JP2002514413A - 選択系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、(a) ウイルスの外被タンパク質ポリペプチドの配列に挿入された異種ポリペプチドからなる融合ポリペプチドをコードしかつ展示するウイルスを提供すること、ただし、該ウイルスは展示されるポリペプチドの内部に配置された切断部位を含むものであること、(b) 該ウイルスを切断剤にさらすこと、(c) 無傷の融合タンパク質を含むウイルスを増殖させること、を含んでなるウイルスの選択方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、ファージ展示系中に展示されたポリペプチドの選択を可能とする選
択系に関する。

【０００２】 ウイルスは、ペプチドおよびタンパク質の展示のために使用されてきた[21, 2
6, 44]。特に、糸状バクテリオファージは、タンパク質およびペプチドの展示の
ために、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とファージの外被タンパ
ク質をコードする遺伝子とを融合させることにより使用されてきた。融合遺伝子
は、融合タンパク質を展示するファージ内で包膜されているので、このことが表
現型と遺伝子型との関連をもたらしている。タンパク質のレパートリーは、ファ
ージの集団によってコードされ、所定の結合活性を有するタンパク質を含む稀な
ファージが固相への結合によって単離される。このようにして、所定の抗原結合
特異性を有する合成ヒト抗体が、異なる構造エレメントから構成された抗体フラ
グメントのレパートリーから選択されてきた[10]。抗体は、抗原と結合するため
には折りたたまれる必要があるので、結合の選択はまた、折りたたみの選択でも
ある。またこの原理は、結合が不連続エピトープによって媒介される場合に、折
りたたまれたペプチドの選択のためにも使用されてきた[8, 11〜13]。

【０００３】 ファージ展示系における問題点とは、所望のポリペプチドを展示しないファー
ジの存在によって引き起こされる高レベルのバックグラウンドの存在である。例
えば、抗体レパートリーは通常、p3タンパク質との融合タンパク質としてファー
ジミドベクター上でコードされ、ヘルパーファージの使用によって包膜される。
ヘルパーファージ外被タンパク質は、抗体と外被タンパク質との融合体（ファー
ジミド上にコードされている）と競合し、折りたたまれた抗体フラグメントの多
価性(multivalent)展示よりはむしろ「一価性(monovalent)」展示を有するファ
ージをもたらす。このことは、ファージ上で展示される抗体の親和力と結合力（
多価性展示の場合）とを区別するのに有用である。しかしながら、ファージの大
多数は、ヘルパーファージ外被タンパク質のみを展示する。この外被タンパク質
は、抗原への「バックグラウンド」結合の一因となる。この場合には、折りたた
まれた抗体を展示するファージを選択し、展示しないファージを排除することが
望ましい。

【０００４】 さらに、現在使用されている前記系の全ては、所望の特性を有するポリペプチ
ドをコードしないファージから、所望の展示ファージを単離するために、選択す
べきポリペプチドの結合活性に依存している。このことは、公知の結合活性を有
する折りたたまれたポリペプチドを選択するために利用し得る展示系に対して制
限を加えるものである。展示されたタンパク質またはポリペプチドを、それらの
結合活性とは無関係に選択するための手段を有することが好ましい。

【０００５】 例えば、折りたたまれたタンパク質をde novoで構築することには、かなりの
関心がある。タンパク質を、二次構造の所定のエレメントの組立て(assembly)に
より、またランダムな配列からde novoで設計するための試みがなされてきた（
総覧は[5]）。いくつかの場合には、設計されたタンパク質は二次構造のエレメ
ントを保持してはいたが、天然のタンパク質の折りたたみに特徴的な、安定した
三次相互作用を有しないことが示されており、このことはモルテングロビュール
(molten globule)の存在を示唆している（[6]およびその中の文献を参照された
い）。既存の主鎖に基づく天然様タンパク質の作成は、より大きな成功を収めた
[7, 8]。これらの場合においては、de novo設計されたタンパク質の結合活性は
不明となるであろう。この場合には、折りたたまれたタンパク質を展示するファ
ージを選択して、展示しないファージを取り除くことが望ましい。

【０００６】 折りたたまれたタンパク質を、細菌中の分解酵素を残存させるそれらの能力に
関してスクリーニングする試みがなされてきたが[16〜18]、そのような方法では
、細菌の増殖や生存が、折りたたまれたタンパク質の機能によらない場合には選
択できない。このように、これらの系は、折りたたまれる能力によって選択する
ことが望まれるポリペプチドのごく少数にのみ適応できるにすぎない。

【０００７】 マイナーなファージ外被タンパク質p3に融合された、タンパク質加水分解に対
して安定であるタグと、p3タンパク質自体との間にペプチド配列を挿入し、続い
てタンパク質加水分解することにより、タンパク質加水分解に対して感受性であ
るペプチド配列を担持するファージを選択する手段が得られることが以前に示さ
れている[19, 米国特許第5,780,279号]。これらの実験において、ファージを、
ファージ上のタンパク質加水分解に安定であるN-末端タグと結合するアフィニテ
ィー樹脂に結合させる。結合したファージをタンパク質加水分解と溶出に付すと
、切断される配列を有するファージのみが溶出される。この方法は、ファージ上
に展示されたレパートリーの中で、プロテアーゼの基質として好適であるアミノ
酸配列を同定するために使用される。導入された配列は短く、個別には折りたた
まれる能力を有しないであろう。さらに、この系は、結合されたファージよりは
むしろ溶出されたファージを特異的に選択する。換言すると、切断されていない
ファージよりもむしろ、切断されたファージを単離するために特異的に構成され
ている。

【０００８】発明の概要 本発明は、所望でないウイルスを排除するために、ペプチド切断を用いる方法
に関するものである。

【０００９】 故に、第一の態様に従っては、本発明はウイルスを選択するための、以下のス
テップ： (a) ウイルスの外被タンパク質ポリペプチドの配列中に挿入された異種ポリペ
プチドからなる融合ポリペプチドをコードしかつ展示するウイルスを提供するこ
と、ただしそのウイルスは展示されるポリペプチドの内部に配置された切断部位
を含むものであること、 (b) そのウイルスを切断剤にさらすこと、 (c) 無傷の融合タンパク質を含むウイルスを増殖させること、 を含んでなる方法を提供する。

【００１０】 本発明によれば、ウイルスは、切断剤を用いる非抵抗性ウイルス粒子の切断に
よって選択され得る。本明細書で用いられる「ウイルス」とは、ウイルス粒子の
感染性接種物を指し、該ウイルス粒子は切断部位を、場合によってはウイルスゲ
ノムにコードされた異種ポリペプチドの一部として取り込み得る。このように、
「ウイルス」は、ポリペプチドのレパートリーをコードし得る複数のウイルス粒
子を意味し得る。または必要に応じて、単一のウイルス粒子を示すために使われ
得る。用語「ウイルス」は、天然で、または遺伝子操作により、切断部位を取り
込み得るあらゆる適当なウイルスを含む。本発明で使用するのに好ましいウイル
スは、バクテリオファージ、好ましくは糸状バクテリオファージである。

【００１１】 用語「ポリペプチド」は、一般的にペプチド結合などにより共有結合で互いに
結合した複数のアミノ酸で構築された分子を意味する。「融合」ポリペプチドと
は本質的に、ウイルス外被タンパク質中に組み込まれたポリペプチドであり、融
合はウイルス外被タンパク質と対象のポリペプチドとの間で生じる。融合により
対象のポリペプチドはウイルス外被タンパク質中に、有利にはそのドメイン間に
組み込まれるか、または該ポリペプチドがウイルス外被タンパク質の一端に配置
され末端融合体を形成する。ポリペプチドは「異種」ポリペプチドと称され、そ
のポリペプチドが挿入されるウイルス外被タンパク質に対して異種であることを
意味する。しかしながら、異種ポリペプチドを、そのウイルスの別のポリペプチ
ドから誘導することも可能である。

【００１２】 1つの意味においては、本明細書では、ポリペプチドは、構造またはサイズの
違いを意味することなしに「タンパク質」と交換可能に使用される。実質的には
、構造ポリペプチド、酵素活性を有するポリペプチドおよび結合活性を有するポ
リペプチド（抗体や抗体フラグメントを含む）を含めて、いかなるポリペプチド
も本発明の方法によって選択され得る。切断部位はポリペプチド中に存在するこ
とができ、天然に存在するものでも、またポリペプチド中もしくはポリペプチド
に結合されたリンカーペプチド中に遺伝子操作で導入されてもよい。「ポリペプ
チド」はまた、本質的に折りたたまれていないポリペプチドであって、かつ切断
部位をコードしこの部位をウイルスの外被タンパク質中に挿入するように機能す
る挿入ポリペプチドも意味する。挿入ポリペプチドは、N-末端またはC-末端融合
体の形を取ってもよく、または外被タンパク質自体の一部を形成してもよい。

【００１３】 「切断部位」とは、切断剤にさらされた際に切断され得る部位である。本発明
においては、プロテアーゼ切断部位（プロテアーゼで切断可能な部位）の使用が
好ましい。プロテアーゼ切断部位は、本発明のポリペプチドの一部となってもよ
く、またはその内部に組み込まれていてもよい。他には、切断部位はウイルスの
外被タンパク質中に独立して組み込まれていてもよい。切断部位の特徴は、本発
明に従う特異的挿入の部位以外にはウイルス中に切断部位が存在しないこと、ま
たは切断のために接近不能であること、または感染を媒介するためのウイルス粒
子の集合(assembly)の後に必要とされないウイルスタンパク質中にのみ存在する
こと、のいずれかである。

【００１４】 本発明によれば、切断部位は、ウイルスの任意の好適な位置に挿入または存在
させることができる。しかしながら、有利には、切断部位は外被タンパク質自体
の中または融合タンパク質の一部を形成する異種ポリペプチドの中に挿入するか
または存在する。

【００１５】 本発明の好ましい態様においては、2以上の切断部位を使用してもよい。例え
ば1つの部位が、ウイルス中に挿入されているかまたは存在することが知られて
いて、もう1つの部位が、知られていないかまたは異種ポリペプチド配列のラン
ダム化に依存していてもよい。特に好ましい実施形態においては、切断部位はプ
ロテアーゼ切断部位および1以上のアミノ酸の側鎖を介して形成された結合（ジ
スルフィド結合など）を含み得る。ジスルフィド結合は、DTTまたはβ-メルカプ
トエタノール等の還元剤によって切断される。

【００１６】 ウイルスがジスルフィド結合を含む場合には、2つのシステイン残基（それら
の側鎖を介してジスルフィド結合を形成する）の間に配置されたプロテアーゼ切
断部位の切断は、ウイルス感染性の喪失にはつながらないであろう。なぜなら、
ジスルフィド結合はウイルスポリペプチドの共有結合を保持し得るからである。

【００１７】 このように、本発明はさらに、ポリペプチド中のジスルフィド結合の存在を同
定する方法を提供する。

【００１８】 逆に、ジスルフィド含有ポリペプチドの選択が望まれていない場合には、ウイ
ルスを、タンパク質加水分解の前または後に還元剤で処理して、プロテアーゼで
切断されてはいるがジスルフィド結合によってまだ保持されているウイルスに起
因するバックグラウンドを取り除くことが有利である。

【００１９】 融合ポリペプチドは、1以上の異種ポリペプチドを含み得る。末端融合体の場
合には、1つのそのような異種ポリペプチドは、タンパク質タグとして機能し、
融合タンパク質を発現するファージの同定を可能にし得るものである。かかる場
合には、切断部位を、タグの内部または近傍に配置し、切断部位の切断によりタ
グが遊離するようにしてもよい。

【００２０】 タグは、本発明の方法によってウイルスを単離するために使用できるリガンド
に対する結合能を有する、どのような適当な化学種であってもよい。従ってタグ
は、本発明の方法で使用される切断剤に対して抵抗性である。タグ/リガンド対
の例としては、バルナーゼ(barnase)/バルスター(barstar)、アビジン/ビオチン
、抗体または抗体フラグメントとリガンド、キレート基とキレート（例えば金属
）等が挙げられる。

【００２１】 以下により詳細に記述される本発明の全ての実施形態において、切断されてい
ないポリペプチドが選択の対象となり、切断されたものは選択ステップにおいて
廃棄される。

【００２２】 好ましくは、本発明のウイルスは、異種ポリペプチドのレパートリーをコード
する。レパートリーとは、ランダムな様式で、または部分的にランダム化された
様式で互いに僅かに異なるメンバー（好ましくはポリペプチド）の集合体である
。好ましくは、ポリペプチドのレパートリーは、ランダム変異または部分的にラ
ンダム化された変異を好ましくは組み込んだ変異体ポリペプチドの集合体である
。本明細書においては、レパートリーは好ましくは10⁴以上のメンバーから成る
。レパートリーは、膨大な数のメンバー（典型的には10⁸〜10¹¹の間、そして可
能性としては10¹⁴またはそれ以上）を含むことが有利である。

【００２３】 異種ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドのレパートリーは、外被タン
パク質中に組み込まれることによりそれをコードするウイルスの表面に、または
そのウイルスを感染させた細胞の表面に、有利に展示される。ウイルスがバクテ
リオファージである場合には、タンパク質はまた、そのバクテリオファージを感
染させた細菌の表面上に展示され得る。

【００２４】 切断部位は、有利には、異種ポリペプチド中またはそれに隣接して配置され、
その結果、切断部位はその異種ポリペプチドの折りたたみにより保護され、そし
て、正しく折りたたまれ得る異種ポリペプチドを選択できるようになっている。
しかしながら、他にも、切断部位は、異種ポリペプチドから離れて配置され得る
。そのような実施形態においては、切断部位は、ファージ展示技術におけるバッ
クグラウンドを減少させるように機能し得る。例えば、ポリペプチドのレパート
リーをコードするファージミドとともに使用されるヘルパーファージに切断部位
を導入すると、宿主細胞への感染の前に切断することによりヘルパーファージを
除去することが可能となる。したがって、「空の」ファージに起因するバックグ
ラウンドが劇的に減少する。故に、有利には、切断部位はウイルス外被タンパク
質中に組み込まれている。

【００２５】 本明細書において言及するとき、ファージミドとは、ウイルス複製配列を含ん
でいるが少なくとも1つのウイルス機能を欠失しているプラスミドクローニング
ベクターである。これは、ファージミドは従来の核酸導入技術によって宿主細胞
中に挿入されて、宿主細胞中でエピソーム状態で存在するであろうが、それらは
ウイルス粒子へと集合してウイルスの感染サイクルを完結することはできない、
ということを意味する。ヘルパーファージは、欠損ウイルス機能を供給し、ファ
ージミドがウイルス粒子へとパッケージングされることを可能にするために使用
される。本発明によれば、ファージミドは、切断部位を組み込んだ異種ポリペプ
チドを有する外被タンパク質融合体をコードし得る。

【００２６】 ヘルパーファージは、ファージミドのウイルス粒子へのパッケージングを可能
とするために、ファージミド中で欠失しているウイルス機能を提供する。本発明
によれば、ヘルパーファージが切断剤（プロテアーゼ等）により切断され得るも
のとするために、ヘルパーファージを改変し得る。本発明の一態様においては、
ヘルパーファージには、「レスキューされた」子孫ファージにおいて切断された
とき、ヘルパーファージ由来の外被タンパク質が感染を媒介できないようにする
切断部位を有する外被タンパク質を組み込んでもよい。

【００２７】 前述のことから明らかなように、本発明の方法においては、切断に抵抗性であ
るウイルスが選択される。有利には、抵抗性のウイルス粒子は、感受性宿主細胞
（細菌宿主細胞等）の感染によって選択されるであろう。切断されたウイルス粒
子は感染性を失っている。他には、リガンドに対するウイルス粒子の結合（例え
ばタグを介するもの）が、ウイルス中の切断部位の保護に依存し、その結果切断
されたウイルスはリガンド/タグ結合によって単離されない。

【００２８】詳細な説明 本発明は、基本的な方法論を応用することが望まれている、意図された手法に
従って、いくつかの方法で構成され得る。ファージ展示技術におけるバックグラ
ウンドを減少させるために、ビリオンの選択的切断を用いる。異種ポリペプチド
を含まないか、または正確な折りたたみが可能でない異種ポリペプチドを発現す
るファージを切断して除去することにより、ファージ展示法の感度を実質的に増
加させ得る。下記の実験の部で示されるように、本発明の方法論を用いると、フ
ァージ展示は、従来法による展示技術では選択しにくいポリペプチドを選択する
ために使用される。

【００２９】 第一の構成においては、ビリオン外被タンパク質中の切断部位の切断を利用し
て、異種ポリペプチドを展示しないファージ、または正しく折りたたまれない異
種ポリペプチドを展示するファージに起因するバックグラウンドを減少させ得る
。展示されたポリペプチドの切断は、本発明によれば、ウイルスの宿主細胞への
感染を損なう結果となる。このように、切断剤にさらしたウイルスを増殖させる
ことにより、切断に抵抗性する展示されたポリペプチドを含むビリオンについて
該ウイルスを富化できる。本明細書では、「損なう」とは、減少することを意味
し、それ故に、影響を受けたウイルスによる宿主細胞への感染を、一部分だけま
たは完全に妨げることを含む。

【００３０】 外被タンパク質は、ウイルスを保持する宿主細胞中で、またはウイルス自体の
表面で切断剤に利用され得るという理由に基づいて切断部位として選択される。
かくして、好ましい実施形態においては、切断可能な外被タンパク質を有するビ
リオンを宿主細胞への感染を媒介できなくするために、ウイルス調製物を切断剤
で処理することができる。あるいは、ウイルスを感染させた細胞は、その細胞内
で働いている切断剤で処理してもよく、それにより、切断可能な外被タンパク質
を有するウイルスのパッケージングが阻止されるであろう。

【００３１】 本発明によれば、選択への言及は、スクリーニングへの言及であると解釈され
得るが、それは、当業者には明らかであるように、同じ方法をファージのスクリ
ーニングに使用し得るからである。

【００３２】 切断部位は、もともと外被タンパク質の一部であってもよいが、好ましくはそ
れらは外被タンパク質内に遺伝子操作により導入される。好ましい切断部位には
プロテアーゼ切断部位が含まれ、それらはポリペプチド中に見出されるか、また
はその配列の必要不可欠な部分として遺伝子操作により導入される。典型的には
、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼによる切断を受けやすいアミノ酸配列
によって規定され得る。例えば、本発明は、プロテアーゼであるトリプシン(Lys
, Argで切断)、キモトリプシン(Phe, Trp, Tyr, Leu)、サーモリシン(小さい脂
肪族残基)、ズブチリシン(小さい脂肪族残基)、Glu-C(Glu)、第Xa因子(Ile/Leu-
Glu-Gly-Arg)、Arg-C(Arg)およびトロンビン、の1種以上によって切断され得る
プロテアーゼ切断部位の使用を含む。

【００３３】 プロテアーゼ切断部位は、切断部位を含む付加的なポリペプチドと外被タンパ
ク質との融合体を構築することにより、ウイルスの外被タンパク質中に組み込み
得る。付加的なポリペプチドは、ウイルス外被タンパク質中のある位置に挿入し
て、機能性のウイルスキャプシドの集合とその後の感染を可能とするが、切断さ
れた場合には感染能力が損なわれるようにすべきである。

【００３４】 従って、外被タンパク質中に組み込まれたプロテアーゼ切断部位が切断されな
いまま残った場合には、ウイルスは機能性ビリオンへと集合することができ、宿
主細胞へ感染する能力を保持している。しかしながら、プロテアーゼ切断部位が
切断されると、ウイルス外被タンパク質の構造は壊され、ウイルスは、宿主細胞
に感染する能力の少なくとも一部を失うであろう。

【００３５】 好ましい実施形態においては、本発明で使用するウイルスは、バクテリオファ
ージ、好ましくは糸状バクテリオファージである。糸状バクテリオファージは、
ファージ展示技術において、ポリペプチドの大規模なレパートリーをコードする
ファージライブラリーからポリペプチドを選択するために幅広く使用されている
。通常は、ポリペプチドのレパートリーは、糸状バクテリオファージのp3タンパ
ク質中に挿入されるが、他の好適ないずれの部位も本発明の範囲内で用いられ得
る。

【００３６】 糸状バクテリオファージのp3タンパク質の場合には、該タンパク質は3つのド
メインから成る。N-末端のD1は、tolA受容体への結合に関与し、D2はF-繊毛への
結合（および感染の媒介）に、D3は該タンパク質のファージ粒子への固着（anch
oring）に関与する。ペプチドおよびタンパク質は、感染性を破壊すること無く
ドメイン境界に挿入できるが[21, 22]、全てのドメインの存在がファージ感染性
に関して必須である[23]。バクテリオファージはタンパク質加水分解に対して抵
抗性である（「基質」ファージとしてのその使用を可能にする[19]）が、プロテ
アーゼ切断部位を含むポリペプチドのp3（例えば、ドメイン間接合部への導入は
、タンパク質加水分解の際のファージの感染性の低下へと至らせる。

【００３７】 プロテアーゼ切断部位を、異種ポリペプチド中に組み込んでもよい。上記の通
り、異種ポリペプチドは、ファージライブラリー中のレパートリーの形態でコー
ドされ得る。折りたたまれたポリペプチドまたはタンパク質は、しばしばタンパ
ク質加水分解に対して抵抗性であり、そしてほぐされたタンパク質は感受性であ
るので、切断のためには、ポリペプチド鎖がプロテアーゼ活性部位の特定の立体
構造に結合し、適応する必要があり、それ故に、フレキシブルかつ接近可能であ
り、部分的なほぐれ(unfolding)が可能である必要がある[14, 15]。p3のドメイ
ン接合部にプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチドをクローニングし、続いて
タンパク質加水分解を行うことが、タンパク質加水分解に抵抗性で折りたたまれ
たタンパク質を担持するファージの選択手段を提供する。

【００３８】 ファージミドベクター上にコードされたファージ展示ライブラリー（選択すべ
きポリペプチドはp3のN-末端にクローン化されている）の場合には、ドメイン境
界にプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチドを含有するヘルパーファージを使
用し、続いてタンパク質加水分解を行うことが、「ヘルプ」の提供された後でヘ
ルパーファージを除去することによる、融合タンパク質を展示するファージの選
択手段を提供する。

【００３９】 プロテアーゼ切断可能なヘルパーを使用し、続いてプロテアーゼ切断を行うこ
とにより、融合タンパク質を担持するファージ（および良好な展示）が選択され
る。レパートリー中の多くのファージは融合タンパク質を展示せず[26]、またこ
れらはファージの非特異的結合の一因であるので、これはまた、選択効率を改善
するはずである。従来技術を用いた場合には、ファージライブラリー中の全ファ
ージ粒子の僅か0.1〜1%のみが、ファージミドに由来する遺伝子3タンパク質を含
むにすぎない。従って、選択に用いた固相支持体に非特異的に結合したファージ
粒子の大多数(99〜99.9%)は、ヘルパーファージ由来のp3を含有しており(ファー
ジミドDNAである可能性が大きいファージ粒子に担持されたゲノムに関係ない)、
これらの粒子はタンパク質加水分解切断により非感染性とされる。

【００４０】 第三の実施形態によれば、この選択法は、相互作用性のタンパク質エレメント
の同定のために使用し得る。プロテアーゼ切断部位を有するポリペプチドによっ
て結合された2つの該エレメントが、ファージ上の展示のためにD2ドメインとD3
ドメインとの間にクローン化されると、タンパク質加水分解後に感染性であるフ
ァージは、相互作用性タンパク質エレメント間の非共有結合性相互作用により、
D2ドメインとD3ドメインが一緒に保持されているファージのみである。従って本
発明は、選択されたポリペプチドまたは第二のポリペプチドのレパートリーとの
相互作用能力に関して、ポリペプチドのレパートリーを選択することを可能とす
る。2-ハイブリッド系とは異なり、本発明は、非相互作用性エレメントの解離を
当てにしており、選択ステップにおける相互作用性エレメントの会合とははっき
りと区別される。さらに、本発明は、選択の度合いを著しく増加させるためにフ
ァージ展示の力を利用することを可能とする。

【００４１】 本発明は、場合により、切断部位を切断するにあたって、切断剤の存在下で切
断部位の不安定さをモジュレートする条件や薬剤を使用することを含む。このア
プローチは、例えば切断剤による接近から切断部位を厳重に保護するような様式
で折りたたまれているポリペプチドのみを選択する目的で、切断を強化するため
に、または、例えば切断条件下で通常は比較的不安定であるポリペプチドのレパ
ートリーから安定な変異体を選択する目的で、切断を弱めるために使用し得る。

【００４２】 例えば、切断部位の不安定さのモジュレーションは、かかる不安定さを増加ま
たは減少させる薬剤の使用によって実現される。こうして、タンパク質変性剤を
、好適な濃度で、ポリペプチドを脱安定化しかつより不安定なものとするために
加えてもよい。あるいは、ポリペプチドに対するリガンドを加えてもよい。リガ
ンドは、折りたたまれたポリペプチドの構造を安定化させ、切断に対する感受性
を減少させ得る。あるいは、リガンドは、例えば別の立体配置をとることを支持
することにより、ポリペプチドの折りたたまれた構造を脱安定化し得る。これに
より、ポリペプチドを切断剤に対してより接近しやすいように、それ故により不
安定にすることができる。

【００４３】 更なる実施形態においては、切断工程の条件をいろいろに変えることができ、
例えば、同様の効果をもたらすために、切断を行うpHまたは温度を操作する。こ
うして、切断部位を含むポリペプチドの至適pH値からpHを逸脱させると、切断部
位が切断剤に対してより接近しやすくなる。同様に、ポリペプチドの切断を行う
条件の温度を上げる（または下げる）と、ポリペプチドが切断をより受けやすく
またはより受けにくくなる。

【００４４】 いくつかの場合においては、切断部位の切断が成功した後であっても、非共有
結合的相互作用が原因で、ペプチドがその構造を保持し、外被タンパク質が依然
として生存している。変性剤の使用、温度の変化および他の脱安定化させる可能
性のある技術もまた、切断されたポリペプチドがその構造を保持する可能性を減
少させるために使用し得る。

【００４５】 タンパク質の折りたたみについての、タンパク質加水分解による選択は、数多
くの領域で応用され得る。それは、従来のスクリーニング法よりも遥かに膨大な
数のタンパク質を処理できるからである。例えば、安定性が向上した変異体タン
パク質[1]を、例えばいくつかの部位の残基を同時に変化させた変異体のコンビ
ナトリアルライブラリー[39, 40]から、またはランダム変異体から、または組換
え[3, 4]により単離することが可能となる。また、新規タンパク質および構造を
、多数の配列のレパートリー[16〜18, 41]から単離することが可能であり、そし
て、抗体の親和性の成熟化に酷似した、突然変異および次第に高いストリンジェ
ンシーの選択を数ラウンド行って、折りたたみの安定性を向上させることも可能
となる。

【００４６】 本発明の第二の構成は、正確に折りたたまれた異種ポリペプチドの単離を可能
とするためのタグの使用に関する。これは、正確に折りたたまれたポリペプチド
の、結合したタグ上またはその近傍にある切断部位を保護する能力を利用するも
のである。

【００４７】 ウイルス外被タンパク質のN-末端に融合された安定なタグと、外被タンパク質
自体との間にポリペプチドを挿入し、続いて切断することは、タンパク質加水分
解に抵抗性する折りたたまれたタンパク質を担持するウイルスの選択手段を提供
する。こうして、挿入ポリペプチドが分解されていないビリオンのみが、その外
被の一部としてタグ融合体を保持し、そしてそれ故に、これらのビリオンのみが
、該タグを用いたアフィニティー精製により捕捉される。リガンドからアフィニ
ティー捕捉された相を溶出させた後、これらのファージを増殖させ、同じ選択手
順の更なるラウンドに付すことができる。

【００４８】 あるいはまた、ビリオンを切断の前に、タグに対するリガンドを含むアフィニ
ティーマトリックスに結合させることができる。続いて切断剤を添加すると、抵
抗性ファージのみがマトリックス上に残存する。その後、これらを必要に応じて
溶出させる。

【００４９】 好適なマトリックスには、タグに対するリガンドを結合させたカラム、ビーズ
、および他の表面が含まれる。

【００５０】 本発明によれば、選択への言及は、スクリーニングへの言及として解釈し得る
。なぜなら、当業者には明らかであるように、同じ工程をファージのスクリーニ
ングのために使用し得るからである。

【００５１】 切断部位は実質的に、本発明の前の構成において記述した通りであり、プロテ
アーゼ切断可能な部位であることが有利である。

【００５２】 切断のためには、ポリペプチド鎖が、プロテアーゼ活性部位の特定の立体構造
に結合し適応することが必要であり、それ故に、フレキシブルで接近可能であり
、部分的なほぐれが可能である必要がある[14, 15]。折りたたまれたポリペプチ
ドまたはタンパク質は、その構造が相対的にフレキシブルではないためタンパク
質加水分解に対して抵抗性であることが多いが、その一方でほぐされたタンパク
質は感受性のままである。

【００５３】 上述の通り、改変または突然変異を介して本発明で使用する特定のプロテアー
ゼのいずれの認識配列も含まないポリペプチドを、レパートリーから選択するこ
とが起こり得るが、これは2つの方法で回避し得る。例えば、全く異なる認識配
列を有するプロテアーゼのカクテルの使用により、折りたたみの状態により保護
されていない場合は、全てのポリペプチドが確実に切断されるであろう。あるい
は、選択されるべきポリペプチドのファージレパートリーは、挿入ポリペプチド
がほぐれるがファージとN-末端タグは無傷のままであるように、部分的に変性す
ることができるだろう。タンパク質加水分解と、その後のアフィニティー精製に
より、ポリペプチド中のプロテアーゼ認識配列の欠如によりタンパク質加水分解
から逃れた、全てのファージがレパートリーから除去されるであろう。樹脂に結
合しなかったファージには、展示されたポリペプチド中にプロテアーゼ認識配列
を含み、かつ非変性条件下ではタンパク質加水分解を回避するかまたは回避しな
いファージのみが含まれる。こうして、これらを、展示されたポリペプチドの折
りたたみの状態による保護に基づいた、タンパク質加水分解選択に付すことがで
きる。

【００５４】 選択工程はまた、相互作用性タンパク質エレメントの同定にも使用し得る。従
って、プロテアーゼ切断部位を有するポリペプチドによって結合した2つのエレ
メントが、タンパク質加水分解に対して安定な、ファージ上の展示のためのN-末
端タグと外被タンパク質との間にクローン化された場合には、タンパク質加水分
解の後でタグへのアフィニティー結合を介して捕捉され得るファージは、相互作
用性タンパク質エレメント間の非共有結合性相互作用によってタグとp3タンパク
質が一緒に保持されているファージのみである。

【００５５】 本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、実施例は例示にすぎない。

【００５６】実施例１ 糸状ファージのタンパク質加水分解に対する抵抗性 実施例１〜６についての「材料および方法」を、実施例６の最後に添付する。

【００５７】 ファージを一連の変性条件下、in vitroでインキュベートし、続いて細菌感染
の直前に非変性条件に戻した。10 M尿素中、または極値的なpH（pH ２程度に低
いか、pH 12程度に高い）および極値的な温度（60℃の高さ）でのファージのイ
ンキュベーションは、感染力の重大な低下につながらなかった（表1）。これは
、ファージが変性条件に抵抗すること、またはほぐれてもすぐに再び折りたたま
れうることのいずれかを示す。しかし、GndHClを用いると、ファージの感染力が
、5 M以上で1/5に低下し、8 Mではさらに1/5に低下するのが観察される（表 1)
。

【００５８】 続いてファージを、非変性条件下、異なる特異性を有する数種のプロテアーゼ
（トリプシン、第Xa因子、IgAプロテアーゼ、Asp-N、キモトリプシン、Arg-C、G
lu-C、トロンビン、サーモリシン、ズブチリシン)とともにインキュベートする
。p3タンパク質を切断することが報告されているズブチリシン[24]の場合を除い
て、感染力の低下は見られなった。トリンプシンなどのプロテアーゼの存在下、
尿素3.5 M（または47℃以上）の変性条件下でファージをインキュベートすると
、感染力が低下する。これは、変性条件下においては、ファージ外被タンパク質
が、タンパク質加水分解されうる部位を作るのに十分なまでにほぐされたことを
示す。

【００５９】実施例２ プロテアーゼ切断部位を有するファージの構築 いくつかのタンパク質加水分解部位を含む配列(PAGLSEGSTIEGRGAHE)を、ファ
ージp3のD2とD3ドメイン間のグリシンに富んだフレキシブルな領域に挿入する。
ファージ(fd-K108)を非変性条件下において、トリプシン、サーモリシンまたは
ズブチリシンとともにインキュベートすると、今回は感染力がほぼ完全に喪失し
（10⁷ TU/mlから10 TU/ml未満になる）、Glu-Cおよびキモトリプシンとともにイ
ンキュベートすると、感染力の重大な低下がもたらされる（10⁷ TU/mlから10⁴ T
U/mlになる）。このことは、これらのプロテアーゼが新たなリンカーを切断する
ことを示す。しかし、第Xa因子、Arg-Cまたはトロンビンとともにインキュベー
トしても、これらの酵素に対する切断部位となりうる部位が存在するにもかかわ
らず、感染力の低下にはつながらなかった。おそらく、本発明のポリペプチドの
場合、D2およびD3ドメインの存在がこれらの酵素の接近または切断をブロックす
るのだろう。

【００６０】実施例3 プロテアーゼで切断可能なヘルパーファージおよびファージミドの構築 タンパク質のp3への融合は、該タンパク質のファージ上への多価性の展示をも
たらすはずである。しかし、タンパク質をファージミド(pHEN1など[25])によっ
てコードされるp3に融合し、ファージミドを担う細菌をヘルパーファージ（VCSM
13など）でレスキューする場合、該融合タンパク質はファージへの取り込みにつ
いてヘルパーp3と競合しなければならない。このことにより、各ファージ粒子に
結合した融合タンパク質のコピー数が通常1つ未満である、いわゆる「単量体性(
monomeric)」ファージがもたらされる[26]。 「単量体性」ファージの使用は、高親和性相互作用の選択に対して有利である
と期待できるかもしれない。さらに、「単量体性」ファージ内の融合タンパク質
は、融合タンパク質の多量体間の相互作用が避けられるので、タンパク質加水分
解を受けやすいはずである。しかし、不利な点は、感染性ファージの大部分がタ
ンパク質を展示しないことである。固相に非特異的に結合するこのようなファー
ジは、各ラウンドごとのファージ増殖の間に増幅される。

【００６１】 従って、D2ドメインとD3ドメインの間にプロテアーゼ切断可能な配列を導入し
てヘルパーファージKM13を作成することにより、プロテアーゼで切断可能なヘル
パーファージを構築する。

【００６２】表 1 種々の条件下における野生型fd-DOGの安定性 感染力(TU/ml x 10¹⁰)が測
定され（「材料と方法」を参照）、それは約±６％の推定誤差を有する。

【００６３】

【００６４】 KM13は、ファージミドpHEN1をレスキューすることが示されている。さらに、
ウェスタンブロットおよび抗D3mAbでの検出によって示されるように（図１）、
トリプシンはレスキューされたファージのp3の主部分（約50％）を切断すること
が示されている。しかし、ファージの感染力は切断によってはほとんど変化せず
、このことから、細菌感染を媒介するためには、p3の一部のみが完全な形であれ
ばよいと思われる。

【００６５】 KM13はまた、1本鎖抗体フラグメントをコードするpHEN1ファージミドをもレス
キューすることが示されている[27]。ここで、トリプシンによる切断はファージ
の感染力を1/50に低下させ(データは示さない)、これはヘルパーファージでレス
キューする場合には該ファージのほんの一部が融合タンパク質を発現するにすぎ
ないいう指摘[26,28]と一致する。

【００６６】 また、プロテアーゼで切断可能なファージミドを構築する。該ファージミドは
KM13またはVCSM13でレスキューできる。予想されたように、KM13（VCSM13ではな
い）でレスキューされたこのファージミドの感染力は、トリプシンで破壊される
。このファージミドベクターは、D2-D3リンカーにおいて欠失を起こしやすい。
リンカー領域におけるコドン使用頻度をプロテアーゼ切断部位の両側で変化させ
、かつこれらのリンカー領域の長さを短縮することによって、より安定なベクタ
ーを構築する(pKl; 図 2)。第2のベクター(pK2; 図 2)においては、D3をフレー
ムの外に置くようにポリリンカーの配列を配置して、ポリリンカー内に再ライゲ
ートされたものを非感染性にする。

【００６７】実施例４ プロテアーゼで切断可能なヘルパーファージを用いたファージ抗体ライブラリー の構築 細菌を、p3のN末端に融合したscFVフラグメントのレパートリーをコードする
ファージミドDNAとともにエレクトロポレーションにかけ、液体培地（2xTY、フ
ァージミドを含有する細菌を選択するための抗生物質、および遺伝子３の発現を
抑制するためのグルコースを含む）中で増殖させる。細菌増殖の中間対数増殖期
(OD600 = 0.5)で、ヘルパーファージKM13を、ヘルパーファージと細菌の比が20:
1になるように細菌に添加した。細菌を振とうさせることなく45分間、37℃にて
インキュベートし、次の45分間は振とうさせてインキュベートした。細菌を遠心
によって回収し、ファージミドDNAの存在について選択するために、50μg/mlの
カナマイシンおよび抗生物質を含有するがグルコースは含有しない新鮮な培地に
再懸濁する。この培養物を振とうしながら30℃で一夜増殖させる。

【００６８】 遠心によりファージを含有する上清から細菌を取り除く。1/5容の20% PEG/2.5
M NaClを添加することにより、上清からファージを沈殿させる。4℃にて1〜2時
間経過後、沈殿したファージを遠心により回収する。該ファージをPBS中に再懸
濁して（2回目のPEG沈殿は任意である）選択に使用することができる。

【００６９】 ファージのライブラリーを抗原に結合できるようにする（該抗原はイムノチュ
ーブなどの固相支持体上に固定化されるか、または溶液中にあって、ファージ抗
体のアフィニティー結合後に固定化され得るタグを付した（すなわちビオチン化
した）抗原に結合する）。未結合のファージは、徹底的に洗浄することによって
取り除く（洗浄のストリンジェンシーは時間および添加する界面活性剤によって
変更できる）。

【００７０】 該抗体と遺伝子３の間に挿入された、c-mycタグなどの切断可能なタグを含む
ファージライブラリーは、0.1〜1 mg/mlの濃度で溶解したトリプシンを添加する
ことによって溶出することができる。（抗体と遺伝子３の間に切断可能な配列を
もたないファージライブラリーは100mMのトリエチルアミンを添加することによ
って溶出することができる。この場合、該溶液を1M Tris-HCl pH 7.4を添加して
中和し、10分後にトリプシンを最終濃度が0.1〜1 mg/mlになるように添加する。
）トリプシンはまた、ヘルパーファージ由来の遺伝子3のコピーも切断するが、
一方、ファージミド由来の遺伝子３は無傷のまま残る。従って、抗体融合体を担
持していたファージ、または抗体融合体をなお担持しているファージのみが感染
性となる。

【００７１】 ファージを用いて中間対数増殖期(OD600 = 0.5)の細菌に感染させ、該細菌を
ファージミドDNAを選択する抗生物質を含有する寒天プレートで培養する。個々
のクローンを取り、上記のようにファージを調製した。得られたファージをELIS
A中で用いて、目的の抗原に特異的に結合するファージ抗体を同定する。

【００７２】実施例５ モデルとしてバルナーゼ（barnase)を用いた折りたたみの選択 バルナーゼは110個のアミノ酸残基からなる小さなRNaseであり、その折りたた
みについて詳細に研究されている（検討のためには［２］）。バルナーぜは複数
のトリプシン切断部位を有するが、その折りたたまれたタンパク質は切断に抵抗
する（データ示さず）。従って、D2とD3の間にバルナーゼをクローン化したファ
ージは、プロテアーゼ切断に抵抗し、選択可能である。

【００７３】 バルナーゼは大腸菌にとって有毒なので、触媒として不活性であるが安定な[2
9,30]突然変異体A(Hisl02→Ala)をファージミドpK2中にクローン化する。安定性
のより低い突然変異体B(His102→Ala, Leul4→Ala)もまたクローン化する。Leul
4は疎水性コア中に埋もれており、その突然変異はコア中に大きな空洞を作り出
して様々な構造要素のパッキングに影響を及ぼす[31]。ファージ（KM13でレスキ
ューされたもの）は、ELISAによって阻害剤バルスター（barstar）に結合し (図
3)、そのため、突然変異体バルナーゼを折りたたまれた形態で展示する。

【００７４】 次に、該ファージを一連の温度で、トリプシンとともにインキュベートする(
図4)。10℃でインキュベートした後、突然変異体の双方においてファージ感染力
が1/5〜1/10に低減し、これは（上記のscFVフラグメントの展示と同様に）ほん
の一部のファージが融合タンパク質を展示するにすぎないことを示唆している。
30℃（突然変異体Bに関して)または37℃（突然変異体Aに関して）までの切断で
はさらなる感染力の低下はなかった。双方の場合において、主な移行（トランジ
ション）は、突然変異体の可逆的な熱によるほぐれ（unfolding）について期待
されるものより、少なくとも10℃低い温度でおこる。

【００７５】 ファージAおよびBを異なる割合で混合し、トリプシンとともに、突然変異体の
双方が切断に対して安定である20℃にて、またはAのみが安定であるような37℃
にてインキュベートする。「タンパク質加水分解による選択」のあと、該ファー
ジをプレートし、PCRで分析する。その後、突然変異体を識別するために制限消
化を行う。表2に示すように、突然変異体Aは、37℃でのタンパク質加水分解選択
の1ラウンドの後に1.6 x 10⁴倍に濃縮され、2ラウンドの後に、1.3 x 10⁶倍に濃
縮される。20℃では、濃縮は全く認められない。

【００７６】実施例６ モデルとしてビリン(villin)を用いた折りたたみの選択 f-アクチン-束形成タンパク質であるビリン[32]のヘッドピース(headpiece)ド
メインの35アミノ酸からなるサブドメインは、バルナーゼよりもずっと小さい。
それにもかかわらず、該サブドメインは室温で安定な折りたたみを形成し、タン
パク質加水分解に抵抗する。さらに、その安定性はジスルフィド結合または結合
リガンドに起因するものではない[33]。該ビリンサブドメイン（潜在的トリプシ
ン切断部位をいくつか含む）をファージのD2とD3ドメインの間にクローン化し、
種々の温度でトリプシンとともにインキュベートする。感染力低下の様相はバル
ナーゼの場合ほどシャープではなく、主な移行（トランジション）は35℃以下で
あり、ビリンの熱によるほぐれ（70℃）よりもかなり低い[32,33]。ビリンを展
示するファージを、ファージミドpK1およびヘルパーファージKM13を用いて作製
したファージと混合し、トリプシンとともにインキュベートする。1ラウンドの
タンパク質加水分解選択の後、ビリン融合タンパク質は8.7 x 10³倍に濃縮され
る(表 3)。

【００７７】 まとめると、実施例１および２から得られる結果は、ファージの感染力は温度
、pH、尿素およびGndHCl、ならびにいくつかのプロテアーゼに対して比較的抵抗
性があるが、プロテアーゼ切断部位を有するフレキシブルなリンカーをファージ
外被タンパク質p3のドメインD2とD3の間に挿入すると、該ファージは切断されや
すくなることを示す。対照的に、実施例５および６に示すように、プロテアーゼ
切断部位がバルナーゼまたはビリンのような折りたたまれたタンパク質ドメイン
を含有する場合、ファージは切断に抵抗する。これにより、タンパク質折りたた
みについてのタンパク質加水分解による選択が、1ラウンドの選択につき10⁴倍以
上の濃縮率で可能になる。選択は、バルナーゼ（110アミノ酸からなる平均的サ
イズ[34]のドメイン）およびビリン（35アミノ酸からなる小さなドメイン）の双
方に対して明白である。

【００７８】 異なる安定性を有する構造間の識別は、タンパク質加水分解選択のストリンジ
ェンシーを高めることによって達成できる。従って、温度を上昇させると、バル
ナーゼおよびビリンの双方が切断を受けやすくなり、これはタンパク質がほぐれ
たことを反映している。しかし、プロテアーゼ切断の主要な影響は、円偏光二色
性（CD)によって測定するときに、ほぐれた状態への移行（トランジション）よ
りも低い温度で生じる[38]。これは、ほぐれた状態への移行が完全に可逆的なプ
ロセスである一方で、プロテアーゼによる（ほぐれた構造の）切断が速度論的か
つ不可逆的な過程であり、折りたたまれた構造からほぐれた（そして切断される
）構造への平衡が片側に寄るという事実を反映しているのかもしれない。これは
、CDによって見られるビリンのほぐれた状態への移行 [33]と一致し、35℃程度
（ビリンがプロテアーゼの攻撃を受けやすくなり始めるのと同じ温度）の低い温
度でほぐされた形跡がある。

【００７９】表2 バルナーゼ突然変異体の選択 1:1〜1:10⁸の比のバルナーゼ突然変異体(A+B)の混合物を37℃でのタンパク質
加水分解によって選択した。24個（または2ラウンドでは36個)のファージクロー
ンを分析し、各突然変異体の数を上に記した。^a突然変異体の双方が安定である
と思われる20℃での選択、^b選択前。

【００８０】

【００８１】表3 ビリンの選択 ビリンファージとKM13でレスキューしたpK1を1:1〜1:10⁶の比で混合したもの
を10℃でのタンパク質加水分解によって選択した。24個のファージクローンを分
析し、それぞれの数を上に記した。^a選択前。

【００８２】

【００８３】表4 プライマー配列

【００８４】材料および方法（実施例１〜６） 材料 全ての制限酵素、T4リガーゼは、New England Biolabsから取得したものであ
る。Taq DNAポリメラーゼは、HT Biotechnologyから取得したものである。Pfu D
NAポリメラーゼは、Stratageneから取得したものである。Ultrapure dNTPは、Ph
armaciaから取得したものである。プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤Pefab
locは、Boehringer Mannheimから取得したものである(ただし、TPCK処理したト
リプシンおよびキモトリプシンはSigmaから入手した)。他の全ての化学薬品は、
同様にSigmaから取得したものである。

【００８５】 ファージの調製 ファージのクローニングおよび増殖には、大腸菌TG1[42]を用いる。fd-DOG[43
]またはその誘導体を有するTG1を、15μg/mlのテトラサイクリンを含有する2xTY
中で一晩増殖させる。[27]に記載の如く、KM13またはVCSM13を用いてファージミ
ドをレスキューする。2回のPEG沈降[44]により、ファージ粒子を調製する。

【００８６】 ベクターの構築 ファージベクターfd-DOG[43]を、プロテアーゼ切断可能なfd-K108の構築のた
めの親ベクターとして用いる。ユニークな制限部位(SfiI、KpnI)を、Sculptor i
n vitro 突然変異誘発システム(Amersham)およびオリゴヌクレオチドpkリンカー
を用いて、D2とD3との間のグリシンに富むスペーサー領域中に導入する(表４)。
さらに、制限部位(ApaI、SalI)およびプロテアーゼ切断部位をコードする配列を
、オリゴヌクレオチドpolyXaforおよびpolyXabackを用いてSfiIとKpnI部位との
間にクローニングし、ベクターfd-K108を作製する。

【００８７】 ヘルパーファージVCSM13中に、PCRならびにプライマーfdPCRBackおよびLIBSEQ
forにより作製したBamHI-ClaI断片を移植することにより、fd-K108からプロテア
ーゼ切断可能なヘルパーファージKM13を調製する。

【００８８】 pCANTAB 3 (Pharmacia)を用いる以外は上記と同様に、fd-K108からプロテアー
ゼ切断可能なファージミドベクターを誘導する。PCRならびにプライマーFlagpri
merおよびLSPAbackにより作製したNotI-SfiI断片のクローニングにより、D1のN
末端にFLAG-タグを導入する。D2-D3リンカー中の反復配列に起因する欠失を防ぐ
ため、ポリリンカー領域のコドンの出現頻度を２ステップで変える。すなわち、
(a)PCRならびにプライマーRECGLYforおよびLIBSEQforにより作製したBam-SfiI断
片を用いて、PCRならびにプライマーLSPAforおよびLSPAbackにより組換え体をス
クリーニングする、(b)PCRならびにプライマーRECGLYbackおよびLIBSEQbackによ
り作製したKpnI-ClaI断片を用いて、LSPAforおよびLSPAbackにより組換え体をス
クリーニングする。得られるベクターは、pK1である。蛍光ジデオキシチェーン
ターミネーター(Applied Biosystems)[45]を用いるPCRサイクル配列決定法を用
いて、p3遺伝子全体の配列を決定する。オリゴdelCKpnおよびSculptor Amersham
kitを用いる部位特異的突然変異誘発により、pK1から「フレーム外」ベクターp
K2を誘導する。pK1およびpK2の正確な配列は、Kristensenら、(1998) Folding &
Design 3: 321-328に記載されている。

【００８９】 バルナーゼ(barnase)およびビリン(villin)のクローニング プライマーBarnaseforおよびBarnaseH102AbackならびにPfuポリメラーゼを用
いるPCR増幅のための鋳型として、単一バルナーゼ変異体、His102→AlaおよびLe
u14→Ala[29, 46]をコードするベクターを用いる。得られるPCR産物(単一変異体
、His102→Alaをコードするものと２重変異体、His102→Ala、Leu14→Alaをコー
ドするもの)を、制限酵素SfiIおよびKpnIを用いて消化し、ベクターpK2に連結し
、それぞれファージミドpK2BAおよびpK2BBを得る。得られるバルナーゼ遺伝子の
配列を、PCRサイクル配列決定法により決定する。

【００９０】 f-アクチン結合タンパク質ビリン[33]の頭部の35アミノ酸の熱安定性断片を、
PCRプライマーvillinforおよびvillinbackならびにPfuポリメラーゼを用いて、
ニワトリ滑液嚢cDNAから増幅する。得られるPCR産物を上記の如くクローニング
し、ファージミドpK2Vを得る。

【００９１】 変性剤、pHおよびプロテアーゼに対するファージの抵抗性 変性剤に対する抵抗性については、PBS(25 mM NaH₂PO₄、125 mM NaCl pH 7.0)
中の10 M尿素、または8 M GndHCl(塩酸グアニジン)および50 mM Tris-HCl pH 7.
4、1 mM CaCl₂(バッファーA)を、10μlのファージ保存液(10⁸〜10¹⁰TU)に加え、
容量を1 mlとする。その条件は表１に明記してある。ファージを1〜2時間インキ
ュベートし、次いで100μlのアリコートを1 mlのTG1(OD600 約0.5)に加え、連続
希釈物を、15μg/mlのテトラサイクリンを含有するTYEプレートで培養する。極
端なpH(2〜12)に対するファージの抵抗性については、TrisグリシンまたはTris
HClバッファー(それぞれ0.1 M グリシンまたは0.1 M Tris)を、10μlのファージ
保存液に加える。各100μlのアリコートを中和するために、感染前に50μlの1 M
Tris-HCl pH 7.4を加えた。温度に対する抵抗性については、バッファーAを10
μlのファージ保存液に加え、容量を1 mlとし、所与の温度(20〜60℃)で1時間イ
ンキュベートする。100μlのアリコートをTG1に加え、上記の如く培養する。プ
ロテアーゼに対する抵抗性については、100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、1 mM Ca
Cl₂ pH 7.4 (100 ng/mlのXa因子もしくはトリプシン、キモトリプシン、トロン
ビン、サーモリシンおよびズブチリシン、全て100μg/ml)または50 mM Tris-HCl
、1 mM EDTA pH 7.4 (IgAプロテアーゼ 10 ng/ml)または50 mM NH₄CO₃ pH 8.0 (
Arg-C 100μg/ml、Glu-C 100μg/ml)または25 mM NaH₂PO₄、125 mM NaCl pH 7.0
(AspN 40 ng/ml)を、10μlのファージ保存液(fd-DOGおよびfd-K108)に加え、容
量を100μlとし、プロテアーゼの最終濃度を示したとおりにする。消化物を室温
にて15分間インキュベートし、次いでサンプル(100μl)を上記の如くTG1に感染
させる。

【００９２】 変性剤の存在下におけるプロテアーゼに対する抵抗性については、尿素および
温度変性に関して上記したようにサンプルを調製する。90μlのアリコートに10
μlのトリプシン(1 mg/ml)を加え、室温にて5分後、4μlのPefabloc(100 mM)を
加えてサンプルを上記の如くTG1中に感染させる。

【００９３】 ウェスタンブロット ファージ(KM13を用いてレスキューしたpHEN1およびVCSM13を用いてレスキュー
したpK1)を、トリプシン(50 ng/ml)による切断の前後にSDS-PAGE[47]にかける。
PVDFメンブランに半乾燥移行した後のフィルターは、本質的に[27]に記載の如く
処理する。1次抗体、モノクローナル抗gIII(MoBiTec)を、1:5000の希釈率で加え
、次いで抗マウスHRP結合抗体(Sigma)を1:50000の希釈率で加える。最後に、ル
ミノールに基づくChemiluminescence Western Blottingキット(Boehringer Mann
heim)を用いて、フィルターを現像する。

【００９４】 ELISA RNase阻害剤バースター(barstar)への結合について、[44]に記載の如くファー
ジ展示バルナーゼ変異体を分析する。10 pmolのビオチン化バースターを、バル
ナーゼ変異体Aもしくはバルナーゼ変異体Bまたはビリンを展示する約10¹⁰個のフ
ァージあるいはバッファーAと混合する。バースターに結合するファージを、ス
トレプトアビジン被覆プレート(Boehringer Mannheim)上に捕捉し、HRP結合抗M1
3抗体(Pharmacia)および2,2'-アジノ‐ビス(3‐エチルベンズチアゾリン‐6‐ス
ルホン酸)(Sigma)を用いて発色させる。吸光度の読み取りは405 nmで行う。

【００９５】 温度変性 各温度で、バルナーゼ変異体またはビリンを展示する約10¹⁰個のファージ(ア
ンピシリン抵抗性)を、切断可能な対照fd-K108(テトラサイクリン抵抗性)および
切断不可能な対照ファージミドであるKM13によりレスキューしたpHEN1のクロラ
ムフェニコール抵抗性誘導体と、総容量90μlのバッファーA中で混合した。示し
た温度にて20〜30分間平衡化させた後、10μlのトリプシン(5μg/ml)を加え、イ
ンキュベーションをさらに２分間続ける。4μlの100 mM Pefablocを加えてトリ
プシンを中和する。TG-1において、上記の如く感染および連続希釈を実施し、ア
リコートを、100μg/mlのアンピシリン＋1%グルコース、30μg/mlのクロラムフ
ェニコール＋1%グルコース、または15μg/mlのテトラサイクリンを含有するTYE
プレートで培養する。

【００９６】 選択実験 バルナーゼ変異ファージAの10μlの連続希釈液を、70μlのバッファーA中で10
μlの非希釈バルナーゼ変異ファージBと混合する。20℃または30℃で30分間イン
キュベートした後、10μlのトリプシン(5μg/ml)を加える。２分の消化後、4μl
のPefabloc(100 mM)を加える。上記の如く、ファージをTG1に感染させる。3 ml
の2xTY中で細菌を擦り取って選択の第２ラウンドを実施し、その50μlを50 mlの
2xTY/Amp/Glu中に接種して、上記の如くファージミドをレスキューし、ファージ
を調製する。プライマーLSPAforおよびLSPAbackを用いるPCRによりクローンを分
析し、次いでDdeIを用いて制限消化する。

【００９７】 pK2VとpK1ファージ粒子との間の選択を、上記の如く実施する(ただし、選択を
10℃で実施する)。プライマーLSPAforおよびLSPAbackを用いるPCRによりクロー
ンを分析する。

【００９８】実施例７ シグナル配列の選択のためのプロテアーゼ切断可能ヘルパーファージの使用 タンパク質の転位は、シグナルペプチドにより指令される[48]。これらは、正
に荷電したアミノ末端領域、疎水性配列、およびシグナルペプチダーゼ切断部位
を含むカルボキシ末端領域などの共通の特徴を有することが知られている。シグ
ナルペプチドは、「タンパク質間相互作用およびタンパク質‐脂質相互作用のア
レイ」に関与する[49]。さらに、シグナルペプチドは、タンパク質の折りたたみ
経路を妨げる可能性がある。また、それらは、主として下流のボックスを介して
翻訳の調節に関与している。

【００９９】 DNAポリメラーゼなどの酵素は、ファージ粒子上にほとんど展示されず、その
ことが酵素の選択をほとんど不可能にしている。従って、ポリメラーゼを選択す
るためのファージの展示能力を改良するために、改良シグナル配列を設計し、ヘ
ルパーファージの消化によって「空の」ファージバックグラウンドを排除するフ
ァージ展示技術を使用して選択する。

【０１００】 ファージ上でポリメラーゼを最適に展示するためのシグナル配列の設計を達成
するのは容易ではない。そこで、選択の戦略を工夫して、選択した部位に突然変
異が導入されているライブラリーからシグナル配列を単離する。該シグナル配列
はファージ上には存在しないが、ファージ粒子内にあるファージミドの配列を決
定することによってその配列を獲得することは容易である。

【０１０１】 PCR増幅のために以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、pelBおよ
びg3リーダー配列から２つのライブラリーを作製する。

【０１０２】 制限部位HindIIIおよびNcoIを斜体で示してある。

【０１０３】 pelBリーダーから誘導されるライブラリーIおよびg3リーダーから誘導される
ライブラリーIIは、それぞれプライマー1および２で増幅した4(pelB)のPCR増幅
ならびにプライマー3および2で増幅した5(g3)のPCR増幅によって調製する。各PC
R産物をHindIIIおよびNcoIで消化し、ゲル抽出キット(Qiaquick、Qiagen)を用い
て精製する。0.2μgの得られるインサートをそれぞれ、ライゲーションのために
、予めHindIIIおよびNcoIで消化し、アルカリホスファターゼ(Boehringer Mannh
eim)で脱リン酸化した約2μgのpHEN1-Stoffelベクター(図６)と混合する。ライ
ゲーション混合物を、フェノール‐クロロホルム抽出法およびエタノール沈降法
により精製した後、新しく調製した大腸菌TG1中にエレクトロポレーションする
。

【０１０４】 (i)シャイン‐ダルガルノ(Shine-Delgarno)配列のすぐ上流のイプシロン配列
の近傍および内部、(ii)下流ボックス[50]の近傍および内部のシャイン‐ダルガ
ルノ配列の下流、(iii)正に荷電したアミノ酸残基を含有するN末端領域、疎水性
領域[51]、および高度に保存されたペプチダーゼの切断部位[52]に近いC末端領
域のリーダーペプチドの内部で、pelBおよびg3リーダーのそれぞれ32および20塩
基のランダム化を行う。

【０１０５】 ファージは以前に記載された[25]とおりに製造するが、VCSM13の代わりにヘル
パーファージKM13(実施例３)を使用し、30℃で一晩培養するときに0.1 mMのIPTG
を加える。11μgの抗Taq抗体(Taqstart、Clontech)をイムノチューブ(Nunc)上に
一晩被覆するという以外は以前に記載されたとおりに、トリプシンに対する抵抗
性および結合[44]の選択を行う。以前に記載されたプロトコルに従い、鋳型とし
てファージミドを含有する1個の大腸菌TG1コロニーを用いて、プライマー6およ
び7によりPCRスクリーニングを行い、次いで２％アガロースゲル上でゲル電気泳
動する。増幅断片のサイズを基準として用いて、ポリメラーゼ遺伝子内に欠失が
起こったか否かを確認する。

【０１０６】 合成オリゴヌクレオチドの縮重から算定したライブラリーの推定される多様性
は、pelBおよびg3リーダーについて、それぞれ約3.7x10¹³=4⁹x3⁷x2¹⁶および1.7x
10⁷=4⁴x2¹⁶である。ファージミドライブラリーを用いて大腸菌を形質転換した後
、アンピシリン抵抗性コロニー数として測定されるライブラリーのサイズは、pe
lBおよびg3リーダーについて、それぞれ約1.3x10⁷および9.6x10⁶であることがわ
かる。

【０１０７】 p3‐ポリメラーゼ融合タンパク質を全く発現していない全ファージ粒子を非感
染性とするために、プロテアーゼであるトリプシンでヘルパーファージp3のコピ
ーを特異的に切断することにより、ポリメラーゼの展示の選択を行う。

【０１０８】 双方のライブラリーを混合し、培地中に0.1 mM IPTGを含有させるか、または
含有させないという２つの条件で選択ラウンドを実施する。IPTGを含有させる場
合、ポリメラーゼ遺伝子またはその一部の欠失が、PCRスクリーニング(上記参照
)で示されるようにラウンドIII(28クローン中4個)後に見出される。ラウンドIV
後には、これらのクローンは、集団の大部分に相当する(30クローン中28個)。IP
TGを含有させない場合、これらのクローンは、ラウンドVI後に選択されるクロー
ンの有意な部分に相当する(12クローン中3個)。従って、プロテアーゼ抵抗性の
選択に加えて、抗Taq抗体への結合の選択を導入することにより、ラウンドV以後
から選択を変更する。選択ラウンドVIIおよびVIIIの後、それぞれ(13個中3個)お
よび(19個中0個)のクローンは、欠失したp3‐ポリメラーゼ融合タンパク質に対
応する。

【０１０９】 リーダーの特徴付けのために、個々の大腸菌コロニーのPCR増幅後にHindIII-N
coI断片をサブクローニングする。得られるファージミドを、pHEN1-1x/Stoffel(
x＝7、9、10および12でサブクローニングする)と称する。373A DNA配列決定装置
(Applied Biosystems)を用いて、該Stoffel断片に対応するHindIII-NcoIおよびN
coI-NotI断片の配列を両鎖で決定する。

【０１１０】 ELISAのために、抗Taq抗体(Taqstart、Clontech)を用いてELISAプレートを被
覆し、抗M13‐西洋ワサビペルオキシダーゼ融合タンパク質(Pharmacia Biotech)
を用いて標準的プロトコル[44]により検出する。

【０１１１】 1 mMの代わりに0.1 mMのIPTG濃度を用いることを除いて、大腸菌HB2151を選択
したファージミド[25, 27]に感染させることによって上清中にポリメラーゼを発
現させる。約10μlの上清をポリアクリルアミドゲルに載せて電気泳動(Novex)し
、ゲルをニトロセルロース(Protran, Schleicher and Schuell)上にブロッティ
ングし、抗Taqポリメラーゼ抗体(Taqstart、Clontech)およびヤギ抗マウスIgG‐
西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma)を加え、化学発光(ECL試薬、Amersham)によ
るオートラジオグラフィーフィルム上で検出する。

【０１１２】 12個のクローンの中からプロテアーゼ抵抗性についてスクリーニングされた、
ラウンドVIIからの4個のクローン(7、9、10および12)を、さらに特徴付けする。
シグナル配列内の突然変異のみが考えられ、種々のラウンドでの増幅中に起こっ
た可能性のあるファージミド内のどこか他の位置での突然変異は考えられないと
いうことを確実にするため、シグナル配列を元のベクター中にサブクローニング
する。表５に示した結果は、選択したクローン10の最適なポリメラーゼ展示が元
の配列よりも約50倍高いことを示している。この結果は、抗Taq抗体および抗M13
-HRPを用いるELISAによって、実験誤差内で独立に確認される。すなわち、pelB
リーダーファージミドpHEN1-Stoffelの10⁹個のファージ粒子(シグナル対ノイズ
比：1.46)は、クローン10の10⁷個のファージ粒子(シグナル対ノイズ比：1.47)と
同一のシグナルを与える。

【０１１３】 また、大腸菌HB2151におけるStoffel断片の発現を、種々のリーダー(表６参照
)について試験する。既知のポリメラーゼ量についてスポットの強度を比較する
ことにより、培養上清中のStoffel断片の濃度を評価すると、pelBリーダーにつ
いては約0.1 mg/lであることがわかる。リーダー17および110については発現が3
倍増加するのが観察されるが、リーダー19については約3分の1に減少することが
わかる。

【０１１４】表５ 温度およびIPTG濃度の関数としてのリーダーpelBを有するファージ粒子当 たりのファージポリメラーゼ数 感染性ファージ粒子数としてファージ力価を測定し、トリプシンで処理した後
の感染性ファージ粒子数としてファージポリメラーゼ力価を測定する。ファージ
粒子当たりのファージポリメラーゼ数は力価の比である。ヘルパーファージを用
いてファージ粒子をレスキューしたので、ファージは、p3‐ポリメラーゼ融合タ
ンパク質およびトリプシン切断部位を含有するp3の数コピーか、またはこれらの
p3コピーのみのどちらかを展示する。

【０１１５】 温度 25℃ 30℃ 37℃ 0 mM IPTG 1.7x10^-3 9.1x10^-4 1.2x10^-3 0.1 mM IPTG 9.1x10^-3* 8.3x10^-3 2.4x10^-3* 1 mM IPTG 1.5x10^-2* 5.5x10^-3* 1.2x10^-3* *これらの条件では、ファージ力価が10¹⁰/ml(培地)以下に低下する。

【０１１６】表６ 最適なポリメラーゼ展示のためのラウンドVIIからの選択したリーダーま
たはリーダーpelBについてのファージの特徴付け (表５と同じ説明。IPTGなしでT
=30℃で2xTY中で培養) リーダー 力価 ファージ粒子当たりの x10¹¹ ファージポリメラーゼ数 pelB 1.2 9.1x10^-4 17 2.0 2.5x10^-2 19 0.5 8.3x10^-3 110 0.7 4.3x10^-2 112 1.6 1.4x10^-2

【０１１７】表７ ランダム化および選択した配列 ランダム化DNA配列を5'から3'方向に示す。その上下に、シグナル配列pelB、1
7、19、110および112中で所与の配列と異なる塩基を示す。シャイン-ダルガルノ
配列、開始コドンおよびシグナル配列の最後のコドンGCCには下線を付してある
。HindIII制限部位およびNcoI制限部位を斜体で示す。対応するアミノ酸配列を
下に示す。まずpelBリーダーからライブラリーIを、g3リーダーからライブラリ
ーIIを設計する。

【０１１８】 III-A.ライブラリーIから III-B.ライブラリーIIから

【０１１９】実施例８ プロテアーゼ切断可能なヘルパーファージを用いた触媒活性の選択 ファージ展示による触媒の選択のための戦略は、触媒反応の反応生成物の選択
および触媒を選択するための近接効果の使用に基づいている。この戦略では、タ
グを付した基質が、展示された酵素の近くでファージに架橋されると、該ファー
ジは固相に結合し、展示された酵素[53]によって触媒された分子内切断反応によ
り遊離する。

【０１２０】 同様の手法を適用して活性型DNAポリメラーゼ変異体を選択した。この手法は
、生成物をもたらす触媒反応(この場合、ビオチンタグを組み入れることにより
識別される)と基質(および生成物)をファージに結合させる化学的架橋反応との
２つの化学的に独立した反応を含む。従って、ストレプトアビジンビーズによる
ファージの選択により、タグを付した生成物に化学的に結合するファージが選択
される。近接効果によりトランスでの反応よりもシスでの反応の方が優先するの
で、これらの反応は同一のファージ上に結合する可能性が大きい。

【０１２１】 化学的架橋反応にはマレイミドを用いる。マレイミドは、チオールと反応し、
またアルカリ溶液中ではアミノ基と反応することが知られており、従って、ファ
ージおよび展示された酵素上の様々な部位と反応し得る。主要外被タンパク質(p
8)とN-ビオチノイル-N'-(6-マレイミドヘキサノイル)ヒドラジドの間の共有結合
産物を、SELDI質量スペクトルにより検出する。２つのアミノ基(N末端のAla-1お
よび残基Lys-8)が関係していると考えられる。

【０１２２】 分子進化におけるDNAポリメラーゼの中心的な役割を考慮して、DNAポリメラー
ゼを用いてこの戦略を試験する。DNAプライマーの5'末端にマレイミジル基を導
入する。ポリメラーゼの触媒作用によりビオチン化dUTPをプライマーの3'末端に
付加することにより、該生成物をタグ付けする。それぞれ大腸菌およびテルムス
・アクアティカス(Thermus aquaticus)のDNAポリメラーゼIのクレノウ(Klenow)
断片およびStoffel断片を、糸状バクテリオファージのpIII外被タンパク質に従
来法により融合させることによって、展示のためにクローニングする。双方の断
片は、5'→3'エキソヌクレアーゼドメインを欠いている。また、Stoffel断片は3
'→5'エキソヌクレアーゼ活性をも欠いている。

【０１２３】 該融合タンパク質をファージミド(pHEN1)[25]上にクローニングし、ヘルパー
ファージによりレスキューする。このファージを抗ポリメラーゼ抗体で被覆した
ウェルに結合させてELISAで検出すると、該ポリメラーゼ断片は(ヘルパーファー
ジによるレスキューの後に)ファージ上に展示されることがわかる(データは示し
ていない)。また、抗p3抗体または抗ポリメラーゼ抗体を用いるウェスタンブロ
ットにより該ファージを分析する。これにより、融合タンパク質の存在が確認さ
れるが、遊離のポリメラーゼによる汚染も示される。恐らく、これはアンバー終
止コドンの不完全な抑制によって細菌宿主から分泌されたか、またはファージ表
面から切断されて生じたものであろう。超遠心のさらなる工程またはサイズ排除
クロマトグラフィーによって、遊離のポリメラーゼを除去する。精製したファー
ジを、放射標識した³²P-dCTPを用いるプライマー／鋳型伸長アッセイにおいて、
DNAポリメラーゼ活性についてアッセイすると、活性を有することがわかる。

【０１２４】 しかし、ウェスタンブロットにより示されるとおり、ポリメラーゼ‐p3融合タ
ンパク質は、p3タンパク質と比較して十分にはファージ中に組み込まれない。こ
れは、ヘルパーファージ(KM13)のp3タンパク質(融合タンパク質のそれではない)
が、感染を媒介できなくするようにトリプシンで切断され得る、ヘルパーファー
ジの選択的な使用によって示されたように(実施例３および４)、ヘルパーファー
ジからのp3の組込みに起因するようである。従って、タンパク質溶解後は、融合
タンパク質を組み込んだファージのみが感染性を有することになる。タンパク質
溶解後の力価の低下から、本発明者らは、1000個のファージ粒子のうちのたった
1個のみが融合タンパク質を組み込んだと評価する。シスでのポリメラーゼによ
るタグ付けを当てにすると、この選択プロセスは、ポリメラーゼを欠損する大過
剰のファージによって弱められるであろうが、トランスでタグ付けするためには
利用可能であろう。従って、選択したファージをトリプシンで処理して、展示さ
れるポリメラーゼを欠損するファージの感染性を破壊することができる。

【０１２５】 Stoffel断片を展示するファージを、5'マレイミジル基および3'ビオチン化ヌ
クレオチドを含むプライマー13[TTT CGC AAG ATG TGG CGT]と共にインキュベー
トする。インキュベーション後、ファージをストレプトアビジン被覆ビーズ上に
捕捉し、約1〜5％の感染性ファージを得る。これは、N-ビオチノイル‐N'‐(6‐
マレイミドヘキサノイル)ヒドラジドに関して示されたように、恐らくp8タンパ
ク質を介して、プライマーがファージに化学的に架橋できることを示している。
次いで、このファージを、ビオチン‐dUTP 2および鋳型3[AAA TAC AAC AAT AAA
ACG CCA CAT CTT GCG]の存在下で、5'マレイミジル基を含むプライマー1b[GCGAA
GATGTGG]と共にインキュベートする。ファージの捕捉は、1b、2および3の存在に
依存する(表８)が、ヘルパーファージを切断して非特異的なファージの単離を減
少させるトリプシンの添加にも依存する。

【０１２６】表８ 触媒作用活性のあるファージ−Stoffel粒子の選択 φiおよびφfは、選択の前[a]および後[b]の形質転換ユニット数（tu）を意味す
る。収率＝φf／φi [c]：＋プライマー1b、＋ビオチン化 dUTP 2、＋鋳型 3、および＋トリプシン。

【０１２７】実施例９ ジスルフィド含有ポリペプチドの選択 DNA断片をコードする(ポリ)−ペプチドのクローニング、および選択のためバ
ルナーゼとp3との間にそれらを展示するために、ファージ fd-3を構築する（図
５）。ファージ fd-3には、ファージ fd-TETのp3遺伝子にN末端が融合したバル
ナーゼのH102A突然変異体が含まれる。バルナーゼの最後の残基のコドンと、p3
の最初の残基のコドンの間には、ヌクレオチド配列 CTG CAG GCG GTG CGG CCG C
Aがある。この配列には、PstI 制限部位により挟まれるDNA断片を挿入するため
のPstI DNA制限部位（下線付き）が含まれる。更に該配列にはバルナーゼとp3と
の間にフレームシフトが導入され、これはfd-3における正確なp3リーディングフ
レームの発現を妨げる。従ってファージ fd-3のファージ粒子は、感染タンパク
質p3を展示せず、非感染性である。

【０１２８】 ゆえにファージ fd-3は、ライゲーション後PstI DNAインサートをもたず、選
択の間に増殖することがないベクターなので、クローニングベクターとして好適
である。統計学的に、PstI 制限部位における3つのランダムDNAインサートのう
ち1つは、（インサート中の終止コドンの存在を除いて）バルナーゼ、インサー
ト自体およびp3にまたがるオープンリーディングフレームを作り出し、ファージ
外被中にp3を含有する感染性ファージ粒子となる。これらの組換えクローンにお
いては、バルナーゼの後にインサートが続き、その後にアミノ酸残基AGGAAAが続
き、その後でp3タンパク質が開始する。このAGGAAAペプチドは、p3の感染性機能
およびプロテアーゼのp3N末端付加物への接近が可能となるように、融合タンパ
ク質に十分なフレキシビリティを与えるはずである。

【０１２９】 大腸菌TG1株からのゲノムDNAを、伸長可能な3’末端に6つの縮重位置を含み、
ランダムプライミングを確実にするオリゴヌクレオチドSN6MIX（5'−GAG CCT GC
A GAG CTC AGG NNN NNN−3'）を使用して、アニーリング温度48℃でポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）を30サイクル行なって増幅する。アニーリング温度52℃でのP
CRを30サイクル行なう第２ステップでは、最初のPCR産物を、オリゴヌクレオチ
ドXTND（5'−CGT GCG AGC CTG CAG AGC TCA GG−3'）で再増幅することにより伸
長させる。この反応から得た約150bpの長さを有する産物をアガロースゲルより
精製し、オリゴヌクレオチドXTNDを使用してアニーリング温度52℃でPCRを30サ
イクル行なって再増幅する。これらの再増幅された150bpの断片を部分的にSacI
で消化し（オリゴヌクレオチド中太字で示した部位）、二量体化するためライゲ
ートする。ライゲートした産物を、オリゴヌクレオチドXTNDを使用して、更にア
ニーリング温度44℃でPCRを10サイクル、次にアニーリング温度55℃でPCRを30サ
イクル行なって再増幅する。アニーリング温度は、二量体化断片の中央でのオリ
ゴヌクレオチドのプライミングから識別されるように選択される。前記反応産物
をアガロースゲル上でサイズに従って2回精製して、単量体およびオリゴマー（
二量体以外）を除去する。

【０１３０】 最終二量体画分を、アニーリング温度55℃で、オリゴヌクレオチドXTNDを使用
して、大規模にPCRで増幅し、PstI（オリゴヌクレオチド中イタリック体で示し
た部位）で消化し、そしてPstI消化しかつホスファターゼで処理したベクターfd
-3中にライゲートする。大腸菌中へのエレクトロポレーション後、3.6×10⁷個の
組換え体のレパートリーを得る。ランダムに取り上げたクローンの配列解析から
、主に二量体のDNAインサート（14個中11個）と、いくつかの単量体のDNAインサ
ート（14個中2個）の存在が明らかになる。

【０１３１】 ランダムに取り上げた20個のクローンの配列解析によれば、最初の形質転換細
胞集団から産生されたファージによる大腸菌の再感染によって、バルナーゼ−(
フレーム内の、非終止二量体インサート）−p3融合体をほとんど独占的に含有す
る感染性ファージのライブラリーが得られる。インサートのないベクターおよび
フレーム外にインサートを持つもしくは終止コドン含有インサートを持つベクタ
ーから生じる非感染性ファージは、感染ステップにおいて増殖しない。従ってベ
クターfd-3は、大腸菌ゲノム由来のDNA断片の二量体化によりランダムに生成さ
れるポリペプチドのレパートリーを作製するのに好適である。

【０１３２】 ファージ fd上のバルナーゼとp3との間に挿入された融合体として展示される
このポリペプチドのレパートリーを、TBS-Caバッファー（25mM Tris、137mM NaC
l、1mM CaCl₂、pH7.4）中で、トリプシンおよびサーモリシンを単独で用いて、
または両方の混合物（それぞれ1ng/μl）を用いてタンパク質加水分解性消化に
付す。タンパク質加水分解後ファージを、ストレプトアビジン被覆マイクロタイ
ターウエルプレートに結合したビオチン化バルスターで捕捉し、そしてpH2.0で
溶出する。ファージをpH7に中性化し、大腸菌の再感染によって増殖させ、前述
のように第2のラウンドのために選択する。全てのステップは、ジチオトレイト
ール（DTT）またはβ−メルカプトエタノールなどの還元剤の不在下で行なう。
こうした還元剤は、選択されたポリペプチド中のシステイン側鎖間に形成される
いかなる潜在的なジスルフィド結合をも還元によって切断する。

【０１３３】 ランダムに取り上げたファージを、タンパク質加水分解選択の第1および第2ラ
ウンドの後で溶出し、トリプシンおよびサーモリシンの混合物と共に選択条件下
でインキュベートした後にバルスターへの結合について分析する（表9）。これ
らの配列を決定する（表9）。選択の際にトリプシンおよびサーモリシンの混合
物で処理して分析した18個のクローンのうち17個が、トリプシンおよびサーモリ
シンとのインキュベーション後にビオチン化バルスターに結合することが分かる
。選択の際にトリプシンで処理して分析した8個のクローンのうち5個が、トリプ
シンおよびサーモリシンとのインキュベーション後にビオチン化バルスターに結
合し、そしてサーモリシンで処理して分析した14個のクローンのうち9個が結合
することが分かる。選択の際にプロテアーゼで処理しなかったランダムに取り上
げたクローンは、トリプシンおよびサーモリシンとのインキュベーション後にビ
オチン化バルスターに全く結合しない。ビオチン化バルスターへの結合から、フ
ァージ上のバルナーゼとp3の間に挿入されたポリペプチドが、その全ての共有結
合の完全性を保持し、それゆえ共有結合で連結しているN末端タグ（バルナーゼ
）と感染性タンパク質 p3（そのため全体としてのファージ粒子）を保持してい
ることが示される。

【０１３４】 しかしながら、前記インサートはまた、システインのSH₂基などの側鎖基の間
の結合を介して共有結合で連結された状態で存在しうるので、ペプチド主鎖のタ
ンパク質加水分解性消化の可能性を排除することができない。選択したクローン
の配列解析により、25個の抵抗性クローンのうち19個（76％）が2つ以上のシス
テイン残基を含有していることが明らかになる。

【０１３５】 ポリペプチドインサート中に存在しうるジスルフィド結合の役割を分析するた
めに、選択したファージのうちの13個を、結合したファージの検出の前にトリプ
シンおよびサーモリシンで処理し、続いて20mM DTTで洗浄した後で、ビオチン化
バルスターへの結合について分析し、それにより該インサートを介したバルナー
ゼとp3との共有結合性連結について分析する。DTT洗浄を行わないでプロテアー
ゼ処理後にバルスターに結合し、システインを含有しない2個のファージクロー
ンは、DTT処理によって影響を受けない。DTTなしでプロテアーゼ処理後にバルス
ターに結合し、2つ以上のシステインを含有する他の2個のファージクローンもま
た、プロテアーゼおよびDTT処理後にバルスターに結合することが観察される。
このことは、プロテアーゼの主基質部位の存在にもかかわらず、それらのインサ
ートがペプチド主鎖のタンパク質加水分解から保護されることを示唆している。

【０１３６】 従って前記インサートは、それらのペプチド主鎖のコンホメーションの拘束の
ためにタンパク質加水分解性攻撃から保護される。しかしながら、DTT洗浄を行
わないでプロテアーゼ処理後にバルスターに結合し、2つ以上のシステインを含
有する9個のファージクローンは、プロテアーゼおよびDTT処理後にバルスターに
結合しないことが観察される。このことは、それらのインサートがペプチド主鎖
においてタンパク質加水分解的に切断されるが、還元剤DTTの不在下ではシステ
イン側鎖間のジスルフィド結合によって互いに保持されていることを示唆してい
る。従ってこれらのインサートは、それらのペプチド主鎖のコンホメーションの
拘束のためにタンパク質加水分解性攻撃から保護されない。

【０１３７】 従って、本発明の方法は、システイン含有ポリペプチドがプロテアーゼ攻撃を
受けやすい場合でさえ、該ポリペプチドを選択するように構成することができる
。システイン含有ポリペプチドは選択ステップにおいてジスルフィド結合により
互いに保持される能力があるからである。

【０１３８】表9 非還元条件下でタンパク質加水分解性処理後に選択されたバルナーゼ−p3
融合インサートを展示するファージのバルスター結合、およびそれらのベクター fd-3中のPstIインサートのアミノ酸配列 20mM DTT洗浄を行なわない、トリプシンおよびサーモリシン（それぞれ2ng/μ
l）によるファージのタンパク質加水分解後のバルスター結合（−DTT）は、プロ
テアーゼ処理を行なわない場合のファージのバルスター結合のシグナルの少なく
とも60％であるシグナルの測定により決定する。20mMDTT洗浄後のバルスター結
合（+DTT）は、20mM DTT洗浄を行なわない場合のバルスター結合（−DTT）のシ
グナルの少なくとも60％であるシグナルの測定により決定する。ファージを、ト
リプシン（Tr）またはサーモリシン（Th）によるタンパク質加水分解を1ラウン
ド（1×）または2ラウンド（2×）行なった後にランダムに取り上げる。ファー
ジをプロテアーゼで処理し、マイクロタイターウエルプレート中のビオチン化バ
ルスターで捕捉して、そして適用可能な場合には20mM DTTで洗浄する。結合した
ファージは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗M13ファージ抗体（Pharm
acia Biotech）で検出する。

【０１３９】

【０１４０】実施例10 ジスルフィド関連バックグラウンドを取り除くための還元剤の使用 実施例９に記載のポリペプチドのレパートリーを、上述のようにトリプシンお
よびサーモリシンの両方で消化する（実施例９）が、本実施例では、タンパク質
分解的に処理したファージの、ストレプトアビジン−ビオチン化バルスターで被
覆したマイクロタイターウエルプレートへの結合の後で50mM DTTによる追加の洗
浄ステップを行なう。この洗浄ステップは、N末端バルナーゼタグを展示するフ
ァージを洗い流すために行ない、該タグはもはや無傷のポリペプチド主鎖を介し
てp3に結合しているのではなく、バルナーゼタグとp3の間のポリペプチドインサ
ート中のシステイン側鎖間のジスルフィド結合を介して結合しているにすぎない
。

【０１４１】 タンパク質加水分解の第2ラウンド後に溶出された12個のランダムに取り上げ
たファージを、選択の条件下でのトリプシンおよびサーモリシンの混合物に対す
る安定性について分析し、それらの配列を決定する（表10）。選択の際にトリプ
シンおよびサーモリシンの混合物で処理した10個のクローンが、トリプシンおよ
びサーモリシンと共にインキュベートし、次いで50mM DTTで洗浄した後に、ビオ
チン化バルスターに結合する。その後で捕捉されたファージを検出する。これら
のクローンのうち1個のみが2つ以上のシステインを含有する。

【０１４２】 従って、ファージライブラリーのタンパク質加水分解性処理を行ない、続いて
DTTで洗浄することにより、タンパク質加水分解から保護され、かつジスルフィ
ド結合によって互いに保持されていないペプチドインサートの選択が可能となる
。

【０１４３】表10 タンパク質加水分解性処理、続いて50mM DTTによる処理の後に選択された バルナーゼ−p3融合インサートを展示するファージのバルスター結合、およびfd -3中のそれらのPstIインサートのアミノ酸配列 トリプシンおよびサーモリシン（それぞれ2ng/μl）によるファージのタンパ
ク質加水分解とそれに続く50mMDTT洗浄の後のバルスター結合（＋DTT）を、バル
スター結合（＋DTT）のシグナル（それはプロテアーゼ処理を行なわない場合の
ファージのバルスター結合のシグナルの少なくとも60％である）を測定すること
によって決定する。ファージは、トリプシン（Tr）および／またはサーモリシン
（Th）によるタンパク質加水分解性の2ラウンド（2×）の後にランダムに取り上
げる。ファージを、プロテアーゼで処理し、マイクロタイターウエルプレート中
のビオチン化バルスターで捕捉し、そして適用可能な場合には50mM DTTで洗浄す
る。結合したファージを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗M13ファー
ジ抗体を用いて検出する。

【０１４４】

【０１４５】参照文献 1. Rubingh, D.N. (1997)「Protein engineering from a bioindustrial point
of view（バイオ産業の観点からみたタンパク質工学）」、Current Opinion in
Biotechnology. 8, 417-422. 2. Fersht, A.R. (1993)「Protein folding and stability: the pathway of f
olding of barnase（タンパク質の折りたたみと安定性：バルナーゼの折りたた
み経路）」、FEBS Letters. 325, 5-16. 3. Zhao, H.ら (1998)「Molecular evolution by staggered extension proces
s (StEP) in vitro recombination（in vitroでの組換えにおける誘発された伸
長過程(StEP)による分子進化）」、Nature Biotechnology. 16, 258-261. 4. Patten, P.A., R.J. HowardおよびW.P.C. Stemmer. (1997)「Applications
of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines（DNAシャフリングの医薬
品およびワクチンへの適用）」、Current Opinion in Biotechnology. 8, 724-7
33. 5. Sauer, R.T. (1996)「Protein folding from a combinatorial perspective
（コンビナトリアルの観点からみたタンパク質の折りたたみ）」、Folding & De
sign. 1, R27-R30. 6. Munson, M.ら (1996)「What makes a protein a protein? Hydrophobic cor
e designs that specify stability and structural properties（タンパク質を
タンパク質とするものは何か？安定性および構造特性を特徴づける疎水性コアの
設計）」、Protein Science. 5,1584-1593. 7. Dahiyat, B.I., C.A. SariskyおよびS.L. Mayo. (1997)「De Novo Protein
Design: Towards Fully Automated Sequence Selection（新規タンパク質設計：
完全自動配列選択に向けて）」、Journal of Molecular Biology. 273, 789-796
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lified amino acid sequences（単純化アミノ酸配列からのタンパク質の迅速な
機能的折りたたみ）」、Nature Structural Biology. 4(10), 805-809. 9. Hoogenboom, H.R.およびG. Winter. (1992)「By-passing Immunisation. Hu
man Antibodies from Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments R
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メントの合成レパートリーからのヒト抗体）」、Journal of Molecular Biology
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B1 Immunoglobulin-Binding Domain From Streptococcal Protein G（ストレプ
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21. 13. Gu, H.ら (1995)「A phage display system for studying the sequence d
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するためのファージディスプレイ系）」、Protein Science. 4, 1108-1117. 14. Hubbard, S.J., F. EisenmengerおよびJ.M. Thornton. (1994)「Modeling
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and Nonpolar Amino Acids（極性アミノ酸および非極性アミノ酸の二元的パタ
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ently in libraries of random amino acid sequences（ランダムアミノ酸配列
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tic Dissection of a Novel in vivo Selection for Protein-ligand Interacti
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新規なin vivo選択の機械的精査）」、Journal of Molecular Biology. 268, 60
7-618. 23. Stengele, I.ら (1990)「Dissection of Functional Domains in Phage fd
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ファージfd吸着タンパク質における機能的ドメインの精査。付着と浸透との間の
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Fab）のH鎖およびL鎖を展示させる方法論）」、Nucleic Acids Research. 19, 4
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acterisation of the Recombinant Ribonuclease from Bacillus amyloliquefac
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rected Mutagenesis（Bacillus amyloliquefaciens (バルナーゼ)からの組換え
リボヌクレアーゼの動的特性、および部位特異的突然変異誘発による触媒作用に
おいて重要な残基の研究）」、Biochemistry. 28, 3843-3850. 30. Meiering, E.M., L. SerranoおよびA.R. Fersht. (1992)「Effect of Acti
ve Site Residues in Barnase on Activity and Stability（バルナーゼにおけ
る活性部位残基の、活性および安定性に対する影響）」、Journal of Molecular
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Barnase and the Contribution of Different Interactions to Protein Stabil
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Assembly of Cleaved Barnase from Two Peptide Fragments and Its Relevanc
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断されたバルナーゼの構築メカニズムの分析、および未切断バルナーゼの折りた
たみ経路に対するその関連性）」、Biochemistry. 34, 1464-1468. 36. Gay, G.d.P.およびA.R. Fersht. (1994)「Generation of a Family of Pro
tein Fragments for Structure-Folding Studies. 1. Folding Complementation
of Two Fragments of Chymotrypsin Inhibitor-2 Formed by Cleavage at Its
Unique Methionine Residue（構造−折りたたみ研究のためのタンパク質断片フ
ァミリーの作製。1．独特なメチオニン残基での切断により形成されるキモトリ
プシンインヒビター2の2つの断片の折りたたみ相補性。）」、Biochemistry. 33
, 7957-7963. 37. Wu, L.C., R. GrandoriおよびJ. Carey. (1994)「Autonomous subdomains
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e variants in the periplasm of Escherichia coli（大腸菌の周辺細胞質にお
けるバルナーゼ変異体の熱安定性、分解速度、および発現収率の間の関係）」、
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橋は重要であるか？）」、Nature Structural Biology. 2(2), 122-128. 41. Roy, S.ら (1997)「A Protein Designed by Binary Patterning of Polar
and Nonpolar Amino Acids Displays Native-like Properties（極性アミノ酸お
よび非極性アミノ酸の二次元パターン形成により設計されたタンパク質は、生来
タンパク質の様な特性を示す）」、Journal of the American Chemical Society
. 119, 5302-5306. 42. Gibson, T.J.,「Studies on the Epstein-Barr Virus Genome（エプスタイ
ン−バーウイルスゲノムの研究）」、1984, Univ. of Cambridge, Cambridge, U
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y libraries（ファージディスプレイライブラリーを用いた抗体フラグメントの
作製）」、Nature. 352, 624-628. 44. McCafferty, J.ら (1990)「Phage antibodies: filamentous phage displa
ying antibody variable domains（ファージ抗体：抗体の可変ドメインを展示す
る糸状ファージ）」、Nature. 348, 552-554. 45. Fisch, I.ら (1996)「A strategy of exon shuffling for making large p
eptide repertoires displayed on filamentous bacteriophage（糸状バクテリ
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f protein folding by protein engineering（タンパク質工学によるタンパク質
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sembly of the head of bacteriophage T4（バクテリオファージT4のヘッドを構
成する間の構造タンパク質の切断）」、Nature. 227, 680-685. 48. Schatz, G.およびDobberstein, B. (1996)「Common principles of protei
n translocation across membranes（膜を横切るタンパク質トランスロケーショ
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ペプチドの生と死）」、Nature. 396, 111-113. 50. Sprengart, M.L., Fuchs, E.およびPorter, A.G. (1996)「The downstream
box: an efficient and independent translation initiation signal in E.co
li（下流ボックス：大腸菌における有効かつ独立した翻訳開始シグナル）」、EM
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recognition site and sequence in eukaryotic and prokaryotic signal pept
ides（推定シグナルペプチダーゼ認識部位ならびに真核生物および原核生物のシ
グナルペプチドの配列）」、J. Mol. Biol. 167, 391-409. 52. Von Heijne, G. (1983)「Patterns of amino acids near signal-sequence
cleavage sites（シグナル配列切断部位の近くにあるアミノ酸のパターン）」
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., Schultz, P.G. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 10523-10528.

【図面の簡単な説明】

【図１】 プロテアーゼ部位を有するファージの切断。ファージをKM13（pHEN1, A + B）
またはVCSM13 （pKl, C + D）によりレスキューして調製した。切断されなかっ
たもの（A + C）またはトリプシンで切断されたもの（B + D）を示す。5μl、2.
5μlおよび1μlのファージを図示したようにロードした。分子量マーカーをkDで
示す。

【図２】 ファージミドベクターpK1およびpK2。これらのベクターは、ファージp3タンパ
ク質のD2とD3の間にプロテアーゼ切断可能な配列を含有する。pKlではD2 + D3が
フレーム内にあり、pK2ではD3がフレームの外にある。

【図３】 バルスターへのファージ−バルナーゼの結合。種々の融合タンパク質を展示す
るファージを、ビオチン化バルスターと共にインキュベートし、ストレプトアビ
ジンで被覆したプレート上に捕捉し、そしてELISAで検出する。a）バルナーゼ突
然変異体A、b）バルナーゼ突然変異体B、c）ビリン、d）ファージなし。

【図４】 ファージ融合タンパク質の温度変性。ファージミドを、KM13によりレスキュー
し、所定の温度においてインキュベーションおよびトリプシンによる切断を行な
った後の感染力（TU/ml）を示す。ビリンサブドメイン（三角）、バルナーゼ突
然変異体A（ひし形）、バルナーゼ突然変異体B（四角）、pHEN1−クロラムフェ
ニコール耐性体（丸）との融合。

【図５】 fdベクターであるfd-3。適切なオリゴヌクレオチドを用いるPCR増幅の後に、
制限部位ApaLI（バルナーゼの5’末端にある）およびNotIを使用して、バルナー
ゼのH102A突然変異体の遺伝子をfd-DOG [43]中にサブクローニングして導入し、
fd-3を構築する。

【図６】 ファージ表面上におけるStoffel断片の展示に使用されたファージミドベクタ
ーのマップ。星印は、ライブラリーIおよびIIにおいて少なくとも部分的にラン
ダム化されている配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ジェスティン，ジーン−ルック フランス国 エフ−75003 パリ，ル ド グラビィリエール 42 (72)発明者 ウィンター，グレゴリー，ポール イギリス国 シービー２ １ティーキュー ケンブリッジ，ネビルズ コート ディ ー４，トリニティ カッレッジ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA07 DA06 EA03 GA19 HA03 4B065 AA98X AA98Y AB01 AC20 BA02

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のステップ： (a) ウイルスの外被タンパク質ポリペプチドの配列に挿入された異種ポリペプ
   チドからなる融合ポリペプチドをコードしかつ展示するウイルスを提供すること
   、ただし、該ウイルスは展示されるポリペプチドの内部に配置された切断部位を
   含むものであること、 (b) 該ウイルスを切断剤にさらすこと、 (c) 無傷の融合タンパク質を含むウイルスを増殖させること、 を含んでなるウイルスの選択方法。
2. 【請求項２】 切断部位が融合ポリペプチドの内部に配置されている、請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】 切断後、切断されない融合ポリペプチドを含むウイルスを、
   切断された融合ポリペプチドを含むウイルスから分離する、請求項２記載の方法
   。
4. 【請求項４】 切断が、ウイルスの感染を媒介する切断部位含有ポリペプチ
   ドの能力を損なう、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 ウイルスがあるレパートリーの配列をコードする、請求項１
   〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 【請求項６】 前記レパートリーの配列が展示される異種ペプチドまたはタ
   ンパク質をコードする、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 切断部位が前記レパートリーの配列の内部に含まれる、請求
   項５または６記載の方法。
8. 【請求項８】 切断に抵抗するウイルスを感染により増殖させる、請求項１
   〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 【請求項９】 切断に抵抗するウイルスが折りたたまれたタンパク質または
   ポリペプチドを展示する、請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記レパートリーの一部のメンバーが少なくとも部分的に
    ほぐれる条件下で切断を行なう、請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 展示されたポリペプチドを安定化または脱安定化する分子
    の存在下で切断を行なう、請求項９記載の方法。
12. 【請求項１２】 タンパク質変性剤の存在下で切断を行なう、請求項11記載
    の方法。
13. 【請求項１３】 異種ポリペプチドのリガンドの存在下でタンパク質加水分
    解を行なう、請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
14. 【請求項１４】 安定性が向上したタンパク質またはポリペプチドを単離す
    るための請求項１〜13のいずれか１項記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記レパートリーの展示されたタンパク質がリガンドとの
    結合により選択される、請求項５〜14のいずれか１項記載の方法。
16. 【請求項１６】 ウイルスがバクテリオファージである、請求項１〜15のい
    ずれか１項記載の方法。
17. 【請求項１７】 外被タンパク質が糸状バクテリオファージの遺伝子３によ
    りコードされる外被タンパク質である、請求項16記載の方法。
18. 【請求項１８】 切断部位が遺伝子３タンパク質の第２ドメインと第３ドメ
    インの間に導入される、請求項17記載の方法。
19. 【請求項１９】 バクテリオファージがファージミドと共に用いられるヘル
    パーバクテリオファージである、請求項16記載の方法。
20. 【請求項２０】 バクテリオファージの包膜核酸がファージミドであり、ヘ
    ルパーバクテリオファージの使用を必要とする、請求項19記載の方法。
21. 【請求項２１】 切断部位がプロテアーゼ切断部位であり、切断剤がプロテ
    アーゼである、請求項１〜20のいずれか１項記載の方法。
22. 【請求項２２】 以下のステップ： (a) 異種ポリペプチドのレパートリーをコードするファージミドのライブラリ
    ーを作製すること、 (b) ヘルパーファージの存在下で該ファージミドを発現させること、 (c) 該ファージをプロテアーゼ切断にかけること、 (d) 該ファージを用いて細菌に感染させること、および (e) 該ファージミドを単離すること、 を含んでなる方法。
23. 【請求項２３】 子孫ファージを形成するために、融合ポリペプチドを含む
    ファージミドのヘルパーファージによるレスキューを行なう方法であって、 a) プロテアーゼ感受性切断部位を含むウイルス外被タンパク質をコードする
    ヘルパーファージを提供すること、 b) 融合ポリペプチドを含むファージミドを提供すること、 c) 子孫ファージを、プロテアーゼ切断部位を切断できるプロテアーゼにさら
    し、その結果、該ヘルパーファージから誘導された該タンパク質の切断により、
    その感染を媒介する能力が損なわれること、および d) 感染によって子孫を増殖させること、 を含んでなる方法。
24. 【請求項２４】 プロテアーゼ感受性部位が糸状バクテリオファージM13、f
    dまたは関連種のp3内に含まれる、請求項22記載の方法。