JP2006523086A - 発癌性形態のｒａｓに対する細胞内発現抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞内環境内で機能する抗体に関する。特に、本発明は、発癌性形態のＲＡＳに結合することを本発明者らが示した特定の抗体に関する。このような抗体の使用についても記載する。

Description

本発明は細胞内環境内で機能する抗体に関する。特に、本発明は細胞内環境内で可溶であり、かつ抗原に特異的に結合することが可能な抗体を生成する方法に関する。

細胞内抗体、すなわち、細胞内発現抗体(intrabody)は、高等生物の細胞中での抗原認識において機能することが実証された（Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlagの総説）。この相互作用は、細胞質、核または分泌経路においてうまく阻害される細胞タンパク質の機能に影響を及ぼし得る。この効力は、植物バイオテクノロジーにおけるウイルス耐性によって実証され（Tavladoraki, P.等. (1993) Nature 366: 469〜472）、ＨＩＶウイルスタンパク質（Mhashilkar, A.M.等 (1995) EMBO J 14: 1542〜51；Duan, L. & Pomerantz, R.J. (1994) Nucleic Acids Res 22: 5433〜8；Maciejewski, J.P.等 (1995) Nat Med 1: 667〜73；Levy-Mintz, P.等 (1996) J. Virol. 70: 8821〜8832）および癌遺伝子産物（Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P. & Cattaneo, A. (1993) Biochem Biophys Res Commun 197: 422〜7；Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N. & Cattaneo, A. (1994) Biotechnology (N Y) 12: 396〜9;Cochet, O.等 (1998) Cancer Res 58: 1170〜6)に結合する細胞内抗体についていくつかの応用例が報告された。後者は、癌遺伝子の強制的な発現が腫瘍細胞における染色体転座後に起こることが多いので、重要な領域である（Rabbitts, T.H. (1994) Nature 372: 143〜149）。したがって、これらのタンパク質は、細胞内抗体と結合することによって不活性化することができる重要な細胞内治療標的である（Rabbitts, T.H. (1998) New Eng. J. Med 338: 192〜194）。最後に、全ゲノム配列を決定しようとする国際的な努力によって、何も知られていないタンパク質をコードする膨大な数の遺伝子配列候補が得られる。機能ゲノミクスは、この極めて多量のタンパク質の機能を確認する手法であり、細胞内抗体の使用は、細胞内の抗体に結合することによってタンパク質の機能を直接ノックアウトする概念的に簡単な手法としてこの試みにおける重要なツールになる見込みがある。

したがって、細胞中で機能する抗体を誘導する簡単な手法は、それらの抗体の使用が多数のタンパク質標的に対して何らかの影響を有する場合に必要になる。通常の状況においては、免疫グロブリンは、小胞体中で生合成され、抗体として分泌される。しかし、抗体が細胞質（酸化還元条件が小胞体中の酸化還元条件とは異なる）中で発現されるときには、折りたたみおよび安定性の問題が起こり、発現レベルが低く、抗体ドメインの半減期が限られる。これらの諸問題は、折りたたみタンパク質の安定性に重要であるＶＨドメインおよびＶＬドメインの鎖内ジスルフィド結合の形成を妨げる（Biocca, S., Ruberti, F., Tafani, M., Pierandrei-Amaldi, P. & Cattaneo, A. (1995) Biotechnology (N Y) 13: 1110〜5；Martineau, P., Jones, P. & Winter, G. (1998) J Mol Biol 280: 117〜127）細胞質の還元性環境に起因する可能性が最も高い（Hwang, C., Sinskey, A.J. & Lodish, H.F. (1992) Science 257: 1496〜502）。しかし、一部のｓｃＦｖは、この結合がなくても問題ないことが判明し（Proba, K., Honegger, A. & Pluckthun, A. (1997) J Mol Biol 265: 161〜72；Proba, K., Worn, A., Honegger, A. & Pluckthun, A. (1998) J Mol Biol 275: 245〜53）、これはおそらく抗体可変領域の特定の１次配列によるものと思われる。上記細胞質条件に耐える抗体についての規則または一貫した予測は、本発明までなされていない。さらに別の問題は、細胞内抗体に対する発現形式をどう設計するかであり、ＶＨセグメントとＶＬセグメント（すなわち、抗体結合部位）がＶＨのＣ末端とＶ_ＬのＮ末端においてポリペプチドリンカーによって連結されたｓｃＦｖを使用することに多大な努力が費やされた（Bird, R.E.等 (1988) Science 242: 423〜6）。これは、最も成功した細胞内発現形態であるが、完全抗体から（例えば、モノクローナル抗体から）ｓｃＦｖに変換するときに親和性が低下する欠点がある。したがって、すべてのモノクローナル抗体をｓｃＦｖにすることができるわけではなく、すべてのモノクローナル抗体が細胞中で機能を維持できるわけではない。結局、異なるｓｃＦｖフラグメントは、この細胞環境において発現されるときには、別個の可溶性や凝集性を有する。

抗体は、標的抗原の認識および診断、治療学などの医療のためのin vitroツールとして生物科学において広範に使用されている。最近、遺伝子クローニング技術によって、抗体をコードする遺伝子を操作し、細胞内で発現させることが可能になった（CattaneoおよびBiocca、1999a）。特異的な高い親和結合特性を有する細胞内抗体（ＩＣＡｂ）は、標的タンパク質またはタンパク質相互作用が標的細胞内にのみ存在するヒトの疾患の治療に適用できる可能性が高い。ＩＣＡｂの発現に適切な形態は、単鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ（Biocca等、1994;Cohen、2002;Marasco等、1993）としても知られる単鎖抗体であり、これは重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、およびそれらを融合する柔軟なリンカーペプチドからなる（Bird等、1988;Huston等、1988）。

ＩＣＡｂとして機能的ｓｃＦｖを応用することが進められ、いくつかの分野で実施されている。腫瘍特異的細胞内タンパク質を有効に産生する染色体転座または体細胞突然変異が起こる癌細胞にそれらを使用できる可能性がある（Rabbitts、1994;RabbittsおよびStocks、2002）。タンパク質産物は、細胞表面に現れるのではなく、細胞内にあるので、従来の抗体治療を使用することはできない。ｓｃＦｖ形式は、細胞内での使用に適切である。というのは、そのサイズが最適であり、ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントが単一巨大分子上に存在し、したがってこの２本の鎖を１本にするのに鎖間ジスルフィド結合を必要としないのでベクターからの発現が容易であるためである。このような抗体フラグメントのいくつかは、タンパク質をin vivoで標的にするのに有効であることが実証されたが（Biocca等、1993;RondonおよびMarasco、1997;Tavladoraki等、1993）、正確な折りたたみに問題が多く、その結果、機能が失われ、発現が低下し、半減期が短縮するので、細胞内の還元性環境において有効に働く抗体は依然としてほとんどない（CattaneoおよびBiocca、1999b）。実際、ハイブリドーマに由来するｓｃＦｖの大部分は、十分な高親和性および抗原特異性を有するにもかかわらず、in vivoで有効に機能しないことが一般に見出されている。また、ドメイン内ジスルフィド結合は、真核生物細胞の細胞質内で発現されるｓｃＦｖにおいては結合を形成しない（Biocca等、1995）が、一部のｓｃＦｖは、この結合がなくても問題のないことが判明している（Proba等、1998；WornおよびPluckthun、1998a）。現時点においては、安定な可溶性細胞内抗体に対する要件の一般的な規則または予測はない。

この問題を解決するためにいくつかの手法が採用された。これらの手法としては、ｓｃＦｖを安定化するためのジスルフィド結合の必要性を、固有の高い安定性に置き換えるランダム突然変異を利用するＶＨドメインおよびＶＬドメインの配列改変（Proba等、1998；WornおよびPluckthun、1998b）、またはin vivoで有効であることが経験的に証明されているフレームワークの使用（Tse等、2002；Visintin等、2002）などが挙げられる。

しかし、出願時においては、細胞内環境内で可溶化することを可能にし、その間1以上の抗原/リガンドと特異的に相互作用する能力を維持している細胞内抗体の特性を明らかにする必要性が当分野では依然として残っている。このような抗体は、予防および/または治療にわたる広い応用分野がある。

本発明者らは、最近、細胞内抗体捕捉（ＩＡＣ）技術（Visintin等、1999）（国際公開第00/54057号）として記述されている、酵母および哺乳動物細胞内での細胞内抗体の機能に主に依存する細胞内抗体単離選択方法を開発した。本発明者らはそのような抗体をモデルとして使用して、IAC法から誘導されるコンセンサス骨格（consensus scaffold）を評価し、PCT/GB02/003512に記載している。

本発明者らは数種の抗RASscFV分子を単離している。驚くべきことに、本発明者らはin vivoでこれらの分子の一部により示される乏しい可溶性および安定性を、特定のフレームワーク領域アミノ酸を他の特定のアミノ酸に突然変異させることによって改善することができることを見出した。さらに本発明者らは、例えば図3に示されるI21などの一部の抗体は細胞内環境内では可溶性であるがこれらの特定のリガンドについては低い親和性を示し、他方で他の抗体は高い抗原結合親和性を示すが低い細胞内可溶性を示すことを見出した。本発明者らは、このような環境内で可溶性でありかつ1以上のリガンド/抗原と特異的に相互作用する能力を与えるいくつかの細胞内抗体の構造的特性を決定することがこれらの研究からできた。

重要なことは、本発明者らがドメイン内重鎖可変ドメインジスルフィド結合の存在が、細胞内環境内で可溶性でありかつ1以上のリガンドと特異的に相互作用すべき本発明の抗体に必要ないことも見出したことである。さらに、本明細書に開示される単一ドメイン型のみを含みかつ特定の明確な特性を保持する抗体は可溶性であり、かつこのような環境内で1以上のリガンドと特異的に相互作用することができる。

したがって、第1の態様では、本発明は、細胞内での使用に適切な抗体を生成する方法であって、以下の工程：
(a)細胞内環境内で1以上の抗原と特異的に結合する能力について2以上の抗体を試験すること、およびこのような環境内で1以上の抗原と特異的に結合することが可能な抗体を選択すること、
(b)細胞内環境内で可溶性である能力について2以上の抗体を試験すること、およびこのような環境内で可溶性である抗体を選択すること；ならびに
(c)工程（b）で選択される抗体のフレームワーク領域および、工程(a)で選択される抗体由来のCDR配列から抗体を生成することを含む上記方法を提供する。

本明細書中で定義されるように、「細胞内での使用に適切な」という用語は、上述した抗体が細胞内可溶性であり、かつ抗原結合部位を含むCDRを介して特異的に1以上の抗原と相互作用することが可能であることを意味する。例えばDabのような重鎖可変ドメインのみの抗体の場合、問題とするCDRは重鎖可変ドメインCDRである。重鎖と軽鎖とからなる抗体の場合、抗原結合部位を含むCDRは可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインのCDRである。

上述の方法に従って生成される抗体は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方、あるいは単一ドメイン型のみ（単一ドメイン型抗体）を含んでいてもよい。当業者であればこのリストが網羅的であることを意図するものではないことを理解するだろう。

本明細書中で言及される「単一可変ドメイン型抗体」という用語は、本明細書中で定義されるように1以上の重鎖可変ドメインまたは1以上の軽鎖可変ドメインのいずれかを含むが、重鎖および軽鎖可変ドメインの両方は含まない抗体を意味する。本発明による単一可変ドメイン型抗体がDabであるのが有利である。本明細書中に定義されるように「Dab」は、任意に「バルキング基（bulking group）」に結合する単一可変重鎖ドメインまたは単一可変軽鎖ドメインである。本明細書で定義される「バルキング基」は1以上の抗体定常領域ドメインを含んでもよい。あるいは、「バルキング基」は非免疫グロブリン起源の成分を含んでもよい。これらは細胞毒、蛍光または他の形態の標識を含むことができる。疑問を解消するため、本明細書に定義されるDabは軽鎖または重鎖可変ドメインを単独で、すなわちバルキング基の不在下で含んでもよい。当業者であればこのリストが網羅的であることを意図するものではないことが理解されよう。

上述した方法を使用して生成される抗体がCon (配列番号1 (VH),および配列番号11 (VL)); I21 (配列番号4 (VH)および14 (VL));ならびに I21R33 (配列番号7 (VH)および17 (VL))からなる群から選択されるフレームワーク領域アミノ酸配列の1以上を含むことが有利であろう。または22位および92位のアミノ酸がシステイン残基でないこれらいずれかの重鎖可変ドメイン配列が有利である。

驚くべきことに、本発明者らは重鎖可変ドメインのドメイン内ジスルフィド架橋の形成が細胞内環境内でともに可溶性である抗体を取得するのに必要でないことを見出した。さらに、本発明者らは重鎖可変ドメインのみおよび/または軽鎖可変ドメインのみを含む抗体が、このような環境内で可溶性を示すことができることを見出した。

これらの知見を用いることにより、本発明者らは、細胞内環境内で可溶性である一方で、このような環境内で1以上の抗原と特異的に相互作用することも可能な抗体のデノボ合成方法を発明することができた。

したがって、別の態様で、本発明は細胞内での使用に適切な抗体を生成する方法であって、以下のリスト：図3にI21として記載されかつ配列番号4と示される重鎖フレームワーク領域、配列番号1と示されかつConとして記載されるコンセンサス配列の重鎖フレームワーク領域、図3にI21R33として記載されかつ配列番号７と示される重鎖フレームワーク領域、図3にI21として記載されかつ配列番号14と示される軽鎖フレームワーク領域、配列番号11と示されかつConとして記載されるコンセンサス配列の軽鎖フレームワーク領域、図3にI21R33として記載されかつ配列番号17と示される軽鎖フレームワーク領域；または（Kabatによる）22位および92位のアミノ酸残基がシステイン残基ではないこれらの重鎖フレームワーク配列のいずれかよりなる群から選択されるフレームワーク配列(またはこれらをコードする核酸)のいずれかを少なくとも用いて抗体を合成する工程を含む、上記方法を提供する。

本発明の上述の態様によれば、「抗体を合成する」という用語は、上記配列を含む抗体全体/完全な抗体の選択、ならびに/あるいは上述の配列およびそれらの後続の構築物(assembly)を含む抗体フラグメントの選択をその範囲に含む。

さらに「抗体を合成する」という用語は、上述される多様な配列またはそのフラグメントをコードする核酸を構築または合成する工程を含む上述される抗体の合成をその範囲に含む。核酸の合成はPCRに基づく手法を含んでもよい。当業者は上述の配列をコードする核酸の合成に適した他の方法に気付くであろう。

本発明のこの態様に従って生成される抗体はDabまたはscFVであるのが有利である。本発明のこの態様の別の実施形態では、この方法は細胞内での使用に適した重鎖および軽鎖の両方を含む抗体を生成するためのものである。上述の方法を用いて生成される抗体が突然変異型RASと特異的に相互作用することができるのが有利である。このような場合、この方法は図3に示される問題とするフレームワーク領域と図3に示される対応するCDR配列とを結合する工程をさらに含む。この方法がI21R33、I21R33VHI21VL、Con 33およびI21R33 (VHC22S;C92S)と示される群から選択されるこれらの配列の1以上から抗体を合成することを含むのが好ましい。

当業者であれば、本発明の上述の態様による抗体を生成し、続いて突然変異によってフレームワークおよび/または1以上のCDR配列を改変して生じる抗体のin vivoでの可溶性および/または特異的抗原結合親和性を調節することもできることは理解されるだろう。この改変が置換突然変異誘発を含むことが有利である。突然変異誘発を実施する方法として標準的な実験室技術を含み、これは当業者に周知であろう。

驚くべきことに、本発明者らは、抗体のin vivoでの可溶性を、少なくとも抗体の重鎖可変ドメインを含む可変ドメインフレームワークアミノ酸の1以上を本発明者らがこのような環境内で可溶性であると同定した抗体によって示される可変ドメインフレームワークアミノ酸に突然変異させることによって改善することができることも見出した。特に、本発明者らは、scFv33とscFvI21との間で異なるscFv33（図3に示される）の13アミノ酸残基の、これらの位置でscFvI21によって示されるアミノ酸への突然変異が、細胞内不溶性分子から細胞内可溶性分子への転換をもたらすことを見出した。

従って、別の態様で、本発明は重鎖のVHIIIサブグループに含まれる重鎖可変ドメインを含む抗体分子を、細胞内での使用に適切な抗体分子へと転換する方法であって、抗体重鎖可変ドメインの少なくとも1つを含むフレームワークアミノ酸（またはこれらをコードする核酸）の1以上を、以下の：VH1位、グルタミン；VH5位リシン；VH7位、セリン；VH74位、セリン；VH77位、トレオニン；VH84位、VHアラニン；VH22位、システイン以外のいずれかのアミノ酸；VH92位、システイン以外の他のいずれかのアミノ酸からなる群に（Kabat番号方式に従って）示されるフレームワークアミノ酸に突然変異させる工程を含む、上記方法を提供する。

本発明による抗体が本明細書に定義されるscFvまたはDabであるのが有利である。Dabが重鎖可変ドメインDabであるのが好ましい。

さらに別の態様では、本発明は軽鎖のVK1サブグループに含まれる軽鎖可変ドメインを含む抗体分子を細胞内での使用に適切な抗体分子へと転換する方法であって、抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも1つを含むフレームワークアミノ酸(またはこれらをコードする核酸)の1以上を、以下の：VL0位、トレオニン；VL4位、グルタミンからなる群に（Kabat番号方式に従って）示されるフレームワークアミノ酸に突然変異させる工程を含む、上記方法を提供する。

本発明による抗体が本明細書に定義されるscFvまたはDabであるのが有利である。Dabが重鎖可変ドメインDabであるのが好ましい。

特に、本発明者らは図3に示される配列I21、I21R33およびI21R33（VHC22S；C92S）によって記載される細胞内抗体が細胞内での使用に適切であることを見出した。

従って、更なる別の態様では、本発明は、抗体分子を細胞内での使用に適切な抗体分子へと転換する方法であって、生じるフレームワークアミノ酸配列が図3に示される以下の：配列番号1 (VH-Con), 配列番号4 (VH-I21), 配列番号7 (VH-I21R33)17、または（Kabatによる）22位および92位のアミノ酸残基がシステイン残基でないこれらの重鎖フレームワーク配列のいずれかからなる群から選択される任意の配列を含むように少なくとも抗体重鎖可変ドメインを含むフレームワークアミノ酸（またはそれをコードする核酸）の1以上を突然変異する工程を含む、上記方法を提供する。

本発明の上述の態様の好適な実施形態では、この方法は、以下の工程：(a)生じるフレームワークアミノ酸が図3に示される以下の：配列番号1（VH-Con）、配列番号4（VH-I21）、配列番号７（VH-I21R33）または（Kabatによる）22位および92位のアミノ酸残基がシステイン残基でないこれらの重鎖フレームワーク配列のいずれかからなる群から選択される任意の配列を含むように抗体重鎖可変ドメイン（またはそれをコードする核酸）を突然変異すること；および(b)生じる抗体フレームワークアミノ酸配列が図3に示される以下の：配列番号11（VL-Con）、配列番号14（VL-I21）、配列番号17（VL-I21R33）からなる群から選択される任意の配列を含むように抗体軽鎖可変ドメインをさらに突然変異することを含む。

本発明の上述の態様によれば、突然変異工程を当業者に周知の方法を用いて核酸レベルで実施することが有利である。

本発明の上述の態様に従って生成される細胞内結合性抗体は単一可変ドメイン型抗体（単一可変ドメイン抗体）であってもよく、またはこれらが2以上の可変ドメイン型を含んでもよい。

本明細書中で引用される「単一可変ドメイン型抗体」という用語は、本明細書で定義されているように、1以上の重鎖可変ドメインまたは1以上の軽鎖ドメインのいずれかを含むが、重鎖および軽鎖可変ドメインの両方は含まない抗体を意味する。本発明による単一可変ドメイン型抗体がDabであるのが有利である。本明細書に定義されているように「Dab」は、場合により「バルキング基」と結合する単一可変重鎖ドメインまたは単一可変軽鎖ドメインである。本明細書に定義されているように「バルキング基」は1以上の抗体定常領域ドメインを含んでもよい。あるいは、「バルキング基」は非免疫グロブリン起源の成分を含んでもよい。これらは細胞毒、蛍光または他の形態の標識を含むことができる。当業者であればこのリストが網羅的であることを意図するものではないことが理解されよう。本発明による「Dab」が本明細書に定義されるようなバルキング基と結合する単一重鎖可変ドメインを含むのが最も有利である。疑問を解消するため、本明細書に定義されるDabは軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインを単独で、すなわちバルキング基の不在下で含んでもよい。

本発明の方法によれば、抗体は軽鎖および重鎖可変ドメインの両方を含んでもよく、あるいは軽鎖または重鎖可変ドメインのいずれかを含むが両方は含まないものであってもよい。

さらに別の態様では、本発明は本発明の任意の方法を用いて取得される抗体分子を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、図3に示される：VHI21(配列番号4)、VHI21R33（配列番号7）、または22位および92位のアミノ酸の1以上がシステインではないいずれかの配列；VLI21（配列番号14）およびVLI21R33（配列番号17）、からなる群から選択されるフレームワーク領域配列の任意の1以上から作製されるライブラリーを提供する。

本発明者らは本発明による抗体は治療上の価値が大きいと考えている。

したがって、別の態様では、本発明は本発明による抗体の1以上と製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、1以上の疾患の予防および/または治療用の医薬製造における本発明の1以上の抗体の使用を提供する。

最後の態様では、本発明は細胞内環境内で1以上の抗原と特異的に相互作用するための医薬製造における本発明の1以上の抗体の使用を提供する。

定義
免疫グロブリン分子は、本発明によれば、標的に結合することができる任意の部分を意味する。特に、これらは、免疫グロブリンスーパーファミリー、すなわち、２個のベータシートと通常は保存的ジスルフィド結合とを含む、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折りたたみを含むポリペプチドファミリーのメンバーを含む。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系（例えば、抗体、Ｔ細胞受容体分子など）における広範な役割、細胞接着（例えば、ＩＣＡＭ分子）および細胞内シグナル伝達（例えば、ＰＤＧＦ受容体などの受容体分子)における関与を含めて、in vivoでの細胞および非細胞相互作用の多数の局面に関与している。本発明は抗体、特にｓｃＦｖまたはDabに関する。

本明細書において使用される抗体は、選択標的に結合可能な完全抗体または抗体フラグメントであり、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、Dab、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体を含めた遺伝子操作抗体、ならびにファージディスプレイまたは別の技術を用いて産生された人工的に選択された抗体を含む。Ｆｖ、ＳｃＦｖなどの小さなフラグメントは、サイズが小さく、その結果組織分布に優れているので、診断用途および治療用途に対して有利な諸特性を有する。前記抗体は、DabまたはｓｃＦｖであることが好ましい。

本明細書で定義するように、「Dab」は、「バルキング基」に場合によっては結合していてもよい単一可変重鎖ドメインまたは単一可変軽鎖ドメインである。本明細書で定義される「バルキング基」は、１個または複数の抗体定常領域ドメインを含むことができる。あるいは、「バルキング基」は、非免疫グロブリン起源の成分を含むことができる。これらは、細胞毒、蛍光または他の形態の標識を含むことができる。疑問を解消するために、本明細書で定義されるDabは軽鎖または重鎖可変ドメインを単独で、すなわちバルキング基の不在下で含んでもよい。当業者であれば、このリストが網羅的なものではないことが理解されよう。

重鎖可変ドメインとは、その分子の抗原結合部位の一部を形成する免疫グロブリン分子の重鎖の一部である。ＶＨＩＩＩサブグループは、重鎖可変領域（ＶＨＩＩＩ）の特定のサブグループである。一般に、このグループに属する可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子は、Ｋａｂａｔデータベース中のＶＨＩＩＩコンセンサス配列によって記述することができるＶＨアミノ酸配列を有する。

軽鎖可変ドメインとは、その分子の抗原結合部位の一部を形成する免疫グロブリン分子の軽鎖の一部である。免疫グロブリン分子のＶｋＩサブグループは、可変軽鎖の特定のサブグループである。一般に、このグループに属する可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子は、Ｋａｂａｔデータベース中のＶ_ＫＩコンセンサス配列によって記述することができるＶＨアミノ酸配列を有する。

免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域。免疫グロブリン分子の可変ドメインは、免疫グロブリン折りたたみの存在によって特徴付けられる特定の３次元コンホメーションを有する。可変ドメイン中のあるアミノ酸残基によって、この特徴的な免疫グロブリンドメインコア構造が維持される。これらの残基は、フレームワーク残基として知られ、極めて保存的である傾向にある。

免疫グロブリン分子重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（相補性決定領域）は、フレームワーク領域残基ではない、可変領域の超可変ループ内に含まれるアミノ酸残基である。これらの超可変ループは、免疫グロブリンとリガンドとの相互作用に直接関係する。これらのループ内の残基は、フレームワーク領域内の残基よりも保存性の程度が小さいことを示す傾向にある。

細胞内とは細胞の内部を意味し、本発明は、（核を含む）細胞内で選択的にリガンド／標的に結合する免疫グロブリンを対象とする。細胞はいかなる細胞でもよく、原核生物細胞でも真核生物細胞でもよく、細菌細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞からなる群から選択されることが好ましい。最も好ましい細胞は、酵母細胞および哺乳動物細胞である。したがって、本明細書において使用する「細胞内」免疫グロブリンおよび標的またはリガンドは、細胞内に存在する免疫グロブリンおよび標的／リガンドである。また、「細胞内」という用語は、細胞内環境に似た、または細胞内環境を模倣した環境を意味する。したがって、「細胞内」は、細胞内ではないが、in vitroである環境を意味する場合もある。例えば、本発明による方法は、商業的に得られうる、または自然の系から誘導されうるin vitroでの転写系および／または翻訳系において実施することができる。

本発明におけるＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖のコンセンサス配列とは、細胞内環境内でリガンドに選択的に結合することができる免疫グロブリン分子由来のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖のコンセンサス配列を意味する。細胞内で結合することができる免疫グロブリンの配列が比較されたときに、任意の１つの所与の位置において最も一般的である残基が、その位置のコンセンサス残基として選択される。コンセンサス配列は、各位置におけるすべての細胞内結合免疫グロブリンに対する残基を比較し、次いで、データを照合することによって得られる。この場合、１８種類の免疫グロブリンの配列が比較された。

本発明における特異的（抗体）結合とは、抗体とリガンドとの相互作用が選択的である、すなわち、いくつかの分子が抗体に対して提示された場合に、提示された分子の１種類または数種類にしか抗体が結合しないことを意味する。抗体−リガンド相互作用は高親和性であることが有利であろう。免疫グロブリンとリガンドとの相互作用は、水素結合、ファン・デル・ワールス力などの非共有結合性相互作用によって媒介されるだろう。

「細胞内での使用に適切な」という用語は、それらの（細胞内での使用に適した）抗体が細胞内で可溶性であり、かつ抗原結合部位を含むCDRを介して1以上の抗原と特異的に相互作用することが可能であることを意味する。重鎖可変ドメインのみの抗体、例えばDabの場合、問題とするCDRは重鎖可変ドメインCDRである。重鎖と軽鎖からなる抗体の場合、抗原結合部位を含むCDRは可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインのCDRである。

「細胞内で機能する抗体」という用語は、可変ドメインのＣＤＲがそれらの１個または複数の抗原と細胞内環境内で特異的に相互作用することができるように、抗体が十分な細胞内可溶性を有することを意味する。したがって、本明細書で定義される「細胞内で機能する抗体」は「細胞内での使用に適切な」という用語と同義である。

本発明におけるレパートリーとは、結合特異性の多重度を付与するために、１種類または複数のテンプレート分子の無作為、半無作為または統制された核酸レベルでの変化によって生成される１組の分子を指す。この場合、テンプレート分子は、本明細書に記載する１個もしくは複数のＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列である。レパートリーを生成する方法は、当分野ではよく知られている。

本発明による「ライブラリー」という用語は、ポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは構成メンバーからなる。ライブラリー構成メンバー間での配列の相違は、ライブラリー中に存在する多様性をもたらす。ライブラリーはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態を採ってもよく、または核酸のライブラリーによって形質転換した生物または細胞、例えば細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞などの形態であってもよい。典型的に、個々の生物または細胞のそれぞれはライブラリーの構成メンバーを1つだけ含んでいる。特定の用途では、個々の生物および細胞のそれぞれはライブラリーの2以上の構成メンバーを含むこともできる。核酸が発現ベクター中に組み込まれることで、該核酸にコードされるポリペプチドの発現が可能になるのが有利である。したがって好適な態様では、ライブラリーは宿主生物の集団の形態を採り、各生物が核酸形態におけるライブラリーの単一の構成メンバーを含有する発現ベクターの1以上のコピーを含み、該核酸が発現してこれに対応するポリペプチド構成メンバーを産生することもできる。このライブラリーが免疫グロブリン分子のレパートリーをコードするのが好ましい。「レパートリー」とは、結合特異性の多重度を付与するために、1以上のテンプレート分子の無作為、半無作為または統制された核酸レベルでの変化によって生じる1組の分子を指す。この場合、テンプレート分子は本明細書に記載される1以上のV_Hおよび/またはV_Lアミノ酸配列である。レパートリーを生成する方法は当業界でよく知られている。

図面の詳細な説明
図１．抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの細胞内抗体捕捉
３種類の異なるファージライブラリー（de Wildt等、2000;Sheets等、1998）（全多様度７．０×１０^９）から得られる２．７×１０^１３個のクローンを、精製ＨａＲＡＳＧ１２Ｖ抗原を用いてin vitroでスクリーニングした。１．１８×１０^６個のファージを回収し、ファージミドＤＮＡを調製し、ｓｃＦｖフラグメントを酵母ベクターｐＶＰ１６にクローニングし、４．１３×１０^６個のクローンのサブライブラリーを作製した。８．４５×１０^７個の酵母クローンを、ＬｅｘＡ−ＲＡＳＧ１２Ｖベイト(bait)を発現する酵母Ｌ４０系統中でスクリーニングした。４２８個のコロニーは、ヒスチジン選択プレート上で増殖し、β−ｇａｌフィルターアッセイから判断してｌａｃＺ遺伝子を強力に活性化した。すべてのプレイ(prey)プラスミドを、ヒスチジン非依存性およびβ−ｇａｌ陽性酵母コロニーから単離し、制限酵素、ＢｓｔＮ１、Ｍｓｐ１、Ｍｂｏ１、ＲｓａＩまたはＨｉｎｆ１で消化して、異なるｓｃＦｖクローンを特定することによってフィンガープリントをとった。続いて、ＤＮＡフィンガープリントパターンが異なる５７個のｓｃＦｖクローンを、ＬｅｘＡ−ＲＡＳＧ１２Ｖベイトおよび（異なるライブラリーに由来し単離された）３種類のｓｃＦｖを用いて酵母中で再試験した。これらの３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖのうち、哺乳動物のレポーターアッセイにおいて検出可能な程度に結合したわずか２個のＲＡＳタンパク質。

図２．哺乳動物細胞における抗ＲＡＳ ｓｃＦｖとＲＡＳタンパク質との相互作用
Ａ．ルシフェラーゼアッセイ；ＣＯＳ７細胞に、様々なｓｃＦｖ−ＶＰ１６活性化ドメイン融合体およびＧＡＬ４−ＤＢＤベイトプラスミドｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ（塗りつぶしボックス）またはｐＭ１−ｌａｃＺ（白抜きボックス）を、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧ５−Ｌｕｃおよび内部ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼコントロールプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶとともに一過的に同時トランスフェクトした。抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３、Ｊ４８およびＩ２１または抗−ｇａｌ ｓｃＦｖＲ４を発現するｓｃＦｖ−ＶＰ１６プレイベクターを使用した（Martineau等、1998）。ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および照度計を用いてトランスフェクションから４８時間後に測定した。各アッセイのルシフェラーゼ活性を、（トランスフェクション効率用内部標準として用いた）ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して規格化した。ルシフェラーゼ誘導レベル倍率を、ベースラインとしてとられた非関連ベイトを用いた各ｓｃＦｖ−ＶＰ１６の活性とともに示す。

Ｂ．Ｉｎ ｓｉｔｕ免疫蛍光試験；ＣＯＳ７細胞に、ｐＥＦ−ｍｙｃ−ｎｕｃ−ｓｃＦｖ Ｊ４８（抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ）またはｓｃＦｖＲ４（抗β−ｇａｌ ｓｃＦｖ）およびＲＡＳ抗原を発現するｐＨＭ６−ＲＡＳベクターを一過的に同時トランスフェクトした。４８時間後に、細胞を固定し、（ｍｙｃタグ付けｓｃＦｖを検出する）９Ｅ１０モノクローナル抗体およびウサギ抗ＨＡタグポリクローナル血清、続いて、それぞれ二次フルオレセイン複合抗マウスおよびＣｙ３複合抗ウサギ抗体で染色した。染色パターンを、ＢｉｏＲａｄｉａｎｃｅ共焦点顕微鏡を用いて検査した。ＲＡＳとともに同時発現されたｓｃＦｖ Ｊ４８について、抗原およびＩＣＡｂ蛍光のコロケーションが見られた。

緑色（フルオレセイン）＝ｓｃＦｖの蛍光；赤色（Ｃｙ３）＝抗原の蛍光

図３．抗ＲＡＳ細胞内ｓｃＦｖの配列
ヌクレオチド配列を得て、（単一文字コードとして示される）誘導タンパク質翻訳をアライメントさせた。フレームワーク（ＦＲ）中のダッシュは、（ＩＡＣ法（Tse等、2002）によって単離された抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ ｓｃＦｖから誘導される）コンセンサス（ＣＯＮ）配列を用いたアイデンティティである。数字は、Ｌｅｆｒａｎｃ等（LefrancおよびLefranc、2001）（第１カラムの数字、ＩＭＧＴとして表示）およびＫａｂａｔ等（Kabat等、1991）（第２カラム、Ｋａｂａｔ）の系による残基の参照位置を示す。可変ドメインの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）との間のリンカーの１５個の残基（ＧＧＧＧＳ）_３は示されていない。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、灰色の背景で強調表示されており、フレームワーク領域（ＦＲ）から区別されている。３種類の抗ＲＡＳ細胞内ｓｃＦｖは、３３、Ｊ４８およびＩ２１として設計されている。すべての抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔデータベース（Kabat等、1991）から得られる、中ほどに示す重鎖のＶＨ３サブグループおよび軽鎖のＶ １サブグループ（設計ＶＨ３またはＶ Ｉ）、またはＬｅｆｒａｎｃデータベース（LefrancおよびLefranc、2001）から得られるＩＧＶＨ３およびＩＧＶＫ１に属する。突然変異抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、Ｉ２１Ｋ３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、ｃｏｎ３３およびＩ２１Ｒ３３ＶＨ（Ｃ２２ＳＣ９２Ｓ）として設計されて示されている。Ｉ２１Ｋ３３は、Ｉ２１フレームワーク中のｓｃＦｖ３３の６つのＣＤＲを含み、Ｉ２１Ｒ３３は突然変異Ｌｙｓ９４Ａｒｇ以外は同一であり、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ２１ＶＬは、Ｉ２１のＶＬドメインに融合するＩ２１Ｒ３３のＶＨドメインを含み、ｃｏｎ３３は、正準のコンセンサスフレームワーク（Tse等、2002）中にｓｃＦｖ３３の全６個のＣＤＲを有し、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ（Ｃ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）は、ＶＨドメインの突然変異ＣＹＳ２２ＳＥＲおよびＣＹＳ９２ＳＥＲを有するクローンＩ２１Ｒ３３の突然変異体である。コンセンサス領域とＩ２１Ｒフレームワーク領域との間では、わずかに４個のアミノ酸（Ｈ１、Ｈ５、Ｌ０およびＬ３の位置）が異なる。

図４．抗ＲＡＳ ｓｃＦｖのペリプラズムでの発現および精製
Ｎ末端にｐｅｌＢリーダー配列を有し、Ｃ末端にＨｉｓ６タグおよびｍｙｃタグを有するｓｃＦｖは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを含む２ Ｘ ＴＹ培地１リットル中で、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３０℃で２時間、大腸菌ＨＢ２１５１中のｐＨＥＮ２−ｓｃＦｖベクターからペリプラズムで発現された。誘導後、細胞を回収し、氷冷１ Ｘ ＴＥＳ緩衝剤（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース）４ｍｌで抽出し、さらに１：５ ＴＥＳ緩衝剤６ｍｌを添加した。細胞抽出物の上清を可溶性ペリプラズム画分として使用した。ｈｉｓタグ付けｓｃＦｖを、固定化Ｎｉ^２＋イオンクロマトグラフィーによって精製し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、タンパク質をクーマシーブルーによって染色した。精製抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３およびＪ４８のおおよその収量は、培養物１リットル当たり１００μｇ未満であり、ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ−３３ＶＨＩ２１ＬおよびＩ２１は３ｍｇ／リットルを超え、ｃｏｎ３３は１ｍｇ／リットルであった。

Ｅ＝完全ペリプラズム抽出物およびＰ＝精製ｓｃＦｖ；Ｍ＝Ｍｗマーカー

図５．抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの特異的抗原結合および競合ＥＬＩＳＡ
精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ（４μｇ／ｍｌ、約２００ｎＭ；塗りつぶしボックス）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、３０ｍｇ／ｍｌ、約４５０μＭ；灰色ボックス）をＥＬＩＳＡプレートに室温で１．５時間塗布した。両セットのウェルに、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液をブロッキング用に添加し、続いて精製ｓｃＦｖ（４５０ｎｇ／ウェル）を添加し、終夜４℃でインキュベートした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄後に、結合したｓｃＦｖをＨＲＰ複合抗ポリヒスチジン抗体（ＨＩＳ−１、Ｓｉｇｍａ）を用いて検出し、シグナルをＥｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて定量した。（図中で＋として示す）競合アッセイの場合には、ｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡウェルに添加する前に、ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ（８μｇ／ｍｌ；約４００ｎＭ）を用いて室温で３０分間プレインキュベートした。

図６．ＢＩＡｃｏｒｅを用いた抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００を用いてバイオセンサー測定を実施した。細菌培養物から得られた精製ｓｃＦｖを使用した。

Ａ．抗ＲＡＳ ｓｃＦｖとＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ抗原（固定化１５００ ＲＵ）との結合を示すセンソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）。４０μｌの注射量および２０μｌ／分の流量を使用した。精製ｓｃＦｖ（１０〜２０００ｎＭ）を、固定化ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐを含む、または抗原を含まない、チップの２つのチャネルに添加した。各測定のセンソグラムを、抗原を含まないチャネルの共鳴によって正規化した。

Ｂ．表に、会合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）の値、ならびにＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウエアによる平衡解離定数（Ｋｄ）の計算値を要約する。

図７．ＣＯＳ７細胞における発現ｓｃＦｖの可溶性に対するフレームワーク残基の影響
ＣＯＳ７細胞に、示したｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ｓｃＦｖ発現クローンを一過的にトランスフェクトした。材料および方法に記載したように、可溶性タンパク質および不溶性タンパク質を抽出し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画した。電気泳動後に、タンパク質をメンブレンに移し、抗ｍｙｃタグモノクローナル抗体９Ｅ１０とともにインキュベートした。泳動分子量マーカー（ｋＤａ単位）を左側に示す。右側の矢印は、ｓｃＦｖフラグメントのバンドである。

図８．フレームワーク配列の突然変異による抗ＲＡＳ ＩＣＡｂとＲＡＳ抗原との細胞内相互作用の改善
哺乳動物のツーハイブリッド抗体−抗原相互作用アッセイをＣＯＳ７細胞中で実施した。

Ａ．ＣＯＳ７にｐＥＦＢＯＳＶＰ１６−ｓｃＦｖベクターおよびｐＭ１−ＲＡＳＧ１２Ｖ、ならびにルシフェラーゼレポータークローンをトランスフェクトし、ルシフェラーゼレベルを方法に記載したように求めた。上図は、ｓｃＦｖ−ＶＰ１６結合ＲＡＳ抗原ベイトのルシフェラーゼシグナルの正規化誘導倍率である（ゼロは、ｓｃＦｖを含まないプレイプラスミドから得られたシグナルである）。下図は、ｓｃＦｖ−ＶＰ１６融合タンパク質の発現後のＣＯＳ７細胞抽出物のウェスタンブロットである。ＳｃＦｖ−ＶＰ１６融合タンパク質を、抗ＶＰ１６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４−５）モノクローナル抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。

対照として用いたＩＣＡｂ ｓｃＦｖは、抗−ｇａｌ Ｒ４（Martineau等、1998）であった。ｓｃＦｖ３３突然変異体は、（Ｋａｂａｔ等（Kabat等、1991）を用い、括弧内の数字はＬｅｆｒａｎｃ等による番号付けである（LefrancおよびLefranc、2001)）（図３参照）。

ＶＨ（Ａ７４Ｓ＋Ｓ７７Ｔ）：ＶＨのＡｌａ７４（８３）ＳｅｒおよびＳｅｒ７７（８６）Ｔｈｒ置換
ＶＨ（Ｄ８４Ａ）：ＶＨのＡｓｐ８４（９６）Ａｌａ置換
ＶＨ（Ｒ９４Ｋ）：ＶＨのＡｒｇ９４（１０６）Ｌｙｓ置換
ＶＬ（０Ｔ＋Ｖ３Ｑ）：リンカーとＶＬドメインの間のＴｈｒ付加＋ＶＬのＶａｌ３（３）Ｇｌｎ置換
ＶＬ（Ｆ１０Ｓ）：ＶＬのＰｈｅ１０（１０）Ｓｅｒ置換
ＶＬ（Ｉ８４Ｔ）：ＶＬのＩｌｅ８４（１００）Ｔｈｒ置換
ＶＨ（Ｑ１Ｅ＋Ｖ５Ｌ＋Ａ７Ｓ＋Ｓ２８Ｔ）＋ＶＬ（Ｇ１００Ｑ＋Ｖ１０４Ｌ）：ＶＨのＧｌｎ１（１）Ｇｌｕ、Ｖａｌ５（５）Ｌｅｕ、Ａｌａ７（７）Ｓｅｒ、Ｓｅｒ２８（２９）Ｔｈｒ置換＋ＶＬのＧｌｙ１００ＧｌｎおよびＶａｌ１０４Ｌｅｕ

Ｂ．コンセンサス配列骨格に変換するフレームワーク突然変異を含むｓｃＦｖを用いたＣＯＳ７細胞ツーハイブリッド抗体−抗原相互作用アッセイ。示した様々なｓｃＦｖ−ＶＰ１６プレイ構築体を、ＣＯＳ７細胞中のＧＡＬ４−ＲＡＳＧ１２Ｖベイトプラスミドで一過的にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの４８時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性レベル倍率を、ｓｃＦｖなし（ｓｃＦｖを含まないプレイプラスミド）の活性をベースラインとしてヒストグラムで示す。ＣＯＳ７細胞の可溶性画分におけるｓｃＦｖ−ＶＰ１６の発現レベルを下図に示す。抗ＶＰ１６（１４−５）抗体およびＨＲＰ複合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロットによってバンドを可視化した。

図９．抗ＲＡＳ ｓｃＦｖによるＲＡＳ依存性ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換活性の阻害
突然変異ＨＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）にサブクローン化し、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖを、ｓｃＦｖのＣ末端に原形質膜ターゲティングシグナルおよびｓｃＦｖのＮ末端にＦＬＡＧタグを有するｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂベクターにサブクローン化した。ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＲＡＳＧ１２Ｖ １００ｎｇおよびｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖ ２μｇをＮＩＨ３Ｔ３細胞クローンＤ４に同時トランスフェクトした。２日後に、細胞を１０ｃｍプレートに移し、５％ドナー子ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地中で１４日間増殖させた。最後に、プレートをクリスタルバイオレットで染色し、形質転換細胞の増殖巣を数えた。

（Ａ）染色プレートの代表的な写真。左上図の空ベクターは、陰性対照として、ＲＡＳＧ１２Ｖを含まないｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）とｓｃＦｖを含まないｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂの同時トランスフェクションを示す。増殖巣形成は認められなかった。右上図に、陽性対照として、ＲＡＳＧ１２Ｖ ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂを含み、ｓｃＦｖを含まないｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）を示す。それ以外のプレートにおいては、ＲＡＳＧ１２Ｖ ベクターを、ｐＥＦ−ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖＩ２１またはｐＥＦ−ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３とともに同時トランスフェクトした。

（Ｂ）形質転換増殖巣の相対百分率を、１００に設定された、ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）／ＨＲＡＳＧ１２ＶおよびｐＥＦ−ｍｅｍｂ空ベクターによって誘発される増殖巣形成に対して規格化されたいくつかの増殖巣として求めた。示した結果は、各トランスフェクションを２重で実施した１つの実験のものである。２回の追加実験では、類似の結果が得られた。

一般技術
特に規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。標準技術は、分子、遺伝子および生化学方法（一般には、参照により本明細書に援用するSambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.およびAusubel等.、Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed、John Wiley & Sons, Incを参照されたい）および化学方法に使用される。また、標準免疫学的技術については、Harlow & Lane.、A Laboratory Manual Cold Spring Harbor、N.Yを参照されたい。

抗体のデノボ合成
本発明者らは、可変重鎖フレームワーク残基および可変軽鎖フレームワーク残基を含む抗体のin vivoでの可溶性を決定する可変重鎖フレームワーク残基および可変軽鎖フレームワーク残基を特定した。

したがって、本発明は細胞内での使用に適切な抗体の生成方法であって、
(a)細胞内環境内で1以上の抗原と特異的に結合する能力について2以上の抗体を試験すること、およびこのような環境内で1以上の抗原と特異的に結合することが可能な抗体を選択すること、
(b)細胞内環境内で可溶性である能力について2以上の抗体を試験すること、およびこのような環境内で可溶性である抗体を選択すること；ならびに
(c)工程（b）で選択される抗体のフレームワーク領域および、工程(a)で選択される抗体由来のCDR配列から抗体を生成すること、を含む上記方法を提供する。

本発明者らは、図3においてＩ２１として示され、配列番号４および１４で示されたフレームワーク領域と、図3において配列番号１および１１ならびに図３において配列番号７および１７で示されたコンセンサスのフレームワーク領域とが、それらを含む抗体に、細胞内環境内で機能するのに必要な可溶性を付与することを示している。

また、Ｋａｂａｔによる２２位および９２位の１個または複数においてシステイン残基を含まない上記配列（ＶＨの場合）を使用して、それらを含む抗体に、細胞内環境内で機能するのに必要な可溶性を付与することもできる。特に、その一方または両方の位置におけるシステインがセリンによって置換されたアミノ酸配列を使用して、それらを含む抗体に、細胞内環境内で機能するのに必要なコンホメーションの安定性および可溶性を付与することもできる。

また、実験によって、ｓｃＦｖ分子Ｊ４８および３３上に存在し、図3において配列番号２および１２（Ｊ４８）ならびに配列番号３および１３（３３）で示されたＣＤＲが、それぞれ、細胞内で安定なそれらを含む抗体に、突然変異体ＲＡＳに特異的に結合する能力を付与することが判明した。

したがって、上記フレームワーク配列と上記ＣＤＲ配列の任意の組み合わせは、組み合わせたときに、細胞内環境内で突然変異体ＲＡＳに特異的に結合することができる新規Ｄａｂまたは軽鎖および重鎖抗体を産生するのに使用することができる。

したがって、タンパク質抗原を用いた予備的なin vitroでのファージ抗体スクリーニングに頼らずに、コンセンサスＩＣＡｂ骨格に基づき、酵母細胞アッセイにおいて直接一次スクリーニングが可能な十分な多様性を有するＩＣＡｂライブラリーを構築することができると当然予想される。これによって、例えば、in vitroで発現してタンパク質を与えるのに抗原が不要であり、ＩＡＣ選択のための酵母ベイト発現に対する要件は、単にＤＮＡ配列だけであるという極めて明確な技術的利点が提供される。これによって、任意の生物のゲノム配列分析、例えば、ヒトゲノム配列決定プログラムから予測される任意のタンパク質に結合するＩＣＡｂを選択するために、ＩＡＣ技術を用いる可能性が開かれる。

極めて重要な問題は、有効な細胞内抗体を含むのに必要なライブラリー多様度であり、したがって酵母において十分な抗体多様性を得ることができ、スクリーニングすることができるかどうかである。現行のＩＡＣを成功させるには、極めて多様なライブラリーのin vitroでのファージＡｂスクリーニングから始める必要がある。しかし、そのようなファージ抗体は、（還元性環境における可溶性および折りたたみ問題のために）改変なしでは必ずしも細胞内抗体として働かず、これは、細胞内抗体ライブラリーとしてのこれらのファージｓｃＦｖライブラリーの有効な多様性が、予想されるよりも少ない可能性があることを意味している。固定されたコンセンサスフレームワーク上の無作為化ＣＤＲを用いた特別設計のヒト細胞内抗体ライブラリーの構築は、有効なＩＣＡｂ多様性を増加させるはずである。これによって、十分に有効な多様性を維持し、細胞内抗体のスクリーニングを加速させつつ、予備的なファージパンニングステップを必要とせずに、ライブラリーをＩＣＡｂについてスクリーニングすることが可能になる。

抗体を単離するＩＡＣ方法
ＩＡＣ手法は、他のスクリーニング方法と比較していくつかの利点を有する。ＩＡＣ手法は、ｓｃＦｖの細胞質の直接選択として働く酵母ツーハイブリッドin vivoアッセイに基づいている。また、ＩＡＣ手法は、理論的に、天然型の抗原のターゲティングが可能であるので、転写後修飾タンパク質または特にタンパク質複合体を含めて、細胞質で発現される任意の抗原に対して抗体フラグメント（本明細書の実験ではｓｃＦｖ）を選択することができる。さらに、スクリーニングプロセスには、哺乳動物細胞における細胞内ｓｃＦｖ候補の検証が必要であると考えられる。これらの異なるベイト系およびレポーター系を使用することによって、偽陽性ｓｃＦｖが排除される。また、哺乳動物の抗原−抗体相互作用アッセイは、酵母中での３０℃、またはin vitroファージスクリーニングの室温（または４℃）に対して、３７℃で実施される。酵母から哺乳動物細胞へのこのステップによって、より耐熱性の高い細胞内ｓｃＦｖを選択することができる。単離には哺乳動物アッセイが含まれるので、標的抗原と内因性２量体分子との競合結合に適切なより高い親和性相互作用を選択することができる。

この研究においては、本発明者らは、発癌性タンパク質ＲＡＳに対してＩＡＣ技術を適用し、細胞質中のこの抗原に結合する特異的抗ＲＡＳ ｓｃＦｖを単離した。配列分析によって、すべての抗ＲＡＳ ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔデータベース（Kabat等、1991）によって定義されるＶＨ３およびＶκ１サブグループ、またはＩＭＧＴデータベース（LefrancおよびLefranc、2001）によって定義されるＩＧＨＶ３およびＩＧＫ１サブグループに属することが示された。抗原ＢＣＲまたはＡＢＬ（Tse等、2002）およびＴＡＵ（Visintin等、2002）に結合する大部分の選択されたＩＣＡｂ ｓｃＦｖも同じサブグループに属し、ＶＨおよびＶＬフレームワークのこれらのサブグループが細胞内で機能することができるということを支持している。この観察によって、コンセンサスフレームワーク骨格を定義することができた（Tse等、2002）。

治療ツールまたは生物科学研究ツールとしての細胞内抗体の最も重要な要件は、これらの抗体（または抗体フラグメント）が高い安定性、良好な発現レベルを示し、哺乳動物細胞のあらゆる区画内で機能することである。これらは、厳しい制約であり、ハイブリドーマに由来するｓｃＦｖフラグメントのほとんどは、in vitroでの親和性が良好であっても、改変なしでは還元性環境下で安定ではない。本明細書および既報（Tse等、2002；Visintin等、2002）に記載された細胞内抗体捕捉（ＩＡＣ）技術は、機能的ｓｃＦｖを直接単離するためのin vivoでの遺伝学的スクリーニングに基づくこれらの難点を克服するものである。

Dabライブラリーのスクリーニング
IAC法は単一の可変ドメインのみの抗体（Dab）の選択に等しく適用することができる。適切な方法の簡単な説明を下記に提供する。

合成DabライブラリーのスクリーニングはREF（Laboratory of Molecular Biology ウェブサイトhttp://mrc-lmb.cam.ac.uk内のリンクも参照のこと）に記載されるように細胞内抗体捕捉（IAC）技術のプロトコル（ファージのパンニング工程を除く）に従って行うこともできる。概説すると、500μgのpBTM抗原および１mgのpVP16-Dabライブラリー１もしくはpVP16-Dabライブラリー２をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に同時トランスフェクトする。陽性クローンを栄養要求性マーカー、Trp、LeuおよびHisを用いることによって選択する。陽性コロニーをHisプロトトロピー(prototropy)について選択し、フィルターアッセイによるβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）活性によって確認する。選択した個々のクローンについて、偽陽性クローンを排除し、真陽性クローンを関連するベイトベクターおよび無関係のベイトベクターを用いて、His非依存性増殖およびβ−gal活性化を再試験することによって確認する。

IACを用いて選択した一部の細胞内抗体が高細胞内可溶性を示し、その他が低細胞内可溶性を示す
例えば、抗RAS scFVについてのIACスクリーニングを用いる場合、あるscFV(I21)は細菌ペリプラズムで高収量を、哺乳動物細胞では高可溶性であるが相互作用の乏しい親和性を示すが、他のscFV（scFV33およびJ48）は高親和性を有するが比較的低度の可溶性発現タンパク質の収量を有する。しかし、I21 scFVフレームワーク配列は、VHおよびVL領域の両方で、図３に示されるコンセンサスフレームワーク（Tseら, 2002）に近似して適合している。したがってこれらの結果は、図３中の配列番号１と１１に合致するコンセンサスフレームワークおよび図３に示される配列番号４と14として識別するI21フレームワーク配列、ならびに配列番号７および１７と命名された図３中のI21R33として識別するコンセンサスフレームワークにより、あつらえの細胞内抗体を形成するための理想的なフレームワーク配列が作製されることを示している。

抗体分子の細胞内可溶性を測定する方法
本発明による抗体の細胞内可溶性を測定する方法は当業者によく知られているだろう。適切な方法として、例えばウエスタンブロット分析を用いた細胞内タンパク質発現レベルの分析がある。適切なプロトコルを下記に概説する。当業者は他の適切な方法を知っているであろう。

哺乳動物細胞中でのscFVの発現レベルおよび可溶性を評価するため、scFVまたはscFV-VP16融合タンパク質をCOS7細胞中で発現させた。scFv発現のため、scFvDNA断片をpEF-myc-cyto発現ベクター（Invitrogen）のNcoI/Notl部位にクローニングした。トランスフェクションの前日にウェル当たり約2x10⁵個のCOS7細胞を6ウェルの培養プレート（Nunc）に播いた。1μgのpEF-myc-cyto-scFvまたはpEF-BOS-scFv-VP16を8μgのLipofectAMINEを用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞をPBSで1回洗浄し、氷冷抽出緩衝剤（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））に３０分間溶解し、4℃、13，000rpmで10分間遠心分離した。ペレット（「不溶性」分画）および上清（「可溶性」分画）をSDS-PAGEで分析し、続いて抗myc（9E10）モノクローナル抗体（scFvの検出用）または抗VP16（14−5、Santa-Cruz）モノクローナル抗体（scFv-VP16AD融合体用）を一次抗体として、そしてＨＲＰ複合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＰＢ）を二次抗体として用いたウエスタンブロットによって分析した。ブロットを高感度化学発光（ECL）検出キット（ABP）によって可視化した。

本発明の方法によって取得した抗体
配列分析によって、すべての抗ＲＡＳ ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔデータベース（Kabat等、1991）によって定義されるＶＨ３およびＶκ１サブグループ、またはＩＭＧＴデータベース（LefrancおよびLefranc、2001）によって定義されるＩＧＨＶ３およびＩＧＫ１サブグループに属することが示される。抗原ＢＣＲまたはＡＢＬ（Tse等、2002）およびＴＡＵ（Visintin等、2002）に結合する大部分の選択されたＩＣＡｂ ｓｃＦｖも同じサブグループに属し、ＶＨおよびＶκフレームワークのこれらのサブグループが細胞内で機能することができるということを支持している。この観察によって、コンセンサスフレームワーク骨格を定義することができた（Tse等、2002）。この抗ＲＡＳ ｓｃＦｖのスクリーニングにおいては、１種類のｓｃＦｖ（Ｉ２１）は、細菌ペリプラズムにおいて高い収率、哺乳動物細胞中での高い可溶性を示すが、哺乳動物細胞における相互作用の親和性に乏しく、他のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ３３およびＪ４８）は高親和性であるが、可溶性発現タンパク質の収率が比較的低い。しかし、Ｉ２１ ｓｃＦｖ フレームワーク配列は、ＶＨ領域とＶＬ領域の両方においてコンセンサスフレームワーク（Tse等、2002）と厳密に一致し、このコンセンサスの有用性を支持するものとして、本発明者らは、コンセンサスフレームワーク（ｃｏｎ３３）またはＩ２１フレームワーク（Ｉ２１Ｒ３３）へのｓｃＦｖ３３の突然変異によって、可溶性および結合性を含めて、この機能が改善されることを見出した。最後に、ｓｃＦｖ３３がＩ２１Ｒコンセンサスフレームワークに突然変異し、ｓｃＦｖ３３ ＣＤＲ配列を保持するときには、ＩＣＡｂは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の発癌性ＲＡＳＧ１２Ｖ形質転換を阻害する決定的な生物学的機能を果たすことができた。これは、おそらく、ＩＣＡｂとＲＡＳ標的抗原との相互作用のためである（図２参照）。これは、哺乳動物細胞用の有効なＩＣＡｂを産生する本発明者らの手法の汎用性を示している。

重鎖および軽鎖の両方を含む細胞内可溶性抗体のドメイン内ジスルフィド架橋形成のための要件
本発明者らは、抗体が細胞内可溶性であるためにドメイン内ジスルフィド形成は必要ないことを見出した。すなわち、Kabat命名法による22位および92位に通常存在する少なくとも1個のシステイン残基がもはや存在しないか、または別の残基、例えばセリンに突然変異した軽鎖および重鎖の両方を含む抗体分子は、細胞内環境内で突然変異RASに特異的に結合することができる。

本発明による抗体が軽鎖および重鎖を含み、抗体のフレームワーク領域が配列番号10および配列番号20に代表されるものであるか、または抗体のフレームワーク領域が（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基22と92の1以上がシステイン残基でないことを除いて配列番号10と配列番号20に代表されるものと同一であるのが有利である。

(a)本発明による単一ドメイン型抗体
本発明者らは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかを含むがその両方は含まない抗体（本明細書で単一のドメイン型のみの抗体と称する）が、細胞内環境内で可溶性であるが、このような環境内で依然として1以上のリガンドと特異的に相互作用することができることを見出した。

したがって、重鎖可変ドメインを含むが、軽鎖可変ドメインを含まない抗体であって、該重鎖可変ドメインのフレームワーク領域配列が図3に示されかつI21（配列番号４）およびI21R33（配列番号７）と命名された群から選択される上記抗体は、このような環境内で可溶性である。

本発明の上述の態様に従って、単一の可変ドメインのみの抗体は、単一の重鎖可変ドメイン（重可変ドメインDab）を含むものであるのが好ましい。

さらに、本発明者らは、軽鎖可変ドメインを含むが、重鎖可変ドメインを含まない抗体であって、該軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域配列が図3に示されかつI21（配列番号14）およびI21R33（配列番号17）と命名された群から選択される上記抗体が、このような環境内で可溶性であり、かつこのような環境内でこれらの1以上のリガンドと特異的に相互作用することができることを見出した。

単一ドメイン抗体はいかなる適切な技術によって調製してもよい。単一ドメイン抗体の調製は、Wardら, (1989) Nature 341: 544-546および欧州特許出願0 368 684 (Medical Research Council)に詳細に記載されている。

本発明による重鎖可変ドメインのみを含む抗体のドメイン内ジスルフィド架橋形成のための要件
本発明者らは、ドメインにおいてＫａｂａｔ命名法による２２位および９２位に通常存在するシステイン残基の少なくとも１個がもはや存在せず、または別の残基、例えば、セリンに突然変異した、１個または複数の重鎖可変ドメインのみを含む本発明による抗体分子が、細胞内環境内で突然変異体ＲＡＳに特異的に結合することができることを見出した。

本発明の上記態様によれば、単一可変ドメイン抗体は、単一重鎖可変ドメインを含むもの（単一重鎖ドメイン抗体）であることが好ましい。

本発明による抗体の細胞への送達
本発明による抗体を細胞内環境に導入するためには、抗体をコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることが有利である。

抗体をコードする核酸をベクターに組み込んで発現させることができる。本明細書において使用する、ベクター（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡを細胞に導入してそれを発現させるのに使用される独立した要素である。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者には周知である。多数のベクターが利用可能であり、適切なベクターは、ベクターの使用目的、ベクターに挿入する核酸のサイズ、およびそのベクターで形質転換させる宿主細胞に応じて選択される。各ベクターは、その機能、およびそれが適合する宿主細胞に応じて様々な成分を含む。このベクター成分としては、一般に、以下、すなわち、複製開始点、１個または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列の１個または複数が挙げられるが、これらだけに限定されない。

また、本発明による抗体をコードする核酸は、一般操作および核酸増幅目的でクローニングベクターに組み込むことができる。

発現ベクターもクローニングベクターも、一般に、選択された１個または複数の宿主細胞中でベクターを複製することができる核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは無関係にベクターを複製することができるものであり、複製開始点または自己複製配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母およびウィルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点はほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、２ｍプラスミド開始点は酵母に適切であり、様々なウィルス開始点（例えば、ＳＶ ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点成分は、これらがＣＯＳ細胞など高レベルのＤＮＡ複製に適格な哺乳動物細胞において使用されない限り、哺乳動物の発現ベクターには不要である。

ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターであり、すなわち、少なくとも１個の生物クラスにおいて複製可能であるが、別の生物クラスにトランスフェクトしても発現させることができる。例えば、あるベクターは大腸菌中でクローン化され、次いで、宿主細胞染色体とは無関係に複製することができないにしても、同じベクターが酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。ＤＮＡは、宿主ゲノムに挿入することによって複製することもできる。しかし、ゲノムＤＮＡの回収は、核酸を切除するのに制限酵素消化が必要になるので、外部で複製したベクターの回収よりも複雑である。ＤＮＡはＰＣＲによって増幅することができ、複製成分なしで宿主細胞に直接トランスフェクトすることができる。

発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができることが有利である。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、この培地中で生存しないだろう。一般の選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、栄養要求の欠乏を補完し、または複合培地から利用不可能な極めて重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

酵母に適切な選択遺伝子マーカーに関しては、マーカー遺伝子の形質発現のために形質転換体の選択を容易にするあらゆるマーカー遺伝子を使用することができる。酵母の適切なマーカーは、例えば、抗生物質Ｇ４１８、ハイグロマイシンもしくはブレオマイシンに対する耐性を付与するマーカーであり、または栄養要求性酵母突然変異体におけるプロトトロピーを提供し、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１またはＨＩＳ３遺伝子である。

ベクターの複製は大腸菌中で都合良く行われるので、大腸菌遺伝マーカーおよび大腸菌複製開始点が含まれることが有利である。これらは、ｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（著作権）ベクターまたはｐＵＣプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９など、大腸菌複製開始点と、アンピシリンなどの抗生物質に対する耐性を付与する大腸菌遺伝マーカーとの両方を含む大腸菌プラスミドから得ることができる。

哺乳動物細胞に適切な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼなどの所望の核酸、またはＧ４１８またはハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を発現する細胞を特定することができるマーカーである。哺乳動物細胞形質転換体は、マーカーを有し発現する形質転換体のみが順応して残存する選択圧下に置かれる。ＤＨＦＲまたはグルタミン合成酵素（ＧＳ）マーカーの場合には、選択圧を次第に増加させる条件下で形質転換体を培養することによって選択圧を強いることができ、それによって（その染色体組込み部位において）選択遺伝子と連結核酸の両方が増幅される。増幅は、増殖に極めて重要なタンパク質の産生を大いに必要とする遺伝子が、所望のタンパク質をコードすることができる密接に関連した遺伝子とともに、組換え細胞の染色体内で縦一列に反復されるプロセスである。多量の所望のタンパク質が、通常、こうして増幅されたＤＮＡから合成される。

発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、所望の核酸に機能的に連結されるプロモーターを含む。このようなプロモーターは、誘導性でも構成的でもよい。プロモーターは、出所のＤＮＡからプロモーターを取り出し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することによって、核酸に機能的に連結される。天然プロモーター配列と多数の異種プロモーターの両方を、抗体をコードする核酸の直接増幅および／または発現に使用することができる。「機能的に連結される」という用語は、記述した成分が意図したように機能できる関係にある近位を指す。コード配列に「機能的に連結され」た制御配列は、制御配列に適合した条件下でコード配列が発現されるように連結される。

原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、例えば、ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。これらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって、当業者は、リンカーまたはアダプターを用いてそれらを所望の核酸に機能的に連結させて、必要な制限部位を提供することができる。細菌系に使用されるプロモーターは、一般に、核酸に機能的に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列も含むだろう。

好ましい発現ベクターは、細菌中で機能することができるｐｈａｇｅｘ、Ｔ７などのバクテリオファージのプロモーターを含む細菌発現ベクターである。最も広く用いられている発現系の１つにおいては、融合タンパク質をコードする核酸を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってベクターから転写することができる（Studier等、Methods in Enzymol. 185;60〜89、1990）。ｐＥＴベクターとともに使用される大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主系統においては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、宿主細菌中で溶原菌ＤＥ３から産生され、その発現は、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃ ＵＶ５プロモーターの制御下にある。この系は、多数のタンパク質の過剰産生にうまく使用されてきた。あるいは、ポリメラーゼ遺伝子は、市販されているＣＥ６ファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）などのｉｎｔ−ファージによる感染によって、ラムダファージ上に導入することができる。他のベクターとしては、ＰＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＬ）などのラムダＰＬプロモーターを含むベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓＴｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳＥ）などのｔｒｃプロモーターを含むベクター、またはｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、もしくはＰＭＡＬ（ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）などのｔａｃプロモーターを含むベクターなどが挙げられる。

酵母宿主とともに使用される適切なプロモーター配列は、調節性でも構成的でもよく、好ましくは、高度に発現される酵母遺伝子、特に、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子から誘導される。すなわち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩまたはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のプロモーター、ａ−もしくはα−因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーター、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼまたはグルコキナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエＧＡＬ ４遺伝子、Ｓ．ポンベｎｍｔ １遺伝子のプロモーターなどの糖分解酵素をコードする遺伝子由来のプロモーター、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子由来のプロモーターを使用することができる。また、１種類の酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）と、別の酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーターエレメントとを含むハイブリッドプロモーター、例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳと、酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーターエレメントとを含むハイブリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を使用することができる。適切な構成的ＰＨＯ５プロモーターは、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７３から始まりヌクレオチド−９で終わるＰＨ０５（−１７３）プロモーターエレメントなどの上流調節性要素（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＡＳ）を欠く短縮型酸性ホスファターゼＰＨ０５プロモーターである。

哺乳動物宿主中のベクターからの遺伝子転写は、ポリオーマウィルス、アデノウイルス、鶏痘ウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノム、アクチンプロモーターなどの異種哺乳動物のプロモーター、または極めて強いプロモーター、例えば、リボソームタンパク質プロモーター、および免疫グロブリン配列に通常付随するプロモーターから誘導されるプロモーターによって制御することができる。

高等真核生物による核酸の転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、向きや位置に比較的無関係である。多数のエンハンサー配列が、哺乳動物の遺伝子から知られている（例えば、エラスターゼおよびグロビン）。しかし、一般には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが使用されるだろう。例としては、複製開始点の後半のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）およびＣＭＶ初期プロモータエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、スプライスして、所望の核酸の５’位または３’位でベクターに入れることができるが、プロモーターから５’部位に位置することが好ましい。

真核生物発現ベクターは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含むことが有利でありうる。ＬＣＲは、特に、遺伝子が、ベクターの染色体組込みが起こる恒久的にトランスフェクトされた真核細胞系において発現される場合に重要である宿主細胞クロマチンに組み込まれた導入遺伝子の組込み部位に無関係な高レベルの発現を指令することができる。

真核生物発現ベクターは、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含むだろう。このような配列は、真核生物またはウィルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、免疫グロブリンまたは標的をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化された断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。

哺乳動物細胞中で核酸の一過的発現をもたらす発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一過的発現は、通常、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、次に、所望の遺伝子産物を高レベルで合成するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターを使用することを含む。

本発明によるベクターの構築には従来の連結技術を使用することができる。単離プラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断され、調整され、必要なプラスミドを産生するのに望ましい形で再度連結される。必要であれば、構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認する分析が、既知の方法で実施される。発現ベクターを構築し、転写物をin vitroで調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、遺伝子産物の発現および機能を評価する分析を実施するのに適切な方法は、当業者に既知である。遺伝子の有無、増幅および／または発現は、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット法、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、本明細書の配列に基づくことができる適切に標識されたプローブを用いて、試料中で直接測定することができる。当業者は、必要であれば、これらの方法を改良する仕方を容易に考えることができる。

抗体は、細胞膜と融合することができるリポソームなどの小胞を用いた微量注入または送達によって、細胞に直接導入することができる。ウィルス融合誘導ペプチドは、細胞の細胞質への膜融合および送達を促進するために使用することが有利である。

免疫グロブリンは、転移(translocation)活性をもたらすようなタンパク質由来のドメインまたは配列に融合または結合することが好ましい。好ましい転移ドメインおよび配列としては、ＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエアンテナペディア(Drosophila Antennapedia)ホメオドメインタンパク質、単純ヘルペス−１ウィルスＶＰ２２タンパク質に由来するドメインおよび配列などが挙げられる。この手段によって、免疫グロブリンは、細胞の近傍に導入されたときに、細胞またはその核に入ることができる。

外因的に添加されたＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）は、原形質膜を通って転移し、核に到達してウイルスゲノムをトランス活性化する。転移活性は、ＨＩＶ−Ｔａｔのアミノ酸３７〜７２（Fawell等.、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91、664〜668）、３７〜６２（Anderson等.、1993、Biochem. Biophys. Res. Commun. 194、876〜884）および（基本配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する）４９〜５８において明らかにされている。Vives等 (1997)、J Biol Chem 272、16010〜7は、転移、核の局在化および細胞遺伝子のトランス活性化に重要と考えられるアミノ酸４８〜６０（ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ）からなる配列を特定した。ガラクトシダーゼおよびＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインからなる融合タンパク質の腹腔内注射によって、生物活性融合タンパク質がマウスの全組織に送達される（Schwarze等、1999、Science 285、1569〜72）。

ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメインタンパク質の第３ヘリックスも、類似の諸特性を有することが判明した（Prochiantz, A.、1999、Ann N Y Acad Sci、886、172〜9の総説）。アンテナペディアにおいて転移をもたらすドメインは、配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを有する塩基性アミノ酸が豊富な１６アミノ酸長ペプチドに局在化している（Derossi等、1994、J Biol Chem、269、10444〜50）。このペプチドは、生物活性物質を培養細胞の細胞質および核に指向するのに使用された（Theodore等、1995、J. Neurosci 15、7158〜7167）。アンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックスの細胞内在化は、受容体に無関係であると考えられ、転移プロセスには、膜リン脂質との直接の相互作用が関与することが示唆された（Derossi等、1996、J Biol Chem、271、18188〜93）。

単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２外被タンパク質は細胞間の輸送が可能であり、細胞の亜集団において発現されるＶＰ２２タンパク質は、集団中の他の細胞に伝播する（ElliotおよびO'Hare、1997、Cell 88、223〜33）。ＧＦＰ（ElliottおよびO'Hare、1999、Gene Ther 6、149〜51）、チミジンキナーゼタンパク質（Dilber等、1999、Gene Ther 6、12〜21）またはｐ５３（Phelan等、1998、Nat Biotechnol 16、440〜3）とＶＰ２２からなる融合タンパク質は、このようにして細胞にターゲティングする。

核および／または原形質膜を通して転移することができるタンパク質の特定のドメインまたは配列を、突然変異誘発または欠失研究によって特定することができる。あるいは、候補配列を有する合成ペプチドまたは発現ペプチドをレポーターに連結させて、転移を分析することができる。例えば、合成ペプチドは、フルオレセインに結合することができ、蛍光顕微鏡を用いてVives等(1997)、J Biol Chem 272、16010〜7に記載の方法によって転移をモニターすることができる。あるいは、緑色蛍光タンパク質をレポーターとして使用することができる（Phelan等、1998、Nat Biotechnol 16、440〜3）。

上述したドメインもしくは配列、または転移活性を有することが明らかにされたドメインもしくは配列のいずれかを使用して、免疫グロブリンを細胞の細胞質または核に指向することができる。ペネトラチンとしても知られる上記アンテナペディアペプチドは、ＨＩＶ Ｔａｔと同様に好ましい。転移ペプチドは、本発明による単一ドメイン免疫グロブリンのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。Ｎ末端融合が好ましい。

ＴＬＭペプチドも細胞への抗体の送達に役立つ。ＴＬＭペプチドは、ＨＢＶのＰｒｅ−Ｓ２ポリペプチドから誘導される。Oess S、Hildt E Gene Ther 2000 May 7:750〜8を参照されたい。抗ＤＮＡ抗体技術も役立つ。抗ＤＮＡ抗体ペプチド技術は、Alexandre Avrameas等、PNAS val 95、pp 5601〜5606、May 1998；Therese Ternynck等、Journal of Autoimmunity (1998) 11、511〜521；およびBioconjugate Chemistry (1999)、vol 10 Number 1、pp 87〜93に記載されている。

本発明によるライブラリー
本発明の別の態様では、図3に示される以下の：VH I21 (配列番号4)、VHI21R33 (配列番号7)、または22位および92位の1以上のアミノ酸がシステインではないこれらの配列のいずれか；VLI21 (配列番号14)およびVLI21R33 (配列番号17)からなる群から選択されるフレームワーク領域配列の任意の1以上から形成されるライブラリーを提供する。

多様なペプチド配列を繊維状バクテリオファージ（ScottおよびSmith (1990 前掲)）の表面に提示するシステムは、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのin vitroでの選択および増幅のための抗体フラグメント（およびこれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに有利であることが証明されている。V_HおよびV_L領域をコードするヌクレオチド配列は大腸菌（E.coli）のペリプラズム領域にこれらを指向するリーダーシグナルをコードする遺伝子断片と連結され、その結果として生じる抗体フラグメントはバクテリオファージの表面に典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えば、pIIIまたはpVIII）との融合体として提示される。あるいは、抗体フラグメントはλファージキャップシド外部に提示される（ファージボディ（phagebodies））。ファージを基礎とする提示システムの利点は、これらは生物系であるため、選択されるライブラリーの構成メンバーを選択されるライブラリー構成メンバーを含むファージを細菌細胞中で増殖させることにより、簡単に増幅することができる点である。さらに、ポリペプチドライブラリーの構成メンバーをコードするヌクレオチド配列はファージまたはファージミドベクターに含まれるので、配列決定、発現および一連の遺伝子操作が比較簡単である。

バクテリオファージ抗体提示ライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は当業界で周知である（McCaffertyら. (1990) 前掲; Kangら. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clacksonら. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burtonら. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboomら. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Changら. (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitlingら. (1991) Gene, 104: 147; Marksら. (1991) 前掲; Barbasら. (1992)前掲; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marksら, 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lernerら. (1992) Science, 258: 1313,参照により本明細書に組み入れる）。

別のライブラリー選択技術として、バクテリオファージλ発現システムが挙げられ、これはバクテリオファージのプラークとして、または溶原ファージのコロニーとして直接スクリーニングされ得る。これらはいずれも既に記載されており（Huseら. (1989) Science, 246: 1275; CatonおよびKoprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinaxら. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8095; Perssonら. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 2432）、本発明において使用されるものである。このような発現システムを用いてライブラリーの最大10⁶種の異なる構成メンバーをスクリーニングすることができるが、実際にはこれらは膨大な構成メンバー（10⁶を超える構成メンバー）のスクリーニングに適していない。他のスクリーニングシステムは、例えばライブラリー構成メンバーの直接的な化学合成を当てにするものである。一つの初期的手法として、WO84/03564に記載されるような、ピンとロッドの配置上でのペプチド合成が挙げられる。各ビーズが個々のライブラリー構成メンバーであるペプチドライブラリーを形成する、ビーズ上でのペプチド合成を含む類似した手法が、米国特許第4，631，211号に記載され、関連した手法がWO92/00091に記載されている。ビーズを基礎とする手法の有意な改善として、各ビーズをオリゴヌクレオチドなどの固有の識別タグで標識して、各ライブラリー構成メンバーのアミノ酸配列の同定を容易にすることを含む。これらの改善されたビーズを基礎とする手法はWO93/06121に記載されている。

別の化学合成法は、各別個のライブラリー構成メンバー（例えば、固有のペプチド配列）がアレイ中の予め規定された位置に離散的に配置されている表面上でのペプチド（またはペプチドミメティック(peptidomimetics)）アレイの合成に関する。各ライブラリー構成メンバーの素性は、アレイにおける構成メンバーの空間的位置によって決定される。予め決められた分子（例えばレセプター）と反応性ライブラリー構成メンバーとの間の結合相互作用が生じるアレイ中の位置を決定して、それにより空間的位置に基づいて反応性ライブラリー構成メンバーの配列が同定される。これらの方法は、米国特許第5,143,854号; WO90/15070 および WO92/10092; Fodorら. (1991) Science, 251: 767; DowerおよびFodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271に記載されている。

ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製する別のシステムは、ライブラリー構成メンバーのin vitro合成のための無細胞酵素機器（cell-free enzymatic machinery）の使用に関する。一つの方法では、RNA分子を、標的リガンドに対する選択とPCR増幅を交互にまわすことによって選択する（Tuerk および Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington および Szostak (1990) Nature, 346: 818）。同様の技術を使用して予め規定されたヒト転写因子に結合するDNA配列を同定することもできる（ThiesenおよびBach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; BeaudryおよびJoyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258およびWO92/14843）。同様の方法において、豊富なライブラリーを作製する方法として、in vitroでの翻訳によりポリペプチドを合成することができる。一般的に固定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058、およびWO92/02536にさらに記載されている。WO95/22625およびWO95/11922 (Affymax)に開示されるようなファージを基礎としない別の提示システムは、ポリソームを使用して選択用のポリペプチドを提示する。これらのおよび全ての先行文献も参照により本明細書に組み入れる。

本明細書に記載されるコンセンサス配列からのライブラリー作製における特に重要な利点は、これらの作製によりファージscFvライブラリーの使用を除き、かつ細胞内抗体捕捉技術の使用について要求される必要なライブラリーの大きさを縮小することができる点である。

本発明による抗体の使用
本発明による抗体分子、好ましくはｓｃＦｖ分子は、in vivoでの治療用途および予防用途、in vitroおよびin vivoでの診断用途、in vitroでのアッセイ用途および試薬用途、機能ゲノミクス用途などに使用することができる。

本発明による抗体および組成物を治療および予防に使用するには、ヒトなどのレシピエント哺乳動物に上記のものを投与することが含まれる。それらは、哺乳動物の細胞内環境へ投与することを含むことが好ましい。

少なくとも９０〜９５％均一である実質的に純粋な抗体は哺乳動物への投与に好ましく、９８〜９９％以上の均一性が医薬品用途、特に、哺乳動物がヒトであるときには最も好ましい。抗体分子は、所望されるように部分的または均一に精製した後に、診断または（体外を含めて）治療に、あるいは当業者に既知の方法を用いてアッセイ手順を開発し実施するのに使用することができる。

本願においては、「予防」という用語は、疾患の誘発前に防御組成物を投与することを含む。「抑制」とは、誘発事象後、疾患が臨床的に現れるまでに、組成物を投与することを意味する。「治療」には、疾患の症状が現れた後に防御組成物を投与することを含む。

選択された本発明の抗体の、疾患予防または治療における有効性をスクリーニングするのに使用することができる動物モデル系が利用可能である。適切なモデルは当業者に既知であろう。

一般に、選択された本発明の抗体は、薬理学的に適切な担体とともに、精製された形で利用されるだろう。一般に、これらの担体としては、水溶液またはアルコール／水溶液、乳濁液、懸濁液、生理食塩水および／または緩衝媒質を含むものなどが挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸リンゲルなどが挙げられる。適切な生理的に許容されるアジュバントは、ポリペプチド複合体の懸濁液を保つのに必要な場合には、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギナートなどの増粘剤から選択することができる。

静脈内ビヒクルとしては、リンゲルデキストロースを主成分とするものなどの、体液および栄養素補充物、電解質補充物などが挙げられる。保存剤、および抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの他の添加剤も存在させることができる（Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版）。

選択された本発明の抗体は、分離投与組成物として、または他の薬剤とともに使用することができる。これらには、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、免疫毒素などの様々な免疫療法薬剤が含まれる。医薬組成物としては、本発明の抗体またはさらには本発明による抗体の組合せ物とさえ組み合わされた様々な細胞障害性薬剤または他の薬剤の「カクテル」などが挙げられる。

本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に知られた経路のいずれかとすることができる。免疫療法を含めて、ただしこれだけに限定されない療法の場合には、選択された本発明の抗体を標準技術に従って患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路を含めて、または、適切には、カテーテルによる直接注入を含めて、任意の適切な方法によることができる。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータによって決まるだろう。

選択された本発明の抗体は、凍結乾燥して保存し、使用前に適切な担体で再構成することができる。既知の凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成によって機能活性の低下度が変わる可能性があり、それを補償するために使用レベルを上方に調整しなければならないことがあることを当業者には理解されるだろう。

選択された本発明の抗体またはそのカクテルを含む組成物を、予防処置および／または治療処置のために投与することができる。ある治療上の適用例においては、選択された細胞の集団の少なくともある程度の阻害、抑制、モジュレーション、死滅または他の何らかの測定可能なパラメータを達成するのに十分な量を「治療有効量」と定義する。この投与量を得るのに必要な量は、疾患の重篤度、および患者自身の免疫系の全般的な状態に依存するが、一般に、体重１キログラム当たり選択免疫グロブリン０．００５〜５．０ｍｇであり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／回の用量がより一般的に使用される。予防的に適用する場合には、選択免疫グロブリン分子またはそのカクテルを含む組成物を、類似の用量、またはわずかに少ない用量で投与することもできる。

１種類または複数の選択された本発明による抗体分子を含む組成物を、哺乳動物における選択標的細胞集団の改変、不活性化、死滅または排除に役立つ予防設定および治療設定に利用することができる。また、本明細書に記載するポリペプチドの選択されたレパートリーは、細胞の不均一な集団から標的細胞集団を、選択的に死滅させ、枯渇させ、または有効に排除するために、体外またはin vitroで使用することができる。哺乳動物から得られる血液を、選択された抗体、細胞表面受容体またはその結合タンパク質と体外で混合し、それによって望ましくない細胞を死滅させ、または血液から除去して、標準技術に従って哺乳動物に戻すことができる。

本発明を、以下の実施例において例示のためだけにさらに説明する。

実施例

材料と方法
Ras抗原
組換え発癌性ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ；残基１〜１６６）を、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づく発現プラスミドを含む細菌細胞中で発現させ、（Pacold等、2000）に記載されたイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過によって精製した。活性型ＲＡＳ抗原を調製するために、精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖタンパク質３ｍｇに、ＧＴＰの非加水分解性アナログである５’−グアニリルイミド２リン酸（ＧｐｐＮｐ、Ｓｉｇｍａ）２ｍＭを、アルカリホスファターゼ手順（Herrmann等、1996）によって添加した。このＧｐｐＮｐ結合ＨＲＡＳＧ１２Ｖを抗原として全体を通して使用した。

in vitroｓｃＦｖファージライブラリースクリーニングおよび特異的ｓｃＦｖ−ＶＰ１６酵母ライブラリーの調製
３種類の異なるｓｃＦｖライブラリー（de Wildt等、2000;Sheets等、1998）のＩＡＣスクリーニングを、（Tse等、2000；Tse等、2002）に記載されたものにわずかな改変を加えて実施した（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙウェブサイトhttp://mrc-lmb.cam.ac.uk内のリンクも参照されたい）。概要を述べると、第１のパンニングステップを使用したファージＡｂライブラリースクリーニングを、イムノチューブに結合した５０μｇ／ｍｌ ＨＲＡＳＧ１２Ｖ抗原の１ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有ＰＢＳ溶液中で実施した。抗ＲＡＳ結合ファージを回収し、大腸菌ＴＧ１中で増幅させた。ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片をｐＶＰ１６酵母ベクター中にサブクローニングし、４．１３×１０^６個のクローンを酵母スクリーニングに使用した。末端切断ＨＲＡＳＧ１２Ｖ ｃＤＮＡをｐＢＴＭ１１６ベクターのＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１部位にクローン化してＲＡＳベイトを調製した。ｐＢＴＭ１１６−ＲＡＳＧ１２Ｖベイトベクター（ｔｒｙｐ＋）を、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール法（Tse等、2000）を用いてサッカロミセス・セレビシエＬ４０にトランスフェクトし、Ｔｒｐ−プレート上で増殖したコロニーを選択した。ＬｅｘＡ−ＲＡＳ融合タンパク質の発現を、抗ｐａｎ ＲＡＳ（Ａｂ−３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を用いたウェスタンブロットによって確認した。ライブラリースクリーニングの場合には、酵母ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ライブラリーＤＮＡ １００μｇを、抗原を安定に発現するＬ４０クローンに形質転換した。陽性コロニーをＨｉｓプロトトロピーのために選択し、フィルターアッセイによるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性によって確認した。単離した個々のクローンについて、偽陽性クローンを除去し、Ｈｉｓ非依存性増殖およびβ−ｇａｌ活性化を再試験することによって真陽性クローンを確認した。

in vitroアッセイ用ｓｃＦｖの精製
ｓｃＦｖのペリプラズム細菌発現は（Tse等、2000）に記載されていた。ｓｃＦｖをｐＨＥＮ２ベクター（マップについてはwww.mrc-cpe.cam.ac.ukを参照されたい）にクローン化し、大腸菌ＨＢ２１５１細胞の１リットル培養物中で１ｍＭ ＩＴＰＧを用いて３０℃で２時間発現させた。細胞を収集し、ペリプラズムタンパク質をＴＥＳ緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ、スクロース）で抽出した。ペリプラズムタンパク質を、１０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ ２．５リットルで終夜透析した。ペリプラズムｓｃＦｖの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）４ｍｌを用いて４℃で１時間実施した。アガロースを、２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ ２０ｍｌで４回洗浄した。ポリヒスチジンタグ付けｓｃＦｖを２５０ｍＭイミダゾールのＰＢＳ溶液４ｍｌで溶出させた。溶出物を、１０％グリセリンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２．５リットルで４℃で終夜透析した。精製ｓｃＦｖを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮機（ＹＭ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、その一定分量を−７０℃で保存した。精製ｓｃＦｖのタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。

ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡプレートウェルに、精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ抗原１００μｌ（４μｇ／ｍｌ、約２００ｎＭ）のＰＢＳ溶液を終夜４℃で塗布した。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳを用いて室温で２時間ウェルをブロックした。それぞれの精製ｓｃＦｖ（約４５０ｎｇ）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで９０μｌに希釈し、３７℃で１時間結合させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後に、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：２０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ポリヒスチジン（ＨＩＳ−１、Ｓｉｇｍａ）モノクローナル抗体を、３７℃で１時間結合させた。ＰＢＳＴで６回洗浄した後に、３，３’，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質系を用いて製造者の指示に従って、ＨＲＰ活性を可視化した。０．５Ｍヒドロスルフェートを用いて反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダー（４５０〜６５０ｎｍフィルター）を用いてデータを収集した。抗原に対するｓｃＦｖの特異性を検証するために、競合ＥＬＩＳＡアッセイも実施した。抗原被覆ＥＬＩＳＡウェルに混合物を添加する前に、ｓｃＦｖをＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ抗原（８μｇ／ｍｌ）とともに室温で３０分間プレインキュベートした。すべての測定を２重で実施した。

表面プラズモン共鳴分析
ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用して、ｓｃＦｖと抗原との結合動力学を測定した。抗原をＣＭ５センサーチップに固定化するために、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）混合物４０μｌを流量１０μｌ／分で流して、センサーチップを始めに活性化した。１０ｍＭ 酢酸ナトリウム中の精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ １００μｇ／ｍｌ、ｐＨ３．５を注入し、約１５００ＲＵまで固定化した。固定化後、エタノールアミン−ＨＣｌ ４０μｌでチップを不活性化した。精製ｓｃＦｖ（１０〜５００ｎＭ）を、流量２０μｌ／分で２５℃で（流出緩衝剤ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖポリソルベート２０）＋２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）固定化ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐを含むチップまたは抗原を含まないチップの２つのチャネルに充填し、ｓｃＦｖの結合親和性を求めた。各測定を２重で実施した。ｓｃＦｖを結合させた後の抗原が固定化されたセンサーチップ表面を、出発ベースラインが得られるまで１０ｍＭ ＨＣｌですすいで再生させた。動力学速度定数ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆを、製造者によって提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウエアによって評価した。Ｋｄ値をｋ_ｏｆｆおよびｋ_ｏｎ速度定数から計算した（Ｋｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）。

哺乳動物のin vivo抗原−抗体相互作用アッセイ
ｓｃＦｖを、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６発現ベクターのＳｆｉ１およびＮｏｔ１部位にクローン化した（原稿準備中）。ＨＲＡＳＧ１２Ｖ ｃＤＮＡ（コドン１〜１６６）をｐＭ１ベクターのＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１部位にサブクローニングすることによって、Ｇａｌ４ ＤＢＤとインフレームであるＲＡＳＧ１２Ｖを発現するＨＲＡＳ発現プラスミド（ｐＭ１−ＲＡＳＧ１２Ｖ）を作製した（Sadowski等、1992）。陽性対照または陰性対照として使用したベイトｐＭ１／β−ｇａｌおよびプレイｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６／Ｒ４（抗β−ｇａｌ ｓｃＦｖ）は、（TseおよびRabbitts、2000）に記載されている。ＣＯＳ７細胞に、ｐＧ５−Ｌｕｃレポータープラスミド ５００ｎｇ（de Wet等、1987）、ｐＲＬ−ＣＭＶ ５０ｎｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６／ｓｃＦｖ ５００ｎｇおよびｐＭ１／抗原ベイト５００ｎｇを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬８μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製造者の指示に従って）とともに一過的に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１Ｘ受動溶解緩衝剤（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）５００μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に室温で１５分間緩やかに振盪させながら溶解させた。細胞可溶化物２０μｌを、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて照度計で分析した。トランスフェクション効率をウミシイタケルシフェラーゼ活性で正規化した。ルシフェラーゼ活性倍率を、ベクターのみを含む試料の正規化ホタルルシフェラーゼ活性を割り算して計算した。データは２重で実施された２つの実験のものである。

免疫蛍光アッセイ
ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片を、発現ｓｃＦｖのＮ末端の核局在化シグナル（ｎｌｓ）およびＣ末端のｍｙｃタグとともに、ｐＥＦ−ｎｕｃ−ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ部位にクローン化した。ＲＡＳ抗原を発現させるために、完全長ＲＡＳＧ１２Ｖ ｃＤＮＡを、ｐＨＭ６ベクター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のＫｐｎ１−ＥｃｏＲ１部位にクローン化して、Ｎ末端のＨＡタグおよびＣ末端のＨｉｓ６タグを有するＲＡＳをコードした。トランスフェクション前日に、１．２×１０^４個のＣＯＳ７細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ Ｃａｍｂｅｒスライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に播いた。プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて同時トランスフェクトし、トランスフェクションから４８時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ ＸのＰＢＳ溶液で透過し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で固定した。ともに１：１００に希釈した抗ｃ−ｍｙｃマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；９Ｅ１０）および抗ＨＡウサギポリクローナル血清（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；ｓｃ−８０５）で細胞を染色した。二次抗体のフルオレセイン連結ヒツジ抗マウス抗体およびＣｙ３連結ヤギ抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＡＰＢ））を１：２００に希釈して染色に使用した。ＰＢＳで数回洗浄した後に、スライドにカバーガラスを載せ、Ｂｉｏ−Ｒａｄｉａｎｃｅ共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて染色パターンを検討した。

ウェスタンブロット分析
哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルおよび可溶性を評価するために、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ＶＰ１６融合タンパク質をＣＯＳ７細胞中で発現させた。ｓｃＦｖ発現の場合には、ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片をｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏ１／Ｎｏｔ１部位にクローン化した。トランスフェクション前日に、ＣＯＳ７細胞を６ウェルの培養プレート（Ｎｕｎｃ）に約２×１０^５個／ウェルで播いた。ｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ｓｃＦｖまたはｐＥＦ−ＢＯＳ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ １μｇを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ８μｌを用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、氷冷抽出緩衝剤（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））に３０分間溶解し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて（ｓｃＦｖ検出用）抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）モノクローナル抗体または（ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤ融合体用）抗ＶＰ１６（１４−５、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）モノクローナル抗体を一次抗体、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＰＢ）を二次抗体として用いたウェスタンブロットによって、ペレット（「不溶性」画分）および上清（「可溶性」画分）を分析した。ブロットを、高感度化学発光（ＥＣＬ）検出キット（ＡＢＰ）によって可視化した。

抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ用フレームワーク残基の突然変異
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３を含むｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６を最初のテンプレートに使用し、全体を通してＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。一次テンプレートとしてｓｃＦｖ３３の逐次部位特異的突然変異誘発を用い、フットプリント突然変異誘発を用いて、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖＩ２１のＦＲおよび抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３のＣＤＲを含む構築体Ｉ２１Ｒ３３（図３に示す配列）を構築した。Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、ｃｏｎ３３およびＩ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ（図３）も、適切なオリゴヌクレオチドを用いてフットプリント突然変異誘発によるＩ２１Ｒ３３の突然変異によって構築した。すべてのｓｃＦｖ構築体をＳｆｉ１またはＮｃｏ１およびＮｏｔ１で消化し、（in vivo抗原抗体相互作用アッセイ用）ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６および（哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖ発現用）ｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏベクターにサブクローン化した。すべての突然変異ｓｃＦｖ構築体をＤＮＡ配列決定によって確認した。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞における形質転換アッセイ
ＲＡＳタンパク質は、細胞の原形質膜に局在化する。したがって、ｓｃＦｖを細胞膜に局在化させるために、本発明者らはｐＥＦ−Ｍｅｍｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＨＲＡＳのカルボキシ末端の２０個のアミノ酸残基をｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏベクターのＮｏｔ１−Ｘｂａ１部位に導入することによって、ｓｃＦｖ発現プラスミドを構築した。この発現ベクターはまた、ＦＬＡＧタグペプチド（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫ）および別のＳｆｉ１クローニング部位をｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂと呼ばれるｐＥＦ−Ｍｅｍｂベクターの平滑末端Ｓｆｉ１部位に導入した。ｓｃＦｖをｐＥＦ−ＦＬＡＧ−ＭｅｍｂのＳｆｉ１−Ｎｏｔ１にサブクローニングした。ＲＡＳＧ１２Ｖの発現の場合には、ＨＲＡＳＧ１２Ｖ突然変異ｃＤＮＡを発現ベクターｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）ＲＥＦにサブクローニングした。少ない継代のＮＩＨ３Ｔ３細胞クローンＤ４（Ｃｈｒｉｓ Ｍａｒｓｈａｌｌ博士提供）を、トランスフェクション前日に、６ウェルのプレートに２×１０^５個細胞／ウェルで播いた。トランスフェクションには、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）１２μｌを使用して、各ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖ ２μｇ＋ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖベクター１００ｎｇを使用した。２日後に、細胞を１０ｃｍプレートに移し、５％ドナー子ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地中で２週間増殖させた。最後に、プレートをクリスタルバイオレットで染色し、増殖巣を数えた。

ＲＡＳタンパク質をin vivoで認識する特異的細胞内抗体フラグメントの単離
本発明者らは、細胞内抗体捕捉技術（Visintin等、1999）を抗ＲＡＳ ＩＣＡｂの単離に応用した。逐次ステップは、特異的細胞内抗体を単離するために、精製ＲＡＳタンパク質を用いた初期in vitroファージｓｃＦｖライブラリーパンニングおよびin vivo抗原−抗体ツーハイブリッド相互作用スクリーニングを含む。in vitroファージＡｂスクリーニングの場合には、５’−グアニリルイミド２リン酸（ＧｐｐＮｐ、Ｓｉｇｍａ、ＧＴＰの非加水分解性アナログ）に結合した精製カルボキシル末端切断型ヒトＨａ−ＲＡＳＧ１２Ｖを抗原として使用した。１ラウンドのin vitroパンニング後に、約１．１８×１０^６個の抗原結合ファージを２．７Ｘ１０^１３個の初期ファージから回収した（図１）。サブライブラリーをファージミドＤＮＡとして調製し、酵母ＶＰ１６転写活性化ドメインベクターにクローン化して、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ−ＶＰ１６−ＡＤライブラリー（約４×１０^６個のクローン）を作製した。この酵母サブライブラリーを、ＲＡＳ−Ｇ１２Ｖに融合したＬｅｘＡ−ＤＢＤを含む融合タンパク質ベイトを発現する酵母菌株（ｈｉｓおよび−ｇａｌレポーター遺伝子を有するＬ４０）にトランスフェクトした。合計約８．４５×１０^７個の酵母コロニーをスクリーニングした（図１）。４２８個のコロニーはヒスチジンの非存在下で増殖し、これらのクローンもβ−ｇａｌを活性化させた。ｓｃＦｖ−ＶＰ１６−ＡＤプラスミドをヒスチジン非依存性のβ−ｇａｌ陽性クローンから単離し、それらのＤＮＡ制限パターンによって分類した。９０％を超えるこれらのｓｃＦｖ−ＶＰ１６−ＡＤプラスミドが同一のＤＮＡフィンガープリントパターンを有し、２０個は配列が決定され、同一のＤＮＡ配列を有することが判明した。異なるＤＮＡフィンガープリントパターンを有するｓｃＦｖに、新しい酵母中のｐＢＴＭ／ＲＡＳＧ１２Ｖベイトを同時形質転換し、ヒスチジン非依存性増殖およびβ−ｇａｌ活性化について分析した。３３、Ｊ４８およびＩ２１で示された３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖをこうして特定した（図１）。酵母中のＲＡＳに対するこれらのｓｃＦｖの結合特異性を、（空ｐＢＴＭ１１６ベクターから作製された）ＬｅｘＡ ＤＢＤおよび非関連抗原（β−ガラクトシダーゼ）との相互作用の欠如によってさらに検証した（データ示さず）。

抗ＲＡＳ ＩＣＡｂの効力を、哺乳動物細胞レポーターアッセイおよびin vivo抗原コロケーションアッセイによって確認した（図２）。使用した哺乳動物細胞アッセイは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子からのルシフェラーゼ産生であった。３種類のｓｃＦｖを、伸長因子−１ａプロモーター（MizushimaおよびNagata、1990）およびＶＰ１６転写活性化ドメイン（ＡＤ）を有する哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６にシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）させた。ｓｃＦｖを、そのＮ末端側で、ＶＰ１６セグメントとともにインフレームにクローン化した（Triezenberg等、1988）。ＲＡＳＧ１２Ｖ抗原を、抗原（ｐＭ−ＲＡＳＧ１２Ｖ）とのＮ末端融合体としてＧＡＬ４−ＤＢＤを含むｐＭベクター（Sadowski等、1992）にクローン化した。ｐＥＦＢＯＳＶＰ１６−ｓｃＦｖおよびｐＭ−ＲＡＳＧ１２Ｖを、ルシフェラーゼレポータープラスミドとともにＣＯＳ７細胞に同時トランスフェクトした。ｓｃＦｖ３３またはＪ４８ ＩＣＡｂ−ＶＰ１６融合体がベイト抗原ＲＡＳＧ１２Ｖとともに発現されると１０倍を超える活性化が認められたが（図２Ａ）、非関連抗原β−ガラクトシダーゼでは認められなかった。しかし、酵母抗ＲＡＳＩＣＡｂ Ｉ２１がＲＡＳＧ１２Ｖベイトと同時発現されたときには、活性化が認められなかった（図２Ａ）。他の哺乳動物細胞系、すなわち、ＨｅｌａおよびＣＨＯ細胞においても類似の結果が得られた。酵母とは反対に、この哺乳動物細胞アッセイにおいてＩＣＡｂ Ｉ２１が抗原と検出可能な程度に相互作用しなかったのは、単に、不十分な親和性しか持たなかった、または酵母アッセイよりも哺乳動物のアッセイが相対的に鈍感であることを反映しているのかもしれないし、おそらくはトランスフェクション効率、内因性転写因子に接近する必要があるレポーター遺伝子活性化、および／または抗原もしくは抗体の発現レベルなどの要因のためかもしれない。

ｌｅｘＡ−ＤＢＤを発現する酵母系およびＧａｌ４−ＤＢＤを発現する哺乳動物系におけるｓｃＦｖ３３およびＪ４８の観察された相互作用は、ｓｃＦｖが、ベイトにおけるＲＡＳとＤＢＤの融合による人工的なものではなく、ＲＡＳ抗原本来のエピトープと相互作用することの良好な指標になる。これの別の証拠は、本来のＲＡＳ抗原が、核局在化シグナル（ｎｌｓ）が付加するｓｃＦｖとともに発現されるコロケーションアッセイから得られた。ＣＯＳ７細胞に、ＨＡエピトープタグを有するＲＡＳ発現ベクターとｍｙｃエピトープタグを有するｓｃＦｖをコードするｓｃＦｖ発現ベクターとを同時トランスフェクトした。５２時間後に、ＲＡＳ抗原が抗ＨＡタグＡｂによって検出され、ｓｃＦｖが抗ｍｙｃタグＡｂによって検出された（図２Ｂ）。ＲＡＳ抗原が単独で、または非関連ＩＣＡｂ（ｓｃＦｖＲ４（Martineau等、1998））とともに発現されたときには、抗原が細胞質中で検出され、抗体が核中で検出されたのに対し（図２Ｂ、下図）、抗原が、ｎｌｓを有する抗ＲＡＳ ＩＣＡｂ ３３とともに同時発現された場合には、ＲＡＳ抗原およびｓｃＦｖの核中でのコロケーションが認められた。これらは、抗ＲＡＳ ＩＣＡｂ ３３が十分な発現、およびＲＡＳ抗原にin vivoで結合する親和性を有し、細胞内での再配置をもたらすことを意味する（抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ Ｊ４８を用いても類似の結果が得られた。データ示さず）。

抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの配列および細菌発現
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ（３３、Ｊ４８およびＩ２１）の配列を決定し、誘導タンパク質配列をアライメントした（図３）。全３種類のｓｃＦｖは、ＪＨ５に連結されたＶＨ３サブグループおよびＶ １サブグループに属する。Ｓｈｅｅｔｓ等のライブラリー（Sheets等、1998）からのみ単離された抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ ｓｃＦｖ（Tse等、2002）についての本発明者らの以前のデータも、ＶＨ３およびＶ １サブグループに属する。本発明者らの以前の研究において、本発明者らは、抗ＢＣＲと抗ＡＢＬ ｓｃＦｖを比較することによって誘導されたコンセンサスフレームワークを定義することができ（Tse等、2002）、類似の研究が抗ＴＡＵ ＩＣＡｂｓを用いてなされた（Visintin等、2002）。本発明者らは、ＶＨ３およびＶ １からなるフレームワークが、細胞内のｓｃＦｖ機能、およびその上に他のＩＣＡｂを設計するコンセンサスセット基本配列に極めて適していると結論した。本明細書の抗ＲＡＳ ＩＣＡｂは、この概念を改善するのに役立つ。

３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの発現レベルが、細菌ペリプラズム発現によって最初に検討された。これらのｓｃＦｖを、ｓｃＦｖの５’にＰｅｌＢリーダー配列を有するｐＨＥＮ２にサブクローニングし、可溶性ｓｃＦｖタンパク質をペリプラズムで発現させた（マップについては、www.mrc-cpe.cam.ac.uk参照）。ペリプラズムｓｃＦｖ抽出物を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製し、タンパク質調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた（図４）。ｓｃＦｖＩ２１は、ペリプラズムに３０℃で分泌されると主に可溶性画分中に蓄積し、ペリプラズム発現収量は約３ｍｇ／リットル培養物であった。他方の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ（３３およびＪ４８）の発現は０．１ｍｇ／リットル未満であった。抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ配列とコンセンサスＩＣＡｂ配列（図３）の比較から、３３およびＪ４８のＶＨフレームワーク残基中に４つの違いのみが明らかになり、その１つはＶＨ ＦＲ１の７位である。この残基は、この領域のコンホメーションに影響を及ぼす３個のうちの１個であり（Jung等、2001）、したがって、ＩＣＡｂ ３３およびＪ４８可溶性に影響を及ぼす可能性がある。Ｉ２１は、ＶＨ ＦＲ１ ６、７および１０位のコンセンサスに一致する。

抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの生化学的および生物物理学的特徴付け
本発明者らの研究において単離されたＩＣＡｂの諸特性も、２種類のin vitroアッセイによって明らかになった。ｓｃＦｖとＲＡＳ抗原との相互作用を、細菌中で生成された精製ｓｃＦｖを用いて、ＥＬＩＳＡおよびバイオセンサーアッセイによって検討した。ＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐを抗原としてＥＬＩＳＡプレート上に塗布し、精製ｓｃＦｖに暴露し、結合したｓｃＦｖをＨＲＰ結合抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した（図５）。全３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、ＢＳＡよりもＲＡＳ抗原に対してかなりのシグナルを発生し、相互作用特異性の尺度としてＲＡＳＧ１２Ｖ抗原とともにプレインキュベーションするとシグナルが抑制された。これらの結果によれば、これらの抗ＲＡＳ ｓｃＦｖが天然型のＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐとのみ相互作用し得ることがさらに示唆される。

結合抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの抗原に対する親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅにおける結合動力学によって測定した（図６）。ｓｃＦｖ３３およびＪ４８のＫｄは、１．３９±１．３１ｎＭ、３．６３±０．１５ｎＭと求められた（図６Ｂ）。これらのｓｃＦｖの親和性の差異は、ＶＨドメイン中のＣＤＲ１配列の差異を示している可能性がある。ｓｃＦｖＩ２１のＫｄは２．１６±０．２５μＭであり、ｓｃＦｖ３３またはＪ４８よりも３桁低い。ｓｃＦｖＩ２１のマイクロモルの範囲のこの低い親和性は、酵母in vivo抗原−抗体相互作用アッセイにおけるその弱いβ−ｇａｌレポーター遺伝子活性化、および哺乳動物細胞アッセイにおける検出可能な結合の欠如と一致する。

ｓｃＦｖフレームワーク配列の改変による抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの機能改善
細菌細胞および哺乳動物細胞において発現されたときには、ｓｃＦｖの安定性と収率に優れた定量相関があり、ｓｃＦｖＩ２１は、細菌（図４）および哺乳動物細胞質（図７）において他の２種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖよりも高い発現収率を示す。ＣＯＳ７発現において試験されたすべてのｓｃＦｖは、かなりの量の「不溶性」ｓｃＦｖを示したが（図７Ｂ）、最適発現レベルはｓｃＦｖＩ２１で明らかであった（図７Ａ）。抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３の可溶性および安定性がin vivoおよびin vitroで改善されるかどうかを、ｓｃＦｖ３３とｓｃＦｖＩ２１との１３アミノ酸差異の一部または全部を含むようにｓｃＦｖ３３のフレームワークを突然変異させることによって評価した（図３）。ｓｃＦｖ３３のＶＨ ＦＲ領域を突然変異させてＩ２１と同じにすると（ＦＲ３末端にｌｙｓではなくａｒｇを含むが）、優れたin vivoでの可溶性が認められた（図７Ａ、Ｉ２１Ｒ−３３）。また、鎖内ジスルフィド結合に必要な両方のＣｙｓ残基をＳｅｒに突然変異させても（図７、ｓｃＦｖ Ｉ２１Ｒ−３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、可溶性発現レベルに対するほんの小さな効果しか得られなかった。

ｓｃＦｖの様々な突然変異体のin vivoでの相互作用を、ＣＯＳ７細胞中でルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価した（図８）。図８Ａに、ｓｃＦｖ３３フレームワークの様々な改変形態の発現およびルシフェラーゼレポーターデータを、ｓｃＦｖ３３自体またはｓｃＦｖＲ４（抗β−ｇａｌの陰性対照、（Martineau等、1998））、および有意なルシフェラーゼ活性をもたらさないｓｃＦｖＩ２１のレベルと比較して示す。このｓｃＦｖ−ＶＰ１６の発現は、本来のｓｃＦｖ ３３よりも増加したが（図８Ａ）、１つの注目すべきｓｃＦｖ３３の突然変異体は、レポーター応答を完全に排除した（図８Ａ）Ａｒｇ９４Ｌｙｓ（Ｋａｂａｔ等による番号付けによる（Kabat等.、1991）、ＩＭＧＴ、Ｌｅｆｒａｎｃ等による１０６位（LefrancおよびLefranc、2001））である。９４位のアルギニン残基は、抗原結合部位（重鎖のＣＤＲ３）に極めて近く、ＲＡＳ抗原との相互作用に直接関与し得る。あるいは、この位置の残基は、ＣＤＲ３ループによってその正に帯電した側鎖を介してＨ１０１位のアスパラギン酸のカルボキシル基と表面架橋を形成することができ（Morea等、1998）、（ＡｒｇからＬｙｓへの）置換は、ＣＤＲ３の重要なコンホメーションに影響を及ぼす可能性がある。他の突然変異体ｓｃＦｖ３３は、一般に、ルシフェラーゼレポーターアッセイから判断して、ＲＡＳ抗原との結合能力を維持した（図８Ａ）。興味深いことに、３種類の突然変異体、ＶＨ（Ａ７４Ｓ＋Ｓ７７Ｔ）、ＶＬ（Ｉ８４Ｔ）およびＶＨ（Ｑ１Ｅ＋Ｖ５Ｌ＋Ａ７Ｓ＋Ｓ２８Ｔ）＋ＶＬ（Ｇ１００Ｑ＋Ｌ１０４Ｖ）は、レポーター遺伝子活性が１．５〜２．５倍増加し、可溶性画分中のｓｃＦｖ−ＶＰ１６が増加した。

Ｈ９４位のアルギニンが維持されたことを除いて、ｓｃＦｖＩ２１のフレームワークへのｓｃＦｖ３３の突然変異が実施された（Ｉ２１Ｒ３３）。ｓｃＦｖ３３がＩＣＡｂコンセンサスフレームワークに変換されたもの（ｃｏｎ３３）と、ＶＨフレームワークのみの突然変異が実施されたもの（Ｉ２１Ｒ−３３ＶＨＩ２１ＶＬ、図３）の２種類のさらに別のｓｃＦｖ３３変異体が構築された。哺乳動物レポーターアッセイにおいては、レポーター遺伝子活性の２〜３倍の増加がＩ２１Ｒ３３およびｃｏｎ ３３で認められたが、本来のｓｃＦｖ３３よりも可溶性が劇的に改善された（図８Ｂ）。これらのデータによれば、コンセンサスフレームワーク、すなわちＩ２１フレームワークは、細胞内抗体発現の最も適切な骨格であり、これらのフレームワークを用いてさらにＩＣＡｂ機能を改善することができる。

ＶＨドメインにおいて保存的システイン残基を欠く抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの活性
還元性環境において、ｓｃＦｖはジスルフィド結合をほとんど形成することができないが、突然変異抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ Ｉ２１Ｒ３３は、ＣＯＳ７細胞においてＲＡＳ抗原と特異的に相互作用する。（Biocca等、1995；Tavladoraki等、1993）。おそらくは、抗βガラクトシダーゼｓｃＦｖＲ４などの、過剰発現されたｓｃＦｖの小集団が、細胞質中でジスルフィド結合を形成し、抗原とin vivoで相互作用し、その一部が細菌の細胞質中でジスルフィド結合していると考えられる（Martineau等、1998）。したがって、ｓｃＦｖが抗原と高親和性を有する場合には、本発明者らの抗原−抗体相互作用アッセイによって、小集団をin vivoで検出することができる。しかし、in vitroでの研究によれば、ジスルフィドがないが正確に折りたたまれるｓｃＦｖを作製できることが示された（Proba等、1998；WornおよびPluckthun、1998a）。したがって、鎖内Ｓ−Ｓ結合に対する要件を試験するために、２２位および９２位（Ｋａｂａｔの番号付け、またはＩＭＧＴによる番号付けで２３および１０４）のシステイン残基を欠く突然変異体ｓｃＦｖをコードする発現ベクターを構築した。Ｉ２１Ｒ３３配列に基づくこのｓｃＦｖは、２個のｃｙｓコドンを有し、セリンに突然変異した（クローンＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）。このタンパク質をコードするベクターを本発明者らの哺乳動物レポーターアッセイで試験した（図８Ｂ）。ｓｃＦｖタンパク質は高レベルで発現され、Ｉ２１Ｒ３３およびＩ２１のそれらとほぼ匹敵し、ルシフェラーゼレポーターを活性化する能力は１２Ｒ３３ ｓｃＦｖに類似していた。これらの結果によれば、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ Ｉ２１Ｒ３３は、鎖内ジスルフィド結合なく十分に折りたたまれ、細胞内でこの状態で機能することができる。

腫瘍形成性形質転換を遮断するＩＣＡｂから抗ＲＡＳ試薬への変換
上述の実験において、本発明者らは、ＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を正準のＩＡＣコンセンサスと等価にするＶＨおよびＶＬフレームワーク領域の突然変異分析によって、抗ＲＡＳ ＩＣＡｂの有効性を改善しようとした（Tse等、2002）。抗ＲＡＳ配列がＮＩＨ３Ｔ３細胞の発癌性ＲＡＳ形質転換を阻害するかどうかを評価することによって、本発明者らの所定のコンセンサスフレームワークの有用性をさらに試験した。本発明者らは、ＲＡＳをベイトとして使用した酵母スクリーニングから単離され（図１）、哺乳動物細胞において十分発現されるにもかかわらず（図７）有効な活性をもたないｓｃＦｖ Ｉ２１クローンを出発点とすることによって、これを評価した。ｓｃＦｖ３３からＩ２１Ｒ３３への突然変異誘発性（すなわち、ｓｃＦｖ３３のＶＨ ＣＤＲおよびＶＬ ＣＤＲを有するＩ２１フレームワーク）によって、ルシフェラーゼレポーターを活性化することができる十分に発現されたタンパク質が得られる（図８Ｂ）。本発明者らは、活性化ＨＲＡＳ（ＲＡＳＧ１２Ｖ）のみを発現するプラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトして、多層増殖可能であり、紡錘状細胞の渦巻き形をした形質転換増殖巣（非接触阻害コロニー）を生成させる競合形質転換アッセイにこのタンパク質を使用した（図９Ａ、ＲＡＳＧ１２Ｖ＋空ｓｃＦｖベクター）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＲＡＳＧ１２ＶベクターとｓｃＦｖＩ２１を発現するベクターを同時トランスフェクトすると、ＲＡＳ依存性ルシフェラーゼレポーターアッセイで認められた活性化の欠如に一致して、対照との差異は本質的に認められなかった（図９ＡおよびＢ）。一方、ＲＡＳＧ１２Ｖが突然変異Ｉ２１クローンのｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３とともに発現されると、おそらくｓｃＦｖとＲＡＳＧ１２Ｖ発現タンパク質とが相互作用し、その機能が阻害されるために、形質転換増殖巣の数は３０％に減少した。したがって、コンセンサス骨格は、本発明者らの実験において機能的ｓｃＦｖを生成する基礎となる。

上記明細書に述べたすべての刊行物を参照により本明細書に援用する。本発明に記載の方法およびシステムの様々な改変形態および変更形態が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求する本発明をそのような具体的実施形態に不当に限定すべきでないことを理解すべきである。実際、生化学、分子生物学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態の様々な変形形態が添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

参考文献

抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの細胞内抗体捕捉を示す図である。 哺乳動物細胞における抗ＲＡＳ ｓｃＦｖとＲＡＳタンパク質との相互作用を示す図である。Ａはルシフェラーゼアッセイ、Ｂはin situ免疫蛍光試験の結果をそれぞれ示す。 抗ＲＡＳ細胞内ｓｃＦｖの配列を示す図である。 抗ＲＡＳ細胞内ｓｃＦｖの配列を示す図である。 抗ＲＡＳ ｓｃＦｖのペリプラズムでの発現および精製を示す図である。 抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの特異的抗原結合および競合ＥＬＩＳＡを示す図である。 ＢＩＡｃｏｒｅを用いた抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの親和性測定を示す図である。Ａは抗ＲＡＳ ｓｃＦｖとＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ抗原（固定化１５００ ＲＵ）との結合を示すセンソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を示し、Ｂに、会合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）の値、ならびにＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウエアによる平衡解離定数（Ｋｄ）の計算値を要約する。 ＣＯＳ７細胞における発現ｓｃＦｖの可溶性に対するフレームワーク残基の影響を示す図である。 フレームワーク配列の突然変異による抗ＲＡＳ ＩＣＡｂとＲＡＳ抗原との細胞内相互作用の改善を示す図である。Ａは、ＣＯＳ７にｐＥＦＢＯＳＶＰ１６−ｓｃＦｖベクターおよびｐＭ１−ＲＡＳＧ１２Ｖ、ならびにルシフェラーゼレポータークローンをトランスフェクトし、ルシフェラーゼレベルを求めた結果を示している。Ｂは、コンセンサス配列骨格に変換するフレームワーク突然変異を含むｓｃＦｖを用いたＣＯＳ７細胞ツーハイブリッド抗体−抗原相互作用アッセイを示す。 抗ＲＡＳ ｓｃＦｖによるＲＡＳ依存性ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換活性の阻害を示す図である。Ａは、染色プレートの代表的な写真であり、Ｂは、形質転換増殖巣の相対的百分率を示す。

Claims (13)

1. 細胞内での使用に適切な抗体を生成する方法であって、
   (a)細胞内環境内で1以上の抗原と特異的に結合する能力について2以上の抗体を試験すること、およびこのような環境内で1以上の抗原と特異的に結合することが可能な抗体を選択すること、
   (b)細胞内環境内で可溶性である能力について2以上の抗体を試験すること、およびこのような環境内で可溶性である抗体を選択すること；ならびに
   (c)工程（b）で選択された抗体のフレームワーク領域および、工程(a)で選択される抗体由来のCDR配列から抗体を生成することを含む上記方法。
2. 細胞内での使用に適切な抗体を生成する方法であって、以下からなるリスト：図3にI21として記載されかつ配列番号4で表される重鎖フレームワーク領域、配列番号１で表されかつConとして記載されるコンセンサス配列の重鎖フレームワーク領域、図3にI21R33として記載されかつ配列番号7で表される重鎖フレームワーク領域、図3にI21として記載されかつ配列番号14で表される軽鎖フレームワーク領域、配列番号11で表されかつConとして記載されるコンセンサス配列の軽鎖フレームワーク領域、図3にI21R33として記載されかつ配列番号17で表される軽鎖フレームワーク領域、または（Kabatによる）22位と92位のアミノ酸残基がシステイン残基ではないこれらの重鎖フレームワーク配列のいずれか、から選択されるフレームワーク配列（またはこれらをコードする核酸）のいずれかを少なくとも用いて抗体を合成する工程を含む、上記方法。
3. 細胞内での使用に適切な抗体分子の合成方法であって、VHIIIサブグループに含まれ、かつ（Kabat番号付けによる）以下の：VH1位、グルタミン；VH5位リシン；VH7位、セリン；VH74位、セリン；VH77位、トレオニン；VH84位、VHアラニン；VH22位、システイン以外のいずれかのアミノ酸；VH92位、システイン以外の他のいずれかのアミノ酸、からなる群から選択される1以上のアミノ酸を示された位置で含む重鎖可変ドメイン（またはそれをコードする核酸）から抗体を合成する工程、および/またはV_K1サブグループに含まれ、かつ（Kabat番号付けによる）以下の：VL0位、トレオニン；VL4位、グルタミン、からなる群から選択される1以上のアミノ酸を示された位置で含む軽鎖可変ドメインから抗体を合成する工程を含む、上記方法。
4. 重鎖のVHIIIサブグループに含まれる重鎖可変ドメインを含む抗体分子を細胞内での使用に適切な抗体分子へ変換する方法であって、抗体重鎖可変ドメインの少なくとも1つを含む1以上のフレームワークアミノ酸（またはそれをコードする核酸）を、以下の：VH1位、グルタミン；VH5位リシン；VH7位、セリン；VH74位、セリン；VH77位、トレオニン；VH84位、VHアラニン；VH22位、システイン以外のいずれかのアミノ酸；VH92位、システイン以外の他のいずれかのアミノ酸、からなる群に（Kabat番号付けにより）示されるアミノ酸に突然変異させる工程を含む、上記方法。
5. 軽鎖のVK1サブグループに含まれる軽鎖可変ドメインを含む抗体分子を細胞内での使用に適切な抗体分子へ変換する方法であって、抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも1つを含む1以上のフレームワークアミノ酸（またはそれをコードする核酸）を、以下の：VL0位、トレオニン；VL4位、グルタミン、からなる群に（Kabat番号付けにより）示されるアミノ酸へ突然変異させる工程を含む、上記方法。
6. 抗体分子を細胞内での使用に適切なものへ変換する方法であって、生じるフレームワークアミノ酸配列が図3に示される以下の：配列番号１（VH-Con）、配列番号4（VH-I21）、配列番号7（VH-I21R33）17；または（Kabatによる）22位と92位のアミノ酸残基がシステイン残基でないこれらの重鎖フレームワーク配列のいずれか、からなる群から選択されるこれらの配列のいずれかを含むように、少なくとも抗体重鎖可変ドメインを含む1以上のフレームワークアミノ酸（またはそれをコードする核酸）を突然変異させる工程を含む、上記方法。
7. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により取得される抗体分子。
8. 抗体分子がDabである請求項7に記載の抗体分子。
9. 重鎖および軽鎖可変ドメインの両方を含む請求項7に記載の抗体分子。
10. VHI21（配列番号4）、VHI21R33（配列番号７）、または22位および92位のアミノ酸の1以上がシステインではないこれらいずれかの配列；VLI21（配列番号14）およびVLI21R33（配列番号17）、からなる図3に示される群から選択されるフレームワーク領域配列のいずれか1以上から作製されるライブラリー。
11. 請求項7〜9のいずれか1項に記載の1以上の抗体と、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物。
12. 1以上の疾患の予防および/または治療のための医薬製造における請求項7〜9のいずれか1項に記載の1以上の抗体の使用。
13. 細胞内環境内で1以上の抗原と特異的に結合する請求項7〜9のいずれか1項に記載の抗体の使用。

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