CN116023501A

CN116023501A - 一种抗her2的免疫毒素分子、及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116023501A
Application number: CN202111240483.9A
Authority: CN
Inventors: 肖建国; 黄浩旻; 朱祯平
Original assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Current assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-04-28
Also published as: WO2023071987A1; TW202325737A

Abstract

本发明提供了一种抗HER2的免疫毒素分子。本发明的免疫毒素分子从氨基端到羧基端包含H‑L1‑PE或PE‑L1‑H结构的融合多肽，其中H为抗HER2的抗体或其抗原结合片段；L1为连接子1；PE包含假单胞菌外毒素A的结构域III的部分或全部。本发明的免疫毒素分子可高特异性地靶向HER2阳性表达的癌细胞，实现高效杀伤癌细胞、抑制肿瘤生长。

Description

一种抗HER2的免疫毒素分子、及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体地，本发明涉及一种抗HER2的免疫毒素分子、及其制备方法与应用。

背景技术

表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是表皮生长因子受体家族四成员之一，在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中均有表达。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)近日发布的2020年全球最新癌症负担数据，全球乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例，成为了全球第一大癌种。而在乳腺癌患者中，HER2阳性患者的比例达到20％～25％，其肿瘤生物学特征恶性程度高，转移和死亡率更高。曲妥珠单抗、帕妥珠单抗以及两种药物的固定剂量组合制剂均改善了HER2阳性乳腺癌的临床治疗获益和生存期。

抗体偶联药物(ADCs)通过单克隆抗体与肿瘤细胞表面的特异性抗原结合，将细胞毒药物定向递送到肿瘤病灶，随着小分子毒素被释放，可以实现与DNA小沟或微管蛋白结合等多种机制诱导癌细胞的凋亡，发挥药物的细胞毒性，由此，也为HER2阳性乳腺癌患者提供了新的治疗选择。ADC也被认为是未来十年单克隆抗体药物发展(特别是在肿瘤靶向治疗领域)的重要方向之一。根据Evaluate Pharma和BCG的预测，全球ADC市场预计2024年将达到129亿美元，2018至2024年的年复合增长率约为35％。当前，全球商业化最成功的ADC药物是治疗HER2阳性乳腺癌的Kadcyla(恩美曲妥珠单抗，T-DM1)，该药已是HER2阳性乳腺癌在国际上的二线标准治疗方案，2019年全球销售额达到13.93亿瑞士法郎(2020年前三季度销售额12.95亿瑞士法郎，同比增长37％)。2019年5月，Kadcyla还被FDA批准为HER2阳性早期乳腺癌患者(接受紫杉烷和曲妥珠单抗治疗后仍残留浸润性疾病)的辅助治疗方案，市场空间进一步扩容。紧随其后的是由第一三共和阿斯利康联合开发的Enhertu(DS-8201a)，这款ADC于2019年12月被FDA首次批准用于治疗HER2阳性乳腺癌。

在过去的数年中，免疫偶联物已被开发为治疗恶性肿瘤的备选治疗方法。免疫偶联物最初由抗体与植物或细菌毒素通过化学偶联组成，该免疫偶联物为一种被称为免疫毒素的形式。抗体与靶细胞上表达的抗原结合，并且毒素被内化，从而通过阻止蛋白合成和诱导凋亡引起细胞死亡(Brinkmann，U.，Mol.Med.Today，2：439-446(1996))。最近，已经将编码抗体和毒素的基因融合，并将免疫毒素表达为融合蛋白。已有很多研究在利用称为假单胞菌外毒素A(“PE”)的细菌毒素作为毒性部分的免疫毒素上进行。通常，将PE截短或突变，从而降低其非特异性毒性，但又不会破坏其对于被免疫毒素的靶向部分所靶向的细胞的毒性。目前，对利用基于PE的免疫毒素作为多种癌症的治疗手段的测试正进行临床试验。

目前，HER2阳性乳腺癌的二线及后期治疗仍然面临有效治疗手段不足的困境，因此临床上存在开发靶向HER2的免疫毒素分子的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抗HER2的免疫毒素分子，该免疫毒素分子可高特异性地靶向HER2阳性表达的癌细胞，实现高效杀伤癌细胞，从而抑制肿瘤生长。本发明的目的还在于提供编码所述免疫毒素分子的核酸分子；提供包含所述核酸分子的表达载体；提供包含所述表达载体的宿主细胞；提供所述免疫毒素分子的制备方法；提供包含所述免疫毒素分子的药物组合物；提供所述免疫毒素分子或所述药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用；提供所述免疫毒素分子或所述药物组合物用于治疗癌症的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明的第一个方面提供了一种抗HER2的免疫毒素分子，从氨基端到羧基端包含H-L1-PE或PE-L1-H结构的融合多肽，其中H为抗HER2的抗体或其抗原结合片段；L1为连接子1；PE包含假单胞菌外毒素A的结构域III的部分或全部。

在一个优选的实施方案中，所述抗HER2的免疫毒素分子从氨基端到羧基端包含H-L1-PE结构的融合多肽。

在一个优选的实施方案中，所述抗HER2的抗体或其抗原结合片段包含单链抗体scFv。

在一个优选的实施方案中，所述单链抗体scFv从氨基端到羧基端包含VL-L2-VH或VH-L2-VL结构的融合多肽，其中VL为轻链可变区，VH为重链可变区，L2为连接子2。

在一个更优选的实施方案中，所述单链抗体scFv从氨基端到羧基端包含VL-L2-VH结构的融合多肽。

在一个优选的实施方案中，所述VH包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；所述VL包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在一个优选的实施方案中，所述单链抗体scFv包含氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的VL或其变体，和氨基酸序列如SEQ ID NO：17所述的VH或其变体，所述变体包含1-5个氨基酸突变。

在一个更优选的实施方案中，所述VL包含Q100C突变，所述VH包含K44C突变。

在一个优选的实施方案中，所述单链抗体scFv包含氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的VL，和氨基酸序列如SEQ ID NO：15所述的VH。

在一个优选的实施方案中，所述L2包含(G4S)_n，其中n选自1-6的任意整数；优选的，所述L2包含(G4S)₄。

在一个优选的实施方案中，所述单链抗体scFv包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：2具有至少98％或99％以上同一性的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述PE为PE25，包含如SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述PE包含至少1个氨基酸突变。

在一个优选的实施方案中，所述L1包含组织蛋白酶B的裂解位点；更优选的，所述L1包含裂解位点Gly-Phe-Leu-Gly。

在一个更优选的实施方案中，所述L1包含如SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述抗HER2的免疫毒素分子包含如SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。

本发明的第二个方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的抗HER2的免疫毒素分子。

在一个优选的实施方案中，所述核酸分子还包含如启动子、终止子、增强子等基因调控元件。

在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述的核酸分子。

在一个优选的实施方案中，所述表达载体是pET-28a。

本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的表达载体。

在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌；更优选的，所述宿主细胞是BL21(DE3)。

本发明的第五个方面提供了一种抗HER2的免疫毒素分子的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗HER2的免疫毒素分子；b)分离并纯化步骤a)所述的抗HER2的免疫毒素分子。

在一个优选的实施方案中，所述纯化包括使用Protein L亲和层析纯化。

本发明的第六个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的上述的抗HER2的免疫毒素分子和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的第七个方面提供了上述的抗HER2的免疫毒素分子或药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为HER2阳性表达的癌症。

在一个优选的实施方案中，所述癌症为HER2高表达的癌症。

在一个优选的实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌和非小细胞肺癌。

本发明的第八个方面提供了一种治疗HER2阳性表达的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述的抗HER2的免疫毒素分子或药物组合物，所述癌症为HER2阳性表达的癌症。

在一个优选的实施方案中，所述癌症为HER2高表达的癌症。

本发明的第九个方面提供了上述的抗HER2的免疫毒素分子或药物组合物在制备杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长的药物中的应用，所述癌细胞为HER2阳性表达的癌细胞。

在一个优选的实施方案中，所述癌细胞为HER2高表达的癌细胞。

在一个优选的实施方案中，所述癌细胞选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌和非小细胞肺癌细胞。

在一个更优选的实施方案中，所述癌细胞为HCC19549细胞或SKBR3细胞。

本发明的第十个方面提供了一种杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述的抗HER2的免疫毒素分子或药物组合物，所述癌细胞为HER2阳性表达的癌细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1 Tra-PE25的SDS-PAGE检测

图2 Tra-PE25免疫毒素ELISA检测

图3 Tra-PE25在HCC1954细胞中的杀伤活性检测

图4 Tra-PE25在BEAS-2B细胞中的杀伤活性检测

图5 Tra-PE25质谱检测

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，构建了一种抗HER2的免疫毒素分子，包含抗HER2抗体或其抗原结合片段、假单胞菌外毒素A的部分或全部、连接子三个部分。实验结果表明，本发明的抗HER2的免疫毒素分子能与肿瘤细胞表面的特异性抗原HER2结合，将细胞毒药物定向递送到肿瘤病灶，随后细胞毒药物会被细胞内化、加工并释放毒素PE25，抑制细胞蛋白质翻译，导致细胞凋亡。在此基础上完成了本发明。

以下实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法或本领域常规方法的详细描述，如核酸分子的制备方法、用于构建载体和质粒的方法、将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法、宿主细胞的培养方法，蛋白的纯化方法等，这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

术语

抗HER2的免疫毒素分子

本发明中，术语“免疫毒素(Immunotoxin)分子”是指由抗体或其抗原结合片段(抗体部分)与毒素(毒素部分)组成的融合多肽(融合蛋白)。其中，抗体部分可特异性地与抗原结合，靶向细胞；毒素部分被与抗体部分结合的细胞胞吞，从而在细胞内发挥毒素的细胞杀伤或促细胞凋亡等作用。

本发明中，术语“融合多肽”是指由两个或多个相同或不同的多肽序列融合得到的新的多肽序列。术语“融合”是指由肽键直接连接或借助一个或多个连接子有效连接。

本发明中，术语“抗体”是指全长抗体，术语“抗原结合片段”是指来源于抗体且能结合抗原表位的片段，包括但不限于scFv、Fv、Fd、Fab、F(ab')2或F(ab')。

本发明中，术语“scFv”是指通过连接子连接一个VH区和一个VL区形成的多肽单链。

本发明中，术语“全长抗体”是指有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，包含可变区和恒定区，其由两条相同的重链(HC)和两条相同的轻链(LC)组成。每条重链的一端有重链可变区(VH)，其后是重链恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有轻链可变区(VL)，另一端有轻链恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链可变区与重链可变区配对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。

本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的CDR分别称为HCDR和LCDR。

本发明中，术语“框架区“(FR)”指抗体可变区内超变区之外的氨基酸组成和排列顺序变化相对较小的部分。抗体的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。本领域的技术人员在获知CDR的氨基酸序列后，可确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H序列。

本发明中，术语“抗”和“结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface PlasmonResonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。

本发明中，术语“连接子(Linker)”用于连接2个多肽链。合适的连接子可以是具有柔性的多肽序列，其实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，连接子中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。

本领域技术人员可以通过本领域熟知的技术对本发明的抗体部分或毒素部分进行修饰或改造，例如添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基，从而进一步改善或优化免疫毒素分子(例如改善亲和力)，并通过常规的测定方法获得修饰或改造后的结果。

在本发明中，本发明的抗体部分还包括其保守性变异体，指与本发明的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多7个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明中，术语“PE”是指假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin，PE)，为由613个氨基酸残基组成的单链毒素蛋白(GeneBank登陆号1IKQ_A)，分子量约66kD。PE包含三个结构域DI、DⅡ、DⅢ。其中DI为结合区，由第1-252位氨基酸残基组成，可引导PE与靶细胞膜上的受体识别并结合。DⅡ为转位区，由第253-384位氨基酸残基组成，负责PE的跨膜转运，使其进入细胞；DⅢ为活性区，由第385-613位氨基酸残基组成，催化延长因子2的ADP核糖基化，导致Ef2失活，从而抑制细胞蛋白合成，最终导致细胞死亡。

本发明中，术语“PE25”为截短的PE，包含序列如SEQ ID NO：4所示的多肽，或SEQID NO：4的变体，所述变体是指包括至少一个突变(如取代、缺失或插入突变)的SEQ ID NO：4，所述PE25保留了PE的抑制细胞蛋白合成的活性。

本发明中，术语“组织蛋白酶B”是一种存在于溶酶体内的半胱氨酸蛋白水解酶,在肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中，组织蛋白酶B的表达均成倍高于甚至3-9倍高于邻近的正常组织。组织蛋白酶B可以选择性地识别并降解一些多肽片段,如Val-Cit、Phe-Lys、Gly-Phe-Leu-Gly等。

本发明中，术语“多肽”和“蛋白”可互换使用。

本发明中，“-”代表肽键。

编码核酸和表达载体

本发明还提供了编码上述抗HER2的免疫毒素分子的核酸分子。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明中，术语“表达载体”是指携带表达盒用于表达特定目的蛋白或其他物质的载体，如质粒、病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、噬菌体、酵母质粒或其他载体。例如包含适当的调控序列，例如启动子、终止子、增强子、标记基因和/或序列等的本领域的常规表达载体，所述表达载体包括但并不限于：病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。所述表达载体较佳地包括pDR1、pcDNA3.4(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR、pTT5、pET-28a、pET-21a，pCGS3。更多技术细节请参见例如Sambrook等，MolecμLar Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见CurrentProtocols in MolecμLar Biology，第二版，Ausubel等编著。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明中，术语“宿主细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能使载体稳定地自行复制，且所携带的多核苷酸分子可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293F或293E细胞。

药物组合物和应用

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗HER2的免疫毒素分子，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为4-8，较佳地pH约为5-7，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。

本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的抗HER2的免疫毒素分子可以和药学上可以接受的载体、释剂或赋形剂一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗HER2的免疫毒素分子氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗HER2的免疫毒素分子以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的抗HER2的免疫毒素分子还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，术语“有效量”是指本发明的抗HER2的免疫毒素分子施用受试者后，在治疗的个体中产生预期效果的量或剂量，该预期效果包括个体病症的改善。术语“受试者”包括但不限于哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、大鼠和小鼠等。

本发明的主要优点包括：

1)本发明的抗HER2的免疫毒素分子能与肿瘤细胞表面的HER2抗原特异结合，可靶向HER2高表达细胞，具有较好的靶向性。

2)本发明的抗HER2的免疫毒素分子具有较强的乳腺癌细胞杀伤活性，且其杀伤活性优于T-DM1(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)，获得了意料不到的技术效果。

3)本发明的抗HER2的免疫毒素分子在大肠杆菌中表达可溶，不需要变复性，纯化过程简单，纯度好，产量高。

4)在连接靶向HER2的抗体分子Ds4d5Fv和PE25的Linker1中含有组织蛋白酶B裂解位点Gly-Phe-Leu-Gly，该Linker1在血浆中非常稳定，当HER2阳性癌细胞摄取了Tra-PE25后，经细胞内溶酶体酶切后释放PE25，精准杀伤癌细胞。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

以下实施例中使用的实验材料和实验试剂，如无特殊说明，均为常规商购获得。

以下实施例中使用的检测方法说明如下：

1、SDS-PAGE检测：

检测系统：Mini protein TeTra system

检测条件：140V恒压45-55min

2、紫外检测：

仪器型号：Nanodrop one(Thermo)

消光系数：1.42

3、Protein A亲和层析

层析柱：XK16/20(GE)

填料：Protein L(金斯瑞)

层析系统：AKTA Pure150(GE)

操作系统：unicorn 7.0(GE)

流速：1.0mL/min

4、ELISA检测及处理

酶标仪：SpecTraMax 190，波长450nm

处理软件：GraphPad Prism 9

实施例1.抗HER2的免疫毒素表达载体的构建

1.1.Anti-HER2免疫毒素氨基酸的设计，以及其基因和相关元件序列的设计

Anti-HER2免疫毒素分子Tra-PE25，其结构为：Ds4d5Fv-Linker1(L1)-PE25，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中Ds4d5Fv来源于曲妥珠单抗的Fv，由VL和VH通过连接子Linker2(L2)连接构建获得，其中VL包含Q100C突变，VH包含K44C突变，命名为Q100C VL 4(G4S)K44C VH(SEQ IDNO：2)。按Kabat系统规则编号。

连接子Linker1(L1)为GGGSGGGGSGSSGFLGSSGSSGLGFGGSSGG(SEQ ID NO：3)；PE25(SEQ ID NO：4)为假单胞菌外毒素PE的DIII区(395-613位)，具有完整的催化活性。

为了提高表达量，编码Tra-PE25的氨基酸序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列用大肠杆菌的密码子优化得到SEQ ID NO：5。为了便于表达，在SEQ ID NO：5的5’加入起始密码子ATG，在SEQ ID NO：5的5’加入终止密码子TAA，得到编码Anti-HER2免疫毒素分子Tra-PE25基因和相关元件序列(SEQ ID NO：6)。

表B序列表(Kabat系统规则编号与定义)

注：小写字母：PE氨基酸序列；单下划线标记：抗体CDR区氨基酸序列；双下划线标记：连接子氨基酸序列；斜体：抗体突变位点。

1.2.抗HER2的免疫毒素表达载体的制备

全基因合成Anti-HER2免疫毒素分子Tra-PE25基因和相关元件序列(SEQ ID NO：6)插入pET-28a的表达框，构建Tra-PE25 PET28a质粒与其质粒菌。提取质粒TRA-PE25PET28a备用。

实施例2.抗HER2的免疫毒素表达菌株的构建

将实施例1.2构建的质粒Tra-PE25 PET28a转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素抗性的2YT琼脂平板，随后挑取单克隆IPTG诱导表达，SDS PAGE检测筛选。挑选表达量最高的细胞株进行后续试验。

实施例3.抗HER2的免疫毒素表达纯化

3.1.IPTG诱导表达抗HER2的免疫毒素

将甘油菌种按体积比为1：1000比例接种含卡那抗性培养基，37度，150rpm培养过夜；将种子液按照体积比为1：1000比例接种含卡那抗性培养基，37度，150rpm培养到OD600为0.7；加入IPTG使终浓度为1mM，25度，120rpm，继续培养18小时；离心8000rpm×5min，去除上清，收集菌体。

将收集到的菌体称重，按照重量比例1：20，用PBS重悬菌体，并充分搅拌；使用破碎仪器：超高压连续流细胞破碎仪，编号：JN-MiniPro，充分破碎；破碎条件：4度，压力值1000Ba，破碎两遍；离心破碎后的菌液，4度，10000rpm，30min，收集上清；用0.22微米滤膜过滤上清。

3.2.Protein L亲和层析分离纯化抗HER2的免疫毒素

使用AKTA Pure150(GE)层析系统来进行亲和层析，色谱柱HiTraP Protein L 5mlpre-column(cytiva)。仪器操作按操作指南进行，A1泵为Buffer A(PBS，pH7.4)，B1泵为Buffer B(50mM甘氨酸缓冲液，pH2.5)。

1)平衡：Buffer A以1mL/min流速冲洗10CV(柱体积)，以维持Protein L凝胶环境适合抗HER2免疫毒素与Protein L的结合。

2)上样：以1mL/min的速率通过Protein L凝胶，使抗HER2免疫毒素与Protein L能特异性的结合。

3)冲平：Buffer A以1mL/min流速冲洗至280nm吸收值低于0.01。

4)洗脱：以1mL/min流速，Buffer B冲洗Protein L凝胶，收集洗脱峰。

5)中和：洗脱峰收集样品用50mM甘氨酸缓冲液(PH 9.0)调pH至7.4。每升培养液可以纯化5mgTra-PE25。

6)SDS-PAGE检测分析纯化得到的抗HER2免疫毒素Tra-PE25。SDS-PAGE如图1所示。

实施例4.抗HER2的免疫毒素ELISA检测

1、包被抗原Her2-ECD-His(SEQ ID NO：7)，每孔100μL，浓度为1μg/mL，于4℃孵育过夜。

2、洗涤：取出包被好抗原的Elisa板，用洗涤缓冲液PBST洗板3次，拍干Elisa板等待下一步封闭。

3、封闭：每孔加入200μL封闭液(PBST+1％BSA)，于室温封闭2h。

4、洗涤：用洗涤缓冲液PBST洗板3次，拍干备用。

5、加入一抗Tra-PE25

1)稀释抗体：在96孔细胞培养板中进行一抗稀释(稀释液为封闭液)：初始浓度为300nM，从左至右依次以2.5倍稀释，稀释11个梯度，第12列设置为不加一抗的空白对照。每个样品，每个梯度设置2个复孔。

2)每孔加入100μL稀释好的一抗，于室温封闭2h。

6、洗涤：用洗涤缓冲液PBST洗板3次，拍干备用。

7、加入二抗：按1：1000的比例用封闭液(PBST+1％BSA)稀释Protein L HRP(SEQID NO：18)，每孔加入100μL稀释好的二抗，于室温避光孵育1h。

8、洗涤：用洗涤缓冲液PBST洗板3次，拍干备用。

9、显色：每孔加入100μL新鲜配制的显色液(TMB)，于室温避光孵育5分钟。

10、终止：每孔加入70μL终止液(2M H₂SO₄)，混匀后，立即到酶标仪上读数，检测波长为450nm。处理数据图谱如图2所示。

图2显示Tra-PE25的EC50为4.220nM，说明Tra-PE25具有较好的与抗原HER2的结合活性。

实施例5.抗HER2的免疫毒素细胞杀伤活性检测

5.1对人乳腺癌细胞杀伤活性检测(HER2高表达)

5.1.1实验材料

1)细胞：HCC19549(人乳腺导管癌细胞)购于ATCC。

2)完全培养基：RPMI 1640+15％FBS+1％Pen-Strep。

3)0.25％Trypsin-EDTA、DPBS、Trypan Blue。

4)CCK-8试剂。

5.1.2实验步骤

1)细胞消化：HCC1954细胞培养至密度达到80％-90％，弃去上清后，用DPBS清洗一遍，加0.25％Trypsin-EDTA，37℃消化3min后，加完全培养基终止，吹打混匀。

2)密度测定与调整：细胞悬液与0.2％Trypan Blue 1:1混合，使用细胞计数仪计数后，调整细胞密度至1.4×10⁴cells/mL。

3)细胞铺板：调整密度后，将细胞悬液铺板至96孔板(3599)，150μL/孔，即2100cells/孔，37℃，5％CO₂培养过夜使细胞贴壁。

4)药物稀释与添加：完全培养基配制药物至终浓度400nM，过滤。4倍梯度依次稀释后，加入96孔板，50μL/孔，则终浓度为100nM起始，4倍梯度稀释。对照T-DM1 500nM起始，4倍梯度稀释。

5)药物孵育：37℃，5％CO₂培养4天。

6)CCK8显色：弃去上清，将96孔板倒扣在吸水纸上晾干后，添加10％CCK-8显色，100μL/孔。37℃孵育1.5h后，使用酶标仪于450nm处读板。

7)数据分析：以不加细胞的孔作为空白对照，记作0％，以加细胞但不加药物的孔作为阴性对照，记作100％。使用GraphPad Prism 9作图并拟合曲线，比较不同药物之间的IC50(nM)的差异。

生物活性检测如图3所示，图3表明Tra-PE25的EC50为0.120nM，对照阳性药物T-DM1的EC50为17.05nM，由此可知，Tra-PE25具有较强的生物活性，可以杀死人乳腺导管癌细胞HCC1954，且对癌细胞的杀伤活性显著高于阳性对照T-DM1。

5.2对人肺正常细胞BEAS-2B杀伤活性检测(HER2不表达)

5.2.1实验材料

1)细胞：BEAS-2B(人正常肺上皮细胞)。

2)完全培养基：RPMI 1640+10％FBS+1％Sodium Pyruvate+1％GlutaMax+1％Pen-Strep。

3)0.05％Trypsin-EDTA、DPBS、Trypan Blue、人血清白蛋白(HSA)。

4)CCK-8试剂。

5.2.2实验步骤

1)细胞消化：BEAS-2B细胞培养至密度达到80％-90％，弃去上清后，用DPBS清洗一遍，加0.05％Trypsin-EDTA，37℃消化2min后，加完全培养基终止，吹打混匀。

2)密度测定与调整：细胞悬液与0.2％Trypan Blue 1:1混合，使用细胞计数仪计数后，调整细胞密度至1×10⁴cells/mL。

3)细胞铺板：调整密度后，将细胞悬液铺板至96孔板(3599)，150μL/孔，即1500cells/孔，37℃，5％CO₂培养过夜使细胞贴壁。

4)药物配制与过滤：完全培养基配制药物至终浓度400nM，过滤除菌。完全培养基配制HSA至终浓度8μM，过滤除菌。

5)药物稀释与添加：药物与HSA溶液(或完全培养基)按照体积比4：1混合，4倍梯度依次稀释后，加入96孔板，50μL/孔，则终浓度为药物80nM起始，HAS 400nM起始，4倍梯度稀释。

6)药物孵育：37℃，5％CO₂培养6天。

7)CCK8显色：弃去上清，将96孔板倒扣在吸水纸上晾干后，添加10％CCK-8显色，100μL/孔。37℃孵育1.5h后，使用酶标仪于450nm处读板。

8)数据分析：以不加细胞的孔作为空白对照，记作0％，以加细胞但不加药物的孔作为阴性对照，记作100％。使用GraphPad Prism 9作图并拟合曲线，比较不同药物之间的IC50(nM)的差异。

生物活性检测如图4所示，图4表明Tra-PE25对正常细胞几乎没有杀伤活性。

实施例6.抗HER2的免疫毒素质谱检测

1)质谱条件：

Waters公司UPLC-XEVO G2 Q-TOF液质联用系统。系统液相部分配置为：BSM二元高压混合泵，SM样品管理器，TUV紫外检测器；质谱部分配置为：ESI源，Q-TOF检测器。数据处理分析采用Masslynx V4.1及BiopharmaLynx分析软件(Version：1.2)。

MS数据均采用轮廓图(continuum)模式，在Resolution模式下采集；LockSpray采集模式为：实时采集并不应用校准。

校准溶液：实时校准(LockSpray)溶液：2ng/μL LE溶液。

质量轴的校正溶液：2μg/μL碘化钠溶液。

质谱参数见表1。

2)液相条件：

色谱柱：Mass PREPTM Micro Desalting Column 2.1×5mm(完整蛋白分子量分析)，柱温：80℃。

流动相A：0.1％FA-H₂O。

流动相B：0.1％FA-CAN。

Seal Wash溶液：10％IPA。

质谱清洗液：50％ACN。

质谱IntelliStart阀清洗液：50％MeOH。

进样体积：10μL。

样品室温度：10℃。

梯度洗脱条件见表2。

表1.质谱参数

表2.梯度洗脱条件

表3 Tra-PE25样品完整分子量

样品名称	理论分子量(Da)	实测分子量(Da)
			Tra-PE25	52364.15	52363.34

质谱检测结果如图5和表3所示，表明本发明的Tra-PE25较均一，与设计基本一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 一种抗HER2的免疫毒素分子、及其制备方法与应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Ser Ser Gly Phe Leu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Leu Gly Phe

260 265 270

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly

275 280 285

Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu

290 295 300

Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe

305 310 315 320

Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe

325 330 335

Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly

340 345 350

Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp

355 360 365

Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg

370 375 380

Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu

385 390 395 400

Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly

405 410 415

His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu

420 425 430

Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr

435 440 445

Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly

450 455 460

Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala

465 470 475 480

Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu

485 490 495

Lys

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Phe Leu Gly

1 5 10 15

Ser Ser Gly Ser Ser Gly Leu Gly Phe Gly Gly Ser Ser Gly Gly

20 25 30

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser

1 5 10 15

Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His

20 25 30

Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

35 40 45

Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg

50 55 60

Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp

65 70 75 80

Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg

85 90 95

Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser

100 105 110

Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

115 120 125

Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg

130 135 140

Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr

145 150 155 160

Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala

165 170 175

Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser

180 185 190

Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

195 200 205

Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys

210 215

<210> 5

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatatacaaa tgacacagtc tccctcaagt ctgagcgcct ccgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgtc gtgcttccca agatgttaat accgctgtgg catggtatca gcagaaaccg 120

ggtaaggctc cgaaactgct gatctactcc gcgagctttc tgtatagcgg tgttccgagc 180

cgtttcagcg gctctcgctc tggcactgac tttaccctga ccatcagctc cttacaaccg 240

gaggattttg caacctatta ctgccagcaa cattatacca ccccgccaac cttcgggtgc 300

ggtacgaaag tcgagatcaa gggtggcggc ggctcgggcg gcggtggttc cggtggcggc 360

ggtagtggcg gtggtggctc tgaagtgcag ctggtcgaga gcggcggcgg tctggtgcag 420

ccgggcggct ccctgcgcct gtcttgtgca gctagtggtt ttaacattaa ggatacgtac 480

atccactggg ttcgtcaagc tccgggtaag tgcctggaat gggtcgcacg tatttacccg 540

acgaacggtt acacccgtta tgcggatagc gttaaaggtc gctttaccat ctctgcggat 600

accagcaaaa acaccgcata cctgcaaatg aacagcttgc gcgcagagga caccgcggtt 660

tactactgca gccgttgggg cggtgacggc ttctacgcca tggattattg gggtcagggt 720

actctggtaa ctgtgagctc aggtggtggt agcggcggtg gcggctccgg ctctagcggt 780

ttcctgggtt ctagcggcag ttccggcctg ggtttcggcg ggtcgtcggg cggaccgact 840

ggtgcagaat ttttgggtga cggcggtgac gttagctttt ctacacgtgg tacgcagaat 900

tggaccgtcg agcgcctttt gcaggcgcat cgtcagctgg aggagcgcgg ttacgtgttc 960

gtgggctacc acggcacctt cctagaggcc gcgcaaagca ttgttttcgg cggggtgcgt 1020

gcgcgtagcc aagatctgga cgcgatttgg cgtggcttct atattgctgg agacccggca 1080

ttggcctatg gttatgcgca ggatcaggag ccggatgcgc gtggacgtat tcgtaatggc 1140

gcgctgttgc gcgtgtatgt tccgagaagc tccctgccgg gtttctaccg caccagtctg 1200

accctggccg cgccagaagc ggcgggtgaa gtagagcgtt taattggtca cccgttgcct 1260

ctccgtttgg acgccatcac cggtccggaa gaggaaggtg gtcgcttgga aaccatcctg 1320

ggctggccgt tagcagagcg cacggttgtt atcccgagcg cgattccgac ggacccacgc 1380

aacgttggtg gagatctgga cccgagctcg atcccggata aggaacaggc gatcagcgcg 1440

ctgccggact acgcgagcca accgggtaag ccgcctcgtg aagacctgaa a 1491

<210> 6

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggatatac aaatgacaca gtctccctca agtctgagcg cctccgtggg tgatcgtgtg 60

accattacct gtcgtgcttc ccaagatgtt aataccgctg tggcatggta tcagcagaaa 120

ccgggtaagg ctccgaaact gctgatctac tccgcgagct ttctgtatag cggtgttccg 180

agccgtttca gcggctctcg ctctggcact gactttaccc tgaccatcag ctccttacaa 240

ccggaggatt ttgcaaccta ttactgccag caacattata ccaccccgcc aaccttcggg 300

tgcggtacga aagtcgagat caagggtggc ggcggctcgg gcggcggtgg ttccggtggc 360

ggcggtagtg gcggtggtgg ctctgaagtg cagctggtcg agagcggcgg cggtctggtg 420

cagccgggcg gctccctgcg cctgtcttgt gcagctagtg gttttaacat taaggatacg 480

tacatccact gggttcgtca agctccgggt aagtgcctgg aatgggtcgc acgtatttac 540

ccgacgaacg gttacacccg ttatgcggat agcgttaaag gtcgctttac catctctgcg 600

gataccagca aaaacaccgc atacctgcaa atgaacagct tgcgcgcaga ggacaccgcg 660

gtttactact gcagccgttg gggcggtgac ggcttctacg ccatggatta ttggggtcag 720

ggtactctgg taactgtgag ctcaggtggt ggtagcggcg gtggcggctc cggctctagc 780

ggtttcctgg gttctagcgg cagttccggc ctgggtttcg gcgggtcgtc gggcggaccg 840

actggtgcag aatttttggg tgacggcggt gacgttagct tttctacacg tggtacgcag 900

aattggaccg tcgagcgcct tttgcaggcg catcgtcagc tggaggagcg cggttacgtg 960

ttcgtgggct accacggcac cttcctagag gccgcgcaaa gcattgtttt cggcggggtg 1020

cgtgcgcgta gccaagatct ggacgcgatt tggcgtggct tctatattgc tggagacccg 1080

gcattggcct atggttatgc gcaggatcag gagccggatg cgcgtggacg tattcgtaat 1140

ggcgcgctgt tgcgcgtgta tgttccgaga agctccctgc cgggtttcta ccgcaccagt 1200

ctgaccctgg ccgcgccaga agcggcgggt gaagtagagc gtttaattgg tcacccgttg 1260

cctctccgtt tggacgccat caccggtccg gaagaggaag gtggtcgctt ggaaaccatc 1320

ctgggctggc cgttagcaga gcgcacggtt gttatcccga gcgcgattcc gacggaccca 1380

cgcaacgttg gtggagatct ggacccgagc tcgatcccgg ataaggaaca ggcgatcagc 1440

gcgctgccgg actacgcgag ccaaccgggt aagccgcctc gtgaagacct gaaataa 1497

<210> 7

<211> 636

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser

1 5 10 15

Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln

20 25 30

Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser

35 40 45

Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile

50 55 60

Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val

65 70 75 80

Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp

85 90 95

Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro

100 105 110

Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys

115 120 125

Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr

130 135 140

Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr

145 150 155 160

Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met

165 170 175

Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser

180 185 190

Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro

195 200 205

Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly

210 215 220

Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly

225 230 235 240

Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr

245 250 255

Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser

260 265 270

Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser

275 280 285

Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp

290 295 300

Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys

305 310 315 320

Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser

325 330 335

Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu

340 345 350

Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala

355 360 365

Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile

370 375 380

Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu

385 390 395 400

Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn

405 410 415

Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly

420 425 430

Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His

435 440 445

Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe

450 455 460

Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp

465 470 475 480

Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly

485 490 495

His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe

500 505 510

Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu

515 520 525

Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu

530 535 540

Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp

545 550 555 560

Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala

565 570 575

Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp

580 585 590

Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys

595 600 605

Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln

610 615 620

Arg Ala Ser Pro Leu Thr His His His His His His

625 630 635

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 700

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Lys Glu Glu Thr

1 5 10 15

Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

20 25 30

Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

35 40 45

Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Thr Leu

50 55 60

Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

65 70 75 80

Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro

85 90 95

Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys

100 105 110

Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu

115 120 125

Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr

130 135 140

Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

145 150 155 160

Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala

165 170 175

Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly

180 185 190

Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu

195 200 205

Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr

210 215 220

Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro

225 230 235 240

Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys

245 250 255

Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu

260 265 270

Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr

275 280 285

Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly

290 295 300

Lys Lys Val Asp Glu Lys Pro Glu Glu Lys Glu Gln Val Thr Ile Lys

305 310 315 320

Glu Asn Ile Tyr Phe Glu Asp Gly Thr Val Gln Thr Ala Thr Phe Lys

325 330 335

Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu

340 345 350

Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly

355 360 365

Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp

385 390 395 400

Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn

405 410 415

Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Ile Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His

420 425 430

Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp

435 440 445

Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn

450 455 460

Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val Ile Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu

465 470 475 480

Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala

485 490 495

Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu Ala Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro

500 505 510

Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gln Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe

530 535 540

Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly

545 550 555 560

Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gln Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu

565 570 575

Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr

580 585 590

Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly Leu Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser

595 600 605

Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys

610 615 620

Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Gln Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln

625 630 635 640

Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg

645 650 655

Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln Thr Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala

660 665 670

Met Asp Arg Met Gly Asn Ile Thr Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln

675 680 685

Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val Val Asn Ser Asn Ser

690 695 700

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

Claims

1.一种抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，从氨基端到羧基端包含H-L1-PE或PE-L1-H结构的融合多肽，其中H为抗HER2的抗体或其抗原结合片段；L1为连接子1；PE包含假单胞菌外毒素A的结构域III的部分或全部。

2.如权利要求1所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述抗HER2的抗体或其抗原结合片段包含单链抗体scFv。

3.如权利要求2所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述单链抗体scFv从氨基端到羧基端包含VL-L2-VH或VH-L2-VL结构的融合多肽，其中VL为轻链可变区，VH为重链可变区，L2为连接子2；优选的，所述单链抗体scFv从氨基端到羧基端包含VL-L2-VH结构的融合多肽。

4.如权利要求3所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述VH包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；所述VL包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

5.如权利要求4所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述单链抗体scFv包含氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的VL或其变体，和氨基酸序列如SEQ ID NO：17所述的VH或其变体，所述变体包含1-5个氨基酸突变；优选的，所述VL包含Q100C突变，所述VH包含K44C突变。

6.如权利要求3所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述L2包含(G4S)_n，其中n选自1-6的任意整数；优选的，所述L2包含(G4S)₄。

7.如权利要求3所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述单链抗体scFv包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：2具有至少98％或99％以上同一性的氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述PE为PE25，包含如SEQID NO：4所述的氨基酸序列。

9.如权利要求1所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述L1包含组织蛋白酶B的裂解位点；优选的，所述L1包含如SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列。

10.如权利要求1所述的抗HER2的免疫毒素分子，其特征在于，所述抗HER2的免疫毒素分子包含如SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。

11.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-10任一项所述的抗HER2的免疫毒素分子。

12.如权利要求11所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

13.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求11或12所述的核酸分子。

14.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求13所述的表达载体。

15.一种如权利要求1所述的抗HER2的免疫毒素分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a)在表达条件下，培养根据权利要求14所述的宿主细胞，从而表达抗HER2的免疫毒素分子；b)分离并纯化步骤a)所述的抗HER2的免疫毒素分子。

16.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的如权利要求1所述的抗HER2的免疫毒素分子和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

17.如权利要求1所述的抗HER2的免疫毒素分子、权利要求16所述的药物组合物在制备治疗HER2阳性表达的癌症的药物中的应用。

18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述癌症选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌和非小细胞肺癌。