DE69937735T2

DE69937735T2 - Phagen-display-selektionssystem für korrekt gefaltete proteine

Info

Publication number: DE69937735T2
Application number: DE69937735T
Authority: DE
Inventors: Lutz Riechmann; Peter Kristensen; Jean-Luc Jestin; Gregory Paul Winter
Original assignee: Domantis Ltd
Current assignee: Domantis Ltd
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-13
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2019-05-14
Also published as: NO20005628L; AU3941399A; JP5161865B2; EP1078051B1; US8680018B2; JP2010148507A; PT1078051E; ATE380865T1; NO329172B1; CA2328422A1; JP4493846B2; CY1107293T1; ES2299244T3; DK1078051T3; US20090203542A1; US7442159B1; DE69937735D1; NO20005628D0; WO1999058655A2; EP1078051A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Auswahlsystem (Selektionssystem), welches die Auswahl (Selektion) von Polypeptiden erlaubt, die in einem Phagendisplaysystem dargestellt werden.
Viren sind für die Darstellung („Display") von Peptiden und Proteinen verwendet worden [21, 26, 44]. Insbesondere sind filamentöse Bakteriophagen für die Darstellung von Proteinen und Peptiden durch die Fusion von Genen, die für die Proteine oder Peptide kodieren, an das Gen, das ein Phagenhüllprotein kodiert, verwendet worden. Da das Fusionsgen in den Phagen eingebaut wird, der das Fusionsprotein darstellt, bietet dies eine Verknüpfung von Phänotyp und Genotyp. Repertoire von Proteinen können von einer Population von Phagen kodiert werden und die seltenen Phagen, die Proteine mit vorherbestimmten Bindungsaktivitäten umfassen, durch die Bindung an eine feste Phase isoliert werden. Auf diese Weise sind synthetische humane Antikörper mit zuvor festgelegter Antigenbindungsspezifität aus Repertoiren von Antikörperfragmenten, die aus verschiedenen strukturellen Elementen zusammengesetzt waren [10], ausgewählt worden. Da es erforderlich ist, dass der Antikörper gefaltet wird, um das Antigen zu binden, selektiert die Auswahl nach Bindung ebenfalls nach Faltung. Dieses Prinzip ist ebenfalls für die Auswahl von gefalteten Peptiden verwendet worden, wo die Bindung durch ein diskontinuierliches Epitop vermittelt wird [8, 11–13].
Ein Problem, das in Phagendisplaysystemen vorhanden ist, ist das Vorhandensein von hohen Niveaus an Hintergrund, der von Phagen verursacht wird, die die gewünschten Polypeptide nicht darstellen. Zum Beispiel werden Antikörperrepertoires im Allgemeinen als Fusionsproteine mit dem p3-Protein auf Phagemidvektoren kodiert und werden durch die Verwendung von Helferphagen umhüllt. Das Helferphagenhüllprotein konkurriert mit der Fusion des Antikörpers und Hüllproteins (kodiert auf dem Phagemid), was zu einem Phagen mit einer eher „monovalenten" als multivalenten Darstellung der gefalteten Antikörperfragmente führt. Dies kann bei der Unterscheidung zwischen der Affinität und der Avidität (mit multivalenter Darstellung) der Antikörper, die auf dem Phagen dargestellt werden, nützlich sein. Die große Mehrheit der Phagen stellt jedoch nur die Helferphagenhüllproteine dar, was zu einer „Hintergrund"-Bindung an das Antigen führt. In diesem Fall ist es wünschenswert, nach Phagen zu selektieren, die gefaltete Antikörper darstellen und solche auszuschließen, die das nicht tun.
Außerdem beruhen alle die Systeme, die derzeit in Verwendung sind, auf einer Bindungsaktivität in dem Polypeptid, das ausgewählt werden soll, um die Isolierung der gewünschten Darstellungskörper von denen, die nicht für Polypeptide kodieren, die eine gewünschte Eigenschaft aufweisen, durchzuführen. Dies führt zu einer Begrenzung verfügbarer Displaysysteme auf die Auswahl gefalteter Polypeptide, welche eine bekannte Bindungsaktivität aufweisen. Es wäre wünschenswert, ein Mittel für die Auswahl von dargestellten Proteinen oder Polypeptiden zu haben, das unabhängig von deren Bindungsaktivität ist.
Zum Beispiel besteht ein beachtliches Interesse an der Erzeugung gefalteter Proteine de novo. Versuche sind gemacht worden, um Proteine de novo durch Zusammensetzung vordefinierter Elemente der Sekundärstruktur und ebenfalls aus Zufallssequenzen zu entwerfen (für einen Review [5]). In einigen Fällen konnte von den gewünschten Proteinen gezeigt werden, dass sie Elemente der Sekundärstruktur behalten, aber dass ihnen die stabilen Tertiärwechselwirkungen fehlen, die für die Faltung nativer Proteine charakteristisch sind, was das Vorhandensein von Molten Globules (siehe [6] und Referenzen darin) nahelegt. Erfolgreicher war die Herstellung nativ-ähnlicher Proteine, basierend auf einem vor-bestehenden Rückgrat [7, 8]. In diesen Fällen werden die Bindungsaktivitäten der de novo entworfenen Proteine unbekannt sein. In diesem Fall ist es wünschenswert, nach Phagen zu selektieren, die die gefalteten Proteine darstellen, und solche auszuschließen, die das nicht tun.
Obwohl Versuche unternommen worden sind, auf gefaltete Proteine aufgrund ihrer Fähigkeit abbauende Enzyme in Bakterien zu überleben zu screenen [16–18], ermöglichen solche Verfahren keine Auswahl, wenn das bakterielle Wachstum oder Überleben nicht von der Funktion des gefalteten Proteins abhängt. Somit sind diese Systeme nur auf eine kleine Minderheit von Polypeptiden anwendbar, die jemand aufgrund ihrer Fähigkeit, sich zu falten, auszuwählen wünschen könnte.
Es konnte zuvor gezeigt werden, dass die Einfügung (Insertion) einer Peptidsequenz zwischen einer proteolytisch stabilen Markierungsstelle, die an das kleine Phagenhüllprotein p3 fusioniert ist, und dem p3-Protein selbst, gefolgt von einer Proteolyse ein Mittel bereitstellt, um nach Phagen zu selektieren, die Peptidsequenzen enthalten, die für Proteolyse anfällig sind [19, US-Patent 5,780,279 ]. In diesen Experimenten werden Phagen an ein Affinitätsharz gebunden, das eine N-terminale, proteolytisch stabile Markierungsstelle auf dem Phagen bindet. Wenn die gebundenen Phagen einer Proteolyse und Eluierung unterzogen werden, werden nur Phagen mit spaltbaren Sequenzen eluiert. Dieses Verfahren wird verwendet, um in einem Repertoire, das auf einem Phagen dargestellt wird, Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die als Substrate für Proteasen geeignet sind. Die eingefügten Sequenzen sind kurz und wären nicht zur unabhängigen Faltung in der Lage. Außerdem selektiert das System spezifisch eher nach eluierten Phagen als gebundenen Phagen; mit anderen Worten, es ist spezifisch konfiguriert, um eher gespaltene als ungespaltene Phagen zu isolieren.
Die WO 92/156479 (Protein engineering corporation) betrifft ein Verfahren des Phagendisplays, bei dem Stellen-gerichtete spaltbare Linker (Verknüpfer) in die Phagen eingebaut werden können, z. B. als Teil eines chimären Hüllproteins, wie beispielsweise das Gen III, um in der Lage zu sein, das Problem der irreversiblen Bindung an das Zielmaterial (Targetmaterial) zu überwinden. Eine Anhydro-Trypsin Modifikation, um die spezifische Bindung des Trypsins aber nicht die Proteaseaktivität zu erhalten, wurde verwendet, um richtig gefaltete funktionale Proteine auf der Oberfläche des MK-BPTI-Phagen zu erkennen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung verwertet die Anwendung der Peptidspaltung, um unerwünschte Viren auszuschließen.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung daher ein Verfahren wie Anspruch 1 bereit, für die Auswahl eines richtig gefalteten Fusionspolypeptids, Schritte umfassend bei denen man:

(a) eine Vielzahl von Virionen bereit stellt, die ein Repertoire von Fusionspolypeptiden kodieren und darstellen, wobei die Fusionspolypeptide ein heterologes Polypeptid umfassen, das in die Sequenz eines viralen Hüllprotein-Polypeptids eingefügt ist, wobei eine Proteasestelle innerhalb des Fusionspolypeptids lokalisiert ist, und zwar so, dass die Stelle in richtig gefalteten Fusionspolypeptiden vor einer Proteasespaltung geschützt ist und in Fusionspolypeptiden, die nicht richtig gefaltet sind, nicht vor einer Spaltung geschützt ist, und wobei das Repertoire zumindest teilweise ungefaltete und gefaltete Mitglieder umfasst;
(b) die Virionen einer Protease aussetzt, wobei Virionen, die richtig gefaltete Fusionspolypeptide darstellen, resistent gegen die Spaltung durch die Protease sind; und solche, die richtig gefaltete Fusionspolypeptide nicht darstellen, nicht resistent gegen die Spaltung durch die Protease sind;
(c) die Virionen vermehrt, die intakte Fusionsproteine umfassen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Virus durch Spaltung nicht-resistenter Virionen unter Verwendung einer Protease ausgewählt werden. Wie hier verwendet, bezieht sich „Virus" auf ein infektiöses Inokulum von Virionen, welche Spaltungsstellen einbauen, wahlweise als Teil eines heterologen Polypeptids, das von dem viralen Genom kodiert wird. Somit kann sich „Virus" auf eine Vielzahl von Virionen beziehen, so dass es ein Repertoire von Polypeptiden kodieren kann; alternativ kann es, falls es der Zusammenhang erfordert, verwendet werden, um ein einzelnes Virion zu bezeichnen. Der Ausdruck „Virus" schließt jedes geeignete Virus ein, das eine Spaltungsstelle einbauen kann, entweder natürlich oder durch Manipulation. Ein bevorzugtes Virus für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein Bakteriophage, vorzugsweise ein filamentöser Bakteriophage.
Der Ausdruck „Polypeptid" wird allgemein verwendet, um Moleküle zu bezeichnen, die aus einer Vielzahl von Aminosäuren zusammengebaut sind, wobei die Aminosäuren beispielsweise durch Peptidbindungen kovalent miteinander verbunden sind. „Fusions"-Polypeptide sind im Wesentlichen Polypeptide, die in virale Hüllproteine eingebaut sind, so dass eine Fusion zwischen dem viralen Hüllprotein und dem in Frage stehenden Polypeptid erzeugt wird. Die Fusion kann das Polypeptid in das virale Hüllprotein einbauen, vorteilhafterweise zwischen Domänen davon, oder kann es an einem Ende platzieren, um eine terminale Fusion zu erzeugen. Das Polypeptid wird als „heterologes" Polypeptid bezeichnet, um zu betonen, dass es heterolog zu dem viralen Hüllprotein ist, in das es eingefügt wurde. Es ist jedoch auch möglich, dass es von einem anderen Polypeptid des Virus abgeleitet ist.
In einer Bedeutung wird Polypeptid hier austauschbar mit „Protein" verwendet, so dass kein Unterschied der Struktur oder Größe impliziert ist. Im Wesentlichen kann jedes Polypeptid durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden, einschließlich struktureller Polypeptide, Polypeptide, die enzymatische Aktivität haben, und Polypeptide, die Bindungsaktivität haben, einschließlich Antikörper und Antikörperfragmente. Spaltungsstellen können in den Polypeptiden vorhanden sein, und sie können natürlich vorkommend sein oder in das Polypeptid oder ein Linkerpeptid, das daran angefügt ist, eingebaut sein. „Polypeptid" kann sich ebenfalls auf eingefügte Polypeptide beziehen, die im Wesentlichen nicht-faltende Polypeptide sind, und dazu dienen, eine spaltbare Stelle zu kodieren und diese Stelle in das Hüllprotein eines Virus einzufügen. Eingefügte Polypeptide können die Form von N- oder C-terminalen Fusionen haben, oder können Teil des Hüllproteins selbst sein.
Eine „spaltbare Stelle" ist eine Stelle, die zur Spaltung in der Lage ist, wenn sie einem spaltenden Agens ausgesetzt wird. In der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Proteasespaltungsstellen ausgenutzt, die in der Lage sind, mit Proteasen gespalten zu werden. Proteasespaltungsstellen können Teil eines Polypeptids gemäß der Erfindung sein, oder darin eingebaut sein; alternativ kann sie unabhängig in das Hüllprotein des Virus eingebaut werden. Ein Merkmal der spaltbaren Stelle ist, dass sie entweder in dem Virus nicht vorkommt, außer an der Stelle ihrer spezifischen Einfügung gemäß der vorliegenden Erfindung oder andererseits für eine Spaltung unzugänglich ist, oder nur in viralen Proteinen vorhanden ist, die nach der Virionzusammensetzung nicht erforderlich sind, um eine Infektion zu vermitteln.
In Übereinstimmung mit der Erfindung kann die spaltbare Stelle in jeder geeigneten Position in dem Virus vorhanden sein oder dort eingebaut werden. Vorzugsweise ist sie entweder in dem Hüllprotein selbst oder dem heterologen Polypeptid, das einen Teil des Fusionspolypeptids bildet, eingebaut oder vorhanden.
Eine Bindung kann vorhanden sein, die durch Seitenketten einer oder mehrerer Aminosäuren gebildet wird, wie beispielsweise eine Disulfidbindung. Disulfidbindungen sind durch reduzierende Agenzien wie beispielsweise DTT oder β-Mercaptoethanol spaltbar.
Wenn ein Virus eine Disulfidbindung enthält, wird eine Spaltung einer Protease-spaltbaren Stelle, die zwischen den zwei Cysteinresten lokalisiert ist, welche die Bindung durch ihre Seitenketten bilden, nicht zu einem Verlust der viralen Infektiösität führen, da die Disulfidbindung in der Lage ist, die kovalente Verknüpfung der viralen Polypeptide zu erhalten.
Für den Fall, dass die Auswahl eines Disulfid-enthaltenden Polypeptids nicht gewünscht ist, werden die Viren vorteilhafterweise vor oder nach der Proteolyse mit einem reduzierenden Agens behandelt, um einen Hintergrund zu vermeiden, der die Folge von Viren ist, die durch die Protease gespalten wurden, aber durch Disulfide zusammengehalten wurden.
Das Fusionspolypeptid kann ein oder mehrere heterologe Polypeptide umfassen. Im Fall der terminalen Fusion kann ein solches heterologes Polypeptid als Proteinmarkierung dienen, was es erlaubt, Phagen zu identifizieren, die das Fusionspolypeptid exprimieren. Die spaltbare Stelle kann in solch einem Fall in oder in der Nähe der Markierung positioniert sein, so dass die Spaltung der spaltbaren Stelle die Markierung freisetzt.
Eine Markierung ist jede geeignete Einheit, die in der Lage ist, an einen Liganden zu binden, der verwendet werden kann, einen Virus durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu isolieren. Dementsprechend ist die Markierung gegenüber der Protease resistent, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird. Beispiele für Markierung/Ligandenpaare schließen Barnase/Barstar, Avidin/Biotin, Antikörper oder Antikörperfragmente und Liganden, chelatbildende Gruppen und Chelate, beispielsweise Metalle und Ähnliches ein.
In allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die in größerer Ausführlichkeit unten beschrieben werden, wird nach den ungespaltenen Polypeptiden selektiert; das gespaltene Material wird in dem Selektionsschritt verworfen.
Vorzugsweise kodiert das erfindungsgemäße Virus ein Repertoire von heterologen Polypeptiden. Ein Repertoire ist eine Sammlung von Mitgliedern, vorzugsweise Polypeptiden, die sich leicht voneinander in einer zufälligen oder teilweise zufällig angeordneten Art unterscheiden. Ein Repertoire von Polypeptiden ist bevorzugt eine Sammlung von abweichenden Polypeptiden, die bevorzugt zufällige oder teilweise zufällig angeordnete Mutationen enthalten. Wie hier verwendet besteht ein Repertoire bevorzugt aus 10⁴ Mitgliedern oder mehr. Ein Repertoire umfasst vorteilhafterweise eine sehr große Anzahl von Mitgliedern, typischerweise zwischen 10⁸ und 10¹¹ und möglicherweise 10¹⁴ oder höher.
Das heterologe Polypeptid oder Repertoire solcher Polypeptide wird vorteilhafterweise auf der Oberfläche des Virus dargestellt, das dafür kodiert und zwar aufgrund dessen, dass es in ein Hüllprotein eingebaut ist, oder auf der Oberfläche von Zellen, die durch das Virus infiziert sind. Wo das Virus ein Bakteriophage ist, kann das Protein ebenfalls auf der Oberfläche der Bakterien dargestellt werden, die mit dem Bakteriophagen infiziert sind.
Die spaltbare Stelle ist vorteilhafterweise in dem heterologen Polypeptid oder benachbart dazu lokalisiert, so dass es durch die Faltung des heterologen Polypeptids geschützt werden kann und somit die Auswahl nach heterologen Polypeptiden erlaubt, die in der Lage sind, korrekt zu falten. Alternativ kann die spaltbare Stelle jedoch auch distal zu dem heterologen Polypeptid lokalisiert sein; in solchen Ausführungsformen kann die spaltbare Stelle dazu dienen, die Reduktion des Hintergrundes in Phagendisplaytechniken zu ermöglichen. Beispielsweise ermöglicht die Einfügung der spaltbaren Stelle in einen Helferphagen, der mit einem Phagemid verwendet wird, der für ein Repertoire von Polypeptiden kodiert, dem Helferphagen, durch Spaltung vor der Infektion der Wirtszellen entfernt zu werden, wodurch der Hintergrund als Folge von „leeren" Phagen drastisch reduziert wird. Vorteilhafterweise ist die spaltbare Stelle daher in das Virushüllprotein eingebaut.
Wie es hier verwendet wird, ist ein Phagemid ein Plasmidklonierungsvektor, der virale Replikationssequenzen umfasst, aber dem mindestens eine virale Funktion fehlt. Dies bedeutet, dass während Phagemide durch herkömmliche Nukleinsäuretransferverfahren in Wirtszellen eingebracht werden können und in den Wirtszellen in einem episomalen Zustand existieren, sie nicht in der Lage sind, in Virionen zusammengebaut zu werden und somit einen viralen Zyklus der Infektion zu vollenden. Helferphagen werden verwendet, um die fehlenden viralen Funktionen zu liefern und dem Phagemid zu erlauben, dass es in Virionen verpackt wird. In Übereinstimmung mit der Erfindung, kann ein Phagemid für Hüllproteinfusionen mit heterologen Polypeptiden kodieren, die eine spaltbare Stelle beinhalten.
Helferphagen stellen die virale Funktion bereit, die in dem Phagemid fehlt, um die Verpackung des Phagemid in Virionen zu erlauben. Helferphagen können modifiziert werden, um sie spaltbar durch eine Protease zu machen. In einem Aspekt können Helferphagen ein Hüllprotein, das eine spaltbare Stelle hat, einbauen, die, wenn sie in dem „ergänzten" ("rescued") vermehrten Phagen gespalten wird, das von dem Helferphagen abgeleitete Hüllprotein so ändern, dass es nicht in der Lage ist, eine Infektion zu vermitteln.
Wie aus dem Vorgenannten ersichtlich sein wird, werden in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Viren ausgewählt, die gegenüber der Spaltung resistent sind. Vorteilhafterweise werden die resistenten Virionen durch Infektion geeigneter Wirtszellen wie beispielsweise Bakterienzellen ausgewählt. Gespaltene Virionen sind nicht infektiös. Alternativ ist die Bindung von Virionen an einen Liganden, z. B. über eine Markierung, abhängig von dem Schutz einer spaltbaren Stelle in dem Virus, so dass die Viren, die gespalten werden, durch die Liganden/Markierungsbindung nicht isoliert werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann in einer Anzahl von Wegen gemäß dem bestimmungsgemäßen Verfahren, auf das gewünscht wird, die grundlegende Methodik anzuwenden, ausgestaltet werden. Selektive Spaltung von Virionen wird verwendet, um den Hintergrund in Phagendisplaytechniken zu reduzieren. Durch Spaltung und Entfernung von Phagen, welche entweder ein heterologes Polypeptid nicht enthalten, oder ein heterologes Polypeptid exprimieren, das nicht zur richtigen Faltung in der Lage ist, kann die Sensitivität eines Phagendisplayprozesses wesentlich gesteigert werden. Wie im experimentellen Abschnitt unten gezeigt wird, kann die Verwendung der Methodik des erfindungsgemäßen Phagendisplays verwendet werden, um Polypeptide auszuwählen, die einer Selektion durch Displaytechniken gemäß Verfahren aus dem Stand der Technik nicht zugänglich sind.
In einer ersten Ausgestaltung kann die Spaltung einer spaltbaren Stelle in einem Virionhüllprotein ausgenutzt werden, um den Hintergrund zu reduzieren, der solchen Phagen zuschreibbar ist, die keine heterologen Polypeptide darstellen oder Phagen, die heterologe Polypeptide darstellen, die unfähig zur richtigen Faltung sind. Die Spaltung von dargestellten Polypeptiden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung führt zu einer Beeinträchtigung der Viren, die Infektion von Wirtszellen zu erreichen. Somit ist es durch Vermehren von Viren, die einer Protease ausgesetzt worden sind, möglich, das Virus für Virionen anzureichern, welche dargestellte Polypeptide umfassen, die gegenüber einer Spaltung resistent sind. Wie es hier verwendet wird, bedeutet „beeinträchtigen" zu reduzieren; es schließt somit eine teilweise und vollständige Verhinderung der Infektion von Wirtszellen durch das betroffene Virus ein.
Das Hüllprotein wird als die Stelle für die Spaltung auf der Grundlage dessen ausgewählt, dass es für Spaltungsagenzien in den Wirtszellen, die das Virus enthalten oder auf der Oberfläche des Virus selbst greifbar ist. Somit können in einer bevorzugten Ausführungsform Viruspräparationen mit einer Protease behandelt werden, um Virionen, die spaltbare Hüllproteine aufweisen, dahingehend unfähig zu machen, eine Infektion der Wirtszellen zu vermitteln. Alternativ können Zellen, die mit dem Virus infiziert sind, mit einer Protease behandelt werden, die aktiv innerhalb der Zelle ist, was die Verpackung der Viren verhindern wird, die ein spaltbares Hüllprotein umfassen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Bezugnahme auf eine Auswahl als eine Bezugnahme auf ein Screening verstanden werden, da die gleichen Prozesse verwendet werden können, um Phagen zu screenen, wie für den Fachmann ersichtlich sein wird.
Proteasestellen können ein natürlicher Teil des Hüllproteins sein, aber bevorzugt werden sie dort eingebaut. Proteasespaltungsstellen können in Polypeptiden auftreten oder als ein integraler Bestandteil ihrer Sequenz eingebaut werden. Typischerweise können Proteasespaltungsstellen als Ausdruck von. Aminosäuresequenzen definiert werden, die der Spaltung durch eine Protease zugänglich sind. Zum Beispiel umfasst die Erfindung die Verwendung von Proteasespaltungsstellen, die durch eine oder mehrere der Proteasen Trypsin (spaltet am Lysin, Arginin), Chymotrypsin (Phe, Trp, Tyr, Leu), Thermolysin (kleine aliphatische Reste), Subtilisin (kleine aliphatische Reste), Glu-C (Glu), Faktor Xa (Ile/Leu-Glu-Gly-Arg), Arg-C (Arg) und Thrombin gespalten werden.
Proteasespaltungsstellen können durch Erzeugung einer Fusion zwischen dem Hüllprotein und einem weiteren Polypeptid in das Hüllprotein eines Virus eingebaut werden, wobei das weitere Polypeptid die Spaltungsstelle enthält. Das weitere Polypeptid sollte an eine Position in das virale Hüllprotein eingefügt werden, so dass es den Zusammenbau eines funktionalen viralen Capsids und eine nachfolgende Infektion erlaubt, aber wenn es gespalten wird, zu einer Verhinderung der Infektiösität führt.
Wenn die Proteasespaltungsstelle, die in das Hüllprotein eingebaut wurde, ungespalten bleibt, ist das Virus daher zum Zusammenbau in funktionale Virionen in der Lage und behält die Fähigkeit, Wirtszellen zu infizieren. Wenn die Proteasespaltungsstelle gespalten wird, wird die Struktur des viralen Hüllproteins jedoch beeinträchtigt und das Virus wird zumindest einen Teil seiner Fähigkeit, Wirtszellen zu infizieren, verlieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Virus für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ein Bakteriophage, vorzugsweise ein filamentöser Bakteriophage. Ein filamentöser Bakteriophage wird in Phagendisplaytechniken häufig für die Selektion von Peptiden aus Phagenbibliotheken, die ein großes Repertoire davon kodieren, verwendet. Herkömmlicherweise, wird das Repertoire der Polypeptide in das p3-Protein des filamentösen Phagen eingefügt, aber jede geeignete andere Stelle kann ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Im Fall des p3-Proteins des filamentösen Bakteriophagen besteht das Protein aus drei Domänen. Die N-terminale D1 ist bei der Bindung an den tolA-Rezeptor beteiligt, D2 bei der Bindung an den F-Pilus (unter Vermittlung der Infektion) und D3 bei der Verankerung des Proteins an den Phagenpartikel. Peptide und Proteine können an den Domänengrenzen eingefügt werden, ohne die Infektiösität aufzuheben [21, 22], aber das Vorhandensein aller Domänen ist für die Phageninfektiösität entscheidend [23]. Die Bakteriophagen sind gegenüber einer Proteolyse resistent (was ihre Verwendung als „Substrat"-Phage erlaubt [19]), aber die Einfügung von Polypeptiden, die Proteasespaltungsstellen enthalten in p3, beispielsweise an den Verbindungen zwischen den Domänen, führt zum Verlust der Infektiösität des Phagen nach der Proteolyse.
Die Proteasespaltungsstellen können in heterologe Polypeptide eingebaut werden. Wie oben beschrieben, können heterologe Polypeptide in Form eines Repertoires in einer Phagenbibliothek kodiert werden. Da gefaltete Polypeptide oder Proteine häufig gegenüber einer Proteolyse resistent sind und ungefaltete Proteine sensitiv sind, erfordert die Spaltung, dass die Polypeptidkette bindet und sich an die spezifische Stereochemie der aktiven Stelle der Protease anpasst, und daher flexibel, zugänglich und zur lokalen Entfaltung in der Lage ist [14, 15]. Die Klonierung eines Polypeptids, das Proteasespaltungsstellen an den Domänverbindungen des p3 umfasst, gefolgt von Proteolyse, stellt ein Mittel der Selektion von Phagen bereit, die Proteine enthalten, die gegenüber einer Proteolyse resistent und gefaltet sind.
Im Falle der Phagendisplayrepertoires (wobei das Polypeptid, das ausgewählt werden soll, am N-Terminus des p3 kloniert ist), die auf Phagemidvektoren kodiert sind, stellt die Verwendung von Helferphagen, die ein Polypeptid umfassen, das Proteasespaltungsstellen an den Domängrenzen umfasst, gefolgt von Proteolyse ein Mittel für die Selektion nach Phagen dar, die das Fusionsprotein darstellen, und zwar durch Entfernung des Helferphagens, nachdem die „Hilfe" geleistet worden ist.
Die Verwendung des Protease-spaltbaren Helfers, gefolgt von der Proteasespaltung selektiert nach Phagen, die das Fusionsprotein enthalten (und nach einem guten Display). Da viele Phagen in einem Repertoire die Fusionsproteine nicht darstellen [26] und diese zu einer nicht-spezifischen Bindung des Phagen beitragen, sollte dies ebenfalls die Auswahleffizienzen verbessern. Wenn die Techniken des Standes der Technik verwendet werden, umfassen möglicherweise nur zwischen 0,1 bis 1 aller Phagenpartikel in einer Phagenbibliothek ein Gen-3-Protein, das aus dem Phagemid entsteht. Daher wird die Mehrheit (99 bis 99,9%) der Phagenpartikel, die nicht-spezifisch an das feste Substrat gebunden haben, das bei der Selektion verwendet wurde, p3 aus dem Helferphagen umfassen (unabhängig von dem Genom, das von dem Phagenpartikel getragen wird, welches am wahrscheinlichsten eine Phagemid-DNA sein wird), wobei diese Partikel durch die proteolytische Spaltung nicht-infektiös werden.
Die Erfindung umfasst während der Spaltung der spaltbaren Stelle wahlweise die Verwendung von Bedingungen oder Agenzien, die die Labilität der Spaltungsstelle in Anwesenheit der Protease modulieren. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Spaltung zu steigern, z. B. um nur nach Polypeptiden zu selektieren, die in solch einer Art falten, dass die spaltbare Stelle vom Zugang durch die Protease dicht abgeschirmt wird, oder die Spaltung zu verringern, z. B. um stabile Mutanten aus einem Repertoire von Polypeptiden auszuwählen, das unter Spaltungsbedingungen für gewöhnlich relativ labil ist.
Zum Beispiel kann die Modulierung der Labilität der Spaltungsstelle durch die Verwendung von Agenzien erreicht werden, welche die Labilität steigern oder verringern. Somit kann ein Proteindenaturierungsmittel bei einer geeigneten Konzentration eingeschlossen sein, um ein Polypeptid zu destabilisieren und es labiler zu machen. Alternativ kann ein Ligand für ein Polypeptid umfasst sein. Der Ligand kann die gefaltete Struktur des Polypeptids stabilisieren, und es weniger empfindlich für die Spaltung machen. Alternativ kann der Ligand die gefaltete Struktur des Polypeptids destabilisieren, z. B. durch die Bevorzugung der Annahme einer alternativen Konfiguration. Dies kann das Polypeptid empfänglicher für die Protease und damit labiler machen.
Die Bedingungen des Spaltungsprozesses können geändert werden, beispielsweise durch die Manipulierung des pH oder der Temperatur, bei denen die Spaltung durchgeführt wird, um ähnliche Effekte zu erreichen. So kann die Abweichung des pHs vom Optimum für das Polypeptid, das die Spaltungsstelle umfasst, die Stelle dahingehend beeinflussen, dass sie zugänglicher für die Protease wird. Ebenso kann die Anhebung (oder Erniedrigung) der Temperatur der Bedingungen, unter denen das Polypeptid gespalten wird, das Polypeptid mehr oder weniger zugänglich für die Spaltung machen.
In einigen Beispielen können nicht-kovalente Wechselwirkungen dafür verantwortlich sein, dass die Peptide ihre Struktur behalten und Hüllproteine funktionsfähig bleiben, selbst nach einer erfolgreichen Spaltung der spaltbaren Stelle. Die Verwendung von denaturierenden Mitteln, Temperaturvariationen und anderen möglichen destabilisierenden Techniken kann ebenfalls verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass ein gespaltenes Polypeptid seine Struktur behält.
Eine proteolytische Selektion nach Proteinfaltung kann in einer Anzahl von Gebieten eingesetzt werden, da es ermöglicht, eine sehr viel größere Anzahl von Proteinen als mit einem herkömmlichen Screening zu verarbeiten. Zum Beispiel ermöglicht es die Isolierung von mutierten Proteinen mit gesteigerter Stabilität [1], z. B. aus kombinatorischen Bibliotheken von Mutanten, in denen Reste an verschiedenen Stellen gleichzeitig variiert werden [39, 40] oder aus zufälligen Mutanten oder durch Rekombination [3, 4]. Es ermöglicht ebenfalls die Isolierung neuer Proteine und Architekturen aus großen Repertoires von Sequenzen [16–18, 41]; und die Verbesserung bei der Faltungsstabilität über mehrere Mutationsrunden und ansteigend stringenter Selektion, ganz wie die Affinitätsreifung von Antikörpern.
Eine zweite Konfiguration der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Markierungen, um die Isolierung richtig gefalteter heterologer Polypeptide zu ermöglichen, Ausnutzung der Fähigkeit der richtig gefalteten Polypeptide, eine spaltbare Stelle in der Nähe einer verknüpften Markierung zu schützen.
Die Einfügung eines Polypeptids zwischen die stabile Markierung, die an den N-Terminus des viralen Hüllproteins fusioniert ist, und dem Hüllprotein selbst, gefolgt von der Spaltung stellt ein Mittel zur Selektion nach einem Virus bereit, das Proteine enthält, die gegenüber der Proteolyse resistent und gefaltet sind. Somit werden nur Virionen, deren eingefügtes Polypeptid nicht abgebaut ist, die Markierungsfusion als Teil ihrer Hülle behalten und nur diese Virionen können daher durch eine Affinitätsaufreinigung unter Verwendung dieser Markierung eingefangen werden. Nach der Flution der durch Affinität eingefangenen Phasen von dem Liganden können diese Phagen vermehrt und weiteren Runden derselben Selektionsprozedur unterzogen werden.
Alternativ können Virionen vor der Spaltung an eine Affinitätsmatrix gebunden werden, die einen Liganden für die Markierung umfasst. Das spaltende Agens kann nachfolgend zugegeben werden und nur resistente Phagen werden auf der Matrix verbleiben. Diese können dann wie erforderlich eluiert werden.
Geeignete Matrizen umfassen Säulen, Beads und andere Oberflächen, an die ein Ligand für die Markierung gebunden ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Bezugnahme auf eine Selektion als eine Bezugnahme auf ein Screening angesehen werden, da dieselben Prozesse verwendet werden können, um Phagen zu screenen, wie für die Fachleute ersichtlich sein wird.
Proteasestellen sind im Wesentlichen wie für die vorige Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung beschrieben und sind vorteilhafterweise Protease-spaltbare Stellen.
Die Spaltung erfordert, dass die Polypeptidkette bindet und sich an die spezifische Stereochemie der Protease-aktiven Stelle anpasst, und somit flexibel, zugänglich und zur lokalen Entfaltung in der Lage ist [14, 15]. Gefaltete Polypeptide oder Proteine sind häufig gegenüber der Proteolyse resistent, als Folge einer relativen Unflexibilität in ihrer Struktur, während nicht-gefaltete Proteine sensitiv bleiben.
Wie oben erwähnt wird, kann die mögliche Auswahl von Polypeptiden aus einem Repertoire, welche als Folge von Variation oder Mutation keine Erkennungssequenz für irgendeine Protease, die in diesem Verfahren verwendet wird, enthalten, auf zwei Arten umgangen werden. Zum Beispiel würde die Verwendung eines Cocktails von Proteasen mit sehr verschiedenen Erkennungssequenzen sicherstellen, dass alle Polypeptide spaltbar sein sollten, falls sie nicht durch ihren gefalteten Zustand geschützt werden. Alternativ könnte ein Phagenrepertoire von Polypeptiden, das ausgewählt werden soll, teilweise denaturiert sein, so dass sich das eingefügte Polypeptid entfaltet, aber der Phage und die N-terminale Markierung intakt bleibt. Der proteolytische Verdau gefolgt von Affinitätsaufreinigung würde alle Phagen aus dem Repertoire entfernen, die der Proteolyse als Folge des Fehlens der Proteaseerkennungssequenzen in dem Polypeptid entgangen sind. Phagen, die nicht an das Harz gebunden sind, enthalten nur Phagen, die die Proteaseerkennungssequenz in dem dargestellten Polypeptid enthalten und die der Proteolyse unter nicht-denaturierenden Bedingungen entgehen oder nicht entgehen können. Somit würden diese einer proteolytischen Selektion, basierend auf dem Schutz durch den Faltungszustand des dargestellten Polypeptids, unterzogen werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben werden und zwar nur für die Zwecke der Darstellung.
Beispiel 1. Resistenz des filamentösen Phagen gegenüber Proteolyse.
Materialien und Methoden für die Beispiele 1 bis 6 sind am Ende von Beispiel 6 angehängt.
Der Phage wird in einem Bereich von denaturierenden Bedingungen in vitro inkubiert und dann direkt vor der Infektion der Bakterien in native Bedingungen zurückgebracht. Die Inkubation des Phagen in 10 M Harnstoff oder extremen pH-Werten (so niedrig wie pH 2 und so hoch wie pH 12) und Temperatur (so hoch wie 60°C) führt nicht zu einem großen Verlust der Infektiösität (Tabelle 1). Dies zeigt, dass der Phage entweder gegenüber den denaturierenden Bedingungen resistent ist, oder dass er, wenn er sich entfaltet, in der Lage ist, sofort zurückzufalten. Jedoch wird mit GndHCl ein 5-facher Verlust der Phageninfektiösität über 5 M beobachtet und ein weiterer 5-facher Verlust bei 8 M (Tabelle 1).
Der Phage wird dann unter nativen Bedingungen mit einem Bereich von Proteasen (Trypsin, Faktor Xa, IgA-Protease, Asp-N, Chymotrypsin, Arg-C, Glu-C, Thrombin, Thermolysin, Subtilisin) mit verschiedenen Spezifitäten inkubiert. Mit Ausnahme für Subtilisin, von dem berichtet wurde, dass es das p3-Protein spaltet [24], gibt es keinen Verlust der Infektiösität. Wenn der Phage unter denaturierenden Bedingungen in Anwesenheit von Proteasen wie beispielsweise Trypsin in 3,5 M Harnstoff (oder > 47°C) inkubiert wird, geht die Infektiösität verloren. Dies zeigt, dass unter denaturierenden Bedingungen die Entfaltung des Phagenhüllproteins ausreichend ist, um die Stellen für die Proteolyse zugänglich zu machen.
Beispiel 2. Herstellung von Phagen mit Proteasespaltungsstellen.
Eine Sequenz (PAGLSEGSTIEGRGAHE), die mehrere proteolytische Stellen umfasst, wird in die flexible Glycin-reiche Region zwischen den D2- und D3-Domänen des Phagen p3 eingefügt. Die Inkubation des Phagen (fd-K108) unter nativen Bedingungen mit Trypsin, Thermolysin oder Subtilisin führt nun zu einem fast vollständigen Verlust der Infektiösität (von 10 auf < 10 TU/ml) und die Inkubation mit Glu-C und Chymotrypsin führt zu einem starken Verlust (von 10 auf 10⁴ TU/ml). Dies zeigt, dass diese Proteasen den neuen Linker spalten. Die Inkubation mit Faktor Xa, Arg-C oder Thrombin führte jedoch nicht zu einem Verlust der Infektiösität, trotz der Anwesenheit möglicher Spaltungsstellen für diese Enzyme. Höchstwahrscheinlich blockiert die Anwesenheit der D2- und D3-Domänen den Zugang oder die Spaltung für diese Enzyme im Fall des vorliegenden Polypeptids.
Beispiel 3. Herstellung eines Protease-spaltbaren Helferphagen und Phagemids.
Die Fusion von Proteinen an p3 sollte zu einer multivalenten Darstellung des Proteins auf dem Phagen führen. Wenn jedoch das Protein an p3 fusioniert wird, das von einem Phagemid kodiert wird (wie beispielsweise pHEN1 [25]) und die Bakterien, die den Phagemid enthalten mit einem Helferphagen (wie beispielsweise VCSM13) ergänzt werden, muss das Fusionsprotein für den Einbau in den Phagen mit dem Helfer p3 konkurrieren. Dies führt zu sogenannten „monomeren" Phagen, in denen normalerweise weniger als eine Kopie des Fusionsproteins an jeden Phagenpartikel angeheftet ist [26].
Von der Verwendung eines „monomeren" Phagen könnte erwartet werden, dass sie für die Auswahl von Hochaffinitätswechselwirkungen vorteilhaft ist. Des Weiteren sollten Fusionsproteine in einem „monomeren" Phagen, sensitiver für eine Proteolyse sein, da Interaktionen zwischen Multimeren des Fusionsproteins vermieden werden. Ein Nachteil ist jedoch, dass die Mehrzahl der infektiösen Phagen ein Protein. nicht darstellen; solche Phagen, die nicht spezifisch an eine feste Phase binden, werden bei jeder Runde des Phagenwachstums amplifiziert.
Protease-spaltbarer Helferphagen werden daher erzeugt, und zwar durch Einfügung der Proteasespaltungssequenzen zwischen die D2- und D3-Domänen, um den Helferphagen KM13 zu erzeugen.
Von KM13 ist gezeigt, dass er den Phagemid pHEN1 ergänzt. Des Weiteren ist gezeigt worden, dass Trypsin eine Hauptfraktion (über 50%) des p3 des ergänzten Phagen spaltet, wie durch Westernblot gezeigt und mit einem anti-D3 mAb (1) nachgewiesen wurde. Die Phageninfektiösität wird jedoch durch die Spaltung geändert; daher scheint es, dass nur ein Teil des p3 intakt sein muss, um eine bakterielle Infektion zu vermitteln.
Von KM13 ist ebenfalls gezeigt, dass es einen pHEN1-Phagemid ergänzt, der für ein Einzelkettenantikörperfragment kodiert [27]. Hier führte die Spaltung durch Trypsin zu einem 50-fachen Verlust der Phageninfektiösität (Daten nicht gezeigt), was übereinstimmend mit Hinweisen ist, dass nur eine kleine Fraktion des Phagen das Fusionsprotein exprimiert, wenn es mit dem Helferphagen ergänzt wird [26,28].
Ein Protease-spaltbarer Phagemid wird ebenfalls konstruiert. Der Phagemid kann mit KM13 oder VCSM13 ergänzt werden. Wie erwartet, wird die Infektiösität dieses Phagemids, der mit KM13 (aber nicht VCSM13) ergänzt wurde, durch Trypsin zerstört. Dieser Phagemidvektor ist anfällig für Deletionen in dem D2-D3-Linker; durch Änderung der Kodon-Usage in den Linkerregionen auf jeder Seite der Protease-spaltbaren Stelle und Verkürzung der Länge dieser Linkerregion wird ein stabilerer Vektor erzeugt (pK1; 2). In einem zweiten Vektor (pK2; 2) wird die Sequenz des Polylinkers so angeordnet, dass sie D3 aus dem Leseraster nimmt, um Religationen innerhalb des Polylinkers nicht infektiös zu machen.
Beispiel 4. Herstellung einer Phagenantikörperbibliothek unter Verwendung von Protease-spaltbaren Helferphagen.
Bakterien werden mit Phagemid-DNA, die für ein Repertoire von scFv-Fragmenten kodiert, die an den N-Terminus des p3 fusioniert sind, einer Elektroporation ausgesetzt und in flüssiger Kultur angezogen (2×TY, das Antibiotika enthält, um nach Bakterien zu selektieren, die Phagemid enthalten und Glucose, um die Expression des Gens 3. zu unterdrücken). In der mittleren log-Phase des bakteriellen Wachstums (OD600 = 0,5) wird der Helferphage KM13 zu den Bakterien zugegeben, um ein Verhältnis von Helferphage zu Bakterien von 20:1 zu erzeugen. Die Bakterien werden bei 37°C ohne Schütteln für 45 Minuten und dann mit Schütteln für 45 Minuten inkubiert. Die Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet und in frischem Medium, das 50 μm/ml Kanamycin und Antibiotika, ohne Glucose, enthält, resuspendiert, um nach dem Vorhandensein der Phagemid-DNA zu selektieren. Die Kultur wird über Nacht bei 30°C unter Schütteln angezogen.
Bakterien werden aus dem Phagen-enthaltenden Überstand durch Zentrifugation entfernt. Der Phage wird aus dem Überstand durch Zugabe von 1/5 des Volumens von 20% PEG/2,5 M NaCl präzipitiert. Nach 1 bis 2 Stunden bei 4°C wird der präzipitierte Phage durch Zentrifugation gesammelt. Der Phage wird in PBS resuspendiert (eine zweite PEG-Präzipitation ist optional) und kann bei der Auswahl verwendet werden.
Der Bibliothek der Phagen wird erlaubt, an das Antigen (immobilisiert an einem festen Träger wie beispielsweise einem Immunoröhrchen oder Lösung an markiertes (d. h. biotinyliertes) Antigen, das nach der Affinitätsbindung der Phagenantikörper immobilisiert werden kann) zu binden. Nicht-gebundener Phage wird durch ausgiebiges Waschen entfernt (die Stringenz des Waschens kann bezüglich der Zeit und zugegebenen Detergenzien variiert werden).
Phagenbibliotheken, die eine spaltbare Markierung umfassen, wie beispielsweise die c-myc-Markierung, die zwischen dem Antikörper und dem Gen 3 eingefügt ist, können durch Zugabe von Trypsin in Lösung mit einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/ml eluiert werden. (Phagenbibliotheken ohne eine spaltbare Sequenz zwischen dem Antikörper und Gen 3 können durch Zugabe von 100 mM Triethylamin eluiert werden. In diesem Fall wird die Lösung durch Zugabe von 1 M Tris-HCl pH 7,4 neutralisiert und nach 10 Minuten wird Trypsin zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 1 mg/ml zugegeben). Trypsin spaltet ebenfalls die Kopien des Gen 3 aus dem Helferphagen, während es das Gen 3 aus dem Phagemid intakt lässt. Somit wird nur der Phage infektiös sein, der eine Antikörperfusion getragen hat oder noch trägt.
Der Phage wird verwendet, um Bakterien in der mittleren log-Phase des Wachstums (OD600 = 0,5) zu infizieren, und die Bakterien werden dann auf Agarplatten ausplattiert, die Antibiotika zur Selektion nach Phagemid-DNA enthalten. Einzelne Klone wurden gepickt und der Phage wie oben präpariert. Der resultierende Phage wird in einem ELISA verwendet, um Phagenantikörper, die spezifisch an das interessierende Antigen binden, zu identifizieren.
Beispiel 5. Selektion nach Spaltung unter Verwendung von Barnase als ein Modell.
Barnase ist eine kleine RNAse von 110 Aminosäureresten, deren Faltung ausgiebig untersucht wurde (für einen Review [2]). Barnase enthält mehrere Stellen für eine Trypsinspaltung, obwohl das gefaltete Protein gegenüber einer Spaltung resistent ist (Daten nicht gezeigt). Phagen, die mit Barnase zwischen D2 und D3 kloniert wurden, sollten daher gegenüber einer Proteasespaltung resistent und zur Selektion in der Lage sein.
Da Barnase für Escherichia coli toxisch ist, wird eine Mutante A (His102 → Ala) in den Phagemid pK2 kloniert, die katalytisch inaktiv aber stabil ist [29, 30]. Eine Mutante B (His102 → Ala, Leu14 → Ala) wird ebenfalls kloniert, mit geringerer Stabilität; Leu14 ist in dem hydrophoben Kern verborgen und seine Mutation erzeugt eine große Höhle in dem Kern, die die Packung verschiedener struktureller Elemente beeinflusst [31]. Die Phagen (ergänzt mit KM13) binden an den Inhibitor Barstar durch ELISA (3) und stellen daher die Mutante Barnase in einer gefalteten Form dar.
Die Phagen werden in einem Temperaturbereich mit Trypsin inkubiert (4). Nach der Inkubation bei 10°C gibt es einen Abfall der Phageninfektiösität von 5- bis 10-fach für beide Mutanten, was nahelegt, dass (wie oben mit der Darstellung des scFv-Fragments) nur ein kleiner Teil der Phagen das Fusionsprotein darstellt. Es gibt keinen weiteren Verlust der Infektiösität bei Spaltung bis 30°C (für Mutante B) oder 37°C (für Mutante A). In beiden Fällen ist der Hauptübergang bei mindestens 10°C unterhalb des Erwarteten für die reversible thermische Entfaltung der Mutanten.
Die Phagen A und B werden in verschiedenen Verhältnissen gemischt und mit Trypsin bei 20°C inkubiert, wo beide Mutanten stabil gegenüber Spaltung sind oder bei 37°C wo nur A stabil ist. Nach der „proteolytischen Selektion werden die Phagen ausplattiert und durch PCR analysiert, was von einem Restriktionsverdau gefolgt wird, um die Mutanten zu unterscheiden. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wird die Mutante A mit einem Faktor von 1,6 × 10⁴ nach einer einzelnen Runde und mit 1,3 × 10⁶ nach zwei Runden der proteolytischen. Selektion bei 37°C angereichert. Bei 20°C kann keine Anreicherung nachgewiesen werden.
Beispiel 6: Selektion nach Faltung unter Verwendung von Villin als ein Modell
Die 35 Aminosäuresubdomäne der Headpiecedomäne des f-Actinbündelnden Proteins Villin [32] ist sehr viel kleiner als Barnase. Sie bildet trotzdem eine stabile Faltung bei Raumtemperatur und ist gegenüber einer Proteolyse resistent; des Weiteren beruht ihre Stabilität nicht auf Disulfidbindung oder bindenden Liganden [33]. Die Villin-Subdomäne (die mehrere potentielle Trypsin-Spaltungsstellen enthält) wird zwischen den D2- und D3-Domänen des Phagen kloniert und mit Trypsin bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Das Profil des Verlusts der Infektiösität ist nicht so scharf wie mit Barnase, mit dem Hauptübergang unter 35°C, deutlich unterhalb der thermalen Entfaltung von Villin (70°C) [32, 33]. Die Phagen, die Villin darstellen, werden mit Phagen gemischt, die unter Verwendung des Phagemids pK1 und des Helferphagen KM13 hergestellt wurden, und mit Trypsin inkubiert. Nach einer einzelnen Runde der proteolytischen Selektion sind die Villin-Fusionsphagen 8,7 × 10³-fach angereichert (Tabelle 3).
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Beispiele 1 und 2, dass die Infektiösität des Phagen gegenüber der Temperatur, pH, Harnstoff und GndHCl und gegenüber mehreren Proteasen relativ resistent ist, aber wenn ein flexibler Linker, der Proteasespaltungsstellen umfasst, zwischen den Domänen D2 und D3 des Phagenhüllproteins p3 eingefügt wird, wird der Phage gegenüber der Spaltung sensitiv. Im Gegensatz dazu, wie in den Beispielen 5 und 6 gezeigt, ist der Phage gegen eine Spaltung resistent, wenn die Proteasespaltungsstellen eine gefaltete Proteindomäne wie beispielsweise Barnase oder Villin umfassen. Dies erlaubt die proteolytische Selektion nach Proteinfaltung, mit Anreicherungsfaktoren von > 10⁴-fach für eine einzelne Runde der Selektion. Die Selektion ist sowohl für Barnase, eine durchschnittlich große [43] Domäne von 110 Aminosäuren, als auch für Villin, eine kleine Domäne von 35 Aminosäuren, offensichtlich.
Die Unterscheidung zwischen Strukturen verschiedener Stabilitäten kann durch Steigerung der Stringenz der proteolytischen Selektion erreicht werden. Somit wurde mit einer Steigerung der Temperatur sowohl Barnase als auch Villin für die Spaltung zugänglich, was eine Proteinentfaltung wiedergibt. Die Hauptbedeutung der Proteasespaltung ist jedoch bei einer Temperatur, die niedriger als der Entfaltungsübergang ist, wie er durch Zirkulardichroismus [38] gemessen wird. Dies mag die Tatsache widerspiegeln, dass der Entfaltungsübergang ein vollständig reversibler Prozess ist, wohingegen die Spaltung durch Proteasen (einer entfalteten Struktur) eine Kinetik und ein irreversibler Prozess ist, der das Gleichgewicht von der gefalteten zur entfalteten (und gespaltenen) Struktur zieht. Dies ist in Übereinstimmung mit dem CD-Entfaltungsübergang, wie er mit Villin gesehen wird [33], wo es bei Temperaturen so niedrig wie 35°C Hinweise auf eine Entfaltung gibt, demselben Punkt an dem Villin für einen Proteaseangriff anfällig wird.
Tabelle 2. Selektion von Barnasemutanten

Mischungen von Barnase-Mutanten (A + B) in Verhältnissen von 1:1 bis 1:10⁸ wurden durch Proteolyse bei 37°C ausgewählt, 24 (oder 36 in Runde 2) Phagenklone analysiert und die Anzahl jeder Mutante oben notiert. ^a Selektion bei 20°C, wo von beiden Mutanten erwartet wird, dass sie stabil sind, ^b vor der Selektion.

	Phage A: Phage B
	Phage A: Phage B	1:1^a	1,10²	1:10⁴	1:10⁶	1:10⁸
Runde 1	Phage A	16 (14^b)	24	20	0	nd
	Phage B	8 (10^b)	0	4	24	nd
	Anreicherung		- -	1,6 × 10⁴	-	nd
Runde 2	Phage A	nd	nd	nd	24	0
	Phage b	nd	nd	nd	12	36
	Anreicherung	nd	nd	nd	1,3 × 10⁶	-

Tabelle 3. Selektion von Villin
Mischungen von Villin-Phage und pK1, ergänzt mit KM13 in Verhältnissen von 1:1 bis 1:10⁶ wurden durch Proteolyse bei 10°C selektiert, 24 Phagenklone analysiert und die Anzahl von jedem Klon oben notiert. ^a vor der Selektion

Villin-Phage pK1

1:1 1:10² 1:10⁴ 1:10⁶

pK1 0 (16^a) 0 7 24

Villin 24 (8^a) 24 17 0

Anreicherung - - 8,7 × 10³ -

Tabelle 4. Primersequenzen
Materialien und Methoden (Beispiele 1 bis 6)
Materialien
Alle Restriktionsenzyme, T4-Ligase werden von New England Biolabs erhalten. Taq-DNA-Polymerase wird von HT Biotechnology erhalten. Pfu-DNA-Polymerase wird von Stratagene erhalten. Ultrareine dNTP von Pharmacia. Proteasen und Proteaseinhibitor Pefabloc werden von Boehringer Mannheim erhalten, mit Ausnahme von Chymotrypsin und Trypsin, die TPCK-behandelt sind, die von Sigma erhalten werden. Alle anderen Chemikalien werden ebenfalls von Sigma erhalten.
Phagenherstellung
Escherichia coli TG1 [42] wird für die Klonierung und Vermehrung des Phagen verwendet. TG1, das fd-DOG [43] enthält, oder Derivate wird über Nacht in 2×TY angezogen, das 15 μg/ml Tetracyclin enthält. Phagemide werden unter Verwendung von KM13 oder VCSM13 wie beschrieben [27] ergänzt. Phagenpartikel werden durch zwei PEG-Präzipitationen präpariert [44].
Vektorkonstruktion
Der Phagenvektor fd-Dog [43] wird als Vorgängervektor für die Konstruktion des Protease-spaltbaren fd-K108 verwendet. Einzigartige Restriktionsstellen (SfiI, KpnI) werden in die Glycin-reiche Spacerregion zwischen D2 und D3 unter Verwendung des Sculptor in vitro-Mutagenesesystems (Amersham) und des Oligonukleotids pkLinkers (Tabelle 4) eingefügt. Weitere Restriktionsstellen (ApaI, SalI) und Sequenz, die eine Proteasespaltungsstelle kodiert, werden zwischen die SfiI- und KpnI-Stellen unter Verwendung der Oligonukleotide polyXefor und polyXaback kloniert, um den Vektor fd-K108 herzustellen.
Der Protease-spaltbare Helferphage KM13 wird aus fd-K108 durch Überführung in den Helferphagen VCSM13 erzeugt, ein BamHI-ClaI-Fragment durch PCR und die Primer fdPCRBack und LIBSEQfor erzeugt.
Ein Protease-spaltbarer Phagemidvektor wird aus fd-K108 so wie oben mit Ausnahme der Verwendung von pCANTAB 3 (Pharmacia) erhalten. Eine FLAG-Markierung wird am N-Terminus des D1 durch Klonierung eines NotI-SfiI-Fragmentes, das durch PCR und die Primer Flagprimer und LSPAback erzeugt wurde, eingefügt. Um Deletionen als Folge einer wiederholten Sequenz in dem D2-D3-Linker zu umgehen, wird die Codon-Usage der Polylinkerregion in zwei Schritten (a) unter Verwendung eines Bam-SfiI-Fragmentes, das durch PCR und die Primer RECGLYfor und LIBSEQfor erzeugt wurde, Screening von Rekombinanten durch PCR und die Primer LSPAfor und LSPAback, (b) unter Verwendung eines KpnI-ClaI-Fragmentes, das durch PCR und die Primer RECGLYback und LIBSEQback hergestellt wurde, Screening der Rekombinanten unter Verwendung von LSPAfor und LSPAback, geändert. Der resultierende Vektor ist pK1. Das gesamte p3-Gen wird unter Verwendung der PCR-Zyklussequenzierung mit Fluoreszenz Dideoxykettenterminatoren (Applied Biosystems) sequenziert [45]. Der „out of frame"-Vektor pK2 wird aus pK1 durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung des Oligos delCKpn und des Sculptor Amersham-Kits erhalten. Die genauen Sequenzen des pK1 und pK2 werden in Kristensen et al. (1988) Folding & Design 3: 321–328 dargestellt.
Klonierung von Barnase und Villin
Die Vektoren, die die einzelnen Barnase-Mutanten, His102 → Ala und Leu14 → Ala [29, 46] kodieren, werden als Vorlage für die PCR-Amplifikation mit den Primern Barnasefor und BarnaseH102back und Pfu-Polymerase verwendet. Die PCR-Produkte (die die Einzelmutante His102 → Ala und die Doppelmutante His102 → Ala, Leu14 → Ala kodieren) werden unter Verwendung der Restriktionsenzyme SfiI und KpnI verdaut und in den Vektor pK2 ligiert, um die Phagemide pK2BA bzw. pK2BB zu ergeben und die Barnase-Gene werden unter Verwendung einer PCR-Zyklussequenzierung sequenziert.
Das 35 Aminosäure-thermostabile Fragment des „Headpiece" des f-Actin-bindenden Proteins Villin [33] wird aus Hühnchenbursa cDNA unter Verwendung der PCR-Primer villinfor und villinback mit Pfu-Polymerase amplifiziert. Die PCR-Produkte werden wie oben. geklont, um das Phagemid pK2V zu ergeben.
Resistenz der Phagen gegenüber denaturierenden Mitteln, pH und Proteasen
Für die Resistenz gegenüber denaturierenden Mitteln wird 10 M Harnstoff in PBS (25 mM NaH₂PO₄, 125 mM NaCl pH 7,0) oder 8 M GndHCl (Guanidinhydrochlorid) und 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM CaCl₂ (Puffer A) zu 10 μl Phagenstocks (10⁶–10¹⁰ TU) gegeben, um ein Volumen von 1 ml und die Bedingungen, die in Tabelle 1 spezifiziert sind, zu ergeben. Die Phagen werden für 1 bis 2 Stunden inkubiert, dann wird 100 ml Aliquot zu 1 ml TG1 (OD600 ~ 0,5) gegeben und serielle Verdünnungen werden auf TYE-Platten mit 15 mg/ml Tetracyclin ausplattiert. Für die Resistenz des Phagen gegenüber extremen pH-Werten (2–12) werden Tris-Glycin oder Tris-HCl-Puffer (0,1 M Glycin bzw. 0,1 M Tris) zu 10 μl Phagenstocks zugegeben, und zum Neutralisieren gaben wir zu jedem 100 μl Aliquot 50 μl 1 M Tris-HCl pH 7,4 vor der Infektion. Für die Resistenz gegenüber der Temperatur wird Puffer A zu 10 ml Phagenstocks gegeben, um ein Volumen von 1 ml zu ergeben und bei einer gegebenen Temperatur (20–60°C) für 1 Stunde inkubiert. 100 μl Aliquots werden zu TG1 zugegeben und wie oben ausplattiert. Für die Resistenz gegenüber Proteasen wird 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl₂ pH 7,4 (Faktor Xa 100 ng/ml oder Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin, Thermolysin und Subtilisin, alle 100 μg/ml) oder 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4 (IgA Protease 10 ng/ml) oder 50 mM NH₄CO₃ pH 8,0 (Arg-C 100 μg/ml, Glu-C 100 μg/ml) oder 25 mM NaH₂PO₄, 125 mM NaCl pH 7,0 (AspN 40 ng/ml) zu 10 μl Phagenstocks (fd-DOG und fd-K108) gegeben, um ein Volumen von 100 μl zu ergeben und eine Endkonzentration der Protease wie angegeben. Die Verdauansätze werden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und die Proben (100 μl) werden dann in TG1 wie oben angegeben infiziert.
Für die Resistenz gegenüber Proteasen in Anwesenheit von denaturierenden Mitteln werden die Proben wie oben für Harnstoff- und die Temperaturdenaturierung angegeben präpariert. Zu 90 μl Aliquots werden 10 μl Trypsin (1 mg/ml) zugegeben, und nach 5 Minuten bei Raumtemperatur werden 4 μl Pefablock (100 mM) zugegeben und die Proben werden in TG1 Wie oben infiziert.
Westernblot
Die Phagen (pHEH1 ergänzt unter Verwendung von KM13 und pK1 ergänzt unter Verwendung von VCSM13) werden vor oder nach der Spaltung durch Trypsin (50 mg/ml) einer SDS-PAGE unterzogen [47]. Nach halbtrockenem („semidry") Transfer auf PVDF-Membranen wird der Filter im Wesentlichen wie in [27] beschrieben verarbeitet. Der primäre Antikörper (monoklonaler anti-gIII (MoBiTec) wird in einer 1:5000-Verdünnung zugegeben, gefolgt von anti-Maus HRP-konjugiertem Antikörper (Sigma) in einer Verdünnung von 1:50000. Am Ende wird der Filter unter Verwendung des Luminolbasierten Chemilumineszenz-Western-Blotting-Kits (Boehringer Mannheim) entwickelt.
ELISA
Phagen, die Barnase-Mutanten darstellen, werden auf die Bindung an den RNAse-Inhibitor Barstar wie beschrieben [44] analysiert. 10 pmol biotinyliertes Barstar wird mit ungefähr 10¹⁰ Phagen, die die Barnase Mutante A oder Barnase Mutante B oder Villin darstellen, oder Puffer A gemischt. Phage, der Barstar bindet, wird auf Streptavidin-beschichteten Platten (Boehringer Mannheim) eingefangen und unter Verwendung von HRP-konjugiertem anti-M13-Antikörper (Pharmacia) und 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma) entwickelt. Die Absorptionsmessungen werden bei 405 nm durchgeführt.
Temperaturdenaturierung
Bei jeder Temperatur werden ungefähr 10¹⁰-Phagen, die die Barnase-Mutanten oder Villin (Amplicillin-resistent) darstellen, mit einer spaltbaren Kontrolle fd-K108 (Tetracyclin-resistent) gemischt, und ein nicht-spaltbares Kontroll-Phagemid, ein Chloramphenicol-resistentes Derivat von pHEN1, ergänzt mit KM13 in einem Gesamtvolumen von 90 μl Puffer A gemischt. Nach einer Äquilibrierung für 20 bis 30 min bei der angegebenen Temperatur wird 10 μl Trypsin (5 mg/ml) zugegeben und die Inkubation für 2 Minuten fortgesetzt. Trypsin wird durch Zugabe von 4 μl 100 mM Pefabloc neutralisiert. Infektion und serielle Verdünnung wird in TG-1 wie oben durchgeführt und Aliquots werden auf TYE-Platten, die 100 μg/ml Ampicillin + 1% Glucose, 30 μg/ml Chloramphenicol + 1% Glucose oder 15 μg/ml Tetracyclin enthalten, ausplattiert.
Selektionsexperimente
10 μl der seriellen Verdünnungen der Barnase-Mutante Phage A wird mit 10 μl der nicht-verdünnten Barnase-Mutante Phage B in 70 μl Puffer A gemischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 20°C oder 37°C werden 10 μl Trypsin (5 μg/ml) zugegeben. Nach 2 Minuten des Verdaus werden 4 μl Pefabloc (100 mM) zugegeben. Die Phagen werden in TG1 wie oben infiziert. Eine zweite Runde der Selektion wird durch Abschaben der Bakterien in 3 ml 2 × TV, 50 μl beimpft und 50 ml 2 × TY/Amp/Glu durchgeführt und der Phagemid ergänzt und der Phage wie oben hergestellt. Die Klone werden durch PCR unter Verwendung der Primer LSPAfor und LSPAback gefolgt von einem Restriktionsverdau unter Verwendung von DdeI analysiert.
Selektionen zwischen pK2V- und pK1-Phagenpartikel werden wie oben durchgeführt mit der Ausnahme, dass die Selektion bei 10°C durchgeführt wird. Die Klone werden durch PCR unter Verwendung der Primer LSPAfor und LSPAback analysiert.
Beispiel 7. Verwendung des Protease-spaltbaren Helferphagen für die Selektion der Signalsequenzen.
Die Translokation von Proteinen wird durch Signalpeptide gesteuert [48]. Von denen ist bekannt, dass sie gemeinsame Merkmale wie beispielsweise positiv geladene Amino-terminale Regionen, eine hydrophobe Sequenz und eine Carboxy-terminale Region, die die Signalpeptidase-Spaltungsstelle einschließt, teilen. Signalpeptide sind in „einem Muster von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen" beteiligt [49]. Die Signalsequenz kann zusätzlich mit dem Proteinfaltungsweg interferieren. Sie sind ebenfalls bei der translationalen Regulation, hauptsächlich durch die Downstream-Box beteiligt.
Enzyme wie beispielsweise DNA-Polymerase werden auf Phagenpartikeln nur sehr schwach dargestellt, was ihre Selektion im Allgemeinen unmöglich macht. Um die Fähigkeiten des Phagendisplays, Polymerasen zu selektieren, zu verbessern, werden daher verbesserte Signalsequenzen entworfen und für die Verwendung einer Phagendisplaytechnik ausgewählt, in der „der leere" Phagenhintergrund durch den Verdau von Helferphagen ausgeschlossen ist.
Der Entwurf einer Signalsequenz für ein optimales Polymerasedisplay auf Phagen ist nicht einfach erreichbar. Eine Selektionsstrategie wird daher entworfen, um Signalsequenzen aus einer Bibliothek zu isolieren, wobei Mutationen an ausgewählten Stellen eingefügt werden. Obwohl die Signalsequenz auf dem Phagen nicht vorhanden ist, kann ihre Sequenz durch Sequenzierung des Phagemids, der innerhalb des Phagenpartikels lokalisiert ist, leicht erhalten werden.
Zwei Bibliotheken werden aus pelB und g3-Leadersequenzen erzeugt, wobei die folgenden Oligonukleotidprimer für die PCR-Amplifikation verwendet werden:
Die Restriktionsstellen HindIII und NcoI sind in Kursiv dargestellt.
Bibliothek I, die von pelB-Leader erhalten wird, und Bibliothek II, die von dem g3-Leader erhalten wird, werden durch PCR-Amplifikation von 4 (pelB), amplifiziert mit 1 und 2, und von 5 (g3), amplifiziert mit 3 und 2, hergestellt. Jedes PCR-Produkt wird mit HindIII und NcoI verdaut und mit einem Gelextraktionskit (Qiaquick, Qiagen) aufgereinigt. 0,2 μg von jedem resultierenden Insert wird für die Ligation mit ungefähr 2 μg pHEN1-Stoffelvektor (6), der zuvor mit HindIII und NcoI verdaut und mit alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) dephosphoryliert wurde, gemischt. Die Ligationsmischung wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung vor der Elektroporation in frisch präparierte E. coli TG1 aufgereinigt.
Die Randomisierung von 32 und 20 Basen für die pelB- bzw. g3-Leader wird durchgeführt: (i) in der Nähe und innerhalb der Epsilonsequenz gerade upstream von der Shine-Delgarno-Sequenz (ii) downstream von der Shine-Delgarno-Sequenz in der Nähe und innerhalb der Downstream-Box [50] (iii) innerhalb des Leaderpeptids an der N-terminalen Region, die die positiv geladenen Aminosäurereste enthält, in der hydrophoben Region [51] und in der C-terminal Region, nahe der hochkonservierten Peptidasespaltungsstelle [52].
Der Phage wird hergestellt, wie zuvor beschrieben [25] mit der Ausnahme, dass der Helferphage KM13 (Beispiel 3) anstelle des VCSM13 verwendet wird und dass 0,1 mM IPTG zu der Übernachtkultur bei 30°C, wenn spezifiziert, zugegeben wird. Selektionen nach der Resistenz gegenüber Trypsin und der Bindung [44] werden wie früher beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 11 μg des anti-Taq-Antikörpers (Taqstart, Clontech) über Nacht an Immunoröhrchen (Nunc) beschichtet wird. Das PCR-Screening wird. mit den Primern 6 und 7 unter Verwendung einzelner E. coli TGI-Kolonien, die den Phagemid enthalten, als Vorlage durchgeführt, gefolgt von einem zuvor beschriebenen Protokoll; nach der Gelelektrophorese auf einem 2 Agarosegel. Die Größe des modifizierten Fragments wird als Kriterium verwendet, um festzustellen, ob Deletionen innerhalb des Polymerase-Gens aufgetreten sind.
Die berechnete Diversität der Bibliotheken, die aus der Degeneriertheit der synthetisierten Oligonukleotide berechnet wurden, ist ungefähr 3,7 × 10¹³ = 4⁹ × 3⁷ × 2¹⁶ und 1,7 × 10⁷ = 4⁴ × 2¹⁶ für die pelB- bzw. g3-Leader. Nach der Transformation der E. coli mit den Phagemid-Bibliotheken wird die Bibliothekgröße, die als Anzahl von Ampicillin-resistenten Kolonien gemessen wird, mit 1,3 × 10⁷ und 9,6 × 10⁶ für die pelB- bzw. g3-Leader bestimmt.
Die Selektion nach der Darstellung der Polymerase wird durch das spezifische Spalten der Helferphagen p3-Kopien mit der Protease Trypsin durchgeführt, so dass alle Phagenpartikel nicht infektiös gemacht werden, die keines der p3-Polymerasefusionsproteine exprimieren.
Beide Bibliotheken werden gemischt und die Selektionsrunden werden in zwei Zuständen durchgeführt, mit oder ohne 0,1 mM IPTG im Kulturmedium. Mit IPTG werden die Deletionen des Polymerase-Gens oder eines Teils davon nach Runde III bemerkt (4 von 28 Klonen) wie durch ein PCR-Screening (siehe oben) gezeigt wurde; nach Runde IV repräsentieren diese Klone die Meisten der Population (28 von 30). Ohne IPTG repräsentieren diese Klone einen signifikanten Teil der ausgewählten nach Runde VI (3 von 12). Die Selektion wird daher von Runde V an durch Einfügung einer Selektion nach Bindung an ein anti-Taq-Antikörper zusätzlich zur Selektion nach Proteaseresistenz geändert. Nach den Selektionsrunden VII und VIII entsprechen (3 von 13) bzw. (0 von 19) Klonen den deletierten p3-Polymerasefusionsproteinen.
Zur Charakterisierung der Leader werden die HindIII-Ncol-Fragmente nach der PCR-Amplifikation individueller E. coli-Kolonien subkloniert. Die resultierenden Phagemide werden als pHENi-lx/Stoffel subkloniert mit x = 7,9,10 und 12 bezeichnet. Das HindIII-NcoI- und das NcoI-NotI-Fragment, das dem Stoffelfragment entspricht, wird auf beiden Strängen unter Verwendung eines 373A DNA-Sequenziergerätes (Applied Biosystems) sequenziert.
Für den ELISA wird ein anti-Taq-Antikörper (Tagstart, Clontech) für die Beschichtung der ELISA-Platte verwendet und ein anti-M13-Meerrettichperoxidase-Fusionsprotein (Pharmacia Biotech) wird für den Nachweis in einem Standardprotokoll [44] eingesetzt.
Die Expression der Polymerase in dem Überstand wird durch Infektion von E. coli HB2151 mit selektierten Phagemiden [25, 27] durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die IPTG-Konzentration 0,1 mM anstelle von 1 mM ist. Ungefähr 10 μl des Überstandes wird auf ein Polyacrylamidgel für die Elektrophorese (Novex) geladen; das Gel wird auf Nitrocellulose (Protran, Schleicher und Schuell) geblottet und ein anti-Taq-Polymeraseantikörper (Tagstart, Clontech) und ein Ziege-anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase (Sigma) wird vor dem Nachweis auf einem Autoradiographiefilm durch Chemilumineszenz (ECL Reagenzien, Amersham).
Vier einzelne Klone 7, 9, 10 und 12 aus Runde VII, die nach Proteaseresistenz unter 12 Klonen gescreent wurden, werden weiter charakterisiert. Um sicherzustellen, dass nur Mutationen innerhalb der Signalsequenz betrachtet werden, und nicht Mutationen irgendwo anders innerhalb des Phagemids, die während der Amplifikation in den verschiedenen Runden aufgetreten sein könnten, werden die Signalsequenzen in den ursprünglichen Vektor subkloniert. Die Ergebnisse, die in Tabelle-5 gezeigt sind, zeigen, dass die optimale Polymerasedarstellung für den ausgewählten Klon 10 ungefähr 50-fach höher als für die ursprüngliche Sequenz ist. Dieses Ergebnis wird unabhängig innerhalb des experimentellen Fehlers durch einen ELISA unter Verwendung von anti-Taq-Antikörper und anti-M13-HRP bestätigt: 10⁹-Phagenpartikel des pelB-Leader-Phagemid pHEN1-Stoffel (Signal zu Rauschverhältnis: 1.46) ergab ein identisches Signal wie 10⁷- Phagenpartikel des Klons 10 (Signal zu Rauschverhältnis: 1.47).
Die Expression des Stoffelfragments in E. coli HB2151 wird ebenfalls für die verschiedenen Leader untersucht (siehe Tabelle 6). Die Konzentration des Stoffelfragments in dem Kulturüberstand wird durch Vergleich der Spotintensitäten für bekannte Mengen der Polymerase abgeschätzt und wird mit ungefähr 0,1 mg/l für den pelB-Leader bestimmt. Eine 3-fache Steigerung der Expression wird für die Leader L7 und L10 beobachtet, wohingegen eine ungefähr 3-fache Verringerung für den Leader I9 beobachtet wird.
Tabelle 5. Anzahl der Phage-Polymerasen pro Phagenpartikel mit Leader pelB, als eine Funktion der Temperatur und IPTG-Konzentrationen

Der Phagentiter wird als Anzahl der infektiösen Phagenpartikel und der Phagenpolymerasetiter als Anzahl der infektiösen Phagenpartikel nach der Behandlung mit Trypsin gemessen. Die Anzahl der Phagenpolymerasen pro Phagenpartikel ist das Verhältnis der Titer. Da die Phagenpartikel mit einem Helferphagen ergänzt wurden, stellen die Phagen entweder ein p3-Polymerase-Fusionsprotein und wenige p3-Kopien, die eine Trypsin-Spaltungsstelle enthalten, oder nur diese p3-Kopien dar.

Temperatur	25°C	30°C	37°C
0 mM IPTG	1,7 × 10^–3	9,1 × 10^–4	1,2 × 10^–3
0,1 mM IPTG	9,1 × 10^–3*	8,3 × 10^–3	2,4 × 10^–3*
1 m MIPTG	1,5 × 10^–2*	5,5 × 10^–3	1,2 × 10^–3*

* unter diesen Bedingungen fiel der Phagentiter unter 10¹⁰/ml des Kulturmediums.

Leader	Titer	Anzahl der Phagenpolymerasen
	× 10¹¹	pro Phagenpartikel
pelB	1,2	9,1 × 10^–4
17	2,0	2,5 × 10^–2
19	0,5	8,3 × 10^–3
110	0,7	4,3 × 10^–2
112	1,6	1,4 × 10^–2

Tabelle 7. Randomisierte und ausgewählte Sequenzen
Die randomisierte DNA-Sequenz wird von 5' nach 3' angegeben; darüber und darunter sind die Basen, die von der gegebenen Sequenz in den Signalsequenzen pelB, 17, 19, 110 und 112 abweichen, gezeigt. Die Shine-Delgarno-Sequenz, das Startkodon und das letzte Kodon der Signalsequenz, GCC, sind unterstrichen worden. Die HindIII- und die NcoI-Restriktionsstellen sind kursiv dargestellt. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind darunter angegeben. Bibliothek I wird zunächst von dem pelB-Leader und die Bibliothek II von dem g3-Leader entworfen. III-A. Aus Bibliothek I
III-B. Aus Bibliothek II
Beispiel 8. Selektion einer katalytischen Aktivität unter Verwendung eines Protease-spaltbaren Helferphagen.
Eine Strategie für die Selektion von Katalysatoren durch ein Phagendisplay basiert auf der Selektion des Reaktionsprodukts einer katalytischen Reaktion und die Verwendung der Umgebungseffekte, um den Katalysator auszuwählen. Bei dieser Strategie wird ein markiertes Substrat in der Umgebung des dargestellten Enzyms kreuzverknüpft; der Phage wird dadurch an eine feste Phase angebracht und durch eine intramolekulare Spaltungsreaktion, die von dem dargestellten Enzym katalysiert wird, freigesetzt [53].
Ein ähnlicher Ansatz ist für die Selektion der aktiven DNA-Polymerasevarianten angewendet worden. Der Ansatz beinhaltet zwei chemisch unabhängige Reaktionen, die katalytische Reaktion, die zu einem Produkt führt (für diesen Fall unterschieden durch den Einbau einer Biotinmarkierung) und einer chemischen Kreuzverknüpfungsreaktion, bei der das Substrat (und Produkt) mit dem Phagen verknüpft werden. Die Selektion des Phagen durch Streptavidin-Beads selektiert daher nach Phagen, die chemisch an das markierte Produkt angebracht sind; von diesen Reaktionen ist wahrscheinlicher, dass sie auf demselben Phagen gekoppelt sind, da Reaktionen in cis gegenüber Reaktionen in trans durch die Nähe bevorzugt sind.
Maleimide werden in einer chemischen Kreuzverknüpfungsreaktion verwendet. Von diesen ist bekannt, dass sie mit Thiolen und in alkalischen Lösungen mit Aminogruppen reagieren und daher in der Lage sind, mit einem weiten Bereich von Stellen auf dem Phagen und auf dem dargestellten Enzym zu reagieren. Ein kovalentes Produkt zwischen dem Haupthüllprotein (p8) und N-Biotinoyl-N'-(6'-maleimidohexanoyl(hydrazid) wird durch SELDI-Massenspektrometrie nachgewiesen. Von zwei Aminosäuregruppen (das N-terminale Ala-1 und der Rest Lys-8) wird angenommen, dass sie beteiligt sind.
Die Strategie wird unter Verwendung von DNA-Polymerasen im Hinblick auf ihre zentrale Rolle in der molekularen Evolution getestet. Eine Maleimidylgruppe wird an dem 5'-Ende eines DNA-Primers eingefügt; das Produkt wird durch Zugabe eines biotinylierten dUTPs an das 3'-Ende des Primers durch die katalytische Aktion der Polymerase markiert. Die Klenow- und Stoffelfragmente der DNA-Polymerase I Escherichia coli bzw. Thermus aquaticus werden für die Darstellung kloniert und zwar durch Fusion an das pIII-Hüllprotein des filamentösen Bakteriophagen durch herkömmliche Techniken. Beiden Fragmenten fehlen die 5'- zu 3'-Exonukleasedomänen; dem Stoffelfragment fehlt ebenfalls eine 3'- nach 5'-Exonukleaseaktivität.
Das Fusionsprotein wird auf einem Phagemid (pHENI) [25] kloniert und durch einen Helferphagen ergänzt. Von den Polymerasenfragmenten wird gezeigt, dass sie auf dem Phagen dargestellt werden (nach Ergänzung mit dem Helferphagen) und zwar durch Bindung des Phagen an Schalen, die mit anti-Polymerase-Antikörpern beschichtet sind, wie durch ELISA nachgewiesen wurde (nicht gezeigt). Die Phagen werden ebenfalls durch einen Westernblot unter Verwendung von anti-p3- oder anti-Polymerase-Antikörper analysiert. Dies bestätigt das Vorhandensein des Fusionsproteins, aber weist ebenfalls auf eine Kontamination durch freie Polymerase hin. Dies kommt höchstwahrscheinlich von der Sekretion des bakteriellen Wirtes durch eine unvollständige Suppression des Amber-Stoppkodons oder durch Spaltung von der Phagenoberfläche. Dies wird durch einen weiteren Schritt der Ultrazentrifugation oder durch Größenausschlusschromatographie entfernt. Die aufgereinigten Phagen werden auf die DNA-Polymeraseaktivität in einem Primer-Template-Extension-Assay mit radioaktiv markierten a³²P-dCTP untersucht und als aktiv bestimmt.
Wie jedoch durch die Westernblots gezeigt wird, wird das Polymerase-p3-Fusionsprotein verglichen mit dem p3-Protein nur schwach in den Phagen eingebaut. Dies scheint die Folge des Einbaus von p3 aus dem Helferphagen zu sein, wie durch die alternative Verwendung eines Helferphagen (KM13 gezeigt wurde), in dem das p3-Protein des Helferphagen (aber nicht das des Fusionsproteins) mit Trypsin gespalten werden kann, so dass es ihn zur Vermittlung der Infektion unfähig macht (Beispiele 3 und 4). Somit sind nach der Proteolyse nur solche Phagen infektiös, die das Fusionsprotein eingebaut hatten; aus dem Verlust im Titer nach der Proteolyse haben wir angenommen, dass nur in einen Phagenpartikel von 1000 das Fusionsprotein eingebaut wurde. Der Selektionsprozess, der auf der Markierung durch Polymerase in cis basiert, würde durch solch einen großen Überschuss an Phagen, denen die Polymerase fehlt, beeinträchtigt werden, für die Markierung in trans aber benutzbar sein. Ausgewählt Phagen werden daher mit Trypsin behandelt, um die Infektiösität derer zu zerstören, denen die dargestellte Polymerase fehlt.

Die Phagen, die das Stoffelfragment darstellen, werden mit Primer 13 [TTT CGC AAG ATG TGG CGT], der eine 5'-Maleimidylgruppe und ein 3'-biotinyliertes Nukleotid umfasst, inkubiert. Nach der Inkubation werden die Phagen auf Streptavidin-beschichteten Beads eingefangen, mit einer Ausbeute von ungefähr 1 bis 5 infektiöser Phagen. Dies zeigt, dass der Primer chemisch an den Phagen kreuzverknüpft werden kann, höchstwahrscheinlich über p8-Protein, wie für das N-Biotinoyl-N'-(6-maleimidohexanyol)hydrazid gezeigt. Die Phagen werden dann mit Primer 1b [GCGAAGATGTGG], der eine 5'-Maleimidylgruppe umfasst, in Anwesenheit von Biotin-dUTP 2 und Vorlage („Template") 3 [AAA TAC AAC AAT AAA ACG CCA CAT CTT GCG] inkubiert. Das Einfangen des Phagen ist abhängig von dem Vorhandensein des 1b, 2 und 3 (Tabelle 8) aber ebenfalls vom Einschluss des Trypsins, welches den Helferphagen spaltet, um die nicht-spezifische Phagenisolierung zu reduzieren. Tabelle 8. Selektion der katalytisch aktiven Phagen-Stoffel-Partikel.

φi^[a] in tu	φf^[b] in tu	Ausbeute in %	Bedingungen ^[c]

8,4 × 10⁵	2,0 × 10⁴	2,4
3,6 × 10⁵	1,0 × 10²	0,028	– Primer 1b
4,4 × 10⁵	3,0 × 10²	0,068	– biotinyliertes dUTP
4,8 × 10⁵	3,0 × 10²	0,062	– Vorlage 3
4,4 × 10⁹	4,0 × 10⁶	0,091	– Trypsin
1,5 × 10⁹	5,5 × 10⁵	0,037	– Trypsin,	– Primer 1b

φi und φf bezeichnen die Anzahl der Transformationseinheiten (tu) vor [a] und nach [b] der Selektion. Ausbeute = φf/φi [c]: + Primer 1b, + biotinyliertes dUTP 2, + Vorlage 3 und + Trypsin.

Beispiel 9. Selektion nach Disulfid-enthaltenden Polypeptiden.
Für die Klonierung von (poly)-Peptid kodierenden DNA-Fragmenten und ihre Darstellung für die Selektion zwischen Barnase und p3, wird der Phage fd-3 konstruiert (5). Der Phage fd-3 umfasst die H102A-Mutante der Barnase N-terminal fusioniert an das p3-Gen des Phagen fd-TET. Zwischen dem Kodon für den letzten Rest der Barnase und dem ersten Rest des p3 befindet sich die Nukleotidsequenz CTG CAG GCG GTG CGG CCG CA. Diese Sequenz enthält eine PstI-DNA-Restriktionsstelle (kursiv) für die Insertion von DNA-Fragmenten, die von PstI-Restriktionsstellen flankiert sind. Die Sequenz fügt des Weiteren einen Frameshift zwischen die Barnase und p3 ein, welcher die Expression des korrekten p3-Leserasters in fd-3 verhindert. Phagenpartikel des Phagen fd-3 stellen daher das infektiöse Protein nicht dar und sind nicht infektiös.
Der Phage fd-3 ist daher als Klonierungsvektor gut geeignet, da Vektoren ohne PstI-DNA-Inserts nach der Ligation während der Selektion nicht vermehrt werden. Statistisch wird 1 von 3 zufälligen DNA Inserts in der PstI-Restriktionsstelle (mit Ausnahme des Vorhandenseins von Stoppkodons innerhalb des Inserts) ein offenes Leseraster erzeugen, welches die Barnase, das Insert selbst und p3 umspannt, und zu infektiösen Phagenpartikeln führt, die p3 in der Phagenhülle enthalten. In diesen rekombinanten Klonen wird Barnase von dem Insert gefolgt, welches dann von den Aminosäureresten AGGAAA gefolgt wird, vor dem Start des p3-Proteins. Dieses AGGAAA-Peptid sollte genug Flexibilität in dem Fusionsprotein bereitstellen, um die Infektiösitätsfunktion des p3 und den Zugang der Protease zu den N-terminalen Anhängen des p3 zu ermöglichen.
Genomische DNA aus dem E. coli-Stamm TG1 wird in 30 Zyklen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit einer Annealingtemperatur von 48°C unter Verwendung des Oligonukleotids SN6MIX (5'-GAG OCT GCA GAG CTC AGG NNN NNN-3'), welches 6 degenerierte Positionen am erweiterbaren 3'-Ende enthält, um ein zufälliges Priming sicherzustellen, amplifiziert. In einem zweiten Schritt von 30 PCR-Zyklen mit einer Annealingtemperatur von 52°C werden primäre PCR-Produkte durch eine Reamplifikation mit dem Oligonukleotid XTND (5'-CGT GCG AGC CTG CAG AGC TCA GG-3') erweitert. Produkte mit einer Länge von ungefähr 150 Bp aus dieser Reaktion werden aus einem Agarosegel aufgereinigt und in 30 PCR-Zyklen unter Verwendung einer Annealingtemperatur von 52°C und des Oligonukleotids XTND reamplifiziert. Diese reamplifizierten 150 Bp-Fragmente werden teilweise mit SacI (die Stelle ist in Fettdruck in den Oligonukletoiden hervorgehoben) verdaut und für die Dimerisierung ligiert. Die ligierten Produkte werden in weiteren 10 PCR-Zyklen mit einer Annealingtemperatur von 44°C gefolgt von 30 PCR-Zyklen mit einer Annealingtemperatur von 55°C unter Verwendung des Oligonukleotids XTND reamplifiziert. Die Annealingtemperaturen werden so ausgewählt, dass sie gegenüber dem Priming der Oligonukleotide in der Mitte der dimerisierten Fragmente unterscheiden. Das Reaktionsprodukt wird zweifach auf einem Agarosegel größenaufgereinigt, um Monomere und Oligomere (Nicht-Dimere) zu entfernen.
Die endgültige Dimerfraktion wird durch PCR unter Verwendung einer Annealingtemperatur von 55°C und dem Oligonukleotid XTND im großen Maßstab amplifiziert, mit PstI verdaut (Stelle in den Oligonukleotiden kursiv dargestellt). und in den ebenfalls PstI verdauten und mit Phosphatase behandelten Vektor fd-3 ligiert. Nach der Elektroporation in E. coli-Bakterien wird ein Repertoire von 3,6 × 10⁷ Rekombinanten erhalten. Die Sequenzanalyse von zufällig gepickten Klonen ergibt das Vorhandensein von hauptsächlich Dimeren (11 von 14) und einigen Monomeren (2 von 14) DNA-Inserts.
Die Reinfektion von E. coli-Bakterien mit den Phagen, die aus der ursprünglichen Population der transformierten Zellen erzeugt wurden, ergab gemäß den Sequenzanalysen von 20 zufällig gepickten Klonen eine Bibliothek von infektiösen Phagen, die nahezu ausschließlich Barnase (in-frame, kein-Stopp-Dimer-Insert)-p3-Fusionen enthielten. Nicht-infektiöse Phagen, die aus dem Vektor ohne Insert resultieren, und aus dem Vektor mit out-of-frame oder Stoppkodon enthaltenen Inserts werden im Infektionsschritt nicht vermehrt. Der Vektor fd-3 ist daher geeignet, um ein Repertoire von Polypeptiden zu erzeugen, dass zufällig durch Dimerisierung der DNA-Fragmente aus dem E. coli-Genom gebildet wurde.
Dieses Repertoire der Polypeptide, die als eine eingefügte Fusion zwischen Barnase und p3 auf dem Phagen fd dargestellt werden, wird einem proteolytischen Verdau mit Trypsin und Thermolysin alleine oder in einer Mischung von beiden (1 ng/μl jeweils) in TBS-Ca-Puffer (25 mM Tris, 137 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,4) unterzogen. Nach der Proteolyse wird der Phage mit biotinyliertem Barstar gebunden an eine Streptavidin-beschichtete Mikrotiterschalenplatte eingefangen und bei pH 2,0 eluiert. Der Phage wird auf pH 7 neutralisiert und durch Reinfektion der E. coli-Zellen vermehrt und für eine zweite Runde wie zuvor ausgewählt. Alle Schritte werden in Abwesenheit irgendeines reduzierenden Agens wie Dithiothreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol durchgeführt, welches reduzieren würde und dadurch jede potentielle Disulfidbindung spalten würde, die zwischen Cystein-Seitenketten innerhalb der selektierten Polypeptide gebildet sind.
Zufällig gepickte Phagen, die nach der ersten und zweiten Runde der proteolytischen Selektion eluiert wurden, werden auf die Bindung an Barstar nach der Inkubation mit einer Mischung aus Trypsin und Thermolysin unter den Bedingungen der Selektion (Tabelle 9) analysiert. Ihre Sequenz wird bestimmt (Tabelle 9). 17 von 18 analysierten Klonen, die mit einer Mischung von Trypsin und Thermolysin während der Selektion behandelt wurden, werden bestimmt, biotinyliertes Barstar nach der Inkubation mit Trypsin und Thermolysin zu binden. 5 von 8 analysierten Klonen, die mit Trypsin während der Selektion behandelt wurden, haben biotinyliertes Barstar nach Inkubation mit Trypsin und Thermolysin gebunden, während von 9 von 14 analysierten Klonen, die mit Thermolysin behandelt wurden, gefunden wurde, dass sie binden. Keine zufällig gepickten Klone, die nicht mit einer Protease während der Selektion behandelt wurden, binden biotinyliertes Barstar nach der Inkubation mit Trypsin und Thermolysin. Die Bindung an biotinyliertes Barstar zeigt, dass die Polypeptid-Einfügung zwischen Barnase und p3 auf dem Phagen seine gesamte kovalente Vollständigkeit erhält und daher die N-terminale Markierung (Barnase) und das Infektionsprotein p3 (und dadurch den Phagenpartikel als Ganzes) kovalent verknüpft beinhaltet.
Die Möglichkeiten des proteolytischen Verdaus des Peptidrückgrats kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, da die Inserts auch kovalent verknüpft durch Bindungen zwischen Seitenkettengruppen wie den SH₂-Gruppen der Cysteine beibehalten werden können. Die Sequenzanalyse der selektierten Klone ergibt das 19 von 25 (76%) resistenten Klonen zwei oder mehr Cysteinreste enthalten.
Um die Rolle der möglichen Disulfidbindungen in den Polypeptid-Inserts zu analysieren, werden 13 der selektierten Phagen auf eine Bindung an biotinyliertes Barstar analysiert (und dadurch auf eine kovalente Verknüpfung der Barnase und p3 durch das Insert) und zwar nach der Behandlung mit Trypsin und Thermolysin gefolgt von einem Waschen mit 20 mM DTT vor der Detektion des gebundenen Phagen. Zwei Phagenklone, die Barstar nach der Proteasebehandlung ohne DTT-Waschen binden und kein Cystein enthalten, sind von der DTT-Behandlung unbeeinflusst. Von zwei anderen Phagenklonen, die Barstar nach der Proteasebehandlung ohne DTT binden und zwei oder mehr Cysteine enthalten, wurde ebenfalls beobachtet, dass sie Barstar nach der Protease und DTT-Behandlung binden. Dies legt nahe, dass ihre Inserts vor der Proteolyse ihres Peptidrückgrats trotz des Vorhandenseins grundsätzlicher Substratstellen für die Proteasen geschützt sind.
Diese Inserts sind daher als Folge einer konformativen Beschränkung ihres Peptidrückgrats vor einem proteolytischen Angriff geschützt. Jedoch wurde von 9 Phagenklonen, die Barstar nach der Proteasebehandlung ohne DTT-Waschen binden und zwei oder mehr Cysteine enthalten, beobachtet, dass sie Barstar nach Protease und DTT-Behandlung nicht binden. Dies legt nahe, dass ihre Inserts im Peptidrückgrat gespalten werden, aber durch Disulfidbindungen zwischen den Cystein-Seitenketten in Abwesenheit des reduzierenden Agens DTT zusammengehalten werden. Diese Inserts werden daher nicht als Folge einer konformativen Beschränkung ihres Peptidrückgrats vor einem proteolytischen Angriff geschützt.
Somit kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung gestaltet werden, um nach Cystein-enthaltenden Polypeptiden zu selektieren, selbst wo die Polypeptide für ein Proteaseangriff empfänglich wären, da die Polypeptide in der Lage sind, im Selektionsschritt durch Disulfidbindungen zusammengehalten zu werden.
Tabelle 9. Barstar-Bindung von Phagen, die Barnase-p3-Fusions-Inserts darstellen, die nach einer proteolytischen Behandlung unter nicht-reduzierenden Bedingungen selektiert wurden und Aminosäuresequenzen ihrer PstI-Inserts in den Vektor fd-3.
Die Barstarbindung (–DTT) nach der Proteolyse der Phagen mit Trypsin und Thermolysin (2 ng/μl jeweils) ohne ein 20 mM DTT-Waschen wird durch Messung eines Signals bestimmt, das mindestens 60% des Signals für eine Barstar-Bindung des Phagen ohne Proteasebehandlung ist. Die Barstar-Bindung (+DTT) nach einem 20 mM-Waschen wird durch Messung eines Signals bestimmt, das mindestens 60% des Signals für die Barstar-Bindung (–DTT) ohne ein 20 mM DTT-Waschen ist. Die Phagen werden zufällig nach einer (1x) oder zwei (2x) Runden der Proteolyse mit Trypsin (Tr) oder Thermolysin (Th) gepickt. Die Phagen werden mit Proteasen behandelt, mit biotinyliertem Barstar in Mikrotiterschalenplatten eingefangen, und mit 20 mM DTT wenn passend gewaschen. Gebundene Phagen werden mit Meerrettichperoxidase konjugiertem anti-M13-Phagen-Antikörper (Pharmacia Biotech) nachgewiesen.
Beispiel 10. Verwendung reduzierender Agenzien, um Disulfidverursachten Hintergrund zu entfernen.
Das Repertoire der Polypeptide, die in Beispiel 9 beschrieben wurden, wird wie zuvor sowohl mit Trypsin und Thermolysin (Beispiel 9) mit der Ausnahme eines zusätzlichen Waschschrittes, hier mit 50 mM DTT nach der Bindung des proteolytisch behandelten Phagen an die Mikrotiterschalenplatten, die mit Streptavidinbiotinyliertem Barstar beschichtet sind, verdaut. Dieser Waschschritt ist so gestaltet, dass er Phagen abwäscht, die eine N-terminale Barnase-Markierung darstellen, die nicht länger an p3 durch ein intaktes Polypeptidrückgrat sondern nur durch Disulfidbindungen zwischen Cystein-Seitenketten in den Polypeptid-Inserts zwischen der Barnase-Markierung und p3 verknüpft sind.
12 zufällig gepickte Phagen, die nach der zweiten Runde der Proteolyse eluiert wurden, werden auf ihre Stabilität gegen eine Mischung von Trypsin und Thermolysin unter den Bedingungen der Selektion analysiert und ihre Sequenzen bestimmt (Tabelle 10). 10 Klone, die mit einer Mischung aus Trypsin und Thermolysin während der Selektion behandelt wurden, binden biotinyliertes Barstar nach der Inkubation mit Trypsin und Thermolysin, gefolgt von Waschen mit 50 mM DTT vor dem Nachweis der eingefangenen Phagen. Nur einer dieser Klone enthält zwei oder mehr Cysteine.
Die proteolytische Behandlung der Phagenbibliothek gefolgt von einem Waschen mit DTT erlaubt daher die Selektion der Peptid-Inserts, die vor der Proteolyse geschützt sind und nicht durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden.
Tabelle 10. Barstarbindung von Phagen, die Barnase-p3-Fusions-Inserts darstellen, die nach der proteolytischen Behandlung gefolgt von einer Behandlung mit 50 mM DTT selektiert wurden und Aminosäuresequenzen ihrer PstI-Inserts in fd-3.
Die Barstarbindung (+DTT) nach der Proteolyse des Phagen mit Trypsin und Thermolysin (2 ng/μl jeweils) gefolgt von einem 50 mM DTT wird durch Messung eines Signals für eine Barstarbindung (+DTT) bestimmt, die mindestens 60 des Signals für eine Barstarbindung des Phagen ohne Proteasebehandlung ist. Die Phagen werden zufällig nach zwei (2×) Runden der proteolytischen Behandlung mit Trypsin (Tr) und/oder Thermolysin (Th) gepickt. Die Phagen werden mit Proteasen behandelt, mit biotinyliertem Barstar in Mikrotiterschalenplatten eingefangen und mit 50 mM DTT, wo passend, gewaschen. Gebundener Phage wird mit einem Meerrettichperoxidase-konjugiertem anti-M13-Phagen-Antikörper nachgewiesen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Spaltung der Phagen mit Proteasestellen. Phagen wurden durch eine Ergänzung mit KM13 (pHENI, A + B) oder mit VCSM13 (pK1, C + D) hergestellt. Ungespalten (A + C) oder gespalten mit Trypsin (B + D). 5 μl, 2,5 μl und 1 ml Phagen wurden wie angegeben geladen. Molekulare Gewichtsmarker sind in kD.
2. Die Phagemid-Vektoren pK1 und pK2. Diese Vektoren enthalten eine Protease-spaltbare Sequenz zwischen D2 und D3 des Phagen p3-Proteins. In pK1 sind D2 + D3 im Leseraster; in pK2, ist D3 außerhalb des Leserasters.
3. Bindung des Phagen-Barnase an Barstar. Phagen, die verschiedene Fusionsproteine darstellen, werden mit biotinyliertem Barstar inkubiert, auf Streptavidin-beschichteten Platten eingefangen und durch ELISA detektiert. a) Barnase-Mutante A, b) Barnase-Mutante B, c) Villin, d) kein Phage.
4. Temperaturdenaturierung der Phagenfusionsproteine. Phagemide wurden mit KM13 ergänzt, Infektiösität (TU/ml) gezeigt nach der Inkubation und Spaltung mit Trypsin bei gegebenen Temperaturen. Fusion mit Villin-Subdomäne (Dreiecke), Barnase-Mutante A (Rauten), Barnase-Mutante B (Quadrate), pHEN1-Chloramphenicol-resistent (Kreise).
5. Der fd-Vektor fd-3. Das Gen für die H102A-Mutante der Barnase wird durch Subklonierung in fd-DOG [43] nach PCR-Amplifikation mit geeigneten Oligonukleotiden unter Verwendung der Restriktionsstellen ApaLI (am Barnase 5'-Ende) und NotI subkloniert, um fd-3 zu erzeugen.
6. Karte des Phagemid-Vektors, der für die Darstellung des Stoffel-Fragments auf der Oberfläche des Phagen verwendet wurde. Das Sternchen zeigt Sequenzen, die zumindest teilweise in den Bibliotheken I und II randomisiert sind.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Auswahl eines richtig gefalteten Fusionspolypeptids, das Schritte umfaßt, bei denen man: (a) eine Vielzahl von Virionen bereit stellt, die ein Repertoire von Fusionspolypeptiden kodieren und darstellen, wobei die Fusionspolypeptide ein heterologes Polypeptid umfassen, das in die Sequenz eines viralen Hüllprotein-Polypeptids eingefügt ist, wobei eine Proteasestelle innerhalb des Fusionspolypeptids lokalisiert ist, und zwar so, dass die Stelle in richtig gefalteten Fusionspolypeptiden vor einer Proteasespaltung geschützt ist und in Fusionspolypeptiden, die nicht richtig gefaltet sind, nicht vor einer Spaltung geschützt ist, und wobei das Repertoire zumindest teilweise ungefaltete und gefaltete Mitglieder umfaßt; (b) die Virionen einer Protease aussetzt, wobei Virionen, die richtig gefaltete Fusionspolypeptide darstellen, resistent gegen die Spaltung durch die Protease sind; und solche, die richtig gefaltete Fusionspolypeptide nicht darstellen, nicht resistent gegen die Spaltung durch die Protease sind; (c) die Virionen vermehrt, die intakte Fusionsproteine umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteasespaltungsstelle in dem heterologen Polypeptid lokalisiert oder benachbart dazu lokalisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteasespaltungsstelle distal zu dem heterologen Polypeptid lokalisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fusionspolypeptid ferner eine selektierbare Markierung umfaßt, wobei die Spaltung die Markierung aus dem Virion entfernt; und Virionen, die die Markierung umfassen, ausgewählt werden, während Virionen, aus denen die Markierung durch Spaltung entfernt wurde, verworfen werden.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Virionen durch Bindung an eine feste Phase mittels einer Markierung abgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Virionen an die feste Phase gebunden werden, bevor sie der Protease ausgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Virionen der Protease ausgesetzt werden, bevor sie an die feste Phase gebunden werden.