DE69233408T2

DE69233408T2 - Herstellung von Antikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken.

Info

Publication number: DE69233408T2
Application number: DE69233408T
Authority: DE
Inventors: David Andrew GRIFFITHS; Renerus Hendricus HOOGENBOOM; David James MARKS; John Mccafferty; Paul Gregory Winter; Walter Geoffrey GRIGG
Original assignee: Medical Research Council; Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: Medical Research Council; MedImmune Ltd
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2012-12-03
Also published as: EP0616640B1; EP2224006A1; DK0616640T3; JPH07502167A; EP1024191A2; EP1024191B1; CA2124460C; EP1024191B8; EP1024191A3; AU3089092A; EP0616640A1; JP3949712B2; CA2124460A1; AU665221B2; DE69233408D1

Description

Diese Erfindung betrifft die Isolierung von Antikörpermolekülen, die gegen Selbstantigene gerichtet sind, insbesondere menschliche Antikörper, die gegen menschliche Selbstantigene gerichtet sind. Die Phage-Display-Technik zur Selektion von Antikörpermolekülen wurde in WO92/01047, PCT/GB92/00883, PCT/GB92/01755 und GB9206372.6 beschrieben.
Die Antragsteller haben erkannt, dass Antikörper, die gegen Selbstantigene gerichtet sind, unter Verwendung der Phage-Display-Technik isoliert werden können.
Menschliche Antiselbst-Antikörper sind von besonderem Wert für in vivo therapeutische und diagnostische Zwecke, da sie die Probleme vermeiden, die sich aus der Antigenität von fremden, z.B. Maus-, Antikörpern ergeben. Die nützlichsten menschlichen Antikörper für die Therapie sind jene, die gegen Zelloberflächenmoleküle, wie Rezeptoren, Adhäsine und Integrine, gerichtet sind, und jene, die gegen zirkulierende biologische Effektormoleküle, wie Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine, gerichtet sind. Es war extrem schwierig, menschliche Antikörper gegen solche Selbstantigene zu erhalten. Diese Erfindung stellt eine wirksame Möglichkeit bereit, solche Antikörper zu erhalten.
Es ist eine herausfordernde Aufgabe, ein Antikörperfragment mit Spezifität gegen Selbstantigen zu isolieren. Tiere erzeugen normalerweise keine Antikörper gegen Selbstantigene, ein Phänomen, das als Toleranz bezeichnet wird (G.J. Nossal, Science 245, 147–153, 1989). Autoimmunerkrankungen können durch einen Zusammenbruch der Toleranz entstehen. Im Allgemeinen führt eine Impfung mit einem Selbstantigen zu keiner Bildung von Antikörpern im Kreislauf. Es ist daher schwierig, Antikörper gegen Selbstantigene zu erzeugen, insbesondere beim Menschen. Es ist möglich, Antikörper in einem Tier, wie einer Maus, zu erzeugen, die menschliche Antigene erkennen, insbesondere, wenn das menschliche Antigen nicht zu eng mit einem Äquivalent in dem Tier verwandt ist. Wenn dann ein menschlicher Antikörper erforderlich ist, muss der Antikörper "humanisiert" werden. z.B. durch CDR-Grafting (Patent GB2188638B).
Die Phage-Antikörper-Technik, wie in (WO92/01047) beschrieben, bietet die Möglichkeit, solche menschlichen Antikörper direkt zu isolieren. In dieser Anmeldung zeigen wir das erste Mal, dass Antikörper gegen Selbstantigene von Phage-Bibliotheken isoliert werden können, die zum Beispiel von nicht immunisierten Quellen abgeleitet werden, und von Bibliotheken, die durch synthetische Rekombination von V-Gensequenzen, vorzugsweise Rekombination von VH- mit DH- und JH-, und VL- mit JL-Sequenzen, hergestellt werden.
Diese Antikörper sind für ihr Antigen spezifisch. Diese Anmeldung zeigt, dass einzelne Bibliotheken, die auf diese Art abgeleitet werden, als Quelle sowohl für fremde als auch Selbstantigene dienen können und eröffnen die Perspektive für eine große universelle Bibliothek zur Isolierung von Antikörpern gegen jedes Antigen.
In der Patentanmeldung WO92/01047 wurde offenbart, dass Antikörperfragmente auf der Oberfläche von Bakteriophagen exponiert werden können und Antigen binden. Antikörperfragmente können direkt unter Verwendung dieses Merkmals selektiert werden. Diese Fähigkeit, Antikörperfragmente (Fab, Fv, scFv und VH) unter Verwendung ihrer Exposition auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen zu isolieren, hat die Perspektive für eine Isolierung von Antikörperspezifitäten (d.h., Antikörper, die gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet sind) eröffnet, die zuvor schwierig oder unmöglich zu isolieren waren. Insbesondere zeigt WO92/01047, dass Antikörperspezifitäten von einem Menschen isoliert werden können, der nicht spezifisch immunisiert ("nicht immunisiert") wurde, sogar Spezifitäten für Antigene wie 2-Phenyl-5-oxazolon, denen Menschen normalerweise nicht ausgesetzt sind.
In Ausführungsformen dieser Erfindung werden natürliche oder synthetische Antikörper-Repertoires, die von menschlichen Sequenzen abgeleitet sind, auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen exponiert, hierin als replizierbares, genetisches Display-Package("replicable genetic display package" – rgdp) bezeichnet, und die Bindungsspezifität für das Selbst durch Bindung an Selbstantigen selektiert. In diesem Verfahren werden die V-Gen-Repertoires von V-Genen abgeleitet, die in vitro oder in vivo und/oder durch Mutation eines oder mehrerer V- Genen umgeordnet wurden. Ein Schlüsselmerkmal der V-Gen-Repertoires ist, dass sie in der Sequenz extrem unterschiedlich sind, mit für gewöhnlich mehr als 10⁶ unterschiedlichen Elementen.
Tatsächlich ist es möglich, dass eine ausreichend große Bibliothek eine Quelle für Spezifitäten bereitstellen kann, die gegen jedes Selbstantigen gerichtet sind. Die V-Gen-Repertoires werden in einen filamentösen Phagen (rgdp) geklont, so dass die Antikörper-Repertoires auf der Oberfläche des rgdp exponiert werden. Die rgdps, die für seltene Antikörperspezifitäten kodieren, die an Antiselbst binden, können mit Hilfe der Bindung an das Selbstantigen selektiert werden. Die Antikörper-Repertoires können in ein Einzel-Replikon- oder Doppel-Replikon-Format geklont werden, wie in WO92/01047 und PCT/GB92/00883 beschrieben.
Die V-Gene können in das genetische Material von rgdp geklont und als einzelne Domäne exprimiert werden, zum Beispiel einzelne variable Domäne der schweren Kette, sogenannte Einzeldomäne-Liganden oder "dAbs" (siehe WO90/01544), oder als variable Domäne der schweren und leichten Ketten eines zugehörigen Antikörpers.
Die zwei Domäne könnten als getrennte Polypeptidketten exponiert sein (Verbunden wie bei Fab-Fragmenten durch nicht kovalente Bindung von Domänen und/oder Disulfidbindungen), oder als Teil derselben Kette (Einketten-Fv-Fragmente, wo die beiden Domäne in derselben Polypeptidkette enthalten sind).
In WO92/01047 und den Beispielen 1 bis 8 dieser Anmeldung wurde eine Fusion von Antikörperfragmenten an das Gen-3-Protein eines filamentösen Bakteriophagen verwendet, um Antikörperfragmente zu exponieren und zu selektieren. Eine alternative Methode wäre die Fusion von Antikörperfragmenten an Gen-8-Protein oder andere Oberflächenmoleküle eines filamentösen Bakteriophagen.
Die Isolierung menschlicher Antikörper, die gegen menschliche Antigene gerichtet sind, ist eine herausfordernde Aufgabe. Es gibt nur eine begrenzte Anzahl mensch licher Antigene, gegen die zirkulierende menschliche Antikörper von Natur aus vorgefunden werden. Es sind Antikörper vorhanden, die gegen Nicht-Selbstantigene menschlichen Ursprungs gerichtet sind. Antikörper, die gegen die menschliche Blutgruppe B gerichtet sind, wurden aus einer Phage-Display-Bibliothek isoliert, die von Probanden der Blutgruppe 0 erstellt wurde (J.D. Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597, 1991), die das Blutgruppe B-Antigen als fremd erkennen.
Diese Erfindung betrifft ein allgemeines Verfahren für die Isolierung von Antikörpern, die gegen Selbstantigene gerichtet sind, die für das fragliche Antigen spezifisch sind. Viele Patienten zeigen signifikante Konzentrationen zirkulierender Autoantikörper. Es wird geschätzt, dass 10 bis 30 % der B-Lymphozyten in normalen, gesunden Individuen an der Bildung von Autoantikörpern beteiligt sind (I.R. Cohen und A. Coooke, Immunol. Today 7, 363–364, 1986). Die gebildeten "natürlichen Autoantikörper" eignen sich jedoch nicht zur therapeutischen Verwendung, da sie häufig IgM, von geringer Affinität und polyreaktiv sind (P. Casali und A.L. Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515–531, 1989; S. Avramaeas, Immunol. Today 12, 154–159). Eine Autoimmunreaktion kann bei einer Autoimmunerkrankung oder nach Infektionen entstehen, und einige monoklonale Antikörper, die gegen Selbstantigene gerichtet sind, wurden von Patienten mit Autoimmunerkrankung isoliert (K. James & G.T. Bell, J. Immunol. Methods 100, 5–40, 1987). Diese Autoantikörper sind häufig spezifisch, können aber nur an einen begrenzten Bereich von Epitopen an dem Antigen binden (M. Bouanani et al., Arthritis Rheum. 34, 1585–1593, 1991).
Die Erstellung von V-Gen-Bibliotheken, die von der mRNA von Plasmazellen abgeleitet werden, die IgG (oder IgM) Antikörper sezernieren, kann somit zu der Isolierung von Antikörperfragmenten führen, die von Autoantikörpern abgeleitet sind. Zum Beispiel könnten Antiselbst-Antikörper von Patienten mit Autoimmunerkrankungen isoliert werden; es wäre zum Beispiel denkbar, Anti-Acetylcholin-Rezeptor-Antikörper von Antikörper-Repertoires zu isolieren, die aus der IgG mRNA von Patienten mit Erb-Goldflam-Syndrom gebildet werden. Zum Beispiel wurde ein Antikörperfragment, das für menschliche Iodidperoxidase spezifisch ist, aus einer Bakteriophage-lambda-Bibliothek von einem Patienten mit einer Schilddrüsen- Autoimmunerkrankung isoliert (S. Portolano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 372–377, 1991). Dies erforderte jedoch ein teures Screening von 200.000 Plaques, um einen Klon zu erhalten. Zusätzlich wurde dies Bibliothek von Schilddrüsengewebe abgeleitet, ein Verfahren, das in den meisten Fällen nicht einfach anwendbar ist.
Im Gegensatz dazu ermöglicht die verfügbare Selektionsleistung mit dem Phage-System, wie in WO92/01047 gezeigt, die sofortige Isolation von Autoantikörpern aus der IgM mRNA peripherer Blutlymphozyten eines Spenders ohne Erkrankung.
Wir zeigen in Beispiel 2, dass Antikörper, die an menschliches Thyroglobulin binden (das sich in den Seren von Menschen mit oder ohne symptomatische Auto-Immunerkrankung befindet), aus Phage-Repertoires von nicht immunisierten Menschen isoliert werden können. Es wäre nicht unbedingt zu erwarten, dass Antikörper gegen menschliches Thyroglobulin durch Immunisierung eines Menschen mit menschlichem Thyroglobulin zu erhalten wären, ungeachtet des Vorhandenseins von Thyroglobulin-Autoantikörpern in vielen Menschen. Es wurde häufig berichtet, dass Autoantikörper gegen Thyroglobulin in normalen Seren ein hohes Maß an Polyreaktivität aufweisen (S. Avrameas, 1991, supra). Im Gegensatz dazu, sind jene, die unter Verwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Phage-Antikörper-Technik isoliert werden, siehe Beispiel 2 zum Beispiel, für Thyroglobulin spezifisch.
In dieser Anmeldung zeigen wir auch, dass selbst Antikörper gegen den menschlichen Tumornekrose-Faktor-α, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus derselben Bibliothek isoliert werden können, wie die Antikörper, die gegen Thyroglobulin gerichtet sind. Viele Selbstantigene haben keine nachweisbaren, zugehörigen, zirkulierenden Autoantikörper. Ferner zeigt Beispiel 3 die Isolierung von Antikörpern gegen die Selbstantigene Mucin, carcinoembryonisches Antigen (CEA) und CD4, für die in normalen Seren keine Antikörper berichtet wurden. Ferner sind diese Antikörper spezifisch, während häufig ein hohes Maß an Polyreaktivität in natürlichen Autoantikörpern vorliegt, die manchmal vorgefunden werden können. Die große Mehrheit von Selbstantigenen haben keine nachweisbaren, zugehörigen zirkulierenden Autoantikörper.
Daher eröffnet die Isolierung von Antiselbst-Antikörpern, wie in dieser Erfindung beschrieben, die Perspektive für die direkte Isolierung menschlicher Antikörper, die an menschliche Antigene binden, für zahlreiche Zwecke, wie Antikörper, die an zirkulierende Hormone binden, um deren Wirkung zu blockieren, zu modifizieren oder zu verstärken, oder Antikörper, die an Zelloberflächenantigen binden, um zum Beispiel Krebszellen darzustellen oder abzutöten.
Der Ursprung der V-Gene, die zu Antiselbst-Antikörpern beitragen, die von Phage-Display-Bibliotheken isoliert werden, ist nicht klar. Eine Toleranz gegenüber Selbstantigenen durch das Immunsystem (die die Bildung von Antikörpern verhindert, gegen diese gerichtet sind) wird entweder durch klonale Deletion oder funktionale Inaktivierung (Anergie) selbstreaktiver B-Lymphozyten vermittelt (D.A. Nemazee & K. Burki, Nature 337, 562–566, 1989; C.C. Goodnow et al., Nature 334, 676–682, 1988; S. B. Hartley et al., Nature 353, 765–769, 1991; D.M. Russell et al., Nature 354, 308-311, 1991). In jedem Fall sind wenige zirkulierende Antiselbst-Antikörper für die meisten Antigene nachweisbar.
Im Falle einer Anergie jedoch, sind funktional inaktivierte, selbstreaktive Zellen von der B-Zelllinie in pheripheren lymphoiden Organen vorhanden, die zu B-Zellen im Kreislauf führen. Diese seltenen Lymphozyten mit Antiselbst-Spezifität können schwere oder leichte Kette-Partner (oder sogar beide) für Phage-Antikörper mit Antiselbst-Spezifität bereitstellen. Als Alternative können solche Antiselbst-Spezifitäten aus der Kombination einer VH-Domäne mit einer VL-Domäne in der Bibliothek entstehen, um eine Spezifität zu erhalten, die normalerweise deletiert wird, wenn sie in der Natur vorkommt. Aus diesem Grund können Kombinationsbibliotheken und "chain-shuffled" Bibliotheken, wie in der Patentanmeldung WO92/01047 beschrieben, besonders reiche Quellen für Antiselbst-Antikörper sein. Ein Selektionsverfahren höherer Leistung, wie jenes, das durch Phage-Antikörper bereitgestellt wird, ist erforderlich, um solche seltenen Antiselbst-Antikörper zu erhalten.
Das Ausmaß einer somatischen Mutation, das in Antiselbst-Antikörperfragmenten beobachtet wird, die durch Phage-Technik in dieser Anmeldung isoliert wurden, zeigt, dass einige Keimliniensequenzen haben und daher aus Virgin-B-Zellen entstanden sind. Andere Antikörper, die durch Phage-Antikörper-Technik in dieser Anmeldung isoliert wurden, weisen eine somatische Hypermutation auf, die zeigt, dass die V-Gene durch Antigen stimuliert wurden, entweder durch ein fremdes, kreuzreaktives Antigen oder andere fremde Antigene. In beiden Fällen sind die Antikörperfragmente, die unter Verwendung der Phage-Technik isoliert wurden, für gewöhnlich eine Kombination aus VH- und VL-Domänen, die ursprünglich in den B-Lymphozyten nicht vorhanden sind, und die Leistung der Phage-Technik, wie in dieser Anmeldung beschrieben, ermöglicht ihre Isolierung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhalten eines Elements eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element) bereitgestellt, wobei das sbp-Element ein Antikörper oder Antikörperfragment mit einer Antigenbindungsstelle mit Bindungsspezifität für ein Antigen ist, das ein menschliches Selbstantigen ist, für das keine spezifischen Antikörper in Seren von Menschen vorgefunden werden, die mit dem Antigen nicht immunisiert sind, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Die Bereitstellung einer Bibliothek, die filamentöse Bakteriophagen umfasst, wobei jeder filamentöse Bakteriophage auf seiner Oberfläche ein sbp-Element exponiert, und jeder filamentöse Bakteriophage Nucleinsäure mit einer Sequenz enthält, die von einem Menschen abgeleitet ist, der mit dem Selbstantigen nicht immunisiert ist, keine Autoimmunerkrankung gegen das Selbstantigen hat, und keine Antikörper hat, die für das Selbstantigen spezifisch sind, die in den Seren vorhanden sind, und die für eine Polypeptidkette kodiert, die Bestandteil des sbp-Elements ist, das an der Oberfläche dieses filamentösen Bakteriophagen exponiert ist;
(b) das Selektieren eines oder mehrerer sbp-Elemente mit Bindungsspezifität für das Selbstantigen durch Bindung an das Selbstantigen.

Der Polypeptidbestandteil, für den die Nucleinsäure in jedem filamentösen Bakteriophagen (rgdp) kodiert, kann eine VH- oder VL-Domäne eines Antikörpers sein, oder ein Teil eines Antikörpers, der entweder alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Bestandteilen ein Antikörperfragment bildet, das zur Bindung eines Antigens imstande ist. Beispiele für Polypeptidketten, die als Bestandteile eines sbp-Elements verwendet werden können, wie zuvor beschrieben, enthalten daher zusätzlich zu VH- und VL-Domänen, V_LC_L, V_HC_H1, scFv-Fragmente, Fab-Fragmente und so weiter.
Jedes sbp-Element, das auf der Oberfläche eines rgdp exponiert ist, kann ein Antikörperfragment sein, das eine V_H-Domäne und eine V_L-Domäne umfasst.
Jedes Antikörperfragment kann ein scFv-Fragment, ein Fab-Fragment, ein Fv-Fragment sein, das aus der V_L- und V_H-Domäne eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht, ein Einzeldomänen-Bindungsligand, der im Wesentlichen aus einer variablen Domäne der schweren Kette (Fd) besteht oder diese umfasst, oder jedem anderen Fragment, das die Fähigkeit zur Bindung eines Epitops oder Antigens aufweist.
Der Schritt zur Bereitstellung einer Bibliothek aus rgdps kann Folgendes umfassen:
das Kombinieren (i) eines ersten Polypeptidketten-Bestandteils eines sbp-Elements, das an eine Komponente eines rgdp fusioniert ist, wodurch bei Expression in einem rekombinanten Wirtszellenorganismus der erste Polypeptidketten-Bestandteil oder eine Population davon auf der Oberfläche von rgdps exponiert wird, oder einer Population eines derartigen, an die Komponente eines rgdp fusionierten ersten Polypeptidketten-Bestandteils mit (ii) einem zweiten Polypeptidketten-Bestandteil eines sbp-Elements oder mit einer Population eines derartigen zweiten Polypeptidketten-Bestandteils, um eine Bibliothek von auf der Oberfläche von rgdps exponierten sbp-Elementen zu bilden;
wobei für zumindest einen von erstem und zweitem Polypeptidketten-Bestandteil oder für zumindest eine der Populationen davon eine Nucleinsäure kodiert, die unter Verwendung der Komponente eines rgdp verpackt werden kann.
Der Schritt zum Bereitstellen einer Bibliothek von rgdp kann Folgendes umfassen:
das Exprimieren des an eine Komponente eines rgdp fusionierten ersten Polypeptidketten-Bestandteils eines sbp-Elements oder einer Population eines solchen ersten Polypeptidketten-Bestandteils in einem rekombinanten Wirtsorganismus, der dadurch den Polypeptidketten-Bestandteil auf der Oberfläche von rgdps exponiert;
das Kombinieren des ersten Polypeptidketten-Bestandteils oder einer Population mit einem zweiten Polypeptidketten-Bestandteil eines sbp-Elements oder einer Population eines solchen zweiten Polypeptidketten-Bestandteils zur Bildung einer Bibliothek von rgdps, die jeweils ein sbp-Element auf ihrer Oberfläche exponieren, wobei zumindest einer der Polypeptidketten-Bestandteils von Nucleinsäure exprimiert wird, die unter Verwendung der Komponente eines rgdp verpackt werden kann.
Wenn das sbp-Element ein Fab-Fragment ist, kann der erste und zweite Polypeptidketten-Bestandteil ein Polypeptid ist, das aus einer V_L- und einer C_L-Domäne besteht, und der zweite Polypeptidketten-Bestandteil ein Polypeptid, das aus einer V_H- und C_H1-Domäne besteht.
Das Kombinieren des ersten und zweiten Polypeptidketten-Bestandteils oder von Populationen derselben kann auf dem Nucleinsäure-Niveau mit Expressionsvektoren erfolgen, in die jeweils eine Sequenz eingefügt wurde, die für einen ersten Bestandteil kodiert, und eine Sequenz, die für einen Sequenz-Bestandteil kodiert. Andererseits kann die Kombination auf dem Polypeptid-Niveau erfolgen, wobei die ersten Bestandteile nicht von denselben Vektoren exprimiert werden wie die zweiten Bestandteile. Tatsächlich kann der eine oder andere von dem ersten und zweiten Bestandteil als lösliche Bibliothek bereitgestellt werden. Einzelheiten für verschie dene Formate, die verwendet werden können, finden sich in WO92/01047 und PCT/GB92/00883.
Der Schritt zum Bereitstellen einer Bibliothek kann Folgendes umfassen:
das Kombinieren (i) von Nucleinsäure, die für einen, an eine Komponente eines rgdp fusionierten, ersten Polypeptidketten-Bestandteil eines sbp-Elements kodiert, oder für eine Population eines solchen, an eine Komponente eines rgdp fusionierten, ersten Polypeptidketen-Bestandteils, mit (ii) Nucleinsäure, die für einen zweiten Polypeptidketten-Bestandteil eines sbp-Elements kodiert, oder für eine Population eines solchen, um eine Bibliothek von Nucleinsäure zu bilden, wobei Nucleinsäure der Bibliothek unter Verwendung der Komponente eines rgdp verpackt verwendet kann;
das Exprimieren des an eine Komponente eines rgdp fusionierten ersten Polypeptidketten-Bestandteils oder einer Population davon und des zweiten Polypeptidketten-Bestandteils eines sbp-Elements oder einer Population davon in einem rekombinanten Wirtsorganismus, um eine Bibliothek von rgdps zu bilden, die jeweils auf ihrer Oberfläche ein sbp-Element exponieren und Nucleinsäure enthalten, die für einen ersten und einen zweiten Polypeptidkette-Bestandteil des auf ihrer Oberfläche exponierten sbp-Elements kodiert.
Leser werden gebeten, falls nähere Einzelheiten zu einem hier beschriebenen Verfahren erwünscht sind, insbesondere WO92/01047 zu beachten.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden sowohl der erste wie auch zweite Polypeptidketten-Bestandteil oder Populationen davon von Nucleinsäure exprimiert, die imstande ist, unter Verwendung der Komponente eins rgdp verpackt zu werden. Dies kann der Fall sein, wenn die Bestandteile gemeinsam ein Fab-Fragment bilden, oder eher, wenn jedes sbp-Element, das auf der Oberfläche eines rgdp exponiert ist, ein scFv-Antikörperfragment ist.
In einer Ausführungsform kann jeder zweite Polypeptidketten-Bestandteil oder eine Population davon von einer Nucleinsäure exprimiert werden, die getrennt von der Nucleinsäure ist, von der der erste Polypeptidketten-Bestandteil oder eine Population davon exprimiert wird. Die Nucleinsäure, die für den ersten Polypeptidketten-Bestandteil kodiert, kann sich auf demselben Expressionsvektor befinden wie die Nucleinsäure, die für den zweiten Polypeptidketten-Bestandteil kodiert, aber getrennt von dieser, so dass zum Beispiel Fab-Fragmente erzeugt werden. Als Alternative kann die Nucleinsäure, die für den ersten Polypeptidketten-Bestandteil kodiert, auf einem anderen Expressionsvektor vorhanden sein als die Nucleinsäure, die für einen zweiten Polypeptidketten-Bestandteil kodiert. Wenn ein erster und zweiter Polypeptidketten-Bestandteil auf demselben Expressionsvektor kodiert werden, können sie als scFv-Fragmente exprimiert werden, wo eine VH-Domäne durch einen Polypeptid-Linker mit einer VL-Domäne verbunden ist, so dass jedes scFv eine einzelne Polypeptidkette ist.
Jedes sbp-Element, das auf der Oberfläche eins rgdp exponiert ist, ist ein Fab-Antikörperfragment.
Die Nucleinsäure kann z.B. von umgeordneten V-Genen eines nicht immunisierten Menschen abgeleitet werden. Es ist besonders schwierig, Antikörper zu erhalten, die menschliche Selbstantigene erkennen (d.h., spezifisch binden).
Die Nucleinsäure kann von einer Bibliothek abgeleitet werden, die durch künstliche oder synthetische Rekombination von V-Gensegmenten hergestellt wird, die Keimlinien-V-Gensequenzen sein können. Die Bibliothek kann vollkommen synthetisch sein.
Sbp-Elemente, die in (b) selektiert werden und auf der Oberfläche von rgdps exponiert sind, können so selektiert oder gescreent werden, dass ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population solcher sbp-Elemente bereitgestellt wird, die jeweils in ihren entsprechenden rgdps Nucleinsäure enthalten, die für das sbp-Element oder eine Polypeptidkette desselben kodiert. Rgdp-Phage, der sbp- Elemente exponiert, die in (b) selektiert wurden, kann gezüchtet werden, um deren Anzahl vor jeder weiteren Selektion oder jedem Screening zu erhöhen. Nucleinsäure, die für ein selektiertes oder gescreentes sbp-Element kodiert und die von einem rgdp abgeleitet wird, das an seiner Oberfläche ein selektiertes oder gescreentes sbp-Element exponiert, kann zum Exprimieren eines sbp-Elements oder eines Fragments eines Derivates desselben in einem rekombinanten Wirtsorganismus verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst jedes Verfahren, in dem Nucleinsäure von einem oder mehreren rgdps, die aus einer Bibliothek durch Bindung an ein Selbstantigen selektiert sind, genommen und zur Bereitstellen kodierender Nucleinsäure in einem weiteren Verfahren (gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung oder nicht) verwendet wird, um ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population von sbp-Elementen oder eine dafür kodierenden Nucleinsäure zu erhalten.
Das Expressionsendprodukt, das selektierte sbp-Element, kann zur Erzeugung eines Derivates modifiziert werden.
Das Expressionsendprodukt oder Derivat davon kann zur Herstellung eines therapeutischen oder prophylaktischen Medikaments oder eines Diagnoseprodukts verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörperfragmente, Derivate davon, einschließlich -ganze Antikörper und Fusionen mit Enzymen, die unter Verwendung eines hierin beschriebenen Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird in einem Verfahren gemäß einer hier beschriebenen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Sets vorgesehen, das eine Bibliothek von Vektoren umfasst, die jeweils Nucleinsäure umfassen, die in rgdps verpackt werden kann, und die für einen Polypeptidketten-Bestandteil eines Antikörpers zur Exposition auf der Oberfläche von rgdps kodiert.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch für die Verwendung eines Sets in einem Verfahren gemäß einer hier beschriebenen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gesorgt, das eine Bibliothek von rgdps umfasst, die jeweils Nucleinsäure enthalten, die zumindest für einen Polypeptidketten-Bestandteil eines Antikörpers kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt im Allgemeinen ein Verfahren zur Herstellung eines replizierbaren, genetischen Display-Package (rgdp) oder einer Population solcher rgdps bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einsetzen einer Nucleotidsequenz, die für ein Bindungsmolekül kodiert, das ein Element eines spezifischen Bindungspaares und ein Antiselbst-Antikörper ist, in ein virales Genom;
(b) Züchten des Virus, das die Nucleotidsequenz enthält, so dass das Bindungsmolekül exprimiert und von dem Virus auf seiner Oberfläche exponiert wird.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Selektieren eines rgdp bereit, das für ein bestimmtes Selbstantigen-Epitop spezifisch ist, das das Erzeugen einer Population solcher rgdps und den zusätzlichen Schritt des Selektierens auf das Bindungsmolekül umfasst, das ein Antiselbst-Antikörper ist, durch Kontaktieren der Population mit dem Epitop, so dass einzelne rgdps mit der gewünschten Spezifität an das Epitop binden können. Das Verfahren kann einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Schritte umfassen: (i) Trennen gebundener rgdps von dem Epitop; (ii) Gewinnen abgetrennter rgdps und (iii) Verwenden der eingesetzten Nucleotidsequenzen von abgetrennten rgdps in einem rekombinanten System zur Herstellung des Bindungsmoleküls getrennt vom Virus. Der Selektionsschritt kann die Nucleotidsequenz isolieren, die für das Bindungsmolekül gewünschter Spezifität kodiert, indem das Bindungsmolekül in Verbindung mit der Oberfläche des Virus exprimiert wird, in dem die kodierende Nucleinsäure enthalten ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen eines multimeren Elements eines spezifischen Bindungspaares (spb) bereit, das ein Antiselbst-Antikörper ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
das Exprimieren einer ersten Polypeptidkette des sbp-Elements oder einer genetisch andersartigen Population des sbp-Elements, fusioniert an eine Komponente eines sezernierten, replizierbaren, genetischen Display-Packages (rgdp) in einem rekombinanten Wirtsorganismus, wodurch das Polypeptid auf der Oberfläche des Package exponiert wird, und das Exprimieren einer zweiten Polypeptidkette des Multimers in einem rekombinanten Wirtsorganismus und das Bewirken oder Zulassen, dass die Polypeptidketten zusammenkommen, um das Multimer als Teil des rgdp zu bilden, wobei zumindest eine der Polypeptidketten von Nucleinsäure exprimiert wird, die unter Verwendung der Komponente dafür verpackt werden kann, wobei das genetische Material jedes rgdp für eine solche Polypeptidkette kodiert.
Beide derartige Ketten können in demselben Wirtsorganismus exprimiert werden.
Die erste und zweite Kette des Multimers können als separaten Ketten von einem einzigen Vektor exprimiert werden, der ihre entsprechende Nucleinsäure enthält.
Zumindest eine der Polypeptidketten (oder der Polypeptidketten-Bestandteile) kann von einem Phage-Vektor exprimiert werden.
Zumindest eine der Polypeptidketten kann von einem Phagemid-Vektor exprimiert werden, wobei das Verfahren die Verwendung eines Helfer-Phagen, oder eines Plasmids, das komplementierende Phage-Gene exprimiert, umfasst, um die Verpackung des Phagemid-Genoms zu unterstützen, und die Komponente der rgdp ein Capsidprotein dafür ist. Das Capsidprotein kann im Helfer-Phage fehlen, schadhaft oder bedingt schadhaft sein.
Das Verfahren kann das Einführen eines Vektors, der zum Exprimieren der ersten Polypeptidkette imstande ist, in einen Wirtsorganismus umfassen, der die zweite Polypeptidkette in freier Form exprimiert, oder das Einführen eines Vektors, der zum Exprimieren des zweiten Polypeptids in freier Form imstande ist, in einen Wirtsorganismus umfassen, der die erste Polypeptidkette exprimiert.
Jede Polypeptidkette kann von Nucleinsäure exprimiert werden, die als rgdp unter Verwendung des Komponentenfusionsprodukts verpackt werden kann, wobei Nucleinsäuren, die für beide Polypeptidketten kodieren, in den entsprechenden rgdps verpackt sind.
Die Fusionen können in Abwesenheit der rgdp-Display-Komponente, möglicherweise Capsid, exprimiert in der Wildtyp-Form, exprimiert werden.
Das Capsidprotein kann im Helfer-Phage fehlen, schadhaft oder bedingt schadhaft sein.
Die Wirtszelle kann ein Mutatorstamm sein, der genetische Diversität in die sbp-Element-Nucleinsäure einführt.
Das rgdp ist ein filamentöser Bakteriophage, der Wirt kann ein Bakterium sein und die Komponente des rgdp ist ein Capsidprotein für den Bakteriophagen. Der Phage kann aus Phagen der Klasse I, fd, M13, f1, If1, Ike, ZJ/Z, Ff, und Phagen der Klasse II, Xf, Pf1 und Pf3 selektiert werden.
Der Phage kann fd oder ein Derivat von fd sein. Das Derivat kann Tetracyclinresistent sein. Das sbp-Element oder die Polypeptidkette davon kann als Fusion mit dem Gen III Capsidprotein von Phage fd oder seinem Gegenstück in einem anderen filamentösen Phagen exprimiert werden. Das sbp-Element oder die Polypeptidkette davon kann in die N-terminale Region des reifen Capsidproteins stromabwärts eines sekretorischen Leader-Peptids eingefügt sein. Die Sequenz kann nach Aminosäure +1 des reifen Proteins eingefügt sein.
Die Einfügungsstelle kann von kurzen Sequenzen flankiert sein, die den Sequenzen entsprechen, die an jedem Ende der Nucleinsäure erscheinen, die einzusetzen ist.
Der Wirt kann E. coli sein.
Nucleinsäure, die für ein sbp-Element-Polypeptid kodiert, kann stromabwärts mit einem viralen Capsidprotein durch ein unterdrückbares, translationales Stopp-Codon gebunden sein, so dass unter Bedingungen, wo der Stopp unterdrückt ist, Fusionsproteine erzeugt werden, die sbp-Element-Polypeptid und virales Capsidproten umfassen, während unter nicht unterdrückenden Bedingungen sbp-Element-Polypeptide in freier Form erzeugt werden.
Selektionssysteme und Assay-Formate werden an anderer Stelle in diesem Text besprochen. In diesen Systemen und Formaten wird die Gensequenz, die für das Bindungsmolekül (z.B. den Antikörper) gewünschter Spezifität kodiert, von einer allgemeinen Population von rgdps mit einem Bereich von Spezifitäten aufgrund ihrer Bindung an ein spezifisches Ziel (z.B. das Antigen oder Epitop) getrennt. Somit können rgdps, die durch diese Expression gebildet werden, selektiert oder gescreent werden, um ein einzelnes sbp-Element oder eine selektierte gemischte Population der sbp-Elemente bereitzustellen, die in ihren entsprechenden rgds mit Nucleinsäure verbunden _ sind, die für das sbp-Element oder eine Polypeptidkette desselben kodiert. Die rgdps können mittels Affinität zu einem Element selektiert werden, das zu dem sbp-Element komplementär ist.
Alle rgdps, die an das zweite Element gebunden sind, können durch Waschen mit einem Elutionsmittel gewonnen werden. Die Waschbedingungen können variiert werden, um rgdps mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten für das Epitop zu erhalten. Als Alternative, z.B. um rgdps hoher Affinität zu erhalten, kann das komplementäre Element (z.b. ein Epitop) der Population von rgdps (z.B. pAbs) präsentiert werden, die bereits an ein Bindungselement gebunden ist, wobei in diesem Fall pAbs mit einer höheren Affinität für das Epitop das bereits gebundene Bindungselement verdrängen. Somit kann der Elutionsmittel ein Molekül enthalten, das mit dem rgdp um die Bindung an das komplementäre sbp-Element konkurriert. Das rgdp kann an dem komplementären sbp-Element in Gegenwart eines Moleküls angewendet werden, das mit dem Package um die Bindung an das komplementäre sbp-Element konkurriert. Nucleinsäure, die von einem selektierten oder gescreenten rgdp abgeleitet wird, kann zum Exprimieren des sbp-Elements oder eines Fragments oder Derivats davon in einem rekombinanten Wirtsorganismus verwendet werden.
Nucleinsäure von einem oder mehreren rgdps kann genommen und zum Bereitstellen kodierender Nucleinsäure in einem weiteren Verfahren verwendet werden, um ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population von sbp-Elementen, oder eine dafür kodierende Nucleinsäure zu erhalten. Das Expressionsendprodukt kann modifiziert werden, um ein Derivat davon zu erzeugen.
Eine bevorzugte Quelle für die Bildung verschiedener Bibliotheken von nicht immunisierten Menschen ist IgM mRNA. In Beispiel 43 von WO92/01047 wurde festgestellt, dass Antikörperfragmente, die gegen das Truthahn-Ei-Lysozym und 2-Phenyl-5-oxazolon gerichtet waren, viel leichter aus einer Phage-Bibliothek isoliert wurden, die von der IgM mRNA von nicht immunisierten menschlichen Spendern abgeleitet wurde, als von einer, die aus IgG mRNA hergestellt wurde. Ferner konnten keine 2-Phenyl-5-oxazolon-Bindungsantikörperfragmente von einer Bibliothek aus 2.000.000 Phage-Antikörperklonen isoliert werden, die aus IgG mRNA nicht immunisierter Mäuse hergestellt worden waren (T. Clackson et al., Nature 352, 624–628, 1991). Die Beispiele 1 bis 3 dieser Anmeldung zeigen die Isolierung von Antikörpern, die für Selbstantigen spezifisch sind, aus der IgM-Bibliothek. Obwohl in diesen Proben die Antiselbst-Spezifitäten als Einketten-Fv-Fragmente in einem einzelnen Replikonformat selektiert wurden, konnten Antikörperspezifitäten als Fab-Fragmente in einem Einzel-Replikonformat oder in einem doppelten, kombinatorischen, Doppel-Replikonformat selektiert werden (Hoogenboom et al., 1991, supra), zum Beispiel unter Verwendung einer Rekombination mit dem IoxP-System (PCT/GB92/00883).
Phage-Bibliotheken können hergestellt werden, die mit Antikörpern angereichert sind, die gegen das Selbst gerichtet sind. B-Lymphozyten exprimieren Oberflächen-IgM und Oberflächen-IgD vor der Stimulierung mit Antigen, exprimieren aber wenig lösliches IgM oder IgD. Diese nicht stimulierten Zellen enthalten mit größerer Wahrscheinlichkeit Antikörpergene mit Antiselbst-Spezifitäten. Im Gegensatz dazu exprimieren terminal differenzierte Plasmazellen, die lösliche Antikörper sezernieren, wenig Oberflächenimmunoglobulin. Die Herstellung von cDNa für die Bildung einer Phage-Bibliothek unter Verwendung von Primern, die für Oberflächen-IgM oder Oberflächen-IgD spezifisch sind, erzeugt ein Repertoire von Antikörpergenen, das mit naiven, unselektierten Genen angereichert ist, die für V-Domäne kodieren. In B-Lymphozyten, die funktionell ruhiggestellt wurden, indem sie dem Selbst ausgesetzt wurden, gibt es deutlich verringerte Werte von Oberflächen-IgM, aber unveränderte Werte von Oberflächen-IgD (C.C. Goodnow et al., supra). Somit kann ein Primer, der für Oberflächen-IgD spezifisch ist, zur Isolierung von Antiselbst-Antikörpern besonders geeignet sein.
Wie in dieser Anmeldung gezeigt wird, ist jedoch IgM mRNA von unselektierten, peripheren Blutlymphozyten eine bevorzugte Quelle für V-Gene für Antiselbst-Spezifitäten. Andere Quellen solcher Antiselbst-Antikörper können fötale mRNA oder Nabelschnurblut-mRNA sein (P.M. Lydyard et al., Scand. J. Immunol. 31, 33–43, 1990).
Es gibt ein- Potenzial zur Herstellung von Repertoires für das Phage-Display unter Verwendung der ursprünglichen Kombination von VH- und VL-Domänen durch die Verwendung von PCR und Verbindung der Gene, die für diese kodieren, in Zellen, die diese Domäne exprimieren. Das Prinzip der "zellinternen PCR", wo die ursprüngliche VH/VL-Paarung beibehalten wird, wurde in PCT/GB92/01483 gezeigt und von Embleton et al. in Nucleic Acids Res., 20, 3831–3837, 1992, beschrieben. Dies kann besonders nützlich sein, wenn Lymphozyten in einer Stufe vor der Deletion von Klonen, die Antiselbst-Antikörper exprimieren, selektiert werden können.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung können V-Gensequenzen, oder sogar Bibliotheken, die durch synthetische Rekombination von V-, D- und J-Segmenten hergestellt werden, verwendet werden. Diese dienen als reiche Quelle für Antiselbst-Antikörper. In den Beispielen 5 bis 7 zeigen wir, dass Antiselbst-Spezifitäten gegen TNF, menschlichen Anti-Rhesus D-Antikörper (OAK3) und menschliches Thyroglobulin von einer Phage-Antikörper-Bibliothek isoliert werden können, die durch synthetische Verbindung von V-, D- und J-Segmenten hergestellt wird. Die Verwendung von Keimlinien-V-Genen für diesen Zweck, wie in den Beispielen 5 bis 7 dargestellt, sollte für die Isolierung von Antiselbst-Antikörpern wertvoll sein, da es einen gewissen Hinweis gibt, dass B-Lymphozyten, die gegen lösliche Selbstantigene gerichtet sind, funktionell ruhig gestellt sind, und jene, die gegen multivalentes, membrangebundenes Selbstantigen gerichtet sind, eliminiert werden (S.B. Hartley et al., supra; D.M. Russell et al., supra). Somit kann die Verwendung synthetischer Bibliotheken, die durch VH-, DH-, JH- oder VL-, JL- oder VL-, JL-Rekombination in vitro oder deren Äquivalent hergestellt werden, zur Isolierung von Antikörpern besonders vorteilhaft sein, die gegen multivalente, membrangebundene Selbstantigene gerichtet sind.
In den Beispielen 5 bis 7 haben wird synthetische VH CDR3-Segmente verwendet, die Sequenzen von Zufallsbasen an der V-D-J-Verbindungsregion enthalten, und diese an Keimlinien-VH-Gensegmente gebunden. Es können andere Strategien verwendet werden, wie die Bildung jeder der CDR-Schleifen mit Zufallssequenz oder die Bildung der CDR-Schleifen mit bekannten kanonischen Strukturen (C. Chothia et al., Nature 342, 877–893, 1989) und das Einglieder von Zufallssequenzelementen. Die Keimlinieneigenschaft der V- und J-Segmente könnte durch Eingliedern spezifischer oder zufälliger Änderungen in die Sequenz oder durch Verwendung somatisch mutierter V-Genregionen verändert werden. Die Strategie, die in den Beispielen 5 bis 7 verwendet wurde, hat den Vorteil, dass die Schleifenstrukturen der V-Gensegmente nur eine begrenzte Anzahl einzelner Falten und Kombinationen von Falten bilden (C. Chothia et al., J. Mol. Biol. 227, 779–817, 1992) und sich vermutlich zur Stabilität entwickelt haben, und eine Verteilung und einen Bereich von Bindungsstellen erzeugt haben, die gut geeignet sind, sich an die Struktur von Antigenen anzupassen. Ferner sind die Framework-Regionen und die ersten zwei hypervariablen Schleifen sowohl der schweren als auch leichten Kette der synthetischen menschlichen Antikörper wahrscheinlich bei vielen verschiedenen Individuen identisch. Solche synthetischen menschlichen Antikörper könnten weniger immunogen als vollkommen künstliche Strukturen sein.
Eine weitere, aber weniger bevorzugte Alternative zu den oben genannten natürlichen und synthetischen Phage-Display-Bibliotheken wäre die Herstellung von Zufallsmutagenese-Bibliotheken, die auf dem Phage exponiert sind, die von einem oder wenigen menschlichen Antikörpermolekülen abgeleitet sind, und die Selektion von Anti-Selbstantigenspezifitäten aus diesen.
SELEKTION
Einzelne rgdps, die die gewünschte Spezifität für ein Antigen exprimieren, können aus einer Bibliothek unter Verwendung der herkömmlichen Screening-Techniken (z.B. wie von Harlow, E., und Lane, D., 1988, supra, Gherardi, E. et al., 1990. J. Immunol. Meth. 126, S.61–68, beschrieben) isoliert werden.
Die Antragsteller haben auch Selektionstechniken entwickelt, die wegen der einzigartigen Eigenschaften von rgdps durchführbar sind. Die allgemeine Darstellung einiger Screening-Prozeduren wird in 5 unter Verwendung von pAbs als beispielhafter rgdp-Typ gezeigt.
Die Population/Bibliothek von zu screenenden pAbs könnte in vitro durch Mutagenisierung bereits bestehender Phage-Antikörper gebildet werden (unter Verwendung von Techniken, die in der Wissenschaft allgemein bekannt sind, wie Oligonucleotidgerichtete Mutagenese (Sambrook, J., et al., 1989 Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press), oder künstliche Rekombination menschlicher V-Segmente, wie an anderer Stelle beschrieben. Diese Population kann in einem oder mehreren Formaten gescreent werden, wie unten unter Bezug nahme auf 5 beschrieben, um jene einzelnen pABS abzuleiten, deren Antigen-Bindungseigenschaften sich von Probe c unterscheiden.
BINDUNGSELUTION
5(i) zeigt Antigen(ag), das an eine oder mehrere feste Oberfläche(n) gebunden ist, wobei die feste(n) Oberfläche(n) durch eine Petrischale, Chromatographiekugeln, magnetische Kugeln und dergleichen bereitgestellt werden kann (können). Die Population / Bibliothek von pAbs wird dann über das ag geleitet, und jene einzelnen p, die binden, werden nach dem Waschen zurückgehalten und wahlweise mit dem Detektionssytem d nachgewiesen. Es kann ein Detektionssystem verwendet werden, das auf Anti-fd-Antiseren beruht (zum Beispiel siehe Beispiel 4 von WO92/01047). Wenn Proben einer gebundenen Population p unter zunehmend stringenten Bedingungen entfernt werden, nimmt die Bindungsaffinität, die in jeder Probe vorhanden ist, zu. Bedingungen einer erhöhten Stringenz können zum Beispiel durch Verlängern der Einwirkzeit oder Ändern des pH der Einweichlösung usw. erhalten werden.
KONKURRENZ
Unter Bezugnahme auf 5(ii) kann Antigen ag an einen festen Träger s gebunden werden und bis zur Sättigung von dem ursprünglichen Bindungsmolekül c gebunden werden. Wenn eine Population eines mutanten pAb (oder eines Satzes nicht verwandter pAbs) dem Komplex dargeboten wird, binden nur jene, die eine höhere Affinität für das Antigen ag haben als c. In den meisten Beispielen wird nur einer Minderheit der Population c durch einzelne aus der Population p verdrängt. Wenn c ein traditionelles Antikörpermolekül ist, kann das gesamte gebundene Material gewonnen werden und gebundenes p durch Infizieren geeigneter Bakterien und/oder durch die Anwendung von Standardtechniken wie PCR gewonnen werden.
Eine vorteilhafte Anwendung ist, wenn ag als Rezeptor und c als entsprechender Ligand verwendet wird. Die gewonnene gebundene Population p ist dann strukturell mit der Rezeptor-Bindungsstelle und/oder dem Liganden verwandt. Es ist bekannt, dass diese Art von Spezifität in der pharmazeutischen Industrie sehr nützlich ist.
Eine weitere vorteilhafte Anwendung ist, wenn ag ein Antikörper ist und c sein Antigen. Die gewonnene gebundene Population p ist dann ein Anti-Idiotyp-Antikörper, der zahlreiche Anwendungen in der Forschung und der diagnostischen und pharmazeutischen Industrie findet.
Gegenwärtig ist es schwierig, direkt nach Anti-Idiotyp-Antikörpern zu selektieren. pABs würden die Möglichkeit bieten, dies direkt durch Binden von pAb Bibliotheken (z.B. einer naiven Bibliothek) an B-Zellen (die Antikörper auf ihrer Oberfläche exponieren) und Isolieren jener Phage, die gut gebunden sind, durchzuführen.
In einigen Fällen kann es sich als vorteilhaft erweisen, die Population p vorzuselektieren. Zum Beispiel kann in dem vorangehenden Anti-Idiotyp-Beispiel p gegen einen verwandten Antikörper absorbiert werden, der das Antigen nicht bindet.
Wenn c jedoch ein pAb ist, dann können keiner oder beide von c und p vorteilhaft auf gewisse Weise markiert werden, sowohl um sie zu unterscheiden als auch gebundenes p gegenüber gebundenem c zu selektieren. Diese Markierung kann physisch sein, zum Beispiel durch Vormarkieren von p mit Biotin; oder vorteilhafter, genetisch. Zum Beispiel kann c mit einer EcoB-Restriktionsstelle markiert werden, während p mit einer EcoK-Restriktionsstelle markiert wird (siehe Carter, P. et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13, 4431–4443).
Wenn gebundenes p + c von dem Antigen eluiert und zum Infizieren geeigneter Bakterien verwendet werden, kommt es zu einer Restriktion (und somit zu keinem Wachstum) der Population c (d.h., EcoB restriktierende Bakterien in diesem Beispiel). Jeder gezüchtete Phage wäre mit diesen Individuen von p mit höheren Bindungsaffinitäten deutlich angereichert. Als Alternative kann die genetische Markierung durch Markieren von p mit neuen Sequenzen erreicht werden, die zum spezifischen Amplifizieren von p von der Mischung unter Verwendung von PCR verwendet werden können.
Da die gebundenen pAbs zum Beispiel unter Verwendung von PCR oder bakterieller Infektion amplifiziert werden können, ist es auch ein Rescue der gewünschten Spezifität möglich, selbst wenn ungenügend Individuen gebunden werden, um eine Detektion mit herkömmlichen Techniken zu ermöglichen.
Das bevorzugte Verfahren zur Selektion eines Phagen, der ein Proteinmolekül mit einer gewünschten Spezifität oder Affinität exponiert, ist häufig eine Elution von einer Affinitätsmatrix mit einem Liganden. Somit kann ein Selbstantigen oder Fragmente davon zum Eluieren spezifischer Phage-Antikörper von Selbstantigen verwendet werden, das an eine Matrix gebunden ist. Als Alternative kann das homologe Antigen von einer anderen Spezies an eine Matrix gebunden werden, eine gebundene Phage-Antikörper-Bibliothek, und Phage-Antikörper, die für das Selbstantigen spezifisch sind, können unter Verwendung von Selbstantigen eluiert werden. Zum Beispiel kann ein bovines Antigen an die Matrix gebunden werden, eine menschliche gebundene Phage-Antikörper-Bibliothek, und das menschliche Antigen zur Elution verwendet werden. Derart isolierte Antiselbst-Antikörper sind für Epitope spezifisch, die den bovinen und menschlichen Antigenen gemein sind. Eine weitere, aber weniger bevorzugte Alternative kann die nicht-spezifische Bindung des Phagen an eine Säule und die Elution mit Selbstantigen sein. Wenn zum Beispiel eine Fab-Phage-Bibliothek an eine Anti-Fab-Affinitätssäule gebunden ist, kann diese bei einem pH gewaschen werden, der keinen nicht-spezifischen Phagen eluiert, und dann mit einer Lösung gewaschen werden, welche dieselbe ist, mit der Ausnahme, dass sie Selbstantigen enthält, wodurch es aufgrund der höheren Affinität für die mobile Phase von Phage exprimierenden Antikörper gegenüber dem Selbstantigen zu einer Elution kommt.
Für jedes dieser Formate sollte eine Elution mit zunehmenden Liganden-Konzentrationen Phagen eluieren, die Bindungsmoleküle zunehmender Affinität exponieren. Wenn jedoch zum Beispiel ein pAb an sein Antigen mit hoher Affinität oder Avidität (oder ein anderes Protein an seinen Bindungspartner) bindet, könnte es nicht möglich sein, den pAb von einer Affinitätsmatrix mit einem Molekül zu eluieren, das mit dem Antigen verwandt ist. Als Alternative könnte kein geeignetes spezifisches Elutionsmolekül vorhanden sein, das in ausreichend hoher Konzentration hergestellt werden kann. In diesen Fällen ist es notwendig, ein Elutionsverfahren zu verwenden, das zum Beispiel für den Antigen-Antikörper-Komplex nicht spezifisch ist. Einige der nicht-spezifischen Elutionsverfahren verringern im Allgemeinen die Phage-Lebensfähigkeit, zum Beispiel wird die Phage-Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit bei pH 12 verringert (Rossomando, E.F. und Zinder N.D., J. Mol. Biol. 36, 387–399, 1968). Es kann zu Wechselwirkungen zwischen zum Beispiel Antikörpern und Affinitätsmatrizen kommen, die ohne vollständige Entfernung der Phage-Infektivität nicht unterbrochen werden können. In diesen Fällen ist ein Verfahren zum Eluieren von Phage erforderlich, das nicht auf der Unterbrechung zum Beispiel der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung beruht. Es wurde daher ein Verfahren entwickelt, das eine Elution gebundener pABs unter milden Bedingungen ermöglicht (Reduktion einer Dithiolgruppe mit Dithiothreitol), die die Phage-Struktur nicht aufbrechen (Beispiel 47 von WO92/01047).
Das Verfahren einer milden Elution verwendet die Bindung der Phage-Antikörper-Population von biotinyliertem Antigen und die Bindung an magnetische Streptavidinkugeln. Nach dem Waschen zur Entfernung nicht gebundener Phagen, wird der Phage-Antikörper eluiert und zum Infizieren von Zellen verwendet, um eine selektierte Phage-Antikörper-Population zu erhalten. Eine Disulfidbindung zwischen dem Biotin und dem Antigenmolekül ermöglicht eine milde Elution mit Dithiothreitol. Eine besonders vorteilhafte Art und Weise der Durchführung dieser Selektion ist die Verwendung von biotinyliertem Antigen im Überschuss, aber bei oder unter einer Konzentration, die der gewünschten Dissoziationskonstante für die Antigen-Antikörper-Bindung entspricht. Dieses Verfahren ist für die Selektion von Antikörpern hoher Affinität vorteilhaft (R.E. Hawkins, S.J. Russell und G. Winter, J. Mol. Biol. 226, 889–896, 1992). Antikörper können auf langsamere off-Rates für die Antigenselektion selektiert werden, wie in (R.E. Hawkins et al., 1992, supra) beschrieben ist. Die Konzentration von biotinyliertem Antigen kann allmählich verringert werden, um Phage-Antikörper höherer Affinität zu selektieren. Als Alternative kann der Phage-Antikörper gegenüber biotinyliertem Antigen im Überschuss vorhanden sein, so dass die Phage-Antikörper um die Bindung konkurrieren, analog zu der Konkurrenz von Peptid-Phage zu biotinyliertem Antikörper, wie von J.K. Scott & G.P. Smith (Science 249, 386–390, 1990) beschrieben.
Diese Elutionsprozedur ist nur ein Beispiel für eine Elutionsprozedur unter milden Bedingungen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren wäre das Einfügen einer Nucleotidsequenz, die für Aminosäuren kodiert, die eine Erkennungsstelle für die Spaltung durch eine hoch spezifische Protease zwischen dem eingesetzten Fremdgen, in diesem Fall einem Gen für ein Antikörperfragment, und der Sequenz des restlichen Gens III darstellt. Beispiele für solch hoch spezifischen Proteasen sind Faktor X und Thrombin. Nach der Bindung des Phagen an eine Affinitätsmatrix und Elution zur Entfernung von Phagen mit nicht spezifischer Bindung und Phagen mit schwacher Bindung, würden die Phagen mit starker Bindung durch Waschen der Säule mit Protease unter Bedingungen entfernt werden, die für den Aufschluss an der Spaltungsstelle geeignet sind. Dies würde das Antikörperfragment von dem Phage-Partikel spalten, wodurch der Phage eluiert wird. Von diesem Phagen wäre anzunehmen, dass er infektiv ist, da die einzige Proteasestelle jene sein sollte, die spezifisch eingefügt wurde. Dann könnten stark bindende Phage durch Infizieren von z.B. E. coli TG1 Zellen gewonnen werden.
Eine alternative Prozedur zu der oben genannten ist die Verwendung der Affinitätsmatrix, die den stark gebundenen pAb zurückhält, und das Extrahieren der DNA, zum Beispiel durch Kochen in SDS-Lösung. Dann kann extrahierte DNA zur direkten Transformation von E. coli Wirtszellen verwendet werden oder als Alternative können die Antikörper kodierenden Sequenzen amplifiziert werden, zum Beispiel unter Verwendung von PCR mit geeigneten Primern, wie den hierin offenbarten, und dann in einen Vektor zur Expression als löslicher Antikörper für weitere Studien oder pAb für weitere Selektionsrunden eingesetzt werden.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Selektion nach Affinität wäre durch Bindung an eine Affinitätsmatrix, die geringe Mengen an Ligand enthält.
Wenn aus einer Population Phagen selektiert werden sollen, die ein Proteinmolekül mit hoher Affinität für ihre Liganden exponieren, ist eine bevorzugte Strategie die Bindung einer Phage-Population an eine Affinitätsmatrix, die eine geringe Menge an Ligand enthält. Es kommt zu einer Konkurrenz zwischen Phagen, die Proteine mit hoher Affinität und geringer Affinität exponieren, um die Bindung an den Liganden auf der Matrix. Phagen, die Protein mit hoher Affinität exponieren, werden bevorzugt gebunden, und Protein mit geringer Affinität wird ausgewaschen. Das Protein hoher Affinität wird dann durch Elution mit dem Liganden gewonnen oder durch andere Prozeduren, die den Phagen von der Affinitätsmatrix eluieren (Beispiel 35 von WO92/01047 zeigt diese Prozedur).
Zusammenfassend kann somit zur Gewinnung der verpackten DNA aus dem Affinitätsschritt das Package einfach eluiert werden, es kann in Gegenwart eines homologen sbp-Elements eluiert werden, das mit dem Package um die Bindung an ein komplementäres sbp-Element konkurriert; es kann durch Kochen entfernt werden, es könnte durch proteolytische Spaltung des Proteins entfernt werden; und andere Verfahren sind für den Fachmann offensichtlich, z.B. Zerstören der Verbindung zwischen dem Substrat und dem komplementären sbp-Element, um die verpackte DNA und das sbp-Element freizusetzen. In jedem Fall ist das Ziel, die DNA aus dem Package zu erhalten, so dass sie direkt oder indirekt zur Expression des von ihr kodierten sbp-Elements verwendet werden kann.
Die Effizienz dieser Selektionsprozedur für pAbs und die Möglichkeit, sehr große Bibliotheken zu erzeugen, bedeutet, dass die Immunisierungstechniken, die zur Erhöhung des Anteils gescreenter Zellen entwickelt wurden, die Antikörper von Interesse bilden, keine absolute Notwendigkeit sind. Die Technik ermöglicht die rasche Isolierung von Bindungsspezifitäten, z.B. Antigen-Bindungsspezifitäten, einschließlich jener, die bei herkömmlichen Techniken schwierig oder sogar unerreichbar wären, zum Beispiel katalytische oder anti-iodiotypische Antikörper. Das Tier kann nun vollkommen weggelassen werden, sobald eine vollständige Bibliothek des Immunrepertoires erstellt wurde.
ANWENDUNGEN VON ANTIKÖRPERN GEGEN SELBSTANTIGENE
Menschliche Antikörper zu Zelloberflächenkomponenten. Die Isolierung solcher Antikörperspezifitäten wäre für die Herstellung von Mitteln besonders nützlich, die eine Zelltötung, zum Beispiel von Krebszellen, vermitteln, zum Beispiel unter Verwendung der natürlichen Effektorfunktion von Antikörpern. Anti-Selbstantikörper können auch in der Herstellung diagnostischer in vivo Darstellungsreagenzien wertvoll sein, zum Beispiel unter Verwendung von Radioisotopen.
Antikörper, die gegen Zelloberflächenkomponenten spezifischer T-Zellen-Untergruppen gerichtet sind, könnten therapeutisch verwendet werden (D. Wraith et al., Cell 57, 709–715, 1989; L. Steinman und R. Mantegazza FASEB J. 4, 2726–2731, 1990), zum Beispiel um eine Wirkung von T-Zellen zu verhindern, die zu rheumatoider Arthritis führt.
MENSCHLICHE ANTIKÖRPER, DIE DIE FUNKTION VON SELBSTMOLEKÜLEN MODIFIZIEREN
Es können Antikörper isoliert werden, die die Wirkung von Selbstmolekülen, wie von Hormonen, Wachstumsfaktoren und Rezeptoren, durch ihre Bindung an ein spezifisches Epitop auf dem Molekül modifizieren. Multifunktionelle Proteine können sowohl erwünschte wie auch unerwünschte Eigenschaften haben, insbesondere, wenn sie therapeutisch verwendet werden. Zum Beispiel bindet das Lymphokin TNF (Tumornekrose-Faktor) an mindestens zwei verschiedene Klassen von Zellrezeptoren – eine, die für gewöhnlich auf vaskulären Endothelialzellen vorgefunden wird, und die andere, die für gewöhnlich auf Tumorzellen vorgefunden wird. Ein Maus-Antikörper zu TNF wurde hergestellt, der eine Bindung von TNF an Endothelialzellen-Rezeptoren verhindert, während dieser weiterhin an Tumorzellen binden kann, wodurch die Tumore ohne toxische Nebenwirkungen angegriffen werden können, die durch Endothelialzellen vermittelt werden (Patentanmeldung PCT/AU90/00337). Für eine therapeutische Verwendung von Antikörpermodifizierungsmitteln von Hormon- oder Wachstumsfaktormolekülen wäre es bevorzugt, über eine menschliche Antikörperspezifität zu verfügen, die direkt durch Selektion von einer Phage-Bibliothek isoliert wird.
MENSCHLICHE ANTI-IDIOTYPEN
Anti-Idiotyp-Antikörper (Antikörper, die gegen die Antigen-Kombinationstellen gerichtet sind, die durch die variablen Domänen menschlicher Antikörper gebildet werden) werden für gewöhnlich durch Isolieren eines Antikörpers gegen ein Antigen und dann Verwenden dieses isolierten Antikörpers als Immunogen hergestellt, um gegen dieses gerichtete Antikörper zu bilden. Wenn der ursprüngliche Antikörper gegen ein Hormon oder einen Wachstumsfaktor gerichtet wird, bedeutet das Verhältnis zwischen Antigen- und Antikörper-Kombinationsstellen, dass der Anti-Idiotyp in einigen Aspekten das Hormon oder den Wachstumsfaktor nachahmen und an den Rezeptor für diese Moleküle binden kann. Die Fraktion von Anti-Idiotyp-Antikörpern, die zum Nachahmen der Bindung des Hormons an den Rezeptor imstande ist, wäre erwartungsgemäß klein. Ferner würde die Deletion von Antiselbst-Lymphozyten bedeuten, dass die Verwendung der herkömmlichen Route zu Anti-Idiotypen für die Isolation menschlicher Anti-Idiotyp-Antikörper schwierig wäre, die Moleküle nachahmen, die menschliche Rezeptoren binden. In dieser Anmeldung zeigen wir, dass Antikörper, die gegen die Antigen-Kombinationsstellen gerichtet sind, die durch die variablen Domänen menschlicher Antikörper gebildet werden, direkt von Phage-Antikörper-Display-Bibliotheken isoliert werden können, wie in Beispiel 1 und 4 gezeigt, und es sollte auch möglich sein, die Anti-Idiotyp-Antikörper, die die Bindung des Hormons nachahmen, direkt durch ein Screening auf eine Bindung an den Rezeptor zu identifizieren.
Anti-Idiotypen können auch zur Behandlung von Autoimmunerkankungen nützlich sein. Sie könnten zur Bindung an zirkulierende Autoantikörper verwendet werden. Es kann jedoch bevorzugt sein, Antikörper erzeugende Zellen direkt anzugreifen, zum Beispiel unter Verwendung eines bispezifischen Antikörpers, der gegen einen Zellenoberflächenmarker wie auch eine Anti-Idiotyp-Spezifität gerichtet ist. Als Alternative könnte die Plasmaphorese verwendet werden, um zirkulierenden Antikörper und die direkt behandelten Zellen zu entfernen.
MENSCHLICHE ANTIKÖRPER GEGEN REZEPTOREN
Menschliche Antikörper, die an Rezeptoren binden, die Ligandenfunktion blockieren oder antagonisieren, könnten direkt aus einer Phage-Bibliothek selektiert werden, die Antikörper exponiert, die von einem nicht immunisierten Spender abgeleitet sind.
MENSCHLICHE ANTIKÖRPER ZUR VERHINDERUNG EINER TRANSPLANTATABSTOßUNG
Antikörper, die gegen die Haupthistokompatibilitätskomplex-Proteine gerichtet sind, könnten zur Behandlung von Patienten nach Transplantationen oder Organen vor der Transplantation verwendet werden, um eine Abstoßung zu verhindern.
Antikörper, die gegen mehrere Lymphozytzellen-Oberflächenmarker gerichtet sind, wurden zur Vermeidung einer Abstoßung in Transplantaten verwendet, z.B. CD45, CD3, CD4, CD8 und Interleukin-2 Rezeptor. Beispiel 3 zeigt, dass menschliche Antikörper gegen CD4 direkt von Phage-Display-Bibliotheken isoliert werden können.
MENSCHLICHE ANTIKÖRPER GEGEN ZYTOKINE
Menschliche Antikörper gegen Zytokine wären zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen wertvoll, zum Beispiel des septischen Schocks mit Anti-TNF und Anti-Interleukin 1 Antikörpern. Beispiel 1 und 6 zeigen, dass menschliche Antikörper gegen TNF direkt von Phage-Antikörper-Bibliotheken isoliert werden können, die von nicht immunisierten Menschen oder der synthetischen Rekombination von V-, D- und H-Fragmenten abgeleitet wurden. In vielen Fällen sind diese Zytokinmoleküle stark zwischen Spezies konserviert, wie zum Beispiel der transformierende Wachstums faktor β (TGF-β), und es hat sich selbst bei Mäusen als schwierig erwiesen, Antikörper zu isolieren, die gegen das menschliche Molekül gerichtet sind. Die Isolierung von menschlichen Antiselbst-Antikörpern, wie in dieser Erfindung beschrieben, stellt ein Verfahren zum Erhalten menschlicher Antikörper mit einer solchen Spezifität bereit.
MENSCHLICHE ANTIKÖRPER ZUR DIAGNOSE UND BEHANDLUNG VON HERZERKRANKUNGEN
Menschliche Antikörper gegen Gerinnungskomponenten, z.B. Fibrin, wären zur Darstellung von Gerinnseln nützlich, wenn sie mit Radioaktivität markiert werden, oder zur Auflösung von Gerinnseln, wenn sie zum Beispiel an ein das Gerinnsel auflösendes Enzym, wie Urokinase, gebunden werden.
ANTIKÖRPER, DIE EINE REZEPTORFUNKTION TRIGGERN
Es können Antikörper selektiert werden, die an einen Zellrezeptor binden und eine biologische Reaktion in der Zelle triggern. Dies ist in der Folge ausführlicher beschrieben und Beispiel 8 beschreibt die Isolierung solcher Antikörper.
Durch Wachstums- und Selektionszyklen werden jene rgdps isoliert, die an die Zellrezeptoren binden. Einige dieser rgdps kodieren für Bindungsspezifitäten mit dem Potenzial (alleine oder in Kombination mit anderen Bindungsspezifitäten), die Rezeptoren zu triggern. Diese Bindungsspezifitäten werden alleine oder in Kombination auf das Triggern der Zellrezeptoren getestet.
Es gibt zahlreiche Zellrezeptoren, in welchen die Bindung eines Liganden, zum Beispiel eines Hormons, Wachstumsfaktors oder Peptids, ein biologisches Ereignis triggert, zum Beispiel die Aktivierung der Tyrosinkinase-Aktivität, oder das Öffnen eines Ionenkanals. Die rgdps könnten auf eine Bindung an Zellrezeptor (oder einen verwandten Rezeptor mit konservierten Oberflächenabschnitten, wie von einer anderen Spezies) selektiert werden, zum Beispiel unter Verwendung von Zellen, die den Zellrezeptor exponieren, oder unter Verwendung eines löslichen Rezeptors, der auf einer Festphase immobilisiert ist, oder unter Verwendung von Domänen oder Peptidepitopen des Rezeptors. Im Idealfall würde der Rezeptor in vernetzter Form bereitgestellt werden (wie für sein Triggern erforderlich ist).
Das Triggern von Rezeptoren an der Zelloberfläche scheint häufig die relative Bewegung von Proteinen oder Untergruppen zu beinhalten. Zum Beispiel beschreiben in den Neurotransmitter-gesteuerten Rezeptoren die fünf Untergruppen, die symmetrisch in der Membranstelle angeordnet sind, einen Ionenpfad zum Zentrum. Es wird angenommen, dass die Bindung des Neurotransmitters die Größe des zentralen Ionenkanals verändert, indem sie kleine Umordnungen zwischen den Untergruppen in einem allosterischen Übergang verursacht. Für Tyrosinkinase-Rezeptoren scheint der Ligand die Rezeptor-Oligomerisation anzutreiben. Somit können Antikörper mit Bindungsspezifitäten, die gegen einen Rezeptor gerichtet sind, das Potenzial aufweisen, eine allosterische Änderung zu fördern oder eine Oligomerisation zu fördern. Die Oligomerisation der Rezeptoren kann auch durch die Verwendung bivalenter oder bispezifischer Antikörper gefördert werden.
Die löslichen Antikörper oder Antikörperfragmente können monovalente Fragmente sein, zum Beispiel Einketten-Fv-Fragmente oder Fab-Fragmente, oder bivalente Fragmente, zum Beispiel Fab₂- oder vollständige Antikörperfragmente. Die Bivalenz könnte auch auf andere Weisen gefördert werden, zum Beispiel (1) durch Kodieren für einen Tag, wie ein Peptid oder Protein (zum Beispiel die Untereinheit eines dimeren Proteins), das selbst assoziiert, am N- oder C-Terminus des monomeren Fragments (2) unter Verwendung eines bivalenten Antikörpers, der an das monovalente Fragment bindet, zum Beispiel an einen gemeinsamen, C-terminalen Tag, oder an eine konstante Antikörper-Domäne, (3) chemischer Vernetzung.
Bispezifische Antikörper oder bispezifische Fragmente können auch wie für die bivalenten Fragmente hergestellt werden. (Zur Expression des bispezifischen Antikörper oder Fragments in derselben Zelle, müssen die Gene, die für beide Spezifitäten kodieren, gemeinsam eingefügt werden).
Die verschiedenen Antikörper-"Arme" könnten gegen denselben Rezeptor gerichtet sein, zum Beispiel zu verschiedenen Epitopen, oder zu zwei verschiedenen Rezeptoren (um hybride Rezeptoren zu triggern).
Die direkte Isolierung von Anti-Selbstantikörpern von Phage-Bibliotheken, wie in dieser Erfindung beschrieben, ist wichtig, damit eine große Anzahl von Antikörpern überlebt, um diese Rezeptoren zu triggern.
Es ist angemessen, die Herstellung von Antikörpern zum Triggern von Rezeptoren, die hier beschrieben und als ein Aspekt der vorliegenden Erfindung dargestellt ist, von der "anti-idiotypischen Route" zu unterscheiden, in welcher spezifische Antikörper, die in einem Tier, einschließlich des Menschen, durch Impfen des Tiers mit einem spezifischen Antigen gebildet werden, selbst zum Impfen eines anderen Tiers verwendet werden, wobei neue Antikörper, die als anti-idiotypische Antikörper (AntiIds) bezeichnet werden, erzeugt werden, die imstande sind, den ersten Satz von Antikörper zu erkennen und zu binden. Einige Spezies dieser Anti-Ids sind imstande, die spezifischen biologischen Eigenschaften des ursprünglichen Antigens nachzuahmen. Wenn zum Beispiel das Antigen ein Peptidhormon oder ein Zellrezeptor ist, kann das Anti-Id zu dem Hormon oder Zellrezeptor eine Reaktion der Zelle hervorrufen (bezüglich Beispielen siehe Gaulton, G.N. und Greane, M.I., 1986. Idiotypic mimicry of biological receptors. Ann. Rev. Immunol. 4, 253–280; Sege, K. und Peterson, P.A., 1978. Use of anti-idiotypic antibodies as cell surface receptor probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 2443–2447).
Der Kern der gegenwärtigen Lehren bezüglich Anti-Ids als Nachahmung von Antigenen ist, dass sie infolge einer Konstruktion von Antikörpern zu Antikörpern des ursprünglichen Antigens erzeugt werden. Es gibt jedoch eine gewisse Unstimmigkeit, ob solche Anti-Idiotypen das ursprüngliche Antigen exakt nachahmen (S.J. Davis et al., Nature 358, 76–79, 1992).
Es gibt daher eine klare Unterscheidung zwischen Antikörpern, die über eine antiidiotypische Route hergestellt wurden, die Antigene, wie Wachstumsfaktoren oder Hormone nachahmen, und Antikörpern, die direkt zu den Rezeptoren gebildet werden, um die Rezeptoren zu triggern. Die Antikörper, die durch eine antiidiotypische Route erhalten werden, benötigen das Antigen (Hormon, Wachstumsfaktor) und binden an dasselbe Epitop auf dem Rezeptor wie das Hormon, während die Antikörper, die durch Bindung an die Rezeptoren abgeleitet werden, nicht an dasselbe Epitop binden müssen, um den Rezeptor zu triggern. Tatsächlich müssen solche Antikörper kein bekanntes Hormon oder keinen Wachstumsfaktor nachahmen, da ihre Spezifität, oder Bindung an den Rezeptor (gekennzeichnet als Epiptop, on-Rate oder off-Rate) oder Blutclearance wahrscheinlich unterschiedlich ist. Das Verfahren zur Herstellung der Antikörper ist auch ziemlich unterschiedlich. Anti-idiotypische Antikörper werden klassisch durch Immunisierung von Tieren hergestellt, obwohl sie direkt von Phage-Display-Bibliotheken, wie zuvor beschrieben, isoliert werden können. Antikörper, die gegen Selbstrezeptoren gerichtet sind, werden durch Selektion von V-Gen-Bibliotheken gebildet (wie zuvor beschrieben).
Neben den Vorteilen gegenüber der anti-idiotypischen Route, können die Antikörper, die direkt durch Rezeptorbindung abgeleitet werden, sogar Vorteile gegenüber dem natürlichen Hormon oder Wachstumsfaktor haben. So können Rezeptoren, die für eine Bindung des natürlichen Hormons oder Wachstumsfaktors schadhaft sind (zum Beispiel bei einer genetischen Erkrankung), durch einen Antikörper getriggert werden, der an ein anderes Epitop bindet.
Als therapeutische Mittel haben die verschiedenen Isotypen von Antikörpern oder Fragmenten von Antikörpern, die die variablen Regionen tragen, die für die Spezifität des Moleküls verantwortlich sind, eine Reihe von Eigenschaften, die gegenüber dem bioaktiven Element, das sie nachahmen, vorteilhaft sind. Zum Beispiel kann im Gegensatz zu natürlichen Hormonen ihre Halbwertzeit im Kreislauf einfach verändert werden. Abhängig von dem gewählten Antikörper-Isotyp oder Fragment, haben sie Halbwertzeiten im Kreislauf in einem Patienten, die von Minuten bis zu mehreren Wochen reichen. Wenn eine langfristige Verwendung oder kurzfristige Clearance erforderlich ist, kann dies leicht durch die Wahl des geeignetem Antikörper-Isotyps erreicht werden, ohne Vorrichtungen mit langsamer Freisetzung wie Implantate oder intravenöse Dauerinfusionen usw. verwenden zu müssen.
Ferner sind viele Hormone oder Gewebewachstumsfaktoren oder Antigene im Allgemeinen funktionell komplex, wobei verschiedene Epitope von jedem der Moleküle verschiedene spezifische Funktionen haben. Klone von Antikörpernachahmungen sind in dieser Hinsicht monofunktional, und könnten somit zur Herstellung eines spezifischen biologischen Effekts eines Hormons verwendet werden, ohne einen zweiten Effekt, wobei der letztere Effekt für den Patienten nachteilig sein könnte. So bindet Lymphokin TNF (Tumornekrose-Faktor) an zwei verschiedene Klassen von Zellrezeptoren – eine, die auf vaskulären Endothelialzellen üblich ist, die andere, die auf Tumorzellen üblich ist. Wenn der TNF modifiziert wird, so dass er nicht an die Endothelialzellrezeptoren binden kann, aber weiterhin an Tumorzellrezeptoren binden kann, werden die Tumore angegriffen, ohne gleichzeitig die sehr toxischen Nebenwirkungen auszulösen, die durch die vaskulären Rezeptoren vermittelt werden. Dies ist in der australischen Patentanmeldung PCT/AU90/00337 beschrieben). Von einer Antikörpernachahmung, die den Tumorzellrezeptor erkennen kann, wäre zu erwarten, dass sie sehr spezifisch ist und Tumorzellen tötet, ohne toxische Nebenwirkungen auszulösen, die durch das vaskuläre Endothel vermittelt werden, da sie keine Ähnlichkeit mit dem TNF-Epitop hätte, das an Rezeptoren auf letztgenanntem bindet.
TERMINOLOGIE
Ein Großteil der in diesem Abschnitt besprochenen Terminologie wurde in dem Text an geeigneter Stelle erwähnt.
SELBST
Ein Selbstantigen ist ein Antigen oder Epitop, das an eine Antigenbindungsstelle binden kann, die durch eine oder mehrere variable Antikörper-Domäne gebildet wird und zwischen Mitgliedern einer Tierspezies konserviert ist und für den Körper nativ ist.
Das Immunsystem versucht, die Bildung von Antikörpern zu Selbstantigenen zu vermeiden. Es wurde nahegelegt, dass (i) Sequenzen von Keimlinie-V-Gensegmenten unter Druck entwickelt wurden, so dass sie gegen fremde, z.B. Pathogene, Antigene und Epitope, gerichtet sind, und nicht mehr imstande sind, Antikörper bereitzustellen, die Selbstantigene binden, und (ii) dass zusätzlich die Immuntoleranz bewirkt, dass diese entstehenden Kombinationen von Gensegmenten, die für Antiselbst-Antikörper kodieren, deletiert oder anergisiert werden. Folglich gibt es normalerweise keine zirkulierenden Antikörper gegen diese Antigene, außer bei Krankheitszuständen, z.B. Autoimmunerkrankungen. Ein Selbstantigen kann so sein, dass es zwischen Individuen einer Spezies nicht variiert. Ein Selbstantigen kann eines sein, für das eine normale allele Variation in der gesamten Population vorhanden ist. Von einer Immunisierung eines Individuums in einer Spezies mit einem Selbstantigen wäre nicht zu erwarten, dass sie zu der Bildung oder Detektion von Antikörpern zu dem Antigen führt, außer vielleicht, wenn die Toleranz absichtlich aufgebrochen wird. Antikörper zu einem Selbstantigen können nur in einem Individuum vorhanden sein, das an einer Autoimmunerkrankung leidet. Andererseits gibt es einige Selbstantigene, für welche zirkulierende Antikörper in einer Subpopulation normaler Individuen einer Spezies vorhanden sind.
Ein Selbstantigen kann ein Antigen sein, das von B-Zellen-Oberflächenantikörpern, nicht aber von zirkulierenden Antikörpern erkannt wird. Es ist vielleicht nicht möglich, zirkulierende Antikörper zu einem Selbstantigen zu detektieren oder zu erhalten, außer vielleicht, wenn das Individuum an einer Autoimmunerkrankung oder einem derartigen Syndrom leidet.
Ein Antiselbst-Antikörper oder Antikörperfragment ist ein Antikörper oder Fragment davon, der/das Bindungsspezifität für ein Selbstantigen hat. Er/es kann ein Epitop erkennen, das nur auf einem Selbstantigen vorgefunden wird, oder kann mit einem Antigen kreuzreaktiv sein, das Individuen der Spezies als fremd erkennen. Die vorliegende Erfindung ist besonders gut zur Herstellung und Isolierung von Antikörperfragmenten geeignet, die nur ein Selbstantigen binden.
SPEZIFISCHES BINDUNGSPAAR
Dies beschreibt ein Paar von Molekülen (von welchen jedes ein Element eines spezifischen Bindungspaares ist), die natürlich abgeleitet oder synthetisch erzeugt werden. Eines von dem Paar von Molekülen hat eine Fläche an seiner Oberfläche, oder einen Hohlraum, die/der spezifisch an eine besondere räumliche oder polare Organisation des anderen Moleküls bindet, und daher als komplementär zu diesem definiert ist, so dass das Paar die Eigenschaft hat, spezifisch aneinander zu binden. Beispiele für Arten spezifischer Bindungspaare sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat, IgG-Protein A.
MULTIMERES ELEMENT
Dies beschreibt ein erstes Polypeptid, das mit mindestens einem zweiten Polypeptid assoziiert ist, wenn die Polypeptide in freier Form exprimiert werden und/oder auf der Oberfläche eines Substrats exprimiert werden. Das Substrat kann durch einen Bakteriophagen bereitgestellt werden. Wenn zwei assoziierte Polypeptide vorhanden sind, ist der assoziierte Polypeptidkomplex ein Dimer, wenn drei vorhanden sind, ein Trimer, usw. Das Dimer, Trimer, Multimer usw. des multimeren Elements kann ein Element eines spezifischen Bindungspaares umfassen.
Beispielhafte multimere Elemente sind schwere Domäne, die auf einem Immunglobulinmolekül beruhen, leichte Domäne, die auf einem Immunglobulinmolekül beruhen, T-Zellrezeptor-Untereinheiten.
REPLIZIERBARES GENETISCHES DISPLAY-PACKAGE (RGDP)
Dies beschreibt ein biologisches Partikel, das genetische Informationen hat, die dem Partikel die Fähigkeit zur Replikation verleihen. Das Partikel kann an seiner Oberflä che zumindest einen Teil eines Polypeptids exponieren. Das Polypeptid kann durch genetische Information kodiert werden, die für das Partikel nativ ist, und/oder künstlich in das Partikel oder einen Vorläufer desselben eingefügt werden. Das exponierte Polypeptid kann jedes Element eines spezifischen Bindungspaares sein, z.B. Domäne der leichten oder schweren Kette, basierend auf einem Immunglobulinmolekül, ein Enzym oder ein Rezeptor usw.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist das Partikel ein filamentöser Bakteriophage, wie fd oder M13.
PACKUNG
Dies beschreibt eine replizierbares genetisches Display-Package, in dem das Partikel ein Element eines spezifischen Bindungspaares auf seiner Oberfläche exponiert. Das Package kann ein Bakteriophage sein, der eine Antigen-Bindungsdomäne auf seiner Oberfläche exponiert. Diese Art von Package wird als Phage-Antikörper (pAb) bezeichnet.
ANTIKÖRPER
Dies beschreibt ein natürlich oder teilweise oder vollständig synthetisch erzeugtes Immunglobulin. Der Begriff beinhaltet auch jedes Protein mit einer Bindungsdomäne, die eine Immunglobulin-Bindungsdomäne oder homolog zu dieser ist. Diese Proteine können von natürlichen Quellen abgeleitet oder teilweise oder vollständig synthetisch erzeugt werden.
Beispielhafte Antikörper sind die Immunglobulin-Isotypen und die Fab-, F(ab¹)₂-,scFv-, Fv-, dAB-, Fd-Fragmente.
IMMUNGLOBULIN-SUPERFAMILIE
Dies beschreibt eine Familie von Polypeptiden, deren Elemente zumindest eine Domäne aufweisen, die in der Struktur mit jener der variablen oder konstanten Domäne von Immunglobulinmolekülen verwandt ist. Die Domäne besteht aus zwei β-Faltblättern und für gewöhnlich einer konservierten Disulfidbindung (siehe A.F. Williams und A.N. Barclay, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6., 381–405).
Beispielhafte Elemente einer Immunglobulin-Superfamilie sind CD4, Plättchenwachstumsfaktor-Rezeptor (PDGFR), interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM). Wenn nicht der Zusammenhang anderes nahe legt, beinhaltet ein Verweis auf Immunglobuline und Immunglobulinhomologe in dieser Anmeldung Elemente der Immunglobulin-Superfamilie und Homologe davon.
HOMOLOGE
Dieser Begriff benennt Polypeptide mit denselben oder konservierten Resten an einer entsprechenden Position in ihrer primären, sekundären oder tertiären Struktur. Der Begriff erstreckt sich auch auf zwei oder mehr Nucleotidsequenzen, die für die homologen Polypeptiden kodieren.
Beispielhafte homologe Peptide sind die Immunglobulin-Isotypen und die TIM-Fass-Enzyme.
FUNKTIONELL
Im Verhältnis zu einem sbp-Element, das auf der Oberfläche eines rgdp exponiert wird, bedeutet dies, dass das sbp-Element in einer gefalteten Form dargeboten wird, in der seine spezifische Bindungsdomäne für sein komplementäres sbp-Element dieselbe oder eng analog zu seiner nativen Konfiguration ist, wodurch es eine ähnliche Spezifität in Bezug auf das komplementäre sbp-Element aufweist.
GENETISCH UNTERSCHIEDLICHE POPULATION
In Verbindung mit sbp-Elementen oder Polypeptidkomponenten davon bezieht sich dies nicht nur auf die Diversität, die in der natürlichen Population von Zellen oder Organismen vorhanden sein kann, sondern auch auf die Diversität, die durch künstliche Mutation in vitro oder in vivo erzeugt werden kann.
Die in vitro Mutation kann zum Beispiel die Zufallsmutagenese unter Verwendung von Oligonucleotiden beinhalten, die Zufallsmutationen der Sequenz aufweisen, die variiert werden soll. Die in vivo Mutagenese kann zum Beispiel Mutatorstämme von Wirtsorganismen verwenden, um die DNA aufzunehmen (siehe Beispiel 38 von WO92/01047). Die Worte "einzigartige Population" können zur Bezeichnung z.B. mehrerer Polypeptidketten verwendet werden, die sich genetisch nicht unterscheiden, d.h., die alle gleich sind. Eine begrenzte Population ist jene, die zwar unterschiedlich ist, aber nicht so sehr wie das volle Repertoire eines Tiers oder einer Bibliothek, synthetisch oder anders. Die Diversität kann durch vorangehende Selektion verringert werden, z.B. unter Verwendung einer Antigen-Bindungsspezifität.
DOMÄNE
Eine Domäne ist ein Teil eines Proteins, der in sich selbst gefaltet und unabhängig von anderen Teilen desselben Porteins und unabhängig von einem komplementären Bindungselement ist. Eine gefaltete Einheit ist eine spezifische Kombination aus einer α-Helix- und/oder β-Faltblattstruktur. Domäne und gefaltete Einheiten enthalten Strukturen, die Aminosäuren zusammenbringen, die in der primären Struktur nicht benachbart sind.
FREIE FORM
Dies beschreibt den Zustand eines Polypeptids, der durch ein replizierbares, genetisches Display-Package nicht exponiert wird.
KONDITIONELL SCHADHAFT
Dies beschreibt ein Gen, das ein schadhaftes Polypeptid unter einem Satz von Bedingungen exprimiert, aber ein anderes, aber verwandtes, nicht schadhaftes Polypeptid unter einem anderen Satz von Bedingungen exprimiert. Ein Beispiel ist ein Gen, das eine Amber-Mutation enthält, die in einem nicht supprimierenden beziehungsweise supprimierenden Wirt exprimiert wird.
Als Alternative kann ein Gen ein Protein exprimieren, das unter einem Satz von Bedingungen schadhaft ist, aber nicht unter einem anderen Satz. Ein Beispiel ist ein Gen mit einer temperaturempfindlichen Mutation.
SUPPRESSIBLES TRANSLATIONALES STOPP-CODON
Dies beschreibt ein Codon, das die Translation von Nucleotidsequenzen stromabwärts des Codons unter einem Satz von Bedingungen ermöglicht, während unter einem anderen Satz von Bedingungen die Translation an dem Codon endet. Beispiele für suppresible translationale Stopp-Codons sind die Amber-, Ochre- und Opal-Codons.
MUTATORSTAMM
Dies ist eine Wirtszelle, die einen genetischen Defekt aufweist, der bewirkt, dass DNA, die in ihr repliziert wird, in Bezug auf ihre Mutter-DNA mutiert ist. Beispielhafte Mutatorstämme sind NR9046mutD5 und NR9046 mut T1 (siehe Beispiel 38 von WO92/01047).
HELFER-PHAGE
Dies ist ein Phage, der zum Infizieren von Zellen verwendet wird, die ein schadhaftes Phage-Genom enthalten und der zum Komplementieren des Defekts dient. Das schadhafte Phage-Genom kann ein Phagemid oder ein Phage mit einer gewissen Funktion sein, das für entfernte Gensequenzen kodiert.
Beispiele für Helfer-Phagen sind M13K07, M13K07 Gen III Nr. 3; und Phagen, die ein Bindungsmolekül exponieren oder für dieses kodieren, das an ein Capsidprotein fusioniert ist.
VEKTOR
Dies ist ein DNA-Molekül, das zur Replikation in einem Wirtsorganismus imstande ist, in das ein Gen eingefügt wird, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu konstruieren.
PHAGE-VEKTOR
Dies ist ein Vektor, der durch Modifikation eines Phage-Genoms abgeleitet wird, der einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen enthält, aber keinen für ein Plasmid.
PHAGEMID-VEKTOR
Dies ist ein Vektor, der durch Modifikation eines Plasmid-Genoms abgeleitet wird, der einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen wie auch den Plasmid-Replikationsursprung enthält.
SEZERNIERT
Dies beschreibt ein rgdp oder ein Molekül, das mit dem Element eines sbp assoziiert wird, das auf dem rgdp exponiert ist, wobei das sbp-Element und/oder das Molekül gefaltet sind und die Packung außen an zelluläres Cytosol angefügt ist.
REPERTOIRE UMGEORDNETER IMMUNGLOBULINGENE
Eine Sammlung natürlich vorkommender Nucleotide, z.B. DNA-Sequenzen, die für exprimierte Immunglobulingene in einem Tier kodieren. Die Sequenzen werden durch die in vivo Umordnung von z.B. V-, D- und J-Segmenten für H-Ketten und z.B. der V- und J-Segmente für L-Ketten erzeugt. Als Alternative können die Sequenzen von einer Zelllinie erzeugt werden, die in vitro immunisiert wird und in der die Umordnung als Reaktion auf die Immunisierung intrazellulär erfolgt.
BIBLIOTHEK
Eine Sammlung von Nucleotiden, z.B. DNA-Sequenzen, in Klonen; oder eine genetisch unterschiedliche Sammlung von Polypeptiden oder spezifischen Bindungspaarelementen, oder Polypeptiden oder sbp-Elementen, die auf rgdps exponiert sind, die selektiert oder gescreent werden können, um ein einzelnen Polypeptid oder sbp-Element oder eine gemischte Population von Polypeptiden oder sbp-Elementen zu erhalten.
REPERTOIRE VON KÜNSTLICH UMGEORDNETEN IMMUNGLOBULINGENEN
Eine Sammlung von Nucleotiden, z.B. DNA-Sequenzen, die vollständig oder teilweise von einer Quelle abgeleitet wird, die nicht die umgeordneten Immunglobulinsequenzen von einem Tier sind. Diese können zum Beispiel DNA-Sequenzen enthalten, die für VH-Domäne kodieren, indem sie nicht umgeordnete V-Segmente mit D- und J-Segmenten kombinieren, und DNA-Sequenzen, die für VL-Domäne kodieren, indem sie V- und J-Segmente kombinieren.
Ein Teil der oder alle DNA-Sequenzen können durch Oligonucleotidsynthese abgeleitet werden.
SEKRETORISCHES LEADER-PEPTID
Dies ist eine Sequenz von Aminosäuren, die mit dem N-terminalen Ende eines Polypeptids verbunden ist, und die die Bewegung des Polypeptids aus dem Cytosol lenkt.
ELUTIONSMITTEL
Dies ist eine Lösung, die zum Aufbrechen der Verbindung zwischen zwei Molekülen verwendet wird. Die Verbindung kann eine nicht kovalente oder kovalente Bindung sein. Die zwei Moleküle können Elemente eines sbp sein.
DERIVAT
Dies ist ein Polypeptid, das von einem anderen Polypeptid abgeleitet wird, für das die DNA in einem ausgewählten rgdp kodiert. Das Polypeptid-Derivat kann sich von dem kodierten Polypeptid durch die Addition, Deletion, Substitution oder Einfügung von Aminosäuren unterscheiden, oder durch die Verbindung von anderen Molekülen mit dem kodierten Polypeptid. Diese Änderungen können auf dem Nucleotid- oder Protein-Niveau erfolgen. Zum Beispiel kann das kodierte Polypeptid ein Fab-Fragment sein, das dann an ein Fc-Ende von einer anderen Quelle gebunden wird. Alternative Marker, wie Enzyme, Fluoresceine usw., können z.B. an Fab-, scFv-Fragmente gebunden sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine Analyse mittels ELISA der Spezifitäten löslicher Einketten-Fvs (scFvs), die von der nicht immunisierten Bibliothek durch Selektion auf bovinem Thyroglobulin (obere Tafel), menschlichem TNFα (mittlere Tafel) oder dem menschlichem mAb Fog-1 (Gamma-1, kappa) isoliert wurden. Die Bindung wurde durch ELISA an einer Reihe von Proteinen wie folgt bestimmt: 1 – Kunststoff,; 2 – Hühnerei-Trypsin-Inhibitor; 3 – Chymotrypsinogen A; 4 – Hühnerei-Ovalbumin; 5 – Keyhole-Limpet-Hämocyanin; 6 – bovines Thyroglobulin; 7 – menschliches TNFα; 8 – Truthahn-Eiweiß-Lysozym; 9 – Pferdeherz-Cytochrom c; 10 – bovines Serumalbumin; 11 – mAb Fog-1.
2 zeigt eine Analyse mittels ELISA der Spezifitäten löslicher scFvs, die von der nicht immunisierten Bibliothek durch Selektion auf menschlichem carcinoembryonischen Antigen (CEA) (obere Tafel); dem MUC1 Peptid (Price et al., 1990, supra), (mittlere Tafel), oder menschlichem CD4 (untere Tafel) isoliert wurden. Die Bindung wurde mittels ELISA an einer Reihe von Proteinen wie folgt bestimmt: 1 Hühnerei-Trypsin-Inhibitor; 2 – Chymotrypsinogen A; 3 – Hühnerei-Ovalbumin; 4 – Keyhole-Limpet-Hämocyanin; 5 – CEA; 6 – Urinextrakt, das menschliches polymorphes epitheliales Mucin (PEM) enthält; 7 – bovines Thyroglobulin; 8 -Hühner-Eiweiß-Lysozym; 9 – bovines Serumalbumin; 10 – Küken-Gammaglobulin, gekoppelt an 4-Hydroxy-3-nitrophenyl-Essigsäure; 11 – menschliches rekombinantes lösliches CD4.
3 zeigt einen ELISA zum Testen der Bindung von drei scFvs, die durch Selektion auf einem menschlichen monoklonalen Antikörper Fog-1 (IgG1, kappa) isoliert wurden, an einer Reihe von menschlichen Antikörpern unterschiedlichen Isotyps, wie folgt: 1 – Fog-1; 2 – das Fv-Fragment von HulysII; 3 – HulysII-Antikörper (IgG1, kappa); 4 – RegA (IgG1, kappa); FogC (IgG3, kappa); 6- Pag1 (IgG1, lambda); 7 – IgG2, lambda-Antikörper, gereinigt von Myelomplasma (Sigma); 8 – Oak3 (IgG3, lambda); 9 – IgG4, lambda, gereinigt von Myelomplasma (Sigma); 10 – FomI (IgM, lambda); 11 – FomA (IgM, lambda).
4 zeigt das Zusammenfügen von V_H-Genen bei der Erstellung einer synthetischen Bibliothek.
5 zeigt schematisch Selektionstechniken für pAbs: 2(i) zeigt ein Bindungs/Elutionssystem; 2(ii) zeigt ein Konkurrenzsystem (p = pAb; ag = Antigen, an das eine Bindung durch pAb erforderlich ist,; c = Konkurrentpopulation, z.B. Antikörper, pAb, Ligand; s = Substrat (z.B. Kunststoffkugeln usw.); d = Detektionssystem).
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Oligonucleotidprimer und Sonden, die in dem Text erwähnt sind, sind in Tabelle IV aufgelistet. Die Tabellen I bis IV sind nach Beispiel 8 angeführt.
Beispiel 1 zeigt die Isolierung von Antikörpern, die gegen den menschlichen Tumornekrose-Faktor α und einen menschlichen monoklonalen Antikörper gerichtet sind, aus einer Phage-Bibliothek von Einketten-Fv-Fragmenten, abgeleitet von einem nicht immunisierten Menschen.
Beispiel 2 zeigt die Isolierung von Antikörpern, die an menschliches Thyroglobulin binden, aus einer Phage-Bibliothek von Einketten-Fv-Fragmenten, abgeleitet von einem nicht immunisierten Menschen.
Beispiel 3 zeigt die Isolierung von Antikörperfragmenten, die gegen die Selbstantigene MUCI Mucin, carcinoembryonisches Antigen (CEA) und rekombinantes lösliches CD4 (rsCD4) gerichtet sind, aus einer Phage-Bibliothek von Einketten-Fv-Fragmenten, abgeleitet von einem nicht immunisierten Menschen.
Beispiel 4 zeigt die weitere Charakterisierung selektierter Antiselbst-Antikörperfragmente durch DNA-Sequenzierung und Affinitätsbestimmungen.
Beispiel 5 zeigt die Bildung einer synthetischen menschlichen Bibliothek unter Verwendung von Keimlinien-VH-Segmenten.
Beispiel 6 zeigt die Isolierung eines Antikörperfragments, das an menschlichen Tumornekrose-Faktor α bindet, aus einer synthetischen, menschlichen Keimlinien-Bibliothek.
Beispiel 7 zeigt die Bildung einer synthetischen menschlichen Bibliothek unter Verwendung von menschlichen Keimlinien-VH-Segmenten, die VH-CDR3-Sequenzen unterschiedlicher Längen enthalten, und die Isolierung von Einketten-Fv- Fragmenten, die an menschliches Thyroglobulin und einen menschlichen monoklonalen Antikörper binden.
Beispiel 8 zeigt die Isolierung von menschlichen Antikörpern, die gegen menschliche Interleukin-1-Rezeptormoleküle gerichtet sind, die die Rezeptorfunktion triggern.
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG VON ANTIKÖRPERN, DIE GEGEN SELBSTANTIGENE GERICHTET SIND, AUS EINER BIBLIOTHEK AUS SCFVS, DIE VON NICHT IMMUNISIERTEN BLUTSPENDERN ERHALTEN WERDEN
Natürlich vorkommende V-Gene, die von menschlichen PBLs isoliert werden, können zu einer großen Bibliothek von Antikörperfragmenten konstruiert werden, die Reaktivitäten gegen Antigene enthalten, welchen der Spender nicht ausgesetzt wurde (WO92/01047, Beispiel 42). Wir haben erkannt, dass diese Bibliotheken auch Reaktivitäten gegen Selbstantigene enthalten können, die entweder durch selbstreaktive B-Zellen entstehen, die nicht deletiert wurden, oder als nicht natürlich vorkommende Fragmente, die sich aus einer VH- und VL-Kettenrekombination ergeben. Um dies zu testen, bildeten wir eine große menschliche scFv-Bibliothek durch Panning, die auf der Oberfläche eines Phagemid exponiert war, gegen menschlichen TNF-α und ein menschliches IgG/k Immunglobulin.
VERFAHREN
RESCUE DER BIBLIOTHEK:
Die Bibliothek von scFvs wurde aus der RNA von menschlichen PBLs konstruiert und wurde bereits beschrieben (WO92/01047, Beispiel 42). Für das Rescue von Phagen, die Antikörperfragmente exponierten, wurden etwa 10⁹ E. coli, die das Phagemid enthielten, zum Beimpfen von 50 ml 2 × TY verwendet, das 1 % Glucose und 100 mg/ml Ampicillin enthielt (2 × Ty- AMP-GLU) und zu einer O.D. von 0,8 unter Schütteln gezüchtet. 5 ml dieser Kultur wurden zum Beimpfen von 50 ml 2 × TY- AMP-GLU verwendet, 2 × 10⁸ TU Delta-Gen 3-Helfer (M13 D Gen III, siehe WO92/01047) wurden zugegeben, und die Kultur wurde 45 Minuten bei 37 °C ohne Schütteln inkubiert, und dann 45 Minuten bei 37 °C mit Schütteln. Die Kultur wurde bei 4000 U/min 10 min zentrifugiert und das Pellet in 2 Litern 2 × TY resuspendiert, enthaltend 100 mg/ml Ampicillin und 50 ml/ml Kanamycin, und über Nacht gezüchtet.
Phagen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (WO92/01047, Beispiel 42). M13 D Gen III wurde wie folgt hergestellt:
M13 D Gen III-Helferphage kodiert nicht für das Gen III-Protein, und somit haben Phagen/Phagemide, die Antikörperfragmente exponieren, eine größere Bindungsavidität an Antigen. Infektiöse M13 D Gen III Partikel werden durch Züchten des Helfer-Phage in Zellen hergestellt, die ein pUC18 Derivat enthalten, das das Wildtyp gIII Protein während der Phage-Morphogenese liefert. Die Kultur wurde 1 Stunde bei 37 °C ohne Schütteln und dann eine weitere Stunde bei 37 °C mit Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert (IEC-Centra 8, 4000 U/min über 10 min), in 300 ml 2 × TY-Nährlösung resuspendiert, die 100 mg Ampicillin/ml und 25 mg Kanamycin/ml enthielt (2 × TY-AMP-KAN), und über Nacht unter Schütteln bei 37 °C gezüchtet.
Phage-Partikel wurden durch zwei PEG-Fällungen (Sambrook et al., 1990) aus dem Kulturmedium gereinigt und konzentriert, in 2 ml PBS resuspendiert und durch ein 0,45 mm Filter geleitet (Minisart NML; Sartorius), um eine Endkonzentration von etwa 10¹³ transduzierenden Einheiten/ml (Ampicillin-resistenten Klonen) zu erhalten.
PANNING DER BIBLIOTHEK
Immunotubes (Nunc) wurden über Nacht in PBS mit 4 ml von entweder 100 mg/ml oder 10 mg/ml rekombinantem menschlichen TNF-α in PBS oder 4 ml von 10 ml/ml Fog-1, einem menschlichen IgG/κ-Immunglobulin, beschichtet, das das menschliche, rote Blutkörperchen Rh (D) Antigen erkennt. Die Röhrchen wurden mit 2 % Marvel-PBS 2 Stunden bei 37 °C blockiert und dann 3 mal in PBS gewaschen. Etwa 1013 TU Phage wurden auf das Röhrchen aufgebracht und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert, wobei dieses auf einem Überkopf-Drehtisch geschwenkt wurde, und dann weitere 1,5 Stunden stehen gelassen. Die Röhrchen wurden 10 mal mit PBS 0,1 % Tween 20 und 10 mal mit PBS gewaschen. Phage wurden durch Zugabe von 1 ml 100 mM Triethylamin und 15 minütiges Auf- und Abdrehen auf einem Überkopf-Drehtisch eluiert, wonach die Lösung sofort mit 0,5 ml 1,0 M Tris-HCl, pH 7,4, neutralisiert wurde. Phagen wurden dann zum Infizieren von 10 ml E. coli TG1 mittleren logs verwendet, indem eluierte Phagen 30 Minuten bei 37 °C mit Bakterien inkubiert wurde. Die E. coli wurden dann auf TYE Platten ausgestrichen, die 1 % Glucose und 100 mg/ml Ampicillin enthielten. Es folgte ein Rescue der erhaltenen bakteriellen Bibliothek mit Delta Gen 3 Helfer-Phage wird zuvor beschrieben, um Phagen für eine anschließende Selektionsrunde herzustellen. Dieses Verfahren wurde dann für insgesamt 4 Runden einer Affinitätsreinigung wiederholt, wobei die Röhrchenwaschung auf 20 mal mit PBS, 0,1 % Tween 20 und 20 mal mit PBS in den Runden 3 und 4 erhöht wurde.
CHARAKTERISIERUNG DER BINDEMITTEL
Eluierte Phagen aus der 3. und 4. Selektionsrunde wurden zum Infizieren von E. coli HB 2151 verwendet, und es wurde lösliches scFv aus einzelnen Kolonien für den Test erzeugt (Marks, et al., 1991). Im Fall von TNF erfolgte auch ein Rescue von Phagen auch aus einzelnen Kolonien. ELISAs wurden wie zuvor beschrieben mit Mikrotiterplatten durchgeführt, die entweder mit 10 μg//ml menschlichem TNF-α in 50 mM Bicarbonat, pH 9,6, oder 10 μg/ml Fog-1 in PBS beschichtet waren. Klone, die in ELISA positiv waren, wurden durch PCR-Fingerprinting (WO92/01047, Beispiel 20) und dann durch Sequenzierung näher charakterisiert.
ERGEBNISSE
TNF: Lösliche scFv von 1536 Kolonien und Phagen von 1152 Kolonien wurden mit Hilfe von ELISA gescreent. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt, deren Legende in der kurzen Beschreibung der Figuren (supra) angeführt ist.
Positive Klone zur Bindung an TNF-α wurden durch PCR-Fingerprinting und Sequenzierung näher charakterisiert. Auf diese Weise wurden 15 verschiedene Bindemittel identifiziert. Vier davon wurden sequenziert.
Fog-1: Lösliches scFv von 96 Klonen wurde mittels ELISA gescreent, und positive Klonen wurden durch PCR-Fingerprinting und Sequenzierung näher charakterisiert. Auf diese Weise wurden 4 verschiedene Bindemittel identifiziert und sequenziert.
BEISPIEL 2
ISOLIERUNG VON ANTIKÖRPERFRAGMENT-SPEZIFITÄTEN, DIE GEGEN MENSCHLICHES THYROGLOBULIN GERICHTET SIND, AUS EINER BIBLIOTHEK VON SCFV-FRAGMENTEN, UNTER VERWENDUNG DER EXPOSITION AUF BAKTERIOPHAGE FD
Beispiel 44 von WO/01047 beschreibt die Selektion von Antikörper-scFv-Fragmenten, die gegen bovines Thyroglobulin gerichtet sind, aus einer Bibliothek von scFv-Fragmenten.
Diese wurden von nicht immunisierten Menschen abgeleitet, auf der Oberfläche von Phage fd exprimiert, durch Panning gegen bovines Thyroglobulin isoliert. Die Ergebnisse zeigten, dass es möglich ist, Antikörper aus einer Bibliothek, die von einem nicht immunisierten Individuum abgeleitet ist, zu isolieren, die ein Antigen binden, dem das Individuum niemals ausgesetzt wurde.
Sechzehn Klone, die sich durch dieses Panning als spezifisch für bovines Thyroglobulin erwiesen, wurden nun auf die Bindung an menschliches Thyroglobulin in einem ELISA-Test analysiert (wie in Beispiel 44 von WO92/01047 beschrieben). Neun dieser Klone banden auch stark an menschliches Thyroglobulin mit Extinktionssignalen zwischen 1,0 und 1,6, 12 Minuten nach Zugabe des Substrates. Es zeigte sich keine Kreuzreaktivität (Signal unter 0,05 nach 90 min) mit einer Reihe nicht verwandter Antigene – Hühnerei-Lysozym, BSA, Ovalbumin, Chymotrypsinogen, Cytochrom c, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Insulin, Cardiolipin und DNA.
Somit können Antikörper mit Spezifität für Epitope auf dem menschlichen Selbstantigen Thyroglobulin aus Bibliotheken isoliert werden, die von nicht immunisierten Menschen hergestellt werden.
Zwei Klone, die sowohl an menschliches als auch bovines Thyroglobulin, α-Thy23 und α-Thy29, banden und zwei Klone, die nur an bovines Thyroglobulin banden, α-Thy 32 und α-Thy33, wurden sequenziert.
BEISPIEL 3
ISOLIERUNG VON ANTIKÖRPERFRAGMENTEN, DIE GEGEN DIE MENSCH-LICHEN SELBSTANTIGENE MUC1 MUCIN, CARCINOEMBRYONISCHES ANTIGEN (CEA) UND REKOMBINANTES LÖSLICHES CD4 (RSCD4) GERICHTET SIND, AUS EINER PHAGE-DISPLAY-BIBLIOTHEK VON MENSCHLICHEN EINKETTEN-FV-FRAGMENTEN
Die Phage-Display-Bibliothek von Einketten-Fv-Fragmenten, die von nicht immunisierten menschlichen Spendern abgeleitet wurde, die in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde bei der Selektion eingesetzt, um Antikörperfragmente zu isolieren, die gegen die Selbstantigene Muc1 Mucin, carcinoembryonisches Antigen (CEA) und rekombinantes, lösliches CD4 (rsCD4) gerichtet sind.
RESCUE DER BIBLIOTHEK
Das Rescue der Bibliothek erfolgte wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass der Standard-Helfer-Phage M13K07 (5 × 10¹⁰ pfu) anstelle des Delta-Gen 3-Helfer-Phagen (M13 D Gen III) für das Rescue der Bibliothek verwendet wurde.
SELEKTION VON PHAGEN, DIE FÜR MUC1 MUCIN UND CARCINOEMBRYONISCHES ANTIGEN (CEA) SPEZIFISCH SIND
Der Phage wurde einem Panning auf Bindung unter Verwendung von Immunotubes (Nunc; Maxisorp) unterzogen, die mit Antigen beschichtet waren, im Wesentlichen wie bei (Marks et al., 1991), oder wurden auf einer Antigen-Säule selektiert (J. McCafferty et al., Nature 348, 552–554, 1990). Die folgenden Antigene wurden verwendet: menschliches, rekombinantes, lösliches CD4 (rsCD4) (exprimiert in Baculovirus von American Biotechnologies Inc. und geliefert von MRC AIDS Reagent Project [ADP608]); menschliches carcinoembryonisches Antigen (CEA); und ein 20 Aminosäuren Peptid (M.R. Price et al., Molec. Immunol. 27, 795–80, 1990), das einem wiederholten Motiv in menschlichem MUC1 Mucin entspricht (Tumor-assoziiertes, polymorphes, epitheliales Mucin oder PEM) (S. Gendler et al., J. Biol. Chem. 263, 12820–12823, 1988; J.R. Gum et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171, 407–415, 1990).
CEA (20 mg/ml) und rsCD4 (10 mg/ml) wurden über Nacht bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf Immunotubes aufgetragen. Für die ersten zwei Selektionsrunden wurden die Röhrchen 10 mal mit PBS, 0,1 % (v/v) Tween 20 und 10 mal mit PBS gewaschen. In den folgenden Selektionsrunden wurden die Röhrchen 20 mal mit PBS, 0,1 % (v/v) Tween 20 und 20 mal mit PBS gewaschen. Phagen wurden mit 100 mM Triethylamin wie bei (Marks et al., 1991) eluiert. Eluierte Phagen (für gewöhnlich 10⁶ bis 10⁷ transduzierende Einheiten) wurden zum Infizieren von E. coli TG1 Zellen verwendet. Es wurden etwa 10⁹ infizierte Bakterien als Impfstoff für das nächste Rescue verwendet.
Die Bibliothek wurde 3 bis 5 Rescue- und Selektionsrunden für jedes Antigen unterzogen.
Für die Selektion von Phagen, die an das MUC1 Peptid binden, wurde das Peptid chemisch an Sepharose 4B gekoppelt (bereitgestellt von M.R. Price). Eine 1 ml Säule wurde vorbereitet und Phagen wurde wie von Cafferty et al., 1990 (supra) beschrieben selektiert. Kurz gesagt, die Sepharose-MUC1 Säule wurde mit PBS gewaschen, die 2 % Magermilchpulver (MPBS) enthielt, und die Phagen wurden in 1 ml desselben Puffers geladen. Nach dem Waschen der Säule der Reihe nach mit 10 ml Volumina von MPBS, PBS, pH 7,2, 50 mM Tris-HCl/500 mM NaCl, pH 8,0, und 50 mM Tris-HCl/500 mM NaCl, pH 9,0, wurden Phagen mit 5 ml 100 mM Triethylamin eluiert und mit 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, neutralisiert. Es wurden fünf Selektionsrunden durchgeführt.
SCREENING UND SEQUENZIERUNG VON KLONEN
Einzelne Ampicillin-resistente Kolonien aus der Infektion von E. coli TG1 mit eluiertem Phage wurden entweder auf die Bindung von Phagen (Clackson et al., 1991) oder löslichen scFv-Fragmenten (Marks et al., 1991) gescreent. Da das Gen, das für das Antikörperfragment kodiert, an jenes, das für das Phage-Hüllprotein kodiert, durch ein Amber-Codon gebunden ist, können lösliche Fragmente von einem Nicht-Suppressor-Bakterienstamm sezerniert werden, der mit dem Phage infiziert ist (Hoogenboom et al., 1991). Die Bindung löslicher scFvs an Antigen im bakteriellem Überstand wurde mit dem Maus-Ak 9E10 (1 μg/ml), der das C-terminale Peptid-Tag erkennt (Munro und Pelham, Cell 46, 291–300, 1986), und dem Peroxidasekonjugiertem Anti-Maus Fc Antikörper (Sigma), wie beschrieben (Ward et al., 1989), detektiert. Platten wurden mit den Antigenen Fog1, TNFa, bovines Thyroglobulin und rsCD4 wie zuvor für die Immunotubes beschrieben beschichtet und mit CEA bei 5 mg/ml. Ein Urinextrakt, das menschliches polymorphes epitheliales Mucin (PEM) enthielt, wurde bei einer Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml verwendet.
Die Spezifität der isolierten Klone wurde durch ELISA der löslichen scFv-Fragmente unter Verwendung von Platten geprüft, die mit verschiedenen Proteinen beschichtet waren.
Die Platten wurden mit den Antigenen Fog1, TNFa, bovines Thyroglobulin, rsCD4, CEA und PEM wie zuvor beschrieben beschichtet. Andere Proteine wurden über Nacht bei Raumtemperatur bei einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS (Cytochrom c [Sigma]) oder in 50 mM NaHCO3, pH 9,6 (bovines Serumalbumin, Truthahn-Eiweiß-Lysozym, Hühner-Eiweiß-Lysozym, Hühner-Ovalbumin, Keyhole Limpet Hämocyanin [CalBiochem], Chymotrypsinogen A, Küken-Eiweiß-Trypsininhibitor [Sigma], Küken-Gammglobulin, gekoppelt an 4-Hydroxy-3-nitrophenyl-Essigsäure) aufgetragen. Klone, von welchen ein positives ELISA Signal erhalten wurde, wurden mittels PCR gescreent und einem "Fingerprinting" mit dem Restriktionsenzym BstNI wie in (Marks et al., 1991, supra) unterzogen, um verschiedene Klone zu identifizieren. Beispiele für Klone mit verschiedenen Restriktionsmustern wurden selektiert und die schwere und leichte Kette unter Verwendung eines Sequenase-Kits (USB) oder unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems) und eines Applied Biosystems 373A DNA-Sequenziergeräts sequenziert.
Sequenzierte Klone wurden unter Verwendung des Programms MacVector 3.5 (IBI Kodak, New Haven, CT) analysiert. Die VH-Gene wurden mit den 83 Keimlinien-Gensegmenten verglichen, die in dem VH-Verzeichnis angeführt sind, das von Tomlinson et al. zusammengestellt wurde (J. Mol. Biol. 227, 776–798, 1992). VL-Gene wurden mit 34 veröffentlichten kappa Keimlinien-Gensegmenten und 13 veröffentlichten lambda Gensegmenten verglichen. Regionen der V-Gene, für die PCR Primer kodieren, waren in der Analyse nicht enthalten.
DIE SELEKTIERTEN ANTIKÖRPERFRAGMENTE ZEIGEN EINE HOHE SPEZIFITÄT GEGEN SELBSTANTIGENE
Nach zwei bis fünf Selektionsrunden wurden E. coli Zellen mit eluierten Phagen infiziert, und Antikörperfragmente, die durch einzelne Klone erzeugt wurden, wurden mittels ELISA auf Bindung gescreent. Phagen, die mit dem 20 Aminosäuren MUC1 Peptid (Price et al., 1990, supra) selektiert wurden, das einem wiederholten Motiv in menschlichem MUC1 Mucin (Tumor-assoziiertes polymorphes epitheliales Mucin oder PEM) (Gender et al., 1988, supra; Gum et al., 1990 supra) entspricht, wurden auf die Bindung an menschliches PEM gescreent und binden somit sowohl Peptid als auch das Protein. Die V-Gene von Klonen mit Bindungsaktivitäten wurden sequenziert, und ein Klon für jedes Antigen von CEA, PEM und rsCD4 identifiziert (Tabelle 1). Das Erscheinen von nur geringen Zahlen von Klonen, die an CEA, PEM und menschliches rekombinantes lösliches CD4 (rsCD4) binden, selbst nach mehreren Selektionsrunden, könnte die Verwendung von VCS-M13 (Stratagene) als Helfer-Phage reflektieren (anstelle des M13DgIII Helfers, der für die anderen Antigene verwendet wurde). Populationen von Phage(mid)-Partikeln, die durch Rescue mit M13DgIII erzeugt wurden (die pIII nicht erzeugen können), haben höhere durchschnittliche Aviditäten als jene, die durch Rescue mit VCS-M13 erzeugt wurden (wo Wildtyp pIII, für das der Helfer-Phage kodiert, mit scFv-pIII Fusionen konkurrieren kann).
Die scFv-Fragmente wurden dann an einer Reihe anderer Proteinantigene auf Bindung gescreent und erwiesen sich als äußerst spezifisch. Dies ist in 2 mit den einzelnen Klonen mit Bindungsaktivität an menschliches CEA, MUC1 und menschliches rsCD4 dargestellt. Die Legend findet sich in der kurzen Beschreibung von 2 (supra).
Somit können Antikörperfragmente, die gegen die menschlichen Selbstantigene CEA und MUC1 (die Tumormarker sind) und rsCD4 gerichtet sind, von derselben Bibliothek abgeleitet werden und haben alle eine hohe Spezifität für Antigen.
BEISPIEL 4
CHARAKTERISIERUNG VON ANTISELBST-ANTIKÖRPERFRAGMENTEN DURCH DNA SEQUENZIERUNG UND BINDUNG AN ANTIGEN
Die Antiselbst-Antikörperfragmente, die in den Beispielen 1, 2 und 3 isoliert wurden, wurden durch DNA-Sequenzierung und Antigenbindung charakterisiert.
DIE ANTIKÖRPERFRAGMENTE WERDEN VON EINEM BEREICH NICHT MUTIERTER UND SOMATISCH MUTIERTER V-GENE ABGELEITET
Die Sequenzen mehrere Klone mit Selbstspezifität wurden wie in Beispiel 3 bestimmt und enthalten sowohl kappa wie auch lambda leichte Ketten (Tabelle II). Ein Vergleich mit den Sequenzen der nächsten Keimlinien-V-Gensegmente zeigt, dass mehrere verschiedene Familien verwendet werden (VH1, 3, 4 und 5; Vk1 und 4, VI1, 2 und 3). In einigen Fällen sind die V-Gene vollständig Keimlinie, zum Beispiel sowohl die VH- als auch VI-Gene von aThy-29. Die meisten der V-Gene haben jedoch mehrere Unterschiede zu den nächsten Keimlinien V-Gensegmenten, sowohl auf dem Nucleotid- als auch Aminsäure-Niveau (Tabelle II), was nahe legt, dass sie von somatisch mutierten B-Zellen abgeleitet sind. Einige Mutationen können während des PCR-Amplifikations- und Zusammenfügungsprozesses entstanden sein, zum Beispiel die VH-Gene von aFOG1-G8 und aMUC1-1, und die Vk-Gene von aThy-33 entstanden wahrscheinlich durch Überkreuzungen zwischen zwei V-Genen während der PCR-Amplifikation (Tabelle II). Ferner können große Unterschiede (zum Beispiel das Vk von aFOG1-H6, das sich um 36 Nucleotide unterscheidet) auf die Verwendung unbekannter V-Gensegmente zurückzuführen sein. Es gibt eine auffallende Homologie in der CDR3 der schweren Kette zwischen aTNF-A1 und aTNF-E1: die Keimlinien-V-Gene sind verschieden, aber es werden dieselben JH-Segmente verwendet und 11/16 Reste von CDR3 sind identisch. Dies legt nahe, dass beide scFv-Fragmente an dasselbe Epitop von TNF binden können.
DIE ANTIKÖRPERFRAGMENTE SIND GEGEN VERSCHIEDENE EPITOPE AUF DEMSELBEN PROTEIN GERICHTET
Die scFv-Fragmente, die gegen bovines Thyroglobulin von Beispiel 2 gerichtet sind, wurden auf Bindung an menschliches Thyroglobulin gescreent, das sich nur um 6 einzelne Aminosäurereste im Protomer unterscheidet (Malthiéry, Y. und Lissitzky, S. (1987), Eur. J. Biochem., 165, 491–498).
Vier der zwölf Klone (einschließlich aThy-29) banden an menschliches Thyroglobulin, während dies für den Rest (einschließlich aThy-32 und aThy-33) nicht zutraf (Daten nicht dargestellt). Ebenso wurden die Fragmente, die an den menschlichen Antikörper Fog-1 banden, auf Bindung an eine Reihe anderer Antikörper gescreent, die sich in dem Isotyp der schweren und leichten Kette unterschieden (3). Die Legende findet sich in der kurzen Beschreibung von 3 (supra). Das Fragment aFOG1-A4 band an Isotypen der schweren Kette g1, 2 und 3, nicht aber an g4 oder m. Im Gegensatz dazu banden die Fragmente aFOG1-H6 und aFOG1-A3 an keinen der anderen Antikörper, einschließlich jener mit demselben Isotyp wie Fog-1, was nahe legt, dass sie gegen die variable Domäne von Fog-1 gerichtet sind.
CHARAKTERISIERUNG SELEKTIERTER SCFV-FRAGMENTE
Die folgenden Klone wurden zur großtechnischen Reinigung und weiteren Charakterisierung gewählt: aFOG1-H6, aFOG1-A3, aTNF-E7 und aThy-29. Kolonien des Nicht-Suppressor E. coli Stamms HB2151, die das geeignete Phagemid enthielten, wurden zum Beimpfen von 2 Litern 2 × Ty verwendet, die 100 μg Ampicillin/ml und 0,1 % Gloucose enthielt. Die Kulturen wurden gezüchtet und induziert (De Bellis, D. und Schwartz, I. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 1311) und die scFv Fragmente mit Tags unter Verwendung des mAb 9E10 wie in (Clackson et al., 1991, supra und WO92/01047) gereinigt.
Die Hemmung der 125I-Fog-1 Bindung an menschliches Rh D Antigen durch die affinitätsgereinigten scFv-Fragmente aFOG1-H6 und aFOG1-A3 wurde im Wesent lichen wie früher (Gorick, B.D., Thompson, K.M., Melamed, M.D. und Hughes, J.N. (1988) Vox. Sang., 55, 165–170) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. 0,0148 μg 125I-FOG1 wurde mit unterschiedlichen Mengen an gereinigtem aFOG1-H6 oder aFOG1-A3 scFv-Fragmenten (0 bis 16 μg) bei 37 °C 1,5 Stunden vorinkubiert, bevor 0,5 μl RIR2 Zellen (oder rr Zellen als Kontrolle) zugegeben wurden. Die Mischung wurde dann weitere 1,5 Stunden bei 37 °C unter konstantem Mischen inkubiert, und schließlich wurden die Zellen vom Überstand abgetrennt. Als Kontrolle wurde auch eine Titrierung mit einem gereinigten scFv-Fragment durchgeführt, das gegen Truthahn-Eiweiß-Lysozym (aTEL9) gerichtet war (Marks et al., 1991, supra).
Kinetische Messungen wurden unter Verwendung der Oberflächenplasmon-Resonanz durchgeführt (BIAcore, Pharmacia Biosensor AB) (Jönsson, U. Fägerstam, L., Ivarsson, B., Lundh, K., Löfås, S., Persson, B., Roos, H., Rönnberg, I., Sjölander, S., Stenberg, E., Ståhlberg, R., Urbaniczky, C., Östlin, H. und Malmqvist, M. (1991) BioTechniques, 11, 620–627; Jönsson, U. und Malmqvist, M. (1992) in Turner A. (Hrg.), Real Time Biospecific Interaction. JAI Press Ltd., San Diego, Band 2, S. 291-336). Zur Trennung monomerer und multimerer Spezies wurden die gereinigten scFv-Fragmente durch Ultrafiltration konzentriert und dann auf einer kalibrierten Superdex 75 FPLC Säule (Pharmacia) in PBS, 0,2 mm EDTA fraktioniert. Die Gelfiltration wurde sowohl durch Extinktion bei 280 nm als auch on-line zu BIAcore mit immobilisiertem Antigen auf dem Sensorchip überwacht (Johnsson et al., 1991).
Kinetische Experiment wurden in zwei verschiedenen Konfigurationen durchgeführt. Zunächst wurden zur Analyse der Bindung von löslichem scFv die verschiedenen Antigene kovalent auf dem Sensorchip immobilisiert (im Fall von mAb Fog-1 wurde der Antikörper auch über einen Maus-Anti-Mensch, kappa leichte Kette, mAb unter Verwendung eines Sensorchips, beschichtet mit Kaninchen-Anti-Maus IgG1, immobilisiert). Zweitens wurde zur Analyse der Bindung des löslichen mAb FOG-1 aFOG-1H6 scFv auf der Chipoberfläche immobilisiert.
Die Antigene wurden durch ihre Aminogruppen unter Verwendung des Amino Coupling Kits (Pharmacia Biosensor AB) (Johnsson, B. Löfås, S. und Lindqvist, G. (1991) Anal. Biochem, 198, 268–277) an den CM5 Sensorchip gekoppelt. Die Antigene wurden in 10 mM Acetatpuffer, pH 5,0, auf etwa 25 μg/ml verdünnt, und 3805 Resonanzeinheiten (RE) TNF, 6249 RE menschliches Thyroglobulin und 5279 RE FOG1 wurden immobilisiert. Für die biospezifische Darstellung von Fog-1 wurde affinitätsgereinigtes Kaninchen-Anti-Maus IgG1 (Pharmacia Biosensor AB) an die Oberfläche gekoppelt, gefolgt von einem Maus-mAb-Anti-Mensch kappa (2300 RE) und dann Fog-1 (2050 RE). Da die Bindung des Kaninchen-Anti-Maus IgG1 an den Maus-mAb durch 10 mM HCl umkehrbar war, wurde der Komplex für jeden analytischen Zyklus erneut gebildet.
ScFv Anti-Fog-1 wurde an die CM5 Oberfläche zu 1538 RE gekoppelt. Alle Bestimmungen wurden bei 25 °C in PBS, 0,2 mM EDTA, 0,05 % BIAcore Tensid P20 mit einer konstanten Fließrate von 10 μl/min und einem eingespritztem Probenvolumen von 35 μl durchgeführt. Es war nicht notwendig, das Antigen zu regenerieren, da sich die scFv-Fragmente rasch zersetzen, mit der Ausnahme der biospezifischen Darstellung von Antigen durch Kaninchen-Anti-Maus IgG1, das mit 10 mM HCl 3 min regeneriert wurde.
Analysen des scFv Monomers wurden im Konzentrationsbereich 100 bis 500 nM und Dimere im Bereich von 40 bis 200 nM durchgeführt, mit Ausnahme des biospezifisch dargestellten Fog-1, bei dem die Konzentration des dimeren scFv 0,25 bis 1,26 μm betrug. Fog-1 wurde auf der aFOG1-H6 scFv-Oberfläche im Konzentrationsbereich von 10 bis 200 nM analysiert.
Alle Konzentrationen wurden aus der UV-Absorption bei 280 nm berechnet (unter der Annahme, dass 0,7 mg/ml scFv A280 = 1 ergibt [Mach, H., Middaugh, C.R. und Lewis, R.V. (1992) Anal. Biochem., 200, 74–80] und dass Mr eines scFv Monomers 30 kD und eines Dimers 60 kD ist). Für die Fraktion des aktiven Protein wurde keine Korrektur vorgenommen und daher sind die on-Raten eine Unterschätzung. Die kinetische Auswertung der Daten wurde nach (Karlsson, R., Michaelsson, A. und Mattsson, L. (1991), J. Immunol. Methods, 145, 229–240) durchgeführt und auf dem Programm Origin 1.1 (Microval Inc., Northampton, Mass., USA) ausgewertet.
ZWEI DER ANTIKÖRPERFRAGMENTE SIND GEGEN IDIOTOPE VON MENSCHLICHEM MAB FOG-1 GERICHTET
Die Bindung von 125I Fog-1 Antikörper an menschliche rote Blutzellen, die das Rh D Antigen tragen, könnte sowohl durch aFOG1-H6 als auch aFOG1-A3 scFv-Fragmente gehemmt werden. So sind sowohl aFOG1-H6 als auch aFOG1-A3 stellen-assoziierte Anti-Idiotyp Antikörper, die mit der Antigen-Bindungsstelle von Fog-1 einen Komplex bilden. Das Ausmaß der Hemmung von 125I-Fog-1, das an das Rh D Antigen bindet (auf menschlichen R1R2 roten Blutzellen) wurde durch Titrierung mit affinitätsgereinigten aFOG1-H6 und aFOG1-A3 scFv-Fragmenten bestimmt. (Als Kontrolle wurde keine Hemmung der 125I-Fog-1 Bindung bei Verwendung eines scFv-Fragments (aTEL9) (Marks et al., 1991, supra) beobachtet, das gegen Truthahn-Eiweiß-Lysozym gerichtet war). Mit dem Maximum von 16 μg scFv (1000-facher molarer Überschuss zu 125I-Fog-1) wurde die Bindung um 14,2 (aFog1-H6) und 20,9 % (aFOG1-A3) gehemmt, was nahe legt, dass die Affinitäten dieser Fragmente für Fog-1 viel geringer sind als die Affinität von Fog-1 für das Rh D Antigen (Ka = 2,2 × 10⁹ M^–1), das monovalent bindet (Gorick et al., 1988, supra). Wenn 100 % der Fragmente aktiv sind, könnten die Affinitäten der zwei Fragmente für die Bindung an Fog-1 mit Ka = 3 × 10⁵ M^–1 für aFOG1-H6 und 6 × 10⁵ M^–1 für aFOG1-A3 geschätzt werden, und dies stimmt mit anderen kinetischen Messungen überein (siehe unten und Tabelle III).
DIE SCFV-FRAGMENTE KÖNNEN SOWOHL MONOMERE WIE AUCH DIMERE IN LÖSUNG BILDEN
Lösliche Antikörperfragmente wurden von bakteriellen Überständen durch Affinitätschromatographie durch Bindung des C-terminalen Peptid-Tags an den mAb 9E10 gereinigt. Nach Ultrafiltration wurden die Fragmente durch FPLC Gelfiltration (Pharmacia) auf Superdex 75 (Pharmacia) weiter gereinigt und on-line sowohl durch UV-Absorption (280 nm) wie auch durch Bindung an Antigen, das auf einem Sensorchip in BIAcore (Pharmacia Biosensors AB) immobilisiert war, detektiert. Dies zeigte, dass die scFv-Fragmente in zwei Spitzen erschienen, deren Größe den Monomeren und Dimeren entsprach. Die Dimere binden wegen ihrer größeren Bindungsavidität stärker an das immobilisierte Antigen als die Monomere. Die scFv Dimere laufen als Monomere auf nicht reduzierenden SDS-Gelen und sind daher nicht durch Disulfidbindungen gebunden. Da zwei Spitzen in der Gelfiltration erkennbar sind, scheint, dass in diesem Fall die Monomere und Dimere nicht rasch interkonvertieren. Vermutlich sind die Dimere scFv-Fragmente, die durch den flexiblen Linker miteinander verbunden sind, der die schweren und leichten Ketten verbindet, oder mit der schweren Kette eines scFv Moleküls, das mit der leichten Kette des anderen assoziiert ist. Wir stellen fest, dass Antikörper-Fab-Fragmente, die in Bakterien hergestellt werden, auch multimerisieren können (unveröffentlichte Daten).
DIE SCFV FRAGMENTE HABEN MIKROMOLARE AFFINITÄTEN
Die Gegenwart von sowohl scFv Monomeren als auch Dimeren könnte zu einer Überschätzung der Bindungsaffinität unter Verwendung von Festphasenmethoden führen. Zur Bestimmung der Affinität und Kinetik der Bindung von scFv-Fragmenten an einen mit Antigen beschichteten Chip unter Verwendung der Oberflächenplasmon-Resonanz, wurden daher die Fragmente durch Gelfiltration gereinigt (Tabelle III). Für die Dimere wurden die off-Rate Konstanten mit etwa 10^–2 s^–1 bestimmt und die on-Rate Konstanten für die scFv Dimere mit etwa 10⁵–10⁶ M^–1 s^–1 (unter der Annahme, dass die Probe vollständig aktiv ist). Im Falle von aFOG-H6 wurde das Antigen (das mAb Fog-1) auf dem Sensorchip in zwei Weisen immobilisiert, entweder direkt oder über einen Kaninchen-Anti-Maus IgG1 Antikörper. Die Ergebnisse waren für jede Methode annähernd gleich (siehe Tabelle III). Die aktive Fraktion von scFv-Fragmenten unterscheidet sich jedoch deutlich und könnte zu einer Unterschätzung der on-Rate (und der Bindungsaffinität) führen; zum Beispiel konnten bei Verwendung einer Fluoreszenzlösch-Titrierung mit mehreren scFv-Fragmenten, die gegen Phenyloxazolon gerichtet waren, nur 0,06 bis 0,38 funktio nelle Bindungsstellen pro scFv-Molekül detektiert werden (unveröffentlichte Daten). Tatsächlich hängen die on-Rate Konstanten, die für die Assoziierung des aFOG1-H6 Fragment und Fog-1 Antikörpers berechnet wurden, davon ab, ob der Antikörper (k_on 2,2 × 10⁵ M^–1 s^–1) oder das scFv-Fragment (k_on 1,0 × 10⁶ M^–1 s^–1) auf dem Sensorchip immobilisiert ist (Tabelle II), was darauf hinweist, dass das aFOG1-H6 Fragment weniger aktiv ist als der Fog-1 Antikörper. Für die scFv Monomere waren die Bindungssignale gering und es war schwierig, der Kinetik der Bindung zu der Oberfläche zu folgen, mit Ausnahme der Dissoziation des aThy-29 Monomers (k_off = 2 × 10^–2 s^–1). Die vierfache Stabilisierung des aThy-29 Fragmentdimers jedoch (siehe unten), legt nahe, dass die off-Rate Konstanten der anderen Monomere > 10^–2 s^–1, möglicherweise 10^–1 s^–1 sind.
Die größere Stabilität der scFv Dimere auf dem Sensorchip, verglichen mit Monomeren, zeigt, dass die Dimere bivalent sind. Die scFv Dimere sind daher analog den zwei Köpfen des Antikörpers IgG (aber mit anderem Abstand zwischen den Köpfen), und ihre Bindungsaviditäten wurden mit etwa 10⁷ M^–1 aus k_on/k_off geschätzt (Tabelle III). Die Affinitäten der Monomere müssen aufgrund ihrer schnelleren Dissoziation von der Oberfläche geringer sein. Für das aTHY-29 Monomer und unter der Annahme, dass die on-Rate Konstante dieselbe für das Dimer ist (Mason, D.W. und Williams, A.F. (1986), Kinetics of Antibody Reactions and The Analysis of Cell Surface Antigens. Blackwell Scientific, Oxford), können wir eine Affinität von etwa 3 × 10⁶ M^–1 schätzen. Diese Affinitäten, berechnet aus den durch Oberflächenplasmon-Resonanz gemessenen Ratenkonstanten, scheinen jenen ähnlich zu sein, die in Lösung durch Fluoreszenzlösch-Techniken gemessen wurden. Zum Beispiel wurde die Bindungsaffinität des monomeren scFv-Fragments aTEL9 (Marks et al., 1991), das an Truthahn-Lysozym bindet (und von derselben Bibliothek abgeleitet wurde), mit 3,9 × 10⁷ M^–1 unter Verwendung der Oberflächenplasmon-Resonanz geschätzt (Tabelle III) und mit 1,2 × 10⁷ M^–1 durch Fluoreszenzlöschung (Marks et al., 1991, supra).
Die Affinitäten von isolierten Antikörpern sind für Antikörper von der primären Maus-Immunantwort typisch (Foote, J. und Milstein, C. (1991), Nature, 352, 530–532). Die Kinetik der Assoziation der Antikörperfragmente an die Protein-Selbstantigene (10⁵ bis 10⁶ M^–1 s^–1) sind auch für zuvor charakterisierte Ab-Proteinwechselwirkungen typisch.
Die Dissoziationskinetik (10² s^–1) jedoch ist relativ schnell für Ab-Proteinwechselwirkungen (aber beide Raten sind im Vergleich zu vielen Ab-Hapten-Wechselwirkungen langsam). Auf den ersten Blick ist es überraschend, dass wir scFv-Fragmente mit solchen schnellen off-Raten isolierten konnten, da nicht zu erwarten war, dass ein "monomerer" Phage auf dem festen Träger während der Waschung zurückgehalten wird. scFv-Fragmente sind jedoch multivalent auf dem Phagen exponiert, insbesondere bei Verwendung des M13DgIII Helfer-Phagen, und einige der scFvs, die zur Bildung von Dimeren in Lösung neigen, können auch Dimere auf dem Phagen bilden. Die multivalenten Wechselwirkungen mit Antigen tragen dazu bei, den Phagen zurückzuhalten, wodurch der kodierte scFv Phage isoliert werden kann.
Zufällige kombinatorische V-Gen-Repertoires, die von der mRNA immunisierter Tiere abgeleitet wurden, sind mit dem für V-Gene der schweren oder leichten Kette kodierenden Teil einer Antigen-Bindungsstelle angereichert und dies erleichtert die Isolierung von Antigen bindenden Fragmenten unter Verwendung der Phage-Technologie, obwohl die Kombinationen von V-Genen jedes B-Lymphozyten weitgehend zerstört zu sein scheinen. Antigen-Bindungsstellen können auch erneut durch die Zufallskombination von Ketten erzeugt werden, wie durch die Isolierung von scFv-Fragmenten gegen Fremdantigene von nicht immunisierten Spendern (Marks et al., 1991, supra) gezeigt wird.
"Natürliche Auto-Antikörper", selbstreaktive Antikörper, die von gesunden Spendern isoliert werden, neigen zu einer geringen Affinität und Polyspezifität und können durch eine eigene Untergruppe von B-Zellen, die interne Aktivitätsgruppe (Holmberg, D. und Coutinho, A. (1985), Immunol. Today 6, 356–357) gut erzeugt werden, die zum Teil durch CD5+ B-Zellen (Casali, P. und Notkins, A.L. (1989), Annu. Rev. Immunol., 7, 513–535) beigetragen wird. Im Gegensatz dazu sind die Antiselbst- scFv-Fragmente, die wir herstellten, in der Bindung an Antigen hoch spezifisch, obwohl sie nur mikromolare Affinitäten haben. Dies ist eine überraschende und wertvolle Erkenntnis. Ihre Affinitäten könnten vermutlich in vitro verbessert werden, zum Beispiel wurde die Affinität eines scFv-Fragments für das Hapten Phenyloxazolon, abgeleitet von der Phage-Bibliothek (und, wie die hier beschriebenen Anti-Selbstantikörper, mit einer relativ schnellen off-Rate), von Ka = 3,1 × 10⁶ M^–1 auf 9,1 × 10⁸ M^–1 durch Chain-Shuffling verbessert (WO92/01047; Marks et al., 1992b, Biotechnology 10, 779–783, 1992). Dies ermöglichte die Bildung hoch spezifischer, menschlicher Antikörper mit hoher Affinität, die gegen Selbstantigene gerichtet sind, zur Verwendung in der Humantherapie.
BEISPIEL 5:
BILDUNG EINER SYNTHETISCHEN BIBLIOTHEK
Durch Exposition von Antikörperrepertoires auf der Oberfläche eines filamentösen Phagen und Selektion des Phagen mit Antigen¹, können wir eine Immunselektion^2,3 nachahmen und menschliche Antikörper aus den umgeordneten V-Genen nicht immunisierter Spender⁴ bilden. Menschliche Antikörper wurden nun durch Synthese aus definierten V-Genelementen hergestellt. Ein Repertoire von 49 menschlichen Keimlinien V_H Gensegmenten wurde in vitro durch Bindung an ein synthetisches "D-Segment" aus fünf zufälligen Aminosäureresten und ein J-Segment umgeordnet, um eine synthetische, dritte Komplementarität bestimmende Region (CDR) aus acht Resten zu bilden. Die umgeordneten V_H Gene wurden mit einer menschlichen Vlambda3 leichten Kette als Einketten-Fv-Fragmente für das Phage-Display geklont. Die Bibliothek aus 10⁷ Phagen wurden mit einem Hapten 2-Phenyl-oxazol-5-on-(phOx-) Konjugat zu bovinem Serumalbumin (BSA) einem Panning unterzogen, und Phagen isoliert, die für Fragmente mit spezifischer Bindungsaktivität zu phOx-BSA kodiert, und mit Affinitäten zu phOx-gamma-Aminobuttersäure (phOx-GABA) im mikromolaren Bereich. Ein Vergleich von einundzwanzig Klonen mit einzigartigen Sequenzen zeigt, dass die in vitro "Immunantwort" auf das Hapten weitgehend auf das V_H26 Segment (V_H3 Familie)⁶ beschränkt war, mit einem Invarianten aromatischen Rest (Tyr, Phe, Trp) bei Rest 98 von CDR3.
Die Verwendung von in vitro umgeordneten V-Genen kann die Konstruktion von Antikörper-Bibliotheken ermöglichen, die zur Bindung von Antigenen bekannter Struktur neigen, und die Bildung von therapeutischen menschlichen Antikörpern mit verringerter Immunogenität.
Variable Domäne eines Antikörpers bestehen aus einem β-Faltblatt-Framework mit drei Schleifen einer hypervariablen Sequenz oder CDRs⁵. Die Schleifen bilden Antigen-Bindungsstellen mit einer Vielzahl von Formen, die von flachen Oberflächen⁷ zu Taschen⁸ reichen. Für menschliche schwere Ketten wird die Sequenzdiversität der ersten zwei CDRs von einem Repertoire von etwa fünfzig Keimlinien-V_H-Segmenten kodiert. (I.M. Tomlinson et al., supra). Die dritte CDR wird aus der Rekombination dieser Segmente mit etwa dreißig D und sechs j Segmenten⁹ erzeugt, und obwohl ihre Sequenz äußerst variabel ist, enthält sie häufig eine Salzbrücke von Asp101 der Schleife zu Arg94 des Frameworks¹⁰. Die Strukturen und Längen der ersten zwei CDRs sind begrenzt^10,11, aber jene von CDR3 unterscheiden sich deutlich, wobei die Längen von 4 bis 25 Resten⁵ reichen.
Es wurde eine Bibliothek aus umgeordneten V_H-Genen mit einer CDR3 aus acht Resten, enthaltend Asp101, in Kombination mit einer einzelnen Vlambda (Ref. 12) leichten Kette erzeugt. Neunundvierzig Keimlinien-V_H-Segmente, die für den Großteil des menschlichen V_H-Repertoires kodieren (Tomlinson et al., supra) wurden jeweils unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion¹³ und Oligonucleotidprimer amplifiziert, die ein synthetisches D-Segment (aus 15 Basen einer Zufallssequenz am 3'-Ende des V_H-Segments) und ein J-Segment einführen, die gemeinsam für eine CDR3-Schleife aus acht Resten kodieren (4). Die umgeordneten Segmente wurden gepoolt und für das Phage-Display mit einer menschlichen Vlambda3 leichten Kette geklont, wodurch eine synthetische Bibliothek aus 10⁷ Phage-Klonen erzeugt wurde.
Wie das Immunsystem kann die synthetische Bibliothek aus 10⁷ Phage-Klonen nur einen kleinen Bruchteil der möglichen Diversität ausschöpfen. Somit ist die Diversität potenziell 49 × 32⁵ = 1,6 × 10⁹ verschiedene Nucleotidsequenzen, oder 49 × 20⁵ = 1,6 × 10⁸ verschiedene Aminosäuresequenzen.
Die Bibliothek wurde vier Runden Züchten und Panning auf mit phOx-bovinem Serumalbumin (BSA) beschichteten Röhrchen unterzogen, und Klone wurden als lösliche¹⁴ Einketten-Fv-Fragmente^15,16 auf Bindungsaktivität an phOx-BSA durch ELISA⁴ gescreent. Nach der dritten und vierten Runde wurden 14/96 beziehungsweise 61/96 Klone mit Bindungsaktivitäten zu phOx-BSA identifiziert und von diesen (29 getestet) band keiner an andere Proteine (siehe Legende von Tabelle B).
Ferner konnte lösliches Hapten mit ihnen um die Bindung an phOx-BSA beschichtete Platten konkurrieren (Tabelle B).
Die Sequenzierung zeigte, dass viele (21129) der phOx-Bindemitteln einzigartig waren, mit einer acht Reste-CDR3, und entweder ein Segment von der V_H4-Familie oder eines von drei Segmenten von der V_H3-Familie verwendeten (Tabelle B).
Gemeinsam verwenden diese Segmente drei der sieben "kanonischen" Faltungen, die für die ersten zwei hypervariablen Schleifen von menschlichen V_H-Segmenten zur Verfügung stehen (C. Chothia, et al, supra). Die Mehrheit der einzigartigen Klone (16/21) wurde von dem VH26-Segment⁶ abgleitet und hatten verwandte Sequenzen in der dritten hypervariablen Schleife: in dieser Gruppe neigt der erste Rest zu einer verzweigten aliphatischen Seitenkette (15/16), der zweite Rest neigt dazu, Lysin oder Arginin zu sein (11/16), während der vierte Rest immer ein aromatischer Rest ist (am häufigsten Tyrosin).
Die Affinitäten (K_d) von zwei der stärkeren Bindemittel (Ox 13 und Ox-31, Tabelle B) für phOx-GABA wurden durch Fluoreszenzlösch-Titrierung¹⁷ mit 3,1 ± 0,2 μM beziehungsweise 6,7 ± 0,7 μM bestimmt. Obwohl der synthetischen Antikörper- Bibliothek die verschiedenen VH-CDR3 Längen und die verschiedenen leichten Ketten von Antikörpern fehlen, die in vivo gebildet werden, sind die Affinitäten für phOx-GABA mit 0,5 μM für einen (Phage)-Antikörper, der von nicht immunisierten menschlichen Spendern⁴ erhalten wurde, oder 1 μM für mehrere Hybridome von einer primären Maus-Immunantwort¹⁸ vergleichbar (siehe aber Caveat, Legende Tabelle A). Zur Verbesserung dieser Affinitäten könnten die vielen verschiedenen selektierten phOx-Antikörper systematisch verändert werden (siehe unten) (Tabelle A).
Im Prinzip bietet die Verwendung von Phage-Display-Bibliotheken aus V-Genen, die in vitro umgeordnet wurden, eine attraktive Alternative zu jenen, die in vivo umgeordnet wurden⁴. Erstens sind die Framework-Regionen und ersten zwei hypervariablen Schleifen sowohl der schweren als auch leichten Ketten der synthetischen menschlichen Antikörper, die aus der Bibliothek erzeugt werden, im Wesentlichen Keimlinie. Dies steht im Gegensatz zu den "primären" Phage-Antikörpern, die von menschlichen V-Genen, die in vivo umgeordnet wurden, erhalten wurden, in welchen das Ausmaß der somatischen Mutation stark variierte⁴. Unter Beiseitelassung des Polymorphismus sind die VH-Gensegmente in verschiedenen Individuen identisch, und die synthetischen Antikörper sind potenziell weniger immunogen. Durch Ändern der Längen und Sequenzen der CDR3 Schleifen der schweren und leichten Kette, oder durch Lokalisieren der minimalen Mutationen in den anderen CDR Schleifen, oder durch Shuffling mit synthetischen "Keimlinien" leichten Ketten^19,20 kann es möglich sein, ihre Affinitäten zu verbessern, während ihr Keimliniencharakter erhalten bleibt.
Zweitens sind beide Arten von Bibliothek stark gewichtet ("biased"). In den "natürlichen" Bibliotheken liegt die Gewichtung außerhalb unserer Kontrolle, und wird zum Beispiel durch allele Variation, Deletionspolymorphismus und Deletion selbtsreaktiver Klone auferlegt. In der synthetischen Bibliothek kann die Gewichtung systematisch eingeführt werden. Hier zum Beispiel wurden alle VH-Gensegmente ausgewählt und somit die Faltung der ersten und zweiten hypervariablen Schleifen: ebenso waren die Länge und Diversität von VH-CDR3 und der leichten Kette festgelegt. Obwohl mehrere Möglichkeiten zur Bildung unterschiedlicher synthetischer Bibliotheken vorgeschlagen wurden², sollte es auch möglich sein, Designprinzipien in die kodierten Strukturen einzugliedern. Wenn die Form des Antigens bekannt wäre, könnte eine Hülle annähernd komplementärer Bindungsstellen entworfen und mit definierten V-Genelementen gebaut werden.
Die Verwendung solcher "Designer"-Bibliotheken würde die Isolierung von Antikörpern mit höheren Affinitäten begünstigen.
TABELLE A
TABELLE A – ZUSAMMENSETZUNG DER SYNTHETISCHEN BIBLIOTHEK
Neunundvierzig menschliche V_H-Segmente (Tomlinson et al., supra) wurden verwendet, eines für jede der V_H ², V_H ⁵ und V_H ⁶ Genfamilien und mehrere Segmente für die anderen drei Familien, und nach Familie geklont. Die Klone von den V_H-Segmenten jeder Familie wurden auf Gegenwart eines Einschubs (im Durchschnitt 85 %) geprüft und zu einer einzigen großen Bibliothek wie in Tabelle B gepoolt, wodurch eine (kontrollierte) Gewichtung für bestimmte Genfamilien erzeugt wurde. Die Segmente von den V_H ², V_H ⁵ und V_H ⁶ Familien sind dadurch in Bezug auf die Segmente von anderen Familien "überrepräsentiert". Die Sequenzierung von fünfunddreißig Klonen von der nicht selektierten Bibliothek bestätigte, dass V_H-Segmente von jeder Familie vorhanden waren und dass die Nucleotide in den erwarteten Verhältnissen im D-Segment vorhanden waren, aber mit einer geringfügigen Gewichtung für C. (An der ersten und zweiten Position jedes Codons, A, 21,3 %; G, 17,9 %; C, 33,77 % und T, 27,1 %; an der dritten Position G, 42,6 % und T, 57,4 %). Die Expressionswerte der Antikörperfragmente wurden ebenso geprüft, und V_H-Segmente wurden in Klonen mit nachweisbaren Expressionswerten identifiziert, zum Beispiel V_H1 (DP-7), V_H2 (DP-27), V_H3 (DP-29,35,38,44,47,51,53), V_H4 (DP-63,69), V_H5 (DP-73) und V_H6 (DP-74).
VERFAHREN
Die Klone wurden auf das Vorhandensein eines Einschubs durch 'PCR-Screening'²¹ mit Oligonucleotiden LMB3 und pHEN-SEQ (Ref. 4) geprüft und von doppelsträngiger DNA durch die Didesoxy-Kettenterminationsmethode²² mit Oligonucleotid LINKSEQ (5'-CGA TCC GCC ACC GCC AGA G-3') sequenziert. (Die Zahlen in den Tabellen sind auf den Einschub korrigiert).
Die Expression von löslichen scFv-Fragmenten wurde durch Auftüpfeln von 10 μl eines Überstands induzierter über Nacht Kulturen in E. coli HB2151 (Ref. 14) auf Nitrozellulosefilter unter Verwendung einer Slot-Blot-Vorrichtung (Minifold II, Schleicher und SchueII) und Detektieren der gebundenen scFv-Fragmente mit Peptid-Tag mit 9E10 Antikörper²³ und Peroxidase-markierten Anti-Maus-Antikörpern geprüft.
TABELLE B
TABELLE B – PHOX-BINDEMITTEL, DIE AUS DER SYNTHETISCHEN BIBLIOTHEK ISOLIERT WURDEN
Phagen wurden aus der Bibliothek durch Rescue mit VCS-M13 hergestellt, und Panning-Runden in phOx-BSA beschichteten Röhrchen wie in Ref. 4 unterzogen. Die Sequenzen von 21 Phagen, die an phOx banden, zeigten vier Keimlinien-VH-Segmente, DP-42,45,47 (VH3-Familie) und DP-67 (VH4-Familie). DP-47 ist mit VH26 identisch (Ref. 6, korrigiert in Ref. 24), während DP-42, DP-45 und DP-67 sich nur in einem oder einigen wenigen Framework-Resten von 8-1B (Ref. 25), 65-2 (Ref. 26) beziehungsweise VH4.22 (Ref. 27) unterscheiden. Klone von der nicht selektierten Bibliothek unter Verwendung des DP47 V_H-Segments und denen das charakteristische Muster von CDR3 fehlte, banden nicht an phOx. Von den getesteten 21 phOx Bindemitteln band keines an BSA, NIP-BSA, Plastik, Chymotrypsinogen A, Cytochrom C, bovines Thyroglobulin, Keyhole Limpet Haemocyanin oder Truthahn-Eiweiß-Lysozym. Vier Kloe, die an BSA banden (nicht aber an phOx) erwiesen sich als Kontaminanten (αBSA3 Klone, von Ref. 4).
VERFAHREN
Wie in Ref. 4. Die relativen Affinitäten der scFv-Fragmente wurden durch Hemmungs-ELISA²⁸ bestimmt. Eine serielle Verdünnung von 4-Gamma-Amino-Buttersäure Methylen-2-Phenyl-oxazol-5-on (phOx-GABA), mit Konzentrationen im Bereich von 6 bis 400 μM, wurde in 4 % Marvel-PBS hergestellt und scFv-Überstand zugesetzt. Die Konzentration von phOx-GABA, die zu einer 50 % Verringerung des Signals (I₅₀) für die Bindung an phOx-BSA führte, wurde aufgezeichnet. Die Affinitäten der Klone Ox-13 und Ox-31 für phOx-GABA wurden durch Fluoreszenzlösch-Titrierung unter Verwendung von scFv bestimmt, die durch das c-myc-Tag (Ref. 4) gereinigt wurden. Im Idealfall würde die Affinität für das phOx-BSA-Konjugat direkt gemessen werden, oder jene für phOx-Capronsäure, aber phOx-GAB wurde hier verwendet, um einen Vergleich mit den Hybridomddaten von Ref. 18 zu ermöglichen. Die Affinitäten der Antikörper für das phOx-Konjugat oder für phOx- Capronsäure sind wahrscheinlich besser als jene, die für phOx-GABE gemessen werden.
FIGUR 4 – ZEIGT DIE ANORDNUNG UMGEORDNETER VH-GENE (SIEHE TEXT) VERFAHREN
Ein synthetisches Oligonucleotid SYNLIB1 (siehe Tabelle IV) führte ein D-Segment mit einer fünf Reste-Zufallsaminosäuresequenz, ein J-Segment und eine Xhol-Restriktionsstelle an dem 3'-Ende von jedem der 49 menschlichen V_H-Keimliniensegmente ein (Tomlinson et al., supra). Der Primer wurde in der Polymerasekettenreaktion¹³ mit auf V_H-Familie basierten Back-Primern (VHBACK) verwendet, die eine Ncol-Stelle⁴, HuVH1BackSfi bis HuVH6BackSfi, eingliederten. Jeder V_H-Segmentklon (bereitgestellt als einzelsträngige Matrize im M13-Vektor) wurde getrennt bei 94 °C 1 Min, bei 50 °C 1 min und bei 72 °C 1,5 min 25 Zyklen auf einem PHC-3 Thermocycler (Techne) amplifiziert. Jede Amplifikation wurde durch Elektrophorese auf Agarosegel geprüft und gleiche DNA-Mengen von V_H-Segmenten derselben Familie wurden gepoolt, mit Ncol und Xhol aufgeschlossen und in den Vektor pHEN1 (Ref. 14) geklont, der eine umgeordnete variable Domäne der Vlambda3 leichten Kette, (IGLV3S1; Ref. 12) trug, die von einem scFv-Fragment erhalten wurde, das an BSA band⁴.
Wenn anstelle eines Zufallsoligonucleotids ein Oligonucleotid, das für eine CDR kodiert, z.B. von einem Nagetier, verwendet wird, würde dieses die nicht menschliche CDR auf die synthetische menschliche Produkt-Bibliothek aufprägen.
IN BEISPIEL 5 ANGEFÜHRTE REFERENZEN

1. McCafferty, Griffiths, A.D., Winter, G. & Chiswell D.J. (1990). Nature, 348, 552–554
2. Milstein, C. (1990). Proc R Soc Lond Biol, 239, 1–16.
3. Winter, G. & Milstein, C (1991). Nature, 349, 293–299.
4. Marks, J.D., et al (1991). J Mol Biol, 222, 581–597.
5. Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. & Gottesman, K.S. Sequences of proteins of immunological interest (US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987).
6. Matthyssens, G. & Rabbits, T.H. (1980). Proc Natl Acad Sci USA, 77, 6561-6565.
7. Amit, A.G., Mariuzza, R.A. Phillips, S.E. & Poljak, R.J. (1986). Science, 233, 747–753.
8. Alzari, P.M. et al (1990). Embo J, 9, 3807–3814.
9. Ichihara, Y., Matsuoka, N. & Kurosawa, Y (1988), Embo J, 7, 4141–4150.
10. Chothia, C. & Lesk, A.M. (1987). J Mol Biol, 196, 901–917.
11. Chothia, C., et al (1989). Nature, 342, 877–883.
12. Frippiat, J.P., et al (1990). Nucleic Acids Res, 18, 7134.
13. Saiki, R.K., et al (1985). Science, 230, 1350–1354.
14. Hoogenboom, H.R., et al (1991). Nucleic Acids Res, 19, 4133–4137.
15. Huston, J.S. et al (1988). Proc Natl Acad Sci USA, 85, 5879–5883.
16. Bird, R.E. et al (1988). Science, 242, 423–426.
17. Eisen, H.N. (1964). Meth Med Research, 10, 115–121.
18. Foote, J. & Milstein, C. (1991). Nature, 352, 530–532.
19. Clackson, T. Hoogenboom, H.R., Griffiths, A.D. & Winter, G (1991). Nature, 352, 624–628.
20. Roberts, A.J., et al (1992). Bio/Technology, im Druck.
21. Gussow, D. & Clackson, T. (1989). Nucleic Acids Res, 17, 4000.
22. Sanger, F., Nicklen, S & Coulson, A.R. (1977). Proc Natl Acad Sci USA, 74, 5463–5467.
23. Munro, S. & Pelham, H.R.B. (1986). Cell, 46, 291–300.
24. Chen, P.P., Liu, M.F., Sinha, S. & Carson, D.A. (1988). Arthritis Rheum, 31, 1429–1431.
25. Berman, J.E. et al (1988). Embo J, 7, 727–738.
26. Matsuda, F., et al (1990), Embo J, 9, 2501–2506.
27. Sanz, I., et al (1989), Embo J, 8, 3741–3748.
28. Rath, S., Stanley, C.M. & Steward, M.W. (1988). J Immunol Methods, 106, 245–249.

BEISPIEL 6
ISOLIERUNG VON ANTIKÖRPERFRAGMENTEN, DIE FÜR DEN TUMORNEKROSE-FAKTOR-α SPEZIFISCH SIND, AUS EINER MENSCHLICHEN SYNTHETISCHEN KEIMLINIEN-BIBLIOTHEK
Ein Klon, der für ein Antikörperfragment kodiert, das für den Tumornekrose-Faktor-α spezifisch ist, wurde aus einer menschlichen, synthetischen Keimlinien-Bibliothek isoliert.
Diese Bibliothek wurde wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Olignucleotid SYNLIB2 anstelle von SYNLIB1 verwendet wurde, so dass eine 5-Aminosäuren-V_H-CDR3 erzeugt wurde. Die Bibliothek wurde einem Panning gegen den Tumornekrose-Faktor-α unterzogen, wie in Beispiel 1 für die Bibliothek beschrieben ist, die von nicht immunisierten Menschen abgeleitet ist. Nach vier Panning-Runden wurde ein Phage-Antikörper (und ein entsprechendes lösliches Fragment) mit Bindungsaktivität an TNF isoliert. Die V_H-Region des scFv-Fragments (αTNF-10) wurde von dem VH-Segment DP-45 abgeleitet (Tomlinson et al., 1992, supra). Die Hapten-Bindungsklone αNIP-6, αNIP-12, αOx-15 und αOx-18 werden auch von diesem Segment abgeleitet, obwohl jedes dieser Fragmente dennoch für die Bindung an Hapten oder TNF spezifisch war. Dies zeigt, dass Antigen-Bindungsstellen mit vollkommen unterschiedlichen Spezifitäten auf demselben Antikörper-Framework durch Substituion von nur CDR3 erzeugt werden können. Die Bindung an nicht-spezifische Antigene wurde durch ELISA bewertet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
BEISPIEL 7
ISOLIERUNG VON EINKETTEN-FV-FRAGMENTEN, DIE AN MENSCHLICHES THYROGLOBULIN BINDEN, UND EINES MENSCHLICHEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS AUS EINER MENSCHLICHEN SYNTHETISCHEN KEIMLINIEN-BIBLIOTHEK DIE VH CDR3-SEQUENZEN UNTERSCHIEDLICHER LÄNGE ENTHÄLT
Eine menschliche, synthetische Einketten-Fv-Fragment-Keimlinien-Bibliothek wurde analog zu der Bibliothek in Beispiel 5 hergestellt, so dass sie Keimlinien-VH-Segmente und synthetische DH- und JH-Regionen enthielt, die VH-CDR3-Regionen zwischen 4 und 12 Aminosäuren bildeten. Es wurde eine umgeordnete, leichte Kette einer einzelnen Keimlinie bereitgestellt. Diese Phage-Bibliothek wurde als Quelle für Antikörperfragmente mit Anti-Mensch-Spezifität verwendet.
Fünfzig Keimlinien-Gen-VH-Segmente (Tomlinson et al., 1991, supra, wie in Beispiel 5) wurden mit Oligonucleotiden amplifiziert, um eine vollständig randomisierte CDR3 einzufügen, deren Länge von 4 bis 12 Resten variierte. In einer ersten PCR-Reaktion wurde jedes Gen mit seinem familienspezischen VHBACK-Primer (einer von VH1BACKSfi bis VH6BACKSfi; Marks et al., 1991, supra; WO92/01047) am 5'-Ende amplifiziert, und eines von der Oligonucleotide der Serie SYNLIB4 – SYNLIB12 am 3'Ende anhybridisiert (Tabelle IV). Die PCR enthielt 2,5 pmol von jedem der geeigneten Oligonucleotidpaare pro 50 μl Reaktionsmischung, enthaltend 250 μM dNTPs, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)₂SO₄, 20 mM TrisHCl (pH 8,8), 2 mM MgCl2, 100 μg/ml BSA und 1 μl (1 Einheit) Taq-DNA-Polymerase (Cetus). Die Matrize war 1 μl eines Bakterienstamms von E. coli, infiziert mit einem M13-Phage-Klon, der für das richtige Keimlinien-V-Gen kodiert. Der Amplifikationszyklus war 94 °C über 1 min, 55 °C über 1 min und 72 °C über 1,5 min. Nach 25 Zyklen wurden 30 pmol desselben VHBACK Oligonucleotids und 30 pmol JHSAL (Tabelle IV) zugesetzt und die PCR 15 Zyklen fortgesetzt, wobei eine Sall-Klonierungsstelle am 3'-Ende des VH-Gens eingefügt wurde. Nach der Verifizierung, dass eine Bande der richtigen Größe auf Agarosegel-Elektrophorese erschien, wurden die PCR-Produkte aller Amplifikationen, die mit demselben SYNLIB-Primer durchgeführt worden waren, gesammelt, mit NcoI und SaII geschnitten, und in NcoI-XhoI-geschnittenes pHEN1-V 3 (pHEN1, das geklontes ILV3S1 enthält) wie in Beispiel 5 geklont. Auf diese Weise wurden 9 Bibliotheken (jeweils mit einer bestimmten CDR3-Länge) hergestellt, die jeweils zwischen 5 × 10⁶ und 5 × 10⁷ Klone enthielten.
SELEKTION
Phagen wurde aus neun verschiedenen Bibliothek durch Rescue mit VCS-M13 hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Phagen von den neun einzelnen Bibliotheken wurden gemischt, um eine große Bibliothek zu erhalten, und einem Panning auf einem von jedem von 2 Antigenen unterzogen: Immunosorp-Röhrchen wurden mit OAK3 (Mensch-Anti-Rhesus D-Antikörper, IgG3, κ) über Nacht in Carbonatpuffer (0,1 M NaHCO₃, pH 9,6 bei 100 μg/ml) oder menschlichem Thyroglobulin (beschichtet bei 100 μg/ml in PBS) beschichtet. Selektionen wurden wie in Beispiel 3 durchgeführt.
SCREENING
ELISA wurde wie in Hoogenboom et al., 1991, supra, beschrieben durchgeführt. ELISA-Platten wurden über Nacht mit OAK3 bei 100 μg/ml in PBS bei Raumtemperatur oder mit menschlichem Thyroglobulin bei 100 μg/ml bei Raumtemperatur beschichtet.
ERGEBNISSE
Nach vier Selektionsrunden auf OAK3-beschichteten Röhrchen wurden eluierte Phagen zum Infizieren von HB2151 verwendet, und lösliche scFv Fragmente auf Bindung durch ELISA analysiert. 59/96 Klonen wurden im OAK3-ELISA als positiv bewertet.
Die menschliche synthetische Keimlinien-Bibliothek wurde des weiteren: 5 Selektionsrunden auf mit menschlichem Thyroglobulin beschichteten Röhrchen unterzogen, wobei sich 80/96 Klone in einem Phage-ELISA einzelner Klone als positiv erwiesen, die einem Rescue mit VCS-M13 unterzogen wurden.
Zwei von jedem der positiven Klone wurden in ELISA auf Bindung gegen eine Reihe von Antigenen (OAK3, menschliches Thyroglobulin, phOx-BSA, NIP-BSA, BSA, Ovalbumin, Chymotrypsinogen-A, Streptavidin, Cytochrom c, KLH, Truthahn-Eiweiß-Lysozym) analysiert. Die zwei OAK3-bindenden Klone (als lösliche scFv-Fragmente) lieferten beide Signale, die etwa dreimal höher als der Hintergrund in ELISA auf OAK3 waren. Die zwei Thyroglobulin bindenden Klone (als scFv-Fragmente, die auf dem Phagen exponiert waren) lieferten beide Signale, die etwa fünfmal höher als der Hintergrund im Thyroglobulin-ELISA waren. Alle Klone erwiesen sich als hochspezifisch für das Antigen, gegen das sie selektiert worden waren. Durch Hybridisierung an familienspezifische Primer (J.D. Marks et al., Eur. J. Immunol. 21, 985-991, 1991) wurde das VH-Segment aller vier Klone als zur VH3-Familie gehörig identifiziert. Die CDR3-Länge jedes Klons wurde durch Amplifizieren des CDR3 mit den Oligonucleotiden CDRFOR und CDRBACK (Tabelle IV) und Analysieren des Produkts auf einem 8 % Polyacrylamid-Gel analysiert. Für die zwei OAK3-bindenden Klone stellten wir eine Länge von 4 oder 7 Aminosäureresten fest, während die Thyroglobulin bindenden Klone beide eine CDR3-Länge von 10 Resten verwendeten.
Somit wurden Antikörper-scFv-Fragmente, die an einen menschlichen monoklonalen Antikörper und ein menschliches Selbstantigen binden, aus einer synthetischen menschlichen Keimlinien-Bibliothek isoliert.
BEISPIEL 8
ISOLIERUNG VON ANTIKÖRPERFRAGMENTEN, DIE DIE AKTIVITÄT DES INTERLEUKIN-1 REZEPTORS TRIGGERN
Die Bibliothek aus Einketten-Fv-Fragmenten, die von einem nicht immunisierten Menschen abgeleitet wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird zum Selektieren von Antikörpern verwendet, die die Aktivität des Interleukin-1 Rezeptors triggern. Antikörperfragmente werden zunächst isoliert, die an die lösliche externe Domäne des Interleukin-1 Rezeptors (IL-1R) von T-Zellen binden. Antikörper-Klone, die somit identifiziert sind, werden dann in Assays auf biologische Aktivität des Interleukin-1-Typs analysiert.
Der IL-1R auf murinen und menschlichen T-Zellen ist ein hoch homologes 80 kD Zelloberflächen-Glycoprotein, das sowohl Interleukin-1α wie auch Interleukin-1β bindet. Ein cDNA-Klon, der für die N-terminalen 316 Aminosäuren der externen Domäne des murinen Rezeptors kodiert, wurde in HeLa-Zellen exprimiert (S.K. Dower et al., J. Immunol. 142, 4314–4320, 1989). Das derart exprimierte, lösliche IL1-R-Molekül wurde gereinigt und zeigt Bindungseigenschaften, die von dem IL-1 R-Molekül voller Länge nicht zu unterscheiden sind, wobei ein Komplex zwischen einem einzigen löslichen IL1-R-Molekül IL-1 gebildet wird. Dieses lösliche Rezeptormolekül bindet an menschliches Interleukin-1. Der menschliche T-Zellen Interleukin-1 Rezeptor wurde von J.E. Sims et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8946–8950, 1989) geklont und sequenziert. Die lösliche externe Domäne des menschlichen IL1-Rezeptors, die Aminosäuren 1 bis 316, wird in HeLa-Zellen exprimiert und gereinigt, wie für den murinen Rezeptor beschrieben.
Die durch Rescue gewonnene, nicht immuniserte menschliche Bibliothek wird zunächst gegen den rekombinanten, menschlichen, löslichen IL-1 Rezeptor selektiert, entsprechend der externen Domäne des IL-1 Rezeptors. Immunoröhrchen werden mit dem löslichen IL-1 Rezeptor wie in Beispiel 1 beschrieben, bei 10 μg/ml be schichtet und ein Panning wird wie in Beispiel 1 beschrieben über insgesamt vier Runden einer Affinitätselektion durchgeführt.
Klone, die an den löslichen IL-1 Rezeptor binden, werden durch ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten charakterisiert, die mit rekombinantem, löslichen IL-1 Rezeptor bei 10 μg/ml beschichtet sind, wie für TNF-α in Beispiel 3 beschrieben. Antikörperfragmente, die signifikante ELISA-Signale bei löslichem IL-1 Rezeptor, nicht aber bei nicht-spezifischen Antigenen zeigen, werden dann für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Antikörper-Klone, die auf diese Weise isoliert wurden, werden dann als lösliche scFv-Fragmente in E. coli exprimiert und wie in Beispiel 4 beschrieben durch mAb 9E10 Affinitätschromatographie gereinigt. Die Bindung an menschliche Rezeptoren wird unter Verwendung der Bindung von ¹²⁵I-markiertem Antikörperfragment an die menschliche Fibroblast-Zellinie TIG-1, die den Interleukin-1-Rezeptor exprimiert, im Wesentlichen wie von T. Takii et al. (Eur. J. Immunol. 22, 1221–1227, 1992) beschrieben, zur Bestimmung der Affinität von ¹²⁵1-IL1α für den Rezeptor dieser Zelllinien bewertet. Die gereinigten Antikörperfragmente, die eine Rezeptorbindung zeigen, werden in einem biologischen Screening-Assay unter Verwendung menschlicher Epithelialzellen verwendet, um sie auf eine Stimulierung der Synthese von Prostacyclin (PG12) und Plättchenaktivierungsfaktor (PAF) zu untersuchen, wie von E. Dejana et al. (Blood 69, 695–699, 1987) beschrieben. Diese Studien identifizieren Antikörperfragmente, die eine Antiselbst-Spezifität gegen IL-1 Rezeptor haben, welche die Rezeptoraktivität triggert. Die Aktivität kann relativ zu menschlichem Interleukin-1α unter Verwendung eines Standard-Bioassays für IL-1α quantifiziert werden, zum Beispiel Proliferation der D10S Helfer-T-Zelllinie unter Verwendung der ³H-Thymidin-Eingliederung (S.F. Orencole und C.A. Dinarello Cytokine 1, 14–22, 1989), oder eines Konversions-Proliferations-Assays, wie von A.J. Gearing et al. (J. Immunol. Methods 99, 7–11, 1987) beschrieben.
TABELLE I FREQUENZ BINDENDER KLONE, DIE AUS EINER NICHT IMMUNISIERTEN SCFV-BIBLIOTHEK NACH SELEKTION ISOLIERT WURDEN
Die Verhältnisse zeigen die Frequenz bindender Klone nach jeder Selektionsrunde. Phagemide wurden einem Rescue mit M13DgIII Helfer-Phage unterzogen, mit Ausnahme der CEA-, MUC1- und rsCD4-Selektionen, wo ein VCS-M13-Helfer-Phage verwendet wurde.
TABELLE II V-GEN-FAMILIE, KEIMLINIENABLEITUNG UND AUSMAß DER SOMATISCHEN HYPERMUTATION VON MEHREREN ANTIGEN SPEZIFISCHEN SCFV FRAGMENTEN, DIE AUS DER NICHT IMMUNISIERTEN BIBLIOTHEK ISOLIERT WURDEN
Referenzen für alle Keimliniengene der schweren Kette finden sich in Tomlinson et al. (1992). Die Referenzen für die leichten Ketten sind VL2.1 (Brockly et al. 1989); IGLV1S2 (Bernard et al. 1990); ILGLVS1 (Frippiat et al. 1990), L8(Vd) und L5(Vb) (Pech et al., 1984); L12(HK102) (Bentley und Rabbits, 1980), B3(VKIV) (Klobeck et al., 1985); 02 und 04 (Pargent et al., 1991); L11 (Scott et al., 1991); HumIvIL1 (Daley et al., 1992). Alternative Namen sind in Klammern angeführt.
a) Diese Gene scheinen durch Überkreuzungen zwischen zwei V-Genen während der PCR-Amplifikation gebildet worden zu sein und daher wurden Übereinstimmungen unter Verwendung der zwei mutmaßlichen Keimliniensegmenten bestimmt: FR, Framework; CDR, Komplementarität bestimmende Region.

Bentley, D.L. und Rabbits, T.H. (1980), Nature 288, 730–3.
Bernard, F., Chuchana, P., Frippiat, J.P., Buluwela, L. und LeFranc, M.P. (1990), Nucleic Acids Res, 18, 7139.
Brockly, F. Alexandre, D., Chuchana, P., Huck, S., Lefranc, G. und Lefranc, M.P. (1989), Nucleic Acids Res, 17, 3976.
Frippiat, J.P. Chuchana, P., Bernard, F. Buluwela, L., Lefranc, G. und Lefranc, M.P. (1990), Nucleic Acids Res, 18, 7134.
Klobeck, H.G. Bornkamm, G.W. Combriato, G., Mocikat, R., Pohlenz, H.D. und Zachau, H.G. (1985), Nucleic Acids Res, 13, 6515–29.
Pargent, W., Meindl, A., Thiebe, R., Mitzel, S. und Zachau, H.G. (1991), Eur J Immunol, 21, 1821–7.
Pech, M., Jaenichen, H.R., Pohlenz, H.D., Neumaier, P.S., Klobeck, H.G. und Zachau, (1984), J Mol Biol, 176, 189–204.
Scott , M.G., Crimmins, D.L., McCourt, D.W., Chung, G., Schable, K.F., Thiebe, R., Quenzel, E.M., Zachau, H.G. und Nahm, M.H. (1991), J Immunol, 47, 4007–13.
Tomlinson , I.M. Walter, G. Marks, J.D., Llewelyn, M.B. und Winter G. (1992), J. Mol. Biol., 227, im Druck.

Tabelle IV Verwendete Oligonucleotide

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Elements eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element), wobei das sbp-Element ein menschlicher Antikörper oder ein Fragment eines menschlichen Antikörpers mit einer Antigenbindungsstelle mit Bindungsspezifität für ein menschliches Ziel-Selbstantigen ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) die Bereitstellung einer Bibliothek, die filamentöse Bakteriophagen umfasst, die jeweils auf ihrer Oberfläche ein sbp-Element exponieren, worin jeder filamentöse Bakteriophage, der auf seiner Oberfläche ein sbp-Element aufweist, Nucleinsäure mit einer Sequenz enthält, die für das auf der Oberfläche des filamentösen Bakteriophagen exponierte sbp-Element oder für eine Polypeptidkette des auf der Oberfläche des filamentösen Bakteriophagen exponierten sbp-Elements kodiert, worin die Bereitstellung der Bibliothek das Präparieren der Nucleinsäure aus menschlichen Antikörpersequenzen eines oder mehrerer Menschen umfasst, die nicht mit dem menschlichen Ziel-Selbstantigen immunisiert sind und keine gegen das menschliche Ziel-Selbstantigen gerichtete Autoimmunerkrankung aufweisen, wobei nicht festgelegt wird, dass menschliche Antikörper mit Bindungsspezifität für dieses menschliche Ziel-Selbstantigen im Kreislauf eines Menschen detektierbar sind; und (b) das Selektieren eines oder mehrerer sbp-Elemente mit Bindungsspezifität für das menschliche Ziel-Selbstantigen durch Bindung an das menschliche Ziel-Selbstantigen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bereitstellung einer Bibliothek eines filamentösen Bakteriophagen Folgendes umfasst: das Kombinieren (i) eines ersten Polypeptidketten-Bestandteils eines sbp-Elements, das an eine Komponente eines filamentösen Bakteriophagen fusioniert ist, wodurch bei Expression in einer rekombinanten Wirtszelle der erste Polypeptidketten-Bestandteil oder eine Population davon auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen exponiert wird, oder einer Population eines derartigen, an die Kom ponente eines filamentösen Bakteriophagen fusionierten ersten Polypeptidketten-Bestandteils mit (ii) einem zweiten Polypeptidketten-Bestandteil eines sbp-Elements oder mit einer Population eines derartigen zweiten Polypeptidketten-Bestandteils, um eine Bibliothek von auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen exponierten sbp-Elementen zu bilden; wobei für zumindest einen von erstem und zweitem Polypeptidketten-Bestandteil oder für zumindest eine der Populationen davon eine Nucleinsäure kodiert, die unter Verwendung der Komponente eines filamentösen Bakteriophagen verpackt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1 worin die Bereitstellung einer Bibliothek eines filamentösen Bakteriophagen Folgendes umfasst: das Kombinieren (i) von Nucleinsäure, die für einen an eine Komponente eines filamentösen Bakteriophagen fusionierten ersten Polypeptidketten-Bestandteil eines sbp-Elements oder für eine Population eines derartigen, an eine Komponente eines filamentösen Bakteriophagen fusionierten ersten Polypeptidketten-Bestandteils kodiert, mit (ii) Nucleinsäure, die für einen zweiten Polypeptidketten-Bestandteil eines sbp-Elements oder für eine Population davon kodiert, um eine Bibliothek von Nucleinsäure zu bilden, wobei Nucleinsäure der Bibliothek unter Verwendung der Komponente eines filamentösen Bakteriophagen verpackt werden kann; das Exprimieren des an eine Komponente eines filamentösen Bakteriophagen fusionierten ersten Polypeptidketten-Bestandteils oder einer Population davon und des zweiten Polypeptidketten-Bestandteils eines sbp-Elements oder einer Population davon in einer rekombinanten Wirtszelle, um eine Bibliothek von filamentösen Bakteriophagen zu bilden, die jeweils auf ihrer Oberfläche ein sbp-Element exponieren und Nucleinsäure enthalten, die für einen ersten und einen zweiten Polypeptidketten-Bestandteil des auf ihrer Oberfläche exponierten sbp-Elements kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin jedes sbp-Element auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen ein Antikörperfragment ist, das eine V_H-Domäne und eine V_L-Domäne umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin sowohl der erste als auch der zweite Polypeptidketten-Bestandteil oder deren Populationen ausgehend von Nucleinsäure exprimiert werden, die unter Verwendung der Komponente eines filamentösen Bakteriophagen verpackt werden kann.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin jedes auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen exponierte sbp-Element ein scFv-Antikörperfragment ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin für den zweiten Polypeptidketten-Bestandteil oder für eine Population davon Nucleinsäure kodiert, die getrennt von der für den ersten Polypeptidketten-Bestandteil oder für eine Population davon kodierenden Nucleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 7, worin jedes auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen exponierte sbp-Element ein Fab-Antikörperfragment ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Nucleinsäure von umgeordneten V-Genen stammt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Selbstantigen ein carcinoembryonisches Antigen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Selbstantigen Tumornekrose-Faktor-Alpha (TNFα) ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin unter (b) selektierte und auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen exponierte sbp-Elemente so selektiert oder gescreent werden, dass ein einzelner, ein sbp-Element exponierender, filamentöser Bakteriophage oder eine gemischte Population des filamentösen Bakteriophagen bereitgestellt wird, wobei jeder filamentöse Bakteriophage Nucleinsäure enthält, die für das sbp-Element oder eine Polypeptidkette davon kodiert, das bzw. die auf seiner Oberfläche exponiert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Nucleinsäure, die für ein selektiertes oder gescreentes sbp-Element kodiert und von einem filamentösen Bakteriophagen stammt, der auf seiner Oberfläche ein selektiertes oder gescreentes sbp-Element exponiert, zur Expression eines sbp-Elements oder eines Fragments oder Derivats davon in einer rekombinanten Wirtszelle verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 13, worin Nucleinsäure von einem oder mehreren filamentösen Bakteriophagen genommen und in einem weiteren Verfahren zur Bereitstellung von kodierender Nucleinsäure eingesetzt wird, um ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population von sbp-Elementen zu erhalten oder Nucleinsäure zu erhalten, die für das einzelne sbp-Element oder die gemischte Population von sbp-Elementen kodiert.
Verfahren nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, worin das Expressionsendprodukt modifiziert wird, um ein Derivat davon herzustellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, worin das Expressionsendprodukt oder Derivat davon zur Herstellung eines therapeutischen oder prophylaktischen Medikaments oder eines Diagnoseprodukts verwendet wird.
Verwendung eines Sets, das eine Bibliothek von Nucleinsäuresequenzen umfasst, die in einem filamentösen Bakteriophagen verpackt werden können und für ei nen Polypeptidketten-Bestandteil eines Antikörpers zur Exposition auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen kodieren, in einem Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche.
Verwendung eines Sets, das eine Bibliothek von filamentösen Bakteriophagen umfasst, wobei jeder filamentöse Bakteriophage Nucleinsäure enthält, die für zumindest einen Polypeptidketten-Bestandteil eines Antikörpers kodiert, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin das Selbstantigen ein Rezeptor ist und ein sbp-Element selektiert wird, das an den Rezeptor bindet und ihn triggert.