ES2335136T3 - Expresion fagica mediante translocacion cotraduccional de polipeptidos de fusion. - Google Patents
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Abstract
Método de expresión en fago filamentoso, en el que se expresan en partículas fágicas polipéptidos de interés codificados por una biblioteca de ADN, en el que dicha biblioteca de ADN es una biblioteca de ADNc o una biblioteca combinatorial de ADN que codifica una biblioteca de péptidos, un biblioteca de anticuerpos o una biblioteca basada en andamiajes alternativos, y en el que los polipéptidos de interés se translocan cotraduccionalmente a través de la membrana citoplasmática de bacterias Gram-negativas.
Description
Expresión fágica mediante translocación
cotraduccional de polipéptidos de fusión.
La presente invención se refiere a un nuevo
método de expresión fágica, a vectores fago o fagémido utilizados
en el mismo y a las partículas fágicas obtenidas con el mismo.
La expresión de polipéptidos sobre un
bacteriófago (expresión fágica) es una técnica de selección que
permite extraer polipéptidos con propiedades deseadas de entre una
gran colección de variantes (Russel, M., Lowman, H.B. y Clackson,
T., Introduction to phage biology and phage display, en: "Phage
Display", Clackson, T. y Lowman, H.B., editores, Oxford
University Press, 2004, páginas 1 a 26). La expresión fágica ha sido
investigada intensivamente para la selección a partir de
bibliotecas combinatoriales de anticuerpos o de péptidos.
Los bacteriófagos que claramente se han
utilizado más ampliamente en la expresión fágica son los fagos
filamentosos. Los fagos filamentosos constituyen una gran familia
de virus bacterianos que infectan muchas bacterias
Gram-negativas. Los fagos filamentosos mejor
conocidos son aquellos que infectan a Escherichia coli; estos
son f1/Ml3/f3 e IKe. Los fagos f1, M13 y fd son los que se han
utilizado hasta el momento para la expresión en fagos filamentosos.
Sus genomas son idénticos en más de 98% y sus productos génicos son
intercambiables.
Un aspecto único del ensamblaje de los fagos
filamentosos, en contraste con el ensamblaje de muchos otros
bacteriófagos, es que es un proceso de secreción. La incorporación
de polipéptidos de cubierta en el fago en crecimiento se produce en
la membrana citoplasmática y los fagos nacientes son extruidos de la
célula a medida que se ensamblan (Russel et al., loc.
cit.). La célula de E. coli no se lisa durante este
proceso. Las cinco proteínas de la cubierta vírica (pIII, pVI,
pVII, pVIII y pIX) se insertan en la membrana citoplasmática antes
de su incorporación en las partículas fágicas (figura 1). Por
ejemplo, la mayor parte de pIII se transloca a través de la
membrana hasta el periplasma, mientras que su cola hidrofóbica
C-terminal ancla la proteína en la membrana.
Un requisito para la expresión en fago
filamentoso es la translocación del polipéptido de interés (PDI) a
través de la membrana citoplasmática. Esto se consigue normalmente
fusionando genéticamente el PDI con una proteína de la cubierta
fágica y translocando el polipéptido de fusión correspondiente.
Alternativamente, el PDI y la proteína de cubierta fágica se
translocan independientemente.
En esta situación, el PDI se liga establemente a
la partícula fágica en el periplasma mediante, por ejemplo, la
formación de un enlace disulfuro (expresión Cys) o la formación de
una cremallera de leucinas (sistema pJuFo) con una proteína de
cubierta fágica correspondiente. En la expresión convencional en
fago filamentoso con fusiones a pIII, se utiliza la ruta Sec para
la translocación del polipéptido de fusión que comprende el PDI. En
esta ruta, en primer lugar se sintetiza el polipéptido en el
ribosoma y después resulta translocado
post-traduccionalmente, en estado no plegado, por el
translocón Sec (figura 2, (3)-(4)-(5)). Es decir, la translocación
a través de la membrana citoplasmática se inicia únicamente tras la
síntesis de una cantidad sustancial de la cadena polipeptídica. Sin
embargo, la contribución del mecanismo de translocación al éxito de
la expresión fágica no ha sido aclarada por completo, y en la
técnica anterior no se ha explorado la posibilidad de utilizar una
ruta de translocación post-traduccional.
Las proteínas intracelulares y extracelulares de
un amplio abanico de tamaños y estructuras han sido expresadas
funcionalmente sobre un fago filamentoso (Russel et al.,
loc. cit.). Sin embargo, algunos polipéptidos son
recalcitrantes a la expresión debido a sus propiedades individuales,
en gran parte por motivos desconocidos. Esto provoca que el éxito
de la expresión de una proteína determinada resulte impredecible. De
esta manera, habitualmente se ha recomendado someter a ensayo en
primer lugar la eficiencia de expresión sobre el fago filamentoso
para cada proteína que deba utilizarse. Además, al crear una
biblioteca combinatorial para la expresión fágica, no todos los
clones se expresan con una eficiencia similar; esto resulta
especialmente cierto para las bibliotecas generadas a partir de
ADNcs. Los problemas de expresión de los polipéptidos pueden ser el
resultado de la interferencia de los mismos con la producción del
fago, su agregación periplasmática, su proteolisis, su toxicidad
para E. coli o su incompatibilidad con la ruta de
translocación utilizada. Especialmente, la etapa anterior a la
translocación es un factor importante que influye sobre la
incorporación de los polipéptidos de fusión a las partículas
fágicas. En el caso de que los polipéptidos se plieguen
prematuramente, pueden ser refractarios a la translocación o
incluso mostrar toxicidad citoplasmática. De esta manera, resulta
importante que la proteína se transloque
post-traduccionalmente (potencialmente permitiendo
el plegamiento prematuro) o cotraduccionalmente (no permitiendo el
plegamiento citoplasmático). Los métodos de expresión en fago
filamentoso actuales utilizan rutas
post-traduccionales para la translocación del
polipéptido de fusión a través de la membrana citoplasmática
(Russel et al., loc. cit.; Paschke, M. y Höhne, W.,
Gene 350:79-88, 2005). De esta manera, los
polipéptidos incompatibles con dichas rutas resultarán refractarios
a la expresión, provocando que las selecciones mediante expresión
fágica sean muy ineficientes o incluso imposibles. Por ejemplo, la
ruta post-traduccional Sec, que se utiliza
prácticamente en exclusiva en la expresión fágica, es inherentemente
incapaz de translocar proteínas que no pueden permanecer en un
estado no plegado en el citoplasma, debido a que el translocón Sec
mismo únicamente puede transportar polipéptidos no plegados (Huber,
D., Boyd, D., Xia, Y., Olma, M.H., Gerstein, M. y Beckwith, J., J.
Bacteriol. 187:2983-2991, 2005; Paschke et
al., loc. cit.).
Rosander, A., Frykberg, L., Ausmess, N. y
Müller, P., Molecular Plant-Microbe Interactions
16:727-737, 2003, dan a conocer el atrapamiento de
secuencias de señal de proteínas exportadas de la bacteria
Gram-negativa Bradyrhizobium japonicum. Los
autores utilizan un método de expresión fágica en el que la proteína
de cubierta carece de una secuencia de señal y por lo tanto depende
del fragmento insertado procedente de la biblioteca de ADN
preparada mediante fragmentación aleatoria de ADN cromosómico
codificante de secuencias de señal, para la exportación con
éxito.
Rosander, A., Bjerketorp, J., Frykberg, L. y
Jacobsson, K., J. of Microbial Methods 51:43-55,
2002, informan de un método de expresión fágica que puede
utilizarse como un nuevo método de cribado para identificar
proteínas extracelulares. Los autores utilizan un vector fagémido
que carece de las secuencias de señal que normalmente orientan la
proteína de fusión codificada a la membrana celular de E.
coli. El ADN cromosómico fragmentado de S. aureus
proporciona las secuencias de señal necesarias y permite la
identificación de diversas proteínas secretadas y proteínas
transmembranales.
Lee, H.C. y Bernstein, H.D., Proceedings of
National Academy of Science U.S.A. 98:3471-3476,
2001, informan de que las proteínas membranales generalmente son
exportadas a través de la ruta SRP.
Jestin, J.-L., Volioti, G. y Winter, G.,
Research in Microbiology 152:187-191, 2001,
describen una expresión mejorada de una proteína (fragmento Stoffel
de polimerasa Taq fusionada con la proteína p3 del fago) en un fago
filamentoso, basada en la aleatorización de una secuencia de señal
pelB y una secuencia situada a menos de 100 nucleótidos
cadena arriba del sitio de corte de peptidasa de señal que es
conocido que influye positivamente sobre la regulación traduccional
y la translocación.
De esta manera, el problema técnico subyacente a
la presente invención es la identificación de nuevos enfoques de
translocación para la expresión eficiente de dichos polipéptidos en
fagos filamentosos que se expresan ineficientemente mediante la
utilización de la translocación post-traduccional.
La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las
realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un método de
expresión en fago filamentoso en el que los polipéptidos de interés
(PDI) expresados en las partículas fágicas se translocan
cotraduccionalmente a través de la membrana citoplasmática de
bacterias Gram-negativas, en particular basado en la
ruta de la partícula de reconocimiento de señal.
Por consiguiente, la presente invención permite
la expresión fágica mediante translocación cotraduccional de los
polipéptidos de fusión que comprenden el PDI. Este método resulta
particularmente adecuado para polipéptidos, que es conocido que
resultan difíciles de expresar en fagos, y para proteínas de
bibliotecas de ADNc y de otras bibliotecas combinatoriales, en
particular en el caso de que deriven de andamiajes proteicos
estables de plegamiento muy rápido.
Asimismo, la invención se refiere a vectores
fago o fagémido que comprenden un constructo génico codificante de
un polipéptido de fusión que comprende el PDI que debe expresarse en
la partícula fágica y una secuencia de señal
N-terminal que induce la translocación
cotraduccional basada en la ruta de la partícula de reconocimiento
de señal, y a fagos obtenidos mediante el método de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Extremos N-terminales (N),
C-terminales (C), polipéptido de interés (PDI),
dominios N-terminales de pIII (N1, N2), dominio
C-terminal de pIII (CT).
- A)
- La expresión del polipéptido de interés (PDI) en una partícula de fago filamentoso siempre incluye la translocación del PDI a través de la membrana citoplasmática (cm) en el periplasma (pp). Con frecuencia, el PDI se transloca en forma de un polipéptido de fusión, incluyendo la proteína de cubierta III (pIII) o un fragmento de la misma. pIII comprende dos dominios N-terminales (N1, N2) y el dominio C-terminal (CT). En el presente ejemplo específico, el polipéptido de fusión consiste del PDI N-terminal y el CT C-terminal. El polipéptido de fusión y pIII se anclan a la membrana citoplasmática mediante un tramo hidrofóbico C-terminal en el dominio CT tras la translocación y antes de su incorporación en la partícula fágica. Citoplasma (cp), membrana externa (me), espacio extracelular (ex).
- B)
- Vista simplificada de una partícula de fago filamentoso que expresa pIII y el polipéptido de fusión de A). Los dominios N-terminales de pIII (N1, N2) y el PDI se incorporan en la partícula fágica mediante el dominio CT.
Vista simplificada de las tres rutas principales
conocidas para la translocación de polipéptidos a través de la
membrana citoplasmática (cm) hacia el interior del periplasma (pp)
de bacterias Gram-negativas. Estas rutas son: la
ruta SRP, la ruta Sec y la ruta Tat. Tanto la ruta Sec como la SRP
se basan en el translocón Sec (SecTR), mientras que la ruta Tat se
basa en el translocón Tat (TatTR). Tanto la ruta Sec como la Tat
translocan polipéptidos post-traduccionalmente,
mientras que la ruta SRP transloca polipéptidos cotraduccionalmente.
Las rutas Sec y SRP convergen en la translocasa Sec, que transporta
las proteínas en estado no plegado (np) a través de la membrana.
Por el contrario, el translocón Tat únicamente transloca proteínas
plegadas (p). La composición de aminoácidos de la secuencia de
señal (ss) favorece fuertemente el direccionamiento de la
preproteína a una de dichas rutas. Tras la translocación, una
peptidasa escinde la secuencia de señal de la preproteína. La ruta
SRP se encuentra mediada por la partícula de reconocimiento de señal
(SRP), una ribonucleoproteína que consiste de la proteína homóloga
de 54 kDa y un ARN 4,5S. En esta ruta, es la SRP que dirige la
preproteína al translocón Sec. La SRP reconoce y se une a las
secuencias de señal correspondientes que emergen del ribosoma (R),
envía el complejo de ribosoma-cadena naciente al
receptor de SRP (SR) y posteriormente la proteína se transloca
cotraduccionalmente mediante el translocón Sec. Los polipéptidos que
son incompatibles con la ruta Sec debido a su plegamiento
citoplasmático prematuro pueden de esta manera translocarse
eficientemente mediante la ruta SRP durante su traducción. (1) La
SRP se une a secuencias de señal particularmente hidrofóbicas de
proteínas nacientes que emergen del ribosoma. (2) La SRP dirige el
complejo de ribosoma-cadena naciente mediante el
receptor de SRP hasta el translocón Sec, donde tiene lugar la
translocación cotraduccional.
La mayoría de preproteínas presentan menos
secuencias de señal hidrofóbicas y experimentan exportación
dependiente de SecB. (3) El Trigger Factor (TF), un chaperón
citosólico que presenta una afinidad general para los polipéptidos
nacientes, se une a la región madura de preproteínas nacientes y
permanece efectivamente unida hasta que la traducción prácticamente
ha finalizado. (4) Tras la disociación de TF, algunos factores
citosólicos tales como SecB ayudan a mantener las preproteínas en
una conformación no plegada extendida. (5) Las preproteínas que
retienen una conformación extendida son transportadas efectivamente
mediante el translocón Sec. (6) Sin embargo, si el plegamiento de
la preproteína se produce en el citoplasma, la proteína
habitualmente es degradada (10) o puede incluso bloquear el
translocón Sec. Las preproteínas con secuencias de señal que
contienen el doble motivo arginina están destinadas al translocón
Tat (7). La asociación con un chaperón (TC), tal como DnaK u otro
factor específico de Tat, probablemente protege la secuencia de
señal hasta que se completa el plegamiento (8). Este mismo factor o
un factor adicional también puede estimular el plegamiento correcto.
La translocación de Tat continúa únicamente en el caso de que la
preproteína se encuentre correctamente plegada; en caso contrario,
la preproteína resulta degradada por la maquinaria proteolítica (9,
10) de la célula.
A) Vista ampliada del casete de expresión de la
serie de vectores fagémidos pDST. El casete de expresión comprende
un elemento promotor/operador del gen lacZ de E. coli
(lacZ p/o), un sitio de unión ribosómica (no ilustrado), las
secuencias codificantes de la secuencia de señal (ss) y un
polipéptido de interés (PDI) que debe expresarse, un codón de
parada supresor (TAG), las secuencias codificantes de un línker
glicina/serina (G/S) flexible y del dominio
C-terminal (aminoácidos 250 a 406) de la proteína
III del fago filamentoso (CTpIII) que median en la incorporación
del polipéptido de fusión en la partícula fágica, dos codones de
parada (TGATAA, no ilustrados) y un elemento terminador de
transcripción (no ilustrado). La secuencia codificante del PDI se
encuentra flanqueada por secuencias de ADN codificantes una
etiqueta Flag (Flag) y una etiqueta c-myc
(c-myc). Se muestran las secuencias de aminoácidos
de una letra para la secuencia de señal de DsbA (DsbAss) como
representantes de las secuencias de señal con diana en la ruta SRP
y para la secuencia de señal de PhoA (PhoAss) como representante de
las secuencias de señal con diana en la ruta Sec. Estas secuencias
de señal contienen una región N-terminal cargada
positivamente (región n), un núcleo hidrofóbico apolar (región h) y
una región C-terminal más polar (región c).
B) Representación esquemática del fagémido
pDST23. Además de los elementos mostrados en A), se ilustra el
origen de replicación del fago filamentoso (ori Ff), el gen represor
lac de E. coli (lacI), que producen represor lac
necesario para el control estrecho del lacZp/o, el origen
ColE1 de replicación (ori ColE1) para la replicación bacteriana del
vector, el gen de resistencia a antibiótico (cat) codificante
de una cloranfenicol acetiltransferasa que media en la resistencia
al cloranfenicol y los sitios de restricción XbaI,
BamHI, PstI y EcoRI. El PDI codificado en
pDST23 es la proteína repetitiva diseñada anquirina (DARPin) 3a.
A) y B) separaron mediante
SDS-PAGE partículas fágicas purificadas en CsCl
producidas mediante la utilización de los fagémidos respectivos, se
transfirieron a membranas de PVDF y se detectaron con anticuerpos
específicos para el dominio C-terminal de la
proteína III (anti-pIII) o la etiqueta Flag
(anti-FlagM1). Las alícuotas aplicadas por carril
se habían normalizado y correspondían a 5x10^{11} partículas
fágicas. Se analizaron los rendimientos de expresión en partículas
fágicas para diversos polipéptidos. Los nombres abreviados de los
polipéptidos se indican en la parte superior de los carriles y se
refieren a los polipéptidos indicados en la Tabla 1. Además, la
Tabla 1 muestra los fagémidos correspondientes utilizados para
producir las partículas fágicas, y se proporciona una visión
general del casete de expresión en la figura 3A. Los rendimientos de
expresión se comparan para cada polipéptido utilizando las
secuencias de señal PhoA (carriles marcados con una "p") o la
secuencia de señal DsbA (carriles marcados con una "d") para
translocar el polipéptido de fusión correspondiente mediante la
ruta Sec o la ruta SRP, respectivamente. Las bandas más intensas
indican rendimientos de expresión más altos. Los pesos moleculares
de las proteínas marcadoras en kDa se indican en ambos lados de la
membrana. La banda en 62 kDa en la membrana
anti-pIII correspondiente a la proteína pIII de tipo
salvaje.
Se incubaron partículas fágicas que expresaban
la DARPin ligante de la quinasa 2 N-terminal cJun
(JNK2) denominada 2_3 (símbolos blancos) o la DARPin ligante de
aminoglucósido quinasa APH(3')-IIIa
denominada 3a (símbolos negros) en pocillos recubiertos con
neutravidina y bloqueados con BSA que contenían proteínas JNK2 o APH
biotiniladas inmovilizadas, respectivamente. Tras el lavado, las
partículas fágicas unidas se detectaron con anticuerpo
anti-M13 acoplado a peroxidasa de rábano picante y
se visualizaron con sustrato BM Blue soluble de la POD. Los datos
en el gráfico muestran la absorbancia (Abs) en la coordenada y
medida a 360 nm tras restar el fondo, medido a 392 nm, frente al
número de partículas fágicas (pp) aplicado por pocillo en el eje x.
Las partículas fágicas producidas utilizando la secuencia de señal
DsbA codificante de variantes fagémidas (triángulos) mostraban una
señal la mitad del máximo ya con aproximadamente 8x10^{8} fagos
por pocillo, mientras que las partículas fágicas producidas a
partir de la secuencia de señal PhoA codificantes de variantes
(cuadrados) mostraban una señal que era la mitad del máximo con
sólo aproximadamente 2x10^{11} partículas fágicas por pocillo,
indicando rendimientos de expresión 100 veces más bajos. De esta
manera, la utilización de la ruta SRP mediada por la secuencia de
señal DsbA para la translocación de los polipéptidos de fusión
incrementó fuertemente los rendimientos de expresión en comparación
con la utilización de la ruta Sec mediada por la secuencia de señal
PhoA.
Las partículas fágicas que expresaban DARPin 2_3
o 3a se analizaron tal como se ha descrito para la figura 5. Los
resultados se proporcionan en un gráfico de columnas (escala
logarítmica) con rendimientos de expresión de PhoAss fijados en 1.
El nivel de expresión (factor de incremento) para cada secuencia de
señal utilizada corresponde al número de partículas fágicas que
proporciona una señal de D0_{450}=0,5 respecto al número de
partículas fágicas que contienen PhoAss que proporciona una señal de
D0_{450}=0, 5. PelBss: secuencia de señal PelB de Erwinia
carotovora (una secuencia de señal putativa dependiente de Sec).
Las secuencias de señal dependientes de SRP de las proteínas de
E. coli TorT (TorTss), TolB (TolBss) y SfmC (SfmCss) se
sometieron a ensayo, además de DsbAss. Se observó un rendimiento de
expresión incrementado en hasta 700 veces con la TorTss dependiente
de SRP en comparación con la PhoAss dependiente de Sec. Las TolBss y
SfmCss dependientes de SRP proporcionaron un rendimiento de
expresión incrementado en hasta 300 veces. La PelBss putativa
dependiente de Sec sólo mostró un rendimiento de expresión
incrementado de dos a seis veces.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención, la
expresión "expresión en fago filamentoso" se refiere a la
expresión fágica basada en fagos filamentosos. Los fagos
filamentosos constituyen una gran familia de virus bacterianos que
infectan muchas bacterias Gram-negativas. Los fagos
filamentosos preferentes son aquellos que infectan E. coli;
en particular f1/M13/fd e IKe. Los métodos para la práctica de la
expresión de fago filamentoso son bien conocidos para el experto en
la materia (por ejemplo Russel et al., loc.
cit.).
En el contexto de la presente invención, la
expresión "secuencia de señal" se refiere a un tramo
N-terminal de aminoácidos de un polipéptido, que
resulta en el direccionamiento del polipéptido a una translocasa. En
E. coli, las secuencias de señal
N-terminales generalmente comprenden 15 a 52
aminoácidos. La mayoría de secuencias de señal contienen una región
N-terminal cargada positivamente (región n), un
núcleo hidrofóbico apolar (región h) y una región
C-terminal más polar (región c). La región c
contiene el sitio de corte para la peptidasa de señal. La peptidasa
de señal es una proteína unida a membrana que separa la secuencia de
señal del polipéptido durante la reacción de translocación. Son
preferentes estas secuencias de señal, que comprenden 18 a 30
aminoácidos. La determinación de secuencias de señal es bien
conocida para el experto en la materia. Por ejemplo, pueden
obtenerse a partir de bases de datos, tales como
Swiss-Prot o GenBank o utilizando datos genómicos
anotados.
En el contexto de la presente invención, el
término "preproteína" se refiere a un polipéptido que comprende
una secuencia de señal N-terminal. La secuencia de
señal se escinde de la preproteína durante la reacción de
translocación, rindiendo de esta manera la proteína madura.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "polipéptido de fusión" se refiere a un polipéptido
que comprende una secuencia de señal N-terminal, el
polipéptido de interés (PDI) y una secuencia de aminoácidos
adicional que permite la expresión en el fago filamentoso.
Preferentemente, esta secuencia adicional comprende un polipéptido
de cubierta de fago filamentoso o un fragmento del mismo.
Alternativamente, dicha secuencia conecta el PDI a la partícula
fágica en el periplasma mediante la formación de un enlace estable,
por ejemplo mediante la formación de un enlace disulfuro (expresión
Cys) o mediante la formación de una cremallera de leucinas (sistema
pJuFo) con una proteína de cubierta fágica correspondiente. En esta
estrategia alternativa, el PDI y la proteína de cubierta fágica
correspondiente se translocan independientemente a través de la
membrana citoplasmática.
En el contexto de la presente invención, el
término "translocación" se refiere a la translocación mediada
por un translocón de un polipéptido a través de una membrana
biológica (Holland, I.B. et al., Biochim. Biophys. Acta
1694:5-16, 2004). La translocación se produce
post-traduccionalmente o
co-traduccionalmente. Por lo tanto, una translocasa
es un enzima o complejo enzimático que transporta específicamente un
polipéptido a través del translocón (Holland et al., loc.
cit.).
En el contexto de la presente invención, la
expresión "ruta Sec" se refiere a un mecanismo de transporte de
proteínas para la translocación post-traduccional
de preproteínas a través de la membrana citoplasmática de bacterias
Gram-negativas a través del translocón Sec (Holland
et al., loc. cit.). La ruta Sec se encuentra
mediada por chaperones moleculares, con frecuencia SecB, que
mantienen las preproteínas en un estado no plegado antes de la
translocación. La ruta Sec es la ruta principal de translocación de
proteínas en las bacterias Gram-negativas.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "ruta SRP" se refiere a un mecanismo de transporte de
proteínas para la translocación cotraduccional de preproteínas a
través de la membrana citoplasmática de bacterias
Gram-negativas a través del translocón Sec
(Schierle, C.F., Berkmen, M., Huber, D., Kumamoto, C., Boyd, D. y
Beckwith, J., J. Bacteriol. 185:5706-5713, 2003;
Huber et al., loc. cit.). La ruta SRP se encuentra
medida por la partícula de reconocimiento de señal (SRP), una
ribonucleoproteína que consiste del homólogo proteico de 54 kDa
(homólogo cincuenta y cuatro, Ffh y un ARN 4,5S. En la ruta SRP, la
secuencia de señal interacciona con SRP en cuanto aparece,
procedente del ribosoma. El complejo que consiste de SRP,
polipéptido naciente y ribosoma seguidamente se transfiere mediante
el receptor de SRP al translocón Sec, donde el polipéptido se
transloca cotraduccionalmente a través del translocón Sec.
Las rutas Sec y SRP convergen en la translocasa
Sec que transporta las proteínas en un estado no plegado a través
de la membrana. La composición de aminoácidos de la secuencia de
señal favorece fuertemente el direccionamiento de la preproteína a
la ruta SRP con preferencia a la ruta Sec, para su translocación
(Hubert et al., loc. cit.).
En el contexto de la presente invención, el
término "DsbA" se refiere a la proteína de intercambio
periplásmico de E. coli tiol:disulfuro (número de acceso
Swiss-Prot P24991). DsbA es un sustrato de la ruta
SRP (Huber et al., loc. cit.). DsbA se exporta
cotraduccionalmente para evitar su plegamiento en el citoplasma, que
inhibiría su exportación.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "ruta Tat" se refiere a la ruta de translocación de
proteínas de doble arginina (Tat) (Paschke et al., loc.
cit.). La ruta Tat difiere fundamentalmente de las rutas Sec y
SRP. En contraste con el translocón Sec, el translocón Tat exporta
únicamente proteínas completamente plegadas. En contraste con la
ruta SRP, el translocón Tat pasa proteínas
post-traduccionalmente a través de la membrana.
En una realización particular, la secuencia de
señal del polipéptido de fusión que comprende el PDI que debe
expresarse en la partícula fágica es una secuencia de señal que
estimula la translocación cotraduccional.
Los métodos para determinar si una secuencia de
señal de interés estimula la translocación cotraduccional a través
de la membrana citoplasmática de bacterias
Gram-negativas son bien conocidos para el experto en
la materia. Por ejemplo, la secuencia de señal de interés se
encuentra genéticamente fusionada con la MaIE madura (número de
acceso Swiss-Prot P02928, residuos 27 a 396). Esta
preproteína artificial seguidamente se expresa en E. coli y
el rendimiento de procesado proteolítico cotraduccional de su cadena
naciente se analiza mediante electroforesis en gel bidimensional,
tal como se ha descrito (Josefsson, L.-G. y Randall, L.L., Methods
Enzymol. 97:77-85, 1983; Schierle et al.,
loc. cit.). La separación de la secuencia de señal
N-terminal de interés mientras las cadenas de
preproteína todavía son nacientes indica que la translocación se
inicia antes de completarse la síntesis del polipéptido y, de esta
manera, que la translocación es cotraduccional. Son secuencias de
señal preferentes aquéllas que estimulan rendimientos de
translocación cotraduccional superiores a 80%, más preferentemente
superiores a 90%, tras fusionarse a MaIE madura. Las secuencias de
señal más preferentes son aquéllas que únicamente estimulan la
translocación cotraduccional y no la translocación
post-traduccional al encontrarse fusionadas a MaIE
madura. Alternativamente, pueden utilizarse secuencias
de señal que ya es conocido que estimulan la translocación cotraduccional, tales como la secuencia de señal de DsbA.
de señal que ya es conocido que estimulan la translocación cotraduccional, tales como la secuencia de señal de DsbA.
En otra realización particular, la secuencia de
señal del polipéptido de fusión que comprende el PDI que debe
expresarse en la partícula fágica es una secuencia de señal con
diana en la ruta de reconocimiento de señal.
La ruta de reconocimiento de señal de las
bacterias Gram-negativas y los métodos que someten a
ensayo la posibilidad de que una secuencia de señal de interés
direccione una preproteína a la ruta SRP son bien conocidos del
experto en la materia. Por ejemplo, la translocación de TrxA
fusionado a una secuencia de señal con diana en la ruta SRP resulta
fuertemente inhibida en E. coli que porta una mutación en el
gen ffh (por ejemplo una cepa mutante ffh77 o
ffh87), que codifica un componente de la SRP (Schierle et
al., loc. cit.; Huber et al., loc. cit.).
De esta manera, aquellas secuencias de señal con diana en la ruta
SRP estimulan la translocación de TrxA a través de la membrana
citoplasmática en E. coli de tipo salvaje, aunque muy
ineficientemente en la cepa mutante ffh. Las secuencias de
señal, de esta manera, pueden agruparse en dos clases diferenciadas.
Aquéllas con diana en la ruta SRP y aquéllas que no presentan como
diana la ruta SRP. Las secuencias de señal con diana en la ruta Sec
pueden redireccionarse a la ruta SRP mediante el incremento de la
hidrofobicidad global de la secuencia de señal, en particular
mediante el incremento de la hidrofobicidad de su región h. Por
ejemplo, las alteraciones modestas de la secuencia de señal MaIE
que simplemente incrementan su hidrofobicidad mediante la
sustitución de aminoácidos polares o pequeños (Gly o Ala) en la
región h por residuos hidrofóbicos grandes redireccionan la
proteína de la ruta Sec a la ruta SRP. Alternativamente, pueden
utilizarse las secuencias de señal que ya es conocido que presentan
su diana en la ruta SRP, tales como la secuencia de señal de DsbA.
Otros ejemplos de secuencias de señal que utilizan la ruta SRP son
aquéllas de un subconjunto de autotransportadores, tales como la de
la hemoglobina proteasa (Hbp, número de acceso UniProtKB 088093).
Poco habitualmente, la secuencia de señal de Hbp es relativamente
larga (52 aminoácidos) y contiene una extensión
N-terminal anterior a la secuencia de señal
clásica. Además, la región h de la secuencia de señal de Hbp no es
particularmente hidrofóbica. La secuencia de señal de SecM (número
de acceso Swiss-Prot P62395) es otro ejemplo de una
secuencia de señal larga que comprende una extensión
N-terminal y una región h moderadamente hidrofóbica
que es conocido que presenta su diana en la ruta SRP.
En todavía otra realización particular, la
secuencia de señal del polipéptido de fusión comprende el PDI que
debe expresarse en la partícula fágica es una secuencia de señal que
estimula la translocación de TrxA a través de la membrana
citoplasmática de las bacterias Gram-negativas.
Muchas secuencias de señal utilizadas
comúnmente, por ejemplo aquéllas de PhoA (número de acceso
Swiss-Prot P00634) y MaIE (número de acceso
Swiss-Prot P02928) sólo estimulan ineficientemente
la translocación de TrxA a través de la membrana citoplasmática
(Schierle et al., loc. cit.). En contraste, la
secuencia de señal de DsbA estimula la translocación eficiente de
TrxA. El fraccionamiento subcelular de las células huésped que
expresan TrxA fusionado a la secuencia de señal de interés permite
discriminar aquellas secuencias de señal que son capaces de
translocar TrxA a través de la membrana citoplasmática hacia el
periplasma de aquéllas que no son capaces (Huber et al.,
loc. cit.). La cantidad de TrxA en la fracción periplásmica
describe la eficiencia de la secuencia de señal para estimular la
translocación de TrxA. Alternativamente, pueden utilizarse
secuencias de señal que ya es conocido que estimulan la
translocación de TrxA, tales como la secuencia de señal de
DsbA.
En una realización preferente, la secuencia de
señal del polipéptido de fusión que comprende el PDI que debe
expresarse en la partícula fágica es una secuencia de señal
seleccionada de entre el grupo que consiste de TorT, SfmC, FocC,
CcmH, YraI, TolB, NikA, FIgI y DsbA y homólogos de los mismos.
En una realización particularmente preferente,
la secuencia de señal del polipéptido de fusión que comprende el
PDI que debe expresarse en la partícula fágica es una secuencia de
señal seleccionada de entre el grupo que consiste de TorT, SfmC,
TolB y DsbA.
En el contexto de la presente invención, el
término "homólogo" de una secuencia de señal se refiere a una
secuencia de aminoácido con una identidad de aminoácidos de 70%,
preferentemente de 80%, y en particular de 90% con cualquiera de
las secuencias de señal indiadas anteriormente en la presente
memoria, conservando simultáneamente la carga total, la
hidrofobicidad y las propiedades de corte de la región n, de la
región h y de la región c de la secuencia de señal,
respectivamente. Son ejemplos de dichos homólogos las secuencias de
aminoácidos en las que se sustituyen uno, dos, tres o cuatro, en
particular uno o dos aminoácidos por otros aminoácidos, en los que
se delecionan uno, dos, tres o cuatro aminoácidos, o se añaden uno o
dos aminoácidos, o se realizan combinaciones de sustituciones,
deleciones y adicionales, tal como se ha indicado anteriormente en
la presente memoria. En las sustituciones de aminoácidos, los
aminoácidos apolares preferentemente se sustituyente por otros
aminoácidos apolares, por ejemplo Ile por Leu, Val, Ala, Trp, Phe o
Met, o viceversa, aminoácidos polares por otros aminoácidos
polares, por ejemplo Thr por Ser, Asn o Gln, o viceversa,
aminoácidos cargados negativamente por otros aminoácidos cargados
negativamente, por ejemplo Asp por Glu, o viceversa, aminoácidos
cargados positivamente por otros aminoácidos cargados
positivamente, por ejemplo Lys por Arg o His, o viceversa.
Por ejemplo, para la secuencia de señal
preferente de DsbA con la secuencia de aminoácidos MKKIWLALAG
LVLAFSASA (SEC ID nº 1), la sustitución del aminoácido Lys2 por
Arg, Ala9 por Leu, Ala14 por Val y Ser16 por Thr resultan
posibles.
Las secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC,
CcmH, YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA es conocido que estimulan la
translocación cotraduccional de TrxA al presentar como diana la ruta
SRP, y presentan, en la mayoría de casos, una hidrofobicidad global
más alta en comparación con las secuencias de señal que presentan
como diana la ruta Sec (Huber et al., loc. cit.).
Las proteínas presentan los números de acceso
Swiss-Prot siguientes: TorT P38683, SfmC P77249,
FocC P62609, CcmH P33925, Yral P42914, TolB P0A855, NikA P33590,
FlgI P0A6S3 y DsbA P24991.
Los cálculos de hidrofobicidad por sí solos no
permiten discriminar entre las secuencias de señal dependientes e
independientes de SR en el intervalo alto de hidrofobicidad (Huber
et al., loc. cit.). De esta manera, otras
características aparte de la hidrofobicidad (por ejemplo la
estructura del péptido de señal) influyen sobre la preferencia para
una ruta de translocación.
En una realización particularmente preferente,
la secuencia de señal es la secuencia de señal de DsbA o cualquier
secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 90% con la
secuencia de señal de DsbA.
El método resulta aplicable a cualquiera de los
métodos de expresión en fago filamentoso, por ejemplo con fagos f1,
M13, fd e lke, en particular f1, M13 y fd.
En particular, el método de la invención
comprende las etapas siguientes:
(a) construir un vector fago filamentoso o
fagémido que contiene un casete de expresión para un polipéptido de
fusión que presenta una secuencia de señal
N-terminal que estimula la translocación
cotraduccional del polipéptido de fusión a través de la membrana
citoplasmática de las bacterias Gram-negativas,
(b) construir una biblioteca combinatorial de
vectores fagos o fagémidos mediante la clonación de una biblioteca
de ADN codificante de los polipéptidos de interés en el casete de
expresión del vector de la etapa (a),
(c) transformar bacterias
Gram-negativas adecuadas con la biblioteca de
vectores de la etapa b), y (d) llevar a cabo ciclos de selección de
fagos de expresión para separar las partículas fágicas basándose en
las propiedades de las proteínas de interés expresadas.
En la etapa (a), el fago filamentoso o vector
fagémido se construye utilizando métodos estándares de tecnología
génica. Por ejemplo, la secuencia de señal codificante de parte del
casete de expresión para el polipéptido de fusión de un vector fago
o fagémido establecido se sustituye por la secuencia codificante de
dicha secuencia de señal utilizando técnicas de ADN estándares.
Alternativamente, se construye de novo utilizando conocimientos
generales sobre la composición de dichos vectores (por ejemplo
Russel et al., loc. cit.) y métodos estándares de
síntesis de ADN y de ensamblaje, un vector fago o fagémido nuevo que
contenga un casete de expresión para el polipéptido de fusión que
contiene dicha secuencia de señal. Los vectores fago o fagémido que
resultan útiles para este fin son, por ejemplo, pAK100, pComb3,
pEXmide3, pHEN1, pJuFo o pSEX. Un ejemplo de este tipo de vector
fagémido (pDST23) se describe en la figura 3 y en el Ejemplo
adjunto, a modo de ilustración de la invención sin limitarla a esta
realización particular.
Preferentemente, la secuencia de señal del
polipéptido de fusión en la etapa (a) estimula la translocación del
polipéptido de fusión a través de la ruta SRP.
Más preferentemente, la secuencia de señal del
polipéptido de fusión en la etapa (a) estimula la translocación
cotraduccional de TrxA.
En la etapa (b), se utilizan métodos estándares
para la preparación de bibliotecas combinatoriales de vectores. Por
ejemplo, se generan bibliotecas combinatoriales de ADN codificante
de las proteínas de interés mediante mutagénesis aleatoria o
sitio-dirigida, mediante barajado del ADN, mediante
la preparación de ADNc mediante amplificación de ARNm celular o
mediante diseño por consenso y después ligación en el casete de
expresión de dicho vector mediante técnicas estándares de ADN.
En la etapa (c), se utilizan métodos estándares
para la transformación de las bacterias
Gram-negativas. Por ejemplo, las bacterias se
transforman con la biblioteca combinatorial de vectores de la etapa
(b) mediante electroporación o medios químicos. Dichos métodos son
bien conocidos por el experto en la materia.
En la etapa (d), se llevan a cabo ciclos de
selección de expresión fágica estándares. Estos ciclos de selección
de expresión fágica son bien conocidos por el experto en la materia
(por ejemplo Russel et al., loc. cit.).
Preferentemente, la propiedad del polipéptido de
interés expresado de la etapa (d) es la unión específica a una
molécula diana de interés. En este caso, las partículas fágicas que
expresan una PDI que se une a la molécula diana se separan de las
partículas fágicas que expresan polipéptidos irrelevantes mediante
la aplicación de las partículas fágicas amplificadas en cada ciclo
de selección a la molécula diana funcionalmente inmovilizada sobre
una superficie, la eliminación mediante lavado de las partículas
fágicas no unidas, la elución de las partículas fágicas unidas y la
utilización de las partículas fágicas eluidas como entrada para la
amplificación de partículas fágicas del ciclo de selección
siguiente.
Se entiende que, al utilizar en el contexto de
la presente invención la expresión "una secuencia de señal" o
"la secuencia de señal" también se hace referencia a "uno o
más", por ejemplo uno, dos, tres o cuatro secuencias de señal de
diferente composición. La utilización de más de una secuencia de
señal puede resultar ventajosa para aplicaciones particulares, y
también se encuentra comprendida dentro del alcance de la presente
invención.
Asimismo, la invención se refiere a un vector
fago o fagémido que comprende un constructo génico codificante de
un polipéptido de fusión que comprende el PDI fusionado con una
secuencia de señal N-terminal que estimula la
translocación cotraduccional de TrxA, en particular una secuencia de
señal que se selecciona de entre el grupo que consiste de las
secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, Yral, TolB, NikA,
FlgI y DsbA, y homólogos de las mismas, preferentemente
seleccionados de entre TorT, SfmC, TolB y DsbA. Resulta más
preferente un vector fago o fagémido que comprende la secuencia de
señal de DsbA o un homólogo de la misma.
El método de la invención resulta
particularmente adecuado para la aplicación con bibliotecas de
compuestos, por ejemplo bibliotecas de ADN, en particular
bibliotecas de ADNc. En contraste con los métodos utilizados hasta
el momento en la expresión fágica, el método de la invención
permite la presentación fiable de polipéptidos obtenidos mediante la
expresión de dichas bibliotecas.
Una realización particular de la invención es el
método de expresión en fago filamentoso descrita, en la que se
expresan PDIs codificadas por una biblioteca de ADN en las
partículas fágicas. Preferentemente, se consigue la translocación
cotraduccional de los PDIs codificados por una biblioteca de ADN
basándose en la ruta de la partícula de reconocimiento de señal,
tal como una secuencia de señal que estimula la translocación
cotraduccional de TrxA. Resulta más preferente el método descrito
en la presente memoria para la expresión fágica de proteínas
repetitivas.
Al igual que con cualquier tecnología de
selección, el éxito de las selecciones de expresión fágica dependen
fuertemente de la diversidad de miembros de la biblioteca
expresados. Una biblioteca combinatorial de ADN de gran tamaño en
sí misma no garantiza que pueda expresarse una gran diversidad de
miembros de la biblioteca. En la expresión fágica, los polipéptidos
que deben expresarse deben translocarse a través de la membrana
citoplasmática antes de su incorporación en partículas fágicas. La
totalidad de los métodos de expresión en fago filamentoso actuales
utiliza una ruta post-traduccional del polipéptido
de fusión a través de la membrana citoplasmática (Russel et
al., loc. cit.; Paschke et al., loc. cit.).
De esta manera, los miembros de la biblioteca incompatibles con
dichas rutas serán refractarios a la expresión, reduciendo
claramente de esta manera la diversidad de la biblioteca que se
expresa.
Las bibliotecas de ADN consideradas son todas
las posibles bibliotecas combinatoriales de ADN, incluyendo
aquéllas producidas mediante mutagénesis aleatoria o
sitio-dirigida, mediante barajado de AND o mediante
diseño por consenso. Dichos métodos generan miembros de la
biblioteca que presentan nuevas propiedades, tales como propiedades
de unión; algunos de ellos serán incompatibles con la translocación
mediante la ruta Sec. Entre dichas bibliotecas se incluyen
bibliotecas de ADN que codifican bibliotecas de péptidos,
bibliotecas de anticuerpos o bibliotecas basadas en andamiajes
alternativos (Russel et al., loc. cit.; Nygren, P.A. y
Skerra, A., J. Immunol. Methods 290:3-28,
2004).
Algunas bibliotecas de ADN adicionales
consideradas son aquéllas codificantes de bibliotecas de anticuerpo
Fv monocatenario (scFv) que se utilizan para seleccionar fragmentos
scFv intracelularmente activos (intracuerpos). Un requisito para
que los intracuerpos es que se plieguen bien y que sean estables en
el citoplasma de E. coli. De esta manera, los intracuerpos
citoplasmáticamente estables y bien plegados se translocan
ineficientemente mediante el mecanismo
post-traduccional de la ruta Sec.
Algunas bibliotecas de ADN adicionales
consideradas son aquéllas codificantes de bibliotecas de andamiajes
basados en proteínas repetitivas, incluyendo proteínas repetitivas
anquirina, proteínas repetitivas ricas en leucinas, proteína
repetitivas de tetratricopéptidos, proteínas repetitivas de
pentatricopéptidos o proteínas repetitivas armadillo/HEAT.
Una biblioteca de ADN preferente es una
biblioteca codificante de proteínas repetitivas anquirina diseñadas
(DARPins) (Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand,
C., Forrer, P., Grütter, M.G. y Plückthun, A., Nat. Biotechnol.
22:575-582, 2004). Se muestran ejemplos de DARPins
expresados en partículas fágicas en el Ejemplo.
Asimismo, la invención describe los fagos
producidos mediante el método de la invención.
Asimismo, la invención se refiere a la expresión
periplásmica de proteínas de plegamiento muy rápido y
citoplasmáticamente estables, en particular a la expresión
periplásmica de DARPins. Los fagémidos codificantes de DsbAss y de
DARPins de los Ejemplos pueden utilizarse directamente para la
expresión periplásmica eficiente de los DARPins en un E.
coli no supresor. Alternativamente, pueden adaptarse vectores de
expresión periplásmica estándares mediante la sustitución del ADN
codificante de la secuencia de señal utilizada para la expresión
periplásmica mediante ADN codificante de una secuencia de señal de
la presente invención, en particular mediante el ADN codificante de
DsbAss. Por ejemplo, la expresión periplásmica eficiente de los
DARPins resulta crucial para la expresión de DARPins fusionados a
proteínas efectoras, en particular toxinas o citoquinas, que
resultan muy difíciles de expresar en el citoplasma.
El nuevo método de expresión fágica
ejemplificado posteriormente en la presente memoria permite
incorporar eficientemente un abanico muy amplio de PDIs que deben
expresarse en partículas fágicas y de esta manera permite la
expresión fágica eficiente. La diferencia clave de este nuevo método
en comparación con los métodos de expresión fágica tradicionales es
la utilización de secuencias de señal que dirigen el polipéptido de
fusión que comprende el PDI que debe expresarse hacia la ruta SRP
cotraduccional (figura 2, (1)-(2)). De esta manera, el PDI que debe
expresarse se transloca eficientemente a través de la membrana
citoplasmática en el periplasma, permitiendo de esta manera una
incorporación eficiente del PDI en las partículas fágicas. Las
proteínas de fusión preferentes también comprende una de las
proteínas de cubierta del fago filamentoso o versiones truncadas de
las proteínas de cubierta. En esta caso, el PDI se ancla a la
membrana citoplasmática mediante la extensión hidrofóbica de la
proteína de cubierta fágica tras la translocación (figura 1) y antes
de la incorporación en la partícula fágica.
Un ejemplo particular de una secuencia de señal
con diana en la ruta SRP es la secuencia de señal de la proteína de
E. coli DsbA (DsbAss). Todos los demás elementos de los
fagémidos pDST ejemplificados se derivan de fagémidos clásicos,
tales como la serie pAK100, que portan las secuencias de señal de
PelB (PelBss) o PhoA (PhoAss) que dirige los polipéptidos de
interés que deben expresarse mediante la ruta Sec
post-traduccional (figura 2, (3)-(4)-(5)).
En una serie de experimentos, los rendimientos
de expresión se compararon entre partículas fágicas producidas a
partir de fagémidos pDST codificantes de fagémidos PhoAss y pDST
codificantes de DsbAss. Se produjeron partículas fágicas mediante
protocolos estándares tal como se describe posteriormente y se
purificaron mediante centrifugación en gradiente de CsCl. La
transferencia western mostró que, para la expresión de un anticuerpo
Fv monocatenario, el fagémido pDST produjo partículas fágicas que
presentaban aproximadamente los mismos rendimientos de expresión
del PDI independiente de la secuencia de señal utilizada (figura 4A,
scFv). Sin embargo, en claro contraste, la totalidad de los cuatro
DARPins sometidos a ensayo sólo pudieron expresarse eficientemente
al utilizar los fagémidos pDST que contenían DsbAss, y
prácticamente no pudo detectarse proteína expresada al utilizar los
fagémidos pDST que contenían PhoAss (figura 4A, DARPins). De manera
similar, los fagémidos pDST que contenían DsbAss resultaron en
rendimientos de expresión considerablemente más altos en el caso de
los polipéptidos GCN4 (figura 4A), proteína D de cabeza de lambda,
TrxA y APH (figura 4B). Se observaron rendimientos de expresión
sólo ligeramente más altos para las proteínas polimerasa Taq y
proteína fosfatasa de fago lambda (\lambdaPP), y no pudo
detectarse proteína expresada en el caso de la quinasa 2
N-terminal c-jun (JNK2, figura 4B).
Lo anterior demuestra que los rendimientos de expresión en
partículas fágicas producidas mediante la utilización de fagémidos
pDST que contienen DsbAss son por lo menos comparables a aquellos
producidos por fagémidos clásicos utilizando PhoAss, aunque
muestran rendimientos de expresión fuertemente incrementados al
expresar DARPins y otras proteínas de plegamiento rápido y
termodinámicamente estables.
Para cuantificar dicha diferencia, se utilizaron
partícula fágicas en experimentos ELISA en fagos. Se compararon
partículas fágicas que expresaban DARPins que se unían
específicamente a las proteínas APH y JNK2 tras la producción a
partir de fagémidos pDST que contenían DsbAss o fagémidos pDST que
contenían PhoAss. Basándose en la detección de partículas fágicas
unidas según cuantificación con un anticuerpo
anti-M13, se observó un rendimiento de expresión
incrementado en más de 100 veces (figura 5).
Para demostrar que los rendimientos de expresión
más altos mediante la utilización de DsbAss también beneficiaban a
los experimentos de selección, se mezclaron en diversas diluciones
dos mezclas de ensayo que contenían tres tipos diferentes de
partículas fágicas producidas a partir de fagémidos codificantes de
DsbAss o PhoAss. Para ambas mezclas de ensayo, se añadieron
partículas fágicas que expresaban DARPins que se unían
específicamente a las proteínas APH y JNK2 a una dilución de
1:10^{7} en partículas fágicas que expresaban DARPins no
seleccionadas E3_5 y E3_19. Estas dos mezclas de ensayo se
utilizaron como bibliotecas de entrada para las selecciones
estándares de expresión fágica de las proteína diana APH y JNK2
(Tabla 2). Mientras que las partículas fágicas específicas de APH y
de JNK2 pudieron enriquecerse a partir de las mezclas de ensayo
producidas a partir de fagémidos codificantes de DsbAss en un
factor de aproximadamente 1.000 por ciclo de selección (ya más de
10% de los clones ensayados eran específicos para su diana tras
únicamente dos ciclos de selección), no pudo observarse
enriquecimiento a partir de la biblioteca de ensayo producida a
partir de fagémidos que contenían PhoAss incluso tras cinco ciclos
de selección (no se observaron clones específicos).
En otra serie de experimentos, se compararon los
rendimientos de expresión mediante ELISA fágica entre partículas
fágicas producidas a partir de fagémidos pDST codificantes de
PhoAss, PelBss, DsbAss, TorTss, TolBss o SfmCss. Las partículas
fágicas que expresaban DARPins que se unían específicamnte a las
proteínas APH y JNK2 se compararon tras su producción a partir de
fagémidos pDST individuales. Basándose en la detección de partículas
fágicas unidas según se cuantificó utilizando un anticuerpo
anti-M13, se observó un rendimiento de expresión
incrementado en un factor de hasta 700 en el caso de las secuencias
de señal dependientes de SRP (DsbAss, TorTss, TolBss o SfmCss) en
comparación con la secuencia de señal dependiente de Sec PhoAss
(figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se adquirieron los compuestos químicos de Fluka
(Suiza) Los oligonucleótidos eran de Microsynth (Suiza). La ADN
polimerasa Vent, los enzimas de restricción y los tampones eran de
New England Biolabs (USA) o de Fermentas (Lituania). El fago
ayudante VCS M13 era de Stratagene (USA). La totalidad de las
clonaciones y amplificaciones de fago se llevaron a cabo en E.
coli XL1-Blue, de Stratagene (USA).
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se indique lo contrario, todos los
métodos de biología molecular se llevaron a cabo según los
protocolos descritos (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E.,
Moore, D.D., Sedman, J.G., Smith, J.A. y Stuhl, K., editores,
Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and
Sons, 1999). Se proporcionan protocolos breves a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se indique lo contrario, todos los
métodos relacionados con la expresión fágica se llevaron a cabo
según protocolos descritos (Clackson, T. y Lowman, H.B., editores,
Phage Dipslay: A Practical Approach, New York: Oxford University
Press, 2004; Barbas III, C.F., Burton, D.R., Scott, J.K., editores,
Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 2001). A continuación, se proporcionan protocolos
breves.
\vskip1.000000\baselineskip
Un derivado del fagémido pAK100 (Krebbe, A.,
Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard,
H.R. y Plückthun, A., J. Immunol. Methods 201:35-55,
1997) codificante de DARPin 3a fue el punto de partida para la
clonación del primer fagémido del presente estudio, denominado
pDST23.
Para sustituir la secuencia de señal de este
derivado pAK100, se diseñaron los oligonucleótidos oDST4 (SEC ID nº
5), oDST5 (SEC ID nº 6), oDST6 (SEC ID nº 7) y oDST8 (SEC ID nº 8).
Estos cuatro oligonucleótidos codifican la secuencia de señal de
DsbA de E. coli. La proteína DsbA de E. coli puede
encontrarse en la base de datos Swiss-Prot (número
de acceso P24991). Su secuencia de señal es MKKIWLALAG LVLAFSASA
(SEC ID nº 1). Los oligonucleótidos oDST4, oDST5, oDST6 y oDST8 se
hibridaron y se amplificaron con los oligonucleótidos oDST6 y oDST8
mediante PCR. El fragmento de ADN resultante codificaba la
secuencia de señal de DsbA y se encontraba flanqueado por los
sitios de endonucleasa de restricción XbaI y BamHI. Este fragmento
de ADN se digirió con XbaI y BamHI y se ligó en un derivado pAK100
tratado y desfosforilado de manera similar. Se aisló el fagémido
pDST23 resultante (figura 3) y la secuencia correcta se verificó
mediante secuenciación del
ADN.
ADN.
Para permitir la comparación experimental
directa con fagémidos codificantes de la secuencia de señal de PhoA
(SEC ID nº 9), se generó un segundo fagémido denominado pDST22.
Nuevamente, se hibridaron y amplificaron cuatro oligonucleótidos,
denominados oDST4p (SEC ID nº 10), oDST5p (SEC ID nº 11), oDST6 (SEC
ID nº 7) y oDST8p (SEC ID nº 12) con oDST6 y oDST8p mediante PCR.
El fragmento de ADN resultante codificaba la secuencia de señal de
PhoA y se encontraba flanqueado por los sitios de endonucleasa de
restricción XbaI y BamHI. Este fragmento de ADN se digirió con XbaI
y BamHI y se ligó en pDST123 tratado y desfosforilado de manera
similar. Se aisló el fagémido pDST22 resultante y se verificó la
secuencia correcta mediante secuenciación del ADN.
\newpage
Los demás fagémidos utilizados en el presente
estudio se indican en la Tabla 1 y se obtuvieron de la manera
siguiente: las secuencias codificantes de las proteína de interés se
amplificaron mediante PCR utilizando cebadores de PCR
apropiadamente diseñados y ADN molde, tal como ADNc preparado o
plásmido de ADN disponible públicamente. De esta manera, se
introdujo un sitio de restricción BamHI o BglII en dirección 5'
respecto a cada una de las secuencias codificantes y se
introdujeron dos sitios de restricción (EcoRI y PstI) 3' respecto a
cada una de las secuencias codificantes. Estos fragmentos de PCR se
digirieron con BamHI o con BglII y con EcoRI o PstI, y después se
ligaron en los fagémidos pDST23 o pDST22 tratados y desfosforilados
de manera similar. El marco de lectura abierta del casete de
expresión para el polipéptido de fusión que comprendía el producto
de PCR clonado se mantuvo para todos los constructos, especialmente
se mantuvo el marco de lectura correcto para la fusión
C-terminal del dominio C-terminal de
la proteína III fágica (CTp3). El primer y último aminoácidos de
las proteínas clonadas de interés se proporcionan en la Tabla 1, así
como el numero de referencia o de acceso para las bases de datos
GenBank o Swiss-Prot. La secuencia correcta de todos
los fagémidos se verificó mediante secuenciación del ADN.
Para las proteínas anquirina diseñadas (DARPins)
3a y 2_3, se generaron los fagémidos codificantes de PelBss (pDST80
y pDST81, respectivamente), SfmCss (pDST86 y pDST87,
respectivament), TolBss (pDST84 y pDST85, respectivamente) y TorTss
(pDST88 y pDST8 9, respectivamente), utilizando la misma estrategia
de clonación descrita anteriormente para DsbAss y PhoAss.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon 5 ml d medio 2xYT que contenía 1%
de glucosa, 34 \mug/ml de cloranfenicol (cam) y 15 \mug/ml de
tetraciclina (tet) con una única copia de E. coli
XL-1 Blue que portaba el fagémido de interés, y las
células se cultivaron durante la noche a 30ºC bajo agitación. Se
inocularon 5 ml de medio 2xYT fresco que contenía 1% de glucosa, 34
\mug/ml de cam y 15 \mug/ml de tet con los cultivos de la noche
a una proporción de 1:100 (DO_{600}\approx0,04) y se cultivaron
a 37ºC hasta una D0600 de 0,5 bajo agitación. Los cultivos se
infectaron con fago ayudante VCS M13 a 4x10^{10} pfu (unidades
formadoras de palca) por ml (multiplicidad de infección \sim20) y
las células se incubaron durante 30 minutos a 37ºC sin agitación y
después durante 30 minutos a 37ºC bajo agitación. Se cambió el
medio mediante recolección de las células mediante centrifugación
(3.500 g, 24ºC, 10 minutos) y se resuspendió el pellet en 50 ml de
medio 2xYT que contenía 34 \mug/ml de cam, 50 \mug/ml de
canamicina (kan) e
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
(IPTG) 0,1 mM. Tras cultivar durante 14 a 16 horas a 30ºC bajo
agitación, se separaron las células mediante centrifugación (5.600
g, 4ºC, 10 minutos). Se incubó el sobrenadante de cultivo sobre
hielo durante 1 hora con un cuarto del volumen de PEG
helado/solución de NaCl (polietilenglicol (PEG) 6000 al 20%, NaCl
2,5 M). Las partículas fágicas precipitadas seguidamente se
recogieron mediante centrifugación a (5.600 g, 4ºC, 15 minutos) y se
redisolvieron en 1 ml de TBS150 (Tris/HCl 25 mM, NaCl 150 mM, pH
7,5). Se realizó una purificación adicional de las partículas
fágicas mediante centrifugación en gradiente de CsCl de la manera
siguiente. Tras la adición de 1,6 g de CsCl, se ajustó el volumen a
4 ml con TBS150. La solución de CsCl se transfirió a un tubo de
polialómero de ½ x ½ pulgadas (Beckmann, USA, nº 358980) y se
centrifugó a 100.000 r.p.m. durante 4 horas en un rotor
TLN-100 (Beckman Instruments) a 4ºC. Tras la
centrifugación, se recuperó la banda de los fagos. Los fagos se
transfirieron a tubos de policarbonato de ½ x 2 pulgadas
(Beckmann, USA nº 349622), que se rellenaron con TBS150 hasta 3 ml.
Tras la centrifugación a 50.000 r.p.m. durante 1 hora en un rotor
TLA-100.3 a 4ºC, los fagos peletizados se
redisolvieron en 3 ml de TBS. Tras una centrifugación adicional a
50.000 r.p.m. durante 1 hora en un rotor TLA-100.3 a
4ºC, los fagos se disolvieron en 1 ml de TBS. La concentración
total de partículas fágicas se cuantificó espectrofotométricamente.
El título infectivo de las muestras de fagos se determinó mediante
titración en células de E. coli XL-1 Blue
utilizando placas de ágar 2xYT que contenían 1% de glucosa y 34
\mug/l de cam. Las colonias se contaron tras incubar durante la
noche a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplicaron 5x 10^{11} partículas fágicas,
purificadas en gradiente de CsCl, a una electroforesis en gel de
dodecilsulfato sódico al 15%-poliacrilamida
(SDS-PAGE) bajo condiciones reductoras y se
transfirieron a una membrana de transferencia
Immobilon-P de fluoruro de polivinilideno (PVDF)
(Millipore, USA) mediante electrotransferencia. La membrana se
bloqueó con MTTBS150 (TBS150, Tween 20 al 0,1%, leche desnatada al
5%) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) y se incubaron con
un anticuerpo murino anti-pIII (MoBiTec, Alemania,
nº PSKAN3) (1:1.000 en MTTBS_{150}, 20 minutos a TA) como
anticuerpo primario, que reconoce el dominio
C-terminal de pIII. Como anticuerpo secundario se
utilizó un fragmento F(ab')_{2} de IgG de cabra antiratón
conjugado con peroxidasa (Pierce, USA, nº 31438) (1:10.000 en
MTTBS150, 1 hora a TA). Las proteínas se detectaron con sustrato
ChemiGlow West (Alpha Innotech, USA).
En un segundo experimento, la membrana bloqueada
se incubó con anticuerpo anti-FLAG M1 murino (Sigma,
USA, nº F3040) (1:5.000 en MTTBS_{150}, 1 hora a TA) como
anticuerpo primario. Como anticuerpo secundario se utilizó un
conjugado de IgG de cabra antiratón y fosfatasa alcalina (Sigma,
USA, nº A3562) (1:10.000 en MTTBS_{150}, 1 hora a TA). Las
proteínas se detectaron con los sustratos fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) (Fluka, Suiza).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo ELISAs con fagos para someter
a ensayo la cantidad de DARPins funcionalmente expresadas en
partículas de fago M13. Se inmovilizaron las proteínas APH y JNK2
biotiniladas (Binz et al., loc. cit.) de la manera
siguiente: se inmovilizó neutravidina (66 nM, 100 \mul/pocillo;
Socochim, Suiza) en TBS_{150} en placas MaxiSorp (Nunc,
Dinamarca, nº 442404) mediante incubación durante la noche a 4ºC.
Los pocillos se bloquearon con 300 \mul de BTTBS150 (TBS150,
Tween-20 al 0,1%, BSA al 1%) durante 1 hora a
temperatura ambiente. La unión de las proteínas APH y JNK2
biotiniladas (100 \mul, 1 \muM) en BTTBS150 se realizó durante 1
hora a 4ºC. Se añadió una serie de dilución de partículas fágicas
en BTTBS150 a los pocillos y se incubaron a TA durante 2 horas.
Tras lavar los pocillos cinco veces con 300 \mul de TTBS150
(TBS150, Tween-20 al 0,1%) durante 5 minutos, las
partículas fágicas unidas se detectaron con conjugado de
anti-M13 con peroxidasa de rábano picante (Amersham
Pharmacia Biotech, Reino Unido, nº
27-9421-01) y sustrato BM Blue del
PDI (Roche Diagnostics, Alemania, nº 1484281).
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron las partículas fágicas de
expresión E3_5, E3_19, 3a y 2_3 a partir de fagémidos codificantes
de la secuencia de señal de PhoA (pDST30, pDST65, pDST2 2, pDST3 4)
o de fagémidos codificantes de la secuencia de señal de DsbA
(pDST32, pDST66, pDST23, pDST37), respectivamente. Estas partículas
fágicas se utilizaron para preparar mezclas de partículas fágicas
producidas a partir de fagémicos codificantes de PhoAss o de DsbAss.
A una mezcla 1:1 de partículas fágicas que expresaban las DARPins
no ligantes E3_5 y E_19, se añadieron partículas fágicas que
expresaban las DARPins específicas de diana 3a o 2_3 a una dilución
de 1:10^{7}. Se recubrieron las proteínas APH y JNK2 biotiniladas
tal como se ha descrito para la ELISA de fagos. A cada pocillo, se
añadieron 0,1 ml de mezclas de partículas fágicas (10 13 cfu/ml) a
0,1 ml de BTTBS150 y se incubaron durante 2 horas. Tras lavar (3
veces para el primer ciclo de selección, 4 veces para el segundo
ciclo y 5 veces para ciclos adicionales) con TTBS150 y (3 veces
para el primer ciclo de selección, 4 veces para el segundo ciclo y 5
veces para ciclos adicionales) con TBS150, las partículas fágicas
se eluyeron mediante incubación durante 15 minutos con 0,2 ml de
tampón de elución (glicina/HCl 0,2 M, pH 2,2) a aproximadamente 22ºC
seguido de una elución durante 30 minutos con 0,2 ml de tripsina
(10 mg/ml en TBS150) a 37ºC. Se utilizaron los eluidos agrupados
(neutralizados con 10 \mul de base Tris 2 M) para la infección de
4 ml de E. coli XL1-Blue en crecimiento
exponencial. Tras 30 minutos a 37ºC sin agitación y 30 minutos a
37ºC bajo agitación, se extendieron las células sobre placas de
ágar 2xYT que contenían 1% de glucosa y 34 \mug/ml de cam y 15
\mug/ml de tet y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Las
células se lavaron de las placas con 2xYT que contenía 1% de
glucosa, 15% de glicerol, 34 \mug/ml de cam y 15 \mug/ml de tet
y se utilizaron para la producción de fagos para el siguiente ciclo
de cribado en fase sólida. Tras cada ciclo de cribado en fase
sólida, se determinó la identidad de 9 a 16 partículas fágicas
eluidas. Esto se llevó a cabo mediante infección de E. coli
con estas partículas fágicas y cribando las colonias mediante PCR
con cebadores específicos de un clon.
<110> Universidad de Zürich
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión fágica utilizando
translocación cotraduccional de polipéptidos de fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P332A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP05106236.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-07-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> E1-T245 de gpD
ligante de Fv monocatenario, que contiene un enlace disulfuro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm8
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D13-Q166 de APH
ligante de DARPin 3a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado del factor de
transcripción GCN4 (R249 a R281, E259-, S262P)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido oDST4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido oDST5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido oD5T6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagagc atgcgtagga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido oDST8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatccat ctttgtagtc cgccg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido oDST4p
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido oDsT5p
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatctttgt agtcggcttt ggtaacaggg gtgaagagca acggtaagag tgccagtgc
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido oDST8p
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatccat ctttgtagtc ggc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia carotovora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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Claims (15)
1. Método de expresión en fago filamentoso, en
el que se expresan en partículas fágicas polipéptidos de interés
codificados por una biblioteca de ADN, en el que dicha biblioteca de
ADN es una biblioteca de ADNc o una biblioteca combinatorial de ADN
que codifica una biblioteca de péptidos, un biblioteca de
anticuerpos o una biblioteca basada en andamiajes alternativos, y
en el que los polipéptidos de interés se translocan
cotraduccionalmente a través de la membrana citoplasmática de
bacterias Gram-negativas.
2. Método según la reivindicación 2, en el que
la translocación cotraduccional se lleva a cabo basándose en la
ruta de la partícula de reconocimiento de señal.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la secuencia de señal utilizada para la translocación del
polipéptido de interés que debe expresarse en la partícula fágica es
una secuencia de señal que estimula la translocación cotraduccional
de TrxA.
4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en
el que la secuencia de señal utilizada para la translocación de los
polipéptidos de interés que deben expresarse en la partícula fágica
se seleccionan de entre el grupo que consiste de secuencias de
señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA, y
secuencias de aminoácidos con una identidad de 70% respecto a una
de dichas secuencias de señal, en el que dichas secuencias de
aminoácidos conservan la carga total, la hidrofobicidad y las
propiedades de corte de las regiones n, h y c de dicha secuencia de
señal, respectivamente.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
la secuencia de señal utilizada para la translocación de los
polipéptidos de interés que deben expresarse en las partículas
fágicas se selecciona de entre el grupo que consiste de secuencias
de señal de TorT, SfmC, TolB y DsbA.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que los polipéptidos de interés que
deben expresarse en las partículas fágicas son proteínas
repetitivas.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas siguientes:
(a) construir un vector fago filamentoso o
fagémido que contiene un casete de expresión para un polipéptido de
fusión que presenta una secuencia de señal
N-terminal que estimula la translocación
cotraduccional del polipéptido de fusión a través de la membrana
citoplasmática de las bacterias Gram-negativas,
(b) construir una biblioteca combinatorial de
vectores fágicos o fagémidos mediante la clonación de la biblioteca
de ADN codificante de los polipéptidos de interés en el casete de
expresión del vector de la etapa (a),
(c) transformar bacterias
Gram-negativas adecuadas con la biblioteca de
vectores de la etapa (b), y (d) llevar a cabo ciclos de selección
de expresión fágica para separar las partículas fágicas basándose en
las propiedades de los polipéptidos de interés expresados.
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8. Método de expresión en fago filamentoso, en
el que un polipéptido de interés expresado en la partícula fágica
se transloca cotraduccionalmente a través de la membrana
citoplasmática de bacterias Gram-negativas
utilizando una secuencia de señal seleccionada de entre el grupo que
consiste de las secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH,
YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA, y secuencias de aminoácidos con una
identidad de 70% respecto a una de dichas secuencias de señal, en
el que dichas secuencias de aminoácidos conservan la carga total,
la hidrofobicidad y las propiedades de corte de las regiones n, h y
c de dicha secuencia de señal, respectivamente.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
la secuencia de señal se selecciona de entre el grupo que consiste
de secuencias de señal de TorT, SfmC, TolB y DsbA.
10. Vector fágico o fagémido adecuado para el
método según la reivindicación 1, que comprende un constructo
génico codificante de una proteína de fusión que comprende el
polipéptido de interés que debe expresarse en la partícula fágica y
una secuencia de señal seleccionada de entre el grupo que consiste
de secuencias de señal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, YraI, TolB, NikA,
FlgI y DsbA, y secuencias de aminoácidos con un 70% de identidad
respecto a dichas secuencias de señal, en el que dichas secuencias
de aminoácidos conservan la carga total, la hidrofobicidad y las
propiedades de corte de las regiones n, h y c de dicha secuencia de
señal, respectivamente.
11. Vector según la reivindicación 10, en el que
la secuencia de señal se selecciona de entre el grupo que consiste
de secuencias de señal de TorT, SfmC, TolB y DsbA.
12. Biblioteca de vectores fágicos o fagémidos
que comprende constructos génicos codificantes de proteínas de
fusión, en la que cada una de las proteínas de fusión comprende una
secuencia de señal que estimula la translocación cotraduccional de
TrxA y un polipéptido de interés que debe expresarse en una
partícula fágica, en la que cada polipéptido de interés se
encuentra codificado por un miembro de una biblioteca de ADN, en la
que dicha biblioteca de ADN es una biblioteca de ADNc o una
biblioteca combinatorial de ADN que codifica una biblioteca de
péptidos, una biblioteca de anticuerpos o una biblioteca basada en
andamiajes alternativos.
13. Biblioteca de vectores según la
reivindicación 12, en la que la secuencia de señal se selecciona de
entre el grupo que consiste de las secuencias de señal de TorT,
SfmC, FocC, CcmH, YraI, TolB, NikA, FlgI y DsbA, y secuencias de
aminoácidos con una identidad de 70% respecto a una de dichas
secuencias de señal, en la que dichas secuencias de aminoácidos
conservan la carga total, la hidrofobicidad y las propiedades de
corte de las regiones n, h y c de dicha secuencia de señal,
respectivamente.
14. Biblioteca de vectores según la
reivindicación 12, en la que la secuencia de señal se selecciona de
entre el grupo que consiste de las secuencias de señal de TorT,
SfmC, TolB y DsbA.
15. Biblioteca de vectores según cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 14, en la que la biblioteca de ADN
codificante de los polipéptidos de interés es una biblioteca de ADN
codificante de proteínas repetitivas.
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