍生化合物或功能性片段亦被包含在本發明中。
依據又另一個方面，本發明是有關於一如上面所描述的抗體，其特徵在於：此外，它能夠專一性地結合至一擬人化學激素家族受體和/或能夠專一性地抑制此一受體的信號。
依據一新穎具體例，本發明是有關於一抗體或者它的衍生化合物或功能性片段，它們由一雙專一性抗體構成，雙專一性抗體的意思是它包含有一能夠與任何被牽連在腫瘤發展的受體[諸如，例如，VEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、HER2neu、HGF、cMET、FGF、四穿膜蛋白(tetraspanins)、整合素(integrins)、CXCR4(不是本發明的抗體，亦即標靶另一個表位)、CXCR7或CXCR2]交互作用的第二要素。
雙專一性或雙功能性抗體構成單株抗體的一第二世代，其中2個不同的可變區域被組合在相同的分子中(Hollinger and Bohlen,1999,Cancer and metastasis,fev. 18:411-419)。它們的利用性在與它們補充新的效應子(effector)功能或標靶在腫瘤細胞的表面上數種分子之能力有關的診斷以及治療領域這兩者中被證明；此等抗體可藉由化學方法(Glennie MJ et al.,1987,J. Immunol. 139,2367-2375;Repp R. et al.,1995,J. Hemat.,377-382)或體方法(somatic methods)(Staerz U.D. and Bevan M.J.,1986,PNAS 83,1453-1457;Suresh M.R. et al.,1986,Method Enzymol.,121:210-228)而且優先地藉由迫使異二聚體化並且因此促進所尋找的抗體的純化可能的基因工程技術(Merchand et al.,1998,Nature Biotech.,16:677-681)而被獲得。
這些雙專一性抗體可被建構有如整個IgG、雙專一性Fab’2、Fab’PEG、雙功能抗體或雙專一性scFv，而且有如一四價雙專一性抗體(其中2個結合位址針對各個被標靶的抗體而存在)(Park et al.,2000,Mol. Immunol.,37(18): 1123-30)或者如上所述者的片段。
除了提供生產與投藥一雙專一性抗體要比生產2種專一性抗體更便宜的一經濟優點外，此等雙專一性抗體的使用具有降低治療的毒性的優點。確實，一雙專一性抗體的使用使降低循環抗體的總數量以及因此可能的毒性是可能的。在本發明的一較佳具體例中，該雙專一性抗體是一種二價或四價抗體。
最後，本發明是有關於上面所描述的抗體或者它的衍生化合物或功能性片段供使用作為一藥物。本發明亦有關於一包含有一由一本發明的抗體或它的衍生化合物或功能性片段的一者所構成的化合物作為一活性成分的藥學組成物。較佳地，該抗體被補充以一賦形劑(excipient)和/或一藥學上可接受的載劑。本發明亦有關於一組成物，其特徵在於此外它包含有不是一針對CXCR4的抗體的一抗腫瘤抗體作為一供使用在一同時的、分開的或延長的方式之組合產物。依據又另一個具體例，本發明亦有關於一如上所述的藥學組成物，其包含有在能夠專一性地抑制受體[諸如IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET、VEGFR或VEGF]的酪胺酸激酶活性(tyrosine kinase activity)的化合物中所選擇的至少一第二抗癌化合物或者一熟習此技藝者所知曉的任何其他抗腫瘤化合物。
在本發明的一第二較佳方面，該第二化合物可在能夠抑制由該等受體所促進的轉移散播的增生(proliferative)和/或抗-細胞凋亡(anti-apoptotic)和/或血管生長(angiogenic)和/或誘發活性(inductive activity)的抗EGFR、抗IGF-IR、抗HER2/neu、抗MET、VEGFR、VEGF等等的經分離抗體、的或它們的功能性片段和衍生化合物中被選擇。
亦適合於提到的是抗CD20抗體[諸如一利妥昔單抗(rituximab)、替伊莫單抗(ibritumomab)或托西莫單抗(tositumomab)；抗CD33抗體[諸如吉姆單抗(gemtuzumab)或林妥珠單抗(lintuzumab)]；抗CD22抗體[諸如依帕珠單抗(epratuzumab)]；抗CD52抗體[諸如阿侖單抗(alemtuzumab)]；抗EpCAM抗體[諸如依決洛(edrecolomab)、Ch17-1A或IGN-101]；抗CTP21或16抗體[諸如Xactin]；抗DNA-Ag抗體(諸如131I-Cotara TNT-1)；抗MUC1抗體[諸如帕木單抗(pemtumomab)或R1150]；抗MUC18抗體(諸如ABX-MA1)；抗GD3抗體[諸如米妥莫單抗(mitumomab)]；抗ECA抗體[諸如CeaVac或拉貝珠(labetuzumab)]；抗CA125抗體(諸如OvaRex)；抗HLA-DR抗體[諸如阿泊珠單抗(apolizumab)]；抗CTLA4抗體(諸如MDX-010)；抗PSMA抗體(諸如MDX-070、111In & 90Y-J591、177Lu J591、J591-DM1)；抗路易士Y抗體(antiLewis Y antibody)(諸如IGN311)；抗血管生成抗體(antiangiogenesis antibody)(諸如AS1405與90YmuBC1)；抗Trai1-R1抗體(諸如TRAIL R1mAb或TRAIL R2mAb)。補充本發明的另一個具體例由一如上所描述的組成物[此外，包含有一細胞毒性(cytotoxic)/細胞生長抑制劑(cytostatic agent)作為一供同時的、分開的或延長使用的組合或綴合產物]構成。
“同時使用”意指投藥被包含在一單一劑量形式中的該組成物的2種化合物。
“分開使用”意指在相同時間投藥被包含在不同劑量形式中的該組成物的2種化合物。“延長使用”意指相繼投藥該組成物的2種化合物(各個被包含在一不同的劑量形式中)。
一般而言，依據本發明的組成物相當地增加癌症治療效用。換句話說，本發明的抗體的治療效用以一意想不到的方式藉由投藥一細胞毒性劑而被增強。由一本發明的組成物所產生的另一個主要的後續優點是有關於使用較低有效劑量的活性成份的可能性，因此使它可能避免或降低副作用(特別地細胞毒性劑的效用)的出現的風險。再者，這個組成物使它可能更快地達到預期的治療效果。
“治療性抗癌劑(therapeutic anticancer agent)”或“細胞毒性劑”意指當它被投藥給一病患時，治療或預防在一病患中癌症的發展的一物質。此等試劑的非限制性實例包括“烷化(alkylating)”劑、抗代謝物(antimetabolites)、抗腫瘤抗生素(antitumor antibiotics)、有絲分裂抑制劑(mitotic inhibitors)、染色質作用(chromatin functioning)的抑制劑、抗血管生成劑(antiangiogenics)、抗雌激素(antiestrogens)、抗雄激素(antiandrogens)以及免疫調節劑(immunomodulators)。此等試劑例如被引用在VIDAL，在標題“細胞毒性”之下專用於與腫瘤學以及血液學(hematology)有關的化合物的記載；該等參考這個文件所引用的細胞毒性化合物在此被引用作為較佳的細胞毒性劑。
“烷化劑”意指在一細胞內可共價地結合以或可烷化任何分子[優先地一核酸(例如，DNA)]的任何物質。此等烷化劑的實例包括氮芥子氣(nitrogen mustards)[諸如雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、黴法蘭(melphalan)、氫氯化物(chlorhydrate)、哌泊溴烷(pipobroman)、松龍苯芥(prednimustine)、磷酸氫二鈉(disodium phosphate)或雌莫司汀(estramustine)]；氧氮磷雜環己烷(oxazaphosphorines)[諸如環磷醯胺(cyclophosphamide)、六甲蜜胺(altretamine)、曲磷胺(trofosfamide)、sulfofosfamide或異環磷醯胺(ifosfamide)]；氮丙啶(aziridines)或乙烯-亞胺(ethylene-imines)[諸如塞替派(thiotepa)、三乙醇胺(triethyleneamine)或阿草特胺(altetramine)]；亞硝基脲(nitrosoureas)[諸如卡莫司汀(carmustine)、鏈脲黴素(streptozocine)、福莫司汀(fotemustine)或洛莫司汀(lomustine)]；烷基磺酸(alkyl sulfonates)[諸如白消安(busulfan)、曲奧舒凡(treosulfan)或英丙舒凡(improsulfan)]；三氮烯(triazenes)[諸如達卡巴仁(dacarbazine)]；或者鉑複合物(platinum complexes)[諸如順鉑(cisplatine)、奧沙利鉑(oxaliplatine)或卡鉑(carboplatine)]。
“抗代謝物”意指一藉由干擾某些活性(一般而言DNA合成)而阻斷生長和/或細胞代謝的物質。抗代謝物的實例包括甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracile)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟脫氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine)、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine,6-TG)、氯脫氧腺苷(chlorodesoxyadenosine)、5-氮雜胞苷(5-azacytidine)、吉西他濱(gemcitabine)、克拉屈濱(cladribine)、脫氧肋間型黴素(deoxycoformycin)以及噴司他丁(pentostatin)。“抗腫瘤抗生素”意指一可預防或抑制DNA、RNA和/或蛋白質合成的化合物。此等抗腫瘤抗生素的實例包括多索如必辛(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、更生黴素(dactinomycin)、光輝黴素(mithramycin)、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博萊黴素(bleomycin)以及丙卡巴肼(procarbazine)。
“有絲分裂抑制劑”預防細胞週期(cell cycle)以及有絲分裂的正常進展。一般而言，微管抑制劑(microtubule inhibitors)或“類紫杉醇(taxoids)”[諸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)以及多西紫杉醇(docetaxel)]能夠抑制有絲分裂。長春花生物鹼(vinca alkaloids)[諸如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)以及長春瑞濱(vinorelbine)]亦能夠抑制有絲分裂。
“染色質抑制劑”或“拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitors)”是抑制形成染色質的蛋白質的正常作用的物質(諸如拓樸異構酶I與II)。此等抑制劑的實例包括：對於拓樸異構酶I，喜樹鹼(camptothecine)以及它的衍生物[諸如伊立替康(irinotecan)或托泊替康(topotecan)]；對於拓樸異構酶II，依託泊苷(etoposide)、磷酸依託泊苷(etiposide phosphate)以及替尼泊苷(teniposide)。一“抗血管生成劑”是任何抑制血管生長的藥物、化合物、物質或試劑。抗血管生成劑的實例包括，沒有限制：雷佐生(razoxin)、馬力馬斯他(marimastat)、巴馬司他(batimastat)、普利司他(prinomastat)、坦諾司他(tanomastat)、伊洛馬司他(ilomastat)、CGS-27023A、溴氯哌喹酮(halofuginone)、COL-3、新伐司他(neovastat)、BMS-275291、沙利竇邁(thalidomide)、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鯊胺(squalamine)、內皮抑制素(endostatine)、SU5416、SU6668、干擾素-α(interferon-alpha)、EMD121974、介白素-12(interleukin-12)、IM862、血管阻斷素(angiostatin)以及維他辛(vitaxin)。“抗雌激素”或“雌激素拮抗物(estrogen antagonist)”意指任何降低、拮抗或抑制雌激素作用的物質。此等試劑的實例是他莫昔芬(tamoxifene)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、艾多西芬(iodoxyfene)、阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、以及依西美坦(exemestane)。
“抗雄激素”或“雄激素拮抗物(androgen antagonist)”意指任何降低、拮抗或抑制雄激素作用的物質。抗雄激素的實例包括氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、安体舒通(sprironolactone)、醋酸環妊酮(cyproterone acetate)、非那甾胺(finasteride)以及西咪替丁(cimitidine)。
免疫調節劑是刺激免疫系統的物質。免疫調節劑的實例包括干擾素(interferon)、介白素(interleukins)[諸如阿地白介素(aldesleukin)、OCT-43、地尼白介素(denileukin diftitox)或介白素-2(interleukine-2)]、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors)[諸如索纳明(tasonermine)]，或者其它類型的免疫調節劑[諸如香菇多糖(lentinan)、西佐糖(sizofiran)、羅喹美克(roquinimex)、匹多莫德(pidotimod)、培加酶(pegademase)、胸腺五肽(thymopentine)、聚I:C(poly I:C)或左旋咪唑(levamisole)組合以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)]。為了更詳細，一熟習此技藝者可參考由治療化學教師法國協會(French Association of Therapeutic Chemistry Teachers)所出版的手冊(標題為“Therapeutic chemistry,vol. 6,Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer,TEC and DOC edition,2003[法語]”)。在一特別較佳的具體例中，該作為一組合產物的本發明的化合物的特徵在於：該細胞毒性劑被化學地結合至該抗體用以同時使用。
在一特別較佳的具體例中，該組成物的特徵在於該細胞毒性/細胞生長抑制劑是在紡錘體抑制劑或安定劑(spindle inhibitors or stabilizers)[較佳地長春瑞濱(vinorelbine)和/或長春氟寧(vinflunine)和/或長春新鹼(vincristine)]中而被選擇。為了促進在該細胞毒性劑與依據本發明的抗體之間的結合，間隔分子(spacer molecules){諸如聚(炔屬烴)聚乙二醇[poly(alkylene)glycol polyethyleneglycol]或胺基酸}可被導入在該2個化合物之間俾以結合；或者，在另一個具體例中，該等已被導入能夠與該抗體反應的功能的細胞毒性劑的活性衍生物可被使用。這些結合技術是一熟習此技藝者所熟知並且將不在本說明中被更詳細的討論。
其它EGFR抑制劑包括，沒有限制：單株抗體C225與抗EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)或化合物ZD-1834、ZD-1838與ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cephalon)、氟米特(flunomide)(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD 183、805(Warner Lambert Parke Davis)、CL-387、785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GMBH/Roche)、那咪定A(Naamidine A)(Bristol-board Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck & Co)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(EGF fusion toxin)(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes Center Cancer)、WHI-P97(Parker Hughes Center Cancer)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)或者“EGFR疫苗”(York Medical/Centro of Immunologia Molecular)。本發明的另一個方面是有關於一組成物，其特徵在於：該等抗體或者它們的衍生化合物或功能性片段的至少一者被組合或綴和以一細胞毒素和/或一放射性同位素(radioisotope)。
較佳地，該毒素或該放射性同位素能夠預防腫瘤細胞的生長或增生，特別是完全地使該腫瘤細胞失活。亦較佳地，該毒素是一腸內細菌毒素(enterobacteria toxin)，特別是假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素A(exotoxin A)。
優先地與治療性抗體組合的放射性同位素是放射γ射線的放射性同位素[較佳地碘131(iodine131)、釔(yttrium90)、金199(gold199)、鈀100(palladium100)、銅67(copper67)、鉍217(bismuth217)以及銻211(antimony211)]。放射a以及β射線的放射性同位素亦可被使用在治療上。“毒性或放射性同位素組合以至少一本發明的抗體或它的一功能性片段”意指任何使結合該毒素或該放射性同位素至至少一抗體可能的方式[特別是藉由在2個化合物之間的共價結合(具有或不具有結合分子的導入)]。
容許化學的(共價的)、靜電的(electrostatic)或非共價的結合綴合的元素的全部或部分的試劑的實例包括特別地苯醌(benzoquinone)、碳二亞胺(carbodiimide)以及更特別地EDC{1-乙基-3-[3-二甲基-胺基丙基]-碳二亞胺-氫氯化物)(1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl]-carbodiimide-hydrochlo ride)}、二順丁烯二醯亞胺(dimaleimide)、二硫代二-硝基苯甲(DTNB)酸[dithiobis-nitrobenzoic(DTNB)acid]、N-琥珀醯亞胺基S乙醯硫基乙酸酯-(N-succinimidyl S-acetyl thio-acetate,SATA)、與紫外(ultraviolet,UV)射線反應的具有一或多個基團、具有一或多個疊氮苯基團(phenylaside groups)的橋接試劑(bridging agents)，最優先地N-[-4(疊氮水楊胺)丁基]-3’-(2’-嘧啶二硫)-丙醯胺[N-[-4(azidosalicylamino)butyl]-3’-(2’-pyridyldithio)-propionamide,APDP]、N琥珀醯亞胺-基3(2-嘧啶二硫)丙酸酯[N-succinimid-yl 3(2-pyridyldithio) propionate,SPDP)以及6-肼基-菸鹼醯胺(6-hydrazino-nicotinamide,HYNIC)}。特別用於放射性同位素的結合的另一個形式可由雙功能性離子螯合劑(bifunctional ion chelating agents)的使用構成。
此等螯合劑(chelators)的實例包括被發展以結合金屬(特別地放射性金屬)與免疫球蛋白的衍生自EDTA[乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)]或DTPA[二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid)]的螯合劑。因此，DTPA與它的衍生物可以有如增加配位子-金屬複合物的安定性與剛性(rigidity)此一方式藉由各種不同的基團在碳鏈上被取代(Krejcarek et al.,l977;Brechbiel et al.,1991;Gansow,1991;US patent 4,831,175)。例如，已經以它的自由形式或以一與一金屬離子的複合物的形式長時間被廣泛地使用在藥物以及生物學的DTPA(二乙烯三胺五乙酸)與它的衍生物展現出與金屬離子[可與治療或診斷感興趣的蛋白質偶合(諸如抗體)]形成安定螯合物(chelate)的傑出特徵，用以發展供癌症治療的放射-免疫綴合物(radio-immuno conjugates)(Meases et al.,1984;Gansow et al.,1990)。亦較佳地，形成該綴合物的該至少一本發明的抗體是在它的功能性片段[特別是已失去它們的Fc組份(Fc component)的片段(諸如scFv片段)]中被選擇。本發明亦包含有該組成物用於製備一意欲預防或治療癌症的藥物的用途。
本發明亦有關於依據本發明的一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段(較佳地擬人化的)和/或一組成物用於製備一用來抑制腫瘤細胞的生長的藥物的用途。一般而言，本發明是有關於一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段(較佳地擬人化的)和/或一組成物用於製備一用來癌症預防或治療的藥物的用途。
可被預防和/或治療的較佳癌症包括前列腺癌(prostate cancer)、骨肉瘤(osteosarcoma)、肺癌(lung cancer)、乳癌(breast cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、結腸癌(colon cancer)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、卵巢癌(ovarian cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)或者任何其他的癌症。本發明亦關於如上所述的一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段和/或一組成物用於製備一用來在一細胞中調控CXCR4活性的藥物的用途。本發明的另一個方面是有關於該所描述的抗體在一診斷與CXCR4表現位準有關的疾病的方法(較佳地活體外)中的用途。較佳地，在該診斷方法中的該CXCR4蛋白質相關疾病是癌症。
因此，本發明的抗體或它們的衍生化合物或功能性片段可被採用在一用於在一生物樣品中活體外偵測和/或定量CXCR4蛋白質[特別是診斷與這個蛋白質的一異常表現有關的疾病(諸如癌症)]的方法中，其中該方法包含有下列步驟：a)　令該生物樣品與一依據本發明的抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段接觸；b)　證明可能形成的抗原-抗體複合物。因此，本發明亦包含有用於實施一如所述的方法的套組或附件，其包含有下列要素：a)　一本發明的多株或單株抗體；b)　另擇地，用於構成有利於免疫反應的介質(medium)的試劑；c)　另擇地，揭示由免疫反應所產生的抗原-抗體複合物的試劑。
一般而言，本發明是有關於一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段[包含有一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID Nos. 4、5以及6的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)的重鏈；以及一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID Nos. 7、8、9的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)的輕鏈]用於活體外診斷一與CXCR4的表現有關的致癌疾患(oncogenic disorder)或活體外測定用於發展一與CXCR4的表現有關的致癌疾患的預後(prognosis)的用途。關於這個方面，本發明特別針對依據本發明的擬人化抗體重鏈和/或一擬人化抗體輕鏈和/或一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段用於活體外診斷一與CXCR4的表現有關的致癌疾患或活體外測定用於發展一與CXCR4的表現有關的致癌疾患的預後的用途。在另一個方面，本發明是針對一種活體外偵測在一個體中一CXCR4表現腫瘤的存在和/或位置的方法，其中該方法包含有下列步驟：(a)令來自該個體的一樣品與一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段[包含有一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID Nos. 4、5以及6的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)的重鏈；以及一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID Nos. 7、8、9的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)的輕鏈]接觸，以及(b)偵測該抗體與該樣品的結合。
較佳地，本發明針對一種活體外偵測在一個體中一CXCR4表現腫瘤的存在和/或位置的方法，其中該方法包含有下列步驟：a)　令一來自該個體的樣品與依據本發明的一擬人化抗體重鏈和/或一擬人化抗體輕鏈和/或一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段接觸；以及b)　偵測該抗體與該樣品的結合。作為一非限制性實例，此偵測可藉由FACS或熟習此技藝者所知曉的任何其他技術而被做出。在另一個方面，本發明針對一種活體外測定在一來自一個體的CXCR4表現腫瘤中的CXCR4表現位準的方法，其中該方法包含有下列步驟：(a’)令一來自該個體的樣品與一包含有一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段[含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID Nos. 4、5以及6的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)的重鏈；以及一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID Nos. 7、8以及9的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)的輕鏈]接觸，以及(b’)定量在該樣品中結合至CXCR4的抗體的位準。
較佳地，本發明針對一種活體外測定在一來自一個體的CXCR4表現腫瘤中的CXCR4表現位準的方法，其中該方法包含有下列步驟：(a’)令一來自該個體的樣品與依據本發明的一擬人化抗體重鏈和/或一擬人化抗體輕鏈和/或一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段接觸；以及(b’)定量在該樣品中結合至CXCR4的抗體的位準。在一較佳具體例中，該CXCR4表現位準是藉由免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)而被測量。
在另一個方面，本發明是有關於一種活體外診斷一CXCR4表現腫瘤或活體外測定用於在一個體中發展一CXCR4表現腫瘤的預後之方法，其中該方法包含有下列步驟：(i)依據本發明(特別地涉及本發明的擬人化抗體)測定CXCR4的表現位準；以及(ii)比較步驟(i)的表現位準與一來自正常組織的CXCR4的參考表現位準。在另一個方面，本發明是有關於一種活體外測定一個體的一腫瘤的CXCR4狀態的方法，其中該方法包含有下列步驟：(1)依據本發明(特別地涉及本發明的擬人化抗體)測定CXCR4的表現位準，與(2)評分該腫瘤的CXCR4表現位準，以及(3)比較該評分與從一對照樣品所獲得者。在另一個方面，本發明是有關於一種測定一致癌疾患是否易感(susceptible)於以一抗-CXCR4抗體或者它的一片段或衍生物治療的方法，其中該方法包含有下列步驟：(a)依據本發明活體外測定一個體的一腫瘤的CXCR4狀態；以及(b)若該狀態是CXCR4(+)，測定該致癌疾患易感於以一抗-CXCR4抗體或者它的一片段或衍生物治療。
在另一個方面，本發明是有關於一種用於篩選和/或鑑定作為CXCR4拮抗物抗腫瘤劑的分子之方法，其包含有下列步驟：a)選擇表現CXCR4的細胞，b)培育該等細胞與一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段[包含有一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ IDNos. 4、5以及6的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)的重鏈；以及一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID No.7、8、9的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)的輕鏈，與c)　評估被測試的分子它們在該抗體或者它的功能性片段或衍生物的一者與CXCR4之間的結合的可能抑制，以及d)　選擇有該抑制能力的分子。在這個方面，本發明特別地有關於一種用於篩選和/或鑑定作為CXCR4拮抗物抗腫瘤劑的分子之方法，其包含有下列步驟：a)　選擇表現CXCR4的細胞，b)　培育該等細胞與依據本發明的一擬人化抗體重鏈和/或一擬人化抗體輕鏈和/或一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段，與c)　評估測試分子它們在該抗體或者它的功能性片段或衍生物的一者與CXCR4之間的結合的可能抑制，以及d)　選擇有該抑制能力的分子。在另一個方面，本發明是有關於一種包含有至少一抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段[包含有一含有下列3個CDR(分別地序列SEQ ID Nos. 4、5以及6的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)的重鏈；以及一含有下列3個CDR(分別地具有序列SEQ ID Nos. 7、8、9的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)的輕鏈]的套組，該抗體較佳地被標定。
在這個方面，本發明特別地有關於一種包含有依據本發明的至少一擬人化抗體重鏈和/或一擬人化抗體輕鏈和/或一擬人化抗體或者它的一衍生化合物或功能性片段的套組，該抗體較佳地被標定。
在另一個方面，本發明是有關於一依據本發明用於活體外測定一腫瘤的CXCR4狀態的套組，該套組進一步包含有：i)　一用於偵測在該抗-CXCR4抗體與CXCR4之間的結合程度的試劑；以及ii)　用於評分CXCR4表現位準的正以及負對照樣品。有利地，它的抗體或功能性片段可被固定化在一支撐物(support)[特別是一蛋白質晶片(protein chip)]上。一此蛋白質晶片是一本發明的標的。
有利地，該生物晶片可被使用在該等用於偵測和/或定量在一生物樣品中的CXCR4蛋白質所需的套組或附件。必須被陳述的是：術語“生物樣品”在此是有關於取自一活生物的樣品[特別是取自一哺乳動物(特別是人類)的血液、組織、器官或其它樣品]或者任何可能含有一此CXCR4蛋白質的樣品[諸如一細胞(若需要，被轉形的)的樣品]。為了獲得一可偵測的和/或可定量的信號，該抗體或它的一功能性片段可以呈一免疫綴合物(immunoconjugate)或一經標定的抗體的形式。
本發明的經標定的抗體或它們的功能物或片段包括，例如，抗體綴合物(免疫綴合物)，它們可例如以酵素[諸如過氧化酶(peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、α-D-半乳糖苷酶(α-D-galactosidase)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、葡萄糖澱粉酶(glucose amylase)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase)、乙醯-膽鹼酯酶(acetyl-cholinesterase)、溶菌酶(lysozyme)、蘋果酸去氫酶(malate dehydrogenase)或葡萄糖-6磷酸去氫酶(glucose-6 phosphate dehydrogenase)]或者藉由一分子[諸如生物素(biotin)、長葉毛地黃配質(digoxigenin)或5-溴-去氧尿苷(5-bromo-desoxyuridine)]而被組合。螢光標記(Fluorescent labels)[特別是包括螢光黃(fluorescein)與它的衍生物、螢光染料(fluorochrome)、玫紅(rhodamine)與它的衍生物、綠螢光蛋白質(green fluorescent protein,GFP)、丹磺醯(dansyl)、繖形酮(umbelliferone)等等]亦可被組合以本發明的抗體或它們的功能性片段。在此等綴合物中，本發明的抗體或它們的功能性片段可藉由一熟習此技藝者知曉的方法而被製備。它們可直接地被結合以酵素或螢光標記；經由一間隔基團(spacer group)或一連接基團(linkage group)[諸如聚醛(polyaldehyde)、戊二醛(glutaraldehyde)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid,DPTA)；或者在結合劑(諸如上面關於治療性綴合物所提到的那些)的存在下。攜帶螢光黃標記的綴合物可藉由與一異硫氰酸酯(isothiocyanate)反應而被製備。
其它綴合物亦可包括化學發光標記(chemiluminescent labels)[諸如魯米那(luminal)與二氧烷(dioxetane)]、生物發光標記(bioluminescent labels)[諸如螢光素酶(luciferase)與螢光素(luciferin)]、或者放射性標記(radioactive labels)[諸如碘123(iodine123)、碘125(iodine125)、碘126(iodine126)、碘133(iodine133)、溴77(bromine77)、鎝99m(technetium99m)、銦111(indium111)、銦113m(indium113m)、鎵67(gallium67)、鎵68(gallium68)、釕95(ruthenium95)、釕97(ruthenium97)、釕103(ruthenium103)、釕105(ruthenium105)、汞107(mercury107)、汞203(mercury203)、錸99m(rhenium99m)、錸101(rhenium101)、錸105(rhenium105)、鈧47(scandium47)、碲121m(tellurium121m)、碲122m(tellurium122m)、碲125m(tellurium125m)、銩165(thulium165)、銩167(thulium167)、銩168(thulium168)、氟18(fluorine18)、釔18(yttrium199)以及碘131(iodine131)。一熟習此技藝者所知曉用於結合放射性同位素與抗體[直接地或經由一螯合劑(諸如上面所提到的EDTA或DTPA)]的現存方法可被使用於有如診斷的放射性同位素。因此應該被提到藉由氯胺(chloramines)-T技術以[I125]Na標定[Hunter W.M. and Greenwood F.C.(1962) Nature 194:495]；如由Crockford等人(美國專利案4,424,200)所描述的以鎝99m(technetium99m)標定或者如由Hnatowich(美國專利案4,479,930)所描述的經由DTPA而被結合。
本發明的抗體作為生物標記的用途亦被揭示。該等方法可被使用於偵測或診斷與CXCR4的表現有關的各種不同的過度增生的致癌疾患(hyperproliferative oncogenic disorders)[被例示為，但不限於乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、皮膚癌、食道癌(oesophageal cancer)、肺癌、頭頸癌(head and neck cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、結腸直腸癌(colorectal cancerr)、骨肉瘤、神經胚細胞瘤(neuroblastoma)、急性淋巴胚細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia)、急性骨髓白血病(Acute myeloid leukemia)、慢性骨髓白血病(chronic myeloid leukemia)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、淋巴瘤(lymphomas)、腎臟癌(renal cancer)、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)、甲狀腺癌(thyroid cancer)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)或者任何與CXCR4的表現有關的其他癌症。如由一熟習此技藝者所確認的，與一特別疾患(disorder)有關的抗體表現的位準將視預先存在的病況的性質和/或嚴重性而變化。
以一熟習此技藝者所知曉的任何傳統方式[例如，局部的(topical)、非經腸道的(parenteral)、肌肉內的(intramuscular)等等]投藥本發明的抗體將提供一非常有用的方法偵測在一樣品中的發育不良細胞(dysplastic cells)以及容許一臨床醫師監測一經歷用於一與CXCR4的表現有關或由CXCR4的表現調節的高度增生疾患的治療之病患的治療攝生法。在另一個方面，本發明是有關於一用於活體內成像一與CXCR4的表現有關的致癌疾患的藥學組成物，其包含有被標定並且活體內結合CXCR4的上述單株抗體或它的片段；以及一藥學上可接受的載劑。
本發明的抗體或者它的一功能性片段或衍生物將發現在各種不同的醫學或研究目的的用途，包括偵測、診斷以及分期與CXCR4有關的各種不同的病理學(pathologies)。病期(Stage)決定具有可能的預後價值並且提供用於設計最佳治療的準則[Simpson et al. J. Clin. Oncology 18:2059(2000)]。一般而言，例如乳癌的病理學分期(pathological staging)比臨床分期更好，因為前者提供一更準確的預後。然而，臨床分期會是較佳的，若它如病理學分期一樣的準確，因為它不是視一用於獲得供病理學評估的組織侵入性操作程序而定。
當與適合的標記或其他適當的可偵測的生物分子或化學品被使用時，本發明的抗體特別地對活體外以及活體內診斷和預後應用有用的。供使用在免疫分析中的標記一般而言是那些熟習此技藝者所知曉的並且包括酵素、放射性同位素以及螢光(fluorescent)、冷光(luminescent)和發色物質(chromogenic substances)[包括有色粒子，諸如膠體金(colloidal gold)或乳膠珠粒(latex beads)]。適合的免疫分析包括酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)。各種不同類型的標記以及綴合該等標記至本發明的抗體的方法是那些熟習此技藝者所熟知的(諸如下列所提出者)。
如此處所用的，術語"一與CXCR4的表現有關的致癌疾患”被意欲包括在一蒙受該疾患的個體中存在高位準或異常低位準的CXCR4(異常)已被顯示是或被懷疑是造成該疾患的病理生理學的原因或一促成該疾患的一惡化的因素之疾病(diseases)以及其他疾患。另擇地，此等疾患可例如藉由一在一蒙受此疾患的個體的感染細胞或組織的細胞表面上的CXCR4位準的增加而被證明。該在CXCR4位準的增加可例如使用本發明的抗體515H7或hz515H7而被偵測。再者，它意指相對地展現出自主生長的細胞，藉此它們展現出一異常的生長表型(phenotype)(特徵在於一顯著喪失控制的細胞增生)。另擇地，該等細胞可表現正常位準的CXCR4但由異常的增生所標記。
在某些具體例中，“增佳的表現”(如有關於CXCR4)意指相較於一對照證明一在表現(如藉由RNA表現或蛋白質表現而被測量)上統計學顯著增加的蛋白質或基因表現位準。更特別地，被認為的是：如所描述的依據本發明的一抗體或者它的一功能性片段或衍生物用於活體外診斷一與CXCR4的表現有關的致癌疾患或者活體外測定用於發展一與CXCR4的表現有關的致癌疾患的預後的用途。依據本發明的另一個廣泛方面是關於一種診斷在一個體中的病理學的過度增生性致癌疾患或者一對於一與CXCR4的表現有關的病理學病況的易感性之方法，其包含有測定在一樣品中含有CXCR4的細胞(CXCR4 bearing cells)的存在或缺乏，以及根據該含有CXCR4的細胞的存在或缺乏診斷一病理學病況或對一病理學病況的易感性。本發明的抗體的診斷用途包含有原發腫瘤(primary tumors)、癌轉移(cancers metastases)、癌幹細胞(cancer stem cells)。為了獲得一可偵測的和/或可定量的信號，該抗體可以一免疫綴合物或一經標定的抗體的形式存在。更特別地，一依據本發明的較佳標的是一種活體外偵測在一個體中一CXCR4表現腫瘤的存在和/或位置的方法，其中該方法包含有下列步驟：(a)令一來自該個體的樣品與依據本發明的一抗體或者它的一功能性片段或衍生物接觸，以及(b)偵測該抗體與該樣品的結合。該標的的另一個方面是在臨床試驗的期間監督CXCR4表現作為對一CXCR4標靶的治療之反應，以及更佳地當CXCR4受體的向下調節或降解是該被測試的化合物的作用機制的組成之一時。
如熟習此技藝者所顯而易見的，本發明的抗體的結合之偵測可藉由各種不同的分析而被展現。雖然任何進行分析的手段適合於本發明，可被提到的是例如FACS、ELISA或IHC。
如此處所用的，術語"樣品"被意欲意指任何包括或可能地包括一新生細胞(neoplastic cell)的生物流體(biological fluid)、細胞、組織、器官或它們的部分，諸如一來自結腸、胃的(gastric)、直腸(rectum)、乳房(breast)、卵巢(ovary)、前列腺(prostate)、腎臟(kidney)、肺(lung)、血液(blood)、腦(brain)、皮膚(skin)、甲狀腺(thyroid)、淋巴結(lymph node)、骨髓(bone marrow)的細胞或者含有或被懷疑含有一新生細胞的其它器官或組織。該術語包括存在於一個體的樣品以及獲得或衍生自該個體的樣品。例如，一樣品可以是由活組織檢驗(biopsy)所獲得的一檢體(specimen)的一組織切片或者被放置在或適應於組織培養的細胞。一樣品進一步可以是一次細胞分離部分(subcellular fraction)或萃取物，或者一粗糙的或實質上純的核酸分子或蛋白質製備物。臨床樣品被意欲包含有從一個體所獲得並且在本發明的操作程序(諸如例如，一測定或偵測CXCR4表現位準的診斷或監測試驗)有用的各種不同的樣品類型。該定義包含有由外科移除所獲得的固體組織樣品、一病理學檢體、一存檔樣品或者一活組織檢驗檢體、組織培養物或從那裡所衍生的細胞與它們的後代，以及從任何那些來源所製備的切片或污跡(smears)。非限制性實例是從結腸、胃的、直腸、乳房、卵巢、前列腺、腎臟、肺、血液、腦、皮膚、甲狀腺、淋巴結、骨髓等等所獲得的樣品。該定義亦包含有生物來源的液體樣品，並且可意指在此所懸浮的細胞或細胞片段或者液體介質以及它的溶質。依據本發明的另一個方面是有關於一種活體外測定在一來自一個體的CXCR4表現腫瘤中的CXCR4的表現位準之方法，其中該方法包含有下列步驟：(a’)令一來自該個體的樣品與依據本發明的一抗體或者它的一功能性片段或衍生物接觸，以及(b’)定量在該樣品中結合至CXCR4的抗體的位準。
如熟習此技藝者所顯而易見的，結合至CXCR4的抗體的位準可以許多方式(諸如藉由各種不同的分析)而被定量。雖然任何用於進行該分析的手段適合於本發明，一較佳的方法藉由免疫螢光法(immunofluorescence)、免疫組織化學或放射免疫分析(radio-immunoassay,RIA)技術或者等效物發揮依據ELISA技術的免疫酵素方法。較佳地，該生物樣品較佳地由一生物流體[諸如血清、全血]、細胞、一組織樣品或生物來源的生物檢體所形成。該樣品可例如包括活組織檢驗的組織，它可被便利地分析一與CXCR4的表現有關的病理學過度增生致癌疾患的存在。一旦存在於該測試樣品中的CXCR4的數量的一測定被做出，結果可與對照樣品(以一類似於該等測試樣品的方式而被獲得但是來自不具有或存在以一與CXCR4的表現有關的病理學過度增生致癌疾患的個體)的那些相比較。若該CXCR4的位準在該測試樣品中被顯著地提高，可斷定有被推斷具有或發展該疾患的個體的一增加的可能性。本發明更特別地有關於一種活體外診斷一CXCR4表現腫瘤或活體外測定用於在一個體中發展一CXCR4表現腫瘤的預後之方法，其中該方法包含有下列步驟：(i)測定如上所述的CXCR4的表現位準，以及(ii)比較步驟(i)的表現位準與一來自正常組織或一無表現CXCR4組織的CXCR4的參考表現位準。如在本申請案所使用的“診斷”一疾病被意欲包括，例如，診斷或偵測一與CXCR4的表現有關或由CXCR4的表現調節的病理學過度增生致癌疾患的存在、監控該疾病的進展以及鑑定或偵測指示一與CXCR4的表現有關的疾患的細胞或樣品。
如在本申請案所使用的“預後”意指從一疾病恢復的可能性或預測一疾病的可能發展或結果。例如，若一來自一個體的樣品對以本發明的抗體染色是陽性的，那麼對那個個體的“預後”要比若該樣品對CXCR4染色是陰性的更佳。如在下面被更詳述的，樣品可在一適當的規模中被評分CXCR4表現位準。然而，本發明的另一個方面亦有關於監測CXCR4表現用於誘發一CXCR4的降解作為它們的作用機制的一者的治療性化合物。在那個例子中，追蹤在細胞膜上的CXCR4表現可以是一關鍵工具俾以評估在臨床試驗的期間的治療以及“個人化(personalized)”治療的效力。CXCR4的表現位準被有利地與在一對照細胞或樣品的位準[亦被意指為一“參考位準(reference level)”或“參考表現位準(reference expression level)”]比較或測量。“參考位準”、“參考表現位準”、“對照位準(control level)”以及“對照(control)”在本說明書中可被交換地使用。廣泛地說，一“對照位準”意指在一可比較的對照細胞(一般而言沒有疾病或癌症)中的一分開的基線位準(baseline level)。它可來自相同的個體或來自另一個正常或沒有存在相同疾病(染病或測試樣品被獲得)的個體。在本發明的上下文中，術語“參考位準”意指一被使用以評估在一病患的一含有癌細胞的樣品中的一CXCR4表現的測試位準之“對照位準”。例如，當在一病患的生物樣品中的CXCR4的位準是高於CXCR4的參考位準，該等細胞被認為具有CXCR4的一高位準表現或過度表現。參考位準可藉由複數種方法而被測定。表現位準可因此定義含有CXCR4的細胞或另擇地CXCR4的表現位準而不依賴表現CXCR4的細胞的數目。因此，關於各個病患的參考位準可藉由一CXCR4的參考比率而被禁止，其中該參考比率可藉由任何在此所描述的測定參考位準的方法而被測定。
例如，對照可以是一預決定值，它可採取各種不同的形式。它可以是一單一截止值(cut-off value)(諸如一中位數或平均數)。“參考位準”可以是一單一數目(同樣地個別地適用於每位病患)，或者參考位準可以依據病患的特別次族群而變化。因此，例如，對於相同的癌症，老人要比較年少者具有一不同的參考位準，並且對於相同的癌症，女人要比男人具有一不同的參考位準。另擇地，“參考位準”可藉由測量在來自如具有要被測試的新生細胞的組織的相同組織之非致癌性癌細胞中的CXCR4的表現位準。並且，“參考位準”可以是一在一病患的新生細胞的CXCR4相對於在相同病患的非腫瘤細胞中的CXCR4之特定比率。“參考位準”亦可以是一活體外經培養的細胞[其可被操作以模擬腫瘤細胞或可以產生表現位準的任何其他方式(準確地測量參考位準)而被操作]的CXCR4位準。另一方面，“參考位準”可根據比較組(諸如在不具有被提高的CXCR4位準的組以及具有被提高的CXCR4位準的組)而被建立。比較組的另一個實例是具有一特別疾病、病況或症狀的組以及無疾病的組。預決定值可被安排，例如，一測試族群被相等地(或不相等地)分組，諸如一低風險組、一中風險組以及一高風險組或者被分成四等份或五等份，最低的四分之一或五分之一是具有最低風險或最高數量的CXCR4以及最高的四分之一或五分之一是具有最高風險或最低數量的CXCR4。參考位準亦可藉由比較在具有相同癌症的病患族群中的CXCR4位準。這可以藉由直方圖分析(histogram analysis)而被完成，其中一全群的病患被圖表地呈現，其中一第一軸代表CXCR4的位準，以及一第二軸代表在腫瘤細胞表現一特定位準的CXCR4的群中的病患的數目。病患的2或多個分開的組可藉由鑑定具有相同或相似位準的CXCR4的群的次集族群而被測定。參考位準的測定可接著根據一最佳區別這些分開的組的位準而被做出。一參考位準亦可代表2或多種標記(其中一者是CXCR4)的位準。2或多種標記可例如由一關於各個標記的位準的數值的比率而被表示。同樣地，一顯然健康的族群要比具有一被知曉具有一與CXCR4的表現有關的狀況之族群具有一不同的‘正常’範圍。因此，被選擇的預決定值可考慮到一個體所屬的種類。適當的範圍以及種類可由那些熟習此技藝者只有以例行實驗而被選擇。關於“被提高的(elevated)”“被增加的”，它意指相對於一被選擇的對照是高的。典型地，對照是根據在一適當的年齡層中顯然健康正常的個體。
亦被瞭解的是：除了預決定的數值，依據本發明的對照可以是與實驗材料平行的被測試的材料的樣品。實例包括在相同時間從相同個體所獲得的組織或細胞，例如一單一生物檢體的部分或者一來自該個體的單一細胞樣品的部分。
在臨床診斷或監控具有一CXCR4調節的疾病的病患中，偵測CXCR4表現細胞或者一在CXCR4位準的增加(相對於在一來自一正常個體或非癌性組織的對應生物樣品中的位準)一般而言指示一具有或被懷疑存在以一CXCR4調節的疾患的個體。依據上述，本發明提供一種用於預測對癌症易感性的方法，其包含有偵測在一組織樣品中的CXCR4的表現位準，它的存在指示對癌症的易感性，其中CXCR4表現的程度與易感性的程度相關聯。因此，在特別具體例中，CXCR4在例如乳房組織、卵巢組織、前列腺組織、胰臟組織、皮膚組織、時到組織、肺組織、頭與頸組織、膀胱組織、結腸直腸組織、骨肉瘤組織、神經胚細胞瘤組織、急性淋巴胚細胞性白血病細胞、急性骨髓白血病細胞、慢性骨髓白血病細胞、慢性淋巴球性白血病細胞、多發性骨髓瘤細胞、淋巴瘤細胞、腎臟組織、神經膠母細胞瘤組織、甲狀腺癌組織、橫紋肌肉瘤組織或者任何被懷疑具有表現CXCR4的細胞之其他組織中的表現可被檢查，在樣品中具有CXCR4的存在提供癌症易感性或一組織專一性腫瘤的出現或存在的一指示。
一種用於評估腫瘤侵犯(tumor aggressiveness)的方法亦被提供。在一具體例中，一種用以觀察隨著時間在一個體中一惡性的進展之方法，其包含有測定由在一腫瘤樣品中的細胞所表現的CXCR4的位準，比較因此所測定的位準與被表現在一不同時間取自相同個體的相等組織樣品中的CXCR4位準，其中隨著時間在該腫瘤樣品中CXCR4表現的程度提供在癌症進展上的資訊。
在又另一個具體例中，本申請案提供用於測定關於一個體的適當治療規程的方法。
依據本發明，在CXCR4位準的存在或缺乏或變化可以是指示該個體可能具有與CXCR4有關的一復發或一進展或一持續性的癌症。因此，藉由測量一在表現CXCR4的細胞的數目上的增加或者在存在於各種不同的組織或細胞中的CXCR4濃度的改變，可能測定一針對改善一與CXCR4有關的惡性之特別的治療攝生法是否有效。
本發明的另一個標的是一種成像一與CXCR4的表現有關的致癌疾患之活體內方法。例如，此一方法可被使用在一存在一致癌疾患的症狀的病患中。若該病患具有例如被增加的CXCR4的表現位準，那麼該病患可能蒙受一癌性疾患。並且，該方法對於在已事先被診斷以一CXCR4調節的癌症的病患中監控進展和/或對治療的反應是有用的。依據上面的目標，本發明提供一包含有一依據本發明的抗體或它的衍生物(較佳地經標定的，特別地放射性標定的)的活體內成像劑(imaging reagent)，以及它在醫學成像上的用途。因此，一依據本發明的一般方法藉由投藥給一病患一成像有效數量的一成像劑(諸如上面所描述的被標定的單株抗體)以及一藥學上有效的載劑，並且接著在它已結合至存在於樣品中的CXCR4之後偵測該試劑而運作。在某些具體例中，該方法藉由投藥一成像有效數量的一成像劑(包含有一標靶部分以及一活性部分)而運作。該成像劑以一對在一哺乳動物(諸如一人類)的診斷使用有效的劑量而被投藥，並且該成像劑的定位以及累積接著被偵測。該成像劑的定位以及累積可藉由放射核酸化物(radionucleide)成像、放射性閃爍攝影術(radioscintigraphy)、核磁共振成像(nuclear magnetic resonance imaging)、電腦斷層掃描(computed tomography)、正電子發射斷層攝影術(positron emission tomography)、電腦軸向斷層掃描(computerized axial tomography)、X-射線(X-ray)或磁共振成像方法(magnetic resonance imaging method)、螢光偵測(fluorescence detection)以及化學發光偵測(chemiluminescent detection)而被偵測。
關於標靶抗腫瘤治療的發展，以免疫組織技術的診斷提供在受體表現位準上的原位資訊(in situ information)，並且因此能夠選擇在需要此一治療的受體的表現位準之後易感於要被治療的病患。關於使用單株抗體的免疫治療，如以曲妥珠單抗(trastuzumab)治療，對治療的反應視被標靶的受體的表現位準而定，其中測定在乳癌(breast carcinoma)的Her2過度表現是現在出現擬人化抗-Her2單株抗體曲妥珠單抗的主要臨床重要性。Her2過度表現的證明是一以曲妥珠單抗治療的前提，因為它藉由專一性地標靶Her2過度表現癌細胞而作用。關於Her2的精確測試旨在確保昂貴以及潛在毒性的曲妥珠單抗治療沒有提供給具有非過度表現腫瘤的病患並且每位可得益於曲妥珠單抗的病患接受適當的治療。關於過度表現Her2的病患選擇的以曲妥珠單抗的教示顯示當使用一以單株抗體的治療時測定受體的表現位準以及在相同時間除了一治療性單株抗體外發展一可被使用於病患選擇的單株抗體的優點。
結果，本發明是有關於一種活體內測定一個體的一腫瘤的CXCR4狀態的方法，其中該方法包含有下列步驟：(1)測定如上所描述的CXCR4的表現位準，(2)評分該腫瘤的CXCR4表現位準，以及(3)比較該評分與從一對照樣品所獲得者。
在本發明的意思中，“CXCR4狀態”是有關於根據如藉由任何方法[諸如免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)、螢光原位雜合(fluorescence in situ hybridization,FISH)、染色體原位雜合(chromosome in situ hybridization,CISH)、基因晶片(gene chip)或由熟習此技藝者所知曉的其他方法]所測量的CXCR4基因的表現位準的測定，分類腫瘤至一CXCR4陽性[CXCR4(+)]CXCR4陰性[CXCR4(-)]種類。
在一較佳具體例中，當組織樣品被福馬林固定(formalin fixed)、被Glyco-fixx固定、石蠟包埋(paraffin embedded)和/或冷凍時，用於診斷的抗體必須能夠結合被標靶的受體。
更特別地，CXCR4表現位準藉由免疫組織化學(IHC)而被測量。
作為一實例，樣品可被評分CXCR4表現位準在一自0-3+的等級用於抗體染色的位準，其中0是陰性以及1+-3+代表在增加強度的4個半定量步驟中的陽性染色。分數1+-3+可被記錄為陽性，因為當相較於分數0(陰性)，各個正分可能是與關於復發和致命疾病的顯著降低風險有關，但是在正分之中增加的強度可提供額外的風險降低。任何傳統的危害分析方法(hazard analysis method)可被使用以評估CXCR4的預後數值。代表性的分析方法包括柯斯回歸分析(Cox regression analysis)，它是一種用於在被檢查的例子的存在下模型化存活或時間對事件(time-to-event)數據的半參數方法(Hosmer and Lemeshow,1999;Cox,1972)。不同於其他存活分析[例如，生命表(Life Tables)或卡本-麥爾(Kaplan-Meyer)]，柯斯容許包括預測變(predictor variables)[共變數(covariates)]在模型中。使用一傳統分析方法(例如柯斯者)可能能夠測試關於在一原發腫瘤至疾病復發(沒有疾病的存活時間或者轉移性疾病的時間)的時間開始或者從疾病死亡的時間(總存活時間)的CXCR4表現狀態的相關性的假說。柯斯迴歸分析亦被知曉為柯斯比例危害分析(Cox proportional hazard analysis)。這個方法被標準化用於測試一在病患存活時間的腫瘤標記的預後數值。當被使用在多變量模型(multivariate mode)，數種共變數的效用被平行測試，藉此具有獨立預後數值的個別共變數可被鑑定(亦即，最有用的標記)。術語腫瘤的陽性或陰性“CXCR4狀態”[亦被意指為CXCR4(+)或CXCR4(-)]分別意指分數0或分數1+-3+。
在診斷或監控乳癌的期間，一樣品可被“評分”。在它最簡單的形式中，評分可以是絕對正或負的，如藉由由免疫組織化學的視覺檢查樣品而被判斷。更定量的評分涉及判斷2個參數[染色的強度以及被染色的(“陽性”)經取樣的細胞的比例]。根據這2個參數，數目可被分配反應陽性染色的增加位準。Allred等人(Allred,Harvey et al. 1998)已描述一種達成這個的方式，該方式涉及評分這兩個參數在一自0(陰性)至3+的等級，以及總結個別參數的分數至一總分數。這個導致一具有0、2、3、4、5、6、7或8的可能分數的等級。(注意在Allred的等級中一為1的分數是不可能的)。一有點簡單的評分方法合併核染色的強度與展現被染色的核的細胞的比例成為一自0至3+的組合等級。評分方法可被應用至評分在細胞核中被活化的Stat5的染色的強度和比例。被使用在本說明的術語陽性或陰性“CXCR4狀態”意指分別對應於在簡化的等級中的分數0或1+-3+的CXCR4的表現位準。
一般而言，依據本發明的一測試或分析的結果可以任何各種不同的格式呈現。結果可以一定性形式被呈現。例如，測試報告可僅指出一特別的多肽是否被偵測，或者亦具有一偵測極限的指示。結果可以一半定量的形式被呈現。例如，各種不同的範圍可被定義，並且該等範圍可被分配為一提供一某些程度的定量資訊的分數(例如，1+至3+)。此一分數可反應各種不同的因子，例如，CXCR4被偵測的細胞的數目、信號的強度(可指示CXCR4的表現位準或含有CXCR4的細胞)等等。結果可以一定量形式而被呈現，例如有如一多肽(CXCR4)被偵測到的細胞的百分比、有如一蛋白質濃度等等。如由一熟習此技藝者所意識到的，由一測試所提供的輸出的類型將視該測試的科技限制以及與多肽的偵測有關的生物顯著性而定。例如，在某些多肽的例子中，一純定性的輸出(例如，多肽是否以一特定偵測位準而被偵測到)提供有意義的資訊。在其他例子中，一更定量的輸出(例如，在要被測試的樣品中的多肽表現位準對正常位準的一比值)是必須的。
在一更佳具體例中，根據一反應產物的強度的評估以及陽性細胞的百分比，CXCR4表現位準的評分從0至3+而被分級。為了更清楚，在下面的表5概述這些參數。僅侵入性腫瘤的完整周圍膜反應性(circumferential membranous reactivity)應被考慮並且通常類似一“雞網(chicken wire)”外貌。在目前的指導方針下，被評分作為CXCR4 IHC的界線(2+或更多的分數)的樣品必須被認為是CXCR4(+)並且必須經歷進一步的評估。IHC分析應該被拒絕，並且由FISCH或若作為非限制性實例的任何其他方法所報導或測試的，對照不是如所預期的，人工製品涉及大部分的樣品並且樣品具有正常乳管(breast ducts)(內部對照)的強的膜陽性暗示過多的抗原恢復。
在依據本發明的方法的一更佳具體例中，該評分包含有使用一依據2個參數(染色強度以及陽性細胞的百分比)的適當等級。在一較佳具體例中，依據本發明的方法意指一適當的等級是一為0至3+的等級，其中無腫瘤細胞的膜反應性被評分為0，並且在超過10%的腫瘤細胞中強的完全反應性被評分為3+。如上面所描述的更詳細的，該適當的等級是一為0至3+的等級，其中無腫瘤細胞的膜反應性被評分為0；在超過10%的腫瘤細胞中微弱可察覺的膜反應性被評分為1+；在超過10%的腫瘤細胞中弱至中等的完全膜反應性被評分為2+；以及在超過10%的腫瘤細胞中強的完全反應性被評分為3+。
在本發明的一特別方面，一腫瘤是具有一為2+的分數的CXCR4(+)。在本發明的一特別方面，一腫瘤是具有一為3+的分數的CXCR4(+)。在本發明的另一個特別方面，一腫瘤是具有一為2+或3+的分數的CXCR4(+)。依據本發明，亦描述一種測定一致癌疾患是否易感於以一抗-CXCR4抗體或它的一片段或衍生物的治療的方法，其中該方法包含有下列步驟：(a)活體外測定一如上所描述的個體的一腫瘤的CXCR4狀態，以及(b)若該狀態是CXCR4(+)，測定該致癌疾患是易感於以一抗-CXCR4抗體或它的一片段或衍生物的治療。在本發明的另一個方面，被認為的是一對此一診斷或預後方法有用的套組，該套組包含有本發明的抗體。為方便起見，呈決定數量的試劑與用於執行診斷分析的指示的一包裝組合(例如套組)亦在本發明的範疇內。該套組含有用於活體外(例如在一ELISA或西方墨點法中)偵測以及定量CXCR4的抗體。本發明的抗體可被提供在一用於活體外(例如在一ELISA或西方墨點法中)偵測以及定量CXCR4的套組中。當該抗體被標定以一酵素，該套組將包括該酵素所需的基質以及輔因子(cofactors)[例如，一提供可偵測的發色團(chromophore)或螢光團(fluorophore)的基質前驅物]。此外，其它添加劑[諸如安定劑、緩衝液(例如，一阻斷緩衝液或溶解緩衝液)以及類似之物]可被包括。此一套組可包含有一被劃分以接收一或多種容器[諸如小瓶(Vials)、管子以及類似之物]的儲藏器(receptacle)，此等容器容納本發明的個別要素。例如，一容器可含有一被結合至一不可溶或部分可溶的載體之第一抗體。一第二容器可含有呈凍乾形式或配於溶液中的可溶、被可偵測地標定的第二抗體。該儲藏器亦可含有一容納一呈凍乾形式或配於溶液中的被可偵測地標定的第三抗體的第三容器。一具有這個性質的套組可被使用在本發明的三明治分析中。標記或包裝插入可提供該組成物的一描述以及用於所欲的活體外或診斷用途的指示。各種不同的試劑的相對劑量可被廣泛地變化以提供在實質上最佳化分析的靈敏度的試劑的溶液中的濃度。特別地，該等試劑可被提供有如乾燥粉末(通常被凍乾的)(包括在溶解上將提供一具有適當濃度的試劑溶液的賦形劑)。在本發明的又一進一步的方面，如在此所詳述的單株抗體或它們的結合片段(被標定以一可偵測的部分)被提供，藉此它們可被包裝或使用，例如，在套組中以診斷或鑑定具有上述抗原的細胞。此等標記的非限制性實例包括螢光團(fluorophores)[諸如螢光素異氰硫酸鹽(fluorescein isothiocyanate)]；發色團、放射性核素(radionuclides)或酵素。此等經標定的抗體或結合片段可被使用於抗原的組織學定位(histological localization)、細胞分類(cell sorting)以及用於偵測或定量例如CXCR4和含有這個抗原的細胞的其他免疫學技術。
作為一用於細胞凋亡分析、用於純化或免疫沉澱來自細胞的CXCR4的正對照有用的套組亦被提供。為了分離以及純化CXCR4，該套組可含有被偶合至珠粒(beads)[例如，瓊脂糖凝膠珠粒(sepharose beads)]的在此所描述的抗體或它們的抗原結合片段。含有用於活體外(例如在一ELISA或一西方墨點法中)偵測以及定量CXCR4的套組可被提供。如同製造物品，該套組包含有一容器以及一插在或與該容器組合的標籤或包裝。該容器容納一包含有至少一本發明的抗-CXCR4抗體或它的結合片段的組成物。含有例如控制抗體的稀釋劑以及緩衝液的額外容器可被包括。該被插入的標籤或包裝可提供該組成物的一描述以及用於所欲的活體外或診斷用途的指示。
更特別地，本發明有關於一種用於藉由熟習此技藝者所知曉的任何方法測定一腫瘤的CXCR4狀態的套組。在一較佳具體例中，如將被描述在實施例的，本發明是有關於一種用於藉由IHC方法測定一腫瘤的CXCR4狀態的套組。在一較佳具體例中，本發明在於一包含有至少一如上面所描述的抗-CXCR4抗體(該抗體較佳地被標定)或者它的一功能性片段或衍生物的套組。必須被瞭解的是：任何標定方法可由熟習此技藝者所使用(諸如，例如，使用上面所提到的標記)。在一較佳具體例中，依據本發明的套組(對活體外偵測在一個體中一CXCR4表現腫瘤的存在和/或位置有用的)進一步包含有一對偵測在該抗-CXCR4抗體與CXCR4之間的結合程度有用的試劑。
在另一個較佳具體例中，對活體外偵測在一CXCR4表現腫瘤中的CXCR4表現位準有用的本發明的套組進一步包含有一對定量在該被標定的抗體與CXCR4之間的結合的位準有用的試劑。
在又另一個具體例中，對活體外測定一腫瘤的CXCR4狀態有用的依據本發明的套組進一步包含有：i)　一對偵測在該被標定的抗體與CXCR4之間的結合程度有用的試劑；以及ii)　對評分CXCR4表現位準有用的正或負對照樣品。該用於活體外測定一腫瘤的CXCR4狀態的套組可進一步包含有一對鼠類抗體專一性的多株抗體，較佳地該對鼠類抗體專一性的多株抗體被標定。本發明亦有關於一依據本發明的抗體用於製備一用來專一性標靶一對表現或過度表現CXCR4的細胞有生物活性的化合物之藥物的用途。在本說明的意義上，一“生物活性化合物(biologically active compound)”是能夠調控(特別是抑制)細胞活性(特別是生長、增生、轉錄以及基因轉譯)的任何化合物。本發明亦有關於一種包含有一依據本發明的抗體或它的一功能性片段[較佳地被標定(特別是被放射性標定的)]的活體內診斷試劑以及它在醫學成像(特別是與細胞表現或過度表現CXCR4有關的癌症的偵測)上的用途。本發明亦有關於一組成物作為一組合產物或者依據本發明的一抗-CXCR4/毒素綴合物或放射性同位素被使用作為藥物。
較佳地，該作為一組合產物的組成物或者該綴合物將藉由一賦形劑和/或一藥學載劑(pharmaceutical vehicle)而被補充。
在本描述中，“藥學載劑”意指進入藥學組成物中不會引起次級反應(secondary reactions)並且例如促進該等活性化合物的投藥、在生物體中增加它的壽命和/或效用、增加它在溶液的溶解度或者改善它的儲存的一化合物或化合物的一組合。此等藥學載劑是一熟習此技藝者所熟知並且依據被選擇的活性化合物的性質與投藥途徑而被採用。較佳地，此等化合物將藉由全身性途徑(systemic route)[特別是藉由靜脈內的(intravenous)、肌肉內的、皮內的(intradermal)、腹膜內的(intraperitoneal)、皮下的(subcutaneous)或者口服的(oral)途徑]而被投藥。更佳地，該包含有依據本發明的抗體的組成物將以隨著時間被平均地間隔的數種劑量而被投藥。它們的投藥途徑、給藥清單(dosing schedules)以及最佳的蓋侖形式(galenic forms)可依據當建立一適合於一病患的治療時一般被考量到的準則(諸如，例如，病患的年齡或體重、他的一般狀態的嚴重性、他對於該治療的耐受性以及經歷的副作用)而被決定。
因此，本發明是有關於一抗體或它的功能性片段的一者用於製備一用來專一性標靶一對於表現或過度表現CXCR4的細胞有生物活性的化合物的藥物的用途。如先前所證明的，依據本發明的CXCR4 Mab在癌症治療的領域中具有強的活性，藉此抗體可被使用在用於鑑定治療癌症的CXCR4拮抗物抗腫瘤試劑(antagonist anti-tumoral agents)的篩選分析中。在這些分析的第一個步驟中，表現CXCR4的細胞被培育以本發明的抗體並且接著分子可被評估它們抑制抗體結合的可能性。被使用在這類型的分析的細胞可以是經轉染的細胞株(諸如CHO-CXCR4、NIH3T3-CXCR4)或者經CXCR4轉染的人類細胞株(諸如U373-MAGI-CXCR4)、表現CXCR4的人類細胞株(諸如NALM6)或初代細胞(primary cells)(諸如PBMC)。被使用以篩選抑制抗體結合在CXCR4表現細胞上的CXCR4拮抗物的方法可以是如由Zhao Q.等人所描述的以細胞為基礎的競爭性酵素連結免疫吸附法(ELISA)(AIDS Research And Human Retroviruses,2003,19,pp947-955)或者使用諸如由Juarez J.等人所描述的螢光活化細胞分選(Fluorescence-Activated cell Sorting,FACS)的規程(Leukemia 2003,17,pp1294-1300)。因此，在本發明的一特別方面，被認為的是一種用於篩選和/或鑑定作為CXCR4拮抗物抗腫瘤試劑的分子之方法，其包含有下列步驟：a)選擇表現CXCR4的細胞，b)培育該等細胞與本發明的一抗體或者它的功能性片段或衍生物的一者，和c)評估該等被測試的分子它們在該抗體或者它的功能性片段或衍生物的一者與CXCR4之間的結合的可能抑制，以及d)選擇有該抑制能力的分子。
本發明的其他特徵以及優點進一步出現在具有實施例以及圖式(它們的說明被呈現在下面)的說明中。圖式簡單說明第1A與1B圖分別顯示藉由qPCR分析的在癌細胞中的CXCR4與CXCR2表現。第2圖顯示藉由FACS分析的在癌細胞中的CXCR4與CXCR2蛋白質表現。第3A與3B圖顯示由未被標定的SDF-1(第3A圖)與515H7Mab(第3B圖)在安定地表現野生型人類CXCR4的CHO-K1細胞的細胞膜上的專一性[125I]SDF1結合的競爭(T：總結合；NS：非專一性結合)。第4圖顯示藉由監控在被安定地表現在NIH-3T3細胞中的野生型CXCR4受體中的[35S]GTPγS結合反應的由515H7 Mab調控G蛋白質活化。
第5圖顯示藉由監控在以SDF-1(10以及100 nM)刺激的HeLa腫瘤細胞中的[35S]GTPγS結合反應的由抗-CXCR4 Mab 515H7調控G蛋白質活化。第6A-6C圖顯示在HEK293細胞中經由一生物發光共振能量轉移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)方法的藉由SDF-1以及藉由515H7調控CXCR4受體與不同交互夥伴(interaction partners)的結合。[第6A圖：CXCR4：CXCR4同二聚和作用(homo-dimerization)；第6B圖：CXCR2：CXCR4異二聚和作用(hetero-dimerization)以及第6C圖：β-抑制蛋白(β-arrestin)的CXCR4-調節的補充]。第7A與7B圖顯示在安定地表現CXCR4受體的NIH3T3細胞中藉由SDF-1以及515H7 Mab抑制福斯高林(forskolin)-刺激的cAMP生產。第8圖顯示藉由監控在被安定地表現在CHO-K1細胞的持續活性突變體Asn119Ser CXCR4受體中的[35S]GTPγS結合反應的由抗-CXCR4 Mab 515H7調控G蛋白質活化。第9圖顯示藉由活體外CXCR4 Mab 515H7抑制SDF-1-誘發的U937細胞移動。第10圖顯示在Nod/Scid小鼠中藉由抗-CXCR4 Mab 515H7抑制MDA-MB-231異種移植(xenograft)腫瘤生長。第11A-11C圖顯示在CHO-CXCR4細胞(第11A圖)以及MDA-MB-231(第11B圖)、U937(第11C圖)癌細胞中藉由抗-CXCR4 Mab 515H7的SDF-1-誘發的鈣釋放抑制。第12圖顯示在U937 Nod/Scid小鼠存活模型中的鼠類抗-CXCR4 Mab m515H7的活性。第13圖顯示在Nod/Scid小鼠中鼠類抗-CXCR4 Mab m515H7在抑制T-細胞KARPAS 299異種移植腫瘤生長上的活性。
第14圖顯示在安定地表現野生型人類CXCR4的CHO-K1細胞的細胞膜上藉由鼠類m515H7 Mab以及嵌合的c515H7 Mab的專一性[125I]SDF1結合的競爭(T：總結合；NS：非專一性結合)。
第15圖顯示藉由監控在被安定地表現在以SDF-1(10 nM)刺激的NIH-3T3細胞的野生型CXCR4受體中的[35S]GTPγS結合反應的由鼠類m515H7 Mab以及由嵌合的c515H7調控G蛋白質活化。第16圖顯示藉由監控在以SDF-1(10 nM)刺激的HeLa腫瘤細胞中的[35S]GTPγS結合反應的由抗-CXCR4鼠類m515H7 Mab以及嵌合的c515H7 Mab調控G蛋白質活化。第17A-17C圖顯示在HEK293細胞中經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的藉由SDF-1以及藉由515H7調控CXCR4受體與不同交互夥伴(interaction partners)結合。(第17A圖：CXCR4：CXCR4同二聚和作用；第17B圖：CXCR2：CXCR4異二聚和作用以及第17C圖：β-抑制蛋白的CXCR4-調節的補充)。
第18A與18B圖顯示在CHO-CXCR4細胞(第18A圖)以及在U937細胞(第18B圖)中抑制SDF-1-誘發的鈣釋放。第19圖顯示藉由活體外抗-CXCR4 Mabs m515H7以及c515H7抑制SDF-1-誘發的U937細胞移動。第20圖顯示在U937 Nod/Scid小鼠存活模型中抗CXCR4嵌合的Mab c515H7活性。第21圖顯示515H7重鏈可變領域與人類生殖系列IGHV3-49*04和IGHJ4*01的胺基酸序列比對。515H7 VH胺基酸序列被與經選擇的人類受體框架序列比對。VH1與VH2(VH3未被表示)序列對應於具有呈粗體的回復突變殘基(back mutated residues)的被實施的515H7 VH領域的擬人化變異體。變異體1 VH1沒有帶有回復突變殘基並且表示一全人類變異體。變異體VH2具有8個回復突變並且是最多的鼠類變異體。變異體VH3帶有5個回復突變(未被表示)。
第22圖顯示515H7輕鏈可變領域與人類生殖系列IGKV4-1*01和IGKJ1*01的胺基酸序列比對。515H7 VL胺基酸序列被與經選擇的人類受體框架序列比對。VL1至VL3序列對應於具有呈粗體的回復突變殘基的被實施的515H7 VL領域的擬人化變異體。變異體VL1沒有帶有回復突變殘基並且代表最多的人類變異體。變異體VL2具有13個回復突變並且是最多的鼠類變異體。變異體VL3帶有5個回復突變。
第23A-23F圖顯示藉由嵌合的515H7以及擬人化515H7的不同變異體交叉阻斷經生物素化的鼠類抗體515H7。515H7(hz515H7)的擬人化變異體對交叉阻斷親代鼠類抗體515H7的活性藉由流動式細胞測量術(flow cytometry)使用經CXCR4轉染的NIH3T3細胞而被評估。擬人化變異體的活性被與嵌合的515H7比較。被組合以嵌合的VL(cVL)的VH(VH1-VH3)的3種不同的變異體的交叉阻斷活性是非常相似的(第23A圖-第23C圖)。當被組合以VL的變異體1與2時，沒有在VH變異體1(VH1，該變異體具有無回復突變)的活性上的降低被測定。該活性的一顯著降低在建構物hz515H7 VH1 VL3中被偵測。第24圖顯示用於測試擬人化抗體515H7變異體VH1 VL1的活性的BRET分析。擬人化變異體515H7 VH變異體1 VL變異體1(hz515H7 VH1 VL1)的活性藉由它抑制SDF-1調節的信號傳導的能力而被評估。如由BRET所測定的，這個變異體僅顯示SDF-1調節的信號傳導的一較小抑制。
SDF-1以一為100 nM的濃度而被使用。第25A-25D圖顯示具有單或雙回復突變的VH1的不同突變體與具有hz515H7 VH1 D76N的不同變異體的組合的比較。單與雙回復突變在VH1中被做出並且被組合以VL1。這些建構物在BRET分析中被評估(第25A-25C圖)。在這些單一回復突變體中僅具有回復突變D76N的建構物顯示SDF-1調節的信號傳導的一增加抑制。在VH的雙回復突變體沒有具有強的抑制活性(第25C圖)。VH1的單一回復突變體D76N被組合以VL的不同變異體。SDF-1濃度是100nM。第26圖顯示具有單或雙回復突變的VH1和VL1的不同突變體相較於建構物VH1 D76N VL2的排列。單以及雙回復突變在VH1中被做出並且被組合以VL1。所有建構物在BRET分析中被評估並且它們的百分比抑制被計算。SDF-1濃度是100nM。
第27A-27B圖顯示藉由擬人化515H7的不同建構物抑制SDF-1結合以及在由FACS與BRET所獲得的結果之間的相關性。在阻斷β-抑制蛋白的補充上具有一強的活性的擬人化抗體515H7的不同變異體在流動式細胞測量術(FACS)中被測試它們對於抑制經生物素化的SDF-1的結合之能力(A)。這些被與VH1和VL1比較。來自以FACS-為基礎的分析結果是與由BRET所獲得的結果相關(B)。第28圖顯示hz515H7 VL2與進一步擬人化版本515H7 VL2.1、515H7 VL2.2和15H7 VL2.3的胺基酸序列比對。515H7 VL胺基酸序列被與經選擇的人類受體框架序列比對。VL2.1、VL2.2以及VL2.3序列對應於具有呈粗體的突變殘基的被實施的擬人化515H7 VL2的擬人化變異體。VL2.1與VL2.2帶有另外4個擬人化殘基，而VL2.3含有另外5個人類殘基。
第29A-29C圖顯示在NIH3T3-CXCR4(第29A圖)U937(第29B圖)以及Ramos細胞(第29C圖)中專一性結合至CXCR4的515H7擬人化Mab(hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1 D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2以及hz515H7 VH1 D76N VL2.3)。第30A-30D以及31圖顯示藉由監控在被安定地表現在以SDF-1(10 nM或100 nM)刺激的NIH-3T3細胞中的受體的[35S]GTPγS結合反應的由擬人化Mab 515H7(hz515H7 VH1 D76N VL2[第30A圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.1[第30B圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.2[第30C圖]以及hz515H7 VH1 D76N VL2.3[第30D圖])調控G蛋白質活化。第32A-32C圖顯示在HEK293細胞中經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的藉由SDF-1以及藉由擬人化515H7 Mab(hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1 D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2以及hz515H7 VH1 D76N VL2.3)調控CXCR4受體與不同交互夥伴結合。(第32A圖：CXCR4：CXCR4同二聚和作用；第32B圖：CXCR2：CXCR4異二聚和作用以及第32C圖：β-抑制蛋白的CXCR4-調節的補充)。
第33A-33D圖例示說明以a)與c)使用515H7的IHC染色/b)與d)使用mIgG1的IHC染色之經Glyofixx-固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。第34A-34D圖例示說明以a)與c)使用515H7的IHC染色/b)與d)使用mIgG1的IHC染色的經福馬林(Formol)固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。第35A-35D圖顯示在安定地表現野生型人類CXCR4的CHO-K1細胞的細胞膜上藉由擬人化hz515H7 Mab(hz515H7 VH1 D76N VL2[第35A&B圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.1[第35A&35C圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.2[第35A&35D圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.3[第35A圖])競爭專一性[125I]SDF1結合(T：總結合；NS：非專一性結合)。
第36圖顯示藉由hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab抑制在U937細胞中的SDF-1-誘發的鈣釋放。第37A-37B圖顯示藉由活體外CXCR4擬人化Mab hz515H7 VH1 D76N VL2抑制SDF-1-誘發的U937細胞移動。第38圖：以a)與c)使用經生物素化的hz515H7 VH1 D76N VL2的IHC染色以及b)與d)使用經生物素化的hIgG1的IHC染色之經Glyofixx固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。
第39圖：以a)與c)經生物素化的hz515H7 VH1 D76N VL2的IHC染色以及b)與d)經生物素化的hIgG1的IHC染色的經福馬林固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。第40圖顯示嵌合的515H7(c515H7) Mab在Scid小鼠的B-細胞Ramos異種移植腫瘤生長上的效用。第41圖顯示版本hz515H7 VH1 D76N VL2Mab在Scid小鼠的B-細胞Ramos異種移植腫瘤生長上的效用。第42圖顯示版本hz515H7 VH1 D76N VL2.1 Mab在Scid小鼠的B-細胞Ramos異種移植腫瘤生長上的效用。
 實 施例 實施例1：CXCR4與CXCR2在癌細胞的表現
-Q-PCR分析：為了定量CXCR4與CXCR2在不同癌細胞株的相對表現，一即時RT-PCR(real time RT-PCR)被使用。
RNA樣品使用RNeasy Mini or Midi Protocols(Qiagen Corporation,France)而從不同的細胞株被萃取。該等RNA樣品接著使用Experion自動化電泳系統(Experion automated electrophoresis system)(BIO-RAD Corporation,France)而被控制並且顯示一好的質量/完整性。1 μg的各個RNA樣品使用iScript cDNA合成套組(BIO-RAD Corporation,France)而被轉換成cDNA模板。cDNA位準使用qPCR以一用於CXCR2的TaqMan探針或用於CXCR4的SYBERGreen而被定量。比較樣品需要標準化，因此被導入內標準品RPL0。TaqMan探針(被使用於CXCR2)帶有一5’FAM報導標記以及一3’TAMRA淬滅基團(quencher group)。PCR酵素藉由在50℃歷時2分鐘以及在95℃歷時10分鐘而被活化。一為2步驟的操作程序被使用[在95℃15秒以及在62℃1分鐘用於40或45個循環]在一PCR混合物[含有5 μl的cDNA模板(稀釋1/20)、1 x qPCR Mastermix(TaqMan Universal PCR Master Mix,Applied Biosystems corporation,Branchburg New Jersey,USA)、50至900 nM的各個引子以及50至100 nM探針配於一為50 μl的總體積]中。所有反應使用iCycler儀器(BIO-RAD Corporation)而被執行。Q-PCR容許決定循環數閥值(Cycle threshold,Ct)。Ct值越小，被測試的基因越被表現。用於人類核醣體蛋白質大的P0的引子和探針是：前向引子，5’-GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG-3’(SEQ ID No. 63)；反向引子，5’-AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA-3’(SEQ ID No. 64)；探針，5-(FAM)-TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA-(TAMRA)-3’(SEQ ID No. 65)。
用於人類CXCR4(化學激素受體4)的引子是：前向引子，5’-CTCCTTCATCCTCCTGGAAATC-3’(SEQ ID No. 66)；反向引子，5’-CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG-3’(SEQ ID No. 67)。
用於CXCR2(化學激素受體2)的引子與探針是：前向引子，5’-GTGGTCATTATCTATGCCCTGG-3’(SEQ ID No. 68)；反向引子，5’-CGACCCTGCTGTATAAGATGAC-3’(SEQ ID No. 69)；探針，5-(FAM)-TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA-(TAMRA)-3’(SEQ ID No. 70)。在我們的比較研究中，2種基因[被測試的基因(CXCR4或CXCR2)以及RPL0]的表現被定量在2個不同的樣品：被測試的細胞株以及一參考細胞株。參考細胞株對應於含有要被定量的基因的最低表現的細胞株。比較基因表現計算使用下列公式而被做出：
相對基因表現=(1+E 基因 ) -ΔCt(1) /(1+E RPL0 ) -ΔCt(2)
E基因=使用被定量的基因的引子/探針的PCR效率
ERPL0=使用RPL0引子/探針的PCR效率
Ct=閥值週期(threshold cycle)
ΔCt(1)=Ct基因(被測試的細胞株)-Ct基因(參考細胞株)
ΔCt(2)=CtRPL0(被測試的細胞株)-CtRPLO(參考細胞株)
關於各個PCR系列，一相對基因定量值被計算，並且癌細胞株考量到它們的表現位準從最高至負的被分類成組。所有數據存在於第1A與1B圖中。所有被測試的癌細胞株表現CXCR4(第1A圖)以及CXCR2，除了DU145以及U-87MG沒有表現CXCR2(第1B圖)。
-FACS分析：MDA-MB-231、PC3以及U937癌細胞株被滲透並且接著被培育以10 μg/mL的抗-CXCR4單株抗體[44717(R&D Systems)對(versus)它的同型對照IgG2b(SIGMA]或者10 μg/mL的抗-CXCR2單株抗體(抗h-CXCR2，克隆48311，R&D Systems，Mab 331對它的同型對照IgG2a)。該等細胞接著以1%BSA/PBS/0.01% NaN3予以清洗。接著，Alexa-標定的二級抗體被加入至該等細胞中並且容許在4℃下培育歷時20分鐘。細胞接著再次被清洗2次。在第2次清洗以後，FACS分析被執行。這些結合研究的結果被提供在第2圖中。因此，腫瘤細胞(諸如MDA-MB-231、PC3以及U937)表現CXCR4以及CXCR2蛋白質這兩者。
實施例2：產生對抗人類CXCR4的單株抗體(Mabs)為了產生針對CXCR4的單株抗體，Balb/c小鼠被免疫以重組的NIH3T3-CXCR4細胞和/或對應於CXCR4細胞外N-端(N-term)以及環(loops)的胜肽。6-16週齡的小鼠在第一次免疫時，被皮下地(s.c.)免疫以配於完全佛朗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant)的抗原1次繼而2至6次s.c免疫以配於不完全佛朗氏佐劑的抗原。免疫反應藉由眼窩採血(retroorbital bleeds)而被監測。血清藉由ELISA(如下面所描述的)而被篩選，並且具有較高力價(titers)的抗-CXCR4抗體的小鼠被使用於融合。在犧牲以及脾臟移除之前的2天，小鼠以抗原被靜脈內地加強免疫(boost)。
- ELISA為了選擇生產抗-CXCR4抗體的小鼠，來自經免疫的小鼠的血清藉由ELISA而被測試。簡言之，微滴定盤(microtiter plates)被包覆以被綴合至BSA(以5μg等量胜肽/mL)的經純化的[1-41]N-端胜肽，100μL/井在4℃下被培育過夜，接著以250μL/井的配於PBS的0.5%明膠(gelatin)阻斷。來自經CXCR4-免疫的小鼠的血漿的稀釋液被添加至各個井中並且在37℃下被培育2小時。該等盤以PBS予以清洗並且接著在37℃下被培育以一綴合至HRP的山羊抗-小鼠IgG抗體(goat anti-mouse IgG antibody)(Jackson Laboratories)歷時1小時。在清洗之後，盤以TMB基質而被發展，反應在5分鐘之後藉由添加100 μL/井1M H2SO4而被中止。發展最高力價的抗-CXCR4抗體的小鼠被使用於抗體產生。
-生產針對CXCR4的Mab的融合瘤(hybridomas)的產生被分離自一發展最高力價的抗-CXCR4抗體的Balb/c小鼠的小鼠脾細胞(splenocytes)被融合以PEG至一小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/O中。細胞以大概1x105/井被放在微滴定盤中，繼而在含有極端培養介質(ultra culture medium)+2 mM L-麩醯胺(L-glutamine)+1 mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)+1x HAT的選擇性培養基中的2週培育。井接著藉由ELISA篩選抗-CXCR4單株IgG抗體。該等抗體分泌融合瘤接著藉由限制稀釋(limiting dilution)而被次選殖至少2次，被活體外培養以產生抗體用於進一步分析。
實施例3：藉由FACS分析抗-CXCR4 Mab 515H7結合專一性以及癌細胞株辨識的特徵描述
在本實驗中，抗-CXCR4 Mab 515H7的專一性結合至人類CXCR4藉由FACS分析而被檢查。經NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4轉染的細胞、MDA-MB-231、Hela以及U937癌細胞株被培育以10 μg/Ml的單株抗體515H7。該等細胞接著以1%BSA/PBS/0.01%NaN3予以清洗。接著，Alexa-標定的二級抗體被添加至該等細胞中並且容許在4℃下培育歷時20分鐘。該等細胞接著再次被清洗2次。在第2次清洗以後，FACS分析被執行。這些結合研究的結果被提供在下面的表6中，表6顯示[由FACS所獲得的平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity,MFI)]：抗-CXCR4 Mab 515H7專一性地結合至人類CXCR4-NIH3T3轉染的細胞株而沒有辨識在親代NIH3T3細胞上。這個Mab亦能夠辨識人類癌細胞株，例如MDA-MB-231乳癌細胞、U937早幼粒癌細胞(U937 promyelocytic cancer cells)以及Hela子宮頸癌細胞。抗-CXCR4 Mab 515H7辨識NIH3T3-hCXCR4轉染物而沒有辨識親代NIH3T3野生型細胞。Mab 515H7亦能夠辨識癌細胞株。
實施例4：在安定地表現人類CXCR4受體的CHO-K1膜上的抗-CXCR4 Mab 515H7與[ 125 I]SDF-1的競爭結合
這個分析容許評估515H7 Mab競爭放射標定的[125I]SDF-1對人類CXCR4受體[在正或異位結合位址(orthosteric or allosteric binding sites)]的結合的能力。在轉染天然的CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)與一帶有CXCR4受體的人類全編碼序列(RefSeq NM_003467)的哺乳動物表現載體之後，安定地以及持續表現人類CXCR4受體的CHO-K1細胞被獲得。細胞在完全培養基(complete culture medium)[被補充以5%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)以及500 μg/ml的遺傳黴素(geneticin)的DMEM-Ham’s F12]中被增殖。放射性配位子結合實驗(Radioligand binding experiments)在細胞膜{在分解緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中機械刮削CHO/CXCR4細胞繼而離心(10000g，15分鐘)之後而被獲得}上被實施。[125I]SDF-1結合(專一性活性：1500 Ci/mmol)使用SPA技術[閃爍親近分析(scintillation proximity assay)-GE Healthcare]而被執行。簡言之，細胞膜(30 μg/井)與要評估的化合物(SDF-1或mAb)、放射性配位子(radioligand)(1 nM)以及最後SPA-WGA-PVT珠粒(7.3 mg/井)一起被培育在結合緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,CaCl2 1mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中。在25℃、1小時以後結合平衡被達到。在離心[1000 g歷時10分鐘]之後，放射性計數在一閃爍計數器(scintillation counter)(TopCount,Perkin Elmer)中被測量。非專一性結合在10 μM的未被標定的SDF-1的存在下被評估。未被標定的SDF-1以一為7.75±0.27 nM(n=4)的pKi值(IC50=產生50%抑制專一性[125I]SDF-1結合的配位子濃度)劑量依賴地抑制[125I]SDF-1結合(第3A圖)。在相同的實驗條件下，515H7(100 nM)有效地競爭[125I]SDF-1結合(%抑制[125I]SDF-1)：(64±3%)(第3B圖)。
實施例5：藉由抗-CXCR4 Mab 515H7調控在表現野生型CXCR4受體的細胞膜中的[ 35 S]GTPγS結合
這個功能性分析容許監控經由野生型人類CXCR4受體的G蛋白質活化以及它藉由CXCR4配位子和515H7 Mab的調控。
安定地並且持續表現野生型CXCR4受體的NIH-3T3細胞如在上面關於CHO-K1細胞的實施例所描述的而被獲得。HeLa(人類子宮頸癌)細胞在完全培養基[被補充以10%FCS、1% L-麩醯胺、2μ碳酸氫鈉的EMEM]中被增殖。[35S]GTPγS結合在細胞膜{在分解緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中機械刮削以及進一步離心(10000g，15分鐘)之後而被獲得}上被執行。合併以及偵測[35S]GTPγS(專一性活性：1000 Ci/mmol)使用SPA技術(閃爍親近分析-GE Healthcare)而被執行。簡言之，細胞膜(10 μg/井)與要評估的化合物(SDF-1或感興趣的mAb)、[35S]GTPγS(0.2-0.4 nM)以及最後SPA-WGA-PVT珠粒(7.3 mg/井)一起被培育在結合緩衝液[Hepes 20mM、GDP 3μM、MgCl2 10mM、NaCl 100mM、EDTA 1mM，pH=7.4]中。在25℃、1小時的期間結合反應被執行。在離心[1000 g歷時10分鐘]之後，放射性計數在一閃爍計數器(TopCount,Perkin Elmer)中被測量。拮抗物效力藉由應用Cheng Prussof方程式而被計算：KB=[拮抗物濃度]/{(EC50’/EC50)-1}其中EC50與EC50’分別是在mAb的缺乏以及存在下SDF-1的效力。
SDF-1誘發一劑量依賴增加的[35S]GTPγS結合，如藉由CXCR4受體的G蛋白質活化的結果。[35S]GTPγS結合的最大刺激對於HeLa與NIH3T3/CXCR4細胞膜分別代表167%以及320%的基礎[35S]GTPγS結合。SDF-1的效力對於這兩者細胞株是相似的並且對應於41.3±9.7 nM(第4圖)。在這些實驗條件下，如在NIH3T3/CXCR4細胞中所測定的515H7 Mab的拮抗物活性是15 nM。相似的拮抗物效力在HeLa細胞中被觀察到(第5圖)。
實施例6：經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的CXCR4與不同的交互作用夥伴的結合：同與異二聚合作用、補充β-抑制蛋白以及515H7 Mab在這些二聚體上的效用
這些功能性分析容許評估在CXCR4同二聚體和CXCR2/CXCR4異二聚體形成的位準下SDF-1和/或515H7 Mab結合至CXCR4受體之後所誘發的構形改變(conformational changes)以及β-抑制蛋白-2信號蛋白質的補充。
用於各個被調查的交互作用夥伴的表現載體藉由應用傳統的分子生物學技術而被建構有如具有對應染料[水母螢光素酶(Renilla reniformis luciferase)、Rluc以及黃螢光蛋白質YFP)的融合蛋白質。在執行BRET實驗之前2天，HEK293細胞被短暫轉染以編碼對應的BRET夥伴的表現載體：[CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP]以研究CXCR4同二聚合作用、[CXCR4/Rluc+CXCR2:YFP]以研究CXCR4和CXCR2異二聚合作用以及[CXCR4/Rluc+β-arr2:YFP]以研究β-抑制蛋白-2的CXCR4調節的補充。隔天，在聚-離胺酸預包覆的白色96 MW盤(poly-lysine pre-coated white 96 MW plates)中細胞被分散在完全培養基[被補充以10% FBS的DMEM]中。為了容許細胞附著至盤上，細胞最初在37℃以CO2 5%被培養。細胞接著被匱乏以200 μl DMEM/井過夜。立即在BRET實驗之前，DMEM被移除並且細胞以PBS予以快速清洗。在添加呈一為50 μl的最終體積的具有或不具有SDF-1300 nM的腔腸素H(coelenterazine H) 5 μM之前，細胞接著在存在或缺乏抗體下於37℃被培育在PBS中10分鐘。在37℃下培育歷時進一步10分鐘之後，在485 nm以及530 nm的光-發射擷取(light-發射acquisition)使用Mithras LB940多標記讀取器(Mithras LB940 multilabel reader)(Berthold)(在室溫下1s/波長/井被重覆15次)而被起始。
BRET比率的計算如先前所描述的(Angers et al.,2000)而被執行：[(發射530 nm)-(發射485 nm) X Cf]/(發射485 nm)，其中Cf=(發射530 nm)/(發射485 nm)用於在相同實驗條件下單獨表現Rluc融合蛋白質的細胞。簡化這個方程式顯示：當2個BRET夥伴存在時，BRET比率對應於所獲得的比率530/485 nm，當僅被融合至Rluc的夥伴存在於該分析時，校正在相同實驗條件下所獲得的比率530/485 nm。為了可讀性，結果以毫BRET單位(milliBRET units)(mBU)而被表示；mBU對應於BRET比率乘以1000。
SDF1(300 nM)增加達20% BRET信號[起因於被融合至CXCR4受體的接合子(adaptor)與受子(acceptor)蛋白質的空間鄰近性(spatial proximity)]，它可能指示CXCR4/CXCR4同二聚體形成或預存在的二聚體的構形改變(第6A圖)。有趣地，SDF1(300 nM)降低達24% BRET信號(起因於被融合至CXCR2與CXCR4的接合子與受子蛋白質的空間鄰近性)，可能亦指示CXCR2/CXCR4異二聚體形成或預存在的二聚體的構形改變(第6B圖)。在後者的例子中，CXCR4/CXCR2的SDF-1-活化的構形似乎較不利於BRET能量轉移。在這兩個例子中，515H7 Mab能夠調控SDF-1-誘發的構型改變，對於CXCR4同-二聚體(69%抑制SDF-1-誘發的BRET增加，第6A圖)以及對於CXCR2/CXCR4異-二聚體形成(對於515H7，90%抑制SDF-1-誘發的BRET降低，第6B圖)。515H7 Mab亦能夠藉由它自己分別地調控CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4空間鄰近性，指示515H7 Mab在CXCR4/CXCR4同以及CXCR2/CXCR4異-二聚體構形這兩者上的一影響(第6A與6B圖)。
藉由SDF-1(300 nM)的CXCR4活化產生細胞內信號分子β-抑制蛋白的一強的補充，如由在BRET信號的233%增強而被顯示(第6C圖)。這個補充藉由515H7 Mab而被部分地抑制(大約95%，第6C圖)顯示Mab 515H7在信號上的效用。
實施例7：CXCR4-調節的抑制cAMP生產
這個功能性分析被設計以經由抑制Gi/o蛋白質監控在腺苷酸環化酶(adenylate cyclases)的位準下CXCR4受體信號傳遞。
cAMP LANCE操作程序(Perkin Elmer)如藉由供應者所詳述的而被應用。簡言之，安定地以及連續表現野生型CXCR4受體的N1H3T3細胞如上面所描述的而被獲得以及增殖。細胞使用無胰蛋白試劑(trypsin-free agent)維爾烯(Versene)而被收集並且以一為106細胞/ml的濃度被再懸浮在一含有AlexaFluor-結合的抗cAMP Mab(1/100th稀釋)以及化合物(福斯高林、SDF-1和/或515H7 Mab)的溶液中。在室溫下培育歷時30分鐘以後，含有銪-鏈黴抗生物素蛋白(Europium-Streptavidin)(1/125th稀釋)以及生物素-cAMP(1/125th稀釋)複合物的偵測混合物被添加。在室溫下培育歷時1小時之後，所形成的FRET信號在一Mithras LB940(Berthold)多標記讀取器中被測量。數據被表示有如獨斷的螢光值或者有如在FK效用的減少之後一相對的刺激對SDF-1反應。
福斯高林(FK)在NIH3T3/CXCR4細胞中以一為大約0.3 μM的效力劑量依賴地刺激cAMP生產(第7A圖)。在SDF-1的共存在下，由於藉由CXCR4受體抑制Gi/o蛋白質活化，細胞內的cAMP位準降低。SDF-1的效力是5.0±3.1 nM(第7A圖)。515H7 Mab有效地抑制SDF-1(100 nM)的福斯高林-刺激的效用達超過80%(第7B圖)。
實施例8：藉由Mab 515H7調控在持續表現活性突變體(active mutant) Asn 119 Ser CXCR4受體的細胞膜中的[ 35 S]GTPγS結合
這個功能性分析容許經由一持續活性突變體(CAM)Asn119Ser CXCR4受體監控G蛋白質活化(參見Zhang et al.,2002)。這個敏感性分析容許根據它們的內在活性[部分促效物(partial agonist)、沉默拮抗物(silent antagonist)或者反向促效物(inverse agonist)]區別CXCR4配位子。如先前由Zhang以及同事所描述的，CXCR4配位子(諸如AMD3100或T140)在CAM CXCR4受體中分別地表現有如部分促效物以及反向促效物。沉默拮抗物的鑑定可能是困難的，因為這類的分子對CXCR4的活性與非活性狀態這兩者必須展現相似的親和力(Wurch et al.,1999)。
在CXCR4受體的編碼序列導入一Asn119Ser突變藉由採用傳統的分子生物學技術[QuickChange定點突變誘發套組(QuickChange site directed mutagenesis kit)，Stratagene US)而被執行。安定地以及持續表現CAM CXCR4受體的CHO-K1細胞如上面實施例所描述的而被獲得。[35S]GTPγS結合在細胞膜(在分解緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中機械刮削以及進一步離心(10000g，15分鐘)之後而被獲得}上被執行。合併[35S]GTPγS(專一性活性：1000 Ci/mmol)使用SPA技術(閃爍親近分析-GE Healthcare)而被執行。簡言之，細胞膜(10 μg/井)與要評估的化合物(SDF-1或mAb)、[35S]GTPγS(0.2-0.4 nM)以及最後SPA-WGA-PV珠粒(7.3 mg/井)一起被培育在結合緩衝液[Hepes 20mM、GDP 3μM、MgCl210mM、NaCl 100mM、EDTA 1mM，pH=7.4]中。在25℃、1小時的期間，結合反應被執行。在離心[1000 g歷時10分鐘]之後，放射性計數在一閃爍計數器(TopCount,Perkin Elmer)中被測量。
SDF-1(100 nM)刺激[35S]GTPγS結合達130%。反向促效物T140抑制基礎的(-17%)以及SDF-1-刺激的(-159%)[35S]GTPγS結合這兩者。相反的，515H7 Mab在CAM CXCR4中表現有如沉默拮抗物，沒有改變基礎的[35S]GTPγS結合(第8圖)但是抑制SDF-1誘發的[35S]GTPγS結合(第8圖)。
實施例9：抗-CXCR4 Mab 515H7在SDF-1-誘發的U937細胞移動上的效用
為了評估抗-CXCR4單株抗體515H7在移動過程上的抑制效用，配於被補充以2% FCS的RPMI 1640培養基的100 000個U-937細胞被放在移動室(migration chambers)的上層室(upper chamber)(具有8-μm孔洞大小的24井盤)(在該等井的較低部分存在或缺乏SDF-1以及具有或不具有Mab 515H7在上層室)。在這個測試中，鼠類IgG2b被導入作為一同型對照。在放置之後2小時，移動的細胞被計數。被表示在第9圖的結果證明：如預期的SDF-1能夠誘發U-937細胞移動的一顯著增加。當細胞被培育以IgG2b同型對照時沒有效用被觀察到。相反的，關於被培育以515H7 Mab的細胞，在SDF-1-誘發的U937細胞轉移上的一顯著與可再現的降低被觀察到：超過80%。
實施例10：抗-CXCR4 Mab 515H7抑制在Nod/Scid小鼠中的MDA-MB-231異種移植腫瘤生長
這些實驗的目標是評估抗-CXCR4 Mab 515H7抑制在Nod/SCID小鼠中的MDB-MB-231異種移植的生長之能力。來自ECACC的MDA-MB-231細胞慣常地被培養在DMEM培養基(Invitrogen Corporation,Scotland,UK)、10% FCS(Sigma,St Louis MD,USA)中。細胞在移植之前48小時被分開，藉此它們是呈指數期(exponential phase)的生長。配於PBS的千萬個MDA-MB-231細胞被移植至7週大的Nod/Scid小鼠(Charles River,France)。在植入之後5天，腫瘤被測量(34 mm3<V3<40 mm3)並且動物被分組(每組6隻具有可比較的腫瘤大小的小鼠)。小鼠被i.p.處理以2 mg/小鼠裝載劑量的Mab 515H7。接著，小鼠以0.5 mg/劑量/小鼠的Mab 515H7被注射一週2次一週3次。在這個實驗中一PBS組被導入作為一對照組。腫瘤體積一週被測量2次並且藉由下列公式而被計算：π/6 X長X寬X高。統計分析使用一曼-懷特尼檢定(Mann-Whitney test)在各個測量中被執行。在這些實驗中，在治療的期間沒有死亡率被觀察到。相較於PBS組，關於515H7 0.5mg/劑量有一在D7與D39之間的腫瘤生長的顯著抑制(p0.002)，以及關於Mab 515H7，在5週的治療之後的平均腫瘤體積相對於PBS被降低達50%(第10圖)。
實 施例11：CXCR4受體-調節的調動細胞內鈣儲存
這個功能性分析被設計經由刺激磷脂酶C(phospholipase C)途徑、誘發來自內質網(endoplasmic reticulum)的細胞內儲存的鈣釋放以監控CXCR4受體信號。安定地與持續表現CXCR4受體的野生型CHO-K1細胞如在上面實施例中所描述的而被獲得。MDA-MB-231[人類乳腺癌(human breast adenocarcinoma)]以及U937(人類白血病)細胞被增殖在完全培養基{分別地[被補充以10% FCS的DMEM]以及[被補充以0% FCS、20 mM HEPES、1%非必需胺基酸溶液、1%丙酮酸鈉、1% L-麩醯胺、4.5 g/l葡萄糖的RPMI 1640]}。所有細胞類型以一為100,000細胞/井的密度被放在黑色96MW盤的適當培養基中。在進行本實驗以前細胞被匱乏過夜。細胞被裝填以配於裝填緩衝液[HBSS 1x、HEPES 20 Mm、丙磺舒酸(Probenicid acid) 25 mM]的螢光鈣染料(Fluo-4 No Wash,Invitrogen US)在37℃歷時30分鐘繼而在25℃30分鐘。藉由SDF-1的刺激藉由直接注入各個井而被執行。關於拮抗實驗，在SDF-1之前，10 μl的Mab溶液被直接地添加至裝填緩衝液中至少10分鐘。動力螢光測量(kinetic fluorescence measurements)在一多模式螢光微量盤讀取器(multi-mode fluorescence microplate reader) Mithras LB940(Berthold)上使用下列設定而被執行：在485 nm激發，在535 nm發射，激發能量在10000任意單位(arbitrary units)。在SDF-1注射之前，在各個井的螢光在0、1秒每秒的期間被記錄並且歷時一為20秒的時間期間(基礎信號)。接著，20 μl的SDF-1被注射並且數據記錄跟隨歷時一為2分鐘的時間期間。各個實驗條件被執行2次。關於各個井的數值藉由減去基礎螢光以及由一沒有細胞的對照井所發射的螢光而被首次校正。相對數據被表示為一由SDF-1(100 nM)所獲得的最大刺激的百分比。
SDF1(100 nM)在重組的CHO/CXCR4中誘發細胞內的鈣的一快速且強的釋放，而沒有螢光信號在天然的CHO-K1細胞中被偵測。最大強度達到>160%的基礎螢光並且在藉由SDF-1刺激之後大約30秒被觀察到；相似的動力曲線(kinetic curves)在MDA-MB-231與U-937這兩者被觀察到(第11A、11B、11C圖)，雖然藉由SDF-1(100 nM)的最大螢光強度是較低的(130-140%的基礎)。515H7抗體(133 nM)在所有3種被研究的細胞株中產生一強的並且幾乎完全抑制SDF-1(100 nM)-誘發的鈣信號。
實施例12：在U937小鼠存活模型中的抗-CXCR4 Mab 515H7活性
來自ATCC的U937細胞被培養在RPMI 1640培養基、10% FCS、1% L-麩醯胺。細胞在移植之前2天被分開，藉此它們在生長的指數期。千萬個U937細胞i.p.注射至雌性NOD/SCID小鼠。在植入之後的2天，小鼠被s.c.治療以一為2 mg的515H7 Mab/小鼠的裝填劑量，並且接著以1 mg的抗體/小鼠一週2次。接受PBS注射的對照小鼠如已被顯示在先前研究中的：在被注射以PBS的小鼠以及被投藥以一小鼠IgG同型對照之間沒有在存活上的差異被觀察到。小鼠存活每天被監控。被描述在第12圖的結果顯示被治療以515H7 Mab的小鼠在生命跨度(life span)上具有一戲劇性以及顯著的增加[關於515H7 Mab具有T/C%大約280(第12圖)]。
實施例13：抗-CXCR4 Mab 515H7抑制在Nod/Scid小鼠中的T-細胞KARPAS 299異種移植腫瘤生長
這個實驗的目標是評估抗-CXCR4 Mab 515H7抑制在Nod/Scid小鼠中的KARPAS 299異種移植的生長。
來自ECACC的KARPAS 299細胞被例行地培養在RPMI培養基、1% L-Glu以及10% FCS(Sigma,St Louis MD,USA)。細胞在在移植之前48小時被分開，藉此它們在生長的指數期。配於PBS的5百萬個KARPAS 299細胞被移植至7週大的Nod/SCID小鼠(Charles River,France)。在植入之後5天，腫瘤是可測量的(32 mm3<V3<49 mm3)，並且動物被分組(每組6隻具有可比較的腫瘤大小的小鼠)。小鼠被i.p.治療以一為2 mg/小鼠裝填劑量的Mab 515H7。
接著，小鼠以1 mg/劑量/小鼠的Mab 515H7被注射一週2次。在這個實驗中，一PBS組被導入作為一對照組。腫瘤體積被測量一週2次，並且藉由下列公式而被計算：π/6 X長X寬X高。統計分析使用一曼-懷特尼檢定在各個測量中被執行。在這些實驗中，在治療的期間沒有死亡率被觀察到。相較於PBS組，關於515H7 Mab 0.5mg/劑量有一在D7與D33之間的腫瘤生長的顯著抑制(p0.002)，以及關於Mab 515H7相對於PBS，在5週的治療之後的平均腫瘤體積被降低達63%(第13圖)。
實施例14：生產抗-CXCR4嵌合的Mab c515H7鼠類515H7 Mab的嵌合格式被設計：它對應於被基因地融合至人類Cκ(Ckappa)與IgG1不變領域(constant domains)的感興趣的鼠類抗體的氫與重鏈可變領域。在藉由使用具有一pCEP4表現載體的HEK293/EBNA系統(InVitrogen,US)的短暫轉染之後，重組的Mab被產生。
對應於515H7 Mab輕與重鏈的可變領域的全部核苷酸序列藉由全基因合成(global gene synthesis)(Genecust,Luxembourg)而被合成。它們被次選殖至一帶有一人類IgG1免疫球蛋白的輕[Cκ]或重[CH1-鉸鏈(Hinge)-CH2-CH3]鏈的不變領域的全編碼序列的pCEP4載體(InVitrogen,US)內。所有選殖步驟依據如被描述在實驗室手冊(Laboratory manual)(Sambrook and Russel,2001)的傳統分子生物學技術或者依據供應商的指示而被執行。各個基因建構物藉由使用Big Dye終止物循環定序套組(Big Dye terminator cycle sequencing kit)(Applied Biosystems,US)的核苷酸定序而被完全地確認並且使用一種3100基因分析器(Genetic Analyzer)(Applied Biosystems,US)而被分析。採用懸浮的HEK293 EBNA細胞(InVitrogen,US)被例行地生長在一迴轉式振盪器(orbital shaker)(110 rpm旋轉速度)上的含有無血清培養基Excell 293(SAFC Biosciences)(被補充以6 mM麩醯胺)的250 ml燒瓶中。短暫轉染以2.106細胞/ml使用被製備在水中的線性25 kDa聚乙亞胺(polyethyleneimine,PEI)(Polysciences)(在一為1 mg/ml混合的最終濃度)以及質體DNA(1.25 μg/ml的最終濃度對於1:1的重至輕鏈質體比率)而被執行。在轉染後4小時，培養物以一體積的新鮮培養基而被稀釋俾以達到一為106細胞/ml的最終細胞密度。培養過程在細胞生存力(cell viability)以及Mab生產的基礎上被監控。典型地，培養被維持歷時4至5天。Mab使用一傳統的層析方法在一蛋白質A樹脂(GEHealthcare,US)上被純化。Mab以適合於功能性評估的位準而被生產。生產率位準典型地在6與15 mg/l的經純化的Mab之間的範圍。
實施例15：藉由FACS分析抗-CXCR4嵌合的Mab c515H7結合專一性以及癌細胞株辨識的特徵描述
在這個實驗中，抗-CXCR4嵌合的Mab c515H7的專一性結合至人類CXCR4藉由FACS分析而被檢查。NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4轉染的細胞以及MDA-MB-231癌細胞株被培育以10 μg/mL的單株抗體c515H7。該等細胞接著以1%BSA/PBS/0.01% NaN3予以清洗。接著，Alexa標定的二級抗體被添加至該等細胞中並且被容許在4℃下培育歷時20分中。該等細胞接著再次被清洗2次。在第二次清洗之後，FACS分析被執行。這些結合研究的結果被提供在下列表7中，表7顯示[由FACS所獲得的平均螢光強度(MFI)]：抗-CXCR4嵌合的Mab c515H7專一性地結合至人類CXCR4-NIH3T3轉染的細胞株並且亦辨識人類癌細胞株(例如MDA-MB-231乳癌細胞)。
實施例16：抗-CXCR4鼠類Mab m515H7以及嵌合的Mab c515H7與[ 125 I]SDF-1在安定地表現人類CXCR4受體的CHO-K1膜的競爭結合
這個分析容許評估鼠類Mab m515H7以及嵌合的Mab c515H7競爭放射標定的[125I]SDF-1至人類CXCR4受體(在正或異位結合位址)的結合。
在轉染天然CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)與一帶有人類CXCR4受體的全編碼序列(RefSeq NM_003467)的哺乳動物表現載體之後，安定地以及持續表現人類CXCR4受體的CHO-K1細胞被獲得。細胞被增殖在完全培養基[被補充以5%胎牛血清(FCS)以及500 μg/ml的遺傳黴素的DMEM-Ham’s F12]中。放射性配位子結合實驗在細胞膜{在分解緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中機械刮削CHO/CXCR4細胞繼而離心(10000g，15分鐘)之後而被獲得}上被實施。[125I]SDF-1結合(專一性活性：1500 Ci/mmol)使用SPA技術(閃爍親近分析-GE Healthcare)而被執行。簡言之，細胞膜(30 μg/井)與要評估的化合物(SDF-1或mAb)、放射性配位子(radioligand)(1 nM)以及最後SPA-WGA-PVT珠粒(7.3 mg/井)一起被培育在結合緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,CaCl2 1mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中。在25℃、1小時以後，結合平衡被達到。在離心[1000 g歷時10分鐘]之後，放射性計數在一閃爍計數器(TopCount,Perkin Elmer)中被測量。非專一性結合在10 μM的未被標定的SDF-1的存在下被評估。
抗-CXCR4 Mabs(100 nM)以下列排列次序的競爭效力(%抑制[125I]SDF-1)有效地競爭[125I]SDF-1結合：m515H7(62±10%)以及c515H7(55±4%)(第14圖)。
實施例17：藉由抗-CXCR4鼠類Mab m515H7以及嵌合的Mab c515H7調控[ 35 S]GTPγS結合在表現野生型CXCR4受體的細胞膜
這個功能性分析容許經由野生型人類CXCR4受體以及它藉由-CXCR4鼠類Mab m515H7和嵌合的Mab c515H7的調控監控G蛋白質活化。安定地與持續表現野生型CXCR4受體的NIH-3T3細胞如在上面關於CHO-K1細胞的實施例所描述的而被獲得。HeLa(人類子宮頸癌)細胞被增殖在完全培養基[被補充以10% FCS、1% L-麩醯胺、2 μM碳酸氫鈉的EMEM]。[35S]GTPγS結合在細胞膜{在分解緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中機械刮削以及進一步離心(10000g，15分鐘)之後而被獲得}上被執行。合併以及偵測[35S]GTPγS(專一性活性：1000 Ci/mmol)使用SPA技術(閃爍親近分析-GE Healthcare)而被執行。簡言之，細胞膜(10 μg/井)與要評估的化合物(SDF-1以極感興趣的Mab)、[35S]GTPγS(0.2-0.4 nM)以及最後SPA-WGA-PVT珠粒(7.3 mg/井)一起被培育在結合緩衝液[Hepes 20mM,GDP 3μM,MgCl2 10mM,NaCl 100mM,EDTA 1mM,pH=7.4]中。在25℃、1小時的期間結合反應被執行。在離心[1000 g歷時10分鐘]之後，放射性計數在一閃爍計數器(TopCount,Perkin Elmer)中被測量。關於各個Mab的IC50被計算。
在這些實驗條件下，如在NIH3T3/CXCR4細胞中所測定的m515H7以及c515H7 Mabs的IC50分別是1.9 nM以及1.5nM(第15圖)。在相同實驗條件下使用Hela細胞所測定的m515H7以及c515H7的IC50分別是0.2 nM以及0.6 nM(第16圖)。
實施例18：經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的CXCR4與不同的交互作用夥伴的結合：同以及異二聚和作用、β-抑制蛋白的補充以及鼠類Mab m515H7和嵌合的Mab c515H7在這些二聚體上的效用
這些功能性分析容許評估在CXCR4同二聚體和CXCR2/CXCR4異二聚體形成的位準下SDF-1和/或515H7 Mab結合至CXCR4受體之後所誘發的構形改變以及β-抑制蛋白-2信號蛋白質的補充。
用於各個被調查的交互作用夥伴的表現載體藉由應用傳統的分子生物學技術而被建構有如具有對應染料(水母螢光素酶、Rluc以及黃螢光蛋白質YFP)的融合蛋白質。在執行BRET實驗之前2天，HEK293細胞被短暫轉染以編碼對應的BRET夥伴的表現載體：[CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP]以研究CXCR4同二聚合作用、[CXCR4/Rluc+CXCR2-YFP]以研究CXCR4和CXCR2異二聚合作用以及[CXCR4/Rluc+β-arr2-YFP]以研究β-抑制蛋白-2的CXCR4調節的補充。隔天，細胞被分散在聚-離胺酸預包覆的白色96 MW盤的完全培養基[被補充以10% FBS的DMEM]中。為了容許細胞附著至盤上，細胞最初在37℃以CO2 5%被培養。細胞接著被匱乏以200 μl DMEM/井過夜。立即在BRET實驗之前，DMEM被移除並且細胞以PBS予以快速清洗。在添加呈一為50 μl的最終體積的具有或不具有SDF-1 100 nM的腔腸素H5 μM之前，細胞接著在存在或缺乏抗體下於37℃被培育在PBS中15分鐘。僅對於同以及異二聚體，在37℃下培育歷時5分鐘以及在室溫下進一步培育歷時20分鐘之後，在485 nm以及530 nm的光-發射擷取使用Mithras LB940多標記讀取器(Berthold)(在室溫下1s/波長/井被重覆15次)而被起始。BRET比率的計算如先前所描述的(Angers et al.,2000)而被執行：[(發射530 nm)-(發射485 nm)X Cf]/(發射485 nm)，其中Cf=(發射530 nm)/(發射485 nm)用於在相同實驗條件下單獨表現Rluc融合蛋白質的細胞。簡化這個方程式顯示：當2個BRET夥伴存在時，BRET比率對應於所獲得的比率530/485 nm，當僅被融合至Rluc的夥伴存在於該分析時，校正在相同實驗條件下所獲得的比率530/485。為了可讀性，結果以毫BRET單位(mBU)而被表示；mBU對應於BRET比率乘以1000。
SDF1(100 nM)增加達大約10% BRET信號(起因於被融合至CXCR4受體的接合子與受子蛋白質的空間鄰近性)，它可能指示CXCR4/CXCR4同二聚體形成或預存在的二聚體的構形改變(第17A圖)。有趣地，SDF1(100 nM)降低達大約17% BRET信號(起因於被融合至CXCR2與CXCR4的接合子與受子蛋白質的空間鄰近性)，可能亦指示CXCR2/CXCR4異二聚體形成或預存在的二聚體的構形改變(第17B圖)。在後者的例子中，CXCR4/CXCR2的SDF-1-活化的構形似乎較不利於BRET能量轉移。在這兩個例子中，m515H7以及c515H7 Mab能夠調控SDF-1-誘發的構型改變，對於CXCR4同-二聚體(關於c515H7，96%抑制SDF-1-誘發的BRET增加，第17A圖)以及對於CXCR2/CXCR4異-二聚體形成(關於c515H7，98%抑制SDF-1-誘發的BRET降低，第17B圖)。m515H7以及c515H7 Mab亦能夠藉由它們自己分別地調控CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4空間鄰近性，指示這些Mab在CXCR4/CXCR4同以及CXCR2/CXCR4異-二聚體構形這兩者上的一影響(第17A與17B圖)。藉由SDF-1(300 nM)的CXCR4活化產生細胞內信號傳遞分子β-抑制蛋白的一強的補充，如由在BRET信號的400%增強而被顯示(第17C圖)。這個補充藉由c515H7 Mab而被部分地抑制(大約93%，第17C圖)顯示這些Mab在信號的效用。
實施例19：CXCR4受體-調節的調動細胞內鈣儲存
這個功能性分析被設計經由刺激磷脂酶C途徑、誘發來自內質網的細胞內儲存的鈣釋放以監控CXCR4受體信號傳遞。
安定地與持續表現野生型CXCR4受體的CHO-K1細胞如在上面實施例中所描述的而被獲得。U937(人類白血病)細胞被增殖在完全培養基{分別地[被補充以10% FCS的DMEM]以及[被補充以10% FCS、20 mM HEPES、1%非必需胺基酸溶液、1%丙酮酸鈉、1% L-麩醯胺、4.5 g/l葡萄糖的RPMI 1640]。所有細胞類型以一為100,000細胞/井的密度被放在黑色的96MW盤的適當培養基中。在進行本實驗以前細胞被匱乏過夜。細胞被裝填以配於裝填緩衝液(HBSS 1x、HEPES 20 Mm、丙磺舒酸25 mM)的螢光鈣染料(Fluo-4 No Wash,Invitrogen US)在37℃歷時30分鐘繼而在25℃ 30分鐘。由SDF-1的刺激藉由直接注入各個井而被執行。關於拮抗實驗，在SDF-1之前，10 μl的Mab溶液被直接地添加至裝填緩衝液中至少10分鐘。動力螢光測量在一多模式螢光微量盤讀取器Mithras LB940(Berthold)上使用下列設定而被執行：在485 nm激發，在535 nm發射，激發能量在10000任意單位。在SDF-1注射之前，在各個井中的螢光在0.1秒每秒的期間被記錄並且歷時一為20秒的時間期間(基礎信號)。接著，20 μl的SDF-1被注射並且數據記錄跟隨歷時一為2分鐘的時間期間。各個實驗條件被執行2次。關於各個井的數值藉由減去基礎螢光以及由一沒有細胞的對照井所發射的螢光而被首次校正。相對數據被表示為一由SDF-1(100 nM)所獲得的最大刺激的百分比。
SDF1(100 nM)在重組的CHO/CXCR4中誘發細胞內的鈣的一快速且強的釋放，而沒有螢光信號在天然的CHO-K1細胞中被偵測。最大強度達到>140%的基礎螢光並且在由SDF-1刺激之後的大約40秒被觀察到；相似的動力曲線在U-937被觀察到(第18A、18B圖)。嵌合的抗體c515H7(133 nM)在被研究的細胞株這兩者中產生一強的且幾乎完全抑制SDF-1(100 nM)-誘發的鈣信號。
實施例20：抗-CXCR4鼠類Mab m515H7以及嵌合的Mab c515H7在SDF-1-誘發的U937細胞移動上的效用
為了評估抗-CXCR4 Mab m515H7和c515H7在移動過程上的抑制效用，配於被補充以2% FCS的RPMI 1640培養基的100 000個U-937細胞被放在移動室(migration chambers)的上層室(upper chamber)(具有8-μm孔洞大小的24井盤)(在該等井的較低部分存在或缺乏SDF-1以及具有或不具有Mab c515H7與m515H7在上層室)。在這個測試中，鼠類IgG2b被導入作為一同型對照。在放置之後2小時，移動的細胞被計數。被表示在第19圖的結果證明：如預期的SDF-1能夠誘發U-937細胞移動的一顯著增加。當細胞被培育以IgG2b同型對照時，沒有效用被觀察到。相反的，關於被培育以c515H7和m515H7 Mab的細胞，在SDF-1-誘發的U937細胞轉移上的一顯著與可再現的降低被觀察到：關於c515H7和m515H7 Mab，大約超過80%。
實施例21：在U937小鼠存活模型中的抗-CXCR4嵌合的Mab c515H7活性
來自ATCC的U937細胞被培養在RPMI 1640培養基、10% FCS、1% L-麩醯胺。細胞在移植之前2天被分開，藉此它們在生長的指數期。千萬個U937細胞i.p.注射至雌性NOD/SCID小鼠。在植入之後的2天，小鼠被s.c.治療以一為2 mg的c515H7 Mab/小鼠的裝填劑量，並且接著以1 mg的抗體/小鼠一週2次。接受PBS注射的對照小鼠如已被顯示在先前研究中的：在被注射以PBS的小鼠以及被投藥以一小鼠IgG同型對照之間沒有在存活上的差異被觀察到。小鼠存活每天被監控。
被描述在第20圖的結果顯示：被治療以c515H7 Mab的小鼠以大約180的T/C%在生命跨度上具有一戲劇性以及顯著的增加。
實施例22：515H7抗-CXCR4鼠類抗體的擬人化 一般操作程序
515H7抗-CXCR4抗體的擬人化藉由採用CDR-移植(CDR-grafting)的全球性規則而被執行。CDR以及框架(framework,FR)區域的免疫遺傳學分析以及定義藉由採用IMGT獨特的編號計劃以及IMGT資料庫與工具(Lefranc,1997-www.imgt.org)而被執行。擬人化方法的效力藉由一生物發光共振能量轉移(BRET)分析經由測試被建造的抗體的功能活性(關於它們抑制β-抑制蛋白的SDF-1-調節的補充的能力)而被評估。在這個分析中，CXCR4被標記以螢光素酶以及具有YFP的β-抑制蛋白。β-抑制蛋白至CXCR4的SDF-1調節的補充是一在CXCR4的信號轉導中的重要步驟。515H7的擬人化變異體的結合亦在一被安定地轉染以人類CXCR4的NIH3T3細胞株上而被測定。結合活性藉由一以生物素化的小鼠抗體的競爭分析而被評估。在一第二個嘗試，擬人化抗體被評估它們抑制生物素化的SDF-1至RAMOS細胞的結合之能力。RAMOS細胞被選擇因為它的高度表現CXCR4以及低度表現CXCR7與SDF-1。
這些分析被使用以特徵化抗-CXCR4抗體的重組擬人化版本。可變領域被格式化以人類IgG1/k不變領域並且被選殖至哺乳動物表現載體pCEP內。重組的IgG1/κ-衍生的抗體被短暫地表現在HEK293細胞。表現培養基懸浮液被過濾並且抗體使用蛋白質A瓊脂糖凝膠而被純化。經純化的抗體被再緩衝在PBS中並且抗體濃度藉由ELISA而被測定。
515H7可變領域的擬人化
為了選擇一適當的人類生殖系列用於CDR移植，具有對515H7 VH鼠類序列最高同源性的人類生殖系列基因被鑑定。因為IMGT資料庫以及工具的幫助，人類IGHV3-49*04生殖系列基因以及人類IGHJ4*01 J生殖系列基因被選擇作為人類受體序列用於鼠類515H7 VH CDR。人類V-基因IGHV3-49*04對小鼠515H7重鏈的可變領域的V-基因具有一為80.27%的同源性。對於人類J-基因IGHJ4*01 J的同源性是87.50%。19個殘基在被選擇的人類生殖系列基因以及小鼠抗體515H7的VH領域之間是不同的。在親代抗體的VH領域以及生殖系列序列之間的比對被描寫在第21圖。
關於輕鏈的可變領域，人類生殖系列基因IGKV4-1*01以及IGKJ1*01被選擇(第22圖)。與人類V-基因IGKV4-1*01的同源性是79.12%。輕鏈的515H7J-基因對人類J-基因IGKJ1*01具有一為84.85%的同源性。
轉譯的人類生殖系列基因IGHV3-49*04與IGKV4-1*01的胺基酸序列被使用以鑑定已被結晶的同源抗體。關於重鏈，具有在RCSB蛋白質資料庫(RCSB Protein Data Bank)中寄存編號1MAM的抗體被選擇作為一模型，而關於輕鏈，抗體1SBS被選擇。這2個領域使用電腦程式DS視覺(DS visual)而被裝配並且被使用作為一用於擬人化抗體515H7的模型。
根據在親代抗體與對應的人類生殖系列序列之間不同的各個殘基的位置，一優先的排列次序提供各個在人類與小鼠序列之間不同的殘基(第21與22圖)。這些優先順序被使用以產生各個擬人化可變領域的3種不同的變異體(分別被命名為VH1、VH2以及VH3)。在第一系列的實驗中，吾人建構以及分析最先3種的擬人化變異體的抗-CXCR4結合活性。VH變異體1(VH1)被組合以鼠類VL並且這些建構物以它們抑制一生物素化的鼠類515H7親代抗體的結合的能力而被評估。所有建構物顯示與鼠類抗體競爭的能力(第23A-C圖)。這個指示最多的人類VH變異體具有如較少的人類變異體的相同結合能力。因此，VH1被組合以VL的3種不同變異體(第23D-F圖)。僅VH1與VL3的組合顯示一與生物素化的鼠類抗體競爭的降低能力，而在框架中沒有攜帶回復突變的最多的人類變異體VH1 VL1顯示如嵌合抗體的相同交叉阻斷活性。
這個變異體VH1 VL1在BRET分析中被進一步測試它抑制β-抑制蛋白的SDF-調節的補充之能力(第24圖)。儘管如由交叉阻斷親代抗體所測定的對受體的所欲結合活性，建構物VH1 VL1僅顯示β-抑制蛋白的補充的一弱的抑制。這個缺乏強的抑制活性使取代人類框架殘基以鼠類殘基是必須的。單一回復突變被建構用於VH1。下列殘基被取代：V48L、E61D、D76N以及A81L(依據一級胺基酸序列編號)。變異體VH1的這些單一回復突變被組合以變異體VL1。在這些中僅回復突變D76N導致一如由BRET分析所評估的信號轉導的增加抑制(第25B圖)。
為了增加這個建構物的活性以及進一步評估其他殘基的重要性，不同的雙回復突變被建構用於VH1。這些建構物的抑制活性被輕微地改善(大約45-50%的平均抑制)，但沒有令人滿意的(第25C圖)。單一回復突變D76N接著被組合以3種不同的VL變異體(第25D圖)。建構物hz515H7 VH D76N VL2顯示一平均88.2%的活性(在如嵌合抗體的相同範圍內)。
單一以及雙回復突變被建構在變異體VL1領域並且與建構物hz515H7 VH1 D76N VL2的活性比較(第26圖)。被測試的組合沒有具有一如這個建構物的相似或更佳的活性。關於hz515H7 VH1 D76N VL2，在框架的人類殘基的百分比被評估：它含有14個非-人類殘基在180個殘基中，它等於一為92.2%的<<萌發指數(germinality index)>>。經由比較，擬人化以及市場化的抗體貝伐單抗(bevacizumab)以及曲妥珠單抗分別含有30與14個非-人類殘基在它們的可變領域。
顯示對於抑制SDF-1-調節的β-抑制蛋白補充最強效力的4個最佳擬人化形式亦被測試它們對於抑制生物素化的SDF-1的結合之能力(第27A圖)。一抑制SDF-1結合以及β-抑制蛋白補充的密切相關性被測定。這個相關性指示抑制SDF-1結合最可能是抑制信號轉導的主要機制。為了進一步擬人化hz515H7 VH1 D76N VL2變異體，3種額外的變異體藉由使用以在第26圖被評估的雙以及三重突變體所獲得的資訊而被設計。4或5個額外的殘基在變異體VL2.1、VL2.2以及VL2.3(亦被意指為VL2-1、VL2-2以及VL2-3)中被個別地擬人化。它們對應於殘基D9、P49、D66、S69、S83、L84；V89。這3種變異體與VL2比較的一比對被顯示在第28圖中。
這些VL2變異體抑制β-抑制蛋白的SDF-1調節的補充的能力被評估。擬人化的hz515H7 VH1 D76N VL2、VL2.1、VL2.2以及VL2.3變異體顯示一相似於嵌合抗體c515H7的活性(第26圖)。
515H7-2可變領域的擬人化為了產生另一種擬人化形式，另一種用於CDR移植(用於輕與重鏈的可變領域這兩者)的適當人類生殖系列被選擇。關於它們兩者，生殖系列被選擇不僅關於與鼠類序列的同源性的百分比而且它們分別具有如鼠類515H7的VL與VH的相同CDR長度。
因為IMGT資料庫以及工具的幫助，人類IGHV3-73*01生殖系列基因以及人類IGHJ4*01 J生殖系列基因被選擇作為人類受體序列用於鼠類515H7 VH CDR。人類V-基因IGHV3-73*01對於小鼠515H7重鏈的可變領域的V-基因具有一大於79%的同源性。對於人類J-基因IGHJ4*01 J的同源性是87.50%。
關於輕鏈的可變領域，人類生殖系列基因IGKV2D-40*01以及IGKJ1*01被選擇。與人類V-基因IGKV2D-40*01的同源性是大於70%。輕鏈的515H7 J-基因對於人類J-基因IGKJ1*01具有一為84.85%的同源性。根據在親代抗體與對應的人類生殖系列序列之間不同的各個殘基的位置，以及熟習此技藝者的知識，數種關鍵殘基被鑑定作為要被回復突變的殘基。
關於重鏈，這些殘基是H35S、V48L、R50F、A61D、D76N和/或A81L(參見表2c的SEQ ID Nos. 86以及90)。關於輕鏈，這些殘基是L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Y和/或V89L(參見表2c的SEQ ID Nos. 85以及89)。
實施例23：藉由FACS分析抗-CXCR4擬人化Mab 515H7結合專一性以及癌細胞株辨識的特徵描述
在本實驗中，抗-CXCR4擬人化Mab 515H7的專一性結合至人類CXCR4藉由FACS分析而被檢查。經NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4轉染的細胞以及Ramos、U937癌細胞株於4℃、黑暗下在100 μl Facs緩衝液中被培育以0至10 μg/mL的擬人化Mab 515H7(hz515H7 VH1 D76N VL2[=hz515H7VL2]、hz515H7 VH1 D76N VL2.1[=hz515H7VL2.1]、hz515H7 VH1 D76N VL2.2[=hz515H7VL2.2]以及hz515H7 VH1 D76N VL2.3[=hz515H7VL2.3])歷時20分鐘。在Facs緩衝液的3次清洗之後，細胞於4℃、黑暗下被培育以二級抗體[一種山羊抗-人類Alexa 488(稀釋1/500)]歷時20分鐘。在Facs緩衝液的3次清洗之後，碘化丙啶(propidium iodide)被添加在各個井中並且僅有活細胞(viable cells)藉由Facs分析。至少5000個活細胞被估算以評估關於各個條件的螢光強度的平均值。這些結合研究的結果被提供在顯示[由FACS所獲得的平均螢光強度(MFI)]的第29A-29C圖中：抗-CXCR4擬人化Mab hz5l5H7專一性地結合至人類CXCR4-NIH3T3轉染的細胞株(第29A圖)(以NIH3T3親代細胞，MFI=2.2)並且亦辨識人類癌細胞株[例如U937(第29B圖)以及Ramos(第29C圖)]。
實施例24：藉由抗-CXCR4擬人化Mab 515H7調控[ 35 S]GTPγS結合在表現野生型CXCR4受體的細胞膜
這個功能性分析容許經由野生型人類CXCR4受體以及它藉由抗-CXCR4擬人化Mab 515H7的調控監控G蛋白質活化。
安定地並且持續表現野生型CXCR4受體的NIH-3T3細胞如在上面關於CHO-K1細胞的實施例所描述的而被獲得。[35S]GTPγS結合在細胞膜{在分解緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中機械刮削以及進一步離心(10000g，15分鐘)之後而被獲得}上被執行。合併以及偵測[35S]GTPγS(專一性活性：1000 Ci/mmol)使用SPA技術(閃爍親近分析-GE Healthcare)而被執行。簡言之，細胞膜(10 μg/井)與要評估的化合物(SDF-1或感興趣的Mab)、[35S]GTPγS(0.2-0.4 nM)以及最後SPA-WGA-PVT珠粒(7.3 mg/井)一起被培育在結合緩衝液[Hepes 20mM、GDP 3μM、MgCl2 10mM、NaCl 100mM、EDTA 1mM，pH=7.4]中。在25℃、1小時的期間，結合反應被執行。在離心[1000 g歷時10分鐘]之後，放射性計數在一閃爍計數器(TopCount,Perkin Elmer)中被測量。關於各個Mab的IC50被計算。
在這些實驗條件下，如在NIH3T3/CXCR4細胞中所測定的擬人化(hz) 515H7 Mab的IC50是3.86 nM對於hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab(第30A圖)、4.05 nM對於hz515H7 VH1 D76N VL2-1 Mab(第30B圖)、5.19 nM對於hz515H7 VH1 D76N VL2-2 Mab(第30C圖)以及8.5 nM對於hz515H7 VH1 D76N VL2-3 Mab(第30D圖)。hz515H7 Mab亦能夠以一下列的抑制%抑制由SDF-1(100 nM)所刺激的[35S]GTPγS結合：86%對於hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab、69%對於hz515H7 VH1 D76N VL2-1 Mab、66%對於hz515H7 VH1 D76N VL2-2 Mab、58%對於hz515H7 VH1 D76N VL2-3 Mab(第31圖)。
實施例25：經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的CXCR4與不同的交互作用夥伴的結合：同與異二聚合作用、補充β-抑制蛋白以及擬人化Mabs 515H7在這些二聚體上的效用
這些功能性分析容許評估在CXCR4同二聚體和CXCR2/CXCR4異二聚體形成的位準下SDF-1和/或515H7擬人化Mab結合至CXCR4受體之後所誘發的構形改變以及β-抑制蛋白-2信號蛋白質的補充。
用於各個被調查的交互作用夥伴的表現載體藉由應用傳統的分子生物學技術而被建構有如具有對應染料(水母螢光素酶、Rluc以及黃螢光蛋白質YFP)的融合蛋白質。在執行BRET實驗之前2天，HEK293細胞被短暫轉染以編碼對應的BRET夥伴的表現載體：[CXCR4/Rlu+CXCR4/YFP]以研究CXCR4同二聚合作用、[CXCR4/Rluc+CXCR2-YFP]以研究CXCR4和CXCR2異二聚合作用以及[CXCR4/Rluc+β-arr2-YFP]以研究β-抑制蛋白-2的CXCR4調節的補充。隔天，細胞被分散在在聚-離胺酸預包覆的白色96 MW盤的完全培養基[被補充以10% FBS的DMEM]中。為了容許細胞附著至盤上，細胞最初在37℃以CO2 5 %被培養。細胞接著被匱乏以200 μl DMEM/井過夜。立即在BRET實驗之前，DMEM被移除並且細胞以PBS快速清洗。在添加呈一為50 μl的最終體積的具有或不具有SDF-1 300 nM的腔腸素H(coelenterazine H) 5 μM之前，細胞接著在存在或缺乏抗體下於37℃被培育在PBS中15分鐘。僅對於同-以及異-二聚體，在37℃下培育歷時5分鐘以及在室溫下進一步培育歷時20分鐘之後，在485 nm以及530 nm的光-發射擷取使用Mithras LB940多標記讀取器(Berthold)(在室溫下1s/波長/井被重覆15次)而被起始。
BRET比率的計算如先前所描述的(Angers et al.,2000)而被執行：[(發射530 nm)-(發射485 nm)X Cf]/(發射485 nm)，其中Cf=(發射530 nm)/(發射485 nm)用於在相同實驗條件下單獨表現Rluc融合蛋白質的細胞。簡化這個方程式顯示：當2個BRET夥伴存在時，BRET比率對應於所獲得的比率530/485 nm，當僅被融合至Rluc的夥伴存在於該分析中時，校正在相同實驗條件下所獲得的比率530/485。為了可讀性，結果以毫BRET單位(mBU)而被表示；mBU對應於BRET比率乘以1000。
SDF1(100 nM)增加達大約12%(起因於被融合至CXCR4受體的接合子與受子蛋白質的空間鄰近性)，它可能指示CXCR4/CXCR4同二聚體形成或預存在的二聚體的構形改變(第32A圖)。有趣地，SDF1(100 nM)降低達大約16% BRET信號(起因於被融合至CXCR2與CXCR4的接合子與受子蛋白質的空間鄰近性)，可能亦指示CXCR2/CXCR4異二聚體形成或預存在的二聚體的構形改變(第32B圖)。在後者的例子中，CXCR4/CXCR2的SDF-1-活化的構形似乎較不利於BRET能量轉移。在這兩個例子中，515H7擬人化Mabs能夠調控SDF-1-誘發的構型改變，對於CXCR4同-二聚體具有一抑制SDF-1-誘發的BRET增加的下列百分比：大約88%對於hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab、65%對於hZ515H7 VH1D76N-VL2.1 Mab、33%對於hz515H7 VH1D76N-VL2.2 Mab以及21%對於hz515H7 VH1D76N-VL2.3 Mab(第32A圖)，以及對於CXCR2/CXCR4異-二聚體具有一抑制SDF-1-誘發的BRET降低的下列百分比：大約100%對於hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab以及50%對於hz515H7 VH1D76N-VL2.1、hz515H7 VH1D76N-VL2.2和hz515H7 VH1D76N-VL2.3 Mabs(第32B圖)。515H7擬人化Mabs亦能夠藉由它們自己分別地調控CXCR4/CXCR4和CXCR2/CXCR4空間鄰近性，指示這些Mabs在CXCR4/CXCR4同以及CXCR2/CXCR4異-二聚體構形這兩者上的一影響(第32A與32B圖)。
藉由SDF-1(100 nM)的CXCR4活化產生細胞內信號傳遞分子β-抑制蛋白的一強的補充，如由在BRET信號的390%增強而被顯示(第32C圖)。這個補充藉由515H7擬人化Mabs而被部分地抑制(大約94%抑制對於hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab、81%對於hz515H7 VH1D76N-VL2.1 Mab、82%對於hz515H7 VH1D76N-VL2.2 Mab以及71%對於hz515H7 VH1D76N-VL2.3 Mab)(第32C圖)，顯示這些Mabs在信號傳遞上的效用。
實施例26：免疫組織化學研究(IHC)
切片被去石蠟化(deparaffinized)、再水合(rehydrated)並且放置在預保暖的呈98℃ EDTA pH8歷時7分鐘用於熱誘發的表位恢復。在Tris緩衝鹽水-0.05% tween 20(TBS-T)(Dako S3006)中清洗3次之後，內生的過氧化酶活性(endogenous peroxidase activity)使用過氧化酶阻斷劑(Peroxidase Blocking Reagent)(Dako K4007)而被阻斷歷時5分鐘。在4℃下培育以抗-CXCR-4小鼠單株抗體(50 μg/ml，克隆515H7，Pierre Fabre)或者小鼠IgG1/κ(IgG1/kappa)(50 μg/ml,X0931,Dako)作為一對照過夜之前，切片以TBS-T予以清洗並且被培育在阻斷試劑(UltraV block-TA-125UB-LabVision)中歷時5分鐘。切片以TBS-T予以清洗並且在室溫下被培育以Envision Dual Link歷時1小時。二胺基聯苯胺(diaminobenzidine)被使用於顯影一褐色反應產物(Dako K3468)。載玻片被浸在蘇木精(hematoxylin)中歷時4分鐘以對比染色(counterstain)(Dako S3309)，並且在被固定在Faramount封固劑(mounting medium)加上蓋玻片(coverslipe)之前於PBS中予以清洗。在這個免疫組織化學操作程序中，褐色反應產物與細胞膜的陽性染色有關，以及缺乏褐色反應產物與陰性染色以及沒有形像化細胞膜有關。
抗-CXCR4小鼠單株抗體(克隆515H7)差別地染色各種不同的腫瘤類型的細胞膜。第33與34圖例示被執行在2個異種移植的模型(其中一抗腫瘤活性已被描述用於515H7：RAMOS以及KARPAS299)的染色。如在第33與34圖中所顯示的，所獲得的染色是固定劑(fixative)依賴的。確實，當組織被福馬林固定時，膜染色是較弱的(第34a與34c圖)，而當Glyo-fixx(一種用於福馬林的取代物)被使用時，膜染色顯著地被增加(第33a與33c圖)。
實施例27：抗-CXCR4擬人化Mabs 515H7對於[ 125 I]SDF-1在安定地表現人類CXCR4受體的CHO-K1膜的競爭結合
這個分析容許評估擬人化Mabs 515H7競爭放射標定的[125I]SDF-1至人類CXCR4受體(在正或異位結合位址)的結合之能力。
在轉染天然的CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)與一帶有CXCR4受體的人類全編碼序列(RefSeq NM_003467)的哺乳動物表現載體之後，安定地以及持續表現人類CXCR4受體的CHO-K1細胞被獲得。細胞在完全培養基[被補充以5%胎牛血清(FCS)以及500 μg/ml的遺傳黴素的DMEM-Ham’s F12]中被增殖。放射性配位子結合實驗在細胞膜{在分解緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,NaCl 150mM]中機械刮削CHO/CXCR4細胞繼而離心(10000g，15分鐘)之後而被獲得}上被實施。[125I]SDF-1結合(專一性活性：1500 Ci/mmol)使用SPA技術(閃爍親近分析-GE Healthcare)而被執行。簡言之，細胞膜(30 μg/井)與要評估的化合物(SDF-1或mAb)、放射性配位子(1 nM)以及最後SPA-WGA-PVT珠粒(7.3 mg/井)一起被培育在結合緩衝液[Hepes 20mM,pH 7.4,CaCl2 1mM,MgCl2 5mM,NaCl 150mM,BSA 1%]中。在25℃、1小時以後，結合平衡被達到。在離心[1000 g歷時10分鐘]之後，放射性計數在一閃爍計數器(TopCount,Perkin Elmer)中被測量。非專一性(NS)結合在10 μM的未被標定的SDF-1的存在下被評估。
抗-CXCR4 Mabs(100 nM)以下列排列次序的競爭效力(%抑制[125I]SDF-1)有效地競爭[125I]SDF-1結合：hz515H7 VH1D76N VL2(77%)、hz515H7 VH1D76N VL2.1(68%)、hZ515H7 VH1D76N VL2.2(61%)以及hZ515H7 VH1D76N VL2.3(49%)(第35A圖)。
Hz515H7 Mab以下列IC50劑量依賴地抑制[125I]SDF-1結合：1.44 nM對於hz515H7 VH1D76N VL2 Mab(第35B圖)、6.69 nM對於hz515H7 VH1D76N VL2.1 Mab(第35C圖)、5.91 nM對於hz515H7 VH1D76N VL2.2 Mab(第35D圖)。
實施例28：CXCR4受體-調節的調動細胞內鈣儲存這個功能性分析被設計經由刺激磷脂酶C途徑、誘發來自內質網的細胞內儲存的鈣釋放以監控CXCR4受體信號傳遞。
U937(人類白血病)細胞被增殖在完全培養基[被補充以10% FCS、20 mM HEPES、1%非必需胺基酸溶液、1%丙酮酸鈉、1% L-麩醯胺、4.5 g/l葡萄糖的RPMI 1640]。細胞以一為100 000細胞/井的密度被放在黑色96MW盤的適當培養基中，並且在進行本實驗以前細胞被匱乏過夜。細胞被裝填以配於裝填緩衝液[HBSS 1x、HEPES 20 Mm、丙磺舒酸25 mM]的螢光鈣染料(Fluo-4 No Wash,Invitrogen US)在37℃歷時30分鐘繼而在25℃30分鐘。由SDF-1的刺激藉由直接注入各個井中而被執行。關於拮抗實驗，在SDF-1之前，10 μl of Mab溶液被直接地添加至裝填緩衝液中至少10分鐘。動力螢光測量在一多模式螢光微量盤讀取器Mithras LB940(Berthold)上使用下列設定而被執行：在485 nm激發，在535 nm發射，激發能量在10000任意單位。在SDF-1注射之前，在各個井中的螢光在0.1秒每秒的期間被記錄並且歷時一為20秒的時間期間(基礎信號)。接著，20 μl的SDF-1被注射並且數據記錄跟隨歷時一為2分鐘的時間期間。各個實驗條件被執行2次。關於各個井的數值藉由減去基礎螢光以及由一沒有細胞的對照井所發射的螢光而被首次校正。相對數據被表示為一由SDF-1(100 nM)所獲得的最大刺激的百分比。SDF1(100 nM)在U-937細胞中誘發細胞內的鈣的一快速且強的釋放。最大強度達到>340%的基礎螢光並且在由SDF-1刺激之後大約40秒被觀察到。hz515H7 VH1D76N VL2 Mab(133 nM)在U937細胞株中產生部分的抑制SDF-1(100 nM)-誘發的鈣信號(第36圖，其中該Mab在圖例中正好被意指為hz515H7VL2)。
實施例29：抗-CXCR4擬人化Mab hz515H7在SDF-1-誘發的U937細胞移動上的效用
為了評估抗-CXCR4擬人化Mab hz515H7 VH1D76N VL2(被意指為hz515H7)在移動過程的抑制效用，U937細胞在37℃、5% CO2下於含有2% FBS的RPMI1640培養基中被培育以10 μg/ml的抗體歷時40分鐘。一總計5x104細胞放置在上層轉井室(transwell chamber)(Corning Lowell,MA,USA)中。在下層室中SDF-1(100 ng/ml)被添加在含有2%FBS的培養基中。U937細胞的移動藉由計數在植種細胞至上層室內之後2小時從轉井室移動的細胞數目而被測量。轉移的細胞根據定量ATP使用CellTiter-發光細胞可活性分析(Luminescent Cell Viability Assay)測量在培養物中活細胞的數目而被計數。
存在於第37A圖中的結果證明：如預期的SDF-1能夠誘發U-937細胞移動的一顯著增加。當細胞被培育以IgG1同型對照時，沒有效用被觀察到。相反的，第37A圖顯示藉由10μg/ml的hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab抑制SDF1-誘發的U937細胞移動。結果表示以三重覆被做出的3個獨立實驗的平均值+/-SD。第37B圖表示一劑量範圍的hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab在SDF-1誘發的細胞移動上的效用。結果表示4個獨立實驗的平均值+/-S.E.M(IC50=4.53 10-3 μg/ml+/-2.210-3)。
實施例30：以hz515H7 VH1 D76N VL2的免疫組織化學研究(IHC)
切片被去石蠟化、再水合並且放置在預保暖的呈98℃EDTA pH8歷時7分鐘用於熱誘發的表位恢復。在Tris緩衝鹽水-0.05% tween 20(TBS-T)(Dako S3006)中清洗3次之後，內生的過氧化酶活性使用過氧化酶阻斷劑而被阻斷歷時5分鐘。在4℃下培育以抗-CXCR-4小鼠單株抗體(50 μg/ml,hz515H7 VH1 D76N VL2,Pierre Fabre)或者生物素化的人類IgG1(50 μg/ml,BP078,The Binding Site)作為一同型對照過夜之前，切片以TBS-T予以清洗並且被培育在阻斷試劑(UltraV block-TA-125UB-LabVision)中歷時5分鐘。切片以TBS-T予以清洗並且在室溫下被培育以鏈黴抗生物素蛋白HRP歷時1小時。二胺基聯苯胺被使用於顯影一褐色反應產物(Dako K3468)。載玻片被浸在蘇木精中歷時4分鐘以對比染色(Dako S3309)並且在被固定在Faramount封固劑加上蓋玻片(coverslipe)之前於PBS中予以清洗。在這個免疫組織化學操作程序中，褐色反應產物與細胞膜的陽性染色有關，以及缺乏褐色反應產物與陰性染色以及沒有形像化細胞膜有關。
生物素化的抗-CXCR4人類抗體515H7 VH1 D76N VL2差別地染色各種不同的腫瘤類型的細胞膜。第38與39圖例示被執行在2個異種移植的模型(其中當小鼠被治療以515H7時，一抗腫瘤活性被描述：RAMOS以及KARPAS299)中的染色。如在第38與39圖中所顯示的，所獲得的染色是固定劑依賴的。確實，當組織被福馬林固定時，膜染色是較弱的(第39a與39c圖)，而當Glyo-fixx(一種用於福馬林的取代物)被使用時，膜染色被顯著地增加(第38a與38c圖)。
實施例31：嵌合的515H7(c515H7)、擬人化形式hz515H7 VH1D76N VL2與hz515H7 VH1 D76N VL2.1 Mabs在Scid小鼠的B-細胞Ramos異種移植腫瘤生長上的效用
來自ATCC的Ramos細胞慣常地被培養在RPMI 1640培養基、10% FCS以及2mM L-Glu(Sigma,St Louis MD,USA)中。細胞在移植之前48小時被分開，藉此它們是呈指數期的生長。配於PBS的千萬個Ramos細胞被sc.移植至7週大的雌性SCID小鼠(Charles River,France)。在植入之後5天，腫瘤被測量(平均100 mm3)並且動物被分組(每組6隻具有可比較的腫瘤大小的小鼠)。小鼠被i.p.處理以2 mg/小鼠裝載劑量的Mabs c515H7、hz515H7 VH1D76N VL2或hz515H7 VH1 D76N VL2.1。接著，小鼠以1 mg/劑量/小鼠的Mabs c515H7、hz515H7 VH1 D76N VL2或hz515H7VH1D76N VL2.1被注射一週2次。在這個實驗中，一PBS組被導入作為一對照組。腫瘤體積一週被測量2次並且藉由下列公式而被計算：π/6X長X寬X高。統計分析使用一曼-懷特尼檢定在各個測量中被執行。
在這些實驗中，在治療的期間沒有死亡率被觀察到。相較於PBS組，關於c515H7 Mab(第40圖)hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab(第41圖)以及hz515H7 VH1 D76N VL2.1(第42圖)1mg/劑量有一在D11與D54之間的腫瘤生長的顯著抑制，以及關於被治療以c515H7以及hz515H7 Mabs相對於PBS組，在4週的治療之後的平均腫瘤體積被降低達92%。
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<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VL人類化變異體
<400>　45
<210>　46
<211>　336
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VL人類化變異體
<400>　46
<210>　47
<211>　336
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VL人類化變異體
<400>　47
<210>　48
<211>　336
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VL人類化變異體
<400>　48
<210>　49
<211>　1350
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VH人類化變異體
<400>　49
<210>　50
<211>　1350
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VH人類化變異體
<400>　50
<210>　51
<211>　1350
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VH人類化變異體
<400>　51
<210>　52
<211>　1350
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VH人類化變異體
<400>　52
<210>　53
<211>　657
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　VL人類化變異體
<400>　53
<210>　54
<211>　657
<212>　DNA
<213>　人工的
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<223>　VL人類化變異體
<400>　54
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<211>　657
<212>　DNA
<213>　人工的
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<223>　VL人類化變異體
<400>　55
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<212>　DNA
<213>　人工的
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<223>　VL人類化變異體
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<212>　DNA
<213>　人工的
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<223>　VL人類化變異體
<400>　57
<210>　58
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<212>　DNA
<213>　人工的
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<223>　VL人類化變異體
<400>　58
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<212>　DNA
<213>　人工的
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<223>　VL人類化變異體
<400>　59
<210>　60
<211>　36
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　最佳化的CDR
<400>　60
<210>　61
<211>　9
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　最佳化的CDR
<400>　61
<210>　62
<211>　24
<212>　DNA
<213>　人工的
<220>
<223>　最佳化的CDR
<400>　62
<210>　63
<211>　24
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<400>　63
<210>　64
<211>　22
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<400>　64
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<211>　26
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<400>　65
<210>　66
<211>　22
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<400>　66
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<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
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<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
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<211>　22
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
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<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
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<211>　30
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<400>　72
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<213>　家鼷鼠
<400>　73
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<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
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<212>　PRT
<213>　智慧人
<400>　77
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<212>　PRT
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<212>　PRT
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<212>　PRT
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<400>　81
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<212>　PRT
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<400>　82
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<212>　PRT
<213>　智慧人
<400>　83
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<211>　219
<212>　PRT
<213>　智慧人
<400>　84
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<212>　PRT
<213>　智慧人
<220>
<221>　混雜_特徵(misc_feature)
<222>　(35)..(35)
<223>　Xaa是His或Ser
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(48)..(48)
<223>　Xaa是Val或Leu
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(50)..(50)
<223>　Xaa是Arg或Phe
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(61)..(61)
<223>　Xaa是Ala或Asp
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(76)..(76)
<223>　Xaa是Asp或Asn
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(81)..(81)
<223>　Xaa是Ala或Leu
<400>　85
<210>　86
<211>　112
<212>　PRT
<213>　智慧人
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(9)..(9)
<223>　Xaa是Leu或Ser
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(21)..(21)
<223>　Xaa是Ile或Met
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(40)..(40)
<223>　Xaa是Asp或Ala
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(43)..(43)
<223>　Xaa是Leu或Gln
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(59)..(59)
<223>　Xaa是Tyr或Ala
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(61)..(61)
<223>　Xaa是Ala或Asp
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(66)..(66)
<223>　Xaa是Asp或Ala
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(69)..(69)
<223>　Xaa是Ser或Thr
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(74)..(74)
<223>　Xaa是Gly或Glu
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(76)..(76)
<223>　Xaa是Asp或Tyr
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(89)..(89)
<223>　Xaa是Val或Leu
<400>　86
<210>　87
<211>　120
<212>　PRT
<213>　智慧人
<400>　87
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<213>　智慧人
<400>　88
<210>　89
<211>　449
<212>　PRT
<213>　智慧人
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(35)..(35)
<223>　Xaa是His或Ser
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(48)..(48)
<223>　Xaa是Val或Leu
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(50)..(50)
<223>　Xaa是Arg或Phe
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(61)..(61)
<223>　Xaa是Ala或Asp
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(76)..(76)
<223>　Xaa是Asp或Asn
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(81)..(81)
<223>　Xaa是Ala或Leu
<400>　89
<210>　90
<211>　219
<212>　PRT
<213>　智慧人
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(9)..(9)
<223>　Xaa是Leu或Ser
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(21)..(21)
<223>　Xaa是Ile或Met
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(40)..(40)
<223>　Xaa是Asp或Ala
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(43)..(43)
<223>　Xaa是Leu或Gln
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(59)..(59)
<223>　Xaa是Tyr或Ala
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(61)..(61)
<223>　Xaa是Ala或Asp
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(66)..(66)
<223>　Xaa是Asp或Ala
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(69)..(69)
<223>　Xaa是Ser或Thr
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(74)..(74)
<223>　Xaa是Gly或Glu
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(76)..(76)
<223>　Xaa是Asp或Tyr
<220>
<221>　混雜_特徵
<222>　(89)..(89)
<223>　Xaa是Val或Leu
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<210>　91
<211>　449
<212>　PRT
<213>　智慧人
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<212>　DNA
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<210>　95
<211>　1347
<212>　DNA
<213>　智慧人
<400>　95
<210>　96
<211>　657
<212>　DNA
<213>　智慧人
<400>　96
第1A與1B圖分別顯示藉由qPCR分析的在癌細胞中的CXCR4與CXCR2表現。
第2圖顯示藉由FACS分析的在癌細胞中的CXCR4與CXCR2蛋白質表現。
第3A與3B圖顯示由未被標定的SDF-1(第3A圖)與515H7 Mab(第3B圖)在安定地表現野生型人類CXCR4的CHO-K1細胞的細胞膜上的專一性[125I]SDF1結合的競爭(T：總結合；NS：非專一性結合)。
第4圖顯示藉由監控在被安定地表現在NIH-3T3細胞中的野生型CXCR4受體中的[35S]GTPγS結合反應的由515H7 Mab調控G蛋白質活化。
第5圖顯示藉由監控在以SDF-1(10以及100 nM)刺激的HeLa腫瘤細胞中的[35S]GTPγS結合反應的由抗-CXCR4 Mab 515H7調控G蛋白質活化。
第6A-6C圖顯示在HEK293細胞中經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的藉由SDF-1以及藉由515H7調控CXCR4受體與不同交互夥伴(interaction partners)的結合。
(第6A圖：CXCR4：CXCR4同二聚和作用；第6B圖：CXCR2：CXCR4異二聚和作用以及第6C圖：β-抑制蛋白的CXCR4-調節的補充)。
第7A與7B圖顯示在安定地表現CXCR4受體的NIH3T3細胞中藉由SDF-1以及515H7 Mab抑制福斯高林-刺激的cAMP生產。
第8圖顯示藉由監控在被安定地表現在CHO-K1細胞的持續活性突變體Asn119Ser CXCR4受體中的[35S]GTPγS結合反應的由抗-CXCR4 Mab 515H7調控G蛋白質活化。
第9圖顯示藉由活體外CXCR4 Mab 515H7抑制SDF-1-誘發的U937細胞移動。
第10圖顯示在Nod/Scid小鼠中藉由抗-CXCR4 Mab 515H7抑制MDA-MB-231異種移植腫瘤生長。
第11A-11C圖顯示在CHO-CXCR4細胞(第11A圖)以及MDA-MB-231(第11B圖)、U937(第11C圖)癌細胞中藉由抗-CXCR4 Mab 515H7的SDF-1-誘發的鈣釋放抑制。
第12圖顯示在U937 Nod/Scid小鼠存活模型中的鼠類抗-CXCR4 Mab m515H7的活性。
第13圖顯示在Nod/Scid小鼠中鼠類抗-CXCR4 Mab m515H7在抑制T-細胞KARPAS 299異種移植腫瘤生長上的活性。
第14圖顯示在安定地表現野生型人類CXCR4的CHO-K1細胞的細胞膜上藉由鼠類m515H7 Mab以及嵌合的c515H7 Mab的專一性[125I]SDF1結合的競爭(T：總結合；NS：非專一性結合)。
第15圖顯示藉由監控在被安定地表現在以SDF-1(10 nM)刺激的NIH-3T3細胞的野生型CXCR4受體中的[35S]GTPγS結合反應的由鼠類m515H7 Mab以及由嵌合的c515H7調控G蛋白質活化。
第16圖顯示藉由監控在以SDF-1(10 nM)刺激的HeLa腫瘤細胞中的[35S]GTPγS結合反應的由抗-CXCR4鼠類m515H7 Mab以及嵌合的c515H7 Mab調控G蛋白質活化。
第17A-17C圖顯示在HEK293細胞中經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的藉由SDF-1以及藉由515H7調控CXCR4受體與不同交互夥伴結合。(第17A圖：CXCR4：CXCR4同二聚和作用；第17B圖：CXCR2：CXCR4異二聚和作用以及第17C圖：β-抑制蛋白的CXCR4-調節的補充)。
第18A與18B圖顯示在CHO-CXCR4細胞(第18A圖)以及在U937細胞(第18B圖)中抑制SDF-1-誘發的鈣釋放。
第19圖顯示藉由活體外抗-CXCR4 Mabs m515H7以及c515H7抑制SDF-1-誘發的U937細胞移動。
第20圖顯示在U937 Nod/Scid小鼠存活模型中抗CXCR4嵌合的Mab c515H7活性。
第21圖顯示515H7重鏈可變領域與人類生殖系列IGHV3-49*04和IGHJ4*01的胺基酸序列比對。515H7 VH胺基酸序列被與經選擇的人類受體框架序列比對。VH1與VH2(VH3未被表示)序列對應於具有呈粗體的回復突變殘基(back mutated residues)的被實施的515H7 VH領域的擬人化變異體。變異體1 VH1沒有帶有回復突變殘基並且表示一全人類變異體。變異體VH2具有8個回復突變並且是最多的鼠類變異體。變異體VH3帶有5個回復突變(未被表示)。
第22圖顯示515H7輕鏈可變領域與人類生殖系列IGKV4-1*01和IGKJ1*01的胺基酸序列比對。515H7 VL胺基酸序列被與經選擇的人類受體框架序列比對。VL1至VL3序列對應於具有呈粗體的回復突變殘基的被實施的515H7 VL領域的擬人化變異體。變異體VL1沒有帶有回復突變殘基並且代表最多的人類變異體。變異體VL2具有13個回復突變並且是最多的鼠類變異體。變異體VL3帶有5個回復突變。
第23A-23F圖顯示藉由嵌合的515H7以及擬人化515H7的不同變異體交叉阻斷經生物素化的鼠類抗體515H7。515H7(hz515H7)的擬人化變異體對交叉阻斷親代鼠類抗體515H7的活性藉由流動式細胞測量術使用經CXCR4轉染的NIH3T3細胞而被評估。擬人化變異體的活性被與嵌合的515H7比較。被組合以嵌合的VL(cVL)的VH(VH1-VH3)的3種不同的變異體的交叉阻斷活性是非常相似的(第23A圖-第23C圖)。當被組合以VL的變異體1與2時，沒有在VH變異體1(VH1，該變異體具有無回復突變)的活性上的降低被測定。該活性的一顯著降低在建構物hz515H7 VH1 VL3中被偵測。
第24圖顯示用於測試擬人化抗體515H7變異體VH1 VL1的活性的BRET分析。擬人化變異體515H7 VH變異體1 VL變異體1(hz515H7 VH1 VL1)的活性藉由它抑制SDF-1調節的信號傳導的能力而被評估。如由BRET所測定的，這個變異體僅顯示SDF-1調節的信號傳導的一較小抑制。SDF-1以一為100 nM的濃度而被使用。
第25A-25D圖顯示具有單或雙回復突變的VH1的不同突變體與具有hz515H7 VH1 D76N的不同變異體的組合的比較。單與雙回復突變在VH1中被做出並且被組合以VL1。這些建構物在BRET分析中被評估(第25A-25C圖)。在這些單一回復突變體中僅具有回復突變D76N的建構物顯示SDF-1調節的信號傳導的一增加抑制。在VH的雙回復突變體沒有具有強的抑制活性(第25C圖)。VH1的單一回復突變體D76N被組合以VL的不同變異體。SDF-1濃度是100nM。
第26圖顯示具有單或雙回復突變的VH1和VL1的不同突變體相較於建構物VH1 D76N VL2的排列。單以及雙回復突變在VH1中被做出並且被組合以VL1。所有建構物在BRET分析中被評估並且它們的百分比抑制被計算。SDF-1濃度是100nM。
第27A-27B圖顯示藉由擬人化515H7的不同建構物抑制SDF-1結合以及在由FACS與BRET所獲得的結果之間的相關性。在阻斷β-抑制蛋白的補充上具有一強的活性的擬人化抗體515H7的不同變異體在流動式細胞測量術(FACS)中被測試它們對於抑制經生物素化的SDF-1的結合之能力(A)。這些被與VH1和VL1比較。來自以FACS-為基礎的分析結果是與由BRET所獲得的結果相關(B)。
第28圖顯示hz515H7 VL2與進一步擬人化版本515H7 VL2.1、515H7 VL2.2和15H7 VL2.3的胺基酸序列比對。515H7 VL胺基酸序列被與經選擇的人類受體框架序列比對。VL2.1、VL2.2以及VL2.3序列對應於具有呈粗體的突變殘基的被實施的擬人化515H7 VL2的擬人化變異體。VL2.1與VL2.2帶有另外4個擬人化殘基，而VL2.3含有另外5個人類殘基。
第29A-29C圖顯示在NIH3T3-CXCR4(第29A圖) U937(第29B圖)以及Ramos細胞(第29C圖)中專一性結合至CXCR4的515H7擬人化Mab(hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1 D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2以及hz515H7 VH1 D76N VL2.3)。
第30A-30D以及31圖顯示藉由監控在被安定地表現在以SDF-1(10 nM或100 nM)刺激的NIH-3T3細胞中的受體的[35S]GTPγS結合反應的由擬人化Mab 515H7(hz515H7 VH1 D76N VL2[第30A圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.1[第30B圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.2[第30C圖]以及hz515H7 VH1 D76N VL2.3[第30D圖])調控G蛋白質活化。
第32A-32C圖顯示在HEK293細胞中經由一生物發光共振能量轉移(BRET)方法的藉由SDF-1以及藉由擬人化515H7 Mab(hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1 D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2以及hz515H7 VH1 D76N VL2.3)調控CXCR4受體與不同交互夥伴結合。(第32A圖：CXCR4：CXCR4同二聚和作用；第32B圖：CXCR2：CXCR4異二聚和作用以及第32C圖：β-抑制蛋白的CXCR4-調節的補充)。
第33A-33D圖例示說明以a)與c)使用515H7的IHC染色/b)與d)使用mIgG1的IHC染色之經Glyofixx-固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。
第34A-34D圖例示說明以a)與c)使用515H7的IHC染色/b)與d)使用mIgG1的IHC染色的經福馬林固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。
第35A-35D圖顯示在安定地表現野生型人類CXCR4的CHO-K1細胞的細胞膜上藉由擬人化hz515H7 Mab(hz515H7 VH1 D76N VL2[第35A&B圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.1[第35A&35C圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.2[第35A&35D圖]、hz515H7 VH1 D76N VL2.3[第35A圖])競爭專一性[125I]SDF1結合(T：總結合；NS：非專一性結合)。
第36圖顯示藉由hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab抑制在U937細胞中的SDF-1-誘發的鈣釋放。
第37A-37B圖顯示藉由活體外CXCR4擬人化Mab hz515H7 VH1 D76N VL2抑制SDF-1-誘發的U937細胞移動。
第38圖：以a)與c)使用經生物素化的hz515H7 VH1 D76N VL2的IHC染色以及b)與d)使用經生物素化的hIgG1的IHC染色之經Glyofixx固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。
第39圖：以a)與c)經生物素化的hz515H7 VH1 D76N VL2的IHC染色以及b)與d)經生物素化的hIgG1的IHC染色的經福馬林固定的RAMOS與KARPAS299異種移植腫瘤。第40圖顯示嵌合的515H7(c515H7)Mab在Scid小鼠的B-細胞Ramos異種移植腫瘤生長上的效用。
第41圖顯示版本hz515H7 VH1 D76N VL2 Mab在Scid小鼠的B-細胞Ramos異種移植腫瘤生長上的效用。
第42圖顯示版本hz515H7 VH1 D76N VL2.1 Mab在Scid小鼠的B-細胞Ramos異種移植腫瘤生長上的效用。

Claims (21)

  1. 一種能夠專一性地結合至CXCR4的擬人化抗體或者其一功能性片段，該功能性片是選自於片段Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc及雙功能抗體(diabodies)之中，其特徵在於：該擬人化抗體或其功能性片段的衍生化合物包含有重鏈與輕鏈，該重鏈具有由CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3所構成的CDRs，以及該輕鏈具有由CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3所構成的CDRs，其中該CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3分別包含有序列SEQ ID Nos.4、5與6，以及該CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3分別包含有序列SEQ ID Nos.7、8與9。
  2. 如申請專利範圍第1項之擬人化抗體或者其一功能性片段，其特徵在於：其包含有一選自於由SEQ ID Nos.10、11、12、13、83、85或87所構成的群組的序列的重鏈可變區域，以及一選自於由SEQ ID Nos.14、15、16、17、18、19、20、84、86或88所構成的群組的序列的輕鏈可變區域。
  3. 如申請專利範圍第1項之擬人化抗體或者其一功能性片段，其特徵在於：其包含有一選自於由SEQ ID Nos.21、22、23、24、89或91所構成的群組的序列之重鏈以及一選自於由SEQ ID Nos.25、26、27、28、29、30、31、90或92所構成的群組的序列之輕鏈。
  4. 如申請專利範圍第1項之擬人化抗體或者其一功能性片段，其選自於由下列所構成的群組： - 擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.16的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.22的重鏈以及一序列SEQ ID No.27的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.17的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.22的重鏈以及一序列SEQ ID No.28的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.18的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.22的重鏈以及一序列SEQ ID No.29的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.19的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.22的重鏈以及一序列SEQ ID No.30的輕鏈； - 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.12的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.14的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.23的重鏈以及一序列SEQ ID No.25的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.12的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.15的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.23的重鏈以及一序列SEQ ID No.26的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.10的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.14的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.21的重鏈以及一序列SEQ ID No.25的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.10的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.88的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.21的重鏈以及一序列SEQ ID No.92的輕鏈； - 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.11的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.88的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.22的重鏈以及一序列SEQ ID No.92的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.12的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.88的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.23的重鏈以及一序列SEQ ID No.92的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.13的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.88的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.24的重鏈以及一序列SEQ ID No.92的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.14的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.25的輕鏈； - 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.15的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.26的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.16的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.27的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.17的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.28的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.18的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.29的輕鏈； - 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.19的輕鏈可變區域；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.30的輕鏈；- 一擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.87的重鏈可變區域以及一序列SEQ ID No.20的輕鏈可變區域；- 擬人化抗體或者其一衍生化合物或功能性片段，其特徵在於：其包含有一序列SEQ ID No.91的重鏈以及一序列SEQ ID No.31的輕鏈。
  5. 一種經分離的核酸分子，其特徵在於其係選自於下列核酸之中：a)一種編碼一如申請專利範圍第1至4項中任一項之擬人化抗體或者其一功能性片段的核酸，DNA或RNA；b)一種與一如在a)中所定義的核酸互補之核酸；c)一種能夠在高度嚴厲的條件下與一包含有核酸序列SEQ ID Nos.38至41、49至52、93或95的重鏈的3個CDRs的至少一者雜合的具有至少18個核苷酸的核酸；以及d)一種能夠在高度嚴厲的條件下與一包含有核酸序列SEQ ID Nos.42至48、53至59、94或96的輕鏈的3個CDRs的至少一者雜合的具有至少18個核苷酸的核 酸。
  6. 如申請專利範圍第5項之經分離的核酸分子，其包含有一選自於由下列所構成的群組的核酸序列：- 一編碼一擬人化抗體的一重鏈可變區域的核酸序列，該重鏈可變區域核苷酸序列包含有一具有SEQ ID No.32的CDR-H1核苷酸序列、一具有SEQ ID No.33的CDR-H2核苷酸序列以及一具有SEQ ID No.34的CDR-H3核苷酸序列；- 一編碼一擬人化抗體的一輕鏈可變區域的核酸序列，該輕鏈可變區域核苷酸序列包含有一具有SEQ ID No.35或60的CDR-L1核苷酸序列、一具有SEQ ID No.36或61的CDR-L2核苷酸序列以及一具有SEQ ID No.37或62的CDR-L3核苷酸序列；以及- 一編碼一編碼一擬人化抗體的一重鏈可變區域以及一輕鏈可變區域的核酸序列的核酸序列，i)該重鏈可變區域核苷酸序列包含有一具有SEQ ID No.32的CDR-H1核苷酸序列、一具有SEQ ID No.33的CDR-H2核苷酸序列以及一具有SEQ ID No.34的CDR-H3核苷酸序列；以及ii)該輕鏈可變區域核苷酸序列包含有一具有SEQ ID No.35或60的CDR-L1核苷酸序列、一具有SEQ ID No.36或61的CDR-L2核苷酸序列以及一具有SEQ ID No.37或62的CDR-L3核苷酸序列。
  7. 一種包含有一如申請專利範圍第5及6項中任一項的核 酸之載體。
  8. 一種包含有一如申請專利範圍第7項的載體之宿主細胞。
  9. 一種用以生產一擬人化抗體或者其一功能性片段的方法，其特徵在於：該方法包含有下列步驟：- 在一介質以及適合的培養條件下培養如申請專利範圍第8項的宿主細胞；以及- 回收該以此方式從該培養介質或從該被培養的細胞所產生的抗體或者其功能性片段之一者。
  10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之擬人化抗體或者其一功能性片段，其係供使用作為一藥物。
  11. 一種組成物，其包含有一由如申請專利範圍第1至4中任一項之擬人化抗體或者其一功能性片段所構成的化合物作為一活性成分。
  12. 如申請專利範圍第11項之組成物，其特徵在於：此外其包含有一不是一針對CXCR4的抗體之抗腫瘤抗體，作為一供使用在一同時的、分開的或延長的方式之組合產物。
  13. 如申請專利範圍第11或12項之組成物，其特徵在於：此外其包含有一細胞毒性/細胞生長抑制劑、一細胞毒素和/或一放射性同位素，作為一供使用在一同時的、分開的或延長的方式之組合或綴合產物。
  14. 如申請專利範圍第11至12項中任一項之組成物，其係供使用作為一藥物。
  15. 如申請專利範圍第1至4項中任一項的擬人化抗體或者其一功能性片段，其係用於預防或治療癌症。
  16. 如申請專利範圍第15項之擬人化抗體或者其一功能性片段，其特徵在於：該癌症是一選自於前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宮內膜癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰臟癌以及結腸癌之中的癌症。
  17. 如申請專利範圍第14項的組成物，其係用於預防或治療癌症。
  18. 如申請專利範圍第17項之組成物，其特徵在於：該癌症是一選自於前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宮內膜癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰臟癌以及結腸癌之中的癌症。
  19. 一種活體外偵測一CXCR4表現腫瘤在一個體中的存在和/或位置的方法，其中該方法包含有下列步驟：(a)令一來自該個體的樣品與一如申請專利範圍第1至4項中任一項之擬人化抗體或者其一功能性片段接觸，以及(b)偵測該抗體與該樣品的結合。
  20. 一種套組，其包含有至少一如申請專利範圍第1至4項中任一項之擬人化抗體或者其一功能性片段。
  21. 如申請專利範圍第20項之套組，其中該抗體被標定。
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