DE69333823T2

DE69333823T2 - Verfahren zur herstellung von gliedern von spezifischen bindungspaaren

Info

Publication number: DE69333823T2
Application number: DE69333823T
Authority: DE
Inventors: Stuart Kevin JOHNSON; Paul Gregory Winter; Andrew David Griffiths; John Andrew Smith; Peter Waterhouse
Original assignee: Medical Research Council; Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: Medical Research Council; MedImmune Ltd
Priority date: 1992-03-24
Filing date: 1993-03-24
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2013-03-25
Also published as: WO1993019172A1; EP0656941B1; DE69333823D1; EP0656941A1; JP3507073B2; JPH07505055A; CA2131151A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Elementen spezifischer Bindungspaare (sbp). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Elementen spezifischer Bindungspaare, die Rekombination zwischen Vektoren einbinden, welche Nucleinsäure umfassen, die für Polypeptidkettenkomponenten von sbp-Elementen kodiert.
Strukturell gesehen umfasst der einfachste Antikörper (IgG) vier Polypeptidketten, zwei schwere (H-) Ketten und zwei leichte (L-) Ketten, die miteinander über Disulfidbindungen verbunden sind. Die leichten Ketten bestehen in zwei unterschiedlichen Formen, die kappa (κ) und lambda (λ) genannt werden. Jede Kette weist eine konstante Region (C) und eine variable Region (V) auf. Jede Kette ist in einer Reihe von Domänen organisiert. Die leichten Ketten weisen zwei Domänen auf, wobei die eine der C-Region und die andere der V-Region entspricht. Die schweren Ketten weisen vier Domänen auf, wobei eine der V-Region entspricht und drei Domänen (1, 2 und 3) in der C-Region liegen. Der Antikörper besitzt zwei Arme (wobei jeder Arm eine Fab-Region darstellt), wovon jeder eine VL- und eine VH-Region aufweist, die miteinander assoziiert sind. Es sind diese gepaarten V-Regionen (VL und VH), die sich von einem Antikörper zum nächsten unterscheiden (aufgrund von Aminosäuresequenzvariationen) und die zusammen für die Erkennung des Antigens und die Bereitstellung einer Antigen-Bindungsstelle (ABS) verantwortlich sind. Noch näher beschrieben besteht jede V-Region aus drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR), die durch vier Gerüstregionen (GR) voneinander getrennt sind. Die CDRs sind die am stärksten variablen Elemente der variablen Regionen, und sie erfüllen die kritische Antigen-Bindungsfunktion. Die CDR-Regionen sind von zahlreichen möglichen Keimliniensequenzen über ein komplexes Verfahren, das Rekombination, Mutation und Selektion einbindet, abgeleitet.
Es wurde gezeigt, dass die Funktion der Bindung von Antigenen von Fragmenten eines ganzen Antikörpers erfüllt werden kann. Beispiele für Bindungsfragmente sind (i) das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht, (iv) das dAb-Fragment (E. S. Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Regionen; und (vi) F(ab')₂-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die über eine Disulfidbrücke an die Gelenksregion gebunden sind.
Obwohl für die zwei Domänen des Fv-Fragments verschiedene Gene kodieren, erwies es sich als möglich, einen synthetischen Linker zu bilden, der ihnen die Fähigkeit verleiht, mit Hilfe. von Rekombinationsverfahren in Form einer einzelnen Proteinkette ausgebildet zu werden (bekannt als einkettiges Fv (scFv); R. E. Bird et al., Science 242, 423–426 (1988); J. S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883 (1988)). Diese scFv-Fragmente wurden aus Genen monoklonaler Antikörper angeordnet, die davor isoliert worden waren.
Bakteriophagen wurden konstruiert, die an ihrer Oberfläche ein großes, biologisch funktionelles Bindungsmolekül (z.B. Antikörperfragmente und Enzyme und Rezeptoren) exprimieren und präsentieren und die intakt und infektiös bleiben. Dies ist in der WO 92/01047 beschrieben. Die Leser der vorliegenden Beschreibung werden prinzipiell dazu angehalten, für eine nähere Erklärung zahlreicher Verfahren, die in den hierin beschriebenen Versuchen eingesetzt werden, die WO 92/01047 zu konsultieren. Die Anmelder bezeichneten die Struktur, die ein Viruspartikel und ein Bindungsmolekül umfasst, das an der viralen Oberfläche präsentiert ist, als "Paket". Ist das Bindungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperderivat oder -fragment oder eine Domäne, die zu einer Immunglobulindomäne homolog ist, so nennen die Anmelder das Paket einen "Phagen-Antikörper" (pAb). Wird jedoch, außer der Zusammenhang verlangt es anders, die Bezeichnung Phagenantikörper allgemein verwendet, gilt dies als ein Verweis auf jedes beliebige Paket zu verstehen, die ein Viruspartikel und ein biologisch funktionelles Bindungsmolekül, das an der viralen Oberfläche präsentiert ist, umfasst.
pAbs haben beim Selektieren von Antikörpergenen, die für Antigenbindungsaktivitäten kodieren, einen weiten Anwendungsbereich. Beispielsweise können pAbs zum Klonieren und Isolieren von Hybridomen (R. Orlandi et al., PNAS 86, 3833-3837 (1989)) und zum Screenen großer kombinatorischer Bibliotheken (wie beispielsweise in W. D. Huse et al,. Science 246, 1275–1281 (1989), erkannt wurde) verwendet werden. insbesondere können Selektionsdurchgänge unter Verwendung von pAbs die Isolierung der Antikörper mit höherer Affinität aus den diesen Bibliotheken erleichtern. Es kann bevorzugt werden, kleine Bibliotheken zu screenen, die aus Antigen-ausgewählten Zellen abgeleitet wurden (P. Casali et al., Science 234, 476–479 (1986)), um die originalen VH/VL-Paare, die die Fv-Region eines Antikörpers umfassen, zu isolieren. Die Verwendung von pAbs kann auch die Konstruktion von gänzlich synthetischen Antikörpern ermöglichen. Weiters können Antikörper hergestellt werden, die einige synthetische Sequenzen, z.B. CDRs, und einige natürlich abgeleitete Sequenzen aufweisen. Beispielsweise könnten V-Gen-Repertoires in vitro durch Kombinieren von nicht neu angeordneten V-Genen mit D- und J-Segmenten gebildet werden. Bibliotheken von pAbs könnten dann durch Binden an ein Antigen selektiert, in vitro in den Antigen-Bindungsschleifen oder den V-Domänen-Gerüstregionen hypermutiert und weiteren Durchgängen der Selektion und Mutagenese unterzogen werden.
Der Beweis, dass eine funktionelle Antigen-Bindungsdomäne an der Oberfläche von Phagen präsentiert werden kann, hat Auswirkungen, die über die Konstruktion neuer Antikörper hinausgehen. Können beispielsweise andere Proteindomänen an der Oberfläche eines Phagen präsentiert werden, so könnten Phagenvektoren verwendet werden, um Gene durch die Bindungseigenschaften des präsentierten Proteins zu klonieren und selektieren. Weiters könnten Varianten von Proteinen, einschließlich Epitopbibliotheken, die in die Oberfläche des Proteins eingebaut sind, hergestellt und leicht aufgrund ihrer Bindungsaktivitäten selektiert werden. So könnten andere Proteinarchitekturen als "neue" Antikörper dienen.
Das Verfahren eröffnet die Möglichkeit, Antikörper vom ersten Prinzip zu bauen, wodurch von dem strukturellen Gerüst profitiert werden kann, an dem sich die Antigen-Bindungsschleifen falten. Im Allgemeinen weisen diese Schleifen eine limitierte Anzahl an Konformationen auf, die eine Vielfalt an Bindungsstellen durch alternative Schleifenkombinationen und verschiedene Seitenketten hervorbringen. längste Erfolge beim Modellieren von Antigen-Bindungsstellen fassen auf De-novo-Designs hoffen. Hier ist allerdings eine hochaufgelöste Antigenstruktur erforderlich. Der Ansatz ist jedoch zur Bildung von z.B. katalytischen Antikörpern, insbesondere für kleine Substrate, interessant. Hierbei können Seitenketten oder Bindungsstellen für prosthetische Gruppen eingeführt werden, nicht nur, um sie selektiv an den Übergangszustand des Substrats zu binden, sondern auch, um direkt an Bindungsbildung und -spaltung beteiligt zu sein. Die einzige Frage, die sich hierbei stellt ist, ob die Antikörperarchitektur, die auf Bindung spezialisiert ist, der beste Ausgangspunkt zur Bildung von Katalysatoren ist. Ursprüngliche Enzymarchitekturen, wie beispielsweise die Triosephosphatisomerase- (TIM-) Tonne, können hier besser geeignet sein. Wie Antikörper weisen auch TIM-Enzyme eine Gerüststruktur (eine Tonne von β-Strängen und α-Helices) und Schleifen auf, um das Substrat zu binden. Zahlreiche Enzyme mit einer Vielzahl katalytischer Eigenschaften basieren auf dieser Architektur, und die Schleifen können zum Modellieren neuer katalytischer und Bindungseigenschaften unabhängig voneinander an den Gerüsten manipuliert werden. Das Phagen-Selektionssystem, wie es von der vorliegenden Offenbarung bereitgestellt wird, kann verwendet werden, um auf Antigenbindungseigenschaften zu selektieren, und die so ausgewählten CDR-Schleifen können entweder an einem Antikörpergerüst oder einem TIM-Tonnengerüst eingesetzt werden. Schleifen, die z.B. an einem TIM-Tonnengerüst angeordnet werden, können durch Mutagenese weiter modifiziert und weiterer Selektion unterzogen werden. Somit besteht kein Bedarf daran, in einem einzelnen Schritt auf hochaffine Bindungsaktivitäten zu selektieren. Die Strategie des Immunsystems, im Rahmen derer sich geringe Affinität zu hoher Affinität entwickelt, scheint realistischer zu sein und kann unter Verwendung dieser Erfindung nachgeahmt werden.
Eine Gruppe an Molekülen, die in dieser Art der Anwendung nützlich sein könnten, sind Rezeptoren. Beispielsweise könnte ein spezifischer Rezeptor an der Oberfläche des Phagen präsentiert werden, sodass er sich an seinen Liganden bindet. Der Rezeptor könnte dann durch beispielsweise In-vitro-Mutagenese modifiziert und Varianten mit höherer Bindungsaffinität zum Liganden selektiert werden. Die Selektion kann gemäß einem oder mehreren der nachstehend beschriebenen Formate durchgeführt werden.
Alternativ dazu könnte der Phagenrezeptor als Grundlage für ein schnelles Screening-System zur Bindung von Liganden, veränderten Liganden oder möglichen Wirkstoffkandidaten verwendet werden. Die Vorteile dieses Systems, nämlich einfaches Klonieren, leichte Expression, Standard-Reagenzien und einfacher Umgang, machen die Anwendung zum Wirkstoffscreenen besonders attraktiv. Im Zusammenhang dieser Erläuterung bezeichnet Rezeptor ein Molekül, das einen spezifischen Liganden oder eine Gruppe spezifischer Liganden bindet. Der natürliche Rezeptor könnte an der Oberfläche einer Zellpopulation exprimiert werden, oder er könnte die extrazelluläre Domäne eines solchen Moleküls darstellen (unabhängig davon, ob solch eine Form in der Natur besteht oder nicht), oder er könnte auch ein lösliches Molekül sein, das eine natürliche Bindungsfunktion im Plasma oder innerhalb einer Zelle oder eines Organs erfüllt.
Eine andere Möglichkeit ist das Präsentieren eines Enzymmoleküls oder einer aktiven Stelle eines Enzymmoleküls an der Oberfläche eines Phagen (siehe die Beispiele 11, 12, 30, 31, 32 und 36 der WO 92/01047). Nachdem das Phagenenzym exprimiert wurde, kann es durch Affinitätschromatographie selektiert werden, beispielsweise an Säulen, die mit Übergangszustand-Analoga derivatisiert sind. Ist ein Enzym mit einer anderen oder modifizierten Spezifität erwünscht, so kann es möglich sein, ein Enzym zu mutieren, das als eine Fusion an einem Bakteriophagen präsentiert ist, und anschließend an einer Säule, die mit einem Analogon, das aufgrund seiner höheren Affinität zu einem Enzym mit der erwünschten modifizierten Spezifität ausgewählt wurde, derivatisiert ist, zu selektieren.
Obwohl in dieser Anmeldung die Anmelder die Möglichkeit diskutieren, auf Varianten von pAbs mit höherer Affinität zu screenen, erkennen sie, dass es in manchen Anwendungen, beispielsweise bei Niederaffinitätschromatographie (S. Ohlson et al., Anal. Biochem. 169, 204–208 (1988)), wünschenswert sein kann, Varianten mit geringerer Affinität zu isolieren.
pAbs ermöglichen auch die Selektion von Antikörpern aufgrund von verbesserter Stabilität. Es wurde im Zusammenhang mit zahlreichen Antikörpern bereits darauf hingewiesen, dass deren Ausbeute und Stabilität verbessert sind, wenn die Antikörper bei 30°C und nicht bei 37°C exprimiert werden. Werden pAbs bei 37°C präsentiert, so sind nur jene, die stabil sind, für Affinitätsselektion auch zugänglich. Sind Antikörper in vivo zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken zu verwenden, so würde gesteigerte Stabilität die Halbwertszeit von Antikörpern im Blutkreislauf verlängern.
Obgleich Stabilität für alle Antikörper und Antikörperdomänen wichtig ist, die unter Verwendung von Phagen ausgewählt werden, ist sie für die Selektion von Fv-Fragmenten, die durch die nicht-kovalente Assoziation von VH- und VL-Fragmenten gebildet werden, von besonderer Bedeutung. Fv-Fragmente haben eine Neigung zu dissoziieren und haben im Vergleich zu ganzen Antikörpern eine stark reduzierte Halbwertszeit im Blutkreislauf. Fv-Fragmente sind durch die Assoziation einer Kette, die als eine Gen-III-Proteinfusion exprimiert wird, mit der komplementären Kette, die als ein lösliches Fragment exprimiert wird, an der Oberfläche von Phagen präsentiert. Weisen Kettenpaare eine starke Neigung zur Dissoziation auf, so ist es viel unwahrscheinlicher, dass sie als pAbs selektiert werden. Daher wird die Population an Paaren angereichert, die sich stabil assoziieren. Obwohl Dissoziation im Fall von Fab-Fragmenten ein geringeres Problem darstellt, würde sich auch hier die Selektion auf Fab-Fragmente konzentrieren, die stabil assoziieren. pAbs ermöglichen Selektion in Bezug auf Stabilität gegenüber Proteaseangriffen, denn nur jene pAbs, die nicht durch Proteasen gespaltet werden, sind in der Lage, ihren Liganden zu binden, und daher werden Phagenpopulationen durch jene angereichert, die stabile Antikörperdomänen aufweisen.
Das Verfahren des Präsentierens von Bindungsmolekülen an der Phagenoberfläche kann auch als ein primäres Kloniersystem verwendet werden. Beispielsweise kann eine cDNA-Bilbiothek konstruiert und in den Bakteriophagen insertiert werden, und diese Phagenbibliothek wird dann auf ihre Fähigkeit, einen Liganden zu binden, gescreent. Die Ligand/Bindungsmolekül-Kombination könnte jedes beliebige Paar von Molekülen einschließen, das die Fähigkeit besitzt, sich aneinander spezifisch zu binden, z.B. Rezeptor/Ligand, Enzym/Substrat (oder Analogon), Nucleinsäure-Bindungsprotein/Nucleinsäure usw. Ist ein Element des komplementären Paars erhältlich, so kann dies ein bevorzugter Weg der Isolierung eines Klons für das andere Element des Paars sein.
Die ersten funktionellen Antikörpermoleküle, die an der Oberfläche eines filamentösen Phagen zu exprimieren sind, waren einkettige Fvs (scFv), die so bezeichnet sind, da variable Schwer- und Leichtkettendomänen, normalerweise in zwei verschiedenen Proteinen, durch ein flexibles Linkerpeptid kovalent aneinander gebunden sind. Alternative Expressionsstrategien waren auch erfolgreich. Fab-Moleküle können an Phagen präsentiert werden, sofern eine der Ketten (schwer oder leicht) an g3-Capsidprotein fusioniert ist und die komplementäre Kette zum Periplasma als ein lösliches Molekül exportiert wird. Die zwei Ketten können auf demselben oder verschiedenen Replikonen kodiert sein; wichtig ist, dass sich die zwei Antikörperketten in jedem fab-Molekül nach Translation anordnen und dass das Dimer über Bindung einer der Ketten an g3p in das Phagenpartikel inkorporiert wird.
In jüngerer Vergangenheit wurde Klonieren mit "Phagemid"-Vektoren durchgeführt, die ca. 100fach höhere Transformationseffizienz aufwiesen als Phagen-DNA. Diese sind Plasmide, die die intergene Region aus filamentösen Phagen enthalten, die es ermöglicht, dass einzelsträngige Kopien der Phagemid-DNA gebildet und in infektiöse filamentöse Partikel gepackt werden können, wenn Zellen, die sie in sich tragen, mit "Helfer"-Phagen infiziert werden, was Phagenkomponenten in trans liefert. Enthalten Phagemide gIII fusioniert an ein Antikörpergen (z.B. pHEN-1 ), so ist das resultierende Fusionsprotein am Phagemidpartikel präsentiert (H. R. Hoogenboom, A. D. Griffiths, K. S. Johnson, D. J. Chiswell, P. Hudson und G. Winter, Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 19(15), 4133– 4137 (1991)). Effiziente Strategien zum Klonieren von Antikörpergenen wurden bereits entwickelt, ein Faktor, der größte Bedeutung bekommt, wenn es sich um große Anzahlen unterschiedlicher Antikörperfragmente wie beispielsweise Repertoires handelt.
Der Kloniervektor fd-DOG-1 wurde in frühen Arbeiten mit Phagenantikörper-Repertoires verwendet, in denen scFv-Fragmente von Milz-mRNA von Mäusen abstammten, die mit dem Hapten Oxazalon immunisiert worden waren (T. Clackson, H. R. Hoogenboom, A. D. Griffiths & G. Winter, Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352, 624-628 (1991)); VH- und VL-Domänen wurden getrennt voneinander amplifiziert, dann nach dem Zufallsprinzip über ein kurzes DNA-Fragment, das für das scFv-Linkerpeptid kodierte, gebunden, um eine Bibliothek von etwa 10⁵ verschiedenen Klonen zu bilden. Diese wurde mittels des immunisierenden Antigens durchsucht, um Kombinationen von VH und VL zu selektieren, die funktionelle Antikörper bildeten. Mehrere Binder wurden isoliert, wobei insbesondere einer eine Affinität aufweist, die nicht viel geringer ist als jene der besten monoklonalen Antikörper, die mittels herkömmlicher Hybridomverfahren hergestellt wurden.
Bei einer Maus sind zu jedem beliebigen Zeitpunkt etwa 10⁷ mögliche H-Ketten und 10⁵ mögliche L-Ketten vorhanden, was eine Gesamtsumme von 10¹² möglichen VH:VL-Kombinationen ergibt, wenn die zwei Ketten nach dem Zufallsprinzip kombiniert werden (diese Zahlen sind geschätzt und geben nur einen ungefähren Hinweis auf die Größe des Repertoires). In Bezug auf diese Zahlen wies die oben genannte Mausbibliothek nur 1 von 10⁷ möglichen VH:VL-Kombinationen als Beispiel auf. Wahrscheinlich wurden Antikörper mit guter Affinität in dem im vorangehenden Absatz beschriebenen Verfahren isoliert, da die Milzzellen, die von einem immunisierten Donor abstammen, in dem B-Zellen in der Lage sind, das Antigen zu erkennen, klonal vermehrt werden und große Mengen an Ig-mRNA produzieren. Die geringe Bibliothekskomplexität in diesem Versuch ist teilweise auf die inhärent geringe Transformationseffizienz der Phagen-DNA im Vergleich zu Plasmid (oder Phagemid) zurückzuführen.
Marks et al. (J. D. Marks, H. R. Hoogenboom, T. P. Bonnert, J. McCafferty, A. D. Griffiths und G. Winter, By-passing immunization: Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991)) und die WO 92/01047 beschreiben die Konstruktion eines Antikörper-Repertoires aus nicht-immunisierten Menschen, die in den Phagemiden pHEN-1 kloniert wurden. Diese Bibliothek, die aus 3 × 10⁷ Klonen besteht, ergab bis jetzt Antikörper, die zu vielen verschiedenen Antigenen spezifisch sind. Diese Antikörper neigen dazu, mäßige Affinitäten aufzuweisen, die von einer primären Immunantwort erwartet wird, was darauf hinweist, dass einsetzbare Antikörper gegen zahlreiche, strukturell unterschiedliche Antigene tatsächlich aus einer einzelnen Quelle isoliert werden können.
Neue Binder können aus Klonen geschaffen werden, die aus Phagenantikörperbibliotheken unter Verwendung eines Verfahrens, das als "Ketten-Neukombination" bezeichnet wird, isoliert werden. In diesem Verfahren wird eine der zwei Ketten fixiert und die andere variiert. Beispielsweise werden durch Fixieren der schweren Kette aus dem hochaffinen Maus-Anti-OX-Phagenantikörper und neuerliches Klonieren des Repertoires leichter Ketten neben der erstgenannten Bibliotheken von 4 × 10⁷ konstruiert. Mehrere neue OX-Binder wurden isoliert, und der Großteil dieser wies schwere Ketten auf, die sich von jenen unterschieden, die zuerst isoliert wurden, und sehr viel verschiedener waren. Diese Beobachtungen spiegeln die Tatsache wider, dass eine kleine Bibliothek ausreichend ist, um die verfügbare Diversität offenzulegen, wenn nur eine Kette variiert wird – ein nützliches Verfahren, wenn die Originalbibliothek nicht ausreichend groß ist, um die verfügbare Diversität zu enthalten.
Die Größe der Bibliothek ist oft von maßgeblicher Bedeutung. Dies gilt besonders, wenn versucht wird, Antikörper aus einem naiven menschlichen Repertoire zu isolieren, ist jedoch ebenso relevant für das Isolieren der Antikörper mit höchster Affinität aus einer immunisierten Quelle.
Es ist klar, dass, während Phagendisplay ein ausgesprochen vielseitiges Werkzeug zum Klonieren und Selektieren von Antikörpergenen ist, hier unter Verwendung der bestehenden Verfahren nur ein geringer Bruchteil der zahlreichen Möglichkeiten aus dieser Vielfalt zugänglich gemacht wird. Transformationseffizienzen stellen die größte Einschränkung für die Bibliotheksgröße dar, deren oberstes Limit unter Verwendung herkömmlicher Verfahren bei etwa 10⁹ liegt. Überschlagsrechnungen lassen darauf schließen, dass dies einige Größenordnungen unter der erzielten Effizienz liegt; exaktere Analysen bestätigen dies.
Perelson & Oster stellten theoretische Überlegungen zur Beziehung zwischen Größe des Immun-Repertoires und der Wahrscheinlichkeit der Bildung eines Antikörpers an, der in der Lage ist, ein bestimmtes Epitop mit einer Affinität, die über einer bestimmten Grenzaffinität K liegt, zu erkennen. Die Beziehung kann durch die folgende Gleichung beschrieben werden: P = e–N(p[K])worin P für die Wahrscheinlichkeit steht, dass ein Epitop mit einer Affinität über dem Grenzwert K durch einen Antikörper im Repertoire nicht erkannt wird; N für die Anzahl an unterschiedlichen Antikörpern im Repertoire steht und p[K] für die Wahrscheinlichkeit steht, dass ein einzelner Antikörper ein zufällig ausgewähltes Epitop mit einer Affinität über dem Grenzwert K erkennt.
In dieser Analyse ist p[K] umgekehrt proportional zur Affinität, obwohl noch kein Algorithmus abgeleitet wurde, der diese Beziehung präzise beschreibt. Dennoch ist es eindeutig, dass je höher die Affinität des Antikörpers ist, desto niedriger sein p[K] ist und desto größer das Repertoire sein muss, um eine akzeptable Wahrscheinlichkeit zu erreichen, jenen Antikörper zu isolieren. Die andere wichtige Eigenschaft ist, dass die Funktion exponentiell ist; wie in 1 gezeigt kann eine geringfügige Veränderung in der Bibliotheksgröße entweder eine vernachlässigbare oder eine drastische Wirkung auf die Wahrscheinlichkeit haben, einen Antikörper mit einem bestimmten p[K]-Wert zu isolieren, je nachdem, welcher Kurvenpunkt durch die Bibliotheksgröße erreicht wird.
Die WO 92/01047 und WO 92/20791 beschreiben, wie die Einschränkungen von Transformationseffizienz (und daher die obere Grenze der Bibliotheksgröße) durch die Verwendung anderer Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Infektion, umgangen werden können. In einer Konfiguration werden Schwer- und Leichtkettengene getrennt voneinander an zwei unterschiedlichen Replikonen kloniert, wovon zumindest eines in der Lage ist, in ein filamentöses Partikel inkorporiert zu werden. Infektiöse Partikel, die eine Kette tragen, werden in Zellen infiziert, die die komplementäre in sich Kette tragen; Infektionsfrequenzen von > 90% können leicht erreicht werden. Schwere und leichte Ketten sind dann in der Lage, sich im Periplasma nach Translation zu assoziieren, wobei die Kombination, die an der Oberfläche des filamentösen Partikels präsentiert ist, mittels einer oder beider Ketten mit g3p verbunden ist. Beispielsweise wird eine Bibliothek von 10⁷ schweren Ketten als eine nicht-fusionierte Population in ein Phagemid kloniert, und 10⁷ leichte Ketten werden als g3-Fusionen in fd-DOG-1 kloniert. Beide Populationen werden dann durch Wachstum vermehrt, sodass es 10⁷ von jeder Schwerketten-hältigen Zelle und 10⁷ Kopien von jedem Leichtketten-Phagen gibt. Durch Zulassen, dass der Phage die Zellen infiziert, können 10⁷ × 10⁷ = 10¹⁴ einmalig vorkommende Kombinationen geschaffen werden, da 10⁷ Zellen vorhanden sind, die dieselbe schwere Kette tragen, die jeweils durch 10⁷ Phagen, die unterschiedliche Leichtketten aufweisen, infiziert werden können. Wird dies für jeden einzelnen unterschiedlichen Schwerkettenklon wiederholt, dann erlangt man schließlich 10¹⁴ verschiedene Schwer/Leicht-Kombinationen in verschiedenen Zellen. Diese Vorgehensweise wird in 2 beschrieben, die die schwere Kette, die als g3-Fusionen an Phagen kloniert sind, und die leichten Ketten zeigt, die als lösliche Fragmente aus einem Phagemid exprimiert werden. Natürlich ist auch die umgekehrte Kombination, leichte Ketten am Phagen, schwere Kette am Phagemid, auch vorstellbar.
In der Konfiguration, die in 2 gezeigt ist, "isoliert" fd-DOG das Phagemid, sodass sowohl Phagen- als auch Phagemid-DNA in filamentöse Partikel gepackt wird und beide Typen gepaarte Schwer- und Leichtketten an ihrer Oberfläche aufweisen, obwohl sie nur über die genetische Information für einen von ihnen verfügen. Für ein bestimmtes Antigen oder Epitop ist die große Mehrheit der Schwer- und Leichtkettenpaarungen nicht funktionell (d.h. sie werden das Antigen oder Epitop nicht binden), sodass eine Selektion in Bezug auf das Antigen die Komplexität der Schwer- und Leichtkettenpopulationen sehr stark reduziert. Nach dem ersten Selektionsdurchgang werden die Klone neu klassifiziert, beispielsweise durch Infizieren frischer Wirtszellen und Selektieren auf beide Replikone. Nach mehreren Durchgängen der Antigenselektion und Gewinnung der zwei Replikone können die beträchtlich reduzierten Schwer- und Leichtkettenpopulationen auf dasselbe Replikon kloniert und mittels herkömmlicher Mittel analysiert werden. Selektion aus den, angenommen, 10¹⁴ Kombinationen bringt eine Population von Phagen hervor, die eine bestimmte Kombination von H- und L-Ketten mit der erwünschten Spezifität aufweisen. Die ausgewählten Phagen jedoch werden nur DNA enthalten, die für einen Partner der gepaarten H- und L-Ketten kodiert. Selektion auf die zwei Replikone kann wie folgt erfolgen. Vektoren der H-Ketenbibliothek können für Tetracyclinresistenz kodieren, während Vektoren der L-Kettenbibliothek für Ampicillinresistenz kodieren. Das Probeneluat, das die Population enthält, wird in zwei Teile geteilt. Ein erster Teil wird auf z.B. Tetracyclinplatten gezüchtet, um jene Bakteriophagen zu selektieren, die DNA enthalten, die für H-Ketten kodiert, welche in die erwünschte Antigenbindung eingebunden sind. Ein zweiter Teil wird auf z.B. Ampicillinplatten gezüchtet, um jene Bakteriophagen zu selektieren, die Phagemid-DNA enthalten, die für L-Ketten kodiert, welche in die erwünschte Antigenbindung eingebunden sind. Eine Reihe an Kolonien aus individuell isolierten Klonen, z.B. aus den Tetracyclinplatten, wird dann verwendet, um spezifische Kolonien, z.B. aus den Ampicillinplatten, zu infizieren. Dies führt dazu, dass Bakteriophagen spezifische Kombinationen von H- und L-Ketten exprimieren, die dann auf Antigenbindung getestet werden können.
Ein technisches Problem bei der Verwendung von getrennten Replikonen für VL- und VH-Ketten ist die sogenannte "Interferenz" zwischen filamentösen Phagenreplikationsstartpunkten, die an verschiedenen Replikonen getragen werden, als ein Resultat von Konkurrenz für denselben Replikationsmechanismus.
Es wurden bereits Verfahren beschrieben, die mit dem Prinzip arbeiten, zuerst die Komplexität eines Repertoires zu reduzieren und anschließend eine oder beide Ketten der reduzierten Population neuerlich zu klonieren (WO 92/20791). Die vorliegende Erfindung liefert einen anderen Ansatz.
TERMINOLOGIE
Zahlreiche Begriffe aus der in diesem Abschnitt erläuterten Terminologie werden im Text an geeigneter Stelle verwendet.
Spezifisches Bindungspaar (sbp)
Dies beschreibt ein Molekülpaar (wobei jedes ein Element eines spezifischen Bindungspaares darstellt), das aus natürlicher Quelle stammt oder synthetisch hergestellt wurde. Eines der Moleküle des Paars weist einen Bereich an seiner Oberfläche oder einen Hohlraum auf, der sich spezifisch an das andere Molekül bindet und daher als komplementär mit einer bestimmten räumlichen und polaren Anordnung dieses anderen Moleküls definiert ist, sodass das Paar die Eigenschaft aufweist, sich spezifisch aneinander zu binden. Beispiele für Arten spezifischer Bindungspaare sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat, IgG-Protein A.
Multimere Elemente
Dies beschreibt ein erstes Polypeptid, das sich mit zumindest einem zweiten Polypeptid assoziiert, wenn die Polypeptide in freier Form und/oder an der Oberfläche eines Substrats exprimiert werden. Das Substrat kann durch einen Bakteriophagen bereitgestellt werden. Sind zwei assoziierte Polypeptide vorhanden, so ist der assoziierte Polypeptidkomplex ein Dimer, sind drei vorhanden, ein Trimer, usw. Das Dimer, Trimer, Multimer usw. oder das multimere Element kann ein Element eines spezifischen Bindungspaares umfassen.
Beispiele für multimere Elemente sind schwere Domänen, die auf einem Immunglobulinmolekül aufbauen, leichte Domänen, die auf einem Immunglobulinmolekül aufbauen, und T-Zell-Rezeptor-Untereinheiten.
Replizierbares genetisches Display-Paket (rgdp)
Dies beschreibt ein biologisches Partikel, das genetische Information in sich trägt und somit das Partikel mit der Fähigkeit zu replizieren bereitstellt. Das Partikel kann an seiner Oberfläche zumindest einen Teil eines Polypeptids präsentieren. Das Polypeptid kann durch genetische Information, die dem Partikel zueigen ist, kodiert und/oder künstlich in das Partikel oder einen Vorläufer davon platziert werden. Das präsentierte Polypeptid kann jeder beliebige Teil eines spezifischen Bindungspaares sein, z.B. Schwer- oder Leichtkettendomänen, die auf einem Immunglobulinmolekül basieren, ein Enzym oder ein Rezeptor usw.
Das Partikel kann ein Virus wie z.B. ein Bakteriophage wie beispielsweise fd oder M13 sein.
Paket
Dies beschreibt ein replizierbares genetisches Display-Paket, in dem das Partikel ein Element eines spezifischen Bindungspaares an seiner Oberfläche präsentiert hält. Das Paket kann ein Bakteriophage sein, der eine Antigen-Bindungsdomäne an seiner Oberfläche präsentiert hält. Diese Art von Paket wurde als Phagen-Antikörper (pAb) bezeichnet.
Antikörper
Dies beschreibt ein Immunglobulin, das entweder natürlich ist oder teilweise oder zur Gänze synthetisch hergestellt wurde. Die Bezeichnung bezieht sich auch auf jedes beliebige Protein, das eine Bindungsdomäne aufweist, die zu einer Immunglobulin- Bindungsdomäne homolog ist. Diese Proteine können aus natürlichen Quellen stammen oder teilweise oder zur Gänze künstlich hergestellt sein.
Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulinisotypen und die Fab-, F(ab')₂-, scFv-, Fv-, dAb-, Fd-Fragmente.
Immunglobulin-Überfamilie
Dies beschreibt eine Familie von Polypeptiden, deren Mitglieder zumindest eine Domäne mit einer Struktur aufweisen, die mit jener der variablen oder konstanten Domäne von Immunglobulinmolekülen verwandt ist. Die Domäne enthält zwei β-Faltblätter und üblicherweise eine konservierte Disulfidbindung (siehe A. F. Williams & A. N. Barclay, Ann. Rev. Immuno. 6, 381–405 (1988)).
Beispiele für Mitglieder einer Immunglobulin-Überfamilie sind CD4, aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktorrezeptor (PDGFR), interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM). Außer der Zusammenhang verlangt es anders, schließt ein Verweis auf Immunglobuline und Immunglobulinhomologe in dieser Anwendung Mitglieder der Immunglobulin-Überfamilie und Homologe davon ein.
Homologe
Dies bezeichnet Polypeptide mit denselben oder konservierten Resten an einer entsprechenden Stelle in ihrer Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur. Die Bezeichnung umfasst auch zwei oder mehrere Nucleotidsequenzen, die für die homologen Polypeptide kodieren.
Beispiele für homologe Peptide sind die Immunglobulinisotypen.
Funktionell
In Bezug auf ein sbp-Element, das an der Oberfläche eines rgdp präsentiert ist, bedeutet funktionell, dass das sbp-Element in einer gefalteten Form präsentiert ist, in der seine spezifische Bindungsdomäne für sein komplementäres sbp-Element dieselbe oder weitgehend analog zu ihrer nativen Konfiguration ist, wobei es ähnliche Spezifität bezüglich dem komplementären sbp-Element zeigt. In dieser Hinsicht unterscheidet es sich von den Peptiden aus Smith et al., s.o., die keine bestimmte gefaltete Konfiguration aufweisen und zahlreiche verschiedene Konfigurationen annehmen können, die durch die komplementären Elemente bestimmt werden, mit denen sie kontaktiert werden können.
Genetisch diverse Population
In Verbindung mit sbp-Elementen oder Polypeptidkomponenten davon bezieht sich diese Bezeichnung nicht nur auf Diversität, die in der natürlichen Population von Zellen oder Organismen bestehen kann, sondern auch auf Diversität, die durch künstliche Mutation in vitro oder in vivo geschaffen werden kann.
Mutation in vitro kann beispielsweise zufällige Mutagenese unter Verwendung von Oligonucleotiden mit zufälligen Mutationen der Sequenz, die wünschenswerterweise variiert werden soll, einbinden. In-vivo-Mutagenese kann beispielsweise Mutatorstämme von Wirtsmikroorganismen verwenden, um die DNA zu schützen (siehe Beispiel 38 der WO 92/01047). Das Wort "Population" selbst kann verwendet werden, um eine Vielzahl von z.B. Polypeptidketten zu bezeichnen, die sich genetisch nicht unterscheiden, d.h. die alle dieselben sind.
Domäne
Eine Domäne ist ein Teil eines Proteins, das innerhalb seiner selbst gefaltet, unabhängig von anderen Teilen desselben Proteins und unabhängig von einem komplementären Bindungselement ist.
Gefaltete Einheit
Dies bezeichnet eine spezifische Kombination aus einer α-Helix und/oder einem β-Strang und/oder einer β-Kehrenstruktur. Domänen und gefaltete Einheiten enthalten Strukturen, die Aminosäuren zusammenfügen, die in der Primärstruktur nicht benachbart sind.
Freie Form
Dies beschreibt den Zustand eines Polypeptids, das nicht durch ein replizierbares genetisches Display-Paket präsentiert wird.
Bedingt defekt
Dies beschreibt ein Gen, das ein bestimmtes Polypeptid unter einer Reihe von Bedingungen nicht exprimiert, es jedoch unter einer anderen Bedingungsreihe sehr wohl exprimiert. Ein Beispiel hierfür ist ein Gen, das eine Amber-Mutation enthält und in nicht-unterdrückenden bzw. unterdrückenden Wirten exprimiert wird.
Alternativ dazu kann ein Gen ein Protein exprimieren, das unter einer bestimmten Reihe an Bedingungen defekt ist, unter anderen Bedingungen jedoch nicht. Ein Beispiel hierfür ist ein Gen mit einer Temperatur-empfindlichen Mutation.
Unterdrückbares Translationsstoppcodon
Dies beschreibt ein Codon, das die Translation von Nucleotidsequenzen stromab des Codons unter einer Reihe von Bedingungen ermöglicht, unter anderen Bedingungen jedoch die Translation am Codon beendet. Beispiele für unterdrückbaree Translationsstoppcodons sind die Amber-, Ochre- und Opalcodons.
Mutatorstämme
Dies ist eine Wirtszelle, die einen genetischen Defekt aufweist, der DNA, die innerhalb dieser Zelle repliziert wurde, dazu veranlasst, in Bezug auf ihre verwandte DNA mutiert zu werden. Beispiele für Mutatorstämme sind NR9046mutD5 und NR9046mutT1 (siehe Beispiel 38).
Helfer-Phagen
Dies ist ein Phage, der verwendet wird, um Zellen zu infizieren, die ein defektes Phagengenom enthalten, und der wirkt, um den Defekt zu ergänzen. Das defekte Phagengenom kann ein Phagemid oder ein Phage mit einer bestimmten Funktion sein, die für entfernte Gensequenzen kodiert. Beispiele für Helfer-Phagen sind M13K07, M113K07 Gen III Nr. 3; und Phagen, die ein Bindungsmolekül, das an ein Capsidprotein fusioniert ist, präsentieren oder dafür kodieren.
Vektor
Dies ist ein DNA-Molekül, das zur Replikation in einem Wirtsorganismus in der Lage ist, in den ein Gen insertiert wird, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu konstruieren:
Phagenvektor
Dies ist ein Vektor, der durch Modifikation eines Phagengenoms gewonnen wird und einen Replikationsstartpunkt für einen Bakteriophagen, jedoch nicht für ein Plasmid, enthält.
Phagemidvektor
Dies ist ein Vektor, der durch Modifikation eines Plasmidgenoms gewonnen wird und einen Replikationsstartpunkt für einen Bakteriophagen sowie den Replikationsstartpunkt für das Plasmid enthält.
Sekretiert
Dies beschreibt ein rgdp oder ein Molekül, das sich mit dem Element eines sbp assoziiert, das am rgdp präsentiert ist, in dem das sbp-Element und/oder das Molekül gefaltet sind und das Paket extern zum zellulären Cytosol angeordnet ist.
Repertoire neu angeordneter Immunglobulingene
Ist eine Sammlung natürlich vorkommender Nucleotide, z.B. von DNA-Sequenzen, die für exprimierte Immunglobulingene in einem Tier kodieren. Die Sequenzen werden durch die In-vivo-Neuanordnung von z.B. V-, D- und J-Segmenten für H-Ketten und z.B. V- und J-Segmenten für L-Ketten gebildet. Alternativ dazu können die Sequenzen aus einer Zelllinie gebildet werden, die in vitro immunisiert wurde und in der die Neuanordnung als Reaktion auf Immunisierung intrazellulär auftritt. Die Bezeichnung "Repertoire" wird verwendet, um auf genetische Diversität hinzuweisen.
Bibliothek
Eine Sammlung von Nucleotid-, z.B. DNA-, Sequenzen innerhalb von Klonen; oder eine genetisch diverse Sammlung von Polypeptiden oder spezifischen Bindungspaarelementen oder Polypeptiden oder sbp-Elementen, die an rgdps präsentiert sind, die in der Lage sind zu selektieren oder zu screenen, um ein einzelnes Polypeptid oder sbp-Elemente oder eine gemischte Population von Polypeptiden oder sbp-Elementen bereitzustellen.
Repertoire von künstlich neu angeordneten Immunglobulingenen
Eine Sammlung von Nucleotid-, z.B. DNA-, Sequenzen, die zur Gänze oder teilweise aus einer Quelle gewonnen wurden, die keine neu angeordneten Immunglobulinsequenzen aus einem Tier sind. Dies kann beispielsweise DNA-Sequenzen, die für VH-Domänen kodieren, durch Kombinieren nicht angeordneter V-Segmente mit D- und J-Segmenten und DNA-Sequenzen, die für VL-Domänen kodieren, durch Kombinieren von V- und J-Segmenten einschließen.
Teile von oder die gesamten DNA-Sequenzen können durch Oligonucleotidsynthese abgeleitet werden.
Sekretionsleaderpeptid
Dies ist eine Sequenz von Aminosäuren, die an das N-terminale Ende eines Polypeptids gebunden sind und das Fortbewegen des Polypeptids aus dem Cytosol hinaus steuern.
Eluent
Dies ist eine Lösung, die verwendet wird, um die Bindung zwischen zwei Molekülen aufzubrechen. Die Bindung kann eine nicht-kovalente oder kovalente Bindung oder Bindungen sein. Die zwei Moleküle können Elemente eines sbp sein.
Derivat
Dies ist eine Substanz, die aus einem Polypeptid gewonnen wird, das durch die DNA innerhalb eines ausgewählten rgdp kodiert wird. Das Polypeptid-Derivat kann sich vom kodierten Polypeptid durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von Aminosäuren oder durch die Bindung anderer Moleküle an das kodierte Polypeptid unterscheiden. Diese Änderungen können auf Nucleotid- oder Proteinniveau erfolgen. Beispielsweise kann das kodierte Polypeptid ein Fab-Fragment sein, das dann an ein Fc-Ende aus einer anderen Quelle gebunden wird. Alternativ dazu können Marker wie Enzyme, Fluoresceine usw. an z.B. Fab- oder scFv-Fragmente gebunden werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung multimerer spezifischer Bindungspaar- (sbp-) Elemente bereitgestellt, umfassend: das Bewirken- oder Ermöglichen von Rekombination zwischen (a) ersten Vektoren, die für eine Population einer Fusion einer ersten Polypeptidkette eines spezifischen Bindungspaarelements kodierende Nucleinsäure und eine Komponente eines replizierbaren genetischen Display-Pakets (rgdp) umfassen, und (b) zweiten Vektoren, die für eine Population einer zweiten Polypeptidkette eines spezifischen Bindungspaarelements kodierende Nucleinsäure umfasst, wobei zumindest eine dieser Populationen genetisch divers ist, wobei die Rekombination zu rekombinanten Vektoren führt, die jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine solche Polypeptidfusion sowie eine solche zweite Polypeptidkette kodiert und unter Verwendung der rgdp-Komponente in rgdps gepackt werden kann.
Die eine oder die andere oder beide Populationen der ersten und zweiten Polypeptidketten können genetisch divers sein. Sind beide genetisch divers, repräsentieren die rekombinanten Vektoren ein extrem diverses Repertoire an sbp-Elementen. Eine oder beide der Populationen kann genetisch divers sein, kann jedoch im Vergleich zum gesamten verfügbaren Repertoire eingeschränkt sein, eventuell aufgrund eines vorangegangen Selektions- oder Screening-Schrittes. Eine Bibliothek von Nucleinsäure, die für eine eingeschränkte Population von Polypeptidketten kodiert, kann das Produkt von Selektion oder Screening unter Verwendung von rgdp-Display sein.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung multimerer spezifischer Bindungspaar- (sbp-) Elemente bereitgestellt, umfassend:

(i) das Exprimieren einer Population einer ersten Polypeptidkette eines spezifischen Bindungspaarelements, das mit einer Komponente eines replizierbaren genetischen Display-Pakets (rgdp) fusioniert ist, das dadurch die Polypeptidketten an der Oberfläche von rgdps präsentiert, aus einem Vektor in rekombinanten Wirtsorganismuszellen und das Kombinieren dieser Population mit einer Population einer zweiten Polypeptidkette des spezifischen Bindungspaarelements durch Bewirken oder Ermöglichen des Aufeinandertreffens von ersten und zweiten Polypeptidketten, sodass diese eine Bibliothek der durch rgdps präsentierten, multimeren spezifischen Bindungspaarelemente bilden, wobei die Population aus zweiten Polypeptidketten nicht aus demselben Vektor exprimiert wird wie die Population aus ersten Polypeptidketten, wobei zumindest eine dieser Populationen genetisch divers ist und aus Nucleinsäure exprimiert wird, die unter Verwendung der rgdp-Komponente gepackt werden kann, wodurch das genetische Material jedes dieser rgdps für eine Polypeptidkette einer solchen genetisch diversen Population kodiert;
(ii) das Selektieren oder Screenen von rgdps, die durch dieses Exprimieren gebildet werden, um ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population dieser sbp-Elemente bereitzustellen, die in ihrem jeweiligen rgdp mit Nucleinsäure assoziiert sind, die für eine Polypeptidkette davon kodiert;
(iii) das Gewinnen von Nucleinsäure aus einem selektierten oder gescreenten rgdp, wobei die gewonnene Nucleinsäure eine der Folgenden ist: (a) Nucleinsäure, die für eine erste Polypeptidkette kodiert, (b) Nucleinsäure, die für eine zweite Polypeptidkette kodiert und (c) ein Gemisch von (a) und (b);
(iv) die Erzeugung eines rekombinanten Vektors durch Bewirken oder Ermöglichen von Rekombination zwischen (a) einem Vektor, der in Schritt (iii) gewonnene Nucleinsäure umfasst, die für eine erste Polypeptidkette kodiert, und einem Vektor, der Nucleinsäure umfasst, die für eine zweite Polypeptidkette kodiert, oder (b) einem Vektor, der Nucleinsäure umfasst, die für eine erste Polypeptidkette kodiert, und einem Vektor, der in Schritt (iii) gewonnene Nucleinsäure umfasst, die für eine zweite Polypeptidkette kodiert.

Die Rekombination kann intrazellulär oder in vitro stattfinden, obwohl sie vorzugsweise in rekombinanten Wirtszellen erfolgt. Dies wird an anderer Stelle erläutert, doch kurz zusammengefasst kann dies das Einführen einer Bibliothek von Vektoren, einschließlich Nucleinsäure, die für erste (oder zweite) Polypeptidketten komponenten von sbp-Elementen kodiert, in Wirtszellen einbinden, die eine Bibliothek von Vektoren in sich tragen, die Nucleinsäure umfassen, die für zweite (oder erste) Polypeptidkettenkomponenten von sbp-Elementen kodiert.
Nach der Rekombination können die Polypeptidfusionen (erste Polypeptidketten, an eine rgdp-Komponente fusioniert) und die zweiten Polypeptidketten exprimiert werden, wodurch rgdps gebildet werden, die an ihrer Oberfläche diese ersten und zweiten Polypeptidketten präsentieren und die jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine dieser ersten Polypeptidketten und eine dieser zweiten Polypeptidketten kodiert, und dies durch das Packen der rekombinanten Vektoren in rgdps. Diese Expression kann daher eine äußerst diverse Bibliothek von sbp-Elementen produzieren, die an rgdp präsentiert sind. In einer Ausführungsform sind die sbp-Elemente präsentierenden rgdps pAbs (d.h. Phagen, die Antikörper oder Antikörperfragmente oder -derivate präsentieren), und jene, die ein Antigen von Interesse binden, können unter Verwendung ihrer Bindungsfähigkeit selektiert werden. Da jeder pAb in sich Nucleinsäure trägt, die für beide Polypeptidketten des auf seiner Oberfläche präsentierten Antikörpers kodiert, stellen pAbs, die durch Bindung an ein Antigen von Interesse selektiert worden sind, Nucleinsäure bereit, die für einen Antikörper kodiert, der jenes Antigen bindet. Die Nucleinsäure kann nach jeder beliebigen, in einem bestimmten Fall erforderlichen Amplifikation und jedem Klonieren aus den ausgewählten pAbs isoliert und zur darauf folgenden Gewinnung erwünschter Antikörper verwendet werden.
Die Rekombination kann durch Einbindung von Sequenzen in die Vektoren gefördert werden, an denen ortsspezifische Rekombination stattfinden kann. Dies ermöglicht exaktes Modellieren der resultierenden rekombinanten Vektoren. Beispielsweise kann eine Sequenz, an der ortsspezifische Rekombination auftreten kann, eine Position in der Nucleinsäure sein, die für einen Polypeptidlinker kodiert, der die zwei Domänen eines einkettigen sbp-Elements verbindet. Das einkettige sbp-Element kann aus einer Immunglobulin-VH-Domäne bestehen, die an eine Immunglobulin-VL-Domäne gebunden ist. VH- und VL-Domänen können sich assoziieren, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden. Der resultierende rekombinante Vektor kann dann Nucleinsäure umfassen, die für ein einkettiges Fv-Derivat eines Immunglobulins kodiert, das aus Rekombination zwischen ersten und zweiten Vektoren resultiert. (Beachte: ein einkettiges sbp-Element, wie beispielsweise ein scFv-Fragment oder -Derivat eines Antikörpers, kann als multimer (dimer) erachtet werden, da es aus zwei Polypeptidkettendomänen, wie beispielsweise VL und VH eines Antikörpers, besteht.)
Die Sequenzen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt, können lox^P-Sequenzen sein, die aus Coliphagen P1 gewonnen werden können, wobei ortsspezifische Rekombination durch Cre-Rekombinase katalysiert wird, die auch aus Coliphagen P1 gewonnen werden kann. Die verwendeten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen können aus einer lox^P-Sequenz gewonnen werden, die aus Coliphagen P1 erhältlich ist.
Die verwendete Cre-Rekombinase kann unter der Steuerung eines regulierbaren Promotors exprimierbar sein.
Um die Effizienz des Verfahrens zu steigern, wodurch der Anteil an produktiver Rekombination, die zu den erwünschten, resultierenden rekombinanten Vektoren führt, gesteigert wird, kann jeder Vektor zwei ortsspezifische Rekombinationssequenzen einbinden, von denen sich jede von der anderen unterscheidet. Die Sequenzen sollten dann so beschaffen sein, dass Rekombination zwischen ähnlichen Sequenzen an unterschiedlichen Vektoren stattfindet, aber nicht zwischen den verschiedenen Sequenzen am selben Vektor.
Jeder der ersten Vektoren und jeder der zweiten Vektoren können eine erste ortsspezifische Rekombinationssequenz und eine zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz, die sich von der ersten unterscheidet, umfassen, wobei ortsspezifische Rekombination zwischen ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen an verschiedenen Vektoren und zwischen zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen an verschiedenen Vektoren, jedoch nicht zwischen einer ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenz und einer zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenz am selben Vektor stattfindet.
Die erste ortsspezifische Rekombinationssequenz kann lox^P sein, die aus Coliphagen P1 erhältlich ist, und die zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz kann eine mutierte lox^P-Sequenz sein oder umgekehrt. Möglicherweise können sowohl die erste als auch die zweite ortsspezifische Rekombinationssequenzen Mutanten sein, solange die erste Sequenz nicht mit der zweiten Sequenz rekombiniert, aber erste Sequenzen untereinander und zweite Sequenzen untereinander rekombinieren.
Eine geeignete mutierte lox^P-Sequenz ist lox^P 511.
Die ersten Vektoren können Phagen oder Phagemide und die zweiten Vektoren Plasmide sein, oder die ersten Vektoren können Plasmide und die zweiten Vektoren Phagen oder Phagemide sein.
In einer Ausführungsform ist die Rekombination intrazellulär und findet in einem bakteriellen Wirt statt, der den rekombinanten Vektor vorzugsweise über die ersten Vektoren und die zweiten Vektoren repliziert. Dies kann verwendet werden, um Selektion von nützlichen Rekombinationsereignissen anzureichern. Die intrazelluläre Rekombination kann in einem bakteriellen Wirt stattfinden, der Plasmide vorzugsweise über Phagen oder Phagemide oder der Phagen oder Phagemide über Plasmide repliziert. Beispielsweise kann der bakterielle Wirt ein PolA-Stamm von E. coli oder eine anderen gram-negative Bakterie sein. PolA-Zellen sind nicht in der Lage, Replikation von Plasmiden zu unterstützen, sie können jedoch Replikation von filamentösen Phagen oder Phagemiden (von Plasmiden, die intergenische filamentöse Phagenregionen enthalten) unterstützen. Sind die ersten Vektoren beispielsweise Plasmide, die ein erstes Markergen enthalten, und sind die zweiten Vektoren Phagen oder Phagemide, die ein zweites Markergen enthalten, so wird Selektion auf beide Marker rekombinante Vektoren ergeben, die das Produkt eines erfolgreichen Rekombinationsereignisses sind, da Rekombination, die den ersten Marker aus Plasmid transferiert, stattfinden muss, damit dieser Marker repliziert und exprimiert werden kann.
Nucleinsäure aus einem oder mehreren rgdps kann genommen und in einem weiteren Verfahren verwendet werden, um ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population von sbp-Elementen oder Polypeptidkettenkomponenten davon oder aber dafür kodierende Nucleinsäure zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Set zur Verwendung bei der Durchführung von Verfahren bereit, umfassend:

(i) einen ersten Vektor mit einer Restriktionsstelle zur Insertion von für ein sbp-Element kodierender Nucleinsäure oder einer Polypeptidkomponente davon, wobei die Restriktionsstelle in der 5'-Endregion der reifen Kodiersequenz eines Phagen-Capsidproteins liegt, mit einer Sekretions-Leadersequenz stromauf dieser Stelle, die eine Fusion des Capsidproteins und des sbp-Polypeptids in den periplasmatischen Raum eines bakteriellen Wirts dirigiert; und
(ii) einen zweiten Vektor mit einer Restriktionsstelle zur Insertion von Nucleinsäure, die für eine zweite solche Polypeptidkette kodiert, wobei zumindest einer der Vektoren einen Replikationsstartpunkt für einzelsträngige Bakteriophagen aufweist und die Vektoren Sequenzen aufweisen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt.

Das Set kann Hilfskomponenten enthalten, die zur Durchführung des Verfahrens erforderlich sind.
Auch werden durch die vorliegende Erfindung rekombinante Wirtszellen bereitgestellt, die eine Bibliothek von ersten Vektoren, die jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine erste Polypeptidkette eines sbp-Elements kodiert, das an eine Komponente eines sekretierbaren replizierbaren genetischen Display-Pakets (rgdp) fusioniert sind, und von zweiten Vektoren, die jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine zweite Polypeptidkette eines sbp-Elements kodiert, in sich tragen, wobei die ersten oder die zweiten Vektoren oder beide in der Lage sind, unter Verwendung der rgdp-Komponente in rgdps gepackt zu werden, und die Vektoren Sequenzen aufweisen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Population von rgdps bereitgestellt, die jeweils an ihrer Oberfläche ein sbp-Element präsentieren und jeweils Nucleinsäure enthalten, die für eine erste und eine zweite Polypeptidkette des sbp-Elements kodiert, das an der Oberfläche präsentiert ist und das eine ortsspezifische Rekombinationssequenz einbindet.
Die Erfindung ermöglicht die Bereitstellung einer Population von rgdps, die jeweils an ihrer Oberfläche ein sbp-Element präsentieren und die jeweils Nucleinsäure enthalten, die eine Kombination von (i) Nucleinsäure, die für eine erste Polypeptidkette eines sbp-Elements kodiert, und (ii) Nucleinsäure, die für eine zweite Polypeptidkette eines sbp-Elements kodiert, umfasst, wobei die Population 10¹⁰ oder mehr Kombinationen von (i) und (ii) enthält. Solch eine Population übersteigt in ihrer Größe das Maximum, das unter Verwendung existierender Verfahren erreicht werden kann. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Produktion von außerordentlich diversen Bibliotheken oder Populationen von rgdps, die sbp-Elemente präsentieren. Die Nucleinsäure, die für eine erste Polypeptidkette eines sbp-Elements kodiert, kann beispielsweise 10⁷ verschiedene Sequenzen innerhalb der gesamten Population aufweisen. Weist die Nucleinsäure, die für eine zweite Polypeptidkette eines sbp-Elements kodiert, ebenfalls solch eine genetische Diversität innerhalb der gesamten Population auf, so ist die Anzahl unterschiedlicher Kombinationen von Nucleinsäure, die für erste und zweite Polypeptidketten kodiert, immens.
In Folge werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Form von Beispielen, die es nicht als Einschränkung zu verstehen gilt, unter Verweis auf die Figuren ausführlicher beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Diagramme der Wahrscheinlichkeit von Isolation eines Antikörpers mit einem bestimmten p[K]-Wert gegenüber der Größe einer Bibliothek.
2 erläutert eine Vorgehensweise zum Klonieren von Schwerkette als g3-Fusion an Phagen, wobei Leichtkette als lösliche Fragmente aus einem Phagemid exprimiert wird.
3(i) und (ii) veranschaulicht die Verwendung von ortsspezifischer Rekombination zur Konstruktion von polykombinatorischen Bibliotheken.
4A zeigt Replikone, die durch Cre-vermittelte Rekombination zwischen dem Akzeptor-Phagenvektor fdDOG-2lox (A) und dem Donor-Plasmidvektor pUC19-2lox (B) gebildet werden. A basiert auf fd-tet-DOG1, wobei Vk aus dem Maus-Anti-phOx-Antikörper NQ10.12.5 an eine menschliche konstante Ck-Domäne gebunden ist und VH aus dem Maus-Anti-TNFa-Antikörper an eine menschliche konstante Cm1-Domäne gebunden ist. B basiert auf pUC19, wobei VH von NQ10.12.5 an die menschliche konstante Cg1-Domäne gebunden ist. Innerhalb von E. coli entwickelt sich aufgrund der reversiblen Eigenschaft von Rekombination im lox-Cre-System ein Gleichgewicht zwischen den sechs Vektoren. Ribosom-Bindungsstellen (kleine offene Kreise), c-myc-Peptidmarkierung (myc), Phagen-fd-Gen-III-Leaderpeptidsequenz (Lg3), pelB-Leaderpeptidsequenz (LpelB), fd-Phagengen III (gIII) und Anordnungen von Oligonucleotiden, die zur Hybridisierung und zum Screenen verwendet wurden, sind angegeben.
4B zeigt die Sequenz über die Wildtyp-loxP- und mutierten loxP-511-Stellen, die in fdDOG-2lox (A) und pUC19-2lox (B) vorhanden sind. Die umgekehrten Wiederholungen in den loxP-Stellen sind umrahmt, und die Position der Punktmutation in der mutierten loxP-511-Stelle ist markiert (#) wie auch die Ribosom-Bindungsstellen (r.b.s.). Es gilt zu beachten, dass die Wildtyp-loxP-Stellen im Raster sind, um sicherzustellen, dass die Schwerketten zum Display am Phagen unmittelbar stromauf an Gen III fusioniert werden können.
5 zeigt eine schematische Darstellung von Selektionsverfahren, die die einmaligen Eigenschaften von pAbs verwenden; 5(i) zeigt ein Bindungs/Elutionssystem; und 5(ii) zeigt ein Konkurrenzsystem (p = pAb; ag = Antigen, an das Bindung durch pAb erforderlich ist; c = Konkurrentenpopulation (z.B. Antikörper, pAb, Liganden); s = Substrat (z.B. Kunststoffkügelchen usw.); d = Detektionssystem.
Hierin werden Verfahren offenbart, die zur Herstellung äußerst diverser Bibliotheken von spezifischen Bindungspaarelementen, wie beispielsweise Antikörper-Schwer- und -Leichketten, nützlich sind. Schwer- und Leichtketten, die an verschiedenen Replikonen kloniert wurden, können in Wirtszellen eingeführt werden. Die Schwer- und Leichtkettengene werden an demselben Replikon rekombiniert, sodass die Endzahl an geschaffenen Kombinationen gleich der Anzahl an Schwerketten multipliziert mit der Anzahl an Leichtketten ist. Rekombination kann in vivo oder in vitro auftreten. Vorzugsweise ist das Akzeptor-Replikon in der Lage, in ein rgdp eingebunden zu werden, sodass funktionelle Kombinationen von Schwer- und Leichtkettengenen selektiert werden können. Solch ein Format ist zur Konstruktion von äußerst diversen Bibliotheken von Antikörper-Schwer- und -Leichtketten, beispielsweise aus nicht-immunisierten Donoren, immunisierten Donoren oder einem Repertoire eines oder mehrerer künstlich neu angeordneten/r Immunglobulingens bzw. -gene besonders vorteilhaft und ist auch für Ketten-Neukombination, Mutagenese, Humanisieren und CDR-"Imprinting" gut geeignet.
Diese Verfahren können auch auf andere Proteine angewandt werden, in denen sich zwei oder mehrere Untereinheiten anordnen, um ein funktionelles Oligomer zu schaffen.
Die Gene für beide Untereinheiten, die auf zwei unterschiedlichen Replikonen vorhanden sind, können auf dasselbe rgdp zusammengeführt werden, sodass günstige Kombinationen von Untereinheitsgenen direkt isoliert werden können, ohne extensives Reklonieren ins Spiel zu bringen. Dies kann durch Rekombination zwischen den Replikonen erreicht werden, nachdem diese in dieselbe Zelle eingeführt worden waren. In einer bevorzugten Anordnung werden Rekombinationsereignisse so eingesetzt, dass die Gene für eine der Ketten an einem Akzeptor-Replikon rekombiniert werden, das das Gen einer Partnerkette enthält. Vorzugsweise ist das Akzeptor-Replikon in der Lage, in ein rgdp gepackt zu werden. Am meisten bevorzugt werden die Gene, die für eine oder mehrere der Untereinheiten kodieren, an ein Capsidgen wie beispielsweise gIII fusioniert, damit das funktionelle Multimer an der Oberfläche des rgdp präsentiert werden kann.
Eine Vielzahl an Rekombinationssystemen ist bekannt, und zahlreiche dieser Systeme könnten auf solche Weise nutzbar gemacht werden, dass Rekombination zwischen Replikonen bewirkt wird. Beispiele für Rekombinationssysteme umfassen allgemeine Rekombination, Transposition und ortsspezifische Rekombination.
Allgemeine Rekombination ist ein Verfahren, wo genetischer Austausch zwischen DNA-Segmenten auftritt, die eine gewisse Homologie miteinander aufweisen, und ist auch als "homologe Rekombination" bekannt. Es ist der grundlegende Mechanismus, durch den genetisches Material zwischen Chromosomen übertragen wird, und in E. coli wird das Verfahren durch das rec-BCD-Enzym katalysiert (siehe F. C. Neidhart (Hrsg.), American Society for Microbiology, "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology", 1034–1043 (1987)). Ein allgemeiner Rekombinationsmechanismus könnte verwendet werden, um Gene von einem Replikon zum anderen zu transferieren, sofern beispielsweise das rgdp-Genom ein Gen für eine der Ketten und ein "Attrappen"-Partnerkettengen aufweist, sodass Rekombination auftreten müsste, um das Attrappen-Gen am rgdp-Replikon durch das funktionelle Gen am zweiten Replikon zu ersetzen, um eine funktionelle Paarung zu bilden.
Transposition könnte auch verwendet werden, um Transfer von genetischer Information von einem Replikon zu einem anderem zu bewirken (siehe F. C. Neidhart (Hrsg.), American Society for Microbiology, "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology", 1061–1070 (1987)). Transposons wie beispielsweise Tn 3 und und Tn 10 sind DNA-Segmente, die auch als "springende Gene" und als "egoistische DNA" bezeichnet werden, und sind an Plasmiden und im E.-coli-Chromosom zu finden. Transposonstruktur ist variable, umfasst jedoch üblicherweise Rekombinasegene, die von wiederholten DNA-Sequenzen flankiert sind; die Rekombinase(n) zusammen mit Wirtsfaktoren katalysiert Insertion des Transposons in Stellen am Chromosom durch einen Mechanismus, der üblicherweise in einer Verdoppelung der Stelle, an der das Transposon insertiert wurde, resultiert. Insertion durch manche Transposons kann hoch ortsspezifisch sein, während andere im Wesentlichen nach dem Zufallsprinzip insertieren. Um Gene von einem Replikon zum anderen zu transferieren, könnte das Donorgen innerhalb eines hoch ortsspezifischen Transposons wie beispielsweise Tn 7 inkorporiert werden. Das Akzeptor-Plasmid würde so bearbeitet werden, dass es die Target-DNA-Sequenz enthält.
Eines der am besten verstandenen ortsspezifischen Rekombinationssysteme ist jenes, das zur Integration und zum Ausschneiden von Bakteriophagen λ verwendet wird (siehe F. C. Neidhart (Hrsg.), American Society for Microbiology, "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology", 1054–1060 (1987)). Dieser Bakteriophage kann, wenn er erst einmal innerhalb der Zelle ist, zwei Entwicklungswege durchschreiten: Lyse oder Lysogenie. Der Lysogenie-Weg umfasst Integration des λ-Genoms in das Chromosom der infizierten Bakterie; Integration ist das Resultat einer ortsspezifischen Rekombination zwischen einer ca. 240 bp langen Sequenz im Bakteriophagen, genannt att P, und einer 25-bp-Stelle im bakteriellen Chromosom, genannt att B. Das Integrationsereignis wird durch einen Wirt-kodierten Faktor namens IHF und ein Phagen-kodiertes Enzym namens Int-Rekombinase, die eine für die zwei att-Stellen übliche 15-bp-Region erkennt, katalysiert. Die integrierte DNA wird durch Sequenzen flankiert, die von att B und att B abgeleitet sind, und diese werden als att L und att R bezeichnet. Das Integrationsereignis ist reversibel und wird durch Int, IHF und ein zweites, Bakteriophagen-kodiertes Enzym, Xis, katalysiert. Es wird erwogen, dass dieses System für Sequenztransfer zwischen Replikonen innerhalb von E. coli verwendet werden könnte. Beispielsweise könnte das Donor-Gen durch att-L- und att-R-Stellen flankiert werden, sodass, wenn Int- und Xis-Proteine in der Wirtszelle bereitgestellt werden, Rekombination zwischen att-L- und att-R-Stellen ein ringförmiges DNA-Segment mit dem Donor-Gen und einer neu geschaffenen att-B-Stelle schaffen würde. Dieses ringförmige Segment könnte dann mit einer att-P-Stelle rekombinieren, die in das Akzeptor-Plasmid eingebaut wurde.
Ein alternatives ortsspezifisches Rekombinationssystem ist das lox P/Cre-Rekombinase-System von Coliphagen P1 (R. H. Hoess & K. Abremski, The Cre-lox recombination system. In: "Nucleic acids and Molecular Biology", F. Eckstein & D. M. J. Lilley (Hrsg.), Bd. 4, 99–109 (1990), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg). Cre-Rekombinase katalysiert ein hochspezifisches Rekombinationsereignis bei den Sequenzen mit dem Namen lox. lox P, die Rekombinationsstelle im Phagen P1, besteht aus zwei umgekehrten 13-bp-Wiederholungen, die durch einen nicht symmetrischen 8-bp-Kern getrennt sind (3). Für die Arbeit, auf die in dieser Anmeldung eingegangen wird, wurde das lox P/Cre-System deshalb aus den verschiedenen Auswahlmöglichkeiten ausgewählt, weil die Rekombination hoch sequenzspezifisch ist, sehr effizient ist und bei einer kurzen Target-Stelle auftritt, die leicht in Kloniervektoren einzubinden ist.
In der im Beispiel erläuterten Konfiguration aus 3 wird lösliche Leichtkette auf ein Phagemid kloniert, das eine einzelne lox-P-Stelle enthält. Die schweren Ketten werden auf ein Plasmid als g3-Fusionen kloniert. Entlang der g3-Fusion liegen das Gen für einen selektierbaren Marker und die Schwerketten/g3/Marker-Sequenz, die durch zwei lox-P-Stellen flankiert ist. Dieses Plasmid enthält auch die Cre-Rekombinase an einem regulierbaren Promotor und weist einen Startpunkt von doppelsträngiger Replikation auf, der mit jenem am Phagemid zusätzlich zu jenem am Helfer-Phagen kompatibel ist, z.B. co-existieren p15A-, RSF-1010- und col-E1-Ursprünge in derselben Zelle. Die Phagemide werden dann in Zellen infiziert, die das Donorplasmid und den induzierten Cre-Rekombinase-Promotor enthalten, sodass Rekombination zwischen den lox-P-Stellen innerhalb von infizierten Zellen auftritt. Manche dieser Rekombinationsereignisse führen zu den Schwerketten/g3/Marker-Sequenzen, die in Form eines Blocks auf den Phagemid an seiner einzigen lox-P-Stelle transferieren. Phagemide werden dann mit einem Helfer-Phagen wie beispielsweise M13K07 isoliert (siehe die WO 92/01047), und die resultierenden Phagemidpartikel werden entweder direkt am Antigen selektiert oder in frische Wirtszellen infiziert und mit Selektion auf Gegenwart beider Marker gezüchtet; das eine vom Phagemid selbst und das andere aus dem Schwerketten/g3/Marker-Block.
Die Verwendung von ortsspezifischer Rekombination, um Gene auf dasselbe Replikon zu bringen, kann auf die Schaffung einer kontinuierlichen Kodiersequenz am selben Replikon ausgedehnt werden, beispielsweiese um einkettige Fv-Moleküle zu konstruieren. Es gibt einen einzelnen offenen Leseraster in der loxP-Sequenz, der in einen scFv-Linker eingebunden werden könnte, der dann ein Substrat für Cre-katalysierte, ortsspezifische Rekombination dienen könnte. Das Platzieren solcher modifizierten scFv-Linkersequenzen an einem oder beiden Enden der zu fusionierenden Gene kann dann in der Schaffung von kontinuierlichen offenen Leserastern in vivo oder in vitro resultieren, sofern Cre-Rekombinase bereitgestellt wird.
Wie bei anderen ortsspezifischen Rekombinationssystemen ist Cre-katalysierte Rekombination umkehrbar, sodass produktive Rekombinanten nur eine Fraktion der Rekombinanten bilden. Selektion von produktiven Neuanordnungen kann durch die Verwendung eines polA-Stamms von Bakterien, vorzugsweise von E. coli oder anderen gram-negativen Bakterien, erleichtert werden. Diesen Zellen mangelt es an DNA-Polymerase I und sie sind nicht in der Lage, Replikation von Plasmiden zu unterstützen (S. Johnston und D. S. Ray (1984), s.o.). Sie sind jedoch in der Lage, Replikation von filamentösen Phagen und Plasmiden zu unterstützen, die filamentöse intergenische Phagenregionen enthalten. Erfolgt Cre-katalysierte Rekombination in polA-Bakterien, so werden durch Selektieren auf Gegenwart beider selektierbarer Marker in derselben polA-Zelle erfolgreiche Rekombinationsereignisse ertragreicher gemacht, da Rekombination für das zweite Markergen, das es zu replizieren und exprimieren gilt, stattfinden muss. Die resultierenden Zellen enthalten dann das vollständige Repertoire und können als Zellen vermehrt und mit Helferphagen infiziert werden, um Phagemide zu produzieren, die die Gene für beide Ketten enthalten und sie an ihrer Oberfläche exprimieren.
Eine andere Art, produktive Rekombinationsereignisse ertragreicher zu machen, ist die Verwendung mutierter loxP-Stellen. Mehrere Mutanten der loxP-Sequenz sind bekannt, und diese werden unter Berücksichtigung ihrer Fähigkeit, sich miteinander und mit der Wildtyp-loxP-Sequenz zu rekombinieren, verglichen (R. H. Hoess, A. Wierzbicki & K. Abremski, Nucl. Acids Res. 14, 2287–2300 (1986)). Beispielsweise weist loxP 511 eine G→A-Punktmutation im zentralen 8-bp-Segment auf, was dazu führt, dass es sich nur mit anderen loxP-511-Stellen rekombiniert, jedoch nicht mit Wildtyp-loxP-Sequenz (R. H. Hoess, A. Wierzbicki & K. Abremski (1986), s.o.). Das Platzieren von Kombinationen aus Wildtyp- und mutierter loxP-Sequenzen kann festlegen, welche Rekombinationsereignisse möglich sind: ihre Verwendung wird in Beispiel 1 beschrieben. Andere mutierte loxP-Stellen sind bekannt, doch ihre Fähigkeiten, sich miteinander und mit der Wildtyp-loxP-Sequenz zu rekombinieren, wurden bisher noch nicht ausführlich charakterisiert, es ist jedoch anzunehmen, dass loxP 511 nicht einzigartig ist. Die Bereitstellung verschiedener mutierter loxP-Stellen in den Vektoren würde es ermöglichen, sogar größere Kontrolle über das Auftreten von Rekombinationsereignissen zu bekommen, was komplexere, kontrollierbare und effiziente Rekombinationsstrategien möglich machen würde.
Die Gegenwart von Target-DNA-Sequenzen für ortsspezifische Rekombination in den Vektoren ist nützlich für darauf folgende Manipulation der Gene. In der Natur vorkommende oder künstlich eingeführte loxP-Sequenzen in den Genomen prokaryotischer und eukaryotischer Organismen können als Target-Stellen zur Insertion von Genen verwendet werden. Darüber hinaus wird auch rascher und effizienter Transfer von Genen in vitro, beispielsweise zwischen verschiedenen Vektoren, erwogen, da Cre-katalysierte Rekombination in vitro leicht auftritt (A. C. Boyd, Nuc. Acids Res. 21, 817–821 (1993)).
Es ist selbstverständlich, dass das Konzept der Verwendung zweier oder mehrerer Replikone zur Bildung von Diversität nicht auf die Präsentation von Multimeren an der Oberfläche filamentöser Bakteriophagen beschränkt ist. Beispielsweise könnten Bakterien in Form eines replizierbaren genetischen Display-Pakets verwendet werden. Fuchs et al. haben beispielsweise gezeigt, dass funktioneller Antikörper durch Fusion an Peptidoglycan-assoziiertes Lipoprotein an der Oberfläche von E. coli präsentiert werden kann (P. Fuchs, F. Breitling, S. Dubel, T. Seehaus und M. Little, Targetting of recombinant antibodies to the surface of Escherichia coli: fusion to a peptidoglycan associated lipoprotein. In: BioTechnology 9, 1369-1373 (1991)). Klauser et al. beschreiben den Transport eines heterologen Proteins an die Oberfläche von E. coli durch Fusion an Neisseria-IgA-Protease (T. Klauser, J. Pohler & T. F. Meyer, Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA protease B domain: conformation-dependent outer membrane translocation. In: EMBO 9, 1991-1999 (1990)). Andere Oberflächenproteine wie beispielsweise pili, ompA oder das an Oberflächen präsentierte Lipoprotein Tra T und gram-positive Organismen wie beispielsweise Lactobacillii und Streptokokken könnten auch verwendet werden. Klonieren und Expression in eukaryotischen Organismen wird auch erwogen.
Alternative Vorgehensweisen zum Klonieren sind möglich, wenn Zellen anstelle von Phagen verwendet werden. Beispielsweise können, zusätzlich zu Transformation und Infektion, durch Konjugation Replikone in die Zellen eingeführt werden. Darüber hinaus können ein oder mehrere Gene rekombiniert oder in das Chromosom transponiert werden, wodurch die Einschränkung auf die Verwendung von kompatiblen Replikonen herabgesetzt wird.
Das polykombinatorische Konzept ist durch Ermöglichen von Produktion einer sehr viel höheren Anzahl an mutierter Nachkommenschaft für Mutagenese-Experimente besonders vorteilhaft. Werden beispielsweise die Gene, die für ein multimeres Peptid oder Polypeptid kodieren, an insgesamt 10 Aminosäurepositionen mutiert, um jede beliebige Aminosäure an diesen Positionen einzubinden, so beträgt die Gesamtzahl an Kombinationen 20¹⁰ => 1,024 10¹³. Diese Zahl geht weit über den Bereich hinaus, der mit herkömmlichen Klonierformaten möglich ist, kann jedoch unter Verwendung der hierin beschriebenen Ansätze erreicht werden.
Die hierin beschriebenen Verfahren sind auf multimere Proteine, die keine Antikörper sind, wie beispielsweise T-Zell-Rezeptoren, CD3 und Insulinrezeptor, anwendbar. Bibliotheken von Proteinen, die mehr als zwei verschiedene und unterschiedliche Untereinheiten aufweisen, können durch beispielsweise mehr als einen Infektionszyklus geschaffen werden. Zellen, die eine der Untereinheiten enthalten, werden mit Phagen infiziert, die die zweite Untereinheit enthalten, und die resultierende Population wird ein zweites Mal mit einem kompatiblen Phagen infiziert, der die dritte Untereinheit trägt.
In manchen Fällen ist es von Vorteil, alle Komponenten des Multimers als g3-Fusionen zu exprimieren. Dies hat den Vorteil, dass schwache Wechselwirkungen zwischen einzelnen Ketten, z.B. VHg3 und VLg3, stabilisiert werden, um Phagen- oder Phagemidpartikel sowohl mit VH als auch mit VL zu schaffen, die mit g3 am selben Partikel fusioniert sind, oder dass Polypeptide, die schwach wechselwirken, oder Polypeptide, die sich nur in Gegenwart von Liganden assoziieren, stabilisiert werden.
Die Anzahl an möglichen Kombinationen mit dem polykombinatorischen Ansatz ist nur durch die Anzahl an Klonen eingeschränkt, die in jedem der Repertoires vorhanden sind, und im spezifischen Fall, wenn Phagen anstelle einer Kette verwendet werden, um Zellen zu infizieren, die die andere enthalten, durch die Anzahl an Phagen und Zellen, die produziert werden können. Die Verwendung von höher entwickelten Verfahren, beispielsweise Fermentationsverfahren, ermöglicht eine noch höhere Anzahl an verfügbaren Kombinationen.
Die für die ersten und zweiten Polypeptidkomponenten von Antikörpern kodierende Nucleinsäure kann vom Repertoire eines immunisierten oder nicht immunisierten Tiers oder Menschen oder von einem oder mehreren künstlich neu angeordneten Immunglobulingen oder -genen abstammen. Künstliche Neuanordnungen von Immunglobulingenen können das Binden von Keimlinien-V-Segmenten in vitro an J-Segmente und im Fall von VH-Domänen an D-Segmente einbinden. Jedes der V-, D- und J-Segmente kann synthetisch sein. Zum Binden kann ein PCR-basiertes Verfahren eingesetzt werden, das Primer verwenden kann, die eine Region randomisierter Sequenz aufweisen können, um Sequenzdiversität in das Produkt einzuführen, künstlich neu angeordnete Immunglobulingene.
Filamentöse F-spezifische Bakteriophagen sind geeignete Beispiele für den Phagentyp, der ein Vehikel zum Display von Bindungsmolekülen, z.B. Antikörpern und Antikörperfragmenten und Derivaten davon, an ihrer Oberfläche bereitstellt und darauf folgende Selektion und Manipulation erleichtert.
Die F-spezifischen Phagen (z.B. fl, fd und M13) entwickelten eine Vermehrungsmethode, die die Wirtszelle nicht tötet, weshalb sie üblicherweise als Vehikel für rekombinante DNA verwendet werden (A. Kornberg, DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco (1980)). Gen III vom Phagen fd ist für die Insertion biologisch aktiver, fremder Sequenzen interessant. Es gibt jedoch auch andere Kandidatenstellen, einschließlich beispielsweise Gen VIII und Gen VI.
Das Protein, für das Gen III kodiert, weist mehrere Domänen auf (D. Pratt et al., Virology 39, 42-53 (1969); R. A. Grant et al., J. Biol. Chem. 256, 539–546 (1981); und J. Armstrong et al., FEBS Lett. 135, 167–172 (1981)).
Das für Sequenzen für biologisch aktive Antikörperfragmente kodierende Gen wurde in die Gen-III-Region von fd insertiert, um ein großes Fusionsprotein zu exprimieren. Ein verwendeter Initiationsvektor war fd-tet (A. N. Zacher et al., Gene 9, 127–140 (1980)), eine Tetracyclin-resistente Version von fd-Bakteriophagen, die als ein Plasmid fortgepflanzt werden können, das dem infizierten E.-coli-Wirt Tetracyclin-Resistenz verleiht. Die Anmelder entschieden sich aus mehreren Gründen dafür, nach der Signalsequenz des fd-Gen-III-Proteins zu insertieren. Insbesondere entschieden sich die Anmelder dafür, nach Aminosäure 1 des reifen Proteins zu insertieren, um den Kontext für die Signalpeptidase-Spaltung beizubehalten. Um die Struktur und Funktion von Gen III selbst beizubehalten, wird der Großteil der ursprünglichen Aminosäuren nach den insertierten Immunglobulinsequenzen synthetisiert. Die insertierten Immunglobulinsequenzen wurden so modelliert, dass sie Reste aus der Switch-Region einbinden, die VH-VL an CH1-CL bindet (A. Lesk & C. Chothia, Nature 335, 188-190 (1988)).
Durch Manipulation von Gen III des Bakteriophagen fd kann ein Bakteriophage konstruiert werden, der an seiner Oberfläche große, biologisch funktionelle Antikörper-, Enzym- und Rezeptormoleküle präsentiert und dabei intakt und infektiös bleibt. Darüber hinaus können die Phagen, die Antikörper von erwünschter Spezifität tragen, aus einem Milieu von Phagen ausgewählt werden, die diese Spezifität nicht aufweisen.
Die Sequenzen, die für eine Population von Antikörpermolekülen und für die Insertion in den Vektor kodieren, um Expression von Antikörper-bindenden Funktionen an der Phagenoberfläche zu erzielen, können aus zahlreichen verschiedenen Quellen stammen. Diese Quellen können beispielsweise immunisierte oder nicht immunisierte Nagetiere oder Menschen sein oder auch Organe wie beispielsweise Milz und Peripherblut-Lymphozyten. Die Kodiersequenzen werden aus diesen Quellen mittels Verfahren gewonnen, die Fachleuten bekannt sind (R. Orlandi et al., (1989) s.o.; J. W. Larrick et al., (1989) s.o.; Y. L. Chiang et al., Bio Techniques 7, 360–366 (1989); E. S. Ward et al., (1989) s.o.; L. Sastry et al., (1989) s.o.)).
Bei herkömmlichen Rekombinationsverfahren zur Herstellung von Antikörpern wird ein Expressionsvektor, der Sequenzen enthält, die für die Antikörper-Polypeptidketten kodieren, verwendet, um z.B. E. coli zu transformieren. Die Antikörper-Polypetpide werden exprimiert und mittels herkömmlicher Screening-Systeme nachgewiesen. Detektiert der Screen ein Antikörper-Polypeptid der erwünschten Spezifität, so muss zum bestimmten transformierten E. coli zurückgekehrt werden, das das erwünschte Antikörper-Polypeptid exprimiert. Weiters muss der Vektor, der die Kodiersequenz für das erwünschte Antikörper-Polypeptid enthält, dann zur Verwendung aus E. coli bei weiteren Verarbeitungsschritten isoliert werden.
In der vorliegenden Erfindung jedoch ist das erwünschte Antikörper-Polypeptid, wenn es exprimiert wird, bereits mit seiner Gen-Kodiersequenz gepackt. Dies bedeutet, dass, wenn ein Antikörper-Polypeptid von erwünschter Spezifität ausgewählt wird, kein Bedarf besteht, für die Isolation jener Sequenz zur ursprünglichen Kultur zurückzukehren. Weiters musste in früheren Verfahren bei herkömmlichen Rekombinationstechniken jeder Klon, der Antikörper exprimierte, einzeln gescreent werden. Die vorliegende Anmeldung sorgt für Selektion von Antikörper mit erwünschten Eigenschaften exprimierenden Klonen.
Da ein rgdp (z.B. ein pAb) ein Element eines spezifischen Bindungspaars (z.B. eines Antikörpers monoklonaler Antigen-Bindungsspezifität) an der Oberfläche einer relativ einfachen replizierbaren Struktur präsentiert, die auch die genetische Information enthält, die für das Element kodiert, können rgdps, z.B. pAbs, die sich an das komplementäre Element des spezifischen Bindungspaares (z.B. Antigen) binden, sehr effizient entweder durch Elution aus dem komplementären Element unter Verwendung von z.B. Diethylamin, hochkonzentrierten Salzlösungen usw. und infizierenden geeigneten Bakterien oder durch Denaturieren der Struktur und insbesondere Amplifizieren der Sequenzen, die für das Element kodieren, unter Verwendung von PCR gewonnen werden. Das bedeutet, dass keine Notwendigkeit besteht, sich zurück auf den ursprünglichen bakteriellen Klon zu beziehen, der den pAb entstehen ließ.
SELEKTIONSFORMATE UND AFFINITÄTSREIFUNG
Einzelne rgdps, z.B. pAbs, die die erwünschte Spezifität z.B. für ein Antigen exprimieren, können aus der komplexen Bibliothek unter Verwendung herkömmlicher Screening-Verfahren isoliert werden (wie z.B. in E. Harlow & D. Lane (1988), s.o., und E. Gherardi et al., J. Immunol. Meth. 126, 61–68 (1990), beschrieben).
Andere Selektionsverfahren, die in der WO 92/01047 beschrieben und veranschaulicht sind, sind nur aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von rgdps durchführbar. Die Grundlagen mancher Screening-Verfahren sind in 5 unter Verwendung von pAbs als ein Beispiel für rgdp-Typen veranschaulicht.
Die zu screenende Population/Bibliothek von pAbs könnte aus immunisierten oder anderen Tieren gebildet werden; oder sie könnte in vitro durch das Unterziehen einer Mutagenese von bereits existierenden Phagen-Antikörpern (unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese) geschaffen werden (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Diese Population kann in einem oder mehreren der nachstehend unter Verweis auf 5 beschriebenen Formate gescreent werden, um jene einzelnen pAbs abzuleiten, deren Antigen-Bindungseigenschaften sich von Probe c unterscheiden.
Bindungselution
5(i) zeigt Antigen (ag), das an eine feste Oberfläche (s) gebunden ist, wobei die feste Oberfläche (s) durch eine Petrischale, durch Chromatographie-Kügelchen, magnetische Kügelchen und dergleichen bereitgestellt werden kann. Die Population/Bibliothek von pAbs wird dann über das ag geführt, und jene einzelnen p, die sich binden, werden nach dem Waschen zurückgehalten und gegebenenfalls mit dem Detektionssystem d nachgewiesen. Ein Detektionssystem, das auf Anti-fd-Antiseren basiert, wird in Beispiel 4 der WO 92/01047 ausführlicher veranschaulicht. Werden Proben von gebundener Population p unter steigend stringenten Bedingungen entfernt, so steigt auch die Bindungsaffinität, die in jeder Probe vorhanden ist. Bedingungen erhöhter Stringenz können beispielsweise durch Anheben der Dauer des Einweichens oder durch Änderung des pH der Einweichlösung usw. erreicht werden.
Konkurrenz
In Bezug auf 5(ii) kann Antigen ag an einen festen Träger s gebunden werden und durch das ursprüngliche Bindungsmolekül c bis zur Sättigung gebunden werden. Wird dem Komplex eine Population von mutiertem pAb (oder eine Reihe von nicht verwandten pAbs) angeboten, so werden sich nur jene binden, die höhere Affinität zu Antigen ag als c aufweisen. In den meisten Beispielen wird nur ein geringer Teil von Population c durch Einzelne aus Population p verdrängt. Ist c ein herkömmliches Antikörpermolekül, so kann das gesamte gebundene Material gewonnen werden, und gebundenes p kann durch Infizieren geeigneter Bakterien und/oder durch die Verwendung herkömmlicher Verfahren wie beispielsweise PCR gewonnen werden.
Eine vorteilhafte Anwendung erfolgt unter Verwendung von ag als Rezeptor und c als entsprechenden Liganden. Die gewonnene gebundene Population p ist dann strukturell mit der Rezeptor-Bindungsstelle und/oder dem Liganden verwandt. Diese Art von Spezifität ist dafür bekannt, besonders nützlich in der Pharmaindustrie zu sein.
Eine andere vorteilhafte Anwendung ist, wo ag ein Antikörper und c sein Antigen ist. Die gewonnene gebundene Population p ist dann ein Anti-Idiotyp-Antikörper, der zahlreiche Verwendungen in der Forschung und der Diagnostik sowie in der pharmazeutischen Industrie hat.
Zur Zeit ist es schwierig, direkt auf Anti-Idiotyp-Antikörper zu selektieren. pAbs könnten die Möglichkeit eröffnen, dies direkt durch Binden von pAb-Bibliotheken (z.B. einer naiven Bibliothek) an B-Zellen (die Antikörper an ihrer Oberfläche exprimieren) und Isolieren jener Phagen, die sich gut banden, umzusetzen.
In manchen Fällen könnte es sich als vorteilhaft erweisen, Population p einer Vorselektion zu unterziehen. Beispielsweise kann im Anti-Idiotyp-Antikörper-Beispiel von zuvor p gegen einen verwandten Antikörper, der sich nicht an das Antigen bindet, absorbiert werden.
Ist c jedoch ein pAb, so können entweder c oder p oder beide günstigerweise auf gewisse Weise markiert werden, um gebundenen p gegenüber gebundenen c zu unterscheiden und zu selektieren. Dieses Markieren kann physikalisch, beispielsweise durch Prä-Markieren von p mit Biotin, erfolgen; oder vorzugsweise genetisch. Beispielsweise kann c mit einer EcoB-Restriktionsstelle markiert werden, während p mit einer EcoK-Restriktionsstelle markiert werden kann (siehe P. Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4431–4443 (1985)). Werden gebundene p + c aus dem Antigen eluiert und verwendet, um geeignete Bakterien zu infizieren, so gibt es Restriktion (und somit kein Wachstum) von Population c (d.h. EcoB-Restriktionsbakterien in diesem Beispiel). Jeder Phage, der wuchs, würde stark an jenen einzelnen Elementen aus p mit höheren Bindungsaffinitäten angereichert sein. Alternativ dazu kann das genetische Markieren durch Markieren von p mit neuen Sequenzen erreicht werden, die verwendet werden können, um p aus dem Gemisch unter Verwendung von PCR spezifisch zu amplifizieren.
Da die gebundenen pAbs unter Verwendung von beispielsweise PCR oder bakterieller Infektion amplifiziert werden können, ist es auch möglich, die erwünschte Spezifität zu isolieren, sogar wenn nicht ausreichend viele einzelnen Elemente gebunden sind, um Detektion über herkömmliche Verfahren zu ermöglichen.
Das bevorzugte Verfahren zur Selektion eines Phagen, der ein Proteinmolekül mit einer erwünschten Spezifität oder Affinität präsentiert, wird häufig Elution aus einer Affinitätsmatrize mit einem Liganden sein (z.B. Beispiel 21 aus der WO 92/01047).
Elution mit steigenden Konzentrationen an Liganden sollte Phagen eluieren, die Bindungsmoleküle von steigender Affinität präsentieren. Bindet sich jedoch z.B. ein pAb an sein Antigen mit hoher Affinität oder Avidität (oder ein anderes Protein an seinen Bindungspartner), so kann es nicht möglich sein, den pAb aus einer Affinitätsmatrize mit Molekül, das mit dem Antigen verwandt ist, zu eluieren. Alternativ dazu kann kein geeignetes spezifisches Elutionsmolekül vorhanden sein, das in ausreichend hoher Konzentration hergestellt werden kann. In diesen Fällen ist es erforderlich, ein Elutionsverfahren zu verwenden, das z.B. zum Antigen-Antikörper-Komplex nicht spezifisch ist. Manche der allgemein verwendeten, nicht- spezifischen Elutionsverfahren reduzieren z.B. Phagenlebensfähigkeit; Phagenlebensfähigkeit wird über die Zeit hinweg bei pH 12 reduziert (E. F. Rossomando & N. D. Zinder, J. Mol. Biol. 36, 387–399 (1968)). Es kann Wechselwirkungen zwischen z.B. Antikörpern und Affinitätsmatrizen geben, die nicht unterbrochen werden können, ohne Phageninfektiosität vollständig aufzuheben. In diesen Fällen ist ein Verfahren zur Elution von Phagen erforderlich, das nicht von der Unterbrechung von z.B. Antikörper-Antigen-Wechselwirkung abhängig ist. Für diese Fälle würde ein Verfahren entwickelt, das Elution von gebundenen pAbs unter milden Bedingungen (Reduktion einer Dithiolgruppe mit Dithiothreit) ermöglicht, die die Phagenstruktur nicht aufschließt (Beispiel 47 aus der WO 92/01047).
Dieses Elutionsverfahren ist nur ein Beispiel für ein Elutionsverfahren unter milden Bedingungen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren stellt die Einführung einer Nucleotidsequenz, die für Aminosäuren kodiert, die eine Erkennungsstelle für Spaltung durch eine hochspezifische Protease zwischen dem insertierten fremden Gen, in diesem Fall ein Gen für ein Antikörper-Fragment, und die Sequenz des Restes von Gen III darstellt, dar. Beispiele für solche hochspezifischen Proteasen sind Faktor X und Thrombin. Nach Bindung des Phagen an eine Affinitätsmatrize und Elution zur Entfernung nicht-spezifisch bindender Phagen und schwach bindender Phagen würde der stark gebundene Phage durch Waschen der Säule mit Protease unter Bedingungen, die für Verdau an der Spaltungsstelle geeignet sind, entfernt werden. Dies würde das Antikörper-Fragment von dem Phagenpartikel spalten und dadurch den Phagen eluieren. Dieser Phage sollte erwartungsgemäß infektiös sein, da die einzige Proteasestelle jene sein sollte, die spezifisch eingeführt wurde. Stark bindende Phagen könnten dann durch Infektion von z.B. E.-coli-TG1-Zellen gewonnen werden.
In einem alternativen Verfahren zum oben beschriebenen wird die Affinitätsmatrize, die den stark gebundenen pAb zurückgehalten hat, genommen und die DNA, beispielsweise durch Kochen in SDS-Lösung, extrahiert. Extrahierte DNA kann dann verwendet werden, um E.-coli-Wirtszellen direkt zu transformieren, oder alternativ dazu können die für Antikörper kodierenden Sequenzen, beispielsweise mittels PCR mit geeigneten Primern wie beispielsweise jene, die hierin offenbart sind, amplifiziert werden und dann in einen Vektor zur Expression in Form eines löslichen Antikörpers zur weiteren Untersuchung oder in Form eines pAb für weitere Selektionsdurchgänge insertiert werden.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Selektion nach Affinität umfasst das Binden an eine Affinitätsmatrize, die geringe Mengen an Liganden enthält.
Sofern erwünscht wird, aus einer Population von Phagen zu selektieren, die ein Proteinmolekül mit einer hohen Affinität zu seinem Liganden präsentieren, so ist eine bevorzugte Vorgehensweise das Binden einer Population von Phagen an eine Affinitätsmatrize, die eine geringe Menge an Liganden enthält. Es gibt Konkurrenz zwischen Phagen, die hochaffine und niederaffine Proteine präsentieren, um die Bindung an den Liganden an der Matrize. Ein Phage, der hochaffines Protein präsentiert, wird vorzugsweise gebunden, und niederaffines Protein wird weggewaschen. Das hochaffine Protein wird dann durch Elution mit dem Liganden oder durch andere Verfahren, die den Phagen aus der Affinitätsmatrize eluieren, gewonnen (Beispiel 35 aus der WO 92/01047 erläutert dieses Verfahren).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass zur Gewinnung der gepackten DNA aus dem Affinitätsschritt das Paket einfach eluiert werden kann, es in Gegenwart eines homologenen sbp-Elements eluiert werden kann, das mit jenem Paket um Bindung an ein komplementäres sbp-Element konkurriert; es durch Kochen entfernt werden könnte, es durch proteolytische Spaltung des Proteins entfernt werden könnte; und auch andere Verfahren werden Fachleuten bekannt sein, z.B. die Zerstörung der Bindung zwischen dem Substrat und dem komplementären sbp-Element, um die gepackte DNA und das sbp-Element freizusetzen. In jedem Fall ist das Ziel das Gewinnen der DNA aus dem Paket, sodass sie direkt oder indirekt verwendet werden kann, um das durch die DNA kodierte sbp-Element zu exprimieren.
Die Effizienz dieses Selektionsverfahrens für pAbs und die Fähigkeit, sehr große Bibliotheken zu schaffen, bedeutet, dass die Immunisierungsverfahren, die entwickelt wurden, um den Anteil an gescreenten Zellen zu erhöhen, die Antikörper von Interesse produzieren, kein absolutes Erfordernis darstellen. Das Verfahren ermöglicht rasche Isolierung von Bindungsspezifitäten, z.B. Antigen-Bindungsspezifitäten, einschließlich jener, die mittels herkömmlicher Verfahren schwer oder gar nicht zu erhalten wären, z.B. katalytischer oder anti-idiotypischer Antikörper. Das Entfernen des Tieres insgesamt ist nun möglich, sobald eine vollständige Bibliothek des Immunrepertoires konstruiert wurde.
Die Struktur des pAb-Moleküls kann in zahlreichen anderen Anwendungen verwendet werden. Einige Beispiele hierfür sind:
Signalamplifikation
Da sie als eine molekulare Einheit in sich selbst wirken, kombinieren rgdps, z.B. pAbs, die Fähigkeit, ein spezifisches Molekül, z.B. Antigen, mit Amplifikation zu binden, sofern das Haupt-Hüllprotein verwendet wird, um eine andere Gruppierung anzubinden. Diese Gruppierung kann über immunologische, chemische oder andere Mittel gebunden werden und kann verwendet werden, um beispielsweise den Komplex mit Detektionsreagenzien oder zytotoxischen Molekülen zur Verwendung in vivo oder in vitro zu markieren.
Physikalische Detektion
Die Größe der rgdps, z.B. pAbs, kann als ein Marker, insbesondere im Zusammenhang mit physikalischen Verfahren zur Detektion wie beispielsweise Elektronenmikroskopie und/oder manche Biosensoren, z.B. Oberflächen-Plasmonresonanz, verwendet werden.
Diagnosetests
Die rgdps, z.B. pAbs, finden auch vorteilhafte Verwendungen in Diagnosetests, insbesondere, wenn Trennung unter Verwendung ihrer physikalischen Eigenschaften, beispielsweise durch Zentrifugation, Filtration usw., durchgeführt werden kann.
Beispiel 1: In-vivo-Rekombination von Antikörpergenen zwischen Replikonen unter Verwendung von Cre/lox
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung des Cre/loxP-Systems zum Transfer von Antikörpergenen zwischen zwei Replikonen in derselben Zelle. Hierbei muss Rekombination auftreten, um ein funktionelles Paaren von Antikörpergenen hervorzubringen.
Zwei Konstrukte wurden hergestellt: ein "Akezptor"-fd-Phagenvektor, fdDOG-2lox (A), und ein "Donor"-Plasmidvektor, pUC19-2lox (B) (siehe 4 und die Legende). A kodiert für die leichte Kette eines ersten Antikörpers (und die schwere Kette eines zweiten, anderen Antikörpers); B kodiert für die schwere Kette des ersten Antikörpers. In beiden Vektoren sind die VH-Gene durch zwei loxP-Stellen flankiert (siehe 4). Um Deletion der VH-Gene in Gegenwart von Cre zu vermeiden, ist eine der zwei loxP-Stellen Wildtyp, die andere jedoch enthält eine G-zu-A-Punktmutation innerhalb der 8-bp-Abstandsregion loxP 511 (R. H. Hoess, A. Wierzbicki & K. Abremski, (1986) s.o.). Die Wildtyp-loxP-Stelle und die mutierte loxP-511-Stelle rekombinieren nicht miteinander im selben Vektor, rekombinieren jedoch, wie nachstehend gezeigt wird, mit Stellen passender Sequenzen in verschiedenen Vektoren. Wird Cre-Rekombinase in vivo durch Infizieren des E. coli mit Phagen P1Cm c1.100 bereitgestellt (J. L. Rosner, Virology 48, 679-689 (1972)), so können A und B durch Rekombination zwischen entweder mutierten oder Wildtyp-loxP-Stellen co-integrieren, um chimäre Plasmide C bzw. D zu schaffen. Weitere Rekombinatian kann dann zwischen den zwei Wildtyp- oder den zwei mutierten loxP-Stellen auftreten, um die ursprünglichen Vektoren (A und B) oder die zwei neuen Vektoren (E und F) zu bilden. Die schweren Ketten von A und B sind daher ausgetauscht, und E kodiert nun für das Fab-Fragment des ersten Antikörpers zur Präsentation als eine Fusion zum N-Terminus des Phagengen-3-Proteins (g3p).
(a) Konstruktion von fdDOG-2lox- und pUC19-2lox-Vektoren
FdDOG-2lox- und pUC19-2lox-Vektoren wurden aus fdDOG-1 bzw. pUC19 gewonnen (WO 92/01047 und WO 92/20791; fdDOG-1 wurde zuvor fdCAT-2 genannt). Die Klonierstellen dieser Vektoren wurden unter Verwendung einer Kombination von ortsgerichteter Mutagenese und Ligation von doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotiden unter Verwendung von herkömmlichen molekularbiologischen Verfahren bearbeitet (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, "Molecular cloning: A Laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1990)).
Diese Konstrukte wurden verwendet, um Donorplasmid B und Akzeptorphagen A, die in 4 abgebildet sind, herzustellen. Plasmid B enthält das VH-Gen des Anti-phOx-(2-Phenyloxazof-5-on) Hybridoms NQ10.12.5 (G. M. Griffiths, C. Berek, M. Kaartinen & C. Milstein, Nature 312, 271-275 (1984)), gebunden an ein menschliches Cg1-Segment und kloniert in pUC19-2lox als ein Sfi-1-Not-1-Fragment. Akzeptorphage A enthält den VL-Partner des Anti-phOx-Hybridoms NQ10.12.5, gebunden an ein menschliches Ck1-Segment, kloniert in fdDOG-2lox als ein Apa-LI-Asc-1-Fragment. Akzeptorphage A enthält auch ein VH-Segment aus einem Anti-Tumornekrosefaktor-Antikörper (D. A. Rathjen, L. J. Furphy & R. Aston, Br. J. Cancer 65, 852-856 (1992)), gebunden an ein menschliches Cm1-Segment und kloniert in fdDOG-2lox als ein Sfi-1-Not-1-Fragment.
Sowohl A- als auch B-Konstrukte wurden in E. coli TG1 transformiert, wobei Konstrukt A Resistenz gegenüber Tetracyclin und Konstrukt B Resistenz gegenüber Ampicillin verlieh.
(b) Herstellung von infektiösen Akzeptorphagenpartikel (Konstrukt A).
Phagenpartikel wurden aus dem Medium von Konstrukt-B-Klonen, die über Nacht in 2 × Tetracyclin-hältigem YT gezüchtet wurden, wie in der PCT WO 92/01047, Beispiel 6, beschrieben, geerntet.
(c) Cre-katalysierte In-vivo-Rekombination
Dies wurde wie folgt durchgeführt:

1. E. coli, die das Plasmid pUC19-2lox enthielten, wurden unter Schütteln bei 37°C in 2 ml 2 × TY-Medium mit 100 mg/ml Ampicillin und 1% Glucose zu einer O.D. 600 nm von 0,4 gezüchtet.
2. 5 × 10⁹ transduzierender Einheiten (tu) von fdDOG-2lox-Phagen wurden zugesetzt (ein zehnfacher Überschuss gegenüber Bakterien) und Inkubation bei 37°C ohne Schütteln weitere 30 min fortgesetzt.
3. 5 × 10⁹ pfu-Phage P1Cm c1.100 (verleiht Chloramphenicol-Resistenz; J. L. Rosner, (1972) s.o.) wurden zugesetzt und Inkubation weitere 30 min bei 37°C fortgesetzt. Die Kultur wurde 40 Stunden lang bei 30°C geschüttelt.
4. Etwa 10¹⁰ tu Phagen-fd-Partikel (einschließlich rekombinanter Phage) wurden aus dem Kulturüberstand durch 5-minütiges Auszentrifugieren von Bakterien bei 13.000 g und Durchführen des Überstandes durch ein steriles 0,45-mm-Filter (Minisart, Sartorius) geerntet.

Um der rekombinierten Population Proben zu entnehmen, wurden 10³ tu der obigen fd-Partikel in frisches E. coli TG1 infiziert, auf 2 × TY-Agar, das 12,5 mg/ml Tetracyclin enthielt, ausgestrichen und dann über Nacht bei 37°C inkubiert. 96 gut getrennte Kolonien wurden in eine 96-Well-Mikrotiterschale, die 100 ml/Well 2 × TY enthielt, das 12,5 mg/ml Tetracyclin enthielt, transferiert und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Diese Platte wurde als Stammlösung verwendet, die dann mittels mehrerer Verfahren gescreent wurde, um zu erkennen, welche Rekombinationsereignisse aufgetreten waren:

(1) ELISA, um Klone zu identifizieren, die Phagen produzierten, die sich an phOx-BSA binden (um Vektor E zu identifizieren).
(2) Replika-Plattierungsmethode, um Klone zu finden, die sowohl gegen Ampicillin als auch gegen Tetracyclin resistent sind (um Vektoren C und D zu identifizieren).
(3) Koloniehybridisierung mit radioaktiv markiertem Oligonucleotid VHNQ10PR, das sich spezifisch an CDR3 von NQ10.12.5 VH bindet (um Vektoren C, D und E zu identifizieren).
(4) PCR mit Oligonucleotiden FDPCRBACK und VHNQ10PR (um Vektoren C und E zu identifizieren).
(5) PCR mit Oligonucleotiden LMB3 und VHNQ10PR (um Vektor D zu identifizieren).

(d) ELISA zur Identifikation von phOX-Bindern (Vektor E)

1. Beschichten der Platte (Falcon 3912) mit 100 μl phOX-BSA (14:1-Substitution) pro Well bei 10 μg/ml in PBS. Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur.
2. Spülen der Wells 3 × mit PBS und Blockieren mit 200 μl pro Well von 2 Marvel/PBS 2 Stunden lang bei 37°C.
3. Spülen der Wells 3 × mit PBS, dann Zusetzen von 25 μl von 10% Marvel/PBS zu allen Wells.
4. Zusetzen von 100 μl Kulturüberstand zu den geeigneten Wells. Vermischen, 2 h bei Raumtemperatur stehen lassen.
5. Auswaschen der Wells 3 × mit PBS, 0,05% Tween 20 und 3 × mit PBS. Zusetzen von 100 ml Schaf-Anti-M13-Antiserum, verdünnt 1:1.000 in 2% Marvel/PBS, zu jedem Well. Inkubieren bei Raumtemperatur 1,5 h lang.
6. Auswaschen der Wells 3 × mit PBS, 0,05% Tween 20 und 3 × mit PBS. Pipettieren von 100 μl einer 1:5.000-Verdünnung von Anti-Schaf-IgG-Antikörper (Peroxidase-konjugiert, Sigma). Inkubieren bei Raumtemperatur 1,5 h lang.
7. Verwerfen des zweiten Antikörpers und Waschen der Wells 3 × mit PBS, 0,05% Tween 20 und 3 × mit PBS.
8. Zusetzen einer 10-mg-ABTS- (2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure), Diammoniumsalz) Tablette zu 20 ml 50 mM Citratpuffer, pH 4,5. (50 mM Citratpuffer, pH 4,5, wird durch Vermischen gleicher Volumina von 50 mM Trinatriumcitrat und 50 mM Zitronensäure hergestellt.)
9. Zusetzen von 20 μl 30% Wassserstoffperoxid zur obigen Lösung unmittelbar vor dem Dispensieren.
10. Zusetzen von 100 μl der obigen Lösung zu jedem Well. Bei Raumtemperatur 30 min lang lassen.
11. Quenchen durch Zusatz von 50 μl 3,2 mg/ml Natriumfluorid. Lesen bei 405 nm.

Fußnote 1: "Marvel" ist getrocknetes Milchpulver. PBS ist 5,84 g NaCl, 4,72 g Na₂HPO₄ und 2,64 g NaH₂PO₄·2H₂O, pH 7,2, in 1 Liter.
Für 68 der 96 Klone wurde erkannt, dass sie im ELISA positiv waren (O.D. 405 nm > 1,0); 71% der Tetracyclin-resistenten Klone entsprechen daher Vektor E (Fig.), da sie für funktionelle Anti-phOX-Fab-Fragmente am Phagen kodieren.
(e) Replika-Plattierung zur Identifikation von Vektoren C und D
Zellen aus der Masterplatte wurden auf eine 2 × YT-Agarplatte, die 100 mg/ml Ampicillin, 12,5 mg/ml Tetracyclin und 1% Glucose enthielt, unter Verwendung einer 96-Nadel-Vorrichtung überimpft. Die Platte wurde bei 37°C über Nacht inkubiert. Fünf Kolonien wuchsen bis zum nächsten Tag, was darauf hinweist, dass 5/96 Klone die in C oder D gezeigten Strukturen aufwiesen.
(f) Koloniehybridisierung zur Identifikation von Vektoren C, D und E
Koloniehybridisierung erfolgte mit der Anordnung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie in Sambrook et al. (1989, s.o.) beschrieben. Die verwendete Sonde war ein radioaktiv markiertes Oligonucleotid VHNQ10PR, das sich spezifisch an CDR3 von NQ10.12.5 VH bindet.
73 der 96 Kolonien waren positiv und entsprachen daher den Vektoren C, D oder E.
(g) PCR-Screenen zur Identifikation von Vektoren C und E.
PCR-Reaktionen wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 11 der WO 92/01047 beschrieben durchgeführt. Zellen aus jedem der 96 Klone wurden vorsichtig unter Verwendung eines Zahnstochers in 20 ml steriles Wasser in einem 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen transferiert. Die Proben wurden dann 5 Minuten lang in ein kochendes Wasserbad platziert, und 2 ml davon wurden als Matrize für jede 20-ml-PCR-Reaktion verwendet.
Dreißig Amplifikationszyklen von jeweils 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 2 Minuten bei 72°C wurden unter Verwendung der Primer FDPCRBACK und VHNQ10PR durchgeführt. PCR-Reaktionsprodukte wurden auf 1% TAE-Agarosegelen aufgelöst (Sambrook et al., (1989) s.o.).
72 der 96 Klone ergaben ein ca. 1-kb-PCR-Fragment und wurden so als positiv verzeichnet. Diese Klone entsprechen den Vektoren C und E.
(g) PCR-Screenen zur Identifikation von Vektor D
Eine zweite Serie von PCR-Reaktionen wurde an Zellen aus der oben beschriebenen Anordnung durchgeführt, wobei dieses Mal die Primer LMB3 und VHNQ10PR verwendet wurde.
Nur 1 der 96 Klone ergab ein PCR-Fragment von ca. 400 bp und wurde daher als Vektor D verzeichnet.
(h) Analyse von Rekombinanten
Die vorangehenden Experimente zeigen, dass von den 96 Tetracyclin-resistenten Klonen, die als Proben genommen wurden, 23 Vektor A, 4 Vektor C, 1 Vektor D und 68 Vektor E waren. Alle 68 Vektor-E-Klone produzierten Phagen, die sich an phOx-BSA banden, die übrigen 28 Klone taten dies jedoch nicht (wie erwartet). Somit entsprechen 70% aller Tetracyclin-resistenten Klone Vektor E, der für funktionelle Anti-phOx-Fabs zum Display am Phagen kodiert. Das Verfahren ist sehr effizient und sollte die Schaffung und Verwendung von äußerst großen kombinatorischen Repertoires ermöglichen.
Beispiel 2. Schaffung einer äußerst großen kombinatorischen Bibliothek unter Verwendung von In-vivo-Rekombination
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion einer äußerst großen Bibliothek von V-Genen von nicht-immunisierten Donoren unter Verwendung des In-vivo-Rekombinationsverfahrens, das im vorangehenden Beispiel erläutert wurde. Zahlreiche der nachstehend erläuterten Verfahren wurden bereits vorher beschrieben (J. Marks et al., (1991) s.o.)).
(a) Herstellung von cDNA-Matrize
500 ml Blut, die etwa 10⁸ B-Lymphozyten enthielten, wurden 2 gesunden freiwilligen Spendern abgenommen. Die weißen Zellen wurden auf Ficoll getrennt, und RNA wurde unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens hergestellt (G. Cathala, J. Savouret, B. Mendez, B. L. Wesr, M. Karin, J. A. Martial und J. D. Bacter, A method for isolation of intact, transcriptionally active ribonucleic acid. DNA 2, 329 (1983)). Drei Erststrang-cDNA-Synthesen wurden wie von Marks et al. (1991, s.o.) beschrieben aus RNA, die 2,5 × 10⁷ B-Zellen entsprach, unter Verwendung von HuIgMFOR-Konstantregionprimer für die Schwerketten und HuCKFORCYS für κ-Leichtketten und HuCLFORCYS für λ-Leichtketten hergestellt (Tabelle 1).
(b) PCR für Schwerketten und Konstruktion eines Schwerkettenrepertoires
VH-Gene wurden unter Verwendung des HuIgMFOR-Primers in Verbindung mit jedem der HuVHBACK-Primer einzeln PCR-amplifiziert. Sechs getrennte PCR-Amplifikationen wurden jeweils mit 50 μl Reaktionsvolumen, das 5 μl des Überstandes aus der cDNA-Synthese enthielt, unter Verwendung des HUIGA/IFOR-Primers, 20 pmol Gesamtkonzentration der Rückwärts-Primer, 20 pmol Konzentration des Vorwärts-Primer, 250 μM dNTPs, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris.HCl (pH 8,8), 2,0 mM MgCl₂, 100 mg/ml BSA und 1 μl (1 Einheit) Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineral- (Paraffin-) Öl überschichtet und unter Verwendung eines Techne-PHC-2-Wärmezyklierers 30 Amplifikationszyklen unterzogen. Der Zyklus bestand aus 1 Minute bei 94°C (Denaturierung), 1 Minute bei 57°C (Anellieren) und 2,5 Minuten bei 72°C (Extension). Die Produkte wurden auf einem 1,0%igen Agarosegel gereinigt, vom Gel durch Geneclean (Bio-101) isoliert und in 25 μl H₂O resuspendiert. Die sechs Produkte wurden dann gesammelt, und "Durchzug"-PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um Sfi-I- und Not-I-Restriktionsstellen anzubinden.
Durchzug-Reaktionen wurden mit den Primern HUVHBACKSfi (äquimolare Mischung von allen 6 Primern) und HUCM1FON0 entworfen. 50 ml Reaktionsgemische, die 5 μl der gesammelten PCR-Produkte aus den vorangehenden Schritten enthielten, wurden unter Verwendung derselben Bedingungen wie für die vorangehende PCR, außer dass 25 Amplifikationszyklen verwendet wurden, amplifiziert. Die resultierenden Fragmente wurden mit Sfi I und Not I verdaut, Gel-gereinigt, und die Fragmente wurden an Sfi-I- und Not-I-geschnittenes pUC19-2lox unter Verwendung bereits beschriebener Verfahren (J. Sambrook et al., (1989) s.o.; PCT WO 92/01047) ligiert. Die Ligationsgemische wurden Phenol-Chloroform-extrahiert, bevor sie Elektroporation in TG1-Zellen unterzogen wurden (J. Marks et al., (1991) s.o.). Kurz zusammengefasst wurde die ligierte DNA in 20 μl Wasser resuspendiert, und 2,5-μl-Proben wurden in 50-μl-Aliquoten von elektrokompetentem E. coli TG1 elektroporiert. Zellen wurden in SOC 1 h lang gezüchtet und dann auf 2YT-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin und 1% Glucose (2YTAG) in 243 × 243 mm Schafen (Nunc) ausplattiert und über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die Kolonien wurden von den Platten abgekratzt und als Bibliotheksstämme in 2YTAG, das 15% Glycerin enthielt, zur Lagerung bei –70°C gegeben.
Für das Schwerketten-Repertoire wurde berechnet, dass es 1.10⁷ unabhängige Rekombinanten aufwies, für die durch Bst-NI-Fingerprinting gezeigt werden konnte, dass sie äußerst divers waren (PCT WO 92/01047).
(c) PCR von leichten Ketten und Konstruktion von κ- und λ-Kettenrepertoires
κ- und λ-Kettengene wurden getrennt voneinander amplifiziert. κ-Kettengene wurden unter Verwendung eines äquimolaren Gemisches der 12 SYNKB-Primer in Verbindung mit HuCKFORCYS (Tabelle 1) amplifiziert. λ-Kettengene wurden aus der cDNA-Synthese unter Verwendung eines äquimolaren Gemischs der 8 DPVL-Primer in Verbindung mit dem HUCLFORCYS-Primer amplifiziert. In jedem Fall wurden 50 μl Reaktionsgemische hergestellt, die 5 μl des Überstandes aus der geeigneten cDNA-Synthese, 20 pmol Gesamtkonzentration des Rückwärts-Primers, 20 pmol Konzentration des Vorwärts-Primers, 250 μM dNTPs, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris.HCl (pH 8,8), 2,0 mM MgCl₂, 100 mg/ml BSA und 1 μl (1 Einheit) Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineral- (Paraffin-) Öl überschichtet und unter Verwendung eines Techne-Wärmezyklierers 30 Amplifikationszyklen unterzogen. Der Zyklus bestand aus 1 Minute bei 94°C (Denaturierung), 1 Minute bei 57°C (Anellieren) und 2,5 Minuten bei 72°C (Extension). Die Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel gereinigt, vom Gel durch Geneclean (Bio-101) isoliert und in 25 μl H₂O resuspendiert.
Durchzug-Reaktionen wurden nun an jedem der zwei Leichtketten-Präparate durchgeführt. κ-Kettengene wurden unter Verwendung eines äquimolaren Gemisches der 12 SYNKBApa-Primer in Verbindung mit beiden HUCKFORCYSNOT amplifiziert. λ-Kettengene wurden unter Verwendung eines äquimolaren Gemisches der 8 DPVLApa-Primer in Verbindung mit HUCLFORCYSNOT amplifiziert. Durchzug-Bedingungen entsprachen jenen der obigen primären Leichtketten-PCRs, außer dass 25 Amplifikationszyklen verwendet wurden.
κ- und λ-Kettenrepertoires wurden getrennt voneinander verarbeitet. In jedem Fall wurden PCR-Produkte mit Apa LI und Not I verdaut und in Apa-LI-Not-I-geschnittenes fdDOG-2lox (hergestellt unter Verwendung von Standardformat) ligiert, die Ligationsgemische wurden durch Phenolextraktion gereinigt und vor Elektroporation in TG1 wie zuvor beschrieben mit Ethanol gefällt, außer dass die transformierten Zellen auf 2YT-Agar mit 12,5 μg/ml Tetracyclin in 243 × 243 mm Schalen (Nunc) ausplattiert und dann über Nacht bei 30°C gezüchtet wurden. Die Kolonien wurden von den Platten abgeschabt und als Bibliotheksstämme in 2YT, das 15% Glycerin enthielt, zur Lagerung bei –70°C gegeben.
Für die κ- und λ-Kettenrepertoires wurde berechnet, dass sie ca. 1.10⁶ voneinander unabhängige Rekombinanten aufwiesen; wiederum gab Bst-NI-Fingerprinting an, dass beide Bibliotheken äußerst divers waren.
(d) In-vivo-Rekombination von schweren und leichten Ketten
Die κ- und λ-Kettenrepertoires wurden getrennt voneinander mit dem Schwerkettenrepertoire unter Verwendung eines Scale-ups des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens rekombiniert.
O.D. 600 nm wurde verwendet, um die Zelldichte der Stämme, die von den Platten abgeschabt wurden, unter Verwendung des Algorithmus O.D.600nm von 1,0 = 5.10⁸ Zellen zu berechnen. Etwa 1.10¹⁰ Zellen aus jedem der κ- und λ-Kettenrepertoires in fdDOG-2lox wurden in 1-l-Volumen von 2 × YT, das 12,5 μg/ml Tetracyclin enthielt, eingeimpft und 30 h lang bei 37°C unter raschem Schütteln gezüchtet. Phagenpartikel wurden aus dem gereinigten Wachstumsmedium wie in der PCT WO 92/01047, Beispiel 6, beschrieben geerntet, und die Stämme wurden auf etwa 1.10¹² TU ml-1 eingestellt.
1.10¹¹ Zellen aus dem Schwerkettenrepertoire wurden in 2 × 1-l-Volumen 2YTAG in 2,5-l-Schüttelkolben eingeimpft und bei 37°C unter raschem Schütteln gezüchtet, bis die Kulturen eine O.D._600nm von 0,4 ml^–1 erreicht hatten. 5.10¹² fdDOG-2lox κ- und λ-fdDOG-2lox-Phagen wurden zugesetzt (ein zehnfacher Überschuss gegenüber Bakterien), und Inkubation wurde bei 37°C ohne Schütteln 30 min lang fortgesetzt. 5.10¹² pfu Phage P1Cm c1.100 wurden zugegeben und die Inkubation weitere 30 min bei 37°C fortgeführt. Die Kulturen wurden dann bei 4.000 g 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde abgegossen. Die Zellpellets wurden in 1 l von 2 × TY, 100 mg/ml Ampicillin, –12,5 mg/ml Tetracyclin, 12,5 mg/ml Chloramphicol, 1% Glucose resuspendiert, und die Kulturen wurden 40 h lang bei 30°C geschüttelt. Phagen-fd-Partikel (einschließlich Rekombinationsphagen) wurden aus dem Kulturüberstand durch 15-minütiges Auszentrifugieren der Bakterien bei 13.000 g geerntet, und die Partikel wurden PEG-gefällt.
Die Rekombinationsbibliotheksphagen wurden dann in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA resuspendiert und auf 1.10¹² TU ml-1 eingestellt: dieser Stamm stellt die Bibliothek dar. Diese Phagen wurden auf Antigen selektiert, neuerlich in frisches E. coli infiziert und durch Ausplattieren auf 2 × YT-Agar, das 12,5 μg/ml Tetracyclin enthielt, gewonnen. Wachstum von selektierten Phagen wird durch Kultur in 2 × YT, das 12,5 μg/ml Tetracyclin (oder andere erforderliche Antikörper – siehe 4, Konstrukt E) enthält, erreicht, und Phagen, die funktionelle Antikörper tragen, werden aus dem Nährmedium gewonnen.
Man beachte, dass Sbp-Elemente und dafür kodierende Nucleinsäure, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, zur Herstellung von Derivaten verwendet werden können. Die Bezeichnung Derivat wurde bereits erläutert.
TABELLE 1 Oligonucleotidsequenzen

Claims

Verfahren zur Herstellung von multimeren spezifischen Bindungspaar- (sbp-) Elementen, umfassend das Bewirken oder Ermöglichen von Rekombination zwischen (a) ersten Vektoren, der für eine Population einer Fusion einer ersten Polypeptidkette eines spezifischen Bindungspaarelements kodierende Nucleinsäure und eine Komponente eines replizierbaren genetischen Display-Pakets (rgdp) umfasst, und (b) zweiten Vektoren, die für eine Population einer zweiten Polypeptidkette eines spezifischen Bindungspaarelements kodierende Nucleinsäure umfasst, wobei zumindest eine dieser Populationen genetisch divers ist, in vitro oder in bakteriellen Zellen in Kultur, wobei die Rekombination zu rekombinanten Vektoren führt, die jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine solche Polypeptidfusion sowie eine solche zweite Polypeptidkette kodiert und unter Verwendung der rgdp-Komponente in rgdps gepackt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Exprimieren der Polypeptidfusionen und der zweiten Polypeptidketten, wodurch rgdps produziert werden, die an ihrer Oberfläche die erste und die zweite Polypeptidkette aufweisen und jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine solche erste Polypeptidkette und eine solche zweite Polypeptidkette kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Rekombination intrazellulär erfolgt und durch Einbindung von Sequenzen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt, in die Vektoren begünstigt wird und worin jeder der ersten Vektoren und jeder der zweiten Vektoren eine erste ortsspezifische Rekombinationssequenz und eine sich von der ersten unterscheidende zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz umfasst, wobei ortsspezifische Rekombination zwischen ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen auf unterschiedlichen Vektoren und zwischen zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen auf unterschiedlichen Vektoren erfolgt, nicht jedoch zwischen einer ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenz und einer zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenz auf demselben Vektor.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Rekombination in vitro erfolgt und durch Einbindung von Sequenzen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt, in die Vektoren begünstigt wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, worin der resultierende rekombinante Vektor Nucleinsäure umfasst, die für ein einkettiges sbp-Element kodiert, das aus Rekombination zwischen ersten und zweiten Vektoren resultiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4 und 5, worin die Sequenzen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt, lox^P-Sequenzen sind, die aus Coliphagen P1 erhältlich sind, oder Sequenzen, die von einer solchen lox^P abgeleitet sind, und worin ortsspezifische Rekombination durch aus Coliphagen P1 erhältliche Cre-Rekombinase katalysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die verwendete Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors exprimierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin jeder der ersten Vektoren und jeder der zweiten Vektoren eine erste ortsspezifische Rekombinationssequenz und eine zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz, die sich von der ersten unterscheidet, umfasst, wobei ortsspezifische Rekombination zwischen ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen auf unterschiedlichen Vektoren und zwischen zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen auf unterschiedlichen Vektoren erfolgt, nicht jedoch zwischen einer ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenz und einer zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenz auf demselben Vektor.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die erste ortsspezifische Rekombinationssequenz aus Coliphagen P1 erhältliche lox^P und die zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz eine mutierte lox^P-Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die erste ortsspezifische Rekombinationssequenz eine lox^P-Mutante und die zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz aus Coliphagen P1 erhältliche lox^P ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin die mutierte lox^P-Sequenz lox^P 511 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ersten Vektoren Phagen oder Phagemide und die zweiten Vektoren Plasmide oder die ersten Vektoren Plasmide und die zweiten Vektoren Phagen oder Phagemide sind.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die ersten Vektoren Phagen oder Phagemide und die zweiten Vektoren Plasmide oder die ersten Vektoren Plasmide und die zweiten Vektoren Phagen oder Phagemide sind und worin die intrazelluläre Rekombination in einem bakteriellen Wirt erfolgt, der den Rekombinationsvektor gegenüber den ersten Vektoren und den zweiten Vektoren bevorzugt repliziert.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die intrazelluläre Rekombination in einem bakteriellen Wirt erfolgt, der Plasmide gegenüber Phagen oder Phagemiden bevorzugt repliziert oder der Phagen oder Phagemiden gegenüber Plasmiden bevorzugt repliziert.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der bakterielle Wirt ein PolA-Stamm von E. coli oder einem anderen gram-negativen Bakterium ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin Nucleinsäure aus einem oder mehreren rgdp(s) herangezogen und in einem weiteren Verfahren eingesetzt wird, um ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population von sbp-Elementen oder Polypeptidkettenkomponenten davon oder dafür kodierende Nucleinsäure zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung von multimeren spezifischen Bindungspaar- (sbp-) Elementen, umfassend: (i) das Exprimieren einer Population einer ersten Polypeptidkette eines spezifischen Bindungspaarelements, das mit einer Komponente eines replizierbaren genetischen Display-Pakets (rgdp) fusioniert ist, das dadurch die Polypeptidketten an der Oberfläche von rgdps präsentiert, aus einem Vektor in rekombinanten Wirtsorganismuszellen und das Kombinieren dieser Population mit einer Population einer zweiten Polypeptidkette des spezifischen Bindungspaarelements durch Bewirken oder Ermöglichen des Aufeinandertreffens von ersten und zweiten Polypeptidketten, so dass diese eine Bibliothek der durch rgdps präsentierten, multimeren spezifischen Bindungspaarelemente bilden, wobei die Population aus zweiten Polypeptidketten nicht aus demselben Vektor exprimiert wird wie die Population aus ersten Polypeptidketten, wobei zumindest eine dieser Populationen genetisch divers ist und aus Nucleinsäure exprimiert wird, die unter Verwendung der rgdp-Komponente gepackt werden kann, wodurch das genetische Material jedes dieser rgdps für eine Polypeptidkette einer solchen genetisch diversen Population kodiert; (ii) das Selektieren oder Screenen von rgdps, die durch dieses Exprimieren gebildet werden, um ein einzelnes sbp-Element oder eine gemischte Population dieser sbp-Elemente bereitzustellen, die in ihrem jeweiligen rgdp mit Nucleinsäure assoziiert sind, die für eine Polypeptidkette davon kodiert; (iii) das Gewinnen von Nucleinsäure aus einem selektierten oder gescreenten rgdp, wobei die gewonnene Nucleinsäure eine der Folgenden ist: (a) Nucleinsäure, die für eine erste Polypeptidkette kodiert, (b) Nucleinsäure, die für eine zweite Polypeptidkette kodiert und (c) ein Gemisch von (a) und (b); (iv) die Erzeugung eines rekombinanten Vektors durch Bewirken oder Ermöglichen von In-vitro-Rekombination zwischen (a) einem Vektor, der in Schritt (iii) gewonnene Nucleinsäure umfasst, die für eine erste Polypeptidkette kodiert, und einem Vektor, der Nucleinsäure umfasst, die für eine zweite Polypeptidkette kodiert, oder (b) einem Vektor, der Nucleinsäure umfasst, die für eine erste Polypeptidkette kodiert, und einem Vektor, der in Schritt (iii) gewonnene Nucleinsäure umfasst, die für eine zweite Polypeptidkette kodiert.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die ersten Vektoren Phagen oder Phagemide und die zweiten Vektoren Plasmide sind oder die ersten Vektoren Plasmide und die zweiten Vektoren Phagen oder Phagemide sind.
Set zur Verwendung bei der Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 3 bis 11, umfassend: (i) einen ersten Vektor mit einer Restriktionsstelle zur Insertion von für ein sbp-Element kodierender Nucleinsäure oder einer Polypeptidkomponente davon, wobei die Restriktionsstelle in der 5'-Endregion der reifen Kodiersequenz eines Phagen-Capsidproteins liegt, mit einer Sekretions-Leadersequenz stromauf dieser Stelle, die eine Fusion des Capsidproteins und des sbp-Polypeptids in den periplasmatischen Raum eines bakteriellen Wirts dirigiert; und (ii) einen zweiten Vektor mit einer Restriktionsstelle zur Insertion von Nucleinsäure, die für eine zweite solche Polypeptidkette kodiert, wobei zumindest einer der Vektoren einen Replikationsstartpunkt für einsträngige Bakteriophagen aufweist und die Vektoren Sequenzen aufweisen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt.
Rekombinante Wirtszellen, die eine Bibliothek von ersten Vektoren in sich tragen, die jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine erste Polypeptidkette eines sbp-Elements, an eine Komponente eines sekretierbaren, replizierbaren genetischen Display-Pakets (rgdp) fusioniert, kodiert, und von zweiten Vektoren, die jeweils Nucleinsäure umfassen, die für eine zweite Polypeptidkette eines sbp-Elements kodiert, wobei die ersten Vektoren oder die zweiten Vektoren oder beide unter Verwendung der rgdp-Komponente in rgdps gepackt werden können und die Vektoren Sequenzen aufweisen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt.
Rekombinante Wirtszellen nach Anspruch 20, worin die Sequenzen, an denen ortsspezifische Rekombination auftritt, aus Coliphagen P1 erhältliche lox^P-Sequenzen oder von solch einer lox^P-Sequenz abgeleitete Sequenzen sind.
Rekombinante Wirtszellen nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin jeder der ersten Vektoren und jeder der zweiten Vektoren eine erste ortsspezifische Rekombinationssequenz und eine zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz, die sich von der ersten unterscheidet, umfasst, wobei ortsspezifische Rekombination zwischen ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen auf unterschiedlichen Vektoren und zwischen zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenzen auf unterschiedlichen Vektoren erfolgt, nicht jedoch zwischen einer ersten ortsspezifischen Rekombinationssequenz und einer zweiten ortsspezifischen Rekombinationssequenz auf demselben Vektor.
Rekombinante Wirtszellen nach Anspruch 22, worin die erste ortsspezifische Rekombinationssequenz aus Coliphagen P1 erhältliche lox^P und die zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz eine mutierte lox^P-Sequenz ist.
Rekombinante Wirtszellen nach Anspruch 22, worin die erste ortsspezifische Rekombinationssequenz eine lox^P-Mutante und die zweite ortsspezifische Rekombinationssequenz aus Coliphagen P1 erhältliche lox^P ist.
Rekombinante Wirtszellen nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, worin die mutierte lox^P-Sequenz lox^P 511 ist.
Population von rgdps, die jeweils an ihrer Oberfläche ein sbp-Element präsentieren und jeweils an ihrer Oberfläche präsentierte Nucleinsäure enthalten, die für eine erste und eine zweite Polypeptidkette des sbp-Elements kodiert, und die eine ortsspezifische Rekombinationssequenz umfasst.
Population von rgdps nach Anspruch 26, worin die ortsspezifische Rekombinationssequenz eine aus Coliphagen P1 erhältliche lox^P-Sequenz oder eine von solch einer lox^P-Sequenz abgeleitete Sequenz ist.
Population von rgdps nach Anspruch 26 oder Anspruch 27, worin das sbp-Element ein einkettiges sbp-Element ist.