ES2384006T3 - Métodos para producir anticuerpos scFv activos y bibliotecas para los mismos - Google Patents

Abstract

Biblioteca de anticuerpos que comprende al menos aproximadamente 108; clones de anticuerpos scFv unicos, en la que cada clon de anticuerpo scFv unico codifica para un anticuerpo scFv unico que comprende al menos una de una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica, y en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para una secuencia de entramado identica a una secuencia de entramado codificada por un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 32.

Description

Metodos para producir anticuerpos scFv activos y bibliotecas para los mismos

Campo

Esta descripcion se refiere a anticuerpos de cadena sencilla recombinantes y a metodos de produccion y uso de 5 tales anticuerpos.

Antecedentes

Los enfoques de ingenieria genetica han permitido la produccion de anticuerpos recombinantes que tienen especificidades de union especificas, estructuras de dominios especificas y otras propiedades deseables. Un tipo de anticuerpo modificado por ingenieria genetica es el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Los fragmentos Fv de 10 cadena sencilla son polipeptidos modificados por ingenieria genetica que contienen una region variable de cadena pesada (VH) unida a una region variable de cadena ligera (VL) mediante un ligador peptidico flexible. Cada dominio VH y VL contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las CDR son secuencias de aminoacidos cortas que varian enormemente entre moleculas de anticuerpo y, por tanto, son responsables de la generacion de la gran diversidad de especificidad de union de anticuerpos. La combinacion de las CDR de la VH

15 mas las CDR de la VL determina la especificidad de union de cualquier anticuerpo dado.

Los fragmentos Fv de cadena sencilla presentan la especificidad de union y afinidad de union monovalente de anticuerpos de tamano completo y proporcionan el beneficio anadido de facilidad relativa de manipulacion y expresion geneticas (porque los scFv se codifican por y se expresan a partir de una unica secuencia codificante, en vez de secuencias codificantes separadas, como los anticuerpos de tamano completo). Los fragmentos Fv de

20 cadena sencilla y otros anticuerpos recombinantes se usan en una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, en pruebas de diagnostico medico, en investigacion basica; y como tratamientos de anticuerpos terapeuticos para diversas enfermedades.

Los intracuerpos son moleculas de anticuerpos modificados por ingenieria genetica que se expresan de manera ectopica dentro de las celulas. Pueden usarse intracuerpos para visualizar o modular la funcion de un antigeno diana 25 dentro de celulas vivas. Por ejemplo, el uso de intracuerpos puede inducir una desactivacion fenotipica o bien mediante la inhibicion directa de la funcion del antigeno seleccionado como diana o bien mediante el desvio del antigeno seleccionado como diana de su ubicacion intracelular normal (por ejemplo, un intracuerpo puede redirigir su antigeno diana a la maquinaria de degradacion). Los intracuerpos tambien pueden potenciar o cambiar la funcion de sus antigenos diana. Para dianas proteicas, los intracuerpos pueden dirigirse a una modificacion postraduccional

30 especifica o a una conformacion de antigeno especifica. Ademas, una desactivacion fenotipica inducida por intracuerpos puede estar confinada a un compartimento celular especifico mediante el direccionamiento de un intracuerpo al compartimento subcelular especifico usando una senal de encauzamiento (por ejemplo, una senal de localizacion nuclear, una senal de localizacion mitocondrial o una senal de retencion en el reticulo endoplasmico). Los intracuerpos tambien pueden modular la funcion de la diana modificando la estructura oligomerica de la diana.

35 Debido a que la desactivacion fenotipica por intracuerpos se basa solo en la capacidad de union de la molecula de anticuerpo a su diana, no es necesario expresar dentro de la celula una molecula de anticuerpo completa sino solo su sitio de union, que esta completamente ubicado dentro de la region variable (Fv). Dadas sus ventajas de tamano pequeno y especificidad de antigeno abarcada dentro de una unica cadena polipeptidica, los scFv son el tipo mas comun de fragmento de anticuerpo recombinante usado para la expresion de anticuerpos intracelulares.

40 Una grave limitacion en el uso de intracuerpos es que la mayoria de los scFv no pueden plegarse en las condiciones reductoras del nucleo y el citosol celular. En tales condiciones, los dos puentes disulfuro conservados de scFv se reducen, desestabilizandose e inactivandose de ese modo la actividad de union de muchos scFv. In vitro, la mayoria de los scFv no pueden renaturalizarse en condiciones reductoras. Analisis estadisticos de secuencias de scFv han mostrado que menos del 1% de los scFv son lo suficientemente estables como para expresarse y ser activos en

45 ausencia de formacion de enlaces disulfuro. Ademas, incluso si una proteina scFv es de hecho lo suficientemente estable en su forma reducida como para expresarse y ser activa in vivo, otros parametros tales como susceptibilidad a proteasas o cinetica de plegamiento pueden influir tambien en el destino in vivo final del intracuerpo y por tanto son criticos para la actividad y expresion de intracuerpos final.

Para obtener un intracuerpo activo, los enfoques actuales implican a menudo dos etapas sucesivas. En primer lugar,

50 se identifica un panel de anticuerpos scFv o Fab que se unen especificamente a un antigeno de interes (por ejemplo, examinando una biblioteca de presentacion en fago). En segundo lugar, los anticuerpos que se unen especificamente se someten a prueba para determinar su capacidad para unirse y/o inhibir el antigeno diana in vivo. Debido a que menos del 1% de los scFv son potencialmente utiles como intracuerpos (debido a que no se expresan y/o no pueden plegarse apropiadamente en las condiciones reductoras que existen dentro de una celula), la

identificacion de scFv individual que puede usarse como intracuerpo requiere el aislamiento de mas de 100 clones de scFv, un numero que es improbable que se obtenga en la mayoria de los casos.

La solicitud WO 00/5405� da a conocer un metodo para determinar la capacidad de una inmunoglobulina para unirse a una antigeno diana en un entorno intracelular. El metodo dado a conocer consiste en proporcionar i) una inmunoglobulina intracelular asociada con una primera molecula, y ii) un antigeno diana intracelular asociado con una segunda molecula, luego evaluar la interaccion intracelular entre la inmunoglobulina frente a la diana en el entorno intracelular, sabiendo que cuando las moleculas primera y segunda se llevan a interaccion estable mediante la union de la inmunoglobulina a la diana en el entorno intracelular, se genera una senal. Para evaluar la posibilidad de realizar este metodo en celulas de mamifero, se ha llevado a cabo una prueba con una primera proteina de fusion que comprende beta�galactosidasa, y una segunda proteina de fusion que comprende el scFvR4 anti� beta galactosidasa.

La solicitud WO 01/4 �01 da a conocer un metodo para aislar un scFv con un entramado que es estable y soluble en un entorno reductor. El metodo dado a conocer se realiza usando un "ensayo de dos hibridos" que comprende las siguientes etapas:

a) se genera una biblioteca de scFv con CDR constantes y entramados variados mediante la mutacion de al menos una region codificante de entramado de la secuencia de ADN de un scFv frente a un antigeno conocido y mediante la introduccion de tales mutaciones en vectores de expresion adecuados,

b) se transforman celulas huesped que pueden expresar un antigeno conocido especifico y que solo sobreviven en presencia de interaccion antigeno�scFv con dicha biblioteca de scFv,

c) se cultivan las celulas huesped asi transformadas en condiciones adecuadas para expresar el antigeno y el scFv y que permiten la supervivencia celular solo en presencia de interaccion antigeno� scFv,

d) se aisla el scFv expresado en las celulas supervivientes y que tiene un entramado definido que es estable y soluble en el entorno reductor.

Der Maur Adrian et al. (Methods, 34: 215�224, 2004) y Der Maur Adrian et al. (Journal of Biological Chemistry, 2��(4�): 450� 5�450 �5, 2002) dan a conocer metodos para aislar un scFv con un entramado que es estable y soluble en un entorno reductor.

Der Maur Adrian et al. (Methods, 34: 215�224, 2004) ensena en la tabla 1 que de un total de 10 clones examinados, solo un 0,1% permiten el crecimiento celular en condiciones selectivas, y solo un �0% de estos clones que permiten el crecimiento celular en condiciones selectivas muestran expresion de lacZ dependiente de scFv.

Laden et al. (Research in Microbiology, 153: 4� ��4� 4, 2002) dieron a conocer un mutante de un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla anti� beta� galactosidasa humano, denominado scFv13R4, y muestran que scFv13R4 puede plegarse apropiadamente en el citoplasma de Escherichia coli y es activo in vivo en levaduras puesto que puede interaccionar con beta� galactosidasa en un ensayo de dos hibridos.

Jung y pluckthun (protein Engineering, 10(�): �5 , 1� ��) da a conocer un metodo para mejorar in vivo el plegado y la estabilidad de un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla usando injerto de CDR. El metodo se realiza con el entramado del anticuerpo 4D5 humanizado.

La solicitud WO ��/45�5 da a conocer un motivo de entramado de anticuerpo humanizado en el que dicho entramado se ha seleccionado de una biblioteca humana basandose en la comparacion con un anticuerpo murino, y la cadena pesada esta codificada por el gen de VH de K5B�, y la cadena ligera esta codificada por el gen de VL TR1.�.

Sin embargo, ninguno de los documentos de la tecnica anterior mencionados anteriormente da a conocer una biblioteca de anticuerpos que comprenda al menos 10 clones de anticuerpos scFv unicos en la que cada clon codifique para una secuencia de entramado identica a un entramado codificado por el clon de anticuerpo scFv13R4 (SEQ ID NO: 32).

En vista de las dificultades anteriores en la produccion e identificacion de anticuerpos que pueden usarse como intracuerpos para su uso en aplicaciones medicas y de investigacion, lo que se necesita son metodos mas eficaces de produccion y seleccion de anticuerpos que puedan usarse como intracuerpos.

Sumario

Los inventores han descrito en el presente documento una biblioteca de anticuerpos que incluye al menos aproximadamente 10 clones de scFv unicos, en la que al menos aproximadamente el 20% de los clones de scFv codifican para un anticuerpo que puede unirse especificamente de manera detectable a un antigeno diana dentro de una celula cuando el anticuerpo codificado por el clon de scFv se expresa dentro de la celula.

Los inventores tambien han descrito en el presente documento una biblioteca de anticuerpos, incluyendo la biblioteca de anticuerpos al menos aproximadamente 10 clones de anticuerpos scFv unicos, en la que al menos aproximadamente el 20% de los clones de anticuerpos scFv pueden expresarse dentro de una celula de E. coli para producir anticuerpo soluble a un nivel de al menos aproximadamente 5 mg por litro de celulas de E. coli, en la que las celulas de E. coli se han hecho crecer hasta una DO �00nm de aproximadamente 5.

En un aspecto, la invencion descrita en el presente documento es una biblioteca de anticuerpos que incluye al menos aproximadamente 10 clones de anticuerpos scFv unicos, en la que cada clon de anticuerpo scFv unico codifica para un anticuerpo scFv unico que comprende al menos una de una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica, y en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para una secuencia de entramado sustancialmente identica a una secuencia de entramado codificada por scFv13R4 (SEQ ID NO: 32).

En la biblioteca de anticuerpos anterior de la invencion, los clones de anticuerpos scFv unicos pueden codificar para anticuerpos scFv que incluyen una secuencia VH CDR3 unica.

En la biblioteca de anticuerpos anterior de la invencion, los clones de anticuerpos scFv unicos pueden codificar para anticuerpos scFv que incluyen una secuencia VH CDR3 unica.

En la biblioteca de anticuerpos anterior de la invencion, los clones de anticuerpos scFv unicos pueden codificar para anticuerpos scFv que incluyen una secuencia VL CDR3 unica.

En la biblioteca de anticuerpos anterior de la invencion los clones de anticuerpos scFv unicos pueden codificar para anticuerpos scFv que incluyen una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica.

Los inventores han descrito en el presente documento un anticuerpo scFv que puede expresarse como una proteina sustancialmente soluble en condiciones reductoras, en las que el anticuerpo scFv se aisla de la biblioteca descrita anteriormente en el tercer aspecto. El anticuerpo scFv puede unirse especificamente a un antigeno diana en condiciones reductoras.

Los inventores han descrito en el presente documento un metodo de produccion de un anticuerpo scFv, que incluye la expresion del anticuerpo scFv descrito anteriormente en el cuarto aspecto dentro de una celula, produciendo de ese modo el anticuerpo scFv. El metodo puede incluir purificar adicionalmente el anticuerpo scFv de la celula.

En un segundo aspecto de la invencion, se describe en el presente documento un metodo para preparar una biblioteca de anticuerpos scFv enriquecida en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse dentro de una celula, que incluye: a) proporcionar una primera coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la primera coleccion comprende clones que comprenden una secuencia unica dentro de un bucle CDR3 de VH, en el que la primera coleccion se ha enriquecido en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse de manera detectable cuando se introducen en una celula; b) proporcionar una segunda coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la segunda coleccion comprende clones que comprenden una secuencia unica dentro de un bucle CDR3 de VL, en el que la segunda coleccion se ha enriquecido en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse de manera detectable cuando se introducen en una celula; c) unir dominios VH de clones de anticuerpos scFv de la primera coleccion con dominio VL de clones de anticuerpos scFv de la segunda coleccion para obtener una tercera coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la tercera coleccion contiene clones de anticuerpos scFv que comprenden una secuencia unica dentro del bucle CDR3 de VH y una secuencia unica dentro del bucle CDR3 de VL, preparando de ese modo la biblioteca de anticuerpos scFv enriquecida en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse dentro de una celula.

En el metodo anterior para preparar una biblioteca de anticuerpos scFv, la primera coleccion incluye clones de anticuerpos scFv que contienen una secuencia VL identica a una secuencia VL de scfv13R4 (SEQ ID NO:33) y la segunda coleccion puede incluir clones de anticuerpos scFv que contienen una secuencia VH identica a una secuencia VH de scFv13R4 (SEQ ID NO:33).

En el metodo anterior para preparar una biblioteca de anticuerpos scFv, la primera coleccion puede incluir clones de anticuerpos scFv que incluyen secuencias CDR1 y CDR2 identicas en el dominio VH y la segunda coleccion puede incluir clones de anticuerpos scFv que incluyen secuencias CDR1 y CDR2 identicas en el dominio VL.

En un tercer aspecto de la invencion, se describe en el presente documento una biblioteca de anticuerpos producida mediante el metodo descrito anteriormente en el sexto aspecto.

Los inventores tambien describieron en el presente documento un anticuerpo seleccionado de una biblioteca de anticuerpos producida mediante el metodo descrito anteriormente en el segundo aspecto.

En un noveno aspecto, la invencion caracteriza un metodo para construir una biblioteca de anticuerpos que incluye: a) seleccionar un entramado de anticuerpo scFv; b) introducir diversidad de secuencia en una region CDR3 VH del entramado de anticuerpo scFv para generar una primera biblioteca que incluye clones de anticuerpos scFv que incluyen una region CDR3 VH unica; c) introducir diversidad de secuencia en una region CDR3 VL del entramado de anticuerpo scFv para generar una segunda biblioteca que incluye clones de anticuerpos scFv que incluyen una region CDR3 VL unica; d) eliminar, de la primera biblioteca, clones que no expresan de manera detectable el anticuerpo scFv; e) eliminar, de la segunda biblioteca, clones que no expresan de manera detectable el anticuerpo scFv; y f) recombinar las bibliotecas primera y segunda para generar una biblioteca final que comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden una region CDR3 VH unica y una region CDR3 VL unica, construyendo de ese modo la biblioteca de anticuerpos.

En el metodo anterior, el scFv es scFv13R4.

Es un objeto de la presente invencion proporcionar una biblioteca de anticuerpos novedosa para el aislamiento de scFv expresados en el citoplasma que pueden usarse como intracuerpos.

Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una biblioteca de anticuerpos novedosa basados en un entramado individual y optimizados para expresion intracelular.

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar metodos novedosos de construccion y validacion de una biblioteca de anticuerpos novedosa para el aislamiento de scFv expresados en el citoplasma que pueden usarse como intracuerpos.

Otro objeto de la presente invencion es proporcionar metodos novedosos de construccion y validacion de una biblioteca de anticuerpos novedosa basados en un entramado individual y optimizados para expresion intracelular.

Todavia otro objeto de la presente invencion es proporcionar metodos novedosos de uso de una biblioteca de anticuerpos con el fin de producir scFv altamente expresados que pueden usarse como intracuerpos.

Aun otro objeto de la presente invencion es proporcionar metodos novedosos de uso de una biblioteca de anticuerpos con el fin de producir scFv basados en un entramado individual y optimizados para expresion intracelular.

Estos y otros objetos, caracteristicas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes tras la revision de la

siguiente descripción detallada de las realizaciones dadas a conocer.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. (a) Resumen esquematico de las etapas seguidas durante la construccion de la biblioteca. Las etapas criticas son: introduccion de bucles CDR3 adaptados en un entramado de scFv humano unico; eliminacion de clones no expresados mediante fusion con la enzima CAT y seleccion en placas CAM; recombinacion de las 13 bibliotecas de VH y 5 de VL, y presentacion en fago. (b) Resumen de los bucles CDR3 recogidos en la base de datos. (c) Distribucion de los aminoacidos en cada posicion de las CDR3 VH de 5 aminoacidos de longitud de 55 anticuerpos humanos reordenados.

Figura 2. Representacion esquematica de la distribucion de longitud de CDR3. Distribucion de las longitudes de CDR3 en la base de datos y en 11� clones secuenciados de la biblioteca.

Figura 3. Analisis de inmunotransferencia de tipo Western de veinte clones de la biblioteca que se clonaron en un vector de expresion citoplasmatica y se expresaron en E. coli bajo el control del promotor de T . Se clonaron veinte clones de la biblioteca en un vector de expresion citoplasmatica y se expresaron en E. coli bajo el control del promotor de T . Se prepararon extractos solubles, se separaron mediante SDS�PAGE y se analizaron mediante tincion con Coomassie (a) o inmunotransferencia de tipo Western (b) usando E10 y un anticuerpo anti�IgG de raton conjugado con fosfatasa alcalina (sustrato BCIP/NBT). Cada carril correspondia a 2 x 10 (2 X 10 a la �)) celulas. La flecha a la izquierda indica la posicion del scFv.

Figura 4. Micrografias fluorescentes seleccionadas de la expresion de scFv escogidos al azar en celulas HeLa. Se transfectaron las celulas con constructos de scFv EGFP tal como se indica. 13R4 y 1F4 representan los controles positivo y negativo, respectivamente. A las 24 h tras la transfeccion, se fijaron las celulas y se visualizaron bajo un microscopio fluorescente con el conjunto de filtro de isotiocianato de fluoresceina. Las micrografias representan campos tipicos que contienen un numero de celulas similar en cada caso. Aumentos: x 400.

Figura 5. Seleccion de elementos de union frente a cinco proteinas purificadas. (a) Se sometieron a prueba 2,5 X 1010 fagos de cada ronda de seleccion mediante ELISA frente a su antigeno respectivo y se revelaron usando un anticuerpo monoclonal conjugado con HRP anti�M13 (Pharmacia). R0 es la biblioteca no seleccionada y Rn la reserva obtenida tras la ronda n) de seleccion. Se sometio a prueba la especificidad en BSA para las 3) rondas de seleccion (A450 nm ∼0,1 0,3). (b) Se sometieron a prueba fagos monoclonales de cada ronda de seleccion frente a proteina GST:Syk mediante ELISA como en (a). Porcentaje de scFv activos solubles (absorbancia > 0,1) seleccionados tras tres rondas frente a la proteina indicada y expresados o bien en el periplasma (gris) o bien en el citoplasma (negro).

Figura �. Fotomicrografias de la expresion de scFV anti�histonas fusionados a EGFP en celulas HeLa. Se transfectaron las celulas y se trataron tal como se indica en la leyenda de la figura 4. Las fotografias representan celulas tipicas transfectadas con scFv13R4 y tres clones anti�histonas representativos (2, 5 y 10). D, tincion con DAPI (azul) combinada con la senal de GFP.

Figura �. Representacion grafica de la expresion de la actividad de scFv seleccionados en condiciones reductoras. Se prepararon extractos de celulas que expresan los scFv en el citoplasma como en la figura 3 en presencia o ausencia de DTT 10 mM. Se realizo ELISA en presencia o ausencia de DTT, por consiguiente. Eje x: cantidad de extracto por pocillo. Eje y: senal de ELISA a 450 nm.

Figura �. Fotomicrografias de la doble tincion de celulas HeLa usando un anticuerpo y mediante inmunofluorescencia. Se transfectaron celulas HeLa con el clon 5 anti�histonas (figura �) fusionado al dsRed monomero de GFP. Se revelaron los microtubulos en las celulas transfectadas mediante IF usando el scFv anti� tubulina 2F12C (tabla 3). Se observaron las celulas a la longitud de onda apropiada para visualizar: (A) scFv 2F12C (microtubulos solos); (B) intracuerpo de clon 5 (histonas solas); (C) 2F12C y con 5 (tanto microtubulos como histonas); (D) como C tincion del nucleo con DAPI.

Descripcion detallada de la invencion

Se proporcionan en el presente documento metodos para construir una biblioteca de scFv enriquecida en scFv que pueden expresarse dentro de una celula procariota o eucariota. Los scFv mantienen su estructura en las condiciones reductoras presentes dentro de una celula, conservan su capacidad para unirse especificamente a un antigeno diana dentro de una celula, y por tanto pueden usarse como intracuerpos en diversos enfoques terapeuticos y de investigacion. Debido a que los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir bibliotecas de scFv que son estables en condiciones reductoras, estas bibliotecas tambien son utiles para producir scFv que pueden expresarse por y purificarse a partir de celulas procariotas o eucariotas (por ejemplo, lisando las celulas y purificando el scFv deseado mediante tecnicas bien conocidas). Tales scFv purificados son utiles como anticuerpos para su uso en investigacion, pruebas de diagnostico y para terapias contra enfermedades.

Una estrategia mejorada para estabilizar scFv que van a usarse in vivo es construir una biblioteca de scFv adaptada para expresion intracelular. Idealmente, una biblioteca de este tipo debe contener solo scFv que puedan plegarse en condiciones reductoras tales como las encontradas en el citoplasma de una celula. Otra estrategia es construir una biblioteca de scFv basandose en un entramado de anticuerpo optimizado individual para la seleccion de intracuerpos.

Se describen en el presente documento metodos para construir una biblioteca de anticuerpos novedosa que se basa en un entramado de anticuerpo optimizado individual y que esta adaptado para expresion intracelular. A traves de evolucion molecular, se obtuvo un scFv humano denominado scFv13R4, que se expresa a altos niveles en el citoplasma de E. coli. Ademas, este scFv se expresa altamente, es soluble y presenta actividad de union especifica frente a un antigeno diana en levadura y celulas de mamifero. Este scFv es muy estable in vitro y puede renaturalizarse en presencia de un agente reductor. Ademas, el analisis de su cinetica de plegamiento mostro que se pliega mas rapido que el scFv original y se agrega mas lentamente in vitro.

La biblioteca de scFv humana basada en el entramado del scFv13R4 optimizado contiene mas de un billon de clones, lo que es mas que las bibliotecas previas de 10 a 10 . La diversidad de la presente biblioteca de scFv humana es mucho mayor que la de las bibliotecas previas porque se diseno la presente biblioteca para que codificase para bucles CDR3 de VH y VL de diversas longitudes diferentes. Ademas, se uso una mezcla sesgada de secuencias oligonucleotidicas degeneradas para codificar para bucles CDR3 que imitan CDR3 humana. Usando bucles CDR3 optimizados y etapas de filtracion para eliminar los clones no expresados, se expulsaron de la biblioteca scFv no expresados y se conservaron los scFv expresados citoplasmaticamente sin comprometer la diversidad de los clones, tal como se confirmo a traves de pruebas con varias proteinas usadas como antigenos. Al contrario que bibliotecas de scFv descritas anteriormente, la mayoria de los scFv en la biblioteca se expresan bien en E. coli y en el citoplasma de mamiferos.

Este nuevo enfoque para construir bibliotecas de scFv permite la seleccion facil y a gran escala de intracuerpos

funcionales. Por ejemplo, se han aislado de la biblioteca varios elementos de union fuerte frente a diferentes proteinas, incluyendo las proteina cinasas Syk y Auroroa�A, el dimero de tubulina αβ, las proteinas E del virus del papiloma, las histonas nucleo, gankirina y MAPK11�14. Algunos de los scFv seleccionados se expresan a un nivel excepcionalmente alto en el citoplasma bacteriano, permitiendo la purificacion de 1 mg o mas de scFv activo a partir de solo 20 ml de cultivo. Ademas, tras tres rondas de seleccion frente a histonas nucleo como antigeno diana, mas de la mitad de los scFv seleccionados eran activos cuando se expresaban in vivo en celulas humanas y se localizaban esencialmente en el nucleo. Este nuevo tipo de biblioteca, los metodos de creacion y uso de tales bibliotecas y los anticuerpos aislados a partir de tales bibliotecas son utiles no solo para la seleccion sencilla y a gran escala de intracuerpos funcionales sino tambien para la expresion y purificacion de scFv altamente expresados que pueden usarse en numerosas aplicaciones biotecnologicas, de diagnostico y terapeuticas.

Intracuerpos

Los intracuerpos son moleculas de anticuerpo modificadas por ingenieria genetica que se expresan de manera ectopica dentro de las celulas. Pueden usarse intracuerpos para visualizar o inhibir un antigeno seleccionado como diana en celulas vivas, y por tanto encuentran uso en diversas aplicaciones de investigacion y medicas (por ejemplo, de diagnostico y terapeuticas). Sin embargo, la tecnologia de intracuerpos se ha visto limitada por el hecho de que menos del 1% de los scFv en una biblioteca de expresion de anticuerpos tipica son los suficientemente estables como para expresarse y/o ser activos in vivo, porque el entorno intracelular reduce los dos puentes disulfuro conservados que la gran mayoria de los scFv requiere para su estabilidad. Se describen en el presente documento metodos de produccion de bibliotecas de scFv que estan enormemente enriquecidas en scFv que son estables en condiciones reductoras y por tanto son adecuados para su uso como intracuerpos. Los intracuerpos pueden usarse para diversos enfoques de investigacion, de diagnostico y terapeuticos que emplean intracuerpos.

En la mayoria de los casos, la obtencion de intracuerpos eficaces requiere actualmente dos etapas sucesivas. En primer lugar, debe aislarse un panel de anticuerpos frente al antigeno diana. Debido a la disponibilidad de bibliotecas de anticuerpos virgenes de muy alta calidad presentados en fago, esta etapa se logra ahora facilmente mediante presentacion en fago y puede automatizarse con el fin de aislar elementos de union frente a varias proteinas en paralelo. En una segunda etapa, estos fragmentos de anticuerpo (scFv o Fab) deben someterse a prueba in vivo para determinar su capacidad para inhibir su diana. Sin embargo, la mayoria de los scFv no se pliegan apropiadamente en las condiciones reductoras encontradas en el citosol y el nucleo de la celula donde se ubican la mayoria de las dianas interesantes. Esto puede dar como resultado scFv agregados e inactivos, que no pueden interaccionar con su diana. Puesto que menos del 1% de los scFv son eficaces como intracuerpos, conseguir un elemento de union individual frente a una proteina requiere el aislamiento de 100 scFv diferentes, un numero que es improbable que se obtenga en la mayoria de los casos. Esto hace que el procedimiento de identificacion de intracuerpos a partir de bibliotecas de scFv regulares sea un procedimiento dificil incluso cuando el examen se realiza in vivo usando sistemas de dos hibridos o equivalentes. Ademas, esta baja proporcion de scFv activos en las bibliotecas actuales da como resultado una disminucion de 100 veces en el repertorio potencial examinado, lo que hace que el aislamiento de intracuerpos frente a diferentes epitopos de la misma proteina sea improbable.

Bibliotecas

Se describen en el presente documento bibliotecas de presentacion en fago de scFv optimizados para expresion intracelular y metodos novedosos de construccion y uso de la biblioteca. La biblioteca se construye sobre un entramado de anticuerpo individual de un scFv original que se selecciono debido a su actividad mejorada dentro del citoplasma. El scFv original es muy estable, tiene un plegamiento y una cinetica de agregacion favorables y se expresa a muy altos niveles en todos los tipos celulares sometidos a ensayo. Tener un entramado individual para la construccion de una biblioteca debe permitir niveles de expresion mas comparables entre clones puesto que la mayoria de sus secuencias se conservan.

Debido a que las secuencias de CDR tambien desempenan un papel en el plegamiento y la expresion de scFv, sin embargo, se cree que el nivel de expresion de los clones presentaria todavia algo de variabilidad. Para minimizar estas diferencias, se introdujo variabilidad solo dentro de los bucles CDR3 porque estos bucles son los mas variables en anticuerpos y por tanto es mas probable que sean altamente tolerantes a variaciones de secuencia y longitud. La introduccion de variabilidad en la CDR3 es suficiente para generar anticuerpos contra la mayoria de proteinas. Ademas, se sesgaron cuidadosamente las frecuencias de los aminoacidos en estos bucles de modo que se recupera la distribucion observada entre secuencias humanas naturales. Cuando se compararon los niveles de expresion de clones seleccionados al azar en el citoplasma, a pesar de algunas claras diferencias, una alta proporcion de los mismos se expresaban correctamente tanto en E. coli como en celulas de mamiferos. Esta proporcion de scFv expresados intracelularmente es mucho mayor que en bibliotecas descritas anteriormente.

Tambien pudieron aislarse elementos de union (es decir, anticuerpos que se unen especificamente a un antigeno diana seleccionado) frente a cinco proteinas diferentes (Aurora�A, GST:Syk, tubulina, histonas y proteina E� del virus del papiloma HPV1�). En estudios posteriores, tambien se han aislado elementos de union frente a nuevas dianas incluyendo gankirina y MAPK11�14. Para MAPK11�14, las cuatro proteinas implicadas son las cuatro

�0

isoformas de la MAP cinasa p3�. Estas proteinas son muy homologas (∼ �0��4% de identidad). En todos los casos, pudieron aislarse scFv especificos para la isoforma usada para la seleccion. Esto subraya la especificidad de los scFv que pueden aislarse a partir de esta biblioteca.

Una preocupacion frecuente cuando se construyen bibliotecas de scFv es la optimizacion simultanea del tamano y la diversidad de la biblioteca. Generalmente, el tamano de una biblioteca de este tipo esta limitado por la eficacia de transformacion a aproximadamente 1010 clones. Dado este numero limitado de clones, es por tanto de gran importancia evitar duplicados o scFv no expresados. Para solucionar este problema, se selecciono en primer lugar un entramado de anticuerpo que ya estaba optimizado para expresion intracelular, y entonces se uso un procedimiento de dos etapas para optimizar adicionalmente la biblioteca.

En primer lugar, se construyeron 1� bibliotecas "pequenas" para cada longitud de CDR3 (13 longitudes de CDR3 VH y 5 longitudes de CDR3 VL) que van a usarse para construir la biblioteca de scFv (vease el ejemplo 1, en el presente documento mas adelante). Se preparo cada una de estas 1 bibliotecas reemplazando la CDR3 correspondiente del scFv13R4 original por la CDR3 aleatorizada. Entonces se fusiono la biblioteca resultante con una y solo una CDR3 aleatorizada con el gen que codifica para cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), que se uso como marcador seleccionable. Tras la transformacion de cada biblioteca de CDR3 en E. coli, se sembraron en placa las bibliotecas en medio que contenia cloranfenicol (CAM) para seleccionar las fusiones CDR3�CAT que se expresaban en el citoplasma de E. coli. Esta etapa redujo la diversidad de cada biblioteca en aproximadamente el 10� 30%.

Aunque se usa el gen de CAT en los ejemplos proporcionados en el presente documento, un experto habitual en la tecnica entiende que pueden fusionarse acidos nucleicos que codifican para cualquier marcador seleccionable apropiado con acidos nucleicos que codifican para CDR3 y usarse en los metodos proporcionados en el presente documento para enriquecer bibliotecas de scFv para scFv que se expresan en celulas procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los marcadores seleccionables para su uso en celulas bacterianas incluyen, pero no se limitan a, el gen de resistencia a kanamicina. Los ejemplos de marcadores seleccionables para su uso en celulas de mamifero incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, el gen de resistencia a neomicina, el gen de resistencia a puromicina y el gen de resistencia a higromicina. Los ejemplos de marcadores seleccionables para celulas de levadura incluyen URA3, HIS3 y purE. Ademas, pueden usarse marcadores tales como proteina fluorescente verde (GFP) y derivados de la misma, beta�galactosidasa, luciferasa u otros marcadores luminiscentes, fluorometricos y/o colorimetricos, en todos los tipos de celulas, por ejemplo, con clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), para enriquecer bibliotecas de scFv para clones que codifican para scFv que pueden expresarse. Un experto habitual en la tecnica entendera como usar las ensenanzas en el presente documento, junto con lo que se conoce en la tecnica, para seleccionar un marcador seleccionable apropiado y un esquema de seleccion apropiado para construir las bibliotecas de scFv descritas en el presente documento.

En una segunda etapa, se uso PCR para ensamblar aleatoriamente las bibliotecas de VH y VL seleccionadas para generar la diversidad final, basandose en la hipotesis de que si se expresaba un clon de scFv recien generado que contenia una nueva secuencia de CDR3 en su region VH mas la VL original de scFv13R4, y si se expresaba un clon de scFv recien generado que contenia una nueva secuencia de CDR3 en su region VL mas la region VH original de scFV 13R4, entonces tambien se expresaria un clon de scFv recombinado que contenia la nueva secuencia de CDR3 en su region VH mas la nueva secuencia de CDR3 en su region VL, dando como resultado de ese modo una biblioteca que contenia solo scFv expresados. Este era el caso puesto que se expresaron al menos parcialmente 1 de 20 clones seleccionados al azar en una forma soluble en el citoplasma de E. coli. De manera importante, puesto que esta etapa de seleccion se realizo durante la construccion de la biblioteca, la diversidad de la biblioteca final estaba limitada solo por la transformacion final. Esta etapa de recombinacion final, al generar una alta diversidad, garantizo que todos los clones eran unicos en la biblioteca final. Conjuntamente, este enfoque dio como resultado una biblioteca de 1,5 billones de scFv expresados y diferentes.

El uso satisfactorio de scFv como intracuerpos a gran escala requiere que la biblioteca cumpla varios puntos esenciales. En primer lugar, el scFv debe ser facil de aislar. Este es el caso de los metodos descritos en el presente documento, puesto que no solo podian aislarse elementos de union frente a todas las proteinas sometidas a prueba, sino que tambien un unico ciclo de seleccion era suficiente para conseguir casi el 100% de los elementos de union. Esta tasa de enriquecimiento muy alta se debe presumiblemente tanto a la alta calidad de la biblioteca sesgada que contiene solo scFv bien expresados como al uso del fago auxiliar sensible a tripsina KM13. Esto es de gran importancia puesto que puede ser posible usar un unico ciclo de seleccion antes de las pruebas in vivo de los scFv como intracuerpos, lo que permite una mejor diversidad de los epitopos seleccionados como diana. Ademas, esta alta tasa de enriquecimiento tambien reduce en una gran suma la cantidad de antigeno purificado necesaria para las etapas de seleccion. Pudo realizarse la seleccion en placas de microtitulacion con tan solo 1 μg de proteina por pocillo. Puesto que no son necesarias la seleccion y confirmacion adicionales de la actividad de union mediante ELISA debido a la muy alta proporcion de elementos de union, es posible ahora aislar buenos intracuerpos con una cantidad muy pequena de antigeno. En segundo lugar, el scFv debe poder plegarse en todos los compartimentos celulares, particularmente en los reductores tales como el citoplasma y el nucleo. De nuevo, este es el caso de la biblioteca de scFv descrita en el presente documento, puesto que mas del �0% de los clones sometidos a prueba son al menos parcialmente solubles en la celula. Ademas, se ha mostrado que pueden obtenerse buenos elementos

de union citoplasmaticos a partir de los scFv seleccionados en fagos en E. coli y en celulas eucariotas.

Se proporcionan en el presente documento bibliotecas de anticuerpos que comprenden al menos aproximadamente: 10 , 5X10 , 10 , 5 X10 , 10, 5 X10 , 10 ,1,5X10 , 5X10 , 1010,5 X1010, 1011, 5X1011, 1012, 1013, 1014, 1015 o 101� clones de scFv unicos, en las que al menos aproximadamente: el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 0%, el �0%, el �0%, el 5% o mas de los clones de scFv codifican para un anticuerpos que puede unirse especificamente de manera detectable a un antigeno diana cuando el anticuerpo codificado por el clon de scFv se expresa dentro de una celula (por ejemplo, como un intracuerpo). El scFv descrito en el presente documento puede expresarse para unirse especificamente de manera detectable a un antigeno diana en cualquier celula procariota o eucariota en la que seria deseable unirse especificamente de manera detectable a un antigeno diana (por ejemplo, pero sin limitarse a, una celula bacteriana, una celula de levadura, una celula de insecto, una celula de anfibio, una celula de ave, una celula de mamifero y similar).

Por "se une especificamente" quiere decirse que el anticuerpo scFv se une preferentemente a su antigeno diana en vez de a otro antigeno. Por "se une especificamente de manera detectable" quiere decirse que puede observarse la union especifica del anticuerpo scFv a su antigeno diana, por ejemplo, pero sin limitarse a un cambio fenotipico en la celula en la que el anticuerpo scFv se une a su antigeno diana, o deteccion de la interaccion entre el anticuerpo scFv y su antigeno diana (por ejemplo, colocalizacion del anticuerpo scFv y su antigeno diana dentro de una celula).

Usos a modo de ejemplo

Aunque las bibliotecas descritas en el presente documento se han optimizado para el aislamiento de intracuerpos, las bibliotecas pueden usarse tambien para seleccionar scFv para aplicaciones de diagnostico y terapeuticas. Ademas, debido a que se diseno la diversidad de CDR3 usando secuencias humanas expresadas, los scFv presentes en la biblioteca son completamente humanos y no deben inducir una respuesta de anticuerpos anti�scFv en pacientes.

Las bibliotecas descritas en el presente documento y los anticuerpos producidos por las mismas son utiles no solo para identificar intracuerpos funcionales sino tambien para el aislamiento de scFv altamente expresados que podrian usarse en numerosas aplicaciones biotecnologicas y terapeuticas. Por ejemplo, la biblioteca y los anticuerpos producidos por las mismas pueden tener usos relacionados con o que incluyen, pero sin limitarse a, estrategias de administracion genica de agentes terapeuticos, herramientas de descubrimiento de farmacos, contrarrestar la aglutinacion de moleculas diana no deseadas, combatir estados patologicos relacionados con trastornos de proteinas plegadas de manera erronea, y union, neutralizacion o modificacion de la funcion de una diana relacionada con cancer.

Por ejemplo, los intracuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para modular la actividad de la tirosina cinasa syk y otras proteinas implicadas en trastornos alergicos (vease, por ejemplo, el documento WO200510�4� 1; vease tambien Ulanova et al., Expert Opin Ther Targets 2005, :�01 ��21. Las MAP cinasas (MAPK) son mediadores clave de la proliferacion celular y a menudo se seleccionan como diana para la inhibicion en la terapia contra el cancer (vease, por ejemplo, Sebolt�Leopold JS y Herrera, R, Nat Rev Cancer, 4:�3 ���4 (2004)) Otras dianas interesantes son microtubulos y proteinas asociadas (vease Jordan MA y Wilson, L, Nat Rev Cancer,

4:253� 2�5 (2004)).

Pueden usarse inmunocuerpos para tratar o prevenir enfermedades en plantas valiosas comercialmente, tales como cultivos, por ejemplo, usando los metodos descritos en Villani, ME et al. Immunomodulation of cucumber mosaic virus infection by antibodies selected in vitro from a stable single�framework phage display library, Plant Molecular Biology 5 (3):305 (2005)).

Los intracuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir infecciones en celulas humanas o animales. Por ejemplo, pueden usarse intracuerpos para tratar, mejorar o prevenir la infeccion de celulas por el virus de la inmunodeficiencia humana, usando metodos tal como se describe, por ejemplo, en Swan, CH et al, T cell protection and enrichment through lentiviral CCR5 gene delivery, Gene Ther. 13:14 0 �14�2.

Los intracuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para seleccionar como diana proteinas implicadas en trastornos neurologicos, por ejemplo, tal como se describe, por ejemplo, en Miller, TW et al (A human single� chain Fv intrabody preferentially targets amino�terminal Huntingtin's fragments in striatal models of Huntington's disease, Neurobiol dis. 1 :4�� 5� (2005)) y Miller y Messer (Intrabody applications in neurological disorders: progress and future prospects, Mol. Ther. 12:3�4� 401 (2005).

Los intracuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para terapia contra el cancer seleccionando como diana una proteina implicada en cancer como oncoproteinas, tal como se describe, por ejemplo, en Williams, BR y Zhu, Z (Intrabody �based approaches to cancer therapy: status and prospects, Current med Chem 13:14 �3� 14�0 (200�) y Doorbar J. y Griffin H. (200 �) Intrabody strategies for the treatment of human papillomavirus

associated disease. Expert Opin. Biol. Ther. �(5), ��.

Los intracuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar infecciones (por ejemplo pero sin limitarse a virus de Epstein�Barr) seleccionando como diana una proteina expresada por un agente infeccioso, por ejemplo, tal como se describe en Fang CY et al (Modulation of Epstein0�Barr Virus Latent Membrane Protein 1 Activity by Intrabodies, Intervirology 50:254� 2�3 (200 �).

Tal como se describe en el presente documento, puede administrarse un intracuerpo a una celula administrando a la celula un vector de expresion que codifica para el intracuerpo de interes. Se conocen bien en la tecnica vectores de expresion que son adecuados para la expresion de intracuerpos. Puede lograrse la administracion de vectores de expresion que codifican para los intracuerpos descritos en el presente documento mediante uno cualquiera de numerosos enfoques bien conocidos, por ejemplo, pero sin limitarse a, transferencia directa de los acidos nucleicos, en un plasmido o vector de expresion viral, solo o en combinacion con portadores tales como liposomas cationicos. Tales vectores de expresion (que contienen secuencias promotoras y potenciadoras adecuadas para expresar una secuencia codificante operativamente unida cuando el vector de expresion se introduce en una celula) y metodos para preparar, usar y administrar tales vectores a celulas se conocen bien en la tecnica y pueden adaptarse facilmente para su uso para administrar intracuerpos a celulas.

Los vectores pueden ser cualquier construccion de nucleotidos usada para administrar genes a celulas, por ejemplo un plasmido o vector viral, tal como un vector retroviral que puede empaquetar un genoma retroviral recombinante (vease por ejemplo, Pastan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. �5:44��, 1�� �; Miller et al., Mol. Cell. Biol. :2� 5, 1���). El retrovirus recombinante puede usarse entonces para infectar y administrar de ese modo un acido nucleico de la invencion a las celulas infectadas. El metodo exacto de introduccion del acido nucleico alterado en celulas de mamifero no se limita, por supuesto, al uso de vectores retrovirales. Otras tecnicas estan ampliamente disponibles para este procedimiento incluyendo el uso de vectores adenovirales (Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5: �41� �4� , 1��4), vectores de virus adenoasociados (VAA) (Goodman et al., Blood �4:14 �2�1500, 1 ��4), vectores lentivirales (Naidini et al., Science 2�2:2 �3�2�� , 1� ��), vectores retrovirales pseudotipados (Agrawal et al., Exper. Hematol.

24:�3 ���4� , 1���). Tambien pueden usarse tecnicas de transduccion fisica, tales como administracion de liposomas y mecanismos de endocitosis mediada por receptor y otros (vease, por ejemplo, Schwartzenberger et al., Blood

��:4� 2�4�� , 1 ���). Esta invencion puede usarse conjuntamente con cualquiera de estos u otros metodos de transferencia genica usados comunmente. Se describen medios apropiados para la transfeccion, incluyendo vectores virales, transfectantes quimicos o metodos fisicoquimicos tales como electroporacion y difusion directa de ADN por, por ejemplo, Wolff, J. A., et al., Science, 24�, 14�5�14 ��, (1� �0); y Wolff, J. A. Nature, 352, �15� �1� , (1��1).

Pueden administrarse intracuerpos permeables en celulas (transcuerpos) a celulas fusionando un anticuerpo scFv con un dominio de transduccion de proteinas (PTD) que permite que el intracuerpo permeable en celulas cruce la membrana celular y entre en la celula, por ejemplo, segun los metodos descritos en Heng, BC y Cao, T (Making cell� permeable antibodies (Transbody) through fusion of protein transduction domains (PTD) with single chain variable fragment (scFv) antibodies: potential advantages over antibodies expressed within the intracellular environment (Intrabody), Med Hypotheses �4:1105�110� (2005)). Alternativamente, el scFv podria mezclarse con lipidos cationicos y administrarse eficazmente a celulas, tal como se muestra con anticuerpos completos (Courtete J., Sibler A.P., Zeder�Lutz G., Dalkara D., Zuber G. & Weiss E. (200�) Suppression of cervical carcinoma cell growth by intracytoplasmic co �delivery of anti�oncoprotein E� antibody and siRNA. Mol. Cancer Ther. �, 1�2��3�). Tales intracuerpos permeables en celulas pueden usarse en cultivo celular (por ejemplo, para fines de investigacion) y para fines de diagnostico (por ejemplo, para detectar un virus o microorganismo en una muestra de celulas de un ser humano, animal o planta que se sospecha que alberga un agente infeccioso. Tales intracuerpos permeables en celulas pueden administrarse a animales de investigacion (por ejemplo pero sin limitarse a administracion sistemica, por ejemplo, mediante administracion por via intravenosa de un intracuerpo a un animal de investigacion, o mediante administracion topica, por ejemplo) para modular la actividad de un antigeno diana particular y alterar de ese modo un fenotipo en el animal. Tales intracuerpos permeables en celulas pueden administrase tambien a pacientes animales humanos o no humanos para tratar o prevenir una enfermedad o infeccion tal como se describio anteriormente. Por ejemplo, pueden administrarse intracuerpos permeables en celulas por via intravenosa, por via topica, por via oral o mediante otros metodos bien conocidos, tal como apreciara un experto habitual en la tecnica.

Uso de los presentes anticuerpos scFv para la produccion de anticuerpos a gran escala

Debido a que los clones de anticuerpos scFv codifican para anticuerpos que se pliegan en condiciones reductoras, las bibliotecas descritas en el presente documento tambien son utiles para identificar anticuerpos scFv que pueden producirse en grandes cantidades expresando los anticuerpos scFv en celulas (por ejemplo, celulas procariotas tales como celulas bacterianas, o celulas eucariotas tales como celulas de levadura, celulas de insecto, celulas de mamifero o similares) y aislando los anticuerpos scFv a partir de las celulas. Los anticuerpos scFv de cadena sencilla para los que seria deseable purificar grandes cantidades de anticuerpo incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, anticuerpos scFv que son utiles en investigacion de laboratorio, para pruebas de diagnostico medico, para pruebas de diagnostico comerciales u otros tipos de pruebas de diagnostico (por ejemplo, para detectar

microorganismos contaminantes en alimentos o agua potable), y para productos terapeuticos de anticuerpos (por ejemplo, para tratar cancer o para tratar enfermedades infecciosas u otros tipos de enfermedades en las que puede usarse un anticuerpo para tratar la enfermedad).

Se proporcionan en el presente documento bibliotecas de anticuerpos para el aislamiento de anticuerpos scFv expresados, comprendiendo la biblioteca de anticuerpos al menos aproximadamente: 10 , 5 X 10 , 10 , 5 X 10 , 10 , 5 X 10 , 10 , 1,5 X 10 , 5 X 10 , 1010, 5 X 1010, 1011, 5 X 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 o 101� clones de anticuerpos scFv unicos, en las que al menos aproximadamente: el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 50%, el 55%, el 0%, el

�5%, el �0%, el 5%, el �0% o mas del �0% de los clones de anticuerpos scFv pueden expresarse dentro de una celula para producir anticuerpo soluble a un nivel de al menos aproximadamente: 5 mg, � mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg o mas de 50 mg por litro de celulas en un frasco hechas crecer hasta una DO �00nm de aproximadamente 5.

Hay muchos enfoques bien aceptados para expresar y purificar proteinas tales como anticuerpos scFv expresados a partir de celulas y un experto habitual en la tecnica entendera como seleccionar el tipo mas apropiado de sistema de expresion celular a partir del cual expresar y purificar anticuerpos scFv. Se conocen en la tecnica muchos manuales que describen metodos para la expresion de proteinas. Vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, JohnWileyand Sons, 200�.

Definiciones

Por "secuencia unica" quiere decirse que, dentro de una coleccion de clones de anticuerpos scFv, hay al menos 10 clones que contienen una secuencia de CDR3 que es diferente de las secuencias de CDR3 de otros clones dentro de la coleccion de clones de anticuerpos scFv. Con referencia a un clon de anticuerpo scFv o una biblioteca de tales clones, una "secuencia unica" es diferente de la secuencia presente en la posicion correspondiente dentro de scFv13R4.

Los terminos "entramado de anticuerpo" y "secuencia de entramado" se refieren a cualquier parte no unica de los clones de anticuerpos scFv, por ejemplo, cualquier parte del anticuerpo scFv que no es una region VH CDR3 unica y/o una region VL CDR3 unica. Tal como se menciona en el presente documento, el entramado de anticuerpo o secuencia de entramado es la de scFv13R4, el clon de scFv original en el que se basan las presentes bibliotecas.

Por "sustancialmente identica" quiere decirse que dos o mas secuencias de aminoacidos que estan comparandose son al menos el ��%, el ��,5%, el % o el ��,5% iguales, o que dos o mas secuencias de acido nucleico que estan comparandose codifican para secuencias de aminoacido que son al menos el ��%, el ��,5%, el �% o el ��,5% iguales.

Por "secuencia comun" quiere decirse una secuencia de nucleotidos o aminoacidos que se comparte entre clones de scFv.

Por "clon de anticuerpo scFv" quiere decirse una molecula de acido nucleico que codifica para una especie individual de anticuerpo scFv que comprende una secuencia unica dentro del dominio CDR3 VH, el dominio CDR3 VL o dentro de ambos dominios CDR3 VH y VL.

Por "antigeno diana" quiere decirse un antigeno al que se une preferentemente un anticuerpo particular, en comparacion con la union de ese anticuerpo particular a otro antigeno que no es un antigeno diana.

Por "se une especificamente" quiere decirse que un anticuerpo se une con fuerza y preferentemente a un antigeno diana particular, en comparacion con la union del anticuerpo a otros antigenos.

Por "expresado de manera ectopica" quiere decirse que la expresion de un anticuerpo de interes no se expresa de manera natural dentro de un tipo particular de celulas en el que el anticuerpo esta expresandose, es decir, el anticuerpo se expresa dentro de la celula porque se ha introducido en la celula un constructo de expresion que codifica para el anticuerpo.

Por "aislado" o "purificado" quiere decirse que un anticuerpo scFv se ha separado sustancialmente, producido aparte de o purificado de otros componentes biologicos en la celulas en la que se ha producido, es decir, se ha separado sustancialmente de otros componentes celulares, tales como otras proteinas celulares, ADN, ARN, lipidos y similares. El termino "aislado" o "purificado" no requiere pureza absoluta; mas bien, esta previsto como un termino relativo. Preferiblemente, un anticuerpo scFv se purifica o se aisla de otros componentes celulares de manera que el anticuerpo scFv representa al menos: el 25%, el 30%, el 40%, el 50%, el �0%, el �0%, el 0%, el 0%, el �5% o mas del contenido total de la preparacion de anticuerpos scFv.

Por anticuerpo "soluble" quiere decirse que una molecula de anticuerpo no esta en forma de agregado. Un anticuerpo soluble tiene la capacidad para unirse especificamente a su antigeno diana.

Por "sustancialmente soluble" quiere decirse que al menos el 20%, por ejemplo, al menos el 25%, el 30%, el 40%, el 50%, el 0%, el �0%, el �0% o mas de un anticuerpo scFv tal como se describe en el presente documento esta plegado apropiadamente y por tanto puede unirse especificamente a su antigeno diana.

5 Ejemplo 1: Construcción de una biblioteca de scFv optimizada para expresión intracelular

MATERIALES

Cepas bacterianas, productos quimicos y enzimas

Se describieron anteriormente medios LB y 2xYT (Miller, J.H. A Short Course in Bacterial Genetics: a Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1��2). La 10 cepa C Max5F' (Bio�rad laboratories) es E. coli K 12, [F' lacIq Tn10] ϕ �0dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U1� recA1 endA1 hsdR1� (rk mk+) phoA supE44 λ thi �1 gyrA96 relA1. MC10�1 (ATCC n.D 5333�) es E. coli K 12, F λ hsdR2 hsdM+ hsdS+ mcrA mcrB1 araD13� Δ(ara-leu)� Δ(lacIPOZY)X �4 galE15 galUgalK1� rpsL thi. La cepa no supresora HB2151 es E. coli K �12 [F'proA+B+ laclq lacZΔM15] ara Δ(lac-pro) thi. Los productos quimicos se adquirieron de Sigma. Las enzimas de restriccion y la Taq polimerasa clonada eran de Fermentas. Se adquirieron

15 las ProofStart y Pfu ADN polimerasas respectivamente de Qiagen y Promega. Se purificaron ADN de plasmido, ADN separado por PCR y agarosa usando los kits Macherey �Nagel Nucleospin.

Oligonucleotidos

Se sintetizaron dieciocho oligonucleotidos escogidos usados para introducir bucles CDR3 degenerados y se purificaron usando cromatografia de liquidos de alta resolucion (HPLC) por IBA GmbH (Goettingen, Alemania). Las

20 secuencias de los 1� oligonucleotidos escogidos es tal como sigue.

H3 n = bucle CDR3 de VH de n aminoacidos de longitud; K3 n = bucle CDR3 de VL kappa (κ) de n aminoacidos de longitud; L3 n = bucle CDR3 de VL lambda (λ) de n aminoacidos de longitud. Para las posiciones degeneradas, los porcentajes de las 4 bases se facilitan como N (A/C/G/T). Las proporciones de cada nucleotido usado en cada posicion escogida (degenerada) se muestra en la tabla I a continuacion.

25 H3 5:

AGGGTGCCTCTGCCCCANNNNNNNNNNNNNNNTCTCACACAGTAATAAACAGCCG (SEQ ID NO: 1);

Tabla 1

* Para las posiciones degeneradas, los porcentajes de las 4 bases se facilitan como N(A/C//T)

Otros oligonucleotidos usados para construir las bibliotecas se sintetizaron mediante MWG y tienen las siguientes secuencias: T .back CCGGATATAGTTCCTCCTTT (SEQ ID NO: 1�); 5 T .for CTGCTAACCAGTAAGGCAAC (SEQ ID NO: 20); M13rev �4� GAGCGGATAACAATTTCACACAGG (SEQ ID NO: 21); M13uni�43 AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT (SEQ ID NO: 22); scFvCAT.rev AACGGTGGTATATCCAGTGA (SEQ ID NO: 23); scFvCAT2.rev CGGTGGTATATCCAGTGATTTTT (SEQ ID NO: 24); 10 PliaisonH3 TGGGGCAGAGGCACCCT (SEQ ID NO: 25); PliaisonH3.back AGGGTGCCTCTGCCCCA (SEQ ID NO: 2 ); PliaisonL3 GCAGTAATAATCAGCCTCGTCC (SEQ ID NO: 2�). Plasmidos Se uso el vector de fagemido pCANTAB� (McCafferty J et al., Appl Biochem Biotechnol 1��4, 4 �:15 ��1� 1) para la

fusion N terminal de fragmentos de NcoI/NotI�scFv a la proteina de cubierta minoritaria pIII del fago filamentoso M13. Este fagemido se deriva de pUC 11� y contiene las siguientes secuencias en el siguiente orden: un promotor lac, la secuencia lider pelB, los sitios NcoI y NotI para la clonacion de scFv, una etiqueta His� y una c� myc reconocida por el anticuerpo monoclonal �E10, un codon ambar y la secuencia genica de pIII.

Para la expresion citoplasmatica de los scFv en E. coli, se uso el plasmido pET23NN. Este plasmido se deriva de pET23d(+) (Novagen) y contiene un promotor de T , seguido por un sitio NcoI que contiene el iniciador ATG, un sitio NotI seguido por una etiqueta c �myc y una His �.

El plasmido pscFv CAT se deriva de pTrc� A y contiene un promotor tac, seguido por un sitio NcoI que contiene el iniciador ATG de un scFv fuera de marca, un sitio NotI seguido por el gen de CAT. Cuando se inserta un scFv dentro de los sitios NcoI� NotI, el scFv se expresa como una fusion con la proteina CAT. Se realizo la construccion tal como sigue: en primer lugar, se elimino el sitio BstEII unico de pTrc��A (A1303�) mediante digestion seguido por relleno del saliente en 5' para formar extremos romos, y ligamiento. Se digirio el plasmido resultante con NcoI y NotI, y se purifico el fragmento de 4210 pb (fragmento I). En segundo lugar, se elimino el sitio NcoI unico del plasmido pACYCI

�4 (X0�403) ubicado dentro del gen de CAT mediante mutagenesis dirigida al sitio cambiando el codon de Thr 1� 2 de ACC a ACG. Entonces, se amplifico el gen de CAT mediante PCR usando CAT NotI.for (TAAGGCGGCCGCAATGGAGAAAAAAATCACTG; SEQ ID NO: 2�) y CAT �HindIII.back (ACTGCCTTAAAAAGCTTACGCC; SEQ ID NO: 2 ). En las secuencias oligonucleotidicas, los sitios de restriccion introducidos estan subrayados y el comienzo y el final del gen de CAT estan en negrita y cursiva. Se digirio el fragmento de PCR de �0 pb PCR mediante NotI y HindIII, y se purifico (fragmento II). En tercer lugar, se purifico un fragmento de scFv13E� NcoI� NotI de �50 pb (una version injertada del scFv13R4 que contenia los bucles CDR de un anticuerpo monoclonal anti �E�. Philibert et al., por publicar) (fragmento III). En cuarto lugar, se ligaron los tres fragmentos I, II y III para dar el plasmido pscFvCAT. Finalmente, se introdujo una delecion interna de 1 �5 pb en el scFv eliminando el fragmento entre los dos sitios PstI del gen. El plasmido resultante, denominado pscFvCAT, es AmpR y CAMs puesto que la delecion del fragmento de PstI dio como resultado un desplazamiento del marco en el scFv.

El plasmido p513�EGFP es un derivado de pSG5 (Green, S., et al. Nucleic Acids Res 1 ���, 1 �:3� �) y alberga la region codificante de EGFP (Clontech, Inc.) bajo el control del promotor temprano de SV40. Los constructos p513� scFv EGFP corresponden a fusiones en marco de la region codificante de scFv y EGFP con un ligador de 10 residuos.

Se amplificaron las regiones codificantes de scFv con los cebadores oligonucleotidicos

5' �ACTGATAAGCTTGCCACCATGGCCGAGGTGC (SEQ ID NO: 30)

y 5'�TTGATTACTAGTGAGTTTTTGTTCTGCGGCC (SEQ ID NO: 31)

y se insertaron en el vector p51 3�EGFP digerido con HindIII-SpeI.

Entramado de anticuerpo optimizado

Para maximizar la eficacia de la biblioteca de scFv, la construccion de la biblioteca comenzo con la seleccion de un entramado de anticuerpo optimizado individual para la seleccion de intracuerpos. A traves de evolucion molecular, se obtuvo un scFv humano denominado scFv13R4, que se expresa a altos niveles en el citoplasma de E. coli. Este scFv tambien se expresa y tiene una conformacion activa y soluble en celulas tanto de levadura como de mamifero. Este scFv es muy estable in vitro y puede renaturalizarse en presencia de un agente reductor. Ademas, el analisis de su cinetica de plegamiento mostro que se pliega mas rapido que el scFv original y se agrega mas lentamente in vitro. Las mutaciones aisladas se ubican principalmente en el dominio VH y parecen ser altamente especificas para este scFv particular puesto que no pueden transferirse a un dominio VH muy homologo. Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de scFv13R4 se muestran a continuacion.

Secuencia de nucleotidos y aminoacidos de scFv13R4 (de los nucleotidos 1 a �1�)

METODOS

Base de datos de secuencias de CDR3

Se uso la version 5 (agosto de 1��2) de la base de datos Kabat (Johnson, G., y Wu, T.T.: Kabat Database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res 2000, 2�:214�21 �). Este conjunto de datos contenia 44�� 0 secuencias. En primer lugar, se extrajeron 4 �43 secuencias VH humanas que no eran un pseudogen y no estaban humanizadas. Entonces se extrajeron secuencias H3 de esta base de datos, teniendo en cuenta en primer lugar la secuencia de nucleotidos cuando estaba presente, luego la secuencia de aminoacidos. Finalmente, se mantuvieron las 34�� secuencias H3 completas que contenian solo los 20 aminoacidos regulares, entre las que 2� 03 eran unicas. Se siguio el mismo procedimiento para las cadenas ligeras λ y κ, respectivamente, dando como resultado 1044 y 12�1 secuencias de las cuales ��5 y �2� eran unicas.

Tambien se extrajeron secuencias de CDR3 de la base de datos IMGT/LIGM DB tal como existia el 2 de noviembre de 2003 (Giudicelli, V., et al. IMGT/LIGM DB, the IMGT(R) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences. Nucleic Acids Res 200 �, 34:D ��1� ��4). Solo se consideraron los genes "productivos/regulares/humanos/ADNc+ARN/reordenados". Se obtuvieron 51 secuencias H3, 1432 K3 y 1131 L3, de las cuales 4323 secuencias H3, ��4 K3 y �12 L3 eran unicas.

Se recogieron tambien 12� secuencias de anticuerpos humanos adicionales del banco de datos de proteinas (Berman, H.M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res 2000, 2�:235�242.). Para esto, se uso el archivo de 510 secuencias ya recopiladas por Andrew Martin el 1 de agosto de 2003 (Allcorn, L.C., y Martin, A.C. R. SACS self� maintaining database of antibody crystal structure information. Bioinformatics 2002, 1�:1�5�1� 1).

Diseno de oligonucleotidos escogidos

Al sesgar las representaciones de los aminoacidos, se calcularon mezclas optimizadas de los nucleotidos en cada una de las tres posiciones de codones tal como se describio anteriormente (Wang, W., y Saven, J.G. Designing gene libraries from protein profiles for combinatorial protein experiments. Nucleic Acids Res 2002, 30:e120; Park, S., et al. Progress in the development and application of computational methods for probabilistic protein design. Comput Chem Eng 2005, 2�: 40��421.). Se limito la terminacion prematura de las secuencias de proteinas imponiendo un limite superior de 0,05 en la probabilidad de producir un codon de terminacion. Para las 34 posiciones que no recuperaron satisfactoriamente las probabilidades deseadas de los aminoacidos, se realizo una segunda optimizacion con el mismo metodo, pero sin restriccion en la frecuencia de codones de terminacion. Para la sintesis de oligonucleotidos, se redondearon las frecuencias calculadas en incrementos del 5% tal como sigue: todas las frecuencias entre el 0% y el 5% se redondearon al 5%; otras frecuencias se redondearon al 5% mas cercano; si la suma resultante era superior al 100%, se elimino un 5% de la frecuencia de aminoacidos redondeada mayor del 5% para la que la diferencia entre la frecuencia redondeada y la diana era maxima y se repitio el procedimiento hasta que la suma era del 100%; si la suma era inferior al 100%, se anadio un 5% a la frecuencia redondeada inferior al

�5%, para la que la diferencia entre la frecuencia redondeada y la diana era maxima y se repitio el procedimiento hasta que la suma era del 100%.

Construccion de bibliotecas de VH y VL

Se introdujeron secuencias de CDR3 variables en scFv13R4 mediante ensamblaje por PCR usando una polimerasa de correccion de lectura de arranque en caliente (ProofStart, Qiagen) usando como plasmido molde pAB 1� scFv13R4p (Martineau, P., y Betton, J.M. in vitro folding and thermodynamic stability of an antibody fragment selected in vivo for high expression levels in Escherichia coli cytoplasm. J Mol Biol 1���, 2 �2:� 21��2 �). Para introducir bucles H3 al azar, se obtuvo el extremo 5' del gen con la secuencia H3 al azar con los oligonucleotidos M13rev �4� y uno de los 13 oligonucleotidos degenerados, y se obtuvo el extremo 3' con PliaisonH3 y M13uni�43 (ambos durante 20 ciclos a 55DC). Se ensamblaron por tanto las dos bandas purificadas mediante PCR (30 ciclos, 55DC) usando M13rev �4� y M 13uni�43. Se purifico la PCR resultante usando un kit comercial (Nucleospin, Macherey �Nagel), se digirio durante 1� horas a 3�DC con las enzimas NcoI y NotI, y entonces se purifico en un gel. Se siguio el mismo procedimiento para introducir bucles L3 y K3 al azar excepto porque los pares de cebadores usados fueron M13rev �4�/PliaisonL3 para el extremo 5' y uno de los oligonucleotidos degenerados que codificaba para el bucle L3/K3 (K3 n o L3 n) con M13uni� 43 para la parte 3' del gen.

Se ligo cada banda digerida durante 1 horas a 1 �DC con 1 μg de NcoI� NotI, se digirio y se purifico pscFvΔCAT en 100 μl usando 10 unidades Weiss de ADN ligasa de T4. Se inactivo con calor el ligamiento y se purifico usando un kit comercial (Nucleospin). Entonces se electroporo el ligamiento en 300 μl de celulas competentes MC 10�1 (Sidhu, S.S., et al. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol 2000, 32�:333�3� 3) y se sembraron en placa en una placa cuadrada de 00 cm2 de LB que contenia 100 μg/ml de ampicilina, entonces se incubaron durante 1� horas a 3�DC. Se rasparon las 1� bibliotecas (13 VH y 5 VL) en 10 ml de LB con glicerol al 10%, e inmediatamente se sembraron en placa 10 bacterias en una placa cuadrada de 00 cm2 de LB que contenia

100 μg/ml de ampicilina, IPTG 1 mM y 30 μg/ml de CAM, entonces se incubaron durante 1 horas a 3 �DC. Entonces se rasparon las 1� bibliotecas en 10 ml de LB con glicerol al 10% y se congelaron a �0DC. Se uso una alicuota para preparar ADN para el ensamblaje de bibliotecas.

Ensamblaje de bibliotecas

Se amplificaron las 13 bibliotecas de VH usando los cebadores M13rev �4�/PliaisonH3.back usando Pfu polimerasa, y se amplificaron las 5 bibliotecas de VL usando scFvCAT.rev/H3Liaison (30 ciclos, 55DC). Se purificaron en primer lugar 1� bandas de PCR, entonces se cuantificaron cuidadosamente en gel usando el software ImageJ. Se agruparon las 13 bandas de VH en cantidades proporcionales a su frecuencia en H3 humano. Esta mezcla se denomino VHpool. Se agruparon las 2 κ de VL con el fin de obtener un �5% de bucles de aminoacidos de longitud y un 25% de bucles de 10 aminoacidos de longitud. Se agruparon las bandas λ de VL para obtener un 30% de los bucles de aminoacidos de longitud, un 30% de los bucles de 10 y un 40% de los bucles de 11. Finalmente, se agruparon las mezclas de κ y λ con el fin de conseguir un 50% de cada clase en la mezcla final denominada VLpool.

Se ensamblaron VHpool y VLpool mediante PCR usando Taq ADN polimerasa y los cebadores M13rev 4�/scFvCAT2.rev en 500 μl (30 ciclos, 55DC). Se digirio sucesivamente la PCR con 20 unidades de NcoI y NotI durante al menos h cada una, se purifico y entonces se cuantifico en gel. Se digirieron sucesivamente 50 μg de vector pCANTAB� con �0 unidades de NcoI y NotI durante al menos h cada una, se purifico y entonces se cuantifico en gel. Se ligaron 5 μg de pCANTAB� linealizado con una cantidad molar igual de inserto (0,�4 μg) en 500 μl a 1�DC usando 50 unidades Weiss de ADN ligasa de T4. Se inactivo con calor el ligamiento y se purifico usando un kit comercial (Nucleospin). Entonces se electroporo el ligamiento purificado en 10 X 300 μl de celulas competentes CMax5αF' (Sidhu, S.S., et al. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol 2000, 32� :333� 3�3), y se sembraron en placa en diez placas cuadradas de �00 cm2 de LB que contenian un 1% de glucosa y 100 μg/ml de ampicilina. Tras la incubacion durante 1� h a 3�DC, se rasparon las celulas en 2xYT que contenia un 10% de glicerol y se mantuvieron congeladas a ��0DC en alicuotas correspondientes a veinte veces la diversidad.

Antigenos

Aurora�A es una proteina etiquetada con His y se produjo en E. coli. Se expreso GST:Syk en E. coli. (Dauvillier, S., et al. Intracellular single� chain variable fragments directed to the Src homology 2 domains of Syk partially inhibit Fc epsilon RI signaling in the RBL�2H3 cell line. J Immunol 2002, 1 ��:22�4� 22�3). Se expreso la proteina E� del virus del papiloma HPV1� en la cianobacteria Anabaena (Desplancq et al., por publicar). Se adquirieron histonas (una mezcla de H2a, H2b, H3 y H4) de Sigma (tipo II�AS. N.D H ��55). Se purifico tubulina a partir de cerebro de cerdo (Williams, R.C.J., y Lee, J.C. Preparation of tubulin from brain. Methods Enzymol 1 ��2, 5 (Pt B):3�� �3�5).

Rescate y examen de bibliotecas

Se realizo el rescate de bibliotecas esencialmente tal como se describio anteriormente usando un fago auxiliar sensible a tripsina (Kristensen, P., y Winter, G. Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages. Fold Des 1 , 3:321� 32�). En resumen, se inoculo una alicuota de la biblioteca correspondiente a un exceso de 10 a 20 veces con respecto a la diversidad (2�3 x 1010 bacterias) en 1000 ml de 2xYT que contenia 100 μg/ml de ampicilina y un 1% de glucosa y se hizo crecer con agitacion a 3 DC hasta que la DO �00nm era de 0,�. Se infectaron 200 ml (∼3 X 1010 celulas) con 5 X 1011 fagos auxiliares KM 13 (Kristensen, P., y Winter, G. Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages. Fold Des 1�� �, 3:321 32�) y se incubaron sin agitacion durante 30 min. a 3� DC. Se sedimentaron las celulas, se resuspendieron en 1000 ml de 2xYT que contenia ampicilina 100 μg/ml y kanamicina 25 μg/ml y se incubaron durante la noche con agitacion vigorosa a 30DC. Se precipito el sobrenadante que contenia fagos dos veces anadiendo 1/5D del volumen de PEG ��000 al 20%, NaCl 2,5 M, y se resuspendio en PBS complementado con un 15% de glicerol. Se almacenaron alicuotas que contenian 1011 �1012 fagos a ��0DC.

Para seleccionar elementos de union, se recubrio una placa de pocillos Nunc Maxisorp con 100 μl de antigenos purificados. Para la primera ronda, se uso una concentracion de antigeno de 10�100 μg/ml. Para rondas posteriores, se uso una concentracion de antigeno de 1 �10 μg/ml. Se lavo la placa 3 veces con PBS que contenia un 0,1% de Tween20 (PBST) y se saturo durante 2 horas a temperatura ambiente con PBS que contenia leche desnatada al 2% (MBPS). Se anadieron 1011 �1012 fagos por pocillo en MPBS al 2% y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavo la placa 20 veces (primera ronda) o 40 veces (2) y 3) rondas) con PBST, y luego se lavo 3 veces con PBS. Se elimino el exceso de PBS, y se eluyeron los fagos anadiendo 100 μl de trietilamina 100 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se neutralizo la suspension de fagos eluida con 50 μl de Tris�HCl 1 M pH �,4, luego se digirio 15 minutos a temperatura ambiente con tripsina anadiendo 1,5 μl de CaCl2 0,1 M y 15 μl de tripsina tratada con TPCK 10 mg/ml (Sigma). Se infecto 1 ml de una cepa Cmax5aF' en crecimiento exponencial a 3�DC en 2xYT con 40 μl de fagos tratados con tripsina, se incubaron 30 min. a 3�DC sin agitacion, entonces se sembraron en

placa en una placa Petri redonda de 15 cm (LB, ampicilina 100 μg/ml, glucosa al 1%). Tras la incubacion durante la noche a 3�DC, se recuperaron las bacterias de la placa y se usaron para preparar una nueva reserva de fagos usando el fago auxiliar KM13. Se usaron 1011 �1012 fagos de esta reserva durante la siguiente ronda de seleccion.

Seleccion periplasmica y citoplasmatica

Para la seleccion periplasmica, se usaron fagos de la ronda 3 para infectar la cepa no supresora HB2151. Se sometieron a prueba clones individuales para detectar la expresion de scFv mediante ELISA en placas de microtitulacion de�� pocillos recubiertas con antigeno tal como se describe (Harrison, J.L., et al. Screening of phage antibody libraries. Methods Enzymol 1 ��, 2��: �3�10�). Para la seleccion citoplasmatica, se preparo plasmido a partir del conjunto de bacterias de la 2) o 3) ronda de seleccion, se digirio con las enzimas NcoI y NotI y se clono la banda de �50 pb en el plasmido pET23NN desfosforilado y digerido con NcoI� NotI. Se transformo el ligamiento en C� Max5αF', y se sembraron en placa las celulas LB con ampicilina 100 μg/ml y se incubaron durante 1� horas a 3�DC. Se rasparon las celulas, y se preparo ADN de plasmido y se uso para transformar BL21 (DE3) pLysS quimicamente competente. Se hicieron crecer clones individuales en una placa de microtitulacion de pocillos que contenia 100 μl de 2xYT, 100 μg/ml de ampicilina con agitacion vigorosa a 3�DC hasta que la DO �00nm alcanzo 0,�. Se anadio IPTG hasta 0,4 mM final y se incubo la placa de microtitulacion durante 1� horas a 24�30DC con agitacion vigorosa en una atmosfera humidificada. Tras la centrifugacion, se resuspendieron las celulas en 100 μl de Tris�HCl 50 mM pH ,5, EDTA 5 mM, se congelaron/descongelaron y se incubaron 1 hora en hielo. Se anadio MgCl2 hasta 10 mM y se digirio el ADN con 10 μg/ml de DNAseI. Se usaron 5�20 μl en un ELISA en una placa de microtitulacion de pocillos recubierta con antigeno (Nunc Maxisorp). Se realizo el revelado usando anticuerpo monoclonal E10 seguido por un anticuerpo anti IgG de raton conjugado con HRP.

Purificacion de scFv

Se purificaron scFv clonados en el plasmido pET23NN a partir del citoplasma de BL21(DE3) pLysS y se purificaron en una columna Ni �NTA tal como se describe para el scFv13R4 original (Martineau, P., et al. Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm. J Mol Biol 1�� �,2� 0:11 ��12� .).

Transfeccion de celulas e inmunofluorescencia

Se mantuvieron celulas HeLa en medio de cultivo tisular de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen) complementado con L �glutamina (2 mM), penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (25 μg/ml) y suero de ternero feral inactivado con calor al 10% a 3 DC en una atmosfera con un 5% de CO2 humidificada. Se llevo a cabo la transfeccion transitoria con el reactivo de lipidos TransFectin (Bio �Rad, Hercules, CA, EE.UU.) segun las instrucciones del fabricante. Se sembraron las celulas sobre cubreobjetos en placas de pocillos a 2,5 X 105 celulas/pocillo el dia antes de la transfeccion. Se mezclaron 1 μg de ADN y 2 μl de reactivo diluido en 100 μl de DMEM y se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se hicieron crecer las celulas a 3�DC durante 24 horas tras la adicion de la mezcla. Se visualizaron las proteinas etiquetadas con GFP expresadas tras la fijacion de las celulas transfectadas con paraformaldehido al 4% en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente. Tras lavado extenso con PBS, se secaron las celulas y se montaron con Fluoromount�G (SouthernBiotech, Birmingham, RU). Se examinaron las celulas procesadas con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan equipado con una camara Olympus DP50. Se recogieron imagenes con objetivo Zeiss 40X planneofluar y se procesaron usando Adobe Photoshop 5.5. Para la figura �, se transfectaron HeLa con el clon 5 anti� histonas fusionado con el dsRed� monomero de GFP, se fijaron como anteriormente y se permeabilizaron con Triton X 100 (0,2%, 5 min.). Se revelo la red de microtubulos con el scFv 2F12C (tabla 3) a 3 μg/ml usando el �E10 anti�myc y un anticuerpo anti�IgG de raton con Alexa Fluor 4 ��. Se observaron las celulas mediante microscopia confocal (X �3).

RESULTADOS

Etapa 1: Seleccion del entramado de anticuerpo

Con el fin de maximizar la eficacia de la biblioteca de scFv, la construccion de la biblioteca comenzo con la seleccion de un entramado de anticuerpo optimizado individual para la seleccion de intracuerpos. A traves de evolucion molecular, se obtuvo un scFv humano denominado scFv13R4, que se expresa a altos niveles en el citoplasma de E. coli. Este scFv tambien se expresa y tiene una conformacion soluble y activa en celulas tanto de levadura como de mamifero. Este scFv es muy estable in vitro y puede renaturalizarse en presencia de un agente reductor. Ademas, el analisis de su cinetica de plegamiento mostro que se pliega mas rapido que el scFv original y se agrega mas lentamente in vitro. Las mutaciones aisladas se ubican principalmente en el dominio VH y parecen ser altamente especificas para este scFv particular puesto que no pueden transferirse a un dominio VH muy homologo. Se muestran a continuacion las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de scFv13R4.

Etapa 2: Introduccion de diversidad en secuencias de CDR3

a) Base de datos de secuencias de CDR3 humanas

Se recopilaron secuencias de CDR3 humanas de tres fuentes principales: la base de datos Kabat (Johnson, G. y Wu, T.T. Kabat Database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res 2000, 2�:214� 21�), la base de datos IMGT database (Giudicelli, V., et al. IMGT/LIGM �DB, the IMGT(R) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences. Nucleic Acids Res 200�, 34:D ��1��� 4) y el RCSB PDB (Berman, H.M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res 2000, 2�:235�242). Tras eliminar los duplicados, la base de datos contenia 51�� secuencias unicas de CDR3 H3, 1432 de K3 y 1131 de L3. Puede observarse que la mayoria de las secuencias H3 eran unicas puesto que, por ejemplo, en la base de datos Kabat, 23�� secuencias H3 (��%) se encontraron solo una vez entre las 2 03 secuencias H3 completas. El resultado era comparable en el caso de L3 y K3 puesto que, respectivamente, el % y el �2% de las secuencias eran unicas en la base de datos Kabat. Esto subraya la muy alta variabilidad de las secuencias de CDR3 humanas.

Esta variabilidad, sin embargo, no se distribuye uniformemente en el bucle, y la frecuencia de cada aminoacido varia de una posicion a otra y para cada longitud de bucle. Ademas, la distribucion de aminoacidos depende del origen de la secuencia del anticuerpo. Este sesgo puede deberse a una restriccion estructural como por ejemplo en el caso del antepenultimo residuo que es frecuentemente un aspartato (D101 usando el esquema de numeracion de Kabat) y desempena un papel importante en el cambio entre la conformacion extendida y doblada de la H3. En otros casos, este sesgo puede deberse solo al numero limitado de secuencias disponibles para los segmentos D y J, y pueden tolerarse aminoacidos distintos de los encontrados en anticuerpos naturales.

Para la construccion de la biblioteca, se decidio preparar CDR3 que imitan la distribucion natural por dos motivos principales: i) un objetivo era generar scFv que fueran tan humanos como fuese posible para un posible uso en terapia de seres humanos; y ii) el mantenimiento de la distribucion de aminoacidos natural dara como resultado mas probablemente anticuerpos funcionales.

Se alinearon secuencias de CDR3 de la base de datos por longitud, y se calcularon las frecuencias para cada uno de los 20 posibles aminoacidos en cada posicion y para cada longitud de bucle. En el caso de las CDR3 de cadena ligera, se analizaron las secuencias independientemente para cada clase. En el caso de las secuencias H3, esto dio como resultado 35 tablas, una para cada longitud de H3 entre 1 y 34 aminoacidos. Para un bucle de longitud n, esta tabla contenia 20n frecuencias.

b) Diseno de oligonucleotidos para codificar para bucles CDR3

Se disenaron dieciocho oligonucleotidos para seguir la distribucion de aminoacidos encontrada en la base de datos de CDR3 recopilada. Se usaron ciento noventa y dos mezclas optimizadas de los cuatro nucleotidos en cada posicion del codon para coincidir tanto como fuese posible con la distribucion de aminoacidos deseada. La principal ventaja de este enfoque es que solo requiere sintesis de oligonucleotidos clasica, lo que da como resultado una mejor calidad de los oligonucleotidos. Debido a las restricciones del codigo genetico, sin embargo, no es posible seguir de manera precisa una distribucion de aminoacidos arbitraria. Ademas, si la biblioteca no sigue estrictamente la distribucion de aminoacidos natural, esto puede introducir diversidad no natural interesante en los bucles CDR3.

Se calcularon en primer lugar mezclas optimizadas para las 24� posiciones variables para hacer coincidir la distribucion con una frecuencia minima de codones de terminacion, entonces se optimizaron adicionalmente 34 posiciones que estaban demasiado distantes de la distribucion diana relajando esta ultima restriccion. Debido a la restriccion del codigo genetico, algunas posiciones no estaban perfectamente optimizadas. Por ejemplo, en la posicion 3, alanina y glicina estaban subrepresentadas en la mezcla y fue necesario introducir una cantidad sustancial de algunos aminoacidos no encontrados de manera natural como cisteina con el fin de coincidir con otras frecuencias de aminoacidos. Sin embargo, hubo un buen acuerdo global entre la base de datos y las frecuencias codificadas en oligonucleotidos puesto que los aminoacidos mas frecuentemente encontrados estaban representados a las tasas mas altas en la biblioteca y los aminoacidos poco comunes estaban presentes habitualmente a una frecuencia baja. Las secuencias de los 1� oligonucleotidos degenerados usados para construir los bucles CDR3 se proporcionaron anteriormente.

c) Construccion de bibliotecas de bucles CDR3 para cadenas VH y VL

Se construyeron bibliotecas independientes para cada longitud de bucle CDR3. Se realizo esto independientemente para cada una de la cadena pesada y las dos clases de cadenas ligeras. Para cada biblioteca, se introdujeron bucles CDR3 al azar mediante PCR y la biblioteca resultante se clono entonces de nuevo en el gen 13R4 de scFv, que se fusiono con el gen de CAT en el vector pscFvCAT. Esto dio como resultado bibliotecas de clones de scFv13R4 con uno y solo un bucle CDR3 aleatorizado.

Se construyo en primer lugar la biblioteca de bucles H3 de 5 aminoacidos de longitud. Se secuenciaron cuarenta y tres clones elegidos aleatoriamente. Algunas posiciones divergian de los valores esperados de frecuencias para los

20 aminoacidos aunque, en promedio, la distribucion de aminoacidos en la biblioteca coincidia con la distribucion esperada. Esto mostro que la calidad de los oligonucleotidos era buena y que la biblioteca resultante seguia la 5

distribucion natural de los aminoacidos en bucles H3 humanos.

Tabla 2

Diversidad de las bibliotecas de CDR3

Fenotipo CAMb

Diversidad iniciala

++ + Diversidad finalc

H3 �5

1,4e� 15/20 3/20 2/20 1,1e�

H3

2,�e� 20/20 0/20 0/20 2,�e�

H3

,2e� 1�/20 3/20 1/20 ,4e�

H3

5,0e� 14/20 4/20 2/20 3,5e�

H3

2,4e� 1�/20 1/20 3/20 1,�e�

H3 �10

1,0e� 10/20 /20 4/20 5,0e�

H3 �11

2,2e� /12 1/12 2/12 1,�e�

H3 �12

1,0e� 15/20 2/20 3/20 ,5e�

H3 �13

2,3e� /12 3/12 1/12 1,5e�

H3 �14

1,0e� 12/20 4/20 4/20 ,0e�

H3 �15

2,1e� /12 3/12 1/12 1,4e�

H3 �1�

1,0e� 12/20 2/20 �/20 ,0e�

H3 �1�

1,1e� 12/20 4/20 4/20 ,�e�

K3��

3,�e� 11/1� 1/1� 4/1� 2,5e�

K3�10

4,4e� 10/1� 1/1� 5/1� 2,�e�

L3��

1,�e� 11/20 /20 3/20 ,4e�

L3�10

1,5e� 10/20 /20 1/20 ,5e�

L3�11

1,�e� 15/20 3/20 2/20 1,4e�

(continuacion) Diversidad de las bibliotecas de CDR3 Fenotipo CAMb Diversidad iniciala ++ + Diversidad finalc

a Diversidad inicial de la biblioteca clonada como fusion con CAT y seleccionada en ampicilina. Este es el numero de clones obtenidos tras la transformacion.

b Se comprobaron entre 12 y 20 clones de la transformacion en placas de CAM. Se incubaron las placas durante 1� h a 3�DC y se estimo el tamano de colonia. Las columnas ++, + y -proporcionan, respectivamente, la fraccion de clones que crecieron de manera normal, las que dieron colonias minusculas y las que no crecieron en absoluto.

C Diversidad de las bibliotecas seleccionadas en CAM. Se estima la diversidad a partir de la columna "Diversidad inicial" y "Fenotipo CAM" suponiendo que la diversidad final es proxima a (Diversidad inicial) X (Fenotipo CAM ++). La diversidad real puede ser superior puesto que algunos de los clones indicados como + en la columna "Fenotipo CAM" pueden estar presentes en baja abundancia.

Etapa 3: Eliminacion de secuencias no expresadas

Tal como se esperaba, no todos los clones formados a partir de la construccion de las bibliotecas de VH y VL eran funcionales por tres motivos principales: i) los oligonucleotidos usados para introducir diversidad pueden contener codones de terminacion; ii) pueden introducirse codones de terminacion o desplazamientos del marco mediante la PCR y las etapas de clonacion; o iii) los scFv apenas se expresan en el citoplasma. Para eliminar estos clones de scFv no funcionales, se seleccionaron clones expresados fusionando el gen de scFv y la enzima acetil transferasa (CAT) usando el metodo de Maxwell KL et al. (A simple in vivo assay for increased protein solubility, Protein Sci 1���; :1� 0��1 �11) tal como se describe a continuacion.

Creacion de proteinas de fusion scFV�CAT

En resumen, se clonaron independientemente las bibliotecas de scFv entre los sitios NcoI y NotI del vector pscFvCAT bajo el control del promotor tac y en marco con un gen de CAT en el sentido de 3'. Se expreso por tanto la proteina de fusion scFv �CAT en el citoplasma. Si un scFv no se expresaba apropiadamente debido a la inclusion de un codon de terminacion o una mutacion de desplazamiento del marco, o si no podia plegarse en el citoplasma, la proteina scFv �CAT o bien no se expresaria o bien no seria activa, dando como resultado un fenotipo sensible a cloranfenicol (CAMS). Por otro lado, si el scFv se expresaba apropiadamente, la proteina scFv CAT resultante se expresaria bien en el citoplasma, y la bacteria seria resistencia a cloranfenicol (CAMR). Ajustando la concentracion de cloranfenicol (CAM), puede incluso seleccionarse la expresion de diferentes niveles de solubilidad de la proteina scFv CAT.

Se sometieron a prueba diferentes concentraciones de CAM durante esta etapa de seleccion que oscilaban entre 15 y 200 μg/ml. A la concentracion mas alta de CAM, la biblioteca se enriquecio en scFv bien expresados, pero tambien en clones que contenian plasmidos recombinados que albergaban deleciones parciales o completas del gen de scFv. A continuacion, se sembraron en placa las bibliotecas en una concentracion de CAM media (30 μg/ml). Esta concentracion era lo suficientemente alta como para eliminar todos los scFv no expresados o que se agregaban fuertemente, pero no dio como resultado una cantidad detectable de plasmidos que albergaban la delecion de scFv.

Para estimar el tamano final de las bibliotecas, se aislaron al menos al menos 12 clones de cada biblioteca inicial, que se selecciono en ampicilina y en CAM para determinar la fraccion de clones CAMR. Algunos clones crecieron rapidamente y formaron colonias en placas de ampicilina/CAM/IPTG (tabla 2, columna ++), algunos crecieron lentamente (columna +) y algunos no crecieron en absoluto (columna �). Se estimo por tanto el tamano de las bibliotecas de scFv expresado (seleccionadas en Amp+CAM+IPTG) como el producto del tamano de la biblioteca original (seleccionada en ampicilina) por la frecuencia de los clones CAMR. Los tamanos de las 1� bibliotecas se proporcionan en la ultima columna de la tabla 2 y oscilaban entre 2,5x10 y 1,�x10 .

Etapa 4: Ensamblaje de la biblioteca seleccionada en CAM

Se ensamblo la biblioteca final recombinando las 13 bibliotecas de VH seleccionadas en CAM con las 5 bibliotecas de VL seleccionadas en CAM. La diversidad teorica posible es de aproximadamente 1015 (∼13VH x 10 x 5 VLx 10 ). Esto es mucho mas de lo que podria obtenerse mediante electroporacion. Por tanto, es muy improbable obtener dos veces el mismo clon en la biblioteca final.

Se amplificaron las 13 bibliotecas de VH y las 5 de VL mediante PCR con una secuencia solapante de 1� nucleotidos, luego se purificaron y cuantificaron en gel de agarosa. Se agruparon entonces los fragmentos purificados de VH y VL en cantidades proporcionales a la distribucion natural de las longitudes de bucles CDR3 en anticuerpos humanos (figura 3a). Finalmente, se ensamblaron las mezclas de VH y VL mediante PCR, se digirieron y se clonaron en un vector adecuado para la presentacion en fago. Se electroporo la biblioteca en la cepa Cmax5αF', dando como resultado una biblioteca de 1,5x10 clones que contenia un inserto de scFv, tal como se comprobo mediante PCR en 100 colonias escogidas aleatoriamente. Se ensamblaron las 1� bibliotecas seleccionadas en CAM en cantidades proporcionales a la distribucion natural de longitudes de bucles CDR3 en anticuerpos humanos para formar una biblioteca final de mas de un billon de clones.

Se secuenciaron ciento dieciocho clones para determinar las secuencias y longitudes de bucles. Casi todas las longitudes de bucles se encontraban en la biblioteca. Bucles de 11 y 1� aminoacidos de longitud estaban tambien subrepresentados en la biblioteca. Esto se debe presumiblemente a la mala calidad de estos oligonucleotidos tal como se muestra mediante su perfil en un bioanalizador Agilent. Longitudes de bucle que oscilaban entre y 12 estaban sobrerrepresentadas en la biblioteca pero solo en un factor de dos veces. Las longitudes de bucles de y 1� aminoacidos, que son las mas frecuentemente encontradas en anticuerpos humanos, estaban todas presentes en la biblioteca. El numero de clones secuenciados era demasiado pequeno para analizar la frecuencia de los aminoacidos encontrados en los bucles CDR3. Excepto por algo de contaminacion con la secuencia 13R4 de scFv original, no se encontro ninguna secuencia de CDR3 dos veces en la biblioteca.

Expresion de scFv en la celula

Debido al uso novedoso de la etapa de seleccion en CAM, se optimizaron independientemente las bibliotecas de VH y VL para la expresion en la celula. Debido a esta optimizacion de las bibliotecas de VH y VL, el resultado debe ser solo proteinas scFv expresadas. Ademas, puesto que solo se modifican los bucles CDR3 entre el entramado de anticuerpo scFv13R4 original y las bibliotecas de scFv resultantes, la mayoria de los residuos de la superficie de contacto entre los dos dominios se conservan entre clones. Por tanto, es probable que cualquier VH se ensamble correctamente con cualquier VL y que el nivel de expresion del scFv resultante este proximo al de ambos clones de las bibliotecas de VH y VL seleccionadas en CAM. En otras palabras, si una VH, con un bucle H3 modificado, se expresa bien cuando se fusiona al VL13R4, tambien se expresara bien cuando se acopla con una VL con un bucle CDR3 modificado y se selecciona como una fusion con el VH1 3R4. Se sometio a prueba esta hipotesis escogiendo clones al azar de la biblioteca final y expresandolos en el citoplasma de E. coli y en el citosol de mamiferos.

Se preparo ADN a partir de la biblioteca final y se clonaron los genes de scFv en un plasmido para la expresion citoplasmatica bajo el control del promotor de T fuerte. Debe indicarse que los muy altos niveles de expresion obtenidos bajo tal promotor fuerte favorecen la agregacion con respecto a la expresion soluble debido a la cinetica de orden alto del proceso de agregacion. La rigurosidad de esta prueba es por tanto alta y podria ser posible aumentar la razon de soluble frente a insoluble usando un promotor mas debil. Se sometieron a prueba veinte clones en E. coli y 1� de ellos mostraban al menos algo de expresion soluble en el citoplasma (figura 3). Un cuarto de los clones (5/20; clones 3, 10, 11, 1�, 1�) se expresaban a muy altos niveles puesto que los scFv eran claramente visibles en un gel tenido con Coomassie. Para obtener una vision mas global de los niveles de expresion soluble en

E. coli, se clono la biblioteca en frente del gen de GFPuv bajo el control del promotor de T . Si el scFv es soluble y se expresa en el citoplasma, esto debe dar como resultado actividad de proteina fluorescente verde (GFP) que puede monitorizarse directamente en un transiluminador UV. Se sometieron a prueba aproximadamente 1000 clones para detectar la presencia de actividad de GFP detectable y aproximadamente el 0% presentaba un fenotipo GFP+, lo que de nuevo indicaba que la mayoria de los clones de scFv de la biblioteca final se expresaban correctamente en el citoplasma de E. coli. Estas dos pruebas demostraron que el metodo novedoso de construccion de una biblioteca de scFv tal como se describio anteriormente era muy satisfactorio en la generacion de scFv expresados de manera citoplasmatica en E. coli.

A continuacion, se sometio a prueba la expresion de la biblioteca en celulas de mamifero. Se clonaron quince scFv en un vector de expresion de mamifero como fusiones con el gen de EGFP y bajo el control del promotor temprano de SV40, luego se transfirieron en celulas HeLa. Se muestran resultados tipicos en la figura 4. Tres clones se expresaban a un alto nivel soluble, comparable con el del scFv13R4 original (clon 15), se encontro que 10 scFv eran principalmente solubles aunque todavia estaba presente algo de material agregado en la celula (clones 33 y 3�), y 2 clones se acumulaban esencialmente como agregados citoplasmaticos (clon 24), tal como se observo con el scFv 1F4 anti�oncoproteina E derivado de hibridoma (figura 4). En conclusion, trece de los quince scFv sometidos a prueba se expresaban como proteinas solubles que podian detectarse facilmente en el citoplasma y en el nucleo de las celulas transfectadas.

Conjuntamente, estos resultados mostraban que mas del 5% de los clones de la biblioteca final expresaban scFv soluble en E. coli (1�/20) y citoplasma de mamiferos (13/15), mientras que aproximadamente el 20% de ellos expresaban scFv a un muy alto nivel (5/20 en E. coli y 3/15 en celulas eucariotas). Globalmente, la mayoria de los clones se expresaban bien en las condiciones reductoras del citoplasma bacteriano y eucariota. Esto es una gran mejora con respecto a resultados obtenidos anteriormente con bibliotecas de scFv no optimizadas.

Seleccion de elementos de union

Tal como se mostro anteriormente, la biblioteca contiene una muy alta proporcion de clones expresados. La siguiente etapa fue seleccionar anticuerpos de la biblioteca frente a proteinas particulares. Por tanto, se uso la biblioteca de presentacion en fago para seleccionar elementos de union frente a cinco antigenos diferentes usando proteinas purificadas adsorbidas sobre placas de microtitulacion. Se realizaron tres rondas de seleccion, y se sometieron a ensayo los fagos eluidos mediante ELISA frente a los antigenos inmovilizados. En todos los casos, se obtuvo una senal positiva tras una unica ronda de seleccion. Esta senal aumento fuertemente tras dos rondas y no aumento adicionalmente durante la tercera ronda de seleccion. Este procedimiento de seleccion muy rapido se debia presumiblemente tanto a la propia biblioteca focalizada, que contiene solo scFv expresados que dan como resultado un fondo bajo, como al uso de un fago auxiliar sensible a tripsina que disminuyo adicionalmente el nivel de fondo.

Para caracterizar el procedimiento de seleccion, se seleccionaron �0 clones de las tres rondas de seleccion frente a la fusion GST:Syk. Se usaron estos clones para preparar fagos monoclonales, que entonces se sometieron a prueba para detectar la union al antigeno mediante ELISA. La figura muestra la distribucion de los valores de ELISA obtenidos para cada ronda de seleccion. La distribucion era normal con una fuerte homogeneidad de la senal en cada ronda de seleccion puesto que mas de la mitad de los clones mostraba una senal de ELISA dentro de 0,1 del valor pico. Durante el procedimiento de seleccion, la senal pico aumento desde 0,4�0,5 tras una unica ronda hasta 0,� tras la ronda 2 y 1,0 tras la ronda 3, en buena correlacion con los resultados obtenidos con los fagos policlonales. Ademas, tras una unica ronda de seleccion, casi el 100% de los clones reconocian ya el antigeno. Esto mostro que el uso de la biblioteca optimizada en combinacion con un fago auxiliar sensible a tripsina da como resultado una ausencia casi total de fondo durante el procedimiento de seleccion.

A continuacion se sometio a prueba si la biblioteca contenia clones que expresaban scFv soluble en el periplasma. Se infecto la cepa HB2151 no supresora con los fagos eluidos tras la tercera ronda de seleccion frente a tubulina, GST:Syk y las histonas nucleo. Se prepararon extractos periplasmicos y se sometieron a prueba para detectar la actividad de union mediante ELISA. En los tres casos, el 12 20% de los clones dio una senal fuerte con valores de absorbancia superiores a 0,5 (10 veces el fondo), y aproximadamente el 30% eran claramente positivos con un valor de absorbancia superior a 0,1 (dos veces el fondo). Estos resultados se comparaban favorablemente con los notificados con otras bibliotecas de scFv, subrayando de nuevo la alta proporcion de clones bien expresados presentes en la biblioteca. Ademas, esto mostro que el enfoque de seleccion en CAM seleccionaba eficazmente constructos sin codones de terminacion presentes en los oligonucleotidos. Esto es de hecho de gran importancia para aislar scFv solubles a partir de bibliotecas de presentacion en fago puesto que frecuentemente se seleccionan codones de terminacion ambar en CDR durante la seleccion de bibliotecas sinteticas y semisinteticas.

En ambas de las caracterizaciones previas, los scFv se expresaban en condiciones oxidantes en el periplasma de E. coli, o bien como una fusion scFv �pIII o bien como una proteina soluble. Ademas, se realizo la seleccion en fago, de nuevo en condiciones oxidantes. Para someter a prueba si los scFv tambien se expresaban de hecho en el citoplasma, se subclono el mismo conjunto de clones (ronda 3) en un vector de expresion citoplasmatica bajo el control del promotor de T fuerte. Para cada antigeno, se sometieron a prueba noventa y cinco clones mediante ELISA para detectar la union a su respectivo antigeno. En cada caso, el numero de clones positivos era comparable

o incluso mejor que en la seleccion periplasmica. Por ejemplo, en el caso de GST:Syk, el �0% de los clones sometidos a prueba eran positivos tras tres rondas de seleccion. Esto demostro que la etapa de seleccion periplasmica no disminuia la proporcion de scFv solubles en el citoplasma. Ademas, cuando se usa la biblioteca optimizada tal como se describio anteriormente, no es necesario seleccionar directamente dentro del citoplasma para evitar introducir un sesgo durante la seleccion.

Se secuenciaron clones individuales de la 2) y 3) ronda de seleccion frente a tubulina. Se muestran las secuencias en la tabla 3.

Tabla 3

Secuencias de algunos scfv anti-tubulina

VH CDR3

VL CDR3

Nombre

Secuencia longitud Secuencia longitud frecuenciaa rendimientob WBc IFd

Ronda 2

SSITIFGGGMDV

HSREVHRTF

C12C

(SEQ ID NO: 34) SGGNTFDY 12 (SEQ ID NO: 35) QQYYRKPWT 1/5 1�

E12C

(SEQ ID NO: 3�) (SEQ ID NO: 3�) 1/5 53

F1C

GNADGGENWELFDK (SEQ ID NO: 3�) 14 QLYQNTLWT (SEQ ID NO: 3�) 2/5 52

SSITIFGGGMDV

QQNWTSPLS

H6C

(SEQ ID NO: 40) 12 (SEQ ID NO: 41) 1/5 nd

Ronda 3

RGRDY

QQYNTSPFS

2C1C

(SEQ ID NO: 42) 5 (SEQ ID NO: 43) 1/ �, +

GRNVLNY

QQNSSSPRFT

2E11C

(SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 45) 10 2/ �, +

GRRALGN

QQYNTSPFS

2F12C

(SEQ ID NO: 4�) (SEQ ID NO: 4�) 1/ 45 + +

GRRALGN

LTWSMRSAI

2G4C

(SEQ ID NO: 4�) (SEQ ID NO: 4�) 1/ 15 + +

GRRALGN

LTTENSVYRLV

2G9C

(SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 51) 11 1/ 50 +

Secuencias de las CDR3 de los mejores clones positivos en un ELISA usando scFv expresados de manera citoplasmatica a partir de la 2ª (5 clones) y la 3ª (� clones) ronda de seleccion (tabla 3). a Frecuencia de aparicion del scFv entre clones secuenciados de la misma ronda. bRendimiento: mg de scFv purificado a partir de 1 litro de celulas hechas crecer en un frasco (DO �00 = 5). cWB: deteccion de tubulina en extractos de cerebro mediante inmunotransferencia de tipo Western. d IF: + significa que el scFv puede revelar la red de microtubulos mediante inmunofluorescencia (figura �). Las secuencias de los clones 2C1C, 2E11C, 2F12C, 2G4C y 2G� C se han presentado a la base de datos EMBL y sus numeros de registro son respectivamente AM ���2�0,AM ���2�1,AM ���2� 2,AM ���2�3 and AM ���2�4.

En todos los casos, los clones secuenciados eran los que proporcionaban la mejor senal en el ELISA realizado con scFv expresados de manera citoplasmatica. La mayoria de los clones eran diferentes puesto que solo un clon de la 2) ronda y uno de la 3) ronda se encontraron dos veces. Esto demuestra que esta todavia presente una alta diversidad tras 3 rondas de seleccion. Se purificaron ocho de los scFv anti� tubulina mediante cromatografia de afinidad a partir del citoplasma. En todos los casos, se purificaron mas de mg de scFv a partir de un litro de celulas

hechas crecer en un frasco (DO �00 = 5), y algunos scFv se expresaban a un nivel por celula comparable al nivel de expresion excepcionalmente alto notificado para un anti�HER2 en el periplasma de E. coli.

Funcionalidad de scFv como intracuerpos

Para determinar si el scFv aislado podria unirse a su diana in vivo, se caracterizaron los scFv anti histona expresados en celulas humanas. Se clono la tercera ronda de seleccion en el vector p513�EGFP y se transfectaron diez clones elegidos aleatoriamente en celulas HeLa. Se muestran en la figura resultados tipicos de las celulas que expresan las fusiones scFv EGFP y observadas mediante microscopia confocal. Un scFv se expresaba como agregados citoplasmaticos. Cuatro scFv se expresaban como proteinas citoplasmaticas solubles, tal como se juzga mediante la tincion homogenea de las celulas, a un nivel comparable al del scFv13R4. Finalmente, la expresion de tres scFv dio lugar a una tincion mas fuerte del nucleo (figura �, clon 2) y dos scFv se localizaban exclusivamente en el nucleo (figura �, clones 5 y 10). Puesto que estas proteinas de fusion scFv EGFP se expresaban en el citoplasma de la celula y no contenian una senal de localizacion nuclear, esto sugeria que podian interaccionar in vivo con las histonas y por tanto eran activas dentro de la celula. Este analisis mostro que aproximadamente la mitad de los clones presentes tras la tercera ronda de seleccion frente a histonas nucleo podian unirse a su diana nuclear in vivo. Esto se confirmo in vitro mediante inmunotransferencia puntual y de tipo Western con scFv purificado. Ademas, la secuenciacion de estos clones mostro que contenian diferentes regiones CDR3 de cadena pesada y ligera.

Caracterización in vitro de scFv anti-tubulina

Para demostrar la actividad del scFv anti�tubulina en las condiciones reductoras en el citoplasma celular, se extrajeron los scFv en presencia de un agente reductor y se comparo la senal de ELISA con la obtenida con los scFv extraidos en condiciones oxidantes. Tal como se muestra en la figura �, los cinco scFv sometidos a prueba dieron la misma senal de ELISA en ambas condiciones, lo que demuestra que los scFv conservan una actividad completa en condiciones reductoras incluso en ausencia de formacion de enlaces disulfuro. Los cinco scFv podian reconocer tubulina no plegada mediante inmunotransferencia de tipo Western en extractos de cerebro y la proteina nativa en un ELISA de competicion. Se sometio a prueba la capacidad de los cinco scFv para interaccionar con microtubulos en celulas mediante IF. Los clones 2F12C y 2G4C revelaron la red de microtubulos en celulas.

La figura ilustra la utilidad de la biblioteca como fuente para estudios proteomicos tanto in vitro como in vivo: se transfectaron celulas HeLa con el clon 5 anti�histonas fusionado con una Red�GFP, y se revelo la red de microtubulos mediante IF usando el scFv 2F12C.

Conjuntamente, estos resultados muestran que la biblioteca descrita en este informe es altamente diversa y funcional y permite un aislamiento rapido y facil de intracuerpos completamente humanos activos in vivo.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Biblioteca de anticuerpos que comprende al menos aproximadamente 10 clones de anticuerpos scFv unicos, en la que cada clon de anticuerpo scFv unico codifica para un anticuerpo scFv unico que comprende al menos una de una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica, y en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para una secuencia de entramado identica a una secuencia de entramado codificada por un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 32.

2. 2.

   Biblioteca de anticuerpos segun la reivindicacion 1, en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para anticuerpos scFv que comprenden una secuencia VH CDR3 unica.

3. 3.

   Biblioteca de anticuerpos segun la reivindicacion 1, en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para anticuerpos scFv que comprenden una secuencia VL CDR3 unica.

4. 4.

   Biblioteca de anticuerpos segun la reivindicacion 1, en la que los clones de anticuerpos scFv unicos codifican para anticuerpos scFv que comprenden una secuencia VH CDR3 unica y una secuencia VL CDR3 unica.

5. 5.

   Metodo para preparar una biblioteca de anticuerpos scFv enriquecida en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse dentro de una celula, que comprende:

   a) proporcionar una primera coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la primera coleccion comprende clones que comprenden una secuencia unica dentro de un bucle CDR3 de VH, en el que la primera coleccion se ha enriquecido en clones de anticuerpos scFv que contienen una secuencia VL identica a la secuencia VL de un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID IVO: 33;

   b) proporcionar una segunda coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la segunda coleccion comprende clones que comprenden una secuencia unica dentro de un bucle CDR3 de VL, en el que la segunda coleccion se ha enriquecido en clones de anticuerpos scFv que contienen una secuencia VH identica a la secuencia VH de un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 33;

   c) unir dominios VH de clones de anticuerpos scFv de la primera coleccion con dominios VL de clones de anticuerpos scFv de la segunda coleccion para obtener una tercera coleccion de clones de anticuerpos scFv, en el que la tercera coleccion contiene clones de anticuerpos scFv que comprenden una secuencia unica dentro del bucle CDR3 de VH y una secuencia unica dentro del bucle CDR3 de VL,

   preparando de ese modo la biblioteca de anticuerpos scFv enriquecida en clones de anticuerpos scFv que pueden expresarse dentro de una celula.

   �. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la primera coleccion comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden secuencias CDR1 y CDR2 identicas en el dominio VH y en el que la segunda coleccion comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden secuencias CDR1 y CDR2 identicas en el dominio VL.

   �. Biblioteca de anticuerpos producida mediante el metodo segun la reivindicacion 5.

   �. Metodo para construir una biblioteca de anticuerpos que comprende:

   a) seleccionar el entramado de un clon de anticuerpo scFv13R4 de SEQ ID NO: 33 como entramado de anticuerpo scFv;

   b) introducir diversidad de secuencia en una region CDR3 VH del entramado de anticuerpo scFv para generar una primera biblioteca que comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden una region CDR3 VH unica;

   c) introducir diversidad de secuencia en una region CDR3 VL del entramado de anticuerpo scFv para generar una segunda biblioteca que comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden una region CDR3 VL unica;

   d) eliminar, de la primera biblioteca, clones que no expresan de manera detectable anticuerpo scFv;

   e) eliminar, de la segunda biblioteca, clones que no expresan de manera detectable anticuerpo scFv; y

   f) recombinar las bibliotecas primera y segunda para generar una biblioteca final que comprende clones de anticuerpos scFv que comprenden una region CDR3 VH unica y una region CDR3 VL unica;

   construyendo de ese modo la biblioteca de anticuerpos.