NO156051B

NO156051B - Fremgangsmaate for fremstilling av type ii-interferon.

Info

Publication number: NO156051B
Application number: NO800105A
Authority: NO
Inventors: Kaname Sugimoto; Shokichi Yuen
Original assignee: Hayashibara Ken; Ashida Shin
Priority date: 1979-01-18
Filing date: 1980-01-17
Publication date: 1987-04-06
Also published as: SE8701856L; NL8000291A; FR2446637B1; FR2446637A1; DK169479B1; JPS5598118A; JPS631296B2; SE451797B; AU5456180A; IT8047632A0; ES8103162A1; ES487852A0; NO800105L; CA1135622A; DE3001585A1; IT1143056B; GB2040292B; SE8701856D0; BE881217A; AU536477B2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

for fremstilling av human-spesifikt type II-

interferon, ved hvilken etablerte humane celler, som er istand til å danne human-spesifikt type II-interferon, transplanteres til et ikke-humant varmblodig dyr, dyret fores, således at de humane celler får mulighet til å utnytte dyrets nærende legemsvæske til sin formering, den resulterende tumor som dannes i dyret, ekstraheres og nedbrytes for å oppnå de formerte humane celler, de formerte humane celler utsettes for effektive mengder av interferon-fremkaller in vivo eller in vitro under betingelser som egner seg til akkumulering av en vesentlig mengde human-spesif ikt type II-interferon, og det akkumulerte human-spesifikke type II-interferon isoleres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte.

Som beskrevet av Shigeyasu Kobayashi , "Interferon",

utgitt av Kodansha Co. Ltd., Tokyo, Japan (1975), D.A.J. Tyrrell, "Interferon and its Clinical Potential", utgitt av William Heineman Medical Books Ltd. (London) (19 76) og i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 21, no. 4 (1976), er interferon den betegnelse som angir et proteinaktig stoff som fremkalles intra- eller ekstra-cellulært ved å utsette levende celler for påvirkning av en interferon-fremkaller, f.eks. vxrus, bakterier, protozoer, rickettsia, nukleinsyre, endotoksin og polysakkarid, og som har den virkning at det ikke-spesifikt hemmer formering av forskjellige vira i celler. På grunn av sin funksjon med hensyn til å hemme virus formeringen, har interferon lenge vært ansett som et lovende terapeutisk og profylaktisk mi'ddel for virale sykdommer. Det er nylig blitt påvist at interferon virker som antitumormiddel, ikke bare på virale tumorer, men også på ikke-virale tumorer, og det stilles derfor store for-ventninger til utnyttelsen av interferon som medisin.

Det er vel dokumentert at begrepet interferon omfatter såvel type I-som type II-interferon. Interferon av type I

eller klassisk interferon har en molekylvekt på ca. 1-3 x 10<4>

og fremkalles ved at man utsetter levende celler for virale infeksjoner, og interferon av type II eller immuninterferon har en molekylvekt på ca. 4-7 x 10 4 og fremkalles i lymfocytter efter stimulering med mitogener eller efter respons på antigener.

Som beskrevet av L.B. Epstein, "Texas Reports on Biology and Medicine", bind 35, s. 41-56 (1977), utgitt av University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA, er interferon av type II mindre stabilt enn interferon av type I under strenge betingelser, nemlig ved en pH-verdi under 2 og over 10 og/eller ved en temperatur på over 56°C. ba imidlertid type II-interferon har en nær tilknytning til immun-reaksjoner, forventes type II-interferon å ha meget større terapeutisk og profylaktisk virkning på interferon-følsomme sykdommer enn type I-interferon.

På grunn av den høye artsspesifisitet kan de terapeutiske og profylaktiske virkninger på humane sykdommer ikke oppnås med interferon som er fremstilt fra andre kilder enn levende humane celler. Hittil er leukocytter blitt anvendt ved fremstillingen av type II-interferon. Det er meget vanskelig å oppnå en stor mengde type II-interferon billig fra leukocytter, fordi leukocytter må fraskilles og fremstilles fra friskt blod og ikke kan tåle langvarig oppbevaring. På grunn av disse omstendigheter er det ikke blitt oppnådd kommersiell produksjon av type II-interferon som kan anvendes som terapeutisk og profylaktisk middel for humane sykdommer.

Det er nå undersøkt en fremgangsmåte som lett vil kunne anvendes for kommersiell produksjon av type II-interferon og har studert mulighetene for dette interferon som terapeutisk og profylaktisk middel. Disse bestrebelser har resultert i den oppdagelse at det ikke kunne oppnås noen stor mengde type II-interferon med høy titer ved å overføre og formere etablerte type II-interferonproduserende humane celler i et dyrkningsmedium in vitro, men at dette lett kunne oppnås ved å transplantere cellene til andre varmblodige dyr eller ved å

pode cellene i et dyrkningsmedium anbragt i et filtermembran-omgitt diffusjonskammer som er utformet og tilpasset i eller på dyrelegemet slik at cellene kan vokse på dyrets legemsvæske som næringsmedium, formere de transplanterte eller podede celler ved å utnytte legemsvæskene i det varmblodige dyr eller i diffusjonskammeret og derefter utsette de formerte celler for påvirkning av en type II-interferon-fremkaller in vivo eller in vitro for å få dannet type II-interferon, og rense og fra-skille det dannede type II-interferon; og at det ved denne

fremgangsmåte erholdte type II-interferon er et utmerket terapeutisk og profylaktisk middel mot type II-interferon-følsomme sykdommer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen avviker fra konvensjonelle fremgangsmåter hvor de levende celler formeres in vitro, og den har den fordel at den krever intet, eller meget mindre næringsmedium,tilført kostbart serum, at opprettholdelsen og reguleringen av betingelsene under formeringen av de etablerte humane celler er lettere, og at det lett kan oppnås et type II-interferon med høy titer. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan etablerte humane celler lett formeres i andre varmblodige dyr under anvendelse av legemsvæsken ved enten å transplantere cellene i denne eller ved å feste i eller på dyrelegemet et diffusjonskammer som er fylt med et dyrkningsmedium med en suspensjon

av cellene, mens dyret fores på vanlig måte. Spesielt har oppfinnelsen, sammenlignet med de konvensjonelle fremgangsmåter hvor cellene formeres in vitro, de ytterligere fordeler at formeringen av cellene er mer stabil, at formeringshastigheten

er høyere og at ubyttet av dannet type II-interferon pr. celle er meget høyere.

Det kan anvendes hvilke som helst etablerte humane celler bare de formeres lett når de transplanteres til andre varmblodige dyr; det kan f.eks. anvendes HPB-ALL-celler, M0LT-3-celler,

P 12/Ichikawa-celler, HPB-MLT-celler, P 8/Seki-celler, JBL-celler, HCL-celler og P 10/Shibata-celler som beskrevet i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 23, nr. 6, s. 697-711

(1978), Namalva-celler som beskrevet i "Journal of Clinical Microbiology", bind 1, s. 116-117 (1975) og BALL-1-celleff, TALL-l-celler og NALL-l-celier som er beskrevet av I. Miyoshi, "Nature", bind 267, s. 843-844 (1977).

Spesielt foretrekkes de humane lymfoblastoidcellelinjer. Etablerte humane celler som kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan utvelges blant de ovennevnte celler, men er ikke begrenset til disse. I trinn som ligger foran induksjonen av interferon av type II, kan de ovennevnte celler anvendes hver for seg eller i kombinasjon. Når de etablerte humane celler som anvendes ved fremstillingen av type II-interferon er leukocytter, særlig lymfocytter, kan anvendelsen

av en celleblanding som inneholder B-lymfocytter (B-celler)

og T-lymfocytter (T-celler) foruten de nevnte etablerte humane celler, ytterligere øke aktiviteten til det induserte type II-interferon. Til de etablerte humane celler kan det om ønsket, blandes humane leukocytter fremstilt fra friskt humant blod.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det anvendes

et hvilket som helst varmblodig dyr, bare etablerte humane celler kan formere seg i dette, f.eks. kan det anvendes fugler, så som kyllinger og duer, og det kan anvendes pattedyr så som hunder, katter, aper, geiter, griser, okser, hester,

kaniner, marsvin, rotter, hamstere, mus og nakne mus. Da transplantasjon av humane celler i de ovennevnte dyr har en tilbøyelighet til å medføre uønskede immunoreaksjoner,

bør dyrene velges i det mest umodne stadium, nemlig egg,

fostre, embryo eller nyfødte eller ganske unge dyr, slik at immunoreaksjonene undertrykkes i størst mulig grad. Før transplantasjon av cellene kan dyret bestråles med ca.

200-600 REM røntgenstråler eller gammastråler, eller det kan injiseres antiserum eller et immunosuppressivt middel for å undertrykke immunoreaksjonene. Nakne mus, selv voksne nakne mus, foretrekkes som de varmblodige dyr, da de er mindre tilbøyelige til å forårsake uønskede immunreaksjoner og fordi etablerte humane celler kan transplanteres til disse og formeres hurtig uten noen forbehandling. Transplantasjon av formerte humane celler fra ett varmblodig dyr til et annet varmblodig dyr kan gjøre formeringen av cellene meget mer stabil og mengden av type II-interferon som dannes i cellene, meget større,

f.eks. transplanteres etablerte humane celler i hamstere og formeres der, hvorefter de formerte humane celler høstes og derefter transplanteres til nakne mus. I dette tilfelle kan de formerte celler transplanteres ytterligere fra ett varmblodig dyr til et annet varmblodig dyr av samme art, samme slekt, samme klasse eller samme inndeling. Etablerte humane celler kan også transplanteres til en hvilken som helst del av dyrelegemet bare de formeres lett der, f.eks. kan de transplanteres intraperitonealt, intravenøst, subkutant eller i allantoishulen.

Istedenfor å transplantere og formere etablerte humane celler til andre varmblodige dyr, kan en hvilken som helst av de ovennevnte celletyper podes og formeres i et næringsmedium fra et annet varmblodig dyr i et di ffusjonskammer av konvensjonell type som innleires f.eks. intraperitonealt, og som er innrettet slik at det lar cellene utnytte dyrets legemsvæske. De kammere som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan være av forskjellige former og størrelser, og de bør være adskilt fra legemsvæsken ved filtermembraner, f.eks. membranfiltere, ultrafiltere eller hule fibere for å hindre at celler unnslipper. Det foretrekkes særlig kammere som har filtermembraner med porestørrelser på ca. 10 7 til 10~<5>m anbragt som adskillelse. Om nødvendig kan diffusjonskammeret være utformet og plassert slik, f.eks. på overflaten av dyrelegemet, at dyrets nærende legemsvæske kan sirkulere gjennom kammeret,

og at utviklingen av de etablerte humane celler som er podet inn i kammeret, kan iakttas gjennom et gjennomsiktig side-

vindu som er utformet i kammerveggen. Diffusjonskammeret kan også være utformet og anbragt slik at det periodisk kan avbrytes fra dyrelegemet for at cellene kan formeres gjennom hele dyrets liv uten unødvendig å måtte avlive dyret, for å øke antall formerte celler pr. dyr. Videre har fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, når den utnytter det ovennevnte diffusjonskammer, den ytterligere fordel foruten at de formerte humane celler lett kan høstes da det ikke er noen direkte kontakt mellom de humane celler og dyrecellene, at det på grunn av de mindre muligheter for å forårsake immunreaksjoner, er mulig å anvende forskjellige varmblodige dyr uten.noen immunreaksjon-reduserende forbehandling av dyrene.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen medfører den fordel,

at det dyr, til hvilket de etablerte humane celler transplanteres, kan fores på vanlig måte, og at det ikke kreves noen særlig behandling, selv ikke efter transplantasjonen av cellene. Den periode som er nødvendig for tilstrekkelig formering av

de transplanterte, etablerte humane celler, er vanligvis ca. 1-10 uker.

Antall formerte humane celler telles og finnes a være

ca. 10 7 - 10 12eller mer pr. dyr. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er med andre ord særlig fordelaktig for fremstilling av type II-interferon, da antallet av celler som transplanteres eller podes i eller på dyrelegemet eller diffusjonskammeret, stiger ca. 10 <2> - 10 <7> ganger eller mer ved fremgangsmåoten;

dette er ca. 10 - 10 ganger eller mer i forhold til det som oppnås ved å pode og formere de samme celler i et nærings-dyrkningsmedium in vitro.

Ved induksjon av type II-interferon kan det anvendes en hvilken som helst metode som fremkaller type II-interferon i de formerte levende humane celler. Cellene kan utsettes for påvirkning av en type II-interferon-fremkaller der de formeres.

F.eks. kan de humane celler som formeres i ascites i suspensjon, eller de tumorceller som fremkommer subkutant, utsettes for påvirkning av en type II-interferon-fremkaller in vivo der de formeres, og det dannede type II-interferon renses derefter og adskilles fra ascites-væsken eller tumoren. På den annen side kan de formerte humane celler efter isolering utsettes for påvirkning av en type II-interferon-fremkaller in vitro for å fremkalle type II-interferon. F.eks. kan de formerte humane celler som er høstet fra ascites, eller slike som er isolert og dissosiert fra de massive tumorer som er frem-kommet subkutant, suspenderes i et næringsmedium som holdes ved ca. 20-40°C, for oppnåelse av en cellékonsentrasjon på ca. 10 <5> - 10 <8>celler pr, ml og derefter utsettes for en type II-interferon-f remkaller. Derefter renses og fraskilles det dannede type II-interferon. Når humane celler formeres i et diffusjonskammer, kan cellene utsettes for en type II-interferon-fremkaller i kammeret in vivo, eller de kan utsettes for denne in vitro, efter at de er isolert fra kammeret.

Ved fremstillingen av type II-interferon kan mengden av fremkalt type II-interferon økes ytterligere ved kjente metoder så som ved "priming", hvor det anvendes humant interferon som er meget artsspesifikt, og/eller superinduksjonsmetoden, hvor det anvendes en metabolisk inhibitor. Videre kan utbyttet av det dannede type II-interferon pr. dyr økes ytterligere ved én eller flere av de følgende metoder: 1) En metode hvor de formerte celler først usettes for en type II-interferon-fremkaller for å fremkalle interferonet på det sted hvor cellene formeres, og derefter, efter høsting fra en viss del av dyrelegemet eller fra hele dyrelegemet, utsettes for en type II-interferon-fremkaller for å fremkalle interferonet in vitro, 2) en metode hvor de humane celler, som allerede er blitt anvendt flere ganger for fremstilling av type II-interferon, utsettes for påvirkning av en type II-interferon-fremkaller in vivo eller in vitro for å fremkalle interferon, og 3) en metode ved hvilken et diffusjonskammer som er innleiret i eller forbundet til eller på dyrelegemet, periodisk avbrytes for å øke antallet av de formerte humane celler.

Som type II-interferon-fremkaller foretrekkes vanligvis mitogener så som fytohemagglutinin, concanavalin A, "pork weed mitogen", lipopolysakkarid, polysakkarid, endotoksin og bakterier. For sensibiliserte celler virker antigen også som type II-interferon-fremkaller. De ovennevnte type II-interferon-fremkallere anvendes vanligvis i en konsentrasjon på ca. 0,001 ug til 10 mg pr. ml. Dessuten oppnås det ved anvendelse av én eller flere type I-interferon-fremkallere, f.eks. virus, nukleinsyre og polynukleotid, i kombinasjon med en type II-interferon-fremkaller, en ytterligere økning av utbyttet av det fremkalte type II-interferon, og det er også på denne måte mulig samtidig å fremkalle type I-interferon og type II-interferon .

Det dannede type II-interferon kan lett renses og fraskilles ved konvensjonelle rense- og adskillelsesmetoder, f.eks. utsalting, dialyse, filtrering, sentrifugering, konsentrering og frysetørring. Hvis det ønskes et høyere renset type II-interferonpreparat, kan type II-interferon av høyeste renhet oppnås ved anvendelse av konvensjonelle metoder, f.eks. adsorpsjpn og desorpsjon ved hjelp av ionebytter, gelfiltrering, affinitetskromatografi, fraksjonering ved hjelp av isoelektrisk punkt og elektroforese, i kombinasjon med de ovennevnte metoder.

Virkningene av humane type I- og type II-interferoner

med høy artsspesifisitet er bestemt ved den konvensjonelle plaque-reduksjonsmetode med humane amnionceller som beskrevet i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 20, nr. 6, s. 616-643

(1975), utgitt av Kyoritsu Snuppen Co., Ltd., Tokyo, Japan.

Hemagglutinasjonsenheten er bestemt efter metoden ifølge J. E. Salk, "Journal of Immunology", bind 49, s. 87-98 (1944).

Nedenstående forsøk A beskriver fremstilling av type II-interferon ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

FORSØK A

Interferon-produktivitet av cellene formert in vitro eller

in vivo.

Forsøk A-I. Formering in vitro.

BALL-1-celler podes i RPMI-1640 medium som er tilsatt

20% føtalt kalveserum ved pH 7,2 og dyrkes i suspensjon ved 37°C. De formerte celler vaskes med serumfritt RPMI-1640 medium ved

pH 7,2 og suspenderes i et frisk medium med samme sammensetning for oppnåelse av en cellekonsentrasjon på ca. lx 10<6> celler pr. ml.

Forsøk A-2. Formering in vivo.

Nyfødte hamstere for-injiseres med antiserum fremstilt i kaniner på kjent måte for å undertrykke deres immunreaksjoner og transplanteres deiefter med subkutane BALL-l-celler. Hamsterne fores på vanlig måte i 3 uker. De massive tumorer

som fremkommer subkutant, isoleres, skjæres i små stykker og dissosieres i en fysiologisk saltoppløsning inneholdende trypsin for oppnåelse av de formerte celler. De således erholdte celler vaskes med serumfritt RPMI-1640 medium ved pH 7,2 og suspenderes i et friskt medium med samme sammensetning for oppnåelse av en cellekonsentrasjon på ca. 1 x 10^ celler pr. ml.

Forsøk A-3. Fremstilling av interferon.

De suspensjoner av BALL-l-celler som er fremstilt i

forsøk A-I og A-2, en cellekonsentrasjon på ca. lx 10^ celler pr. ml, utsettes for fytohemagglutinin og/eller Sendai-virus for å fremkalle interferon. Når fytohemagglutinin anvendes alene, tilsettes suspensjonene fytohemagglutinin i en mengde på ca. 100 ug pr. ml og inkuberes ved 37°C i 3 dager for å fremkalle interferon. Når Sendai-virus anvendes alene, tilsettes suspensjonene Sendai-virus i en mengde på ca. 300 hemagglutinasjonsenheter pr. ml og inkuberes ved 37°C i én dag for å fremkalle interferon. Når fytohemagglutinin og Sendai-virus anvendes sammen, tilsettes suspensjonene først fytohemagglutinin i en mengde på ca. 100 ug pr. ml og inkuberes ved 37°C i 2 dager og derefter Sendai-virus i en mengde på ca. 300

hemagglutinasjonsenheter pr. ml og inkuberes ved 37°C i ytterligere én dag for fremkalling av interferon.

De således erholdte interferonholdige suspensjoner sentrifugeres. De resulterende overliggende væsker konsentreres med et ultrafilter med en molekylvektavskjæring på

6000 og fraksjoneres derefter efter molekylvekten, med dekstrangel. Aktiviteten til det erholdte type I-interferon, molekylvekt ca. 25.000, og det erholdte type II-interferon, molekylvekt ca. 50.000, bestemmes, for bedømmelse av interferonaktiviteten pr. ml suspensjon efter inkubering. Resultatene fremgår av tabell I.

De samlede totale interferon-aktiviteter som er bestemt efter inkubering, uttrykkes som enheter pr. ml suspensjon, og aktiviteten av type II-interferon for hvert preparat er vist i parentes. Det fremgår av de i tabell I viste resultater, at mens det fremkalles en liten mengde interferon i de celler som formeres in vitro, fremkalles det en stor mengde interferon i de celler som formeres in vivo. De celler som formeres både in vitro og in vivo, gir type I-interferon når de utsettes for Sendai-virus. De celler som formeres in vivo, gir imidlertid 4 ganger høyere aktivitet enn de celler som formeres in vitro. Med hensyn til interferonaktiviteten av de preparater som er fremkalt med fytohemagglutinin og/eller Sendai-virus, iakttas en bemerkelsesverdig synergisme med hensyn til interferon-fremkallerne ved fremstillingen av type I- og type II-interferon når det anvendes celler formert in vivo. Spesielt har det type II-interferon som fremkalles ved anvendelse av fytohemagglutinin og Sendai-virus i kombinasjon, en ca. 28 ganger høyere aktivitet enn det som fremkalles under anvendelse av fytohemagglutinin alene. Det iakttas imidlertid ingen synergisme når det anvendes de celler som er formert in vitro.

Forskjellige utføreIsesformer som belyser fremstillingen

av type II-interferon ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, fremgår av det følgende:

Eksempel A

Fremstilling av type II-interferon.

Eksempel A-I.

Til voksne nakne mus transplanteres subkutant etablerte humane BALL-l-celler, og musene f5res på vanlig måte i 3 uker.

De massive tumorer som fremkommer subkutant, ca. 10 g pr.'

naken mus, isoleres, skjæres i små stykker og dissosieres i en fysiologisk saltoppløsning inneholdende trypsin for fra-skillelse av de formerte humane celler. Cellene vaskes med Eagle's minimal essential medium tilsatt 5% volum/volum

humant serum ved pH 7,2, og suspenderes i et friskt medium med samme sammensetning for å oppnå en cellekonsentrasjon på 5 x 10^ celler pr. ml ved 37°C. Til denne suspensjonen settes et delvis renset humant interferon med høy artsspesifisitet i en mengde på ca. 100 enheter pr. ml, og blandingen inkuberes i ca. 2 timer. Derefter settes fytohemagglutinin til blandingen i en mengde på ca. 200 ug pr. ml. Derefter inkuberes blandingen ved denne temperatur i ytterligere 3 dager for å fremkalle type II-interferon. Den inkuberte blanding sentrifugeres ved ca. 1000 g og 4°C for å fjerne bunnfall så som cellerester,

og den resulterende overliggende væske dialyseres mot en fysiologisk saltoppløsning som er bufret ved pH 7,2 med 0,01M fosfatbuffer, i 24 timer. Derefter filtreres det resulterende materiale forsiktig med en filtermembran, og det type II-interferonholdige filtrat konsentreres og frysetørres til et pulver.

Pulverets type II-interferon-aktivitet er ca. 1.500.000 enheter pr. naken mus.

Eksempel A-2.

Til voksne nakne mus transplanteres intraperitonealt etablerte humane BALL-1- og TALL-l-celler, og musene fores på vanlig måte i 5 uker. I de nakne mus injiseres derefter intraperitonealt 1 mg fytohemagglutinin, og 24 timer senere injiseres ca. 3000 hemagglutinasjonsenheter Newcastle disease-virus, hvis aktivitet er nesten'pre-inaktivert ved ultrafiolett bestråling. De nakne mus avlives, og ascites oppsamles 24 timer efter injeksjonen. Ascites-væsken sentrifugeres ved ca. 1000 g og 4°C for å fjerne bunnfall så som cellerester. Den resulterende overliggende væske dialyseres mot en fysiologisk saltoppløsning, bufret til pH 7,2 med en 0,01M fos fatbuffer, i 15 timer.

Det resulterende materiale filtreres derefter og konsentreres forsiktig med filtermembraner for å oppnå et konsentrat inneholdende interferon.

Konsentratets samlede interferonaktivitet er ca. 800.000 enheter pr. 10 nakne mus, hvorav ca. 300.000 enheter er type II-interferon-aktivitet.

Eksempel A-3.

Nyfødte hamstere pre-injiseres med antiserum fremstilt

fra kaniner efter kjente metoder for å undertrykke deres immunreaksjoner, hvorefter de injiseres subkutant med etablerte humane JBL-celler. Hamsterne fores på vanlig måte i 4 uker.

De massive tumorer som fremkommer subkutant, ca. 30 g. pr. hamster, isoleres og behandles på lignende måte som beskrevet i eksempel A-I. De formerte celler vaskes med RPMI-1640-

medium som er tilsatt 10% volum/volum føtalt kalveserum ved pH 7,4 og suspenderes i et friskt medium med samme sammensetning for å oppnå en cellekonsentrasjo1 n på ca. 2 x 10 7 celler pr. ml ved 37°C. Til blandingen settes et delvis renset humant type II-interferon med høy artsspesifisitet i en mengde på

ca. 200 enheter pr. ml, og det inkuberes ved 37°C i ca. 1 time. Til den inkuberte blanding settés derefter concanavalin A i

en mengde på ca. 500 ug pr. ml, og det inkuberes i 3 dager,

hvorefter Sendai-virus tilsettes i en mengde på ca. 300 hemagglutinasjonsenheter pr. ml, og det inkuberes i 16 timer for at interferon skal dannes. Blandingen renses og konsentreres forsiktig med filtermembraner på lignende måte som beskrevet i eksempel A-2, hvorved man får en interferonholdig oppløsning.

Oppløsningens samlede interferonaktivitet er ca. 17.000.000 enheter pr. hamster, hvorav 6.000.000 enheter er type II-interferonaktivitet.

Eksempel A-4.

Til nyfødte rotter transplanteres intravenøst etablerte humane Namalva-celler, hvorefter rottene fores på vanlig måte i 4 uker. De massive tumorer som fremkommer subkutant, ca. 50 g pr. rotte, isoleres, skjæres i små stykker og dissosieres på lignende måte som beskrevet i ekrempel A-I. De formerte humane celler behandles på lignende måte som beskrevet i eksempel A-I, bortsett fra, at det i stedet for fytohemagglutinin tilsettes Maruyama-vaksine i en mengde på ca. 1 ug pr. ml for fremkalling av type II-interferon. Det fremkalte type II-interferon renses, og den resulterende oppløsning inneholdende type II-interferon frysetørres til et pulver på lignende måte som beskrevet i eksempel A-I.

Pulverets type II-interferonaktivitet er ca. 8.000.000 enheter pr. rotte.

Eksempel A-5.

Først bestråles voksne mus med ca. 400 REM røntgenstråling for å undertrykke deres immunreaksjoner, og derefter transplanteres etablerte humane TALL-l-celler subkutant i musene, hvorefter musene fores på vanlig måte i 3 uker. Efter iso-

lering og findeling av de massive tumorer som fremkommer subkutant, ca. 10 g pr. mus, dissosieres tumorcellene på lignende måte som beskrevet i eksempel A-I. Cellere behandles på lignende måte som beskrevet i eksempel A-3 for fremkalling av interferon.

Det fremkalte interferon renses og konsentreres på lignende måte som beskrevet i eksempel A-2, hvorved man får et konsentrat inneholdende interferon.

Knnconfrafofs camlprlp i nfprfprnnalrt iui fol- o r- Q AOO OOO enheter pr. mus, hvorav ca. 3.000.000 enheter er type II-interferonaktivitet.

Eksempel A-6.

I hamstere transplanteres først subkutant etablerte

humane M0LT-3-celler på lignende måte som beskrevet i eksempel A-3, hvorefter hamsterne fores på vanlig måte i 3 uker for at cellene skal formeres. I 10 dager gamle nakne mus transplanteres derefter intraperitonealt de formerte celler, og musene fores på vanlig måte i ytterligere 5 uker. De nakne mus bedøves for oppsamling av ascites. Den erholdte ascites sentrifugeres for høsting av de formerte celler.

Cellene vaskes og behandles på lignende måte som beskrevet i

A-I for fremkalling av type II-interferon. Det fremkalte

type II-interferon renses derefter og konsentreres på lignende måte som beskrevet i eksempel A-2 til et konsentrat inneholdende type II-interferon.

Konsentratets type II-interferonaktivitet er ca. 50O.000 enheter pr. naken mus.

Eksempel A-7.

Under anvendelse av sylindriske diffusjonskammere av formstoff med membranfiltere med porestørrelse 0,5 u og kapasitet ca. 10 ml suspenderes etablerte humane JBL-celler i fysiologisk saltoppløsning. Kamrene innleires intraperitonealt i voksne rotter. Rottene fores på vanlig måte i 4 uker,

hvorefter kamrene fjernes. Konsentrasjonen av de formerte humane celler i kamrene er ca. 5 x 10 9celler pr. ml, hvilket er ca. 1000 ganger eller mer høyere enn hva som oppnås in vitro i et næringsmedium under anvendelse av C02~inkubator. Til suspensjonen av de resulterende celler settes M0LT-3-celler, fremstilt som beskrevet i eksempel A-6, til en konsentrasjon på ca. 20% volum/volum, og blandingen behandles på lignende måte som beskrevet i eksempel A-I for fremkalling av type II-interferon. Det fremkalte type II-interferon renses og konsentreres til et konsentrat inneholdende type II-interferon, som derefter fryse-tørres til et pulver.

Pulverets type II-interferonaktivitet er ca. 4.000.000 enheter pr. rotte.

Eksempel A-8-

Etablerte humane NALL-l-celler transplanteres til allantoishulen i embryonerte egg som er forinkubert ved 37°C

i 5 dager, og eggene inkuberes ved denne temperatur i ytterligere 7 dager. Eggene åpnes, og de formerte humane celler høstes. Suspensjonen av cellene settes til et like stort volum TALL-l-celler, fremstilt som beskrevet i eksempel A-I

for fremkalling av type II-interferon. Det fremkalte type II-interferon renses og konsentreres på lignende måte som beskrevet i eksempel A-2, hvorved man får et konsentrat inneholdende type II-interferon.

Konsentratets type II-interferonaktivitet er ca. 300.000 enheter pr. 10 embryonerte egg.

Eksempel A-9.

Et pulver som er fremstilt som beskrevet i eksempel A-I, renses ytterligere forsiktig i et pH-område på 4-9 på konvensjonell måte som ved adsorpsjon og desorpsjon under anvendelse av ionebytter, fraksjonering efter molekylvekt ved gelfiltrering, konsentrering og omhyggelig filtrering,

slik som beskrevet i Bodo's rapport, "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon. llth International Immunobiological Symposium. 8 & 9 June (1977), Zagreb, Jugoslavia". Man får et høyrenset interferonpreparat med en spesifikk aktivitet på 2 x 10^ enheter pr. mg protein, og det samlede utbytte er ca. 40%.

Resultatene av forsøk B viser at type II-interferon som erholdes ved fremgangsmåten ifølge de ovenstående eksempler,

kan anvendes alene, i kombinasjon med type I-interferon eller i blanding med ett eller flere andre stoffer som effektivt terapeutisk og/eller profylaktisk middel som kan anvendes for injisering eller som preparat for utvendig eller innvendig administrering for behandling av type II-interferon-følsomme sykdommer.

FORSØK B

Terapeutiske og profylaktiske virkninger av type II-interferon på interferon-følsomme sykdommer..

Forsøk B-l.

Behandling av virale sykdommer med type II-interferon

(hemmende virkning på viral formering in vitro).

Til monolag av humane embryoniske lungeceller, fremstilt ved primær kultur i petri-skåler, 6 cm i diameter, settes 0,1, 1,0 eller 10,0 enheter av type II-interferon som er fremstilt som beskrevet i eksempel A-9, og de resulterende blandinger inkuberes i en 5% volum/volum C02-inkubator ved 37°C i 20 timer. Til cellene settes variacella zoster virus eller human cytomegalo virus i mengder som danner 100 plaquer i fravær av type II-interferon. Blandingene inkuberes,'og antall resulterende plaquer telles .

Den hemmende virkning av ty^e II-interferon på virus-formeringen bestemmes under anvendelse av følgende ligning: hvor A betegner antall plaque som dannes i fravær av type II-interferon, og B betegner antall plaque som dannes i nærvær av type II-interferon. Resultatene fremgår av tabell II.

Som det fremgår av de i tabell II viste resultater, kan type II-interferon som fremstilles i henhold til oppfinnelsen, effektivt hemme formeringen av de virussykdomsforårsakende vira. Ved forsøket medfører tilsetningen av type II-interferon ingen abnormalitet i de humane celler.

Forsøk B-2.

Behandling av ikke-virale sykdommer med type II-interferon.

1) Hemning av tumorcelleformering in vitro.

Type II-interferon, fremstilt som beskrevet i eksempel A-9, settes til RPMI-1640 medium som er tilsatt 15% volum/volum føtalt kalveserum, slik at man får en sluttkonsentrasjon på

5, 50 eller 500 enheter pr. ml. Til blandingene transplanteres forskjellige tumorceller for å oppnå en konsentrasjon på 5 x 10 celler pr. ml. Blandingene inkuberes derefter i en 5% volum/volum C02~inkubator ved 37°C i 5 dager, og antall celler pr. ml medium telles. Det utføres kontrollforsøk på lignende måte som i de ovenstående forsøk, bortsett fra at det anvendes et type II-interferon som er for-inaktivert ved oppvarmning ved 100°C i 30 minutter.

Type II-interferoninhiberende virkning på tumorcelle-" formeringen bestemmes ved følgende ligning: hvor A betegner antall celler i kontrollforsøket, og B betegner antall celler i forsøket med type II-interferon. Resultatene fremgår av nedenstående tabell III.

Som det fremgår av de i tabell III viste resultater,

hemmer det type II-interferon som er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, effektivt formering av tumorceller så som BALL-l-celle, TALL-l-celle, NALL-l-celle og JBL-celle, og er effektivt i et aktivt konsentrasjonsområde på 5-500 enheter pr. ml.

2) Hemning av tumorcelieforme ring in vivo.

Forsøket utføres med 8 nakne mus, som er ca. 2 måneder gamle.

TALL-l-celler transplanteres subkutant i alle 8 nakne

mus i en mengde på 7,5 x 10^ celler pr. naken mus. Fra den annen dag efter transplantasjonen gis 4 nakne mus tre intraperitoneale injeksjoner på 1000 enheter type II-interferon, fremstilt som beskrevet i eksempel A-6, pr. uke, 20 injeksjoner ialt. 4 8 dager senere avlives de nakne mus, og og våtvekten av de fremkomne massive tumorer bestemmes. Det utføres kontroll-forsøk med de øvrige 4 nakne mus på lignende måte som beskrevet i ovenstående forsøk, bortsett fra at de ikke får type II-interferon. Resultatene fremgår av nedenstående tabell IV.

3) Hemning av tumorcelleformering in vivo.

Forsøket utføres med 8 nakne mus, som er ca. 2 måneder gamle.

Tumor-JBL-celler transplanteres subkutant i alle 8 nakne mus i en mengde på 1 x IO<7> celler pr. naken mus. Fra annen uke efter transplantasjonen gis 4 nakne mus to intraperitoneale injeksjoner på 1000 enheter type II-interferon, fremstilt som beskrevet i eksempel A-2, pr. uke, 8 injeksjoner ialt. 42 dager senere avlives de nakne mus, og våtvekten av de fremkomne massive tumorer bestemmes.

Det utføres kontrollforsøk med de øvrige 4 nakne mus på lignende måte som beskrevet ovenfor, bortsett fra at de ikke får type II-interferon. Resultatene fremgår av nedenstående tabell V.

Som det fremgår av de i tabell IV og V angitte resultater hemmer type II-interferon-injeksjonen tumordannelse og hemmer også i ekstremt høy grad tumorutvik lingen, selv når det er dannet tumor; våtvekten av de fremkomne massive tumorer hos de type II-interferon-behandlede nakne mus er meget mindre enn hos kontrollmusene. Dessuten viser de type II-interferon-behandlede nakne mus bedre appetitt og er mer aktive enn kontrollmusene.

FORSØK C

Akutt toksisitet

Den akutte toksisitetstest på den type II-interferonpreparat som er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-9, utføres med 20 dager gamle mus, og det påvises at toksisiteten av dette type II-interferonpreparat er ekstremt lav; LDj-Q-verdien er 20.000.000 enheter eller mer pr. kg ved intraperitoneal injisering.

Som det fremgår av de ovenstående forsøk, kan de type II-interf eron-f ølsomme sykdommer som er omtalt i foreliggende beskrivelse, være slike sykdommer som kan behandles og fore-bygges med interferon fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse, f.eks. virale sykdommer så som epidemisk keratokonjunktivitt, herpetisk keratitt, influensa, rubella og serumhepatitt, samt ikke-virale sykdommer så som leukemi og osteosarkom.

De terapeutiske og profylaktiske midler inneholdende

type II-interferon som kan anvendes i forbindelse med de nevnte type II-interferon-følsomme sykdommer, kan fremstilles i forskjellige former og faser avhengig av anvendelsen, f.eks. flytende preparater til spraypreparater, øyeskyllemidler, nese-

dråper, gurglemidler og injeksjonsmidler, pastapreparater så som salve og pastapreparater i pulver-, granul- og tablett-form. Midlene er tilstrekkelig effektive når innholdet av type II-interferon er 1 - 10.000.000 enheter pr. g, og de kan om ønsket anvendes i kombinasjon eller i blanding med ett eller flere andre stoffer, f.eks. terapeutiske midler, bærestoffer, fyllstoffer og stabiliseringsmidler.

Da interferon ved intravenøs injisering lett elimineres fra blodet i løpet av 10 minutter og utskilles fra systemet, gjør særlig administrering av interferon ved instillering, f.eks.

ved å innføre interferon i en instillerings-sukkersupplements-oppløsning, det mulig å forlenge administreringstiden.for å

oppnå full og effektiv utnyttelse av det tildryppede interferon og ytterligere forbedre interferonets terapeutiske og profylaktiske innvirkning på interferon-følsomme sykdommer.

Forskjellige utføre Ises former for type II-interferonholdige preparater av den her beskrevne type, beskrives i det følgende:

Eksempel B

Preparater inneholdende type II-interferon.

Eksempel B-l.

Flytende preparat

Et flytende preparat fremstilles ved å oppløse det type II-interferonholdige pulver som fremstilles ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-I, i fysiologisk saltoppløsning i en mengde på ca. 500 enheter pr. ml.

Preparatet kan anvendes som rpray, øyeskyllemiddel, nese-dråper og gurglemiddel ved behandling og forebyggelse av virale sykdommer, særlig epidemisk keratokonjunktivitt og influensa.

Eksempel B-2.

Injeksjonspreparat

Et injeksjonspreparat fremstilles ved å blande det type II-interferon som fremstilles som beskrevet i eksempel A-9, i fysiologisk saltoppløsning i en mengde på ca. 100.000 enheter pr. ml.

Injeksjonspreparatet er egnet til behandling og forebyggelse av. alle type II-interferon-følsomme sykdommer, herunder virale

sykdommer og tumorsykdommer.

Eksempel B-3.

Sukkersupplement-injeksjonsoppløsning.

En sukkersupplement-injeksjonsoppløsning for intravenøs instillering fremstilles ved å blande 1.000.000 enheter av et interferonpreparat inneholdende type I- og type II-interferoner som begge er fremstilt som beskrevet i eksempel A-5, og 100 mg cyklofosfamid i 500 ml av en 10% vekt/volum vandig maltose-oppløsning.

Sukkersupplement-injeksjonsoppløsningen er egnet som opp-løsning for kontinuerlig intravenøs infusjon til behandling

•og forebyggelse av tumorsykdommer.

Eksempel B-4.

Injeksjonsoppløsning.

En injeksjonsoppløsning fremstilles ved å oppløse 500.000 enheter av et interferonpreparat inneholdende type I- og 'type II-interferoner som er fremstilt som beskrevet i eksempel A-2, og 2 mg mitomycin C i 100 ml av en 10% vekt/volum vandig maltose-oppløsning.

Injeksjonsoppløsningen egner seg til behandling og forebyggelse av tumorsykdommer.

Eksempel B-5.

Salve.

En salve fremstilles på konvensjonell måte ved å blande

det pulver som fremstilles som beskrevet i eksempel A-4, flytende paraffin og vaselin til et preparat med en type II-interferonaktivitet på 10.000 enheter pr. g.

Salven egner seg til behandling av virale hudsykdommer.

Eksempel B-6.

Tablett

Tabletter fremstilles på konvensjonell måte ved å tablettere en blanding av det type II-interferonholdige pulver som er fremstilt som beskrevet i A-7, stivelse og maltose for å oppnå en type II-interferonaktivitet på ca. 1.000 enheter pr. tablett (ca . 100 mg) .

Tablettene egner seg til behandling og forebyggelse av

virale sykdommer som forekommer i fordøyelsessystemet.

Eksempel B- 7

Flytende tilberedning.

En flytende tilberedning for oral administrering fremstilles ved oppløsning av 5 mg metotrexat, og et konsentrat med en type II-interf eronaktivitet på 200.000 enheter fremstilles ved metoden i eksempel A-8 i 10 ml av en 10%ig (vekt/volum) vannholdig maltoseoppløsning.

Tilberedningen er egnet for behandling og forebyggelse av tumorsykdommer.

Claims

1 . Fremgangsmåte for fremstilling av human-spesifikt type II-interferon, ved hvilken etablerte humane celler, som er istand til å danne human-spesifikt type II-interferon, transplanteres til et ikke-humant varmblodig dyr, dyret fores, således at de humane celler får mulighet til å utnytte dyrets nærende legemsvæske til sin formering, den resulterende tumor som dannes i dyret, ekstraheres og nedbrytes for å oppnå de formerte humane celler, de formerte humane celler utsettes for effektive mengder av interferon-fremkaller in vivo eller in vitro under betingelser som egner seg til akkumulering av en vesentlig mengde human-spesifikt type II-interferon, og det akkumulerte human-spesifikke type II-interferon isoleres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, karakterisert ved at det som interferon-fremkaller anvendes både type I-interferon-fremkaller og type II-interferon-fremkaller .

2. Fremgangsmåte for fremstilling av human-spesifikt type II-interferon, ved hvilken etablerte, humane celler, som er istand til å danne human-spesifikt type II-interferon, suspenderes i et konvensjonelt diffusjonskammer, hvor den nærende legemsvæske fra et ikke-humant, varmblodig dyr tilføres til de humane celler, diffusjonskammeret innleires eller anbringes i eller på et ikke-humant varmblodig dyr på en slik måte at den nærende legemsvæske fra dyret tilføres til de humane celler i diffusjonskammeret, dyret fores slik at de humane celler får mulighet til å utnytte legemsvæsken til sin formering, de formerte humane celler høstes fra diffusjonskammeret, de formerte humane celler utsettes for en effektiv mengde interferon-frem kallere in vivo eller in vitro for å akkumulere en vesentlig mengde human-spesifikt type II-interferon, og det akkumulerte, human-spesifikke type II-interferon utvinnes på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, karakterisert ved at det som interferon-fremkaller anvendes både type I-interferon-fremkaller og type II-interferon-fremkaller .