JPS5889195A - 標的細胞障害性因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、標的細胞障害性因子の製造方法に関する。

標的細胞障害性因子（Ｔａｒｇｅｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｙｓ
ｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ以下、単にＴＣＬＦと略称する。）
は、マウスＬ−９２９細胞を標的細胞とし、この細胞に
障害（Ｃｙｔｏ−ｔｏｘｉｃｉｔｙ　）を与え、その細
胞を死滅破壊（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ　）させる因子でリ
ンホトキシン、ツモア　ネクロシス　ファクターなどが
知られている。

リンホトキシンは、青木隆−ほか共著「リンホカイン」
、新免疫学寮書６．１９７９年、医学書院、Ｂｌｏｏｍ
、　Ｂ、Ｒ０＆　Ｇｌａｄｅ　、　Ｐ、Ｒ，共編［Ｉｎ
　Ｖｉｔｒｏｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ｃｅｌｌ　−ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ　ｉｒｒｍｕｎｉｔｙ　Ｊ　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ１１９７１年、などにも記載されている
ように、例えば、感作された’ｌ’　１７７７球細胞に
抗原を作用させるか、ミトーゲンとしてフィトヘマグル
チニン、コンカナバリンＡをはじめとするリンホトキシ
ン誘導剤をＴリッツ球細胞に作用させることによって、
その細胞内外に誘導生成する蛋白性物質であって、細胞
障害機能を持つ物質に与えられた名称である。

リンホトキシンは、マウスＬ　−９２９細胞のみならず
、ヒト腫瘍細胞さらにはヒト正常細胞にも障害を与える
ことが知られている。またツモア　ネクロシス　ファク
ターは、Ｃａｒｓｗｅｌｌ、Ｅ、Ａ、　ｅｔ　ａｔ。

Ｐｒ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、
　Ｖｏｌ　、　７２、陽９．３６６６−３６７０頁（１
９７５年）及びＥ、　Ｐ　ｉｃｋ　＠　Ｔｕｍｏｒ　Ｎ
ｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　ｉｎ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅｓ　　Ｖｏｌ、　１１、ｐｐ、２３５〜２７２、Ａ
ｃａｄｅｍ　ｉｃ　ｐｒｅｓｓ　、　　１９８１年、な
どにも記載されているように、例えば、ウサギにＢａｃ
ｉｌｌｕｓ　ＣａｌｍｅｔｔｅＧｕｅｒｉｎ　（ＢＣＧ
）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ１
工ｙトドキシンなどのツモア　ネクロシス　ファクター
誘導剤を非経口的に投与することによって、その血清中
マクロファージ細胞が誘導生成する蛋白性物質であって
、Ｍｅｔｈ　Ａ肉腫出血性壊死能を持つ物質に与えられ
た名称である。ツモア　ネクロシスファクターは、マウ
スＬ−９２９細胞のみならずヒト腫瘍細胞にも障害を与
えそれを死滅破壊させるがヒト正常細胞には実質的に障
害を与えないことが知られている。

このように、マウスＬ　−９２９細胞を標的細胞とする
ＴＣＬＦは、腫瘍細胞に対して細胞障害機能を持ってい
ることより、悪性腫瘍治療剤として期待されてきた。Ｔ
ＣＬＦには種特異性がほとんど見られないので、ウサギ
、ラットなど種々の動物由来の細胞から調製したＴＣＬ
Ｆを利用することも考えられるが、ヒトの治療に供する
には、ヒトの生細胞由来であることが、治療上に生ずる
抗原性などの副作用の懸念もなく極めて安全であり、優
れている。

本発明者は、工業的規模で容易に実施し得るヒトのＴＣ
ＬＦの製造方法を検討し、そのＴＣＬＦが悪性腫瘍治療
剤として有用であるか否かを鋭意研究した。

その結果、ＴＣＬＦ産生能を有する培養株化されたヒト
由来の３３１Ｊンパ芽球様細胞を増殖させて得られるＢ
リンパ芽球様細胞に、ＴＣＬＦ誘導剤を作用させること
によって、ＴＣＬＦが高活性で誘導生成され、これを精
製採取することによってＴＣＬＦが多量容易に製造しう
ろことを見いだし、そのＴＣＬＦが悪性腫瘍の治療剤と
して優れていることを確認して本発明を完成した。

このようにして製造されたＴＣＬＦは、分子量約１〜１
０万の範囲に存在し、少くとも３種の糖蛋白質を含有し
ていることが明らかとなり、その作用は、マウスＬ　−
９２９細胞のみならずヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅さ
せる能力を有しているが、ヒト正常細胞には実質的に障
害を与えないことが判明した。

以下、本発明のＴＣＬＦの製造方法について詳細に説明
する。

本発明に使用する培養株化されたヒト由来のＢリンパ芽
球様細胞には、常法に従って、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｅ　）で増殖させた細胞が使用できる。しかしながら、
本発明の場合には、Ｂリンパ芽球様細胞の増殖に際し、
ヒト以外の温血動物体内に直接移植するかまたは拡散チ
ャンバー内へ接種して、その温血動物の体液の供給を受
けながら増殖させたＢ　ＩＪンパ芽球様細胞を使用する
方が望ましい。

即ち、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で増殖させる場合と
は違って、高価な血清などを含む栄養培地が不要または
大幅に節約できるばかりでなく、細胞増殖中の維持管理
も極めて容易であり、その上誘導生成されるＴＣＬＦ活
性が高い特徴を有している。

ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株化された
ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞をヒト以外の温血動物体
内に移植し、あるいは、その動物の体液の供給を受ける
ことのできる拡散チャンバー内に収容し、このチャンバ
ーを動物体内に埋設し通常の飼育をすれば、温血動物体
から供給される栄養物を含有する体液を利用してその細
胞が容易に増殖しうるのである。更に生体外（ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　）で増殖させる場合と比較して、この細胞の
増殖が安定していること、その増殖速度が大きいこと、
得られる細胞量が多いこと、更には細胞当りのＴＣＬＦ
の収量が著増することも天きな特徴である。

本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒ
ト以外の温血動物体内に移植して容易に増殖し得てしか
もＴＣＬＦ産生を有するＢリンパ芽球様細胞であればよ
イ。例えば［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ
ＭｉｃｒｏＣ１１ｎｉｃａ１　Ｖｏｌ、１．　１１６〜
１１７頁（１９７５年）に記載されているＮａｍａ１ｗ
３細胞、１０Ｍ１ｙｏｓｈｉ著「ＮａｔｕｒｅＪＶｏｌ
、２６７．８４３〜８４４頁（１９７７年）に記載され
ているＢＡＬＬ−１細胞、「組織培養」第６巻、第１３
号、５２７〜５４６頁（１９８０年）に記載されている
ＪＢＬ細胞、Ｅ　Ｂ　Ｖ　−Ｓａ細胞、ＥＢ　Ｖ　−Ｗ
ａ細胞、ＥＢＶ−ＨＯ細胞や、その他ＢＡＬＭ　２細胞
、ＣＣＲＦ−８Ｂ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　　１２０）な
どの株化細胞、更には、正常なりリンパ球細胞を各種ウ
ィルス、薬剤、放射線などで処理し培養株化させた細胞
などが自由に使用される。

また、これらＢリンパ芽球様細胞のＴＣＬＦ産生能を有
する遺伝子を、例えばポリエチレングリコールやセンダ
イウィルスなどを利用する細胞融合の手段や、ＤＮＡＩ
Ｊガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラ
ーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段などに
よって処理し、その増殖速度を高めたり、細胞当りのＴ
　ＣＬ　Ｆ産生能を高めたりして使用してもよく、本明
細書に記載する株化細胞のみに限定されるものではない
。

これらの細胞は、後に述べるＴＣＬＦを誘導生成させる
までの過程で、単独で又は２種以上を混合して自由に利
用される。必要ならば、これに、例えばヒトの新鮮面か
ら調整される白血球を併用することもできる。′ 本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖し
得るものであればよく、例えばニワ）　ＩＪ、ハトなど
の鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ
、ウシ、モルモット、ラット、ノ１ムスター、普通マウ
ス、ヌードマウスなどの哺乳類が使用できる。

これらの動物にヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞を移
植すると好ましくない免疫反応を起すおそれがあるので
、その反応をできるだけ抑えるため、使用する動物はで
きるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、または新生期
、幼少期のものの方が好ましい。

また、これら動物に例えば２００〜６００レム程度のエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤力どを注射するなどの前処置をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したもの
であっても免疫反応が弱いので、これらの前処置を必要
とすることもなく、培養株化されたヒト由来のＢリンパ
芽球様細胞が移植でき、急速に増殖できるので特に好都
合である。

また、培養株化されたヒト由来のＢリンノ（芽球様細胞
を例えば先づ）・ムスターに移植し増殖させた後、この
細胞を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト
以外の温血動物間で移植してヒト由来のＢリンパ芽球様
細胞の増殖をより安定化したり、更にそれらから誘導生
成されるＴＣＬＦ量を増加させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、四組間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞
を移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増殖しう
る部位であればよく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下
など自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径的１０　〜１０　　ｍを有するメンブランフィル
タ−１限外濾過膜またはフォローファイバーなどを設け
た公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内
、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む
体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培養
株化されたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞を何れも増殖
させることができる。

また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、潅流させる°ようにした
チャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内
のヒト由来めＢリンパ芽球様細胞の増殖状態を透視でき
るようにすることも、また、このチャンバ一部分のみを
着脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細
胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量を更に高め
ることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト・由来
のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞が動物細胞と直接接触しない
ので、ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞のみが容易に採取
できるだけでなく、好ましくない免疫反応を起す心配も
少ないので、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、
各種温血動物を自由に利用できる特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。

ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞を増殖させるだめの期間
は通常１〜１０週の期間で目的を達成することができる
。このようにして得られるヒト由来の１３１Ｊンパ芽球
様細胞数は動物個体当り約１０　〜１０　　個、または
それ以上に達することも見出した。

換言すれば、本発明で使用するＴＣＬＦの製造方法によ
り増殖させたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞数は、動物
個体当り移植した細胞数の約１０〜１０　　倍、または
それ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増殖さ
せるｉ合の約１０　〜１０　　倍、またはそれ以上にも
達して、ＴＣＬＦの製造のために極めて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来のＢリンパ芽球様細
胞からＴＣＬＦを誘導生成させる方法は自由である。そ
れが増殖した動物体内のままでＴＣＬＦ誘導剤を作用さ
せることもできる。例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増
殖したヒト由来の１３１Ｊンパ芽球様細胞に、または皮
下に生じた腫瘍細胞に、ＴＣＬＦ誘導剤を直接作用させ
てＴＣＬＦを誘導生成させ、次いでその血清、腹水また
は腫瘍からＴＣＬＰを精製採取すればよい。

また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体内から取
り出し、生体外でＴＣＬＦ誘導剤を作用させてＴＣＬＦ
を誘導生成させることもできる。

例えば、腹水中で増殖したヒト由来のＢリンパ芽球様細
゛胞を採取し、または皮下に生じたヒト由来のＢす゛ン
パ芽球様細胞を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる細胞
を約２０〜４０℃に保りた栄養培地に細胞濃度が約１０
５〜１０／−になるように浮遊させ、これにＴＣＬＦ誘
導剤を作用させることによってＴＣＬＦを誘導生成させ
、これを精製採取すればよい。

更に、ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞を拡散チャンバー
内で増殖させた場合は、増殖させた細胞を弊ヤンバー内
のままで１またはチャンバーから取り出して、ＴＣＬＦ
誘導剤を作用させ、ＴＣＬ−Ｆを誘導生成させることも
できる。

また、例えば増殖させたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞
に先づ動物体内のままでＴＣＬＦを誘導生成させた後、
次いで同一動物個体の特定の部位または全体から採取し
たヒト由来のＢ　ＩＪ　７パ芽球様細胞に動物体外でＴ
ＣＬＦを誘導生成させる方法、また一度ＴＣＬＦの誘導
生成に使用した細胞を更に２度以上ＴＣＬＦの誘導生成
に使用する方法、または動物体内に埋設、若しくは接続
するチャンバーを交換して得られる細胞数を増加させる
方法などによって、使用する動物個体当りのＴＣＬＦ生
成量を更に高めることも自由である。

本発明のＴＣＬＦ誘導剤としては、α−インターフェロ
ン誘導剤として知られているウィルス、゛核酸、ポリヌ
クレオチドなどやγ−インターフェロン誘導剤として知
られているフィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ１
ポークウイードミトーゲン、リボポリサツカリド、エン
ドトキシン、多糖類、細菌などが適宜用いられるが、通
常、α−インターフェロン誘導剤を使用する方が、高活
性のＴＣＬＦを誘導生成できるので好都合である。

、ｔた。感作化された細胞にとっては、抗原もＴＣＬＦ
の誘導剤である。

更に、ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞からＴＣＬＦを誘
導生成させるに際し、ＴＣ〜ＬＰ誘導剤として、α−イ
ンターフェロン誘導剤とγ−インターフェロン誘導剤と
を併用することによりＴＣＬＦの生成量を著増しうろこ
とが判明した。

また、これら誘導生成によってＴＣＬＦが産生されるだ
けでなく、種特異性の高いヒトインターフェロンも同時
に産生されることが判明した。

このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同時
生産を可能にし、更に、ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞
の高度利用を可能にし、ヒ）ＴＣＬＦ及びヒトインター
フェロンを大量に安価に供給する点からきわめて好都合
である。

このようにして誘導生成されたＴＣＬＦは、公知の精製
分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮、
凍結乾燥などを行なうことによって容易に精製分離し、
採取することができる。更に高度の精製を必要とする場
合には、例えば、イオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾
過、および等電点分画、電気泳動などの公知の方法を組
合せれば、最高純度のＴＣＬＦを採取することも可能だ
が、抗体を用いたアライニティクロマトグラフィーや、
コンカナバリンＡ−セファロースヲ用いたアライロティ
クロマトグラフィーにより、高純度のＴＣＬＦを極めて
簡便かつ迅速に製造できるので非常に好都合である。

このようにして製造されたＴＣＬＦは、分子量約１〜１
０万の範囲に少くとも３種の糖蛋白質すなわち分子量約
１〜２万、約３．５〜５万及び約７〜９万の存在が明ら
かとなり、その作用は、マウスＬ−９２９細胞のみなら
ずヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅させる能力を有してい
るが、ヒト正常細胞には実質的に障害を与えないことが
判明した。

従って、本発明のＴＣＬＦは、ＴＣＬＦ感受性疾患例え
ば悪性腫瘍の予防剤、治療剤なかでも、従来、治療がき
わめて困難とされてきたヒトの各種悪性腫瘍治療剤とし
て有利に用いる９ことができる。

ＴＣＬＦの活性は、Ｂｌｏｏｍ、Ｂ、Ｒ０＆　Ｇｌａｄ
ｅ、Ｐ、Ｒ。

共編［Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅ
ｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｒｒｍｕｎｉｔｙＪＡｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７１年）に報告されて
いるリンホトキシンの場合の方法に従って、マウスＬ　
−９２９細胞を標的細胞に使用して、一定時間後の生残
細胞数を測定する方法を用いた。

ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性は［蛋白
質核酸酵素Ｊ　Ｖｏｌ、２０．Ｎｎ６．６１６〜６４３
頁（１９７５年）に報告されているヒト羊膜由来のＰＬ
細胞を使用して公知のプラーク半減法で測定した。

赤血球凝集価はＪ、Ｅ、　８ａｌｋ著［Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ＩｍｎｕｎｏｌｏｇｙＪＶｏｌ　、　４９　、
８７頁、（１９４４年）の方法に準じて測定した。

次に、ＴＣＬＦの産生に関する実験Ａを述べる。

〔実験　Ａ〕　生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）又は、生体
内で増殖させて得た細胞によるＴＣＬＦ産生能試験実験
　Ａ−１生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）での増殖ヒト由来の
Ｂ　ＩＪンバ芽球様細胞ＢλＬＬ−１細胞を牛胎児血清
をＩ％補足したＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　　１６４０培地（ＰＨ
７，２）に接種し、３７℃で浮遊培養した。得られた細
胞を血清無添加のＲＰＭＩ　　１６４０培地（ＰＨ７，
２）で洗浄し、同培地に約１×１０７１ｎｌに表るよう
懸濁した。

実験　Ａ−２生体内での増殖 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で゛゛調
製た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後
、その皮下にＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常の
方法で３週間飼育した。皮下に生じた腫瘤を摘出し細切
し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を
血清無添加のＲＰＭＩ　　１６４０培地（ｐ”　７−２
）で洗浄し、同培地に約１ＸＩＯ／ｄになるよう懸濁し
た。

実験　Ａ−３ＴＣＬＥの産生 実験Ａ−１、実験Ａ−２で得九ＢＡＬＬ−を細胞の懸濁
液にセンダイウィルス若しくはフィトヘマグルチニンを
単用゛するかまたはセンダイウィルスとフィトへ妥グル
チニンとを併用してＴＣＬＦを誘導生成させた。即ち、
約ｌＸｌ０／ｍ／の細胞濃度を有する懸濁液にセンダイ
ウィルスをｍｌ当り約３００赤血球凝集価の割合で添加
し、３７℃で２日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させた。

また、フィトヘマグルチニ／の場合には、細胞懸濁液ｍ
ｌ当り約（３）μｙを添加して３７℃で２日間保ってＴ
ＣＬＦを誘導生成させた。また、センダイウィルスとフ
ィトヘマグルチニンとを併用する場合には、センダイウ
ィルスをｍｌ当り約３００赤血球凝集価及びフィトヘマ
グルチニンをｍｌ当り約父μＩを添加して３７℃で２日
間保ってＴＣＬＦを誘導生成させた。この際、ＴＣＬＦ
以外に多量のα−インターフェロン、γ−インターフェ
ロンが同時に産生されていた。

ＴＣＬＦの産生結果は第１表に示す。

（イ）数値は、ｍｌ当りのＴＣＬＦ活性を示す。

但し、（）内の数値は、ｍｌ当りのヒトインターフェロ
ン活性を示す。

第１表の峙果から明らかなように、ＴＣＬＦは生体外で
増殖させた細胞からも生成される。しかしながら生体内
で増殖させた細胞から誘導生成されるＴＣＬＦ量の方が
多く、生体外で誘導生成されるものの約１０倍以上であ
る。またセンダイウィルスによって誘導生成されるＴＣ
ＬＦは、フィトヘマグルチニンを使用する場合と同擲以
上である〇また、ＴＣＬＦ誘導剤が、センダイウィルス
単独またはフィトヘマグルチニン単独の場合に誘導生成
されるＴＣＬＦ活性と、センダイウィルス及びフィトヘ
マグルチニンとを併用する場合に誘導生成されるＴＣＬ
Ｆ活性とに着目すると、生体外で増殖させた細胞を用い
た場合も、生体内で増殖させた細胞を用いた場合もいず
れもセンダイウィルスとフィトヘマグルチニンとの相乗
効果が認められる。

その相乗効果の程度は、生体内で増殖させた細胞を用い
た場合の方が特に顕著である。

以上述べた実験結果から明らかなように、種特異性のな
いＴＣＬＦの誘導生成に種特異性の高いインターフェロ
ン誘導剤なかでもα−インターフェロン誘導剤及びγ−
インターフェロン誘導剤の併用が好都合である。

次に、ＴＣＬＦの製造実施例を述べる。

実施例　Ａ−１ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下にヒト由来のリンパ芽球様細胞ＢＡＬＬ−１細
胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下
に生じた約１５ｇの腫瘤を摘出し細切し、生理食塩水中
で分散させほぐした。得られた細胞を血清無添加のＲＰ
　Ｍ　Ｉ　　１６４０培地（ＰＨ７，２）で洗浄し、同
培地に約５×１０／ｍｌに懸濁した。この懸濁液に、セ
ンダイウィルスをｄ当り約１，０００赤血球凝集価及び
フィトヘマグルチニンを１当り約２００μｔを添加し、
３７℃で２日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させた。これ
を約４℃、約１．０００９で遠心分離し、沈澱物を除去
し、得られた上清をＰＨ７，２，０，０１Ｍ　ＩＪン酸
塩緩衝液を含有する生理食塩水で２１時間透析し、更に
精密濾過して得た濾液を濃縮し、凍結乾燥してＴＣＬＦ
活性を含有する粉末を得た。得られたＴＣＬＦ活性は、
ノ・ムスク−１匹当り約ｓ、ｏｏｏ万単位であった。な
お、本品には、ヒトインターフェロン約３，２００万単
位含有していた。

実施例　Ａ−２ ヒト由来のリンパ芽球様細胞ＢＡＬＬ−１細胞を牛胎児
血清を２０Ｘ補足したＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐ”
　７．４）に接種し、３７℃で常法に従い生体外（ｉｎ
ｙｉｔｒｏ）で浮遊培養した。得られた細胞を血清無添
加のＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐ”　７．４）で洗浄
し、同培地に約Ｉ　Ｘ　１０’／　ｍｌになるように懸
濁した。この懸濁−液にセンダイウィルスをｍｌ当り約
１，０００赤血球凝集価及びコンカナバリンＡをｍｌ当
り約５μｔを添加し、羽℃で１日保つてＴＣＬＦを誘導
生成させた。これを４℃、約１．ｏｏｏ　ｇで遠心分離
し、得られた上清をＰＨ７，２，０，０１Ｍ　！Ｊン酸
塩緩衝液を含有する生理食塩水で１５時間透析し、更に
精密濾過して得た濾液を濃縮してＴＣＬＦ活性を含有す
る溶液を得た。得られたＴＣＬＦ活性は誘導生成時の懸
濁液ｌｔ当り約４５０万単位であった。なお、本液のヒ
トインターフェロン活性は、誘導生成時の懸濁液、１を
当り約１，２００万単位であった。

実施例　Ａ−３ 成長したヌードマウスの腹腔内に、ヒト由来のリンパ芽
球様細胞Ｎａｍａ　１ｗａ細胞を移植後、通常の方法で
５週間飼育した・。この腹腔内へ、約３，０００赤面球
凝集価のニューカッスル病ウィルスを紫外線によって予
めほとんど失活させて注入し、Ｕ時間後に屠殺して腹水
を採取した。以後、実施例Ａ−１と同様に精製し濃縮し
てＴＣＬＦ活性を有する粉末を得た。得られたＴＣＬＦ
活性は、ヌードマウス１匹当り約９００万単位であった
。なお、本品にはヒトインターフェロン約５２０万単位
を含有していた。

実施例　Ａ−４ 成長した普通マウスに約４００レムのエックス［−予め
照射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮下
に培養株化されたヒト由来の３３１Ｊンパ芽球様細胞Ｃ
ＣＲＦ−８Ｂ細胞を移植し、その後通常の方法で３週間
飼育した。皮下に生じた約１０ｇの腫瘤を摘出した後、
実施例Ａ−１と同様にして細胞を分散させた。この細胞
を実施例Ａ−１と同様に懸濁した後、この懸濁液に、セ
ンダイウィルスをｍｌ当り約５００赤血球凝集価及びコ
ンカナバリ／Ａをｍｌ当り０．８μ２を添加し、３７℃
で１日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させた。以後、実施
例Ａ−１と同様に精製濃縮してＴＣＬＦ活性を有する粉
末を得た。得られたＴＣＬ、Ｆ活性は、マウス１匹当り
２，４００万単位であった。なお、本品にはヒトーイン
ターフェロン約１，９００万単位含有していた。

実施例　Ａ−５ 新生児のハムスターに実施例Ａ−１と同様にしてヒト由
来のリンパ芽球様細胞ＪＢＬ細胞を移植し、その後通常
の方法で４週間飼育した。皮下に生じた約２０ｇの腫瘤
を実施例Ａ−１と同様にほぐして約３Ｘ１０／ｍｌの細
胞懸濁液を得た。本懸濁液にセンダイウィルスをｍｌ当
り約１，０００赤面球凝集価を添加し３６℃で２日間保
ってＴＣＬＦを誘導生成させ次いで実施例Ａ−２と同様
に精製濃縮してＴＣＬＦ活性を有する濃縮液を得た。得
られたＴＣＬＦ活性は、ハムスター１匹当り約１，６０
０万単位であった。なお本液にはハムスター１匹当り約
７００万単位のヒトインターフェロンを含有していた。

実施例　Ａ−６ 孔径０．５ミクロンのメンブランフィルタ−を設けた内
容量的１０　ｍｌのプラスチック製両筒型拡散チャンバ
ー内に、培養株化されたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞
ＥＢＶ−ＨＯ細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長
したラットの腹腔内に埋設した。

このラットを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チャンバーを取り出した。これにより得られたヒト由来
のＢリンパ芽球様細胞の濃度は約６Ｘ　１０　／　ｍｌ
であって、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキ、ユベー
ター中で増殖させる場合の約１０倍以上にも達すること
がわかった。この細胞を実施例Ａ−２と同様に懸濁し、
この懸濁液に、ｍｌ当り約５００赤血球凝集価のニュー
カッスル病ウィルスを紫外線で予めほとんど失活させて
加え、さらにフィトへマグルチニンをｍｌ当り約１００
μ？加え３７℃で２日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させ
た。以後、実施例Ａ−１と同様に精製し濃縮してＴＣＬ
Ｆ活性を有する粉末を得た。得られたＴＣＬＦはラット
１匹肖り約５４０万単位であった。なお、本品にはヒト
インターフェロン約６８０万単位を含有していた。

実施例　Ａ−７ ３７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、培養株化さ
れたヒト由来の１３１Ｊンパ芽球様細胞ＡＢＬＬ−１細
胞を移植した後、３７℃で１週間保った。この卵を割卵
した後、増殖細胞を採取した。この細を 胞を実施例Ａ−１と同様に５Ｘ１０／ｍｌに懸濁した。

この懸濁液にｍｌ当り約１，０００赤面球凝集価のセン
ダイライ・ルスを添加し、３７℃で１日間保ってＴＣＬ
Ｆを誘導生成させ、次いで実施例Ａ−２と同様に精製濃
縮してＴＣＬＦ活性を有する濃縮液を得た。得られたＴ
ＣＬＦ活性は、５受精卵１０個当り約頒万単位であった
。なお、重液には、゛受精卵１０個当り約お万単位のヒ
トインターフェロンを含有していた。

実施例　Ａ−８ 実施例Ａ−１の方法で調製したＴＣＬＦ含有粉末を、Ｇ
、　Ｂｏｄｏの報％　（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ。

５ｔａｎｄａｉｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ　ｕｓｅ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ。

１１ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｒＩＴｎｕ
ｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　８
＆９　Ｊｕｎｅ　１９７７、　Ｚａｇｒｅｂ、Ｙｕｇｏ
ｓｌａｖｉａ）に準じティオン交換への吸脱着、ゲル濾
過による分子量分画、濃縮及び精密濾過などの手段によ
りインターフェロンを除去し、さらに硫安塩析により濃
縮精製を行ない、その後、ＰＨ７，４，０，０１Ｍリン
酸塩緩衝液中でフィトヘマグルチニンーセファロースア
ライニティクロマトグラフィーを行い、吸着画分を０．
１ＭＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン含有上記緩衝液
で溶出させ、得られた画分を上記緩衝液で透析し、濃縮
後、凍結乾燥してＴＣＬＦ活性を含有する粉末を得た。

このようにして得られたＴ　ＣＬ＝、Ｆは、１活性３０
．０００単位／ｒｎ９であった。

さらに、ゲル濾過法により分子量分画したところ、分子
量７〜９万、分子量３．５〜５万及び分子量１〜２万の
ＴＣＬＦが活性量比的１：１：２で分取された。本ＴＣ
ＬＦはいずれも糖蛋白質で、その糖含量は分子量の違い
によっても異なるが、約５〜４５％である。

以上述べた製造実施例のようにして得た本発明のＴＣＬ
Ｆは、ＴＣＬＦ単独で若しくはＴＣＬＦとインターフェ
ロンとの混合物でまたはＴＣＬＦに１種若しくは２種以
上の他の物質を含有せしめることにより、例えば注射薬
、内服薬、点眼薬、点鼻薬、外用薬などとしてＴＣＬＦ
感受性疾患の予防剤、治療剤として有利に用いることが
できる。

ＴＣＬＦ感受性疾患とは、ＴＣＬＦによって予防され若
しくは治療される疾患であり、例えば、乳癌、肺癌、膀
胱癌、子宮癌、大腸癌、背痛、白血病、リンパ腫、皮膚
癌などの悪性腫瘍である。

次に、ＴＣＬＦの有効性、毒性、用法および用量につい
て実験Ｂで明らかにする 〔実験　Ｂ）　　ＴＣＬＦの有効性、毒性試験実験　Ｂ
−１ ＢＡＬＢ／Ｃ由来ヌードマウスに人乳癌組織片を背部皮
下に移植する。腫瘍体積が約２００−の時期から実施例
Ａ−８の方法で得られたＴＣＬＦの分子量７〜９万、分
子量３．５〜５万１分子量１〜２万の混合品（以下、単
にＴＣＬＰ混合品と称す暮。）を４および４０単位７に
９．１日２回に分けて静注し、１５５日目マウスを殺し
、腫瘍重量を測定した。その結果を第２表に示した。な
お、対′照はＴＣＬＦ無含有生理食塩水を静注した。

゛　　※　危険率５％以下で対照の値に比し、推計学的
に有意差あり。

実験　Ｂ−２ 体重２５夕前後のＢ　Ｄ　Ｆ１雄マウスを各群１０匹と
し、２　ＩＩ角に切断、したルイス肺癌を背部皮下に移
植した。移植後８日目から実施例Ａ−８の方法で得られ
たＴＣＬＦ混合品および分子量１〜２万のＴＣＬＦをそ
れぞれ４および４０単位／に９，１日２回に分けて連日
静注し、２１１日目マウスを殺して腫瘍重量を測定した
。

その結果を第３表に示した。なお、対照はＴＣＬＦ無含
有生理食塩水を静注した。

秦　危険率５％以下で対照の値に比し、推計学的に有意
差あり。

実験　Ｂ−３ 体重２５ｇ前後のＢＤＦｔ雄マウスマウ加匹とし、これ
に白血病Ｌ　　１２１０細胞を移植した。移植後１日目
からＴＣＬＦ混合品をそれぞれ加単位／　ｋｇ　／日お
よび３００単位／に９７日を１日１回又は１日２回投与
して連日静注し、生残率が関％に低下するまでの日数を
比較した。なお対照として、ＴＣＬＦ無含有生理食塩水
又はマイトマイシン０．５■／に９７日を同様に静注し
た。結果は第４表に示した。

第　　　４　　　表 第４表の結果からＴＣＬＦ混合品の投与量が比較的少な
い場合でもその投与方法を１日１回から１日２回に増す
ことによりきわめて有効である。

実験　Ｂ−４ 体重２５ｇ前後のＢＤＦｌ雄マウス各群加西とし、これ
に白血病Ｐ３８８細胞を移植した。移植後１日目からＴ
ＣＬＦ混合品を１日１回、連日、腹腔内にＩ日間静注し
、ＴＣＬＦ混合品の投与量、生残日数及び生残率（％）
の関係を求めた。なお対照はＴＣＬＦ無含有生理食塩水
又はマイトマイシン０．５■／　ｋｇ　／日を静注した
。

結果は第５表に示した。

第５表の結果から明らかなように、ＴＣＬＦ混合品を１
，０００単位以上／　ｋｇ　／日の大量投与が予防剤、
治療剤としてきわめて有効である。

実験　Ｂ−５急性毒性 生後ｍ８のマウスを使用して、実施例Ａ−８の方法で得
られたＴＣＬＦ混合品の急性毒性試験をしたところ、本
ＴＣＬＦ混合品の毒性は極めて低く、腹腔内に注射した
時のＬＤｓｏは１０，０００単位以上／ｋｇであること
が判明した。

また、ヒト正常細胞とヒト腫瘍細胞とを用いて、常法に
従ってｉｎ、　ｖｉｔｒｏで細胞の生育を艶％阻害する
ＴＣＬＦ混合品の濃度を調べた。

その結果、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　（４０７）細胞、Ｌｉ
ｖｅｒ　（Ｃｈａｎｇ）細胞又はＧｉｒａｒｄｉ　Ｈｅ
ａｒｔ細胞などの正常細胞ではいずれも２０，０００単
位以上／ｄと高濃度であるのに対し、ＫＢ（鼻咽腔癌）
細胞、Ｈ，Ｅｐ＃２（咽喉癌）細胞又はＨＬＥ（肝癌）
細胞ではそれぞれ１８単位／ｍｌ、２４単位／　ｍｌ　
、お単位／ｍｌと−きわめて低濃度であった。

以上の実験からも明らかなように、本発明のＴＣＬＦは
、その有効用量からも極めて安全であり、ＴＣＬＦ感受
性疾患に用いることができる。

更には、悪性腫瘍に適用するにあたっては、例えば患者
・の腫瘍の一部を取り、本発明のＴＣＬＦと生体外で処
理することによって腫瘍の免疫原性を高めた後、腫瘍患
者の体内に戻すことにより、この悪性腫瘍の治療を行う
こともできる。

本発明のＴＣＬＦの成人１日当りの用量は５〜５０．０
００，０００単位であり、好ましくは局所注射および点
眼などの局所適用用量は５〜１，０００，０００単位、
軟膏の場合１０〜５，０００，０００単位、静注および
筋注なと全身注射の場合５０〜１０，０００，０００単
位、経口投与の場合５００〜５０，０００，０００単位
であるが用法あるいは症状に応じて適宜増減することが
できる。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤あ
るいは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤に調製す
ることができるが、ＴＣＬＦの毒性、有効量及び安定性
などを考慮すると医薬用製剤ダラム当り５単位以上のＴ
ＣＬＦを含有せしめることが望ましい０ 本発明のＴＣＬＦを含有するＴＣＬＦ感受性疾患序防剤
、若しくは治療剤は、その目的に応じてその形状を自由
に選択できる。

経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤などの腸溶
製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、注射剤としては
、例えば用時に注射用蒸溜水に溶解して使用する凍結乾
燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟７膏剤として用
いることもできる。

以下に製剤の実施例を示すが、製剤はこれのみに限定さ
れるものではない。

実施例　Ｂ−１注　射　剤 実施例Ａ−８の方法で調製したＴＣＬＦ混合品２０．０
００単位を２００１ｎｌの生理食塩水に溶解し、メンブ
ランフィルタ−を用いて無菌的に濾過する。濾液を滅菌
したガラス容器に２　ｍｌずつ充填して凍結−乾燥し、
これを密栓して、凍結乾燥粉末製剤とする。

本品は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療に好適で
ある。

実施例　Ｂ−２軟　膏　剤 実施例Ａ＝３の方法で調製したＴＣＬＦ混合品を常法に
従い少量の流動パラフィンに研和した後、ワセリンを加
え関単位／ｇの軟膏薬とした。

本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に好適であ
る。

実施例　Ｂ−３点　眼　剤 Ｒ溜水８００　ｒｎｌ　、！：β−フェニルエチルアル
コール５ａｔと実施例Ａ−６の方法で調製したＴＣＬＦ
混合品の４０，０００単位とに等張化するよう食塩を加
え蒸溜水で１，０００　ｗｔｌとし点眼剤とした。

本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適である。

実施例　Ｂ−４腸溶性錠剤 実施例Ａ−８の方法で調製した分子量１万〜２万のＴＣ
ＬＦを常法に従って澱粉とマルトースとを混合使用して
打錠するに際し、このＴＣＬＦを製品１錠（１００■）
当り２，０００単位になるように含有せしめて錠剤を製
造し、これにメチルセルロースフタレートをコーティン
グして腸溶性錠剤としだ。

本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好適である
。

特許出願人 株式会社林原生物化学研究所 手　　続　　補　　正　　書 昭和５６年１２月２９日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 Ｌ　事件の表示１ 昭和５６年特許願第１８７６２６号 ２　発明の名称 標的細胞障害性因子の製造方法 ａ　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、補正の対象 手　　続　　補　　正　　書 昭和５６年１２月２９日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 ｔ　事件の表示 昭和５６年特許願第１８７６２６号 ２　発明の名称 標的細胞障害性因子の製造方法 ａ　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 明細書における「特許請求の範囲」の項２、特許請求の
範囲 （り　　標的細胞障害性因子産生能を有する培養株化さ
れたヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞に、標的細胞障
害性因子誘導剤を作用させ、生成した標的細胞障害性因
子を精製採取することを特徴とする標的細胞障害性因子
の製造方法。

（２１標的細胞障害性因子産生能を有する培養株化され
たヒト由来のＢリンパ芽球様細胞をヒト以外の温血動物
体内に直接移植するか、または拡散チャンバー内へ接種
して、その温血動物の体液の供給を受けながら増殖させ
て得られるヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞に標的細
胞障害性因子誘導剤を作用させることを特徴とする特許
請求の範囲＋１１項記載の標的細胞障害性因子の製造方
法。

（３）　　ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞がＢＡＬＬ−
１細胞、Ｎａｍａ１ｗａ細胞、ＣＣＲＦ−３Ｂ細胞、Ｅ
ＢＶ−ＨＯ細胞及びＪＢＬ細胞から選ばれる細胞である
こ゛とを特徴とする特許請求の範囲（１）項または（２
）項記載の標的細胞障害性因子の製造方法。

（４）標的細胞障害性因子誘導剤としてα−インターフ
ェロン誘導剤を使用するか、″または、α−インターフ
ェロン誘導剤及びｒ−インターフェロン誘導剤を併用す
ることを特徴とする特許請求の範囲（１）項、（２）項
または（３）項記載の標的細胞障害性因子の製造方法。

（５）　　α−インターフェロン誘導剤がウィルスであ
り、ｒ−インターフェロン誘導剤がフィトヘマグルチニ
ン又はコンカナバリンＡである特許請求の範囲（４）項
記載の標的細胞障害性因子の製造方法。

（６）標的細胞障害性因子をヒトインターフェロンとと
もに産生せしめることを特徴とする特許請求の範囲（１
）項、（２）項、（３）項、（４）項または（５）項記
載の標的細胞障害性因子の製造方法。

項、（４）項、（５）項または（６）項記載の標的細胞
障害性因子の製造方法。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　標的細胞障害性因子産生能を有する培養株化
   されたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞に、標的細胞障害
   性因子誘導剤を作用させ、生成した標的細胞障害性因子
   を精製採取することを特徴とする標的細胞障害性因子の
   、製造方法。
2. （２）標的細胞障害性因子産生能を有する培養株化され
   たヒト由来のＢ　＋７ンパ芽球様細胞をヒト以外の温血
   動物体内に直接移植するか、または拡散チャンバー内へ
   接種して、その温血動物の体液の供給を受けながら増殖
   させて得られるヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞に標
   的細胞障害性因子誘導剤を作用させることを特徴とする
   特許請求の範囲（１）項記載の標的細胞障害性因子の製
   造方法。
3. （３）ヒト由来の３３１Ｊンバ芽球様細胞がＢＡＬＬ−
   １細胞、ＮａｔｍＩｗａ細胞、ＣＣＲＦ−８Ｂ細胞、Ｅ
   ＢＶ−ＨＯ細胞及びＪＢＬ細胞から選ばれる細胞である
   ことを特徴とする特許請求の囲範（１）項または（２）
   項記載の標的細胞障害性因子の製造方法。
4. （４）標的細胞障害性因子誘導剤としてα−インターフ
   ェロン誘導剤を使用するか、または、α−インターフェ
   ロン誘導剤及びｒ−インターフェロン誘導剤を併用する
   ことを特徴とする特許請求の範囲（１）項、（２）項ま
   たは４３）項記載の標的細胞障害性因子の製造方法。
5. （５）　　α−インターフェロン誘導剤がウィルスであ
   り、γ−インターフェロン誘導剤がフィトヘマグルチニ
   ン又はコンカナバリンＡである特許請求の範囲（４）項
   記載の標的細胞障害性因子の製造方法。
6. （６）標的細胞障害性因子をヒトインターフェロシとと
   もに産生せしめることを特徴とする特許請求の範囲（１
   ）項、（２）項、（３）項、（４）項または（５）現記
   、載の標的細胞障害性因子の製造方法。