KR930000188B1 - 신규 림포카인(lymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법 - Google Patents

신규 림포카인(lymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

신규 림포카인(Iymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법
본 발명은 신규 림포카인(lIymphokine) 및 그 제법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 신규 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 (monoclonal antibody) 및 그 제조방법에 관한 것이다.
임파성 독소(LT: lymphotoxin)과 종양 괴사 유전자(TNF : tumor necrosis facotr)는 종양 세포를 손상시키는 림포카인으로 공지되어 있다. 예를들어, 임파성 독소(LT)는 Aoki, Ryuichi 등에 의해 일본국 동경 소재 Igaku-Shoin이 출판한SHIN-MENEKIGAKU SOSHO, Vol.6, “Lymphokine” 87-105면(1979)과, Aca demic Press, Inc.에 의해 출판된 Bloom, 13 R 및 Glade, P. R. 저서인In Vitro Me thod in Cell-Mediated Immunity(1971)및Cellular Immunology, Vol.38, 388-402 (1978)면등에 기재되어 있으며, 또 종양 괴사 유전자(TNF)는 Carswell, E.A. 등에 의해Proc. Nat Acda, Sci.USA,Vol.72 No.9, 3666-3670면(1975)과 Aca demic Press, Inc 에 의해 출판된 Pick, E. 저서인 “Lymphokines”. Vol.2, 235-272면, “Tumor Necrosis Factor”(1981)에 기재되어 있다. Ohnishi, H. 등은 일본국 특허 공개 공보 제 146,293/83호에서 림포카인 글리코프로테인에 대해 기술하고 있다.
Milstein, C.는Scientific Americal, Vol.243, No.4, 56-64면(1980)에서 모노클로날 항체에 대해 상세히 기술하였다.
본 발명자 등은 수년간에 걸쳐 림포카인에 대한 연구를 행한 결과로서, 종래 공지된 림포카인과는 전혀 다른 물리화학적 특성을 가지며, 악성 종양세포에 대해 세포 독성을 가진 신규 림포카인을 발견하게 되었다. 이같은 연구 결과를 근거로 본 발명자 등은 이같은 림포카인의 제조는 물론 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체와 그 제조방법을 확립하기에 이르렀다.
본 발명은 특히 다음의 물리화학적 특성을 가진 신규의 인간 림포카인 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 신규 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체와 그 제조방법에 관한 것이다. 이후 본 발명의 신극 림포카인을 간략히 “LK 1”으로 표기한다.
물리화학적 성질
(가) 분자량 : 20,000±2,000달톤
(나) 등전점 : PI=5.6±0.2
(다) 전기영동 이동도 : Disc-PAGE에서 Rf=0.29±0.02
(라) 자외선 흡수 스펙트럼 : 280nm 부근에서 흡수 최대
(마) 용매에 대한·용해성 :
물, 생리 식염수 및 인산염 완충액에 가용
에틸 에테르, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에 불용 또는 난용
(바) 착색 반응 :
Lowry's 방법 또는 마이크로뷰렛법에 의해 단백질 양성반응
페놀-황산법 또는 안트론-환산법에 의해 당질 양성반응
(사) 생물학적 활성 :
L 929 세포에 대해 세포 독성
KB 세포에 대해 성장 억제
인터페론 활성을 실질적으로 나타내지 않음
(아) 수용액중에서의 안정성 :
pH 7.2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃까지 안정
4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH 4.0∼11.0 범위에서 안정
(자) 냉동 보존시 안정성: -10℃에서 1개월 이상 안정
LK 1은 인간 백혈구, 인간 임파구 및 이들의 배양 주화 세포계(培養株化細胞系 : established cell line) 등의 LK 1 생성 인간 세포를 LK 1 유발물질에 노출시켜 제조한다. 인간 백혈구와 임파구 양쪽 모두는 신선한 인간 헐액으로 부터 분리할 수 있다. 배양 주화된 인간 세포계는 그 사용전에 종래의 시험관적 방법에 따라 증식시킬 수도 있다.
본 발명을 보다 효과적으로 실시하기 위한 바람직한 방법으로는 이와 같은 인간 세포계를 인간이외의 온혈동물에게 직접 이식하거나 또는 인간이외의 온혈동물의 영양 체액을 세포계에 공급하는 공지된 형태의 확산 챔버안에 접종시키는 생체내 세포 증식방법이 있다. 시험관내 세포 증식과는 달리 생체내 중식방법에서는 증식된 인간 세포와 함께 매우 역가 높은 LK 1을 수득할 수 있을뿐 아니라, 고가의 혈청을 함유하는 영양 배지를 전혀 필요로 하지 않거나 극히 소량으로도 족하며, 또 세포 증식중에 그다지 주의를 요하지 않는다. 특히, 숙주로서 인간이외의 온혈동물을 사용하는 생체내 방법에 있어서, 세포계를 인간이외의 온혈동물에 이식하거나, 이와 달리 세포계를 체액을 공급받도록 고안된 종래의 확산 챔버내에 넣어, 이 챔버를 동물체내에 설치하거나 매몰함으로써 인간이외의 온혈동물로 부터 공급된 영양 체액을 사용하면서 인간 세포계를 쉽게 증식시킬 수 있다. 이 각개의 경우 모든 동물은 평상시대로 사육된다. 더욱이, 생체내 방법은 시험관법에서 얻을 수 있는 것보다 횔씬 더 안정되고, 또 빠른 세포 증식, 세포당 높은 세포 생산율과 극히 높은 LK 1 생산율을 얻을 수 있다는 부수적인 특징을 갖고 있다.
본 발명에서 사용 가능한 인간 세포계는 LK 1을 생산할 수 있고, 인간이외의 온혈동물에 이식하여 거기서 쉽게 증식될 수 있는 세포계들이면 좋다. 예를들어, 문헌 [Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 20, No.6., 616-643면(1975)]에 나와 있는 각종 인간 세포계를 본 발명에서 사용할 수 있다. 특히, 적합한 예로는Journal of Clinical Microbiology, Vol.1, 116-117면(1975)에 기재된 Namalwa(ATCC CRL 1432) ; Miyoshi, I.에 의해Nature, Vol.267, 843-844면(1977)에 기재된 BALL-1, TALL-1 및 NALL-1 ;The Journal of Immunology, Vol.113, 1334-1345면 (1974)에 기재된 M-7002와 B-7101;The Tissue Culture, Vol.6, No.13, 527-546면(1980)에 기재된 JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT 3(ATCC CRL 1552) 및 EBV-HO ; CCRF-SB(ATCC CCL 120) ; CCRF-CEM(ATCC CCL 119) ; BALM 2 : DND-41 등과 같은 인간 임파 아구계와 정상의 단핵 세포 또는 과립 세포를 발암성 비루스, 약제 또는 방사선으로 형질전환시켜 제조되는 기타 배양 주화된 세포계를 들 수 있다.
이들 세포계의 세포당 증식 속도 및/또는 LK 1 생산성은, 이들 세포계를 폴리에틸렌 글리콜 또는 센다이(Sendai) 비루스를 사용하는 세포 융합법에 따라 처리하거나, 또는 핵산 분해 효소(nuclease), 리가제(ligate), DNA 중합 효소(polymerase) 등의 효소를 사용하는 유전자 재조합에 따라 처리해서 증가시킬 수 있다. 본 명세서에 이같은 이용 가능한 인간 세포계를 나열한 것은 본 발명의 범위를 이에 한정하려는 의도가 아님을 주지하기 바란다.
경우에 따라서는 이들 세포계의 1개 또는 그 이상의 구성체를 다음에 기술하려고 하는 LK 1 유발 단계까지의 여러 단계에서 조합하여 사용할 수도 있다. 또한, 예를들어, 신선한 인간 혈액으로 부터 제조되는 인간 백혈구, 또 임파구를 세포계와 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용 가능한 인간이외의 온혈동물은 이같은 인간 세포가 증식가능한 온혈동물이라면 어느것을 사용해도 좋다. 예를들어, 닭과 비둘기 등의 가금류 ; 또는 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 염소, 돼지, 말, 소, 기니아, 퍼그, 쥐, 누우드 래트(Nude rat), 햄스터, 마우스(mouse), 누우드 마우드 등의 포유동물류를 사용할 수 있다. 이같은 동물들에 인간 세포를 이식하는 경우에는 불필요한 면역반응을 유발하는 결과가 초래되는 관계로 가능한한 이같은 면역반응을 제거하기 위해서는 달걀, 유충 또는 태아 또는 신생 또는 유년생 동물 등과 같이, 가능한한 가장 어린 단계의 인간이외의 온혈동물을 사용하는 것이 바람직하다. 면역반응을 가능한한 최저 수준으로 낮추기 위해서 이식하기 전에 동물들을 약 200∼600램의 X-선 또는 γ-선 조사 처리하거나 또는 적당한 항 혈청 또는 면역 억제제를 주사하여 처리할 수도 있다. 누우드 마우스 및 누우드 래트 등의 면역 결핍 동물들이 숙주 동물로서 적합하다. 전술한 인간 세포계는 모두가 성년기 동물에 사용하는 경우에도 면역반응을 전혀 나타내지 않기 때문에 불필요한 면역반응을 일으킬 우려없이 이들 세포계를 이같은 사전처리를 하지 않은 동물에 이식하여 그 체내에서 쉽게 증식시킬 수 있다.
동일하거나 또는 서로 상이한 인간이외의 온혈동물을 사용하는 연속 이식법에 따라 세포 증식의 안정화 및/또는 LK 1 생산의 촉진을 기할 수 있다. 예를들자면, 이들 목적은 인간 세포계를 우선 햄스터에 이식해서 증식한 후, 계속해서 증식된 인간 세포를 누우드 마우스에 이식함으로써 달성할 수 있다. 이 경우에 있어서, 연속 이식법은 동일 종(種) 또는 속(屬)은 물론이고, 동일 강(鋼) 또는 목(目)의 인간이외의 온혈동물에 대해서 실시하여도 좋다.
인간 세포는 이들 세포가 그 체내에서 증식할 수 있는한 동물의 어느 부위에 이식하든 상관없다. 예를들자면, 요막강(allantoic cavity)에 이식하거나 또는 정맥내, 복강내 또는 피하에 이식할 수 있다.
인간 세포를 동물에 이식하는 대신에 전술한 인간 세포중 1종을 챔버가 동물 세포로서 오염되는 것을 방지하면서도 인간 세포에 동물의 영양 체액을 공급할 수 있는 적합한 수단, 예를들어, 공칭 기공 크기가 약 10-7∼10m-5인 멤브레인 필터, 한외 여과기 또는 유공 섬유(hollow fiber)가 설치된 각종 형태와 크기의 종래의 확산 챔버내에 넣고, 이 챔버를 예컨대 동물의 복강내에 매몰한 다음 인간 세포가 동물로 부터 영양 체액을 공급받으면서 그 안에서 증식되도록 함으로써 인간 세포를 쉽게 증식시킬 수 있다. 더욱이, 확산 챔버를 동물체 표면상에 위치하도록 설계하여 챔버내의 영양 유체 (fluid)가 자유로이 챔버를 통해 순환하도록 할 수 있다. 챔버벽에 장치한 투명한 측벽 유리창을 통해 세포 증식 기간동안 챔버내의 배양액을 관측할 수 있으며, 또는 챔버 자체를 일정 간격으로 새로운 것으로 교체해 줌으로써 동물을 도살하지 않고서도 전생존기간동안 세포 증식을 계속할 수 있음과 동시에 동물당 세포 생산성을 훨씬 더 촉진시킬 수 있다. 또, 인간 세포와 동물 세포의 직접적인 접촉이 이루어지지 않으므로 이와 같은 확산 챔버는 불필요한 면역반응을 훨씬 크게 쉽사리 감소시킬 수 있기 때문에, 어떠한 인간이외의 온혈동물도 이같은 면역반응을 감소시키기 위한 사전처리를 할 필요없이 그대로 사용할 수 있으며, 또 증식된 살아있는 인간 세포를 이로 부터 쉽게 수득할 수가 있다.
동물의 급식은 평상시대로 행할 수 있으며, 또 이식후에도 별다른 특별한 주의를 요하지 않는다. 최대 세포 증식을 달성하는데 요하는 기간은 일반적으로 1∼10주 이다. 이같이 수득된 인간 세포의 수는 동물개체당 107~1012개 세포 또는 그 이상이다. 특히, 본 발명에 의하면, 이식된 인간 세포는 약 102~107배 또는 그 이상으로 증가하는데, 이는 인간 세포를 시험관내 영양배지에서 접종하여 증식시켜 수득되는 세포의 약 10~106배 또는 그 이상에 해당된다. 이같은 사실은 LK 1 생산에 매우 획기적인 사실이다.
증식된 인간 세포중에서 LK 1 생산이 유발될 수 있는 방법이라면 어떤 방법이든 본 발명에서 사용될 수 있다. 증식된 인간 세포는 세포 증식을 위한 숙주로 사용된 동물내에서 LK 1 유발물질에 노출시킬 수도 있다. 예를들어, 복수(腹水)중에 현탁하여 증식시킨 인간 세포 또는 피하 등에서 형성된 종양 세포를 생체내에서 LK 1 유발물질에 직접 노출시켜 LK 1 생산을 유도하며, 또 축적된 LK 1을 복수, 혈청 및/또는 종양으로 부터 수확한 후 LK 1의 정제를 행한다. 이와 다른 방법으로는, 증식된 인간 세포 동물로 부터 수확한 다음 시험관내에서 LK 1 유발물질에 노출시킬 수도 있다. 예를들어, 복수 현탁액으로 부터 수확하여 얻거나 피하 등에 형성된 종양 세포를 적출하여 분리하여 얻은 증식된 인간 세포를 약 20∼40℃ 온도로 미리 예열한 영양 배지에 약 105∼108세포/ml의 세포 밀도가 되도록 현탁시켜 시험관내에서 LK 1 유발물질에 노출시킨 후 배양액으로 부터 축적된 LK 1을 회수하는 방법이 있다. 종래의 확산 챔버를 사용할 경우 증식된 인간 세포를 LK 1 유발물질에 노출시킬 때는 챔버내에서 하거나 또는 증식 세포를 수확한 후에 한다.
이같이 수득된 인간 세포는 LK 1 유도 생성을 행하기 전에 세포의 세대시간을 조절하기 위해 시험관내에서 추가로 1∼4일간 배양시킬 수도 있다.
동물 개체당 LK 1 생산성은 다음 방법중 1개 또는 그 이상을 채택함으로써 보다 더욱 촉진시킬 수 있다.
(1) 증식된 인간 세포를 세포 증식용 숙주로 사용한 동물체내에서 LK 1 유발물질에 노출시킨 다음, 이 동물의 특정부위 또는 몸전체로 부터 수확한 후, 이 인간 세포를 시험관내에서 LK 1 유발물질에 노출시키는 방법.
(2) 인간 세포를 LK 1 유발물질에 반복적으로 노출시키는 방법, 및/또는
(3) 동물체내에 매몰하거나 또는 동물과 연결시킨 확산 챔버를 일정 간격을 두고 새로운 챔버로 바꾸어주는 방법.
본 발명에서 사용 가능한 LK 1을 유발물질로서는 비루스, 핵산 및 뉴클레오티드 등과 같은 종래의 α-인터페론 유발물질(IFN-α 유발물질) ; 또는 식물성 혈구 응집소, 콘카나발린 A, 자리콩 잡초 유사 분열 물질(pokeweed mitogen), 지방 다당류, 내독소(endotoxin), 다당류 및 박테리아 등과 같은 종래의 γ-인터페론(IFN-γ) 유발물질을 들 수 있다. 항원은 감작(感作)된 세포에 대하여 LK 1 유발물질로 작용한다.
LK 1 생산성은 LK 1 유발물질로서 IFN-α 유발물질과 IFN-γ 유발물질을 혼합 사용함으로써 보다 더욱 증진시킬 수 있다. 이와 같은 혼합 사용으로 인간 고유 인터페론(HuIFN)의 동시 생성을 유발시킬 수 있다는 사실이 확인되었다. 이 방법은 저렴한 LK 1 및 HuIFN 등과 같이 2개 또는 그 이상의 생물학적 활성물질을 동시에 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있음은 물론 인간 세포를 훨씬 효과적으로 이용할 수 있다는 탁월한 장점을 가지고 있다.
이와 같이 해서 수득된 LK 1은 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축 및/또는 동결건조 등과 같은 1가지 또는 그 이상의 정제방법 및/또는 분리방법을 사용해서 회수할 수 있다. 훨씬 더 정제된 LK 1 제제가 필요한 경우에는 전술한 방법에 추가해서 이온교환을 이용한 홉착 및 분리, 겔, 여과, 등전점 분획 (分劃), 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래퍼, 칼럼 크로마토그래퍼 및/또는 친화성 크로마토그래피 등의 기타 종래의 방법을 조합하여 사용함으로서 최고순도의 제제를 수득할 수 있다.
다음에 설명하고자 하는 모노클로날 항-LK 1 항체를 BrCN-활성화 Se pharose(스웨덴국의 Uppsala 소재의 Pharmacia Fine Chemical AB 제품) 등의 적당한 수불용성 담체에 결합시켜 제조되는 부동화 모노클로날 항체의 사용으로 LK 1 정제를 보다 신속히 하고 보다 용이하게 하는 장점을 갖게 된다.
이와 같이 수득된 LK 1은 다음의 물리화학적 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
(가) 분자량 : 20,000 ±2.000달톤
(나) 등전 점 : pI= 5.6±0.2
(다) 전기영동 이동도 : Disc-PAGE에서 Rf=0.29±0.02
(라) 자외선 흡수 스펙트럼 : 280nm 부근에서 흡수 최대
(마) 용매에 대한 용해성 :
물, 생리 식염수 및 인산염 완충액에 가용
에틸 에테르, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에 불용 또는 난용
(바) 착색 반응 :
Lowry's 방법 또는 마이크로뷰렛법에 의해 단백질 양성반응
페놀-황산법 또는 안트론-황산법에 의해 당질 양성반응
(사) 생물학적 활성 :
L 929 세포에 대해 세포 독성
KB 세포에 대해 성장 억제
인터페론 활성을 실질적으로 나타내지 않음
(아) 수용액중에서의 안정성 :
pH 7.2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃까지 안정
4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH 4.0∼11.0 범위에서 안정
(자) 냉동 보존시 안정성 : -10℃에서 1개월 이상 안정
또한, 이와 같이 제조된 LK 1은 정상적인 인간 세포에 대해서는 전혀 세포 붕해를 일으키지 않지만, 마우스 섬유 아세포계 L 929는 물론 각종 인간 종양 세포에 대해서는 탁월한 세포 붕해 효과가 있어 이들 세포를 사멸시킨다는 사실이 확인되었다. 따라서, 이 LK 1은 조성물 형태 등으로 하여 악성 종양, 특히 그 치료가 매우 어려운 것으로 보이는 각종 악성 인간 종양 등과 같은 Lk 1 감수성 질병에 대한 예방제 및/또는 치료제로서 탁월하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 모노클로날 항체 제조방법은 인간이외의 온혈동물을 이와 같이 수득한 LK 1을 항원으로 하여 면역시키고, 동물 몸체로 부터 항체 생성 세포를 수거한 후, 이 항체 생성 세포를 골수중 세포와 융합시키고, 이 수득한 하이브리도마 (hybridoma) 세포로 부터 LK 1에 특이적인 항체를 생성할 수 있는 클로운(clone)을 선별하여, 이 클로운을 증식시키고, 또 증식된 세포를 방치해서 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체를 생성시키는 단계로 구성된다.
이와 같은 면역은 항원인 LK 1의 수용액, 유화액 또는 현탁액을 닭, 비둘기, 개, 고양이, 원숭이, 염소, 돼지, 암소, 말, 토끼, 기니아 피그, 래트, 햄스터 또는 마우스 등의 적당한 인간이외의 온혈동물에 정맥내, 복강내 또는 피하 주사하고, 이들 동물을, 3일 또는 그 이상 사육해서 항체 생성을 유발함으로써 달성할 수 있다. 일본국 특허 공고 제 23,847/83호에 따라 수득할 수 있는 LK 1과 당류의 결합체를 또한 항원으로 사용할 수 있다. 이들 항원은 약 3∼30일 간격으로 1회, 또는 필요한 경우 2회 또는 그 이상 주사할 수 있다.
항체 생성이 유발된 면역된 동물의 비장 세포를 문헌 [Kohler, G 등,Nature, Vol.256, 495-497면(1975) 및Eur.J.Immunol.,Vol.6, 511-519면(1976)]에 기재된 적당한 방법에 따라 동종 또는 이종의 골수종세포와 융합시킨다. 이같이 수득한 잡종 세포를 선별해서 클로닝한 후, 이 클로운을 시험관내 또는 생체내에서 배양한 다음, 수득한 배양액으로 부터 축적된 고도의 특이성을 가진 모노클로날 항체를 회수한다. 특히, 생체내 배양법의 경우 클로운의 증식이 훨씬 잘 행해지며, 또 고가의 혈청을 사용하지 않고도 모노클로날 항테를 횔씬 고수율로 생산할 수 있기 때문에, 생체내 배양법이 시험관내 배양법 보다 훨씬 바람직하다. 생체내 배양법의 경우 클로운을 면역에 사용된 동일 또는 상이한 종(種)의 이같은 인간이외의 온혈동물에 이식하거나 또는 이 클로운을 이같은 동물의 영양 체액을 수용할 수 있도록 고안된 종래형의 확산챔버에 접종함으로써 이같은 동물의 영양 체액을 사용해서 클로운을 증식시키고, 축적된 모노클로날 항체를 복수(腹水) 및 혈액과 같은 체액으로 부터 회수하게 된다. 이와는 달리, 생체내에서 증식시킨 후 클로운을 혈청이 함유되지 아니한 배지에서 추가로 1일∼5일간 배양한 다음, 수득한 배양액으로 부터 축적된 모노클로날 항체를 회수할 수도 있다.
이같이 수득된 모노클로날 항체는 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축 및/또는 동결건조 등의 1가지 또는 그 이상의 분리방법 및/또는 정제방법으로 쉽게 회수할 수 있다. 보다 높은 순도를 필요로 하는 경우에는 전술한 방법에 추가해서 이온 교환을 이용한 흡착 및 분리, 겔 여과, 등전점 분획, 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피와 같은 기타 종래의 방법을 조합하여 사용함으로써 최고순도의 제제를 수득할 수 있다. 모노클로날 항체의 회수율은 고순도 LK 1을 BrCN-활성화 Sepharose 등의 적당한 수불용성 담체상에 결합시켜 수득되는 부동화 LK 1 겔을 사용해서 유리하게 개선할 수 있다.
본 발명에 따라 수득된 모노클로날 항체는 LK 1 제조를 위해 행해지는 친화성 크로마토그래피용 리간드(ligand)로서 아주 유용할 뿐만아니라, 악성 종양에 대한 세포독 작용을 갖는 LK 1에 대한 특이성으로 인하여 각종 인간질병 진단에 아주 유용하다.
LK 1 역가는 표적상(標的狀) 적혈구로서 KB 세포나 또는 L 929 세포를 사용해서 측정하였다. KB 세포를 사용하는 경우에는 KB 세포에 대한 성장 억제 활성을 문헌 [Cancer Chimotherapy Reports Part 3, Vol.3, No.2, 9월호(1972)]에 기재된 방법을 다소 변형시킨 방법에 따라 측정하였다. L 929 세포를 사용하는 경우에는 악티노마이신 D 존재하에 L 929 세포에 대한 세포독 작용을 문헌 [Academic Press, Inc.(1981) 간행의 Pick, E. 편저, Lymphokines, Vol.2, 245-249면 “Tumor Necrosis Factor”]에 기재된 방법을 다소 변형시킨 방법에 따라 측정하였다. 전체 명세서를 통해서 별도 언급이 없는 경우에는 L 929 세포를 사용하는 후자의 방법을 이용하였다.
HuIFN의 역가는 문헌[Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol.20, No.6, 616-643aus(1975)]에 기재된 인간 양막(羊膜) 유래의 FL 세포를 사용하는 종래의 플래크 감소법(plaque reduction method)으로 검정하였다. 혈구 응집소 역가는 문헌[Salk, S.E. The Journal of Immunology, Vol.49, 87-89면(1944)]에 보고된 방법을 다소 변형시킨 방법으로 검정하였다.
다음의 실허예는 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
[실험예 A - 1]
부분 절제된 LK 1의 제조
새로 태어난 햄스터에 토끼에서 제조한 종래의 항 혈청을 주사하여 이들의 면역반응을 약화시키고, 인간 임파 아구계 BALL-1을 피하 이식한 후 평상시대로 3주간 사육하였다. 피하에 형성된 종양물질을 잘라내어 세절한 후 생리 식염수중에서 분리시켰다. 이같이 수득된 세포 현탁액을 RPMI 1640 배지(PH 7.2)로 세척하고, 혈청을 보충한 후에 새로이 제조한 동일 배지에 재현탁시켜 약 2×105세포/ml의 세포 밀도를 갖도록 하였다. 이 세포 현탁액에 센다이 비루스(약 400 혈구 응집소 역가/ml)를 첨가하고, 또 37℃에서 24시간 동안 배양시켜 LK 1 생성을 유도하였다. 이 배양액을 약 4℃에서 약 1000×g로 원심분리하고, 수득한 침전물을 분리하였다. 이같이 수득된 상청액을 0.O1M 인산염 완충액 (pH 7.2)을 함유하는 생리 식염수로 20시간 동안 투석하고 박막 필터로 처리하였다. 이어서, 여과액을 부동화 항-HuIFN 항체 컬럼을 통해주어 미홉착 분획을 수거하였다. 크로마토포커싱 (chromatofocusing), 농축 및 동결건조 방법을 사용하여 이들 분획으로 부터 활성 분획을 회수함으로써 LK 1 활성을 가진 분말을 수득하였다.
이 분말의 비활성 (specific activity)은 약 106단위/mg 단백질이었고, LK 1 수율은 햄스터 1마리당 약 3.0×107단위이었다.
[실험예 A -2]
항-LK 1 항체의 제조
실험예 A-1에서 기재한 방법에 따라 수득된 LK 1 제제를 약 0.5w/v% 단백질 농도가 되도록 생리 식염수에 용해하고, 이 용액을 동일 용량의 프로인트 완전 보조액 (Freund's complete adjuvant)에 첨가하였다. 이같이 수득된 혼합물중에서 0.2ml를 취하여 마우스에 피하 주사하고, 최초 주사 후 7일간을 면역이 되도록 촉진시켰다. 동물의 항체 생성 세포중에서 항-LK 1 항체 생성을 유발한 후에 동물의 비강을 잘라 내어 세절한 후 분리하고, 37℃로 미리 가온한 50w/v% 폴리에틸렌 글리콜 1000을 함유하는 혈청이 없는 이이글 최소 필수 배지[Eagle's minimal essential medium( pH 7.2)]중에서 마우스 골수종 세포계 P3- X63-Ag8(미합중국 매리릴랜드 록크빌 소재의 Flow Laboratories Inc. 로 부터 구입)과 항께 현탁시켜 각각의 세포 밀도가 104세포/ml가 되도록 한 다음, 수득 혼합물을 5분간 방치하였다. 그 다음에는 이 혼합물을 새로 제조한 동일 배지를 사용하여 20배로 희석하여 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 함유 배지에서 성장 가능한 하이브리도마(hybridoma) 세포를 문헌[Davidson, R.L. and Gerald, P.S. inSomatic Cell Gentics, Vol.2, No.2, pp.175-176(1976)]에 기재된 방법에 따라 수거해서 항-LK 1 항체를 생산 할 수 있는 하이브리도마 세포를 클로닝하였다. 마우스 1마리당 약 106개 세포의 투여량으로 클로닝된 하이브리도마 세포출 마우스의 복강내에 이식하고, 2주일간 사육한 후 도살하였다. 복수액 및 혈액 등의 동물의 체액을 회수해서 원심분리한 후 황산 암모늄으로 염석한 다음, 30%∼50% 포화도에서 침강시킨 분획을 수거하였다 이들 분획을 투석한 후 실험예 A-1에 기재된 방법에 따라 제조된 LK 1 시편을 BrCN-활성화 Sepharose와 실온에서 반응시켜 수득한 부동화 항-LK 1 항체 겔을 사용하는 친화성 크로마토그래피로 처리하여 항-LK 1 항체 분획을 수득하고, 이어서 이것을 투석, 농축, 동결건조시켜 분말을 얻었다. 이 분말을 LK 1의 세포독 작용에 대하여 면역학적으로 특이한 중화반응을 나타내었다.
수용액중에서의 모노플로날 항체의 안정성은 전술한 조건하에서 배양한 후에 잔류 중화 활성을 검정함으로써 측정하였다 pH 7.2에서 각기 다른 온도에서 30분간 배양했을 경우, 60℃에서 80% 이상의 활성이 유지되었으나, 70℃에서는 90% 이상의 활성이 상실되었다. 4℃에서 각기 다른 pH치에서 16시간 동안 배양한 후의 활성은 pH 범위 4.0∼11.0의 경우에서는 활성은 안정하였으나, pH 2.0에서는 90% 이상이 상실되었다.
모노클로날 항체의 특성을 연구함에 있어 본 발명의 모노클로날 항체는 2-메르캅토에탄올에 대한 내성이 없었으며, 항-마우스 면역 글로불린 M 항체와는 특이한 항원-항체반응이 일어난다는 사실을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 면역 글로불린 M 항체급으로 분류된다.
실험예 A -3
고순도 LK 1의 제조 및 물리화학적 특성
실험예 A-1에서 기재된 방범으로 수득된 부분 정체 LK 1 시편을 실험예 A-2에 기재된 방법으로 제조된 부동화 모노클로날 항체 겔을 사용하는 친화성 크로마토그래피 분리처리를 하여 LK 1 분획을 수거한 다음, 이를 투석, 농축 및 동결건조시켰다.
수득한 물질은 비활성이 약 109단위/mg 단백질인 고순도 LK 1 제제이었다. KB 세포를 사용하는 제제의 LK 1 검정 또한 거의 동일한 비활성을 나타내었다
LK 1의 물리화학적 특성을 이 제제로서 측정하였다
(1) 분자량 :
LK 1의 분자량은 문헌[Weber, K. and Osborn. M., J. Biol. Chem., Vol.244, page 4,406(1969)]에 기재된 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 전기영동법을 다소 변형시킨 방법으로 측정하였다. 10% 아크릴아미드 겔의 칼럼에 0.1% SDS 존재하에 약 10㎍ 분취량의 제제를 가한 후 4시간 동안 칼럼당 8mA의 전류를 통해주어 전기영동을 하였다 추출 및 활성 성분의 Lk 1 검정으로 LK 1의 분자량은 20,000 ±2,000 달톤이었다.
(2) 등전점 :
스웨덴국 스톡홀름 LKB-Produkter AB에서 시판하고 있는 일렉트로포커싱 (electrofocusing)용의 겔 생성물인 “AMPHOLINE PAGPLATE”를 사용해서 제제를 2시간 동안 25W에서 일렉트로포커싱 처리를 한 결과 등전점 PI는 5.6±0.2이었다.
(3) 전기영동 이동도 :
문헌[Davis, B.J.Ann.N.Y.Acad.Sci., Vol.121, Page 404(1964)]에 기재된 방법을 다소 변형시킨 방법에 따라 약 10㎍ 분취량의 제제를 10% 아크릴아미드 겔 칼럼상에 부가하고, pH 8.3에서 칼럼당 3mA로서 2시간 동안 전기영동을 행하고, 추출한 후 LK 1 활성을 검정한 결과, 전기영동 이동도 Rf는 0.29± 0.02이었다.
(4) 자외선 흡수 스펙트럼 :
일본국 교오도 소재의 Shimadzu Seisakusho KK. 제품인 UV-250 스펙트로미터를 사용해서 제제의 UV-스펙트럼을 분석한 후, 흡수 최대 스펙트럼을 280nm 부근에서 발견하였다.
(5) 용매에 대한 용해성 :
물, 생리 식염수 및 인산염 완충액에 가용
에틸 에테르. 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에 불용 또는 난용
(6) 착색반응 :
Lowry's 방법 또는 마이크로뷰렛법에 의해 단백질 양성반응
페놀-황산법 또는 안트론-황산법에 의해 당질 양성반응
(7) 생물학적 활성 :
L 929 세포에 대해 세포 독성 및 KB 세포에 대해 성장 억제 활성이 확인되었다. HuIFN 활성은 실질적으로 전혀 확인되지 않았다.
(8) 수용액중에서리 안정성 :
㉮ 열안정성 :
약 1×106단위/ml 분취량의 제제를 pH 7.2 및 각기 상이한 온도에서 30분간 유지하여 잔류 세포독 작용을 검정하였다. 그 결과, LK 1은 60℃까지는 안정함을 확인하였다.
㉰ pH 안정성 :
0.1ml 분취량의 제제 (1×106단위/ml)를 pH 2∼7의 Mcllvaine 완충액 : pH 7∼8의 인산염 완충액 ; pH 8∼11의 글리신-NaOH 완충액 등의 각기 상이한 pH 값의 완충용액 1ml에 첨가하고 4℃에서 16시간 동안 유지한 다음, 이 혼합물 0.1ml을 0.05M 인산염 완충액(pH 7.2)을 사용하여 pH 7. 2로 조정하고, 잔류활성을 검정하였다. 그 결과, LK 1은 pH 4.0∼11.0에서 안정하였음을 확인하였다.
㉰ “DISPASE”에 대한 안정성 :
약 1×106단위/ml의 제제에 일본국 도오교 Godo Shusei Co., Ltd.에서 시판하고 있는 바실러스(bacillus) 미생물의 프로테아제 효소인 “DISPASE”를 첨가하고, 이 혼합물을 pH 7.2 및 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양기간중 소량의 혼합물을 주기적으로 샘플링하여 1w/v% 농도가 되도록 송아지 혈청 알부민을 첨가해서 효소 반응을 중지시켰다. 시료중에서의 LK 1 활성을 검정한 결과, LK 1은 DISPASE 처리에 민감하였고, 효소반응이 진행됨에 따라 그 활성을 상실하였다.
(9) 냉동 보존시 안정성 :
LK 1 제제를 -10℃ 및 pH 7.2의 수용액중에 1개월 저장하고 녹인 후에 검정한 결과, 활성의 감소를 전혀 감지할 수 없었다.
위에 나온 결과로 부터 명백한 것처런 LK 1은 LT, TNF 또근 INF 등과 같은 공지된 림포카인의 물리화학적 특성보다 탁월한 특성을 갖고 있다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 새로운 림포카인 LK 1의 세포독 작용을 면역학적으로 특이하게 중화할 수 있는 성질을 갖는 신규 물질이다.
[실험예 B - 1]
악성 종양에 대한 성장 억제 효과
몇가지 인간 세포에 대한 LK 1의 성장 억제 효과를 실험예 A-1 및 실험예 A-3에 기재된 방법에 따라 수득한 LK 1 제제를 사용해서 검사하였다.
표 1에 수록된 1개의 인간 세포(106세포)를 태아 송아지 혈청을 보충한 통상의 배지 1ml에 현탁시켜 1일간 배양하고, 실험예 A-1 또는 실험예 A-3에 기재된 방법에 따라 제조된 LK 1 제제 50단위 또는 500단위를 함유하는 생리 식염수 0.1ml를 첨가한 후 37℃에서 2일간 배양하였다. 배양 완료 후, 생존 세포를 문헌[Applied Micro bilolgy, Vol.22, No.4, pp.671-677(1971)]에 기재된 방법에 따라 염색제의 1종인 뉴트랄 레드(neutral red)로서 염색하여 염색제를 산성화 에탄을 용액을 사용해서 용리시켰다 그후에 파장 540nm에서 용리액의 흡광도를 측정해서 생존세포의 수를 산출하였다 대조액으로 LK 1이 함유되지 아니한 생리 식염수 0.1ml를 사용하였다. 성장 억제율(%)은 다음 식으로 부터 계산하였다.
Figure kpo00001
계산 결과는 표 1에 나와 있다.
표 1에 나와 있는 결과로부터 명백히 알 수 있는 것처럼, LK 1은 완전 정상세포에는 영향을 미치지 않았으나, 각종 악성 종양 세포의 성장을 크게 억제하고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 부분 정제 LK 1의 효과는 고순도 LK 1의 효과와 잘 대조를 이룸을 확인할 수 있다.
[표 1]
Figure kpo00002
주 : *는 악성 종양 유래의 인간 세포계를 나타낸다.
**는 정상적인 인간 세포계를 나타낸다.
[실시예 B-2]
1군 BALB/c 마우스에서 마우스 육종(sarcoma) 유래의 메트 에이(Meth A) 세표를 이식하였다. 이식 10일 후 부터 실험예 A-3에서 기술한 방법에 따라 수득한 Lk1제제를 함유하는 생리 식염수를 투여량 100 또는 1000단위/일로서 15일간 마우스에 피하 주사하였다. 그후에 쥐들을 도살하여 동물내에 형성된 종양 무게를 측정하였다.
측정 결과는 표 2에 나와 있다.
[표 2]
Figure kpo00003
주: *는 5% 신뢰 한계의 대조치에 대한 통계적 신뢰치를 의미한다.
[실시예 B-3]
여러군(群)의 BALB/C 누우드 마우스의 등부위에 인간 유방암 조직의 소편을 피하 이식하였다. 동물체내에서 종양물질이 약 200mm3로 성장한 후에 실험예 A-1 또는 실험예 A-3에서 기술한 방법에 따라 수득한 LK 1제제를 함유하는 생리식염수를 100단위/kg 또는 1000단위/kg의 1회투여량으로 매일 1회씩 20일간 정맥내 주사하였다. 그후에 동물을 도살하여 수득한 종양물질의 중량을 측정하였다.
수득한 결과는 표 3에 나와 있다.
[표 3]
Figure kpo00004
주 : *는 5% 신뢰 한계의 대조치에 대한 통계적 신뢰치를 의미한다.
[실시예 B -4]
실험예 A-3에 기재된 방법에 따라 수득한 LK 1 제제를 1군의 20일령되는 마우스들에 투여한 급성 독성 시험 결과는 이 제제의 독성이 매우 낮아서 복강내 주사했을 경우 LD50이 109단위 또는 그 이상임이 확인되었다.
상기 실험으로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 LK 1은 생체내에서는 물론 생체외에서도 악성 종양의 성장 억제에 매우 효과적이다. 더구나, LK 1의 투여는 다량 투여의 경우에도 실제로 정상 세포에 아무 영향을 미치지 않는 한편 소량 투여로도 종양 세포에 영향을 미칠 수 있다는 점에서 매우 안전하다.
본 LK 1의 효과적인 투여량은 일반적으로 어른의 경우 5∼500,000,000 단위/일의 범위이다 특히, 국부 주사 또는 점안제 형태등의 국부 투여의 경우 5∼10,000 ,000단위/일이고, 연고제 또는 좌제 형태등의 경피 또는 경점막 투여의 경우 10∼50 ,600,000단위/일이며, 정맥 주사 또는 근육 주사 등의 계통 투여인 경우 50∼100 ,000.000 단위/일이고, 그리고 경구 투여의 경우 500∼500,000,000 단위/일의 범위가 사용되지만, 이 투여량은 그 처방이나 또는 환자의 증상에 따라 크게 변화시킬 수도 있다.
LK 1은 적당한 종래의 담체, 염기 및/또는 운반체와 혼합한 후에 통상적인 방법으로 약으로 제조할 수 있으나, 이의 LK 1 함량은 그 독성, 효과적인 투여량 및 안전성의 관점에서 5단위/g 이상이 되어야만 한다.
LK 1 감수성 질병에 대한 예방약 및/또는 치료제의 형태는 자유롭게 선택할 수 있는데, 예를 들어, 경구 투여의 경우에는 캡슐, 정제 또는 산제 등의 장(賜) 용 제제 ; 직장 투여의 경우에는 좌제 : 또 점비제, 점안제 또는 연고제 형태는 물론 주사용 제제로서 제조할 수 있으며, 주사제는 예를 들어, 사용전에 이를 증류수와 함께 주사 용액에 용해시키는 동결건조 주사제로 제조될 수 있다.
예를 들어, 악성 종양 환자의 치료에 있어 환자로부터 추출해 낸 종양 조직편은 조직편의 면역 유전성을 촉진시키기 위해서 LK 1과 함께 생체외에서 처리하여 환자에게 투여해서 악성 종양의 보다 효과적인 치료효과를 얻을 수도 있다.
다음의 실시예 1∼12는 LK 1의 제조방법, LK 1 함유 약제 조성물 및 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체에 대해 각각 설명하고 있다.
[실시예 1]
인간 임파 아구계 BALL-1을 20% 태아 송아지 혈청을 보충한 이이글 최소 필수 배지 (pH 7.4)에 접종하고, 37℃의 현탁액중에서 통상의 방법으로 생체외 배양하였다. 이어서, 증식된 인간 세포를 혈청이 함유되지 아니한 이이글 최소 필수 배지 (pH 7.4)로 세척하고, 새로히 제조한 동일 배지에 재현탁시켜 약 1× 107세포/ml의 세포 밀도가 되게 하였다. 세포 현탁액에 센다이 비루스를 약 1,000혈구 응집 역가/ml의 투여량으로 첨가하고 38℃에서 1일간 배양해서 LK 1 생성을 유발시켰다.
수득한 배양액을 4℃에서 약 1000×g로 원심분리한 후 상청액을 0.01M인산염 완충액 (pH 7.2)을 함유하는 생리 식염수에 대해 15시간 동안 투석하고 박막 필터로 처리하였다. 이어서, 여과액을 실험예 A-1에서와 마찬가지로 항-LK 1항체 칼럼속을 통과시켜 주고, 비흡착 분획을 항-LK 1 항체-결합 겔의 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 방법으로 실험예 A-3에서와 마찬가지로 정제한 다음 농축시켜 LK 1 비활성이 약 109단위/mg 단백질인 농축액을 수득하였다.
수율은 유도 세포 현탁액 1ℓ당 약 2×106단위이었다.
[실시예 2]
새로 태어난 햄스터에 토끼로부터 제조한 종래의 항 혈청을 주사하여 면역반응을 약화시키고, 인간 임파아구계 BALL-1을 피하 이식한 후 평상시 대로 3주간 사육하였다. 동물 피하에 형성된 각각 약 15g의 종양 물질을 잘라내어 세절하고 생리 식염중에서 분리하였다. 혈청이 함유되지 아니한 RPMI 1640 배지 (pH7.2)로 세척한 후 증식된 세포를 새로히 제조한 동일 배지에 재현탁시켜 약 5×106세포/ml의 세포 밀도가 되게 하였다.
이 세포 현탁액에 센다이 비루스와 E.coli 내독소를 각각 약 1,000혈구 응집 역가/ml 및 약 10㎍/ml의 투여량으로 첨가하고, 37℃에서 1일간 배양시켜 LK 1 생성을 유발시켰다. 4℃ 및 약 1000×g에서 배양액을 원심분리하여 침전물을 제거한 후 상청액을 0.01M인산염 완충액 (pH 7.2) 함유 생리 식염수 용액에 대해 21시간 동안 투석시킨 후 박막 필터로 처리하였다. 여과액을 실시예 1에서와 마찬가지로 항체 칼럼으로 정제하고, 용리액을 농축 및 동결건조시켜 LK 1 비활성이 약 109단위/mg 단백질인 분말을 수득하였다.
수율은 약 4.0×107단위이었다.
[실시예 3]
성숙한 누우드 마우스의 복강내에 인간 임파 아구계 TALL-1을 이식하고 평상시와 같이 5주간 사육한 후, 사전에 자외선 조사(照射)하여 완전히 비활성시킨 뉴우캐슬 질병 비루스(누우드 마우스 1마리당 약 3,000혈구 응집 역가)를 복강내 주사하고, 주사 24시간 후에 도살한 후 이들의 복수액을 수거하였다. 이 복수액을 실시예 2에서와 마찬가지로 정제, 농축 및 동결건조시켜 LK 1 활성을 갖는 분말을 수득하였다. 수율은 누우드 마우스 1마리당 약 4.0×106단위이었다.
[실시예 4]
성숙한 마우스들에게 약 400램의 X-선을 조사하여 이들의 면역반응을 약화시키고, 인간 임파 아구계 Mono-1을 피하 이식한 후 3주간 평상시대로 사육하였다. 동물 피하에 형성된 각각 약 10g의 종양물질을 잘라 내고 실시예 2에서와 마찬가지로 분리하였다. 이와 같이 수득된 인간 세포를 실시예 2에서와 마찬가지로 현탁시킨 후, 수득한 세포 현탁액에 센다이 비루스와 콘카나발린 A각각을 약 500혈구 응집 역가/ml 및 0.8㎍/ml의 투여량으로 해서 첨가하고, 37℃에서 1일간 배양해서 LK 1생성을 유발시켰다. 그후에 배양액을 실시예 2에서와 마찬가지로 정제, 농축 및 동결건조시켜 LK 1 활성을 갖는 분말을 수득하였다.
수율은 마우스 1마리당 약 2.4×107단위이었다.
[실시예 5]
새로 태어난 햄스터에 실시예 2에서와 마찬가지로 인간 임파 아구계 Nam alwa(ATCC CRL 1432)를 이식하고 평상시대로 4주간 사육하였다. 동물 피하에 형성된 각각 약 20g의 종양물질을 잘라낸 후 분리시켜 약 3×106세포/ml의 세포 밀도를 갖는 세포 현탁액을 수득하였다. 이 세포 현탁액에 센다이 비루스를 약 1,000혈구 응집 역가/ml의 투여량으로 첨가하고, 36℃에서 2일간 배양시켜 LK 1 생성을 유발시켰다. 배양액을 실시예 1에서와 마찬가지로 정제 및 농축시켜 LK 1활성을 갖는 농축액을 수득하였다.
수율은 햄스터 1마리당 약 2.6×107단위이었다.
[실시예 6]
인간 임피 아구계 NALL-1을 생리 식염수에 현탁시키고, 약 0.5μ의 공칭 기공도를 갖는 박막 필터가 부착된 약 10ml의 실린더형 플라스틱 확산 챔버내에 넣었다. 이 챔버를 성숙한 래트(rat) 복강내에 매몰한 후, 이 동물을 평상시대로 4주간 사육하였다. 챔버를 제거한 후 챔버내의 세포 밀도는 약 5×108세포/ml로서, 이는 영양 배지를 사용하는 CO2배양기내에서 생체외 증식을 시킨 경우에 비교할 때 약 100배 또는 그 이상이었다. 인간 세포를 실시예 2에서와 마찬가지로 배지에 현탁시키고. 자외선 조사로 사전에 비활성화시킨 뉴우캐슬 질병 비루스(약 500혈구 응집역가/ml)와 식물성 혈구 응집소(약 50㎍/ml)를 첨가한 후 37℃ 에서 1일간 배양시켜 LK 1 생성을 유발시켰다. 그후에 배양액을 실시예 2에서와 마찬가지로 정제, 농축 및 동결건조시켜 LK 1활성을 갖는 분말을 수득하였다.
수율은 래드 1마리당 약 1.0×107단위이었다.
[실시예 7]
인간 임파 아구계 CCRF-CEM(ATCC CCL 119)을 배아 단계 달걀의 요막강 (allantoic cavities)에 접종하고, 이를 37℃에서 5일간 배양한 후 이 달걀을 동일 온도에서 추가로 1주일 더 배양하였다. 증식된 인간세포를 달걀로부터 수거해서 실시예 1에서와 마찬가지로 현탁시켜 5×106세포/ml의 세포 밀도가 되게 하였다. 이어서, 세포 현탁액에 센다이 비루스(약 500혈구 응집 역가/ml)를 첨가하고 37℃에서 1일간 배양시켜 LK 1 생성을 유발하였다. 수득한 배양액을 실시예 2에서와 마찬가지로 정제, 농축시켜 LK 1 활성을 갖는 분말을 수득하였다.
수율은 배아 단계 달걀 10개당 약 8.0×105단위이었다.
[실시예 8]
주사제
실시예 2에서 제조한 LK 1 시편 500,000 단위를 200m1의 생리 식염수에 용해하고. 박막 필터를 사용하여 살균 조건하에서 여과하였다. 2ml 분취량의 여과액을 살균된 유리 바이알에 넣고 동결건조한 후 밀봉시켜 분말화 주사제를 수득하였다.
이 주사제는 유방암, 폐암, 간암 및 빈혈병 치료용으로 특히 유용하다.
[실시예 9]
연고제
실시예 3에서 제조된 LK 1 시편을 최소량의 유동 파라핀과 더불어 반죽하여 균일화하였다. 이어서, 이 혼합물에 통상적인 방법으로 백색 와셀린을 첨가해서 20,000단위/g의 LK 1 함량을 갖는 연고제를 제조하였다.
이 연고제는 피부암, 유방암 및 임파종 치료용으로 특히 유용하다.
[실시예 10]
점안제 (Collyrium)
800ml의 증류수, 500ml의 β-페닐에틸 알콜과 실시예 4에서 제조한 LK 1 시편 20,000,000 단위의 혼합물을 추가량만큼의 증류수중에서 염화나트륨과 혼합해서 1,000ml의 등장성 용액을 제조하였다.
이 용액은 망막아종 치료를 위한 점안제로서 특히 유용하다.
[실시예 11]
장용정 (腸溶錠)
전분, 말토오즈 및 실시예 7에서 제조한 LK 1 시편의 혼합물로 정제(100mg) 당 200,000 단위의 LK 1함량을 갖는 정제를 만든 다음, 이들 정제를 메틸 셀룰로오즈의 프탈레이트 에스테르로 피복해줌으로써 장용정을 종래의 방법에 따라 제조하였다.
이들 정제는 결장암 및 간암 치료용으로 특히 유용하다.
[실시예 12]
항원으로서 실험예 A-1에 기재된 방법에 따라 수득한 고순도 LK 1을 사용한 이외에는 실험예 A-2에서와 마찬가지 방법으로 마우스를 면역시켰다. 그후에 이들 동물의 비장 세포를 일본국 오오사까 소재의 다이닙봉 파아마슈티칼 캄파니 리밋티드의 제품인 쥐 골수종계 P3-NS-l/l-Ag4-1과 함께 140mM NaCl, 54mM KCI, 1mM NaH2PO4및 2mM CaCl2를 함유하는 염 용액에 현탁시켜 각각의 세포 밀도가 104세포/ml되게 하였다.
이 세포 현탁액에 자외선 조사로 비활성화 시킨 센다이 비루스를 추가로 함유하는 동일 조성의 새로운 염용액을 얼음냉각 조건하에서 첨가하고, 이 혼합물을 5분간 방치하였다. 그후, 이 혼합물을 37℃ RPMI 1640 배지로 약 20배 되게 희석하고, 항-LK 1 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마세포를 실험예 A-2에서와 마찬가지 방법으로 클로닝하였다. 클로닝된 하이브리도마 세포를 종래 방법에 따라 면역반응을 약화시킨 7주령되는 햄스터의 복강내에 이식하고(약 107세포/햄스터), 실험예 A-2에서와 마찬가지 방법으로 동물체로부터 모노클로날 항체를 회수하였다.
실험예 A-2에서 제조된 모노클로날 항체에서와 동일하게 이 생성물 역시 LK 1의 세포독 작용을 면역학적으로 중화시키는 특성을 나타내었다.
수용액중에서 이 모노클로날 항체의 안정성은 전술한 조건하에서 배양한 후에 잔류 중화 활성을 검정함으로써 측정하였다. ph 7.2 및 각기 상이한 온도에서 30분간 배양하는 경우, 60℃에서는 80% 이상의 활성이 유지되었으나, 70℃에서는 90% 이상이 상실되었다. 4℃ 및 각기 상이한 pH값에서 16시간 배양하는 경우 활성은 pH범위 2.0∼11.0에서 안정하였다.
모노클로날 항체의 몇가지 특성을 검토한 결과, 본 발명의 모노클로날 항체는 2-메르캅토에탄올에 대하여 내성을 가지며, 항-마우스 면역 글로불린 G항체와는 특이한 항원-항체반응을 일으킨다는 사실을 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 면역 글로불린 항체급으로 분류된다.
[실시예 13]
P3-NS-l/l-Ag4-1 대신 일본국 오오사까 소재의 다이닙뽕 파골마슈우티칼 캄파니 리밋티드로부터 입수할 수 있는 쥐 골수종계 SP2/O-Ag14를 사용한 이외에는 실시예 12에서와 마찬가지로 방법으로 모노클로날 항-LK 1항체를 제조하였다.
LK 1의 세포독 작용으로 모노클로날 항체에 의한 면역학적으로 특이적인 중화를 시험한 결과, 실시예 12 에서와 유사한 결과를 수득하였다. 따라서, 이들 모노클로날 항체 또한 면역 글로불린 G항체급으로 분류된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 관하여 이상에서 기술하였으나, 당 기술 분야에 숙련된 자라면 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위내에서 여러가지 변화 및 수정을 가할 수 있음을 주지해야만 한다.

Claims (28)

  1. 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진 림포카인(LK 1)을 생성할 수 있는 인간 세포를 LK 1 유발물질에 노출시키고, 축적된 LK 1을 회수함을 특징으로 하는 LK 1의 제조방법.
    (가) 분자량 : 20,000±2,000 달톤
    (나) 등전점 : PI=5.6±0.2
    (다) 전기영동 이동도 : Disc-PAGE에서 Rf=0.29土0.02
    (라) 자외선 흡수 스펙트럼 : 280nm부근에서 흡수 최대
    (마) 용매에 대한 용해성 : 물, 생리 식염수 및 인산염 완충액에 가용 에틸 에테르, 에틸.아세테이트 또는 클로로포름에 불용 또는 난용
    (바) 착색반응 : Lowry's방법 또는 마이크로뷰렛법에 의해 단백질 양성반응 페놀-황산법 또는 안트론-황산법에 의해 당질 양성반응.
    (사) 생물학적 황성 : L 929 세포에 대해 세포 독성 KB 세포에 대해 성장 억제 인터페론 활성을 실질적으로 나타내지 않음.
    (아) 수용액중에서의 안정성 : pH 7.2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃까지 안정 4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH 4.0∼11.0범위에서 안정
    (자) 냉동 보존시 안정성 : -10℃에서 1개월 이상 안정
  2. 제1항에 있어서, LK 1을 생성할 수 있는 인간 세포를 생체외에서 증식시키는 LK 1의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서 LK 1을 생성할 수 있는 인간 세포를 생체내에서 증식시키는 LK 1의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 인간 세포를 인간이외의 온혈동물에 이식하고, 이 동물을 사육해서 인간 세포가 동물의 영양 체액을 이용해서 증식되도록 하며, 동물 내부에 형성된 종양을 절취하여 분리함으로써 LK 1을 생성할 수 있는 인간세포를 수득하는 LK 1의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 인간이외의 온혈동물의 영양 체액이 인간 세포에 공급되는 확산 챔버내에 인간 세포를 현탁시키고, 이 챔버를 인간이외의 온혈 동물 체내 또는 체표면에 설치하거나 매몰하며, 이 챔버내에서 동물의 영양 체액을 인간 세포에 공급하고, 동물을 사육해서 인간 세포가 동물의 영양체액을 이용해서 증식하도록 하며, 증식된 인간 세포를 챔버로부터 수거함으로써 LK 1을 생성할 수 있는 인간 세포를 수득하는 LK 1의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 인간이외의 온혈동물이 닭, 비둘기, 개, 고양이, 원숭이, 염소, 돼지, 소, 말, 토끼, 기니아 피그, 래트, 누우드 래트, 햄스터, 마우스 또는 누우드 마우스인 LK 1의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 인간이외의 온혈동물이 닭, 비둘기, 개, 고양이, 원숭이, 염소, 돼지, 소, 말, 토끼, 기니아 피그, 래트. 누우드 래트, 햄스터, 마우스 또는 누우드 마우스인 LK 1의 제조방법.
  8. 제4항에 있어서, 인간이외의 온혈동물이 면역 결핍되거나 면역 억제된 것인 LK.1의 제조방법.
  9. 제5항에 있어서, 확산 챔버가 공칭 기공도 10-7~10-5m를 갖는 1개 또는 그 이상의 박막 필터, 중공 섬유 또는 환외 여과기를 구비한 것인 LK 1의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, LK 1을 생성할 수 있는 인간 세포가 인간 백혈구 또는 인간 임파구인 LK 1의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, LK 1을 생성할 수 있는 인간 세포가 임파 아구 세포인 LK 1의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, LK 1을 생성할 수 있는 인간 세포가 Namalwa(ATCC CRL 1432), BALL-1, TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, MOLT-3- (ATCC CRL 1552), CCRF-EB(ATCC CCL 120), CCRF-CEM(ATCC CCL 119) 및 BALM 2로 구성 되는 군으로부터 선택되는 세포인 LK 1의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 노출 단계를 생체외에서 진행시키는 LK 1의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 노출 단계를 생체내에서 진행시키는 LK 1의 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, LK 1 유발물질이 비루스, 헥산, 뉴클레오티드, 유사 분열 물질, 내독소, 지방 다당류, 당류 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로 부터 선택되는 물질인 LK 1의 제조방법.
  16. 항원으로 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진 LK 1을 사용하여 인간이외의 온혈동물을 면역시키고, 이 동물체로부터 항체 생성 세포를 수거하며, 이 항체 생성 세포를 골수종 세포와 융합시키고, 수득된 하이브리도마 세포로부터 항-LK 1 항체를 생성할 수 있는 클로운(clone)을 선별하여 이 클로운을 증식시키고, 이 증식된 세포가 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하도록 하는 방법을 특징으로 하는 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체 제조방법.
    (가) 분자량 : 20,000±2,000 달톤
    (나) 등전점 : PI=5.6±0.2
    (다) 전기영동 이동도 : Disc-PAGE에서 Rf=0.29±0.02
    (라) 자외선 흡수 스펙트럼 280nm부근에서 흡수 최대
    (마) 용매에 대한 용해성 : 물, 생리 식염수 및 인산염 완충액에 가용 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에 불용 또는 난용
    (바) 착색반응 : Lowry's 방법 또는 마이크로뷰렛법에 의해 단백질 양성반응 페놀-황산법 또는 안트론-확산법에 의해 당질 양성반응.
    (사) 생물학적 활성 : L 929 세포에 대해 세포 독성 KB 세포에 대해 성장 억제 인터페론 활성을 실질적으로 나타내지 않음.
    (아) 수용액중에서의 안정성 : pH 7. 2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃까지 안정 4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH 4.0∼11.0범위에서 안정
    (자) 냉동 보존시 안정성 : -10℃에서 1개월 이상 안정
  17. 제16항에 있어서, 항체 생성 세포가 비장 세포인 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 인간이외의 온혈동물이 마우스인 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체 제조방법.
  19. 제16항에 있어서, 제 1항의 방법에 따라 제조된 LK 1을 사용하는 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체제조방법.
  20. 제16항에 있어서, 융합 단계가 항체 생성 세포를 골수종 세포와 함께 효과량만큼의 세포 융합 유발제를 함유하는 염 용액에 현탁시키고, 수득한 세포 현탁액을 세포 융합이 진행되는 충분한 기간동안 방치하는 단계로 되어 있는 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체 제조방법.
  21. 제16항에 있어서, 세포 융합 유발제가 센다이 (sendai) 비루스 도는 폴리에틸렌 글리콜인 LK 1에 특이적인 모노클로날 항체 제조방법.
  22. 아래와 같이 물리화학적 성질을 가진 LK 1과 상당량의 불순물을 함유하는 용액을 부동화 항-LK 1 항체 칼럼에 통해주어 친화성 크로마토그래피 분리를 행하고, 수득한 LK 1-활성 분획을 회수하는 단계로 구성되는 LK 1의 정제방법.
    (가) 분자량 : 20,000±2,000 달톤
    (나) 등전점 : PI=5.6±0.2
    (다) 전기영동 이동도 : Disc-PAGE에서 Rf=0.29±0.02
    (라) 자외선 흡수 스펙트럼 : 280nm부근에서 흡수 최대
    (마) 용매에 대한 용해성 : 물, 생리 식염수 및 인산염 완충액에 가용 에틴 에테르, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에 불용 또는 난용
    (바) 착색반응 : Lowry's방법 또는 마이크로뷰렛법에 의해 단백질 양성반응 페놀-황산법 또는 안트론-황산법에 의해 당질 양성반응
    (사) 생물학적 활성 : L 929 세포에 대해 세포 독성 KB 세포에 대해 성장 억제 인터페론 활성을 실질적으로 나타내지 않음.
    (아) 수용액중에서의 안정성; pH 7.2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃까지 안정 4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH 4.0∼11.0범위에서 안정
    자) 냉동 보존시 안정성 : -10℃에서 1개월 이상 안정
  23. 제22항에 있어서, 제16항의 제조방법에 따라 제조한 항-LK 1항체를 사용하는 LK 1의 정제방법.
  24. 제22항에 있어서, 수득한 LK 1의 비활성 (specific activity) 이 106단위/mg 단백질 또는 그 이상인 LK 1의 정제방법.
  25. 약제학적으로 허용되는 담체에 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진 유효량의 LK 1을 활성 성분으로 첨가하여 의약품 조성을 제조하는 의약품 조성물의 제조방법.
    (가) 분자량 : 20,000±2,
    (나) 등전 점 Pl=5.6±0.2
    (다) 전기영동 이동도 : Disc-PAGE에서 R(=0.29±0.02)
    (라) 자외선 흡수 스펙트럼 : 280nm부근에서 흡수 최대
    (마) 용매에 대한 용해성 : 물, 생리 식염수 및 인산염 완충액에 가용 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에 불용 또는 난용
    (바) 착색반응 : Lowry's방법 또는 마이크로뷰렛법에 의해 단백질 양성반응 페놀-황산법 도는 안트론-황산법에 의해 당질 양성반응.
    (사) 생물학적 활성 : L 929세포에 대해 세포 독성 KB세포에 대해 성장 억제 인터페론 활성을 실질적으로 나타내지 않음.
    (아) 수용액중에서의 안정성 : pH 7.2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃까지 안정 4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH 4.0∼11.0범위에서 안정.
    (자) 냉동 보존시 안정성 -10℃에서 1개월 이상 안정
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물이 항 종양제인 의약품 조성물의 제조방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 조성물에 LK 1을 5단위/g 이상 첨가하는 의약품 조성물의 제조방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 주사제, 점안제, 연고, 좌제 및 점비제로 된 군으로부터 선택되는 것인 의약품 조성물의 제조방법.
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