CN113521015B - 一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种融合蛋白4D5Fv‑PE25冻干剂及其制备方法和应用，属于药物制备技术领域。本发明提供的冻干剂包括药物活性成分和冻干保护剂；其中，所述药物活性成分为融合蛋白4D5Fv‑PE25；所述冻干保护剂包括甘露醇、丙三醇、蔗糖、甘氨酸和人血白蛋白中的任意一种或多种。本发明通过对冻干保护剂进行筛选优化，最终成功获得一种融合蛋白4D5Fv‑PE25冻干剂，该冻干剂产品具有活性高，外观良好等优点，同时制备工艺简单，原料成本低，有效拓宽了融合蛋白4D5Fv‑PE25的应用，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳腺癌是女性最常见的癌症之一,目前全球每年大约有一百万的女性病人被诊断为乳腺癌患者，约有30％的乳腺癌病例被鉴定为人表皮生长因子受体2(HER2)过度表达，中国每年也有超过十万的妇女罹患此疾，但仅有20％左右的确诊病患得到抗HER2治疗，有大量患者因高昂的进口药价而错过了最佳治疗时机。
4D5Fv-PE25是一种融合蛋白，其在经原核表达方式生产，采用曲妥珠单抗(4D5)的可变区(Fv)与绿脓杆菌外毒素PE25相融合，从而产生的一种新的免疫毒素(CN106589131A)。该融合蛋白的4D5Fv部分将特异性地与细胞表面的HER2胞外结构域结合，从而将融合蛋白的PE25部分带到肿瘤细胞上并被其吞嗜至癌细胞内，进而在癌细胞内，该融合蛋白将裂解释放出毒素PE25，以杀伤细胞。经试验验证，其是一种高效的治疗HER2阳性乳腺癌的免疫毒素药物。
由于蛋白质与其他的化学药物相比，其分子量更大，结构更复杂，容易降解、聚合等而变得更加不稳定。因此，为了更好的保护这些药物能够稳定的发挥相应的作用和效果，生物药物的制剂研究显得尤为重要。
冷冻干燥是一种常用的保存蛋白质药物的技术。可将需要保护的蛋白质与其他物质按比例溶解混合在一起，经冷冻干燥方法去除水分，形成一种疏松的粉末状物质组成，从而起到保护蛋白质药物，延长其贮藏期等作用，然而发明人发现，迄今尚未有关于4D5Fv-PE25蛋白冻干剂的报道。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂及其制备方法和应用。本发明通过对冻干保护剂进行筛选优化，最终获得一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂产品，该冻干剂具有活性高，外观良好等优点，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂，所述冻干剂包括药物活性成分和冻干保护剂。
其中，所述药物活性成分为融合蛋白4D5Fv-PE25；
所述冻干保护剂包括甘露醇、丙三醇、蔗糖、甘氨酸和人血白蛋白中的任意一种或多种。
进一步的，所述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂由如下物质制成：
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+0.35％(w/v)人血白蛋白+4％(w/v)甘露醇。通过试验证明，采用上述筛选优化得到的冻干制品，其表面饱满光滑，外观效果极佳，同时复溶后活性较高。
本发明的第二个方面，提供上述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂的制备方法，所述制备方法包括：
将冻干保护剂和融合蛋白4D5Fv-PE25溶于PBS溶液中溶解后过滤；
按照预设程序进行样品冻干。
本发明通过优化冻干程序，配合冻干保护剂的使用，从而使得最终制备得到的融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂具有良好的外观和活性。
本发明的第三个方面，提供上述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤包括乳腺癌。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
上述技术方案通过对冻干保护剂进行筛选优化，最终成功获得一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂，该冻干剂产品具有活性高，外观良好等优点，同时制备工艺简单，原料成本低，有效拓宽了融合蛋白4D5Fv-PE25的应用，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中单一成分保护剂效果比对图，n＝3。注：设置4D5Fv-PE25终浓度分别为1.0*10^5；3.0*10^4；1.0*10^4；3.0*10^3；1.0*10^3；3.0*10^2；1.0*10^2；3.0*10^1；1.0*10^1ng/mL进行MTT细胞活力实验，每个浓度3个重复。
图2为本发明实施例中单一配方冻干比对图；其中，左侧图为甘露醇；右侧图为人血白蛋白。
图3为本发明实施例中多物质配方冻干比对图；其中，左侧图为甘露醇；右侧图为人血白蛋白Buffer 5(体系5)。
图4为本发明实施例中不同冻干配方制品活性检测图。注：设置4D5Fv-PE25终浓度分别为0.01；0.02；0.04；0.08μg/mL进行MTT细胞活力实验，每个浓度3个重复。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂，所述冻干剂包括药物活性成分和冻干保护剂。
其中，所述药物活性成分为融合蛋白4D5Fv-PE25；
所述冻干保护剂包括甘露醇、丙三醇、蔗糖、甘氨酸和人血白蛋白中的任意一种或多种。
本发明的又一具体实施方式中，所述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂由如下物质制成：
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+2％(w/v)甘露醇；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+0.20％(w/v)人血白蛋白+3％(w/v)甘露醇；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+0.20％(w/v)人血白蛋白+2％(w/v)甘露醇；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+0.35％(w/v)人血白蛋白+4％(w/v)甘露醇+1％(w/v)蔗糖；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+0.35％(w/v)人血白蛋白+4％(w/v)甘露醇；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+0.35％(w/v)人血白蛋白；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+2％(w/v)丙三醇；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+2％(w/v)甘氨酸；
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+2％(w/v)蔗糖。
其中，w/v的单位为g/mL。
溶剂为PBS溶液。
本发明的又一具体实施方式中，所述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂由如下物质制成：
3％(w/v)融合蛋白4D5Fv-PE25+0.35％(w/v)人血白蛋白+4％(w/v)甘露醇。通过试验证明，采用上述筛选优化制备得到的冻干制品，其表面饱满光滑，外观效果极佳，同时复溶后活性较高。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂的制备方法，所述制备方法包括：
将冻干保护剂和融合蛋白4D5Fv-PE25溶于PBS溶液中溶解后过滤；
按照预设程序进行样品冻干。
其中，所述PBS溶液具体组成为：Na2HPO4 10mM；KH2PO4 2mM；NaCl137mM；KCl2.7mM。
所述过滤采用滤膜过滤方式进行；进一步优选的，所述滤膜孔径为0.22微米。
冻干程序包括预冻、主干燥和解析干燥；
本发明的又一具体实施方式中，包括在-50℃进行预冻处理；然后梯度升温至32℃进行主干燥处理；最后在32℃进行解析干燥。
本发明的又一具体实施方式中，冻干程序为：
预冻：-50℃，8小时；
主干燥：-20℃，22小时，0.18mbar；
0℃，17小时，0.18mbar；
15℃，7小时，0.18mbar；
32℃，11小时，0.18mbar；
解析干燥：32℃，13小时，0.013mbar。
本发明通过优化冻干程序，配合冻干保护剂的使用，从而使得最终制备得到的融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂具有良好的外观和活性。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤包括乳腺癌。
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下各实施例中所用的原料都可通过商购获得，所用的设备均为现有设备。
实施例
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
表达菌株：融合蛋白4D5Fv-PE25表达工程菌(E.coli BL21)，由实验室构建。
细胞系：SK-BR-3，MDA-MB-231均购自ATCC。
1.1.2试剂
盐酸精氨酸(美国sigma W381918-5KG)；还原型谷胱甘肽(美国sigma V900456-25G)；Triton X-100(美国sigma V900502-500ML)；盐酸胍(美国sigma 50950-1KG)；IPTG(美国sigma I6758-5G)；硫酸铵(湖南九典)，甘露醇、蔗糖(上海国药)。
1.1.3仪器
超声破碎仪(美国SONICS VCX 800)；高速冷冻离心机(美国Thermo FisherLYNX4000)；匀浆机(德国Ika T10)；超滤机(德国Merck Millipore mini pellicon)；蛋白纯化系统(美国GE PURE 150)，冻干机(德国Christ Epsilon 60D Lscplus)。
1.1.4培养基
LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g。
1.2方法
1.2.1制品制备
按照已公开专利《融合蛋白4D5Fv-PE25及其制备方法和用途》(申请号：2015106746528)的制备方法进行融合蛋白4D5Fv-PE25提取。
1.2.2制品冻干
将甘露醇，丙三醇，蔗糖与甘氨酸溶解于PBS溶液(Na2HPO4 10mM；KH2PO4 2mM；NaCl137mM；KCl 2.7mM)，分别配置成质量比(w/v)为15％；15％；15％；15％，利用0.22微米滤膜过滤后备用，人血白蛋白为20％(w/v)原液作为保护剂直接添加。
首先选择2％(w/v)甘露醇单一组分作为保护剂(体系1)，按照每50ml西林瓶装10ml，每瓶含4D5Fv-PE25 300mg的体系进行制品配置，放入冻干机后运行三个不同冻干程序(冻干程序1，冻干程序2与冻干程序3)进行样品冻干，复溶后检测冻干制品活力。
冻干程序1：
预冻：-30℃，5小时；
主干燥：-15℃，12小时，0.30mbar；
0℃，10小时，0.30mbar；
15℃，4小时，0.30mbar；
30℃，6小时，0.30mbar；
解析干燥：30℃，6小时，0.013mbar。
冻干程序2：
预冻：-50℃，8小时；
主干燥：-20℃，22小时，0.18mbar；
0℃，17小时，0.18mbar；
15℃，7小时，0.18mbar；
32℃，11小时，0.18mbar；
解析干燥：32℃，13小时，0.013mbar。
冻干程序3：
预冻：-50℃，12小时；
主干燥：-20℃，22小时，0.18mbar；
0℃，22小时，0.18mbar；
15℃，10小时，0.18mbar；
34℃，15小时，0.18mbar；
解析干燥：34℃，18小时，0.013mbar。
再选择9种不同成分冻干保护剂配方，按照每50ml西林瓶装量总体积为10ml，每瓶含4D5Fv-PE25 300mg的体系进行制品配置与灌装，运行最优冻干程序(程序2)进行样品冻干。
不同冻干冻干配方各组份在体系中比例如下：
体系1：2％(w/v)甘露醇。
体系2：0.20％(w/v)人血白蛋白，3％(w/v)甘露醇。
体系3：0.20％(w/v)人血白蛋白，2％(w/v)甘露醇。
体系4：0.35％(w/v)人血白蛋白，4％(w/v)甘露醇，1％(w/v)蔗糖。
体系5：0.35％(w/v)人血白蛋白，4％(w/v)甘露醇。
体系6：0.35％(w/v)人血白蛋白。
体系7：2％(w/v)丙三醇。
体系8：2％(w/v)甘氨酸。
体系9：2％(w/v)蔗糖。
1.2.3细胞活力测定
将得到的冻干粉复溶后MTT法测定细胞活力，HER2阳性细胞系选择SK-BR-3，对照组选择MDA-MB-231，GraphPad Prism绘制细胞活力曲线并计算半抑制浓度(IC50)。
2结果与分析
2.1单一配方冻干比对
使用单一配方作为冻干保护剂的4D5Fv-PE25制品活性试验中，人血白蛋白效果最好，其对SK-BR-3细胞的IC50均值为0.0407μg/mL，明显低于其他组，而甘露醇组IC50均值为0.0707μg/mL，对4D5Fv-PE25的活性保护作用优于丙三醇、甘氨酸与蔗糖组，差异显著。(图1)
人血白蛋白组作为保护剂的冻干制品表面饱满光滑，单纯使用甘露醇冻干制品的表面有大量点状凸起，且颗粒物分布不均，外观效果差(图2)。
2.2多物质配方冻干比对
单纯使用人血白蛋白作为冻干保护剂时，冻干制品萎缩现象明显，冻干制品体积缩小，四周脱离玻璃瓶，而使用Buffer5作为保护剂的冻干制品无明显萎缩，成型好，表面光滑饱满，外观效果优良。(图3)
将所得冻干制品复溶后，利用MTT法测定HER2阳性乳腺癌细胞系(SK-BR-3)的细胞活力，绘制细胞活力曲线(图4)，结果显示Buffer5活性较高，是4D5Fv-PE25的最佳冻干保护剂配方。
2.3不同冻干程序对比
以体系1经冻干程序1得到制品活力最低，程序2与程序3所得制品活力相当，程序1的预冻温度仅为-30℃，解析温度为30℃，且处理时间均短于程序2与3，推测是由于冻干过程条件不够，引起的机械效应和溶质效应导致蛋白受损，引起了活性降低。冻干程序2与3效果相差不大，但程序2中对应各步骤的作用时间短，利于节能减排，降低能耗，是最佳冻干程序。
表1不同冻干程序所得制品活力对比(n＝3)
Figure BDA0002734999530000111
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一种融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂，其特征在于，所述冻干剂包括药物活性成分融合蛋白4D5Fv-PE25和冻干保护剂；
具体的，其由如下原料制成：
3%融合蛋白4D5Fv-PE25+0.35%人血白蛋白+4%甘露醇；
上述各原料的浓度单位均为w/v，g/mL，溶剂为PBS溶液。
2.权利要求1所述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将冻干保护剂和融合蛋白4D5Fv-PE25溶于PBS溶液中溶解后过滤；
按照预设程序进行样品冻干。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述PBS溶液具体组成为：Na2HPO4 10mM;KH2PO4 2mM; NaCl 137mM; KCl 2.7mM。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述过滤采用滤膜过滤方式进行。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述滤膜孔径为0.22微米。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，冻干程序包括预冻、主干燥和解析干燥。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，冻干程序包括在-50℃进行预冻处理；然后梯度升温至32℃进行主干燥处理；最后在32℃进行解析干燥；
冻干程序为：
预冻：-50℃，8小时；
主干燥：-20℃，22小时，0.18mbar；
0℃，17小时，0.18mbar；
15℃，7小时，0.18mbar；
32℃，11小时，0.18mbar；
解析干燥：32℃，13小时，0.013mbar。
8.权利要求1所述融合蛋白4D5Fv-PE25冻干剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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