JP2010521447A - 活性なscFv抗体及びそのライブラリーを生産する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
細胞内発現抗体は、細胞内で異所的に発現される遺伝子工学的に操作された抗体分子である。細胞内発現抗体は、生存細胞において標的化された抗原を視覚化又は阻害するために使用することができ、したがって、種々の研究及び医学的(例えば、診断及び治療的)用途における使用を見出す。しかしながら、細胞内発現抗体技術は、典型的な抗体発現ライブラリー中のほんの1%未満のscFvがインビボにおいて発現及び/又は活性となるには十分に安定であるという事実によって制限されている。これは、細胞内環境が、非常に多くのscFvが安定性のために必要とする2つの保存されたジスルフィド結合を減少するためである。還元条件下で安定であり、したがって、細胞内発現抗体としての使用に適しているscFvに非常に富んだscFvのライブラリーを生産する方法が本明細書に記載されている。細胞内発現抗体は、細胞内発現抗体を使用する種々の研究、診断、及び治療的アプローチのために用いることができる。
細胞内発現のために最適化されたscFvの新規なファージディスプレイライブラリー、このライブラリーを構築及び使用する新規な方法が本明細書に記載されている。ライブラリーは、細胞質内で改善された活性のために選択される親scFvの単一の抗体フラグメントに基づいて構築される。親scFvは非常に安定であり、好ましいフォールディング及び凝集動力学を有し、全ての試験された細胞型において非常に高レベルで発現される。ライブラリーの構築のために単一のフレームワークを有することは、それらの配列の大部分が保存されているので、クローン間でより匹敵する発現レベルを可能にしなければならない。
本明細書に記載のライブラリーは細胞内発現抗体の単離のために最適化されているが、ライブラリーもまた、診断及び治療用途のためにscFvを選択することができる。さらに、本発明者らは、発現されたヒト配列を用いてCDR3多様性を設計したので、ライブラリーに存在するscFvは、完全なヒトであり、患者の抗scFv抗体応答を誘導してはならない。
scFv抗体クローンは還元条件下でフォールドする抗体をコードするので、本明細書に記載のライブラリーもまた、細胞(例えば、細菌細胞などの原核細胞、又は酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの真核細胞など)内にscFv抗体を発現させることによって大量に生産され得るscFv抗体を同定し、細胞からscFv抗体を単離するために有用である。大量の抗体を精製することが望まれる一本鎖scFv抗体は、限定されないが、例えば、実験室研究において有用であるscFv抗体が含まれ、医学的診断試験用、市販の診断試験又は他の種類の診断試験用(飲料水又は食物における汚染した微生物を検出するため)、抗体治療用(癌を治療するため、又は抗体が疾患を治療するために使用可能である感染又は他の種類の疾患を治療するため)が挙げられる。
「固有の配列」とは、scFv抗体クローンの回収の中で、scFv抗体クローンの回収に含まれる他のクローンのCDR3配列とは異なるCDR3配列を含む少なくとも106個のクローンが存在することを意味する。scFv抗体クローン又はこのようなクローンのライブラリーに関して、「固有の配列」は、scFv13R4内の対応する位置に存在する配列とは異なっている。
材料
細菌株、化合物及び酵素
LB及び2×YT培地は、前述される(Miller,J.H.A Short Course in Bacterial Genetics:a Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria.Cold Spring Harbor Laboratory Press;1992)。菌株C−Max5F’(Bio−rad laboratories)は、大腸菌K−12,[F’lacfq Tn10]ψ80dlacZΔM15デルタ(lacZYA−argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk -mk +)phoA supE44λ−thi−1 gyrA96 relA1である。MC1061(ATCC #53338)は、大腸菌K−12、F−λ−hsdR2 hsdM+ hsdS+ mcrA mcrB1 araD139Δ(ara−leu)7696Δ(lacIPOZY)X74 galE15 galU galKl6 rpsL thiである。非サプレッサー菌株HB2151は、大腸菌K−12[F’proA+B+ laclq lacZΔM15]araΔ(lac−pro)thiである。化合物はSigmaから購入した。制限酵素及びクローニングされたTaqポリメラーゼはFermentasから購入した。ProofStart及びPfu DNAポリメラーゼは、それぞれQiagen及びPromegaから購入した。プラスミドDNA、PCR及びアガロース分離したDNAは、Macherey−Nagel Nucleospinキットを用いて精製した。
変性CDR3ループを導入するために使用される18個のスパイクされたオリゴヌクレオチドを合成し、IBA GmbH(Goettingen,Germany)によって高速液体クロマトグラフィー(HPLS)を用いて精製した。18個のスパイクされたオリゴヌクレオチドの配列は下記の通りである。H3 n=n個のアミノ酸の長さVH CDR3ループ;K3 n=n個のアミノ酸の長さVLカッパ(κ)CDR3ループ;L3 n=n個のアミノ酸の長さVLラムダ(λ)CDR3ループ。変性位置に関して、4塩基の割合は、N(A/C/G/T)として与えられる。各スパイクされた(変性された)位置で使用される各ヌクレオチドの割合は、下記の表1に示されている。
*変性した位置に関して、4塩基の割合はN(A/C/G/T)として与えられる。
ファージミドベクターPhagemid vector pCANTAB6(McCafferty J et al.,Appl Biochem Biotechnol 1994,47:157−171)は、線状ファージM13のマイナーコートタンパク質pIIIへのNcoI/NotI−scFvフラグメントのN末端融合のために使用された。このファージミドは、pUC119由来であり、下記の順番で下記の配列を含む:lacプロモーター、pelBリーダー配列、scFvクローニングのためのNcoI及びNotI部位、9E10モノクローナル抗体によって認識されるHis6及びc−mycタグ、アンバーコドン及びpIII遺伝子配列。
scFVライブラリーの効果を最大限にするために、ライブラリーの構築は、細胞内発現抗体の選択のための単一の最適化された抗体フレームワークの選択から開始した。分子進化を通じて、scFv13R4と呼ばれるヒトscFvを得て、それは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する。また、このscFvが発現し、酵母及び哺乳動物細胞の両方において可溶性であり活性な構造を有する。このscFvは、インビトロでは非常に安定であり、還元剤の存在下において復元することができる。さらに、そのフォールディングの分析は、親scFvよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示す。単離された変異体は、主に、VHドメインに局在化し、この特定のscFvに非常に特異的であるように見え、それは、それらが非常に相同なVHドメインに転移することができないためである。scFv13R4のヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記に示す。
CDR3配列のデータベース
KabatデータベースのRelease 5(1992年8月)を用い(Johnson,G.,及びWu,T.T.:Kabat Database and its applications:30 years after the first variability plot.Nucleic Acids Res 2000,28:214−218)。このデータセットには44990配列が含まれる。第1に、4643個のヒトVH配列は、偽遺伝子ではなく、ヒト化されておらず、抽出された。次に、H3配列は、このデータセットから抽出され、最初に、存在する場合にはヌクレオチド配列を考慮し、次にアミノ酸を考慮する。最後に、僅か20個の標準のアミノ酸を含む3469個の完全なH3配列が、2703個が固有である中で維持された。同じ手法は、それぞれλ及びκ軽鎖のために行われ、775個及び828個が固有である1044及び1291個の配列をもたらした。
アミノ酸の表示を偏らせることにおいて、3つのコドン位置の各々でのヌクレオチドの最適化された混合物が前述のように設計された(Wang,W.,及びSaven,J.G.Designing gene libraries from protein profiles for combinatorial protein experiments.Nucleic Acids Res 2002,30:el20;Park,S.,et al.Progress in the development and application of computational methods for probabilistic protein design.Comput Chem Eng 2005,29:407−421)。タンパク質配列の未成熟終了は、停止コドンを実現する可能性に上界の0.05を課すことによって制限された。アミノ酸の所望の可能性を十分に回収しなかった34個の位置については、第2の最適化が同じ方法でなされたが、停止コドン頻度に制限を課さなかった。オリゴヌクレオチド合成に関して、計算された頻度は、下記の通り、5%増加の範囲内であった:0%〜5%の間の全ての頻度は、5%の概数で表された;他の頻度は、最も近似の5%の概数で表された;得られた合計が100%を超える場合、5%は、5%を超える概数で表されたアミノ酸頻度から除去され、概数で表された頻度と標的頻度との間の相違は最大であり、合計まで累次積分されたプロセスは100%であった;この合計が100%を下回る場合、5%は、95%を下回る概数で表された頻度に添加され、概数で表された頻度と標的頻度との間の相違は最大となり、合計まで累次積分されたプロセスは100%であった。
可変CDR3配列は、鋳型プラスミドpAB1−scFv13R4p(Martineau,P.,及びBetton,J.M.In vitro folding and thermodynamic stability of an antibody fragment selected in vivo for high expression levels in Escherichia coli cytoplasm.J Mol Biol 1999,292:921−929.)を用いたホットスタートプルーフリーディングポリメラーゼ(ProofStart,Qiagen)によりPCRアセンブリによってscFv13R4に導入された。ランダムH3ループを導入するために、ランダムH3配列を有する5’の遺伝子が、オリゴヌクレオチドM13rev−49及び13個の変性オリゴヌクレオチドの1つを用いて得られ、3’は、PliaisonH3及びM13uni−43(55℃で20サイクルについて)で得られた。このようにして、2つの精製されたバンドは、M13rev−49及びM13uni−43を用いたPCR(30サイクル、55℃)によってアセンブリされた。得られたPCRは、市販のキット(Nucleospin,Macherey−Nagel)を用いて精製され、NcoI及びNotI酵素を用いて16時間、37℃で設計され、次にゲル上で精製された。同じ手法は、使用されたプライマー対が5’端についてはM13rev−49/PliaisonL3であり、その遺伝子の3’部分については、M13uni−43を含むL3/K3ループ(K3 n又はL3 n)をコードする変性オリゴヌクレオチドの1つであることを除いては、ランダムL3及びK3ループを導入するために行われた。
13個のVHライブラリーは、Pfuポリメラーゼ及びプライマーM13rev−49/PliaisonH3.backを用いて増幅させ、5VLライブラリーは、scFvCAT.rev/H3 Liaisonを用いて増幅させた(30サイクル、55℃)。18個のPCRバンドを最初に精製し、次に、ImageJソフトウェアを用いてゲル上で注意深く定量した。13個のVHライブラリーは、ヒトH3におけるそれらの頻度に比例した量でプールされた。このミックスは、VHプールと呼ばれた。2個のVLκバンドは、75%の9アミノ酸長のループ、25%の10アミノ酸長のループを得るためにプールされた。VLλバンドは、30%の9アミノ酸長のループ、30%の10アミノ酸長のループ、40%の11アミノ酸長のループを得るためにプールされた。最後に、κ及びλミックスは、VLプールと呼ばれる最終のミックスに各クラスの50%を得るためにプールされた。
Aurora−Aは、Hisタグ化されたタンパク質であり、大腸菌で生産された。GST:Sykは、大腸菌で発現させた(Dauvillier,S.,et al.Intracellular single−chain variable fragments directed to the Src homology 2 domains of Syk partially inhibit Fc epsilon RI signaling in the RBL−2H3 cell line.J Immunol 2002 169:2274 2283)。パピローマウイルスHPB16由来のE6タンパク質は、シアノバクテリアAnabaena(Desplancqら、公開)において発現された。ヒストン(H2a、H2b、H3及びH4のミックス)をSigma(タイプII−AS、#H7755)から購入した。チューブリンをブタ脳から精製した(Williams,R.C.J.,及びLee,J.C.Preparation of tubulin from brain.Methods Enzymol 1982,85(Pt B):376−385)。
ライブラリー救出は、トリプトン感受性ヘルパーファージを用いて、基本的には、前述されるように行った(Kristensen,P.,及びWinter,G.Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages.Fold Des 1998,3:321−328)。要約すると、10〜20倍過剰である多様性(2〜3×1010個の細菌)に対応するライブラリーのアリコートは、100μg/mlのアンピシリン及び1%グルコースを含む1000mlの2×YTに撒かれ、OD600nmが0.7になるまで37℃で振とうしながら増殖させた。200ml(約3×1010細胞)は5×1011ヘルパーファージKM13(Kristensen,P.,及びWinter,G.Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages.FoldDes 1998,3:321−328)で感染され、振とうなしに30分間37℃でインキュベートされた。細胞をペレットにし、100μg/mlのアンピシリン及び25μg/mlのカナマイシンを含む1000mlの2×YTに再懸濁させ、激しく振とうしながら30℃で一晩インキュベートされた。ファージを含む上清は、5分の1量のPEG−8000 20%、NaCl 2.5Mを添加することによって沈殿させ、15%グリセロールを補足されたPBSに再懸濁させた。1011〜1012のファージを含むアリコートを−80℃で保存した。
ペリプラスムスクリーニングに関して、ラウンド3のファージを用いて、非サプレッシブ菌株HB2151に感染させた。個々のクローンは、(Harrison,J.L.,et al.Screening of phage antibody libraries.Methods Enzymol 1996,267:83−109)に記載されるように、抗原をコートした96ウェルのマイクロタイタープレートによってscFv発現について試験された。細胞質スクリーニングに関して、プラスミドは、第2又は第3の選択ラウンドの細菌プールから調製し、NcoI及びNotI酵素で消化し、750bpバンドが、NcoI−NotI消化され、脱リン酸化されたプラスミドpET23NNにクローニングされた。連結は、C−Max5αF’に形質転換され、100μg/mlアンピシリンを含むLBに細胞を蒔き、16時間37℃でインキュベートした。細胞を回収し、プラスミドDNAを調製し、これを用いて化学的にコンピーテントなBL21(DE3)pLysSを形質転換した。個々のクローンは、100μlの2×YT、100μg/mlのアンピシリンを含む96ウェルマイクロタイタープレート中で激しく振とうしながら、37℃で、OD600nmが0.6に到達するまで増殖させた。IPTGを最終0.4mMまで添加し、マイクロタイタープレートを湿気雰囲気下で激しく振とうしながら、24〜30℃で16時間インキュベートした。遠心分離後、細胞を100μlの50mM Tris−HCl pH7.5、5mM EDTAに再懸濁し、凍結/融解し、氷上で1時間インキュベートした。MgCl2を最大10mM添加し、DNAを10μg/mlのDNAseIで消化した。5〜20μlは、抗原をコートした96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc Maxisorb)上でELISAに使用された。暴露は、9E10モノクローナル抗体、その後、HRP結合させた抗マウスIgG抗体を用いて行われた。
プラスミドpET23NNにクローニングされたscFvは、BL21(DE3)pLysSの細胞質から精製され、親scFv13R4(Martineau,P.,et al.Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm. J Mol Biol 1998,280:117−127)について記載されるように、Ni−NTAカラムで精製した。
HeLa細胞は、L−グルタミン(2mM)、ペニシリン(100IU/ml)、ストレプトマイシン(25μg/ml)及び10%熱不活性化したウシ胎児血清を補足したダルベッコ変法イーグル組織培地(DMEM;Invitrogen)中で、37℃、湿度5%、CO2雰囲気下で維持した。一時的なトランスフェクションは、製造業者の使用説明書に従ってTransFectin脂質試薬(Bio−Rad,Hercules,CA,USA)を用いて行った。トランスフェクションの前日に、6ウェルプレートのカバースリップ上に2.5×105細胞/ウェルで細胞を播種した。1μgのDAN、100μlのDMEMに希釈した2μlの試薬を混合し、室温で20分間放置した。混合物を添加してから24時間、37℃で細胞を増殖させた。発現されたGFPタグ化したタンパク質は45分間室温で、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを用いてトランスフェクトした細胞の固定後に視覚化された。PBSで過剰に洗浄後、細胞を死滅させ、Fluoromount−G(SouthernBiotech,Birmingham,UK)でマウントした。処置された細胞は、Olympus DP50カメラを搭載したZeiss Axioplan蛍光顕微鏡を用いて試験した。Zeiss40×plan−neofluar対物で画像を回収し、Adobe Photoshop5.5を用いて加工した。図8に関して、HeLaは、dsRedモノマーGFPに融合した抗ヒストンクローン5でトランスフェクトされ、上述されるように固定され、Trito X−100(0.2%、5分)で透過された。微小管ネットワークは、9E10抗myc及びAlexa Fluor488抗マウスIgG抗体を用いて、3μg/mlで2F12C scFv(表3)を用いて示された。細胞は、共焦点顕微鏡によって観察された(×63)。
工程1:抗体フレームワークの選択
scFvライブラリーの有効性を最大限にするために、ライブラリーの構築は、細胞内発現抗体の選択のために単一の最適化された抗体フレームワークの選択から開始した。分子進化を通じて、scFv13R4と呼ばれるヒトscFvを得て、これは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する。また、このscFvは、酵母及び哺乳動物細胞において発現され、可溶性及び安定な構造を有する。このscFvは、インビトロでは非常に安定であり、還元剤の存在下で復元可能である。さらに、そのフォールディング動力学の分析は、それが親scFvよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示した。単離された突然変異体は、主にVHドメインに局在化し、この特定のscFvに非常に特異的であるようである。scFv13R4のヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記に示す。
a)ヒトCDr3配列のデータベース
ヒトCDR3配列は、3つの主要な供給源からコンパイルされた:Kabatデータベース(Johnson,G.及びWu,T.T.Kabat Database and its applications:30 years after the first variability plot.Nucleic Acids Res 2000,28:214−218)、IMGTデータベース(Giudicelli,V.,et al.IMGT/LIGM−DB,the IMGT(R)comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences.Nucleic Acids Res 2006,34:D781−784)、及びRCSB PDB(Berman, HM.,et al.The Protein Data Bank.Nucleic Acids Res 2000,28:235−242)。二重を取り出した後、データベースは、5179H3、1432K3、及び1131L3CDR3固有の配列を含んでいた。大部分のH3配列は固有であることを気付くことができ、それは、例えば、Kabatデータベースでは、2368H3配列(88%)は、2703の完全なH3配列のうちのただ一度であったためである。結果は、L3及びK3の場合において同等であり、それは、それぞれ87%及び82%の配列がKabatデータベースにおいて固有であったためである。これは、ヒトCDR3配列の非常に高い可変性を強調する。
18個のオリゴヌクレオチドは、コンパイルされたCDR3データベースに見出されたアミノ酸分布に従うように設計された。コドンの各位置での4つのヌクレオチドの192個の最適化されたミックスを用いて、所望のアミノ酸分布を用いてできるだけ十分に合致させた。このアプローチの腫瘍な利点は、より良好なオリゴヌクレオチドの質をもたらす伝統的なオリゴヌクレオチド合成を必要とするだけであるということである。しかしながら、遺伝コードの制限のために、任意のアミノ酸分布を正確に従うことができない。さらに、ライブラリーは天然のアミノ酸分布を厳格に従わない場合、これは、CDR3ループにおける対象とする非天然の多様性を誘導する場合がある。
各CDR3ループ長についての独立したライブラリーを構築した。これは、重鎖及び2種の軽鎖の各々について独立してなされた。各ライブラリーに関して、ランダムCDR3ループは、PCRによって導入され、次に、得られたライブラリーは、scFv13R遺伝子に戻ってクローニングされ、それは、ベクターpscFvCATのCAT遺伝子に融合された。これは、1つ及びただ1つの無作為化されたCDR3ループを有するscFv13R4クローンのライブラリーをもたらした。
b形質転換からの12〜20クローンがCAMプレート上で検査された。プレートは、16時間37℃でインキュベートされ、コロニーサイズを推定した。カラム++、+及び−は、それぞれ、正常に増殖され、小さなコロニーを提供し、全く成長しなかったコロニーの分画を示す。
cCAM上で選択されたライブラリーの多様性。多様性は、最後の多様性が(最初の多様性)×(CAM表現型++)に近いことを想定することによって、カラム「最初の多様性」及び「CAM表現型」あら推定される。現実の多様性はより高いかもしれないが、これは、カラム「CAM表現型」において+で記されたクローンのいくつかが低い量で存在していたかもしれないためである。
期待されるように、VH及びVLライブラリーの構築から形成されたクローンの全てが、3つの主要な理由のために本質的であったわけではない:i)多様性を導入するために使用されたオリゴヌクレオチドは終止コドンを含む場合がある;ii)終止コドン又はフレームシフトはPCR及びクローン工程によって導入されてもよい;又は(iii)scFvは細胞質ではあまり発現しない。これらの機能的ではないscFvクローンを除去するために、発現したクローンは、下記に記載されるようなMaxwell KLら(A simple in vivo assay for increased protein solubility, Protein Sci 1999;8:1908−1911)の方法を用いて、scFv遺伝子とクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)酵素とを誘導させることによって選択された。
要約すると、scFvライブラリーは、tacプロモーターの調節下でベクターpscFv−CATのNcoIとNotI部位との間で独立して、下流の遺伝子とフレームを合わせてクローニングされた。したがって、scFv−CAT融合タンパク質は細胞質で発現した。scFvが終止コドンの封入又はフレームシフト変異のために適切に発現されない場合、あるいは細胞質でフォールディングができない場合、得られたscFv−CATタンパク質は、発現されないか又は活性でなく、その結果としてクロラムフェニコール感受性(CAMS)表現型となる。他方、scFvが適切に発現されると、得られるscFv−CATタンパク質は、細胞質で十分に発現され、細菌は、クロラムフェニコール耐性(CAMR)となる。クロラムフェニコール(CAM)濃度を調整することによって、異なる可溶性レベルのscFv−CATタンパク質の発現を選択さえ可能となる。
最終ライブラリーは、5CAM選択されたBLライブラリーを用いた13CAM選択されたVHライブラリーを再度組み合わせることによってアセンブリされた。理論的に可能な多様性は、1015(約13VH×107×5VL×106)である。これは、エレクトロポレーションによって得ることができたライブラリーよりも非常に大きい。つまり、最終ライブラリーにおいて同じクローンを2回得る可能性は非常に小さい。
CAM選択工程の新規な使用のため、VH及びVLライブラリーは、独立して、細胞における発現のために最適化された。VH及びVLライブラリーのこの最適化のため、結果は、発現されたscFv13R4だけでなければならない。さらに、CDR3ループだけが、元々のscFv抗体フレームワークと得られたscFvライブラリーとの間で修飾されるので、2つのドメイン間の大部分の接合部分は、クローン間で保存されている。したがって、任意のVHは、任意のVLと正確にアセンブリされ、得られるscFvの発現レベルは、CAMにおいて選択されるVH及びVLライブラリーからの両方のクローンのものに近いこと考えられる。換言すれば、VHは、修飾されたH3ループを有し、VL13R4に融合されると十分に発現される場合、修飾されたCFR3ループを有するVLと結合し、VH13R4との融合体として選択される場合に十分に発現する。この仮説は、最終のライブラリー由来のランダムクローンを拾い上げ、大腸菌の細胞質及び哺乳動物の細胞質ゾルにおいてそれらを発現させることによって試験された。
上記で示されるように、ライブラリーは、非常に高い比率の発現されたクローンを含む。次の工程は、特定のタンパク質に対して、ライブラリーから抗体を選択することである。したがって、ファージディスプレイライブラリーは、マイクロタイタープレートに吸着した精製されたタンパク質を用いた5つの異なる抗原に対する結合剤について選択した。選択の3ラウンドを行い、溶出したファージは、固相化された抗原に対してELISAによって試験された。全ての場合において、陽性シグナルは、1回のラウンドの選択後に得られた。このシグナルは2回のラウンド後に増強されたが、第3ラウンドの選択中にさらに増加することはなかった。この非常に早い選択プロセスは、恐らくは、低いバックグラウンドをもたらす発現されたscFvだけを含むフォーカスされたライブラリー自体、並びにバックグラウンドレベルをさらに減少させたトリプシン感受性ヘルパーファージの使用に起因する。
単離されたscFvがインビボでそれらの標的に結合するか否かを測定するために、ヒト細胞において発現した抗ヒストンscFvが特徴付けられた。第3ラウンドの選択は、ベクターp513−EGFPにクローニングされ、10個の無作為に選択されたクローンをHeLa細胞にトランスフェクトされた。scFv−EGFP融合体を発現している細胞の、蛍光顕微鏡によって観察された典型的な結果を図6に示す。1つのscFvは、細胞質凝集体として発現された。4つのscFvは、scFv13R4の同程度のレベルで、細胞の均一な染色によって判断されるように、可溶性細胞質タンパク質として発現された。最後に、3つのscFvの発現は、核のより強力な染色を生じさせ(図6、クローン2)、2つのscFvは、核に排他的に局在化された(図6、クローン5及び10)。これらのscFv−EGFP融合タンパク質が細胞の細胞質に発現され、核局在化シグナルを含まなかったので、これは、ヒストンとインビボで相互することができ、したがって、細胞内で活性であることを示唆する。この分析は、コアヒストンに対する第3ラウンドの選択後に存在する約半分のクローンがインビボでそれらの核標的に結合することを示した。これは、インビトロにおいて、精製されたscFvを用いたウェスタン及びドットブロットによって確認された。さらに、これらのクローンの配列決定により、それらが、異なる重及び軽CDR3領域を含むことを示した。
細胞の細胞質における還元条件下で抗チューブリンscFvの活性を証明するために、scFvは、還元剤の存在下で抽出され、ELISAシグナルと、還元条件下で抽出されたscFvを用いて得られたものとを比較した。図7に示されるように、試験された5個のscFvは、両方の条件下で同じELISAシグナルを与え、scFVが、ジスルフィド結合形成がない場合でさえも、還元条件下で十分に活性を保持することを示す。5個のscFvは、競合ELISAにおいて、脳抽出物及び天然のタンパク質のウェスタンブロットによるフォールディングしていないチューブリンを認識することができた。細胞内で微小管と相互作用する5つのscFvの能力は、IFによって試験された。クローン2F12C及び2G4Cは、細胞内の微小管ネットワークを表した。
Claims (18)
- 少なくとも約106個の固有の(unique)scFvクローンを含む抗体ライブラリーであって、scFvクローンによってコードされる抗体が細胞内で発現される場合、少なくとも約20%のscFvクローンが、細胞内の標的抗原と検出可能に特異的に結合し得る抗体をコードする前記抗体ライブラリー。
- 少なくとも約106個の固有のscFv抗体クローンを含む抗体ライブラリーであって、少なくとも約20%のscFv抗体クローンが、大腸菌細胞1リットルあたり少なくとも約5mgのレベルで可溶性抗体を生産するために大腸菌細胞内で発現することができ、ここで、大腸菌細胞はOD600nmが約5になるまで増殖させる前記抗体ライブラリー。
- 少なくとも約106個の固有のscFv抗体クローンを含む抗体ライブラリーであって、各固有のscFv抗体クローンが、固有のCDR3VH配列及び固有のCDR3VL配列の少なくとも1つを含む固有のscFv抗体をコードし、ここで、固有のscFv抗体クローンが、scFv13R4によってコードされるフレームワーク配列と実質的に同一なフレームワーク配列をコードする前記抗体ライブラリー。
- 前記固有のscFv抗体クローンが、固有のCDR3VH配列を含むscFv抗体をコードする、請求項3に記載の抗体ライブラリー。
- 前記固有のscFv抗体クローンが、固有のCDR3VL配列を含むscFv抗体をコードする、請求項3に記載の抗体ライブラリー。
- 前記固有のscFv抗体クローンが、固有のCDR3VH配列及び固有のCDR3VL配列を含むscFv抗体をコードする、請求項3に記載の抗体ライブラリー。
- 請求項3に記載のライブラリーから単離された、還元条件下で実質的に可溶性タンパク質として発現され得るscFv抗体。
- 前記scFv抗体が、還元条件下で標的抗原に特異的に結合し得る、請求項7に記載のscFv抗体。
- 細胞内で請求項7に記載のscFv抗体を発現し、それによりscFv個体を生産することを含む、scFv抗体を生産する方法。
- 細胞からscFv抗体を精製することをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 細胞内で発現可能なscFv抗体クローンに富んだscFv抗体を調製する方法であって、
a)scFv抗体クローンの第1の回収物を用意し、ここで、第1の回収物が、VHのCDR3ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第1の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るscFv抗体に富んでいて;
b)scFv抗体クローンの第2の回収物を用意し、ここで、第2の回収物が、VLのCDR3ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第2の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るscFv抗体に富んでいて;
c)第1の回収物のscFv抗体クローン由来のVHドメインと、第2の回収物のscFv抗体クローン由来のVLドメインとを接合して、scFv抗体クローンの第3の回収物を得て、ここで、第3の回収物が、VHのCDR3ループ内の固有の配列、及びVLのCDR3ループ内の固有の配列を含むscFv抗体クローンを含む
を含み、それにより、細胞内で発現され得るscFv抗体クローンに富んだscFv抗体ライブラリーを調製する前記方法。 - 前記第1の回収物が、第1の回収物に含まれる他のscFv抗体クローンと比較して、実質的に同一のVLを含むscFv抗体クローンを含み、前記第2の回収物が、第2の回収物に含まれる他のscFv抗体クローンと比較して、実質的に同一のVH配列を含むscFv抗体クローンを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の回収物が、scFv13R4VL配列に実質的に同一であるVLを含むscFv抗体クローンを含み、前記第2の回収物が、scFv13R4VH配列に実質的に同一であるVHを含むscFv抗体クローンを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の回収物が、VHドメインと同一であるCDR1及びCDR2配列を含むscFv抗体クローンを含み、前記第2の回収物が、VLドメインと同一であるCDR1及びCDR2配列を含むscFv抗体クローンを含む、請求項11に記載の方法。
- 請求項11に記載の方法によって製造される抗体ライブラリー。
- 請求項11に記載の方法によって製造される抗体ライブラリーから選択される抗体。
- 抗体ライブラリーを構築する方法であって、
a)scFv抗体フレームワークを選択し;
b)scFv抗体フレームワークのVH CDR3領域に配列多様性を導入して、固有のVH CDR3領域を含むscFv抗体クローンを含む第1のライブラリーを生じさせ;
c)scFv抗体フレームワークのVL CDR3領域に配列多様性を導入して、固有のVL CDR3領域を含むscFv抗体クローンを含む第2のライブラリーを生じされ;
d)第1のライブラリーから、scFv抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し;
e)第2のライブラリーから、scFv抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し;
f)第1及び第2のライブラリーを再結合させて、固有のVH CDR3領域及びVL CDR3領域を含むscFv抗体ライブラリーを含む第1のライブラリーを生じさせる
ことを含み、
それにより、抗体ライブラリーを構築する前記方法。 - 前記scFvがscFv13R4である、請求項17に記載の方法。
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