NL192086C

NL192086C - Werkwijze ter bereiding van interferonen en werkwijze ter bereiding van een geneesmiddel dat interferonen bevat.

Info

Publication number: NL192086C
Application number: NL7900476A
Authority: NL
Original assignee: Hayashibara Ken; Ashida Shin
Priority date: 1978-01-22
Filing date: 1979-01-22
Publication date: 1997-02-04
Also published as: FI66428C; NO790195L; CA1135186A; DK25579A; US4276282A; CH637831A5; NO152976B; GB2016015A; FI66428B; NO152976C; FR2414920A1; FI790188A; GB2016015B; DE2902136C2; FR2414920B1; IT1116493B; SE436969B; AU533201B2; DE2902136A1; DK153848C

Description

1 192086

Werkwijze ter bereiding van interferonen en werkwijze ter bereiding van een geneesmiddel dat interferonen bevat

Da onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van interferonen door het 5 blootstellen van menselijke cellen aan de werking van een interferon-inductor en winnen en zuiveren van de door de inductie verkregen interferonen.

Deze werkwijze is bekend uit de Franse octrooiaanvrage nr. 2.034.473, waarbij synthese van interferonen wordt geïnduceerd door proefdieren en klassieke in vitro-celsuspensies (onder meer van menselijke cellen) te behandelen met complexen van nucleïnezuren als interferon-inductor. Deze werkwijze is echter 10 niet geschikt voor een bereiding van interferonen op grote schaal, en bovendien is de weikwijze met celsuspensies duur, aangezien menselijk serum is vereist.

Dit probleem wordt vermeden door de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, die bovendien geschikt is voor bereidingen op grote schaal, doordat de menselijke cellen worden vermenigvuldigd na (a) transplantatie van de cellen in het lichaam van een warmbloedig dier, of (b) enten van de cellen in een 15 diffusiekamer die is verbonden met de voedende lichaamsvochten van het dier, waarbij de aldus geïntroduceerde cellen zich vermenigvuldigen terwijl het dier de cellen voorziet van zijn voedende lichaamsvochten, en de cellen vervolgens al of niet afgescheiden uit het dierlijke lichaam worden blootgesteld aan de werking van de interferon-inductor, om interferonen te produceren, waarna de door de inductie verkregen interferonen worden gewonnen en gezuiverd.

20 Ook zijn door deze werkwijze meer mogelijkheden verkregen voor het voorkomen en behandelen van ziekten die gevoelig zijn voor de weiking van interferonen.

Zoals onder meer beschreven door W. E. Stewart II (Interferons and their Actions (Press) 1e uitgave, 1977, biz. 49-72) zijn interferonen eiwitten met antivirale en immunomodulerende eigenschappen die door levende cellen worden gesynthetiseerd wanneer de cellen hiertoe worden geïnduceerd met stoffen zoals 25 virussen. Sinds hun ontdekking worden interferonen dan ook beschouwd als veelbelovende preventieve en therapeutische middelen tegen virale ziekten.

Gedurende de laatste jaren heeft men uitgezien naar de bereiding van interferonen als therapeutische middelen, aangezien werd geconstateerd dat deze stoffen zowel ten opzichte van virale als ten opzichte van niet-virale tumoren antitumorale effecten vertonen. Omdat interferonen in beginsel soortspecifiek zijn, zijn 30 alleen de interferonen afkomstig van levende menselijke cellen werkzaam bij het vootkomen en behandelen van menselijke ziekten. Voor de bereiding van interferonen werden gewooniijk leukocyten gebruikt als levende menselijke cellen. Leukocyten worden verkregen door ze af te zonderen uit vers bloed, maar hef bewaren en in grote hoeveelheden tegen een lage kostprijs ter beschikking stellen is zeer moeilijk.

De onderzoekers hebben zowel onderzoek verricht naar gemakkelijk op Industriële schaal toepasbare 35 werkwijzen ter bereiding van Interferonen, zoals interferonen van leukocyten, interferonen van lymfoblastoï-den, interferonen van fibroblasten en immuno-interferonen (interferon type II), als naar de mogelijkheden van de verkregen producten bij het voorkomen en behandelen van ziekten die gevoelig zijn voor interferonen.

Vergeleken met de gebruikelijke werkwijzen die voor de in vitro-vermenigvuldiging van cellen worden 40 toegepast, heeft de werkwijze volgens de uitvinding het voordeel dat er geen of veel minder voedings-medium nodig is waaraan kostbaar menselijk serum moet worden toegevoegd, dat het vermenigvuldigen van de verkregen cellen gemakkelijker kan worden gehandhaafd en dat een hogere interferonactiviteit kan worden verkregen. Meer in het bijzonder geldt dat menselijke cellen gemakkelijk in het lichaam van andere warmbloedige dieren kunnen worden vermenigvuldigd door de cellen daarin te transplanteren, of door een 45 diffusiekamer die de cellen bevat, te verbinden met een dier dat op de gebruikelijke wijze wordt gevoed, terwijl het dier de cellen voorziet van zijn voedende lichaamsvochten, fn vergelijking met de gebruikefijke in vitro-werkwijzen bewerkstelligt de uitvinding bovendien dat de verkregen menselijke cellen zich stabieler en sneller kunnen vermenigvuldigen en dat er een hogere celproductie en een hogere interferonopbrengst per cel kan worden bereikt. Alle menselijke cellen kunnen worden gebruikt op voorwaarde dat ze zich gemakke-50 lijk vermenigvuldigen, wanneer ze worden getransplanteerd in andere warmbloedige dieren. Normale menselijke cellen zoals OUMS-20-cellen, OUMS-25-cellen, HEF-2-cellen, HUF-2-cellen, en WI-38-ceHen, beschreven in ’’Protein, Nucleic Acid and Enzyme” (1975), deel 20, nr. 6, p. 616-643, gepubliceerd door Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, en cellen afkomstig van menselijke tumorcellen zoals Namalva-ceNen, beschreven in Journal of Clinical Microbiology (1975) deel 1, p. 116-117, BALL-1-cellen, TALL-1-ceRen, 55 NALL-1 -cellen, beschreven door Isoa Miyoshi, Nature (1977) deel 267, p. 843-844 en JBL-cellen, beschreven door Isoa Miyoshi, Cancer (1977) deel 40, nr. 6, kunnen bij de werkwijze volgens de uitvinding worden gebruikt.

192086 2

Volgens de uitvinding kan om het even welk warmbloedig dier worden gebruikt wanneer de toe te passen menselijke cellen hierin gemakkelijk kunnen worden vermenigvuldigd. Zo kunnen bijvoorbeeld vogels zoals kippen en duiven worden gebruikt, alsook zoogdieren zoals honden, katten, apen, geiten, vaikens, runderen, paarden, konijnen, cavia’s, ratten, hamsters en naakte muizen (de zogenaamde ’’nude mice”).

5 Omdat de dieren wellicht ongewenste immuun-reacties zullen vertonen wanneer de menselijke cellen erin worden getransplanteerd, verdient het de voorkeur de dieren te gebruiken in een zo onrijp mogelijke vorm, zoals eieren, embryo’s, foetussen, pasgeboren of jonge dieren, om gebruik te maken van immunoparalyse.

Vóór de transplantatie van de cellen kunnen de dieren eerst worden behandeld door bestraling met X-stralen óf γ-stralen bij 200-600 rem, of met een antisemm of een immunosupressief middel om de 10 immuun-reacties te onderdrukken.

Als warmbloedig dier verdient de naakte muis de voorkeur omdat deze geen of vrijwel geen immuun-reacties vertoont en de menselijke cellen hierin zonder voorbehandelingen getransplanteerd en snel vermenigvuldigd kunnen worden.

Het vermenigvuldigen van de menselijke cellen kan verder worden gestabiliseerd door de cellen eerst te 15 transplanteren in een hamster en vervolgens in een naakte muis, waarbij interferon met een verhoogde activiteit wordt geïnduceerd.

De vermenigvuldigde cellen kunnen verder worden getransplanteerd van het ene warmbloedige dier naar het andere van dezelfde soort, hetzelfde geslacht, dezelfde klasse of dezelfde orde, behalve de mens. De verkregen menselijke cellen kunnen worden getransplanteerd in om het even welk deel van het dierlijke 20 lichaam, op voorwaarde dat de cellen hierin gemakkelijk tot vermenigvuldiging kunnen komen, bijvoorbeeld intraveneus, intraperitoneaal, subcutaan, en in de allantoïsholte.

In plaats van het rechtstreeks in dierlijke lichamen vermenigvuldigen van de menselijk cellen, kunnen deze ook geënt en vermenigvuldigd worden in een diffusiekamer die verschillende grootten en vormen kan hebben, en voorzien is van een filtermembraan met poriën met een diameter van ongeveer 10'7 en tot 10‘5 25 meter, bijvoorbeeld een membraanfilter, ultrafilter of holle vezel, welke kamer bijvoorbeeld intraperitoneaal wordt aangebracht in het dierlijke lichaam, terwijl de dieren de cellen dan voorzien van voedende lichaams-stoffen.

Indien nodig kunnen de geïntroduceerde menselijke cellen in de diffusiekamer worden vermenigvuldigd, terwijl de voedende lichaamsvloeistof van de warmbloedige dieren in en uit het voedingsmedium in de 30 kamer kan stromen om de cellen te voorzien van voedende vloeistof. Wanneer in dit geval de kamer is aangebracht op het dierlijke lichaam, kan de vermenigvuldiging van de cellen door de wand van de kamer worden gevolgd en kan het aantal cellen per dier verder worden verhoogd zonder het nodeloos te doden, door achtereenvolgens de kamer te verwijderen, de cellen in een andere kamer met vers medium te enten en deze kamer opnieuw op dezelfde dieren aan te brengen.

35 De methode met de diffusiekamer heeft als bijkomende kenmerken dat om het even welk warmbloedig dier, behalve de mens, voor het vermenigvuldigen van de menselijke cellen kan worden gebruikt, dat een voorbehandeling voor het onderdrukken van immuun-reacties niet nodig is en dat de geïntroduceerde menselijke cellen die in de kamer vermenigvuldigd zijn, gemakkelijk kunnen worden gewonnen zonder verontreiniging door dierlijke cellen, omdat de menselijke cellen geen direct contact hebben met de dierlijke 40 cellen en er zodoende geen gevaar bestaat voor ongewenste reacties.

Na de transplantatie van de menselijke cellen wordt het dier op de gebruikelijke wijze gevoed zonder een speciale behandeling.

De vermenigvuldigingsperiode van de menselijke cellen is gewoonlijk 1 tot 20 weken. Wanneer de 45 bepaalde cellen die getransplanteerd worden afkomstig zijn van menselijke normale of tumorale leucocyten, is de vermenigvuldigingsfactor van de cellen zo hoog dat de vermenigvuldiging gewoonlijk bereikt kan worden in een periode van 1 tot 5 weken.

Het aantal bij de vermenigvuldiging verkregen menselijke cellen werd geteld en bleek ongeveer 107 tot ongeveer 1012 of meer te zijn per dier.

50 Met andere woorden kan gesteld worden dat de werkwijze volgens de uitvinding zeer voordelig is voor het bereiden van interferonen vanwege het feit dat het aantal cellen dat getransplanteerd of geënt is op het dier toeneemt met een factor 102-107 of meer door de uitgevoerde werkwijze terwijl er een factor 101- 106 of meer wordt verkregen door enting en vermenigvuldiging van dezelfde cellen in een voedend medium in vitro.

55 De vermenigvuldigde levende menselijke cellen kunnen geïnduceerd worden volgens een willekeurige methode ter bereiding van interferonen. Het deel van het dierlijk lichaam zelf waar de cellen vermenigvuldigd worden, kan worden blootgesteld aan een interferon-inductor. Zo kan bijvoorbeeld interferon verkregen 3 192086 worden door de gesuspendeerde menselijke cellen die intraperitoneaal vermenigvuldigd worden of de menselijke tumorcellen die subcutaan gevormd worden bloot te stellen aan de interferon-inductor om interferon te induceren, en het geïnduceerde interferon uit de behandelde menselijke cellen te verzamelen en te zuiveren.

5 Interferonen kunnen ook geïnduceerd worden door het winnen van de vermenigvuldigde menselijke cellen uit dierlijk lichaam en de cellen in vitro bloot te stellen aan de interferon-inductor. Zo worden bijvoorbeeld mensetijke cellen die verkregen werden door het verzamelen van de intraperitoneaal vermenigvuldigde gesuspendeerde menselijke cellen, of cellen verkregen door dissociatie van de geïsoleerde menselijke massieve tumor die subcutaan in een dierlijk lichaam gevormd is, in een voedingsmedium 10 gesuspendeerd dat gehouden wordt op een temperatuur van ongeveer 20 tot 40°C ter verkrijging van een concentratie van ongeveer 10^108 cellen per ml. Vervolgens worden de cellen blootgesteld aan de interferon-inductor om interferonen te induceren en de gevormde interferon wordt verzameld en gezuiverd.

Wanneer menselijke cellen vermenigvuldigd worden in diffusiekamers kunnen de cellen aan interferon-inductors in de kamers worden blootgesteld of nadat de cellen uit de kamers zijn gewonnen.

15 Bij de inductie van interferonen kan de productie van interferonen verhoogd worden volgens bekende methoden zoals priming-methode onder toepassing van interferon en de superinductiemtehode onder toepassing van een metabolische inhibitor.

De interferonproductie per dier kan verder verhoogd worden door het toepassen van de volgende werkwijzen: 20 a) een methode waarbij het aantal levende cellen per dier verder wordt verhoogd zonder dat het dier onnodig wordt gedood door het achtereenvolgens verwijderen van de kamer, het enten van de cellen in een andere kamer met vers voedingsmedium hierin en door het aanbrengen van deze laatste kamer op hetzelfde dier, b) een werkwijze waarbij de menselijke cellen die in het dieriijke lichaam vermenigvuldigd zijn, worden 25 blootgesteld aan een interferon-inductor in vivo en/of in v'rtro om interferonen te induceren onder toepassing van dezelfde cellen, hetgeen één of meerdere keren kan gebeuren.

Hierbij kan om het even welke bekende interferon-inductor worden gebruikt zoals bijvoorbeeld virussen, bacteriën, protozoa, rickettsia’s, nucleïnezuren, endotoxinen en polysachariden.

Het gevormde interferon kan makkelijk worden gezuiverd volgens bekende zuiveringsmethoden zoals 30 bijvoorbeeld uitzouten, dialyse, filtratie, centrifugeren, indampen en lyofiliseren. Indien noodzakelijk kan het verkregen interferonpreparaat verder gezuiverd worden volgens bekende werkwijzen zoals adsorptie en desorptie met een ionenwisselaar, gelfiltratie, affiniteitschromatografie, fractionering, gebruik makend van de verschillen in de waarde vanbet isoëlektrisch punt van aanwezige eiwitten en elektroforese.

De interferon-activiteit kan worden bepaald volgens de onconventionele methode van de ’’plaque” -35 reductie met FL-cellen afgeleid van een menselijk amnion, zoals beschreven in ’’Protein, Nucleic Acid and Enzyme”, deel. 20, nr. 6, blz. 616-643 (1975), gepubliceerd door Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo. De hemagglutininetiter werd bepaald volgens de methode zoals beschreven door J. E. Salk, ’’Journal of Immunology”, deel 49, blz. 87 (1944).

De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, waarin de 40 bereiding van interferonen is aangegeven.

Voorbeeld I

Op volwassen naakte muizen werd subcutaan een transplantatie uitgevoerd met BALL-1 -cellen afgeleid van de mens en deze cellen werden op gebruikelijke wijze gedurende drie weken gevoed. Ongeveer 10 g 45 massieve tumor per muis, subcutaan gevormd, werd verwijderd, fijngesneden, gesuspendeerd in een zoutoplossing met trypsine om de tumor te doen dissociëren in cellen en de cellen werden gewonnen door centrifugeren. De cellen werden gewassen met een Eagle is minimaal essentieel medium met een pH van 7,2 en een temperatuur van 37°C, dat 5 v/v % menselijk serum bevatte en ze werden opnieuw gesuspendeerd ter verkrijging van een concentratie van ongeveer 5 x 106 cellen per ml. Aan het verkregen mengsel 50 werden ongeveer 100 eenheden per ml. partieel gezuiverd menselijke soort specifieke interferonen toegevoegd en het mengsel werd gedurende ongeveer 2 uren bewaard en vervolgens werden ongeveer 300 hemagglutininetiters per ml. Sendai-virus toegevoegd en geïncubeerd gedurende nogmaals 20 uren om interferonen te induceren. Het geïncubeerde mengsel werd gecentrifugeerd bij ongeveer 1000 g en een temperatuur van 4°C voor het verwijderen van precipitaten zoals cellen. De verkregen bovenstaande 55 vloeistof werd bij een temperatuur van 4°C gedurende 48 uren gedialyseerd ten opzichte van een buffer-oplossing van 0,1 M met een pH van 2,0, die zoutzuur en kaliumchloride bevatte en vervolgens ten opzichte van 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing bij een pH van 7,2 gedurende 12 uren, en zorgvuldig gefiltreerd 192086 4 door een membraanfiltratie. Het fiitraat werd ingedampt en gelyofiliseerd tot een interferonpoeder met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 20 miljoen eenheden per muis.

Voorbeeld II

5 Bij volwassen naakte muizen werd intraperitoneaal een transplantatie uitgevoerd met OUMS-20-cellen die uit de mens zijn verkregen en de voeding had gedurende 5 weken op gebruikelijke wijze plaats. De muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met Newcastle-ziekte-virus dat oorspronkelijk een hemagglutininetiter had van ongeveer 3000, maar bijna volledig gepreïnactiveerd was door een ultraviolette straling, en na 24 uren werden ze gedood waarna de ascites-vloeistof werd verzameld. Deze vloeistof werd gecentrifugeerd bij 10 ongeveer 1000 g bij een temperatuur van 4°C ter verwijdering van de precipitaten, zoals celmateriaal. De bovenstaande vloeistof werd bij een temperatuur van 4°C gedurende 48 uren gedialyseerd ten opzichte van een bufferoplossing van 0,1 M, bij een pH van 2,0, welke oplossing zoutzuur en kaliumchloride bevatte, en vervolgens gedialyseerd ten opzichte van een 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing met een pH van 7,2 gedurende 15 uren en zorgvuldig gefiltreerd door membraanfiltratie. Het fiitraat werd geconcentreerd ter 15 verkrijging van een interferonoplossing met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 700.000 eenheden/10 naakte muizen.

Voorbeeld III

Pasgeboren hamsters werden intraperitoneaal geïnjecteerd met bekend konijn-antilymfocytenserium tegen 20 hamsterthymocyten en subcutaan getransplanteerd met JBL-cellen afkomstig van de mens, en ze werden op gebruikelijke wijze gedurende 4 weken gevoed.

Er werd per hamster ongeveer 30 g massieve tumor subcutaan gevormd en deze werd afgescheiden en gedissocieerd op eenzelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I. De verkregen cellen werden gewassen met RPM11640 medium bij een pH van 7,4 en een temperatuur van 37°C met 10 v/v % kalfsserum en 25 opnieuw gesuspendeerd ter verkrijging van een concentratie van ongeveer 2 x 107 cellen per ml. Aan de verkregen gemengde oplossing werden 200 eenheden per ml toegevoegd van gedeeltelijk gezuiverd interferon met een menselijke soortspecifiteit en vervolgens werd het mengsel gedurende ongeveer 1 uur bewaard. Na toevoeging van ongeveer 100 hemagglutininetiters per ml. Sendai-virus werd het verkregen mengsel gedurende nogmaals 16 uren bewaard om interferonen te induceren.

30 Vervolgens werd de verkregen oplossing gezuiverd en geconcentreerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld II, ter verkrijging van een interferonoplossing met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 15.000.000 eenheden per hamster.

Voonbee/cf IV

35 Op pasgeboren ratten werd een intraveneuse transplantatie uitgevoerd met menselijke Namalva-cellen en de dieren werden op gebruikelijke wijze gedurende 4 weken gevoed.

Er werd per rat een massieve subcutane tumor van 50 g gevormd, verwijderd en gedissocieerd op een zelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I. Vervolgens werden de verkregen cellen op een zelfde wijze verder behandeld als aangegeven is in voorbeeld I om interferonen te induceren. De verkregen interferon-40 oplossing werd gezuiverd en gelyofiliseerd op een zelfde wijze als vermeld in voorbeeld I ter verkrijging van een interferonpoeder met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 30.000.000 eenheden per rat.

Voorbeeld V

45 Volwassen muizen werden onderworpen aan een röntgenstraling bij ongeveer 400 rem om de immuun-reacties te verzwakken en vervolgens werd subcutaan getransplanteerd met TALL-1-cellen afkomstig van de mens, en de dieren werden op gebruikelijke wijze gedurende drie weken gevoed.

Ongeveer 10 g massieve tumor die subcutaan per muis werd gevormd, werd afgezonderd en gedissocieerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I.

50 De verkregen cellen werden op een zelfde wijze behandeld als aangegeven is in vooibeeld III om het interferon te induceren. De verkregen interferonoplossing weid gezuiverd en geconcentreerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld II om een interferonoplossing te geven met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 8.000.000 eenheden per muis.

55 Voorbeeld VI

Op een zelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld III werden gedurende een periode van 3 weken OUMS-25 menselijke cellen subcutaan getransplanteerd in hamsters en vervolgens intraperitoneaal 5 192086 getransplanteerd in naakte muizen die 10 dagen oud waren. Deze naakte muizen werden op gebruikelijke wijze gedurende 5 weken gevoed, en de ascites-vloeistof werd onder verdoving verzameld. De vloeistof werd gecentrifugeerd om de vermenigvuldigde cellen te verzamelen. De cellen werden gewassen en interferonen werden op een zelfde wijze geïnduceerd als aangeven is in voorbeeld I. De verkregen 5 interferonoplossing werd gezuiverd en ingedampt op een zelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld II ter verkrijging van een oplossing met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 2.000.000 eenheden per muis.

I/oorbeeld VII

10 Menselijke JBL-cellen werden gesuspendeerd in een zoutoplossing in cilindrische diffusiekamers uitgevoerd in kunststof met een inhoud van 10 ml voorzien van een membraan met poriën met een diameter van ongeveer 0,5 micron. Deze kamers werden intraperitoneaal aangebracht in volwassen ratten. De ratten werden op de gebruikelijke wijze gedurende vier weken gevoed en daarna werden de kamers verwijderd.

De concentratie van de cellen in de kamers bleek ongeveer 5 x 10® cellen per ml te zijn, hetgeen 15 ongeveer 1000 keren meer was dan in vitro werd bereikt op een voedingsmedium van een C02-incubator.

De cellen werden verder behandeld zoals aangegeven is in voorbeeld I om interferonen te induceren. De verkregen interferonoplossing werd gezuiverd, ingedampt en gelyofiliseerd tot een interferonpoeder met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 30.000.000 eenheden per rat.

20 Voorbeeld VIII

in de allantoïs-holte van bevruchte witte eieren die gedurende 5 dagen bij 37°C waren bewaard, werden menselijke NALL-1 -cellen getransplanteerd en de eieren werden gedurende 1 week bewaard bij een temperatuur van 37°C.

De eieren werden geopend en de vermenigvuldigde cellen werden verzameld. De cellen werden op een 25 zelfde behandeld als aangegeven is in voorbeeld I om interferonen te induceren. De verkregen interferon-oplossing werd gezuiverd en geconcentreerd op een zelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld II ter verkrijging van een interferonoplossing met een hoge activiteit. De interferonactiviteit was ongeveer 400.000 eenheden/10 bevruchte witte eieren.

30 Voorbeeld IX

Het interferonpoeder dat bereid is op een wijze zoals aangegeven in voorbeeld I werd verder gezuiverd volgens een werkwijze die beschreven is door G. Bodo (Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon ”11th International Immunobiological Symposium", 8 en 9 juni 1977, Zagreb, Joegoslavië), te weten een adsorptie en desorptie met een ionenwisselaar, een fractionering op molecule-35 gewicht door gelfiltratie, concentreren en zorgvuldig filtreren met een membraanfilter. De verkregen interferonoplossing had een activiteit van 2x10® eenheden per mg proteïne. De interferonopbrengst bedroeg ongeveer 40%.

Het interferon dat verkregen is in de voorbeelden I—IX kan bij voorkeur als zodanig of in mengsels gebruikt worden met één of meer andere stoffen zoals stoffen ter verkrijging van injectievloeistoffen en 40 geneesmiddelen voor inwendig of uitwendig gebruik ter voorkoming en ter behandeling van menselijke ziekten die gevoelig zijn voor interferon. De uitvinding zal verder worden toegelicht aan de hand van de volgende experimenten die vermeld zijn in de proeven 1-3.

Proef 1 45 De behandeling van virusziekten met interferon (inhibitietest ten aanzien van de virus-vermenigvuldiging in vitro).

Aan monolagen van menselijke embryonische longcellen gevormd door een primaire cultuur in Petrischalen met een diameter van 6 cm werden 0,1,10, of 100 eenheden interferon toegevoegd, bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld IX, en de verkregen mengsels werden bewaard in een 5 v/v % 50 Co2-incubator gedurende 20 uren bij een temperatuur van 37°C. Aan de cellen werd Varicella-zoster virus of menselijk cytomegalovirus toegevoegd in een hoeveelheid van ongeveer 100 plaque vormende eenheden wanneer aan de cellen geen interferon werd toegevoegd. Het mengsel werd geïcubeerd en het aantal gevormde plaques werd geteld.

Het remmende effect van interferon ten opzichte van de vermenigvuldiging van het virus werd bepaald 55 onder toepassing van de volgende vergelijking:

Δ — R

vermindering van het aantal plaques (%) = A~ x 100, 192086 6 waarbij A het aantal plaques is wanneer geen interferon wordt toegevoegd en B het aantal gevormde plaques is wanneer interferon wel wordt toegevoegd. De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabel A.

5 TABEL A

eenheden Varicella-zoster virus menselijk cytomegalovirus 0 0% 0% 10 1 12% 5% 10 53% 64% 100 91% 84% 15 Zoals duidelijk zat zijn uit de resultaten die samengevat zijn in tabel A remmen de interferonen volgens de uitvinding de vermenigvuldiging van de ziekteverwekkende virussen.

Er werd geen afwijking gevonden bij de in cultuur gebrachte menselijke cellen wanneer interferonen toegevoegd werden aan de cellen.

20 Proef 2

De behandeling van niet-virale ziekten met interferonen.

a) Test waarmee het inhibiteren bepaald werd ten opzichte van het vermenigvuldigen van tumorcellen in vitro.

Aan RPMI 1640 medium verrijkt met 15 v/v % foetaal kalfserum werd interferon toegevoegd dat bereid is 25 volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld IX ter verkrijging van een concentratie van 30, 300 en 3000 eenheden per ml. De verkregen mengsels werden geënt met menselijke tumorcellen ter verkrijging van een concentratie van 5 x 105 cellen per ml en werden geïncubeerd in 5 v/v % C02-incubators gedurende 5 dagen bij een temperatuur van 37°C. Vervolgens werd het aantal cellen per ml. medium geteld. Controleproeven die uitgevoerd werden zoals boven aangegeven behalve dat de interferonen eerst 30 geïnactiveerd werden door verhitting bij een temperatuur van 100°C gedurende 30 minuten werden op een zelfde wijze geïncubeerd.

Het remmende effect van het interferon op de celvermenigvuldiging werd bepaald met de volgende vergelijking: „g. remming van de celvermenigvuldiging (%) = (A~5x10 ) - (B-5x10.) x iqq (A-5x10 ) waarbij A het aantal cellen in de controleproef is en B het aantal cellen in de proef die uitgevoerd werd met interferon.

De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabel B.

40

TABEL B

interferonconcentratie menselijke tumorcellen

45 eenheden per ml BALL-1 TALL-1 NALL-1 JBL

30 +18% +12% +21% +19% 300 +57% +61% +63% +54% 3000 +57% +61% +85% +91% 50 -

Zoals duidelijk zal zijn uit de resultaten van tabel B remmen interferonen de vermenigvuldiging van tumorcellen zoals BALL-1 -cellen, TALL-1-cellen, NALL-1-cellen en JBL-cellen sterk en zijn interferonen werkzaam bij een concentratie van 30 tot 3000 eenheden per ml.

55 b) Inhibitietest ten aanzien van de vermenigvuldiging van tumorcellen in vivo.

Deze test werd uitgevoerd met 8 naakte muizen die ongeveer 2 maanden oud waren. Tall-1-cellen (tumorcellen) in een hoeveelheid van 7,5 x 10® cellen per muis werden subcutaan getransplanteerd in alle 7 192086 muizen. Vanaf de derde dag van de transplantatie kregen vier muizen intraperitoneaal 20 doseringen interferon toegediend, bereid zoals aangegeven is in voorbeeld III, waarbij driemaal per week een dosering van 10.000 eenheden per muis werd uitgevoerd. Na de transplantatie werden de muizen gedurende 48 dagen gevoed en vervolgens gedood. Het natte gewicht van de in de muis gevormde tumor werd bepaald.

5 De overige vier muizen werden als controlemuizen gebruikt en gevoed en gedood op dezelfde wijze, behalve dat deze geen interferon kregen toegediend. Het natte gewicht van de gevormde massieve tumor werd eveneens bepaald. De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabel C.

TABEL C

10 -- controle met interferon behandeld 1 5,8 g 1,6 g 2 8,8 g 1,1 g 15 3 4,3 g 0 g 4 7,5 g 0 g gemiddeld gewicht 6,6 g 0,7 g 20 c) Inhibitetiest ten aanzien van de vermenigvuldiging van tumorcellen in vivo.

Deze test werd uitgevoerd met 8 naakte muizen die ongeveer 2 maanden oud waren.

JBL-cellen (tumorcellen) werden in alle muizen in een hoeveelheid van 107 cellen per muis subcutaan getransplanteerd. Vanaf de derde week van de transplantatie ontvingen vier muizen intraperitoneaal 8 doseringen interferon bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld II, één dosering van 1000 25 eenheden per muis, 2 doseringen per week. Na de transplantatie werden de muizen gedurende 42 dagen gevoed en daarna gedood. Het natte gewicht van de gevormde tumor werd bepaald. De andere vier muizen werden als controle gebruikt, gevoed en gedood op dezelfde wijze, maar deze ontvingen geen interferon.

Het natte gewicht van de gevormde tumor werd bepaald. De hierbij verkregen resultaten zijn samengevat in tabel D.

30

TABEL D

controle met interferon behandeld 35 1 4,5 g 0,7 g 2 4,9 g 1,4 g 3 17,1 g 0,9 g 4 20,3 g 0,7 g gemiddeld gewicht 11,7 g 0,9 g 40 -

Zoals duidelijk zal zijn uit de resultaten van de tabellen C en D remmen interferonen de vorming van de menselijke massieve tumor in de muis en zelfs wanneer de tumor gevormd is, is het gewicht hiervan aanzienlijk lager dan bij de controle. In vergelijking met de controle vertonen de met interferon behandelde 45 naakte muizen een grotere eetlust en grotere lichaamsactiviteit.

Proef 3

Acute toxidteitstesten.

Een acute toxiciteitstest werd uitgevoerd met naakte muizen van 20 dagen door intraperitoneaal de 50 interferonoplossing te injecteren die bereid is volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld IX. Het resultaat van dit onderzoek is dat er een lage toxiteit is gebleken. De LD^-waarde is groter dan 20.000.000 eenheden per kg wanneer het onderzochte middel intraperitoneaal geïnjecteerd werd bij de muis.

Zoals duidelijk zal zijn uit de bovenveimelde proeven zijn de voor interferonen gevoelige ziekten die hierboven beschreven zijn degene die kunnen worden voorkomen of genezen met de interferonen volgens 55 de uitvinding. Dit zijn virale ziekten zoals epidemisch keratoconjunctivitis, herpes-keratitis, influenza, rubella en serumhepatitis, en niet-virale ziekten zoals leukemie en osteosarcoma.

Geneesmiddelen of therapeutische middelen tegen voor interferonen gevoelige ziekten die op de hiervoor 192086 8 beschreven wijze verkregen interferonen bevatten, zijn op verschillende wijzen en in verschillende vormen te bereiden, afhankelijk van het gebruik hiervan zoals een vloeibare bereidingsvorm zoals een nebula, oogwaters, neusdruppels, gorgelvloeistoffen en injectievloeistoffen, pastabereidingen zoals zalven en vaste preparaten zoals poeders, korrels en tabletten. De preparaten zijn voldoende effectief voor het voorkomen 5 en behandelen van de voor interferonen gevoelige ziekten wanneer zij in het algemeen tot 1 tot 10.000.000 eenheden interferon per gram bevatten. Indien noodzakelijk kunnen aan het farmaceutische middel één of meer stoffen toegevoegd worden die gebruikelijk zijn bij therapeutische middelen zoals dragers, vulmiddel-len en stabilisatoren.

Enkele uitvoeringsvormen van interferon-houdende preparaten zullen beschreven worden in de 10 voorbeelden X-XVI.

Voorbeeld X

Een vloeibare toedieningsvorm.

Een vloeibaar preparaat werd bereid met een zoutoplossing en de interferonen verkregen volgens de 15 werkwijze die beschreven is in voorbeeld I ter verkrijging van een interferon-concentratie van 500 eenheden per ml. Het preparaat is geschikt als nebula, oogwater, neusdruppel en gorgeldrank ter voorkoming en behandeling van virale ziekten, met name epidemische keratoconjunctivitis en influenza.

Voorbeeld XI

20 Een injecteerbare oplossing.

Een injecteerbare oplossing werd bereid door uit te gaan van een zoutoplossing en de interferonen verkregen volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld IX ter verkrijging van een interferon-concentratie van 100.000 eenheden per ml.

De injecteerbare oplossing is geschikt om alle voor interferonengevoelige ziekten te behandelen, zoals 25 virale en tumorale ziekten.

Voorbeeld XII

Een injecteerbare oplossing.

Een injecteerbare oplossing werd bereid met 500 ml van een 10 gew./vol.% waterige maltose-oplossing 30 1.000.000 eenheden interferonen bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld V en 10 mg cyclofosfamide. De injecteerbare oplossing is geschikt voor het behandelen van ziekten met name tumorale ziekten.

Voorbeeld XIII

35 Een injecteerbare oplossing.

Een injecteerbare oplossing werd bereid met 100 ml van een 10 gew./vol.% waterige maltose-oplossing, 500.000 eenheden interferonen, bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld VI, en 2 mg mitomycine C.

De injecteerbare oplossing is geschikt voor het behandelen van met name tumorale ziekten.

40

Voorbeeld XIV Een zalf.

Een zalf werd bereid op gebruikelijke wijze door het mengen van interferonpoeder dat bereid is volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld IV, met vaseline en vloeibare paraffine ter verkrijging van een 45 interferonactiviteit van 10.000 eenheden per gram. Het preparaat is geschikt voor het behandelen van virale huidziekten.

Voorbeeld XV Tabletten.

50 Tabletten werden bereid op een gebruikelijke wijze door het tablettenen van een mengsel van interferon-poeder dat verkregen is volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld VII, zetmeel en maltose ter verkrijging van een interferonactiviteit van 1000 eenheden per tablet van 100 mg. De tabletten zijn geschikt voor het voorkomen en behandelen van virale ziekten van het spijsverteringssysteem.

55 Voorbeeld XVI

Een vloeibaar preparaat.

Een vloeibaar preparaat voor orale toediening werd bereid uit 10 ml van een 10 gew./vol.% waterige

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van interferonen door het blootstellen van menselijke cellen aan de werking van een interferon-inductor en winnen en zuiveren van de door de inductie verkregen interferonen, met het 10 kenmerk, dat de menselijke cellen worden vermenigvuldigd na a. transplantatie van de cellen in het lichaam van een warmbloedig dier, of b. enten van de cellen in een diffusiekamer die is verbonden met de voedende lichaamsvochten van het dier, waarbij de aldus geïntroduceerde cellen zich vermenigvuldigen terwijl het dier de cellen voorziet van zijn 15 voedende lichaamsvochten, en de cellen vervolgens al of niet afgescheiden uit het dierlijke lichaam worden blootgesteld aan de werking van de interferon-inductor, om interferonen te produceren, waarna de door de inductie verkregen interferonen worden gewonnen en gezuiverd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de geïntroduceerde cellen leukocyten zijn.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de geïntroduceerde cellen worden gekozen uit een 20 groep van cellen bestaande uit Namalva-cellen, TALL-1 -cellen, BALL-1-cellen, NALL-1 -cellen of JBL-cellen.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als warmbloedig dier een zoogdier wordt gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de diffusiekamer poriën heeft met een diameter van 10'7 tot 10-s meter.

5 9 192086 maltose-oplossing, 200.000 eenheden interferonen verkregen volgens de werkwijze die aangegeven is in voorbeeld VIII, en 5 mg methotrexaat. Het preparaat is geschikt voor het behandelen van met name tumorale ziekten.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de menselijke cellen worden vermenigvuldigd 25 gedurende 1-20 weken.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de vermenigvuldigde cellen worden blootgesteld aan de werking van de interferon-inductor in een concentratie van 105 tot 108 cellen per ml.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de vermenigvuldigde cellen worden blootgesteld aan de werking van de interferon-inductor bij een temperatuur van 20-40 °C.

9. Werkwijze ter bereiding van een geneesmiddel dat interferonen bevat, met het kenmerk, dat de volgens een der conclusies 1-8 verkregen interferonen in een voor geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm worden gebracht.

10. Gevormd geneesmiddel verkregen volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het 1-10.000.000 eenheden interferon per gram geneesmiddel bevat.