NL8000291A

NL8000291A - Werkwijze voor het bereiden van interferon type ii, de therapeutische toepassing van interferon type ii en de farmaceutische preparaten op basis hiervan.

Info

Publication number: NL8000291A
Application number: NL8000291A
Authority: NL
Original assignee: Hayashibara Ken
Priority date: 1979-01-18
Filing date: 1980-01-17
Publication date: 1980-07-22
Also published as: SE8701856D0; BE881217A; DK169479B1; NO156051C; NO800105L; US4285929A; SE451797B; DK11880A; FI68519C; GB2040292A; IT8047632A0; FR2446637A1; JPS5598118A; SE8000243L; CH650801A5; SE456741B; GB2040292B; SE8701856L; FI68519B; ES487852A0

Description

-1- 21120/Vk/Jl * ~r

Aanvrager: Ken Hayashibara, Okayama, Japan en Shin Ashida, Hyogo, Japan.

Korte aanduiding: Werkwijze voor het bereiden van interferon type II, de therapeutische toepassing van interferon type II en de farmaceutische preparaten op basis hiervan.

5

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van interferon type II. De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van geneeskundige preparaten tegen virale tumorziekten en op de aldus bereide geneeskrachtige preparaten op basis 10 van interferon type II. De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een werkwijze voor de bereiding van interferon, met name interferon type II en op een werkwijze voor de bereiding van therapeutische en profylactische middelen , die effectief zijn voor type II interferon- gevoelige ziekten.

15 Zoals beschreven door Shigeyasu Kobayashi "Interferon", gepubli ceerd door Kodansha Co.Ltd., Tokio Japan (1975), D.A.J. Tyrrel, "Interferon and Its Clinical Potential", gepubliceerd door William Heineman Medical Books Ltd. (Londen) (1976) en in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme"·, vol. 21, no. 4 ( 1976) wordt met interferon een eiwitachtige stof 20 aangegeven die intra- of extra-cellulair geïnduceerd wordt door levende cellen bloot te stellen aan de inwerking van een interferon-inductiemiddel, bijvoorbeeld virus, bacterie, protozoon, rickettsia, nuclelnezuur, endo-toxine en polysaccharide en dat het een functie heeft om niet specifiek de vermenigvuldiging van bepaalde virussen in cellen te remmen. Vanwege 25 de virale vermenigvuldigings-remraende functie is interferon lang beschouwd als een veelbelovend therapeutisch en profylactisch middel voor virale ziekten vanaf de ontdekking hiervan. Onlangs is aangetoond dat interferon werkt als een anti-tumormiddel, niet alleen op een virale tumor maar ook op een niet-virale tumor en daarom heeft men grote verwachtingen van 30 interferon als geneesmiddel.

Uit de literatuur is het bekend dat de aanduiding interferon beide typen betreft namelijk type I en type II. Interferon type I of 4 het klassieke interferon met een molecuulgewicht van ongeveer 1-3 x 10 wordt verkregen door levende cellen bloot te stellen aan virale infecties 35 en interferon type II of het immune interferon met een molecuulgewicht van 4 4-7 x 10 wordt verkregen in lymfocyten door stimulering met mitogenen of als respons op antigenen. Zoals beschreven door L.B. Epstein, "Texas Reports on Biology and Medicine", vol. 35, bladzijde 41-56 (1977), gepu- % 8000291 % -2- 21120/Vk/jl bliceerd door de University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, U.S.A., is-interferon type II minder stabiel dan interferon type I onder strirgente omstandigheden, namelijk bij een pH lager dan 2 en boven 10 en /of bij een temperatuur boven 56°C. Omdat interferon type II echter een 5 nauw verband heeft met imunoreacties, wordt verwacht van interferon type II dat dit een veel hogere therapeutische en profylactische werking heeft ten aanzien van interferon-gevoelige ziekten dan interferon type I.

Door de hoge specificiteit ten aanzien van bepaalde stoffen zijn de therapeutische en profylactische werking ten aanzien van menselijke 10 ziekten te verwezenlijken met interferon dat is verkregen uit een andere bron dan van levende menselijke cellen. Tot nu toe zijn leucocy-ten gebruikt ter bereiding van type II interferon. Het verkrijgen van een grote hoeveelheid interferon type II tegen een lage kostprijs uit leuco-cyten is tamelijk moeilijk omdat leucocyten moeten worden afgescheiden en 15 bereid uit vers bloed en het is niet mogelijk om gedurende lange tijd bewaard te worden. Door deze omstandigheden is een productie van interferon type II op grote schaal, dat gebruikt kan worden als therapeutisch en profylactisch middel tegen menselijke ziekten tot nu toe niet bewerkstelligd .

20 Door de gedane onderzoekingen is een werkwijze ontwikkeld die makkelijk toegepast kan worden voor het bereiden van interferon type II op grotere schaal en de gebruiksmogelijkheden zijn onderzocht van dit interferon als therapeutisch en profylactisch middel. De gedane onderzoekingen hebben geresulteerd in een werkwijze volgens de uitvinding ter 25 bereiding van interferon type II, hierdoor gekenmerkt, dat menselijke cellen die interferon type II produceren in andere lichamen van warmbloedige dieren worden getransplanteerd of de cellen worden geënt in een cul-tuurmedium aangebracht in een diffusiekamer verdeeld door filtermembra-nen, zodanig ontworpen om aangebracht te worden in of op een dierlijk 30 lichaam, zodat de cellen kunnen groeien op de lichaamsvloeistof, waardoor de getransplanteerde of geënte cellen worden vermenigvuldigd in het warmbloedige lichaam of de diffusieruimte onder toepassing van de lichaamsvloeistof, waardoor de vermenigvuldigde menselijke cellen worden onderworpen aan de inwerking van een inductie-middel voor inferon type II in 35 vivo of in vitro of interferon type II te induceren en het geïnduceerde int erf er on., type II te zuiveren en af te scheiden.

Uit de gedane onderzoekingen is ook gebleken, dat een grote hoeveelheid zeer zuiver interferon type II niet verkregen kon worden door 8000291 ♦ -3- 21120/Vk/jl > transplantatie en vermenigvuldiging van interferon type II door gebruik van menselijke cellen in een voedingsstof-houdend cultuurmedium in vitro, v maar wel verkregen kan worden door het transplanteren van de cellen naar andere warmbloedige lichamen of het enten van de cellen in een cultuur-5 medium, dat aangebracht is in een diffusiekamer met filtermembranen, ontworpen en passend in of op een dierlijk lichaam, zodat de cellen kunnen groeien op de voedende lichaamsvloeistof, waarbij de getransplanteerde of geënte cellen vermenigvuldigd worden onder gebruikmaking van de lichaamsvloeistof in het warmbloedige dierlijke lichaam of de diffusiekamer, waar-10 na de verkregen vermenigvuldigde cellen worden onderworpen aan de inwerking van een interferon type II inductiemiddel in vivo of in vitro zodat interferon type II geïnduceerd wordt en vervolgens het geïnduceerde interferon type II gezuiverd en/óf gescheiden wordt en het interferon type II dat verkregen is door de bovenvermelde werkwijze kan dan toegepast worden 15 als voortreffelijk therapeutisch en profylactisch middel tegen ziekten die gevoelig zijn voor het interferon type II.

De werkwijze volgens de uitvinding wijkt af van de bekende werkwijze waarbij levende cellen worden vermenigvuldigd in vitro en heeft het voordeel, dat®en of veel minder voedingsmedium toegevoegd moet worden 20 samen met kostbaar serum, waarbij het handhaven en de controle van de omstandigheden tijdens het vermenigvuldigen van de toegepaste menselijke cellen makkelijker is en zuiverder interferon type II makkelijker kan worden verkregen. Bij de werkwijze volgens de uitvinding kunnen verkregen menselijke cellen makkelijk worden vermenigvuldigd in andere warmbloe-25 dige dierlichamen, onder toepassing van de lichaamsvloeistof door transplantatie van de cellen hierin of door het verbinden van het dierlijk lichaam met een diffusie-ruimte die gevuld is met een cultuurmedium, waarin de cellen zijn gesuspendeerd, terwijl de dieren op gebruikelijke wijze worden gevoed. Met name in vergelijking met conventionele werkwij-30 zen waarbij cellen in vitro werden vermenigvuldigd heeft de werkwijze volgens de uitvinding bovendien het voordeel dat het vermenigvuldigen van de cellen gelijkmatiger verloopt,dat het vermenigvuldigen met een hogere snelheid kan worden uitgevoerd, en dat de opbrengst aan geïnduceerd interferon type II per cel veel hoger is.

35 Hiertoe ontwikkelde menselijke cellen kunnen gebruikt worden als deze makkelijk en snel vermenigvuldigen wanneer ze getransplanteerd worden in andere warmbloedige dierlichamen. Hiertoe kunnen gebruikt worden HPB-ALL cel, M0LT-3 cel, P 12/Ichikawa cel, HPB-MLT cel, P 8/Seki cel, 80002« < -4- 21120/Vk/jl JBL cel, HCL cel en P 10/Shibata cel, beschreven in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", vol. 23, no. 6, blz. 697-711 (1978), Namalva cel beschre- \ ven in "Journal of Clinical Microbiology", vol. 1, blz. 116-117 (1975), en BALL-1 cel, TALL-1 cel en NALL-1 cel beschreven door I. Miyoshi, 5 "Nature", vol. 267, blz. 843-844 (1977). Met name de menselijke lymfoblas-toide cellen verdienen de voorkeur. Bepaalde menselijke cellen die toegepast kunnen worden volgens de uitvinding, kunnen gekozen worden uit de bovenvermelde cellen, hoewel deze opsomming niet als beperkend moet worden beschouwd. Bij de stappen die uitgevoerd moeten worden voordat 10 interferon type II ingebracht wordt kunnen de bovenvermelde cellen alleen of in combinatie worden gebruikt.Aan deze cellen worden desgewenst menselijke leucocyten toegevoegd, die bereid zijn uit vers menselijk bloed.

Diverse warmbloedige dieren kunnen worden gebruikt bij de werkwijze volgens de uitvinding, zolang de ontwikkelde menselijke cellen hier-15 in vermenigvuldigd kunnen worden. Hiertoe kunnen vogels worden gebruikt, zoals kippen en duiven en zoogdieren zoals honden, katten, apen, geiten, varkens, runderen, paarden, konijnen, guinesche biggetjes, ratten, hamsters, muizen en witte muizen. Omdat de transplantatie van menselijke cellen in de bovenvermelde dierlichamen ongewenste imunoreacties kunnen ver-20 oorzaken, moeten de dieren gekozen worden in een zo vroeg mogelijk stadium, zoals in de vorm van het ei, foetus, embryo of pas-geboren of jong dier om de imunoreacties zoveel mogelijk te onderdrukken. Voor het transplanteren van de cellen kunnen de dieren bestraald worden met ongeveer 200-600 REM, röntgenstralen of 'fc -stralen of door het injecteren van een 25 anti -serum of imuno-onderdrukkend middel om de imunoreacties te onderdrukken. Bij voorkeur worden witte (niide) muizen gebruikt zelfs als ze volwassen zijn als warmbloedig dier, omdat deze minder onderhevig zijn aan de ongewenste immunoreacties en de ontwikkelde menselijke cellen kunnen hierop getransplanteerd worden en snel vermenigvuldigd wórden zonder dat een 30 voorbehandeling noodzakelijk is. Het transplanteren van vermenigvuldigde menselijke cellen uit een warmbloedig dierlichaam naar een ander warmbloedig dierlichaam kan het vermenigvuldigen van de cellen gelijkmatiger doen plaatshebben en de hoeveelheid interferon type II dat in de cellen gebracht wordt kan groter zijn. Zo kunnen bijvoorbeeld ontwikkelde of verkregen 35 menselijke cellen getransplanteerd' worden in hamsters, en hierin worden vermenigvuldigd en vervolgens worden de vermenigvuldigde menselijke cellen verzameld en getransplanteerd op witte muizen. Hierbij kunnen de vermenigvuldigde cellen verder getransplanteerd worden uit een warmbloedig dier- 8 0 0 0 2-3 1 <· -5- 21120/Vk/jl * lichaam naar een ander warmbloedig dierlichaam van dezelfde soort, genus, klasse of verkregen menselijke cellen kunnen ook getransplanteerd worden op elk willekeurig deel van een dierlijk lichaam als hierin maar de ver- v mènigvuldiging plaats heeft. Deze overbrenging kan intraperitoneaal, 5 intraveneus, subcutaan plaatshebben of in de allantois holte.

In plaats van het transplanteren en vermenigvuldigen/van verkregen menselijke cellen naar andere warmbloedige dierlichamen kunnen de bovenvermelde cellen ook worden geënt en vermenigvuldigd in een voedingsstof van andere warmbloedige dierlichamen met behulp van een conventionele 10 diffusie-ruimte die bijvoorbeeld intraperitoneaal ingebracht kan worden en zodanig opgebouwd, dat de ingebrachte cellen gevoed kunnen worden met de lichaamsvloeistof. De ruimten die geschikt zijn volgens de uitvinding, kunnen diverse vormen en afmetingen hebben en moeten van elkaar gescheiden zijn door filtermembranen, bijvoorbeeld membraanfilters, ultrafilters, 15 en holle vezels, om lekkage van de cellen te voorkomen. Met name verdie- _7 nen kamers met aangebrachte filtermembranen met poriëngrootte van 10 -5 tot 10 m de voorkeur. Indien noodzakelijk kan de diffusieruimte aangebracht worden op bijvoorbeeld de buitenkant van een dierlijk lichaam, waarbij de voedende lichaamsvloeistof van het dier door de aangebrachte 20 ruimte kan circuleren en de ontwikkeling van de aangebrachte menselijke cellen die in deze ruimte zijn geënt geabsorbeerd kan worden via een transparant venster dat in de wand van de ruimte is aangebracht. De diffusieruimte kan ook zodanig zijn ontworpen en aangebracht, dat deze periodiek losgekoppeld kan worden van het dierlijk lichaam en de cellen die 25 dan een vermenigvuldiging ondergaan gedurende de levensduur van het dier, zonder dat het noodzakèlijk is om het dier te doden om verder de opbrengst te vergroten van de vermenigvuldigde cellen per dier. Verder heeft de werkwijze onder toepassing van de bovenvermelde diffusieruimte een additioneel voordeel, namelijk dat naast de vermenigvuldigde menselijke cellen die 30 makkelijk verzaméld kunnen worden, er geen direct contact is tussen de cellen en de dierlijke cellen, zodat diverse warmbloedige dieren gebruikt kunnen worden, zonder dat er een voorbehandeling noodzakelijk is om de immunoreacties te onderdrukken, door de lagere kans op het veroorzaken van immunoreacties.

35 De werkwijze volgens de uitvinding biedt het voordeel, dat de dieren waarop de verkregen menselijke cellen worden getransplanteerd, gevoed kunnen worden op gebruikelijke wijze en dat er geen speciale behandeling vereist is, zelfs na het transplanteren van de cellen. De periode 8000291 ί -6- 21120/Vk/jl die vereist is voor een voldoende vermenigvuldiging van de getransplanteerde verkregen menselijke cellen is gewoonlijk 1 tot 10 weken.

Het aantal vermenigvuldigde menselijke cellen werd geteld en 7 12 bleek ongeveer 10-10 of meer te bedragen per dier. Met andere woorden 5 geldt dat de werkwijze volgens de uitvinding op zeer voordelige wijze kan worden toegepast voor de bereiding van interferon type II omdat het aantal cellen dat getransplanteerd of geënt wordt in het dierlijk lichaam of in 2 7 de diffusieruimte toeneemt met een factor 10 -10 of meer volgens deze g werkwijze. De verhoging bedraagt een factor 10 tot 10 of meer in verge-Ί0 lijking met de werkwijze die uitgevoerd wordt bij het enten en vermenigvuldigen van dezelfde cellen in de voedende cultuursamenstelling in vitro·.

Met betrekking tot de toevoer van interferon type II, kan gesteld worden dat elke werkwijze toegepast kan worden zolang interferon type II geïnduceerd wordt in de vermenigvuldigde levende menselijke cellen. 15 De cellen kunnen worden blootgesteld aan de inwerking van een interferon type Il-inductiemiddel, waarin ze vermenigvuldigd zijn. Zo kunnen de menselijke cellen bijvoorbeeld vermenigvuldigd worden in ascites in suspensie of de tumorcellen die aanwezig zijn, welke subcutaan kunnen worden blootgesteld aan de werking van interferon type Il-inductiemiddel in vivo, 20 waarin ze vermenigvuldigd zijn en het geïnduceerde interferon type II wordt vervolgens gezuiverd en afgescheiden uit de asciten of de tumor. In tegenstelling hiermee kunnen de vermenigvuldigde menselijke cellen na afscheiding worden blootgesteld aan de werking van het interferon type II-induc-tiemiddel in vitro om interferon type II te induceren. Zo kunnen de ver-25 menigvuldigde menselijke cellen verzameld worden uit de asciten of de cellen kunnen worden afgescheiden en gedissocieerd uit de massieve tumor die subcutaan is ontstaan, waarbij de cellen worden gesuspendeerd in een voe-

dingsmedium, dat gehouden wordt op een temperatuur van ongeveer 20-40°C

5 8 om een cel-concentratie te geven van ongeveer 10 -10 cellen per ml en ver-30 volgens blootgesteld aan een induetiemiddel voor interferon type II. Vervolgens wordt het geïnduceerde interferon type II gezuiverd en afgescheiden. Wanneer het menselijke cellen worden vermenigvuldigd in een diffusieruimte, kunnen de cellen worden blootgesteld aan een inductiemiddel voor interferon type II in die ruimte in vivo of blootgesteld worden aan een 35 inductiemiddel in vitro nadat de cellen gewonnen zijn uit deze ruimte.

Bij de bereiding van interferon type II kan de hoeveelheid van het geïnduceerde interferon type II verder verbeterd worden volgens bekende werkwijzen zoals de voorbehandelingsmethode (priming) waarbij zeer 80 0 0 29 ! -7- 21120/Vk/jl specifiek de interferon van menselijke stoffen en/of de super-inductie-methode wordt toegepast onder gebruikmaking van een metabolische inhibitor. Verder kan de opbrengst aan geïnduceerd interferon type II per dier verder worden verbeterd door één of meer van de hieronder genoemde 5 bewerkingen; 1) een werkwijze waarbij de vermenigvuldigde cellen eerst worden blootgesteld aan een induetiemiddel voor interferon type II om het interferon te induceren, waarin ze vermenigvuldigd zijn en vervolgens na verzamelen bloot te stellen aan een deel of het gehele dierlijke lichaam 10 aan een induetiemiddel voor interferon type II om het interferon in vitro te induceren.

2) een werkwijze waarbij de menselijke cellen die reeds gebruikt zijn of herhaaldèlijk gebruikt zijn ter bereiding van een interferon type II worden blootgesteld aan de werking van een induetiemiddel voor inter- 15 feron type II in vivo of in vitro om het interferon te induceren, en 3) een werkwijze waarbij een diffusienaimte aangebracht wordt in of op of verbonden wordt met het dierlijk lichaam periodiek wordt losgekoppeld om het aantal vermenigvuldigde menselijke cellen te verhogen.

Als inductie-middel voor interferon type II kunnen mitogenen 20 worden gebruikt zoals fytohemagglutinine, concanavaline A, mitogeen uit varkenskruid, lipopolysaccharide, polysaccharide, endotoxine en bacteriën, op gevoelig gemaakte cellen werken antigenen ook als induetiemiddel voor interferon type II. De bovenvermelde inductiemiddelen voor interferon type II worden gewoonlijk gebruikt bij een concentratie van ongeveer 0,001 25 pg tot 10 mg/ml. Verder kunnen als inductiemiddelen voor interferon type I bijvoorbeeld een,virus, nucleïnezuur en polynucleötide gebruikt worden met een Induetiemiddel voor interferon type II, waardoor de verdere op brengst aan interferon type II kan worden verbeterd, en ook de mogelijkheid wordt verkregen om gelijktijdig interferon type I en type II te induceren. 30 Het geïnduceerde interferon type II kan worden gezuiverd en af gescheiden op een makkelijke wijze door een conventionele zuivering en afscheiding, bijvoorbeeld door uitzouten, dialyse, filtratie, centrifugeren, indampen en vriesdrogen. Wanneer het gewenst is om zeer zuiver interferon type II te bereiden is het mögelijk om interferon type II met een 35 hoogste zuiverheid te verkrijgen onder toepassing van conventionele technieken zoals absorptie en desorptie aan een ionenwisselaar, gel-filtratie, affiniteit-chromatografie, fractioneren op basis van iso-elektrisch punt en elektroforese, in combinatie met de eerder vermelde bewerkingen.

£ o f* Π ^ W '· V fc * ./ 4 > -8- 21120/Vk/jl

De activiteit van interferon type I en type II, welke zeer hoog zijn ten aanzien van menselijke stoffen werd bepaald met de plek-reductie-methode onder toepassing van FL-cellen, afgeleid uit een menselijk amnion, zoals beschreven in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", vol. 20, no. 6, 5 blz 616-643 (1975), gepubliceerd door Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, Japan.

De hemagglutineringseenheid werd onderzocht volgens de methode die beschreven is door J.E, Salk, "Journal of Immunology", vol. 49, blz. 87-98 (1944).

10 De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende, niet beperkende voorbeelden.

Voorbeeld I

De bereiding interferon type II volgens de uitvinding.

De productiviteit van de cellen die in vito of in vitro zijn 15 vermenigvuldigd met betrekking tot het verkrijgen van interferon.

Voorbeeld I-a:

Het vermenigvuldigen in vitro.

BALL-1-cellen werden geënt in een RPMI-1640 medium, waaraan toegevoegd werd 20 % fetaal runderserum bij een pH van 7,2 en het kweken werd 20 bewerkstelligd in een suspensie bij een temperatuur van 37°C. De vermenig-vuldigde cellen werden gewassen met serum-vrij RPMI-1640 medium bij een pH van 7,2 en gesuspendeerd in een vers medium van dezelfde samenstelling om een ceihconcentratie te bewerkstelligen van ongeveer 1 x 10^ cellen per ml.

25 Voorbeeld I-b,

Het vermenigvuldigen in vivo.

Pasgeboren hamsters werden geïnjecteerd met een anti-serum dat bereid was onder gebruikmaking van een konijn, volgens een bekende methode voor het onderdrukken van de immunoreacties en vervolgens werden sub-30 cutaan BALL-1-cellen getransplanteerd. De hamsters werden op gebruikelijke wijze gedurende 3 weken gevoed. De massieve tumors die subcutaan ontstonden werden afgescheiden, in stukjes gesneden en gedissocieerd in een fysiologische zoutoplossing die trypsine bevatte, om de vermenigvuldigde cellen te verzamelen. De aldus verkregen cellen werden gewassen met serum-35 vrij RPMI-1640 medium, bij een pH van 7,2 en gesuspendeerd in een vers medium van dezelfde samenstelling om een celconcentratie te bewerkstelli- g gen van ongeveer 1 x 10 cellen per ml.

800029! •k -9- 21120/Vk/jl

Voorbeeld I-c

De bereiding van interferon.

De suspensies van de BALL-1 cellen, verkregen volgens voorbeeld I-'a en I-b, met een celconcentratie van ongeveer 1 x 10^ cellen per ml, 5 werden blootgesteld aan een fytohemagglutinine en/of Sendai virus om interferon te induceren. Meer in het bijzonder kan gesteld worden dat wanneer alleen phytohemagglutidine werd gebruikt de suspensies werden gemengd met phytohemagglutinine in een hoeveelheid van ongeveer 100 pg per ml en gedurende 3 dagen bij een temperatuur van 37°C werden bewaard om 10 het interferon te induceren. Wanneer aLleen Sendai virus werd gebruikt, werd het virus toegevoegd aan de suspensie in een hoeveelheid van ongeveer 300 hemagglütineringseenheden per ml en gedurende een dag bewaard om interferon te induceren. Wanneer zowel phytohemagglutinine en Sendai virus in combinatie werden gebruikt, werd aan de suspensies eerst phytohemag-15 glutinine toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 100 pg / ml en gedurende twee dagen bewaard bij ?een temperatuur van 37°C en veriolgens werd Sendai virus toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 300 hemag-glutinine-eenheden per ml en dit mengsel gedurende 1 dag bewaard bij een temperatuur van 37°C ora interferon te induceren. De aldus verkregen in-20 terferon bevattende suspensies wenden gecentrifugeerd. De ontstane bovenstaande vloeistof werd geconcentreerd met behulp van een ultrafilter met een scheiding op moleculaire basis van 6.000 en vervolgens gefractioneerd op basis van het molecuulgewicht met dextran gel. De activiteit van het verkregen interferon type I met een molecuulgewicht van ongeveer 25.000 25 en interferon type II met een molecuulgewicht van ongeveer 50.000 werd bepaald om de interferon activiteit te onderzoeken per ml-suspensie na bewaren. Deze resultaten zijn samengevat in tabel A.

TABEL A

30 Interferon inductiemiddel Vermenigvuldiging ____in vitro__in vivo phytohemagglutinine 20 400 (20) (400)

Sendai virus 1.700 6.700 35 (0) (0)

Phytohemagglutinine 1.740 24.000 $ 0 0 ^ ? 9 ^ + Sendai virus (30) (11.000) Λ ·* -10- 21120/Vk/jl ί

Opmerking: De bepaalde totale interferon activiteit na het bewaren is uitgedrukt in eenheden per ml suspensie en de activiteit van interferon type II voor elk preparaat is tussen haakjes weergegeven.

5 Zoals duidelijk zal zijn uit de resultaten die weergegeven zijn in tabel A werd een kleine hoeveelheid interferon geïnduceerd in de cellen die in vitro werden vermenigvuldigd, terwijl een grote hoeveelheid gei'ncu-ceerd werd in de cellen die in vivo werden vermenigvuldigd. De cellen die in rvitro vermenigvuldigd zijn, evenals de cellen die in vivo zijn ver-menigvuldigd, produceerden interferon type I wanneer ze werden behandeld met Sendai virus. De cellen die in vivo vermenigvuldigd werden, gaven ech ter een vier keer hogere activiteit dan bij vermenigvuldiging in vitro.

Aangaande de activiteit van interferon bij de preparaten die geïnduceerd zijn door phytohemagglutinine en/of Sendai virus werd een op-15 merkelijk synergistisch effect waargenomen bij de interferon inductiemidde-len bij het bereiden van interferon type I en type II wanneer de cellen in vivo werden vermenigvuldigd. Met name interferon type II, geïnduceerd onder toepassing van phytohemagglutinine en Sendai virus in combinatie, had een 28 keren grotere activiteit dan geïnduceerd onder toepassing van 20 enkel phytohemagglutinine . Er werden echter geen synergistische werkingen waargenomen wanneer de cellen werden vermenigvuldigd in vitro.

In voorbeeld II zijn diverse uitvoeringsvormen aangegeven voor het bereiden van interferon type II volgens de uitvinding.

Voorbeeld II

25 Het bereiden van interferon type II.

Voorbeeld Il-a

Volwassen witte muizen werden subcutaan getransplanteerd met verkregen menselijke BALL-1-cellen en deze muizen werden op gebruikelijke wijze gedurende drie weken gevoed. De hierdoor ontstane subcutane massieve 30 tumoren, ongeveer 10 g per witte muis, werd afgescheiden, in kleine stukken gesneden en gedissocieerd in een fysiologische zoutoplossing die tryp-sine bevatte om de vermenigvuldigde menselijke cellen te verzamelen. De cellen werden gewassen met een minimaal noodzakelijk Eagle's vloeistof waaraan toegevoegd was 5 νοί.ί menselijk serum bij een pH van 7,2 en ge- 35 suspendeerd in vers medium van dezelfde samenstelling ter verkrijging van 6 een celconcentratie van ongeveer 5 x 10 cellen per ml bij een temperatuur van 37°C. Aan de suspensie werd een gedeeltelijk gezuiverd menselijk' zeer specifiek interferon toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 8 0 0 0 2 9 1 ' -11- 21120/Vk/jl 100 eenheden per ml en het mengsel Werd gedurende 2 uren bewaard. Phyto-hemagglutinine werd vervolgens aan het mengsel toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 200 per ml. Vervolgens werd het mengsel bij deze temperatuur bewaard gedurende nogmaals 3 dagen om interferon type II te 5 induceren. Het aldus bewaarde mengsel werd gecentrifugeerd bij ongeveer 1000 g en bij een temperatuur van 4°C om het neerslag zoals celdebris te verwijderen en de verkregen bovenstaande vloeistof werd gedialyseerd tegen een fysiologische zoutoplossing die gebufferd is bij een pH van 7,2 met een 0,01 M fosfaatbuffer gedurende 24 uren. Vervolgens werd het 10 verkregen mengsel zorgvuldig gefiltreerd met behulp van een filtermenbraan en het interferon type II bevattende filtraat werd geconcentreerd en gevriesdroogd tot een poeder. De activiteit van interferon type II van dit poeder was ongeveer 1.500.000 eenheden per witte muis.

Voorbeeld Il-b 15 Volwassen witte buizen werden intraperitoneaal getransplanteerd met verkregen menselijke BALL-1- en TALL-1-cellen en op'gebruikelijke wijze gedurende 5 weken gevoed. De witte muizen werden vervolgens intraperitoneaal geïnjecteerd met één mg phytohemagglutinine en 24 uren later geïnjecteerd met ongeveer 3-000 hemagglutinine-eenheden van Newcastle-20 ziekte virus, waarvan de activiteit nagenoeg voor-geïnactiveerd was door ultra-viölette bestEaling. De witte muizen werden gedood om de ascites te verzamelen 24 uren na de injectie. De ascites werden gecentrifugeerd bij ongeveer 1000 g en een temperatuur van 4°C om het neerslag te verwijderen zoals celdebris. De verkregen bovenstaande vloeistof werd gedialyseerd 25 ten opzichte van een fysiologische zoutoplossing, gebufferd bij pH=7,2 met een 0,01 M fosfaatbuffer gedurende 15 uren. Het verkregen mengsel werd vervolgens gefiltreerd en zorgvuldig geconcentreerd met filtermem-braan, ter verkrijging van een concentraat dat interferon bevatte.

De totale interferon activiteit van het concentraat was onge-30 veer 800.000 eenheden per 10 witte muizen, waarvan ongeveer 300.000 eenheden toegeschreven werden aan de activiteit van interferon type II.

Voorbeeld II-c.

Pasgeboren hamstere werden voor-geïnjecteerd met een anti-serum dat bereid was uit een konijn volgens een werkwijze die bekend is om de 35 immunoreacties te onderdrukken en vervolgens subcutaan geïnjecteerd met verkregen menselijke JBL-cellen. De hamsters werden op gebruikelijke wijze gedurende 4 weken gevoed. De massieve tumoren die subcutaan optraden, ongeveer 30 g per hamster, werden afgescheiden en op dezelfde wijze be- 8000291 ί *► -12- 21120/Vk/jl handeld als aangegeven is in voorbeeld II-a. De vermenigvuldigde cellen werden gewassen met RPMI-1640 medium, waaraan toegevoegd was 10 vol. % fetaal runderserum bij een pH van 7,4 en gesuspendeerd in een vers medium van dezelfde samenstelling om een celconcentratie te verkrijgen van onge-5 veer 2 x 10 cellen per ml bij een temperatuur van 37 C. Aan het mengsel werd een gedeeltelijk gezuiverd menselijk specifiek interferon type II toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 200 eenheden per ml en gedurende een uur bewaard bij een temperatuur van 37°C. Aan het bewaarde mengsel werd vervolgens concanavaline A toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 10 500 pg per ml en gedurende drie dagen werd het mengsel bewaard waarna Sendai virus werd toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 300 hemag-glutinine-eenheden per ml en het mengsel werd gedurende 16 uren bewaard om interferon te induceren. Het mengsel werd gezuiverd en zorgvuldig geconcentreerd met filtermembranen op eenzelfde wijze als aangegeven is in 15 voorbeeld II-b ter verkrijging van een interferon-houdende oplossing.

De totale interferon activiteit van de oplossing was ongeveer 17.000.000 eenheden per hamster, waarvan 6.000.000 eenheden werden toegeschreven aan de activiteit van interferon type II.

Voorbeeld Il-d 20 Pasgeboren ratten werden intraperitoneaal getransplanteerd met verkregen menselijke Namalva cellen en op gebruikelijke wijze gedurende vier weken gevoed. De ontstane subcutane massieve tumors, ongeveer 50 g per rat, werden afgescheiden, fijngesneden en op eenzelfde wijze gedissocieerd als beschreven is in voorbeeld ΙΙ-a. De vermenigvuldigde menselij-25 ke cellen werden op dezelfde wijze behandeld, als aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-a, behalve dat Maruyama vaccin werd toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 1 jig per ml om interferon type II te induceren in plaats van phytohemagglutinine. Het geïnduceerde interferon type II werd gezuiverd·.! en de verkregen'·oplossing met interferon type II werd gevriesdroogd 30 tot een poeder op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld Il-a.

De activiteit van interferon type II van het poeder was ongeveer 8.000.000 eenheden per rat.

Voorbeeld Il-e

Eerst werden volwassen muizen bestraald met ongeveer 400 REM 35 röntgenstralen om de immunoreacties te onderdrukken en vervolgens sub-cutaan getransplanteerd met verkregen menselijke TALL-1 cellen en op gebruikelijke wijze gevoed't gedurende drie weken. Na afscheiden en fijnsnijden van de massieve tumoren, die subcutaan waren ontstaan, in een hoeveel- 800029! . \ -13- 21120/Vk/jl heid van 10 g per muis, werden de tumorcellen gedissocieerd op dezelf de wijze als aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-a. De cellen werden- op eenzelfde wijze verder behandeld als aangegeven is in voorbeeld II-c om interferon te induceren. Het geïnduceerde interferon werd gezuiverd en geconcentreerd 5 op eenzelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-b, ter verkrijging van een concentraat met interferon.

De totale interferon-activiteit van het concentraat was ongeveer 9.000.000 eenheden per muis waarvan 3.000.000 eerheden toegeschreven werden aan de activiteit van interferon type II.

10 Voorbeeld Il-f

Hamsters werden eerst subcutaan getransplanteerd met verkregen menselijke MOLT-3-cellen op eenzelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld II-c en op gebruikelijke wijze gedurende drie weken gevoed om de cellen te vermenigvuldigen. 10 Dagen oude witte muizen werden vervolgens 15 intraperitoneaal getransplanteerd met de vermenigvuldigde cellen en op gebruikelijke wijze gedurende de volgende vijf weken gevoed. De witte muizen werden verdoofd en de ascites werden verzameld. De verkregen ascites werden gecentrifugeerd om de vermenigvuldigde cellen te verzamelen. De cellen werden gewassen en op eenzelfde wijze behandeld als aange-20 geven is in voorbeeld ΙΙ-a om interferon type II te induceren. Het geïnduceerde interferon type II werd vervolgens gezuiverd en geconcentreerd op eenzelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-b tot een concentraat met interferon type II.

De activiteit van interferon type II van het concentraat was 25 ongeveer 500.000 eenheden per witte muis.

Voorbeeld Il-g

Onder toepassing van een cylindrische diffusieruimte vervaardigd uit een kunststof met hierin aangebrachte membraanfilters met een poriëngrootte van 0,5 jira en een inhoud van ongeveer 10 ml werden verkre-30 gen menselijke JBL-cellen gesuspendeerd in een fysiologische zoutoplossing.

De ruimten werden intraperitoneaal aangebracht in volwassen ratten. De ratten werden op gebruikelijke wijze gedurende 4 weken gevoed en daarna werden de kamers verwijdend. De concentratie aan de vermenigvuldigde men- 9 selijke cellen in de ruimten was ongeveer 5 x 10 cellen per ml, hetgeen 35 ongeveer 1000 keren hoger was dan bewerkstelligd in vitro, in een voe-dingsmedium onder toepassing van een (^-incubator. Aan de suspensie van de verkregen cellen werden M0LT-3 cellen toegevoegd zoals bereid in voorbeeld ΙΙ-f ter verkrijging van een concentratie van ongeveer 20 vol.Ji en 8 0 0 0 2 S i 4 -14- 21120/Vk/jl het mengsel werd op eenzelfde wijze behandeld als aangegeven is in voorbeeld Il-a om interferon type II te induceren. Het geïnduceerde interferon' type II werd gezuiverd en geconcentreerd tot een concentraat met interferon type II dat vervolgens gevriesdroogd werd tot een poeder.

5 De activiteit van het interferon type II van het poeder was ongeveer 4.000.000 eenheden per rat.

Voorbeeld Il-h

Verkregen menselijke NALL-1 cellen werden getransplanteerd in de allantoïsruimten van embryogene eieren die gedurende vijf dagen waren 10 bewaard bij een temperatuur van 37°C en vervolgens werden de eieren bij deze temperatuur nogmaals gedurende 7 dagen bewaard. De eieren werden geopend en de vermenigvuldigde menselijke cellen werden verzameld. Aan de suspensie van de cellen werd een equivolume hoeveelheid TALL-1 cellen toegevoegd, bereid zoals aangegeven in voorbeeld Il-e en behandeld op een 15 wijze zoals aangegeven in voorbeeld ΙΙ-a om interferon type II te induceren. Het geïnduceerde interferon type II werd gezuiverd en geconcentreerd, óp dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-b ter verkrijging van een concentraat met interferon type II.

De activiteit van interferon type II van het concentraat was 20 ongeveer 300.000 eenheden per 10 embryogene eieren.

Voorbeeld Il-i

Een poeder dat bereid is volgens de methode zoals aangegeven in voorbeeld ΙΙ-a werd verder zorgvuldig gezuiverd bij een pH van 4-9 onder toepassing van conventionele bewerkingen zoals absorptie en desorp-25 tie met behulp van een ionenwisselaar, fractionering op het molecuulge- wicht met gelfiltratie, concentreren en zorgvuldig filtreren zoals beschreven is in Bodo-rapport, "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon. 11th International Immunobiological Symposium, 8 & 9 juni (1977), Zagreb, Joegoslavië". Een zeer zuiver interferonprepa-30 raat met een specifieke activiteit van 2 x 10^ eenheden per mg eiwit werd verkregen en de totale terugwinning was ongeveer 40 %.

Uit de resultaten van het hierna volgende voorbeeld III blijkt dat interferon type II, verkregen volgens de werkwijzei die beschreven zijn in de bovenvermelde voorbeelden alleen kan worden toegepast, in combina-35 tie met interferon type I of gemengd met één of meer andere stoffen zoals een effectief therapeutisch en/of profylactisch middel dat gebruikt kan worden als injectie, of als geneesmiddel dat uitwendig of inwendig kan worden toegediend bij ziekten die gevoelig zijn voor interferon type II.

P, λ Λ Λ ^ n -1 C V - ' s -15- 21120/Vk/jl \

Voorbeeld III

Therapeutische en profylactische werking van interferon type II ten aanzien van ziekten die gevoelig zijn voor interferon.

Voorbeeld III-a 5 Therapie van virale ziekten met interferon type II (remmende werking op virale vermenigvuldiging in vitro).

De monolagen van menselijke embroygene longcellen werden gevormd door een eerste cultuur in Petrischalen met een diameter van 6 cm waaraan toegevoegd werden 0,1-1,0 of 10,0 eenheden interferon type II be-10 reid volgens een werkwijze zoals aangegeven in voorbeeld ΙΙ-i en de verkregen mengsels werden gedurende 20 uren bewaard in een ruimte met 5 vol.^ CO2 bij een temperatuur van 37°C. Aan de cellen werden varicella zoster virus of menselijk cytomegalo virus toegevoegd in een hoeveelheid, dat 100 plekken gevormd werden.'in afwezigheid van interferon type II. De 15 mengsels werden bewaard en het aantal gevormde plekken werd geteld.

De remmende invloed van interferon type II op de virale vermenigvuldiging werd bepaald onder toepassing van de volgende vergelijking.

A - B

Vermindering van het aantal plekken {%) = —^— x 100 waarbij A het aantal plekken is dat gevormd wordt in afwezigheid van in-20 terferon type II en B het aantal plekken is dat gevormd wordt in aanwezigheid van interferon type II.

De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabé. B.

TABEL B

25 ________—1_

Type II interferon Varicella zoster virus menselijk cytomegalo virus (eenheden) (ί) (ί) 0 0 0 30 °»1__3 6_ 1,0 49 54 10,0 88 83

Zoals duidelijk zal zijn uit de resultaten van tabel B is met 35 behulp van interferon type II een effectieve remmende werking verkregen op het vermenigvuldigen van het virale ziekte verwekkende virus. Bij het uitgevoerde experiment bleek verder dat interferon type II geen nevenverschijnselen bewerkstelligde in de menselijke cellen.

8 0 0 0 2 9 1

Y

-16- 21120/Vk/jl

Voorbeeld III-b

Therapie van niet-virale ziekten met interferon type II.

1) het remmen van de vermenigvuldiging van de tumorcellen in vitro.

5 Interferon type II bereid volgens de werkwijze die beschreven is in voorbeeld ΙΙ-i werd toegevoegd aan RPMI-1640 medium, waaraan toegevoegd werd 15 vol.i fetaal runderserum ter verkrijging van eeri eindcon-centratie van 5-50 of 500 eenheden per ml. Aan de mengsels werden verschillende tumorcellen getransplanteerd ter verkrijging van een concentra-5 10 tie van 5 x 10 cellen per ml. De mengsels werden vervolgens bewaard in een ruimte met 5 vol.% CO2 bij een temperatuur van 37°C gedurende 5 dagen en een aantal cellen per ml medium werd geteld. De blanco-experimenten werden op dezelfde wijze uitgevoerd als de bovenvermelde experimenten, behalve dat interferon type II werd gebruikt dat voor-geïnactiveerd was door het 15 te verwarmen bij 100°C, gedurende 30 minuten.

De remmende werking van interferon type II op de vermenigvuldiging van tumorcellen werd bepaald volgens de onderstaande vergelijking.

De remmende werking van de vermenigvuldiging voor tumorcellen (50 is:

20 (A - 5 x 105) - (B - 5 x 105) χ 1Q(J

(A - 5 x 105) waarbij A het aantal cellen is van de blanco en B het aantal cellen is van het experiment met interferon type II.

De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabel C.

25 Zoals blijkt uit de resultaten van tabel C werd met behulp van interferon type II dat bereid is volgens de uitvinding, een effectieve remmende werking verkregen op het vermenigvuldigen van de tumorcellen, zoals BALL-1, TALL-1, NALL-1 en JBL-cellen en bleek eveneens effectief te zijn ten opzichte van een concentratiegebied van 5-500 eenheden per ml.

30 {zie tabel C op bladzijde 17) 2) de remmende werking bij het vermenigvuldigen van tumorcellen in vivo.

Dit experiment werd uitgevoerd met 8 witte muizen die ongeveer 2 maanden oud waren.

35 TALL-1 cellen werden subcutaan getransplanteerd in alle 8 witte g muizen in een hoeveelheid van 7,5 x 10 cellen per witte muis. Gerekend vanaf de tweede dag na de transplanatatie, kregen 4 witte muizen 3 intra-peritoneale injecties van 1000 eenheden interferon type II bereid volgens 0 g 'Λ ^ ·1 - < · .-¾ -17- 21120/Vk/jl

TABEL C

Type II interferon menselijke tumorcel concentratie ----r—-

(eenheden per ml) BALL-1 TALL-2 NALL-1 JBL

5__{%) (%) (%)__(j) 5 +17 +13 + 19 +18 50 +55 +59 +61 +50 10 500 +84 +80 +86 +89 _____-l -......-_L_J__l de methode die aangegeven is in voorbeeld II-f , gedurende een week, waarbij totaal 20 injecties werden gegeven. 48 Dagen later werden de 15 witte muizen gedood en het natte gewicht van de ontstane massieve tumoren werd bepaald. Het blanco-experiment werd uitgevoerd met de andere vier witte muizen op eenzelfde wijze als boven is vermeld, behalve dat hieraan geen interferon type II werd toegediend.

De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabel D.

20 TABEL D

Experiment no. Blanco (g) met Type II interferon behandelde witte _______________muizen (g) __ 1 5,6 1,3 25 _’_ 2 4,5 0,8 3 9,0 0 30 4 6,3 0

Gemiddeld gewicht 6,3 0,5 35 8000291 -18- 21120/Vk/jl 3) De remmende werking op het vermenigvuldigen van tumorcellen in vivo.

Deze test werd uitgevoerd met 8 witte muizen die ongeveer 2 maanden oud waren.

5 Tumor JBL-cellen werden subcutaan getransplanteerd bij de 8 7 witte muizen in een hoeveelheid van 1 x 10 cellen per witte muis. Vanaf de tweede week na de transplantatie kregen vier witte muizen twee intra-peritoneale injecties van 1000 eenheden interferon type II, bereid volgens een werkwijze die aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-b gedurende een week, 10 waarbij in totaal 8 injecties werden gegeven. 42 Dagen later werden de witte muizen gedood en het natte gewicht van de ontstane massieve tumoren werd bepaald. Hét blanoo-experiment werd uitgevoerd met de vier andere witte muizen op eenzelfde wijze als hierboven is aangegeven, behalve dat hieraan geen interferon type II werd toegediend. De hierbij verkregen re-15 sultaten zijn samengevat in tabel E.

TABEL E

Experiment no. Blanco met interferon type II

(g) behandelde witte muizen (g) 20 1 4,7 0,5 2 6,2 0,5 25 3 15,3 0,5 4 16,9 0,8

Gemiddelde 10,8 0,6 gewicht 30 -s---

Zoals duidelijk blijkt uit de resultaten van de tabellen D en E heeft interferon type II dat geïnjecteerd is een remmende werking op de vorming van tumor en ook een remmende werking op de verdere ontwikkeling hiervan, zelfs wanneer ze in ontwikkeling zijn. Het natte gewicht van de 35 ontstane massieve tumoren van de met interferon type II behandelde witte muizen was minder dan die van het blanco-experiment.Verder kan gesteld worden, dat de met interefron type II .behandelde muizen een betere eetlust hadden en actiever waren dan de blanco dieren.

/s\ r\ r* * -( , ·ρ ' j

V

-19- 21120/Vk/jl

Voorbeeld IV

Acute toxiciteit.

De acute toxiciteit werd bepaald van een preparaat dat interferon type II bevatte bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in 5 voorbeeld ΙΙ-i en het experiment werd uitgevoerd met muizen die 20 dagen oud waren en deze Heken een toxiciteit te hebben ten aanzien van het interferon type II-preparaat dat zeer laag was. De LD^-waarde bedroeg 20.000.000 eenheden of meer per kg bij een intraperitoneale injectie.

Zoals uit de bovenvermelde experimenten blijkt kunnen de op in-terferor. type II gevoelige ziekten behandeld worden en .deze ziekten kunnen voorkomen worden met het interferon dat bereid is volgens de uitvinding.

Zo kunnen bijvoorbeeld virale ziekten zoals epidemisch keratoconjunctivitis, herpetisch keratitis, influenza, rubella en serum hepatitis en niet-virale ziekten zoals leukemie en osteosarcoma worden bestreden of voor-15 komen.

De therapeutische en profylactische middelen met interferon type II die toegepast kunnen worden bij de interferon type II gevoelige ziekten kunnen in diverse vormen en fasen worden bereid in afhankelijkheid van'het gebruik, bijvoorbeeld een vloeibaar preparaat voor nebula, 20 het wassen van de ogen, neusdruppels, gorgelen en injecteren, een pasta-bereiding zoals voor een zalf en een vaste stof bereiding in de vorm van een poedér, granule en tablet. De middelen zijn voldoende effectief wanneer het interferon type II aanwezig is in een hoeveelheid van 1-10.000.000 eenheden per g en desgewenst kan het gebruikt worden in combinatie of als 25 mengsel met één of meer andere stoffen, bijvoorbeeld therapeutisch middel, draagstof, vulstof en stabilisator.

Met name wanneer interferon intraveneus geïnjecteerd wordt kan het snel worden verwijderd uit het bloed binnen ongeveer 10 minuten en uit het systeem worden afgescheiden, na toediening van interferon, bij-30 voorbeeld door interferon te verwerken in een toe te voegen suiker-hou-dende oplossing voor de toedieningstijd wordt verlengd en een volledig en effectief gebruik verkregen wordt van het toegediende interferon en de verdere therapeutische en profylactische werking van het interferon verbeterd wordt ten opzichte van interferon-gevoelige ziekten.

35 De diverse uitvoeringsvormen van de preparaten met interferon type II volgens de uitvinding zullen nader worden beschreven in voorbeeld V.

8 0 C 0 2 9 1 ƒ -20- 21120/Vk/jl

Voorbeeld V.

De bereiding van preparaten die interferon type II bevatten.

Voorbeeld V-a

Vloeibaar preparaat.

5 Een vloeibaar preparaat werd bereid door interferon type II

bevattend poeder, bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-a op te lossen in een fysiologisch zoutoplossing in een hoeveelheid van ongeveer 500 eenheden per ral. Het preparaat kan gebruikt worden als nebula, oogvloeistof, neusdruppel en gorgelmiddel voor het behandelen 10 en voorkomen van virale ziekten, met name epidemisch keratoconjunctivitis en influenza.

Voorbeeld V-b

Injectie.

Een injecteervloeistof werd bereid door het mengen van inter-15 feron type II bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-i in een fysiologische zoutoplossing in een hoeveelheid van ongeveer 100.000 eenheden per ml.

De injectie is geschikt voor het behandelen en voorkomen van alle interferon type II gevoelige ziekten met inbegrip van virale en tumor-20 ziekten.

Voorbeeld V-c

Suikerhoudende supplementaire injectie-oplossing.

Een suikerhoudende supplementaire injectie-oplossing voor het intraveneus toedienen werd bereid door het mengen van 1.000.000 eenheden 25 interferonpreparaat met interferon type I en II die beide bereid waren volgens een werkwijze die beschreven is in voorbeeld Il-e en 100 mg cyclofosfamide in een hoeveelheid van 500 ml van een 10 gew.i-ige waterige maltose-oplossing.

De supplementaire suiker houdende oplossing die geïnjecteerd 30 kan worden is geschikt als continu toe te dienen intraveneuze infusie-, oplossing voor het behandelen en voorkomen van tumor-ziekten.

Voorbeeld V-d

Injectie.

Een injecteeroplossing werd bereid door het oplossen van 35 500.000 eenheden interferonpreparaat met interferon type I en II, bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-b en 2 mg mitomycine C in 100 ml van een 10 gew.i-ige waterige maltose-oplossing.

De irjjecteeroplossing is geschikt voor het behandelen en voor- /2\ /' „ G J '

V

-21- 21120/Vk/jl komen van tumor-ziekten.

Voorbeeld V-e

Zalf

Een zalf werd bereid volgens een conventionele werkwijze door 5 het mengen·-van poeder bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld ΙΙ-d, vloeibare paraffine en vaseline ter verkrijging van een interferon type II-activiteit van 10.000 eenheden per g.

De zalf is geschikt voor het behandelen van virale huidziekten.

Voorbeeld V-f 10 Tablet.

Tabletten werden bereid volgens een conventionele werkwijze door het tabletteren van een mengsel van interferon type II bevattend poeder dat bereid is volgens voorbeeld Il-g, zetmeel en maltose ter verkrijging van een interferon type II-activiteit van ongeveer 1000 eenheden 15 per tablet (ongeveer 100 mg).

De tabletten zijn geschikt voor het behandelen en voorkomen van virale ziekten die optreden in het spijsverteringssysteem.

Voorbeeld V-g

Vloeibaar preparaat 20 Een vloeibaar preparaat voor orale toediening werd bereid door het oplossen van 5 mg metbötrexaat en het concentraat met een interferon type II-activiteit van 200.000 eenheden werd bereid door het toepassen van een werkwijze zoals aangegeven in voorbeeld ΙΙ-h in 10 ml van een 10 gew.56-ige waterige maltose-oplossing.

25 Dit preparaat is geschikt voor het behandelen en voorkomen van tumor-ziekten.

-CONCLUSIES- 5020291

Claims

1. Werkwijze ter bereiding van een geneesmiddel met een werking tegen tumor, met het kenmerk, dat interferon type II in een voor 5 geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm wordt gebracht.

2. Gevormd geneesmiddel met een werking tegen tumor, verkregen door het toepassen van de werkwijze volgens conclusie 1.

3. Werkwijze ter bereiding van geneeskrachtige verbindingen geschikt voor gebruik bij de werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 10 dat men interferon type II bereicfc op een voor analoge verbindingen bekende wijze.

4. Werkwijze ter bereiding van interferon type II, met het kenmerk, dat menselijke cellen die interferon type II produceren in andere lichamen van warmbloedige dieren worden getransplanteerd of de cellen wor- 15 den geënt in een cultuurmedium aangebracht in een diffusiekamer verdeeld door filtermembranen, zodanig ontworpen, om aangebracht te worden in of op een dierlijk lichaam, zodat de cellen kunnen groeien op de lichaamsvloeistof waardoor de getransplanteerde of geënte cellen worden vermenigvuldigd in het warmbloedige lichaam of de diffusieruimte onder toepassing 20 van de lichaamsvloeistof, waardoor de vermenigvuldigde menselijke cellen worden onderworpen aan de inwerking van een inductiemiddel voor interferon type II in vivo of in vitro om interferon type II te induceren en het geïnduceerde interferon type II te zuivern en af te scheiden.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de in- 25 terferon type II producerende verkregen menselijke cellen afkomstig zijn van mensèlijke lymfoblastoïde cellijnen.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de interferon type II producerende verkregen menselijke cellen gekozen zijn uit HPB-ALL cellen, M0LT-3 cellen, P 12/Ichikawa cellen, HPB-MLT cellen,

30 P 8/Seki cellen, HCL cellen, P 10/Shibata cellen, Namalva cellen, BALL-1 cellen, TALL-1 cellen, NALL-1 cellen en JBL cellen.

7. Werkwijze volgens conclusie 4-6, met het kenmerk, dat meer dan één variëteit van de toegepaste menselijke cellen wordt gebruikt.

8. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de 35 warmbloedige dieren zoogdieren zijn.

9. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat als zoogdieren worden gebruikt, honden, katten, apen., varkens, runderen, paarden, geiten, konijnen, guineze biggetjes, ratten, hamsters, muizen en % -23- 21120/Vk/jl V witte (nude) muizen.

10. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de dif- fusieruimte voorzien is van hierin op afstand aangebrachte filtermembranen -7 -5 met een poriëngrootte van 10 tot 10 m.

11. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat inter feron type I en interferon type II inductiemiddelen in combinatie worden toegepast.

12. Werkwijze volgens conclusie 4-11, met het kenmerk, dat de vermenigvuldigde menselijke celsuspensie wordt onderworpen aan de inwer- 10 king van een interferoninductiemiddel bij een interferon inductiemiddel-concentratie van ongeveer 0,001 jug tot 10 mg/ml.

13. Werkwijze volgens conclusie 4-12, met het kenmerk, dat de vermenigvuldigde menselijke cellen worden onderworpen aan de inwerking van een interferon induetiemiddel bij een temperatuur van 20-40°C.

14. Preparaten voor het behandelen en/of voorkomen van interferon type II-gevoelige ziekten , met het kenmerk, dat het preparaat interferon type II bevat, bereid volgens een werkwijze zoals aangegeven in conclusie 4-13.

15. Preparaten volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat deze 20 ook interferon type I bevatten.

16. Preparaten volgens conclusie 14-15, met het kenmerk, dat het interferon type II aanwezig is ineen hoeveelheid van 1-10.000.000 eenheden per g. 3000291